特表 2024-538449 ナチュラルキラー細胞調製物を増殖させるためのフィーダーフリー細胞培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-21

(54)【発明の名称】ナチュラルキラー細胞調製物を増殖させるためのフィーダーフリー細胞培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20241011BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241011BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20241011BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241011BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20241011BHJP

   C12N 5/074 20100101ALN20241011BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALN20241011BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20241011BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

C12N5/10

A61K35/17

A61P35/00

A61P31/12

C12N5/074

C12N5/0789

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024529582

(86)(22)【出願日】2022-11-18

(85)【翻訳文提出日】2024-06-20

(86)【国際出願番号】 IB2022061155

(87)【国際公開番号】W WO2023089561

(87)【国際公開日】2023-05-25

(31)【優先権主張番号】63/281,002

(32)【優先日】2021-11-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100217663

【弁理士】

【氏名又は名称】末広 尚也

(72)【発明者】

【氏名】スノーデン，アンドリュー ダブリュ．

(72)【発明者】

【氏名】ザマニ，アリ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA25

4B065BB19

4B065BC01

4B065BD39

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB33

(57)【要約】

本開示は、増殖ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞調製物を産生するフィーダー細胞フリー方法を対象とする。本方法は、ＮＫ細胞の出発調製物を提供することと、ナチュラルキラー細胞ｐ３０関連タンパク質（ＮＫｐ３０）調節剤単独、又は本明細書に記載の他の増殖剤で出発調製物を処理することとを含む。本方法は、処理された調製物を、ＮＫ細胞の出発調製物を増殖させるのに有効な条件下で培養して、増殖ＮＫ細胞調製物を産生することを更に伴う。本開示の他の態様は、本明細書に記載の方法に従って産生されたＮＫ細胞の治療調製物に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の治療調製物を産生する方法であって、前記方法が、
ＮＫ細胞の出発調製物を提供することと、
前記出発調製物をナチュラルキラー細胞ｐ３０関連タンパク質（ＮＫｐ３０）調節剤で処理することと、
処理された前記調製物を、前記ＮＫ細胞の出発調製物を増殖させるのに有効な条件下で培養し、それによって、増殖ＮＫ細胞調製物を産生することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記培養が、細胞のフィーダー細胞集団の存在下で前記ＮＫ細胞の出発調製物を培養することを伴わない、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＮＫｐ３０調節剤が、ＮＫｐ３０抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記処理が、
前記調製物に、前記ＮＫｐ３０調節剤と併せて、２Ｂ４リガンド、ＤＮＡＭ－１リガンド、又はそれらの組み合わせを投与することを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＮＫｐ３０調節剤、前記２Ｂ４リガンド、及び／又は前記ＤＮＡＭ－１リガンドが、固体支持体に結合されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記固体支持体が、複数のビーズである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記２Ｂ４リガンドが、ＣＤ４８タンパク質又はそのポリペプチド断片である、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記２Ｂ４リガンドが、２Ｂ４抗体又はその抗体結合断片である、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＤＮＡＭ－１リガンドが、ＣＤ１５５タンパク質又はそのポリペプチド断片である、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ＤＮＡＭ－１リガンドが、ＣＤ１１２タンパク質又はそのポリペプチド断片である、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記処理が、
前記ＮＫｐ３０調節剤、前記２Ｂ４リガンド、及び前記ＤＮＡＭ－１リガンドの組み合わせを前記ＮＫ細胞の出発調製物に投与することを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記組み合わせが、ＮＫｐ３０抗体、ＣＤ４８タンパク質又はポリペプチド、及びＣＤ１５５タンパク質又はポリペプチドを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記処理が、前記培養の間に定期的に繰り返される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記処理及び前記培養が、前記出発調製物中のＮＫ細胞の数よりも少なくとも２０倍多いＮＫ細胞を含む増殖ＮＫ細胞調製物を産生するのに有効である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記処理及び前記培養が、前記出発調製物中のＮＫ細胞の数よりも少なくとも４０倍多いＮＫ細胞を含む増殖ＮＫ細胞調製物を産生するのに有効である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記処理及び前記培養が、前記出発調製物中のＮＫ細胞の数よりも４０倍多いＮＫ細胞を含む増殖ＮＫ細胞調製物を産生するのに有効である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記増殖ＮＫ細胞調製物が、ヒト増殖ＮＫ細胞調製物である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記増殖ＮＫ細胞調製物が、後期未成熟ＮＫ細胞と成熟ＮＫ細胞との異質混合物を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記増殖ＮＫ細胞調製物が、ＣＤ５６^＋／ＣＤ３^－／ＣＤ４５^＋／ＣＤ１６^＋／－ ＮＫ細胞を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記増殖ＮＫ細胞調製物が、ＮＫＧ２－ＣタイプＩＩ内在性膜タンパク質を発現するが、ＮＫＧ２－Ａ／ＮＫＧ２－ＢタイプＩＩ内在性膜タンパク質を発現しない細胞を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記ＮＫ細胞の出発調製物の細胞が、遺伝子改変され、それによって、遺伝子改変されたＮＫ細胞を含む増殖ＮＫ細胞調製物を産生する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記遺伝子改変されたＮＫ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記出発調製物の前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６^＋／－／ＣＤ１６^－／ＣＤ４５^＋／ＣＤ３４^－ ｉＮＫ細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記ＮＫ細胞の出発調製物が、ＣＤ３４^＋人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又はＣＤ３４^＋臍帯血細胞に由来する、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記方法が、
前記処理又は前記培養の間に、前記出発調製物に１つ又は２つ以上の刺激性サイトカインを投与することを更に含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記１つ又は２つ以上の刺激性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記培養後、ＮＫ細胞の増殖調製物を、２Ｂ４リガンド、４－１ＢＢリガンド、又はＯＸ４０Ｌのうちの１つ又は２つ以上と組み合わせたＤＮＡＭ－１リガンドで処理することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記増殖ＮＫ細胞調製物が、約２×１０^９～約１×１０^１１個のＮＫ細胞を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法に従って産生された、ＮＫ細胞の治療調製物。

【請求項30】

医薬組成物であって、
請求項２９に記載のＮＫ細胞の治療調製物と、
医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。

【請求項31】

養子ＮＫ細胞療法を必要とする対象を治療する方法であって、前記方法が、
前記対象に、請求項２９に記載の治療調製物又は請求項３０に記載の医薬組成物を、前記養子ＮＫ細胞療法を必要とする対象を治療するのに有効な量で投与することを含む、方法。

【請求項32】

前記対象が、がんを有し、前記投与が、がん細胞死を引き起こす、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記対象が、ウイルス感染を有し、前記投与が、ウイルス感染細胞死を引き起こす、請求項３１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、治療ＮＫ細胞調製物を産生するための、ｉＰＳＣ（ｉＮＫ）又は臍帯血（ＣＢ－ＮＫ）に由来するナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞のフィーダーフリー増殖のための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫応答において重要な役割を果たす細胞傷害性リンパ球である。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－として表現型的に特徴付けられ、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞を自発的に溶解する能力を有する。ＮＫ細胞はまた、抗体依存性細胞傷害性と呼ばれるプロセスによる適応免疫応答に関与し、ＮＫ細胞は、抗体分子によって結合された細胞に直接結合し、それを死滅させる。ヒトの身体において、ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、及び胸腺などの様々な免疫臓器において分化及び成熟する。

【0003】

ヒト人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、ｉＰＳＣ）は、特定の遺伝子の強制発現によって非多能性細胞から人工的に生成される多能性幹細胞の一種である。ｉＰＳＣを利用して、様々な種類のがん、並びに急性及び慢性ウイルス感染症を治療するための治療的に生存可能なＮＫ細胞の潜在的に無制限の供給源を生成することができる。したがって、制御可能な様式でｉＰＳＣからＮＫ細胞を効率的かつ再現性よく生成することができることが必須である。

【0004】

フィーダー細胞依存的な様式でｉＰＳＣから始まるＮＫ細胞分化のプロセスが記述されている。ｉＰＳＣ／ＣＤ３４^＋由来未成熟ＮＫ細胞からのＮＫ細胞のエクスビボ増殖のための既存のプロトコルは、Ｋ５６２腫瘍形成性細胞株などの人工的に生成されたフィーダー細胞株との共培養に依存する。フィーダー細胞系における増殖は、養子細胞免疫療法における増殖された細胞集団のその後の使用に悪影響を及ぼし得る未知の遺伝的な／安全性の変動を増殖されたＮＫ細胞集団に導入する。したがって、Ｋ５６２細胞又は他のフィーダー細胞株との共培養を伴わないＮＫ細胞のエクスビボ増殖の強力な方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、ナチュラルキラー細胞の増殖における現在の欠陥を克服することを対象とする。

【0006】

本開示の第１の態様は、増殖ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞調製物を産生する方法を対象とする。本方法は、ＮＫ細胞の出発調製物を提供することと、出発調製物をナチュラルキラー細胞ｐ３０関連タンパク質（natural killer cell p30、ＮＫｐ３０）調節剤で処理することと、を含む。本方法は、処理された調製物を、ＮＫ細胞の出発調製物を増殖させるのに有効な条件下で培養して、増殖ＮＫ細胞調製物を産生することを更に伴う。任意の実施形態では、出発ＮＫ細胞調製物は、人工多能性幹細胞又は臍帯血に由来する調製物である。任意の実施形態では、ＮＫｐ３０調節剤は、抗ＮＫｐ３０抗体である。

【0007】

本開示の別の態様は、本明細書に開示される方法に従って産生されたＮＫ細胞の治療調製物を対象とする。

【0008】

本開示の別の態様は、本明細書に開示される方法に従って産生されたＮＫ細胞の増殖調製物と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を対象とする。

【0009】

本開示の別の態様は、養子ＮＫ細胞療法を必要とする対象を治療する方法を対象とする。本方法は、養子ＮＫ細胞療法を必要とする対象に、本明細書に開示される方法に従って産生されたＮＫ細胞の治療調製物又はそれを含む医薬組成物を、養子ＮＫ細胞療法を必要とする対象を治療するのに有効な量で投与することを伴う。

【0010】

ｉＰＳＣ又は臍帯血に由来するＣＤ３４^＋前駆細胞に由来する未成熟ＮＫ細胞の異質調製物からＮＫ細胞を増殖させるための方法が本明細書に開示される。これらの方法は、ＮＫ細胞と、フィーダー細胞集団、例えば、遺伝子改変されたフィーダー細胞株（Ｋ５６２）又はエプスタイン－バーウイルスでの感染によって天然に不死化されたＢ細胞株との共培養を必要とする先行技術の方法とは異なる。本明細書に記載のフィーダーフリー培養法は、インビボ移植時のそれらの持続性及び増殖能力により、養子細胞療法に有利である後期未成熟ＮＫ細胞及び成熟ＮＫ細胞の異質増殖集団を産生する。対照的に、フィーダー培養物中で増殖されたＮＫ細胞は、増殖が制限され、かつ／又は患者の治療後に急速に枯渇する成熟ＮＫ細胞のより均質な集団を含む。本開示の増殖ＮＫ細胞調製物は、腫瘍形成性フィーダー細胞の非存在下で産生されるため、フィーダー細胞汚染のリスクがなく、したがって、増殖ＮＫ細胞調製物の治療移植の前に厳密な精製プロセスを用いる必要がない。本明細書に記載のフィーダーフリー方法に従って産生された増殖ＮＫ細胞調製物は、異なる遺伝的背景及び免疫原性障壁にわたって個体に複数回の用量で投与するのに好適な「既製の」治療ＮＫ細胞組成物として利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】増殖剤の特定の組み合わせを含む第１のラウンドの処理による、培養物中で１０日間にわたる臍帯血ＣＤ３４＋由来のＮＫ細胞の増加倍率を示すグラフである。フィーダー細胞（すなわち、Ｋ５６２細胞）の存在下でのＮＫ細胞の増殖を、比較のために並行して行った。ＮＫｐ３０＝抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＮＫｐ３０ビオチン化抗体、２Ｂ４＝抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗２Ｂ４（ＣＤ２４４）ビオチン化抗体、ＣＤ４８＝抗ＦｃビーズにコンジュゲートされたＣＤ４８－Ｆｃタンパク質、ＣＤ１５５＝抗ＦｃビーズにコンジュゲートされたＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質、ＩＣＡＭ２＝抗ＦｃビーズにコンジュゲートされたＩＣＡＭ－２－Ｆｃタンパク質、４－１ＢＢＬ＝抗Ｆｃビーズにコンジュゲートされた４－１ＢＢＬ－Ｆｃタンパク質、Ｋ５６２－４－１ＢＢＬ－ＩＬ２１又はＫ５６２＝フィーダー細胞培養物。

【図2】増殖剤の特定の組み合わせでの第２のラウンドの処理後の更なる１０日間の培養にわたるＮＫ細胞（図１を参照して説明されるように第１のラウンドにおいてＮＫｐ３０／２Ｂ４の存在下で培養された）の増加倍率を示すグラフである。ＮＫｐ３０＝抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＮＫｐ３０ビオチン化抗体、ＣＤ２＝抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＣＤ２ビオチン化抗体、ＣＤ４８＝抗ＦｃビーズにコンジュゲートされたＣＤ４８－Ｆｃタンパク質、ＮＫｐ４６＝抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＮＫｐ４６ビオチン化抗体、ＮＫｐ４４＝抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＮＫｐ４４ビオチン化抗体、ＮＫｐ８０＝抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＮＫｐ８０ビオチン化抗体。

【図3】ＬｉｇａＴｒａｐビーズ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、タンパク質Ａ／Ｇビーズ、又は抗ヒトＦｃ抗体のいずれかに各々コンジュゲートされたＣＤ４８、ＣＤ１５５、及びＮＫｐ３０の存在下での培養３日目及び１０日目のｉＰＳＣ（ｉＮＫ）に由来するＮＫ細胞の増加倍率を示すグラフである。

【図4A】最初の３日間をＮＫｐ３０の存在下とし、続いて抗ビオチンビーズ（ＤＮＡＭ１）にコンジュゲートされた抗ＤＮＡＭ１ビオチン化抗体、又はＬｉｇａＴｒａｐビーズ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に各々コンジュゲートされたＣＤ４８若しくは４－１ＢＢＬを添加した、培養１０日目のｉＰＳＣ（ｉＮＫ）由来のＮＫ細胞の増加倍率を示すグラフである。

【図4B】最初の３日間をＮＫｐ３０の存在下とし、続いてＬｉｇａＴｒａｐビーズ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に各々コンジュゲートされたＩＬ２１若しくは４－１ＢＢＬ、又はＩＬ２１と４－１ＢＢＬとの組み合わせ、又はＣＤ４０、又はＣＲＡＣＣを添加した、培養１０日目のｉＰＳＣ（ｉＮＫ）由来のＮＫ細胞の増加倍率を示すグラフである。

【図5A-1】本明細書に記載のフィーダーフリー方法を使用してｉＰＳＣから産生されたＮＫ細胞のＣＤ５６＋ＣＤ３－集団にサブゲートされた、ＮＫ表面マーカー（図５Ａ～５Ｃ）及び枯渇マーカー（図５Ｄ）のフローサイトメトリー分析を示す。培養１０日目に分析を行い、ここで、出発集団ｉＮＫは、最初の３日間をＮＫｐ３０の存在下とし、続いて抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＤＮＡＭ１ビオチン化抗体を添加して、培養された。図５Ａ及び図５Ａ－１は、ＣＤ５６陽性細胞にサブゲートされた一般的なＮＫマーカー（ＣＤ４５、ＮＫＰ３０、ＤＮＡＭ１、２Ｂ４）の発現レベルのフローサイトメトリー分析を示す。図５Ｂ及び図５Ｂ－１は、未成熟ＮＫマーカー（ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４６、ＮＫＰ４４）の発現レベルを示し、図５Ｃ及び図５Ｃ－１は、成熟ＮＫマーカー（ＮＫｐ８０、ＣＤ１６、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＣＲＡＣＣ）の発現を示すグラフである。図５Ｄ及び図５Ｄ－１は、増殖ＮＫ上の枯渇マーカーの発現レベルを示すグラフである。このマーカー分析は、増殖ＮＫ集団が成熟及び未成熟表現型の組み合わせを含有し、著しい枯渇集団を含まないことを示し、更なる増殖の潜在性を指摘する。

【図5A-2】図５Ａ－１の続きである。

【図5B-1】本明細書に記載のフィーダーフリー方法を使用してｉＰＳＣから産生されたＮＫ細胞のＣＤ５６＋ＣＤ３－集団にサブゲートされた、ＮＫ表面マーカー（図５Ａ～５Ｃ）及び枯渇マーカー（図５Ｄ）のフローサイトメトリー分析を示す。培養１０日目に分析を行い、ここで、出発集団ｉＮＫは、最初の３日間をＮＫｐ３０の存在下とし、続いて抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＤＮＡＭ１ビオチン化抗体を添加して、培養された。図５Ａ及び図５Ａ－１は、ＣＤ５６陽性細胞にサブゲートされた一般的なＮＫマーカー（ＣＤ４５、ＮＫＰ３０、ＤＮＡＭ１、２Ｂ４）の発現レベルのフローサイトメトリー分析を示す。図５Ｂ及び図５Ｂ－１は、未成熟ＮＫマーカー（ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４６、ＮＫＰ４４）の発現レベルを示し、図５Ｃ及び図５Ｃ－１は、成熟ＮＫマーカー（ＮＫｐ８０、ＣＤ１６、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＣＲＡＣＣ）の発現を示すグラフである。図５Ｄ及び図５Ｄ－１は、増殖ＮＫ上の枯渇マーカーの発現レベルを示すグラフである。このマーカー分析は、増殖ＮＫ集団が成熟及び未成熟表現型の組み合わせを含有し、著しい枯渇集団を含まないことを示し、更なる増殖の潜在性を指摘する。

【図5B-2】図５Ｂ－１の続きである。

【図5C-1】本明細書に記載のフィーダーフリー方法を使用してｉＰＳＣから産生されたＮＫ細胞のＣＤ５６＋ＣＤ３－集団にサブゲートされた、ＮＫ表面マーカー（図５Ａ～５Ｃ）及び枯渇マーカー（図５Ｄ）のフローサイトメトリー分析を示す。培養１０日目に分析を行い、ここで、出発集団ｉＮＫは、最初の３日間をＮＫｐ３０の存在下とし、続いて抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＤＮＡＭ１ビオチン化抗体を添加して、培養された。図５Ａ及び図５Ａ－１は、ＣＤ５６陽性細胞にサブゲートされた一般的なＮＫマーカー（ＣＤ４５、ＮＫＰ３０、ＤＮＡＭ１、２Ｂ４）の発現レベルのフローサイトメトリー分析を示す。図５Ｂ及び図５Ｂ－１は、未成熟ＮＫマーカー（ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４６、ＮＫＰ４４）の発現レベルを示し、図５Ｃ及び図５Ｃ－１は、成熟ＮＫマーカー（ＮＫｐ８０、ＣＤ１６、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＣＲＡＣＣ）の発現を示すグラフである。図５Ｄ及び図５Ｄ－１は、増殖ＮＫ上の枯渇マーカーの発現レベルを示すグラフである。このマーカー分析は、増殖ＮＫ集団が成熟及び未成熟表現型の組み合わせを含有し、著しい枯渇集団を含まないことを示し、更なる増殖の潜在性を指摘する。

【図5C-2】図５Ｃ－１の続きである。

【図5D-1】本明細書に記載のフィーダーフリー方法を使用してｉＰＳＣから産生されたＮＫ細胞のＣＤ５６＋ＣＤ３－集団にサブゲートされた、ＮＫ表面マーカー（図５Ａ～５Ｃ）及び枯渇マーカー（図５Ｄ）のフローサイトメトリー分析を示す。培養１０日目に分析を行い、ここで、出発集団ｉＮＫは、最初の３日間をＮＫｐ３０の存在下とし、続いて抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＤＮＡＭ１ビオチン化抗体を添加して、培養された。図５Ａ及び図５Ａ－１は、ＣＤ５６陽性細胞にサブゲートされた一般的なＮＫマーカー（ＣＤ４５、ＮＫＰ３０、ＤＮＡＭ１、２Ｂ４）の発現レベルのフローサイトメトリー分析を示す。図５Ｂ及び図５Ｂ－１は、未成熟ＮＫマーカー（ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４６、ＮＫＰ４４）の発現レベルを示し、図５Ｃ及び図５Ｃ－１は、成熟ＮＫマーカー（ＮＫｐ８０、ＣＤ１６、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＣＲＡＣＣ）の発現を示すグラフである。図５Ｄ及び図５Ｄ－１は、増殖ＮＫ上の枯渇マーカーの発現レベルを示すグラフである。このマーカー分析は、増殖ＮＫ集団が成熟及び未成熟表現型の組み合わせを含有し、著しい枯渇集団を含まないことを示し、更なる増殖の潜在性を指摘する。

【図5D-2】図５Ｄ－１の続きである。

【図6】ｉＰＳＣ由来の増殖ＮＫ細胞（ｉＮＫ）の細胞傷害性効果を示すグラフである。出発ＮＫ調製物をＮＫｐ３０の存在下で最初の３日間培養し、続いて更なる７日間の培養のために、抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＤＮＡＭ１ビオチン化抗体を添加した。この死滅アッセイでは、増殖ＮＫ調製物を、異なる比（０．２５：１～１０：１のＮＫ：Ｋ５６２）でＫ５６２がん細胞株（「標的」細胞）と共培養して、標的Ｋ５６２細胞に対する増殖ＮＫ調製物の細胞傷害性効果を決定した。各時点（６時間毎）で、リアルタイムライブイメージングシステム（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，ＵＳ）を使用して、生きたがん細胞のレベルを決定し、時間０（播種日）での標的細胞の初期負荷数に対して正規化した。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本開示は、フィーダーフリー細胞培養環境においてｉＰＳＣ又は臍帯血に由来するナチュラルキラー細胞を増殖させる方法に関する。ナチュラルキラー（以下、「ＮＫ」と略記する）細胞は、免疫反応に関与するリンパ系細胞である。これらの細胞は、腫瘍細胞、がん化を受けている細胞、ウイルス感染細胞、及び生体内の他の異常細胞を死滅させることを含む、様々な機能を有する。したがって、ＮＫ細胞は、先天性免疫監視機構の重要な構成要素である。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞に対して自発的な非ＭＨＣ拘束性細胞傷害性活性を示し、インビボでのウイルス感染及びがん発生に対する耐性を媒介する。したがって、ＮＫ細胞の数を効果的に増殖又は増加させるためのエクスビボ法は、腫瘍及びウイルス感染の免疫療法治療に好適な治療有効濃度の細胞を生成するのに有用である。

【0013】

したがって、本開示の第１の態様は、増殖ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞調製物を産生する方法を対象とする。本方法は、ＮＫ細胞の出発調製物を提供することと、出発調製物をナチュラルキラー細胞ｐ３０関連タンパク質（ＮＫｐ３０）調節剤で処理することと、を含む。本方法は、処理された調製物を、ＮＫ細胞の出発調製物を増殖させるのに有効な条件下で培養して、増殖ＮＫ細胞調製物を産生することを更に伴う。

【0014】

本開示のこの態様及び全ての態様によれば、増殖ＮＫ細胞調製物を産生する方法は、方法の間の任意のどの時点でも細胞のフィーダー細胞集団の存在下でＮＫ細胞の出発調製物を培養することを伴わない。本方法は、フィーダー細胞集団の完全な非存在下で行われる。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の出発調製物は、未成熟ＮＫ（immature NK、ｉＮＫ）細胞の調製物である。未成熟ＮＫ細胞としては、Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１８６９（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって定義されているステージ３及び４のＮＫ前駆細胞が挙げられ、それは、成熟ＮＫ細胞になることができる。未成熟ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３３５、ＣＤ３３７、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＰ８０、及びＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}のうちのいずれか１つ又は２つ以上のそれらの発現によって定義される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の出発調製物は、成熟ＮＫ細胞の調製物である。成熟ＮＫ細胞は、特徴的な表面マーカー及びＮＫ細胞機能を有し、更なる分化の潜在性を欠く、コミットされたＮＫ細胞である（Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１８６９（２０１８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。成熟ＮＫ細胞は、ＣＤ１６、ＣＤ５６^ｄｉｍ、ＫＩＲ、及びＣＤ５７のいずれか１つ又は２つ以上のそれらの発現によって定義される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の出発調製物は、未成熟ＮＫ細胞と成熟ＮＫ細胞との混合物を含有する調製物である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の出発調製物は、ＣＤ５６^＋／－／ＣＤ１６^－／ＣＤ４５^＋／ＣＤ３４^－発現プロファイルによって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の出発調製物は、ＣＤ５６^＋／ＣＤ１６^－／ＣＤ４５^＋／ＣＤ３４^－発現プロファイルによって特徴付けられる。

【0016】

任意の実施形態では、出発ＮＫ細胞調製物のＮＫ細胞は、臍帯血のｉＰＳＣ又はＣＤ３４＋造血前駆細胞に由来する哺乳動物ＮＫ細胞である。好適な哺乳動物ＮＫ細胞集団としては、ヒトＮＫ細胞、霊長類ＮＫ細胞、ウシＮＫ細胞、イヌＮＫ細胞、ネコＮＫ細胞、齧歯類ＮＫ細胞（例えば、マウスＮＫ細胞）、並びに他の哺乳動物に由来するＮＫ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、出発ＮＫ調製物のＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞であり、増殖ＮＫ調製物のＮＫ細胞も同様にヒトＮＫ細胞である。

【0017】

任意の実施形態では、ＮＫ細胞の出発調製物は、ＣＤ３４^＋造血前駆細胞集団に由来する。任意の実施形態では、ＣＤ３４^＋造血前駆細胞集団は、ＣＤ３４^＋臍帯血細胞の集団である。ＣＤ３４^＋造血前駆細胞からＮＫ細胞を産生する方法は、当該技術分野において周知されており、例えば、以下を参照されたい：Ｓｐａｎｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｇｒａｄｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｌｏｓｅｄ－ｓｙｓｔｅｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓ，」ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（６）：ｅ２０７４０（２０１１）、Ｃａｎｙ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＩＬ－１５ ａｎｄ ＩＬ－１２ ｄｒｉｖｅｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３４－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ，」Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４（７）：ｅ１０１７７０１（２０１５）、及びＳｐａｎｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｇｈ ｌｏｇ－ｓｃａｌｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，」ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（２）：ｅ９２２１（２０１０）。これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0018】

任意の実施形態では、ＣＤ３４^＋造血前駆細胞集団は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団に由来するか、又はそれから分化する。ｉＰＳＣ集団からナチュラルキラー細胞を生成する方法は、当該技術分野において周知されている（例えば、以下を参照されたい：Ｒｅｚｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，」Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２５（８）：１７６９－８１（２０１７）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．「Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｅｎｈａｎｃｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ，」Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２３（２）：１８１－１９２．ｅ５（２０１８）、Ｎｉ ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ４ｚｅｔａ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｕｔ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｅｎｈａｎｃｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ，」Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３２（４）：１０２１－３１（２０１４）。これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0019】

任意の実施形態では、出発ＮＫ細胞調製物のＮＫ細胞は、遺伝子改変され、すなわち、外来遺伝子又は核酸配列を含有及び／又は発現し、これが次に細胞又はその子孫の遺伝子型又は表現型を改変する。例えば、一実施形態では、出発ＮＫ細胞調製物のＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変される。別の実施形態では、出発ＮＫ細胞調製物のＮＫ細胞は、１つ又は２つ以上のケモカイン受容体を発現又は過剰発現するように遺伝子改変される。遺伝子改変されたＮＫ細胞を産生する方法は、当該技術分野において周知されており、本明細書に記載の方法における使用に好適である（例えば、以下を参照されたい：Ｒｅｚｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，」Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２５（８）：１７６９－８１（２０１７）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．「Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｅｎｈａｎｃｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ，」Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２３（２）：１８１－１９２．ｅ５（２０１８）、Ｎｉ ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ４ｚｅｔａ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｕｔ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｅｎｈａｎｃｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ，」Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３２（４）：１０２１－３１（２０１４）、Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｃｌｏｎａｌ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，」Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２３（２）：３３０－８（２０１５）、Ｒｏｍａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，「ＣＤ１９－ＣＡＲ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＮＫ－９２ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ＮＫ ｃｅｌｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｂ－ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０（７）：１２８７－９４（２０１６）。これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の方法によれば、増殖ＮＫ調製物の細胞は、出発調製物細胞の遺伝子改変を保持する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞などの遺伝子改変されたＮＫ細胞を増殖させて、遺伝子改変されたＮＫ細胞の増殖調製物を産生するのに好適である。

【0020】

任意の実施形態では、精製されたＮＫ細胞の集団を含むＮＫ細胞の出発調製物。ＮＫ細胞は、ＭＡＣＳ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）などの磁気細胞分離方法又はＦＡＣＳ（商標）などのフローサイトメトリー法によって、ＮＫ細胞及び他の細胞、例えば、ＰＭＢＣ又は全血などを含む試料から精製され得る。細胞、例えば、ＮＫ細胞の精製のためのこれら及び他の方法は、当該技術分野において周知されている。

【0021】

任意の実施形態では、出発調製物中の該ＮＫ細胞の濃度は、５～２０ｍｌの標準ＮＫ細胞培養培地中、約１×１０^５～約１×１０^６個の細胞のいずれかである。任意の実施形態では、出発調製物中の該ＮＫ細胞の濃度は、５～２０ｍｌの標準ＮＫ細胞培養培地中、約２．５×１０^５～約７．５×１０^５個の細胞である。任意の実施形態では、出発調製物中の該ＮＫ細胞の濃度は、５～２０ｍｌ中、約１×１０^５、１．５×１０^５、２×１０^５、２．５×１０^５、３×１０^５、３．５×１０^５、４×１０^５、４．５×１０^５、５×１０^５、５．５×１０^５、６×１０^５、６．５×１０^５、７×１０^５、７．５×１０^５、８×１０^５、８．５×１０^５、９×１０^５、９．５×１０^５、又は１×１０^６個の細胞である。任意の実施形態では、出発調製物中の該ＮＫ細胞の濃度は、５～２０ｍｌの標準ＮＫ細胞培養培地中、５×１０^５個の細胞である。

【0022】

本明細書で使用される場合、「細胞培養培地」という用語は、ＮＫ細胞の維持に必要とされる化学的条件を提供する液体を含む。ＮＫ細胞増殖を支持することが既知の化学的条件の例としては、細胞培養培地中に定期的に提供される（又は手動で与えられ得る）溶液、緩衝液、血清、血清成分、栄養素、ビタミン、サイトカイン、及び他の成長因子が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載のＮＫ細胞を増殖させる方法における使用に好適な細胞培養培地としては、ＮＫ－ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、Ｘ－Ｖｉｖｏ１０、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、ＢＩＮＫＩＴ ＮＫ細胞初期培地（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ ＵＳＡ）、ＡＩＭ－Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＮＫ細胞培養培地（Ｕｐｃｙｔｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0023】

上述されるように、本明細書に開示される方法に従ってＮＫ細胞を増殖させる方法は、出発調製物をＮＫｐ３０調節剤で処理することを伴う。ＮＫｐ３０（天然細胞傷害性誘発受容体３、活性化ナチュラルキラー受容体３０、及びＣＤ３３７としても既知）は、その細胞外リガンドに結合することによって活性化されるＮＫ細胞の細胞膜受容体である。ＮＫｐ３０の細胞外リガンドとしては、大型プロリンリッチタンパク質ＢＡＧ６（「ＢＡＧ６」）及び天然細胞傷害性誘発受容体３リガンド１（Ｂ７ホモログ６又はＢ７－Ｈ６としても既知）が挙げられる。本明細書に記載されるように、好適なＮＫｐ３０調節剤は、抗ＮＫｐ３０抗体、抗ＮＫｐ３０抗体断片（例えば、ＮＫｐ３０Ｆａｂ断片、ＮＫｐ３０単一可変ドメインなど）又は抗ＮＫｐ３０抗体ベースの分子（例えば、ＮＫｐ３０単鎖抗体）である。好適な抗ＮＫｐ３０抗体、抗体断片、及び抗体ベースの分子は、当該技術分野で知られており、本明細書に開示される方法で使用するために市販されている（例えば、以下を参照されたい：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｂｃａｍ、Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ（Ｒ＆Ｄ）及びＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）。任意の実施形態では、本明細書に開示される方法に従う使用に好適なＮＫｐ３０調節剤は、ＮＫｐ３０のリガンド、例えば、ＢＡＧ６若しくはＢ７－Ｈ６、又はＢＡＧ６若しくはＢ７－Ｈ６のＮＫｐ３０受容体結合断片である。本明細書に記載のインビトロ細胞培養方法における使用に好適な好適な組換えＢＡＧ６タンパク質及びＢ７－Ｈ６タンパク質、特に組換えヒトＢＡＧ６タンパク質及びＢ７－Ｈ６タンパク質は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＡｂｃａｍから市販されている。

【0024】

いくつかの実施形態では、出発調製物は、ＮＫｐ３０調節剤で処理される。いくつかの実施形態では、出発調製物は、第２又は第３の増殖剤と併せてＮＫｐ３０調節剤で処理される。いくつかの実施形態では、ＮＫｐ３０調節剤は、１ラウンド又は２ラウンド以上の増殖（すなわち、１０日）のために出発調製物に単独で投与され、次いで増殖の後続のラウンドでは、ＮＫｐ３０調節剤は、第２又は第３の増殖剤と併せて投与される。更に別の実施形態では、ＮＫｐ３０調節剤は、１ラウンド又は２ラウンド以上の増殖（すなわち、１０日）のために出発ＮＫ調製物に投与され、次いで増殖の後続のラウンドでは、ＮＫｐ３０調節剤は、除去され、かつ／又は第２及び／若しくは第３の増殖剤によって置き換えられる。

【0025】

本明細書に開示される方法に従う使用のための好適な第２及び第３の増殖剤としては、ＮＫ細胞受容体２Ｂ４（「２Ｂ４」）リガンド及びＤＮＡＭ－１リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0026】

ＮＫ細胞受容体２Ｂ４は、ＳＬＡＭファミリーメンバー４及びシグナル伝達リンパ球活性化分子４としても知られており、ＮＫ細胞の活性化及びＮＫ細胞の細胞傷害性の刺激に関与する異好性受容体である。ＣＤ４８は、２Ｂ４のリガンドであり、したがって、任意の実施形態では、本明細書に開示される方法において増殖剤として使用するための好適な２Ｂ４リガンドは、ＣＤ４８タンパク質又はその２Ｂ４受容体結合断片である。インビトロ細胞培養の使用に好適な組換えＣＤ４８タンパク質、特に組換えヒトＣＤ４８タンパク質は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＡｂｃａｍから市販されている。いくつかの実施形態では、２Ｂ４リガンドは、抗２Ｂ４抗体、抗体断片、又は抗体ベースの分子である。好適な抗２Ｂ４抗体及び抗体ベースの分子は、当該技術分野で知られており、購入及び記載の方法における使用のために市販されている（例えば、以下を参照されたい：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＡｂｃａｍ）。

【0027】

ＣＤ２２６抗原としても既知のＤＮＡＭ－１は、細胞間接着、リンパ球シグナル伝達、細胞傷害性、及びリンホカイン分泌に関与する細胞表面受容体である。ＤＮＡＭ－１の機能的リガンドとして、ＣＤ１５５（ネクチン様タンパク質５及びポリオウイルス受容体としても既知）及びＣＤ１１２（ネクチン－２としても既知）が挙げられる。したがって、本明細書に開示される方法における増殖剤としての使用のための好適なＤＮＡＭ－１リガンドとしては、組換えＣＤ１５５タンパク質及びＣＤ１１２タンパク質又はこれらのタンパク質のＤＮＡＭ－１結合断片が挙げられる。インビトロ細胞培養の使用に好適な組換えＣＤ１５５及びＣＤ１１２タンパク質、特に組換えヒトＣＤ１５５及びＣＤ１１２タンパク質は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＡｂｃａｍから市販されている。他の好適なＤＮＡＭ－１リガンドとしては、ＤＮＡＭ－１抗体、抗体断片、及び抗体ベースの分子が挙げられる。好適な抗ＤＮＡＭ－１抗体及び抗体ベースの分子は、当該技術分野で知られており、購入及び記載の方法における使用のために市販されている（例えば、以下を参照されたい：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａｂｃａｍ及びＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）。

【0028】

本開示のこの態様及び全ての態様によれば、組換えタンパク質リガンド、例えば、ＣＤ１５５又はＣＤ４８の使用は、それぞれのＮＫ細胞受容体を調節して、ＮＫ細胞の分裂増殖を誘導する能力を保持するこれらのリガンドタンパク質の断片、突然変異体、又は変異体（例えば、改変形態）の使用を含むことが理解される。言い換えれば、好適なリガンド断片、突然変異体、変異体などは、エクスビボ培養条件においてＮＫ細胞の分裂増殖を増強するためにそれぞれのＮＫ細胞受容体を調節することに関連するため、それらの生物学的活性を保持するものである。

【0029】

本明細書に記載の方法の任意の実施形態では、ＮＫｐ３０調節剤は、好適な２Ｂ４リガンドと組み合わせて出発ＮＫ調製物に投与される。任意の実施形態では、ＮＫｐ３０調節剤は、ＤＮＡＭ－１リガンドと併せて投与される。任意の実施形態では、ＮＫｐ３０調節剤は、２Ｂ４リガンド及びＤＮＡＭ－１リガンドと併せて投与される。好ましい実施形態では、ＮＫｐ３０調節剤はＮＫｐ３０抗体であり、該抗体は、組換えＣＤ４８タンパク質及び組換えＣＤ１５５タンパク質と併せて出発ＮＫ細胞調製物に投与される。

【0030】

本明細書に記載のＮＫ細胞増殖方法において、ＮＫｐ３０調節剤、２Ｂ４リガンド、及びＤＮＡＭ－１リガンドと組み合わせて、及び／又はそれらの代替として使用され得る他の薬剤としては、固定化ＩＬ２１、ＣＤ４０タンパク質（ＣＤ４０リガンドに結合する）、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７タンパク質（ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７に結合する）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）に対するリガンド、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）に対するリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。ＩＬ２１は、ＩＬ２１受容体及び共通サイトカイン受容体ガンマ鎖に結合するサイトカインであり、ＣＤ４０は、ＣＤ４０リガンドに結合する共刺激タンパク質であり、ＣＲＡＣＣタンパク質は、ＩｇスーパーファミリーのＣＤ２サブセットに属するＩ型膜貫通タンパク質である。インビトロ細胞培養の使用に好適なＩＬ２１、ＣＤ４０、及びＣＲＡＣＣは、当該技術分野で知られており、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及びＳｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから市販されている。ＴＮＦＲＳＦ９に対する機能的リガンドは４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）又は抗４－１ＢＢ抗体であり、ＴＮＦＲＳＦ４に対する機能的リガンドはＯＸ４０Ｌである。インビトロ細胞培養の使用に好適な組換え４－１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌタンパク質、特に組換えヒト４－１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌタンパク質、又はその三量体構築物（活性型）若しくは特異的４－１ＢＢ活性化抗体（抗４－１ＢＢ抗体）としての受容体結合断片は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及びＡｂｃａｍから市販されている。ＮＫｐ３０調節剤、２Ｂ４リガンド、及びＤＮＡＭ－１リガンドと組み合わせて、及び／又はそれらの代替として投与され得る別の増殖剤は、白血球接着タンパク質ＬＦＡに対するリガンドである細胞内接着分子２（ＩＣＡＭ－２）である。インビトロ細胞培養の使用に好適な組換えＩＣＡＭ－２タンパク質、特に組換えヒトＩＣＡＭ－２タンパク質又はその受容体結合断片も当該技術分野で知られており、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｃａｍ、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及びＳｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから市販されている。

【0031】

任意の実施形態では、ＮＫ細胞増殖を誘導する本明細書に開示される薬剤、すなわち、ＮＫｐ３０調節剤、２Ｂ４リガンド、ＤＮＡＭ－１リガンド、ＩＣＡＭ－２、４－１ＢＢリガンド、調節剤（抗体）ｃｒａ、及びＯＸ４０Ｌは、本明細書において集合的に「ＮＫ細胞培養増殖剤」と称される。任意の実施形態では、本明細書に記載のこれらのＮＫ細胞培養増殖剤は、天然の可溶性形態で出発ＮＫ細胞調製物に投与される。いくつかの実施形態では、これらのＮＫ細胞培養増殖剤は、固体支持体又は基質に結合され、この基質結合形態で出発ＮＫ細胞調製物に投与される。更に別の実施形態では、ＮＫ細胞培養増殖剤のうちの１つ又は２つ以上は、可溶性形態で投与されるが、１つ又は２つ以上は、固体支持体に結合された出発ＮＫ細胞調製物に投与される。

【0032】

本方法のこの実施形態によれば、増殖剤は、出発ＮＫ細胞集団の分化及び増殖を誘導するために出発ＮＫ集団に投与される前に、好適な固体支持体、例えば、細胞培養ビーズ又は粒子に結合され得る。任意の実施形態では、ＮＫ増殖剤は各々、それら自体の固体支持体に結合又はコンジュゲートされ、例えば、一種の増殖剤が一種の細胞培養ビーズに結合される。別の実施形態では、ＮＫ細胞増殖剤のうちの２つ又はそれ以上は、１種類のビーズに一緒に結合される。細胞培養ビーズへのＮＫ増殖剤の結合は、当該技術分野において日常的であり、例えば、結合対部分の第１のメンバーが増殖剤（例えば、ビオチン又はＦｃ断片）にコンジュゲートされ、結合対部分の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン又はＦｃ受容体）が固体支持体にコンジュゲートされる、標準的な結合対部分の使用を介して達成され得る。好適な結合対部分としては、Ｆｃ－ＩｇＧ Ｆｃ受容体、ビオチン－ストレプトアビジン、ＩｇＧ－タンパク質Ａ、マルトース－マルトース結合タンパク質（maltose-maltose binding protein、ＭＢＰ）、アルブミン－アルブミン結合タンパク質（albumin-albumin-binding protein、ＡＢＰ）、及びカルモジュリン－カルモジュリン結合ペプチド（calmodulin-calmodulin binding peptide、ＣＢＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの実施形態では、増殖剤は、結合部分、例えば、Ｆｃ部分、ビオチン部分、又は任意の他の結合対部分に結合され、ビーズ又は他の固体支持体は、ＮＫ増殖剤を固体支持体にコンジュゲート又は結合させるためのパートナー結合対部分を含有する。

【0033】

本明細書に記載のＮＫ細胞調製物を増殖させるフィーダーフリー方法の実施形態は、増殖プロセスを補足するために、出発ＮＫ調製物を１つ又は２つ以上の刺激性サイトカインで処理することを更に伴い得る。この実施形態によれば、１つ又は２つ以上の刺激性サイトカインは、増殖剤が細胞調製物に投与されるのと同時に、又は培養工程中の任意の時点（すなわち、培養の０日目～１０日目の間の任意の時点の間）で、細胞培養培地への添加を介して出発ＮＫ細胞調製物に投与され得る。個々のサイトカイン又はサイトカインの組み合わせは、増殖期間中に１回添加され得るか、又は増殖を最大化するために必要に応じて繰り返し添加され得る。本明細書に記載の方法において増殖剤を補足し得る好適な刺激性サイトカインとしては、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、又はこれらのサイトカインの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0034】

本明細書に記載の出発ＮＫ細胞調製物を増殖させる方法によれば、出発ＮＫ細胞調製物は、本方法の０日目にＮＫ細胞培養増殖剤のうちの１つ又は２つ以上で処理される。ＮＫ細胞培養増殖剤は各々、細胞成長培地において、出発ＮＫ細胞調製物の増殖を誘導するのに好適な濃度で投与される。典型的には、個々のＮＫ細胞培養増殖剤又は刺激性サイトカイン、例えば、ＮＫｐ３０調節剤、２Ｂ４リガンド、及びＤＮＡＭ－１リガンドの好適な濃度は、約０．１～１０００ｎｇ／ｍＬの範囲にある。いくつかの実施形態では、各増殖剤の濃度は、約１～２００ｎｇ／ｍＬの範囲にある。いくつかの実施形態では、各増殖剤の濃度は、約１０～１００ｎｇ／ｍＬの範囲、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１３０ｎｇ／ｍｌ、１４０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ、１７０ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、１９０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、又は≧２００ｎｇ／ｍｌにある。以下の実施例は、増殖剤の例示的な有効濃度を実証する。

【0035】

ＮＫ細胞の出発集団が１つ又は２つ以上の増殖剤で処理されると、処理された調製物は、調製物中のＮＫ細胞の数を増加又は増殖させる条件下で培養される。調製物中のＮＫ細胞の数を増加又は増殖させるのに有効な条件は、標準的な細胞成長培地（例えば、５％ウシ胎児血清を含有するＮＫ ＭＡＣＳ培地）の存在下での標準的な細胞培養条件、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２、及び８０％湿度を含む。

【0036】

本明細書に記載の１つ又は２つ以上の増殖剤の存在下での出発ＮＫ細胞調製物の培養は、１ラウンド又は２ラウンド以上で行うことができ、各ラウンドは、約５～約１５日、例えば、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、又は＞１５日である。各ラウンドの終わりに、該培養工程から得られた増殖ＮＫ細胞調製物は、１ラウンド又は２ラウンド以上の増殖の更なるラウンドに供される前に、収集及び分割され得る。上記のように、増殖の更なるラウンドは、細胞を同じか又は異なる増殖試薬で処理することによって行われ得る。増殖の各ラウンドの間、１つの又は増殖試薬は、典型的には、出発細胞調製物に１回だけ投与される。しかしながら、１ラウンドの増殖内での１つ又は２つ以上の増殖試薬及び／又は刺激性サイトカインの反復投与も企図される。

【0037】

本明細書に記載の１つ又は２つ以上の増殖剤の存在下でＮＫ細胞の出発調製物を培養することは、出発調製物中の細胞の数より少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍、少なくとも９５倍、少なくとも１００倍以上の細胞を含む増殖ＮＫ細胞調製物を産生することができる。

【0038】

任意の実施形態では、出発ＮＫ細胞調製物を処理及び培養する方法は、出発調製物中の細胞の数よりも少なくとも４０倍多い細胞を含む増殖ＮＫ細胞調製物を産生するのに有効である。

【0039】

任意の実施形態では、出発ＮＫ細胞調製物を処理及び培養する方法は、出発調製物中の細胞の数よりも４０倍超えて多い細胞を含む増殖ＮＫ細胞調製物を産生するのに有効である。

【0040】

任意の実施形態では、本明細書に記載のＮＫ細胞を増殖させるフィーダーフリー方法は、約２×１０^９～約１×１０^１１個のＮＫ細胞を含む増殖ＮＫ調製物を産生する。任意の実施形態では、本明細書に記載の方法は、２×１０^９個のＮＫ細胞、３×１０^９個のＮＫ細胞、４×１０^９個のＮＫ細胞、５×１０^９個のＮＫ細胞、６×１０^９個のＮＫ細胞、７×１０^９個のＮＫ細胞、８×１０^９個のＮＫ細胞、９×１０^９個のＮＫ細胞、１×１０^１０個のＮＫ細胞、２×１０^１０個のＮＫ細胞、３×１０^１０個のＮＫ細胞、４×１０^１０個のＮＫ細胞、５×１０^１０個のＮＫ細胞、６×１０^１０個のＮＫ細胞、７×１０^１０個のＮＫ細胞、８×１０^１０個のＮＫ細胞、９×１０^１０個のＮＫ細胞、１×１０^１１個のＮＫ細胞、又は１×１０^１１個超のＮＫ細胞を含む増殖ＮＫ調製物を産生する。

【0041】

本明細書に記載の方法によれば、増殖ＮＫ細胞調製物は、未成熟ＮＫ細胞と成熟ＮＫ細胞との異質混合物を含む調製物である。一実施形態では、増殖ＮＫ細胞調製物は、後期未成熟ＮＫ細胞及び成熟ＮＫ細胞の調製物である。一実施形態では、増殖ＮＫ細胞調製物は、ＣＤ５６^＋／ＣＤ３^－／ＣＤ４５^＋／ＣＤ１６^＋／－発現プロファイルによって特徴付けられる細胞の調製物である。別の実施形態では、増殖ＮＫ細胞調製物のＮＫ細胞は、ＮＫＧ２－ＣタイプＩＩ内在性膜タンパク質を発現するが、ＮＫＧ２－Ａ／ＮＫＧ２－ＢタイプＩＩ内在性膜タンパク質を発現しない。この発現パターンを利用して、本明細書に記載の方法によって産生された増殖ＮＫ細胞調製物を、フィーダー細胞集団の存在下で産生された増殖ＮＫ細胞調製物と区別することができる（すなわち、フィーダー細胞培養系において産生されたＮＫ細胞は、ＮＫＧ２－ＣタイプＩＩ内在性膜タンパク質を発現しないが、ＮＫＧ２－Ａ／ＮＫＧ２－ＢタイプＩＩ内在性膜タンパク質を発現する。

【0042】

本明細書に記載の方法に従って生成された増殖ＮＫ細胞調製物のＮＫ細胞は、機能的ＮＫ細胞である。換言すれば、増殖細胞調製物のＮＫ細胞は、ＮＫ細胞に起因するそれらの正常な生物学的機能を保持する。ＮＫ細胞機能の非限定的なリストとしては、例えば、細胞傷害性、アポトーシスの誘導、細胞運動性、指向性遊走、サイトカイン及び他の細胞シグナル応答、サイトカイン／ケモカイン産生及び分泌、活性化及び阻害性細胞表面分子の発現、移植宿主における細胞ホーミング及び生着（インビボ保持）、並びに疾患又は疾患プロセスインビボの変化が挙げられる。

【0043】

本開示の別の態様は、本明細書に開示される方法に従って産生されたＮＫ細胞の治療調製物を対象とする。本明細書で言及される場合、ＮＫ細胞の「治療調製物」は、治療有効濃度の機能的ＮＫ細胞を含む調製物である。治療調製物中のＮＫ細胞の量は、企図されるインビボでの使用又は免疫療法に依存して変化する。投与される治療量はまた、患者の状態及び併用療法に依存して変化し、全ての適切な因子を考慮することによって決定されるべきである。

【0044】

本開示の別の態様は、ＮＫ細胞の治療調製物と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を対象とする。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」としては、当業者に既知であるような、任意の及び全ての水性溶媒（例えば、水、生理食塩水、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなど）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、分散媒地、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤又は抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。医薬組成物中の様々な構成成分のｐＨ及び正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。

【0045】

本開示の別の態様は、養子ＮＫ細胞療法を必要とする対象を治療する方法を対象とする。本方法は、養子ＮＫ細胞療法を必要とする対象に、本明細書に開示される方法に従って産生されたＮＫ細胞の治療調製物又はそれを含む医薬組成物を、養子ＮＫ細胞療法を必要とする対象を治療するのに有効な量で投与することを伴う。

【0046】

一実施形態では、養子ＮＫ細胞療法を必要とする対象は、がんを有する対象である。ＮＫ細胞の注入は、急性骨髄性白血病又は多発性骨髄腫などの血液がん、並びにいくつかの固形腫瘍、例えば、脳腫瘍、ユーイング肉腫、及び横紋筋肉腫を含む、ＮＫ細胞溶解に感受性のがんを有する患者のための治療選択肢である。機能的ＮＫ細胞の数の増加はまた、とりわけ、リンパ腫、結腸直腸がん、肺がん、及び乳がんを含むいくつかのがんの治療において使用される治療抗体の有効性を著しく増強し得る。

【0047】

したがって、一実施形態では、養子ＮＫ細胞療法は、がんを有する対象に投与され、増殖ＮＫ細胞調製物は、がん細胞死を引き起こすために投与される。本明細書に開示される増殖ＮＫ細胞調製物による治療に好適な例示的な固形腫瘍としては、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺、及び乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な血液学的腫瘍としては、骨髄の腫瘍、Ｔ細胞悪性腫瘍又はＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、骨髄腫などが挙げられる。本明細書に提供される増殖ＮＫ細胞調製物を使用して治療され得るがんの更なる例としては、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜のがん、胃がん（gastric cancer）又は胃がん（stomach cancer）（胃腸がん及び胃腸間質がんを含む）、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓又は腎細胞がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、様々な種類の頭頸部がん、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、並びに鼻咽頭がん及び黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0048】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って生成された増殖ＮＫ細胞調製物は、原発がん治療と組み合わせてがんを有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、増殖ＮＫ細胞集団は、化学療法、手術、又は放射線と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って生成された増殖ＮＫ細胞調製物は、例えば、多発性骨髄腫を有する対象において、がん治療として自己幹細胞移植を受けた対象に投与される。

【0049】

別の実施形態では、養子ＮＫ細胞療法は、ウイルス感染を有する対象に投与され、増殖ＮＫ細胞調製物を投与して、抗ウイルス免疫及びウイルス感染宿主細胞の死を増強する。本明細書に開示される方法に従って生成された増殖ＮＫ細胞調製物による治療に好適なウイルス感染としては、二本鎖ＤＮＡ（double-stranded DNA、ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（single-stranded DNA、ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ゲノムＲＮＡ（double-stranded genomic RNA、ｄｓＲＮＡ）、一本鎖陽性ＲＮＡ、及び一本鎖陰性ＲＮＡウイルスによって引き起こされるか、又はそれらに関連する任意の感染が挙げられる。任意の実施形態では、ウイルス感染は、急性感染、例えば、インフルエンザ（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１）、パラインフルエンザ、パラミクソウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、エンテロウイルス、痘瘡ウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス感染（例えば、デングウイルス（dengue virus、ＤＥＮＶ）、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、及びジカウイルス）、出血熱ウイルス（例えば、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、及びトガウイルス科のウイルス）、及びコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）による感染であるが、これらに限定されない。任意の実施形態では、ウイルス感染は、肝炎ウイルス、エプスタイン－バーウイルス（ヘルペスウイルス）、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus、ＨＩＶ）などの慢性ウイルス感染である。

【0050】

細胞組成物、例えば、治療有効量の本明細書に記載の増殖ＮＫ細胞を含む組成物を投与する方法は、当該技術分野で知られており、Ｒｅｚｖａｎｉらの米国特許公開第２０１８／０３５３５４４号及びＤａｈｅｒらの同第２０２１／０２３０５４８号に例示されているものなどの手順が挙げられ、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。使用される活性化ＮＫ細胞の量は、インビトロの使用とインビトロの使用との間で、並びに標的細胞の量及び種類に応じて変化し得る。投与される量はまた、患者の状態に依存して変化し、かつ医療者によって全ての適切な因子を考慮することによって決定されるべきである。

【実施例】

【0051】

以下の実施例は、本開示の実施形態を例示するために提供されるが、その範囲を限定することを意図するものではない。

【0052】

実施例１：フィーダーフリー培養系は、ＮＫ細胞集団の著しい増殖を達成する
フィーダーフリー増殖培養の確立のために、ＣＤ３４^＋臍帯血を元とするＮＫ細胞の出発集団を得た。このＮＫ細胞の出発調製物は、ＣＤ５６^＋／－／ＣＤ１６^－／ＣＤ４５^＋／ＣＤ３４^－である未成熟ＮＫ細胞から主に構成された。

【0053】

５％ＦＢＳを含有する１０ｍｌのＮＫ－ＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中のおよそ５×１０^５個の細胞を各々が含有するいくつかの培養物を、０日目（播種日）に播種した。各培養物に、増殖因子の特定の組み合わせを添加して、ＮＫ細胞増殖を誘導するそれらの能力を調査した。これらの組み合わせとしては、抗ＮＫｐ３０モノクローナル抗体コンジュゲートビーズ（ＮＫｐ３０）／抗２Ｂ４モノクローナル抗体コンジュゲートビーズ（２Ｂ４）（０．２５ｕｇ／ｍｌ）、ＮＫｐ３０／２Ｂ４／ＣＤ１５５－Ｆｃコンジュゲートビーズ（ＣＤ１５５）（０．２５ｕｇ／ｍｌのＮＫｐ３０／２Ｂ４及び３ｕｇ／ｍｌのＣＤ１５５）；ＮＫｐ３０／２Ｂ４／ＩＣＡＭ２－Ｆｃコンジュゲートビーズ（ＩＣＡＭ２）（０．２５ｕｇ／ｍｌのＮＫｐ３０／２Ｂ４及び３ｕｇ／ｍｌのＩＣＡＭ２）、ＮＫｐ３０／２Ｂ４／４－１ＢＢＬ－Ｆｃコンジュゲートビーズ（４－１ＢＢＬ）（０．２５ｕｇ／ｍｌのＮＫｐ３０／２Ｂ４及び３ｕｇ／ｍｌの４－１ＢＢＬ）；及びＮＫｐ３０／ＣＤ４８－Ｆｃコンジュゲートビーズ（ＣＤ４８）（０．２５ｕｇ／ｍｌのＮＫｐ３０及び３ｕｇ／ｍｌのＣＤ４８）が挙げられる。比較のために、播種されたＮＫ培養物をまた、４－１ＢＢＬ及びＩＬ２１サイトカインと組み合わせて、伝統的なフィーダー細胞、すなわち、Ｋ５６２細胞、骨髄性白血病細胞株、又はＫ５６２フィーダー細胞の存在下で成長させた。細胞を標準的な培養条件、すなわち、３７℃、５％ＣＯ_２、及び８０％湿度でインキュベートした。

【0054】

図１は、前段落に記載の様々な増殖剤の存在下での培養において１０日間にわたって観察されたＮＫ細胞増殖の増加を示す。増殖させた細胞集団を、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－／ＣＤ４５＋／ＣＤ１６^＋／－の発現プロファイルに基づいて、未成熟ＮＫ細胞と成熟ＮＫ細胞との混合物として特徴付けた。図１のグラフに示されるように、この１０日間の短い培養期間にわたって、ＮＫｐ３０抗体／２Ｂ４抗体／ＣＤ１５５の組み合わせ及びＮＫｐ３０抗体／２Ｂ４抗体／ＩＣＡＭ２の組み合わせで処理した培養物において、ＮＫ細胞の数の＞１５倍の増加が観察された。これらの培養物における増殖倍率は、フィーダー培養物で観察されたＮＫ増殖のレベルに対応した。

【0055】

第２のラウンドの培養では、前段落に記載の第１のラウンドからのＮＫｐ３０／２Ｂ４の存在下で培養した細胞を、増殖因子の同じ又は異なる組み合わせを使用する第２のラウンドの増殖のために選択した。最初の残りのビーズを除去せずに、細胞数を最初の最適数（２．５Ｅ５／ｍｌ）に調整し、次いで新鮮なＮＫｐ３０／２Ｂ４ビーズ（０．２５ｕｇ／ｍｌ）又はＣＤ４８ビーズ（３ｕｇ／ｍｌ）を添加した。全ての他の抗ＣＤ２、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ８０を、個々のコンジュゲートビーズにおいて０．２５ｕｇ／ｍｌ濃度で添加した。

【0056】

図２は、更に１２日間の培養にわたって観察されたＮＫ細胞増殖の増加を示す。この図に示されるように、ＮＫｐ３０を有するＮＫ細胞の出発培養物を、２Ｂ４のリガンドであるＣＤ４８で処理することは、ＮＫｐ３０及び２Ｂ４抗体で処理した培養物と比較して、より高い増殖倍率を有した。他の因子、特にＮＫｐ４６モノクローナル抗体を含めると、増殖が更に増強された。

【0057】

第２の実験において、固体支持体、すなわち、ビーズコンジュゲートの効果を、フィーダーフリー培養物において試験した。この実験では、抗ＮＫｐ３０抗体を抗ビオチンビーズにコンジュゲートし、全ての条件において０．２５ｕｇ／ｍｌで使用した。固体支持体を試験するために、Ａ／Ｇビーズ（棒グラフ上でＡＧ条件として記載される）又は抗ヒトＦｃペプチドを含有するアガロースビーズ（棒グラフ上でＬｉｇａｔｒａｐ条件として記載される）を貫通するようにＣ４８及びＣ１５５をコンジュゲートした。非固体支持体条件では、ＣＤ４８及びＣＤ１５５を、一切のビーズコンジュゲーションなしで抗ヒトＦｃモノクローナル抗体とともにインキュベートした（棒グラフ上でＦｃ条件として記載される）。

【0058】

図３のグラフに示されるように、増殖因子がタンパク質Ａ／Ｇビーズにコンジュゲートされた培養物におけるＮＫ細胞増殖は、ＬｉｇａＴｒａｐビーズ及び抗Ｆｃビーズにコンジュゲートされた因子を含有する培養物と比較して、１０日間にわたって最も高い増殖倍率を有した。

【0059】

第３の実験では、ＮＫｐ３０と組み合わせたＤＮＡＭ１、ＣＤ４８、及び４－１ＢＢＬのｉＮＫ増殖に対する効果を試験した。図４に示されるように、抗ビオチンビーズにコンジュゲートされたＮＫｐ３０とＤＮＡＭ１との組み合わせで処理した培養物におけるＮＫ細胞増殖は、ＬｉｇａＴｒａｐビーズにコンジュゲートされたＣＤ４８又は４－１ＢＢＬを含有する培養物と比較して、１０日間にわたって最も高い増殖倍率を有した。

【0060】

実施例２：フィーダーフリー増殖ＮＫ細胞集団の特徴付け。
フィーダーフリー増殖ＮＫ細胞集団のフローサイトメトリー分析を実施して、集団の異質性を評価した。したがって、ＮＫｐ３０の存在下での３日間の培養及び抗ビオチンビーズにコンジュゲートされた抗ＤＮＡＭ１ビオチン化抗体の存在下での更なる７日間の培養、一般的ＮＫマーカー（ＣＤ５６、ＮＫＰ３０、ＤＮＡＭ１、２Ｂ４）、未成熟ＮＫマーカー（ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４６、ＮＫＰ４４）、及び成熟ＮＫマーカー（ＮＫｐ８０、ＣＤ１６、ＫＩＲ、ＣＲＡＣＣ）の発現を、ＮＫ細胞のＣＤ５６＋ＣＤ３－サブゲート化集団において評価した。加えて、枯渇マーカー、すなわち、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴの発現もまた発現された。

【0061】

がん細胞（Ｋ５６２）に対するフィーダーフリー増殖ＮＫ集団の死滅効力を評価するために、標的細胞を９６ウェルプレートに最適数（２０Ｋ）で播種した。この数は、エフェクター細胞（ＮＫ細胞）の添加後の高い細胞密度を回避するために選択された。アッセイの当日、標的細胞は、９６ウェルプレートに３連で播種した後、少なくとも２時間沈降した。次いで、増殖させたＮＫ細胞を、様々なＥ：Ｔ比（ＮＫ：Ｋ５６２）でプレートに添加し、全ウェル画像を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅイメージングシステムを使用して６時間毎に５０時間記録した。がん細胞に対する増殖ＮＫ細胞の死滅効力を、各時点での蛍光標的細胞の数を時間０でのそれらの数と比較することによって評価した。がん細胞の死滅は、最初の２５時間の時点で容易に検出可能であり、増殖ＮＫ集団の存在下での生存蛍光Ｋ５６２のパーセンテージの減少によって示されるように、経時的に増加した（図６）。死滅はＮＫ細胞比に比例し、最も早い死滅は１０：１及び２．５：１のＥ：Ｔ比の間で起こった。

【0062】

実施例１及び２の考察
ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６又はＣＤ１６の発現及びＣＤ３の不在を特徴とするリンパ球の一種である。ＮＫ細胞は、活性化受容体及び阻害受容体の両方を発現する。ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、２Ｂ４、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、及びＤＮＡＭ－１などの活性化受容体が関与する場合、ＮＫ細胞は、これらの活性化受容体のリガンド（Ｂ７Ｈ６（ＮＫｐ３０リガンド）、ＣＤ４８（２Ｂ４リガンド）、及びＣＤ１５５（ＤＮＡＭ－１リガンド）など）を発現する標的細胞（例えば、がん細胞）を直接死滅させることができる。一方、ＮＫ細胞上の阻害性受容体（ＮＫＧ２Ａ）の関与は、標的細胞の溶解を防止する。

【0063】

養子ＮＫ細胞治療は、がん患者にとって有望な療法である。有効な治療用量に達するために、ＮＫ細胞を大量に増殖させる必要がある。しかしながら、以前の研究は、ＮＫ細胞増殖が細胞老化に起因していくつかの分裂に限定されることを示している。ＮＫ細胞を増殖させるための現在の増殖方法は、Ｋ５６２細胞などの白血病由来フィーダー細胞株上で発現される活性化リガンドを有する高用量サイトカインの使用を伴う。フィーダー細胞の使用は、未知の変数をＮＫ細胞産生システムに導入し、これは、臨床使用のためのＮＫ細胞産物の安全性及び品質にとって好ましくない。本明細書に記載のフィーダーフリー増殖培養プロトコルは、フィーダー細胞の必要性を排除し、したがって、方法論を単純化し、更に同等のレベルの細胞増殖を提供する。

【0064】

更に、本明細書に記載のように産生された増殖ＮＫ集団のフローサイトメトリー分析によって示されるように（図５Ａ～Ｃ）、フィーダーフリー系は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４６、ＮＫＰ４４の発現によって示される後期未成熟ＮＫ細胞（図５Ｂ）と、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６、ＫＩＲ、ＣＲＡＣＣの発現によって示される成熟ＮＫ（図５Ｃ）との混合物を産生する。一方、図５Ｄのフローサイトメトリー分析に示されるように、フィーダーフリー増殖ＮＫ集団は、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴなどの既知のＮＫ枯渇マーカーの発現の欠如によって示されるように、枯渇のいかなる徴候も示さなかった。図５Ａ～Ｄに示されるように、この枯渇の欠如、並びに未成熟状態及び成熟状態の両方の増殖ＮＫの存在は、患者への移植の際の持続性及び増殖能力の観点から有利であるはずである。対照的に、フィーダー細胞系で増殖させたＮＫ細胞は、増殖能力が限られている可能性があり、かつ／又は枯渇により近い成熟ＮＫ細胞のより均一な集団を産生する。

【0065】

図６に示されるように、フィーダーフリー系で増殖させたＮＫ細胞の細胞傷害性は強力であり、少なくとも非特異的標的（Ｋ５６２）に対してフィーダー系で増殖させたＮＫ細胞の公表された細胞傷害性と同等であった。最後に、フィーダー細胞は腫瘍形成性であるため、フィーダーフリー系を用いることによって、フィーダー系細胞培養において腫瘍形成性細胞を除去するために必要とされるような、増殖後の厳密な精製工程を用いる必要性が排除される。

【0066】

好ましい実施形態を本明細書で詳細に描写及び説明するが、本開示の趣旨から逸脱することなく様々な修正、追加、置換などを行うことができ、したがって、これらは以下の特許請求の範囲に定義される本開示の範囲内であると考えられることは、当業者には明らかであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A-1】

【図5A-2】

【図5B-1】

【図5B-2】

【図5C-1】

【図5C-2】

【図5D-1】

【図5D-2】

【図6】

【国際調査報告】