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▶ エヴィア ライフ サイエンシズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-18
(54)【発明の名称】肝線維症を処置するための組成物およびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20241010BHJP
A61K 35/407 20150101ALI20241010BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20241010BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241010BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241010BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20241010BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20241010BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241010BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20241010BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241010BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071 ZNA
A61K35/407
A61K38/19
A61P1/16
A61P31/14
A61P31/20
A61P37/02
A61P35/00
A61P3/00
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024523159
(86)(22)【出願日】2022-10-18
(85)【翻訳文提出日】2024-06-14
(86)【国際出願番号】 US2022078303
(87)【国際公開番号】W WO2023069949
(87)【国際公開日】2023-04-27
(31)【優先権主張番号】63/256,840
(32)【優先日】2021-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521323037
【氏名又は名称】エヴィア ライフ サイエンシズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】落谷 孝広
(72)【発明者】
【氏名】木村 公則
(72)【発明者】
【氏名】松崎 潤太郎
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC20
4B065CA44
4B065CA60
4C084AA02
4C084BA44
4C084DA25
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZB071
4C084ZB072
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB331
4C084ZC191
4C084ZC211
4C084ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB52
4C087BB64
4C087CA04
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA75
4C087ZB07
4C087ZB26
4C087ZB33
4C087ZC19
4C087ZC21
4C087ZC75
(57)【要約】
肝臓疾患、障害、および損傷の処置のための組成物、組成物を作製する方法、および組成物を使用する方法が提供される。上記組成物は、化学的に誘導される肝前駆細胞（ＣＬｉＰｓ）、および／または細胞外小胞（ＥＶｓ）（例えば、エクソソーム）のようなＣＬｉＰｓから形成される無細胞材料を含み得る。いくつかの実施形態において、上記組成物および／または方法は、既存の肝臓コラーゲンまたは新たな肝臓コラーゲンの形成を低減する；および／または既存の線維症の量または新たな線維症の形成を低減することを必要とする被験体において、上記のことをするために有効である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞外小胞（ＥＶｓ）を作製する方法であって、前記方法は、化学的に誘導される肝前駆細胞（ＣＬｉＰｓ）を培養すること、および前記ＣＬｉＰｓによって分泌されるＥＶｓを採取することを包含する方法。
【請求項2】
前記ＣＬｉＰｓは、肝細胞をＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤とともに培養することを包含する方法によって形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、Ａ８３－０１である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記Ａ８３－０１は、約１μＭ～約１０μＭ、または約０．１μＭ～約１０μＭ、または約０．５μＭの濃度にある、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ＣＬｉＰｓは、肝細胞をＧＳＫ３阻害剤とともに培養することを包含する方法によって形成される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ＣＨＩＲ９９０２１は、約０．１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、または約３μＭの濃度にある、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＣＬｉＰｓは、肝細胞を血清とともに培養することを包含する方法によって形成される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記血清は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記血清は、培養培地の約５～２０％、または培養培地の約１０％である、請求項８および９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＣＬｉＰｓは、肝細胞をＲＯＣＫ阻害剤とともに培養することを包含する方法によって形成される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記Ｙ－２７６３２は、約１μＭ～約１００μＭ、または約５μＭ～約２５μＭ、または約１０μＭの濃度にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞は、哺乳動物の肝臓から単離／精製された肝細胞として始まった、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞は、前記阻害剤および／または血清とともに、少なくとも５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、もしくは２０日間または約５日間～約２５日間、あるいはその間の任意の部分範囲もしくは整数の日数、必要に応じて、約７日間～約２２日間、約５日間～約２５日間もしくは約１０日間～約２０日間、または約１２日間～約１７日間；あるいは約１３日間、１４日間、もしくは１５日間にわたって培養される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＥＶｓは、エクソソームを含むかまたはそれからなる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞は、ヒト細胞であり、前記培養することは、ＴＧＢβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、および血清を含み、必要に応じて、ＲＯＣＫ阻害剤を排除する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞は、マウスまたはラット細胞であり、前記培養することは、ＴＧＢβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、必要に応じて、血清を排除する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法に従って作製される、細胞外小胞（ＥＶｓ）。
【請求項20】
請求項１９に記載の、有効量のＥＶｓを含む医薬組成物。
【請求項21】
被験体を処置する治療的または非治療的方法であって、前記方法は、前記被験体に、請求項２０に記載の医薬組成物を投与することを包含する方法。
【請求項22】
肝線維症に関して被験体を処置する方法であって、前記方法は、有効量のＣＬｉＰｓを含む医薬組成物または請求項２０に記載の医薬組成物を前記被験体に投与することを包含する方法。
【請求項23】
前記ＣＬｉＰｓは、ヒト細胞から形成される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項24】
前記医薬組成物は、ＣＬｉＰｓを含む、請求項２２～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記ＣＬｉＰｓは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６６３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐのうちの１種またはこれより多くのもの、ならびに／または１種もしくはこれより多くのサイトカインであって、必要に応じてここで前記サイトカインは、ＴＮＦαであるかまたはこれを含むサイトカイン、あるいはこれらの任意の組み合わせを含むＥＶｓを分泌する、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記医薬組成物は、無細胞である、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記医薬組成物は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６６３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐのうちの１種またはこれより多くのもの、ならびに／または１種もしくはこれより多くのサイトカインであって、必要に応じてここで前記サイトカインは、ＴＮＦαであるかまたはこれを含むサイトカイン、あるいはこれらの任意の組み合わせを含むＥＶｓを含む、請求項２１～２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項28】
前記被験体にＴＮＦαを投与することをさらに包含する、請求項２０～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記被験体は、肝臓疾患または障害を有する、請求項２０～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記肝臓疾患または障害は、感染、必要に応じてＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、もしくはＣ型肝炎；または免疫系の問題、必要に応じて、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎、もしくは原発性硬化性胆管炎；がん、必要に応じて、肝臓がん、胆管がん、もしくは肝細胞腺腫；遺伝性肝障害、必要に応じて、ヘモクロマトーシス、高シュウ酸尿症、ウイルソン病、もしくはα１アンチトリプシン欠乏症；アルコール乱用および／もしくは薬物過剰摂取からの損傷；または非アルコール性脂肪肝疾患から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記ＣＬｉＰｓまたはＥＶｓは、既存の肝臓コラーゲンの量もしくは新たな肝臓コラーゲンの形成を低減する；既存の線維症の量もしくは新たな線維症の形成を低減する；１もしくはこれより多くの肝線維症関連遺伝子の発現の変化、必要に応じて、Ｍｍｐ２ ｍＲＮＡの発現の増加、Ｔｉｍｐ１、αＳＭＡ、および／もしくはＣｏｌ１ａのｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の発現の低減、あるいはこれらの任意の組み合わせを誘導する；肝サテライト細胞において好ましい、肝サテライト細胞活性化の１もしくはこれより多くのマーカー（例えば、αＳＭＡ）の発現の低減を誘導する；細胞周期、オートファジー、細胞膜融合、および／またはジンクフィンガータンパク質と関連する１もしくはこれより多くの遺伝子（ここで必要に応じて前記遺伝子は、Ｄｍｔｆ１、Ｚｆｐ６１２、Ｉｔｇａ６、Ｔｒｉｍ２４、Ｅａｆ２、Ｚｆｐ１１９ａ、Ｄｉｄｏ１、Ｍａｓｐ２、Ｓｇｋ１、Ｓｍ１１５６７、Ｅｍｌ５、Ｓｒｓｆ５、Ｒａｂ３５、Ｆａｍ２０６ａ、Ｚｆｐ１３１、Ｚｋｓｃａｎ１４、Ｉｎｓｃ、Ｎｔｎ３、またはこれらの組み合わせである）の発現の変化を誘導する；肝サテライト細胞においてＭＭＰ１および／もしくはＭＭＰ１３のｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の増加を誘導する；ならびに／あるいは肝サテライト細胞においてＴＮＦαのｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の低減を誘導することができる、請求項１～３０のいずれか１項に記載の組成物または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１８日出願の米国特許出願第６３／２５６，８４０号（これは、その全体において具体的に本明細書に参考として援用される）の利益および優先権を主張する。
本出願は、２０２１年１０月１８日出願の米国特許出願第６３／２５６，８４０号（これは、その全体において具体的に本明細書に参考として援用される）の利益および優先権を主張する。
【0002】
配列表の参照
「ＥＶＩＡ１０２ＰＣＴ．ｘｍｌ」という名称のｘｍｌファイルとして提出された配列表（作成日：２０２２年１０月１８日、サイズ：１８，４９６バイト）は、米国特許法施行規則１．８３４条（ｃ）（１）に従って本明細書により参考として援用される。
「ＥＶＩＡ１０２ＰＣＴ．ｘｍｌ」という名称のｘｍｌファイルとして提出された配列表（作成日：２０２２年１０月１８日、サイズ：１８，４９６バイト）は、米国特許法施行規則１．８３４条（ｃ）（１）に従って本明細書により参考として援用される。
【0003】
発明の分野
本発明の分野は、一般に、化学的に誘導される肝前駆細胞、その細胞でおよびその細胞から作製された組成物、ならびに肝線維症を処置するためのこれを使用する方法に関する。
本発明の分野は、一般に、化学的に誘導される肝前駆細胞、その細胞でおよびその細胞から作製された組成物、ならびに肝線維症を処置するためのこれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
肝細胞は、肝臓疾患を処置する細胞移植のための唯一の有効な細胞供給源と見做されている；しかし、それらの入手は、ドナー不足に起因して制限されている。従って、改善された細胞供給源および代替の処置が、開発されなければならない。結果は、再増殖能力を有する肝前駆細胞が、成熟齧歯類肝細胞およびヒト乳児肝細胞から、低分子阻害剤の適切な組み合わせを使用して得ることができることを示す（Ｋａｔｓｕｄａら， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０， ４１－５５， （２０１７）， ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．１０．００７， Ｋａｔｓｕｄａら， ｅＬｉｆｅ ８：ｅ４７３１３， ３１ ｐａｇｅｓ， （２０１９） ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４７３１３）。しかし、これらの細胞が肝機能を改善する能力の根底にある機序および従って、肝疾患および障害を処置するためのそれらの使用の範囲は、不明のままであった。
従って、本発明の目的は、化学的に誘導される肝前駆細胞が肝機能を改善する能力の根底にある機序、ならびにこれらに基づいて開発された改善された組成物およびその使用方法への見通しを提供することである。
肝細胞は、肝臓疾患を処置する細胞移植のための唯一の有効な細胞供給源と見做されている；しかし、それらの入手は、ドナー不足に起因して制限されている。従って、改善された細胞供給源および代替の処置が、開発されなければならない。結果は、再増殖能力を有する肝前駆細胞が、成熟齧歯類肝細胞およびヒト乳児肝細胞から、低分子阻害剤の適切な組み合わせを使用して得ることができることを示す（Ｋａｔｓｕｄａら， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０， ４１－５５， （２０１７）， ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．１０．００７， Ｋａｔｓｕｄａら， ｅＬｉｆｅ ８：ｅ４７３１３， ３１ ｐａｇｅｓ， （２０１９） ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４７３１３）。しかし、これらの細胞が肝機能を改善する能力の根底にある機序および従って、肝疾患および障害を処置するためのそれらの使用の範囲は、不明のままであった。
従って、本発明の目的は、化学的に誘導される肝前駆細胞が肝機能を改善する能力の根底にある機序、ならびにこれらに基づいて開発された改善された組成物およびその使用方法への見通しを提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｋａｔｓｕｄａら， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０， ４１－５５， （２０１７）， ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．１０．００７
【非特許文献2】Ｋａｔｓｕｄａら， ｅＬｉｆｅ ８：ｅ４７３１３， ３１ ｐａｇｅｓ， （２０１９） ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４７３１３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
発明の要旨
肝臓疾患、障害、および損傷の処置のための組成物、組成物を作製する方法、および組成物を使用する方法が，提供される。上記組成物は、化学的に誘導される肝前駆細胞（ＣＬｉＰｓ）、および／または上記ＣＬｉＰｓから形成される無細胞材料（例えば、エクソソームのような細胞外小胞（ＥＶｓ））を含む。いくつかの実施形態において、上記組成物および／または方法は、下記のことを必要とする被験体において、既存の肝臓コラーゲンまたは新たな肝臓コラーゲンの形成を低減する；既存の線維症の量または新たな線維症の形成を低減する；１もしくはこれより多くの肝線維症関連遺伝子の発現の変化を誘導する、必要に応じて、Ｍｍｐ２ ｍＲＮＡの発現を増加させる、Ｔｉｍｐ１、αＳＭＡ、および／もしくはＣｏｌ１ａのｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の発現を低減する、あるいはこれらの任意の組み合わせである；肝サテライト細胞において好ましい、肝サテライト細胞活性化の１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、αＳＭＡ）の発現の低減を誘導する；細胞周期、オートファジー、細胞膜融合、および／もしくはジンクフィンガータンパク質と関連する１もしくはこれより多くの遺伝子（必要に応じてここで上記遺伝子は、Ｄｍｔｆ１、Ｚｆｐ６１２、Ｉｔｇａ６、Ｔｒｉｍ２４、Ｅａｆ２、Ｚｆｐ１１９ａ、Ｄｉｄｏ１、Ｍａｓｐ２、Ｓｇｋ１、Ｓｍ１１５６７、Ｅｍｌ５、Ｓｒｓｆ５、Ｒａｂ３５、Ｆａｍ２０６ａ、Ｚｆｐ１３１、Ｚｋｓｃａｎ１４、Ｉｎｓｃ、Ｎｔｎ３、もしくはこれらの組み合わせである）の発現の変化を誘導する；肝サテライト細胞においてＭＭＰ１および／もしくはＭＭＰ１３のｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の増加を誘導する；ならびに／あるいは肝サテライト細胞においてＴＮＦαのｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の低減を誘導するために有効である。
肝臓疾患、障害、および損傷の処置のための組成物、組成物を作製する方法、および組成物を使用する方法が，提供される。上記組成物は、化学的に誘導される肝前駆細胞（ＣＬｉＰｓ）、および／または上記ＣＬｉＰｓから形成される無細胞材料（例えば、エクソソームのような細胞外小胞（ＥＶｓ））を含む。いくつかの実施形態において、上記組成物および／または方法は、下記のことを必要とする被験体において、既存の肝臓コラーゲンまたは新たな肝臓コラーゲンの形成を低減する；既存の線維症の量または新たな線維症の形成を低減する；１もしくはこれより多くの肝線維症関連遺伝子の発現の変化を誘導する、必要に応じて、Ｍｍｐ２ ｍＲＮＡの発現を増加させる、Ｔｉｍｐ１、αＳＭＡ、および／もしくはＣｏｌ１ａのｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の発現を低減する、あるいはこれらの任意の組み合わせである；肝サテライト細胞において好ましい、肝サテライト細胞活性化の１種もしくはこれより多くのマーカー（例えば、αＳＭＡ）の発現の低減を誘導する；細胞周期、オートファジー、細胞膜融合、および／もしくはジンクフィンガータンパク質と関連する１もしくはこれより多くの遺伝子（必要に応じてここで上記遺伝子は、Ｄｍｔｆ１、Ｚｆｐ６１２、Ｉｔｇａ６、Ｔｒｉｍ２４、Ｅａｆ２、Ｚｆｐ１１９ａ、Ｄｉｄｏ１、Ｍａｓｐ２、Ｓｇｋ１、Ｓｍ１１５６７、Ｅｍｌ５、Ｓｒｓｆ５、Ｒａｂ３５、Ｆａｍ２０６ａ、Ｚｆｐ１３１、Ｚｋｓｃａｎ１４、Ｉｎｓｃ、Ｎｔｎ３、もしくはこれらの組み合わせである）の発現の変化を誘導する；肝サテライト細胞においてＭＭＰ１および／もしくはＭＭＰ１３のｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の増加を誘導する；ならびに／あるいは肝サテライト細胞においてＴＮＦαのｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の低減を誘導するために有効である。
【0007】
ＣＬｉＰｓから形成されるＥＶｓを作製する方法がまた、提供される。上記方法は、代表的には、ＣＬｉＰｓを培養することおよび上記ＣＬｉＰｓによって分泌されるＥＶｓを採取することを包含する。代表的には、上記細胞は、例えば、約１μＭ～約１０μＭ、もしくは約０．１μＭ～約１０μＭ、または約０．５μＭの濃度のＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤（例えば、Ａ８３－０１）とともに培養される。代表的には、上記細胞はまた、例えば、約０．１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、または約３μＭの濃度のＧＳＫ３阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）とともに培養される。
【0008】
代表的には、上記細胞は、哺乳動物の肝臓から単離／精製された肝細胞として始まる。
【0009】
いくつかの実施形態において、特に上記出発細胞がヒト肝細胞である場合、上記細胞は、例えば、上記培養培地の５～２０％、または上記培養培地の約１０％の濃度の血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））とともに培養される。
【0010】
いくつかの実施形態において、特に、上記出発細胞が齧歯類細胞（例えば、マウスまたはラットに由来する）である場合、上記細胞は、例えば、約１μＭ～約１００μＭ、もしくは約５μＭ～約２５μＭ、または約１０μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）とともに培養される。いくつかの実施形態において、特に、上記細胞がヒトである場合、ＲＯＣＫ阻害剤は、上記培養することから排除され得る。
【0011】
上記細胞は、上記阻害剤および／もしくは血清とともに、少なくとも５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、もしくは２０日間；または約５日間～約２５日間、あるいはその間の任意の部分範囲もしくは整数の日数、必要に応じて、約７日間～約２２日間、約５日間～約２５日間もしくは約１０日間～約２０日間、または約１２日間～約１７日間；あるいは約１３日間、１４日間、もしくは１５日間にわたって培養され得る。
【0012】
有効量のＣＬｉＰｓおよび／またはこれから形成されるＥＶｓを含む医薬組成物がまた、提供される。
【0013】
上記組成物は、代表的には、有効量のＣＬｉＰｓおよび／またはこれから形成されるＥＶｓを含む医薬組成物を上記被験体に投与することを包含する、処置することを必要とする被験体を処置する治療的および非治療的方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、肝線維症に関して被験体を処置するために有効である。
【0014】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、ＥＶｓまたはＥＶｓを分泌するＣＬｉＰｓを含み、上記ＥＶｓは、１またはこれより多くのマイクロＲＮＡｓ（例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６６３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐのうちの１またはこれより多くのもの）、ならびに／または１もしくはこれより多くのサイトカイン（必要に応じてここで上記サイトカインは、ＴＮＦαであるかまたはこれを含む）、あるいはこれらの任意の組み合わせを有する。
【0015】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記被験体に、第２の活性薬剤を投与することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記被験体にＴＮＦαを投与することを包含する。
【0016】
上記方法は、肝臓疾患または障害（例えば、感染、必要に応じて、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、もしくはＣ型肝炎；免疫系の問題、必要に応じて、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎、もしくは原発性硬化性胆管炎；がん、必要に応じて、肝臓がん、胆管がん、もしくは肝臓細胞腺腫；遺伝性肝障害、必要に応じて、ヘモクロマトーシス、高シュウ酸尿症、ウイルソン病、もしくはΑ１アンチトリプシン欠乏症；アルコール乱用および／もしくは薬物過剰摂取からの損傷；または非アルコール性脂肪肝疾患）を有する被験体を処置するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0017】
図面の簡単な説明
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【発明を実施するための形態】
【0033】
発明の詳細な説明
Ｉ． 定義
本明細書で使用される場合、用語「キャリア」または「賦形剤」とは、１種もしくはこれより多くの活性成分が組み合わされる、製剤中の有機成分もしくは無機成分、天然のもしくは合成の不活性成分に言及する。
Ｉ． 定義
本明細書で使用される場合、用語「キャリア」または「賦形剤」とは、１種もしくはこれより多くの活性成分が組み合わされる、製剤中の有機成分もしくは無機成分、天然のもしくは合成の不活性成分に言及する。
【0034】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能な」とは、上記活性成分の生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性材料を意味する。
【0035】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、標準的な医薬キャリア、例えば、リン酸緩衝塩類溶液、水およびエマルジョン（例えば、油／水型または水／油型エマルジョン）、ならびに種々のタイプの湿潤剤のうちのいずれかを包含する。
【0036】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」または「治療上有効な量」とは、処置されている障害、疾患、もしくは状態の１もしくはこれより多くの症状を緩和する、または所望の薬理学的および／もしくは生理学的効果を別の方法で提供するために十分な投与量を意味する。正確な投与量は、被験体に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康状態など）、処置されている疾患もしくは障害、ならびに投与されている薬剤の投与経路および薬物動態のような種々の要因に応じて変動する。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語「防止」または「防止すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」とは、疾患もしくは障害によって引き起こされる１もしくはこれより多くの症状に関するリスクにあるかまたはその素因を有する被験体または系に組成物を投与して、上記疾患もしくは障害の特定の症状の停止、上記疾患もしくは障害の１もしくはこれより多くの症状の低減もしくは防止、上記疾患もしくは障害の重篤度の低減、上記疾患もしくは障害の完全な除去、上記疾患もしくは障害の発生もしくは進行の安定化もしくは遅延を引き起こすことを意味する。
【0038】
本明細書で使用される場合、用語「被験体」、「個体」および「患者」とは、本開示の組成物を使用する処置の標的である任意の個体に言及する。上記被験体は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。従って、上記被験体は、ヒトであり得る。上記被験体は、症候性または無症候性であり得る。上記用語は、特定の年齢または性別を意味しない。従って、成体および新生の被験体（雄性であろうと雌性であろうと）は、網羅されることが意図される。被験体は、コントロール被験体または試験被験体を含み得る。
【0039】
本明細書で使用される場合、「実質的に変化した」とは、コントロールと比較して、少なくとも、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、７５％、１００％、またはこれより大きい変化を意味する。
【0040】
本明細書で使用される場合、用語「精製される」、「単離される」などの用語は、天然の環境にある分子または化合物と通常会合している他の構成成分を実質的に含まない（少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、および最も好ましくは９０％含まない）形態にある分子または化合物の単離に関する。
【0041】
本明細書で使用される場合、「処置」とは、疾患、病的状態、または障害を治癒、改善、安定化、または防止する意図での患者の医療的管理に言及する。この用語は、積極的処置、すなわち、具体的には、疾患、病的状態、または障害の改善に向けた処置を含み、原因処置、すなわち、その関連する疾患、病的状態、または障害の原因の除去に向けた処置をも含む。さらに、この用語は、緩和的処置、すなわち、上記疾患、病的状態、または障害を治癒するよりむしろ、症状の軽減のために設計された処置；防止的処置、すなわち、上記関連する疾患、病的状態、または障害の発生を最小化するかまたは部分的にもしくは完全に阻害することに向けた処置；および支持的処置、すなわち、上記関連する疾患、病的状態、または障害の改善に向けた別の特定の治療を補うために使用される処置を含む。
【0042】
本明細書中での値の範囲の記載は、本明細書で別段示されなければ、その範囲内に入る各別個の値に個々に言及する簡略法として働くことが意図されるに過ぎず、各別個の値は、それが本明細書に個々に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。
【0043】
用語「約」の使用は、述べられた値をおよそ±１０％の範囲において上回るかまたは下回るかのいずれかである値を記載することが意図される；他の形態では、値は、述べられた値をおよそ±５％の範囲において上回るかまたは下回るかのいずれかである値の範囲に及び得る；他の形態では、値は、述べられた値をおよそ±２％の範囲において上回るかまたは下回るかのいずれかである値の範囲に及び得る；他の形態では、値は、述べられた値をおよそ±１％の範囲において上回るかまたは下回るかのいずれかである値の範囲に及び得る。上述の範囲は、文脈によって明らかになることが意図され、さらなる限定は意味されない。
【0044】
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして本明細書で表され得る。このような範囲が表される場合、文脈が別段具体的に示さなければ、その１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までの範囲がまた、具体的に企図されかつ開示されていると見做される。同様に、先行詞「約」の使用によって値が近似値として表される場合、文脈が別段具体的に示さなければ、その特定の値が、開示されたと見做されるべき別の具体的に企図される実施形態を形成することは、理解される。上記範囲の各々の端点が、文脈が別段具体的に示さなければ、他の端点との関係性においても、他の端点とは独立していても有意であることは、さらに理解される。個々の値の全ておよび明示的に開示される範囲内に含まれる値の部分範囲がまた、文脈が別段具体的に示さなければ、具体的に企図され、開示されると見做されるべきであることは、理解されるべきである。最後に、全ての範囲が、範囲として、および第１の端点から（第１の端点を含む）から第２の端点まで（第２の端点を含む）の個々の数字の集合として、その記載される範囲の両方に言及することは、理解されるべきである。後者の場合、個々の数字のうちのいずれかが、その範囲が言及する量、値、または特徴の１つの形態として選択され得ることは、理解されるべきである。このようにして、範囲は、第１の端点から（第１の端点を含む）から第２の端点まで（第２の端点を含む）の数字または値のセットを記載し、そこから、そのセットのうちの単一のメンバー（すなわち、単一の数値）が、その範囲が言及する量、値、または特徴として選択され得る。上記のことは、特定の場合に、これらの実施形態のうちのいくつかまたは全てが明示的に開示されるかどうかにかかわらず、あてはまる。
【0045】
本明細書で開示されるあらゆる化合物は、本明細書で具体的に開示されることが意図され、かつ本明細書で具体的に開示されると見做されるべきである。さらに、本開示内で特定され得るあらゆる部分範囲は、本明細書で具体的に開示されることが意図され、かつ本明細書で具体的に開示されると見做されるべきである。結果として、任意の化合物、または化合物の下位群は、使用のために具体的に含まれるかもしくは使用から排除されるか、または化合物のリストの中に含まれるかもしくはリストから排除されるかのいずれかであり得ることが、具体的に企図される。
【0046】
本開示の組成物を調製するために使用されるべき構成成分、および本明細書で開示される方法内で使用されるべき上記組成物自体が、開示される。これらおよび他の材料が本明細書で開示され、これらの材料の組み合わせ、部分セット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物の各種々の個々のおよび集合的な組み合わせならびに並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）の具体的な言及が明示的に開示されない場合もあるが、各々が具体的に企図され、本明細書に記載されることが理解される。例えば、特定のポリペプチドが開示され、考察され、多くのポリペプチドに対して行われ得る多くの改変が考察される場合、具体的に反対に示されなければ、ポリペプチドの各々およびあらゆる組み合わせおよび並べ替え、ならびに可能な改変が、具体的に企図される。従って、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスが、分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスと同様に開示され、組み合わせの一例、Ａ～Ｄが開示される場合、各々が個々に記載されていないとしても、各々は、個々にかつ具体的に企図される。つまり、組み合わせ、Ａ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、およびＣ－Ｆは、開示されていると見做される。同様に、これらの任意の部分セットまたは組み合わせがまた、開示される。従って、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、およびＣ－Ｅの下位群は、開示されていると見做される。この概念は、本開示の組成物を作製および使用する方法におけるステップが挙げられるが、これらに限定されない、本出願の全ての局面にあてはまる。従って、行われるべき種々のさらなるステップが存在する場合、これらのさらなるステップの各々が、本開示の方法の任意の具体的な実施形態または実施形態の組み合わせで行われ得ることは、理解される。
【0047】
ＩＩ． 組成物
肝疾患、障害、および傷害を処置するための組成物および方法が、本明細書で開示される。上記組成物は、化学的に誘導される肝前駆細胞（ＣＬｉＰｓ）を含み得る、および／またはこれによって形成され得る。上記組成物は、細胞ベースの組成物、または無細胞組成物であり得る。ＣＬｉＰｓを作製する方法がまた、提供される。
肝疾患、障害、および傷害を処置するための組成物および方法が、本明細書で開示される。上記組成物は、化学的に誘導される肝前駆細胞（ＣＬｉＰｓ）を含み得る、および／またはこれによって形成され得る。上記組成物は、細胞ベースの組成物、または無細胞組成物であり得る。ＣＬｉＰｓを作製する方法がまた、提供される。
【0048】
Ａ． 化学的に誘導される肝前駆細胞（ＣＬｉＰｓ）
本開示の組成物および方法は、代表的には、化学的に誘導される肝前駆細胞（ＣＬｉＰｓ）、好ましくはヒトの化学的に誘導される肝前駆細胞（ｈＣＬｉＰｓ）から構成または形成される。上記細胞は、好ましくは、意図的に遺伝子改変されず、例えば、組換え遺伝子技術、指向性遺伝子編集などによって改変されない。しかし、遺伝子改変された細胞も、企図される。例としては、不死化ＣＬｉＰｓ（例えば、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）、および／またはＴＥＲＴを、代表的には、条件付きまたは構成的に活性なプロモーターの制御下で有するもの）が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、以下の実施例を参照のこと）。
本開示の組成物および方法は、代表的には、化学的に誘導される肝前駆細胞（ＣＬｉＰｓ）、好ましくはヒトの化学的に誘導される肝前駆細胞（ｈＣＬｉＰｓ）から構成または形成される。上記細胞は、好ましくは、意図的に遺伝子改変されず、例えば、組換え遺伝子技術、指向性遺伝子編集などによって改変されない。しかし、遺伝子改変された細胞も、企図される。例としては、不死化ＣＬｉＰｓ（例えば、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）、および／またはＴＥＲＴを、代表的には、条件付きまたは構成的に活性なプロモーターの制御下で有するもの）が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、以下の実施例を参照のこと）。
【0049】
１． 出発肝細胞の供給源
化学的誘導の出発材料として使用される肝臓細胞（肝細胞ともいわれる）は、代表的には、肝細胞マーカー遺伝子（例えば、アルブミン（ＡＬＢ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ），グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、トリプトファン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）、ｍｉＲ－１２２など）のうちの少なくとも１タイプ、好ましくは２もしくはこれより多くのタイプ、より好ましくは３もしくはこれより多くのタイプ、さらにより好ましくは４もしくはこれより多くのタイプ、特に好ましくは５もしくはこれより多くのタイプ、および最も好ましくはＡＬＢ、ＴＴＲ、Ｇ６ＰＣ、ＴＡＴ、ＴＤＯ２およびＣＹＰから選択される６タイプ全てを含む。好ましくは、上記肝細胞は、機能的である。機能的肝細胞とは、以下から選択される機能のうちの１またはこれより多くのもの、好ましくは２またはこれより多くのもの、より好ましくは３またはこれより多くのもの、さらにより好ましくは４またはこれより多くのもの、および最も好ましくは全てを保持する肝細胞に言及する：（ｉ）毛細胆管構造を有し、その細管の中に薬物代謝産物を蓄積する；（ｉｉ）細胞膜においてＡＢＣトランスポーター（例えば、ＭＤＲ１、ＭＲＰなど）を発現する；（ｉｉｉ）ＡＬＢを分泌して発現する；（ｉｖ）グリコーゲンを蓄積する；および（ｖ）薬物代謝酵素（例えば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２など）として活性を有する。
化学的誘導の出発材料として使用される肝臓細胞（肝細胞ともいわれる）は、代表的には、肝細胞マーカー遺伝子（例えば、アルブミン（ＡＬＢ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ），グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、トリプトファン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）、ｍｉＲ－１２２など）のうちの少なくとも１タイプ、好ましくは２もしくはこれより多くのタイプ、より好ましくは３もしくはこれより多くのタイプ、さらにより好ましくは４もしくはこれより多くのタイプ、特に好ましくは５もしくはこれより多くのタイプ、および最も好ましくはＡＬＢ、ＴＴＲ、Ｇ６ＰＣ、ＴＡＴ、ＴＤＯ２およびＣＹＰから選択される６タイプ全てを含む。好ましくは、上記肝細胞は、機能的である。機能的肝細胞とは、以下から選択される機能のうちの１またはこれより多くのもの、好ましくは２またはこれより多くのもの、より好ましくは３またはこれより多くのもの、さらにより好ましくは４またはこれより多くのもの、および最も好ましくは全てを保持する肝細胞に言及する：（ｉ）毛細胆管構造を有し、その細管の中に薬物代謝産物を蓄積する；（ｉｉ）細胞膜においてＡＢＣトランスポーター（例えば、ＭＤＲ１、ＭＲＰなど）を発現する；（ｉｉｉ）ＡＬＢを分泌して発現する；（ｉｖ）グリコーゲンを蓄積する；および（ｖ）薬物代謝酵素（例えば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２など）として活性を有する。
【0050】
上記肝細胞は、これらが肝細胞である限りにおいて、例えば、上記の肝細胞マーカー遺伝子の発現によって特徴づけられる場合、任意の供給源から提供され得る。例えば、上記肝細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サルなど、好ましくはヒト、ラットまたはマウスから得られ得る。上記肝細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）もしくは多能性幹細胞（例えば、分化誘導法によるｉＰＳ細胞）から、または直接的再プログラミングによって線維芽細胞から得られ得る。いくつかの実施形態において、上記肝細胞は、遺伝子改変されていない。
【0051】
例示的な供給源は、哺乳動物の肝臓から単離／精製された肝細胞である。例えば、非ヒト哺乳動物の場合には、肝臓が除去され得る。ヒトに関しては、成人肝組織小片が、外科手術によって、または最近病気になったドナー（成人または若年者であり得る）から、切除され得る。妊娠中絶の胎児から切除される肝臓がまた、使用され得る。細胞は、新鮮に単離され得るか、または以前に肝臓から除去され、単離／精製された肝細胞である低温貯蔵された細胞であり得る。上記肝臓は、健常な肝臓であり得る。いくつかの実施形態において、上記肝臓細胞は、上記処置されるべき被験体に対して自己である。
【0052】
肝細胞は、哺乳動物肝臓またはその組織小片から、灌流法によって精製され得る（「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ」（Ｙｏｄｏｓｈａ， ２００４）など）。具体的には、門脈を介してＥＧＴＡ溶液での予備灌流の後に、肝臓は、コラゲナーゼまたはディスパーゼのような酵素溶液（ハンクス溶液など）での灌流によって消化され得、上記肝細胞は、濾過、低速遠心分離などによって細胞小片および非実質細胞を除去することによって精製され得る。
【0053】
２． 阻害剤、血清、および他の因子
ＣＬｉＰｓを形成するために、上記肝細胞を、代表的には、ＴＧＦ－βレセプターの１種またはこれより多くの阻害剤およびＧＳＫ３の１種またはこれより多くの阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態において、上記細胞をまた、１種もしくはこれより多くのＲＯＣＫ阻害剤および／または血清と接触させる。上記接触することは、代表的には、インビトロ／エキソビボで起こる。
ＣＬｉＰｓを形成するために、上記肝細胞を、代表的には、ＴＧＦ－βレセプターの１種またはこれより多くの阻害剤およびＧＳＫ３の１種またはこれより多くの阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態において、上記細胞をまた、１種もしくはこれより多くのＲＯＣＫ阻害剤および／または血清と接触させる。上記接触することは、代表的には、インビトロ／エキソビボで起こる。
【0054】
上記阻害剤の各々（以下でより詳細に考察される）は、標的分子もしくはシグナル伝達経路（例えば、ＴＧＦ－β、ＧＳＫ３、ＲＯＣＫなど）の発現を低減または防止するタンパク質、核酸、低分子、抗体または他の薬剤であり得る。
【0055】
阻害剤は、上記標的分子の発現または活性を、直接または間接的に阻害し得るかまたは別の方法で低減し得る。例えば、ＲＯＣＫ活性化の負の調節因子は、小さなＧＴＰ結合タンパク質（例えば、Ｇｅｍ、ＲｈｏＥ、およびＲａｄ）を含み、これらは、ＲＯＣＫ活性を減弱し得る。ＲＯＣＫの自己阻害活性はまた、そのカルボキシ末端とそのキナーゼドメインとの相互作用でキナーゼ活性を低減することによって実証されている。
【0056】
阻害剤は、低分子、抗体、アンチセンス化合物および負の調節因子であり得るが、これらに限定されない。好ましくは、上記阻害剤のうちの１もしくはこれより多くのものまたは全てが、低分子量化合物（例えば、低分子）である。
【0057】
他の例では、上記阻害剤は、アンチセンス化合物である．一般に、アンチセンス技術の背後にある原理は、アンチセンス化合物が標的核酸にハイブリダイズし、遺伝子発現活性、または機能（例えば、転写、翻訳またはスプライシング）のモジュレーションをもたらすことである。遺伝子発現のモジュレーションは、例えば、標的ＲＮＡ分解または占有ベースの阻害によって達成され得る。分解による標的ＲＮＡ機能のモジュレーションの例は、ＤＮＡ様アンチセンス化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションの際の、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈベースの分解である。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、占有ベースの阻害によって（例えば、スプライス部位へのアクセスを遮断することによって）、スプライシングのような遺伝子発現をモジュレートするために使用され得る。
【0058】
アンチセンス化合物としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。アンチセンス化合物は、阻害のための標的をコードする核酸を特異的に標的化し得る。上記のアンチセンス化合物の各々は、配列特異的標的遺伝子調節を提供する。この配列特異性は、アンチセンス化合物を、目的の標的核酸の選択的モジュレーションのための有効なツールにする。核酸を特異的に標的とするアンチセンス化合物を設計、調製および使用する方法は、当業者の能力の範囲内である。
【0059】
別の実施形態において、上記阻害剤は、機能遮断抗体であり得る。
【0060】
ａ． ＴＧＦ－βレセプター阻害剤
肝細胞を、代表的には、インビトロで、ＴＧＦ－βレセプター阻害剤を含む１またはこれより多くの低分子量シグナル伝達経路阻害剤と接触させる。本発明のために使用されるＴＧＦ－βレセプター阻害剤は、これがトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－βレセプターの機能を阻害する限りにおいて、任意の阻害剤であり得、ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル伝達阻害剤、例えば、低分子、抗体、アンチセンス化合物およびＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル伝達分子の負の調節因子が挙げられる。抗体、アンチセンス化合物および負の調節因子は、ＴＧＦ－βシグナル伝達分子（例えば、ＡＬＫ４、５、および／または７）を標的とするために設計され得る。
肝細胞を、代表的には、インビトロで、ＴＧＦ－βレセプター阻害剤を含む１またはこれより多くの低分子量シグナル伝達経路阻害剤と接触させる。本発明のために使用されるＴＧＦ－βレセプター阻害剤は、これがトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－βレセプターの機能を阻害する限りにおいて、任意の阻害剤であり得、ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル伝達阻害剤、例えば、低分子、抗体、アンチセンス化合物およびＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル伝達分子の負の調節因子が挙げられる。抗体、アンチセンス化合物および負の調節因子は、ＴＧＦ－βシグナル伝達分子（例えば、ＡＬＫ４、５、および／または７）を標的とするために設計され得る。
【0061】
ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル伝達の例示的な低分子阻害剤としては、Ａ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ（Ｅ－６１６４５２）、ＬＤＮ－１９３１８９ ２ＨＣｌ、Ｋ０２２８８、ＢＩＢＦ－０７７５、ＴＰ０４２７７３６ ＨＣｌ、ＬＤＮ－２１４１１７、ＳＤ－２０８、バクトセルチブ（ＴＥＷ－７１９７）、ＭＬ３４７、ＬＤＮ－２１２８５４、ＤＭＨ１、ドルソモルフィン（化合物Ｃ），２ＨＣｌ、ピルフェニドン（Ｓ－７７０１）、スルファサラジン（ＮＳＣ ６６７２１９）、ＡＵＤＡ、ＰＤ １６９３１６、ＴＡ－０２、ＩＴＤ－１、ＬＹ ３２００８８２、アラントラクトン、ハロフジノン、ＳＩＳ３ ＨＣｌ、ドルソモルフィン（化合物Ｃ）、およびヘスペレチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
他の例としては、２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン、３－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（４－キノリル）－１－フェニルチオカルバモイル－１Ｈ－ピラゾール（Ａ－８３－０１）、２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）プテリジン－４－イル）ピリジン－４－イルアミン（ＳＤ－２０８）、３－（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）］－１Ｈ－ピラゾール、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン（全てＭｅｒｃｋから）およびＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0063】
好ましい例は、Ａ－８３－０１（本明細書では「Ａ」ともいわれる）である。代表的には、例えば、上記阻害剤、Ａ８３－０１は、約０．１μＭ～約１０μＭ、または約０．５μＭの濃度で使用される。
【0064】
ｂ． ＧＳＫ３阻害剤
肝細胞をまた、代表的には、インビトロでＧＳＫ３阻害剤の１またはこれより多くの阻害剤と接触させる。上記ＧＳＫ３阻害剤は、これがグリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）３の機能を阻害する限りにおいて、任意のＧＳＫ３阻害剤であり得る。例としては、ＳＢ２１６７６３（Ｓｅｌｌｅｃｋ）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１（全てＡｘｏｎ ｍｅｄｃｈｅｍから）、ＳＢ４１５２８６（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびケンパウロン（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ）が挙げられる。好ましい例は、ＣＨＩＲ９９０２１（本明細書中、「Ｃ」ともいわれる）である。代表的には、例えば、上記阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１は、約０．１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、または約３μＭの濃度で使用される。
肝細胞をまた、代表的には、インビトロでＧＳＫ３阻害剤の１またはこれより多くの阻害剤と接触させる。上記ＧＳＫ３阻害剤は、これがグリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）３の機能を阻害する限りにおいて、任意のＧＳＫ３阻害剤であり得る。例としては、ＳＢ２１６７６３（Ｓｅｌｌｅｃｋ）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１（全てＡｘｏｎ ｍｅｄｃｈｅｍから）、ＳＢ４１５２８６（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびケンパウロン（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ）が挙げられる。好ましい例は、ＣＨＩＲ９９０２１（本明細書中、「Ｃ」ともいわれる）である。代表的には、例えば、上記阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１は、約０．１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、または約３μＭの濃度で使用される。
【0065】
ｃ． ＲＯＣＫ阻害剤
いくつかの実施形態において、肝細胞をまた、ＲＯＣＫの１またはこれより多くの阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態において、例えば、肝細胞がヒト細胞である場合、上記ＲＯＣＫ阻害剤は、除外され得る。
いくつかの実施形態において、肝細胞をまた、ＲＯＣＫの１またはこれより多くの阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態において、例えば、肝細胞がヒト細胞である場合、上記ＲＯＣＫ阻害剤は、除外され得る。
【0066】
Ｒｈｏ関連キナーゼ（本明細書中、ＲＯＣＫ、Ｒｏｃｋ、Ｒｈｏ関連コイルドコイルキナーゼ、およびＲｈｏキナーゼとしても公知でありかつ／またはそのようにいわれる）としては、ＲＯＣＫ１（ＲＯＫβまたはｐ１６０ＲＯＣＫとも称される）およびＲＯＣＫ２（ＲＯＫαとも称される）が挙げられる。ＲＯＣＫタンパク質は、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅｓと相互作用するセリン－スレオニンキナーゼである。 好ましくは、上記ＲＯＣＫ阻害剤は、低分子である。例示的な低分子ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２（米国特許第４，９９７，８３４号）およびファスジル（ＨＡ １０７７としても公知； Ａｓａｎｏら， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２４１：１０３３－１０４０， １９８７）が挙げられる。これらの阻害剤は、キナーゼドメインに結合して、ＲＯＣＫ酵素活性を阻害する。ＲＯＣＫを特異的に阻害することが報告された他の低分子としては、Ｈ－１１５２（（Ｓ）－（＋）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン、 Ｉｋｅｎｏｙａら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ８１：９， ２００２； Ｓａｓａｋｉら， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ９３：２２５， ２００２）； Ｎ－（４－ピリジル）－Ｎ’－（２，４，６－トリクロロフェニル）ウレア（Ｔａｋａｍｉら， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １２：２１１５， ２００４）；および３－（４－ピリジル）－１Ｈ－インドール（Ｙａｒｒｏｗら， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １２：３８５， ２００５）、ＧＳＫ２６９９６２Ａ（Ａｘｏｎ ｍｅｄｃｈｅｍ）、およびファスジル塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。
【0067】
さらなる低分子Ｒｈｏキナーゼ阻害剤としては、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０３／０５９９１３、ＷＯ ０３／０６４３９７、ＷＯ ０５／００３１０１、ＷＯ ０４／１１２７１９、ＷＯ ０３／０６２２２５およびＷＯ ０３／０６２２２７；米国特許第７，２１７，７２２号および同第７，１９９，１４７号；ならびに米国特許出願公開番号２００３／０２２０３５７号、同第２００６／０２４１１２７号、同第２００５／０１８２０４０号および同第２００５／０１９７３２８号に記載されるものが挙げられる。
【0068】
特に好ましい実施形態において、上記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２（本明細書中、「Ｙ」ともいわれる）である。（＋／－）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミドとしても公知のＹ－２７６３２は、Ｒｈｏ関連キナーゼの活性を特異的に阻害する低分子阻害剤である。Ｙ－２７６３２は、米国特許第４，９９７，８３４号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ ９８／０６４３３に開示される。いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２である場合、ＲＯＣＫ阻害剤の有効量は、約１～約１００μＭ、または約５～約２５μＭ、または約１０μＭである。
【0069】
上記ＧＳＫ３阻害剤および上記ＲＯＣＫ阻害剤を、個々に肝細胞と接触させる場合にほとんど肝幹細胞／前駆細胞を誘導しないのに対して、肝幹細胞／前駆細胞を誘導する効率（「再プログラミング効率」ともいわれる）は、ＴＧＦ－βレセプター阻害剤のみを肝細胞と接触させる場合と比較して、上記ＧＳＫ３阻害剤をＴＧＦ－βレセプター阻害剤と一緒に肝細胞と接触させる場合に有意に増加する。さらに、ラットおよびマウス細胞の再プログラミング効率はまた、ＴＧＦ－βレセプター阻害剤のみを肝細胞と接触させる場合と比較して、ＲＯＣＫ阻害剤をＴＧＦ－βレセプター阻害剤と一緒に肝細胞と接触させる場合に増加する（Ｋａｔｓｕｄａら， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０， ４１－５５， （２０１７）， ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．１０．００７（これはその全体において本明細書に参考として援用される））。従って、いくつかの実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を、ＴＧＦ－βレセプター阻害剤に加えて、肝細胞と接触させる。
【0070】
ｄ． 血清および他の因子
結果はまた、いくつかのヒト肝細胞（例えば、初代乳児ヒト肝細胞（ＩＰＨＨｓ））を使用した場合に、上記細胞を好ましくは、ＲＯＣＫ阻害剤と接触させず、さらにまたは代わりに、血清（例えば、ウシ胎仔血清）と接触させることを示す（Ｋａｔｓｕｄａら， ｅＬｉｆｅ ８：ｅ４７３１３， ３１ ｐａｇｅｓ， （２０１９） ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４７３１３（これはその全体において本明細書に参考として具体的に援用される））。従って、いくつかの実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤および／または血清を、ＴＧＦ－βレセプター阻害剤に加えて、肝細胞と接触させる。
結果はまた、いくつかのヒト肝細胞（例えば、初代乳児ヒト肝細胞（ＩＰＨＨｓ））を使用した場合に、上記細胞を好ましくは、ＲＯＣＫ阻害剤と接触させず、さらにまたは代わりに、血清（例えば、ウシ胎仔血清）と接触させることを示す（Ｋａｔｓｕｄａら， ｅＬｉｆｅ ８：ｅ４７３１３， ３１ ｐａｇｅｓ， （２０１９） ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４７３１３（これはその全体において本明細書に参考として具体的に援用される））。従って、いくつかの実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤および／または血清を、ＴＧＦ－βレセプター阻害剤に加えて、肝細胞と接触させる。
【0071】
血清の例としては、哺乳動物（ウシ、ヒト、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ラット、およびマウスが挙げられるが、これらに限定されない）に由来するものが挙げられる。特定の実施形態において、上記血清は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、胎仔もしくは新生仔仔ウシ血清（Ｆｅｔａｌ ｏｒ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）（ＦＣＳ）、ウシ成体血清（ＡＢＳ）、およびヒト血清である。存在する場合、血清は、代表的には、培養培地の５～２０％程度存在する。特定の実施形態において、上記血清は、１０％ ＦＢＳである。
【0072】
無血清培地の場合、血清代用物（ＢＳＡ、ＨＡＳ、ＫＳＲなど）が添加され得る。
【0073】
一般に、成長因子、サイトカイン、またはホルモンのような因子がさらに添加される。このような因子の例としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯｓＭ）、ヒドロコルチゾン２１－ヘミスクシネートまたはその塩およびデキサメタゾン（Ｄｅｘ）のうちの１より多くのものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0074】
ｅ． ＭＥＫ阻害剤
ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤以外の低分子量シグナル伝達経路阻害剤はまた、ＴＧＦ－βレセプター阻害剤と組み合わされ得る。このような阻害剤の例としては、ＭＥＫ阻害剤が挙げられるが、これに限定されない。上記ＭＥＫ阻害剤は、特に限定されず、これがＭＥＫの機能（ＭＡＰキナーゼ－ＥＲＫキナーゼ）を阻害する限りにおいて任意の阻害剤が使用され得る。ここで例としては、ＡＺＤ６２４４、ＣＩ－１０４０（ＰＤ１８４３５２）、ＰＤ０３２５９０１、ＲＤＥＡ１１９（ＢＡＹ８６９７６６）、ＳＬ３２７、Ｕ０１２６（全てＳｅｌｌｅｃｋから）、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２４およびＵ０１２５（全てＣｏｓｍｏ Ｂｉｏから）が挙げられる。
ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤以外の低分子量シグナル伝達経路阻害剤はまた、ＴＧＦ－βレセプター阻害剤と組み合わされ得る。このような阻害剤の例としては、ＭＥＫ阻害剤が挙げられるが、これに限定されない。上記ＭＥＫ阻害剤は、特に限定されず、これがＭＥＫの機能（ＭＡＰキナーゼ－ＥＲＫキナーゼ）を阻害する限りにおいて任意の阻害剤が使用され得る。ここで例としては、ＡＺＤ６２４４、ＣＩ－１０４０（ＰＤ１８４３５２）、ＰＤ０３２５９０１、ＲＤＥＡ１１９（ＢＡＹ８６９７６６）、ＳＬ３２７、Ｕ０１２６（全てＳｅｌｌｅｃｋから）、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２４およびＵ０１２５（全てＣｏｓｍｏ Ｂｉｏから）が挙げられる。
【0075】
ｆ． 例示的な好ましい実施形態
特に、上記細胞と少なくとも以下とを接触させることは好ましい：
ＴＧＦ－βレセプター阻害剤としてのＡ－８３－０１（Ａ）を、ＧＳＫ３阻害剤としてのＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）と組み合わせて（ＡＣ）、必要に応じて血清（例えば、ＦＢＳ）とさらに組み合わせて（ＦＡＣ）；
ＴＧＦ－βレセプター阻害剤としてのＡ－８３－０１（Ａ）を、ＲＯＣＫ阻害剤としてのＹ－２７６３２（Ｙ）と組み合わせて（ＹＡ）、必要に応じて血清（例えば、ＦＢＳ）とさらに組み合わせて（ＦＹＡ）；
ＴＧＦ－βレセプター阻害剤としてのＡ－８３－０１（Ａ）を、ＧＳＫ３阻害剤としてのＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）およびＲＯＣＫ阻害剤としてのＹ－２７６３２（Ｙ）と組み合わせて（ＹＡＣ）、必要に応じて血清（例えば、ＦＢＳ）とさらに組み合わせて（ＦＹＡＣ）。
特に、上記細胞と少なくとも以下とを接触させることは好ましい：
ＴＧＦ－βレセプター阻害剤としてのＡ－８３－０１（Ａ）を、ＧＳＫ３阻害剤としてのＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）と組み合わせて（ＡＣ）、必要に応じて血清（例えば、ＦＢＳ）とさらに組み合わせて（ＦＡＣ）；
ＴＧＦ－βレセプター阻害剤としてのＡ－８３－０１（Ａ）を、ＲＯＣＫ阻害剤としてのＹ－２７６３２（Ｙ）と組み合わせて（ＹＡ）、必要に応じて血清（例えば、ＦＢＳ）とさらに組み合わせて（ＦＹＡ）；
ＴＧＦ－βレセプター阻害剤としてのＡ－８３－０１（Ａ）を、ＧＳＫ３阻害剤としてのＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）およびＲＯＣＫ阻害剤としてのＹ－２７６３２（Ｙ）と組み合わせて（ＹＡＣ）、必要に応じて血清（例えば、ＦＢＳ）とさらに組み合わせて（ＦＹＡＣ）。
【0076】
マウスおよびラット肝細胞を培養するための好ましい製剤は、ＹＡＣである。
【0077】
ＩＰＨＨｓを培養するための好ましい製剤は、ＦＡＣである。
【0078】
特定の実施形態において、培地に添加されるＴＧＦ－βレセプター阻害剤の濃度は、例えば、０．０１～１０μＭ、および好ましくは０．１～１μＭの範囲において適切に選択され得る；培地に添加されるＧＳＫ３阻害剤の濃度は、例えば、０．０１～１００μＭ、および好ましくは１～１０μＭの範囲において適切に選択され得る；培地に添加されるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、例えば、０．０００１～５００μＭ、および好ましくは１～５０μＭの範囲において適切に選択され得る；そして培地に添加される血清の濃度は、例えば、５％～２０％、好ましくは８％～１２％、例えば、１０％の範囲において適切に選択され得る。
【0079】
阻害剤および／またはＣＬｉＰｓを作製する方法はまた、ＷＯ ２０２０／０８０５５０、ＷＯ ２０１７／１１９５１２、米国特許第１０，９６１，５０７号、米国特許出願第１７／２８５，０３８号、Ｋａｔｓｕｄａら， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０， ４１－５５， （２０１７）， ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．１０．００７、およびＫａｔｓｕｄａら， ｅＬｉｆｅ ８：ｅ４７３１３， ３１ ｐａｇｅｓ， （２０１９） ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４７３１３（これらの各々は、その全体において本明細書に参考として具体的に援用される）のうちの１またはこれより多くのものに記載される。
【0080】
３． 培養することおよび選択ガイドライン
肝細胞と上記阻害剤および選択肢的な血清との間の接触は、肝細胞を、これらの物質の存在下で培養することによって行われ得る。具体的には、これらの阻害剤および必要に応じて血清は、培養を行うために有効な濃度において培地に添加される。適切な培地の例としては、基礎培地が挙げられるが、これに限定されない。市販の基礎培地がまた、使用され得る。ここで例としては、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地およびＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ培地が挙げられるが、これらに特に限定されず、これらを、単独で使用してもよいし、これらのうちの２種またはこれより多くのものを組み合わせて使用してもよい。培地への添加剤の例としては、種々のアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン、Ｌ－プロリンなど）、種々の無機塩（亜セレン酸の塩、ＮａＨＣＯ３など）、種々のビタミン（ニコチンアミド、アスコルビン酸誘導体など）、種々の抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）、抗真菌剤（例えば、アンホテリシンなど）、およびバッファー（ＨＥＰＥＳなど）が挙げられる。
肝細胞と上記阻害剤および選択肢的な血清との間の接触は、肝細胞を、これらの物質の存在下で培養することによって行われ得る。具体的には、これらの阻害剤および必要に応じて血清は、培養を行うために有効な濃度において培地に添加される。適切な培地の例としては、基礎培地が挙げられるが、これに限定されない。市販の基礎培地がまた、使用され得る。ここで例としては、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地およびＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ培地が挙げられるが、これらに特に限定されず、これらを、単独で使用してもよいし、これらのうちの２種またはこれより多くのものを組み合わせて使用してもよい。培地への添加剤の例としては、種々のアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン、Ｌ－プロリンなど）、種々の無機塩（亜セレン酸の塩、ＮａＨＣＯ３など）、種々のビタミン（ニコチンアミド、アスコルビン酸誘導体など）、種々の抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）、抗真菌剤（例えば、アンホテリシンなど）、およびバッファー（ＨＥＰＥＳなど）が挙げられる。
【0081】
これらの阻害剤が水に不溶性のまたは水溶性が不十分な化合物である場合、それらは、少量の低毒性有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯなど）の中で溶解されてもよく、次いで、その得られたものが、上記の最終濃度を与えるために培地に添加され得る。
【0082】
この培養のために使用される培養容器は、これが接着培養のために適している限りにおいて特に限定されず、ここで例としては、ディッシュ、ペトリ皿、組織培養ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、および培養バッグが挙げられる。使用される培養容器は、上記細胞との接着性を増強する目的で、その内表面が細胞支持基材でコーティングされていてもよい。このような細胞支持基材の例としては、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ポリ－Ｌ－リジン、ラミニンおよびフィブロネクチンが挙げられ、好ましくは、コラーゲンおよび／またはマトリゲルである。
【0083】
肝細胞は、１０２～１０６ 細胞／ｃｍ２、および好ましくは１０３～１０５ 細胞／ｃｍ２の細胞密度で培養用基上に播種され得る。培養は、ＣＯ２ インキュベーターの中で、１～１０％、好ましくは２～５％およびより好ましくは約５％のＣＯ２濃度の雰囲気中、３０～４０℃、好ましくは３５～３７．５℃、およびより好ましくは約３７℃で行い得る。培養期間は、例えば、１～４週間、好ましくは１～３週間、およびより好ましくは約２週間であり得る。培地は、１～３日間ごとに新鮮なものと交換され得る。
【0084】
このようにして、肝細胞を肝臓幹細胞／前駆細胞へと再プログラミングするように、肝細胞を上記ＴＧＦ－βレセプター阻害剤、および必要に応じて上記ＧＳＫ３阻害剤および／または上記ＲＯＣＫ阻害剤および／または血清と接触させる。成熟肝細胞は、一般に、インビトロで増殖しないと考えられているが、Ｋａｔｓｕｄａら， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０， ４１－５５， （２０１７）， ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．１０．００７に記載されるように、ＹＡＣで２週間の培養によって約１５倍程度増殖することが見出された。同様に、ＩＰＨＨｓは、効率的に増殖し、ＦＡＣで２週間にわたって培養すると、優勢な集団になった（Ｋａｔｓｕｄａら， ｅＬｉｆｅ ８：ｅ４７３１３， ３１ ｐａｇｅｓ， （２０１９） ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４７３１３）。
【0085】
好ましい実施形態において、上記ＣＬｉＰｓは、以下を有する：
（ａ）自己再生能力；および
（ｂ）肝細胞および胆管上皮細胞の両方に分化する両能性の能力。本明細書中、用語「胆管上皮細胞」（「ＢＥＣ」ともいわれる）は、ＢＥＣマーカーとしてサイトケラチン１９（ＣＫ１９）およびＧＲＨＬ２を発現する細胞をいう。
上記ＣＬｉＰｓはまた、胎児肝芽細胞および肝損傷の際に出現するオーバル細胞を含み得る。
（ａ）自己再生能力；および
（ｂ）肝細胞および胆管上皮細胞の両方に分化する両能性の能力。本明細書中、用語「胆管上皮細胞」（「ＢＥＣ」ともいわれる）は、ＢＥＣマーカーとしてサイトケラチン１９（ＣＫ１９）およびＧＲＨＬ２を発現する細胞をいう。
上記ＣＬｉＰｓはまた、胎児肝芽細胞および肝損傷の際に出現するオーバル細胞を含み得る。
【0086】
好ましい実施形態において、上記の特徴（ａ）および（ｂ）、ならびに従来から公知の肝臓幹細胞（ＬＳＣ）に類似して、本開示の再プログラミング方法によって得られるＣＬｉＰｓは：
（ｃ）表面抗原マーカーとして上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現するが、他の公知のＬＳＣによって発現されるデルタホモログ１（Ｄｌｋ１）を発現しない。さらに、いくつかの実施形態によれば、ＣＬｉＰｓは、ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質共役レセプター５（ＬＧＲＳ）およびＦｏｘＬ１（これらは公知のＬＳＣマーカーである）を発現しない。
ＣＬｉＰｓはまた、以下の特徴のうちの１またはこれより多くのものを有し得る：
（ｄ）見かけの成長速度は、少なくとも１０継代、好ましくは２０継代またはより多くの継代にわたって遅くならない；
（ｅ）肝細胞およびＢＥＣへの分化能力は、少なくとも１０継代、好ましくは２０継代、またはより多くの継代にわたって保持される；
（ｆ）核細胞質（Ｎ／Ｃ）比は、肝細胞のものより高い；
（ｇ）α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＳＲＹ－ｂｏｘ（Ｓｏｘ）９、ＥｐＣＡＭ、Ｔｈｙ－１／ＣＤ９０、肝細胞核因子１ホメオボックスＢ（ＨＮＦ１－β）、フォークヘッドボックスＪ１（ＦｏｘＪ１）、ＨＮＦ６／ｏｎｅ ｃｕｔ－１（ＯＣ１）、ＣＤ４４、インテグリンα６（Ａ６）およびＣＫ１９遺伝子からなる群より選択される１またはこれより多くのＬＳＣマーカー遺伝子の発現は、肝細胞と比較して増加する。
（ｈ）ＡＦＰ、ＣＤ４４、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ１９、Ｓｏｘ９、Ａ６およびＣＤ９０からなる群より選択される１またはこれより多くのタンパク質の発現は、肝細胞と比較して増加する。
（ｃ）表面抗原マーカーとして上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現するが、他の公知のＬＳＣによって発現されるデルタホモログ１（Ｄｌｋ１）を発現しない。さらに、いくつかの実施形態によれば、ＣＬｉＰｓは、ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質共役レセプター５（ＬＧＲＳ）およびＦｏｘＬ１（これらは公知のＬＳＣマーカーである）を発現しない。
ＣＬｉＰｓはまた、以下の特徴のうちの１またはこれより多くのものを有し得る：
（ｄ）見かけの成長速度は、少なくとも１０継代、好ましくは２０継代またはより多くの継代にわたって遅くならない；
（ｅ）肝細胞およびＢＥＣへの分化能力は、少なくとも１０継代、好ましくは２０継代、またはより多くの継代にわたって保持される；
（ｆ）核細胞質（Ｎ／Ｃ）比は、肝細胞のものより高い；
（ｇ）α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＳＲＹ－ｂｏｘ（Ｓｏｘ）９、ＥｐＣＡＭ、Ｔｈｙ－１／ＣＤ９０、肝細胞核因子１ホメオボックスＢ（ＨＮＦ１－β）、フォークヘッドボックスＪ１（ＦｏｘＪ１）、ＨＮＦ６／ｏｎｅ ｃｕｔ－１（ＯＣ１）、ＣＤ４４、インテグリンα６（Ａ６）およびＣＫ１９遺伝子からなる群より選択される１またはこれより多くのＬＳＣマーカー遺伝子の発現は、肝細胞と比較して増加する。
（ｈ）ＡＦＰ、ＣＤ４４、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ１９、Ｓｏｘ９、Ａ６およびＣＤ９０からなる群より選択される１またはこれより多くのタンパク質の発現は、肝細胞と比較して増加する。
【0087】
いくつかの実施形態において、ＣＬｉＰｓは、上記の特徴（ｄ）～（ｈ）全てを有する。
【0088】
よって、ＣＬｉＰｓは、最も代表的には、インビトロまたはエキソビボで、有効量において、および上記で考察した特徴のうちの１もしくはこれより多くのもの、好ましくは大部分または全てを有する細胞を誘導するために適した条件下で、ＴＧＦ－βレセプター阻害剤と、および好ましくは、さらにはＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤および／または血清と肝細胞を接触させることによって、肝細胞から誘導され得る。
【0089】
４． ＣＬｉＰｓの維持／増殖
上記ＣＬｉＰｓは、例えば、
（ｉ）第１～第４継代にわたってコラーゲンまたはマトリゲルでコーティングした培養容器上で；および
（ｉｉ）第５継代などにわたってマトリゲルでコーティングした培養容器上で、
阻害剤（複数可）および必要に応じて血清の存在下でそれらを継代することによって効率的に維持／増殖され得る。
上記ＣＬｉＰｓは、例えば、
（ｉ）第１～第４継代にわたってコラーゲンまたはマトリゲルでコーティングした培養容器上で；および
（ｉｉ）第５継代などにわたってマトリゲルでコーティングした培養容器上で、
阻害剤（複数可）および必要に応じて血清の存在下でそれらを継代することによって効率的に維持／増殖され得る。
【0090】
培養容器として、ＣＬｉＰｓを肝細胞から誘導するために使用されるものに類似の培養容器が使用され得る。第１～第４継代にわたって使用される培養容器は、コラーゲンまたはマトリゲルでコーティングされる。
【0091】
いったん上記のように得られた初代ＣＬｉＰｓが７０～１００％ コンフルエンシーに達したら、それらをこのコラーゲンまたはマトリゲルでコーティングした培養容器上に１０３～１０５ 細胞／ｃｍ２の密度で播種し得る。培地として、ＣＬｉＰｓの誘導培養に関して記載された培地が、同様に使用され得る。添加される上記阻害剤および必要に応じて血清の濃度はまた、ＣＬｉＰｓの誘導培養に関して上で記載された濃度範囲から適切に選択され得る。培養温度およびＣＯ２濃度はまた、ＣＬｉＰｓの誘導培養のための条件に従う。いったん７０～１００％ コンフルエンシーに達したら、上記細胞は、トリプシンで処理して解離させ、継代させ得る。
【0092】
第５継代などのために、マトリゲルでコーティングした培養容器が、好ましくは使用される。安定なＣＬｉＰｓは、約５～８継代後に得られ得る。１０継代またはさらに後には、クローニングは、慣用的な手順によって行われ得る。
【0093】
上記のように、上記阻害剤および必要に応じて血清は、ＣＬｉＰｓ誘導のためのみならず、維持／増殖培養のためにも、培地に添加され得る。
【0094】
５． ＣＬｉＰｓから肝細胞への再分化
いくつかの実施形態において、上記ＣＬｉＰｓは、ＣＬｉＰｓとして利用される。他の実施形態において、上記ＣＬｉＰｓは、肝細胞へと再分化される。ＣＬｉＰｓを肝細胞へと再分化させる誘導は、任意の公知の方法によって行われ得る。このような方法は、例えば、オンコスタチンＭ（ＯｓＭ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などを添加した培養容器中で培養する方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２２７（５）， ｐ． ２０５１－２０５８ （２０１２）； Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４５（５）， ｐ． １２２９－１２３９ （２００７））、またはマトリゲル重層法と組み合わせた方法（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３５， １３５１－１３５９ （２００２））であり得る。肝細胞への分化を誘導するための培地は、阻害剤（複数可）および必要に応じて血清を添加してもよいし、添加しなくてもよいが、好ましくは添加するのがよい。
いくつかの実施形態において、上記ＣＬｉＰｓは、ＣＬｉＰｓとして利用される。他の実施形態において、上記ＣＬｉＰｓは、肝細胞へと再分化される。ＣＬｉＰｓを肝細胞へと再分化させる誘導は、任意の公知の方法によって行われ得る。このような方法は、例えば、オンコスタチンＭ（ＯｓＭ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などを添加した培養容器中で培養する方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２２７（５）， ｐ． ２０５１－２０５８ （２０１２）； Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４５（５）， ｐ． １２２９－１２３９ （２００７））、またはマトリゲル重層法と組み合わせた方法（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３５， １３５１－１３５９ （２００２））であり得る。肝細胞への分化を誘導するための培地は、阻害剤（複数可）および必要に応じて血清を添加してもよいし、添加しなくてもよいが、好ましくは添加するのがよい。
【0095】
ＣＬｉＰｓの分化を誘導することによって得られる肝細胞は、成熟肝細胞に代表的な毛細胆管様構造を有し得るので、その細管中に薬物代謝産物を蓄積し得る。さらに、それらは、細胞膜においてＡＢＣトランスポーター（例えば、ＭＲＰ２タンパク質）を発現し得る。さらに、それらは、一連の肝機能（例えば、アルブミンの分泌発現、グリコーゲン蓄積、およびシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）薬物代謝酵素活性）を発揮し得る。具体的には、ＣＬｉＰｓは、機能的肝細胞へと再分化され得る。
【0096】
６． ＢＥＣへのＣＬｉＰｓの分化の誘導
ＢＥＣへのＣＬｉＰｓの分化の誘導は、任意の公知の方法によって行われ得る。このような方法は、例えば、コラーゲンゲルがＥＧＦおよびインスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）を含む培地中で培養するために使用される方法であり得る。
ＢＥＣへのＣＬｉＰｓの分化の誘導は、任意の公知の方法によって行われ得る。このような方法は、例えば、コラーゲンゲルがＥＧＦおよびインスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）を含む培地中で培養するために使用される方法であり得る。
【0097】
いくつかの実施形態において、分化したＣＬｉＰｓは、胆管様構造を形成し得る。特定の実施形態において、上記ＢＥＣ誘導法は、以下のステップを包含する：
（ｉ）阻害剤（複数可）および必要に応じて血清の存在下で、低密度において、フィーダー細胞上でＣＬｉＰｓを培養すること；ならびに
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた上記細胞を、マトリゲルを含む培地中でさらに培養すること。
（ｉ）阻害剤（複数可）および必要に応じて血清の存在下で、低密度において、フィーダー細胞上でＣＬｉＰｓを培養すること；ならびに
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた上記細胞を、マトリゲルを含む培地中でさらに培養すること。
【0098】
ステップ（ｉ）において使用されるフィーダー細胞は、特に限定されず、維持および培養を支持する目的で概して使用される任意の細胞が、使用され得る。例えば、それらは、マウス胎仔由来の線維芽細胞（ＭＥＦ）およびＳＴＯ細胞（ＡＴＣＣ， ＣＲＬ－１５０３）、好ましくは ＭＥＦであり得る。
【0099】
低密度とは、維持および培養を支持する目的で概して使用される細胞密度より低い密度に言及し、これは、例えば、１×１０３～５×１０４ 細胞／ｃｍ２、および好ましくは５×１０３～３×１０４ 細胞／ｃｍ２の範囲にある細胞密度である。フィーダー細胞を播種するための培養容器は、コラーゲンおよびゼラチンのような細胞支持基材でコーティングされたものであり得る。初代または継代されたＣＬｉＰｓは、阻害剤（複数可）および必要に応じて血清を含む培地中で解離、再懸濁されるようにトリプシンで処理され得、１０４～１０５ 細胞／ｃｍ２の細胞密度でフィーダー細胞上に播種され得る。必要であれば、上記培地は、血清が添加され得る。
【0100】
翌日に、上記培地は、多能性幹細胞（例えば、ｍＴｅＳＲＴＭ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））のための維持培地で置き換えられ得、阻害剤（複数可）および必要に応じて血清の存在下で、３～１０日間、好ましくは４～８日間、培養に供され得る。上記培地は、１～３日間ごとに新鮮なものと交換され得る。引き続いて、上記培地は、マトリゲルを含む培地と交換され得、３～１０日間、好ましくは４～８日間、さらに培養に供され得る。上記培地は、１～３日間ごとに新鮮なものと交換され得る。上記培地に添加されるマトリゲルの濃度は、１～５％、好ましくは１～３％の範囲で適切に選択され得る。合計で約１～３週間培養すると、胆管様構造が形成され、ここで上記細胞は、ＢＥＣマーカーとして高レベルでＣＫ１９およびＧＲＨＬ２を発現している。さらに、アクアポリン（例えば、ＡＱＰ１およびＡＱＰ９）およびイオンチャネル（例えば、ＣＦＴＲおよびＡＥ２）の遺伝子およびタンパク質発現が増加している。さらに、密着結合マーカーとしてのＺＯ－１の強い発現は、管構造の内腔において観察される。さらに、これらの細胞は、水を輸送する能力および内腔中の薬物代謝産物を輸送および蓄積する能力を有することから、本発明のＬＳＣは、機能的ＢＥＣへと分化し得る。
【0101】
Ｂ． 無細胞材料
一般に、細胞ベースの治療は、制御されない分化、副作用、腫瘍形成、および同種異系使用の不適合のような制限を有し得る。反対に、ＣＬｉＰｓに由来する細胞外小胞（ＥＶｓ）の治療的および非治療的使用は、このような欠点を克服する可能性を有する。従って、ＣＬｉＰｓに由来する無細胞組成物もまた、提供される。
一般に、細胞ベースの治療は、制御されない分化、副作用、腫瘍形成、および同種異系使用の不適合のような制限を有し得る。反対に、ＣＬｉＰｓに由来する細胞外小胞（ＥＶｓ）の治療的および非治療的使用は、このような欠点を克服する可能性を有する。従って、ＣＬｉＰｓに由来する無細胞組成物もまた、提供される。
【0102】
ＥＶｓを含む無細胞組成物およびその使用方法が提供される。上記ＥＶｓは、因子の不均一な混合物（例えば、馴化培地）の一部またはこれらから単離される画分であり得る。他の実施形態において、ＥＶｓ、またはその１もしくはこれより多くのサブタイプは、ＣＬｉＰｓの馴化培地から単離されるかまたは別の方法で収集される。上記ＥＶｓ、またはその１もしくはこれより多くのサブタイプは、上記被験体への投与の前に、薬学的に受容可能な組成物（例えば、キャリアもしくはマトリクスもしくはデポー）中に懸濁され得る。
【0103】
１． 細胞外小胞
本開示の組成物は、ＣＬｉＰｓに由来する細胞外小胞、またはその単離もしくは分画されたサブタイプ（単数または複数）であり得るかまたはこれらを含み得る。細胞外小胞は、細胞から天然に放出される脂質二重層に範囲が定められた粒子であり、細胞とは異なり、複製できない。ＥＶｓは、直径が、最小の物理的に可能なユニラメラリポソーム（およそ２０～３０ナノメートル）に近いサイズから１０ミクロンもしくはこれより大きい程度までの範囲に及ぶが、ＥＶｓの大多数は、２００ｎｍより小さい。
本開示の組成物は、ＣＬｉＰｓに由来する細胞外小胞、またはその単離もしくは分画されたサブタイプ（単数または複数）であり得るかまたはこれらを含み得る。細胞外小胞は、細胞から天然に放出される脂質二重層に範囲が定められた粒子であり、細胞とは異なり、複製できない。ＥＶｓは、直径が、最小の物理的に可能なユニラメラリポソーム（およそ２０～３０ナノメートル）に近いサイズから１０ミクロンもしくはこれより大きい程度までの範囲に及ぶが、ＥＶｓの大多数は、２００ｎｍより小さい。
【0104】
多様なＥＶサブタイプが提唱されており、これらとしては、エクトソーム、マイクロ小胞（ＭＶ）、マイクロ粒子、エクソソーム、オンコソーム、アポトーシス小体（ＡＢ）、トンネルナノチューブ（ＴＮＴ）などが挙げられる（Ｙａｎｅｚ－Ｍｏ，ら， Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ． ４： ２７０６６ （２０１５） ｄｏｉ：１０．３４０２／ｊｅｖ．ｖ４．２７０６６． ＰＭＣ ４４３３４８９）。これらのＥＶサブタイプは、大部分はバイオジェネシス（細胞経路、細胞または組織の実体、起源の状態）に基づいて、種々の、しばしば重複する定義によって定義されている（Ｔｈｅｒｙ，ら， Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ． ７ （１）： １５３５７５０ （２０１８）． ｄｏｉ：１０．１０８０／２００１３０７８．２０１８．１５３５７５０）。しかし、ＥＶサブタイプは、サイズ、構成する分子、機能、または分離方法によっても定義され得る。Ｔｈｅｒｙらにおいて考察されるように、ＥＶｓのサブタイプは、以下によって定義され得る：
ａ）ＥＶｓの物理的特性（例えば、サイズ（「小さなＥＶｓ」（ｓＥＶｓ）および「中程度の／大きなＥＶｓ」（ｍ／ｌＥＶｓ）、範囲が定義される（例えば、それぞれ、＜１００ｎｍもしくは＜２００ｎｍ［小］、もしくは＞２００ｎｍ［大および／もしくは中］）または密度（低い、中程度の、高い（各範囲が定義される））；
ｂ）生化学的組成（ＣＤ９＋／ＣＤ６３＋／ＣＤ８１＋－ ＥＶｓ、アネキシンＡ５染色されるＥＶｓなど）；あるいは
ｃ）状態または起源細胞の記載（ポドサイトＥＶｓ、低酸素ＥＶｓ、大きなオンコソーム、アポトーシス小体）。
ａ）ＥＶｓの物理的特性（例えば、サイズ（「小さなＥＶｓ」（ｓＥＶｓ）および「中程度の／大きなＥＶｓ」（ｍ／ｌＥＶｓ）、範囲が定義される（例えば、それぞれ、＜１００ｎｍもしくは＜２００ｎｍ［小］、もしくは＞２００ｎｍ［大および／もしくは中］）または密度（低い、中程度の、高い（各範囲が定義される））；
ｂ）生化学的組成（ＣＤ９＋／ＣＤ６３＋／ＣＤ８１＋－ ＥＶｓ、アネキシンＡ５染色されるＥＶｓなど）；あるいは
ｃ）状態または起源細胞の記載（ポドサイトＥＶｓ、低酸素ＥＶｓ、大きなオンコソーム、アポトーシス小体）。
【0105】
従って、いくつかの実施形態において、上記組成物は、上記で考察されるとおりの（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に従って定義される１またはこれより多くのＥＶサブタイプであるか、またはこれを含む。
【0106】
いくつかの実施形態において、上記小胞は、エクソソームであるか、またはこれを含む。エクソソームは、エンドサイトーシスを促進する表面タンパク質を有し、それらは、高分子を送達する能力を有する。また、エクソソームが、これらが送達される個体と同じ個体から得られる場合、上記エクソソームは、免疫寛容性である。
【0107】
エクソソームは、３０～１５０ｎｍ、しばしば４０～１００ｎｍのサイズを有する小胞であり、大部分の細胞タイプにおいて観察される。エクソソームはしばしば、ＭＶｓに類似であるが、重要な差異を有する： 形質膜から直接発生するのではなく、それらは、多胞体（ＭＶＢｓ）へと内向き出芽によって生成される。エクソソームの形成は、３つの異なる段階を含む：（１）形質膜からのエンドサイトーシス小胞の形成、（２）管腔内小胞（ＩＬＶｓ）からなるＭＶＢｓをもたらすエンドソーム小胞膜の内向き出芽。および（３）これらのＭＶＢｓと形質膜との融合（これは、小胞内容物を放出する）（エクソソームとして公知）。
【0108】
エクソソームは、約５ｎｍの平均厚を有する脂質二重層を有する（例えば、Ｌｉ， Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ， ７（３）：７８９－８０４ （２０１７） ｄｏｉ： １０．７１５０／ｔｈｎｏ．１８１３３を参照のこと）。エクソソームの脂質構成成分としては、セラミド（ときおり、エクソソームをライソソームから区別するために使用される）、コレステロール、スフィンゴ脂質、および長くかつ飽和脂肪－アシル鎖を有するホスホグリセリドが挙げられる。エクソソームの外側表面は、代表的には、サッカリド鎖（例えば、マンノース、ポリラクトサミン、α－２，６シアル酸、およびＮ結合型グリカン）が豊富である。
【0109】
多くのエクソソームは、血小板由来成長因子レセプター、ラクトアドヘリン、膜貫通型タンパク質およびライソソーム関連膜タンパク質－２Ｂ、膜輸送および融合タンパク質（アネキシン、フロチリン、ＧＴＰａｓｅ、ヒートショックタンパク質、テトラスパニンなど）、多胞体バイオジェネシスに関与するタンパク質、ならびに脂質関連タンパク質およびホスホリパーゼなどのタンパク質を含む。従って、これらの特徴的なタンパク質は、エクソソームの単離および定量のための良好な生体マーカーとして働く。エクソソームが運ぶ別の重要なカーゴは、デオキシ核酸（ＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のようなコードおよび非コードリボ核酸（ＲＮＡ）を含む核酸である。
【0110】
いくつかの実施形態において、上記小胞は、１またはこれより多くの代替の細胞外小胞（例えば、ＡＢｓ、ＭＶｓ、ＴＮＴｓ、または本明細書中もしくは他の箇所で考察される他のもの）を含むか、またはそれらである。
【0111】
ＡＢｓは、サイズが不均一であり、形質膜から起こる。それらは、全ての細胞タイプから放出され得、サイズが約１～５μｍである。
【0112】
２０ｎｍ～１μｍのサイズを有するＭＶｓは、サイトゾルタンパク質の組み込みに伴うブレビングに起因して形成される。ＡＢｓとは対照的に、ＭＶｓの形状は均一である。それらは、形質膜から起こり、大部分の細胞タイプにおいて観察される。
【0113】
ＴＮＴｓは、形質膜から形成される薄く（例えば、５０～７００ｎｍ）かつ１００μｍまでの長さのアクチンを含むチューブである。
【0114】
いくつかの実施形態において、上記ＥＶｓは、約２０ｎｍ～約５００ｎｍの間である。いくつかの実施形態において、上記ＥＶｓは、約２０ｎｍ～約２５０ｎｍまたは２００ｎｍまたは１５０ｎｍまたは１００ｎｍの間である。
【0115】
以下の例は、ＣＬｉＰｓから単離されたＥＶｓが、多くのｍｉＲＮＡｓおよびサイトカインを含むことを示す。以下の例は、ＣＬｉＰｓから単離されたＥＶｓが、以下を含むことを示す： ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６６３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐ（例えば、図１６を参照のこと）、ならびにＴＮＦα。
【0116】
従って、いくつかの実施形態において、上記ＥＶｓは、以下のうちの１またはこれより多くのものを含む： ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６６３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐ、および／もしくは１またはこれより多くのサイトカイン（例えば、ＴＮＦα）、またはこれらの任意の組み合わせ。
【0117】
２． 細胞外小胞を作製する方法
ａ． 作製するための細胞供給源
細胞外小胞
本明細書で使用される場合、ＥＶｓ（ＡＢ、ＭＶ、エクソソーム、およびＴＮＴが挙げられる）とは、代表的には、細胞または組織によって形成される脂質小胞に言及する。それらは、培養されたおよび培養されていない組織、細胞、または流体、ならびに培養細胞に由来するかもしくは培養細胞によって調整された流体（例えば、馴化培地）を含め、被験体から直接、組織、細胞、および／または流体から、単離され得る。例えば、エクソソームは、生理学的流体（例えば、血漿、リンパ液、悪性胸水、羊水、乳汁、精液、唾液、および尿）中に存在し、培養細胞の培地へと分泌される。
ａ． 作製するための細胞供給源
細胞外小胞
本明細書で使用される場合、ＥＶｓ（ＡＢ、ＭＶ、エクソソーム、およびＴＮＴが挙げられる）とは、代表的には、細胞または組織によって形成される脂質小胞に言及する。それらは、培養されたおよび培養されていない組織、細胞、または流体、ならびに培養細胞に由来するかもしくは培養細胞によって調整された流体（例えば、馴化培地）を含め、被験体から直接、組織、細胞、および／または流体から、単離され得る。例えば、エクソソームは、生理学的流体（例えば、血漿、リンパ液、悪性胸水、羊水、乳汁、精液、唾液、および尿）中に存在し、培養細胞の培地へと分泌される。
【0118】
本開示の組成物のＥＶｓは、代表的には、ＣＬｉＰｓから形成される。上記ＣＬｉＰｓは、本明細書中上記でおよび下記で、または他の箇所（例えば、Ｋａｔｓｕｄａら， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０， ４１－５５， （２０１７）， ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．１０．００７， Ｋａｔｓｕｄａら， ｅＬｉｆｅ ８：ｅ４７３１３， ３１ ｐａｇｅｓ， （２０１９） ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４７３１３、および米国特許第１０，９６１，５０７号（これらの各々は、その全体において本明細書に参考として具体的に援用される））で考察されるように調製および維持され得る。
【0119】
培養されたおよび培養されていない組織、細胞、または流体、ならびに培養細胞に由来するかもしくは培養細胞によって調整された流体（例えば、馴化培地）を含め、細胞外小胞を、被験体から直接、組織、細胞、および流体から単離する方法は、当該分野で公知である。
【0120】
例えば、Ｌｉ， Ｔｈｅｒｎａｏｓｔｉｃｓ， ７（３）：７８９－８０４ （２０１７） ｄｏｉ： １０．７１５０／ｔｈｎｏ．１８１３３， Ｈａ，ら， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ， ６（４）：２８７－２９６ （２０１６） ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１， Ｓｋｏｔｌａｎｄ，ら， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６６：３０－４１ （２０１７） ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｐｌｉｐｒｅｓ．２０１７．０３．００１， Ｐｈｉｎｎｅｙ ａｎｄ Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ３５：８５１－８５８ （２０１７） ｄｏｉ： １０．１００２／ｓｔｅｍ．２５７５（これらの各々は、参考として具体的に援用され、細胞外小胞、特に、エクソソームを単離することを記載する）を参照のこと。
【0121】
上記ＥＶｓは、初代細胞または組織または流体から収集され得る。いくつかの実施形態において、上記小胞は、処置されるべき被験体の細胞、組織、または流体から単離される。天然の供給源から単離されたＥＶｓを利用することの利点としては、人工的に生成された脂質小胞と関連し得る免疫原性の回避が挙げられる。
【0122】
上記ＥＶｓはまた、細胞株または組織から収集され得る。例示的な細胞株は、市販されており、ヒト骨髄、ヒト臍帯、ヒト胚性組織、およびヒト脂肪（脂肪吸引物に由来するものまたは成熟脂肪細胞から脱分化したものを含む）を含むそれらの種々の供給源を含む。
【0123】
ｂ． 細胞外小胞を収集する方法
細胞外小胞（エクソソームを含む）は、分画遠心分離、浮遊密度勾配遠心分離、濾過、高速液体クラマトグラフィー、および免疫アフィニティー捕捉を使用して単離され得る。
細胞外小胞（エクソソームを含む）は、分画遠心分離、浮遊密度勾配遠心分離、濾過、高速液体クラマトグラフィー、および免疫アフィニティー捕捉を使用して単離され得る。
【0124】
例えば、エクソソームを細胞培養物から単離するための最も一般的な単離技術のうちの１つは、分画遠心分離であり、それによって、培養培地中の大きな粒子および細胞デブリは、２００～１００，０００×ｇの間の遠心力を使用して分離され、上記エクソソームは、エクソソームを約１００，０００×ｇで沈殿させることによって、上清から分離される。しかし、純度は、スクロースまたはＯｐｔｉｐｒｅｐでの浮遊密度勾配遠心分離を使用してサンプルを遠心分離することによって改善され得る。重水素／スクロースベースの密度勾配超遠心分離と組み合わせたタンジェンシャルフロー濾過を使用して、臨床試験のための治療用エクソソームを単離した。
【0125】
以下の実施例では、ｈＣＬｉＰｓを、ＳＨＭ ＋ ＦＡＣ中で懸濁し、播種し、４日間培養した。最後の培地交換は、無血清であった。培養上清を収集し、２００００ｇで遠心分離した。その上清を濾過し、３５０００ｒｐｍで超遠心分離した。超遠心分離後、その上清を廃棄し、エクソソームをペレットへと形成した（超遠心分離は、培養上清の量に応じて反復され得る）。ＰＢＳをそのペレットに添加し、その混合物を再度超遠心分離し、その上清を廃棄し、その得られた生成物を洗浄した。そのペレットを、チューブ中に残った非常に少量のＰＢＳ（約１００μＬ）で溶解して、エクソソーム溶液を調製した。
【0126】
限外濾過および高速液体クラマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、それらのサイズ差に基づいてＥＶｓを単離するさらなる方法である。ＨＰＬＣによって調製されるＥＶｓは、高度に精製される。
【0127】
流体静力学的濾過透析は、細胞外小胞を尿から単離するために使用されている。
【0128】
ＥＶ収集のための他の一般的な技術は、アフィニティーベースの方法論を使用する正の選択および／または負の選択を伴う。抗体は、異なる媒体条件において固定され得、分離のために、磁性ビーズ、クロマトグラフィーマトリクス、プレート、およびマイクロ流体デバイスと組み合わされ得る。例えば、エクソソーム関連抗原（例えば、分化抗原群（ＣＤ）分子、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、およびＲａｓ関連タンパク質（Ｒａｂ５））に対する抗体は、エクソソームのアフィニティーベースの分離のために使用され得る。これらのまたは異なる抗原を運ぶ非エクソソーム小胞はまた、類似の方法において単離され得る。
【0129】
マイクロ流体ベースのデバイスはまた、ＥＶｓ（例えば、エクソソーム）を迅速にかつ効率的に単離するために使用されており、マイクロスケールにおいてエクソソームの物理的および生化学的特性の両方を利用している。サイズ、密度、および免疫アフィニティーに加えて、ソーティング技術（例えば、音響、電気泳動および電磁的操作）が実行され得る。
【0130】
エクソソームを含むＥＶｓを特徴づける方法はまた、当該分野で公知である。エクソソームは、それらのサイズ、タンパク質含有量、および脂質含有量に基づいて特徴づけられ得る。エクソソームは、４０～１００ｎｍの間のサイズを有する球形の構造であり、他の系（例えば、１００～５００ｎｍのサイズ範囲を有するマイクロ小胞）と比較して遙かに小さい。いくつかの方法が、ＥＶｓを特徴づけるために使用され得る（フローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング分析、動的光散乱、ウェスタンブロット法、質量分析法、および顕微鏡検査技術が挙げられる）。ＥＶｓはまた、それらのタンパク質組成に基づいて特徴づけおよび記録され得る。例えば、インテグリンおよびテトラスパニンは、エクソソーム中で見出される最も存在量が多いタンパク質のうちの２つである。他のタンパク質マーカーとしては、ＴＳＧ１０１、ＡＬＧ－２相互作用タンパク質Ｘ（ＡＬＩＸ）、フロチリン１、および細胞接着分子が挙げられる。タンパク質と同様に、脂質は、ＥＶｓの主要な構成成分であり、それらを特徴づけるために利用され得る。
【0131】
Ｃ． 医薬組成物
ＣＬｉＰｓ、ＥＶｓ、および肝機能をモジュレートするために本明細書で記載される他の分子（例えば、ｍｉＲＮＡｓもしくはサイトカイン、またはこれらをコードする核酸など）のうちの１つまたはこれより多くのもの）を含む医薬組成物がまた，提供される。医薬組成物は、非経口的に（例えば、筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳｕｂＱ）、または真皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）注射もしくは注入）、経皮的に（受動的にもしくはイオントフォレシスもしくはエレクトロポレーションを使用して）、または任意の他の適切な手段によって投与され得、各投与経路に適した投与形態において製剤化され得る。
ＣＬｉＰｓ、ＥＶｓ、および肝機能をモジュレートするために本明細書で記載される他の分子（例えば、ｍｉＲＮＡｓもしくはサイトカイン、またはこれらをコードする核酸など）のうちの１つまたはこれより多くのもの）を含む医薬組成物がまた，提供される。医薬組成物は、非経口的に（例えば、筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳｕｂＱ）、または真皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）注射もしくは注入）、経皮的に（受動的にもしくはイオントフォレシスもしくはエレクトロポレーションを使用して）、または任意の他の適切な手段によって投与され得、各投与経路に適した投与形態において製剤化され得る。
【0132】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、全身に、例えば、静脈内もしくは腹腔内投与によって、標的化した細胞への上記組成物の送達に有効な量で投与される。
【0133】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、局所に、例えば、処置されるべき部位へ直接またはその近傍に注射することによって投与される。例えば、肝臓の処置のためのようないくつかの実施形態において、上記組成物は、肝臓またはそこに近接した領域に直接注射されるかまたは別の方法で投与されるが、他の部位も企図される。例えば、同所性肝移植は、いくつかの肝疾患、例えば、肝硬変、劇症肝炎、およびいくつかの致命的な遺伝性酵素欠乏症の処置のための治療応答である（Ｓｈａｒｍａ，ら， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ４０（１）：８３－９２ （２０１２）． ｄｏｉ：１０．１１７７／０１９２６２３３１１４２５０６１）。手順はいまや慣用的であるが、移植後合併症およびドナー不足を含め、その欠点がないわけではない。よって、肝機能を支援するために代替の手順が調査されている。これらの手順の中には、種々の全身の部位への単離した肝細胞の移植がある。脂肪パッド、筋、皮下組織、腹膜、肺、腎臓、肝臓、および脾臓を含め、多くの部位が試験されている。従って、いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、細胞および／または無細胞材料を含み、上記の部位のうちの１またはこれより多くの部位へと局所投与される。
【0134】
いくつかの実施形態において、局所注射は、全身投与によって達成され得るものより大きな上記組成物の局所濃度の増加を引き起こす。
【0135】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、カテーテルまたはシリンジを使用することによって、適切な位置へと局所に送達される。このような組成物を局所に送達する他の手段としては、注入ポンプ（例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）を使用することまたは上記組成物をポリマー埋込物（例えば、Ｐ． Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊ． Ｇ． Ｌｌｏｙｄ－Ｊｏｎｅｓ， ｅｄｓ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ： Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， Ｅｎｇｌａｎｄ： Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ Ｌｔｄ．， １９８８ ＩＳＢＮ－１０： ０８９５７３５８０６を参照のこと）へと組み込むことが挙げられ、これらは、埋込物の直ぐ近くの領域に材料の徐放をもたらし得る。
【0136】
上記組成物は、直接（例えば、それを上記細胞と接触させることによって）、または間接的に（例えば、任意の生物学的プロセスの作用を通じて）、いずれかで上記細胞に提供し得る。例えば、上記小胞は、生理学的に受容可能なキャリア中に製剤化され得、上記細胞の周りの組織または流体へと注射され得る。
【0137】
インビボでの方法のための例示的な投与量は、以下の実験において考察される。さらなる試験が行われるにつれて、種々の患者における種々の状態の処置に適した投与量レベルに関する情報が明らかになり、当業者は、レシピエントの治療状況、年齢、および全身の健康状態を考慮して、適切な投与を確認することができる。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路、および所望の処置の継続期間に依存する。
【0138】
一般に、局所注射または注入に関しては、投与量は低くてもよい。一般に、本開示の小胞を使用して個体に投与される活性薬剤の総量は、その同じ所望のもしくは意図した効果のために投与されなければならない活性薬剤の量より小さくすることができる、かつ／または低減した毒性を示し得る。
【0139】
好ましい実施形態において、上記組成物は、非経口注射（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、真皮下など）によって、水性溶液で投与される。
【0140】
上記製剤は、懸濁剤または乳剤の形態にあり得る。一般に、有効量の、１またはこれより多くの活性薬剤を含む医薬組成物が提供され、必要に応じて、薬学的に受容可能な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／またはキャリアを含む。このような組成物は、希釈剤、滅菌水、種々のｐＨおよびイオン強度にある種々のバッファーの内容の緩衝化塩類溶液（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）；ならびに必要に応じて、添加剤（例えば、洗浄剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリソルベート２０または８０ともいわれる））、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、ならびに保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）を含み得る。非水性溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油（例えば、オリーブ油およびコーン油）、ゼラチン、および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。上記製剤は、凍結乾燥されてもよく、使用直前に再溶解／再懸濁されてもよい。上記製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通過させる濾過によって、滅菌剤を上記組成物に組み込むことによって、上記組成物に照射することによって、または上記組成物を加熱することによって、滅菌され得る。
【0141】
経皮製剤がまた、調製され得る。これらは、代表的には、軟膏剤、ローション剤、スプレー剤、またはパッチ剤であり、これらは全て、標準的技術を使用して調製され得る。経皮製剤は、浸透増強剤を含み得る。化学的増強剤ならびにエレクトロポレーションおよびマイクロニードルを含む物理的方法は、この方法とともに機能し得る。
【0142】
ＩＩＩ． 方法
本開示の組成物は、肝疾患および障害ならびに傷害の処置のために使用され得る。上記方法は、代表的には、投与することを必要性とする被験体に、本開示の組成物のうちの１またはこれより多くのものを、肝臓疾患もしくは障害、または肝損傷の１またはこれより多くの症状を低減または逆転させるために有効な量で投与することを包含する。
本開示の組成物は、肝疾患および障害ならびに傷害の処置のために使用され得る。上記方法は、代表的には、投与することを必要性とする被験体に、本開示の組成物のうちの１またはこれより多くのものを、肝臓疾患もしくは障害、または肝損傷の１またはこれより多くの症状を低減または逆転させるために有効な量で投与することを包含する。
【0143】
肝疾患および障害としては、感染症（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎）；免疫系の問題（例えば、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎、および原発性硬化性胆管炎）；がん（例えば、肝臓がん、胆管がん、および肝細胞腺腫）；遺伝性肝障害（例えば、ヘモクロマトーシス、高シュウ酸尿症、ウイルソン病、およびアルファー１アンチトリプシン欠乏症）；アルコール乱用および／または薬物過剰摂取からの損傷；非アルコール性脂肪肝疾患が挙げられるが、これらに限定されない。肝臓疾患の悲惨な合併症としては、急性肝不全および肝硬変が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記肝臓疾患または障害は、肝線維症であるかまたは肝線維症を含む。
【0144】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、既存の肝線維症および／または新たな線維症の形成を低減する。いくつかの実施形態において、上記組成物は、例えば、ヒドロキシプロリンの量によって測定されるように、既存の肝臓コラーゲンの量または新たな肝臓コラーゲンの形成を低減する。いくつかの実施形態において、上記組成物は、抗Ｃｏｌ１ａ抗体での染色、１もしくはこれより多くの肝線維症関連遺伝子の発現の変化（例えば、Ｍｍｐ２ ｍＲＮＡの発現の増加、Ｔｉｍｐ１、αＳＭＡ、および／もしくはＣｏｌ１ａ ｍＲＮＡならびに／またはタンパク質の発現の低減、あるいはこれらの任意の組み合わせ）によって検出されるように、既存の線維症の量または新たな線維症の形成を低減する。
【0145】
好ましい実施形態において、上記組成物は、肝サテライト細胞活性化の１またはこれより多くのマーカー、例えば、αＳＭＡの発現の低減を、好ましくは肝サテライト細胞において誘導する。
【0146】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、細胞周期、オートファジー、細胞膜融合、および／またはジンクフィンガータンパク質（例えば、Ｄｍｔｆ１、Ｚｆｐ６１２、Ｉｔｇａ６、Ｔｒｉｍ２４、Ｅａｆ２、Ｚｆｐ１１９ａ、Ｄｉｄｏ１、Ｍａｓｐ２、Ｓｇｋ１、Ｓｍ１１５６７、Ｅｍｌ５、Ｓｒｓｆ５、Ｒａｂ３５、Ｆａｍ２０６ａ、Ｚｆｐ１３１、Ｚｋｓｃａｎ１４、Ｉｎｓｃ、およびＮｔｎ３）と関連する１またはこれより多くの遺伝子の発現の変化を誘導する（例えば、図６を参照のこと）。
【0147】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、肝サテライト細胞におけるＭＭＰ１および／またはＭＭＰ１３ ｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の増加、ならびに／あるいはＴＮＦα ｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の低減を誘導する。
【0148】
以下の実験結果は、ＴＮＦαが肝サテライト細胞におけるαＳＭＡ ｍＲＮＡ発現を低減し得ることを示す。従って、いくつかの実施形態において、ＴＮＦαは、上記組成物中に含まれるか、またはそうでなければ本開示の組成物とともに共投与される。
【0149】
組成物は、ＣｌｉＰｓ、これから形成される物質（例えば、エクソソーム）、およびその活性な要素（マイクロＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６６３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、および／もしくはｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐ）、および／またはＴＮＦαのような１もしくはこれより多くのサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない。
【0150】
以下の実施例において、ｈＣＬｉＰｓによって生成されるエクソソームに存在するとして特定されたマイクロＲＮＡのうちのいくつかは、潜在的な機能／活性によって分類される。従って、いくつかの実施形態において、特定の使用のために選択されたエクソソームは、概説されるように上記標的疾患または機能障害の処置のために所望される機能／活性のうちの１またはこれより多くのものを有し得る：
【0151】
検出されるｍｉＲＮＡｓをまた、エクソソーム機能／活性の潜在的な寄与によって分類した：
１）線維症の抑制のために作用するマイクロＲＮＡ
・ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ： ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ／ＨＭＧＢ１／ＴＬＲ４／ＮＦ－κＢシグナル伝達、ａＳＭＡ↓
・ｍｉＲ－２４，ｍｉＲ－２７ｂ： ＴＧＦｂｅｔａシグナル伝達↓
・ｍｉＲ－１９２－５ｐ： ＴＧＦｂｅｔａシグナル伝達に関連するＺｅｂ１およびＺｅｂ２；
ＥＭＴの阻害
２）肝再生のために作用するマイクロＲＮＡ：
・ｍｉＲ－２４： 細胞成長および移動阻害ならびに分化の促進；
ＴＧＦβシグナル伝達の阻害；
３）抗炎症作用を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－１６： ＴＮＦ↑； 抗アポトーシス
４）ＮＡＳＨに対して治療効果を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－１８２－５ｐ； ｍｉＲ－１８３－５ｐ
５）肝細胞癌を抑制する効果を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－２３ａ； ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３１－５ｐ； ｍｉＲ－１８２－５ｐ； ｍｉＲ－１８３－５ｐ
１）線維症の抑制のために作用するマイクロＲＮＡ
・ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ： ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ／ＨＭＧＢ１／ＴＬＲ４／ＮＦ－κＢシグナル伝達、ａＳＭＡ↓
・ｍｉＲ－２４，ｍｉＲ－２７ｂ： ＴＧＦｂｅｔａシグナル伝達↓
・ｍｉＲ－１９２－５ｐ： ＴＧＦｂｅｔａシグナル伝達に関連するＺｅｂ１およびＺｅｂ２；
ＥＭＴの阻害
２）肝再生のために作用するマイクロＲＮＡ：
・ｍｉＲ－２４： 細胞成長および移動阻害ならびに分化の促進；
ＴＧＦβシグナル伝達の阻害；
３）抗炎症作用を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－１６： ＴＮＦ↑； 抗アポトーシス
４）ＮＡＳＨに対して治療効果を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－１８２－５ｐ； ｍｉＲ－１８３－５ｐ
５）肝細胞癌を抑制する効果を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－２３ａ； ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３１－５ｐ； ｍｉＲ－１８２－５ｐ； ｍｉＲ－１８３－５ｐ
【0152】
上記組成物は、例えば、適切な等張性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中に懸濁され得る。いくつかの実施形態は、薬学的に受容可能な添加剤をさらに含む。
【0153】
例えば、細胞またはＥＶｓの懸濁物は、肝疾患のタイプ、肝損傷などの重篤度に応じて異なり得るが、成体の場合には、例えば、１０８～１０１１ 細胞が、門脈内投与、脾臓内投与などによって移植され得る。
【0154】
組み合わせ治療がまた、企図される。従って、いくつかの実施形態において、ＣＬｉＰｓおよび／またはＣＬｉＰｓから形成されるＥＶｓは、第２の活性薬剤とともに、共投与することを必要とする被験体に共投与される。上記第２の活性薬剤は、上記ＣＬｉＰｓおよび／またはＥＶｓと同じまたは異なる混合物中にあり得、同時にまたは異なる時に投与され得る。いくつかの実施形態において、上記さらなる活性薬剤は、上記被験体が罹患する疾患もしくは障害（例えば、肝臓疾患または障害）のための従来の処置である。
【実施例】
【0155】
実施例
実施例１： 肝線維症は、ｈＣＬｉＰ移植によって改善される
材料および方法
使用した細胞
初代ヒト肝細胞（ロット： ＦＣＬ）を、Ｖｅｒｉｔａｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）から購入した。ヒト肝サテライト細胞（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、肝サテライト細胞として購入した。
実施例１： 肝線維症は、ｈＣＬｉＰ移植によって改善される
材料および方法
使用した細胞
初代ヒト肝細胞（ロット： ＦＣＬ）を、Ｖｅｒｉｔａｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）から購入した。ヒト肝サテライト細胞（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、肝サテライト細胞として購入した。
【0156】
培地の組成
ＳＨＭを、初代ヒト肝細胞のための基礎培地として使用した。ＳＨＭを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＭＡ）中に２．４ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３およびＬ－グルタミンを含め、そこに、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ， ＭＯ）、３０ｍｇ／ｌのＬ－プロリン（Ｓｉｇｍａ）、０．０５％ ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌの表皮成長因子（Ｓｉｇｍａ）、インスリン－トランスフェリン－セリン－Ｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０－７ Ｍ デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ ニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ アスコルビン酸－２ホスフェート（Ｗａｋｏ， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）、および抗生物質／抗真菌剤溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加することによって調製した。１０％ ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．５μＭ Ａ－８３－０１（Ｗａｋｏ）、および３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ， Ｒｅｓｔｏｎ， ＶＡ）をこの基礎培地ＳＨＭに添加することによって調製したＳＨＭ＋ＡＣ＋１０％ ＦＢＳ（ＳＨＭ＋ＦＡＣ）を、ｈＣＬｉＰｓを培養するために使用した。Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％ ＦＢＳ、およびＰ／Ｓを各々、Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加し、実験に応じて、肝サテライト細胞の基礎培地として使用した。
ＳＨＭを、初代ヒト肝細胞のための基礎培地として使用した。ＳＨＭを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＭＡ）中に２．４ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３およびＬ－グルタミンを含め、そこに、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ， ＭＯ）、３０ｍｇ／ｌのＬ－プロリン（Ｓｉｇｍａ）、０．０５％ ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌの表皮成長因子（Ｓｉｇｍａ）、インスリン－トランスフェリン－セリン－Ｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０－７ Ｍ デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ ニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ アスコルビン酸－２ホスフェート（Ｗａｋｏ， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）、および抗生物質／抗真菌剤溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加することによって調製した。１０％ ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．５μＭ Ａ－８３－０１（Ｗａｋｏ）、および３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ， Ｒｅｓｔｏｎ， ＶＡ）をこの基礎培地ＳＨＭに添加することによって調製したＳＨＭ＋ＡＣ＋１０％ ＦＢＳ（ＳＨＭ＋ＦＡＣ）を、ｈＣＬｉＰｓを培養するために使用した。Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％ ＦＢＳ、およびＰ／Ｓを各々、Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加し、実験に応じて、肝サテライト細胞の基礎培地として使用した。
【0157】
初代ヒト肝細胞からのｈＣＬｉＰｓの生成
低温貯蔵した初代ヒト肝細胞の約半分を、３７℃のウォーターバスで融解し、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および抗生物質／抗真菌剤溶液を添加した１０ｍｌ Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へと溶解した。その混合物のうちの５０ｇを５分間遠心分離した後、細胞ペレットを、１０％ ＦＢＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、抗生物質／抗真菌剤溶液、および１０－７Ｍ インスリン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ培地中で再懸濁した。トリパンブルー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、生細胞数を測定した。小児初代ヒト肝細胞（ロット： ＦＣＬ）を、コラーゲンＩをコーティングしたプレート（ＩＷＡＫＩ， Ｓｈｉｚｕｏｋａ， Ｊａｐａｎ）上に、２×１０４ 生細胞／ｃｍ２で播種した。３～６時間後、その培地を、ＳＨＭ＋ＦＡＣと交換した。引き続き、その培地を、２～３日ごとに交換し、上記細胞を１４日間培養した。
低温貯蔵した初代ヒト肝細胞の約半分を、３７℃のウォーターバスで融解し、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および抗生物質／抗真菌剤溶液を添加した１０ｍｌ Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へと溶解した。その混合物のうちの５０ｇを５分間遠心分離した後、細胞ペレットを、１０％ ＦＢＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、抗生物質／抗真菌剤溶液、および１０－７Ｍ インスリン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ培地中で再懸濁した。トリパンブルー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、生細胞数を測定した。小児初代ヒト肝細胞（ロット： ＦＣＬ）を、コラーゲンＩをコーティングしたプレート（ＩＷＡＫＩ， Ｓｈｉｚｕｏｋａ， Ｊａｐａｎ）上に、２×１０４ 生細胞／ｃｍ２で播種した。３～６時間後、その培地を、ＳＨＭ＋ＦＡＣと交換した。引き続き、その培地を、２～３日ごとに交換し、上記細胞を１４日間培養した。
【0158】
ｈＣＬｉＰｓの継代培養
７０～１００％ コンフルエントｈＣＬｉＰｓを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＭＡ）を使用して培養ディッシュから剥離し、１０ｃｍ コラーゲンでコーティングしたプレート上に１×１０５ 細胞／ディッシュで再度播種した。
７０～１００％ コンフルエントｈＣＬｉＰｓを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＭＡ）を使用して培養ディッシュから剥離し、１０ｃｍ コラーゲンでコーティングしたプレート上に１×１０５ 細胞／ディッシュで再度播種した。
【0159】
肝線維症を有するモデルマウスの生成
四塩化炭素（０．５ｍｌ／ｋｇ）を、１：４の比でオリーブ油の中に溶解し、８週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（これは、免疫不全マウスである）に１週間に２回、８週間にわたって腹腔内投与し、それによって肝線維症を引き起こした。
四塩化炭素（０．５ｍｌ／ｋｇ）を、１：４の比でオリーブ油の中に溶解し、８週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（これは、免疫不全マウスである）に１週間に２回、８週間にわたって腹腔内投与し、それによって肝線維症を引き起こした。
【0160】
肝線維症を有するモデルマウスへのｈＣＬｉＰｓの移植
調製したｈＣＬｉＰｓを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＭＡ）を使用することによって細胞ペレットへと形成し、次いで、これを、ＤＭＥＭ中に懸濁した。イソフルランで麻酔している肝線維症を有するモデルマウスを、開腹術に供し、そのマウスの脾臓を露出させ、細胞溶液を、５×１０５または１×１０６ 細胞／マウスで注射し、それによって、上記細胞を脾臓内に移植した。移植から２週間後に、マウスを解剖し、肝線維症の程度を評価した。
調製したｈＣＬｉＰｓを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＭＡ）を使用することによって細胞ペレットへと形成し、次いで、これを、ＤＭＥＭ中に懸濁した。イソフルランで麻酔している肝線維症を有するモデルマウスを、開腹術に供し、そのマウスの脾臓を露出させ、細胞溶液を、５×１０５または１×１０６ 細胞／マウスで注射し、それによって、上記細胞を脾臓内に移植した。移植から２週間後に、マウスを解剖し、肝線維症の程度を評価した。
【0161】
ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｖｅｎｌｏ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用することによって抽出した。
全ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｖｅｎｌｏ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用することによって抽出した。
【0162】
逆転写
逆転写のために、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、使用した。
逆転写のために、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、使用した。
【0163】
リアルタイムＰＣＲ
ｃＤＮＡに関しては、リアルタイムＰＣＲを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＴａｑＭａｎＴＭ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ， ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅＴＭ ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。遺伝子発現の変化を、内部標準としてＡＣＴＢを使用することによって試験した。使用したプライマーは、以下の表１に示される。
ＭＭＰ１：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ Ｍｍｐ１ Ｈｓ００８９９６５８ Ｍ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
β－アクチン：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ Ａｃｔｂ Ｈｓ０３０２３８８０ Ｇ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
ｃＤＮＡに関しては、リアルタイムＰＣＲを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＴａｑＭａｎＴＭ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ， ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅＴＭ ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。遺伝子発現の変化を、内部標準としてＡＣＴＢを使用することによって試験した。使用したプライマーは、以下の表１に示される。
【表1】
β－アクチン：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ Ａｃｔｂ Ｈｓ０３０２３８８０ Ｇ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
【0164】
組織免疫染色
組織免疫染色のために使用した抗体は、以下のとおりである。パラフィンブロックサンプルを、ホルマリンでの固定後に作製した。それをエタノールおよびキシレンで脱脂後、ＩｍｍｕｎｏＳａｖｅｒ（Ｎｉｓｓｉｎ ＥＭ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）を２００倍希釈することによって調製した溶液を、９８℃において４５分間使用して、抗原検索を行った。０．３％ Ｈ２Ｏ２を含むメタノール中での浸漬を、室温で３０分間行って、内因性ペルオキシダーゼを不活性化した。０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を含むＰＢＳを浸潤させた後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ溶液を使用して、４℃で３０分間ブロッキングを行った。次いで、一次抗体を、室温で１時間または４℃で一晩インキュベートした。上記サンプルを、ＩｍｍＰＲＥＳＳ ＩｇＧ－ペルオキシダーゼキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）および金属増強ＤＡＢ基質キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して染色した。最後に、上記サンプルを、ヘマトキシリン溶液中に浸漬し、カバーグラスをその上に置いて、サンプルを観察した。
組織免疫染色のために使用した抗体は、以下のとおりである。パラフィンブロックサンプルを、ホルマリンでの固定後に作製した。それをエタノールおよびキシレンで脱脂後、ＩｍｍｕｎｏＳａｖｅｒ（Ｎｉｓｓｉｎ ＥＭ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）を２００倍希釈することによって調製した溶液を、９８℃において４５分間使用して、抗原検索を行った。０．３％ Ｈ２Ｏ２を含むメタノール中での浸漬を、室温で３０分間行って、内因性ペルオキシダーゼを不活性化した。０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を含むＰＢＳを浸潤させた後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ溶液を使用して、４℃で３０分間ブロッキングを行った。次いで、一次抗体を、室温で１時間または４℃で一晩インキュベートした。上記サンプルを、ＩｍｍＰＲＥＳＳ ＩｇＧ－ペルオキシダーゼキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）および金属増強ＤＡＢ基質キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して染色した。最後に、上記サンプルを、ヘマトキシリン溶液中に浸漬し、カバーグラスをその上に置いて、サンプルを観察した。
【表3】
【0165】
デジタルＰＣＲ
全ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することによって凍結肝臓組織から収集した。全ＤＮＡを使用して、Ｔａｑｍａｎ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｓｓａｙのプローブ、Ｍｏｕｓａｅ Ｔｆｒｃ（ＶＩＣ）、およびＴａｑｍａｎ ＲＮａｓｅ Ｐ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（ＦＡＭ）を使用することによって、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｖ２およびＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、ｈＣＬｉＰｓを移植した後のマウスの肝臓に含まれるヒト細胞を検出した。
全ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することによって凍結肝臓組織から収集した。全ＤＮＡを使用して、Ｔａｑｍａｎ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｓｓａｙのプローブ、Ｍｏｕｓａｅ Ｔｆｒｃ（ＶＩＣ）、およびＴａｑｍａｎ ＲＮａｓｅ Ｐ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（ＦＡＭ）を使用することによって、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｖ２およびＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、ｈＣＬｉＰｓを移植した後のマウスの肝臓に含まれるヒト細胞を検出した。
【0166】
ヒドロキシプロリン定量
肝臓組織を使用して、Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ Ｖｓｉｏｎ）によってヒドロキシプロリンを定量した。
肝臓組織を使用して、Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ Ｖｓｉｏｎ）によってヒドロキシプロリンを定量した。
【0167】
結果
四塩化炭素の腹腔内投与による肝線維症を有するモデルマウスの生成
尾を切ることによって採血し、線維症の程度を、ＡＳＴおよびＡＬＴを使用してモニターし、四塩化炭素の投与後の時間経過に対して状態を調べた。投与量に関しては、基準として１００～４００ｍｇ／ｋｇを１週間に２回投与することで、状態を適切に調べた。以前の試験を参考にしながら、２００ｍｇ／ｋｇの四塩化炭素を６週齢のマウスに腹腔内投与したところ、１０日で１／３のマウスが死亡した。死亡したマウスは全て、元々低体重であったか、または投与後に体重が有意に低下した。これらの事実に鑑みて、６週齢のマウスで投与を開始することは、早すぎると考えられた。その結果、マウスに投与し始めることを、８週齢のマウスへと変更して、再び試験した。８週齢のマウスで投与を開始すると、１匹のマウスのみが死亡し、線維症を有するマウスの安定した生産に成功した。線維症の程度を、シリウスレッド染色またはＣｏｌ１ａ抗体を使用する免疫染色によって病理学的に観察した。
四塩化炭素の腹腔内投与による肝線維症を有するモデルマウスの生成
尾を切ることによって採血し、線維症の程度を、ＡＳＴおよびＡＬＴを使用してモニターし、四塩化炭素の投与後の時間経過に対して状態を調べた。投与量に関しては、基準として１００～４００ｍｇ／ｋｇを１週間に２回投与することで、状態を適切に調べた。以前の試験を参考にしながら、２００ｍｇ／ｋｇの四塩化炭素を６週齢のマウスに腹腔内投与したところ、１０日で１／３のマウスが死亡した。死亡したマウスは全て、元々低体重であったか、または投与後に体重が有意に低下した。これらの事実に鑑みて、６週齢のマウスで投与を開始することは、早すぎると考えられた。その結果、マウスに投与し始めることを、８週齢のマウスへと変更して、再び試験した。８週齢のマウスで投与を開始すると、１匹のマウスのみが死亡し、線維症を有するマウスの安定した生産に成功した。線維症の程度を、シリウスレッド染色またはＣｏｌ１ａ抗体を使用する免疫染色によって病理学的に観察した。
【0168】
肝線維症を有するモデルマウスの血液生化学検査
移植の時点で、尾を切ることによって採血し、血清を分離し、ＡＳＴ、ＡＬＴ、総ビリルビン、および血小板数を測定した。
移植の時点で、尾を切ることによって採血し、血清を分離し、ＡＳＴ、ＡＬＴ、総ビリルビン、および血小板数を測定した。
【表2】
【0169】
総ビリルビンは、正常値を示した（表２）。ＡＳＴおよびＡＬＴを、１週間に２回経時的に測定したところ、最初の投与時で有意に上昇した後、それらは安定し、基準値より高かった。これらの事実は、軽度のレベルの肝線維症を有するモデルが作製されたことを示す。移植後に、上記モデルをＡＳＴ／ＡＬＴに関して非移植群と比較したところ、有意差は見出されなかった（図１Ａ～１Ｂ）。
【0170】
ｈＣＬｉＰ移植に起因する肝臓組織におけるコラーゲン量の減少
ヒドロキシプロリンは、コラーゲンを構成するアミノ酸のうちの１タイプである。ｈＣＬｉＰ移植から２週間で解剖を行い、肝臓組織中のヒドロキシプロリンの量を定量した。ｈＣＬｉＰｓを移植した群では、ヒドロキシプロリンの量は有意に減少した（図２）。これは、ｈＣＬｉＰ移植がコラーゲン生成を抑制するかまたはコラーゲンを分解する可能性を示す。
ヒドロキシプロリンは、コラーゲンを構成するアミノ酸のうちの１タイプである。ｈＣＬｉＰ移植から２週間で解剖を行い、肝臓組織中のヒドロキシプロリンの量を定量した。ｈＣＬｉＰｓを移植した群では、ヒドロキシプロリンの量は有意に減少した（図２）。これは、ｈＣＬｉＰ移植がコラーゲン生成を抑制するかまたはコラーゲンを分解する可能性を示す。
【0171】
ｈＣＬｉＰ移植による病的肝線維症の改善
線維症の程度を、シリウスレッド染色または１ａ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ）抗体を使用する免疫染色によって、病理学的に評価した。ｈＣＬｉＰｓを移植した群では、Ｃｏｌ１ａ陽性面積は、有意に低減した（図３Ａ）。シリウスレッド染色では、ｈＣＬｉＰ移植によって改善される傾向が観察された。さらに、シリウスレッド染色およびヒドロキシプロリンの量は、正の相関を示すことが明らかにされた（図３Ｂ）。
線維症の程度を、シリウスレッド染色または１ａ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ）抗体を使用する免疫染色によって、病理学的に評価した。ｈＣＬｉＰｓを移植した群では、Ｃｏｌ１ａ陽性面積は、有意に低減した（図３Ａ）。シリウスレッド染色では、ｈＣＬｉＰ移植によって改善される傾向が観察された。さらに、シリウスレッド染色およびヒドロキシプロリンの量は、正の相関を示すことが明らかにされた（図３Ｂ）。
【0172】
ｈＣＬｉＰ移植に起因する肝線維症関連遺伝子の発現の変化
肝線維症と関連する遺伝子（Ｍｍｐ２、Ｔｉｍｐ１、αＳＭＡ、およびＣｏｌ１ａ）の発現の変化を、リアルタイムＰＣＲで観察した。ＨＣＬｉＰｓを移植した群では、Ｍｍｐ２ ｍＲＮＡの発現レベルが有意に増加した一方で、Ｔｉｍｐ１、αＳＭＡ、およびＣｏｌ１ａ ｍＲＮＡの発現レベルは有意に減少した（図４Ａ～４Ｄ）。ｈＣＬｉＰ移植の結果として、コラーゲンを分解する遺伝子の発現の増加およびコラーゲンを生成する遺伝子の発現の減少が、線維症を有する肝臓において観察された。
肝線維症と関連する遺伝子（Ｍｍｐ２、Ｔｉｍｐ１、αＳＭＡ、およびＣｏｌ１ａ）の発現の変化を、リアルタイムＰＣＲで観察した。ＨＣＬｉＰｓを移植した群では、Ｍｍｐ２ ｍＲＮＡの発現レベルが有意に増加した一方で、Ｔｉｍｐ１、αＳＭＡ、およびＣｏｌ１ａ ｍＲＮＡの発現レベルは有意に減少した（図４Ａ～４Ｄ）。ｈＣＬｉＰ移植の結果として、コラーゲンを分解する遺伝子の発現の増加およびコラーゲンを生成する遺伝子の発現の減少が、線維症を有する肝臓において観察された。
【0173】
肝臓組織におけるｈＣＬｉＰｓの存在
脾臓から移植されたｈＣＬｉＰｓがどこに存在するかを試験するために、肝臓組織スライスを使用して、ヒトミトコンドリア抗体での免疫染色を行った。しかし、検出は失敗した。従って、全ＤＮＡを、凍結肝臓組織から収集し、マウスＴｆｒｃおよびヒトＲＮａｓｅ Ｐを使用して、それらの各々のコピー数を測定した。０～１％のヒト細胞を移植群において検出した（図５）。マウス肝臓中に５×１０５個の移植細胞が存在し、約１×１０８個の細胞が存在することから、マウス肝臓中の移植したｈＣＬｉＰｓの数／細胞数は、０．５％である。移植後２週間目には、マウス肝臓中に存在するヒト細胞のパーセンテージは、最大で１％であった。これは、ｈＣＬｉＰｓがおそらく、移植後にマウス肝臓中で増殖したことを示す。
脾臓から移植されたｈＣＬｉＰｓがどこに存在するかを試験するために、肝臓組織スライスを使用して、ヒトミトコンドリア抗体での免疫染色を行った。しかし、検出は失敗した。従って、全ＤＮＡを、凍結肝臓組織から収集し、マウスＴｆｒｃおよびヒトＲＮａｓｅ Ｐを使用して、それらの各々のコピー数を測定した。０～１％のヒト細胞を移植群において検出した（図５）。マウス肝臓中に５×１０５個の移植細胞が存在し、約１×１０８個の細胞が存在することから、マウス肝臓中の移植したｈＣＬｉＰｓの数／細胞数は、０．５％である。移植後２週間目には、マウス肝臓中に存在するヒト細胞のパーセンテージは、最大で１％であった。これは、ｈＣＬｉＰｓがおそらく、移植後にマウス肝臓中で増殖したことを示す。
【0174】
ｈＣＬｉＰ移植に起因する遺伝子プロフィールの変化
非移植群および移植群のＲＮＡを使用して、マイクロアレイ分析を行った。ｈＣＬｉＰ移植は、１８タイプの遺伝子（Ｄｍｔｆ１、Ｚｆｐ６１２、Ｉｔｇａ６、Ｔｒｉｍ２４、Ｅａｆ２、Ｚｆｐ１１９ａ、Ｄｉｄｏ１、Ｍａｓｐ２、Ｓｇｋ１、Ｓｍ１１５６７、Ｅｍｌ５、Ｓｒｓｆ５、Ｒａｂ３５、Ｆａｍ２０６ａ、Ｚｆｐ１３１、Ｚｋｓｃａｎ１４、Ｉｎｓｃ、およびＮｔｎ３）の発現の有意な減少を生じた（図６）。これらは、細胞周期、オートファジー、細胞膜融合、またはジンクフィンガータンパク質と関連する遺伝子であり、それらの遺伝子プロフィールは、ｈＣＬｉＰ移植によって大きく変化した。
非移植群および移植群のＲＮＡを使用して、マイクロアレイ分析を行った。ｈＣＬｉＰ移植は、１８タイプの遺伝子（Ｄｍｔｆ１、Ｚｆｐ６１２、Ｉｔｇａ６、Ｔｒｉｍ２４、Ｅａｆ２、Ｚｆｐ１１９ａ、Ｄｉｄｏ１、Ｍａｓｐ２、Ｓｇｋ１、Ｓｍ１１５６７、Ｅｍｌ５、Ｓｒｓｆ５、Ｒａｂ３５、Ｆａｍ２０６ａ、Ｚｆｐ１３１、Ｚｋｓｃａｎ１４、Ｉｎｓｃ、およびＮｔｎ３）の発現の有意な減少を生じた（図６）。これらは、細胞周期、オートファジー、細胞膜融合、またはジンクフィンガータンパク質と関連する遺伝子であり、それらの遺伝子プロフィールは、ｈＣＬｉＰ移植によって大きく変化した。
【0175】
実施例２： 肝サテライト細胞との共培養は、ｈＣＬｉＰｓの治療機序を明らかにする
材料および方法
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓを使用する共培養
肝サテライト細胞を、Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％ ＦＢＳ、およびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加することによって調製した培地中に懸濁し、１×１０４ 生細胞／ｃｍ２で播種した。一晩の後、その培地を、ＴＧＦβおよびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍに添加することによって調製した培地と交換した。２４時間のインキュベーション後、ｈＣＬｉＰｓを、ＳＨＭ培地中に懸濁し、共培養を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ－ＣＯＬ挿入物（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して、１×１０５ 生細胞／ウェルで４８時間行った。
材料および方法
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓを使用する共培養
肝サテライト細胞を、Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％ ＦＢＳ、およびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加することによって調製した培地中に懸濁し、１×１０４ 生細胞／ｃｍ２で播種した。一晩の後、その培地を、ＴＧＦβおよびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍに添加することによって調製した培地と交換した。２４時間のインキュベーション後、ｈＣＬｉＰｓを、ＳＨＭ培地中に懸濁し、共培養を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ－ＣＯＬ挿入物（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して、１×１０５ 生細胞／ウェルで４８時間行った。
【0176】
肝サテライト細胞へのＴＮＦαの添加
肝サテライト細胞を、Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％ ＦＢＳ、およびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加することによって調製した培地中で懸濁し、１×１０４ 生細胞／ｃｍ２で播種した。一晩の後、その培地を、ＴＧＦβおよびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍに添加することによって調製した培地と交換した。２４時間のインキュベーション後、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを添加し、２４時間曝露した。
肝サテライト細胞を、Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％ ＦＢＳ、およびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加することによって調製した培地中で懸濁し、１×１０４ 生細胞／ｃｍ２で播種した。一晩の後、その培地を、ＴＧＦβおよびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍに添加することによって調製した培地と交換した。２４時間のインキュベーション後、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを添加し、２４時間曝露した。
【0177】
エクソソームの収集
ｈＣＬｉＰｓを、ＳＨＭ ＋ ＦＡＣ中に懸濁し、２×１０３ 生細胞／ｃｍ２で播種した。その培地を２日ごとに交換し、その培地を、培養の４日目にＳＨＭ ＋ ＡＣと交換した。２４時間の培養後、その培養上清を収集した。その収集した培養上清を、２００００ ｇ、４℃において１０分間遠心分離した。その上清をＳｔｅｒｉｃｕｐ Ｑｕｉｃｋ Ｒｅｌｅａｓｅ－ＧＰ Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｖａｃｕｕｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。上記の処理した培養上清を、３５０００ｒｐｍ、４℃で１時間１０分超遠心分離した。超遠心分離の直後に、その上清を廃棄し、エクソソームをペレットへと形成した（培養上清の量に応じて、超遠心分離を２～５回反復した）。ＰＢＳをそのペレットに添加し、その混合物を再度超遠心分離し、その上清を廃棄し、その得られた生成物を洗浄した。そのペレットを、チューブに残ったごく少量のＰＢＳ（約１００μＬ）に溶解して、エクソソーム溶液を調製した。
ｈＣＬｉＰｓを、ＳＨＭ ＋ ＦＡＣ中に懸濁し、２×１０３ 生細胞／ｃｍ２で播種した。その培地を２日ごとに交換し、その培地を、培養の４日目にＳＨＭ ＋ ＡＣと交換した。２４時間の培養後、その培養上清を収集した。その収集した培養上清を、２００００ ｇ、４℃において１０分間遠心分離した。その上清をＳｔｅｒｉｃｕｐ Ｑｕｉｃｋ Ｒｅｌｅａｓｅ－ＧＰ Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｖａｃｕｕｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。上記の処理した培養上清を、３５０００ｒｐｍ、４℃で１時間１０分超遠心分離した。超遠心分離の直後に、その上清を廃棄し、エクソソームをペレットへと形成した（培養上清の量に応じて、超遠心分離を２～５回反復した）。ＰＢＳをそのペレットに添加し、その混合物を再度超遠心分離し、その上清を廃棄し、その得られた生成物を洗浄した。そのペレットを、チューブに残ったごく少量のＰＢＳ（約１００μＬ）に溶解して、エクソソーム溶液を調製した。
【0178】
ｈＣＬｉＰ由来のエクソソームにおけるｍｉＲＮＡの分析
収集したエクソソームを、ｍｉＲＮＡの存在に関して分析した。ＭｉＲＮＡｓを、Ｑｉａｇｅｎ マイクロＲＮＡｅａｓｙキットを使用することによって、ＣＬｉＰ ＥＶｓから精製した。精製したマイクロＲＮＡｓを、包括的ｍｉＲＮＡ発現分析に投入し、３Ｄ‐Ｇｅｎｅ（登録商標） ｍｉＲＮＡ ＬａｂｅｌｉｎｇキットおよびｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ２１データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）に登録された２，５８８のｍｉＲＮＡ配列を検出するように設計された３Ｄ‐Ｇｅｎｅ（登録商標） Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｉｐ（ともにＴｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用して行った。マイクロアレイ実験を、Ｋａｍａｋｕｒａ Ｔｅｃｈｎｏ‐Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．によって行った。シグナル強度＞２６を有するｍｉＲＮＡを、検出されたｍｉＲＮＡｓと見做した。
収集したエクソソームを、ｍｉＲＮＡの存在に関して分析した。ＭｉＲＮＡｓを、Ｑｉａｇｅｎ マイクロＲＮＡｅａｓｙキットを使用することによって、ＣＬｉＰ ＥＶｓから精製した。精製したマイクロＲＮＡｓを、包括的ｍｉＲＮＡ発現分析に投入し、３Ｄ‐Ｇｅｎｅ（登録商標） ｍｉＲＮＡ ＬａｂｅｌｉｎｇキットおよびｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ２１データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）に登録された２，５８８のｍｉＲＮＡ配列を検出するように設計された３Ｄ‐Ｇｅｎｅ（登録商標） Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｉｐ（ともにＴｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用して行った。マイクロアレイ実験を、Ｋａｍａｋｕｒａ Ｔｅｃｈｎｏ‐Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．によって行った。シグナル強度＞２６を有するｍｉＲＮＡを、検出されたｍｉＲＮＡｓと見做した。
【0179】
肝サテライト細胞へのｈＣＬｉＰ由来のエクソソームの添加
肝サテライト細胞を、Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％ ＦＢＳ、およびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加することによって調製した培地中に懸濁し、１×１０４ 生細胞／ｃｍ２で播種した。一晩の後、その培地を、ＴＧＦβおよびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍに添加することによって調製した培地と交換した。２４時間のインキュベーション後、１０μｇ／ｍＬのｈＣＬｉＰ由来のエクソソーム溶液を添加し、その混合物を４８時間培養した。
肝サテライト細胞を、Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％ ＦＢＳ、およびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加することによって調製した培地中に懸濁し、１×１０４ 生細胞／ｃｍ２で播種した。一晩の後、その培地を、ＴＧＦβおよびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍに添加することによって調製した培地と交換した。２４時間のインキュベーション後、１０μｇ／ｍＬのｈＣＬｉＰ由来のエクソソーム溶液を添加し、その混合物を４８時間培養した。
【0180】
不死化ｈＣＬｉＰｓの生成
３つの遺伝子、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）、およびＴＥＲＴを導入し、４タイプ（Ａ～Ｄ）の細胞を、プロモーターの差異に応じて作製した。
３つの遺伝子、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）、およびＴＥＲＴを導入し、４タイプ（Ａ～Ｄ）の細胞を、プロモーターの差異に応じて作製した。
【表4】
【0181】
肝分化の誘導
ｈＣＬｉＰｓを、コラーゲンＩでコーティングした２４ウェルプレート上に、５×１０４ 細胞／ウェル（２．５×１０４ 細胞／ｃｍ２）の播種密度で播種した。５０～８０％ コンフルエントになったときに、その培地を、２％ ＦＢＳ、０．５ｍＭ Ａ－８３－０１、および３ｍＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含むＳＨＭと交換した。分化誘導群（Ｈｅｐ－ｉ（＋））に関しては、５ｎｇ／ｍｌのヒトＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ）および１０－６Ｍ デキサメタゾンを添加した。上記細胞を６日間培養し、ここでその培地を、２日ごとに交換した。６日目に、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）および上記培地の１：７の比での混合物を、培地の代わりに、分化誘導群（Ｈｅｐ－ｉ（＋））の上に注いだ。８日目に、そのゲルを吸引し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を補充したハンクス平衡化塩類溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄した。
ｈＣＬｉＰｓを、コラーゲンＩでコーティングした２４ウェルプレート上に、５×１０４ 細胞／ウェル（２．５×１０４ 細胞／ｃｍ２）の播種密度で播種した。５０～８０％ コンフルエントになったときに、その培地を、２％ ＦＢＳ、０．５ｍＭ Ａ－８３－０１、および３ｍＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含むＳＨＭと交換した。分化誘導群（Ｈｅｐ－ｉ（＋））に関しては、５ｎｇ／ｍｌのヒトＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ）および１０－６Ｍ デキサメタゾンを添加した。上記細胞を６日間培養し、ここでその培地を、２日ごとに交換した。６日目に、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）および上記培地の１：７の比での混合物を、培地の代わりに、分化誘導群（Ｈｅｐ－ｉ（＋））の上に注いだ。８日目に、そのゲルを吸引し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を補充したハンクス平衡化塩類溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄した。
【0182】
ＣＹＰ活性の測定
ＣＹＰ活性の測定のために、２％ ＦＢＳを含むＳＨＭを、基礎培地として使用した。ＣＹＰ３Ａ４を、１０μＭ リファンピシンまたは１ｍＭ フェノバルビタールで誘導した。ＣＹＰ１Ａ２を、５０μＭ オメプラゾールで誘導した。ＣＹＰ誘導因子を含む培地を、毎日交換した。３日後に、Ｐ４５０－ＧｌｏＴＭ ＣＹＰ３Ａ４ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＣＹＰ活性を測定した。
ＣＹＰ活性の測定のために、２％ ＦＢＳを含むＳＨＭを、基礎培地として使用した。ＣＹＰ３Ａ４を、１０μＭ リファンピシンまたは１ｍＭ フェノバルビタールで誘導した。ＣＹＰ１Ａ２を、５０μＭ オメプラゾールで誘導した。ＣＹＰ誘導因子を含む培地を、毎日交換した。３日後に、Ｐ４５０－ＧｌｏＴＭ ＣＹＰ３Ａ４ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＣＹＰ活性を測定した。
【0183】
タンパク質の抽出
細胞を、Ｍ－ＰＥＲＴＭ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔで十分にピペッティングし、溶解させた。その溶解物を、１５０００ｇにおいて、４℃で１０分間遠心分離し、その上清をタンパク質溶液として使用した。そのタンパク質濃度を、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。
細胞を、Ｍ－ＰＥＲＴＭ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔで十分にピペッティングし、溶解させた。その溶解物を、１５０００ｇにおいて、４℃で１０分間遠心分離し、その上清をタンパク質溶液として使用した。そのタンパク質濃度を、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。
【0184】
ウェスタンブロッティング
上記タンパク質溶液を、４×ＳＤＳ サンプル緩衝液（Ｍｅｒｃｋ）と混合し、その混合物を、９５℃で５分間インキュベートして、移動サンプルを調製した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＰｒｏｔｅｉｎＴＭ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯＲＡＤ）を、分子量マーカーとして使用した。４～２０％ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標） ＴＧＸＴＭ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（ＢＩＯＲＡＤ）を、移動タンクの中に入れ、その標本および分子量マーカーを載せた。１００ｍｌ １０×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳを９００ｍｌ ｍｉｌｉＱで希釈して、泳動緩衝液として使用し、移動を１００Ｖで１時間１０分行った。転写に関しては、８０ｍｌ １０×Ｔｒｉｓ／グリシンを７２０ｍｌ ｍｉｌｉＱで希釈し、２００ｍｌ メタノールを添加して、転写緩衝液として使用し、ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ膜（Ｍｅｒｃｋ）への転写を、１００Ｖで１時間行った。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ溶液を使用して、室温で１時間ブロッキングを行い、一次抗体を、１０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ溶液を添加したＴＢＳ－Ｔで希釈し、それらを４℃で一晩放置した。得られた生成物をＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、二次抗体をＴＢＳ－Ｔで希釈し、室温で１時間インキュベートした。その得られた生成物を、ＴＢＳ－Ｔで再度３回洗浄し、ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ ＬＤ（Ｗａｋｏ， Ｊａｐａｎ）で染色し、検出をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯＲＡＤ）で行った。
上記タンパク質溶液を、４×ＳＤＳ サンプル緩衝液（Ｍｅｒｃｋ）と混合し、その混合物を、９５℃で５分間インキュベートして、移動サンプルを調製した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＰｒｏｔｅｉｎＴＭ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯＲＡＤ）を、分子量マーカーとして使用した。４～２０％ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標） ＴＧＸＴＭ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（ＢＩＯＲＡＤ）を、移動タンクの中に入れ、その標本および分子量マーカーを載せた。１００ｍｌ １０×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳを９００ｍｌ ｍｉｌｉＱで希釈して、泳動緩衝液として使用し、移動を１００Ｖで１時間１０分行った。転写に関しては、８０ｍｌ １０×Ｔｒｉｓ／グリシンを７２０ｍｌ ｍｉｌｉＱで希釈し、２００ｍｌ メタノールを添加して、転写緩衝液として使用し、ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ膜（Ｍｅｒｃｋ）への転写を、１００Ｖで１時間行った。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ溶液を使用して、室温で１時間ブロッキングを行い、一次抗体を、１０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ溶液を添加したＴＢＳ－Ｔで希釈し、それらを４℃で一晩放置した。得られた生成物をＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、二次抗体をＴＢＳ－Ｔで希釈し、室温で１時間インキュベートした。その得られた生成物を、ＴＢＳ－Ｔで再度３回洗浄し、ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ ＬＤ（Ｗａｋｏ， Ｊａｐａｎ）で染色し、検出をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯＲＡＤ）で行った。
【表5】
【0185】
統計分析
統計分析を、ＳＰＳＳを使用して行った。スチューデントのｔ検定およびダネットの検定を行った。ｐ＜０．０５の註釈： ＊， ｐ＜０，０１： ＊＊， ｐ＜０．００１： ＊は、本明細書中以降使用される。
統計分析を、ＳＰＳＳを使用して行った。スチューデントのｔ検定およびダネットの検定を行った。ｐ＜０．０５の註釈： ＊， ｐ＜０，０１： ＊＊， ｐ＜０．００１： ＊は、本明細書中以降使用される。
【0186】
結果
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養による肝サテライト細胞活性化レベルの減少
肝サテライト細胞は、肝線維症の進行病態生理において中心的な役割を果たす。肝サテライト細胞の活性化によって、肝サテライト細胞は細胞外マトリクス物質を生成し、肝線維症において中心的役割を果たす。従って、肝サテライト細胞活性化に対するｈＣＬｉＰｓとのその共培養の影響を調査するために実験を設計した。肝サテライト細胞を播種し、一晩の後に、その培地を、ＴＧＦβおよびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍに添加することによって調製した培地と交換した。２４時間のインキュベーション後、ｈＣＬｉＰｓを、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ－ＣＯＬ挿入物を使用して４８時間共培養した。肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養の結果として、αＳＭＡ（これは、肝サテライト細胞活性化マーカーである）の発現は、肝サテライト細胞におけるｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで有意に減少した（図７）。
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養による肝サテライト細胞活性化レベルの減少
肝サテライト細胞は、肝線維症の進行病態生理において中心的な役割を果たす。肝サテライト細胞の活性化によって、肝サテライト細胞は細胞外マトリクス物質を生成し、肝線維症において中心的役割を果たす。従って、肝サテライト細胞活性化に対するｈＣＬｉＰｓとのその共培養の影響を調査するために実験を設計した。肝サテライト細胞を播種し、一晩の後に、その培地を、ＴＧＦβおよびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍに添加することによって調製した培地と交換した。２４時間のインキュベーション後、ｈＣＬｉＰｓを、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ－ＣＯＬ挿入物を使用して４８時間共培養した。肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養の結果として、αＳＭＡ（これは、肝サテライト細胞活性化マーカーである）の発現は、肝サテライト細胞におけるｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで有意に減少した（図７）。
【0187】
肝サテライト細胞および不死化ｈＣＬｉＰｓの共培養による肝サテライト細胞活性化レベルの減少
ｈＣＬｉＰｓは、有意により高い増殖能力を有するが、非実質細胞の集団は、非実質細胞の混入に起因して、継代を繰り返した後に増加する。従って、複数回の継代後にｈＣＬｉＰｓの機能および治療効果を正確に評価することは困難である。従って、不死化ｈＣＬｉＰｓを生成して、これらがｈＣＬｉＰｓのものと同じ機能を有するかどうかを評価した。第１に、４タイプ（Ａ～Ｄ）の不死化ｈＣＬｉＰｓを、プロモーターなどにおける差異に応じて生成した。不死化ｈＣＬｉＰｓがｈＣＬｉＰｓのものと同じ機能を有するかどうかを試験するために、不死化ｈＣＬｉＰｓを、分化の誘導に供し、ＣＹＰ酵素活性を測定した。ＡおよびＤでは、ＣＹＰ酵素活性は、分化の誘導に起因して増加した（図８Ａ～８Ｄ）のに対して、ＢおよびＣでは、分化の誘導は変化を引き起こさず、酵素活性は低かった。これらの結果に鑑みて、不死化において肝前駆細胞の代わりに、胆管上皮細胞のような混合した細胞の他のタイプが不死化した可能性がある。従って、ＡおよびＤは、不死化ｈＣＬｉＰｓとして使用した。次に、肝サテライト細胞および不死化ｈＣＬｉＰｓを共培養した。肝サテライト細胞および不死化ｈＣＬｉＰｓの共培養の結果として、αＳＭＡ ｍＲＮＡ（これは、肝サテライト細胞活性化マーカーである）の発現は、肝サテライト細胞において有意に減少した（図９）。
ｈＣＬｉＰｓは、有意により高い増殖能力を有するが、非実質細胞の集団は、非実質細胞の混入に起因して、継代を繰り返した後に増加する。従って、複数回の継代後にｈＣＬｉＰｓの機能および治療効果を正確に評価することは困難である。従って、不死化ｈＣＬｉＰｓを生成して、これらがｈＣＬｉＰｓのものと同じ機能を有するかどうかを評価した。第１に、４タイプ（Ａ～Ｄ）の不死化ｈＣＬｉＰｓを、プロモーターなどにおける差異に応じて生成した。不死化ｈＣＬｉＰｓがｈＣＬｉＰｓのものと同じ機能を有するかどうかを試験するために、不死化ｈＣＬｉＰｓを、分化の誘導に供し、ＣＹＰ酵素活性を測定した。ＡおよびＤでは、ＣＹＰ酵素活性は、分化の誘導に起因して増加した（図８Ａ～８Ｄ）のに対して、ＢおよびＣでは、分化の誘導は変化を引き起こさず、酵素活性は低かった。これらの結果に鑑みて、不死化において肝前駆細胞の代わりに、胆管上皮細胞のような混合した細胞の他のタイプが不死化した可能性がある。従って、ＡおよびＤは、不死化ｈＣＬｉＰｓとして使用した。次に、肝サテライト細胞および不死化ｈＣＬｉＰｓを共培養した。肝サテライト細胞および不死化ｈＣＬｉＰｓの共培養の結果として、αＳＭＡ ｍＲＮＡ（これは、肝サテライト細胞活性化マーカーである）の発現は、肝サテライト細胞において有意に減少した（図９）。
【0188】
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養に起因する肝サテライト細胞における遺伝子発現の変化
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓを共培養して、肝サテライト細胞活性化およびコラーゲン線維症の分解に関与するシグナル遺伝子発現の変化を確認した。肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養の結果として、ＭＭＰ１およびＭＭＰ１３ ｍＲＮＡの発現は、肝サテライト細胞において増加した。ＴＧＦβの添加の結果として、ＴＮＦα ｍＲＮＡの発現は減少した（図１０Ａ～１０Ｄ）。
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓを共培養して、肝サテライト細胞活性化およびコラーゲン線維症の分解に関与するシグナル遺伝子発現の変化を確認した。肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養の結果として、ＭＭＰ１およびＭＭＰ１３ ｍＲＮＡの発現は、肝サテライト細胞において増加した。ＴＧＦβの添加の結果として、ＴＮＦα ｍＲＮＡの発現は減少した（図１０Ａ～１０Ｄ）。
【0189】
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養に起因するｈＣＬｉＰｓ遺伝子発現の変化
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓを共培養して、ＴＧＦβの存在下および非存在下で、肝サテライト細胞活性化およびコラーゲン線維症の分解に関与するシグナル遺伝子発現の変化を確認した。ＴＧＦβの存在下での肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養の結果として、ｈＣＬｉＰｓにおけるＭＭＰ１３ ｍＲＮＡの発現は、有意に増加した。ＴＮＦα ｍＲＮＡの発現は増加したが、ＴＩＭＰ３ ｍＲＮＡの発現は減少した（図１１Ａ～１１Ｃ）。
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓを共培養して、ＴＧＦβの存在下および非存在下で、肝サテライト細胞活性化およびコラーゲン線維症の分解に関与するシグナル遺伝子発現の変化を確認した。ＴＧＦβの存在下での肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養の結果として、ｈＣＬｉＰｓにおけるＭＭＰ１３ ｍＲＮＡの発現は、有意に増加した。ＴＮＦα ｍＲＮＡの発現は増加したが、ＴＩＭＰ３ ｍＲＮＡの発現は減少した（図１１Ａ～１１Ｃ）。
【0190】
肝サテライト細胞へのＴＮＦαの添加の際の遺伝子発現の変化
ＴＧＦβの存在下での肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養が、ｈＣＬｉＰｓにおいてＴＮＦα ｍＲＮＡの発現の増加を生じたことから、ＴＮＦαの分泌はサイトカインとしてｈＣＬｉＰｓから増加したと考えられる。従って、ＴＮＦα（これは、サイトカインの１タイプである）を、活性化肝サテライト細胞に添加した。ＴＮＦαの添加は、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、および５０ｎｇ／ｍｌの群においてαＳＭＡ ｍＲＮＡ発現の有意な減少を生じた（図１２）。
ＴＧＦβの存在下での肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養が、ｈＣＬｉＰｓにおいてＴＮＦα ｍＲＮＡの発現の増加を生じたことから、ＴＮＦαの分泌はサイトカインとしてｈＣＬｉＰｓから増加したと考えられる。従って、ＴＮＦα（これは、サイトカインの１タイプである）を、活性化肝サテライト細胞に添加した。ＴＮＦαの添加は、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、および５０ｎｇ／ｍｌの群においてαＳＭＡ ｍＲＮＡ発現の有意な減少を生じた（図１２）。
【0191】
ｈＣＬｉＰ由来のエクソソームを肝サテライト細胞に添加する場合の肝サテライト細胞活性化レベルの減少
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養は、ｈＣＬｉＰ由来の分泌物に起因して、αＳＭＡの発現の減少を示す。種々の細胞由来の分泌物（例えば、サイトカインまたはエクソソーム）が存在する。エクソソームは安定であり、無細胞治療に使用しやすい。従って、ｈＣＬｉＰ由来のエクソソームを収集し、エクソソーム溶液を肝サテライト細胞に添加し、発現の変化を観察した。肝サテライト細胞を播種し、一晩の後、その培地を、ＴＧＦβおよびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍに添加することによって調製した培地と交換した。２４時間のインキュベーション後、１０μｇ／ｍＬのｈＣＬｉＰ由来のエクソソーム溶液を添加し、その混合物を４８時間培養した。ｈＣＬｉＰ由来のエクソソームを肝サテライト細胞に添加すると、肝サテライト細胞においてタンパク質レベルで、αＳＭＡ（これは、肝サテライト細胞活性化マーカーである）の発現の減少が生じた。さらに、添加したエクソソーム中のｍＲＮＡの遺伝子発現が確認され、多くのＴＮＦα ｍＲＮＡが含まれることが見出された（図１３Ａ～１３Ｂ）。
肝サテライト細胞およびｈＣＬｉＰｓの共培養は、ｈＣＬｉＰ由来の分泌物に起因して、αＳＭＡの発現の減少を示す。種々の細胞由来の分泌物（例えば、サイトカインまたはエクソソーム）が存在する。エクソソームは安定であり、無細胞治療に使用しやすい。従って、ｈＣＬｉＰ由来のエクソソームを収集し、エクソソーム溶液を肝サテライト細胞に添加し、発現の変化を観察した。肝サテライト細胞を播種し、一晩の後、その培地を、ＴＧＦβおよびＰ／ＳをＳｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍに添加することによって調製した培地と交換した。２４時間のインキュベーション後、１０μｇ／ｍＬのｈＣＬｉＰ由来のエクソソーム溶液を添加し、その混合物を４８時間培養した。ｈＣＬｉＰ由来のエクソソームを肝サテライト細胞に添加すると、肝サテライト細胞においてタンパク質レベルで、αＳＭＡ（これは、肝サテライト細胞活性化マーカーである）の発現の減少が生じた。さらに、添加したエクソソーム中のｍＲＮＡの遺伝子発現が確認され、多くのＴＮＦα ｍＲＮＡが含まれることが見出された（図１３Ａ～１３Ｂ）。
【0192】
ＴＧＦβの存在下でのｈＣＬｉＰ由来のエクソソーム中のｍＲＮＡ
エクソソームを、ＴＧＦβの存在下および非存在下で収集し、エクソソームにおける遺伝子発現の変化を観察した。ＴＧＦβの存在下では、エクソソームにおけるＭＭＰ１３およびＴＩＭＰ３ ｍＲＮＡの発現レベルは減少した。さらに、エクソソームにおけるＴＮＦαの発現レベルは増加した（図１４Ａ～１４Ｃ）。
エクソソームを、ＴＧＦβの存在下および非存在下で収集し、エクソソームにおける遺伝子発現の変化を観察した。ＴＧＦβの存在下では、エクソソームにおけるＭＭＰ１３およびＴＩＭＰ３ ｍＲＮＡの発現レベルは減少した。さらに、エクソソームにおけるＴＮＦαの発現レベルは増加した（図１４Ａ～１４Ｃ）。
【0193】
ｈＣＬｉＰ由来のエクソソームにおけるｍｉＲＮＡ
収集したエクソソームをまた、ｍｉＲＮＡの存在に関して分析した。結果を図１６に示す。環状ｍｉＲＮＡは、線維症の阻害に寄与すると考えられるものである。
収集したエクソソームをまた、ｍｉＲＮＡの存在に関して分析した。結果を図１６に示す。環状ｍｉＲＮＡは、線維症の阻害に寄与すると考えられるものである。
【0194】
検出したｍｉＲＮＡｓを、エクソソーム機能／活性の潜在的寄与によっても分類した：
１）線維症の抑制のために作用するマイクロＲＮＡ
・ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ： ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ／ＨＭＧＢ１／ＴＬＲ４／ＮＦ－κＢシグナル伝達、ａＳＭＡ↓
・ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７ｂ： ＴＧＦｂｅｔａシグナル伝達↓
・ｍｉＲ－１９２－５ｐ： ＴＧＦｂｅｔａシグナル伝達に関連するＺｅｂ１およびＺｅｂ２；
ＥＭＴの阻害
２）肝再生のために作用するマイクロＲＮＡ：
・ｍｉＲ－２４： 細胞成長＆移動阻害、および分化を促進する；
ＴＧＦβシグナル伝達の阻害；
３）抗炎症作用を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－１６： ＴＮＦ↑； 抗アポトーシス
４）ＮＡＳＨに対して治療効果を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－１８２－５ｐ； ｍｉＲ－１８３－５ｐ
５）肝細胞癌を抑制する効果を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－２３ａ； ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３１－５ｐ； ｍｉＲ－１８２－５ｐ； ｍｉＲ－１８３－５ｐ
１）線維症の抑制のために作用するマイクロＲＮＡ
・ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ： ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ／ＨＭＧＢ１／ＴＬＲ４／ＮＦ－κＢシグナル伝達、ａＳＭＡ↓
・ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７ｂ： ＴＧＦｂｅｔａシグナル伝達↓
・ｍｉＲ－１９２－５ｐ： ＴＧＦｂｅｔａシグナル伝達に関連するＺｅｂ１およびＺｅｂ２；
ＥＭＴの阻害
２）肝再生のために作用するマイクロＲＮＡ：
・ｍｉＲ－２４： 細胞成長＆移動阻害、および分化を促進する；
ＴＧＦβシグナル伝達の阻害；
３）抗炎症作用を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－１６： ＴＮＦ↑； 抗アポトーシス
４）ＮＡＳＨに対して治療効果を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－１８２－５ｐ； ｍｉＲ－１８３－５ｐ
５）肝細胞癌を抑制する効果を有するマイクロＲＮＡｓ：
・ｍｉＲ－２３ａ； ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３１－５ｐ； ｍｉＲ－１８２－５ｐ； ｍｉＲ－１８３－５ｐ
【0195】
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示の発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で引用される刊行物およびそれらが引用する資料は、参照により具体的に援用される。
【0196】
当業者は、慣用的な実験法のみを使用して、本明細書に記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】