知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-18
(54)【発明の名称】ｍＲＮＡ発現のための遺伝子構造体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20241010BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241010BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241010BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20241010BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241010BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241010BHJP
C12N 15/85 20060101ALN20241010BHJP
A61K 38/02 20060101ALN20241010BHJP
A61K 39/00 20060101ALN20241010BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12N15/63 Z
A61P35/00
A61P15/00
A61K48/00
A61P37/04
C12N15/85 Z ZNA
A61K38/02
A61K39/00 H
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024522481
(86)(22)【出願日】2022-10-14
(85)【翻訳文提出日】2024-04-30
(86)【国際出願番号】 KR2022015581
(87)【国際公開番号】W WO2023063769
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】10-2021-0137521
(32)【優先日】2021-10-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519124327
【氏名又は名称】ゲノミックツリー インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＯＭＩＣＴＲＥＥ，ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】アン ソンファン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA44
4C084DA27
4C084NA03
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA811
4C084ZB261
4C085AA03
4C085BA01
4C085BB23
4C085CC05
4C085CC08
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
(57)【要約】
本発明は、ｍＲＮＡ発現のための遺伝子構造体、前記遺伝子構造体を含む医薬組成物、ワクチン組成物及び遺伝子治療用組成物に関し、より詳細には、コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）由来の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む遺伝子構造体、前記遺伝子構造体を含む医薬組成物、ワクチン組成物及び遺伝子治療用組成物に関する。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現のためのコーディング領域；前記コーディング領域の上流に位置する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）；及び
前記コーディング領域の下流に位置する３’非翻訳領域（ＵＴＲ）；を含む遺伝子構造体であり、
前記５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、コロナウイルスのリーダー配列を含む遺伝子構造体。
【請求項2】
前記５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、配列番号１で表されるコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）のリーダー配列を含む、請求項１に記載の遺伝子構造体。
【請求項3】
前記５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＮＬ６３、ＳＡＲＳ－１、又はＭＥＲＳ由来のリーダー配列を含む、請求項１に記載の遺伝子構造体。
【請求項4】
前記５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、配列番号２～配列番号４からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含む、請求項１に記載の遺伝子構造体。
【請求項5】
前記３’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、配列番号５の配列を含む、請求項１に記載の遺伝子構造体。
【請求項6】
プロモーター及び／又はポリ（Ａ）配列をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子構造体。
【請求項7】
前記プロモーターは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の上流に位置する、請求項６に記載の遺伝子構造体。
【請求項8】
前記ポリ（Ａ）配列は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の下流に位置する、請求項６に記載の遺伝子構造体。
【請求項9】
配列番号１８又は配列番号１９の配列を含む、請求項１に記載の遺伝子構造体。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載の遺伝子構造体を含むベクター。
【請求項11】
請求項１～９のいずれか１項に記載の遺伝子構造体を含む医薬組成物。
【請求項12】
請求項１～９のいずれか１項に記載の遺伝子構造体を含むワクチン組成物。
【請求項13】
請求項１～９のいずれか１項に記載の遺伝子構造体を含む遺伝子治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ｍＲＮＡ発現のための遺伝子構造体、前記遺伝子構造体を含む医薬組成物、ワクチン組成物及び遺伝子治療用組成物に関し、より詳細には、コロナウイルス由来の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む遺伝子構造体、前記遺伝子構造体を含む医薬組成物、ワクチン組成物及び遺伝子治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療剤は、既存の遺伝子に新しい情報を付加、修正、及び削除し、遺伝子を患者の細胞にプラスミドＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ：ｐＤＮＡ）、ｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）状態で伝達し、病気の治療又は予防を行う治療剤として開発されてきた（Ｄｕｎｂａｒ，Ｃ．Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１８ １：１２）。
【0003】
遺伝子治療剤の目的は、遺伝性疾患や奇病に罹患している人の遺伝的欠陥を矯正し、病気を完治させることにある。最近の技術革新及び研究開発投資により、全世界の遺伝子治療剤市場が年平均１０％レベルに成長すると共に、遺伝子治療剤が新しい製薬市場のブルーチップとして浮び上がっており、そのうち、ｍＲＮＡは、ワクチン開発及びタンパク質代替治療剤分野で有望な治療道具として出現している。遺伝子治療剤の原理は、遺伝子をｐＤＮＡ及びｍＲＮＡ状態でウイルス、リポソーム、アンチセンス技術などを用いて細胞内に流入させ、治療剤として機能させることにある（Ｄｕｎｂａｒ，Ｃ．Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１８ １：１２）。
【0004】
ｍＲＮＡ治療剤は、安定性、効率性、及び生産性の面でＤＮＡ治療剤やウイルス治療剤などより優れるという長所を有する。一つ目に、ｍＲＮＡが細胞質で発生するので、感染又はゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡ挿入による突然変異が発生する確率が低くなる。二つ目に、ｍＲＮＡが細胞質内で多様に変形可能であるので、半減期を調節したり、翻訳されるタンパク質の量を増加させ、細胞内の安定性を増加させることができる。三つ目に、ｍＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に容易に使用されるので、迅速な開発及びＧＭＰ生産が可能であり、大量生産が容易になるという利点がある（Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ２０１３ ３５８－３６７）。
【0005】
ｍＲＮＡとは、ＤＮＡの遺伝情報をリボソームに伝達し、ｍＲＮＡによる翻訳過程を経てタンパク質を発現させるＲＮＡである。治療剤又はワクチン開発を目的とする組換えｍＲＮＡは、Ｔ７、ＳＰ６など（これに限定されない）のプロモーターとＲＮＡ重合酵素によって線形ＤＮＡから作られた後、試験管内転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）によって５’キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）とポリＡアデニル化（ｐｏｌｙ Ａ ｔａｉｌｉｎｇ）が起こる。このように作られたｍＲＮＡは、細胞質内の成熟したｍＲＮＡと類似する構造であり、５’キャッピング、５’ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）、３’ＵＴＲ、ポリＡ、及び発現しようとする標的遺伝子で構成される。このうち、非翻訳部位（５’又は３’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）は、この配列が何かによってｍＲＮＡの安定性及び翻訳活性化に影響を与え、半減期及び発現量が増加する。また、ポリＡは、細胞質内のｍＲＮＡの分解を防止し、安定性を高め、発現量を増加させる。したがって、ｍＲＮＡ治療剤が体内で効率的且つ安定的にタンパク質を発現するためには、最適な非翻訳部位配列とポリＡの長さを探すことが重要である（Ｐａｒｄｉ，Ｎ ｅｔ ａｌ，．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１８ ２６１－２７９）。
【0006】
このような技術的背景下で、本出願の発明者等は、コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）由来の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む遺伝子構造体を開発し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、コロナウイルス由来の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む遺伝子構造体を提供することにある。
【0008】
本発明の目的は、前記遺伝子構造体を含むベクターを提供することにある。
【0009】
本発明の目的は、前記遺伝子構造体を含む医薬組成物を提供することにある。
【0010】
本発明の目的は、前記遺伝子構造体を含むワクチン組成物を提供することにある。
【0011】
本発明の目的は、前記遺伝子構造体を含む遺伝子治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
前記目的を達成するために、本発明は、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現のためのコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）；前記コーディング領域の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に位置する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）；及び前記コーディング領域の下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に位置する３’非翻訳領域（ＵＴＲ）；を含む遺伝子構造体であり、前記５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、コロナウイルスのリーダー配列を含む遺伝子構造体を提供する。
【0013】
また、本発明は、前記遺伝子構造体を含むベクターを提供する。
【0014】
また、本発明は、前記遺伝子構造体を含む医薬組成物を提供する。また、本発明は、前記遺伝子構造体を含むワクチン組成物を提供する。
【0015】
また、本発明は、前記遺伝子構造体を含む遺伝子治療用組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】コロナウイルス構造とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）及びサブゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡ発現に対する模式図である。（Ａ）は、コロナウイルスの外形及び各タンパク質のｍＲＮＡ量をノーザンブロットで分析したものである。（Ｂ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡ構造及びこれから発現される代表的なサブゲノムＲＮＡを示したものである。
【0017】
【図2】ｍＲＮＡ発現のための鋳型ＤＮＡに対する模式図である。
【0018】
【図3】ＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡ発現のために鋳型ＤＮＡをＰＣＲ方法で製作する過程を示した図である。
【0019】
【図4】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ遺伝子のｍＲＮＡ発現のために鋳型ＤＮＡをＰＣＲ方法で製作する過程を示した図である。
【0020】
【図5】ヒトＡＤＣＹＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡ発現のために鋳型ＤＮＡをＰＣＲ方法で製作する過程を示した図である。
【0021】
【図6】ＩＶＴ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）方法で対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＥＧＦＰ、ＡＤＣＹＡＰ１及びＮ遺伝子のｍＲＮＡ発現を確認した図である。
【0022】
【0023】
【0024】
【発明を実施するための形態】
【0025】
他の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
【0026】
最近、全世界的に流行しているＣＯＶＩＤ－１９は、コロナウイルスの変種であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によるものであり、コロナウイルスは、Ｎ（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）タンパク質が覆っている約３０ｋｂ程度の（＋）ＲＮＡを遺伝体として有しており、その上側には、Ｍ（ｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質とＥ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）タンパク質が脂質と共に膜をなしており、外側にはスパイク（ｓｐｉｋｅ）タンパク質が突出しているので、王冠の形状と類似する外形をなしている（図１）。
【0027】
コロナウイルス遺伝体（Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ）は、感染後に細胞内に入り込み、直ぐｍＲＮＡとしての役割をし、前側の上端部位に位置しているｏｒｆ１ｂ（ｏｐｅｎ ｒｅａジｎｇ ｆｒａｍｅ １ｂ）で転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）が起こり、ＲｄＲＰ（ＲＮＡ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を生産する。ＲｄＲＰは、ＲＮＡを鋳型として用いてＲＮＡを合成できる酵素である（Ｉｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００６，２５：４９３３－４９４２）。
【0028】
したがって、ＲｄＲＰは、細胞に入り込んだゲノムＲＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ）を鋳型として用いて、複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）過程を経て同じ長さのマイナス鎖ゲノムＲＮＡ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ（－） ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ）を合成する。このように作られた（－）ゲノムＲＮＡは、再度転写のための鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）としての役割をし、様々なタンパク質を生成できる各種ｍＲＮＡを作り出す。
【0029】
コロナウイルスの転写メカニズム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）モデルは、未だに明らかに確立されていないが、感染後のウイルスの生活史を見ると、細胞内には、必要な各タンパク質（Ｓ、Ｅ、Ｍ、Ｎ）を作り出すために必要なｍＲＮＡとしての役割をする複数個のサブゲノムＲＮＡ（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ）が存在していると知られている（Ｋｒｚｙｓｚｔｏｆ Ｐｙｒｃ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００４，１：７）。
【0030】
構造的な特徴を見ると、全てのサブゲノムＲＮＡの長さは異なるが、後側（３’末端）部位は、いずれもゲノムＲＮＡと共通的な３’ＵＴＲ部位を有している。
【0031】
また、ゲノムＲＮＡの前側（５’末端）には、短い長さ（約７５ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）の塩基配列で構成されたリーダー配列（Ｌｅａｄｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が存在するが、これも、特徴的に全てのサブゲノムＲＮＡの前側に追加されている。特徴的には、全てのサブゲノムＲＮＡは、タンパク質を作るコーディング配列とリーダー配列との間に遺伝子間（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ）配列を有し、リーダー配列と遺伝子間配列は、タンパク質の発現時にリボソームが認識できる５’ＵＴＲとして作用し、全てのサブゲノムＲＮＡの３’末端には３’ＵＴＲ配列を含んでいる。
【0032】
したがって、５’ＵＴＲとして作用し得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダー配列及び遺伝子間配列を連結し、直ぐ後側に発現しようとする遺伝子のコーディング配列、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲ配列及びポリＡ配列を連結したｍＲＮＡを製作し、これを細胞に導入させると、所望のタンパク質を発現できることを確認した（図１）。また、５’ＵＴＲとしては、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＮＬ６３、ＳＡＲＳ－１、ＭＥＲＳ由来のリーダー配列も使用可能である。
【0033】
このとき、ｉｎ ｖｉｔｒｏで所望のターゲット遺伝子のｍＲＮＡを発現するために、前記配列の５’末端にプロモーター配列（Ｔ７、ＳＰ７など）を連結し、ＩＶＴ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）方法でターゲット遺伝子のｍＲＮＡを製作することができる。
【0034】
これに基づいて、本発明は、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡを発現するためのコーディング領域；前記コーディング領域の上流に位置する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）；及び前記コーディング領域の下流に位置する３’非翻訳領域（ＵＴＲ）；を含む遺伝子構造体であり、前記５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、コロナウイルスのリーダー配列を含む遺伝子構造体に関する。
【0035】
前記リーダー配列と関連して、コロナウイルスのうちゲノムＲＮＡと転写発現された各サブゲノムｍＲＮＡ（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｍＲＮＡ）は、５’末端に約７２ｂｐ～７７ｂｐで構成されたリーダー配列を共通的に有しており、これは、コロナウイルスの独特の特徴であり、ウイルス配列のうち感染細胞で最も豊富に存在するターゲットである。これは、コロナウイルスの全てのサブゲノムＲＮＡにおいて、ゲノムＲＮＡの５’末端から誘導された約７２ｂｐに該当するリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ＲＮＡ）が各サブゲノムＲＮＡの５’末端に結合するリーダージョイニング（ｌｅａｄｅｒ ｊｏｉｎｉｎｇ）現象を示すためである。よって、リーダー配列は、細胞内でウイルス遺伝子のうち最も高い複製数を有し、Ｎタンパク質をコーディングするサブゲノムＲＮＡがその次に高い複製数を有する。
【0036】
具体的には、前記５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、配列番号１で表されるコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）のリーダー配列を含む遺伝子構造体に関する。
【0037】
前記リーダー配列は、配列番号１（ＡＴＴＡＡＡＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＡＡＣＧ）で表される配列を含む。
【0038】
本明細書の「核酸」は、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。前記核酸と関連して、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、及び「オリゴヌクレオチド」は、相互交換的に使用される。任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はこれらの類似体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、公知又は非公知の任意の機能を行うことができる。ポリヌクレオチドは、一つ以上の変形したヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチド構造に対する変形は、ポリマーのアセンブリ前後に可能である。
【0039】
好ましくは、核酸は、糖／リン酸バックボーンのホスホジエステル結合によって互いに共有結合されたヌクレオチドモノマーを含んだり、又はこれからなるポリマーである。「核酸」は、塩基変形した、糖変形した、又はバックボーン変形したＤＮＡ又はＲＮＡ分子のような、変形した核酸を含む。
【0040】
前記ＤＮＡは、デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）に対する略語である。これは、核酸分子、すなわち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらのヌクレオチドは、通常、デオキシ－アデノシン－モノホスフェート、デオキシ－チミジン－モノホスフェート、デオキシ－グアノシン－モノホスフェート及びデオキシ－シチジン－モノホスフェートモノマーであり、糖（デオキシリボース）、塩基及びホスフェートからなり、特有のバックボーン構造によって重合される。バックボーン構造は、典型的には、１つ目に、ヌクレオチドの糖の一部、すなわち、デオキシリボース、２つ目に、ホスフェートの一部、隣接したモノマー間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の順序、すなわち、糖／ホスフェートバックボーンに連結された各塩基の順序は、ＤＮＡ配列と呼ばれる。ＤＮＡは、単一鎖又は二重鎖であり得る。二重鎖の形態において、第１の鎖のヌクレオチドは、典型的に第２の鎖のヌクレオチドと混成化し、例えば、Ａ／Ｔ塩基対及びＧ／Ｃ塩基対による。
【0041】
前記ＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡを含む。ＲＮＡは、通常、リボ核酸の略語である。これは、核酸分子、すなわち、ヌクレオチドからなるポリマーである。ヌクレオチドは、通常、いわゆるバックボーンを介して互いに連結されたアデノシン－モノホスフェート、ウリジン－モノホスフェート、グアノシン－モノホスフェート及びシチジンモノホスフェートモノマーである。バックボーンは、１つ目に、糖、例えば、リボースと、２つ目に、隣接モノマーのホスフェートの一部との間のホスホジエステル結合によって形成される。各モノマーの特異的な連続は、ＲＮＡ配列と呼ばれる。通常、ＲＮＡは、ＤＮＡ配列の転写によって、例えば、細胞内で得られる。真核細胞において、転写は、典型的に核又はミトコンドリア内で行われる。体内において、ＤＮＡの転写は、通常、ｍＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡに加工され得る。例えば、真核細胞内でのＲＮＡの加工は、スプライシング、５’－キャッピング、ポリアデニル化、核又はミトコンドリア及びそれと類似するものからの排出などの他の多様な転写後変形を含む。メッセンジャーＲＮＡは、通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。典型的には、ｍＲＮＡは、５’－キャップ、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）配列を含む。メッセンジャーＲＮＡを除いては、転写及び／又は翻訳の調節に含まれ得るＲＮＡのいくつかのノンコーディング形態が存在する。
【0042】
５’ＵＴＲは、オープンリーディングフレームの５’に位置する。５’ＵＴＲは、転写開始部位で始まり、オープンリーディングフレームの開始コドンの前のヌクレオチドで終決する。５’ＵＴＲは、例えば、リボソーム結合部位のような遺伝子発現を調節する要素を含むことができる。５’ＵＴＲは、例えば、５’－キャップの追加によって転写後変形し得る。５’ＵＴＲは、５’キャップと開始コドンとの間に位置した成熟ｍＲＮＡの配列に相応する。
【0043】
前記５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダー配列及び遺伝子間配列を連結したものであり、配列番号２～配列番号４で構成された群から選ばれる一つ以上の配列を含むことができる。
【0044】
３’ＵＴＲは、典型的には、ｍＲＮＡのタンパク質コーディング領域（すなわち、オープンリーディングフレーム）とポリ（Ａ）配列との間に位置したｍＲＮＡの一部である。ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、アミノ酸配列に翻訳されない。３’ＵＴＲ配列は、通常、遺伝子発現過程中にそれぞれｍＲＮＡに転写される遺伝子によってコーディングされる。遺伝体配列は、選択的イントロンを含むｍＲＮＡに優先的に転写される。その後、ｍＲＮＡは、５’キャッピング、スプライシング及び３’－末端のポリアデニル化のような３’－末端の変形及び選択的エンド又はエキソヌクレアーゼ分解などの段階を含む。３’ＵＴＲは、タンパク質コーディング領域の停止コドン３’の直ぐ横に位置し、ポリ（Ａ）配列５’の直ぐ横のヌクレオチドを含む。
【0045】
前記３’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲ配列を含むことができ、配列番号５の配列を含むことができる。
【0046】
典型的には、前記３’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、ペプチド又はタンパク質に翻訳され得るいくつかのヌクレオチドトリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔｓ）の配列であり得る。オープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン、すなわち、その５’－末端にアミノ酸メチオニン（ＡＴＧ又はＡＵＧ）を一般的にコーディングする３個の後続ヌクレオチドの組み合わせ、及び、通常、３ヌクレオチドの倍数の長さを示す後続領域を含む。ＯＲＦは、好ましくは、停止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）によって終決する。これは、オープンリーディングフレームの唯一の停止コドンである。したがって、本発明の脈絡で、オープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン（例えば、ＡＴＧ又はＡＵＧ）で始まり、好ましくは、停止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ又はＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡのそれぞれ）で終決する、３個に分けられ得るヌクレオチドの数からなるヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレームは、分離されたり、又は、より長い核酸配列、例えば、ベクター又はｍＲＮＡに併合され得る。また、オープンリーディングフレームは、「ポリペプチド又はタンパク質コーディング領域」と呼ばれ得る。
【0047】
本発明によると、プロモーター及び／又はポリ（Ａ）配列をさらに含むことができる。
【0048】
前記プロモーターは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の上流に位置し得る。前記プロモーターは、例えば、ＲＮＡ重合酵素プロモーターのような、転写のために必要な要素を含むことができる。前記プロモーターは、ＳＰ６又はＴ７などのファージＲＮＡ重合酵素プロモーター、好ましくは、ｍＲＮＡ配列をコーディングするＴ７プロモーターを含むことができる。
【0049】
前記ポリ（Ａ）配列の長さは多様であり得る。例えば、ポリ（Ａ）配列は、約２０アデニンヌクレオチド～約３００アデニンヌクレオチド、好ましくは、約４０アデニンヌクレオチド～約２００アデニンヌクレオチド、約６０アデニンヌクレオチド、７０アデニンヌクレオチド、８０アデニンヌクレオチド、９０アデニンヌクレオチド又は１００アデニンヌクレオチド、さらに好ましくは、約５０アデニンヌクレオチド～約１００アデニンヌクレオチド、又は約２０アデニンヌクレオチド～約４００アデニンヌクレオチドの長さを有することができる。
【0050】
ポリ（Ａ）配列は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の下流に位置し得る。例えば、ポリ（Ａ）配列は、直接又はリンカーを介して、例えば、１～５０、好ましくは、１～２０ヌクレオチドのリンカーを介して、又は、２、４、６、８、１０、２０などのヌクレオチドのような、ヌクレオチドのストレッチを介して連結され得る。
【0051】
具体的な実施例において、本発明に係る遺伝子構造体は、５’－から－３’－方向に５’－プロモーター－５’ＵＴＲ－コーディング領域（ＯＲＦ）－３’ＵＴＲ－ポリ（Ａ）の構造を含むことができる。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列を用いてターゲット遺伝子のｍＲＮＡをＩＶＴ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）方法で発現させるために、具体的には、５’－Ｔ７プロモーター－５’ＵＴＲ－ターゲット遺伝子－３’ＵＴＲ－ポリＡの配列で構成された鋳型ＤＮＡを製作することができる。
【0052】
また、本発明は、前記遺伝子構造体を含むベクターに関する。前記ベクターは、発現ベクター、クローニングベクターなどであり得る。前記ベクターは、ｍＲＮＡ又はペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のような発現生産物の生産に使用され得る。前記ベクターは、前記プロモーター配列、例えば、ＲＮＡプロモーター配列のようなベクターの配列ストレッチの転写に必要な配列を含むことができる。前記ベクターは、例えば、ＲＮＡベクター又はＤＮＡベクターであり得る。前記ベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドベクターであり得る。
【0053】
前記ベクターは、円形分子であってもよく、二重鎖分子を含むことができる。円形及び二重鎖ＤＮＡ分子は、独創的な人工核酸分子に貯蔵形態として容易に使用され得る。前記ベクターは、細胞、例えば、培養された細胞の形質転換に使用され得る。前記ベクターは、人工ＲＮＡ分子の獲得のために体外転写に使用され得る。前記円形ベクターは、例えば、制限酵素切断によって線形化され得る。
【0054】
場合によって、前記ベクターは、クローニング部位、抗生剤抵抗性因子のような選別マーカー、及び複製原点のようなベクターの増幅に適した配列を含むことができる。
【0055】
前記ベクターは、真核細胞、原核細胞、又は真核、原核、ウイルス又はファージ体外転写システムのような、真核生物、原核生物、ウイルス又はファージ転写システムを使用する転写に適している。場合によって、ベクターは、体外転写システムに基づいたＴ７ ＲＮＡ重合酵素のような、体外転写システムに基づいたファージを使用する体外転写に適している。
【0056】
前記ベクターは、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ－デキストラン処理、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ナノパーティクル－媒介形質注入、タンパク質伝達ドメイン媒介導入、及びＰＥＧ－媒介形質注入などのような当業界の多様な方法によって細胞に伝達され得るが、これに制限されるものではない。
【0057】
前記ベクターとして、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターなどの公知の発現ベクターを使用することができ、ベクターは、ＤＮＡ組換え技術を用いた任意の公知の方法によって当業者が容易に製造することができる。
【0058】
組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸の発現に適した形態で核酸を含むことができ、これは、組換え発現ベクターが発現のために使用されるように、すなわち、発現される核酸配列に作動可能に連結されるように宿主細胞をベースにして選択され得る一つ以上の調節要素を含むことを意味する。
【0059】
組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、関心ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を許容する方式で（例えば、試験管内転写／翻訳システムで、又は、ベクターが宿主細胞内に導入される場合は宿主細胞で）調節要素に連結されることを意味する。
【0060】
組換え発現ベクターは、Ｔ７プロモーターを含み、メッセンジャーＲＮＡ合成に適した形態を含むことができ、これは、ｉｎ ｓｉｔｕでｍＲＮＡ合成を行えるように、すなわち、Ｔ７ポリメラーゼによってメッセンジャーＲＮＡが合成され得る一つ以上の調節要素を含むことを意味する。
【0061】
「調節要素」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及びその他の発現調整要素（例えば、転写終決信号、例えば、ポリアデニル化信号及びポリ－Ｕ配列）を含むことができる。調節要素は、多くの類型の宿主細胞でヌクレオチド配列の誘導又は恒常的発現を指示する要素、及び特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示する要素（例えば、組織－特異的調節配列）を含む。
【0062】
具体的には、前記調節要素は、配列番号１８又は１９の配列を含む遺伝子構造体を含むことができる。
【0063】
前記核酸は、リボ核酸、例えば、メッセンジャーリボ核酸ｍＲＮＡの形態で注入され得る。本発明に係る核酸は、ｍＲＮＡの形態であり得る。これを通じて、一時的タンパク質発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が可能になる。
【0064】
本発明は、他の観点において、前記遺伝子構造体を含むワクチン組成物に関する。
【0065】
本発明は、他の観点において、前記遺伝子構造体を含む遺伝子治療用組成物に関する。
【0066】
前記組成物は、前記組成物で発現されたｍＲＮＡを伝達するための伝達手段を含むことができる。
【0067】
発現されたｍＲＮＡは、ナノ粒子、例えば、金ナノ粒子を介して伝達され得る。
【0068】
前記金ナノ粒子は、表面が変形可能である。変形に対する具体的な例示は、Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ．２０１９ Ｊｕｎｅ １８；５２（６）：１４９６－１５０６．及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０２１，１３，９００．などに具体的に例示されており、本発明に参照として導入され得る。
【0069】
前記ｍＲＮＡに金ナノ粒子を連結し、カチオン性エンドソーム破壊性（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ）ポリマーで複合体を形成し、この複合体を細胞に伝達することができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ １，ｐａｇｅｓ８８９－９０１（２０１７））。前記カチオン性エンドソーム破壊性（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ）ポリマーは、例えば、ポリエチレンイミン、ポリ（アルギニン）、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ－［２－｛（２－アミノエチル）アミノ｝－エチル－アスパルトアミド］（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とポリ（アルギニン）のブロックコポリマー、ＰＥＧとポリ（リシン）のブロックコポリマー、又はＰＥＧとポリ｛Ｎ－［Ｎ－（２－アミノエチル）－２－アミノエチル］アスパルトアミド｝（ＰＥＧ－ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））のブロックコポリマーであり得る。
【0070】
場合によって、表面がアルギニンで変形した金粒子を使用することができる。
【0071】
アルギニンで変形した金粒子を、核酸切断酵素又はこれをコーディングするポリヌクレオチド及び／又は切断因子又はこれをコーディングするポリヌクレオチドと共に組み立てることができる。これを通じて、結果物は、ターゲット細胞の膜と融合し、細胞質に移動するようになる（ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１７，１１：２４５２－２４５８）。
【0072】
発現されたｍＲＮＡは、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、ＬＮＰ（ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏ－Ｐａｒｔｉｃｌｅ）又は多様なナノ粒子を介して伝達され得る。リポソーム又はＬＮＰは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質又は中性脂質などを含み、さらに、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）又はコレステロールなどの他の脂質を含む場合もある。このようなｍＲＮＡ伝達体は、米国特許公開第２０１８／０３１１１７６号、第２０１９／００３２０５１号、第２０２１／００４６１９２号、国際特許公開第ＷＯ２０１８／０８１４８０号、第ＷＯ２０２０／０９７５４０号、第ＷＯ２０２０／０９７５４８号、第ＷＯ２０２１／００７２７８号などに具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
【0073】
前記カチオン性脂質は、米国特許公開第２０１８／０３１１１７６号、第２０１９／００３２０５１号などに具体的に例示されており、例えば、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、又は３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）又はそれらの類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザネジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン、β－Ｌ－アルギニル－２，３－Ｌ－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイルアミドトリヒドロクロリド、Ｎ’，Ｎ’－ジオクタデシル－Ｎ－４，８－ジアザ－１０－アミノデカノイルグリシンアミド［７１］、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、アミノリピド ２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ，１）、１，２－ジステアリルオキシ－／Ｖ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、Ｃ１２－２００、９８Ｎ１２－５、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－９－アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ５Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－８－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘンイコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコス－１８－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコス－１７－エン－９－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－１－ノニリコサ－１１，１４－ジエン－１－イル］ピロリジン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコス－２０－エン－１０－アミン、（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコス－１５－エン－１０－アミン、（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－１４－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－１７－エン－１０－アミン、（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコント－２４－エン－１０－アミン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－２０－エン－１０－アミン、（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコント－２２－エン－１０－アミン、（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコス－１６－エン－８－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘンイコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン－８－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘンイコサン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン、１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデカン－９－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン、Ｒ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、Ｓ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－［（５Ｚ）－オクト－５－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－（ノニルオキシ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン；（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，９，１２－トリエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－３－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ）－ドコス－１３－エン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ）－ドコス－１３－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（９Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｈ（１－メトイルオクチル）オキシ］－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－１－［（３，７－ジメチルオクチル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－（オクチルオキシ）－３－（｛８－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］－メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－｛［８－（２－オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン及び（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２－トリエン－１０－アミン、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン ５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、ＤＭＲＩＥ－ＨＰ、リポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）、３ｂ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カ
ルバモイル）コレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｉ」）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、ＤＭＤＭＡ、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ－ＴＫＯ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、リポフェクタミン、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ又はＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ｇａｍｍａ－ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＸＴＣ２、及びＣ２Ｋとしても知られている）、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ｙ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＭＣ２としても知られている）、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（ＭＣ３としても知られている）又は（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ）（１－Ｂ１１としても知られている）、又はその混合物であり得るが、これに制限されるものではない。
ルバモイル）コレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｉ」）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、ＤＭＤＭＡ、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ－ＴＫＯ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、リポフェクタミン、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ又はＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ｇａｍｍａ－ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＸＴＣ２、及びＣ２Ｋとしても知られている）、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ｙ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＭＣ２としても知られている）、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（ＭＣ３としても知られている）又は（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ）（１－Ｂ１１としても知られている）、又はその混合物であり得るが、これに制限されるものではない。
【0074】
前記非カチオン性脂質は、米国特許公開第２０１８／０３１１１７６号、第２０１９／００３２０５１号などに具体的に例示されており、例えば、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、又はリシルホスファチジルグリセロールであり得る。場合によって、前記非カチオン性脂質は、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン ４－（－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチル ＰＥ、１６－Ｏ－ジメチル ＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）であり得るが、これに制限されるものではない。
【0075】
前記中性脂肪は、米国特許公開第２０１８／０３１１１７６号、第２０１９／００３２０５１号などに具体的に例示されており、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、又はセレブロシドを含み得るが、これに制限されるものではない。
【0076】
前記ｍＲＮＡ伝達時に生成される粒子の凝集を防止するために、ＰＥＧ脂肪を含むことができる。ＰＥＧ脂肪は、米国特許公開第２０１８／０３１１１７６号、第２０１９／００３２０５１号などに具体的に例示されており、例えば、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、又はその混合物であり得る。非制限的な例として、ＰＬＧＡは、ＰＬＧＡ－ＤＳＰＥ－ＰＥＧを形成する脂質－終端（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）ＰＥＧにコンジュゲートされ得る。また、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＰＧ）、ジアルキルオキシプロピルに結合されたＰＥＧ（ｅ．ｇ．，ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールに結合されたＰＥＧ（ｅ．ｇ．，ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールに結合されたＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンに結合されたＰＥＧ、セラミドにコンジュゲートされたＰＥＧ、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミドオリゴマー（ｅ．ｇ．，ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）などのＰＥＧ－脂質コンジュゲート、及びその混合物から選択され得る。前記ＰＥＧは、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ又はその混合物であり得るが、これに制限されるものではない。
【0077】
前記ｍＲＮＡ伝達にペプチドが使用され得る。ペプチドは、核酸のアニオン性リン酸基との静電気的相互作用を行うカチオンを有さなければならなく、リン酸基との静電気的相互作用を行うために、正に荷電したアミノ酸を含むことができる。ｍＲＮＡ伝達に使用可能なペプチドの具体的な内容は、ＡＩＭＳ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，７（４）：３２３－３３８．に記載されており、本発明に参照として導入され得る。
【0078】
前記ｍＲＮＡ伝達に使用可能なペプチドは、プロタミンを含むことができる。プロタミンは、精巣で精子を形成中にあるＤＮＡの安定性に寄与するカチオン性アルギニンが豊富な小さい核タンパク質であり、プロタミンは、ｍＲＮＡ分子を安定化させ、効率的に伝達することができる。米国特許登録第９３５２０２８号には、プロタミン－ｍＲＮＡ複合物が具体的に記載されており、これは、本発明に参照として導入され得る。
【0079】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）も、ｍＲＮＡの伝達に有望なカチオン性分子であり得る。アルギニンが豊富なＲＡＬＡペプチド（ＷＥＡＲＬＡＲＡＬＡＲＡＬＡＲＨＬＡＲＡＬＡＲＡＬＲＡＣＥＡ）、ＲＡＬＡ、ＬＡＨ４（ＫＫＡＬＬＡＬＡＬＨＨＬＡＨＬＡＬＨＬＡＬＡＬＫＫＡ）及びＬＡＨ４－Ｌ１（ＫＫＡＬＬＡＨＡＬＨＬＬＡＬＬＡＬＨＬＡＨＡＬＫＫＡ）などの両親媒性ＣＰＰを用いてｍＲＮＡ分子を伝達することができる。
【0080】
場合によって、前記リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）又はＬＮＰ（ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏ－Ｐａｒｔｉｃｌｅ）以外に、ｍＲＮＡ伝達にペプチドをさらに含むことができる。前記ペプチドは、核酸パッケージング機能を提供し、ＤＮＡ又はＲＮＡが細胞内或いは細胞外で分解されることを防止することができる。このようなペプチドの例示は、米国特許公開第２０２１／０１７００４６号に具体的に記載されており、本明細書に参照として導入され得るが、これに制限されるものではない。前記組成物には、さらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含むことができる。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能でなければならなく、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち一つの成分を使用したり、又は二つ以上の成分を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化することができ、特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）された形態の剤形に製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥剤形の製造のために、本発明の属する技術分野で通常知られている方法が使用可能であり、凍結乾燥のための安定化剤が追加されることもある。さらに、当分野の適正な方法で又はレミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて各疾病又は成分によって好ましく製剤化することができる。
【0081】
本発明の組成物に含まれる有効成分などの含量及び投与方法は、通常の患者の症候と疾病の深刻度に基づいて本技術分野の通常の専門家が決定することができる。また、前記組成物は、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの多様な形態で製剤化することができ、単位－投与量又は多－投与量容器、例えば、密封されたアンプル及び瓶などで提供されることもある。
【0082】
本発明の組成物は、経口又は非経口投与が可能である。本発明に係る組成物の投与経路としては、これらに限定されないが、例えば、気管支、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下又は局所投与が可能である。本発明に係る組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、方法、排泄率又は疾病の重症度などによってその範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決定することができる。また、臨床投与のために、公知の技術を用いて本発明の組成物を適切な剤形に製剤化することができる。
【実施例】
【0083】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈しないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0084】
実施例１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列を確認するためのｃＤＮＡ合成
【0085】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のサブゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡの５’ＵＴＲと３’ＵＴＲ配列を確認するために、ベロ細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させて培養した後、分離した全体のＲＮＡを忠南大学校の獣医科大学（ＢＳＬ３）から受けた。これからｃＤＮＡを合成するために抽出した全体のＲＮＡ １μｇにオリゴ－ｄＴ ０．５μｇを添加し、合計１２．５μｌに作った後、６５℃で５分間氷に反応させた。上記の反応液に５Ｘ反応バッファー４μＬ、ｄＮＴＰミックス１ｍＭ、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈマイナス逆転写酵素（Ｍｉｎｕｓ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）１μｌ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を添加し、合計２０μｌの反応液に作った。逆転写反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）反応は、４２℃で６０分間、７０℃で１０分間行い、単一鎖ｃＤＮＡを合成した。
【0086】
製作されたｃＤＮＡからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ、Ｓ、Ｅ遺伝子の５’ＵＴＲと３’ＵＴＲを含むｃＤＮＡを増幅するためにＰＣＲを行った。ＰＣＲに使用したプライマー配列は、表１の通りである。
【0087】
【表1】
【0088】
ＰＣＲ反応は、合計２０μｌの溶液で行い、合成されたｃＤＮＡ １ｎｇ、順方向プライマー（配列番号７）１０ｐｍｏｌｅ、逆方向プライマー（配列番号７～配列番号９）１０ｐｍｏｌｅ、２Ｘ ｐｆｕマスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）１０μＬ（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を添加した。ＰＣＲ反応条件は、次の通りである：９５℃で２分（１サイクル）；９５℃で２０秒－６０℃で４０秒－７２℃で１分（３０サイクル）；７２℃（５分）。ＰＣＲ産物は、ｐＴＯＰ Ｂｌｕｎｔ Ｖ２ベクター（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｅｊｅｏｎ，、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）した後、ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に形質転換した。形質転換後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）が含まれた固体培地（Ｂｉｏｌｏａｒｄ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に塗抹し、３７℃で８時間培養した後、ＨｉＧｅｎｅＴＭプラスミドミニプレップキット（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ）（Ｖｅｒ．２．０）（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した後、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングを行った。
【0089】
実施例２．サンガーシーケンシングを通じたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ、Ｓ、Ｅ遺伝子の５’ＵＴＲ及び共通３’ＵＴＲ配列の確認
【0090】
【表2】
【0091】
３’ＵＴＲ ５’－
ＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣ－３’（配列番号５）
ＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣ－３’（配列番号５）
【0092】
実施例３．ＧＦＰ ｍＲＮＡ発現のためのＩＶＴ鋳型の製作
【0093】
ＧＦＰ ｍＲＮＡ発現のためのＩＶＴ鋳型を製作するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子の５’ＵＴＲの直ぐ後側にＧＦＰ遺伝子コーディング配列を連結し、続いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２３’ＵＴＲ配列及びポリＡ配列（６５ヌクレオチド）をＰＣＲ方法で連結した（図３）。
【0094】
このために、Ｎ遺伝子の５’ＵＴＲにＴ７プロモーター配列（配列番号１０：５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）をＰＣＲ方法で連結した。前記実施例１で製作されたＮ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ １ｎｇを鋳型として用いて、順方向プライマー（配列番号６）１０ｐｍｏｌｅ、逆方向プライマー（配列番号１１）１０ｐｍｏｌｅ、２Ｘ ｐｆｕマスターミックス１０μＬ（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を添加した。ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）反応条件は、次の通りである：９５℃で２分（１サイクル）；９５℃で２０秒－６０℃で４０秒－７２℃で１分（３０サイクル）；７２℃（５分）。製作されたＰＣＲ産物は、アガロースゲル（２％）に電気泳動して確認した。Ｎ遺伝子の３’ＵＴＲ配列は、前記実施例１で製作されたＮ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ １ｎｇを用いて、順方向プライマー（配列番号１２）１０ｐｍｏｌｅ、逆方向プライマー（配列番号１３）１０ｐｍｏｌｅ、２Ｘ ｐｆｕマスターミックス１０μＬ（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を添加した。ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）反応条件は、次の通りである：９５℃で２分（１サイクル）；９５℃で２０秒－６０℃で４０秒－７２℃で１分（３０サイクル）；７２℃（５分）。製作されたＰＣＲ産物は、アガロースゲル（２％）に電気泳動して確認した。ＧＦＰ遺伝子は、ＧＦＰ遺伝子を含むｐＦＧＦＰ Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１ｎｇを鋳型として用いて、５’ＵＴＲの３’末端配列とＧＦＰ遺伝子の５’末端配列とが連結された順方向プライマー（配列番号１４）１０ｐｍｏｌｅ、ＧＦＰ遺伝子の３’末端配列と３’ＵＴＲの５’末端配列とが連結された逆方向プライマー（配列番号１５）１０ｐｍｏｌｅ、２Ｘ ｐｆｕマスターミックス１０μＬ（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を添加した。ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）反応条件は、次の通りである：９５℃で２分（１サイクル）；９５℃で２０秒－６０℃で４０秒－７２℃で１分（３０サイクル）；７２℃（５分）。製作されたＰＣＲ産物は、アガロースゲル（２％）に電気泳動して確認した。
【0095】
Ｔ７プロモーター配列、５’ＵＴＲ配列、ＧＦＰ遺伝子配列、３’ＵＴＲ配列及び６５ヌクレオチドのポリＡ配列を連結するためにＰＣＲ方法を使用した。前記製作されたそれぞれのＰＣＲ産物を１００ｐｇずつ同量で混合した後で鋳型として使用し、順方向Ｔ７プロモーター配列プライマー１０ｐｍｏｌｅ（配列番号６）、３’ＵＴＲ配列の３’末端の２０ヌクレオチドと６５ヌクレオチドのポリＡ配列を連結した逆方向プライマー（配列番号１６）１０ｐｍｏｌｅ、２Ｘ ｐｆｕマスターミックス１０μＬ（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を添加した。ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）反応条件は、次の通りである：９５℃で２分（１サイクル）；９５℃で２０秒－６０℃で４０秒－７２℃で２分（３０サイクル）；７２℃（５分）。製作されたＰＣＲ産物は、アガロースゲル（２％）に電気泳動して確認した。ＰＣＲ産物は、ｐＴＯＰ Ｂｌｕｎｔ Ｖ２ベクター（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）にライゲーションした後、ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に形質転換した。形質転換後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）が含まれた固体培地（Ｂｉｏｌｏａｒｄ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に塗抹し、３７℃で８時間培養した後、ＨｉＧｅｎｅＴＭプラスミドミニプレップキット（Ｖｅｒ．２．０）（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した後、サンガーシーケンシングで製作されたＩＶＴ鋳型配列を確認した（配列番号１８）。
【0096】
ターゲット遺伝子が含まれていない対照群ＲＮＡ発現のためのＩＶＴ鋳型を製作するために、前記製作された３’ＵＴＲ ＤＮＡ １００ｐｇを鋳型として用いて、５’ＵＴＲの３’末端配列と３’ＵＴＲの５’末端配列とが連結された順方向プライマー（配列番号１６）１０ｐｍｏｌｅ、３’ＵＴＲの３’末端配列と６５ヌクレオチドとが連結された逆方向プライマー（配列番号１７）１０ｐｍｏｌｅ、２Ｘ ｐｆｕマスターミックス１０μＬ（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を添加した。ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）反応条件は、次の通りである：９５℃で２分（１サイクル）；９５℃で２０秒－６０℃で４０秒－７２℃で１分（３０サイクル）；７２℃（５分）。製作されたＰＣＲ産物は、アガロースゲル（２％）に電気泳動して確認した。
【0097】
Ｔ７プロモーター配列、５’ＵＴＲ配列、３’ＵＴＲ配列及び６５ヌクレオチドのポリＡ配列を連結するためにＰＣＲ方法を使用した。前記製作されたそれぞれのＰＣＲ産物を１００ｐｇずつ同量で混合した後で鋳型として使用し、順方向Ｔ７プロモーター配列プライマー１０ｐｍｏｌｅ（配列番号６）、３’ＵＴＲ配列の３’末端の２０ヌクレオチドと６５ヌクレオチドのポリＡ配列を連結した逆方向プライマー（配列番号１６）１０ｐｍｏｌｅ、２Ｘ ｐｆｕマスターミックス１０μＬ（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を添加した。ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）反応条件は、次の通りである：９５℃で２分（１サイクル）；９５℃で２０秒－６０℃で４０秒－７２℃で１分（３０サイクル）；７２℃（５分）。製作されたＰＣＲ産物は、アガロースゲル（２％）に電気泳動して確認した。
【0098】
ＰＣＲ産物は、ｐＴＯＰ Ｂｌｕｎｔ Ｖ２ベクター（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）にライゲーションした後、ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に形質転換した。形質転換後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）が含まれた固体培地（Ｂｉｏｌｏａｒｄ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に塗抹し、３７℃で８時間培養した後、ＨｉＧｅｎｅＴＭプラスミドミニプレップキット（Ｖｅｒ．２．０）（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した後、サンガーシーケンシングで製作されたＩＶＴ鋳型配列を確認した（配列番号１９）。
【0099】
【表3】
【0100】
［配列番号１８］Ｔ７ ５ＵＴＲ ｅＧＦＰ ３’ＵＴＲ ｏｌｉｇｏ ｄＴ （６５）
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＡＡＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＡＡＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
【0101】
［配列番号１９］Ｔ７ ５’ＵＴＲ ３’ＵＴＲ ｏｌｉｇｏ ｄＴ（６５）
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＡＡＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＣＴＡＡＡＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＡＡＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＣＴＡＡＡＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
【0102】
実施例４．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ遺伝子ｍＲＮＡ発現のためのＩＶＴ鋳型の製作
【0103】
実施例１で合成したｃＤＮＡ １ｎｇを用いて、ＰＣＲ反応を合計２０μＬの溶液で行い、順方向プライマー（配列番号６）１０ｐｍｏｌｅ、逆方向プライマー（配列番号１６）１０ｐｍｏｌｅ、２Ｘ ｐｆｕマスターミックス１０μＬ（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を添加した。ＰＣＲ反応条件は、次の通りである：９５℃で２分（１サイクル）；９５℃で２０秒－６０℃で４０秒－７２℃で２分３０秒（３０サイクル）；７２℃（５分）。ＰＣＲ産物は、ｐＴＯＰ Ｂｌｕｎｔ Ｖ２ベクター（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）にライゲーションした後、ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に形質転換した。形質転換後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）が含まれた固体培地（Ｂｉｏｌｏａｒｄ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に塗抹し、３７℃で８時間培養した後、ＨｉＧｅｎｅＴＭプラスミドミニプレップキット（Ｖｅｒ．２．０）（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した後、サンガーシーケンシングを行った（配列番号２０）。
【0104】
実施例５．ヒトＡＤＣＹＡＰ１遺伝子ｍＲＮＡ発現のためのＩＶＴ鋳型の製作
【0105】
ＡＤＣＹＰ１ ｍＲＮＡ発現のためのＩＶＴ鋳型を製作するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子の５’ＵＴＲの直ぐ後側にＡＤＣＹＡＰ１遺伝子コーディング配列を連結し、続いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２３’ＵＴＲ配列とポリＡ配列（６５ヌクレオチド）をＰＣＲ方法で連結した（図３）。
【0106】
このために、ＡＤＣＹＡＰ１遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３プラスミドＤＮＡ（大韓民国登録特許第１３９９０７７号）１ｎｇを鋳型として用いて、５’ＵＴＲの３’末端配列とＡＤＣＹＡＰ１遺伝子の５’末端配列とが連結された順方向プライマー（配列番号２１）１０ｐｍｏｌｅ、ＡＤＣＹＡＰ１遺伝子の３’末端配列と３’ＵＴＲの５’末端配列とが連結された逆方向プライマー（配列番号２２）１０ｐｍｏｌｅ、２Ｘ ｐｆｕマスターミックス１０μＬ（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を添加した。ＰＣＲ反応条件は、次の通りである：９５℃で２分（１サイクル）；９５℃で２０秒－６０℃で４０秒－７２℃で２分（３０サイクル）；７２℃（５分）。
【0107】
Ｔ７プロモーター配列、５’ＵＴＲ配列、ＡＤＣＹＡＰ１遺伝子配列、３’ＵＴＲ配列及び６５ヌクレオチドのポリＡ配列を連結するためにＰＣＲ方法を使用した。前記製作されたそれぞれのＰＣＲ産物を１０ｐｇずつ同量で混合した後で鋳型として使用し、順方向Ｔ７プロモーター配列プライマー（配列番号６）１０ｐｍｏｌｅ、３’ＵＴＲ配列の３’末端の２０ヌクレオチドと６５ヌクレオチドのポリＡ配列を連結した逆方向プライマー（配列番号１６）１０ｐｍｏｌｅ、２Ｘ ｐｆｕマスターミックス１０μＬ（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を添加した。ＰＣＲ反応条件は、次の通りである：９５℃で２分（１サイクル）；９５℃で２０秒－６０℃で４０秒－７２℃で２分３０秒（３０サイクル）；７２℃（５分）。製作されたＰＣＲ産物は、アガロースゲル（２％）に電気泳動して確認した。ＰＣＲ産物は、ｐＴＯＰ Ｂｌｕｎｔ Ｖ２ベクター（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）にライゲーションした後、ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に形質転換した。形質転換後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）が含まれた固体培地（Ｂｉｏｌｏａｒｄ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に塗抹し、３７℃で８時間培養した後、ＨｉＧｅｎｅＴＭプラスミドミニプレップキット（Ｖｅｒ．２．０）（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した後、サンガーシーケンシングを行った（配列番号２３）。
【0108】
【表4】
【0109】
［配列番号２３］Ｔ７ ５’ＵＴＲ ＡＤＣＹＡＰ１ ３’ＵＴＲ ｏｌｉｇｏ ｄＴ （６５）
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＡＡＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＧＧＧＡＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＣＧＧＧＡＴＣＡＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＧＡＴＧＧＣＴＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＣＧＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＧＣＴＣＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧＣＧＣＣＡＣＴＣＧＧＡＣＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＡＡＣＡＡＡＧＧＧＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＴＡＡＡＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＧＧＧＡＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＣＧＧＧＡＴＣＡＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＧＡＴＧＧＣＴＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＣＧＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＧＣＴＣＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧＣＧＣＣＡＣＴＣＧＧＡＣＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＡＡＣＡＡＡＧＧＧＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
【0110】
実施例６．ＩＶＴを通じたＧＦＰ、Ｎ遺伝子及びＡＤＣＹＡＰ１ ｍＲＮＡ発現の確認
【0111】
ＩＶＴ方法でそれぞれのｍＲＮＡを製作するために、Ｔ７プロモーター配列に該当する順方向プライマー（配列番号６）１０ｐｍｏｌｅ、３’ＵＴＲと６５ヌクレオチドのポリＡとが連結された逆方向プライマー（配列番号１６）１０ｐｍｏｌｅ、２Ｘ ｐｆｕマスターミックス（Ｂｉｏｆａｃｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）１０μｌを添加し、合計２０μＬになるようにＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、次の通りである：９５℃で２分（１サイクル）；９５℃で２０秒－６０℃で４０秒－７２℃で２分３０秒（３０サイクル）；７２℃（５分）。増幅したＰＣＲ産物は、１％のアガロースゲルで電気泳動した後、Ｑｉａｑｕｉｃｋ(R)ゲル抽出キット（Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製し、ＩＶＴのための鋳型として使用した。
【0112】
ＩＶＴは、Ｈｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（ＮＥＢ）を用いて製造社の指針に従って行った。前記製作されたＰＣＲ産物１μｇを鋳型として用いて、２Ｘ ＡＲＣＡ／ＮＴＰ ＭＩＸ １０μｌ及びＴ７ポリメラーゼ２μｌを添加し、対照群の場合は３７℃で１６時間、ＧＦＰ、ＡＤＣＹＡＰ、及びＮ遺伝子（ｇｅｎｅ）の場合は３７℃１時間にわたって反応させることによって、ｍＲＮＡを合成し、５’末端に抗－逆転キャップ類似体（Ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ ｃａｐ ａｎａｌｏｇ；ＡＲＣＡ）を追加できるようにした。反応後、ＤＮａｓｅ Ｉを２μｌ添加した後、３７℃で１５分間反応させることによってＤＮＡ鋳型を除去した。ＩＶＴ反応後、反応溶液をＬｉＣｌ溶液（ＮＥＢ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）と２：１の体積で混合し、－２０℃で３０分間培養した後、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって上澄液を除去した。冷たい７０％のエタノールを５００μＬ入れ、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後で上澄液を除去し、常温で１０分間培養することによって残った溶液を除去し、最終５０μＬのＲＮａｓｅフリー（ｆｒｅｅ）蒸留水に溶出した。精製されたＲＮＡは、Ｑｕｂｉｔを用いて定量し、アガロースゲル（１％、０．５Ｘ ＴＢＥ）に電気泳動することによってｍＲＮＡ産物を確認した（図６）。電気泳動後、サイズを確認した結果、予想されるサイズと一致することを確認した。
【0113】
実施例７．ヒト細胞株対象ＧＦＰ、Ｎ遺伝子及びＡＤＣＹＡＰ１タンパク質発現の確認
【0114】
７－１．トランスフェクション及び細胞収獲
【0115】
ＩＶＴ方法で合成されたｍＲＮＡをリポフェクタミンメッセンジャーＭＡＸと１：１、ｗ：ｖで混ぜ、子宮頸部癌細胞株であるＨｅＬａ細胞株にトランスフェクションした後、４８時間にわたってＣＯ２培養器で培養した。ＧＦＰ ｍＲＮＡトランスフェクションした細胞の場合、トランスフェクションしてから４８時間後、蛍光顕微鏡を通じてＧＦＰの発現を確認した後で細胞を収穫した。ＡＤＣＹＡＰ１ ｍＲＮＡトランスフェクト細胞（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌ）の場合、トランスフェクションしてから４８時間後、細胞イメージング（ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ）を行い、ヘモサイトメーター（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）でカウントし、細胞生存性（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定した後で収穫した。Ｎ遺伝子ｍＲＮＡトランスフェクト細胞の場合、トランスフェクションしてから４８時間後、細胞イメージングを行って収穫した。収獲された細胞から、ｐｒｏ－ｐｒｅｐ（ｉＮｔＲＯＮ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｏｎｇｎａｍ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を用いて製造社の指針に従ってタンパク質を抽出した。
【0116】
７－２．ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）
【0117】
抽出したタンパク質は、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）Ｔｅｔｒａ垂直型電気泳動セル（Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｃｅｌｌ）（Ｂｉｏ－ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）装備を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロースメンブレン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｂｉｏ－ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に移動させた。メンブレンに移動させたタンパク質は、５％のスキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）（Ｂｉｏｐｕｒｅ，Ｓｅｏｕｌ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）で１時間にわたってブロッキングした後、５％のスキムミルクにそれぞれ抗ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）、抗ＡＤＣＹＡＰ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ヌクレオカプシド（ｂｉｏＳｅｒｖＵＫ，Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，ＵＫ）、抗ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）抗体を希釈した溶液にメンブレンを入れ、４℃で１６時間にわたって反応させた。前記結果物は、１Ｘ ＴＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄し、５％のスキムミルクに２次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を希釈した溶液に常温で２時間にわたって反応させ、１Ｘ ＴＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄した。ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ溶液（Ａｄｖａｎｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）とＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ ＥＣＬ溶液（Ａｄｖａｎｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を１：１の比率で混ぜてからメンブレンに処理し、常温で１分間反応させた後、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ＋（Ｂｉｏ－ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）装備を用いてタンパク質の発現を確認した。
【0118】
７－３．蛍光イメージングとウェスタンブロットを通じたＧＦＰタンパク質発現の確認
【0119】
ＨｅＬａ細胞株にトランスフェクションしてから４８時間後、蛍光顕微鏡を通じて観察した結果、試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）と対照群ｍＲＮＡを処理した細胞ではＧＦＰの発現を確認できなかったが、ＧＦＰｍＲＮＡを処理した細胞ではＧＦＰの発現を確認できた。細胞を収穫し、タンパク質を抽出した後でウェスタンブロットを行った結果も、ＧＦＰ ｍＲＮＡを処理した細胞でのみＧＦＰの発現を確認できた（図７）。これを通じて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５’ＵＴＲと３’ＵＴＲ配列を用いて本発明で製作したｍＲＮＡが細胞内に入り込み、タンパク質としてうまく発現されることを確認できた。したがって、本発明を通じて、その他のｍＲＮＡを発現できることを提示する。
【0120】
７－４．ＡＤＣＹＡＰ１の細胞増殖抑制効果の確認及びウェスタンブロットを通じたＡＤＣＹＡＰ１タンパク質発現の確認
【0121】
ＡＤＣＹＡＰ１は、子宮頸部癌細胞の生長を抑制するものとして知られている（大韓民国登録特許：第１３９９０７７号）。子宮頸部癌ＨｅＬａ細胞株にトランスフェクションしてから４８時間後、細胞の生長を確認した結果、対照群ｍＲＮＡをトランスフェクションした細胞と比較したとき、ＡＤＣＹＡＰ ｍＲＮＡをトランスフェクションした細胞は約４０％減少することを確認できた（図８）。また、細胞を収穫し、タンパク質を抽出した後でウェスタンブロットを行った結果、ＡＤＣＹＡＰ１ ｍＲＮＡを処理した細胞ではＡＤＣＹＡＰ１タンパク質の発現が増加することを確認できた。これを通じて、細胞内で発現されたＡＤＣＹＡＰ１タンパク質によって細胞の増殖が抑制されることを確認できた（図８）。このような結果は、本発明を通じて製作されるｍＲＮＡを癌治療剤の目的で活用できることを提示する。
【0122】
７－５．ウェスタンブロットを通じたヌクレオカプシドタンパク質発現の確認
【0123】
ＨｅＬａ細胞株にトランスフェクションしてから４８時間後、細胞を収穫し、タンパク質を抽出した後でウェスタンブロットを行った結果、Ｎ遺伝子ｍＲＮＡを処理した細胞ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質が発現されることを確認できた（図９）。
【0124】
以上では、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は好適な実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。
【産業上の利用可能性】
【0125】
本発明に係る遺伝子構造体を通じて、増加したタンパク質の生産を提供できるｍＲＮＡを発現することができる。これにより、ワクチン又は遺伝子治療に使用できる薬学的組成物を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【0126】
電子ファイルを添付した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】