特表 2024-538427 二重機能抗原結合分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-18

(54)【発明の名称】二重機能抗原結合分子

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20241010BHJP

   C07K 16/32 20060101ALI20241010BHJP

   C07K 16/08 20060101ALI20241010BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241010BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241010BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/32

C07K16/08

C12N15/13

C12N15/63 Z

A61K39/395 N

A61P43/00 111

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024546515

(86)(22)【出願日】2022-10-18

(85)【翻訳文提出日】2024-06-17

(86)【国際出願番号】 IL2022051102

(87)【国際公開番号】W WO2023067596

(87)【国際公開日】2023-04-27

(31)【優先権主張番号】287372

(32)【優先日】2021-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IL

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524149344

【氏名又は名称】トロジャン バイオ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】バーコヴィッツ，アナト

(72)【発明者】

【氏名】ディアマント，ノーム シー．

(72)【発明者】

【氏名】アハロニ，アミール

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA14

4C085AA16

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域中に挿入された少なくとも１個の免疫原性ペプチドを含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、挿入は、抗体または抗原結合フラグメント配列の除去を含む。本発明の抗体または抗原結合フラグメントおよび第２の抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、標的細胞上に過剰発現される抗原に結合できる、二重機能抗原結合分子が、提供される。二重機能抗原結合分子をコードする核酸分子、二重機能抗原結合分子を含む医薬組成物および二重機能抗原結合分子を投与することによる癌を治療する方法も、提供される。抗体または抗原結合フラグメントを製造する方法もまた、提供される。
【選択図】図１０

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ．抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲ中に挿入された少なくとも１個の免疫原性ペプチドを含む第１の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記挿入は、ＣＤＲ配列の除去を含む、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント；および
ｂ．上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を結合できる第２の抗体であって、セツキシマブ、パニツムマブおよびネシツムマブまたはそれらに対する少なくとも８５％の配列同一性を含む抗体から選択される、第２の抗体、
を含む二重機能抗原結合分子。

【請求項2】

前記第１の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび前記第２の抗体は、ヘテロ二量体化を促進しかつホモ二量体化を抑制する少なくとも１つの改変を含む、請求項１に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項3】

前記第１のおよび第２の抗体の一方は、配列番号１０７４を含む重鎖定常領域を含みおよびもう一方の抗体は、配列番号１０７５を含む重鎖定常領域を含む、請求項２に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項4】

前記第１の抗体またはその抗原結合フラグメントは、標的細胞に結合し、かつ前記標的細胞は、癌細胞、樹状細胞または両方である、請求項１～３のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項5】

前記免疫原性ペプチドは、癌特異的ペプチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項6】

前記癌特異的ペプチドは、表１で与えられるペプチド配列から選択される、請求項５に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項7】

前記免疫原性ペプチドは、ウイルスペプチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項8】

前記ウイルスペプチドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）、アデノウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）またはインフルエンザウイルス（ＦＬＵ）由来である、請求項７に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項9】

前記ウイルスペプチドは、表２または表３で与えられるペプチド配列から選択される、請求項８に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項10】

前記第１の抗体またはその抗原結合フラグメントにより結合される細胞の細胞質に前記第１の抗体またはその抗原結合フラグメントを向ける細胞透過配列をさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項11】

前記細胞透過配列は、エンドソーム脱出ドメイン（ＥＥＤ）である、請求項１０に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項12】

前記第１の抗体またはその抗原結合フラグメントは、エンドソーム経路中に取り込まれかつ前記細胞質に送達される、請求項１０または１１に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項13】

前記ＣＤＲは、標的抗原への結合にほとんどまたは全く寄与しない不活性ＣＤＲである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項14】

不活性ＣＤＲは、前記標的抗原と接触する２個以下のアミノ酸を含む、請求項１３に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項15】

接触は、ＣＤＲのアミノ酸と前記標的抗原のアミノ酸の間の５Å以下の距離を含む、請求項１４に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項16】

前記挿入および除去は、前記第１の抗体またはその抗原結合フラグメントが前記免疫原性ペプチドを欠く前記第１の抗体または抗原結合フラグメントと同等の親和性でその標的抗原を結合するように前記第１の抗体またはその抗原結合フラグメントの全体の立体配座における変化を生じないかまたは最小限の変化を生じる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項17】

抗原結合領域の少なくとも１個の不活性ＣＤＲは、細胞透過配列で置換される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項18】

前記標的細胞は、樹状細胞でありかつ樹状細胞抗原は、ＣＤ４０、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ２０９、およびＣＤ２０７から選択される、請求項４～１７のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項19】

前記標的細胞は、悪性免疫細胞でありかつ免疫細胞抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、およびＣＤ２２から選択される、請求項４～１７のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項20】

前記標的細胞は、癌細胞でありかつ癌細胞抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＴＬＡ、ＬＡＧ－３、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１から選択される、請求項４～１９のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項21】

化学リンカーを欠く、請求項１～２０のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項22】

前記第１の抗体またはその抗原結合フラグメント内で前記抗原結合領域、前記免疫原性ペプチドおよび前記細胞透過性配列はそれぞれ、リンカーにより分離される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項23】

前記免疫原性ペプチドは、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞または両方により認識される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項24】

前記免疫原性ペプチドが挿入される前に前記第１の抗体は、
ａ．配列番号１０２１の重鎖可変領域および配列番号１０２２の軽鎖可変領域を含む抗体ＴＭａｂ４；
ｂ．配列番号１０２３の重鎖可変領域および配列番号１０２４の軽鎖可変領域を含む抗体３Ｅ１０；および
ｃ．配列番号１０２６の重鎖可変領域および配列番号１０２７の軽鎖可変領域を含む抗体７１Ｆ１２、
から選択される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項25】

少なくとも１個の：
ａ．前記免疫原性ペプチドは、前記ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３またはＣＤＲＬ３中に挿入される；
ｂ．前記免疫原性ペプチドは、前記３Ｅ１０のＣＤＲＬ１またはＣＤＲＬ２中に挿入される；および
ｃ．前記免疫原性ペプチドは、前記７１Ｆ１２のＣＤＲＬ１中に挿入される、
請求項２４に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項26】

前記第１の抗体は、
ａ．配列番号１０２２の軽鎖可変領域および配列番号１０２８～１０４０、１０４３～１０４５、１０４７～１０５５、および１０５８～１０５９から選択される重鎖可変領域；
ｂ．配列番号１０２１の重鎖可変領域および配列番号１０４１～１０４２、１０４６、および１０５６～１０５７から選択される軽鎖可変領域；
ｃ．配列番号１０２３の重鎖可変領域および配列番号１０６０～１０６５から選択される軽鎖可変領域；
ｄ．配列番号１０２６の重鎖可変領域および配列番号１０６６の軽鎖可変領域；および
ｅ．配列番号１０２７の軽鎖可変領域および配列番号１０６７の重鎖可変領域、
の少なくとも１つを含む、請求項２５に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項27】

２つの重鎖および２つの軽鎖を含み、
ａ．前記２つの重鎖は、配列番号１０８８および１０８０でありかつ前記２つの軽鎖は、配列番号１０８７および１０７９であり；
ｂ．前記２つの重鎖は、配列番号１０８８および１０８２でありかつ前記２つの軽鎖は、配列番号１０８７および１０８１であり；
ｃ．前記２つの重鎖は、配列番号１０９０および１０８０でありかつ前記２つの軽鎖は、配列番号１０８９および１０７９であり；
ｄ．前記２つの重鎖は、配列番号１０９０および１０８２でありかつ前記２つの軽鎖は、配列番号１０８９および１０８１であり；または
ｅ．前記２つの重鎖は、配列番号１０８８および１０８６でありかつ前記２つの軽鎖は、配列番号１０８７および１０８５である、
請求項３～２６のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子。

【請求項28】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域中に挿入された少なくとも１個の免疫原性ペプチドを含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記挿入は、抗体または抗原結合フラグメント配列の除去を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項29】

請求項１～１７のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子または請求項１８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体、賦形剤または補助剤を含む医薬組成物。

【請求項30】

少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む核酸分子であって、前記オープンリーディングフレームは、請求項１～１７のいずれか１項に記載の二重機能抗原結合分子または請求項２９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、核酸分子。

【請求項31】

請求項３０に記載の核酸分子に動作可能に連結される少なくとも１つの調節エレメントを含む発現ベクター。

【請求項32】

それを必要とする対象において癌を治療する方法であって、請求項２９に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、それにより対象において癌を治療する、方法。

【請求項33】

前記癌は、ＥＧＦＲ陽性癌である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する方法であって、
ａ．目的の抗体またはその抗原結合フラグメントを選択すること；
ｂ．その標的に結合された前記選択された抗体または抗原結合ドメインの構造分析を受け取ること；
ｃ．前記構造分析に基づき前記標的への結合に必要とされない前記選択された抗体または抗原結合ドメインの少なくとも１個のＣＤＲを決定すること；
ｄ．前記決定された少なくとも１個のＣＤＲまたはその一部を免疫原性ペプチドと置換すること；
を含み、それにより抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する、方法。

【請求項35】

抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する方法であって、
ａ．目的の抗体またはその抗原結合フラグメントを選択すること；
ｂ．免疫原性ペプチドのデータベースを受け取ること；
ｃ．目的の前記選択された抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域のペプチドと前記データベースの免疫原性ペプチドのペアワイズアラインメントを実施すること；
ｄ．所定の閾値を越えるアラインメントスコアを有する前記選択された抗体またはその抗原結合フラグメント由来のペプチドおよび免疫原性ペプチドを決定すること；および
ｅ．前記選択された抗体またはその抗原結合フラグメントからの前記決定されたペプチドを前記決定された免疫原性ペプチドと置換すること；
を含み、それにより抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する、方法。

【請求項36】

目的の前記選択抗体またはその抗原結合フラグメントの構造において可能な限り少ない乱れを生じるために前記置換することを最適化することをさらに含む、請求項３４または３５に記載の方法。

【請求項37】

前記操作される抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫原性ペプチド送達抗体である、請求項３４～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

ステップ（ａ）は、標的細胞の表面に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを選択することを含む、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

ステップ（ａ）は、表面への結合時に内部移行されかつ前記標的細胞の細胞質ゾルに送達される抗体またはその抗原結合フラグメントを選択することを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記標的細胞の細胞質ゾルへの前記免疫原性ペプチドの送達、前記標的細胞の表面へのＨＬＡ分子との複合体での前記免疫原性ペプチドの送達および前記免疫原性ペプチドに特異的なエフェクター細胞による前記標的細胞の特異的死滅：の少なくとも１つを確認することをさらに含む、請求項３４～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

標的細胞の表面上のタンパク質に結合する標的化抗体を選択することならびに前記遺伝子操作抗体および前記標的化抗体を組み合わせることにより二重機能抗原結合分子を生じることをさらに含む、請求項３４～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記組み合わせることは、ヘテロ二量体化を促進しかつホモ二量体化を抑制するために前記標的化抗体の重鎖定常領域および前記操作される抗体の重鎖定常領域を操作することを含む、請求項４１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１８日出願のイスラエル特許出願第２８７３７２号の優先権の利益を主張するものであり、この出願特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、抗癌免疫療法の分野に関する。

【発明の概要】

【0002】

本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域中に挿入された少なくとも１個の免疫原性ペプチドを含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の抗体または抗原結合フラグメントおよび第２の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む二重機能抗原結合分子は、標的細胞上で過剰発現される抗原に結合できる。二重機能抗原結合分子をコードする核酸分子、二重機能抗原結合分子を含む医薬組成物および二重機能抗原結合分子を投与することによる癌を治療する方法もまた、提供される。抗体または抗原結合フラグメントを製造する方法も提供される。

【0003】

第１の態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域中に挿入された少なくとも１個の免疫原性ペプチドを含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、挿入は、抗体または抗原結合フラグメント配列の除去を含む。

【0004】

別の態様では、下記を含む二重機能抗原結合分子が提供される：
ａ．抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲ中に挿入された少なくとも１個の免疫原性ペプチドを含む第１の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、挿入はＣＤＲ配列の除去を含む、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント：および
ｂ．上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を結合できる第２の抗体であって、抗体は、セツキシマブ、パニツムマブおよびネシツムマブまたはそれらと少なくとも８５％の配列同一性を含む抗体から選択される、第２の抗体。

【0005】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、標的細胞に結合し、標的細胞は、癌細胞、樹状細胞またはそれらの両方である。いくつかの実施形態では、第１の抗体またはその抗原結合フラグメントは、標的細胞に結合し、標的細胞は、癌細胞、樹状細胞またはそれらの両方である。

【0006】

いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、癌特異的ペプチドである。

【0007】

いくつかの実施形態では、癌特異的ペプチドは、表１で与えられるペプチド配列から選択される。

【0008】

いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、ウイルスペプチドである。

【0009】

いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）、アデノウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）またはインフルエンザウイルス（ＦＬＵ）由来である。

【0010】

いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、表２または表３で与えられるペプチド配列から選択される。

【0011】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体またはその抗原結合フラグメントを抗体またはその抗原結合フラグメントを結合する細胞の細胞質に向ける、細胞透過配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１の抗体またはその抗原結合フラグメントを、第１の抗体またはその抗原結合フラグメントにより結合される細胞の細胞質に向ける、細胞透過配列をさらに含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、エンドソーム脱出ドメイン（ＥＥＤ）である。

【0013】

いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドを欠く抗体は、エンドソーム経路中に取り込まれ、細胞質に送達される。いくつかの実施形態では、第１の抗体またはその抗原結合フラグメントは、エンドソーム経路中に取り込まれ、細胞質に送達される。

【0014】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１個のＣＤＲまたはその一部は、免疫原性ペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、第１の抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１個のＣＤＲまたはその一部は、免疫原性ペプチドで置換される。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、標的抗原への結合にほとんどまたは全く寄与しない不活性ＣＤＲである。

【0016】

いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲは、標的抗原と接触する２個以下のアミノ酸を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、接触は、ＣＤＲのアミノ酸と標的抗原のアミノ酸の間の５Å以下の距離を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、挿入および除去は、抗体またはその抗原結合フラグメントの全体立体配座において変化を生じないか、または最小限の変化しか生じず、それにより抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫原性ペプチドを欠く抗体または抗原結合フラグメントと同等の親和性でその標的抗原を結合する。いくつかの実施形態では、挿入および除去は、第１の抗体またはその抗原結合フラグメントの全体立体配座において変化を生じないか、または最小限の変化しか生じず、それにより第１の抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫原性ペプチドを欠く第１の抗体または抗原結合フラグメントと同等の親和性でその標的抗原を結合する。

【0019】

いくつかの実施形態では、抗原結合領域の少なくとも１個の不活性ＣＤＲは、細胞透過配列で置換される。

【0020】

いくつかの実施形態では、標的細胞は、樹状細胞であり、樹状細胞抗原は、ＣＤ４０、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ２０９、およびＣＤ２０７から選択される。

【0021】

いくつかの実施形態では、標的細胞は、悪性免疫細胞であり、免疫細胞抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、およびＣＤ２２から選択される。

【0022】

いくつかの実施形態では、標的細胞は、癌細胞であり、癌細胞抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＴＬＡ、ＬＡＧ－３、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１から選択される。

【0023】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、化学リンカーを欠く。

【0024】

いくつかの実施形態では、抗原結合領域、免疫原性ペプチドおよび細胞透過配列は、リンカーによりそれぞれ分離される。いくつかの実施形態では、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント内で、抗原結合領域、免疫原性ペプチドおよび細胞透過配列は、リンカーによりそれぞれ分離される。

【0025】

いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞またはそれらの両方により認識される。

【0026】

いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドが挿入される前の抗体は、下記から選択される：
ａ．配列番号１０２１の重鎖可変領域および配列番号１０２２の軽鎖可変領域を含む抗体ＴＭａｂ４；
ｂ．配列番号１０２３の重鎖可変領域および配列番号１０２４の軽鎖可変領域を含む抗体３Ｅ１０；および
ｃ．配列番号１０２６の重鎖可変領域および配列番号１０２７の軽鎖可変領域を含む抗体７１Ｆ１２。

【0027】

いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドが挿入される前の第１の抗体は、下記から選択される：
ａ．配列番号１０２１の重鎖可変領域および配列番号１０２２の軽鎖可変領域を含む抗体ＴＭａｂ４；
ｂ．配列番号１０２３の重鎖可変領域および配列番号１０２４の軽鎖可変領域を含む抗体３Ｅ１０；および
ｃ．配列番号１０２６の重鎖可変領域および配列番号１０２７の軽鎖可変領域を含む抗体７１Ｆ１２。

【0028】

いくつかの実施形態では、少なくとも１個の：
ａ．免疫原性ペプチドは、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３またはＣＤＲＬ３中に挿入される；
ｂ．免疫原性ペプチドは、３Ｅ１０のＣＤＲＬ１またはＣＤＲＬ２中に挿入される；および
ｃ．免疫原性ペプチドは、７１Ｆ１２のＣＤＲＬ１中に挿入される。

【0029】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは：
ａ．配列番号１０２２の軽鎖可変領域および配列番号１０２８～１０４０、１０４３～１０４５、１０４７～１０５５、および１０５８～１０５９から選択される重鎖可変領域；
ｂ．配列番号１０２１の重鎖可変領域および配列番号１０４１～１０４２、１０４６、および１０５６～１０５７から選択される軽鎖可変領域；
ｃ．配列番号１０２３の重鎖可変領域および配列番号１０６０～１０６５から選択される軽鎖可変領域；
ｄ．配列番号１０２６の重鎖可変領域および配列番号１０６６の軽鎖可変領域；
ｅ．配列番号１０２７の軽鎖可変領域および配列番号１０６７の重鎖可変領域、
の少なくとも１つを含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、第１の抗体は：
ａ．配列番号１０２２の軽鎖可変領域および配列番号１０２８～１０４０、１０４３～１０４５、１０４７～１０５５、および１０５８～１０５９から選択される重鎖可変領域；
ｂ．配列番号１０２１の重鎖可変領域および配列番号１０４１～１０４２、１０４６、および１０５６～１０５７から選択される軽鎖可変領域；
ｃ．配列番号１０２３の重鎖可変領域および配列番号１０６０～１０６５から選択される軽鎖可変領域；
ｄ．配列番号１０２６の重鎖可変領域および配列番号１０６６の軽鎖可変領域；および
ｅ．配列番号１０２７の軽鎖可変領域および配列番号１０６７の重鎖可変領域、
の少なくとも１つを含む。

【0031】

別の態様では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを含む第１の抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに標的癌細胞上で過剰発現される抗原を結合できる第２の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、二重機能抗原結合分子が提供される。

【0032】

いくつかの実施形態では、標的癌細胞上で過剰発現される抗原は、ＥＧＦＲであり、第２の抗体は、セツキシマブ、パニツムマブおよびネシツムマブから選択される。

【0033】

いくつかの実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、ヘテロ二量体化を促進しホモ二量体化を抑制する少なくとも１つの改変を含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、第１および第２の抗体の一方は、配列番号１０７４を含む重鎖定常領域を含み、およびもう一方の抗体は、配列番号１０７５を含む重鎖定常領域を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、二重機能抗原結合分子は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含み：
ａ．２つの重鎖は、配列番号１０８８および１０８０であり、２つの軽鎖は、配列番号１０８７および１０７９であり；
ｂ．２つの重鎖は、配列番号１０８８および１０８２であり、２つの軽鎖は、配列番号１０８７および１０８１であり；
ｃ．２つの重鎖は、配列番号１０９０および１０８０であり、２つの軽鎖は、配列番号１０８９および１０７９であり；
ｄ．２つの重鎖は、配列番号１０９０および１０８２であり、２つの軽鎖は、配列番号１０８９および１０８１であり；または
ｅ．２つの重鎖は、配列番号１０８８および１０８６であり、２つの軽鎖は、配列番号１０８７および１０８５である。

【0036】

別の態様では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントまたは本発明の二重機能抗原結合分子および薬学的に許容可能な担体、賦形剤または補助剤を含む、医薬組成物が提供される。

【0037】

別の態様では、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む核酸分子が提供され、オープンリーディングフレームは、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは本発明の二重機能抗原結合分子をコードする。

【0038】

別の態様では、本発明の核酸分子に動作可能に連結された少なくとも１つの調節エレメントを含む、発現ベクターが提供される。

【0039】

別の態様では、それを必要とする対象において癌を治療する方法が提供され、方法は、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含み、それにより対象における癌を治療する。

【0040】

いくつかの実施形態では、癌は、癌特異的抗原を過剰発現する。

【0041】

いくつかの実施形態では、癌は、ＥＧＦＲ陽性癌である。

【0042】

いくつかの実施形態では、二重機能抗原結合分子は、癌ワクチンであり、樹状細胞抗原を結合できる抗原結合領域を含む。

【0043】

別の態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する方法が提供され、方法は：
ａ．目的の抗体またはその抗原結合フラグメントを選択すること、
ｂ．その標的に結合された選択された抗体または抗原結合ドメインの構造分析を行うこと；
ｃ．構造分析に基づき標的への結合のために必要とされない選択された抗体または抗原結合ドメインの少なくとも１個のＣＤＲを決定すること；
ｄ．決定された少なくとも１個のＣＤＲまたはその一部を免疫原性ペプチドと置換すること；
を含み、それにより抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する。

【0044】

別の態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する方法が提供され、方法は：
ａ．目的の抗体またはその抗原結合フラグメントを選択すること、
ｂ．免疫原性ペプチドのデータベースを入手すること；
ｃ．目的の選択抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域のペプチドとデータベースの免疫原性ペプチドのペアワイズアラインメントを実施すること；
ｄ．所定の閾値を越えるアラインメントスコアを有する選択された抗体またはその抗原結合フラグメント由来のペプチドおよび免疫原性ペプチドを決定すること；および
ｅ．選択された抗体またはその抗原結合フラグメント由来の決定されたペプチドを、決定された免疫原性ペプチドと置換すること；
を含み、それにより抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する。

【0045】

いくつかの実施形態では、方法は、置換を最適化して、目的の選択抗体またはその抗原結合フラグメントの構造において可能な限り少ない乱れ（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）をもたらすことをさらに含む。

【0046】

いくつかの実施形態では、操作された抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫原性ペプチド送達抗体である。

【0047】

いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、標的細胞の表面に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを選択することを含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、表面への結合時に内部移行され、標的細胞の細胞質ゾルに送達される、抗体またはその抗原結合フラグメントを選択することを含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞の細胞質ゾルへの免疫原性ペプチドの送達、標的細胞の表面へのＨＬＡ分子との複合体での免疫原性ペプチドの送達および免疫原性ペプチドに特異的なエフェクター細胞による標的細胞の特異的死滅、の少なくとも１つを確認することをさらに含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞の表面上のタンパク質に結合する標的化抗体を選択すること、ならびに操作された抗体および標的化抗体を組み合わせることにより二重機能抗原結合分子を生成することをさらに含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、組み合わせることは、標的化抗体の重鎖定常領域および操作された抗体の重鎖定常領域を操作して、ヘテロ二量体化を促進しホモ二量体化を抑制することを含む。

【0052】

本発明のさらなる実施形態および適用性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および具体的実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、実例として与えられているにすぎず、この詳細な説明から、本発明の趣旨および範囲内で様々な変更および修正が当業者には明らかであることは理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1】その抗原を係合する抗体および結合に関与しない不活性ＣＤＲの存在を示す概略図である。

【図2】不活性ＣＤＲ含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその不活性ＣＤＲが免疫原性ペプチドで置換された後の本発明のトロイの木馬抗体の画像である。

【図3】本発明の樹状細胞ワクチン接種法を段階的に示した図である。

【図4】本発明のＢ細胞標的化ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介法を段階的に示した図である。

【図5】本発明のＣＤ８＋Ｔ細胞媒介癌死滅法を段階的に示した図である。

【図6】トロイの木馬抗体の産生法の実施形態の概要を示す。

【図7A-7C】（７Ａ）ＴＭａｂ４（Ｐ１）抗体のＣＤＲＨ１中に挿入された免疫原性ペプチドを含むＴＡｂ、（７Ｂ）ＴＭａｂ４（Ｐ１）抗体のＣＤＲＨ３中に挿入された免疫原性ペプチドを含むＴＡｂ、および（７Ｃ）ＴＭａｂ４（Ｐ１）抗体のＣＤＲＬ３またはＣＤＲＨ２中に挿入された免疫原性ペプチドを含むＴＡｂ、と接触され、その後ペプチド特異的エフェクター細胞と共培養された癌細胞の特異的死滅の棒グラフである。

【図8】３Ｅ１０（Ｐ２）抗体のＣＤＲＬ１中に挿入された免疫原性ペプチドを含むＴＡｂと接触され、その後ペプチド特異的エフェクター細胞と共培養された癌細胞の特異的死滅の棒グラフである。

【図9A-9B】エフェクター細胞単独（細胞のみ）で、（９Ａ）親抗体３Ｅ１０（Ｐ２）およびＴＡｂ Ｔ２＿１１、ならびに（９Ｂ）親抗体ＴＭａｂ４（Ｐ１）およびＴＡｂ Ｔ１８、と共に培養されたアポトーシス性癌細胞の折れ線グラフである。

【図10】二官能性トロイの木馬抗体および対応する対照の概略図である。ｂｉ－ＴＡｂは、ＦＴＡｂとして標識され、対照ｂｉ－ＴＡｂは、ｃＦＴＡｂとして標識される。

【図11】癌細胞の表面上のＥＧＦＲへのｂｉ－ＴＡｂの結合を示すヒストグラムである。治療抗体は、陽性対照として使用され、蛍光標識二次抗体は、陰性対照として使用される。上段パネルは、０．３ｎＭの濃度を示し、下段パネルは、３ｎＭの濃度を示す。ｂｉ－ＴＡｂは、ＦＴＡｂとして標識される。

【図12】異なる時点でＨＬＡペプチド複合体を提示する癌細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。各ｂｉ－ＴＡｂ（白色バー）は、同じ死滅化モジュールを有するが免疫原性ペプチドを有しないその陰性対照（灰色バー）と比較される。ｂｉ－ＴＡｂは、ＦＴＡｂとして標識され、対照ｂｉ－ＴＡｂは、ｃＦＴＡｂとして標識される。

【図13】種々のエフェクター対標的細胞の比率でのエフェクター細胞により死滅された癌細胞のパーセンテージの折れ線グラフである。各ｂｉ－ＴＡｂ（薄灰色線）は、その陰性対照（黒線）と比較される。エフェクター細胞を含まない抗体のみの点が、含まれる。ｂｉ－ＴＡｂは、ＦＴＡｂとして標識され、対照ｂｉ－ＴＡｂは、ｃＦＴＡｂとして標識される。

【発明を実施するための形態】

【0054】

本発明は、いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域中に挿入された少なくとも１個の免疫原性ペプチドを含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、挿入は、抗体または抗原結合フラグメント配列の除去を含む。本発明の抗体または抗原結合フラグメントおよび第２の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む二重機能抗原結合分子は、標的細胞上で過剰発現される抗原に結合できる。二重機能抗原結合分子をコードする核酸分子、二重機能抗原結合分子を含む医薬組成物および二重機能抗原結合分子を投与することによる癌を治療する方法も、提供される。抗体または抗原結合フラグメントを製造する方法もまた、提供される。

【0055】

本発明は、抗体／抗原結合分子が、免疫原性ペプチドのための送達系として使用できるという意外な発見に基づく。すなわち、高度に免疫原性のペプチドは、癌細胞に特異的に送達でき、それにより、それらに対する免疫監視を強化できる。抗体は、この場合、治療分子を癌細胞に結合させ得る、癌エピトープに対する抗原結合ドメインを有する。抗体／抗原結合分子のエンドサイトーシス時に、免疫原性ペプチドは、細胞質に送達され得る。これは、細胞透過配列、または特に、エンドソーム脱出配列の含有により強化できる。しかし、エンドソーム脱出は、抗体の受容体媒介トランスサイトーシス、細胞質への抗体直接送達、などのいくつかの機構のように不可欠ではない。治療分子は、切断され、免疫原性ペプチドを放出し、これは次いでＨＬＡ分子と複合体化して細胞表面上で提示され、従って癌細胞の免疫原性を高め、かつ癌および癌死滅に対する免疫監視を強化し得る。

【0056】

あるいは、抗原結合領域は、樹状細胞抗原を結合でき、これは、樹状細胞に癌細胞抗原を含む治療分子を送達し得る。分子は、結合時に取り込まれ、免疫原性癌ペプチドは、本発明の分子の残部から切断され、ＨＬＡ分子により樹状細胞の表面上に提示され得る。これは次に、この免疫原性ペプチドを標的にし従って癌を標的にするように細胞傷害性免疫細胞（Ｔ細胞およびＮＫ細胞）を訓練する。

【0057】

第１の態様により、抗原結合分子が提供される。

【0058】

別の態様により、本発明の抗原結合分子を含む組成物が提供される。

【0059】

別の態様により、本発明の抗原結合分子をコードする核酸分子が提供される。

【0060】

別の態様により、本発明の核酸分子を含む発現ベクターが提供される。

【0061】

別の態様により、標的細胞の表面上でペプチドを発現させる方法が提供され、方法は、本発明の抗原結合分子または本発明の医薬組成物と標的細胞を接触させること、それにより標的細胞の表面上でペプチドを発現させることを含む。

【0062】

別の態様により、対象において癌を治療する方法が提供され、方法は、本発明の抗原結合分子または本発明の医薬組成物を対象に投与すること、それによりそれを必要としている対象において癌を治療することを含む。

【0063】

別の態様により、標的細胞の表面上でペプチドを発現させることにおける使用のための本発明の組成物が提供される。別の態様により、癌を治療することにおける使用のための本発明の組成物が提供される。別の態様により、癌の治療のための薬物の製造における使用のための本発明の組成物が提供される。

【0064】

いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、二重機能分子である。いくつかの実施形態では、第１の機能は、抗原を結合することである。いくつかの実施形態では、第２の機能は、細胞へ侵入することである。いくつかの実施形態では、第２の機能は、ペプチドを送達することである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、免疫原性ペプチドである。いくつかの実施形態では、第２の機能は、細胞の細胞質中へ免疫原性ペプチドを送達することである。

【0065】

いくつかの実施形態では、分子は、抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、領域は、ドメインである。いくつかの実施形態では、領域は、抗原を結合する。いくつかの実施形態では、抗原は、標的細胞上にある。いくつかの実施形態では、抗原結合領域は、標的細胞に結合できる。いくつかの実施形態では、抗原は、癌抗原である。いくつかの実施形態では、癌抗原は、癌特異的抗原である。いくつかの実施形態では、癌抗原は、癌細胞上の抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、免疫細胞抗原である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、マクロファージ、好中球、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞である。いくつかの実施形態では、抗原は、樹状細胞抗原である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｂ細胞抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞上で発現される。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞表面上で発現される。いくつかの実施形態では、抗原は、ＭＨＣ分子として細胞表面上で提示される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、抗原およびＨＬＡタンパク質のタンパク質複合体である。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞表面タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質は、細胞表面受容体である。いくつかの実施形態では、抗原結合領域は、抗原を結合できる。

【0066】

いくつかの実施形態では、樹状細胞抗原は、ＣＤ４０、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ２０９、およびＣＤ２０７から選択される。樹状細胞のマーカーは、当技術分野で周知であり、いずれかのこのような表面マーカーが、抗原として使用されてよい。いくつかの実施形態では、樹状細胞抗原は、ＣＤ４０である。樹状細胞抗原を標的とする抗原結合ドメインは、当技術分野で周知であり、いずれかのこのような抗原結合ドメインが用いられてよい。非限定例として、Ｆａｂ５１６は、ＣＤ４０に特異的に結合する。

【0067】

いくつかの実施形態では、免疫細胞抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、およびＣＤ２２から選択される。いくつかの実施形態では、樹状細胞抗原は、ＣＤ２０である。いくつかの実施形態では、免疫細胞抗原は、Ｂ細胞抗原である。免疫細胞のマーカーは一般に周知で、特にＢ細胞のマーカーは当技術分野で周知であり、いずれかのこのような表面マーカーが、抗原として使用されてよい。免疫細胞抗原を標的とする抗原結合ドメインは、当技術分野で周知であり、いずれかのこのような抗原結合ドメインが、用いられてよい。非限定例として、アーゼラは、ＣＤ２０に特異的に結合する。

【0068】

いくつかの実施形態では、癌細胞抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＴＬＡ、ＬＡＧ－３、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１から選択される。癌細胞のマーカーは、当技術分野で周知であり、いずれかのこのような表面マーカーは、抗原として使用し得る。いくつかの実施形態では、癌細胞抗原は、ＰＤ－Ｌ１である。免疫細胞抗原を標的とする抗原結合ドメインは、当技術分野で周知であり、いずれかのこのような抗原結合ドメインを用い得る。非限定例として、デュルバルマブは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。

【0069】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、完全抗体である。

【0070】

本明細書で使用される、「抗体」という用語は、内部表面形状および抗原の抗原決定基の特徴に相補的な電荷分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖の折り畳みから形成される少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドまたはポリペプチド群を指す。抗体は典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含む四量体形態を有し、各対は１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。抗体は、オリゴクローナル、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ラクダ化、ＣＤＲグラフト化、多重特異性、二重特異性、触媒性、ヒト化、完全ヒト型、抗イディオタイプであってよく、および可溶型または結合型で標識できる抗体、ならびに、単独でまたは他のアミノ酸配列と組み合わせてのいずれかで、そのエピトープ結合フラグメント、バリアントまたは誘導体を含むフラグメントであってよい。抗体は、いずれの種由来であってもよい。抗体という用語はまた、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（ダイアボディ）、およびジスルフィド結合可変領域（ｄｓＦｖ）を含むがこれらに限定されない、結合フラグメントも含む。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち抗原結合部位を含む分子、を含む。抗体フラグメントは、Ｆｃ領域またはそのフラグメントを含むがこれらに限定されない別の免疫グロブリンドメインに融合されてよく、または融合されなくてもよい。当業者はさらに、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、可変領域（例えば、ＶＬおよびＶＨ）－Ｆｃ融合体およびｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体を含むがそれらに限定されない他の融合産物が生成され得ることを理解するであろう。

【0071】

免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってよい。

【0072】

「抗原」は、抗体形成を誘発できかつ抗体により結合され得る、分子または分子の一部である。抗体形成は、マウス、ラット、ウサギ、ブタおよび抗体の生成によく使用される他の動物で起こり得るが、無論、異種抗原に対する応答としてヒトでも起こり得る。抗原は、１つまたは２つ以上のエピトープを有し得る。上記で言及した特異的反応は、抗原が高度に選択的に、その対応する抗体と反応し、かつ他の抗原により誘発され得る数多くの他の抗体とは反応しないであろうことを示すと意図される。

【0073】

本発明による用語「抗原決定基」または「エピトープ」は、特定の抗体と特異的に反応する抗原分子の領域を指す。エピトープ由来のペプチド配列は、当該技術分野において既知の方法を適用して、単独でまたは担体部分と併せて、使用されて、動物を免疫化し、追加のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生できる。免疫グロブリン可変ドメインはまた、ＩＭＧＴ情報システム（ｉｍｇｔ．Ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）（ＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ－Ｑｕｅｓｔ）を使用して分析されて、ＣＤＲを含む可変領域セグメントを特定することもできる。例えば、Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｊ６：Ｗ５０３－５０８（２００８）を参照されたい。

【0074】

Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列のナンバリングシステムを定義した。当業者は、実験データに依存することなく、配列自体を超えて、この「Ｋａｂａｔナンバリング」のシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）により記載されるナンバリングシステムを指す。

【0075】

用語「抗体」（免疫グロブリンとも呼ばれる）は、最も広い意味で使用され、特に、それらが所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体および抗体フラグメントを包含する。特定の実施形態では、キメラ抗体またはヒト化抗体の使用もまた、本発明により包含される。

【0076】

天然起源の抗体構造の基本単位は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質複合体であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成され、非共有結合およびジスルフィド結合の両方により共に連結される。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を置いて配置される鎖内ジスルフィド架橋も有する。５つのヒト抗体クラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）が存在し、これらのクラス内で、様々なサブクラスは、単一の抗体分子内の免疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィド架橋構造、ならびに鎖長および配列の違い等の、構造の違いに基づき認識される。抗体のクラスおよびサブクラスは、そのアイソタイプである。

【0077】

重鎖および軽鎖のアミノ末端領域は、カルボキシ末端領域よりも配列において多様であり、したがって可変ドメインと呼ばれる。抗体構造のこの部分は、抗体の抗原結合特異性を付与する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、一緒に単一の抗原結合部位を形成し、したがって、基本的な免疫グロブリン単位は、２つの抗原結合部位を有する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６，６５１－６３（１９８５）、Ｎｏｖｏｔｎｙ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２ ４５９２－４５９６）。

【0078】

重鎖および軽鎖のカルボキシ末端部分は、定常ドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬを形成する。これらのドメインにおける多様性ははるかに低いが、動物種ごとに違いがあり、およびさらに、同じ個体内でそれぞれ異なる機能を有するいくつかの異なる抗体のアイソタイプがある。

【0079】

「フレームワーク領域」または「ＦＲ」という用語は、本明細書で定義される超可変領域アミノ酸残基以外の、抗体の可変ドメイン内のアミノ酸残基を指す。本明細書で使用される「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する、抗体の可変ドメイン中のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＫＡＢＡＴシステムを用いて決定される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、コチア（Ｃｌｏｔｈｉａ）を用いて決定される。いくつかの実施形態では、コチアシステムは、改良コチアシステム（Ｍａｒｔｉｎシステム）である。

【0080】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫原性ペプチドを欠く、または含まない、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドを欠く、または含まないは、免疫原性ペプチドの挿入の前である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、標的細胞に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、標的細胞の表面に接着する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞透過性抗体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞中へと貪食される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞中へと取り込まれる。いくつかの実施形態では、細胞中へと、は、細胞のエンドソーム経路の中へと、である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、エンドソーム経路中へと組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、エンドソーム経路から脱出する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、それを結合する細胞の細胞質中へと送達される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＤＮＡ結合抗体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ループス抗体である。

【0081】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｔｍａｂ４抗体である。いくつかの実施形態では、Ｔｍａｂ４は、配列番号１０２１の重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含みかつ細胞を結合でき細胞質ゾルに到達できる類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、Ｔｍａｂ４は、配列番号１０２２の軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含みかつ細胞を結合でき細胞質ゾルに到達できる類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、３Ｅ１０抗体である。いくつかの実施形態では、３Ｅ１０は、配列番号１０２３の重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含みかつ細胞を結合でき細胞質ゾルに到達できる類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、３Ｅ１０は、配列番号１０２４の軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含みかつ細胞を結合でき細胞質ゾルに到達できる類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、７１Ｆ１２抗体である。いくつかの実施形態では、７１Ｆ１２は、配列番号１０２６の重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含みかつ細胞を結合でき細胞質ゾルに到達できる類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、７１Ｆ１２は、配列番号１０２７の軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含みかつ細胞を結合でき細胞質ゾルに到達できる類似体または相同体を含む。

【0082】

いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、少なくとも１個の免疫原性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の免疫原性ペプチドを含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、外来性免疫原性ペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、抗原結合分子中に挿入される。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域中に挿入される。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、抗原結合分子の天然部分ではない。いくつかの実施形態では、ペプチドは、アミノ酸のある配列である。いくつかの実施形態では、免疫原性アミノ酸の配列は、抗原結合分子の配列中に挿入される。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、抗原結合分子のアミノ酸を置換する。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドの挿入は、アミノ酸配列の除去を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、抗体またはその抗原結合フラグメントの配列である。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、抗原結合分子に人工的に連結されない。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、組換え分子である。いくつかの実施形態では、組換え分子は、免疫原性ペプチドのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、抗原結合分子に化学結合により連結されない。いくつかの実施形態では、化学結合は、ペプチド結合以外の任意の結合である。いくつかの実施形態では、化学結合は、アミノ酸結合以外の任意の結合である。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、ペプチド結合、アミノ酸結合またはそれらの両方により抗原結合分子に連結される。

【0083】

本明細書で使用される、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、同じ意味で用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。別の実施形態では、本明細書で使用される、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、天然ペプチド、ペプチド模倣体（典型的には、非ペプチド結合または他の合成的改変を含む）およびペプチド類似体ペプトイドおよびセミペプトイドまたはこれらの任意の組み合わせを包含する。別の実施形態では、記載されるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、身体中でそれらをより安定にするまたは細胞の中へとより透過可能にする改変を有する。一実施形態では、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、天然起源のアミノ酸ポリマーに適用される。別の実施形態では、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、１個または複数のアミノ酸残基が対応する天然起源のアミノ酸の人工の化学的類似体である、アミノ酸ポリマーに適用される。

【0084】

本明細書で使用される、「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡによりコードされ、従って天然起源ではない、タンパク質を指す。用語「組換えＤＮＡ」は、遺伝的組換えの実験室手法により形成されたＤＮＡ分子を指す。一般に、この組換えＤＮＡは、細胞中で組換えタンパク質を発現するために使用されるベクター、プラスミドまたはウイルスの形態である。

【0085】

いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、最大で５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、３～２０、３～１５、３～１２、３～１１、３～１０、３～７、５～２０、５～１５、５～１２、５～１１、５～１０、７～２０、７～１５、７～１２、７～１１、または７～１０個のアミノ酸である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、８～１１個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、８個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、９個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、１０個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、１１個のアミノ酸からなる。

【0086】

本明細書で使用される、「免疫原性ペプチド」という用語は、ヒト免疫系に曝露されると免疫応答を生ずるアミノ酸配列を指す。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、非ヒトペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、免疫細胞からの免疫応答を生ずる。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、免疫細胞からの免疫応答で認識される。いくつかの実施形態では、認識されることは、それにより結合されることである。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、樹状細胞からの免疫応答を生ずる。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、細胞表面上で提示される。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、ＭＨＣ分子として提示される。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、ＨＬＡとの複合体で提示される。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、Ｔ細胞からの免疫応答を生ずる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞から選択される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、ＣＤ４エピトープ、ＣＤ８エピトープまたはそれらの両方を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、ＮＫ細胞からの免疫応答を生ずる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、増大した免疫応答である。いくつかの実施形態では、免疫原性は、免疫原性の増大を含む。いくつかの実施形態では、増大されるは、対照ペプチドに比較してである。いくつかの実施形態では、対照ペプチドは、ヒトペプチドである。いくつかの実施形態では、対照ペプチドは、非癌性ペプチドである。いくつかの実施形態では、対照ペプチドは、非免疫原性ペプチドである。

【0087】

いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、癌ペプチドである。いくつかの実施形態では、癌ペプチドは、癌特異的ペプチドである。いくつかの実施形態では、癌ペプチドは、増大した癌ペプチドである。いくつかの実施形態では、癌ペプチドは、癌細胞中の増大された表面発現を有するペプチドである。いくつかの実施形態では、癌ペプチドは、表１で提供されるペプチドである。いくつかの実施形態では、癌ペプチドは、表１で提供される配列から選択される。いくつかの実施形態では、癌ペプチドは、配列番号７０２～１０２０で提供される配列から選択される。癌ペプチドは当該技術分野において周知であり、例えば、癌抗原ペプチドデータベース：ｃａｐｅｄ．ｉｃｐ．ｕｃｌ．ａｃ．ｂｅ／Ｐｅｐｔｉｄｅ／ｓｅａｒｃｈ、で見つけることができる。

【表1】

【0088】

いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、非ヒトペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、ウイルスペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、細菌ペプチドである。ウイルスペプチドは、当技術分野で周知であり、いずれかのこのようなペプチドを採用し得る。このようなペプチドは、例えば、免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）およびＶＤＪＤＢデータベース：ｉｅｄｂ．ｏｒｇおよびｖｄｊｄｂ．ｃｄｒ３．ｎｅｔで見つけることができる。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）またはインフルエンザウイルス（ＦＬＵ）から選択されるウイルス由来である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＦＬＵ、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）、アデノウイルスおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）から選択されるウイルス由来である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＣＭＶである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＥＢＶである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＦＬＵである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＰＶである。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、表２で提供されるペプチドである。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、表２で提供される配列から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、表３で提供されるペプチドである。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、表３で提供される配列から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号１～７０１から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号１～６９５から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号１～１１から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号１～９から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号１～５から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号１である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号２である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号３である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号４である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号５である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号６である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号７である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号８である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号９である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号１０である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号１１である。いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、１５１、１９７、４７１、６７７、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、および７０１から選択される。

【0089】

【表2】

【表3】

【0090】

いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントの相補性決定領域（ＣＤＲ）中に挿入される。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドの挿入は、ＣＤＲ配列の除去を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１個のＣＤＲは、免疫原性ペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、全ＣＤＲである。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲの少なくとも一部である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ配列は、ＣＤＲの少なくとも一部の配列を含む。いくつかの実施形態では、一部は、少なくとも４個のアミノである。いくつかの実施形態では、一部は、少なくとも５個のアミノである。いくつかの実施形態では、一部は、少なくとも６個のアミノである。いくつかの実施形態では、一部は、少なくとも７個のアミノである。いくつかの実施形態では、一部は、少なくとも８個のアミノである。いくつかの実施形態では、一部は、少なくとも９個のアミノである。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドの挿入は、ＣＤＲの除去を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドの挿入は、ＣＤＲの少なくとも一部の除去を含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、ＣＤＲまたはＣＤＲの一部の置換はまた、ＣＤＲに隣接する少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、隣接するは、ＣＤＲに対しＮ末端である。いくつかの実施形態では、隣接するは、ＣＤＲに対しＣ末端である。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のアミノ酸は、ＣＤＲに直接隣接する少なくとも１、２、３、４または５個のアミノ酸である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のアミノ酸は、４～５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のアミノ酸は、４個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のアミノ酸は、５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、隣接する領域は、５、６、７、８、９または１０個以下のアミノ酸である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、隣接する領域は、５個以下のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、隣接する領域は、１０個以下のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、隣接する領域は、ＣＤＲループのステムを含む。構造を保存するため、かつ可能な限り乱れを少なくするために、ＣＤＲそれ自体（またはその一部）と併せて、ＣＤＲに隣接する領域の一部を置換することも必要な場合があることは、当業者には理解されるであろう。

【0092】

いくつかの実施形態では、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ１は、配列番号１０２１のアミノ酸２６～３３を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ２は、配列番号１０２１のアミノ酸５１～５８を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ３は、配列番号１０２１のアミノ酸９７～１０９を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、ＴＭａｂ４のＣＤＲＬ１は、配列番号１０２２のアミノ酸２７～３８を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、ＴＭａｂ４のＣＤＲＬ２は、配列番号１０２２のアミノ酸５６～５８を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、ＴＭａｂ４のＣＤＲＬ３は、配列番号１０２２のアミノ酸９５～１０３を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、３Ｅ１０のＣＤＲＨ１は、配列番号１０２３のアミノ酸２６～３３を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、３Ｅ１０のＣＤＲＨ２は、配列番号１０２３のアミノ酸５１～５８を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、３Ｅ１０のＣＤＲＨ３は、配列番号１０２３のアミノ酸９７～１０５を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、３Ｅ１０のＣＤＲＬ１は、配列番号１０２４のアミノ酸２７～３６を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、３Ｅ１０のＣＤＲＬ２は、配列番号１０２４のアミノ酸５４～５６を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、３Ｅ１０のＣＤＲＬ３は、配列番号１０２４のアミノ酸９３～１０１を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、７１Ｆ１２のＣＤＲＨ１は、配列番号１０２６のアミノ酸２６～３３を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、７１Ｆ１２のＣＤＲＨ２は、配列番号１０２６のアミノ酸５１～５７を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、７１Ｆ１２のＣＤＲＨ３は、配列番号１０２６のアミノ酸９６～１０５を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、７１Ｆ１２のＣＤＲＬ１は、配列番号１０２７のアミノ酸２６～３４を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、７１Ｆ１２のＣＤＲＬ２は、配列番号１０２７のアミノ酸５２～５４を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、７１Ｆ１２のＣＤＲＬ３は、配列番号１０２７のアミノ酸９１～１００を含む、またはこれらからなる。

【0093】

いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、細胞透過配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、細胞透過ドメインである。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、細胞透過ペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、細胞の内部に分子を向ける。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、細胞の内部に分子を送達する。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、細胞の内部への分子の侵入を可能にする。いくつかの実施形態では、細胞の内部は、エンドソームである。いくつかの実施形態では、細胞の内部は、細胞質である。いくつかの実施形態では、細胞質への送達は、エンドソームからの退出を含む。いくつかの実施形態では、細胞質への送達は、エンドソームからの脱出を含む。いくつかの実施形態では、エンドソームは、エンドソーム経路である。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、ペプチド透過ドメイン（ＰＴＤ）である。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）である。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、エンドソーム脱出ドメイン（ＥＥＤ）である。細胞質中への進入、特に、エンドサイトーシス後にエンドソーム経路からの脱出を可能にするペプチド配列は、当技術分野で周知であり、いずれかのこのようなペプチド配列を採用し得る。

【0094】

Ｔｍａｂ４のＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ３はいずれも、抗体侵入に関与することは当該技術分野において既知である（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ａｃｉｄｉｃ ｐＨ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｓｏｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ”，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１６，１０；２３５：１６５－１７５、およびＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｉｎｔａｃｔ，ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｐｅｎｅｔｒａｔｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｏｌ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ”，Ｍａｂｓ，２０１４；６（６）：１４０２－１４を参照されたい、これらの文献は参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、Ｔｍａｂ４のＣＤＲＬ１を含む。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、Ｔｍａｂ４のＣＤＲＬ１からなる。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、Ｔｍａｂ４のＣＤＲＬ３を含む。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、Ｔｍａｂ４のＣＤＲＬ３からなる。他の抗体中へ細胞透過配列をグラフトする方法（例えば、Ｃｈｉｏらにより提供された方法など）は、当技術分野において既知である。

【0095】

いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、抗体の二重特異性抗体フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、複数の抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、少なくとも２つの抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、２つの抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合領域は、標的細胞に結合できる抗原結合領域である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合領域は、免疫原性ペプチドを含むように変異される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合領域は、細胞透過配列を含むように変異される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合領域は、免疫原性ペプチド、細胞透過配列または両方を含むように変異される。いくつかの実施形態では、変異は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の変異である。いくつかの実施形態では、抗原結合領域のＣＤＲは、変異される。いくつかの実施形態では、変異されるは、置換されるである。いくつかの実施形態では、置換されるは、免疫原性ペプチドにより置換される。いくつかの実施形態では、置換されるは、細胞透過配列により置換される。

【0096】

いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、不活性ＣＤＲである。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲは、標的抗原への結合に寄与しない。いくつかの実施形態では、結合は、標的抗原へのＣＤＲを含む抗原結合領域の結合である。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲは、結合に対し、ほとんど、または全く寄与しない。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲは、標的抗原と接触する２個以下のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲは、標的抗原と接触する２個より少ないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲは、標的抗原と接触する２、１または０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲは、標的抗原と接触する２個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲは、標的抗原と接触する１個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲは、標的抗原と接触するアミノ酸を含まない。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲは、標的抗原と接触しない。いくつかの実施形態では、接触は、３、５、７、９または１０Å以下の距離を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、接触は、５Å以下の距離を含む。いくつかの実施形態では、距離は、ＣＤＲのアミノ酸と標的抗原のアミノ酸の間の距離である。いくつかの実施形態では、距離は、抗原結合ドメインが抗原に結合される時に存在する距離である。いくつかの実施形態では、距離は、結合の結晶学的調査中の距離である。

【0097】

いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲの変異または置換は、結合を減少させない。いくつかの実施形態では、結合を低下させないことは、結合を大きく低下させないことである。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲの変異または置換は、結合を抑止しない。いくつかの実施形態では、大きな低下は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９５または９９％を越える結合の低下である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、大きな低下は、１０％を越える結合の低下である。いくつかの実施形態では、大きな低下は、２０％を越える結合の低下である。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲの変異または置換は、結合を１００％低下させない。

【0098】

いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲの変異または置換は、細胞透過を低下させない。いくつかの実施形態では、細胞透過を低下させないことは、細胞透過を大きく低下させないことである。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲの変異または置換は、細胞透過を抑止しない。いくつかの実施形態では、大きな低下は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９５または９９％を越える透過における低下である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、大きな低下は、１０％を越える透過における低下である。いくつかの実施形態では、大きな低下は、２０％を越える透過における低下である。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲの変異または置換は、透過を１００％低下させない。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲの変異または置換は、透過を対照抗体のレベルまで低下させない。いくつかの実施形態では、対照抗体は、細胞に侵入しない抗体である。細胞に侵入しない抗体は、当該技術分野において周知であり、例えば、アダリムマブおよびムロモナブを含む。いくつかの実施形態では、細胞透過を低下させないことは、免疫原性ペプチドを欠くまたは含まない抗体またはその抗原結合フラグメントの結合に実質的に等しい透過を保持することを含む。

【0099】

いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドの挿入およびＣＤＲ配列の除去は、抗体またはその抗原結合フラグメントの立体配座の変化を生じない。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドの挿入およびＣＤＲ配列の除去は、抗体またはその抗原結合フラグメントの立体配座の最小限の変化を生じる。いくつかの実施形態では、立体配座は、全体の立体配座である。いくつかの実施形態では、立体配座は、３Ｄ構造である。いくつかの実施形態では、立体配座は、三次構造である。いくつかの実施形態では、変化は、乱れである。いくつかの実施形態では、最小限の変化は、結合の損失を伴わない。いくつかの実施形態では、最小限の変化は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％未満の変化である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、最小限の変化は、免疫原性ペプチドを欠くまたは含まない抗体またはその抗原結合フラグメントと同等の親和性での標的抗原への結合を含む。いくつかの実施形態では、同等は、親和性の低下がないことである。いくつかの実施形態では、同等は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％以下の親和性の低下である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、同等は、１０％以下の親和性の低下である。いくつかの実施形態では、同等は、２０％以下の親和性の低下である。

【0100】

いくつかの実施形態では、変異されるＣＤＲは、標的細胞を結合できる抗原結合領域中にある。いくつかの実施形態では、変異導されるＣＤＲは、標的細胞を結合できる抗原結合領域中には存在しない。いくつかの実施形態では、変異されるＣＤＲは、標的細胞に結合できる抗原結合領域以外の抗原結合領域中にある。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、標的細胞を結合できる抗原結合領域中のＣＤＲを置換する。いくつかの実施形態では、細胞透過配列は、標的細胞を結合する抗原結合領域ではない抗原結合領域中のＣＤＲを置換する。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドおよび細胞透過配列は、同じ抗原結合領域中にある。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドおよび細胞透過配列は、異なる抗原結合領域中にある。

【0101】

いくつかの実施形態では、標的細胞は、樹状細胞であり、樹状細胞抗原は、ＣＤ４０であり、ＣＤ４０に結合できる抗原結合領域は、Ｆａｂ５１６であり、軽鎖ＣＤＲＬ２は、上記細胞透過配列、上記免疫原性ペプチドまたはそれらの両方により置換される。

【0102】

いくつかの実施形態では、標的細胞は、Ｂ細胞であり、Ｂ細胞抗原は、ＣＤ２０であり、ＣＤ２０に結合できる抗原結合領域は、アーゼラであり、重鎖ＣＤＲＨ１、軽鎖ＣＤＲＬ１および軽鎖ＣＤＲＬ２の少なくとも１つは、上記細胞透過配列、上記免疫原性ペプチドまたはそれらの両方により置換される。いくつかの実施形態では、置換されるは、ペプチドまたは配列を含むように変異される、である。いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲＨ１は、置換される。いくつかの実施形態では、軽鎖ＣＤＲＬ１は、置換される。いくつかの実施形態では、軽鎖ＣＤＲＬ２は、置換される。

【0103】

いくつかの実施形態では、標的細胞は、癌であり、癌細胞抗原は、ＰＤ－Ｌ１であり、ＰＤ－Ｌ１に結合できる抗原結合領域は、デュルバルマブであり、重鎖ＣＤＲＨ１、軽鎖ＣＤＲＬ２の少なくとも１つは、上記細胞透過配列、上記免疫原性ペプチドまたはそれらの両方により置換される。いくつかの実施形態では、置換されるは、ペプチドまたは配列を含むように変異される、である。いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲＨ１は、置換される。いくつかの実施形態では、軽鎖ＣＤＲＬ２は、置換される。

【0104】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＭａｂ４であり、免疫原性ペプチドは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３のいずれか１つの中に挿入される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＭａｂ４であり、免疫原性ペプチドは、ＣＤＲＨ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＭａｂ４であり、免疫原性ペプチドは、ＣＤＲＨ２中に、挿入される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＭａｂ４であり、免疫原性ペプチドは、ＣＤＲＨ３中に挿入される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＭａｂ４であり、免疫原性ペプチドは、ＣＤＲＬ３中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号１は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号２は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号３は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号４は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号５は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号１は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号２は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号３は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号４は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号５は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号１は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ３中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号２は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ３中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号３は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ３中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号４は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ３中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号５は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ３中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号１は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＬ３中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号２は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＬ３中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号３は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＬ３中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号４は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＬ３中に挿入される いくつかの実施形態では、配列番号５は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＬ３中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号６は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号７は、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ２３中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号８は、ＴＭａｂ４の軽鎖の１４～２２のアミノ酸に代えて挿入される。 いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１中へは、重鎖のアミノ酸２５～３３を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１中へは、重鎖のアミノ酸２６～３３を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１中へは、重鎖のアミノ酸２６～３２を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１中へは、重鎖のアミノ酸２７～３３を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１中へは、重鎖のアミノ酸２８～３３を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１中へは、重鎖のアミノ酸２２～３０を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１中へは、重鎖のアミノ酸２２～２９を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１中へは、重鎖のアミノ酸２６～３１を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１中へは、重鎖のアミノ酸２３～３２を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１中へは、重鎖のアミノ酸２３～３１を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１中へは、重鎖のアミノ酸２８～３５を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３中へは、重鎖のアミノ酸１００～１０８を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３中へは、重鎖のアミノ酸９９～１０６を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３中へは、重鎖のアミノ酸９９～１０５を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３中へは、重鎖のアミノ酸１００～１０６を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３中へは、重鎖のアミノ酸１００～１０５を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３中へは、重鎖のアミノ酸１００～１０４を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３中へは、重鎖のアミノ酸９９～１０７を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ２中へは、重鎖のアミノ酸５２～５９を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ２中へは、重鎖のアミノ酸５２～６０を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ３中へは、軽鎖のアミノ酸９７～１０３を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ３中へは、軽鎖のアミノ酸９８～１０３を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ３中へは、軽鎖のアミノ酸９６～１０４を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ３中へは、軽鎖のアミノ酸９８～１０４を置換することを含む。

【0105】

いくつかの実施形態では、抗体は、３Ｅ１０であり、免疫原性ペプチドは、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２のいずれか１つの中に挿入される。いくつかの実施形態では、抗体は、３Ｅ１０であり、免疫原性ペプチドは、ＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、抗体は、３Ｅ１０であり、免疫原性ペプチドは、ＣＤＲＬ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号１は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号２は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号３は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号４は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号５は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号１は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号２は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号３は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号４は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号５は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号６は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号９は、３Ｅ１０のＣＤＲＬ２中に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１中へは、軽鎖のアミノ酸２７～３５を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１中へは、軽鎖のアミノ酸２８～３６を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ２中へは、軽鎖のアミノ酸５０～５８を置換することを含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、抗体は、７１Ｆ１２であり、免疫原性ペプチドは、ＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号１は、７１Ｆ１２のＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号２は、７１Ｆ１２のＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号３は、７１Ｆ１２のＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号４は、７１Ｆ１２のＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、配列番号５は、７１Ｆ１２のＣＤＲＬ１中に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１中へは、軽鎖のアミノ酸２８～３６を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１中へは、軽鎖のアミノ酸２６～３４を置換することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ２中へは、軽鎖のアミノ酸５０～５８を置換することを含む。

【0107】

いくつかの実施形態では、抗体は、商業的に入手できる抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＭａｂ４、３Ｅ１０および７１Ｆ１２のいずれか１つと同等のレベルで結合される細胞中に侵入する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＭａｂ４と同等のレベルで結合される細胞中に侵入する。いくつかの実施形態では、抗体は、３Ｅ１０と同等のレベルで結合される細胞中に侵入する。いくつかの実施形態では、抗体は、７１Ｆ１２と同等のレベルで結合される細胞中に侵入する。いくつかの実施形態では、同等は、元の抗体の少なくとも、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９９、または１００％である透過を伴う。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、同等は、元の抗体の少なくとも８０％である透過を伴う。いくつかの実施形態では、同等は、元の抗体の少なくとも９０％である透過を伴う。

【0108】

いくつかの実施形態では、抗原結合領域および免疫原性ペプチドは、同じアミノ酸鎖の一部である。いくつかの実施形態では、抗原結合領域および細胞透過配列は、同じアミノ酸鎖の一部である。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドおよび細胞透過配列は、同じアミノ酸鎖の一部である。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、単一の融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、単一のアミノ酸鎖である。

【0109】

いくつかの実施形態では、抗原結合領域および免疫原性ペプチドは、リンカーにより分離される。いくつかの実施形態では、抗原結合領域および細胞透過配列は、リンカーにより分離される。いくつかの実施形態では、免疫原性および細胞透過配列は、リンカーにより分離される。いくつかの実施形態では、リンカーは、化学リンカーではない。いくつかの実施形態では、リンカーは、人工リンカーではない。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも、１、２、３、４または５個のアミノ酸を含む、またはこれらからなる。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸を含む、またはこれらからなる。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸を含む、またはこれらからなる。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0110】

いくつかの実施形態では、抗体は、抗体Ｔ１－Ｔ１９、Ｔ１＿３０－Ｔ１＿３５、Ｔ１＿３９－Ｔ１＿４５およびＴ１＿４７から選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０２８～１０４０、１０４３～１０４５、１０４７～１０５５、および１０５８～１０５９または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、類似体または相同体は、免疫原性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、類似体または相同体は、細胞を結合できる。いくつかの実施形態では、類似体または相同体は、細胞結合時に細胞質ゾルに送達される。いくつかの実施形態では、細胞質ゾルへの到達は、結合細胞の表面上への免疫原性ペプチドの提示を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０２８を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０２９を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０３０を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０３１を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０３２を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０３３を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０３４を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０３５を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０３６を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０３７を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０３８を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０３９を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０４０を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０４３を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０４４を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０４５を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０４７を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０４８を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０４９を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０５０を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０５１を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０５２を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０５３を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０５４を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０５５を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０５８を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２２を含む軽鎖可変領域および配列番号１０５９を含む重鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。

【0111】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０４１～１０４２、１０４６、および１０５６～１０５７から選択される配列を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０４１を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０４２を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０４６を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０５６を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０５７を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。

【0112】

いくつかの実施形態では、抗体は、抗体Ｔ２＿６、Ｔ２＿１１－Ｔ２＿１３、Ｔ２＿２０およびＴ２＿２３から選択される。 いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２３を含む重鎖可変領域および配列番号１０６０～１０６５から選択される配列を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２３を含む重鎖可変領域および配列番号１０６０を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２３を含む重鎖可変領域および配列番号１０６１を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２３を含む重鎖可変領域および配列番号１０６２を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２３を含む重鎖可変領域および配列番号１０６３を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２３を含む重鎖可変領域および配列番号１０６４を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２３を含む重鎖可変領域および配列番号１０６５を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。

【0113】

いくつかの実施形態では、抗体は、抗体Ｔ４＿１およびＴ４＿３から選択される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２６を含む重鎖可変領域および配列番号１０６６を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０２７を含む重鎖可変領域および配列番号１０６７を含む軽鎖可変領域または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、少なくとも８５％の同一性は、少なくとも、９０、９２、９５、９７、９９、または１００％の同一性である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。抗原結合ＣＤＲ、免疫原性ペプチドおよび細胞透過部分などの、抗体中の特定の領域が、機能のために必要とされるが、他の領域は、機能を変えることなく変化を許容し得ることは、当業者には理解されるであろう。他の不活性ＣＤＲは、多くのＣＤＲ間配列ならびに抗体の定常領域内の配列などの、このような領域である。機能を保持するがこれらの他の領域で変化を含む類似体および相同体もまた、本発明に包含される。

【0115】

いくつかの実施形態では、抗原結合領域は、単鎖抗体である。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、第１の単鎖抗体および第２の単鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第１の単鎖抗体は、標的細胞の抗原を結合できる。いくつかの実施形態では、第２の単鎖抗体は、機能的でない。いくつかの実施形態では、第２の単鎖抗体は、細胞透過配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の単鎖抗体は、免疫原性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第２の単鎖抗体は、免疫原性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の単鎖抗体は、免疫原性ペプチドと置換される不活性ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、第１の単鎖抗体は、細胞透過配列と置換される不活性ＣＤＲを含む。いつかの実施形態では、第１の単鎖抗体と上記第２の単鎖抗体は、リンカーにより分離される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーまたはアミノ酸リンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸リンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ペプチド結合である。

【0116】

いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、第１の重鎖および第１の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、第１の重鎖および第１の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の重鎖および第１の軽鎖は、標的細胞上の抗原を結合できる。いくつかの実施形態では、第１の重鎖のＣＤＲは、不活性である。いくつかの実施形態では、第１の軽鎖のＣＤＲは、不活性である。いくつかの実施形態では、第１の重鎖の不活性ＣＤＲは、免疫原性ペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、第１の軽鎖の不活性ＣＤＲは、免疫原性ペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、第１の重鎖の不活性ＣＤＲは、細胞透過配列で置換される。いくつかの実施形態では、第１の軽鎖の不活性ＣＤＲは、細胞透過配列で置換される。

【0117】

いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、第２の重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、第２の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、第２の重鎖および第２の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、第２の重鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、第２の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、第２の重鎖および第２の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の重鎖のＣＤＲは、不活性である。いくつかの実施形態では、第２の軽鎖のＣＤＲは、不活性である。いくつかの実施形態では、第２の重鎖は、免疫原性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第２の軽鎖は、免疫原性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第２の重鎖は、細胞透過配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の軽鎖は、細胞透過配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の軽鎖のＣＤＲは、置換される。いくつかの実施形態では、第２の重鎖のＣＤＲは、置換される。いくつかの実施形態では、第２の重鎖の不活性ＣＤＲは、免疫原性ペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、第２の軽鎖の不活性ＣＤＲは、免疫原性ペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、第２の重鎖の不活性ＣＤＲは、細胞透過配列で置換される。いくつかの実施形態では、第２の軽鎖の不活性ＣＤＲは、細胞透過配列で置換される。

【0118】

いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、二重機能抗原結合分子である。いくつかの実施形態では、組成物は、二重機能抗原結合分子を含む。いくつかの実施形態では、二重機能抗原結合分子は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、二重機能抗原結合分子は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重機能抗原結合分子は、第１の抗体または抗原結合分子および第２の抗体または抗原結合分子を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗体は、第１の重鎖および第１の軽鎖を含み、第２の抗体は、第２の重鎖および第２の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖は、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインの間でハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされるは、結合されることである。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされるは、ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗体またはその抗原結合フラグメントは、標的細胞上で過剰発現される抗原を結合できる。いくつかの実施形態では、標的細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態では、抗原は、癌抗原である。

【0119】

癌抗原の例は、限定されないが、上皮増殖因子（ＥＧＦＲ）、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ネクチン細胞接着分子４（ネクチン－４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（ＴＲＯＰ－２／ＴＡＣＳＴＤ２）、組織因子（ＴＦ／Ｆ３）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ－１）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー８（ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８）、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９）、表面抗原分類－２２（ＣＤ２２）、シグレック－３（ＣＤ３３）、表面抗原分類３８（ＣＤ３８）、表面抗原分類７９（ＣＤ７９）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、血管内皮細胞増殖因子２（ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、キャンパス－１抗原（ＣＤ５２）、血小板由来増殖因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲα）、ジシアロガングリオシドＧＤ２、モノシアロジヘキソシルガングリオシド（ＧＭ３）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、および細胞傷害性Ｔリンパ球結合タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）を含む。これらの癌抗原に結合する抗体は、当技術分野で周知であり、いずれかのこのような抗体が、本発明の標的化モジュールとして使用され得る。いくつかの実施形態では、標的化分子により標的化される癌抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＴＬＡ、ＬＡＧ－３、およびＰＤ－Ｌ１から選択される。ターゲティング部分に使用できる抗体の例は、表４で提供される。

【表4】

【0120】

いくつかの実施形態では、抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、セツキシマブ、パニツムマブおよびネシツムマブから選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、セツキシマブである。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、パニツムマブである。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、ネシツムマブである。いくつかの実施形態では、セツキシマブは、配列番号１０６９を含む重鎖または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、セツキシマブは、配列番号１０６８を含む軽鎖または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、パニツムマブは、配列番号１０７１を含む重鎖または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、パニツムマブは、配列番号１０７０を含む軽鎖または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、ネシツムマブは、配列番号１０７３を含む重鎖または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、ネシツムマブは、配列番号１０７２を含む軽鎖または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、類似体または相同体は、標的結合機能を保持する。いくつかの実施形態では、類似体または相同体は、抗体のＣＤＲを保持する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、不活性ではない全てのＣＤＲである。

【0121】

いくつかの実施形態では、第２の抗体の少なくとも１個の不活性ＣＤＲは、免疫原性ペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、標的化抗体である。いくつかの実施形態では、セツキシマブのＣＤＲＨ１は、置換される。いくつかの実施形態では、セツキシマブのＣＤＲＬ１は、置換される。いくつかの実施形態では、セツキシマブのＣＤＲＬ２は、置換される。いくつかの実施形態では、パニツムマブのＣＤＲＬ１は、置換される。いくつかの実施形態では、パニツムマブのＣＤＲＬ２は、置換される。いくつかの実施形態では、ネシツムマブのＣＤＲＬ１は、置換される。いくつかの実施形態では、ネシツムマブのＣＤＲＬ２は、置換される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、表１～３で提供されるものから選択されるペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、表１で提供されるものから選択されるペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、表２で提供されるものから選択されるペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、表３で提供されるものから選択されるペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１～１１から選択されるペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１～５から選択されるペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１で置換される。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、不活性ＣＤＲ由来のアミノ酸配列に代えて免疫原性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、不活性ＣＤＲは、表１４で提供される。

【0122】

いくつかの実施形態では、第１の抗体は、ヘテロダイマー化を促進する少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗体は、ホモ二量体化を抑制する少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、ヘテロダイマー化を促進する少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、ホモ二量体化を抑制する少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ノブインホール改変である。いくつかの実施形態では、改変は、変異である。いくつかの実施形態では、改変は、定常領域にある。いくつかの実施形態では、定常領域は、Ｆｃ領域である。

【0123】

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｉｇ ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｉｇ 重鎖ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｉｇ ＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｉｇ 重鎖ＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｉｇ ＣＨ２およびＩｇ ＣＨ３ドメインの両方を含む、または両方からなる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｉｇ重鎖ＣＨ２およびＩｇ重鎖ＣＨ３ドメインの両方を含む、または両方からなる。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、Ｆｃ領域の第１の部分を含み、および第２の鎖は、Ｆｃ領域の第２の部分を含む。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはそれらの両方を含む。いくつかの実施形態では、第２の部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはそれらの両方を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域の第１の部分とＦｃ領域の第２の部分の境界は、機能的なＦｃ領域を生成する。いくつかの実施形態では、境界は、接触を含む。いくつかの実施形態では、境界は、隣接位置決めを含む。いくつかの実施形態では、境界は、本発明のタンパク質複合体の形成を含む。いくつかの実施形態では、境界は、第１および第２のダイマー化ドメインのダイマー化を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは、Ｉｇ ＣＨ２ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは、重鎖ＣＨ２ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｉｇ ＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、重鎖ＣＨ３ドメインである。

【0124】

いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは、アミノ酸配列ＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号１０９７）または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは、配列番号１０９７からなる。いくつかの実施形態では、配列番号１０９７は、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインである。

【0125】

いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸配列ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１０９８）または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸配列ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１０９９）または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、配列番号１０９８からなる。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、配列番号１０９９からなる。いくつかの実施形態では、配列番号１０９８は、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、配列番号１０９９は、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、配列番号１０９８配列は、ヨーロッパ系およびアメリカ系のヒトで主に見つかる配列である。いくつかの実施形態では、配列番号１０９９は、アジア系のヒトで主に見つかる配列である。

【0126】

いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、変異を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、第１の変異を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、第２の変異を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは、変異を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２ドメインは、第１の変異を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ２ドメインは、第２の変異を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、両方とも変異を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２ドメインおよび第１のＣＨ３ドメインはそれぞれ、第１の変異を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＨ２ドメインおよび第２のＣＨ３ドメインはそれぞれ、第２の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、第１のポリペプチド鎖のホモ二量体化を抑制する。いくつかの実施形態では、第１の変異は、第１のポリペプチド鎖のホモ二量体化を抑制する。いくつかの実施形態では、変異は、第２のポリペプチド鎖のホモ二量体化を抑制する。いくつかの実施形態では、第２の変異は、第２のポリペプチド鎖のホモ二量体化を抑制する。いくつかの実施形態では、変異は、ヘテロダイマー化を許容する。いくつかの実施形態では、変異は、第１および第２の鎖のヘテロダイマー化を許容する。いくつかの実施形態では、許容することは、促進することである。いくつかの実施形態では、許容することは、強化することである。

【0127】

重鎖のヘテロ二量体化を促進しおよび／またはホモ二量体化を抑制する変異は、当該技術分野において周知である。いずれかのこのような変異または変化を、本発明のポリペプチドを構築するために使用し得る。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ由来の領域は、ＩｇＡ由来の領域で置換される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａ由来の領域は、第１のＣＨ３ドメイン中に挿入され、ＴＣＲｂ由来の領域は、第２のＣＨ３ドメイン中に挿入される。いくつかの実施形態では、変異は、ＴＣＲ由来の領域の挿入である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲａおよびＴＣＲｂから選択される。いくつかの実施形態では、変異は、異なるＩｇ由来の領域の挿入である。これらの変異の例は、表５で見出される。いくつかの実施形態では、変異は、表５の変異から選択される。いくつかの実施形態では、第１の変異は、表５の行および第２の列で提供される変異の群から選択され、第２の変異は、表５の第３の列の同じ行で提供される変異の群である。表５中の変異は、特に明記しない限り、ＩｇＧ１に対するＫａｂａｔナンバリングと共に提供され；対応する変異は、他のＩＧで、特に他のＩｇＧで作製できる。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｔ３６６Ｙであり、第２の変異は、Ｙ４０７Ｔである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗであり、第２の変異は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｓ３６４ＨおよびＦ４０５Ａであり、第２の変異は、Ｙ３４９ＴおよびＴ３９２Ｆである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖであり、第２の変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｋ３９２Ｄ、およびＫ４０９Ｄであり、第２の変異は、Ｅ３５６Ｋ、およびＤ３９９Ｋである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、およびＬ３６８Ｅであり、第２の変異は、Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｋ３６０Ｅ、およびＫ４０９Ｗであり、第２の変異は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ４０９Ｗ、およびＹ３４９Ｃであり、第２の変異は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、およびＳ３５４Ｃである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｆ４０５Ｌであり、第２の変異は、Ｋ４０９Ｒである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｋ３６０Ｄ、Ｄ３９９Ｍ、およびＹ４０７Ａであり、第２の変異は、Ｅ３４５Ｒ、Ｑ３４７Ｒ、Ｔ３６６Ｖ、およびＫ４０９Ｖである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｙ３４９Ｓ、Ｋ３７０Ｙ、Ｔ３６６Ｍ、およびＫ４０９Ｖであり、第２の変異は、Ｅ３５６Ｇ、Ｅ３５７Ｄ、Ｓ３６４Ｑ、およびＹ４０７Ａである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｔ３６６Ｋであり、第２の変異は、Ｃ３５１Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ｄ、Ｙ３４９ＥおよびＲ３５５Ｅ、Ｙ３４９ＥおよびＲ３５５Ｄ、Ｙ３４９ＤおよびＲ３５５Ｅ、ならびにＹ３４９ＤおよびＲ３５５Ｄから選択される。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｔ３６６ＫおよびＣ３５１Ｋであり、第２の変異は、Ｃ３５１Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ｄ、Ｙ３４９ＥおよびＲ３５５Ｅ、Ｙ３４９ＥおよびＲ３５５Ｄ、Ｙ３４９ＤおよびＲ３５５Ｅ、ならびにＹ３４９ＤおよびＲ３５５Ｄから選択される。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅであり、第２の変異は、Ｌ３５１ＫおよびＴ３６６Ｋである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｌ３６８ＤおよびＫ３７０Ｓであり、第２の変異は、Ｅ３５７ＱおよびＳ３６４Ｋである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｔ３６６Ｗであり、第２の変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。いくつかの実施形態では、Ｉｇは、ＩｇＧ２であり、第１の変異は、Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、およびＬ３６８Ｅであり、第２の変異はＣ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｓ３５４ＣまたはＴ３６６Ｗであり、第２の変異は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、またはＹ４０７Ｖである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｓ３６４ＨまたはＦ４０５Ａであり、第２の変異は、Ｙ３４９ＴまたはＴ３９２Ｆである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、またはＹ４０７Ｖであり、第２の変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、またはＴ３９４Ｗである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｋ３９２ＤまたはＫ４０９Ｄであり、第２の変異は、Ｅ３５６ＫまたはＤ３９９Ｋである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、またはＬ３６８Ｅであり、第２の変異は、Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、またはＫ４０９Ｒである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｋ３６０ＥまたはＫ４０９Ｗであり、第２の変異は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶまたはＦ４０５Ｔである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ４０９Ｗ、またはＹ３４９Ｃであり、第２の変異は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、またはＳ３５４Ｃである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｋ３６０Ｄ、Ｄ３９９Ｍ、またはＹ４０７Ａであり、第２の変異は、Ｅ３４５Ｒ、Ｑ３４７Ｒ、Ｔ３６６Ｖ、またはＫ４０９Ｖである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｙ３４９Ｓ、Ｋ３７０Ｙ、Ｔ３６６Ｍ、またはＫ４０９Ｖであり、第２の変異は、Ｅ３５６Ｇ、Ｅ３５７Ｄ、Ｓ３６４Ｑ、またはＹ４０７Ａである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｌ３５１ＤまたはＬ３６８Ｅであり、第２の変異は、Ｌ３５１ＫまたはＴ３６６Ｋである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｌ３６８ＤまたはＫ３７０Ｓであり、第２の変異は、Ｅ３５７ＱまたはＳ３６４Ｋである。いくつかの実施形態では、第１の変異は、Ｔ３６６Ｗであり、第２の変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、またはＹ４０７Ｖである。いくつかの実施形態では、Ｉｇは、ＩｇＧ２であり、第１の変異は、Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、またはＬ３６８Ｅであり、第２の変異は、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、またはＫ４０９Ｒである。いくつかの実施形態では、第１の重鎖定常領域は、配列番号１０７４、または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体もしくは相同体を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、第２の重鎖定常領域は、配列番号１０７４を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、第１の重鎖定常領域は、配列番号１０７５、または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体もしくは相同体を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、第２の重鎖定常領域は、配列番号１０７５を含む、またはこれらからなる。配列番号１０７４および配列番号１０７５は相互にヘテロ二量体化するが、ホモ二量体化を抑制することが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、ＣＬドメインは、配列番号１０７６、または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体もしくは相同体を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域は、配列番号１０７６を含む、または配列番号１０７６からなる。いくつかの実施形態では、類似体または相同体は、ヘテロ二量体化を促進しかつホモ二量体化を抑制する変異を保持する。

【表5】

【0128】

いくつかの実施形態では、二重機能抗原結合分子は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、２つの重鎖は、配列番号１０８８および１０８０であり、２つの軽鎖は、配列番号１０８７および１０７９、または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体もしくは相同体である。いくつかの実施形態では、２つの重鎖は、配列番号１０８８および１０８２であり、２つの軽鎖は、配列番号１０８７および１０８１、または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体もしくは相同体である。いくつかの実施形態では、２つの重鎖は、配列番号１０９０および１０８２であり、２つの軽鎖は、配列番号１０８９および１０７９、または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体もしくは相同体である。いくつかの実施形態では、２つの重鎖は、配列番号１０９０および１０８２であり、２つの軽鎖は、配列番号１０８９および１０８１、または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体もしくは相同体である。いくつかの実施形態では、２つの重鎖は、配列番号１０８８および１０８６であり、２つの軽鎖は、配列番号１０８７および１０８５、または少なくとも８５％の配列同一性を含む類似体もしくは相同体である。類似体または相同体は、標的化モジュールにより標的タンパク質を標的化し、細胞に結合し、死滅化モジュールにより細胞質ゾルに送達され、かつＨＬＡとの複合体で細胞表面上に提示される免疫原性ペプチドを含むことが、理解されるであろう。

【0129】

いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または補助剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、対象への投与用に処方される。いくつかの実施形態では、組成物は、全身投与用に処方される。いくつかの実施形態では、組成物は、腫瘍への投与用に処方される。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内投与用に処方される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象への投与用に処方される。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。

【0130】

本明細書で使用される、「担体」、「賦形剤」、または「補助剤」という用語は、活性薬剤ではない医薬組成物の任意の成分を指す。本明細書で使用される、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、非毒性の不活性固体、半固体液体充填剤、希釈剤、封入材料、任意のタイプの製剤補助剤、または単に生理食塩水などの無菌水性媒体を指す。薬学的に許容可能な担体として機能し得る物質のいくつかの例は、ラクトース、ブドウ糖およびスクロースなどの糖類；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末状トラガント；麦芽；ゼラチン；滑石；ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールポリエチレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質非含有水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝液、ならびに医薬製剤に使用される他の非毒性の相溶性物質である。本明細書において担体として機能し得る物質のいくつかの非限定例は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、トラガント末、麦芽、ゼラチン、滑石、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油、アルギン酸、ポリオール、発熱物質を含まない水、等張生理食塩水、リン酸緩衝液、ココアバター（坐剤基剤）、乳化剤ならびに他の医薬製剤で使用される他の非毒性の医薬適合性物質を含む。ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤および滑剤、ならびに着色料、香味剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤、および保存剤も存在し得る。任意の非毒性、不活性および有効な担体が、本明細書で意図される組成物を製剤化するために使用され得る。この関連で、好適な薬学的に許容可能な担体、賦形剤および希釈剤は、当業者には周知であり、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｄａｖａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（２００１）；ｔｈｅ ＣＴＦＡ（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００４）；およびｔｈｅ “Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ，” Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔに記載されるものである。これらの全ての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本組成物に有用な薬学的に許容可能な賦形剤、担体および希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、およびＤＭＳＯを含む。これらの追加の不活性成分、ならびに効果的配合および投与手順は、当該技術分野において周知であり、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，（２００５）などの標準的教科書に記載されている。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書中に記載される組成物はまた、人工的に作成された構造物、例えば、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、徐放粒子、および血清中でペプチドまたはポリペプチドの半減期を延長する他のビークルに含有されてよい。リポソームは、エマルション、フォーム、ミセル、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散物およびラメラ層などを含む。本明細書に記載のペプチドとの使用のためのリポソームは、中性および負電荷のリン脂質およびコレステロールなどのステロールを通常含む、標準的なビークル形成脂質から形成される。脂質の選択は通常、リポソームサイズおよび血液中の安定性などを考慮して決定される。種々の方法を、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにより概説されるように、リポソームの調製に利用できる。さらに、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号も参照されたい。

【0131】

担体は、全体で、本明細書に提示される医薬組成物の約０．１重量％～約９９．９９９９９重量％を構成し得る。

【0132】

本明細書で使用される、「投与する」、「投与」などの用語は、健全な医療行為において、活性剤を含む組成物を、治療効果を提供するように対象に送達する任意の方法を指す。本発明の主題の一態様は、それを必要としている患者への本発明の主題の組成物の治療的有効量の静脈内投与を提供する。他の好適な投与経路は、非経口、皮下、経口、筋肉内、腫瘍内または腹腔内を含み得る。

【0133】

いくつかの実施形態では、核酸分子は、オープンリーディングフレームを含む。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、本発明の抗原結合分子をコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、本発明の抗原結合分子を一括してコードする複数のオープンリーディングフレームを含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、本発明の核酸分子に動作可能に連結された少なくとも１つの調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、本発明の核酸分子をコードするオープンリーディングフレームに動作可能に連結された少なくとも１つの調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、本発明の抗原結合分子を一括してコードするオープンリーディングフレームにそれぞれ動作可能に連結された複数の調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、オープンリーディングフレームに動作可能に連結された少なくとも１つの調節エレメントをそれぞれ含む複数のベクターを含み、複数のオープンリーディングフレームは、本発明の核酸分子を一括してコードする。

【0135】

本明細書で使用される用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指し、上記遺伝子産物の転写および／または翻訳を含む。従って、核酸分子の発現は、核酸フラグメントの転写（例えば、ｍＲＮＡまたは他の機能性ＲＮＡを生ずる転写）および／または前駆物質または成熟タンパク質（ポリペプチド）へのＲＮＡの翻訳を指し得る。

【0136】

細胞内での遺伝子の発現は、当業者に周知である。それは、多くの方法の中でも特に、遺伝子導入、ウイルス感染、または細胞のゲノムの直接改変により実行できる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、プラスミドまたはウイルスベクターなどの発現ベクター中にある。

【0137】

ベクター核酸配列は通常、少なくとも細胞中での増殖のための複製起点、および必要に応じ、異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性）、ポリアデニン配列などの追加のエレメントを含む。

【0138】

ベクターは、非ウイルス法によりまたはウイルス法により送達されるＤＮＡプラスミドであってよい。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはポックスウイルスベクターであってよい。プロモーターは、哺乳動物細胞において活性であり得る。プロモーターは、ウイルスプロモーターであってよい。

【0139】

いくつかの実施形態では、遺伝子は、プロモーターに動作可能に連結される。「動作可能に連結される」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞中に導入される場合は宿主細胞において）調節エレメントに連結されることを意味すると意図される。

【0140】

いくつかの実施形態では、ベクターは、電気穿孔（例えば、Ｆｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５８２４（１９８５）に記載されるように）、ヒートショック、ウイルスベクターによる感染、小ビーズまたは粒子のマトリックス内もしくは表面上の核酸を用いた小粒子による高速弾道貫入（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２７．７０－７３（１９８７））、などの標準的方法により細胞に導入される。

【0141】

本明細書で使用される、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼ、即ち、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための開始部位の周りにクラスター化される一群の転写制御モジュールを指す。プロモーターは、離散形機能モジュールから構成され、それぞれは、約７～２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写活性化因子またはリプレッサータンパク質に対する１種または複数の認識部位を含む。

【0142】

いくつかの実施形態では、核酸配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩおよびＰｏｌ ＩＩ）により転写される。ＲＮＡＰ ＩＩは、真核細胞で見出される酵素である。それは、ＤＮＡの転写を触媒して、ｍＲＮＡおよびほとんどのｓｎＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの前駆物質を合成する。

【0143】

いくつかの実施形態では、哺乳動物発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（±）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（±）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶおよびｐＢＫ－ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびに、それらの誘導体を含むが、これらに限定されない。

【0144】

いくつかの実施形態では、レトロウイルスなどの真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターが、本発明で用いられる。ＳＶ４０ベクターは、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２を含む。いくつかの実施形態では、ウシパピローマウイルス由来のベクターは、ｐＢＶ－１ＭＴＨＡを含み、エプスタイン・バーウイルス由来のベクターは、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５を含む。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ－４０初期プロモーター、ＳＶ－４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞での発現に有効であると示される他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする、任意の他のベクターが挙げられる。

【0145】

いくつかの実施形態では、水平感染および標的特異性などの利点を提供する組み換えウイルスベクターは、インビボ発現のために使用される。一実施形態では、水平感染は、例えば、レトロウイルスのライフサイクルに固有であり、それにより単一の感染細胞が多くの子孫ビリオンを生成し、これらが母体から分離し隣接細胞に感染するプロセスである。一実施形態では、結果は、広い領域が急速に感染されるようになることであり、そのほとんどはもとのウイルス粒子により最初に感染されなかった。一実施形態では、水平に伝染できないウイルスベクターが、生成される。一実施形態では、この特徴は、望ましい目的が限局数の標的細胞にのみ特定の遺伝子を導入することである場合、有用であり得る。

【0146】

種々の方法が、細胞中に本発明の発現ベクターを導入するために使用できる。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２），ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９），Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．（１９８８）およびＧｉｌｂｏａ ｅｔ ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４－５１２，１９８６］に一般的に記載されており、例えば、組換えウイルスベクターによる安定なまたは一時的な遺伝子導入、リポフェクション、電気穿孔および感染を含む。さらに、ポジティブ－ネガティブ選択法に関する米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。

【0147】

一実施形態では、植物発現ベクターが、使用される。一実施形態では、ポリペプチドコード配列の発現は、いくつかのプロモーターにより推進される。いくつかの実施形態では、ウイルスプロモーター、例えばＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１－５１４（１９８４）］、またはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７－３１１（１９８７）］が、使用される。別の実施形態では、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット［Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１－１６８０（１９８４）およびＢｒｏｇｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８－８４３（１９８４）］またはヒートショックプロモーター、例えば大豆ｈｓｐ１７．５－Ｅまたはｈｓｐ１７．３－Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９－５６５（１９８６）］などの植物プロモーターが、使用される。一実施形態では、構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、微量注入、電気穿孔、および当業者に公知の他の技術を用いて植物細胞中に導入される。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ ４２１－４６３（１９８８）］を参照されたい。当技術分野で公知である、昆虫および哺乳動物宿主細胞系などの他の発現系もまた、本発明により使用されてよい。

【0148】

挿入されたコード配列（ポリペプチドをコードする）の転写および翻訳のための必須のエレメントを含む以外に、本発明の発現構築物はまた、発現されたポリペプチドの安定性、産生、精製、収率または活性を最適化するように操作された配列を含み得ることは理解されよう。

【0149】

いくつかの実施形態では、方法は、癌を治療する方法である。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、癌を治療することにおける使用のためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の二重機能抗原結合分子は、癌を治療することにおける使用のためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、癌を治療することにおける使用のためのものである。いくつかの実施形態では、癌は、癌特異的抗原を発現する癌である。いくつかの実施形態では、癌は、癌特異的抗原を過剰発現する癌である。いくつかの実施形態では、過剰発現は、非癌細胞中でよりも高いレベルでの発現である。いくつかの実施形態では、非癌細胞は、癌細胞と同じ細胞型または組織である。いくつかの実施形態では、癌は、免疫原性癌ペプチドを発現する癌である。いくつかの実施形態では、癌は、血液癌である。いくつかの実施形態では、癌は、悪性免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌である。いくつかの実施形態では、癌は、ＰＤ－Ｌ１陽性癌である。いくつかの実施形態では、癌は、ＥＧＦＲ陽性癌である。いくつかの実施形態では、癌は、ＥＧＦＲを過剰発現する癌である。

【0150】

本明細書で使用される、「癌」は、細胞増殖に関連する疾患を指す。癌の非限定的種類は、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫および生殖細胞腫瘍を含む。一実施形態では、癌腫は、限定されないが、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、および結腸癌を含む上皮細胞由来の腫瘍を指す。一実施形態では、肉腫は、限定されないが、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫および軟組織肉腫を含む間葉細胞由来腫瘍を指す。一実施形態では、リンパ腫は、骨髄を出てリンパ節中で成熟する傾向がある、造血細胞由来の腫瘍を指し、限定されないがホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および免疫増殖性疾患を含む。一実施形態では、白血病は、骨髄を出て血液中で成熟する傾向がある、造血細胞由来の腫瘍を指し、限定されないが急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞性白血病、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病および成人Ｔ細胞白血病を含む。一実施形態では、芽細胞腫は、未成熟前駆細胞または胚性組織由来の腫瘍を指し、限定されないが肝芽腫、髄芽腫、腎芽細胞腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽細胞腫および多形神経膠芽腫を含む。一実施形態では、生殖細胞腫瘍は、生殖細胞由来の腫瘍を指し、限定されないがジャーミノーマ胚細胞腫瘍またはセミノーマ胚細胞腫瘍（ＧＧＣＴ、ＳＧＣＴ）および非ジャーミノーマ胚細胞腫瘍または非セミノーマ胚細胞腫瘍（ＮＧＧＣＴ、ＮＳＧＣＴ）を含む。一実施形態では、ジャーミノーマまたはセミノーマ腫瘍は、限定されないがジャーミノーマ、ジスゲルミノーマおよびセミノーマを含む。一実施形態では、非ジャーミノーマまたは非セミノーマ腫瘍は、純粋生殖細胞および混合生殖細胞腫瘍を指し、限定されないが胚性癌腫、卵黄嚢腫瘍、絨毛癌、涙腺癌（ｔｅａｒｏｏｍ）、多胚腫、性腺芽腫および奇形癌を含む。

【0151】

いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子は、癌ワクチンである。いくつかの実施形態では、癌ワクチンは、樹状細胞抗原を結合できる抗原結合領域を含む抗原結合分子である。樹状細胞中への進入時に、免疫原性癌ペプチドは、本発明の分子の残部から切断され、ＨＬＡ分子により樹状細胞の表面上に提示されることは、当業者には理解されよう。これは次に、この免疫原性ペプチドを標的にし、従って癌を標的にするように細胞傷害性免疫細胞（Ｔ細胞およびＮＫ細胞）を訓練する。

【0152】

いくつかの実施形態では、治療することは、対象に免疫原性ペプチドに特異的なエフェクター細胞を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、細胞傷害性細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、ペプチドに曝露されている。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、ＨＬＡとの複合体でペプチドを提示する抗原提示細胞に曝露されている。

【0153】

いくつかの実施形態では、治療することは、免疫原性ペプチドを含むワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、免疫原性ペプチドを含むワクチンを以前に受けている。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、癌に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、本発明の方法により治療されるのに適する。いくつかの実施形態では、対象は、免疫原性ペプチドに以前に曝露されている。いくつかの実施形態では、対象は、免疫原性ペプチドが由来する病原体に以前に感染している。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルスである。いくつかの実施形態では、対象は、ペプチドに対し免疫応答を開始できる。いくつかの実施形態では、対象は、ペプチドまたはその一部を認識するＴＣＲを含むＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、対象は、ペプチドまたはその一部を認識するＢＣＲを含む記憶Ｂ細胞を含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞中でペプチドの表面提示を生成する方法である。いくつかの実施形態では、表面提示は、ペプチドと複合体化したＨＬＡの提示である。いくつかの実施形態では、発現は、表面提示である。いくつかの実施形態では、発現は、ＨＬＡ複合体での発現である。

【0155】

別の態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する方法が提供され、方法は：
ａ．目的の抗体またはその抗原結合フラグメントを選択すること、
ｂ．選択された抗体またはその抗原結合ドメインの少なくとも１個のＣＤＲが標的への結合に必要とされないことを決定すること；
ｃ．決定された少なくとも１個のＣＤＲまたはその一部をペプチドと置換すること；
を含み、それにより、抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する。

【0156】

別の態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する方法が提供され、方法は：
ａ．目的の抗体またはその抗原結合フラグメントを選択すること、
ｂ．ペプチドのデータベースを受け取ること；
ｃ．データベースのペプチドとの選択された抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域のペプチドのアラインメントを実施すること；
ｄ．所定の閾値を越えるアラインメントスコアを有する選択された抗体またはその抗原結合フラグメント由来のペプチドおよびデータベース由来のペプチドを決定すること；および
ｅ．選択された抗体またはその抗原結合フラグメントから決定されたペプチドを、データベースから決定されたペプチドと置換すること；
を含み、それにより抗体またはその抗原結合フラグメントを操作する。

【0157】

いくつかの実施形態では、操作される抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の抗体または抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、操作される抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の抗原結合分子である。いくつかの実施形態では、操作される抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の二重機能抗原結合分子である。いくつかの実施形態では、操作される抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫原性ペプチド送達抗体である。いくつかの実施形態では、操作される抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の方法における使用のためである。いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞透過性抗体である。いくつかの実施形態では、選択することは、それが結合する細胞中に侵入する抗体を選択することである。いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、商業的に入手できる抗体である。

【0158】

いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、標的細胞の表面に結合する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、標的細胞の表面に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを選択することを含む。いくつかの実施形態では、表面に結合することは、表面抗原に結合することである。いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＤＮＡ結合抗体である。いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞のエンドサイトーシス経路中に取り込まれる。いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、それが結合する細胞の細胞質中に輸送される。いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、エンドソーム脱出ができる。いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、それが結合する細胞の細胞質ゾルに送達される。いくつかの実施形態では、方法は、細胞透過性部分を、抗体またはその抗原結合フラグメント中に挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞透過性部分は、免疫原性ペプチドの前に挿入される。いくつかの実施形態では、細胞透過性部分は、免疫原性ペプチドの後に挿入される。いくつかの実施形態では、細胞透過性部分は、免疫原性ペプチドの挿入と同時に挿入される。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、標的細胞の表面への結合時に内部移行され標的細胞の細胞質ゾルに送達される、抗体またはその抗原結合フラグメントを選択することを含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＭａｂ４、３Ｅ１０および７１Ｆ１２のいずれか１つと同等のレベルで結合される細胞中に侵入／内部移行する。いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＭａｂ４と同等のレベルで結合される細胞中に侵入／内部移行する。いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、３Ｅ１０と同等のレベルで結合される細胞中に侵入／内部移行する。いくつかの実施形態では、操作する前の抗体またはその抗原結合フラグメントは、７１Ｆ１２と同等のレベルで結合される細胞中に侵入／内部移行する。いくつかの実施形態では、同等は、元の抗体の少なくとも、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９９、または１００％である透過を伴う。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、同等は、元の抗体の少なくとも８０％である透過を伴う。いくつかの実施形態では、同等は、元の抗体の少なくとも９０％である透過を伴う。

【0160】

いくつかの実施形態では、決定することは、少なくとも１個の不活性ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、決定することは、細胞中への輸送に関与しない少なくとも１個の不活性ＣＤＲを決定することを含む。いくつかの実施形態では、決定することは、エンドソーム脱出に関与しない少なくとも１個のＣＤＲを決定することを含む。いくつかの実施形態では、決定することは、その標的に結合された抗体またはその抗原結合フラグメントの構造分析に基づく。いくつかの実施形態では、構造分析は、インシリコ分析である。いくつかの実施形態では、構造分析は、結晶学的分析である。いくつかの実施形態では、方法は、構造分析を受けることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、構造分析を実施することをさらに含む。いくつかの実施形態では、分析は、抗体またはその抗原結合フラグメントのそれぞれのアミノ酸の標的のアミノ酸までの距離を与える。いくつかの実施形態では、分析は、抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲのそれぞれのアミノ酸の標的のアミノ酸までの距離を与える。いくつかの実施形態では、決定することは、ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸の標的までの距離を決定することである。いくつかの実施形態では、抗原と接触している２個以下のアミノ酸を有するＣＤＲは、結合に必要とされないと決定される。いくつかの実施形態では、決定することは、ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸の標的までの距離を決定することである。いくつかの実施形態では、抗原と接触している１個以下のアミノ酸を有するＣＤＲは、結合に必要とされないと決定される。いくつかの実施形態では、結合に必要とされないＣＤＲは、不活性ＣＤＲである。いくつかの実施形態では、結合に必要とされないＣＤＲは、その中での変異が抗体機能に影響しないことが示されているＣＤＲである。いくつかの実施形態では、機能は、結合である。

【0161】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、免疫原性ペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０または１１個のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも７個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも８個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、８～１１個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、本明細書で提供される免疫原性ペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域由来である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲ由来である。ＣＤＲの位置を決定する方法は、当該技術分野において周知であり、ＣｌｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔシステムを使用し得る。抗体の可変ドメインの配列を考慮して、当業者は、容易にＣＤＲを特定できるであろう。

【0162】

いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＣＤＲは、除去される。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＣＤＲの一部は、除去される。いくつかの実施形態では、除去されるアミノ酸は、免疫原性ペプチドで置換される。いくつかの実施形態では、置換することは、最適化される。いくつかの実施形態では、方法は、置換を最適化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、最適化することは、構造的最適化である。いくつかの実施形態では、最適化することは、最適化アルゴリズムを実施することを含む。いくつかの実施形態では、最適化することは、選択された抗体またはその抗原結合フラグメントの構造中で可能な限り少ない乱れを生じることを含む。いくつかの実施形態では、最適化することは、インシリコ分析または免疫原性ペプチドの少なくとも１個の決定されたＣＤＲ中への挿入とそれに伴うＣＤＲの全ての可能な部分の除去および選択された挿入、ならびに最小の乱れを生じる部分の除去を含む。いくつかの実施形態では、最適化は、少なくとも１個の充填アミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、最適化は、決定されたＣＤＲ以外での少なくとも１つの代償の変異を生成することを含む。いくつかの実施形態では、最適化アルゴリズムは、最小摂動置換（ｍｉｎｉｍａｌ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（ＭＢＲ）アルゴリズムである。いくつかの実施形態では、最適化は、ＣＤＲ隣接配列の最適化を含む。いくつかの実施形態では、隣接配列の最適化は、抗体ステムの保存を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲに隣接するステムの構造は、維持される。いくつかの実施形態では、ステムは、ＣＤＲに隣接するβシートの末端である。いくつかの実施形態では、末端は、ＣＤＲに直接隣接する少なくとも１、２、３、４または５個のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0163】

いくつかの実施形態では、方法は、選択された抗体またはその抗原結合フラグメントにより結合された同じ標的への操作された抗体またはその抗原結合フラグメントの結合を確認することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、選択された抗体またはその抗原結合フラグメントにより結合された同じ標的への操作された抗体またはその抗原結合フラグメントの結合を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、選択された抗体またはその抗原結合フラグメントにより結合された同じ標的への操作された抗体またはその抗原結合フラグメントの結合を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、結合は、選択された抗体またはその抗原結合フラグメントの結合と同等である。いくつかの実施形態では、測定することは、結合が、選択された抗体またはその抗原結合フラグメントに比べて有意に低下されないことを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、有意には、統計的に有意にである。いくつかの実施形態では、大きく低下されたは、１０％を越える低下を含む。いくつかの実施形態では、有意に低下されたは、２０％を越える低下を含む。いくつかの実施形態では、有意に低下されたは、５０％を越える低下を含む。いくつかの実施形態では、有意に低下されたは、消失されることである。

【0164】

いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞の細胞質ゾル中のペプチドのレベルを測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞質ゾルへのペプチドの送達を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞質ゾルへのペプチドの送達を測定することをさらに含む。

【0165】

いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞の細胞質ゾルへのペプチドの送達を確認することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞の細胞質ゾル中のペプチドのレベルを測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞質ゾルへのペプチドの送達を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞質ゾルへのペプチドの送達を測定することをさらに含む。

【0166】

いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞の表面へのペプチドの送達を確認することをさらに含む。いくつかの実施形態では、送達は、ペプチドの表面提示である。いくつかの実施形態では、送達は、標的細胞の表面へのＨＬＡ分子との複合体でのペプチドの送達である。いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞の表面上のペプチドのレベルを測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、レベルは、ＨＬＡとの複合体でのペプチドのレベルである。いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞の表面へのペプチドの送達を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞の表面へのペプチドの送達を測定することをさらに含む。

【0167】

いくつかの実施形態では、方法は、エフェクター細胞による標的細胞の死滅を確認することをさらに含む。いくつかの実施形態では、死滅は、特異的死滅である。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、ペプチドに特異的である。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、エフェクター細胞による標的細胞の死滅を測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、エフェクター細胞による標的細胞の死滅を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、インビトロの方法である。いくつかの実施形態では、確認すること、測定することおよび決定することは、インビトロで実施される。いくつかの実施形態では、インビトロは、エクスビボである。確認すること、測定することおよび決定することを実施する方法の例は、本明細書で提供されるが、このような測定すること／確認すること／決定することのための当該技術分野において既知の任意のアッセイが、使用され得る。

【0168】

ペプチドおよび特に免疫原性ペプチドのデータベースは、当技術分野で周知であり、任意のこのようなデータベースを採用し得る。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、癌ペプチドである。いくつかの実施形態では、データベースは、表３を含む、または表３からなる。いくつかの実施形態では、アラインメントは、ペアワイズアラインメントである。いくつかの実施形態では、アラインメントは、アラインメントペアを生成するための、選択された抗体またはその抗原結合フラグメント由来の１つのペプチドと、データベースの１つのペプチドのアラインメントである。いくつかの実施形態では、所定の閾値を越えるアラインメントスコアを有するアラインメントペアは、ステップ（ｅ）での置換のために使用される。

【0169】

いくつかの実施形態では、方法は、二重機能抗原結合分子中に操作された抗体を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、二重機能抗原結合分子は、本発明の分子である。いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞上のタンパク質に結合する標的化抗体を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的細胞上は、標的細胞の表面上である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、受容体である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、癌抗原である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、癌細胞上でのみ発現され、対応する健康な細胞では発現されない。いくつかの実施形態では、タンパク質は、対応する健康な細胞に比較して、癌細胞上で過剰発現されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、対応する細胞は、癌細胞と同じ組織または細胞型の細胞である。いくつかの実施形態では、対応する細胞は、対照細胞である。いくつかの実施形態では、選択された標的化抗体は、操作される抗体と組み合わされる。いくつかの実施形態では、組み合わせることは、二重機能抗原結合分子を生成する。いくつかの実施形態では、二重機能抗原結合分子は、二重特異性抗体である。

【0170】

いくつかの実施形態では、操作される抗体は、１つの重鎖および１つの軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、標的化抗体または抗原結合フラグメントは、１つの重鎖および１つの軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、操作される抗体は、単鎖抗体である。いくつかの実施形態では、標的化抗体は、単鎖抗体である。いくつかの実施形態では、単鎖抗体は、アミノ酸リンカーにより単一ポリペプチドで連結された重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、標的化抗体の重鎖定常領域は、ヘテロ二量体化を促進しホモ二量体化を抑制するように操作される、いくつかの実施形態では、操作される抗体の重鎖定常領域は、ヘテロ二量体化を促進しおよび／またはホモ二量体化を抑制するように操作される、いくつかの実施形態では、操作されるは、改変されるである。いくつかの実施形態では、改変されるは変異されるある。いくつかの実施形態では、方法は、操作される抗体および／または標的化抗体の定常領域を操作することを含む。いくつかの実施形態では、操作することは、表５で提供される一連の変異を生成することである。いくつかの実施形態では、使われる重鎖定常領域は、配列番号１０７４および１０７５または８５％の配列同一性を含む類似体または相同体を含む、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、類似体または相同体は、ノブインホール変異を保持する。

【0171】

本明細書で使用される、値と組み合わせたときの「約」という用語は、参照値のプラスおよびマイナス１０％を指す。例えば、約１０００ナノメートル（ｎｍ）の長さは、１０００ｎｍ±１００ｎｍの長さを指す。

【0172】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別の意味が明示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、複数のこのようなポリヌクレオチドを含み、「ポリペプチド（ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１つまたは複数のポリペプチドおよび当業者に既知のその同等物への言及を含む、などである。特許請求の範囲は、いずれか任意の要素を除外するように記載されてもよいことに、さらに留意されたい。したがって、この記述は、請求要素の列挙、または「否定的な」制限の使用に関連して、「単独」、「唯一」などの排他的な用語を使用するための先行基準として機能することが意図される。

【0173】

「Ａ、Ｂ、およびＣ等の少なくとも１つ」に類似した慣例が使用される事例では、概して、このような構造は、当業者が慣例を理解するであろうという意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、ならびにＣの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に等を有する系を含むがこれらに限定されないであろう）。２つ以上の代替的な用語を提示する実質的に任意の離接的な単語および／または句は、明細書、特許請求の範囲、または図面のいずれにおいても、用語の１つ、用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を企図すると理解されるべきであることは当業者によりさらに理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」もしくは「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むと理解されるであろう。

【0174】

明確にするために別個の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが、理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態として説明される本発明の種々の特徴はまた、別々にまたは任意の好適な副組み合わせで提供されてよい。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、全ての組み合わせが個別に、かつ明示的に開示されたかのように、本明細書において開示される。さらに、様々な実施形態およびその要素のすべての部分的組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、すべてのそのような部分的組み合わせが本明細書で個別に、かつ明示的に開示されたかのように、本明細書において開示される。

【0175】

本発明の追加の目的、利点、および新規の特徴は、限定することを意図しない、以下の実施例を考察することにより、当業者に明らかになるであろう。さらに、上で説明されおよび以下の特許請求の範囲のセクションで請求される、本発明の様々な実施形態および態様の各々は、以下の実施例において実験的に裏付けられる。

【0176】

上で説明され、以下の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的に裏付けられる。

【0177】

実施例
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で使用される検査法は、分子の、生化学の、微生物学のおよび組み換えＤＮＡの技術を含む。これらの技術は文献で詳細に説明される。例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）”Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載される方法論；”Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；”Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ－Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ” ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ” ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、を参照されたい。これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる）。他の一般的な参考文献は、本明細書全体を通して記載される。

【0178】

材料および方法
細胞浸透アッセイ：全てのＡｂの透過能力を、細胞内の抗体検出とそれに続くフローサイトメトリー分析によりスクリーニングする。蛍光標識抗Ｆｃ－ＦＩＴＣを用いて、細胞内抗体を検出する。手短に説明すると、乳癌細胞を、２４ウェルプレートに播種し、０．５～１μＭの対照抗体またはトロイの木馬Ａｂと６時間インキュベートする。次に、細胞を、ＰＢＳおよび低ｐＨ緩衝剤（グリシン、ｐＨ＝２．５）で洗浄して、細胞表面に結合した抗体を取り出す。その後、細胞を、固定し、透過処理し、抗Ｆｃ－ＦＩＴＣ抗体により細胞内蛍光標識する（ＰＢＳ中の０．１％サポニン、１％ＢＳＡ、室温で２時間）。標識された細胞を、ＦＩＴＣについてフローサイトメトリーにより分析し、非標識細胞を、陰性対照として使用する。細胞内トロイの木馬Ａｂのプロテアソーム分解のレベルを決定するために、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を、トロイの木馬抗体の添加の前に細胞に加える。

【0179】

ルシフェラーゼ死滅アッセイ：ルシフェラーゼを発現する標的癌細胞（Ｔ）を、９６ウェルプレートに播種し、種々の濃度（０．５～４μＭ）でトロイの木馬Ａｂにより処置する。３～２４時間後に、トロイの木馬Ａｂ内の関連ペプチドに特異的な、抗原特異的エフェクター細胞（Ｅ）を、種々のＥ：Ｔ比率で加える。細胞をその後、１８～２４時間にわたり共培養し、続いて、ルシフェラーゼ基質（Ｂｉｏ－Ｇｌｏ；Ｐｒｏｍｅｇａ）を加える。生存細胞の数を定量するために、発光強度（ｌｕｍ）を記録する。死滅を、％死滅＝１－ｌｕｍ（治療した標的＋エフェクター）／Ｌｕｍ（非治療対照）を計算することにより評価し、これは、他の対照に対しても計算できる。

【0180】

画像ベース死滅アッセイ（ＩｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステム）：標的細胞（Ｔ）を最初に、細胞質ゾル赤色色素（ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｌｉｇｈｔ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｄ）で標識し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ撮像装置で標的細胞増殖の追跡を可能にする。標識された標的細胞をその後、９６ウェルプレートに播種し、種々の濃度（０．５～４μＭ）でトロイの木馬Ａｂにより処置する。３～２４時間後に、トロイの木馬Ａｂ内の関連ペプチドに特異的な、抗原特異的エフェクター細胞（Ｅ）を、種々のＥ：Ｔ比率で加える。次に、プレートを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（３７℃；５％ＣＯ２）中に置き、２時間間隔で４８時間にわたり撮像する。あるいは、カスパーゼ３／７緑色色素を培地に加えて、標的細胞のアポトーシス評価を可能にする。データを、次記の２つの主要パラメーターを比較するＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェア分析ツールにより分析する：増殖： 時間０ｈに正規化した赤色染料の集密度； およびアポトーシス：（赤色＋緑色領域）／時間０ｈに正規化した赤色領域。

【0181】

ＥＧＦＲ結合アッセイ：癌細胞表面上のＥＧＦＲを結合する完全なトロイの木馬抗体（ＦＴＡｂ）の能力を評価するために、フローサイトメトリー結合アッセイを、確立した。予め播種した細胞を、トリプシン処理し、洗浄し、その後、０．３または３ｎＭのＦＴＡｂまたは陽性対照として機能するＥＧＦＲ二価の治療抗体と氷上で１時間インキュベートした。その後、細胞を、ＰＢＳ緩衝液中の２％ＦＢＳで３回洗浄し、氷上で３０分間蛍光二次抗体（抗ヒトＦｃ－ＦＩＴＣ）で標識する。細胞をその後、同じ緩衝液で３回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析する。ＦＴＡｂ結合は、ＦＩＴＣ蛍光レベルに比例する。

【0182】

癌細胞表面上のＨＬＡ－ペプチド複合体の提示：ＦＴＡｂとのインキュベーション時の、癌細胞上のＨＬＡ－ペプチド複合体の提示のレベルを定量するために、ＨＬＡ－ペプチド複合体を特異的に結合するＴＣＲ様抗体を、用いた。手短に説明すると、細胞を、２４ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１μＭのＦＴＡｂまたはｃＦＴＡｂ（対照ＦＴＡｂ）と異なる持続時間（４時間、８時間および１０時間）の間インキュベートする。次に、細胞を、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）にコンジュゲートされたＣ１－１７抗体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．“Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ａ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｐｐ６５－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１” Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０２１，２２，２３４９を参照、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）と氷上で３０分間インキュベートし、フローサイトメトリーにより分析する。

【0183】

実施例１： トロイの木馬抗体のデザイン
癌細胞により提示される免疫原性ペプチドは、免疫細胞活性化および癌細胞死滅をもたらし得ることが知られている。対象内のリンパ球は、免疫原性ペプチドを認識し、対象の免疫系は、癌細胞に対抗させられる。この機序は、癌細胞中に免疫原性ペプチドを積極的に送達すること、これらの癌細胞が次に（ｉｎ ｔｕｒｎ）、それらの細胞表面上に免疫原性ペプチドを提示することにより、利用できる。次の２つのクラスの免疫原性ペプチドを用いることができる：１）ウイルスまたは細菌ペプチドなどの非自己ペプチド／ヒトで見出されないペプチド、および２）免疫系が健康な細胞に対し活性化されないよう癌特異性を与えるために、変異された、あるいは改変されたヒトペプチドである、改変された自己ペプチド。

【0184】

免疫原性ペプチドは、抗体を介して送達できると、以前に仮定されている。Ｓｅｆｒｉｎらは、ジスルフィド結合を介してペプチドにコンジュゲートた完全サイズの抗体を利用した（Ｓｅｆｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９ “Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｆｏｒ ａｔｔａｃｋ ｂｙ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ”，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ａｕｇ ２１；１０：１９６２）。しかし、この構築物は、非常に低い安定性を有し、血清中で高率の脱コンジュゲーションを生じる可能性がある。これは次に、標的細胞への不十分な送達、低下した効力および高いオフターゲット効果（副作用）につながる可能性がある。Ｇａｓｔｏｎらは、ペプチドが重鎖または軽鎖のアミノ酸鎖の末端に組み込まれた、または鎖内のヒンジドメインに隣接して配置された、融合タンパク質構築物を採用した（Ｇａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９，“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｕｓｉｏｎｓ”，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，Ｄｅｃ １０；９（１）：１８６８８）。この方法は、製造収率の低下、凝集の増大およびインビトロ安定性の低下をもたらした。

【0185】

これらの方法に固有の問題を軽減するために、鎖の末端でまたは構造間に免疫原性ペプチドを挿入するのではなく、免疫原性ペプチドを、抗体可変領域中に挿入する。特に、免疫原性ペプチドを、抗体の重鎖または軽鎖内の全てのまたは一部の「不活性」の、必須でないＣＤＲを置換するために用いる（図１）。インシリコモデル化を用いて、既知の治療抗体中の不活性ＣＤＲループを特定する。不活性ＣＤＲを次に、免疫原性ペプチドにより置換する（図２）。この立体配座では、操作された抗体は、高い安定性および抗原結合親和性を維持する。免疫原性ペプチドがＣＤＲより短い場合は、充填アミノ酸を、抗体立体配座を変えないように付加できる。同様に、ＣＤＲが免疫原性ペプチドより長い場合には、ＣＤＲの一部のみが、除去される。不活性ＣＤＲの隣接領域もまた、置換できるが、これらの領域はしばしば全体の抗体立体配座に重要であるので、それらの全体構造を保存しなければならない。これらの操作された抗体は、トロイの木馬抗体と呼ばれる。

【0186】

実施例２：トロイの木馬抗体の使用
本発明のトロイの木馬抗体の１つの用途は、樹状細胞ワクチン接種である。樹状細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４０）に対する抗体が、操作のために使用される。この場合、抗ヒトＣＤ４０抗体Ｆａｂ５１６を採用し、標的癌により発現される改変された自己抗原を、不活性ＣＤＲ中に挿入する。ＣＤ４０への抗体結合後に、抗体は消化され、免疫原性ペプチドを含む短鎖ペプチドが、ＭＨＣＩ分子により細胞表面に提示される。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、これらの樹状細胞により活性化され、腫瘍特異的になり、強化された腫瘍細胞死滅をもたらす（図３）。

【0187】

本発明のトロイの木馬抗体はまた、白血病などのＢ細胞悪性腫瘍を治療するために使用される。この場合、Ｂ細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２０）に対する抗体が、使用される。例えば、アーゼラ抗体は、ウイルスエピトープ（例えば、ＣＤ４ウイルスエピトープ／ＣＤ４ Ｔ細胞により認識されるエピトープ）で置換された不活性ＣＤＲを有する。エンドサイトーシス後に、抗体はプロセスされ、ＭＨＣＩＩ分子によりＢ細胞の表面上に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルスエピトープを認識し、悪性細胞を死滅させる（図４）。

【0188】

本発明のトロイの木馬抗体はまた、固形腫瘍または一般癌を治療するために使用される。ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭおよびＰＳＭＡなどの癌特異的エピトープに結合する抗体が、使用され、特に二重特異的抗体が、用いられる。二重特異的分子の場合、１つのみの抗原結合ドメインが、癌細胞に薬剤を運ぶのために必要とされ；他のものは、ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される１種または複数のペプチドおよび／または細胞透過成分で置換できる。細胞透過成分はまた、２つの不活性ＣＤＲが存在する場合、非二重特異性抗体中に挿入できることは無論理解されよう（１つは透過成分のため、もう１つは、免疫原性ペプチドのため）。あるいは、免疫原性ペプチドの挿入が内部移行を妨げない限り、内部移行することが既知の抗体を使用できる。標的タンパク質に結合後、抗体は、消化され、細胞質ゾルに放出される（エンドソーム脱出）。そこから、それは、ＭＨＣＩＩ分子を介して、癌細胞の表面上に提示される（図５）。

【0189】

実施例３：不活性ＣＤＲ特定を含むトロイの木馬抗体経路（図６、右側経路）
トロイの木馬抗体は、最初に目的の抗体を選択することにより設計される。その標的への抗体の結合の構造分析が行われ、不活性ＣＤＲが、特定される。不活性ＣＤＲは、タンパク質標的に直接接触しないＣＤＲである（タンパク質標的から５Åを超える距離）。ＣＤＲを置換できる好適な免疫原性ペプチドが、特定され、操作される抗体中に挿入される。免疫原性ペプチドは、予め選択されてよく、または免疫原性ペプチドは、除去されるＣＤＲに対するその類似性に基づき選択されてよい。計算機モデル化を用いて、好適なペプチドを選択し、正確な抗体立体配座を確認する。この計算機モデル化は、最小摂動置換（ＭＢＲ）と呼ばれ、それは、ＣＤＲ内の置換位置を最適化するために適用できる。例えば、ＣＤＲが免疫原性ペプチドより長い場合、充填アミノ酸が、抗原結合の最小摂動（ｍｉｎｉｍａｌ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）のために付加される必要があり得る。同様に、ＣＤＲが免疫原性ペプチドより短い場合、ＣＤＲ間領域からのアミノ酸がまた、除去され得る。隣接するアミノ酸もまたしばしば、結合および抗体立体配座に関与し、隣接領域における抗体立体配座および構造的類似性／最小摂動もまた望ましい。ＭＢＲは、免疫原性ペプチドの位置決めを最適化する。

【0190】

抗体が明らかな不活性ＣＤＲなしに選択される場合、ＭＢＲは、抗体内、特にＣＤＲ内の可能な置換位置をランク付けするために適用される。結合を乱さない（または所定の閾値より小さく乱す）位置が見出されるならば、免疫原性ペプチドは、この位置に挿入される。

【0191】

ＭＢＲ分析は、抗体の標準構造を考慮し、この構造を最も厳密に維持する位置／置換位置を選択する。抗体ステム保存は、高度に保存される。ステムは、ＣＤＲループに直接隣接するβシート部分を指す。この領域はまた、ＣＤＲ隣接領域とも呼ばれる。これらの１～５個のアミノ酸は、ループ位置に重要であり、高度に強固である傾向があるが、一方でループそれ自体、特に不活性ＣＤＲループは、それほど規則的でない。ステム保存は従って、ＭＢＲ分析の間は重要である。ＭＢＲはまた、他の既知の抗体の位置頻度マトリックスを考慮する。計算機モデルは、帰属された数百の既知の抗体を有し、各位置での各アミノ酸の頻度を考慮する。既知の抗体の位置頻度に最も密接に一致するペプチド置換が、好ましい。最終的に、ＭＢＲは、ペプチド置換のための抗体内の最適位置を出力する、または２つ以上の許容可能な位置が存在する場合、それは、階層位置を出力する。

【0192】

実施例４：配列類似性によるトロイの木馬抗体経路（図６、左側経路）
トロイの木馬抗体はあるいは、配列類似性に基づき生成できる。標的抗体は、免疫原性ペプチドのリストにあるように（例えば、表１～３を参照）選択される。ペアワイズ配列アラインメントは、種々のウイルスペプチドと抗体の間で実施される。８～１１個のアミノ酸の抗体内で重なり合うペプチドは、免疫原性ペプチドと比較され、アラインメントスコアは、各対（抗体由来の１個のペプチドと１個の免疫原性ペプチド）に対し与えられる。スコアは、ｂｌｏｓｕｍ６２、およびギャップオープニング当り、およびギャップエクステンション当り－３のペナルティに基づき計算された。閾値が、許容可能なアラインメントについて設定された（例えば、＞２５を下記の実施例で使用した）。アラインメントスコアの閾値に適合する免疫原性ペプチドと置換されるべき抗体中のペプチドが、選択され、ＭＢＲが、適用されて置換位置を最適化する。

【0193】

実施例５：トロイの木馬抗体の機能的確認（不活性ＣＤＲ）
配列類似性に基づく置換は、ＣＤＲに限定されず、抗体中のどこでも実施できる。配列における類似性のため、最小の乱れが予測される。それにもかかわらず、この方法および不活性ＣＤＲ置換法は依然として、抗体がその機能性を維持していることの確認を必要とする。特に、抗体が依然としてその標的に結合し、かつ依然として細胞中に内部移行することが決定される必要がある。結合／内部移行が消失される場合、新規の抗体は使い物にならない。

【0194】

免疫原性ペプチドの挿入のために選択された第１の抗体は、ＴＭａｂ４としても知られる、ＤＮＡ加水分解抗体３Ｄ８であった。マウス抗体３Ｄ８は最初に、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅａｖｙ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉ－ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ Ｂｏｔｈ Ｄｏｕｂｌｅ－ ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２００６，Ｊｕｎ ２；２８１（２２）：１５２８７－９で開示され、そのヒト化型は、国際公開第ＷＯ２０１９／２４４０８６号で提供された。ＴＭａｂ４は、癌細胞に結合し、かつそれに侵入し、エンドソーム脱出を介して細胞質に到達することが示され、従って、それは、トロイの木馬抗体への変換のために選択された。重鎖のＣＤＲ１、２、３（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）と軽鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）が不活性ＣＤＲであることが見出された。

【0195】

最初に、ＴＭａｂ４のＣＤＲＨ１を置換する能力を、試験した。ＣＭＶ由来の２個のペプチド、ＥＢＶ由来の２個のペプチドおよびインフルエンザ由来の１個のペプチドを、ＣＤＲＨ１中の種々の位置に挿入した（表６参照）。陰性対照（アダリムマブ）よりも優れた透過は、ＣＤＲＨ１内の位置に関係なく全ての挿入ペプチドで維持された。しかし、いくつかの挿入は、優れた透過を示し、一方で他のものは、親ＴＭａｂ４に比較して、透過が低下した。いくつかの構築物は、ＣＤＲに隣接したアミノ酸の置換を含んだ。これは、これらの追加の置換が全体の抗体立体配座の乱れを低減すると予測されたため実施した。具体的には、構築物Ｔ１では、ＣＤＲに対し直接Ｎ末端の「Ｓ」もまた、置換した。構築物Ｔ＿３２、Ｔ＿３３およびＴ＿３４では、ＣＤＲに対し直接Ｎ末端の「ＣＡＡＳ」もまた、置換した。構築物Ｔ＿４２、Ｔ＿４３では、ＣＤＲに対し直接Ｎ末端の「ＡＡＳ」もまた、置換した。１つの構築物、Ｔ１＿３４は、抗体の乱れを減らすと予測された重鎖の代償変異（Ｔ３０Ｓ）を含んだ。従って、不活性ＣＤＲの全体の変化は、予測されたように透過を消失させなかったが、細胞に侵入する全体の能力に影響を有した。

【表6】

【0196】

生成した抗体のいくつかを、トロイの木馬抗体中に存在する免疫原性ペプチドに特異的なエフェクター細胞の存在下で標的細胞を死滅させるそれらの能力について試験した。図７Ａでわかるように、全ての抗体は依然として、細胞に侵入できたが、特異的な死滅を誘導する能力は、非常に多様であった。ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）ペプチドの５種の挿入のうち、２種は、特異的死滅を生じず、一方で他の３種は、死滅を生じた。ペプチドＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号２）に関しては、優れた透過を生じた２種の挿入はまた、優れた死滅も生じた。

【0197】

次に、ＣＤＲＨ３中への配列番号１および配列番号３の挿入を、試験した（表７）。配列番号３は、それが置換するＣＤＲに対しある程度の構造的類似性を示し、特に、ＣＤＲの先頭に近い「Ｇ」は、維持され、そのため、それを、配列番号１と共に試験した。ＣＤＲＨ３は、抗体結合および細胞透過に全く重要でないことが以前に報告された（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ Ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉ－ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１３ Ｄｅｃ １３；２８８（５０）：３５８７７－８５を参照されたい、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。しかし、配列番号１の挿入は、透過を大きく損ない、それにより、それは、陰性対照抗体よりわずかに優れているに過ぎなかった。対照的に、配列番号３の挿入は、２つの挿入位置で、親抗体より優れているとは言わないまでも同じくらい良好な透過を常にもたらした。これは全て、挿入位置に適合する免疫原性ペプチドの選択が極めて重要であることを示唆する。

【表7】

【0198】

興味深いことに、ＣＤＲＨ３中に挿入された配列番号１を含むトロイの木馬抗体を用いて特異的死滅を試験した場合、意外な結果が観察された。最低の測定された透過を有する２つのＴａｂは、特異的な死滅を示した（図７Ｂ）。細胞内での低い検出は、効果的死滅をもたらす急速な抗体プロセッシングおよび細胞表面上の提示が原因であった可能性がある。

【0199】

ＣＤＲＬ３中への配列番号１および配列番号５の挿入、およびＣＤＲＨ２中への配列番号１の挿入もまた、試験した（表８）。配列番号５は、ＣＤＲＬ３と極めて高い配列アラインメントを有し、そのため、試験のために選択された。構築物のいくつかは、ＣＤＲに隣接したアミノ酸の置換を含んだ。これは、これらの追加の置換が全体の抗体立体配座の乱れを減らすと予測されたため実施された。具体的には、構築物Ｔ１＿４４およびＴ１＿４５では、ＣＤＲに対し直接Ｃ末端の「Ｆ」もまた、置換した。構築物Ｔ１８では、ＣＤＲに対し直接Ｃ末端の「Ｙ」もまた、置換した。全ての試験された挿入は、親抗体と実質的に同等の良好な透過を生じた。ＣＤＲＬ３は細胞透過に重要であると報告されているので、この結果は極めて重要であり、この機能は、試験された免疫原性ペプチドによるこのＣＤＲの置換により乱されなかった。

【表8】

【0200】

特異的死滅を、配列番号１を含むトロイの木馬抗体について試験し、この場合、全ての抗体は、死滅を誘導することが明らかになった（図７Ｃ）。これは、この挿入が、高い測定された透過および高レベルの特異的死滅を生じることを示す。不活性ＣＤＲ置換の組み合わせを含むトロイの木馬抗体もまた、生成する。４個のＣＤＲが不活性であるので、２、３および４個の免疫原性ペプチドの組み合わせが、生成される。挿入されるペプチドは、同じペプチドの反復であっても、または異なるペプチドであってもよい。

【0201】

細胞中に透過できる第２のＤＮＡ結合抗体もまた、試験した。抗体３Ｅ１０（Ｗｅｉｓｂａｒｔ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｉ ｂｙ ａ ｌｕｐｕｓ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ”，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｊｕｌ ９；５：１２０２２を参照されたい、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を、不活性ＣＤＲについて調査し、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２の両方が結合中に抗原に関与しなかったと決定された。配列番号１を、ＣＤＲＬ１またはＣＤＲＬ２のいずれかに挿入し、配列番号３をまた、ＣＤＲＬ１中に挿入した（表９）。構築物の１つは、ＣＤＲに隣接したアミノ酸に隣接する置換を含んだ。これは、追加の置換が全体抗体立体配座の乱れを減らすと予測されたため、実施された。具体的には、構築物Ｔ２＿１３では、ＣＤＲに対し直接Ｎ末端の「ＬＬＩＫ」およびＣＤＲに対し直接Ｃ末端の「ＹＬ」を同様に、置換した。全ての配列番号１の挿入は、陰性対照を越える透過をもたらしたが、この場合も、透過のレベルは様々であった。

【表9】

【0202】

ペプチド特異的エフェクター細胞による死滅を、３Ｅ１０由来であり配列番号１を含むトロイの木馬抗体で処置した癌細胞について、同様に試験した。両方の試験されたＴＡｂは、強力な特異的死滅を生じた（図８）。これらの結果は、トロイの木馬システムの普遍性を示す。免疫原性ペプチドは、細胞中に透過できかつペプチド特異的死滅をもたらす、種々の抗体中に挿入できる。

【0203】

生成した全てのＴＡｂは、癌細胞と共に培養され、透過が、測定される。透過は、不活性ＣＤＲの置換時に抗体立体配座を維持すると決定された全てのペプチドについて観察される。全てのＴＡｂは、ペプチド特異的エフェクター細胞の存在下で、特異的癌細胞死滅を誘導するそれらの能力について試験される。全ての癌細胞が細胞表面までＨＬＡ複合体を運ぶことができ、それによりＴＡｂの免疫原性ペプチドを提示できるので、試験される癌の特定のタイプは重要ではないことが、当業者には理解されよう。ＴＡｂは、免疫原性ペプチドを有しない親抗体のものを超える高められた特異的細胞死滅を生じることができる。不活性ＣＤＲ置換の組み合わせを含むトロイの木馬抗体もまた、生成する。２個のＣＤＲが不活性であるので、２個の免疫原性ペプチドの組み合わせが、生成される。挿入されるペプチドは、同じペプチドの反復であっても、または異なるペプチドであってもよい。

【0204】

実施例６：トロイの木馬抗体の機能確認（配列類似性）
配列類似性に基づく置換もまた、ＴＭａｂ４抗体に対し実施した。
免疫原性ペプチド（表３参照）のスクリーニングは、試験したペプチドの０．００５７％のみが、可能な置換についてアラインメントスコア閾値（＞２５）を越えることを見出した。ＴＭａｂ４抗体に対し最も高い類似性を有する３種を、置換のために選択した。ＥＢＶ由来の配列番号６は、抗体の重鎖内のアミノ酸２８～３５に対応した。これは、そのＣ末端でＣＤＲＨ１に隣接する２個のアミノ酸（「ＭＨ」）を含む。重鎖中の代償変異（Ｙ２７Ｄ）もまた、抗体の乱れを減らすために作製した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２由来の配列番号７は、抗体の重鎖内のアミノ酸５２～６０に対応する。これは、そのＣ末端でＣＤＲＨ２に隣接する２個のアミノ酸（「ＹＹ」）を含む。ＥＢＶ由来の配列番号８は、抗体の軽鎖の第１のフレームワーク領域中のアミノ酸１４～２２に対応する。これらの３種のＴＡｂを、生成し、透過を、前述のように試験した（表１０）。全ての３種は、陰性対照のものを越えた透過を示したが、配列番号７および配列番号８は、親抗体と同等かまたはそれより良好な透過を生じ、一方で配列番号６は、より悪い透過を生じた。

【表10】

【0205】

配列類似性法をまた、３Ｅ１０抗体を改変するために使用した。免疫原性ペプチド（表３参照）のスクリーニングは、試験したペプチドの０．００９３％のみが、可能な置換についてアラインメントスコア閾値（＞２５）を越えることを見出した。ＥＢＶ由来の配列番号６は、抗体のＣＤＲＬ１内のアミノ酸２８～３６に対応する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２由来の配列番号９は、抗体の重鎖内のアミノ酸５０～５８に対応する。これは、そのＮ末端でＣＤＲＬ２に隣接する４個のアミノ酸（「ＬＬＩＫ」）およびそのＣ末端でＣＤＲＬ２に隣接する２個のアミノ酸（「ＹＬ」）を含む。両方のＴＡｂを、生成し、それらは、親抗体と同等であった細胞中への浸透を有すると見出された（表１１）。

【表11】

【0206】

最後に、第３の抗体であるＤＮＡ結合抗体、７１Ｆ１２（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｏｎａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ”，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７；７：１６４２８を参照されたい、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を、不活性ＣＤＲについて分析し、ＣＤＲＬ１が不活性であると決定した。置換を、配列類似性に基づき実施し、アデノウイルス由来の配列番号１０は、抗体（Ｔ４＿１と呼ばれる）のＣＤＲＬ１内のアミノ酸２６～３４に対応した。ＨＰＶ由来の配列番号１１は、抗体（Ｔ４＿３と呼ばれる）の重鎖の第１のフレームワーク領域中のアミノ酸１７～２４に対応する。両方のＴＡｂを、生成し、それらは、親抗体と少なくとも同等であった細胞中への浸透を有すると見出された。

【0207】

全ての生成したＴＡｂをまた、前述のように特異的細胞死滅について試験した。うまく細胞に侵入したＴＡｂは、死滅を含まない親抗体より優れた細胞死滅を誘導できる。

【0208】

実施例７：トロイの木馬抗体による死滅のさらなる確認
トロイの木馬抗体による死滅を、第２の方法により確認した。ＩｎｃｕＣｙｔｅイメージングシステムを用いて、癌細胞を追跡し、カスパーゼ３／７色素の存在下でアポトーシスを定量した（材料と方法を参照）。ＴＭａｂ４および３Ｅ１０抗体由来のＴＡｂ（Ｔ１８およびＴ２＿１１）を、両方が良好な死滅化を示したので、さらなる調査のために選択した。図９Ａ～９Ｂから分かるように、両方のＴＡｂは、エフェクター細胞単独により、または親抗体で処置した細胞と共培養したエフェクター細胞により生じたものを充分に越える特異的細胞死滅を生じた。これは、免疫原性ペプチドが標的細胞中に移入されるのみならず、プロセスされかつ細胞表面上に提示され、これがエフェクター細胞による特異的死滅を可能にする、ということを示す。

【0209】

他のＴＡｂもまた、ＩｎｃｕＣｙｔｅイメージングアッセイを用いて試験される。エフェクター細胞単独および／または親抗体により誘導されたものを超える特異的死滅が、本発明のＴＡｂを用いて観察される。

【0210】

作製した種々のＴＡｂの配列、および親抗体を表１２にまとめる。重鎖が免疫原性ペプチドを含む場合、親の軽鎖を使用してＴＡｂを作製し、軽鎖が免疫原性ペプチドを含む場合、親の重鎖を使用してＴＡｂを作製することは理解されよう。特に、３Ｅ１０抗体は、異なる軽鎖を含む２種の変種（Ｐ２およびＰ３と呼ばれる）を有する。いずれかが、ＴＡｂを生成するために使用できる。

【表12】

【0211】

種々の既知の治療抗体を、不活性ＣＤＲについて調査した。その抗原と接触している各ＣＤＲの結晶構造分析を実施し、抗原と接触しているアミノ酸の数を数えた。ＣＤＲのアミノ酸と抗原のアミノ酸の間の５Å未満の距離を、接触と見なした。抗原と接触している３個以上のアミノ酸は、結合に関与するＣＤＲを示す。２個未満は、確実な不活性ＣＤＲを示す。正確に２個は、結合に関与している可能性が少ない、または関与が低いＣＤＲを示す。評価のために、全てのこのようなＣＤＲを、不活性と見なす。多数の他の抗体が、表１～３で提供されるものなどの免疫原性ペプチドで置換され得る不活性ＣＤＲを含むと見出された。ＭＢＲを、位置決めを最適化するために使用する。あるいは、ＴＡｂを、既知の抗体、特に不活性ＣＤＲを有するものに対し配列相同性を有する、表３からのペプチドを特定することにより設計する。高い相同性を有するペプチドを、ＴＡｂを生成するために、抗体中に入れ替える。全ての生成されたＴａｂを、細胞透過について検査し、透過性を維持する。ＴＡｂをまた、前述のように特異的細胞死滅について試験し、親抗体により得られたものを越える死滅のレベルを観察する。

【0212】

実施例８：標的化抗体と組み合わせたトロイの木馬抗体（二重特異性トロイの木馬抗体、ｂｉ－ＴＡｂ）。
前述のＴＡｂは、それらが標的細胞に侵入し免疫原性ペプチドに対し刺激されたエフェクター細胞により特異的死滅を誘導すると示された、死滅化モジュールと考えられてよい。しかし、これらの分子の特異度を高め、癌細胞にそれらを標的化し、オフターゲット効果を減らすために、標的化モジュールを、加えた。３種のＥＧＦＲ抗体：セツキシマブ、パニツムマブおよびネシツムマブ、を選択して、標的化モジュールとして使用した。全ての３種は、ＥＧＦＲに特異的に結合すること、およびＥＧＦＲを過剰発現する癌を標的にすることが既知である。他の癌特異的／過剰発現分子を標的にする抗体もまた、可能である。これは単なる標的化モジュールであり、かつ死滅化モジュールと異なるので、任意の既知の癌標的化抗体を使用できる。ＥＧＦＲを、単に概念実証として使用した。

【0213】

Ｔ１８およびＴ２＿１１ ＴＡｂを、原理証明としてｂｉ－ＴＡｂの生成のために使用した。対照の二官能性抗体もまた、ＴＭａｂ４または３Ｅ１０親抗体を用いて生成した。二重特異性分子を、重鎖のホモ二量体化を制限するために、既知のノブインホール手法を用いて生成した。ユニークな改変を、死滅化モジュールおよび標的化モジュールの両方の重鎖の定常領域中に作製した（表１３参照；Ｓｈａｔｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｆｕｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ”，２０１３，ｍＡｂｓ ５：６，８７２－８８１、で提供された方法を参照、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これは、異なる重鎖間のヘテロダイマー化を促進し、ホモ二量体化を防止する。作製されたｂｉ－ＴＡｂは、目的の二重機能分子の少なくとも９０％の純度を有すると見出された。最終ｂｉ－ＴＡｂおよびそれらの対照の概略図を、図１０に示し、全配列を、表１３で提供する。

【表13】

【0214】

ｂｉ－ＴＡｂを、高レベルのＥＧＦＲを発現する乳癌細胞上の表面ＥＧＦＲに結合するそれらの能力について試験した。追加の死滅化モジュールは標的化モジュールの表面結合に影響を与えないはずであると予測され、実際にそれは、観察されたことであった（図１１）。ｂｉ－ＴＡｂは０．３ｎＭまたは３ｎＭのいずれの濃度でも、対照の元の抗ＥＧＦＲ抗体と同等レベルで、表面ＥＧＦＲにうまく結合した。従って、ｂｉ－ＴＡｂは、選択された標的化モジュールに基づき癌細胞を効果的に標的化できる。

【0215】

次に、ＨＬＡ分子との複合体で癌細胞の表面上に免疫原性ペプチドを運ぶｂｉ－ＴＡｂの能力を、試験した。ＨＬＡペプチド提示を、本明細書で前述のように、測定した（材料と方法）。経時変化実験を実施して、経時的に表面提示を監視した。全ての５種のｂｉ－ＴＡｂは、１０時間のインキュベーションにより細胞表面にペプチドをうまく運んだ（図１２）。全てのｂｉ－ＴＡｂは、それらの対照の対応物より優れていた。

【0216】

最後に、癌細胞死滅を、種々のエフェクター細胞濃度で調査した。それぞれ異なる標的化モジュールを有するｂｉ－ＴＡｂ３～５を、１：１、３：１、および６：１のエフェクター：標的細胞（Ｅ：Ｔ）濃度で試験した。６：１の比率で全ての３種の抗体は、対照抗体で観察されるものを超える特異的死滅を誘導した（図１３）。ｂｉ－ＴＡｂ４および５（１つは、ＴＡｂ由来のＰ１を含み、１つはＴＡｂ由来のＰ２を含む）もまた、３：１およびさらに１：１の比率で増大した死滅を示した。エフェクター細胞を含まない培養物を、コントロールとして用いた。これらの結果は、ｂｉ－ＴＡｂは癌細胞標的化と高レベルの特異的死滅を組み合わせるので、ｂｉ－ＴＡｂの高レベルの有効性を示す。

【0217】

使用した３種の抗ＥＧＦＲ抗体はそれら自体、不活性ＣＤＲを含む。これらの不活性ＣＤＲの要約を、表１４で提供する。セツキシマブのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２ならびにパニツムマブＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２、ならびにネシツムマブのＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２は全て、不活性であると見出された。これらのＣＤＲはまた、免疫原性ペプチドで置換される。置換された抗体の標的化が、確認され、ＥＧＦＲへ結合するおよび癌細胞を過剰発現するＥＧＦＲへ標的化する能力は、維持される。改変された標的化モジュールの死滅化モジュールとの組み合わせは、送達される免疫原性ペプチドの数を増大させる。死滅化モジュールで使用されるペプチドおよび標的化モジュールで使用されるペプチドは、同じであっても、または異なっていてもよい。

【表14】

【0218】

ｂｉ－ＴＡｂは、他の死滅化モジュールおよび種々の標的化モジュールを用いて生成される。ｂｉ－ＴＡｂは、癌細胞標的化、ＨＬＡペプチド表面提示および特異的死滅に関して上述のように評価される。ｂｉ－Ｔａｂは、対照二官能性分子より優れ、癌に標的化でき、ペプチド提示を誘導でき、および最終的に免疫原性ペプチドに特異的なエフェクター細胞により標的細胞の死滅を強化できる。

【0219】

インビボ検証もまた、実施される。操作されたｂｉ－ＴＡｂは、標的化モジュールにより標的化できる腫瘍を発現する免疫コンピテントマウス中に注入される。免疫原性ペプチドを欠くおよび／または非癌関連標的に結合する対照二官能性分子もまた、投与される。経時的な動物生存が、腫瘍サイズと同様に監視される。トロイの木馬抗体は、統計的に有意に腫瘍を収縮させおよび／または生存時間を延長すると見出され、それらが癌に対する免疫系を活性化させることを示す。マウスは、事前に免疫原性ペプチドでワクチン接種され得る。

【0220】

本発明はその特定の実施形態と共に説明されてきたが、多くの代替物、修正物および変形物があることは当業者には明らかであろう。従って、本発明は、添付の請求項の範囲の趣旨と広い範囲に入るこのような代替物、修正物および変形物のすべてを包含すると意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】