特表 2024-538100 細胞外小胞の産生のための改変産生細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-18

(54)【発明の名称】細胞外小胞の産生のための改変産生細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20241010BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241010BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20241010BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241010BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N15/09 100

C12M1/00 D

A61K38/20

A61K31/7088

A61K48/00

A61K35/12

A61P43/00 105

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522295

(86)(22)【出願日】2022-10-14

(85)【翻訳文提出日】2024-04-18

(86)【国際出願番号】 US2022078150

(87)【国際公開番号】W WO2023064924

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】63/255,857

(32)【優先日】2021-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522228126

【氏名又は名称】ロンザ セールス アーゲー

【氏名又は名称原語表記】ＬＯＮＺＡ ＳＡＬＥＳ ＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】マーティン， シェリー， エー．

(72)【発明者】

【氏名】マコーネル， ラッセル， イー．

(72)【発明者】

【氏名】フィン， ジョナサン

(72)【発明者】

【氏名】エステス， スコット， ディー．

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029BB11

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BD21

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084DA12

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA14

4C086ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087NA14

4C087ZB21

(57)【要約】

本開示は、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示す産生細胞から、細胞外小胞を産生する方法、及び細胞外小胞の産生を増加させる方法を提供する。また、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を有する細胞組成物も提供される。コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能は、産生細胞からの細胞外小胞の収率及び産生を増加させる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

産生細胞から産生される細胞外小胞（ＥＶ）の数を増加させる方法であって、前記産生細胞のコレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示すように前記産生細胞を改変することを含む、方法。

【請求項2】

産生細胞から細胞外小胞（ＥＶ）を産生する方法であって、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示す前記産生細胞を培養することを含む、方法。

【請求項3】

前記コレステロール生合成における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能が、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－コエンザイムＡレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）、ステロール調節エレメント結合タンパク質２（ＳＲＥＢＦ２）、スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＬＥ）、若しくは７－デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＤＨＣＲ７）から選択される１つ以上の遺伝子、又は前記遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記産生細胞によって産生される前記ＥＶが、前記コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能が低下していない産生細胞によって産生されるＥＶと比較して、増加した収率を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記収率が、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約２６倍、少なくとも約２７倍、少なくとも約２８倍、少なくとも約２９倍、又は少なくとも約３０倍増加する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記収率が、約２倍～約３０倍、約２倍～約２５倍、約２倍～約２０倍、約２倍～約１５倍、約２倍～約１０倍、約２倍～約５倍、約５倍～約３０倍、約５倍～約２５倍、約５倍～約２０倍、約５倍～約１５倍、約５倍～約１０倍、約１０倍～約３０倍、約１０倍～約２５倍、約１０倍～約２０倍、約１０倍～約１５倍、約１５倍～約３０倍、約１５倍～約２５倍、約１５倍～約２０倍、約２０倍～約３０倍、約２０倍～約２５倍、又は約２５倍～約３０倍増加する、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記収率が、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記コレステロール生合成における低下した遺伝子が、ＳＲＥＢＦ２である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＳＲＥＢＦ２遺伝子の発現が、約２倍～約２０倍低下する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＳＲＥＢＦ２遺伝子の発現が、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、又は約２０倍低下する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記コレステロール生合成における低下した遺伝子が、ＨＭＧＣＲである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ＨＭＧＣＲ遺伝子の発現が、約２倍～３０倍低下する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ＨＭＧＣＲ遺伝子の発現が、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２３倍、約２４倍、約２５倍、約２６倍、約２７倍、約２８倍、約２９倍、又は約３０倍低下する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記コレステロール生合成経路における遺伝子及び／タンパク質機能が、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約１０％、少なくとも約５％、又は少なくとも約１％低下する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記コレステロール生合成経路における遺伝子及び／タンパク質機能が、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約３０％低下する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記改変が、前記産生細胞を、前記コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させることができる薬剤と接触させることを含む、請求項１及び３～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記産生細胞が、前記産生細胞を、前記コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させることができる薬剤と接触させることによって、前記培養前に改変される、請求項２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記薬剤が、スタチン、カリプラジン、ＰＲＯＴＡＣ、ＡＹ９９４４、又はＢＭ１５７６６を含む、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項19】

前記スタチンが、アトルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記スタチンが、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約約１０ｎＭ、約１１ｎＭ、約１２ｎＭ、約１３ｎＭ、約１４ｎＭ、約１５ｎＭ、約１６ｎＭ、約１７ｎＭ、約１８ｎＭ、又は約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２６０ｎＭ、約２７０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約２９０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３１０ｎＭ、約３２０ｎＭ、約３３０ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３６０ｎＭ、約３７０ｎＭ、約３８０ｎＭ、約３９０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４１０ｎＭ、約４２０ｎＭ、約４３０ｎＭ、約４４０ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４６０ｎＭ、約４７０ｎＭ、約４８０ｎＭ、約４９０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５１０ｎＭ、約５２０ｎＭ、約５３０ｎＭ、約５４０ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５６０ｎＭ、約５７０ｎＭ、約５８０ｎＭ、約５９０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６１０ｎＭ、約６２０ｎＭ、約６３０ｎＭ、約６４０ｎＭ、約６５０ｎＭ、約６６０ｎＭ、約６７０ｎＭ、約６８０ｎＭ、約６９０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７１０ｎＭ、約７２０ｎＭ、約７３０ｎＭ、約７４０ｎＭ、約７５０ｎＭ、約７６０ｎＭ、約７７０ｎＭ、約７８０ｎＭ、約７９０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８１０ｎＭ、約８２０ｎＭ、約８３０ｎＭ、約８４０ｎＭ、約８５０ｎＭ、約８６０ｎＭ、約８７０ｎＭ、約８８０ｎＭ、約８９０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９１０ｎＭ、約９２０ｎＭ、約９３０ｎＭ、約９４０ｎＭ、約９５０ｎＭ、約９６０ｎＭ、約９７０ｎＭ、約９８０ｎＭ、約９９０ｎＭ、又は約１，０００ｎＭの濃度で接触される、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

前記スタチンが、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ～約９０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約８０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約７０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約６０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約４０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約３０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２０ｎＭ、０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、又は約１ｎＭ～約２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約２０ｎＭ、約５ｎＭ～約１５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約４０ｎＭ、約１０ｎＭ～約３０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、又は約１０ｎＭ～約２０ｎＭの濃度で接触される、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項22】

前記コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させることができる前記薬剤が、遺伝子編集技術を含む、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項23】

前記遺伝子編集技術が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記遺伝子編集技術が、ｓｉＲＮＡを含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記産生細胞によって産生される前記ＥＶが、前記コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能が低下していない産生細胞によって産生されるＥＶと比較して、ＥＶ当たりのコレステロール含有量が低下している、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ＥＶ当たりのコレステロール含有量が、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、又は約８０％低下する、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ＥＶ当たりのコレステロール含有量が、約１％～約８０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約１０％～約２０％、約２０％～約８０％、約２０％～約７０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約２０％～約３０％、約３０％～約８０％、約３０％～約７０％、約３０％～約６０％、約３０％～約５０％、約３０％～約４０％、約４０％～約８０％、約４０％～約７０％、約４０％～約６０％、又は約４０％～約５０％低下する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記産生細胞によって産生される前記ＥＶが、前記コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能が低下していない産生細胞によって産生されるＥＶと比較して、平均サイズ分布に差異がない、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記産生細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記産生細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、肥満細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又はＣ２Ｃ１２細胞である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記産生細胞が、幹細胞である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記ＥＶが、足場部分を更に含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記足場部分が、足場Ｘを含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

足場Ｘが、プロスタグランジンＦ２受容体負の調節因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）、ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）、インテグリンβ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）、インテグリンα－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）、４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）、ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記足場部分が、ＰＴＧＦＲＮタンパク質である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記足場部分が、配列番号１と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記足場部分が、足場Ｙを含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項38】

前記足場Ｙが、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳタンパク質）、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質）、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１タンパク質）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記ＥＶが、足場部分に連結された少なくとも１つの治療剤を更に含む、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記ＥＶが、少なくとも１つの治療剤を更に含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記治療剤が、サイトカイン、小分子、増殖因子、抗原、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＰＲＯＴＡＣ、アジュバント、免疫調節剤、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３９又は４０に記載の方法。

【請求項42】

前記治療剤が、ＩＬ－１２である、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

前記治療剤が、ＳＴＩＮＧアゴニストである、請求項４０に記載の方法。

【請求項44】

前記治療剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４０に記載の方法。

【請求項45】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、Ｋｒａｓ、ＳＴＡＴ３、Ｎｒａｓ、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／ｂ、ＮＬＲＰ３、又はそれらの任意の組み合わせを標的化する、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法で使用するための、産生細胞。

【請求項47】

請求項１及び３～４５のいずれか一項に記載の方法によって調製された、産生細胞。

【請求項48】

請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法又は請求項４６若しくは４７に記載の産生細胞によって産生される、細胞外小胞。

【請求項49】

請求項４６若しくは４７に記載の産生細胞、又は請求項４８に記載の細胞外小胞を含む、バイオリアクター。

【請求項50】

疾患又は状態の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行う方法であって、請求項４８に記載の細胞外小胞を投与することを含む、方法。

【請求項51】

疾患又は状態の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行うための、請求項４８に記載の細胞外小胞の使用。

【請求項52】

疾患又は状態の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行うための、請求項４８に記載の細胞外小胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１４日に出願された米国仮出願第６３／２５５，８５７号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表の参照
本出願とともに提出された電子的に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルにおける配列表の内容（名称４０００＿１２９ＰＣ０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２６、サイズ：２４，４９０バイト、及び作成日：２０２２年１０月１４日）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、細胞外小胞（例えば、エクソソーム）を得るために使用することができる改変された産生細胞に関する。本開示はまた、そのような改変された産生細胞からＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

細胞外小胞、特に、エクソソームは、生体内の全てのタイプの細胞への様々なペイロードの効率的な送達を可能にする新しいモダリティとして関心を集めている。エクソソーム生物学を新しい医薬品に応用するための取り組みが加速するにつれて、エクソソームを製造するための現在の最先端技術と、大規模な臨床及び商業的製造をサポートするために必要な能力との間に、技術的なギャップが生じている。その目的のために、かなりの試みがインビトロで産生細胞株の増殖及び生産性を維持することに焦点を当ててきたが、エクソソーム収率を最大化することは依然として課題である。したがって、細胞外小胞の効率的、低コスト、及び信頼性の高い高力価産生のための新規の方法が必要である。

【発明の概要】

【0005】

いくつかの態様において、本開示は、産生細胞から産生される細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ、ＥＶ）の数を増加させる方法を提供し、本方法は、産生細胞のコレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示すように産生細胞を改変することを含む。いくつかの態様において、本開示はまた、産生細胞から細胞外小胞（ＥＶ）を産生する方法を提供し、本方法は、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示す産生細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、コレステロール生合成における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能は、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－コエンザイムＡレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）、ステロール調節エレメント結合タンパク質２（ＳＲＥＢＦ２）、スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＬＥ）、若しくは７－デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＤＨＣＲ７）から選択される１つ以上の遺伝子、又はその遺伝子によってコードされるタンパク質を含む。いくつかの態様において、産生細胞によって産生されるＥＶは、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能が低下していない産生細胞によって産生されるＥＶと比較して、増加した収率を有する。いくつかの態様において、収率は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約２６倍、少なくとも約２７倍、少なくとも約２８倍、少なくとも約２９倍、又は少なくとも約３０倍増加する。いくつかの態様において、収率は、約２倍～約３０倍、約２倍～約２５倍、約２倍～約２０倍、約２倍～約１５倍、約２倍～約１０倍、約２倍～約５倍、約５倍～約３０倍、約５倍～約２５倍、約５倍～約２０倍、約５倍～約１５倍、約５倍～約１０倍、約１０倍～約３０倍、約１０倍～約２５倍、約１０倍～約２０倍、約１０倍～約１５倍、約１５倍～約３０倍、約１５倍～約２５倍、約１５倍～約２０倍、約２０倍～約３０倍、約２０倍～約２５倍、又は約２５倍～約３０倍増加する。いくつかの態様において、収率は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。いくつかの態様において、コレステロール生合成における低下した遺伝子は、ＳＲＥＢＦ２である。いくつかの態様において、ＳＲＥＢＦ２遺伝子の発現は、約２倍～約２０倍低下する。いくつかの態様において、ＳＲＥＢＦ２遺伝子の発現は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、又は約２０倍低下する。いくつかの態様において、コレステロール生合成における低下した遺伝子は、ＨＭＧＣＲである。いくつかの態様において、ＨＭＧＣＲ遺伝子発現は、約２倍～約３０倍低下する。いくつかの態様において、ＨＭＧＣＲ遺伝子発現は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２３倍、約２４倍、約２５倍、約２６倍、約２７倍、約２８倍、約２９倍、又は約３０倍低下する。いくつかの態様において、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能は、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約１０％、少なくとも約５％％、又は少なくとも約１％低下する。いくつかの態様において、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能は、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約３０％低下する。いくつかの態様において、改変は、産生細胞を、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させることができる薬剤と接触させることを含む。いくつかの態様において、産生細胞は、産生細胞を、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させることができる薬剤と接触させることによって、培養前に改変される。いくつかの態様において、薬剤は、スタチン、カリプラジン、ＰＲＯＴＡＣ、ＡＹ９９４４、又はＢＭ１５７６６を含む。いくつかの態様において、スタチンは、アトルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、スタチンは、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約約１０ｎＭ、約１１ｎＭ、約１２ｎＭ、約１３ｎＭ、約１４ｎＭ、約１５ｎＭ、約１６ｎＭ、約１７ｎＭ、約１８ｎＭ、又は約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２６０ｎＭ、約２７０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約２９０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３１０ｎＭ、約３２０ｎＭ、約３３０ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３６０ｎＭ、約３７０ｎＭ、約３８０ｎＭ、約３９０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４１０ｎＭ、約４２０ｎＭ、約４３０ｎＭ、約４４０ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４６０ｎＭ、約４７０ｎＭ、約４８０ｎＭ、約４９０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５１０ｎＭ、約５２０ｎＭ、約５３０ｎＭ、約５４０ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５６０ｎＭ、約５７０ｎＭ、約５８０ｎＭ、約５９０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６１０ｎＭ、約６２０ｎＭ、約６３０ｎＭ、約６４０ｎＭ、約６５０ｎＭ、約６６０ｎＭ、約６７０ｎＭ、約６８０ｎＭ、約６９０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７１０ｎＭ、約７２０ｎＭ、約７３０ｎＭ、約７４０ｎＭ、約７５０ｎＭ、約７６０ｎＭ、約７７０ｎＭ、約７８０ｎＭ、約７９０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８１０ｎＭ、約８２０ｎＭ、約８３０ｎＭ、約８４０ｎＭ、約８５０ｎＭ、約８６０ｎＭ、約８７０ｎＭ、約８８０ｎＭ、約８９０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９１０ｎＭ、約９２０ｎＭ、約９３０ｎＭ、約９４０ｎＭ、約９５０ｎＭ、約９６０ｎＭ、約９７０ｎＭ、約９８０ｎＭ、約９９０ｎＭ、又は約１，０００ｎＭの濃度で接触される。いくつかの態様において、スタチンは、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ～約９０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約８０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約７０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約６０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約４０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約３０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２０ｎＭ、０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、又は約１ｎＭ～約２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約２０ｎＭ、約５ｎＭ～約１５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約４０ｎＭ、約１０ｎＭ～約３０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、又は約１０ｎＭ～約２０ｎＭの濃度で接触される。いくつかの態様において、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させることができる薬剤は、遺伝子編集技術を含む。いくつかの態様において、遺伝子編集技術は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、遺伝子編集技術は、ｓｉＲＮＡを含む。いくつかの態様において、産生細胞によって産生されるＥＶは、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能が低下していない産生細胞によって産生されるＥＶと比較して、ＥＶ当たりのコレステロール含有量が低下している。いくつかの態様において、ＥＶ当たりのコレステロール含有量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、又は約８０％低下する。いくつかの態様において、ＥＶ当たりのコレステロール含有量は、約１％～約８０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約１０％～約２０％、約２０％～約８０％、約２０％～約７０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約２０％～約３０％、約３０％～約８０％、約３０％～約７０％、約３０％～約６０％、約３０％～約５０％、約３０％～約４０％、約４０％～約８０％、約４０％～約７０％、約４０％～約６０％、又は約４０％～約５０％低下する。いくつかの態様において、産生細胞によって産生されるＥＶは、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能が低下していない産生細胞によって産生されるＥＶと比較して、平均サイズ分布に差異がない。いくつかの態様において、産生細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、産生細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、肥満細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又はＣ２Ｃ１２細胞である。いくつかの態様において、産生細胞は、幹細胞である。いくつかの態様において、ＥＶは、足場部分を更に含む。いくつかの態様において、足場部分は、足場Ｘを含む。いくつかの態様において、足場Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体負の調節因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）、ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）、インテグリンβ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）、インテグリンα－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）、４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）、ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様において、足場部分は、ＰＴＧＦＲＮタンパク質である。いくつかの実施形態において、足場部分は、配列番号１と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、足場部分は、足場Ｙを含む。いくつかの態様において、足場Ｙは、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳタンパク質）、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基
質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質）、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１タンパク質）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様において、ＥＶは、足場部分に連結された少なくとも１つの治療剤を更に含む。いくつかの態様において、ＥＶは、少なくとも１つの治療剤を更に含む。いくつかの態様において、治療剤は、サイトカイン、小分子、増殖因子、抗原、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＰＲＯＴＡＣ、アジュバント、免疫調節剤、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、治療剤は、ＩＬ－１２である。いくつかの態様において、治療剤は、ＳＴＩＮＧアゴニストである。いくつかの態様において、治療剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｋｒａｓ、ＳＴＡＴ３、Ｎｒａｓ、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／ｂ、ＮＬＲＰ３、又はそれらの任意の組み合わせを標的化する。

【0006】

本開示はまた、いくつかの態様において、本明細書に記載の方法で使用するための産生細胞を提供する。いくつかの態様において、本開示はまた、本明細書に記載の方法によって調製された産生細胞も提供する。

【0007】

いくつかの態様において、本開示はまた、本明細書に記載の方法によって生成されたＥＶも提供する。

【0008】

いくつかの態様において、本開示はまた、本明細書に記載の産生細胞又はＥＶを含むバイオリアクターも提供する。

【0009】

いくつかの態様において、本開示はまた、疾患若しくは障害の治療及び／又は予防を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、本方法は、本明細書に開示される細胞外小胞を投与することを含む。

【0010】

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の細胞外小胞を使用して、それを必要とする対象における疾患又は状態を治療又は予防することを提供する。

【0011】

いくつかの態様において、本開示は、疾患又は状態の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行うための、本明細書に記載の細胞外小胞を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】コレステロール合成経路における主要な調節因子である２つの遺伝子（例えば、ＨＭＧＣＲ及びＳＲＥＢＦ２）のｓｉＲＮＡノックダウンが、細胞当たりのＥＶ産生の増加に対応して、未処理対照に対して細胞当たり正規化された相対発光を有意に増加させることを示す。

【図2A】細胞生存率（％）を示す。

【図2B】未処理、非標的ｓｉＲＮＡ処理、ＰＴＧＦＲＮ ｓｉＲＮＡ処理、ＳＲＥＢＦ２ ｓｉＲＮＡ処理、及びＨＭＧＣＲ ｓｉＲＮＡ処理された産生細胞の総細胞密度を示す。

【図2C】図２Ａ及び２Ｂの産生細胞から回収されたＥＶの密度勾配を示す。

【図2D】対照、ＳＲＥＢＦ２ノックダウン、及びＨＭＧＣＲノックダウンの産生細胞から回収されたＥＶのタンパク質含有量のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。

【図2E】未処理、非標的ｓｉＲＮＡ処理、ＰＴＧＦＲＮ ｓｉＲＮＡ処理、ＳＲＥＢＦ２ ｓｉＲＮＡ処理、及びＨＭＧＣＲ ｓｉＲＮＡ処理された産生細胞において細胞当たりの産生されるＥＶの総量を示す。

【図2F】未処理、非標的ｓｉＲＮＡ処理、ＰＴＧＦＲＮ ｓｉＲＮＡ処理、ＳＲＥＢＦ２ ｓｉＲＮＡ処理、及びＨＭＧＣＲ ｓｉＲＮＡ処理された産生細胞からの精製ＥＶの増加倍率を示す。

【図2G】未処理、非標的ｓｉＲＮＡ処理、ＰＴＧＦＲＮ ｓｉＲＮＡ処理、ＳＲＥＢＦ２ ｓｉＲＮＡ処理、及びＨＭＧＣＲ ｓｉＲＮＡ処理された産生細胞からの精製ＥＶにおける、Ａｍｐｌｅｘ（商標）Ｒｅｄによって測定された総コレステロール（μｇ／ｍＬ）を示す。

【図2H】未処理、非標的ｓｉＲＮＡ処理、ＰＴＧＦＲＮ ｓｉＲＮＡ処理、ＳＲＥＢＦ２ ｓｉＲＮＡ処理、及びＨＭＧＣＲ ｓｉＲＮＡ処理された産生細胞における、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によって測定された精製ＥＶの総量を示す。

【図2I】未処理、非標的ｓｉＲＮＡ処理、ＰＴＧＦＲＮ ｓｉＲＮＡ処理、ＳＲＥＢＦ２ ｓｉＲＮＡ処理、及びＨＭＧＣＲ ｓｉＲＮＡ処理された産生細胞からの精製ＥＶのコレステロール含有量の倍率変化を示す。

【図2J】未処理、非標的ｓｉＲＮＡ処理、ＰＴＧＦＲＮ ｓｉＲＮＡ処理、ＳＲＥＢＦ２ ｓｉＲＮＡ処理、及びＨＭＧＣＲ ｓｉＲＮＡ処理された産生細胞からの精製ＥＶの平均直径を示す。

【図3A】ＥＶ力価に対するコレステロール生合成の薬理学的阻害の効果を示す。１日目から６日目までのシンバスタチン処理（対照、１０ｎＭ、５０ｎＭ、２５０ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、及び５０μＭ）の細胞生存率を示す。

【図3B】ＥＶ力価に対するコレステロール生合成の薬理学的阻害の効果を示す。１日目から６日目までのシンバスタチン処理（対照、１０ｎＭ、５０ｎＭ、２５０ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、及び５０μＭ）の生細胞密度を示す。

【図3C】ＥＶ力価に対するコレステロール生合成の薬理学的阻害の効果を示す。処理の１日目、２日目、及び３日目（対照、２μＭ、５μＭ、及び１０μＭ）における、カリプラジン処理された産生細胞の生存率を示す。

【図3D】ＥＶ力価に対するコレステロール生合成の薬理学的阻害の効果を示す。１日目から３日目までのカリプラジン処理（対照、２μＭ、５μＭ、及び１０μＭ）の生細胞密度を示す。

【図4A】シンバスタチン処理されたＨｉＢｉｔレポーター細胞株（図４Ｃ）についての生細胞密度（図４Ａ）、生存率（図４Ｂ）、及びＨｉＢｉｔルシフェラーゼを示す。

【図4B】シンバスタチン処理されたＨｉＢｉｔレポーター細胞株（図４Ｃ）についての生細胞密度（図４Ａ）、生存率（図４Ｂ）、及びＨｉＢｉｔルシフェラーゼを示す。

【図4C】シンバスタチン処理されたＨｉＢｉｔレポーター細胞株（図４Ｃ）についての生細胞密度（図４Ａ）、生存率（図４Ｂ）、及びＨｉＢｉｔルシフェラーゼを示す。

【図4D】ＨｉＢｉｔルシフェラーゼレポーターアッセイからのＥＶ力価に対するシンバスタチン（ＳＩＭ）処理の効果を示す。未処理対照に対する倍率変化は、培養日数及びシンバスタチン濃度（２ｎＭ、５ｎＭ、及び１０ｎＭ）の関数として示されている。

【図4E】ＨｉＢｉｔルシフェラーゼレポーターアッセイからのＥＶ力価に対するカリプラジン（ＣＡＲ）処理の効果を示す。未処理対照に対する倍率変化は、培養日数及びカリプラジン濃度（５μＭ及び１０μＭ）の関数として示されている。

【図5A】プロテインＸ（ＰｒＸ）産生細胞（未処理及び５ｎＭシンバスタチン）から産生されるＥＶの密度勾配、並びにｅｘｏＩＬ－１２産生細胞（未処理、５ｎＭシンバスタチン、１０ｎＭシンバスタチン）から産生されるＥＶの密度勾配を示す。

【図5B】図５Ａにおいて回収されたＥＶのタンパク質ゲルを示す。

【図6A】シンバスタチン処理された産生細胞から産生されるＥＶ（ｅｘｏＩＬ－１２）についてのインビトロＨＥＫ ＩＬ－１２レポーターアッセイの結果を示す。組換えＩＬ－１２、ｅｘｏＩＬ－１２製剤、未処理、５ｎＭ、及び１０ｎＭシンバスタチン（ＳＭ）処理された産生細胞からのＥＶ（ｅｘｏＩＬ－１２）間のＨＥＫ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおけるインビトロ効力を示す。

【図6B】シンバスタチン処理された産生細胞から産生されるＥＶ（ｅｘｏＩＬ－１２）についてのインビトロＨＥＫ ＩＬ－１２レポーターアッセイの結果を示す。ｅｘｏ－ＩＬ－１２製剤、並びに対照、５ｎＭシンバスタチン（ＳＭ）、及び１０ｎＭシンバスタチン（ＳＭ）処理された産生細胞からのｅｘｏＩＬ－１２についてのＨＥＫ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおけるインビトロ力価を示す。

【図7】産生細胞によるエクソソーム産生の誘導についてのインビトロアッセイ、及びＨｉＢｉｔレポーター細胞に対する１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、及び１００ｎＭのコレステロール合成阻害剤ロスバスタチン（ＲＯＳ）を含む培養の効果を示す棒グラフである。データは、発光／細胞として提示されている。

【図8A】エクソソーム産生におけるプレニル化の関与の欠如を実証する。ＧＧＴａｓｅ阻害剤ＧＧＴＩ２４１８に曝露したＨｉＢｉｔレポーター細胞からの結果のグラフ表示である。培養日数の関数としての生細胞密度（ＶＣＤ；１０^６として）を示す。

【図8B】エクソソーム産生におけるプレニル化の関与の欠如を実証する。ＧＧＴａｓｅ阻害剤ＧＧＴＩ２４１８に曝露したＨｉＢｉｔレポーター細胞からの結果のグラフ表示である。培養日数の関数としての発光（ＲＬＵ）を示す。

【図9A】生細胞密度（ＶＣＤ）に対する、シンバスタチン中で培養された産生細胞に外因性コレステロールを添加することによる影響を示す折れ線グラフである。

【図9B】エクソソーム産生に対する、シンバスタチン中で培養された産生細胞に外因性コレステロールを添加することによる影響を示す折れ線グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本開示は、産生細胞から産生される細胞外小胞（ＥＶ）の数を増加させる方法を対象とし、本方法は、産生細胞のコレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示すように産生細胞を改変することを含む。本開示はまた、産生細胞から細胞外小胞（ＥＶ）を産生する方法を対象とし、本方法は、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示す産生細胞を培養することを含む。

【0014】

本開示をより詳細に説明する前に、本開示は、説明される特定の組成物又はプロセス工程に限定されず、そのため、当然ながら変化し得ることを理解されたい。本開示を読むと当業者には明らかであろうように、本明細書に記載及び例示される個々の態様の各々は、本開示の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、又はそれらと組み合わされ得る個別の成分及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。

【0015】

本明細書で提供される表題は、本開示の様々な態様の限定ではなく、これらの態様は、本明細書全体を参照することによって理解され得る。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるので、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

【0016】

Ｉ．定義
本説明をより容易に理解できるようにするために、特定の用語が最初に定義される。追加の定義が、詳細な説明全体を通して示される。

【0017】

「ａ」又は「ａｎ」実体という用語は、１つ以上のその実体を指すことに留意されたい。例えば、「ヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。したがって、「１つ（ａ）」（又は「１つ（ａｎ）」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。特許請求の範囲は、いずれかの任意選択的な要素を除外するように起草され得ることを、更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「単に」、「のみ」などのような排他的な用語の使用のため、又は否定的な限定の使用のための先行詞として機能するよう意図される。

【0018】

更に、本明細書で使用される「及び／又は」は、他の有無にかかわらず、２つの特定の特徴又は構成要素の各々の具体的な開示としてみなされるべきである。したがって、本明細書の「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、Ａ及びＢ、Ａ又はＢ、Ａ（単独）、及びＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、以下の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）、の各々を包含することが意図される。

【0019】

態様が、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を用いて本明細書に記載される場合はいつも、「からなる」及び／又は「から本質的になる」という用語で記載される別様の類似の態様もまた提供されることが理解される。

【0020】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。

【0021】

単位、接頭辞、記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で表記する。数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。値の範囲が記載される場合、その範囲の記載された上限値及び下限値との間の各介在整数値、及びその各端数も、そのような値間の各下位範囲とともに特に開示されていることを理解されるべきである。任意の範囲の上限値及び下限値は、独立して範囲内に含まれるか、又は範囲から除外され得、いずれかの限界値を含む、いずれの限界値も含まない、又は両方の限界値を含む各範囲も、本開示内に包含される。本明細書に列挙される範囲は、その範囲内の全ての値の略記であると理解される。例えば、１～１０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲を含むと理解される。

【0022】

値が明示的に記載される場合、記載される値とほぼ同じ量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）又は量（ａｍｏｕｎｔ）である値も、本開示の範囲内であることを理解されたい。組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の各下位組み合わせもまた特に開示され、本開示の範囲内である。逆に、異なる要素又は要素の群が個別に開示される場合、それらの組み合わせも開示される。開示の任意の要素が複数の代替物を有するものとして開示される場合、各代替物が単独で又は他の代替物と任意の組み合わせで除外されるその開示の例も、本明細書によって開示され、開示の２つ以上の要素は、そのような除外を有し得、そのような除外を有する要素の全ての組み合わせが、本明細書に開示される。

【0023】

ヌクレオチドは、同様に、それらの一般的に受け入れられている１文字コードによって言及される。別途示されない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’方向で左から右に書かれる。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される、それらの一般的に知られている１文字記号によって本明細書で言及される。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。

【0024】

アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向で左から右に書かれる。アミノ酸は、それらの一般的に知られている３文字の記号によって、又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字の記号のいずれかによって、本明細書で言及される。

【0025】

本明細書で提供される表題は、本開示の様々な態様を限定するものではなく、これらの態様は、本明細書全体を参照することによって理解され得る。したがって、以下に定義される用語は、本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。

【0026】

「約（ａｂｏｕｔ）」は、ほぼ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）という用語は、本明細書において、概ね（ｒｏｕｇｈｌｙ）、およそ（ａｒｏｕｎｄ）、又はその領域を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用される場合、記載された数値の上下の境界を広げることによって、その範囲を修正する。一般に、用語「約」は、上又は下に（より高い又はより低い）例えば、１０％の相違によって、記載された値を上回る及び下回る数値を修正することができる。いくつかの態様において、本明細書で使用される用語は、参照量の５％以内であることを意味する。例えば、約５０％は、４７．５％～５２．５％の値の範囲を包含すると理解される。

【0027】

本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」又は「ＥＶ」という用語は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有する全ての膜結合小胞（例えば、エクソソーム、ナノ小胞）を含む。一般的に、細胞外小胞は直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、細胞外小胞の外部表面に表示される内部空間（例えば、内腔）内、及び／又は膜をまたぐいずれかで、様々な巨大分子ペイロードを含むことができる。様々な態様において、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／又はそれらの組み合わせを含む。ある特定の態様において、細胞外小胞は、足場部分を含む。例として、限定されないが、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接又は間接操作（例えば、連続押出又はアルカリ溶液による処理による）によって細胞に由来する小胞、小胞化オルガネラ、及び生体細胞によって産生される小胞（例えば、原形質膜の直接発芽又は後期エンドソームと原形質膜との融合によって）が含まれる。細胞外小胞は、生きているか、若しくは死んだ生物、外植された組織若しくは器官、原核細胞若しくは真核細胞、及び／又は培養細胞に由来し得る。いくつかの態様において、細胞外小胞は、１つ以上の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。

【0028】

本明細書で使用される場合、「エクソソーム」という用語は、内部空間（すなわち、内腔）をカプセル化する膜を含み、直接原形質膜出芽によるか、又は後期エンドソームの原形質膜との融合により当該細胞から生成される、細胞由来の小さい（直径２０～３００ｎｍ、より好ましくは直径４０～２００ｎｍ）小胞を指す。エクソソームは、細胞外小胞の一種である。エクソソームは、脂質又は脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療剤）、レシーバー（例えば、標的部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、若しくはＤＮＡ）、糖（例えば、単純糖、多糖類、若しくはグリカン）、又は他の分子を含む。いくつかの態様において、エクソソームは、足場部分を含む。エクソソームは、プロデューサー細胞に由来することができ、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、又はそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。いくつかの態様において、本開示のエクソソームは、１つ以上の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。

【0029】

本明細書で使用される場合、「ナノ小胞」という用語は、内部空間をカプセル化する膜を含む、細胞由来の小さい（直径２０～２５０ｎｍ、より好ましくは直径３０～１５０ｎｍ）小胞を指し、直接的又は間接的操作によって当該細胞（例えば、産生細胞）から生成され、当該ナノ小胞は当該操作なしでは当該産生細胞によって産生されない。当該産生細胞の適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液での処理、超音波処理、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ナノ小胞の産生は、いくつかの例では、当該産生細胞の破壊を生じ得る。好ましくは、ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽又は後期エンドソームの原形質膜との融合により、プロデューサー細胞に由来する小胞を実質的に含まない。ナノベシクルは、脂質又は脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療剤）、レシーバー（例えば、標的部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、若しくはＤＮＡ）、糖（例えば、単純糖、多糖類、若しくはグリカン）、又は他の分子を含む。いくつかの態様において、ナノ小胞は、足場部分を含む。ナノ小胞は、ナノ小胞が当該操作に従って産生細胞に由来するため、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、又はそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。

【0030】

本明細書で使用される場合、「表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）」（例えば、足場Ｘ操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム））という用語は、操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面が、改変前のＥＶ（例えば、エクソソーム）、又は天然に存在するＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面とは異なるように、その組成物において改変された膜又はＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面を有するＥＶ（例えば、エクソソーム）を指す。操作は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面で、又はＥＶ（例えば、エクソソーム）の膜内で行うことができ、それによって、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面が変化される。例えば、膜は、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などのその組成物において改変される。組成物は、化学的、物理的、若しくは生物学的方法によって、又は化学的、物理的、若しくは生物学的方法によって以前に又は同時に改変された細胞から産生されることによって、変化され得る。具体的には、組成物は、遺伝子操作によって、又は遺伝子操作学によって既に改変されている細胞から産生されることによって変化され得る。いくつかの態様において、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面に露出され得る、又はＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面で露出された部分のアンカーポイント（結合部）であり得る、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ（例えば、エクソソーム）が天然に発現しないタンパク質）又はその断片若しくはバリアントを含む。他の態様において、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面に露出され得る、又はＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面で露出された部分のアンカーポイント（結合部）であり得る、天然のエクソソームタンパク質（例えば、足場Ｘ）又はその断片若しくはバリアントのより高い発現（例えば、より多い数）を含む。

【0031】

本明細書で使用される場合、「内腔操作されたエクソソーム）」（例えば、足場Ｙ操作されたエクソソーム）という用語は、操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔が、改変前のＥＶ（例えば、エクソソーム）又は天然に存在するＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔とは異なるように、その組成物において改変された膜又はＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔を有するＥＶ（例えば、エクソソーム）を指す。操作は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔又は膜内で直接行うことができ、それによって、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔が変化される。例えば、膜は、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などのその組成物において改変され、それによって、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔が改変される。組成物は、化学的、物理的、若しくは生物学的方法によって、又は化学的、物理的、若しくは生物学的方法によって既に改変された細胞から産生されることによって、変化され得る。具体的には、組成物は、遺伝子操作によって、又は遺伝子操作学によって既に改変されている細胞から産生されることによって変化され得る。いくつかの態様において、内腔操作されたエクソソームは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔で露出され得る、又はＥＶ（例えば、エクソソーム）の内層で露出された部分のアンカーポイント（結合部）であり得る、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ（例えば、エクソソーム）が天然に発現しないタンパク質）又はその断片若しくはバリアントを含む。他の態様において、内腔操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、エクソソームの内腔に露出され得る、又はエクソソームの内腔で露出された部分のアンカーポイント（結合部）であり得る、天然のエクソソームタンパク質（例えば、足場Ｘ若しくは足場Ｙ）又はその断片若しくはバリアントのより高い発現を含む。

【0032】

「改変された」という用語は、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）の文脈で使用される場合、ＥＶ（例えば、エクソソーム）及び／又はその産生細胞の変更又は操作を指し、それによって、改変されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、天然に存在するＥＶ（例えば、エクソソーム）とは異なる。いくつかの態様において、本明細書に記載の改変されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、天然に存在するＥＶ（例えば、エクソソーム）の膜と比較して、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成が異なる膜を含む（例えば、膜は、より高い密度又は数の天然のエクソソームタンパク質を含み、かつ／又は膜は、エクソソームに天然に見出されないタンパク質（例えば、ＩＬ－１２）を含む）。ある特定の態様において、膜に対するかかる改変は、ＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、表面操作されたＥＶ、例えば、本明細書に記載のエクソソーム）の外部表面を変化させる。ある特定の態様において、膜に対するかかる改変は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）（例えば、本明細書に記載の内腔操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム））の内腔を変化させる。

【0033】

本明細書で使用される場合、「足場部分」という用語は、ＩＬ－１２部分又は目的の任意の他の化合物を、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面又は外部表面のいずれかで固定するために使用することができる分子を指す。ある特定の態様において、足場部分は、合成分子を含む。いくつかの態様において、足場部分は、非ポリペプチド部分を含む。他の態様において、足場部分は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に天然に存在する脂質、炭水化物、又はタンパク質を含む。いくつかの態様において、足場部分は、ＥＶ、例えば、エクソソームに天然に存在しない脂質、炭水化物、又はタンパク質を含む。ある特定の態様において、足場部分は、足場Ｘである。いくつかの態様において、足場部分は、足場Ｙである。更なる態様において、足場部分は、足場Ｘ及び足場Ｙの両方を含む。ある特定の態様において、足場部分は、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン－３、ＣＤ２、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＩＣＡＭ－１、インテグリンα４、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ－１α及びβ、Ｖｔｉ－１Ａ及びＢ、ＣＤ３ε及びζ、ＣＤ９、ＣＤ１８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＸＣＲ４、ＦｃＲ、ＧｌｕＲ２／３、ＨＬＡ－ＤＭ（ＭＨＣ ＩＩ）、免疫グロブリン、ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ成分、ＴＣＲβ、テトラスパニン、又はそれらの組み合わせを含む。

【0034】

本明細書で使用される場合、「足場Ｘ」という用語は、エクソソームの表面で最近特定されたエクソソームタンパク質を指す。例えば、米国特許第１０，１９５，２９０号を参照されたい（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。足場Ｘタンパク質の非限定的な例には、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブ調節因子（「ＰＴＧＦＲＮタンパク質」）；ベイシジン（「ＢＳＧタンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（「ＩＧＳＦ２タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（「ＩＧＳＦ３タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（「ＩＧＳＦ８タンパク質」）；インテグリンβ－１（「ＩＴＧＢ１タンパク質」）；インテグリンα－４（「ＩＴＧＡ４タンパク質」）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（「ＳＬＣ３Ａ２タンパク質」）；及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（「ＡＴＰ１Ａ１タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ２タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ３タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ４タンパク質」、「ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂタンパク質」）が含まれる。いくつかの態様において、足場Ｘタンパク質は、全タンパク質又はその断片（例えば、機能的断片、例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の外部表面又は内腔表面に別の部分を固定することができる最小の断片）であり得る。いくつかの態様において、足場Ｘは、部分（例えば、治療用タンパク質、例えば、ＩＬ－１２部分）をエクソソームの外部表面又は内腔表面に固定することができる。

【0035】

本明細書で使用される場合、「足場Ｙ」という用語は、エクソソームの内腔表面内で新たに特定されたエクソソームタンパク質を指す。例えば、国際公開第ＷＯ／２０１９／０９９９４２号を参照されたい（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。足場Ｙタンパク質の非限定的な例には、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（「ＭＡＲＣＫＳタンパク質」）、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質１（「ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質」）、及び脳酸可溶性タンパク質１（「ＢＡＳＰ１タンパク質」）が含まれる。いくつかの態様において、足場Ｙタンパク質は、全タンパク質又はその断片（例えば、機能的断片、例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面に別の部分を固定することができる最小の断片）であり得る。いくつかの態様において、足場Ｙは、ＩＬ－２部分をＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔に固定することができる。

【0036】

本明細書で使用される場合、タンパク質（治療用タンパク質、足場Ｘ、又は足場Ｙ）の「断片」という用語は、天然に存在するタンパク質と比較して、天然に存在する配列よりも短いタンパク質、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端が欠失したタンパク質、並びに／又はタンパク質の任意の他の部分が欠失したタンパク質のアミノ酸配列を指す。本明細書で使用される際、用語「機能的断片」は、タンパク質機能を保持するタンパク質断片を指す。したがって、いくつかの態様において、足場Ｘタンパク質の機能的断片は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面又は外部表面に部分を固定する能力を保持する。同様に、ある特定の態様において、足場Ｙタンパク質の機能的断片は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面に部分を固定する能力を保持する。断片が機能的断片であるかどうかは、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、及び自己蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰなど）との断片の融合物を含む、ＥＶ（例えば、エクソソーム）のタンパク質含有量を決定する技術分野で既知の任意の方法によって評価され得る。いくつかの態様において、足場Ｘタンパク質の機能的断片は、天然に存在する足場Ｘタンパク質の能力（例えば、部分を固定する能力）の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は約１００％を保持する。いくつかの態様において、足場Ｙタンパク質の機能的断片は、天然に存在する足場Ｙタンパク質の能力（例えば、別の分子を固定する能力）の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は約１００％を保持する。

【0037】

本明細書で使用される場合、分子（例えば、機能的分子、抗原、足場Ｘ及び／又は足場Ｙ）の「バリアント」という用語は、当該技術分野で既知の方法による比較で、ある特定の構造的及び機能的同一性を別の分子と共有する分子を指す。例えば、タンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフト又は再配列を含み得る。

【0038】

いくつかの態様において、足場Ｘのバリアントは、全長の成熟ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、若しくはＡＴＰトランスポータータンパク質、又はＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、若しくはＡＴＰトランスポータータンパク質の断片（例えば、機能的断片）と、少なくとも約７０％の同一性を有するバリアントを含む。いくつかの態様において、ＰＴＧＦＲＮのバリアント又は断片のバリアントは、配列番号１によるＰＴＧＦＲＮ又はその機能的断片と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。

【0039】

いくつかの態様において、足場Ｙのバリアントは、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、又はＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、若しくはＢＡＳＰ１の断片と少なくとも７０％の同一性を有するバリアントを含む。いくつかの態様において、ＭＡＲＣＫＳのバリアント又は断片のバリアントは、配列番号４７によるＭＡＲＣＫＳ又はその機能的断片と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、ＭＡＲＣＫＳＬ１のバリアント又は断片のバリアントは、配列番号４８によるＭＡＲＣＫＳＬ１又はその機能的断片と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、ＢＡＳＰ１のバリアント又は断片のバリアントは、配列番号４９によるＢＡＳＰ１又はその機能的断片と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、足場Ｙタンパク質のバリアント又は断片のバリアントは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔を特異的に標的化する能力を保持する。いくつかの態様において、足場Ｙは、１つ以上の変異、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。

【0040】

「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、ポリペプチドのアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置き換えられている場合、置換が保存的であると考えられる。別の態様において、アミノ酸の鎖は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／又は組成物が異なる構造的に同様の鎖で保存的に置き換えることができる。

【0041】

２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の「配列同一性パーセント」又は「同一性パーセント」という用語は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入されなければならない付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を考慮して、比較幅にわたって配列によって共有される同一のマッチング位置の数を指す。マッチング位置は、同一のヌクレオチド又はアミノ酸が標的配列及び参照配列の両方で提示される任意の位置である。標的配列に提示されるギャップは、ギャップがヌクレオチド又はアミノ酸ではないため、カウントされない。同様に、参照配列に提示されるギャップは、標的配列ヌクレオチド又はアミノ酸がカウントされ、参照配列からのヌクレオチド又はアミノ酸はカウントされないため、参照配列はカウントされない。

【0042】

配列同一性の割合は、同一のアミノ酸残基又は核酸塩基が両方の配列で生じる位置の数を判定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を、比較枠における位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて、配列同一性の割合を得ることによって計算される。配列の比較及び２つの配列間の配列同一性の割合の決定は、オンライン使用及びダウンロードの両方に容易に利用可能なソフトウェアを使用して達成され得る。好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給源から入手可能であり、タンパク質配列及びヌクレオチド配列の両方のアラインメントのためのものである。配列同一性パーセントを決定するのに好適な１つのプログラムは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＢＬＡＳＴプログラムスイートの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列の比較に使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列の比較に使用される。他の好適なプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、又はＭａｔｃｈｅｒ、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳｓｕｉｔｅの一部であり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａでＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からも入手可能である。

【0043】

ポリヌクレオチド又はポリペプチド参照配列とアライメントする単一のポリヌクレオチド又はポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ独自の配列同一性の割合を有し得る。配列同一性パーセント値は、最も近い１０分の１に四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り捨てられ、一方、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数であることに留意されたい。

【0044】

当業者は、配列同一性の割合の計算のための配列アライメントの生成が、一次配列データによって排他的に駆動される二値配列比較に限定されないことを理解するであろう。配列アラインメントは、複数の配列アラインメントから導出され得る。複数の配列アラインメントを生成するための１つの好適なプログラムは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２であり、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手可能である。別の好適なプログラムは、ＭＵＳＣＬＥであり、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から入手可能である。ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、代替的に、例えば、ＥＢＩから入手可能である。

【0045】

また、配列アライメントは、構造データ（例えば、結晶タンパク質構造）、機能データ（例えば、変異の位置）、又は系統発生データ等の異種情報源からのデータと配列データを統合することによって生成され得ることも理解されるであろう。多重配列アラインメントを生成するために不均一なデータを統合する好適なプログラムは、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅであり、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能であり、代替的に、例えば、ＥＢＩから入手可能である。また、配列同一性パーセントを計算するために使用される最終アライメントは、自動又は手動のいずれかで精選され得ることも理解されるであろう。

【0046】

ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、又はその両方における変異を含有することができる。一態様において、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、又は欠失を生じるが、コードされたポリペプチドの特性又は活性を変化させない変異を含有する。別の態様において、ヌクレオチド変異体は、遺伝コードの縮退性に起因するサイレント置換によって産生される。他の態様において、変異体では、５～１０、１～５、又は１～２個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失、又は付加される。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ内のコドンを他のもの、例えばＥ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主に変更させる）ために、産生することができる。

【0047】

天然発生の変異体は、「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、生物の染色体上の所与の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替形態の１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドレベルのいずれかで変化し得、本開示に含まれる。代替的に、非天然発生の変異体は、突然変異誘発技術によって、又は直接合成によって産生することができる。

【0048】

タンパク質工学及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、変異体を生成して、ポリペプチドの特徴を改善又は変更することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に失うことなく、分泌タンパク質のＮ末端又はＣ末端から欠失させることができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４－２９８８（１９９３）は、３、８、又は２７個のアミノ酸残基を欠失した後でさえ、ヘパリン結合活性を有するバリアントＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０個のアミノ酸残基を欠失した後に、最大１０倍高い活性を呈した。（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）

【0049】

更に、十分な証拠によって、変異体がしばしば天然発生のタンパク質と同様の生物学的活性を保持することが実証される。例えば、Ｇａｙｌｅ及び同僚（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１（１９９３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの広範囲な変異解析を行った。彼らは、ランダムな突然変異誘発を使用して、分子の全長にわたり変異体当たり平均して２．５個のアミノ酸変化であった３，５００を超える個々のＩＬ－１ａ変異体を生成した。複数の変異を、全ての可能なアミノ酸位置で調べた。研究者らは、「分子のほとんどは、［結合又は生物学的活性］にほとんど影響を与えずにできた」ことを認めた。（要約を参照する）実際に、調べられた３，５００ヌクレオチド配列超のうち、２３個の固有のアミノ酸配列のみが、野生型と著しく活性が異なるタンパク質を産生した。

【0050】

上記のように、ポリペプチド変異体は、例えば、改変ポリペプチドを含む。改変には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０－７９（２０１０）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アミノ酸のアルギニル化などのタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化が含まれる。いくつかの態様において、足場Ｘ及び／又は足場Ｙは、任意の好都合な位置で改変される。

【0051】

本明細書で使用される場合、「に連結された」又は「にコンジュゲートされた」という用語は、互換的に使用され、それぞれ、第１の部分と第２の部分（例えば、足場ＸとＩＬ－１２部分）との間に形成される共有結合又は非共有結合を指す。例えば、細胞外小胞内又は細胞外小胞上で発現される足場部分及びＩＬ－１２部分、例えば、足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）は、それぞれ、細胞外小胞の内腔表面内又は外部表面に発現される。

【0052】

「カプセル化された」という用語又はその用語の文法的に異なる形態（例えば、カプセル化又はカプセル化すること）は、２つの部分を化学的又は物理的に連結することなく、第２の部分（例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム））内に第１の部分（例えば、抗原）を有する状態又はプロセスを指す。いくつかの態様において、「カプセル化された」という用語は、「の内腔に」と互換的に使用することができる。第１の部分（例えば、抗原）を第２の部分（例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム））にカプセル化する非限定的な例は、本明細書の他箇所に開示されている。

【0053】

本明細書で使用される場合、「産生細胞」という用語は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を生成するために使用される細胞を指す。産生細胞は、インビトロで培養される細胞、又はインビボでの細胞であり得る。産生細胞には、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の生成に有効であることが知られている細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｓ９ｆ細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、産生細胞は、抗原提示細胞である。いくつかの態様において、産生細胞は、細菌細胞株である。いくつかの態様において、産生細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、若しくはこれらの細胞のうちのいずれかに由来する細胞、又はそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様において、産生細胞は、細菌細胞ではない。他の態様において、産生細胞は、抗原提示細胞ではない。

【0054】

本明細書で使用される場合、「と会合した」という用語は、それぞれ、第１の部分（例えば、タンパク質、例えば、ＩＬ－１２部分）と第２の部分（例えば、細胞外小胞）との間に形成される共有結合若しくは非共有結合、又は第１の部分（例えば、タンパク質、例えば、ＩＬ－１２部分）の第２の部分（例えば、細胞外小胞）へのカプセル化を指す。例えば、いくつかの態様において、足場部分、例えば、足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）は、細胞外小胞内又は細胞外小胞上で発現され、タンパク質（例えば、ＩＬ－１２部分）は、細胞外小胞の外部表面にロードされる。一態様において、「と会合した」という用語は、共有結合、非ペプチド結合、又は非共有結合を意味する。例えば、アミノ酸のシステインは、チオール基を含み、これは、ジスルフィド結合を形成するか、又は第２のシステイン残基上のチオール基と架橋することができる。共有結合の例としては、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、π結合、δ結合、グリコシド結合、アグノスティック結合、曲がった結合、配位結合、π逆結合、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、コンジュゲーション、超コンジュゲーション、芳香族性、多座性、又は反結合が挙げられるが、これらに限定されない。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（例えば、カチオン－π結合又は塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素錯体、低障壁水素結合、又は対称性を持つ水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力、又は化学極性が挙げられる。他の態様において、「と会合した」という用語は、第１の部分（例えば、細胞外小胞）が、第２の部分（例えば、タンパク質、例えば、ＩＬ－１２部分）をカプセル化することを意味する。いくつかの態様において、第１の部分及び第２の部分は、互いに連結され得る。他の態様において、第１の部分及び第２の部分は、互いに物理的及び／又は化学的に連結されていない。

【0055】

本明細書で使用される「ロードされた」という用語、又はその用語の文法的に異なる形態（例えば、ロード又はロードされた）は、第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、及びエクソソーム）に会合した第１の部分（例えば、ＩＬ－１２部分、ＳＴＩＮＧアゴニスト）を有する状態又はプロセスを指す。いくつかの態様において、第１の部分は、第２の部分に化学的又は物理的に連結される。いくつかの態様において、第１の部分は、第２の部分に化学的又は物理的に連結されていない。いくつかの態様において、第１の部分は、第２の部分、例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔内に、例えば、「カプセル化され」て存在する。いくつかの態様において、第１の部分は、第２の部分の外部表面と会合し、例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面に連結又はコンジュゲートされる（例えば、第２の部分の「表面提示」）。

【0056】

本明細書で使用される場合、「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」、又は「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、並びに「抽出された」及び「抽出すること」という用語は、互換的に使用され、精製、例えば、所望のＥＶ調製物の選択又は濃縮のうちの１つ以上のプロセスを受けた、所望のＥＶの調製物（例えば、複数の既知又は未知の量及び／又は濃度）の状態を指す。いくつかの態様において、本明細書で使用される単離すること又は精製することとは、産生細胞を含む試料からＥＶ（例えば、画分）を除去、部分的に除去するプロセスである。いくつかの態様において、単離されたＥＶ組成物は検出可能な望ましくない活性を有しないか、又は、代替的には、望ましくない活性のレベル若しくは量は、許容されるレベル若しくは量未満である。他の態様において、単離されたＥＶ組成物は、許容される量及び／又は濃度以上の所望のＥＶの量及び／又は濃度を有する。他の態様において、単離されたＥＶ組成物は、組成物が得られる出発材料（例えば、産生細胞調製物）と比較して、濃縮されている。この濃縮は、出発物質と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、又は９９．９９９９％超であり得る。いくつかの態様において、単離されたＥＶ調製物は、残留生物学的産物を実質的に含まない。いくつかの態様において、単離されたＥＶ調製物は、任意の混入した生物学的物質を、１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、又は９０％含まない。残留生物学的産物は、非生物物質（化学物質を含む）又は不要な核酸、タンパク質、脂質、若しくは代謝産物を含むことができる。残留生物学的産物を実質的に含まないことはまた、ＥＶ組成物が検出可能な産生細胞を含まないこと、及びＥＶのみが検出可能であることを意味し得る。

【0057】

本明細書で使用される「遊離ＩＬ－１２部分」という用語は、細胞外小胞と会合していないが、それ以外の場合、細胞外小胞と会合したＩＬ－１２部分と同一であるＩＬ－１２部分を意味する。特に、ＩＬ－１２部分と会合した細胞外小胞と比較した場合、遊離ＩＬ－１２部分は、細胞外小胞と会合した同じＩＬ－１２部分である。いくつかの態様において、遊離ＩＬ－１２部分を、その有効性、毒性、及び／又は任意の他の特徴においてＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞と比較した場合、細胞外小胞と会合したＩＬ－１２部分と比較した遊離ＩＬ－１２部分の量は、ＥＶと会合したＩＬ－１２部分の量と同じである。

【0058】

本明細書で使用される「ｅｘｏＩＬ－１２」という用語は、ＩＬ－１２部分、例えば、ＩＬ－１２タンパク質又はその断片がロードされたエクソソームを指す。いくつかの態様において、ＩＬ－１２部分は、エクソソームの外部表面と会合している（例えば、ＩＬ－１２部分の表面提示）。いくつかの態様において、ＩＬ－１２部分は、エクソソームの外部表面に連結されているか、又はエクソソームの外部表面にコンジュゲートされている。いくつかの態様において、ＩＬ－１２部分は、表面に露出した足場タンパク質（例えば、足場Ｘタンパク質、例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）に連結又はコンジュゲートされている。いくつかの態様において、ＩＬ－１２部分は、エクソソームの脂質二重層に連結又はコンジュゲートされている。いくつかの態様において、エクソソームは、エクソソームの内腔にＩＬ－１２部分を含む。いくつかの態様において、ＩＬ－１２部分は、エクソソームの内腔表面（例えば、足場タンパク質、例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮ）と会合している。いくつかの態様において、ＩＬ－１２部分は、エクソソームの内腔内にカプセル化され、足場タンパク質とは会合していない。

【0059】

本明細書で使用する場合、「リガンド」という用語は、受容体に結合し、受容体を調節して生物学的応答を生成する分子を指す。調節は、受容体によって媒介される生物学的応答の活性化、非活性化、遮断、又は減衰であり得る。受容体は、内因性リガンド又は外因性リガンドのいずれかによって調節され得る。内因性リガンドの非限定的な例としては、抗体及びペプチドが挙げられる。外因性アゴニストの非限定的な例は、薬物、小分子、及び環状ジヌクレオチドを含む。リガンドは、完全リガンド、部分リガンド、又は逆リガンドであり得る。

【0060】

本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、例えば、薬学的に許容される担体及び賦形剤などの１つ以上の他の化学成分と混合若しくは混ぜ合わされ、又は懸濁された、本明細書に記載の化合物（例えば、ＥＶ）のうちの１つ以上を指す。薬学的組成物の１つの目的は、ＥＶの調製物の対象への投与を容易にすることである。用語「賦形剤」又は「担体」は、化合物の投与を更に促進するために薬学的組成物に添加される不活性物質を指す。「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ヒトを含む動物での使用について米国連邦政府の規制機関によって承認されているか又は米国薬局方に収載されている任意の薬剤、並びに、対象への組成物の投与を禁止する程度に望ましくない生理学的効果の生成を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を無効にしない任意の担体又は希釈剤を包含する。薬学的組成物を調製するのに有用であり、一般に安全で、非毒性であり、望ましい賦形剤及び担体が、含まれる。

【0061】

本明細書で使用される場合、「ペイロード」という用語は、ＥＶと接触する標的（例えば、標的細胞）に作用する治療剤を指す。ＥＶ及び／又は産生細胞に導入され得るペイロードは、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分若しくは毒素を含むか、又は転写を中断させるヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素のようなポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ分子、又はｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、若しくはｓｉＲＮＡのような調節機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分を含むアミノ酸又は翻訳を中断させる毒素）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、並びに低分子（例えば、低分子薬物及び毒素）のような治療剤を含む。

【0062】

「投与」、「投与すること」という用語、並びにそれらの変異形は、組成物（例えば、ＥＶ）又は薬剤を対象に導入することを指し、組成物又は薬剤の同時及び順次導入を含む。組成物又は薬剤の対象への導入は、腫瘍内、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、若しくは皮下）、直腸、リンパ内、髄腔内、腫瘍内、眼周又は局所を含む任意の好適な経路による。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。好適な投与経路は、組成物又は薬剤がその意図された機能を実行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物又は薬剤を対象の静脈へと導入することによって投与される。

【0063】

「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、治療、又は療法が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の組成物及び方法は、ヒト療法及び獣医学的用途の両方に適用可能である。いくつかの態様において、対象は哺乳動物であり、他の態様において、対象はヒトである。本明細書で使用される場合、「哺乳動物対象」は、全ての哺乳動物を含み、これには、ヒト、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコなど）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）が含まれるが、これらに限定されない。

【0064】

本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）パーセンテージ濃度で約１０％未満の巨大分子を含むことを意味する。いくつかの画分は、０．００１％未満、０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、又は１０％未満（ｍ／ｖ）の巨大分子を含み得る。

【0065】

本明細書で使用される場合、「灌流培養」とは、培養容器中で細胞を維持しながら、細胞に新鮮な培地が連続的に供給され、使用済み培地が連続的に除去される細胞培養法又は細胞培養を指す。いくつかの態様において、灌流培養用の培養容器は、毛細管繊維又は膜などの細胞保持デバイスを含む。細胞保持デバイスを備えた灌流バイオリアクターの例としては、中空繊維フィルター又は音響セルセパレーターなどの細胞保持デバイスに接続された、撹拌槽バイオリアクターなどのＮ末端製造容器などのバイオリアクターが挙げられる。いくつかの態様において、灌流培養は、単一細胞灌流培養である。いくつかの態様において、灌流培養は、新鮮な培地の添加及び使用済み培地の除去のために個々の細胞が単離される、単一細胞懸濁液灌流バイオリアクターの使用を含み。いくつかの態様において、灌流培養は、遠心分離によって使用済み培地から細胞を分離することを含む。

【0066】

本明細書で使用される場合、「フェッドバッチ」とは、細胞を回収するまで細胞が培養容器内に留まり、最初の培養培地が最初の細胞培養物に添加され、追加の供給培地が添加されて栄養素の枯渇を防ぐ、細胞培養法又は細胞培養物を指す。いくつかの態様において、供給培地は、培養プロセス中に１回添加される。いくつかの態様において、供給培地は、培養プロセス中に複数回添加される。いくつかの態様において、流加培養物は、定流量流加培養及び対数的流加培養を含み得る。

【0067】

本明細書で使用される「治療する」、「治療」、又は「治療すること」は、例えば、疾患若しくは状態の重症度の低減、疾患経過の持続時間の低減、疾患若しくは状態に関連する１つ以上の症状の改善若しくは除去、疾患若しくは状態を有する対象に、疾患若しくは状態を必ずしも治癒することのない有益な効果の提供を指す。本用語はまた、疾患若しくは状態又はそれらのその症状の予防又は防止を含む。一態様において、「治療すること」又は「治療」という用語は、抗原に対する対象における免疫応答を誘導することを意味する。いくつかの態様において、疾患又は状態は、がんである。

【0068】

本明細書で使用される「防止する」又は「防止すること」は、特定の転帰の発生又は重症度を減少又は低下させることを指す。いくつかの態様において、転帰を防止することは、予防的治療を通じて達成される。いくつかの態様において、本明細書に記載されるサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２部分）を含むＥＶ（例えば、エクソソーム）は、対象に予防的に投与される。

【0069】

本明細書で使用される場合、「免疫調節剤」という用語は、細胞外小胞と接触した標的（例えば、標的細胞）に作用し、免疫系を調節する薬剤（すなわち、治療剤）を指す。ＥＶ（例えば、エクソソーム）及び／又は産生細胞に導入することができる免疫調節物質の非限定的な例には、チェックポイント阻害物質の調節剤、チェックポイント阻害物質のリガンド、サイトカイン、それらの誘導体、又はそれらの任意の組み合わせなどの薬剤が含まれる。免疫調節剤にはまた、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチドであるｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチドコンジュゲート化ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡなど、又は小分子も含まれる。

【0070】

ＩＩ．細胞外小胞を産生する方法
本開示は、産生細胞から産生される細胞外小胞（ＥＶ）の数を増加させる方法を提供し、本方法は、産生細胞のコレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示すように産生細胞を改変することを含む。本開示はまた、産生細胞から細胞外小胞（ＥＶ）を産生する方法を提供し、本方法は、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示す産生細胞を培養することを含む。

【0071】

理論に束縛されることを望むものではないが、本出願人は、驚くべきことに、産生細胞におけるコレステロール合成経路の遺伝的及び／又は薬理学的阻害が、コレステロール合成経路の遺伝的及び／又は薬理学的阻害を有しない産生細胞と比較して、回収されたＥＶの収率を増加させることを発見した。これらの結果は、コレステロールレベルがエクソソーム分泌にプラスの効果を有することを見出した以前の研究とはまったく対照的である。特に、Ｋｕｌｓｈｒｅｓｈｔｈａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１９，９：１６３７３は、シンバスタチンで処理した産生細胞がエクソソーム分泌を低下させることを見出した。同様に、Ｂａｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １６２（７）：１－１８（２０２１）は、コレステロール代謝産物２７－ヒドロキシコレステロール（２７ＨＣ）の存在下で初代マウス多形核好中球、ＲＡＷ２６４．７単球細胞、及び４Ｔ１マウス乳がん細胞の培養がエクソソーム産生の増加をもたらし、コレステロールレベルの増加がエクソソーム産生の増加をもたらすことを示唆した。最後に、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｌｌｉａｎｃｅ（ｖｏｌ．４，ｎｏ．８，ｅ２０２１０１０５５，Ｊｕｎｅ，２０２１）に報告されたＧｕｉｘらの分析では、培養物中の老化したニューロンの多胞体におけるコレステロールの蓄積が、若いニューロンと比較して、小さな細胞外小胞の分泌の増加と相関していることが示された。これは、コレステロールの増加が細胞外小胞の産生の増加と関連していることを再度示唆している。したがって、本明細書に提示される結果は、異なるスタチンを使用する様々な産生細胞におけるコレステロール阻害が、一貫してエクソソーム産生の増加をもたらすことを示した。これは、本出願の時点での当該分野の状況を考慮すると、予想されなかったであろう。

【0072】

いくつかの態様において、コレステロール合成経路における１つ以上の遺伝子又はそれらのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。遺伝子の非限定的な例としては、ＨＭＧ ＣｏＡ（３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリルコエンザイムＡ）、ＳＱＬＥ（スクアレンモノオキシゲナーゼ）、ＡＣＡＴ１（アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１）、ＡＣＡＴ２（アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２）、ＨＭＧＣＳ１（３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ１）、ＨＭＧＣＳ２（３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ２）、ＨＭＧＣＲ（３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ）、ＭＶＫ（メバロン酸キナーゼ）、ＰＭＶＫ（ホスホメバロン酸キナーゼ）、ＭＶＤ（メバロン酸デカルボキシラーゼ）、ＩＤＩ１（イソペンテニル－二リン酸デルタイソメラーゼ１）、ＩＤＩ２（イソペンテニル－二リン酸デルタイソメラーゼ２）、ＦＤＰＳ（ファルネシル二リン酸シンターゼ）、ＧＧＰＳ１（ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ１）、ＦＤＦＴ１（ファルニル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ１）、ＳＱＬＥ（スクアレンエポキシダーゼ）、ＬＳＳ（ラノステロールシンターゼ）、ＤＨＣＲ２４（２４－デヒドロコレステロールレダクターゼ）、ＣＹＰ５１Ａ１（シトクロムＰ４５０ファミリー５１サブファミリーＡポリペプチド１）、ＴＭ７ＳＦ２（膜貫通７スーパーファミリーメンバー２）、ＦＡＸＤＣ２（Ｃ５ｏｒｆ４脂肪酸ヒドロキシラーゼドメイン含有２）、ＭＳＭＯ１（ＳＣ４ＭＯＬメチルステロールモノオキシゲナーゼ）、ＮＳＤＨＬ（ＮＡＤ（Ｐ）依存性ステロイドデヒドロゲナーゼ様）、ＨＳＤ１７Ｂ７（ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ７）、ＥＢＰ（エモパミル結合タンパク質（ステロールイソメラーゼ）、ＳＣ５Ｄ（ＳＣ５ＤＬステロール－Ｃ５－デサチュラーゼ合成）、ＤＨＣＲ７（７－デヒドロコレステロールレダクターゼ）、ＣＥＬ（カルボキシルエステルリパーゼ）、ＬＩＰＡ（リパーゼＡ、リソソーム酸）、ＳＯＡＴ１（ステロールＯ－アセチルトランスフェラーゼ１）、ＳＯＡＴ２（ステロールＯ－アセチルトランスフェラーゼ２）、ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ）、ＡＢＣＧ１（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ）、ＳＬＣＯ２Ｂ１（溶質担体有機アニオン輸送体ファミリーメンバー２Ｂ１）、ＳＬＣＯ１Ｂ３（溶質担体有機アニオン輸送体ファミリーメンバー１Ｂ３）、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＳＲＥＢＦ１（ステロール結合エレメント転写因子１）、ＳＲＥＢＦ２（ステロール結合エレメント転写因子２）、ＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＦシャペロン）、ＭＢＴＰＳ１（Ｓ１Ｐ膜結合転写因子ペプチダーゼ部位１）、ＭＢＴＰＳ２（Ｓ２Ｐ、膜結合転写因子ペプチダーゼ部位２）、ＩＮＳＩＧ１（インスリン誘導遺伝子１）、ＩＮＳＩＧ２（インスリン誘導遺伝子２）、ＡＭＦＲ（ＧＰ７８、自己分泌型運動因子受容体Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ）、ＮＲ１Ｈ３（ＬＸＲＡ、核内受容体サブファミリー１）グループＨメンバー３）、ＮＲ１Ｈ２（ＬＸＲＢ、核内受容体サブファミリー１グループＨメンバー２）、ＲＸＲＡ（レチノイドＸ受容体α）、ＲＸＲＢ（レチノイドＸ受容体β）、又はＭＹＬＩＰ（ＩＤＯＬ、ミオシン調節軽鎖相互作用タンパク質）が挙げられる。いくつかの態様において、遺伝子は、ＨＭＧＣＲである。他の態様において、遺伝子は、ＳＲＥＢＦ２である。

【0073】

いくつかの態様において、ＳＭ（スクアレンモノオキシゲナーゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＡＣＡＴ１（アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＡＣＡＴ２（アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＨＭＧＣＳ２（３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ合成酵素２）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＭＶＫ（メバロン酸キナーゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＰＭＶＫ（ホスホメバロン酸キナーゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＩＤＩ１（イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ１）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＩＤＩ２（イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ２）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＦＤＰ（ファルネシル二リン酸シンターゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＧＧＰＳ１（ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ１）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＦＤＦＴ１（ファルネシル－二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ１）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＳＱＬＥ（スクアレンエポキシダーゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＬＳＳ（ラノステロールシンターゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＤＨＣＲ２４（２４－デヒドロコレステロールレダクターゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＣＹＰ５１Ａ１（シトクロムＰ４５０ファミリー５１サブファミリーＡポリペプチド１）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＴＭ７ＳＦ２（膜貫通７スーパーファミリーメンバー２）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＦＡＸＤＣ２（Ｃ５ｏｒｆ４脂肪酸ヒドロキシラーゼドメイン含有２）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＭＳＭＯ１（ＳＣ４ＭＯＬメチルステロールモノオキシゲナーゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＮＳＤＨＬ（ＮＡＤ（Ｐ）依存性ステロイドデヒドロゲナーゼ様）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＥＢＰ（エモパミル結合タンパク質（ステロールイソメラーゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＨＳＤ１７Ｂ７（ヒドロキシステロイド（１７β）デヒドロゲナーゼ７）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＤＨＣＲ７（７－デヒドロコレステロールレダクターゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＣＥＬ（カルボキシルエステルリパーゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、リパ（リパーゼＡ、リソソーム酸）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＳＯＡＴ１（ステロールＯ－アセチルトランスフェラーゼ１）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＳＯＡＴ２（ステロールＯ－アセチルトランスフェラーゼ２）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＳＬＣＯ２Ｂ１（溶質担体有機アニオン輸送体ファミリーメンバー２Ｂ１）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＳＬＣＯ１Ｂ３（溶質担体有機アニオン輸送体ファミリーメンバー１Ｂ３）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＳＲＥＢＦ１（ステロール結合エレメント転写因子１）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＳＲＥＢＦ２（ステロール結合エレメント転写因子２）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＦシャペロン）の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＭＢＴＰＳ１（Ｓ１Ｐ膜結合転写因子ペプチダーゼ部位１）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＭＢＴＰＳ２（Ｓ２Ｐ、膜結合転写因子ペプチダーゼ部位２）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＩＮＳＩＧ１（インスリン誘導遺伝子１）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＩＮＳＩＧ２（インスリン誘導遺伝子２）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＡＭＦＲ（ＧＰ７８、自己分泌型運動因子受容体Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＮＲ１Ｈ３（ＬＸＲＡ、核内受容体サブファミリー１グループＨメンバー３）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＮＲ１Ｈ２（ＬＸＲＢ、核内受容体サブファミリー１グループＨメンバー２）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＲＸＲＡ（レチノイドＸ受容体α）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＲＸＲＢ（レチノイドＸ受容体β）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。いくつかの態様において、ＭＹＬＩＰ（ＩＤＯＬ、ミオシン調節軽鎖相互作用タンパク質）又はそのタンパク質の発現が、阻害又は低減され得る。

【0074】

ＨＭＧＣＲ
３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－コエンザイムＡレダクターゼ（一般に、ＨＭＧ Ｃｏ－Ａレダクターゼ又はＨＭＧＣＲと略され、ＬＤＬＣＱ３としても知られている）は、ヒトにおいてＨＭＧＣＲ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＨＭＧＣＲ遺伝子は、５番染色体上に位置する（塩基７５，３３６，３３４～７５，３６２，１１６；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００５．１０）。ＨＭＧＣＲは、ＨＭＧ－ＣｏＡのメバロン酸への変換を触媒し、コレステロール合成の律速酵素である。メバロン酸に由来するステロール及び非ステロール代謝産物によって媒介される負のフィードバック機構は、ＨＭＧＣＲ酵素活性を調節する。通常、哺乳動物細胞において、ＨＭＧＣＲは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を介したＬＤＬの内在化及び分解に由来するコレステロールによって抑制される。

【0075】

ＨＭＧＣＲタンパク質は、選択的スプライシングによって産生される３つのアイソフォームを有する。配列を以下の表１に示す。

【表1】

【0076】

いくつかの態様において、本開示の方法は、産生細胞のコレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示すように産生細胞を改変することを含む。いくつかの態様において、本開示の方法は、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示す産生細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質は、ＨＭＧＣＲ遺伝子及び／又はＨＭＧＣＲタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、「ＨＭＧＣＲ遺伝子」という用語は、任意の転写物、ゲノムＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡを指す。本明細書で使用される場合、「ＨＭＧＣＲタンパク質」とは、上に開示されたＨＭＧＣＲアイソフォーム１、ＨＭＧＣＲアイソフォーム２、又はＨＭＧＣＲアイソフォーム３、並びにそのバリアント及び変異体を指す。本明細書で使用される場合、ＨＭＧＣＲタンパク質という用語はまた、野生型ＨＭＧＣＲタンパク質の少なくとも１つの機能を有する本明細書に開示されるアイソフォームのうちのいずれかの任意の断片又は変異体を包含する。

【0077】

本明細書で使用される場合、「低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能」という用語は、物理的レベルの低下（例えば、ゲノムからの編集による遺伝子配列の減少、又はタンパク質発現の低下によるタンパク質の減少）及び機能の低下の両方を指す。例えば、ＨＭＧＣＲ遺伝子のレベルの低下は、例えば、ストップコドン又はフレームシフトを導入する変異の導入による遺伝子機能の低下、転写を変化させるであろうエピジェネティック修飾による遺伝子機能の低下、又はプロモーター遺伝子若しくはＨＭＧＣＲ発現を調節する別の遺伝子における変異若しくは他の変化による遺伝子機能の低下を指し得る。いくつかの態様において、改変細胞におけるＨＭＧＣＲ遺伝子のレベルの低下は、参照（例えば、未処理）細胞と比較して、機能的ＨＭＧＣＲタンパク質（例えば、野生型ＨＭＧＣＲタンパク質）をコードすることができるゲノムＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、及び／又はｍＲＮＡの量（例えば、濃度）の減少を指す。同様に、ＨＭＧＣＲタンパク質の減少は、（部分的若しくは完全な）機能喪失を引き起こす変化（例えば、変異若しくは翻訳後修飾）、又はＨＭＧＣＲの機能部位に結合する分子の活性（例えば、その酵素活性）の変化を含むがこれらに限定されない、機能的なＨＭＧＣＲタンパク質（例えば、野生型ＨＭＧＣＲタンパク質）の発現をもたらす変化を指し得る。

【0078】

ＨＭＧＣＲ遺伝子レベル（例えば、遺伝子全体若しくはその一部の存在／不在、又は遺伝子機能）は、当該技術分野で既知の様々な方法によって測定することができる。ＨＭＧＣＲタンパク質レベル（例えば、ＨＭＧＣＲタンパク質又はその断片の存在／不在、又は定量若しくはタンパク質機能）は、当該技術分野で既知の様々な方法によって測定することができる。

【0079】

いくつかの態様において、産生細胞におけるＨＭＧＣＲ遺伝子の発現レベルの低下及び／又はＨＭＧＣＲタンパク質の発現若しくは機能レベルの低下は、ＨＭＧＣＲ遺伝子の発現レベルの低下及び／又はＨＭＧＣＲタンパク質の発現レベルの低下を有しない産生細胞によって産生されるＥＶと比較して、産生細胞によって産生されるＥＶの収率を増加させることができる。いくつかの態様において、収率は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約２６倍、少なくとも約２７倍、少なくとも約２８倍、少なくとも約２９倍、又は少なくとも約３０倍増加する。いくつかの態様において、収率は、約２倍～約３０倍、約２倍～約２５倍、約２倍～約２０倍、約２倍～約１５倍、約１２倍～約１０倍、約２倍～約５倍、約５倍～約３０倍、約５倍～約２５倍、約５倍～約２０倍、約５倍～約１５倍、約５倍～約１０倍、約１０倍～約３０倍、約１０倍～約２５倍、約１０倍～約２０倍、約１０倍～約１５倍、約１５倍～約３０倍、約１５倍～約２５倍、約１５倍～約２０倍、約２０倍～約３０倍、約２０倍～約２５倍、又は約２５倍～約３０倍増加する。いくつかの態様において、収率は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。

【0080】

いくつかの態様において、ＨＭＧＣＲ遺伝子の発現は、約２～約２０倍低下する。いくつかの態様において、ＨＭＧＣＲ遺伝子の発現は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、又は約２０倍低下する。

【0081】

いくつかの態様において、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／タンパク質機能は、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約１０％、少なくとも約５％、又は少なくとも約１％低下する。いくつかの態様において、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／タンパク質機能は、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約３０％低下する。

【0082】

いくつかの態様において、本明細書に記載の方法の改変は、産生細胞を、ＨＭＧＣＲ遺伝子及び／又はＨＭＧＣＲタンパク質機能を低下させることができる薬剤と接触させることを含む。いくつかの態様において、薬剤は、スタチンを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、スタチンは、メバロン酸経路（例えば、コレステロール生合成経路）、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）における第１及び主要な律速酵素の活性部位を競合的に遮断することによって作用する。この部位の阻害は、基質へのアクセスを妨げ、それによって、ＨＭＧ－ＣｏＡのメバロン酸への変換を妨げる。スタチンの活性成分は、内因性基質、ＨＭＧ－ＣｏＡ、及びメバルジルＣｏＡ遷移状態中間体と構造的に類似している修飾３，５－ジヒドロキシグルタル酸部分である。この活性部位は、スタチンが３Ｒ，５Ｒ配置を有することを必要とする立体選択的プロセスにおいて、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ活性に結合し、阻害する。スタチンの分子的及び臨床的差異は、部分的に還元されたナフタレン（ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン）、ピロール（アトルバスタチン）、インドール（フルバスタチン）、ピリミジン（ロスバスタチン）、ピリジン（セリバスタチン）、又はキノリン（ピタバスタチン）であり得る活性部分に結合する環から生じる。環上の置換基は、スタチンの溶解度及び薬理学的特性を定義する。親水性（プラバスタチン及びロスバスタチン）は、共通の活性部位に加えて他の極性置換基に由来するが、親油性（アトルバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、シンバスタチン、及びセリバスタチン）は、非極性置換基の付加により生じる。いくつかの態様において、スタチンは、アトルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、シンバスタチン、又はそれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの態様において、スタチンは、シンバスタチンを含む。いくつかの態様において、スタチンは、ロバスタチン、シンバスタチン、及び／又はプラバスタチンを含む。いくつかの態様において、スタチンは、アトルバスタチンを含む。いくつかの態様において、スタチンは、フルバスタチンを含む。いくつかの態様において、スタチンは。ロスバスタチンを含む。いくつかの態様において、スタチンは、セリバスタチンを含む。いくつかの態様において、スタチンは、ピタバスタチンを含む。いくつかの態様において、スタチンは、プラバスタチン及び／又はロスバスタチンを含む。いくつかの態様において、スタチンは、アトルバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、シンバスタチン、及び／又はセリバスタチンを含む。

【0083】

いくつかの態様において、スタチン（例えば、シンバスタチン）は、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約約１０ｎＭ、約１１ｎＭ、約１２ｎＭ、約１３ｎＭ、約１４ｎＭ、約１５ｎＭ、約１６ｎＭ、約１７ｎＭ、約１８ｎＭ、又は約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２６０ｎＭ、約２７０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約２９０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３１０ｎＭ、約３２０ｎＭ、約３３０ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３６０ｎＭ、約３７０ｎＭ、約３８０ｎＭ、約３９０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４１０ｎＭ、約４２０ｎＭ、約４３０ｎＭ、約４４０ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４６０ｎＭ、約４７０ｎＭ、約４８０ｎＭ、約４９０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５１０ｎＭ、約５２０ｎＭ、約５３０ｎＭ、約５４０ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５６０ｎＭ、約５７０ｎＭ、約５８０ｎＭ、約５９０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６１０ｎＭ、約６２０ｎＭ、約６３０ｎＭ、約６４０ｎＭ、約６５０ｎＭ、約６６０ｎＭ、約６７０ｎＭ、約６８０ｎＭ、約６９０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７１０ｎＭ、約７２０ｎＭ、約７３０ｎＭ、約７４０ｎＭ、約７５０ｎＭ、約７６０ｎＭ、約７７０ｎＭ、約７８０ｎＭ、約７９０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８１０ｎＭ、約８２０ｎＭ、約８３０ｎＭ、約８４０ｎＭ、約８５０ｎＭ、約８６０ｎＭ、約８７０ｎＭ、約８８０ｎＭ、約８９０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９１０ｎＭ、約９２０ｎＭ、約９３０ｎＭ、約９４０ｎＭ、約９５０ｎＭ、約９６０ｎＭ、約９７０ｎＭ、約９８０ｎＭ、約９９０ｎＭ、又は約１，０００ｎＭの濃度で産生細胞と接触される。いくつかの態様において、スタチンは、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ～約９０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約８０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約７０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約６０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約４０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約３０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２０ｎＭ、０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、又は約１ｎＭ～約２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約２０ｎＭ、約５ｎＭ～約１５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約４０ｎＭ、約１０ｎＭ～約３０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、又は約１０ｎＭ～約２０ｎＭの濃度で接触される。

【0084】

いくつかの態様において、スタチン（例えば、シンバスタチン）は、約１ｎＭ～約１０ｎＭの濃度で産生細胞と接触される。

【0085】

いくつかの態様において、スタチンは、ＥＶを回収する前に、産生細胞と接触される。いくつかの態様において、スタチンは、ＥＶを回収する前に、産生細胞と、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、又は約２４時間接触される。一部の態様において、スタチンは、産生細胞と、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、約９６時間、約１０８時間、約１２０時間、約１３２時間、約１４４時間、約１５６時間、約１６８時間、約１８０時間、約１９２時間、約２０４時間、約２１６時間、約２２８時間、又は約２４０時間接触される。いくつかの態様において、スタチンは、ＥＶを回収する前に、生産細胞と、約１０日間～約１５日間、約１０日間～約２０日間、約１０日間～約２５日間、約１０日間～約３０日間、約１０日間～約３５日間、又は約１０日間～約４０日間接触される。いくつかの態様において、ＥＶが回収される間、スタチンは、産生細胞と接触される。いくつかの態様において、スタチンは、約３０日間、約３５日間、又は約４０日間にわたる連続（例えば、灌流）細胞培養プロセスの期間にわたって、産生細胞と接触される。

【0086】

いくつかの態様において、薬剤は、メグルトール、クリノフィブラート、ヘスペレチン７－Ｏ－グルコシド、化合物８１（ＨＭＧ４９９とも呼ばれ、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９，５１３８（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている関連構造を含む）、ＰＲＯＴＡＣ、又はＭｏｎａｃｏｌｉｎ Ｊを含む。

【0087】

いくつかの態様において、産生細胞は、産生細胞を、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させることができる薬剤と接触させることによって、培養前に改変される。

【0088】

いくつかの態様において、薬剤は、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約約１０ｎＭ、約１１ｎＭ、約１２ｎＭ、約１３ｎＭ、約１４ｎＭ、約１５ｎＭ、約１６ｎＭ、約１７ｎＭ、約１８ｎＭ、又は約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２６０ｎＭ、約２７０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約２９０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３１０ｎＭ、約３２０ｎＭ、約３３０ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３６０ｎＭ、約３７０ｎＭ、約３８０ｎＭ、約３９０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４１０ｎＭ、約４２０ｎＭ、約４３０ｎＭ、約４４０ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４６０ｎＭ、約４７０ｎＭ、約４８０ｎＭ、約４９０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５１０ｎＭ、約５２０ｎＭ、約５３０ｎＭ、約５４０ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５６０ｎＭ、約５７０ｎＭ、約５８０ｎＭ、約５９０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６１０ｎＭ、約６２０ｎＭ、約６３０ｎＭ、約６４０ｎＭ、約６５０ｎＭ、約６６０ｎＭ、約６７０ｎＭ、約６８０ｎＭ、約６９０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７１０ｎＭ、約７２０ｎＭ、約７３０ｎＭ、約７４０ｎＭ、約７５０ｎＭ、約７６０ｎＭ、約７７０ｎＭ、約７８０ｎＭ、約７９０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８１０ｎＭ、約８２０ｎＭ、約８３０ｎＭ、約８４０ｎＭ、約８５０ｎＭ、約８６０ｎＭ、約８７０ｎＭ、約８８０ｎＭ、約８９０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９１０ｎＭ、約９２０ｎＭ、約９３０ｎＭ、約９４０ｎＭ、約９５０ｎＭ、約９６０ｎＭ、約９７０ｎＭ、約９８０ｎＭ、約９９０ｎＭ、又は約１，０００ｎＭの濃度で産生細胞と接触される。いくつかの態様において、スタチンは、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ～約９０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約８０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約７０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約６０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約４０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約３０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２０ｎＭ、０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、又は約１ｎＭ～約２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約２０ｎＭ、約５ｎＭ～約１５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約４０ｎＭ、約１０ｎＭ～約３０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、又は約１０ｎＭ～約２０ｎＭの濃度で接触される。

【0089】

いくつかの態様において、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させることができる薬剤は、遺伝子編集技術を含む。いくつかの態様において、遺伝子編集技術は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、遺伝子編集技術は、ｓｉＲＮＡを含む。

【0090】

ＳＲＥＢＦ２
ステロール調節エレメント結合因子２（一般にＳＲＥＢＦ２と略され、ｌｏ、ｎｕ、ＳＲＥ、ｎｕｃ、ＳＲＥＢ、ＳＲＥＢＰ、ｂＨＬＨｄ、ｌｏｐ１３、ＳＲＥＢＰ２、ｂＨＬＨｄ２、ＳＲＥＢＰ－２、ＡＩ６０８２５７、及びＳＲＥＢＰ２ｇｃとしても知られている）は、ヒトにおいてＳＲＥＢＦ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＳＲＥＢＦ２遺伝子は、１５番染色体上に位置する（塩基８２，０３１，４７０～８２，０８９，５８０；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００８１．７）。ＳＲＥＢＦ２は、コレステロール合成の主要な調節因子であり、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＣＳ）、及びメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）などの遺伝子の発現を活性化する転写因子である。

【0091】

ＳＲＥＢＦ２タンパク質は、選択的スプライシングによって生成される２つのアイソフォームを有する。配列を以下の表２に示す。

【表2】

【0092】

いくつかの態様において、本開示の方法は、産生細胞のコレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示すように産生細胞を改変することを含む。いくつかの態様において、本開示の方法は、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示す産生細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質は、ＳＲＥＢＦ２遺伝子及び／又はＳＲＥＢＦ２タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、「ＳＲＥＢＦ２遺伝子」という用語は、任意の転写物、ゲノムＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡを指す。本明細書で使用される場合、「ＳＲＥＢＦ２タンパク質」とは、上に開示されたＳＲＥＢＦ２アイソフォーム１又はＳＲＥＢＦ２アイソフォーム２、並びにそのバリアント及び変異体を指す。本明細書で使用される場合、ＳＲＥＢＦ２タンパク質という用語はまた、野生型ＳＲＥＢＦ２タンパク質の少なくとも１つの機能を有する本明細書に開示されるアイソフォームのうちのいずれかの任意の断片又はバリアントを包含する。

【0093】

本明細書で使用される場合、「低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能」という用語は、物理的レベルの低下（例えば、ゲノムからの編集による遺伝子配列の減少、又はタンパク質発現の低下によるタンパク質の減少）及び機能の低下の両方を指す。例えば、ＳＲＥＢＦ２遺伝子のレベルの低下は、例えば、ストップコドン又はフレームシフトを導入する変異の導入による遺伝子機能の低下、転写を変化させるであろうエピジェネティック修飾による遺伝子機能の低下、又はプロモーター遺伝子若しくはＳＲＥＢＦ２発現を調節する別の遺伝子における変異若しくは他の変化による遺伝子機能の低下を指し得る。いくつかの態様において、改変細胞におけるＳＲＥＢＦ２遺伝子のレベルの低下は、参照（例えば、未処理）細胞と比較して、機能的ＳＲＥＢＦ２タンパク質（例えば、野生型ＳＲＥＢＦ２タンパク質）をコードすることができるゲノムＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、及び／又はｍＲＮＡの量（例えば、濃度）の減少を指す。同様に、ＳＲＥＢＦ２タンパク質の減少は、（部分的若しくは完全な）機能喪失を引き起こす変化（例えば、変異若しくは翻訳後修飾）、又はＳＲＥＢＦ２の機能部位に結合する分子の活性（例えば、その転写活性化活性）の変化を含むがこれらに限定されない、機能的なＳＲＥＢＦ２タンパク質（例えば、野生型ＳＲＥＢＦ２タンパク質）の発現をもたらす変化を指し得る。

【0094】

ＳＲＥＢＦ２の遺伝子レベル（例えば、遺伝子全体若しくはその一部の存在／不在、又は遺伝子機能）は、当該技術分野で既知の様々な方法によって測定することができる。ＳＲＥＢＦ２タンパク質レベル（例えば、ＳＲＥＢＦ２タンパク質又はその断片の存在／不在、又は定量若しくはタンパク質機能）は、当該技術分野で既知の様々な方法によって測定することができる。

【0095】

いくつかの態様において、産生細胞におけるＳＲＥＢＦ２遺伝子の低下した発現レベル及び／又はＳＲＥＢＦ２タンパク質の発現又は機能レベルは、ＳＲＥＢＦ２遺伝子の低下した発現レベル及び／又はＳＲＥＢＦ２タンパク質の発現レベルを有しない産生細胞によって産生されるＥＶと比較して、産生細胞によって産生されるＥＶの収率を増加させることができる。いくつかの態様において、収率は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍、少なくとも約２２倍、少なくとも約２３倍、少なくとも約２４倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約２６倍、少なくとも約２７倍、少なくとも約２８倍、少なくとも約２９倍、又は少なくとも約３０倍増加する。いくつかの態様において、収率は、約２倍～約３０倍、約２倍～約２５倍、約２倍～約２０倍、約２倍～約１５倍、約２倍～約１０倍、約２倍～約５倍、約５倍～約３０倍、約５倍～約２５倍、約５倍～約２０倍、約５倍～約１５倍、約５倍～約１０倍、約１０倍～約３０倍、約１０倍～約２５倍、約１０倍～約２０倍、約１０倍～約１５倍、約１５倍～約３０倍、約１５倍～約２５倍、約１５倍～約２０倍、約２０倍～約３０倍、約２０倍～約２５倍、又は約２５倍～約３０倍増加する。いくつかの態様において、収率は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。

【0096】

いくつかの態様において、ＳＲＥＢＦ２遺伝子の発現は、約２倍～約３０倍低下する。いくつかの態様において、ＳＲＥＢＦ２遺伝子の発現は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２３倍、約２４倍、約２５倍、約２６倍、約２７倍、約２８倍、約２９倍、又は約３０倍低下する。

【0097】

いくつかの態様において、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能は、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約１０％、少なくとも約５％％、又は少なくとも約１％低下する。いくつかの態様において、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能は、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約３０％低下する。

【0098】

いくつかの態様において、本明細書に記載の方法の改変は、産生細胞を、ＳＲＥＢＦ２遺伝子及び／又はＳＲＥＢＦ２タンパク質機能を低下させることができる薬剤と接触させることを含む。いくつかの態様において、薬剤は、ベツリンを含む（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１１ Ｊａｎ ５；１３（１）：４４－５６（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。いくつかの態様において、薬剤は、ファトスタチンを含む。いくつかの態様において、薬剤は、シュードプロトジオシンを含む。いくつかの態様において、薬剤は、オリゴマーアミロイドβ４２を含む。いくつかの態様において、薬剤は、ルテオリンを含む。いくつかの態様において、薬剤は、クロフィブラートを含む。

【0099】

いくつかの態様において、改変は、産生細胞を、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させることができる薬剤と接触させることを含む。いくつかの態様において、産生細胞は、産生細胞を、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させることができる薬剤と接触させることによって、培養前に改変される。

【0100】

いくつかの態様において、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させることができる薬剤は、遺伝子編集技術を含む。いくつかの態様において、遺伝子編集技術は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、遺伝子編集技術は、ｓｉＲＮＡを含む。

【0101】

ＩＩＡ．遺伝子編集ツール
１つ以上の遺伝子編集ツールを、本開示の産生細胞からの細胞外小胞の数を増加させる方法、並びに細胞外小胞の産生及び産生方法で使用することができる。

【0102】

ＩＩ．Ａ．１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
いくつかの態様において、本開示において使用することができる遺伝子編集ツールは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。そのようなシステムは、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いることができ、これは、いくつかの事例では、それが発現される所望の細胞型（例えば、ＣＨＯ細胞、例えば、ＭＳＣ細胞）に対してコドン最適化される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成することによって、ゲノム部位を標的化するＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼを使用する。これにより、ＮＧＧモチーフの上流の３つのヌクレオチドの二本鎖切断が生じる。いくつかの態様において、二本鎖切断とは対照的に、一本鎖ニックをもたらすであろう改変バージョンのＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を使用することができる。他の酵素との更なる融合は、二本鎖切断の不在下で部位特異的塩基編集をもたらし得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの固有の能力は、２つ以上のｇＲＮＡ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のｇＲＮＡ）を有する単一のＣａｓ９タンパク質を共発現させることによって、複数の異なるゲノム遺伝子座を同時に標的化する能力である。そのようなシステムはまた、２つの別個の分子を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いることができる。ある特定の態様において、２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ターゲッターＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「アクチベーターＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又は「足場」）分子を含む。

【0103】

ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二重鎖の半分を形成する一連のヌクレオチドとの両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成する一連のヌクレオチドを含む。したがって、ｃｒＲＮＡの一連のヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一連のヌクレオチドと相補的であり、ハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言える。ｃｒＲＮＡは、一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを更に提供する。したがって、ｇＲＮＡは、標的配列及びｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズする配列を含む。したがって、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（対応する対として）は、ハイブリダイズして、ｇＲＮＡを形成する。細胞内での改変に使用する場合、特定のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列及び／又は長さは、ＲＮＡ分子が使用されるであろう種（例えば、ヒト）に特異的であるように設計され得る。

【0104】

３つのエレメント（Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｃｒＲＮＡ）をコードする天然に存在する遺伝子は、典型的には、オペロン（複数可）に組織化される。天然に存在するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、Ｃａｓ９システム及び生物によって異なるが、２１～４６ヌクレオチド長の２つのダイレクトリピート（ＤＲ）が隣接する、２１～７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含むことが多い（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは、３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは、３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズし、これは、次いで、Ｃａｓ９タンパク質に結合する。

【0105】

あるいは、本明細書で使用されるＣＲＩＳＰＲシステムは、コドン最適化されたＣａｓ９とともに機能する融合ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物（すなわち、単一の転写物）を更に用いることができる。この単一のＲＮＡは、しばしば、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ又はシングルガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡと称される。ｇＲＮＡ内では、ｃｒＲＮＡ部分は、所与の認識部位の「標的配列」として特定され、ｔｒａｃｒＲＮＡは、しばしば、「足場」と称される。簡潔に述べると、標的配列を含む短いＤＮＡ断片は、ガイドＲＮＡ発現プラスミドに挿入される。ｇＲＮＡ発現プラスミドは、標的配列（いくつかの態様において、約２０ヌクレオチド）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の形態（足場）、並びに細胞において活性である好適なプロモーター、及び真核細胞において適切にプロセシングされるために必要なエレメントを含む。システムの多くは、アニーリングされて二本鎖ＤＮＡを形成し、次いで、ｇＲＮＡ発現プラスミドにクローニングされるカスタムの相補オリゴに依存する。

【0106】

次いで、ｇＲＮＡ発現カセット及びＣａｓ９発現カセットが、細胞に導入される。例えば、Ｍａｌｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ．１５；３３９（６１２１）：８２３－６、Ｊｉｎｅｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２ Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６－２１、Ｈｗａｎｇ Ｗ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒｃｈ；３１（３）：２２７－９、Ｊｉａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒｃｈ；３１（３）：２３３－９、Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（８）：７４７－５２（２０１０）、及びＣｏｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ．１５；３３９（６１２１）：８１９－２３を参照されたい（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１、ＷＯ／２０１４／０６５５９６Ａ１、ＷＯ／２０１４／０８９２９０Ａ１、ＷＯ／２０１４／０９３６２２Ａ２、ＷＯ／２０１４／０９９７５０Ａ２、及びＷＯ／２０１３１４２５７８Ａ１も参照されたい（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0107】

いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で提供され得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡとの複合体の形態で提供され得る。他の態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、タンパク質をコードする核酸の形態で提供され得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））又はＤＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で提供され得る。他の態様において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子、又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別個のＤＮＡ分子の形態で提供され得る。

【0108】

ある特定の態様において、ｄｓＤＮＡの各鎖上の標的部位に特異的な２つの別個のＣａｓタンパク質（例えば、ニッカーゼ）は、別の核酸上のオーバーハング配列に相補的なオーバーハング配列、又は同じ核酸上の別個の領域を生成することができる。核酸をｄｓＤＮＡの両方の鎖上の標的部位に特異的な２つのニッカーゼと接触させることによって生成されるオーバーハング末端は、５’又は３’オーバーハング末端のいずれかであり得る。例えば、オーバーハング配列が生成されるように、第１のニッカーゼは、ｄｓＤＮＡの第１の鎖に一本鎖切断を生成することができ、一方、第２のニッカーゼは、ｄｓＤＮＡの第２の鎖に一本鎖切断を生成することができる。生成されるオーバーハング末端配列が、異なる核酸分子上のオーバーハング末端配列に相補的であるように、一本鎖切断を生成する各ニッカーゼの標的部位を選択することができる。２つの異なる核酸分子の相補的なオーバーハング末端は、本明細書に開示される方法によってアニールされ得る。いくつかの態様において、第１の鎖上のニッカーゼの標的部位は、第２の鎖上のニッカーゼの標的部位とは異なる。

【0109】

いくつかの態様において、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２遺伝子、並びにそのコードされるＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２タンパク質の発現は、細胞を、例えば、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２遺伝子に特異的であるＣＲＩＳＰＲ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム）と接触させることによって減少する。

【0110】

いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲを使用した遺伝子編集は、参照細胞（例えば、ＣＲＩＳＰＲを使用した遺伝子編集を受けていない対応する細胞）において観察されるＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２の遺伝子レベルと比較して、遺伝子レベルを少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％低下させる。いくつかの態様において、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２の遺伝子レベルは、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して、例えば、デジタルドロップレットＰＣＲによって測定することができる。

【0111】

いくつかの態様において、本明細書に開示されるｇＲＮＡ又はＣａｓ９をコードする核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡである。他の態様において、本明細書に開示されるｇＲＮＡ又はＣａｓ９をコードするＲＮＡ又はＤＮＡは、それぞれ、合成ＲＮＡ又は合成ＤＮＡである。いくつかの態様において、合成ＲＮＡ又は合成ＤＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの態様において、ある特定のクラスの全ての核酸塩基は、非天然核酸塩基で置き換えられている（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドにおける全てのウリジンは、非天然核酸塩基、例えば、５－メトキシウリジン又はシュードウリジンで置き換えられ得る）。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド（例えば、合成ＲＮＡ又は合成ＤＮＡ）は、天然核酸塩基のみを含む。すなわち、合成ＤＮＡの場合は、Ａ、Ｃ、Ｔ、及びＵのみを含み、合成ＲＮＡ又は合成ＤＮＡの場合は、Ａ、Ｃ、Ｔ及びＵのみを含む。

【0112】

ＩＩ．Ａ．２．メガヌクレアーゼ
いくつかの態様において、細胞におけるＶＨＬの発現を調節するために使用される遺伝子編集ツールは、メガヌクレアーゼシステムなどのヌクレアーゼ剤を含む。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づいて、４つのファミリーに分類されており、これらのファミリーは、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」、「ＧＩＹ－ＹＩＧ」、「Ｈ－Ｎ－Ｈ」、及び「Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックス」ファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びホスホジエステル結合の加水分解に関与する。

【0113】

ＨＥａｓｅは、それらの長い認識部位、及びそれらのＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型の許容性が注目に値する。メガヌクレアーゼのドメイン、構造、及び機能は既知である。例えば、Ｇｕｈａｎ ａｎｄ Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８：１９９－２４８、Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：９６０－９、Ｊｕｒｉｃａ ａｎｄ Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：１３０４－２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３８：４９－９５、及びＭｏｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：７６４を参照されたい。

【0114】

いくつかの例では、天然に存在するバリアント、及び／又は操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。動態、補因子相互作用、発現、至適条件、及び／又は認識部位の特異性、並びに活性のスクリーニングを改変するための方法は既知である。例えば、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２９５２－６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３４：９９３－１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：３８７０－９、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４２：３１－４１、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：４７９１－８００、Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１５４、ＷＯ２００５／１０５９８９、ＷＯ２００３／０７８６１９、ＷＯ２００６／０９７８５４、ＷＯ２００６／０９７８５３、ＷＯ２００６／０９７７８４、及びＷＯ２００４／０３１３４６を参照されたい（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0115】

任意のメガヌクレアーゼを本明細書で使用することができ、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｅｃＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ－ＴｌｉＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｆ－ＳｃｅＩ、Ｆ－ＳｃｅＩＩ、Ｆ－ＳｕｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＡｍａＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｍｏｅＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＣｖｕＩ、Ｉ－ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ－ＤｄｉＩ、Ｉ－ＤｄｉＩＩ、Ｉ－ＤｉｒＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＨｓＮＩＰ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＮａａＩ、Ｉ－ＮａｎＩ、Ｉ－ＮｃＩＩＰ、Ｉ－ＮｇｒＩＰ、Ｉ－ＮｉｔＩ、Ｉ－ＮｊａＩ、Ｉ－Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ－ＰａｋＩ、Ｉ－ＰｂｏＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＡＩ、Ｉ－ＰｃｕＶＩ、Ｉ－ＰｇｒＩＰ、Ｉ－ＰｏｂＩＰ、Ｉ－ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ－ＰｂｐＩＰ、Ｉ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｅｘＩＰ、Ｉ－ＳｎｅＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩ、Ｉ－ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ－ＳｑｕＩＰ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ－ＴｄｅＩＰ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＵａｒＡＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ－ＶｉｎＩＰ、Ｉ－ＺｂｉＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、ＰＩ－Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩＩ、ＰＩ－ＴｈｙＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、又はその任意の活性バリアント若しくは断片が含まれるが、これらに限定されない。

【0116】

いくつかの態様において、メガヌクレアーゼは、１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する。いくつかの態様において、メガヌクレアーゼは、ゲノムにおける１つの完全に一致する標的配列を認識する。いくつかの態様において、メガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ホーミングヌクレアーゼは、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」ファミリーのホーミングヌクレアーゼである。いくつかの態様において、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」ファミリーのホーミングヌクレアーゼは、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－Ｄｍｏｌ、又はそれらの組み合わせから選択される。

【0117】

ＩＩ．Ａ．３ ＴＡＬＥＮ
いくつかの態様において、本開示で使用することができる遺伝子編集ツールは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのヌクレアーゼ剤を含む。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物又は真核生物のゲノムにおける特定の標的配列で二本鎖切断を行うために使用できる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然の若しくは操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター又はその機能的部分を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合することによって生成される。

【0118】

固有のモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、任意の所与のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特異的なＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、したがって、所望の標的配列で二本鎖切断を行うために使用することができる。ＷＯ２０１０／０７９４３０、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）ＰＮＡＳ １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ ＆ Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８－４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７－７６１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３－１４８を参照されたい（それらは全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0119】

好適なＴＡＬヌクレアーゼの非限定的な例、及び好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、米国特許出願第２０１１／０２３９３１５Ａ１号、同第２０１１／０２６９２３４Ａ１号、同第２０１１／０１４５９４０Ａ１号、同第２００３／０２３２４１０Ａ１号、同第２００５／０２０８４８９Ａ１号、同第２００５／００２６１５７Ａ１号、同第２００５／００６４４７４Ａ１号、同第２００６／０１８８９８７Ａ１号、及び同第２００６／００６３２３１Ａ１号に開示されている（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0120】

様々な態様において、例えば、目的のゲノム遺伝子座における標的核酸配列内又はその近くで切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、標的核酸配列が、標的化ベクターによって改変される配列又はその近くにある。本明細書に提供される様々な方法及び組成物とともに使用するのに好適なＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書に記載される標的化ベクターによって改変される標的核酸配列内又はその近くで結合するように特異的に設計されるＴＡＬヌクレアーゼが含まれる。

【0121】

ＩＩ．Ａ．４ ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
いくつかの態様において、本開示で使用することができる遺伝子編集ツールは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムなどのヌクレアーゼ剤を含む。ジンクフィンガーベースのシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインの２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」、「ジンクフィンガータンパク質」、又は「ＺＦＰ」とは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合する、タンパク質又はより大きなタンパク質内のドメインであり、これは、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列に結合することによって、酵素ドメインの活性を配列の近傍に向け、したがって、標的配列の近傍の内因性標的遺伝子の改変を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的に任意の所望の配列に結合するように操作されることができる。したがって、切断又は組換えが所望される標的ＤＮＡ配列を含む標的遺伝子座を特定した後、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを、標的遺伝子座内の１つ以上の標的ＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。細胞におけるジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質の発現は、標的遺伝子座における改変に影響を及ぼす。

【0122】

いくつかの態様において、ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを含む。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：１６０９－１６１４、Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｂｒｕａｒｙ：５６－６５、米国特許第６，４５３，２４２号を参照されたい（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。典型的には、単一のジンクフィンガードメインは、約３０アミノ酸長である。個々のジンクフィンガーは、３ヌクレオチド（すなわち、トリプレット）配列（又は、隣接するジンクフィンガーの４ヌクレオチド結合部位と１ヌクレオチド重複し得る４ヌクレオチド配列）に結合する。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインが（例えば、標的配列に）結合するように操作される配列の長さは、操作されたジンクフィンガー結合ドメインにおけるジンクフィンガーの数を決定するであろう。例えば、フィンガーモチーフが重複するサブ部位に結合しないＺＦＰの場合、６ヌクレオチド標的配列は、２つのフィンガー結合ドメインによって結合され、９ヌクレオチド標的配列は、３つのフィンガー結合ドメインによって結合されるなどである。標的部位における個々のジンクフィンガー（すなわち、サブ部位）の結合部位は、連続している必要はないが、マルチフィンガー結合ドメインにおけるジンクフィンガー（すなわち、フィンガー間リンカー）間のアミノ酸配列の長さ及び性質に応じて、１つ又はいくつかのヌクレオチドによって分離され得る。いくつかの態様において、個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、３～６個の個々のジンクフィンガーリピートを含み、各々９～１８塩基対を認識することができる。

【0123】

ジンクフィンガー結合ドメインは、選択される配列に結合するように操作され得る。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６；２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．、ａｎｄ Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照されたい（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。操作方法としては、限定されないが、合理的な設計及び様々なタイプの選択が挙げられる。

【0124】

ジンクフィンガードメインによる結合のための標的ＤＮＡ配列の選択は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に開示されている方法に従って達成することができる。ヌクレオチド配列の簡単な目視検査が、標的ＤＮＡ配列の選択にも使用され得ることは、当業者には明らかであろう。したがって、標的ＤＮＡ配列選択のための任意の手段は、本明細書に記載される方法において使用され得る。標的部位は、一般に、少なくとも９ヌクレオチド長を有し、したがって、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインによって結合される。しかしながら、例えば、４つのフィンガー結合ドメインの１２ヌクレオチド標的部位への結合、５つのフィンガー結合ドメインの１５ヌクレオチド標的部位への結合、又は６つのフィンガー結合ドメインの１８ヌクレオチド標的部位への結合もまた可能である。明らかなように、より長い標的部位へのより大きな結合ドメイン（例えば、７フィンガー、８フィンガー、９フィンガーなど）の結合も可能である。

【0125】

ジンクフィンガー融合タンパク質の酵素ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから得ることができる。酵素ドメインを誘導することができる例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．、及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素が既知である（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮＡａｓｅＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３を参照）。これらの酵素（又はそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を、切断ドメイン及び切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。

【0126】

本明細書に記載のＺＦＰの酵素ドメインとして使用するのに好適な例示的な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位で）ＤＮＡに配列特異的に結合し、結合部位又はその近くでＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合及び切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、及び同第５，４８７，９９４号、並びにＬｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0127】

ＩＩ．Ａ．５ 干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）
いくつかの態様において、細胞におけるＶＨＬの発現を減少させるために使用され得る遺伝子編集ツールは、ＲＮＡ干渉分子（「ＲＮＡｉ」）を含む。本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉは、内因性遺伝子サイレンシング経路（例えば、Ｄｉｃｅｒ及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））を介した標的ｍＲＮＡの分解による内因性標的遺伝子産物の発現の減少を媒介するＲＮＡポリヌクレオチドである。ＲＮＡｉ剤の非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」とも称される）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

【0128】

いくつかの態様において、本開示に有用な遺伝子編集ツールは、１つ以上のｍｉＲＮＡを含む。「ｍｉＲＮＡ」は、約２１～２５ヌクレオチド長の天然に存在する小さな非コードＲＮＡ分子を指す。いくつかの態様において、本開示に有用なｍｉＲＮＡは、コレステロール合成経路における遺伝子に少なくとも部分的に相補的である（例えば、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２ ｍＲＮＡ分子）。ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制、ｍＲＮＡの切断、及び／又は脱アデニル化を介して、内因性標的遺伝子産物（すなわち、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２タンパク質）の発現を下方制御（例えば、低下）することができる。

【0129】

いくつかの態様において、本開示で使用することができる遺伝子編集ツールは、１つ以上のｓｈＲＮＡを含む。「ｓｈＲＮＡ」（又は「ショートアピンＲＮＡ」分子）は、ヘアピンループを形成する一端に二本鎖領域及びループ領域を含むＲＮＡ配列を指し、これを使用して、遺伝子発現を低減及び／又はサイレンシングすることができる。二本鎖領域は、典型的には、ステムの両側の約１９ヌクレオチド～約２９ヌクレオチド長であり、ループ領域は、典型的には、約３～約１０ヌクレオチド長である（３’末端又は５’末端一本鎖オーバーハングヌクレオチドは任意選択的である）。ｓｈＲＮＡは、細胞内に導入されるプラスミド又は非複製組換えウイルスベクターにクローニングされ、ｓｈＲＮＡコード配列のゲノムへの組み込みをもたらすことができる。したがって、ｓｈＲＮＡは、内因性標的遺伝子の翻訳及び発現の安定かつ一貫した抑制を提供することができる。

【0130】

いくつかの態様において、本開示に有用な遺伝子編集ツールは、１つ以上のｓｉＲＮＡを含む。「ｓｉＲＮＡ」は、典型的には、約２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるマルチタンパク質複合体と結合し、その間に「パッセンジャー」センス鎖が酵素的に切断される。次いで、配列相同性のために、活性化されたＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖が、対応するｍＲＮＡにＲＩＳＣをガイドし、同じヌクレアーゼが標的ｍＲＮＡを切断し、特異的な遺伝子サイレンシングをもたらす。特定の態様において、ｓｉＲＮＡは、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、又は約２４ヌクレオチド長であり、その３’末端に２塩基のオーバーハングを有する。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：１９，１９９８、並びに米国特許第７，７３２，４１７号、同第８，２０２，８４６号、及び同第８，３８３，５９９号に更に記載されている（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0131】

ＩＩ．Ａ．６ アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
いくつかの態様において、細胞におけるＨＭＧＣＲ及び／若しくはＳＲＥＢＦ２遺伝子、並びに／又はＨＭＧＣＲ及び／若しくはＳＲＥＢＦ２タンパク質の発現を減少させるために使用することができる遺伝子編集ツールは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＳＯ」とは、標的核酸（特に、標的核酸上の連続した配列）にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子（すなわち、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２）の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがって、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。

【0132】

いくつかの態様において、本開示に有用なＡＳＯは、一本鎖である。本開示の一本鎖オリゴヌクレオチドは、イントラ又はインター自己相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって約５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができることが理解される。いくつかの態様において、本開示に有用なＡＳＯは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含むことができる。ＡＳＯに対して行われ得る追加の改変（例えば、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２の遺伝子発現を阻害又は低減するために使用され得るものなど）は、例えば、米国公開第２０１９／０２７５１４８Ａ１号に提供されている。

【0133】

いくつかの態様において、ＡＳＯは、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２転写物（例えば、ｍＲＮＡ）のヌクレアーゼ媒介分解を介して、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２タンパク質の発現を減少させることができ、ＡＳＯは、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ１などのＲＮａｓｅ Ｈ）を動員することができる。ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を加水分解する遍在的な酵素である。したがって、ある特定の態様において、一旦標的配列（例えば、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２ ｍＲＮＡ）に結合すると、ＡＳＯは、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２ ｍＲＮＡの分解を誘導し、それによって、ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２タンパク質の発現を減少させることができる。

【0134】

本明細書に開示されるように、遺伝子編集ツールの上記の例は、限定することを意図するものではなく、当該技術分野で利用可能な任意の遺伝子編集ツールを使用して、ＨＭＧＣＲ及び／若しくはＳＲＥＢＦ２遺伝子、並びに／又はＨＭＧＣＲ及び／若しくはＳＲＥＢＦ２タンパク質の発現を低減又は阻害することができる。

【0135】

ＩＩＢ．タンパク質阻害剤
１つ以上のタンパク質阻害剤（例えば、小分子ＨＭＧＣＲ及び／又はＳＲＥＢＦ２阻害剤）は、本開示の産生細胞から産生される細胞外小胞の数を増加させる方法及び細胞外小胞を産生する方法において使用され得る。

【0136】

いくつかの態様において、本開示で使用され得るタンパク質阻害剤ツールは、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）を含む。ＰＲＯＴＡＣは、標的タンパク質に結合するリガンド、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合するリガンド、及びこれらの２つのリガンドをコンジュゲートするためのリンカーの３つの化学要素を有するヘテロ二官能性小分子である。ＰＲＯＴＡＣは、ユビキチン－プロテアソームシステムを介して標的タンパク質を分解する化学的ノックダウン戦略である。従来の阻害剤の競合及び占有駆動型プロセスとは異なり、ＰＲＯＴＡＣは、その作用様式において触媒作用を有し、低曝露で標的タンパク質分解を促進することができる。更に、従来の低分子阻害剤は、通常、標的の酵素活性を阻害するが、ＰＲＯＴＡＣは、タンパク質の酵素活性だけでなく、タンパク質全体を分解することによって非酵素活性にも影響する。

【0137】

いくつかの態様において、ＰＲＯＴＡＣは、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ，２０２１；１１（５）：１３００－１３１４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンド（例えば、ＶＨＬ、ＣＲＢＮ、ｃＩＡＰ、及びＭＤＭ２）に連結されたスタチン（例えば、ＨＭＧＣＲリガンド）を含む。いくつかの態様において、ＰＲＯＴＡＣは、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０２０，６３，９，４９０８－４９２８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＨＭＣＧＲを分解する。

【0138】

いくつかの態様において、タンパク質阻害剤は、カリプラジンを含む。

【0139】

ＩＩＩ．細胞外小胞（例えば、エクソソーム）
本明細書において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生する方法が開示される。本方法は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の産生収率を改善する。

【0140】

いくつかの態様において、産生細胞によって産生されるＥＶ（例えば、本明細書に記載のＥＶ産生を増加させる方法及びＥＶを産生する方法）は、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能が低下していない産生細胞によって産生されるＥＶと比較して、ＥＶ当たりのコレステロール含有量が低下している。いくつかの態様において、ＥＶ当たりのコレステロール含有量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、又は約８０％低下する。いくつかの態様において、ＥＶ当たりのコレステロール含有量は、約１％～約８０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約１０％～約２０％、約２０％～約８０％、約２０％～約７０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約２０％～約３０％、約３０％～約８０％、約３０％～約７０％、約３０％～約６０％、約３０％～約５０％、約３０％～約４０％、約４０％～約８０％、約４０％～約７０％、約４０％～約６０％、又は約４０％～約５０％低下する。

【0141】

本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、約２０～３００ｎｍの間の直径を有する細胞外小胞である。いくつかの態様において、本明細書に記載の産生細胞から得られるＥＶのサイズ（例えば、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を有する）は、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を有しない産生細胞から産生されるＥＶと比較して、平均サイズに差がない。ある特定の態様において、本開示のエクソソームは、約２０～２９０ｎｍ、２０～２８０ｎｍ、２０～２７０ｎｍ、２０～２６０ｎｍ、２０～２５０ｎｍ、２０～２４０ｎｍ、２０～２３０ｎｍ、２０～２２０ｎｍ、２０～２１０ｎｍ、２０～２００ｎｍ、２０～１９０ｎｍ、２０～１８０ｎｍ、２０～１７０ｎｍ、２０～１６０ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１４０ｎｍ、２０～１３０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２０～１１０ｎｍ、２０～１００ｎｍ、２０～９０ｎｍ、２０～８０ｎｍ、２０～７０ｎｍ、２０～６０ｎｍ、２０～５０ｎｍ、２０～４０ｎｍ、２０～３０ｎｍ、３０～３００ｎｍ、３０～２９０ｎｍ、３０～２８０ｎｍ、３０～２７０ｎｍ、３０～２６０ｎｍ、３０～２５０ｎｍ、３０～２４０ｎｍ、３０～２３０ｎｍ、３０～２２０ｎｍ、３０～２１０ｎｍ、３０～２００ｎｍ、３０～１９０ｎｍ、３０～１８０ｎｍ、３０～１７０ｎｍ、３０～１６０ｎｍ、３０～１５０ｎｍ、３０～１４０ｎｍ、３０～１３０ｎｍ、３０～１２０ｎｍ、３０～１１０ｎｍ、３０～１００ｎｍ、３０～９０ｎｍ、３０～８０ｎｍ、３０～７０ｎｍ、３０～６０ｎｍ、３０～５０ｎｍ、３０～４０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、４０～２９０ｎｍ、４０～２８０ｎｍ、４０～２７０ｎｍ、４０～２６０ｎｍ、４０～２５０ｎｍ、４０～２４０ｎｍ、４０～２３０ｎｍ、４０～２２０ｎｍ、４０～２１０ｎｍ、４０～２００ｎｍ、４０～１９０ｎｍ、４０～１８０ｎｍ、４０～１７０ｎｍ、４０～１６０ｎｍ、４０～１５０ｎｍ、４０～１４０ｎｍ、４０～１３０ｎｍ、４０～１２０ｎｍ、４０～１１０ｎｍ、４０～１００ｎｍ、４０～９０ｎｍ、４０～８０ｎｍ、４０～７０ｎｍ、４０～６０ｎｍ、４０～５０ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２９０ｎｍ、５０～２８０ｎｍ、５０～２７０ｎｍ、５０～２６０ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、５０～２４０ｎｍ、５０～２３０ｎｍ、５０～２２０ｎｍ、５０～２１０ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１９０ｎｍ、５０～１８０ｎｍ、５０～１７０ｎｍ、５０～１６０ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、５０～１４０ｎｍ、５０～１３０ｎｍ、５０～１２０ｎｍ、５０～１１０ｎｍ、５０～１００ｎｍ、５０～９０ｎｍ、５０～８０ｎｍ、５０～７０ｎｍ、５０～６０ｎｍ、６０～３００ｎｍ、６０～２９０ｎｍ、６０～２８０ｎｍ、６０～２７０ｎｍ、６０～２６０ｎｍ、６０～２５０ｎｍ、６０～２４０ｎｍ、６０～２３０ｎｍ、６０～２２０ｎｍ、６０～２１０ｎｍ、６０～２００ｎｍ、６０～１９０ｎｍ、６０～１８０ｎｍ、６０～１７０ｎｍ、６０～１６０ｎｍ、６０～１５０ｎｍ、６０～１４０ｎｍ、６０～１３０ｎｍ、６０～１２０ｎｍ、６０～１１０ｎｍ、６０～１００ｎｍ、６０～９０ｎｍ、６０～８０ｎｍ、６０～７０ｎｍ、７０～３００ｎｍ、７０～２９０ｎｍ、７０～２８０ｎｍ、７０～２７０ｎｍ、７０～２６０ｎｍ、７０～２５０ｎｍ、７０～２４０ｎｍ、７０～２３０ｎｍ、７０～２２０ｎｍ、７０～２１０ｎｍ、７０～２００ｎｍ、７０～１９０ｎｍ、７０～１８０ｎｍ、７０～１７０ｎｍ、７０～１６０ｎｍ、７０～１５０ｎｍ、７０～１４０ｎｍ、７０～１３０ｎｍ、７０～１２０ｎｍ、７０～１１０ｎｍ、７０～１００ｎｍ、７０～９０ｎｍ、７０～８０ｎｍ、８０～３００ｎｍ、８０～２９０ｎｍ、８０～２８０ｎｍ、８０～２７０ｎｍ、８０～２６０ｎｍ、８０～２５０ｎｍ、８０～２４０ｎｍ、８０～２３０ｎｍ、８０～２２０ｎｍ、８０～２１０ｎｍ、８０～２００ｎｍ、８０～１９０ｎｍ、８０～１８０ｎｍ、８０～１７０ｎｍ、８０～１６０ｎｍ、８０～１５０ｎｍ、８０～１４０ｎｍ、８０～１３０ｎｍ、８０～１２０ｎｍ、８０～１１０ｎｍ、８０～１００ｎｍ、８０～９０ｎｍ、９０～３００ｎｍ、９０～２９０ｎｍ、９０～２８０ｎｍ、９０～２７０ｎｍ、９０～２６０ｎｍ、９０～２５０ｎｍ、９０～２４０ｎｍ、９０～２３０ｎｍ、９０～２２０ｎｍ、９０～２１０ｎｍ、９０～２００ｎｍ、９０～１９０ｎｍ、９０～１８０ｎｍ、９０～１７０ｎｍ、９０～１６０ｎｍ、９０～１５０ｎｍ、９０～１４０ｎｍ、９０～１３０ｎｍ、９０～１２０ｎｍ、９０～１１０ｎｍ、９０～１００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１１０～２９０ｎｍ、１２０～２８０ｎｍ、１３０～２７０ｎｍ、１４０～２６０ｎｍ、１５０～２５０ｎｍ、１６０～２４０ｎｍ、１７０～２３０ｎｍ、１８０～２２０ｎｍ、又は１９０～２１０ｎｍの直径を有する。本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）のサイズは、当該技術分野で既知の方法に従って測定され得る。

【0142】

いくつかの態様において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、内部（内腔）表面及び外部表面を含む二重脂質膜（「ＥＶ（例えば、エクソソーム）、膜」）を含む。ある特定の態様において、内部（内腔）表面は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内部コア（すなわち、内腔）に面する。ある特定の態様において、外部表面は、産生細胞又は標的細胞のエンドソーム、多小胞体、又は膜／細胞質と接触し得る。

【0143】

いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、脂質及び脂肪酸を含む。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。

【0144】

いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜は、内側リーフレット及び外側リーフレットを含む。内側及び外側リーフレットの組成物は、当技術分野で既知の経二重層分布アッセイ（ｔｒａｎｓｂｉｌａｙｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）によって決定することができ、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８５ ８１９：１７０を参照されたい。いくつかの態様において、外側リーフレットの組成物は、およそ７０～９０％のコリンリン脂質、およそ０～１５％の酸性リン脂質、及びおよそ５～３０％のホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの態様において、内側リーフレットの組成物は、およそ１５～４０％のコリンリン脂質、およそ１０～５０％の酸性リン脂質、及びおよそ３０～６０％のホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、約４０％～約６０％のコレステロールを含む。いくつかの態様において、産生細胞によって産生されるＥＶは、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能が低下していない産生細胞によって産生されるＥＶと比較して、ＥＶ当たりのコレステロール含有量が低下している。

【0145】

いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）膜は、グリカンのような１つ以上の多糖類を更に含む。

【0146】

いくつかの態様において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＩＬ－１２部分を含み、ＩＬ－１２部分が、ＥＶの外部表面上又はＥＶの内腔表面上のいずれかで、足場部分を介してＥＶに連結される。

【0147】

いくつかの態様において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＶの内腔にＩＬ－１２部分を含む。他の態様において、ＥＶは、ＥＶの外部表面にＩＬ－１２部分を含み、任意選択的に、第１の足場部分（例えば、足場Ｘ）を介して連結される。他の態様において、ＥＶは、任意選択的に、足場部分（例えば、足場Ｘ又は足場Ｙ）を介して連結される、ＥＶの内腔表面上のＩＬ－１２部分を含む。

【0148】

ＩＩＩ．Ａ．足場部分
１つ以上の足場部分を使用して、ＩＬ－１２部分を本開示のＥＶに固定することができる。いくつかの態様において、ＩＬ－１２部分は、足場部分に連結される。いくつかの態様において、ＥＶは、２つ以上の足場部分を含む。いくつかの態様において、ＩＬ－１２は、第１の足場部分に連結され、第２の部分（例えば、第２のポリペプチド又はポリヌクレオチド）は、第２の足場部分に連結される。いくつかの態様において、第１の足場部分及び第２の足場部分は、同じタイプの足場部分であり、例えば、第１及び第２の足場部分は、両方とも足場Ｘタンパク質である。いくつかの態様において、第１の足場部分及び第２の足場部分は、異なる種類の足場部分であり、例えば、第１の足場部分は、足場Ｙタンパク質であり、第２の足場部分は、足場Ｘタンパク質である。いくつかの態様において、第１の足場部分は、本明細書に開示される足場Ｙである。いくつかの態様において、第１の足場部分は、本明細書に開示される足場Ｘである。いくつかの態様において、第２の足場部分は、本明細書に開示される足場Ｙである。いくつかの態様において、第２の足場部分は、本明細書に開示される足場Ｘである。

【0149】

いくつかの態様において、ＥＶは、例えば、ｎＩＬ－１２部分をＥＶ（例えば、エクソソーム）に（例えば、内腔表面上又は外部表面上のいずれかで）固定することができる１つ以上の足場部分を含む。ある特定の態様において、足場部分は、ポリペプチド（「足場タンパク質」）である。ある特定の態様において、足場タンパク質は、エクソソームタンパク質又はその断片を含む。他の態様において、足場部分は、非ポリペプチド部分である。いくつかの態様において、足場タンパク質には、エクソソーム膜上に濃縮されている、膜貫通タンパク質、内在性タンパク質、及び表在性タンパク質などの様々な膜タンパク質が含まれる。それらは、様々なＣＤタンパク質、トランスポーター、インテグリン、レクチン、及びカドヘリンを含み得る。ある特定の態様において、足場部分（例えば、足場タンパク質）は、足場Ｘを含む。他の態様において、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質）は、足場Ｙを含む。更なる態様において、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質）は、足場Ｘ及び足場Ｙの両方を含む。

【0150】

いくつかの態様において、ＩＬ－１２部分は、ＥＶの外部表面上の足場部分（例えば、足場Ｘ）に連結される。いくつかの態様において、ＩＬ－１２部分は、ＥＶの内腔表面上の足場部分（例えば、足場Ｘ）に連結される。いくつかの態様において、ＩＬ－１２部分は、ＥＶの内腔表面上の足場部分（例えば、足場Ｙ）に連結される。

【0151】

ＩＩＩ．Ａ．１．足場Ｘ操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）
いくつかの態様において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、その組成物に改変された膜を含む。例えば、それらの膜組成物は、タンパク質、脂質、又は膜のグリカン含有量を変化させることによって改変することができる。

【0152】

いくつかの態様において、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＰＥＧ誘導融合及び／又は超音波融合のような化学的及び／又は物理的方法により生成される。他の態様において、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、遺伝子操作によって生成される。遺伝子改変産生細胞又は遺伝子改変細胞の子孫から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、改変された膜組成物を含み得る。いくつかの態様において、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質、例えば、足場Ｘ）をより高密度若しくはより低密度（例えば、より高い数）で有するか、又は足場部分のバリアント若しくは断片を含む。

【0153】

例えば、表面（例えば、足場Ｘ）操作されたＥＶは、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質、例えば、足場Ｘ）をコードする外因性配列、又はそのバリアント若しくは断片で形質転換された細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）から産生され得る。外因性配列から発現された足場部分を含むＥＶは、改変された膜組成物を含み得る。

【0154】

足場部分の様々な修飾又は断片を、本開示の態様に使用することができる。例えば、結合剤に対する増強された親和性を有するように改変された足場部分は、結合剤を使用して精製され得る表面操作されたＥＶを生成するために使用することができる。ＥＶ及び／又は膜をより効果的に標的化するように改変された足場部分を使用することができる。エクソソーム膜への特異的かつ効果的な標的化に必要とされる最小限の断片を含むように改変された足場部分も使用することができる。

【0155】

足場部分は、融合分子、例えば、足場ＸのＩＬ－１２部分への融合分子として発現されるように操作することができる。例えば、融合分子は、ＩＬ－１２部分に連結された本明細書に開示される足場部分（例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、又はその断片若しくはバリアント）を含み得る。

【0156】

いくつかの態様において、本明細書に記載の表面（例えば、足場Ｘ）操作されたＥＶは、当該技術分野で既知のＥＶと比較して、優れた特徴を示す。例えば、表面（例えば、足場Ｘ）操作は、天然に存在するＥＶ又は従来のエクソソームタンパク質を使用して産生されるＥＶよりも、それらの表面により高度に濃縮された改変タンパク質を含む。更に、本開示の表面（例えば、足場Ｘ）操作されたＥＶは、天然に存在するＥＶ又は従来のエクソソームタンパク質を使用して産生されるＥＶと比較して、より大きな、より特異的な、又はより制御された生物学的活性を有することができる。

【0157】

いくつかの態様において、足場Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体負の調節因子（ＰＴＧＦＲＮポリペプチド）を含む。ＰＴＧＦＲＮタンパク質は、ＣＤ９パートナー１（ＣＤ９Ｐ－１）、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質Ｆ（ＥＷＩ－Ｆ）、プロスタグランジンＦ２－α受容体調節タンパク質、プロスタグランジンＦ２－α受容体関連タンパク質、又はＣＤ３１５とも称され得る。ヒトＰＴＧＦＲＮタンパク質の全長アミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｐ２Ｂ２）は、配列番号１として表３に示されている。ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチド（配列番号１のアミノ酸１～２５）、細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２６～８３２）、膜貫通ドメイン（配列番号１のアミノ酸８３３～８５３）、及び細胞質ドメイン（配列番号１のアミノ酸８５４～８７９）を含む。成熟ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチドを伴わない配列番号１（すなわち、配列番号１のアミノ酸２６～８７９）からなる。いくつかの態様において、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。他の態様において、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインと、（ｉ）膜貫通ドメインのＮ末端に、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１１０個、少なくとも１２０個、少なくとも１３０個、少なくとも１４０個、少なくとも１５０個のアミノ酸、（ｉｉ）膜貫通ドメインのＣ末端に、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、若しくは少なくとも２５個のアミノ酸、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方と、を含む。

【0158】

いくつかの態様において、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの断片は、ＩｇＶなどの１つ以上の機能ドメイン又は構造ドメインを欠く。

【0159】

いくつかの実施形態において、足場タンパク質は、配列番号２６（ＭＡＲＫＳ）、配列番号８７９（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、又は配列番号１（ＢＡＳＰ１）と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の態様において、足場Ｘは、配列番号１と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の態様において、足場Ｘは、配列番号３３と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の態様において、足場Ｘは、１個のアミノ酸変異、２個のアミノ酸変異、３個のアミノ酸変異、４個のアミノ酸変異、５個のアミノ酸変異、６個のアミノ酸変異、又は７個のアミノ酸変異を除いて、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様において、足場Ｘは、配列番号３３のアミノ酸配列と、配列番号３３のＮ末端及び／又はＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、又は２０個のアミノ酸、又はそれ以上長いアミノ酸と、を含む。

【表3】

【0160】

他の足場Ｘタンパク質の非限定的な例は、２０１９年２月５日に発行された米国特許第ＵＳ１０１９５２９０Ｂ１号（参照によりその全体が組み込まれる）に見出すことができる。

【0161】

いくつかの態様において、配列は、天然タンパク質のＮ末端から、少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、又は８００個のアミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。いくつかの態様において、配列は、天然タンパク質のＣ末端から、少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、又は８００個のアミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。いくつかの態様において、配列は、天然タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方から、少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、又は８００個のアミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。いくつかの態様において、配列は、天然タンパク質の１つ以上の機能ドメイン又は構造ドメインを欠く足場部分の断片をコードする。

【0162】

いくつかの態様において、足場部分（例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）は、１つ以上の異種タンパク質に連結される。１つ以上の異種タンパク質は、足場部分のＮ末端に連結され得る。１つ以上の異種タンパク質は、足場部分のＣ末端に連結され得る。いくつかの態様において、１つ以上の異種タンパク質は、１つ以上の異種タンパク質は、足場部分のＮ末端及びＣ末端の両方に連結され得る。いくつかの態様において、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの態様において、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。

【0163】

いくつかの態様において、足場Ｘを使用して、任意の部分（例えば、ＩＬ－１２部分）を、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面及び外部表面に同時に連結することができる。例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドを使用して、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の外部表面に加えて、内腔内（例えば、内腔表面上）のＩＬ－１２部分を連結することができる。いくつかの態様において、足場Ｘは、ＥＶの内腔表面上及び／又はＥＶの外部表面上にＩＬ－１２を固定することができる足場タンパク質である。

【0164】

ＩＩＩ．Ａ．２．足場Ｙ操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）
いくつかの態様において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、天然に存在するＥＶのものとは異なる内部空間（すなわち、内腔）を含む。例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面における組成が、天然に存在するエクソソームのタンパク質、脂質、又はグリカン含有量とは異なるように、ＥＶを変化させることができる。

【0165】

いくつかの態様において、操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質、例えば、足場Ｙ）又はＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面の組成若しくは含有量を変化させる足場部分の改変若しくは断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞から産生され得る。ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面に発現され得るエクソソームタンパク質の様々な改変又は断片は、本開示の態様に使用することができる。

【0166】

いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面を変化させることができるエクソソームタンパク質には、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）タンパク質、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

【0167】

いくつかの態様において、足場Ｙは、ＭＡＲＣＫＳタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９９６６）を含む。ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、プロテインキナーゼＣ基質、８０ｋＤａタンパク質、軽鎖としても知られている。全長ヒトＭＡＲＣＫＳタンパク質は、３３２アミノ酸長であり、アミノ酸残基１５２～１７６にカルモジュリン結合ドメインを含む。いくつかの態様において、足場Ｙは、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９００６）を含む。ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ様タンパク質１、及びマクロファージミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質としても知られている。全長ヒトＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、１９５アミノ酸長である。ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、アミノ酸残基８７～１１０における脂質結合及びカルモジュリン結合に関与するエフェクタードメインを有する。いくつかの態様において、足場Ｙは、ＢＡＳＰ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ８０７２３）を含む。ＢＡＳＰ１タンパク質は、２２ｋＤａ神経組織リッチ酸性タンパク質又は神経軸索膜タンパク質ＮＡＰ－２２としても知られている。全長ヒトＢＡＳＰ１タンパク質配列（異性体１）は、２２７アミノ酸長である。選択的スプライシングによって産生される異性体は、配列番号４９（異性体１）からアミノ酸８８～１４１を欠いている。表４は、本明細書に開示される例示的な足場Ｙ（すなわち、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１タンパク質）の全長配列を提供する。

【表4】

【0168】

成熟ＢＡＳＰ１タンパク質配列は、配列番号４９からの最初のＭｅｔを欠いており、したがって、配列番号４９のアミノ酸２～２２７を含む。

【0169】

他の態様において、本開示に有用な足場Ｙは、配列番号４９のアミノ酸２～２２７と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様において、本開示に有用な足場Ｙは、１個のアミノ酸変異、２個のアミノ酸変異、３個のアミノ酸変異、４個のアミノ酸変異、５個のアミノ酸変異、６個のアミノ酸変異、又は７個のアミノ酸変異を除いて、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。

【0170】

いくつかの態様において、配列番号４９のアミノ酸残基１にＭｅｔがない配列番号４９のタンパク質配列は、本開示の足場Ｙ（例えば、ＩＬ－１２部分に連結された足場部分）であるのに十分である。いくつかの態様において、足場Ｙは、配列番号４９のアミノ酸残基１のＭｅｔがない配列番号４９と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0171】

本明細書に記載の足場Ｙ操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、配列番号４９のアミノ酸残基１のＭｅｔがない配列番号４９に示される配列で形質転換された細胞から産生され得る。

【0172】

いくつかの態様において、本開示に有用な足場Ｙタンパク質は、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」（ＥＤ）を含み、ＮＤ及び／又はＥＤは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面と会合している。いくつかの態様において、本開示に有用な足場Ｙタンパク質は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインを含み、細胞内ドメインは、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」（ＥＤ）を含み、ＮＤ及び／又はＥＤは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面と会合している。本明細書で使用される場合、「と会合している」という用語は、膜成分への共有結合を伴わない、足場タンパク質とＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面との間の相互作用を指す。例えば、本開示に有用な足場は、例えば、脂質アンカー（例えば、ミリスチン酸）、及び／又は膜リン脂質の負に帯電した頭部と静電気的に相互作用する多塩基性ドメインを介して、ＥＶの内腔表面と会合し得る。他の態様において、足場タンパク質Ｙは、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ＮＤは、ＥＶの内腔表面と会合し、ＥＤは、イオン相互作用によってＥＶの内腔表面と会合し、ＥＤは、配列において少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個の連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む。

【0173】

他の態様において、足場タンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ＮＤは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面と会合し、ＥＤは、イオン相互作用によってＥＶの内腔表面と会合し、ＥＤは、配列において少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個の連続した塩基性アミノ酸（例えば、リジン（Ｌｙｓ））を含む。

【0174】

いくつかの態様において、ＮＤは、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面と、脂質化を介して、例えば、ミリストイル化を介して会合する。いくつかの態様において、ＮＤは、Ｎ末端にＧｌｙを有する。いくつかの態様において、Ｎ末端Ｇｌｙは、ミリストイル化されている。

【0175】

いくつかの態様において、ＥＤは、イオン相互作用によってＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面と会合する。いくつかの態様において、ＥＤは、静電相互作用、特に、誘引性の静電相互作用によって、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔表面に会合している。

【0176】

いくつかの態様において、ＥＤは、（ｉ）塩基性アミノ酸（例えば、リジン）、又は（ｉｉ）ポリペプチド配列において互いに隣接する２つ以上の塩基性アミノ酸（例えば、リジン）を含む。いくつかの態様において、塩基性アミノ酸は、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。いくつかの態様において、塩基性アミノ酸は、（Ｌｙｓ）ｎであり、式中、ｎは、１～１０の整数である。

【0177】

他の態様において、ＥＤは、少なくとも１つのリジンを含み、ＥＤのＮ末端がＮＤのＣ末端でリジンに直接連結されている場合、ＮＤはＣ末端でリジンを含み、すなわち、リジンはＥＤのＮ末端にあり、ＮＤのＣ末端でリジンに融合されている。他の態様において、ＥＤのＮ末端がリンカー（例えば、１つ以上のアミノ酸）によってＮＤのＣ末端に連結されている場合、ＥＤは、少なくとも２個のリジン、少なくとも３個のリジン、少なくとも４個のリジン、少なくとも５個のリジン、少なくとも６個のリジン、又は少なくとも７個のリジンを含む。

【0178】

本開示に有用な足場Ｙタンパク質の非限定的な例は、国際公開第ＷＯ／２０１９／０９９９４２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

【0179】

いくつかの態様において、本開示に有用な足場Ｙタンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含まない。いくつかの態様において、足場Ｙタンパク質は、足場タンパク質のＮ末端に脂質アンカーとして機能する脂質化アミノ酸（例えば、ミリストイル化アミノ酸）を含む。いくつかの態様において、足場タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基は、Ｇｌｙである。Ｎ末端Ｇｌｙの存在は、Ｎ－ミリストイル化の絶対要件である。いくつかの態様において、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、合成である。いくつかの態様において、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、グリシン類似体、例えば、アリルグリシン、ブチルグリシン、又はプロパルギルグリシンである。

【0180】

他の態様において、脂質アンカーは、当該技術分野で既知の任意の脂質アンカー、例えば、パルミチン酸又はグリコシルホスファチジルイノシトールであり得る。まれな状況下では、例えば、ミリスチン酸が制限されている培養培地を使用することによって、短鎖及び不飽和を含むいくつかの他の脂肪酸が、Ｎ末端グリシンに取り付けられ得る。例えば、ＢＫチャネルにおいて、ミリスチン酸塩は、ヒドロキシエステル結合を介して内部セリン／トレオニン又はチロシン残基に翻訳後に取り付けられることが報告されている。以下の表に、当該技術分野で既知の膜アンカーを提示する：

【表5】

【0181】

ＩＩＩ．Ｂ．リンカー
上に記載したように、本開示の細胞外小胞（ＥＶ）（例えば、エクソソーム）は、目的の分子（例えば、ペイロード、例えば、ＩＬ－１２部分）をＥＶ（例えば、外部表面又は内腔表面上）に連結する１つ以上のリンカーを含むことができる。いくつかの態様において、ペイロード（例えば、生物学的に活性な分子）は、ＥＶに直接的に、又は足場部分（例えば、足場Ｘ又は足場Ｙ）を介して連結される。ある特定の態様において、ペイロード（例えば、生物学的に活性な分子）は、リンカーによって足場部分に連結される。ある特定の態様において、ペイロード（例えば、生物学的に活性な分子）は、リンカーによって第２の足場部分に連結される。

【0182】

ある特定の態様において、ペイロード（例えば、生物学的に活性な分子）は、足場Ｘを介してエクソソームの外部表面に連結される。更なる態様において、ペイロード（例えば、生物学的に活性な分子）は、足場Ｘ又は足場Ｙを介してエクソソームの内腔表面に連結される。リンカーは、当該技術分野で既知の任意の化学的部分であり得る。

【0183】

いくつかの態様において、２つ以上のリンカーは、直列に連結し得る。複数のリンカーが存在する場合、各リンカーは、同じであっても、異なっていてもよい。概して、リンカーは、柔軟さを提供する、又は立体障害を予防／改善する。リンカーは、典型的には切断されないが、ある特定の態様において、そのような切断が望ましい場合がある。したがって、いくつかの態様において、リンカーは、１つ以上のプロテアーゼ切断可能部位を含み得、それはリンカーの配列内に位置し得るか、リンカー配列のいずれかの末端でリンカーに隣接し得る。

【0184】

いくつかの態様において、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、少なくとも約６５個、少なくとも約７０個、少なくとも約７５個、少なくとも約８０個、少なくとも約８５個、少なくとも約９０個、少なくとも約９５個、又は少なくとも約１００個のアミノ酸を含むことができる。

【0185】

いくつかの態様において、ペプチドリンカーは合成、すなわち非天然発生である。一態様において、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直鎖配列を、天然に連結されていないか又は天然では遺伝的に融合されていないアミノ酸の第２の直鎖配列に、連結又は遺伝子的に融合するアミノ酸配列を含む、ペプチド（又はポリペプチド）（例えば、天然に存在する又は非天然に存在するペプチド）を含む。例えば、一態様において、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変形態である（例えば、付加、置換、又は欠失などの変異を含む）天然に存在しないポリペプチドを含み得る。

【0186】

いくつかの態様において、リンカーは、非ポリペプチド部分である。

【0187】

リンカーは、切断を受けやすく（「切断可能なリンカー」）、それによって、生物学的に活性分子（例えば、ＩＬ－１２部分）の放出を促進することができる。

【0188】

いくつかの態様において、リンカーは、「還元感受性リンカー」である。いくつかの態様において、還元感受性リンカーは、ジスルフィド結合を含有する。いくつかの態様において、リンカーは「酸に不安定なリンカー」である。いくつかの態様において、酸に不安定なリンカーは、ヒドラゾンを含有する。好適な酸に不安定なリンカーにはまた、例えば、シスアコニットリンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、又はこれらの任意の組み合わせも含まれる。

【0189】

いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーを含む。

【0190】

ＩＩＩ．Ｃ．治療剤
いくつかの態様において、本明細書に記載されるＥＶは、少なくとも１つの治療剤又は生物学的活性分子を更に含むことができる。いくつかの態様において、治療剤は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）、小分子、増殖因子、抗原、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＰＲＯＴＡＣ、アジュバント、免疫調節剤、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

【0191】

いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の機能を調節する。いくつかの態様において、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６核酸（例えば、ＳＴＡＴ６プレｍＲＮＡ及びＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡを含むＳＴＡＴ６転写物）などの哺乳動物ＳＴＡＴ６をコードする核酸分子（例えば、ＷＯ２０２１／０３０７７６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）の機能、又は哺乳動物ＳＴＡＴ６をコードするかかる核酸分子の天然に存在するバリアントの機能を調節する。いくつかの態様において、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３核酸（例えば、ＳＴＡＴ３プレｍＲＮＡ及びＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを含むＳＴＡＴ３転写物）などの哺乳動物ＳＴＡＴ３をコードする核酸分子（例えば、ＷＯ２０２１／０３０７６８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）の機能、又は哺乳動物ＳＴＡＴ３をコードするかかる核酸分子の天然に存在するバリアントの機能を調節する。いくつかの態様において、ＡＳＯは、ＣＥＢＰ／ｂ核酸（例えば、ＣＥＢＰ／ｂプレｍＲＮＡ及びＣＥＢＰ／ｂ ｍＲＮＡを含むＣＥＢＰ／ｂ転写物）などの哺乳動物ＣＥＢＰ／ｂをコードする核酸分子（例えば、ＷＯ２０２１／０３０７８０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）の機能、又は哺乳動物ＣＥＢＰ／ｂをコードするかかる核酸分子の天然に存在するバリアントの機能を調節する。いくつかの態様において、ＡＳＯは、ＮＲＡＳ核酸（例えば、ＮＲＡＳプレｍＲＮＡ及びＮＲＡＳ ｍＲＮＡを含むＮＲＡＳ転写物）などの哺乳動物ＮＲＡＳをコードする核酸分子（例えば、ＷＯ２０２１／０３０７６９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）の機能、又は哺乳動物ＮＲＡＳをコードするかかる核酸分子の天然に存在するバリアントの機能を調節する。いくつかの態様において、ＡＳＯは、ＫＲＡＳ核酸（例えば、ＫＲＡＳプレｍＲＮＡ及びＫＲＡＳ ｍＲＮＡを含むＫＲＡＳ転写物）などの哺乳動物ＫＲＡＳをコードする核酸分子（例えば、ＷＯ２０２１／０３０７８１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）の機能、又は哺乳動物ＫＲＡＳをコードする、かかる核酸分子の天然に存在するバリアントの機能を調節する。本開示の文脈における「ＡＳＯ」という用語は、２つ以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を指す。

【0192】

いくつかの態様において、治療剤は、ＷＯ２０１９／１８３５７８に記載されているように、ＳＴＩＮＧアゴニストを含む。

【0193】

いくつかの態様において、本開示は、疾患若しくは障害を治療又は予防する方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象に、本明細書に開示される細胞外小胞を投与することを含む。本開示はまた、本明細書に記載の細胞外小胞を使用して、それを必要とする対象における疾患又は状態を治療又は予防することを提供する。いくつかの態様において、本開示は、疾患又は状態の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行うための、本明細書に記載の細胞外小胞を提供する。

【0194】

ＩＶ．産生細胞
本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、インビトロで増殖した細胞又は対象の体液から産生することができる。エクソソームがインビトロ細胞培養から産生される場合、様々な産生細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ２Ｃ１２、及びＭＳＣを使用することができる。いくつかの態様において、産生細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、肥満細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又はＣ２Ｃ１２細胞から選択することができる。いくつかの態様において、産生細胞は、幹細胞である。

【0195】

産生細胞は、本明細書に記載されるように、コレステロール生合成経路における遺伝子及び／又はタンパク質機能を低下させるように遺伝的及び／又は薬理学的に改変され得る。いくつかの態様において、改変された産生細胞は、本明細書に記載されるＥＶを産生するタンパク質をコードする外因性配列を含むように（例えば、遺伝的に）更に改変され得る。遺伝子改変産生細胞は、一過性又は安定な形質転換によって外因性配列を含み得る。外因性配列は、プラスミドとして形質転換され得る。いくつかの態様において、外因性配列は、ベクターである。外因性配列は、産生細胞のゲノム配列に、標的化部位で、又はランダムな部位に、安定して組み込むことができる。いくつかの態様において、安定細胞株は、内腔操作されたエクソソームを産生するために生成される。

【0196】

外因性配列は、エクソソームタンパク質をコードする内因性配列の内部、上流（５’末端）、又は下流（３’末端）に位置する、産生細胞のゲノム配列に挿入され得る。当技術分野で既知の様々な方法を、産生細胞への外因性配列の導入のために使用することができる。例えば、様々な遺伝子編集法（例えば、相同組換え、トランスポゾン媒介システム、ｌｏｘＰ－Ｃｒｅシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＴＡＬＥＮを使用する方法）を使用して改変された細胞は、本開示の範囲内である。

【0197】

外因性配列は、本明細書に開示される足場部分又はその断片若しくはバリアントをコードする配列を含むことができる。足場部分をコードする配列の追加のコピーを導入して、本明細書に記載のエクソソームを産生することができる（例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面又は内腔表面上により高密度の足場部分を有する）。足場部分の改変又は断片をコードする外因性配列を導入して、足場部分の改変又は断片を含む内腔操作及び／又は表面操作されたエクソソームを生成することができる。

【0198】

いくつかの態様において、産生細胞は、タンパク質に連結された足場部分をコードする１つ以上のベクターで改変（例えば、トランスフェクト）され得る。

【0199】

いくつかの態様において、本明細書に開示される産生細胞は、追加の外因性配列を含むように更に改変される。例えば、追加の外因性配列は、内因性遺伝子の発現を調節するか、又はペイロード（例えば、ＩＬ－１２部分）としてのある特定のポリペプチドを含むエクソソームを産生するために導入され得る。いくつかの態様において、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変され、一方は、足場部分（例えば、足場Ｘ及び／又は足場Ｙ）又はそのバリアント若しくは断片をコードし、他方は、ペイロードをコードする。いくつかの態様において、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変され、一方は、本明細書に開示される足場部分又はそのバリアント若しくは断片をコードし、他方は、追加の機能性をエクソソームに付与するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、産生細胞は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個、又はそれ以上の追加の外因性配列を含むように更に改変される。

【0200】

いくつかの態様において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）（例えば、表面操作された及び／又は内腔操作されたエクソソーム）は、本明細書に開示される完全長の成熟した足場部分又はタンパク質（例えば、治療用タンパク質）に連結された足場部分をコードする配列で形質転換された細胞から産生され得る。本明細書に記載の足場部分のうちのいずれかは、プラスミド、ゲノムに挿入された外因性配列、又は合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの他の外因性核酸から発現され得る。

【0201】

いくつかの態様において、本開示は、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を示す、細胞外小胞（ＥＶ）産生細胞を含むバイオリアクターを提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、灌流バイオリアクターを使用して行われる。いくつかの態様において、バイオリアクターは、細胞保持デバイスに接続される。

【0202】

いくつかの態様において、産生細胞は、バイオリアクター（例えば、Ｗａｖｅバイオリアクター、撹拌槽バイオリアクター、振盪バイオリアクター）で培養することができる。バイオリアクターの様々な構成は、当該技術分野で既知であり、必要に応じて、好適な構成を選択することができる。いくつかの態様において、培養は、例えば、Ｎ－１若しくはＮ末端容器又はバイオリアクターで行われる。いくつかの態様において、培養容器は、フェッドバッチ又は灌流バイオリアクターである。いくつかの態様において、バイオリアクターは、セルセパレーターに接続される。例えば、中空繊維性膜（例えば、交互接線流濾過（ＡＴＦ）、接線流濾過（ＴＦＦ））、又は音響セルセパレーターなどの細胞保持デバイスに接続されたＮ末端生成容器（特に、撹拌槽バイオリアクター）を使用することができる。

【0203】

ＩＶ．細胞組成物
いくつかの態様において、本開示は、細胞外小胞（ＥＶ）を産生する改変された細胞を含む細胞組成物を提供し、改変された細胞は、コレステロール生合成経路における低下した遺伝子及び／又はタンパク質機能を有する。いくつかの態様において、低下した遺伝子及び／又はタンパク質（コレステロール生合成におけるタンパク質を含む）は、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－コエンザイムＡレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）、ステロール調節エレメント結合タンパク質２（ＳＲＥＢＦ２）、スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＬＥ）、若しくは７－デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＤＨＣＲ７）から選択される１つ以上の遺伝子、又はその遺伝子によってコードされるタンパク質を含む。

【0204】

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の方法で使用するための産生細胞を提供する。いくつかの態様において、産生細胞は、本明細書に記載の方法に従って調製される。

【0205】

Ｖ．薬学的組成物及び治療方法
明細書で提供されるのは、対象への投与に好適な形態で、所望の純度を有する本開示のＥＶ、例えば、エクソソーム、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、薬学的組成物である。薬学的に許容される賦形剤又は担体は、部分的には、投与される特定の組成物によって、並びに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、複数の細胞外小胞を含む薬学的組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．２１ｓｔ ｅｄ．（２００５）を参照されたい）薬学的組成物は、一般に滅菌されて製剤化され、かつ米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠する。

【0206】

いくつかの態様において、薬学的組成物は、本明細書に記載の１つ以上の治療剤及びエクソソームを含む。ある特定の態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、薬学的に許容される担体中の１つ以上の追加の治療剤と、同時投与される。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤の投与前に投与される。他の態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤の投与後に投与される。更なる態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤と同時に投与される。

【0207】

許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエント（例えば、動物又はヒト）に非毒性であり、これらには、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清、アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン金属錯体（例えば、亜鉛－タンパク質錯体）、及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

【0208】

担体又は希釈剤の例は、これらに限定されないが、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンを含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体又は化合物が本明細書に記載の細胞外小胞と互換性がない場合を除き、その組成物中における使用が企図される。補充治療薬は、組成物中へと組み込まれることもできる。典型的には、薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合性があるように製剤化される。ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、筋肉内経路、又は吸入剤として投与され得る。ある特定の実施形態において、エクソソームを含む薬学的組成物は、例えば、注射によって静脈内投与される。ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、任意選択的に、ＥＶ（例えば、エクソソーム）が意図された疾患、障害、又は状態を治療することに少なくとも部分的に有効である他の治療剤と組み合わせて投与され得る。

【0209】

非経口、皮内、皮下、又は局所用途に使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝液、並びに塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張度調整のための薬剤を含むことができる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムのような酸又は塩基で調整され得る。調製物は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、又はガラス製若しくはプラスチック製の複数回用量のバイアルに封入され得る。

【0210】

注射可能な使用に好適な薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与については、好適な担体は、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物は、概して滅菌され、容易に注射可能である程度の流体である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、並びにそれらの好適な混合物を含む、溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。所望の場合、等張化合物、例えば、糖、マニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールのようなポリアルコール、及び塩化ナトリウムは、組成物に添加されることができる。注射用組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。

【0211】

滅菌注射用溶液は、必要に応じて、本明細書に列挙される又は当該技術分野で既知の１つ以上の成分とともに、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を、有効量で、かつ適切な溶媒で組み込むことによって調製することができる。概して、分散液は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を、基本的な分散媒及び任意の所望の他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性薬剤及びその予め滅菌濾過された溶液から任意の追加の所望の成分の粉末を得る、高減圧乾燥及び冷凍乾燥（凍結乾燥）である。ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の持続放出又はパルス放出を可能にするような様式で製剤化され得る、デポー注射又はインプラント調製物の形態で投与され得る。

【0212】

エクソソームを含む組成物の全身投与は、経粘膜手段によることもできる。経粘膜投与のために、バリアに浸透するのに適した浸透剤が、製剤に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与用の、洗浄剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、鼻腔スプレーの使用を通じて達成されることができる。

【0213】

ある特定の態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物は、薬学的組成物の恩恵を受けるであろう対象に静脈内投与される。特定の他の態様において、組成物は、例えば、リンパ内注射若しくはリンパ節内注射（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０５（４６）：１７９０８（２００８）を参照されたい）、又は筋肉内注射、皮下注射、腫瘍内注射、胸腺若しくは肝臓への直接注射によってリンパ系に投与される。

【0214】

ある特定の態様において、エクソソームを含む薬学的組成物は、液体懸濁液として投与される。ある特定の態様において、薬学的組成物は、投与後にデポーを形成し得る製剤として投与される。ある特定の好ましい態様において、デポーは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を血液循環にゆっくり放出するか、又はデポー形態のままである。

【0215】

典型的には、薬学的に許容される組成物は、汚染物質を含まないように高度に精製され、生体適合性があり、毒性がなく、対象への投与に適している。水が担体の構成要素である場合、水は、汚染物質、例えば、エンドトキシンを含まないように高度に精製及び加工される。

【0216】

薬学的に許容される担体は、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／又は鉱物油であり得るが、これらに限定されない。薬学的組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、風味増強剤、乳化剤、懸濁剤及び／又は保存料を更に含み得る。

【0217】

本明細書に記載の薬学的組成物は、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）と、任意選択的に、薬学的に活性な薬剤又は治療剤と、を含む。治療薬は、生物学的薬、小分子薬、又は核酸約であり得る。

【0218】

本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む薬学的組成物が、提供される。いくつかの態様において、剤形は、静脈内注射用の液体懸濁液として製剤化される。いくつかの態様において、剤形は、腫瘍内注射用の液体懸濁液として製剤化される。

【0219】

ある特定の態様において、エクソソームの調製は、残留複製能力のある核酸を破壊するにために、例えば、Ｘ線、ガンマ線、ベータ粒子、アルファ粒子、中性子、陽子、元素核、ＵＶ線のような放射線を受ける。

【0220】

ある特定の態様において、エクソソームの調製物は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００超、又は１００ｋＧｙ超の照射線量を使用するガンマ照射に曝される。

【0221】

ある特定の態様において、エクソソームの調製物は、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００超、又は１００００ｍＳｖ超の照射線量を使用するＸ線照射に曝される。

【0222】

本開示はまた、疾患又は障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、本方法は、対象に、本明細書に開示される細胞外小胞を投与することを含む。

【実施例】

【0223】

実施例１
産生細胞からのＥＶ産生を改善することができるかどうかを決定するために、高スループットＥＶレポーターアセイを開発した。レポーターアッセイは、最小限に処理された試料中のＥＶ関連発光を測定することができる広いダイナミックレンジ（例えば、１０^５～１０^１１）を有する。ＥＶ産生細胞は、ＰＴＧＲＮ－ＦＬＡＧ－ＨｉＢｉＴルシフェラーゼタンパク質を発現し、産生されたＥＶに関連する蛍光シグナルを提供する。ｓｉＲＮＡ試薬は、ＨＥＫ ＨｉＢｉｔレポーター細胞での使用のために最適化された。約２００個の遺伝子のｓｉＲＮＡノックダウンスクリーニングを行い、ＨｉＢｉｔルシフェラーゼをＥＶ産生の尺度として評価した。ＨＭＧＣＲ及びＳＲＥＢＦ２のノックダウンは、未処理の対照細胞と比較して、ＥＶ産生を有意に増加させるものとして特定された（図１）。

【0224】

実施例２
産生細胞におけるＨＭＧＣＲ及びＳＲＥＢＦ２のノックダウンがＥＶ産生を増加させることを検証するために、未処理産生細胞、非標的ｓｉＲＮＡ処理産生細胞、ＰＴＧＦＲＮノックダウン産生細胞、ＳＲＥＢＦ２ノックダウン産生細胞、及びＨＭＧＣＲノックダウン産生細胞から採取された試料からナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を行った。未処理産生細胞、非標的ｓｉＲＮＡ処理産生細胞、ＰＴＧＦＲＮノックダウン産生細胞、ＳＲＥＢＦ２ノックダウン産生細胞、及びＨＭＧＣＲノックダウン産生細胞の生細胞密度及び生存率（％）を決定し（図２Ａ及び２Ｂ）、ＥＶを精製し、特徴付けた（図２Ｃ及び２Ｄ）。細胞当たりに産生された総ＥＶは、ＳＲＥＢＦ２ノックダウン産生細胞及びＨＭＧＣＲノックダウン産生細胞において有意に増加した（図２Ｅ）。ＳＲＥＢＦ２ノックダウンは、未処理産生細胞と比較して、ＥＶ産生の約１５倍の増加をもたらし、ＨＭＧＣＲノックダウンは、未処理産生細胞と比較して、約２５倍の増加をもたらした（図２Ｆ）。総コレステロール及び総精製ＥＶを、各処理群について定量した（それぞれ、図２Ｇ及び２Ｈ）。総ＥＶに対して正規化したコレステロールの倍率変化を計算した。これは、処理群のＥＶのコレステロール含有量の差を示した（図２Ｉ）。未処理産生細胞、非標的ｓｉＲＮＡ処理産生細胞、ＰＴＧＦＲＮノックダウン産生細胞、ＳＲＥＢＦ２ノックダウン産生細胞、及びＨＭＧＣＲノックダウン産生細胞から精製されたＥＶからのサイズ分布に大きな差異は観察されなかった（図２Ｊ）。

【0225】

実施例３
これらの結果を、産生細胞を培養するために使用される培地にシンバスタチン及びカリプラジンを補充することによって、更に検証し、確認した。生存率及び生細胞密度に対する産生細胞のシンバスタチン及びカリプラジン処理の効果を、ＨｉＢｉｔレポーター細胞株で評価した（それぞれ、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ）。対照と比較した、ＨｉＢｉｔルシフェラーゼに対するシンバスタチン及びカリプラジン処理の効果を、それぞれ表５及び表６に示す。

【表6】

１９１９ ＨｉＢｉｔレポーター細胞株をシェイクフラスコにバッチ再供給した。２日目及び３日目に、細胞を再供給した。１０ｎＭ用量は、研究の期間にわたって十分に許容された。図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃは、生細胞密度、生存率、及びＨｉＢｉｔルシフェラーゼレポーターに対するシンバスタチン投薬の効果を示す（それぞれ、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）。

【表7】

１９１９ ＨｉＢｉｔレポーター細胞株を使用して、２日目に１回の培地交換を行った。全ての状態は、十分に許容された。

【0226】

これらの結果を更に検証するために、培地に補充された２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭのシンバスタチンの存在下で、ＥＶ産生を評価し、未処理の対照と比較した（図４Ｄ）。その結果が、以下の表７に定量化されている。ＩＣ_５０は、約１０～約２０ナノモル濃度のシンバスタチンと決定され、同様のＥＶ収率の増加が得られた。

【表8】

【0227】

また、ＥＶの産生を、未処理対照と比較して、培地に補充された５μＭ及び１０μＭのカリプラジンの存在下で評価した（図４Ｅ）。その結果が、以下の表８に定量化されている。

【表9】

【0228】

これらのデータは、コレステロール生合成経路を薬理学的に調節することがＥＶ収率を増加させ得ることを示している。

【0229】

これらの結果を更に検証するために、ＥＶ収率に対するシンバスタチンの効果を、２つの異なるＨＥＫ産生細胞株（一方がプロテインＸ ＥＶ（ＰｒＸ）を産生する細胞株、及び他方がＩＬ－１２ ＥＶ（ｅｘｏＩＬ－１２）を産生する細胞株）で評価した。ＥＶを精製する前に、細胞株を、シンバスタチン（５ｎＭ及び１０ｎＭ）で１０日間処理した。図５Ａは、ＥＶ精製のそれぞれの密度勾配を示す。図５Ｂは、タンパク質ゲルを示す。その結果が、以下の表９に定量化されている。これらのデータは、シンバスタチン処理がＥＶのタンパク質含有量を明らかに変化させることなく、ＥＶ収率を増加させることを示している。

【表10】

【0230】

これらの結果が異なる細胞株で再現され得るかどうかを評価するために、ＣＨＯ－Ｓ細胞を１０ｎＭのシンバスタチンで処理し、ＥＶ収率を未処理対照と比較した。表１０は、その結果を定量化したものである。

【表11】

【0231】

６ｎＭのシンバスタチンで処理して６日後のＣＨＯ－Ｓ細胞でも、未処理対照に対して同様の５．６倍の増加が観察された。

【0232】

これらの結果を別の細胞株でも再現できるかどうかを更に試験するために、ヒト脂肪ＭＳＣ細胞（ＡＴＣＣ）を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＭＳＣ ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標）ＸＦ無血清培地で、Ｃｅｌｌｂｉｎｄ Ｔ１２５フラスコに接着させて増殖させた。培養物が約５０％コンフルエンスに達したとき、培地を除去し、同一の増殖培地（対照）又は６ｎＭのシンバスタチン（ｓｉｍ処理）を補充した増殖培地と交換した。培養物を更に４日間インキュベートし、その時点で、条件培地を回収し、細胞デブリを遠心分離によって除去した。次いで、清澄化した条件培地を陰イオン交換（ＡＥＸ）超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）によって分析し、ピーク面積を比較することによって各試料中の細胞外小胞の相対量を推定した。表１１は、その結果を定量化したものであり、６ｎＭシンバスタチンで処理された脂肪ＭＳＣ細胞による２．６倍のＥＶ産生の増加を示す。これらのデータは、ＭＳＣは治療用ＥＶ空間で使用される好ましい細胞型であるため、重要である。これらの結果は、スタチン処理によるＥＶ産生の増強が、ＨＥＫ細胞に特有なものではないことを示す。

【表12】

【0233】

実施例４
スタチン（例えば、シンバスタチン）で処理された産生細胞からのＥＶ収率の増加が、結果として得られるＥＶに対して機能的な影響があるかどうかを決定するために、シンバスタチンで処理されたｅｘｏＩＬ－１２ ＥＶを、５ｎＭ及び１０ｎＭのシンバスタチンで処理された産生細胞から回収し、それらの効力を。機能的ＨＥＫ ＩＬ－１２レポーターアッセイで評価し、未処理対照と比較した。図６Ａ及び図６Ｂは、未処理対照、組換えヒトＩＬ－１２、及びｅｘｏＩＬ－１２製剤と比較して、シンバスタチン処理で産生されたＥＶについて同様のインビトロ効力を示す。これらの結果は、シンバスタチンで処理された産生細胞から精製されたｅｘｏＩＬ－１２ ＥＶが、未処理の産生細胞から精製されたＥＶと同様のインビトロ効力を示したことを示す。

【0234】

これらの結果を、シンバスタチン処理された培養物から精製したＰｒＸ ＥＶを使用して確認し、その後、ＳＴＩＮＧアゴニスト又はＳＴＡＴ６アンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかをロードした。ｅｘｏＩＬ－１２ ＥＶと同様に、ｅｘｏＳＴＩＮＧ ＥＶ及びｅｘｏＡＳＯ－ＳＴＡＴ６ ＥＶのシンバスタチン処理は、対照と比較してインビボ効力に影響がなかった（データは示さず）。

【0235】

実施例５
スタチンで処理された産生細胞からのＥＶ収率の増加が他のスタチンに一般化可能であるかどうかを調べるために実験を行い、ＨｉＢｉｔ産生細胞を、様々な濃度のロスバスタチン（「ＲＯＳ」；１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、及び１００ｎＭ）に曝露した。特に、ロスバスタチンは、フルオロフェニル及びスルホン基を介して追加のＨＭＧＣＲ結合能力を有する完全合成の疎水性分子である。反対に、シンバスタチンは、真菌代謝産物に由来する親油性分子である。しかし、これらの差異にもかかわらず、ロスバスタチンは、誘導後４日目に、処理されたＨｉＢｉｔレポーター細胞におけるＥＶ発現の用量依存的な増加を示した（図７）。これらの結果は、コレステロールを低下させることによって観察されるＥＶ発現の増加がシンバスタチンに特有のものではなく、むしろスタチンの一般的な現象であると思われることを示す。

【0236】

実施例６
ＥＶの発現の増加が、一般にプレニル化ではなくコレステロール自体に関連しているかどうかを判定するために、産生細胞をＧＧＴａｓｅの合成阻害剤に曝露した後のエクソソーム産生を調査した。プレニル化は、ＥＶ生合成に関与することが示されているＲａｂタンパク質の活性を制御する。プレニル化の前駆体は、コレステロール経路の中間体に由来し、これは、スタチン及びｓｉＲＮＡの両方の処理によって枯渇する可能性が高いが、カラプラジン処理によって枯渇する可能性は低い。ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴａｓｅ）は、タンパク質のカルボキシル末端へのプレニル残基の結合によるタンパク質の翻訳後修飾に関与している。プレニル化タンパク質は、プレニル基の疎水性の性質により、膜結合性である。培養物を、ＧＧＴＩ－２４１８（ＧＧＴａｓｅ Ｉのペプチド模倣阻害剤）で処理し、生細胞密度（ＶＣＤ）及びエクソソーム産生（ＲＬＵによって表現される）を２日目、４日目、６日目、及び８日目に評価した。ＧＧＴＩ－２４１８への培養物の曝露は、細胞密度（図８Ａ）又はエクソソーム産生（図８Ｂ）のいずれにも効果がなかった。これは、プレニル化が、本明細書で試験される培養条件下でエクソソーム産生に影響を及ぼさないことを示唆し、コレステロールの役割を支持する。

【0237】

実施例７
増強されたエクソソーム産生に対するコレステロール枯渇の重要性を確認するために、細胞培養培地にシンバスタチンを添加すると同時に、様々な濃度の合成コレステロールを培地に補充することによって、ＨｉＢｉｔレポーター細胞株の内因性コレステロール生合成経路を阻害した。内因性コレステロールを合成コレステロールに置き換えることで、シンバスタチンの効果が逆転すると予想された。シンバスタチンによる細胞コレステロールの枯渇は、ＨｉＢｉｔ培養物における生細胞密度の特徴的な低下（ＶＣＤ；図９Ａ）とエクソソーム産生の増加（図９Ｂ）とを引き起こした。外因性合成コレステロール及び６ｍＭシンバスタチンで増殖させた細胞培養物は、ＶＣＤの低下を示さなかった（図９Ａ）。ＥＶ産生のシンビスタチンによる誘導は、コレステロールの補充を行うことによって大幅に減弱されたが、ＥＶ産生は、スタチンを欠く対照培養物よりも高いことが依然として観察された（図９Ｂ）。高コレステロール単独での増殖培養物は細胞培養ＶＣＤ又はエクソソーム産生に影響を及ぼさなかったため、この逆転はシンバスタチン効果に特異的であった（図９Ａ及び９Ｂ）。

【0238】

参照による組み込み
本出願で引用された全ての刊行物、特許、特許出願及び他の文書は、各個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文書が、全ての目的のために参照により組み込まれることが個々に示されているのと同じ範囲まで、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0239】

均等物
様々な具体的な態様が例示され、説明されているが、上記の明細書は限定されるものではない。本発明（複数可）の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。本明細書を検討すれば、当業者には、多くの変形形態が明らかになるであろう。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【配列表】

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【国際調査報告】