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▶ アケロ セラピューティクス，インコーポレイティドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-18
(54)【発明の名称】エフルキシフェルミンの薬学的組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/18 20060101AFI20241010BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241010BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20241010BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241010BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20241010BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20241010BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20241010BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20241010BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20241010BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20241010BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241010BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241010BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20241010BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20241010BHJP
A61P 19/06 20060101ALI20241010BHJP
A61P 25/30 20060101ALI20241010BHJP
A61P 39/02 20060101ALI20241010BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241010BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20241010BHJP
C07K 14/50 20060101ALN20241010BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20241010BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20241010BHJP
【ＦＩ】
A61K38/18
A61K47/68
A61K47/26
A61K47/18
A61K47/02
A61K47/12
A61K47/22
A61K47/14
A61K47/10
A61K47/38
A61P1/16
A61P3/10
A61P3/04
A61P3/06
A61P19/06
A61P25/30
A61P39/02
A61P43/00 105
A61P3/00
C07K14/50 ZNA
C07K16/00
C07K19/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024522698
(86)(22)【出願日】2022-10-12
(85)【翻訳文提出日】2024-06-10
(86)【国際出願番号】 US2022077968
(87)【国際公開番号】W WO2023064808
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】63/255,286
(32)【優先日】2021-10-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524141968
【氏名又は名称】アケロ セラピューティクス，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100203828
【弁理士】
【氏名又は名称】喜多村 久美
(72)【発明者】
【氏名】マリアナ エヌ．ディミトローバ
(72)【発明者】
【氏名】ティモシー ピー．ロルフ
(72)【発明者】
【氏名】ジーモン アイゼル
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ ボスティック
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA09
4C076AA11
4C076AA12
4C076AA29
4C076BB11
4C076BB16
4C076CC16
4C076CC41
4C076DD09
4C076DD26Z
4C076DD41Z
4C076DD42Z
4C076DD43Z
4C076DD50Z
4C076DD51
4C076DD60
4C076DD67
4C076EE23
4C076EE32
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF11
4C076FF36
4C076FF61
4C084AA02
4C084BA44
4C084DB54
4C084MA16
4C084MA27
4C084MA44
4C084MA66
4C084NA03
4C084NA10
4C084ZA701
4C084ZA751
4C084ZB211
4C084ZC211
4C084ZC311
4C084ZC331
4C084ZC351
4C084ZC371
4C084ZC391
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、エフルキシフェルミンを含む薬学的組成物、凍結乾燥組成物を調製するためのプロセス、並びに非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）若しくはアルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬ）、２型糖尿病、肥満、高トリグリセリド血症、脂質異常、タンパク質ミスフォールディング病、アルコール関連及び他の渇望若しくは中毒を治療するために、肝硬変を逆転させるか、又はＮＡＳＨ、ＡＳＨ、ＡＬＤ、ＡＦＬ、若しくはタンパク質ミスフォールディング病に関連する線維症を低減させるために、肝臓脂肪含有量を正常化するために、上昇した血糖を低下させるために、インスリン感受性を増加させるために、並びに／あるいは尿酸レベルを低下させるために使用する方法を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
薬学的組成物であって、（１）エフルキシフェルミン（ＥＦＸ）と、
（２）糖と、
（３）約２０～約２００ｍＭのアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ又はアルギニン／グルタミン酸と、
（４）界面活性剤と、を含み、
前記組成物が、約６．９～約８．１のｐＨを有する、組成物。
【請求項2】
ＥＦＸ濃度が、約２５～約１５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ＥＦＸ濃度が、約２８ｍｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＥＦＸ濃度が、約５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項5】
前記ＥＦＸ濃度が、約７０ｍｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項6】
前記ＥＦＸ濃度が、約１００ｍｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項7】
アルギニン／アルギニン－ＨＣｌを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
約２０ｍＭ～約２００ｍＭのアルギニン／アルギニン－ＨＣｌを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
約１２０ｍＭのアルギニン／アルギニン－ＨＣｌを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
約１：３０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ～約１：５０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌの比率でアルギニン／アルギニン－ＨＣｌを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
アルギニン／グルタミン酸を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
約２０ｍＭ～約２００ｍＭのアルギニン／グルタミン酸を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、リン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム／コハク酸、グルタミン酸ナトリウム／グルタミン酸、酢酸ナトリウム／酢酸、グリシルグリシン／グリシルグリシン－ＨＣｌ、ヒスチジン、又はクエン酸緩衝液を更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記糖が、スクロースである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
スクロース濃度が、約５０～約２２０ｍＭである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記スクロース濃度が、約１２０ｍＭである、請求項１５又は１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記糖が、グルコース、フルクトース、又はマルトースである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
前記界面活性剤が、ポリソルベート－２０又はポリソルベート－８０である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
界面活性剤濃度が、約０．００４％～約０．１％ｗ／ｖである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記組成物が、約７．３のｐＨを有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
前記組成物が、室温で≦５ｃＰの粘度を有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項23】
前記組成物が、約２～８℃の温度で少なくとも２１ヶ月間、液体として安定である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項24】
（１）約２５～１５０ｍｇ／ｍＬのエフルキシフェルミン（ＥＦＸ）と、（２）約１２０ｍＭのスクロースと、
（３）約１２０ｍＭのアルギニン／アルギニン－ＨＣｌと、
（４）約０．０６％重量／体積（ｗ／ｖ）のポリソルベート－２０と、
（５）約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌと、を含み、
前記組成物が、約７．３のｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項25】
液体組成物である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項26】
前記組成物がゲル製剤であり、前記糖がトレハロースである、請求項１に記載の組成物。
【請求項27】
トレハロース濃度が、約１８０～約２２０ｍＭである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
前記トレハロース濃度が、約２２０ｍＭである、請求項２６又は２７に記載の組成物。
【請求項29】
前記組成物が、－３０℃～－２０℃で最長２４ヶ月間保管された場合、約４０％以下のＥＦＸ荷電バリアント種を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項30】
前記組成物が、約２～８℃で最長９ヶ月間保管された場合、約４０％以下のＥＦＸ酸性荷電バリアント種を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項31】
前記組成物が、約２５℃で最長４週間保管された場合、約４０％以下のＥＦＸ酸性荷電バリアント種を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項32】
前記組成物が、約２５℃で最長４週間で、約２０％以下のＥＦＸサイズバリアント種を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項33】
前記組成物が、約２～８℃で最長１４ヶ月間保管された場合、約１０％以下のＥＦＸサイズバリアント種を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項34】
再構成された凍結乾燥組成物である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項35】
凍結乾燥組成物である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項36】
約１％以下の残留水分含有量を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項37】
前記組成物が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を更に含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項38】
前記ＰＥＧが、ＰＥＧ－４０００である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項39】
前記ＰＥＧ－４０００が、約０．０５％～約５％、任意選択で約０．１５％～約１．５％の濃度で存在する、請求項３８に記載の組成物。
【請求項40】
前記ＰＥＧ－４０００が、約０．５％の濃度で存在する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項41】
前記組成物が、カルボキシメチルセルロース又はヒドロキシプロピルメチルセルロースを更に含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項42】
（ｉ）前記カルボキシメチルセルロースが、カルボキシメチルセルロースナトリウムであるか、又は（ｉｉ）前記ヒドロキシプロピルメチルセルロースが、ヒドロキシプロピルメチルセルロースナトリウムである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項43】
前記カルボキシメチルセルロースナトリウムが、約０．０５％～約５％、任意選択で約０．１５％～約１．５％の濃度で存在する、請求項４２に記載の組成物。
【請求項44】
前記カルボキシメチルセルロースナトリウムが、約０．５％の濃度で存在する、請求項４３に記載の組成物。
【請求項45】
約８０ｍＭのアルギニン／グルタミン酸と、約８０ｍＭのスクロースと、を含む、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項46】
（ａ）請求項３５又は３６に記載の組成物を約５分以内に再構成して、再構成された組成物を得ることと、（ｂ）前記再構成された組成物を対象に投与することと、を含む、方法。
【請求項47】
工程（ａ）の前記再構成された組成物が、工程（ｂ）の前に最長１０分間室温で維持される、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
工程（ｂ）が、前記再構成された組成物を前記対象に皮下投与することを含む、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項49】
請求項３５又は３６に記載の組成物と、希釈剤と、を含む、デュアルチャンバデバイス。
【請求項50】
薬学的組成物であって、（１）エフルキシフェルミン（ＥＦＸ）と、
（２）２．９％のＬ－リジンと、
（３）０．００８％重量／体積（ｗ／ｖ）のポリソルベート－２０と、
（４）１０ｍＭのＴｒｉｓと、を含み、
前記組成物が、７．８±０．３のｐＨを有する、薬学的組成物。
【請求項51】
凍結乾燥組成物を調製するためのプロセスであって、（ａ）請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物を凍結することと、
（ｂ）約－５℃～約－２０℃の温度で工程（ａ）の前記組成物をアニールすることと、
（ｃ）工程（ｂ）の生成物を一次乾燥することと、
（ｄ）工程（ｃ）の生成物を二次乾燥させることと、を含む、プロセス。
【請求項52】
工程（ａ）における凍結することが、約－４０℃～約－５０℃の温度で行われる、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項53】
工程（ｂ）におけるアニールすることが、約５～約２０時間行われる、請求項５１又は５２に記載のプロセス。
【請求項54】
工程（ｂ）におけるアニールすることが、約－５℃～約－１０℃の温度で行われる、請求項５１～５３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項55】
工程（ｃ）における一次乾燥することが、約０．０８～０．２ｍｂａｒのチャンバ圧力で行われる、請求項５１～５３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項56】
工程（ｃ）における一次乾燥することが、約－５℃～－３０℃の温度で行われる、請求項５１～５４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項57】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬ）を治療する方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項58】
硬変を伴うＮＡＳＨを逆転させる方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項59】
アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）又はアルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬ）を治療する方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項60】
肝臓脂肪含有量を正常化することを必要とする対象において肝臓脂肪含有量を正常化する方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか１項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項61】
肝臓脂肪含有量が、＜５％の肝臓脂肪含有量に低減される、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
肝硬変を逆転させるか、又はＮＡＳＨ、ＡＳＨ、ＡＬＤ、ＡＦＬ、若しくはタンパク質ミスフォールディング病に関連する線維症を低減させる方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項63】
２型糖尿病を治療する方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項64】
肥満を治療する方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項65】
脂質異常症を治療する方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項66】
血糖を低下させる方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項67】
インスリン感受性を増加させる方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項68】
尿酸を低減させる方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項69】
渇望又は中毒を治療する方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項70】
タンパク質ミスフォールディング病を治療する方法であって、請求項１～３６又は５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項71】
前記タンパク質ミスフォールディング病が、嚢胞性線維症、α１アンチトリプシン欠損、又はトランスサイレチン型心アミロイドーシスである、請求項７０に記載の方法。
【請求項72】
ミスフォールドしたタンパク質コレクター分子を投与することを更に含む、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項73】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬ）を治療する方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項74】
硬変を伴うＮＡＳＨを逆転させる方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項75】
アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）又はアルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬ）を治療する方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項76】
肝臓脂肪含有量を正常化することを必要とする対象において肝臓脂肪含有量を正常化する方法であって、請求項３７～４５のいずれか１項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項77】
肝硬変を逆転させるか、又はＮＡＳＨ、ＡＳＨ、ＡＬＤ、ＡＦＬ、若しくはタンパク質ミスフォールディング病に関連する線維症を低減させる方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項78】
２型糖尿病を治療する方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項79】
肥満を治療する方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項80】
脂質異常症を治療する方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項81】
血糖を低下させる方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項82】
インスリン感受性を増加させる方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項83】
尿酸を低減させる方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項84】
渇望又は中毒を治療する方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項85】
タンパク質ミスフォールディング病を治療する方法であって、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照及び電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、２０２１年１０月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２５５，２８６号の優先権を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１０月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２５５，２８６号の優先権を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
参照によりその全体が組み込まれるのは、本明細書と同時に提出され、以下のように識別されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表である：５００１１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ＸＭＬ；サイズ：２，４９７バイト；作成日：２０２２年１０月９日。
【0003】
本開示は、エフルキシフェルミン（ＥＦＸ）を含む薬学的組成物、凍結乾燥組成物を調製するためのプロセス、及び使用方法に関する。
【背景技術】
【0004】
線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、脂質、炭水化物、及びタンパク質の代謝を調節するために肝臓、膵臓、筋肉、及び脂肪組織に作用する内分泌ホルモンである。パラクリンホルモンとして作用するヒトＦＧＦ２１はまた、ストレスから細胞を保護する上で重要な役割を果たす。これらの属性は、ＦＧＦ２１アゴニズムを説得力のある治療メカニズムにするが、天然のＦＧＦ２１は、血流中のその短い半減期によって制限される。Ｆｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質であるエフルキシフェルミン（ＥＦＸ）は、ヒトＦＧＦ２１の半減期を増加させるように遺伝子操作されている（Ｈｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１２；７（１１）：ｅ４９３４５、Ｓｔａｎｉｓｌａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２０１７；１５８（５）：１３１４－１３２７）。しかしながら、ＥＦＸの製剤は、電荷及びサイズバリアントの形成を含む翻訳後修飾を受けやすく、安定性の拘束をもたらす。当技術分野では、エフルキシフェルミン（ＥＦＸ）などのＦｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質の強化された安定化及び低減された翻訳後修飾を提供する医薬製剤が必要である。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、エフルキシフェルミン（ＥＦＸ）、糖、約２０～約２００ｍＭのアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ又はアルギニン／グルタミン酸、及び界面活性剤を含む薬学的組成物を提供する。様々な態様では、組成物は、約６．９～約８．１のｐＨを有する。様々な態様では、組成物の糖は、スクロース、グルコース、フルクトース、又はマルトースである。任意選択で、組成物の界面活性剤は、ポリソルベート－２０又はポリソルベート－８０である。様々な態様では、薬学的組成物は、約２５～１５０ｍｇ／ｍＬのＥＦＸ、約１２０ｍＭのスクロース、約１２０ｍＭのアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、約０．０６％の重量／体積（ｗ／ｖ）ポリソルベート－２０、及び約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む。任意選択で、組成物ｐＨは約７．３である。
【0006】
本開示の組成物は、様々な例において、凍結乾燥されるが、これは必須ではない。この点において、本開示は、本明細書に開示される凍結乾燥組成物を５分以内に再構成し、再構成された組成物を対象に投与するための方法を提供する。様々な実施形態では、再構成された組成物は、室温で最大１０分間維持される。本開示はまた、本明細書に開示される組成物及び希釈剤のいずれかを含むデュアルチャンバデバイスも提供する。ある特定の態様では、希釈剤は、注射用水又は緩衝剤（例えば、本明細書に開示される製剤に基づく複合緩衝液）である。
【0007】
本開示はまた、ＥＦＸ、２．９％のＬ－リジン、０．００８％重量／体積（ｗ／ｖ）のポリソルベート－２０、及び１０ｍＭのＴｒｉｓを含む薬学的組成物を提供する。様々な態様では、組成物は７．８±０．３のｐＨを有する。
【0008】
本開示はまた、凍結乾燥組成物を調製するためのプロセスを提供する。様々な態様では、プロセスは以下の工程：（ａ）本明細書に開示される組成物を凍結する工程と、（ｂ）工程（ａ）の組成物を約－５℃～約－１５℃の温度でアニールする工程と、（ｃ）工程（ｂ）の生成物を一次乾燥する工程と、（ｄ）工程（ｃ）の生成物を二次乾燥する工程と、を含む。
【0009】
本開示は、（ａ）非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）又はアルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬ）、２型糖尿病、肥満、脂質異常、アルコール関連及び他の渇望若しくは中毒、又はタンパク質ミスフォールディング病を、必要とする対象において治療する方法、（ｂ）対象において肝臓脂肪含有量を正常化する方法、（ｃ）ＮＡＳＨ、ＡＳＨ、ＡＬＤ、ＡＦＬ、又はタンパク質ミスフォールディング病に関連する肝硬化若しくは線維症を逆転させる方法、（ｄ）対象において血糖を低下させる及び／又はインスリン感受性を増加させる方法、並びに（ｅ）対象において尿酸レベルを低下させる方法を更に提供する。本方法は、本明細書に開示される薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0010】
前述の要約は、本発明の全ての態様を定義することを意図するものではなく、追加の態様は、詳細な説明などの他のセクションで説明される。文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせは、たとえ特徴の組み合わせが本明細書の同じ文章、又は段落、又はセクションで一緒に見出されなくても、企図されることが理解されるべきである。更に、本発明は、追加の態様として、特に上記の変形例よりも範囲が狭い本発明の全ての態様を含む。
【0011】
本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特に断りがない限り、オープンエンドの用語として解釈されるべきである。本発明の態様が特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」として記載される場合、態様はまた、特徴から「なる」又は「本質的になる」ことが企図される。本明細書に提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をよりよく例示することを意図しており、別段の請求がない限り、本開示の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる文言も、請求されていない要素を本開示の実践に不可欠であると示すものと解釈されるべきではない。操作例では、又は別段の指示がある場合を除いて、量を表す全ての数は、その用語が関連技術分野の当業者によって解釈されるであろうように、「約」という用語によって全ての例で修正されたものとして理解されるべきである。「ａ」又は「ａｎ」で記載又は特許請求される本発明の態様に関して、これらの用語は、文脈がより限定された意味を明確に必要としない限り、「１つ以上」を意味することが理解されるべきである。セット内の１つ以上として説明される要素に関して、セット内の全ての組み合わせが企図されることが理解されるべきである。
【0012】
また、値の範囲を説明するとき、本開示は、その範囲内に見出される個々の値を企図することも理解されたい。例えば、「約ｐＨ６～約ｐＨ８のｐＨ」は、ｐＨ６．１、６．６、７．２、７．５など、及びそのような値の間の任意の値であり得るが、これらに限定されない。本明細書に記載の範囲のいずれにおいても、範囲の端点は、範囲に含まれる。しかしながら、説明はまた、より低い端点及び／又はより高い端点が除外されるのと同じ範囲を企図する。「約」という用語を使用する場合、それは、その列挙された数のプラス又はマイナス５％、１０％、又はそれ以上を意味する。意図された実際のバリエーションは、コンテキストから決定可能である。
【0013】
本発明の追加の特徴及び変形は、図面及び詳細な説明を含む本出願の全体から当業者に明白であり、そのような特徴は全て本発明の態様として意図される。同様に、本明細書に記載の本発明の特徴は、特徴の組み合わせが本発明の態様として指定されるかどうかにかかわらず、本発明の態様としても意図される追加の態様に再結合することができる。文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせは、たとえ特徴の組み合わせが本明細書の同じ文章、又は段落、又はセクションで一緒に見出されなくても、企図されること（別々のセクションで説明されていても）が理解されるべきである。また、本明細書において本発明にとって重要であると記載されるそのような限定のみがそのようにみなされるべきであり、本明細書において重要であると記載されていない限定を欠く本発明の変形は、本発明の態様として意図される。セクション見出しの使用は、単に読む便宜のためであり、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ジスルフィド結合及びポリペプチド鎖を有するＥＦＸ概略構造を示す。
【図2A】ｐＨ≦６．５での様々な製剤におけるＥＦＸの視覚的に観察されたゲル形成及びシュリーレン相分離を示す。
【図2B】ｐＨ≦６．５での様々な製剤におけるＥＦＸの視覚的に観察されたゲル形成及びシュリーレン相分離を示す。
【図3】４００秒－１の剪断速度及び時間ゼロでの製剤Ｆ１～Ｆ２０（Ｆ１１を除く）中のＥＦＸ１００ｍｇ／ｍＬの初期動的粘度を示す。
【図4A】４０℃／７５％相対湿度（ＲＨ）で３日間、続いて２～８℃で１０秒－１の剪断速度にて２１ヶ月間保管後の製剤Ｆ１～Ｆ２０（Ｆ１１を除く）中のＥＦＸの動的粘度を示す（図４Ｂは、０～５０ｃＰの拡大図である）。
【図4B】４０℃／７５％相対湿度（ＲＨ）で３日間、続いて２～８℃で１０秒－１の剪断速度にて２１ヶ月間保管後の製剤Ｆ１～Ｆ２０（Ｆ１１を除く）中のＥＦＸの動的粘度を示す（図４Ｂは、０～５０ｃＰの拡大図である）。
【図6】Ｔｒｉｓ／Ｌｙｓ製剤Ｆ１８中のＥＦＸの実施例ＡＥＸ ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図7】撮像されたキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）によって分離されたＥＦＸ製剤Ｆ１８における電荷バリアントの分布を示す。
【図8A】図８Ａは、様々な製剤における２５℃での時間の関数としてＡＥＸ－ＨＰＬＣによって測定される、ＥＦＸ電荷バリアントの形成を示す。Ｆ３３中のＥＦＸは、経時的な最低の純度損失の速度（メインピーク面積に対する％として）を示す。
【図9】時間の関数としてＡＥＸ－ＨＰＬＣによって測定される、ＥＦＸ電荷バリアントの形成を示す。アッセイは、５℃の目標温度で実施し、２～８℃の温度範囲を表す結果を提供した。Ｆ３３中のＥＦＸは、経時的に最も緩慢な純度損失の速度（メインピーク面積の減少％として）を示す。
【図10】製剤Ｆ１８におけるＥＦＸのサイズ排除ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図11】様々な製剤のＳＥ－ＨＰＬＣによって定量された、２５℃で保管したときのＥＦＸのサイズバリアント（ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳ）の形成を示す。Ｆ３３中のＥＦＸは、試験した製剤の最低の１週間当たりの純度損失の速度を例証した。
【図12】様々な製剤のＳＥ－ＨＰＬＣによって定量された、２～８℃で保管したときのＥＦＸのサイズバリアント（ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳ）の形成を示す。Ｆ３３中のＥＦＸは、試験した製剤において最低の純度損失の速度を例証した。
【図13】ＥＦＸ（Ｆ１８）の非還元ＣＥ－ＳＤＳの例示的な電気泳動図である。
【図14】２５℃での保管中の様々な製剤における、ＣＥ－ＳＤＳ（非還元）によるＥＦＸのサイズバリアント（ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳ）を示す。Ｆ３３中のＥＦＸは、試験した製剤中で最低の純度損失の速度を例証した。
【図15】２～８℃での保管中の様々な製剤におけるＣＥ－ＳＤＳ（非還元）によるＥＦＸのサイズバリアントを示す。
【図16】逆相ＨＰＬＣによるＥＦＸの分析を示す。
【図17】ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した、２５℃で保管したＥＦＸの様々な製剤におけるサイズバリアント（ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳ）の形成を示す。Ｆ１８及びＦ３３中のＥＦＸは、最も緩慢な純度損失の速度を例証した。
【図18】ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した、２～８℃でのＥＦＸの様々な製剤におけるサイズバリアント（ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳ）の形成を示す。Ｆ１８及びＦ３３中のＥＦＸは、最も遅い純度損失率を例証した。
【図19】二量体及びＨＭＷ種に対応するメインピーク及びピークを示す、Ｆ１８中のＥＦＸのＳＥＣ－ＭＡＬＬＳクロマトグラムを示す。
【図20】ＳＶ－ＡＵＣによって分析されたＦ１８及びＦ３３中のＥＦＸの沈降係数分布プロファイルを示す。
【図21】ｉＬｉｔｅ ＦＧＦ２１細胞ベースの効力バイオアッセイによって測定した、Ｆ１８中のＥＦＸの濃度応答曲線を示す。表示されるデータは、単一プレート上に三連でプレートされたＥＦＸ希釈物の平均ＲＬＵ（相対発光量）である。エラーバーは、三連ＲＬＵ値の標準偏差を示す。
【図22】時間の関数として、ＥＦＸ標準と比較して、２５℃で保管された様々な製剤における、細胞ベースのバイオアッセイによるＥＦＸの効力を示す。Ｆ３３中のＥＦＸは、最低の効力損失率を例証した。
【図23】時間の関数として、ＥＦＸ標準と比較して、２～８℃で保管された様々な製剤における、細胞ベースのバイオアッセイによるＥＦＸの効力を示す。Ｆ３３中のＥＦＸは、試験した製剤のうちで最も低い力価損失率を例証した。
【図24】Ｆ１８及びＦ３３製剤におけるＥＦＸの二次微分ＦＴＩＲスペクトルを示す。
【図25】製剤Ｆ１８及びＦ３３中のＥＦＸの遠紫外ＣＤスペクトルを示す。
【図26】Ｆ１８及びＦ３３中のＥＦＸの近紫外ＣＤスペクトルを示す。
【図28】５０℃に２回加熱したＥＦＸ Ｆ１８及びＦ３３のμＤＳＣサーモグラムを示す。
【図29】アニーリング（バイアル）なしの凍結乾燥プロセス設計の例を示す。
【図30A】－１０℃で５時間行われたアニーリングプロセス工程（図３０Ａ：バイアル）及び－１５℃で１０時間行われたアニーリングプロセス工程（図３０Ｂ：デュアルチャンバデバイス）を有する凍結乾燥プロセス設計の例を示す。
【図30B】－１０℃で５時間行われたアニーリングプロセス工程（図３０Ａ：バイアル）及び－１５℃で１０時間行われたアニーリングプロセス工程（図３０Ｂ：デュアルチャンバデバイス）を有する凍結乾燥プロセス設計の例を示す。
【図31】選択された製剤における凍結乾燥ＥＦＸの再構成時間を示す。
【図32】凍結乾燥プロセスにアニーリング工程を組み込んだ後の（－５℃で１０時間）、バイアル中の凍結乾燥Ｆ３３の再構成時間を示す。
【図33A】凍結乾燥プロセスにアニーリング工程を組み込んだ後（－１５℃で１０時間）の、デュアルチャンバデバイスにおける凍結乾燥Ｆ３３の再構成時間を示す。
【図33B】凍結乾燥プロセスにアニーリング工程を組み込んだ後（－１５℃で１０時間）の、デュアルチャンバデバイスにおける凍結乾燥Ｆ３３の再構成時間を示す。
【図34】ＢＥＴ（Ｂｒｕｎａｕｅｒ、Ｅｍｍｅｔｔ及びＴｅｌｌｅｒ法）によって測定した、アニーリング工程を伴うか、又は伴わずに凍結乾燥することによって、Ｆ３３と同じ成分を含むが、異なる濃度のＥＦＸ（Ｆ１：５０ｍｇ／ｍｌ ＥＦＸ；Ｆ２：２８ｍｇ／ｍｌのＥＦＸ）を有する製剤から生成した凍結乾燥ケーキの比表面積を示す。凍結乾燥中にアニーリング工程なしで生成されたケーキ（ＮＡプロセス設計）と比較して、凍結乾燥中に－５℃で１０時間又は－１０℃で５時間のアニーリング工程のいずれかを使用して凍結乾燥ケーキを生成した。
【図35】ＳＥＭ－ＥＤＸ分析のための凍結乾燥ケーキの断片を示す。
【図36】箱ひげ図（Ｂｏｘ－ａｎｄ－Ｗｈｉｓｋｅｒ ｐｌｏｔｓ）として提示されるＳＥＭ－ＥＤＸによる凍結乾燥ケーキ孔の分布及び中央断面積を示す。
【図37】凍結乾燥サイクルにアニーリング工程を組み込むことによって、ＳＥＭによる凍結乾燥ケーキの構造が改善されることを示す。ＦＲ１及びＦＲ２は、それぞれ、５０ｍｇ／ｍＬ及び２８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度での製剤Ｆ３３を表す。
【図38-1】製剤Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、及びＦ３３中の２５℃での凍結乾燥ＥＦＸの長期安定性の表を示す。
【図38-2】製剤Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、及びＦ３３中の２５℃での凍結乾燥ＥＦＸの長期安定性の表を示す。
【図39】実施例７に記載されるように、様々な製剤でラットに投与されるＥＦＸの持続性を示す折れ線グラフである。濃度（ｎｇ／ｍＬ）はｙ軸に示され、時間（時間）はｘ軸に示される。
【図40】実施例に記載の様々な製剤において投与されるＥＦＸの全身曝露（ＡＵＣ）及び全身循環における最高濃度（Ｃｍａｘ）を示す薬物動態パラメータを要約する図表である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
ＥＦＸは、Ｆｃドメインに融合したＦＧＦ２１バリアントである。驚くべきことに、ＥＦＸは、タンパク質の製剤及び保管を複雑にする独自の特性を示す。親の注射可能な生物製剤は、脱アミドなどの翻訳後修飾を最小限に抑えるために、わずかに酸性～中性のｐＨ（例えば、ｐＨ５．２～ｐＨ６．９）でしばしば製剤化される。予想外に、ＥＦＸは、６．５未満のｐＨで劇的に異なる粘弾性特性を採用し、ゲル様挙動、相分離、及び流動性の損失を示す。これらの特徴は、製品の皮下投与及び注射可能な生物製剤の開発を困難にする。更に、ｐＨ６．９以下では、ＥＦＸ組成物は、タンパク質凝集及びクリッピング／断片化の傾向、並びに可視粒子及びサブビジブル粒子の形成を示した。これらの変化は、安全性（特に免疫原性）及び安定性の懸念に関連する可能性があるため、注射可能な生物製剤にとっても望ましくない。本明細書に記載の材料及び方法は、例えば、冷蔵条件下（２～８℃）で液体として、及び冷蔵及び周囲条件下（２５℃）で凍結親和性として、注射に適し、保管時に安定したＥＦＸの製剤を提供することによって、重要な技術的利点を提供する。本開示の様々な態様では、本明細書に記載の製剤は、（例えば、相分離、剛性ゲル形成、非ニュートン粘弾性挙動、及び凝集及び／又は粒子形成を防止又は最小化することによって）強化されたＥＦＸ立体配座安定性を提供し、翻訳後修飾（例えば、電荷及び／又はサイズバリアント）を低減し、ＥＦＸ組成物に有益な溶液特性を付与する。
【0016】
定義
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。
【0017】
「ＡＥＸ ＨＰＬＣ」は、アニオン交換高速液体クロマトグラフィーを指す。
【0018】
「ＡＳＨ」は、アルコール性脂肪性肝炎を指す。
【0019】
「ＡＬＤ」は、アルコール性肝疾患を指す。
【0020】
「ＡＦＬ」は、アルコール性脂肪性肝疾患を指す。
【0021】
「ＢＥＴ」は、ブルナウアー・エメット・テラー法を指す。
【0022】
「ＣＥ－ＳＤＳ」は、ドデシル硫酸ナトリウムを用いたキャピラリー電気泳動を指す。
【0023】
「ＥＦＸ」は、エフルキシフェルミンを指す。
【0024】
「ＨＭＷＳ」は、高分子量種を指す。
【0025】
「ｉｃＩＥＦ」は、イメージングキャピラリー等電点電気泳動を指す。
【0026】
「ＬＭＷＳ」は、低分子量種を指す。
【0027】
「ＮＡＦＬ」は、非アルコール性脂肪性肝疾患を指す。
【0028】
「ＮＡＳＨ」は、非アルコール性脂肪性肝炎を指す。
【0029】
「ＲＨ」は、相対湿度を指す。
【0030】
「ＲＰ－ＨＰＬＣ」は、逆相高速液体クロマトグラフィーを指す。
【0031】
「ＳＥ－ＨＰＬＣ」は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィーを指す。
【0032】
「ＳＥＭ－ＥＤＸ」は、走査型電子顕微鏡エネルギー分散型Ｘ線分光法を指す。
【0033】
「ＳＶ－ＡＵＣ」は、超遠心沈降速度法を指す。
【0034】
「ｐＩ」は、等電点を指す。
【0035】
本開示は、エフルキシフェルミンを含む薬学的組成物を提供する。様々な態様では、組成物は、ＥＦＸ、糖、アルギニン／アルギニン－ＨＣｌ又はアルギニン／グルタミン酸（例えば、約２０～２００ｍＭの濃度）、及び界面活性剤を含む。組成物は、約６．９～約８．１のｐＨを有する。代替的な態様では、組成物は、ＥＦＸ、Ｌ－リジン、界面活性剤（例えば、ポリソルベート－２０）、及びＴｒｉｓを約７．８±０．３のｐＨで含む。また、ＥＦＸを含む凍結乾燥組成物を調製するための方法も提供される。本開示は、本明細書に記載の薬学的組成物を、様々な障害、例えば（限定されないが）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）若しくはアルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬ）、２型糖尿病、肥満、高トリグリセリド血症、脂質異常、タンパク質ミスフォールディング病、渇望及び中毒を治療するために、並びにＮＡＳＨに関連する線維症を低減させるために、肝硬変を逆転させるか、又はＮＡＳＨ、ＡＳＨ、ＡＬＤ、ＡＦＬ、若しくはタンパク質ミスフォールディング病に関連する線維症を低減させるために、肝臓脂肪含有量を正常化するために、血糖を低下させるために、インスリン感受性を増加させるために、及び／あるいは尿酸レベルを低下させるために使用する方法を提供する。組成物及び方法の様々な態様は、以下により詳細に記載される。小見出しの使用は、単に読者の便宜のためであり、いかなる方法でも本開示を限定するものと解釈されるべきではない。文書全体は、統一された開示として読まれることが意図され、以下に説明される特徴の全ての組み合わせが企図される。
【0036】
ＥＦＸは、ポリグリシンセリンリンカーを介してヒトＦＧＦ２１のバリアントにヒト免疫グロブリンＩｇＧ１ Ｆｃ断片を融合させることによって生成される９２．１ｋＤａの長時間作用型線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）類似体である。各分子は、１つの二量体Ｆｃドメイン及び２つの修飾ＦＧＦ２１ポリペプチド鎖を含有する。ＥＦＸは、図１に記載されているように、８つのジスルフィド結合、６つの鎖内結合、及び２つの鎖間結合を有している。２つの鎖内ジスルフィド結合は、Ｃｙｓ３１８とＣｙｓ３３６との間のＦＧＦ２１ポリペプチドにあり、各モノマーに対して１つである。３つの修飾を、Ｌ３４１Ｒ、Ｐ４１４Ｇ、及びＡ４２３ＥでＦＧＦ２１配列に導入した（成熟したヒトＦＧＦ２１に対して、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、及びＡ１８０Ｅに対応する）。これらの修飾は、１）インビボタンパク質分解性劣化に対する感受性を低下させ、２）β－Ｋｌｏｔｈｏに対する親和性を高め、３）凝集する傾向を減少させる（Ｈｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１２；７（１１）：ｅ４９３４５、Ｓｔａｎｉｓｌａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２０１７；１５８（５）：１３１４－１３２７）。
【0037】
ＥＦＸは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む。ＥＦＸは、米国特許第８，０３４，７７０号、同第８，４１０，０５１号、同第８，６４２，５４６号、同第８，３６１，９６３号、同第９，２７３，１０６号、同第１０，０１１，６４２号、同第８，１８８，０４０号、同第８，８３５，３８５号、同第８，７９５，９８５号、同第８，６１８，０５３号、並びに同第１１，０７２，６４０号、又は国際特許公開第ＷＯ２００９１４９１７１号及び同第ＷＯ２０１０１２９５０３号に更に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0038】
ＥＦＸは、任意の好適な量で薬学的組成物中に存在してもよい。様々な態様では、薬学的組成物中のＥＦＸの濃度は、約２５ｍｇ／ｍｌ～約１５０ｍｇ／ｍｌである。例えば、薬学的組成物中のＥＦＸの濃度は、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、又は少なくとも約７０ｍｇ／ｍｌ、かつ約１５０ｍｇ／ｍｌ以下、約１４０ｍｇ／ｍｌ以下、約１３０ｍｇ／ｍｌ以下、約１２０ｍｇ／ｍｌ以下、約１１０ｍｇ／ｍｌ以下、又は約１００ｍｇ／ｍｌ以下である。例示的な態様では、組成物は、約２８ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＦＸを含む。例示的な態様では、組成物は、約５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＦＸを含む。例示的な態様では、組成物は、約７０ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＦＸを含む。例示的な態様では、組成物は、約１００ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＦＸを含む。
【0039】
ＥＦＸを含む薬学的組成物は、液体、凍結乾燥、又はゲル製剤であってもよい。
【0040】
本明細書に記載の薬学的組成物は、糖を含む。好適な糖としては、スクロース、フルクトース、マルトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。糖は、組成物中に、約１０ｍＭ～約２５０ｍＭ、又は約２０ｍＭ～約２２０ｍＭ、又は約５０ｍＭ～約２２０ｍＭ、又は約８０～約２２０ｍＭ、又は約１２０ｍＭの濃度で存在してもよい。いくつかの態様では、薬学的組成物中の糖の濃度は、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約６０ｍＭ、少なくとも約７０ｍＭ、少なくとも約８０ｍＭ、少なくとも約９０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１１０ｍＭ、又は少なくとも約１２０ｍＭ、かつ約２５０ｍＭ以下、約２４０ｍＭ以下、約２３０ｍＭ以下、約２２０ｍＭ以下、約２１０ｍＭ以下、約２００ｍＭ以下、約１９０ｍＭ以下、約１８０ｍＭ以下、約１７０ｍＭ以下、約１６０ｍＭ以下、約１５０ｍＭ以下、約１４０ｍＭ以下、又は約１３０ｍＭ以下である。
【0041】
任意選択で、本明細書に記載の薬学的組成物は、約５０ｍＭ、約８０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、約１２０ｍＭ、又は約１２５ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１３５ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１４５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１５５ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１６５ｍＭ、約１７５ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１８５ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２１０ｍＭ、約２１５ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２３０ｍＭ、又は約２３５ｍＭの濃度の糖を含む。
【0042】
様々な態様では、薬学的組成物は、液体又は凍結乾燥形態である。例示的な液体又は凍結乾燥薬学的組成物（例えば、本明細書に記載の液体製剤のいずれかを凍結乾燥することによって調製される凍結乾燥形態）は、約５０ｍＭ～約２２０ｍＭ、例えば、約８０ｍＭ又は約１２０ｍＭの濃度のスクロースを含む。
【0043】
様々な態様では、糖はトレハロースである。例えば、いくつかの態様では、薬学的組成物はゲル製剤であり、糖はトレハロースである。例示的なゲル製剤は、約１８０ｍＭ～約２５０ｍＭ、例えば２２０ｍＭの濃度のトレハロースを含む。
【0044】
様々な態様では、薬学的製剤は、アミノ酸、例えば、アルギニン、アルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、アルギニン／グルタミン酸、グリシン、グルタミン、アスパラギン、又はリジンを含む。様々な態様では、組成物は、アルギニン／アルギニン－ＨＣｌを含む。様々な態様では、アルギニン／アルギニン－ＨＣｌは、約１：１０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ～約１：１００のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌの比率で存在する。いくつかの態様では、アルギニン／アルギニン－ＨＣｌは、約１：３０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ～約１：５０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌの比率で存在する。様々な態様では、アルギニン／アルギニン－ＨＣｌは、約１：１０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、約１：２０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、約１：３０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、約１：４０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、約１：５０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、約１：６０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、約１：７０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、約１：８０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、約１：９０のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、又は約１：１００のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌの比率で存在する。様々な態様では、組成物は、約２０ｍＭ～約２００ｍＭのアルギニン／アルギニン－ＨＣｌを含む。例えば、薬学的組成物中のアルギニン／アルギニン－ＨＣｌの濃度は、様々な態様では、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約５５ｍＭ、少なくとも約６０ｍＭ、少なくとも約６５ｍＭ、少なくとも約７０ｍＭ、少なくとも約７５ｍＭ、少なくとも約８０ｍＭ、少なくとも約８５ｍＭ、少なくとも約９０ｍＭ、少なくとも約９５ｍＭ、又は少なくとも約１００ｍＭ、かつ約２００ｍＭ以下、約１８０ｍＭ以下、約１７５ｍＭ以下、約１６０ｍＭ以下、約１５５ｍＭ以下、約１５０ｍＭ以下、約１４５ｍＭ以下、約１４０ｍＭ以下、約１３５ｍＭ以下、約１３０ｍＭ以下、約１２５ｍＭ以下、約１２０ｍＭ以下、約１１０ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下、約９０ｍＭ以下、約８０ｍＭ以下、約７０ｍＭ以下、又は約６０ｍＭ以下である。本開示の代表的な態様では、組成物は約１２０ｍＭのアルギニン／アルギニン－ＨＣｌを含む。本開示の別の代表的な態様では、組成物は約８０ｍＭのアルギニン／アルギニン－ＨＣｌを含む。様々な態様では、薬学的組成物は、ゲル形態である。例示的なゲル薬学的組成物は、１つ以上のアミノ酸を含まない（すなわち、アルギニン、アルギニン／アルギニン－ＨＣｌ、アルギニン／グルタミン酸、グリシン、グルタミン、アスパラギン、又はリジンなどのアミノ酸を含有しない）。
【0045】
様々な態様では、組成物は、アルギニン／グルタミン酸又はアルギニン／グルタミン酸塩を含む。本明細書で使用される場合、「グルタミン酸」及び「グルタミン酸塩」は、互換的に使用され得る。様々な態様では、アルギニン／グルタミン酸は、約１：１０のアルギニン／グルタミン酸～約１：１００のアルギニン／グルタミン酸の比率で存在する。様々な態様では、アルギニン／グルタミン酸は、約１：１０のアルギニン／グルタミン酸、約１：２０のアルギニン／グルタミン酸、約１：３０のアルギニン／グルタミン酸、約１：４０のアルギニン／グルタミン酸、約１：５０のアルギニン／グルタミン酸、約１：６０のアルギニン／グルタミン酸、約１：７０のアルギニン／グルタミン酸、約１：８０のアルギニン／グルタミン酸、約１：９０のアルギニン／グルタミン酸、又は約１：１００のアルギニン／グルタミン酸の比率で存在する。いくつかの態様では、アルギニン／グルタミン酸は、約１：３０のアルギニン／グルタミン酸～約１：５０のアルギニン／グルタミン酸の比率で存在する。
【0046】
様々な態様では、組成物は、約２０ｍＭ～約２００ｍＭのアルギニン／グルタミン酸を含む。例えば、薬学的組成物中のアルギニン／グルタミン酸の総濃度は、任意選択で、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭ、又は少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約５５ｍＭ、少なくとも約６０ｍＭ、少なくとも約６５ｍＭ、少なくとも約７０ｍＭ、少なくとも約７５ｍＭ、少なくとも約８０ｍＭ、少なくとも約８５ｍＭ、少なくとも約９０ｍＭ、少なくとも約９５ｍＭ、又は少なくとも約１００ｍＭ、かつ約２００ｍＭ以下、約１８０ｍＭ以下、約１７５ｍＭ以下、約１７０ｍＭ以下、約１６５ｍＭ以下、約１６０ｍＭ以下、約１５５ｍＭ以下、約１５０ｍＭ以下、約１４５ｍＭ以下、約１４０ｍＭ以下、約１３５ｍＭ以下、約１３０ｍＭ以下、約１２５ｍＭを超え、約１２０ｍＭ以下、約１１５ｍＭ以下、約１１０ｍＭ以下、約１０５ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下、約９０ｍＭ以下、約８０ｍＭ以下、約７０ｍＭ以下、又は約６０ｍＭ以下である。例示的な態様では、組成物は、８０～１５０ｍＭ又は９０～１５０ｍＭの範囲内、例えば、約８０ｍＭ又は約１２０ｍＭの総濃度でアルギニン／グルタミン酸を含む。
【0047】
様々な態様では、アミノ酸は、リジン（例えば、Ｌ－リジン又はＬ－リジン－ＨＣｌ）である。Ｌ－リジンに関する本明細書の任意の開示はまた、リジン－ＨＣｌにも適用される。様々な態様では、組成物は約０．１％～１０％のリジンを含む。例えば、薬学的組成物中のリジンの濃度は、任意選択で、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、又は少なくとも約２％、かつ約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約４％以下、又は約３％以下である。例示的な態様では、組成物は、約２．９％の濃度のリジンを含む。様々な態様では、組成物は約６．８ｍＭ～６８４．０ｍＭのＬ－リジンを含む。例えば、薬学的組成物中のＬ－リジンの濃度は、任意選択で、少なくとも約６．８ｍＭ、少なくとも約３４．２ｍＭ、少なくとも約６８．４ｍＭ、少なくとも約１０２．６ｍＭ、又は少なくとも約１３６．８ｍＭ、かつ約６８４．０ｍＭ以下、約６１５．６ｍＭ以下、約５４７．２ｍＭ以下、約４７８．８ｍＭ以下、約４１０．４ｍＭ以下、約２７３．６ｍＭ以下、又は約２０５．２ｍＭ以下である。例示的な態様では、組成物は、約１９８．３ｍＭの濃度のＬ－リジンを含む。様々な態様では、組成物は、約５．５ｍＭ～５４７．５ｍＭのリジン－ＨＣｌを含む。例えば、薬学的組成物中のリジン－ＨＣｌの濃度は、任意選択で、少なくとも約５．５ｍＭ、少なくとも約２７．４ｍＭ、少なくとも約５４．８ｍＭ、少なくとも約８２．１ｍＭ、又は少なくとも約１０９．５ｍＭ、かつ約５４７．５ｍＭ以下、約４９２．７ｍＭ以下、約４３８．０ｍＭ以下、約３８３．２ｍＭ以下、約３２８．５ｍＭ以下、約２１８．０ｍＭ以下、又は約１６４．２ｍＭ以下である。例示的な態様では、組成物は、約１５８．８ｍＭの濃度のリジン－ＨＣｌを含む。
【0048】
様々な態様では、組成物は、Ｔｒｉｓ（トロメタミン）及び／又はＴｒｉｓ－ＨＣｌなどのアルカリ化緩衝剤を含む。本明細書で使用される場合、「Ｔｒｉｓ」及び「トロメタミン」は、互換的に使用され得る。様々な態様では、組成物は約１～５０ｍＭのＴｒｉｓを含む。例えば、薬学的組成物中のＴｒｉｓの濃度は、任意選択で、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、かつ約１５ｍＭ以下、約２０ｍＭ以下、約２５ｍＭ以下、約３０ｍＭ以下、約３５ｍＭ以下、約４０ｍＭ以下、約４５ｍＭ以下、又は約５０ｍＭ以下である。例示的な態様では、組成物は、約１０ｍＭの濃度のＴｒｉｓを含む。様々な態様では、組成物は約１～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む。例えば、薬学的組成物中のＴｒｉｓ－ＨＣｌの濃度は、任意選択で、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、かつ約１５ｍＭ以下、約２０ｍＭ以下、約２５ｍＭ以下、約３０ｍＭ以下、約３５ｍＭ以下、約４０ｍＭ以下、約４５ｍＭ以下、又は約５０ｍＭ以下である。例示的な態様では、組成物は、約１０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む。様々な態様では、組成物は、約１～５０ｍＭのＴｒｉｓ及び１～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌの両方を含む。
【0049】
本明細書に記載の薬学的組成物は、様々な態様では、界面活性剤を含む。任意選択で、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリオキシエチレン、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。様々な態様では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、又はポリソルベート８０である。例示的な態様では、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。別の例示的な態様では、界面活性剤は、ポリソルベート２０である。
【0050】
様々な実施形態では、製剤は、任意の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、又はＰＥＧ１０００（例えば、ＰＥＧ３３５０又はＰＥＧ４０００）を更に含む。例えば、様々な態様では、製剤は、約０．０５％～約５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ４０００）、任意選択で約０．１５％～約１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ４０００）、例えば、約０．１％～約１％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ４０００）又は約０．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ４０００）を含む。あるいは、様々な実施形態では、製剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）若しくはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、又はその塩、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースナトリウム（Ｎａ－ＨＰＭＣ）若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｎａ－ＣＭＣ）を含む。この点において、製剤は、任意選択で、約０．０５％～約５％のＣＭＣ若しくはＨＰＭＣ（又はその塩）、任意選択で、約０．１５％～約１．５％のＨＰＭＣ（例えば、Ｎａ－ＨＰＭＣ）若しくはＣＭＣ（例えば、Ｎａ－ＣＭＣ）、例えば、約０．１％～約１％のＨＰＭＣ（例えば、Ｎａ－ＨＰＭＣ）若しくはＣＭＣ（例えば、Ｎａ－ＣＭＣ）、又は約０．５％のＨＰＭＣ（例えば、Ｎａ－ＨＰＭＣ）若しくはＣＭＣ（例えば、Ｎａ－ＣＭＣ）を含む。様々な態様では、製剤は、ＰＥＧとＣＭＣ（又はその塩）又はＨＰＭＣ（又はその塩）との混合物、例えば、本明細書に記載される量のうちのいずれかのこれらの成分を含む。任意選択で、製剤は、ＰＥＧ、ＨＰＭＣ（又はその塩）、及びＣＭＣ（又はその塩）を含む。
【0051】
本明細書に記載の薬学的組成物は、異なる比率で１つの界面活性剤又は複数の界面活性剤を含んでもよい。いくつかの態様では、界面活性剤は、約０．００１％～約１％ｗ／ｖ（又は約０．００２％～約０．５％）の濃度で含まれる。いくつかの態様では、薬学的組成物は、少なくとも約０．００１％、少なくとも約０．００２％、少なくとも約０．００３％、少なくとも約０．００４％、少なくとも約０．００５％、少なくとも約０．００７％、少なくとも約０．０１％、又は少なくとも約０．０５％、かつ約０．１％以下、約０．２％以下、約０．３％以下、約０．４％以下、約０．５％以下、約０．６％以下、約０．７％以下、約０．８％以下、約０．９％以下、又は約１．０％以下の濃度の界面活性剤を含む。いくつかの態様では、薬学的組成物は、約０．００１％、約０．００２％、約０．００３％、約０．００４％、約０．００５％、約０．００６％、約０．００７％、約０．００８％、約０．００９％、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、又は約１％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤を含む。例示的な態様では、組成物は、約０．００４％～約０．１％ｗ／ｖの濃度の界面活性剤を含む。いくつかの態様では、薬学的組成物は、任意選択で０．００４％～約０．１％ｗ／ｖの濃度のポリソルベート２０又はポリソルベート８０を含む。いくつかの態様では、界面活性剤は、ポリソルベート２０であり、ポリソルベート２０は、約０．０６％ｗ／ｖの濃度で存在する。あるいは、ポリソルベート２０は、約０．００８％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
【0052】
様々な態様では、組成物はまた、緩衝剤を含んでもよい。好適な緩衝液としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、グルタミン酸ナトリウム／グルタミン酸緩衝液、グリシルグリシン／グリシルグリシン－ＨＣｌ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、又はクエン酸緩衝液（又はそれらの組み合わせ）が挙げられるが、これらに限定されない。様々な態様では、組成物は、約５ｍＭ～約２００ｍＭの緩衝液を含む。例えば、薬学的組成物中のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の濃度は、任意選択で、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、又は少なくとも約３０ｍＭ、かつ約２００ｍＭ以下、約１８０ｍＭ以下、約１６０ｍＭ以下、約１４０ｍＭ以下、約１２０ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下、約８０ｍＭ以下、約６０ｍＭ以下、又は約５０ｍＭ以下である。様々な態様では、緩衝液は、任意選択で約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で含まれるＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液である。本開示の代表的な態様では、組成物は約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を含む。ゲル製剤である薬学的組成物について、様々な実施形態では、薬学的組成物は、リン酸ナトリウム緩衝液、コハク酸ナトリウム／コハク酸緩衝液、又は酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液を含んでもよい。
【0053】
任意選択で、薬学的組成物のｐＨは、約６～約８．１である。様々な態様では、薬学的組成物のｐＨは、約６．９～約８．１である。様々な態様では、薬学的組成物のｐＨは、約７～約８であり、例えば、約７．０～約７．８、又は約７．２～約７．４、又は約７．５～約８である。いくつかの態様では、薬学的組成物のｐＨは、約７．３（例えば、７．３±０．３）である。いくつかの態様では、薬学的組成物のｐＨは、約７．８（例えば、７．８±０．３）である。
【0054】
タンパク質組成物の安定性は、薬学的組成物の１つ以上の特性を調べることによって特性化され、組成物が様々な温度又は条件のいずれかの下で保管された後の時点を含む、製剤の後の任意の所望の時点で調べることができる。本開示の文脈における安定な組成物は、一般に、例えば、最小又は低減された相分離、剛性一貫性を有するゲルの最小又は低減された形成、ニュートン粘弾性挙動、最小又は低減されたＥＦＸ分解生成物、及び／又はＥＦＸへの最小又は低減された翻訳後修飾（例えば、最小又は低減された電荷及び／又はサイズ変異バリアント）を示す。任意選択で、薬学的組成物は、冷蔵下（２～８℃）（任意選択で２１ヶ月間保管）で液体として、及びよりストレスの多い周囲条件（２５℃）で凍結乾燥体として保管されるとき、これらの特性のうちの１つ以上を示す。
【0055】
本明細書に記載の薬学的組成物は、ＥＦＸの望ましくない荷電バリアント種及びサイズバリアント種を最小限に抑え、これは、自宅での患者による製品の製造、保管、分配及び自己投与に重要な技術的利点を提供する。電荷バリアントは、翻訳後修飾の結果として形成され得る、異なる電荷分布（すなわち、ＥＦＸのより酸性又は塩基性のバリアント）を有するＥＦＸの形態である。様々な態様では、組成物は、－３０℃～－２０℃で最長２４ヶ月間保管される場合、約４０％以下の荷電バリアント種を含む。ＥＦＸの電荷バリアントは、ＡＥＸ－ＨＰＬＣ及びｉｃＩＥＦなどのいくつかの技術のうちのいずれかを使用して測定することができる。ＡＥＸ－ＨＰＬＣを使用して、ＥＦＸ電荷バリアントは、クロマトグラフ上のプレピーク（塩基性バリアント、又はそれらの表面上の負電荷が少ないＥＦＸ電荷バリアント）、メインピーク、及びポストピーク（それらの表面上の負電荷が多い酸性バリアント、又はＥＦＸ電荷バリアント）上のパーセンテージ存在量によって特性化される。ＡＥＸ－ＨＰＬＣは、実施例３に更に記載されている。あるいは、ＥＦＸの電荷バリアントは、ＥＦＸ又は電荷バリアントの等電点（ｐＩ）に基づいてｉｃＩＥＦを使用して解決することができ、ｉｃＩＥＦ電位図上のプレピーク（酸性バリアント）、メインピーク、及びポストピーク（塩基性ピーク）のパーセンテージ存在量として測定することができる。ｉｃＩＥＦに関する材料及び方法は、実施例３に更に記載されている。様々な態様では、組成物は液体組成物であり、所望により、－３０℃～－２０℃で最長２４ヶ月間保管した場合に、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下、又は約０．０１％以下の荷電バリアントを含む（すなわち、液体組成物は、－３０℃～－２０℃の温度を含む保管条件下で０～２４ヶ月間試験した場合に、このレベル以下の荷電バリアントを含む）。例示的な態様では、液体組成物は、－３０℃～－２０℃で最長２４ヶ月間保管された場合、約４０％以下の酸性荷電バリアント種を含む。
【0056】
様々な態様では、薬学的組成物は液体組成物又は凍結乾燥組成物であり、好ましくは、２℃～８℃で最長９ヶ月間保管した場合に、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下、又は約０．０１％以下の荷電バリアントを含む（すなわち、液体組成物又は凍結乾燥組成物は、２℃～８℃の温度を含む保管条件下で０～９ヶ月間試験した場合に、このレベル以下の荷電バリアントを含む）。例示的な態様では、液体又は凍結乾燥組成物は、約２～８℃で最長９ヶ月間保管された場合、約４０％以下の酸性荷電バリアント種を含む。
【0057】
様々な態様では、薬学的組成物は液体組成物又は凍結乾燥組成物であり、約２０℃～３０℃で最長４週間保管した場合に、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下、又は約０．０１％以下の荷電バリアントを含む（すなわち、液体組成物又は凍結乾燥組成物は、２０℃～３０℃の温度／６０％の相対湿度を含む保管条件下で０～４週間試験した場合に、このレベル以下の荷電バリアントを含む）。例示的な態様では、液体組成物又は凍結乾燥組成物は、約２５℃で最長４週間保管した場合、約４０％以下の酸性荷電バリアント種を含む。
【0058】
様々な態様では、薬学的組成物は凍結乾燥組成物であり、約２０℃～３０℃で最長１４ヶ月間保管した場合に、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下、又は約０．０１％以下の荷電バリアントを含む（すなわち、凍結乾燥組成物は、２０℃～３０℃の温度／６０％の相対湿度を含む保管条件下で０～１４ヶ月間試験した場合に、このレベル以下の荷電バリアントを含む）。例示的な態様では、凍結乾燥組成物は、約２５℃で最長１４ヶ月間保管された場合、約４０％以下の酸性荷電バリアント種を含む。
【0059】
本開示の文脈におけるサイズバリアントは、高分子量種（ＨＭＷＳ）の凝集又は形成、及びＥＦＸの低分子量種（ＬＭＷＳ）の断片化又は形成を指す。ＥＦＸのサイズバリアントは、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酸ナトリウムによる毛細管電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ、還元及び非還元）、又は逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、沈降速度分析超遠心分離（ＳＶ－ＡＵＣ）及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）等のいくつかの技法のいずれかを使用して測定することができる。
【0060】
ＳＥ－ＨＰＬＣを使用して、ＥＦＸサイズバリアントは、主要な種としてのＥＦＸホモ二量体、優勢なクロマトグラフィーピーク、及びＨＰＬＣプロファイル上の低レベルの二量体（２つのＥＦＸホモ二量体を含む）及び高分子量（ＨＭＷ）ＥＦＸサイズバリアントを検出することによって特性化される。ＳＥ－ＨＰＬＣに関する材料及び方法は、実施例３に更に記載されている。
【0061】
変性条件下でＣＥ－ＳＤＳを使用して、ＥＦＸサイズバリアントは、２２０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出されるように、電気泳動図上のピークの移動によって特性化される。この分析を使用して、非還元、変性ＥＦＸは、メインピークとしてインタクトタンパク質を示し、一方、単鎖及び低分子量種は、プレピークとしてメインピークの前に移動し、凝集体／ＨＭＷサイズバリアントは、ポストピークとしてメインピークの後に現れる。ＣＥ－ＳＤＳに関する材料及び方法は、実施例３に更に記載されている。
【0062】
ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して、ＥＦＸサイズバリアントを、２８０ｎｍのＵＶ吸光度検出器を用いて溶出ＥＦＸタンパク質ピークを検出することによって特性化する。この分析を使用して、サイズバリアントは、クロマトグラム上のメインピークから解決されたプレピーク又はポストピークとして可視化される。ＲＰ－ＨＰＬＣに関する材料及び方法は、実施例３に更に記載されている。
【0063】
様々な態様では、薬学的組成物は、液体又は凍結乾燥組成物であり、好ましくは、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、約０．１％以下、又は約０．０１％以下のＥＦＸサイズバリアントを、約２５℃などの約２０～３０℃の温度で最長２０週間保管した場合に含む（すなわち、液体組成物は、この温度での保管条件で０～２０週間試験した場合、このレベル以下のサイズバリアント種を含む）。例示的な態様では、液体組成物は、約２５℃で最長２０週間保管した場合、約１０％以下のＥＦＸサイズバリアント種を含む。例示的な態様では、凍結乾燥組成物は、約２５℃で最長２０週間保管した場合、約０％のＥＦＸサイズバリアント種を含む（すなわち、ＥＦＸサイズバリアント種は検出されない）。
【0064】
様々な態様では、薬学的組成物は、液体組成物又は凍結乾燥組成物であり、好ましくは、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、約０．１％以下、又は約０．０１％以下のＥＦＸサイズバリアントを、約２～８℃の温度で最長１４ヶ月間保管した場合に含む（すなわち、液体組成物は、約２～８℃の温度を含む保管条件下で０～１４ヶ月間試験した場合、このレベル以下のサイズバリアント種を含む）。例示的な態様では、液体組成物は、約２～８℃で最長１４ヶ月間保管した場合、約１０％以下のＥＦＸサイズバリアント種を含む。例示的な態様では、凍結乾燥組成物は、約２～８℃で最長１４週間保管した場合、約０％のＥＦＸサイズバリアント種を含む（すなわち、ＥＦＸサイズバリアント種は検出されない）。
【0065】
様々な態様では、薬学的組成物は、液体又は凍結乾燥組成物であり、好ましくは、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、約０．１％以下、又は約０．０１％以下のＥＦＸサイズバリアントを、約２０～３０℃（例えば、約２５℃）の温度で最長４週間保管した場合に含む（すなわち、液体組成物は、約２５℃の温度を含む保管条件で０～４週間試験した場合、このレベル以下のサイズバリアント種を含む）。例示的な態様では、液体組成物は、約２５℃で最長４週間保管した場合、約２０％以下のＥＦＸサイズバリアント種を含む。例示的な態様では、凍結乾燥組成物は、約２５℃で最長１４週間保管した場合、約０％のＥＦＸサイズバリアント種を含む（すなわち、ＥＦＸサイズバリアント種は検出されない）。
【0066】
本開示の様々な態様では、薬学的組成物は、凍結乾燥組成物である。凍結乾燥した場合、凍結乾燥生成物の残留水分含有量は、任意選択で約１％以下（例えば、約０．５％以下）である。様々な態様では、凍結乾燥製剤を適切な希釈剤で再構成して、本開示によって企図される凍結乾燥ＥＦＸの再構成された組成物を形成する。この点において、本開示はまた、本明細書に開示される薬学的組成物を再構成する方法を提供する。本方法は、（ａ）約５分以内に本明細書に開示される凍結乾燥された薬学的組成物を再構成することと、（ｂ）再構成された組成物を対象に投与することとを含む。任意選択で、工程（ｂ）は、再構成された組成物を対象に皮下投与することを含む。本開示は更に、希釈剤と混合した本開示の凍結乾燥製剤から生じる再構成組成物である薬学的組成物を提供する。
【0067】
本開示は、凍結乾燥組成物を調製するためのプロセスも提供する。このプロセスは、次の工程を含む：（ａ）本明細書に開示される組成物を凍結する工程と、（ｂ）工程（ａ）の薬学的組成物を約－５℃～約－１５℃の温度でアニールする工程と、（ｃ）工程（ｂ）の生成物を一次乾燥する工程と、（ｄ）工程（ｃ）の生成物を二次乾燥する工程と、を含む。注目すべきことに、本明細書に開示されるプロセスは、強化された特性を有する凍結乾燥ＥＦＸ医薬品を生成する。例えば、得られた凍結乾燥プロセスの生成物は、他の凍結乾燥条件の生成物と比較して、非常に短時間（１分未満～最長１０分の範囲）で再構成することができる。多くの場合、再構成時間は、他の薬学的組成物及び凍結乾燥プロセスと比較して約５０％以上改善される。更に、本明細書に開示される凍結乾燥組成物を調製するためのプロセスは、得られるケーキの比表面積（より密度の低いケーキ）を大幅に減少させ、これは、大幅に短い再構成時間に関連する。これは、投与の直前に再構成を実施することができるため、臨床医及び患者に大きな利点を提供し、治療時点又は自己投与の前に用量を調製するための時間を最小限に抑える。
【0068】
様々な態様では、凍結乾燥プロセスの工程（ａ）における凍結は、約－４０℃～約－５０℃の温度で行われる。様々な態様では、工程（ａ）における凍結は、約－４０℃、約－４１℃、約－４２℃、約－４３℃、約－４４℃、約－４５℃、約－４６℃、約－４７℃、約－４８℃、約－４９℃、又は約－５０℃の温度で行われる。
【0069】
様々な態様では、工程（ｂ）におけるアニーリングは、約５時間～約２０時間行われる。様々な態様では、工程（ｂ）におけるアニーリングは、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、又は約１０時間行われる。
【0070】
様々な態様では、工程（ｂ）におけるアニーリングは、約－５℃～約－２０℃の温度で行われる。様々な態様では、工程（ｂ）におけるアニーリングは、約－５℃、約－６℃、約－７℃、約－８℃、約－９℃、約－１０℃、約－１１℃、約－１２℃、約－１３℃、約－１４℃、約－１５℃、約－１６℃、約－１７℃、約－１８℃、約－１９℃、又は約－２０℃の温度で行われる。
【0071】
様々な態様では、工程（ｃ）における一次乾燥は、約０．０８～０．２ｍｂａｒのチャンバ圧力で行われる。様々な態様では、工程（ｃ）における一次乾燥は、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、又は約０．２０ｍｂａｒのチャンバ圧力で行われる。
【0072】
様々な態様では、工程（ｃ）における一次乾燥は、約－５℃～－３０℃の温度で行われる。様々な態様において、工程（ｃ）における一次乾燥は、約－１０℃、約－１１℃、約－１２℃、約－１３℃、約－１４℃、約－１５℃、約－１６℃、約－１７℃、約－１８℃、約－１９℃、約－２０℃、約－２１℃、約－２２℃、約－２３℃、約－２４℃、約－２５℃、約－２６℃、約－２７℃、約－２８℃、約－２９℃、又は約－３０℃の温度で行われる。
【0073】
様々な態様では、工程（ｄ）における二次乾燥は、約３５～５５℃の温度で行われる。様々な態様において、工程（ｄ）における二次乾燥は、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、又は約５５℃の温度で行われる。
【0074】
本明細書に開示されるＥＦＸ薬学的組成物は、代謝障害を含むがこれらに限定されない、いくつかの疾患、障害、又は状態を治療、改善、予防、又は逆転させるために使用することができる。様々な態様では、本開示は、疾患又は障害を治療する方法を提供し、本方法は、ＥＦＸを含む薬学的組成物を、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することを含む。疾患又は障害は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬ）、肝脂肪症、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）又はアルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬ）、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、肥満、渇望若しくは中毒（アルコール関連又は食物などの他のもの）、高トリグリセリド血症、脂質異常血症、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症など）、又は老化のいずれかであり得る。様々な態様では、本開示は、肝硬変を逆転させるか、又はＮＡＳＨ、ＡＳＨ、ＡＬＤ、ＡＦＬ、又はタンパク質ミスフォールディング病に関連する線維症を減少させる方法を提供する。この点において、治療後、ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＲＮ）組織学的スコアリングシステム（Ｋｌｅｉｎｅｒ Ｄ ｅｔ ａｌ，２００５ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４１，１３１３）に基づいて、対象の線維症スコアは、好ましくは、Ｆ４（硬変）からＦ３（進行性線維症）以下に後退する。例示的な実施形態では、中毒は、アルコール、薬物、又はニコチンなどの行動又は物質に対する持続的な強迫的依存を包含する。例示的な実施形態では、渇望は、糖などの特定の物質又は活動に対する強い、緊急の、又は異常な欲求を包含する。本開示はまた、本明細書に開示される薬学的ＥＦＸ組成物をそれを必要とする対象に投与することによって、肝臓脂肪含有量を正常化する方法、血糖値を低下させる方法、インスリン感受性を増加させる方法、及び／又は尿酸レベルを低下させる方法を提供する。例示的な実施形態では、肝臓脂肪含有量を正規化することは、肝臓脂肪含有量（例えば、肝臓脂肪絶対含有量）を低減することを指し、好ましくは、肝臓脂肪含有量を典型的な、健康な、疾患のない対象（すなわち、本明細書に記載の疾患／障害のうちの１つ以上に罹患していない対象）のものに低減する。様々な実施形態では、肝臓脂肪含有量は、＜５％の絶対肝臓脂肪に低減される。≧５％の絶対肝臓脂肪含有量は、肝脂肪症（脂肪性肝疾患）に関連し、５％未満の絶対肝臓脂肪含有量は、疾患のない対象について臨床的に正常な範囲内で考慮される（例えば、Ｃｈａｌａｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；６７（１）：３２８－３５７を参照されたい）。
【0075】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療としての第２相臨床試験において、エフルキシフェルミンは、投与１６週間後の患者の約半数において、肝臓脂肪の正常化及び線維症の退縮を含む、前例のないレベルの有効性を示した。ＥＦＸの臨床プロファイルの独自性は、健康なリポタンパク質プロファイルを回復させ、血糖制御を改善し（２型糖尿病性ＮＡＳＨ患者ではヘモグロビンＡ１ｃが０．６～０．９％減少）、尿酸レベルを低下させることによっても強調される（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｎａｔ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２７：１２６２－１２７１）。
【0076】
「それを必要とする対象」は、薬学的組成物の投与から利益を得るであろうヒトなどの対象であり、本明細書に記載の障害のうちのいずれかの症状と診断され得るか、又はそれに罹患し得る。例えば、尿酸レベルの低下を必要とする対象は、痛風に罹患している対象であり得る。肝硬変を後退させるか、又はＮＡＳＨ、ＡＳＨ、ＡＬＤ、ＡＬＦ、若しくはタンパク質ミスフォールディング病に関連する線維症を軽減する方法を必要とする対象は、ＮＡＳＨ、ＡＳＨ、ＡＬＤ、ＡＬＦ、若しくはタンパク質ミスフォールディング疾患に罹患しているか、又はＮＡＳＨ、ＡＳＨ、ＡＬＤ、ＡＬＦ、若しくはタンパク質ミスフォールディング病から回復している可能性がある。
【0077】
様々な態様では、障害は、タンパク質ミスフォールディング病である。ミスフォールドしたタンパク質は、様々な病原性応答を引き起こす可能性があり、いくつかのヒト疾患に関与しているか、又は少なくともいくつかのヒト疾患に関連していると考えられている。例示的なタンパク質ミスフォールディング病としては、嚢胞性線維症、α－１アンチトリプシン欠乏症、及びトランスサイレチン型心アミロイドーシスが挙げられるが、これらに限定されない。この方法は、所望の生物学的応答を達成するのに有効な量で、本開示の薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。関連する態様では、方法は、治療レジメンの一部として薬学的ＥＦＸ組成物を投与することを含み、治療レジメンはまた、タンパク質ミスフォールディング病（α－１アンチトリプシン欠乏症など）に対するミスフォールドしたタンパク質コレクター分子又はオリゴヌクレオチドベースの治療薬の投与を含む。
【0078】
「治療する」という用語、並びにそれに関連する用語は、必ずしも１００％又は完全な治療又は寛解を意味するものではない。むしろ、当業者であれば、潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する治療の程度には様々なものがある。この点において、疾患又は障害を治療する方法は、任意の量又は任意のレベルの治療を提供することができる。更に、本方法によって提供される治療は、治療されている疾患の１つ以上の状態又は症状又は徴候の治療、及び／若しくは状態又は疾患を有する対象の生活の質の改善を含み得る。本開示の治療方法は、疾患の１つ以上の症状を阻害し得る。また、本開示の方法によって提供される治療は、疾患の進行を遅らせる、又は逆転させることを包含し得る。
【0079】
対象の生活の質の改善は、例えば、欧州生活の質５質問ツール（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ ５ ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ ｔｏｏｌ）（ＥＱ－５Ｄ）を使用して１つ以上の生活の質パラメータを決定することによって測定することができ、患者によって報告されるように、患者の生活の質に対する移動性、気分、全体的な影響を決定する。ＥＱ－５Ｄアンケートには、回答者が認識した健康状態を報告できるビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）も含まれている。例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｂａｌｅｓｔｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎａｌｄｉ Ａｒｃｈ Ｃｈｅｓｔ Ｄｉｓ．２０１２ Ｓｅｐ；７８（３）：１５５－９を参照されたい。治療は、肝疾患質問票を使用してモニタリングしてもよい。例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｙｏｕｎｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１９ Ｓｅｐ；１７（１０）：２０９３－２１００．ｅ３を参照されたい。肝臓治療はまた、組織学的データ（例えば、線維症の退行、ＮＡＳＨの分解など）及び肝臓傷害のバイオマーカー（例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、及び／又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ））などの客観的パラメータを測定することによってモニタリングされ得る。ＮＡＳＨ患者における肝臓の組織病理学スコアリングの例示的な方法は、例えば、その全体が参照により組み込まれるＫｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｈｅｐｔｏｌｏｇｙ ４１，１３１３に開示されている。
【0080】
前述の方法に関して、組成物は、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、髄内、髄腔内、脳室内、皮内、経皮、皮下、鼻腔内、吸入（例えば、上気道及び／又は下気道）、経腸、硬膜外、尿道、膣、又は直腸の投与経路を含む任意の好適な投与経路によって投与され得る。様々な事例において、組成物は、対象に静脈内に、筋肉内に、又は皮下に投与される。例えば、いくつかの態様では、組成物は皮下投与される。投与される組成物中のＥＦＸの量又は用量（すなわち、「有効量」）は、臨床的に合理的な時間枠にわたって対象において所望の生物学的効果を達成するのに十分であるべきである。
【0081】
人体で実践される方法の特許を禁止する管轄区域では、組成物をヒト対象に「投与する」という意味は、ヒト対象が任意の技術（例えば、注射、挿入等）によって自己投与することができる制御物質を処方することに限定され得る。本開示は、本明細書に記載の疾患又は障害のいずれかを治療するための薬学的組成物の使用を企図する。本開示は、本明細書に記載の疾患又は障害のいずれかを治療するための薬物の調製における組成物の使用を更に企図する。本開示は更に、本明細書で言及される疾患又は障害のうちのいずれかの治療に使用するための、本明細書に記載の組成物を提供する。人体で実践される方法の特許を禁止しない管轄区域では、組成物の「投与」は、人体で実践される方法と前述の活動との両方を含む。
【0082】
更なる態様として、対象への投与を容易にする方法でパッケージ化された本明細書に記載の薬学的組成物を含むキットが提供される。一態様において、キットは、密封されたボトル、容器、使い捨て又は多用途バイアル、プレフィルドデバイス（例えば、注射器）、又はプレフィルド注射デバイスなどの容器にパッケージ化された本明細書に記載の薬学的組成物／製剤を含み、任意選択で、容器に貼付されるか、又は本方法を実践する際の薬学的組成物の使用を説明するパッケージに含まれるラベルを有する。一態様では、薬学的組成物は、単位剤形でパッケージ化される。このキットは、特定の投与経路に従って薬学的組成物を投与するのに適したデバイスを含み得るが、これは必須ではない。例えば、本開示は、本明細書に開示される薬学的組成物を、それを必要とする対象に送達するためのデュアルチャンバデバイスを提供する。デュアルチャンバデバイスは、本明細書に開示される凍結乾燥された薬学的組成物と、デバイスの２つの別個のチャンバ内の希釈剤とを含む組み合わせ製品である。プレフィルドデュアルチャンバデバイス（ＤＣＤ）は、デバイスの２つの別々のチャンバ内に凍結乾燥薬物及び希釈剤を含有する組み合わせ製品である。ＤＣＤは、患者と医師に高い安定性と利便性を提供し、製品の品質、患者のコンプライアンス、及び市場競争力を大幅に向上させる。ＤＣＤはまた、シールの完全性、無菌性、及びバイオ医薬品との適合性を提供し、浸出性及び針刺し損傷を回避する。本開示とともに使用するための適切なデュアルチャンバデバイスは、当該技術分野に記載されている。例えば、Ｉｎｇｌｅ Ｒ．，Ｆａｎｇ Ｗ．（２０２１）．Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ５９７，１２０３１を参照されたい。
【0083】
以下の実施例は、本開示の代表的な特徴を示す。これらの態様の説明から、本発明の他の態様は、以下に提供される説明に基づいて行う及び／又は実践することができる。本方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１－３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋなどの論文に記載されている分子生物学的手法の使用を含む。
【実施例】
【0084】
実施例１：エフルキシフェルミン製剤
この実施例は、以下に記載される研究において評価されるＥＦＸ製剤を記載する。
この実施例は、以下に記載される研究において評価されるＥＦＸ製剤を記載する。
【0085】
親注射可能なタンパク質ベースの生物製剤は、タンパク質中のアスパラギン残基を中間コハク酸イミドとしてアスパラギン酸又はイソアスパラギン酸に変換し、グルタミンをグルタミン酸又はピログルタミン酸に変換する脱アミド又は酸化などの翻訳後修飾を最小限に抑えるために、ｐＨ５．２～約ｐＨ６．９の範囲のわずかに酸性から中性のｐＨでしばしば製剤化される。ｐＨ７．６を超えると、脱アミド（酸性電荷バリアントの形成）が頻繁に観察され、安定性、官能性、及び／又はタンパク質効力の喪失をもたらす。ｐＨ７．０未満では、塩基性荷電バリアントの形成も観察される。
【0086】
脱アミド、酸化、及び電荷バリアントの形成を最小限に抑えるために、ｐＨ範囲４．５～７．０の様々な賦形剤を用いて、ＥＦＸ製剤を開発した。驚くべきことに、ＥＦＸの粘弾性特性は、ｐＨ６．５未満で劇的に変化し、ゲル様挙動、相分離、及び流動性の損失を示した。これらの特徴は、生物製剤の注射可能な製剤には困難である。これらのゲルの高い動的粘度（いくつかの例では最大２３，９５０ｃＰ（センチポイズ））、並びにゲルの長時間の安定性（いくつかの例では、２～８℃で保管されて２１ヶ月もの長い間）は、パターン形成格子に配列された、おそらくは架橋水素結合の結果、秩序があり、安定した３次元構造の形成を示している。
【0087】
加えて、ｐＨ６．９以下で試験された製剤の大部分は、タンパク質凝集、クリッピング／断片化、及び／又は可視粒子並びにサブビジブル粒子の形成の傾向を示した。そのような変化は、安全性（特に免疫原性）、不安定性、及び効力の懸念の喪失に関連する可能性があるため、注射可能な生物製剤にとっては望ましくない。
【0088】
したがって、一連の研究は、分解経路及び翻訳後修飾（電荷バリアントの形成の増加など）を最小限に抑えることに焦点を当てながら、水素結合の架橋格子を形成するＥＦＸの独自の傾向を克服し、ゲル形成及び顕著な相分離をもたらすＥＦＸ製剤を開発するように設計された。
【0089】
実施例１及びその後の実施例で評価したＥＦＸ製剤を表１に列挙し、使用した賦形剤及び化学物質を表２に列挙した。
【0090】
【表1-1】
【0091】
【表1-2】
【0092】
【表2】
【0093】
実施例２：製剤を特性化する：ゲル形成及び相分離（シュリーレン相分離）
この実施例は、本明細書に記載の様々な製剤の物理的特性を説明する。驚くべきことに、ＥＦＸは、他のほとんどの生物製剤に適した条件下で製剤化及び保管された場合、ゲルを形成し、相分離する傾向を有する。
この実施例は、本明細書に記載の様々な製剤の物理的特性を説明する。驚くべきことに、ＥＦＸは、他のほとんどの生物製剤に適した条件下で製剤化及び保管された場合、ゲルを形成し、相分離する傾向を有する。
【0094】
視覚的な外観
ＥＦＸ製剤を、２，０００～３，７５０ルクスでの欧州薬局方（第９版、モノグラフ２．９．２０）に従って、白色背景の前で５秒間、黒色背景の前で５秒間、穏やかな、手動の、放射状の攪拌の下で、ゲル形成、相分離、乳白色、及び可視粒子の有無について検査した。観察された可視粒子を分類するために、表３に列挙されるように、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ－Ｃｏｄｅｘ」（ＤＡＣ２００６）に基づく数値スコアを適用した。繊維様構造、おそらく非固有の粒子、及び追加の試料属性を表４に記載されるように文書化した。
ＥＦＸ製剤を、２，０００～３，７５０ルクスでの欧州薬局方（第９版、モノグラフ２．９．２０）に従って、白色背景の前で５秒間、黒色背景の前で５秒間、穏やかな、手動の、放射状の攪拌の下で、ゲル形成、相分離、乳白色、及び可視粒子の有無について検査した。観察された可視粒子を分類するために、表３に列挙されるように、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ－Ｃｏｄｅｘ」（ＤＡＣ２００６）に基づく数値スコアを適用した。繊維様構造、おそらく非固有の粒子、及び追加の試料属性を表４に記載されるように文書化した。
【0095】
【表3】
【0096】
【表4】
【0097】
タンパク質濃度（相分離、シュリーレン相分離）
ＥＦＸ濃度を、２８０ｎｍの吸光度を測定するＳｏｌｏＶＰＥ機器を用いたスロープ分光法を使用してＵＶ／可視分光法によって決定した。
ＥＦＸ濃度を、２８０ｎｍの吸光度を測定するＳｏｌｏＶＰＥ機器を用いたスロープ分光法を使用してＵＶ／可視分光法によって決定した。
【0098】
粘度（ゲル形成）
動的粘度を、Ｋｉｎｅｘｕｓウルトラプラスレオメーター（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。レオメーターには、コーンプレートのセットアップ（コーン直径４０ｍｍ、１°の角度）が装備されていた。測定ＣＰ１／４０コーンの寸法は、測定ギャップを０．０２４ｍｍに固定し、これには、約３１０μｌの試料容量が必要であった。試料表面の乾燥を避けるために、蒸発ブロッカーを適用した。測定は、２５℃で３分間、４００秒－１の一定の剪断速度で行った。更に、２５℃で１０秒－１から１０００秒－１までの剪断速度で１１個のデータポイントテーブルを生成した。
動的粘度を、Ｋｉｎｅｘｕｓウルトラプラスレオメーター（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。レオメーターには、コーンプレートのセットアップ（コーン直径４０ｍｍ、１°の角度）が装備されていた。測定ＣＰ１／４０コーンの寸法は、測定ギャップを０．０２４ｍｍに固定し、これには、約３１０μｌの試料容量が必要であった。試料表面の乾燥を避けるために、蒸発ブロッカーを適用した。測定は、２５℃で３分間、４００秒－１の一定の剪断速度で行った。更に、２５℃で１０秒－１から１０００秒－１までの剪断速度で１１個のデータポイントテーブルを生成した。
【0099】
水素－重水素（Ｈ－Ｄ）交換グアニジニウム／尿素質量分析法
製剤Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１１中のＥＦＸのゲル形成及び相分離は、パターン形成格子を採用した架橋水素結合の結果である。Ｈ－Ｄ交換による研究は、格子形成及びシュリーレン相分離の機序を解明する。
製剤Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１１中のＥＦＸのゲル形成及び相分離は、パターン形成格子を採用した架橋水素結合の結果である。Ｈ－Ｄ交換による研究は、格子形成及びシュリーレン相分離の機序を解明する。
【0100】
データ概要：ゲル形成及び相分離（シュリーレン相分離）
理論上及びｉｃＩＥＦによって測定されたＥＦＸの等電点（ｐＩ）は、約ｐＨ６．６である。製剤Ｆ１～Ｆ１２は、ｐＩを下回るｐＨで製剤化したが、製剤Ｆ１３～Ｆ２０のｐＨ値は、ｐＩを上回っていた（表１を参照）。ＰＨ６．５未満で製剤化した製剤（低～中性ｐＨ製剤）中のＥＦＸは、ゲル化又は相分離を受ける傾向を示した。ゲル形成ＥＦＸ製剤の画像を図２に示す。製剤Ｆ１１は、配合直後に高密度の３Ｄ構造化ゲルを形成した。４０℃／７５％ＲＨで３日間保管した後、製剤Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、Ｆ８、及びＦ９もまた、ゲル形成、相分離、及び／又は沈殿を示した。半透明のゲルは、製剤Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、及びＦ７において形成し、ゲル内に高い濁度を示した（図７）。
理論上及びｉｃＩＥＦによって測定されたＥＦＸの等電点（ｐＩ）は、約ｐＨ６．６である。製剤Ｆ１～Ｆ１２は、ｐＩを下回るｐＨで製剤化したが、製剤Ｆ１３～Ｆ２０のｐＨ値は、ｐＩを上回っていた（表１を参照）。ＰＨ６．５未満で製剤化した製剤（低～中性ｐＨ製剤）中のＥＦＸは、ゲル化又は相分離を受ける傾向を示した。ゲル形成ＥＦＸ製剤の画像を図２に示す。製剤Ｆ１１は、配合直後に高密度の３Ｄ構造化ゲルを形成した。４０℃／７５％ＲＨで３日間保管した後、製剤Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、Ｆ８、及びＦ９もまた、ゲル形成、相分離、及び／又は沈殿を示した。半透明のゲルは、製剤Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、及びＦ７において形成し、ゲル内に高い濁度を示した（図７）。
【0101】
製剤Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１２は、３日後に４０℃／７５％ＲＨで観察された、底部に白色ゲル状相、上部に濁った液体上清を有する相分離（シュリーレン相分離）を示した。例として、ＳｏｌｏＶＰＥによって評価されるＦ１２の下相で測定されたタンパク質濃度は１６３．１ｍｇ／ｍＬであり、上清相では５９．９ｍｇ／ｍＬであった。更に、４０℃／７５％ＲＨで２週間保管した後、製剤Ｆ５及びＦ６は、それらの外観及び粘弾性特性の同様の劇的な変化を示した。
【0102】
２５℃／６０％の相対湿度で、製剤Ｆ２及びＦ８は、それぞれ、１週間及び１ヶ月の保管後に高密度ゲルを形成した。加えて、２５℃／６０％ＲＨで１ヶ月保管した後のＦ１４については、相分離及び可視粒子形成が観察されたが、他の温度条件（２～８℃及び４０℃／７５％ＲＨ）については観察されなかった。
【0103】
４００秒－１及び時間ゼロでの製剤Ｆ１～Ｆ２０（Ｆ１１を除く）における１００ｍｇ／ｍＬのＥＦＸの動的粘度を図３に提示する。測定された動的粘度は、ｐＨに依存し、より低いｐＨで増加するように見えた。例えば、１００ｍｇ／ｍＬ及び室温でのＥＦＸ製剤Ｆ１４～Ｆ２０の粘度は、全て、ｐＨ７．０以上で、５ｃＰ以下であった。比較すると、測定された動的粘度は、ｐＨ６．５以下での製剤Ｆ１～Ｆ１０の配合直後には１０～１６ｃＰの範囲であった（図３）。製剤１１（Ｆ１１）において、ＥＦＸは、即座に、配合時に高密度／剛性ゲル格子を形成し、動的粘度の更なる実験的評価を不可能にした。
【0104】
様々な条件下でのＥＦＸの保管中に、ｐＨ６．５以下の他の製剤が相分離を受け、高粘度ゲルを形成した。（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０、及びＦ１１）。ゲル形成は、架橋された水素結合の結果であるように見え、パターン形成格子を形成し、非常に剛性の高い三次元構造をもたらした。ゲルＥＦＸ形成の速度は、保管温度に依存し、４０℃で約３日以内に生じるが、それぞれ２５℃及び２～８℃で数週間又は数ヶ月後に生じる。一度形成されると、３次元ゲル格子は、様々な保管条件下で２１ヶ月後にゲル状の外観を保持する製剤Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１１によって証明されるように、安定又は不可逆的に見えた。
【0105】
図４は、４０℃で３日後の１０秒－１の剪断速度でのＦ１～Ｆ２０（Ｆ１１を除く）についての１００ｍｇ／ｍＬでのＥＦＸの動的粘度を示す。ゲルを形成したこれらの製剤は、数万ｃＰで動的粘度を有するように見える。ＥＦＸの動的粘度は、２～８℃で２１ヶ月間保管した後も変化しなかった（図４及び表５）。例えば、低剪断速度でのＦ２及びＦ１０の測定された動的粘度は、それぞれ、注ぎやすいシリコーンゴム及びチョコレートシロップに匹敵する、２３，９５０ｃＰ及び１０，５６０ｃＰと高かった。
【0106】
製剤Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１１は、不可逆的なゲルを形成し、相分離を受け、Ｆ１３～Ｆ４２などの均質な液体製剤と比較して、剪断速度の関数として明らかに異なる粘弾性特性を示した。図５に示すように、製剤Ｆ１３～Ｆ２０、並びにＦ２１～Ｆ４２（図示せず）におけるＥＦＸの動的粘度は、増加する剪断速度の関数として一定のままであり、したがってニュートン挙動を示す。対照的に、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１１の粘度は、増加する剪断速度の関数として減少するように見え、したがって、非ニュートンずり減粘効果を示す。これにもかかわらず、それらはゲル状のままであり、水素結合連結格子が高い剪断速度（１０００秒－１など）に耐えるのに十分に安定であることを示している。ｐＨ依存性に加えて、ゲル形成及び相分離もまた、各製剤を構成する賦形剤に依存するように見えた。この点を説明すると、賦形剤の組成が異なるが、同様なｐＨのＦ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１１が、幅広い動的粘度と関連付けられた。そのような差は、低剪断速度及び高剪断速度の両方で観察され、したがって、粘弾性特性が特定の賦形剤の性質に強い依存性を示すことを例証した。低剪断速度での動的粘度を表５Ａに要約し、１０００秒－１の剪断速度での動的粘度を表５Ｂに要約する。
【0107】
【表5】
【0108】
【表6】
【0109】
剪断速度、非常に低い粘度、及びゲル形成の非存在、又は有意なシュリーレン相分離の関数としてのそれらのニュートン挙動に基づいて、製剤Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、Ｆ１８、Ｆ２０、及びＦ３３～Ｆ４２（ｐＨ≧６．５）を更なる開発のために選択した。
【0110】
実施例３：電荷バリアントの形成、タンパク質凝集、クリッピング／断片化、細胞ベースの効力の評価
ニュートン挙動及び低溶液粘度を維持することに加えて、本明細書に記載のＥＦＸ製剤を、高分子量種（ＨＭＷＳ）への凝集、低分子量種（ＬＭＷＳ）へのクリッピング又は断片化、サブビジブル粒子（ＳＶＰ）及び可視粒子の形成、並びにより酸性又は塩基性電荷バリアントの形成をもたらす翻訳後修飾について評価した。荷電種の形成速度は、冷蔵温度では一般的に他のタンパク質と比較してＥＦＸの方が高く、室温では形成速度が増加する。本実施例は、例えば、荷電種形成、ＨＭＷＳなどを最小限に抑えることを求めるために実施される研究を記載する。
ニュートン挙動及び低溶液粘度を維持することに加えて、本明細書に記載のＥＦＸ製剤を、高分子量種（ＨＭＷＳ）への凝集、低分子量種（ＬＭＷＳ）へのクリッピング又は断片化、サブビジブル粒子（ＳＶＰ）及び可視粒子の形成、並びにより酸性又は塩基性電荷バリアントの形成をもたらす翻訳後修飾について評価した。荷電種の形成速度は、冷蔵温度では一般的に他のタンパク質と比較してＥＦＸの方が高く、室温では形成速度が増加する。本実施例は、例えば、荷電種形成、ＨＭＷＳなどを最小限に抑えることを求めるために実施される研究を記載する。
【0111】
翻訳後修飾：ＥＦＸ電荷バリアントの決定
ＥＦＸの電荷不均一性を、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ－ＨＰＬＣ）及びイメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）によって評価した。これらの２つの方法は、異なる機序を使用してタンパク質の電荷バリアントを分離する。ＡＥＸ－ＨＰＬＣ分離は、帯電した固定クロマトグラフィーマトリックスと相互作用するタンパク質の表面上の露出した電荷に基づいている。ｉｃＩＥＦによる分離は、分離キャピラリーに確立されたｐＨ勾配を介してその等電点に電気泳動的に移動するタンパク質の各電荷バリアントに基づく。分離のそれらの異なるメカニズムの結果として、ＡＥＸ及びｉｃＩＥＦは、タンパク質の電荷不均一性を評価するための補完的かつ直交的な方法とみなされる。
ＥＦＸの電荷不均一性を、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ－ＨＰＬＣ）及びイメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）によって評価した。これらの２つの方法は、異なる機序を使用してタンパク質の電荷バリアントを分離する。ＡＥＸ－ＨＰＬＣ分離は、帯電した固定クロマトグラフィーマトリックスと相互作用するタンパク質の表面上の露出した電荷に基づいている。ｉｃＩＥＦによる分離は、分離キャピラリーに確立されたｐＨ勾配を介してその等電点に電気泳動的に移動するタンパク質の各電荷バリアントに基づく。分離のそれらの異なるメカニズムの結果として、ＡＥＸ及びｉｃＩＥＦは、タンパク質の電荷不均一性を評価するための補完的かつ直交的な方法とみなされる。
【0112】
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ－ＨＰＬＣ）による電荷バリアントの評価
ＥＦＸ製剤中の電荷不均一性の分布を、アニオン交換樹脂カラムＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｑ－ＳＴＡＴ（４．６ｍｍ×１００ｍｍ、７μｍ粒径）を使用して、２３０ｎｍでのＵＶ吸光度検出を用いて評価した。負に帯電したＥＦＸは、２０ｍＭのＴｒｉｓ中で平衡化され、２０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルを含有するｐＨ８に緩衝された正に帯電したカラムマトリックスに結合する。ＥＦＸの弱荷電バリアントは、低塩濃度によってクロマトグラフィーカラムから容易に置き換えられるが、より負に帯電したＥＦＸバリアントは、それらを置き換えるためにより高い塩濃度を必要とする。塩勾配は、０．５ｍＬ／分の流速で０．７Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）の線形勾配であった。クロマトグラフィーカラム温度を分析全体を通して３０℃に維持した。
ＥＦＸ製剤中の電荷不均一性の分布を、アニオン交換樹脂カラムＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｑ－ＳＴＡＴ（４．６ｍｍ×１００ｍｍ、７μｍ粒径）を使用して、２３０ｎｍでのＵＶ吸光度検出を用いて評価した。負に帯電したＥＦＸは、２０ｍＭのＴｒｉｓ中で平衡化され、２０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルを含有するｐＨ８に緩衝された正に帯電したカラムマトリックスに結合する。ＥＦＸの弱荷電バリアントは、低塩濃度によってクロマトグラフィーカラムから容易に置き換えられるが、より負に帯電したＥＦＸバリアントは、それらを置き換えるためにより高い塩濃度を必要とする。塩勾配は、０．５ｍＬ／分の流速で０．７Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）の線形勾配であった。クロマトグラフィーカラム温度を分析全体を通して３０℃に維持した。
【0113】
Ｆ１８で製剤化されたＥＦＸの代表的なＡＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示し、プレピーク、ポストピーク、及びメインピークの面積を定量化し、表６に要約する。クロマトグラフィー分析の目的のために、ＥＦＸにおける電荷バリアントは、プレピーク（より塩基性のバリアント、又はそれらの表面上の負電荷がより少ないＥＦＸ電荷バリアント）、メインピーク、及びポストピーク（より産生のバリアント又はそれらの表面上の負電荷が多いよりＥＦＸ電荷バリアント）としてグループ化される。
【0114】
【表7】
【0115】
イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）による電荷バリアントの評価
ＥＦＸの等電点（ｐＩ）を実験的に確認するために、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ ｉＣＥ３を使用してイメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）法を開発した。様々な製剤中のＥＦＸを、両性溶液、３Ｍ尿素、及びｐＩ５．８５及びｐＩ８．１８に対応するマーカーを含有する混合物中で調製した。電荷バリアントの分離を、周囲温度で１００μｍの内径及び５０ｍｍの長さのコーティングされたキャピラリー内で実施し、タンパク質ピークを２８０ｎｍでの吸光度によって監視した。電荷バリアントを２つの異なるフォーカシング工程を使用して分離し、最初は１，０００Ｖで１分間、続いて３，０００Ｖで１０分の移動を行った。
ＥＦＸの等電点（ｐＩ）を実験的に確認するために、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ ｉＣＥ３を使用してイメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）法を開発した。様々な製剤中のＥＦＸを、両性溶液、３Ｍ尿素、及びｐＩ５．８５及びｐＩ８．１８に対応するマーカーを含有する混合物中で調製した。電荷バリアントの分離を、周囲温度で１００μｍの内径及び５０ｍｍの長さのコーティングされたキャピラリー内で実施し、タンパク質ピークを２８０ｎｍでの吸光度によって監視した。電荷バリアントを２つの異なるフォーカシング工程を使用して分離し、最初は１，０００Ｖで１分間、続いて３，０００Ｖで１０分の移動を行った。
【0116】
製剤Ｆ１８におけるＥＦＸのメインピークは、見かけのｐＩが６．６７で移動し、これは、約６．５の理論的ｐＩとよく一致する（図７）。追加の電荷バリアントのピークは、電気泳動図において低レベルで検出され、メインピークの前（酸性バリアント）又は後（塩基性バリアント）のいずれかに移動した。ピーク面積に基づく存在量のパーセンテージとして表される酸性ピーク、メインピーク、及び塩基性ピークの分布が、表７に示される。ｉｃＩＥＦ電気泳動図からのプレピーク、メインピーク、及びポストピークの分布は、ＡＥＸ－ＨＰＬＣによって報告されたプレピーク、メインピーク、及びポストピークの分布を反映している。
【0117】
【表8】
【0118】
Ｆ１～Ｆ２０についてＦ３３と比較して経時的なＥＦＸのメインピークの減少として示される、２５℃／６０％ＲＨで保管されたときの電荷バリアントの形成を、図８Ａに示す。特に４週間の保管中、ｐＨ７．０～７．６の範囲で緩衝されたＡｒｇ／Ａｒｇ－ＨＣｌ、スクロース、ＰＳ２０又はＰＳ８０を含有するＴｒｉｓ－ＨＣｌ中に製剤化された（Ｆ３３～Ｆ３８）ＥＦＸは、Ｆ１８におけるＥＦＸよりもメインピーク損失の速度が約６０％遅く、Ｆ２０におけるＥＦＸよりもより多くの酸性電荷バリアントの形成速度が２倍以上遅いことを示した。
【0119】
更に、図８Ｂは、ＡＥＸ－ＨＰＬＣによって測定されたより塩基性電荷バリアント（プレピーク）についてのクロマトグラムの総ピーク面積のパーセントとしての相対存在量を示し、図８Ｃは、製剤Ｆ１～Ｆ２０について、２５℃／６０％ＲＨでの時間０、１週間、及び１ヶ月でのより酸性のバリアントに対応する、ポストピークのパーセントを示す。図８Ｂから明らかなように、塩基性電荷バリアント又はプレピークは、総クロマトグラム面積の１０％未満で比較的一定のままである製剤Ｆ１５～Ｆ２０及びＦ３３と比較して、製剤Ｆ１～Ｆ１２において著しく存在量が多く、Ｆ１は５３％の塩基性バリアントを示している。対照的に、製剤Ｆ１５～Ｆ２０は、２５℃／６０％ＲＨで１ヶ月保管した後、より多くの酸性バリアントの形成を示した（表８）。
【0120】
Ｆ３３の改善された安定性は、２～８℃で保管した場合にも明らかであり、ＥＦＸの電荷バリアントの形成速度はＦ１８よりも約５０％低く、Ｆ２０よりも３．２倍低かった（表９）。
【0121】
要約すると、賦形剤（すなわち、糖、界面活性剤、及びＡｒｇ／Ａｒｇ－ＨＣｌ）の独自の組み合わせを有するＦ３３は、（試験された製剤と比較して）液体製剤として最も安定した薬学的組成物であり、タンパク質ベースのバイオ医薬品で一般的に使用される他の賦形剤を含有する製剤と比較して、２～８℃で保管した場合、２５℃／６０％ＲＨでの電荷バリアントの形成の最も緩慢な速度によって確認されるように、ＥＦＸのメインピークは経時的に比較的変化しないままであった（図９）。
【0122】
【表9】
【0123】
【表10】
【0124】
ＳＥ－ＨＰＬＣによるサイズバリアント（凝集及び断片化）の評価
凝集（高分子量種（ＨＭＷＳ）形成）又は断片化（低分子量種（ＬＭＷＳ）形成）から生じるＥＦＸ分子サイズバリアントを、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度検出を伴うシリカゲル濾過カラム（Ｔｏｓｈｏ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ）を使用したサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によって特性化した。移動相は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．９）から構成された。ＥＦＸのサイズバリアントは、室温で、０．５ｍＬ／分でカラムから均一濃度で溶出され、ＵＶ吸光度検出器を使用してピークを定量化した。ＥＦＸのサイズバリアントは、図１０に示すように、主な種、優勢なクロマトグラフィーピーク、及び低レベルの二量体（２つのＥＦＸホモ二量体を含む）並びに高分子量（ＨＭＷ）ＥＦＸサイズバリアントに分離される。
凝集（高分子量種（ＨＭＷＳ）形成）又は断片化（低分子量種（ＬＭＷＳ）形成）から生じるＥＦＸ分子サイズバリアントを、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度検出を伴うシリカゲル濾過カラム（Ｔｏｓｈｏ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ）を使用したサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によって特性化した。移動相は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．９）から構成された。ＥＦＸのサイズバリアントは、室温で、０．５ｍＬ／分でカラムから均一濃度で溶出され、ＵＶ吸光度検出器を使用してピークを定量化した。ＥＦＸのサイズバリアントは、図１０に示すように、主な種、優勢なクロマトグラフィーピーク、及び低レベルの二量体（２つのＥＦＸホモ二量体を含む）並びに高分子量（ＨＭＷ）ＥＦＸサイズバリアントに分離される。
【0125】
ＳＥ－ＨＰＬＣによるＥＦＸのメインピークの減少として示される、２５℃での選択された製剤、Ｆ１～Ｆ２０及びＦ３３の保管中のサイズバリアントの形成を、図１１に示す。ｐＨ範囲７．０～７．６で緩衝されたＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、Ａｒｇ／Ａｒｇ－ＨＣｌ、スクロース、ＰＳ２０又はＰＳ８０を含有する製剤（Ｆ３３～Ｆ３８）は、２５℃で他の製剤よりもメインピーク損失の速度が緩慢であり、対照的に、Ｆ１８よりも顕著に７０％緩慢であり、Ｆ１４よりも１９．５倍以上緩慢であった（表１０）。２～８℃で保管した場合、Ｆ３３中のＥＦＸのサイズバリアント（ＨＭＷＳ及びＬＭＷＳ）の形成速度は、Ｆ１８よりも約５０％低く、例としてＦ１４よりも２０倍低かった（表１１）。ＥＦＸとＦ３３に含まれる（及び列挙された濃度での）賦形剤との独自の組み合わせは、２～８℃で保管した場合、ＥＦＸのサイズバリアントプロファイルが時間の経過とともに比較的変化しないことを確実にした（図１２）。同様に、２５℃でよりストレスの多い条件下で保管した場合、Ｆ３３は、タンパク質ベースのバイオ医薬品に一般的に使用される他の賦形剤に基づく製剤と比較して、サイズバリアントの形成速度が最も緩慢なことを示した（図１１）。
【0126】
【表11】
【0127】
【表12】
【0128】
ＣＥ－ＳＤＳ（非還元）によるサイズバリアント（ＨＭＷＳ及びＬＭＷＳ）の評価
ＥＦＸの純度を評価するために、ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）によるキャピラリー電気泳動を使用した。方法は、還元された変性ＥＦＸ、並びに非還元の変性ＥＦＸを使用した。
ＥＦＸの純度を評価するために、ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）によるキャピラリー電気泳動を使用した。方法は、還元された変性ＥＦＸ、並びに非還元の変性ＥＦＸを使用した。
【0129】
ＥＦＸのサイズバリアントを、変性、非還元条件下でＣＥ－ＳＤＳによって定量的に決定した。ＥＦＸを、ｐＨ６．５及び１０％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ溶液で１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と混合し、その後、室温で１４０ｍＭのＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を添加した。次に、２２０ｎｍの吸光度を監視するＰＤＡ検出器を取り付けたＢｅｃｋｍａｎ ＰＡ８００ Ｐｌｕｓ薬学的分析システムを用いて、２０ｃｍのコーティングされていないシリカキャピラリー（内径５０μｍ）中で試料を分析した。各電気泳動分析からのデータは、３２カラットデータ収集ソフトウェアを使用して取得した。
【0130】
非還元、変性ＥＦＸの分析は、メインピークとしてインタクトなタンパク質を示した。単鎖及び低分子量種は、プレピークとしてメインピークの前に移動する。ＥＦＸの代表的な電気泳動図に示すように、ＥＦＸの凝集体をポストピークとしてメインピークの後に統合した（図１３）。
【0131】
図１４に示すように、選択された製剤中のＥＦＸのサイズバリアントの形成は２５℃で保管されており、ＣＥ－ＳＤＳ（非還元）によって経時的にメインピークが減少することが明らかであり、そして、図１５において２～８℃で保管された。ＥＦＸ製剤を２～８℃で保管した場合、全ての製剤のサイズバリアントは、経時的に比較的変化しなかった（図１５）。２５℃では、純度損失がより大きく、例えばＦ１（－７．０４％／週）であった。比較すると、Ｆ３３はこれらの条件下で改善された安定性を示し、サイズバリアントが約１０倍遅い速度（－０．７０％／週）で形成された。
【0132】
ＲＰ－ＨＰＬＣによるサイズバリアント（ＨＭＷＳ及びＬＭＷＳ）の形成の評価
ＲＰ－ＨＰＬＣ法は、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５μｍ粒径）カラム上で、４５℃にて７０％Ｎ－プロパノール及び３０％アセトニトリルの二相勾配に対して水中の０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸の移動相を使用して、並びに０．５ｍＬ／分の流量でＥＦＸを分離する。溶出したタンパク質ピークを、２８０ｎｍのＵＶ吸光度検出器で検出する。
ＲＰ－ＨＰＬＣ法は、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５μｍ粒径）カラム上で、４５℃にて７０％Ｎ－プロパノール及び３０％アセトニトリルの二相勾配に対して水中の０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸の移動相を使用して、並びに０．５ｍＬ／分の流量でＥＦＸを分離する。溶出したタンパク質ピークを、２８０ｎｍのＵＶ吸光度検出器で検出する。
【0133】
ＥＦＸのＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを図１６に示す。分離されたピーク（１～７番）の含有量を、オンライン高分解能質量分析によって特性化し、表１２に要約した。
【0134】
２５℃で保管された選択された製剤Ｆ１～Ｆ２０及びＦ３３におけるサイズバリアントの形成は、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定された経時的なメインピークの減少として明らかであり、図１７に示される。ｐＨ範囲７．０～７．６で緩衝されたＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、Ａｒｇ／Ａｒｇ－ＨＣｌ、スクロース、ＰＳ２０又はＰＳ８０を含有するＥＦＸの製剤（Ｆ３３～Ｆ３８）は、２５℃で製剤Ｆ１８よりも約１０％遅いメインピーク損失速度を有し、製剤Ｆ１４よりも約６倍遅い速度を有する（表１０）。２～８℃で保管した場合、Ｆ３３中のサイズバリアント（ＨＭＷＳ及びＬＭＷＳ）の形成速度もＦ１８の約半分であり、Ｆ２０の約３０倍低かった（表１３）。
【0135】
試験した様々な製剤は、ＥＦＸの安定性に有益な効果をもたらしたが、Ｆ３３に含まれる賦形剤（すなわち、糖、界面活性剤、及びＡｒｇ／Ａｒｇ－ＨＣｌ）とのＥＦＸの組み合わせは優れており、２～８℃で保管した場合、ＥＦＸのサイズバリアントプロファイルが時間の経過とともに比較的変化しないことを確実にした（図１８）。同様に、２５℃でよりストレスの多い条件下で保管した場合、Ｆ３３は、タンパク質ベースのバイオ医薬品に一般的に使用される他の賦形剤の組み合わせに基づく製剤と比較して、サイズバリアントの形成速度が最も緩慢なことを示した（図１７）。
【0136】
【表13】
【0137】
【表14】
【0138】
質量分析による最も安定した製剤におけるＥＦＸの質量及び電荷バリアントの評価
変更された電荷バリアントの変化に関連する質量バリアント及び翻訳後修飾を解明するために、ＥＦＸの様々な製剤を、インタクト質量及びトリプシンで消化した後のペプチドマッピングによって特性化した。トリプシンペプチドの調製中に生じる脱アミド化又は酸化などの化学修飾を最小限に抑えるために、還元条件下で消化を実施した。得られたトリプシンペプチドを、紫外線吸収（２８０ｎｍ）による検出を備えたＣ１８逆相超高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＰＬＣ）を使用して分離し、次いで、高分解能質量分析によって特性化した。非ストレス製剤（凍結保管）中のＥＦＸの質量バリアントの種類を、２～８℃で１ヶ月間、２５℃で１ヶ月間、及び４０℃で１ヶ月間（２５℃で１ヶ月間との類似性のためにデータは示されていない）保管した製剤中のものと比較した。最も安定な製剤、Ｆ１８及びＦ３３におけるＥＦＸの未修飾のインタクトなホモ二量体、及び他の質量バリアント（断片及び修飾種）の相対存在量を表１４に要約する。
変更された電荷バリアントの変化に関連する質量バリアント及び翻訳後修飾を解明するために、ＥＦＸの様々な製剤を、インタクト質量及びトリプシンで消化した後のペプチドマッピングによって特性化した。トリプシンペプチドの調製中に生じる脱アミド化又は酸化などの化学修飾を最小限に抑えるために、還元条件下で消化を実施した。得られたトリプシンペプチドを、紫外線吸収（２８０ｎｍ）による検出を備えたＣ１８逆相超高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＰＬＣ）を使用して分離し、次いで、高分解能質量分析によって特性化した。非ストレス製剤（凍結保管）中のＥＦＸの質量バリアントの種類を、２～８℃で１ヶ月間、２５℃で１ヶ月間、及び４０℃で１ヶ月間（２５℃で１ヶ月間との類似性のためにデータは示されていない）保管した製剤中のものと比較した。最も安定な製剤、Ｆ１８及びＦ３３におけるＥＦＸの未修飾のインタクトなホモ二量体、及び他の質量バリアント（断片及び修飾種）の相対存在量を表１４に要約する。
【0139】
【表15】
【0140】
各トリプシンペプチドについて、翻訳後修飾の種類を特定した。ＥＦＸの最も安定な製剤（Ｆ１８及びＦ３３）からの修飾されたアミノ酸残基を含有する各ペプチドの相対存在量を、非ストレスの同じ製剤を参照して、２５℃で１ヶ月間ストレスを与えた後に比較した（表１５を参照）。
【0141】
【表16】
【0142】
Ｆ１８及びＦ３３で製剤化されたＥＦＸの翻訳後修飾の主な形態は、アスパラギン（Ａｓｎ）の低レベルのＡｓｎのスクシンイミド中間体を含む酸性アスパラギン酸残基への脱アミドであり、より多くの酸性電荷バリアントをもたらす。ＥＦＸの各モノマー鎖中の９つのＡｓｎ残基のうちの８つは、ある程度の脱アミドを示した。更に、４つのグルタミン（Ｇｌｎ）残基のうちの２つも、各モノマー鎖において、酸性グルタミン酸に脱アミドされた。メチオニン（Ｍｅｔ）の酸化は、３つの位置で低レベルで存在した。予想されるように、翻訳後修飾及び電荷バリアント形成の著しく低いレベルは、ＥＦＸの最も安定した製剤、Ｆ１８及びＦ３３ではストレス下で明らかであり、Ｆ３３はＦ１８よりも感受性が低く、特に脱アミドに最も感受性の高い２つのＡｓｎ残基及び酸化に最も感受性の高いＭｅｔが出現する（表１５を参照）。
【0143】
サイズ排除クロマトグラフィー－多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ）による最も安定した製剤におけるＥＦＸのサイズバリアントの評価
ＥＦＸの未希釈試料中の分子量による種の分布を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによって評価した。ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ法は、２つのインライン検出器：１）２８０ｎｍ及び３６０ｎｍで記録するＵＶ検出器、（１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び２）光散乱検出器（ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、異なるサイズのＥＦＸの種の溶出を監視する。データ分析及び分子量（ＭＷ）計算を、ＡＳＴＲＡ６ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、ＭＡＬＬＳデータ上で実施した。ＥＦＸについて、０．９７ｍＬ ｍｇ－１ｃｍ－１の理論消光係数を使用して、分子量値を計算した。
ＥＦＸの未希釈試料中の分子量による種の分布を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによって評価した。ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ法は、２つのインライン検出器：１）２８０ｎｍ及び３６０ｎｍで記録するＵＶ検出器、（１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び２）光散乱検出器（ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ ＩＩ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、異なるサイズのＥＦＸの種の溶出を監視する。データ分析及び分子量（ＭＷ）計算を、ＡＳＴＲＡ６ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、ＭＡＬＬＳデータ上で実施した。ＥＦＸについて、０．９７ｍＬ ｍｇ－１ｃｍ－１の理論消光係数を使用して、分子量値を計算した。
【0144】
ＥＦＸの製剤の反復注入の分析は、９２ｋＤａの計算されたＭＷと良好に一致して、８８．０～８８．４ｋＤａの見かけのＭＷを割り当てた、タンパク質の９４．５％を占めるメインピークを明らかにした。二量体及びＨＭＷ、並びに低ＭＷバリアント（ＬＭＷ）の２つの高ＭＷバリアントを含む、比較的少ない量の３つの追加の種も見出された。図１９は、Ｆ１８におけるＥＦＸの代表的なＳＥＣ－ＭＡＬＬＳクロマトグラム（非ストレス）を示す。低存在量バリアントの分子量の正確な決定は、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳに必要な高タンパク質濃度の結果として、様々なピークの比較的不完全な分離のために困難であった。それにもかかわらず、二量体種は１３６ｋＤａの見かけのＭＷを有し、ＨＭＷ種は２９２ｋＤａの見かけのＭＷを有し、ＨＭＷ種はより大きなオリゴマー、おそらくは四量体を表し得ることを意味する。ＬＭＷ種は、ＭＷを割り当てるのに十分に豊富ではなかった。
【0145】
最も安定した製剤における超遠心チン光速度法（ＳＶ－ＡＵＣ）によるサイズ分布
異なる製剤中のＥＦＸの流体力学的立体配座特性を、Ｏｐｔｉｍａ分析用超遠心分離器（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してＳＶ－ＡＵＣによって分析した。試料は、１．０ｍｇタンパク質／ｍＬで分析した。ＳＶ－ＡＵＣの実行は、８穴Ａｎ５０チタンローター中の１２－ｍｍ Ｅｐｏｎ－炭二重セクター中心試料セルを用いて、２０℃で４５，０００ｒｐｍで実施した。半径方向走査測定のサブセットから選択された生の沈降境界データのグローバルフィッティングを、ソフトウェアプログラムＳＥＤＦＩＴ Ｖ．１１．７１を使用した連続分布ｃ（ｓ）分析法によって各試料について実施した。沈降係数分布ｃ（ｓ）プロファイルの作成に加え、標準条件（Ｓ２０，ｗ）、摩擦係数比（ｆ／ｆ０）、分子量（ＭＷ）下での沈降係数を推定した。
異なる製剤中のＥＦＸの流体力学的立体配座特性を、Ｏｐｔｉｍａ分析用超遠心分離器（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してＳＶ－ＡＵＣによって分析した。試料は、１．０ｍｇタンパク質／ｍＬで分析した。ＳＶ－ＡＵＣの実行は、８穴Ａｎ５０チタンローター中の１２－ｍｍ Ｅｐｏｎ－炭二重セクター中心試料セルを用いて、２０℃で４５，０００ｒｐｍで実施した。半径方向走査測定のサブセットから選択された生の沈降境界データのグローバルフィッティングを、ソフトウェアプログラムＳＥＤＦＩＴ Ｖ．１１．７１を使用した連続分布ｃ（ｓ）分析法によって各試料について実施した。沈降係数分布ｃ（ｓ）プロファイルの作成に加え、標準条件（Ｓ２０，ｗ）、摩擦係数比（ｆ／ｆ０）、分子量（ＭＷ）下での沈降係数を推定した。
【0146】
Ｆ１８及びＦ３３中のＥＦＸの代表的な沈降係数分布プロファイルを図２０に示す。グラフの縦軸は濃度分布を示し、横軸は沈降係数に基づいた種の分離を示す。全種の約１００％を占める製剤Ｆ３３の主な種は、４．０６Ｓの見かけの沈降係数、１．８のｆ／ｆ０、及び計算された見かけのＭＷ８９．７ｋＤａを有する（表１６）。全種の９８．７％を占める製剤Ｆ１８の主な種は、４．４７Ｓの見かけの沈降係数、１．６のｆ／ｆ０、及び計算された見かけのＭＷ８８．９ｋＤａを有する（表１６）。ＨＭＷ種は、全種の０．２％～１．３％を占める。Ｆ１８ではＬＭＷ種は観察されない（スケール拡張インサートを有する図２３）。ＨＭＷ種の沈降係数値は、二量体（約６．５Ｓ）及びより大きなオリゴマー種、潜在的に四量体（約９Ｓ）と一致する。
【0147】
【表17】
【0148】
細胞ベースの効力バイオアッセイ
ＥＦＸ細胞ベースの効力バイオアッセイは、ヒト胚性腎細胞株ＨＥＫ２９３に由来する「ｉＬｉｔｅ ＦＧＦ２１ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｙ Ｃｅｌｌｓ」（Ｓｖａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＢＭ３０７１）を使用する。これらのＦＧＦ２１ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｙ Ｃｅｌｌｓは、下記を過剰発現するように組換え操作されている：（１）ヒトＦＧＦ２１の２つの専用共受容体：ヒト線維芽細胞成長因子受容体－１ｃ（ＦＧＦＲ１ｃ）及びヒトβＫｌｏｔｈｏ（ＫＬＢ）、並びに（２）活性化ＦＧＦＲ１ｃからの下流細胞内シグナル伝達に応答してホタルルシフェラーゼを発現するように設計されたレポーター系（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４，７４３２－７４３７、Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｔａｂ．２０１８；１３：４５－５５、Ｙｉｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８３，１９－２４）。ＫＬＢとの共受容体複合体として結合すると、ＦＧＦ２１はＦＧＦＲ１ｃのチロシンキナーゼを活性化し、ＦＧＦＲ１ｃは下流アダプタータンパク質をリン酸化し、ＥＲＫ１／２（細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ）のリン酸化を含むラット肉腫－マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＲＡＳ－ＭＡＰＫ）カスケードの活性化をもたらす。リン酸化ＥＲＫ１／２は、転写因子であるＥＴＳドメイン含有タンパク質Ｅｌｋ１を活性化する核に転座する（Ｏｒｎｉｔｚ ａｎｄ Ｉｔｏｈ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１５；４（３）：２１５－６６、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｒｅｐ．２０１９ Ｆｅｂ；１９（２）：７５９－７７０）。したがって、ｉＬｉｔｅ ＦＧＦ２１ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｙ Ｃｅｌｌｓは、ＦＧＦＲ１ｃ－ＫＬＢのＦＧＦ２１の共受容体複合体のアゴニストとしてのＥＦＸのインビトロ効力を、細胞ベースのアッセイによって測定することを可能にする。共受容体に同時に結合するＥＦＸの三量体複合体は、ＥＦＸがＦＧＦＲ１ｃ媒介シグナル伝達を活性化する程度に比例してルシフェラーゼ酵素の発現を刺激する。
ＥＦＸ細胞ベースの効力バイオアッセイは、ヒト胚性腎細胞株ＨＥＫ２９３に由来する「ｉＬｉｔｅ ＦＧＦ２１ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｙ Ｃｅｌｌｓ」（Ｓｖａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＢＭ３０７１）を使用する。これらのＦＧＦ２１ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｙ Ｃｅｌｌｓは、下記を過剰発現するように組換え操作されている：（１）ヒトＦＧＦ２１の２つの専用共受容体：ヒト線維芽細胞成長因子受容体－１ｃ（ＦＧＦＲ１ｃ）及びヒトβＫｌｏｔｈｏ（ＫＬＢ）、並びに（２）活性化ＦＧＦＲ１ｃからの下流細胞内シグナル伝達に応答してホタルルシフェラーゼを発現するように設計されたレポーター系（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４，７４３２－７４３７、Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｔａｂ．２０１８；１３：４５－５５、Ｙｉｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８３，１９－２４）。ＫＬＢとの共受容体複合体として結合すると、ＦＧＦ２１はＦＧＦＲ１ｃのチロシンキナーゼを活性化し、ＦＧＦＲ１ｃは下流アダプタータンパク質をリン酸化し、ＥＲＫ１／２（細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ）のリン酸化を含むラット肉腫－マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＲＡＳ－ＭＡＰＫ）カスケードの活性化をもたらす。リン酸化ＥＲＫ１／２は、転写因子であるＥＴＳドメイン含有タンパク質Ｅｌｋ１を活性化する核に転座する（Ｏｒｎｉｔｚ ａｎｄ Ｉｔｏｈ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１５；４（３）：２１５－６６、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｒｅｐ．２０１９ Ｆｅｂ；１９（２）：７５９－７７０）。したがって、ｉＬｉｔｅ ＦＧＦ２１ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｙ Ｃｅｌｌｓは、ＦＧＦＲ１ｃ－ＫＬＢのＦＧＦ２１の共受容体複合体のアゴニストとしてのＥＦＸのインビトロ効力を、細胞ベースのアッセイによって測定することを可能にする。共受容体に同時に結合するＥＦＸの三量体複合体は、ＥＦＸがＦＧＦＲ１ｃ媒介シグナル伝達を活性化する程度に比例してルシフェラーゼ酵素の発現を刺激する。
【0149】
ｉＬｉｔｅ ＦＧＦ２１ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｙ細胞をプレートした後、ＥＦＸ試験試料の段階希釈液とともにインキュベートし、適切な陽性対照及び陰性対照を並行して実行する。発現されるルシフェラーゼの量を測定するために、細胞を、洗剤及びルシフェラーゼ基質であるルシフェリンを含有する試薬で溶解する。ルシフェラーゼによるルシフェリンの切断は、発光計を使用して測定された発光を生じる。発光シグナルを被験試料タンパク質濃度の関数としてプロットし、非線形最小二乗回帰分析によって４パラメータのロジスティック方程式に適合する濃度応答曲線を生成する。試験試料の相対効力は、同時に生成された参照標準濃度応答プロットに適合する曲線の値に下限／上限漸近線及び丘勾配を制限し、次いで、参照標準のＥＣ５０と試料のＥＣ５０パラメータとの比率をとることによって決定される。Ｆ１８中のＥＦＸの代表的な濃度応答曲線を図２１に示す。
【0150】
ｉ－Ｌｉｔｅ細胞ベースのバイオアッセイによって測定された、２５℃で保管された、選択された製剤Ｆ１～Ｆ２０及びＦ３３中のＥＦＸの相対効力を図２２に示す。２～８℃で保管された、選択された製剤中のＥＦＸの相対効力を図２３に示す。両方の保管条件下で、ｐＨ範囲７．０～７．６で緩衝されたＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、Ａｒｇ／Ａｒｇ－ＨＣｌ、スクロース、ＰＳ２０又はＰＳ８０を含有するＥＦＸ製剤（Ｆ３３～Ｆ３８）は、２５℃／６０％ＲＨでの１２週間の保管にわたって約８０％の効力の損失を示したＦ３などの他の製剤の多くとは対照的に、相対効力の経時的な明らかな損失を示さない。
【0151】
ＥＦＸとＦ３３に含まれる賦形剤との独自の組み合わせにより、タンパク質ベースのバイオ医薬品に一般的に使用される他の賦形剤に基づく製剤とは対照的に、２５℃で保管した場合、ＥＦＸの細胞ベースの効力が時間の経過とともに比較的変化しないことが確実となった（図２２）。
【0152】
実施例４：ＥＦＸ製剤の立体配座安定性及び熱安定性
ＥＦＸタンパク質を含有する溶液のフーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）スペクトルを、２５℃の制御された温度でＴｅｎｓｏｒ２７ ＦＴＩＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ）及びＡｑｕａＳｐｅｃ透過オプティカルベンチ上で得た。希釈せずに測定したタンパク質試料のスペクトルを、４，０００～８５０ｃｍ－１の波数で４ｃｍ－１の分解能で記録した。各単一ビーム測定は、６０回のスキャンの平均であり、大気補償を使用した（スペクトル中の干渉Ｈ２Ｏ及び／又はＣＯ２バンドの排除）。ＥＦＸを含有する各試料の背景補正された吸光度スペクトルを、１，７００～１，６００ｃｍ－１の波数領域におけるベクトル正規化の後、９つの平滑化点を有する二次微分スペクトルに変換した。
ＥＦＸタンパク質を含有する溶液のフーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）スペクトルを、２５℃の制御された温度でＴｅｎｓｏｒ２７ ＦＴＩＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ）及びＡｑｕａＳｐｅｃ透過オプティカルベンチ上で得た。希釈せずに測定したタンパク質試料のスペクトルを、４，０００～８５０ｃｍ－１の波数で４ｃｍ－１の分解能で記録した。各単一ビーム測定は、６０回のスキャンの平均であり、大気補償を使用した（スペクトル中の干渉Ｈ２Ｏ及び／又はＣＯ２バンドの排除）。ＥＦＸを含有する各試料の背景補正された吸光度スペクトルを、１，７００～１，６００ｃｍ－１の波数領域におけるベクトル正規化の後、９つの平滑化点を有する二次微分スペクトルに変換した。
【0153】
Ｆ１８及びＦ３３中のＥＦＸの二次微分ＦＴＩＲスペクトルを図２４に示す。吸収スペクトルは、βシートに対応する約１６４１ｃｍ－１及び１６８９ｃｍ－１で強力なバンドを示し、Ｆｃドメインを含むタンパク質に典型的な、タンパク質における逆平行βシート構造の優位性を示している。
【0154】
遠紫外円偏光二色性分光法（ＣＤ）による立体配座安定性
ＥＦＸの二次構造を、遠紫外円偏光二色性分光法（ＣＤ）によって分析した。遠紫外ＣＤ分光法（１９０～２６０ｎｍ）の主要な発色団は、タンパク質のペプチド結合である。ＣＤシグナルは、波長の関数として、タンパク質の配列によって決定される、二次構造の下にあるペプチド結合の向きから生じる。したがって、遠紫外ＣＤスペクトルは、タンパク質の二次構造の感度測定を提供する。
ＥＦＸの二次構造を、遠紫外円偏光二色性分光法（ＣＤ）によって分析した。遠紫外ＣＤ分光法（１９０～２６０ｎｍ）の主要な発色団は、タンパク質のペプチド結合である。ＣＤシグナルは、波長の関数として、タンパク質の配列によって決定される、二次構造の下にあるペプチド結合の向きから生じる。したがって、遠紫外ＣＤスペクトルは、タンパク質の二次構造の感度測定を提供する。
【0155】
Ｃｈｉｒａｓｃａｎ Ａｕｔｏ Ｑ１００ ＣＤ分光計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｔｄ．）を自動遠紫外ＣＤ分光測定に使用した（波長範囲：１９０～２６０ｎｍ）。スペクトルを、２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度及び０．１ｍｍの経路長を有する２０℃で収集した。スペクトル帯域幅を１．０ｎｍに設定し、１点当たりのサンプリング時間を１．０秒とし、ステップサイズを１．０ｎｍとした。タンパク質試料の測定ごとに１０回の連続スキャンを平均化した。各タンパク質試料を測定する前に、製剤緩衝液の参照スペクトルを記録し、次いでタンパク質のスペクトルから差し引いた。減算後、ＣＤ値を平均残基楕円率（［θ］ｍｒ）値に変換した。
【0156】
製剤Ｆ１８及びＦ３３中のＥＦＸの遠紫外ＣＤスペクトル（１９５～２６０ｎｍ）（図２５）は、Ｆｃドメインを組み込んだ他のタンパク質のスペクトルと一致している（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，２０１２）。このスペクトルは、適切に折り畳まれたＦｃドメインを示す２３０ｎｍの小さな肩部の特徴を有する。ＣＤスペクトルの一次負の楕円率は、ＦＧＦ２１を含む線維芽細胞増殖因子スーパーファミリーにおけるタンパク質の典型であり、ＥＦＸのＦＧＦ２１ポリペプチド鎖が適切に折り畳まれていることを示す（Ｘｕ ｅｔ ａｌ，２０１２）。しかしながら、ＥＦＸを含有するいくつかの製剤中のＬ－リジン及びポリソルベート２０などのいくつかの賦形剤の存在は、特に１９５ｎｍ未満の波長で、スペクトルの遠紫外波長領域におけるバックグラウンド吸光度を実質的に増加させることに留意されたい。この高いバックグラウンド吸光度を各タンパク質試料のスペクトルから差し引かなければならないため、得られる差は、この波長領域（λ＜１９５ｎｍ）で不良なシグナル／ノイズ及びより大きな変動性を有する。
【0157】
近紫外円偏光二色性分光法（ＣＤ）による立体配座安定性
ＥＦＸの三次構造を、近紫外ＣＤによって評価した。タンパク質の近紫外ＣＤスペクトルにおけるシグナルは、芳香族アミノ酸と関連付けられ、非対称立体配座環境に位置するジスルフィド結合と関連付けられ、タンパク質がその独特な３次元構造に折り畳まれたときにのみ存在する。
ＥＦＸの三次構造を、近紫外ＣＤによって評価した。タンパク質の近紫外ＣＤスペクトルにおけるシグナルは、芳香族アミノ酸と関連付けられ、非対称立体配座環境に位置するジスルフィド結合と関連付けられ、タンパク質がその独特な３次元構造に折り畳まれたときにのみ存在する。
【0158】
Ｃｈｉｒａｓｃａｎ Ａｕｔｏ Ｑ１００ ＣＤ分光計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｔｄ．）上で、近紫外ＣＤスペクトル測定（２５０～３５０ｎｍ）を得た。スペクトルを、２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度及び５．０ｍｍの経路長を有する２０℃で収集した。スペクトル帯域幅を１．０ｎｍに設定し、１点当たりのサンプリング時間を１．０秒とし、ステップサイズを１．０ｎｍとした。タンパク質試料の測定ごとに１０回の連続スキャンを平均化した。タンパク質試料を測定する前に、製剤緩衝液の参照スペクトルを記録し、試料のスペクトルから差し引いた。減算後、ＣＤ値を平均残基楕円率（［θ］ｍｒ）値に変換した。
【0159】
製剤Ｆ１８及びＦ３３中のＥＦＸの近紫外ＣＤスペクトルを図２６に示す。スペクトルは、トリプトファン残基に起因する２８９～２９２ｎｍでの顕著なシグナル、チロシン残基に対応する２７０～２８５ｎｍでの顕著なシグナル、及び２５０～２７０ｎｍでの広範なジスルフィドシグナルに重ねられたフェニルアラニン及びチロシン残基に起因する２５０～２７０ｎｍでの顕著なシグナルを含有する。これらの特徴の強度は、ＥＦＸの折り畳み構造内のジスルフィド結合及び芳香族アミノ酸の独自の構造配置を反映している。例えば、ＥＦＸの試料が完全に展開された場合、スペクトルはゼロ周りの直線であり、一方、部分的に展開されたタンパク質は、特にジスルフィド結合の空間配置に関連する２５０～２７０ｎｍの領域において、様々なスペクトルシグナルの強度の低下を示すであろう。近紫外ＣＤスペクトルの形状及び強度は、ＥＦＸが明確に定義された三次構造で折り畳まれていることを示す。
【0160】
示差走査微小熱量測定（μＤＳＣ）による熱安定性
ＥＦＸの熱安定性を、ＭｉｃｌｅＣａｌ Ａｕｔｏ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣシステム（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して示差走査微小熱量測定（μＤＳＣ）によって評価した。２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を使用してサーモグラムを収集した。ＥＦＸの展開に関連する吸熱を特性化するために、ＥＦＸを含有するか、又はＥＦＸを含まずに賦形剤及び緩衝剤を含む製剤の試料を、１０～１１０℃で６０℃／時の速度で加熱した。高温加熱中の試料の沸騰を防ぐために、μＤＳＣセルを加圧した。ベースラインランを、基準細胞及び試料細胞の両方に製剤緩衝液を充填することによって実施した。ベースラインサーモグラムを、ＥＦＸを含有する製剤の各測定値から差し引いた。次に、試料の過剰熱容量値をタンパク質濃度に対して正規化した。熱遷移中点温度（Ｔｍ）値を、加熱スキャンの微分分析を使用して、ピーク又は肩部の中心で決定した。熱安定性パラメータの値を決定するために、Ｏｒｉｇｉｎ ７．０ ＤＳＣソフトウェアを用いて、データ分析及びピークデコンボリューションを実施した。
ＥＦＸの熱安定性を、ＭｉｃｌｅＣａｌ Ａｕｔｏ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣシステム（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して示差走査微小熱量測定（μＤＳＣ）によって評価した。２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を使用してサーモグラムを収集した。ＥＦＸの展開に関連する吸熱を特性化するために、ＥＦＸを含有するか、又はＥＦＸを含まずに賦形剤及び緩衝剤を含む製剤の試料を、１０～１１０℃で６０℃／時の速度で加熱した。高温加熱中の試料の沸騰を防ぐために、μＤＳＣセルを加圧した。ベースラインランを、基準細胞及び試料細胞の両方に製剤緩衝液を充填することによって実施した。ベースラインサーモグラムを、ＥＦＸを含有する製剤の各測定値から差し引いた。次に、試料の過剰熱容量値をタンパク質濃度に対して正規化した。熱遷移中点温度（Ｔｍ）値を、加熱スキャンの微分分析を使用して、ピーク又は肩部の中心で決定した。熱安定性パラメータの値を決定するために、Ｏｒｉｇｉｎ ７．０ ＤＳＣソフトウェアを用いて、データ分析及びピークデコンボリューションを実施した。
【0161】
Ｆ１８及びＦ３３中のＥＦＸの代表的なサーモグラムを図２７に示す。それらは、約３３．８～３８．８、６２．７～６５．１、及び８１．１～８１．７℃のそれぞれのＴｍ値を有する３つの独特の吸熱ピークを明らかにする（表１７）。６５℃でのピークは、２つの熱展開事象の存在を示す、顕著な左肩部を含むが、２つのピークは、デコンボリューションアプローチによって解明することができなかった。ＦＧＦ２１ドメインの展開に対応する３８．８℃での第１の吸熱は、完全に可逆的である。図２８は、５０℃に加熱し、１０℃に冷却した後に得られた第２のサーモグラムと重ね合わせ、次いで５０℃に再加熱したときのＥＦＸの初期サーモグラムを示す。これらの２つの連続した熱溶融からの重ね合わせ可能なサーモグラムは、最初の展開（Ｔｍ１＝３８．８℃）が完全に可逆であることを確認する。
【0162】
【表18】
【0163】
μＤＳＣ法は、約２８℃での展開開始を例証し、ＥＦＸが立体配座的に不安定であることを示唆している。タンパク質が展開するにつれて、アミノ酸残基が外面でより露出し、潜在的にＡｓｐ及びＧｌｎの脱アミド及びＭｅｔの酸化をもたらし得る一方で、より多くの疎水性アミノ酸の露出はタンパク質凝集を引き起こし得る。Ａｒｇ／Ａｒｇ－ＨＣｌ、Ｇｌｕ、及びＬｙｓを含有する製剤は、ＥＦＸの立体配座安定性を改善し、それによって、物理的分解、凝集、及び電荷バリアントの形成を低減するようである。スクロースを含有する製剤はまた、トレハロースを含有するものよりも優れた粘弾性特性、立体配座及び熱安定性を有するようである。
【0164】
実施例５：凍結乾燥プロセス
この実施例は、室温で安定し、患者がＥＦＸを自己投与することを可能にする製剤の開発を説明する。Ｆ２、Ｆ３、Ｆ７、Ｆ９、Ｆ１２、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、Ｆ１８、及びＦ３３を含む１１個のＥＦＸ製剤を、バイアル及びデュアルチャンバデバイス中で凍結乾燥した。様々な凍結乾燥プロセス設計／サイクル（パラメータ）を評価して、プロセスの堅牢性、重要な品質属性（ＣＱＡ）の一貫性、及び室温での長期的な安定性を改善／最適化した。患者による自己投与の容易さを確実にするために、様々な製剤及び凍結乾燥プロセスセットパラメータについて、凍結乾燥物を再構成する時間を測定した。
この実施例は、室温で安定し、患者がＥＦＸを自己投与することを可能にする製剤の開発を説明する。Ｆ２、Ｆ３、Ｆ７、Ｆ９、Ｆ１２、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、Ｆ１８、及びＦ３３を含む１１個のＥＦＸ製剤を、バイアル及びデュアルチャンバデバイス中で凍結乾燥した。様々な凍結乾燥プロセス設計／サイクル（パラメータ）を評価して、プロセスの堅牢性、重要な品質属性（ＣＱＡ）の一貫性、及び室温での長期的な安定性を改善／最適化した。患者による自己投与の容易さを確実にするために、様々な製剤及び凍結乾燥プロセスセットパラメータについて、凍結乾燥物を再構成する時間を測定した。
【0165】
凍結乾燥プロセスの説明
凍結乾燥させる凍結乾燥プロセス／サイクルを変化させて、再構成時間、凍結乾燥ケーキの外観、再構成後のサブビジブル粒子数、及び長期保管中の安定性を含む、プロセス工程及びプロセス性能パラメータのＣＱＡへの影響を評価した。
凍結乾燥させる凍結乾燥プロセス／サイクルを変化させて、再構成時間、凍結乾燥ケーキの外観、再構成後のサブビジブル粒子数、及び長期保管中の安定性を含む、プロセス工程及びプロセス性能パラメータのＣＱＡへの影響を評価した。
【0166】
初期凍結乾燥プロセス／サイクル
アニーリング工程のないバイアルの凍結乾燥プロセスの例を図２９に示す。凍結乾燥機の棚は、５℃で予め冷却され、最初の凍結サイクルは－４５℃で続く。その後、一次乾燥を－２５℃の棚温度及び０．０８ｍＢａｒのチャンバ圧力で行う。一次乾燥中に、生成物に熱を加えて、相分離された氷を昇華によって水蒸気に直接変換する。一次乾燥の終了（図２９の矢印で示される）は、キャパシタンスゲージ及びピラニ真空センサが棚温度を超えて安定した製品温度と一直線になる時点として定義される。一次乾燥は昇華によって氷結晶を除去するが、二次乾燥は拡散によってＥＦＸ水に結合したものを除去するために必要である。二次乾燥は昇華中にある程度起こるが、低い棚温度（一次乾燥に典型的）での水の脱着速度は低い。その後の二次乾燥サイクル中に棚温度を４０℃に上げることによって、吸着された水は１０時間後に完全に除去される。
アニーリング工程のないバイアルの凍結乾燥プロセスの例を図２９に示す。凍結乾燥機の棚は、５℃で予め冷却され、最初の凍結サイクルは－４５℃で続く。その後、一次乾燥を－２５℃の棚温度及び０．０８ｍＢａｒのチャンバ圧力で行う。一次乾燥中に、生成物に熱を加えて、相分離された氷を昇華によって水蒸気に直接変換する。一次乾燥の終了（図２９の矢印で示される）は、キャパシタンスゲージ及びピラニ真空センサが棚温度を超えて安定した製品温度と一直線になる時点として定義される。一次乾燥は昇華によって氷結晶を除去するが、二次乾燥は拡散によってＥＦＸ水に結合したものを除去するために必要である。二次乾燥は昇華中にある程度起こるが、低い棚温度（一次乾燥に典型的）での水の脱着速度は低い。その後の二次乾燥サイクル中に棚温度を４０℃に上げることによって、吸着された水は１０時間後に完全に除去される。
【0167】
凍結乾燥プロセスの開発
凍結乾燥プロセスのバリエーションを調査した。特に、最初の凍結サイクルは、棚温度が凍結サイクル中に上下に循環するアニーリング工程を含むように適合された。アニーリングは、製剤の設計に応じて、２つの異なる目的を果たす：ａ）それは、相分離された結晶化賦形剤のための結晶の成長を可能にし、ｂ）それは、オストヴァルト熟成を介して氷結晶のサイズを増加させ、これは、より大きな孔径をもたらし、それによって一次乾燥中の昇華速度を増加させる。この研究におけるアニーリング工程では、－１０℃で５時間アニーリング（図３３）、－７℃又は－５℃で１０時間アニーリング（図示せず）を検討した。アニーリング工程の完了時に、棚を－４５℃に冷却し、凍結乾燥プロセスを－２５℃で一次乾燥工程とともに継続した（図３０）。
凍結乾燥プロセスのバリエーションを調査した。特に、最初の凍結サイクルは、棚温度が凍結サイクル中に上下に循環するアニーリング工程を含むように適合された。アニーリングは、製剤の設計に応じて、２つの異なる目的を果たす：ａ）それは、相分離された結晶化賦形剤のための結晶の成長を可能にし、ｂ）それは、オストヴァルト熟成を介して氷結晶のサイズを増加させ、これは、より大きな孔径をもたらし、それによって一次乾燥中の昇華速度を増加させる。この研究におけるアニーリング工程では、－１０℃で５時間アニーリング（図３３）、－７℃又は－５℃で１０時間アニーリング（図示せず）を検討した。アニーリング工程の完了時に、棚を－４５℃に冷却し、凍結乾燥プロセスを－２５℃で一次乾燥工程とともに継続した（図３０）。
【0168】
凍結乾燥プロセスにアニーリングサイクルを組み込むことが凍結乾燥ＥＦＸの再構成時間に及ぼす影響
ＥＦＸを含有する製剤の凍結乾燥された乾燥粉末ケーキを、製剤Ｆ３３に基づいて、注射用水及び配合希釈剤で再構成した。患者による使用を容易にするために、再構成時間は、理想的には５分以下であるべきである（ただし、これは、本開示の文脈において必要とされない）。
ＥＦＸを含有する製剤の凍結乾燥された乾燥粉末ケーキを、製剤Ｆ３３に基づいて、注射用水及び配合希釈剤で再構成した。患者による使用を容易にするために、再構成時間は、理想的には５分以下であるべきである（ただし、これは、本開示の文脈において必要とされない）。
【0169】
製剤の異なる乾燥固形分を考慮に入れるために、凍結乾燥中の水損失の重量測定を実施した。そのために、凍結乾燥の前後に各製剤の１０バイアルを計量し、水損失を算出した。続いて、決定された注射用水量を使用して、乾燥粉末ケーキを再構成した。ピペットを使用して、容器クロージャ（バイアル又はデュアルチャンバデバイス、ＤＣＤ）の中心部に水を添加した。容器クロージャを注意深く旋回させた（振動は避けた）。凍結乾燥ケーキを完全に再構成するのにかかった時間を記録した（時間：分：秒又は分：秒）。
【0170】
アニーリング工程なしの凍結乾燥プロセスの完了時に（図２９）、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ７、Ｆ９、Ｆ１２、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、及びＦ１８を含む、１００ｍｇ／ｍＬのＥＦＸに対応する１０の凍結乾燥製剤の再構成時間を記録した（図３１を参照）。
【0171】
選択された１０個の製剤の測定された再構成時間は、Ｆ２の１時間：２０分：５８秒から、Ｆ１６の７分：５５秒まで幅広く多岐にわたり、製剤の組成及びｐＨへの依存性を示している。特に、ＥＦＸが経時的に構造化ゲル格子を形成しやすいＦ２などの製剤では、再構成時間が著しく長かった。このような製剤は、高い粘度（図４）及び非ニュートン挙動（図５）で特性化される。より長い再構成時間は、ＥＦＸの等電点を下回るｐＨで配合された製剤でも明らかであった。
【0172】
凍結乾燥プロセスにアニーリング工程を組み込むこと（図３０）は、比表面積（密度の低いケーキ）を減少させ、細孔サイズ面積を最大化すること（図３７）によって凍結乾燥ケーキの構造を大幅に改善し、バイアル（図３２）及びデュアルチャンバデバイス（図３３）中の所与の製剤（例えば、Ｆ３３）について再構成を約５０％だけ加速した。
【0173】
比表面積（ＢＥＴ）
凍結乾燥ケーキの構造に対するアニーリング工程の効果を、比表面積ＢＥＴ分析によって評価した。選択された凍結乾燥製剤の比表面積を、Ａｕｔｏｓｏｒｂ－１（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用したＢＥＴ（ブルナウアー・エメット・テラー理論）法によって分析した。ＢＥＴ法は、固体材料の表面積の決定のために最も広く使用される手順であり、以下の式を使用する。
Ｗ：相対圧力で吸着されたガスの重量（ｐ／ｐ０）［ｇ］；
ｐ：７７．３ケルビンの表面と平衡している吸着ガスの部分蒸気圧［Ｐａ］、
ｐ０：吸着ガスの飽和圧力［Ｐａ］
Ｗｍ：表面被覆の単層を構成する吸着物の重量［ｇ］
Ｃ：ＢＥＴ定数は、第１の吸着層の吸着エネルギーに関連しているす
凍結乾燥ケーキの構造に対するアニーリング工程の効果を、比表面積ＢＥＴ分析によって評価した。選択された凍結乾燥製剤の比表面積を、Ａｕｔｏｓｏｒｂ－１（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用したＢＥＴ（ブルナウアー・エメット・テラー理論）法によって分析した。ＢＥＴ法は、固体材料の表面積の決定のために最も広く使用される手順であり、以下の式を使用する。
【数1】
ｐ：７７．３ケルビンの表面と平衡している吸着ガスの部分蒸気圧［Ｐａ］、
ｐ０：吸着ガスの飽和圧力［Ｐａ］
Ｗｍ：表面被覆の単層を構成する吸着物の重量［ｇ］
Ｃ：ＢＥＴ定数は、第１の吸着層の吸着エネルギーに関連しているす
【0174】
ＢＥＴ方程式は、１／［Ｗ（ｐ０／ｐ）－１］対ｐ／ｐ０の線形プロットを必要とし、これはほとんどの固体について、通常０．０５～０．３５のｐ／ｐ０範囲の吸着等温線の限られた領域に限定されている。標準的な多点ＢＥＴ手法では、適切な相対圧力範囲内の最低３点が必要である。
【0175】
単層の重量（Ｗｍ）は、ＢＥＴプロットの勾配（ｓ）及び切片（ｉ）から得ることができる。
【数2】
【0176】
ＢＥＴ法の適用における第２段階は、表面積の計算である。これには、吸着物分子の分子断面積（Ａｃｓ）の知識が必要である。試料の全表面積（Ｓｔ）は、以下のように表すことができる：
Ｎ：アボガドロ数（６．０２２１４１５×１０２３個の分子／ｍｏｌ）
Ｍ：吸着物の分子量［ｇ／ｍｏｌ］
【数3】
Ｍ：吸着物の分子量［ｇ／ｍｏｌ］
【0177】
固体の比表面積（Ｓ）［ｍ２／ｇ］は、総表面積（Ｓｔ［ｍ２］）及び試料重量（ｗ［ｇ］）から計算することができる。
Ｓ＝Ｓｔ／ｗ
Ｓ＝Ｓｔ／ｗ
【0178】
試料の調製及び分析
約１００ｍｇの凍結乾燥製品をスパチュラで慎重に小片に粉砕し、測定容器に移した。クリプトンの吸着によって面積を測定する前に、環境から吸着された全てのガスを試料の表面から除去する必要がある。測定容器を脱気ステーションに取り付け、真空をオンにした。室温で１６時間脱気した後、真空を中止した。
約１００ｍｇの凍結乾燥製品をスパチュラで慎重に小片に粉砕し、測定容器に移した。クリプトンの吸着によって面積を測定する前に、環境から吸着された全てのガスを試料の表面から除去する必要がある。測定容器を脱気ステーションに取り付け、真空をオンにした。室温で１６時間脱気した後、真空を中止した。
【0179】
続いて、測定容器（セル）をヘリウム（０．７～１．０バール）で約５秒間充填した。クリプトンの吸着を－１９５．８℃（７７．３Ｋ）の浴温度にて測定した。０．０５～０．３５のｐ／ｐ０領域をカバーする７つのデータポイントを収集した。１／［Ｗ＊（ｐ０／ｐ）－１］をｐ／ｐ０に対してプロットした。
【0180】
凍結乾燥プロセスに組み込まれたアニーリング工程ありで又はなしで、製剤Ｆ３３から製造された凍結乾燥ケーキの比表面積（ＢＥＴ）を図３４に提示する。比表面積の数値は、凍結乾燥中にアニーリング工程なしで製造されたケーキ（ＮＡプロセス設計）と比較して、－５℃のアニーリング工程を１０時間使用して製造されたケーキ（Ａ１プロセス設計）又は－１０℃のケーキを５時間使用して製造されたケーキ（Ａ２プロセス設計）の数値がそれぞれ５０％及び７５％低かった（図３４を参照）。データは、凍結乾燥プロセスにおけるアニーリング工程の組み込みが、得られたケーキ（密度の低いケーキ）の比表面積を大幅に減少させることを例証しており、これはＦ３３（図３３Ａ及び３３Ｂ）のような著しく短い再構成時間に関連している。
【0181】
走査型電子顕微鏡－エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＳＥＭ－ＥＤＸ）による凍結乾燥ケーキの形態及び構造の評価
ＥＦＸを含有する凍結乾燥製剤の形態を、ＳＥＭ－ＥＤＸ法によって、ＪＳＭ－ＩＴ２００（Ｊｅｏｌ）システムを使用して分析した。試料調製を、制御された湿度（≦１０％ｒ．ｈ）下でグローブボックス内で実施した。凍結乾燥ケーキ中の細孔の数、並びに二次電子検出器（ＳＥＤ）からのシグナルを使用して細孔の面積をカウントした。入射電圧及びプローブ電流を、それぞれ５ｋＶ及び２０％に設定した。全ての測定は、２０分間の平衡化後、制御されていない高真空下で行った。明るさとコントラストを調整して、得られる画像のコントラストを高くした。細孔の計数及びポア面積の定量化は、Ｊｅｏｌ粒子解析ソフトウェアＶ３を使用して行った。（各試料について微調整された）取得された画像の明るさ値に基づいて、２レベルの二値化（マルチトーン画像の白黒への変換）を適用して、細孔を識別した。２０μｍ２未満の面積を有する細孔を解析から除外した。
ＥＦＸを含有する凍結乾燥製剤の形態を、ＳＥＭ－ＥＤＸ法によって、ＪＳＭ－ＩＴ２００（Ｊｅｏｌ）システムを使用して分析した。試料調製を、制御された湿度（≦１０％ｒ．ｈ）下でグローブボックス内で実施した。凍結乾燥ケーキ中の細孔の数、並びに二次電子検出器（ＳＥＤ）からのシグナルを使用して細孔の面積をカウントした。入射電圧及びプローブ電流を、それぞれ５ｋＶ及び２０％に設定した。全ての測定は、２０分間の平衡化後、制御されていない高真空下で行った。明るさとコントラストを調整して、得られる画像のコントラストを高くした。細孔の計数及びポア面積の定量化は、Ｊｅｏｌ粒子解析ソフトウェアＶ３を使用して行った。（各試料について微調整された）取得された画像の明るさ値に基づいて、２レベルの二値化（マルチトーン画像の白黒への変換）を適用して、細孔を識別した。２０μｍ２未満の面積を有する細孔を解析から除外した。
【0182】
ＳＥＭ分析も、ベンチトップ走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）Ｐｈｅｎｏｍ（Ｐｈｅｎｏｍ－Ｗｏｒｌｄ Ｂ．Ｖ．）を使用して完了した。装置にはＣＣＤカメラ及びダイヤフラム真空ポンプが装備されていた。試料の照射、並びに参照試料の球状粒子の分解能を確認した。
【0183】
凍結乾燥ケーキを回収するために、ケーキを含むガラスバイアルを、ダイヤモンド砥石、Ｐｒｏｘｘｏｎを装備したＭｉｃｒｏｍｏｔ ５０／Ｅを使用して中央で水平に切断した。図３５に示すように、かみそりの刃を使用して凍結乾燥ケーキの水平及び垂直スライスを調製した。
【0184】
スライスを試料ホルダー上の炭素導電性セメント上に置き、断面の切断を表１８に列挙したように上面として提示した。
【0185】
【表19】
【0186】
ＥＦＸ乾燥粉末ケーキを、２０倍の光学倍率及び５ｋＶの加速電圧を用いて真空下で分析した。電子光学倍率を、各試料の代表的な切片から収集された画像を用いて、３４０倍～１０，０００倍に調整した。最低倍率は、試料の高さ及びＳＥＭ内の位置に依存した。
【0187】
凍結乾燥プロセスにおけるアニーリング工程あり又はなしで、製剤Ｆ３３から製造され、ＳＥＭ－ＥＤＸによって分析された凍結乾燥ケーキの断面の細孔面積の分布の箱ひげ図を図３６に示す。アニーリング工程のないプロセスと比較して、アニーリング工程を伴う凍結乾燥によって製造されたケーキでは、より広い細孔面積の分布が明らかである。
【0188】
これと一致して、図３７のＳＥＭ画像は、凍結乾燥プロセスにおけるアニーリング工程の組み込みが、比表面積の減少（より密度の低いケーキ）及び孔径面積の最大化によって乾燥粉末ケーキ構造及び形態を大幅に改善し、一次及び二次乾燥プロセスステップを容易にし、再構成時間を改善することを例証している。
【0189】
実施例６：ストレス条件下で保管されたＥＦＸの凍結乾燥製剤の長期安定性
ｐＨ範囲７．３～７．８の凍結乾燥製剤（Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、及びＦ３３）を選択し、室温条件下（２５℃／６０％相対湿度）で保管した。最長１２ヶ月間の保管後の安定性を評価するために、製剤を、ＥＦＸ製剤のＱＣ放出に使用される一連の試験に対して評価した。図３８は、製剤Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、及びＦ３３における２５℃での凍結乾燥ＥＦＸの長期安定性を示す試験のためのデータをまとめたものである。
ｐＨ範囲７．３～７．８の凍結乾燥製剤（Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、及びＦ３３）を選択し、室温条件下（２５℃／６０％相対湿度）で保管した。最長１２ヶ月間の保管後の安定性を評価するために、製剤を、ＥＦＸ製剤のＱＣ放出に使用される一連の試験に対して評価した。図３８は、製剤Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１７、及びＦ３３における２５℃での凍結乾燥ＥＦＸの長期安定性を示す試験のためのデータをまとめたものである。
【0190】
電荷バリアント、サイズバリアント（凝集、クリッピング／断片化）、ＭＦＩによるサブビジブル粒子形成、及び時間０、３ヶ月、６ヶ月（図示せず）、９ヶ月、及び１４ヶ月における４つ全ての製剤におけるＥＦＸの細胞ベースの効力を比較すると、データは、このｐＨ範囲内のＦ３３を含む凍結乾燥製剤についての重要な生成物属性の経時的な数値において、本質的に変化又は最小限の変化を示し、方法の可変性を可能にした。
【0191】
凍結サイクルにアニーリングステップを組み込んだ凍結乾燥プロセスは、プロセスの堅牢性を改善しただけでなく、一貫した製品属性、室温を含む様々な条件下での長期的な安定性、並びに患者による自己投与の容易さを可能にする迅速な再構成をもたらした。
【0192】
これらの観察は、最も安定した製剤Ｆ３３で凍結乾燥されたＥＦＸだけでなく、冷蔵及び室温条件下で液体として保管されたときに、電荷バリアント、サイズバリアント（ＨＭＷＳ及びＬＭＷＳ）、及びサブビジブル粒子の形成の有意な速度を以前に例証した他の製剤にも適用可能であった。
【0193】
実施例７：ＥＦＸの血清濃度
インビボで様々な製剤の薬物動態パラメータを調べた。群１～７の各動物に、ＥＦＸを含む適切な試験物質製剤の単回皮下（ＳＣ）用量（体積５ｍＬ／ｋｇ）を投与した。各群に投与されるＥＦＸ製剤の詳細を、表１９に提供する。各群は９匹の雌で構成され、各対象に投与された用量は１００ｍｇ／ｋｇであった。
インビボで様々な製剤の薬物動態パラメータを調べた。群１～７の各動物に、ＥＦＸを含む適切な試験物質製剤の単回皮下（ＳＣ）用量（体積５ｍＬ／ｋｇ）を投与した。各群に投与されるＥＦＸ製剤の詳細を、表１９に提供する。各群は９匹の雌で構成され、各対象に投与された用量は１００ｍｇ／ｋｇであった。
【0194】
【表20】
【0195】
投与後の様々な時点におけるＥＦＸの濃度を図３９に図示する。図４０は、全身曝露（ＡＵＣ）を示す薬物動態パラメータの要約を提供し、バイオアベイラビリティ、並びに全身循環における最高濃度（Ｃｍａｘ）の指標を提供する。驚くべきことに、ＰＥＧ（すなわち、ＰＥＧ４０００）は、ＥＦＸに共有結合していないにもかかわらず、皮下注射後に全身曝露／バイオアベイラビリティを増加させた。
【0196】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。前述の発明は、理解を明確にするために例示及び実施例としてある程度詳細に説明されているが、本開示の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の変更及び修正が行われ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27A】
【図27B】
【図28】
【図29】
【図30A】
【図30B】
【図31】
【図32】
【図33A】
【図33B】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38-1】
【図38-2】
【図39】
【図40】
【配列表】
【国際調査報告】