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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-18
(54)【発明の名称】ポリリボヌクレオチドを精製するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20241010BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z
C12N15/10 110Z
C12N15/10 114Z
C12N15/10 100Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024522631
(86)(22)【出願日】2022-10-18
(85)【翻訳文提出日】2024-05-27
(86)【国際出願番号】 US2022046969
(87)【国際公開番号】W WO2023069397
(87)【国際公開日】2023-04-27
(31)【優先権主張番号】63/256,703
(32)【優先日】2021-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520445473
【氏名又は名称】フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ダドキン， ヴァディム
(72)【発明者】
【氏名】ペク， キ ヨン
(57)【要約】
本開示は、ポリリボヌクレオチドを分離及び／又は精製するための組成物及び方法に関する。ポリリボヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドとポリリボヌクレオチドの標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとの混合物から分離することができ、治療薬としての使用として利用可能であり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的領域を含む線状ポリリボヌクレオチドを、線状ポリリボヌクレオチド及び環状ポリリボヌクレオチドの混合物を含む複数のポリリボヌクレオチドから分離する方法であって、（ａ）前記複数のポリリボヌクレオチドであって、そのサブセットが前記標的領域を含む前記線状ポリリボヌクレオチドを含む複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することと；
（ｂ）前記サンプルを前記標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させることと；
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている前記標的領域を含む前記線状ポリリボヌクレオチドを、前記サンプル中の前記複数のポリリボヌクレオチドから分離することと；
を含む、方法。
【請求項2】
前記環状ポリリボヌクレオチドが、前記標的領域を欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
標的領域を含むポリリボヌクレオチドを、複数のポリリボヌクレオチドから分離する方法であって、（ａ）前記複数のポリリボヌクレオチドであって、そのサブセットが前記標的領域を含み、前記標的領域が前記標的領域を含む前記ポリリボヌクレオチドの３’又は５’末端に位置しない、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することと；
（ｂ）前記サンプルを前記標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させることと；
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている前記標的領域を含む前記ポリリボヌクレオチドを前記サンプル中の前記複数のポリリボヌクレオチドから分離することと、
を含む、方法。
【請求項4】
標的領域を含む線状ポリリボヌクレオチドを前記標的領域を含む複数の環状ポリリボヌクレオチドから分離する方法であって、（ａ）前記複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することと；
（ｂ）前記サンプルを、前記線状ポリリボヌクレオチドの前記標的領域と第１の結合親和性でハイブリダイズし、前記環状ポリヌクレオチドの前記標的領域と前記第１の結合親和性と異なる第２の結合親和性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させることと；
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている前記標的領域を含む前記線状ポリリボヌクレオチドを、前記サンプル中の前記複数の環状ポリリボヌクレオチドから分離することと、
を含む、方法。
【請求項5】
前記第１の結合親和性が、前記第２の結合親和性より小さく、前記オリゴヌクレオチドが、前記線状ポリリボヌクレオチドに優先的に結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
標的領域を含む第１の配置におけるポリリボヌクレオチドを、前記標的領域を含む第２の配置における複数のポリリボヌクレオチドから分離する方法であって、（ａ）前記複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することと；
（ｂ）前記サンプルを、前記第１の配置における前記ポリヌクレオチドの前記標的領域と第１の結合親和性でハイブリダイズし、前記第２の配置における前記ポリヌクレオチドの前記標的領域と前記第１の結合親和性と異なる第２の結合親和性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させることと；
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている前記標的領域を含む前記第１の配置における前記ポリリボヌクレオチドを、前記サンプル中の前記第２の配置における前記複数のポリリボヌクレオチドから分離することと、
を含む、方法。
【請求項7】
前記第１の結合親和性が前記第２の結合親和性より低く、前記オリゴヌクレオチドが前記第１の配置における前記ポリリボヌクレオチドに優先的に結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ステップ（ｃ）が、前記オリゴヌクレオチドを固定化することを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記標的領域がポリＡ配列を欠いている、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記オリゴヌクレオチドが粒子にコンジュゲートされている、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記オリゴヌクレオチドが第１の捕捉剤にコンジュゲートされている、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記オリゴヌクレオチドが、前記第１の捕捉剤に化学的リンカーによってコンジュゲートされている、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記化学的リンカーがトリエチレングリコールを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記化学的リンカーが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端にコンジュゲートされている、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項15】
前記第１の捕捉剤が抗原を含む、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記抗原がビオチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記第１の捕捉剤に結合する第２の捕捉剤を準備することをさらに含む、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記第２の捕捉剤が抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記抗体又はその抗原結合断片がストレプトアビジンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記第２の捕捉剤が粒子にコンジュゲートされている、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記粒子が磁気粒子又はビーズである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記標的領域を含む前記ポリリボヌクレオチドが、イントロン又はその一部分を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記標的領域がイントロン又はその一部分を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記標的領域が、前記イントロン又はその一部分の５’又は３’側に位置する、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
スプライスされたポリリボヌクレオチドをスプライスされていない又は部分的にスプライスされたポリリボヌクレオチドから分離することを含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項26】
前記スプライスされたポリリボヌクレオチドが環状ポリリボヌクレオチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記スプライスされたポリリボヌクレオチドが線状ポリリボヌクレオチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
前記スプライスされたポリリボヌクレオチドが、イントロン又はその一部分を欠いている、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記スプライスされたポリリボヌクレオチドの量を、前記サンプルと比較して少なくとも５０％富化する、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記イントロン又はその一部分を含む前記ポリリボヌクレオチドが、線状ポリリボヌクレオチドである、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記標的領域を含む前記捕捉されたポリリボヌクレオチドを１回以上洗浄することをさらに含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
ステップ（ｃ）後、第１の溶出ステップを実施して、前記標的領域を含む前記捕捉されたポリリボヌクレオチドを放出することをさらに含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記第１の溶出ステップが、第１の緩衝剤を添加し、及び／又は前記サンプルを加熱することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記第１の溶出ステップが、前記サンプルを少なくとも５０℃に加熱することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記第１の溶出ステップ後、第２の溶出ステップを実施することをさらに含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記第２の溶出ステップが、第２の緩衝剤を添加し、及び／又は前記サンプルを加熱することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項37】
前記第２の溶出ステップが、前記サンプルを少なくとも５０℃に加熱することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記第２の緩衝液が変性剤を含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項39】
前記変性剤が、ホルムアミド又は尿素を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
ステップ（ａ）が、前記サンプルを前記オリゴヌクレオチドとともに少なくとも１０分間インキュベートすることを含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
ステップ（ｂ）が、前記オリゴヌクレオチドによって結合されていない前記サンプルの一部分を回収することを含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
複数のオリゴヌクレオチドであって、各オリゴヌクレオチドが異なる標的領域にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドを準備することを含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
各オリゴヌクレオチドが、第１の捕捉剤にコンジュゲートされている、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的領域の長さが等しい部分と少なくとも８０％の相補性を有する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的領域の前記長さが等しい部分と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の相補性を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
ステップ（ａ）が、前記オリゴヌクレオチドを、前記標的領域を含む前記ポリリボヌクレオチドに対する１０：１～１：１０のモル比で準備することを含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法によって生成される、ポリリボヌクレオチドの集団。
【請求項48】
請求項４７に記載のポリリボヌクレオチドの集団であって、標的領域を欠いている環状ポリリボヌクレオチドを含み、前記環状ポリリボヌクレオチドが、前記組成物中の前記全ポリリボヌクレオチドの少なくとも４０％（モル／モル）を含む、集団。
【請求項49】
ポリリボヌクレオチドの混合物を含む組成物であって、前記混合物の第１のサブセットが、標的領域を欠いている環状ポリリボヌクレオチドを含み、前記複数のポリリボヌクレオチドの第２のサブセットが、前記標的領域を含む線状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで前記第１のサブセットが、前記組成物中の前記全ポリリボヌクレオチドの少なくとも４０％（モル／モル）を含む、組成物。
【請求項50】
前記集団が、５０％（モル／モル）未満の線状ポリリボヌクレオチドを含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項51】
標的領域を含むポリリボヌクレオチド及び前記標的領域にハイブリダイズするように設計されているオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが第１の捕捉剤にコンジュゲートされている、組成物。
【請求項52】
前記標的領域を欠いているポリリボヌクレオチドをさらに含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項53】
前記標的領域を欠いている前記ポリリボヌクレオチドが環状ポリリボヌクレオチドである、請求項５２に記載の組成物。
【請求項54】
前記第１の捕捉剤に結合するように設計されている第２の捕捉剤をさらに含む、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項55】
前記第２の捕捉剤が粒子にコンジュゲートされている、請求項５４に記載の組成物。
【請求項56】
前記第１の捕捉剤がビオチンである、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項57】
前記第２の捕捉剤がストレプトアビジンである、請求項５１～５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項58】
請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法によって生成される、請求項４９～５７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項59】
前記線状ポリリボヌクレオチドが、イントロン又はその一部分を含む、請求項４９～５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項60】
前記標的領域が、前記イントロン又はその一部分を含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項61】
前記標的領域が、前記イントロン又はその一部分の５’又は３’側に位置する、請求項６０に記載の組成物。
【請求項62】
請求項４９～６１のいずれか一項に記載の組成物及び希釈剤、担体、又は賦形剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
ポリリボヌクレオチドは、種々の治療及び改変適用に有用である。したがって、ポリリボヌクレオチドを分離及び精製するための新しい組成物及び方法が有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0002】
一態様では、本発明は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドを複数のポリリボヌクレオチドから分離する方法を特徴とする。この方法では、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルが準備される。サンプル中の複数のポリリボヌクレオチドのサブセットは、標的領域を有する。方法は、サンプルを標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させること、及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有するポリリボヌクレオチドをサンプル中の複数のポリリボヌクレオチドから分離することをさらに含む。
【0003】
別の態様では、本発明は、標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドを、線状ポリリボヌクレオチド及び環状ポリリボヌクレオチドの混合物を含む複数のポリリボヌクレオチドから分離する方法を特徴とする。この方法では、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルが準備される。サンプル中の複数の線状ポリリボヌクレオチドのサブセットは、標的領域を有する。方法は、サンプルを標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させること、及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドをサンプル中の複数のポリリボヌクレオチドから分離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的領域を有するポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列（即ち、ポリＡテール）を欠いている。いくつかの実施形態では、標的領域は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドの３’又は５’末端に位置しない。環状ポリリボヌクレオチド又はそのサブセットは、標的領域が欠け得る。
【0004】
別の態様では、本発明は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドを複数のポリリボヌクレオチドから分離する方法を特徴とする。方法は、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含み、ここで複数のポリリボヌクレオチドのサブセットは、標的領域を有する。標的領域は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドの３’又は５’末端に位置しない（即ち、標的領域は、ポリリボヌクレオチド上に内部的に位置する）。方法は、サンプルを標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させること、及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有するポリリボヌクレオチドをサンプル中の複数のポリリボヌクレオチドから分離することをさらに含む。
【0005】
別の態様では、本発明は、標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドを、標的領域を有する複数の環状ポリリボヌクレオチドから分離する方法を特徴とする。方法は、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含む。方法は、サンプルをオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む。オリゴヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性でハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性と異なる第２の結合親和性でハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドをサンプル中の複数の環状ポリリボヌクレオチドから分離する。いくつかの実施形態では、第１の結合親和性は、第２の結合親和性より低く、オリゴヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドに優先的に結合する。
【0006】
別の態様では、本発明は、標的領域を有する第１の配置におけるポリリボヌクレオチドを、標的領域を有する第２の配置における複数のポリリボヌクレオチドから分離する方法を特徴とする。方法は、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含む。方法は、サンプルをオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む。オリゴヌクレオチドは、第１の配置におけるポリヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性でハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドは、第２の配置におけるポリヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性と異なる第２の結合親和性でハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有する第１の配置におけるポリリボヌクレオチドをサンプル中の第２の配置における複数のポリリボヌクレオチドから分離する。いくつかの実施形態では、第１の結合親和性は、第２の結合親和性より低く、オリゴヌクレオチドは、第１の配置におけるポリリボヌクレオチドに優先的に結合する。
【0007】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、分離は、オリゴヌクレオチドを固定化することを含む。
【0008】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、標的領域は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドの５’又は３’末端に位置しない。例えば、標的領域は、ポリリボヌクレオチド上に内部的に位置し得る。いくつかの実施形態では、標的領域は、ポリリボヌクレオチドの３’末端に位置しない。
【0009】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、標的領域は、ポリリボヌクレオチドの５’又は３’末端に位置し、標的領域は、ポリＡ配列を含有しない。いくつかの実施形態では、標的領域は、ポリリボヌクレオチドの３’末端に位置し、ポリＡ配列を含有しない。
【0010】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、標的領域は、ポリＡ配列を含有しない。
【0011】
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、粒子にコンジュゲートされる。粒子は、例えば、磁気粒子又はビーズであってもよい。ビーズは、例えば、架橋アガロース、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズであってもよい。
【0012】
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、第１の捕捉剤にコンジュゲートされる。
【0013】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、化学的リンカーを介して第１の捕捉剤又は粒子にコンジュゲートされる。化学的リンカーは、例えばトリエチレングリコールを含んでもよい。いくつかの実施形態では、化学的リンカーは、オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端にコンジュゲートされる。
【0014】
いくつかの実施形態では、第１の捕捉剤は、抗原（例えば、ビオチン）を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルを第１の捕捉剤に結合している第２の捕捉剤（ｓｅｃｏｎｄ ｃａｐｔｕｒｅ）と接触させることをさらに含む。第２の捕捉剤は、例えば、抗体又はその抗原結合断片（例えば、ストレプトアビジン）を含んでもよい。
【0016】
いくつかの実施形態では、第２の捕捉剤は、粒子にコンジュゲートされる。粒子は、例えば、磁気粒子又はビーズであってもよい。ビーズは、例えば、架橋アガロース、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズであってもよい。いくつかの実施形態では、第２の捕捉剤は、化学的リンカーを用いて粒子にコンジュゲートされる。化学的リンカーは、例えば、トリエチレングリコールを含んでもよい。
【0017】
いくつかの実施形態では、標的領域を有するポリリボヌクレオチドは、イントロン又はその一部分（例えば、半分イントロン（ｈａｌｆ－ｉｎｔｒｏｎ））を含む。標的領域は、イントロン又はその一部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、イントロン又はその一部分は、触媒イントロン（例えば、グループＩ触媒イントロン又はグループＩＩ触媒イントロン）又はその一部分である。いくつかの実施形態では、イントロン又はその一部分は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、イントロン又はその一部分は、２０～５００、２０～４００、２０～３００、２０～２００、２０～１００、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、又は１００～２００ヌクレオチドの長さを有する。
【0018】
いくつかの実施形態では、標的領域は、半分イントロン（例えば、触媒イントロンの５’又は３’部分）を含む。いくつかの実施形態では、標的領域は、５’半分－イントロン（例えば、触媒イントロンの５’部分に対応する５’半分－イントロン）を含む。いくつかの実施形態では、標的領域は、３’半分－イントロン（例えば、触媒イントロンの３’部分に対応する３’半分－イントロン）を含む。いくつかの実施形態では、標的領域は、グループＩ触媒イントロンの５’半分を含む。いくつかの実施形態では、グループＩ触媒イントロンの５’半分は、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡ、Ｔ４ファージｔｄ遺伝子、又はその変異体の５’部分に由来する。いくつかの実施形態では、標的領域は、グループＩ触媒イントロンの３’半分を含む。いくつかの実施形態では、グループＩ触媒イントロンの３’半分は、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡ、Ｔ４ファージｔｄ遺伝子、又はその変異体からの３’部分から選択される。
【0019】
標的領域は、イントロン若しくはその一部分の５’若しくは３’側に位置してもよい、又はイントロン若しくはその一部分の５’若しくは３’側に位置する領域の一部分を含んでもよい。
【0020】
いくつかの実施形態では、方法は、スプライスされたポリリボヌクレオチドをスプライスされていない又は部分的にスプライスされたポリリボヌクレオチドから分離することを含む。いくつかの実施形態では、スプライスされたポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スプライスされたポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スプライスされたポリリボヌクレオチドは、イントロン又はその一部分を欠いている（例えば、スプライスされたポリリボヌクレオチドは、触媒イントロン、例えばグループＩ触媒イントロン、又はその一部分を欠いている）。
【0021】
いくつかの実施形態では、方法は、スプライスされたポリリボヌクレオチドの量を、サンプルと比較して、少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上）富化する。
【0022】
いくつかの実施形態では、イントロン又はその一部分を有するポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドである。
【0023】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５ヌクレオチド（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、若しくはそれ以上のヌクレオチド）の長さを有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、５～１００、５～９５、１０～９０、１０～８０、１２～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１８～３０、２０～２５、又は２０～２２ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２３ヌクレオチドの長さである。
【0024】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、約４５℃～約７５℃、例えば、約４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、又は７５℃の融解温度（Ｔｍ）を有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約４５℃～約６５℃のＴｍを有する。
【0025】
いくつかの実施形態では、方法は、捕捉された標的領域を有するポリリボヌクレオチドを、（例えば、接触及び／又は分離ステップ後）１回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、又はそれ以上）洗浄するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１及び／又は第２の捕捉剤を１回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、又はそれ以上）洗浄することをさらに含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、方法は、第１の溶出ステップを実施し、捕捉された標的領域を有するポリリボヌクレオチドを放出させるステップをさらに含む。第１の溶出ステップは、例えば、第１の緩衝剤を添加し、及び／又はサンプルを、例えば少なくとも５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、又はそれ以上に加熱することを含んでもよい。
【0027】
いくつかの実施形態では、方法は、第２の溶出ステップを実施することをさらに含む。第２の溶出ステップは、第２の緩衝剤を添加し、及び／又はサンプルを、例えば少なくとも５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、又はそれ以上に加熱することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、第２の緩衝液は、変性剤、例えば、ホルムアミド又は尿素を含む。第２の緩衝液は、例えば、約４０％～約６０％のホルムアミド（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、又は６０％のホルムアミド）を含んでもよい。
【0028】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルをオリゴヌクレオチド（例えば、第１の捕捉剤にコンジュゲートされた）とともに少なくとも１０分（例えば、少なくとも２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、又はそれ以上）かけてインキュベートすることを含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドによって結合されていないサンプルの一部分を回収することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、捕捉剤（例えば、第１及び／又は第２の捕捉剤）によって結合されていないサンプルの一部分を回収することを含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、方法は、複数のオリゴヌクレオチドを準備することを含み、各オリゴヌクレオチドは、異なる標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、各オリゴヌクレオチドは、第１の捕捉剤にコンジュゲートされる。
【0031】
いくつかの実施形態では、方法は、複数の標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを準備することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、３’半分イントロン及び５’半分イントロンにハイブリダイズする単一オリゴヌクレオチドを準備することを含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、方法は、３’半分－イントロンにハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチド及び５’半分－イントロンにハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドを準備することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、各々が３’半分－イントロン及び／又は５’半分－イントロン上の異なる領域にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドを準備することを含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的領域の長さが等しい一部分と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の相補性を有する。
【0034】
いくつかの実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドをポリリボヌクレオチドに対する１０：１～１：１０（例えば、１０：１、５：１、２：１、１：２、１：５、又は１：１０）のモル比で準備することを含む。
【0035】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の実施形態のいずれかの方法によって生成されるポリリボヌクレオチドの集団を特徴とする。集団は、例えば、標的領域を欠いている環状ポリリボヌクレオチドを含んでもよく、環状ポリリボヌクレオチドは、組成物中の全ポリリボヌクレオチドの少なくとも１％（例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上）（モル／モル）を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、集団は、５０％未満（例えば、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満）（モル／モル）の線状ポリリボヌクレオチドを有する。
【0037】
別の態様では、本発明は、ポリリボヌクレオチドの混合物を含む組成物を特徴とする。混合物の第１のサブセットは、標的領域を欠いている環状ポリリボヌクレオチドを含み、複数のポリリボヌクレオチドの第２のサブセットは、標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドを含む。第１のサブセットは、組成物中の全ポリリボヌクレオチドの少なくとも１％（例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上）（モル／モル）を含む。
【0038】
別の態様では、本発明は、標的領域を有するポリリボヌクレオチド及び標的領域にハイブリダイズするように設計されているオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、オリゴヌクレオチドが第１の捕捉剤（例えば抗原、例えばビオチン）にコンジュゲートされている組成物を特徴とする。組成物は、例えば、標的領域を欠いているポリリボヌクレオチドをさらに含んでもよい。標的領域を欠いているポリリボヌクレオチドは、例えば、環状ポリリボヌクレオチドであってもよい。組成物は、第１の捕捉剤に結合するように設計されている第２の捕捉剤（例えば、抗体又はその抗原結合断片、例えばストレプトアビジン）をさらに含んでもよい。第２の捕捉剤は、粒子にコンジュゲートされ得る。
【0039】
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載される方法によって生成される。
【0040】
本明細書に記載される組成物のいずれかのいくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、イントロン又はその一部分を含む。標的領域は、イントロン又はその一部分を含んでもよい。標的領域は、イントロン又はその一部分の５’又は３’側に位置し得る。
【0041】
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドは、修飾され得る。
【0042】
別の態様では、本発明は、例えば、上に記載される方法、及び希釈剤、担体、又は賦形剤によって生成される、本明細書に記載される組成物を含む医薬組成物を特徴とする。
【0043】
定義
本開示の理解を促すため、いくつかの用語が以下に定義される。本明細書で定義される用語は、本開示に関連する領域における当業者によって一般に理解されているような意味を有する。「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの用語は、単数の実体のみを指すことを意図しておらず、一般的クラスも含むが、その具体例は、例示のために使用されてもよい。「又は」という用語は、代替物のみを指すように明示されない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するものとして使用されるが、本開示は、代替物のみと「及び／又は」とを指すような定義を支持する。本明細書中の用語は、具体的な実施形態を説明するために使用されるが、それらの使用は、請求項において概説される場合を除き、限定するものとして解釈されるべきでない。
本開示の理解を促すため、いくつかの用語が以下に定義される。本明細書で定義される用語は、本開示に関連する領域における当業者によって一般に理解されているような意味を有する。「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの用語は、単数の実体のみを指すことを意図しておらず、一般的クラスも含むが、その具体例は、例示のために使用されてもよい。「又は」という用語は、代替物のみを指すように明示されない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するものとして使用されるが、本開示は、代替物のみと「及び／又は」とを指すような定義を支持する。本明細書中の用語は、具体的な実施形態を説明するために使用されるが、それらの使用は、請求項において概説される場合を除き、限定するものとして解釈されるべきでない。
【0044】
本明細書で使用されるとき、値の範囲内に提供される任意の値は、上限と下限の両方、並びに上限及び下限の範囲内に含まれる任意の値を含む。
【0045】
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、列挙値の±１０％以内にある値を指す。
【0046】
本明細書で使用されるとき、「担体」という用語は、細胞への組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の輸送又は送達を、部分又は完全カプセル化をした薬剤、又はその組み合わせを介して、環状ポリリボヌクレオチドの共有結合修飾によって容易にする化合物、組成物、試薬、又は分子である。担体の非限定的な例には、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン又はグリコーゲン型物質）、ナノ粒子（例えば、環状ポリリボヌクレオチドにカプセル化又は共有結合されるナノ粒子）、リポソーム、フソソーム、生体外で分化した網状赤血球、エキソソーム、タンパク質担体（例えば、ポリリボヌクレオチドに共有結合したタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー又はトランスフェクション試薬）が含まれる。
【0047】
本明細書で使用されるとき、「環状ポリリボヌクレオチド」、「環状ＲＮＡ」、及び「ｃｉｒｃＲＮＡ」という用語は、互換的に使用され、遊離末端（即ち、遊離３’及び／又は５’末端）を有していない構造を有するポリリボヌクレオチド分子、例えば、共有結合又は非共有結合を介して環状又は末端のない構造を形成するポリリボヌクレオチド分子を意味する。環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、共有的に閉じているポリリボヌクレオチドであってもよい。
【0048】
本明細書で使用されるとき、「疾患」、「障害」、及び「症状」という用語はそれぞれ、最適でない健康の状態、例えば、医療専門家によって通常は診断又は処置されている、又は診断又は処置されることになる状態を指す。
【0049】
「異種」は、天然に存在する（天然の）状況以外の状況下で生じること意味する。「異種」ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列がその配列の天然ゲノムにおいて見出されるもの以外の方法で使用されていることを示す。例えば、「異種プロモーター」は、そのプロモーターによって天然に転写される配列でない配列の転写を駆動するために使用され；それ故、「異種プロモーター」配列は、組換え核酸技術を用いて、発現構築物中に含まれることが多い。「異種」という用語はまた、別の配列との天然に存在しない関係において配置される所与の配列を指すように使用され；例えば、異種コード又は非コードヌクレオチド配列は、一般にゲノム形質転換技術によってゲノムに挿入され、遺伝子修飾又は組換えゲノムをもたらす。
【0050】
本明細書で使用されるとき、「半分イントロン」という用語は、イントロンの一部分を指し、第１の半分イントロン及び第２の半分イントロンは、一緒に触媒イントロンなどのイントロンを形成する。半分イントロンは、イントロンの５’部分（例えば、触媒イントロンの５’部分）又はイントロンの３’部分（例えば、触媒イントロンの３’部分）であってもよく、それにより５’半分－イントロン及び３’半分－イントロンは、機能的イントロン、例えば自己スプライシングを触媒する（ｃａｔａｌｙｔｉｃ）ことが可能な機能的イントロンを一緒に形成する。半分イントロンという用語は、２つの部分に分割されたイントロンを指すことが意図されている。半分イントロンという用語は、２つの部分又は半分の長さが等しいことを述べる、意味する、又は示唆することは意図されない。半分イントロンという用語は、分割イントロンという用語と同義的に使用され、「イントロン断片」という用語の代わりに使用してもよい。
【0051】
本明細書で使用されるとき、「不純物」という用語は、組成物、例えば、本明細書に記載される医薬組成物中に存在する望ましくない物質である。いくつかの実施形態では、不純物は、プロセス関連不純物である。いくつかの実施形態では、不純物は、本明細書に記載のとおり、最終組成物中の所望の産物以外、例えば活性薬剤成分以外、例えば環状ポリリボヌクレオチドといった産物関連物質である。本明細書で使用されるとき、「プロセス関連不純物」という用語は、本明細書に記載の線状ポリリボヌクレオチド以外の、最終組成物、調製物、又は産物において望ましくない、組成物、調製物、又は産物の作製において使用される、存在する、又は生成される物質である。いくつかの実施形態では、プロセス関連不純物は、ポリリボヌクレオチドの合成又は環状化において使用される酵素である。本明細書で使用されるとき、「産物関連物質」という用語は、組成物、調製物、若しくは産物、又はその任意の中間体の合成中に生成される物質又は副産物である。いくつかの実施形態では、産物関連物質は、デオキシリボヌクレオチド断片である。いくつかの実施形態では、産物関連物質は、デオキシリボヌクレオチド単量体である。いくつかの実施形態では、産物関連物質は、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドの誘導体又は断片、例えば、１０、９、８、７、６、５、若しくは４つのリボ核酸、モノリボ核酸（ｍｏｎｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、ジリボ核酸（ｄｉｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、又はトリリボ核酸（ｔｒｉｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）の断片の１つ以上である。
【0052】
本明細書で使用されるとき、対象の「適応度を増加させる」又は「適応度を促進する」は、本明細書に記載のペプチド又はポリペプチドの投与の結果としての、生理における、又は対象生物によって実施される任意の活性の任意の好ましい改変、例えば限定はされないが、以下の所望の効果のいずれか１つ以上を指す：（１）生物的又は非生物的ストレスの耐性の増加；（２）収率又はバイオマスの増加；（３）開花期の変更；（４）害虫又は病原体に対する抵抗性の増加、（４）除草剤に対する抵抗性の増加；（５）対象生物（例えば、農業的に重要な昆虫）の集団の増加；（６）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）の生殖率の増加；（７）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）の運動性の増加；（８）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）の体重の増加；（９）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）の代謝率又は活動性の増加；（１０）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）による受粉（例えば、所与の期間内に受粉された植物の数）の増加；（１１）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）の副産物（例えば、ミツバチからの蜂蜜又はカイコからの絹）の生成の増加；（１２）対象生物（例えば、昆虫）の栄養素含有量（例えば、タンパク質、脂肪酸、又はアミノ酸）の増加；又は（１３）駆除薬（例えば、ネオニコチノイド（例えば、イミダクロプリド）又は有機リン殺虫剤（例えば、ホスホロチオエート、例えば、フェニトロチオン））に対する対象生物の抵抗性の増加、（１４）ヒト又は非ヒト動物などの対象生物の健康の増強又は疾患の低減。宿主適応度の増加は、調節剤が投与されていない対象生物と比較して判定することができる。逆に、対象の「適応度の低下」は、本明細書に記載のペプチド又はポリペプチドの投与の結果としての、生理における、又は対象生物によって実施される任意の活性の任意の好ましくない改変、例えば限定はされないが、以下の意図された効果のいずれか１つ以上を指す：（１）生物的又は非生物的ストレスの耐性の低下；（２）収率又はバイオマスの低下；（３）開花期の変更；（４）害虫又は病原体に対する抵抗性の低下、（４）除草剤に対する抵抗性の低下；（５）対象生物（例えば、農業的に重要な昆虫）の集団の減少；（６）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）の生殖率の低下；（７）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）の運動性の低下；（８）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）の体重の減少；（９）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）の代謝率又は活動性の低下；（１０）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）による受粉（例えば、所与の期間内に受粉された植物の数）の減少；（１１）対象生物（例えば昆虫、例えばミツバチ又はカイコ）の副産物（例えば、ミツバチからの蜂蜜又はカイコからの絹）の生成の低下；（１２）対象生物（例えば、昆虫）の栄養素含有量（例えば、タンパク質、脂肪酸、又はアミノ酸）の減少；又は（１３）駆除薬（例えば、ネオニコチノイド（例えば、イミダクロプリド）又は有機リン殺虫剤（例えば、ホスホロチオエート、例えば、フェニトロチオン））に対する対象生物の抵抗性の低下、（１４）ヒト又は非ヒト動物などの対象生物の健康の低減又は疾患の低減。宿主適応度の低下は、調節剤が投与されていない対象生物と比較して判定することができる。対象の生理、表現型、又は活動性における特定の変化、例えば植物における開花期の変更により、状況に応じて（例えば、気候又は他の環境条件における変化に適応するのに）、対象の適応度が増加するか又は対象の適応度が低下すると考察可能であることは当業者にとって明らかであろう。例えば、開花期の遅延（例えば、所与のカレンダー日付に開花する集団内の植物が約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％減少すること）は、より遅いか又はより涼しい春季への有利な適応であり得て、それ故、植物の適応度を増加させると考察可能であり；逆に、より早期の又はより暖かい春季という状況下での開花期の同様の遅延は、植物の適応度を低下させると考察可能である。
【0053】
本明細書で使用されるとき、「線状ポリリボヌクレオチド」、「線状ＲＮＡ」、及び「線状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチド分子を意味する。５’及び３’末端の一方又は両方は、遊離末端であってもよい、又は別の部分に連結されてもよい。線状ポリリボヌクレオチドは、環状化を受けていない（例えば、環状化前である）ポリリボヌクレオチドであってもよく、例えば、スプリットライゲーション（ｓｐｌｉｎｔ ｌｉｇａｔｉｏｎ）、又は化学的な、酵素的な、リボザイム若しくはスプライシング触媒による環状化法を介する、環状化のための出発物質として使用することができる。
【0054】
本明細書で使用されるとき、「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、糖、核酸塩基、又はヌクレオチド間結合に対する少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【0055】
本明細書で使用されるとき、「修飾リボヌクレオチド」という用語は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合に対する少なくとも１つの修飾を有するヌクレオシドを含有するリボヌクレオチドを意味する。
【0056】
本明細書で使用されるとき、「裸の送達」という用語は、担体の助けを借りず、細胞への送達を助ける部分への共有結合修飾も使用しない、細胞への送達のための製剤である。裸の送達製剤には、トランスフェクション試薬、カチオン担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体のいずれも含まれない。例えば、環状ポリリボヌクレオチドの裸の送達製剤は、共有結合修飾なしで環状ポリリボヌクレオチドを含み、担体を含まない製剤である。
【0057】
本明細書で使用されるとき、「ニックＲＮＡ」又は「ニック線状ポリリボヌクレオチド」又は「ニック線状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、環状ＲＮＡのニッキング又は分解から生じる５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチド分子を意味する。「ニック環状ＲＮＡ」は、ニックされている環状ＲＮＡを意味する。
【0058】
「任意選択的に置換されたＸ」という用語は、本明細書で使用されるとき、「Ｘであって、任意選択的に置換されているＸ」（例えば、「アルキルであって、任意選択的に置換されているアルキル」）に等しいことが意図されている。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）が本質的に任意選択的であることを意味することは意図されていない。「任意選択的に置換された」という用語は、本明細書で使用されるとき、０、１、若しくはより多くの置換基（例えば、０～２５、０～２０、０～１０、又は０～５の置換基）を有することを指す。例えば、Ｃ１アルキル基、即ち、メチルは、オキソと置換されることで、ホルミル基を形成し、また－ＯＨ又は－ＮＨ２とさらに置換されることで、カルボキシル基又はアミド基を形成し得る。
【0059】
「医薬組成物」という用語は、医薬組成物内に含まれる環状又は線状ポリリボヌクレオチドを、療法によるヒト又は動物の体の処置に使用できることを開示することも意図している。
【0060】
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つ又は複数の核酸サブユニット又はヌクレオチドを含む分子を意味し、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用することができる。ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、又はそれらの変異体から選択される１つ又は複数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、ヌクレオシド及び少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上のリン酸（ＰＯ３）基を含み得る。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボース又はデオキシリボースのいずれか）、及び１つ又は複数のリン酸基を含み得る。リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。ポリリボヌクレオチド、リボ核酸、又はＲＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合された複数のリボヌクレオチドを含む高分子を指し得る。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。
【0061】
本明細書で使用されるとき、本明細書中の「ポリリボヌクレオチドカーゴ」という用語は、少なくとも１つのポリリボヌクレオチドを含む任意の配列を含む。実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、１つ又は複数の発現（又はコーディング）配列を含み、各発現（又はコーディング）配列は、ポリペプチドをコードする。実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、調節又は触媒機能を有するポリリボヌクレオチドなどの１つ又は複数の非コード配列を含む。実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、発現及び非コード配列の組み合わせを含む。実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、本明細書に記載の１つ又は複数のポリリボヌクレオチド配列、例えば、１つ又は複数の調節要素、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素、又はスペーサー配列を含む。
【0062】
本明細書で互換的に使用されるとき、「ポリＡ」及び「ポリＡ配列」という用語は、少なくとも５ヌクレオチドの長さであり、アデノシン残基からなる核酸分子の翻訳されない隣接領域を指す。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、又は少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｓｏｎ ｆｒａｍｅ）（例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム）の３’側（例えば、その下流）に位置し、ポリＡ配列は、ポリＡが翻訳されないように、終結配列（例えば、停止コドン）の３’側に存在する。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、終結配列及び３’非翻訳領域の３’側に位置する。
【0063】
本明細書で使用されるとき、核酸の要素は、それらが転写されて、線状ポリリボヌクレオチドを形成し得て、次いで本明細書に提供される方法を用いて、環状ポリリボヌクレオチドに環状化され得るように、ベクターに配置される場合、「作動可能に連結されている（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」又は「作動可能に連結されている（ｌｉｎｋｅｄ）」。
【0064】
ポリデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボ核酸、及びＤＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合された複数のデオキシリボヌクレオチドを含む高分子を意味する。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシドポリリン酸であり得る。ヌクレオチドは、発光タグやマーカーなどの検出可能なタグ（例えば、フルオロフォア）を含む、例えば、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰから選択することができるデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのデオキシリボヌクレオシドポリリン酸を意味する。ヌクレオチドは、成長する核酸鎖に組み込むことができる任意のサブユニットを含み得る。このようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ、或いは、１つ又は複数の相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵに特異的であるか、又はプリン（即ち、Ａ又はＧ、又はその変異体）若しくはピリミジン（即ち、Ｃ、Ｔ、又はＵ、又はその変異体）に相補的な任意の他のサブユニットであり得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらの誘導体若しくは変異体である。場合によっては、ポリヌクレオチドは、いくつか例を挙げると、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）であり、ヌクレオチド配列、及び一本鎖、二本鎖、三本鎖、らせん、ヘアピンなどのその任意の構造的実施形態の両方を包含する。場合によっては、ポリヌクレオチド分子は環状である。ポリヌクレオチドは、様々な長さを有し得る。核酸分子は、少なくとも約１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、１キロ塩基（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、又はそれ以上の長さを有し得る。ポリヌクレオチドは、細胞又は組織から単離することができる。ポリヌクレオチド配列の実施形態は、単離及び精製されたＤＮＡ／ＲＮＡ分子、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ分子、及び合成ＤＮＡ／ＲＮＡ類似体を含み得る。
【0065】
ポリヌクレオチドの実施形態、例えば、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又は修飾ヌクレオチドを含む１つ又は複数のヌクレオチド変異体を含有するポリヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドの例には、限定されるものではないが、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｄ４６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６－ジアミノプリンなどが含まれる。場合によっては、ヌクレオチドは、三リン酸部分への修飾を含む、それらのリン酸部分の修飾を含む。そのような修飾の非限定的な例としては、より長いリン酸鎖（例えば、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上のリン酸部分を有するリン酸鎖）及びチオール部分の修飾（例えば、α－チオ三リン酸及びβ－チオ三リン酸）が挙げられる。実施形態では、核酸分子はまた、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で（例えば、典型的には相補的ヌクレオチドとの水素結合を形成するのに利用できる１つ又は複数の原子で、又は典型的には相補的なヌクレオチドとの水素結合を形成できない１つ又は複数の原子で）修飾される。実施形態では、核酸分子は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）などのアミン反応性部分の共有結合を可能にするために、アミノアリル－ｄＵＴＰ（ａａ－ｄＵＴＰ）及びアミノヘキシルアクリルアミド－ｄＣＴＰ（ａｈａ－ｄＣＴＰ）などのアミン修飾基を含む。本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準的なＤＮＡ塩基対又はＲＮＡ塩基対の代替物は、高い１立方ｍｍ当たりのビット密度、より高い安全性（天然毒素の偶発的又は意図的な合成に対する耐性）、光プログラムされたポリメラーゼにおけるより容易な識別、又は下位二次構造を提供し得る。デノボ又は増幅合成のための天然及び突然変異ポリメラーゼと適合するそのような代替塩基対は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｔｚ Ｋ，Ｍａｌｙｓｈｅｖ ＤＡ，Ｌａｖｅｒｇｎｅ Ｔ，Ｗｅｌｔｅ Ｗ，Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ Ｋ，Ｄｗｙｅｒ ＴＪ，Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ Ｐ，Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ ＦＥ，Ｍａｒｘ Ａ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ，８：６１２－４に記載されている。
【0066】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基（天然又は非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用されるとき、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、それらの断片及び他の同等物、変異体、及び類似体が含まれ得る。ポリペプチドは、単一分子であっても、又は二量体、三量体、若しくは四量体などの多分子複合体であってもよい。ポリペプチドはまた、単鎖、又は抗体若しくはインスリンなどの多重鎖ポリペプチドを含み得、会合又は連結され得る。最も一般的なジスルフィド結合は、多重鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用することができる。
【0067】
本明細書で使用されるとき、「植物改変ポリペプチド（ｐｌａｎｔ－ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、遺伝的特性（例えば、遺伝子発現を増加させる、遺伝子発現を低下させる、又はそれ以外ではＤＮＡ若しくはＲＮＡのヌクレオチド配列を改変する）、エピジェネティック特性、又は植物の生化学的若しくは生理学的特性を、植物の生理又は表現型の変化、例えば植物適応度の増加又は低下をもたらす方法で改変し得るポリペプチドを指す。
【0068】
本明細書で使用されるとき、「精製する」、「精製すること」、及び「精製」という用語は、不純物（例えば、プロセス関連不純物（例えば、酵素）、プロセス関連物質（例えば、デオキシリボヌクレオチド断片、デオキシリボヌクレオチド単量体））又は副産物（例えば、線状ＲＮＡ）を、他の物質の中でも環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡの混合物を含有するサンプルから除去し、不純物（例えば、プロセス関連不純物（例えば、酵素）、プロセス関連物質（例えば、デオキシリボヌクレオチド断片、デオキシリボヌクレオチド単量体））又は副産物（例えば、線状ＲＮＡ）のレベルが元の混合物と比較して低下した、又は線状ＲＮＡ若しくは物質が開始混合物と比較して質量ベースで４０％若しくはそれ以上（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、若しくは９９％若しくはそれ以上）低下している、環状ＲＮＡの濃縮された集団を含有する組成物を生成する、１つ以上のステップ又はプロセスを指す。
【0069】
本明細書で使用されるとき、「純粋な」及び「純度」という用語は、分析物（例えば、環状ＲＮＡ）が単離されている、他の成分を含まない程度を指す。核酸（例えば、ポリリボヌクレオチド）との関連で、単離された核酸（例えば、環状ＲＮＡ）の純度は、任意の汚染物質、不純物、又は副産物（例えば、線状ＲＮＡ及び他の物質）を含まない核酸の集団に関して表すことができる。例えば、環状ＲＮＡの集団の純度は、単離された材料の全質量当たりの環状ＲＮＡが集団にどのくらい存在するかを示し、例えば、参照としての純粋な環状ＲＮＡを用いて決定され得る。本開示で見出される純度のレベルは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％超、又は９９％超（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの実施形態では、汚染物質又は不純物又は副産物のレベルは、約２０％、１５％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％（ｗ／ｗ）以下である。純度は、特定の分析物（例えば、環状ＲＮＡ）又は特定の不純物又は副産物（例えば、線状ＲＮＡ）のレベルを、ゲル電気泳動、分光光度法（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＮａｎｏＤｒｏｐ）、又は核酸の集団の純度の測定に適した他の技術を用いて検出し、（例えば、当該技術分野で公知のアッセイによって決定する場合）全核酸含量に対する分析物のパーセンテージ（ｗ／ｗ）を計算することによって決定することができる。
【0070】
本明細書で使用されるとき、「１つ以上の不純物又は副産物を実質的に含まない」という語句は、１つ以上の不純物若しくは副産物（例えば、本明細書で開示される１つ以上の不純物又は副産物）を含まない、又は最小量の１つ以上の不純物若しくは副産物を含有するサンプル、例えば、濃縮された環状ＲＮＡの集団を含有するサンプルの特性を指す。最小量の１つ以上の不純物又は副産物は、２０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれ以下）であってもよい。別の例では、サンプル又は濃縮された環状ＲＮＡの集団は、１つ以上の不純物又は副産物が、１５％（ｗ／ｗ）未満（例えば、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれ以下）の量で存在する場合、１つ以上の不純物又は副産物を実質的に含まない。別の例では、サンプル又は濃縮された環状ＲＮＡの集団は、１つ以上の不純物又は副産物が、１０％（ｗ／ｗ）未満（例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれ以下）の量で存在する場合、１つ以上の不純物又は副産物を実質的に含まない。別の例では、サンプル又は濃縮された環状ＲＮＡの集団は、１つ以上の不純物又は副産物が、５％（ｗ／ｗ）未満（例えば、４％、３％、２％、１％（ｗ／ｗ）以下又はそれ以下）の量で存在する場合、１つ以上の不純物又は副産物を実質的に含まない。さらに別の例では、サンプル又は濃縮された環状ＲＮＡの集団は、１つ以上の不純物又は副産物が、１％未満（０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれ以下）の量で存在する場合、１つ以上の不純物又は副産物を実質的に含まない。
【0071】
本明細書で使用されるとき、「調節要素」は、環状又は線状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を変更する、核酸配列などの部分である。
【0072】
本明細書で使用されるとき、「スペーサー」は、２つの隣接するポリヌクレオチド領域間に距離又は柔軟性をもたらす（例えば、１つ以上のヌクレオチドの）任意の隣接するヌクレオチド配列を指す。
【0073】
本明細書で使用されるとき、「配列同一性」という用語は、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用して２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定される。配列は、それらが最適に整列された場合（デフォルトパラメータを使用して、ＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムによって整列された場合）に少なくとも特定の最小パーセンテージの配列同一性を共有する場合、「実質的に同一」又は「本質的に類似」と呼ばれる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をその全長にわたって整列させ、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般に、ギャップ作成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ拡張ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）のＧＡＰのデフォルトパラメータが使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトのスコア行列は、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、デフォルトのスコア行列は、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ ８９，９１５－１９）。配列アラインメント及び配列同一性パーセンテージのスコアは、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．３又はＥｍｂｏｓｓＷｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１０．０（プログラム「針」を使用）などのコンピュータープログラムを使用して決定される。別法又はこれに加えて、パーセント同一性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用してデータベースで検索することによって決定される。配列同一性は、配列の全長にわたる配列同一性を指す。
【0074】
本明細書で使用されるとき、ＲＮＡに関して「構造化された」は、それ自身又は同じＲＮＡ分子中の他の配列を用いる構造（例えば、ヘアピンループ）を形成するため、ＲＮＡＦｏｌｄソフトウェア又は類似の予測ツールによって予測されるＲＮＡ配列を指す。
【0075】
本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、動物、植物、又は微生物などの生物を指す。実施形態では、対象は、脊椎動物（例えば、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、又は両生類）である。実施形態では、対象はヒトである。実施形態では、対象は非ヒト哺乳動物である。実施形態では、対象は、非ヒト霊長類（例えば、サル、類人猿）、有蹄動物（例えば、ウシ、水牛、バイソン、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ、ラマ、アルパカ、シカ、ウマ、ロバ）、肉食動物（例えば、イヌ、ネコ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、又はウサギ類（例えば、ウサギ）などの非ヒト哺乳動物である。実施形態では、対象は、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ）、ガンカモ目（Ａｎｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、アヒル、ガチョウ）、古顎類（Ｐａｌｅａｏｇｎａｔｈａｅ）（例えば、ダチョウ、エミュー）、ハト目（Ｃｏｌｕｍｂｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ハト（ｐｉｇｅｏｎｓ）、ハト（ｄｏｖｅｓ））、又はオウム目（Ｐｓｉｔｔａｃｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、オウム）といった鳥類分類群のメンバーなどの鳥類である。実施形態では、対象は、節足動物（例えば、昆虫、クモ類、甲殻類）、線虫、環形動物、蠕虫、又は軟体類などの無脊椎動物である。実施形態では、対象は、無脊椎動物の農業害虫又は無脊椎動物若しくは脊椎動物宿主に対する寄生虫である無脊椎動物である。実施形態では、対象は、被子植物（双子葉又は単子葉であり得る）又は裸子植物（例えば、針葉樹、ソテツ、マオウ門（Ｇｎｅｔｏｐｈｙｔｅ）、イチョウ）、シダ、ツクシ、ヒカゲノカズラ、又はコケ植物などの植物である。実施形態では、対象は、真核藻類（単細胞又は多細胞）である。実施形態では、対象は、作条作物、果実生成植物及び樹木、野菜、樹木、及び観賞植物、例えば、観賞花、低木、樹木、グランドカバー、及び芝生などの農業又は園芸上重要な植物である。
【0076】
本明細書で使用されるとき、「処置する」及び「処置すること」という用語は、対象の疾患又は障害（例えば、感染症、がん、毒性、又はアレルギー反応）の予防的又は治療的処置を指す。処置の効果には、疾患又は疾患若しくは障害の１つ若しくは複数の徴候若しくは発現の逆転、軽減、重症度の軽減、治癒、進行の阻害、再発の可能性の低減、疾患又は障害の状態の安定化（即ち、悪化しないこと）、又は治療的処置がない場合の疾患又は障害の状態又は症状と比較して、疾患又は障害の蔓延の防止が含まれ得る。実施形態は、植物を処置して、無脊椎動物害虫又は微生物（例えば、細菌、真菌、卵菌、又はウイルス）病原体に起因するか又はそれと関連する疾患又は有害な症状を制御することを含む。実施形態は、植物を処置して、害虫又は病原体圧力に耐える植物の自然防御能又は免疫能を増加させることを含む。
【0077】
本明細書で使用されるとき、「終結要素」は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドにおける発現配列の翻訳を終結させる核酸配列などの部分である。
【0078】
本明細書で使用されるとき、「翻訳効率」は、リボヌクレオチド転写産物からのタンパク質又はペプチド産生の速度又は量である。ある実施形態では、翻訳効率は、例えば、所与の翻訳系、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物のような無細胞翻訳系において、例えば所与の期間で、タンパク質又はペプチドをコードする所与の量の１転写産物当たりで生成されるタンパク質又はペプチドの量として表され得る。
【0079】
本明細書で使用されるとき、「翻訳開始配列」は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドにおける発現配列の翻訳を開始させる核酸配列である。
【0080】
本明細書で使用されるとき、「治療用ポリペプチド」は、対象に投与されるか又は対象で発現されると、いくつかの治療的利益を提供するポリペプチドを指す。実施形態では、治療用ポリペプチドを使用して、対象における疾患、障害、又は症状を、治療用ペプチドの対象への投与によって、又は治療用ポリペプチドの対象における発現によって処置又は予防する。他の実施形態では、治療用ポリペプチドは、細胞内で発現され、細胞は、対象に投与することで、治療的利益を提供する。
【0081】
本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、（例えば、ＰＣＲを使用して）合成される、又は外来ＤＮＡ断片がクローニング若しくは発現を目的として挿入可能である、若しくは挿入されている高次生物のウイルス、プラスミド、若しくは細胞から採取される、ＤＮＡの断片を意味する。いくつかの実施形態では、ベクターは、生物内で安定に維持され得る。ベクターは、例えば、複製起点、選択可能マーカー又はレポーター遺伝子、例えば、抗生物質耐性若しくはＧＦＰ、又は複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を含み得る。該用語は、直鎖状ＤＮＡ断片（例えば、ＰＣＲ産物、線状化プラスミド断片）、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを含む。一実施形態では、本明細書に提供されるベクターは、複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を含む。別の実施形態では、本明細書に提供されるベクターはＭＣＳを含まない。
【0082】
本明細書で使用されるとき、「収率」という用語は、出発物質（例えば、ポリリボヌクレオチド、例えば、環状ポリリボヌクレオチド及び線状ポリリボヌクレオチドなどの混合集団）中の分析物の量と比較した、精製ステップ又はプロセス後に得られた分析物（例えば、環状ポリリボヌクレオチドの集団）の相対量を指す（ｗ／ｗ）。収率は、パーセンテージとして表すことができる。本開示との関連で、出発物質中の分析物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）及び精製ステップ後に得られた分析物の量は、アッセイ（例えば、ゲル電気泳動又は分光光度法）を用いて測定することができる。本開示の方法を用いて、出発物質、例えば、ポリリボヌクレオチドの混合集団中に存在する量と比較して、約２０％（ｗ／ｗ）又はそれ以上の環状ポリリボヌクレオチドの濃縮集団の収率をもたらすことができる。例えば、方法を用いて、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％（ｗ／ｗ）又はそれ以上の精製された環状ポリリボヌクレオチドの収率をもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【0083】
【図1】本明細書に記載される方法を示す概略図である。左側は、線状ポリリボヌクレオチド及び環状ポリリボヌクレオチドの混合物であり、その一部は標的領域を含有する。第１の捕捉剤にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドが、ポリリボヌクレオチドの混合物に添加され、標的領域を含有するポリリボヌクレオチドにハイブリダイズする。粒子にコンジュゲートされている第２の捕捉剤が、第１の捕捉剤に結合し、それにより、標的領域を含有するポリリボヌクレオチドが標的領域を欠いているポリリボヌクレオチドから分離される。
【図2】環状ＲＮＡが自己スプライシングによって生成された場合のインビトロ転写（ＩＶＴ）混合物中の線状副産物を示すゲルである。ゲルは、所望の環状ＲＮＡ産物、スプライされていない線状ＲＮＡ、部分的にスプライスされた線状ＲＮＡ、ニック環状ＲＮＡ、及びスプライスされたイントロンを示す。
【図3】線状ＲＮＡ副産物を自己スプライシングによって生成された環状ＲＮＡから除去するための方法の設計を示す概略図である。
【図4】線状副産物をオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して捕捉することによる環状ＲＮＡの濃縮を示すゲルである。構築物は、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計された。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、モデルタンパク質：ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）である。
【図5】線状副産物をオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して捕捉することによる環状ＲＮＡの濃縮を示すゲルである。構築物は、５’から３’へ：触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計された。ＯＲＦは、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）である。
【図6】線状副産物をオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して捕捉することによる環状ＲＮＡの濃縮を示すゲルである。
【図7】線状副産物をオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して捕捉することによる、環状ＲＮＡを濃縮するための２つの異なる手法を示すゲルである。一方の方法は、ＲＮＡ－オリゴ混合物をチューブ内でストレプトアビジン－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズとともにインキュベートすること（バッチ法）であり、他方は、ビーズをカラム内に予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって通過させること（カラム法）である。
【図8】連続的な線状ＲＮＡプルダウンによる、環状ＲＮＡのさらなる濃縮を示すゲルである。
【図9】線状副産物をオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して捕捉することによる、環状ＲＮＡ濃縮に対する結合緩衝液における塩濃度の効果を示すゲルである。図９Ａは、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ＯＲＦを含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計された構築物を示す。ＯＲＦはｈＥＰＯである。図９Ｂは、図９Ａと類似する構築物を示すが、ＯＲＦは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（スパイク）である。
【図10】線状副産物をオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して捕捉することによる、環状ＲＮＡを濃縮するための線状ＲＮＡプルダウン法によって精製されている環状ＲＮＡからの増強された発現を示すゲルである。構築物は、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ＯＲＦを含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計された。ＯＲＦは、モデルタンパク質：ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）である。
【図11】線状副産物をオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して捕捉することによる、環状ＲＮＡを濃縮するための線状ＲＮＡプルダウン法によって精製されている環状ＲＮＡからの増強された発現を示すゲルである。構築物は、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ＯＲＦを含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計された。ＯＲＦはｈＥＰＯである。
【図12】本明細書に記載の線状プルダウン法において使用される３’半分－イントロン（＃１～＃４）及び５’半分－イントロン（＃５及び＃６）についての代表的なオリゴマー設計を示す概略図である。
【図13】数が減少したオリゴマーを用いて、線状副産物をオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して捕捉することによる、線状ＲＮＡプルダウンによる環状ＲＮＡ濃縮に対する効果を示すゲルである。
【図14】２つのオリゴ（即ち、３’半分－イントロンに対するオリゴマー及び５’半分－イントロンに対するオリゴマー）の組み合わせを用いて、線状副産物をオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して捕捉することによる、線状ＲＮＡプルダウンによる環状ＲＮＡ濃縮に対する効果を示すゲルである。
【図15】線状副産物をオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して捕捉することによる、環状ＲＮＡを濃縮するための線状ＲＮＡプルダウン法によって精製されている環状ＲＮＡからの発現を示す棒グラフである。
【図16】３’半分－イントロンと５’半分－イントロンの両方を標的にする代表的な単一オリゴマーを示す概略図である。
【図17】３’半分－イントロンと５’半分－イントロンの両方を標的にする単一オリゴマーを用いて、線状副産物をオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して捕捉することによる、線状ＲＮＡプルダウンによる環状ＲＮＡ濃縮に対する効果を示すゲルである。
【発明を実施するための形態】
【0084】
本開示は、リボヌクレオチドを処理する、例えば精製するための組成物及び方法を記載する。線状又は環状ポリリボヌクレオチドなどのポリリボヌクレオチドは、種々の改変又は治療を目的として使用することができる。しかし、ポリリボヌクレオチドが特定の生物学的反応を介して生成されるとき、様々な不純物、副産物、又は不完全な産物が認められることがある。本発明は、所望のポリリボヌクレオチド組成物、量、及び／若しくは純度を有する組成物、又は所望のポリリボヌクレオチド組成物、量、及び／若しくは純度を有する複数のポリリボヌクレオチドを含有する集団を生成するため、これらの不純物、副産物、又は不完全な産物をサンプルから低減又は除去するのに有用な方法を特徴とする。
【0085】
特定の実施形態では、方法は、スプライシング反応を受けているポリリボヌクレオチドを精製するために有用である。そのような実施形態では、方法を用いて、スプライスされたポリリボヌクレオチドをスプライスされていないポリリボヌクレオチドから、又はスプライスされていないポリリボヌクレオチドをスプライスされたポリリボヌクレオチドから分離することができる。いくつかの実施形態では、方法を用いて、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、スプライスされている）を線状ポリリボヌクレオチドから、又は線状ポリリボヌクレオチドを環状ポリリボヌクレオチドから分離することができる。所望のポリリボヌクレオチドを含有するそのような精製された組成物は、様々な下流適用、例えば、ポリヌクレオチドカーゴ（例えば、遺伝子又はタンパク質をコードする）の標的細胞への送達にとって有用であり得る。組成物及び方法は、以下により詳細に記載されている。
【0086】
方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドを複数のポリリボヌクレオチドから分離することを含む。方法は、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含む。複数のポリリボヌクレオチドのサブセットは、標的領域を有する。方法は、サンプルを標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させること、及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有するポリリボヌクレオチドをサンプル中の複数のポリリボヌクレオチドから分離することをさらに含む（図１）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドを複数のポリリボヌクレオチドから分離することを含む。方法は、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含む。複数のポリリボヌクレオチドのサブセットは、標的領域を有する。方法は、サンプルを標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させること、及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有するポリリボヌクレオチドをサンプル中の複数のポリリボヌクレオチドから分離することをさらに含む（図１）。
【0087】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドを、線状ポリリボヌクレオチド及び環状ポリリボヌクレオチドの混合物を含む複数のポリリボヌクレオチドから分離するステップを含む。この方法では、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルが準備される。サンプル中の複数の線状ポリリボヌクレオチドのサブセットは、標的領域を有する。方法は、サンプルを標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させるステップ、及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドをサンプル中の複数のポリリボヌクレオチドから分離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的領域を有するポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列（例えば、ポリＡテール）を欠いている。いくつかの実施形態では、標的領域は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドの３’又は５’末端に位置しない。環状ポリリボヌクレオチド又はそのサブセットは、標的領域が欠け得る。
【0088】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドを複数のポリリボヌクレオチドから分離するステップを含む。方法は、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含み、複数のポリリボヌクレオチドのサブセットは、標的領域を有する。標的領域は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドの３’又は５’末端に位置しない（例えば、標的領域は、ポリリボヌクレオチド上に内部的に位置する）。方法は、サンプルを標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させること、及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有するポリリボヌクレオチドをサンプル中の複数のポリリボヌクレオチドから分離することをさらに含む。
【0089】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的領域に対する示差的な結合親和性によってポリリボヌクレオチドを分離することを含む。示差的な結合は、標的結合領域が結合のための標的部位への接近を調節する示差的な二次的構成要素の内部に存在する場合、達成され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、第１の構造配置におけるポリリボヌクレオチドの標的領域に第１の親和性で、また第２の構造配置におけるポリリボヌクレオチドの標的領域に例えば第１の親和性と異なる第２の親和性で結合し得る。いくつかの実施形態では、示差的な結合又は二次的構成要素は、標的領域が線状ポリリボヌクレオチドか環状ポリリボヌクレオチドかの内部に、又は２つ以上の異なる構造配置で存在するポリリボヌクレオチド中に存在する場合、生じ得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性で、また環状ポリリボヌクレオチドの標的領域に第２の結合親和性で結合し得る。第１の結合親和性は、第２の結合親和性より大きい場合がある。或いは、第１の結合親和性は、第２の結合親和性より小さい場合がある。より低い結合親和性は、オリゴヌクレオチドが標的に、例えば、ある配置の標的により大きい結合親和性でというよりも優先的に結合することを可能にする。
【0090】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的領域を有する第１の配置におけるポリリボヌクレオチドを、標的領域を有する第２の配置における複数のポリリボヌクレオチドから分離することを含む。方法は、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含む。方法は、サンプルをオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む。オリゴヌクレオチドは、第１の配置におけるポリヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性でハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドは、第２の配置におけるポリヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性と異なる第２の結合親和性でハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有する第１の配置におけるポリリボヌクレオチドをサンプル中の第２の配置における複数のポリリボヌクレオチドから分離する。いくつかの実施形態では、第１の結合親和性は、第２の結合親和性より小さく、オリゴヌクレオチドは、第１の配置におけるポリリボヌクレオチドに優先的に結合する。
【0091】
いくつかの実施形態では、方法は、ポリリボヌクレオチドを（例えば、捕捉剤の存在下又は非存在下で）粒子にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む。
【0092】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドを、標的領域を有する複数の環状ポリリボヌクレオチドから分離するステップを含む。方法は、複数のポリリボヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含む。方法は、サンプルをオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む。オリゴヌクレオチドは、線状ポリヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性でハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性と異なる第２の結合親和性でハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドをサンプル中の複数の環状ポリリボヌクレオチドから分離する。いくつかの実施形態では、方法は、ポリリボヌクレオチドを、（例えば、捕捉剤の存在下又は非存在下で）粒子にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む。
【0093】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、第１の捕捉剤にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、方法は、第１の捕捉剤に結合する第２の捕捉剤を準備するステップをさらに含む。第２の捕捉剤は、粒子にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、第１の捕捉剤は、粒子にコンジュゲートされる。
【0094】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、粒子にコンジュゲートされる。
【0095】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドを複数のポリリボヌクレオチドから分離するステップを含む。方法は、複数のポリリボヌクレオチド及び第１の捕捉剤にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含む。複数のポリリボヌクレオチドのサブセットは、標的領域を有し、オリゴヌクレオチドは、標的領域にハイブリダイズする。方法は、サンプルを第１の捕捉剤に結合する第２の捕捉剤と接触させるステップ、及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有するポリリボヌクレオチドをサンプル中の複数のポリリボヌクレオチドから分離するステップをさらに含む。
【0096】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的領域を有する第１の配置（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）におけるポリリボヌクレオチドを、第２の配置における標的領域を有する複数のポリリボヌクレオチドから分離するステップを含む。方法は、複数のポリリボヌクレオチド及び第１の捕捉剤にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含む。オリゴヌクレオチドは、第１の配置におけるポリヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性でハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドは、第２の配置におけるポリヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性と異なる第２の結合親和性でハイブリダイズする。方法は、サンプルを第１の捕捉剤に結合する第２の捕捉剤と接触させるステップ、及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有する第１の配置におけるポリリボヌクレオチドをサンプル中の第２の配置における複数のポリリボヌクレオチドから分離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の結合親和性は、第２の結合親和性より小さく、オリゴヌクレオチドは、第１の配置におけるポリリボヌクレオチドに優先的に結合する。
【0097】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドを、標的領域を含む複数の環状ポリリボヌクレオチドから分離するステップを含む。方法は、複数のポリリボヌクレオチド及び第１の捕捉剤にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含む。オリゴヌクレオチドは、線状ポリヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性でハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドの標的領域に第１の結合親和性と異なる第２の結合親和性でハイブリダイズする。方法は、サンプルを第１の捕捉剤に結合する第２の捕捉剤と接触させるステップ、及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドをサンプル中の複数の環状ポリリボヌクレオチドから分離するステップをさらに含む。
【0098】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、第１又は第２の捕捉剤を伴わないオリゴヌクレオチドを用いて、標的領域を有するポリリボヌクレオチドを複数のポリリボヌクレオチドから分離するステップを含む。オリゴヌクレオチドは、粒子に直接的にコンジュゲートされ得る。方法は、複数のポリリボヌクレオチド及び粒子にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドを含むサンプルを準備することを含む。複数のポリリボヌクレオチドのサブセットは、標的領域を有し、オリゴヌクレオチドは、標的領域にハイブリダイズする。
【0099】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、標的領域は、標的領域を有するポリリボヌクレオチドの５’又は３’末端に位置しない。例えば、標的領域は、ポリリボヌクレオチド上に内部的に位置し得る。いくつかの実施形態では、標的領域は、ポリリボヌクレオチドの３’末端に位置しない。
【0100】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、標的領域は、ポリリボヌクレオチドの５’又は３’末端に位置し、標的領域は、ポリＡ配列を含有しない。いくつかの実施形態では、標的領域は、ポリリボヌクレオチドの３’末端に位置し、ポリＡ配列を含有しない。
【0101】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、標的領域は、ポリＡ配列（例えば、ポリＡテール）を含有しない。
【0102】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、分離は、オリゴヌクレオチドを固定化することを含む。方法は、例えば、オリゴヌクレオチド、第１の捕捉剤、第２の捕捉剤、粒子、又はその組み合わせを固定化することを含んでもよい。
【0103】
いくつかの実施形態では、粒子は磁気粒子である。方法は、磁気粒子に磁気力などの力を加えることを含んでもよい。粒子又はビーズは、例えば、架橋アガロース、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズであってもよい。方法は、ビーズ又は粒子に、機械力、光学力、遠心力、又は音響力などの力を加えることを含んでもよい。
【0104】
いくつかの実施形態では、標的領域を有するポリリボヌクレオチドは、イントロン又はその一部分（例えば、半分イントロン）を含む。標的領域は、イントロン又はその一部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、イントロン又はその一部分は、触媒イントロン（例えば、グループＩ触媒イントロン又はグループＩＩ触媒イントロン）又はその一部分である。いくつかの実施形態では、イントロン又はその一部分は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、イントロン又はその一部分は、２０～５００、２０～４００、２０～３００、２０～２００、２０～１００、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、又は１００～２００ヌクレオチドの長さを有する。
【0105】
いくつかの実施形態では、標的領域は、半分イントロン（例えば、触媒イントロンの５’又は３’部分）を含む。いくつかの実施形態では、標的領域は、５’半分－イントロン（例えば、触媒イントロンの５’部分に対応する５’半分－イントロン）を含む。いくつかの実施形態では、標的領域は、３’半分－イントロン（例えば、触媒イントロンの３’部分に対応する３’半分－イントロン）を含む。いくつかの実施形態では、標的領域は、グループＩ触媒イントロンの５’半分を含む。いくつかの実施形態では、グループＩ触媒イントロンの５’半分は、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡ、Ｔ４ファージｔｄ遺伝子、又はその変異体の５’部分に由来する。いくつかの実施形態では、標的領域は、グループＩ触媒イントロンの３’半分を含む。いくつかの実施形態では、グループＩ触媒イントロンの３’半分は、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡ、Ｔ４ファージｔｄ遺伝子、又はその変異体からの３’部分から選択される。
【0106】
本明細書に記載のとおり、該方法を用いて分離する、例えば、スプライスされていないポリリボヌクレオチドからスプライスすることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、スプライスされたポリリボヌクレオチドをスプライスされていない又は部分的にスプライスされたポリリボヌクレオチドから分離することを含む。いくつかの実施形態では、スプライスされたポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スプライスされたポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スプライスされたポリリボヌクレオチドは、例えば、生成中のスプライシング（例えば、自己スプライシング）事象後、イントロン又はその一部分を欠いている。いくつかの実施形態では、イントロン又はその一部分を有するポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドである。
【0107】
いくつかの実施形態では、方法は、標的領域を有する捕捉されたポリリボヌクレオチド及び／又は捕捉剤（例えば、第１及び／又は第２の捕捉剤）を１回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、又はそれ以上）洗浄することをさらに含む。洗浄は、接触ステップ後及び／又は分離ステップ後に行ってもよい。
【0108】
いくつかの実施形態では、方法は、標的領域を含む捕捉されたポリリボヌクレオチド及び／又は捕捉剤（例えば、第１及び／又は第２の捕捉剤）を、標的領域を有するポリリボヌクレオチドから放出するための第１の溶出ステップを実施することをさらに含む。第１の溶出ステップは、第１の緩衝剤を添加し、及び／又はサンプルを、例えば少なくとも５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、又はそれ以上に加熱することを含んでもよい。
【0109】
いくつかの実施形態では、方法は、第２の溶出ステップを実施することをさらに含む。第２の溶出ステップは、第２の緩衝剤を添加し、及び／又はサンプルを、例えば少なくとも５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、又はそれ以上に加熱することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、第２の緩衝剤は、変性剤、例えばホルムアミド又は尿素を含む。第２の緩衝剤は、例えば、約４０％～約６０％のホルムアミド（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、又は６０％のホルムアミド）を含んでもよい。
【0110】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルをオリゴヌクレオチド及び／又は捕捉剤（例えば、第１及び／又は第２の捕捉剤）と少なくとも１０分（例えば、少なくとも２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、又はそれ以上）かけてインキュベートすることを含む。
【0111】
いくつかの実施形態では、方法は、捕捉剤（例えば、第１及び／又は第２の捕捉剤）及び／又はオリゴヌクレオチドによって結合されていないサンプルの一部分を回収することを含む。
【0112】
いくつかの実施形態では、方法は、複数のオリゴヌクレオチドを準備することを含み、各オリゴヌクレオチドは、異なる標的領域にハイブリダイズする。各オリゴヌクレオチドは、例えば、第１の捕捉剤又は粒子、例えば磁気粒子又はビーズにコンジュゲートされ得る。
【0113】
いくつかの実施形態では、方法は、複数の標的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを準備することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、３’半分イントロン及び５’半分イントロンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを準備することを含む。
【0114】
いくつかの実施形態では、方法は、３’半分－イントロンにハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチド及び５’半分－イントロンにハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドを準備することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、各々が３’半分－イントロン及び／又は５’半分－イントロン上の異なる領域にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドを準備することを含む。
【0115】
いくつかの実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドをポリリボヌクレオチドに対する１０：１～１：１０（例えば、１０：１、５：１、２：１、１：２、１：５、又は１：１０）のモル比で準備することを含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、方法は、粒子、例えばビーズ、例えば磁気ビーズのサンプルを準備することを含む。粒子は、容器内、例えばマイクロ遠心チューブ内に存在し得る、又はカラムに充填され得る。粒子は、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。方法は、ポリリボヌクレオチドの混合物を（例えば、第１の捕捉剤にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドとともに）、粒子を含有するカラムに流すことを含んでもよい。そのようなことから、オリゴヌクレオチドによって結合されているポリリボヌクレオチドは、カラムに結合することになる。いくつかの実施形態では、粒子は、例えば、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている第１の捕捉剤に結合するように設計されている、第２の捕捉剤にコンジュゲートされる。他の実施形態では、粒子は、例えば、ポリリボヌクレオチドの標的領域にハイブリダイズするように設計されているオリゴヌクレオチドに直接的にコンジュゲートされる。
【0117】
いくつかの実施形態では、例えば磁気粒子を使用する場合、方法は、磁気粒子を、例えば、永久磁石を提供することにより、容器（例えば、マイクロ遠心チューブ）内でペレット化することを含んでもよい。
【0118】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、サンプル中の所望のポリリボヌクレオチドの量を濃縮する。例えば、方法は、所望の（例えば、スプライスされた）ポリリボヌクレオチドの量を、精製前のサンプルと比較して、少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上）濃縮し得る。
【0119】
いくつかの実施形態では、精製の方法により、５０％（モル／モル）未満（例えば、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％（モル／モル）未満）の線状ポリリボヌクレオチドを有する環状ポリリボヌクレオチドがもたらされる。
【0120】
オリゴヌクレオチド
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドの標的領域にハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的領域の長さが等しい部分と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の相補性を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドの標的領域に対する最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１つのミスマッチを有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的領域に対するミスマッチを有しない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（例えば、修飾されたリン酸塩、糖、又は塩基を有する）修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的領域にハイブリダイズするように設計された一部分及び標的領域にハイブリダイズしない一部分（例えば、末端領域）を含有する。
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドの標的領域にハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的領域の長さが等しい部分と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の相補性を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドの標的領域に対する最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１つのミスマッチを有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的領域に対するミスマッチを有しない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（例えば、修飾されたリン酸塩、糖、又は塩基を有する）修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的領域にハイブリダイズするように設計された一部分及び標的領域にハイブリダイズしない一部分（例えば、末端領域）を含有する。
【0121】
オリゴヌクレオチドは、例えば、少なくとも５ヌクレオチド（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、若しくはそれ以上のヌクレオチド）の長さであってもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、５～１００、５～９５、１０～９０、１０～８０、１２～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１８～３０、２０～２５、又は２０～２２ヌクレオチドの長さである。
【0122】
オリゴヌクレオチドは、例えば、３０～７０％、例えば、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、又は７０％のＧＣ含量を有してもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、約４５℃～約７５℃、例えば、約４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、又は７５℃の融解温度（Ｔｍ）を有してもよい。
【0123】
捕捉剤
本明細書に記載のとおり、オリゴヌクレオチド及び／又は粒子は、捕捉剤にコンジュゲートされ得る。捕捉剤は、標的分子に結合する、例えばそれを捕捉するように設計される。捕捉剤又は捕捉剤のセット、例えば、第１及び／又は第２の捕捉剤は、抗体又はその抗原結合断片及び抗原などの任意の親和性ペアを含んでもよい。同様に、親和性ペアは、受容体又はその断片及びその同族リガンドを含んでもよい。第１の捕捉剤及び第２の捕捉剤は、共有結合又は非共有結合（例えば、イオン力又はファンデルワールス力）相互作用を可能にするのに十分な結合エネルギーで相互作用するように設計された任意の２つの分子であり得る。
本明細書に記載のとおり、オリゴヌクレオチド及び／又は粒子は、捕捉剤にコンジュゲートされ得る。捕捉剤は、標的分子に結合する、例えばそれを捕捉するように設計される。捕捉剤又は捕捉剤のセット、例えば、第１及び／又は第２の捕捉剤は、抗体又はその抗原結合断片及び抗原などの任意の親和性ペアを含んでもよい。同様に、親和性ペアは、受容体又はその断片及びその同族リガンドを含んでもよい。第１の捕捉剤及び第２の捕捉剤は、共有結合又は非共有結合（例えば、イオン力又はファンデルワールス力）相互作用を可能にするのに十分な結合エネルギーで相互作用するように設計された任意の２つの分子であり得る。
【0124】
本明細書に記載の組成物又は方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、第１の捕捉剤にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、第１の捕捉剤は抗原を含む。抗原は、例えばビオチンであってもよい。
【0125】
本明細書に記載のとおり、捕捉剤又はオリゴヌクレオチド（例えば、捕捉剤にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチド）は、第２の捕捉剤によって結合され得る、又は結合されるように設計され得る。いくつかの実施形態では、第２の捕捉剤は、例えば、抗原に結合するように設計されている抗体又はその抗原結合断片を含む。第２の捕捉剤は、例えばストレプトアビジンであってもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、第１の捕捉剤にコンジュゲートされないか又はそれを含まない、また第２の捕捉剤は、オリゴヌクレオチドに直接的に結合する。
【0126】
いくつかの実施形態では、第１の捕捉剤は、抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、第２の捕捉剤は抗原である。
【0127】
粒子
本明細書に記載のオリゴヌクレオチド及び／又は捕捉剤は、粒子、例えば、磁気粒子又はビーズにコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド及び／又は捕捉剤は、複数の粒子にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、粒子は、複数の捕捉剤及び／又はオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。
本明細書に記載のオリゴヌクレオチド及び／又は捕捉剤は、粒子、例えば、磁気粒子又はビーズにコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド及び／又は捕捉剤は、複数の粒子にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、粒子は、複数の捕捉剤及び／又はオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。
【0128】
磁気粒子は、磁気力に対して応答性がある少なくとも１つの成分を含む。磁気粒子は、全体的に磁気的であってもよい、又は非磁性である成分を含有してもよい。磁気粒子は、磁気ビーズ、例えば、実質的に球状の磁気ビーズであってもよい。磁気粒子は、全体的に磁気的であってもよい、又は、例えば、１つ以上の標的分子に結合するための１つ以上の官能基及び／若しくは修飾などの１つ以上の追加材料によって囲まれた１つ以上の磁気コアを含有してもよい。いくつかの例では、磁気粒子は、磁気成分及び１つ以上のシラノール基で修飾された表面を含有してもよい。このタイプの磁気粒子は、標的核酸分子に結合するために使用されてもよい。
【0129】
粒子、例えば、磁気粒子又はビーズは、多孔質体、非多孔質体、中空体、固体、半固体、半流体、流体、及び／又はその組み合わせであってもよい。いくつかの場合、粒子、例えばビーズは、溶解性又は分解性であってもよい。いくつかの場合、粒子、例えばビーズは、分解性でなくてもよい。いくつかの実施形態では、ビーズは、架橋アガロース、例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）で構成される。
【0130】
粒子、例えば、磁気粒子又はビーズは、天然及び／又は合成材料を含んでもよい。例えば、粒子、例えばビーズは、天然高分子、合成高分子又は天然及び合成高分子の両方を含み得る。天然高分子の例として、タンパク質及び糖、例えば、デオキシリボ核酸、ガム、セルロース、デンプン（例えば、アミロース、アミロペクチン）、タンパク質、酵素、多糖、絹、ポリヒドロキシアルカノエート、キトサン、デキストラン、コラーゲン、カラギーナン、イスパキュラ、アカシア、寒天、ゼラチン、セラック、カラヤガム、キサンタンガム、トウモロコシ糖ガム、グアーガム、ガムカラヤ、アガロース、アルギン酸、アルギン酸塩、又はその天然高分子が挙げられる。合成高分子の例として、アクリル、ナイロン、シリコーン、スパンデックス、ビスコースレーヨン、ポリカルボン酸、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、ポリ乳酸、シリカ、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（クロロトリフルオロエチレン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリエチレン、ポリイソブチレン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（オキシメチレン）、ポリホルムアルデヒド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニリデンジクロリド）、ポリ（二フッ化ビニリデン）、ポリ（フッ化ビニル）及び／又はその組み合わせ（例えば、共重合体）が挙げられる。ビーズはまた、脂質、ミセル、セラミックス、ガラスセラミックス、材料複合体、金属、他の無機材料、及びその他を含む、ポリマー以外の材料から形成されてもよい。
【0131】
架橋は、使用される特定の架橋剤に応じて、永久的又は可逆的であってもよい。可逆的架橋は、ポリマーが適切な条件下で線状化又は解離することを可能にし得る。いくつかの場合、可逆的架橋はまた、ビーズの表面に結合された材料の可逆的結合を可能にし得る。
【0132】
粒子、例えば、ビーズ又は磁気粒子は、均一サイズ又は不均一サイズであってもよい。いくつかの場合、粒子、例えばビーズの直径は、少なくとも約１μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、５００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍ、又はそれ以上であってもよい。いくつかの場合、粒子、例えばビーズは、約１μｍ未満、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、５００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍ又はそれ以下の直径を有してもよい。いくつかの場合、粒子、例えばビーズは、約４０～７５μｍ、３０～７５μｍ、２０～７５μｍ、４０～８５μｍ、４０～９５μｍ、２０～１００μｍ、１０～１００μｍ、１～１００μｍ、２０～２５０μｍ、若しくは２０～５００μｍ、５００μｍ～１ｍｍ、１ｍｍ～２ｍｍ、１～５ｍｍ、若しくは１～１０ｍｍの範囲の直径を有してもよい。
【0133】
粒子は、任意の好適な形状であってもよい。粒子、例えば、磁気粒子又はビーズの形状の例として、限定はされないが、球状、非球状、卵円状、長方形、非晶質、環状、円柱状、及びそのバリエーションが挙げられる。
【0134】
リンカー
いくつかの実施形態では、リンカーを使用して、本明細書に記載の組成物又は方法において使用される２つ以上の成分をコンジュゲートする。例えば、リンカーを使用して、オリゴヌクレオチドを捕捉剤に、捕捉剤を粒子（例えば、ビーズ）に、オリゴヌクレオチドを粒子（例えば、ビーズ）に、又はその任意の組み合わせ若しくはバリエーションでコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、化学的リンカーによって第１の捕捉剤にコンジュゲートされる。化学的リンカーは、オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端にコンジュゲートされ得る。或いは、化学的リンカーは、オリゴヌクレオチドの内部領域にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、リンカーを使用して、本明細書に記載の組成物又は方法において使用される２つ以上の成分をコンジュゲートする。例えば、リンカーを使用して、オリゴヌクレオチドを捕捉剤に、捕捉剤を粒子（例えば、ビーズ）に、オリゴヌクレオチドを粒子（例えば、ビーズ）に、又はその任意の組み合わせ若しくはバリエーションでコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、化学的リンカーによって第１の捕捉剤にコンジュゲートされる。化学的リンカーは、オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端にコンジュゲートされ得る。或いは、化学的リンカーは、オリゴヌクレオチドの内部領域にコンジュゲートされ得る。
【0135】
いくつかの実施形態では、第２の捕捉剤は、粒子にコンジュゲートされる。粒子は、例えば、磁気粒子又はビーズであってもよい。ビーズは、例えば架橋アガロース、例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズであってもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、粒子（例えばビーズ、例えば磁気ビーズ又は架橋アガロース、例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズ）に直接的にコンジュゲートされる。
【0136】
化学的リンカーは、例えば、オリゴヌクレオチドと捕捉剤（例えば、第１の捕捉剤）及び／又は捕捉剤（例えば、第２の捕捉剤）及び粒子との間に、空間、硬性、及び／又は柔軟性をもたらす。いくつかの実施形態では、リンカーは、結合、例えば共有結合、例えば、アミド結合、ジスルフィド結合、Ｃ－Ｏ結合、Ｃ－Ｎ結合、Ｎ－Ｎ結合、Ｃ－Ｓ結合、又は化学反応、例えば化学的コンジュゲーションからもたらされるあらゆる種類の結合であってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、２５０個以下の原子（例えば、１～２、１～４、１～６、１～８、１～１０、１～１２、１～１４、１～１６、１～１８、１～２０、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、１～５０、１～５５、１～６０、１～６５、１～７０、１～７５、１～８０、１～８５、１～９０、１～９５、１～１００、１～１１０、１～１２０、１～１３０、１～１４０、１～１５０、１～１６０、１～１７０、１～１８０、１～１９０、１～２００、１～２１０、１～２２０、１～２３０、１～２４０、又は１～２５０個の原子；２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個の原子）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、２５０個以下の非水素原子（例えば、１～２、１～４、１～６、１～８、１～１０、１～１２、１～１４、１～１６、１～１８、１～２０、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、１～５０、１～５５、１～６０、１～６５、１～７０、１～７５、１～８０、１～８５、１～９０、１～９５、１～１００、１～１１０、１～１２０、１～１３０、１～１４０、１～１５０、１～１６０、１～１７０、１～１８０、１～１９０、１～２００、１～２１０、１～２２０、１～２３０、１～２４０、又は１～２５０個の非水素原子；２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個の非水素原子）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーの骨格は、２５０個以下の原子（例えば、１～２、１～４、１～６、１～８、１～１０、１～１２、１～１４、１～１６、１～１８、１～２０、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、１～５０、１～５５、１～６０、１～６５、１～７０、１～７５、１～８０、１～８５、１～９０、１～９５、１～１００、１～１１０、１～１２０、１～１３０、１～１４０、１～１５０、１～１６０、１～１７０、１～１８０、１～１９０、１～２００、１～２１０、１～２２０、１～２３０、１～２４０、又は１～２５０個の原子；２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個の原子）を含む。リンカーの「骨格」は、コンジュゲートの一方の部分からコンジュゲートのもう一方の部分にかけての最短経路を一緒に形成するリンカー中の原子を指す。リンカーの骨格内の原子は、コンジュゲートの一方の部分をコンジュゲートのもう一方の部分に連結することに直接的に関与する。例えば、リンカーの骨格内の炭素に結合した水素原子は、コンジュゲートの一方の部分をコンジュゲートのもう一方の部分に連結することに直接的に関与するとみなされない。
【0137】
いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、合成高分子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー）に由来する合成基を含んでもよい。化学的リンカーは、例えば、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列（例えば、１～２５アミノ酸、１～１０アミノ酸、１～９アミノ酸、１～８アミノ酸、１～７アミノ酸、１～６アミノ酸、１～５アミノ酸、１～４アミノ酸、１～３アミノ酸、１～２アミノ酸、又は１アミノ酸配列）であってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上の任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２０アルキレン、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２０ヘテロアルキレン（例えば、ＰＥＧ単位）、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２０アルケニレン（例えば、Ｃ２アルケニレン）、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２０ヘテロアルケニレン、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２０アルキニレン、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２０ヘテロアルキニレン、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ２０シクロアルキレン（例えば、シクロプロピレン、シクロブチレン）、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２０ヘテロシクロアルキレン、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ２０シクロアルケニレン、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ２０ヘテロシクロアルケニレン、任意選択的に置換されたＣ８～Ｃ２０シクロアルキニレン、任意選択的に置換されたＣ８～Ｃ２０ヘテロシクロアルキニレン、任意選択的に置換されたＣ５～Ｃ１５アリレン（例えば、Ｃ６アリレン）、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ１５ヘテロアリレン（例えば、イミダゾール、ピリジン）、Ｏ、Ｓ、ＮＲｉ（Ｒｉは、Ｈ、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２０アルキル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２０ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２０アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２０ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２０アルキニル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２０ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ２０シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ２０シクロアルケニル、任意選択的に置換されたＣ４～Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、任意選択的に置換されたＣ８～Ｃ２０シクロアルキニル、任意選択的に置換されたＣ８～Ｃ２０ヘテロシクロアルキニル、任意選択的に置換されたＣ５～Ｃ１５アリール、又は任意選択的に置換されたＣ３～Ｃ１５ヘテロアリールである）、Ｐ、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、リン酸塩、ホスホリル、又はイミノを含んでもよい。
【0138】
リンカーを用いたコンジュゲート中の２つ以上の成分の共有結合的コンジュゲーションは、周知の有機化学合成技術及び方法を用いて達成することができる。２つの成分上の相補的な官能基は、互いに反応し、共有結合を形成し得る。相補的な反応性官能基の例として、限定はされないが、例えば、マレイミド及びシステイン、アミン及び活性化カルボン酸、チオール及びマレイミド、活性化スルホン酸及びアミン、イソシアン酸塩及びアミン、アジド及びアルキン、並びにアルケン及びテトラジンが挙げられる。ポリペプチドへの部位特異的コンジュゲーションは、当該技術分野で公知の技術を用いて達成することができる。
【0139】
組成物
本明細書に記載のとおり、本発明は、本明細書に記載される方法によって生成されたポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物を特徴とする。集団は、例えば、標的領域を欠いている環状ポリリボヌクレオチドを含んでもよく、環状ポリリボヌクレオチドは、組成物中の全ポリリボヌクレオチドの少なくとも１％（例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上）（モル／モル）を含む。いくつかの実施形態では、集団は、組成物中の５０％未満（例えば、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満）（モル／モル）の線状ポリリボヌクレオチドを有する。
本明細書に記載のとおり、本発明は、本明細書に記載される方法によって生成されたポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物を特徴とする。集団は、例えば、標的領域を欠いている環状ポリリボヌクレオチドを含んでもよく、環状ポリリボヌクレオチドは、組成物中の全ポリリボヌクレオチドの少なくとも１％（例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上）（モル／モル）を含む。いくつかの実施形態では、集団は、組成物中の５０％未満（例えば、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満）（モル／モル）の線状ポリリボヌクレオチドを有する。
【0140】
他の実施形態では、集団は、例えば、標的領域を有する第１の配置におけるポリリボヌクレオチド及び標的領域を有する第２の配置におけるポリリボヌクレオチドを含んでもよく、第１の配置におけるポリリボヌクレオチドは、組成物中の全ポリリボヌクレオチドの少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上）（モル／モル）を含む。
【0141】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、本発明は、ポリリボヌクレオチドの混合物を含む組成物を特徴とする。混合物の第１のサブセットは、標的領域を欠いている環状ポリリボヌクレオチドを含み、複数のポリリボヌクレオチドの第２のサブセットは、標的領域を有する線状ポリリボヌクレオチドを含む。第１のサブセットは、組成物中の全ポリリボヌクレオチドの少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上）（モル／モル）を含む。
【0142】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、本発明は、標的領域を有するポリリボヌクレオチド及び標的領域にハイブリダイズするように設計されているオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、オリゴヌクレオチドが第１の捕捉剤（例えば抗原、例えばビオチン）にコンジュゲートされている組成物を特徴とする。組成物は、例えば、標的領域を欠いているポリリボヌクレオチドをさらに含んでもよい。標的領域を欠いているポリリボヌクレオチドは、例えば、環状ポリリボヌクレオチドであってもよい。組成物は、第１の捕捉剤に結合するように設計されている第２の捕捉剤（例えば、抗体又はその抗原結合断片、例えばストレプトアビジン）をさらに含んでもよい。第２の捕捉剤は、例えばリンカーを介して粒子にコンジュゲートされ得る。
【0143】
本明細書に記載される組成物のいずれかのいくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、イントロン又はその一部分を含む。標的領域は、イントロン又はその一部分を含んでもよい。標的領域は、イントロン又はその一部分の５’又は３’側に位置してもよい。
【0144】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、修飾されたポリリボヌクレオチドであってもよい。
【0145】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、質量ベースで、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）、又は１００％（ｗ／ｗ）純粋である。純度は、例えば限定はされないが、クロマトグラフィー（カラムを使用する、ペーパーを使用する、ゲルを使用する、ＨＰＬＣを使用する、ＵＨＰＬＣを使用するなど、又はＩＣによる、ＳＥＣによる、逆相による、アニオン交換による、混合モードによるなど）又は電気泳動（尿素ＰＡＧＥ、チップベース、ポリアクリルアミドゲル、ＲＮＡ、キャピラリー、ｃ－ＩＥＦなど）などの分離技術の使用など、当業者に公知のいくつかの分析技術のいずれか１つにより、質量分析、ＵＶ－可視光、蛍光、光散乱、屈折率に基づく検出技術を用いる、又は検出のための銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を用いる分離前若しくは分離後の誘導体化方法の存在下又は非存在下で測定することができる。或いは、純度は、質量分析による、顕微鏡による、円二色性（ＣＤ）分光学による、ＵＶ若しくはＵＶ－ｖｉｓ分光光度法による、蛍光測定（例えば、Ｑｕｂｉｔ）による、リボヌクレアーゼＨ分析による、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、又は検出のための銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を用いる方法による分離技術を用いることなく、測定することができる。
【0146】
いくつかの実施形態では、純度は、生物学的試験方法（例えば、細胞ベース又は受容体ベースの試験）によって測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の調製物におけるリボヌクレオチド集団全体の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）又は１００％（ｗ／ｗ）が、環状ポリリボヌクレオチド分子中に含有される。パーセントは、例えば限定はされないが、クロマトグラフィー（カラムを使用する、ペーパーを使用する、ゲルを使用する、ＨＰＬＣを使用する、ＵＨＰＬＣを使用するなど、又はＩＣによる、ＳＥＣによる、逆相による、アニオン交換による、混合モードによるなど）又は電気泳動（尿素ＰＡＧＥ、チップベース、ポリアクリルアミドゲル、ＲＮＡ、キャピラリー、ｃ－ＩＥＦなど）などの分離技術の使用など、当業者に公知のいくつかの分析技術のいずれか１つにより、質量分析、ＵＶ－可視光、蛍光、光散乱、屈折率に基づく検出技術を用いる、又は検出のための銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を用いる分離前若しくは分離後の誘導体化方法の存在下又は非存在下で測定することができる。或いは、純度は、質量分析による、顕微鏡による、円二色性（ＣＤ）分光学による、ＵＶ若しくはＵＶ－ｖｉｓ分光光度法による、蛍光測定（例えば、Ｑｕｂｉｔ）による、リボヌクレアーゼＨ分析による、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、又は検出のための銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を用いる方法による分離技術を用いることなく、測定することができる。
【0147】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、１００，０００μｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、６００ｍｇ／ｍＬ、６５０ｍｇ／ｍＬ、７００ｍｇ／ｍＬ、又は７５０ｍｇ／ｍＬの環状ポリリボヌクレオチド濃度を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、モノヌクレオチドを実質的に含まない、又は１ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、若しくは１００，０００μｇ／ｍＬ以下のモノヌクレオチド含量を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、最大で、１ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬの検出限界からのモノヌクレオチド含量を有する。
【0148】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、質量ベースで、全ヌクレオチドの０．１％（ｗ／ｗ）、０．２％（ｗ／ｗ）、０．３％（ｗ／ｗ）、０．４％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、０．６％（ｗ／ｗ）、０．７％（ｗ／ｗ）、０．８％（ｗ／ｗ）、０．９％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）以下、又はそれらの間の任意のパーセンテージのモノヌクレオチド含量を有し、ここで全ヌクレオチド含量は、デオキシリボヌクレオチド分子及びリボヌクレオチド分子の全質量である。
【0149】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００ｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、６００ｍｇ／ｍＬ、６５０ｍｇ／ｍＬ、７００ｍｇ／ｍＬ、又は７５０ｍｇ／ｍＬ以下の線状ＲＮＡ含有物、例えば、線状ＲＮＡ対応物又はＲＮＡ断片を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、最大で、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００ｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、６００ｍｇ／ｍＬ、６５０ｍｇ／ｍＬ、７００ｍｇ／ｍｌ、又は７５０ｍｇ／ｍｌの検出限界からの線状ＲＮＡ含有物、例えば、線状ＲＮＡ対応物又はＲＮＡ断片を有する。
【0150】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、１０％（ｗ／ｗ）、９．９％（ｗ／ｗ）、９．８％（ｗ／ｗ）、９．７％（ｗ／ｗ）、９．６％（ｗ／ｗ）、９．５％（ｗ／ｗ）、９．４％（ｗ／ｗ）、９．３％（ｗ／ｗ）、９．２％（ｗ／ｗ）、９．１％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、若しくは０．１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれらの間のパーセンテージのニックＲＮＡ含量を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、０程度に低いニックＲＮＡ含量を有する、又はニックＲＮＡを実質的に含まない。
【0151】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、３０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、若しくは０．１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれらの間のパーセンテージの線状ＲＮＡとニックＲＮＡを組み合わせた含量を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、０程度に低いニックＲＮＡと線状ＲＮＡを組み合わせた含量を有する、又はニック及び線状ＲＮＡを実質的に含まない。
【0152】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、質量分析、ＵＶ分光又は蛍光検出器、光散乱技術、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を、ＨＰＬＣを含む、ＨＰＬＣ、チップ若しくはゲルベースの電気泳動による分離方法の使用の存在下又は非存在下、分離前若しくは分離後のいずれかの誘導体化方法、銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を用いる検出方法、又は顕微鏡法、視覚的方法若しくは分光光度計の使用の存在下又は非存在下で用いる方法などの分析方法の検出限界以下の線状ＲＮＡ含有物、例えば、線状ＲＮＡ対応物又はＲＮＡ断片を有する。
【0153】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、例えば、実施例２における方法によって測定したとき、０．１％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下の線状ＲＮＡを有する。
【0154】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物の線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状対応物又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物の線状ポリリボヌクレオチド分子は、線状対応物（例えば、環状化前バージョン）を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物の線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチドに対する非対応物又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物の線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチドに対する非対応物を含む。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチドの対応物及び環状ポリリボヌクレオチドの非対応物又はその断片の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチドの対応物及び環状ポリリボヌクレオチドの非対応物の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチド分子断片は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、若しくはそれ以上のヌクレオチドの長さ、又はそれらの間の任意のヌクレオチド数である断片である。
【0155】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、例えば、分光光度計によって測定したとき、約１．６～約２．３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を有する。いくつかの実施形態では、Ａ２６０／Ａ２８０吸光度比は、約１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、又はそれらの間の任意の数である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチドの生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、例えば、分光光度計によって測定したとき、約１．８を超えるＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を有する。いくつかの実施形態では、Ａ２６０／Ａ２８０吸光度比は、約１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、又はそれ以上である。
【0156】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、不純物又は副産物を実質的に含まない。様々な実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物中の少なくとも１つの不純物又は副産物のレベルは、不純物又は副産物を除去するための精製又は処理前の組成物の場合と比較したとき、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）低下する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロセス関連不純物又は副産物のレベルは、不純物又は副産物を除去するための精製又は処理前の組成物の場合と比較したとき、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）低下する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの産物関連物質のレベルは、不純物又は副産物を除去するための精製又は処理前の組成物の場合と比較したとき、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）低下する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、プロセス関連不純物又は副産物をさらに実質的に含まない。いくつかの実施形態では、プロセス関連不純物又は副産物は、タンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質）、デオキシリボ核酸（例えば、宿主細胞デオキシリボ核酸などの細胞デオキシリボ核酸）、モノデオキシリボヌクレオチド若しくはジデオキシリボヌクレオチド分子、酵素（例えば、ヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ、又はリガーゼ）、試薬成分、ゲル成分、又はクロマトグラフ材料を含む。いくつかの実施形態では、不純物又は副産物は、緩衝液試薬、リガーゼ、ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ阻害剤、リボヌクレアーゼＲ、デオキシリボヌクレオチド分子、アクリルアミドゲル細片、及びモノデオキシリボヌクレオチド分子から選択される。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、タンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質）汚染物質、不純物、又は副産物として、環状ポリリボヌクレオチド分子の１ミリグラム（ｍｇ）当たり、０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満のタンパク質汚染物質、不純物、又は副産物を含む。
【0157】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、ＤＮＡ含有物を実質的に含まない、例えば、鋳型ＤＮＡ又は細胞ＤＮＡ（例えば、宿主細胞ＤＮＡ）は、０程度に低いＤＮＡ含量を有する、又は１ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ以下のＤＮＡ含量を有する。
【0158】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、ＤＮＡ含有物を実質的に含まない、０程度に低いＤＮＡ含量を有する、又は質量ベースで全ヌクレオチドの０．００１％（ｗ／ｗ）、０．０１％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下のＤＮＡ含量を有し、ここで全ヌクレオチド分子は、デオキシリボヌクレオチド含有物及びリボヌクレオチド分子の全質量である。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、ヌクレオシドを消化する酵素による全ＤＮＡ消化後に定量液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって測定したとき（ＤＮＡの含量は、ＬＣ－ＭＳによって測定したとき、各塩基（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の検量線から逆計算される）、ＤＮＡ含有物を実質的に含まない、０程度に低いＤＮＡ含量を有する、又は質量ベースで全ヌクレオチドの０．００１％（ｗ／ｗ）、０．０１％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下のＤＮＡ含量を有する。
【0159】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍｌ、又は５００ｎｇ／ｍｌ以下のタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）、例えば、酵素、産物関連タンパク質、例えば、担体タンパク質）汚染物質、不純物、又は副産物を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチドの生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、最大で０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍｌ、又は５００ｎｇ／ｍｌの検出限界からのタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）、例えば酵素などの産物関連タンパク質）汚染物質、不純物、又は副産物を有する。
【0160】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、環状ポリリボヌクレオチドの１ミリグラム（ｍｇ）当たり、０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満のタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）、例えば酵素などの産物関連タンパク質）汚染物質、不純物、又は副産物を有する。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチドの生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、環状ポリリボヌクレオチドの１ミリグラム（ｍｇ）当たり、最大で０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇの検出レベルからのタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）、例えば酵素などの産物関連タンパク質）汚染物質、不純物、又は副産物を有する。
【0161】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、例えば、カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）試験によって測定したとき、低レベルの内毒素を有する、又は内毒素が実質的に不在である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの生成における医薬調製物若しくは組成物又は中間体は、カブトガニ血球抽出成分試験によって測定したとき、２０ＥＵ／ｋｇ（重量）、１０ＥＵ／ｋｇ、５ＥＵ／ｋｇ、１ＥＵ／ｋｇ未満の内毒素を含む、又は内毒素を欠いている。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド組成物は、低レベルのヌクレアーゼ又はリガーゼを有する、又はそれが不在である。
【0162】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、約５０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、１９％（ｗ／ｗ）、１８％（ｗ／ｗ）、１７％（ｗ／ｗ）、１６％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、１４％（ｗ／ｗ）、１３％（ｗ／ｗ）、１２％（ｗ／ｗ）、１１％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）以下の少なくとも１つの酵素、例えばポリメラーゼ、例えばＲＮＡポリメラーゼを含む。
【0163】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の生成における環状ポリリボヌクレオチド医薬調製物若しくは組成物又は中間体）は、無菌である、又は微生物を実質的に含まない、例えば、組成物若しくは調製物は、無菌条件下で試験したとき、１００未満の生存可能な微生物の成長を支持し、組成物若しくは調製物は、ＵＳＰ＜７１＞の基準を満たし、及び／又は組成物若しくは調製物は、ＵＳＰ＜８５＞の基準を満たす。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、滅菌前、１００ＣＦＵ／１００ｍｌ、５０ＣＦＵ／１００ｍｌ、４０ＣＦＵ／１００ｍｌ、３０ＣＦＵ／１００ｍｌ、２００ＣＦＵ／１００ｍｌ、１０ＣＦＵ／１００ｍｌ、又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含む。
【0164】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド調製物は、不純物又は副産物を除去するため、カラムクロマトグラフィー又はｐＨ、バイアル不活性化などの当該技術分野で公知の技術を用いて、さらに精製することができる。
【0165】
ポリヌクレオチド
本発明は、分離及び／又は精製の方法において使用され、本明細書に記載の組成物中に存在するポリリボヌクレオチドを特徴とする。本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチド、環状ポリリボヌクレオチド又はその組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、（例えば、線状ポリリボヌクレオチドの適合可能な末端をスプライシングすることにより）線状ポリリボヌクレオチドから生成される。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド鋳型（例えば、ベクター、線状化ベクター、又はｃＤＮＡ）から転写される。したがって、本発明は、ポリリボヌクレオチドの生成において有用である、線状デオキシリボヌクレオチド、環状デオキシリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド、及び環状ポリリボヌクレオチド及びその組成物を特徴とする。
本発明は、分離及び／又は精製の方法において使用され、本明細書に記載の組成物中に存在するポリリボヌクレオチドを特徴とする。本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチド、環状ポリリボヌクレオチド又はその組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、（例えば、線状ポリリボヌクレオチドの適合可能な末端をスプライシングすることにより）線状ポリリボヌクレオチドから生成される。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド鋳型（例えば、ベクター、線状化ベクター、又はｃＤＮＡ）から転写される。したがって、本発明は、ポリリボヌクレオチドの生成において有用である、線状デオキシリボヌクレオチド、環状デオキシリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド、及び環状ポリリボヌクレオチド及びその組成物を特徴とする。
【0166】
線状ポリリボヌクレオチド
本発明は、以下の１つ以上を含み得る線状ポリリボヌクレオチドを特徴とする：３’半分－イントロン；３’スプライス部位；３’エクソン；ポリリボヌクレオチドカーゴ；５’エクソン；５’スプライス部位；及び５’半分－イントロン。いくつかの実施形態では、３’半分－イントロンは、触媒グループＩイントロン、例えば、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡ、Ｔ４ファージｔｄ遺伝子、又はその変異体からの触媒グループＩイントロンの３’部分に対応する。いくつかの実施形態では、５’半分－イントロンは、触媒グループＩイントロン、例えば、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡ、Ｔ４ファージｔｄ遺伝子、又はその変異体からの触媒グループＩイントロンの５’部分に対応する。
本発明は、以下の１つ以上を含み得る線状ポリリボヌクレオチドを特徴とする：３’半分－イントロン；３’スプライス部位；３’エクソン；ポリリボヌクレオチドカーゴ；５’エクソン；５’スプライス部位；及び５’半分－イントロン。いくつかの実施形態では、３’半分－イントロンは、触媒グループＩイントロン、例えば、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡ、Ｔ４ファージｔｄ遺伝子、又はその変異体からの触媒グループＩイントロンの３’部分に対応する。いくつかの実施形態では、５’半分－イントロンは、触媒グループＩイントロン、例えば、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡ、Ｔ４ファージｔｄ遺伝子、又はその変異体からの触媒グループＩイントロンの５’部分に対応する。
【0167】
線状ポリリボヌクレオチドは、追加的な要素を、例えば、上記要素の外側又はそれらいずれかの間に含んでもよい。例えば、上記要素のいずれかは、本明細書に記載のとおり、スペーサー配列によって分離されてもよい。本明細書に記載される標的領域は、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドの任意の領域内に存在してもよい。いくつかの実施形態では、標的領域は、イントロン又はその一部分の内部に存在する。
【0168】
特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるデオキシリボヌクレオチド（例えば、ベクター、線状化ベクター、又はｃＤＮＡ）を鋳型（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが線状ポリリボヌクレオチドをコードする領域の上流に配置されている、本明細書に提供されるベクター、線状化ベクター、又はｃＤＮＡ）として使用して、無細胞系における転写（例えば、インビトロ転写）を実施することにより、線状ポリリボヌクレオチドを生成する方法である。
【0169】
デオキシリボヌクレオチド鋳型を転写し、本明細書に記載の成分を含有する線状ポリリボヌクレオチドを生成することができる。発現時、線状ポリリボヌクレオチドは、例えば後の使用のため、スプライスされることで環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る、スプライシングに適合するポリリボヌクレオチドを生成することができる。
【0170】
いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、５０～２０，０００、例えば、３００～２０，０００（例えば、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、又は２０，０００）リボヌクレオチドの長さである。線状ポリリボヌクレオチドは、例えば、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、又は少なくとも５，０００リボヌクレオチドの長さであり得る。
【0171】
環状ポリリボヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本発明は、環状ポリリボヌクレオチドを特徴とする。環状ポリリボヌクレオチドは、５’エクソン及び３’エクソンを連結するスプライス結合を含んでもよい。本明細書に記載される標的領域は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの任意の領域内に存在し得る。環状ポリリボヌクレオチドは、例えばスプライシング後、イントロンが欠け得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、環状ポリリボヌクレオチドを特徴とする。環状ポリリボヌクレオチドは、５’エクソン及び３’エクソンを連結するスプライス結合を含んでもよい。本明細書に記載される標的領域は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの任意の領域内に存在し得る。環状ポリリボヌクレオチドは、例えばスプライシング後、イントロンが欠け得る。
【0172】
環状ポリヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドカーゴをさらに含んでもよい。ポリリボヌクレオチドカーゴは、発現配列、非コード配列、又は発現配列及び非コード配列の組み合わせを含んでもよい。ポリリボヌクレオチドカーゴは、ポリペプチドをコードする発現配列を含んでもよい。ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする発現配列に作動可能に連結されているＩＲＥＳを含んでもよい。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳと５’エクソン断片又は３’エクソン断片との間にスペーサー領域をさらに含む。スペーサー領域は、例えば、少なくとも５（例えば、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０）リボヌクレオチドの長さであってもよい。スペーサー領域は、例えば、５～５００（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００）リボヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、ポリＡ－Ｃ、ポリＡ－Ｇ、ポリＡ－Ｕ、又は他の異質若しくはランダム配列を含む。
【0173】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである。
【0174】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソームへの結合部位を収容するのに十分なサイズであり得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは、有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって、少なくとも２０，０００ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド、少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも１４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチドの長さが生成され得る。
【0175】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書中に記載の１つ以上の要素を含む。いくつかの実施形態では、要素は、スペーサー配列によって互いに分離され得る。いくつかの実施形態では、要素は、１リボヌクレオチド、２ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、最大約１ｋｂ、少なくとも約１０００ヌクレオチド、又はそれらの間の任意の量のヌクレオチドによって互いに分離され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の要素は、互いに隣接しており、例えばスペーサーエレメントを欠いている。
【0176】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の反復エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書中に記載の１つ以上の修飾を含む。一実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシド修飾を含む。一実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドのヌクレオシドの最大１００％が修飾される。一実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド修飾は、ウリジン修飾又はアデノシン修飾である。
【0177】
その環状化の結果として、環状ポリリボヌクレオチドは、それを線状ポリリボヌクレオチドと区別する特定の特徴を含んでもよい。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドよりも多かれ少なかれアクセス可能な標的領域を含有してもよい。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドと比較した場合にエキソヌクレアーゼによる分解をより受けにくいことがある。そのようなものとして、環状ポリリボヌクレオチドは、特にエキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートされるとき、線状ポリリボヌクレオチドより安定であり得る。環状ポリリボヌクレオチドの安定性の線状ポリリボヌクレオチドと比較しての増加は、環状ポリリボヌクレオチドを、ポリペプチドを生成するための細胞形質転換試薬としてより有用なものにし、線状ポリリボヌクレオチドより容易に、そしてより長い間、貯蔵可能である。エキソヌクレアーゼで処理された環状ポリリボヌクレオチドの安定性は、ＲＮＡ分解が（例えば、ゲル電気泳動によって）生じているか否かを判定する、当該技術分野で標準の方法を用いて試験することができる。さらに、線状ポリリボヌクレオチドと異なり、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドが子ウシ腸ホスファターゼなどのホスファターゼとともにインキュベートされるとき、脱リン酸化をより受けにくい可能性がある。
【0178】
ポリリボヌクレオチドカーゴ
本明細書に記載のポリリボヌクレオチドカーゴは、少なくとも１つのポリリボヌクレオチドを含む任意の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、発現配列、非コード配列、又は発現配列及び非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、ポリペプチドをコードする発現配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、ポリペプチドをコードする発現配列に作動可能に連結されているＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、対象に対する生物学的効果を有するポリペプチドをコードする発現配列を含む。
本明細書に記載のポリリボヌクレオチドカーゴは、少なくとも１つのポリリボヌクレオチドを含む任意の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、発現配列、非コード配列、又は発現配列及び非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、ポリペプチドをコードする発現配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、ポリペプチドをコードする発現配列に作動可能に連結されているＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、対象に対する生物学的効果を有するポリペプチドをコードする発現配列を含む。
【0179】
ポリリボヌクレオチドカーゴは、例えば、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、１～２０，０００ヌクレオチド、１～１０，０００ヌクレオチド、１～５，０００ヌクレオチド、１００～２０，０００ヌクレオチド、１００～１０，０００ヌクレオチド、１００～５，０００ヌクレオチド、５００～２０，０００ヌクレオチド、５００～１０，０００ヌクレオチド、５００～５，０００ヌクレオチド、１，０００～２０，０００ヌクレオチド、１，０００～１０，０００ヌクレオチド、又は１，０００～５，０００ヌクレオチドを含む。
【0180】
実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、１つ又は複数の発現（又はコード）配列を含み、ここで各発現（又はコード）配列は、ポリペプチドをコードする。実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、１つ又は複数の非コード配列を含む。実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、全体的に非コード配列からなる。実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、発現（又はコード）配列及び非コード配列の組み合わせを含む。
【0181】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のとおりに作製されたポリリボヌクレオチドは、治療法又は農業におけるエフェクターとして使用される。例えば、本明細書に記載の方法（例えば、本明細書に記載の無細胞法）によって作製された環状ポリリボヌクレオチドは、（例えば、医薬、動物、又は農業組成物において）対象に投与することができる。別の例では、本明細書に記載の方法（例えば、本明細書に記載の無細胞法）によって作製された環状ポリリボヌクレオチドは、細胞に送達することができる。
【0182】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットに開示されたとおりの任意の特徴、又は特徴のいずれかの組み合わせを含む。
【0183】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、オープンリーディングフレームを含む。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。オープンリーディングフレームは、ＲＮＡ又はポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、ポリペプチドをコードし、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、例えば、ポリペプチドをコードする線状ポリリボヌクレオチドと比較した場合、ポリペプチドの（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又はそれ以上の）発現増加をもたらす。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド、例えば環状ポリリボヌクレオチドの純度の増加は、例えば、環状及び線状ポリリボヌクレオチドの集団と比較した場合、ポリペプチドの（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又はそれ以上の）発現増加をもたらす。
【0184】
ポリペプチド発現配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、１つ以上の発現（又はコード）配列を含み、ここで各発現配列は、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれ以上の発現（又はコード）配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、１つ以上の発現（又はコード）配列を含み、ここで各発現配列は、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれ以上の発現（又はコード）配列を含む。
【0185】
各コードポリペプチドは、直鎖状又は分岐状であってもよい。実施形態では、ポリペプチドは、約５～約４０，０００アミノ酸、約１５～約３５，０００アミノ酸、約２０～約３０，０００アミノ酸、約２５～約２５，０００アミノ酸、約５０～約２０，０００アミノ酸、約１００～約１５，０００アミノ酸、約２００～約１０，０００アミノ酸、約５００～約５，０００アミノ酸、約１，０００～約２，５００アミノ酸、又はそれらの間の任意の範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、有用であり得る、約４０，０００アミノ酸未満、約３５，０００アミノ酸未満、約３０，０００アミノ酸未満、約２５，０００アミノ酸未満、約２０，０００アミノ酸未満、約１５，０００アミノ酸未満、約１０，０００アミノ酸未満、約９，０００アミノ酸未満、約８，０００アミノ酸未満、約７，０００アミノ酸未満、約６，０００アミノ酸未満、約５，０００アミノ酸未満、約４，０００アミノ酸未満、約３，０００アミノ酸未満、約２，５００アミノ酸未満、約２，０００アミノ酸未満、約１，５００アミノ酸未満、約１，０００アミノ酸未満、約９００アミノ酸未満、約８００アミノ酸未満、約７００アミノ酸未満、約６００アミノ酸未満、約５００アミノ酸未満、約４００アミノ酸未満、約３００アミノ酸未満、又はそれ以下の長さを有する。
【0186】
本明細書に含まれるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド又は天然に存在しないポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、参照ポリペプチドの機能断片又は変異体（例えば、酵素の酵素活性断片又は変異体）であるか又はそれを含む。例えば、ポリペプチドは、例えば、特定領域にわたり、又は全配列にわたり、本明細書に記載のポリペプチド又は天然に存在するポリペプチドの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかの機能的に活性のある変異体であってもよい。いくつかの場合、ポリペプチドは、目的のタンパク質と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上）の同一性を有し得る。
【0187】
ポリペプチドのいくつかの例として、限定はされないが、蛍光タグ若しくはマーカー、抗原、治療用ポリペプチド、又は農業用途のポリペプチドが挙げられる。
【0188】
治療用ポリペプチドは、ホルモン、神経伝達物質、成長因子、酵素（例えば、オキシドレダクターゼ、代謝酵素、ミトコンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素、リソソーム酵素、デサチュラーゼ）、サイトカイン、抗原結合ポリペプチド（例えば、抗原結合抗体又は抗体様断片、例えば、一本鎖抗体、ナノボディ又は他のＩｇ重鎖若しくは軽鎖を含むポリペプチド）、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、インターフェロン、インターロイキン、及び血栓溶解剤であってもよい。
【0189】
農業用途のポリペプチドは、バクテリオシン、溶解素、抗菌ポリペプチド、抗真菌ポリペプチド、根粒Ｃリッチペプチド、菌細胞調節ペプチド（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｙｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ペプチド毒素、殺虫性（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ）ポリペプチド（例えば、殺虫性（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ）ポリペプチド又は殺線虫性ポリペプチド）、抗原結合ポリペプチド（例えば、抗原結合抗体又は抗体様断片、例えば、一本鎖抗体、ナノボディ又は他のＩｇ重鎖若しくは軽鎖を含むポリペプチド）、酵素（例えば、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、キチナーゼ）、ペプチドフェロモン、及び転写因子であってもよい。
【0190】
いくつかの場合、ポリリボヌクレオチドは、非ヒトタンパク質を発現する。
【0191】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、抗体、例えば、抗体断片、又はその一部分を発現する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドによって発現される抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプであり得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の一部分、例えば、軽鎖、重鎖、Ｆｃ断片、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖ断片、又はＦａｂ断片、そのさらなる一部分を発現する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の１つ以上の部分を発現する。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、それらの各々は、抗体の一部分を発現し、それらの和は、抗体を構成し得る。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列、及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列を含む。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチドが細胞又は無細胞環境下で発現される場合、軽鎖及び重鎖は、適切な修飾、フォールディング、又は他の翻訳後修飾を受け、機能的抗体を形成し得る。
【0192】
実施形態では、ポリペプチドは、複数のポリペプチド、例えば、１つのポリペプチド配列の複数のコピー、又は複数の異なるポリペプチド配列を含む。実施形態では、複数のポリペプチドは、リンカーアミノ酸又はスペーサーアミノ酸によって接続される。
【0193】
実施形態では、ポリヌクレオチドカーゴは、シグナルペプチドをコードする配列を含む。多くのシグナルペプチド配列は記載がなされており、例えば、Ｔａｔ（ツインアルギニン転座）シグナル配列は、典型的に、脂質二重層を通じてそのようなＴａｔシグナルペプチドを含む折り畳みタンパク質を転座させることに役立つ、コンセンサスＳＲＲｘＦＬＫ「ツインアルギニン」モチーフを含むＮ末端ペプチド配列である。また、例えば、ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅで公的に利用可能なシグナルペプチドデータベースを参照されたい。シグナルペプチドは、タンパク質を特定の細胞小器官に誘導するためにも有用であり；例えば、ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂで公的に利用可能なＳｐｄｂシグナルペプチドデータベースにおいて開示された、実験的に測定され、計算的に予測されたシグナルペプチドを参照されたい。
【0194】
実施形態では、ポリヌクレオチドカーゴは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をコードする配列を含む。数百のＣＰＰ配列が記載されており；例えば、ｃｒｄｄ［ｄｏｔ］ｏｓｄｄ［ｄｏｔ］ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ｃｐｐｓｉｔｅ／で公的に利用可能な細胞透過性ペプチドのデータベースのＣＰＰｓｉｔｅを参照されたい。一般に使用されるＣＰＰ配列の例が、ＣＧＩペプチドのＣ末端に融合され得る、ポリ－アルギニン配列、例えば、オクタアルギニン（ｏｃｔｏａｒｇｉｎｉｎｅ）又はノナアルギニン（ｎｏｎｏａｒｇｉｎｉｎｅ）である。
【0195】
実施形態では、ポリヌクレオチドカーゴは、自己集合ペプチドをコードする配列を含み；例えば、Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２１：３４１２，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２１－２３７９４－６を参照されたい。
【0196】
いくつかの実施形態では、発現配列は、（例えば、発現配列の３’末端に）ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列の長さは、１０を超えるヌクレオチドの長さである。一実施形態では、ポリＡ配列は、１５を超えるヌクレオチドの長さである（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチドであるか又はそれを超える）。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２０２］～［０２０４］におけるポリＡ配列の記載に従って設計される。いくつかの実施形態では、発現配列は、（例えば、発現配列の３’末端で）ポリＡ配列を欠いている。
【0197】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の特徴を調節するため、ポリＡを含むか、ポリＡを欠いているか、又は修飾ポリＡを有する。いくつかの実施形態では、ポリＡを欠いているか又は修飾ポリＡを有する環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の機能特性、例えば、免疫原性（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ以上のマーカーのレベル）、半減期、及び／又は発現効率を改良する。
【0198】
治療用ポリペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、治療用ポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。治療用ポリペプチドは、対象に投与されるか又は対象内で発現される場合、いくつかの治療的利益を提供するポリペプチドである。治療用ポリペプチドの対象への投与又は対象内での発現を用いて、疾患、障害、若しくは状態又はその症状を処置又は予防することができる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれ以上の治療用ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、治療用ポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。治療用ポリペプチドは、対象に投与されるか又は対象内で発現される場合、いくつかの治療的利益を提供するポリペプチドである。治療用ポリペプチドの対象への投与又は対象内での発現を用いて、疾患、障害、若しくは状態又はその症状を処置又は予防することができる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれ以上の治療用ポリペプチドをコードする。
【0199】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、治療用タンパク質をコードする発現配列を含む。該タンパク質は、それを必要とする対象における疾患を処置することができる。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、それを必要とする対象における変異された、下方発現された、又は存在しないタンパク質を補償し得る。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、それを必要とする対象における細胞、組織、又はウイルスを標的にし、それと相互作用し、又はそれに結合することができる。
【0200】
治療用ポリペプチドは、細胞から分泌され得る、又は細胞の細胞質、核、若しくは膜区画に局在化され得るポリペプチドであり得る。
【0201】
治療用ポリペプチドは、ホルモン、神経伝達物質、成長因子、酵素（例えば、オキシドレダクターゼ、代謝酵素、ミトコンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素、リソソーム酵素、デサチュラーゼ）、サイトカイン、転写因子、抗原結合ポリペプチド（例えば、抗原結合抗体又は抗体様断片、例えば一本鎖抗体、ナノボディ又は他のＩｇ重鎖若しくは軽鎖を含むポリペプチド）、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、インターフェロン、インターロイキン、血栓溶解剤、抗原（例えば、腫瘍、ウイルス、又は細菌抗原）、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９などのエンドヌクレアーゼ）、膜タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、膜貫通受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、抗原受容体、イオンチャネル、又は膜トランスポーター）、分泌タンパク質、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、又はＺｎフィンガー）、又は遺伝子書き込みタンパク質（ｇｅｎｅ ｗｒｉｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０２０／０４７１２４号パンフレットを参照されたい）であってもよい。
【0202】
いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、抗体、例えば、全長抗体、抗体断片、又はその一部分である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）によって発現される抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプであり得る。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現・抗体の一部分、例えば、軽鎖、重鎖、Ｆｃ断片、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖ断片、又はＦａｂ断片、そのさらなる一部分を発現する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、抗体の１つ以上の部分を発現する。例えば、ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、それらの各々は、抗体の一部分を発現し、それらの和は、抗体を構成し得る。いくつかの場合、ポリリボヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列、及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列を含む。ポリリボヌクレオチドが細胞下で発現される場合、軽鎖及び重鎖は、適切な修飾、フォールディング、又は他の翻訳後修飾を受け、機能的抗体を形成し得る。
【0203】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のとおりに作製されたポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、治療法又は農業におけるエフェクターとして使用される。例えば、本明細書に記載の方法によって作製されたポリリボヌクレオチドは、（例えば、医薬、動物、又は農業組成物において）対象に投与することができる。実施形態では、対象は、脊椎動物（例えば、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、又は両生類）である。実施形態では、対象はヒトである。実施形態では、方法の対象は非ヒト哺乳動物である。実施形態では、対象は、非ヒト霊長類（例えば、サル、類人猿）、有蹄動物（例えば、ウシ、水牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ、ラマ、アルパカ、シカ、ウマ、ロバ）、肉食動物（例えば、イヌ、ネコ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、又はウサギ類（例えば、ウサギ）などの非ヒト哺乳動物である。実施形態では、対象は、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ）、ガンカモ目（Ａｎｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、アヒル、ガチョウ）、古顎類（Ｐａｌｅａｏｇｎａｔｈａｅ）（例えば、ダチョウ、エミュー）、ハト目（Ｃｏｌｕｍｂｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ハト（ｐｉｇｅｏｎｓ）、ハト（ｄｏｖｅｓ））、又はオウム目（Ｐｓｉｔｔａｃｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、オウム）といった鳥類分類群のメンバーなどの鳥類である。実施形態では、対象は、節足動物（例えば、昆虫、クモ類、甲殻類）、線虫、環形動物、蠕虫、又は軟体類などの無脊椎動物である。実施形態では、対象は、無脊椎動物の農業害虫又は無脊椎動物若しくは脊椎動物宿主に対する寄生虫である無脊椎動物である。実施形態では、対象は、被子植物（双子葉又は単子葉であり得る）又は裸子植物（例えば、針葉樹、ソテツ、マオウ門（Ｇｎｅｔｏｐｈｙｔｅ）、イチョウ）、シダ、ツクシ、ヒカゲノカズラ、又はコケ植物などの植物である。実施形態では、対象は、真核藻類（単細胞又は多細胞）である。実施形態では、対象は、作条作物、果実生成植物及び樹木、野菜、樹木、及び観賞植物、例えば、観賞花、低木、樹木、グランドカバー、及び芝生などの農業又は園芸上重要な植物である。
【0204】
植物改変ポリペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、植物改変ポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。植物改変ポリペプチドは、植物の生理又は表現型の変化、例えば植物の適応度の増加又は低下をもたらす様式で、植物の遺伝的特性を改変し得る（例えば、遺伝子発現を増加させる、遺伝子発現を低下させる、又はそれ以外ではＤＮＡ若しくはＲＮＡのヌクレオチド配列を改変する）、エピジェネティック特性を改変し得る、又は生理学的若しくは生化学的特性を改変し得るポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０若しくはそれ以上の異なる植物改変ポリペプチド、又は１つ以上の植物改変ポリペプチドの多重コピーをコードする。植物改変ポリペプチドは、種々の植物の生理若しくは表現型を改変し得る、又は種々の植物の適応度を増加若しくは低下させ得る、又は１つ以上の特定の植物（例えば、植物の特定の種又は属）におけるこのような変化をもたらすものであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、植物改変ポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。植物改変ポリペプチドは、植物の生理又は表現型の変化、例えば植物の適応度の増加又は低下をもたらす様式で、植物の遺伝的特性を改変し得る（例えば、遺伝子発現を増加させる、遺伝子発現を低下させる、又はそれ以外ではＤＮＡ若しくはＲＮＡのヌクレオチド配列を改変する）、エピジェネティック特性を改変し得る、又は生理学的若しくは生化学的特性を改変し得るポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０若しくはそれ以上の異なる植物改変ポリペプチド、又は１つ以上の植物改変ポリペプチドの多重コピーをコードする。植物改変ポリペプチドは、種々の植物の生理若しくは表現型を改変し得る、又は種々の植物の適応度を増加若しくは低下させ得る、又は１つ以上の特定の植物（例えば、植物の特定の種又は属）におけるこのような変化をもたらすものであり得る。
【0205】
本明細書で使用することができるポリペプチドの例として、酵素（例えば、代謝組換え酵素、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、又はユビキチン化タンパク質）、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞透過性ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、又はＺｎフィンガー）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー、又はシャペロンを挙げることができる。
【0206】
農業ポリペプチド（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、農業ポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。農業ポリペプチドは、農業使用に適するポリペプチドである。実施形態では、農業ポリペプチドを、（例えば、葉面スプレー、ダスティング、注射、又は種子被覆により）植物若しくは種子に、又は（例えば、土壌ドレンチ又は顆粒土壌適用により）植物の環境に適用することで、植物の生理、表現型、又は適応度の改変をもたらす。農業ポリペプチドの実施形態は、植物又は非ヒト動物宿主の内部又は表面に常在する１つ以上の微生物のレベル、活性、又は代謝を改変するポリペプチドを含み、その改変により、宿主の適応度増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、農業ポリペプチドは、植物ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、農業ポリペプチドは、昆虫ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、農業ポリペプチドは、非ヒト脊椎動物、無脊椎動物、微生物、又は植物細胞と接触する際、生物学的効果を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、農業ポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。農業ポリペプチドは、農業使用に適するポリペプチドである。実施形態では、農業ポリペプチドを、（例えば、葉面スプレー、ダスティング、注射、又は種子被覆により）植物若しくは種子に、又は（例えば、土壌ドレンチ又は顆粒土壌適用により）植物の環境に適用することで、植物の生理、表現型、又は適応度の改変をもたらす。農業ポリペプチドの実施形態は、植物又は非ヒト動物宿主の内部又は表面に常在する１つ以上の微生物のレベル、活性、又は代謝を改変するポリペプチドを含み、その改変により、宿主の適応度増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、農業ポリペプチドは、植物ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、農業ポリペプチドは、昆虫ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、農業ポリペプチドは、非ヒト脊椎動物、無脊椎動物、微生物、又は植物細胞と接触する際、生物学的効果を有する。
【0207】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０若しくはそれ以上の農業ポリペプチド、又は１つ以上の農業ポリペプチドの多重コピーをコードする。
【0208】
農業適用に有用なポリペプチドの実施形態として、例えば、バクテリオシン、溶解素、抗菌ペプチド、根粒Ｃリッチペプチド、及び菌細胞調節ペプチドが挙げられる。ミツバチ及びカイコなどの昆虫の適応度を増加させるため、このようなポリペプチドを使用して、標的微生物のレベル、活性、又は代謝を改変することができる。農業的に有用なポリペプチドの実施形態は、ペプチド毒素、例えば、当該技術分野で公知のとおり、昆虫病原菌（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、又はゼノラブダス・ネマトフィラ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ））によって天然に生成されたものを含む。農業的に有用なポリペプチドの実施形態は、農業的に重要な害虫又は病原体を制御するための（シクロジペプチド又はジケトピペラジンなどの小ペプチドを含む）ポリペプチド、例えば、植物における疾患を制御するための抗菌ポリペプチド若しくは抗真菌ポリペプチド、又は昆虫若しくは線虫などの無脊椎動物害虫を制御するための殺虫性（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ）ポリペプチド（例えば、殺虫性（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ）ポリペプチド又は殺線虫性ポリペプチド）を含む。農業的に有用なポリペプチドの実施形態は、抗体、ナノボディ、及びその断片、例えば、インタクトな抗体又はナノボディの特定の結合活性の少なくとも一部（例えば、少なくとも１０％）を保持する抗体又はナノボディ断片を含む。農業的に有用なポリペプチドの実施形態は、転写因子、例えば植物転写因子を含み；例えば、ａｇｒｉｓ－ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ［ｄｏｔ］ｏｒｇ／ＡｔＴＦＤＢ／で公的に利用可能な、モデル植物のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）において同定された転写因子ファミリーを列記する「ＡｔＴＦＤＢ」データベース）を参照されたい。農業的に有用なポリペプチドの実施形態は、ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａなどのＣａｓヌクレアーゼ）を含む。農業的に有用なポリペプチドの実施形態は、細胞透過性ペプチド、酵素（例えば、アミラーゼ、セルラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、キチナーゼ）、ペプチドフェロモン（例えば、酵母接合フェロモン、無脊椎動物の生殖及び幼生のシグナル伝達フェロモン、例えば、Ａｌｔｓｔｅｉｎ（２００４）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２５：１３７３－７６を参照されたい）をさらに含む。
【0209】
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、１つ以上の発現配列に作動可能に連結される（例えば、各ＩＲＥＳは、１つ以上の発現配列に作動可能に連結される）。実施形態では、ＩＲＥＳは、異種プロモーターとコード配列の５’末端との間に位置する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、１つ以上の発現配列に作動可能に連結される（例えば、各ＩＲＥＳは、１つ以上の発現配列に作動可能に連結される）。実施形態では、ＩＲＥＳは、異種プロモーターとコード配列の５’末端との間に位置する。
【0210】
ポリリボヌクレオチド内に含めるのに適したＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームと会合することが可能なＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ要素は、少なくとも約５ｎｔ、少なくとも約８ｎｔ、少なくとも約９ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約２５０ｎｔ、少なくとも約３５０ｎｔ、又は少なくとも約５００ｎｔである。
【0211】
いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ要素は、限定はされないが、ウイルス、哺乳動物、及びショウジョウバエを含む生物のＤＮＡに由来する。このようなウイルスＤＮＡは、限定はされないが、ピコルナウイルス相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）とともに、脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＭＣＶ）ｃＤＮＡ及びポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）ｃＤＮＡに由来し得る。一実施形態では、ＩＲＥＳ要素の由来元であるショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＤＮＡは、限定はされないが、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のアンテナペディア遺伝子を含む。
【0212】
いくつかの実施形態では、存在する場合、ＩＲＥＳ配列は、タウラ症候群ウイルス、トリアトマウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、ソレノプシスインビクタウイルス１、ムギクビレアブラムシウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒト（ｆｕｍａｎ）ポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ腸管ウイルス、カシミール蜂ウイルス、ヒトライノウイルス２、ヒメヨコバイ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）ウイルス－１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ヒメヨコバイ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）ウイルス－１、ヒメトビＰウイルス（Ｈｉｍｅｔｏｂｉ Ｐ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス（Ｅｑｕｉｎｅ ｒｈｉｎｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、チャシャクガピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ショウジョウバエＣウイルス、アブラナ科トバモ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｔｏｂａｍｏ）ウイルス、クリケット麻痺（Ｃｒｉｃｋｅｔ ｐａｒａｌｙｓｉｓ）ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死性麻痺ウイルス（Ａｐｈｉｄ ｌｅｔｈａｌ ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性蜂麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡｌ、ヒトＡＭＬｌ／ＲＵＮＸｌ、ショウジョウバエアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ－１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ－ＩＡＰｌ、ヒトｃ－ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１α、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ－１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエリーパー（ｒｅａｐｅｒ）、イヌスカンパー（Ｓｃａｍｐｅｒ）、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＸＩＡＰ、サリウイルス（Ｓａｌｉｖｉｒｕｓ）、コサウイルス、パレコウイルス、ショウジョウバエヘアレス（ｈａｉｒｌｅｓｓ）、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＦＩＩＤ、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＡＰ１、ヒトｃ－ｓｒｃ、ヒトＦＧＦ－１、サルピコマウイルス（ｐｉｃｏｍａｖｉｒｕｓ）、カブクリンクルウイルス（Ｔｕｒｎｉｐｃｒｉｎｋｌｅｖｉｒｕｓ）、ｅＩＦ４Ｇに対するアプタマー、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）又はコクサッキーウイルスＡ（ＣＶＢ１／２）のＩＲＥＳ配列である。さらに別の実施形態では、ＩＲＥＳは、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）のＩＲＥＳ配列である。さらなる実施形態では、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ配列である。
【0213】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上）の発現配列に隣接する少なくとも１つのＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上）の発現配列の両側に隣接する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に１つ以上のＩＲＥＳ配列を含み、得られるペプチド及び／又はポリペプチドの分離をもたらす。
【0214】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドカーゴは、ＩＲＥＳを含む。例えば、ポリリボヌクレオチドカーゴは、例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ８１：１－１９，２０２１に記載されるとおり、環状ＲＮＡ ＩＲＥＳを含み得る。
【0215】
調節要素
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、１つ以上の調節要素を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば、ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、１つ以上の調節要素を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば、ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。
【0216】
調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含んでもよい。調節要素は、隣接配列に作動可能に連結されてもよい。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量又は数と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が、１つ以上の発現配列の発現を促進することができる。複数の調節要素が、当業者に周知である。
【0217】
いくつかの実施形態では、調節要素は、翻訳モジュレーターである。翻訳モジュレーターは、ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレーターは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接した少なくとも１つの翻訳モジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接した翻訳モジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、翻訳モジュレーターは、各発現配列の片側又は両側にあり、発現産物、例えばペプチド及び／又はポリペプチドの分離をもたらす。
【0218】
いくつかの実施形態では、調節要素は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ結合部位である。
【0219】
調節要素のさらなる例が、例えば、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１５４］～［０１６１］に記載されている。
【0220】
翻訳開始配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に作動可能に連結されている翻訳開始配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に作動可能に連結されている翻訳開始配列を含む。
【0221】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコードし、翻訳開始配列、例えば開始コドンを含み得る。いくつかの実施形態では、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えば、コザック配列を含む。ある実施形態では、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。ある実施形態では、翻訳開始配列、例えば、コザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。ある実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。ある実施形態では、翻訳開始配列は、ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。ある実施形態では、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。翻訳開始配列のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６３］～［０１６５］に記載されている。
【0222】
ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０を超える開始コドンなどの２つ以上の開始コドンを含んでもよい。翻訳は、第１の開始コドンで開始し得るか、又は第１の開始コドンの下流で開始し得る。
【0223】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、第１の開始コドン、例えばＡＵＧでないコドンで開始し得る。ポリリボヌクレオチドの翻訳は、代替的な翻訳開始配列、例えば限定はされないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧで開始し得る。いくつかの実施形態では、翻訳は、選択的条件、例えばストレス誘導条件下で、代替的な翻訳開始配列で開始する。非限定的な例として、ポリリボヌクレオチドの翻訳は、代替的な翻訳開始配列、例えばＡＣＧで開始し得る。別の非限定的な例として、ポリリボヌクレオチドの翻訳は、代替的な翻訳開始配列のＣＴＧ／ＣＵＧで開始し得る。別の非限定的な例として、ポリリボヌクレオチドの翻訳は、代替的な翻訳開始配列のＧＴＧ／ＧＵＧで開始し得る。別の非限定的な例として、ポリリボヌクレオチドは、リピート関連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列、例えば、反復ＲＮＡの短いストレッチ、例えば、ＣＧＧ、ＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）、ＣＡＧ、ＣＴＧを含む代替的な翻訳開始配列で翻訳を開始し得る。
【0224】
終結配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、少なくとも（ｌｅａｓｔ）１つの終結配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に作動可能に連結されている終結配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、終結配列を欠いている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、少なくとも（ｌｅａｓｔ）１つの終結配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に作動可能に連結されている終結配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、終結配列を欠いている。
【0225】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、各発現配列は、終結配列を有する場合も有しない場合もある。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、発現配列は、終結配列を欠いていることで、ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される。終結配列の除外は、ローリングサークル翻訳又は発現産物の連続的発現をもたらし得る。
【0226】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、各発現配列は、終結配列を有する場合も有しない場合もある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、発現配列は、終結配列を欠いていることで、環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される。終結配列の除外は、リボソーム停止又は脱落の欠如に起因して、ローリングサークル翻訳又は発現産物、例えばペプチド又はポリペプチドの連続的発現をもたらし得る。このような実施形態では、ローリングサークル翻訳は、各発現配列を通じて、連続的発現産物を発現する。いくつかの他の実施形態では、発現配列の終結配列は、スタガー要素の一部であり得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の発現配列は、終結配列を含む。しかし、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列のローリングサークル翻訳又は発現が実施される。このような場合、発現産物は、リボソームが終結配列、例えば停止コドンに遭遇し、翻訳を終結させる場合、リボソームから脱落し得る。いくつかの実施形態では、翻訳は、リボソーム、例えば、リボソームの少なくとも１つのサブユニットが環状ポリリボヌクレオチドとの接触状態を維持しながら終結される。
【0227】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列の末端に終結配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現配列は、後続の２つ以上の終結配列を含む。このような実施形態では、翻訳が終結され、ローリングサークル翻訳が終結される。いくつかの実施形態では、リボソームは、環状ポリリボヌクレオチドと完全に隔てられる。いくつかのこのような実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列の生成において、翻訳の開始前に環状ポリリボヌクレオチドと再会合するため、リボソームを必要とし得る。一般に、終結配列は、翻訳の終結を伝えるインフレームのヌクレオチドトリプレット、例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧを含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の終結配列は、フレームシフトされた終結配列、例えば限定はされないが、翻訳を終結し得る、オフフレーム又は－１及び＋１シフトされたリーディングフレーム（例えば、隠れた停止）である。フレームシフトされた終結配列は、発現配列の第２及び第３のリーディングフレーム内に出現する三重ヌクレオチド、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡを含む。フレームシフトされた終結配列は、細胞に対して有害であることが多い、ｍＲＮＡの誤読を防止するのに重要であり得る。いくつかの実施形態では、終結配列は、停止コドンである。
【0228】
終結配列のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６９］～［０１７０］に記載されている。
【0229】
非翻訳領域
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。ある実施形態では、イントロンは、ヒトイントロンである。
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。ある実施形態では、イントロンは、ヒトイントロンである。
【0230】
例示的な非翻訳領域が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１９７］～［２０１］に記載されている。
【0231】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含む。例示的なポリＡ配列が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２０２］～［０２０５］に記載されている。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている。
【0232】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、アデノシン及びウリジンの１つ又は複数のストレッチが内包されたＵＴＲを含む。これらのＡＵリッチのシグネチャーは、発現産物のターンオーバー速度を増加させ得る。
【0233】
ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性、又は免疫原性（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベル）を調節するのに有用であり得る。特定の環状ポリリボヌクレオチドを改変するとき、ＡＲＥの１つ又は複数コピーを環状ポリリボヌクレオチドに導入してもよく、ＡＲＥのコピーは、発現産物の翻訳及び／又は産生を調節し得る。同様に、ＡＲＥを、同定及び除去し、又は環状ポリリボヌクレオチドに改変することで、細胞内安定性を調節し、ひいては得られるタンパク質の翻訳及び産生に作用することができる。
【0234】
任意の遺伝子からの任意のＵＴＲが環状ポリリボヌクレオチドの各隣接領域に組み込まれてもよいことは理解されるべきである。
【0235】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、３’ＵＴＲを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、終結配列を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列：１つ又は複数のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ又は複数の複製タンパク質をコードする配列、外因性遺伝子をコードする配列、治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）をコードする配列、調節要素（例えば、翻訳モジュレーター、例えば、翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、内因性遺伝子を標的にする１つ又は複数の調節核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、及び治療的ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列、の１つ又は複数を含む。
【0236】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲを欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、３’ＵＴＲを欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、終結配列を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いているという事実は、環状ポリリボヌクレオチドがエキソヌクレアーゼによって分解されない、又はエキソヌクレアーゼの存在下で限られた範囲に限って分解される、例えば、エキソヌクレアーゼの不在下で同等又は類似的であることを意味し得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによって分解されない。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝露されるとき、分解が低下している。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠いている。
【0237】
スタガー要素
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接した少なくとも１つのスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接したスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、各発現配列の片側又は両側にあり、発現産物、例えばペプチド及び／又はポリペプチドの分離をもたらす。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部分である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれが、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられる。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列のうちの発現配列の一部を含む。
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接した少なくとも１つのスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接したスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、各発現配列の片側又は両側にあり、発現産物、例えばペプチド及び／又はポリペプチドの分離をもたらす。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部分である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれが、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられる。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列のうちの発現配列の一部を含む。
【0238】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含む。連続的発現産物、例えばペプチド又はポリペプチドの生成を回避しながら、ローリングサークル翻訳を維持するため、スタガー要素を含めることで、翻訳中のリボソーム停止を誘導してもよい。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ又は複数の発現配列の少なくとも１つの３’末端にある。スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル翻訳中にリボソームを停止させるように設計され得る。スタガー要素は、限定はされないが、２Ａ様、又はＣＨＹＳＥＬ（配列番号７２）（シス作用性ヒドロラーゼエレメント）配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＥＸ５ＮＰＧＰ（式中、Ｘ１は、不在又はＧ若しくはＨであり、Ｘ２は、不在又はＤ若しくはＧであり、Ｘ３は、Ｄ又はＶ又はＩ又はＳ又はＭであり、Ｘ５は、任意のアミノ酸である）（配列番号８３）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。いくつかの実施形態では、この配列は、強力なαらせん性を有するアミノ酸の非保存配列と、それに続くコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥＸＮＰＧＰ（式中、ｘ＝任意のアミノ酸である）（配列番号４）とを含む。スタガー要素のいくつかの非限定例として、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号５５）、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ（配列番号５６）、ＶＥＰＮＰＧＰ（配列番号５７）、ＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号５８）、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ（配列番号５９）、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ（配列番号１０）、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号１１）、ＧＤＶＥＮＰＧＰ（配列番号１２）、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３）、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ（配列番号１４）、ＩＥＳＮＰＧＰ（配列番号１５）、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ（配列番号１６）、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号１７）、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号１８）、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ（配列番号１９）、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ（配列番号２０）、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号２１）ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ（配列番号２２）、及びＤＳＥＦＮＰＧＰ（配列番号２３）が挙げられる。
【0239】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスタガー要素は、本明細書に記載のコンセンサス配列のＧ及びＰの間などで、発現産物を切断する。１つの非限定例として、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物を切断するための少なくとも１つのスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接したスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の後にスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に存在するスタガー要素を含むことで、各発現配列から個別のペプチド及び／又はポリペプチドの翻訳を引き起こす。
【0240】
いくつかの実施形態では、スタガー要素は、翻訳中にリボソーム停止を誘導する、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含む。非天然ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含んでもよい。これらなどの例は、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと、分子の骨格に対する変化によって区別される。修飾は、翻訳中にリボソーム停止を誘導し得る、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合（例えば、連結リン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格）に対する任意の修飾、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。本明細書に提供される例示的な修飾のいくつかは、本明細書中の他の箇所に記載されている。
【0241】
いくつかの実施形態では、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中に他の形態で存在する。例えば、いくつかの例示的な環状ポリリボヌクレオチドでは、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の終結配列、及び第１の発現配列に連続する発現の第１の翻訳開始配列から終結配列を分離するヌクレオチドスペーサー配列を含む。いくつかの例において、第１の発現配列の第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に連続する発現の第１の翻訳開始配列の上流（それに対する５’側）に存在する。いくつかの場合、第１の発現配列及び第１の発現配列に連続する発現配列は、環状ポリリボヌクレオチド中の２つの別々の発現配列である。第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及びその連続する発現配列の連続的翻訳を可能にし得る。
【0242】
いくつかの実施形態では、第１のスタガー要素は、終結配列を含み、第１の発現配列の発現産物をその連続する発現配列の発現産物から分離し、それにより分離した発現産物を作出する。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチド中の連続する配列の第１の翻訳開始配列の上流に第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される一方で、第２の発現配列に連続する発現配列の第２の翻訳開始配列の上流に存在する第２の発現配列のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳されない。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチド中に発現配列が１つだけ存在し、第１の発現配列及びその連続する発現配列は、同じ発現配列である。いくつかの例示的な環状ポリリボヌクレオチドでは、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の終結配列、及び下流の翻訳開始配列から終結配列を分離するヌクレオチドスペーサー配列を含む。いくつかのそのような例では、第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（に対する５’側）に存在する。いくつかの場合、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び任意の連続する発現配列の連続的翻訳を可能にする。
【0243】
いくつかの実施形態では、第１のスタガー要素は、第１の発現配列の１回の発現産物を第１の発現配列の次回の発現産物から分離し、それにより分離した発現産物を作出する。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流に第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される一方で、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳されない。いくつかの場合、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始配列との間の距離は、対応する環状ポリリボヌクレオチドにおいて、環状ポリリボヌクレオチドにおける第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍大きい。いくつかの場合、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始配列との間の距離は、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離よりも、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上大きい。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含む。
【0244】
スタガー要素の例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１７２］～［０１７５］に記載されている。
【0245】
非コード配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、１つ以上の非コード配列、例えば、ポリペプチドの発現をコードしない配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０若しくは１０より大きい非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチド発現配列をコードしない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドカーゴ）は、１つ以上の非コード配列、例えば、ポリペプチドの発現をコードしない配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０若しくは１０より大きい非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチド発現配列をコードしない。
【0246】
非コード配列は、天然又は合成配列であり得る。いくつかの実施形態では、非コード配列は、細胞挙動、例えば、リンパ球挙動などを改変し得る。いくつかの実施形態では、非コード配列は、細胞ＲＮＡ配列に対してアンチセンスである。
【0247】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、典型的に、（特定のＲＮＡ構造（例えば、５～３０ｂｐのｍｉＲＮＡ、２００～５００ｂｐのｌｎｃＲＮＡ）に応じて約５～５００塩基対（ｂｐ）のＲＮＡ又はＲＮＡ様構造である調節核酸を含み、細胞内の発現された標的遺伝子におけるコード配列と同一（相補的）又はほぼ同一（実質的に相補的）である核酸塩基配列を有し得る。実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、より小さいｍｉＲＮＡ中間体又は成熟ｍｉＲＮＡにプロセシング可能である、約５０～約１０００ｂｐであり得る、より小さいＲＮＡにプロセシング可能であるＲＮＡ前駆体、例えばｍｉＲＮＡ前駆体をコードする調節核酸を含む。
【0248】
長い非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）は、１００ヌクレオチドより長い非タンパク質コード転写物と定義される。多くのＩｎｃＲＮＡは、組織特異性として特徴づけられる。近傍のタンパク質コード遺伝子に対して逆方向に転写される多様なＩｎｃＲＮＡは、有意な割合（例えば、哺乳動物ゲノムにおける全ＩｎｃＲＮＡの約２０％）を含み、おそらくは近傍遺伝子の転写を調節する。一実施形態では、本明細書に提供されるポリリボヌクレオチドは、ＩｎｃＲＮＡのセンス鎖を含む。一実施形態では、本明細書に提供されるポリリボヌクレオチドは、ＩｎｃＲＮＡのアンチセンス鎖を含む。
【0249】
実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、内因性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の全て又は少なくとも１つの断片に対して、実質的に相補的である、又は完全に相補的である調節核酸をコードする。実施形態では、調節核酸は、転写における特定遺伝子の新規に生成された核ＲＮＡ転写物のｍＲＮＡへの成熟を防止するため、イントロンとエクソンとの間の境界での、エクソン間における、又はエクソンに隣接した配列を補完する。特定遺伝子に対して相補的である調節核酸は、その遺伝子に対するｍＲＮＡとハイブリダイズし、その翻訳を阻止し得る。アンチセンス調節核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその誘導体若しくはハイブリッドであり得る。いくつかの実施形態では、調節核酸は、内因性遺伝子又は外因性遺伝子の発現の調節に関与するタンパク質に結合し得るタンパク質結合部位を含む。
【0250】
実施形態では、ポリリボヌクレオチドの長さは、目的の転写産物にハイブリダイズする調節性核酸をコードし、ここで調節性ＲＮＡは、約５～３０ヌクレオチド、約１０～３０ヌクレオチド、又は約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド若しくは３０を超えるヌクレオチドの長さを有する。実施形態では、調節性ＲＮＡの標的化転写産物との配列同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％である。
【0251】
実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、標的遺伝子の約５～約２５の隣接ヌクレオチドと同一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子をコードする、又はそのｍｉＲＮＡの前駆体をコードする。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡが特定の標的ｍＲＮＡを認識し、それに結合することを可能にする配列を有する。実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡから開始し、約３０～７０％（約３０～６０％、約４０～６０％、又は約４５％～５５％）のＧＣ含量を含み、対象（例えば、哺乳動物）のゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列であって、例えば標準ＢＬＡＳＴ検索による決定として導入されるべきであるヌクレオチド配列とは高いパーセンテージの同一性を有しない。
【0252】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ前駆体）、例えば、２、３、４、５、６、又はそれ以上のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ前駆体を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、標的配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％又は１００％のヌクレオチド配列相補性を有する、ｍｉＲＮＡ（又はその前駆体）をコードする配列を含む。
【0253】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子のプロセシング経路における中間体に類似する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能することができ、その逆も言える。マイクロＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのようにＲＩＳＣを使用して、標的遺伝子を下方制御するが、ｓｉＲＮＡと異なり、大部分の動物のｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを切断しない。代わりに、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制又はポリＡ除去及びｍＲＮＡ分解を通じて、タンパク質出力を低減する。公知のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの内部に存在し；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端からのヌクレオチド２～８とほぼ完全な相補性を有する部位を標的にするように思われる。この領域は、シード領域として知られる。成熟ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡが互換可能であることから、外因性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと相補的なシードを有するｍＲＮＡを下方制御する。
【0254】
公知のｍｉＲＮＡ配列のリストは、特に、ウェルカム・トラスト・サンガー研究所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ），Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、メモリアル・スローン・ケタリングがんセンター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、及び欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）などの研究組織によって維持されたデータベース内に見出すことができる。公知の有効なｓｉＲＮＡ配列及び同族結合部位についても、関連文献において十分に表されている。ＲＮＡｉ分子は、当該技術分野で公知の技術によって容易に設計及び生成される。加えて、有効な特定の配列モチーフを見出す機会を増加させる計算ツールが存在する。
【0255】
タンパク質結合配列
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームがＲＮＡ配列内の内部部位に結合することを可能にする、１つ又は複数のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に設計することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドを宿主の免疫系の成分からマスクすることによって、宿主の免疫系による検知を逃避し得るか又は低下させているか、分解を調節しているか、又は翻訳を調節している。
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームがＲＮＡ配列内の内部部位に結合することを可能にする、１つ又は複数のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に設計することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドを宿主の免疫系の成分からマスクすることによって、宿主の免疫系による検知を逃避し得るか又は低下させているか、分解を調節しているか、又は翻訳を調節している。
【0256】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含むことで、例えば、免疫応答、例えば、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）応答を逃避する。いくつかの実施形態では、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、外因性としての環状ポリリボヌクレオチドのマスキングを補助するヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、外因性又は外来性としての環状ポリリボヌクレオチドの隠蔽を補助するヌクレオチド配列である。
【0257】
線状ＲＮＡへのリボソーム会合の伝統的機構は、ＲＮＡのキャップされた５’末端へのリボソーム結合を含む。リボソームは、５’末端から開始コドンに移動するとすぐに、第１のペプチド結合が形成される。本開示によると、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳の内部開始（即ち、キャップ非依存性）は、遊離末端又はキャップ末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより、リボソームは、ポリペプチド伸長を開始コドンで開始させる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば、開始コドンを含む、１つ又は複数のＲＮＡ配列を含む。
【0258】
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始における役割を果たす特徴を有する。それは、リボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始させるプロセスに関与することが一般に知られるコザック配列のようなシグネチャーを内包する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２４）（ここでＲは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）である）を有し、それにもう一つの「Ｇ」が後続する。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
【0259】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合するタンパク質結合配列をコードする。いくつかの実施形態では、タンパク質結合配列は、環状ポリリボヌクレオチドを特異的標的に標的化し、又は局在化する。いくつかの実施形態では、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。
【0260】
いくつかの実施形態では、タンパク質結合部位として、限定はされないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１、及びＲＮＡに結合する任意の他のタンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
【0261】
スペーサー配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、１つ以上のスペーサー配列を含む。スペーサーは、２つの隣接するポリヌクレオチド領域間で距離又は柔軟性を提供する、（例えば、１つ以上のヌクレオチドの）任意の隣接するヌクレオチド配列を指す。スペーサーは、本明細書に記載の核酸因子のいずれかの間に存在してもよい。スペーサーはまた、本明細書に記載の核酸因子の内部に存在してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、１つ以上のスペーサー配列を含む。スペーサーは、２つの隣接するポリヌクレオチド領域間で距離又は柔軟性を提供する、（例えば、１つ以上のヌクレオチドの）任意の隣接するヌクレオチド配列を指す。スペーサーは、本明細書に記載の核酸因子のいずれかの間に存在してもよい。スペーサーはまた、本明細書に記載の核酸因子の内部に存在してもよい。
【0262】
スペーサーは、例えば、少なくとも５（例えば、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０）リボヌクレオチドの長さであってもよい。いくつかの実施形態では、各スペーサー領域は、少なくとも５（例えば、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０）リボヌクレオチドの長さである。各スペーサー領域は、例えば、５～５００（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００）リボヌクレオチドの長さであってもよい。第１のスペーサー領域、第２のスペーサー領域、又は第１のスペーサー領域及び第２のスペーサー領域は、ポリＡ配列を含んでもよい。第１のスペーサー領域、第２のスペーサー領域、又は第１のスペーサー領域及び第２のスペーサー領域は、ポリＡ－Ｃ配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第１のスペーサー領域、第２のスペーサー領域、又は第１のスペーサー領域及び第２のスペーサー領域は、ポリＡ－Ｇ配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のスペーサー領域、第２のスペーサー領域、又は第１のスペーサー領域及び第２のスペーサー領域は、ポリＡ－Ｔ配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のスペーサー領域、第２のスペーサー領域、又は第１のスペーサー領域及び第２のスペーサー領域は、ランダム配列を含む。
【0263】
スペーサーはまた、本明細書に記載の核酸領域内に存在してもよい。例えば、ポリヌクレオチドカーゴ領域は、１つ又は複数のスペーサーを含んでもよい。スペーサーは、ポリヌクレオチドカーゴ内の領域を分離し得る。
【0264】
いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、例えば、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、又は少なくとも３０ヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５又は３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５又は３０ヌクレオチドの長さ以下である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０～５０ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、スペーサー配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチドの長さである。
【0265】
スペーサー配列は、ポリＡ配列、ポリＡ－Ｃ配列、ポリＣ配列、又はポリＵ配列であり得る。
【0266】
いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、ポリＡ－Ｔ、ポリＡ－Ｃ、ポリＡ－Ｇ、又はランダム配列であり得る。
【0267】
スペーサー配列を使用して、ＩＲＥＳを隣接する構成要素から分離することで、ＩＲＥＳ又は隣接要素の構造と機能を維持（ｍａｒｔｉｎｉ）することができる。スペーサーは、ＩＲＥＳに応じて特異的に改変することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡＦｏｌｄなどのＲＮＡフォールディングのコンピュータソフトウェアを利用して、スペーサーを含むベクターの様々な要素の設計を導くことができる。
【0268】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、（例えば、５’アニーリング領域とポリリボヌクレオチドカーゴとの間に）５’スペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、５’スペーサー配列は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さである。さらなる実施形態では、５’スペーサー配列は、少なくとも３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５又は３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５又は３０ヌクレオチドの長さ以下である。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、２０～５０ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、５’スペーサー配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡ配列である。別の実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡ－Ｃ配列である。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡ－Ｇ配列を含む。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡ－Ｔ配列を含む。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、ランダム配列を含む。
【0269】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、（例えば、３’アニーリング領域とポリリボヌクレオチドカーゴとの間に）３’スペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、３’スペーサー配列は、少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、３’スペーサー配列は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さである。さらなる実施形態では、３’スペーサー配列は、少なくとも３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’スペーサー配列は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５又は３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’スペーサー配列は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５又は３０ヌクレオチドの長さ以下である。いくつかの実施形態では、３’スペーサー配列は、２０～５０ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、３’スペーサー配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、３’スペーサー配列は、ポリＡ配列である。別の実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡ－Ｃ配列である。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡ－Ｇ配列を含む。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、ポリＡ－Ｔ配列を含む。いくつかの実施形態では、５’スペーサー配列は、ランダム配列を含む。
【0270】
一実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、５’スペーサー配列を含むが、３’スペーサー配列を含まない。別の実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、３’スペーサー配列を含むが、５’スペーサー配列を含まない。別の実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、５’スペーサー配列も３’スペーサー配列も含まない。別の実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳ配列を含まない。さらなる実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳ配列、５’スペーサー配列又は３’スペーサー配列を含まない。
【0271】
いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、少なくとも３リボヌクレオチド、少なくとも４リボヌクレオチド、少なくとも５リボヌクレオチド、少なくとも約８リボヌクレオチド、少なくとも約１０リボヌクレオチド、少なくとも約１２リボヌクレオチド、少なくとも約１５リボヌクレオチド、少なくとも約２０リボヌクレオチド、少なくとも約２５リボヌクレオチド、少なくとも約３０リボヌクレオチド、少なくとも約４０リボヌクレオチド、少なくとも約５０リボヌクレオチド、少なくとも約６０リボヌクレオチド、少なくとも約７０リボヌクレオチド、少なくとも約８０リボヌクレオチド、少なくとも約９０リボヌクレオチド、少なくとも約１００リボヌクレオチド、少なくとも約１２０リボヌクレオチド、少なくとも約１５０リボヌクレオチド、少なくとも約２００リボヌクレオチド、少なくとも約２５０リボヌクレオチド、少なくとも約３００リボヌクレオチド、少なくとも約４００リボヌクレオチド、少なくとも約５００リボヌクレオチド、少なくとも約６００リボヌクレオチド、少なくとも約７００リボヌクレオチド、少なくとも約８００リボヌクレオチド、少なくとも約９００リボヌクレオチド、又は少なくとも約１００リボヌクレオチドを含む。
【0272】
バイオリアクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）を精製する任意の方法は、バイオリアクター内で実施してもよい。バイオリアクターは、生物又はそのような生物に由来する生化学的活性物質を含む化学的又は生物学的プロセスが実施される、任意の容器を指す。バイオリアクターは、本明細書に記載の環状ＲＮＡを生成又は精製するための無細胞法に適合し得る。バイオリアクター用の容器は、単回使用（ディスポーザブル）、オートクレーブ可能、又は滅菌可能であり得る、培養フラスコ、ディッシュ、又はバッグを含んでもよい。バイオリアクターは、ガラス製であってもよい、又はポリマーベースであってもよい、又は他の材料で製造されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）を精製する任意の方法は、バイオリアクター内で実施してもよい。バイオリアクターは、生物又はそのような生物に由来する生化学的活性物質を含む化学的又は生物学的プロセスが実施される、任意の容器を指す。バイオリアクターは、本明細書に記載の環状ＲＮＡを生成又は精製するための無細胞法に適合し得る。バイオリアクター用の容器は、単回使用（ディスポーザブル）、オートクレーブ可能、又は滅菌可能であり得る、培養フラスコ、ディッシュ、又はバッグを含んでもよい。バイオリアクターは、ガラス製であってもよい、又はポリマーベースであってもよい、又は他の材料で製造されてもよい。
【0273】
バイオリアクターの例として、限定はされないが、撹拌タンク（例えば、十分に混合された）バイオリアクター及び平板（例えば、プラグフロー）バイオリアクター、空輸バイオリアクター、膜撹拌タンク（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｉｒｒｅｄ ｔａｎｋ）、スピンフィルター撹拌タンク、振動ミキサー、流動層リアクター、及び膜バイオリアクターが挙げられる。バイオリアクターを運転するモードは、バッチ又は連続プロセスであってもよい。バイオリアクターは、試薬及び製品の流れが継続的に供与され、システムから取り除かれる場合、連続的である。バッチバイオリアクターは、連続再循環フローを有し得るが、試薬又は製品回収の連続供与を有し得ない。
【0274】
本開示のいくつかの方法は、ポリリボヌクレオチドの大規模生成を対象とする。大規模生成方法の場合、方法は、１リットル（Ｌ）～５０Ｌ、又はそれ以上（例えば、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、５０Ｌ、又はそれ以上）の体積で実施することができる。いくつかの実施形態では、方法は、５Ｌ～１０Ｌ、５Ｌ～１５Ｌ、５Ｌ～２０Ｌ、５Ｌ～２５Ｌ、５Ｌ～３０Ｌ、５Ｌ～３５Ｌ、５Ｌ～４０Ｌ、５Ｌ～４５Ｌ、１０Ｌ～１５Ｌ、１０Ｌ～２０Ｌ、１０Ｌ～２５Ｌ、２０Ｌ～３０Ｌ、１０Ｌ～３５Ｌ、１０Ｌ～４０Ｌ、１０Ｌ～４５Ｌ、１０Ｌ～５０Ｌ、１５Ｌ～２０Ｌ、１５Ｌ～２５Ｌ、１５Ｌ～３０Ｌ、１５Ｌ～３５Ｌ、１５Ｌ～４０Ｌ、１５Ｌ～４５Ｌ、又は１５～５０Ｌの体積で実施することができる。
【0275】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１ｇのＲＮＡを生成し得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、１～２００ｇのＲＮＡ（例えば、１～１０ｇ、１～２０ｇ、１～５０ｇ、１０～５０ｇ、１０～１００ｇ、５０～１００ｇ、５０～２００ｇのＲＮＡ）を生成し得る。いくつかの実施形態では、生成される量は、１リットル当たりで測定され（例えば、１リットル当たり１～２００ｇ）、バッチ又は反応当たりで測定され（例えば、バッチ又は反応当たり１～２００ｇ）、又は単位時間当たりで測定される（例えば、１時間又は１日当たり１～２００ｇ）。
【0276】
いくつかの実施形態では、生成能力を増強するため、２つ以上のバイオリアクターを連続的に利用することができる（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つのバイオリアクターを連続的に使用することができる）。
【0277】
使用方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のとおりに作製されたポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、治療又は農業におけるエフェクターとして使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のとおりに作製されたポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、治療又は農業におけるエフェクターとして使用される。
【0278】
例えば、本明細書に記載の方法によって精製されたポリリボヌクレオチドは、（例えば、医薬、動物、又は農業組成物で）対象に投与してもよい。いくつかの実施形態では、対象は、脊椎動物（例えば、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、又は両生類）である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト哺乳動物である。実施形態では、対象は、非ヒト霊長類（例えば、サル、類人猿）、有蹄動物（例えば、ウシ、水牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ、ラマ、アルパカ、シカ、ウマ、ロバ）、肉食動物（例えば、イヌ、ネコ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、又はウサギ類（例えば、ウサギ）などの非ヒト哺乳動物である。実施形態では、対象は、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ）、ガンカモ目（Ａｎｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、アヒル、ガチョウ）、古顎類（Ｐａｌｅａｏｇｎａｔｈａｅ）（例えば、ダチョウ、エミュー）、ハト目（Ｃｏｌｕｍｂｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ハト（ｐｉｇｅｏｎｓ）、ハト（ｄｏｖｅｓ））、又はオウム目（Ｐｓｉｔｔａｃｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、オウム）といった鳥類分類群のメンバーなどの鳥類である。実施形態では、対象は、節足動物（例えば、昆虫、クモ類、甲殻類）、線虫、環形動物、蠕虫、又は軟体類などの無脊椎動物である。実施形態では、対象は、無脊椎動物の農業害虫又は無脊椎動物若しくは脊椎動物宿主に対する寄生虫である無脊椎動物である。実施形態では、対象は、被子植物（双子葉又は単子葉であり得る）又は裸子植物（例えば、針葉樹、ソテツ、マオウ門（Ｇｎｅｔｏｐｈｙｔｅ）、イチョウ）、シダ、ツクシ、ヒカゲノカズラ、又はコケ植物などの植物である。実施形態では、対象は、真核藻類（単細胞又は多細胞）である。実施形態では、対象は、作条作物、果実生成植物及び樹木、野菜、樹木、及び観賞植物、例えば、観賞花、低木、樹木、グランドカバー、及び芝生などの農業又は園芸上重要な植物である。
【0279】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組成物又は調製物を対象に提供することによる、対象を変更する方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物又は調製物は、核酸分子（例えば、本明細書に記載のＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子）であるか又はそれを含み、ポリヌクレオチドは、真核生物対象に提供される。いくつかの実施形態では、組成物又は調製物は、本明細書に記載の核酸を含む真核又は原核細胞であるか又はそれを含む。
【0280】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組成物又は調製物を対象に提供することによる、それを必要とする対象における症状を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物又は調製物は、核酸分子（例えば、本明細書に記載のＤＮＡ分子又はポリリボヌクレオチド）であるか又はそれを含み、ポリヌクレオチドは、真核生物対象に提供される。いくつかの実施形態では、組成物又は調製物は、本明細書に記載の核酸を含む真核又は原核細胞であるか又はそれを含む。
【0281】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む真核生物又は原核細胞を対象に提供することによる、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）を対象に提供する方法を提供する。
【0282】
調製物
本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、組成物、例えば、細胞、植物、無脊椎動物、非ヒト脊椎動物、又はヒト対象への送達のための組成物、例えば、農業、動物、又は医薬組成物で製剤化することができる。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、医薬組成物で製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリリボヌクレオチド及び希釈剤、担体、アジュバント、又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド及び担体又は担体を全く含まない希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドと担体を全く含まない希釈剤とを含む組成物は、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の対象へのネイキッド送達に使用される。
本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、組成物、例えば、細胞、植物、無脊椎動物、非ヒト脊椎動物、又はヒト対象への送達のための組成物、例えば、農業、動物、又は医薬組成物で製剤化することができる。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、医薬組成物で製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリリボヌクレオチド及び希釈剤、担体、アジュバント、又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド及び担体又は担体を全く含まない希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドと担体を全く含まない希釈剤とを含む組成物は、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の対象へのネイキッド送達に使用される。
【0283】
医薬組成物は、任意選択的に、１つ以上の追加的な活性物質、例えば、治療及び／又は予防活性物質を含んでもよい。医薬組成物は、任意選択的に、本明細書に記載の組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、例えば、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって承認され、不活性成分データベース内に列記されている不活性成分のいずれか１つを含む組成物）の媒体又は培地として役立つ不活性物質を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、無菌及び／又はパイロジェンフリーであってもよい。医薬品の製剤化及び／又は製造における一般的考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ & Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書中に援用される）において見出すことができる。不活性物質の非限定例として、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散体、懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、平滑剤、油、及びこれらの混合物が挙げられる。
【0284】
本明細書に提供される医薬組成物の説明は、主にヒトへの投与に適する医薬組成物を対象とするが、このような組成物が任意の他の動物、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳類への投与に適することは当業者によって理解されるであろう。ヒトへの投与に適する医薬組成物の、組成物を様々な動物への投与にとって好適なものにする修飾は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、単に通常の（可能であれば）実験を行うことで、そのような修飾を設計及び／又は実施することができる。医薬組成物の投与が企図される対象として、限定はされないが、ヒト及び／若しくは他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／若しくはラットなどの商業的に重要な哺乳類を含む哺乳類；並びに／又は家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／若しくはシチメンチョウなどの商業的に重要な鳥類を含む鳥類が挙げられる。
【0285】
本明細書に記載の医薬組成物の調製物は、薬理学の分野における公知の又は以降に開発されている任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような予備的方法は、活性成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の付属成分と会合状態にし、そして次に、必要である場合及び／又は望ましい場合、製品を分割、形成及び／又はパッケージングするステップを含む。
【0286】
いくつかの実施形態では、調製物中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、線状ポリリボヌクレオチド分子の１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００ｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍｌ、又は２ｍｇ／ｍｌ以下の存在である。
【0287】
いくつかの実施形態では、調製物中に存在する環状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）、９９．１％（ｗ／ｗ）、９９．２％（ｗ／ｗ）、９９．３％（ｗ／ｗ）、９９．４％（ｗ／ｗ）、９９．５％（ｗ／ｗ）、９９．６％（ｗ／ｗ）、９９．７％（ｗ／ｗ）、９９．８％（ｗ／ｗ）、９９．９％（ｗ／ｗ）、又は１００％（ｗ／ｗ）の分子である。
【0288】
いくつかの実施形態では、調製物中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子である。
【0289】
いくつかの実施形態では、調製物中に存在するニックポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、又は１５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子である。
【0290】
いくつかの実施形態では、調製物中に存在するニック及び線状ポリリボヌクレオチド分子の組み合わせの量についての参照基準は、医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下のニック及び線状ポリリボヌクレオチド分子の組み合わせである。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、最終の環状ポリリボヌクレオチド製剤の中間医薬調製物である。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、原体又は活性医薬成分（ＡＰＩ）である。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、対象への投与のための製剤である。
【0291】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの調製物は、（線状ＲＮＡの減少の前、間又は後に）さらに処理され、ＤＮＡ、タンパク質汚染物質、不純物、又は副産物（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質又はプロセス不純物タンパク質）、内毒素、モノヌクレオチド分子、及び／又はプロセス関連不純物が実質的に除去される。
【0292】
塩
いくつかの場合、本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、１つ又は複数の塩を含む。浸透圧を制御するため、ナトリウム塩などの生理学的塩が、本明細書に提供される組成物に含まれ得る。他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、及び／又は塩化マグネシウムなどを含み得る。いくつかの場合、組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容できる塩と共に製剤化される。１つ又は複数の薬学的に許容できる塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムイオンなどの無機イオンのものを含み得る。そのような塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マンデル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、又はマレイン酸などの無機酸又は有機酸の塩を含み得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。
いくつかの場合、本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、１つ又は複数の塩を含む。浸透圧を制御するため、ナトリウム塩などの生理学的塩が、本明細書に提供される組成物に含まれ得る。他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、及び／又は塩化マグネシウムなどを含み得る。いくつかの場合、組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容できる塩と共に製剤化される。１つ又は複数の薬学的に許容できる塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムイオンなどの無機イオンのものを含み得る。そのような塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マンデル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、又はマレイン酸などの無機酸又は有機酸の塩を含み得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。
【0293】
緩衝剤／ｐＨ
本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、トリス緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（例えば、水酸化アルミニウムアジュバントを有する）；又はクエン酸緩衝剤などの１つ又は複数の緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、いくつかの場合、５～２０ｍＭの範囲内に含まれる。
本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、トリス緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（例えば、水酸化アルミニウムアジュバントを有する）；又はクエン酸緩衝剤などの１つ又は複数の緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、いくつかの場合、５～２０ｍＭの範囲内に含まれる。
【0294】
本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、約５．０～約８．５の間、約６．０～約８．０の間、約６．５～約７．５の間、又は約７．０～約７．８の間のｐＨを有し得る。組成物又は医薬組成物は、約７のｐＨを有し得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。
【0295】
洗浄剤／界面活性剤
本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、意図される投与経路に応じて、１種又は複数種の洗浄剤及び／又は界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般に「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）」と呼ばれる）、例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）という商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；エトキシ（オキシ－ｌ，２－エタンジイル）基の繰り返し数が異なり得るオクトキシノール、例えば、オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、又はｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール及びオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）界面活性剤として知られる）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）３０）；並びにソルビタンエステル（一般に、「ＳＰＡＮ（登録商標）」として知られる）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標） ８５）及びソルビタンモノラウレート、オクトキシノール（オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００）又はｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、又はデオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。１種又は複数種の洗浄剤及び／又は界面活性剤は、微量でのみ含まれ得る。いくつかの例では、組成物は、オクトキシノール－１０及びポリソルベート８０のそれぞれを１ｍｇ／ｍｌ未満含むことができる。本明細書では、非イオン性界面活性剤を使用することができる。界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。いくつかの例では、界面活性剤は、少なくとも１０、少なくとも１５、及び／又は少なくとも１６のＨＬＢを有する。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状の形態で含まれ得る。
本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、意図される投与経路に応じて、１種又は複数種の洗浄剤及び／又は界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般に「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）」と呼ばれる）、例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）という商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；エトキシ（オキシ－ｌ，２－エタンジイル）基の繰り返し数が異なり得るオクトキシノール、例えば、オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、又はｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール及びオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）界面活性剤として知られる）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）３０）；並びにソルビタンエステル（一般に、「ＳＰＡＮ（登録商標）」として知られる）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標） ８５）及びソルビタンモノラウレート、オクトキシノール（オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００）又はｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、又はデオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。１種又は複数種の洗浄剤及び／又は界面活性剤は、微量でのみ含まれ得る。いくつかの例では、組成物は、オクトキシノール－１０及びポリソルベート８０のそれぞれを１ｍｇ／ｍｌ未満含むことができる。本明細書では、非イオン性界面活性剤を使用することができる。界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。いくつかの例では、界面活性剤は、少なくとも１０、少なくとも１５、及び／又は少なくとも１６のＨＬＢを有する。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状の形態で含まれ得る。
【0296】
希釈剤
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、線状ポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、線状ポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む。
【0297】
希釈剤は、非担体賦形剤であり得る。非担体賦形剤は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドなどの、組成物のためのビヒクル又は媒体として働く。非担体賦形剤は、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドなどの、組成物のためのビヒクル又は媒体として働く。非担体賦形剤の非限定的な例としては、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散体、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、滑沢剤、油、及びそれらの混合物が挙げられる。非担体賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって承認され、細胞透過効果を示さないＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄａｔａｂａｓｅに列挙された非有効成分のいずれかであり得る。非担体賦形剤は、例えば、獣医学的使用に好適な非ヒト動物への投与に好適な任意の不活性成分であり得る。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な組成物の変更は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとしても通常の実験のみでこのような変更を設計及び／又は行うことができる。
【0298】
ある実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、希釈剤を含むものなどのネイキッド送達製剤として送達され得る。ネイキッド送達製剤は、担体を用いずに、修飾又はポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入、キャップされたポリリボヌクレオチド、又はその複合体なしで、ポリリボヌクレオチドを細胞に送達する。
【0299】
ネイキッド送達製剤は、担体を含まない製剤であり、ここで、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さず、又はポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入なしである。ある実施形態では、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さないポリリボヌクレオチドは、タンパク質、小分子、粒子、ポリマー、又はバイオポリマーに共有結合されないポリリボヌクレオチドである。細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さないポリリボヌクレオチドは、修飾リン酸基を含まない。例えば、細胞への送達を助ける部分に結合する共共有結合修飾を有さないポリリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、アルキル又はアリールホスホネート、又はホスホトリエステルを含まない。
【0300】
ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、トランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体のうちのいずれか又は全てを含まない。ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリン、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－β－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンを含まない。
【0301】
ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、非担体賦形剤を含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、細胞透過効果を示さない不活性成分を含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、緩衝液、例えばＰＢＳを含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、溶媒、非水性溶媒、希釈剤、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、滑沢剤、又は油である。
【0302】
ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、希釈剤を含む。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。ある実施形態では、希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、又は等張剤である。ＲＮＡ可溶化剤の例としては、水、エタノール、メタノール、アセトン、ホルムアミド、及び２－プロパノールが挙げられる。緩衝液の例としては、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス－トリス、２－［（２－アミノ－２－オキソエチル）－（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス、トリシン、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ビシン、又はホスフェートが挙げられる。等張剤の例としては、グリセリン、マンニトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、又はスクロースが挙げられる。
【0303】
担体
ある実施形態では、本開示の組成物は、環状ポリリボヌクレオチド及び担体を含む。ある実施形態では、本開示の組成物は、線状ポリリボヌクレオチド及び担体を含む。
ある実施形態では、本開示の組成物は、環状ポリリボヌクレオチド及び担体を含む。ある実施形態では、本開示の組成物は、線状ポリリボヌクレオチド及び担体を含む。
【0304】
特定の実施形態において、組成物は、小胞又は他の膜ベースの担体中に本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、組成物は、小胞又は他の膜ベースの担体中に本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドを含む。
【0305】
他の実施形態において、組成物は、細胞、小胞若しくは他の膜ベースの担体中に又はそれらを介して環状ポリリボヌクレオチドを含む。他の実施形態において、組成物は、細胞、小胞若しくは他の膜ベースの担体中に又はそれらを介して線状ポリリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、組成物は、リポソーム又は他の同様の小胞中に環状ポリリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、組成物は、リポソーム又は他の同様の小胞中に線状ポリリボヌクレオチドを含む。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層又は多重膜脂質二重層及び比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層から構成される球形の小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。リポソームは、生体適合性であり、非毒性であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてそのロードを輸送する（例えば、概説については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
【0306】
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から作製され得るが；リン脂質が、薬物担体としてリポソームを生成するために、最も一般的に使用される。多重膜小胞脂質の調製のための方法が、当該技術分野において公知である（例えば、多重膜小胞脂質調製に関連するその教示内容が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照されたい）。脂質膜が水溶液と混合されるとき、小胞形成が自然に起こり得るが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押し出し装置を用いることによって、振とうの形態の力を加えることによって促進され得る（例えば、概説については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。押し出された脂質は、押し出された脂質の調製に関するその教示内容が参照により本明細書に援用される、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：６４７－５２，１９９７に記載されるように、減少したサイズのフィルタに通して押し出すことによって調製され得る。
【0307】
特定の実施形態において、本開示の組成物は、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド及び脂質ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子を含む。特定の実施形態において、本開示の組成物は、線状ポリリボヌクレオチド及び脂質ナノ粒子を含む。脂質ナノ粒子は、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド分子のための生体適合性及び生分解性送達システムを提供する担体の別の例である。脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド分子のための生体適合性及び生分解性送達システムを提供する担体の別の例である。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特性を保持し、薬物安定性及び負荷容量を改善し、薬物漏出を防止する、修飾された固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬物送達の重要な構成要素である。これらのナノ粒子は、薬物送達を、特定の標的に有効に指向し、薬物安定性及び制御薬物放出を改善し得る。リポソーム及びポリマーを組み合わせる新しいタイプの担体である脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）も、用いられ得る。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの補完的な利点を有する。ＰＬＮは、コア－シェル構造から構成され；ポリマーコアは、安定した構造を提供し、リン脂質シェルは、良好な生体適合性を提供する。したがって、２つの構成要素が、薬物封入効率を増加させ、表面修飾を促進し、水溶性薬物の漏出を防止する。概説については、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。
【0308】
担体のさらなる非限定的な例としては、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲン型材料）、タンパク質担体（例えば、ポリリボヌクレオチドに共有結合されたタンパク質又は線状ポリリボヌクレオチドに共有結合されたタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー又はトランスフェクション試薬）が挙げられる。炭水化物担体の非限定的な例としては、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、及び無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリンが挙げられる。カチオン性担体の非限定的な例としては、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－ｂ－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ｌ－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ＼Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣ１）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（ｌ，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、及びＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）が挙げられる。タンパク質担体の非限定的な例としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンが挙げられる。
【0309】
エキソソームはまた、本明細書に記載される組成物又は調製物の薬物送達ビヒクルとして使用され得る。エキソソームはまた、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド組成物又は調製物の薬物送達ビヒクルとして使用され得る。レビューのためには、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ２８７－９６，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。
【0310】
エクスビボ分化赤血球はまた、本明細書に記載される組成物又は調製物の担体として使用され得る。エクスビボ分化赤血球はまた、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド組成物又は調製物の担体として使用され得る。例えば、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレット；国際公開第２０１７／１２３６４６号パンフレット；国際公開第２０１７／１２３６４４号パンフレット；国際公開第２０１８／１０２７４０号パンフレット；国際公開第２０１６／１８３４８２号パンフレット；国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレット；国際公開第２０１８／１５１８２９号パンフレット；国際公開第２０１８／００９８３８号パンフレット；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６；米国特許第９，６４４，１８０号明細書；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：４２３；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６を参照されたい。
【0311】
例えば、国際公開第２０１８／２０８７２８号パンフレットに記載されるようなフソソーム組成物も、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド分子を送達するための担体として使用され得る。例えば、国際公開第２０１８／２０８７２８号パンフレットに記載されるようなフソソーム組成物も、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド分子を送達するための担体として使用され得る。
【0312】
ビロソーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド分子を標的細胞に送達するための担体として使用され得る。ビロソーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド分子を標的細胞に送達するための担体として使用され得る。
【0313】
例えば、国際特許公開番号国際公開第２０１１／０９７４８０号パンフレット、国際公開第２０１３／０７０３２４号パンフレット、国際公開第２０１７／００４５２６号パンフレット、又は国際公開第２０２００４１７８４号パンフレットに記載されるような植物ナノ小胞及び植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）も、本明細書に記載される組成物又は調製物を送達するための担体として使用され得る。植物ナノ小胞及び植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）も、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド組成物又は調製物を送達するための担体として使用され得る。
【0314】
マイクロバブルも、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド分子を送達するための担体として使用され得る。マイクロバブルも、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド分子を送達するための担体として使用され得る。例えば、米国特許第７１１５５８３号明細書；Ｂｅｅｒｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００２ Ｏｃｔ １；１０６（１４）：１７５６－１７５９；Ｂｅｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１９ Ａｐｒ；１４（４）：１０１５－１０２６；Ｈｅｒｎｏｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００８ Ｊｕｎ ３０；６０（１０）：１１５３－１１６６；Ｒｙｃｈａｋ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１４ Ｊｕｎ；７２：８２－９３を参照されたい。ある実施形態では、マイクロバブルは、アルブミン被覆されたペルフルオロカーボンマイクロバブルである。
【0315】
本明細書に記載のポリリボヌクレオチドを含む担体は、複数の粒子を含み得る。粒子は、３０～７００ナノメートル（例えば、３０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、１００～５００、５０～５００、又は２００～７００ナノメートル）の物品サイズ中央値を有し得る。粒子の大きさは、細胞へのポリリボヌクレオチドを含むペイロードの沈着に有利に働くように最適化することができる。特定の細胞型へのポリリボヌクレオチドの沈着は、異なる粒径に有利であり得る。例えば、粒径は、抗原提示細胞へのポリリボヌクレオチドの沈着のために最適化され得る。粒径は、樹状細胞へのポリリボヌクレオチドの沈着のために最適化され得る。さらに、粒径は、流入領域リンパ節細胞へのポリリボヌクレオチドの沈着のために最適化され得る。
【0316】
脂質ナノ粒子
本開示によって提供される組成物、方法、及び送達システムは、特定の実施形態において、本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む任意の好適な担体又は送達モダリティを用い得る。脂質ナノ粒子は、ある実施形態では、１つ以上のイオン性脂質、例えば、非カチオン性脂質（例えば、中性又はアニオン性、又は両性脂質）；１つ以上のコンジュゲート脂質（ＰＥＧコンジュゲート脂質又は全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーにコンジュゲートされた脂質など）；１つ以上のステロール（例えば、コレステロール）を含む。
本開示によって提供される組成物、方法、及び送達システムは、特定の実施形態において、本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む任意の好適な担体又は送達モダリティを用い得る。脂質ナノ粒子は、ある実施形態では、１つ以上のイオン性脂質、例えば、非カチオン性脂質（例えば、中性又はアニオン性、又は両性脂質）；１つ以上のコンジュゲート脂質（ＰＥＧコンジュゲート脂質又は全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーにコンジュゲートされた脂質など）；１つ以上のステロール（例えば、コレステロール）を含む。
【0317】
ナノ粒子形成において使用され得る脂質（例えば、脂質ナノ粒子）は、例えば、参照により援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４に記載されるものを含み－例えば、脂質含有ナノ粒子は、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４中の脂質の１つ以上を含み得る。脂質ナノ粒子は、さらなる要素、例えば、ポリマー、例えば、参照により援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーを含み得る。
【0318】
ある実施形態では、コンジュゲート脂質は、存在する場合、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－ｌ－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、及び国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレット（参照により援用される）の表２に記載されるもの、並びに上記のものの組合せのうちの１つ以上を含み得る。
【0319】
ある実施形態では、脂質ナノ粒子に組み込まれ得るステロールとしては、参照により援用される国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書に記載されるものなどの、コレステロール又はコレステロール誘導体の１つ以上が挙げられる。さらなる例示的なステロールとしては、参照により本明細書に援用される、Ｅｙｇｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６に記載されるものを含む植物ステロールが挙げられる。
【0320】
ある実施形態では、脂質粒子は、イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質、及びステロールを含む。これらの構成要素の量は、独立して、所望の特性を達成するために変化され得る。例えば、ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、総脂質の約２０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％の量のイオン化可能な脂質（他の実施形態において、それは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）又は４０～５０％（ｍｏｌ）；約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％であり得る）、総脂質の約５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の量のコンジュゲート脂質、及び総脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の量のステロールを含む。総脂質対核酸の比率は、必要に応じて変化され得る。例えば、総脂質対核酸（質量又は重量）比は、約１０：１～約３０：１であり得る。
【0321】
ある実施形態では、脂質対核酸比（質量／質量比；ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲であり得る。脂質及び核酸の量は、所望のＮ／Ｐ比、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のＮ／Ｐ比を得るために調整され得る。一般に、脂質ナノ粒子製剤の全脂質含量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【0322】
本明細書に記載される組成物、例えば、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド））の送達のための脂質ナノ粒子を形成するために（例えば、他の脂質成分と組み合わせて）使用され得る脂質化合物のいくつかの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。
ある実施形態では、式（ｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。
【化1】
【0323】
【化2】
【0324】
【化3】
【0325】
【化4】
【0326】
【化5】
【0327】
【化6】
【0328】
【化7】
【0329】
【化8】
Ｘ１が、Ｏ、ＮＲ１、又は直接結合であり、Ｘ２が、Ｃ２～５アルキレンであり、Ｘ３が、Ｃ（＝Ｏ）又は直接結合であり、Ｒ１が、Ｈ又はＭｅであり、Ｒ３が、Ｃ１～３アルキルであり、Ｒ２が、Ｃ１～３アルキルであり、又はＲ２が、それが結合される窒素原子及びＸ２の１～３個の炭素原子と一緒になって、４員、５員、若しくは６員環を形成し、又はＸ１が、ＮＲ１であり、Ｒ１及びＲ２が、それらが結合される窒素原子と一緒になって、５員若しくは６員環を形成し、又はＲ２が、Ｒ３及びそれらが結合される窒素原子と一緒になって、５員、６員、若しくは７員環を形成し、Ｙ１が、Ｃ２～１２アルキレンであり、Ｙ２が、
【化9】
ｎが、０～３であり、Ｒ４が、Ｃ１～１５アルキルであり、Ｚ１が、Ｃ１～６アルキレン又は直接結合であり、
Ｚ２が
【化10】
Ｒ５が、Ｃ５～９アルキル又はＣ６～１０アルコキシであり、Ｒ６が、Ｃ５～９アルキル又はＣ６～１０アルコキシであり、Ｗが、メチレン又は直接結合であり、Ｒ７が、Ｈ又はＭｅ、又はその塩であり、ただし、Ｒ３及びＲ２が、Ｃ２アルキルであり、Ｘ１が、Ｏであり、Ｘ２が、直鎖状Ｃ３アルキレンであり、Ｘ３が、Ｃ（＝０）であり、Ｙ１が、直鎖状Ｃｅアルキレンであり、（Ｙ２）ｎ－Ｒ４が、
【化11】
【0330】
ある実施形態では、式（ｘｉｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。
ある実施形態では、式（ｘｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。
【化12】
【0331】
【化13】
【0332】
【化14】
【0333】
【化15】
【0334】
【化16】
【0335】
ある実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド））の送達のための脂質ナノ粒子を形成するのに使用される脂質化合物は、以下の反応のうちの１つによって作製される：
【化17】
【0336】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を細胞に送達するために、式（ｘｘｉ）を含むＬＮＰが使用される。いくつかの実施形態では、式（ｘｘｉ）のＬＮＰは、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットによって記載されるＬＮＰ（例えば、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットの表１の脂質など、式（１）の脂質）である。
式中、
各ｎは、独立に、２～１５の整数であり；Ｌ１及びＬ３は、各々独立に、－ＯＣ（Ｏ）－＊又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊であり、式中、「＊」は、Ｒ１又はＲ３との結合点を指し；
Ｒ１及びＲ３は、各々独立に、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルケニル、アルデヒド、ヘテロシクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアミノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、（ヘテロシクリル）（アルキル）アミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アルキニル、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキルアミノ、（アミノカルボニルアルキル）（アルキル）アミノ、アルケニルカルボニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニル、（アルキルアミノアルキル）（アルキル）アミノカルボニル、アルキルアミノアルキルカルボニル、ジアルキルアミノアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホキシド、アルキルスルホキシドアルキル、アルキルスルホニル、及びアルキルスルホンアルキルからなる群から選択される１つ又は複数の置換基によって任意選択で置換されている、線状又は分枝状Ｃ９～Ｃ２０アルキル又はＣ９～Ｃ２０アルケニルであり；及び
Ｒ２は、
からなる群から選択される。
【化18】
各ｎは、独立に、２～１５の整数であり；Ｌ１及びＬ３は、各々独立に、－ＯＣ（Ｏ）－＊又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－＊であり、式中、「＊」は、Ｒ１又はＲ３との結合点を指し；
Ｒ１及びＲ３は、各々独立に、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルケニル、アルデヒド、ヘテロシクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアミノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、（ヘテロシクリル）（アルキル）アミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アルキニル、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキルアミノ、（アミノカルボニルアルキル）（アルキル）アミノ、アルケニルカルボニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニル、（アルキルアミノアルキル）（アルキル）アミノカルボニル、アルキルアミノアルキルカルボニル、ジアルキルアミノアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホキシド、アルキルスルホキシドアルキル、アルキルスルホニル、及びアルキルスルホンアルキルからなる群から選択される１つ又は複数の置換基によって任意選択で置換されている、線状又は分枝状Ｃ９～Ｃ２０アルキル又はＣ９～Ｃ２０アルケニルであり；及び
Ｒ２は、
【化19】
【0337】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を細胞に送達するために、式（ｘｘｉｉ）を含むＬＮＰが使用される。いくつかの実施形態では、式（ｘｘｉｉ）のＬＮＰは、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットによって記載されるＬＮＰ（例えば、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットの表２の脂質など、式（２）の脂質）である。
式中、
各ｎは、独立に、１～１５の整数であり；
Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、
からなる群から選択される。
Ｒ３は、
からなる群から選択される。
【化20】
各ｎは、独立に、１～１５の整数であり；
Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、
【化21】
Ｒ３は、
【化22】
【0338】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を細胞に送達するために、式（ｘｘｉｉｉ）を含むＬＮＰが使用される。いくつかの実施形態では、式（ｘｘｉｉｉ）のＬＮＰは、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットによって記載されるＬＮＰ（例えば、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットの表３の脂質など、式（３）の脂質）である。
式中、
Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－、又は－ＯＣ（Ｏ）－＊から選択され、式中、＊は、Ｒ１との結合点を指し；
Ｒ１は、
からなる群から選択され、
Ｒ２は、
からなる群から選択される。
【化23】
Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－、又は－ＯＣ（Ｏ）－＊から選択され、式中、＊は、Ｒ１との結合点を指し；
Ｒ１は、
【化24】
Ｒ２は、
【化25】
【0339】
ある実施形態では、本明細書に記載される組成物（例えば核酸（例えば環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）又はタンパク質）は、イオン化可能な脂質を含むＬＮＰ中で提供される。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、米国特許第９，８６７，８８８号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１に記載されるようなヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（ＳＭ－１０２）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１３において合成されるような９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（ＬＰ０１）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）実施例７、８、又は９において合成されるようなジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１４及び１６において合成されるような１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、イミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）脂質（３Ｓ、１０Ｒ、１３Ｒ、１７Ｒ）－１０、１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２、３、１４、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－テトラデカヒドロ－ｌＨ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエート、例えば、国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）からの構造（Ｉ）である。
【0340】
ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、カチオン性脂質、イオン化可能なカチオン性脂質、例えば、ｐＨに応じて正荷電若しくは中性形態で存在し得るカチオン性脂質、又は容易にプロトン化され得るアミン含有脂質であり得る。ある実施形態では、カチオン性脂質は、例えば、生理的条件下で、正に荷電することが可能である脂質である。例示的なカチオン性脂質としては、正電荷を有する１つ以上のアミン基を含む。ある実施形態では、脂質粒子は、中性脂質、イオン化可能なアミン含有脂質、生分解性アルキン脂質、ステロイド、多価不飽和脂質を含むリン脂質、構造脂質（例えば、ステロール）、ＰＥＧ、コレステロール及びポリマーコンジュゲート脂質のうちの１つ以上との配合物中のカチオン性脂質を含む。ある実施形態では、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質であり得る。本明細書に開示される例示的なカチオン性脂質は、６．０を超える有効ｐＫａを有し得る。実施形態において、脂質ナノ粒子は、第１のカチオン性脂質と異なる有効ｐＫａ（例えば、第１の有効ｐＫａより高い）を有する第２のカチオン性脂質を含み得る。脂質ナノ粒子は、４０～６０ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、及び治療剤、例えば、脂質ナノ粒子内に封入されるか又はそれと結合された本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド））を含み得る。ある実施形態では、核酸は、カチオン性脂質と同時に配合される。核酸は、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰの表面に吸着され得る。ある実施形態では、核酸は、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰ内に封入され得る。ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、例えば、標的化剤で被覆された標的部分を含み得る。実施形態において、ＬＮＰ製剤は、生分解性である。ある実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の脂質、例えば、式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉ）、（ｖｉｉ）及び／又は（ｉｘ）を含む脂質ナノ粒子は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は１００％のＲＮＡ分子を封入する。
【0341】
脂質ナノ粒子製剤に使用され得る例示的なイオン化可能な脂質としては、限定はされないが、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレットの表１に列挙されるものが挙げられる。さらなる例示的な脂質としては、限定はされないが、以下の式の１つ以上：米国特許出願公開第２０１６／０３１１７５９号明細書のＸ；米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１６０１５１２８４号明細書のＩ、ＩＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１７０２１０９６７号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＩ、又はＩＩＡ；米国特許出願公開第２０１５０１４００７０号明細書のＩ－ｃ；米国特許出願公開第２０１３／０１７８５４１号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０３０３５８７号明細書又は米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０１４１６７８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２３９９２６号明細書のＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、又はＶ；米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書のＩ；国際公開第２０１７／１１７５２８号パンフレットのＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１４９８９４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１５／００５７３７３号明細書のＡ；国際公開第２０１３／１１６１２６号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２０１３／００９０３７２号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５２３号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５０４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／００５３５７２号明細書のＡ；国際公開第２０１３／０１６０５８号パンフレットのＡ；国際公開第２０１２／１６２２１０号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２００８／０４２９７３号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６７０号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１４／０２００２５７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２０３４４６号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０００５３６３号明細書のＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１４／０３０８３０４号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ、ＩＩＤ、又はＩＩＩ～ＸＸＩＶ；米国特許出願公開第２０１３／０３３８２１０号明細書の；国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレットのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１２／０１０１１４７８号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１２／００２７７９６号明細書のＩ又はＸＸＸＶ；米国特許出願公開第２０１２／００５８１４４号明細書のＸＩＶ又はＸＶＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０３２３２６９号明細書の；米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０２０２８７１号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ；米国特許出願公開第２０１１／００７６３３５号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、又はＸＶＩ；米国特許出願公開第２００６／００８３７８号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／００６４２４２号明細書のＩ又はＸ－Ａ－Ｙ－Ｚ；米国特許出願公開第２０１３／００２２６４９号明細書のＸＶＩ、ＸＶＩＩ、又はＸＶＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１０／００６２９６７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１８９３５１号明細書のＩ～Ｘ；米国特許出願公開第２０１４／００３９０３２号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書のＶ；米国特許出願公開第２０１６／０３１７４５８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１９５９２０号明細書のＩ；米国特許出願公開第１０，２２１，１２７号明細書の５、６、又は１０；国際公開第２０１８／０８１４８０号パンフレットのＩＩＩ－３；国際公開第２０２０／０８１９３８号パンフレットのＩ－５又はＩ－８；米国特許出願公開第９，８６７，８８８号明細書の１８又は２５；米国特許出願公開第２０１９／０１３６２３１号明細書のＡ；国際公開第２０２０／２１９８７６号パンフレットのＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書の１；米国特許出願公開第２０１９／０２４０３４９号明細書のＯＦ－０２；米国特許出願公開第１０，０８６，０１３号明細書の２３；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ（２０２０）のｃＫＫ－Ｅ１２／Ａ６；国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレットのＣ１２－２００；Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０１７）の７Ｃ１；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌの３０４－Ｏ１３又は５０３－Ｏ１３；米国特許第９，７０８，６２８号明細書のＴＳ－Ｐ４Ｃ２；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩ；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩ；及び国際公開第２０２１／１１３７７７号パンフレットの（１）、（２）、（３）又は（４）が挙げられる。例示的脂質としては、国際公開第２０２１／１１３７７７号パンフレットの表１～表１６のいずれか１つの脂質がさらに挙げられる。
【0342】
ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例９に記載されるようなＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３ｌＺ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３ｌ－テトラエン－ｌ９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１０に記載されるような脂質ＡＴＸ－００２である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１１に記載されるような（ｌ３Ｚ，ｌ６Ｚ）－Ａ，Ａ－ジメチル－３－ノニルドコサ－ｌ３、ｌ６－ジエン－ｌ－アミン（化合物３２）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１２に記載されるような化合物６又は化合物２２である。
【0343】
例示的な非カチオン性脂質としては、限定はされないが、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、ｌ８－ｌ－ｔｒａｎｓ ＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用され得ることが理解される。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０～Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。さらなる例示的な脂質としては、特定の実施形態において、限定はされないが、参照により本明細書に援用される、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６に記載されるものが挙げられる。このような脂質としては、ある実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＤＧＴＳ）との肝臓トランスフェクションを改善することが分かっている植物脂質が挙げられる。
【0344】
脂質ナノ粒子に使用するのに好適な非カチオン性脂質の他の例としては、限定はされないが、非リン脂質、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル－アリールサルフェートポリエチルオキシ化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。他の非カチオン性脂質が、国際公開第２０１７／０９９８２３号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（全内容が参照により本明細書に援用される）に記載される。
【0345】
ある実施形態では、非カチオン性脂質は、オレイン酸又は米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）の式Ｉ、ＩＩ、若しくはＩＶの化合物である。非カチオン性脂質は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を占め得る。ある実施形態では、非カチオン性脂質含量は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の５～２０％（ｍｏｌ）又は１０～１５％（ｍｏｌ）である。実施形態において、イオン化可能な脂質対中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲（例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、又は８：１）である。
【0346】
ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、いずれのリン脂質も含まない。
【0347】
ある態様において、脂質ナノ粒子は、膜完全性を提供するために、ステロールなどの成分をさらに含み得る。脂質ナノ粒子に使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロール及びその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定的な例としては、極性類似体、例えば、５ａ－コレスタノール、５３－コプロスタノール、コレステリル－（２，－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノール；非極性類似体、例えば、５ａ－コレスタン、コレステノン、５ａ－コレスタノン、５ｐ－コレスタノン、及びデカン酸コレステリル；及びそれらの混合物が挙げられる。ある実施形態では、コレステロール誘導体は、極性類似体、例えば、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルである。例示的なコレステロール誘導体が、ＰＣＴ公開国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書（これらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される）に記載される。
【0348】
ある実施形態では、ステロールなどの、膜完全性を提供する成分は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０－５０％（ｍｏｌ）（例えば、０～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、又は４０～５０％）を占め得る。ある実施形態では、このような成分は、脂質ナノ粒子の総脂質含量の２０～５０％（ｍｏｌ）３０～４０％（ｍｏｌ）である。
【0349】
ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコンジュゲート脂質分子を含み得る。一般に、これらは、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、及び／又は立体安定化を提供するのに使用される。例示的なコンジュゲート脂質としては、限定はされないが、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられる。ある実施形態では、コンジュゲート脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）コンジュゲート脂質である。
【0350】
例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、限定はされないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－ｌ－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－ｌ，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物が挙げられる。さらなる例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、例えば、米国特許第５，８８５，６ｌ３号明細書、米国特許第６，２８７，５９ｌ号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１７５６８２、米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書、米国特許出願第２０１８／００２８６６４号明細書、及び国際公開第０９９８２３号明細書（これらは全て、全内容が参照により本明細書に援用される）に記載される。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（全内容が参照により本明細書に援用される）の式ＩＩＩ、ＩＩＩ－ａ－Ｉ、ＩＩＩ－ａ－２、ＩＩＩ－ｂ－１、ＩＩＩ－ｂ－２、又はＶの化合物である。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書（これらは両方とも、全内容が参照により本明細書に援用される）の式ＩＩのものである。ある実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスタ－５－エン－３［β］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］を含む。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、
から選択される構造を含む。
【化26】
【0351】
ある実施形態では、ＰＥＧ以外の分子とコンジュゲートされた脂質も、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用され得る。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、及びカチオン性ポリマー脂質（ＧＰＬ）コンジュゲートが、ＰＥＧ－脂質の代わりに又はそれに加えて使用され得る。
【0352】
例示的なコンジュゲート脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート及びカチオン性ポリマー－脂質が、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（これらは全て、全内容が参照により本明細書に援用される）の表２に列挙されるＰＣＴ及びＬＩＳ特許出願に記載される。
【0353】
ある実施形態では、ＰＥＧ又はコンジュゲート脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を占め得る。ある実施形態では、ＰＥＧ又はコンジュゲート脂質含量は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０．５～１０％又は２～５％（ｍｏｌ）である。イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ／コンジュゲート脂質のモル比は、必要に応じて変化され得る。例えば、脂質粒子は、組成物のモル又は総重量当たり３０～７０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり０～６０％のコレステロール、組成物のモル又は総重量当たり０～３０％の非カチオン性脂質及び組成物のモル又は総重量当たり１～１０％のコンジュゲート脂質を含み得る。好ましくは、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり３０～４０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり４０～５０％のコレステロール、及び組成物のモル又は総重量当たり１０～２０％の非カチオン性脂質を含む。ある他の実施形態において、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり５０～７５％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり２０～４０％のコレステロール、及び、組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン性脂質及び組成物のモル又は総重量当たり１～１０％のコンジュゲート脂質である。組成物は、組成物のモル又は総重量当たり６０～７０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり２５～３５％のコレステロール、及び組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン性脂質を含有し得る。組成物はまた、組成物のモル又は総重量当たり最大で９０％のイオン化可能な脂質及び組成物のモル又は総重量当たり２～１５％の非カチオン性脂質を含有し得る。製剤はまた、例えば、組成物のモル又は総重量当たり８～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり５～３０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は総重量当たり０～２０％のコレステロール；組成物のモル又は総重量当たり４～２５％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり４～２５％の非カチオン性脂質、組成物のモル又は総重量当たり２～２５％のコレステロール、組成物のモル又は総重量当たり１０～３５％のコンジュゲート脂質、及び組成物のモル又は総重量当たり５％のコレステロール；又は組成物のモル又は総重量当たり２～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり２～３０％の非カチオン性脂質、組成物のモル又は総重量当たり１～１５％のコレステロール、組成物のモル又は総重量当たり２～３５％のコンジュゲート脂質、及び組成物のモル又は総重量当たり１～２０％のコレステロール；或いは組成物のモル又は総重量当たり最大で９０％のイオン化可能な脂質及び組成物のモル又は総重量当たり２～１０％の非カチオン性脂質、或いは組成物のモル又は総重量当たり１００％のカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子製剤であり得る。ある実施形態では、脂質粒子製剤は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。ある他の実施形態において、脂質粒子製剤は、６０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。
【0354】
ある実施形態では、脂質粒子は、イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質（例えばリン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）及びＰＥＧ化脂質を含み、ここで、脂質のモル比は、イオン化可能な脂質では２０～７０モルパーセントの範囲であり、目標は４０～６０であり、非カチオン性脂質のモルパーセントは、０～３０の範囲であり、目標は０～１５であり、ステロールのモルパーセントは、２０～７０の範囲であり、目標は３０～５０であり、ＰＥＧ化脂質のモルパーセントは、１～６の範囲であり、目標は２～５である。
【0355】
ある実施形態では、脂質粒子は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質／非カチオン性脂質／ステロール／コンジュゲート脂質を含む。
【0356】
一態様において、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。
【0357】
ある実施形態では、１つ以上のさらなる化合物も含まれ得る。それらの化合物は、別々に投与され得、又はさらなる化合物は、本発明の脂質ナノ粒子に含まれ得る。言い換えると、脂質ナノ粒子は、核酸又は第１の核酸と異なる少なくとも第２の核酸に加えて、他の化合物を含有し得る。限定はされないが、他のさらなる化合物は、小型若しくは大型有機又は無機分子、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びその誘導体、ペプチド模倣薬、核酸、核酸類似体及び誘導体、生体材料から作製された抽出物、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
【0358】
ある実施形態では、ＬＮＰは、生分解性、イオン化可能な脂質を含む。ある実施形態では、ＬＮＰは、（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，ｌ２－ジエノエート（３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ２－ジエノエート）とも呼ばれる）又は別のイオン化可能な脂質を含む。例えば、国際公開第２０１９／０６７９９２号パンフレット、国際公開第／２０１７／１７３０５４号パンフレット、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット、及び国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレット、並びにその中に提供される参考文献の脂質を参照されたい。ある実施形態では、ＬＮＰ脂質に関するカチオン性及びイオン化可能という用語は、同義的であり、例えば、イオン化可能な脂質は、ｐＨに応じてカチオン性である。
【0359】
ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される、数１０ｎｍ～数１００ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、又は１５０ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、又は約９０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。特定の実施形態において、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約８０ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約１００ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約ｌｍｍ～約５００ｍｍ、約５ｍｍ～約２００ｍｍ、約１０ｍｍ～約１００ｍｍ、約２０ｍｍ～約８０ｍｍ、約２５ｍｍ～約６０ｍｍ、約３０ｍｍ～約５５ｍｍ、約３５ｍｍ～約５０ｍｍ、又は約３８ｍｍ～約４２ｍｍの範囲である。
【0360】
ＬＮＰは、ある場合には、比較的均質であり得る。多分散指数は、ＬＮＰの均質性、例えば、脂質ナノ粒子の粒度分布を示すのに使用され得る。小さい（例えば、０．３未満の）多分散指数は、一般に、狭い粒度分布を示す。ＬＮＰは、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、又は０．２５の多分散指数を有し得る。ある実施形態では、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。
【0361】
ＬＮＰのゼータ電位は、組成物の界面動電位を示すのに使用され得る。ある実施形態では、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を表し得る。より高度に荷電された種は、身体内の細胞、組織、及び他の要素と不必要に相互作用し得るため、正又は負の比較的低い電荷を有する脂質ナノ粒子が一般に望ましい。ある実施形態では、ＬＮＰのゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、又は約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。
【0362】
タンパク質及び／又は核酸の封入の効率は、提供される初期量と比べた、調製後にＬＮＰで封入されるか又は他の形でＬＮＰと結合されるタンパク質及び／又は核酸の量を表す。封入効率は、高い（例えば、ほぼ１００％）のが望ましい。封入効率は、例えば、１つ以上の有機溶媒又は洗浄剤で脂質ナノ粒子を分解する前及び後で脂質ナノ粒子を含有する溶液中のタンパク質又は核酸の量を比較することによって、測定され得る。アニオン交換樹脂が、溶液中の遊離タンパク質又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定するのに使用され得る。蛍光が、溶液中の遊離タンパク質及び／又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定するのに使用され得る。本明細書に記載される脂質ナノ粒子の場合、タンパク質及び／又は核酸の封入効率は、少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であり得る。ある実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。ある実施形態では、封入効率は、少なくとも９５％であり得る。
【0363】
ＬＮＰは、任意に、１つ以上のコーティングを含み得る。ある実施形態では、ＬＮＰは、コーティングを有するカプセル、フィルム、又は錠剤に製剤化され得る。本明細書に記載される組成物を含むカプセル、フィルム、又は錠剤は、任意の有用なサイズ、引張り強さ、硬度又は密度を有し得る。
【0364】
ＬＮＰの追加的な例示的脂質、製剤、方法、及び特徴付けについては、国際公開第２０２０／０６１４５７号パンフレット及び国際公開第２０２１／１１３７７７号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）により教示されている。ＬＮＰのさらなる例示的脂質、製剤、方法、及び特徴付けについては、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍａｔｅｒ（２０２１）．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５７８－０２１－００３５８－０（全体として参照により本明細書に援用される）により教示されている（例えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．の図２の例示的脂質及び脂質誘導体を参照のこと）。
【0365】
ある実施形態では、インビトロ又はエクスビボ細胞リポフェクションが、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又はＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて行われる。特定の実施形態において、ＬＮＰは、ＧｅｎＶｏｙ＿ＩＬＭイオン化可能な脂質混合物（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて製剤化される。特定の実施形態において、ＬＮＰは、２，２‐ジリノレイル‐４‐ジメチルアミノエチル‐［１，３］‐ジオキソラン（ＤＬｉｎ‐ＫＣ２‐ＤＭＡ）又はジリノレイルメチル‐４‐ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）を用いて製剤化され、その製剤及びインビボでの使用が、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５１（３４）：８５２９－８５３３（２０１２）（全体が参照により本明細書に援用される）に教示される。
【0366】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えば、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ ＲＮＰ、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの送達のために最適化されたＬＮＰ製剤が、国際公開第２０１９０６７９９２号パンフレット及び国際公開第２０１９０６７９１０号パンフレット（両方とも参照により援用される）に記載され、環状ポリリボヌクレオチド及び本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドの送達のために有用である。
【0367】
核酸（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）の送達に有用なさらなる特定のＬＮＰ製剤が、米国特許第８１５８６０１号明細書及び米国特許第８１６８７７５号明細書（両方とも参照により援用される）に記載され、これは、ＯＮＰＡＴＴＲＯの名称で販売されているパチシラン中で使用される製剤を含む。
【0368】
実施形態では、本明細書に記載のタンパク質又はポリペプチドの少なくとも一部分（例えば、抗原部分）をコードするポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）は、ＬＮＰ中で製剤化される：（ａ）ＬＮＰは、カチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、及びＰＥＧ脂質を含む、（ｂ）ＬＮＰは、８０ｎｍ～１６０ｎｍの平均粒径を有する、及び（ｃ）ポリリボヌクレオチド。実施形態では、ＬＮＰ中で製剤化されているポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）は、ワクチンである。
【0369】
ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）ＬＮＰの代表的な投与では、約０．１、０．２５、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０、又は１００ｍｇ／ｋｇ（ＲＮＡ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）抗原組成物の用量は、３０～２００ｍｃｇ、例えば、３０ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、７５ｍｃｇ、１００ｍｃｇ、１５０ｍｃｇ、又は２００ｍｃｇである。
【実施例】
【0370】
以下の実施例は、本明細書に記載される組成物及び方法がどのように使用され、作製され、評価され得るかの説明を当業者に提供するために提示され、本開示を純粋に例示するものであることが意図されており、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。
【0371】
実施例１：環状ＲＮＡを濃縮するための線状ＲＮＡプルダウン法
本実施例は、線状ＲＮＡ副産物を自己スプライシングによって生成された環状ＲＮＡから除去するための方法の設計について記載する。
本実施例は、線状ＲＮＡ副産物を自己スプライシングによって生成された環状ＲＮＡから除去するための方法の設計について記載する。
【0372】
環状ＲＮＡが自己スプライシングによって生成されるとき、インビトロ転写（ＩＶＴ）混合物中にはいくつかの主要な線状不純物又は副産物が存在し得る：スプライスされていない線状ＲＮＡ、部分的にスプライスされた線状ＲＮＡ、ニック環状ＲＮＡ、及びスプライスされたイントロン（図２）。
【0373】
オリゴマーは、イントロン領域に対する相補的配列を有するように設計する。イントロン領域は、環状ＲＮＡ産物中に存在せず、線状ＲＮＡ又はスプライスアウトされた形態の一部として線状副産物中に限って存在する配列である（図２及び図３）。オリゴマーは、ストレプトアビジンタンパク質に高い親和性で結合し得るＴＥＧリンカーによって接続されているビオチンを有するように設計する。一旦オリゴマーがイントロン配列を含有する線状副産物に結合すると、副産物は、ストレプトアビジンビーズによって捕捉され得て、環状ＲＮＡは、非結合画分中に濃縮され得る。
【0374】
実施例２：線状ＲＮＡプルダウンは線状副産物を特異的に捕捉し、環状ＲＮＡを濃縮する
本実施例は、オリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによる環状ＲＮＡの濃縮を実証する。
本実施例は、オリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによる環状ＲＮＡの濃縮を実証する。
【0375】
本実施例において、構築物は、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計した。ＯＲＦは、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ、図４の場合）又はホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ、図５の場合）のいずれかであった。線状ＲＮＡの長さは、Ｇｌｕｃ ＯＲＦの場合に約１．４Ｋｂであり、Ｆｌｕｃ ＯＲＦの場合に約２．６Ｋｂであった。
【0376】
イントロン配列を含有する線状副産物を除去するための線状ＲＮＡプルダウン（ＬＰ）の場合、イントロン領域に対する６つの異なるオリゴマーを設計した：３’半分－イントロンに対する４つのオリゴマー、及び５’半分－イントロンに対する２つのオリゴマー。各オリゴマーは、２３ヌクレオチドであり、ＴＥＧによって連結されているビオチンを有した。
【0377】
７．５ｍＭのＮＴＰの存在下でＤＮＡ鋳型からのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。デオキシリボヌクレアーゼで２０分間処理することにより、鋳型ＤＮＡを除去した。合成された線状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｔ２０５０）で精製した。自己スプライシングが転写中に生じ；さらなる又は追加的な反応は必要でなかった。
【0378】
自己スプライスされたＲＮＡ（２００ピコモル）を、同じ量の各オリゴマー（２００ピコモルの各オリゴマー、全部で１．２ナノモルのオリゴマー）と、全体で５００μｌ中の１倍結合緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で混合した（最終ＲＮＡ濃度は４００ｎＭであった）。ＬＰ効率に対するＲＮＡ：オリゴマー比の効果を試験するため、２倍（８００ｎＭ）及び５倍より多いオリゴマー（２μＭ）を使用した。陰性対照として、オリゴマーを伴わないＲＮＡを使用した。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートし、次に１００μｌのストレプトアビジン－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）と混合した。混合物をミックスローター上、ＲＴで１時間インキュベートし、ストレプトアビジン－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズを遠心分離によってスピンダウンすることにより、非結合画分を収集した。ビーズを１倍結合緩衝液で３回洗浄した。樹脂を１倍結合緩衝液の存在下、７５℃で１０分間加熱することにより、ビーズに結合しているＲＮＡを溶出させた（図４及び図５中の「溶出された」）。ビーズを９５％ホルムアミドの存在下、９５℃で５分間加熱することにより、ビーズに依然として結合しているＲＮＡを溶出させた（図４及び図５中の「樹脂」）。非結合及び溶出ＲＮＡの濃度をＱｕｂｉｔによって測定し、尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素ＰＡＧＥ）によって２００ｎｇのＲＮＡを分離し、ゲル染色を用いて染色し、画像処理システムを用いて可視化した。
【0379】
１．４ＫｂのＲＮＡ（図４）と２．６ＫｂのＲＮＡ（図５）の両方において、入力と比較して、非結合画分における環状ＲＮＡの有意な濃縮が認められた（１．４ＫｂのＲＮＡにおける約９０％の濃縮（図４）及び２．６ＫのＲＮＡにおける５０％の濃縮（図５））。樹脂に結合しているＲＮＡの大半が、イントロン領域を含有する線状ＲＮＡであった（線状ＲＮＡ、図４及び図５）が、オリゴマーがイントロンを含有するＲＮＡを特異的に捕捉したことが示される。オリゴマー濃度の増加は、１．４ＫｂのＲＮＡと２．６ＫｂのＲＮＡの両方において環状ＲＮＡの濃縮収率に影響しなかった。
【0380】
実施例３：単一オリゴマーが線状ＲＮＡ副産物を捕捉し、環状ＲＮＡを濃縮し得る
本実施例は、オリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによる環状ＲＮＡの濃縮を実証する。本実施例において、線状ＲＮＡは、自己スプライシング中にスプライスアウトされている３’半分－イントロンの５’末端に拡張された領域を含んだ。
本実施例は、オリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによる環状ＲＮＡの濃縮を実証する。本実施例において、線状ＲＮＡは、自己スプライシング中にスプライスアウトされている３’半分－イントロンの５’末端に拡張された領域を含んだ。
【0381】
本実施例において、構築物を、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ＯＲＦを含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計した。構築物は、５’末端に３６ヌクレオチドの拡張された配列を含んだ。
【0382】
拡張された配列を含有する線状副産物をプルダウンするため、拡張された領域に対するオリゴマーを設計した。オリゴマーは、３６ヌクレオチドであり、ＴＥＧによって連結されているビオチンを有した。
【0383】
７．５ｍＭのＮＴＰの存在下でＤＮＡ鋳型からのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。デオキシリボヌクレアーゼで２０分間処理することにより、鋳型ＤＮＡを除去した。合成された線状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｔ２０５０）で精製した。自己スプライシングが転写中に生じ；さらなる／追加的な反応は必要でなかった。
【0384】
自己スプライスされたＲＮＡ（２００ピコモル）を、４００ピコモルのオリゴと、１倍結合緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で混合した（最終ＲＮＡ濃度は４００ｎＭであり、オリゴマー濃度は８００ｎＭであった）。線状ＲＮＡプルダウン効率に対するＲＮＡ：オリゴマー比の効果を試験するため、２．５倍（１μＭ）又は５倍より多い（２μＭ）オリゴマーを使用した。陰性対照として、オリゴマーを伴わないＲＮＡを使用した。ＲＮＡ－オリゴマー混合物をＲＴで３０分間インキュベートし、次に１００μｌのストレプトアビジン－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）と混合した。混合物をミックスローター上、ＲＴで１時間インキュベートし、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズを遠心分離によってスピンダウンすることにより、非結合画分を収集した。ビーズを１倍結合緩衝液で３回洗浄した。樹脂を１倍結合緩衝液の存在下、７５℃で１０分間加熱することにより、樹脂に結合したＲＮＡを溶出させた（図６中の「溶出された」）。樹脂を９５％ホルムアミドの存在下、９５℃で５分間加熱することにより、ビーズに依然として結合していたＲＮＡを溶出させた（図６中の「樹脂」）。非結合及び溶出ＲＮＡの濃度をＱｕｂｉｔによって測定し、尿素ＰＡＧＥによって２００ｎｇのＲＮＡを分離し、ゲル染色を用いて染色し、画像処理システムを用いることによって可視化した。
【0385】
非結合画分中の環状ＲＮＡの濃縮は入力と比較して有意であった（８００ｎＭのオリゴにおいて５０％の濃縮（図６））。樹脂に結合したＲＮＡの大半は、拡張された領域を有する線状ＲＮＡであり、オリゴマーが拡張された領域を有する線状ＲＮＡを特異的に捕捉することが示された（線状ＲＮＡ、図６）。オリゴマー濃度の増加は、環状ＲＮＡの濃縮収率に、８００ｎＭのオリゴマーの場合の５０％から４μＭのオリゴマーの場合の９６％にかけて有意に影響した。
【0386】
実施例４：バッチ精製及びカラム充填方法を比較する
本実施例は、オリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによる環状ＲＮＡの濃縮についての２つの異なる手法を実証する。一方の方法は、ＲＮＡ－オリゴ混合物をチューブ内でストレプトアビジン－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズとインキュベートすること（バッチ法）であり、他方の方法は、ビーズをカラムに予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって通過させること（カラム法）であった。
本実施例は、オリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによる環状ＲＮＡの濃縮についての２つの異なる手法を実証する。一方の方法は、ＲＮＡ－オリゴ混合物をチューブ内でストレプトアビジン－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズとインキュベートすること（バッチ法）であり、他方の方法は、ビーズをカラムに予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって通過させること（カラム法）であった。
【0387】
本実施例において、構築物を、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ＯＲＦを含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計した。
【0388】
イントロン配列を含有する線状副産物をプルダウンするため、イントロン領域に対する６つの異なるオリゴマーを設計した：３’半分－イントロンに対するオリゴマー、及び５’半分－イントロンに対する２つのオリゴマー。各オリゴマーは、２３ヌクレオチドであり、ＴＥＧによって連結されているビオチンを有した。
【0389】
７．５ｍＭのＮＴＰの存在下でＤＮＡ鋳型からのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。デオキシリボヌクレアーゼで２０分間処理することにより、鋳型ＤＮＡを除去した。合成された線状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｔ２０５０）で精製した。自己スプライシングが転写中に生じ；さらなる／追加的な反応は必要でなかった。
【0390】
自己スプライスされたＲＮＡ（１ナノモル）を、２ナノモルの各オリゴと、全体で２．５ｍｌ中の１倍結合緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で混合した（最終ＲＮＡ濃度は４００ｎＭであり、オリゴマー濃度は各オリゴマー当たり８００ｎＭであった）。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を、７５℃で３分間の加熱の存在下又は非存在下で、ＲＴで３０分間インキュベートした。陰性対照として、オリゴマーを伴わないＲＮＡ混合物を使用した。バッチ精製法の場合、５００μｌのストレプトアビジン－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズを混合物に添加した。次に、混合物をミックスローター上、ＲＴで１時間インキュベートし、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズを遠心分離によってスピンダウンすることにより、非結合画分を収集した。カラム精製の場合、５００μｌのビーズを空のカラムに予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を充填された樹脂上に置いた。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって樹脂を通過させ、フロースルーを収集した。非結合又はフロースルーのＲＮＡ濃度をＱｕｂｉｔによって測定し、２００ｎｇのＲＮＡを尿素ＰＡＧＥによって分離し、ゲル染色を用いて染色し、画像処理システムを用いて可視化した。
【0391】
入力と比較した、環状ＲＮＡの濃縮における有意差は、バッチ精製法とカラム精製法との間で見出されなかった（例えば、それぞれレーン３及びレーン４対レーン６及びレーン７を参照されたい）（図７）。ＲＮＡ－オリゴマーの加熱及び冷却により、環状ＲＮＡの濃縮は増加しなかった。このデータは、線状ＲＮＡのプルダウン法（ＬＰ）の方法が、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズのカラム充填を通じてスケールアップ可能であることを示す。
【0392】
実施例５：連続的な線状ＲＮＡプルダウンは環状化効率が低い場合に環状ＲＮＡをさらに濃縮し得る
本実施例は、連続的な線状ＲＮＡプルダウンによる環状ＲＮＡの濃縮を実証し得る。
本実施例は、連続的な線状ＲＮＡプルダウンによる環状ＲＮＡの濃縮を実証し得る。
【0393】
本実施例において、構築物を、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ＯＲＦを含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計した。
【0394】
イントロン配列を含有する線状副産物をプルダウンするため、イントロン領域に対する６つの異なるオリゴマーを設計した：３’半分－イントロンに対する４つ、及び５’半分－イントロンに対する２つ。各オリゴマーは、２３ヌクレオチドであり、ＴＥＧによって連結されているビオチンを有した。
【0395】
７．５ｍＭのＮＴＰの存在下でＤＮＡ鋳型からのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。デオキシリボヌクレアーゼで２０分間処理することにより、鋳型ＤＮＡを除去した。合成された線状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｔ２０５０）で精製した。自己スプライシングが転写中に生じたが；さらなる／追加的な反応は必要でなかった。
自己スプライスされたＲＮＡ（１ナノモル）を、２ナノモルの各オリゴと、全体で２．５ｍｌ中の１倍結合緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で混合した（最終ＲＮＡ濃度は４００ｎＭであり、オリゴマー濃度は各オリゴマー当たり８００ｎＭであった）。ＲＮＡ－オリゴマー混合物をＲＴで３０分間インキュベートした。カラム精製の場合、５００μｌのビーズを空のカラムに予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を充填された樹脂上に置いた。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって樹脂を通過させ、フロースルーを収集した。収集したフロースルーを追加的なオリゴマーと混合し（最終で８００ｎＭ）、次に新たに予め充填された樹脂を通過させた。フロースルーを収集し、フロースルーの第１及び第２ラウンドの濃度をＱｕｂｉｔによって測定した。２００ｎｇのＲＮＡを尿素ＰＡＧＥによって分離し、ゲル染色を用いて染色し、画像処理システムを用いて可視化した。
自己スプライスされたＲＮＡ（１ナノモル）を、２ナノモルの各オリゴと、全体で２．５ｍｌ中の１倍結合緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で混合した（最終ＲＮＡ濃度は４００ｎＭであり、オリゴマー濃度は各オリゴマー当たり８００ｎＭであった）。ＲＮＡ－オリゴマー混合物をＲＴで３０分間インキュベートした。カラム精製の場合、５００μｌのビーズを空のカラムに予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を充填された樹脂上に置いた。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって樹脂を通過させ、フロースルーを収集した。収集したフロースルーを追加的なオリゴマーと混合し（最終で８００ｎＭ）、次に新たに予め充填された樹脂を通過させた。フロースルーを収集し、フロースルーの第１及び第２ラウンドの濃度をＱｕｂｉｔによって測定した。２００ｎｇのＲＮＡを尿素ＰＡＧＥによって分離し、ゲル染色を用いて染色し、画像処理システムを用いて可視化した。
【0396】
線状ＲＮＡプルダウンの第１ラウンドでは、環状ＲＮＡの１３０％の濃縮がなされた（図８、第１のＬＰ；環状ＲＮＡの純度が２３％から５４％に）。プルダウンの第２ラウンドの場合、追加的な濃縮がなされ、次に最終的に２００％を超える濃縮が達成された（図８、第２のＬＰ；環状ＲＮＡの純度が２３％から７２％に）。
【0397】
実施例６：異なる塩濃度による線状ＲＮＡプルダウンの最適化
本実施例は、環状ＲＮＡ濃縮に対する結合緩衝液における塩濃度の効果を、オリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによって実証する。
本実施例は、環状ＲＮＡ濃縮に対する結合緩衝液における塩濃度の効果を、オリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによって実証する。
【0398】
本実施例において、構築物を、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ＯＲＦを含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計した。ＯＲＦは、ｈＥＰＯ（ｈＥＰＯ、図９Ａの場合）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（スパイク、図９Ｂの場合）のいずれかであった。線状ＲＮＡの長さは、ｈＥＰＯ ＯＲＦの場合に約１．２Ｋｂであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＯＲＦの場合に約４．５Ｋｂであった（たとえＲＮＡのサイズが４．５Ｋｂであっても、６％尿素ＰＡＧＥ上で２Ｋｂのラダーとともに動く）。
【0399】
イントロン配列を含有する線状副産物をプルダウンするため、イントロン領域に対する６つの異なるオリゴマーを設計した：３’半分－イントロンに対する４つ、及び５’半分－イントロンに対する２つ。各オリゴマーは、２３ヌクレオチドであり、ＴＥＧによって連結されているビオチンを有した。
【0400】
７．５ｍＭのＮＴＰの存在下でＤＮＡ鋳型からのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。デオキシリボヌクレアーゼで２０分間処理することにより、鋳型ＤＮＡを除去した。合成された線状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｔ２０５０）で精製した。自己スプライシングが転写中に生じ；さらなる又は追加的な反応は必要でなかった。
【0401】
自己スプライスされたＲＮＡ（１ナノモル）を、２ナノモルの各オリゴと、全体で２．５ｍｌ中の１倍結合緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で混合した（最終ＲＮＡ濃度は４００ｎＭであり、オリゴマー濃度は各オリゴマー当たり８００ｎＭであった）。環状ＲＮＡ濃縮に対する塩濃度の効果を試験するため、５００ｍＭ、１０００ｍＭ及び２０００ｍＭのＮａＣｌ濃度についても試験した。ＲＮＡ－オリゴマー混合物をＲＴで３０分間インキュベートした。カラム精製の場合、５００μｌのビーズを空のカラムに予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を充填された樹脂上に置いた。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって樹脂を通過させ、フロースルーを収集した。フロースルーを収集し、フロースルー中のＲＮＡの濃度をＱｕｂｉｔによって測定した。２００ｎｇのＲＮＡを尿素ＰＡＧＥによって分離し、ゲル染色を用いて染色し、画像処理システムを用いて可視化した。
【0402】
１．２ＫｂのＲＮＡの場合、異なる塩条件下で環状ＲＮＡ濃縮に対する有意差は認められなかった（図９Ａ）。しかし、４．５ＫｂのＲＮＡの環状ＲＮＡ濃縮は、塩濃度が増加したとき、増加した（図９Ｂ）。１５０ｍＭのＮａＣｌにおいては６０％の濃縮がなされた（入力からの２０％の環状ＲＮＡ純度から３２％の環状ＲＮＡ純度へ）が、２０００ｍＭのＮａＣｌにおいては９０％の濃縮がなされた（入力からの２０％の環状ＲＮＡ純度から３８％の環状ＲＮＡ純度へ）。このデータは、線状ＲＮＡプルダウン（ＬＰ）において、より高い塩が長いＲＮＡの環状ＲＮＡ濃縮を改善し得ることを示す。
【0403】
実施例７：線状ＲＮＡプルダウン媒介性環状ＲＮＡ濃縮は下流工程精製後の環状ＲＮＡ発現を増強する
本実施例は、線状ＲＮＡプルダウン法によって精製されている環状ＲＮＡからの増強された発現を実証する。
本実施例は、線状ＲＮＡプルダウン法によって精製されている環状ＲＮＡからの増強された発現を実証する。
【0404】
本実施例において、構築物を、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ＯＲＦを含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計した。ＯＲＦは、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ、図１０の場合）又はｈＥＰＯ（図１１の場合）のいずれかであった。
【0405】
イントロン配列を含有する線状副産物をプルダウンするため、イントロン領域に対する６つの異なるオリゴマーを設計した：３’半分－イントロンに対する４つのオリゴマー、及び５’半分－イントロンに対する２つのオリゴマー。各オリゴマーは、２３ヌクレオチドであり、ＴＥＧによって連結されているビオチンを有した。
【0406】
７．５ｍＭのＮＴＰの存在下でＤＮＡ鋳型からのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。デオキシリボヌクレアーゼで２０分間処理することにより、鋳型ＤＮＡを除去した。合成された線状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｔ２０５０）で精製した。自己スプライシングが転写中に生じ；さらなる／追加的な反応は必要でなかった。
【0407】
自己スプライスされたＲＮＡ（１ナノモル）を、２ナノモルの各オリゴと、全体で２．５ｍｌ中の１倍結合緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で混合した（最終ＲＮＡ濃度は４００ｎＭであり、オリゴマー濃度は各オリゴマー当たり８００ｎＭであった）。ＲＮＡ－オリゴマー混合物をＲＴで３０分間インキュベートした。カラム精製の場合、５００μｌのビーズを空のカラムに予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を充填された樹脂上に置いた。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって樹脂を通過させ、フロースルーを収集した。収集したフロースルーを、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（１００Ｋカットオフ）によって水で緩衝液交換した。
【0408】
濃縮された環状ＲＮＡを異なる下流工程で精製した。対照として濃縮を伴わないインビトロ転写ＲＮＡを並行して精製した。
【0409】
Ｇｌｕｃをコードする環状ＲＮＡの場合、４つの異なる精製方法を試験した。第１の方法はカラム精製であり、濃縮された環状ＲＮＡをカラム精製した（Ｍｏｎａｒｃｈ）。第２の方法はゲル精製であった。Ｇｌｕｃをコードする濃縮された環状ＲＮＡを尿素ＰＡＧＥによって精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶出させ、エタノール沈殿し、ＲＮＡｓｅを含まない水に再懸濁した。第３の方法は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）であった。Ｇｌｕｃをコードする環状ＲＮＡを逆相クロマトグラフィーによって精製し、画分を、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（１００Ｋカットオフ）においてクエン酸ナトリウム、次いで水で緩衝液交換した。第４の方法は、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）であった。Ｇｌｕｃをコードする環状ＲＮＡをアニオン交換クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）（ＡＥＸ）によって精製し、画分を、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（１００Ｋカットオフ）において水で緩衝液交換した。比較として、インビトロ転写ＲＮＡにＲＰ及びＡＥＸ精製を施した。
【0410】
ｈＥＰＯをコードする環状ＲＮＡの場合、４つの異なる精製方法を試験した。第１の方法は、精製を行わず、緩衝液交換している環状ＲＮＡのみを使用した（ＢＥ）。第２の方法は、ゲル精製であった。ｈＥＰＯをコードする濃縮された環状ＲＮＡを尿素ＰＡＧＥによって精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶出させ、エタノール沈殿し、ＲＮＡｓｅを含まない水に再懸濁した。第３の方法は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）であった。ｈＥＰＯをコードする環状ＲＮＡを逆相クロマトグラフィーによって精製し、画分を、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（１００Ｋカットオフ）においてクエン酸ナトリウム、次いで水で緩衝液交換した。第４の方法は、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）であった。ｈＥＰＯをコードする環状ＲＮＡをアニオン交換クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）（ＡＥＸ）によって精製し、画分を、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（１００Ｋカットオフ）において水で緩衝液交換した。比較として、インビトロ転写ＲＮＡにゲル精製、ＲＰ及びＡＥＸ精製を施した。
【0411】
濃縮（ＬＰ）又は非濃縮（ＩＶＴ）環状ＲＮＡからのＧｌｕｃの発現を比較するため、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、０．１ピコモルの精製されている環状ＲＮＡをヒーラ細胞（９６ウェルプレート内で１０，０００細胞／ウェル）にトランスフェクトした。６時間、２４時間又は４８時間の時点で、細胞培地を収集した。Ｇｌｕｃ活性を測定するため、１０μｌの収集した細胞培地を白色９６ウェルプレートに移し、生物発光レポーターアッセイ系を製造業者の使用説明書に従って使用した（Ｐｉｅｒｃｅガウシアルシフェラーゼフラッシュアッセイキット、１６１５８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。プレートをルミノメーター装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）で読み取った。
【0412】
濃縮（ＬＰ）又は非濃縮（ＩＶＴ）環状ＲＮＡからのｈＥＰＯの発現を比較するため、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、０．２５ピコモルの精製されている環状ＲＮＡをヒーラ細胞（９６ウェルプレート内で１０，０００細胞／ウェル）にトランスフェクトした。２４時間又は４８時間の時点で、細胞培地を収集した。分泌されたｈＥＰＯタンパク質の量を、ｈＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、製造業者の使用説明書に従って測定した。
【0413】
Ｇｌｕｃ ＲＮＡ及びｈＥＰＯ ＲＮＡの両方において、線状ＲＮＡプルダウン（ＬＰ）を介して精製されている環状ＲＮＡは、濃縮を行わずに環状ＲＮＡを同じ方法を用いて精製した場合より優れた発現を示した（例えば、ＬＰ－ＲＰは、Ｇｌｕｃの場合にＩＶＴ－ＲＰより４倍超高い発現、またｈＥＰＯの場合に２倍高い発現を示した）。このデータは、本明細書に記載の方法を用いる環状ＲＮＡの濃縮が発現を増強することを示す。
【0414】
実施例８：オリゴマーの数が減少した線状ＲＮＡプルダウンは環状ＲＮＡを濃縮する
本実施例は、より少数のオリゴマーでオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによる、環状ＲＮＡの濃縮を実証する。
本実施例は、より少数のオリゴマーでオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによる、環状ＲＮＡの濃縮を実証する。
【0415】
本実施例において、構築物を、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ＯＲＦを含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計した。本実施例の場合、ＯＲＦはｈＥＰＯであり、ｈＥＰＯ ＯＲＦを有する線状ＲＮＡの長さは約１．４Ｋｂである。
【0416】
イントロン配列を含有する線状副産物を除去するための線状プルダウンの場合、イントロン領域に対する６つの異なるオリゴマーを設計した：３’半分－イントロンに対する４つのオリゴマー（＃１～＃４）、及び５’半分－イントロンに対する２つのオリゴマー（＃５及び＃６）（図１２）。各オリゴマーは、２３ヌクレオチドであり、ＴＥＧによって連結されているビオチンを有した。本実施例において、オリゴマーの数が減少した場合のプルダウン効率を試験した。
【0417】
第１の試験において、３’半分－イントロンに対するオリゴマーを試験した（＃１～＃４）。７．５ｍＭのＮＴＰの存在下でＤＮＡ鋳型からのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。デオキシリボヌクレアーゼで２０分間処理することにより、鋳型ＤＮＡを除去した。合成された線状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｔ２０５０）で精製した。自己スプライシングが転写中に生じ；さらなる又は追加的な反応は必要でなかった。
【0418】
自己スプライスされたＲＮＡ（２００ピコモル）を、３’半分－イントロンに対する各オリゴマー（＃１～＃４）と、２つの異なる濃度（２．４μＭ又は４．８μＭ）で、全体で５００μｌ中の１倍結合緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で混合した（最終ＲＮＡ濃度は４００ｎＭであった）。陰性対照として、オリゴマーを伴わないＲＮＡを使用した。陽性対照の場合、全部で６つのオリゴマー（＃１～＃６）の混合物を使用した。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。カラム精製の場合、５００μｌの樹脂を空のカラムに予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を充填された樹脂上に置いた。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって樹脂を通過させ、フロースルーを収集した。フロースルーのＲＮＡの濃度をＱｕｂｉｔによって測定し、２００ｎｇのＲＮＡを尿素ＰＡＧＥによって分離し、ゲル染色溶液を用いて染色し、画像処理システムを用いて可視化した。
【0419】
＃１及び＃２オリゴマーは、２．４μＭ及び４．８μＭの両方の濃度で、プルダウンに全部で６つのオリゴマーを使用する場合の陽性対照と比較して、類似の濃縮効率（図１３Ａ、６％ゲル）及び３’半分－イントロンの除去（図１３Ｂ、１０％ゲル）を示した。
【0420】
第２の試験において、３’半分－イントロン（＃１及び＃２）及び５’半分－イントロン（＃５及び＃６）の両方に対するオリゴの組み合わせを試験した。７．５ｍＭのＮＴＰの存在下でＤＮＡ鋳型からのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。デオキシリボヌクレアーゼで２０分間処理することにより、鋳型ＤＮＡを除去した。合成された線状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｔ２０５０）で精製した。自己スプライシングが転写中に生じ；さらなる又は追加的な反応は必要でなかった。
【0421】
自己スプライスされたＲＮＡ（２００ピコモル）を、＃５若しくは＃６オリゴと組み合わせた＃１オリゴマー、又は＃５若しくは＃６オリゴと組み合わせた＃２オリゴマーと、全体で５００μｌ中の１倍結合緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で混合した（最終ＲＮＡ濃度は４００ｎＭであった）（最終オリゴマー濃度はそれぞれ、２．４μＭである）。陰性対照として、オリゴマーを伴わないＲＮＡを使用した。さらなる対照として、＃１オリゴのみ又は＃５オリゴマーのみを使用した。陽性対照の場合、全部で６つのオリゴマー（＃１～＃６）の混合物を使用した。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。カラム精製の場合、５００μｌの樹脂を空のカラムに予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を充填された樹脂上に置いた。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって樹脂を通過させ、フロースルーを収集した。フロースルーのＲＮＡの濃度をＱｕｂｉｔによって測定し、２００ｎｇのＲＮＡを尿素ＰＡＧＥによって分離し、ゲル染色を用いて染色し、画像処理システムを用いて可視化した。
【0422】
３’半分－イントロン又は５’半分－イントロンに対する２つのオリゴの組み合わせは、類似する環状ＲＮＡ濃縮効率（図１４Ａ、６％ゲル）及び３’半分－イントロンに対する単一オリゴマーを使用するより優れたイントロン除去（図１４Ｂ、１０％ゲル）を示した。＃１及び＃５オリゴの組み合わせは、プルダウンに全部で６つのオリゴマーを使用する場合の陽性対照と比較して、類似する環状ＲＮＡ濃縮効率（図１４Ａ）及びイントロン除去効率（図１４Ｂ）を示した。これらのデータは、２つのオリゴマーの使用が６つのオリゴマーの使用と等しい環状ＲＮＡ濃縮及びイントロン除去効率を有することを示す。
【0423】
実施例９：数が減少したオリゴマーを用いる線状ＲＮＡプルダウン媒介性の環状ＲＮＡ濃縮が環状ＲＮＡの発現をもたらす
本実施例は、２つのオリゴマーを用いる線状ＲＮＡプルダウン法によって精製されている環状ＲＮＡからの発現を実証する。
本実施例は、２つのオリゴマーを用いる線状ＲＮＡプルダウン法によって精製されている環状ＲＮＡからの発現を実証する。
【0424】
本実施例において、構築物を、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ｈＥＰＯ ＯＲＦを含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計した。７．５ｍＭのＮＴＰの存在下でＤＮＡ鋳型からのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。デオキシリボヌクレアーゼで２０分間処理することにより、鋳型ＤＮＡを除去した。合成された線状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｔ２０５０）で精製した。自己スプライシングが転写中に生じ；追加的な反応は必要でなかった。
【0425】
イントロン配列を含有する線状副産物を除去するための線状プルダウンの場合、イントロン領域に対する６つの異なるオリゴマー（＃１～＃６）を実施例８に記載のとおりに設計した。
【0426】
自己スプライスされたＲＮＡ（２００ピコモル）を、＃１オリゴマー及び＃５若しくは＃６オリゴマー、又は＃２オリゴマー及び＃５若しくは＃６オリゴマーと、全体で５００μｌ中の１倍結合緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で混合した（最終ＲＮＡ濃度は４００ｎＭであった）（最終オリゴマー濃度はそれぞれ、２．４μＭである）。陰性対照として、オリゴマーを伴わないＲＮＡを使用した。別の対照として、＃１オリゴマーのみ又は＃５オリゴマーのみを使用した。陽性対照の場合、全部で６つのオリゴマー（＃１～＃６）の混合物を使用した。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。カラム精製の場合、５００μｌの樹脂を空のカラムに予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を充填された樹脂上に置いた。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって樹脂を通過させ、フロースルーを収集した。収集したフロースルーを、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（１００Ｋカットオフ）によって水で緩衝液交換した。
【0427】
異なるオリゴマーによる濃縮された（ＬＰ）環状ＲＮＡからのｈＥＰＯの発現を比較するため、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、０．２５ピコモルの精製された環状ＲＮＡを、ヒーラ細胞（９６ウェルプレート内で１０，０００細胞／ウェル）にトランスフェクトした。２４時間の時点で、細胞培地を収集した。分泌されたｈＥＰＯタンパク質の量を、ｈＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、製造業者の使用説明書に従って測定した。
【0428】
２つのオリゴマーを用いる線状プルダウン（ＬＰ）を介して精製されている環状ＲＮＡは、全部で６つのオリゴマー（＃１～＃６）を用いるＬＰを介して精製されている環状ＲＮＡと同等の発現を示した（図１５）。特に、データは、環状ＲＮＡの発現が、２つのオリゴマー（即ち、３’半分－イントロンに対するオリゴマー及び５’半分－イントロンに対するオリゴマー）の組み合わせを用いるＬＰを介して精製されている環状ＲＮＡから得られ、全部で６つのオリゴマーを用いるＬＰを介して精製されている環状ＲＮＡから認められた発現において同等であることを示す。
【0429】
実施例１０：３’半分－イントロンと５’半分－イントロンの両方を標的にする単一オリゴマーによる線状ＲＮＡプルダウン
本実施例は、３’半分－イントロンと５’半分－イントロンの両方を標的にする単一オリゴマーによるオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによる環状ＲＮＡの濃縮を実証する。
本実施例は、３’半分－イントロンと５’半分－イントロンの両方を標的にする単一オリゴマーによるオリゴ－ストレプトアビジン相互作用を介して線状副産物を捕捉することによる環状ＲＮＡの濃縮を実証する。
【0430】
本実施例において、構築物を、触媒イントロンの３’半分、エクソン断片２（Ｅ２）、ＯＲＦを含むポリリボヌクレオチドカーゴ、エクソン断片１（Ｅ１）、及び触媒イントロンの５’半分を含むように設計した。ＯＲＦはｈＥＰＯであり、線状ＲＮＡの長さは約１．４Ｋｂであった。
【0431】
本実施例において、２つのオリゴマーを設計した：オリゴ５－Ｂｉｏ＿１Ａ５は、＃１オリゴ（実施例８に記載される３’半分－イントロンに対するオリゴマー）とそれに続く＃５オリゴ（実施例８に記載される５’半分－イントロンに対するオリゴマー）からなる；オリゴ５－Ｂｉｏ＿５Ａ１は、＃５オリゴとそれに続く＃１オリゴからなる。５－Ｂｉｏ＿１Ａ５オリゴマーと５－Ｂｉｏ＿５Ａ１オリゴマーの両方は、異なるオリゴマー配列とＴＥＧによってオリゴマーに連結されている５’末端ビオチンとの間に、アデノシンリンカーの８つのヌクレオチドを有する。５－Ｂｉｏ＿１Ａ５及び５－Ｂｉｏ＿５Ａ１オリゴマーの概略図を図１６に提示する。
【0432】
７．５ｍＭのＮＴＰの存在下でＤＮＡ鋳型からのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。デオキシリボヌクレアーゼで２０分間処理することにより、鋳型ＤＮＡを除去した。合成された線状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｔ２０５０）で精製した。自己スプライシングが転写中に生じ；追加的な反応は必要でなかった。
【0433】
自己スプライスされたＲＮＡ（２００ピコモル）を、３’半分－イントロンと５’半分－イントロンの両方を標的にするオリゴマー５－Ｂｉｏ＿１Ａ５又は５－Ｂｉｏ＿５Ａ１（２．４μＭの濃度）と、５００μｌの全体積中の１倍結合緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で混合した（最終ＲＮＡ濃度は４００ｎＭであった）。陰性対照として、オリゴマーを伴わないＲＮＡを使用した。陽性対照の場合、全部で６つのオリゴマー（＃１～＃６）の混合物を使用した。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。カラム精製の場合、５００μｌの樹脂を空のカラムに予め充填し、ＲＮＡ－オリゴマー混合物を充填された樹脂上に置いた。ＲＮＡ－オリゴマー混合物を重力によって樹脂を通過させ、フロースルーを収集した。フロースルーのＲＮＡの濃度をＱｕｂｉｔによって測定し、２００ｎｇのＲＮＡを尿素ＰＡＧＥによって分離し、ゲル染色を用いて染色し、画像処理システムを用いて可視化した。
【0434】
５－Ｂｉｏ＿１Ａ５又は５－Ｂｉｏ＿５Ａ１を用いる線状プルダウン法を介して精製されている環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡ（図１７Ａ）及びイントロンＲＮＡ（図１７Ｂ）を効率的に除去した。環状ＲＮＡ濃縮効率（図１７Ａ）及びイントロン除去効率（図１７Ｂ）は、全部で６つのオリゴマーをプルダウンに使用する場合の陽性対照と類似していた。これらのデータは、３’半分－イントロンと５’半分－イントロンの両方を標的にするように設計されている単一オリゴマーを線状プルダウンに使用して、環状ＲＮＡを濃縮することで、６つのオリゴマーによるＬＰを用いることに匹敵する環状ＲＮＡ濃縮効率及びイントロン除去効率を得ることができる。
【0435】
他の実施形態
本発明がその具体的な実施形態と関連させて記載されている一方で、それがさらなる修飾が可能であり、本願が、一般に本発明の原則に従い、本発明が関連する当該技術分野内の公知の又は習慣的な実践の範囲に属するような本発明からの逸脱を含む、本発明の任意のバリエーション、使用、又は適応を包含することが意図され、記載される上述の必須の特徴に適用可能であり、請求項の範囲内に従うことは理解されるであろう。他の実施形態は、請求項の範囲内に含まれる。
本発明がその具体的な実施形態と関連させて記載されている一方で、それがさらなる修飾が可能であり、本願が、一般に本発明の原則に従い、本発明が関連する当該技術分野内の公知の又は習慣的な実践の範囲に属するような本発明からの逸脱を含む、本発明の任意のバリエーション、使用、又は適応を包含することが意図され、記載される上述の必須の特徴に適用可能であり、請求項の範囲内に従うことは理解されるであろう。他の実施形態は、請求項の範囲内に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【国際調査報告】