特表 2024-538119 ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤のナノポリマーを使用したがん及び自己免疫疾患の治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-18

(54)【発明の名称】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤のナノポリマーを使用したがん及び自己免疫疾患の治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20241010BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20241010BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 31/4045 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 31/165 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 31/18 20060101ALI20241010BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61K9/51

A61K47/34

A61P35/00

A61P29/00

A61P37/02

A61P35/02

A61K45/06

A61P1/16

A61P15/00

A61P3/10

A61P11/06

A61P3/04

A61P25/16

A61P25/28

A61P17/00

A61P25/00

A61P9/00

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P21/00

A61P1/04

A61P21/04

A61P5/14

A61P7/06

A61K38/12

A61K31/4045

A61K31/165

A61K31/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522438

(86)(22)【出願日】2022-10-17

(85)【翻訳文提出日】2024-06-05

(86)【国際出願番号】 US2022046905

(87)【国際公開番号】W WO2023064634

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】63/256,246

(32)【優先日】2021-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】322011885

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ バージニア パテント ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＶＩＲＧＩＮＩＡ ＰＡＴＥＮＴ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】７２２ Ｐｒｅｓｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｓｕｉｔｅ １０７，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ ２２９０３（ＵＳ）

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ケスター， マーク

(72)【発明者】

【氏名】フェイス， デーヴィッド ジェー．

(72)【発明者】

【氏名】イレンドゥラ， アヌラーダ

(72)【発明者】

【氏名】ローラン， トーマス ピー．， ジュニア

(72)【発明者】

【氏名】マナバラン， ジョン サニル

(72)【発明者】

【氏名】マーチ， エンリカ

(72)【発明者】

【氏名】オコナー， オーウェン

(72)【発明者】

【氏名】パル， イプシタ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C076AA65

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC27

4C076EE24

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA17

4C084AA19

4C084AA20

4C084BA26

4C084MA02

4C084MA38

4C084NA14

4C084ZA01

4C084ZA16

4C084ZA55

4C084ZA59

4C084ZA66

4C084ZA70

4C084ZA75

4C084ZA89

4C084ZB07

4C084ZB11

4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZC202

4C084ZC35

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC13

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA38

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA16

4C086ZA55

4C086ZA59

4C086ZA66

4C086ZA70

4C086ZA75

4C086ZA89

4C086ZA94

4C086ZA96

4C086ZB07

4C086ZB11

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZC21

4C086ZC35

4C206AA01

4C206GA13

4C206GA28

4C206JA13

(57)【要約】

ナノ粒子内にカプセル化され、及び／又はさもなければナノ粒子と会合された、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含む組成物が提供される。幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣｉは、ロミデプシン、ボリノスタット、ベリノスタット、パノビノスタット、及び／又はキダミドである。幾つかの実施態様では、ナノ粒子はポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ＰＥＧ－メチルエーテル（ｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ）ナノポリマーである。また、ここに開示される組成物の有効量を投与することによって、限定されないが腫瘍及び／又はがんなどの、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する疾患、障害、及び／又は状態を治療するための方法；並びにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する腫瘍及び／又はがんの成長、増殖、及び／又は転移を阻害するための方法であって、限定されないが、化学療法剤などの少なくとも一種の追加の治療活性剤を投与することを任意選択的に含みうる方法が提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ナノ粒子内にカプセル化され、及び／又はさもなければナノ粒子と会合された、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含む組成物。

【請求項2】

ＨＤＡＣｉが、ボリノスタット、ロミデプシン、ベリノスタット、及びパノビノスタット、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、任意選択的にＨＤＡＣｉがロミデプシンである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

一又は複数種のポリマー及び／又は一又は複数種の界面活性剤を含む、請求項１又は請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

一又は複数種のポリマーが、ポリエステル、任意選択的にＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、及び／又はＰＣＬ、それらのコポリマー、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

ポリマーが、合成ポリマー；生分解性ポリマー；生体適合性ポリマー；両親媒性ポリマー；ジブロックコポリマー；及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリマーを含む、請求項３又は４に記載の組成物。

【請求項6】

ポリマーが、親水性のＰＥＧ鎖、任意選択的にエンドキャップとして、メトキシＰＥＧ、ＰＥＧ－カルボン酸、ＰＥＧ－ヒドロキシル、及び／又はＰＥＧアミンを含み、かつ２Ｋ～１０Ｋの鎖長範囲を有する、請求項３から５の何れか一項に記載の組成物。

【請求項7】

ポリマーが、疎水性コア形成ポリマーであり、任意選択的にＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、及び／又はＰＣＬからなる群から選択される疎水性コア形成ポリマーである、請求項３から５の何れか一項に記載の組成物。

【請求項8】

ナノ粒子が、メチルエーテル－ＰＥＧポリラクチド－ｃｏ－グリコリド（ｍＰＥＧ－ＰＬＧＡ，５０：５０）を含む、請求項１から７の何れか一項に記載の組成物。

【請求項9】

相添加モード、ＨＤＡＣｉ／ポリマー比、ＨＤＡＣｉ／界面活性剤比、溶媒／貧溶媒比、添加速度、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される一又は複数のパラメーターが最適化される、請求項１から８の何れか一項に記載の組成物。

【請求項10】

（ａ）ＨＤＡＣｉ／ポリマー比が、約１：１０から約１：１００Ｗ／Ｗ、任意選択的に１：１０から約１：５０Ｗ／Ｗの範囲であり；
（ｂ）ＨＤＡＣｉ／界面活性剤比が、約１：０．０５から約１：０．２Ｗ／Ｗの範囲であり；
（ｃ）溶媒／貧溶媒比が、約１：１０から約１：１の範囲であり、任意選択的に貧溶媒が、水、ＰＢＳ、又は別のイオン性緩衝液からなる群から選択され；及び／又は
（ｄ）添加速度が、約１０から約５００ｍＬ／時間、任意選択的に約１０から約５０ｍＬ／時間の範囲である、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対する感受性と関連する疾患、障害、又は状態を治療するための方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１から１０の何れか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項12】

ＨＤＡＣｉに対する感受性と関連する疾患、障害、又は状態が、腫瘍及び／又はがん、炎症性疾患、障害、又は状態；自己免疫疾患、障害、又は状態；或いはそれらの任意の組み合わせである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

腫瘍及び／又はがんが、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬＬ）、及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対する感受性と関連する腫瘍及び／又はがんの成長、増殖、及び／又は転移を阻害するための方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１から１０の何れか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項15】

腫瘍及び／又はがんが、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬＬ）、及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

少なくとも一種の追加の治療活性剤を対象に投与することを更に含む、請求項１４から１５の何れか一項に記載の方法。

【請求項17】

少なくとも一種の追加の治療活性剤が化学療法剤である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

化学療法剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン；ビンクリスチン、プレドニゾン、アザシチジン、デシタビン、クラドリビン、メトトレキサート、プララトレキサート、及びシクロスポリンＡ、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対する感受性と関連する炎症性及び／又は自己免疫疾患、障害、又は状態を治療するための方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１から１０の何れか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項20】

炎症性及び／又は自己免疫疾患、障害、又は状態が、脂肪肝疾患、子宮内膜症、１型及び２型糖尿病、炎症性腸疾患、喘息、肥満、アルツハイマー及びパーキンソン病、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、痛風、炎症性関節炎センター、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、狼瘡）、血管炎、アジソン病、セリアックスプルー病（グルテン過敏性腸症）、皮膚筋炎、バセドウ病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、乾癬／乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、自己免疫性血管炎、ギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経炎からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

少なくとも一種の追加の治療活性剤を対象に投与することを更に含む、請求項１９又は請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

少なくとも一種の追加の治療活性剤が、抗炎症及び／又は免疫抑制剤である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

薬物分子を含むナノ粒子を製造する方法であって、
（ａ）薬物分子と一又は複数種のポリマーを含む最初又はその後の反応混合物の二つ以上のパラメーターを一又は複数回の反復で変化させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の変化に基づいて、更なる反応混合物に対してパラメーターの所望の組み合わせを選択する工程；及び
（ｃ）更なる反応混合物から薬物分子を含むナノ粒子を沈殿させる工程
を含む、方法。

【請求項24】

反応混合物が、溶媒、非溶媒、界面活性剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される反応混合物を更に含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

溶媒が有機溶媒である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

非溶媒が、水性溶媒、水、又はＰＢＳ緩衝液である、請求項２４及び２５に記載の方法。

【請求項27】

相添加モード、薬物／ポリマー比、薬物／界面活性剤比、溶媒／貧溶媒比、添加速度、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される一又は複数のパラメーターを最適化することを含む、請求項２３から２６の何れか一項に記載の方法。

【請求項28】

薬物がＨＤＡＣｉであり、任意選択的にロミデプシンである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

請求項２８に記載の方法であって、
（ａ）ＨＤＡＣｉ／ポリマー比が、約１：１０から約１：１００Ｗ／Ｗ、任意選択的に１：１０から約１：５０Ｗ／Ｗの範囲であり；
（ｂ）ＨＤＡＣｉ／界面活性剤比が、約１：０．０５から約１：０．２Ｗ／Ｗの範囲であり；
（ｃ）溶媒／貧溶媒比が、約１：１０から約１：１の範囲であり、任意選択的に、貧溶媒が、水、ＰＢＳ、又は別のイオン性緩衝液からなる群から選択され；及び／又は
（ｄ）添加速度が、約１０から約５００ｍＬ／時間、任意選択的に約１０から約５０ｍＬ／時間の範囲である、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願との相互参照］
この出願は、２０２１年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２５６２４６号の優先権及び利益を主張し、その開示全体を出典明示によりここに援用する。

【0002】

［技術分野］
本開示の主題は、幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、特にロミデプシンを用いて、疾患、障害、及び状態を治療するための方法に関する。幾つかの実施態様では、疾患、障害、又は状態は腫瘍及び／又はがんである。

【背景技術】

【0003】

ロミデプシン（（１Ｓ，４Ｓ，７Ｚ，１０Ｓ，１６Ｅ，２１Ｒ）－７－エチリデン－４，２１－ジイソプロピル－２－オキサ－１２，１３－ジチア－５，８，２０，２３－テトラアザビシクロ［８．７．６］トリコサ－１６－エン－３，６，９，１９，２２－ペンタオン；イストダックス、デプシペプチド、ＦＫ２２８、ＦＲ９０１２２８、ＮＳＣ６３０１７６としても知られる）は、元々はクロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）株９６８から単離された二環式デプシペプチドである（Ｕｅｄａ等，１９９４）。ロミデプシンは、所定の種類のリンパ腫の治療に承認されているヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤である。インビトロ系とインビボ系の双方において、ロミデプシンは、遺伝子発現の誘導又は抑制、細胞周期停止、分化、細胞増殖阻害、アポトーシスの誘導、トランスフォーム細胞の形態復帰、及び血管新生の阻害を含む多面発現活性を有することが示されている。ロミデプシン曝露は、腫瘍発生、炎症、自己免疫疾患、及び免疫調節効果に関連する多くの重要な調節遺伝子の誘導と抑制の双方を調節することが示されている。

【0004】

殆どのＨＤＡＣ阻害剤は、クラスＩ（ＨＤＡＣ１、２、３、及び８）ＨＤＡＣとクラスＩＩ（ＨＤＡＣ４、５、６、７、９、及び１０）ＨＤＡＣの双方を阻害することを意味する汎ＨＤＡＣ阻害剤である。加えて、それらは、ＨＤＡＣ１１と呼ばれる唯一のクラスＩＶ ＨＤＡＣを阻害する。臨床的に利用可能なＨＤＡＣ阻害剤は、クラスＩＩＩ ＨＤＡＣ（サーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎｓ又はＳｉｒｔｓ））を阻害しない。ＨＤＡＣはヒストンのアセチル化リジン残基からのアセチル基の除去を触媒し、クロマチン凝縮の変化と最終的には遺伝子発現の調節をもたらし、これらの酵素の阻害剤への曝露後に見られる細胞への影響の多くを誘発する。

【0005】

様々なクラスのＨＤＡＣ酵素のうち、ロミデプシンは、ＨＤＡＣ１、２、３、及び８を含むクラスＩ ＨＤＡＣ酵素を最も強力に阻害する。ＨＤＡＣ阻害剤への曝露後に見られるクロマチン凝縮の変化は、ユークロマチンとして知られるオープンクロマチン構造を維持することによってＤＮＡを「転写活性」にする。ヒストンの脱アセチル化によって促進されるその凝縮状態では、クロマチンは転写抑制状態に維持される。ロミデプシンは、多数の遺伝子の発現を誘導し抑制する。マイクロアレイ解析を使用して腫瘍細胞株で調べた７０００を超える遺伝子のうち、ロミデプシンへの曝露後に約１００が上方制御され、別の１００が下方制御された。変化した遺伝子発現のパターンは様々で、（ｉ）細胞状況；（ｉｉ）薬物の濃度；（ｉｉｉ）薬物への曝露期間；及び（ｉｖ）併用医薬を含む、多くの要因に依存しうる。一貫して上方制御された遺伝子には、ｐ２１ＷＡＦ／Ｃｉｐ１、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、及びカスパーゼ９が含まれる一方、一貫して下方制御された遺伝子には、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）及びサイクリンＡ２が含まれていた（Ｓａｓａｋａｗａ等，２００５；Ｈｏｓｈｉｎｏ等，２００７）。これらの遺伝子の多くは、シグナル伝達、増殖阻害、及びアポトーシスにおける重要な調節機能と関連するタンパク質をコードしている。

【0006】

重要なことは、ＨＤＡＣの脱アセチル化の阻害に加えて、ＨＤＡＣ阻害剤は、非ヒストンタンパク質のアセチル化状態に影響を及ぼし、その翻訳後状態及び限定されないが免疫調節効果を含むその後の機能に影響を与える場合があることである（Ｖｅｒｖｅｒｉｓ等，２０１３）。これらの効果の範囲はあまりよく理解されていないが、Ｂｃｌ－６及びｐ５３を含む、がん生物学に関与する重要なタンパク質が含まれている。

【0007】

多数の研究により、複数の腫瘍細胞株にわたるロミデプシンのインビトロ及びインビボ活性が評価されている。ロミデプシンは、ナノモル濃度で、リンパ腫、白血病、前立腺がん、腎臓がん、結腸がん、肺がん、胃がん、乳がん、膵臓がん、並びにメラノーマを含む血液腫瘍株と固形腫瘍株の両方に対して強力な抗がん活性を示した。ヒトＢ細胞慢性リンパ性白血病細胞（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病細胞（ＰＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫細胞、食道がん細胞及び膵臓がん細胞、並びに多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞における抗増殖活性及びアポトーシス促進活性の誘導が、１から５００ｎＭの範囲の濃度で見られた。ロミデプシンはまた、ヒトの肺、胃、乳房、及び結腸癌細胞に対して強力な細胞傷害性効果を示したが、正常ヒト細胞に対しては弱い細胞傷害性効果を示した。

【0008】

インビボでのロミデプシンの有効性は、マウスでの多数のヒト異種移植片研究で調べられている。これらの研究では、ロミデプシンは、上皮組織、間葉系組織、及び血液系組織由来のものを含む複数のヒト腫瘍型に対して広範な抗腫瘍活性を示した（例えば、Ｕｅｄａ等，１９９４を参照）。前臨床活性は臨床活性の優れた予測因子ではなかったが（つまり、その薬物は臨床で実証されているよりも多くの前臨床がんモデルで活性である）、ロミデプシン、そして実際にはＨＤＡＣ阻害剤とみなされるこのクラスの薬物が、Ｔ細胞悪性腫瘍にわたって特有の系譜選択活性を持つことが証明されており、その起源の細胞に関係なく、所定の免疫学的治療及び他のエピジェネティック薬物を補完しうることは明らかである。

【発明の概要】

【0009】

この概要は、本開示の主題の幾つかの実施態様を列挙し、多くの場合、これらの実施態様の変形及び置換を列挙する。この概要は、多数の多様な実施態様の単なる例示に過ぎない。所与の実施態様の一又は複数の代表的な特徴の言及も同様に例示的なものである。そのような実施態様は、典型的には、言及された特徴の有無にかかわらず存在しうる；同様に、その特徴は、この概要に列挙されているかどうかにかかわらず、本開示の主題の他の実施態様に適用することができる。過度の繰り返しを避けるため、この概要では、そのような特徴の全ての可能な組み合わせを列挙したり、示唆したりするものではない。

【0010】

幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ナノ粒子内にカプセル化され、及び／又はさもなければナノ粒子と会合された、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる組成物に関する。幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣｉは、ボリノスタット、ロミデプシン、ベリノスタット、パノビノスタット、及びキダミド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、任意選択的に、ＨＤＡＣｉはロミデプシンである。幾つかの実施態様では、ナノ粒子はポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ＰＥＧ－メチルエーテル（ｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ）ナノ粒子である。幾つかの実施態様では、本開示の主題の組成物は、一又は複数種のポリマー及び／又は一又は複数種の界面活性剤を含む。幾つかの実施態様では、一又は複数種のポリマーは、ポリエステル、任意選択的にＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、及び／又はＰＣＬ、それらのコポリマー、及びそれらの混合物からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、ポリマーは、合成ポリマー；生分解性ポリマー；生体適合性ポリマー；両親媒性ポリマー；ジブロックコポリマー；及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリマーを含む。幾つかの実施態様では、ポリマーは、親水性のＰＥＧ鎖、任意選択的にエンドキャップとして、メトキシＰＥＧ、ＰＥＧ－カルボン酸、ＰＥＧ－ヒドロキシル、及び／又はＰＥＧアミンを含み、かつ２Ｋ～１０Ｋの鎖長範囲を有する。幾つかの実施態様では、ポリマーは疎水性コア形成ポリマーであり、任意選択的にＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、及び／又はＰＣＬからなる群から選択される疎水性コア形成ポリマーである。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、メチルエーテル－ＰＥＧポリラクチド－ｃｏ－グリコリド（ｍＰＥＧ－ＰＬＧＡ，５０：５０）を含む。幾つかの実施態様では、相添加モード、ＨＤＡＣｉ／ポリマー比、ＨＤＡＣｉ／界面活性剤比、溶媒／貧溶媒比、添加速度、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される組成物の一又は複数のパラメーターが最適化される。幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣｉ／ポリマー比は、約１：１０から約１：１００Ｗ／Ｗ、任意選択的に１：１０から約１：５０Ｗ／Ｗの範囲であり；ＨＤＡＣｉ／界面活性剤比は、約１：０．０５から約１：０．２Ｗ／Ｗの範囲であり；溶媒／貧溶媒比は、約１：１０から約１：１の範囲であり、任意選択的に、貧溶媒は、水、ＰＢＳ、又は別のイオン性緩衝液からなる群から選択され；及び／又は添加速度は、約１０から約５００ｍＬ／時間、任意選択的に約１０から約５０ｍＬ／時間の範囲である。

【0011】

本開示の主題は、また、幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する疾患、障害、及び／又は状態を治療するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、本方法は、ナノ粒子内にカプセル化され、及び／又はさもなければナノ粒子と会合された、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する疾患、障害、及び／又は状態は、腫瘍及び／又はがんである。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬＬ）、及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫からなる群から選択される。

【0012】

本開示の主題は、また、幾つかの実施態様では、ここに開示された組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与することによって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する疾患、障害、及び／又は状態を治療するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣｉに対する感受性と関連する疾患、障害、及び／又は状態は、腫瘍及び／又はがん、炎症性疾患、障害、及び／又は状態；自己免疫疾患、障害、及び／又は状態；或いはそれらの任意の組み合わせである。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬＬ）、及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫からなる群から選択される。

【0013】

本開示の主題は、また、幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する腫瘍及び／又はがんの成長、増殖、及び／又は転移を阻害するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、本方法は、ナノ粒子内にカプセル化され、及び／又はさもなければナノ粒子と会合された、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、少なくとも一種の追加の治療活性剤を対象に投与することを更に含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は化学療法剤である。幾つかの実施態様では、化学療法剤は、シクロホスファミド、ドキソルビシン；ビンクリスチン、プレドニゾン、アザシチジン、デシタビン、クラドリビン、メトトレキサート、プララトレキサート、及びシクロスポリンＡ、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0014】

本開示の主題は、また、幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対する感受性と関連する腫瘍及び／又はがんの成長、増殖、及び／又は転移を阻害するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、本方法は、ここに開示される組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬＬ）、及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫からなる群から選択される。

【0015】

幾つかの実施態様では、本開示の方法は、少なくとも一種の追加の治療活性剤を対象に投与することを更に含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は化学療法剤である。幾つかの実施態様では、化学療法剤は、シクロホスファミド、ドキソルビシン；ビンクリスチン、プレドニゾン、アザシチジン、デシタビン、クラドリビン、メトトレキサート、プララトレキサート、及びシクロスポリンＡ、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0016】

本開示の主題は、また、幾つかの実施態様では、炎症性及び／又は自己免疫疾患、障害、又は状態を治療するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、炎症性及び／又は自己免疫疾患、障害、又は状態は、脂肪肝疾患、子宮内膜症、１型及び２型糖尿病、炎症性腸疾患、喘息、肥満、アルツハイマー及びパーキンソン病、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、痛風、炎症性関節炎センター、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、狼瘡）、血管炎、アジソン病、セリアックスプルー病（グルテン過敏性腸症）、皮膚筋炎、バセドウ病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、乾癬／乾癬性関節炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、自己免疫性血管炎、ギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経炎からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、本開示の方法は、本開示の主題の組成物を少なくとも一種の追加の治療活性剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は、抗炎症及び／又は免疫抑制剤である。

【0017】

本開示の主題は、また、幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対する感受性と関連する炎症性及び／又は自己免疫疾患、障害、及び／又は状態を治療するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、方法は、ここに開示される組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、炎症性及び／又は自己免疫疾患、障害、又は状態は、脂肪肝疾患、子宮内膜症、１型及び２型糖尿病、炎症性腸疾患、喘息、肥満、アルツハイマー及びパーキンソン病、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、痛風、炎症性関節炎センター、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、狼瘡）、血管炎、アジソン病、セリアックスプルー病（グルテン過敏性腸症）、皮膚筋炎、バセドウ病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、乾癬／乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、自己免疫性血管炎、ギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経炎からなる群から選択される。

【0018】

幾つかの実施態様では、本開示の方法は、少なくとも一種の追加の治療活性剤を対象に投与することを更に含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は、抗炎症及び／又は免疫抑制剤である。

【0019】

本開示の主題は、幾つかの実施態様では、一又は複数種の薬物分子を含むナノ粒子を製造するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、本方法は、（ａ）薬物分子と一又は複数種のポリマーを含む最初又はその後の反応混合物の二つ以上のパラメーターを一又は複数回の反復で変化させる工程；（ｂ）工程（ａ）の変化に基づいて、更なる反応混合物に対してパラメーターの所望の組み合わせを選択する工程；及び（ｃ）更なる反応混合物から薬物分子を含むナノ粒子を沈殿させる工程を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。幾つかの実施態様では、反応混合物は、溶媒、非溶媒、界面活性剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される反応混合物を更に含む。幾つかの実施態様では、溶媒は有機溶媒である。幾つかの実施態様では、非溶媒は、水性溶媒、水、又はＰＢＳ緩衝液である。

【0020】

幾つかの実施態様では、本開示の方法は、相添加モード、薬物／ポリマー比、薬物／界面活性剤比、溶媒／貧溶媒比、添加速度、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される一又は複数のパラメーターの最適化を含む。幾つかの実施態様では、薬物はＨＤＡＣｉであり、任意選択的にロミデプシンである。幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣｉ／ポリマー比は、約１：１０から約１：１００Ｗ／Ｗ、任意選択的に１：１０から約１：５０Ｗ／Ｗの範囲であり；ＨＤＡＣｉ／界面活性剤比は、約１：０．０５から約１：０．２Ｗ／Ｗの範囲であり；溶媒／貧溶媒比は、約１：１０から約１：１の範囲であり、任意選択的に、貧溶媒は、水、ＰＢＳ、又は別のイオン性緩衝液からなる群から選択され；及び／又は添加速度は、約１０から約５００ｍＬ／時間、任意選択的に約１０から約５０ｍＬ／時間の範囲である。

【0021】

従って、本開示の主題の目的は、限定されないが、腫瘍、がん、炎症性疾患、障害、及び／又は状態、及び自己免疫疾患、障害、及び／又は状態を含む、ヒストン脱アセチル化酵素生物活性感受性と関連する疾患、障害、及び／又は状態を治療するための組成物及び方法を提供することである。

【0022】

この目的及び他の目的は、本開示の主題によって全部又は一部が達成される。更に、本開示の主題の目的を上述したが、本開示の主題の他の目的及び利点は、次の説明、図面、及び実施例（これらは出典明示により援用され、明細書の一部を形成する）を検討すれば当業者には明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】ＰＤＬＬＡポリマーの化学構造。メトキシポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（ＤＬ－ラクチド）ｍＰＥＧ－Ｐ（ＤＬ）ＬＡ；（Ｍｗ約５０００：１００００Ｄａ）。

【図2A】光散乱データ。ロミデプシンを含む粒子の粒径分布を示す代表的なＤＬＳグラフ。（図２Ａ）中性リポソーム。

【図2B】５％コレステロールを含む中性リポソーム。

【図2C】ｍ－ＰＥＧ ＰＤＬＬＡ。

【図3】５０ｎｍスケールバーでのｍ－ＰＥＧナノロミデプシン（ＮａｎｏＲｏｍｉ）ＰＤＬＬＡ（左パネル）及びゴーストｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ（右パネル）のクライオ電子顕微鏡画像。

【図4】ナノロミデプシン製剤の薬物濃度。レーン１は中性リポソーム；レーン２は５％コレステロールを含む中性リポソーム；レーン３は室温でのポリマーナノロミデプシン粒子、及びレーン４は４℃でのポリマーナノロミデプシン粒子。

【図5A】がん細胞株におけるナノロミデプシンポリマーの用量及び時間依存性反応。（図５Ａ）５種の異なるヒトがん細胞株を、ある濃度範囲のロミデプシン及びナノロミデプシンポリマーで処置し、６０時間でＣＥＬＬ ＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（登録商標）アッセイを使用して細胞生存率を評価。ＩＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して細胞株及び時間に基づいて定量した。

【図5B】各時点での８細胞株に対するロミデプシン及びナノロミデプシンポリマーのＩＣ_５０（ｎＭ）（図５Ｂの各パネルの４つのデータ点の各セットにおいて左から右へそれぞれ３０、６０、及び９６時間のバー）。

【図6A】ナノロミデプシンポリマーは、がん細胞株においてアポトーシスを誘導する。（図６Ａ）ＨＨ細胞株のロミデプシン及びナノロミデプシン処置後３０時間におけるアポトーシスマーカーとしての切断型ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の解析を示す代表的なフローサイトメトリードットプロット。

【図6B】ロミデプシン、ナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ ＰＢＳ、ナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ Ｈ_２Ｏ、及びナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＬＧＡでの処置後３０時間における、アポトーシスの指標である切断型ＰＡＲＰを発現するＨＨ細胞のパーセンテージの増加を濃度依存的に示すグラフ。

【図7】ナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡは、ナノロミデプシンポリマーの中で最も強力である。試験した全ての細胞株に対してＩＣ_５０活性に基づいて、ロミデプシンと全３種のナノロミデプシンポリマーの効力を比較するヒストグラムバー。各ドットはがん細胞株を表す。

【図8】ナノロミデプシンＰＤＬＬＡは、ヒストンタンパク質Ｈ３及びＨ４のアセチル化を誘導する。（図８Ａ）ロミデプシン、及びナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ Ｈ_２Ｏでの処置から３０時間後のＨＨ細胞におけるＡｃＨ３及びＡｃＨ４の発現（すなわち、ヒストン３［Ｈ３］及びヒストン４［Ｈ４］のアセチル化［Ａｃ］）のレベルの濃度依存的変化を示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラム（上のパネル）。ロミデプシン及びナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ Ｈ_２Ｏでの処置から３０時間後のＨＨ細胞における、濃度依存的に平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定したＡｃＨ３及びＡｃＨ４の発現のレベルの変化を示す棒グラフ（下のパネル）（図８Ｂ）漸増濃度のロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡでの処置後のＡｃＨ３及びＡｃＨ４に対するＨＨ細胞のウェスタンブロット解析では、ＨＨ細胞株は３０時間及び高用量（３ｎＭ及び３０ｎＭ）の両処置でＨ３及びＨ４のアセチル化レベルの増加を示した。

【図9】正常細胞におけるロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡポリマーの用量及び時間依存的反応。３体の健康なドナー由来のＰＢＭＣを、ある濃度範囲のロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡで処置し、２４、４８、及び７２時間でＣＥＬＬ ＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（登録商標）アッセイを使用して細胞生存率を評価した。

【図10】ナノロミデプシンＰＤＬＬＡを使用したインビボでの有効性、薬物動態及び薬力学研究。ナノロミデプシンＰＤＬＬＡとロミデプシンの間で治療反応を比較するための例示的なインビボ異種移植マウスモデル。

【図11A】ナノロミデプシンＰＤＬＬＡを使用した単回投与毒性研究。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、示された用量のロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡ（ＮａｎｏＲｏｍｉ）の単回処置を施した。ロミデプシン（図１１Ａ及び１１Ｃ）及びＮａｎｏＲｏｍｉ（図１１Ｂ及び１１Ｄ）を投与されたマウスの元の体重に対するパーセンテージとしての体重。ＳＥＭと共に開始体重のパーセンテージとして体重変化のパーセンテージを示す（ｎ＝５マウス／群）。図１１Ａ及び１１Ｂ：腹腔内投与。図１１Ｃ及び１１Ｄ：静脈内投与。

【図11B】（上記）

【図11C】（上記）

【図11D】（上記）

【図12A】ナノロミデプシンＰＤＬＬＡを使用した単回投与毒性研究。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、示された用量のロミデプシンとＮａｎｏＲｏｍｉの単回処置を施した。ロミデプシン（図１２Ａ及び１２Ｃ）及びＮａｎｏＲｏｍｉ（図１２Ｂ及び１２Ｄ）での処置後の臨床スコア（ｎ＝５マウス／群）がＳＥＭと共に示される。図１２Ａ及び１２Ｂ：腹腔内投与。図１２Ｃ及び１２Ｄ：静脈内投与。

【図12B】（上記）

【図12C】（上記）

【図12D】（上記）

【図13】ナノロミデプシンＰＤＬＬＡを使用した薬物動態研究。遊離ロミデプシン（丸）又はナノロミデプシンＰＤＬＬＡ（四角）での単回処置の（図１３Ａ）腹腔内又は（図１３Ｂ）静脈内投与後の血漿中のロミデプシン濃度の血漿濃度－時間依存プロット。

【図14A】ナノロミデプシンＰＤＬＬＡを使用した反復投与毒性研究。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、矢印で示した日に腹腔内投与経路によりロミデプシン又はナノロミデプシンＰＤＬＬＡの２ｍｇ／ｋｇ処置をマウスに施した。ＳＥＭと共に開始体重のパーセンテージとしての体重変化のパーセンテージ（図１４Ａ；ｎ＝５マウス／群）と、ＳＥＭと共に臨床スコア（図１４Ｂ；ｎ＝５マウス／群）が示される。

【図14B】（上記）

【図15】ナノロミデプシンＰＤＬＬＡを使用した有効性研究。Ｈ９－ｄｔｏｍａｔｏ－ルシフェラーゼ腫瘍担持マウスにおいて、矢印で示した日に腹腔内投与経路によりロミデプシン又はナノロミデプシンＰＤＬＬＡ又は等量ビヒクル（ＰＢＳ）又はゴーストナノ粒子の２ｍｇ／ｋｇ処置をマウスに施した。インビボで、ロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡ処置後の反応を判定するためにＢＬＩ画像を取得した。全てのコホートは、移植後７、１０、１４、及び１７日目（矢印）に、薬物投与前にＬａｇｏＸ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して画像化した。画像の取得後、ヒトＨ９異種移植片の平均ＢＬＩ曲線を作成した。ここで、ｙ軸は全光束（光子／秒）を表し、ｘ軸は時間（日数）関数を表す。

【図16】本開示の主題の例示的なナノ沈殿法。図１６Ａは、伝統的なナノ沈殿法の例証図である。これは、本開示の主題の多面的アプローチと比較するために含めている。図１６Ｂは、多チャネルシリンジポンプ及び多点スターラーを使用したパラレルアプローチにおける製剤及びナノ粒子特性の操作パラメーター最適化の概略図である。ナノロミデプシン製剤のスケールアップには、図１６Ｂの最適化されたパラメーターを利用した。

【図17】光散乱及びＬＣ／ＭＳデータ。溶媒スクリーニング：本開示のナノ沈殿法によるナノロミデプシンＮＰ調製における溶媒の役割。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン＋１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、及びエタノール（ＥｔＯＨ）中で調製されたナノロミデプシンＮＰの粒子の平均粒径（図１７Ａ）、多分散性（ＰＤＩ；図１７Ｂ）、及びロミデプシン濃度（図１７Ｃ）の棒グラフが示される。

【図18】追加の光散乱及びＬＣ／ＭＳデータ。ポリマーの濃度効果を示す、本開示の主題の例示的なナノ沈殿法におけるＮＰ特性に関するポリマーの鎖長、ブロックポリマーに対するｍ－ＰＥＧの比、及びブロックポリマーの分子量を含むジブロックコポリマーの最適化。平均粒径（図１８Ａ）、粒子のＰＤＩ（図１８Ｂ）、ナノロミデプシンの薬物濃度（図１８Ｃ）、及び薬物濃度に対する薬物：ポリマー比の影響（図１８Ｄ）の棒グラフが示される。

【図19A-19B】追加の光散乱及びＬＣ／ＭＳデータ。薬物濃度の膜カットオフに関する遠心フィルター最適化、及びローダミン色素を使用して可視化した製剤からの過剰な未カプセル化薬物の除去。平均粒径（図１９Ａ）、ナノロミデプシンの薬物濃度（図１９Ｂ）、粒子のＰＤＩ（図１９Ｃ）の棒グラフ、及びローダミン色素を使用して可視化された製剤からの遊離薬物の除去（図１９Ｄ）が示される。

【図19C-19D】（上記）

【図20A-20B】追加の光散乱及びＬＣ／ＭＳデータ。薬物濃度に対する貧溶媒の効果の最適化。平均粒径（図２０Ａ）、粒子のＰＤＩ（図２０Ｂ）、ナノロミデプシンの薬物濃度（図２０Ｃ）、及び薬物濃度に対する有機対水比の影響（図２０Ｄ）の棒グラフが示される。

【図20C-20D】（上記）

【図21A】追加の光散乱及びＬＣ／ＭＳデータ。スケールアップされたナノロミデプシン製剤の複数バッチにおける、ゼータ電位及びクライオＥＭデータ及び薬物のサイズと濃度のバッチ間の再現性。平均粒径（図２１Ａ）、粒子のＰＤＩ（図２１Ｂ）、及びナノロミデプシンの薬物濃度（図２１Ｃ）の棒グラフが示される。図２１Ｄ－１から２１Ｄ－３は、ゴースト粒子（すなわち、ロミデプシンを含まないＮＰ；図２１Ｄ－１）、水中で形成されたナノロミデプシンＮＰ（図２１Ｄ－２）、及び１×ＰＢＳ中で形成されたナノロミデプシンＮＰ（図２１Ｄ－３）に対する強度によるサイズ分布及びゼータ電位分布を示す。図２１Ｅは、それぞれ図２１Ｄ－１から２１Ｄ－３におけるように形成されたナノロミデプシン粒子の低温電子顕微鏡写真である。

【図21B】（上記）

【図21C】（上記）

【図21D-1】（上記）

【図21D-2】（上記）

【図21D-3】（上記）

【図21E】（上記）

【0024】

Ｉ．一般的考慮事項
Ｉ．Ａ．がんの治療のためのＨＤＡＣ阻害剤の臨床承認
ロミデプシン（イストダックス）は、２００９年１１月に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、以前に少なくとも一回全身療法を受けた再発性又は難治性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）患者の治療用として承認された。２０１１年５月に、以前に少なくとも一回治療を受けた再発性又は難治性（末梢Ｔ細胞リンパ腫）ＰＴＣＬ患者の治療に対して適用が拡大された。ＰＴＣＬにおける適用は迅速承認に基づいて認められる一方（表１）、ＣＴＣＬでの承認は完全承認として付与された。ＰＴＣＬにおける適用は、否定的なランダム化第４相試験を受けて、当該薬物の現在のスポンサーによって最近撤回された。

【0025】

Ｒ／Ｒ ＰＴＣＬ患者の市場からのロミデプシンの除去は、これらの疾患の患者を治療する多くの研究者が、ＰＴＣＬ患者に対する効果的な治療法の欠如を遺憾に思っているため、残念な出来事とみなされている。単剤として、ロミデプシンは患者の約２５％において反応を示した。この薬物の重要な有利な特徴は、そのベネフィットの持続期間が長いことであり、反応が見られる患者ではおよそ１年をはるかに超える場合がある。このベネフィットの持続期間は、Ｒ／Ｒ ＰＴＣＬに対して他の最近承認された薬物でも見られ、薬物の臨床的に意味のある効果であると考えられる（この疾患において承認された他の薬物については表１を参照）。この否定的なランダム化第４相コミットメント試験では、ロミデプシンは、ＣＨＯＰ（すなわち、シクロホスファミド（Cyclophosphamide）、ヒドロキシダウノルビシン（Hydroxydaunorubicin）塩酸塩（塩酸ドキソルビシン）、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）（ビンクリスチン）、及びプレドニゾン（Prednisone））と呼ばれる標準治療化学療法剤と組み合わせて検討された。このレジメンは過度の毒性を引き起こすことが判明し、一人の患者が耐えられる治療量が制限され、否定的な試験結果につながった可能性が高い。これは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤のアザシチジンやデシタビン、抗フォール剤プララトレキサートなどの他の標的薬物と合理的に組み合わせた場合のロミデプシンの利点とは明らかに異なる。これらの組み合わせでは、ロミデプシンは強力な相乗効果を示し、それが臨床に応用され、二種の薬物の組み合わせがこの疾患における任意の他の薬物の組み合わせを上回る活性を生み出した。よって、ロミデプシンの真の価値は、必ずしも化学療法との組み合わせにあるのではなく、他の合理的に標的とされた薬物と組み合わせることにある可能性がある。

【0026】

Ｉ．Ｂ．ロミデプシンの毒性
２０２０年１１月４日の時点で、約１１９８５人のがん患者がロミデプシンの単独療法又は併用療法を受けている（Ｃｅｌｇｅｎｅ，２０２１）。ロミデプシンに関連する最も一般的な有害反応は、消化器系（吐き気、嘔吐、下痢、及び便秘）、血液系（血小板減少症、白血球減少症［好中球減少症及びリンパ球減少症］、及び貧血）、並びに無力状態（無力症、疲労、倦怠感、及び嗜眠）である。ロミデプシンを用いた臨床試験では、肺炎、敗血症、並びにエプスタイン・バーウイルス及びＢ型肝炎ウイルスを含むウイルスの再活性化などの重篤で、時には致死的な感染症が報告されている。肝不全を引き起こすエプスタイン・バーウイルス感染の再活性化が、ロミデプシンのレシピエントで発生した。実際、ＥＢＶの再活性化は、添付文書の枠で囲まれた警告欄に表示されている。合衆国（ＵＳ）、オーストラリア及びヨーロッパでの臨床試験において、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の再活性化がＰＴＣＬ患者の１．１％で発生した。ロミデプシンで一般的に見られる他の種類のイベントには、電解質異常（低マグネシウム血症、低カリウム血症、低カルシウム血症）、発熱、及び味覚障害が含まれうる。ロミデプシンによる過敏症反応の報告がまた少しある（Ｋａｋａｒ等，２０２０）。

【0027】

ロミデプシンに関連する最も重篤な有害事象は心毒性であった。補正ＱＴの延長並びに心電図（ＥＣＧ）の幾つかの変化（Ｔ波及びＳＴ部分変化を含む）が臨床試験で報告されている。ロミデプシンによる最初の臨床経験では、不整脈によるグレード５の死亡例が数例あり、これは薬物間相互作用、つまり特定の制吐薬を含む組み合わせが原因であった。これらの心電図の変化は一過性であり、心血管の機能的変化又は症状とは関連していなかったが、この薬物の使用に関連した致死的な不整脈があったことは十分に証明されている。

【0028】

現在、ロミデプシンでは再発性又は難治性ＣＴＣＬ患者に対する承認は継続して持ち越されている。上で述べたように、以前は未治療のＰＴＣＬ成人患者において実施されたロミデプシン＋ＣＨＯＰベース化学療法の最近報告されたランダム化第３相（第４相コミットメントの一部）（Ｒｏ－ＣＨＯＰ試験と呼ばれる；ロミデプシン（Romidepsin）、シクロホスファミド（Cyclophosphamide）、ヒドロキシダウノルビシン（Hydroxydaunorubicin）塩酸塩（塩酸ドキソルビシン）、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）（ビンクリスチン）、及びプレドニゾン（Prednisone）；ＮＣＴ０１７９６００２）からのデータは、無増悪生存期間の改善を示す主要評価項目を満たさなかったため、否定的として報告された（ＰＦＳ；Ｂａｃｈｙ等，２０２０）。Ｒｏ－ＣＨＯＰの毒性プロファイルは実質的であり、この特定の組み合わせに関する第Ｉｂ／ＩＩ相データ試験と一致することが見出されており、予期せぬ所見はなかった。ロミデプシンの追加による治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）の発生率が高いため、６サイクルのＣＨＯＰを適切に投与する能力が妨げられた。従って、ＣＨＯＰ＋ロミデプシンの併用は、以前は未治療のＰＴＣＬ患者に対する標準治療に進歩をもたらすものではない（Ｂａｃｈｙ等，２０２０）。これらの総合的な要因、最近の市場からの撤退、化学療法との併用で見られる過剰な毒性が、ロミデプシンがＰＴＣＬ患者の重要な満たされていない医療ニーズに対処するという事実と相まって、その有効性を高めながらその傾向を修正する薬物のバージョンを開発する前例のない機会を生み出している。

【0029】

Ｉ．Ｃ．ナノポリマーロミデプシンの利点
ナノ医薬は、薬物動態、バイオアベイラビリティ、及び毒物学的プロファイル、並びに標的化送達を改善する小分子治療薬のためのナノスケール「ソリューション」を提供する。加えて、我々のグループは、その治療指数を高め、ＩＰ保護を延長するために、抗がん薬、神経薬、及び代謝薬のナノ製剤の開発でも最先端にいる。ロミデプシンの物理化学的特性及び関連する薬物毒性を改善するために、薬物のナノテクノロジー由来バージョンの最適化は、ロミデプシンを送達するための非常に有望なアプローチであると考えられるが、これは、効率的、特異的、及び制御された形でのこの薬物の充填と放出を可能にするためである。その小さい粒径、大きな表面積対体積比、コンビナトリアルナノ治療薬の創製能力、その表面上の標的リガンドの多価性を達成する能力などのナノ粒子の独特の特性が、様々ながんのためのナノ粒子ベースの薬物送達に優れた利点をもたらす。加えて、ナノ治療薬は腫瘍微小環境に有利な傾向が実質的に大きく、オフターゲットの毒性を軽減又は完全に排除するという利点があることが広く観察されている。これらの原理に基づいて、ロミデプシンのナノポリマーはロミデプシンの課題の多くを解決することができ、おそらく優れた安全性プロファイル、顕著に改善されたスケジュール、そしておそらく優れた活性と有効性を生み出すことができると考えられる。安全性プロファイルの向上により、ロミデプシンと他の効果的な治療薬を組み合わせる機会が大幅に広がると我々は予想する。

【0030】

我々のグループは、新規なナノ治療用ポリマーを含むロミデプシンとの新規な治療的組み合わせを開拓した。前臨床及び臨床経験において、ロミデプシン＋Ｔ細胞悪性腫瘍に活性な他の薬剤で見られる大きな相乗効果を実証する新たに得られたデータに基づいて、我々は、ロミデプシンに基づいている新規で独創的な比率算出ナノポリマー薬物を設計するプラットフォームを開発した。ここではＰＴＣＬで有効な一揃いの薬物にわたって適用されているこの戦略は、この疾患の新しい標準治療を創製し、この困難な疾患の自然経過を変化させる見込みをもたらす。

【0031】

ＩＩ．定義
ここで使用される用語法は、特定の実施態様を説明することのみを目的としており、本開示の主題を限定することを意図したものではない。

【0032】

次の用語は当業者にはよく理解されていると考えられるが、次の定義は、本開示の主題の説明を容易にするために記載される。

【0033】

以下に別段の定義がない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。ここで用いられる技術への言及は、当該技術分野で一般に理解されている技術を指すことを意図しており、当業者には明らかなそれらの技術の変形又は同等の技術の代替を含む。次の用語は当業者にはよく理解されていると考えられるが、次の定義は、本開示の主題の説明を容易にするために記載される。

【0034】

本開示の主題を説明する際に、多くの技術及び工程が開示されることが理解されるであろう。これらのそれぞれには個別の利点があり、それぞれを他の開示された技術の一又は複数、或いは場合によっては全てと組み合わせて、使用することもできる。

【0035】

従って、明確にするために、この明細書では、個々の工程のあらゆる可能な組み合わせを不必要な形で繰り返すことは控える。それにも関わらず、明細書及び特許請求の範囲は、そのような組み合わせが完全にここに開示され請求項に記載された主題の範囲内にあることを理解して読まれるべきである。

【0036】

長年の特許法の慣例に従って、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含むこの出願において使用される場合、「一つ又は複数」を指す。例えば、「抗体」という語句は、複数の同じ抗体を含む、一つ又は複数の抗体を指す。同様に、「少なくとも一つ」という語句は、あるエンティティを指すためにここで用いられる場合、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、又はそれ以上の（限定されないが、１と１００の間と１００を超える整数値を含む）エンティティを指す。

【0037】

特に明記されない限り、明細書及び特許請求の範囲において使用される成分、反応条件などの量を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。「約」という用語は、ここで使用されて、質量、重量、時間、体積、濃度、又はパーセンテージの量などの測定可能な値を指す場合、特定の量から幾つかの実施態様では±２０％、幾つかの実施態様では±１０％、幾つかの実施態様では±５％、幾つかの実施態様では±１％、幾つかの実施態様では±０．５％、及び幾つかの実施態様では±０．１％の変動を、かかる変動が、開示された方法を実施し、及び／又は開示された組成物を用いるのに適切であるため、包含していることを意味する。従って、別段の指示がない限り、この明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、本開示の主題によって得られることが求められる所望の特性に応じて変動しうる近似値である。

【0038】

ここで端点によって記載される数値範囲には、その範囲内に包含される全ての数値及び分数が含まれる（例えば、１から５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、４．２４、及び５が含まれる）。同様に、ここで端点によって記載される数値範囲には、その範囲内に包含される部分範囲が含まれる（例えば、１から５には、１～１．５、１．５～２、２～２．７５、２．７５～３、３～３．９０、３．９０～４、４～４．２４、４．２４～５、２～５、３～５、１～４、及び２～４が含まれる）。

【0039】

疾患、状態、又は障害の症状の重症度、或いは対象がそのような症状を経験する頻度、或いはその両方が低減される場合、疾患又は障害は「軽減」される。

【0040】

ここで使用される場合、エンティティのリストの文脈で使用される「及び／又は」という用語は、単独で又は組み合わせて存在するエンティティを指す。従って、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」という語句には、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤが個別に含まれるが、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの任意のあらゆる組み合わせ及びサブコンビネーションもまた含まれる。

【0041】

本開示の主題の文脈で使用される「追加の治療活性化合物」又は「追加の治療剤」という用語は、治療されている特定の傷害、疾患、又は障害に対する追加の治療用途のための化合物の使用又は投与を指す。そのような化合物には、例えば、無関係の疾患若しくは障害、又は治療されている傷害、疾患若しくは障害に対する一次治療に反応性ではない可能性のある疾患又は障害を治療するために使用されているものが含まれうる。

【0042】

ここで使用される場合、「アジュバント」という用語は、特定の抗原と組み合わせて使用した場合に免疫反応の増強を誘発する物質を指す。

【0043】

ここで使用される場合、化合物「の投与」及び／又は「を投与する」という用語は、治療を必要とする対象に本開示の主題の化合物を提供することを指すと理解されるべきである。

【0044】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の未記載の要素及び／又は方法工程を排除するものではない。「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、指定された要素及び／又は工程が存在するが、他の要素及び／又は工程を追加することができ、依然として関連する主題の範囲内に含まれることを意味する専門用語である。

【0045】

ここで使用される場合、「から本質的になる」という語句は、関連する開示又は請求項の範囲を、特定された材料及び／又は工程と、それに加えて、開示された及び／又は請求項記載の主題の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。例えば、薬学的組成物は、一つの薬学的活性剤又は複数の薬学的活性剤「から本質的になる」ことができ、これは、記載された薬学的活性剤が、薬学的組成物中に存在する唯一の薬学的活性剤であることを意味する。しかしながら、担体、添加物、及び／又は他の不活性薬剤が、そのような薬学的組成物中に存在し得、かつ存在する可能性が高く、「から本質的になる」という語句の性質内に包含されることに留意されたい。

【0046】

ここで使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句は、特に記載されていないあらゆる要素、工程、又は成分を除外する。「からなる」という語句が、前段部の直後ではなく、請求項の特徴部の文節に現れる場合、その文節に記載される要素のみを限定し；他の要素は全体として請求項から除外されるものではないことに留意されたい。

【0047】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語に関して、これら三種の用語のうちの一つがここで使用される場合、本開示の請求項記載の主題は、他の二種の用語の何れかの使用を含みうる。例えば、幾つかの実施態様では所与の活性薬剤を含む組成物は、幾つかの実施態様ではその同じ活性薬剤から本質的になり得、実際、幾つかの実施態様ではその同じ活性薬剤からなりうる。

【0048】

ここで使用される「両親媒性ポリマー」は、親水性単位鎖と疎水性単位鎖の両方を含むポリマー材料を表す。幾つかの実施態様では、様々なポリマーがＮＰ特性を制御し、ポリマーには、限定されないが、「ステルス」性を付与しうる、疎水性コア及びＰＥＧの様々な各鎖長のｍ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡ、ｍ－ＰＥＧ－ＰＣＬ及びｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡが含まれる。

【0049】

ここで使用される「水溶液」という用語は、ここに記載の重炭酸ナトリウムなどの一般に使用される他の成分を含み得、ペプチドを可溶化しながら水溶液のｐＨを調整するために使用される任意の酸又は塩基溶液を更に含む。

【0050】

ここで使用される「バッチ間」とは、特に薬物充填のための物理化学的特性の観点で、バッチ間で最適な変動を伴う、製剤化が再現可能である方法を表す。

【0051】

「結合」という用語は、限定されないが、酵素と基質、リガンドと受容体、抗体と抗原、タンパク質のＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ、及びＤＮＡ又はＲＮＡ鎖と相補鎖など、分子の相互の接着を指す。

【0052】

ここで使用される「結合パートナー」とは、別の分子に結合できる分子を指す。

【0053】

ここで使用される「生体適合性」という用語は、宿主において実質的に有害な反応を誘発しない材料を指す。

【0054】

ここで使用される「生分解性」とは、体内で非毒性の天然産物に分解でき、容易に除去されうる物質を指す。一般に、生体適合性及び生分解性は、エステル結合を含むＰＬＡ及びＰＬＧＡポリマーと関連付けられることがよくある。幾つかの実施態様では、これらのポリマーの分解は、加水分解によるものではなく、細胞又はインビボの生物学的作用によるものである。生分解性の特性を持つポリマーは、薬物放出に所定の役割を果たす。幾つかの実施態様では、薬物放出は、ポリマー結合の切断、ポリマーマトリックスの浸食、及び粒子からのカプセル化薬物の拡散によって支配される。

【0055】

ここで使用される場合、ペプチドの「生物学的に活性な断片」又は「生物活性断片」という用語は、その天然リガンドに特異的に結合することができ、及び／又はタンパク質の所望の機能を実施することができるより長いペプチド又はタンパク質の天然及び合成部分、例えば目的のエピトープを依然として含み、免疫原性である、より大きなペプチドのタンパク質の断片を包含する。

【0056】

ここで使用される「生体試料」という用語は、限定されないが、皮膚、毛髪、組織、血液、血漿、細胞、汗及び尿を含む、対象から得られた試料を指す。

【0057】

ここで使用される「遠心フィルター」は、遠心分離法又は超遠心分離法によって過剰な未カプセル化薬物を除去するためにナノ粒子を処理するために使用される材料を表す。幾つかの実施態様では、本開示の主題の方法において用いられる遠心フィルターは、約３Ｋから約１００Ｋのカットオフ範囲を有する。

【0058】

遺伝子の「コード領域」は、遺伝子の転写によって生成されるｍＲＮＡ分子のコード領域とそれぞれ相同又は相補的である、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基及び遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドを含む。

【0059】

薬物及び薬物相互作用に関してここで使用される「相補的」とは、一又は複数の治療薬が対象に与えられなかった場合に生じたよりも大きなベネフィットが対象にもたらされる一又は複数の治療薬間の相互作用を指す。幾つかの実施態様では、相補的な薬物相互作用により、対象に相乗的なベネフィットがもたらされる。

【0060】

生体分子に関してここで使用される「相補的」とは、二つの核酸（例えば、二つのＤＮＡ分子）間のサブユニット配列相補性の広い概念を指す。両方の分子のヌクレオチド位置が、通常、所与の位置で互いに塩基対形成できるヌクレオチドによって占められている場合、核酸はこの位置で互いに相補的であると考えられる。従って、二つの核酸は、各分子中の相当数（幾つかの実施態様では少なくとも５０％）の対応位置が、互いに塩基対形成できるヌクレオチド（例えば、Ａ：Ｔ及びＧ：Ｃヌクレオチド対）によって占められている場合、互いに相補的である。従って、第一の核酸領域のアデニン残基は、その残基がチミン又はウラシルである場合、第一の領域と逆平行である第二の核酸領域の残基と特異的な水素結合を形成すること（「塩基対形成」）ができることが知られている。同様に、第一の核酸鎖のシトシン残基は、その残基がグアニンである場合、第一の鎖に対して逆平行である第二の核酸鎖の残基と塩基対形成することができることが知られている。核酸の第一の領域は、二つの領域が逆平行に配置されている場合に、第一の領域の少なくとも一つのヌクレオチド残基が第二の領域の残基と塩基対形成することができるならば、同じ又は異なる核酸の第二の領域に相補的である。限定ではなく例を挙げると、第一の領域は第一の部分を含み、第二の領域は第二の部分を含み、第一の部分と第二の部分が逆平行に配置されるとき、第一の部分の幾つかの実施態様では少なくとも約５０％、幾つかの実施態様では少なくとも約７５％、幾つかの実施態様では少なくとも約９０％、幾つかの実施態様では少なくとも約９５％が第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。幾つかの実施態様では、第一の部分の全てのヌクレオチド残基が、第二の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。

【0061】

ここで使用される「化合物」とは、本開示の主題の方法で使用されるポリペプチド、単離された核酸、又は他の薬剤を指す。

【0062】

「対照」細胞、組織、試料、又は対象は、試験細胞、組織、試料、又は対象と同じ種類の細胞、組織、試料、又は対象である。対照は、例えば、試験細胞、組織、試料、又は対象が検査されるのと正確に又はほぼ同時に検査されうる。対照は、また、例えば、試験細胞、組織、試料、又は対象が検査される時間とは隔たった時間に検査することもでき、対照の検査の結果を記録して、記録された結果を、試験細胞、組織、試料、又は対象の検査によって得られた結果と比較することができるようにすることができる。対照は、また、試験群又は試験対象以外の別の供給源又は類似の供給源から得ることもでき、その場合、試験試料は、試験が実施されている状態、疾患又は障害を有することが疑われる対象から得られる。

【0063】

「試験」細胞は検査されている細胞である。

【0064】

「病態を示す」細胞は、組織内に存在する場合、その組織が存在する（又は組織が得られた）動物が状態、疾患、又は障害に罹患していることを示す細胞である。

【0065】

「病原性」細胞は、組織内に存在する場合、その組織が存在する（又は組織が得られた）動物において状態、疾患、又は障害を引き起こすか、又はその一因となる細胞である。

【0066】

状態、疾患、又は障害に罹患していない動物の組織内に一つ又は複数の細胞が存在する場合、組織は細胞を「正常に含む」。

【0067】

ここで使用される「コンビナトリアル」及び「コンビナトリアル方式」は、ナノ粒子の物理化学的特性を比較するために単一の実験で複数のパラメーターを利用するプロセスを表す。

【0068】

ここで使用される「濃度」は、ナノ粒子中の薬物の量の測定値である。一般に、ナノ粒子中の薬物の濃度は、溶媒と貧溶媒の比、薬物対ポリマー比、混合速度、密度、Ｄ、誘電率、極性、粘度、溶離液強度などの溶媒特性を含む、機械的プロセスと製剤プロセスの両方の影響を受ける。幾つかの実施態様では、粒子は、限定されないが２０μｇ／ｍＬから１０００μｇ／ｍＬを含む濃度でロミデプシンを含みうる。

【0069】

ここで使用される場合、「状態」、「病状」、「疾患」、「病態」、及び「障害」という用語は、罹患細胞又は目的の細胞が、本開示の主題の組成物で標的とされうる生理学的状態を指す。幾つかの実施態様では、疾患は白血病であり、幾つかの実施態様では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

【0070】

ここで使用される「制御された添加」は、限定されないがサイズ、ＰＤＩ、ゼータ電位、及び薬物充填量を含む再現可能な特性を有する粒子を生成するためにシリンジポンプを使用して固定の添加速度（幾つかの実施態様では、約１０から約５００ｍＬ／時間）で一方の相を別の相に添加することを表す。

【0071】

ここで使用される「抗凍結剤」とは、凍結乾燥プロセス中にＮＰの安定性を保護する添加物又は安定剤を表し、これには限定されないが、マンニトール、グルコースなどの添加物が含まれる。

【0072】

ここで使用される場合、「診断」という用語は、状態、疾患、又は障害に対するリスク又は傾向を検出することを指す。どのような診断方法にも偽陽性と偽陰性が存在する。どの診断方法でも１００％の精度をもたらすわけではない。

【0073】

「疾患」とは、動物が恒常性を維持できない動物の健康の状態であり、疾患が改善されない場合、動物の健康は悪化し続ける。

【0074】

対照的に、動物の「障害」とは、動物が恒常性を維持することはできるが、動物の健康状態が、障害がない場合よりも好ましくない健康状態のことである。治療せずに放置しても、障害は必ずしも動物の健康状態の更なる低下を引き起こすとは限らない。

【0075】

ここで使用される場合、「有効量」又は「治療有効量」は、限定されないが、状態、疾患、又は障害の症状を軽減するなど、選択された効果を生み出すのに十分な化合物又は組成物の量を指す。複数の化合物などの組み合わせの形態で化合物を投与する状況では、一又は複数の他の化合物と組み合わせて投与される場合の各化合物の量は、その化合物が単独で投与される場合とは異なりうる。従って、化合物の組み合わせの有効量は、組み合わせを全体として集合的に指し、各化合物の実際の量は変動しうる。「より有効な」という用語は、選択された効果が、比較されている第二の治療と比較して、一つの治療によりより大きな程度で生じることを意味する。

【0076】

ここで使用される「カプセル化効率」は、使用される全薬物と比較した、粒子内にカプセル化された薬物の％を示す。

【0077】

「コード化」とは、ヌクレオチド（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ）の明らかにされた配列又はアミノ酸の明らかにされた配列と、そこから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型として機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。従って、遺伝子に対応するか又は遺伝子に由来するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的系及び／又はインビトロ又はエクスビボ系でタンパク質を産生する場合、遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列（後者に示されているウラシル塩基を除く）と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードしていると言うことができる。

【0078】

ここで使用される場合、特定のタンパク質又はペプチドの「本質的に純粋な」製剤とは、製剤中のタンパク質又はペプチドの重量で、幾つかの実施態様では少なくとも約９５％、幾つかの実施態様では少なくとも約９９％が、特定のタンパク質又はペプチドである製剤である。

【0079】

ここで使用される「製剤変数」は、ナノ粒子の反応混合物における変更のために考慮される変数又はパラメーターを表し、これには、限定されないが、薬物対ポリマー比、界面活性剤の選択、溶媒又は非溶媒に対する界面活性剤の添加、水対有機比、カプセル化効率の向上に寄与するパラメーターが含まれる。

【0080】

「断片」、「セグメント」、又は「部分配列」は、少なくとも一つのアミノ酸を含むアミノ酸配列の一部、又は少なくとも一つのヌクレオチドを含む核酸配列の一部である。「断片」、「セグメント」、及び「部分配列」という用語は、ここでは互換的に使用される。

【0081】

ここで使用される場合、「機能的」生体分子は、それが特徴付けられうる特性を示す形態の生体分子である。例えば、機能的酵素とは、その酵素が特徴付けられうる特徴的な触媒活性を示す酵素である。

【0082】

ここで使用される「親水性」とは、水と容易に相互作用し、及び／又は水に可溶性である高極性基を含む物質を指す。

【0083】

ここで使用される「疎水性」とは、極性の低い基を含む物質を指し、典型的には水への溶解度が低いことを特徴とする。

【0084】

ここで使用される場合、「ＨＤＡＣ活性の阻害剤」、「ＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）」という語句とその文法的変形語は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボを問わず、少なくとも一種のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の少なくとも一つの生物活性の阻害剤を指す。例示的なＨＤＡＣ阻害剤には、限定されないが、ロミデプシン、ボリノスタット、パノビノスタット、ベリノスタット、及びキダミド（すなわち、Ｎ－（２－アミノ－４－フルオロフェニル）－４－［［［（Ｅ）－３－ピリジン－３－イルプロパ－２－エノイル］アミノ］メチル］ベンズアミド）が含まれる。ＨＤＡＣ阻害剤として機能しうる他の化合物には、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸、並びに限定されないが、４－フェニル酪酸、エンチノスタット、ギビノスタット、ドロキシノスタット、ツバスタチンＡ、プラシノスタットなどを含むその誘導体が含まれる。

【0085】

ここで使用される場合、「注射する」、「適用する」、及び「投与する」には、限定されないが、局所、経口、頬側、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内（心室内）、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣、眼、肺、膣、及び直腸アプローチを含む任意の数の経路及び方法による本開示の主題の化合物の投与が含まれる。

【0086】

ここで使用される場合、「リガンド」は、標的化合物又は分子に特異的に結合する化合物である。リガンドは、異種化合物の試料中の化合物の存在を決定する結合反応においてリガンドが機能する場合、化合物「に特異的に結合し」、又は化合物「と特異的に反応性である」。

【0087】

ここで使用される場合、「結合」という用語は、二つの基の間の連結を指す。連結は、限定されないが、イオン結合、水素結合、及び疎水性／親水性相互作用を含む、共有結合又は非共有結合の何れかでありうる。

【0088】

ここで使用される場合、「リンカー」という用語は、共有結合又は非共有結合の何れかで、例えば限定されないが、イオン結合若しくは水素結合若しくはファンデルワールス相互作用を通じて、二つの他の分子を一緒にする分子を指す。

【0089】

ここで使用される「凍結乾燥」は、保存期間、用量ロジスティックス、及び貯蔵ロジスティックスを改善するために、抗凍結剤の有無にかかわらず、粉末形態のＮＰを作製するために利用されるプロセスを表す。

【0090】

ここで使用される「平均粒径」は、一般に、幾つかの実施態様では、球状粒子の流体力学的直径を指す。一般に、ＮＰサイズは、ＰＥＧ表面化学などの表面化学を介してマクロファージの取り込みに役割を果たす。幾つかの実施態様では、ＮＰを調製するために使用されるポリマーのより低い分子量は、より小さいサイズのＮＰに寄与し、その結果、薬物放出動態の変化、より高い循環、肝臓及び脾臓などの器官における蓄積の減少が生じ、より多くの薬物曝露が生物活性の増強に寄与する。

【0091】

ここで使用される「発現レベルを測定する」及び「発現レベルを決定する」という用語は、アッセイの結果を目的の遺伝子又はタンパク質の発現レベルと相関させるために使用できる任意の測定又はアッセイを指す。このようなアッセイには、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルなどの測定が含まれ、ノーザンブロット分析及びウェスタンブロット分析、結合アッセイ、イムノブロットなどのアッセイによって実施されうる。発現レベルには発現率が含まれ得、存在するｍＲＮＡ又はタンパク質の実際の量によって測定されうる。このようなアッセイは、情報を保存し処理し、レベル、シグナル等を定量しるのに役立ち、レベルの比較に使用される情報をデジタル化するプロセス又はシステムと合わせられる。

【0092】

ここで使用される「分子量」という語句は、バルクポリマーの鎖長を指す。幾つかの実施態様では、溶解度、粘度、結晶化度、機械的強度、及び分解速度などの物理的特性が、ポリマーの分子量に依存しうる。

【0093】

「単分散」及び均一溶液は、同義語として又は互換的に使用され、ここでは、同じ又はほぼ同じ直径分布の粒子を単分散と呼ぶ。

【0094】

ここで使用される「多変量」とは、薬物の物理化学的特性を決定するＮＰの調製に含まれる変数の数を表す。

【0095】

ここで使用される「ナノ」、「ナノ材料」、「ナノ粒子」、及び「ＮＰ」という用語は、その間の全ての整数又は分数を含む約１０００ｎｍ以下（限定されないが、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００ｎｍなど）の寸法及び／又はサイズ（例えば、長さ、幅、直径など）を有する少なくとも一つの領域を有する構造を指す。幾つかの実施態様では、寸法はより小さい（例えば、約５００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１２５ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、又は更に約２０ｎｍ未満）。幾つかの実施態様では、寸法は、約２０ｎｍと約２５０ｎｍの間（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、又は２５０ｎｍ）である。一般に、粒子は、サイズ依存性の急速な腎クリアランスを誘導するサイズとサイズ依存性の肝臓蓄積を防ぐサイズの間のサイズ範囲を占める。本開示の組成物は、限定されないが、コア－シェル、円形、球形、楕円体、及びミセル形を含む様々な形状で存在するかもしれない。一般に、球形を有するナノ粒子はナノスフィアと呼ばれる。

【0096】

幾つかの実施態様では、「コア－シェル」ナノ粒子を含むナノ粒子は、両親媒性の生体適合性、生分解性のブロックコポリマーから形成される。幾つかの実施態様では、コア－シェルナノ粒子は、シェルが親水性であり、コアが疎水性であるジブロックポリマーから作製されたナノ粒子である。

【0097】

ここで使用される「ナノ沈殿」は、幾つかの実施態様では、ボトムアップアプローチによってポリマーＮＰを作製する方法を指す。この方法の幾つかの実施態様では、適度な磁気撹拌下で、一方の相が別の相に添加される。幾つかの実施態様では、疎水性薬物をカプセル化するためにナノ沈殿が用いられる。これが選ばれる理由は、その単純性、拡張性、及び制御された添加によるバッチ間の再現性である。この方法では、サイズ、ゼータ電位、薬物充填量などの望ましい特性を達成するために、コンビナトリアル方式での複数パラメーター最適化が容易になる。

【0098】

ここで使用される「操作変数」とは、限定されないが、機械的速度、混合溶媒、添加モード、添加速度、遠心分離速度、及びコロイド溶液の物理化学的特性を改善する時間を含む、変更のために考慮される機械的変数又はパラメーターを表す。

【0099】

ここで使用される「最適化」は、治療効果を発揮する粒子中の望ましく有効な薬物濃度を見出すプロセスを表す。幾つかの実施態様では、プロセス及び製剤化パラメーターをコンビナトリアル方式で含めることによって薬物濃度を最適化するために、多面的アプローチが使用される。ここで使用される「多面的」とは、ナノ粒子の物理化学的特性を最適化するためにナノ沈殿法を操作するアプローチのプロセスを表す。一般に、ナノ沈殿法はパラメーターの最適化を容易にする。他の実施態様では、マルチチャネルシリンジシステムを備えたシリンジポンプが、ナノ粒子を操作するために適用される。

【0100】

ここで使用される「その他の点では同一の試料」という用語は、第一の試料に類似した試料を指し、すなわち、同じ対象から同じ組織又は体液から同じ方法で得られるか、又は異なる対象から得られる同様の試料を指す。「罹患していない対象からのその他の点では同一の試料」という用語は、検査対象の疾患又は障害を有することが知られていない対象から得られた試料を指す。もちろん、試料は標準試料でありうる。類推により、「その他の点では同一」という用語は、対象又は罹患していない対象の領域又は組織に関してもまた使用することができる。

【0101】

ここで使用される「パラレル」とは、コンビナトリアル方式での複数パラメーターの最適化を伴うナノ粒子作製のアプローチを指し、コンビナトリアルアプローチの同義語としてしばしば使用される。

【0102】

ここで使用される「パラメーター」は、ＮＰの物理化学的特性に関して変更のために考慮されるパラメーターを表す。一般に、サイズ、電荷、及び薬物のカプセル化効率に影響を与えるプロセス及び製剤関連のパラメーターがある。

【0103】

ここで使用される場合、薬学的組成物の「非経口投与」には、対象の組織の物理的破壊を特徴とする任意の投与経路及び組織の破壊を介した薬学的組成物の投与が含まれる。従って、非経口投与には、限定されないが、組成物の注射、外科的切開を通した組成物の適用、組織貫通非外科的創傷を通した組成物の適用などによる薬学的組成物の投与が含まれる。特に、非経口投与には、限定されないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射、腫瘍内、及び腎臓透析注入術が含まれると考えられる。

【0104】

幾つかの実施態様では、「粒子数」又は「集団」は、均一サイズ、電荷、形状、及び組成を有するナノ粒子を含む、均一サイズ、電荷、形状、及び組成を有する粒子を含む、ナノ粒子を含む粒子の群を指す。

【0105】

「薬学的組成物」という用語は、少なくとも一種の活性成分を含む組成物を意味し、それにより、組成物は、哺乳動物（例えば、限定されないが、ヒト）における特定の有効なアウトカムについての研究に適している。当業者であれば、当業者のニーズに基づいて活性成分が所望の有効な結果をもたらすかどうかを決定するのに適切な技術を理解し、評価するであろう。

【0106】

「薬学的に許容される」とは、ヒト又は獣医学への適用において生理学的に許容されることを意味する。同様に、「薬学的組成物」には、ヒト及び獣医学用の製剤が含まれる。

【0107】

ここで使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、適切な化合物又は誘導体と組み合わせることができ、組み合わせた後、対象に適切な化合物を投与するために使用できる化学組成物を意味する。

【0108】

ここで使用される場合、「生理学的に許容される」エステル又は塩という用語は、薬学的組成物の任意の他の成分と適合性があり、組成物が投与される対象に有害ではない、活性成分のエステル又は塩の形態を意味する。

【0109】

「複数」とは少なくとも二つを意味する。

【0110】

「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基から構成されるポリマー、関連する天然に存在する構造変異体、及びペプチド結合を介して連結された合成の非天然の類似体、関連する天然に存在する構造変異体、及びその合成の非天然の類似体を指す。

【0111】

「合成ペプチド又はポリペプチド」とは、非天然のペプチド又はポリペプチドを意味する。合成ペプチド又はポリペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成法が当業者に知られている。

【0112】

ここで使用される「防止する」という用語は、何かが起こらないようにすること、又は何かが起こる可能性があり又はおそらく起こることに対して事前の措置を講じることを意味する。医学の文脈では、「防止」とは一般に、疾患又は状態に罹患する可能性を減らすために取られる措置を指す。「防止」は絶対的なものである必要はなく、程度の問題として生じる場合があることに留意のこと。

【0113】

「予防性（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）」又は「予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）」治療は、状態、疾患、又は障害の兆候を示さないか、又は初期の兆候のみを示す対象に施される治療である。予防的又は予防性治療は、状態、疾患、又は障害の発症に関連する病状の発症リスクを低下させる目的で施される。

【0114】

「タンパク質」という用語は、典型的には、大きなポリペプチドを指す。ここでは、ポリペプチド配列を描くために一般的な表記法が使用される：ポリペプチド配列の左端はアミノ末端であり；ポリペプチド配列の右端はカルボキシル末端である。

【0115】

ここで使用される場合、「精製された」という用語及び類似の用語は、天然環境において分子又は化合物に通常は付随する他の成分と比較しての、分子又は化合物の濃縮に関する。「精製された」という用語は、プロセス中に特定の分子の完全な純度が達成されていることを必ずしも示すわけではない。

【0116】

ここで使用される「高度に精製された」化合物は、幾つかの実施態様では９０％を超える純度であり、幾つかの実施態様では９５％を超える純度であり、幾つかの実施態様では９８％を超える純度である化合物を指す。

【0117】

ここで使用される場合、「哺乳動物」という用語は、哺乳綱の任意のメンバーを指し、これには、限定されないが、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばチンパンジー及び他の類人猿及びサル種；家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ；家畜哺乳類、例えばイヌ及びネコ；齧歯類を含む実験動物、例えばマウス、ラット及びモルモット等々が含まれる。この用語は特定の年齢又は性別を指すものではない。従って、雌か雄かを問わず、成体及び新生仔対象、並びに胎仔もこの用語の範囲内に含まれることが意図される。

【0118】

ここで使用される「拡張性」は、製剤のＰＫ及びＰＤ効果を試験するインビトロ及びインビボ実験を実施するために、ナノ製剤を少量から大量へもっていくプロセスを表す。

【0119】

ここで使用される場合、「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性」という語句は、一つ又は複数の望ましくないヒストン脱アセチル化酵素生物活性が発生し、及び／又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤による治療によって改善されうる影響を有する細胞、組織、又は器官を指す。幾つかの実施態様では、望ましくないヒストン脱アセチル化酵素生物活性は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を単独で又は他の治療と組み合わせて用いる治療によってその少なくとも一つの症状が改善され及び／又は阻害される疾患、障害、又は状態に関連する。

【0120】

ここで使用される「溶媒」は、幾つかの実施態様では、使用される有機物質を指し、幾つかの実施態様では、成膜材料、ロミデプシン、及びポリマーのための溶媒として作用する。幾つかの実施態様では、水混和性溶媒、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、又は溶媒の組み合わせを含む極性溶媒が、ナノ粒子の調製のために薬物及びポリマーを溶解するために使用される。溶媒の物理的特性は、ＮＰの物理化学的特性とＮＰを作製する全体的なナノ沈殿法を含み、薬物とポリマーの溶解度に影響する。アセトニトリルは、薬物、ポリマー、及び界面活性剤を溶解してナノ沈殿法でＮＰを調製するために使用される溶媒の特定の例である。幾つかの実施態様では、アセトニトリル（ＡＣＮ）が最高の濃度、最低のＰＤＩ、及び平均サイズをもたらした。ＡＣＮに加えて、他の溶媒も本開示を検討すれば当業者には明らかであろう。

【0121】

ここで使用される「貧溶媒」とは、薬物及びポリマーを含む溶媒を分散させるために用いることができる、限定されないが水又はＰＢＳなどの緩衝液を含む水性溶媒を指す。非溶媒と貧溶媒という用語は互換性がある。幾つかの実施態様では、親水性添加物を非溶媒に添加することもできる。

【0122】

ここで使用される「対象」という用語は、本開示の主題の組成物及び方法を使用した疾患又は障害の治療及び／又は予防が望ましいかもしれない種のメンバーを指す。従って、「対象」という用語は、幾つかの実施態様では、限定されないが、脊索動物門（例えば、硬骨魚綱（硬骨魚）、両生綱（両生類）、爬虫綱（爬虫類）、鳥綱（鳥類）、及び哺乳綱（哺乳類）及びそこに包含される全ての目と科を含む動物界のあらゆるメンバーを包含することが意図される。

【0123】

本開示の主題の組成物及び方法は、温血脊椎動物に特に有用である。従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、哺乳動物及び鳥類に関する。より特定的に提供されるのは、ヒト及び他の霊長類などの哺乳動物、並びに絶滅の危機に瀕しているために重要な哺乳動物（シベリアトラなど）、経済的に重要な哺乳動物（ヒトによる消費のために飼育場で飼育されている動物）及び／又はヒトにとって社会的に重要な哺乳動物（ペットとして又は動物園で飼育されている動物）、例えばヒト以外の肉食動物（ネコ及びイヌなど）、イノシシ属動物（ブタ、雄ブタ、及びイノシシ）、反芻動物（ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダ）、齧歯類（マウス、ラット、及びウサギなど）、有袋類、及びウマに由来する、及び／又はそれらでの使用のための組成物及び方法である。また提供されるのは、絶滅の危機に瀕しており、動物園で飼育されている種類の鳥、並びに家禽、より特定的には家畜化された家禽、例えば、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどの飼っている鳥類を含む鳥類に対する開示の方法及び組成物の使用であり、それらがヒトにとって経済的にまた重要であるためである。従って、また提供されるのは、限定されないが家畜化されたイノシシ属動物（ブタ及び雄ブタ）、反芻動物、ウマ、家禽などを含む家畜に対する開示の方法及び組成物の使用である。

【0124】

ここで使用される「試料」とは、幾つかの実施態様では、限定されないが、正常組織試料、患部組織試料、生検、血液、唾液、糞便、精液、涙、及び尿を含む、対象からの生体試料を指す。試料は、目的の細胞、組織、又は体液を含む対象から得られる任意の他の材料源であってもよい。試料は細胞又は組織培養物から取得することもできる。

【0125】

ここで使用される「標準」という用語は、比較のために使用されるものを指す。例えば、標準は、試験化合物を投与する際に結果を比較するために投与され使用される既知の標準薬剤又は化合物であり得、或いは標準は、パラメーター又は機能に対する薬剤又は化合物の効果を測定する際に対照値を得るために測定される標準パラメーター又は機能でありうる。標準とは、既知の量で試料に添加され、目的のマーカーを測定する前に試料を処理し又は精製若しくは抽出手順に供する際の精製若しくは回収率などを決定するのに役立つ薬剤又は化合物などの「内部標準」を指す場合もある。内部標準は、多くの場合、内因性マーカーと区別できるように、放射性同位体などで標識された目的の精製マーカーである。

【0126】

分析、診断、又は治療の「対象」は動物である。そのような動物には哺乳動物が含まれ、幾つかの実施態様ではヒトが含まれる。

【0127】

ここで使用される場合、「それを必要とする対象」とは、本開示の主題の方法から恩恵を受けるであろう患者、動物、哺乳動物、又はヒトである。

【0128】

「実質的に純粋な」という用語は、天然に付随する成分から分離された化合物、例えばタンパク質又はポリペプチドを記述する。典型的には、化合物は、試料中の全材料の幾つかの実施態様では少なくとも１０％、幾つかの実施態様では少なくとも２０％、幾つかの実施態様では少なくとも５０％、幾つかの実施態様では少なくとも６０％、幾つかの実施態様では少なくとも７５％、幾つかの実施態様では少なくとも９０％、幾つかの実施態様では少なくとも９９％（体積、湿重量又は乾燥重量、又はモルパーセント又はモル分率）が目的の化合物であるとき、実質的に純粋である。純度は、任意の適切な方法によって、例えば、ポリペプチドの場合には、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析によって測定することができる。化合物、例えばタンパク質は、天然に付随する成分が本質的に含まれていない場合、又は天然の状態でそれに付随する天然の汚染物質から分離されている場合にも、実質的に精製されている。

【0129】

「界面活性剤」は、ここではＮＰの安定性をサポートする材料として使用される。幾つかの実施態様では、界面活性剤は、二種の液体の間、気体と液体の間、又は液体と固体の間の表面張力を低下させる化合物である。幾つかの実施態様では、界面活性剤組成物には、限定されないが、ポラクサマー（例えば、ポラクサマー１８８、ポラクサマー２３７、ポラクサマー３３８、及びポラクサマー４０７）、トゥイーン２０、トゥイーン８０、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などが含まれる。一般に、これらの材料は乳化剤として使用され、凝集を避けることができる。

【0130】

ここで使用される「症状」という用語は、患者が経験し、疾患を示す、構造、機能、又は感覚における正常からの逸脱又は任意の病的な現象を指す。対照的に、「兆候」は疾患の客観的な証拠である。例えば、鼻血は兆候である。それは患者、医師、看護師、その他の観察者には明らかである。

【0131】

「治療的」処置とは、病理学的兆候を示す対象に、それらの兆候を軽減又は除去する目的で施される処置である。

【0132】

化合物の「治療有効量」とは、化合物が投与される対象に有益な効果をもたらすのに十分な化合物の量である。

【0133】

ここで使用される場合、「治療薬」という語句は、例えば、疾患又は障害を治療し、阻害し、予防し、その影響の軽減し、その重症度の軽減し、その発症の可能性の低減し、その進行を遅延させ、及び／又は治癒するために使用される薬剤を指す。

【0134】

ここで使用される「治療（処置）」及び「治療する」という用語は、治療的処置と予防的又は防止的手段の両方を指し、その目的は、標的とされる病的状態を予防又は遅らせ（軽減させ）、病的状態を防止し、有益な結果を追求又は獲得し、及び／又は、たとえ治療が最終的に成功しなかったとしても、個体が状態、疾患、又は障害を進行させる可能性を低くすることである。治療を必要とする者には、既にその状態にある者、並びに状態、疾患、又は障害に罹りやすいか、又はその素因がある者、或いはその状態を予防すべき者が含まれる。

【0135】

ここで使用される場合、「ベクター」、「クローニングベクター」、及び「発現ベクター」という用語は、導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進するために宿主細胞に形質導入及び／又は宿主細胞を形質転換するように、ポリヌクレオチド配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができるビヒクルを指す。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが含まれる。

【0136】

ここで使用される場合、「ゼータ電位」という語句は、粒子の表面電位の測定値を指す。本開示の主題の幾つかの実施態様では、粒子は、－２５から＋２５の範囲のゼータ電位を有する。

【0137】

ここに開示される全ての遺伝子、遺伝子名、及び遺伝子産物は、ここに開示される組成物及び方法が適用できる任意の種に由来するホモログ及び／又はオルソログに対応することが意図される。従って、この用語には、限定されないが、ヒト及びマウス由来の遺伝子及び遺伝子産物が含まれる。特定の種に由来する遺伝子又は遺伝子産物が開示される場合、この開示は例示のみを意図しており、それが現れる文脈が明確に示していない限り、限定として解釈されるべきではないことが理解される。

【0138】

ＩＩＩ．例示的な実施態様
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ＨＤＡＣｉポリマーナノ粒子を含む組成物、ナノ粒子の作製に使用されるパラレルアプローチ、及びナノ粒子内の薬物濃度の最適化に含まれる多変数パラメーターに関する。ここでの方法は、限定されないが、薬物／ポリマー比、溶媒／水比、混合速度、制御された添加及びＨＤＡＣｉ ＮＰの製造に使用される処理方法を含む、変更されたパラメーター／操作条件を開示する。他の実施態様では、疎水性ｍ－ＰＥＧ ＰＤＬＬＡ（５Ｋ：１０Ｋ）ポリマーをＨＤＡＣｉのカプセル化に使用して、薬物のＰＫプロファイルを改善した。幾つかの実施態様では、より小さいＨＤＡＣｉ ＮＰの組成物は、薬物放出動態の改善をもたらす非晶質ｍ－ＰＥＧ ＰＤＬＬＡポリマーを含む。幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣｉは、ナノ粒子内にカプセル化され、及び／又はさもなければナノ粒子と会合される。幾つかの実施態様では、代表的なパラメーターの組み合わせは、薬物充填量に関して最適化され、製剤を「ロックダウン」するように選択された。幾つかの実施態様では、ロックダウン製剤化パラメーターは、インビボ研究のためのＨＤＡＣｉ ＮＰのスケールアップを容易にした。幾つかの実施態様では、最適化されたハイスループットパラレル合成又はコンビナトリアルアプローチにより、非常にコスト及びエネルギー効率の高い方法で、現在の濃度、約５００μｇ／ｍＬで３００～４００ｍＬの体積のナノ製剤を達成することが可能になった。例示的なナノ粒子は、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ＰＥＧ－メチルエーテル（ｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ）ナノ粒子である。一部のナノ粒子は、他のポリマー、界面活性剤、脂質、又はポリマーと脂質の組み合わせを用い又は含みうる。また、他の方法を用いて、コア－シェル、円形、スフィア形、球状、ミセル、単層、及び二重層のポリマーソームを生成して、一又は複数のヒストンＨＤＡＣｉを構成することもできる。

【0139】

従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣ阻害剤に対する感受性と関連する疾患、障害、及び／又は状態の予防及び／又は治療に使用するための組成物に関する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、一又は複数種のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる組成物に関する。例示的なＨＤＡＣｉには、ボリノスタット、ロミデプシン、ベリノスタット、パノビノスタット、及びキダミドが含まれる。

【0140】

幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣｉは、ナノ粒子内にカプセル化され、及び／又はさもなければナノ粒子と会合される。例示的なナノ粒子は、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ＰＥＧ－メチルエーテル（ｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ）ナノ粒子であるが、ナノ粒子は、他の脂質、有機分子、及び／又は無機分子を用いるか又は含みうる。

【0141】

従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ナノ粒子内にカプセル化された、及び／又はナノ粒子と会合したヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる組成物に関する。幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣｉは、ボリノスタット、ロミデプシン、ベリノスタット、パノビノスタット、及びキダミド、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、任意選択的に、ＨＤＡＣｉはロミデプシンである。幾つかの実施態様では、ナノ粒子はポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ＰＥＧ－メチルエーテル（ｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ）ナノ粒子である。幾つかの実施態様では、本開示の主題の組成物は、一又は複数種のポリマー及び／又は一又は複数種の界面活性剤を含む。幾つかの実施態様では、一又は複数種のポリマーは、ポリエステル、任意選択的にＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、及び／又はＰＣＬ、それらのコポリマー、及びそれらの混合物からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、ポリマーは、合成ポリマー；生分解性ポリマー；生体適合性ポリマー；両親媒性ポリマー；ジブロックコポリマー；及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリマーを含む。幾つかの実施態様では、ポリマーは、親水性のＰＥＧ鎖、任意選択的にメトキシＰＥＧ、ＰＥＧ－カルボン酸、ＰＥＧ－ヒドロキシル、及び／又はＰＥＧアミンをエンドキャップとして含み、鎖長の範囲は２Ｋ～１０Ｋである。幾つかの実施態様では、ポリマーは疎水性コア形成ポリマーであり、任意選択的にＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、及び／又はＰＣＬからなる群から選択される疎水性コア形成ポリマーである。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、メチルエーテル－ＰＥＧポリラクチド－ｃｏ－グリコリド（ｍＰＥＧ－ＰＬＧＡ，５０：５０）を含む。幾つかの実施態様では、相添加モード、ＨＤＡＣｉ／ポリマー比、ＨＤＡＣｉ／界面活性剤比、溶媒／貧溶媒比、添加速度、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される組成物の一又は複数のパラメーターが最適化される。幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣｉ／ポリマー比は、約１：１０から約１：１００Ｗ／Ｗ、任意選択的に１：１０から約１：５０Ｗ／Ｗの範囲であり；ＨＤＡＣｉ／界面活性剤比は約１：０．０５から約１：０．２Ｗ／Ｗの範囲であり；溶媒／貧溶媒の比は、約１：１０から約１：１の範囲であり、任意選択的に貧溶媒は、水、ＰＢＳ、又は別のイオン性緩衝液からなる群から選択され；及び／又は添加速度は、約１０から約５００ｍＬ／時間、任意選択的に約１０から約５０ｍＬ／時間の範囲である。

【0142】

ＩＩＩ．Ａ．製剤
本開示の主題の組成物（例えば、ＨＤＡＣ ＮＰ）は、適切である可能性のある任意の標的部位に組成物を送達すると期待される任意の製剤又は経路で投与されうる。

【0143】

本開示の主題の組成物は、幾つかの実施態様では、担体、特に限定されないが、ヒトにおいて薬学的に許容される担体などの薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。任意の適切な薬学的製剤を使用して、対象に投与するための組成物を調製することができる。

【0144】

例えば、適切な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質、及び製剤を意図されたレシピエントの体液と等張にする溶質を含みうる水性及び非水性の無菌注射溶液が含まれうる。

【0145】

特に上で述べられた成分に加えて、本開示の主題の製剤は、問題の製剤のタイプを考慮して、当該技術分野で慣用の他の薬剤を含むことができることを理解すべきである。例えば、発熱物質を含まない滅菌水溶液及び非水溶液を使用することができる。

【0146】

本開示の主題の治療計画及び組成物は、限定されないが、サイトカイン及び他の免疫調節化合物を含む追加のアジュバント又は生物学的反応修飾剤と共に使用することができる。

【0147】

ＩＩＩ．Ｂ．投与
本開示の主題の組成物の適切な投与方法には、限定されないが、静脈内投与及び標的組織又は器官（例えば、腫瘍、がん、又はそれらに関連する内皮組織）への直接送達が含まれる。例示的な投与経路には、非経口、経腸、静脈内、動脈内、心臓内、心膜内、骨内（intraosseal）、皮内、皮下、真皮内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、実質性、経口、舌下、頬側、吸入、及び鼻内が含まれる。特定の投与経路の選択は、製剤の性質及び本開示の主題の組成物が作用することが望まれる最終的な標的部位に少なくとも部分的に基づいてなされうる。幾つかの実施態様では、投与方法は、治療が必要とされる部位への組成物の局所化された送達又は蓄積のための特徴を包含する。幾つかの実施態様では、組成物は治療される部位に直接送達される。

【0148】

ＩＩＩ．Ｃ．用量
本開示の主題の組成物の有効用量が、それを必要とする対象に投与される。「治療有効量」又は「治療量」は、測定可能な反応（例えば、治療される対象における生物学的又は臨床的に関連する反応、例えば、限定されないが、腫瘍及び／又はがんの成長及び／又は増殖の減少、及び／又は対象において疾患、障害、及び／又は状態が発症する程度及び／又はタイミングの減少）を生じさせるのに十分な治療組成物の量である。本開示の主題の組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の対象に対して所望の治療反応を達成するのに有効な量の活性化合物を投与するように変えることができる。選択される投薬量レベルは、組成物の活性、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、治療される疾患、障害、及び／又は状態の重症度、及び治療される対象の状態及び以前の病歴に依存するであろう。しかし、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで本開示主題の組成物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることは、当業者の技量の範囲内である。組成物の効力は変化する可能性があるため、「治療有効量」も変化する可能性がある。しかし、ここに記載の方法を使用すると、当業者は、本開示の主題の組成物の効力及び有効性を容易に評価し、それに応じて治療計画を調整することができる。

【0149】

ここに提示される本開示の主題の開示を検討した後、当業者は、特定の製剤、組成物を用いて使用される投与方法、及び治療される特定の疾患、障害、及び／又は状態を考慮して、個々の対象に合わせて投薬量を調整することができる。用量の更なる計算では、対象の身長と体重、症状の重症度と段階、及び追加の有害な身体的状態の存在を考慮することができる。そのような調整又は変更、並びにそのような調整又は変更を行う時期及び方法の評価は、医療分野の当業者にはよく知られている。

【0150】

幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する疾患、障害、又は状態を治療するための方法であって、ここに開示される組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法にも関する。幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する疾患、障害、又は状態は、腫瘍及び／又はがんである。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する疾患、障害、又は状態は、自己免疫疾患、障害、又は状態であり、幾つかの実施態様では、大顆粒リンパ球性白血病でありうる。

【0151】

従って、本開示の主題は、幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する疾患、障害、及び／又は状態を治療するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、該方法は、ナノ粒子内にカプセル化された、及び／又はさもなければナノ粒子と会合されたヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する疾患、障害、及び／又は状態は、腫瘍及び／又はがんである。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬＬ）、及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫からなる群から選択される。

【0152】

本開示の主題は、幾つかの実施態様では、ここに開示される有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することによって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対する感受性と関連する疾患、障害、及び／又は状態を治療するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣｉに対する感受性と関連する疾患、障害、又は状態は、腫瘍及び／又はがん、炎症性疾患、障害、又は状態；自己免疫疾患、障害、又は状態；又はそれらの任意の組み合わせである。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬＬ）、及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫からなる群から選択される。

【0153】

幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する腫瘍及び／又はがんの成長、増殖、及び／又は転移を阻害するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、該方法は、ここに開示される組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。

【0154】

従って、本開示の主題は、幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する腫瘍及び／又はがんの成長、増殖、及び／又は転移を阻害するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、該方法は、ナノ粒子内にカプセル化された、及び／又はさもなければナノ粒子と会合されたヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、本開示の方法は、対象に少なくとも一種の追加の治療活性剤を投与することを更に含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は化学療法剤である。幾つかの実施態様では、化学療法剤は、シクロホスファミド、ドキソルビシン；ビンクリスチン、プレドニゾン、アザシチジン、デシタビン、クラドリビン、メトトレキサート、プララトレキサート、及びシクロスポリンＡ、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0155】

本開示の主題は、幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対する感受性と関連する腫瘍及び／又はがんの成長、増殖、及び／又は転移を阻害するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、該方法は、ここに開示される組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬＬ）、及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫からなる群から選択される。

【0156】

幾つかの実施態様では、本開示の方法は、対象に少なくとも一種の追加の治療活性剤を投与することを更に含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は化学療法剤である。幾つかの実施態様では、化学療法剤は、シクロホスファミド、ドキソルビシン；ビンクリスチン、プレドニゾン、アザシチジン、デシタビン、クラドリビン、メトトレキサート、プララトレキサート、及びシクロスポリンＡ、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0157】

ＩＩＩ．Ｄ．併用療法
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対する感受性と関連する所与の疾患、障害、又は状態が、ＨＤＡＣ阻害剤と、治療される疾患、障害、又は状態に適切な一又は複数種の追加の治療剤で治療される併用療法に関する。従って、幾つかの実施態様では、本開示の方法は、対象に少なくとも一種の追加の治療活性剤を投与することを更に含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなりうる。治療される疾患、障害、又は状態が腫瘍及び／又はがんである幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は化学療法剤でありうる。化学療法（細胞傷害性）剤には、限定されないが、５－フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、ファルネシルタンパク質転移酵素阻害剤、ゲムシタビン、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロ尿素、プリコマイシン、プロカルバジン、ライオキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナム、ビンブラスチン、メトトレキサート、ビンクリスチン、及び任意の類似体及び／又は前述の誘導体又は変異体が含まれる。殆どの化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、副腎皮質ステロイドホルモン、有糸分裂阻害剤、及びニトロソ尿素、ホルモン剤、その他の薬剤、及びそれらの類似体、誘導体、又は変異体のカテゴリーに入る。幾つかの実施態様では、化学療法剤は、シクロホスファミド、ドキソルビシン；ビンクリスチン、及びプレドニゾン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は、シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）、低メチル化剤、クラドリビン、又はプララトレキサートである。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は、ＰＩ３Ｋ、Ｂｃｌ－２、ＢＴＫ、ＨＤＡＣ、ＤＮＭＴ、ＢＲＡＦ、又はＭＥＫを標的とする活性薬剤であり、及び／又はエピジェネティック現象を標的とするものとして分類される活性薬剤であり、及び／又は限定されないがモノクローナル抗体、抗体／薬物コンジュゲート、二重特異性抗体などの免疫学的治療剤、及び／又は限定されないがＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－Ｔベース治療薬（限定されないが市販のＴ細胞治療薬を含む）などの養子細胞療法である。

【0158】

幾つかの実施態様では、腫瘍及び／又はがんは、限定されないが、白金系薬剤、タキサン、アルキル化剤、アントラサイクリン（例えば、限定されないがリポソームドキソルビシンを含むドキソルビシン）、代謝拮抗剤、及び／又はビンカアルカロイドなどの一又は複数種の化学療法剤に対して感受性であり、及び／又は難治性、再発性、及び／又は耐性である。幾つかの実施態様では、がんは卵巣がんであり、卵巣がんは、白金系薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、カバジタキセル）、及び／又はアントラサイクリン（例えば、限定されないがリポソームドキソルビシンを含むドキソルビシン）に対して難治性、再発性、又は耐性である。幾つかの実施態様では、がんは結腸直腸がんであり、がんは、代謝拮抗剤（例えば、葉酸拮抗剤（例えば、ペメトレキセド、フロクスウリジン、ラルチトレキセド）、ピリミジン類似体（例えば、カペシタビン、シトララビン、ゲムシタビン、５ＦＵ））、及び／又は白金系薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）に対して難治性、再発性、又は耐性である。幾つかの実施態様では、がんは肺がんであり、がんは、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、カバジタキセル）、白金系薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）経路阻害剤、上皮増殖因子（ＥＧＦ）経路阻害剤）及び／又は代謝拮抗剤（例えば、限定されないが、ペメトレキセド、フロクスウリジン、又はラルチトレキセドを含む葉酸拮抗剤）、及びピリミジン類似体（カペシタビン、シトララビン、ゲムシタビン、５ＦＵ）に対して難治性、再発性、又は耐性である。幾つかの実施態様では、がんは乳がんであり、がんは、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、カバジタキセル）、ＶＥＧＦ経路阻害剤、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、限定されないがリポソームドキソルビシンを含むドキソルビシン、エピルビシン、バルルビシン、イダルビシン）、白金系薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）、及び／又は代謝拮抗剤（例えば、限定されないが、ペメトレキセド、フロクスウリジン、又はラルチトレキセドを含む葉酸拮抗剤）、及びピリミジン類似体（例えば、カペシタビン、シトララビン、ゲムシタビン、５ＦＵ）に対して難治性、再発性、又は耐性である。幾つかの実施態様では、がんは胃がんであり、がんは、代謝拮抗剤（例えば、限定されないが、ペメトレキセド、フロクスウリジン、ラルチトレキセドを含む葉酸拮抗剤）及びピリミジン類似体（例えば、カペシタビン、シトララビン、ゲムシタビン、５ＦＵ）及び／又は白金系薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）に対して難治性、再発性、又は耐性である。幾つかの実施態様では、ナノ粒子の一部としてのＨＤＡＣｉの提供は、一又は複数種の化学療法剤に対して難治性、再発性、及び／又は耐性であるという腫瘍及び／又はがんの性質を克服する。或いは、又は加えて、本開示の主題の組成物及び方法は、例えば限定されないが、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミドダカルバジン、及びＢＣＮＵ）、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、白金類似体、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、Ａｒａ－Ｃ、ゲムシタビン）、トポイソメラーゼ阻害剤、ステロイド、及びそれらの組み合わせを含む、例えばリンパ腫の治療にルーチン的に使用される活性薬剤を含みうる。

【0159】

幾つかの実施態様では、治療される疾患、障害、又は状態は炎症性疾患、障害、又は状態である。例示的で、非限定的な炎症性疾患、障害、又は状態には、脂肪肝疾患、子宮内膜症、１型及び２型糖尿病、炎症性腸疾患、喘息、肥満、アルツハイマー及びパーキンソン病、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、痛風、炎症性関節炎センター、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、ループス）、血管炎、腫瘍／がんが含まれる。従って、幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は、これらの疾患、障害、又は状態の何れかの治療／管理に典型的に用いられる任意の抗炎症剤でありうる。例示的な抗炎症剤には、限定されないが、アルクロフェナク；ジプロピオン酸アルクロメタゾン；アルゲストンアセトニド；アルファアミラーゼ；アムシナファル；アムシナフィド；アンフェナクナトリウム；アミプリロース塩酸塩；アナキンラ；アニロラック；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；ベンジダミン塩酸塩；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリプロフェン；プロピオン酸クロベタゾール；酪酸クロベタゾン；クロピラック；プロピオン酸クロチカゾン；酢酸コルメタゾン；コルトドキソン；デフラザコート；デソニド；デソキシメタゾン；ジプロピオン酸デキサメタゾン；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；ジフロラゾン二酢酸塩；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサル；ジフルプレドナート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリソン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラク；エトフェナマート；フェルビナク；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナク；フェンクロラック；フェンドサル；フェンピパロン；フェンチアザク；フラザロン；フルアザコート；フルフェナム酸；フルミゾール；酢酸フルニソリド；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオコルチンブチル；フルオロメトロン酢酸塩；フルクアゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；プロピオン酸フルチカゾン；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；プロピオン酸ハロベタゾール；ハロプレドン酢酸塩；イブフェナク；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダプ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール；酢酸イソフルプレドン；イソキセパック；イソキシカム；ケトプロフェン；ロフェミゾール塩酸塩；ロルノキシカム；エタボン酸ロテプレドノール；メクロフェナム酸ナトリウム；メクロフェナム酸；二酪酸メクロリゾン；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；スレプタン酸メチルプレドニゾロン；モミフルマート；ナブメトーン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；パラニリン塩酸塩；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；フェンブタゾングリセリン酸ナトリウム；ピルフェニドン；ピロキシカム；ピロキシカム桂皮酸塩；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナゼート；プリフェロン；プロドリン酸；プロクアゾン；プロキサゾール；クエン酸プロキサゾール；リメクソロン；ロマザリット；サルコレックス；サルナセジン；サルサラート；塩化サンギナリウム；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダク；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルメート；タロサレート；テブフェロン；テニダップ；テニダップナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チオピナク；ピバル酸チキソコルトール；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフルミデート；ジドメタシン；ゾメピラックナトリウム；メトトレキサート、デキサメタゾン、デキサメタゾンアルコール、リン酸デキサメタゾンナトリウム、酢酸フルオロメタロン、フルオロメタロンアルコール、エタボン酸ロトプレンドール、メドリゾン、酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、ジフルプレドナート、リメキソロン、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ロドキサミドトロメタミン、グルココルチコイド、ジクロフェナク、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0160】

幾つかの実施態様では、治療される疾患、障害、又は状態は、自己免疫疾患、障害、又は状態である。例示的な自己免疫疾患、障害、又は状態には、アジソン病、セリアックスプルー病（グルテン過敏性腸症）、皮膚筋炎、バセドウ病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、乾癬／乾癬性関節炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、自己免疫性血管炎、ギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経炎が含まれる。従って、幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は、これらの疾患、障害、又は状態の何れかの治療／管理に典型的に用いられる任意の治療薬であり得、これには、限定されないが、上に列挙した抗炎症薬及び／又はステロイド（限定されないが、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、及びデキサメタゾンを含む）、コルヒチン、ヒドロキシクロロキン（プラケニル）、スルファサラジン、ダプソン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル（セルセプト、マイフォーティック）、アザチオプリン（イムラン）、抗ＩＬ－１生物製剤（限定されないがアナキンラ／キネレット、カナキヌマブ／イラリス、及びリロナセプト／アルカリストを含む）、抗ＴＮＦ生物製剤（限定されないがインフリキシマブ／レミケード、アダリムマブ／ヒュミラ、ゴリムマブ／シンポニ、エタネルセプト／エンブレル、及びセルトリズマブ／シムジアを含む）、抗ＩＬ－６生物製剤（限定されないが、トシリズマブ／アクテムラ及びサリルマブ／ケブザラを含む）、補体阻害剤（限定されないが、エクリズマブを含む）、抗ＣＤ２０生物製剤（限定されないが、リツキシマブ／リツキサンを含む）、Ｂ細胞増殖因子ターゲティング生物製剤（限定されないが、ベリムマブ／ベンリスタを含む）、適応免疫－Ｔ細胞を標的とした治療薬（限定されないが、シクロスポリンを含む）、Ｔ細胞の共刺激及び／又は活性化を標的とした治療薬（限定されないが、アバタセプト／オレンシアを含む）、抗ＩＬ－１７生物製剤（限定されないが、セクキヌマブ／コセンティクスを含む）、イクセキズマブ／タルツ、ブロダルマブ／シリクを含む）、抗ＩＬ－２３生物製剤（限定されないが、グセルクマブ／トレムフィアを含む）、抗ＩＬ－１２／２３生物製剤（限定されないが、ウステキヌマブ／ステラーラを含む）、抗ＩＬ－５生物製剤（限定されないが、メポリズマブ／ヌーカラ、レスリズマブ／シンケア、ベンラリズマブ／ファセンラを含む）、抗ＩＬ－４／ＩＬ－２３生物製剤（限定されないが、デュピルマブ／デュピクセントを含む）、ＩｇＥを標的とする生物製剤（限定されないが、オマリズマブ／ゾレアを含む）、リンパ球の移動／輸送を標的とする薬剤（限定されないが、ベドリズマブ／エンタイビオを含む）、限定されないがＪＡＫ阻害剤（限定されないが、トファシチニブ／ゼルヤンツ、ウパダシチニブ／リンヴォック、及びバリシチニブ／オルミエントなど）を含む、任意の自己免疫疾患、障害、又は状態に関連している任意の生物学的活性の小分子阻害剤、又はこれらの薬剤の何れかの任意の組み合わせ、又はこれらの任意の薬学的に許容可能な塩又は誘導体が含まれる。その全開示が出典明示によりここに援用される米国特許第１００９２５８４号を参照のこと。

【0161】

従って、本開示の主題は、幾つかの実施態様では、炎症性及び／又は自己免疫性の疾患、障害、又は状態を治療する方法にも関する。幾つかの実施態様では、炎症性及び／又は自己免疫疾患、障害、又は状態は、脂肪肝疾患、子宮内膜症、１型及び２型糖尿病、炎症性腸疾患、喘息、肥満、アルツハイマー及びパーキンソン病、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、痛風、炎症性関節炎センター、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、狼瘡）、血管炎、アジソン病、セリアックスプルー病（グルテン過敏性腸症）、皮膚筋炎、バセドウ病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、乾癬／乾癬性関節炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、自己免疫性血管炎、ギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経炎からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、本開示の方法は、本開示の主題の組成物を、少なくとも一種の追加の治療活性剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は、抗炎症及び／又は免疫抑制剤である。

【0162】

本開示の主題は、幾つかの実施態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対する感受性と関連する炎症性及び／又は自己免疫疾患、障害、及び／又は状態を治療するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、該方法は、ここに開示される組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、炎症性及び／又は自己免疫疾患、障害、又は状態は、脂肪肝疾患、子宮内膜症、１型及び２型糖尿病、炎症性腸疾患、喘息、肥満、アルツハイマー及びパーキンソン病、強直性脊椎炎（ＡＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、痛風、炎症性関節炎センター、筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、狼瘡）、血管炎、アジソン病、セリアックスプルー病（グルテン過敏腸疾患）、皮膚筋炎、バセドウ病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、乾癬／乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、自己免疫性血管炎、ギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経炎からなる群から選択される。

【0163】

幾つかの実施態様では、本開示の方法は、対象に少なくとも一種の追加の治療活性剤を投与することを更に含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の追加の治療活性剤は、抗炎症及び／又は免疫抑制剤である。

【0164】

ＩＩＩ．Ｅ．ナノ粒子の合成
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ナノ粒子を合成するための方法、その方法における有用なアプローチ、及びその方法及び組成物によって作製されるナノ粒子（ＮＰ）を提供する。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、幾つかの実施態様ではロミデプシンを含むナノ粒子の合成に関する。幾つかの実施態様では、ここに記載の方法は、多点撹拌機でＮＰ特性を最適化するために、「高スループットパラレル方式」で相から相へのマルチチャネル由来の制御された添加を利用することを含む。粒子は二種の溶液の界面に形成される。幾つかの実施態様では、この方法は半自動であり、明確に定まった形態を有する単分散ＮＰを生成する。ここでの方法は、ナノ粒子を形成する一又は複数種の材料を第二の溶液又は貧溶媒と混合することを含む。この方法を使用して生成された粒子の集団は、所定範囲の均一なサイズと形状を有している。本開示の方法の幾つかの実施態様に従って生成される粒子は、ロミデプシンの比較的正確な所望の濃度を達成することができる。幾つかの実施態様では、生成された粒子は負のゼータ電位を有する。幾つかの実施態様では、ここで生み出された方法は、安定かつ拡張可能な製剤を生成するための、反復的で迅速に最適化する低コストの製造技術である。幾つかの実施態様では、この方法は、非常に効果的で再現可能なスケールアップ合成を記述する。

【0165】

従って、本開示の主題は、幾つかの実施態様では、一又は複数種の薬物分子を含むナノ粒子を製造するための方法にも関する。幾つかの実施態様では、本方法は、（ａ）薬物分子と一又は複数種のポリマーを含む最初又はその後の反応混合物の二つ以上のパラメーターを一又は複数回の反復で変化させる工程；（ｂ）工程（ａ）の変化に基づいて、更なる反応混合物のためにパラメーターの所望の組み合わせを選択する工程；及び（ｃ）更なる反応混合物から薬物分子を含むナノ粒子を沈殿させる工程を含み、それらから本質的になり、又はそれらからなる。幾つかの実施態様では、反応混合物は、溶媒、非溶媒、界面活性剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される反応混合物を更に含む。幾つかの実施態様では、溶媒は有機溶媒である。幾つかの実施態様では、非溶媒は、水性溶媒、水、又はＰＢＳ緩衝液である。

【0166】

幾つかの実施態様では、粒子はポリマーから調製される。ポリマー材料は、生体適合性及び生分解性でありうる。幾つかの実施態様では、組成物は、メトキシポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）、メトキシポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）ジブロックコポリマーを含む。幾つかの実施態様では、生成された粒子の集団は、モノメチルポリエチレングリコール（メトキシＰＥＧ、又はｍＰＥＧ）を有する。幾つかの実施態様では、コアを形成する疎水性ポリマーの鎖長及び分子量は可変である。幾つかの実施態様では、シェルを形成する親水性ポリエチレングリコールの比は可変であり、制御される。ポリエチレングリコールを含む製剤は、粒子の凝集及び「オプソニン化」から粒子を保護するとしばしば考えられる。多くの場合、「ステルス」性を有する生体適合性粒子を作製することが望ましい。幾つかの実施態様では、ステルス性には、免疫系、クリアランスの代謝経路などを回避することが含まれる。幾つかの実施態様では、この（これらの）方法を使用して生成されるナノ粒子組成物は安定であり、ポロキサマー１８８などの非イオン性界面活性剤を含む。組成物は、薬理学的性質及び薬物動態学的特徴、毒性及び有効性の改善を促進する特性を有しうる。幾つかの実施態様では、本開示の主題は、治療用途のためのロミデプシンポリマーナノ粒子製剤の合成及び最適化のための詳細な方法を提供する。

【0167】

ロミデプシンに関連する確立された物理化学的特性及び毒性に関連する課題に対処するために、本開示の主題は、幾つかの実施態様において、薬理学的挙動が改善された薬物のバージョンを合成するための最適化されたナノテクノロジーアプローチを提供する。これらのアプローチにより、効率的な処方方法での薬物の高度な充填と放出を可能としうる。ナノ粒子の小さいサイズ、大きな表面積対体積比、合理的なコンビナトリアルナノ治療薬の創製能力、その表面上のホーニングモチーフを生体共役反応させる能力などのナノ粒子の独特の特性が、伝統的な小分子創薬設計及び発見と比較して多くの利点をもたらす。

【0168】

ナノ粒子の特性及びここに記載の方法論に基づいて、ロミデプシンを含むナノ粒子（その実施態様をここでは「ナノロミデプシン」及び「ＮａｎｏＲｏｍｉ」と呼ぶ）は、実質的に改善された薬物特性を持つナノ治療薬を生成し、それを疾患治療のためのより有利な薬物にする。本開示の主題は、幾つかの実施態様では、ロミデプシンで製剤化した新規ポリマーナノ粒子に関する。ナノ粒子の製剤化は、期待される望ましいサイズ、カプセル化効率、及び薬物動態パラメーターを容易にするように操作された。列挙されたパラメーターの一部又は全てを含む、列挙されたパラメーターの一又は複数は、ナノ粒子の安定性、サイズ、多分散性指数（ＰＤＩ）、ゼータ電位、及び薬物のカプセル化に影響を与える役割を果たしうる。例示的なパラメーターには、次のうちの一又は複数が含まれうる：０から約０．３の範囲のＰＤＩ、約３０～１５０ナノメートルの範囲のサイズ、球状、棒状、及び円筒状、任意選択的に球状からなる群から選択される形態；約－３０から約＋３０の範囲のゼータ電位、約５０～６０％のカプセル化効率；約５００から約６００μｇ／ｍＬの濃度；約２Ｋから約１０Ｋの範囲のＰＥＧの使用；及び約４Ｋから約２５Ｋのポリマーサイズ。限定されないが、コア形成ブロックポリマーの化学的性質、親水性ブロックポリマーの分子量、ポリマーの濃度、溶媒の制御された添加、溶媒と貧溶媒の比、貧溶媒のｐＨ、界面活性剤の選択とパーセント濃度、及び粒子のコアシェル性を含む要因が、ナノ粒子の物理化学的特性に影響を及ぼす。本開示のナノ粒子は、薬物の薬物動態学的特徴を改善することが示されている。

【0169】

幾つかの実施態様では、本開示の方法は、相添加モード、薬物／ポリマー比、薬物／界面活性剤比、溶媒／貧溶媒比、添加速度、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される一又は複数のパラメーターの最適化を含む。幾つかの実施態様では、薬物はＨＤＡＣｉであり、任意選択的にロミデプシンである。幾つかの実施態様では、ＨＤＡＣｉ／ポリマー比は、約１：１０から約１：１００Ｗ／Ｗ、任意選択的に１：１０から約１：５０Ｗ／Ｗの範囲であり；ＨＤＡＣｉ／界面活性剤比は、約１：０．０５から約１：０．２Ｗ／Ｗの範囲であり；溶媒／貧溶媒比は、約１：１０から約１：１の範囲であり、任意選択的に、貧溶媒は、水、ＰＢＳ、又は別のイオン性緩衝液からなる群から選択され；及び／又は添加速度は、約１０から約５００ｍＬ／時間、任意選択的に約１０から約５０ｍＬ／時間の範囲である。

【実施例】

【0170】

次の実施例は例証的な実施態様を提供する。本開示及び当業者の一般的な水準に鑑みると、当業者であれば、次の実施例が例示のみを目的としており、本開示の主題の範囲から逸脱することなく数多くの変更、修正、及び変形を採用できることが理解されるであろう。

【0171】

更なる説明がなくとも、当業者であれば、前述の説明と次の例証的な実施例を使用して、本開示の主題の化合物を製造しかつ利用し、本開示の主題の方法を実施することができると考えられる。従って、次の実施例は、本開示の主題の実施態様を特に指摘するものであり、本開示の残りの部分を如何なる形でも限定するものとして解釈されるべきではない。

【0172】

［実施例のための材料と方法］
［細胞株］Ｔ細胞リンパ腫細胞株ＨＨ及びＨ９（両方とも皮膚Ｔ細胞リンパ腫；ＣＴＣＬ）、ＳＵＰ－Ｔ１（Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫）、並びにＦＥＰＤ及びＳＵＰ－Ｍ２（ＡＬＫ陰性未分化大細胞リンパ腫；ＡＬＣＬ）をＡＴＣＣから入手した。ＮＫＬ（ナチュラルキラー細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫）細胞株（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等，１９９６）をまた用いた。皮膚メラノーマ細胞株ＦＭ３－２９をＤＳＭＺから入手した。大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）白血病細胞株ＴＬ－１は、Ｌｏｕｇｈｒａｎ研究室で作製した。全ての細胞は、加湿インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ_２で増殖させた。細胞株はショートタンデムリピートＤＮＡプロファイリング（Ｇｅｎｅｔｉｃａ ＤＮＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって確認し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ ＰＬＵＳ検出キット（Ｌｏｎｚａ ＃ＬＴ０７－７１０）を使用してルーチン的にマイコプラズマ汚染について検査した。実験は解凍後６週間以内に実施した。ＨＨ、Ｈ９、ＳＵＰ－Ｔ１、ＦＥＰＤ及びＦＭ３－２９細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含むＲＰＭＩ－１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＡＺ）中で培養した。ＳＵＰ－Ｍ２細胞は、２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。ＴＬ－１細胞は、１０％ＦＢＳを含み、２００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ カタログ＃１３０－０９７－７４３）を補充したＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。ＮＫＬ細胞は、１０％ＦＢＳを含み、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。

【0173】

［化合物］ロミデプシン（デプシペプチド，ＦＫ２２８，ＦＲ９０１２２８，ＮＳＣ６３０１７６）は、ｅＮｏｖａｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（カタログ＃０５３４２；Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から購入した。脂質１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び１，２－ジオレオイルｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩；ＰＥＧ２０００ ＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓで注文した。コレステロールとＰｏｌａｘｅｍｅｒ １８８はＳｉｇｍａで注文し、全ての有機溶媒Ａｍｉｃｏｎフィルター、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｉｎｉｓａｒｔシリンジフィルター及び一般補給品はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃで注文し、２０％エタノール中のＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４ＢはＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ社から購入した。全てのポリマーは、Ａｋｉｎａ社の一部門であるＰｏｌｙｓｃｉｔｅｃｈで注文した。

【0174】

［ナノロミデプシンリポソームの調製と特性評価］脂質薄膜は、２５ｍｇ／ｍＬ濃度の脂質と１ｍｇ／ｍＬ濃度のロミデプシンのクロロホルム溶液を蒸発させることによって調製した。中性リポソームは、脂質ＤＳＰＣ：ＤＯＰＥ：ＰＥＧ２０００ＰＥ及びロミデプシンをこの順序及びモル比５．６７：２．８３：１．０：０．５で混合することによって調製した。次に、中性＋５％コレステロール製剤を、全容量１ｍＬの脂質に対してそれぞれモル比５．３：２．６７：１．０：０．５：０．５で混合した。ロミデプシンを１ｍｇ／ｍＬの濃度でクロロホルムに溶解し、０．５Ｍ比の溶液を脂質試料に添加した。脂質混合物をガラス試験管内で完全に混合し、ついでクロロホルムを窒素下３５～４０℃において２～３時間蒸発させて完全に乾固させた（試験管の周りに薄膜を形成した）。微量のクロロホルムをロータリーエバポレーターにより減圧下で３０分かけて除去した。次に、リポソームをヒートシェーカー（６０℃；６００ｒｐｍ）内で１×ＰＢＳで２時間再水和させ、１５分ごとにボルテックスしてミセルに転換し、リポソームに合成し、これをその後、超音波浴に２０分間入れ、細分化してリポソーム試料を均質化した。

【0175】

ついで、０．１μｍのポリカーボネート膜を取り付けたＡｖａｎｔｉ Ｍｉｎｉ押出機（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用し、シリンジ間でリポソーム溶液を１１回往復させることにより、リポソームをサイズ調整した。最終試料を収集し、その後、１×ＰＢＳを溶離液として使用してセファロースビーズ上のサイズ排除カラムによって精製し、遊離薬物を除去した。

【0176】

［ナノロミデプシンポリマー粒子の調製と特性評価］ナノロミデプシンポリマー粒子は、バルクナノ沈殿によって調製した。ｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡポリマー（図１）、ロミデプシン、及びｐｏｌａｘａｍｅｒ １８８のアセトニトリル溶液を、１０ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、及び１ｍｇ／ＭＬ濃度で調製した。それぞれ０．５ｍＬのポリマー及び薬物溶液（薬物／ポリマー比；１／５）と０．１ｍＬの界面活性剤（薬物に対して１０％ｗ／ｗ）を混合し、５００ｒｐｍで連続的に撹拌した。Ｍｉｌｌｉ Ｑナノ純水（有機／水性比；１：９）を１０ｍｌ／時間の速度で添加した。その期間にわたって溶媒分散を記録し、有機溶媒を完全に除去するために更に３時間撹拌を続けた。最後に、２４℃において２０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離によってナノ粒子を取り出した。粒子は、ナノ純水又は１×ＰＢＳ中に再構成することによって収集した。ナノロミデプシン粒子は４℃において保存した。これらの製剤の粒径と形態は、ＤＬＳとクライオＥＭを使用して評価した。薬物濃度は、以下に記載される分析的質量分析法、ＬＣ－ＭＳで定量した。

【0177】

［動的光散乱（ＤＬＳ）］ＤＬＳ測定をポリマーナノ粒子について実施した。粒子の粒径分布を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓモデルＺＥＮ３６９０，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＷＲ１４１ＸＺ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用した動的光散乱によって分析した。粒径に対する特定のサイズの粒子のパーセンテージを２５℃において３回測定した（図２Ａ～２Ｃを参照）。

【0178】

［電子顕微鏡法］ポリマー粒子のサイズと形態は、１２０ｋＶ クライオ電子顕微鏡（クライオＥＭ）で動作するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０（ＦＥＩ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ）透過型電子顕微鏡を使用して測定した。クライオＥＭ試料は、標準的な検証方法によって調製した。約３μｌの試料溶液のアリコートをグロー放電有孔カーボンコートグリッド（２／１－３Ｃ Ｃ－Ｆｌａｔ；Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ，ＵＳＡ）上に塗布し、過剰な溶液を濾紙で吸い取った。次に、試料を－１８０℃の液体エタンのリザーバ中に素早く浸漬した。ガラス化した試料を液体窒素中に保存し、Ｇａｔａｎ ６２６低温貯蔵サンプルホルダー（Ｇａｔａｎ，Ｐｌｅａｓｏｎｔｖｉｌｌｅ，ＣＡ）に移し、ついで－１８０℃において顕微鏡内に維持した。全ての画像は、低温条件下でＧａｔａｎ ４Ｋ×４ＫピクセルＣＣＤカメラを用いて、標本レベル及び－１から－３μｍの範囲の公称デフォーカスで、それぞれ９６００倍又は２９０００倍の倍率、１．１２ｎｍ又は０．３７ｎｍのピクセルサイズで記録した。粒子は２９０００倍で記録し、画像は５０ｎｍスケールバーで記録した。例示的な画像を図３に示す。

【0179】

［ナノ粒子中のロミデプシンのＬＣ－ＭＳ定量］ＬＣ－ＭＳは、ＴＱ－Ｓ分光計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で実施した。試料は、粒子サイズ１．７μｍ、ＩＤ２．１ｍｍ×５０ｍｍ長のカラムのＡｃｑｕｉｔｙ Ｃ１８カラムＢＥＨハイブリッドテクノロジーを通過させることによって分析した。カラム温度５０℃、注入量１μＬに設定し、流量０．５ｍＬ／分で２分間、移動相Ａ：水＋０．１％ギ酸、移動相Ｂ：ＭｅＯＨ＋０．１％ギ酸の勾配で溶出させた。例示的な結果を図４に示す。

【0180】

［細胞生存率アッセイ］細胞生存率については、細胞株を４８ウェルプレートに適切な細胞密度（ＳＵＰ－Ｔ１、ＨＨ、ＮＫＬ、ＴＬ－１は１０００００細胞／ｍｌ／ウェル、Ｈ９、ＦＥＰＤ ＳＵＰ－Ｍ２及びＦＭ３－２９は５００００細胞／ｍｌ／ウェル）で播種した。ナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ ＰＢＳ、ナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ Ｈ_２Ｏ、ナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＬＧＡ Ｈ_２Ｏ、又は未カプセル化ロミデプシンを、０．０３ｎＭから３０ｎｍの範囲の濃度で細胞に添加した。同じ濃度のポリマーカプセル化ロミデプシンを得るために、空のゴーストナノｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ及びナノｍＰＥＧ ＰＬＧＡを標準対照として様々な希釈度で様々な細胞株に添加した。３７℃、５％ＣＯ_２で２４、６０、及び９６時間インキュベートした後に細胞を収集し、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）発光試薬を使用して、ＡＴＰの存在量を定量することによって細胞生存率をアッセイした。ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）試薬を１：１の比で添加して１５分後、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でルミネセンスを読み取った。ルミネセンスは、生存率１００％と定義した未治療対照に対して正規化した。

【0181】

［フローサイトメトリー］細胞を３０時間の処理後に回収し、ＰＢＳで二回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、７０％メタノールで透過処理した後、関連抗体：ＨＤＡＣ１ポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、ウサギ抗アセチルヒストンＨ３ Ｋ９／Ｋ１４、及びウサギ抗アセチルヒストンＨ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共にインキュベートした。室温における３０分のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで二回洗浄し、ＦＩＴＣ結合二次ヤギ抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を添加した。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、その後ＰＢＳで洗浄した。二回目の洗浄後、細胞を、４％ＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターでのシグナル取得の準備を整えた。細胞株におけるアポトーシスは、蛍光色素結合抗切断型ＰＡＲＰ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、切断型ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ－１（ＰＡＲＰ）の存在によって評価した。染色後、Ａｔｔｕｎｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して細胞を取得し、ＦｌｏＪｏ解析ソフトウェアを使用してデータを解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、各マーカーの発現レベルを示した。

【0182】

［ウェスタンブロット］細胞は、通常の増殖条件下で２４時間、各薬物及びナノポリマーについて指定された濃度でインキュベートした。全細胞可溶化物からのタンパク質を１２％から２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。膜をリン酸緩衝生理食塩水及び５％脱脂粉乳を含む０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００でブロックし、その後、特異的一次抗体で一晩プローブした。抗体は、対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて検出した。ブロットはＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＬＡＲＩＴＹ^ＴＭ及びＣＬＡＲＩＴＹ ＭＡＸ^ＴＭＥＣＬ化学発光基質検出試薬を使用して展開した。シグナル検出とイメージングは、シグナル定量化を伴うＣＨＥＭＩＤＯＣ^ＴＭシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してキャプチャし解析した。使用したモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は次の通りであった：アセチル化ヒストンＨ３、アセチル化ヒストンＨ４、ビンキュリン、及びβ－アクチン（全てＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）。

【0183】

［インビボ研究］単回投与毒性研究では、ＭＴＤ研究のために５から７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを選択した。動物は、体重に基づいて用量群にランダムに割り当てた。群に割り当てる前に、動物の体重変動は平均体重の２０％を超えなかった。マウスは、ナノロミデプシン（ＮａｎｏＲｏｍｉ）と遊離ロミデプシンの二つのコホートに分けた。各コホートはサブコホートに分けた。各サブコホート（ｎ＝５）は、腹腔内（ＩＰ）及び静脈内（ＩＶ）投与経路により、１、２、３、５及び８ｍｇ／ｋｇ体重の用量で単回治療を受けた。ＮａｎｏＲｏｍｉは、無菌条件下でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。ロミデプシンはＤＭＳＯ中で調製し、その後無菌条件下でＰＢＳで希釈した。反復投与ＭＴＤでは、マウスを２及び３ｍｇ／ｋｇのナノロミデプシンＰＤＬＬＡ及び遊離ロミデプシンで１、４、８及び１１日に、腹腔内治療した。マウスは最後の治療後７日間モニタリングした。単回投与及び反復投与の毒性研究では、体重減少と臨床スコアの二つのエンドポイントを使用した。臨床徴候は、活動、外観（被毛状態と目／鼻）、姿勢、及び身体状態を観察することによってスコア化し、それぞれ最大３点とした（０、正常；１、正常から僅かな逸脱；２、正常から中程度の逸脱、３、正常から重大な逸脱）。安楽死の基準には、２０％を超える体重減少か、６を超える臨床スコアに達したかを含めた。

【0184】

薬物動態研究では、マウスを二つの治療コホートに分け、一方はナノロミデプシンＰＤＬＬＡ、他方は遊離ロミデプシンとした。各治療コホートは、投与経路（ＩＰ又はＩＶ）に応じて二つのサブコホートに更に分けた。各サブコホート（ｎ＝２１）は、ＮａｎｏＲｏｍｉ又は遊離ロミデプシンの我々の単回投与毒性研究から定義された1/2ＭＴＤの単回治療（２．５ｍｇ／ｋｇ体重）を受けた。治療後１、３、６、１８、２４、４８及び７２時間でマウスを屠殺した（各時点当たりｎ＝３）。血液（約１ｍＬ）をＣＯ２麻酔下で終末心臓穿刺により採取し、ＥＤＴＡコートＫ３ＥＤＴＡチューブに採取し、続いて遠心分離（２０００×ｇで１５分間）して血漿を単離した。血漿を凍結保存バイアルに入れ、液体窒素を使用して瞬間凍結させることによって保存した。３匹の未治療マウスからの血液を治療開始時（Ｔ＝０）に採取し、対照として使用した。ロミデプシンのレベルは、ストックロミデプシンで得られた標準曲線を用いたタンデム質量分析検出と組み合わせた逆相液体クロマトグラフィーに基づく検証方法によって定量した。

【0185】

［データ解析］血漿中の遊離ロミデプシン／ナノロミデプシンＰＤＬＬＡの薬物動態プロファイルを、ＰＫＳｏｌｖｅｒソフトウェアを使用するノンコンパートメント解析によって解析し、最大濃度（Ｃｍａｘ）、Ｃｍａｘの時間（Ｔｍａｘ）、曲線下面積（ＡＵＣ）及び半減期などの薬物動態パラメーターを決定した。有効性研究では、５から７週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、蛍光タンパク質Ｃｈｉｌｉ（それぞれ５５４ｎｍと５８１ｎｍにｄＴｏｍａｔｏ吸収極大と発光極大）と、バイオルミネセンス生成タンパク質であるホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を発現するＨ９細胞を側腹部の皮下に３００万個注射した。インビボＢＬＩ解析は、低温冷却されたＬａｇｏ Ｘ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）で行った。細胞接種の４日後から週に二回マウスを画像化した。異種移植腫瘍が１０^７超の生物発光強度（光子／秒）に達したところで、マウスをそれぞれ１０匹ずつの次の４治療群に無作為化した：（ｉ）通常のＰＢＳのみで対照群を治療；（ｉｉ）ゴーストナノ粒子（ｉｉｉ）ロミデプシン（２ｍｇ／ｋｇ）（ｉｖ）ナノロミデプシン（２ｍｇ／ｋｇ）は１、４、８、及び１１日目に腹腔内注射により投与した。ベースライン画像データは、全マウスについて１日目（薬物投与の開始）と治療前の薬物投与の毎日、記録した。動物の数、研究デザイン、及び動物の治療は、米国バージニア州シャーロッツビルにあるバージニア大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって審査され、承認された。

【0186】

実施例１
ポリマーナノ粒子へのロミデプシンのカプセル化
我々は最初に、ロミデプシンをカプセル化するためにリポソームナノ製剤を選択した。リポソームは、インビボでの細胞及び組織の取り込み及び化合物の体内分布の改善に大きく貢献するため、広く受け入れられているナノ担体である。我々は、幾つかの実施態様ではＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、及び／又はＰＥＧを含む、標準的な脂質組み合わせを使用することによって、ロミデプシンの中性リポソーム製剤を調製した。この方法により、中性リポソーム及びコレステロールリポソームにそれぞれ１３１ｎＭ及び１４８ｎＭの許容可能なサイズ、０．１４及び０．０８の多分散性指数（ＰＤＩ）のナノ粒子が得られた。しかし、リポソームの調製中に脂質にコレステロールを添加した後でも、粒子中の薬物の濃度は非常に低い（１％未満）か、無視できるほどであった。これらの最適ではない結果を考慮して、我々はナノ粒子の再設計を続けた。

【0187】

ポリマーナノ粒子は、ここ数年にわたり、がん研究並びにターゲティング薬物送達においてますます注目を集めている。ＦＤＡ承認の生分解性両親媒性ブロックコポリマーであるポリ乳酸－グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）からポリｄｌ－乳酸（ＰＤＬＬＡ）ポリマーが、生体適合性ＮＰの創製において重要な役割を果たしている。従って、我々は努力を継続し、分子量（Ｍｗ 約５０００：１００００Ｄａ）のｍ－ＰＥＧ ＰＤＬＬＡを選択し、ボトムアップ「バルクナノ沈殿又は溶媒置換」法によってロミデプシンポリマーナノ粒子を調製した。このジブロックコポリマーの疎水性により、疎水性薬物の捕捉が促進される可能性がある。我々は、特定の薬物／ポリマー／界面活性剤比を使用したバルクナノ沈殿法を開発した。薬物／ポリマー（Ｄ／Ｐ）比、有機対水（Ｏ／Ｗ）比、薬物／界面活性剤（Ｄ／Ｓ）比、温度、及び溶媒の選択を変えて、最適なサイズとＰＤＩを得て、粒子内の薬物濃度を改善することにより、体系的な実験操作条件を実験の設計に含めた。Ｄ／Ｐ；１：５、Ｏ／Ｗ；１：９；Ｄ／ポラキサマー１８８ １：０．１（ｗ／ｗ）４℃で、より高い薬物充填量が達成された。この方法により、０．２４から０．２６の妥当な多分散性指数（ＰＤＩ）と６０～７０ｎＭのｚ平均を有するナノ粒子が得られた。インビボ実験に対する薬物濃度を改善するために、５ＫのＰＥＧ、（５Ｋ：２０Ｋ）のＰＥＧ対ポリマーを維持するより高分子量のＰＤＬＬＡ、（ＬＡ：ＧＡ比を５０：５０に維持する２Ｋ：１０Ｋ、５Ｋ：２０Ｋ、５Ｋ：４５Ｋ、５Ｋ：７５Ｋ）を含む様々な比のｍ－ＰＥＧ及びＰＬＧＡ、並びに様々な界面活性剤と室温及び４℃におけるＤ／Ｐ比を有するｍ－ＰＥＧ－ＰＣＬを含む他のタイプのポリマーを調査する。上記の製剤／ナノ粒子は、４℃において１年を超えて安定であった。持続放出速度をもたらすロミデプシンの最適なカプセル化を伴うモデルナノポリマースカフォールド、ナノロミデプシンが達成された。

【0188】

実施例２
ナノロミデプシンポリマーは細胞生存率を低下させ、がん細胞にアポトーシスを誘導する
がん細胞株ＨＨ及びＨ９（ＣＴＣＬ）、ＳＵＰ－Ｔ１（Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫）、ＦＥＰＤ（ＡＬＣＬ）、ＳＵＰ－Ｍ２（ＡＬＫ－ＡＬＣＬ）、ＮＫＬ（ナチュラルキラー細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫）、ＴＬ－１（ＬＧＬ白血病）及びＦＭ３－２９（皮膚メラノーマ）においてロミデプシンとロミデプシンを含む三種のナノポリマーで処置した後の細胞生存率に対する反応のパターンを特定するために比較濃度－反応評価を実施した。ＩＣ_５０（増殖能力の５０％を阻害）を、３０、６０、及び９６時間における、０．３～３０ｎＭのロミデプシン及びナノロミデプシンポリマーの増加用量範囲の分析後に決定した。（図５Ａ及び５Ｂ）。空のゴーストポリマーはそれに応じて希釈した。ナノロミデプシンの３種の製剤は全て、濃度及び時間依存的に全てのがん細胞株の細胞増殖を阻害した。（図５Ｂ）。５０％生存率の阻害能力（ＩＣ_５０）は、試験した様々な細胞株に対して三種のナノ製剤で様々であった。６０時間の時点で、がん細胞株は一貫してナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ Ｈ_２Ｏ（０．７～１．９ｎＭ範囲のＩＣ_５０；平均１．２；）に対して最も感受性が高く、これはロミデプシン（０．６～１．９ｎＭ範囲のＩＣ_５０；平均１．２２５；表２）と非常に類似していた。ナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ ＰＢＳ（ｎＭ範囲１．３～７．５のＩＣ_５０；平均２．８１２；表２）及びナノｍＰＥＧ ＰＬＧＡ（ｎＭ範囲１．１～５．５のＩＣ_５０；平均２．８７５；表２）は両方とも、ロミデプシン及びナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ Ｈ_２Ｏと比較して効力が低かった。対応する空のゴーストナノ粒子を調査したところ、試験したどのがん細胞株でも増殖の阻害はなかった（図５Ａ）。ラットＮＫ細胞の構造的及び機能的特徴を持つＦ３４４ラットの自然発生白血病細胞株ＮＫＬ－１６におけるロミデプシンに対する三種のナノロミデプシン薬物の細胞傷害活性の比較では、ヒトがん細胞株と類似していることが示され、ナノロミデプシンｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ Ｈ_２Ｏが、三種の製剤の中で最も強力で、試験した３つ全ての時点（２４、４８、及び７２時間）でＩＣ_５０がロミデプシンと非常に類似していた（図５Ｂ）。

【0189】

フローサイトメトリーにより、切断型ＰＡＲＰの発現の増加によって示されるように、三種のナノポリマー全てでの処置がロミデプシンと同様のアポトーシスを誘導したことが実証された（図６Ａ及び６Ｂ）。しかし、ナノロミデプシンｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ ＰＢＳ及びナノロミデプシンｍ－ＰＥＧ ＰＤＬＬＡ Ｈ_２Ｏは、ロミデプシン及びナノロミデプシンｍ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡと比較して、増加したＰＡＲＰ切断を示した。

【0190】

実施例３
ナノロミデプシンＰＤＬＬＡは全ての細胞株にわたり最も強力なロミデプシンナノポリマーであった
アポトーシスのフローサイトメトリー解析及び細胞生存率アッセイから、三種のナノポリマー全てが、疾患及び組織学に依存しない形で、がん細胞株において有意な細胞死及びアポトーシスの誘導を示したことが明らかであった。全てのがん細胞株にわたって、６０時間の時点で、Ｎａｎｏ－Ｒｏｍｉ ｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡ Ｈ_２Ｏが三種のナノロミデプシンポリマー全ての中で最も低いＩＣ_５０値を示し、ＩＣ_５０値（１．２６＋／－０．４０ｎＭ）はロミデプシン（１．２３＋／－０．４９ｎＭ）に匹敵し、Ｎａｎｏ－Ｒｏｍｉ ｍＰＥＧ ＰＬＧＡ Ｈ_２ＯのＩＣ_５０値（２．８８＋／－１．５１ｎＭ；図７）よりも有意に小さかった（ｐ＜０．００２）。これに基づいて、我々は、その後の研究のための候補ナノポリマーとしてｍＰＥＧ ＰＤＬＬＡを選択した。

【0191】

実施例４
ナノロミデプシンＰＤＬＬＡはがん細胞においてヒストンタンパク質のアセチル化を誘導する
リジンアセチル化はタンパク質の可逆的な翻訳後修飾であり、遺伝子発現の制御において重要な役割を果たす（Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ等，２００９）。ロミデプシンは、ヒストン３（Ｈ３）及びヒストン４（Ｈ４；Ｆｕｒｕｍａｉ等，２００２；Ｌｕｃｈｅｎｋｏ等，２０１４）のリジン残基のアセチル化を増加させる、クラスＩヒストン脱アセチル化酵素、ＨＤＡＣ１及びＨＤＡＣ２に対して比較的選択的である。ロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡの用量を増加させて処置した後、Ｈ３及びＨ４のアセチル化のレベルを測定した。がん細胞をロミデプシン又はナノロミデプシンＰＤＬＬＡの何れかで３０時間処置すると、フローサイトメトリーを使用してＨ３とＨ４の両方のアセチル化が濃度依存的に増加することが観察された（図８Ａ）。Ｈ３リジン２７及びＨ４リジン１６のアセチル化レベルを、ロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡの用量を増加させて処置した後に測定した。ウエスタンブロット解析は、０．３から３０ｎＭのロミデプシン又はナノロミデプシンＰＤＬＬＡによる処置後３０時間の時点でＨ３及びＨ４のアセチル化の増加を示す（図８Ｂ）。Ｈ３タンパク質とＨ４タンパク質の両方のアセチル化の増加は、３０ｎＭのロミデプシンで処置した細胞と比較して、３０ｎｍのナノロミデプシンＰＤＬＬＡで処置した細胞では２から３倍多かった。

【0192】

実施例５
健康なドナーの正常細胞及びがん細胞のナノロミデプシンＰＤＬＬＡ及び遊離ロミデプシンに対する感受性
三人の健康なドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養し、増加濃度のロミデプシン、ナノロミデプシンＰＤＬＬＡ、又はゴーストＰＤＬＬＡポリマー（つまり、ロミデプシンを含まないＰＤＬＬＡポリマー）で２４、４８、及び７２時間処理した。３人のドナー全員からの細胞は、時間及び用量依存的に、ロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡの両方に対して感受性を示したが、ゴーストＰＤＬＬＡポリマーには感受性を示さなかった（図９）。しかしながら、４８時間及び７２時間では、ドナー１及び２からのＰＢＭＣは、ナノロミデプシンＰＤＬＬＡに対する感受性が、ロミデプシンに対する感受性よりも４倍から１５０倍低い範囲にあった（表３）。７２時間では、ドナー３からのＰＢＭＣは、ロミデプシン（ＩＣ_５０ ２．４８）及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡ（ＩＣ_５０ ２．４８；表３）の両方に対して同等の感受性を示した。６０時間では、ナノロミデプシンＰＤＬＬＡは、健康なドナーからのＰＢＭＣ（０．４～６．３ｎＭ範囲のＩＣ_５０；平均３．０）よりも、ある範囲のがん細胞で２．４倍強力であった（０．７～１．９ｎＭ範囲のＩＣ_５０；平均１．２；表３）。一方、７２時間では、健康なドナーからのＰＢＭＣは、がん細胞（０．６～１．９ｎＭ範囲のＩＣ_５０；平均１．２２５；表２）よりもロミドプシンに対する感受性が１．５倍高かった（０．０４～２．５ｎＭ範囲のＩＣ_５０；平均０．８）。

【0193】

実施例６
インビボ研究
がん、最初はリンパ腫のインビボマウスモデルにおけるナノロミデプシンＰＤＬＬＡの効果を調査した。将来の有効性研究のための最大耐用量（ＭＴＤ）と服薬スケジュールを特定するために、単回投与及び複数回投与の毒性研究を実施した。ナノロミデプシンポリマーの半減期、体内分布、及び放出動態プロファイルを調査するために、薬物動態研究を実施した。

【0194】

単回投与毒性アッセイ：遊離ロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡ治療群の両方において、用量と体重減少及び／又は臨床スコアとの間に明らかな相関関係が観察された。ロミデプシンとナノロミデプシンＰＤＬＬＡは両方とも急性の体重減少を引き起こし、１４日以内にベースラインに戻った（図１１Ａ～１１Ｄ）。マウスは、両薬物の腹腔内（ＩＰ）投与経路について８ｍｇ／ｋｇ（上のパネル）で人道的エンドポイントに達した。腹腔内（ＩＰ）投与経路では、ロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡについてＭＴＤを５ｍｇ／ｋｇと決定した。静脈内（ＩＶ）投与経路では、マウスはロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡで８ｍｇ／ｋｇまででのみ治療した（下のパネル）。しかし、８ｍｇ／ｋｇ用量のロミドペシンによるＩＶ治療ではＭＴＤに達しなかった。単回投与毒性研究では、ナノロミデプシンＰＤＬＬＡは遊離ロミデプシンと比較してほぼ同等の毒性を示すことが示唆された。加えて、ロミデプシンとＮａｎｏＲｏｍｉは両方とも、最初の７日間の治療後に同等の臨床スコアを示した（図１２Ａ～１２Ｄ）。

【0195】

薬物動態解析：反復投与毒性研究及び有効性研究のための好ましい投与経路及び用量を調査するために、薬物動態（ＰＫ）解析を実施した。ＰＫ研究では、ＩＰ経路による遊離ロミデピン／ナノロミデプシンＰＤＬＬＡ治療後の血漿中のロミデプシン濃度（図１３Ａ）は、ＩＶ経路により与えられた同じ用量と比較して高かった（図１３Ｂ；遊離ロミデプシンＩＰ＞遊離ロミデプシンＩＶ；ＮａｎｏＲｏｍｉ ＩＰ＞ＮａｎｏＲｏｍｉ ＩＶ）。ＰＫ解析は、ＩＶ経路による血漿からのロミデプシンのクリアランスがＩＰ投与経路と比較して速かったことを示していた。ＩＰ経路により送達されたナノロミデプシンＰＤＬＬＡは、遊離製剤と比較して、より高い血漿ロミデプシン濃度（Ｃｍａｘ）及びＴｍａｘを示した（表４）。ナノロミデプシンＰＤＬＬＡのＣｍａｘ及び曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＩＰ経路の遊離ロミデプシンと比較して３．５倍高かった。ＩＶ経路では、ナノロミデプシンＰＤＬＬＡのＣｍａｘ及びＡＵＣは、遊離ロミデプシンと比較して１０倍及び２５倍高い（表３）。しかしながら、ＮａｎｏＲｏｍｉのＡＵＣは、ＩＶ経路と比較してＩＰ経路の方が３倍高い。このデータに基づいて、将来の研究のための好ましい投与経路としてＩＰ経路を選択した。ナノロミデプシンＰＤＬＬＡ及び遊離ロミデプシンのＩＰ投与後のロミデプシンのピーク濃度はそれぞれ８０４ｎＭ及び２１８ｎＭであった。ＩＶ経路では、ナノロミデプシンＰＤＬＬＡ及び遊離ロミデプシンのピーク濃度はそれぞれ４２５ｎＭ及び３８ｎＭであった。Ｔ細胞リンパ腫細胞株における我々のインビトロデータによると、ナノロミデプシンＰＤＬＬＡのＥＣ_５０は約２～８ｎＭである。ＰＫ解析から、我々はＭＴＤ用量の半分の投与で血漿中のＥＣ_５０濃度の８０～４００倍を達成したことが示唆される。

【0196】

反復投与毒性アッセイ：次に、有効性研究のためのナノロミデプシンＰＤＬＬＡの適切な用量を特定するために、反復投与毒性アッセイを実施した。マウスに２及び３ｍｇ／ｋｇの遊離ロミデプシン／ＮａｎｏＲｏｍｉを１、４、８、及び１１日に投与し、マウスが完全に回復するまでモニタリングした。薬物動態解析より、投与経路として腹腔内経路を選択した。実験期間中、２及び３ｍｇ／ｋｇの遊離ロミデプシン／ナノロミデプシンＰＤＬＬＡ治療群の両方で死亡は観察されなかった（遊離ロミデプシン治療群の１匹のマウスを除く）。２ｍｇ／ｋｇの遊離ロミデピン／ＮａｎｏＲｏｍｉ治療群では、ロミデプシン及びＮａｎｏＲｏｍｉ治療群の両方で、１０％未満の体重減少（上のパネル）と被毛状態と活動性の僅かな変化（下のパネル）が観察された。しかしながら、全てのマウスは、２ｍｇ／ｋｇ用量の遊離ロミデプシン／ナノロミデプシンＰＤＬＬＡに対して１１日間の治療にわたって良好な耐容性があり、治療後２～５日後に正常な体重を回復した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。しかしながら、３ｍｇ／ｋｇロミデプシン／ナノロミデプシンＰＤＬＬＡ治療群は重度の体重減少と臨床スコア＞４を示し、反復投与毒性研究では推奨されなかった。加えて、アロメトリー計算により、２ｍｇ／ｋｇのナノロミデプシンＰＤＬＬＡ／遊離ロミデプシンのヒト等価用量は０．１６ｍｇ／ｋｇであり、反復投与毒性試験で投与された遊離ロミデピン／ＮａｎｏＲｏｍｉの全量は０．６４ｍｇ／ｋｇであることが示され、これは、ヒト成人リンパ腫患者における、２８日サイクルの１日、８日、１５日にわたるロミデプシン治療（１．１ｍｇ／ｋｇ）に匹敵する。

【0197】

有効性研究分析：ｄｔｏｍａｔｏルシフェラーゼ発現Ｈ９細胞を接種したマウスを、４治療群のうちの一つに無作為に割り当てた（各コホートでｎ＝１０）：：（ｉ）通常のＰＢＳのみで治療した対照群；（ｉｉ）ゴーストナノ粒子（ｉｉｉ）ロミデプシン（２ｍｇ／ｋｇ）（ｉｖ）ナノロミデプシン（２ｍｇ／ｋｇ）を１、４、８、及び１１日目に腹腔内注射により投与した。Ｈ９細胞株の移植後７日目、１１日目、１４日目、及び１７日目にマウスを画像化した。マウスはその後数週間にわたってモニターされ、対照群対治療群での腫瘍増殖がモニターされる。移植の１７日後、対照及びゴーストナノ粒子群と比較して、ロミデプシン及びナノロミデプシンＰＤＬＬＡ群において細胞増殖抑制効果が観察された（図１５）。接種後１７日目の時点で、ロミデプシン治療群とナノロミデプシン治療群の間で治療反応に有意差は観察されなかったが、以前の文献では、ロミデピンに対する最適な治療反応は通常、治療の約２１日後に起こることが示唆されていた。我々は、ロミデプシン治療群とナノロミデプシン治療群の間の用量反応は、その後の数週間の追跡調査でより決定的なものになると予想する。この有効性研究は、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫マウスモデル及び患者由来末梢Ｔ細胞リンパ腫異種移植片（ＰＤＸ）マウスモデルを含む他のＴ細胞リンパ腫モデルを含むように拡張される。

【0198】

実施例７
ＨＤＡＣ阻害剤と補完的な薬物パートナーの併用ナノ治療薬の開発
ロミデプシン及び他のＨＤＡＣ阻害剤は、低メチル化剤、プララトレキサート、及び生物製剤を含む多くの他の標的薬物と相乗作用を示すことが示されている（例えば、Ｋａｌａｃ等，２０１１；Ａｍｅｎｇｕａｌ等，２０１３；Ｊａｉｎ等，２０１５；Ｍａｒｃｈｉ等，２０１５；Ｌｕｅ等，２０１６；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ等，２０１９；Ｆａｌｃｈｉ等，２０２１；Ｓｃｏｔｔｏ等，２０２１を参照）。前臨床ＰＴＣＬモデルにおけるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と低メチル化剤の間の相乗効果が示されており（Ｍａｒｃｈｉ等，２０１５；Ｓｃｏｔｔｏ等，２０２１）、進行性リンパ系悪性腫瘍の患者における経口５－アザシチジン（ＡＺＡ）とロミデプシン（ＲＯＭＩ）の第１相及び第２相試験が実施され、ヒト患者におけるこの主張が裏付けられた。この併用は、非Ｔ細胞リンパ腫患者よりもＰＴＣＬ患者において実質的により活性が高かった。これらの研究から、併用されたエピジェネティック修飾因子がＰＴＣＬ患者において強力に活性であることが確立された（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ等，２０１９；Ｆａｌｃｈｉ等，２０２１）。

【0199】

ＨＤＡＣ阻害剤パートナーを前提としたコンビナトリアルナノ治療薬が企図される。これらの組み合わせは、単独療法の活性を増強し、かつ限定されないがチェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、及び／又はＰＤＬ－１阻害剤）を含む他の免疫薬に対して腫瘍細胞及び腫瘍微小環境を予備刺激するために使用される。ＨＤＡＣ阻害剤を補完することが知られている一連の資産にわたるレシオメトリックな組み合わせの開発に焦点を当てた詳細な薬理学に基づいて、がん及び自己免疫疾患の治療に使用される併用ナノ治療薬のライブラリーが開発される。

【0200】

実施例８の材料と方法
［材料］ｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ ５０００：１００００Ｄａ、ｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ ５０００：４０００Ｄａ、ｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ ５０００：１４０００Ｄａ、ｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ ５０００：２００００Ｄａ、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ ５０００：２００００Ｄａを、ＰｏｌｙＳｃｉＴｅｃｈ（登録商標）から購入した。ロミデプシンは、ｅＮｏｖａｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（カタログ＃ ０５３４２；Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から購入した。ポロキサマーは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。溶媒：アセトニトリル（ＡＣＮ）、アセトン＋１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、クロロホルム＋メタノール（Ｍｅ－ＯＨ）（１：１）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、遠心分離フィルターはＡｍｉｃｏｎから購入した（１０Ｋ、５０Ｋ、１００Ｋ）。Ｃｈｅｍｙｘ Ｆｕｓｉｏｎ ２００シリンジポンプを、デュアルチャネル又はマルチチャネルシリンジと共に使用した。

【0201】

ナノロミデプシンポリマー粒子の調製、最適化、スケールアップ及び特性評価
［調製］ナノロミデプシンポリマー粒子は、バルクナノ沈殿によって調製した。ｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡポリマー（図１６Ａを参照）、ロミデプシン、及びポラキサマー１８８のアセトニトリル溶液を、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、及び１ｍｇ／ＭＬの濃度で調製した。それぞれ０．５ｍＬのポリマー及び薬物溶液（薬物／ポリマー比；１／５）と０．１ｍＬの界面活性剤（薬物に対して１０％ｗ／ｗ）を混合し、５００ｒｐｍで連続的に撹拌した。Ｍｉｌｌｉ Ｑナノ純水（有機／水性比；１：９）を１０ｍｌ／時の速度で添加した。この期間にわたって溶媒分散を記録し、有機溶媒を完全に除去するために更に３時間撹拌を続けた。最後に、２４℃において２０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離によってナノ粒子を取り出した。粒子は、ナノ純水又は１×ＰＢＳ中で再構成することによって収集した。ナノロミデプシン粒子は４℃で保存した。これらの製剤の粒径と形態を、ＤＬＳとクライオＥＭを使用して評価した。薬物濃度は、以下に記載される分析的質量分析法、ＬＣ－ＭＳで定量した。

【0202】

［ナノロミデプシン製剤の薬物濃度の最適化］ナノロミデプシン製剤の最適化を、制御された添加及びナノ沈殿法によって相を送達するように設計された半自動シリンジポンプを使用する反復実験アプローチによって達成した。而して、製剤化パラメーター及び操作パラメーター（図１６Ｂ）は、薬物濃度が改善されたＮＰを製造するように逐次的に変更した。逐次的に変更したパラメーターには、限定されないが、薬物／ポリマー比、薬物対界面活性剤比、ポリマー長、親水性ＰＥＧ対コア形成疎水性ポリマー比、ポリマー選択、溶媒スクリーニング、溶媒／貧溶媒比、混合速度、割合、相間添加の変更、処理速度、及び所望の粒径を達成するフィルター、ＰＤＩ、及びＮＰ内の薬物濃度が含められた。各パラメーターの最適化中に、２～１０個の変数の群が含められ、実験のデザインがパラレルに行われる。これらの変数から最良のものを選択し、更に反復操作が行われる次のパラメーター最適化に取り込んだ。

【0203】

［溶媒スクリーニング：ナノ沈殿法によるナノロミデプシンＮＰに対する溶媒の役割］ｍ－ＰＥＧ ＰＤＬＬＡ ５：１０ｋＤａストック溶液をＡＣＮで作製した。ＮＰ製剤に対する溶媒の影響を探索するために、５種の水混和性溶媒群（ＡＣＮ、アセトン＋１０％ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＥｔＯＨ、クロロホルム＋Ｍｅ－ＯＨ（１：１））をロミデプシンＮＰの調製に考慮し、これらの溶媒でそれぞれ薬物溶液を作製し、ボルテックスして溶解させた。薬物溶液とポリマー溶液を組み合わせて、１：２５の薬物対ポリマー比を達成した。ポロキサマー溶液は、薬物質量に対して１０％でＡＣＮにそれを溶解させることによって調製した。シリンジポンプを使用し、界面活性剤、濃度、及び溶媒／貧溶媒比を一定にして、５０ｍＬ／時間の予め決められた速度で相分配を行った。溶液をドラフト内で３時間撹拌して、有機相を蒸発させた。遠心分離を、１００Ｋ膜カットオフの遠心フィルターユニットを用いて実施して試料を精製した。ナノ粒子を収集し、水で再構成し、４℃において保存し、上述の方法、ＤＬＳ／クライオＥＭを使用した形態学的特性、及びＬＣ／ＭＳによる薬物濃度によって特徴付けした。

【0204】

［ポリマー最適化：ナノ沈殿法によるナノロミデプシンＮＰに対するコポリマーの役割］ポリマーナノ粒子を、ｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡとｍ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡの二種類のブロックコポリマーを用いて調製し；異なるポリマージブロック長のＰＤＬＬＡポリマーを含めた；ｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ ５：１０ｋＤａ、ｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ ５：４ｋＤａ、ｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ ５：１４ｋＤａ、ｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ ５：２０ｋＤａ、ｍ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡ（５０：５０）５：２０ｋＤａ、ｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ ５：１０ｋＤａ粒子を二つの異なる比；Ｄ／Ｐ １：１０とＤ／Ｐ １：２５で薬物を用いて作製する。ポリマーをＡＣＮに溶解し、ボルテックスして完全に溶解させた。薬物ストック溶液をＡＣＮ中で調製した。ポロキサマー溶液は、薬物質量に対して１０％の溶液を使用してそれをＡＣＮに溶解することによって調製した。１：１０又は１：２５の比で、薬物溶液とポリマー溶液を最適化に含めた。５０ｍＬ／時間の予め決めた速度での相分配にシリンジポンプを使用した。固定した薬物対界面活性剤比及び溶媒／貧溶媒比を維持した。溶液をドラフト内で３時間撹拌して、有機相を蒸発させた。遠心分離を、１００Ｋ膜カットオフの遠心フィルターユニットで実施して、試料を精製した。ナノ粒子を収集し、水で再構成し、４℃で保存し、上記の方法、ＤＬＳ／クライオＥＭを使用した形態学的特性、及びＬＣ／ＭＳによる薬物濃度によって特徴付けた。

【0205】

［遠心フィルター最適化：ナノロミデプシンＮＰの処理に対するフィルターユニットの役割］薬物溶液及びポリマー溶液をＡＣＮで作製し、ボルテックスして溶質溶解を達成した。溶液を、１：２５の薬物対ポリマー比で混合し、シリンジ中に充填した。シンチレーションバイアル中で、ポロキサマーを薬物質量に対して１０％まで水で希釈し、１０：１の薬物対ポロキサマー比を達成した。溶媒／貧溶媒比を固定し、５０ｍＬ／時間の予め決めた速度での相分配にシリンジポンプを使用した。溶液をドラフト内で３時間撹拌して、有機相を蒸発させた。遠心分離を、Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルター１０Ｋ、５０Ｋ、及び１００Ｋ膜カットオフを伴う遠心フィルターユニットを用いて実施し、試料から未カプセル化薬物を分離した。別のセットでは、ローダミン色素を二通りの異なる比で使用し、１０Ｋと１００Ｋのフィルターを使用した。ナノ粒子を収集し、水で再構成し、４℃で保存し、上記の方法、ＤＬＳ／クライオＥＭを使用する形態学的特性、及びＬＣ／ＭＳによる薬物濃度によって特徴付けた。

【0206】

［溶媒対貧溶媒比の最適化：ナノロミデプシンＮＰの調製における有機対水比］薬物溶液及びｍ－ＰＥＧ ＰＤＬＬＡ（５Ｋ：１０Ｋ）ポリマー溶液をＡＣＮで作成し、ボルテックスして透明な溶液を得た。溶液を１：２５の薬物対ポリマー比で混合し、シリンジに充填した。シンチレーションバイアルで、ポロキサマー溶液を水で薬物質量に対して１０％まで希釈し、１０：１の薬物とポロキサマーの比を達成した。事前に計算した溶媒／貧溶媒比に分配するために、５０ｍＬ／時間の予め決めた速度での相分配にシリンジポンプを使用する。有機対水の様々な比での複数の実験が考慮される；１：９、１：５、１：３、１：２、及び１：１。最近、１：１の比の有機対非溶媒１×ＰＢＳも検討した。溶液をドラフト内で３時間撹拌して、有機相を蒸発させた。遠心分離を１００Ｋ膜カットオフの遠心フィルターユニットで実施して、試料を精製した。ナノ粒子を収集し、水で再構成し、４℃で保存し、上記の方法、ＤＬＳ／クライオＥＭを使用する形態学的特性、及びＬＣ／ＭＳによる薬物濃度によって特徴付けた。

【0207】

［ナノロミデプシン製剤のスケールアップ］ナノロミデプシン製剤を、パラメーターの反復最適化法を利用して１～２０ｍＬにスケールアップした。薬物濃度に関して設定された各パラメーター最適化からの最良の条件がスケールアップに含められる。ロミデプシン、ｍ－ＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ ５：１０ｋＤａ、及びポロキサマー１８８をＡＣＮに溶解させ、ボルテックスして、薬物とポリマーをＡＣＮに完全に溶解させ、予め決められた比（Ｄ／Ｐ １：２５、Ｄ／界面活性剤 １：０．１Ｗ／Ｗ）を達成した。シリンジポンプを使用して、５０ｍＬ／時の予め決められた速度で相分配した。固定された薬物対界面活性剤比及び溶媒／貧溶媒比を維持した。溶液をドラフト内で３時間撹拌して、有機相を蒸発させた。遠心分離は、１００Ｋ膜カットオフの遠心フィルターユニットで実施して、試料を精製した。ナノ粒子を収集し、水で再構成し、４℃で保存し、上記の方法、ＤＬＳ／クライオＥＭを使用した形態学的特性、及びＬＣ／ＭＳによる薬物濃度によって特徴付けた。

【0208】

［ナノロミデプシン製剤の特性評価］これらの製剤の粒径において、単分散性、ゼータ電位及び形態を、ＤＬＳ及びクライオＥＭを使用して評価した。薬物濃度は、本明細書の他の箇所に記載されているように、分析的質量分析法、ＬＣ－ＭＳで定量した。

【0209】

実施例８
ナノロミデプシン製剤の薬物濃度の最適化
ナノロミデプシンスカフォールドを、ボトムアップナノ沈殿法を使用して開発し、継続してナノ粒子を再設計した。ｍ－ＰＥＧ ＰＤＬＬＡ（５Ｋ：１０Ｋ）ポリマーの疎水性は、疎水性薬物の捕捉に有利である。伝統的なナノ沈殿法は、疎水性薬物のカプセル化に適用される、単純で拡張性があり、再現可能な単一工程プロセスである（図１６Ａを参照）。ナノロミデプシンは、複数の細胞株でのインビトロアッセイにおいて、同等濃度の遊離ロミデプシンと比較して等しく強力であることが示された。インビボ実験をサポートするために、生成物のスケールアップを追求した。一実施態様では、ナノ製剤中のロミデプシンの最高濃度は３１μｇ／ｍＬであり、これは１．５％という非常に低いカプセル化効率（ＥＥ）に相当した。インビボ実験で治療効果をもたらすインビボ血漿濃度の達成では、ＥＥを改善するために反復実験アプローチを採用した。特に、ナノ沈殿法のコンビナトリアルアプローチを開発し、薬物濃度を改善するために「パラレル合成の原理」（図１６Ｂ）に基づいてパラメーター／操作条件を逐次的に変更した。而して、ＮＰ製剤をこの工学的な方法を使用して調製し、提案されたインビボ実験を短時間で容易に行うことを可能にした。

【0210】

薬物濃度を改善する代表的なアプローチとして、次のタンデムアプローチを実証した。幾つかの実施態様では、ナノ沈殿法は単一工程であり、コンビナトリアル方式でのＮＰ特性の最適化に適している。この実施例には、疎水性薬物であるロミデプシンの含有に関して考慮されたパラメーターの最適化が含まれる。期待される結果は、最適サイズ及びＰＤＩと共に薬物充填量に関係する。この方法によるポリマーＮＰ形成のメカニズムには、複数の操作パラメーターと、ポリマー、薬物、及び溶媒の固有の特性が関係する。特定の撹拌速度でのポリマー含有有機相の水性相中への制御添加と、相の速度制御／速度依存的混合とにより、水溶液中への有機溶媒の拡散が引き起こされる。有機溶媒が蒸発すると、ポリマーの溶解度が低下し、過飽和に達し、核形成、成長、沈殿が生じてＮＰが形成される。最もエネルギー的に好ましい構造に適合させるために、両親媒性のジブロックコポリマー（幾つかの実施態様では、ｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡであるが、但し、他のＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、及びＰＣＬを含む他の両親媒性のＰＥＧ化ポリマーを使用することもできる）がコア－シェル球状構造に押し込められて、粒子コアを構成し、薬物と疎水性ブロック間の疎水性及び他の潜在的な相互作用によって薬物を一緒に保持して捕捉する。水溶性ＰＥＧアームはシェルを形成する水性相中に延びる。溶媒の特性が、方向付ける効果によってＮＰの形成を決定づける。効率的な溶媒と水の交換が、ＮＰ形成を促進する。水中における溶媒の拡散速度は、ＮＰの物理化学的特性と形成に影響を与えるもう一つの要因であり、溶媒の混和性、イオン強度、密度、粘度、及び撹拌速度に依存する。アセトニトリルとアセトンは拡散係数が高く、ＮＰの形成を促進することが知られている。ロミデプシンとポリマーの溶解度は、ナノ沈殿法に適した有機溶媒中で試験した。ロミデプシンの溶解度と、揮発性が高くインビボ毒性が少ない有機溶媒の水混和性が溶媒スクリーニングの基準であった。この方法に含められるパラメーター並びにポリマーの特性が、ポリマーＮＰのサイズ、形状、及び物理化学的特性を決める。生分解性ＰＥＧブロックコポリマーは自己集合して、ＰＥＧ化ポリマーミセル、ナノスフェア、又は二重層粒子、及び約２０から約１０００ｎＭの範囲の様々なサイズのポリマーソームになる。ジブロックポリマーの生分解性、疎水性、及び他の物理化学的特性は、コアの表面浸食と拡散による薬物の安定した放出に有利であるため、両親媒性ジブロックポリマーが放出制御薬物送達用途に影響を与える。異なる分子量と様々な組成のポリマーが市販されているため、ロミデプシンの薬物送達用のナノ粒子の選択を許容するパラレルアプローチを使用してＮＰを調製できるようになった。スケールアップのための基礎を作りだし、ＥＥに対する各変数の役割を理解するために、複数の合成パラメーターが探究される。我々は、我々の提案した「パラメーター最適化のパラレルアプローチ」法を試験した。我々は５つのパラメーターを考慮し、各パラメーターにおいて２～３の変数を研究に含めた。我々は、薬物充填量という「重要な」ＮＰ特性に対するこれらのパラメーターの影響を測定した。パラメーターと変数のリストには次のものを含めた、１．相添加モード（有機を水へ／水を有機へ）、２．薬物／ポリマー；３つの変数；１／１０；１／２５；及び１／５０Ｗ／Ｗ、３．有機溶媒／水；３つの変数：１：９、１：３、及び１：２、４．薬物／界面活性剤比；３つの変数：１／０．１、１／０．２、及び１／０．０５及び５．添加速度；３つの変数：２０、３０、及び５０ｍＬ／時間。我々は、薬物充填量に実質的な影響を与える重要なパラメーターとして、相添加モード、薬物／ポリマー比、及び有機溶媒対水比を特定した。速度と界面活性剤の比もまた薬物充填量に影響するが、それほど重要ではない。我々のパラレル多面的反復アプローチを使用して、１回の実験で５つのパラメーターを最適化することができた。この研究の結果により、プロジェクトの「ゴー／ノーゴー」決定の範囲が直ぐに決まった。我々は、各パラメーターから最良の変数を選択し、それを一つの実験に組み込み、次のパラメーターの累積効果を確立できるようにした；有機の水への添加、Ｄ／Ｐ １：２５、有機／水 １：２、及び薬物充填速度５０ｍＬ／時間。我々は、パラレルアプローチが、ナノロミデプシンの生産を大幅に改善し、薬物充填最適化研究に大きな影響を与えることを見出した。その結果、この戦略により、薬物濃度が１．４％のＥＥの最初のアプローチから次の実験では７６．２６％に改善され、代表的な最適化されたパラメーターが明らかになった；全ての結果を（表５Ａ）に列挙する。これは、ＮＰ ＥＥに対する各変数の役割と影響を独立してかつ集合的に解明するのに役立った。我々は、次のパラメーターを、ナノ粒子における潜在的に「薬物充填量を最大化」できる重要なパラメーターとして特定した：相添加、薬物／ポリマー、薬物／界面活性剤、添加速度、及び溶媒／貧溶媒。

【0211】

加えて、本方法では、正確に同じ合成中に全てのパラメーターが探究されるため、人的エラーと実験間の時間が削減される。我々は、列挙された各パラメーターの変数の効果と、作製されたＮＰの物理化学的特性に対するそれらの影響を解明した。溶媒スクリーニングを実施して、アセトニトリル、アセトン＋１０％ＤＭＳＯ、ＥｔＯＨ、及びＭｅＯＨ＋クロロホルムを含む水混和性溶媒中におけるロミデプシンの溶解度を試験し、ＮＰの特性と薬物充填量を試験した。界面活性剤のポロキサマー１８８を水性相に添加して、ＮＰの安定性を維持し、凝集を回避した。我々は、アセトニトリルが、ロミデプシン及びｍ－ＰＥＧ ＰＤＬＬＡを溶解し、並びに単分散製剤及びより高いカプセル化効率で均一サイズの粒子を創製するのに望ましい溶媒であることを見出した（図１７Ａ～１７Ｃ）。特定の操作方法に拘束されることは望まないが、アセトニトリルの拡散速度と粘度に関連している可能性がある。これは、溶媒特性を調節することにより、ナノ沈殿中のＮＰの物理的特性に「調節可能性」を付与する。ＮＰ特性に対するパラメーターの影響を決定するために、ポリマーの種類（ｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡ対ｍ－ＰＥＧ ＰＬＧＡ）、ポリマー長、親水性ＰＥＧブロック対疎水性ＰＤＬＬＡブロックの比、及び薬物対ポリマー比をこの研究に含めた。この研究はまた薬物放出を促進するポリマーの最適化にも役立つ可能性がある。ポリマーと薬物を、溶媒スクリーニングからの所望の溶媒であるアセトニトリルに溶解させた（反復プロセス）。この研究のデータは、最適なポリマーがｍ－ＰＥＧ ＰＤＬＬＡ，５Ｋ：１０Ｋ、及び１／２５（Ｗ／Ｗ）のＤ／Ｐ比であることを明確に示したが、これは、これらが薬物充填量とＮＰのサイズに最も大きな影響を与えるためである（図１８Ａ～１８Ｄ）。遠心フィルターを使用して、調製されたナノ粒子製剤を処理し、未カプセル化薬物と残留溶媒を除去した。我々は、Ａｍｉｃｏｎ １００Ｋフィルターが、３０～１００ｎＭの範囲の特定のＮＰサイズを持つ所与の製剤により適していることを見出した。また、我々は、可視化剤であるローダミンＢと二通りの異なる濃度のロミデプシンの共カプセル化を示し、二つの異なるサイズのフィルターを使用してフィルターの粒子通過を試験した。この研究は、過剰な薬物がフィルター（濃い色のチューブ）を通って流れ、ＮＰが共薬物を収容することを実証した（図１９Ａ～１９Ｄ）。最後に、我々は、粒子中への薬物の充填と粒子のサイズに有意に影響を与えうるパラメーター、水への有機溶媒添加と溶媒対貧溶媒の比、並びに溶媒と貧溶媒としての１×ＰＢＳの１：１の比を１：１の水と比較して試験した。結果を図２０Ａ～２０Ｄに示す。この研究から特定されたＥＥに最も影響を与える変数は、水への有機添加と１：１の溶媒対貧溶媒比である。我々は１×ＰＢＳを用いると、カプセル化が有意に向上することも見出した。

【0212】

要約すると、我々は、ＮＰ製造における各パラメーターの役割の重要性と、パラメーター間の相互作用を解明する特性を見出した（表５Ｂ）。我々は、スケールアッププロセスに対して、水への有機添加、Ｄ／Ｐ比、Ｏ／Ｗ比、添加速度を含む、複数の最適化からの全てのパラメーターの望ましい変数を含め、５００μｇ／ｍＬのロミデプシン濃度で７～１０ｍＬスケールのナノロミデプシンの複数のバッチを製造した。結果は、サイズ、ＰＤＩ、粒子中の薬物充填量に関してバッチ間の再現性を明確に実証した。製剤容量スケールアップは、設計されたインビボ実験の要件を満たした。サイズ、ＰＤＩ（ＤＬＳデータ）、ＮＰの形態（クライオＥＭ）、及び薬物濃度（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を図２１Ａ～２１Ｅに示した。表５Ｃ、５Ｄ、及び５Ｅをまた参照のこと。従って、ＮＰの物理化学的特性の最適化のパラレルアプローチは有利であり、スケールアップの能力を改善する。このアプローチは、抗がん薬のカプセル化のための効果的で制御された戦略であり、スケールアップの可能性を有している。理論的には、この合成アプローチでは、現在の実験室での設定を更に変更することなく、約５０％のＥＥで３００～４００ｍＬのナノロミデプシンを生成できる。ナノサイズの薬物製剤のスケールアップに関連する問題に対処する方法論は、商業化の範囲を促進する可能性がある。

【0213】

［実施例の考察］
ロミデプシンは、クラスＩ ＨＤＡＣに対してより大きな阻害効果を持つ最も強力なＨＤＡＣ阻害剤であり、最も選択的なＨＤＡＣ阻害剤でもある。ロミデプシンは、米国において次を含む二つの異なる規制当局の承認を取得した：（１）２００９年における一種類の前治療を受けた再発性又は難治性ＣＴＣＬ患者に対する完全承認、及び（２）２０１１年における一種類の前治療を受けた再発又は難治性ＰＴＣＬ患者に対する早期承認。一般にこの薬剤の忍容性は良好であるが、（ｉ）潜在的に致死的な心毒性；（ｉｉ）グレード５の毒性と枠内警告に関連しているＥＢＶ及びＢ型肝炎ウイルスの再活性化；（ｉｉｉ）不便なスケジュール（４週間のうち３週間の間、毎週４時間以上投与される）；並びに僅か２５％の患者にのみ反応が得られるという限界的な効果を含む、多くの制限が伴っている。

【0214】

これらの欠点にもかかわらず、この薬物には、次を含む多くの臨床的に意味のある特性が伴う：（ｉ）１年を超える持続性のある反応期間；（ｉｉ）ＤＮＭＴ阻害剤などの他のエピジェネティック標的化薬物との強力な相乗効果、及び（ｉｉｉ）ＰＴＣＬ患者の治療を行う医師によって好まれるＨＤＡＣ阻害剤であること。まとめると、ロミデプシン媒介毒性を軽減し、そのスケジュールの不具合を軽減する戦略は、腫瘍細胞標的化を改善する取り組みと併用で改善される有効性と相まって、ＰＴＣＬだけでなく他のがん及び可能な自己免疫疾患に対してこのクラスの薬物を最適化するための有効なアプローチとなる。

【0215】

ナノ粒子の独特の特性、例えばその小さいサイズ、大きな表面積対体積比、及びその表面上の標的リガンドの多価性を達成する能力は、様々ながんへのナノ粒子ベースの薬物送達に優れた利点をもたらす。がんにおけるナノ治療薬は、ナノ粒子の担体効果と吸収後の標的化物質の位置決め効果を通じて腫瘍細胞を標的とする。

【0216】

ナノポリマーであるポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）（ＰＤＬＬＡ）は、より優れた物理化学的特性を示す多孔質構造を有しており、癒着防止剤の添加に好都合である。従って、我々は、毒性を軽減し、ＰＴＣＬ及び自己免疫疾患においてより良好な治療反応をもたらすｍＰＥＧ－ＰＤＬＬＡカプセル化ロミデプシンを開発した。これまでの我々のデータは、次の通りにナノポリマー誘導体がロミデプシンよりも優れていることを実証している：
１． ナノロミデプシンＰＤＬＬＡは、ＣＴＣＬ、ＡＬＫ－ＡＬＣＬ、ＬＧＬ－白血病、及び皮膚メラノーマ細胞株において、未カプセル化ロミデプシンと同様のＩＣ_５０値で細胞傷害性を示した；
２． 健康な個体からのＰＢＭＣのナノロミデプシンＰＤＬＬＡによる処置は、ロミデプシンによるＰＢＭＣ処置と比較して細胞傷害性が少なく、がん株と比較して細胞傷害性が少ないため、治療範囲が拡大した；
３． ナノロミデプシンＰＤＬＬＡはアポトーシスを誘導し、ヒストンＨ３タンパク質とＨ４タンパク質の両方のアセチル化を増加させた。ナノロミデプシンＰＤＬＬＡで処置した細胞では、ロミデプシンと比較して、ヒストンタンパク質のアセチル化の変化が２から３倍大きくなった。
４． ナノロミデプシンＰＤＬＬＡは、単回及び反復投与毒性アッセイにおいて遊離ロミデプシンと等価又は同等の毒性を示した。薬物動態解析から得られた最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）、血漿濃度－時間曲線下の積分面積（ＡＵＣ）、及び最大血漿濃度の時間（Ｔｍａｘ）は、ナノロミデプシンの単回投与が、腹腔内経路による遊離ロミデプシンの単回投与と比較して血漿中のロミデプシンの３～４倍高い曝露をもたらすことを示唆した。Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、及びＴｍａｘは、ロミデプシンのナノカプセル化により血漿中のロミデプシンが長期間利用可能となり、ヒトにおける臨床的に関連する曝露を特定するのに有効であることを示した。

【0217】

ここに開示されるように、ナノロミデプシンＰＤＬＬＡポリマーは、腫瘍細胞を標的とするのに効果的であり、正常細胞においてより低い細胞傷害性を有し、ロミデプシンと同等／等価な毒性を有し、従って、ロミデプシンとは区別される独自の特性を有する資産となる。

【0218】

［参考文献］
限定されないが、全ての特許、特許出願及びその公報、科学雑誌記事、及びデータベースエントリ（限定されないが、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）生物配列データベースエントリ及びそのなかの利用可能な全ての注釈を含む）を含む、本開示に列挙される全ての参考文献は、それらがここで用いられる方法論、技術、及び／又は組成物を補足し、説明し、その背景を提供し、及び／又は教示する範囲で、その全体が出典明示によりここに援用される。参考文献の検討は、単にその著者によってなされた主張を要約することを意図している。如何なる参考文献（又は如何なる参考文献の一部）も関連した先行技術であるということは自認しない。本出願人は、引用した参考文献の正確性及び適切性について異議を唱える権利を留保する。

【0219】

Ａｍｅｎｇｕａｌ等（２０１３）Ｓｉｒｔｕｉｎ ａｎｄ ｐａｎ－ｃｌａｓｓ Ｉ／ＩＩ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ（ＤＡＣ）ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｓ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｉｎ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ １２２：２１０４－１３。
Ｂａｃｈｙ等（２０２０）Ｆｉｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏ－ＣＨＯＰ Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ Ｓｔｕｄｙ（Ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｂｙ ＬＹＳＡ）：Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ Ｐｌｕｓ ＣＨＯＰ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ １３６（Ｓｕｐｐｌ １）：３２－３３。
Ｃｅｌｇｅｎｅ（２０２１）Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ：Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ’ｓ Ｂｒｏｃｈｕｒｅ（Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０．０）Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄａｔｅ：１２ Ａｐｒ ２０２１。
Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ等（２００９）Ｌｙｓｉｎｅ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ｃｏ－ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍａｊｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５（５９４２）：８３４－４０。
Ｆａｌｃｈｉ等（２０２１）Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｏｒａｌ ５－ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ ａｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＰＴＣＬ：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｐｈａｓｅ ２ ｓｔｕｄｙ．Ｂｌｏｏｄ １３７（１６）：２１６１－２１７０。
Ｆｕｒｕｍａｉ等（２００２）ＦＫ２２８（ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ）ａｓ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｌａｓｓ Ｉ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２（１７）：４９１６－２１。
Ｈｏｓｈｉｎｏ等（２００７）Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＦＫ２２８，ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ １８（３）：５８５－９２。
Ｊａｉｎ等（２０１５）Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒａｌａｔｒｅｘａｔｅ ａｎｄ ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ ｃｏｎｆｉｒｍｓ ｐｏｔｅｎｔ ｓｙｎｅｒｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１：２０９６－１０６。
Ｋａｋａｒ等（２０１４）Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７０（１）：ｅ２１－２。
Ｋａｌａｃ等（２０１１）ＨＤＡＣ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ ａｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ＤＬＢＣＬ．Ｂｌｏｏｄ １１８：５５０６－１６。
Ｌｕｃｈｅｎｋｏ等（２０１４）Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ｇｌｏｂａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．Ｍｏｌ Ｏｎｃｏｌ．８（８）：１３７９－９２。
Ｌｕｅ等（２０１６）Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＥＺＨ２ ａｎｄ ＨＤＡＣ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｉｓ Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｉｎ ＥＺＨ２ Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｂｌｏｏｄ １２８：８３９。
Ｍａｒｃｈｉ等（２０１５）Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｐｒｏｄｕｃｅ ｍａｒｋｅｄ ｓｙｎｅｒｇｙ ｉｎ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １７１（２）：２１５－２２６。
Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ等（２０１９）Ｏｒａｌ ５－ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ ｅｘｈｉｂｉｔ ｍａｒｋｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＰＴＣＬ：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｐｈａｓｅ １ ｓｔｕｄｙ．Ｂｌｏｏｄ １３４（１７）：１３９５－１４０５。
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等（１９９６）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ＮＫＬ，ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２４：４０６－４１５。
Ｓａｓａｋａｗａ等（２００５）Ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＦＫ２２８，ａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６９（４）：６０３－６１６。
Ｓｃｏｔｔｏ等（２０２１）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｓｔｅｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｉｍｍｕｎｅ－Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０（８）：１４２２－１４３０。
Ｕｅｄａ等（１９９４）ＦＲ９０１２２８，ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ Ｎｏ．９６８．ＩＩＩ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）４７（３）：３１５－３２３。
米国特許第１００９２５８４号。
Ｖｅｒｖｅｒｉｓ等（２０１３）Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＨＤＡＣＩｓ）：ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ７：４７－６０。

【0220】

【0221】

【0222】

【0223】

【0224】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A-19B】

【図19C-19D】

【図20A-20B】

【図20C-20D】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D-1】

【図21D-2】

【図21D-3】

【図21E】

【国際調査報告】