特表 2024-538230 乳様生成物の生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-18

(54)【発明の名称】乳様生成物の生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20241010BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 35/20 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 3/02 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20241010BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12P21/02 C

A61K35/20

A61P3/02

A61P43/00 111

A61P31/00

A61P3/04

A61P37/04

A61P7/00

A61P13/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024524434

(86)(22)【出願日】2022-10-27

(85)【翻訳文提出日】2024-06-20

(86)【国際出願番号】 EP2022080089

(87)【国際公開番号】W WO2023073108

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】21205070.2

(32)【優先日】2021-10-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】590002013

【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100140453

【弁理士】

【氏名又は名称】戸津 洋介

(74)【代理人】

【識別番号】100200540

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 祐子

(72)【発明者】

【氏名】マルケス ド リマ， マリア

(72)【発明者】

【氏名】ビアンキ， アリアナ

(72)【発明者】

【氏名】マシンチアン， オミッド

(72)【発明者】

【氏名】クラウス， マリン

(72)【発明者】

【氏名】デスタイラッツ， フレデリック

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA10

4B064CC03

4B064CC30

4B064CD20

4B064CD30

4B064DA01

4B064DA10

4B065AA90X

4B065AB10

4B065AC20

4B065BA30

4B065BB19

4B065BB20

4B065BC41

4B065CA44

4B065CA60

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB39

4C087MA16

4C087MA52

4C087NA14

4C087ZA51

4C087ZA70

4C087ZA81

4C087ZB09

4C087ZB31

4C087ZC02

4C087ZC21

4C087ZC51

(57)【要約】

乳腺細胞を産生する方法、及び哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物を製造する方法であって、哺乳動物成体母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）、例えばヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）に由来するラクトサイトを生成するステップと、哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物をラクトサイトから発現させるステップとを含む、方法。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及び／又はレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、
を含む、乳腺細胞の集団を産生する方法。

【請求項2】

前記培養培地が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記培養ステップｉ）が、前記ｍＢＳＣを、任意選択で少なくとも１２日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において、培養して、それによってｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記培養ステップｉ）が、ｈＢＳＣを、任意選択で８日間以下、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによって前記ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、請求項２又は４に記載の方法。

【請求項7】

ステップｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

ステップｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記乳腺細胞が、ヒト乳腺細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

ＢＭＰ４が、０日目～１０日目の間、好ましくは０日目～３日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｈＢＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ＢＭＰ４が前記培養培地に３日間添加される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ＲＡが、１０日目～１５日目の間、任意選択で６日目～１１日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｈＢＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ＲＡが、前記培養培地に５日間添加される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ＢＭＰ４が、５～２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ又は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記培養培地に添加される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

ＲＡが、１μＭの濃度で前記培養培地に添加される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ＥＢが、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から任意選択で選択される、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける前記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している、請求項２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも３５％が、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも１５％が、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、かつ／又は任意選択で、ＥＢの少なくとも２０％が、ＥｐＣＡＭ及びＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ＥＢが、１つ以上の乳特異的生物活性マーカー、任意選択でオステオポンチン（ＯＰＮ）を発現する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現が増加されており、任意選択でオステオポンチン（ＯＰＮ）の発現が増加されている、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの分泌が増加されており、任意選択でオステオポンチン（ＯＰＮ）の分泌が増加されている、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記乳腺細胞が、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

分化プロトコルにおける哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるための、ＢＭＰ４及び／又はＲＡの使用。

【請求項24】

哺乳動物乳様生成物を製造する方法であって、
Ｃ）哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｄ）前記ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、
を含み、
ステップＡ）が、ＢＭＰ４及び／又はＲＡを含む培養培地中でｈＢＳＣを培養することを含む、方法。

【請求項25】

前記培養培地が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

ステップＡ）が、３０日～４５日の工程、任意選択で４５日未満の工程、任意選択で４４日未満の工程、任意選択で３５日未満の工程、任意選択で３１日未満の工程である、請求項２４又は２５に記載の方法。

【請求項27】

ヒト乳様生成物を製造する方法であって、
ステップＡ）が、
ｉ）ｍＢＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えばＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、少なくとも１２日間培養することによって、ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質とＲＡとから構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

ヒト乳代替生成物を製造する方法であって、
ステップＡ）が、
ｉ）ｍＢＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えばＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、８日間以下培養することによって、ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質とＲＡとから構成される混合浮遊ゲル中で２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、請求項２５又は２６に記載の方法。

【請求項29】

ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４及びヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で１０日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４及びヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で６日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項32】

ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で６日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項33】

ステップＡ）が、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

ステップＡ）が、三次元懸濁培養条件で行われる、請求項２４～２６及び３３に記載の方法。

【請求項35】

請求項２４～３４のいずれか一項に記載の方法に従って得ることができる、ヒト乳様生成物。

【請求項36】

治療に使用するための、請求項３５に記載のヒト乳様生成物。

【請求項37】

請求項３５に記載のヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物としての、任意選択で母乳代替物としての使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳腺細胞の産生方法に関する。本発明はまた、哺乳動物乳様生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）、例えばヒト乳様生成物をインビトロで製造する方法であって、哺乳動物成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）、例えばヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）に由来するラクトサイトを培養及び分化によって生成する、及び／又はかかるラクトサイトを含む乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物を、かかるラクトサイト及び／又は乳腺様腺オルガノイドから発現させるステップと、を含む、方法に関する。本発明はまた、哺乳動物乳様生成物、例えば、かかる方法から得ることができるヒト乳様生成物に関する。

【0002】

［背景技術］
哺乳動物の乳、特にヒトの乳は、多数の成分を含む複雑な体液であり、その成分のそれぞれは、乳児及びおそらく母体の健康に実質的に寄与し得る。少なくとも６ヶ月齢まではヒト母乳が最も適切な栄養源であることが明らかになってきている。ヒト乳の多くの成分は、乳児用フォーミュラの製造の基礎となる牛乳中には全く見られないか、ほとんど見られないか、又は活性が低い。このような成分には、例えばタンパク質ラクトフェリン、増殖／成長因子、長鎖多価不飽和脂肪酸又はオリゴ糖が含まれる。ヒト乳組成物は、現在の乳児用フォーミュラを開発するためのゴールドスタンダードとして使用されているが、乳児用フォーミュラ組成物における最近の主要な開発にもかかわらず、現在の製造プロセスでヒト乳の複製物が達成されると考えることは非現実的である。

【0003】

今日、ヒト乳の唯一の供給源は、ヒトドナー（授乳中の母親）である。献乳は、非商業的使用（ヒト乳バイオバンク）及び商業的使用について報告されている。しかしながら、献乳は限られており、強い規制、安全性、及び時には倫理的又は宗教的制約を伴う。

【0004】

哺乳動物の乳、特にヒト乳中には幹細胞が見出されており、ヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）と呼ばれている。ｈＢＳＣは、高度に可塑性であり、培養において複数の細胞種に分化し、より重要なことには、ヒト乳腺の小葉－腺房（ｌｏｂｕｌｏ－ａｌｖｅｏｌａｒ）構造を形成するのに必要な３つの系列に分化することが示されている（Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２）。しかしながら、かかる文献は、かかる細胞の機能性を実証していない。

【0005】

したがって、本発明の目的は、乳腺細胞を産生するための改善された方法を提供すること、及び培養細胞において哺乳動物乳（例えば、ヒト乳）の発現を再現することである。本発明の目的はまた、レシピエントの特異なニーズに適合させることができる培養細胞からの分泌により、カスタマイズされた哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物を調製すること、及び／又は乳幼児期栄養のための既存の牛乳ベースの解決策を補完するためにヒト乳生物活性を生成することである。

【0006】

［発明の概要］
本発明は、上述の技術的課題を解決する。

【0007】

本明細書で提供されるのは、乳腺細胞の集団を産生する方法であって、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及び／又はレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法である。

【0008】

本明細書でさらに提供されるのは、分化プロトコルにおける哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるための、ＢＭＰ４及び／又はＲＡの使用である。

【0009】

本明細書でさらに提供されるのは、哺乳動物乳様生成物を産生する方法であって、
Ａ）哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｂ）上記ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、を含み、
ステップＡ）が、ＢＭＰ４及び／又はＲＡを含む培養培地中でｈＢＳＣを培養することを含む、方法である。

【0010】

本明細書でさらに提供されるのは、本明細書中に記載の方法に従って得ることができるヒト乳様生成物である。

【0011】

本明細書でさらに提供されるのは、治療に使用するための、本明細書中に記載の方法による、ヒト乳様生成物である。

【0012】

本明細書でさらに提供されるのは、本明細書中に記載の方法によるヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物、任意選択的に母乳代替物としての使用である。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、ラクトサイトによる脂質産生機能を示す。

【図2】図２は、ラクトサイトによる脂質産生機能を示す。

【図3】ヒト及びウシのラクトフェリン由来のペプチドの、タンデムＭＳペプチドスペクトルのマッチについての２つの例を、図３及び図４に示す。

【図4】ヒト及びウシのラクトフェリン由来のペプチドの、タンデムＭＳペプチドスペクトルのマッチについての２つの例を、図３及び図４に示す。

【図5】実施例４の結果を図５に示す。

【図6-1】図６は、三次元オルガノイド設定を使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の非神経外胚葉系列分化に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の効果を示す。ａ．乳腺前駆体の生成及び０日目～３日目の間のＢＭＰ４処理の手順を要約したスキーム。ｂ．異なる濃度のＢＭＰ４への曝露後の形態変化の顕微鏡観察。ｃ～ｆ、同定された様々なマーカー：ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３を使用した、乳腺陽性前駆細胞数のフローサイトメトリーによる定量。ｇ～ｈ．主要な非神経外胚葉マーカーとしてのヒトＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２ＣのＲＮＡ発現レベル。ｉ～ｋ．神経外胚葉マーカーとしてのヒトＰＡＸ６、ＯＴＸ２及びＳＯＸ１１。ｌ．管腔マーカーとしてのヒトＫＲＴ１８。ｍ．分泌型リン酸化乳糖タンパク質としてのヒトＯＰＮ。

【図6-2】図６は、三次元オルガノイド設定を使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の非神経外胚葉系列分化に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の効果を示す。ａ．乳腺前駆体の生成及び０日目～３日目の間のＢＭＰ４処理の手順を要約したスキーム。ｂ．異なる濃度のＢＭＰ４への曝露後の形態変化の顕微鏡観察。ｃ～ｆ、同定された様々なマーカー：ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３を使用した、乳腺陽性前駆細胞数のフローサイトメトリーによる定量。ｇ～ｈ．主要な非神経外胚葉マーカーとしてのヒトＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２ＣのＲＮＡ発現レベル。ｉ～ｋ．神経外胚葉マーカーとしてのヒトＰＡＸ６、ＯＴＸ２及びＳＯＸ１１。ｌ．管腔マーカーとしてのヒトＫＲＴ１８。ｍ．分泌型リン酸化乳糖タンパク質としてのヒトＯＰＮ。

【図7】図７は、乳腺三次元分化の３０日目～３５日目の間のエストロゲン関連受容体アルファ（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）及びＭＵＣ１のＲＮＡ発現レベルに対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の効果を示す。

【図8】図８は、三次元オルガノイド設定を用いた人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の乳腺特異的系列分化に対するレチノイン酸（ＲＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の効果を示す。ａ．乳腺前駆体の生成並びに１０日目～１５日目の間のＲＡ、ＢＳＡ及びＦＢＳの適用の手順を要約したスキーム。ｂ．ＲＡ、ＢＳＡ及びＦＢＳへの曝露後の形態変化の顕微鏡観察。ｃ．カルセインＡＭ及びエチジウムホモダイマー１をベースとした、様々な条件下の細胞生存率のフローサイトメトリー評価。ｄ～ｆ．上皮マーカー：ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ及びＭＵＣ１を使用した乳腺前駆細胞数のフローサイトメトリーによる定量。

【図9】図９は三次元オルガノイドモデルを使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の乳腺分化に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）とレチノイン酸（ＲＡ）との組み合わせ効果を示す。ａ～ｃ．分化期間（２５日目（対照プロトコルの場合）及び２０日目（期間短縮プロトコルの場合））及び誘導前段階（３５日目（ＢＭＰ４及びＲＡを含む対照プロトコルの場合）、及び２６日目（期間短縮プロトコルの場合））中に同定された数種のマーカー：ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３を使用した乳腺陽性前駆細胞数のフローサイトメトリーによる定量、ｄ～ｆ．誘導後期間（４２日目（ＢＭＰ４及びＲＡを含む対照プロトコルの場合）及び３１日目（期間短縮プロトコルの場合）。^＊は、ＢＭＰ４とＲＡとの組み合わせを含む短縮された改変プロトコル（３１日）を表す。

【図10】図１０は、オステオポンチンタンパク質の分泌の、液体クロマトグラフィー・質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）ベースでのターゲットプロテオミクス解析を示す。

【0014】

［発明を実施するための形態］
定義
本発明の文脈において、「インビトロ」という用語は、試験管、培養皿、バイオリアクター又は生きている生物の体外の任意の場所で行われるか又は生じることを意味する。

【0015】

本発明の文脈において、「哺乳動物」という用語は、哺乳動物種、例えばヒト、ウシ、サル、ラクダ、ヒツジ、ヤギなどに属する動物を指す。

【0016】

本発明の文脈において、「ラクトサイト」又は「乳腺様細胞」という用語は、ＣＫ１８細胞マーカーを発現し、哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）、特にヒト成体母乳肝細胞（ｈＢＳＣ）に由来する、分泌上皮細胞を特定する。ヒト成体母乳幹細胞は、適切なインフォームドコンセントの下でドナーから得ることができる。本発明の一実施形態では、ＢＳＣは改変されていない。一実施形態では、ＢＳＣは、外因性核酸及び／又は外因性核酸を含む誘導性遺伝子発現系を含むように改変されていない。ここで、誘導性遺伝子発現系は、ホルモン又はシグナル伝達因子を発現するように構成されている。一実施形態では、外因性核酸及び／又は外因性核酸を含む誘導性遺伝子発現系は、ラクトサイトへの細胞分化を促進している。

【0017】

本発明の文脈において、「乳腺様（ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｌｉｋｅ）オルガノイド」又は「乳腺様（ｍａｍｍａｒｙ ｌｉｋｅ）オルガノイド」という用語は、二次元又は三次元（２Ｄ／３Ｄ）で発達し、上記で定義されたようなラクトサイトを含む、乳腺のミニチュア化及び単純化されたバージョンを意味する。

【0018】

本発明の文脈において、「ヒト乳様生成物」という用語は、細胞培養した乳生成物である。かかる生成物は、本発明の方法に従って生成されたラクトサイト及び／又は乳腺様オルガノイドによって発現される食用生成物である。

【0019】

本発明による「ヒト乳様生成物」は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳と同じ成分（例えば、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素並びにそれらのレベルの観点による）を有することができる。これを本明細書では「標準ヒト乳生成物」と称する。あるいは、本発明による「ヒト乳様生成物」は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然に見出される成分の比率及び濃度を変化させることができる。これを本明細書では「非標準乳様生成物」と称する。本発明による「ヒト乳様生成物」は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然には見出されない成分を含むように調整することができる（「調整（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）乳様生成物」）。ヒト乳様生成物の非限定的な例は、サプリメント、強化剤、ヒト母乳代替物（又は代用物）、ならびに生物活性物質のうちの１つのみ及び／又は一部に富んだ原材料、栄養状態の良好な母親のヒト母乳に典型的に見出すことができる多量栄養素及び微量栄養素からなる群から選択される。

【0020】

「ヒト乳様生成物」は、自然に分泌される乳を摂取する代わりに使用することができる（「ヒト乳代替物」）。乳代替生成物は、天然に分泌された乳と組み合わせて摂取されるサプリメント（「ヒト乳サプリメント」）又は強化剤（「ヒト乳強化剤」）として使用することができる。

【0021】

一実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物は、少なくとも、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に典型的に見出すことができる多量栄養素及び微量栄養素を含む。一実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物は、タンパク質、ペプチド、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール及びＬ－カルニチンを含む。一実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物はまた、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡからなる群から選択される、少なくとも１つの生物活性物質を含む。本発明による標準ヒト乳様生成物は、天然のヒト母乳分泌による生成物ではない。

【0022】

別の実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、かかる生成物を摂取する乳児の具体的なニーズに適合させることができる。本発明によるヒト乳様生成物は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に典型的に見出され得る、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素のうちの１つのみ及び／又は一部を含み得る。かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、「非標準ヒト乳様生成物」という用語で称されることもある。一実施形態では、本発明による非標準ヒト乳様生成物は、タンパク質、ペプチド、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物（ヒト乳オリゴ糖を含む）、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール、Ｌ－カルニチン、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡからなる群から選択される、１つ以上の栄養素又は生物活性物質を含む。

【0023】

本発明の文脈において、「無調整ヒト乳様生成物」という用語は、ラクトサイトによって、及び／又は本発明の方法のステップＡ）及びステップＢ）に従って生成された乳腺様オルガノイドによって発現され、本発明の方法の任意のステップＣ）によるさらなる処理に供されていない、ヒト乳様生成物を示す。無調整ヒト乳様生成物は、標準及び非標準ヒト乳様生成物の両方を含み得る。非標準ヒト乳様生成物の非限定的な例は、サプリメント、強化剤、ならびに栄養状態の良好な母親のヒト母乳に典型的に見出され得る、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素のうちの１つのみ及び／又は一部に富んだ原材料からなる群から選択される。

【0024】

本発明の文脈において、「調整ヒト乳様生成物」という用語は、ラクトサイトによって、及び／又は本発明の方法のステップＡ）及びステップＢ）に従って生成された乳腺様オルガノイドによって発現され、本発明の方法の任意のステップＣ）によるさらなる処理に供されている、ヒト乳様生成物を示す。

【0025】

調整ヒト乳様生成物は、標準及び非標準ヒト乳様生成物のいずれをも含み得る。

【0026】

本発明の文脈において、「ＥＢ」という用語は、「胚様体」を意味する。

【0027】

本発明の文脈において、「ｍＥＢ」という用語は、「ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地で培養された胚様体」を意味する。

【0028】

ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地は、基礎培地、少なくとも１種類の増殖サプリメント、ヘパリン及びヒドロコルチゾンを含む、無血清培養培地を指す。

【0029】

本発明の文脈において、「胚様体（ＥＢ）」、「ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地で培養された胚様体（ｍＥＢ）」、「マンモスフェア」及び／又は「スフェロイド」という用語は、本発明の方法のステップＡ）下で母乳幹細胞（ＢＳＣ）によって懸濁液中に形成された三次元凝集体を指す。

【0030】

本発明の文脈における「乳児」という用語は、１２ヶ月齢未満、例えば９ヶ月齢未満、特に６ヶ月齢未満の小児を指す。

【0031】

本発明の文脈において、乳児は、正期産児又は早期産児のいずれかであり得る。本発明の一実施形態では、乳児は、早期産児及び正期産児の群から選択される。

【0032】

用語「正期産児」は、正期産又は３７週以上の在胎齢で生まれた乳児を指す。

【0033】

用語「早期産児」は、３７週未満の在胎齢で生まれた乳児を指す。

【0034】

本発明の文脈において、「出生時体重」という用語は、出生後に胎児又は新生児が獲得していた最初の体重を意味する。

【0035】

本発明の文脈において、「低出生体重」という用語は、２５００ｇ未満（２４９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。

【0036】

本発明の文脈において、「極低出生時体重」という用語は、１５００ｇ未満（１４９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。

【0037】

本発明の文脈において、「超低出生時体重」という用語は、１０００ｇ未満（９９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。

【0038】

用語「在胎不当過小児」は、在胎期間別成長チャート（ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｒｔ）の出生時体重に対する平均基準よりも２標準偏差を超えて低い出生時体重を有する乳児、又は同じ在胎齢の乳児から得られた集団ベースの体重データの１０^ｔｈパーセンタイル未満の出生時体重を有する乳児を指す。「在胎不当過小児」という用語には、構造的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）もしくは遺伝的起源のいずれかにより、又は子宮内発育遅延の結果として、出生時に小さい乳児が含まれる。

【0039】

本発明の文脈において、「幼児（ｙｏｕｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ）」又は「低年齢の小児（ｔｏｄｄｌｅｒ）」という用語は、１～３歳の小児を示す。

【0040】

本明細書で使用される「乳児用フォーミュラ」という用語は、乳児を対象とし、Ｃｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、（Ｃｏｄｅｘ ＳＴＡＮ ７２－１９８１）、及びＣｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、（Ｃｏｄｅｘ ＳＴＡＮ ７２－１９８１）に定義されている乳児用特別用途食品（特別医療目的用食品を含む）に定義されている栄養組成物を指す。乳児用フォーミュラはまた、出生後１ケ月の間の乳児の特定の栄養補給用途を意図する食品であって、当該フォーミュラそのものによって、このカテゴリーに該当する乳児の栄養要件（乳児用フォーミュラ及びフォローオンフォーミュラに対する、Ａｒｔｉｃｌｅ ２（ｃ）ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ９１／３２１／ＥＥＣ ２００６／１４１／ＥＣ ｏｆ ２２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００６）を満たす、食品を指す。乳児用フォーミュラは、スターター乳児用フォーミュラ及びフォローアップフォーミュラ又はフォローオンフォーミュラを包含する。一般に、スターターフォーミュラは、出生時からの乳児のための母乳代替物であり、フォローアップフォーミュラ又はフォローオンフォーミュラは６ヶ月以降のための母乳代替物である。

【0041】

「グローイングアップミルク」（又はＧＵＭ）は、１年目以降から与えられる。このミルクは、概して、特に小児の栄養必要量に合わせて調整された乳系飲料である。かかる飲料は、他の食品と組み合わせて１２ヶ月から２～３歳の小児に与えるために使用される栄養組成物である。

【0042】

本発明の文脈において、「強化剤」という用語は、乳児又は幼児に対して栄養上の利益を有する１つ以上の栄養素を含む組成物を指す。

【0043】

「乳強化剤」という用語は、ヒト母乳、乳児用フォーミュラ、グローイングアップミルク、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳のいずれかを強化又は補充するために使用される任意の組成物を意味する。したがって、本発明のヒト乳強化剤は、ヒト母乳、乳児用フォーミュラ、グローイングアップミルク、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳に溶解させた後に投与することができ、あるいは独立した組成物として投与することができる。

【0044】

独立した組成物として投与される場合、本発明のヒト乳強化剤は、「サプリメント」であると特定することもできる。一実施形態では、本発明の乳強化剤はサプリメントである。

【0045】

「ヒト乳強化剤」という用語は、ヒト母乳、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳を、強化又は補充するために使用される任意の組成物を意味する。本発明による「ヒト乳強化剤」は、極低出生時体重（ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ、ＶＬＢＷ）又は超低出生時体重（ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ、ＥＬＢＷ）を有する早産で生まれた乳児に投与されることが意図され得る。

【0046】

本発明による乳強化剤は、液体形態の粉末であってもよい。

【0047】

液体形態を有する乳強化剤組成物は、いくつかの特定の利点を示す。例えば、液体製剤は、特定の重量又は体積に較正された液滴を送達する包装と組み合わせられる場合、より便利であり得る。

【0048】

更に、液体製剤は強化される組成物と混合するのがより容易であるが、粉末製剤は場合によっては塊を形成することがある。

【0049】

本発明の文脈において、「ヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率及び成熟を増加させる」という用語は、分化プロトコルを経たｈＢＳＣの出発集団から生成された非乳腺前駆細胞と比較して、乳腺前駆細胞の割合を増加させることを意味する。本発明において、上記分化プロトコルは、ＢＭＰ４及び／又はＲＡの使用を含む。したがって、上記の乳腺前駆細胞の割合の増加は、ＢＭＰ４及び／又はＲＡの使用を含まないがそれ以外は同じである分化プロトコルを経たｈＢＳＣの出発集団から生成された非乳腺前駆細胞に対する乳腺前駆細胞の割合と比較されてもよい。

【0050】

本発明の文脈において、「生存率を増加させる」という用語は、生きていて健康である細胞の数を増加させることを意味する。上記細胞は、さらなる分化ステップが可能であり、例えば、本発明の文脈において、乳腺オルガノイドへと発達することが可能である。

【0051】

本発明の文脈において、「乳腺前駆細胞」又は類似の用語は、少なくとも２つの乳腺前駆体マーカーを発現する細胞を意味する。上記マーカーとしては、ＣＤ４９ｆ、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３が挙げられるが、これらに限定されない。逆に、本発明の文脈において、「非乳腺前駆細胞」又は類似の用語は、少なくとも２つの乳腺前駆体マーカーを発現しない細胞を意味する。

【0052】

本明細書におけるＥｐｉＣｕｌｔ培地又はＥｐｉＣｕｌｔＢ培地への言及は、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを含む無血清培養培地を指す。

【0053】

本明細書中に開示される培養培地は、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の増殖／成長及び分化を支援するように設計された、必須栄養素を含む固体、半固体又は液体を指す。ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地は、本発明において使用され得る培養培地の一例である。

【0054】

本発明による方法及び使用
本発明は、特定の条件下で培養され及び分化したｈＢＳＣを使用して乳腺細胞を産生する方法、及び哺乳動物乳様生成物をインビトロで製造する方法において上記乳腺細胞を使用する方法に関する。

【0055】

驚くべきことに、本明細書中に記載される方法における骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及び／又はレチノイン酸（ＲＡ）の添加は、非神経外胚葉前駆細胞の割合を増加させ、神経外胚葉前駆細胞の割合を減少させることによって、非神経外胚葉前駆細胞の、より均質な混合物を提供することが、本発明において実証された。

【0056】

本明細書中に記載の方法におけるＢＭＰ４及び／又はＲＡの添加は、ｈＢＳＣの乳腺前駆細胞への分化効率を増加させ、したがって、本明細書中に記載される方法によって産生される乳腺前駆細胞の数を増加させることも、本発明において実証された。利点としては、乳腺細胞の収率向上が挙げられる。

【0057】

驚くべきことに、本明細書中に記載の方法におけるＲＡの添加は、本発明の方法によって産生される乳腺前駆細胞の生存率を増加させることも見出された。

【0058】

典型的には、ｈＢＳＣの分化及び形態形成を補助するために、血清添加培養液が使用される。現在、ＲＡが血清の有効な代替物として使用され得ることが見出されている。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の方法は、有利には無血清である。

【0059】

ＢＭＰ４とＲＡとの組み合わせは、オステオポンチン（ＯＰＮ）などの乳特異的生物活性マーカーの発現レベル及び分泌レベルを改善することも実証されている。

【0060】

ＢＭＰ４とＲＡとの組み合わせによって分化効率が増加することから、全体的な分化プロトコルの長さを短縮できることも実証されている。この短縮は、細胞死の低減、乳様物の収率の向上、及び費用節約などの重大な利益を有する。

【0061】

哺乳動物乳腺細胞の産生
一態様では、本発明は、特定の条件下で培養及び分化されたｈＢＳＣを用いて乳腺細胞を産生する方法に関する。

【0062】

したがって、本発明は、乳腺細胞の集団を産生する方法であって、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及び／又はレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中でヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法を提供する。

【0063】

本発明はまた、分化プロトコルにおけるヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるための、ＢＭＰ４及び／又はＲＡの使用を提供する。

【0064】

したがって、本発明は、乳腺細胞の集団を産生する方法であって、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む培養培地中でヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法を提供する。

【0065】

本発明はまた、分化プロトコルにおけるヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるための、ＢＭＰ４の使用を提供する。

【0066】

したがって、本発明は、乳腺細胞の集団を産生する方法であって、
ｉ）レチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中でヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法を提供する。

【0067】

本発明はまた、分化プロトコルにおけるヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるための、ＲＡの使用を提供する。

【0068】

したがって、本発明は、乳腺細胞の集団を産生する方法であって、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）とレチノイン酸（ＲＡ）とを含む培養培地中でヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法を提供する。

【0069】

本発明はまた、分化プロトコルにおけるヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるための、ＢＭＰ４及びＲＡの使用を提供する。いくつかの実施形態では、本発明はまた、哺乳動物乳様生成物の製造効率を増加させるための、ＢＭＰ４及びＲＡの使用を提供する。

【0070】

いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する。上記ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドは泌乳能（ｌａｃｔｏｇｅｎｉｃ）を有しており、すなわち、乳を産生することができる。

【0071】

骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、本明細書中に記載されている分化方法の初期段階において培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～１０日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～６日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に培養培地に添加される。０日目は、ｈＢＳＣが培養培地に初めて添加される時点、すなわち、ｈＢＳＣが初めて分化誘導される時点である。

【0072】

いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、３日間培養培地に添加される。

【0073】

いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。

【0074】

いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。

【0075】

本明細書中に記載されている方法において生成されたＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。

【0076】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。

【0077】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上は、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上は、２つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。

【0078】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５０％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも５０％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも７５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも７５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0079】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0080】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも３５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0081】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも１５％は、ＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0082】

ＥＢはまた、非神経外胚葉マーカーを発現し、それによって非神経細胞系列への富化を示す。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の非神経外胚葉マーカーは、ＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２Ｃから選択される。

【0083】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の非神経外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。

【0084】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の非神経外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも３～１５倍増加している。

【0085】

いくつかの実施形態では、ＥＢの非神経外胚葉マーカーＴＦＡＰ２Ａの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢの非神経外胚葉マーカーＴＦＡＰ２Ｃの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。

【0086】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の神経外胚葉マーカーの発現が減少している。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の神経外胚葉マーカーは、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２及びＳＯＸ１１から選択される。

【0087】

したがって、本明細書中に記載される方法は、細胞集団中に存在する細胞のタイプに関してより均質な細胞集団を提供し、すなわち、細胞集団は、非神経外胚葉系列細胞の、より均質な集団を含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の神経外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも０．５倍に減少している。すなわち、これらのマーカーの発現レベルは半分に減少している。いくつかの実施形態では、上記神経外胚葉マーカーは、ＰＡＸ６、ＯＸＴ２及びＳＯＸ１１から選択される。

【0089】

いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳特異的生物活性マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳特異的生物活性マーカーはオステオポンチン（ＯＰＮ）である。

【0090】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、増加している。

【0091】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。

【0092】

いくつかの実施形態では、ＥＢのＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢのＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。

【0093】

いくつかの実施形態では、ＥＢのＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも４倍増加している。

【0094】

いくつかの実施形態では、ＥＢのＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも１８倍増加している。

【0095】

いくつかの実施形態では、乳腺細胞の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、増加している。いくつかの実施形態では、乳腺細胞の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、上記マーカーは、エストロゲン関連受容体α（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）及びＭＵＣ１から選択される。いくつかの実施形態では、乳腺細胞のＥＳＲＲＡの発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、乳腺細胞のＫＲＴ１４の発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、乳腺細胞のＭＵＣ１の発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、少なくとも２倍増加している。

【0096】

レチノイン酸（ＲＡ）
いくつかの実施形態では、ＲＡは、本明細書中に記載されている分化方法の初期段階において培養条件に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、乳腺分化系列の運命決定（ｍａｍｍａｒｙ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）段階の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、１０日目～１５日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、６日目～１１日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、１１日目の後に培養培地に添加されない。いくつかの実施形態では、ＲＡは、１１日目の前に培養培地に添加される。０日目は、ｈＢＳＣが培養培地に初めて添加される時点、すなわち、ｈＢＳＣが初めて分化誘導される時点である。

【0097】

いくつかの実施形態では、ＲＡは、培養培地に５日間添加される。

【0098】

いくつかの実施形態では、ＲＡは、１μＭの濃度で培養培地に添加される。

【0099】

いくつかの実施形態では、ＲＡは、１０日目～１５日目の間に、1μＭの間の濃度で培養条件に添加される。

【0100】

いずれかに記載されている方法において生成されたＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記の１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ及びＭＵＣ１から選択される。

【0101】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＲＡで処理されていないＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。

【0102】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はウシ胎仔血清などの血清で処理されたＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。

【0103】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以上は、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上は、２つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ及びＭＵＣ１から選択される。

【0104】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも４０％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0105】

いくつかの実施形態では、ＥＢは、ＲＡで処理されていないＥＢと比較して、細胞生存率が増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢは、少なくとも８５％以上の生存率を有する。いくつかの実施形態では、ＥＢは、少なくとも９５％以上の生存率を有する。

【0106】

本明細書中に記載の乳腺細胞の集団を産生する方法は、本明細書中に記載の哺乳動物乳様生成物を産生するための方法において、特に本明細書中に記載されるステップＡ）の一部として、組み合わせられてもよく、及び／又は利用されてもよい。

【0107】

例えば、本明細書中に記載の乳腺細胞の集団を産生する方法のいくつかの実施形態では、培養ステップｉ）は、ｈＢＳＣを、任意選択で少なくとも１２日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによってｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む。

【0108】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の乳腺細胞の集団を産生する方法のいくつかの実施形態では、成長ステップｉｉ）は、ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させることを含む。

【0109】

いくつかの実施形態では、ステップｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０の間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む。

【0110】

いくつかの実施形態では、ステップｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む。

【0111】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されている乳腺細胞の集団を産生する方法において、培養ステップｉ）は、ｈＢＳＣを、任意選択で少なくとも１２日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによってｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含み、成長ステップｉｉ）は、ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させることを含む。

【0112】

ＢＭＰ４及びＲＡ
本明細書中に記載されるＢＭＰ４に関する任意の実施形態は、本明細書中に記載されるＲＡに関する任意の実施形態と組み合わせてもよいことは理解される。

【0113】

例えば、ＢＭＰ４及びＲＡを培養培地に添加するタイミングに関して、いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に培養培地に添加され、ＲＡは、１０日目～１５日目の間に培養培地に添加される。

【0114】

いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に培養培地に添加され、ＲＡは、６日目～１１日目の間に培養培地に添加される。

【0115】

本明細書中に記載される方法におけるＢＭＰ４とＲＡとの組み合わせは、ＢＭＰ４及びＲＡのそれぞれ単独について観察される結果を超える、さらなる驚くべき効果を示すことも理解される。

【0116】

本明細書中に記載されるＢＭＰ４とＲＡとの組み合わせを使用した方法において生成されたＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。

【0117】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。

【0118】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又はそれ以上は、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上は、２つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。

【0119】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも６０％は、中間分化の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、誘導前の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、誘導後の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも４０％は、誘導後の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0120】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、中間分化の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、誘導前の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５％は、誘導後の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、誘導後の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0121】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５０％は、中間分化の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２５％は、誘導前の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、誘導後の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも４０％は、誘導後の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0122】

いくつかの実施形態では、中間分化の段階は２５日目であり、誘導前の段階は３５日目であり、誘導後の段階は４２日目である。いくつかの実施形態では、中間分化の段階は２０日目の間である。誘導前の段階は２６日目であり、誘導後の段階は３１日目である。

【0123】

いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳特異的生物活性マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳特異的生物活性マーカーはオステオポンチン（ＯＰＮ）である。

【0124】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける上記マーカーの発現レベルと比較して増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの分泌が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける上記マーカーの発現レベルと比較して、増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢにおけるＯＰＮの分泌が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおけるＯＰＮの発現レベルと比較して、増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢにおけるＯＰＮの分泌が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおけるＯＰＮの発現レベルと比較して、４０％以上増加している。

【0125】

本明細書中に記載の乳腺細胞の集団を産生する方法は、本明細書中に記載の哺乳動物乳様生成物を産生するための方法において、特に本明細書中に記載されるステップＡ）の一部として、組み合わせられてもよく、及び／又は利用されてもよい。

【0126】

例えば、本明細書中に記載の乳腺細胞の集団を産生する方法のいくつかの実施形態では、培養ステップｉ）は、ｈＢＳＣを、任意選択で少なくとも１２日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及び任意選択でＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによってｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む。いくつかの実施形態では、ステップＡｉ）は、８日間以下である。

【0127】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の乳腺細胞の集団を産生する方法のいくつかの実施形態では、成長ステップｉｉ）は、形成されたＥＢを、任意選択でＲＡを含む三次元包埋系において、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲルにおいて、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成することを含む。いくつかの実施形態では、ステップＡｉｉ）は、少なくとも２３日間、例えば２５日間以下である。

【0128】

本明細書中に記載されている乳腺細胞の集団を産生する方法のいくつかの実施形態では、培養ステップｉ）は、ｈＢＳＣを、任意選択で少なくとも１２日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによってｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含み、成長ステップｉｉ）は、形成されたＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系において、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲルにおいて、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成することを含む。

【0129】

哺乳動物乳様生成物の製造
本発明はまた、本明細書で定義されるステップＡ）及びステップＢ）のいずれか、並びに本明細書で定義される任意のステップＣ）を含む、本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物を製造する方法にも関する。本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物を製造するための上記方法は、ステップＡ）の一部として、哺乳動物乳腺細胞を産生する方法も含み得る。特に、ＢＭＰ４及び／又はＲＡは、本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物を製造する方法のいずれかに、特にステップＡ）の一部として添加されてもよい。ＢＭＰ４とＲＡとの組み合わせを使用する上記方法はまた、長さの異なる哺乳動物乳様生成物産生時間を含む。

【0130】

ステップＡ ｈＢＳＣからのラクトサイト及び／又は乳腺様オルガノイドの生成
本発明の方法によれば、乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、ステップＡ）下で生成される。

【0131】

このような乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、ｈＢＳＣを利用する任意の既報の方法に従って生成することができる。

【0132】

一実施形態では、このような乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、その全体が本明細書に援用されるＨａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の手順に従って生成することもできる。

【0133】

上記の科学刊行物（以下、「Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ刊行物」とも称する）に記載されている方法論は、ｈＢＳＣからヒト乳腺様細胞及び／又はオルガノイドを生成するためのプロトコルを表す。

【0134】

より具体的には、ステップＡは、好ましくは
胚様体形成
乳腺分化系列の運命決定
分枝及び腺房分化、並びに
乳生物活性の誘導
を含む。

【0135】

これらの段階の各々は、特定の培養培地を用いて、特定の時間にわたって実施されてもよい。

【0136】

いくつかの実施形態では、ステップＡは、合計で４０～４５日間、好ましくは４２日間実施される。

【0137】

いくつかの実施形態では、ステップＡは、短縮され、４２日未満、任意選択で４０日未満、任意選択で３１日未満実施される。好ましくは、ステップＡは３１日間実施される。

【0138】

いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は、０日目～１０日目の間である。いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は、１０日間である。

【0139】

いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は、短縮され、０日目～６日目の間である。いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は、６日間である。いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は、１０日間以下である。

【0140】

いくつかの実施形態では、乳腺分化系列の運命決定段階は、１０日目～１５日目の間である。いくつかの実施形態では、乳腺分化系列の運命決定段階は、６日目～１１日目の間である。いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は、５日間である。いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は、５日間以下である。

【0141】

いくつかの実施形態では、分枝及び腺房分化段階は、１５日目～３５日目の間である。いくつかの実施形態では、分枝及び腺房分化段階は、２０日間である。

【0142】

いくつかの実施形態では、分枝及び腺房分化段階は、短縮され、１１日目～２６日目の間である。いくつかの実施形態では、分枝及び腺房分化段階は、１５日間である。いくつかの実施形態では、分枝及び腺房分化段階は、１５日間以下である。

【0143】

いくつかの実施形態では、乳生物活性の誘導段階は、３５日目～４２日目の間である。いくつかの実施形態では、乳生物活性の誘導段階は、７日間である。

【0144】

いくつかの実施形態では、乳生物活性の誘導段階は、短縮され、２６日目～３１日目の間である。いくつかの実施形態では、乳生物活性の誘導段階は、５日間である。いくつかの実施形態では、乳生物活性の誘導段階は、５日間以下である。

【0145】

したがって、いくつかの実施形態では、ステップＡは合計４２日間実施され、ここで、胚様体形成段階は０日目～１０日目の間であり、乳腺分化系列の運命決定段階は１０日目～１５日目の間であり、分枝及び腺房分化段階は１５日目～３５日目の間であり、乳生物活性の誘導段階は３５日目～４２日目の間である。

【0146】

他の実施形態では、プロセスが短縮され、その結果ステップＡは合計３１日間実施され、ここで、胚様体形成段階は０日目～６日目の間であり、乳腺分化系列の運命決定段階は６日目～１１日目の間であり、分枝及び腺房分化段階は１１日目～２６日目の間であり、乳生物活性の誘導段階は２６日目～３１日目の間である。

【0147】

本明細書中に記載される方法における使用のための期間及び培養培地のさらなる詳細は、以下に提供される。

【0148】

いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４が培養培地に添加される。この添加は、本明細書に記載のように乳腺前駆細胞の割合を増加させるためである。

【0149】

ＢＭＰ４は、本明細書中に記載されるように、培養培地に添加される。

【0150】

ＢＭＰ４は、本明細書中に記載されている分化方法の初期段階において培養条件に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～１０日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～６日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に培養培地に添加される。０日目は、ｈＢＳＣが培養培地に初めて添加される時点、すなわち、ｈＢＳＣが初めて分化を誘導される時点である。

【0151】

いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、３日間培養培地に添加される。

【0152】

いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。

【0153】

いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。

【0154】

いくつかの実施形態では、ＲＡは、ステップ２において培養培地に添加される。これは、乳腺前駆細胞の割合を増加させるため、及び／又は乳腺前駆細胞の生存率を増加させるためである。

【0155】

ＲＡは、本明細書中に記載されるように培養培地に添加される。

【0156】

ＲＡは、本明細書中に記載される分化方法の初期段階において培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、乳腺分化系列の運命決定段階の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、１０日目～１５日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、６日目～１１日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、１１日目の後に培養培地に添加されない。０日目は、ｈＢＳＣが培養培地に初めて添加される時点、すなわち、ｈＢＳＣが初めて分化を誘導される時点である。

【0157】

いくつかの実施形態では、ＲＡは、培養培地に５日間添加される。

【0158】

いくつかの実施形態では、ＲＡは、１μＭの濃度で培養培地に添加される。

【0159】

いくつかの実施形態では、ＲＡは、１０日目～１５日目の間に、1μＭの間の濃度で培地に添加される。

【0160】

本発明の一実施形態では、ステップａ）下でヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、かかるステップａ）は、
ｉ）ｈＢＳＣを、適切な培養培地（例えば、任意選択で抗生物－抗真菌剤溶液及びファンギゾンを添加した、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中で培養して、１週間後に、ｈＢＳＣから形成されたマンモスフェアを回収するステップ；及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを、適切な系（例えば、任意選択でウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びインスリン及び上皮成長因子（ＥＧＦ）及びヒドロコルチゾン及び抗生物－抗真菌剤溶液及びフンギゾンを添加した、Ｌ－グルタミンを含む培養培地ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０を含む乳腺分化培地など）中で少なくとも１週間、例えば２～４週間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。

【0161】

本発明の一実施形態では、ステップａ）下でヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、かかるステップａ）は、
ｉ）ｈＢＳＣを、本明細書中に記載のＢＭＰ４を任意選択で含む適切な培養培地（例えば、任意選択で抗生物質－抗真菌剤溶液及びファンギゾンを添加した、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中で培養して、１週間後に、ｈＢＳＣから形成されたマンモスフェアを回収するステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを、本明細書中に記載のＲＡを任意選択で含む適切な系（例えば、任意選択でウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びインスリン及び上皮成長因子（ＥＧＦ）及びヒドロコルチゾン及び抗生物－抗真菌剤溶液及びフンギゾンを添加した、Ｌ－グルタミンを含む培養培地ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０を含む乳腺分化培地など）中で少なくとも１週間、例えば２～４週間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。

【0162】

本発明の一実施形態では、ステップａ）下でヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、かかるステップａ）は、
ｉ）ｈＢＳＣを、本明細書中に記載のＢＭＰ４を含む適切な培養培地（例えば、任意選択で抗生物－抗真菌剤溶液及びファンギゾンを添加した、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中で培養して６日後に、ｈＢＳＣから形成されたマンモスフェアを回収するステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを、本明細書中に記載のＲＡを含む適切な系（例えば、任意選択でウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びインスリン及び上皮成長因子（ＥＧＦ）及びヒドロコルチゾン及び抗生物－抗真菌剤溶液及びフンギゾンを添加した、Ｌ－グルタミンを含む培養培地ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０を含む乳腺分化培地など）中で１０日未満成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。

【0163】

本発明の一実施形態では、ステップａ）下でヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、かかるステップａ）は、
ｉ）ｈＢＳＣを、マンモスフェア形成のための非接着条件下で適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中で凝集させ及び培養するステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを、三次元の適切な系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル、又は非接着性プレート内の懸濁培養物）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。

【0164】

本発明の一実施形態では、ステップａ）下でヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、かかるステップａ）は、
ｉ）ｈＢＳＣを、マンモスフェア形成のための非接着条件下で、本明細書中に記載のＢＭＰ４を任意選択で含む適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中で凝集及び培養するステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを、本明細書中に記載のＲＡを任意選択で含む三次元の適切な系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル、又は非接着性プレート内の懸濁培養物）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
本発明の一実施形態では、ステップａ）下でヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、かかるステップａ）は、
ｉ）ｈＢＳＣを、マンモスフェア形成のための非接着条件下で、本明細書中に記載のＢＭＰ４を含む適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中で凝集させ及び培養するステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを、本明細書中に記載のＲＡを含む三次元の適切な系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル、又は非接着性プレート内の懸濁培養物）中で１０日間未満成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。

【0165】

一実施形態では、ステップＡ）下での乳腺の運命決定は、特定の因子（例えば、上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦ）を添加した馴化培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）を適用することによって得られる。

【0166】

一実施形態では、ステップＡ）下での乳腺の運命決定は、特定の因子（例えば、上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦ）及びＲＡを添加した馴化培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）を適用することによって得られる。

【0167】

本発明の一実施形態では、本方法は、ステップＡ）下で乳腺様オルガノイドを生成するステップを含む。

【0168】

本発明の一実施形態では、ステップＡ）下で乳腺様オルガノイドを生成する方法は、細胞の二次元単層、付着ＥＢを有する二次元（２Ｄ ｗｉｔｈ ａｔｔａｃｈｅｄ ＥＢ）、非接着性プレート内の懸濁液、及び混合浮遊ゲルからなる群から選択される条件下で細胞を培養するステップを含む。

【0169】

別の好ましい実施形態では、ステップＡ）におけるマンモスフェア（ｍＥＢ）を、適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で少なくとも１５日間培養する。

【0170】

より好ましい実施形態では、ステップＡ）におけるマンモスフェア（ｍＥＢ）を、適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で２０日間培養する。

【0171】

一実施形態では、本発明による方法は、ステップＡ）に従う培養条件を提供し［例えば、ステップＡ）ｉ）下、及び／又はステップＡ）ｉｉ）下］、この条件は、標準ヒト乳様生成物を分泌することができるヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）に由来するラクトサイトを生成するように調整されている。

【0172】

一実施形態では、栄養素及び生体模倣刺激の送達は、細胞成長、分化、及び組織形成に影響を与えるように制御される。一実施形態では、このような制御は、バイオリアクター内で行われる。

【0173】

一実施形態では、本発明による方法は、ステップＡ）に従う培養条件を提供し［例えば、ステップＡ）ｉ）下、及び／又はステップＡ）ｉｉ）下］、培養条件は、非標準ヒト乳様生成物を分泌することができるヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）に由来するラクトサイトを生成するように調整されている。

【0174】

好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒトｈＢＳＣからラクトサイトを生成するステップを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法であって、このようなステップＡ）は、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において少なくとも４２日間、ｈＢＳＣを乳腺細胞（例えば、ラクトサイト）へと分化させることを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも３１日間。いくつかの実施形態では、３１日間以下である。

【0175】

好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒトｈＢＳＣからラクトサイトを生成するステップを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法であって、このようなステップＡ）は、本明細書中に記載されるＢＭＰ４及び／又はＲＡを含む適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において少なくとも４２日間、ｈＢＳＣを乳腺細胞（例えば、ラクトサイト）へと分化させることを含む、方法が提供される。好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒトｈＢＳＣからラクトサイトを生成するステップを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法であって、このようなステップＡ）は、本明細書中に記載されるＢＭＰ４及びＲＡを含む適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において少なくとも３１日間以下、ｈＢＳＣを乳腺細胞（例えば、ラクトサイト）へと分化させることを含む、方法が提供される。

【0176】

別の好ましい実施形態では、ステップＡ）下でｈＢＳＣからラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）ｈＢＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中で、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において、少なくとも１２日間（－２日目～１０日目）培養することによって、ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、適切な三次元包埋系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル）中で少なくとも３０日間、好ましくは３２日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。

【0177】

別の好ましい実施形態では、ステップＡ）下でｈＢＳＣからラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）ｈＢＳＣを、本明細書中に記載のＢＭＰ４を任意選択で含む適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中で、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において、少なくとも１２日間（－２日目～１０日目）培養することによって、ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを任意選択で含む適切な三次元包埋系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル）中で少なくとも３０日間、好ましくは３２日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。

【0178】

別の好ましい実施形態では、ステップＡ）下でｈＢＳＣからラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）ｈＢＳＣを、本明細書中に記載のＢＭＰ４を含む適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中で、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において、８日（－２日目～６日目）間以下培養することによって、ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル）中で２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。

【0179】

本発明の特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下でｈＢＳＣからラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を生産する方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、
ｉ）標準培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のようにＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン（ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間（－２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）及びヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）が添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１０日間（０日目～１０日目）のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間（１０日目～１５日目）のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間（１５日目～３５日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間（３５日目～４２日目）インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む。

【0180】

本発明の特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下でｈＢＳＣからラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を生産する方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、
ｉ）標準培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のようにＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間（－２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）及びヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）及び任意選択で本明細書中に記載のＢＭＰ４が添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１０日間（０日目～１０日目）のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及び任意選択で本明細書中に記載のＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間（１０日目～１５日目）のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間（１５日目～３５日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間（３５日目～４２日目）インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む。

【0181】

本発明の特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下でｈＢＳＣからラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を生産する方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、
ｉ）標準培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のようにＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間（－２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）及びヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）及び本明細書中に記載のＢＭＰ４が添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で６日間（０日目～６日目）のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及び本明細書中に記載のＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間（６日目～１１日目）のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を１５日間（１１日目～２６日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間（２６日目～３１日目）インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む。

【0182】

ステップｉｖ）は、好ましくは、乳タンパク質発現細胞、特にラクトサイト、及び／又は乳腺様オルガノイドへの分化をもたらす。

【0183】

本発明のさらに特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下でｈＢＳＣからラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を生産する方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、
ｉ）標準培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のようにＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間（－２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリンを添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間（０日目～１０日目）のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間（１０日目～１５日目）包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間（３５日目～４２日目）インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む。

【0184】

本発明のさらに特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下でｈＢＳＣからラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を生産する方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、
ｉ）標準培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のようにＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間（－２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリン及び任意選択で本明細書中に記載のＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間（０日目～１０日目）のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及び任意選択でＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間（１０日目～１５日目）包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間（３５日目～４２日目）インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む。

【0185】

本発明のさらに特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下でｈＢＳＣからラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を生産する方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、
ｉ）標準培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のようにＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間（－２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリン及び本明細書中に記載のＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で６日間（０日目～６日目）のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間（６日目～１１日目）包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間（１１日目～２６日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間（２６日目～３１日目）インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む。

【0186】

ステップｉｖ）は、好ましくは、乳タンパク質発現細胞、特にラクトサイト、及び／又は乳腺様オルガノイドへの分化をもたらす。

【0187】

本明細書で言及される標準培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のようにＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからカタログ番号Ａ１５１７００１の「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地」として市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ａ１５１７００１＃／Ａ１５１７００１も参照されたい）。

【0188】

ｍＴｅＳＲ（商標）培地は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからカタログ番号８５８５０で市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｍｔｅｓｒ１．ｈｔｍｌも参照されたい）。このような培地は、「Ｄｅｆｉｎｅｄ，Ｆｅｅｄｅｒ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｉｓｓｕｅ １，Ｓｅｐｔ ２００７にも記載されている。

【0189】

一実施形態では、特に好ましい実施形態について上で定義されたステップｉｉｉ）及び／又はｉｖ）は、好ましくは、少なくとも乳腺細胞（ｂｒｅａｓｔ ｃｅｌｌ）、管腔細胞、及び基底細胞の形成／これらの細胞への分化をもたらす。これに関連して、乳腺細胞（ｂｒｅａｓｔ ｃｅｌｌ）は、好ましくは、β－カゼイン、乳タンパク質、及びホルモン受容体からなる群から選択されるマーカーのうち、１つ又は複数、好ましくはすべてを発現する。更に、管腔細胞は、好ましくは、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、及びＣＫ１８からなる群から選択されるマーカーののうち、１つ又は複数、好ましくはすべてを発現する。更に、基底細胞は、好ましくは、ＣＫ１４、α－平滑筋アクチン及びＰ６３からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する。

【0190】

さらなる一実施形態では、特に好ましい実施形態について上で定義したステップｉｉ）及び／又はｉｖ）におけるｍＥＢ（マンモスフェア）の誘導後に、β－カゼイン、乳タンパク質、及びホルモン受容体からなる群から選択されるマーカーのうち、１つ以上を発現する乳腺様オルガノイド、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、及びＣＫ１８からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する管腔細胞、並びにＣＫ１４、α－平滑筋アクチン及びＰ６３からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する基底細胞を得ることもできる。

【0191】

本発明の一実施形態において、上記の方法は、標準ヒト乳様生成物を製造するために提供される。

【0192】

別の実施形態において、上記の方法は、非標準ヒト乳様生成物を製造するために提供される。

【0193】

一実施形態では、栄養素及び生体模倣刺激の送達は、細胞成長、分化及び組織形成に影響を与えるように制御される。一実施形態では、このような制御は、バイオリアクター内で行われる。

【0194】

本明細書中に記載されている哺乳動物乳様生成物を製造する方法においてＢＭＰ４を培養培地に添加する場合、本明細書中に記載されている方法において生成されるＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。

【0195】

いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して増加されている。

【0196】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又はそれ以上は、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上は、２つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。

【0197】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５０％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも５０％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも７５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも７５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0198】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0199】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも３５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0200】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも１５％は、ＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0201】

ＥＢはまた、非神経外胚葉マーカーを発現し、それによって非神経細胞系列への富化を示す。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の非神経外胚葉マーカーは、ＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２Ｃから選択される。

【0202】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の非神経外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。

【0203】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の非神経外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも３～１５倍増加している。

【0204】

いくつかの実施形態では、ＥＢの非神経外胚葉マーカーＴＦＡＰ２Ａの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢの非神経外胚葉マーカーＴＦＡＰ２Ｃの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。

【0205】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の神経外胚葉マーカーの発現が減少している。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の神経外胚葉マーカーは、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２及びＳＯＸ１１から選択される。

【0206】

したがって、本明細書中に記載される方法は、細胞集団中に存在する細胞のタイプに関してより均質な細胞集団を提供し、すなわち、細胞集団は、非神経外胚葉系列細胞の、より均質な集団を含む。

【0207】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の神経外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍に減少している。すなわち、これらのマーカーの発現レベルは半分に減少している。いくつかの実施形態では、上記神経外胚葉マーカーは、ＰＡＸ６、ＯＸＴ２及びＳＯＸ１１から選択される。

【0208】

いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳特異的生物活性マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳特異的生物活性マーカーはオステオポンチン（ＯＰＮ）である。

【0209】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、増加している。

【0210】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。

【0211】

いくつかの実施形態では、ＥＢのＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢのＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。

【0212】

いくつかの実施形態では、ＥＢのＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも４倍増加している。

【0213】

いくつかの実施形態では、ＥＢのＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも１８倍増加している。

【0214】

いくつかの実施形態では、乳腺細胞の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、増加している。いくつかの実施形態では、乳腺細胞の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、上記マーカーは、エストロゲン関連受容体α（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）及びＭＵＣ１から選択される。いくつかの実施形態では、乳腺細胞のＥＳＲＲＡの発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、乳腺細胞のＫＲＴ１４の発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、乳腺細胞のＭＵＣ１の発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、少なくとも２倍増加している。

【0215】

したがって、一例として、本明細書で提供されるのは、ヒト乳様生成物を製造するための方法であって、ステップＡ）下でヒト母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）からラクトサイトを生成することを含み、かかるステップＡ）が
ｉ）ｈＢＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及び本明細書中に記載のＢＭＰ４中で培養することによって、ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させて、１０日後に、ｈＢＳＣから形成されたマンモスフェアを回収するステップ；及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを、適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で少なくとも１０日間培養して、ラクトサイトを生成するステップ、
を含み、
マンモスフェア（ＥＢ）の１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないマンモスフェア（ＥＢ）における上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して増加している、
方法である。

【0216】

本明細書中に記載されている哺乳動物乳様生成物を製造する方法においてＲＡを培養培地に添加する場合、本明細書中に記載されている方法において生成されるＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記の１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ及びＭＵＣ１から選択される。

【0217】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＲＡで処理されていないＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。

【0218】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はウシ胎仔血清などの血清で処理されたＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。

【0219】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以上は、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又はそれ以上は、２つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ及びＭＵＣ１から選択される。

【0220】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも４０％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0221】

いくつかの実施形態では、ＥＢは、ＲＡで処理されていないＥＢと比較して、細胞生存率が増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢは、生存率が少なくとも８５％以上である。いくつかの実施形態では、ＥＢは、生存率が少なくとも９５％以上である。

【0222】

したがって、一例として、本明細書で提供されるのは、ヒト乳様生成物をインビトロで製造する方法であって、
Ａ）ヒト母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｂ）上記ラクトサイトからヒト乳様生成物を分泌させるステップ、を含み、
かかるステップＡ）は、
ｉ）ｈＢＳＣを、適切な培養培地、例えばＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、少なくとも１２日間培養することによって、ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含み、
マンモスフェア（ＥＢ）は、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＲＡで処理されていないＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して増加されている、方法である。

【0223】

本明細書中に記載されている哺乳動物乳様生成物を製造する方法においてＢＭＰ４及びＲＡを培養培地に添加する場合、本明細書中に記載されている方法において生成されるＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。

【0224】

いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して増加されている。

【0225】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又はそれ以上は、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上は、２つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態は、上記乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。

【0226】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも６０％は、中間分化段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、誘導前段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも４０％は、誘導後の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0227】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、中間分化の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、誘導前の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５％は、誘導後の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0228】

いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５０％は、中間分化の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２５％は、誘導前の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、誘導後の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。

【0229】

いくつかの実施形態では、中間分化の段階は２５日目である。誘導前の段階は３５日目であり、誘導後の段階は４２日目である。いくつかの実施形態では、中間分化の段階は２０日目の間である。誘導前の段階は２６日目であり、誘導後の段階は３１日目である。

【0230】

いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳特異的生物活性マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳特異的生物活性マーカーはオステオポンチン（ＯＰＮ）である。

【0231】

いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける上記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、増加している。

【0232】

したがって、一例として、本明細書で提供されるのは、ヒト乳様生成物を製造するための方法であって、ステップＡ）下でヒト母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）からラクトサイトを生成することを含み、かかるステップＡ）が
ｉ）ｈＢＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及び本明細書中に記載のＢＭＰ４中で培養することによって、ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させて、１０日後に、ｈＢＳＣから形成されたマンモスフェアを回収するステップ；及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを、適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で少なくとも１０日間培養して、ラクトサイトを生成するステップ、
を含み、
マンモスフェア（ＥＢ）は、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないマンモスフェア（ＥＢ）における上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して増加している、
方法である。

【0233】

したがって、一例として、本明細書で提供されるのは、ヒト乳様生成物を製造するための方法であって、ステップＡ）下でヒト母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）からラクトサイトを生成することを含み、かかるステップＡ）が
ｉ）ｈＢＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及び本明細書中に記載のＢＭＰ４中で培養することによって、ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させて、６日後に、ｈＢＳＣから形成されたマンモスフェアを回収するステップ；及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを、ＲＡを含む適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で少なくとも１０日間未満培養して、ラクトサイトを生成するステップ、
を含み、
マンモスフェア（ＥＢ）の１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないマンモスフェア（ＥＢ）における上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している、
方法である。

【0234】

本明細書に開示される任意の方法又は方法ステップは、支持体として膜マトリックスを使用するのではなく、三次元懸濁培養において行われ得ることが理解されるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、全ての分化手順の間、細胞は懸濁培養で維持される。

【0235】

ステップＢヒト母乳様生成物の発現
本発明の一実施形態において、本方法は、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドからヒト乳様生成物を発現させるステップを含む。

【0236】

ヒト乳様生成物の発現は、好ましくは、かかるラクトサイト及び／又は乳腺様腺オルガノイドからのヒト乳様生成物の発現の誘導時に生じる。

【0237】

一実施形態では、泌乳期のラクトサイトは、催乳因子（例えば、プロラクチン、ハイドロコルチゾン、及びインスリン）を添加した特定の培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔ Ｂ）を適用することによって誘導される。

【0238】

特に、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト母乳幹細胞（ＢＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから得られたヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質又はオリゴ糖、好ましくはヒト乳オリゴ糖などを含む、又はこれらからなる群から選択される、ヒト乳の生物活性物質を含有する。本発明者らは具体的には、とりわけオリゴ糖（ラクトース）、脂質（Ｃ１２：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１ ｎ－９、Ｃ１８：２脂肪酸）、及びタンパク質（ラクトフェリン、アルファラクトアルブミンを同定することに成功した。

【0239】

本発明の一実施形態では、ヒト母乳幹細胞（ＢＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから得られたヒト乳様生成物は、標準ヒト乳生成物である。本発明の別の実施形態では、ヒト母乳幹細胞（ＢＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから得られたヒト乳様生成物は、非標準ヒト乳生成物である。

【0240】

ステップＣ 調整ヒト母乳様生成物を製造するためのさらなる処理
本発明の任意の一実施形態では、本方法は、ステップＢ）から得ることができるヒト乳様生成物に対して行われ、かかる生成物に対して追加の処理を行って調整ヒト乳様生成物を提供することを含む追加のステップＣ）を含む。

【0241】

一実施形態では、ヒト母乳様生成物に対して行われる追加の処理ステップＣ）は、精製ステップ、単離プロセス、抽出プロセス、分画ステップ、濃縮プロセス、酵素処理、さらなる成分（例えば、ヒト乳腺オルガノイドによって発現され得ないもの（例えば、免疫グロブリン、プロバイオティクス、ビタミン類及び／又はミネラル類など））の添加又はそれらの組合せからなる群において選択され得る。

【0242】

ヒト乳様生成物
標準ヒト母乳様生成物
本発明の一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、標準ヒト母乳様生成物であり、すなわち、栄養状態の良好な母親のヒト母乳と同じ成分を含む。

【0243】

母乳哺育の利点は、科学文献において周知であり、標準ヒト母乳様生成物へのアクセスが可能になることで、かかる生成物を多くの同様に周知の健康上の利点のために使用可能になる。

【0244】

かかる実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、実際の授乳が不可能な状況下で、母乳代替物として使用することができる。

【0245】

かかる実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、例えば、泌乳が少ない女性、又は出産の６ヶ月後に泌乳しなくなった女性の授乳経験がより長期間になるよう支援するために使用されることが意図される。

【0246】

同様に、標準ヒト母乳様生成物は、例えば、病気により母親からの実際の授乳が損なわれる状況下であっても、授乳を可能にするために使用されることが意図される。

【0247】

別の実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、母乳の産生が自然に開始されない状況、例えば乳児を養子とした場合に使用されることが意図される。

【0248】

一実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物は、天然に生じるとおりのヒト母乳授乳期の生成物ではない。

【0249】

一実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、乳児に最適な栄養を提供する際に使用するためのものである。

【0250】

一実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、乳児に健康な発育を提供する際に使用するためのものである。

【0251】

一実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、幼児における感染、肥満の予防及び免疫発達の促進に使用するためのものである。

【0252】

一実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、無調整ヒト母乳様生成物である。

【0253】

別の実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、調整ヒト母乳様生成物である。

【0254】

一実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン及びミネラルを含む。

【0255】

別の実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル及び生物活性物質を含む。

【0256】

一実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール及びＬ－カルニチンを含む。

【0257】

さらなる実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物はまた、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡからなる群において選択される少なくとも１つの生物活性物質を含む。

【0258】

かかる標準ヒト母乳様生成物は、本発明の方法に従って、例えば、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡ）を添加するステップＣ）を含めることによって調製され得る。

【0259】

一実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、プロバイオティクスを含有する。

【0260】

かかる標準ヒト母乳様生成物は、例えば、いくつかの商業的に入手可能な供給源から得ることができるプロバイオティクス（例えば、Ｂ．ラクティス（Ｂ．Ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．Ｒａｍｎｈｏｓｕｓ））を含有させることにより、本発明の方法に従い調製され得る。

【0261】

かかる実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、胃腸機能を最適化するため、及び／又は免疫を促進するために使用され得る。

【0262】

一実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、分泌型ＩｇＡ及びプロバイオティクスを含有する。

【0263】

かかる標準ヒト母乳様生成物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１５６３０１号及び国際公開第２００９／１５６３６７号に記載されているように調製することができるプロバイオティクスと分泌型ＩｇＡとの組合せを添加するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製することができる。かかる実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、免疫グロブリンの欠乏を予防するために、並びに／又は乳児及び幼児における再発感染の予防において使用され得る。

【0264】

非標準ヒト母乳様生成物
本発明の一実施形態では、ヒト乳様生成物は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然に見出される成分比及び成分濃度とは変更させることができる。これを本明細書では「非標準乳様生成物」と称する。

【0265】

一実施形態では、本発明による非標準ヒト乳様生成物は、乳強化剤、サプリメント、及び／又は特別な目的に適合させたヒト母乳代替物からなる群において選択され得る。

【0266】

ヒト乳強化剤及びヒト乳生物活性サプリメント
一実施形態では、本発明の方法は、授乳中の母親から自然に得られるヒト母乳を強化するために、又は乳児用フォーミュラを強化するために使用することができる非標準ヒト母乳様生成物を提供する。

【0267】

別の実施形態では、本発明の方法は、必要に応じて乳児又は幼児のためのサプリメントとして使用され得る非標準ヒト母乳様生成物を提供する。

【0268】

かかる実施形態では、非標準ヒト母乳様生成物は、健康な発育を提供するために、及び／又は、乳児又は幼児における特定の状態（例えば、ぜんそく、アレルギー、認知変化など）に典型的に関連する病気を発症するリスクを低減するために、及び／又は、発育、免疫の発達、感染からの保護を促進するために、使用され得る。

【0269】

注目すべきことに、かかる強化剤又はサプリメント中の成分（特に生物活性成分）がヒト起源であることは、それらが本発明の方法によるものであるという事実と相まって、かかる成分にそのままの（ｉｎｔａｃｔ）又はより高い機能性を提供すると考えられる。

【0270】

非標準ヒト母乳様生成物は、強化剤として使用されることが意図される。強化剤として使用されることが意図されるかかる非標準ヒト母乳様生成物は、本発明の方法に従って、例えば、ステップＢ）から得ることができるヒト母乳様生成物からの特定の生物活性物質の単離及び／又は濃縮のステップＣ）を含めることによって、調製され得る。かかる単離ステップは、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の古典的な分画、富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）及び／又は精製を介して行われてもよい。

【0271】

サプリメントとして使用されることが意図される非標準ヒト母乳様生成物は、ヒト乳オリゴ糖（例えば、２ＦＬ、３ＦＬ、ＬＮＴ、ＬｎＮＴ、ＤｉＦｌ、６ＳＬ及び／又は３ＳＬ）、脂質、増殖／成長因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子）、サイトカイン（例えば、形質転換増殖因子－β２（ＴＧＦβ－２）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ－ガンマ）、ＴＮＦ－アルファ）、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、マイクロＲＮＡを含むエキソソーム、及び抗菌／保護的生物活性物質（例えば、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトアドヘリン）からなる群において選択される１つ以上の生物活性物質を含み得る。サプリメントとして使用されることが意図されるかかる非標準ヒト母乳様生成物は、本発明の方法に従って、例えば、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物から生物活性物質を単離するステップＣ）を含めることによって調製され得る。かかる単離ステップは、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の古典的な分画、富化及び／又は精製を介して行われてもよい。

【0272】

一実施形態では、非標準ヒト母乳様生成物は、フコシル化ヒト乳オリゴ糖、例えば２ＦＬ及び／又は３ＦＬを含有するサプリメント又は乳強化剤である。かかるサプリメント又は乳強化剤は、ＦＵＴ２遺伝子が不活性であることに起因してフコシル化オリゴ糖を分泌しない女性のヒト母乳のプロファイルを充足させる際に使用するためのものである。

【0273】

強化剤又はサプリメントとして使用されることが意図されるかかる非標準ヒト母乳様生成物は、本発明の方法に従って、例えば、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物からフコシル化オリゴ糖（例えば、２ＦＬ及び／又は３ＦＬ）を単離及び／又は濃縮するステップＣ）を含めることによって調製され得る。

【0274】

かかる実施形態では、標準ヒト母乳様生成物は、胃腸機能を最適化するため、及び／又は免疫を促進するために使用され得る。

【0275】

遺伝的疾患を有する乳児のためのヒト母乳様生成物
一実施形態では、本発明によるヒ非標準ト母乳様生成物は、遺伝的疾患を有して生まれた乳児の特異的なニーズに対処するように調整され得る。

【0276】

ガラクトース血症
かかる実施形態では、非標準ヒト母乳様生成物は、ガラクトース血症に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ガラクトース血症は、乳児のガラクトース代謝能に影響を及ぼす稀な遺伝子疾患である。

【0277】

かかる実施形態では、非標準ヒト母乳様生成物は、ラクトース及び／又はラクトース含有サッカリドを除去されるべきである。かかる実施形態では、非標準ヒト母乳様生成物は、ガラクトース血症に罹患した乳児に健康な発育を提供するために使用され得る。

【0278】

一実施形態では、ラクトース及び／又はラクトース含有サッカリドが除去された非標準ヒト母乳様生成物は、酵素処理（ラクターゼ処理）のステップＣ）、又はステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の膜分画及び限外濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得ることもできる。

【0279】

別の実施形態では、ラクトース及び／又はラクトース含有サッカリドが除去された非標準ヒト母乳様生成物は、ステップＡ）においてα－ラクトアルブミン欠失ｈＢＳＣを使用することによって、本発明の方法に従って得られ得る。

【0280】

フェニルケトン尿症
かかる実施形態では、非標準ヒト母乳様生成物は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ＰＫＵは、フェニルアラニンをチロシンに変換するフェニルアラニンヒドロキシラーゼが存在しないこと又は機能不全であることに起因する。未処置では、脳毒性により重度の精神遅滞がもたらされる。

【0281】

かかる実施形態では、非標準ヒト母乳様生成物のフェニルアラニンは除去又は減少させるべきである。かかる実施形態では、非標準ヒト母乳様生成物は、ＰＫＵに罹患した乳児に健康な発育を提供するために使用され得る。一実施形態では、非標準ヒト母乳様生成物のフェニルアラニン含量が、かかる生成物を摂取する対象の体重１ｋｇ当たり２０ｍｇ未満に維持されるように、フェニルアラニンを減少させる。

【0282】

一実施形態では、フェニルアラニンを減少させ又は除去した非標準ヒト母乳様生成物は、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の酵素処理（タンパク質加水分解）又は濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得ることができる。

【0283】

一実施形態では、フェニルアラニンを減少させた非標準ヒト母乳様生成物は、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の酵素処理（タンパク質加水分解）又は濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得ることができる。

【0284】

別の実施形態では、フェニルアラニンを減少させた非標準ヒト母乳様生成物は、本発明の方法に従って、ステップＢ）において、限定量又はゼロ量のフェニルアラニンを提供する培養培地を、例えば、乳清由来のグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）を含有する培養培地などを提供することによって得ることができる。

【0285】

本明細書に開示するとおりの詳細な説明の様々な態様及び実施形態は、本発明を作製及び使用する特定の方法を例示するものであり、請求項及び詳細な説明と共に考慮するにあたり、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の態様及び実施形態に由来する特徴を、本発明の同じ又は異なる態様及び実施形態に由来する更なる特徴と組み合わせてもよいことも理解されたい。

【0286】

発明を実施するための形態及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「１つの」（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、別段の指示が文脈上明確にない限り、複数の参照物も含まれる。

【0287】

本発明の追加的な実施形態
第１の追加の実施形態では、以下が提供される。

【0288】

Ｓ１． 哺乳動物乳様生成物を製造する方法であって、
Ａ）哺乳動物成体母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｂ）前記哺乳動物成体乳幹細胞（ｍＢＳＣ）に由来する前記ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌するステップ、
を含む、方法。

【0289】

Ｓ２． 非標準ヒト乳様生成物を製造する方法であって、
Ａ）ヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｂ）前記ヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）に由来する前記ラクトサイトから前記ヒト乳様生成物を分泌するステップ、
を含み、
前記非標準ヒト乳様生成物が、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、コリン、ミオイノシトール、Ｌ－カルニチン、成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞、エキソソーム由来の生物活性物質及び分泌型ＩｇＡからなる群から選択される、栄養素又は生物活性物質のうちの１つ以上を含む、
ステートメント１に記載の方法。

【0290】

Ｓ３． ステートメント１に記載のヒト乳様生成物をさらに処理して調整ヒト乳様生成物を得るステップＣ）を、任意選択で含む、ステートメント１又は２に記載の方法。

【0291】

Ｓ４．ステップＣ）が、精製ステップ、単離プロセス、抽出プロセス、分画ステップ、濃縮プロセス、酵素処理、さらなる成分の添加又はこれらの組み合わせからなる群において選択される、ステートメント３に記載の方法。

【0292】

Ｓ５．ステップＡ）に従う培養条件が、非標準ヒト乳様生成物を分泌することができるヒト成体母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）に由来するラクトサイトを生成するように調整されている、ステートメント２～４のいずれか１つに記載の方法。

【0293】

Ｓ６．調整ヒト乳様生成物が、ステップＣ）下で、ステップＢ）の前記ヒト乳様生成物に、ステップＢ）において前記ラクトサイトによって分泌されない１つ以上のヒト母乳成分を添加することによって得られる、ステートメント３～５のいずれか１つに記載の方法。

【0294】

Ｓ７．前記ラクトサイトが、ステップＡ）下で生成される乳腺様オルガノイド構造の一部である、ステートメント１～６のいずれか１つに記載の方法。

【0295】

Ｓ８．前記ヒト乳様生成物が、オリゴ糖、脂質及びタンパク質からなる群から選択される生物活性物質からなる、又は生物活性物質を含む、ステートメント１～７のいずれか１つに記載の方法。

【0296】

Ｓ９．前記ヒト乳様生成物が、ラクトース、Ｃ１２：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１ ｎ－９、Ｃ１８：２、ラクトフェリン及びアルファラクトアルブミンからなる群から選択される生体活性物質からなる、又は生物活性物質を含む、ステートメント１～８のいずれか１つに記載の方法。

【0297】

Ｓ１０．ステートメント２～９のいずれか１つに記載の方法に従って得ることができる、ヒト乳様生成物。

【0298】

Ｓ１１．オリゴ糖、脂質及びタンパク質からなる群から選択される、生物活性物質を含む、又は生物活性物質からなる、ステートメント１０に記載のヒト乳様生成物。

【0299】

Ｓ１２．ラクトース、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１６：０脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、Ｃ１８：１ ｎ－９脂肪酸、Ｃ１８：２脂肪酸、ラクトフェリン及びアルファラクトアルブミンからなる群から選択される生物活性物質を含む、又は生物活性物質からなる、ステートメント１１に記載のヒト乳様生成物。

【0300】

Ｓ１３．治療に使用するための、ステートメント１０～１２のいずれか１つに記載のヒト乳様生成物。

【0301】

Ｓ１４．母乳代替物としての、ステートメント１０～１２のいずれか１つに記載のヒト母乳様生成物の使用。

【0302】

第２の追加の実施形態では、以下が提供される。
Ｓ１． 乳腺細胞の集団を産生する方法であって、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む培養培地中でヒト母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法。

【0303】

Ｓ２． 前記培養ステップｉ）が、前記ｈＢＳＣを、任意選択で少なくとも１２日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによって前記ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む、ステートメント１に記載の方法。

【0304】

Ｓ３． 前記成長ステップｉｉ）が、前記ＥＢを、三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、ステートメント１又は２に記載の方法。

【0305】

Ｓ４． 前記乳腺細胞がヒト乳腺細胞である、ステートメント１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0306】

Ｓ５． ＢＭＰ４が、０日目～１０日目の間、好ましくは０日目～３日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｈＢＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、ステートメント１～４のいずれか１つに記載の方法。

【0307】

Ｓ６． ＢＭＰ４が前記培養培地に３日間添加される、ステートメント１～５のいずれか１つに記載の方法。

【0308】

Ｓ７． ＢＭＰ４が、５～２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ又は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記培養培地に添加される、ステートメント１～６のいずれか１つに記載の方法。

【0309】

Ｓ８． 前記ＥＢが、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から任意選択で選択される、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、ステートメント１～７のいずれか１つに記載の方法。

【0310】

Ｓ９． 前記ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける前記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している、ステートメント１～８のいずれか１つに記載の方法。

【0311】

Ｓ１０． 前記ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも５０％が、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも１５％が、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも２０％が、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、かつ／又はＥＢの少なくとも１５％が、ＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、ステートメント１～９のいずれか１つに記載の方法。

【0312】

Ｓ１１． 前記ＥＢが、ＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２Ｃから任意選択で選択される、１つ以上の非神経外胚葉マーカーを発現する、ステートメント１～１０のいずれか１つに記載の方法。

【0313】

Ｓ１２． 前記ＥＢの１つ以上の非神経外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける前記非神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍、任意選択で少なくとも３～１５倍増加している、ステートメント１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0314】

Ｓ１３． 前記ＥＢの１つ以上の非神経外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける前記神経外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍に減少し、任意選択で、前記神経外胚葉マーカーが、ＰＡＸ６、ＯＸＴ２及びＳＯＸ１１から選択される、ステートメント１～１２のいずれか１つに記載の方法。

【0315】

Ｓ１４． 前記ＥＢが、１つ以上の乳特異的生物活性マーカー、任意選択でオステオポンチン（ＯＰＮ）を発現する、ステートメント１～１３のいずれか１つに記載の方法。

【0316】

Ｓ１５． 前記ＥＢのＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおけるＯＰＮの発現レベルと比較して、少なくとも２倍、任意選択で少なくとも４～１８倍増加している、ステートメント１～１４のいずれか１つに記載の方法。

【0317】

Ｓ１６． 前記乳腺細胞が、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する、ステートメント１～１５のいずれか１つに記載の方法。

【0318】

Ｓ１７． 前記乳腺細胞の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して増加しており、任意選択で、前記乳腺細胞の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、少なくとも２倍増加し、任意選択で、上記マーカーが、エストロゲン関連受容体α（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）及びＭＵＣ１から選択される、ステートメント１～１６のいずれか１つに記載の方法。

【0319】

Ｓ１８． 分化プロトコルにおけるヒト母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるための、ＢＭＰ４の使用。

【0320】

Ｓ１９． 哺乳動物乳様生成物を製造する方法であって、
Ｃ）ヒト母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｄ）前記ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、
を含み、
ステップＡ）が、ＢＭＰ４を含む培養培地中で前記ｈＢＳＣを培養することを含む、方法。

【0321】

Ｓ２０． ヒト乳様生成物を製造する方法であって、
ステップＡ）が、
ｉ）ｈＢＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えばＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、少なくとも１２日間培養することによって、前記ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、ステートメント１９に記載の方法。

【0322】

Ｓ２１． ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む、標準ｈＢＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４及びヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で１０日間の前記ＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中での前記ｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、ステートメント２０に記載の方法。

【0323】

Ｓ２２． ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｈＢＳＣ培地Ｅ８中で２日間のインキュベーションによる、前記ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間の前記ＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、ステートメント２０に記載の方法。

【0324】

Ｓ２３． ステップＡ）が、ステートメント１～１７のいずれか１つに記載の方法を含む、ステートメント１９～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0325】

Ｓ２４． ステートメント１９～２３のいずれか１つに記載の方法に従って得ることができる、ヒト乳様生成物。

【0326】

Ｓ２５． 治療に使用するための、ステートメント２４に記載のヒト乳様生成物。

【0327】

Ｓ２６． ステートメント２４に記載のヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物、任意選択で母乳代替物としての使用。

【0328】

第３の追加の実施形態では、以下が提供される。
Ｓ１． 乳腺細胞の集団を産生する方法であって、
ｉ）培養培地レチノイン酸（ＲＡ）中でヒト母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法。

【0329】

Ｓ２． 前記培養ステップｉ）が、前記ｈＢＳＣを、任意選択で少なくとも１２日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによって前記ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む、ステートメント１に記載の方法。

【0330】

Ｓ３． 前記成長ステップｉｉ）が、前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させることを含む、ステートメント１又は２に記載の方法。

【0331】

Ｓ４． ステップｉｉ）がさらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中での前記ｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む、ステートメント３に記載の方法。

【0332】

Ｓ５． ステップｉｉ）がさらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋した前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む、ステートメント３に記載の方法。

【0333】

Ｓ６． 前記乳腺細胞がヒト乳腺細胞である、ステートメント１～５のいずれか１つに記載の方法。

【0334】

Ｓ７． ＲＡが、１０日目～１５日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｈＢＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、ステートメント１～６のいずれか１つに記載の方法。

【0335】

Ｓ８． ＲＡが、前記培養培地に５日間添加される、ステートメント１～７のいずれか１つに記載の方法。

【0336】

Ｓ９． ＲＡが、１μＭの濃度で前記培養培地に添加される、ステートメント１～８のいずれか１つに記載の方法。

【0337】

Ｓ１０．前記ＥＢが、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ及びＭＵＣ１から任意選択で選択される、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、ステートメント１～９のいずれか１つに記載の方法。

【0338】

Ｓ１１．前記ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＲＡで処理されていないＥＢにおける前記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している、ステートメント１～１０のいずれか１つに記載の方法。

【0339】

Ｓ１２．前記ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以上が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも４０％が、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも１０％が、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、かつ／又は任意選択で、ＥＢの少なくとも１５％が、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、ステートメント１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0340】

Ｓ１３．前記ＥＢが、ＲＡで処理されていないＥＢと比較して増加した細胞生存率を有する、ステートメント１～１２のいずれか１つに記載の方法。

【0341】

Ｓ１４．前記ＥＢが、少なくとも８５％以上、好ましくは９５％以上の生存率を有する、ステートメント１～１３のいずれか１つに記載の方法。

【0342】

Ｓ１５．前記乳腺細胞が、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する、ステートメント１～１４のいずれか１つに記載の方法。

【0343】

Ｓ１６． 分化プロトコルにおけるヒト母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるための、ＲＡの使用。

【0344】

Ｓ１７． 哺乳動物乳様生成物を製造する方法であって、
Ａ）ヒト母乳幹細胞（ｈＢＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｂ）前記ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、を含み、
ステップＡ）が、ＲＡを含む培養培地中で前記ｈＢＳを培養することを含む、方法。

【0345】

Ｓ１８． ヒト乳様生成物を製造する方法であって、
ステップＡ）が、
ｉ）ｈＢＳＣを、適切な培養培地、例えばＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、少なくとも１２日間培養することによって、前記ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質とＲＡとから構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、ステートメント１６に記載の方法。

【0346】

Ｓ１９． ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｈＢＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で１０日間の前記ＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中での前記ｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、ステートメント１８に記載の方法。

【0347】

Ｓ２０． ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｈＢＳＣ培地Ｅ８中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリンを添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋した前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、ステートメント１８に記載の方法。

【0348】

Ｓ２１． ステップＡ）が、ステートメント１～１５のいずれか１つに記載の方法を含む、ステートメント１７～２０のいずれか１つに記載の方法。

【0349】

Ｓ２２． ステートメント１７～２０のいずれか１つに記載の方法に従って得ることができる、ヒト乳様生成物。

【0350】

Ｓ２３． 治療に使用するための、ステートメント２２に記載のヒト乳様生成物。

【0351】

Ｓ２４． ステートメント２２に記載のヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物、任意選択で母乳代替物としての使用。

【0352】

第４の追加の実施形態では、以下が提供される。
Ｓ１． 乳腺細胞の集団を産生する方法であって、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及び／又はレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法。

【0353】

Ｓ２． 前記培養培地が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む、ステートメント１に記載の方法。

【0354】

Ｓ３． 培養ステップｉ）が、前記ｍＢＳＣを、任意選択で少なくとも１２日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによって前記ｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む、ステートメント１又は２に記載の方法。

【0355】

Ｓ４． 前記培養ステップｉ）が、前記ｈＢＳＣを、任意選択で８日間以下、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによって前記ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む、ステートメント２に記載の方法。

【0356】

Ｓ５． 前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、ステートメント１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0357】

Ｓ６． 前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、ステートメント２又は４に記載の方法。

【0358】

Ｓ７． ステップｉｉ）がさらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中での前記ｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む、ステートメント５に記載の方法。

【0359】

Ｓ８． ステップｉｉ）がさらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋した前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む、ステートメント６に記載の方法。

【0360】

Ｓ９． 前記乳腺細胞がヒト乳腺細胞である、ステートメント１～８のいずれか１つに記載の方法。

【0361】

Ｓ１０． ＢＭＰ４が、０日目～１０日目の間、好ましくは０日目～３日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｈＢＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、ステートメント１～９のいずれか１つに記載の方法。

【0362】

Ｓ１１． ＢＭＰ４が、前記培養培地に３日間添加される、ステートメント１～１０のいずれか１つに記載の方法。

【0363】

Ｓ１２． ＲＡが、１０日目～１５日目の間、任意選択で６日目～１１日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｈＢＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、ステートメント１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0364】

Ｓ１３． ＲＡが、前記培養培地に５日間添加される、ステートメント１～１２のいずれか１つに記載の方法。

【0365】

Ｓ１４． ＢＭＰ４が、５～２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ又は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記培養培地に添加される、ステートメント１～１３のいずれか１つに記載の方法。

【0366】

Ｓ１５． ＲＡが、１μＭの濃度で前記培養培地に添加される、ステートメント１～１４のいずれか１つに記載の方法。

【0367】

Ｓ１６． 前記ＥＢが、任意選択でＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、ステートメント１～１５のいずれか１つに記載の方法。

【0368】

Ｓ１７． 前記ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している、ステートメント２～１５のいずれか１つに記載の方法。

【0369】

Ｓ１８． 前記ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも３５％が、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも１５％が、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、かつ／又は任意選択で、ＥＢの少なくとも２０％が、ＥｐＣＡＭ及びＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、ステートメント１～１６のいずれか１つに記載の方法。

【0370】

Ｓ１９． 前記ＥＢが、１つ以上の乳特異的生物活性マーカー、任意選択でオステオポンチン（ＯＰＮ）を発現する、ステートメント１～１８のいずれか１つに記載の方法。

【0371】

Ｓ２０． 前記ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現が増加しており、任意選択でオステオポンチン（ＯＰＮ）の発現が増加している、ステートメント１～１９のいずれか１つに記載の方法。

【0372】

Ｓ２１． 前記ＥＢにおける１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの分泌が増加されており、任意選択でオステオポンチン（ＯＰＮ）の分泌が増加されている、ステートメント１～２０のいずれか１つに記載の方法。

【0373】

Ｓ２２． 前記乳腺細胞が、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する、ステートメント１～２１のいずれか１つに記載の方法。

【0374】

Ｓ２３． 分化プロトコルにおける哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるための、ＢＭＰ４及び／又はＲＡの使用。
Ｓ２４． 哺乳動物乳様生成物を製造する方法であって、
Ａ）哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｂ）前記ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、を含み、
ステップＡ）が、ＢＭＰ４及び／又はＲＡを含む培養培地中で前記ｈＢＳＣを培養することを含む、方法。

【0375】

Ｓ２５． 前記培養培地が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む、ステートメント２４に記載の方法。

【0376】

Ｓ２６． ステップＡ）が、３０日～４５日の間の工程、任意選択で４５日未満の工程、任意選択で４４日未満の工程、任意選択で３５日未満の工程、任意選択で３１日未満の工程である、ステートメント２４又は２５に記載の方法。
Ｓ２７． ヒト乳様生成物を製造する方法であって、
ステップＡ）が、
ｉ）前記ｍＢＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えばＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、少なくとも１２日間培養することによって前記ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質とＲＡとから構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、ステートメント２４～２６のいずれか１つに記載の方法。

【0377】

Ｓ２８． ヒト乳代替生成物を製造する方法であって、
ステップＡ）が、
ｉ）前記ｍＢＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えばＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、８日間以下培養することによって、前記ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質とＲＡとから構成される混合浮遊ゲル中で２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、ステートメント２５又は２６に記載の方法。

【0378】

Ｓ２９． ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４及びヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で１０日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中での前記ｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、ステートメント２７に記載の方法。

【0379】

Ｓ３０． ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４及びヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で６日間の前記ＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中での前記ｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、ステートメント２８に記載の方法。

【0380】

Ｓ３１． ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間の前記ＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋した前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、ステートメント２７に記載の方法。

【0381】

Ｓ３２． ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で６日間の前記ＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋した前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、ステートメント２８に記載の方法。

【0382】

Ｓ３３． ステップＡ）が、ステートメント１～２２のいずれか１つに記載の方法を含む、ステートメント２４～３２のいずれか１つに記載の方法。

【0383】

Ｓ３４． ステップＡ）が三次元懸濁培養条件で行われる、ステートメント２４～２６及び３３に記載の方法。

【0384】

Ｓ３５． ステートメント２４～３４のいずれか１つに記載の方法に従って得ることができる、ヒト乳様生成物。

【0385】

Ｓ３６． 治療に使用するための、ステートメント３５に記載のヒト乳様生成物。

【0386】

Ｓ３７． ステートメント３５に記載のヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物、任意選択で母乳代替物としての使用。

【0387】

本明細書で述べる現在の好ましい実施形態に対する様々な変更及び修正が、当業者には明らかとなる点を理解されたい。このような変更及び修正は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、並びに本発明の付随する利点を減らすことなく、なされてもよい。したがって、このような変更及び修正は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。

【0388】

実験
実施例１
ｈＢＳＣの培養及びｈＢＳＣからラクトサイトへの分化
本発明者らの目的は、ドナーから採取したヒト母乳細胞からｈＢＳＣを単離し、乳腺分化条件（Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２０１２に記載の条件）下で、その分化中に分析用の上清を採取し、分泌された栄養素に基づいてラクトサイトの機能性を実証することである。

【0389】

材料
献乳試料
インフォームドコンセントへの署名後に得られた献乳を、搾乳から３時間以内に使用した。

【0390】

スフェロイド形成培地の配合
５００ｍＬのＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地キットに、３％ペニシリン・ストレプトマイシン及び２μＬ／ｍＬフンギゾンを添加した（表１）。

【0391】

【表1】

【0392】

乳腺分化培地の配合
Ｌ－グルタミンを含む５００ｍＬのＲＰＭＩ １６４０に、２０％ＦＢＳ、４μｇ／ｍＬのインスリン、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、５％ペニシリン・ストレプトマイシン、及び２μＬ／ｍＬのフンギゾンを添加した（表２）。

【0393】

【表2】

【0394】

実験計画
１．１ ヒト母乳細胞（ｈＢＭＣ）の単離
・各献乳をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で希釈し（１：１）、遠心分離した（２０℃で８００×ｇ、２０分間）。
・脂肪層及び液体部分のスキムミルクを除去し、細胞ペレットをＰＢＳ中で３回洗浄した（２０℃で３００×ｇ、５分間）。
・細胞生存率はフローサイトメトリーによって評価した

【0395】

１．２ 胚性幹細胞マーカーによるヒト母乳細胞（ｈＢＭＣ）の染色
各献乳から１００μＬのｈＢＭＣの試料を生存率について染色し、及び胚性幹細胞マーカーに対する抗体で染色した（各抗体製造業者の指示に従った）。

【0396】

【表3】

【0397】

・細胞をＦＡＣＳ（ＬＳＲＩＩ、５つのレーザーを有する新しい細胞分析装置、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって解析した。

【0398】

１．３ スフェロイドとしてのｈＢＭＣの培養
・各献乳からのｈＢＭＣの残りを、超低接着６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内のスフェロイド形成培地（３ｍＬ／ウェル）（表１を参照されたい）中で、３７℃、５％ＣＯ _２にて培養した。

【0399】

１．４ 乳腺分化条件下でのｈＢＭＣの培養（３～４週間）及び上清回収
・初代ｈＢＭＣスフェロイドを、各献乳につき１～３ウェル（１ウェル当たり１ｍＬの培地）で、３７℃、５％ＣＯ_２にて、組織培養用２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の乳腺分化培地中で４週間インキュベーションした（表２を参照されたい）。スフェロイドを回収し、遠心分離した（３００ｇ、５分）。培地を廃棄し、１ｍＬのトリプシンを５分間添加した。その後、細胞を遠心分離し、トリプシンを除去し、１ｍＬの乳腺培地を細胞に添加した。
・毎週、上清を各ウェルから回収し、（－２０±５℃）で保存した。
・新鮮な乳腺分化培地を各ウェルに添加した。

【0400】

１．５ ＥＬＩＳＡによるα－ラクトアルブミン及びラクトフェリン検出
各ＥＬＩＳＡキットの製造業者の指示に従って、α－ラクトアルブミン（Ｃｌｏｕｄ ｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＥＢ０１８Ｈｕ）及びラクトフェリン（Ｃｌｏｕｄ ｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＥＡ７８０Ｈｕ）について、上清をＥＬＩＳＡで解析した。

【0401】

結果
フローサイトメトリー：
表４に報告するように、３名のドナー全てのｈＢＭＣが、５つのマーカーの全てを発現した。

【0402】

ＴＲＡ－１－１６０の発現が最も高く、全ての生存細胞で２３．５％～３３．４％であった。ＳＳＥＡ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧは、より広い発現範囲を有し、全ての生存細胞で、それぞれ２．５％～２１％、６．２％～２２．１％、及び０．９％～２２．２％であった。ＯＣＴ４発現は最も低く、全ての生存細胞で、０．１％～２．７％であった。

【0403】

【表4】

【0404】

１．６ 培養物の外観：
低接着プレート内のｍａｍｍｏｃｕｌｔ培地中で１週間後、ｈＢＭＣはスフェロイドを形成した。細胞が乳腺培地中の培養プレートに播種されると、その一部は表面に付着し、乳腺様の形態を示す。

【0405】

１．７ ＥＬＩＳＡ：
各ドナーについて、１週間培養後の乳腺培地中のｈＢＭＣ培養物によるラクトフェリン及びα－ラクトアルブミン分泌のＥＬＩＳＡ結果を、以下の表７に報告する。

【0406】

【表5】

【0407】

まとめ及び結論
・ｈＢＭＣは様々なレベルの胚性幹細胞マーカーを発現しており、様々な細胞系列に分化することができる胚性幹細胞の存在が確認された。
・乳腺分化条件下で、これらの胚性幹細胞の一部は乳腺様の形態を獲得し、この形態は約２週間維持された。

【0408】

したがって、本研究の条件下で、乳腺様細胞は分化を示し、かつ培養することができた。

【0409】

実施例２
ラクトサイトによって分泌された脂質の分析
方法：上記の手順１．４下で１週目及び２週目に得られた上清を分析して、ラクトサイトによって分泌される複数種の脂質クラスに含まれる、脂肪酸の存在を調査する。溶融シリカＣＰ－Ｓｉｌ ８８キャピラリーカラム（１００％シアノプロピルポリシロキサン、１００ ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚０．２５ｍｍ）を備えた分取ステーションモジュールを有する７６９３オートサンプラーを備えた７８９０Ａガスクロマトグラフを、２５０℃で加熱されたスプリットインジェクター（１：２５比）、及び３００℃で操作される水素炎イオン化検出器と共に使用する。

【0410】

ＦＡＭＥ（脂肪酸メチルエステル）の調製は、メタノール性塩酸（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｒｉｃ ａｃｉｄ）による試料の直接エステル交換によって行われる。ＦＡＭＥの分離は、キャピラリーガスクロマトグラフィー・ＦＩＤ（ＧＣ）を使用して行われる。

【0411】

ＦＡＭＥの同定は、保持時間（ＲＴ）及び外部標準との比較によって行われる。ＦＡの定量は、内部標準としてメチルＣ１１：０を使用した計算によって行われる。本方法のエステル交換性能は、第２の内部標準としてＴＡＧ Ｃ１３：０を用いて制御される。

【0412】

・１０ｍＬのスクリューキャップ付ガラス試験管に２５０ｍＬの上清試料を添加する。
・３００ｍＬの内部標準ＦＡＭＥ Ｃ１１：０溶液を添加する。
・３００ｍＬの内部標準ＴＡＧ Ｃ１３：０溶液を添加する。
・２ｍＬのメタノールを添加する。
・２ｍＬのメタノール／ＨＣｌ（３Ｎ）を添加する。
・１ｍＬのヘキサンを添加する。
・試験管にしっかりと蓋をして、激しく振とうする。
・１００℃／６０分で加熱し、時々振とうする。
・室温まで自然冷却する（約１５分）。
・２ｍＬの水を加える。
・１２００ｇで５分間遠心分離する。
・ヘキサン相（上相）を、ガラスウール及び無水硫酸ナトリウムを含有するパスツールピペットを通して、清浄な空のＧＣバイアルへと濾過する。

【0413】

結果：１週目及び２週目についてそれぞれ表５、図１及び表６、図２に報告するように、分析は脂肪酸の存在を明らかにしており、ラクトサイトによる脂質産生機能を示す。

【0414】

【表6】

【0415】

【表7】

【0416】

実施例３
上清中のタンパク質の分析
方法：１．４に上述したように１週目に得られた上清試料中のタンパク質の同定を、Ｄｚｉｅｃｉａｔｋｏｗｓｋａらが記載した手順に従って行った（Ｄｚｉｅｃｉａｔｋｏｗｓｋａ Ｍ．，Ｈｉｌｌ Ｒ，ａｎｄ Ｈａｎｓｅｎ ＫＣ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；１１５６：５３－６６；ＧｅＬＣ－ＭＳ／ＭＳ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ）。簡潔に述べると、培養上清中のタンパク質を一次元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析によって分離した。タンパク質染色後、検出されたタンパク質バンドを切り出し、ゲル内消化し、続いて放出されたペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって分離及び検出した。ＭＳスペクトルを、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用したタンパク質データベース検索によってさらに処理した。厳しいフィルター基準を適用し（ペプチド質量許容差：５ｐｐｍ；セミトリプシン切断；偽発見率（ＦＤＲ）：１％；ケラチン汚染排除）、上清の高バックグラウンドのウシタンパク質（培養培地中のウシ胎児血清の存在に起因する）中のヒトタンパク質を検出した。

【0417】

結果：異なる３つのヒト乳タンパク質、すなわち、α－２－マクログロブリン、インターα－トリプシン阻害剤重鎖Ｈ２及びラクトフェリンが、この解析において同定された。例えば、ヒトラクトフェリンは、対比する相同なウシラクトフェリンペプチドと特異的に異なる１４個のペプチドのマッチングにより同定された。ヒト及びウシのラクトフェリン由来のペプチドの、タンデムＭＳペプチドスペクトルのマッチについての２つの例を、以下の図３及び図４に示す。これらの結果は、ｈＢＭＣ培養物の上清中にヒト乳タンパク質、例えばラクトフェリンが存在することを確定する。

【0418】

実施例４
上清中の炭水化物の分析
方法：１．４で上述したように１週目、２週目及び３週目に得られた上清試料を、ＡｕｓｔｉｎとＢｅｎｅｔがヒト乳について記載した手順に従って、ラクトース又はヒト乳オリゴ糖の存在について分析した［Ａｕｓｔｉｎ，Ｓ．；Ｂｅｎｅｔ，Ｔ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｌａｃｔｏｓｅ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２０１８，１０１０，８６－９６］。簡潔に述べると、初代細胞上清のアリコートをラミナリトリオースの溶液と混合した後、２－アミノベンズアミドで標識した。標識後、試料をＵＨＰＬＣで分析し、検出されたラクトース又はオリゴ糖を、等モルの応答因子を仮定したマルトトリオースの検量線に対して定量した。
結果を図５に報告する。

【0419】

結果：ラクトースは、分化の１週目、２週目及び３週目に初代細胞上清中に１０～２５ｍｇ／Ｌの様々な濃度で見出された。

【0420】

実施例５
三次元オルガノイドの設定を使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の非神経外胚葉系列分化に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の効果
方法：ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入し、乳腺前駆細胞の三次元分化のために使用した。簡潔に述べると、５５０万個の解離したｉＰＳＣを、４．５ｍＬの凝集培地を含有する６ウェルプレート（超低接着）に、平面状シェーカープラットフォーム（９５ＲＰＭに設定）を使用して播種した。０日目～３日目の間に、様々な濃度のＢＭＰ４（３１４－ＢＰ－０５０、Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ ＡＧ）を培養培地に添加した。

【0421】

結果：様々な濃度のＢＭＰ４でｉＰＳＣ細胞を試験して、非神経外胚葉分化を誘導した（図６のａ、ｂ）。フローサイトメトリーによる定量によると、２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４は、ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１（ＣＤ２２７）及びＧＡＴＡ３などの乳腺前駆体マーカーの発現を有意に誘導した（図６のｃ～ｆ）。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ解析によると、主要な非神経外胚葉マーカーとしてのヒトＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２Ｃ（ＡＰ２ガンマ）の発現は、分化の１０日目に対照試料と比較して増加した（図６のｇ～ｈ）。さらに、ペアードボックス遺伝子６（ＰＡＸ６）、オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）及びＳＲＹボックス転写因子１１（ＳＯＸ１１）などのヒト特異的神経外胚葉マーカーの発現レベルは、分化中に減少した（図６のｉ～ｋ）。最後に、ＢＭＰ４は、ヒト管腔特異的マーカーのサイトケラチン１８（ＫＲＴ１８）及び分泌型リン酸化乳糖タンパク質オステオポンチン（ＯＰＮ）の発現を誘導することができる（図６のｌ～ｍ）。

【0422】

より詳細には、図６は、三次元オルガノイド設定を使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の非神経外胚葉系列分化に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の効果を示す。ａ．乳腺前駆体の生成及び０日目～３日目の間のＢＭＰ４処理の手順を要約したスキーム。ｂ．異なる濃度のＢＭＰ４への曝露後の形態変化の顕微鏡観察。ｃ～ｆ、同定された様々なマーカー：ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３を使用した、乳腺陽性前駆細胞数のフローサイトメトリーによる定量。ｇ～ｈ．主要な非神経外胚葉マーカーとしてのヒトＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２ＣのＲＮＡ発現レベル。ｉ～ｋ．神経外胚葉マーカーとしてのヒトＰＡＸ６、ＯＴＸ２及びＳＯＸ１１。ｌ．管腔マーカーとしてのヒトＫＲＴ１８。ｍ．分泌型リン酸化乳糖タンパク質としてのヒトＯＰＮ。

【0423】

より詳細には、図７は、乳腺三次元分化の３０日目～３５日目の間のエストロゲン関連受容体アルファ（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）及びＭＵＣ１のＲＮＡ発現レベルに対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の効果を示す。

【0424】

これらの結果は、ＢＭＰ４が幹細胞の運命決定を非神経外胚葉系列へと誘導し、驚くべきことに、乳腺前駆細胞の特異化を有意に増加させることを実証する。

【0425】

実施例６
エストロゲン関連受容体アルファ（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）及びＭＵＣ１の発現プロファイルを使用して、ｉＰＳＣ細胞の三次元乳腺分化の最終段階におけるＢＭＰ４の効果を評価した。驚くべきことに、ＢＭＰ４は、対照試料と比較して、３０日目、３３日目及び３５日目に全ての遺伝子のＲＮＡ発現レベルを増加させた（図７）。

【0426】

これらの結果は、ＢＭＰ４が、幹細胞の分化に由来する乳腺細胞における乳生物活性の発現を有意に増加させることを実証する。

【0427】

実施例７
三次元オルガノイド設定を用いた人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の乳腺特異的系列分化に対するレチノイン酸（ＲＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の効果
方法：ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をＦｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入し、乳腺前駆細胞の三次元分化のために使用した。簡潔に述べると、５５０万個の解離したｉＰＳＣを、４．５ｍＬの凝集培地を含有する６ウェルプレート（超低接着）に、平面状シェーカープラットフォーム（９５ＲＰＭに設定）を使用して播種した。ＲＡ（１ｕＭ、１０５５２６１１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢＳＡ（５％、Ａ７０３０－５０Ｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＦＢＳ（５％、１０２７０１０６、Ｇｉｂｃｏ）１０日目～１５日目の間。

【0428】

結果：レチノイン酸（ＲＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の効果を、非神経外胚葉特異化に続く、ｉＰＳＣの乳腺上皮系列への分化において試験した。ＲＡ誘導オルガノイドは、スフェロイド形状から、ヒト乳腺における肺胞形成を模倣し得る出芽オルガノイドへの形態の移行を示す（図８のｂ）。前駆細胞生存率は、ＢＳＡ及びＦＢＳと比較してＲＡ条件で有意に高い（図８のｃ）。ＲＡ処理後の乳腺前駆細胞数のフローサイトメトリーによる定量から、ＥＰＣＡＭ（ＣＤ３２６）、ＣＤ４９ｆ及びＭＵＣ１（ＣＤ２２７）の発現レベルの有意な増加が明らかになった（図８のｄ～ｆ）。

【0429】

より詳細には、図８は、三次元オルガノイド設定を用いた人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の乳腺特異的系列分化に対するレチノイン酸（ＲＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の効果を示す。ａ．乳腺前駆体の生成並びに１０日目～１５日目の間のＲＡ、ＢＳＡ及びＦＢＳの適用の手順を要約したスキーム。ｂ．ＲＡ、ＢＳＡ及びＦＢＳへの曝露後の形態変化の顕微鏡観察。ｃ．カルセインＡＭ及びエチジウムホモダイマー１をベースとした、様々な条件下の細胞生存率のフローサイトメトリー評価。ｄ～ｆ．上皮マーカー：ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ及びＭＵＣ１を使用した乳腺前駆細胞数のフローサイトメトリーによる定量。

【0430】

結果として、ＲＡは、乳腺オルガノイド発生の初期段階において上皮前駆細胞分化を増進することができる。

【0431】

実施例８
ヒト母乳中に見られるものに非常に似た乳生物活性を生成するために、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を、４２日間と期間短縮プロトコルとしての３１日間とで使用する、異なる方法を、ヒト乳腺の生体模倣モデルとしてｉＰＳＣ由来乳腺オルガノイドを使用する三次元プラットフォームにおいて確立した（図９）。

【0432】

２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４及び１μＭのＲＡを単一フォーマット又は組み合わせフォーマットで使用した、４２日プロトコル及び期間短縮プロトコル（３１日^＊－^＊は、ＢＭＰ４とＲＡとの組み合わせを含む期間短縮した改変プロトコル（３１日）を示す）において、フローサイトメトリー定量を使用したところ、三次元培養したｉＰＳＣ細胞は、対照条件と比較して、ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１（ＣＤ２２７）及びＧＡＴＡ３などの乳腺前駆体マーカーの発現を誘導することができる、又は分化時間及び／又は誘導前段階（図９のａ～ｃ）及び誘導後期間（図９のｄ～ｆ）の間、これらの発現プロファイルを維持することができる。

【0433】

より詳細には、図９は三次元オルガノイドモデルを使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の乳腺分化に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）とレチノイン酸（ＲＡ）との組み合わせ効果を示す。ａ～ｃ．分化期間（２５日目（対照プロトコルの場合）及び２０日目（期間短縮プロトコルの場合））及び誘導前段階（３５日目（ＢＭＰ４及びＲＡを含む対照プロトコルの場合）、及び２６日目（期間短縮プロトコルの場合））中に同定された数種のマーカー：ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３を使用した乳腺陽性前駆細胞数のフローサイトメトリーによる定量、ｄ～ｆ．誘導後期間（４２日目（ＢＭＰ４及びＲＡを含む対照プロトコルの場合）及び３１日目（期間短縮プロトコルの場合）。^＊は、ＢＭＰ４とＲＡとの組み合わせを含む短縮された改変プロトコル（３１日）を表す。

【0434】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、ヒトオステオポンチンペプチド－ＧＤＳＶＶＹＧＬＲ及び－ＹＰＤＡＶＡＴＷＬＮＰＤＰＳＱＫが、細胞培養上清中に特異的に検出された（図１０）。

【0435】

より詳細には、図１０は、オステオポンチンタンパク質の分泌の、液体クロマトグラフィー・質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）ベースでのターゲットプロテオミクス解析を示す。オステオポンチンタンパク質の分泌は、対照とする分化方法の使用により、又は骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、レチノイン酸（ＲＡ）を用いることで、及びこの２つの因子の組み合わせにより、ｉＰＳ由来乳腺細胞の培養物の培地中に検出された。

【0436】

これらの結果は、ＢＭＰ４とＲＡとの組み合わせが、幹細胞の分化に由来する乳腺細胞における乳腺前駆体マーカー及び乳生物活性の発現及び分泌を有意に増加させることを実証する。

【0437】

本明細書で述べる現在の好ましい実施形態に対する様々な変更及び修正が、当業者には明らかとなる点を理解されたい。このような変更及び修正は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、並びに本発明の付随する利点を減らすことなく、なされてもよい。したがって、このような変更及び修正は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【手続補正書】

【提出日】2024-09-27

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及び／又はレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、
を含む、乳腺細胞の集団を産生する方法。

【請求項2】

前記培養培地が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記培養ステップｉ）が、前記ｍＢＳＣを、任意選択で少なくとも１２日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において培養して、それによって前記ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記培養ステップｉ）が、前記ｍＢＳＣを、任意選択で８日間以下、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において培養して、それによって前記ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系中で、少なくとも３０日間成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系中で、２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

ステップｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

ステップｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記乳腺細胞が、ヒト乳腺細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

ＢＭＰ４が、０日目～１０日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｍＢＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

ＢＭＰ４が前記培養培地に３日間添加される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

ＲＡが、１０日目～１５日目の間、任意選択で６日目～１１日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｍＢＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

ＲＡが、前記培養培地に５日間添加される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

ＢＭＰ４が、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記培養培地に添加される、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

ＲＡが、１μＭの濃度で前記培養培地に添加される、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記ＥＢが、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から任意で選択される、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける前記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している、請求項２に記載の方法。

【請求項18】

前記ＥＢの少なくとも１０％が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも３５％が、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも１５％が、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、かつ／又は任意選択で、ＥＢの少なくとも２０％が、ＥｐＣＡＭ及びＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記ＥＢが、１つ以上の乳特異的生物活性マーカー、任意選択でオステオポンチン（ＯＰＮ）を、発現するか、その発現が増加しているか、又はその分泌が増加している、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記乳腺細胞が、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

分化プロトコルにおける哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるための、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及び／又はレチノイン酸（ＲＡ）を含む組成物。

【請求項22】

哺乳動物の乳様生成物を製造する方法であって、
Ａ）哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｂ）前記ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、
を含み、
ステップＡ）が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及び／又はレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で前記ｍＢＳＣを培養することを含む、方法。

【請求項23】

前記培養培地が、ＢＭＰ４及びＲＡを含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

ステップＡ）が、３０日～４５日の工程である、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

ヒト乳様生成物を製造する方法であって、
ステップＡ）が、
ｉ）ｍＢＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地中で、適切な三次元培養系において、少なくとも１２日間培養することによって、ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系中で、少なくとも３０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項26】

ヒト乳様生成物を製造する方法であって、
ステップＡ）が、
ｉ）ｍＢＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地中で、適切な三次元培養系において、８日間以下培養することによって、ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系中で２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項27】

ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間のインキュベーションによる、ｍＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４及びヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で１０日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間のインキュベーションによる、ｍＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４及びヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で６日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中で２日間のインキュベーションによる、ｍＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項30】

ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ_３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中で２日間のインキュベーションによる、ｍＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で６日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項31】

請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法に従って得ることができる、ヒト乳様生成物。

【請求項32】

哺乳動物の乳様生成物を製造する方法であって、
Ａ）哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｂ）前記ラクトサイトから哺乳動物の乳様生成物を分泌させるステップ、
を含み、
ステップＡ）が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及び／又はレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で前記ｍＢＳＣを培養することを含み、かつ、ステップＡ）が、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法を含む、哺乳動物の乳様生成物を製造する方法。

【請求項33】

請求項３２に記載の方法に従って得ることができる、ヒト乳様生成物。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０４３７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0437】

本明細書で述べる現在の好ましい実施形態に対する様々な変更及び修正が、当業者には明らかとなる点を理解されたい。このような変更及び修正は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、並びに本発明の付随する利点を減らすことなく、なされてもよい。したがって、このような変更及び修正は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
本発明は以下の態様であってもよい。
項目１
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及び／又はレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、
を含む、乳腺細胞の集団を産生する方法。
項目２
前記培養培地が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む、項目１に記載の方法。
項目３
前記培養ステップｉ）が、前記ｍＢＳＣを、任意選択で少なくとも１２日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において、培養して、それによってｈＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む、項目１又は２に記載の方法。
項目４
前記培養ステップｉ）が、ｈＢＳＣを、任意選択で８日間以下、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによって前記ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを含む、項目２に記載の方法。
項目５
前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
項目６
前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、項目２又は４に記載の方法。
項目７
ステップｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む、項目５に記載の方法。
項目８
ステップｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、
を含む、項目６に記載の方法。
項目９
前記乳腺細胞が、ヒト乳腺細胞である、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
項目１０
ＢＭＰ４が、０日目～１０日目の間、好ましくは０日目～３日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｈＢＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
項目１１
ＢＭＰ４が前記培養培地に３日間添加される、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項目１２
ＲＡが、１０日目～１５日目の間、任意選択で６日目～１１日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｈＢＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
項目１３
ＲＡが、前記培養培地に５日間添加される、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
項目１４
ＢＭＰ４が、５～２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ又は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記培養培地に添加される、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
項目１５
ＲＡが、１μＭの濃度で前記培養培地に添加される、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
項目１６
前記ＥＢが、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から任意選択で選択される、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
項目１７
前記ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける前記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している、項目２～１５のいずれか一項に記載の方法。
項目１８
前記ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも３５％が、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意選択で、ＥＢの少なくとも１５％が、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、かつ／又は任意選択で、ＥＢの少なくとも２０％が、ＥｐＣＡＭ及びＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
項目１９
前記ＥＢが、１つ以上の乳特異的生物活性マーカー、任意選択でオステオポンチン（ＯＰＮ）を発現する、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
項目２０
前記ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現が増加されており、任意選択でオステオポンチン（ＯＰＮ）の発現が増加されている、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法。
項目２１
前記ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの分泌が増加されており、任意選択でオステオポンチン（ＯＰＮ）の分泌が増加されている、項目１～２０のいずれか一項に記載の方法。
項目２２
前記乳腺細胞が、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
項目２３
分化プロトコルにおける哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるための、ＢＭＰ４及び／又はＲＡの使用。
項目２４
哺乳動物乳様生成物を製造する方法であって、
Ｃ）哺乳動物母乳幹細胞（ｍＢＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｄ）前記ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、
を含み、
ステップＡ）が、ＢＭＰ４及び／又はＲＡを含む培養培地中でｈＢＳＣを培養することを含む、方法。
項目２５
前記培養培地が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む、項目２４に記載の方法。
項目２６
ステップＡ）が、３０日～４５日の工程、任意選択で４５日未満の工程、任意選択で４４日未満の工程、任意選択で３５日未満の工程、任意選択で３１日未満の工程である、項目２４又は２５に記載の方法。
項目２７
ヒト乳様生成物を製造する方法であって、
ステップＡ）が、
ｉ）ｍＢＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えばＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、少なくとも１２日間培養することによって、ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質とＲＡとから構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、項目２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
項目２８
ヒト乳代替生成物を製造する方法であって、
ステップＡ）が、
ｉ）ｍＢＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えばＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、８日間以下培養することによって、ｍＢＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質とＲＡとから構成される混合浮遊ゲル中で２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、項目２５又は２６に記載の方法。
項目２９
ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ _３ 及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４及びヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で１０日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、項目２７に記載の方法。
項目３０
ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ _３ 及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４及びヘパリン及びヒドロコルチゾンが添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で６日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、
と定義され、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、項目２８に記載の方法。
項目３１
ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ _３ 及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、項目２７に記載の方法。
項目３２
ステップＡ）ｉ）が、
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ _３ 及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｍＢＳＣ培地Ｅ８中で２日間のインキュベーションによる、ｈＢＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で６日間のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）を産生するステップ、と定義され、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲルとコラーゲンＩとの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、及び
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＢＳ及びプロラクチン及びプロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク発現の誘導、
を含む、項目２８に記載の方法。
項目３３
ステップＡ）が、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法を含む、項目２４～３２のいずれか一項に記載の方法。
項目３４
ステップＡ）が、三次元懸濁培養条件で行われる、項目２４～２６及び３３に記載の方法。
項目３５
項目２４～３４のいずれか一項に記載の方法に従って得ることができる、ヒト乳様生成物。
項目３６
治療に使用するための、項目３５に記載のヒト乳様生成物。
項目３７
項目３５に記載のヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物としての、任意選択で母乳代替物としての使用。

【国際調査報告】