(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-18
(54)【発明の名称】アンチセンスオリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20241010BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20241010BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241010BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241010BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 120Z
C12N15/113 ZNA
A61K31/712
A61K48/00
A61P35/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526008
(86)(22)【出願日】2022-03-22
(85)【翻訳文提出日】2024-05-21
(86)【国際出願番号】 KR2022003884
(87)【国際公開番号】W WO2023075043
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】10-2021-0148357
(32)【優先日】2021-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520095603
【氏名又は名称】オートテリック バイオ インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100173473
【弁理士】
【氏名又は名称】高井良 克己
(72)【発明者】
【氏名】ク ジヘ
(72)【発明者】
【氏名】クォン ヘジョン
(72)【発明者】
【氏名】キム ジヘ
(72)【発明者】
【氏名】パク チョンウィ
(72)【発明者】
【氏名】ホン スジョン
(72)【発明者】
【氏名】パク チャンヒ
(72)【発明者】
【氏名】キム テフン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB26
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、配列番号１ないし配列番号３のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つの変形されたヌクレオチドを含む新規のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関するものである。該新規なオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ－β２タンパク質の発現抑制効果に優れているように表われ、癌細胞の死滅効果も優れ、血しょうでの安定性も改善された。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ－β２の発現と関連がある疾病などを治療するための医薬組成物として有用に使われる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１ないし配列番号３のうちの何れか１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上のヌクレオチドは、ヌクレオシドが変形されたヌクレオチドであり、
ここで、変形されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）変形されたヌクレオチド、２’－フルオロ（Ｆ）変形されたヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル（Ｏ－Ｍｅ）変形されたヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）変形されたヌクレオチド、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）変形されたヌクレオチド、制限されたエチル（ｃＥＴ）変形されたヌクレオチド、及びポリアルキレンオキシド変形されたヌクレオチドからなる群から選択された、オリゴヌクレオチド。
【請求項2】
前記オリゴヌクレオチドの５’端部の１つ以上のヌクレオチドまたは３’端部の１つ以上のヌクレオチドが変形されたヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
前記オリゴヌクレオチドの５’端部の１つ以上のヌクレオチド及び３’端部の１つ以上のヌクレオチドが変形されたヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
前記オリゴヌクレオチドの５’端部の最初ないしｎ番目のヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドの３’端部の最初ないしｍ番目のヌクレオチドが、前記変形されたヌクレオチドである、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド（ここで、ｎ及びｍは、それぞれ独立して１～１０のうち何れか１つの整数である）。
【請求項5】
前記オリゴヌクレオチドの５’端部の最初ないしｎ番目のヌクレオチド及び前記オリゴヌクレオチドの３’端部の最初ないしｍ番目のヌクレオチドが、前記変形されたヌクレオチドである、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
前記オリゴヌクレオチドの５’端部の（ｎ＋１）番目のヌクレオチド及び３’端部の（ｍ＋１）番目のヌクレオチドの間に１つ以上の変形されたヌクレオチドをさらに含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
下記表１の１～３０番のうち何れか１つの配列で表したアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、下記表１で下線が引かれた太字で表示されたヌクレオチドが変形されたヌクレオチドであり、
ここで、変形されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）変形されたヌクレオチド、２’－フルオロ（Ｆ）変形されたヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル（Ｏ－Ｍｅ）変形されたヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）変形されたヌクレオチド、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）変形されたヌクレオチド、制限されたエチル（ｃＥＴ）変形されたヌクレオチド、及びポリアルキレンオキシド変形されたヌクレオチドからなる群から選択された、オリゴヌクレオチド：
【表1】
【請求項8】
表１の１～３０番のうち何れか１つの配列で表したオリゴヌクレオチドの変形されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）変形されたヌクレオチドである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項9】
隣接するヌクレオシドの間の結合は、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合である、請求項１から請求項８のうち何れか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項10】
隣接するヌクレオシドの間の結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項１から請求項８のうち何れか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項11】
請求項９に記載のオリゴヌクレオチドを含む、癌治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞内のＤＮＡ塩基配列情報は、ｍＲＮＡに転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）された後、リボソームでｍＲＮＡの情報に基づいてｔＲＮＡが対応するアミノ酸を持って来て、それをペプチド結合で連結させる過程を通じてタンパク質が生産される。
【0003】
このような遺伝子発現過程中に、もし、ｍＲＮＡと相補的な塩基配列を有した一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが存在すれば、この相補的ＤＮＡまたはＲＮＡは、ｍＲＮＡと結合して二本鎖を形成して、タンパク質の生産を防ぐことができる。
【0004】
前記のように転写されてタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡ（センスＲＮＡ）と二本鎖で結合して、その機能を阻害させることができる相補的関係のＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチドをアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと称する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らは、ＴＧＦ－β ｍＲＮＡ発現の抑制能が向上したアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発するために研究した結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドのうち、一部の糖の構造を変形させた新規のアンチセンスオリゴヌクレオチドがＴＧＦ－β抑制効果に優れ、安定性が高いという点を確認した。
【0006】
したがって、本発明は、新規のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれを含有する医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、配列番号１の５’－ＧＧＣＧＧ ＣＡＴＧＴ ＣＴＡＴＴ ＴＴＧＴＡ－３’のオリゴヌクレオチド；配列番号２の５’－ＣＧＧＣＡ ＴＧＴＣＴ ＡＴＴＴＴ ＧＴＡＡＡ－３’のオリゴヌクレオチド；または配列番号３の５’－ＧＣＧＧＣ ＡＴＧＴＣ ＴＡＴＴＴ ＴＧＴＡＡ－３’のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つの変形されたヌクレオシドを含む新規のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関するものである。
【0008】
具体的に、本発明は、配列番号１ないし配列番号３のうちの何れか１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシドが変形されたヌクレオチドを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関するものである。
【0009】
ここで、ヌクレオシドが変形されたヌクレオチドは、ヌクレオシドが２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）変形されたヌクレオチド、２’－フルオロ（Ｆ）変形されたヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル（Ｏ－Ｍｅ）変形されたヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）変形されたヌクレオチド、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）変形されたヌクレオチド、制限されたエチル（ｃＥＴ：（Ｒ／Ｓ）－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ）変形されたヌクレオチドまたはポリアルキレンオキシド（例えば、トリエチレングリコール（ＴＥＧ））変形されたヌクレオチドである（以下、特別な言及がない限り、前記のようにヌクレオシドが変形されたヌクレオチドを「変形されたヌクレオチド」と称する）。
【0010】
例えば、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、変形されるヌクレオシドのリボース五炭糖の２’位置が２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）形態、２’－フルオロ形態、または２’－Ｏ－メチル形態であるか、変形されるヌクレオシドのリボース五炭糖の２’位置の酸素が４’位置の炭素と連結されるＬＮＡまたはＥＮＡ形態であるか、前記ＬＮＡの２’位置の酸素及び４’位置の炭素を連結するブリッジがメチル基で置換されたｃＥＴ形態である。
【0011】
前記例示した変形ヌクレオシドの構造は、次のように示すことができるる：
【0012】
【0013】
本発明のオリゴヌクレオチドは、５’端部及び／または３’端部に１つ以上の変形されたヌクレオシドを含む。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドの５’端部または３’端部に１個またはそれ以上の変形されたヌクレオシドを含みうる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドの５’端部または３’端部に１個またはそれ以上の変形されたヌクレオシドを有するヌクレオチド、すなわち、「変形されたヌクレオチド」を含みうる。
【0014】
具体的に、本発明によるオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの５’端部の１つ以上のヌクレオチドまたは３’端部の１つ以上のヌクレオチドが変形されたヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドである。
【0015】
また、本発明によるオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの５’端部の１つ以上のヌクレオチド及び３’端部の１つ以上のヌクレオチドが変形されたヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドである。
【0016】
本発明において、前記オリゴヌクレオチドの５’端部の最初ないしｎ番目のヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドの３’端部の最初ないしｍ番目のヌクレオチドが変形されたヌクレオチドである。
【0017】
また、本発明において、前記オリゴヌクレオチドの５’端部の最初ないしｎ番目のヌクレオチド及び前記オリゴヌクレオチドの３’端部の最初ないしｍ番目のヌクレオチドが変形されたヌクレオチドである。
【0018】
ここで、ｎ及びｍは、それぞれ独立して１～１０のうち何れか１つの整数であり、望ましくは、ｎ及びｍは、それぞれ独立して１～９のうち何れか１つの整数であり、さらに望ましくは、ｎ及びｍは、それぞれ独立して１～７のうち何れか１つの整数である。
【0019】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、前記５’端部または３’端部に存在する変形されたヌクレオシドの間に変形されたヌクレオチドをさらに含みうる。
【0020】
すなわち、前記オリゴヌクレオチドの５’端部の（ｎ＋１）番目のヌクレオチド及び３’端部の（ｍ＋１）番目のヌクレオチドの間に１つ以上の変形されたヌクレオチドをさらに含みうる。
【0021】
本発明のオリゴヌクレオチドの望ましい例は、下記表の１～３０番で表したアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち何れか１つである。
【0022】
下記表１で下線が引かれた太字のヌクレオチドが変形されたヌクレオチドを示す。
【0023】
【表1】
【0024】
前記表１のオリゴヌクレオチドの変形されたヌクレオチド（下線が引かれた太字で表示される）は、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）変形されたヌクレオチドである。
【0025】
一方、表１において、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１３５５９９は、ＴＧＦ－β２を発現する塩基配列で公知されたものであって、下記の通りである（配列番号４参照）：
【0026】
【0027】
例えば、表１のＡ００２オリゴヌクレオチドは、ＮＭ＿００１１３５５９９配列の１６９５～１６７６番の塩基配列に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、Ａ００２－０１Ｍオリゴヌクレオチドは、Ａ００２オリゴヌクレオチドの２０個のヌクレオチドのうちから５’位置の４個及び３’位置の４個のヌクレオチドが変形されたヌクレオチド（望ましくは、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）変形されたヌクレオチド）であるということを示す。
【0028】
本発明のオリゴヌクレオチドで、ヌクレオシドの間の結合は、当該ヌクレオシドが変形されたものであるか否かと関係なく、ホスホジエステルであるか、またはホスホロチオエートである。
【0029】
【0030】
前記表１のオリゴヌクレオチドでヌクレオチドの間の＊表示は、ホスホロチオエートを示す。
【0031】
本発明のオリゴヌクレオチドは、陽イオンと共に塩を形成しうる。したがって、本明細書において、「オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩も含む概念として理解しなければならない。
【0032】
本発明において、前記のようなヌクレオシドの変形は、当該技術分野で公知の有機化学的合成方法を通じて製造可能である。
【0033】
また、本発明は、前記のように変形されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関するものである。
【0034】
例えば、本発明は、前記のように変形されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、ＴＧＦ－β２タンパク質の過発現と関連がある疾病（例えば、悪性腫瘍、良性腫瘍、免疫疾患、線維症または眼科疾患など）を予防または治療するための医薬組成物に関するものである。
【発明の効果】
【0035】
本発明のオリゴヌクレオチドを固形癌細胞株に処理した時、ＴＧＦ－β２タンパク質の発現抑制効果がさらに優れているように表われ、癌細胞の死滅効果も優れ、血しょうでの安定性も改善されるということを確認した。
【0036】
したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ－βの発現と関連がある疾病、例えば、悪性腫瘍、良性腫瘍、免疫疾患、線維症、眼科疾患などを治療するための医薬組成物として有用に使われる。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】Ａ５４９を本発明のＡＳＯ ２０ｎＭで処理してＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ発現変化を示すグラフである。
【図2】Ａ５４９及びＰＡＮＣ－１を本発明のＡＳＯ １μＭで処理してＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ発現変化を示すグラフである。
【図3】Ａ５４９及びＰＡＮＣ－１を本発明のＡＳＯ １μＭで処理してＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ発現変化を示すグラフである。
【図4】Ａ５４９、ＰＡＮＣ－１及びＡ２０５８の各細胞株に対する本発明のＡＳＯの吸収（ｕｐｔａｋｅ）程度を示すグラフである。
【図5】Ａ５４９、ＰＡＮＣ－１及びＡ２０５８の各細胞株に対する本発明のＡＳＯの吸収（ｕｐｔａｋｅ）程度を示すグラフである。
【図6】Ａ５４９、ＰＡＮＣ－１及びＡ２０５８の各細胞株に対する本発明のＡＳＯの吸収（ｕｐｔａｋｅ）程度を示すグラフである。
【図7】本発明のＡＳＯの安定性改善効果の有無を確認した実験の結果である。
【図8】Ａ５４９細胞株に対する本発明のＡＳＯの濃度別処理後、ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベル及びタンパク質発現レベルを示すグラフである。
【図9】Ａ５４９、ＰＡＮＣ－１及びＡ２０５８の各細胞株について本発明のＡＳＯを濃度別に処理した時のＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルを示した図面である。
【図10】Ａ５４９、ＰＡＮＣ－１及びＡ２０５８の各細胞株について本発明のＡＳＯを濃度別に処理した時のＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルを示した図面である。
【図11】Ａ５４９、ＰＡＮＣ－１及びＡ２０５８の各細胞株について本発明のＡＳＯを濃度別に処理した時のＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルを示した図面である。
【図12】多様な癌腫の細胞株について本発明のＡＳＯを処理した時のＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルを示した図面である。
【図13】多様な癌腫の細胞株について本発明のＡＳＯを処理した時のＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルを示した図面である。
【図14】多様な癌腫の細胞株について本発明のＡＳＯを処理した時のＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルを示した図面である。
【図15】多様な癌腫の細胞株について本発明のＡＳＯを処理した時のＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルを示した図面である。
【図16】多様な癌腫の細胞株について本発明のＡＳＯを処理した時のＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルを示した図面である。
【図17】多様な癌腫の細胞株について本発明のＡＳＯを処理した時のＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルを示した図面である。
【図18】Ａ２０５８細胞株を移植したゼノグラフトマウスに本発明のＡＳＯを投与した時の腫瘍の成長曲線を示した図面である。
【図19】Ａ２０５８細胞株を移植したゼノグラフトマウスに本発明のＡＳＯを投与した時の腫瘍の成長曲線を示した図面である。
【図20】Ａ２０５８細胞株を移植したゼノグラフトマウスに本発明のＡＳＯを投与した時の腫瘍の成長曲線を示した図面である。
【図21】Ａ２０５８細胞株を移植したゼノグラフトマウスに本発明のＡＳＯを投与した時の腫瘍の成長曲線を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本発明のオリゴヌクレオチドを固形癌細胞株に処理した時、ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡの発現抑制効果がさらに優れているように表われ、癌細胞の成長を抑制する抗ガン効果も優れ、血しょうでの安定性も改善されるということを確認した。
【0039】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の思想や範囲が、これに限定されるものではない。
【0040】
１．実験方法（共通事項）
【0041】
ア．細胞培養
【0042】
下記表２のように細胞タイプによって、ＲＰＭＩ １６４０（１０％ ＦＢＳ、１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）、ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ、１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）またはＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（１０％ ＦＢＳ、１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）などの培地を使用し、細胞は、３７℃、ＣＯ２ ５．０％の環境で培養した。
【0043】
【表2】
【0044】
イ．トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ）を使用したトランスフェクション
【0045】
細胞の特性及びプレートのサイズによって適切な数の細胞をシーディングし、２４時間培養した後に培地を交換した（１０％ ＦＢＳ、ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）。ＡＳＯを濃度に合わせてＦＢＳが含まれていない培地に入れ、トランスフェクション試薬も、ＦＢＳが含まれていない培地に入れた。
【0046】
ＡＳＯが入った混合物とトランスフェクション試薬が入った混合物とを１：１に混ぜて５分間常温で反応させた。培地を交換した細胞株にこの混合物を分注し、試験目的によって２４時間または４８時間インキュベーター（３７℃、ＣＯ２ ５％）で培養した。
【0047】
細胞シーディング及びトランスフェクション試薬は、下記表３のようである：
【0048】
【表3】
【0049】
ウ．トランスフェクション試薬なしにトランスフェクション
【0050】
細胞の特性及びプレートのサイズによって適切な数の細胞をシーディングし、２４時間培養した。
【0051】
ＡＳＯを濃度に合わせて１０％ ＦＢＳが含まれた培地に入れた。
【0052】
ＡＳＯが入った混合物を細胞がシーディングされたプレートに分注した後、試験目的によって２４時間または４８時間インキュベーター（３７℃、ＣＯ２ ５％）で培養した。
【0053】
２．ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析
【0054】
ア．ＲＮＡ抽出及び定量
【0055】
トランスフェクション後、２４時間または４８時間経過した時に、培養液をいずれも除去し、ＲＮＡ精製（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）キット（Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ７４１３６）を用いてＲＮＡを抽出し、以後、マイクロ－体積プレート（Ｔａｋｅ ３、Ｂｉｏｔｅｋ）とマルチプレートリーダー（Ｒｅａｄｅｒ）（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１、Ｂｉｏｔｅｋ）とを用いて吸光測定法でＲＮＡを定量した。
【0056】
イ．ｃＤＮＡ合成
【0057】
抽出したＲＮＡ ２μｇでｃＤＮＡ合成キット（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｅｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ１６２２）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成は、製造社の指示事項による合成条件下で進行し、ＰＣＲ完了後にｃＤＮＡを２０ｎｇ／μｌになるように蒸留水（ＤＷ）で希釈した。
【0058】
ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析のために、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲを進行した。リファレンス遺伝子としては、ヒトＳＲＳＦ９が使われた。
【0059】
下記表４ないし表６のような組成、条件で混合物を製造してＰＣＲを進行した。
【0060】
【表4】
【0061】
【表5】
【0062】
【表6】
【0063】
３．ＴＧＦ－β２タンパク質発現定量分析（ＥＬＩＳＡ）
【0064】
適切な数の細胞をシーディングし、２４時間後にＡＳＯをトランスフェクションした。
【0065】
トランスフェクションし、４８時間経過時に、上澄み液を回収し、それを遠心分離した（１３，０００ｒｐｍ、１分）。
【0066】
上澄み液のみ回収してＴＧＦ－β２ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して製造社の指示によって定量分析を施行した。
【0067】
４．ＡＳＯ物質の製造
【0068】
前記表１のＡＳＯ物質を通常使われる公知の方法で（例えば、論文 Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３；またはＳ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３などに記載の方法を参照して）製造した。
【0069】
実験例５．Ａ５４９細胞株に対するＡＳＯ ２０ｎＭの処理結果
【0070】
トランスフェクション試薬がある条件でＡＳＯを２０ｎＭの濃度で細胞株Ａ５４９に処理した後、ＴＧＦ－β２のｍＲＮＡレベルの変化を候補物質別に比較した。
【0071】
細胞株Ａ５４９（Ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の培養培地は、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓであった。
【0072】
６ウェルプレートにウェル当たり２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍｌの細胞をシーディングした。
【0073】
トランスフェクション：細胞シーディング２４時間後、培地を交換し（既存の培養液除去後、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを含まず、１０％ ＦＢＳが含まれたｍｅｄｉａを１．８ｍｌ入れる）、試験するＡＳＯを処理濃度の２０倍（４００ｎＭ）になるようにｐｌａｉｎ ｍｅｄｉａに入れ、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ）も、７．５ｕｌ／１００ｕｌの濃度になるようにｐｌａｉｎ ｍｅｄｉａに入れた。希釈して準備したＡＳＯが入った混合物とトランスフェクション試薬が入った混合物とを１：１に混ぜて５分間常温で反応させた（この際、ＡＳＯの濃度は、２００ｎＭになる）。反応させたＡＳＯ及びトランスフェクション試薬混合物の最終濃度が２０ｎＭになるように、培地を交換した細胞株に２００ｕｌずつ分注した後、２４時間培養した（ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７℃、ＣＯ２ ５．０％））。
【0074】
ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析：
【0075】
－ＲＮＡ抽出及び定量：トランスフェクション２４時間後に培養液をいずれも除去した後、ＲＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ７４１３６）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出後、ｍｉｃｒｏ－ｖｏｌｕｍｅ ｐｌａｔｅ（Ｔａｋｅ ３、Ｂｉｏｔｅｋ）とｍｕｌｔｉ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１、Ｂｉｏｔｅｋ）とを用いて吸光測定法でＯＤ２６０ｎｍでＲＮＡ定量した。
【0076】
－ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：抽出したＲＮＡ ２ｕｇでｃＤＮＡ合成ｋｉｔ（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ１６２２）を用いてｃＤＮＡ合成した。合成条件は、ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎによって進行し、ＰＣＲ完了後、ｃＤＮＡを２０ｎｇ／ｕｌになるように蒸留水（ＤＷ）で希釈した。
【0077】
－ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析のためのｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ進行：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅとしてｈｕｍａｎ ＳＲＳＦ９を使用して、前記表４ないし表６と同じ組成及び条件でＰＣＲ混合物を製造して、ＰＣＲを進行した。
【0078】
－Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ－β２のｍＲＮＡ発現抑制率（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ、％）を非処理細胞（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｃｅｌｌ：細胞株にＡＳＯなしにトランスフェクション試薬のみ処理）に対する相対的な比率で計算して結果を確認した。
【0079】
図１は、Ａ５４９をＡＳＯ ２０ｎＭ（トランスフェクション試薬と共に）処理時に、Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルの変化を確認したものである。
【0080】
実験の結果は、下記表７のようである：
【0081】
【表7】
【0082】
実験例６．Ａ５４９、ＰＡＮＣ－１細胞株にＡＳＯを１ｕＭ（ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ環境）処理後、ｈｕｍａｎ ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルの変化確認
【0083】
Ａ５４９及びＰＡＮＣ－１細胞株を対象にして、トランスフェクション試薬がない条件（ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ環境）で各ＡＳＯを１μＭの濃度で処理し、２４時間後のＴＧＦ－β２のｍＲＮＡレベルの変化を比較した。
【0084】
実験方法：
【0085】
細胞株Ａ５４９（Ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、培養培地ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを使用し、細胞株Ｐａｎｃ－１（Ｐａｎｃｒｅａｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、培養培地ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを使用した。
【0086】
６ウェルプレートに各ウェル当たり（２～２．５）×１０５ｃｅｌｌｓ／１．８ｍｌの細胞をシーディングした。
【0087】
トランスフェクション：
【0088】
－細胞シーディング後、２４時間培養した。
【0089】
－ＡＳＯを最終処理する濃度の１０倍の濃度（１０ｕＭ）になるように１０％ ＦＢＳが含まれた培養培地に入れた。
【0090】
－ＡＳＯが入った混合物を細胞がシーディングされたプレートに最終濃度が１ｕＭになるように２００μｌずつ分注した後、２４時間培養した（ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７℃、ＣＯ２ ５．０％））。
【0091】
ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析：
【0092】
－ＲＮＡ抽出及び定量：トランスフェクション２４時間後に培養液をいずれも除去した後、ＲＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ７４１３６）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出後、ｍｉｃｒｏ－ｖｏｌｕｍｅ ｐｌａｔｅ（Ｔａｋｅ ３、Ｂｉｏｔｅｋ）とｍｕｌｔｉ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１、Ｂｉｏｔｅｋ）とを用いて吸光測定法でＯＤ２６０ｎｍで濃度を算出した。
【0093】
－ｃＤＮＡ合成：抽出したＲＮＡ ２μｇでｃＤＮＡ合成ｋｉｔ（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ１６２２）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成完了したｃＤＮＡを２０ｎｇ／ｕｌになるように蒸留水（ＤＷ）で希釈した。
【0094】
－ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析のためのｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ進行：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅとしてｈｕｍａｎ ＳＲＳＦ９を使用し、前記表４ないし表６と同じ組成及び条件でＰＣＲ混合物を製造して、ＰＣＲを進行した。
【0095】
－Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ－β２のｍＲＮＡ発現抑制率（％）を非処理された細胞（細胞株にＡＳＯなしにトランスフェクション試薬のみ処理したもの）に対する相対的な比率で計算して結果を確認し、Ａ５４９細胞株に対する結果は、下記表８及び図２に示し、ＰＡＮＣ－１細胞株に対する結果は、下記表９及び図３に示した。
【0096】
【表8】
【0097】
【表9】
【0098】
実験例７：ＦＡＭ（５’－フルオレセインアミダイト）ＡＳＯを使用してＡ５４９細胞株でｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ比較
【0099】
ＦＡＭ（５’－フルオレセインアミダイト：５－Ｆｌｕｒｏｅｓｃｅｉｎ ａｍｉｄｉｔｅ）標識されたＡＳＯを使用してＡ５４９、ＰＡＮＣ－１及びＡ２０５８細胞株でｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ（トランスフェクション試薬がない環境での吸収）を比較した。
【0100】
実験方法：
【0101】
細胞株Ａ５４９（Ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、培養培地ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを使用し、細胞株ＰＡＮＣ－１（Ｐａｎｃｒｅａｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）及びＡ２０５８（Ｍｅｌａｎｏｍａ）は、培養培地ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを使用した。
【0102】
細胞シーディング：
【0103】
４チャンバスライドに各ウェル当たり４×１０５ｃｅｌｌｓ／５００μｌの細胞をシーディングした。
【0104】
トランスフェクション：
【0105】
試験するＡＳＯを１０％ ＦＢＳ及び１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを含むＤＭＥＭ培地中に１μＭの濃度になるようにして、各ウェルに２００μｌずつ分注し、２４時間培養した（ＣＯ２インキュベーター、３７℃、ＣＯ２ ５．０％）。
【0106】
ＦＡＣＳ分析
【0107】
トリプシン－ＥＤＴＡを処理して細胞を取り外し（ｄｅｔａｃｈ）、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳで細胞を浮遊させた後、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類器）分析を進行した。平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を確認して、各細胞の相対的なＦＡＭ標識ＡＳＯの含量を比較した。
【0108】
【0109】
実験の結果、試験に使われたＡＳＯいずれも正常に細胞内によく吸収されたということを確認した。
【0110】
実験例８：ＡＳＯをヒト血しょうにスパイキングした後、安定性の測定
【0111】
ヒトの血しょうにＡＳＯをスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）して７日間培養し、残っているＡＳＯの量を分析した。
【0112】
実験方法：
【0113】
ヒトの血しょうにＡＳＯの最終濃度が５ｕＭになるようにスパイキングし、３７℃インキュベーターで４０ｒｐｍで回転しながら７日間インキュベーションした。時間別（０、４時間、１日、２日、７日）に血しょうをサンプリングして残存するＡＳＯの量をＨＰＬＣで分析した。０時間に検出されたＡＳＯの量を基準に残っているＡＳＯ量の比率を計算した。
【0114】
実験の結果を図７に図示した。
【0115】
本発明によるＡＳＯ物質は、ｎａｋｅｄ ＡＳＯ（Ａ００２及びＡ００４）に比べて安定性が大きく増加して、７日後にも８０％以上血しょうに残存するということを確認した。
【0116】
実験例９：Ａ５４９細胞株を対象にしてトランスフェクション試薬がある条件でＡＳＯを濃度別に処理後（５－１６０ｎＭ）、ｍＲＮＡ及びタンパク質分泌レベルの変化確認
【0117】
トランスフェクション試薬がある条件でＡＳＯを濃度別（０ｎＭ、５ｎＭ、２０ｎＭ、８０ｎＭ）にＡ５４９細胞株に処理した後、ＴＧＦ－β２のｍＲＮＡレベルとタンパク質分泌レベルとの変化を確認した。
【0118】
実験方法：
【0119】
細胞株Ａ５４９（Ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、培養培地ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを使用した。
【0120】
６ウェルプレートにウェル当たり２×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍｌの細胞をシーディングした。
【0121】
トランスフェクション：
【0122】
－細胞シーディング２４時間後、培地を交換した（既存の培養液除去後、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを含まず、１０％ ＦＢＳが含まれた培地１．８ｍｌを入れる）。試験するＡＳＯを処理する濃度の２０倍になるようにｐｌａｉｎ ｍｅｄｉａに希釈した。
【0123】
－トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ）も、７．５μｌ／１００μｌの濃度になるようにｐｌａｉｎ ｍｅｄｉａで希釈した。
【0124】
－希釈して準備したＡＳＯが入った混合物とトランスフェクション試薬が入った混合物とを体積比１：１に混ぜて５分間常温で反応させた。
【0125】
－反応させたＡＳＯ及びトランスフェクション試薬混合物をあらかじめ設定した最終濃度になるように、培地を交換した細胞株に２００ｕｌずつ分注した後、２４時間培養した（ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７℃、ＣＯ２ ５．０％））。
【0126】
－１％ ＦＢＳを含み、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを含まない培地１ｍｌに培地交換した後、４８時間培養した（ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７℃、ＣＯ２ ５．０％））。
【0127】
ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析：
【0128】
－ＲＮＡ抽出及び定量：トランスフェクション７２時間後に培養液をいずれも除去した後、ＲＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ７４１３６）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出後、ｍｉｃｒｏ－ｖｏｌｕｍｅ ｐｌａｔｅ（Ｔａｋｅ ３、Ｂｉｏｔｅｋ）とｍｕｌｔｉ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１、Ｂｉｏｔｅｋ）とを用いて吸光測定法でＯＤ２６０ｎｍで濃度を算出した。
【0129】
－ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：抽出したＲＮＡ ２μｇでｃＤＮＡ合成ｋｉｔ（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ１６２２）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成完了したｃＤＮＡは、蒸留水（ＤＷ）を使用して２０ｎｇ／μｌになるように希釈した。
【0130】
－ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析のためのｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ進行：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅとしてｈｕｍａｎ ＳＲＳＦ９を使用した。前記表４ないし表６と同じ組成及び条件でＰＣＲ混合物を製造して、ＰＣＲを進行した。
【0131】
ＴＧＦ－β２タンパク質発現定量分析（ＥＬＩＳＡ）
【0132】
－別途に集めておいた培養薬を遠心分離して上澄み液のみ回収してＴＧＦ－β２ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ）で製造者の指示事項（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）によって定量分析を進行した。
【0133】
実験の結果を図８に示した。実験の結果、本発明によるＡＳＯは、濃度依存的にヒトＴＧＦ β２ ｍＲＮＡレベル及び分泌レベルを減少させるということを確認することができた。
【0134】
実験例１０：トランスフェクション試薬がない条件（Ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ条件）でＡＳＯを濃度別に処理後、ヒトＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ抑制確認
【0135】
トランスフェクション試薬がないｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ条件でＡＳＯを濃度別（３．９～４０００ｎＭ）にＡ５４９、ＰＡＮＣ－１及びＡ２０５８細胞株に処理した後、非処理細胞と対比したヒトＴＧＦ－β２のｍＲＮＡレベルの変化を確認した。
【0136】
実験方法：
【0137】
細胞株Ａ５４９（Ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、培養培地ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを使用し、細胞株ＰＡＮＣ－１（Ｐａｎｃｒｅａｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）及びＡ２０５８（Ｍｅｌａｎｏｍａ）は、培養培地ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを使用した。
【0138】
６ウェルプレートにウェル当たり（２～２．５）×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍｌの細胞をシーディングした。
【0139】
トランスフェクション：
【0140】
－細胞シーディング２４時間後、培地を交換した（既存の培養液除去後、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓを含まず、１０％ ＦＢＳが含まれた培地１．８ｍｌを入れる）。試験するＡＳＯを処理する濃度の１０倍になるようにｐｌａｉｎ ｍｅｄｉａに希釈した。
【0141】
－希釈して準備したＡＳＯが入った混合物をあらかじめ設定した最終濃度になるように、培地を交換した細胞株に２００μｌずつ分注した後、４８時間培養した（ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７℃、ＣＯ２ ５．０％））。
【0142】
ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析：
【0143】
－ＲＮＡ抽出及び定量：トランスフェクション４８時間後に培養液をいずれも除去した後、ＲＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ７４１３６）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出後、ｍｉｃｒｏ－ｖｏｌｕｍｅ ｐｌａｔｅ（Ｔａｋｅ ３、Ｂｉｏｔｅｋ）とｍｕｌｔｉ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１、Ｂｉｏｔｅｋ）とを用いて吸光測定法でＯＤ２６０ｎｍで濃度を算出した。
【0144】
－ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：抽出したＲＮＡ ２μｇでｃＤＮＡ合成ｋｉｔ（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ１６２２）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成完了したｃＤＮＡは、蒸留水（ＤＷ）を使用して２０ｎｇ／μｌになるように希釈した。
【0145】
－ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析のためのｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ進行：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅとしてｈｕｍａｎ ＳＲＳＦ９を使用した。前記表４ないし表６と同じ組成及び条件でＰＣＲ混合物を製造して、ＰＣＲを進行した。
【0146】
【0147】
実験の結果、Ａ５４９細胞株に対しては、特に、Ａ００２－０４Ｍ、Ａ００２－０５Ｍ、Ａ００２－０８ＭのＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ阻害効果に優れ、ＰＡＮＣ－１細胞株に対しては、特に、Ａ００２－０１Ｍ、Ａ００２－０４Ｍ、Ａ００２－０５Ｍ、Ａ００２－０８ＭのＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ阻害効果に優れ、Ａ２０５８細胞株に対しては、特に、Ａ００２－０４Ｍ、Ａ００２－０５Ｍ、Ａ００２－０８Ｍ、Ａ００４－０４ＭのＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ阻害効果に優れた。
【0148】
実験例１１：多様な癌腫の細胞株についてトランスフェクション試薬がない条件（ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ条件）でＡＳＯで処理した後、ｈｕｍａｎ ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルの変化確認
【0149】
多様な癌腫の細胞株を対象にしてＡＳＯを処理し、２４時間または７２時間後のＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルの減少を確認した。
【0150】
実験方法：
【0151】
実験対象の細胞株及び使用培地は、前記表２のようである。
【0152】
６ウェルプレートにウェル当たり（２～２．５）×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍｌの細胞をシーディングした。
【0153】
トランスフェクション：
【0154】
－細胞シーディング２４時間後、１％ ＦＢＳが含まれた培地１．８ｍｌを入れた。
【0155】
－試験するＡＳＯを処理する濃度の１０倍になるようにｐｌａｉｎ ｍｅｄｉａに希釈した。
【0156】
－希釈して準備したＡＳＯが入った混合物をあらかじめ設定した最終濃度になるように、培地を交換した細胞株に２００μｌずつ分注した後、２４時間または７２時間培養した（ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７℃、ＣＯ２ ５．０％））。
【0157】
ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析：
【0158】
－ＲＮＡ抽出及び定量：トランスフェクション２４時間後に培養液をいずれも除去した後、ＲＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ７４１３６）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出後、ｍｉｃｒｏ－ｖｏｌｕｍｅ ｐｌａｔｅ（Ｔａｋｅ ３、Ｂｉｏｔｅｋ）とｍｕｌｔｉ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１、Ｂｉｏｔｅｋ）とを用いて吸光測定法でＯＤ２６０ｎｍで濃度を算出した。
【0159】
－ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：抽出したＲＮＡ ２μｇでｃＤＮＡ合成ｋｉｔ（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ１６２２）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成完了したｃＤＮＡは、蒸留水（ＤＷ）を使用して２０ｎｇ／μｌになるように希釈した。
【0160】
－ＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡ定量分析のためのｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ進行：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅとしてｈｕｍａｎ ＳＲＳＦ９を使用した。前記表４ないし表６と同じ組成及び条件でＰＣＲ混合物を製造して、ＰＣＲを進行した。
【0161】
ヒトＴＧＦ－β２のｍＲＮＡ抑制率（％）を非処理細胞（細胞株にＡＳＯなしにトランスフェクション試薬のみ処理したもの）に対する相対的な比率で計算した。
【0162】
【0163】
実験の結果、特に、Ａ００２－０４ＭまたはＡ００２－０５Ｍによって多様な癌腫（肺癌、胆管癌、三重陰性乳癌、黒色腫、膵臓癌、膠芽腫など）でｈＴＧＦ－β２ ｍＲＮＡレベルが顕著に減少するということを確認した。
【0164】
実験例１２：黒色腫細胞株であるＡ２０５８を移植したヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）ゼノグラフトマウスモデルでの抗ガン効能の評価
【0165】
ヒト化Ａ２０５８ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ：
【0166】
Ｍｏｕｓｅ：ＮＳＧ－ｂ２ｍ免疫欠乏マウス、雌５～７週齢、６匹／群
【0167】
マウス入庫後、一週間順化させた。
【0168】
ヒトＰＢＭＣ（末梢血液単核細胞：Ｚｅｎｂｉｏ、Ｃａｔ＃ ＳＥＲ－ＰＢＭＣ－２００－Ｆ）を１×１０７細胞／匹で静脈（ｉ．ｖ．）投与して移植した。
【0169】
ＰＢＭＣを移植してから５日後、Ａ２０５８細胞株を２×１０６細胞／匹で皮下投与して移植した。
【0170】
Ａ２０５８細胞株を移植してから５日後、本発明によるＡＳＯを腹腔内注射して投与し始めた：
【0171】
処理：週３回、投与容量は、３０ｍｇ／ｋｇ、投与体積は、１０ｍｌ／ｋｇ（すなわち、注射液の濃度は、ＡＳＯ ３０ｍｇ／１０ｍｌ）。
【0172】
観察：週２回体重及び腫瘍体積の測定
【0173】
下記の集合Ａ、集合Ｂ及び集合Ｃの全体的な実験設計は、類似しているが、移植したＰＢＭＣの供与者別に区分したものである。
【0174】
集合Ａ、集合Ｂ及び集合Ｃに対する各郡別の実験設計は、下記表１０ないし表１２のようである：
【0175】
【表10】
【0176】
【表11】
【0177】
【表12】
【0178】
【0179】
各集合別の腫瘍増殖抑制率（ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ：ＩＲ）は、下記表１３ないし表１５のようである：
【0180】
【表13】
【0181】
【表14】
【0182】
【表15】
【0183】
前記実験の結果から、本発明によるＡＳＯ投与時に、腫瘍増殖抑制率は、ＰＢＭＣによる免疫治療効果よりもさらに優れているということを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【0184】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ－β２の発現を抑制して抗ガン剤として使われる。
【配列リストフリーテキスト】
【0185】
配列番号１：５’－ＧＧＣＧＧ ＣＡＴＧＴ ＣＴＡＴＴ ＴＴＧＴＡ－３’
【0186】
配列番号２：５’－ＣＧＧＣＡ ＴＧＴＣＴ ＡＴＴＴＴ ＧＴＡＡＡ－３’
【0187】
配列番号３：５’－ＧＣＧＧＣ ＡＴＧＴＣ ＴＡＴＴＴ ＴＧＴＡＡ－３’
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】
【国際調査報告】