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2024-538181絹によって刺激されたコラーゲン及びクローディン－１発現、並びに絹によって刺激された抗炎症効果
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-18
(54)【発明の名称】絹によって刺激されたコラーゲン及びクローディン－１発現、並びに絹によって刺激された抗炎症効果
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20241010BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20241010BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20241010BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20241010BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20241010BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20241010BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17
A61K8/64
A61Q19/00
A61P17/02
A61P17/16
A61Q19/08 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024523188
(86)(22)【出願日】2022-10-18
(85)【翻訳文提出日】2024-06-17
(86)【国際出願番号】 US2022078314
(87)【国際公開番号】W WO2023069956
(87)【国際公開日】2023-04-27
(31)【優先権主張番号】63/256,942
(32)【優先日】2021-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/256,896
(32)【優先日】2021-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516092706
【氏名又は名称】エボルブド バイ ネイチャー， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】アルトマン，グレゴリー，エイチ．
(72)【発明者】
【氏名】コスタッシュ，マリウス
(72)【発明者】
【氏名】ジェネル，エヴァ
(72)【発明者】
【氏名】ボスケス，カルロス，ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】スワンプラディド，ジュタマス
(72)【発明者】
【氏名】ジャイガネーシュ，アヴィナッシュ
(72)【発明者】
【氏名】ミュオーロ，ローラ，アール．
【テーマコード（参考）】
4C083
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C083AB311
4C083AB331
4C083AD451
4C083BB51
4C083CC02
4C083DD32
4C083DD33
4C083EE12
4C083EE13
4C084AA02
4C084BA01
4C084CA49
4C084MA22
4C084MA58
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA33
4C084ZA89
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）コラーゲン発現の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、及び／又はｉｉ）クローディン－１発現の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、及び／又は
ｉｉｉ）もう１つの抗炎症遺伝子の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、
によって軽減される障害、疾患、又は状態の治療又は予防の方法であって、前記方法が、約１ｋＤａ～約５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａ、約１４ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約２５ｋＤａ、約２５ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約３５ｋＤａ、約３５ｋＤａ～約４０ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約５４ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａ、約４０ｋＤａ～約４５ｋＤａ、約４５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ～約１００ｋＤａ、及び約８０ｋＤａ～約１４４ｋＤａから選択される平均重量平均分子量と、１～約５の多分散性とを有する絹フィブロイン断片を含む組成物を、前記対象に投与することを含み、
前記組成物中の絹フィブロイン断片の濃度が、約０．００１％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖである、方法。
【請求項2】
前記組成物が、０～５００ｐｐｍの臭化リチウムを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記組成物が、０～５００ｐｐｍの炭酸ナトリウムを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記絹フィブロイン断片が、１～約１．５の多分散性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記絹フィブロイン断片が、約１．５～約２．０の多分散性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記絹フィブロイン断片が、約１．５～約３．０の多分散性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記絹フィブロイン断片が、約２．０～約２．５の多分散性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記絹フィブロイン断片が、約２．５～約３．０の多分散性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記絹フィブロイン断片が、前記組成物に製剤化する前の少なくとも１０日間、水溶液中にある場合、自然発生的に又は徐々にゲル化せず、色又は濁度が視覚的に変化しない、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで、前記組成物中に存在する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記絹フィブロイン断片が、約０．０１％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで、前記組成物中に存在する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記絹フィブロイン断片が、約０．０２５％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで、前記組成物中に存在する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記絹フィブロイン断片が、約０．０５％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで、前記組成物中に存在する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記組成物が、注射可能な組成物又は外用組成物として製剤化される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記組成物が、薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記薬学的に許容可能な担体が、水相を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記薬学的に許容可能な担体が、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項18】
前記組成物が、上皮表面への投与のために製剤化される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記上皮表面が、表層表皮領域、角質層、眼表面、又は腸表面である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記組成物が、経表皮水分蒸散量を低減するために製剤化される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記組成物が、バリア製剤として製剤化される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記組成物が、創傷閉鎖製剤として製剤化される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記組成物が、前記対象における皺を予防若しくは改善する、前記対象における加齢性色素斑を予防若しくは改善する、前記対象における乾燥肌を予防若しくは改善する、又は前記対象における不均一な皮膚の色調を予防若しくは改善するために製剤化される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記組成物が、前記対象における皮膚のたるみを予防若しくは改善する、前記対象における皮膚の老化を予防若しくは改善する、前記対象における低減した皮膚の引張強度を予防若しくは改善する、前記対象における光損傷した皮膚を予防若しくは改善する、又は前記対象における皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を予防若しくは改善するために製剤化される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記疾患又は状態が、皺、加齢性色素斑、乾燥肌、不均一な皮膚の色調、皮膚のたるみ、皮膚の老化、低減した皮膚の引張強度、光損傷した皮膚、又は皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
約１ｋＤａ～約５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａ、約１４ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約２５ｋＤａ、約２５ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約３５ｋＤａ、約３５ｋＤａ～約４０ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約５４ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａ、約４０ｋＤａ～約４５ｋＤａ、約４５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ～約１００ｋＤａ、及び約８０ｋＤａ～約１４４ｋＤａから選択される平均重量平均分子量と、１～約５の多分散性とを有する絹フィブロイン断片を含む組成物の使用であって、前記組成物中の絹フィブロイン断片の濃度が、約０．００１％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖであり、ｉ）コラーゲン発現の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、及び／又は
ｉｉ）クローディン－１発現の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、及び／又は
ｉｉｉ）もう１つの抗炎症遺伝子の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、によって軽減される障害、疾患、又は状態の治療又は予防のための薬剤の製造における、使用。
【請求項27】
前記組成物が、０～５００ｐｐｍの臭化リチウムを更に含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項28】
前記組成物が、０～５００ｐｐｍの炭酸ナトリウムを更に含む、請求項２６又は２７に記載の使用。
【請求項29】
前記絹フィブロイン断片が、１～約１．５の多分散性を有する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項30】
前記絹フィブロイン断片が、約１．５～約２．０の多分散性を有する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項31】
前記絹フィブロイン断片が、約１．５～約３．０の多分散性を有する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項32】
前記絹フィブロイン断片が、約２．０～約２．５の多分散性を有する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項33】
前記絹フィブロイン断片が、約２．５～約３．０の多分散性を有する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項34】
前記絹フィブロイン断片が、前記組成物に製剤化する前の少なくとも１０日間、水溶液中にある場合、自然発生的に又は徐々にゲル化せず、色又は濁度が視覚的に変化しない、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項35】
前記絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで、前記組成物中に存在する、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項36】
前記絹フィブロイン断片が、約０．０１％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで、前記組成物中に存在する、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記絹フィブロイン断片が、約０．０２５％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで、前記組成物中に存在する、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項38】
前記絹フィブロイン断片が、約０．０５％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで、前記組成物中に存在する、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項39】
前記組成物が、注射可能な組成物又は外用組成物として製剤化される、請求項２６～３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項40】
前記組成物が、薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項２６～３９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項41】
前記薬学的に許容可能な担体が、水相を含む、請求項４０に記載の使用。
【請求項42】
前記薬学的に許容可能な担体が、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンを含む、請求項４０又は４１に記載の使用。
【請求項43】
前記組成物が、上皮表面への投与のために製剤化される、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項44】
前記上皮表面が、表層表皮領域、角質層、眼表面、又は腸表面である、請求項４３に記載の使用。
【請求項45】
前記組成物が、経表皮水分蒸散量を低減するために製剤化される、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項46】
前記組成物が、バリア製剤として製剤化される、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項47】
前記組成物が、創傷閉鎖製剤として製剤化される、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項48】
前記組成物が、前記対象における皺を予防若しくは改善する、前記対象における加齢性色素斑を予防若しくは改善する、前記対象における乾燥肌を予防若しくは改善する、又は前記対象における不均一な皮膚の色調を予防若しくは改善するために製剤化される、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項49】
前記組成物が、前記対象における皮膚のたるみを予防若しくは改善する、前記対象における皮膚の老化を予防若しくは改善する、前記対象における低減した皮膚の引張強度を予防若しくは改善する、前記対象における光損傷した皮膚を予防若しくは改善する、又は前記対象における皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を予防若しくは改善するために製剤化される、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項50】
前記疾患又は状態が、皺、加齢性色素斑、乾燥肌、不均一な皮膚の色調、皮膚のたるみ、皮膚の老化、低減した皮膚の引張強度、光損傷した皮膚、又は皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を含む、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連技術の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／２５６，９４２号、及び２０２１年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／２５６，８９６号の利益を主張するものであり、それら両方は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／２５６，９４２号、及び２０２１年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／２５６，８９６号の利益を主張するものであり、それら両方は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、絹フィブロイン組成物、及びコラーゲン発現を刺激するための方法の分野にある。
【背景技術】
【0003】
絹は、様々な昆虫及びクモによって産生される天然高分子である。絹は、フィラメントコアタンパク質、絹フィブロイン、及び非フィラメント状タンパク質、セリシンからなる膠状コーティングを含む。
【0004】
外用又は非経口投与によるコラーゲン刺激に好適な安定した絹フィブロインペプチド溶液の必要性が存在する。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、コラーゲン発現を刺激又は調節することによって軽減される障害、疾患、又は状態の治療又は予防を必要とする対象において、それを行う方法であって、約１ｋＤａ～約５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約１４ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約２５ｋＤａ、約２５ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約３５ｋＤａ、約３５ｋＤａ～約４０ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約５４ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａ、約４０ｋＤａ～約４５ｋＤａ、約４５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ～約１００ｋＤａ、及び約８０ｋＤａ～約１４４ｋＤａから選択される平均重量平均分子量と、１～約５の多分散性とを有する絹フィブロイン断片を含む組成物を、対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、０～５００ｐｐｍの臭化リチウムを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、０～５００ｐｐｍの炭酸ナトリウムを更に含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、１～約１．５の多分散性を有する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、約１．５～約２．０の多分散性を有する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、約１．５～約３．０の多分散性を有する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、約２．０～約２．５の多分散性を有する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、約２．５～約３．０の多分散性を有する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、組成物の総重量に対して約０．００１重量％～約１０．０重量％で、組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量に対して約０．００１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）のセリシンを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、絹フィブロイン断片に対して約０．００１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）のセリシンを更に含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、組成物に製剤化する前の少なくとも１０日間、水溶液中にある場合、自然発生的に又は徐々にゲル化せず、色又は濁度が視覚的に変化しない。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、組成物の総重量に対して約０．０１重量％～約１０．０重量％で、組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、組成物の総重量に対して約０．０１重量％～約１．０重量％で、組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、組成物の総重量に対して約１．０重量％～約２．０重量％で、組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、組成物の総重量に対して約２．０重量％～約３．０重量％で、組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、組成物の総重量に対して約３．０重量％～約４．０重量％で、組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、組成物の総重量に対して約４．０重量％～約５．０重量％で、組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片は、組成物の総重量に対して約５．０重量％～約６．０重量％で、組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、組成物は、注射可能な組成物として、又は外用組成物として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、皮膚科学的に許容可能な担体を更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、注射可能な許容可能な担体を更に含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、懸濁液、エマルジョン、粉末、溶液、分散液、又はエリキシルのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、ゲル、ゼリー、クリーム、ローション、フォーム、スラリー、軟膏、油、ペースト、坐剤、スプレー、半固体組成物、固体組成物、スティック、若しくはムースのうちの１つ以上を含むか、又はそれらとして製剤化される。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、ゴマ油、コーン油、綿実油、又は落花生油のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、マンニトール又はデキストロースのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、約０．００１％～約１０％（ｗ／ｖ）のヒアルロン酸を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、約１％～約１０％（ｗ／ｖ）、約１０％～約２５％（ｗ／ｖ）、約２５％～約５０％（ｗ／ｖ）、又は約５０％～約９９．９９％（ｗ／ｖ）のヒアルロン酸を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、脂肪族油、脂肪アルコール、脂肪酸、グリセリド、アシルグリセロール、及びリン脂質のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、水相を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンを含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、炭化水素油、脂肪酸、脂肪酸油、脂肪酸エステル、又はカチオン性四級アンモニウム塩のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体の一部は、ポリエポキシリンカー、ジエポキシリンカー、ポリエポキシ－ＰＥＧ、ジエポキシ－ＰＥＧ、ポリグリシジル－ＰＥＧ、ジグリシジル－ＰＥＧ、ポリアクリレートＰＥＧ、ジアクリレートＰＥＧ、１，４－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）ブタン、１，４－ビスグリシジルオキシブタン、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、ＵＶ光、グルタルアルデヒド、１，２－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）エチレン（ＥＧＤＧＥ）、１，２，７，８－ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、ビスカルボジイミド（ＢＣＤＩ）、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル（ＰＥＴＧＥ）、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）、１－（２，３－エポキシプロピル）－２，３－エポキシシクロヘキサン、カルボジイミド、及びそれらの任意の組み合わせから選択される架橋剤、架橋前駆体、又は活性化剤で改変される。いくつかの実施形態では、ポリエポキシリンカーは、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）、１，６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリ－メチロールプロパンポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、及びソルビトールポリグリシジルエーテルから選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、注射可能な組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は注入によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下注射、皮内注射、経皮注射、又は真皮下注射によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、骨内注射、心臓内注射、関節内注射、又は海綿体内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、デポー注射によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、浸潤注射によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、留置カテーテルによって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、マイクロニードルによって投与される。いくつかの実施形態では、組成物を投与することは、対象における１つ以上のメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を減少させる。いくつかの実施形態では、コラーゲン発現を刺激又は調節することは、コラーゲン発現を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲン発現は、ベースレベルに対して、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％増加する。いくつかの実施形態では、コラーゲン発現は、ベースレベルに対して、約１０１％、約１０２％、約１０３％、約１０４％、約１０５％、約１０６％、約１０７％、約１０８％、約１０９％、約１１０％、約１１１％、約１１２％、約１１３％、約１１４％、約１１５％、約１１６％、約１１７％、約１１８％、約１１９％、約１２０％、約１２１％、約１２２％、約１２３％、約１２４％、約１２５％、約１２６％、約１２７％、約１２８％、約１２９％、約１３０％、約１３１％、約１３２％、約１３３％、約１３４％、約１３５％、約１３６％、約１３７％、約１３８％、約１３９％、約１４０％、約１４１％、約１４２％、約１４３％、約１４４％、約１４５％、約１４６％、約１４７％、約１４８％、約１４９％、約１５０％、約１５１％、約１５２％、約１５３％、約１５４％、約１５５％、約１５６％、約１５７％、約１５８％、約１５９％、約１６０％、約１６１％、約１６２％、約１６３％、約１６４％、約１６５％、約１６６％、約１６７％、約１６８％、約１６９％、約１７０％、約１７１％、約１７２％、約１７３％、約１７４％、約１７５％、約１７６％、約１７７％、約１７８％、約１７９％、約１８０％、約１８１％、約１８２％、約１８３％、約１８４％、約１８５％、約１８６％、約１８７％、約１８８％、約１８９％、約１９０％、約１９１％、約１９２％、約１９３％、約１９４％、約１９５％、約１９６％、約１９７％、約１９８％、約１９９％、又は約２００％増加する。いくつかの実施形態では、組成物を投与することは、対象における皺を予防若しくは改善すること、対象における加齢性色素斑を予防若しくは改善すること、対象における乾燥肌を予防若しくは改善すること、又は対象における不均一な皮膚の色調を高めることのうちの１つ以上をもたらす。いくつかの実施形態では、組成物を投与することは、対象における皮膚のたるみを予防若しくは改善すること、対象における皮膚の老化を予防若しくは改善すること、対象における低減した皮膚の引張強度を予防若しくは改善すること、対象における光損傷した皮膚を予防若しくは改善すること、又は対象における皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を予防若しくは改善することのうちの１つ以上をもたらす。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、皺、加齢性色素斑、乾燥肌、不均一な皮膚の色調、皮膚のたるみ、皮膚の老化、低減した皮膚の引張強度、光損傷した皮膚、又は皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、甲状腺ホルモン誘発性心筋
肥大を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、腱の断裂、損傷、又は裂傷を含む。いくつかの実施形態では、腱は、小円筋腱、棘下筋腱、棘上筋腱、肩甲下筋腱、三角筋腱、二頭筋腱、三頭筋腱、腕橈骨筋腱、回外筋腱、橈側手根屈筋腱、尺側手根屈筋腱、長橈側手根伸筋腱、短橈側手根伸筋腱、腸腰筋腱、内閉鎖筋腱、長内転筋腱、腓骨又はマグナス筋腱、大殿筋又は中殿筋腱、四頭筋腱、膝蓋腱、膝窩腱、縫工筋腱、腓腹筋腱、アキレス腱、ヒラメ筋腱、前脛骨筋腱、長腓骨筋腱、長指屈筋腱、骨間筋腱、深指屈筋腱、小趾外転筋腱、母指対立筋腱、長母指屈筋腱、母指伸筋又は外転筋腱（Ｅｘｔｅｎｓｏｒ ｏｒ ａｂｄｕｃｔｏｒ ｐｏｌｌｉｃｉｓ ｔｅｎｄｏｎｓ）、長母趾屈筋腱、短趾屈筋腱、中様筋腱、母趾外転筋腱、長趾屈筋腱、小趾外転筋腱、眼筋腱、眼瞼挙筋腱、咬筋腱、側頭筋腱、僧帽筋腱、胸鎖乳突筋腱、頭半棘筋又は頭板状筋腱、顎舌骨筋又は甲状舌骨筋腱、胸骨舌骨筋腱、腹直筋腱、外腹斜筋腱、腹横筋腱、広背筋腱、及び脊柱起立筋腱から選択される。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、ウェルナー症候群を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、低下した糖尿病性皮膚の完全性を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、関節炎を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、関節リウマチを含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、腫瘍の進行又は腫瘍の成長を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、低下した心機能を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、エーラス・ダンロス症候群を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、腹部大動脈瘤を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、創傷を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、皮膚又は結合組織の疾患を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、軟骨の疾患を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、再発性多発軟骨炎、ティーツェ症候群、蜂巣炎、エーラス・ダンロス症候群、ケロイド（にきびケロイドを含む）、ムコポリサダリドーシスＩ（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｄｄａｒｉｄｏｓｉｓ Ｉ）、壊死性障害（環状肉芽腫、リポイド類壊死症を含む）、骨形成不全症、皮膚弛緩症、皮膚筋炎、デュピュイトラン拘縮、ホモシスチン尿症、エリテマトーデス（皮膚、円板状、深在性、全身性、及び腎炎を含む）、マルファン症候群、混合性結合組織疾患、ムチン沈着症（濾胞性を含む）、ムコ多糖症（Ｉ、ＩＩ、ＵＵ、ＩＶ、ＩＶ、及びＶＩＩ）、粘液水腫、成年性浮腫性硬化症及び滑液嚢腫、結合組織新生物、ヌーナン症候群、骨斑紋症、硬結性紅斑を含む脂肪織炎、結節性非化膿性及び腹膜、陰茎硬化症、弾性線維性仮性黄色腫、関節炎を含むリウマチ性疾患（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、カプラン症候群、フェルティ症候群、リウマトイド結節、強直性脊椎炎、及びスチル病）、骨増殖症、リウマチ性多発筋痛症、限局性強皮症、並びに全身性強皮症（ＣＲＥＳＴ症候群）から選択される。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症；瘢痕（ｃｉｃａｔｉｘ）（肥厚性（ｈｙｐｅｒｔｏｐｈｉｃ）を含む）；皮膚瘻、皮膚弛緩症（ｃｕｉｓ ｌａｘａ）；肢端皮膚炎、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎（アレルギー性接触、光アレルギー性、ウルシ）、刺激性皮膚炎（光毒性、おむつかぶれ）、職業性皮膚炎を含む皮膚炎；剥脱性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、薬疹（中毒性表皮壊死症、結節性紅斑、血清病など）、発汗異常性、間擦疹、神経皮膚炎、及び放射線皮膚炎を含む湿疹；皮膚筋炎；慢性遊走性、硬結性、伝染性、多形性（スティーヴンス・ジョンソン症候群）、及び結節性（スイート症候群）を含む紅斑；突発性を含む発疹；ざ瘡様発疹を含む顔面皮膚疾患（ケロイド、酒さ、尋常性、及びファーブル・ラクーショー症候群）；水虫を含む足の皮膚疾患；手の皮膚疾患；ケラトアカントーマ；皮膚硬結、真珠腫性中耳炎（中耳を含む）、魚鱗癬（先天性魚鱗癬様紅皮症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｉｃｈｔｙｏｓｉｆｏｒｍ ｅｒｙｔｈｒｏｄｅｒｍｓ）、表皮剥離性角質増殖症、葉状魚鱗癬、尋常性魚鱗癬、Ｘ連鎖性魚鱗癬、及びシェーグレン・ラルソン症候群を含む）、膿漏性角皮症、掌蹠角皮症（ｐａｌｍｏｐｌａｎｔａｒ ｋｅｒａｔｏｄｅｒｍｓ）、毛包性角化症、脂漏性角化症、不全角化症、及び汗孔角化症を含む角化症；脚部皮膚疾患、マスト細胞症（色素性蕁麻疹）、類壊死症（環状肉芽腫及びリポイド類壊死症）、光過敏症（光アレルギー性又は光毒性皮膚炎（ｐｈｏｔｏｘｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、種痘様水疱症、日光皮膚炎（ｓｕｎｄｕｒｎ）、及び色素性乾皮症）；銀皮症、色素沈着、メラノーシス、黒色表皮腫（ａｃｏｎｔｈｏｓｉｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、黒子、ポイツ・ジェガース症候群、低色素沈着、先天性白皮症、まだら症（ｐｉｂａｌｄｉｓｍ）、白斑、色素失調症、色素性蕁麻疹、色素性乾皮症、痒疹を含む色素異常症；掻痒症（肛門及び外陰部を含む）；膿瘡及び壊疽性膿皮症を含む膿皮症；頭皮疾患（ｓｃｌａｐ ｄｅｒｍａｔｏｓｅｓ）；成人性浮腫性強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｍａ ａｄｕｌｔｏｒｕｍ）；新生児皮膚硬化症（ｓｃｌｅｒｍａ ｎｅｏｎａｔｏｒｕｍ）；毛髪疾患（脱毛症、毛包炎、男性型多毛症、多毛症（ｈｙｐｅｒｔｉｃｈｏｓｉｓ）、縮れ毛症候群）、爪疾患（ネイル・パテラ症候群、嵌入爪又は爪形成異常、爪真菌症、爪周囲炎）、皮脂腺疾患（鼻瘤、新生物）、汗腺疾患（化膿性汗腺炎、多汗症、乏汗症、稗粒腫（ｍｉｌｉａｒａ）、フォックス・フォアダイス病、新生物）を含む皮膚付属器（ｓｋｉｎ ａｐｐｅｎａｇｅ）疾患；先天性白皮症（ａｌｆｉｎｉｓｍ）、皮膚弛緩症、家族性良性慢性天疱瘡、ポルフィリン症、肢端皮膚炎、外胚葉形成不全症、エリス・ファンクレフェルト症候群、巣状皮膚低形成、エーラス・ダンロス症候群、表皮水疱症、魚鱗癬（ｉｃｈｔｙｓｏｓｉｓ）を含む遺伝性皮膚疾患；皮膚真菌症、ブラストミセス症、カンジタ症、黒色分芽菌症、マズラ菌症、パラコクシジオイデス症、スポロトリクム症、白癬を含む感染性皮膚疾患；頸部顔面放線菌症、細菌性血管腫症（ｂａｃｉｌｌｉａｒｙ ａｎｇｉｏｍａｔｏｓｉｓ）、膿瘡、丹毒、慢性遊走性紅斑、紅色陰癬、鼠径部肉芽腫、化膿性汗腺炎、マズラ菌症、爪周囲炎、ピンタ、鼻硬化症、ブドウ球菌皮膚感染症（せつ腫症（ｆｕｒｕｎｃｏｌｏｓｉｓ）、癰、膿痂疹、熱傷様皮膚症候群）、皮膚梅毒、皮膚結核、フランベジアを含む細菌性皮膚疾患；幼虫移行症、リーシュマニア症、シラミ寄生症、及び疥癬を含む寄生性皮膚疾患；伝染性紅斑、突発性発疹、単純ヘルペス、伝染性軟属腫（ｍｏｏｌｕｓｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ）、及び疣贅を含むウイルス性皮膚疾患から選択される。
肥大を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、腱の断裂、損傷、又は裂傷を含む。いくつかの実施形態では、腱は、小円筋腱、棘下筋腱、棘上筋腱、肩甲下筋腱、三角筋腱、二頭筋腱、三頭筋腱、腕橈骨筋腱、回外筋腱、橈側手根屈筋腱、尺側手根屈筋腱、長橈側手根伸筋腱、短橈側手根伸筋腱、腸腰筋腱、内閉鎖筋腱、長内転筋腱、腓骨又はマグナス筋腱、大殿筋又は中殿筋腱、四頭筋腱、膝蓋腱、膝窩腱、縫工筋腱、腓腹筋腱、アキレス腱、ヒラメ筋腱、前脛骨筋腱、長腓骨筋腱、長指屈筋腱、骨間筋腱、深指屈筋腱、小趾外転筋腱、母指対立筋腱、長母指屈筋腱、母指伸筋又は外転筋腱（Ｅｘｔｅｎｓｏｒ ｏｒ ａｂｄｕｃｔｏｒ ｐｏｌｌｉｃｉｓ ｔｅｎｄｏｎｓ）、長母趾屈筋腱、短趾屈筋腱、中様筋腱、母趾外転筋腱、長趾屈筋腱、小趾外転筋腱、眼筋腱、眼瞼挙筋腱、咬筋腱、側頭筋腱、僧帽筋腱、胸鎖乳突筋腱、頭半棘筋又は頭板状筋腱、顎舌骨筋又は甲状舌骨筋腱、胸骨舌骨筋腱、腹直筋腱、外腹斜筋腱、腹横筋腱、広背筋腱、及び脊柱起立筋腱から選択される。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、ウェルナー症候群を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、低下した糖尿病性皮膚の完全性を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、関節炎を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、関節リウマチを含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、腫瘍の進行又は腫瘍の成長を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、低下した心機能を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、エーラス・ダンロス症候群を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、腹部大動脈瘤を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、創傷を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、皮膚又は結合組織の疾患を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、軟骨の疾患を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、再発性多発軟骨炎、ティーツェ症候群、蜂巣炎、エーラス・ダンロス症候群、ケロイド（にきびケロイドを含む）、ムコポリサダリドーシスＩ（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｄｄａｒｉｄｏｓｉｓ Ｉ）、壊死性障害（環状肉芽腫、リポイド類壊死症を含む）、骨形成不全症、皮膚弛緩症、皮膚筋炎、デュピュイトラン拘縮、ホモシスチン尿症、エリテマトーデス（皮膚、円板状、深在性、全身性、及び腎炎を含む）、マルファン症候群、混合性結合組織疾患、ムチン沈着症（濾胞性を含む）、ムコ多糖症（Ｉ、ＩＩ、ＵＵ、ＩＶ、ＩＶ、及びＶＩＩ）、粘液水腫、成年性浮腫性硬化症及び滑液嚢腫、結合組織新生物、ヌーナン症候群、骨斑紋症、硬結性紅斑を含む脂肪織炎、結節性非化膿性及び腹膜、陰茎硬化症、弾性線維性仮性黄色腫、関節炎を含むリウマチ性疾患（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、カプラン症候群、フェルティ症候群、リウマトイド結節、強直性脊椎炎、及びスチル病）、骨増殖症、リウマチ性多発筋痛症、限局性強皮症、並びに全身性強皮症（ＣＲＥＳＴ症候群）から選択される。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症；瘢痕（ｃｉｃａｔｉｘ）（肥厚性（ｈｙｐｅｒｔｏｐｈｉｃ）を含む）；皮膚瘻、皮膚弛緩症（ｃｕｉｓ ｌａｘａ）；肢端皮膚炎、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎（アレルギー性接触、光アレルギー性、ウルシ）、刺激性皮膚炎（光毒性、おむつかぶれ）、職業性皮膚炎を含む皮膚炎；剥脱性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、薬疹（中毒性表皮壊死症、結節性紅斑、血清病など）、発汗異常性、間擦疹、神経皮膚炎、及び放射線皮膚炎を含む湿疹；皮膚筋炎；慢性遊走性、硬結性、伝染性、多形性（スティーヴンス・ジョンソン症候群）、及び結節性（スイート症候群）を含む紅斑；突発性を含む発疹；ざ瘡様発疹を含む顔面皮膚疾患（ケロイド、酒さ、尋常性、及びファーブル・ラクーショー症候群）；水虫を含む足の皮膚疾患；手の皮膚疾患；ケラトアカントーマ；皮膚硬結、真珠腫性中耳炎（中耳を含む）、魚鱗癬（先天性魚鱗癬様紅皮症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｉｃｈｔｙｏｓｉｆｏｒｍ ｅｒｙｔｈｒｏｄｅｒｍｓ）、表皮剥離性角質増殖症、葉状魚鱗癬、尋常性魚鱗癬、Ｘ連鎖性魚鱗癬、及びシェーグレン・ラルソン症候群を含む）、膿漏性角皮症、掌蹠角皮症（ｐａｌｍｏｐｌａｎｔａｒ ｋｅｒａｔｏｄｅｒｍｓ）、毛包性角化症、脂漏性角化症、不全角化症、及び汗孔角化症を含む角化症；脚部皮膚疾患、マスト細胞症（色素性蕁麻疹）、類壊死症（環状肉芽腫及びリポイド類壊死症）、光過敏症（光アレルギー性又は光毒性皮膚炎（ｐｈｏｔｏｘｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、種痘様水疱症、日光皮膚炎（ｓｕｎｄｕｒｎ）、及び色素性乾皮症）；銀皮症、色素沈着、メラノーシス、黒色表皮腫（ａｃｏｎｔｈｏｓｉｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、黒子、ポイツ・ジェガース症候群、低色素沈着、先天性白皮症、まだら症（ｐｉｂａｌｄｉｓｍ）、白斑、色素失調症、色素性蕁麻疹、色素性乾皮症、痒疹を含む色素異常症；掻痒症（肛門及び外陰部を含む）；膿瘡及び壊疽性膿皮症を含む膿皮症；頭皮疾患（ｓｃｌａｐ ｄｅｒｍａｔｏｓｅｓ）；成人性浮腫性強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｍａ ａｄｕｌｔｏｒｕｍ）；新生児皮膚硬化症（ｓｃｌｅｒｍａ ｎｅｏｎａｔｏｒｕｍ）；毛髪疾患（脱毛症、毛包炎、男性型多毛症、多毛症（ｈｙｐｅｒｔｉｃｈｏｓｉｓ）、縮れ毛症候群）、爪疾患（ネイル・パテラ症候群、嵌入爪又は爪形成異常、爪真菌症、爪周囲炎）、皮脂腺疾患（鼻瘤、新生物）、汗腺疾患（化膿性汗腺炎、多汗症、乏汗症、稗粒腫（ｍｉｌｉａｒａ）、フォックス・フォアダイス病、新生物）を含む皮膚付属器（ｓｋｉｎ ａｐｐｅｎａｇｅ）疾患；先天性白皮症（ａｌｆｉｎｉｓｍ）、皮膚弛緩症、家族性良性慢性天疱瘡、ポルフィリン症、肢端皮膚炎、外胚葉形成不全症、エリス・ファンクレフェルト症候群、巣状皮膚低形成、エーラス・ダンロス症候群、表皮水疱症、魚鱗癬（ｉｃｈｔｙｓｏｓｉｓ）を含む遺伝性皮膚疾患；皮膚真菌症、ブラストミセス症、カンジタ症、黒色分芽菌症、マズラ菌症、パラコクシジオイデス症、スポロトリクム症、白癬を含む感染性皮膚疾患；頸部顔面放線菌症、細菌性血管腫症（ｂａｃｉｌｌｉａｒｙ ａｎｇｉｏｍａｔｏｓｉｓ）、膿瘡、丹毒、慢性遊走性紅斑、紅色陰癬、鼠径部肉芽腫、化膿性汗腺炎、マズラ菌症、爪周囲炎、ピンタ、鼻硬化症、ブドウ球菌皮膚感染症（せつ腫症（ｆｕｒｕｎｃｏｌｏｓｉｓ）、癰、膿痂疹、熱傷様皮膚症候群）、皮膚梅毒、皮膚結核、フランベジアを含む細菌性皮膚疾患；幼虫移行症、リーシュマニア症、シラミ寄生症、及び疥癬を含む寄生性皮膚疾患；伝染性紅斑、突発性発疹、単純ヘルペス、伝染性軟属腫（ｍｏｏｌｕｓｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ）、及び疣贅を含むウイルス性皮膚疾患から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0006】
本明細書で開示される実施形態を、添付の図面を参照して更に説明する。示した図面は必ずしもスケール通りではなく、代わり、一般的に、本明細書で開示される実施形態の原理を例証する際に強調がなされている。
【0007】
【図1A】図１Ａ～１Ｃは、若い皮膚及び老化した皮膚におけるコラーゲン合成の概略図、並びにコラーゲン合成の刺激における絹フィブロインの提案される役割を示す。図１Ａ：健康な若い皮膚では、高密度コラーゲンマトリックス中の真皮線維芽細胞が、新たなコラーゲンを産生することによってマトリックスを継続的に強化する。若い皮膚では、真皮細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内の無傷のコラーゲンが、線維芽細胞の付着部位及び機械的抵抗を提供する。線維芽細胞は、伸びて新たなコラーゲン（緑色）を産生し、ＥＣＭの完全性及び安定性を促進する。
【図1B】図１Ｂ：加齢に伴い、線維芽細胞による新たなコラーゲンの産生が減少し、コラーゲンマトリックスが分解する。加齢に伴い、コラーゲン合成の低減及びＭＭＰ活性の上昇により、コラーゲン原線維が断片化される。これにより、線維芽細胞の機械的張力が失われ、ＥＣＭの完全性及び安定性が失われる。
【図1C】図１Ｃ：マトリックスへの絹フィブロインの添加は、線維芽細胞によるコラーゲン産生を刺激し、マトリックスの構造完全性を回復させる。添加された絹フィブロインは、恐らく線維芽細胞との直接的相互作用並びにコラーゲン断片の架橋によって、線維芽細胞を刺激してコラーゲンを産生する。これは、ＥＣＭの完全性の回復、及びより若い皮膚の外観を促進すると予測される。（出典Ｖａｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＡｍＪ Ｐａｔｈｏｌ．２００６，１６８：１８６１）。
【図2】コラーゲン産生が、絹組成に依存することを示す。様々な絹濃度での細胞内コラーゲン産生は、絹の種類の関数として示される。刺激率は、陰性対照と比較したコラーゲン形成の増加である。絹平均ＭＷ組成：絹Ａ＝低ＭＷ（約１４ｋＤａ～約３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量）、絹Ｂ＝中ＭＷ（約３９ｋＤａ～約５４ｋＤａから選択される平均重量平均分子量）。
【図3】インビトロモデル：細胞外マトリックス生成。タイムラインは、実験の時間順序及び処置条件を示す。
【図4】インビトロモデル：コラーゲン産生。陽性対照処置は、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍＬ＋Ｖｉｔ Ｃ（２０μｇ／ｍＬ）であった。
【図5A】図５Ａ及び５Ｂは、ヒト真皮線維芽細胞をＶｉｔ Ｃの存在下で絹を用いて処置すると、総コラーゲン産生が増加する。図５Ａは、５日間のＶｉｔ Ｃ、並びにＴＧＦ－ｂ（陽性対照としての役割を果たす）、媒体対照、レチノイン酸、中ＭＷ絹、又は低ＭＷ絹との共処置を用いたヒト真皮線維芽細胞のシリウスレッド染色である。スケールバーは、６５０μｍを表す。
【図6】中ＭＷ絹及び低ＭＷ絹は、総コラーゲン産生を高める。刺激の２４時間後のヒト真皮線維芽細胞に対するシリウスレッドの分光光度分析（ｎ＝２）。
【図7】中ＭＷ絹及び低ＭＷ絹は、ヒト真皮線維芽細胞においてＣＯＬ１Ａ１遺伝子発現を上方制御した。処置後８時間の絹及びレチノイン酸処置されたヒト真皮線維芽細胞におけるＣＯＬ１Ａ１に対する定量的ＰＣＲ。ｎ＝１群当たり２。ＴＧＦ－ｂ＋Ｖｉｔ．Ｃ処置されたヒト真皮線維芽細胞において８倍超の増加（陽性対照としての役割を果たす）。
【図8A】図８Ａ及び８Ｂは、低ＭＷ絹は、コラーゲン１タンパク質発現を上方制御する。図８Ａは、生細胞上でゲーティングされたレチノイン酸処置、ビヒクル処置、及び低ＭＷ絹処置されたヒト真皮線維芽細胞のコラーゲン１の代表的なフローサイトメトリー分析のヒストグラムである。示されるデータは、ｎ＝１群当たり３を表す。
【図8B】図８Ｂは、ビヒクル対照と比較した、レチノイン酸処置及び低ＭＷ絹処置された細胞におけるコラーゲン１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加率を示す。データは、一元配置ＡＮＯＶＡ、続くボンフェローニ補正を用いた事後ｔ検定で、平均＋ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５として要約される。ｎ＝１群当たり３：ＴＧＦ－β＋Ｖｉｔ Ｃ処置されたヒト真皮線維芽細胞（陽性対照としての役割を果たす）におけるコラーゲン１ ＭＦＩの３４．５％の増加。レチノイン酸処置及び低ＭＷ絹処置されたヒト真皮線維芽細胞（ｎ＝１）におけるコラーゲン１（緑色染色）及びヘキスト（青色）共局在化を示す代表的な免疫組織化学染色。
【図9】低ＭＷ絹は、ＣＯＬ４Ａ１タンパク質発現を変化させない。レチノイン酸処置、ビヒクル処置、及び低ＭＷ絹処置されたヒト真皮線維芽細胞におけるＣＯＬ４Ａ１＋細胞頻度（生細胞における）の定量分析。ｎ＝１群当たり２。
【図10】Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ（商標）分子は、ヒト真皮線維芽細胞において、レチノイン酸と同様のコラーゲン１の刺激を示す。
【図11】Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ（商標）の３３Ｂは、ヒト真皮線維芽細胞においてＣＯＬ１Ａ１遺伝子発現を上方制御する。処置後８時間の絹及びレチノイン酸処置されたヒト真皮線維芽細胞におけるＣＯＬ１Ａ１に対する定量的ＰＣＲ。ｎ＝１群当たり２。
【図12】本開示の絹フィブロインタンパク質断片（ＳＰＦ）を産生するための様々な実施形態を示すフローチャートである。
【図13】抽出及び溶解工程の間に、本開示の絹タンパク質断片溶液を産生するプロセスの間に改変され得る様々なパラメータを示すフローチャートである。
【図14A】図１４Ａ及び１４Ｂは、ＤＡＰＩで対比染色した、低ＭＷ絹（ＲＩＴＣ標識）に２×５時間曝露したＥＦＴ－４００組織の断面を示す。５倍の倍率の画像（図１４Ａ）は、全組織厚を示し、１０倍の倍率の画像（図１４Ｂ）は、表皮に焦点を合わせている。
【図14B】図１４Ａ及び１４Ｂは、ＤＡＰＩで対比染色した、低ＭＷ絹（ＲＩＴＣ標識）に２×５時間曝露したＥＦＴ－４００組織の断面を示す。５倍の倍率の画像（図１４Ａ）は、全組織厚を示し、１０倍の倍率の画像（図１４Ｂ）は、表皮に焦点を合わせている。
【図15A】図１５Ａ及び１５Ｂは、ＤＡＰＩで対比染色した、中ＭＷ絹（ＦＩＴＣ標識）に２×５時間曝露したＥＦＴ－４００組織の断面を示す。５倍の倍率の画像（図１５Ａ）は、全組織厚を示し、１０倍の倍率の画像（図１５Ｂ）は、表皮に焦点を合わせている。
【図15B】図１５Ａ及び１５Ｂは、ＤＡＰＩで対比染色した、中ＭＷ絹（ＦＩＴＣ標識）に２×５時間曝露したＥＦＴ－４００組織の断面を示す。５倍の倍率の画像（図１５Ａ）は、全組織厚を示し、１０倍の倍率の画像（図１５Ｂ）は、表皮に焦点を合わせている。
【図16】本明細書に記載される絹フィブロイン（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ（商標））処置されたＥｐｉＤｅｒｍＦＴ組織の顕微鏡断面図である。蛍光タグ付き絹フィブロインの蛍光撮像。
【図18】本明細書に記載される絹フィブロインが、損傷したヒト皮膚においてクローディン－１発現を回復させることを示す。
【図19】本明細書に記載される絹フィブロインが、どのようにクローディン－１発現を回復させて皮膚バリアを改善するかを示す。
【図20】図２０中の図２０Ａ～２１Ｈは、中スキッド絹が、インビトロで、ヒト新生児表皮ケラチノサイトにおいてどのようにクローディン－１タンパク質発現を増加させるかを示す。（２０Ａ～２０Ｈ）２４時間、中スキッド（３３Ｂ）絹ポリペプチド（０．５ｍｇ／ｍＬ～６ｍｇ／ｍＬ＝０．０５～０．６％ｗ／ｖ）を用いずに（２０Ａ、２０Ｇ）、又は用いて（２０Ｂ～２０Ｆ、２０Ｈ）処置したケラチノサイト細胞（約８０～９０％コンフルエンス）の代表的な免疫組織化学画像。クローディン－１発現（赤色）は、中スキッド絹の添加とともに増加する。パネルＧ及びＨを、標的一次抗体の非特異的結合を示すために、正常なウサギＩｇＧアイソタイプ対照抗体で処置した。
【図21】図２１中の図２１Ａ～２１Ｄは、低スキッド絹が、インビトロで、ヒト新生児表皮ケラチノサイトにおいてどのようにクローディン－１タンパク質発現を増加させるかを示す。２４時間、低スキッド（２７ｐ）絹ポリペプチド（０．５ｍｇ／ｍＬ～７ｍｇ／ｍＬ＝０．０５～０．７％ｗ／ｖ）を用いずに（２１Ａ）、又は用いて（２１Ｂ～２１Ｄ）処置したケラチノサイト細胞（約８０～９０％コンフルエンス）の代表的な免疫組織化学画像。クローディン－１発現（赤色）は、低スキッド絹の添加とともに増加する。
【図22A】図２２Ａ及び２２Ｂは、皮膚生検におけるクローディン－１上方制御の検出のための実験の結果を示す。穿刺皮膚生検を、３０～６０歳の年齢範囲のヒトドナーから取得した。２２Ａ：皮膚生検を材料及び方法に記載されるようにアセトンで前処置し、次いで、絹又は他の試薬を図に示されるようにそれらに添加した。
【図22B】２２Ｂ：生検を最初にアセトンで、次いでビヒクルで処置した場合、クローディン－１（橙色染色）は消滅し、再生しなかった。しかしながら、アセトン処置後、中皮膚（３３Ｂ）絹を適用した場合、クローディン－１発現は回復した。
【図23】低（２７Ｐ）スキッド絹及び中（３３Ｂ）スキッド絹の実験の結果が、ヒト皮膚においてクローディン－１発現を回復させることを示す。穿刺皮膚生検を、３０～５２歳の年齢範囲のヒトドナーから取得した。皮膚生検を材料及び方法に記載されるようにアセトンで処置し、次いで、絹又は他の試薬を図に示されるようにそれらに添加した。皮膚の切片を、クローディン－１（橙色染色）及び細胞核（青色染色）について染色した。低（２７Ｐ）絹ポリペプチド及び中（３３Ｂ）絹ポリペプチドで処置した皮膚生検は、アセトンでの処置後にクローディン－１発現を上方制御した。（代表的な実験がこの図に示される）。（２ｍｇ／ｍＬ＝０．２％、３ｍｇ／ｍＬ＝０．３％、４ｍｇ／ｍＬ＝０．４％）。
【図24】図２４中の図２４Ａ～２４Ｄは、クローディン－１上方制御の定量化を示す。Ａ、Ｂ 各実験内のクローディン－１（赤色強度）対ＤＡＰＩ（細胞数）の比を平均して、１細胞当たりのクローディン－１発現を表した。データを処置なしサンプルに対して正規化し、エラーバーは、正規化されたデータの標準偏差を表す。Ｃ、Ｄ ヒト皮膚サンプル中のクローディン－１の総面積を示す分析。データは、パーセンテージ±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５として表される（更なる詳細については材料及び方法を参照されたい）。（２ｍｇ／ｍＬ＝０．２％、３ｍｇ／ｍＬ＝０．３％、４ｍｇ／ｍＬ＝０．４％、５ｍｇ／ｍＬ＝０．５％、６ｍｇ／ｍＬ＝０．６％、７ｍｇ／ｍＬ＝０．７％、６０ｍｇ／ｍＬ＝６％）。
【図25】低スキッド（２７Ｐ）絹は、真皮皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン発現を上方制御する。ヒト真皮線維芽細胞を様々な濃度の低（２７Ｐ）スキッド絹ポリペプチドで処置し、コラーゲンの発現を可視化した。コラーゲン発現を、２ｍｇ／ｍＬの低（２７Ｐ）スキッド絹ポリペプチド（０．２％）で上方制御した。
【図26】低スキッド（２７Ｐ）絹は、２ｍｇ／ｍＬ（０．２％ｗ／ｖ）で、真皮皮膚線維芽細胞においてコラーゲン発現を上方制御する。ヒト真皮線維芽細胞を様々な濃度の低（２７Ｐ）スキッド絹ポリペプチドで処置し、コラーゲンの発現を可視化及び定量化した。コラーゲン発現は、２ｍｇ／ｍＬの低（２７Ｐ）スキッド絹ポリペプチドで有意に上方制御された。（０．２５ｍｇ／ｍＬ＝０．０２５％、０．５ｍｇ／ｍＬ＝０．０５％、２ｍｇ／ｍＬ＝０．２％、７ｍｇ／ｍＬ＝０．７％）。
【図27】低スキッド（２７Ｐ）絹は、創傷閉鎖アッセイにおいて細胞遊走を加速させる。ヒト初代ケラチノサイトを、血清及び成長因子を含まない培地中で成長させた（更なる詳細は材料及び方法を参照されたい）（陰性対照）。それが層を形成した後、層の連続性を妨害する引っ掻き傷を作製した。細胞を、生成された「創傷」（ギャップ）に遊走させ、それを充填する速度を測定した。血清及び成長因子を含まない培地で処置したケラチノサイトは、生成された総ギャップの約２０％を再充填した（「創傷閉鎖」）。ケラチノサイトを、血清及び成長因子を含有する培地で処置した場合、創傷閉鎖はほぼ完全であった（陽性対照）。培地及び０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０５％）の低スキッド（２７Ｐ）絹ポリペプチドで処置したケラチノサイトも、ほぼ完全であった。
【図28】絹ポリペプチドとのＣＤ４４相互作用。固相タンパク質間相互作用アッセイの結果。低スキッド絹（２７Ｐ）及び中スキッド絹（３３Ｂ）を高結合９６ウェルプレート上に固定した。低（２７Ｐ）絹ポリペプチド組成物及び中（３３Ｂ）絹ポリペプチド組成物の両方で結合したヒトＣＤ４４－ｈＦｃタンパク質（レーン３を４と、及び７を６と比較する）。中スキッド（３３Ｂ）絹は、二次抗体に対してより高い非特異的結合を有した（レーン６を２と比較する）が、ＣＤ４４－ｈＦｃを添加した場合、得られたシグナルは、はるかにより高かった（レーン７を６と比較する）。吸光度は、３つの技術的反復の平均である。独立した実験は、同様の結果（図示せず）を示した。
【図29】小皺及び皺の専門家による評価の概要を示すグラフである。
【図30】皮膚の堅さの専門家による評価の概要を示すグラフである。
【図31】発赤の専門家による評価の概要を示すグラフである。
【図32】ＴＥＷＬデータ（Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ（登録商標）によって測定される）の概要を示すグラフである。
【図33】ＮｕｍＷｒデータ（シリコーンプロフィロメトリーによって測定される）の概要を示すグラフである。
【図34】くまデータ（シリコーンプロフィロメトリーによって測定される）の概要を示すグラフである。
【図35】３３Ｂ研究についての自己認識質問票からのトップボックス応答を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0008】
絹フィブロイン又は絹フィブロイン断片を作製する方法は、知られており、例えば、米国特許第９，１８７，５３８号、同第９，５１１，０１２号、第９，５１７，１９１号、同第９，５２２，１０７号、同第９，５２２，１０８号、同第９，５４５，３６９号、及び同第１０，１６６，１７７号に記載されている。動物の毛髪のコーティング用途を含むコーティング用途において、絹フィブロイン又は絹フィブロイン断片を使用する方法は、知られており、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２２２５７９号及び同第２０１６／０２８１２９４号に記載されている。化粧品用途で絹フィブロイン又は絹フィブロイン断片を使用する組成物及び方法は、知られており、例えば、米国特許出願公開第２０１８／０２８０２７４号及び同第２０１８／０００８５２２号、並びに国際公開第２０１９／００５８４８号に記載されている。本明細書に引用される刊行物の全てが、参照によりそれらの全体において組み込まれる。
【0009】
定義
前のセクションで、及び本明細書の残りの部分全体を通して使用される場合、別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
前のセクションで、及び本明細書の残りの部分全体を通して使用される場合、別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【0010】
全てのパーセンテージ、部、及び比は、別段の指定がない限り、本発明のコラーゲンブースティング組成物の総重量に基づく。列挙された成分に関連する全てのそのような重量は、活性レベルに基づいており、したがって、別段の指定がない限り、市販の材料に含まれ得る溶媒又は副生成物を含まない。「重量パーセント」という用語は、本明細書では「重量％」又は％ｗ／ｗとして示され得る。
【0011】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」という用語は、一般的に、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈される。
【0012】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、一般的に、当業者により決定される許容可能な誤差範囲内にある特定の数値を指し、それは、数値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定系の限度に一部依存する。例えば、「約」は、所定の数値の±２０％、±１０％、又は±５％の範囲を意味し得る。
【0013】
本明細書で使用される場合、「皮膚科学的に許容可能な担体」という用語は、例えば、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応などのいかなる悪影響も引き起こすことなく、哺乳動物ケラチン組織と接触して使用するのに好適な担体を意味する。皮膚科学的に許容可能な担体としては、限定なしで、水、液体、又は固体の軟化剤、ヒューメクタント、溶媒などが挙げられ得る。
【0014】
本明細書で使用される場合、界面活性剤の「親水性－親油性バランス」（ＨＬＢ）という用語は、分子の異なる領域の値を計算することによって決定される、親水性又は疎水性である程度の尺度であり、Ｇｒｉｆｆｉｎの方法ＨＬＢ＝２０＊Ｍｈ／Ｍ（式中、Ｍｈは、界面活性剤の親水性部分の分子質量であり、Ｍは、界面活性剤分子全体の分子質量である）によって記載され、０～２０のスケールで結果を与える。０のＨＬＢ値は、完全に親油性の分子に対応し、２０の値は、完全に親水性の分子に対応する。ＨＬＢ値は、分子の界面活性剤特性を予測するために使用され得る：ＨＬＢ＜１０：脂質可溶性（水不溶性）、ＨＬＢ＞１０：水溶性（脂質不溶性）、ＨＬＢ＝１～３：消泡剤、３～６：Ｗ／Ｏ（油中水型）乳化剤、７～９：湿潤剤及び展着剤、８～１６：Ｏ／Ｗ（水中油型）乳化剤、１３～１６：界面活性剤、１６～１８：可溶化剤又はヒドロトロープ。
【0015】
本明細書で使用される場合、「平均重量平均分子量」は、同じ組成物の絹フィブロイン又はその断片の重量平均分子量の２つ以上の値の平均を指し、２つ以上の値は、２つ以上の別個の実験読取値によって決定される。
【0016】
本明細書で使用される場合、ポリマーの「多分散性（ＰＤ）」という用語は、通常、ポリマーの分子量分布の広さの尺度として使用され、多分散性
の式によって定義される。
【数1】
【0017】
本明細書で使用される場合、「実質的に均質な」という用語は、同定された分子量の周りに正規分布で分布している絹フィブロインベースのタンパク質断片を指し得る。本明細書で使用される場合、「実質的に均質な」という用語は、本開示の組成物全体にわたる、例えば、構成成分又は添加剤、例えば、絹フィブロイン断片、皮膚科学的に許容可能な担体などの均一な分布を指し得る。
【0018】
本明細書で使用される場合、「絹フィブロインペプチド」、「絹フィブロインタンパク質断片」、及び「絹フィブロイン断片」という用語は、互換的に使用される。分子量又はアミノ酸単位の数は、分子サイズが重要なパラメータになるときに定義される。
【0019】
ＳＰＦの定義及び特性
本明細書で使用される場合、「絹タンパク質断片」（ＳＰＦ）は、以下のうちの１つ以上を含む：本明細書で定義される「絹フィブロイン断片」、本明細書で定義される「組換え絹断片」、本明細書で定義される「クモ絹断片」、本明細書で定義される「絹フィブロイン様タンパク質断片」、及び／又は本明細書で定義される「化学的に改変された絹断片」。ＳＰＦは、本明細書に説明される任意の分子量の値又は範囲、及び本明細書に説明される任意の多分散性の値又は範囲を有し得る。本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態では、「絹タンパク質断片」という用語はまた、天然絹ポリペプチド若しくはそれらのバリエーション、天然絹ポリペプチドのアミノ酸配列、又は両方の組み合わせから各々が独立して選択される、少なくとも２つの同一の反復単位を含む、又はそれからなる絹タンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、「絹タンパク質断片」（ＳＰＦ）は、以下のうちの１つ以上を含む：本明細書で定義される「絹フィブロイン断片」、本明細書で定義される「組換え絹断片」、本明細書で定義される「クモ絹断片」、本明細書で定義される「絹フィブロイン様タンパク質断片」、及び／又は本明細書で定義される「化学的に改変された絹断片」。ＳＰＦは、本明細書に説明される任意の分子量の値又は範囲、及び本明細書に説明される任意の多分散性の値又は範囲を有し得る。本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態では、「絹タンパク質断片」という用語はまた、天然絹ポリペプチド若しくはそれらのバリエーション、天然絹ポリペプチドのアミノ酸配列、又は両方の組み合わせから各々が独立して選択される、少なくとも２つの同一の反復単位を含む、又はそれからなる絹タンパク質を指す。
【0020】
ＳＰＦ分子量及び多分散性
一実施形態では、本開示の組成物は、約１～約５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約５～約１０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１０～約１５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１５～約２０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１４～約３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２０～約２５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２５～約３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３０～約３５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３５～約４０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３９～約５４ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約４０～約４５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約４５～約５０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約５０～約５５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約５５～約６０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約６０～約６５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約６５～約７０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約７０～約７５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約７５～約８０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約８０～約８５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約８５～約９０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約９０～約９５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約９５～約１００ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１００～約１０５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１０５～約１１０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１１０～約１１５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１１５～約１２０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１２０～約１２５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１２５～約１３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１３０～約１３５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１３５～約１４０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１４０～約１４５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１４５～約１５０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１５０～約１５５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１５５～約１６０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１６０～約１６５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１６５～約１７０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１７０～約１７５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１７５～約１８０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１８０～約１８５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１８５～約１９０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１９０～約１９５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１９５～約２００ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２００～約２０５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２０５～約２１０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２１０～約２１５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２１５～約２２０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２２０～約２２５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２２５～約２３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２３０～約２３５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２３５～約２４０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２４０～約２４５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２４５～約２５０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２５０～約２５５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２５５～約２６０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２６０～約２６５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２６５～約２７０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２７０～約２７５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２７５～約２８０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２８０～約２８５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２８５～約２９０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２９０～約２９５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２９５～約３００ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３００～約３０５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３０５～約３１０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３１０～約３１５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３１５～約３２０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３２０～約３２５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３２５～約３３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３３０～約３３５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３３５～約３４０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３４０～約３４５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３４５～約３５０ｋＤａの間から選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。
一実施形態では、本開示の組成物は、約１～約５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約５～約１０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１０～約１５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１５～約２０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１４～約３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２０～約２５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２５～約３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３０～約３５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３５～約４０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３９～約５４ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約４０～約４５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約４５～約５０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約５０～約５５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約５５～約６０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約６０～約６５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約６５～約７０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約７０～約７５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約７５～約８０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約８０～約８５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約８５～約９０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約９０～約９５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約９５～約１００ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１００～約１０５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１０５～約１１０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１１０～約１１５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１１５～約１２０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１２０～約１２５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１２５～約１３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１３０～約１３５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１３５～約１４０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１４０～約１４５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１４５～約１５０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１５０～約１５５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１５５～約１６０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１６０～約１６５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１６５～約１７０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１７０～約１７５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１７５～約１８０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１８０～約１８５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１８５～約１９０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１９０～約１９５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約１９５～約２００ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２００～約２０５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２０５～約２１０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２１０～約２１５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２１５～約２２０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２２０～約２２５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２２５～約２３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２３０～約２３５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２３５～約２４０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２４０～約２４５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２４５～約２５０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２５０～約２５５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２５５～約２６０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２６０～約２６５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２６５～約２７０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２７０～約２７５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２７５～約２８０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２８０～約２８５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２８５～約２９０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２９０～約２９５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約２９５～約３００ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３００～約３０５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３０５～約３１０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３１０～約３１５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３１５～約３２０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３２０～約３２５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３２５～約３３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３３０～約３３５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３３５～約３４０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３４０～約３４５ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。一実施形態では、本開示の組成物は、約３４５～約３５０ｋＤａの間から選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、組成物番号１００１～番号２４５０から選択され、約１ｋＤａ～約１４５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有し、１～約５の間（限定されないが、１の多分散性を含む）、１～約１．５の間（限定されないが、１の多分散性を含む）、約１．５～約２の間、約１．５～約３の間、約２～約２．５の間、約２．５～約３の間、約３～約３．５の間、約３．５～約４の間、約４～約４．５の間、及び約４．５～約５から選択される多分散性を有するＳＰＦ組成物を含む：
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【0022】
本明細書で使用される場合、「低分子量」、「低ＭＷ（ｌｏｗ ＭＷ）」、又は「低ＭＷ（ｌｏｗ－ＭＷ）」のＳＰＦは、重量平均分子量、又は約５ｋＤａ～約３８ｋＤａ、約１４ｋＤａ～約３０ｋＤａ、若しくは約６ｋＤａ～約１７ｋＤａから選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含み得る。いくつかの実施形態では、特定のＳＰＦの標的低分子量は、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約１６ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約１８ｋＤａ、約１９ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２１ｋＤａ、約２２ｋＤａ、約２３ｋＤａ、約２４ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２６ｋＤａ、約２７ｋＤａ、約２８ｋＤａ、約２９ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３１ｋＤａ、約３２ｋＤａ、約３３ｋＤａ、約３４ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約３６ｋＤａ、約３７ｋＤａ、又は約３８ｋＤａの重量平均分子量であり得る。
【0023】
本明細書で使用される場合、「中分子量」、「中ＭＷ（ｍｅｄｉｕｍ ＭＷ）」、又は「中ＭＷ（ｍｉｄ－ＭＷ）」のＳＰＦは、重量平均分子量、又は約３１ｋＤａ～約５５ｋＤａ、若しくは約３９ｋＤａ～約５４ｋＤａの間から選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含み得る。いくつかの実施形態では、特定のＳＰＦについての標的中分子量は、約３１ｋＤａ、約３２ｋＤａ、約３３ｋＤａ、約３４ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約３６ｋＤａ、約３７ｋＤａ、約３８ｋＤａ、約３９ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４１ｋＤａ、約４２ｋＤａ、約４３ｋＤａ、約４４ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約４６ｋＤａ、約４７ｋＤａ、約４８ｋＤａ、約４９ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約５１ｋＤａ、約５２ｋＤａ、約５３ｋＤａ、約５４ｋＤａ、又は約５５ｋＤａの重量平均分子量であり得る。
【0024】
本明細書で使用される場合、「高分子量」、「高ＭＷ（ｈｉｇｈ ＭＷ）」、又は「高ＭＷ（ｈｉｇｈ－ＭＷ）」のＳＰＦは、重量平均分子量、又は約５５ｋＤａ～約１５０ｋＤａの間から選択される平均重量平均分子量を有するＳＰＦを含み得る。いくつかの実施形態では、特定のＳＰＦについての標的高分子量は、約５５ｋＤａ、約５６ｋＤａ、約５７ｋＤａ、約５８ｋＤａ、約５９ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約６１ｋＤａ、約６２ｋＤａ、約６３ｋＤａ、約６４ｋＤａ、約６５ｋＤａ、約６６ｋＤａ、約６７ｋＤａ、約６８ｋＤａ、約６９ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約７１ｋＤａ、約７２ｋＤａ、約７３ｋＤａ、約７４ｋＤａ、約７５ｋＤａ、約７６ｋＤａ、約７７ｋＤａ、約７８ｋＤａ、約７９ｋＤａ、又は約８０ｋＤａであり得る。
【0025】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される分子量（例えば、低分子量絹、中分子量絹、高分子量絹）は、当業者により理解され得るように、それぞれのＳＰＦ内に含まれるアミノ酸のおよその数に変換され得る。例えば、アミノ酸の平均重量は、約１１０ダルトン（すなわち、１１０ｇ／ｍｏｌ）であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、直鎖状タンパク質の分子量を１１０ダルトンにより除すことを、その中に含まれるアミノ酸残基数の近似に使用することができる。
【0026】
一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、１～約５．０の間から選択される多分散性を有し、限定されないが、１の多分散性を含む。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約１．５～約３．０から選択される多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、１～約１．５から選択される多分散性を有し、限定されないが、１の多分散性を含む。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約１．５～約２．０から選択される多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．０～約２．５から選択される多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．５～約３．０から選択される多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．０～約３．５から選択される多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．５～約４．０から選択される多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．０～約４．５から選択される多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．５～約５．０の間から選択される多分散性を有する。
【0027】
一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、１の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約１．１の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約１．２の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約１．３の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約１．４の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約１．５の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約１．６の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約１．７の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約１．８の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約１．９の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．０の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．１の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．２の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．３の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．４の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．５の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．６の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．７の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．８の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約２．９の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．０の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．１の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．２の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．３の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．４の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．５の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．６の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．７の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．８の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約３．９の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．０の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．１の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．２の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．３の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．４の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．５の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．６の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．７の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．８の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約４．９の多分散性を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＳＰＦは、約５．０の多分散性を有する。
【0028】
いくつかの実施形態では、低、中、及び／又は高分子量ＳＰＦの組み合わせを有する、本明細書に記載される組成物において、そのような低、中、及び／又は高分子量ＳＰＦは、同一又は異なる多分散性を有してもよい。
【0029】
絹フィブロイン断片
絹フィブロイン又は絹フィブロインタンパク質断片を作製する方法、及び様々な分野におけるそれらの適用は、知られており、例えば、米国特許第９，１８７，５３８号、同第９，５１１，０１２号、同第９，５１７，１９１号、同第９，５２２，１０７号、同第９，５２２，１０８号、同第９，５４５，３６９号、及び同第１０，１６６，１７７号、同第１０，２８７，７２８号、及び同第１０，３０１，７６８号に記載されており、それらの全てが、それらの全体において本明細書に組み込まれる。カイコであるＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ由来の未加工の絹は、２つの主要タンパク質で構成される：絹フィブロイン（およそ７５％）及びセリシン（およそ２５％）。絹フィブロインは、剛性及び強度を提供する半結晶構造を伴う線維性タンパク質である。本明細書で使用される場合、「絹フィブロイン」という用語は、約３７０，０００Ｄａの重量平均分子量を有するＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉの繭の線維を意味する。粗製カイコ繊維は、フィブロインの二重糸からなる。これらの二重繊維を一緒に保持している接着物質がセリシンである。絹フィブロインは、約３５０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する重鎖（Ｈ鎖）、及び約２５，０００Ｄａの重量平均分子量を有する軽鎖（Ｌ鎖）で構成される。絹フィブロインは、高分子量を有するポリマーの主要構成成分を占める、大きな疎水性ドメインを伴う両親媒性ポリマーである。疎水性領域は、小さな親水性スペーサーにより中断され、鎖のＮ及びＣ末端がまた、高度に親水性である。Ｈ鎖の疎水性ドメインは、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒの反復ヘキサペプチド配列及びＧｌｙ－Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｔｙｒジペプチドのリピートを含み、それは、安定な逆平行シート結晶子を形成することができる。Ｌ鎖のアミノ酸配列は非反復的であり、そのため、Ｌ鎖はより親水性であり、比較的弾性である。絹フィブロイン分子中の親水性（Ｔｙｒ、Ｓｅｒ）及び疎水性（Ｇｌｙ、Ａｌａ）鎖セグメントは、絹フィブロイン分子の自己構築を可能にするように代替的に配置される。
絹フィブロイン又は絹フィブロインタンパク質断片を作製する方法、及び様々な分野におけるそれらの適用は、知られており、例えば、米国特許第９，１８７，５３８号、同第９，５１１，０１２号、同第９，５１７，１９１号、同第９，５２２，１０７号、同第９，５２２，１０８号、同第９，５４５，３６９号、及び同第１０，１６６，１７７号、同第１０，２８７，７２８号、及び同第１０，３０１，７６８号に記載されており、それらの全てが、それらの全体において本明細書に組み込まれる。カイコであるＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ由来の未加工の絹は、２つの主要タンパク質で構成される：絹フィブロイン（およそ７５％）及びセリシン（およそ２５％）。絹フィブロインは、剛性及び強度を提供する半結晶構造を伴う線維性タンパク質である。本明細書で使用される場合、「絹フィブロイン」という用語は、約３７０，０００Ｄａの重量平均分子量を有するＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉの繭の線維を意味する。粗製カイコ繊維は、フィブロインの二重糸からなる。これらの二重繊維を一緒に保持している接着物質がセリシンである。絹フィブロインは、約３５０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する重鎖（Ｈ鎖）、及び約２５，０００Ｄａの重量平均分子量を有する軽鎖（Ｌ鎖）で構成される。絹フィブロインは、高分子量を有するポリマーの主要構成成分を占める、大きな疎水性ドメインを伴う両親媒性ポリマーである。疎水性領域は、小さな親水性スペーサーにより中断され、鎖のＮ及びＣ末端がまた、高度に親水性である。Ｈ鎖の疎水性ドメインは、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒの反復ヘキサペプチド配列及びＧｌｙ－Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｔｙｒジペプチドのリピートを含み、それは、安定な逆平行シート結晶子を形成することができる。Ｌ鎖のアミノ酸配列は非反復的であり、そのため、Ｌ鎖はより親水性であり、比較的弾性である。絹フィブロイン分子中の親水性（Ｔｙｒ、Ｓｅｒ）及び疎水性（Ｇｌｙ、Ａｌａ）鎖セグメントは、絹フィブロイン分子の自己構築を可能にするように代替的に配置される。
【0030】
本明細書では、多様な適用のために、複数の業界にわたって使用され得る、純粋で高度にスケーラブルな絹フィブロイン－タンパク質断片混合溶液を産生するための方法が提供される。任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、これらの方法は、限定されないが、組換え絹タンパク質、及び絹様又はフィブロイン様タンパク質の断片化を含む、本明細書に記載される任意のＳＰＦの断片化に等しく適用可能であると考えられる。
【0031】
本明細書で使用される場合、「フィブロイン」という用語は、カイコフィブロイン及び昆虫又はクモ絹タンパク質を含む。一実施形態では、フィブロインは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉから得られる。Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ由来の未加工の絹は、２つの一次タンパク質で構成される：絹フィブロイン（およそ７５％）及びセリシン（およそ２５％）。絹フィブロインは、剛性及び強度を提供する半結晶構造を伴う線維性タンパク質である。本明細書で使用される場合、「絹フィブロイン」という用語は、約３７０，０００Ｄａの重量平均分子量を有するＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉの繭の線維を意味する。水溶性絹フィブロインタンパク質断片への、これらの不溶性絹フィブロイン線維の変換には、濃縮中性塩（例えば、８～１０Ｍの臭化リチウム）の添加が必要であり、これは、分子間及び分子内イオン結合並びに水素結合に干渉し、それらは、そうでなければ、フィブロインタンパク質を水に不溶性にする。絹フィブロインタンパク質断片、及び／又はその組成物を作製する方法は、公知であり、例えば、米国特許第９，１８７，５３８号、第９，５１１，０１２号、第９，５１７，１９１号、第９，５２２，１０７号、第９，５２２，１０８号、第９，５４５，３６９号、及び第１０，１６６，１７７号において記載されている。
【0032】
カイコであるＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉからの未加工の絹繭を、小片に切断した。小片の絹繭を、Ｎａ２ＣＯ３の水溶液中で約１００℃で約６０分間にわたり処理して、セリシンを除去した（脱ガム）。使用される水の容量は、約０．４×未加工の絹重量と等しく、Ｎａ２ＣＯ３の量は、未加工の絹繭小片の重量の約０．８４８×である。結果として得られる、脱ガムされた絹繭小片を、約６０℃で脱イオン水で３回リンスした（２０分／リンス）。各サイクルについてのリンス水の容量は、０．２Ｌ×未加工の絹繭小片の重量であった。脱ガムされた絹繭小片からの過剰な水を除去した。ＤＩ水洗浄工程の後、湿潤の、脱ガムされた絹繭小片を室温で乾燥させた。脱ガムされた絹繭小片をＬｉＢｒ溶液と混合し、混合物を約１００℃まで加熱した。温めた混合物を乾燥オーブン中に入れ、約１００℃で約６０分間にわたり加熱し、天然絹タンパク質の完全な溶解を達成した。結果として得られる絹フィブロイン溶液を濾過し、接線流濾過（ＴＦＦ）及び脱イオン水に対する１０ｋＤａ膜を使用して７２時間にわたり透析した。結果として得られる絹フィブロイン水溶液は、約８．５重量％の濃度を有する。次に、８．５％絹溶液を水で希釈し、１．０％ｗ／ｖの絹溶液をもたらした。ＴＦＦを次に使用して、純粋な絹溶液を、水に対して２０．０％ｗ／ｗの濃度の絹に更に濃縮することができる。
【0033】
一連の水の変化を通じて絹を透析することは、手作業であり、時間集中的なプロセスであり、特定のパラメータを変化させること、例えば、透析前に絹溶液を希釈することにより加速することができる。透析プロセスは、半自動装置、例えば、接線流濾過システムを使用することにより、製造のために増減させることができる。
【0034】
いくつかの実施形態では、絹溶液は、様々な調製条件パラメータ、例えば９０℃３０分、９０℃６０分、１００℃３０分、及び１００℃６０分などの下で調製される。簡単には、９．３ＭのＬｉＢｒを調製し、室温で少なくとも３０分間にわたり放置した。５ｍＬのＬｉＢｒ溶液を１．２５ｇの絹に添加して、６０℃のオーブン中に入れた。各セットからのサンプルを、４、６、８、１２、２４、１６８、及び１９２時間で除去した。
【0035】
いくつかの実施形態では、絹溶液は、様々な調製条件パラメータ、例えば９０℃３０分、９０℃６０分、１００℃３０分、及び１００℃６０分などの下で調製される。簡単には、９．３ＭのＬｉＢｒ溶液を４つの温度：６０℃、８０℃、１００℃、又は沸騰のうちの１つまで加熱した。５ｍＬの高温ＬｉＢｒ溶液を１．２５ｇの絹に添加し、６０℃のオーブン中に入れた。各セットからのサンプルを、１、４、及び６時間で除去した。
【0036】
いくつかの実施形態では、絹溶液は、様々な調製条件パラメータの下で調製される。例えば：４つの異なる絹抽出の組み合わせを使用した：９０℃３０分、９０℃６０分、１００℃３０分、及び１００℃６０分。簡単には、９．３ＭのＬｉＢｒ溶液を４つの温度：６０℃、８０℃、１００℃、又は沸騰のうちの１つまで加熱した。５ｍＬの高温ＬｉＢｒ溶液を１．２５ｇの絹に添加し、ＬｉＢｒの同温度でオーブン中に入れた。各セットからのサンプルを、１、４、及び６時間で除去した。１ｍＬの各サンプルを、７．５ｍＬの９．３Ｍ ＬｉＢｒに添加し、粘度試験のために冷蔵した。
【0037】
いくつかの実施形態では、ＳＰＦは、未加工の未精練、部分的精練、又は精練済みのカイコ繊維を中性臭化リチウム塩で溶解することにより得られる。未加工のカイコ絹は、任意のセリシンを除去し、断片混合物の所望の重量平均分子量（ＭＷ）及び多分散性（ＰＤ）を達成するために、選択された温度及び他の条件下で処理される。プロセスパラメータの選択は、使用目的に依存して、異なる最終絹タンパク質断片の特徴を達成するように変更することができる。結果として得られる最終断片溶液は、プロセス汚染物質の検出不能なレベル、医薬、医療、及び消費者アイケア市場において許容可能なレベルの１００万分の一（ｐｐｍ）を伴う純粋な絹フィブロインタンパク質断片及び水である。ＳＰＦの濃度、サイズ、及び多分散性は、所望の使用及び性能要件に依存して、更に変更することができる。
【0038】
図５は、本開示の純粋な絹フィブロインタンパク質断片（ＳＰＦ）を産生するための様々な実施形態を示すフローチャートである。例証される工程の全てが、必ずしも、本開示の全ての絹溶液を製作するために必要とされるわけではないことを理解すべきである。図５、工程Ａにおいて例証するように、繭（熱処置若しくは非熱処置）、絹線維、絹粉末、クモ絹、又は組換えクモ絹を、絹供給源として使用することができる。Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉからの未加工の絹繭から出発した場合、その繭を切断して小さな小片、例えば、ほぼ等しいサイズの小片にすることができる（工程Ｂ１）。未加工の絹を次に抽出し、リンスしてセリシンを除去する（工程Ｃ１ａ）。これによって、セリシンを実質的に含まない未加工の絹がもたらされる。一実施形態では、水を８４℃～１００℃の間の温度（理想的には沸点）まで加熱し、次にＮａ２ＣＯ３（炭酸ナトリウム）を、Ｎａ２ＣＯ３が完全に溶解するまで沸騰水に添加する。未加工の絹を沸騰水／Ｎａ２ＣＯ３（１００℃）に添加し、およそ１５～９０分間にわたり浸漬させ、より長期の時間にわたる沸騰によって、より小さな絹タンパク質断片がもたらされる。一実施形態では、水の容積は約０．４×未加工の絹重量に等しく、Ｎａ２ＣＯ３の容積は約０．８４８×未加工の絹の重量に等しい。一実施形態では、水の容積は０．１×未加工の絹重量に等しく、Ｎａ２ＣＯ３の容積は２．１２ｇ／Ｌで維持される。
【0039】
その後、水に溶解したＮａ２ＣＯ３溶液を排出させ、過剰の水／Ｎａ２ＣＯ３を、絹フィブロイン線維から除去する（例えば、手動、機械を使用した脱水サイクルなどによりフィブロイン抽出物をリングアウトする（ｒｉｎｇ ｏｕｔ））。結果として得られる絹フィブロイン抽出物を、典型的には約４０℃～約８０℃の温度範囲で、水の容積を少なくとも１回変化させ（必要な回数だけ繰り返す）、温水～熱水でリンスし、全ての残りの吸着セリシン又は汚染物質を除去する。結果として得られる絹フィブロイン抽出物は、実質的にセリシンが欠乏した絹フィブロインである。一実施形態では、結果として得られる絹フィブロイン抽出物は、約６０℃の温度で水でリンスされる。一実施形態では、各サイクルについてのリンス水の量は、０．１Ｌ～０．２Ｌ×未加工の絹の重量に等しい。リンス効果を最大にするために、リンス水を掻き混ぜる、回転させる、又は循環させると有利であり得る。リンス後、過剰の水を、抽出された絹フィブロイン線維から除去する（例えば、手動によるか、又は機械を使用してフィブロイン抽出物をリングアウトする）。あるいは、当業者に公知の方法、例えば圧力、温度、若しくは他の試薬、又はそれらの組み合わせなどを、セリシン抽出の目的のために使用することができる。あるいは、絹糸腺（１００％セリシン不含の絹タンパク質）を、カイコ（ｗｏｒｍ）から直接除去することができる。これは、タンパク質構造のいかなる変化も伴わずに、セリシンを含まない液体絹タンパク質をもたらし得る。
【0040】
抽出されたフィブロイン線維を次に、完全に乾燥させる。一度、乾燥したら、抽出された絹フィブロインを、周囲～沸騰温度の間で、絹フィブロインに添加された溶媒を使用して溶解させる（工程Ｃ１ｂ）。一実施形態では、溶媒は、臭化リチウム（ＬｉＢｒ）の溶液である（ＬｉＢｒについての沸点は１４０℃である）。あるいは、抽出されたフィブロイン線維は乾燥されないが、しかし、湿潤であり、溶媒中に置かれ；溶媒濃度を次に変動させて、乾燥絹を溶媒に添加する場合と同様の濃度を達成することができる。ＬｉＢｒ溶媒の最終濃度は、０．１Ｍ～９．３Ｍの範囲であり得る。抽出されたフィブロイン線維の完全な溶解は、溶媒を溶解する濃度とともに、処置時間及び温度を変動させることにより達成することができる。限定されないが、ホスフェートリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）、硝酸カルシウム、塩化カルシウム溶液、又は他の無機塩の濃縮水溶液を含む、他の溶媒を使用することができる。完全な溶解を確実にするために、絹線維を、既に加熱されている溶媒溶液内に十分浸漬させ、次に、約６０℃～約１４０℃の範囲の温度で１～１６８時間にわたり維持すべきである。一実施形態では、絹線維を、溶媒溶液内に十分浸漬させ、次に、約１００℃の温度で約１時間にわたり乾燥オーブン中に置くべきである。
【0041】
絹フィブロイン抽出物をＬｉＢｒ溶液に添加する（又はその逆の）温度は、フィブロインを完全に溶解させるのに要求される時間に対する、並びに結果として得られる、最終ＳＰＦ混合溶液の分子量及び多分散性に対する効果を有する。一実施形態では、絹溶媒溶液濃度は２０％ｗ／ｖ未満又はそれに等しい。加えて、導入又は溶解の間に撹拌を使用して、変動する温度及び濃度で溶解を促してもよい。ＬｉＢｒ溶液の温度は、作製される絹タンパク質断片混合物の分子量及び多分散性に対する制御を提供する。一実施形態では、より高い温度は、絹をより迅速に溶解させ、絹溶液の高まったプロセススケーラビリティ及び大量生産をもたらす。一実施形態では、８０℃～１４０℃の温度に加熱されたＬｉＢｒ溶液を使用することによって、完全な溶解を達成するために、オーブン中で必要とされる時間が低下する。６０℃又は６０℃超で溶解溶媒の時間及び温度を変動させることによって、元の分子量の天然絹フィブロインタンパク質から形成されるＳＰＦ混合溶液のＭＷ及び多分散性が変化し、制御される。
【0042】
あるいは、繭全体を、抽出をバイパスすることにより、溶媒、例えばＬｉＢｒなどの中に直接入れることができる（工程Ｂ２）。これは、疎水性及び親水性のタンパク質を分離するために当技術分野において公知の方法、例えばカラム分離及び／又はクロマトグラフィー、イオン交換、塩及び／又はｐＨでの化学沈殿、並びに／あるいは酵素消化及び濾過又は抽出など（全ての方法は、標準的なタンパク質分離法のための一般的な例であり、これらに限定されない）を使用する、絹及び溶媒溶液からのカイコ粒子のその後の濾過及びセリシン除去を必要とする（工程Ｃ２）。カイコが除去されている非熱処置繭を、代わりに、抽出をバイパスして、溶媒、例えばＬｉＢｒなどの中に直接入れてもよい。上に記載される方法は、セリシン分離のために使用することができ、非熱処置繭が、有意に少ないカイコの残骸を含むという利点を伴う。
【0043】
透析を使用して、結果として得られる溶解したフィブロインタンパク質断片溶液から溶解溶媒を、その溶液をある容積の水に対して透析させることにより除去することができる（工程Ｅ１）。透析前の前濾過は、絹及びＬｉＢｒ溶液から全ての残骸（すなわち、カイコの残遺物）を除去するのに有用である（工程Ｄ）。一例では、３μｍ又は５μｍフィルタを２００～３００ｍＬ／分の流量で使用して、所望の場合には、透析及び潜在的な濃縮の前に０．１％～１．０％の絹－ＬｉＢｒ溶液まで濾過する。本明細書で開示される方法は、上に記載されるように、特に、スケーラブルなプロセス方法を作製することを考慮した場合、濾過及び下流での透析を促進するために、濃度を９．３Ｍ ＬｉＢｒから０．１Ｍ～９．３Ｍの範囲まで減少させるための時間及び／又は温度を使用することである。あるいは、追加の時間又は温度の使用を伴わずに、９．３Ｍ ＬｉＢｒ－絹タンパク質断片溶液を水で希釈して、残骸の濾過及び透析を促進させてもよい。所望の時間及び温度の濾過での溶解の結果は、公知のＭＷ及び多分散性の、半透明な、粒子不含の室温での保管安定性のある絹タンパク質断片ＬｉＢｒ溶液である。溶媒が除去されるまで、透析水を定期的に変える（例えば、１時間、４時間後に水を変え、次に、１２時間毎に合計６回水を変える）ことが有利である。水容量交換の総数は、絹タンパク質の溶解及び断片化のために使用される溶媒の、結果として得られる濃度に基づいて変動させることができる。透析後、最終絹溶液を更に濾過して、全ての残る残骸（すなわち、カイコの残遺物）を除去することができる。
【0044】
あるいは、接線流濾過（ＴＦＦ）は、生体分子の分離及び精製のための迅速で効率的な方法であり、結果として得られる溶解フィブロイン溶液から溶媒を除去するために使用することができる（工程Ｅ２）。ＴＦＦは、高度に純粋な絹タンパク質断片水溶液を提供し、制御された反復可能な様式において大容積の溶液を産生するために、プロセスのスケーラビリティを可能にする。絹及びＬｉＢｒの溶液を、ＴＦＦの前に希釈することができる（水か又はＬｉＢｒのいずれかの中で２０％～０．１％絹）。ＴＦＦ処理の前での、上に記載されるような前濾過によって、フィルタ効率を維持することができ、残骸粒子の存在の結果としての、フィルタの表面上での絹ゲル境界層の形成を潜在的に回避する。ＴＦＦの前の前濾過はまた、結果として得られる水だけの溶液の自然発生的な又は長期的なゲル化を起こし得る絹及びＬｉＢｒ溶液から全ての残る残骸（すなわち、カイコの残遺物）を除去するために有用である（工程Ｄ）。ＴＦＦ（循環又はシングルパス）は、０．１％～３０．０％の絹（より好ましくは０．１％～６．０％の絹）の水－絹タンパク質断片溶液の作製のために使用することができる。異なるカットオフサイズのＴＦＦ膜が、溶液中での絹タンパク質断片混合物の所望の濃度、分子量、及び多分散性に基づいて必要とされ得る。１～１００ｋＤａの範囲の膜は、例えば、抽出沸騰時間の長さ、又は溶解溶媒（例えば、ＬｉＢｒ）中での時間及び温度を変動させることにより作製される分子量絹溶液を変動させために必要であり得る。一実施形態では、ＴＦＦ５又は１０ｋＤａ膜は、絹タンパク質断片混合溶液を精製し、最終的な所望の絹と水の比率をもたらすために使用される。その上に、ＴＦＦシングルパス、ＴＦＦ、及び当技術分野において公知の他の方法、例えば流下膜式蒸発器などを、溶解溶媒（例えば、ＬｉＢｒ）の除去後に溶液を濃縮するために使用することができる（結果として得られる０．１％～３０％絹の範囲の所望濃度を伴う）。これは、水ベースの溶液を作製するために、当技術分野において公知の標準的なＨＦＩＰ濃縮方法の代替法として使用することができる。より大きい細孔膜をまた、小さな絹タンパク質断片を濾別し、より厳格な多分散性の値を伴う及び／又は伴わない、より高分子量の絹の溶液を作製するために利用することができる。
【0045】
ＬｉＢｒ及びＮａ２ＣＯ３検出のためのアッセイは、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備えたＨＰＬＣシステムを使用して実施することができる。計算は、濃度に対してプロットされた、分析物についての結果として得られるピーク面積の線形回帰により実施した。本開示の多数の製剤の２つ以上のサンプルを、サンプル調製及び分析のために使用した。一般的に、異なる処方物の４つのサンプルを、１０ｍＬ容量フラスコ中に直接量り取った。サンプルを５ｍＬの２０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３．０）中に懸濁し、時々振盪しながら２～８℃で２時間にわたり維持して、フィルムから分析物を抽出した。２時間後、溶液を２０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３．０）で希釈した。メスフラスコからのサンプル溶液を、ＨＰＬＣバイアル中に移し、炭酸ナトリウム及び臭化リチウムの推定のためにＨＰＬＣ－ＥＬＳＤシステム中に注入した。
【0046】
絹タンパク質製剤中のＮａ２ＣＯ３及びＬｉＢｒの定量化のために開発された分析方法は、１０～１６５μｇ／ｍＬの範囲で線形であることが見出されたが、注入精度についてのＲＳＤは、炭酸ナトリウム及び臭化リチウムについて、それぞれ、面積については２％及び１％並びに保持時間については０．３８％及び０．１９％であった。この分析方法は、絹タンパク質製剤中の炭酸ナトリウム及び臭化リチウムの定量的決定のために適用することができる。
【0047】
図６は、抽出及び溶解工程の間に、本開示の絹タンパク質断片溶液を産生するプロセスの間に改変され得る様々なパラメータを示すフローチャートである。選択方法のパラメータは、使用目的、例えば、分子量及び多分散性に依存して、明確な最終溶液の特徴を達成するように変更することができる。例証される工程の全てが、必ずしも、本開示の全ての絹溶液を製作するために必要とされるわけではないことを理解すべきである。
【0048】
一実施形態では、幅広い適用のために有用な絹タンパク質断片溶液は、以下の工程に従って調製される：Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉのカイコからの絹繭の小片を形成する工程；Ｎａ２ＣＯ３水溶液中で約１００℃において約６０分間、小片を抽出して（水の容量は、未加工の絹重量の約０．４×に等しく、Ｎａ２ＣＯ３の量は、小片の重量の約０．８４８×である）、絹フィブロイン抽出物を形成する工程；絹フィブロイン抽出物を、約６０℃で、リンス水の容量中での１回のリンス当たり約２０分間にわたり３回リンスする工程（各サイクルについてのリンス水は、小片の重量の約０．２Ｌ×に等しい）、絹フィブロイン抽出物から過剰な水を除去する工程、絹フィブロイン抽出物を乾燥する工程、乾燥絹フィブロイン抽出物をＬｉＢｒ溶液中に溶解する工程（ＬｉＢｒ溶液がまず約１００℃に加熱されて、絹及びＬｉＢｒ溶液を作製し、維持される）、絹及びＬｉＢｒ溶液を、約１００℃で約６０分間にわたり乾燥オーブン中に入れ、天然絹タンパク質構造の完全な溶解及び更なる断片化を、所望の分子量及び多分散性を伴う混合物中に達成する工程、溶液を濾過して、カイコからの全ての残る残骸を除去する工程、溶液を水で希釈して、１．０重量％絹溶液をもたらす工程、及び接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して溶液から溶媒を除去する工程。一実施形態では、１０ｋＤａの膜を利用して絹溶液を精製し、最終的な所望の絹と水の比をもたらす。ＴＦＦを次に使用して、絹溶液を、水中の２．０重量％絹の濃度まで更に濃縮することができる。
【0049】
任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、抽出（すなわち、時間及び温度）、ＬｉＢｒ（すなわち、絹フィブロイン抽出物に添加される、又はその逆の場合でのＬｉＢｒ溶液の温度）、及び溶解（すなわち、時間及び温度）パラメータを変動させると、異なる粘度、均一性、及び色を伴う溶媒及び絹溶液がもたらされる。また、いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、抽出のための温度を上昇させること、抽出時間を延長すること、絹を溶解する場合に、出現時に及び長期にわたって、より高い温度のＬｉＢｒ溶液を使用すること、並びに（例えば、本明細書に示すようなオーブン、又は代替の熱源における）温度での時間を増加させることは全て、より低い粘性の、かつより均一な溶媒及び絹溶液をもたらした。
【0050】
抽出工程は、６０℃～１００℃での又はその間の温度を維持することができる、より大きな容器、例えば、工業用洗浄機械中で完了することができる。リンス工程を、また、工業用洗浄機械において完了することができ、手動でのリンスサイクルを排除する。ＬｉＢｒ溶液中での絹の溶解は、対流式オーブン以外の容器、例えば、撹拌槽型反応器中で生じ得る。一連の水の変化を通じて絹を透析することは、手作業であり、時間集中的なプロセスであり、特定のパラメータを変化させること、例えば、透析前に絹溶液を希釈することにより加速することができる。透析プロセスは、半自動装置、例えば、接線流濾過システムを使用することにより、製造のために増減させることができる。
【0051】
抽出（すなわち、時間及び温度）、ＬｉＢｒ（すなわち、絹フィブロイン抽出物に添加される又はその逆の場合でのＬｉＢｒ溶液の温度）、及び溶解（すなわち、時間及び温度）パラメータを変動させると、異なる粘度、均一性、及び色を伴う溶媒及び絹溶液がもたらされる。抽出のための温度を増加させること、抽出時間を延長すること、絹を溶解させる場合に、出現時及び長期にわたって、より高い温度のＬｉＢｒ溶液を使用すること、及び（例えば、本明細書中に示すようなオーブン中、又は代替の熱源）の温度での時間を増加させることは、全て、粘性がより低く、より均一な溶媒及び絹溶液をもたらす。ほとんど全てのパラメータが、実行可能な絹溶液をもたらす一方で、完全な溶解を４～６時間よりも短い時間で達成させるような方法が、プロセススケーラビリティのために好ましい。
【0052】
一実施形態では、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａの間から選択される重量平均を有する絹フィブロインタンパク質断片の溶液を、以下の工程に従って調製する：約３０分～約６０分の処置時間にわたり、絹供給源を、沸騰（１００℃）炭酸ナトリウムの水溶液に添加することにより、絹供給源を脱ガムする工程、溶液からセリシンを除去して、非検出レベルのセリシンを含む絹フィブロイン抽出物を産生する工程、絹フィブロイン抽出物から溶液を排出する工程、絹フィブロイン抽出物を、約６０℃～約１４０℃の範囲の臭化リチウム溶液中での絹フィブロイン抽出物の配置時に、開始温度を有する臭化リチウムの溶液中に溶解する工程、約１４０℃の温度を有するオーブン中の絹フィブロイン－臭化リチウムの溶液を、最大で１時間にわたり維持する工程、絹フィブロイン抽出物から臭化リチウムを除去する工程、並びに絹タンパク質断片の水溶液を産生する工程（水溶液は、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａから選択される重量平均分子量、及び１～約５、又は約１．５～約３．０の多分散性を有する断片を含む）。本方法は、更に、溶解工程の前に、絹フィブロイン抽出物を乾燥させることを含み得る。絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー臭化リチウムアッセイを使用して測定される３００ｐｐｍ未満の臭化リチウム残渣を含み得る。絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー炭酸ナトリウムアッセイを使用して測定される１００ｐｐｍ未満の炭酸ナトリウム残渣を含み得る。絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、凍結乾燥してもよい。いくつかの実施形態では、絹フィブロインタンパク質断片溶液は、ゲル、粉末、及びナノファイバーを含む様々な形態中に更に加工されてもよい。
【0053】
一実施形態では、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａの間から選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインタンパク質断片の溶液を、以下の工程に従って調製する：脱ガムをもたらすように、約３０分～約６０分の処置時間にわたり、炭酸ナトリウムの沸騰（１００℃）水溶液に絹供給源を添加する工程、この溶液からセリシンを除去して、検出不可能なレベルのセリシンを含む絹フィブロイン抽出物を産生する工程、絹フィブロイン抽出物から溶液を排出する工程、約８０℃～約１４０℃の範囲の臭化リチウム溶液中での絹フィブロイン抽出物の配置時に、開始温度を有する臭化リチウム溶液中に絹フィブロイン抽出物を溶解する工程、絹フィブロイン－臭化リチウムの溶液を、約６０℃～約１００℃の範囲中の温度を有する乾燥オーブン中で、最大で１時間の期間にわたり維持する工程、絹フィブロイン抽出物から臭化リチウムを除去する工程、並びに、絹フィブロインタンパク質断片の水溶液を産生する工程（絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、約１０ｐｐｍ～約３００ｐｐｍの臭化リチウム残渣を含み、絹タンパク質断片の水溶液は、約１０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍの炭酸ナトリウム残渣を含み、絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａから選択される重量平均分子量及び１～約５、又は約１．５～約３．０の多分散性を有する断片を含む）。本方法は、更に、溶解工程の前に、絹フィブロイン抽出物を乾燥させることを含み得る。絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー臭化リチウムアッセイを使用して測定される３００ｐｐｍ未満の臭化リチウム残渣を含み得る。絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー炭酸ナトリウムアッセイを使用して測定される１００ｐｐｍ未満の炭酸ナトリウム残渣を含み得る。
【0054】
いくつかの実施形態では、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａの間から選択される平均重量平均分子量を有する絹フィブロインタンパク質断片の水溶液を調製するための方法は、以下の工程を含む：約３０分～約６０分の処置時間にわたり、絹供給源を、炭酸ナトリウムの沸騰（１００℃）水溶液に添加することにより、絹供給源を脱ガムする工程、この溶液からセリシンを除去して、検出不可能なレベルのセリシンを含む絹フィブロイン抽出物を産生する工程、絹フィブロイン抽出物から溶液を排出する工程、絹フィブロイン抽出物を、約６０℃～約１４０℃の範囲の臭化リチウム溶液中での絹フィブロイン抽出物の配置時に、開始温度を有する臭化リチウムの溶液中に溶解する工程、約１４０℃の温度を有するオーブン中で、絹フィブロイン－臭化リチウムの溶液を少なくとも１時間の期間にわたり維持する工程、絹フィブロイン抽出物から臭化リチウムを除去する工程、並びに、絹タンパク質断片の水溶液を産生する工程（水溶液は、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａから選択される平均重量平均分子量及び１～約５、又は約１．５～約３．０の多分散性を有する断片を含む）。本方法は、更に、溶解工程の前に、絹フィブロイン抽出物を乾燥させることを含み得る。純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー臭化リチウムアッセイを使用して測定される３００ｐｐｍ未満の臭化リチウム残渣を含み得る。純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー炭酸ナトリウムアッセイを使用して測定される１００ｐｐｍ未満の炭酸ナトリウム残渣を含み得る。本方法は、更に、治療用薬剤を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。本方法は、更に、酸化防止剤又は酵素のうちの１つから選択される分子を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。本方法は、更に、ビタミンを、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。このビタミンは、ビタミンＣ又はその誘導体であってよい。純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、凍結乾燥してもよい。本方法は、更に、アルファヒドロキシ酸を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。アルファヒドロキシ酸は、グリコール酸、乳酸、酒石酸、及びクエン酸からなる群から選択することができる。本方法は、更に、約０．５％～約１０．０％の濃度のヒアルロン酸又はその塩形態を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。本方法は、更に、酸化亜鉛又は二酸化チタンのうちの少なくとも１つを添加することを含み得る。フィルムを、本方法により産生される純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液から作製してもよい。フィルムは、約１．０重量％～約５０．０重量％のビタミンＣ又はその誘導体を含み得る。フィルムは、約２．０重量％～約２０．０重量％の範囲の水含量を有し得る。フィルムは、約３０．０重量％～約９９．５重量％の純粋な絹フィブロインタンパク質断片を含み得る。ゲルを、本方法により産生される純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液から作製することができる。ゲルは、約０．５重量％～約２０．０重量％のビタミンＣ又はその誘導体を含み得る。ゲルは、少なくとも２％の絹含量及び少なくとも２０％のビタミン含量を有し得る。
【0055】
いくつかの実施形態では、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａの間から選択される平均重量平均分子量を有する絹フィブロインタンパク質断片の水溶液を調製するための方法は、以下の工程を含む：脱ガムをもたらすために、約３０分～約６０分の処置時間にわたり絹供給源を、炭酸ナトリウムの沸騰（１００℃）水溶液に添加する工程、この溶液からセリシンを除去して、検出不可能なレベルのセリシンを含む絹フィブロイン抽出物を産生する工程、絹フィブロイン抽出物から溶液を排出する工程、約８０℃～約１４０℃の範囲の臭化リチウム溶液中での絹フィブロイン抽出物の配置時に、開始温度を有する臭化リチウム溶液中に絹フィブロイン抽出物を溶解する工程、約６０℃～約１００℃の間の範囲の温度を有するオーブン中で、絹フィブロイン－臭化リチウムの溶液を少なくとも１時間の期間にわたり維持する工程、絹フィブロイン抽出物から臭化リチウムを除去する工程、並びに、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液を産生する工程（純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、約１０ｐｐｍ～約３００ｐｐｍの臭化リチウム残渣を含み、絹タンパク質断片の水溶液は、約１０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍの炭酸ナトリウム残渣を含み、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａから選択される平均重量平均分子量、及び１～約５、又は約１．５～約３．０の多分散性を有する断片を含む）。本方法は、更に、溶解工程の前に、絹フィブロイン抽出物を乾燥させることを含み得る。純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー臭化リチウムアッセイを使用して測定される３００ｐｐｍ未満の臭化リチウム残渣を含み得る。純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー炭酸ナトリウムアッセイを使用して測定される１００ｐｐｍ未満の炭酸ナトリウム残渣を含み得る。本方法は、更に、治療用薬剤を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。本方法は、更に、酸化防止剤又は酵素のうちの１つから選択される分子を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。本方法は、更に、ビタミンを、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。このビタミンは、ビタミンＣ又はその誘導体であってよい。純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、凍結乾燥してもよい。本方法は、更に、アルファヒドロキシ酸を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。アルファヒドロキシ酸は、グリコール酸、乳酸、酒石酸、及びクエン酸からなる群から選択することができる。本方法は、更に、約０．５％～約１０．０％の濃度のヒアルロン酸又はその塩形態を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。本方法は、更に、酸化亜鉛又は二酸化チタンのうちの少なくとも１つを添加することを含み得る。フィルムを、本方法により産生される純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液から作製してもよい。フィルムは、約１，０重量％～約５０．０重量％のビタミンＣ又はその誘導体を含み得る。フィルムは、約２．０重量％～約２０．０重量％の範囲の水含量を有し得る。フィルムは、約３０．０重量％～約９９．５重量％の純粋な絹フィブロインタンパク質断片を含み得る。ゲルを、本方法により産生される純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液から作製することができる。ゲルは、約０．５重量％～約２０．０重量％のビタミンＣ又はその誘導体を含み得る。ゲルは、少なくとも２％の絹含量及び少なくとも２０％のビタミン含量を有し得る。
【0056】
一実施形態では、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａの間から選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインタンパク質断片の溶液は、以下の工程に従って調製される：脱ガムをもたらすために、約３０分の処置時間にわたり絹供給源を、炭酸ナトリウムの沸騰（１００℃）水溶液に添加する工程、この溶液からセリシンを除去して、検出不可能なレベルのセリシンを含む絹フィブロイン抽出物を産生する工程、絹フィブロイン抽出物から溶液を排出する工程、約８０℃～約１４０℃の範囲の臭化リチウム溶液中での絹フィブロイン抽出物の配置時に、開始温度を有する臭化リチウム溶液中に絹フィブロイン抽出物を溶解する工程、絹フィブロイン－臭化リチウムの溶液を、約６０℃～約１００℃の範囲中の温度を有する乾燥オーブン中で、最大で１時間の期間にわたり維持する工程、絹フィブロイン抽出物から臭化リチウムを除去する工程、並びに、絹フィブロインタンパク質断片の水溶液を産生する工程（絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、約１０ｐｐｍ～約３００ｐｐｍの臭化リチウム残渣、約１０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍの炭酸ナトリウム残渣、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａから選択される重量平均分子量、及び１～約５、又は約１．５～約３．０の多分散性を有する断片を含む）。本方法は、更に、溶解工程の前に、絹フィブロイン抽出物を乾燥させることを含み得る。絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー臭化リチウムアッセイを使用して測定される３００ｐｐｍ未満の臭化リチウム残渣を含み得る。絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー炭酸ナトリウムアッセイを使用して測定される１００ｐｐｍ未満の炭酸ナトリウム残渣を含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、更に、活性剤（例えば、治療用薬剤）を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含むことができる。本方法は、更に、酸化防止剤又は酵素のうちの１つから選択される活性剤を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。本方法は、更に、ビタミンを、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。このビタミンは、ビタミンＣ又はその誘導体であってよい。純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液は、凍結乾燥してもよい。本方法は、更に、アルファ－ヒドロキシ酸を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。アルファヒドロキシ酸は、グリコール酸、乳酸、酒石酸、及びクエン酸からなる群から選択することができる。本方法は、更に、約０．５％～約１０．０％の濃度のヒアルロン酸又はその塩形態を、純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液に添加することを含み得る。フィルムを、本方法により産生される純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液から作製してもよい。フィルムは、約１．０重量％～約５０．０重量％のビタミンＣ又はその誘導体を含み得る。フィルムは、約２．０重量％～約２０．０重量％の範囲の水含量を有し得る。フィルムは、約３０．０重量％～約９９．５重量％の純粋な絹フィブロインタンパク質断片を含み得る。ゲルを、本方法により産生される純粋な絹フィブロインタンパク質断片の水溶液から作製することができる。ゲルは、約０．５重量％～約２０．０重量％のビタミンＣ又はその誘導体を含み得る。ゲルは、少なくとも２重量％の絹含量及び少なくとも２０重量％のビタミン含量を有し得る。
【0057】
絹タンパク質断片の分子量は、抽出時間及び温度を含む、抽出工程の間に利用される特定のパラメータ、臭化リチウム中への絹の浸漬の時間でのＬｉＢｒ温度及び溶液が特定の温度で維持される時間を含む、溶解工程の間に利用される特定のパラメータ、並びに濾過工程の間に利用される特定のパラメータに基づいて制御され得る。本開示の方法を使用してプロセスパラメータを制御することにより、５ｋＤａ～２００ｋＤａ、又は１０ｋＤａ～８０ｋＤａから選択される様々な異なる分子量で、２．５と等しい又はそれよりも低い多分散性を伴う絹フィブロインタンパク質断片溶液を作製することが可能である。異なる分子量を伴う絹溶液を達成するためにプロセスパラメータを変更することにより、所望の性能要件に基づき、２．５と等しい又はそれよりも低い、望ましい多分散性を伴う断片混合物最終産物の範囲を標的とすることができる。例えば、眼科用薬物を含む高分子量絹フィルムは、より低分子量のフィルムと比較して、制御された徐放速度を有してもよく、アイケア製品における送達賦形剤のために理想的となる。追加的に、２．５を超える多分散性を伴う絹フィブロインタンパク質断片溶液を達成することができる。更に、異なる平均分子量及び多分散性を伴う２つの溶液を混合して、組み合わせ溶液を作製することができる。あるいは、カイコから直接除去された液体絹糸腺（１００％セリシン不含絹タンパク質）を、本開示の絹フィブロインタンパク質断片溶液のいずれかとの組み合わせにおいて使用することができる。純粋な絹フィブロインタンパク質断片組成物の分子量を、屈折率検出器（ＲＩＤ）を伴う高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して決定した。多分散性を、Ｃｉｒｒｕｓ ＧＰＣオンラインＧＰＣ／ＳＥＣソフトウェアバージョン３．３（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して算出した。
【0058】
処理パラメータにおける差は、分子量、及びペプチド鎖サイズ分布（多分散性、ＰＤ）において変動する再生絹フィブロインをもたらし得る。これは、次に、機械的強度、水可溶性などを含む、再生絹フィブロインの性能に影響を及ぼす。
【0059】
パラメータを、未加工の絹繭を処理して絹溶液にする間に変動させた。これらのパラメータを変動させることによって、結果として得られる絹溶液のＭＷに影響を及ぼした。操作されたパラメータは、（ｉ）抽出の時間及び温度、（ｉｉ）ＬｉＢｒの温度、（ｉｉｉ）溶解オーブンの温度、及び（ｉｖ）溶解時間を含んだ。実験を、抽出時間を変動させることの効果を決定するために行った。表１～７に結果をまとめる。以下がまとめである：
・３０分間のセリシン抽出時間は、６０分間のセリシン抽出時間よりも大きい分子量をもたらした。
・分子量はオーブン中で時間の経過とともに減少する。
・１４０℃ ＬｉＢｒ及びオーブンは、９５００Ｄａの分子量を下回る信頼区間の下限をもたらした
・１時間目及び４時間目での３０分間の抽出では、未消化の絹を有する。
・１時間目での３０分間の抽出は、３５，０００Ｄａである信頼区間の下限を伴う、有意に高い分子量をもたらした。
・信頼区間の上限に達した分子量の範囲は、１８０００～２１６０００Ｄａ（特定の上限値を伴う溶液を提供するために重要である）であった。
・３０分間のセリシン抽出時間は、６０分間のセリシン抽出時間よりも大きい分子量をもたらした。
・分子量はオーブン中で時間の経過とともに減少する。
・１４０℃ ＬｉＢｒ及びオーブンは、９５００Ｄａの分子量を下回る信頼区間の下限をもたらした
・１時間目及び４時間目での３０分間の抽出では、未消化の絹を有する。
・１時間目での３０分間の抽出は、３５，０００Ｄａである信頼区間の下限を伴う、有意に高い分子量をもたらした。
・信頼区間の上限に達した分子量の範囲は、１８０００～２１６０００Ｄａ（特定の上限値を伴う溶液を提供するために重要である）であった。
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【0060】
実験を、抽出温度を変動させた効果を決定するために行った。表７に結果をまとめる。以下がまとめである：
・９０℃でのセリシン抽出は、１００℃抽出でのセリシン抽出より高いＭＷをもたらした
・９０℃及び１００℃の両方が、オーブン中での経時的なＭＷの減少を示す。
・９０℃でのセリシン抽出は、１００℃抽出でのセリシン抽出より高いＭＷをもたらした
・９０℃及び１００℃の両方が、オーブン中での経時的なＭＷの減少を示す。
【表8】
【0061】
実験を行って、絹に添加された場合の臭化リチウム（ＬｉＢｒ）温度を変動させた効果を決定した。表８～９に結果をまとめる。以下がまとめである：
・分子量又は信頼区間に対する影響はなし（全て、ＣＩ約１０５００～６５００Ｄａ）
・試験によって、ＬｉＢｒが添加され、溶解を始めると、ＬｉＢｒ－絹溶解の温度が、室温でその質量の大部分が絹であることに起因して、元のＬｉＢｒ温度を下回って迅速に下落することが例証される。
・分子量又は信頼区間に対する影響はなし（全て、ＣＩ約１０５００～６５００Ｄａ）
・試験によって、ＬｉＢｒが添加され、溶解を始めると、ＬｉＢｒ－絹溶解の温度が、室温でその質量の大部分が絹であることに起因して、元のＬｉＢｒ温度を下回って迅速に下落することが例証される。
【表9】
【表10】
【0062】
実験を、オーブン／溶解温度の効果を決定するために行った。表１０～１４に結果をまとめる。以下がまとめである：
・オーブン温度は、３０分間抽出された絹より、６０分間抽出された絹に対して、より少ない効果を有する。理論により拘束されることを望まないが、３０分絹は、抽出の間にそれほど分解されず、したがって、オーブン温度は、より大きなＭＷに対してより多くの効果を有しており、絹の分解部分がより少ないと考えられる。
・６０℃対１４０℃オーブンについて、３０分間抽出された絹は、より高いオーブン温度で、より低いＭＷの非常に有意な効果を示した一方で、６０分間抽出された絹は、効果を有したが、しかし、それはずっと少なかった。
・１４０℃オーブンは、約６０００Ｄａで信頼区間における下限をもたらした。
・オーブン温度は、３０分間抽出された絹より、６０分間抽出された絹に対して、より少ない効果を有する。理論により拘束されることを望まないが、３０分絹は、抽出の間にそれほど分解されず、したがって、オーブン温度は、より大きなＭＷに対してより多くの効果を有しており、絹の分解部分がより少ないと考えられる。
・６０℃対１４０℃オーブンについて、３０分間抽出された絹は、より高いオーブン温度で、より低いＭＷの非常に有意な効果を示した一方で、６０分間抽出された絹は、効果を有したが、しかし、それはずっと少なかった。
・１４０℃オーブンは、約６０００Ｄａで信頼区間における下限をもたらした。
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【0063】
カイコであるＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉからの未加工の絹繭を、小片に切断した。未加工の絹繭の小片を、Ｎａ２ＣＯ３（約１００℃）の水溶液中で約３０分～約６０分の時間にわたり沸騰させて、セリシンを除去した（脱ガム）。使用される水の容量は、約０．４×未加工の絹重量と等しく、Ｎａ２ＣＯ３の量は、未加工の絹繭小片の重量の約０．８４８×である。結果として得られる、脱ガムされた絹繭小片を、約６０℃で脱イオン水で３回リンスした（２０分／リンス）。各サイクルについてのリンス水の容量は、０．２Ｌ×未加工の絹繭小片の重量であった。脱ガムされた絹繭小片からの過剰な水を除去した。ＤＩ水洗浄工程の後、湿潤の、脱ガムされた絹繭小片を室温で乾燥させた。脱ガムされた絹繭小片をＬｉＢｒ溶液と混合し、混合物を約１００℃まで加熱した。温めた混合物を乾燥オーブン中に入れ、約６０℃～約１４０℃の範囲の温度で約６０分間にわたり加熱して、天然絹タンパク質の完全な溶解を達成した。結果として得られる溶液を室温まで冷却し、次に、３，５００ＤａのＭＷＣＯ膜を使用してＬｉＢｒ塩を除去するために透析した。複数の交換を、オクトンブロマイド（Ｂｒ－）二重接合イオン選択電極上の加水分解フィブロイン溶液リードにおいて決定されたように、Ｂｒ－イオンが１ｐｐｍ未満になるまで、Ｄｉ水中で実施した。
【0064】
結果として得られる絹フィブロイン水溶液は、約６ｋＤａ～約１６ｋＤａ、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａ、及び約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａの間から選択される平均重量平均分子量並びに約１．５～約３．０の多分散性を有する純粋な絹フィブロインタンパク質断片を含む約８．０％ｗ／ｖの濃度を有する。８．０％ｗ／ｖをＤＩ水で希釈し、１．０％ｗ／ｖ、２．０％ｗ／ｖ、３．０％ｗ／ｖ、４．０％ｗ／ｖ、５．０％ｗ／ｖコーティング溶液を提供した。
【0065】
様々な％の絹濃度が、接線流濾過（ＴＦＦ）の使用を通じて産生されている。全ての場合において、１％絹溶液を入力フィードとして使用した。１％絹溶液７５０～１８，０００ｍＬの範囲を、開始容積として使用した。溶液をＴＦＦにおいて透析濾過し、臭化リチウムを除去する。一度、残留ＬｉＢｒの指定レベルを下回ると、溶液は、限外濾過を受けて、水の除去を通じて濃度を増加させる。以下の例を参照のこと。
【0066】
６つの絹溶液を、標準的な絹構造において利用し、以下の結果を伴った：
溶液＃１は、５．９重量％の絹濃度、１９．８ｋＤａの平均ＭＷ、及び２．２ＰＤＩである（６０分の沸騰抽出、１時間にわたる１００℃のＬｉＢｒ溶解で作製）。
溶液＃１は、５．９重量％の絹濃度、１９．８ｋＤａの平均ＭＷ、及び２．２ＰＤＩである（６０分の沸騰抽出、１時間にわたる１００℃のＬｉＢｒ溶解で作製）。
【0067】
溶液＃２は、６．４重量％の絹濃度である（３０分の沸騰抽出、４時間にわたる６０℃のＬｉＢｒ溶解で作製）。
【0068】
溶液＃３は、６．１７重量％の絹濃度である（３０分の沸騰抽出、１時間にわたる１００℃のＬｉＢｒ溶解で作製）。
【0069】
溶液＃４は、７．３０重量％の絹濃度である：７．３０％の絹溶液を、１バッチ当たり１００ｇの絹繭の３０分抽出バッチから産生した。抽出された絹線維を次に、１００℃の９．３Ｍ ＬｉＢｒを使用して、１００℃のオーブン中で１時間にわたり溶解した。１００ｇの絹線維を１バッチ当たりに溶解し、ＬｉＢｒ中の２０％絹を作製した。ＬｉＢｒ中に溶解された絹を次に、１％の絹に希釈し、５μｍフィルタを通して濾過し、大きな残骸を除去した。１５，５００ｍＬの１％濾過絹溶液を、ＴＦＦの開始容積／透析濾過容積として使用した。一度、ＬｉＢｒが除去されれば、この溶液を１３００ｍＬ前後の容積に限外濾過した。１２６２ｍＬの７．３０％絹を次に回収した。水を供給液に添加し、残りの溶液を除去するのを助け、５４７ｍＬの３．９１％絹を次に回収した。
【0070】
溶液＃５は、６．４４重量％の絹濃度である：６．４４重量％の絹溶液を、１バッチ当たり２５、３３、５０、７５、及び１００ｇの絹繭の混合物の６０分抽出バッチで開始して産生した。抽出された絹線維を次に、１００℃の９．３Ｍ ＬｉＢｒを使用して、１００℃のオーブン中で１時間にわたり溶解した。絹線維の１バッチ当たり３５、４２、５０、及び７１ｇを溶解して、ＬｉＢｒ中の２０％絹を作製し、合わせた。ＬｉＢｒ中の溶解された絹を次に、１％の絹に希釈し、５μｍフィルタを通して濾過し、大きな残骸を除去した。１７，０００ｍＬの１％濾過絹溶液を、ＴＦＦの開始容積／透析濾過容積として使用した。一度、ＬｉＢｒが除去されれば、この溶液を３０００ｍＬ前後の容積に限外濾過した。１４９０ｍＬの６．４４％絹を次に回収した。水を供給液に添加し、残りの溶液を除去するのを助け、１４５４ｍＬの４．８８％絹を次に回収した。
【0071】
溶液＃６は、２．７０重量％の絹濃度である：２．７０％の絹溶液を、１バッチ当たり２５ｇの絹繭の６０分抽出バッチで開始して産生した。抽出された絹線維を次に、１００℃の９．３Ｍ ＬｉＢｒを使用して、１００℃のオーブン中で１時間にわたり溶解した。３５．４８ｇの絹線維を１バッチ当たり溶解し、ＬｉＢｒ中の２０％の絹を作製した。ＬｉＢｒ中に溶解された絹を次に、１％の絹に希釈し、５μｍフィルタを通して濾過し、大きな残骸を除去した。１０００ｍＬの１％濾過絹溶液を、ＴＦＦの開始容積／透析濾過容積として使用した。一度、ＬｉＢｒが除去されれば、この溶液を３００ｍＬ前後の容積に限外濾過した。３１２ｍＬの２．７％の絹を次に回収した。
【0072】
高分子量を伴う絹フィブロイン溶液の調製を表１５中に与える。
【表16】
【0073】
織物への適用のための絹水性コーティング組成物を、以下の表１６及び１７中に与える。
【表17】
【表18】
【0074】
３つの絹溶液をフィルム製造において利用し、以下の結果を伴った：
溶液＃１は、５．９％の絹濃度、１９．８ｋＤａの平均ＭＷ、及び２．２ＰＤ（６０分間の沸騰抽出、１時間にわたる１００℃のＬｉＢｒ溶解で作製）である。
溶液＃１は、５．９％の絹濃度、１９．８ｋＤａの平均ＭＷ、及び２．２ＰＤ（６０分間の沸騰抽出、１時間にわたる１００℃のＬｉＢｒ溶解で作製）である。
【0075】
溶液＃２は、６．４％の絹濃度（３０分間の沸騰抽出、４時間にわたる６０℃のＬｉＢｒ溶解で作製）である。
【0076】
溶液＃３は、６．１７％の絹濃度（３０分間の沸騰抽出、１時間にわたる１００℃ ＬｉＢｒ溶解で作製）である。
【0077】
フィルムは、Ｒｏｃｋｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｖｏｌ． ６；Ｎｏ． １０；オンライン公開日：２０１１年９月２２日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１１．３７９）に従って作製した。４ｍＬの１％又は２％（重量／容積）の絹水溶液を１００ｍｍのペトリ皿中に添加し（絹の容積は、より厚い又はより薄いフィルムについて変動することができ、重要ではない）、覆いのない状態で一晩乾燥させた。真空デシケーターの底部を水で満たした。乾燥フィルムをデシケーター中に置き、真空適用して、ディッシュからの除去の前にフィルムを４時間にわたり水アニーリングさせた。溶液＃１から成型されたフィルムは、構造的に連続的なフィルムをもたらさなかった。フィルムはいくつかの小片に割れていた。これらのフィルムの小片は、水アニーリング処置にも関わらず水中に溶解した。
【0078】
様々な分子量の絹溶液及び／又は分子量の組み合わせは、ゲル適用のために最適化することができる。以下は、本プロセスの例を提供するが、しかし、それは、適用又は製剤化において限定することを意図しない。３つの絹溶液をゲル作製において利用し、以下の結果を伴った：
溶液＃１は、５．９％の絹濃度、１９．８ｋＤａの平均ＭＷ、及び２．２ＰＤ（６０分間の沸騰抽出、１時間にわたる１００℃のＬｉＢｒ溶解で作製）である。
溶液＃１は、５．９％の絹濃度、１９．８ｋＤａの平均ＭＷ、及び２．２ＰＤ（６０分間の沸騰抽出、１時間にわたる１００℃のＬｉＢｒ溶解で作製）である。
【0079】
溶液＃２は、６．４％の絹濃度（３０分間の沸騰抽出、４時間にわたる６０℃のＬｉＢｒ溶解で作製）である。
【0080】
溶液＃３は、６．１７％の絹濃度（３０分間の沸騰抽出、１時間にわたる１００℃ ＬｉＢｒ溶解で作製）である。
【0081】
「Ｅｇｅｌ」は、Ｒｏｃｋｗｏｏｄ ｏｆ ａｌ．において記載されているようなエレクトロゲル化プロセスである。簡潔には、１０ｍｌの絹水溶液を、５０ｍｌの円錐形チューブに添加し、一対の白金線電極を絹溶液中に浸漬させた。２０ボルトの電位を、プラチナ電極に５分間にわたり印加し、電源をオフにしてゲルを回収した。溶液＃１は、５分間の印加電流にわたってＥＧＥＬを形成しなかった。
【0082】
溶液＃２及び＃３を、公開された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）プロトコルに従ってゲル化した。挙動は、公開された溶液に典型であるように思われた。
【0083】
材料及び方法：以下の装置及び材料が、絹分子量の決定において使用される： ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒ．１０．０１を有するＡｇｉｌｅｎｔ １１００、屈折率検出器（ＲＩＤ）、分析バランス、メスフラスコ（１０００ｍＬ、１０ｍＬ、及び５ｍＬ）、ＨＰＬＣグレードの水、ＡＣＳグレードの塩化ナトリウム、ＡＣＳグレードのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物、リン酸、デキストランＭＷ標準－公称分子量５ｋＤａ、１１．６ｋＤａ、２３．８ｋＤａ、４８．６ｋＤａ、及び１４８ｋＤａ、５０ｍＬ ＰＥＴ又はポリプロピレン製ディスポーザブル遠心チューブ、目盛り付きピペット、テフロン（登録商標）性キャップを伴う褐色ガラスＨＰＬＣバイアル；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＰｏｌｙＳｅｐ ＧＦＣ Ｐ－４０００カラム（サイズ：７．８ｍｍ×３００ｍｍ）。
【0084】
手順工程：
Ａ）１Ｌ移動相（０．０１２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液）の調製。
２５０ｍＬの清潔な乾燥したビーカーを取り、それをバランス上に置き、風袋の重さを量る。約３．３５０９ｇのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物をビーカーに添加する。リン酸ナトリウム二塩基の正確な重量を量ったことを書き留める。１００ｍＬのＨＰＬＣ水をビーカー中に添加することにより、秤量されたリン酸ナトリウムを溶解する。ビーカーの内容物をこぼさないように注意する。溶液を、清潔で乾燥した１０００ｍＬのメスフラスコ中に注意深く移す。ビーカーをリンスし、リンス液をメスフラスコ中に移す。リンスを４～５回繰り返す。別個の清潔で乾燥した２５０ｍＬのビーカー中に、正確に約５．８４４０ｇの塩化ナトリウムを秤量する。秤量した塩化ナトリウムを５０ｍＬの水中に溶解し、溶液を、メスフラスコ中のリン酸ナトリウム溶液に移す。ビーカーをリンスし、リンス液をメスフラスコ中に移す。リン酸を用いて、溶液のｐＨを７．０±０．２に調整する。ＨＰＬＣ水でメスフラスコ中の容積を１０００ｍＬにして、激しく撹拌し、溶液を均一に混合する。この溶液を、０．４５μｍのポリアミド膜フィルタを通して濾過する。この溶液を清潔な乾燥溶媒ボトルに移し、ボトルにラベルを付ける。この溶液の容積は、リン酸ナトリウム二塩基性七水和物及び塩化ナトリウムの量を対応するように変動させることにより、要件に対して変動させることができる。
Ａ）１Ｌ移動相（０．０１２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液）の調製。
２５０ｍＬの清潔な乾燥したビーカーを取り、それをバランス上に置き、風袋の重さを量る。約３．３５０９ｇのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物をビーカーに添加する。リン酸ナトリウム二塩基の正確な重量を量ったことを書き留める。１００ｍＬのＨＰＬＣ水をビーカー中に添加することにより、秤量されたリン酸ナトリウムを溶解する。ビーカーの内容物をこぼさないように注意する。溶液を、清潔で乾燥した１０００ｍＬのメスフラスコ中に注意深く移す。ビーカーをリンスし、リンス液をメスフラスコ中に移す。リンスを４～５回繰り返す。別個の清潔で乾燥した２５０ｍＬのビーカー中に、正確に約５．８４４０ｇの塩化ナトリウムを秤量する。秤量した塩化ナトリウムを５０ｍＬの水中に溶解し、溶液を、メスフラスコ中のリン酸ナトリウム溶液に移す。ビーカーをリンスし、リンス液をメスフラスコ中に移す。リン酸を用いて、溶液のｐＨを７．０±０．２に調整する。ＨＰＬＣ水でメスフラスコ中の容積を１０００ｍＬにして、激しく撹拌し、溶液を均一に混合する。この溶液を、０．４５μｍのポリアミド膜フィルタを通して濾過する。この溶液を清潔な乾燥溶媒ボトルに移し、ボトルにラベルを付ける。この溶液の容積は、リン酸ナトリウム二塩基性七水和物及び塩化ナトリウムの量を対応するように変動させることにより、要件に対して変動させることができる。
【0085】
Ｂ）デキストラン分子量標準液の調製
少なくとも５つの異なる分子量標準が、試験されるサンプルの期待値が、使用される標準の値により挟まれるように、実行されるサンプルの各バッチについて使用される。６本の２０ｍＬシンチレーションガラスバイアルを、分子量標準に対してそれぞれラベルする。約５ｍｇの各々のデキストラン分子量標準を正確に秤量し、重量を記録する。デキストラン分子量標準を５ｍＬの移動相中に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの標準溶液を作製する。
少なくとも５つの異なる分子量標準が、試験されるサンプルの期待値が、使用される標準の値により挟まれるように、実行されるサンプルの各バッチについて使用される。６本の２０ｍＬシンチレーションガラスバイアルを、分子量標準に対してそれぞれラベルする。約５ｍｇの各々のデキストラン分子量標準を正確に秤量し、重量を記録する。デキストラン分子量標準を５ｍＬの移動相中に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの標準溶液を作製する。
【0086】
Ｃ）サンプル溶液の調製
サンプル溶液を調製する際に、利用可能なサンプルの量に限界がある場合、調製物は、比率が維持されている限り調整してもよい。サンプルの種類及びサンプル中の絹タンパク質含量に依存して、５０ｍＬの使い捨て遠心チューブ中の十分なサンプルを、分析用の１ｍｇ／ｍＬサンプル溶液を作製するために、分析バランスで秤量する。サンプルを等容積の移動相中で溶解し、１ｍｇ／ｍＬ溶液を作製する。チューブを固くキャップし、サンプルを混合する（溶液中）。サンプル溶液を室温で３０分間にわたり放置する。サンプル溶液を再度１分間にわたり穏やかに混合し、４０００ＲＰＭで１０分間にわたり遠心分離する。
サンプル溶液を調製する際に、利用可能なサンプルの量に限界がある場合、調製物は、比率が維持されている限り調整してもよい。サンプルの種類及びサンプル中の絹タンパク質含量に依存して、５０ｍＬの使い捨て遠心チューブ中の十分なサンプルを、分析用の１ｍｇ／ｍＬサンプル溶液を作製するために、分析バランスで秤量する。サンプルを等容積の移動相中で溶解し、１ｍｇ／ｍＬ溶液を作製する。チューブを固くキャップし、サンプルを混合する（溶液中）。サンプル溶液を室温で３０分間にわたり放置する。サンプル溶液を再度１分間にわたり穏やかに混合し、４０００ＲＰＭで１０分間にわたり遠心分離する。
【0087】
Ｄ）サンプルのＨＰＬＣ分析
１．０ｍＬの全ての標準及びサンプル溶液を個々のＨＰＬＣバイアル中に移す。分子量標準（各々１回注入）及び各サンプルを２回ずつ注入する。以下のＨＰＬＣ条件を使用して、全ての標準及びサンプル溶液を分析する：
１．０ｍＬの全ての標準及びサンプル溶液を個々のＨＰＬＣバイアル中に移す。分子量標準（各々１回注入）及び各サンプルを２回ずつ注入する。以下のＨＰＬＣ条件を使用して、全ての標準及びサンプル溶液を分析する：
【表19】
【0088】
Ｅ）データ分析及び計算－Ｃｉｒｒｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した平均分子量の計算
標準及び分析サンプルのクロマトグラフィーデータファイルを、Ｃｉｒｒｕｓ ＳＥＣデータ収集及び分子量分析ソフトウェア中にアップロードする。サンプルの各注入についての重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、ピーク平均分子量（Ｍｐ）、及び多分散性を計算する。
標準及び分析サンプルのクロマトグラフィーデータファイルを、Ｃｉｒｒｕｓ ＳＥＣデータ収集及び分子量分析ソフトウェア中にアップロードする。サンプルの各注入についての重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、ピーク平均分子量（Ｍｐ）、及び多分散性を計算する。
【0089】
クモ絹断片
クモ絹は、３つのドメイン：タンパク質鎖を支配する反復中間コアドメイン、並びに非反復Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインからなる天然ポリマーである。大きなコアドメインは、ブロック共重合体様配置において組織化され、それにおいて、２つの基本配列、結晶性〔ポリ（Ａ）又はポリ（ＧＡ）］及びより少ない結晶性（ＧＧＸ又はＧＰＧＸＸ）ポリペプチドが交互に現れる。ドラッグライン絹（Ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ）は、大瓶状腺ドラッグライン絹タンパク質１（ＭａＳｐ１）及び大瓶状腺ドラッグライン絹タンパク質２（ＭａＳｐ２）で構成されるタンパク質複合体である。両方の絹が、およそ３５００アミノ酸長である。ＭａＳｐ１はファイバーコア及び周辺部において見出すことができるのに対し、ＭａＳｐ２は特定のコア領域中でクラスタを形成する。ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２の大きな中心ドメインは、ブロック共重合体様配置において組織化され、それにおいて、２つの基本配列、結晶性［ポリ（Ａ）又はポリ（ＧＡ）］、及びより少ない結晶性（ＧＧＸ又はＧＰＧＸＸ）ポリペプチドが、コアドメイン中で交互に現れる。特定の二次構造が、ポリ（Ａ）／（ＧＡ）、ＧＧＸ、及びＧＰＧＸＸモチーフに割り当てられ、それぞれ、βシート、βヘリックス、及びβスパイラルを含む。反復コアドメインの一次配列、組成物、及び二次構造エレメントは、クモ絹の機械的特性に関与する；それに対して、非反復Ｎ及びＣ末端ドメインは、管腔中での液体絹ドープの貯蔵及びスピニングダクト中での線維形成のために不可欠である。
クモ絹は、３つのドメイン：タンパク質鎖を支配する反復中間コアドメイン、並びに非反復Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインからなる天然ポリマーである。大きなコアドメインは、ブロック共重合体様配置において組織化され、それにおいて、２つの基本配列、結晶性〔ポリ（Ａ）又はポリ（ＧＡ）］及びより少ない結晶性（ＧＧＸ又はＧＰＧＸＸ）ポリペプチドが交互に現れる。ドラッグライン絹（Ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ）は、大瓶状腺ドラッグライン絹タンパク質１（ＭａＳｐ１）及び大瓶状腺ドラッグライン絹タンパク質２（ＭａＳｐ２）で構成されるタンパク質複合体である。両方の絹が、およそ３５００アミノ酸長である。ＭａＳｐ１はファイバーコア及び周辺部において見出すことができるのに対し、ＭａＳｐ２は特定のコア領域中でクラスタを形成する。ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２の大きな中心ドメインは、ブロック共重合体様配置において組織化され、それにおいて、２つの基本配列、結晶性［ポリ（Ａ）又はポリ（ＧＡ）］、及びより少ない結晶性（ＧＧＸ又はＧＰＧＸＸ）ポリペプチドが、コアドメイン中で交互に現れる。特定の二次構造が、ポリ（Ａ）／（ＧＡ）、ＧＧＸ、及びＧＰＧＸＸモチーフに割り当てられ、それぞれ、βシート、βヘリックス、及びβスパイラルを含む。反復コアドメインの一次配列、組成物、及び二次構造エレメントは、クモ絹の機械的特性に関与する；それに対して、非反復Ｎ及びＣ末端ドメインは、管腔中での液体絹ドープの貯蔵及びスピニングダクト中での線維形成のために不可欠である。
【0090】
ＭａＳｐ１とＭａＳｐ２との間での主な違いは、ＭａＳｐ２中の総アミノ酸含量の１５％を占めるプロリン（Ｐ）残基の存在であるのに対し、ＭａＳｐ１はプロリン不含である。Ｎ．クラビペス（Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓ）ドラッグライン絹中のプロリン残基の数を算出することにより、線維中の２つのタンパク質の存在を推定することが可能である；８１％のＭａＳｐ１及び１９％のＭａＳｐ２。異なるクモは、ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２の異なる比率を有する。例えば、オーブウィーバーＡｒｇｉｏｐｅ ａｕｒａｎｔｉａからのドラッグライン絹線維は、４１％ＭａＳｐ１及び５９％のＭａＳｐ２を含む。大瓶状腺絹の比率におけるそのような変化は、絹線維の性能を左右し得る。
【0091】
少なくとも７種類の異なる種類の絹タンパク質が、１つのオーブウィーバー種のクモについて公知である。絹は、一次配列、物理的特性及び機能において異なる。例えば、フレーム、半径、及びライフラインを構築するために使用されるドラッグライン絹は、強度、靭性、及び弾性を含む、顕著な機械的特性のため公知である。等重量ベースで、クモ絹は、鋼及びケブラー（登録商標）よりも高い靭性を有する。捕捉スパイラルにおいて見出される鞭状腺絹は、最大５００％の拡張性を有する。小瓶状腺絹は、オーブウェブの補助スパイラル及び捕食において見出され、大瓶状腺絹とほぼ同様の高い靭性及び強度を持つが、しかし、水中では超収縮しない。
【0092】
クモ絹は、それらの高い張力強度及び靭性について公知である。組換え絹タンパク質はまた、特に、保湿作用又は軟化作用、良好なフィルム形成特性、及び低表面密度を改善することができるように、美容組成物又は皮膚学的組成物に有利な特性を付与する。多様かつ固有の生体力学的特性は、生体適合性及び遅い分解速度と一緒に、クモ絹を、組織工学、誘導組織修復、及び薬物送達のための生体材料としての、美容製品（例えば、爪及び毛髪強化剤、皮膚ケア製品）、並びに産業材料（例えば、ナノワイヤ、ナノファイバー、表面コーティング）のための優れた候補にする。
【0093】
一実施形態では、絹タンパク質は、天然クモ絹タンパク質から由来するポリペプチドを含み得る。ポリペプチドは、特に、それが、天然のクモ絹タンパク質から由来する限り限定されず、ポリペプチドの例は、天然クモ絹タンパク質及び組換えクモ絹タンパク質、例えば天然クモ絹タンパク質の変異体、類似体、誘導体、又は同様のものを含む。優れた粘り強さに関して、ポリペプチドは、クモの大瓶状腺において産生されるメジャードラッグライン絹タンパク質から由来し得る。メジャードラッグライン絹タンパク質の例は、Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓからの大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びにＡｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓからのＡＤＦ３及びＡＤＦ４などを含む。主要なドラッグライン絹タンパク質から由来するポリペプチドの例は、主要なドラッグライン絹タンパク質の変異体、類似体、誘導体又は同様のものを含む。更に、ポリペプチドは、クモの鞭状腺において産生される鞭状腺絹タンパク質から由来し得る。鞭状腺絹タンパク質の例は、ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）などから由来する鞭状腺絹タンパク質を含む。
【0094】
メジャードラッグライン絹タンパク質から由来するポリペプチドの例は、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）により表されるアミノ酸配列の２つ以上の単位を含むポリペプチド、好ましくはその５つ以上の単位を含むポリペプチド、及びより好ましくはその１０個以上の単位を含むポリペプチドを含む。あるいは、メジャードラグライン絹タンパク質から由来するポリペプチドは、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）により表されるアミノ酸配列の単位を含むポリペプチドであってもよく、それは、Ｃ末端に、米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１～３のいずれかにより表されるアミノ酸配列又は米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１～３のいずれかにより表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。主要なドラッグライン絹タンパク質から由来するポリペプチドにおいて、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）により表されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、又は互いに異なっていてもよい。宿主として微生物、例えば大腸菌などを使用して組換えタンパク質を産生する場合では、主要なドラッグライン絹タンパク質から由来するポリペプチドの分子量は、生産性の観点から、５００ｋＤａ以下、又は３００ｋＤａ以下、又は２００ｋＤａ以下である。
【0095】
式（１）では、ＲＥＰ１はポリアラニンを示す。ＲＥＰ１において、連続で配置されるアラニン残基の数は、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、更に好ましくは４以上、及び特に好ましくは５以上である。更に、ＲＥＰ１において、連続で配置されるアラニン残基の数は、好ましくは２０以下、より好ましくは１６以下、更に好ましくは１２以下、及び特に好ましくは１０以下である。式（１）では、ＲＥＰ２は、１０～２００アミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列である。アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン、及びアラニン残基の総数は、その中に含まれるアミノ酸残基の総数に対して４０％以上、好ましくは６０％以上、及びより好ましくは７０％以上である。
【0096】
メジャードラッグライン絹では、ＲＥＰ１は、結晶性βシートが形成される線維中の結晶領域に対応し、ＲＥＰ２は、部品の大半が規則的な構成を欠き、より多くの柔軟性を有する線維中のアモルファス領域に対応する。更に、［ＲＥＰ１－ＲＥＰ２］は、結晶領域及びアモルファス領域で構成される反復領域（反復配列）に対応し、これは、ドラッグライン絹タンパク質の特徴的な配列である。
【0097】
組換え絹断片
いくつかの実施形態では、組換え絹タンパク質は、組換えクモ絹ポリペプチド、組換え昆虫絹ポリペプチド、又は組換えムール貝絹ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え絹タンパク質断片は、Ａｒａｎｅｉｄａｅ若しくはＡｒａｎｅｏｉｄｓの組換えクモ絹ポリペプチド、又はＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉの組換え昆虫絹ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え絹タンパク質断片は、Ａｒａｎｅｉｄａｅ若しくはＡｒａｎｅｏｉｄｓの組換えクモ絹ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え絹タンパク質断片は、Ａｒａｎｅｉｄａｅ若しくはＡｒａｎｅｏｉｄｓの天然クモ絹ポリペプチドから由来する反復単位を有するブロック共重合体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え絹タンパク質断片は、Ａｒａｎｅｉｄａｅ若しくはＡｒａｎｅｏｉｄｓのクモ絹ポリペプチドから由来する合成反復単位を有するブロック共重合体、及びＡｒａｎｅｉｄａｅ若しくはＡｒａｎｅｏｉｄｓのクモ絹ポリペプチドの天然反復単位から由来する非反復単位を含む。
いくつかの実施形態では、組換え絹タンパク質は、組換えクモ絹ポリペプチド、組換え昆虫絹ポリペプチド、又は組換えムール貝絹ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え絹タンパク質断片は、Ａｒａｎｅｉｄａｅ若しくはＡｒａｎｅｏｉｄｓの組換えクモ絹ポリペプチド、又はＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉの組換え昆虫絹ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え絹タンパク質断片は、Ａｒａｎｅｉｄａｅ若しくはＡｒａｎｅｏｉｄｓの組換えクモ絹ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え絹タンパク質断片は、Ａｒａｎｅｉｄａｅ若しくはＡｒａｎｅｏｉｄｓの天然クモ絹ポリペプチドから由来する反復単位を有するブロック共重合体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組換え絹タンパク質断片は、Ａｒａｎｅｉｄａｅ若しくはＡｒａｎｅｏｉｄｓのクモ絹ポリペプチドから由来する合成反復単位を有するブロック共重合体、及びＡｒａｎｅｉｄａｅ若しくはＡｒａｎｅｏｉｄｓのクモ絹ポリペプチドの天然反復単位から由来する非反復単位を含む。
【0098】
遺伝子工学における最近の進歩は、様々な種類の組換え絹タンパク質を産生するための経路を提供している。組換えＤＮＡ技術は、より実用的な絹タンパク質の供給源を提供するために使用されている。本明細書で使用される場合、「組換え絹タンパク質」は、遺伝子工学方法を使用して原核生物又は真核生物発現系において異種的に産生される合成タンパク質を指す。
【0099】
組換え絹ペプチドを合成するための様々な方法が公知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ § ８ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９８７， （１９９０））により記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。グラム陰性の桿状細菌である大腸菌は、タンパク質の産業規模の生産のための十分に確立された宿主である。したがって、組換え絹の大部分は、大腸菌において生産されてきた。操作が簡単である大腸菌は、短い世代時間を有し、比較的低コストであり、多量のタンパク質産生のためにスケールアップすることができる。
【0100】
組換え絹タンパク質は、絹タンパク質について、このタンパク質の断片について、又はそのようなタンパク質の類似体についてコードするｃＤＮＡを含む、形質転換された原核生物又は真核生物系により産生されることができる。組換えＤＮＡアプローチは、プログラムされた配列、二次構造、構造、及び正確な分子量を伴う組換え絹の産生を可能にする。このプロセスにおいて４つの主な工程がある：（ｉ）遺伝子「カセット」中への合成絹様遺伝子の設計及び組立、（ｉｉ）ＤＮＡ組換えベクター中へのこのセグメントの挿入、（ｉｉｉ）宿主細胞中へのこの組換えＤＮＡ分子の形質転換、並びに（ｉｖ）選択されたクローンの発現及び精製。
【0101】
「組換えベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、例えばラムダファージなど、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス若しくはバキュロウイルスベクターなど、又は人工染色体ベクター、例えば細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などを含む、当業者に公知の任意のベクターを含む。当該ベクターは、発現ベクター並びにクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミド並びにウイルスベクターを含み、一般的に、特定の宿主生物体（例えば、細菌、酵母、又は植物）において又はインビトロ発現系における動作可能に連結されたコード配列の発現のために必要な所望のコード配列及び適したＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、一般的に、特定の所望のＤＮＡ断片を操作及び増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現のために必要な機能的配列を欠き得る。
【0102】
原核生物系は、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌を含む。原核生物発現ベクターは、宿主生物体により認識されることができる複製起点、当該宿主において機能的である相同又は異種プロモーター、クモ絹タンパク質について、このタンパク質の断片について、又は類似タンパク質についてコードするＤＮＡ配列を含むことができる。原核性発現生物の非限定的な例は、大腸菌、バチルス・サブチリス、バチルス・メガテリウム、コリネバクテリウム・グルタミカム、アナベナ、カウロバクター、グルコノバクター、ロドバクター、シュードモナス、パラコッカス、バチルス（例えば、バチルス・サブチリス）、ブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、リゾビウム（シノリゾビウム）、フラボバクテリウム、クレブシエラ、エンテロバクター、ラクトバチルス、ラクトコッカス、メチロバクテリウム、プロピオニバクテリウム、スタフィロコッカス、又はストレプトマイセスの細胞である。
【0103】
真核生物系は、酵母及び昆虫、哺乳類、又は植物の細胞を含む。この場合では、発現ベクターは、酵母プラスミドの複製起源又は自律複製配列、プロモーター、クモ絹タンパク質について、断片について、又は類似タンパク質についてコードするＤＮＡ配列、ポリアデニル化配列、転写終結部位、及び、最後に、選択遺伝子を含み得る。真核発現生物の非限定的な例は、酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、担子胞子性、子嚢胞子性など、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニジェール、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニデュランス、トリコデルマ・リーセイ、アクレモニウム・クリソゲナム、カンジダ、ハンゼヌラ、クルイベロミセス、サッカロミセス（例えば、サッカロミセス・セレビシエ）、シゾサッカロミセス、ピキア（例えば、ピキア・パストリス）又はヤロウィア細胞など、哺乳類細胞、例えばＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞など、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、ＭＥＬ細胞など、「昆虫宿主細胞」、例えばスポドプテラ・フルギペルダ又はトリコプルシア・ニ細胞などを含む。ＳＦ９細胞、ＳＦ－２１細胞、又はＨｉｇｈ－Ｆｉｖｅ細胞、ここで、ＳＦ－９及びＳＦ－２１は、スポドプテラ・フルギペルダからの卵巣細胞であり、Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ細胞は、トリコプルシア・ニ、「植物宿主細胞」、例えばタバコ、ジャガイモ、又はエンドウ豆細胞などからの卵細胞である。
【0104】
様々な異種宿主系が、異なる型の組換え絹を産生するために探索されてきた。組換え部分的スピドロイン並びに操作された絹は、クローニングされ、細菌（大腸菌）、酵母（ピキア・パストリス）、昆虫（カイコの幼虫）、植物（タバコ、大豆、ジャガイモ、シロイヌナズナ）、哺乳類細胞株（ＢＨＴ／ハムスター）、及びトランスジェニック動物（マウス、ヤギ）において発現されている。絹タンパク質の大半が、Ｎ末端又はＣ末端のＨｉｓタグを伴って産生され、精製を単純化し、十分な量のタンパク質を産生する。
【0105】
いくつかの実施形態では、異種系を使用して組換えクモ絹タンパク質を発現するために好適な宿主は、トランスジェニック動物及び植物を含み得る。いくつかの実施形態では、異種系を使用して組換えクモ絹タンパク質を発現するために好適な宿主は、細菌、酵母、哺乳類細胞株を含む。いくつかの実施形態では、異種系を使用して組換えクモ絹タンパク質を発現するために好適な宿主は、大腸菌を含む。いくつかの実施形態では、異種系を使用して組換えクモ絹タンパク質を発現するために好適な宿主は、ゲノム編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）を使用して生成されたトランスジェニックＢ．モリカイコを含む。
【0106】
本開示中の組換え絹タンパク質は、天然絹タンパク質の反復単位に基づく合成タンパク質を含む。合成反復絹タンパク質配列の他、これらは、追加的に、１つ以上の天然非反復絹タンパク質配列を含むことができる。
【0107】
いくつかの実施形態では、「組換え絹タンパク質」は、組換えカイコ絹タンパク質又はその断片を指す。絹フィブロイン及び絹セリシンの組換え産生が報告されている。様々な宿主が産生のために使用され、大腸菌、サクロミセス・セレビシエ、シュードモナス属、ロドシュードモナス属、バチルス属、及びストレポミセス属を含む。ＥＰ０２３０７０２を参照のこと。それは、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【0108】
本明細書では、また、Ｂ．モリ絹重鎖（Ｈ鎖）の反復ドメインから由来するＧＡＧＡＧＸ（配列番号１）ヘキサペプチド（ＸはＡ、Ｙ、Ｖ、又はＳである）を含む、絹フィブロインタンパク質様マルチブロックポリマーの設計及び生物学的合成が提供される。
【0109】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＡＧＡＧＳ（配列番号２）ヘキサペプチド反復ユニットを含むＢ．モリ絹重鎖（Ｈ鎖）の反復ドメインから由来する、絹タンパク質様マルチブロックポリマーを提供する。ＧＡＧＡＧＳ（配列番号２）ヘキサペプチドは、Ｈ鎖のコアユニットであり、結晶性ドメインの形成において重要な役割を果たしている。ＧＡＧＡＧＳ（配列番号２）ヘキサペプチド反復ユニットを含む絹タンパク質様マルチブロックポリマーは、天然絹フィブロインタンパク質と同様に、自発的に、βシート構造中に凝集し、ここで、絹タンパク質様マルチブロックポリマー中では、本明細書に記載される任意の重量平均分子量を有する。
【0110】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｂ．モリの絹重鎖のＨ鎖から誘導されたＧＡＧＡＧＳ（配列番号２）ヘキサペプチド反復断片及び大腸菌により産生される哺乳類エラスチンＶＰＧＶＧ（配列番号３）モチーフで構成される絹ペプチド様マルチブロック共重合体を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｂ．モリの絹重鎖のＨ鎖から誘導されたＧＡＧＡＧＳ（配列番号２）ヘキサペプチド反復断片及び大腸菌により産生されるＧＶＧＶＰ（配列番号４）で構成される融合絹フィブロインタンパク質を提供し、ここで、本明細書に記載される任意の重量平均分子量を有する絹タンパク質様マルチブロックポリマー中である。
【0111】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ＧＡＧＡＧＳ）１６（配列番号５）反復断片で構成されるＢ．モリカイコ組換えタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、大腸菌により産生される、（ＧＡＧＡＧＳ）１６（配列番号５）反復断片及び非反復（ＧＡＧＡＧＳ）１６－Ｆ－ＣＯＯＨ、（ＧＡＧＡＧＳ）１６－Ｆ－Ｆ－ＣＯＯＨ、（ＧＡＧＡＧＳ）１６－Ｆ－Ｆ－Ｆ－ＣＯＯＨ、（ＧＡＧＡＧＳ）１６－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－ＣＯＯＨ、（ＧＡＧＡＧＳ）１６－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－ＣＯＯＨ、（ＧＡＧＡＧＳ）１６－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－Ｆ－ＣＯＯＨで構成される組換えタンパク質を提供し、式中、Ｆは、以下のアミノ酸配列ＳＧＦＧＰＶＡＮＧＧＳＧＥＡＳＳＥＳＤＦＧＳＳＧＦＧＰＶＡＮＡＳＳＧＥＡＳＳＥＳＤＦＡＧ（配列番号６）を有し、本明細書に記載される任意の重量平均分子量を有する絹タンパク質様マルチブロックポリマー中にある。
【0112】
いくつかの実施形態では、「組換え絹タンパク質」は、組換えクモ絹タンパク質又はその断片を指す。部分的ｃＤＮＡクローンに基づく組換えクモ絹タンパク質の産生が報告されている。そのようなものとして産生される組換えクモ絹タンパク質は、クモのネフィラ・クラビペスからの、ドラッグラインクモ絹タンパク質スピドロイン１から由来する反復配列の一部を含む。Ｘｕ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：７１２０－７１２４（１９９０）を参照のこと。ネフィラ・クラビペスのドラッグライン絹からの第２のフィブロインタンパク質スピドロイン２の反復配列の一部分をコードするｃＤＮＡクローン及びその組換え合成は、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌｕｍｅ ２６７，ｐｐ．１９３２０－１９３２４において記載されている。形質転換された大腸菌からのネフィラ・クラビペスのタンパク質断片及び変異体を含むクモ絹タンパク質の組換え合成が、米国特許 第５，７２８，８１０号及び第５，９８９，８９４号において記載されている。小瓶状腺クモ絹タンパク質をコードするｃＤＮＡクローン及びその発現が、米国特許 第５，７３３，７７１号及び第５，７５６，６７７号において記載されている。オーブウェブスピニングクモからの鞭状腺絹タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンが、米国特許 第５，９９４，０９９号において記載されている。米国特許 第６，２６８，１６９号は、大腸菌、バチルス・サブチリス、及びピキア・パストリス組換え発現系による、ネフィラ・クラビペスの天然クモドラッグラインにおいて見出される反復ペプチド配列から由来するクモ絹様タンパク質の組換え合成を記載する。ＷＯ０３／０２０９１６には、ネフィラ・マダガスカリエンシス、ネフィラ・セネガレンシス、テトラグナタ・カウアイエンシス、テトラグナタ・バーシカラー、アルギオペ・オーランティア、アルギオペ・トリファシアータ、ガステラカンサ・マンモサ、及びラトロデクトス・ゲオメトリクスの大瓶状腺、アルギオペ・トリファシアタの鞭状腺、ドロメデス・テネブロススの瓶状腺、プレクトリューリス・トリスティスからの２組の絹腺、及びマイガロモルフ・ユーアグルス・チソセウスの絹腺から由来する反復配列を有するクモクモ絹タンパク質をコードするｃＤＮＡクローン及びその組換え産生が記載されている。上の参考文献の各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【0113】
いくつかの実施形態では、組換えクモ絹タンパク質は、クモ絹タンパク質及び昆虫絹タンパク質、クモ絹タンパク質及びコラーゲン、クモ絹タンパク質及びレシリン、又はクモ絹タンパク質及びケラチンのハイブリッドタンパク質である。クモ絹反復単位は、天然大瓶状腺ポリペプチド、例えばドラッグラインクモ絹ポリペプチド、小瓶状腺ポリペプチド、鞭状腺ポリペプチド、凝集腺クモ絹ポリペプチド、ブドウ状腺クモ絹ポリペプチド、又は梨状腺クモ絹ポリペプチドなどの内で反復的に生じる少なくとも１つのペプチドモチーフを含む、又はそれからなる領域のアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。
【0114】
いくつかの実施形態では、本開示における組換えクモ絹タンパク質は、天然クモ絹タンパク質の反復単位、コンセンサス配列、及び、任意選択的に、１つ以上の天然非反復クモ絹タンパク質配列から由来する合成クモ絹タンパク質を含む。天然クモ絹ポリペプチドの反復単位は、アラネイダ又はアラネオイドのドラッラインクモ絹ポリペプチド又は鞭状腺クモ絹ポリペプチドを含み得る。
【0115】
本明細書で使用される場合、クモ絹「反復単位」は、天然大瓶状腺ポリペプチド、例えばドラッグラインクモ絹ポリペプチド、小瓶状腺ポリペプチド、鞭状腺ポリペプチド、凝集腺クモ絹ポリペプチド、ブドウ状腺クモ絹ポリペプチド、又は梨状腺クモ絹ポリペプチドなどの内で反復的に生じる少なくとも１つのペプチドモチーフを含む、又はそれからなる。「反復単位」は、アミノ酸配列において、天然の絹ポリペプチド（例えば、ＭａＳｐＩ、ＡＤＦ－３、ＡＤＦ－４、又はＦｌａｇ）（すなわち、同一のアミノ酸配列）内で反復的に生じる、少なくとも１つのペプチドモチーフ（例えば、ＡＡＡＡＡＡ）（配列番号２１）又はＧＰＧＱＱ（配列番号５））を含む、又はそれからなる領域に、又はそれらと実質的に類似したアミノ酸配列（すなわち、変異アミノ酸配列）に対応する領域を指す。天然絹ポリペプチド内の対応するアミノ酸配列と「実質的に類似」しているアミノ酸配列を有する「反復単位」（すなわち、野生型反復単位）はまた、その特性に関して類似しており、例えば、「実質的に類似した反復単位」を含む絹タンパク質は、依然として不溶性であり、その不溶性を保持する。例えば、天然絹ポリペプチドのアミノ酸配列と「同一」であるアミノ酸配列を有する「反復単位」は、ＭａＳｐＩ、ＭａＳｐＩＩ、ＡＤＦ－３、及び／又はＡＤＦ－４の１つ以上のペプチドモチーフに対応する絹ポリペプチドの一部であり得る。例えば、天然絹ポリペプチドのアミノ酸配列と「実質的に類似」しているアミノ酸配列を有する「反復単位」は、ＭａＳｐＩ、ＭａＳｐＩＩ、ＡＤＦ－３、及び／又はＡＤＦ－４の１つ以上のペプチドモチーフに対応するが、しかし、特定のアミノ酸位置で１つ以上のアミノ酸置換を有する絹ポリペプチドの一部であり得る。
【0116】
本明細書で使用される場合、「コンセンサスペプチド配列」という用語は、特定の位置（例えば、「Ｇ」）において頻繁に生じるアミノ酸を含有するアミノ酸配列を指し、ここで、更に決定されない他のアミノ酸は、プレースホルダー「Ｘ」によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列は、（ｉ）ＧＰＧＸＸ（配列番号７）、ここで、Ｘは、Ａ、Ｓ、Ｇ、Ｙ、Ｐ、及びＱから選択されるアミノ酸である、（ｉｉ）ＧＧＸ、ここで、Ｘは、Ｙ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｎ、及びＱ、好ましくはＹ、Ｐ、及びＱから選択されるアミノ酸である、（ｉｉｉ）Ａｘ、ここで、ｘは５～１０からの整数である、のうちの少なくとも１つである。
【0117】
コンセンサスペプチド配列ＧＰＧＸＸ（配列番号７）及びＧＧＸ、すなわち、グリシンリッチモチーフは、絹ポリペプチド、及びしたがって、当該モチーフを含有する絹タンパク質から形成される糸に柔軟性を提供する。詳細には、反復されたＧＰＧＸＸ（配列番号７）モチーフは、ターンらせん構造を形成し、絹ポリペプチドに弾性を付与する。大瓶状腺及び鞭状腺絹は両方ともＧＰＧＸＸ（配列番号７）モチーフを有する。反復されたＧＧＸモチーフは、１ターン当たり３つのアミノ酸を有するらせん構造に関連付けられ、大半のクモ絹において見出される。ＧＧＸモチーフは、絹に追加的な弾性特性を提供し得る。反復されたポリアラニンＡｘ（ペプチド）モチーフは、例えば、ＷＯ０３／０５７７２７において記載されるように、絹ポリペプチドに強度を提供する結晶性βシート構造を形成する。
【0118】
いくつかの実施形態では、本開示における組換えクモ絹タンパク質は、２つの同一の反復単位を含み、各々が、レジリンから由来するＧＧＲＰＳＤＴＹＧ（配列番号８）及びＧＧＲＰＳＳＳＹＧ（配列番号９）からなる群から選択される少なくとも１つの、好ましくは１つのアミノ酸配列を含む。レシリンは、大半の節足動物において見出されるエラストマータンパク質であり、低い剛性及び高い強度を提供する。
【0119】
本明細書で使用される場合、「非反復単位」は、米国特許第８，３６７，８０３号において記載されるように、好ましくは、クモアラネウス・ダイアデマトゥスのＡＤＦ－３（配列番号１）、ＡＤＦ－４（配列番号２）、ＮＲ３（配列番号４１）、ＮＲ４（配列番号４２）、ＡＤＦ－４内の天然ドラグラインポリペプチド内の対応する非反復（カルボキシ末端）アミノ酸配列（すなわち、野生型非反復（カルボキシ末端）単位）と「実質的に類似」しているアミノ酸配列を指し、Ｃ１６ペプチド（クモ絹タンパク質ｅＡＤＦ４、分子量４７．７ｋＤａ、ＡＭＳｉｌｋ）は、Ａ．ダイアデマトゥスからのＡＤＦ４の天然配列から適合されたアミノ酸配列である、配列ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ（配列番号１０）の１６反復を含む。非反復ＡＤＦ－４及びその変異体は、効率的な組立挙動を呈する。
【0120】
合成クモ絹タンパク質の間で、本開示における組換え絹タンパク質は、いくつかの実施形態では、米国特許第８２８８５１２号において記載されるポリペプチド配列配列番号１を有するＣ１６タンパク質を含む。配列番号１において示されるポリペプチド配列の他に、特に、この配列の機能的等価物、機能的誘導体、及び塩も含まれる。
【0121】
本明細書で使用される場合、「機能的等価物」は、上記のアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置において、具体的に言及されるアミノ酸以外のアミノ酸を有する変異体を指す。
【0122】
いくつかの実施形態では、本開示における組換えクモ絹タンパク質は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８７，７１２０，（１９９０）によって記載されるスピドロインメジャー１、Ｈｉｎｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６７，１９３２０，（１９２２）によって記載されるスピドロインメジャー２、米国特許出願第２０１６／０２２２１７４号、及び米国特許第９，０５１，４５３号、同第９，６１７，３１５号、同第９，６８９，０８９号、同第８，１７３，７７２号、同第８，６４２，７３４号、同第８，３６７，８０３号、同第８，０９７，５８３号、同第８，０３０，０２４号、同第７，７５４，８５１号、同第７，１４８，０３９号、同第７，０６０，２６０号に記載される組換えクモ絹タンパク質、又はあるいは、特許出願第ＷＯ９５／２５１６５号に記載されるマイナースピドロインに対応するクモ絹タンパク質を含む少なくとも１つの天然又は組換え絹タンパク質を有効量で含む。上で引用された参考文献の各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。本開示の組換えＲＳＰＦのために好適な追加の組換えクモ絹タンパク質は、アラネウス・ダイアデマトゥスの「大瓶状」腺からのＡＤＦ３及びＡＤＦ４を含む。
【0123】
組換え絹はまた、他の特許及び特許出願に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる：ＵＳ２００４／５９０１９６、ＵＳ７，７５４，８５１、ＵＳ２００７／６５４４７０、ＵＳ７，９５１，９０８、ＵＳ２０１０／７８５９６０、ＵＳ８，０３４，８９７、ＵＳ２００９／０２６３４３０、ＵＳ２００８／２２６８５４、ＵＳ２００９／０１２３９６７、ＵＳ２００５／７１２０９５、ＵＳ２００７／９９１０３７、ＵＳ２００９／０１６２８９６、ＵＳ２００８／８５２６６、ＵＳ８，３７２，４３６、ＵＳ２００７／９８９９０７、ＵＳ２００９／２６７５９６、ＵＳ２０１０／３１９５４２、ＵＳ２００９／２６５３４４、ＵＳ２０１２／６８４６０７、ＵＳ２００４／５８３２２７、ＵＳ８，０３０，０２４、ＵＳ２００６／６４３５６９、ＵＳ７，８６８，１４６、ＵＳ２００７／９９１９１６、ＵＳ８，０９７，５８３、ＵＳ２００６／６４３２００、ＵＳ８，７２９，２３８、ＵＳ８，８７７，９０３、ＵＳ２０１９／００６２５５７、ＵＳ２０１６／０２８０９６０、ＵＳ２０１１／０２０１７８３、ＵＳ２００８／９９１９１６、ＵＳ２０１１／９８６６６２、ＵＳ２０１２／６９７７２９、ＵＳ２０１５／０３２８３６３、ＵＳ９，０３４，８１６、ＵＳ２０１３／０１７２４７８、ＵＳ９，２１７，０１７、ＵＳ２０１７／０２０２９９５、ＵＳ８，７２１，９９１、ＵＳ２００８／２２７４９８、ＵＳ９，２３３，０６７、ＵＳ８，２８８，５１２、ＵＳ２００８／１６１３６４、ＵＳ７，１４８，０３９、ＵＳ１９９９／２４７８０６、ＵＳ２００１／８６１５９７、ＵＳ２００４／８８７１００、ＵＳ９，４８１，７１９、ＵＳ８，７６５，６８８、ＵＳ２００８／８０７０５、ＵＳ２０１０／８０９１０２、ＵＳ８，３６７，８０３、ＵＳ２０１０／６６４９０２、ＵＳ７，５６９，６６０、ＵＳ１９９９／１３８８３３、ＵＳ２０００／５９１６３２、ＵＳ２０１２／００６５１２６、ＵＳ２０１０／０２７８８８２、ＵＳ２００８／１６１３５２、ＵＳ２０１０／００１５０７０、ＵＳ２００９／５１３７０９、ＵＳ２００９／０１９４３１７、ＵＳ２００４／５５９２８６、ＵＳ２００５／８９５５１、ＵＳ２００８／１８７８２４、ＵＳ２００５／０２６６２４２、ＵＳ２００５／０２２７３２２、及びＵＳ２００４４４１８。
【0124】
組換え絹はまた、他の特許及び特許出願に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる：ＵＳ２０１９／００６２５５７、ＵＳ２０１５／０２８４５６５、ＵＳ２０１３／０２２５４７６、ＵＳ２０１３／０１７２４７８、ＵＳ２０１３／０１３６７７９、ＵＳ２０１３／０１０９７６２、ＵＳ２０１２／０２５２２９４、ＵＳ２０１１／０２３０９１１、ＵＳ２０１１／０２０１７８３、ＵＳ２０１０／０２９８８７７、ＵＳ１０，４７８，５２０、ＵＳ１０，２５３，２１３、ＵＳ１０，０７２，１５２、ＵＳ９，２３３，０６７、ＵＳ９，２１７，０１７、ＵＳ９，０３４，８１６、ＵＳ８，８７７，９０３、ＵＳ８，７２９，２３８、ＵＳ８，７２１，９９１、ＵＳ８，０９７，５８３、ＵＳ８，０３４，８９７、ＵＳ８，０３０，０２４、ＵＳ７，９５１，９０８、ＵＳ７，８６８，１４６、及びＵＳ７，７５４，８５１。
【0125】
いくつかの実施形態では、本開示における組換えクモ絹タンパク質は、２～８０の反復単位を含む、又はそれらからなり、各々が、本明細書で定義されるＧＰＧＸＸ、ＧＧＸ、及びＡｘから独立して選択される。
【0126】
いくつかの実施形態では、本開示の組換えクモ絹タンパク質は、反復単位を含む、又はそれらからなり、各々が、独立して、ＧＰＧＡＳ（配列番号１１）、ＧＰＧＳＧ（配列番号１２）、ＧＰＧＧＹ（配列番号１３）、ＧＰＧＧＰ（配列番号１４）、ＧＰＧＧＡ（配列番号１５）、ＧＰＧＱＱ（配列番号１６）、ＧＰＧＧＧ（配列番号１７）、ＧＰＧＱＧ（配列番号１８）、ＧＰＧＧＳ（配列番号１９）、ＧＧＹ、ＧＧＰ、ＧＧＡ、ＧＧＲ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＮ、ＧＧＱ、ＡＡＡＡＡ（配列番号２０）、ＡＡＡＡＡＡ（配列番号２１）、ＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２２）、ＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２３）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２４）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２５）、ＧＧＲＰＳＤＴＹＧ（配列番号２６）、及びＧＧＲＰＳＳＳＹＧ（配列番号２７）、（ｉ）ＧＰＹＧＰＧＡＳＡＡＡＡＡＡＧＧＹＧＰＧＳＧＱＱ（配列番号２８）、（ｉｉ）ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ（配列番号２９）、（ｉｉｉ）ＧＰＧＱＱＧＰＧＱＱＧＰＧＱＱＧＰＧＱＱ（配列番号３０）：（ｉｖ）ＧＰＧＧＡＧＧＰＹＧＰＧＧＡＧＧＰＹＧＰＧＧＡＧＧＰＹ（配列番号３１）、（ｖ）ＧＧＴＴＩＩＥＤＬＤＩＴＩＤＧＡＤＧＰＩＴＩＳＥＥＬＴＩ（配列番号３２）、（ｖｉ）ＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＱＧＱＧＱＧＱＧＱＧＧＲＰＳＤＴＹＧ（配列番号３３）、（ｖｉｉ）ＳＡＡＡＡＡＡＡＡＧＰＧＧＧＮＧＧＲＰＳＤＴＹＧＡＰＧＧＧＮＧＧＲＰＳＳＳＹＧ（配列番号３４）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＳＧＧＡＧＧＳ（配列番号３５）、（ｉｘ）ＧＰＧＧＡＧＰＧＧＹＧＰＧＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＳＧＰＧＧＹ（配列番号３６）、（ｘ）ＧＰＹＧＰＧＡＳＡＡＡＡＡＡＧＧＹＧＰＧＣＧＱＱ（配列番号３７）、（ｘｉ）ＧＰＹＧＰＧＡＳＡＡＡＡＡＡＧＧＹＧＰＧＫＧＱＱ（配列番号３８）、（ｘｉｉ）ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＣＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ（配列番号３９）、（ｘｉｉｉ）ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＫＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ（配列番号４０）、（ｘｉｖ）ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＫＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ（配列番号４０）又は米国特許 第８，８７７，９０３号において記載されるそれらの変異体、例えば、ペプチド鎖中のＧＰＧＡＳ（配列番号１１）、ＧＧＹ、ＧＰＧＳＧ（配列番号１２）の連続順序、又はペプチド鎖中のＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２３）、ＧＰＧＧＹ（配列番号１３）、ＧＰＧＧＰ（配列番号１４）の連続順序、ペプチド鎖中のＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２３）、ＧＰＧＱＧ（配列番号１８）、ＧＧＲの連続順序を有する合成クモペプチドからなる群から選択される。
【0127】
いくつかの実施形態では、本開示は、天然クモ絹タンパク質から由来するアミノ酸の反復単位、例えばスピドロインメジャー１ドメイン、スピドロインメジャー２ドメイン、又はスピドロインマイナー１ドメインなどを模倣する絹タンパク質様マルチブロックペプチド及び三次元立体構造の改変を伴わない反復単位間のバリエーションのプロファイルを提供し、ここで、これらの絹タンパク質様マルチブロックペプチドは、以下の配列（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び／又は（ＩＶ）のうちの１つに対応するアミノ酸の反復単位を含む。
【0128】
［（ＸＧＧ）ｗ（ＸＧＡ）（ＧＸＧ）ｘ（ＡＧＡ）ｙ（Ｇ）ｚＡＧ］ｐ式（Ｉ）、式中、Ｘはチロシンに又はグルタミンに相当し、ｗは２又は３に等しい整数であり、ｘは１～３の整数であり、ｙは５～７の整数であり、ｚは１又は２に等しい整数であり、及びｐは整数であり、本明細書に記載される任意の重量平均分子量を有し、並びに／あるいは
［（ＧＰＧ２ＹＧＰＧＱ２）ａ（Ｘ’）２Ｓ（Ａ）ｂ〕ｐ式（ＩＩ）、式中、Ｘ’はアミノ酸配列ＧＰＳ又はＧＰＧに対応し、ａは２又は３に等しく、ｂは７～１０の整数であり、及びｐは整数であり、本明細書に記載される任意の重量平均分子量を有し、並びに／あるいは
［（ＧＲ）（ＧＡ）ｌ（Ａ）ｍ（ＧＧＸ）ｎ（ＧＡ）ｎ（Ａ）ｍ〕ｐ式（ＩＩＩ）及び／又は［（ＧＧＸ）ｎ（ＧＡ）ｍ（Ａ）ｌ〕ｐ式（ＩＶ）、式中、Ｘ”はチロシン、グルタミン、又はアラニンに対応し、ｌは１～６の整数であり、ｍは０～４の整数であり、ｎは１～４の整数であり、及びｐは整数である。
［（ＧＰＧ２ＹＧＰＧＱ２）ａ（Ｘ’）２Ｓ（Ａ）ｂ〕ｐ式（ＩＩ）、式中、Ｘ’はアミノ酸配列ＧＰＳ又はＧＰＧに対応し、ａは２又は３に等しく、ｂは７～１０の整数であり、及びｐは整数であり、本明細書に記載される任意の重量平均分子量を有し、並びに／あるいは
［（ＧＲ）（ＧＡ）ｌ（Ａ）ｍ（ＧＧＸ）ｎ（ＧＡ）ｎ（Ａ）ｍ〕ｐ式（ＩＩＩ）及び／又は［（ＧＧＸ）ｎ（ＧＡ）ｍ（Ａ）ｌ〕ｐ式（ＩＶ）、式中、Ｘ”はチロシン、グルタミン、又はアラニンに対応し、ｌは１～６の整数であり、ｍは０～４の整数であり、ｎは１～４の整数であり、及びｐは整数である。
【0129】
いくつかの実施形態では、組換えクモ絹タンパク質又は配列（Ｖ）のアミノ酸反復単位を含むクモ絹タンパク質の類似体：
［（Ｘａａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ）ｗ（Ｘａａ Ｇｌｙ Ａｌａ）（Ｇｌｙ Ｘａａ Ｇｌｙ）ｘ（Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ）ｙ（Ｇｌｙ）ｚＡｌａ Ｇｌｙ］ｐ式（Ｖ）、式中、Ｘａａはチロシン又はグルタミンであり、ｗは２又は３に等しい整数であり、ｘは１～３の整数であり、ｙは５～７の整数であり、ｚは１又は２に等しい整数であり、及びｐは整数である。
［（Ｘａａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ）ｗ（Ｘａａ Ｇｌｙ Ａｌａ）（Ｇｌｙ Ｘａａ Ｇｌｙ）ｘ（Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ）ｙ（Ｇｌｙ）ｚＡｌａ Ｇｌｙ］ｐ式（Ｖ）、式中、Ｘａａはチロシン又はグルタミンであり、ｗは２又は３に等しい整数であり、ｘは１～３の整数であり、ｙは５～７の整数であり、ｚは１又は２に等しい整数であり、及びｐは整数である。
【0130】
いくつかの実施形態では、本開示中の組換えクモ絹タンパク質は、米国特許第８，３６７，８０３号において記載されているように、ＡＤＦ－３又はその変異体、ＡＤＦ－４又はその変異体、ＭａＳｐＩ（配列番号４３）又はその変異体、ＭａＳｐＩＩ（配列番号４４）又はその変異体からなる群から選択される。
【0131】
いくつかの実施形態では、本開示は、哺乳類細胞において産生される水溶性の組換えクモ絹タンパク質を提供する。哺乳類細胞において産生されるクモ絹タンパク質の溶解性は、これらのタンパク質中のＣＯＯＨ末端の存在に起因し、それによって、それらはより親水性になる。これらのＣＯＯＨ末端アミノ酸は、微生物宿主において発現されるクモ絹タンパク質中には存在しない。
【0132】
いくつかの実施形態では、本開示における組換えクモ絹タンパク質は、ＧＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４１）、ＧＫＧＧＧＧＧＧ（配列番号４２）、ＧＣＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３）、ＧＫＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４４）、及びＧＣＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４５）からなるアミノ酸配列から選択されるアミノ末端又はカルボキシル末端で改変された水溶性組換えクモ絹タンパク質Ｃ１６を含む。いくつかの実施形態では、本開示における組換えクモ絹タンパク質は、タンパク質の分子量が、本明細書に記載される範囲であるように、Ｃ１６ＮＲ４、Ｃ３２ＮＲ４、Ｃ１６、Ｃ３２、ＮＲ４Ｃ１６ＮＲ４、ＮＲ４Ｃ３２ＮＲ４、ＮＲ３Ｃ１６ＮＲ３、又はＮＲ３Ｃ３２ＮＲ３を含む。
【0133】
いくつかの実施形態では、本開示中の組換えクモ絹タンパク質は、米国特許第８，８７７，９０３号において記載されているように、ＡダイアデマトゥスからのＡＤＦ４の天然配列から適合された合成反復ペプチドセグメント及びアミノ酸配列を有する組換えクモ絹タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本開示中のＲＳＰＦは、天然クモ絹タンパク質から由来する反復ペプチド単位、例えばスピドロインメジャー１ドメイン、スピドロインメジャー２ドメイン、又はスピドロインマイナー１ドメインなどを有する組換えクモ絹タンパク質を含み、ここで、反復ペプチド配列は、米国特許第８，３６７，８０３号において記載されているように、ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＱＧＱＧＱＧＱＧＱＧＧＲＰＳＤＴＹＧ（配列番号４６）又はＳＡＡＡＡＡＡＡＡＧＰＧＧＧＮＧＧＲＰＳＤＴＹＧＡＰＧＧＧＮＧＧＲＰＳＳＳＹＧ（配列番号４７）である。
【0134】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＰＧＧＡＧＰＧＧＹＧＰＧＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＳＧＰＧＧＹ（配列番号４８）反復断片で構成され、本明細書に記載される分子量を有する組換えクモタンパク質を提供する。
【0135】
本明細書で使用される場合、「組換え絹」という用語は、組換えクモ及び／又はカイコ絹タンパク質あるいはその断片を指す。一実施形態では、クモ絹タンパク質は、帯状絹（ブドウ状腺絹）、卵嚢絹（円柱腺絹）、卵ケース絹（管状腺絹）、非粘着性ドラッグライン絹（大瓶状腺絹）、付着糸絹（梨状腺絹）、粘着性絹コア線維（鞭状腺絹）、及び粘着性絹外線維（凝集腺絹）からなる群から選択される。例えば、組換えクモ絹タンパク質は、本明細書に記載されるように、米国特許出願第２０１６／０２２２１７４号並びに米国特許第９，０５１，４５３号、同第９，６１７，３１５号、同第９，６８９，０８９号、同第８，１７３，７７２号、及び同第８，６４２，７３４号に記載されるタンパク質を含む。
【0136】
一部の生物は、固有の配列、構造エレメント、及び機械的特性を伴う複数の絹線維を作製する。例えば、オーブウィービングクモは、環境又はライフサイクルニッチに適合するように調整された線維中に重合された、異なる絹ポリペプチド配列を産生する６つの固有の種類の腺を有する。線維は、それらが由来する腺にちなんで名付けられ、ポリペプチドは、腺の略語（例えば、「Ｍａ」）及びスピドロインについての「Ｓｐ」（クモフィブロインについての略）で標識される。ｏｒｂウィーバーでは、これらの種類は、大瓶状腺（ＭａＳｐ、ドラッグラインとも呼ばれる）、小瓶状腺（ＭｉＳｐ）、鞭状腺（Ｆｌａｇ）、ブドウ状腺（ＡｃＳｐ）、管状腺（ＴｕＳｐ）、及び梨状腺（ＰｙＳｐ）を含む。異なる属及び生物種の間の線維の種類、ドメイン、及び変動にわたるポリペプチド配列のこの組み合わせは、組換え線維の商業産生により利用することができる、幅広い潜在的な特性に導く。今日まで、組換え絹を用いた研究の大部分が、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）に焦点を当ててきた。
【0137】
ブドウ状腺（ＡｃＳｐ）絹は、中程度に高い強度及び中程度に高い伸張性とを合わせた結果、高い靭性を有する傾向がある。ＡｃＳｐ絹は、ポリセリン及びＧＰＸのモチーフをしばしば組み込む、大きなブロック（「アンサンブルリピート」）サイズにより特徴付けられる。管状腺（ＴｕＳｐ又は円筒形（Ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ））絹は、大きな直径を有する傾向があり、中程度の強度及び高い伸張性を伴う。ＴｕＳｐ絹は、それらのポリセリン及びポリトレオニン含量、並びにポリアラニンの短い管により特徴付けられる。大瓶状（ＭａＳｐ）絹は、高い強度及び中程度の伸張性を有する傾向がある。ＭａＳｐ絹は、２つのサブタイプ、ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２のうちの１つであり得る。ＭａＳｐ１絹は、一般的に、ＭａＳｐ２絹よりも伸張性が低く、ポリアラニン、ＧＸ、及びＧＧＸモチーフにより特徴付けられる。ＭａＳｐ２絹は、ポリアラニン、ＧＧＸ、及びＧＰＸモチーフにより特徴付けられる。小瓶状腺（ＭｉＳｐ）絹は、中程度の強度及び中程度の伸張性を有する傾向がある。ＭｉＳｐ絹は、ＧＧＸ、ＧＡ、及びポリＡモチーフにより特徴付けられ、しばしば、およそ１００アミノ酸のスペーサーエレメントを含む。鞭状腺（Ｆｌａｇ）絹は、非常に高い伸張性及び中程度の強度を有する傾向がある。Ｆｌａｇ絹は通常、ＧＰＧ、ＧＧＸ、及び短いスペーサーモチーフにより特徴付けられる。
【0138】
絹ポリペプチドは、非反復領域（例えば、Ｃ末端ドメイン及びＮ末端ドメイン）により隣接された反復ドメイン（ＲＥＰ）で特徴的に構成されている。一実施形態では、Ｃ末端ドメイン及びＮ末端ドメインの両方が、７５～３５０アミノ酸長である。反復ドメインは、階層構造を示す。反復ドメインは、一連のブロック（反復ユニットとも呼ばれる）を含む。ブロックは、絹反復ドメイン全体にわたって、時々完全で、時々不完全に（準反復ドメインを形成する）反復される。ブロックの長さ及び組成は、異なる絹の種類の間で、及び異なる種にわたり変動する。米国公開出願第２０１６／０２２２１７４号の表１は、その全体が本明細書に組み込まれ、選択された種及び絹型からのブロック配列の例を列挙し、更なる例が、Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ １６９－１８４（２０１１）、及びＧａｔｅｓｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：５５１３，ｐｇ． ２６０３－２６０５（２００１）において提示されている。一部の場合では、ブロックは規則的なパターンにおいて配置され、絹配列の反復ドメイン中に複数回（通常、２～８）現れるより大きなマクロリピートを形成する。反復ドメイン又はマクロリピート内の反復ブロック、及び反復ドメイン内の反復マクロリピートは、スペーシングエレメントにより分離されうる。
【0139】
本開示の特定の実施形態に従った、ブロック及び／又はマクロリピートドメインからの特定のクモ絹ブロック共重合体ポリペプチドの構造が、米国特許出願公開第２０１６／０２２２１７４号において例証されている。
【0140】
組換え原核生物又は真核生物系における遺伝子発現により産生されるクモ絹配列に基づく組換えブロック共重合体ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法に従って精製することができる。好ましい実施形態では、商業的に入手可能な発現／分泌系を使用することができ、それにより、組換えポリペプチドが発現され、その後、宿主細胞から分泌され、周囲の培地から簡単に精製される。発現／分泌ベクターを使用しない場合、代替的なアプローチは、ポリペプチドが発現された原核細胞又は真核細胞から由来する細胞可溶化物（細胞の完全性の破壊後の細胞の残り）から組換えブロック共重合体ポリペプチドを精製することを含む。そのような細胞可溶化物の生成のための方法は、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、組換えブロック共重合体ポリペプチドは、細胞培養上清から単離される。
【0141】
組換えブロック共重合体ポリペプチドは、親和性分離により、例えば、それらのＮ末端又はＣ末端の６～８のヒスチジン残基でタグ付けされた組換えポリペプチドの単離用の組換えポリペプチド又はニッケルカラムに特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用により精製されてもよい。代替タグは、ＦＬＡＧエピトープ又はヘマグルチニンエピトープを含み得る。そのような方法は、当業者により一般的に使用される。
【0142】
そのようなポリペプチド（すなわち、組換え絹タンパク質）の溶液を次に、本明細書に記載されるように調製し、使用してもよい。
【0143】
別の実施形態では、組換え絹タンパク質は、米国特許第８，６４２，７３４号において記載される方法に従って調製してもよく、その全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に記載されるように使用される。
【0144】
一実施形態では、組換えクモ絹タンパク質が提供される。クモ絹タンパク質は、典型的には、１７０～７６０アミノ酸残基、例えば１７０～６００アミノ酸残基など、好ましくは２８０～６００アミノ酸残基、例えば３００～４００アミノ酸残基など、より好ましくは３４０～３８０アミノ酸残基からなる。小さなサイズが有利である。なぜなら、より長いクモ絹タンパク質は、非結晶性凝集体を形成する傾向があり、それは、可溶化及び重合のために厳しい溶媒の使用が必要となるためである。組換えクモ絹タンパク質は、特に、クモ絹タンパク質が、クモ絹タンパク質のＮ末端部分から由来する３つ以上の断片を含む場合では、７６０を上回る残基を含んでもよく、クモ絹タンパク質は、クモ絹タンパク質の対応する部分から由来する少なくとも１つの断片（ＮＴ）、及びクモ絹タンパク質の対応する内部断片から由来する反復断片（ＲＥＰ）からなるＮ末端断片を含む。任意選択的に、クモ絹タンパク質は、クモ絹タンパク質の対応する断片から由来するＣ末端断片（ＣＴ）を含む。クモ絹タンパク質は、典型的には、クモ絹タンパク質のＮ末端部分から由来する単一断片（ＮＴ）を含むが、しかし、好ましい実施形態では、Ｎ末端断片は、少なくとも２つ、例えばクモ絹タンパク質のＮ末端部分から由来する２つの断片（ＮＴ）などを含む。このように、スピドロインは、式ＮＴｍ－ＲＥＰ、及び代替的にＮＴｍ－ＲＥＰ－ＣＴにより模式的に表すことができ、ｍは、１以上、例えば２以上など、好ましくは１～２、１～４、１～６、２～４、又は２～６の範囲内の整数である。好ましいスピドロインは、式ＮＴ２－ＲＥＰ又はＮＴ－ＲＥＰ、及び代替的にＮＴ２－ＲＥＰ－ＣＴ又はＮＴ－ＲＥＰ－ＣＴにより模式的に表すことができる。タンパク質断片は、典型的には、ペプチド結合を介して共有結合される。一実施形態では、クモ絹タンパク質は、ＲＥＰ断片に結合されたＮＴ断片からなり、そのＲＥＰ断片は、任意選択的に、ＣＴ断片に結合される。
【0145】
一実施形態では、単離されたクモ絹タンパク質のポリマーを産生する方法の第１の工程は、好適な宿主、例えば大腸菌などにおける、クモ絹タンパク質をコードするポリ核酸分子の発現を含む。このようにして得られたタンパク質は、標準的な手順を使用して単離される。任意選択的に、リポ多糖類及び他の発熱性物質は、この段階で積極的に除去される。
【0146】
単離されたクモ絹タンパク質のポリマーを産生する方法の第２の工程では、液体媒体中のクモ絹タンパク質の溶液が提供される。「可溶性」及び「溶液中」という用語は、タンパク質が目に見えるように凝集せず、６０，０００×ｇで溶媒から沈殿しないことを意味する。液体媒体は、任意の好適な媒体、例えば水性媒体など、好ましくは生理学的媒体、典型的には、緩衝水性媒体、例えば１０～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液又はリン酸緩衝液などであり得る。液体媒体は、６．４以上のｐＨ及び／又はクモ絹タンパク質の重合を防止するイオン組成物を有する。すなわち、液体媒体は、ｐＨ６．４以上、あるいはクモ絹タンパク質の重合を防止するイオン組成物のいずれか、又はその両方を有する。
【0147】
クモ絹タンパク質の重合を防止するイオン組成物は、本明細書で開示される方法を利用して、当業者により容易に調製されることができる。クモ絹タンパク質の重合を防止する好ましいイオン組成物は、３００ｍＭ超のイオン強度を有する。クモ絹タンパク質の重合を防止するイオン組成物の特定の例は、３００ｍＭ超のＮａＣｌ、１００ｍＭのリン酸塩、及びクモ絹タンパク質の重合に対する所望の予防効果を有するこれらのイオンの組み合わせ、例えば、１０ｍＭのリン酸塩及び３００ｍＭのＮａＣｌの組み合わせを含む。
【0148】
ＮＴ断片の存在によって、溶液の安定性が改善され、これらの条件下でのポリマー形成が防止される。これは、即時の重合が望ましくないであろう場合、例えば、タンパク質精製の間、大バッチの調製中、又は他の条件を最適化する必要がある場合に有利であり得る。液体媒体のｐＨは、クモ絹タンパク質の高い溶解性を達成するために、６．７以上、例えば７．０以上など、あるいは更に８．０以上、例えば最大１０．５などまで調整されることが好ましい。また、液体媒体のｐＨは、６．４～６．８の範囲に調整されることが有利であり得るが、それによって、クモ絹タンパク質の十分な溶解性が提供されるが、しかし、その後のｐＨ調整が６．３以下まで促進される。
【0149】
第３の工程では、液体媒体の特性は、６．３以下のｐＨ及び重合を可能にするイオン組成物に調整される。すなわち、クモ絹タンパク質が溶解される液体媒体が、６．４以上のｐＨを有する場合、ｐＨは６．３以下まで減少される。当業者は、典型的には、強酸又は弱酸の添加を含め、これを達成するための様々な方法を十分に認識している。クモ絹タンパク質が溶解される液体媒体が、重合を防止するイオン組成物を有する場合、イオン組成物は、重合を可能にするように変化する。当業者は、これを達成するための様々な方法、例えば、希釈、透析、又はゲル濾過を十分に認識している。必要な場合、この工程は、液体媒体のｐＨを６．３以下に減少させること、及び重合を可能にするためにイオン組成物を変化させることを含む。液体媒体のｐＨは、６．２以下、例えば６．０以下などに調整されることが好ましい。特に、先行工程における６．４又は６．４～６．８からのｐＨ降下を、この工程において６．３又は６．０～６．３、例えば、６．２に限定することは、実用的な観点から有利であり得る。好ましい実施形態では、この工程の液体媒体のｐＨは、３以上、例えば４．２以上などである。結果として得られるｐＨ範囲、例えば、４．２～６．３によって、迅速な重合が促進される。
【0150】
第４の工程では、クモ絹タンパク質は、６．３以下のｐＨ及びクモ絹タンパク質の重合を可能にするイオン組成物を有する液体媒体中で重合することができる。ＮＴ断片の存在によって、６．４以上のｐＨでのクモ絹タンパク質の溶解性、及び／又はクモ絹タンパク質の重合を防止するイオン組成物が改善されるが、それは、イオン組成物がクモ絹タンパク質の重合を可能にする場合、６．３以下のｐＨでのポリマー形成を加速させる。結果として得られるポリマーは、好ましくは、固体及び肉眼的であり、それらは、６．３以下のｐＨ及びクモ絹タンパク質の重合を可能にするイオン組成物を有する液体媒体中で形成される。好ましい実施形態では、この工程の液体媒体のｐＨは、３以上、例えば４．２以上などである。結果として得られるｐＨ範囲、例えば、４．２～６．３によって、迅速な重合が促進される。結果として得られるポリマーは、本明細書に記載される分子量で提供され、物品コーティングのために必要な場合に使用され得る溶液形態として調製されてもよい。
【0151】
クモ絹タンパク質の重合を可能にするイオン組成物は、本明細書で開示される方法を利用して、当業者により容易に調製されることができる。クモ絹タンパク質の重合を可能にする好ましいイオン組成物は、３００ｍＭ未満のイオン強度を有する。クモ絹タンパク質の重合を可能にするイオン組成物の具体的な例は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸塩、２０ｍＭのリン酸塩、及びクモ絹タンパク質の重合に対する予防効果を欠くこれらのイオンの組み合わせ、例えば、１０ｍＭのリン酸塩又は２０ｍＭのリン酸塩及び１５０ｍＭのＮａＣｌの組み合わせを含む。この液体媒体のイオン強度は、１～２５０ｍＭの範囲に調整されることが好ましい。
【0152】
任意の特定の理論に限定されることを望まないが、ＮＴ断片は反対に荷電した極を有し、ｐＨにおける環境変化は、タンパク質の表面上の荷電バランスに影響を及ぼし、重合が続き、他方で塩は同じ事象を阻害することが想定される。
【0153】
中性ｐＨでは、酸性極の過剰な負荷電を埋めるエネルギッシュなコストによって、重合が防止されると予測されうる。しかし、二量体が、より低いｐＨでその等電点に近づくにつれて、誘引性の静電力が最終的に支配的となり、観察された塩並びにＮＴ及びＮＴ含有ミニスピドロインのｐＨ依存的な重合挙動が説明される。いくつかの実施形態では、ｐＨ誘導性ＮＴ重合、及びＮＴ－ミニスピドロインの線維アセンブリの効率増加が、表面静電電位変化に起因していること、並びに、ＮＴの１つの極での酸性残基のクラスタリングによって、その荷電バランスがシフトして、重合転移が、６．３以下のｐＨ値で生じることが提案されている。
【0154】
第５の工程では、結果として得られる、好ましくは固体のクモ絹タンパク質ポリマーは、当該液体媒体から単離される。任意選択的に、この工程は、リポ多糖類及び他の発熱性物質をスピドロインポリマーから積極的に除去することを含む。
【0155】
任意の特定の理論に限定されることを望まないが、スピドロインポリマーの形成は、水溶性スピドロイン二量体の形成を介して進行することが観察されている。本開示はまた、このように、単離されたクモ絹タンパク質の二量体を産生する方法を提供し、最初の２つの方法工程は、上記に説明されるとおりである。クモ絹タンパク質は、６．４以上のｐＨ及び／又は当該クモ絹タンパク質の重合を防止するイオン組成での液体媒体中の二量体として存在する。第３の工程は、第２の工程において得られた二量体を単離することを含み、任意選択的に、リポ多糖類及び他の発熱性物質の除去を含む。好ましい実施形態では、本開示のクモ絹タンパク質ポリマーは、重合したタンパク質二量体からなる。本開示は、このように、クモ絹タンパク質の二量体を産生するための、クモ絹タンパク質の新規使用、好ましくは、本明細書で開示されるものを提供する。
【0156】
別の態様によれば、本開示は、本明細書で開示されるクモ絹タンパク質のポリマーを提供する。一実施形態では、このタンパク質のポリマーは、本開示に従った方法のいずれか１つにより取得可能である。このように、本開示は、組換え絹ベースのコーティングとしてクモ絹タンパク質のポリマーを産生するための、組換えクモ絹タンパク質の様々な使用、好ましくは、本明細書で開示されるものを提供する。一実施形態によれば、本開示は、組換え絹ベースのコーティングとして単離クモ絹タンパク質のポリマーを産生するための、クモ絹タンパク質の二量体の新規使用、好ましくは本明細書で開示されるものを提供する。これらの使用において、ポリマーは、６．３以下のｐＨ及び当該クモ絹タンパク質の重合を可能にするイオン組成を有する液体媒体中で産生されることが好ましい。一実施形態では、液体媒体のｐＨは、３以上、例えば４．２以上などである。結果として得られるｐＨ範囲、例えば、４．２～６．３によって、迅速な重合が促進される。
【0157】
本開示の方法を使用して、重合プロセスを制御することが可能であり、これによって、所望の特性及び形状を伴う絹ポリマーを得るためのパラメータの最適化が可能となる。
【0158】
一実施形態では、本明細書に記載される組換え絹タンパク質は、米国特許第８，６４２，７３４号において記載されているものを含み、その全体が参照により組み込まれる。
【0159】
別の実施形態では、本明細書に記載される組換え絹タンパク質は、米国特許第９，０５１，４５３号において記載されている方法に従って調製されてもよく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0160】
米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１により表されるアミノ酸配列は、Ｃ末端でのＡＤＦ３のアミノ酸配列の５０のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列と同一である（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）。米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号２により表されるアミノ酸配列は、２０の残基がＣ末端から除去された、米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１により表されるアミノ酸配列と同一である。米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号３により表されるアミノ酸配列は、２９の残基がＣ末端から除去された、配列番号１により表されるアミノ酸配列と同一である。
【0161】
式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）により表されるアミノ酸配列の単位を含み、Ｃ末端に配列番号１～３のいずれかにより表されるアミノ酸配列又は米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１～３のいずれかにより表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの例は、米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号８により表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号８により表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、以下の変異により得られる：ＡＤＦ３（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のアミノ酸配列において、そのＮ－末端に開始コドン、Ｈｉｓ １０タグ、及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）認識部位で構成されるアミノ酸配列（米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号５）が付加されており、１～１３番目の反復領域が約二倍になっており、翻訳が１１５４番目のアミノ酸残基で終了する。米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号８により表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて、Ｃ末端配列は、配列番号３により表されるアミノ酸配列と同一である。
【0162】
更に、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）により表されるアミノ酸配列の単位を含み、Ｃ末端に、米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１～３のいずれかにより表されるアミノ酸配列又は米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１～３のいずれかにより表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号８により表されるアミノ酸配列を有し、それにおいて、１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されており、結晶領域及びアモルファス領域で構成される反復領域を有するタンパク質であり得る。
【0163】
更に、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）により表されるアミノ酸配列の２つ以上の単位を含むポリペプチドの例は、米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有するＡＤＦ４から由来する組換えタンパク質である。米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１５により表されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベース（ＮＣＢＩ受入番号：ＡＡＣ４７０１１、ＧＩ：１２６３２８９）から得られたＡＤＦ４の部分アミノ酸配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ １０タグ、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）認識部位で構成されるアミノ酸配列（米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号５）を付加することにより得られたアミノ酸配列である。更に、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）により表されるアミノ酸配列を２つ以上の単位を含むポリペプチドは、米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有し、それにおいて、１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されており、並びに結晶領域及びアモルファス領域で構成される領域を有するポリペプチドであり得る。更に、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）により表されるアミノ酸配列の２つ以上の単位を含むポリペプチドの例は、米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１７により表されるアミノ酸配列を有するＭａＳｐ２から由来する組換えタンパク質である。米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１７により表されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩウェブデータベース（ＮＣＢＩ受入番号：ＡＡＴ７５３１３、ＧＩ：５０３６３１４７）から得られたＭａＳｐ２の部分配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ １０タグ、及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）認識部位で構成されるアミノ酸配列（米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号５）を付加することにより得られるアミノ酸配列である。更に、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）により表されるアミノ酸配列の２つ以上の単位を含むポリペプチドは、米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１７により表されるアミノ酸配列を有し、それにおいて、１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されており、並びに結晶領域及びアモルファス領域で構成される領域を有するポリペプチドであり得る。
【0164】
鞭状腺絹タンパク質から由来するポリペプチドの例は、式２：ＲＥＰ３（２）により表されるアミノ酸配列の１０以上の単位を含むポリペプチド、好ましくはその２０以上の単位を含むポリペプチド、及びより好ましくはその３０以上の単位を含むポリペプチドを含む。宿主として微生物、例えば大腸菌などを使用して組換えタンパク質を産生する場合では、鞭状腺絹タンパク質から由来するポリペプチドの分子量は、生産性の観点から、好ましくは５００ｋＤａ以下、より好ましくは３００ｋＤａ以下、更に好ましくは２００ｋＤａ以下である。
【0165】
式（２）では、ＲＥＰ３は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘで構成されるアミノ酸配列を示し、ここで、Ｘは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸を示す。
【0166】
クモ絹の主要な特徴は、鞭状腺絹が結晶領域を有しないが、しかし、アモルファス領域で構成される反復領域を有することである。主要なドラッグライン絹及び同様のものは、結晶領域及びアモルファス領域で構成される反復領域を有するため、それらは高い応力及び伸縮性の両方を有すると予想される。一方、鞭状腺絹に関しては、応力はメジャードラッグライン絹のそれよりも劣るが、伸縮性は高い。これについての理由は、鞭状腺絹の大半がアモルファス領域で構成されることであると考えられる。
【0167】
式２：ＲＥＰ３（２）により表されるアミノ酸配列の１０以上の単位を含むポリペプチドの例は、米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１９により表されるアミノ酸配列を有する鞭状腺絹タンパク質から由来する組換えタンパク質である。米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１９により表されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベース（ＮＣＢＩ受入番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）から得られたネフィラ・クラビペスの鞭状腺絹タンパク質の部分配列、具体的には、反復部分及びモチーフに対応するＮ末端から１２２０残基から１６５９残基までのそのアミノ酸配列（ＰＲ１配列として言及する）を、ＮＣＢＩデータベース（ＮＣＢＩ受入番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）から得られたネフィラ・クラビペスの鞭状腺絹タンパク質の部分配列、具体的には、Ｃ末端から８１６残基～９０７残基のＣ末端アミノ酸配列を組み合わせて、その後に、開始コドン、Ｈｉｓ １０タグ、及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識部位で構成されるアミノ酸配列（米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号５）を、組み合わせた配列のＮ末端に付加することにより得られたアミノ酸配列である。更に、式２：ＲＥＰ３（２）により表されるアミノ酸配列の１０以上の単位を含むポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、及び／又は付加され、アモルファス領域で構成される反復領域を有する、米国特許第９，０５１，４５３号の配列番号１９により表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。
【0168】
ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換された宿主を使用して産生することができる。遺伝子を産生するための方法は、特に限定されないが、それは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など、及びそれをクローニングすることにより、クモから由来する細胞から天然クモ絹タンパク質をコードする遺伝子を増幅することにより産生されてもよく、又は化学的に合成されてもよい。また、遺伝子を化学的に合成する方法は、特に限定されないが、それは、例えば、以下のとおりに合成することができる：ＮＣＢＩウェブデータベースなどから得られた天然クモ絹タンパク質のアミノ酸配列の情報に基づいて、ＡＫＴＡオリゴパイロットプラス１０／１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で自動的に合成されたオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲなどにより連結される。この時点で、タンパク質の精製及び観察を促進するために、上記のアミノ酸配列のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を、開始コドン及びＨｉｓ １０タグで構成されるアミノ酸配列が付加されたＮ末端に合成することが可能である。
【0169】
発現ベクターの例は、ＤＮＡ配列に基づいてタンパク質を発現することができるプラスミド、ファージ、ウイルス及び同様のものを含む。プラスミド型発現ベクターは、それによって、標的遺伝子を宿主細胞中で発現することができ、それ自体が増幅することができる限り、特に限定されない。例えば、宿主として大腸菌ロゼッタ（ＤＥ３）を使用する場合において、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクター、及び同様のものを使用することができる。これらの間で、タンパク質の生産性に関しては、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを使用することが好ましい。宿主の例は、動物細胞、植物細胞、微生物などを含む。
【0170】
本開示中で使用されるポリペプチドは、好ましくは、ＡＤＦ３から由来するポリペプチドであり、それは、アラネウス・ダイアデマトゥスの２つの主要なドラッグライン絹タンパク質のうちの１つである。このポリペプチドは、基本的に高い強度－伸張性及び強靭性を有し、簡単に合成されるという利点を有する。
【0171】
したがって、本明細書に記載される実施形態、物品、及び／又は方法に従って使用される組換え絹タンパク質（例えば、組換えクモ絹ベースのタンパク質）は、上に記載される、又は米国特許第８，１７３，７７２号、同第８，２７８，４１６号、同第８，６１８，２５５号、同第８，６４２，７３４号、同第８，６９１，５８１号、同第８，７２９，２３５号、同第９，１１５，２０４号、同第９，１５７，０７０号、同第９，３０９，２９９号、同第９，６４４，０１２号、同第９，７０８，３７６号、同第９，０５１，４５３号、同第９，６１７，３１５号、同第９，９６８，６８２号、同第９，６８９，０８９号、同第９，７３２，１２５号、同第９，８５６，３０８号、同第９，９２６，３４８号、同第１０，０６５，９９７号、同第１０，３１６，０６９号、及び同第１０，３２９，３３２号、及び米国特許公開第２００９／０２２６９６９号、同第２０１１／０２８１２７３号、同第２０１２／００４１１７７号、同第２０１３／００６５２７８号、同第２０１３／０１１５６９８号、同第２０１３／０３１６３７６号、同第２０１４／００５８０６６号、同第２０１４／００７９６７４号、同第２０１４／０２４５９２３号、同第２０１５／００８７０４６号、同第２０１５／０１１９５５４号、同第２０１５／０１４１６１８号、同第２０１５／０２９１６７３号、同第２０１５／０２９１６７４号、同第２０１５／０２３９５８７号、同第２０１５／０３４４５４２号、同第２０１５／０３６１１４４号、同第２０１５／０３７４８３３号、同第２０１５／０３７６２４７号、同第２０１６／００２４４６４号、同第２０１７／００６６８０４号、同第２０１７／００６６８０５号、同第２０１５／０２９３０７６号、同第２０１６／０２２２１７４号、同第２０１７／０２８３４７４号、同第２０１７／００８８６７５号、同第２０１９／０１３５８８０号、同第２０１５／０３２９５８７号、同第２０１９／００４０１０９号、同第２０１９／０１３５８８１号、同第２０１９／０１７７３６３号、同第２０１９／０２２５６４６号、同第２０１９／０２３３４８１号、同第２０１９／００３１８４２号、同第２０１８／０３５５１２０号、同第２０１９／０１８６０５０号、同第２０１９／０００２６４４号、同第２０２０／００３１８８７号、同第２０１８／０２７３５９０号、同第２０１９１／０９４４０３号、同第２０１９／００３１８４３号、同第２０１８／０２５１５０１号、同第２０１７／００６６８０５号、同第２０１８／０１２７５５３号、同第２０１９／０３２９５２６号、同第２０２０／００３１８８６号、同第２０１８／００８０１４７号、同第２０１９／０３５２３４９号、同第２０２０／００４３０８５号、同第２０１９／０１４４８１９号、同第２０１９／０２２８４４９号、同第２０１９／０３４０６６６号、同第２０２０／０００００９１号、同第２０１９／０１９４７１０号、同第２０１９／０１５１５０５号、同第２０１８／０２６５５５５号、同第２０１９／０３５２３３０号、同第２０１９／０２４８８４７号、及び同第２０１９／０３７８１９１号において記述される１つ以上の組換え絹タンパク質を含み得るが、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0172】
絹フィブロイン様タンパク質断片
本開示中の組換え絹タンパク質は、天然絹タンパク質の反復単位に基づく合成タンパク質を含む。合成反復絹タンパク質配列の他、これらは、追加的に、１つ以上の天然非反復絹タンパク質配列を含むことができる。本明細書で使用される場合、「絹フィブロイン様タンパク質断片」は、本明細書で定義される分子量及び多分散性、並びに天然絹タンパク質、フィブロイン重鎖、フィブロイン軽鎖、あるいは１つ以上のＧＡＧＡＧＳ（配列番号２）ヘキサアミノ酸反復単位を含む任意のタンパク質から選択されるタンパク質とある程度の相同性を有するタンパク質断片を指す。いくつかの実施形態では、相同性の程度は、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、約８０％、約７９％、約７８％、約７７％、約７６％、約７５％、又は７５％未満から選択される。
本開示中の組換え絹タンパク質は、天然絹タンパク質の反復単位に基づく合成タンパク質を含む。合成反復絹タンパク質配列の他、これらは、追加的に、１つ以上の天然非反復絹タンパク質配列を含むことができる。本明細書で使用される場合、「絹フィブロイン様タンパク質断片」は、本明細書で定義される分子量及び多分散性、並びに天然絹タンパク質、フィブロイン重鎖、フィブロイン軽鎖、あるいは１つ以上のＧＡＧＡＧＳ（配列番号２）ヘキサアミノ酸反復単位を含む任意のタンパク質から選択されるタンパク質とある程度の相同性を有するタンパク質断片を指す。いくつかの実施形態では、相同性の程度は、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、約８０％、約７９％、約７８％、約７７％、約７６％、約７５％、又は７５％未満から選択される。
【0173】
本明細書に記載されるように、タンパク質、例えば天然絹タンパク質、フィブロイン重鎖、フィブロイン軽鎖、あるいは１つ以上のＧＡＧＡＧＳ（配列番号２）ヘキサアミノ酸反復単位を含む任意のタンパク質などは、約９％～約４５％の間のグリシン、又は約９％のグリシン、又は約１０％のグリシン、約４３％のグリシン、約４４％のグリシン、約４５％のグリシン、又は約４６％のグリシンを含む。本明細書に記載されるように、タンパク質、例えば天然絹タンパク質、フィブロイン重鎖、フィブロイン軽鎖、あるいは１つ以上のＧＡＧＡＧＳ（配列番号２）ヘキサアミノ酸反復単位を含む任意のタンパク質などは、約１３％～約３０％の間のアラニン、又は約１３％のアラニン、又は約２８％のアラニン、又は約２９％のアラニン、又は約３０％のアラニン、又は約３１％のアラニンを含む。本明細書に記載されるように、タンパク質、例えば天然絹タンパク質、フィブロイン重鎖、フィブロイン軽鎖、あるいは１つ以上のＧＡＧＡＧＳ（配列番号２）ヘキサアミノ酸反復単位を含む任意のタンパク質などは、９％～約１２％の間のセリン、又は約９％のセリン、又は約１０％のセリン、又は約１１％のセリン、又は約１２％のセリンを含む。
【0174】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される絹フィブロイン様タンパク質は、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、又は約５５％のグリシンを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に説明される絹フィブロイン様タンパク質は、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、又は約３９％のアラニンを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される絹フィブロイン様タンパク質は、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、又は約２２％のセリンを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される絹フィブロイン様タンパク質は、独立して、天然フィブロイン中に含まれることが公知である任意のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される絹フィブロイン様タンパク質は、独立して、天然フィブロイン中に含まれることが公知である任意のアミノ酸を除外し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される絹フィブロイン様タンパク質中の平均で６つのアミノ酸中２つ、６つのアミノ酸中３つ、又は６つのアミノ酸中４つが、グリシンである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される絹フィブロイン様タンパク質中の平均で６つのアミノ酸中１つ、６つのアミノ酸中２つ、又は６つのアミノ酸中３つが、アラニンである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される絹フィブロイン様タンパク質中の平均で６つのアミノ酸中０、６つのアミノ酸中１つ、又は６つのアミノ酸中２つが、セリンである。
【0175】
ＳＰＦの他の特性
本開示の組成物は、「生体適合性」である又は「生体適合性」を示し、組成物が、毒性がない、有毒でない、生理学的反応性がない、及び免疫拒絶を起こさないことにより、生体組織又は生体システムと適合することを意味する。そのような生体適合性は、参加者が、局所的に、延長期間にわたり彼らの皮膚上に本開示の組成物を適用することにより証明することができる。一実施形態では、延長期間は約３日間である。一実施形態では、延長期間は約７日間である。一実施形態では、延長期間は約１４日間である。一実施形態では、延長期間は約２１日間である。一実施形態では、延長期間は約３０日間である。一実施形態では、延長期間は、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１２ヶ月間、及び無期限からなる群から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるコーティングは、生体適合性コーティングである。
本開示の組成物は、「生体適合性」である又は「生体適合性」を示し、組成物が、毒性がない、有毒でない、生理学的反応性がない、及び免疫拒絶を起こさないことにより、生体組織又は生体システムと適合することを意味する。そのような生体適合性は、参加者が、局所的に、延長期間にわたり彼らの皮膚上に本開示の組成物を適用することにより証明することができる。一実施形態では、延長期間は約３日間である。一実施形態では、延長期間は約７日間である。一実施形態では、延長期間は約１４日間である。一実施形態では、延長期間は約２１日間である。一実施形態では、延長期間は約３０日間である。一実施形態では、延長期間は、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１２ヶ月間、及び無期限からなる群から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるコーティングは、生体適合性コーティングである。
【0176】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、生体適合性組成物（例えば、絹を含む生体適合性コーティング）であってもよく、評価されて、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ － Ｐａｒｔ １： Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ａ ｒｉｓｋ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ」と題される国際規格ＩＳＯ１０９９３－１に準拠し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、生体適合性組成物であってもよく、細胞傷害性、感作性、血液適合性、発熱性、移植性、遺伝毒性、がん原性、生殖発生毒性、及び分解のうちの１つ以上について、ＩＳＯ １０６９９３－１の下で評価されてもよい。
【0177】
本開示の組成物は、「低アレルギー性」であり、アレルギー反応を起こす可能性が比較的低いことを意味する。そのような低アレルギー性は、参加者が、局所的に、延長期間にわたり彼らの皮膚上に本開示の組成物を適用することにより証明することができる。一実施形態では、延長期間は約３日間である。一実施形態では、延長期間は約７日間である。一実施形態では、延長期間は約１４日間である。一実施形態では、延長期間は約２１日間である。一実施形態では、延長期間は約３０日間である。一実施形態では、延長期間は、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１２ヶ月間、及び無期限からなる群から選択される。
【0178】
一実施形態では、本開示の組成物の安定性は約１日である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は約２日である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は約３日である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は約４日である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は約５日である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は約６日である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は約７日である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は約８日である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は約９日である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は約１０日である。
【0179】
一実施形態では、本開示の組成物の安定性は、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、又は約３０日である。
【0180】
一実施形態では、本開示の組成物の安定性は１０日～６ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は６ヶ月～１２ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は１２ヶ月～１８ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は１８ヶ月～２４ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は２４ヶ月～３０ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は３０ヶ月～３６ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は３６ヶ月～４８ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は４８ヶ月～６０ヶ月である。
【0181】
一実施形態では、本開示のＳＰＦ組成物は、タンパク質の結晶性に起因して、水溶液中で可溶性ではない。一実施形態では、本開示のＳＰＦ組成物は、水溶液中で可溶性である。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、約３分の２の結晶性部分及び約３分の１のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、約半分の結晶性部分及び約半分のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、９９％の結晶性部分及び１％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、９５％の結晶性部分及び５％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、９０％の結晶性部分及び１０％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、８５％の結晶性部分及び１５％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、８０％の結晶性部分及び２０％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、７５％の結晶性部分及び２５％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、７０％の結晶性部分及び３０％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、６５％の結晶性部分及び３５％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、６０％の結晶性部分及び４０％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、５０％の結晶性部分及び５０％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、４０％の結晶性部分及び６０％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、３５％の結晶性部分及び６５％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、３０％の結晶性部分及び７０％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、２５％の結晶性部分及び７５％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、２０％の結晶性部分及び８０％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、１５％の結晶性部分及び８５％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、１０％の結晶性部分及び９０％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、５％の結晶性部分及び９０％のアモルファス領域を含む。一実施形態では、本開示の組成物のＳＰＦは、１％の結晶性部分及び９９％のアモルファス領域を含む。
【0182】
本明細書で使用される場合、「無機残渣を実質的に含まない」という用語は、組成物が０．１％（ｗ／ｗ）以下の残渣を示すことを意味する。一実施形態では、「無機残渣を実質的に含まない」は、０．０５％（ｗ／ｗ）以下の残渣を示す組成物を指す。一実施形態では、「無機残渣を実質的に含まない」は、０．０１％（ｗ／ｗ）以下の残渣を示す組成物を指す。一実施形態では、無機残渣の量は、０ｐｐｍ（「検出不能」又は「ＮＤ」）～１０００ｐｐｍの間である。一実施形態では、無機残渣の量は、ＮＤ～約５００ｐｐｍである。一実施形態では、無機残渣の量は、ＮＤ～約４００ｐｐｍである。一実施形態では、無機残渣の量は、ＮＤ～約３００ｐｐｍである。一実施形態では、無機残渣の量は、ＮＤ～約２００ｐｐｍである。一実施形態では、無機残渣の量は、ＮＤ～約１００ｐｐｍである。一実施形態では、無機残渣の量は、１０ｐｐｍ～１０００ｐｐｍの間である。
【0183】
本明細書で使用される場合、「無機残渣を実質的に含まない」という用語は、組成物が０．１％（ｗ／ｗ）以下の残渣を示すことを意味する。一実施形態では、「無機残渣を実質的に含まない」は、０．０５％（ｗ／ｗ）以下の残渣を示す組成物を指す。一実施形態では、「有機残渣を実質的に含まない」は、０．０１％（ｗ／ｗ）以下の残渣を示す組成物を指す。一実施形態では、有機残渣の量は、０ｐｐｍ（「検出不能」又は「ＮＤ」）～１０００ｐｐｍの間である。一実施形態では、有機残渣の量は、ＮＤ～約５００ｐｐｍである。一実施形態では、有機残渣の量は、ＮＤ～約４００ｐｐｍである。一実施形態では、有機残渣の量は、ＮＤ～約３００ｐｐｍである。一実施形態では、有機残渣の量は、ＮＤ～約２００ｐｐｍである。一実施形態では、有機残渣の量は、ＮＤ～約１００ｐｐｍである。一実施形態では、有機残渣の量は、１０ｐｐｍ～１０００ｐｐｍの間である。
【0184】
本開示の組成物は、「生体適合性」を示し、組成物が、毒性がない、有毒でない、又は生理学的反応性がない、及び免疫拒絶を起こさないことにより、生体組織又は生体システムと適合することを意味する。そのような生体適合性は、参加者が、局所的に、延長期間にわたり彼らの皮膚上に本開示の組成物を適用することにより証明することができる。一実施形態では、延長期間は約３日間である。一実施形態では、延長期間は約７日間であり、一実施形態では、延長期間は約１４日間であり、一実施形態では、延長期間は約２１日間である。一実施形態では、延長期間は約３０日間である。一実施形態では、延長期間は、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１２ヶ月間、及び無期限からなる群から選択される。
【0185】
本開示の組成物は、「低アレルギー性」であり、アレルギー反応を起こす可能性が比較的低いことを意味する。そのような低アレルギー性は、参加者が、局所的に、延長期間にわたり彼らの皮膚上に本開示の組成物を適用することにより証明することができる。一実施形態では、延長期間は約３日間である。一実施形態では、延長期間は約７日間である。一実施形態では、延長期間は約１４日間である。一実施形態では、延長期間は約２１日間である。一実施形態では、延長期間は約３０日間である。一実施形態では、延長期間は、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１２ヶ月間、及び無期限からなる群から選択される。
【0186】
以下は、本開示の絹溶液の調製における及びそのための様々なパラメータの好適な範囲の非限定的な例である。本開示の絹溶液は、これらのパラメータのうちの１つ以上（しかし、必ずしも全てではない）を含み得るが、そのようなパラメータの範囲の様々な組み合わせを使用して調製され得る。
【0187】
一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、３０．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、２５．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、２０．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１９．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１８．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１７．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１６．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１５．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１４．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１３．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１２．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１１．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１０．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、９．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、８．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、７．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、６．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、５．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、４．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、３．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、２．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１．０重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．９重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．８重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．７重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．６重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．５重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．４重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．３重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．２重量％未満である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．１重量％未満である。
【0188】
一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．１重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．２重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．３重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．４重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．５重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．６重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．７重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．８重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、０．９重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、２．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、３．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、４．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、５．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、６．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、７．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、８．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、９．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１０．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１１．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１２．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１３．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１４．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１５．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１６．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１７．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１８．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、１９．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、２０．０重量％超である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、２５．０重量％超である。
【0189】
一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約３０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約２５．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約２０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約１５．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約１０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約９．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約８．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約７．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約６．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約６．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約５．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約５．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約４．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約４．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約３．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約３．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約２．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約２．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約２．４重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．５重量％～約５．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．５重量％～約４．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．５重量％～約４．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．５重量％～約３．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．５重量％～約３．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．５重量％～約２．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１．０重量％～約４．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１．０重量％～約３．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１．０重量％～約３．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１．０重量％～約２．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１．０重量％～約２．４重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１．０重量％～約２．０重量％の範囲である。
【0190】
一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約２０．０重量％～約３０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約１０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１．０重量％～約１０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約２重量％～約１０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約０．１重量％～約６．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約６．０重量％～約１０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約６．０重量％～約８．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約６．０重量％～約９．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１０．０重量％～約２０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１１．０重量％～約１９．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１２．０重量％～約１８．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１３．０重量％～約１７．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１４．０重量％～約１６．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１．０重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１．５重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約２．０重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約２．４重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約３．０重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約３．５重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約４．０重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約４．５重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約５．０重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約５．５重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約６．０重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約６．５重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約７．０重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約７．５重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約８．０重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約８．５重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約９．０重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約９．５重量％である。一実施形態では、溶液中のＳＰＦ（％）は、約１０．０重量％である。
【0191】
一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、検出不能～２５．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、検出不能～５．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、１．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、２．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、３．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、４．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、５．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、１０．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、２５．０重量％である。
【0192】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロインタンパク質断片は、貯蔵条件、ＳＰＦのパーセント、並びに出荷の数及び出荷条件に依存して、１０日間～３年間の保管安定性を有する（それらは、水溶液中で貯蔵した場合に、ゆっくりと又は自然発生的にゲル化することはなく、断片の凝集はなく、したがって経時的な分子量の増加はない）。追加的に、ｐＨを変化させて、絹の未熟な折り畳み及び凝集を防止することにより、保管寿命を延長させることができる及び／又は出荷条件を支援することができる。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は０～１年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は０～２年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は０～３年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は０～４年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は０～５年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は１～２年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は１～３年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は１～４年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は１～５年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は２～３年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は２～４年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は２～５年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は３～４年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は３～５年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は４～５年間である。
【0193】
一実施形態では、本開示の組成物の安定性は１０日～６ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は６ヶ月～１２ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は１２ヶ月～１８ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は１８ヶ月～２４ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は２４ヶ月～３０ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は３０ヶ月～３６ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は３６ヶ月～４８ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は４８ヶ月～６０ヶ月である。
【0194】
一実施形態では、ＳＰＦを有する本開示の組成物は、検出不可能なレベルのＬｉＢｒ残渣を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、１０ｐｐｍ～１０００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、１０ｐｐｍ～３００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、２５ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉ Ｂｒ残渣の量は、５０ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、７５ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、１００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、２００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、３００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、４００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、５００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、６００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、７００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、８００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、９００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、１０００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、検出不能～５００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、検出不能～４５０ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残基の量は、検出不能～４００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、検出不能～３５０ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、検出不能～３００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、検出不能～２５０ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、検出不能～２００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、検出不能～１５０ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、検出不能～１００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、１００ｐｐｍ～２００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、２００ｐｐｍ～３００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、３００ｐｐｍ～４００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＬｉＢｒ残渣の量は、４００ｐｐｍ～５００ｐｐｍである。
【0195】
一実施形態では、ＳＰＦを有する本開示の組成物は、検出不能なレベルのＮａ２ＣＯ３残渣を有する。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、１００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、２００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、３００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、４００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、５００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、６００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、７００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、８００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、９００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、１０００ｐｐｍ未満である。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、検出不能～５００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、検出不能～４５０ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、検出不能～４００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、検出不能～３５０ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、検出不能～３００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、検出不能～２５０ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、検出不能～２００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、検出不能～１５０ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、検出不能～１００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、１００ｐｐｍ～２００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、２００ｐｐｍ～３００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、３００ｐｐｍ～４００ｐｐｍである。一実施形態では、本開示の組成物中のＮａ２ＣＯ３残渣の量は、４００ｐｐｍ～５００ｐｐｍである。
【0196】
本開示のＳＰＦ溶液組成物のユニークな特色は、貯蔵条件、絹のパーセント、並びに出荷の数及び出荷条件に依存して、１０日間～３年間の保管安定性である（それらは、水溶液中で貯蔵した場合に、ゆっくりと又は自然発生的にゲル化することはなく、断片の凝集はなく、したがって経時的な分子量の増加はない）。追加的に、ｐＨを変化させて、絹の未熟な折り畳み及び凝集を防止することにより、保管寿命を延長させることができ及び／又は出荷条件を支持することができる。一実施形態では、本開示のＳＰＦ溶液組成物は、室温（ＲＴ）で、最大２週間にわたる保管安定性を有する。一実施形態では、本開示のＳＰＦ溶液組成物は、ＲＴで、最大４週間にわたる保管安定性を有する。一実施形態では、本開示のＳＰＦ溶液組成物は、ＲＴで、最大６週間にわたる保管安定性を有する。一実施形態では、本開示のＳＰＦ溶液組成物は、ＲＴで、最大８週間にわたる保管安定性を有する。一実施形態では、本開示のＳＰＦ溶液組成物は、ＲＴで、最大１０週間にわたる保管安定性を有する。一実施形態では、本開示のＳＰＦ溶液組成物は、ＲＴで、最大１２週間にわたる保管安定性を有する。一実施形態では、本開示のＳＰＦ溶液組成物は、ＲＴで、約４週間～約５２週間の範囲の保管安定性を有する。
【0197】
以下の表１８は、本開示のＳＰＦ組成物の実施形態についての保管安定性試験結果を示す。
【表20】
【0198】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される絹フィブロインタンパク質断片から由来する絹フィルムの水溶性は、溶媒アニーリング（水アニーリング又はメタノールアニーリング）、化学架橋、酵素架橋、及び熱処置によって改変することができる。
【0199】
いくつかの実施形態では、アニーリングのプロセスは、コーティング材料として使用される絹フィブロインタンパク質断片溶液中でベータシート形成を誘導することを含み得る。絹フィブロインタンパク質ベースの断片のアニーリング（例えば、増加した結晶化度）又は他の方法での「分子充填」を促進する技術が記載されている。いくつかの実施形態では、非結晶性絹フィルムは、水又は有機溶媒の群から選択される溶媒の存在においてベータシートを導入するためにアニールされる。いくつかの実施形態では、非結晶性絹フィルムは、水の存在においてベータシートを導入するためにアニールされる（水アニーリングプロセス）。いくつかの実施形態では、非結晶性絹フィブロインタンパク質断片フィルムは、メタノールの存在においてベータシートを導入するためにアニールされる。いくつかの実施形態では、アニーリング（例えば、ベータシート形成）は、有機溶媒の添加により誘導される。好適な有機溶媒は、以下に限定されないが、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノール、又はそれらの組み合わせを含む。
【0200】
いくつかの実施形態では、アニーリングは、いわゆる「水アニーリング」又は「水蒸気アニーリング」により行われ、それにおいて、水蒸気が、ベータシートのパッキングを促すために、中間可塑剤又は触媒として使用される。いくつかの実施形態では、水アニーリングのプロセスは、真空下で実施され得る。好適なそのような方法が、Ｊｉｎ Ｈ－Ｊ ｅｔ ａｌ． （２００５）、Ｗａｔｅｒ－ｓｔａｂｌｅ Ｓｉｌｋ Ｆｉｌｍｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｂｅｔａ－Ｓｈｅｅｔ Ｃｏｎｔｅｎｔ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１５：１２４１－１２４７；Ｘｉａｏ Ｈ． ｅｔ ａｌ． （２０１１）、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｌｋ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂｙ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ Ｖａｐｏｒ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１２（５）：１６８６－１６９６において記載されている。
【0201】
水アニーリングプロセスの重要な特色は、絹フィブロインタンパク質断片ペプチド鎖において結晶性ベータシートの形成を駆動して、絹フィブロインを連続フィルム中に自己構築させることである。いくつかの実施形態では、絹フィブロインタンパク質断片フィルムの結晶性は、水蒸気の温度及びアニーリングの期間を制御することにより制御される。いくつかの実施形態では、アニーリングは、約６５℃～約１１０℃の範囲の温度で実施される。いくつかの実施形態では、水の温度は、約８０℃に維持される。いくつかの実施形態では、アニーリングは、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、約１００℃、約１０５℃、及び約１１０℃の群から選択される温度で実施される。
【0202】
いくつかの実施形態では、アニーリングプロセスが、約１分～約４０分、約１分～約５０分、約１分～約６０分、約１分～約７０分、約１分～約８０分、約１分～約９０分、約１分～約１００分、約１分～約１１０分、約１分～約１２０分、約１分～約１３０分、約５分～約４０分、約５分～約５０分、約５分～約６０分、約５分～約７０分、約５分～約８０分、約５分～約９０分、約５分～約１００分、約５分～約１１０分、約５分～約１２０分、約５分～約１３０分、約１０分～約４０分、約１０分～約５０分、約１０分～約６０分、約１０分～約７０分、約１０分～約８０分、約１０分～約９０分、約１０分～約１００分、約１０分～約１１０分、約１０分～約１２０分、約１０分～約１３０分、約１５分～約４０分、約１５分～約５０分、約１５分～約６０分、約１５分～約７０分、約１５分～約８０分、約１５分～約９０分、約１５分～約１００分、約１５分～約１１０分、約１５分～約１２０分、約１５分～約１３０分、約２０分～約４０分、約２０分～約５０分、約２０分～約６０分、約２０分～約７０分、約２０分～約８０分、約２０分～約９０分、約２０分～約１００分、約２０分～約１１０分、約２０分～約１２０分、約２０分～約１３０分、約２５分～約４０分、約２５分～約５０分、約２５分～約６０分、約２５分～約７０分、約２５分～約８０分、約２５分～約９０分、約２５分～約１００分、約２５分～約１１０分、約２５分～約１２０分、約２５分～約１３０分、約３０分～約４０分、約３０分～約５０分、約３０分～約６０分、約３０分～約７０分、約３０分～約８０分、約３０分～約９０分、約３０分～約１００分、約３０分～約１１０分、約３０分～約１２０分、約３０分～約１３０分、約３５分～約４０分、約３５分～約５０分、約３５分～約６０分、約３５分～約７０分、約３５分～約８０分、約３５分～約９０分、約３５分～約１００分、約３５分～約１１０分、約３５分～約１２０分、約３５分～約１３０分、約４０分～約５０分、約４０分～約６０分、約４０分～約７０分、約４０分～約８０分、約４０分～約９０分、約４０分～約１００分、約４０分～約１１０分、約４０分～約１２０分、約４０分～約１３０分、約４５分～約５０分、約４５分～約６０分、約４５分～約７０分、約４５分～約８０分、約４５分～約９０分、約４５分～約１００分、約４５分～約１１０分、約４５分～約１２０分、及び約４５分～約１３０分の群から選択される期間持続する。いくつかの実施形態では、アニーリングプロセスは、約１分～約６０分の範囲の期間持続する。いくつかの実施形態では、アニーリングプロセスは、約４５分～約６０分の範囲の期間持続する。処理後のより長い水のアニーリングは、絹フィブロインタンパク質断片の増加した結晶性に対応した。
【0203】
いくつかの実施形態では、アニーリングされた絹フィブロインタンパク質断片膜によって、湿潤絹フィブロインタンパク質断片膜が、１００％メタノール中で、室温で６０分間にわたり浸漬される。メタノールアニーリングによって、絹フィブロインタンパク質断片膜の組成物が、主に非晶質のランダムコイルから結晶性抗平行ベータシート構造に変化した。
【0204】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＳＰＦ溶液を使用して、メタノールでの沈殿によりＳＰＦマイクロ粒子を調製することができる。代替的なフラッシュ乾燥、流動床乾燥、スプレー乾燥、又は真空乾燥を適用して、絹溶液から水を除去することができる。ＳＰＦ粉末は次に、冷蔵又は他の特別な取り扱い手順を伴うことなく、保存及び取り扱うことができる。いくつかの実施形態では、ＳＰＦ粉末は低分子量絹フィブロインタンパク質断片を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＦ粉末は中分子量絹フィブロインタンパク質断片を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＦ粉末は、低分子量絹フィブロインタンパク質断片及び中分子量絹フィブロインタンパク質断片の混合物を含む。
【0205】
コラーゲンブースティング組成物及びその方法における絹タンパク質断片
本開示は、コラーゲン発現を刺激又は調節することによって軽減される障害、疾患、又は状態の治療又は予防を必要とする対象において、それを行う方法であって、約１ｋＤａ～約５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約１４ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約２５ｋＤａ、約２５ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約３５ｋＤａ、約３５ｋＤａ～約４０ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約５４ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａ、約４０ｋＤａ～約４５ｋＤａ、約４５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ～約１００ｋＤａ、及び約８０ｋＤａ～約１４４ｋＤａから選択される平均重量平均分子量と、１～約５の多分散性とを有する絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片を含む組成物を、対象に投与することを含む、方法を提供する。絹フィブロイン断片の任意の他の分子量、分子量範囲、及び多分散性、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片を、本開示の方法及び組成物に使用することができる。
本開示は、コラーゲン発現を刺激又は調節することによって軽減される障害、疾患、又は状態の治療又は予防を必要とする対象において、それを行う方法であって、約１ｋＤａ～約５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約１４ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約２５ｋＤａ、約２５ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約３５ｋＤａ、約３５ｋＤａ～約４０ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約５４ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａ、約４０ｋＤａ～約４５ｋＤａ、約４５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ～約１００ｋＤａ、及び約８０ｋＤａ～約１４４ｋＤａから選択される平均重量平均分子量と、１～約５の多分散性とを有する絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片を含む組成物を、対象に投与することを含む、方法を提供する。絹フィブロイン断片の任意の他の分子量、分子量範囲、及び多分散性、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片を、本開示の方法及び組成物に使用することができる。
【0206】
いくつかの実施形態では、組成物は、０～５００ｐｐｍの臭化リチウムを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、０～５００ｐｐｍの炭酸ナトリウムを更に含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、１～約１．５の多分散性を有する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、約１．５～約２．０の多分散性を有する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、約１．５～約３．０の多分散性を有する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、約２．０～約２．５の多分散性を有する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、約２．５～約３．０の多分散性を有する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、組成物の総重量に対して約０．００１重量％～約１０．０重量％で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量に対して約０．００１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）のセリシンを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片に対して約０．００１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）のセリシンを更に含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、組成物に製剤化する前の少なくとも１０日間、水溶液中にある場合、自然発生的に又は徐々にゲル化せず、色又は濁度が視覚的に変化しない。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、組成物の総重量に対して約０．０１重量％～約１０．０重量％で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、組成物の総重量に対して約０．０１重量％～約１．０重量％で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、組成物の総重量に対して約１．０重量％～約２．０重量％で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、組成物の総重量に対して約２．０重量％～約３．０重量％で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、組成物の総重量に対して約３．０重量％～約４．０重量％で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、組成物の総重量に対して約４．０重量％～約５．０重量％で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン断片、又は限定するものではないが、本明細書に記載される任意の他の絹タンパク質断片は、組成物の総重量に対して約５．０重量％～約６．０重量％で組成物中に存在する。
【0207】
いくつかの実施形態では、組成物は、注射可能な組成物として、又は外用組成物として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、限定するものではないが、コラーゲンをブーストする（例えば、限定するものではないが、コラーゲン発現を刺激又は調節する）ことによって、皮膚の外観及び感触を改善するために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、皮膚上のコラーゲンをブーストするために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、皮内のコラーゲンをブーストするために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、頭皮上のコラーゲンをブーストするために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするための液体溶液として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするためのフィルムとして製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするための固体として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするための粉末として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするためのゲルとして製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするための絹ゲルとして製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするための、リドカイン含有又は不含絹／ＨＡゲルとして製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするための石鹸として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするためのクリームとして製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするためのローションとして製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするためのシャンプーとして製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするためのコンディショナーとして製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするための栄養剤として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするためのマスクとして製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするためのオーバー・ザ・カウンター製品として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするための薬物として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするための治療薬として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするための絹コーティング織物として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンをブーストするための絹コーティング不織材料として製剤化される。
【0208】
いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、皮膚科学的に許容可能な担体を更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、注射可能な許容可能な担体を更に含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、懸濁液、エマルジョン、粉末、溶液、分散液、又はエリキシルのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、ゲル、ゼリー、クリーム、ローション、フォーム、スラリー、軟膏、油、ペースト、坐剤、スプレー、半固体組成物、固体組成物、スティック、又はムースのうちの１つ以上を含む又は製剤化される。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、ゴマ油、コーン油、綿実油、又は落花生油のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、マンニトール又はデキストロースのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、約０．００１％～約１０％（ｗ／ｖ）のヒアルロン酸を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、約１％～約１０％（ｗ／ｖ）、約１０％～約２５％（ｗ／ｖ）、約２５％～約５０％（ｗ／ｖ）、又は約５０％～約９９．９９％（ｗ／ｖ）のヒアルロン酸を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＨＡは、１００，０００ダルトン以上、１５０，０００ダルトン以上、１００万ダルトン以上、又は２００万ダルトン以上の分子量を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＨＡは、１００，０００ダルトン以下、１５０，０００ダルトン以下、１００万ダルトン以下、又は２００万ダルトン以下の分子量を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＨＡは、高分子量（例えば、約１ＭＤａ～約４ＭＤａのＨＡ分子量）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＨＡは、低分子量（例えば、約１ＭＤａ未満のＨＡ分子量）を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡ源は、例えばヒアルロン酸ナトリウムなどのヒアルロン酸塩であってもよい。いくつかの実施形態では、ＨＡは、架橋されている。架橋ＨＡは、膜、ゲル、半ゲル、スポンジ、又はミクロスフェアなどの各種形状に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、架橋ＨＡは、流体ゲル形態であり、すなわち、その容器の形状を呈する。ＨＡゲル又は半ゲルの粘度は、非共役ＨＡ及び／又はヒアルロネートの添加によって変化させることができる。粘度はまた、本明細書に記載されるように、ＳＰＦ－ＳＰＦ、ＳＰＦ－ＨＡ、及び／又はＨＡ－ＨＡ架橋の程度を変化させることによって調節することができる。いくつかの実施形態では、ＨＡの約４％～約１２％が、ＨＡ－ＨＡ又はＨＡ－ＳＰＦとして架橋され得る。
【0209】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、脂肪族油、脂肪アルコール、脂肪酸、グリセリド、アシルグリセロール、及びリン脂質のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、水相を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンを含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、炭化水素油、脂肪酸、脂肪酸油、脂肪酸エステル、又はカチオン性四級アンモニウム塩のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体の一部は、ポリエポキシリンカー、ジエポキシリンカー、ポリエポキシ－ＰＥＧ、ジエポキシ－ＰＥＧ、ポリグリシジル－ＰＥＧ、ジグリシジル－ＰＥＧ、ポリアクリレートＰＥＧ、ジアクリレートＰＥＧ、１，４－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）ブタン、１，４－ビスグリシジルオキシブタン、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、ＵＶ光、グルタルアルデヒド、１，２－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）エチレン（ＥＧＤＧＥ）、１，２，７，８－ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、ビスカルボジイミド（ＢＣＤＩ）、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル（ＰＥＴＧＥ）、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）、１－（２，３－エポキシプロピル）－２，３－エポキシシクロヘキサン、カルボジイミド、及びそれらの任意の組み合わせから選択される架橋剤、架橋前駆体、又は活性化剤で改変される。いくつかの実施形態では、ポリエポキシリンカーは、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）、１，６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリ－メチロールプロパンポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、及びソルビトールポリグリシジルエーテルから選択される。
【0210】
いくつかの実施形態では、組成物は、麻酔薬化合物を更に含む。いくつかの実施形態では、化合物は、ベンゾカイン、クロロプロカイン、コカイン、シクロメチカイン、ジメトカイン、ピペロカイン、プロポキシカイン、プロカイン、プロパラカイン、テトラカイン、アルチカイン、ブピバカイン、シンコカイン、エチドカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、ロピバカイン、及びトリメカインから選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、リドカインを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物中のリドカインの濃度は、約０．０１％～約１％であり、０．０１％の任意の増分を含む。いくつかの実施形態では、組成物中のリドカインの濃度は、約０．３％である。
【0211】
特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、組成物注射部位での痛み又は不快感を改善又は軽減するのに有効な量の１つ以上の麻酔薬を含むことができる。局部麻酔薬は、アンブカイン、アモラノン、アミロカイン、ベノキシネート、ベンゾカイン、ベトキシカイン、ビフェナミン、ブピバカイン、ブタカイン、ブタンベン、ブタニリカイン、ブテタミン、ブトキシカイン、カルチカイン、クロロプロカイン、コカエチレン、コカイン、シクロメチカイン、ジブカイン、ジメチソキン、ジメトカイン、ジペロドン、ジサイクロミン、エクゴニジン、エクゴニン、塩化エチル、エチドカイン、ベータ－ユーカイン、ユープロシン、フェナルコミン、フォルモカイン、ヘキシルカイン、ヒドロキシテトラカイン、イソブチル－ｐ－アミノベンゾエート、ロイシノカインメシレート、レボキサドロール、リドカイン、メピバカイン、メプリルカイン、メタブトキシカイン、塩化メチル、ミルテカイン、ネパイン、オクタカイン、オルトカイン、オキセサゼイン、パレトキシカイン、フェナカイン、フェノール、ピペロカイン、ピリドカイン、ポリドカノール、プラモキシン、プリロカイン、プロカイン、プロパノカイン、プロパラカイン、プロピポカイン、プロポキシカイン、シュードカイン、ピロカイン、ロピバカイン、サリチルアルコール、テトラカイン、トリカイン、トリメカイン、ゾラミン、及びそれらの塩からなる群から選択することができる。
【0212】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、重量による、約０．０１％～約０．０２％、又は約０．０３％～約０．０４％、又は約０．０５％～約０．０６％～約０．０７％、又は約０．０８％～約０．０９％、又は約０．１％～約０．２％、又は約０．３％～約０．４％、又は約０．５％～約０．６％、又は約０．７％～約０．８％、又は約０．９％～約１．０％、又は約１％～約１．５％、又は約１．５％～約２．０％、又は約２．０％～約２．５％、又は約２．５％～約３．０％、又は約３．０％～約３．５％、又は約３．５％～約４．０％、又は約４．０％～約４．５％、又は約４．５％～約５．０％、又は約５．０％～約５．５％、又は約５．５％～約６．０％、又は約６．０％～約６．５％、又は約６．５％～約７．０％、又は約７．５％～約８．０％、又は約８．０％～約８．５％、又は約８．５％～約９．０％、又は約９．５％～約１０％の濃度のリドカイン又は本明細書に列挙する他の麻酔薬を含み得る。
【0213】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、ゲルを含む、又はゲルとして製剤化される。ゲルは、注射可能なゲル、例えば、限定するものではないが、組織フィラー又は外用投与用ゲルであり得る。好適なゲルは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／００５８４８に記載されている。いくつかの実施形態では、ゲルは、絹フィブロイン若しくは絹フィブロイン断片、又は本明細書に記載される任意の他のＳＰＦ、ヒアルロン酸（ＨＡ）、並びにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び／又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡの一部は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、及び二級アルコールのうちの１つ以上を含む１つ以上のリンカー部分によって改変又は架橋されており、リンカー部分は、リンカーの一端でＨＡに付着している。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン若しくは絹フィブロイン断片、又は本明細書に記載される任意の他のＳＰＦの一部は、改変又は架橋されている。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン若しくは絹フィブロイン断片、又は本明細書に記載される任意の他のＳＰＦの一部は、遊離している。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン若しくは絹フィブロイン断片、又は本明細書に記載される任意の他のＳＰＦの一部は、ＨＡに架橋されている。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン若しくは絹フィブロイン断片、又は本明細書に記載される任意の他のＳＰＦの一部は、絹フィブロイン若しくは絹フィブロイン断片、又は本明細書に記載される任意の他のＳＰＦに架橋されている。いくつかの実施形態では、絹フィブロイン又は絹フィブロイン断片は、セリシンを実質的に欠いている。いくつかの実施形態では、ゲルは、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、又は約１５％の修飾度（ＭｏＤ）を有する。いくつかの実施形態では、改変又は架橋は、架橋剤として、ジエポキシ－ＰＥＧ、ポリグリシジル－ＰＥＧ、ジグリシジル－ＰＥＧ、ジエポキシ－ＰＰＧ、ポリグリシジル－ＰＰＧ、ジグリシジル－ＰＰＧ、又はそれらの任意の組み合わせを使用して得られる。いくつかの実施形態では、改変又は架橋は、約２００Ｄａ、約５００Ｄａ、１０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、又は約６０００ＤａのＭＷを有するポリエチレングリコールジグリシジルエーテルを使用して得られる。いくつかの実施形態では、改変又は架橋は、約３８０Ｄａ、又は約６４０ＤａのＭＷを有するポリプロピレングリコールジグリシジルエーテルを使用して得られる。いくつかの実施形態では、ゲルは、ヒドロゲルである。いくつかの実施形態では、ゲルは、水を更に含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、単相である。いくつかの実施形態では、ゲル中のＨＡ及び絹の総濃度は、約１８ｍｇ／ｍＬ、約１９ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２１ｍｇ／ｍＬ、約２２ｍｇ／ｍＬ、約２３ｍｇ／ｍＬ、約２４ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約２６ｍｇ／ｍＬ、約２７ｍｇ／ｍＬ、約２８ｍｇ／ｍＬ、約２９ｍｇ／ｍＬ、又は約３０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ゲル中の絹フィブロイン又は絹フィブロイン断片に対するＨＡの比は、約９２／８、約９３／７、約９４／６、約９５／５、約９６／４、約９７／３、約１８／１２、約２７／３、約２９．４／０．６、約９９／１、約９２．５／７．５、又は約９０／１０である。いくつかの実施形態では、ゲルは、真皮フィラーである。いくつかの実施形態では、ゲルは、生分解性である。いくつかの実施形態では、ゲルは、注射可能である。いくつかの実施形態では、ゲルは、３０Ｇ又は２７Ｇの針を通して注射可能である。いくつかの実施形態では、ゲルは、約５Ｐａ～約５００Ｐａの貯蔵弾性率（Ｇ’）を有する。いくつかの実施形態では、Ｇ’は、約１Ｈｚ、約５Ｈｚ、又は約１０Ｈｚの振動応力により測定される。いくつかの実施形態では、ゲルは、約１Ｐａ・ｓ～約１０Ｐａ・ｓの複素粘度を有する。いくつかの実施形態では、複素粘度は、約１Ｈｚ、約５Ｈｚ、又は約１０Ｈｚの振動応力により測定される。いくつかの実施形態では、ゲルは、ヒアルロン酸（ＨＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、デンプン、アルギネート、コンドロイチン－４－硫酸塩、コンドロイチン－６－硫酸塩、キサンタンガム、キトサン、ペクチン、寒天、カラギーナン、及びグアーガムからなる群から選択されるグリコサミノグリカンを含む。
【0214】
いくつかの実施形態では、組成物は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、注射可能な組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は注入により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下注射、皮内注射、経皮注射、又は真皮下注射によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、骨内注射、心臓内注射、関節内注射、又は海綿体内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、デポー注射によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、浸潤注射によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、留置カテーテルによって投与される。いくつかの実施形態では、組成物又はその一部は、生体適合性、生分解性、生体吸収性、生体再吸収性、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、流体構成成分、例えば、単一の流体又は実質的に１つ以上の流体を含む溶液を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、水又は水溶液を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、組織の外科的切除後など、当技術分野で知られた任意の手段によって、皮下に注射可能、移植可能、又は送達可能である。いくつかの実施形態では、組成物は、真皮フィラーである。いくつかの実施形態では、組成物は無菌である。
【0215】
実施形態では、本明細書に記載される組成物中の重量パーセント含水量は、約１％、又は約２％、又は約３％、又は約４％、又は約５％、又は約６％、又は約７％、又は約８％、又は約９％、又は約１０％、又は約１１％、又は約１２％、又は約１３％、又は約１４％、又は約１５％、又は約１６％、又は約１７％、又は約１８％、又は約１９％、又は約２０％、又は約２１％、又は約２２％、又は約２３％、又は約２４％、又は約２５％、又は約２６％、又は約２７％、又は約２８％、又は約２９％、又は約３０％、又は約３１％、又は約３２％、又は約３３％、又は約３４％、又は約３５％、又は約３６％、又は約３７％、又は約３８％、又は約３９％、又は約４０％、又は約４１％、又は約４２％、又は約４３％、又は約４４％、又は約４５％、又は約４６％、又は約４７％、又は約４８％、又は約４９％、又は約５０％、又は約５１％、又は約５２％、又は約５３％、又は約５４％、又は約５５％、又は約５６％、又は約５７％、又は約５８％、又は約５９％、又は約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４％、又は約６５％、又は約６６％、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％である。
【0216】
いくつかの実施形態では、コラーゲン発現をブーストすることに加えて、組成物を軟組織内及びその周辺に投与して、ボリュームを与え、軟組織欠損を補助、又は別様に治療することができる。本明細書に記載される組成物は、真皮下の複数レベルに投与され得る。本明細書で使用される場合、「軟組織」という用語は、体の他の構造及び臓器を結合、支持、又は囲むものを指し得る。例えば、本明細書に記載される軟組織は、限定するものではないが、皮膚、真皮組織、真皮下組織、皮膚組織、皮下組織、硬膜内組織、筋肉、腱、靭帯、線維組織、脂肪、血管及び動脈、神経、並びに滑膜（皮内）組織を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示は、個体の軟組織状態を治療する方法であって、本明細書で開示される１つ以上の組成物を個体の軟組織状態の部位に投与することを含み、組成物の投与が、軟組織状態を改善して、それによって軟組織状態を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、軟組織状態は、乳房組織の状態、顔面組織の状態、頸部の状態、皮膚の状態、上腕の状態、下腕の状態、手部の状態、肩部の状態、背部の状態、胴部（腹部を含む）の状態、臀部の状態、大腿の状態、下腿の状態（ふくらはぎの状態を含む）、足部の状態（足底脂肪パッドの状態を含む）、眼の状態、生殖器の状態、又は他の身体の一部、領域、若しくは範囲に範囲を及ぼす状態である。
【0217】
いくつかの実施形態では、本開示は、限定するものではないが、表皮－真皮接合部を含む皮膚の領域、並びに表層真皮（乳頭領域）及び深部真皮（網状領域）を含む真皮を含む真皮領域に関する組成物及び治療方法を提供する。皮膚は３つの一次層で構成される：防水性を提供し、感染に対するバリアとして機能する表皮；皮膚の付属物のための場所としての役目を果たす真皮；及び皮下組織（皮下脂肪層）。表皮は血管を含まず、真皮からの拡散により栄養供給される。表皮を構成する細胞の主な種類は、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、及びメルケル細胞である。
【0218】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物を、１つ以上の状態の治療を必要とする患者においてそれを行う方法に提供され得る。いくつかの実施形態では、治療有効量の組成物を、状態又は他の組織欠損を治療するために、それを必要とする患者の組織に送達することができる。
【0219】
本明細書で使用される場合、「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、患者において、状態、例えば軟組織の状態などの美容的又は臨床的症状を低下又は排除する、あるいは、個体において、状態の美容的又は臨床的症状の発症を遅延又は予防することを指す。
【0220】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物によって治療される状態は、軟組織の状態を含み得る。軟組織の状態は、限定されないが、身体の一部、領域、又は範囲の増大、再建、疾患、障害、欠損、又は不完全性を含む。一態様では、開示の組成物によって治療される軟組織の状態は、限定するものではないが、顔面の増大、顔面の再建、顔面の疾患、顔面の障害、顔面の欠陥、又は顔面の不完全性を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物によって治療される軟組織の状態は、限定するものではないが、皮膚の脱水、皮膚弾力の欠如、皮膚の荒れ、皮膚の張りの欠如、皮膚のストレッチライン若しくはマーク、皮膚の蒼白、真皮の凹み、窪んだ頬、窪んだこめかみ、薄い唇、尿道の欠陥、皮膚の欠陥、乳房の欠陥、後眼窩欠陥、顔面のひだ、又は皺を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物によって治療される軟組織状態は、限定するものではないが、乳房の不完全性、欠損、疾患、及び／又は障害、例えば、乳房の増大、乳房の再建、乳房固定術、小乳房症、胸椎低形成、ポーランド症候群、被膜収縮及び／又は破裂などのインプラント合併症に起因する欠損；顔面の不完全性、欠損、疾患、又は障害、例えば、顔面の増大、顔面の再建、Ｐａｒｒｙ－Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群、エリテマトーデスの隆起、皮膚の凹み、陥没した頬、陥没したこめかみ、薄い唇、鼻の不完全性又は欠損、後眼窩の不完全性又は欠損、顔面のひだ、線、及び／又は眉間線などの皺、鼻唇溝、口周囲線、及び／又はマリオネットライン、及び／又は顔の他の輪郭の変形若しくは不完全性；首の不完全性、欠損、疾患、又は障害；皮膚の不完全性、欠損、疾患、及び／又は障害；他の軟組織の不完全性、欠損、疾患、及び／又は障害、例えば、上腕、下肢、手、肩、背中、腹部を含む胴体、殿部、上腿、ふくらはぎを含む下腿、足底脂肪パッドを含む足、眼、生殖器、又は他の身体の一部、領域、若しくは範囲の増大又は再構成、あるいはこれらの身体の一部、領域、若しくは範囲に影響を及ぼす疾患若しくは障害など；尿失禁、便失禁、他の型の失禁；及び胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）を含む。
【0221】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、限定するものではないが、皮膚、真皮組織、真皮下組織、皮膚組織、皮下組織、硬膜内組織、筋肉、腱、靭帯、線維組織、脂肪、血管及び動脈、神経、並びに滑膜（皮内）組織を含む軟組織に送達され得る。
【0222】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、細胞接着、遊走、及び増殖シグナルとともに人工生分解性マトリックスを提供することによって、創傷内に直接配置されて治癒を助けることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、生分解性メッシュ若しくは他の移植材料上にコーティングされ得るか、又はそれ自体が、シート又は他の構造に形成され得るか、又は水和形態で維持され得る。
【0223】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法のいずれかとともに使用される組成物の量は、所望の変化及び／又は改善、所望の状態の症状の低下及び／又は除去、個人及び／又は医師により望まれる臨床及び／又は美容効果、並びに治療される身体部分又は領域に基づいて決定される。組成物投与の有効性は、以下の臨床的及び／又は美容的尺度のうちの１つ以上によって表され得る：変化した及び／又は改善された軟組織形状、変化した及び／又は改善された軟組織サイズ、変化した及び／又は改善された軟組織輪郭、変化した及び／又は改善された組織機能、組織内部成長サポート、及び／又は新たなコラーゲン沈着、組成物の持続移植、改善された患者の満足度及び／又は生活の質、並びに移植可能な異物の減少した使用。例えば、乳房増大の手順について、組成物及び方法の有効性は、以下の臨床的及び／又は美容的尺度の１つ以上により表すことができる：増加した乳房サイズ、変化した乳房形状、変化した乳房輪郭、持続生着、莢膜収縮のリスクにおける低下、脂肪壊死性嚢胞形成の減少した速度、改善した患者の満足度及び／又は生活の質、並びに乳房インプラントの減少した使用。
【0224】
いくつかの実施形態では、組成物を投与することは、対象における１つ以上のメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を減少させる。いくつかの実施形態では、コラーゲン発現を刺激又は調節することは、コラーゲン発現を増加させることを含む。
【0225】
いくつかの実施形態では、コラーゲン発現は、ベースレベルに対して、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％増加する。
【0226】
いくつかの実施形態では、コラーゲン発現は、ベースレベルに対して、約１０１％、約１０２％、約１０３％、約１０４％、約１０５％、約１０６％、約１０７％、約１０８％、約１０９％、約１１０％、約１１１％、約１１２％、約１１３％、約１１４％、約１１５％、約１１６％、約１１７％、約１１８％、約１１９％、約１２０％、約１２１％、約１２２％、約１２３％、約１２４％、約１２５％、約１２６％、約１２７％、約１２８％、約１２９％、約１３０％、約１３１％、約１３２％、約１３３％、約１３４％、約１３５％、約１３６％、約１３７％、約１３８％、約１３９％、約１４０％、約１４１％、約１４２％、約１４３％、約１４４％、約１４５％、約１４６％、約１４７％、約１４８％、約１４９％、約１５０％、約１５１％、約１５２％、約１５３％、約１５４％、約１５５％、約１５６％、約１５７％、約１５８％、約１５９％、約１６０％、約１６１％、約１６２％、約１６３％、約１６４％、約１６５％、約１６６％、約１６７％、約１６８％、約１６９％、約１７０％、約１７１％、約１７２％、約１７３％、約１７４％、約１７５％、約１７６％、約１７７％、約１７８％、約１７９％、約１８０％、約１８１％、約１８２％、約１８３％、約１８４％、約１８５％、約１８６％、約１８７％、約１８８％、約１８９％、約１９０％、約１９１％、約１９２％、約１９３％、約１９４％、約１９５％、約１９６％、約１９７％、約１９８％、約１９９％、又は約２００％増加する。
【0227】
いくつかの実施形態では、コラーゲン発現は、ベースレベルに対して、約２２５％、又は約２５０％、又は約２７５％、又は約３００％、又は約３２５％、又は約３５０％、又は約３７５％、又は約４００％、又は約４２５％、又は約４５０％、又は約４７５％、又は約５００％、又は約５２５％、又は約５５０％、又は約５７５％、又は約６００％、又は約６２５％、又は約６５０％、又は約６７５％、又は約７００％、又は約７２５％、又は約７５０％、又は約７７５％、又は約８００％、又は約８２５％、又は約８５０％、又は約８７５％、又は約９００％、又は約９２５％、又は約９５０％、又は約９７５％、又は約１０００％増加する。
【0228】
いくつかの実施形態では、組成物を投与することは、対象における皺を予防若しくは改善すること、対象における加齢性色素斑を予防若しくは改善すること、対象における乾燥肌を予防若しくは改善すること、対象における不均一な皮膚の色調を高めること、又は皮膚の外観及び感触を改善することのうちの１つ以上をもたらす。皮膚の外観及び感触の改善は、限定するものではないが、損傷した皮膚の外観及び感触を改善するだけでなく、そうでなければ視覚的には損傷していない皮膚の外観及び感触を改善することも含む。いくつかの実施形態では、組成物を投与することは、対象における皮膚のたるみを予防若しくは改善すること、対象における皮膚の老化を予防若しくは改善すること、対象における低減した皮膚の引張強度を予防若しくは改善すること、対象における光損傷した皮膚を予防若しくは改善すること、又は対象における皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を予防若しくは改善することのうちの１つ以上をもたらす。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、皺、加齢性色素斑、乾燥肌、不均一な皮膚の色調、皮膚のたるみ、皮膚の老化、低減した皮膚の引張強度、光損傷した皮膚、又は皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、皮膚の状態を含む。いくつかの実施形態では、皮膚の状態は、皮膚の脱水、皮膚弾力の欠如、皮膚の荒れ、皮膚の張りの欠如、皮膚のストレッチライン、皮膚のストレッチマーク、皮膚の蒼白、真皮の凹み、窪んだ頬、窪んだこめかみ、薄い唇、後眼窩欠損、顔面のひだ、及び皺であり得る。
【0229】
いくつかの実施形態では、開示される治療方法は、増大、再建、疾患の治療、障害の治療、身体の一部、領域、又は範囲の欠陥又は不完全性の治療を含む。いくつかの実施形態では、開示される治療方法は、顔面の増大、顔面の再建、顔面の疾患の治療、顔面の障害の治療、顔面の欠陥の治療、又は顔面の不完全性の治療を含む。
【0230】
いくつかの実施形態では、提供される治療方法は、レーザー治療の前、後、又は最中に本開示の組成物を投与すること、皮膚剥離の前、後、又は最中に本開示の組成物を投与すること、放射線治療の前、後、又は最中に本開示の組成物を投与することのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、提供される治療方法は、限定するものではないが、任意のタイプの火傷（例えば、熱傷、日焼け、火による火傷、熱水火傷、放射線熱傷、化学火傷など）を含む火傷を治療するために、本開示の組成物を投与することのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、提供される治療方法は、限定するものではないが、第１度、第２度、又は第３度の火傷を含む火傷を治療するために、本開示の組成物を投与することのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、提供される治療方法は、加齢による皮膚状態を治療するために、本開示の組成物を投与することのうちの１つ以上を含む。
【0231】
いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、甲状腺ホルモン誘発性心筋肥大を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、腱の断裂、損傷、又は裂傷を含む。いくつかの実施形態では、腱は、小円筋腱、棘下筋腱、棘上筋腱、肩甲下筋腱、三角筋腱、二頭筋腱、三頭筋腱、腕橈骨筋腱、回外筋腱、橈側手根屈筋腱、尺側手根屈筋腱、長橈側手根伸筋腱、短橈側手根伸筋腱、腸腰筋腱、内閉鎖筋腱、長内転筋腱、腓骨又はマグナス筋腱、大殿筋又は中殿筋腱、四頭筋腱、膝蓋腱、膝窩腱、縫工筋腱、腓腹筋腱、アキレス腱、ヒラメ筋腱、前脛骨筋腱、長腓骨筋腱、長指屈筋腱、骨間筋腱、深指屈筋腱、小趾外転筋腱、母指対立筋腱、長母指屈筋腱、母指伸筋又は外転筋腱（Ｅｘｔｅｎｓｏｒ ｏｒ ａｂｄｕｃｔｏｒ ｐｏｌｌｉｃｉｓ ｔｅｎｄｏｎｓ）、長母趾屈筋腱、短趾屈筋腱、中様筋腱、母趾外転筋腱、長趾屈筋腱、小趾外転筋腱、眼筋腱、眼瞼挙筋腱、咬筋腱、側頭筋腱、僧帽筋腱、胸鎖乳突筋腱、頭半棘筋又は頭板状筋腱、顎舌骨筋又は甲状舌骨筋腱、胸骨舌骨筋腱、腹直筋腱、外腹斜筋腱、腹横筋腱、広背筋腱、及び脊柱起立筋腱から選択される。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、ウェルナー症候群を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、低下した糖尿病性皮膚の完全性を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、関節炎を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、関節リウマチを含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、腫瘍の進行又は腫瘍の成長を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、低下した心機能を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、エーラス・ダンロス症候群を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、腹部大動脈瘤を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、創傷を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、皮膚又は結合組織の疾患を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、軟骨の疾患を含む。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、再発性多発軟骨炎、ティーツェ症候群、蜂巣炎、エーラス・ダンロス症候群、ケロイド（にきびケロイドを含む）、ムコポリサダリドーシスＩ（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｄｄａｒｉｄｏｓｉｓ Ｉ）、壊死性障害（環状肉芽腫、リポイド類壊死症を含む）、骨形成不全症、皮膚弛緩症、皮膚筋炎、デュピュイトラン拘縮、ホモシスチン尿症、エリテマトーデス（皮膚、円板状、深在性、全身性、及び腎炎を含む）、マルファン症候群、混合性結合組織疾患、ムチン沈着症（濾胞性を含む）、ムコ多糖症（Ｉ、ＩＩ、ＵＵ、ＩＶ、ＩＶ、及びＶＩＩ）、粘液水腫、成年性浮腫性硬化症及び滑液嚢腫、結合組織新生物、ヌーナン症候群、骨斑紋症、硬結性紅斑を含む脂肪織炎、結節性非化膿性及び腹膜、陰茎硬化症、弾性線維性仮性黄色腫、関節炎を含むリウマチ性疾患（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、カプラン症候群、フェルティ症候群、リウマトイド結節、強直性脊椎炎、及びスチル病）、骨増殖症、リウマチ性多発筋痛症、限局性強皮症、並びに全身性強皮症（ＣＲＥＳＴ症候群）から選択される。いくつかの実施形態では、障害、疾患、又は状態は、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症；瘢痕（ｃｉｃａｔｉｘ）（肥厚性（ｈｙｐｅｒｔｏｐｈｉｃ）を含む）；皮膚瘻、皮膚弛緩症（ｃｕｉｓ ｌａｘａ）；肢端皮膚炎、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎（アレルギー性接触、光アレルギー性、ウルシ）、刺激性皮膚炎（光毒性、おむつかぶれ）、職業性皮膚炎を含む皮膚炎；剥脱性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、薬疹（中毒性表皮壊死症、結節性紅斑、血清病など）、発汗異常性、間擦疹、神経皮膚炎、及び放射線皮膚炎を含む湿疹；皮膚筋炎；慢性遊走性、硬結性、伝染性、多形性（スティーヴンス・ジョンソン症候群）、及び結節性（スイート症候群）を含む紅斑；突発性を含む発疹；ざ瘡様発疹を含む顔面皮膚疾患（ケロイド、酒さ、尋常性、及びファーブル・ラクーショー症候群）；水虫を含む足の皮膚疾患；手の皮膚疾患；ケラトアカントーマ；皮膚硬結、真珠腫性中耳炎（中耳を含む）、魚鱗癬（先天性魚鱗癬様紅皮症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｉｃｈｔｙｏｓｉｆｏｒｍ ｅｒｙｔｈｒｏｄｅｒｍｓ）、表皮剥離性角質増殖症、葉状魚鱗癬、尋常性魚鱗癬、Ｘ連鎖性魚鱗癬、及びシェーグレン・ラルソン症候群を含む）、膿漏性角皮症、掌蹠角皮症（ｐａｌｍｏｐｌａｎｔａｒ ｋｅｒａｔｏｄｅｒｍｓ）、毛包性角化症、脂漏性角化症、不全角化症、及び汗孔角化症を含む角化症；脚部皮膚疾患、マスト細胞症（色素性蕁麻疹）、類壊死症（環状肉芽腫及びリポイド類壊死症）、光過敏症（光アレルギー性又は光毒性皮膚炎（ｐｈｏｔｏｘｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、種痘様水疱症、日光皮膚炎（ｓｕｎｄｕｒｎ）、及び色素性乾皮症）；銀皮症、色素沈着、メラノーシス、黒色表皮腫（ａｃｏｎｔｈｏｓｉｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、黒子、ポイツ・ジェガース症候群、低色素沈着、先天性白皮症、まだら症（ｐｉｂａｌｄｉｓｍ）、白斑、色素失調症、色素性蕁麻疹、色素性乾皮症、痒疹を含む色素異常症；掻痒症（肛門及び外陰部を含む）；膿瘡及び壊疽性膿皮症を含む膿皮症；頭皮疾患（ｓｃｌａｐ ｄｅｒｍａｔｏｓｅｓ）；成人性浮腫性強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｍａ ａｄｕｌｔｏｒｕｍ）；新生児皮膚硬化症（ｓｃｌｅｒｍａ ｎｅｏｎａｔｏｒｕｍ）；毛髪疾患（脱毛症、毛包炎、男性型多毛症、多毛症（ｈｙｐｅｒｔｉｃｈｏｓｉｓ）、縮れ毛症候群）、爪疾患（ネイル・パテラ症候群、嵌入爪又は爪形成異常、爪真菌症、爪周囲炎）、皮脂腺疾患（鼻瘤、新生物）、汗腺疾患（化膿性汗腺炎、多汗症、乏汗症、稗粒腫（ｍｉｌｉａｒａ）、フォックス・フォアダイス病、新生物）を含む皮膚付属器（ｓｋｉｎ ａｐｐｅｎａｇｅ）疾患；先天性白皮症（ａｌｆｉｎｉｓｍ）、皮膚弛緩症、家族性良性慢性天疱瘡、ポルフィリン症、肢端皮膚炎、外胚葉形成不全症、エリス・ファンクレフェルト症候群、巣状皮膚低形成、エーラス・ダンロス症候群、表皮水疱症、魚鱗癬（ｉｃｈｔｙｓｏｓｉｓ）を含む遺伝性皮膚疾患；皮膚真菌症、ブラストミセス症、カンジタ症、黒色分芽菌症、マズラ菌症、パラコクシジオイデス症、スポロトリクム症、白癬を含む感染性皮膚疾患；頸部顔面放線菌症、細菌性血管腫症（ｂａｃｉｌｌｉａｒｙ ａｎｇｉｏｍａｔｏｓｉｓ）、膿瘡、丹毒、慢性遊走性紅斑、紅色陰癬、鼠径部肉芽腫、化膿性汗腺炎、マズラ菌症、爪周囲炎、ピンタ、鼻硬化症、ブドウ球菌皮膚感染症（せつ腫症（ｆｕｒｕｎｃｏｌｏｓｉｓ）、癰、膿痂疹、熱傷様皮膚症候群）、皮膚梅毒、皮膚結核、フランベジアを含む細菌性皮膚疾患；幼虫移行症、リーシュマニア症、シラミ寄生症、及び疥癬を含む寄生性皮膚疾患；伝染性紅斑、突発性発疹、単純ヘルペス、伝染性軟属腫（ｍｏｏｌｕｓｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ）、及び疣贅を含むウイルス性皮膚疾患から選択される。
【0232】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法のいずれかで使用される組成物の量は、典型的には、治療有効量である。本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、「有効量」、「治療有効用量」、及び／又は「有効用量」と同義であり、それを必要とする患者における予想される生物学的、美容的、又は臨床応答を引き起こす組成物の量を指す。非限定的な例として、有効量は、本明細書に開示された臨床的及び／又は美容的対策のうちの１つ以上を達成するのに十分な量である。開示される方法の特定の適用のために投与される適した有効量が、本明細書に提供される指針を使用して、当業者により決定されることができる。例えば、有効量は、本明細書に記載される任意の及び全てのインビトロ及びインビボアッセイから推定することができる。当業者は、個体の状態を治療の経過を通してモニタリングすることができること、及び投与される、本明細書で開示される組成物の有効量を適宜調整することができることを認識する。
【0233】
いくつかの実施形態では、投与される組成物の量は、限定するものではないが、少なくとも０．００１ｇ、又は少なくとも０．００２ｇ、又は少なくとも０．００３ｇ、又は少なくとも０．００４ｇ、又は少なくとも０．００５ｇ、又は少なくとも０．００６ｇ、又は少なくとも０．００７ｇ、又は少なくとも０．００８ｇ、又は少なくとも０．００９ｇ、又は少なくとも０．０１ｇ、又は少なくとも０．０２ｇ、又は少なくとも０．０３ｇ、又は少なくとも０．０４ｇ、又は少なくとも０．０５ｇ、又は少なくとも０．０６ｇ、又は少なくとも０．０７ｇ、又は少なくとも０．０８ｇ、又は少なくとも０．０９ｇ、又は少なくとも０．１ｇ、又は少なくとも０．２ｇ、又は少なくとも０．３ｇ、又は少なくとも０．４ｇ、又は少なくとも０．５ｇ、又は少なくとも０．６ｇ、又は少なくとも０．７ｇ、又は少なくとも０．８ｇ、又は少なくとも０．９ｇ、又は少なくとも１ｇ、又は少なくとも２ｇ、又は少なくとも３ｇ、又は少なくとも４ｇ、又は少なくとも５ｇ、又は少なくとも６ｇ、又は少なくとも７ｇ、又は少なくとも８ｇ、又は少なくとも９ｇ、又は少なくとも１０ｇ、又は少なくとも１１ｇ、又は少なくとも１２ｇ、又は少なくとも１３ｇ、又は少なくとも１４ｇ、又は少なくとも１５ｇ、又は少なくとも２０ｇ、又は少なくとも２５ｇ、又は少なくとも３０ｇ、又は少なくとも３５ｇ、又は少なくとも４０ｇ、又は少なくとも４５ｇ、又は少なくとも５０ｇ、又は少なくとも５５ｇ、又は少なくとも６０ｇ、又は少なくとも６５ｇ、又は少なくとも７０ｇ、又は少なくとも７５ｇ、又は少なくとも８０ｇ、又は少なくとも８５ｇ、又は少なくとも９０ｇ、又は少なくとも９５ｇ、又は少なくとも１００ｇである。
【0234】
いくつかの実施形態では、投与される組成物の量は、限定するものではないが、最大０．００１ｇ、又は最大０．００２ｇ、又は最大０．００３ｇ、又は最大０．００４ｇ、又は最大０．００５ｇ、又は最大０．００６ｇ、又は最大０．００７ｇ、又は最大０．００８ｇ、又は最大０．００９ｇ、又は最大０．０１ｇ、又は最大０．０２ｇ、又は最大０．０３ｇ、又は最大０．０４ｇ、又は最大０．０５ｇ、又は最大０．０６ｇ、又は最大０．０７ｇ、又は最大０．０８ｇ、又は最大で０．０９ｇ、又は最大で０．１ｇ、又は最大で０．２ｇ、又は最大で０．３ｇ、又は最大で０．４ｇ、又は最大で０．５ｇ、又は最大で０．６ｇ、又は最大で０．７ｇ、又は最大０．８ｇ、又は最大０．９ｇ、又は最大１ｇ、又は最大２ｇ、又は最大３ｇ、又は最大４ｇ、又は最大５ｇ、又は最大６ｇ、又は最大７ｇ、又は最大８ｇ、又は最大９ｇ、又は最大１０ｇ、又は最大１１ｇ、又は最大１２ｇ、又は最大１３ｇ、又は最大１４ｇ、又は最大１５ｇ、又は最大２０ｇ、又は最大２５ｇ、又は最大３０ｇ、又は最大３５ｇ、又は最大４０ｇ、又は最大４５ｇ、又は最大５０ｇ、又は最大５５ｇ、又は最大６０ｇ、又は最大６５ｇ、又は最大７０ｇ、又は最大７５ｇ、又は最大８０ｇ、又は最大８５ｇ、又は最大９０ｇ、又は最大９５ｇ、又は最大１００ｇである。
【0235】
いくつかの実施形態では、投与される組成物の量は、限定するものではないが、約０．００１ｇ、又は約０．００２ｇ、又は約０．００３ｇ、又は約０．００４ｇ、又は約０．００５ｇ、又は約０．００６ｇ、又は約０．００７ｇ、又は約０．００８ｇ、又は約０．００９ｇ、又は約０．０１ｇ、又は約０．０２ｇ、又は約０．０３ｇ、又は約０．０４ｇ、又は約０．０５ｇ、又は約０．０６ｇ、又は約０．０７ｇ、又は約０．０８ｇ、又は約０．０９ｇ、又は約０．１ｇ、又は約０．２ｇ、又は約０．３ｇ、又は約０．４ｇ、又は約０．５ｇ、又は約０．６ｇ、又は約０．７ｇ、又は約０．８ｇ、又は約０．９ｇ、又は約１ｇ、又は約２ｇ、又は約３ｇ、又は約４ｇ、又は約５ｇ、又は約６ｇ、又は約７ｇ、又は約８ｇ、又は約９ｇ、又は約１０ｇ、又は約１１ｇ、又は約１２ｇ、又は約１３ｇ、又は約１４ｇ、又は約１５ｇ、又は約２０ｇ、又は約２５ｇ、又は約３０ｇ、又は約３５ｇ、又は約４０ｇ、又は約４５ｇ、又は約５０ｇ、又は約５５ｇ、又は約６０ｇ、又は約６５ｇ、又は約７０ｇ、又は約７５ｇ、又は約８０ｇ、又は約８５ｇ、又は約９０ｇ、又は約９５ｇ、又は約１００ｇである。
【0236】
いくつかの実施形態では、投与される組成物の量は、限定するものではないが、０．００１ｇ～０．０１ｇ、又は０．０１ｇ～０．１ｇ、又は０．１ｇ～１ｇ、又は１ｇ～１０ｇ、又は１０ｇ～２０ｇ、又は２０ｇ～３０ｇ、又は３０ｇ～４０ｇ、又は４０ｇ～５０ｇ、又は５０ｇ～６０ｇ、又は６０ｇ～７０ｇ、又は７０ｇ～８０ｇ、又は８０ｇ～９０ｇ、又は９０ｇ～１００ｇである。
【0237】
いくつかの実施形態では、投与される組成物の容積は、限定するものではないが、少なくとも０．０１ｍＬ、又は少なくとも０．０２ｍＬ、又は少なくとも０．０３ｍＬ、又は少なくとも０．０４ｍＬ、又は少なくとも０．０５ｍＬ、又は少なくとも０．０６ｍＬ、又は少なくとも０．０７ｍＬ、又は少なくとも０．０８ｍＬ、又は少なくとも０．０９ｍＬ、又は少なくとも０．１０ｍＬ、又は少なくとも０．１５ｍＬ、又は少なくとも０．２０ｍＬ、又は少なくとも０．２５ｍＬ、又は少なくとも０．３０ｍＬ、又は少なくとも０．３５ｍＬ、又は少なくとも０．４０ｍＬ、又は少なくとも０．４５ｍＬ、又は少なくとも０．５０ｍＬ、又は少なくとも０．５５ｍＬ、又は少なくとも０．６０ｍＬ、又は少なくとも０．６５ｍＬ、又は少なくとも０．７０ｍＬ、又は少なくとも０．７５ｍＬ、又は少なくとも０．８０ｍＬ、又は少なくとも０．８５ｍＬ、又は少なくとも０．９０ｍＬ、又は少なくとも０．９５ｍＬ、又は少なくとも１ｍＬ、又は少なくとも２ｍＬ、又は少なくとも３ｍＬ、又は少なくとも４ｍＬ、又は少なくとも５ｍＬ、又は少なくとも６ｍＬ、又は少なくとも７ｍＬ、又は少なくとも８ｍＬ、又は少なくとも９ｍＬ、又は少なくとも１０ｍＬ、又は少なくとも１５ｍＬ、又は少なくとも２０ｍＬ、又は少なくとも２５ｍＬ、又は少なくとも３０ｍＬ、又は少なくとも３５ｍＬ、又は少なくとも４０ｍＬ、又は少なくとも４５ｍＬ、又は少なくとも５０ｍＬ、又は少なくとも５５ｍＬ、又は少なくとも６０ｍＬ、又は少なくとも６５ｍＬ、又は少なくとも７０ｍＬ、又は少なくとも７５ｍＬ、又は少なくとも８０ｍＬ、又は少なくとも８５ｍＬ、又は少なくとも９０ｍＬ、又は少なくとも９５ｍＬ、又は少なくとも１００ｍＬ、又は少なくとも１１０ｍＬ、又は少なくとも１２０ｍＬ、又は少なくとも１３０ｍＬ、又は少なくとも１４０ｍＬ、又は少なくとも１５０ｍＬ、又は少なくとも１６０ｍＬ、又は少なくとも１７０ｍＬ、又は少なくとも１８０ｍＬ、又は少なくとも１９０ｍＬ、又は少なくとも２００ｍＬ、又は少なくとも２１０ｍＬ、又は少なくとも２２０ｍＬ、又は少なくとも２３０ｍＬ、又は少なくとも２４０ｍＬ、又は少なくとも２５０ｍＬ、又は少なくとも２６０ｍＬ、又は少なくとも２７０ｍＬ、又は少なくとも２８０ｍＬ、又は少なくとも２９０ｍＬ、又は少なくとも３００ｍＬ、又は少なくとも３２５、３５０ｍＬ、又は少なくとも３７５ｍＬ、又は少なくとも４００ｍＬ、又は少なくとも４２５ｍＬ、又は少なくとも４５０ｍＬ、又は少なくとも４７５ｍＬ、又は少なくとも５００ｍＬ、又は少なくとも５２５ｍＬ、又は少なくとも５５０ｍＬ、又は少なくとも５７５ｍＬ、又は少なくとも６００ｍＬ、又は少なくとも６２５ｍＬ、又は少なくとも６５０ｍＬ、又は少なくとも６７５ｍＬ、又は少なくとも７００ｍＬ、又は少なくとも７２５ｍＬ、又は少なくとも７５０ｍＬ、又は少なくとも７７５ｍＬ、又は少なくとも８００ｍＬ、又は少なくとも８２５ｍＬ、又は少なくとも８５０ｍＬ、又は少なくとも８７５ｍＬ、又は少なくとも９００ｍＬ、又は少なくとも９２５ｍＬ、又は少なくとも９５０ｍＬ、又は少なくとも９７５ｍＬ、又は少なくとも１０００ｍＬである。
【0238】
いくつかの実施形態では、投与される組成物の容積は、限定するものではないが、最大０．０１ｍＬ、又は最大０．０２ｍＬ、又は最大０．０３ｍＬ、又は最大０．０４ｍＬ、又は最大０．０５ｍＬ、又は最大０．０６ｍＬ、又は最大０．０７ｍＬ、又は最大０．０８ｍＬ、又は最大０．０９ｍＬ、又は最大０．１０ｍＬ、又は最大０．１５ｍＬ、又は最大０．２０ｍＬ、又は最大０．２５ｍＬ、又は最大０．３０ｍＬ、又は最大０．３５ｍＬ、又は最大０．４０ｍＬ、又は最大０．４５ｍＬ、又は最大０．５０ｍＬ、又は最大０．５５ｍＬ、又は最大０．６０ｍＬ、又は最大０．６５ｍＬ、又は最大０．７０ｍＬ、又は最大０．７５ｍＬ、又は最大０．８０ｍＬ、又は最大０．８５ｍＬ、又は最大０．９０ｍＬ、又は最大０．９５ｍＬ、又は最大１ｍＬ、又は最大２ｍＬ、又は最大３ｍＬ、又は最大４ｍＬ、又は最大５ｍＬ、又は最大６ｍＬ、又は最大７ｍＬ、又は最大８ｍＬ、又は最大９ｍＬ、又は最大１０ｍＬ、又は最大１５ｍＬ、又は最大２０ｍＬ、又は最大２５ｍＬ、又は最大３０ｍＬ、又は最大３５ｍＬ、又は最大４０ｍＬ、又は最大４５ｍＬ、又は最大５０ｍＬ、又は最大５５ｍＬ、又は最大６０ｍＬ、又は最大６５ｍＬ、又は最大７０ｍＬ、又は最大７５ｍＬ、又は最大８０ｍＬ、又は最大８５ｍＬ、又は最大９０ｍＬ、又は最大９５ｍＬ、又は最大１００ｍＬ、又は最大１１０ｍＬ、又は最大１２０ｍＬ、又は最大１３０ｍＬ、又は最大１４０ｍＬ、又は最大１５０ｍＬ、又は最大１６０ｍＬ、又は最大１７０ｍＬ、又は最大１８０ｍＬ、又は最大１９０ｍＬ、又は最大２００ｍＬ、又は最大２１０ｍＬ、又は最大２２０ｍＬ、又は最大２３０ｍＬ、又は最大２４０ｍＬ、又は最大２５０ｍＬ、又は最大２６０ｍＬ、又は最大２７０ｍＬ、又は最大２８０ｍＬ、又は最大２９０ｍＬ、又は最大３００ｍＬ、又は最大３２５、３５０ｍＬ、又は最大３７５ｍＬ、又は最大４００ｍＬ、又は最大４２５ｍＬ、又は最大４５０ｍＬ、又は最大４７５ｍＬ、又は最大５００ｍＬ、又は最大５２５ｍＬ、又は最大５５０ｍＬ、又は最大５７５ｍＬ、又は最大６００ｍＬ、又は最大６２５ｍＬ、又は最大６５０ｍＬ、又は最大６７５ｍＬ、又は最大７００ｍＬ、又は最大７２５ｍＬ、又は最大７５０ｍＬ、又は最大７７５ｍＬ、又は最大８００ｍＬ、又は最大８２５ｍＬ、又は最大８５０ｍＬ、又は最大８７５ｍＬ、又は最大９００ｍＬ、又は最大９２５ｍＬ、又は最大９５０ｍＬ、又は最大９７５ｍＬ、又は最大１０００ｍＬである。
【0239】
いくつかの実施形態では、投与される組成物の容積は、限定するものではないが、約０．０１ｍＬ、又は約０．０２ｍＬ、又は約０．０３ｍＬ、又は約０．０４ｍＬ、又は約０．０５ｍＬ、又は約０．０６ｍＬ、又は約０．０７ｍＬ、又は約０．０８ｍＬ、又は約０．０９ｍＬ、又は約０．１０ｍＬ、又は約０．１５ｍＬ、又は約０．２０ｍＬ、又は約０．２５ｍＬ、又は約０．３０ｍＬ、又は約０．３５ｍＬ、又は約０．４０ｍＬ、又は約０．４５ｍＬ、又は約０．５０ｍＬ、又は約０．５５ｍＬ、又は約０．６０ｍＬ、又は約０．６５ｍＬ、又は約０．７０ｍＬ、又は約０．７５ｍＬ、又は約０．８０ｍＬ、又は約０．８５ｍＬ、又は約０．９０ｍＬ、又は約０．９５ｍＬ、又は約１ｍＬ、又は約２ｍＬ、又は約３ｍＬ、又は約４ｍＬ、又は約５ｍＬ、又は約６ｍＬ、又は約７ｍＬ、又は約８ｍＬ、又は約９ｍＬ、又は約１０ｍＬ、又は約１１ｍＬ、又は約１２ｍＬ、又は約１３ｍＬ、又は約１４ｍＬ、又は約１５ｍＬ、又は約１６ｍＬ、又は約１７ｍＬ、又は約１８ｍＬ、又は約１９ｍＬ、又は約２０ｍＬ、又は約２１ｍＬ、又は約２２ｍＬ、又は約２３ｍＬ、又は約２４ｍＬ、又は約２５ｍＬ、又は約２６ｍＬ、又は約２７ｍＬ、又は約２８ｍＬ、又は約３０ｍＬ、又は約３５ｍＬ、又は約３６ｍＬ、又は約３７ｍＬ、又は約３８ｍＬ、又は約３９ｍＬ、又は約４０ｍＬ、又は約４１ｍＬ、又は約４２ｍＬ、又は約４３ｍＬ、又は約４４ｍＬ、又は約４５ｍＬ、又は約４６ｍＬ、又は約４７ｍＬ、又は約４８ｍＬ、又は約４９ｍＬ、又は約５０ｍＬ、又は約５１ｍＬ、又は約５２ｍＬ、又は約５３ｍＬ、又は約５４ｍＬ、又は約５５ｍＬ、又は約５６ｍＬ、又は約５７ｍＬ、又は約５８ｍＬ、又は約５９ｍＬ、又は約６０ｍＬ、又は約６１ｍＬ、又は約６２ｍＬ、又は約６３ｍＬ、又は約６４ｍＬ、又は約６５ｍＬ、又は約６６ｍＬ、又は約６７ｍＬ、又は約６８ｍＬ、又は約６９ｍＬ、又は約７０ｍＬ、又は約７１ｍＬ、又は約７２ｍＬ、又は約７３ｍＬ、又は約７４ｍＬ、又は約７５ｍＬ、又は約７６ｍＬ、又は約７７ｍＬ、又は約７８ｍＬ、又は約７９ｍＬ、又は約８０ｍＬ、又は約８１ｍＬ、又は約８２ｍＬ、又は約８３ｍＬ、又は約８４ｍＬ、又は約８５ｍＬ、又は約８６ｍＬ、又は約８７ｍＬ、又は約８８ｍＬ、又は約８９ｍＬ、又は約９０ｍＬ、又は約９１ｍＬ、又は約９２ｍＬ、又は約９３ｍＬ、又は約９４ｍＬ、又は約９５ｍＬ、又は約９６ｍＬ、又は約９７ｍＬ、又は約９８ｍＬ、又は約９９ｍＬ、又は約１００ｍＬ、又は約１１０ｍＬ、又は約１２０ｍＬ、又は約１３０ｍＬ、又は約１４０ｍＬ、又は約１５０ｍＬ、又は約１６０ｍＬ、又は約１７０ｍＬ、又は約１８０ｍＬ、又は約１９０ｍＬ、又は約２００ｍＬ、又は約２１０ｍＬ、又は約２２０ｍＬ、又は約２３０ｍＬ、又は約２４０ｍＬ、又は約２５０ｍＬ、又は約２６０ｍＬ、又は約２７０ｍＬ、又は約２８０ｍＬ、又は約２９０ｍＬ、又は約３００ｍＬ、又は約３１０ｍＬ、又は約３２０ｍＬ、又は約３３０ｍＬ、又は約３４０ｍＬ、又は約３５０ｍＬ、又は約３６０ｍＬ、又は約３７０ｍＬ、又は約３８０ｍＬ、又は約３９０ｍＬ、又は約４００ｍＬ、又は約４１０ｍＬ、又は約４２０ｍＬ、又は約４３０ｍＬ、又は約４４０ｍＬ、又は約４５０ｍＬ、又は約４６０ｍＬ、又は約４７０ｍＬ、又は約４８０ｍＬ、又は約４９０ｍＬ、又は約５００ｍＬ、又は約５１０ｍＬ、又は約５２０ｍＬ、又は約５３０ｍＬ、又は約５４０ｍＬ、又は約５５０ｍＬ、又は約５６０ｍＬ、又は約５７０ｍＬ、又は約５８０ｍＬ、又は約５９０ｍＬ、又は約６００ｍＬ、又は約６１０ｍＬ、又は約６２０ｍＬ、又は約６３０ｍＬ、又は約６４０ｍＬ、又は約６５０ｍＬ、又は約６６０ｍＬ、又は約６７０ｍＬ、又は約６８０ｍＬ、又は約６９０ｍＬ、又は約７００ｍＬ、又は約７１０ｍＬ、又は約７２０ｍＬ、又は約７３０ｍＬ、又は約７４０ｍＬ、又は約７５０ｍＬ、又は約７６０ｍＬ、又は約７７０ｍＬ、又は約７８０ｍＬ、又は約７９０ｍＬ、又は約８００ｍＬ、又は約８１０ｍＬ、又は約８２０ｍＬ、又は約８３０ｍＬ、又は約８４０ｍＬ、又は約８５０ｍＬ、又は約８６０ｍＬ、又は約８７０ｍＬ、又は約８８０ｍＬ、又は約８９０ｍＬ、又は約９００ｍＬ、又は約９１０ｍＬ、又は約９２０ｍＬ、又は約９３０ｍＬ、又は約９４０ｍＬ、又は約９５０ｍＬ、又は約９６０ｍＬ、又は約９７０ｍＬ、又は約９８０ｍＬ、又は約９９０ｍＬ、又は約１０００ｍＬである。
【0240】
いくつかの実施形態では、投与される組成物の容積は、限定するものではないが、０．０１ｍＬ～０．１０ｍＬ、又は０．１０ｍＬ～１ｍＬ、又は１ｍＬ～１０ｍＬ、又は１０ｍＬ～１００ｍＬ、又は５０ｍＬ～１００ｍＬ、又は１００ｍＬ～１５０ｍＬ、又は１５０ｍＬ～２００ｍＬ、又は２００ｍＬ～２５０ｍＬ、又は２５０ｍＬ～３００ｍＬ、又は３００ｍＬ～３５０ｍＬ、又は３５０ｍＬ～４００ｍＬ、又は４００ｍＬ～４５０ｍＬ、又は４５０ｍＬ～５００ｍＬ、又は５００ｍＬ～５５０ｍＬ、又は５５０ｍＬ～６００ｍＬ、又は６００ｍＬ～６５０ｍＬ、又は６５０ｍＬ～７００ｍＬ、又は７００ｍＬ～７５０ｍＬ、又は７５０ｍＬ～８００ｍＬ、又は８００ｍＬ～８５０ｍＬ、又は８５０ｍＬ～９００ｍＬ、又は９００ｍＬ～９５０ｍＬ、又は９５０ｍＬ～１０００ｍＬ、又は１ｍＬ～２５ｍＬ、又は１ｍＬ～５０ｍＬ、又は１ｍＬ～７５ｍＬ、又は１ｍＬ～１００ｍＬ、又は１０ｍＬ～２５ｍＬ、又は１０ｍＬ～５０ｍＬ、又は１０ｍＬ～７５ｍＬ、又は１００ｍＬ～２５０ｍＬ、又は１００ｍＬ～５００ｍＬ、又は１００ｍＬ～７５０ｍＬ、又は１００ｍＬ～１０００ｍＬである。
【0241】
コラーゲン刺激組成物としての絹フィブロインタンパク質断片
カイコであるＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ由来の未加工の絹は、２つの主要タンパク質で構成される：絹フィブロイン（約７５％）及びセリシン（約２５％）。絹フィブロインは、剛性及び強度を提供する半結晶構造を伴う線維性タンパク質である。本明細書で使用される場合、「絹フィブロイン」という用語は、約３７０，０００Ｄａの重量平均分子量を有するＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉの繭の線維を意味する。粗製カイコ繊維は、フィブロインの二重糸からなる。これらの二重繊維を一緒に保持している接着物質がセリシンである。絹フィブロインは、約３５０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する重鎖（Ｈ鎖）、及び約２５，０００Ｄａの重量平均分子量を有する軽鎖（Ｌ鎖）で構成される。
カイコであるＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ由来の未加工の絹は、２つの主要タンパク質で構成される：絹フィブロイン（約７５％）及びセリシン（約２５％）。絹フィブロインは、剛性及び強度を提供する半結晶構造を伴う線維性タンパク質である。本明細書で使用される場合、「絹フィブロイン」という用語は、約３７０，０００Ｄａの重量平均分子量を有するＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉの繭の線維を意味する。粗製カイコ繊維は、フィブロインの二重糸からなる。これらの二重繊維を一緒に保持している接着物質がセリシンである。絹フィブロインは、約３５０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する重鎖（Ｈ鎖）、及び約２５，０００Ｄａの重量平均分子量を有する軽鎖（Ｌ鎖）で構成される。
【0242】
これらのフィブリル絹フィブロインの、水溶性絹フィブロインタンパク質断片への変換は、濃縮重塩（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｈｅａｖｙ ｓａｌｔ）（例えば、８～１０Ｍの臭化リチウム）の添加を必要とし、これが、そうでなければフィブロインタンパク質を水に対して不溶性にする、分子間及び分子内のイオン結合及び水素結合に干渉する。絹フィブロイン若しくは絹フィブロイン断片を作製する方法、及び／又はその組成物は、知られており、例えば、米国特許第９，１８７，５３８号、同第９，５１１，０１２号、同第９，５１７，１９１号、同第９，５２２，１０７号、同第９，５２２，１０８号、同第９，５４５，３６９号、及び同第１０，１６６，１７７号に記載されている。
【0243】
本明細書では、未加工の未精練、部分精練、又は精練済みのカイコ繊維を、中性臭化リチウム塩で溶解することによって得られる絹タンパク質断片（ＳＰＦ）混合溶液が提供される。未加工のカイコ繊維は、セリシンを除去し、断片混合物の所望の重量平均分子量（ＭＷ）及び多分散性（ＰＤ）を達成するために、選択された温度及び他の条件下で処理される。選択したプロセスパラメータは、使用目的に応じて異なる最終絹タンパク質断片の特性を達成するように変更され得る。結果として得られる最終断片溶液は、プロセス汚染物質のＰＰＭから検出不能なレベル、医薬、医療、及び消費者化粧品市場で許容可能なレベルを有する絹タンパク質断片及び水である。溶液中の絹タンパク質断片の濃度、サイズ、及び多分散性は、所望の用途及び性能要件に応じて更に変更され得る。
【0244】
一実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法における適用のために有用な絹タンパク質断片溶液は、以下の工程に従って調製される：Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉのカイコから絹繭の小片を形成する工程、Ｎａ２ＣＯ３水溶液中で約１００℃において約６０分間、小片を抽出して（水の容量は、未加工の絹重量の約０．４×に等しく、Ｎａ２ＣＯ３の量は、小片の重量の約０．８４８×である）、絹フィブロイン抽出物を形成する工程、絹フィブロイン抽出物を、約６０℃で、リンス水の容量中での１回のリンス当たり約２０分間にわたり３回リンスする工程（各々のサイクルについてのリンス水は、約０．２Ｌ×の小片の重量に等しい）、絹フィブロイン抽出物から過剰な水を除去する工程、絹フィブロイン抽出物を乾燥する工程、乾燥絹フィブロイン抽出物をＬｉＢｒ溶液中に溶解する工程（、ＬｉＢｒ溶液がまず約１００℃に加熱されて、絹及びＬｉＢｒ溶液を作製し、維持される）、絹及びＬｉＢｒ溶液を、約１００℃で約６０分間にわたり乾燥オーブン中に入れ、天然絹タンパク質構造の完全な溶解及び更なる断片化を、所望の分子量及び多分散性を伴う混合物中に達成する工程、溶液を濾過して、カイコからの全ての残る残骸を除去する工程、溶液を水で希釈して、１．０重量％絹溶液をもたらす工程、並びに接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して溶液から溶媒を除去する工程。一実施形態では、１０ｋＤａの膜を利用して絹溶液を精製し、最終的な所望の絹と水の比をもたらす。ＴＦＦを次に使用して、絹溶液を、水中の２．０重量％絹の濃度まで更に濃縮することができる。
【0245】
任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、抽出（すなわち、時間及び温度）、ＬｉＢｒ（すなわち、絹フィブロイン抽出物に添加される、又はその逆の場合でのＬｉＢｒ溶液の温度）、及び溶解（すなわち、時間及び温度）パラメータを変動させると、異なる粘度、均一性、及び色を伴う溶媒及び絹溶液がもたらされる。また、任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、抽出のための温度を増加させること、抽出時間を延長すること、絹を溶解させる場合に、出現時に及び長期にわたって、より高い温度のＬｉＢｒ溶液を使用すること（例えば、本明細書に示すようなオーブン中、又は代替の熱源）の温度での時間を増加させることは、全て、より低い粘性の、より均一な溶媒及び絹溶液をもたらした。
【0246】
一実施形態では、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａから選択される重量平均を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片の溶液を、以下の工程に従って調製する：約３０分～約６０分の処置時間にわたり、絹供給源を、沸騰（１００℃）炭酸ナトリウムの水溶液に添加することによって、絹供給源を脱ガムする工程、溶液からセリシンを除去して、非検出レベルのセリシンを含む絹フィブロイン抽出物を産生する工程、絹フィブロイン抽出物から溶液を排出する工程、絹フィブロイン抽出物を、約６０℃～約１４０℃の範囲の臭化リチウム溶液中での絹フィブロイン抽出物の配置時に、開始温度を有する臭化リチウムの溶液中に溶解する工程、約１４０℃の温度を有するオーブン中で、絹フィブロイン－臭化リチウムの溶液を少なくとも１時間の期間にわたり維持する工程、絹フィブロイン抽出物から臭化リチウムを除去する工程、及び絹タンパク質断片の水溶液を産生すること（水溶液は、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する断片を含み、絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、約１．５～約３．０の多分散性を含む）。本方法は、更に、溶解工程の前に、絹フィブロイン抽出物を乾燥させることを含み得る。絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー臭化リチウムアッセイを使用して測定したとき、３００ｐｐｍ未満の臭化リチウム残渣を含み得る。絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー炭酸ナトリウムアッセイを使用して測定したとき、１００ｐｐｍ未満の炭酸ナトリウム残渣を含み得る。絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、凍結乾燥され得る。
【0247】
一実施形態では、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片の溶液を、以下の工程に従って調製する：脱ガムをもたらすように、約３０分～約６０分の処置時間にわたり、炭酸ナトリウムの沸騰（１００℃）水溶液に絹供給源を添加する工程、この溶液からセリシンを除去して、検出不可能なレベルのセリシンを含む絹フィブロイン抽出物を産生する工程、絹フィブロイン抽出物から溶液を排出する工程、約８０℃～約１４０℃の範囲の臭化リチウム溶液中での絹フィブロイン抽出物の配置時に、開始温度を有する臭化リチウム溶液中に絹フィブロイン抽出物を溶解する工程、約６０℃～約１００℃の間の範囲の温度を有するオーブン中で、絹フィブロイン－臭化リチウムの溶液を少なくとも１時間の期間にわたり維持する工程、絹フィブロイン抽出物から臭化リチウムを除去する工程、及び絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液を産生する工程（絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、約１０ｐｐｍ～３００ｐｐｍの臭化リチウム残渣を含み、絹タンパク質断片の水溶液は、約１０ｐｐｍ～１００ｐｐｍの炭酸ナトリウム残渣を含み、絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する断片を含み、絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、約１．５～約３．０の多分散性を含む）。本方法は、更に、溶解工程の前に、絹フィブロイン抽出物を乾燥させることを含み得る。絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー臭化リチウムアッセイを使用して測定したとき、３００ｐｐｍ未満の臭化リチウム残渣を含み得る。絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー炭酸ナトリウムアッセイを使用して測定したとき、１００ｐｐｍ未満の炭酸ナトリウム残渣を含み得る。
【0248】
一実施形態では、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片の溶液は、以下の工程に従って調製される：脱ガムをもたらすために、約３０分の処置時間にわたり絹供給源を、炭酸ナトリウムの沸騰（１００℃）水溶液に添加する工程、この溶液からセリシンを除去して、検出不可能なレベルのセリシンを含む絹フィブロイン抽出物を産生する工程、絹フィブロイン抽出物から溶液を排出する工程、約８０℃～約１４０℃の範囲の臭化リチウム溶液中での絹フィブロイン抽出物の配置時に、開始温度を有する臭化リチウム溶液中に絹フィブロイン抽出物を溶解する工程、約６０℃～約１００℃の間の範囲の温度を有するオーブン中で、絹フィブロイン－臭化リチウムの溶液を少なくとも１時間の期間にわたり維持する工程、絹フィブロイン抽出物から臭化リチウムを除去する工程、及び絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液を産生する工程（絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、約１０ｐｐｍ～３００ｐｐｍの臭化リチウム残渣、約１０ｐｐｍ～１００ｐｐｍの炭酸ナトリウム残渣、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する断片を含み、絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、約１．５～約３．０の多分散性を含む）。本方法は、更に、溶解工程の前に、絹フィブロイン抽出物を乾燥させることを含み得る。絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー臭化リチウムアッセイを使用して測定したとき、３００ｐｐｍ未満の臭化リチウム残渣を含み得る。絹フィブロインベースのタンパク質断片の水溶液は、高速液体クロマトグラフィー炭酸ナトリウムアッセイを使用して測定したとき、１００ｐｐｍ未満の炭酸ナトリウム残渣を含み得る。
【0249】
一実施形態では、溶液中の絹フィブロインベースのタンパク質断片は、セリシンを実質的に欠いており、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａから選択される重量平均分子量を有し、約１．５～約３．０から選択される多分散性を有する。一実施形態では、溶液中の絹フィブロインベースのタンパク質断片は、セリシンを実質的に欠いており、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａから選択される重量平均分子量を有し、約１．５～約３．０から選択される多分散性を有する。一実施形態では、溶液中の絹フィブロインベースのタンパク質断片は、セリシンを実質的に欠いており、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有し、約１．５～約３．０から選択される多分散性を有する。
【0250】
本明細書で使用される場合、「セリシンを実質的に含まない」又は「セリシンを実質的に欠いている」という用語は、セリシンタンパク質の大部分が除去された絹線維を指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．０１重量％～約１０．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．０１重量％～約９．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．０１重量％～約８．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．０１重量％～約７．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．０１重量％～約６．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．０１重量％～約５．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０重量％～約４．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．０５重量％～約４．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．１重量％～約４．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．５重量％～約４．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約１．０重量％～約４．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約１．５重量％～約４．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約２．０重量％～約４．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約２．５重量％～約４．０重量％のセリシンを有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．０１重量％～約０．１重量％のセリシン含量を有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．１重量％を下回るセリシン含量を有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、セリシンを実質的に欠いている絹フィブロインは、約０．０５重量％を下回るセリシン含量を有する絹フィブロインを指す。一実施形態では、絹供給源が、沸騰（１００℃）炭酸ナトリウムの水溶液に、約３０分間～約６０分間の処置時間にわたり添加される場合に、約２６．０重量％～約３１．０重量％の脱ガム損失が得られる。
【0251】
以下は、本開示の絹溶液の調製における及びそのための様々なパラメータの好適な範囲の非限定的な例である。本開示の絹溶液は、これらのパラメータのうちの１つ以上（ただし、必ずしも全てではない）を含み得るが、そのようなパラメータの範囲の様々な組み合わせを使用して調製され得る。
【0252】
一実施形態では、溶液中の絹（％）は、限定するものではないが、３０重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、２５重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、２０重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１９重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１８重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１７重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１６重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１５重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１４重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１３重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１２重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１１重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１０重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、９重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、８重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、７重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、６重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、５重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、４重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、３重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、２重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．９重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．８重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．７重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．６重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．５重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．４重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．３重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．２重量％未満である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．１重量％未満である。
【0253】
一実施形態では、溶液中の絹（％）は、限定するものではないが、０．１重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．２重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．３重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．４重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．５重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．６重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．７重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．８重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、０．９重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、２．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、３．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、４．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、５．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、６．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、７．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、８．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、９．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１０．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１１．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１２．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１３．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１４．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１５．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１６．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１７．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１８．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、１９．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、２０．０重量％超である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、２５．０重量％超である。
【0254】
一実施形態では、溶液中の絹（％）は、限定するものではないが、約０．１重量％～約３０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約２５．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約２０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約１５．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約１０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約９．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約８．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約７．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約６．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約６．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約５．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約５．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約４．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約４．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約３．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約３．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約２．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約２．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約２．４重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約５．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．５重量％～約４．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．５重量％～約４．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．５重量％～約３．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．５重量％～約３．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．５重量％～約２．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１．０重量％～約４．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１．０重量％～約３．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１．０重量％～約３．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１．０重量％～約２．５重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１．０重量％～約２．４重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１．０重量％～約２重量％の範囲である。
【0255】
一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約２０．０重量％～約３０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約１０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１．０重量％～約１０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約２重量％～約１０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約０．１重量％～約６．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約６．０重量％～約１０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約６．０重量％～約８．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約６．０重量％～約９．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１０．０重量％～約２０．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１１．０重量％～約１９．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１２．０重量％～約１８．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１３．０重量％～約１７．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１４．０重量％～約１６．０重量％の範囲である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１．０重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１．５重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約２．０重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約２．４重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、３．０重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、３．５重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約４．０重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約４．５重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約５．０重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約５．５重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約６．０重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約６．５重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約７．０重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約７．５重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約８．０重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約８．５重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約９．０重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約９．５重量％である。一実施形態では、溶液中の絹（％）は、約１０．０重量％である。
【0256】
一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、検出不能～３０．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、検出不能～５．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、１．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、２．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、３．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、４．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、５．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、１０．０重量％である。一実施形態では、溶液中のセリシン（％）は、３０．０重量％である。
【0257】
いくつかの実施形態では、本開示の絹フィブロインタンパク質ベースの断片は、貯蔵条件、絹のパーセント、並びに出荷の数及び出荷条件に応じて１０日間～３年間の保管安定性を有する（水溶液中で貯蔵した場合、それらは、徐々に又は自然発生的にゲル化することはなく、断片の凝集はなく、したがって経時的な分子量の増加はない）。追加的に、ｐＨを変化させて、絹の未熟な折り畳み及び凝集を防止することにより、保管寿命を延長させることができ及び／又は出荷条件を支持することができる。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は０～１年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は０～２年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は０～３年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は０～４年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は０～５年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は１～２年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は１～３年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は１～４年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は１～５年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は２～３年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は２～４年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は２～５年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は３～４年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は３～５年間である。一実施形態では、ＬｉＢｒ－絹断片溶液の安定性は４～５年間である。
【0258】
一実施形態では、本開示の組成物の安定性は１０日～６ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は６ヶ月～１２ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は１２ヶ月～１８ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は１８ヶ月～２４ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は２４ヶ月～３０ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は３０ヶ月～３６ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は３６ヶ月～４８ヶ月である。一実施形態では、本開示の組成物の安定性は４８ヶ月～６０ヶ月である。
【0259】
一実施形態では、本開示の組成物は、６ｋＤａ～１７ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１７ｋＤａ～３９ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３９ｋＤａ～８０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、４０ｋＤａ～６５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１ｋＤａ～５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、５ｋＤａ～１０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１０ｋＤａ～１５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１５ｋＤａ～２０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２０ｋＤａ～２５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２５ｋＤａ～３０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３０ｋＤａ～３５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３５ｋＤａ～４０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、４０ｋＤａ～４５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、４５ｋＤａ～５０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、５０ｋＤａ～５５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、５５ｋＤａ～６０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、６０ｋＤａ～６５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、６５ｋＤａ～７０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、７０ｋＤａ～７５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、７５ｋＤａ～８０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、８０ｋＤａ～８５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、８５ｋＤａ～９０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、９０ｋＤａ～９５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、９５ｋＤａ～１００ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１００ｋＤａ～１０５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１０５ｋＤａ～１１０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１１０ｋＤａ～１１５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１１５ｋＤａ～１２０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１２０ｋＤａ～１２５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１２５ｋＤａ～１３０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１３０ｋＤａ～１３５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１３５ｋＤａ～１４０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１４０ｋＤａ～１４５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１４５ｋＤａ～１５０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１５０ｋＤａ～１５５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１５５ｋＤａ～１６０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１６０ｋＤａ～１６５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１６５ｋＤａ～１７０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１７０ｋＤａ～１７５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１７５ｋＤａ～１８０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１８０ｋＤａ～１８５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１８５ｋＤａ～１９０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１９０ｋＤａ～１９５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、１９５ｋＤａ～２００ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２００ｋＤａ～２０５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２０５ｋＤａ～２１０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２１０ｋＤａ～２１５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２１５ｋＤａ～２２０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２２０ｋＤａ～２２５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２２５ｋＤａ～２３０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２３０ｋＤａ～２３５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２３５ｋＤａ～２４０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２４０ｋＤａ～２４５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２４５ｋＤａ～２５０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２５０ｋＤａ～２５５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２５５ｋＤａ～２６０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２６０ｋＤａ～２６５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２６５ｋＤａ～２７０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２７０ｋＤａ～２７５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２７５ｋＤａ～２８０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２８０ｋＤａ～２８５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２８５ｋＤａ～２９０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２９０ｋＤａ～２９５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、２９５ｋＤａ～３００ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３００ｋＤａ～３０５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３０５ｋＤａ～３１０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３１０ｋＤａ～３１５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３１５ｋＤａ～３２０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３２０ｋＤａ～３２５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３２０ｋＤａ～３３０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３３０ｋＤａ～３３５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３５０ｋＤａ～３４０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３４０ｋＤａ～３４５ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタンパク質断片を含む。一実施形態では、本開示の組成物は、３４５ｋＤａ～３５０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する絹フィブロインベースのタン
パク質断片を含む。
パク質断片を含む。
【0260】
一実施形態では、本開示の絹フィブロインベースのタンパク質断片の組成物は、約１～約５．０から選択される多分散性を有する。一実施形態では、絹フィブロインベースのタンパク質断片の組成物は、約１．５～約３．０から選択される多分散性を有する。一実施形態では、絹フィブロインベースのタンパク質断片の組成物は、約１～約１．５から選択される多分散性を有する。一実施形態では、絹フィブロインベースのタンパク質断片の組成物は、約１．５～約２．０から選択される多分散性を有する。一実施形態では、絹フィブロインベースのタンパク質断片の組成物は、約２．０～約２．５から選択される多分散性を有する。一実施形態では、絹フィブロインベースのタンパク質断片の組成物は、約２．０～約３．０から選択される多分散性を有する。一実施形態では、絹フィブロインベースのタンパク質断片の組成物は、約２．５～約３．０から選択される多分散性を有する。
【0261】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥絹粉末は、貯蔵後に水、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、又は有機溶液に再懸濁して、最初に生成されたものよりも高濃度の溶液を含む様々な濃度の絹溶液を作製することができる。別の実施形態では、絹フィブロインベースのタンパク質断片は、１０質量％未満の水を含有する乾燥タンパク質形態を作製するために、ロトサームエバポレータ又は当技術分野において既知の他の方法を使用して乾燥される。一実施形態では、有機溶液中の本開示の絹フィブロインベースのタンパク質断片の溶解性は、約５０．０％～約１００％の範囲である。一実施形態では、有機溶液中の本開示の絹フィブロインベースのタンパク質断片の溶解性は、約６０．０％～約１００％の範囲である。一実施形態では、有機溶液中の本開示の絹フィブロインベースのタンパク質断片の溶解性は、約７０．０％～約１００％の範囲である。一実施形態では、有機溶液中の本開示の絹フィブロインベースのタンパク質断片の溶解性は、約８０．０％～約１００％の範囲である。一実施形態では、有機溶液中の本開示の絹フィブロインベースのタンパク質断片の溶解性は、約９０．０％～約１００％の範囲である。一実施形態では、本開示の絹フィブロインベースの断片は、有機溶液中で非可溶性である。
【0262】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法における適用に有用な絹フィブロインタンパク質断片はまた、絹フィブロインタンパク質断片の水性ゲルを含む。絹フィブロインタンパク質断片溶液のゲル化は、ソニケーション、ボルテックス、加熱、溶媒処置（例えば、メタノール、エタノール）、電気ゲル化、超音波処理、化学物質（例えば、ビタミンＣ）などによって誘導され得る。
【0263】
絹ペプチドは、天然の絹フィブロイン加水分解物からの抽出物である。絹ペプチドは、パーソナルケア製品に組み込まれると、真珠の光沢及び絹のような感触を示す。絹ペプチドの構造は、ヒトの毛髪及び皮膚組織に類似している。絹ペプチドは、１０個以上のアミノ酸残基及び本明細書に記載される重量平均分子量を有するセリンに富むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、絹ペプチド抽出物は、皮膚、例えば、ヒトの皮膚によって容易に吸収され、皮膚に栄養素を与え、皮膚の代謝を促進することができる。
【0264】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法における適用に有用な絹フィブロインタンパク質断片溶液はまた、低分子量絹フィブロインペプチド（約２００Ｄａ～５ｋＤａの重量平均分子量）を含む。絹フィブロインタンパク質加水分解物に由来する低分子量絹フィブロインペプチドは、遊離アミノ酸の天然の保湿因子を補完して、頭皮の水分含量を改善することができる。いくつかの実施形態では、低分子量絹フィブロインペプチドは、毛包の奥深くに浸透して、修復し、水を補充し、毛髪に栄養を与え、水分バランスを改善し、ふけの発生を予防することができる。
【0265】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法における用途に有用な絹フィブロインタンパク質断片溶液はまた、加水分解された絹フィブロインに由来する絹フィブロインタンパク質アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、絹フィブロインアミノ酸は、市販の加水分解絹（ＣＡＳ番号：９６６９０－４１－４）からのものである。Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉの絹フィブロインタンパク質に由来するアミノ酸組成物は、主に、Ｇｌｙ（４３％）、Ａｌａ（３０％）、及びＳｅｒ（１２％）からなる。
【0266】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、絹フィブロインタンパク質断片の有益な効果を高める植物抽出物を含む。いくつかの実施形態では、植物抽出物は、米、オート、アーモンド、Ｃａｍｅｌｌｉａ Ｓｉｎｅｎｓｉｓ（緑茶）抽出物、Ｂｕｔｙｒｏｓｐｅｒｍｕｍ Ｐａｒｋｉｉ（シアバター）、ココナッツ、パパイヤ、マンゴー、ピーチ、レモン、小麦、ローズマリー、アプリコット、藻類、グレープフルーツ、サンダルウッド、ライム、オレンジ、Ａｃａｃｉａ ｃｏｎｃｉｎｎａ、Ｂｕｔｅａ ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ、Ｂｕｔｅａ ｓｕｐｅｒｂ、Ｂｕｔｅａ ｆｒｏｎｄｏｓａ、Ｃａｍｐａｎｕｌａｔａ（ファイヤーチューリップ）、Ａｄａｎｓｏｎｉａ Ｄｉｇｉｔａｔａ（バオバブ）、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ（デーツ）、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ Ｓａｂｄａｒｉｆｆａ（ハイビスカス）、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ Ｍｅｌｅｇｕｅｔａ（アフリカンペッパー）、Ｋｈａｙａ Ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ（マホガニーウッド）、Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ Ｉｎｄｉｃａ（タマリンド、又はクルクミン）、Ｃｙｐｅｒｕｓ Ｐａｐｙｒｕｓ（パピルス）、Ａｇｅｒａｔｕｍ ｓｐｐ．、バーチ、ごぼう、ホーステイル、ラベンダー、マジョラム、イラクサ、テールキャット、タイム、オークバーク、エキナセア、セイヨウイラクサ、マンサク、ホップ、ヘンナ、カモミール、セイヨウサンザシ、ライムツリーブロッサム、アーモンド、松葉、ホースチェスナット、ジュニパー、キウイ、メロン、マロウ、ハナタネツケバナ、ワイルドタイム、ヤロウ、メリッサ、レストハロー、コルツフット、マシュマロ、ライスメリステム、モリンガ、ジンセン及びジンジャー根、アロエベラ、ａｌｏｅ ｂａｒｂａｄｅｎｓｉｓ葉抽出物、ｌａｖａｎｄｕｌａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（ラベンダー）花抽出物、ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ（エルダーベリー）果実抽出物、ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ（デーツ）種子抽出物、ａｖａｎｄｕｌａ ｓｔｏｅｃｈａｓ（スパニッシュラベンダー）抽出物、ｓｐｉｒａｅａ ｕｌｍａｒｉａ（メドウスイート）葉抽出物、ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ ｒｅｃｕｔｉｔａ（カモミール）葉抽出物、及びＳｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ（コンフリー）葉抽出物、並びにそれらの組み合わせからの抽出物からなる群から選択される。これらの植物の抽出物は、種子、根、茎、葉、花、樹皮、果実、及び／又は植物全体から得られる。
【0267】
いくつかの実施形態では、植物抽出物は、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法において、組成物の総重量により約０．００１重量％～約１０．０重量％の範囲の重量パーセントで提供される。いくつかの実施形態では、植物抽出物は、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法において、組成物の総重量により約０．００５重量％～約５．０重量％の範囲の重量パーセントで提供される。いくつかの実施形態では、植物抽出物は、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法において、組成物の総重量により約０．０１重量％～約２．０重量％の範囲の重量パーセントで提供される。いくつかの実施形態では、植物抽出物は、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法において、組成物の総重量により約０．００４５重量％～０．００５５重量％の範囲の重量パーセントで提供される。
【0268】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、２９０～３２９ｎｍの波長の紫外線を吸収するＵＶフィルタを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、パラ－アミノ安息香酸、パラ－アミノ安息香酸エチル、パラ－アミノ安息香酸アミル、パラ－アミノ安息香酸オクチル、サリチル酸エチレングリコール、サリチル酸フェニル、サリチル酸オクチル、サリチル酸ベンジル、サリチル酸ブチルフェニル、サリチル酸ホモメンチル、シンナミン酸ベンジル、パラメトキシケイヒ酸２－エトキシエチル、パラ－メトキシケイヒ酸オクチル、モノ（２－エチルヘキサノエート）ジパラ－メトキシケイヒ酸グリセリル、パラ－メトキシケイヒ酸イソプロピル、ジイソプロピル－ジイソプロピルシンナミン酸エステル混合物、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、ヒドロキシメトキシベンゾフェノン、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルホン酸及びその塩、ジヒドロキシメトキシベンゾフェノン、ジヒドロキシメトキシベンゾフェノンジスルホン酸ナトリウム、ジヒドロキシベンゾフェノン、テトラヒドロキシベンゾフェノン、４－ｔｅｒｔ－ブチル－４’－メトキシジベンゾイルメタン、２，４，６－トリアニリノ－ｐ－（カルボ－２’－エチルヘキシル－１’－オキシ）－１，３，５－トリアジン、及び２－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）ベンゾトリアゾールからなる群から選択されるＵＶフィルタを含む。いくつかの実施形態では、ｐ－メトキシケイヒ酸２－エチルヘキシル、４－ｔｅｒｔ－ブチル－４’－メトキシジベンゾイルメタン、オクトクリレン、２，４－ビス－［｛４－（２－エチルヘキシルオキシ）－２－ヒドロキシ｝－フェニル］－６－（４－メトキシフェニル）－１，３，５－トリアジン、メチレンビス－ベンゾトリアゾリルテトラメチルブチルフェノール、２，４，６－トリス－［４－（２－エチルヘキシルオキシカルボニル）アニリノ］－１，３，５－トリアジン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル、オキシベンゾン、２，２’－ジヒドロキシ－４，４’－ジメトキシベンゾフェノン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される水溶性紫外線吸収剤である。
【0269】
いくつかの実施形態では、ＵＶフィルタは、メトキシジベンゾイルメタンブチル、メトキシケイヒ酸エチルヘキシル、サリチル酸エチル、オクトクリレン、メトキシケイヒ酸エチルヘキシル、ｐ－メトキシケイヒ酸イソアミル、ヘキシルトリアゾン、ジエチルヘキシルブタミドトリアゾン、メチレンビス－ベンゾトリアゾリルテトラメチルブチルフェノール、フェニルジベンズイミダゾールテトラスルホン酸二ナトリウム、ビス－エチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、ベンゾフェノン－３、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0270】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２、Ｆｅ２Ｏ３、ＺｒＯ２、ＭｎＯ、Ａｌ２Ｏ３、及びそれらの組み合わせから選択されるＵＶフィルタとしての無機顔料を含む。
【0271】
いくつかの実施形態では、ＵＶフィルタは、コラーゲンブースティング組成物の総重量により約０．００１重量％～約２０．０重量％の範囲の重量パーセントで組成物中に提供される。いくつかの実施形態では、ＵＶフィルタは、組成物の総重量により約０．０１重量％～約１０．０重量％の範囲の重量パーセントで組成物中に提供される。いくつかの実施形態では、ＵＶフィルタは、組成物の総重量により約０．０５重量％～約８．０重量％の範囲の重量パーセントで組成物中に提供される。
【0272】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、炭化水素油、炭化水素ワックス、シリコーン油、アセトグリセリドエステル、エトキシル化グリセリド、脂肪酸のアルキルエステル、脂肪酸のアルケニルエステル、脂肪族アルコール、脂肪族アルコールエーテル、エーテルエステル、ラノリン、ラノリン誘導体、多価アルコール、ポリエーテル誘導体、多価エステル、ワックスエステル、ミツロウ誘導体、植物ワックス、天然又はエッセンシャルオイル、リン脂質、ステロール、アミド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される皮膚軟化剤を含む。
【0273】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製方法及び使用方法に組み込まれた皮膚軟化剤は、（１）炭化水素油及びワックス、例えば、鉱油、ワセリン、パラフィン、オゾケライト、マイクロクリスタリンワックス、ポリエチレン、スクアレン、及びペルヒドロスクアレン、（２）シリコーン油、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、水溶性及びアルコール溶性のシリコーングリコールコポリマー、（３）アセトグリセリドエステル、例えば、アセチル化モノグリセリド、（４）エトキシル化グリセリド、例えば、エトキシル化モノステアリン酸グリセリル、（５）１０～２０個の炭素原子を有する脂肪酸のアルキルエステル、例えば、ラウリン酸ヘキシル、ラウリン酸イソヘキシル、パルミチン酸イソヘキシル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、オレイン酸イソデシル、ステアリン酸ヘキサデシル、ステアリン酸デシル、イソステアリン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル、アジピン酸ジイソヘキシル、アジピン酸ジヘキシルデシル、セバシン酸ジイソプロピル、乳酸ラウリル、乳酸ミリスチル、メチル、イソプロピル、脂肪酸のブチルエステル、（６）１０～２０個の炭素原子を有する脂肪酸のアルケニルエステル、例えば、ミリスチン酸オレイル、ステアリン酸オレイル、及びオレイン酸オレイル、（７）１０～２０個の炭素原子を有する脂肪酸、例えば、ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ヒドロキシステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リシノール酸、アラキジン酸、ベヘン酸、及びエルカ酸、（８）１０～２０個の炭素原子を有する脂肪アルコール、例えば、ラウリル、ミリスチル、セチル、ヘキサデシル、ステアリル、イソステアリル、ヒドロキシステアリル、オレイル、リシノレイル、ベヘニル、エルシルアルコール、及び２－オクチルドデカノール、（９）脂肪アルコールエーテル、例えば、１０～２０個の炭素原子のエトキシル化脂肪アルコール、それらに付着した、１～５０個のエチレンオキシド基又は１～５０個のプロピレンオキシド基のラウリル、セチル、ステアリル、イソステアリル、オレイル、コレステロールアルコール、（１０）エーテル－エステル、例えば、エトキシル化脂肪アルコールの脂肪酸エステル、（１１）ラノリン及びその誘導体、例えば、ラノリン油、ラノリンワックス、ラノリンアルコール、ラノリン脂肪酸、ラノリン脂肪酸イソプロピル、エトキシル化ラノリン、エトキシル化ラノリンアルコール、エトキシル化コレステロール、プロポキシル化ラノリンアルコール、アセチル化ラノリン、アセチル化ラノリンアルコール、リノール酸ラノリンアルコール、リシノレイン酸ラノリンアルコール、リシノレイン酸ラノリンアルコールの酢酸塩、エトキシル化アルコール－エステルの酢酸塩、ラノリンの水素化分解、エトキシル化水素化ラノリン、エトキシル化ソルビトールラノリン、並びに液体及び半固体のラノリン吸収塩基、（１２）多価アルコール及びポリエーテル誘導体、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール２０００及び４０００、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレングリコール、グリセロール、ソルビトール、エトキシル化ソルビトール、ヒドロキシプロピルソルビトール、ポリエチレングリコール２００－６０００、メトキシポリエチレングリコール３５０、５５０、７５０、２０００、及び５０００、ポリ［エチレンオキシド］ホモポリマー（１００，０００～５，０００，０００Ｄａの重量平均分子量）、ポリアルキレングリコール及び誘導体、ヘキシレングリコール（２－メチル－２，４－ペンタンジオール）、１，３－ブチレングリコール、１，２，６－ヘキサントリオール、エトヘキサジオールＵＳＰ（２－エチル－ｌ，３－ヘキサンジオール）、Ｃ１５－Ｃ１８ビシナルグリコール、並びにトリメチロールプロパンのポリオキシプロピレン誘導体、（１３）多価アルコールエステル、例えば、エチレングリコールモノ及びジ脂肪酸エステル、ジエチレングリコールモノ及びジ脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール（２００－６０００）モノ及びジ脂肪酸エステル、プロピレングリコールモノ及びジ脂肪酸エステル、モノオレイン酸ポリプロピレングリコール２０００、モノステアリン酸ポリプロピレングリコール２０００、エトキシル化モノステアリン酸プロピレングリコール、グリセリルモノ及びジ脂肪酸エステル、ポリグリセロールポリ脂肪酸エステル、エトキシル化モノステアリン酸グリセリル、モノステアリン酸１，３－ブチレングリコール、ジステアリン酸１，３－ブチレングリコール、ポリオキシエチレンポリオール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ヤシ脂肪酸スクロース、ジラウリン酸スクロース、ジステアリン酸スクロース、ヘキサエルカ酸スクロース、ラウリン酸スクロース、ミリスチン酸スクロース、オレイン酸スクロース、パルミチン酸スクロース、ペンタエルカ酸スクロース、ポリベヘン酸スクロース、ポリ綿実脂肪酸スクロース、ポリラウリン酸スクロース、ポリリノール酸スクロース、ポリオレイン酸スクロース、ポリパーム脂肪酸スクロース、ポリダイズ油脂肪酸スクロース、ポリステアリン酸スクロース、リシノレイン酸スクロース、ステアリン酸スクロース、テトライソステアリン酸スクロース、トリベヘン酸スクロース、テトラステアリン酸スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ ｔｒｉｓｔｅａｒａｔ）、（１４）ワックスエステル、例えば、ミツロウ、鯨蝋、ミリスチン酸ミリスチル、及びステアリン酸ステアリル、（１５）ミツロウ誘導体、例えば、様々なエチレンオキシド含量のエトキシル化ソルビトールとのミツロウの反応生成物であるポリオキシエチレンソルビトールミツロウ、（１６）植物ワックス、例えば、カルナウバ及びカンデリラワックス、（１７）天然油又は精油、例えば、柑橘油、非柑橘果物油、ナット油、風味、香料、又は芳香を有する油、キャノーラ油、コーン油、ニーム油、オリーブ油、綿実油、ココナッツ油、分画ココナッツ油、パーム油、ナッツ油、サフラワー油、ゴマ油、大豆油、ピーナッツ油、アーモンド油、カシュー油、ヘーゼルナッツ油、マカダミア油、ピーカン油、松の実油、ピスタチオ油、クルミ油、グレープフルーツシード油、レモン油、オレンジ油、スイートオレンジ油、タンジェリン油、ライム油、マンダリン油、オメガ３油、亜麻仁油（ｆｌａｘｓｅｅｄ ｏｉｌ）（亜麻仁油（ｌｉｎｓｅｅｄ ｏｉｌ））、アプリコット油、アボカド油、ニンジン油、カカオバター油、ココナッツ油、分画ココナッツ油、ヘンプ油、パパイヤシード油、米ぬか油、シアバター油、ティーツリーシード油、及び小麦胚芽油、ラベンダー油、ローズマリー油、桐油、ホホバ油、ポピーシード油、シアバター、ヒマシ油、マンゴー油、ローズヒップ油、トール油、カモミール油、桂皮油、シトロネラ油、ユーカリ油、フェンネルシード油、ジャスミン油、ジュニパーベリー油、ラズベリーシード油、ラベンダー油、月見草油、レモングラス油、ナツメグ油、パチュリ油、ペパーミント油、パイン油、ローズ油、ローズヒップ油、ローズマリー油、ユーカリ油、ティーツリー油、ローズウッド油、サンダルウッド油、サッサフラス油、スペアミント油、ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ヒマシ）シード油、ウインターグリーン油、（１８）リン脂質、例えば、レシチン及び誘導体、（１９）ステロール、例えば、コレステロール及びコレステロール脂肪酸エステル、並びに（２０）脂肪酸アミド、エトキシル化脂肪酸アミド、及び固体脂肪酸アルカノールアミド、（２１）ラノリン、ｔｈｅｒｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ（カカオ）シードバター、ワセリン、ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｃｅｒｉｆｅｒａ（カンデリラ）ワックス、ハチミツ、ゲラニオール、メンソール、カンファー、セチルエステル、鉱油、サリチル酸、フェノール、パルミトイルイソロイシンのうちの１つ以上を含む。
【0274】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、水溶性低分子量保湿剤、脂溶性低分子量保湿剤、水溶性高分子量保湿剤、及び脂溶性高分子量保湿剤、ヒューメクタント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される保湿剤を含む。
【0275】
いくつかの実施形態では、保湿剤は、ヒューメクタントを含む。本明細書で使用される場合、「ヒューメクタント」という用語は、ものを湿った状態に維持するために使用される吸湿性物質を意味する。ヒューメクタントは、吸収により近傍の空気中の水分を引き付け、かつ保持し、水蒸気を生物又は物体の表面の内部又は下部に引き込む。
【0276】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、ヒューメクタントとして、水溶性絹フィブロインペプチドを含む。絹フィブロインタンパク質断片に由来するアミノペプチドは、皮膚によって容易に吸収され得る。いくつかの実施形態では、水溶性絹フィブロインペプチドを組成物に添加して、使用後の感触を高めることができる。
【0277】
いくつかの実施形態では、絹フィブロインタンパク質断片に由来するアミノ酸は、コンディショニング剤としてコラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法に添加され得る（例えば、湿った感触、柔らかさ、滑らかさ、光沢などの優れた状態効果を発揮する目的で）。
【0278】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、ハチミツ、アロエベラ、アロエベラ葉汁、アロエベラ葉抽出物、ソルビトール、尿素、乳酸、乳酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸、トレハロース、マルチトール、アルファ－ヒドロキシ酸、ピログルタミン酸ナトリウム、ピロリドンカルボキシレート、Ｎ－アセチル－エタノールアミン、乳酸ナトリウム、イソプロパノール、ポリアルキレングリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール）、１，３－プロパンジオール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、グリセリルココネート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｃｏｃｏｎａｔｅ）、ヒドロキシステアレート、ミリステート、オレエート、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、リン脂質、コラーゲン、エラスチン、セラミド、レシチンソルビトール、ＰＥＧ－４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の更なるヒューメクタントを含み得る。
【0279】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３ブチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポリエチレングリコール、グルタミン、マンニトール、ピロリドン－カルボン酸ナトリウム（重合度ｎ＝２以上）、ポリプロピレングリコール（重合度ｎ＝２以上）、ポリグリセリン（重合度ｎ＝２以上）、乳酸、ラクテート、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される多価アルコールを、保湿剤として含む。
【0280】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、コレステロール及びコレステロールエステルからなる群から選択される脂溶性低分子量保湿剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、任意選択的に、カルボキシビニルポリマー、ポリアスパルテート、トラガカント、キサンタンガム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、水溶性キチン、キトサン、及びデキストリンからなる群から選択される水溶性高分子量保湿剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、任意選択的に、ポリビニルピロリドン－エイコセンコポリマー、ポリビニルピロリドン－ヘキサデセンコポリマー、ニトロセルロース、デキストリン脂肪酸エステル、及び高分子シリコーンからなる群から選択される脂溶性高分子量保湿剤を含む。
【0281】
追加の好適な保湿剤としては、本質的に水溶性及び／又は水膨潤性であるポリマー保湿剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、ヒアルロン酸又はキトサンを保湿剤と組み合わせて、それらの性質を高める。
【0282】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、コラーゲンブースティング組成物の総重量により約０．１重量％～約３０．０重量％の保湿剤を含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、コラーゲンブースティング組成物の総重量により約０．５重量％～約２５．０重量％の保湿剤を含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量により約１．０重量％～約２０．０重量％の保湿剤を含有する。
【0283】
本明細書に記載される組成物は、薬物などの追加の活性剤を含み得る。いくつかの実施形態では、活性剤は、酵素阻害剤、麻酔剤、医療用神経毒、酸化防止剤、抗感染剤、抗炎症剤、血管拡張剤、紫外（ＵＶ）線遮断剤（例えば、入れ墨用染料、インク、又は顔料）、反射剤、ホルモン、免疫抑制剤、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上であり得る。本明細書に記載される組成物は、酵素阻害剤、麻酔剤、医療用神経毒（例えば、ボツリヌス毒素及びクロストリジウム毒素）、酸化防止剤、抗感染剤（例えば、抗生物質）、血管拡張剤、染料（例えば、入れ墨用インク又は顔料、反射剤、抗炎症剤、紫外（ＵＶ）線遮断剤、染料、ホルモン、免疫抑制剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される活性剤を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は、ラパマイシン又はラパマイシン様化合物である。いくつかの実施形態では、活性剤は、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ、アモキシシリン）、エリスロマイシン（例えば、ステアリン酸エリスロマイシン）、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン）、及びセファロスポリン（例えば、セファレキシン）、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質であり得る。
【0284】
いくつかの実施形態では、追加の活性剤は、ニトログリセリン、ラベタロール、チアジド（ｔｈｒａｚｉｄｅ）、二硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリトール、ジギタリス、ヒドララジン、ジアゾキシド、アムリノン、Ｌ－アルギニン、硫酸バメタン、フマル酸ベンシクラン、ヘミコハク酸ベンフロジル、ニコチン酸ベンジル、塩酸ブフロメジル、塩酸ブフェニン、塩酸ブチルアミン（ｂｕｔａｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、クエン酸セチエジル、シクロニカート、マレイン酸シネパジド、シクランデラート、ジクロロ酢酸ジイソプロピルアンモニウム、ニコチン酸エチル、ヘプロニカート、ニコチン酸ヘキシル、酒石酸イフェンプロジル、ニコチン酸イノシトール、塩酸イソクスプリン、カリジノゲナーゼ、ニコチン酸メチル、シュウ酸ナフチドフリル、クエン酸ニカメタート、ニセリトロール、ニコボキシル、ニコフラノース、ニコチニルアルコール、酒石酸ニコチニルアルコール、一酸化窒素、ノニバミド、オキシペンチフィリン、パパベリン、パパベロリン、ペンチフィリン、過酸化亜硝酸、ピナシジル、ピプラテコール、プロペントフィルチン、ラウバシン、スルオクチジル、テアスプリン、塩酸チモキサミン、ニコチン酸トコフェロール、トラゾリン、ニコチン酸キサンチノール、ジアゾキシド、ヒドララジン、ミノキシジル、ニトロプルシドナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される血管拡張剤であり得る。
【0285】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、重量による、約０．０１％～約０．１％、又は約０．０５％～約０．１５％、又は約０．１％～約０．２％、又は約０．１５％～約０．２５％、又は約０．２％～約０．３％、又は約０．２５％～約０．３５％、又は約０．３％～約０．４％、又は約０．３５％～約０．４５％、又は約０．４％～約０．５％、又は約０．４５％～約０．５５％、又は約０．５％～約０．６％、又は約０．５５％～約０．６５％、又は約０．６％～約０．７％、又は約０．６５％～約０．７５％、又は約０．７％～約０．８％、又は約０．７５％～約０．８５％、又は約０．８％～約０．９％、又は約０．８５％～約０．９５％、又は約１％～約２％、又は約１．５％～約２．５％、又は約２％～約３％、又は約２．５％～約３．５％、又は約３％～約４％、又は約３．５％～約４．５％、又は約４％～約５％、又は約４．５％～約５．５％、又は約５％～約６％、又は約５．５％～約６．５％、又は約６％～約７％、又は約６．５％～約７．５％、又は約７％～約８％、又は約７．５％～約８．５％、又は約８％～約９％、又は約８．５％～約９．５％、又は約９％～約１０％、又は約１０％～約１５％、又は約１５％～約２０％、又は約２０％～約２５％、又は約２５％～約３０％、又は約３０％～約３５％、又は約３５％～約４０％、又は約４０％～約４５％、又は約４５％～約５０％の濃度の追加の活性剤を含み得る。
【0286】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、線維症阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、治療部位内又はその周囲の病理学的プロセスに対する阻害効果を発揮するように作用する化合物を更に含み得る。特定の態様では、活性剤は、以下の化合物のクラスのうちの１つから選択され得る：抗炎症剤（例えば、デキサメタゾン、コルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、６α－メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、及びアスピリン）。
【0287】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、粒子を含み、粒子は、高分子粒子、雲母、シリカ、泥、及び粘土を含み得る。コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法における粒子は、滑らかさ、低減した摩擦、滑りやすい感触の利点をもたらすと同時に、毛髪を清潔で軽く、風通しの良い状態に保ち、手及び／又は毛髪に広げたときに改善された質感を保つ。
【0288】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、アニオン性及び／又は非イオン性及び／又は双性イオン性ポリマーからなる群から選択されるポリマーから形成されるポリマー粒子を含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリスチレン、ポリビニルアセテート、ポリジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート、ポリ－ｎ－ブチルアクリレート、ポリ－ｎ－ブチルメタクリレート、ポリ－２－エチルヘキシルメタクリレート、６，１２－ナイロン、ポリウレタン、エポキシ樹脂、スチレン／酢酸ビニルコポリマー、スチレン／トリメチルアミノエチルメタクリレートクロリコポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリマーから形成されるポリマー粒子を含有する。
【0289】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、ポリエチレンホモポリマー、エチレン－アクリル酸コポリマー、約６，０００Ｄａ～約１２，０００Ｄａの範囲の分子量を有するポリアミドポリマー、ポリエチレン－酢酸ビニルコポリマー、シリコーン－合成ワックスコポリマー、シリコーン－天然ワックスコポリマー、カンデリラ－シリコーンコポリマー、オゾケライト－シリコーンコポリマー、合成パラフィンワックス－シリコーンコポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される疎水性ポリマーから形成されるカチオン性ポリマー粒子を含有する。
【0290】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、別個の粒子を沈着させるための膨潤したポリマー粒子を含有する。いくつかの実施形態では、膨潤したポリマー粒子は、粒子状シリコーンポリマー及び表面アルキル化球状シリコン粒子からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、膨潤したポリマー粒子を形成するシリコーンポリマーは、ポリジオルガノシロキサン、ポリモノオルガノシロキサン、及び架橋ポリジメチルシロキサン、ヒドロキシル又はメチルを含む末端基を任意選択的に有する架橋ポリモノメチルシロキサン、及び架橋ポリジメチルシロキサン（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ製のＤＣ２－９０４０シリコーン液）からなる群から選択される。ポリジソルガノシロキサン（ｐｏｌｙｄｉｓｏｒｇａｎｏｓｉｌｏｘａｎｅｓ）は、好ましくは、Ｒ３ＳｉＯ０．５反復単位及びＲ２ＳｉＯ反復単位の好適な組み合わせから誘導される。ポリモノオルガノシロキサンは、Ｒ１ＳｉＯ１．５から誘導される。各Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル（例えば、ビニル）、アルカリル、アラルキル、又はアリール（例えば、フェニル）基を表す。いくつかの実施形態では、Ｒは、メチル基である。
【0291】
いくつかの実施形態では、ポリマー粒子は、１０００ｎｍ未満のメジアン粒子サイズを有するナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ポリマー粒子は、約５ｎｍ～約６００ｎｍのメジアン粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、ポリマー粒子は、約１０ｎｍ～約５００ｎｍのメジアン粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、ポリマー粒子は、約１０ｎｍ～約４００ｎｍのメジアン粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、ポリマー粒子は、約２０ｎｍ～約３００ｎｍのメジアン粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、ポリマー粒子は、約５０ｎｍ～約６００ｎｍのメジアン粒子サイズを有する。
【0292】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、本明細書で開示されるように、皮膚科学的に許容可能な担体中に分散液又は懸濁液を形成する粘土粒子を含有する。本明細書全体を通して、「粘土」という用語は、水と混合すると塑性になる細粒の土の材料を意味することが意図される。粘土は、天然、合成、又は化学的に改変された粘土であり得る。粘土は、不純物、例えば、少量のカリウム、ナトリウム、マグネシウム、又は鉄を含有する含水ケイ酸アルミニウムを含む。
【0293】
一実施形態では、粘土は、３８．８％～９８．２％のＳｉＯ２及び０．３％～３８．０％のＡｌ２Ｏ３を含有する材料であり、更に、Ｆｅ２Ｏ３、ＣａＯ、ＭｇＯ、ＴｉＯ２、ＺｒＯ２、Ｎａ２Ｏ、及びＫ２Ｏから選択される金属酸化物のうちの１つ以上を含有する。いくつかの実施形態では、粘土は、八面体配位のアルミニウム、マグネシウム、若しくは鉄、又は四面体配位のシリコンの含水シートを含む層状構造を有する。
【0294】
一実施形態では、粘土は、カオリン、タルク、２：１フィロケイ酸塩、１：１フィロケイ酸塩、スメクタイト、ベントナイト、モンモリロナイト（ベントナイトとしても知られる）、ヘクトライト、ボルコンコイト、ノントロナイト、サポナイト、バイデライト、ソーコナイト、及びそれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、粘土は、カオリン又はベントナイトである。いくつかの実施形態では、粘土は、合成ヘクトライトである。別の実施形態では、粘土は、ベントナイトである。
【0295】
いくつかの実施形態では、粘土は、約０．７ｍｅｑ／１００ｇ～約１５０ｍｅｑ／１００ｇのカチオン交換容量を有する。いくつかの実施形態では、粘土は、約３０ｍｅｑ／１００ｇ～約１００ｍｅｑ／１００ｇのカチオン交換容量を有する。
【0296】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、本明細書で開示される、カチオン性に荷電したヘアコンディショニング剤と静電的に複合体を形成したアニオン性に荷電した粘土を有する複合粒子を含む。
【0297】
市販の合成ヘクトライトとしては、商品名Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）ＲＤ、Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）ＲＤＳ、Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）ＸＬＧ、Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）ＸＬＳ、Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）Ｄ、Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）ＤＦ、Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）ＤＳ、Ｌａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）Ｓ、及びＬａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）ＪＳ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｌａｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）で販売されている製品が挙げられる。市販のベントナイトとしては、商品名Ｇｅｌｗｈｉｔｅ（登録商標）ＧＰ、Ｇｅｌｗｈｉｔｅ（登録商標）Ｈ、Ｇｅｌｗｈｉｔｅ（登録商標）Ｌ、Ｍｉｎｅｒａｌ Ｃｏｌｌｏｉｄ（登録商標）ＢＰ、Ｍｉｎｅｒａｌ Ｃｏｌｌｏｉｄ（登録商標）ＭＯ、Ｇｅｌｗｈｉｔｅ（登録商標）ＭＡＳ １００（ｓｃ）、Ｇｅｌｗｈｉｔｅ（登録商標）ＭＡＳ １０１、Ｇｅｌｗｈｉｔｅ（登録商標）ＭＡＳ １０２、Ｇｅｌｗｈｉｔｅ（登録商標）ＭＡＳ １０３、Ｂｅｎｔｏｌｉｔｅ（登録商標）ＷＨ、Ｂｅｎｔｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｌ１０、Ｂｅｎｔｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｈ、Ｂｅｎｔｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｌ、Ｐｅｒｍｏｎｔ（登録商標）ＳＸ１０Ａ、Ｐｅｒｍｏｎｔ（登録商標）ＳＣ２０、及びＰｅｒｍｏｎｔ（登録商標）ＨＮ２４（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｌａｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）；Ｂｅｎｔｏｎｅ（登録商標）ＥＷ及びＢｅｎｔｏｎｅ（登録商標）ＭＡ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）；並びにＢｅｎｔｏｎｉｔｅ（登録商標）ＵＳＰ ＢＬ ６７０及びＢｅｎｔｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｈ４４３０（Ｗｈｉｔａｋｅｒ、Ｃｌａｒｋｅ ＆ Ｄａｎｉｅｌｓ）で販売されている製品が挙げられる。いくつかの実施形態では、粒子は、約１μｍ～約１００μｍのメジアン粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約２μｍ～約５０μｍのメジアン粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約２μｍ～約２０μｍのメジアン粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約４μｍ～約１０μｍのメジアン粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約１μｍ、約１．１μｍ、約１．２μｍ、約１．３μｍ、約１．４μｍ、約１．５μｍ、約１．６μｍ、約１．７μｍ、約１．８μｍ、約１．９μｍ、約２．０μｍ、約２．１μｍ、約２．２μｍ、約２．３μｍ、約２．４μｍ、約２．５μｍ、約２．６μｍ、約２．７μｍ、約２．８μｍ、約２．９μｍ、約３．０μｍ、約３．１μｍ、約３．２μｍ、約３．３μｍ、約３．４μｍ、約３．５μｍ、約３．６μｍ、約３．７μｍ、約３．８μｍ、約３．９μｍ、約４．０μｍ、約４．１μｍ、約４．２μｍ、約４．３μｍ、約４．４μｍ、約４．５μｍ、約４．６μｍ、約４．７μｍ、約４．８μｍ、約４．９μｍ、約５．０μｍ、約５．１μｍ、約５．２μｍ、約５．３μｍ、約５．４μｍ、約５．５μｍ、約５．６μｍ、約５．７μｍ、約５．８μｍ、約５．９μｍ、約６．０μｍ、約６．１μｍ、約６．２μｍ、約６．３μｍ、約６．４μｍ、約６．５μｍ、約６．６μｍ、約６．７μｍ、約６．８μｍ、約６．９μｍ、約７．０μｍ、約７．１μｍ、約７．２μｍ、約７．３μｍ、約７．４μｍ、約７．５μｍ、約７．６μｍ、約７．７μｍ、約７．８μｍ、約７．９μｍ、約８．０μｍ、約８．１μｍ、約８．２μｍ、約８．３μｍ、約８．４μｍ、約８．５μｍ、約８．６μｍ、約８．７μｍ、約８．８μｍ、約８．９μｍ、約９．０μｍ、約９．１μｍ、約９．２μｍ、約９．３μｍ、約９．４μｍ、約９．５μｍ、約９．６μｍ、約９．７μｍ、約９．８μｍ、約９．９μｍ、及び約１０．０μｍから選択されるメジアン粒子サイズを有する。
【0298】
いくつかの実施形態では、カチオン性に荷電したヘアコンディショニング剤の、粘土に対する重量比は、０．０５：１～２０：１である。いくつかの実施形態では、カチオン性に荷電したヘアコンディショニング剤の、粘土に対する重量比は、０．１：１～１０：１である。いくつかの実施形態では、カチオン性に荷電したヘアコンディショニング剤の、粘土に対する重量比は、０．２：１～５：１である。いくつかの実施形態では、カチオン性に荷電したヘアコンディショニング剤の、粘土に対する重量比は、０．０５：１、０．１：１、０．２：１、０．５：１、０．７５：１、１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４．０：１、４．５：１、５．０：１、５．５：１、６．０：１、６．５：１、７．０：１、７．５：１、８．０：１、８．５：１、９．０：１、９．５：１、１０．０：１、１０．５：１、１１．０：１、１１．５：１、１２．０：１、１２．５：１、１３．０：１、１３．５：１、１４．０：１、１４．５：１、１５．０：１、１５．５：１、１６．０：１、１６．５：１、１７．０：１、１７．５：１、１８．０：１、１８．５：１、１９．０：１、１９．５：１、及び２０．０：１から選択される。
【0299】
いくつかの実施形態では、粒子は、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法において、絹コラーゲンブースティング組成物の総重量により約０．０１重量％～約１０．０重量％の範囲の重量パーセントで存在する。いくつかの実施形態では、粒子は、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法において、絹コラーゲンブースティング組成物の総重量により約０．１重量％～約１０．０重量％の範囲の重量パーセントで存在する。いくつかの実施形態では、粒子は、絹コラーゲンブースティング組成物の総重量により約０．１重量％～約２．０重量％の範囲の重量パーセントで組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、粒子は、絹コラーゲンブースティング組成物の総重量により約１．０重量％～約９．０重量％の範囲の重量パーセントで組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、粒子は、絹コラーゲンブースティング組成物の総重量により約１．０重量％～約５．０重量％の範囲の重量パーセントで組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、粒子は、組成物の総重量により約０．０１重量％、約０．１重量％、約０．２重量％、約０．３重量％、約０．４重量％、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、約１．０重量％、約１．１重量％、約１．２重量％、約１．３重量％、約１．４重量％、約１．５重量％、約１．６重量％、約１．７重量％、約１．８重量％、約１．９重量％、約２．０重量％、約２．１重量％、約２．２重量％、約２．３重量％、約２．４重量％、約２．５重量％、約２．６重量％、約２．７重量％、約２．８重量％、約２．９重量％、約３．０重量％、約３．１重量％、約３．２重量％、約３．３重量％、約３．４重量％、約３．５重量％、約３．６重量％、約３．７重量％、約３．８重量％、約３．９重量％、約４．０重量％、約４．１重量％、約４．２重量％、約４．３重量％、約４．４重量％、約４．５重量％、約４．６重量％、約４．７重量％、約４．８重量％、約４．９重量％、約５．０重量％、約５．１重量％、約５．２重量％、約５．３重量％、約５．４重量％、約５．５重量％、約５．６重量％、約５．７重量％、約５．８重量％、約５．９重量％、約６．０重量％、約６．１重量％、約６．２重量％、約６．３重量％、約６．４重量％、約６．５重量％、約６．６重量％、約６．７重量％、約６．８重量％、約６．９重量％、約７．０重量％、約７．１重量％、約７．２重量％、約７．３重量％、約７．４重量％、約７．５重量％、約７．６重量％、約７．７重量％、約７．８重量％、約７．９重量％、約８．０重量％、約８．１重量％、約８．２重量％、約８．３重量％、約８．４重量％、約８．５重量％、約８．６重量％、約８．７重量％、約８．８重量％、約８．９重量％、約９．０重量％、約９．１重量％、約９．２重量％、約９．３重量％、約９．４重量％、約９．５重量％、約９．６重量％、約９．７重量％、約９．８重量％、約９．９重量％、及び約１０．０重量％から選択される重量パーセントで組成物中に存在する。
【0300】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、特により大きなサイズの粒子の粒子分散安定性を維持するために、コロイド安定剤を任意選択的に含む。好適なコロイド安定剤は、プロピレンオキシド－エチレンオキシドコポリマー又はエチレンオキシド－プロピレンオキシドグラフト化ポリエチレンイミン、ポリオキシエチレン（２０～８０単位ＰＯＥ）イソオクチルフェニルエーテル、脂肪族アルコールエトキシレート、ポリビニルピロリドンを含むポリエトキシル化ポリテレフタレートブロックコ－ポリマー、ビニルピロリドン反復単位を含有するコポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0301】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、皮膚科学的に許容可能な担体としてエマルジョンを含む。いくつかの実施形態では、皮膚科学的に許容可能な担体は、従来のエマルジョンとして存在する。いくつかの実施形態では、皮膚科学的に許容可能な担体は、マイクロエマルジョンとして存在する。いくつかの実施形態では、皮膚科学的に許容可能な担体は、油中水型エマルジョンとして存在する。いくつかの実施形態では、皮膚科学的に許容可能な担体は、水中油型エマルジョンとして存在する。いくつかの実施形態では、皮膚科学的に許容可能な担体は、ナノ－エマルジョンとして存在する。いくつかの実施形態では、皮膚科学的に許容可能な担体は、シリコーン油中水型エマルジョンとして存在する。いくつかの実施形態では、皮膚科学的に許容可能な担体は、水中シリコーン油型エマルジョンとして存在する。
【0302】
本明細書で使用される場合、従来のエマルジョンは、１つの連続相及び１つの分散相を有し、これは、界面活性剤でのコーティングにより安定化された非常に小さな球体として存在する。連続相の性質に応じて、エマルジョンは、水中油型又は油中水型として記載される。これらのエマルジョンは、理想的な場合には速度論的に安定している。すなわち、無限にではないが、長期間さえ保持される。特に温度変動中には、それらは、沈降、クリーミング、増粘、又は凝集の結果として相分離する傾向がある。
【0303】
本明細書で使用される場合、マイクロエマルジョンは、油性構成成分、水性構成成分、及び界面活性剤の３成分を有する三元系を含有する、熱力学的に安定で、等方性で、流体で、光学的に透明な単一液相である。界面活性剤、又はより頻繁には、界面活性剤及び共界面活性剤の混合物が、油／水界面張力を非常に低い値、多くの場合、１０３～１０９、好ましくは１０４～１０６Ｎ／ｍの範囲に低減し、これにより２つの不溶性相が、熱撹拌の結果として、それら自体が均一に分散された状態になる場合に、マイクロエマルジョンが生じる。マイクロエマルジョンは、１００～１０００オングストロームの大きさの平衡領域、いわゆる、副相を有する双連続構造を有することが多い。マイクロエマルジョンは、油がミセルによって可溶化されるＯ／Ｗ（水中油）型マイクロエマルジョンの１つの状態、又は水相及び油相の両方が連続構造を有するように、界面活性剤分子の会合の数が無限になる双連続マイクロエマルジョンのいずれかを指す。
【0304】
性質については、マイクロエマルジョンは、透明又は半透明に見え、全ての配合成分及び構成成分が、その中に均一に溶解している単相状態の溶液として存在し得る。
【0305】
製造プロセスに関わらず、マイクロエマルジョンは、同一の配合構成成分を有し、同一温度で調製される場合、同一の状態になり得る。したがって、上記の３成分（油、水、及び界面活性剤）並びに残りの成分は、必要に応じて任意の順序で添加及び混合され得、任意の力での機械力を使用して撹拌して、結果として実質的に同一の状態（外観、粘度、使用感などにおいて）を有するマイクロエマルジョンを得ることができる。
【0306】
双連続マイクロエマルジョンは、水相及び油相の２つの相を、広がり隣接し絡み合ったドメインの形態で含み、その界面で、安定化界面活性界面活性剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ－ａｃｔｉｖｅ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）が単分子層として濃縮されている。個々の構成成分、水、油、及び好適な乳化剤系が混合されると、非常に低い界面張力のために、双連続マイクロエマルジョンが非常に容易に、通常は自発的に形成される。ドメインは、少なくとも一次元でナノメートルの大きさの非常に小さな広がりしか有しないため、マイクロエマルジョンは、視覚的に透明に見え、使用される乳化剤系に応じて、熱力学的、すなわち、無限に、特定の温度範囲で安定している。
【0307】
本明細書で使用される場合、ナノエマルジョンという用語は、それらのナノ粒子サイズ、例えば、１０００ｎｍ未満のために透明又は半透明の外観を示すエマルジョンを指す。
【0308】
乳化剤（例えば、界面活性剤）は、互いに混和しない液相である極性相、多くの場合、水と非極性の有機相との間の界面張力を低減し、したがってそれらの相互溶解性を高める物質である。界面活性剤は、少なくとも１つの親水性及び１つの疎水性の構造単位の特徴的な構造上の特徴を有する。この構造上の特徴は、両親媒性とも称される。
【0309】
アニオン性、カチオン性、両親媒性、及び非イオン性の界面活性剤は、水及び油性物質の乳化による乳化化粧品材料の製造用の乳化剤として従来から使用されている。しかしながら、合成界面活性剤は、皮膚表面組織の破壊に関わり、体内に入ると、肝臓損傷の原因となるため、天然タンパク質ベースの乳化剤を含む多くの天然由来のタンパク質ベースの乳化剤が、それらの高い安全性から用いられている。
【0310】
タンパク質ベースの乳化剤を使用して得られる乳化化粧品材料は、一般に、使用中に柔らかくしっとりとした感触を有するが、完成品は、崩れ感があり、広がりがないことが多い。化粧品に使用される乳化剤の重要な要素としては、安全性及び乳化力だけでなく、使用中の感触も含む。本開示は、本明細書で開示されるコラーゲンブースティング組成物用の乳化担体を安定化するための乳化剤（以下、絹乳化剤）としての絹フィブロインタンパク質断片の使用を提供する。
【0311】
一実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、乳化剤系内に絹乳化剤を有する担体として、エマルジョンを含む。絹フィブロインは、高分子量を有するポリマーの主要構成成分を占める、大きな疎水性ドメインを伴う両親媒性ポリマーである。疎水性領域は、小さな親水性スペーサーにより中断され、鎖のＮ及びＣ末端がまた、高度に親水性である。Ｈ鎖の疎水性ドメインは、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒの反復ヘキサペプチド配列及びＧｌｙ－Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｔｙｒジペプチドのリピートを含み、それは、安定な逆平行シート結晶子を形成することができる。Ｌ鎖のアミノ酸配列は非反復的であり、そのため、Ｌ鎖はより親水性であり、比較的弾性である。絹フィブロイン分子中の親水性（Ｔｙｒ、Ｓｅｒ）及び疎水性（Ｇｌｙ、Ａｌａ）鎖セグメントは、絹フィブロイン分子の自己構築を可能にするように代替的に配置される。
【0312】
いくつかの実施形態では、乳化剤系は、絹乳化剤と、高ＨＬＢ値を有する低分子とを含む。疎水性反復基の組成は、各親水性－Ｓｅｒ－に対して１つのペンタ－ペプチド－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－であり、絹フィブロインタンパク質の親水性－疎水性バランス（ＨＬＢ）は、高ＨＬＢ値（すなわち、１０超）を有する親水性分子の添加により作製された親水性環境において、７．９５～１６．７４の範囲に改変され得る。絹フィブロインタンパク質断片のＨＬＢ値のこの範囲は、Ｏ／Ｗ型エマルジョンからＷ／Ｏ型エマルジョンまでの広範囲のエマルジョンの調製を可能にする。いくつかの実施形態では、高ＨＬＢ値を有する親水性分子は、グリセロールＨＬＢ １１．２８、ブタンテトラオールＨＬＢ １２．７、キシリトールＨＬＢ １４．１３、Ｄ－ソルビトールＨＬＢ １５．５５、イノシトールＨＬＢ １６．７４、ヒアルロン酸、ヒアルロネート、カラギーナン、プルラン、アルギン酸、アルギネート、微生物エキソポリサッカライド、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、グリコサミノグリカン、グルコマンナン、及びそれらの組み合わせを含む多糖からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、乳化剤系は、絹乳化剤及びグリセロールを含む。
【0313】
いくつかの実施形態では、絹乳化剤及び高いＨＬＢ値を有する親水性分子は、１：１～１：１０の絹乳化剤対親水性分子の重量比で、エマルジョン担体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、絹乳化剤及び高いＨＬＢ値を有する親水性分子は、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３．０、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８、１：４．９、１：５．０、１：５．１、１：５．２、１：５．３、１：５．４、１：５．５、１：５．６、１：５．７、１：５．８、１：５．９、１：６、１：６．１、１：６．２、１：６．３、１：６．４、１：６．５、１：６．６、１：６．７、１：６．８、１：６．９、１：７、１：８、１：９、及び１：１０から選択される、絹乳化剤対親水性分子の重量比で、エマルジョン担体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、絹乳化剤及び高いＨＬＢ値を有する親水性分子は、１：１の絹乳化剤対親水性分子の重量比で、エマルジョン担体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、乳化剤系は、１：１～１：３の絹乳化剤対グリセロールの重量比で、絹乳化剤及びグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、乳化剤系は、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３．０から選択される、絹乳化剤対グリセロールの重量比で、絹乳化剤及びグリセロールを含む。
【0314】
一実施形態では、本開示は、エマルジョン担体用の乳化剤（以下、絹乳化剤）として、上記の絹フィブロインタンパク質断片の水溶液又は絹フィブロインタンパク質ベースの断片の水性ゲルを提供する。上記の絹フィブロインタンパク質断片の水溶液又は絹フィブロインタンパク質断片の水性ゲルを油性構成成分と混合して、絹フィブロインタンパク質断片の水溶液又は水性ゲル中の水と、油性構成成分との間の均一な乳化を達成することができる。
【0315】
いくつかの実施形態では、乳化剤として使用される絹フィブロインタンパク質断片は、約５ｋＤａ超の重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、乳化剤として使用される絹フィブロインタンパク質は、約５ｋＤａ～約３５０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、乳化剤として使用される絹フィブロインタンパク質は、約２０ｋＤａ～約８０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、乳化剤として使用される絹フィブロインタンパク質は、約４０ｋＤａ～約６０ｋＤａから選択される重量平均分子量を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される任意の絹フィブロイン断片を、乳化剤として使用することができる。
【0316】
いくつかの実施形態では、エマルジョン担体中に提供される絹乳化剤の量は、エマルジョン担体の総重量により約０．１重量％～約１５．０重量％の範囲である。いくつかの実施形態では、エマルジョン担体中に提供される絹乳化剤の量は、エマルジョン担体の総重量により約０．７５重量％～約１０．０重量％の範囲である。いくつかの実施形態では、エマルジョン担体中に提供される絹乳化剤の量は、約０．１重量％、約０．２重量％、約０．３重量％、約０．４重量％、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、約１．０重量％、約１．２５重量％、約１．５０重量％、約１．７５重量％、約２．０重量％、約２．２５重量％、約２．５重量％、約２．７５重量％、約３．０重量％、約３．２５重量％、約３．５重量％、約３．７５重量％、約４．０重量％、約４．２５重量％、約４．５重量％、約４．７５重量％、約５．０重量％、約５．２５重量％、約５．５重量％、約５．７５重量％、約６．０重量％、約６．２５重量％、約７．５重量％、約７．７５重量％、約８．０重量％、約８．２５重量％、約８．５重量％、約８．７５重量％、約９．０重量％、約９．２５重量％、約９．５重量％、約９．７５重量％、約１０．０重量％、約１０．２５重量％、約１０．５重量％、約１０．７５重量％、約１１．０重量％、約１１．２５重量％、約１１．５重量％、約１１．７５重量％、約１２．０重量％、約１２．２５重量％、約１２．５０重量％、約１２．７５重量％、約１３．０重量％、約１３．２５重量％、約１３．５０重量％、約１３．７５重量％、約１４．０重量％、約１４．２５重量％、約１４．５０重量％、約１４．７５重量％、及び約１５．０重量％からなる群から選択される。
【0317】
水溶液中の絹タンパク質は、より高い分子量を有すると、振動又は撹拌のせん断によってより容易にフィブリル化する傾向がある。フィブリル化タンパク質は、水不溶性の塊からなり、化粧品材料の使用中の心地良い感触の低減を引き起こす。
【0318】
いくつかの実施形態では、絹フィブロインタンパク質断片は、親水性の環境を高めるために高ＨＬＢ値を有する親水性物質とブレンドされ、そのような親水性物質としては、絹フィブロイン溶液のゲル化を防ぐグリセロール、ブタンテトラオール、キシリトール、Ｄ－ソルビトール、イノシトールポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリ乳酸、セルロース、キチン、及びポリビニルアルコールが挙げられる。ランダムコイルからβシート構造へのフィブロインの形状変化（フィブリル化）を防ぐことが重要である。
【0319】
いくつかの実施形態では、１０超のＨＬＢ値を有するスクロース脂肪エステルベースの乳化剤が、絹フィブロインタンパク質の乳化効率を高めるために、乳化安定剤として絹フィブロインタンパク質に添加される。
【0320】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法のための乳化系は、スクロース脂肪酸エステルベースの乳化剤、及び絹フィブロインタンパク質の水溶液又は絹フィブロインタンパク質の水性ゲルを含み得る。
【0321】
いくつかの実施形態では、絹フィブロインタンパク質断片を含有する水溶液又は水性ゲルは、コラーゲン刺激組成物の共乳化剤として使用され得、絹タンパク質の水溶液又はゲルは、未精練、部分精練、又は精練済みの紡績カイコ繊維（繭フィラメント）を中性塩（例えば、臭化リチウム）で溶解することによって得られる。いくつかの実施形態では、スクロース脂肪酸エステルは、スクロースパルミテート及びスクロースラウレートエステルである。いくつかの実施形態では、絹タンパク質は、高まった乳化効率を有するコラーゲン刺激組成物のための界面活性剤として用いられ得る。いくつかの実施形態では、リン脂質（例えば、レシチン）を使用して、絹フィブロインタンパク質断片に由来する共乳化剤と複合体を形成させ、その乳化力（界面活性剤の効率）を高めることができる。
【0322】
いくつかの実施形態では、絹フィブロインタンパク質断片ベースの乳化剤を使用して得られたマイクロエマルジョンを含有するコラーゲン刺激組成物は、一般に、使用中に良好な展延性、滑らかで湿った感触を有する。いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法のためのエマルジョン担体は、共乳化剤として１つ以上のイオン性界面活性剤を更に含むことができる。
【0323】
イオン性界面活性剤は、水溶液中に荷電を有するようにイオン化される界面活性剤であり、荷電の種類に応じて、それは、両性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、又はアニオン性界面活性剤に分類される。アニオン性界面活性剤及び両性界面活性剤、又はアニオン性界面活性剤及びカチオン性界面活性剤を水溶液中で混合すると、油に対する界面張力が低下する。
【0324】
両性界面活性剤は、少なくとも１つのカチオン性官能基及び１つのアニオン性官能基を有し、溶液が酸性の場合はカチオン性であり、溶液がアルカリ性の場合はアニオン性であり、等電点付近で非イオン性界面活性剤と同様の特性を呈する。
【0325】
両性界面活性剤は、アニオン性基の種類に基づいて、カルボン酸型、硫酸エステル型、スルホン酸型、及びリン酸エステル型に分類される。本発明の場合、カルボン酸型、硫酸エステル型、及びスルホン酸型が好ましい。カルボン酸型は、更にアミノ酸型及びベタイン型に分類される。特に好ましいのは、ベタイン型である。
【0326】
具体的な例としては、イミダゾリン型両性界面活性剤（例えば、２－ウンデシル－１－ヒドロキシエチル－１－カルボキシメチル－４，５－ジヒドロ－２－イミダゾリウムナトリウム塩、及び１－［２－（カルボキシメトキシ）エチル］－１－（カルボキシメチル）－４，５－ジヒドロ－２－ノルコアルキルイミダゾリウム水酸化物二ナトリウム塩）、並びにベタイン型界面活性剤（例えば、２－ヘプタデシル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルジメチルアルニノ酢酸ベタイン（ｌａｕｒｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｂｅｔａｉｎｅ）、アルキルベタイン、アミドベタイン、及びスルホベタイン）が挙げられる。
【0327】
カチオン性界面活性剤の例としては、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベネニルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、及びメチル硫酸セチルトリメチルアンモニウムなどの四級アンモニウム塩が挙げられる。他の例としては、ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド、ステアリン酸ジメチルアミノエチルアミド、パルミチン酸ジエチルアミノエチルアミド、パルミチン酸ジメチルアミノエチルアミド、ミリスチン酸ジエチルアミノエチルアミド、ミリスチン酸ジメチルアミノエチルアミド、ベヘン酸ジエチルアミノエチルアミド、ベヘン酸ジメチルアミノエチルアミド、ステアリン酸ジエチルアミノプロピルアミド、ステアリン酸ジメチルアミノプロピルアミド、パルミチン酸ジエチルアミノプロピルアミド、パルミチン酸ジメチルアミノプロピルアミド、ミリスチン酸ジエチルアミノプロピルアミド、ミリスチン酸ジメチルアミノプロピルアミド、ベヘン酸ジエチルアミノプロピルアミド、及びベヘン酸ジメチルアミノプロピルアミドなどのアミドアミン化合物が挙げられる。
【0328】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法のための乳化剤系は、１つ以上のアニオン性界面活性剤を更に含み得る。アニオン性界面活性剤は、脂肪酸石鹸、Ｎ－アシルグルタミン酸塩、及びアルキルエーテル酢酸塩などのカルボン酸塩型、α－オレフィンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、及びアルキルベンゼンスルホン酸塩などのスルホン酸型、高級アルコール硫酸エステル塩及びリン酸エステル塩などの硫酸エステル型に分類される。カルボン酸塩型、スルホン酸型、及び硫酸エステル塩型が好ましく、特に好ましいには、硫酸エステル塩型である。
【0329】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製方法及び使用方法のためのアニオン性界面活性剤は、高級アルキル硫酸エステル塩（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びラウリル硫酸カリウム）、アルキルエーテル硫酸エステル塩（例えば、ＰＯＥ－ラウリル硫酸トリエタノールアミン及びＰＯＥ－ラウリル硫酸ナトリウム）、Ｎ－アシルサルコシン酸（例えば、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム）、高級脂肪酸アミドスルホン酸塩（例えば、Ｎ－ミリストイルＮ－メチルタウリン酸ナトリウム、Ｎ－ココイル－Ｎ－メチルタウリン酸ナトリウム、及びジャウロイルメチルタウリン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｊａｕｒｏｙｌｍｅｔｈｙｌ ｔａｕｒａｔｅ））、リン酸エステル塩（例えば、ＰＯＥ－オレイルエーテルリン酸ナトリウム及びＰＯＥステアリルエーテルリン酸）、スルホコハク酸塩（例えば、ジ－２－エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム、モノラウロイルモノエタノールアミドポリオキシエチレンスルホコハク酸ナトリウム、及びラウリルポリプロピレングリコールスルホコハク酸ナトリウム）、アルキルベンゼンスルホン酸塩（例えば、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン、及び直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸）、高級脂肪酸エステル硫酸塩（例えば、水素化ココナッツ油脂肪族酸グリセリル硫酸ナトリウム）、Ｎ－アシルグルタミン酸塩（例えば、Ｎ－ラウロイルグルタミン酸一ナトリウム、Ｎ－ステアロイルグルタミン酸二ナトリウム、及びＮ－ミリストイル－Ｌ－グルタミン酸ナトリウム）、硫酸化油（例えば、ロート油）、ＰＯＥ－アルキルエーテルカルボン酸、ＰＯＥ－アルキルアリールエーテルカルボン酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、高級脂肪酸エステルスルホン酸塩、ｓｅｃ－アルコール硫酸塩、高級脂肪酸アルキルアミド硫酸塩、ラウロイルモノエタノールアミンコハク酸ナトリウム、Ｎ－パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン、並びにカゼイン酸ナトリウムからなる群から選択される。
【0330】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法のための乳化剤系は、共乳化剤として１つ以上の非イオン性界面活性剤を更に含み得る。非イオン性界面活性剤は、好ましくは、８．９～１４のＨＬＢ値を有する。ＨＬＢが７である場合、水への溶解性及び油への溶解度がバランスを保つことが一般に知られている。すなわち、本発明に好ましい界面活性剤は、油／水中で中程度の溶解性を有する。
【0331】
非イオン性界面活性剤は、以下を含み得る。（１）ポリエチレンオキシド伸長ソルビタンモノあるキレート（例えば、ポリソルベート）。（２）ポリアルコキシル化アルカノール。（３）ポリアルコキシル化アルキルフェノールは、ＩＣＯＮＯＬ（登録商標）及びＴＲＩＴＯＮ（登録商標）という商標名で市販されている、少なくとも約１４のＨＬＢ値を有するポリエトキシル化オクチル又はノニルフェノールを含む。（４）ポロキサマー。エチレンオキシド（ＥＯ）及びプロピレンオキシド（ＰＯ）のブロックコポリマーに基づく界面活性剤も、有効であり得る。ＥＯ－ＰＯ－ＥＯブロック及びＰＯ－ＥＯ－ＰＯブロックの両方が、ＨＬＢが少なくとも約１４、好ましくは少なくとも約１６である限り、十分に機能すると予想される。そのような界面活性剤は、ＢＡＳＦからＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）及びＴＥＴＲＯＮＩＣ（登録商標）の商標名で市販されている。（５）ポリアルコキシル化エステル：エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロールなどのポリアルコキシル化グリコールは、部分的又は完全にエステル化され得、すなわち、１つ以上のアルコールが、（Ｃ８～Ｃ２２）アルキルカルボン酸でエステル化され得る。少なくとも約１４、好ましくは少なくとも約１６のＨＬＢを有するそのようなポリエトキシル化エステルは、本発明の組成物における使用に好適であり得る。（６）アルキルポリグルコシド。これは、（Ｃ８～Ｃ１６）アルキル鎖長を有するグルコポン４２５を含む。（７）高ＨＬＢ値（８～１８）を有するスクロース脂肪酸エステル：ヤシ脂肪酸スクロース、ジラウリン酸スクロース、ジステアリン酸スクロース、ヘキサエルカ酸スクロース、ヘキサオレイン酸／ヘキサパルミチン酸／ヘキサステアリン酸スクロース、ヘキサパルミチン酸スクロース、ラウリン酸スクロース、ミリスチン酸スクロース、オレイン酸スクロース、パルミチン酸スクロース、ペンタエルカ酸スクロース、ポリベヘン酸スクロース、ポリ綿実脂肪酸スクロース、ポリラウリン酸スクロース、ポリリノール酸スクロース、ポリオレイン酸スクロース、ポリパーム脂肪酸スクロース、ポリダイズ油脂肪酸スクロース、ポリステアリン酸スクロース、リシノレイン酸スクロース、ステアリン酸スクロース、テトライソステアリン酸スクロース、トリラウリン酸スクロース。
【0332】
いくつかの実施形態では、乳化剤系は、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンモノオレイン酸モノオレイン酸塩、ソルビタンモノイソステアリン酸モノイソステアリン酸塩、ソルビタンモノラウリン酸モノラウリン酸塩、ソルビタンモノパルミチン酸モノパルミチン酸塩、ソルビタンモノステアリン酸モノステアリン酸塩、ソルビタンセスキオレイン酸塩、ソルビタントリオレイン酸塩、ジグリセリルソルビタンペンタ－２－エチルヘキシレート、ジグリセリルソルビタンテトラ－２－エチルヘキシレート）からなる群から選択される親油性非イオン性界面活性剤、グリセリル及びポリグリセリル脂肪族酸（例えば、モノ綿実油脂肪酸グリセリン、モノエルカ酸グリセリル、セスキオレイン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、α，α’－オレイン酸ピログルタミン酸グリセリル、リンゴ酸モノステアリン酸グリセリル）、プロピレングリコール脂肪酸エステル（例えば、モノステアリン酸プロピレングリコール）、水素化ヒマシ油誘導体、グリセリルアルキルエーテル、及びそれらの組み合わせを含む。
【0333】
いくつかの実施形態では、乳化剤系は、ＰＯＥ－ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノオレイン酸ＰＯＥ－ソルビタン、モノステアリン酸ＰＯＥ－ソルビタン、モノオレイン酸ＰＯＥ－ソルビタン、及びテトラオレイン酸ＰＯＥ－ソルビタン）；ＰＯＥソルビトール脂肪酸エステル（例えば、モノラウリン酸ＰＯＥソルビトール、モノオレイン酸ＰＯＥ－ソルビトール、ペンタオレイン酸ＰＯＥ－ソルビトール、及びモノステアリン酸ＰＯＥ－ソルビトール）；ＰＯＥ－グリセリル脂肪酸エステル（例えば、モノステアリン酸ＰＯＥ－グリセリル、モノイソステアリン酸ＰＯＥ－グリセリル、及びトリイソステアリン酸ＰＯＥグリセリングリセリルなどのモノオレイン酸ＰＯＥ）；ＰＯＥ－脂肪酸エステル（例えば、ジステアリン酸ＰＯＥ、モノジオレイン酸ＰＯＥ、及びジステアリン酸エチレングリコール）；ＰＯＥ－アルキルエーテル（例えば、ＰＯＥ－ラウリルエーテル、ＰＯＥ－オレイルエーテル、ＰＯＥ－ステアリルエーテル、ＰＯＥ－ベヘニルエーテル、ＰＯＥ ２－オクチルドデシルエーテル、及びＰＯＥ－コレスタノールエーテル）；プルアロニック（例えば、プルアロニック）；ＰＯＥ－ＰＯＰ－アルキルエーテル（例えば、ＰＯＥ－ＰＯＰ－セチルエーテル、ＰＯＥ－ＰＯＰ２－デシルテトラデシルエーテル、ＰＯＥ－ＰＯＰ－モノブチルエーテル、ＰＯＥ－ＰＯＰ－ラノリン水和物、及びＰＯＥ－ＰＯＰグリセリングリセリルエーテル）；テトラＰＯＥ－テトラＰＯＰ－エチレンジアミノ凝縮物（例えば、テトロニック）；ＰＯＥ－ヒマシ油水素化ヒマシ油誘導体（例えば、ＰＯＥ－ヒマシ油、ＰＯＥ－水素化ヒマシ油、モノイソステアリン酸ＰＯＥ－水素化ヒマシ油、トリイソステアリン酸ＰＯＥ－水素化ヒマシ油、ＰＯＥ－水素化ヒマシ油モノピログルタミン酸モノイソステアリン酸ジエステル、及びＰＯＥ水素化ヒマシ油マレイン酸）；ＰＯＥ－ミツロウ－ラノリン誘導体（例えば、ＰＯＥ－ソルビトールミツロウ）；アルカノールアミド（例えば、パーム油脂肪酸ジエタノールアミド、ラウリン酸モノエタノールアミド、及び脂肪酸イソプロパノールアミド）；ＰＯＥ－プロピレングリコール脂肪酸エステル；ＰＯＥ－アルキルアミン；ＰＯＥ－脂肪酸アミド；スクロース脂肪酸エステル；アルキルエトキシジメチルアミンオキシド；及びトリオレイルリン酸を含む。
【0334】
親水性界面活性剤は、イオン性又は非イオン性であり得る。好適なイオン性界面活性剤としては、アルキルアンモニウム塩；フシジン酸塩；アミノ酸、オリゴペプチド、及びポリペプチドの脂肪酸誘導体；アミノ酸、オリゴペプチド、及びポリペプチドのグリセリド誘導体；レシチン及び水素化レシチン；リゾレシチン及び水素化リゾレシチン；リン脂質及びその誘導体；リゾリン脂質及びその誘導体；カルニチン脂肪酸エステル塩；アルキル硫酸塩；脂肪酸塩；ドクサートナトリウム；アシルラクチレート；モノ－及びジ－グリセリドのモノ－及びジ－アセチル化酒石酸エステル；スクシニル化モノ－及びジ－グリセリド；モノ－及びジ－グリセリドのクエン酸エステル；並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0335】
前述の群のうち、イオン性界面活性剤としては、一例として、レシチン、リゾレシチン、リン脂質、リゾリン脂質、及びそれらの誘導体；カルニチン脂肪酸エステル塩；アルキル硫酸塩；脂肪酸塩；ドクサートナトリウム；アシルラクチレート；モノ－及びジ－グリセリドのモノ－及びジ－アセチル化酒石酸エステル；スクシニル化モノ－及びジ－グリセリド；モノ－及びジ－グリセリドのクエン酸エステル；並びにそれらの混合物が挙げられる。
【0336】
イオン性界面活性剤は、レシチン、リゾレシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルセリン、ＰＥＧ－ホスファチジルエタノールアミン、ＰＶＰ－ホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸の乳酸エステル、ステアロイル－２－乳酸塩、ステアロイル乳酸塩、スクシニル化モノグリセリド、モノ／ジグリセリドのモノ／ジアセチル化酒石酸エステル、モノ／ジグリセリドのクエン酸エステル、コリルサルコシン、カプロエート、カプリル酸塩、カプロン酸塩、ラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、オレイン酸塩、リシノール酸塩、リノール酸塩、リノレン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル硫酸塩、テラセシル硫酸塩、ドクサート、ラウロイルカルニチン、パルミトイルカルニチン、ミリストイルカルニチン、並びにそれらの塩及び混合物のイオン化形態であり得る。
【0337】
親水性非イオン性界面活性剤としては、アルキルグルコシド；アルキルマルトシド；アルキルチオグルコシド；ラウリルマクロゴールグリセリド；ポリエチレングリコールアルキルエーテルなどのポリオキシアルキレンアルキルエーテル；ポリエチレングリコールアルキルフェノールなどのポリオキシアルキレンアルキルフェノール；ポリエチレングリコール脂肪酸モノエステル及びポリエチレングリコール脂肪酸ジエステルなどのポリオキシアルキレンアルキルフェノール脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールグリセロール脂肪酸エステル；ポリグリセロール脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステルなどのポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル；グリセリド、植物油、水素化植物油、脂肪酸、及びステロールからなる群の少なくとも１つのメンバーとポリオールの親水性エステル交換生成物；ポリオキシエチレンステロール、その誘導体、及び類似体；ポリオキシエチル化ビタミン及びその誘導体；ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックコポリマー；並びにそれらの混合物；ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、並びにトリグリセリド、植物油、及び水素化植物油からなる群の少なくとも１つのメンバーとポリオールの親水性エステル交換生成物が挙げられ得るが、これらに限定されない。ポリオールは、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、プロピレングリコール、ペンタエリスリトール、又は糖類であり得る。
【0338】
他の親水性－非イオン性界面活性剤としては、ＰＥＧ－１０ラウレート、ＰＥＧ－１２ラウレート、ＰＥＧ－２０ラウレート、ＰＥＧ－３２ラウレート、ＰＥＧ－３２ジラウレート、ＰＥＧ－１２オレエート、ＰＥＧ－１５オレエート、ＰＥＧ－２０オレエート、ＰＥＧ－２０ジオレエート、ＰＥＧ－３２オレエート、ＰＥＧ－２００オレエート、ＰＥＧ－４００オレエート、ＰＥＧ－１５ステアレート、ＰＥＧ－３２ジステアレート、ＰＥＧ－４０ステアレート、ＰＥＧ－１００ステアレート、ＰＥＧ－２０ジラウレート、ＰＥＧ－２５グリセリルトリオレエート、ＰＥＧ－３２ジオレエート、ＰＥＧ－２０グリセリルラウレート、ＰＥＧ－３０グリセリルラウレート、ＰＥＧ－２０グリセリルステアレート、ＰＥＧ－２０グリセリルオレエート、ＰＥＧ－３０グリセリルオレエート、ＰＥＧ－３０グリセリルラウレート、ＰＥＧ－４０グリセリルラウレート、ＰＥＧ－４０パーム核油、ＰＥＧ－５０水素化ヒマシ油、ＰＥＧ－４０ヒマシ油、ＰＥＧ－３５ヒマシ油、ＰＥＧ－６０ヒマシ油、ＰＥＧ－４０水素化ヒマシ油、ＰＥＧ－６０水素化ヒマシ油、ＰＥＧ－６０コーン油、ＰＥＧ－６カプレート／カプリレートグリセリド、ＰＥＧ－８カプレート／カプリレートグリセリド、ポリグリセリル－１０ラウレート、ＰＥＧ－３０コレステロール、ＰＥＧ－２５フィトステロール、ＰＥＧ－３０大豆ステロール、ＰＥＧ－２０トリオレエート、ＰＥＧ－４０ソルビタンオレエート、ＰＥＧ－８０ソルビタンラウレート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ＰＯＥ－９ラウリルエーテル、ＰＯＥ－２３ラウリルエーテル、ＰＯＥ－１０オレイルエーテル、ＰＯＥ－２０オレイルエーテル、ＰＯＥ－２０ステアリルエーテル、トコフェリルＰＥＧ－１００スクシネート、ＰＥＧ－２４コレステロール、ポリグリセリル－１０オレエート、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、スクロースモノステアレート、スクロースモノラウレート、スクロースモノパルミテート、ＰＥＧ１０－１００ノニルフェノールシリーズ、ＰＥＧ１５－１００オクチルフェノールシリーズ、及びポロキサマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0339】
好適な親油性界面活性剤としては、ほんの一例として、脂肪アルコール；グリセロール脂肪酸エステル；アセチル化グリセロール脂肪酸エステル；低級アルコール脂肪酸エステル；プロピレングリコール脂肪酸エステル；ソルビタン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル；ステロール及びステロール誘導体；ポリオキシエチル化ステロール及びステロール誘導体；ポリエチレングリコールアルキルエーテル；糖エステル；糖エーテル；モノ－及びジ－グリセリドの乳酸誘導体；グリセリド、植物油、水素化植物油、脂肪酸、及びステロールからなる群の少なくとも１つのメンバーとポリオールの疎水性エステル交換生成物；油溶性ビタミン／ビタミン誘導体；並びにそれらの混合物が挙げられる。この群のうち、好ましい親油性界面活性剤としては、グリセロール脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、及びそれらの混合物、又は植物油、水素化植物油、及びトリグリセリドからなる群の少なくとも１つのメンバーとポリオールの疎水性エステル交換生成物が挙げられる。
【0340】
いくつかの実施形態では、乳化剤系は、モノ－グリセロール誘導体及び／又はジグリセロール誘導体を含む。具体的な例としては、モノグリセロールモノオクタン酸塩、モノオクチルモノグリセリルエーテル、モノグリセロールモノノナン酸塩、モノノニルモノグリセリルエーテル、モノグリセロールモノデカン酸塩、モノデシルモノグリセリルエーテル、モノグリセロールモノウンデシレン酸塩、モノウンデシレニルグリセリルエーテル、モノグリセロールモノドデカン酸塩、モノドデシルモノグリセリルエーテル、モノグリセロールモノテトラデカン酸塩、モノグリセロールモノヘキサデカン酸塩、モノグリセロールモノオレイン酸塩、及びモノグリセロールモノイソステアリン酸塩などのモノグリセロール誘導体、並びにジグリセロールモノオクタン酸塩、モノオクチルジグリセリルエーテル、ジグリセロールモノノナン酸塩、モノノニルジグリセリルエーテル、ジグリセロールモノデカン酸塩、モノデシルジグリセリルエーテル、ジグリセロールモノウンデシレン酸塩、モノウンデシレニルグリセリルエーテル、ジグリセロールモノドデカン酸塩、モノドデシルジグリセリルエーテル、ジグリセロールモノテトラデカン酸塩、ジグリセロールモノヘキサデカン酸塩、ジグリセロールモノオレイン酸塩、及びジグリセロールモノイソステアリン酸塩などのジグリセロール誘導体が挙げられる。
【0341】
いくつかの実施形態では、乳化剤系は、絹乳化剤と、ラウリン酸スクロース及びパルミチン酸スクロースのうちの１つ以上とを含む。いくつかの実施形態では、乳化剤系は、絹乳化剤と、ラウリン酸スクロースとを含む。いくつかの実施形態では、乳化剤系は、絹乳化剤と、パルミチン酸スクロースとを含む。いくつかの実施形態では、乳化剤系は、絹乳化剤、ラウリン酸スクロース、及びパルミチン酸スクロースを含み、エマルジョン担体中のラウリン酸スクロース及びパルミチン酸スクロースは、１：１～１：３の範囲のラウリン酸スクロース対パルミチン酸スクロースの重量比を有する。いくつかの実施形態では、乳化剤系は、絹乳化剤、ラウリン酸スクロース、及びパルミチン酸スクロースを含み、エマルジョン担体中のラウリン酸スクロース、及びパルミチン酸スクロースは、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、及び１：３．０から選択されるラウリン酸スクロース対パルミチン酸スクロースの重量比を有する。いくつかの実施形態では、乳化剤系は、絹乳化剤、ラウリン酸スクロース、及びパルミチン酸スクロースを含み、エマルジョン担体中のラウリン酸スクロース及びパルミチン酸スクロースは、１：１、１：１．１、１：１．２、及び１：３から選択されるラウリン酸スクロース対パルミチン酸スクロースの重量比を有する。いくつかの実施形態では、乳化剤系は、絹乳化剤、ラウリン酸スクロース、及びパルミチン酸スクロースを含み、エマルジョン担体中のラウリン酸スクロース及びパルミチン酸スクロースは、１：１のラウリン酸スクロース対パルミチン酸スクロースの重量比を有する。
【0342】
いくつかの実施形態では、乳化剤系は、絹乳化剤、グリセロール、ラウリン酸スクロース、及びパルミチン酸スクロースを含み、エマルジョン担体中のラウリン酸スクロース及びパルミチン酸スクロースは、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、及び１：３．０から選択されるラウリン酸スクロース対パルミチン酸スクロースの重量比を有し、エマルジョン担体中の絹乳化剤及びグリセロールは、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、及び１：３．０から選択される絹乳化剤対グリセロールの重量比を有する。
【0343】
いくつかの実施形態では、乳化剤系、絹乳化剤、グリセロール、ラウリン酸スクロース、及びパルミチン酸スクロースを含み、エマルジョン担体中のラウリン酸スクロース及びパルミチン酸スクロースは、１：１、１：１．１、１：１．２、及び１：１．３のラウリン酸スクロース対パルミチン酸スクロースの重量比を有し、エマルジョン担体中の絹乳化剤及びグリセロールは、１：１、１：２、及び１：３．０から選択される絹乳化剤対グリセロールの重量比を有する。
【0344】
いくつかの実施形態では、乳化剤系は、コラーゲンブースティング組成物の総重量により０．１重量％～５．０重量％の範囲の重量パーセントで、エマルジョン担体中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、乳化剤系は、コラーゲンブースティング組成物の総重量により０．１重量％～３．０重量％の範囲の重量パーセントで、エマルジョン担体中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、乳化剤系は、コラーゲンブースティング組成物の総重量により０．１重量％～２．０重量％の範囲の重量パーセントで、エマルジョン担体中に組み込まれる。
【0345】
いくつかの実施形態では、エマルジョン担体は、上記の絹乳化剤を含む乳化剤系で乳化された油相を含む。脂肪性材料は、油相を形成するのに有用であり得る。脂肪性材料は、炭化水素油、シリコン油、高級脂肪酸、高級アルコール、合成エステル油、シリコーン油、液体油脂、固体油脂、ワックス、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0346】
一実施形態では、脂肪性材料は、任意選択的に、ワックスを含む。ワックスは、ポリエチレンワックス、ポリプロピレンワックス、ミツロウ、カンデリラワックス、パラフィンワックス、オゾケライト、マイクロクリスタリンワックス、カルナウバワックス、コットンワックス、エスパルトワックス、カルナウバワックス、ベイベリーワックス、ツリーワックス、鯨ワックス、モンタンワックス、ライスワックス、ラノリン、カポック（ｋａｐｏｋ）ワックス、酢酸ラノリン、液体ラノリン、サトウキビワックス、ラノリン脂肪酸イソプロピルエステル、ラウリン酸ヘキシル、還元ラノリン、ホホバワックス、硬質ラノリン、シェラックワックス、ＰＯＥラノリンアルコールエーテル、ＰＯＥラノリンアルコールアセテート、ＰＯＥコレステロールエーテル、ラノリン脂肪酸ポリエチレングリコール、ＰＯＥ水素化ラノリンアルコールエーテル、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0347】
一実施形態では、脂肪性材料は、任意選択的に、エステル油を含む。エステル油は、イソステアリン酸コレステリル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、イソステアリン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクタデシル、２－エチルヘキサン酸セチル、イソノナン酸セテアリル、オクタン酸セテアリル、イソノナン酸イソノニル、イソノナン酸イソトリデシル、トリ－２－エチルヘキサン酸グリセリル、トリ（カプリレーテルカプリン酸）グリセリル、オレイン酸ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジカプリリルエーテル、カプリル酸／カプリン酸プロピレングリコールジエステル、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0348】
一実施形態では、脂肪性材料は、任意選択的に、グリセリド脂肪エステルを含む。本明細書で使用される場合、「グリセリド脂肪酸エステル」という用語は、グリセロールとＣ６－Ｃ３０カルボン酸などの長鎖カルボン酸との間に形成されたモノ－、ジ－、及びトリ－エステルを指す。カルボン酸は、飽和若しくは不飽和であり得るか、又はヒドロキシルなどの親水性基を含有し得る。好ましいグリセリド脂肪酸エステルは、Ｃ１０～Ｃ２４、好ましくはＣ１０～Ｃ２２、最も好ましくはＣ１２～Ｃ２０の範囲の炭素鎖長のカルボン酸に由来する。
【0349】
一実施形態では、脂肪性材料は、任意選択的に、合成エステル油を含む。いくつかの実施形態では、合成エステル油は、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、酢酸ラノリン、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、１２－ヒドロキシステアリン酸コレステリル、エチレングリコールジ－２－エチルヘキシレート、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、モノイソステアリン酸－Ｎ－アルキルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ－２－ヘプチルウンデカン酸グリセリル、トリメチロールプロパントリ－２－エチルヘキシレート、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、ペンタンエリスリトールテトラ－２－エチルヘキシレート、グリセリルトリ－２－エチルヘキシレート、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、セチル２－エチルヘキサノエート、パルミチン酸２－エチルヘキシル、トリミリスチン酸グリセリル、トリ－２－ヘプチルウンデカン酸グリセリド、ヒマシ油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オレイル、セトステアリルアルコール、アセトグリセリド、パルミチン酸２－ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソプロピル、Ｎ－ラウロイル－Ｌ－グルタミン酸－２－オクチルドデシルエステル、アジピン酸ジ－２－ヘプチルウンデシル、ラウリン酸エチル、ジ－２－エチルヘキシルセバケート（ｃｅｂａｔａｔｅ）、ミリスチン酸２－ヘキシルデシル、パルミチン酸２－ヘキシルデシル、アジピン酸２－ヘキシルデシル、ジイソプロピルセバケート（ｃｅｂａｔａｔｅ）、コハク酸２－エチルヘキシル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸アミル、クエン酸トリエチル、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0350】
一実施形態では、脂肪性材料は、任意選択的に、エーテル油を含む。いくつかの実施形態では、エーテル油は、アルキル－１，３－ジメチルエチルエーテル、ノニルフェニルエーテル、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0351】
一実施形態では、脂肪性材料は、任意選択的に、高級脂肪酸を含む。本明細書で使用される場合、高級脂肪酸は、８～２２の範囲の炭素数を有する。いくつかの実施形態では、高級脂肪酸は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、イソステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0352】
一実施形態では、脂肪性材料は、任意選択的に、高級脂肪アルコールを含む。本明細書で使用される場合、高級脂肪族アルコールは、８～２２の範囲の炭素数を有する。いくつかの実施形態では、高級脂肪酸は、直鎖アルコール（例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、及びセトステアリルアルコール）及び分岐鎖エチルアルコール（例えば、モノステアリルグリセリルエーテル（バチルアルコール）、２－デシルテトラデシノール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、ヘキシルドデカノール、イソステアリルアルコール、及びオクチルドデカノール）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0353】
いくつかの実施形態では、脂肪相は、液体油／脂を含む。いくつかの実施形態では、液体油脂肪は、アボカド油、椿油、カメ油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリーブ油、菜種油、卵黄油、ゴマ種子油、杏仁油、小麦胚芽油、ササンクア油、ヒマシ油、亜麻仁油、サフラワー油、綿実油、ペリラ油、大豆油、ピーナッツ油、茶種子油、カヤ油、ライスブラン油、中国木油、日本木油、ホホバ油、胚芽油、トリグリセロール、トリオクタン酸グリセリル、及びトリイソパルミチン酸グリセリル、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0354】
いくつかの実施形態では、脂肪相は、固形油／脂を含む。いくつかの実施形態では、固形油脂は、カカオバター、ココナッツ油、ウマ獣脂、パーム脂、硬化ココナッツ油、パーム油、牛獣脂、羊獣脂、硬化牛獣脂、パーム核油、豚獣脂、牛骨獣脂、ジャパニーズコアワックス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｏｒｅ ｗａｘ）、硬化油、ニートフット（ｎｅａｔｓｆｏｏｔ）獣脂、ジャパニーズワックス、及び水素化ヒマシ油、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0355】
いくつかの実施形態では、脂肪相は、植物油を含む。いくつかの実施形態では、植物油は、ブリチ油（ｂｕｒｉｔｉ ｏｉｌ）、大豆油、オリーブ油、茶樹油、ローズマリー油、ホホバ油、ココナッツ油、ゴマ種子油、ゴマ油、パーム油、アボカド油、ババス油、米油、アーモンド油、アルゴン油、ヒマワリ油、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、植物油は、ココナッツ油、ヒマワリ油、及びゴマ油からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、油性構成成分は、カカオバター、パームステアリン、ヒマワリ油、大豆油、及びココナッツ油から選択される。
【0356】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法のための油相は、脂質材料を含む。いくつかの実施形態では、脂質材料は、セラミド、リン脂質（例えば、大豆レシチン、卵レシチン）、糖脂質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0357】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法のための油相は、炭化水素油を含む。本明細書で使用される場合、炭化水素油は、２０個未満の炭素原子の平均炭素鎖長を有する。好適な炭化水素油としては、環状炭化水素、直鎖脂肪族炭化水素（飽和又は不飽和）、及び分岐鎖脂肪族炭化水素（飽和又は不飽和）が挙げられる。直鎖炭化水素油は、典型的には、約６個～約１６個の炭素原子、好ましくは約８個～約１４個の炭素原子を含有する。分岐鎖炭化水素油は、より多数の炭素原子、例えば、約６個～約２０個の炭素原子、好ましくは約８個～約１８個の炭素原子を含有することができ、かつ典型的には含有し得る。本発明の好適な炭化水素油は、一般的に、周囲温度（２５～３０℃）で０．０００１～０．５Ｐａ・ｓ、好ましくは０．００１～０．０５Ｐａ・ｓ、より好ましくは０．００１～０．０２Ｐａ・ｓの粘度を有する。
【0358】
いくつかの実施形態では、水素炭素油は、液状ワセリン、スクアラン、プリスタン、パラフィン、イソパラフィン、セレシン、スクアレン、鉱油、軽質鉱油、軽質鉱油及び重質鉱油のブレンド、ポリイソブテン、水素化ポリイソブテン、テルペン油、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0359】
いくつかの実施形態では、水素炭素油は、軽質鉱油である。本明細書で使用される場合、鉱油は、石油から得られる透明な油性液体であり、そこからワックスが除去され、より揮発性の高い留分が蒸留によって除去される。２５０℃～３００℃で蒸留される留分は鉱油と呼ばれ、炭化水素の混合物からなり、炭化水素分子当たりの炭素原子の数は、通常、Ｃ１０～Ｃ４０の範囲である。鉱油は、その粘度により特徴付けられ得、軽質鉱油は、重質鉱油よりも比較的粘度が低く、これらの用語は、Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，２２ｎｄ ｒｅｖｉｓｉｏｎ，ｐ． ８９９（１９９０）でより具体的に定義されている。本発明における使用のための好適な軽質鉱油の市販品の例としては、Ｓｉｌｋｏｌｅｎｅから入手可能なＳｉｒｉｕｓ（登録商標）Ｍ４０（炭素鎖長Ｃ０～Ｃ２８、主にＣ１２～Ｃ２０、粘度４．３×１０Ｐａ・ｓ）である。本発明において使用され得る他の炭化水素油としては、テトラデカン、ヘキサデカン、及びオクタデカンなどの直鎖飽和炭化水素、ジオクチルシクロヘキサン（例えば、ＨｅｎｋｅｌからのＣＥＴＩＯＬ（登録商標）Ｓ）などの環状炭化水素、分岐鎖炭化水素（例えば、Ｅｘｘｏｎ Ｃｏｒｐ．からのＩＳＯＰＡＲ（登録商標）及びＩＳＯＰＡＲ（登録商標）Ｖ）を含む比較的低分子量の炭化水素が挙げられる。
【0360】
いくつかの実施形態では、油相の脂肪性材料は、ジヘプタン酸ネオペンチルグリコール、ジカプリル酸プロピレングリコール、アジピン酸ジオクチル、ココ－カプリル酸塩／カプリン酸塩、アジピン酸ジエチルヘキシル、ジリノール酸ジイソプロピル二量体、ジリノール酸ジイソステアリル二量体、ｂｕｔｙｒｏｓｐｅｒｍｕｍ ｐａｒｋｉｉ（シア）バター、乳酸Ｃ１２－Ｃ１３アルキル、酒石酸ジ－Ｃ１２－Ｃ１３アルキル、クエン酸トリ－Ｃ１２－Ｃ１３アルキル、乳酸Ｃ１２－Ｃ１５アルキル、ジオクタン酸ｐｐｇ、ジオクタン酸ジエチレングリコール、メドウフォーム油、オレイン酸Ｃ１２－１５アルキル、ネオペンタン酸トリデシル、セテアリルアルコール及びポリソルベート６０、Ｃ１８－Ｃ２６トリグリセリド、セテアリルアルコール及びセテアリルグルコシド、アセチル化ラノリン、ｖｐ／エイコセンコポリマー、ヒドロキシステアリン酸グリセリル、Ｃ１８－３６酸グリコールエステル、Ｃ１８－３６トリグリセリド、ヒドロキシステアリン酸グリセリル、及びそれらの混合物からなる群から選択される。また、好適かつ好ましいのは、セチルアルコール及びステアリン酸グリセリル及びＰＥＧ－７５、ステアリン酸塩及びセテス－２０及びステアレス－２０、ラウリルグルコシド及びジポリヒドロキシステアリン酸ポリグリセリル－２、ベヘネス－２５、ポリアミド－３及びテトラ－ジ－ｔ－ブチルヒドロキシケイヒ酸ペンタエリスリチル、ポリアミド－４及びＰＥＧ－１００ステアリン酸塩、セチルリン酸カリウム、ステアリン酸及びヘクタイトである。
【0361】
いくつかの実施形態では、油相用の脂肪性材料は、液体パラフィン、液体イソパラフィン、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、イソステアリン酸イソプロピル、２－エチルヘキサン酸セチル、イソノナン酸イソノニル、グリセリルトリ（カプリレーテルカプリン酸）、アルキ－１，３－ジメチルブチルエーテル、分子量１００～５００のメチルポリシロキサン、デカメチルシドペンタシロキサン、オクタメチルシドテトラシロキサン、炭素数１２～２２の高級脂肪酸、炭素数１２～２２の高級アルコール、セラミド、糖脂質、及びテルペン油からなる群から選択される。
【0362】
いくつかの実施形態では、油相の脂肪性材料は、パラフィン油、ステアリン酸グリセリル、ミリスチン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル、セチルステアリル２－エチルヘキサノエート、水素化ポリイソブテン、ワセリン、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、マイクロクリスタリンワックス、ラノリン及びステアリン酸、シリコーン油、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0363】
一実施形態では、油相用の脂肪性材料は、ホホバ油、オリーブ油、カメリア油、アボカド油、カカオ油、ヒマワリ油、杏仁油、パーム油、ヒマシ油、ブリチ油、中鎖トリグリセリドを含む植物油からなる群から選択される。
【0364】
一実施形態では、絹乳化剤によって乳化可能な油性材料は、植物油、イソドデカン、及びイソヘキサデカン、並びに脂肪酸の１つ以上の油性エステルからなる群から選択され、植物油は、ホホバ油及び／又はカメリア油から選択され、当該油性エステルは、イソノナン酸イソノニル及びココカプリル酸塩から選択される。
【0365】
いくつかの実施形態では、油相は、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法において、コラーゲンブースティング、組成物の総重量により１．０重量％～約９５重量％の範囲の重量パーセントで存在する。いくつかの実施形態では、油相は、コラーゲンブースティング組成物の総重量により４５．０重量％～約９５重量％の範囲の重量パーセントで、コラーゲンブースティング組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、油相は、コラーゲンブースティング組成物の総重量により４５．０重量％～約６５．０重量％の範囲の重量パーセントで、コラーゲンブースティング組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、油相は、コラーゲンブースティング組成物の総重量により５．０重量％～約４５重量％の範囲の重量パーセントで、コラーゲンブースティング組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、油相は、コラーゲンブースティング組成物の総重量により５．０重量％～約３５重量％の範囲の重量パーセントで、コラーゲンブースティング組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、油相は、コラーゲンブースティング組成物の総重量により１０．０重量％～約２５重量％の範囲の重量パーセントで、コラーゲンブースティング組成物中に存在する。
【0366】
いくつかの実施形態では、油相は、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法において、エマルジョン担体の総重量により約５０．０重量％～９５．０重量％の範囲の重量パーセントで提供される。いくつかの実施形態では、油相は、エマルジョン担体の総重量により約５重量％～４５重量％の範囲の重量パーセントで、コラーゲンブースティング組成物中に提供され、これは、そのような含量が、エマルジョン担体が、おおよそ室温よりも広い温度範囲にわたる安定性、及び良好な感触を有することを可能にするためである。
【0367】
いくつかの実施形態では、エマルジョン担体用の水相は、水、水溶液、アルコール及び水のブレンド、又は水性担体としてのリオトロピック液晶相を含む。本発明のコラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法に含有される水の選択は、特に限定されず、具体的な例としては、精製水、イオン交換水、及び水道水が挙げられる。いくつかの実施形態では、水性は、エタンジオール、プロパンジオール、グリセロール、ブタンジオール、ブタンテトラオール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群から選択される１つ以上の低分子多価アルコールを更に含む。いくつかの実施形態では、水相は、メタノール、エタノール、及びイソプロパノールを含む１つ以上の低級アルコール溶媒を更に含む。
【0368】
水及び多価アルコールのブレンド比は、エマルジョンの配合の種類に基づいて適切に決定される。
【0369】
いくつかの実施形態では、エマルジョンは、組成物の総重量により約５０重量％～約９８重量％の水相を含む。いくつかの実施形態では、エマルジョンは、組成物の総重量により約６０重量％～約９０重量％の水相を含む。いくつかの実施形態では、エマルジョン中の水相の量は、組成物の総重量により約５０．０重量％、約５１．０重量％、約５２．０重量％、約５３．０重量％、約５４．０重量％、約５５．０重量％、約５６．０重量％、約５７．０重量％、約５８．０重量％、約５９．０重量％、約６０．０重量％、約６１．０重量％、約６２．０重量％、約６３．０重量％、約６４．０重量％、約６５．０重量％、約６６．０重量％、約６７．０重量％、約６８．０重量％、約６９．０重量％、約７０．０重量％、約７１．０重量％、約７２．０重量％、約７３．０重量％、約７４．０重量％、約７５．０重量％、約７６．０重量％、約７７．０重量％、約７８．０重量％、約７９．０重量％、約８０．０重量％、約８１．０重量％、約８２．０重量％、約８３．０重量％、約８４．０重量％、約８５．０重量％、約８６．０重量％、約８７．０重量％、約８８．０重量％、約８９．０重量％、約９０．０重量％、約９１．０重量％、約９２．０重量％、約９３．０重量％、約９４．０重量％、約９５．０重量％、約９６．０重量％、約９７．０重量％、約９８．０重量％から選択される。
【0370】
いくつかの実施形態では、絹含有乳化剤系は、水相に存在する。
【0371】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、粘度調整剤及び／又は増粘剤を含む。いくつかの実施形態では、増粘剤は、モノステアリン酸エチレングリコール、カルボマーポリマー、カルボキシビニルポリマー、アクリルコポリマー、メチルセルロース、ラクチド及びグリコリドモノマーのコポリマー、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カラギーナン、疎水性変性ヒドロキシエチルセルロース、ラポナイト、セルロースエーテル（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びナトリウムカルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース）の水溶性塩、カラヤガム、アラビアゴム、グアーガム（Ｇｕａｒｓ）、ＨＰグアーガムなどの天然ガム、ヘテロ多糖ガム（例えば、キサンタンガム）、及びトラガカントガムからなる群から選択される。
【0372】
いくつかの実施形態では、増粘剤は、タルク、ヒュームドシリカ、ポリマーポリエーテル化合物（例えば、１個～約１８個の炭素原子を含有するアルキル又はアシル基でキャップされたポリエチレン又はポリプロピレンオキシド（ＭＷ３００～１，０００，０００））、ステアリン酸エチレングリコール、１６個～２２個の炭素原子を有する脂肪酸のアルカノールアミド、ジステアリン酸ポリエチレングリコール３、ポリアクリル酸（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）４２０、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）４８８、又はＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）４９３）、アクリル酸の架橋ポリマー、アクリル酸及び疎水性モノマーのコポリマー、カルボン酸含有モノマー及びアクリルエステルのコポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）１３４２）、アクリル酸及びアクリレートエステルの架橋コポリマー、多官能剤で架橋されたポリアクリル酸（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９１０、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９３４、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９４０、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９４１、及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９８０、Ｕｌｔｒｅｚ（登録商標）１０）、並びに結晶性長鎖アシル誘導体からなる群から選択される。
【0373】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、組成物の総重量により約０．１重量％～約１５．０重量％の増粘剤／粘度調整剤を含む。いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、組成物の総重量により約０．１重量％～約１０．０重量％の増粘剤／粘度調整剤を含む。いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、組成物の総重量により約０．５重量％～約６．０重量％の増粘剤／粘度調整剤を含む。いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、組成物の総重量により約０．９重量％～約４．０重量％の増粘剤／粘度調整剤を含む。いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、組成物の総重量により約２．０重量％の増粘剤／粘度調整剤を含む。いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製方法及び使用方法において提供される増粘剤／粘度調整剤の量は、組成物の総重量により約０．１重量％、約０．２重量％、約０．３重量％、約０．４重量％、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、約１．０重量％、約１．２５重量％、約１．５０重量％、約１．７５重量％、約２．０重量％、約２．２５重量％、約２．５重量％、約２．７５重量％、約３．０重量％、約３．２５重量％、約３．５重量％、約３．７５重量％、約４．０重量％、約４．２５重量％、約４．５重量％、約４．７５重量％、約５．０重量％、約５．２５重量％、約５．５重量％、約５．７５重量％、約６．０重量％、約６．２５重量％、約７．５重量％、約７．７５重量％、約８．０重量％、約８．２５重量％、約８．５重量％、約８．７５重量％、約９．０重量％、約９．２５重量％、約９．５重量％、約９．７５重量％、約１０．０重量％、約１０．１重量％、約１０．２重量％、約１０．３重量％、約１０．４重量％、約１０．５重量％、約１０．６重量％、約１０．７重量％、約１０．８重量％、約１０．９重量％、約１１．０重量％、約１１．１重量％、約１１．２重量％、約１１．３重量％、約１１．４重量％、約１１．５重量％、約１１．６重量％、約１１．７重量％、約１１．８重量％、約１１．９重量％、約１２．０重量％、約１２．１重量％、約１２．２重量％、約１２．３重量％、約１２．４重量％、約１２．５重量％、約１２．６重量％、約１２．７重量％、約１２．８重量％、約１２．９重量％、約１３．０重量％、約１３．１重量％、約１３．２重量％、約１３．３重量％、約１３．４重量％、約１３．５重量％、約１３．６重量％、約１３．７重量％、約１３．８重量％、約１３．９重量％、約１４．０重量％、約１４．１重量％、約１４．２重量％、約１４．３重量％、約１４．４重量％、約１４．５重量％、約１４．６重量％、約１４．７重量％、約１４．８重量％、約１４．９重量％、約１５．０重量％からなる群から選択される。
【0374】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、水性担体として、水、水溶液、アルコール、アルコール及び水のブレンド、又はリオトロピック液晶相を含む。組成物に含有される水の選択は、特に限定されず、具体的な例としては、精製水、イオン交換水、及び水道水が挙げられる。いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、エタンジオール、プロパンジオール、グリセロール、ブタンジオール、ブタンテトラオール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群から選択される１つ以上の低分子多価アルコールを更に含む。いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、メタノール、エタノール、及びイソプロパノールを含む１つ以上の低級アルコール溶媒を更に含む。
【0375】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、組成物の総重量により約５０重量％～約９８重量％の水性担体を含む。いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、組成物の総重量により約６０重量％～約９０重量％の水性担体を含む。いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製方法及び使用方法における水性担体の量は、組成物の総重量により約５０．０重量％、約５１．０重量％、約５２．０重量％、約５３．０重量％、約５４．０重量％、約５５．０重量％、約５６．０重量％、約５７．０重量％、約５８．０重量％、約５９．０重量％、約６０．０重量％、約６１．０重量％、約６２．０重量％、約６３．０重量％、約６４．０重量％、約６５．０重量％、約６６．０重量％、約６７．０重量％、約６８．０重量％、約６９．０重量％、約７０．０重量％、約７１．０重量％、約７２．０重量％、約７３．０重量％、約７４．０重量％、約７５．０重量％、約７６．０重量％、約７７．０重量％、約７８．０重量％、約７９．０重量％、約８０．０重量％、約８１．０重量％、約８２．０重量％、約８３．０重量％、約８４．０重量％、約８５．０重量％、約８６．０重量％、約８７．０重量％、約８８．０重量％、約８９．０重量％、約９０．０重量％、約９１．０重量％、約９２．０重量％、約９３．０重量％、約９４．０重量％、約９５．０重量％、約９６．０重量％、約９７．０重量％、約９８．０重量％から選択される。
【0376】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、非水性液体担体を含む。本明細書で使用される場合、非水性液体担体は、液体担体が実質的に水を含まないことを意味する。本発明において、「液体担体は実質的に水を含まない」とは、液体担体が水を含まないか、又は液体担体が水を含有する場合、水の量が非常に少ないことを意味する。本発明において、含まれる場合の水の量は、組成物の重量により１％以下、好ましくは０．５％以下、より好ましくは０．３％以下、更により好ましくは０．１％以下、更により好ましくは０％である。
【0377】
いくつかの実施形態では、非水性液体担体は、鉱油、炭化水素油、水素化ポリデセン、ポリイソブテン、イソパラフィン、イソドデカン、イソヘキサデカン、揮発性シリコーン油、不揮発性シリコーン油、イソヘキサデカン、スクアレン、スクアレン、エステル油、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される油性材料を含む。いくつかの実施形態では、非水性液体担体は、白色鉱油、スクアラン、水素化ポリイソブテン、イソヘキサデカン、及びイソドデカンからなる群から選択される油性材料を含む。いくつかの実施形態では、非水性液体担体は、スクアラン及び水素化ポリイソブテンを含む。いくつかの実施形態では、非水性液体担体は、白色鉱油、イソヘキサデカン、及びイソドデカンを含む。いくつかの実施形態では、炭化水素油は、液体パラフィン、液体イソパラフィン、スクアレン、鉱油、飽和及び不飽和ドデカン、飽和及び不飽和トリデカン、飽和及び不飽和テトラデカン、飽和及び不飽和ペンタデカン、飽和及び不飽和ヘキサデカン、ポリブテン、ポリデセン、ペルメチル置換異性体、例えば、ヘキサデカン及びエイコサンのペルメチル置換異性体（例えば、２，２，４，４，６，６，８，８－ジメチル－１０－メチルウンデカン及び２，２，４，４，６，６－ジメチル－８－メチルノナン）、イソブチレン及びブタンのコポリマー、ポリ－α－オレフィン（例えば、エチレン、プロピレン、１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン、１－オクテン、１－デセン、１－ドデカン、１－テトラデセンのポリマー）、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0378】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、イソステアリン酸イソプロピル、ラウリン酸ヘキシル、ラウリン酸イソヘキシル、パルミチン酸イソヘキシル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、オレイン酸イソデシル、ステアリン酸ヘキサデシル、ステアリン酸デシル、イソステアリン酸イソプロピル、アジピン酸ジヘキシルデシル、乳酸ラウリル、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ステアリン酸オレイル、オレイン酸オレイル、ミリスチン酸オレイル、酢酸ラウリル、プロピオン酸セチル、アジピン酸オレイル、ミリスチン酸イソプロピル、ステアリン酸グリコール、及びラウリン酸イソプロピル、ステアリン酸イソセチルステアロイル、アジピン酸ジイソプロピル、クエン酸トリステアリル、トリオレイン、ジラウリン酸トリステアリングリセリル、トリメチロールプロパンのＣ８－Ｃ１０トリエステル、３，３ジエタノール－１，５ペンタジオールのテトラエステル、アジピン酸のＣ８－Ｃ１０ジエステル、エチレングリコールモノ及びジ－脂肪酸エステル、ジエチレングリコールモノ－及びジ－脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールモノ及びジ脂肪酸エステル、プロピレングリコールモノ－及びジ－脂肪酸エステル、モノオレイン酸ポリプロピレングリコール、モノステアリン酸ポリプロピレングリコール２０００、モノステアリン酸エトキシル化プロピレングリコール、グリセリルモノ－及びジ－脂肪酸エステル、ポリグリセロールポリ－脂肪酸エステル、エトキシル化モノステアリン酸グリセリル、モノステアリン酸１，３－ブチレングリコール、ジステアリン酸１，３－ブチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン、ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される脂肪酸エステル油を含む有機性油を含む。
【0379】
いくつかの実施形態では、非水性液体担体は、約８個～約２０個の炭素原子を有する揮発性イソパラフィンを含む。いくつかの実施形態では、非水性液体担体は、約８個～約１６個の炭素原子を有する揮発性イソパラフィンを含む。いくつかの実施形態では、非水性液体担体は、約１０個～約１６個の炭素原子を有する揮発性イソパラフィンを含む。いくつかの実施形態では、揮発性イソパラフィンは、イソブテンの三量体、四量体、及び五量体、並びにそれらの混合物からなる群から選択される。市販のイソパラフィン炭化水素は、その重合度の分布を有することができ、例えば、三量体、四量体、及び五量体の混合物であり得る。本明細書においては、四量体とは、四量体が最も高い含量を有する市販のイソパラフィン炭化水素、すなわち、四量体が、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更により好ましくは８５％以上の量で含まれることを意味する。
【0380】
いくつかの実施形態では、揮発性イソパラフィンは、いくつかのグレードのイソパラフィンの混合物である。いくつかの実施形態では、揮発性イソパラフィンは、３７．８℃で、約０．５ｍｍ２・ｓ－１～約５０ｍｍ２・ｓ－１、約０．８ｍｍ２・ｓ－１～約４０ｍｍ２・ｓ－１、約１ｍｍ２・ｓ－１～約３０ｍｍ２・ｓ－１、約１ｍｍ２・ｓ－１～約２０ｍｍ２・ｓ－１、及び約１ｍｍ２・ｓ－１～約１０ｍｍ２・ｓ－１から選択される粘度範囲を有する。２つ以上のイソパラフィン炭化水素溶媒を使用する場合、イソパラフィン炭化水素溶媒の混合物が、上記の粘度を有することが好ましい。
【0381】
いくつかの実施形態では、非水性液体担体は、エステル油を含む。いくつかの実施形態では、エステル油は、３以下の、及び室温で液体としてのＨＬＢを有する。いくつかの実施形態では、エステル油は、パルミチン酸メチル、ステアリン酸メチル、オレイン酸メチル、リノール酸メチル、及びラウリン酸メチルからなる群から選択される。一実施形態では、エステル油は、ステアリン酸メチルである。
【0382】
いくつかの実施形態では、エステル油は、調節された触感と生成物安定性との間のバランスの観点から、及び／又は発泡防止の観点から、コラーゲンブースティング組成物の総重量により約０．１重量％～約２５重量％、約０．５重量％～約１５重量％、約１．０重量％～約１０重量％、約１．０重量％～約５．０重量％から選択される重量パーセントで、非水性液体担体に含まれる。
【0383】
いくつかの実施形態では、非水性液体担体は、トリメチロイルプロパントリカプリレート／トリカプリレート、安息香酸Ｃ１２－Ｃ１５アルキル、ステアリン酸エチルヘキシル、ヤシ脂肪酸エチルヘキシル、オレイン酸デシル、ヤシ脂肪酸デシル、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エチルヘキシルパーラゴネート（ｅｔｈｙｌｈｅｘｙｌ ｐｅｒｌａｇｏｎａｔｅ）、ペンタエリスリチルテトラカプリレート／テトラカプレート、ミリスチン酸ＰＰＧ－３ベンジルエーテル、プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、イソステアリン酸エチルヘキシル、パルミチン酸エチルヘキシル、並びにｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ、ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ、ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、ｏｅｎｏｔｈｅｒａ ｂｉｅｎｎｉｓ、及びｒａｐａｅ ｏｌｅｕｍなどの天然油、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される脂肪酸エステルを含む。
【0384】
いくつかの実施形態では、非水性液体担体は、グリセリド脂肪酸エステルを含む。いくつかの実施形態では、本発明におけるヘアオイルにおける使用に好適なグリセリド脂肪酸エステルは、周囲温度（２５～３０℃）で０．０１～０．８Ｐａ・ｓ、好ましくは０．０１５～０．６Ｐａ・ｓ、より好ましくは０．０２～０．０６５Ｐａ・ｓの粘度を有する。
【0385】
一実施形態では、脂肪性材料は、グリセリド脂肪酸エステルを含む。本明細書で使用される場合、「グリセリド脂肪酸エステル」という用語は、グリセロールとＣ６－Ｃ３０カルボン酸などの長鎖カルボン酸との間に形成されたモノ－、ジ－、及びトリ－エステルを指す。カルボン酸は、飽和若しくは不飽和であり得るか、又はヒドロキシルなどの親水性基を含有し得る。好ましいグリセリド脂肪酸エステルは、Ｃ１０～Ｃ２４、好ましくはＣ１０～Ｃ２２、最も好ましくはＣ１２～Ｃ２０、最も好ましくはＣ１２～Ｃ１８の範囲の炭素鎖長のカルボン酸に由来する。いくつかの実施形態では、グリセリド脂肪酸エステルは、Ｃ６－Ｃ１２脂肪酸鎖を有する中鎖トリグリセリドである。
【0386】
いくつかの実施形態では、グリセリド脂肪エステルは、カメリア油、ココナッツ油、ヒマシ油、サフラワー油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、タラ肝油、アーモンド油、アボカド油、パーム油、ゴマ油、ラノリン、及び大豆油などの様々な植物性及び動物性油脂から供給される。合成油としては、トリミリスチン、トリオレイン、及びトリステアリングリセリルジラウレートが挙げられる。植物由来のグリセリド脂肪エステルとしては、アーモンド油、ヒマシ油、ココナッツ油、パーム核油、ゴマ油、ヒマワリ油、及び大豆油が挙げられる。
【0387】
いくつかの実施形態では、グリセリド脂肪酸エステルは、ココナッツ油、ヒマワリ油、アーモンド油、及びそれらの混合物から選択される。
【0388】
非水性液体担体は、コラーゲンブースティング組成物の総重量により約５０％～約９９．９％、約６０％～約９９．８％、より好ましくは約６５％～約９８％のコラーゲンブースティング組成物の重量によるレベルで含まれる。
【0389】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、非絹界面活性剤を実質的に含まない水性液体担体を含む。いくつかの実施形態では、水性液体担体は、水、水溶液、アルコール、アルコール及び水のブレンド、又はリオトロピック液晶相から選択される。組成物に含有される水の選択は、特に限定されず、具体的な例としては、精製水、イオン交換水、及び水道水が挙げられる。
【0390】
いくつかの実施形態では、水性液体担体は、エタンジオール、プロパンジオール、グリセロール、ブタンジオール、ブタンテトラオール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群から選択される１つ以上の低分子多価アルコールを含む。いくつかの実施形態では、水性液体担体は、水及びグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、水性液体担体は、１：１０の水対グリセロールの重量比で、水及びグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、水性液体担体は、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、及び１：１から選択される水対グリセロールの重量比で、水及びグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、水性液体担体は、１：１の水対グリセロールの重量比で、水及びグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、水性液体担体は、１：１０の水対グリセロールの重量比で、水及びグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、水性液体担体は、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、及び１：１から選択される絹フィブロインタンパク質断片対グリセロールの重量比で、絹フィブロインタンパク質断片及びグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、水性液体担体は、１：１の絹フィブロインタンパク質断片対グリセロールの重量比で、絹フィブロインタンパク質断片及びグリセロールを含む。
【0391】
いくつかの実施形態では、水性液相のｐＨは、約４．０～約９．０の範囲で調整される。いくつかの実施形態では、水性液相のｐＨは、約４．５～約８．５の範囲で調整される。いくつかの実施形態では、水性液相のｐＨは、約５．０～約７．０の範囲で調整される。ｐＨ調整剤は、緩衝液（例えば、ＰＢＳ緩衝液）、アルカリ金属塩、酸、クエン酸、コハク酸、リン酸、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、エタノールアミン、炭酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせを含み得る。
【0392】
いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量により約１．０重量％～約９９．０重量％の水性液体担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量により約５．０重量％～約４５．０重量％の水性液体担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量により約５．０重量％～約３５．０重量％の水性液体担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量により約１０．０重量％～約３０．０重量％の水性液体担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量により約４５．０重量％～約９５．０重量％の水性液体担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量により約６０．０重量％～約９０．０重量％の水性液体担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量により約４５．０重量％～約７５．０重量％の水性液体担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量により約６０．０重量％～約７５．０重量％の水性液体担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物中の水性液体担体の量は、組成物の総重量により約１．０重量％、約２．０重量％、約３．０重量％、約４．０重量％、約５．０重量％、約６．０重量％、約７．０重量％、約８．０重量％、約９．０重量％、約１０．０重量％、約１１．０重量％、約１２．０重量％、約１３．０重量％、約１４．０重量％、約１５．０重量％、約１６．０重量％、約１７．０重量％、約１８．０重量％、約１９．０重量％、約２０．０重量％、約２１．０重量％、約２２．０重量％、約２３．０重量％、約２４．０重量％、約２５．０重量％、約２６．０重量％、約２７．０重量％、約２８．０重量％、約２９．０重量％、約３０．０重量％、約３１．０重量％、約３２．０重量％、約３３．０重量％、約３４．０重量％、約３５．０重量％、約３６．０重量％、約３７．０重量％、約３８．０重量％、約３９．０重量％、約４０．０重量％、約４１．０重量％、約４２．０重量％、約４３．０重量％、約４４．０重量％、約４５．０重量％、約４６．０重量％、約４７．０重量％、約４８．０重量％、約４９．０重量％、約５０．０重量％、約５１．０重量％、約５２．０重量％、約５３．０重量％、約５４．０重量％、約５５．０重量％、約５６．０重量％、約５７．０重量％、約５８．０重量％、約５９．０重量％、約６０．０重量％、約６１．０重量％、約６２．０重量％、約６３．０重量％、約６４．０重量％、約６５．０重量％、約６６．０重量％、約６７．０重量％、約６８．０重量％、約６９．０重量％、約７０．０重量％、約７１．０重量％、約７２．０重量％、約７３．０重量％、約７４．０重量％、約７５．０重量％、約７６．０重量％、約７７．０重量％、約７８．０重量％、約７９．０重量％、約８０．０重量％、約８１．０重量％、約８２．０重量％、約８３．０重量％、約８４．０重量％、約８５．０重量％、約８６．０重量％、約８７．０重量％、約８８．０重量％、約８９．０重量％、約９０．０重量％、約９１．０重量％、約９２．０重量％、約９３．０重量％、約９４．０重量％、約９５．０重量％、約９６．０重量％、約９７．０重量％、約９８．０重量％から選択される。
【0393】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、天然又は合成の芳香性エッセンシャルオイルを含む。いくつかの実施形態では、芳香性エッセンシャルオイルは、ユーカリ油、ラバンディン油、ラベンダー油、ベチバー油、リトシークベバ油、レモン油、サンダルウッド油、ローズマリー油、カモミール油、セイバリー油、ナッツメグ油、シナモン油、ヒソップ油、キャラウェイ油、オレンジ油、ゲラニオール油、ケイド油、アーモンド油、アルガン油、アボカド油、スギ油、小麦胚芽油、ベルガモット油、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0394】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、ビタミンＫ、リボフラビン、ピリドキシン、補酵素チアミンピロホスフェート、フラビンアデニンジヌクレオチド、葉酸、ピリドキサールホスフェート、テトラドロ葉酸（ｔｅｔｒａｄｒｏｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるビタミンを含む。
【0395】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、組成物の総重量により約０．０１重量％～約８．０重量％のビタミン及び／又は補酵素を含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量により約０．００１重量％～約１０．０重量％のビタミン及び／又は補酵素を含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の総重量により約０．０５重量％～約５．０重量％のビタミン及び／又は補酵素を含有する。
【0396】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、任意選択的に、トリアゾール、イミダゾール、ナフタレン誘導体、ベンズイミダゾール、モルフリン（ｍｏｒｐｈｌｉｎｅ）誘導体、ジチオカルバミン酸塩、ベンズイソチアゾール、ベンズアミド、ホウ素化合物、ホルムアルデヒド供与体、イソチアゾロン、チオシアン酸塩、四級アンモニウム化合物、ヨウ素誘導体、フェノール誘導体、殺菌剤、ピリジン、ジアルキルチオカルバミン酸塩、ニトリル、パラベン、アルキルパラベン、及びそれらの塩からなる群から選択される防腐剤を含む。
【0397】
いくつかの実施形態では、コラーゲン刺激組成物並びにその作製及び使用方法は、水溶液、エタノール溶液、油、ジェル、エマルジョン、懸濁液、ムース、液晶、固体、ジェル類、ローション、クリーム、エアゾルスプレー、ペースト、フォーム、及びトニックからなる群から選択される形態で製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、クリーム、スプレー、エアロゾルムース、又はジェルからなる群から選択される形態である。
【0398】
一実施形態では、組成物は、本開示の化合物の良好な可溶化及び／又は溶解を確実にし、かつ本開示の化合物の沈殿を最小限にするための可溶化剤を含むことができる。これは、非経口使用のための組成物、例えば、注射用組成物にとって特に重要であり得る。親水性薬物、及び／又は界面活性剤などの他の構成成分の溶解性を高めるために、又は組成物を安定又は均質な溶液若しくは分散液として維持するために、可溶化剤が添加され得る。
【0399】
好適な可溶化剤の例としては、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ベンジルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール及びその異性体、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、マンニトール、トランスクトール、ジメチルイソソルビド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及び他のセルロース誘導体、シクロデキストリン及びシクロデキストリン誘導体などのアルコール及びポリオール；テトラヒドロフルフリルアルコールＰＥＧエーテル（グリコフロール）又はメトキシＰＥＧなどの約２００～約６０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールのエーテル；アミド、並びに２－ピロリドン、２－ピペリドン、ε－カプロラクタム、Ｎ－アルキルピロリドン、Ｎ－ヒドロキシアルキルピロリドン、Ｎ－アルキルピペリドン、Ｎ－アルキルカプロラクタム、ジメチルアセトアミド、及びポリビニルピロリドンなどの他の窒素含有化合物；プロピオン酸エチル、クエン酸トリブチル、クエン酸アセチルトリエチル、クエン酸アセチルトリブチル、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、酪酸エチル、トリアセチン、一酢酸プロピレングリコール、二酢酸プロピレングリコール、．イプシロン．－カプロラクトン及びその異性体、δ－バレロラクトン及びその異性体、β－ブチロラクトン及びその異性体などのエステル；並びにジメチルアセトアミド、ジメチルイソソルビド、Ｎ－メチルピロリドン、モノオクタノイン、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、及び水などの当技術分野で既知の他の可溶化剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0400】
可溶化剤の混合物も使用することができる。例としては、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ポリエチレングリコール２００－１００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、及びジメチルイソソルビドが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい可溶化剤としては、ソルビトール、グリセロール、トリアセチン、エチルアルコール、ＰＥＧ－４００、グリコフロール、及びプロピレングリコールが挙げられる。
【0401】
含まれ得る可溶化剤の量は、特に制限されない。所定の可溶化剤の量は、生物学的に許容可能な量に限定されることがあり、この量は、当業者によって容易に決定され得る。場合により、例えば薬物濃度を最大にするために、生物学的に許容可能な量を遥かに超える量の可溶化剤を含むことが有利であり得、過剰の可溶化剤は、患者への組成物の投与に先立ち、蒸留又は蒸発などの従来の技術を使用して除去される。したがって、存在する場合、可溶化剤は、薬物及び他の賦形剤の合計重量に基づいて、１０重量％、２５重量％、５０重量％、１００重量％、又は最大約２００重量％の重量比であり得る。必要に応じて、５％、２％、１％、又は更にはそれ以下などの非常に少量の可溶化剤を使用することもできる。典型的には、可溶化剤は、約１重量％～約１００重量％、より典型的には、約５重量％～約２５重量％の量で存在することができる。
【0402】
組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な添加剤及び賦形剤を更に含むことができる。そのような添加剤及び賦形剤としては、粘着除去剤、消泡剤、緩衝剤、ポリマー、抗酸化剤、防腐剤、キレート剤、粘度調節剤、張性調節剤、香味料、着色剤、臭気剤、乳白剤、懸濁剤、結合剤、フィラー、可塑剤、潤滑剤、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0403】
注射による投与用に本開示の組成物が組み込まれ得る形態としては、水性若しくは油性懸濁液又はエマルジョンが挙げられ、ゴマ油、コーン油、綿実油、又は落花生油、並びにエリキシル剤、マンニトール、デキストロース、又は滅菌水溶液、及び類似の医薬ビヒクルを含む。
【0404】
生理食塩水中の水溶液もまた、従来、注射用に使用されている。エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール（及びそれらの好適な混合物）、シクロデキストリン誘導体、並びに植物油も用いられ得る。適切な流動性は、例えば、分散液の場合に必要な粒子サイズを維持するためのレシチンなどのコーティングの使用によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールによってもたらされ得る。
【0405】
本開示の組成物は、ゲル、水溶性ゼリー、クリーム、ローション、懸濁液、フォーム、粉末、スラリー、軟膏、溶液、油、ペースト、坐剤、スプレー、エマルジョン、生理食塩水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ベースの溶液などの、局所又は外用投与に適した固体、半固体、又は液体形態の調製物に製剤化され得る。一般に、より高密度の担体は、領域に、有効成分への長時間の曝露を提供することができる。対照的に、溶液製剤は、選択された領域に、有効成分のより即時性の曝露を提供することができる。
【0406】
医薬組成物はまた、好適な固相又はゲル相担体又は賦形剤を含むことができ、これらは、皮膚の角質層透過性バリアにわたる治療用分子の浸透を高める、又はその送達を助ける化合物である。外用製剤の分野で訓練された者に知られているこれらの浸透促進分子が多く存在する。そのような担体及び賦形剤の例としては、ヒューメクタント（例えば、尿素）、グリコール（例えば、プロピレングリコール）、アルコール（例えば、エタノール）、脂肪酸（例えば、オレイン酸）、界面活性剤（例えば、ミリスチン酸イソプロピル及びラウリル硫酸ナトリウム）、ピロリドン、モノラウリン酸グリセロール、スルホキシド、テルペン（例えば、メントール）、アミン、アミド、アルカン、アルカノール、水、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、並びにポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0407】
本開示の方法における使用のための別の例示的な製剤は、経皮送達デバイス（「パッチ」）を用いる。そのような経皮パッチを使用して、別の活性医薬成分の有無にかかわらず、制御された量で、本明細書に記載される連続又は不連続の注入組成物を提供することができる。薬剤送達のための経皮パッチの構築及び使用は、当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号、同第４，９９２，４４５号、及び同第５，００１，１３９号（これらの各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。そのようなパッチは、薬剤の連続性、拍動性、又はオンデマンド送達用に構築され得る。
【0408】
医薬組成物はまた、本明細書に記載される組成物、及び舌下、頬側、直腸、骨内、眼内、鼻腔内、硬膜外、又は脊髄内投与に適した１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤から調製され得る。そのような医薬組成物の調製は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄａｔａ，Ｔｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，２００２、及びＰｒａｔｔ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，ｅｄｓ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ａｃｔｉｏｎ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｎ．Ｙ．，１９９０（これらの各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0409】
これらの方法としては、経口経路、十二指腸内経路、非経口注射（静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、血管内、腹腔内、若しくは注入を含む）、外用（例えば、経皮適用）、カテーテル若しくはステントによる局所送達を介した直腸投与、又は吸入、脂肪内又は髄腔内が挙げられる。
【0410】
本開示の組成物はまた、ステント、すなわち、動脈内に挿入された円筒形ポリマーなど、含浸又はコーティングされたデバイスを介して送達され得る。そのような投与方法は、例えば、バルーン血管形成術などの施術後の再狭窄の予防又は改善を助けることができる。理論に拘束されるものではないが、本開示の化合物は、再狭窄に寄与する動脈壁における平滑筋細胞の遊走及び増殖を遅延させる又は阻害することができる。本開示の化合物は、例えば、ステントのストラットから、ステントグラフトから、グラフトから、又はステントのカバー若しくはシースからの局所送達によって投与され得る。いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、マトリックスと混合される。そのようなマトリックスは、高分子マトリックスであり得、化合物をステントに結合させるのに役立ち得る。そのような使用に適した高分子マトリクスとしては、例えば、ポリラクチド、ポリカプロラクトングリコリド、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリアミノ酸、多糖類、ポリホスファゼン、ポリ（エーテル－エステル）コポリマー（例えば、ＰＥＯ－ＰＬＬＡ）などのラクトンベースのポリエステル又はコポリエステル；ポリジメチルシロキサン、ポリ（エチレン－ビニルアセテート）、アクリレートベースのポリマー又はコポリマー（例えば、ポリヒドロキシエチルメチルメタクリレート、ポリビニルピロリジノン）、ポリテトラフルオロエチレンなどのフッ素化ポリマー、及びセルロースエステルが挙げられる。好適なマトリックスは、非分解性であり得るか、又は経時的に分解して、化合物を放出し得る。本明細書で開示される組成物は、ディップ／スピンコーティング、スプレーコーティング、ディップコーティング、及び／又はブラシコーティングなどの様々な方法によってステントの表面に適用され得る。化合物を溶媒中で適用することができ、溶媒を蒸発させ、したがってステント上に化合物の層を形成することができる。あるいは、組成物は、ステント又はグラフの本体、例えば、マイクロチャネル又はマイクロポアに位置付けられ得る。埋め込まれると、組成物は、ステントの本体から拡散して動脈壁に接触する。そのようなステントは、そのようなマイクロポア又はマイクロチャネルを含有するように製造したステントを、好適な溶媒中の本開示の化合物の溶液に浸漬した後、溶媒を蒸発させることによって調製され得る。本明細書で開示される組成物は、血管形成術中に使用されるバルーンから血管内に投与され得る。本開示の組成物の心膜を介する又は外膜適用を介する血管外投与も、再狭窄を減少させるために実施され得る。
【0411】
例示的な非経口投与形態としては、無菌水溶液中の溶液又は懸濁液、例えば、プロピレングリコール水溶液又はデキストロース水溶液が挙げられる。そのような剤形は、必要に応じて、好適に緩衝化され得る。
【0412】
本開示は、キットも提供する。キットは、好適なパッケージ内に、本明細書で開示される組成物を含み、使用説明書、臨床試験の内容、及び副作用のリストを含み得る文書を含む。そのようなキットは、科学文献の参考文献、添付文書、臨床試験結果、及び／又はこれらの要約などの情報も含むことができ、これらは、組成物の活性及び／若しくは利点を示すか若しくは確立し、かつ／又は用量、用法、副作用、薬物相互作用、又は医療提供者に有用な他の情報を記載する。そのような情報は、様々な研究、例えば、インビボモデルを含む実験動物を使用した研究、及びヒトの臨床試験に基づく研究の結果に基づき得る。キットは、別の活性医薬成分を更に含有し得る。使用に適したパッケージング及び追加の物品（例えば、液体調製物用の計量カップ、空気への曝露を最小限にするためのフォイル包装など）は、当技術分野において知られており、キットに含まれ得る。本明細書に記載されるキットは、医師、看護師、薬剤師、処方官（ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ｏｆｆｉｃｉａｌｓ）などを含む医療提供者に提供、販売、及び／又は宣伝され得る。キットはまた、いくつかの実施形態では、消費者に直接販売され得る。キットは、好ましくは、本明細書に記載される疾患及び状態の治療における使用を目的とする。
【0413】
以下の条項は、特定の実施形態を説明する。
【0414】
第１項． ｉ）コラーゲン発現の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、及び／又はｉｉ）クローディン－１発現の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、及び／又はもう１つの抗炎症遺伝子の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、によって軽減される障害、疾患、又は状態の治療又は予防の方法であって、方法が、約１ｋＤａ～約５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａ、約１４ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約２５ｋＤａ、約２５ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約３５ｋＤａ、約３５ｋＤａ～約４０ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約５４ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａ、約４０ｋＤａ～約４５ｋＤａ、約４５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ～約１００ｋＤａ、及び約８０ｋＤａ～約１４４ｋＤａから選択される平均重量平均分子量と、１～約５の多分散性とを有する絹フィブロイン断片を含む組成物を、対象に投与することを含み、組成物中の絹フィブロイン断片の濃度が、約０．００１％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖである、方法。
【0415】
第２項． 組成物が、０～５００ｐｐｍの臭化リチウムを更に含む、第１項に記載の方法。
【0416】
第３項． 組成物が、０～５００ｐｐｍの炭酸ナトリウムを更に含む、第１項又は第２項に記載の方法。
【0417】
第４項． 絹フィブロイン断片が、１～約１．５の多分散性を有する、第１～３項のいずれか一項に記載の方法。
【0418】
第５項． 絹フィブロイン断片が、約１．５～約２．０の多分散性を有する、第１～３項のいずれか一項に記載の方法。
【0419】
第６項． 絹フィブロイン断片が、約１．５～約３．０の多分散性を有する、第１～３項のいずれか一項に記載の方法。
【0420】
第７項． 絹フィブロイン断片が、約２．０～約２．５の多分散性を有する、第１～３項のいずれか一項に記載の方法。
【0421】
第８項． 絹フィブロイン断片が、約２．５～約３．０の多分散性を有する、第１～３項のいずれか一項に記載の方法。
【0422】
第９項． 絹フィブロイン断片が、組成物に製剤化する前の少なくとも１０日間、水溶液中にある場合、自然発生的に又は徐々にゲル化せず、色又は濁度が視覚的に変化しない、第１～８項のいずれか一項に記載の方法。
【0423】
第１０ａ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１０ｂ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約２％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１０ｃ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１０ｄ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１０ｅ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約５％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１０ｆ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約６％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１０ｇ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１０ｈ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１０ｉ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約９％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。
【0424】
第１１ａ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０１％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１１ｂ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００２％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１１ｃ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００３％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１１ｄ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００４％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１１ｅ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００５％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１１ｆ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００６％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１１ｇ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００７％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１１ｈ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００８％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１１ｉ項． 絹フィブロイン断片が、約０．００９％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。
【0425】
第１２ａ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０２５％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１２ｂ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０１％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１２ｃ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０２％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１２ｄ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０３％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１２ｅ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０４％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１２ｆ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０５％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１２ｇ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０６％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１２ｈ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０７％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１２ｉ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０８％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１２ｊ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０９％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。
【0426】
第１３ａ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０５％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｂ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０１％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｃ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０２％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｄ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０３％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｅ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０４％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｆ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０６％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｇ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０７％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｈ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０８％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｉ項． 絹フィブロイン断片が、約０．０９％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｊ項． 絹フィブロイン断片が、約０．１％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。
【0427】
第１３ｋ項． 絹フィブロイン断片が、約０．１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｌ項． 絹フィブロイン断片が、約０．１５％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｍ項． 絹フィブロイン断片が、約０．２％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｎ項． 絹フィブロイン断片が、約０．２５％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｏ項． 絹フィブロイン断片が、約０．３％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｐ項． 絹フィブロイン断片が、約０．３５％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｑ項． 絹フィブロイン断片が、約０．４％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｒ項． 絹フィブロイン断片が、約０．４５％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｓ項． 絹フィブロイン断片が、約０．５％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｔ項． 絹フィブロイン断片が、約０．５５％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｕ項． 絹フィブロイン断片が、約０．６％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｖ項． 絹フィブロイン断片が、約０．６５％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｘ項． 絹フィブロイン断片が、約０．７又は０．７５％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｙ項． 絹フィブロイン断片が、約０．８又は０．８５％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。第１３ｚ項． 絹フィブロイン断片が、約０．９又は０．９５％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第１～９項のいずれか一項に記載の方法。
【0428】
第１４ａ項． 組成物が、注射可能な組成物又は外用組成物として製剤化される、第１～１３項のいずれか一項に記載の方法。第１４ｂ項． 組成物が、ゲル、ゼリー、クリーム、ローション、フォーム、スラリー、軟膏、油、ペースト、坐剤、スプレー、半固体組成物、固体組成物、スティック、又はムースとして製剤化される、第１～１３項のいずれか一項に記載の方法。
【0429】
第１５項． 組成物が、薬学的に許容可能な担体を更に含む、第１～１４項のいずれか一項に記載の方法。
【0430】
第１６ａ項． 薬学的に許容可能な担体が、水相を含む、第１５項に記載の方法。第１６ｂ項． 薬学的に許容可能な担体が、懸濁液、エマルジョン、粉末、溶液、分散液、又はエリキシルのうちの１つ以上を含む、第１５項に記載の方法。
【0431】
第１７項． 薬学的に許容可能な担体が、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンを含む、第１５項又は第１６項に記載の方法。
【0432】
第１８ａ項． 組成物が、上皮表面への投与のために製剤化される、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。第１８ｂ項． 組成物が、注射によって投与されるために製剤化される、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。第１８ｃ項． 組成物が、皮下注射、皮内注射、経皮注射、又は真皮下注射によって投与されるために製剤化される、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。第１８ｄ項． 組成物が、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、骨内注射、心臓内注射、関節内注射、又は海綿体内注射によって投与されるために製剤化される、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。第１８ｅ項． 組成物が、デポー注射によって、浸潤注射によって、留置カテーテルによって、又はマイクロニードルによって投与されるために製剤化される、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。第１８ｆ項． 組成物が、経皮的に投与されるために製剤化される、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。
【0433】
第１９項． 上皮表面が、表層表皮領域、角質層、眼表面、又は腸表面である、第１８項に記載の方法。
【0434】
第２０項． 組成物が、経表皮水分蒸散量を低減するために製剤化される、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。
【0435】
第２１項． 組成物が、バリア製剤として製剤化される、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。
【0436】
第２２項． 組成物が、創傷閉鎖製剤として製剤化される、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。
【0437】
第２３項． 組成物が、対象における皺を予防若しくは改善する、対象における加齢性色素斑を予防若しくは改善する、対象における乾燥肌を予防若しくは改善する、又は対象における不均一な皮膚の色調を予防若しくは改善するために製剤化される、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。
【0438】
第２４項． 組成物が、対象における皮膚のたるみを予防若しくは改善する、対象における皮膚の老化を予防若しくは改善する、対象における低減した皮膚の引張強度を予防若しくは改善する、対象における光損傷した皮膚を予防若しくは改善する、又は対象における皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を予防若しくは改善するために製剤化される、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。
【0439】
第２５ａ項． 疾患又は状態が、皺、加齢性色素斑、乾燥肌、不均一な皮膚の色調、皮膚のたるみ、皮膚の老化、低減した皮膚の引張強度、光損傷した皮膚、又は皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を含む、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。第２５ｂ項． 疾患又は状態が、甲状腺ホルモン誘発性心筋肥大、又は腱の断裂、損傷、若しくは裂傷を含む、第１～１７項のいずれか一項に記載の方法。
【0440】
第２６項． 約１ｋＤａ～約５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約６ｋＤａ～約１７ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約１７ｋＤａ～約３９ｋＤａ、約１４ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約２５ｋＤａ、約２５ｋＤａ～約３０ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約３５ｋＤａ、約３５ｋＤａ～約４０ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約５４ｋＤａ、約３９ｋＤａ～約８０ｋＤａ、約４０ｋＤａ～約４５ｋＤａ、約４５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ～約１００ｋＤａ、及び約８０ｋＤａ～約１４４ｋＤａから選択される平均重量平均分子量と、１～約５の多分散性とを有する絹フィブロイン断片を含む組成物の使用であって、組成物中の絹フィブロイン断片の濃度が、約０．００１％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖであり、ｉ）コラーゲン発現の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、及び／又はｉｉ）クローディン－１発現の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、及び／又はｉｉｉ）もう１つの抗炎症遺伝子の刺激若しくは調節を必要とする対象において、それを行うこと、によって軽減される障害、疾患、又は状態の治療又は予防のための薬剤の製造における、使用。
【0441】
第２７項． 組成物が、０～５００ｐｐｍの臭化リチウムを更に含む、第２６項に記載の使用。
【0442】
第２８項． 組成物が、０～５００ｐｐｍの炭酸ナトリウムを更に含む、第２６項又は第２７項に記載の使用。
【0443】
第２９項． 絹フィブロイン断片が、１～約１．５の多分散性を有する、第２６～２８項のいずれか一項に記載の使用。
【0444】
第３０項． 絹フィブロイン断片が、約１．５～約２．０の多分散性を有する、第２６～２８項のいずれか一項に記載の使用。
【0445】
第３１項． 絹フィブロイン断片が、約１．５～約３．０の多分散性を有する、第２６～２８項のいずれか一項に記載の使用。
【0446】
第３２項． 絹フィブロイン断片が、約２．０～約２．５の多分散性を有する、第２６～２８項のいずれか一項に記載の使用。
【0447】
第３３項． 絹フィブロイン断片が、約２．５～約３．０の多分散性を有する、第２６～２８項のいずれか一項に記載の使用。
【0448】
第３４項． 絹フィブロイン断片が、組成物に製剤化する前の少なくとも１０日間、水溶液中にある場合、自然発生的に又は徐々にゲル化せず、色又は濁度が視覚的に変化しない、第２６～３３項のいずれか一項に記載の使用。
【0449】
第３５項． 絹フィブロイン断片が、約０．００１％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第２６～３４項のいずれか一項に記載の使用。
【0450】
第３６項． 絹フィブロイン断片が、約０．０１％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第２６～３４項のいずれか一項に記載の方法。
【0451】
第３７項． 絹フィブロイン断片が、約０．０２５％ｗ／ｖ～約１％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第２６～３４項のいずれか一項に記載の使用。
【0452】
第３８項． 絹フィブロイン断片が、約０．０５％ｗ／ｖ～約０．７％ｗ／ｖで組成物中に存在する、第２６～３４項のいずれか一項に記載の使用。
【0453】
第３９項． 組成物が、注射可能な組成物又は外用組成物として製剤化される、第２６～３８項のいずれか一項に記載の使用。
【0454】
第４０項． 組成物が、薬学的に許容可能な担体を更に含む、第２６～３９項のいずれか一項に記載の使用。
【0455】
第４１項． 薬学的に許容可能な担体が、水相を含む、第４０項に記載の使用。
【0456】
第４２項． 薬学的に許容可能な担体が、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンを含む、第４０又は４１項に記載の使用。
【0457】
第４３項． 組成物が、上皮表面への投与のために製剤化される、第２６～４２項のいずれか一項に記載の使用。
【0458】
第４４項． 上皮表面が、表層表皮領域、角質層、眼表面、又は腸表面である、第４３項に記載の使用。
【0459】
第４５項． 組成物が、経表皮水分蒸散量を低減するために製剤化される、第２６～４２項のいずれか一項に記載の使用。
【0460】
第４６項． 組成物が、バリア製剤として製剤化される、第２６～４２項のいずれか一項に記載の使用。
【0461】
第４７項． 組成物が、創傷閉鎖製剤として製剤化される、第２６～４２項のいずれか一項に記載の使用。
【0462】
第４８項． 組成物が、対象における皺を予防若しくは改善する、対象における加齢性色素斑を予防若しくは改善する、対象における乾燥肌を予防若しくは改善する、又は対象における不均一な皮膚の色調を予防若しくは改善するために製剤化される、第２６～４２項のいずれか一項に記載の使用。
【0463】
第４９項． 組成物が、対象における皮膚のたるみを予防若しくは改善する、対象における皮膚の老化を予防若しくは改善する、対象における低減した皮膚の引張強度を予防若しくは改善する、対象における光損傷した皮膚を予防若しくは改善する、又は対象における皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を予防若しくは改善するために製剤化される、第２６～４２項のいずれか一項に記載の使用。
【0464】
第５０項． 疾患又は状態が、皺、加齢性色素斑、乾燥肌、不均一な皮膚の色調、皮膚のたるみ、皮膚の老化、低減した皮膚の引張強度、光損傷した皮膚、又は皮膚伸展線条（ストレッチマーク）を含む、第２６～４２項のいずれか一項に記載の使用。
【実施例】
【0465】
ここで、以下の実施例を参照して、本明細書に包含される実施形態が説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は、決してこれらの実施例に限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形例を包含するものとして解釈されるべきである。
【0466】
一般的手順
本発明の組成物は、当技術分野で既知の様々な方法によって作製され得る。そのような方法には、以下の実施例のもの、及び以下に具体的に例示される方法が含まれる。
本発明の組成物は、当技術分野で既知の様々な方法によって作製され得る。そのような方法には、以下の実施例のもの、及び以下に具体的に例示される方法が含まれる。
【0467】
実施例１：絹フィブロインによるコラーゲン刺激
皮膚の健康及び老化における絹－コラーゲンの関係－薬用化粧品が増えている。アンチエイジングスキンケア製品及び敏感肌の消費者による使用に適した製品に対する需要の高まりに応えて、スキンケア業界は、「薬用化粧品」を開発している。これらの化粧品は、皮膚の健康を強化し、かつそれを美しくするために、生物学的に活性な成分を組み込み、それらの目的は、皮膚の不完全性を隠すのではなく、その原因を解決することである。薬用化粧品に対する需要の高まりは、若い外観を保持したいという付随する願望を伴う世界人口の高齢化の結果であり、過去１０年間は、４０歳以上の人々の著しい増加を伴う急速な人口増加が見られ、これらの高齢群における化粧品の使用も増加している。その結果、皺、加齢性色素斑、乾燥肌、及び不均一な皮膚の色調を予防又は改善する製品の需要が高まり、新たな処方の開発及び業界の成長に拍車をかけている。［Ｍｏｒｄｏｒ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（２０１９）． Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｍａｒｋｅｔ－Ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｔｙｐｅ（Ｓｋｉｎ Ｃａｒｅ，Ｈａｉｒ Ｃａｒｅ，Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ，Ｏｒａｌ Ｃａｒｅ），Ａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ，Ｂｏｔａｎｉｃａｌｓ，Ｅｘｆｏｌｉａｎｔｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ），ａｎｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ－Ｇｒｏｗｔｈ，Ｔｒｅｎｄｓ，ａｎｄ Ｆｏｒｅｃａｓｔ（２０１９－２０２４）。ｗｗｗ．ｍｏｒｄｏｒｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｉｎｄｕｓｔｒｙ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｌｏｂａｌ－ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－ｍａｒｋｅｔ－ｉｎｄｕｓｔｒｙで入手可能。２０１９年５月５日にアクセス。ｗｅｂ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／２０１９０５０６１８４３００／ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｏｒｄｏｒｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｉｎｄｕｓｔｒｙ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｌｏｂａｌ－ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－ｍａｒｋｅｔ－ｉｎｄｕｓｔｒｙでアーカイブ。］これらの製品は、皮膚の疾患状態を治療するための薬物を含んでいないため、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの機関によって規制されておらず、医師の処方箋を必要としない。［Ｍａｒｔｉｎ ＫＩ，Ｇｌａｓｅｒ ＤＡ（２０１１）Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ ｂｅａｕｔｙ． Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１０８：１、Ｒｅｐｏｒｔ Ｌｉｎｋｅｒ（２０１８）Ｇｌｏｂａｌ Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｍａｒｋｅｔ Ｏｕｔｌｏｏｋ ２０２２。ｗｗｗ．ｒｅｐｏｒｔｌｉｎｋｅｒ．ｃｏｍ／ｐ０１１０３４８７／Ｇｌｏｂａｌ－Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－Ｍａｒｋｅｔ－Ｏｕｔｌｏｏｋ．ｈｔｍｌで入手可能。２０１９年５月５日にアクセス。ｗｅｂ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／２０１９０５０６１８４７５８／ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｏｒｔｌｉｎｋｅｒ．ｃｏｍ／ｐ０１１０３４８７／Ｇｌｏｂａｌ－Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－Ｍａｒｋｅｔ－Ｏｕｔｌｏｏｋ．ｈｔｍｌでアーカイブ。］薬用化粧品の高い人気及びアクセサビリティのために、それらの世界市場は、２０１７年に４７０億米ドルであり、２０２３年までに８００億米ドル値に達すると予想されている。［Ｍｏｒｄｏｒ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（２０１９）． Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｍａｒｋｅｔ－Ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｔｙｐｅ（Ｓｋｉｎ Ｃａｒｅ，Ｈａｉｒ Ｃａｒｅ，Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ，Ｏｒａｌ Ｃａｒｅ），Ａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ，Ｂｏｔａｎｉｃａｌｓ，Ｅｘｆｏｌｉａｎｔｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ），ａｎｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ－Ｇｒｏｗｔｈ，Ｔｒｅｎｄｓ，ａｎｄ Ｆｏｒｅｃａｓｔ（２０１９－２０２４）。ｗｗｗ．ｍｏｒｄｏｒｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｉｎｄｕｓｔｒｙ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｌｏｂａｌ－ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－ｍａｒｋｅｔ－ｉｎｄｕｓｔｒｙで入手可能。２０１９年５月５日にアクセス。ｗｅｂ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／２０１９０５０６１８４３００／ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｏｒｄｏｒｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｉｎｄｕｓｔｒｙ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｌｏｂａｌ－ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－ｍａｒｋｅｔ－ｉｎｄｕｓｔｒｙでアーカイブ。］米国では、薬用化粧品市場は、近年、１００億ドルを遥かに超えた小売売上高があり、成長を続けている。［Ｐａｃｋａｇｅｄ Ｆａｃｔｓ（２０１２）Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ＵＳ． ６ｔｈ ｅｄ． ｗｗｗ．ｐａｃｋａｇｅｄｆａｃｔｓ．ｃｏｍ／Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－Ｅｄｉｔｉｏｎ－６２８１７７５／で入手可能。２０１９年５月５日にアクセス。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／２０１９０５０６１８３８０６／ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐａｃｋａｇｅｄｆａｃｔｓ．ｃｏｍ／Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－Ｅｄｉｔｉｏｎ－６２８１７７５／］でアーカイブ。］
皮膚の健康及び老化における絹－コラーゲンの関係－薬用化粧品が増えている。アンチエイジングスキンケア製品及び敏感肌の消費者による使用に適した製品に対する需要の高まりに応えて、スキンケア業界は、「薬用化粧品」を開発している。これらの化粧品は、皮膚の健康を強化し、かつそれを美しくするために、生物学的に活性な成分を組み込み、それらの目的は、皮膚の不完全性を隠すのではなく、その原因を解決することである。薬用化粧品に対する需要の高まりは、若い外観を保持したいという付随する願望を伴う世界人口の高齢化の結果であり、過去１０年間は、４０歳以上の人々の著しい増加を伴う急速な人口増加が見られ、これらの高齢群における化粧品の使用も増加している。その結果、皺、加齢性色素斑、乾燥肌、及び不均一な皮膚の色調を予防又は改善する製品の需要が高まり、新たな処方の開発及び業界の成長に拍車をかけている。［Ｍｏｒｄｏｒ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（２０１９）． Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｍａｒｋｅｔ－Ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｔｙｐｅ（Ｓｋｉｎ Ｃａｒｅ，Ｈａｉｒ Ｃａｒｅ，Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ，Ｏｒａｌ Ｃａｒｅ），Ａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ，Ｂｏｔａｎｉｃａｌｓ，Ｅｘｆｏｌｉａｎｔｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ），ａｎｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ－Ｇｒｏｗｔｈ，Ｔｒｅｎｄｓ，ａｎｄ Ｆｏｒｅｃａｓｔ（２０１９－２０２４）。ｗｗｗ．ｍｏｒｄｏｒｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｉｎｄｕｓｔｒｙ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｌｏｂａｌ－ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－ｍａｒｋｅｔ－ｉｎｄｕｓｔｒｙで入手可能。２０１９年５月５日にアクセス。ｗｅｂ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／２０１９０５０６１８４３００／ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｏｒｄｏｒｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｉｎｄｕｓｔｒｙ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｌｏｂａｌ－ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－ｍａｒｋｅｔ－ｉｎｄｕｓｔｒｙでアーカイブ。］これらの製品は、皮膚の疾患状態を治療するための薬物を含んでいないため、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの機関によって規制されておらず、医師の処方箋を必要としない。［Ｍａｒｔｉｎ ＫＩ，Ｇｌａｓｅｒ ＤＡ（２０１１）Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ ｂｅａｕｔｙ． Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１０８：１、Ｒｅｐｏｒｔ Ｌｉｎｋｅｒ（２０１８）Ｇｌｏｂａｌ Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｍａｒｋｅｔ Ｏｕｔｌｏｏｋ ２０２２。ｗｗｗ．ｒｅｐｏｒｔｌｉｎｋｅｒ．ｃｏｍ／ｐ０１１０３４８７／Ｇｌｏｂａｌ－Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－Ｍａｒｋｅｔ－Ｏｕｔｌｏｏｋ．ｈｔｍｌで入手可能。２０１９年５月５日にアクセス。ｗｅｂ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／２０１９０５０６１８４７５８／ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｏｒｔｌｉｎｋｅｒ．ｃｏｍ／ｐ０１１０３４８７／Ｇｌｏｂａｌ－Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－Ｍａｒｋｅｔ－Ｏｕｔｌｏｏｋ．ｈｔｍｌでアーカイブ。］薬用化粧品の高い人気及びアクセサビリティのために、それらの世界市場は、２０１７年に４７０億米ドルであり、２０２３年までに８００億米ドル値に達すると予想されている。［Ｍｏｒｄｏｒ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（２０１９）． Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｍａｒｋｅｔ－Ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｔｙｐｅ（Ｓｋｉｎ Ｃａｒｅ，Ｈａｉｒ Ｃａｒｅ，Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ，Ｏｒａｌ Ｃａｒｅ），Ａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ，Ｂｏｔａｎｉｃａｌｓ，Ｅｘｆｏｌｉａｎｔｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ），ａｎｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ－Ｇｒｏｗｔｈ，Ｔｒｅｎｄｓ，ａｎｄ Ｆｏｒｅｃａｓｔ（２０１９－２０２４）。ｗｗｗ．ｍｏｒｄｏｒｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｉｎｄｕｓｔｒｙ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｌｏｂａｌ－ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－ｍａｒｋｅｔ－ｉｎｄｕｓｔｒｙで入手可能。２０１９年５月５日にアクセス。ｗｅｂ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／２０１９０５０６１８４３００／ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｏｒｄｏｒｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｉｎｄｕｓｔｒｙ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｌｏｂａｌ－ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－ｍａｒｋｅｔ－ｉｎｄｕｓｔｒｙでアーカイブ。］米国では、薬用化粧品市場は、近年、１００億ドルを遥かに超えた小売売上高があり、成長を続けている。［Ｐａｃｋａｇｅｄ Ｆａｃｔｓ（２０１２）Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ＵＳ． ６ｔｈ ｅｄ． ｗｗｗ．ｐａｃｋａｇｅｄｆａｃｔｓ．ｃｏｍ／Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－Ｅｄｉｔｉｏｎ－６２８１７７５／で入手可能。２０１９年５月５日にアクセス。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ａｒｃｈｉｖｅ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／２０１９０５０６１８３８０６／ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐａｃｋａｇｅｄｆａｃｔｓ．ｃｏｍ／Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ－Ｅｄｉｔｉｏｎ－６２８１７７５／］でアーカイブ。］
【0468】
皮膚の健康及び老化におけるコラーゲン、線維芽細胞、及び細胞外マトリックスの役割。
【0469】
真皮は、皮膚の最も大きな部分であり、主に、皮膚の強度、復元性、及び弾性に関与する、高密度でコラーゲンが豊富なタンパク質性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で構成されている。［Ｒｉｔｔｉｅ Ｌ，Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ（２０１５）Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｓｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ５：ａ０１５３７０、Ｑｕａｎ Ｔ，Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ（２０１５）Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｒｍａｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ａｇｉｎｇ：Ａ ｍｉｎｉ－ｒｅｖｉｅｗ． Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ６１：４２７－４３４．］数十年もの間、科学者らは、薄化、乾燥、細かい皺などの皮膚の老化の目に見える特徴が、加齢に伴う皮膚コラーゲンの分解の増加を反映することを知見している。［Ｓｍｉｔｈ ＪＧ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＥＡ，Ｓａｍｓ ＷＭ，Ｃｌａｒｋ ＲＤ（１９６２）Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｗｉｔｈ ａｇｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｕｎ ｄａｍａｇｅ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ３９：３４７－３５０、Ｌａｖｋｅｒ ＲＭ（１９７９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅｘｐｏｓｅｄ ａｎｄ ｕｎｅｘｐｏｓｅｄ ａｇｅｄ ｓｋｉｎ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ７３：５９－６６、Ｖａｒａｎｉ Ｊ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｇｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１４：４８０－４８６、Ｖａｒａｎｉ Ｊ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｇｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１４：４８０－４８６．］皮膚の結合組織の主要構成成分として、コラーゲンは、皮膚の強度及び復元性を維持する上で重要な役割を果たし、その変性は、脆弱で、容易にあざができ、一般的な若い外観を失った皮膚をもたらす。［同書。］より具体的には、真皮に対する加齢の影響は、コラーゲンベースの細胞外マトリックスの構造及び組織への有害な変化を伴う。［Ｒｉｔｔｉｅ Ｌ，Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ（２０１５）Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｓｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ５：ａ０１５３７０、Ｑｕａｎ Ｔ，Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ（２０１５）Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｒｍａｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ａｇｉｎｇ：Ａ ｍｉｎｉ－ｒｅｖｉｅｗ． Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ６１：４２７－４３４．］
【0470】
皮膚におけるこのコラーゲンの変性は、コラーゲン自体の発現の、通常の加齢に伴う減少と併せて、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）と呼ばれるコラーゲン分解酵素の発現の、通常の加齢に伴う増加の結果として生じる。酵素的ＭＭＰ作用の増加は、経時的に真皮ＥＣＭにおける断片化されたコラーゲンフィブリルの蓄積をもたらす。このコラーゲンの断片化に伴うＥＣＭの構造的完全性の喪失は、メカノトランスダクションとして知られる現象を介して、コラーゲンを産生する真皮線維芽細胞の形状の完全性の喪失に生物学的に変換される。［Ｒｉｔｔｉｅ Ｌ，Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ（２０１５）Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｓｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ５：ａ０１５３７０、Ｑｕａｎ Ｔ，Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ（２０１５）Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｒｍａｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ａｇｉｎｇ：Ａ ｍｉｎｉ－ｒｅｖｉｅｗ． Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ６１：４２７－４３４．］真皮線維芽細胞とその周囲のＥＣＭとの相互作用は、細胞表面上のインテグリンとして知られる膜貫通型結合及びシグナル伝達受容体を介して生じる。健康で若い皮膚に見られる、正常な組織張力などの適切な機械的応力を受けている「伸ばされた」コラーゲンマトリックスに付着した線維芽細胞では、コラーゲン産生が高い。しかしながら、コラーゲン発現は、老化した皮膚のＥＣＭに見られるような、より「弛緩した」ＥＣＭ環境内の線維芽細胞では抑制されており、断片化されたコラーゲンが多く蓄積する。［Ｃｈｉｑｕｅｔ Ｍ（１９９９）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｒｅｓｓ． Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ １８：４１７－４２６．］したがって、適切な線維芽細胞の形状の喪失は、その細胞機能の喪失に関連しており、これは、コラーゲン産生の更なる低減につながり、次いで、ＭＭＰ発現の増加につながる。［Ｒｉｔｔｉｅ Ｌ，Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ（２０１５）Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｓｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ５：ａ０１５３７０、Ｑｕａｎ Ｔ，Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ（２０１５）Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｒｍａｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ａｇｉｎｇ：Ａ ｍｉｎｉ－ｒｅｖｉｅｗ． Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ６１：４２７－４３４．］これらのコラーゲンベースの効果に加えて、皮膚の真皮線維芽細胞のポピュレーション（数）自体も加齢中に低減される。若年者の皮膚と高齢者の皮膚とでは、コラーゲン含量が６８％低減され、線維芽細胞の数が３５％低減されることが示されている。Ｖａｒａｎｉ Ｊ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｇｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１４：４８０－４８６、Ｖａｒａｎｉ Ｊ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｇｅｄ ｓｋｉｎ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ． ＡｍＪ Ｐａｔｈｏｌ １６８：１８６１－１８６８．］コラーゲン及びＭＭＰの発現及び線維芽細胞の細胞機能の変化のその後のフィードバックループは、コラーゲンマトリックスの密度低下がＥＣＭタンパク質産生の下方制御サイクルを永続させるため、老化した皮膚の目に見える特徴をもたらす、コラーゲンの恒常性の変化を助長する。［Ｒｉｔｔｉｅ Ｌ，Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ（２０１５）Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｓｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ５：ａ０１５３７０、Ｑｕａｎ Ｔ，Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ（２０１５）Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｒｍａｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ａｇｉｎｇ：Ａ ｍｉｎｉ－ｒｅｖｉｅｗ． Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ６１：４２７－４３４．］
【0471】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、皮膚の老化の顕在化の重要な決定因子は、真皮線維芽細胞の年齢ではなく、ＥＣＭの構造的な質であると考えられる。［Ｑｕａｎ Ｔ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｒｍａｌ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ａｇｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １３３：６５８－６６７．］したがって、ＥＣＭ及び線維芽細胞の健康を促進する老化又は損傷した皮膚の治療は、皮膚の外観の年齢依存性変化を成功裏に改善することができる。事実、研究によれば、老化した皮膚で観察されたコラーゲン産生の減少は、真皮線維芽細胞を刺激する処置によって幾分改善され得る。［Ｖａｒａｎｉ Ｊ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｇｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１４：４８０－４８６、Ｖａｒａｎｉ Ｊ ｅｔ ａｌ （２００６）Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｇｅｄ ｓｋｉｎ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ． ＡｍＪ Ｐａｔｈｏｌ １６８：１８６１－１８６８、Ｎｕｓｇｅｎｓ ＢＶ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｔｏｐｉｃａｌｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩＩ，ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍｉｓ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１６：８５３－８５９、Ｑｕａｎ Ｔ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｒｍａｌ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ， ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ａｇｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １３３：６５８－６６７、Ｒｉｔｔｉｅ Ｌ，Ｆｉｓｈｅｒ ＧＪ（２０１５）Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｓｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ５：ａ０１５３７０．］更に、日焼けで損傷した皮膚に見られる、より顕著な皮膚外観の変化は、コラーゲン産生線維芽細胞自体の損傷の結果ではないため、この損傷の改善も可能であると予想される。［Ｓｍｉｔｈ ＪＧ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＥＡ，Ｓａｍｓ ＷＭ，Ｃｌａｒｋ ＲＤ（１９６２）Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｗｉｔｈ ａｇｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｕｎ ｄａｍａｇｅ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ３９：３４７－３５０、Ｌａｖｋｅｒ ＲＭ（１９７９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅｘｐｏｓｅｄ ａｎｄ ｕｎｅｘｐｏｓｅｄ ａｇｅｄ ｓｋｉｎ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ７３：５９－６６、Ｖａｒａｎｉ Ｊ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｇｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１４：４８０－４８６、Ｖａｒａｎｉ Ｊ（２００１）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｉ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｄａｍａｇｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎ ｐｈｏｔｏａｇｅｄ ｓｋｉｎ ａｎｄ ｂｙ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ－ｄｅｇｒａｄｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５８：９３１－９４２、Ｖａｒａｎｉ Ｊ ｅｔ ａｌ （２００６）Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｇｅｄ ｓｋｉｎ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ． ＡｍＪ Ｐａｔｈｏｌ １６８：１８６１－１８６８．］
【0472】
絹ベースのスキンケアは、コラーゲン発現を促進し、老化及び損傷した皮膚を改善する。
【0473】
絹線維は、そのコアにおいて、フィブロインとして知られる天然タンパク質で構成されている。皮膚の結紮に利用された最初の埋め込み型生体材料として、絹フィブロインは、十分に確立された使用の歴史及びヒトの皮膚との適合性を誇る。２００３年に、著者らは、絹フィブロインタンパク質が線維芽細胞によるコラーゲン産生を誘導する能力について報告し、改変された絹タンパク質ベースのマトリックスを用いた線維芽細胞の培養により、コラーゲン発現が促進され、かつ線維芽細胞密度が増加した。［Ｃｈｅｎ Ｊ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｎ ＲＧＤ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｌｋ ｆｉｂｅｒｓ． Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ａ ６７：５５９－５７０．］絹フィブロインとＥＣＭ産生細胞との間の直接的相互作用が、これらの好ましい結果に関与したと考えられる。
【0474】
本明細書に記載されるように、絹フィブロインの液体製剤（ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標））は、線維芽細胞に影響を与える。すなわち、絹フィブロインを添加すると、培養中の線維芽細胞が刺激されて、対照線維芽細胞より２０～３０％超多いコラーゲンを産生する（絹フィブロインの添加濃度に応じて、図２を参照）。上記の有害なフィードバックループを考慮すると、この結果は、老化及び／又は損傷した皮膚の薬用化粧品治療の開発に非常に有望な発見である。
【0475】
スキンケア成分として、液体絹フィブロインは、ＥＣＭタンパク質の皮膚の知覚濃度を一時的に上昇させると考えられる。線維芽細胞上のインテグリンとの相互作用を介した分子シグナル伝達に加えて、絹フィブロインのタンパク質配列は、コラーゲンに存在するアミノ酸と容易かつ迅速に結合する水素が豊富なアミノ酸が主体となっている。具体的には、絹フィブロインのβシートが豊富な構造は、可逆的な水素結合で主に構成されており、そのタンパク質配列は、非極性アミノ酸のグリシン及びアラニンが主体となっている。［Ｍａｒｅｌｌｉ Ｂ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３３：１０２－１０８、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＷＡ ｅｔ ａｌ（１９５５）Ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｒｏｉｎ ａｎｄ ｏｆ Ｔｕｓｓａｈ Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｒｏｉｎ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ７７：３９０８－３９１３．］これらの水素が豊富なアミノ酸は、健康な皮膚、筋肉、及び骨の形成に関与するコラーゲンに存在する、密に存在する極性及び荷電アミノ酸と容易かつ迅速に結合する。［Ｌｏｄｉｓｈ Ｈ ｅｔ ａｌ． （２０００）Ｃｏｌｌａｇｅｎ：Ｔｈｅ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｔｒｉｘ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．］コラーゲンと絹フィブロインとの結合は、ＥＣＭの完全性及び安定性を更に高め得る、元来安定した相互作用である。［Ｓａｘｅｎａ Ｔ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｃｈａｐｔｅｒ ３－Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙ（Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）Ａ２－Ｋｕｍｂａｒ，Ｓａｎｇａｍｅｓｈ Ｇ．Ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｌａｕｒｅｎｃｉｎ ＣＴ，Ｄｅｎｇ Ｍ（ｅｄｓ），ｐｐ ４３－６５． Ｏｘｆｏｒｄ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．］インテグリンの絹フィブロインとの関与、及びＥＣＭの安定化によって刺激される、その後の正のフィードバック生物学的ループは、コラーゲン産生を促進し、より健康的で若々しい皮膚をもたらす（図１）。ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標）フィブロインは、ヒトの皮膚を引き締め、かつ張りを持たせることが臨床的に証明されている。
【0476】
ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標）は、絹フィブロインタンパク質の液体製剤である。絹フィブロインタンパク質を精製及び可溶化するためのプロセスは、有毒な化学物質を含まず、純粋な絹の繭、毒性のない塩、及び水のみを必要とする。これは、絹の調製に従来使用されているより過酷な加水分解法を、使用される塩及び生分解性ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標）の両方が、水路に流入しても安全であるため、廃水管理を必要としないグリーンケミストリー法に置き換えたものである。これは、ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標）が、ヒトの皮膚に接触する、合成の、かつ毒性を有し得る成分を、非毒性の、再生可能で、酸性に必要なエネルギーがより少なく、かつ廃棄物の生成がより少ない成分に置き換えることを意味する。ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標）は、生体適合性でもあり、あらゆるタイプの皮膚との接触に対して、敏感肌を有する人々に対してさえも、安全であることを意味する。事実、様々な形態の絹が、創傷被覆材及びグラフトの足場として使用されており、創傷治癒を改善することが見出されている。［Ａｌｔｍａｎ ＧＨ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｓｉｌｋ－ｂａｓｅｄ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４：４０１－４１６． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ４５７３２５４／、Ｔｈｕｒｂｅｒ ＡＥ，Ｏｍｅｎｅｔｔｏ ＦＧ，Ｋａｐｌａｎ ＤＬ（２０１５）Ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｉｏｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７１：１４５－１５７． ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ４５７３２５４／ｐｄｆ／ｎｉｈｍｓ７１７１０７．ｐｄｆ．］
【0477】
米国環境保護庁（ＥＰＡ）によれば、グリーンケミストリーは、ソース削減のための化学の使用、すなわち、化学試薬、溶媒、及び製品の危険性を最小限にする又は排除することによって、そのソースでの汚染を削減する。これは、そのような有害物質の使用又は生成を削減又は排除する化学製品及びプロセスの設計によって達成される。グリーンケミストリーの原則は、化学製品の製造、使用、及び廃棄を含む、そのライフサイクル全体に適用される。
【0478】
液体絹のフィブロイン単位は、様々な二次構造で堅牢な生体材料に自己組織化する能力を有し、通常、生物及び環境に悪影響を与える溶媒、可塑剤、又は触媒を必要とすることなしに、絹がより高次のポリマーに重合することができることを意味する。更に、タンパク質の疎水性の性質及び結晶化の傾向は、温度及び湿度の変化に対する復元性を与え、ゲル及びフィルムなどの構造の形成を促進する機会を提供する。［Ｌｉ ＡＢ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｓｉｌｋ－ｂａｓｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２１９：４１６－４３０． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ４６５６１２３／．］ｐＨの変動が効能を大幅に阻害し得る薬物及び生体分子とは異なり、絹フィブロインの水素が豊富なアミノ酸構造は、ｐＨ変化によって悪影響を受けない。［Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＷＡ ｅｔ ａｌ（１９５５）Ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｒｏｉｎ ａｎｄ ｏｆ Ｔｕｓｓａｈ Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｒｏｉｎ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ７７：３９０８－３９１３．］低ｐＨは、コラーゲンの機械的構造の「捻じれを戻す」ことができると仮定されている［Ｃｏｆｆｅｙ ＪＷ ｅｔ ａｌ（１９７６）Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ，ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１：５２８０－５２８２、Ｆｉｎｅ ＮＡ ｅｔ ａｌ（２０１５）ＳＥＲＩ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｓｃａｆｆｏｌｄ，ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ｓｉｌｋ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｉｎ ｔｗｏ－ｓｔａｇｅ ｂｒｅａｓｔ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ：１－ｙｅａｒ ｄａｔａ． Ｐｌａｓｔｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔ Ｓｕｒｇ １３５：３３９－３５１］（皮膚の密な角質層に位置する機械的構造など）。その結果、表皮及び真皮内への強化された輸送のためのプロトン化戦略は、ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標）の機能性を妨げないはずである。臨床スキンケア試験は、この仮説を裏付けており、低ｐＨの薬用美容液を塗布して、ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標）でアイトリートメントを行った後、わずか７日間で小皺及び皺の外観の減少が観察された。
【0479】
ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標）は、ハイドラント、乳化剤、エクスフォリアント、クレンザー、ゲル／フィラー、ビタミンＣなどの生物活性物質又は（フタレートを含まない）香料のための担体、更には静菌剤としての役割を果たすことができる。したがって、ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標）は、スキンケアにおいて非常に効果的な有効成分である。
【0480】
実施例２：コラーゲン産生に対するＡｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋの効果：研究の説明
研究目的：処置の２４時間後の、線維芽細胞培養物のコラーゲン濃度に対する試験物質（ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標））の効果の評価。初代ヒト線維芽細胞（継代５）を、２４ウェル培養プレートに５００００細胞／ｃｍ２で播種し、一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。培地を廃棄し、５００μＬの様々な濃度の試験品又は参照物質で置き換えた。プレートを２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。培養培地を除去し、細胞をリンスし、回収した。細胞内及び細胞外コラーゲンを、シリウスレッド色素（ネイティブコラーゲンの三重らせん（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ構造に対して特異的な親和性を示す）で定量化した。色素－コラーゲン複合体の吸光度は、５４０ｎｍで分光光度的に測定した。超音波処理後、ブラッドフォード法を使用して総タンパク質を評価した。
研究目的：処置の２４時間後の、線維芽細胞培養物のコラーゲン濃度に対する試験物質（ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ ＳＩＬＫ（商標））の効果の評価。初代ヒト線維芽細胞（継代５）を、２４ウェル培養プレートに５００００細胞／ｃｍ２で播種し、一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。培地を廃棄し、５００μＬの様々な濃度の試験品又は参照物質で置き換えた。プレートを２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。培養培地を除去し、細胞をリンスし、回収した。細胞内及び細胞外コラーゲンを、シリウスレッド色素（ネイティブコラーゲンの三重らせん（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ構造に対して特異的な親和性を示す）で定量化した。色素－コラーゲン複合体の吸光度は、５４０ｎｍで分光光度的に測定した。超音波処理後、ブラッドフォード法を使用して総タンパク質を評価した。
【0481】
試験系：細胞－現在の作業指示に従って調製された初代ヒト線維芽細胞。研究前に、細胞を培地ＤＭＤＭ ４．５ｇ／ｌのグルコース、２ｍＭのＬ－グルタミン又は安定化グルタミン、１０％熱不活化胎児子牛血清（ＦＣＳ）、５０ＵＩ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで培養する。研究中、ＦＣＳを、参照物質及び試験物質の両方の希釈のために、１％に低減する。細胞は、マイコプラズマが除去されている。マイコプラズマの評価を、現行の作業指示書に従って行った。
【0482】
参照物質：陰性対照：１％熱不活化ＦＣＳ培養培地；陽性対照：１％ＦＣＳ培養培地中の形質転換成長因子β１（ＴＧＦβ）２０ｎｇ／ｍｌ。
【0483】
材料及び試薬
材料：細胞培養用の２４ウェルプレート；吸光度読み取り用の９６ウェルプレート；細胞スクレーパー；超音波プローブ；ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ ＥＸプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）－読み取り範囲０～３．５単位の吸光度－直線性範囲０～２．０００単位の吸光度；細胞培養実験室で使用される従来の材料。
材料：細胞培養用の２４ウェルプレート；吸光度読み取り用の９６ウェルプレート；細胞スクレーパー；超音波プローブ；ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ ＥＸプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）－読み取り範囲０～３．５単位の吸光度－直線性範囲０～２．０００単位の吸光度；細胞培養実験室で使用される従来の材料。
【0484】
試薬：培養培地：ＤＭＥＭ ４．５ｇ／ｌのグルコース、２ｍＭのＬグルタミン又は安定化グルタミン、１０％熱不活化ＦＣＳ、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）（５℃±３℃で貯蔵）；ダルベッコのＰＢＳ Ｃａ２＋及びＭｇ２＋不含（室温２０℃±５℃で貯蔵）；Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｄ ８０ ＣＡＳ ２６１０－１０－８（室温２０℃±５℃で貯蔵）；プロテアーゼ阻害剤カクテル（５℃±３℃で貯蔵）；ブラッドフォード試薬（５℃±３℃で貯蔵）；ＢＳＡ溶液（ウシアルブミン血清）（５℃±３℃で貯蔵）；ＨＣｌ（室温２０℃±５℃で貯蔵）；ＮａＯＨ（室温２０℃±５℃で貯蔵）；ＴＧＦ β１（－２０℃±５℃で貯蔵）；３ｍｇ／ｍｌのコラーゲン溶液（５℃±３℃で貯蔵）。
【0485】
シリーズの定義：８つの濃度の試験物質を試験した。コラーゲンの評価を、非細胞毒性の４つの最高濃度で行った。各試験物質又は参照物質の状態を、少なくとも３つの培養ウェルで試験する。
【0486】
試験プロトコル
細胞播種：細胞を２４ウェル培養プレートに５００００細胞／ｃｍ２で播種し、次いで、一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。
細胞播種：細胞を２４ウェル培養プレートに５００００細胞／ｃｍ２で播種し、次いで、一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。
【0487】
細胞と試験物質との間の接触：試験物質及び参照物質の希釈を、１％ＦＣＳ培養培地で行った。培地を廃棄し、５００μｌの様々な濃度の試験物質又は参照物質で置き換えた。陰性対照のウェルを、１％ＦＣＳ培養培地で満たした。プレートを、４８時間±１時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。
【0488】
コラーゲン合成及び細胞密度の評価：各ウェルから培養培地を除去し、細胞層を５００μＬの２×濃縮プロテアーゼ阻害剤カクテルでリンスした。全ての培地及び阻害剤を、同一チューブ内にプールした。
【0489】
５００μＬの１×濃縮プロテアーゼ阻害剤カクテル中でスクレーピングすることにより細胞層を回収し、ウェルを５００μｌの１×カクテルで再度リンスした。細胞外マトリックスを構成する２つの容積を、同一チューブ内にプールし、超音波プローブによって４０秒間処置した。
【0490】
細胞内及び細胞外コラーゲンを、ネイティブコラーゲンの三重らせん（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ構造に対して特異的な親和性を示すシリウスレッド色素（Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｄ ８０）で定量化した。複合色素－コラーゲンの吸光度を、分光光度計を用いて５４０ｎｍで測定する。較正範囲を、０～１０μｇのコラーゲンで確立する。
【0491】
総タンパク質量を、ＰＢＳ中の０～４００μｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液から確立した較正範囲を用いて、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７６；７２：２４８－５４）を使用して評価した。３０μｌの各サンプル（試験物質、参照物質、標準の希釈）を、９６ウェルプレート中の２８０μｌのブラッドフォード試薬と混合した。プレートを、遮光下、室温で約１５分間インキュベートする。吸光度を、ブランクとしてのブラッドフォード試薬に対して６２０ｎｍで測定した。
【0492】
絹フィブロインを添加すると、培養中の線維芽細胞が刺激されて、絹フィブロインの添加濃度に応じて、対照線維芽細胞より２０～３０％超多いコラーゲンを産生する。また、コラーゲン産生は、絹組成に依存している（図２）。様々な絹濃度での細胞内コラーゲン産生は、絹の種類の関数として示される。刺激率は、陰性対照と比較したコラーゲン形成の増加である。絹平均ＭＷ組成：絹Ａ＝低ＭＷ（約１４ｋＤａ～約３０ｋＤａから選択される平均重量平均分子量）、絹Ｂ＝中ＭＷ（約３９ｋＤａ～約５４ｋＤａから選択される平均重量平均分子量）。
【0493】
結果の計算及び解釈
細胞密度：タンパク質濃度を、確立された検量線に従って計算する。吸光度＝ｆ（μｇでのタンパク質量）。これは、１ウェル当たりのタンパク質のμｇで表される。
細胞密度：タンパク質濃度を、確立された検量線に従って計算する。吸光度＝ｆ（μｇでのタンパク質量）。これは、１ウェル当たりのタンパク質のμｇで表される。
【0494】
コラーゲンの決定：ウェル毎のコラーゲンの量は、確立された検量線に従って決定する（吸光度＝ｆ（μｇでのコラーゲン量）。これは、１ウェル当たりのコラーゲンのμｇで表される。結果は、ウェル中のコラーゲン量とタンパク質量との間の比によって表される。
【0495】
実施例３：ヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン合成に対する中分子量及び低分子量（ＭＷ）絹の効果
Ｉ．研究の目的
ヒト真皮線維芽細胞からのコラーゲンの産生における絹の効果を決定すること
Ｉ．研究の目的
ヒト真皮線維芽細胞からのコラーゲンの産生における絹の効果を決定すること
【0496】
ＩＩ．試験物質及び濃度の計算
製剤：液体；貯蔵条件：冷蔵庫（４℃）； 試験物質の性質：化粧品成分。試験物質の濃度を以下に示す（表３－１）。試験物質の特定、純度、及び安定性に関連する情報は、製造部門の責任下にある。
製剤：液体；貯蔵条件：冷蔵庫（４℃）； 試験物質の性質：化粧品成分。試験物質の濃度を以下に示す（表３－１）。試験物質の特定、純度、及び安定性に関連する情報は、製造部門の責任下にある。
【表21】
【0497】
ＩＩＩ．研究の原則
線維芽細胞は、皮膚の真皮区画における主要な細胞である。それらは、コラーゲン合成に特化している。コラーゲンには多くの異なる種類があり、そのうちのほんのわずかが、皮膚の健康における役割を果たす。コラーゲン１及びコラーゲン３は、皮膚の健康及び美しさに重要である。存在量の観点から、コラーゲン１は、皮膚細胞外マトリックスの７０％を構成し、張力及びけん引力に対する耐性を付与する。（Ｈｕｉ Ｈｕｉ Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０；１０：１９７２３．） 皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン１遺伝子発現の低減は、真皮におけるコラーゲン１レベルを制限し、これは、皺形成を引き起こす（Ｈｕｉ Ｈｕｉ Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０；１０：１９７２３．）。したがって、コラーゲン１合成を促進することは、審美学及びアンチエイジングトリートメントに重要である（Ｈｕｉ Ｈｕｉ Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０；１０：１９７２３、ＤＭ Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｓｔ．Ａｅｓｔｈｅｔ．Ｒｅｓ．２０２１； ８：２）。一方で、コラーゲン４、特にＣＯＬ４Ａ１サブユニットは、疾患において顕著な役割を果たす（Ａｎａ Ｍａｒｉａ Ａｂｒｅｕ－Ｖｅｌｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０１２ Ｊａｎ；４（１）：１－８．）。
線維芽細胞は、皮膚の真皮区画における主要な細胞である。それらは、コラーゲン合成に特化している。コラーゲンには多くの異なる種類があり、そのうちのほんのわずかが、皮膚の健康における役割を果たす。コラーゲン１及びコラーゲン３は、皮膚の健康及び美しさに重要である。存在量の観点から、コラーゲン１は、皮膚細胞外マトリックスの７０％を構成し、張力及びけん引力に対する耐性を付与する。（Ｈｕｉ Ｈｕｉ Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０；１０：１９７２３．） 皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン１遺伝子発現の低減は、真皮におけるコラーゲン１レベルを制限し、これは、皺形成を引き起こす（Ｈｕｉ Ｈｕｉ Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０；１０：１９７２３．）。したがって、コラーゲン１合成を促進することは、審美学及びアンチエイジングトリートメントに重要である（Ｈｕｉ Ｈｕｉ Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０；１０：１９７２３、ＤＭ Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｓｔ．Ａｅｓｔｈｅｔ．Ｒｅｓ．２０２１； ８：２）。一方で、コラーゲン４、特にＣＯＬ４Ａ１サブユニットは、疾患において顕著な役割を果たす（Ａｎａ Ｍａｒｉａ Ａｂｒｅｕ－Ｖｅｌｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０１２ Ｊａｎ；４（１）：１－８．）。
【0498】
薬用化粧品治療で一般的に使用されるレチノールは、皮膚に有意な生物学的効果を及ぼさない。したがって、皮膚の健康において重要な役割を果たすために、レチノールは、レチノイン酸（レチノールよりも２０倍強力）に変換する必要がある（Ｍａｌｗｉｎａ Ｚａｓａｄａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ａｌｅｒｇｏｌ．２０１９ Ａｕｇ；３６（４）：３９２－３９７．）。異なる濃度のレチノイン酸は、真皮線維芽細胞によるコラーゲン１産生を刺激又は阻害することが示されている（Ｖａｒａｎｉ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９０ Ｍａｙ；９４（５）：７１７－２３．）。更に、レチノール及びレチノイン酸は、それらの不安定性（光及び空気感受性）並びに毒性によって制限される。これらの制限は、レチノール及びレチノイン酸を含有する生成物の製剤化、貯蔵、及び適用を複雑にする。したがって、コラーゲンをブーストし、製剤を安定化させ、安全かつ使いやすい新しい化粧品有効成分に対する満たされていないニーズがある。
【0499】
本研究は、正常なヒト真皮線維芽細胞を使用してコラーゲン産生に対する試験物質の有効性を評価することを目的とする。総（細胞内及び細胞外）コラーゲンをシリウスレッドで定量化した。複合染料－コラーゲンの吸光度を、５４０ｎｍの波長の分光光度計で決定した。定量的コラーゲン１遺伝子発現分析を、リアルタイムＰＣＲ標準法を使用して行った。フローサイトメトリーを使用して、試験物質を用いたインビトロヒト真皮線維芽細胞刺激後のコラーゲンタンパク質アイソフォームを検出／確認した。
【0500】
ＩＶ．研究過程及び方法
研究期間：２０２１年３月３０日～２０２１年８月３０日。
実験のために、ヒト真皮線維芽細胞の初代培養物を、７０％超のコンフルエンスに達したときに使用した。
研究期間：２０２１年３月３０日～２０２１年８月３０日。
実験のために、ヒト真皮線維芽細胞の初代培養物を、７０％超のコンフルエンスに達したときに使用した。
【0501】
インビトロモデル：細胞外マトリックス生成
初代ヒト真皮線維芽細胞を、１％ＦＢＳ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｃｙｔｉｖａ）を含有するＤＭＥＭ １ｇ／Ｌグルコース培地（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日、各処置条件とともに５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｖｉｔ Ｃとしても既知、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した培地を、各培養物に添加して、細胞外マトリックスの自己組織化を促進した：培地を２日毎に合計５日間、新鮮な培地で置き換えた。タイムラインは、実験の時間順序を示し、処置条件は図３に列挙されている：陽性対照処置は、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋Ｖｉｔ Ｃ（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）Ｇｈｅｔｔｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ． Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２０１８ Ａｕｇ； １７９（２）：３８１－３９３。
初代ヒト真皮線維芽細胞を、１％ＦＢＳ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｃｙｔｉｖａ）を含有するＤＭＥＭ １ｇ／Ｌグルコース培地（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日、各処置条件とともに５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｖｉｔ Ｃとしても既知、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した培地を、各培養物に添加して、細胞外マトリックスの自己組織化を促進した：培地を２日毎に合計５日間、新鮮な培地で置き換えた。タイムラインは、実験の時間順序を示し、処置条件は図３に列挙されている：陽性対照処置は、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋Ｖｉｔ Ｃ（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）Ｇｈｅｔｔｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ． Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２０１８ Ａｕｇ； １７９（２）：３８１－３９３。
【0502】
インビトロモデル：コラーゲン産生
初代ヒト真皮線維芽細胞を、１％ＦＢＳ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｃｙｔｉｖａ）を含有するＤＭＥＭ １ｇ／Ｌグルコース培地（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の各ウェルに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日、培地に、図４に示される処置条件を補充した。陽性対照処置は、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｖｉｔ Ｃ（２０μｇ／ｍｌ）であった。
初代ヒト真皮線維芽細胞を、１％ＦＢＳ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｃｙｔｉｖａ）を含有するＤＭＥＭ １ｇ／Ｌグルコース培地（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の各ウェルに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日、培地に、図４に示される処置条件を補充した。陽性対照処置は、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｖｉｔ Ｃ（２０μｇ／ｍｌ）であった。
【0503】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー染色のために以下の抗体を使用した：抗コラーゲン１（Ａｂｃａｍ）、抗ＣＯＬ４Ａ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、続いて、二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７コンジュゲート二次、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）－５９４コンジュゲート二次、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８コンジュゲート二次と反応させた。
フローサイトメトリー染色のために以下の抗体を使用した：抗コラーゲン１（Ａｂｃａｍ）、抗ＣＯＬ４Ａ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、続いて、二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７コンジュゲート二次、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）－５９４コンジュゲート二次、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８コンジュゲート二次と反応させた。
【0504】
定量的ＲＴ－ＰＣＲ
Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ ＭｉｃｒｏＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、全ＲＮＡを細胞から単離した。ＲＮＡを、ｑＰＣＲＢＩＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写し、結果として得られるｃＤＮＡを、ｑＰＣＲＢＩＯ ＳｙＧｒｅｅｎ Ｂｌｕｅ Ｍｉｘ Ｌｏ－ＲＯＸ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して増幅した。表３－２に示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った
Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ ＭｉｃｒｏＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、全ＲＮＡを細胞から単離した。ＲＮＡを、ｑＰＣＲＢＩＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写し、結果として得られるｃＤＮＡを、ｑＰＣＲＢＩＯ ＳｙＧｒｅｅｎ Ｂｌｕｅ Ｍｉｘ Ｌｏ－ＲＯＸ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して増幅した。表３－２に示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った
【表22】
【0505】
免疫蛍光
細胞を、抗コラーゲン１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）とともに４℃で一晩インキュベートし、
続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８コンジュゲート二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応させた。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色し、ＰＢＳで洗浄し、Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でマウントした。
細胞を、抗コラーゲン１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）とともに４℃で一晩インキュベートし、
続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８コンジュゲート二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応させた。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色し、ＰＢＳで洗浄し、Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でマウントした。
【0506】
シリウスレッド色素染色及び分光光度分析
簡潔に述べると、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、水道水で慎重に洗浄し、シリウスレッド（０．１％、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、室温で１時間インキュベートした。染色溶液を除去し、細胞を０．５％ｖ／ｖ酢酸で２回洗浄した。分光光度分析のために、シリウスレッドを０．１Ｎ水酸化ナトリウム中で溶出し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｌｕｘ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、５４０ｎｍでの光学密度を決定した。（Ｘｕ Ｑ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７ Ａｕｇ；２９３（２）：Ｆ６３１－４０。
簡潔に述べると、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、水道水で慎重に洗浄し、シリウスレッド（０．１％、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、室温で１時間インキュベートした。染色溶液を除去し、細胞を０．５％ｖ／ｖ酢酸で２回洗浄した。分光光度分析のために、シリウスレッドを０．１Ｎ水酸化ナトリウム中で溶出し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｌｕｘ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、５４０ｎｍでの光学密度を決定した。（Ｘｕ Ｑ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７ Ａｕｇ；２９３（２）：Ｆ６３１－４０。
【0507】
統計分析
複数の群間の比較については、全体的な差を、ボンフェローニ多重比較を用いたＡＮＯＶＡによって分析した。
複数の群間の比較については、全体的な差を、ボンフェローニ多重比較を用いたＡＮＯＶＡによって分析した。
【表23】
【0508】
Ｖ．結果
この研究では、絹がヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生を上方制御したと仮定した。この仮説を試験するために、ヒト真皮線維芽細胞を、コラーゲン合成及び細胞外マトリックス形成のブースターである絹及びＶｉｔ Ｃと共処置することによって、細胞外マトリックスを生成するために、インビトロモデルを使用した（ＤｅＰｈｉｌｌｉｐｏ，ＮＮ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｔｈｏｐ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．２０１８ Ｏｃｔ；６（１０）、Ｐｕｌｌａｒ ＪＭ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．２０１７ Ａｕｇ；９（８）：８６６．）（図３）。予備データは、Ｖｉｔ Ｃを有する中ＭＷ絹及びＶｉｔ Ｃを有する低ＭＷ絹が、正常なヒト真皮線維芽細胞における総コラーゲンレベルを高めたことを示した（図５Ａ～５Ｂ）。
この研究では、絹がヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生を上方制御したと仮定した。この仮説を試験するために、ヒト真皮線維芽細胞を、コラーゲン合成及び細胞外マトリックス形成のブースターである絹及びＶｉｔ Ｃと共処置することによって、細胞外マトリックスを生成するために、インビトロモデルを使用した（ＤｅＰｈｉｌｌｉｐｏ，ＮＮ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｔｈｏｐ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．２０１８ Ｏｃｔ；６（１０）、Ｐｕｌｌａｒ ＪＭ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．２０１７ Ａｕｇ；９（８）：８６６．）（図３）。予備データは、Ｖｉｔ Ｃを有する中ＭＷ絹及びＶｉｔ Ｃを有する低ＭＷ絹が、正常なヒト真皮線維芽細胞における総コラーゲンレベルを高めたことを示した（図５Ａ～５Ｂ）。
【0509】
コラーゲン活性化剤としての絹の機能的役割を調べるために、図４に示すように、Ｖｉｔ Ｃを実験モデルから除外した。データは、中ＭＷ絹及び低ＭＷ絹の処置が総コラーゲン産生を高め、コラーゲンブースティング生成物の単一成分としての中ＭＷ絹及び低ＭＷ絹の潜在的な役割を示唆したことを示した（図６）。
【0510】
次いで、コラーゲンブースティング特性を詳細に調査した。中ＭＷ絹及び低ＭＷ絹で処置したヒト真皮線維芽細胞が、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子発現を上方制御したことが見出され、遺伝子は、ビヒクル対照と比較してＩ型コラーゲンのプロα１鎖をコードする（図７）。このデータは、絹ペプチドが細胞内ＣＯＬ１Ａ１遺伝子発現を制御したことを示した。
【0511】
フローサイトメトリー分析により、低ＭＷ絹が、コラーゲン４のサブユニットであるＣＯＬ４Ａ１のタンパク質発現を調節しない一方で、コラーゲン１タンパク質発現を有意に上方制御したことが更に確認された（図８Ａ～８Ｂ）。一方で、中ＭＷ絹（１２０μＭ）は、コラーゲン１及びコラーゲン４タンパク質発現を増加させなかった（データは示さず）。興味深いことに、コラーゲンエンハンサー分子であるレチノイン酸は、ＣＯＬ４Ａ１陽性細胞を強固に増加させ、正常なヒト真皮線維芽細胞においてコラーゲン１タンパク質発現を一貫性なく増加／減少させた（図８Ａ～８Ｂ及び図９）。加えて、ＴＧＦ－β及びＶｉｔ Ｃ（陽性対照）で共処置した正常なヒト線維芽細胞は、ＣＯＬ４Ａ１陽性細胞（レチノイン酸よりも低い程度まで）及びコラーゲン１タンパク質発現を増加させた（図８Ａ及び図９）。低ＭＷ絹は、ヒト真皮線維芽細胞において細胞内コラーゲン１合成を選択的に誘導したと結論付けられた。
【0512】
ＶＩ．結論
保持された実験条件下では、低ＭＷ絹は、コラーゲン合成にプラスの効果を示す。
保持された実験条件下では、低ＭＷ絹は、コラーゲン合成にプラスの効果を示す。
【0513】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び公開されている参考文献が、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。本開示の方法は、その特定の実施形態との関連において記載されてきた一方で、更なる改変が可能であることが理解されるであろう。更に、本出願は、本開示の方法が関係する当技術分野における公知又は慣用的な実務内にあるような、本開示からのそのような逸脱を含む、本開示の方法の任意のバリエーション、使用、又は適応を対象とすることを意図する。
【0514】
実施例４：組織断面を使用した透過分析
回収した組織を１０％ホルマリン中で１８～２４時間インキュベートした後、ホルマリンをＤＰＢＳに交換した。組織を一連の勾配エタノール（７０～９５％）で脱水し、キシレンで脱水し、パラフィンに包埋した。断面を含有するスライドを、標準的な手順に従って調製した。各組織からの３つの切片を各スライド上に調製した。組織毎に１つの未染色の脱パラフィンスライドを、蛍光透過分析用に調製した。スライドを、ｄＨ２Ｏで５～１０分間再水和した。ＤＡＰＩストック溶液を、ｄＨ２Ｏで１：４７，０００希釈し、スライドを希釈溶液中で１０分間インキュベートした。スライドをｄＨ２Ｏで３回リンスした。組織切片を、イムノマウントマウンティング溶液（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号９９９０４０２）で覆い、カバースリップを適用した。スライドは、１０×対物レンズを使用するＯｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１００スライドスキャナーで画像化して、蛍光シグナルを視覚化した。
回収した組織を１０％ホルマリン中で１８～２４時間インキュベートした後、ホルマリンをＤＰＢＳに交換した。組織を一連の勾配エタノール（７０～９５％）で脱水し、キシレンで脱水し、パラフィンに包埋した。断面を含有するスライドを、標準的な手順に従って調製した。各組織からの３つの切片を各スライド上に調製した。組織毎に１つの未染色の脱パラフィンスライドを、蛍光透過分析用に調製した。スライドを、ｄＨ２Ｏで５～１０分間再水和した。ＤＡＰＩストック溶液を、ｄＨ２Ｏで１：４７，０００希釈し、スライドを希釈溶液中で１０分間インキュベートした。スライドをｄＨ２Ｏで３回リンスした。組織切片を、イムノマウントマウンティング溶液（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号９９９０４０２）で覆い、カバースリップを適用した。スライドは、１０×対物レンズを使用するＯｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１００スライドスキャナーで画像化して、蛍光シグナルを視覚化した。
【0515】
組織断面を使用した透過分析
各時点で、蛍光標識された試験物質で処置したＥＦＴ－４００組織を、中性緩衝ホルマリンで固定し、標準的な組織学的方法を使用して断面を含有するスライドを調製した。未染色の脱パラフィンスライドを、（核を視覚化するために）ＤＡＰＩで対比染色し、ＸＭ１０蛍光カメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＶＳ－１２０自動スライドスキャナーシステムを使用して画像化した。全ての切片を、ＤＡＰＩ（４５５ｎｍ）、ＦＩＴＣ（５１８ｎｍ）、及びＴＲＩＴＣ（６１５ｎｍ）フィルタを使用して画像化した。蛍光標識された物質を含有しないｄＨ２Ｏ対照組織を使用して、処置された組織の蛍光シグナルを評価するためのスケーリング閾値を確立した。図１４Ａ及び１４Ｂは、ＤＡＰＩで対比染色した、低ＭＷ絹（ＲＩＴＣ標識）に２×５時間曝露したＥＦＴ－４００組織の断面を示す。５倍の倍率の画像（図１４Ａ）は、全組織厚を示し、１０倍の倍率の画像（図１４Ｂ）は、表皮に焦点を合わせている。図１５Ａ及び１５Ｂは、ＤＡＰＩで対比染色した、中ＭＷ絹（ＦＩＴＣ標識）に２×５時間曝露したＥＦＴ－４００組織の断面を示す。５倍の倍率の画像（図１５Ａ）は、全組織厚を示し、１０倍の倍率の画像（図１５Ｂ）は、表皮に焦点を合わせている。
各時点で、蛍光標識された試験物質で処置したＥＦＴ－４００組織を、中性緩衝ホルマリンで固定し、標準的な組織学的方法を使用して断面を含有するスライドを調製した。未染色の脱パラフィンスライドを、（核を視覚化するために）ＤＡＰＩで対比染色し、ＸＭ１０蛍光カメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＶＳ－１２０自動スライドスキャナーシステムを使用して画像化した。全ての切片を、ＤＡＰＩ（４５５ｎｍ）、ＦＩＴＣ（５１８ｎｍ）、及びＴＲＩＴＣ（６１５ｎｍ）フィルタを使用して画像化した。蛍光標識された物質を含有しないｄＨ２Ｏ対照組織を使用して、処置された組織の蛍光シグナルを評価するためのスケーリング閾値を確立した。図１４Ａ及び１４Ｂは、ＤＡＰＩで対比染色した、低ＭＷ絹（ＲＩＴＣ標識）に２×５時間曝露したＥＦＴ－４００組織の断面を示す。５倍の倍率の画像（図１４Ａ）は、全組織厚を示し、１０倍の倍率の画像（図１４Ｂ）は、表皮に焦点を合わせている。図１５Ａ及び１５Ｂは、ＤＡＰＩで対比染色した、中ＭＷ絹（ＦＩＴＣ標識）に２×５時間曝露したＥＦＴ－４００組織の断面を示す。５倍の倍率の画像（図１５Ａ）は、全組織厚を示し、１０倍の倍率の画像（図１５Ｂ）は、表皮に焦点を合わせている。
【0516】
この研究の結果は、ＥＦＴ－４００組織におけるＲＩＴＣ標識低ＭＷ絹試験材料の時間依存性透過の証拠を示している。対照的に、ＦＩＴＣ標識中ＭＷ絹で処置されたＥＦＴ－４００組織では、ほとんど透過が観察されなかった。この研究では、組織断面の画像で行われた観察と、各時点でＥＦＴ－４００組織から回収した培養培地で測定された蛍光シグナルの定量化との間に非常に良好な相関関係がある。
【0517】
実施例５：ワセリン代用
ワセリンは、皮膚保護剤としてのＯＴＣ使用についてＦＤＡに承認されている。その密封の性質は、皮膚からの水分喪失を防止する物理的バリアを作製し、切り傷及び擦り傷を和らげ、かぶれ及び湿疹などを治療し得る。しかしながら、粗油から作製され、多くの形態の生命に毒性があり得、その抽出が気候変動を助長し得、皮膚を水和せず、脂っぽくかつ重くあり得、かつその製造プロセスが乳がんとの潜在的な関連を有する多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）を含むなど、ワセリンに関する懸念が存在する。
ワセリンは、皮膚保護剤としてのＯＴＣ使用についてＦＤＡに承認されている。その密封の性質は、皮膚からの水分喪失を防止する物理的バリアを作製し、切り傷及び擦り傷を和らげ、かぶれ及び湿疹などを治療し得る。しかしながら、粗油から作製され、多くの形態の生命に毒性があり得、その抽出が気候変動を助長し得、皮膚を水和せず、脂っぽくかつ重くあり得、かつその製造プロセスが乳がんとの潜在的な関連を有する多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）を含むなど、ワセリンに関する懸念が存在する。
【0518】
本明細書に記載される絹フィブロイン組成物は、皮膚バリアとして作用することができ、かつ／又は皮膚バリア製剤として製剤化され得る。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、クローディン－１低減は、密着結合機能を破壊し、例えば、アトピー性皮膚炎において、表皮バリア欠損をもたらすと考えられる。Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ，ＪＡＣＩ，２０１０，Ｂｅｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０２０。また、いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、クローディン－１欠損マウスは、重度の脱水、皺のある皮膚、及び表皮透過性の上昇を有すると考えられる。Ｆｕｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ，ＪＣＢ，２００２。
【0519】
図１６は、本明細書に記載される絹フィブロイン（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ（商標））処置されたＥｐｉＤｅｒｍＦＴ組織の顕微鏡断面図である。蛍光タグ付き絹フィブロインの蛍光撮像。図１７Ａ～１７Ｎは、本明細書に記載される絹フィブロインが、損傷したヒト皮膚（Ｎ＝１、５２歳の白人女性）においてクローディン－１発現を回復させることを示す。図１８は、本明細書に記載される絹フィブロインが、損傷したヒト皮膚においてクローディン－１発現を回復させることを示す。図１９は、本明細書に記載される絹フィブロインが、どのようにクローディン－１発現を回復させて皮膚バリアを改善するかを示す。図１０は、本明細書に記載される絹フィブロインが、どのようにヒト真皮線維芽細胞においてコラーゲン産生を刺激するかを示し、本明細書に記載される絹フィブロインは、ヒト真皮線維芽細胞において、レチノイン酸と同様のコラーゲン１の刺激を示す。図１１は、本明細書に記載される絹フィブロインが、どのようにヒト真皮線維芽細胞においてＣＯＬ１Ａ１遺伝子発現を上方制御するかを示し、本明細書に記載される絹フィブロインは、ヒト真皮線維芽細胞においてＣＯＬ１Ａ１遺伝子発現を上方制御する。処置後８時間の絹及びレチノイン酸処置されたヒト真皮線維芽細胞におけるＣＯＬ１Ａ１に対する定量的ＰＣＲ。ｎ＝１群当たり２。ＴＧＦ－β＋Ｖｉｔ Ｃ処置されたヒト真皮線維芽細胞において８倍超の増加（陽性対照としての役割を果たす）ＡＳＴＳ。
【0520】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本明細書に記載される絹フィブロイン、例えば、限定されないが、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ（商標）３３Ｂが、角質層の表面上に保持されると考えられる。本明細書に記載される絹フィブロインは、皮膚バリア用途に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される絹フィブロインは、Ｈ２Ｏで５回リンスした後、角質層に保持される。
【0521】
図１７Ａ～１７Ｎは、絹フィブロインが、損傷したヒト皮膚においてクローディン－１発現を回復させることを示す。
【0522】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び公開されている参考文献が、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。本開示の方法は、その特定の実施形態との関連において記載されてきた一方で、更なる改変が可能であることが理解されるであろう。更に、本出願は、本開示の方法が関係する当技術分野における公知又は慣用的な実務内にあるような、本開示からのそのような逸脱を含む、本開示の方法の任意のバリエーション、使用、又は適応を対象とすることを意図する。
【0523】
実施例６：皮膚状態を治療するための絹ポリペプチド組成物の投与量。
導入
皮膚は、高度に層状の構造を維持することによって、液体及び電解質の損失を制御する物理的バリアを提供する。表皮内のこのバリアは、層状上皮の最外層を形成し、主にケラチノサイトで構成されている。ケラチノサイト細胞は、カルシウムに応答して異なる分化段階を経て、その結果、基底層から上皮の最上層に移動する。皮膚バリアプロセスの一部は、ケラチノサイト間の皮膚密着結合の形成を含み、これは次に、皮膚の完全性を維持する。クローディンタンパク質ファミリーのメンバー、特にクローディン－１は、この密着結合形成、並びに細胞間接着及び完全性の維持において重要な役割を果たすことが周知である。
導入
皮膚は、高度に層状の構造を維持することによって、液体及び電解質の損失を制御する物理的バリアを提供する。表皮内のこのバリアは、層状上皮の最外層を形成し、主にケラチノサイトで構成されている。ケラチノサイト細胞は、カルシウムに応答して異なる分化段階を経て、その結果、基底層から上皮の最上層に移動する。皮膚バリアプロセスの一部は、ケラチノサイト間の皮膚密着結合の形成を含み、これは次に、皮膚の完全性を維持する。クローディンタンパク質ファミリーのメンバー、特にクローディン－１は、この密着結合形成、並びに細胞間接着及び完全性の維持において重要な役割を果たすことが周知である。
【0524】
線維芽細胞は、皮膚の真皮区画に見られ、コラーゲン産生に関与する。皮膚のコラーゲン１の低減は、皺及び皮膚の健康の悪化を引き起こす。コラーゲン１のブースティングは、皮膚の健康を回復させ、皺の消失をもたらす。皮膚におけるコラーゲン１産生に取り組むために薬用化粧品として使用されるレチノールは、不安定であり、上昇した毒性を有する一方で、有効であるように、レチノイン酸に変換されなければならない。ここでは、創傷治癒を促進し、潜在的な作用機序についてある程度の詳細を提供するために、クローディン－１の上方制御を促進する絹製剤の使用及び投与量、コラーゲン、ケラチノサイト細胞遊走が説明される。絹は、皮膚バリア機能を促進することが見出され、炎症を促進する遺伝子を下方制御した。したがって、記載される絹ポリペプチド組成物を使用して、広範囲の皮膚状態を治療することができる。
【0525】
結果及び考察
絹は、ケラチノサイト培養物中のクローディン－１の発現を上方制御する。
絹は、ケラチノサイト培養物中のクローディン－１の発現を上方制御する。
【0526】
皮膚バリア機能に対する絹処置の効果を調べるために、密着結合タンパク質であるクローディン－１が、適切な皮膚バリア機能にとって重要であるため、これに焦点を当てた。クローディン－１発現に対する可溶性絹ポリペプチドの効果を試験するために、中スキッド絹及び低スキッド絹の用量応答評価を、初代ケラチノサイト細胞系を用いて行った。ケラチノサイトは、皮膚に見られ、表皮の形成に関与する不可欠な細胞集団である。ケラチノサイトの障害は、乾癬及びアトピー性皮膚炎などの様々な皮膚疾患をもたらす。初代ケラチノサイトを、ある濃度範囲の中スキッド絹（０．０５％～０．６％ｗ／ｖ）及び低スキッド絹（０．０５％～０．７％ｗ／ｖ）で処置し、クローディン－１発現のためにヒト抗マウスモノクローナルクローディン－１一次抗体（ｓｃ－８１７９６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で染色した（図２０Ａ～２０Ｈ、２４Ａ）。３３Ｂ絹ポリペプチド濃度が、６ｍｇ／ｍＬ（０．６％ｗ／ｖ）に達したとき、クローディン－１発現が、上方制御された（図２０、２４Ａ）。予備結果は、７ｍｇ／ｍＬ（０．７％ｗ／ｖ）の２７ｐ絹ポリペプチドの添加が、増加したクローディン－１発現をもたらしたことを示した（図２１、２４Ｂ）。６ｍｇ／ｍＬの濃度の中スキッド絹が、初代ケラチノサイト細胞培養物中でクローディン－１発現を上方制御し、皮膚バリア機能を促進する可能性があると結論付けられた。
【0527】
絹は、皮膚生検においてクローディン－１の発現を上方制御する。
【0528】
初代ケラチノサイト培養物中の中スキッド（３３Ｂ）絹ポリペプチドの効果が、ヒト皮膚においてクローディン－１に影響を及ぼすかどうかを調査するために、皮膚生検を使用した。生検を、３０～６０歳の年齢範囲の女性皮膚ドナーから採取した。皮膚生検を９９．５％以上のアセトンで処置して、クローディン－１を枯渇させた（図２２Ａ～２２Ｂ）。未処置生検と比較して、アセトン処置されたヒト皮膚において低減したクローディン－１免疫反応性が見られ、モデル確立の成功を示した。アセトン処置後、皮膚生検を水、石油ゼリー、セラミド、並びに２つの濃度の中スキッド絹、及び１つの濃度の低スキッド絹で処置した。３０～６０歳の女性のヒト皮膚ドナーからのデータは、２ｍｇ／ｍＬの最小濃度の３３Ｂ絹ポリペプチド組成物が、石油ゼリーに匹敵するレベルで、アセトン前処置された皮膚においてクローディン－１発現を回復させたことを示す（図２３、２４Ｃ、２４Ｄ）。４ｍｇ／ｍＬの低スキッド（２７Ｐ）絹も、クローディン－１レベルを回復させた（図２３、２４Ｃ、２４Ｄ）。セラミドは、その系においてクローディン－１に顕著な効果を有しなかった（図２３、２４Ｄ）。
【0529】
絹は、皮膚線維芽培養物中でコラーゲンの発現を上方制御する。
【0530】
コラーゲンは、皮膚の健康において重要な役割を果たし、コラーゲン－１が、真皮細胞外マトリックスの約７０％を構成することが知られている。したがって、ヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生に対する低スキッド（２７Ｐ）絹ポリペプチドの効果を、用量応答研究として試験した。初代真皮線維芽細胞を、ある濃度範囲の低スキッド（２７Ｐ）絹ポリペプチド（０．０２５％～０．７％ｗ／ｖ）で処置し、シリウスレッド分光光度分析を使用して総コラーゲンについて評価した。ＴＧＦ－βは、コラーゲン産生の周知のプロモーターであるため、ＴＧＦ－β処置された線維芽細胞を陽性対照として使用した。シリウスレッド色素染色された細胞を、明視野顕微鏡を使用して可視化し、ＯＤ ５４０での分光分析によって追加的に定量化した。結果は、ビタミンＣの非存在下において、０．２％及び０．７％の低スキッド（２７Ｐ）絹ポリペプチドで処置したヒト線維芽細胞培養物中で、優位に増加したコラーゲン産生を示す（図２５及び２６）。しかしながら、２０μＬ／ｍＬのビタミンＣの存在下において、２７ｐ処置された線維芽細胞ではコラーゲン産生の有意な差は観察されなかった（データは示さず）。
【0531】
実施例７：低スキッド（２７Ｐ）絹ポリペプチドは、インビトロモデルでの創傷閉鎖における細胞遊走を加速する。
皮膚上皮の１つの重要な機能は、創傷治癒である。創傷治癒は、皮膚の破損によって作製されるギャップを埋めるために、細胞分裂及び遊走を必要とする。絹組成物が、創傷治癒の任意の態様に影響を及ぼすかどうかを試験するために、創傷閉鎖インビトロアッセイを使用した。最初に、ヒト初代ケラチノサイトの層を作製した。ケラチノサイト層の連続体を破壊する引っ掻き傷を生成し、細胞に自由空間を占有させた。ケラチノサイトを、低スキッド（２７Ｐ）絹ポリペプチドを含有した培地で処置した場合、それらは遊走し、血清及び成長因子を含有する培地で処置されたケラチノサイトと同じくらい速く引っ掻き傷の利用可能な空間を充填した（図２７）。したがって、低スキッド（２７Ｐ）絹ポリペプチドが、創傷治癒を加速する上皮細胞におけるシグナル伝達経路を活性化すると結論付けられた。
皮膚上皮の１つの重要な機能は、創傷治癒である。創傷治癒は、皮膚の破損によって作製されるギャップを埋めるために、細胞分裂及び遊走を必要とする。絹組成物が、創傷治癒の任意の態様に影響を及ぼすかどうかを試験するために、創傷閉鎖インビトロアッセイを使用した。最初に、ヒト初代ケラチノサイトの層を作製した。ケラチノサイト層の連続体を破壊する引っ掻き傷を生成し、細胞に自由空間を占有させた。ケラチノサイトを、低スキッド（２７Ｐ）絹ポリペプチドを含有した培地で処置した場合、それらは遊走し、血清及び成長因子を含有する培地で処置されたケラチノサイトと同じくらい速く引っ掻き傷の利用可能な空間を充填した（図２７）。したがって、低スキッド（２７Ｐ）絹ポリペプチドが、創傷治癒を加速する上皮細胞におけるシグナル伝達経路を活性化すると結論付けられた。
【0532】
実施例８：ＣＤ４４受容体は、インビトロで低（２７Ｐ）絹及び中（３３Ｂ）絹と相互作用する。
ＣＤ４４受容体は、創傷治癒及びコラーゲン調節に関与している。絹ポリペプチドが、ヒトＣＤ４４受容体と相互作用することができるかどうかを試験するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の原則に基づく固相タンパク質間相互作用アッセイを開発した。簡潔に述べると、絹ポリペプチドを９６ウェルプレートの表面上に固定し、ヒトＣＤ４４－ｈＦｃ構築物との相互作用を測定した。Ｆｃ部分を使用して、二次抗ヒトＦｃ ＩｇＧと絹上で結合したＣＤ４４を検出した。絹を単離されたヒトＦｃ断片で処置した場合、結合は有意ではなかった（図２８）。これとは対照的に、ＣＤ４４－ｈＦｃは、固定化された低スキッド（２７Ｐ）絹及び中スキッド（３３Ｂ）絹の両方に対して有意により高い結合を示した。この結果は、低（２７Ｐ）スキッド絹ポリペプチド及び中（３３Ｂ）スキッド絹ポリペプチドが、インビトロでＣＤ４４と相互作用することができることを示す。
ＣＤ４４受容体は、創傷治癒及びコラーゲン調節に関与している。絹ポリペプチドが、ヒトＣＤ４４受容体と相互作用することができるかどうかを試験するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の原則に基づく固相タンパク質間相互作用アッセイを開発した。簡潔に述べると、絹ポリペプチドを９６ウェルプレートの表面上に固定し、ヒトＣＤ４４－ｈＦｃ構築物との相互作用を測定した。Ｆｃ部分を使用して、二次抗ヒトＦｃ ＩｇＧと絹上で結合したＣＤ４４を検出した。絹を単離されたヒトＦｃ断片で処置した場合、結合は有意ではなかった（図２８）。これとは対照的に、ＣＤ４４－ｈＦｃは、固定化された低スキッド（２７Ｐ）絹及び中スキッド（３３Ｂ）絹の両方に対して有意により高い結合を示した。この結果は、低（２７Ｐ）スキッド絹ポリペプチド及び中（３３Ｂ）スキッド絹ポリペプチドが、インビトロでＣＤ４４と相互作用することができることを示す。
【0533】
実施例９：絹は、皮膚における炎症応答に関与した遺伝子の発現を下方制御する。
皮膚及び上皮の恒常性を制御する別の機序は、炎症である。絹製剤が炎症経路に影響を及ぼすかどうかを調査するために、皮膚生検を中スキッド（３３Ｂ）絹ポリペプチドで処置し、炎症の機序を制御する遺伝子の差次的な発現を探した。皮膚生検を９９．５％アセトンで処置し、次いで、５ｍｇ／ｍＬ及び６０ｍｇ／ｍＬの中スキッド（３３Ｂ）絹ポリペプチドを適用した。処置後、ＲＮＡを抽出し、遺伝子発現について分析した。炎症に関与するいくつかの遺伝子が、ビヒクル（水）のみで処置された皮膚生検との関連で、５ｍｇ／ｍＬ及び６０ｍｇ／ｍＬの中スキッド（３３Ｂ）絹ポリペプチドで処置された皮膚生検において下方制御された（表２）。これらの結果は、中スキッド（３３Ｂ）絹ポリペプチドが炎症を下方制御し、皮膚の健康を促進することができることを示す。
皮膚及び上皮の恒常性を制御する別の機序は、炎症である。絹製剤が炎症経路に影響を及ぼすかどうかを調査するために、皮膚生検を中スキッド（３３Ｂ）絹ポリペプチドで処置し、炎症の機序を制御する遺伝子の差次的な発現を探した。皮膚生検を９９．５％アセトンで処置し、次いで、５ｍｇ／ｍＬ及び６０ｍｇ／ｍＬの中スキッド（３３Ｂ）絹ポリペプチドを適用した。処置後、ＲＮＡを抽出し、遺伝子発現について分析した。炎症に関与するいくつかの遺伝子が、ビヒクル（水）のみで処置された皮膚生検との関連で、５ｍｇ／ｍＬ及び６０ｍｇ／ｍＬの中スキッド（３３Ｂ）絹ポリペプチドで処置された皮膚生検において下方制御された（表２）。これらの結果は、中スキッド（３３Ｂ）絹ポリペプチドが炎症を下方制御し、皮膚の健康を促進することができることを示す。
【0534】
表２． 中皮膚（３３Ｂ）絹で処置された皮膚生検のトランスクリプトーム分析。この表の遺伝子は、炎症経路に関与し、９９．５％アセトンでの処置、並びに５ｍｇ／ｍＬ（０．５％）（ＴｒｔＡ）及び６０ｍｇ／ｍＬ（６％）（ＴｒｔＢ）の中スキッド（３３Ｂ）絹でのその後の処置の後に、皮膚生検において下方制御された。
【表24-1】
【表24-2】
【表24-3】
【表24-4】
【表24-5】
【0535】
実施例１０：外用適用された絹は、経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の低減をもたらす
研究で評価された濃度（２％）で、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ ３３Ｂは、経表皮水分蒸散量を有意に低減し、細胞及びエクスビボ皮膚レベルで観察された利益が、外用適用された場合に測定可能な皮膚バリア利益につながることを立証した。（プラセボ血清を使用した研究参加者は、ＴＥＷＬのいかなる低減も経験しなかった）。
研究で評価された濃度（２％）で、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ ３３Ｂは、経表皮水分蒸散量を有意に低減し、細胞及びエクスビボ皮膚レベルで観察された利益が、外用適用された場合に測定可能な皮膚バリア利益につながることを立証した。（プラセボ血清を使用した研究参加者は、ＴＥＷＬのいかなる低減も経験しなかった）。
【0536】
３３Ｂを使用した研究参加者はまた、専門の評価者によって評価されるように、皮膚の質感及び堅さの有意な改善、並びに発赤、小皺、及び皺の低減を経験した。血清形式の成分性能に関する自己認識フィードバックも有望であった（表１）。
【表25】
【0537】
Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ ３３Ｂは、皮膚バリア機能を改善することが証明されているレベル（２％）で、安定した水性ベースの製剤に製剤化され得る。
【0538】
試験材料：
・血清、Ｓ３３Ｂ－１８（２％Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ ３３Ｂを含有する）
・血清、ＮＳＳ－１４４－７５（絹を欠くプラセボ血清）
・血清、Ｓ３３Ｂ－１８（２％Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ ３３Ｂを含有する）
・血清、ＮＳＳ－１４４－７５（絹を欠くプラセボ血清）
【0539】
研究プロトコル
本研究の目的は、２８日間の使用期間にわたる、小皺／皺、質感、発赤、色素沈着、堅さ、水和、弾性、及びバリア（経表皮水分蒸散量又はＴＥＷＬ）に対する、３３Ｂを含有する血清の有効性を評価することであった。
本研究の目的は、２８日間の使用期間にわたる、小皺／皺、質感、発赤、色素沈着、堅さ、水和、弾性、及びバリア（経表皮水分蒸散量又はＴＥＷＬ）に対する、３３Ｂを含有する血清の有効性を評価することであった。
【0540】
同じパラメータを、プラセボ対照を使用した第２の研究で評価して、有益な効果が、３３Ｂ以外の製剤中の他の成分に起因しなかったことを確実にした。消費者認識情報も、３３Ｂを評価する研究で収集した。対象は、新たにクレンジングした顔に、それぞれの試験物質を１日２回（朝及び夜）使用するように指示された。以下からなる研究評価を、ベースライン、７日目、及び２８日目に行った：
・小皺／皺、色素沈着、堅さ、発赤（専門の臨床評価者によって視覚的に評価される）
・触覚的質感／滑らかさ（専門の臨床評価者によって評価される）
・経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を介した皮膚バリア（Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ（登録商標）ＴＭ ３００（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して測定される）。
・皮膚表面の水和（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＣＭ ８２５（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して測定される）。
・弾性及び堅さ（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＭＰＡ ５８０（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して測定される）。
・皮膚表面の線及び皺を、シリコーン複製を介して収集し、プロフィロメトリーを介して評価した。
・自己認識質問票（３３Ｂ血清研究のみ）。
・小皺／皺、色素沈着、堅さ、発赤（専門の臨床評価者によって視覚的に評価される）
・触覚的質感／滑らかさ（専門の臨床評価者によって評価される）
・経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を介した皮膚バリア（Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ（登録商標）ＴＭ ３００（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して測定される）。
・皮膚表面の水和（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＣＭ ８２５（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して測定される）。
・弾性及び堅さ（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＭＰＡ ５８０（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して測定される）。
・皮膚表面の線及び皺を、シリコーン複製を介して収集し、プロフィロメトリーを介して評価した。
・自己認識質問票（３３Ｂ血清研究のみ）。
【0541】
結果
小皺／皺、堅さ、及び発赤の改善（専門の臨床評価者によって視覚的に評価される）を以下に要約する（色素沈着の改善は、統計的に有意ではなかった）
小皺／皺、堅さ、及び発赤の改善（専門の臨床評価者によって視覚的に評価される）を以下に要約する（色素沈着の改善は、統計的に有意ではなかった）
【0542】
小皺及び皺
２％の３３Ｂは、プラセボ対照と比較して、小皺及び皺の外観を有意に低減した（専門の評価者によって評価される）。
２％の３３Ｂは、プラセボ対照と比較して、小皺及び皺の外観を有意に低減した（専門の評価者によって評価される）。
【表26】
【0543】
堅さ
２％の３３Ｂは、プラセボ対照と比較して、皮膚の堅さの外観を有意に改善した（専門の評価者によって評価される）。
２％の３３Ｂは、プラセボ対照と比較して、皮膚の堅さの外観を有意に改善した（専門の評価者によって評価される）。
【表27】
【0544】
発赤
２％の３３Ｂは、プラセボ対照と比較して、発赤の外観を有意に低減した（専門の評価者によって評価される）。
２％の３３Ｂは、プラセボ対照と比較して、発赤の外観を有意に低減した（専門の評価者によって評価される）。
【表28】
【0545】
３３Ｂ研究及びプラセボ研究の両方について、２８日目の質感（滑らかさ）の触覚的評価の統計的に有意な改善が見られた。
【0546】
３３Ｂ血清を使用した研究群について、７日目のデータ点及び２８日目のデータ点の両方で、経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の統計的に有意な低減が観察された。プラセボ群では改善は見られなかった。
【0547】
ベースラインと比較して、皮膚表面水和（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（登録商標）を介して測定される）は、３３Ｂを含有する血清を使用した対象間で、７日後及び２８日後に統計的に有意な程度まで改善された。プラセボ群の有意な改善は、２８日目のデータ点でのみ観察された。
【0548】
弾性及び堅さ（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）によって測定される）は、いずれの群でも改善しなかった。皮膚表面の線及び皺（シリコーン型のプロフィロメトリーによって測定される）を評価する８つのパラメータのうちの２つは、２％の３３Ｂを含有する血清の適用後に統計的に有意な改善を示した。
【0549】
試験血清及びプラセボの両方について、皺の数（ＮｕｍＷｒ）が有意に低減された（データは図３３にプロットされている）
【0550】
くまは、３３Ｂを使用した試験群について有意に低減され、プラセボ群のくまの低減は、統計的に有意ではなかった（データは図３４にプロットされている）。
【0551】
３３Ｂ血清研究における自己認識質問票は、好ましい結果を示した。表１及び図３５は、トップボックス応答を選択する対象のパーセントに基づいて、どの記述が統計的に有意であったかを示す（非常にそう思う、及びそう思う）。
【0552】
結論
この研究で評価された濃度（２％）で、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ ３３Ｂは、経表皮水分蒸散量を有意に低減し、皮膚バリアに利益をもたらすという主張を立証する。追加的に、水和、発赤の低減、小皺／皺の外観の低減、及び皮膚質感の外観の改善に関する主張が実証される。血清形式の成分性能に関する自己認識フィードバックも有望である。
この研究で評価された濃度（２％）で、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｌｋ ３３Ｂは、経表皮水分蒸散量を有意に低減し、皮膚バリアに利益をもたらすという主張を立証する。追加的に、水和、発赤の低減、小皺／皺の外観の低減、及び皮膚質感の外観の改善に関する主張が実証される。血清形式の成分性能に関する自己認識フィードバックも有望である。
【0553】
実施例１１：初代ケラチノサイトクローディン－１発現。
初代ヒト新生児上皮ケラチノサイトを、１Ｘ ＥＤＧＳ （Ｅｐｉｌｉｆｅ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び６０μＭのＣａＣｌ２を含有するＥｐｉｌｉｆｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、４８ウェル組織培養処置プレートのウェル中で培養した。継代２～５の間の細胞を実験に使用し、８０～９０％のコンフルエンスに達するまで、５％ＣＯ２で３７℃においてインキュベートした。次いで、細胞を１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで２回穏やかに洗浄し、次いで無血清Ｅｐｉｌｉｆｅ培地（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、６０μＭのＣａＣｌ２のみ）で３７℃、５％ＣＯ２において３０分間処置した。それぞれの濃度の中スキッド絹（０．０５、０．１、０．２、０．５、０．６％ｗ／ｖ）又は低スキッド絹（０．０５、０．２、０．４、０．７％ｗ／ｖ）を含有する無血清Ｅｐｉｌｉｆｅ培地を、１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄した後に添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。処置なしの細胞を、水を含有する無血清Ｅｐｉｌｉｆｅ培地（ビヒクル対照）で処置した。
初代ヒト新生児上皮ケラチノサイトを、１Ｘ ＥＤＧＳ （Ｅｐｉｌｉｆｅ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び６０μＭのＣａＣｌ２を含有するＥｐｉｌｉｆｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、４８ウェル組織培養処置プレートのウェル中で培養した。継代２～５の間の細胞を実験に使用し、８０～９０％のコンフルエンスに達するまで、５％ＣＯ２で３７℃においてインキュベートした。次いで、細胞を１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで２回穏やかに洗浄し、次いで無血清Ｅｐｉｌｉｆｅ培地（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、６０μＭのＣａＣｌ２のみ）で３７℃、５％ＣＯ２において３０分間処置した。それぞれの濃度の中スキッド絹（０．０５、０．１、０．２、０．５、０．６％ｗ／ｖ）又は低スキッド絹（０．０５、０．２、０．４、０．７％ｗ／ｖ）を含有する無血清Ｅｐｉｌｉｆｅ培地を、１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄した後に添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。処置なしの細胞を、水を含有する無血清Ｅｐｉｌｉｆｅ培地（ビヒクル対照）で処置した。
【0554】
免疫蛍光染色について、２４時間の処置後、細胞を１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで３回洗浄し、暗所で室温（ＲＴ）において１０分間、４％パラホルムアルデヒド（１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで希釈）で固定した。次いで、細胞を１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄し、０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで希釈）で室温において１０分間透過処理し、次いで、スーパーブロッキング溶液（１Ｘ Ｄ－ＰＢＳ中の正常ヤギ血清、正常ロバ血清、１０％ＢＳＡ、魚皮ゼラチン、１００％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）で室温において３０分間ブロッキングした。１Ｘ Ｄ－ＰＢＳ中の５０％ブロッキング溶液中で希釈されたヒト抗マウスモノクローナルクローディン－１一次抗体（１：３００、ｓｃ－８１７９６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を、固定細胞に添加し、室温で１時間又は４℃で一晩インキュベートした。ＩｇＧ対照細胞を、一次抗体結合の陰性対照として、正常マウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；ｓｃ－３８７８）で処置した。１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄した後、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ（商標） ５９４コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ二次Ａｂ（１：４００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を細胞に添加し、暗所で室温において１時間インキュベートした。１Ｘ Ｄ－ＰＢＳ洗浄後、核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色し、１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで再度洗浄し、ＤＡＰＩ及びＴＸ－Ｒｅｄ蛍光撮像のために、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有するＳｌｏｗＦａｄｅ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔでマウントした。中絹（３３Ｂ）の実験を、少なくとも３回の生物学的反復で行い、細胞を２０倍の倍率で撮像して、ＤＡＰＩ染色核及びＴＸ－Ｒｅｄ染色クローディン－１を可視化した。低絹（２７ｐ）の予備実験を、１回の生物学的反復、２回の技術的反復で行い、画像を３３Ｂ実験と同様に処理した。中スキッド絹処置サンプルと未処置サンプルとの間の多重比較を用いた通常の一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計分析を行い、ｐ＜０．０５である場合に有意であるとみなした。
【0555】
実施例１２：皮膚生検クローディン－１発現。
簡潔に述べると、健康な皮膚をアセトンで５分間前処置して、最初の損傷を作製した。石油ゼリー、２、３、４、５、及び６０ｍｇ／ｍｌでの中スキッド絹（ＡＳ ＴＭ ３３Ｂ）２０μｌ、又はビヒクル対照を、皮膚生検に２４時間適用した。その後、皮膚サンプルをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）溶液で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ｉＨｉｓｔｏ ＩＮＣによるクリオスタット切片化のために処理した。切片を、抗クローディン－１抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と４℃で一晩インキュベートし、続いてＡＦ－６４７コンジュゲート二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応させた。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色し、ＰＢＳで洗浄し、Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でマウントした。クローディン－１陽性範囲を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。データは、少なくとも２つの別個の顕微鏡視野、２００倍、１条件当たり１～６人のドナーからのパーセンテージ±ＳＥＭとして表される。クローディン－１の正規化された発現を計算するために、以下の式を使用した。
クローディン－１染色％＝クローディン１染色総面積表皮総面積×１００
簡潔に述べると、健康な皮膚をアセトンで５分間前処置して、最初の損傷を作製した。石油ゼリー、２、３、４、５、及び６０ｍｇ／ｍｌでの中スキッド絹（ＡＳ ＴＭ ３３Ｂ）２０μｌ、又はビヒクル対照を、皮膚生検に２４時間適用した。その後、皮膚サンプルをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）溶液で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ｉＨｉｓｔｏ ＩＮＣによるクリオスタット切片化のために処理した。切片を、抗クローディン－１抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と４℃で一晩インキュベートし、続いてＡＦ－６４７コンジュゲート二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応させた。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色し、ＰＢＳで洗浄し、Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でマウントした。クローディン－１陽性範囲を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。データは、少なくとも２つの別個の顕微鏡視野、２００倍、１条件当たり１～６人のドナーからのパーセンテージ±ＳＥＭとして表される。クローディン－１の正規化された発現を計算するために、以下の式を使用した。
クローディン－１染色％＝クローディン１染色総面積表皮総面積×１００
【0556】
複数の群間の比較については、全体的な差を、ボンフェローニ多重比較検定を用いたＡＮＯＶＡによって分析した。
【0557】
実施例１３：真皮線維芽細胞におけるコラーゲン発現。
初代ヒト真皮線維芽細胞を、１Ｘ ＬＳＧＳ（低血清成長サプリメント、Ｇｉｂｃｏ）、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２９２μｇ／ｍＬのＬ－グルタミン（１００μＭのクエン酸緩衝液中）を含有する線維芽細胞増殖培地（ＦＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で、６５～７０％のコンフルエンスまで、５％ＣＯ２で３７℃において増殖させた。実験について、継代２～６の間の線維芽細胞を、４８ウェル組織培養処置プレートのウェルに播種して、１％ＦＢＳ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｃｙｔｖｉａ）を含有するＤＭＥＭ １ｇ／Ｌグルコース培地（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、８０～９０％のコンフルエンスに達するように、３７℃、５％ＣＯ２で一晩増殖させた。次いで、細胞を１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで２回穏やかに洗浄し、次いで無血清ＤＭＥＭ培地（２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンのみ）で３７℃、５％ＣＯ２において３０分間処置した。それぞれの濃度の低スキッド絹（０．２５、０．５、２．０、７．０ｍｇ／ｍＬ）を含有する無血清ＤＭＥＭ培地を、１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄した後に添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。陰性対照細胞を、水を含有する無血清ＤＭＥＭ培地（ビヒクル対照）で処置した一方で、陽性対照細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１を含有する無血清ＤＭＥＭ培地で処置した。全ての処置条件を、２０μｇ／ｍＬのビタミンＣ（Ｌ－アスコルビン酸）の非存在下及び存在下で追加的に試験した。
初代ヒト真皮線維芽細胞を、１Ｘ ＬＳＧＳ（低血清成長サプリメント、Ｇｉｂｃｏ）、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２９２μｇ／ｍＬのＬ－グルタミン（１００μＭのクエン酸緩衝液中）を含有する線維芽細胞増殖培地（ＦＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で、６５～７０％のコンフルエンスまで、５％ＣＯ２で３７℃において増殖させた。実験について、継代２～６の間の線維芽細胞を、４８ウェル組織培養処置プレートのウェルに播種して、１％ＦＢＳ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｃｙｔｖｉａ）を含有するＤＭＥＭ １ｇ／Ｌグルコース培地（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、８０～９０％のコンフルエンスに達するように、３７℃、５％ＣＯ２で一晩増殖させた。次いで、細胞を１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで２回穏やかに洗浄し、次いで無血清ＤＭＥＭ培地（２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンのみ）で３７℃、５％ＣＯ２において３０分間処置した。それぞれの濃度の低スキッド絹（０．２５、０．５、２．０、７．０ｍｇ／ｍＬ）を含有する無血清ＤＭＥＭ培地を、１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄した後に添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。陰性対照細胞を、水を含有する無血清ＤＭＥＭ培地（ビヒクル対照）で処置した一方で、陽性対照細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１を含有する無血清ＤＭＥＭ培地で処置した。全ての処置条件を、２０μｇ／ｍＬのビタミンＣ（Ｌ－アスコルビン酸）の非存在下及び存在下で追加的に試験した。
【0558】
シリウスレッド分光光度分析を使用して総コラーゲン産生を測定するために、線維芽細胞（２４時間の処置後）を１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄し、暗所で室温（ＲＴ）において１０分間、４％パラホルムアルデヒド（１Ｘ Ｄ－ＰＢＳで希釈）中で固定した。次いで、細胞を水道水で２回洗浄し、シリウスレッド色素（０．１％）で室温において１時間染色した。次いで、細胞を０．５％ｖ／ｖ酢酸（酸性水）で２回迅速に洗浄した。分光光度分析のために、シリウスレッド色素を０．１ Ｎ ＮａＯＨ中で溶出し（１分未満）、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｌｕｘ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、５４０ｎｍでの光学密度を測定した。軽度に染色された固定線維芽細胞を、明視野顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ７０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して４倍の倍率で撮像した。４つの生物学的反復及び２つの技術的反復からのデータを平均化した。統計的有意性についての試験を、処置されたサンプルと陰性対照サンプルとの間の二元配置ＡＮＯＶＡ（ダネットの多重比較検定）を使用して行い、ｐ＜０．０５である場合に有意であるとみなした。
【0559】
実施例１４：低スキッド絹は、創傷閉鎖アッセイにおいてケラチノサイト遊走を加速する。
初代ヒト新生児上皮ケラチノサイトを、１ｘ ＨＫＧＳ（Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｓ００１Ｋ）、０．２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬのアムホテリシン、７０μＭのＣａ２＋を含有するＭ－１５４培地（Ｍ１５４５００、Ｇｉｂｃｏ）を用いて、２４ウェル組織培養処置プレートにおいて継代２～４の間培養した。細胞培養物を、９０～９５％のコンフルエンスに達するまで、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートした。次いで、細胞を１ｘ Ｄ－ＰＢＳで穏やかに洗浄し、２０μＬのピペットチップで均一に引っ掻き、ウェルにおいて直線状創傷を作製した。細胞を１ｘ Ｄ－ＰＢＳで穏やかに洗浄した。処置条件は、以下の通りであった：陰性対照は、無血清Ｍ－１５４培地（ゲンタマイシン、アムホテリシン、水、７０μＭのＣａ２＋のみ）を含有し、陽性対照は、１ｘ ＨＫＧＳ、抗生物質、及び７０μＭのＣａ２＋を含む完全Ｍ－１５４培地を含有し、試験サンプルは、抗生物質及び７０μＭのＣａ２＋を含む無血清Ｍ－１５４培地中で希釈された０．５ｍｇ／ｍＬの２７ｐを含有した。それぞれの処置条件を、引っ掻き及び１ｘ Ｄ－ＰＢＳ洗浄後に細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートさせた。細胞を、ライブイメージング明視野顕微鏡（Ｃｙｔａｔｉｏｎ １、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＴｅｋ）で、３０分間隔で２０時間撮像した。２０時間にわたる細胞の画像スタックを、ＩｍａｇｅＪ（創傷治癒サイズツールプラグイン）を使用して分析して、各フレームの創傷面積を測定した。データを、経時的な（時間）創傷閉鎖（％）（以下の式による）としてプロットし、エラーバーは、各条件で処置された細胞の少なくとも２つのウェルで測定された創傷閉鎖（％）の標準偏差を表す。
初代ヒト新生児上皮ケラチノサイトを、１ｘ ＨＫＧＳ（Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｓ００１Ｋ）、０．２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬのアムホテリシン、７０μＭのＣａ２＋を含有するＭ－１５４培地（Ｍ１５４５００、Ｇｉｂｃｏ）を用いて、２４ウェル組織培養処置プレートにおいて継代２～４の間培養した。細胞培養物を、９０～９５％のコンフルエンスに達するまで、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートした。次いで、細胞を１ｘ Ｄ－ＰＢＳで穏やかに洗浄し、２０μＬのピペットチップで均一に引っ掻き、ウェルにおいて直線状創傷を作製した。細胞を１ｘ Ｄ－ＰＢＳで穏やかに洗浄した。処置条件は、以下の通りであった：陰性対照は、無血清Ｍ－１５４培地（ゲンタマイシン、アムホテリシン、水、７０μＭのＣａ２＋のみ）を含有し、陽性対照は、１ｘ ＨＫＧＳ、抗生物質、及び７０μＭのＣａ２＋を含む完全Ｍ－１５４培地を含有し、試験サンプルは、抗生物質及び７０μＭのＣａ２＋を含む無血清Ｍ－１５４培地中で希釈された０．５ｍｇ／ｍＬの２７ｐを含有した。それぞれの処置条件を、引っ掻き及び１ｘ Ｄ－ＰＢＳ洗浄後に細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートさせた。細胞を、ライブイメージング明視野顕微鏡（Ｃｙｔａｔｉｏｎ １、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＴｅｋ）で、３０分間隔で２０時間撮像した。２０時間にわたる細胞の画像スタックを、ＩｍａｇｅＪ（創傷治癒サイズツールプラグイン）を使用して分析して、各フレームの創傷面積を測定した。データを、経時的な（時間）創傷閉鎖（％）（以下の式による）としてプロットし、エラーバーは、各条件で処置された細胞の少なくとも２つのウェルで測定された創傷閉鎖（％）の標準偏差を表す。
【数2】
【0560】
実施例１５：絹ポリペプチドとのＣＤ４４相互作用。
固相タンパク質間相互作用アッセイのために、マルチウェル免疫プレート、Ｎａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ９４１０－１ＣＳ、ロット２０１８２）を使用した。ウェルを、２０，０００ｘ ｇの最大速度で遠心分離した２００μＬの絹溶液でコーティングした。絹を含むプレートを４℃で一晩インキュベートした。ウェルを２００μＬのＴＢＳ １ｘで３回洗浄した。２００μＬのブロッキング溶液（ＴＢＳ中のＢＬＯＴＴＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＲＥＦ ３７５３０ ＬＯＴＸＢ３４４９４１（１ｘ ＴＢＳ中で１／２０希釈））を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを２００μＬのＴＢＳ １ｘで３回洗浄した。１ｘ ＴＢＳ中のＣＤ４４－ｈＦｃの２００ｎＭ溶液１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを２００μＬのＴＢＳ １ｘで３回洗浄した。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ペルオキシダーゼ抗体を、１ｘ ＴＢＳ中で１：５０，０００希釈した。１００μＬの１：５０，０００抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ペルオキシダーゼ抗体希釈を、各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを２００μＬのＴＢＳ １ｘで３回洗浄した。１００μＬの超高感度ＴＭＢ溶液を各ウェルに添加し、６５３ｎｍでの吸光度を１分毎に６０分間測定した。
固相タンパク質間相互作用アッセイのために、マルチウェル免疫プレート、Ｎａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ９４１０－１ＣＳ、ロット２０１８２）を使用した。ウェルを、２０，０００ｘ ｇの最大速度で遠心分離した２００μＬの絹溶液でコーティングした。絹を含むプレートを４℃で一晩インキュベートした。ウェルを２００μＬのＴＢＳ １ｘで３回洗浄した。２００μＬのブロッキング溶液（ＴＢＳ中のＢＬＯＴＴＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＲＥＦ ３７５３０ ＬＯＴＸＢ３４４９４１（１ｘ ＴＢＳ中で１／２０希釈））を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを２００μＬのＴＢＳ １ｘで３回洗浄した。１ｘ ＴＢＳ中のＣＤ４４－ｈＦｃの２００ｎＭ溶液１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを２００μＬのＴＢＳ １ｘで３回洗浄した。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ペルオキシダーゼ抗体を、１ｘ ＴＢＳ中で１：５０，０００希釈した。１００μＬの１：５０，０００抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ペルオキシダーゼ抗体希釈を、各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを２００μＬのＴＢＳ １ｘで３回洗浄した。１００μＬの超高感度ＴＭＢ溶液を各ウェルに添加し、６５３ｎｍでの吸光度を１分毎に６０分間測定した。
【0561】
使用した材料：
ブロッキング溶液：ＴＢＳ中のブロッカーＢＬＯＴＴＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＲＥＦ ３７５３０ ＬＯＴＸＢ３４４９４１（１ｘ ＴＢＳ中で１／２０希釈）。
組換えヒトＣＤ４４タンパク質（Ｆｃ－Ｔａｇ）、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１２２１１－Ｈ０２Ｈ、ＬＣ１３ＡＰ３００１ ５０μｇ。
ヤギで産生された抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ペルオキシダーゼ抗体、親和性単離抗体、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ０１７０－１ｍＬ、ロット００００１５４６４４、ソース００００１４１５２４
ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片精製タンパク質、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＧ７１４、ロット番号３８５３８１１。
ＴＢＳ Ｔａｂｌｅｔｓ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５２４７５０－１ＥＡ、ロット：３７８０７３５
超高感度ＴＭＢ溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＥＳ０２２－５００ｍＬ、ロット番号３７３９１１３）
ブロッキング溶液：ＴＢＳ中のブロッカーＢＬＯＴＴＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＲＥＦ ３７５３０ ＬＯＴＸＢ３４４９４１（１ｘ ＴＢＳ中で１／２０希釈）。
組換えヒトＣＤ４４タンパク質（Ｆｃ－Ｔａｇ）、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１２２１１－Ｈ０２Ｈ、ＬＣ１３ＡＰ３００１ ５０μｇ。
ヤギで産生された抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ペルオキシダーゼ抗体、親和性単離抗体、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ０１７０－１ｍＬ、ロット００００１５４６４４、ソース００００１４１５２４
ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片精製タンパク質、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＧ７１４、ロット番号３８５３８１１。
ＴＢＳ Ｔａｂｌｅｔｓ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５２４７５０－１ＥＡ、ロット：３７８０７３５
超高感度ＴＭＢ溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＥＳ０２２－５００ｍＬ、ロット番号３７３９１１３）
【0562】
実施例１６：臨床研究のための３３Ｂ血清の調製
１０００ｍＬのビーカー内で、ＲＯ／ＤＩ水（５６６．９４ｇ、９４．４９％）を、４ブレードピッチインペラ撹拌シャフトを備えたオーバーヘッド撹拌器で撹拌した。水を、ホットプレート上で６０～６５℃に同時に加熱した。所望の温度に達すると、ヒドロキシエチルセルロース（５．２８ｇ、０．８８％）を撹拌水に振るい入れた。加熱装置をオフにし、混合物をその後の３０分間超にわたって撹拌しながらわずかに冷却させた。ヒドロキシエチルセルロースが溶解したら、Ｇｅｏｇａｒｄ Ｕｌｔｒａ（グルコノラクトン及び安息香酸ナトリウムで構成されたブレンド、グルコノラクトン）（５．４０ｇ、０．９０％）を添加した。溶液を均質になるまで撹拌した。撹拌速度を２００ｒｐｍに低減した。６％固体（１９．９８ｇ、２．００％の３３Ｂ＋１．３３％の水に等しい３．３３％）を含有する絹溶液を添加した。混合物を約５分間撹拌し、スパチュラで断続的に手動撹拌して、混合を補助した。次いで、混合物を、２５％水酸化ナトリウム水溶液（２．４０ｇ、０．４０％）を使用してｐＨ５．０に調整した。均質になると、撹拌を停止し、生成物をフロストガラスドロッパーボトルにパッケージングした。
１０００ｍＬのビーカー内で、ＲＯ／ＤＩ水（５６６．９４ｇ、９４．４９％）を、４ブレードピッチインペラ撹拌シャフトを備えたオーバーヘッド撹拌器で撹拌した。水を、ホットプレート上で６０～６５℃に同時に加熱した。所望の温度に達すると、ヒドロキシエチルセルロース（５．２８ｇ、０．８８％）を撹拌水に振るい入れた。加熱装置をオフにし、混合物をその後の３０分間超にわたって撹拌しながらわずかに冷却させた。ヒドロキシエチルセルロースが溶解したら、Ｇｅｏｇａｒｄ Ｕｌｔｒａ（グルコノラクトン及び安息香酸ナトリウムで構成されたブレンド、グルコノラクトン）（５．４０ｇ、０．９０％）を添加した。溶液を均質になるまで撹拌した。撹拌速度を２００ｒｐｍに低減した。６％固体（１９．９８ｇ、２．００％の３３Ｂ＋１．３３％の水に等しい３．３３％）を含有する絹溶液を添加した。混合物を約５分間撹拌し、スパチュラで断続的に手動撹拌して、混合を補助した。次いで、混合物を、２５％水酸化ナトリウム水溶液（２．４０ｇ、０．４０％）を使用してｐＨ５．０に調整した。均質になると、撹拌を停止し、生成物をフロストガラスドロッパーボトルにパッケージングした。
【0563】
絹溶液の添加を省略して（絹の代わりに等量の水を添加して）、上記の手順を複製してプラセボ血清を産生した。
【0564】
臨床研究
２８日間の期間にわたり、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｃｏｎｓｕｍｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈにより、一重盲検、自宅使用研究を実施した。本研究は、「２８日間の使用期間にわたる老化の兆候を改善する試験物質の有効性を決定する臨床研究」と題された。合計３４人の女性参加者を研究の試験群に登録した一方で（３２人が研究を完了）、２３人の女性参加者を研究のプラセボ群に登録した（２２人が試験を完了）。対象は、新たにクレンジングした顔に１日２回（朝及び夜）適用する指示とともに、３３Ｂ血清又はプラセボ血清のいずれかを支給された。研究評価は、ベースライン、７日目、及び２８日目に完了し、以下を含んだ。
・小皺／皺、色素沈着、堅さ、及び発赤を臨床評価者によって視覚的に評価した
・触覚的質感／滑らかさを臨床評価者によって評価した
・経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を介した皮膚バリアを、Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ（登録商標） ＴＭ ３００（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ）で測定した。
・皮膚表面の水和を、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（登録商標） ＣＭ ８２５（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ）で測定した。
・対象は、皮膚特性、製品有効性、及び認識された改善を評価する自己認識質問票（ＳＰＱ）に記入した。
２８日間の期間にわたり、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｃｏｎｓｕｍｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈにより、一重盲検、自宅使用研究を実施した。本研究は、「２８日間の使用期間にわたる老化の兆候を改善する試験物質の有効性を決定する臨床研究」と題された。合計３４人の女性参加者を研究の試験群に登録した一方で（３２人が研究を完了）、２３人の女性参加者を研究のプラセボ群に登録した（２２人が試験を完了）。対象は、新たにクレンジングした顔に１日２回（朝及び夜）適用する指示とともに、３３Ｂ血清又はプラセボ血清のいずれかを支給された。研究評価は、ベースライン、７日目、及び２８日目に完了し、以下を含んだ。
・小皺／皺、色素沈着、堅さ、及び発赤を臨床評価者によって視覚的に評価した
・触覚的質感／滑らかさを臨床評価者によって評価した
・経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を介した皮膚バリアを、Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ（登録商標） ＴＭ ３００（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ）で測定した。
・皮膚表面の水和を、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（登録商標） ＣＭ ８２５（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ）で測定した。
・対象は、皮膚特性、製品有効性、及び認識された改善を評価する自己認識質問票（ＳＰＱ）に記入した。
【0565】
実施例１７：抗炎症データ
【表29-1】
【表29-2】
【表29-3】
【表29-4】
【表29-5】
【表29-6】
【表29-7】
【表29-8】
【表29-9】
【表29-10】
【表29-11】
【表30-1】
【表30-2】
【表30-3】
【表30-4】
【表30-5】
【表30-6】
【表30-7】
【表30-8】
【表30-9】
【表30-10】
【表30-11】
【表30-12】
【表30-13】
【表31-1】
【表31-2】
【表31-3】
【表32-1】
【表32-2】
【表32-3】
【表32-4】
【表32-5】
【表32-6】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【配列表】
【国際調査報告】