特表 2024-538595 セリアック病エピトープ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-23

(54)【発明の名称】セリアック病エピトープ

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20241016BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20241016BHJP

   C07K 14/415 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 15/29 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241016BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20241016BHJP

   A61P 1/14 20060101ALI20241016BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20241016BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241016BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241016BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241016BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241016BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20241016BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20241016BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06 ZNA

C07K7/08

C07K14/415

C12N15/29

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P1/00

A61P1/14

A61K38/16

A61K47/68

A61K48/00

A61K31/7088

A61K35/76

A61K35/12

A61K39/00 H

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024519079

(86)(22)【出願日】2022-09-28

(85)【翻訳文提出日】2024-05-21

(86)【国際出願番号】 GB2022052450

(87)【国際公開番号】W WO2023052759

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】2113858.1

(32)【優先日】2021-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】510041810

【氏名又は名称】ネクステラ エーエス

【氏名又は名称原語表記】ＮＥＸＴＥＲＡ ＡＳ

(74)【代理人】

【識別番号】110001070

【氏名又は名称】弁理士法人エスエス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】レゼット， ゲール オーゲ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA45

4C076AA95

4C076CC16

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA19

4C084BA41

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA661

4C084ZA662

4C084ZA691

4C084ZA692

4C085AA03

4C085BB11

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZA66

4C086ZA69

4C087AA01

4C087AA03

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA66

4C087ZA69

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA18

4H045BA19

4H045CA30

4H045EA22

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、アミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹを含むたとえばＴ細胞エピトープなどのエピトープ、または１つ以上のＱ残基がＥ残基に置換されたアミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹを含むたとえばＴ細胞エピトープなどのエピトープを含むペプチドを提供し、このペプチドは５０アミノ酸以下の長さである。前記ペプチドおよびＭＨＣ分子を含むコンジュゲートもしくは複合体、並びに前記ペプチドおよび複合体の、さまざまな治療および診断用の使用も提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含むエピトープ、または
１つ以上のＱ残基がＥ残基に置換されたアミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含むエピトープ
を含むペプチドであって、前記ペプチドが５０アミノ酸以下の長さである、ペプチド。

【請求項2】

前記ペプチドが、アミノ酸配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、もしくはＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、または１つ以上の前記Ｑ残基がＥ残基に置換されたアミノ酸配列、またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列を含み、
前記実質的に相同の配列が１、２、または３アミノ酸の置換、付加、または欠失を有する配列を含む、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

前記エピトープが、アミノ酸配列ＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、ＰＹＰＥＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、またはＰＹＰＥＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）を含む、請求項１または請求項２に記載のペプチド。

【請求項4】

前記ペプチドが、前記アミノ酸配列を脱アミドするトランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）によって得ることができる配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項5】

前記ペプチドがアミノ酸配列ＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）を含み、
好ましくは前記ペプチドがＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、またはＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項6】

前記ペプチドがアミノ酸配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）を含み、かつ、
残基３の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基１０の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基８の前記ＱがＥ残基に置換される；
もしくは、
前記ペプチドがアミノ酸配列ＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）を含み、かつ、
残基２の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基９の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基７の前記ＱがＥ残基に置換される；
もしくは、
前記ペプチドがアミノ酸配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を含み、かつ、
残基３の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基１０の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基８の前記ＱがＥ残基に置換される；
請求項１～５のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項7】

前記ペプチドが、アミノ酸配列：
ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、
ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、
ＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、
ＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、または
ＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項8】

前記ペプチドが、アミノ酸配列ＱＰＱＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）またはＱＰＥＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項9】

前記ペプチドが、アミノ酸配列ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）またはＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）を含む、請求項８に記載のペプチド。

【請求項10】

前記ペプチドが、位置１０または位置１０に対応する位置にＧ残基を含み、
好ましくは前記ペプチドが位置１０および１１、または位置１０および１１に対応する位置に残基ＧおよびＴを含む、もしくは、
位置１０および１３、または位置１０および１３に対応する位置に残基ＧおよびＬを含み、
前記位置が請求項１において定義される９量体に関して定義される、請求項１～９のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項11】

ＭＨＣ分子と結合または関連付けされた請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチドを含む、コンジュゲートまたは複合体。

【請求項12】

請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、または
請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体をコードするヌクレオチド配列を含む、１つ以上の核酸分子。

【請求項13】

請求項１２に記載の核酸分子を含む発現ベクター、または前記発現ベクターを含む細胞、もしくは請求項１２に記載の核酸分子を含む細胞。

【請求項14】

請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、請求項１１において定義されるコンジュゲートまたは複合体、請求項１２において定義される核酸分子、もしくは請求項１３において定義される発現ベクターまたは細胞を含む組成物。

【請求項15】

前記組成物がワクチン組成物である、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

対象におけるセリアック病を診断するための方法であって、前記方法が、
前記対象由来のサンプルと、請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチドまたは請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体とを接触させること、および
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体が、前記サンプル中のＴ細胞と結合するかどうか、または
前記サンプルが前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体と結合する抗体を含有するかどうか、を決定することを含み、
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体がＴ細胞と前記結合すること、または前記サンプル中に前記抗体が前記存在することが、前記対象がセリアック病であること、もしくはセリアック病になりやすいことを示す、方法。

【請求項17】

治療に用いるため、好ましくはセリアック病の処置もしくは予防に用いるため、または
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体に対する対象の寛容化に用いるため、または
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体に対する免疫応答の抑制もしくは低減に用いるための、
請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、または請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体、または請求項１２において定義される核酸分子、または請求項１３において定義される発現ベクターもしくは細胞。

【請求項18】

治療に用いるため、好ましくはセリアック病の処置もしくは予防に用いるため、または
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体に対する対象の寛容化に用いるため、または
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体に対する免疫応答の抑制もしくは低減に用いるための、
薬物もしくは組成物の製造における、請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、または請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体、または請求項１２において定義される核酸分子、または請求項１３において定義される発現ベクターもしくは細胞の使用。

【請求項19】

対象におけるＣｅＤを処置もしくは予防する方法、または対象の寛容化の方法、または対象における免疫応答を抑制する方法であって、
前記方法が、請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、または請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体、または請求項１２において定義される核酸分子、または請求項１３において定義される発現ベクターもしくは細胞の有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項20】

請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、または請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体と特異的に結合する結合タンパク質。

【請求項21】

前記結合タンパク質が、Ｔ細胞受容体、または抗体、または抗体の抗原結合ドメインを含む、請求項２０に記載の結合タンパク質。

【請求項22】

前記Ｔ細胞受容体が可溶性Ｔ細胞受容体である、請求項２１に記載の結合タンパク質。

【請求項23】

前記結合タンパク質が、細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくはＴ細胞またはＮＫ細胞の表面に発現される、請求項２０または請求項２１に記載の結合タンパク質。

【請求項24】

前記結合タンパク質が、たとえば細胞毒性部分またはｓｉＲＮＡなどのペイロードと関連付けられるか、またはエフェクター細胞に対する特異性を有する第２の結合タンパク質と関連付けられる、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項25】

治療に用いるため、好ましくはセリアック病の処置または予防に用いるための、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項26】

治療に用いるため、好ましくはセリアック病の処置または予防に用いるための薬物または組成物の製造における、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の結合タンパク質の使用。

【請求項27】

対象におけるセリアック病を処置または予防する方法であって、
前記方法が、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の結合タンパク質の有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項28】

請求項２０～２２のいずれか一項に記載の結合タンパク質を産生する方法であって、
前記方法が、請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、または請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体の使用を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は一般的にエピトープ、特にＴ細胞エピトープの分野に関する。本発明はさらに、前記エピトープを含むペプチドと、前記エピトープまたはペプチドに関する製品またはそれを含む製品とに関する。こうした製品は、特にセリアック病（ＣｅＤ：ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）の処置または診断における治療および診断に使用される。

【背景技術】

【0002】

セリアック病（ＣｅＤ）は免疫の介在する障害であり、特にコムギ（グリアジンおよびグルテニン）、オオムギ（ホルデイン）、およびライムギ（セカリン）などの穀類由来の食餌性グルテンタンパク質に対する異常な腸Ｔ細胞応答などの免疫反応を伴う。

【0003】

ＣｅＤは強力な遺伝的基盤（遺伝的素因）を有し、この疾患の特徴は、ＨＬＡ－ＤＱ２（特にＨＬＡ－ＤＱ２．５だがＨＬＡ－ＤＱ２．２も）またはＨＬＡ－ＤＱ８分子の状況における脱アミドグルテンペプチドを認識するグルテン反応性ＣＤ４ Ｔ細胞である（非特許文献１）。

【0004】

よって、この疾患は強いＨＬＡ関連性を有し、患者の約９０％がＨＬＡ－ＤＱ２．５（ＤＱＡ１＊０５－ＤＱＢ１＊０２）を発現し、残りの患者のほとんどがＨＬＡ－ＤＱ８（ＤＱＡ１＊０３－ＤＱＢ１＊０３：０２）またはＨＬＡ－ＤＱ２．２（ＤＱＡ１＊０２：０１－ＤＱＢ１＊０２）を発現する。グルテンタンパク質はプロリン含有量が高いためにタンパク質分解耐性であり、結果的に腸内に長い免疫原性ペプチドフラグメントが残る。現在、コムギグルテンに対するＴ細胞応答は、タンパク質分解耐性α－グリアジン３３量体ペプチド内に見出され得るα－グリアジンの２つのエピトープ、ＤＱ２．５－グリア－α１ａ（ＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４））およびＤＱ２．５－グリア－α２（ＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５））、ならびにω－グリアジンの２つのエピトープ、ＤＱ２．５－グリア－ω１（ＰＦＰＱＰＥＱＰＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６））およびＤＱ２．５－グリア－ω２（ＰＱＰＥＱＰＦＰＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））に対する反応性に支配されていると考えられている。重要なことに、グルテンペプチドの免疫原性はトランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２：ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ２）酵素による翻訳後修飾によって大きく増強され、この酵素は脱アミドによって特定のグルタミン残基（Ｑ）をグルタミン酸（Ｅ）に転換する。負に帯電したアンカー残基の導入によって、おそらくはｐＭＨＣ（ペプチド－主要組織適合複合体（ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ））の安定性が増加することによって、このペプチドがＨＬＡ－ＤＱ２．５結合のためにより適したものとなるだろう。

【0005】

ＣｅＤの他の特徴は、自己抗原トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）およびグルテンペプチドに対する抗体である（非特許文献２、非特許文献３）。グルテンペプチド反応性のＢ細胞およびＴＧ２反応性のＢ細胞の両方が、グルテン反応性（抗グルテン）ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する抗原提示細胞の働きをすることによって、病原性Ｔ細胞応答に対する増幅ループに関与すると考えられる。よって、Ｂ細胞（抗体）およびＴ細胞応答の両方がＣｅＤに関与する（非特許文献４、非特許文献５）。

【0006】

ＣｅＤにおける免疫応答は、古典的にコムギ、オオムギ、およびライムギ由来のプロリンおよびグルタミンに富むグルテンタンパク質に対して観察されるが、患者によってはカラスムギ（アベニン）にも感受性を示す。ＣｅＤは主に小腸に影響し、古典的な症状はたとえば慢性下痢、腹部膨満および疼痛、吸収障害、ならびに食欲不振などの胃腸の問題を含む。しかし、こうした症状は他の疾患および状態にも共通するため、診断が容易でないことがよくある。患者はＣｅＤの診断が得られるまで重篤な症状を有し、長期間にわたって検査を受けることがある。

【0007】

ＣｅＤに対する唯一の確立された処置は、生涯にわたってグルテン除去食を順守することであり、それは一般的に腸粘膜の回復をもたらし、症状を改善し、合併症が発生するリスクを低減させる。しかし、こうした除去食は恒常性の再確立の達成が不確実になることに加えて、管理および順守の達成が非常に困難である（非特許文献６）。よって、ＣｅＤ患者の再燃および再発は極めて一般的である。

【0008】

加えて、ＣｅＤは診断が困難である。ＴＧ２抗体または抗グルテンペプチド抗体の検出に基づく診断アッセイは極めて疾患特異的であるが、こうしたアッセイにはルーチン的使用を妨げる問題があり（たとえば感度が低いこと、または手順が煩雑であることなど）、これはＣｅＤに罹患した多くの患者が現行の方法を用いて診断され得ないことを意味する。

【0009】

ＣｅＤの比率は、世界の異なる地域において少ないところでは３００分の１から多いところでは４０分の１までさまざまであり、平均すると１００人に１人から１７０人に１人である。しかし、症例の８０％は未診断のままであると推定されている。子供も成人もＣｅＤに罹患し得る。

【0010】

よって、ＣｅＤに対する改善された治療および診断方法は非常に望ましい。たとえばスクリーニングなどによって、症状のない人々の早期診断が可能になることが理想的であろう。

【0011】

この目的のために、過去数年間にわたって、異常なＴ細胞応答を引き起こす作用をし得る、すなわちＣｅＤにおける役割を有し得るグルテン由来のＴ細胞エピトープ（グルテン由来ペプチド）を同定および特徴付けするための研究が行われてきた。ＣｅＤ患者のＣＤ４＋Ｔ細胞は、疾患関連のＨＬＡ－ＤＱ分子（たとえば上記で考察されたＤＱ２．５、ＤＱ２．２、およびＤＱ８など）によって提示されたときにグルテンペプチドを認識するが、健常な対象のものは認識しない。加えて、ＣｅＤ患者のグルテン反応性Ｔ細胞は、抗原ペプチド中の特定のグルタミン（Ｑ）残基が酵素ＴＧ２によってグルタミン酸残基（Ｅ）に転換されたときに、そのペプチドをかなり良好に認識するようになることがしばしば観察される。こうした転換ペプチドは、脱アミドペプチドまたは脱アミドグルテンペプチドとも呼ばれる。疾患関連ＨＬＡ－ＤＱ分子によって提示されるグルテンペプチド／エピトープを認識するＣＤ４＋Ｔ細胞は、疾患のドライバーであると考えられる。

【0012】

グリアジン（α－、γ－、およびω－グリアジン）、グルテニン（高分子量および低分子量グルテニンの両方）、ホルデイン、セカリン、およびアベニンに由来する多くの異なるＨＬＡ－ＤＱ拘束性Ｔ細胞エピトープが同定されている（非特許文献７）。こうしたＴ細胞エピトープは９アミノ酸（９量体）のコア領域を有するが、ほとんどのＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｎ末端およびＣ末端フランキング残基の包含による９アミノ酸より長いペプチドを認識する。加えて、グルテン特異的Ｔ細胞応答は一般的に、グルテンの脱アミドに依存するか、または強く促進される。多くの異なるＴ細胞エピトープが同定されているが、ＣｅＤ患者に対する治療および診断の選択肢を改善するために他のものを同定することが必要である。これは特に、多くのＴ細胞によって認識されるエピトープが未知であるため、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されるＣｅＤ活性グルテンエピトープのプールが完成には程遠いことが広く認識されているためである（非特許文献８）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】リンドフォース（Ｌｉｎｄｆｏｒｓ）ら、２０１９、ネイチャー・レビューズ・ディジーズ・プライマーズ（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｉｓ．Ｐｒｉｍｅｒｓ）、５（３）

【非特許文献2】オスマン（Ｏｓｍａｎ）ら、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノロジー（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２０００；１２１（２）：２４８－２５４

【非特許文献3】ドルム（Ｄｏｒｕｍ）ら、２０１６、サイエンティフィック・リポーツ（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．）６、２５５６５

【非特許文献4】ソリッド（Ｓｏｌｌｉｄ）、２００２、上記

【非特許文献5】スタムネス（Ｓｔａｍｎａｅｓ）およびソリッド、セミナーズ・イン・イムノロジー（Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ．）、２０１５；２７（５）：３４３－３５２）

【非特許文献6】スタムネスら、アドバンスド・サイエンス（Ａｄｖ Ｓｃｉ）（ヴァインハイム（Ｗｅｉｎｈ））、８巻（４）、２０２１

【非特許文献7】ソリッドら、２０２０、イムノジェネティクス（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）７２、８５－８８

【非特許文献8】シャーフ（Ｓｈｅｒｆ）ら、２０２０年３月１７日、フロンティアズ・イン・ニュートリション（Ｆｒｏｎｔ．Ｎｕｔｒ．）

【非特許文献9】ワルコウィアク（Ｗａｌｋｏｗｉａｋ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０２０、５８８（７８３７）：２７７

【非特許文献10】ラキ（Ｒａｋｉ）ら、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、２０１７、１５３（３）：７８７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、ＣｅＤに関連する新たなＴ細胞エピトープの同定に基づくものである。驚くべきことに、このエピトープはこれまで古典的な六倍体のパンコムギ（トリチクム・アエスチブム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ））において見出されていなかったが、二倍体の野生型のコムギ（トリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ））に見出される。特に、コムギゲノムのサイズおよび複雑さ、ならびに複数のコムギ系統に対するゲノムアセンブリデータがないことが、六倍体パンコムギにおいて本明細書に開示される新たなエピトープを含むＣｅＤ関連エピトープが隠されている原因であり得る（非特許文献９）。おそらく、このことがＣｅＤにおける公知のエピトープ反応性の欠如が支配的であることの根底にあるだろう（非特許文献１０）。よってこうしたエピトープは、ＣｅＤの治療および診断に対する心躍る新たな機会を提供するものである。

【0015】

このエピトープは従来の技術を用いて同定されたのではなく、免疫優性α－グリアジンエピトープＤＱ２．５－グリア－α１ａと相互作用する能力を有することで選択された抗体がいくつかの特性を示し、さらに調査したところその抗体がＣｅＤ患者における別のＴ細胞エピトープも認識する可能性が示唆されたという驚くべき発見によって同定された。広範囲のデータベース解析とインビトロ検査との混合によって、この抗体がＣｅＤに関連する新たなＴ細胞エピトープを認識できることが示された。このＴ細胞エピトープは、９量体コア配列（非脱アミド配列）ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を有する。その脱アミド形態も提供される。

【0016】

よって１つの態様において、本発明は、アミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む（またはそれからなる）エピトープ、または１つ以上のＱ残基がＥ残基に置換されたアミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む（またはそれからなる）エピトープを含む、たとえば単離ペプチドなどのペプチドを提供する。

【0017】

代替的に見て、本発明は、アミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む、または１つ以上のＱ残基がＥ残基に置換されたアミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む、たとえば単離ペプチドなどのペプチドを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】Ａ．ＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５－グリア－α１ａ特異的抗体１０７の結合特性を示す図である。８つの異なるＨＬＡ－ＤＱ２．５：グルテンペプチド複合体およびＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＣＬＩＰ２を特異性分析（ｎ＝２）のためのＥＬＩＳＡに用いた。ｐＭＨＣ捕捉レベルを照合するために、ＨＬＡ－ＤＱ２のβ鎖に特異的なｍＡｂ２．１２．Ｅ１１を含めた。エラーバーは２つ組の平均±ＳＤを示す。 Ｂ．腸生検の形質細胞（ＰＣ：Ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ）およびＢ細胞はＤＱ２．５－グリア－α１ａペプチドを提示することを示す図である。未処置セリアック病（ＵＣＤ：ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）もしくは処置セリアック病（ＴＣＤ：ｔｒｅａｔｅｄ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）患者または健常対照のいずれかに由来する腸生検から調製した単一細胞懸濁物中のＰＣおよびＢ細胞におけるＤＱ２．５－グリア－α１ａ提示の検出を行った。マウスＩｇＧ２ｂ ｍＡｂ１０７を検出に用い、二次抗体単独使用に対する陽性細胞のパーセンテージを決定した。ＣＤ１９＋ＰＣにおける対照患者の層別化を行った。各記号は１つの個体に対応する。

【図2-1】Ａ．導出物（ｌｅａｄｓ）の生物物理学的特徴付けを示す図である。ＳＰＲを用いて、ＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５－グリア－α１ａに対するオフ速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）結合に基づいてＦａｂフラグメントをランク付けした。個々のクローンＩＤが示されている。

【図2-2】Ｂ．導出物（ｌｅａｄｓ）の生物物理学的特徴付けを示す図である。Ｆａｂを全長ｈＩｇＧ１に再編成し、関連する可溶性ペプチド：ＨＬＡ－ＤＱ２．５複合体のパネルに対するＥＬＩＳＡで解析した。エラーバーは２つ組の平均±ＳＤを示す。 Ｃ．導出物（ｌｅａｄｓ）の生物物理学的特徴付けを示す図である。Ｂで用いられたそれぞれのペプチドの９量体コアエピトープの配列比較を示す。

【図3】細胞上のｐＭＨＣに対するｍＡｂ４．７Ｃ結合の評価を示す図である。 Ａ．示されるとおりの共有的に連結されたペプチドによってＨＬＡ－ＤＱ２．５を発現するように操作されたマウスＡ２０ Ｂ細胞を５μｇ／ｍｌの抗体によって染色した。 Ｂ．注記のとおりの５０μＭグルテンペプチドをＲａｊｉ Ｂ細胞にインビトロで積載し、５μｇ／ｍｌの抗体によって染色した（１２量体α１ａペプチド：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）；ＣＬＩＰ２ペプチド（ＭＡＴＰＬＬＭＱＡＬＰＭＧＡＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４））：３３量体：ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５））。

【図4-1】Ａ．ｍＡｂ４．７ＣのＴ細胞活性化阻害能力を示す図である。グリアジン特異的ＳＫＷ３ Ｔ細胞の活性化を示す。Ｒａｊｉ Ｂ細胞にペプチドの段階希釈物を積載し、操作されたグリアジン特異的ＳＫＷ３ Ｔ細胞と共培養した。フローサイトメトリーにおいてＣＤ６９^＋ＣＤ１９^－細胞としてＴ細胞活性化を測定した。エラーバーは２つ組（ｎ＝２）の平均±ＳＤを示す。

【図4-2】Ｂ．ｍＡｂ４．７ＣのＴ細胞活性化阻害能力を示す図である。ＣＤ６９アップレギュレーションによって測定された最大Ｔ細胞活性化の６０％をもたらすペプチド用量にて、１μＭのｍＡｂ４．７Ｃまたは０．１μＭのパンＨＬＡ抗体をＲａｊｉ Ｂ細胞に加えた後にＴ細胞とインキュベートした。抗体の存在を伴わないペプチド特異的Ｔ細胞活性化に対するＴ細胞活性化を算出した。

【図5】ｐＨＬＡ特異的抗体は、ＣｅＤ患者の小腸生検に由来する細胞におけるグルテンペプチドの提示を検出することを示す図である。未処置ＨＬＡ－ＤＱ２．５＋ＣｅＤ患者（ｎ＝８）（Ａ）または正常な腸組織構造を有する対照（ｎ＝３）（Ｂ）由来の単一細胞懸濁物を調製した。細胞は、生きた大きいリンパ球ＣＤ３－ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１４－ＣＤ３８＋ＣＤ２７＋ＣＤ１９＋ＣＤ４５＋ＰＣとしてゲートされた（Ａ）。Ａｌｅｘａ－５４６－コンジュゲート二次抗体によって結合されたｍＩｇＧ２ｂ抗体を検出し、アイソタイプ対照抗体（アイソタイプ）の染色に従って設定されたゲートに基づいて、陽性細胞の頻度を算出した。各グループの平均パーセンテージが水平線として示され、点線はアイソタイプ対照の平均バックグラウンド染色を表す。各々のＣｅＤ患者は独自の色で表され、修正されたマーシュスコアによる生検組織構造の変化が示される。

【図6】トリチクム・アエスチブム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）由来のＤＱ２．５－グリア－α１ａと相同のトリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）ペプチドの同定を示す図である。ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅサーチエンジン（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／）を用いて、トリチクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）分類群に対して、ｐ１０にプロリンを有さないが好ましくはグリシンを有するＤＱ２．５－グリア－α１ａ相同ペプチドをサーチすることによって、ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡとして注記される祖先コムギ種トリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）のペプチドを同定した。位置ｐ６およびｐ１０を明瞭にするために四角で囲んでいる（Ａ）。ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡの完全なアミノ酸配列を示す（Ｂ）。ＤＱ２．５－グリア－α１ａ相同ペプチドの仮説的な９量体コアが下線付きの太字で強調されている。

【図7】Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープ候補に対する抗体結合の評価を示す図である。Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡペプチドを、比較のために相同のＤＱ２．５－グリア－α１ａおよびＤＱ２．５－グリア－α２エピトープならびに対応するｐ４およびｐ６位置のＱｌｎ（Ｑ）からＧｌｕ（Ｅ）への交換に対してアライメントした。公知のＰ位置が示されており、特にＤＱ２．５－グリア－α１ａエピトープは人工的なｐ１０グリシン伸長を含有する（Ａ）。記載されるとおり、示されるペプチド（５０μＭ）をヒトＤＱ２．５^＋Ｒａｊｉ細胞にパルスし、ＦＡＣＳにおいて抗体結合を検査した（Ｂ）。

【図8-1】Ａ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープ候補の生理的な関連形態に対する抗体結合の評価を示す図である。Ｔ．ウラルツ（Ｕｒａｒｔｕ）Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ配列をトリプシンおよびキモトリプシンによってインシリコ消化し、その関連消化フラグメントを下線で示している。 Ｂ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープ候補の生理的な関連形態に対する抗体結合の評価を示す図である。Ｔ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）Ｑ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴ（コムギ）配列をトリプシンおよびキモトリプシンによってインシリコ消化し、その関連消化フラグメントを下線で示している。

【図8-2】Ｃ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープ候補の生理的な関連形態に対する抗体結合の評価を示す図である。比較のために、関連配列を相同のＤＱ２．５－グリア－α１ａおよびＤＱ２．５－グリア－α２エピトープならびにｐ６位置のＱｌｎ（Ｑ）からＧｌｕ（Ｅ）への交換に対してアライメントした。公知のＰ位置が示される。 Ｄ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープ候補の生理的な関連形態に対する抗体結合の評価を示す図である。記載されるとおり、示されるペプチドをヒトＤＱ２．５^＋Ｒａｊｉ細胞にパルスし（５０μＭ）、ＦＡＣＳにおいて抗体結合を検査した。

【図9-1】Ａ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡタンパク質のインビトロキモトリプシンタンパク質分解の評価を示す図である。Ｔ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）Ｑ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴ（Ａ）タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生して親和性精製した後に、インビトロキモトリプシン消化および得られたペプチドセグメント（Ｄ）の質量分析を行った。パネルＡ：Ｑ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析。レーンＭ_１：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５１６、レーンＭ_２：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５２１、レーン１：ＢＳＡ（２．００μｇ）、レーン２：Ｑ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴ（還元条件、２．００μｇ）、レーン３：Ｑ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴ（非還元条件、２．００μｇ）、レーン４：Ｑ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴ（還元条件）、レーン５：Ｑ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴ（非還元条件）、一次抗体：マウス抗Ｈｉｓ ｍＡｂ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ００１８６）。 Ｂ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡタンパク質のインビトロキモトリプシンタンパク質分解の評価を示す図である。Ｔ．ウラルツ（Ｕｒａｒｔｕ）Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ（Ｂ）タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生して親和性精製した後に、インビトロキモトリプシン消化および得られたペプチドセグメント（Ｅ）の質量分析を行った。パネルＢ：Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析。レーンＭ１：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５１６、レーンＭ２：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５２１、レーン１：ＢＳＡ（２．００μｇ）、レーン２：Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ（還元条件、２．００μｇ）、レーン３：Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ（還元条件）、一次抗体：マウス抗Ｈｉｓ ｍＡｂ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ００１８６）。

【図9-2】Ｃ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡタンパク質のインビトロキモトリプシンタンパク質分解の評価を示す図である。Ｔ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）Ｑ９ＦＵＷ７＿ＷＨＥＡＴ（Ｃ）タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生して親和性精製した後に、インビトロキモトリプシン消化および得られたペプチドセグメント（Ｆ）の質量分析を行った。パネルＣ：Ｑ９ＦＵＷ７＿ＷＨＥＡＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析。レーンＭ_１：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５１６、レーンＭ_２：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５２１、レーン１：ＢＳＡ（２．００μｇ）、レーン２：Ｑ９ＦＵＷ７＿ＷＨＥＡＴ（還元条件、２．００μｇ）、レーン３：Ｑ９ＦＵＷ７＿ＷＨＥＡＴ（還元条件）、一次抗体：マウス抗Ｈｉｓ ｍＡｂ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ００１８６）。 Ｄ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡタンパク質のインビトロキモトリプシンタンパク質分解の評価を示す図である。Ｔ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）Ｑ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴ（Ａ）タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生して親和性精製した後に、インビトロキモトリプシン消化および得られたペプチドセグメント（Ｄ）の質量分析を行った。関連エピトープの予想される９量体コア領域が一覧で示される。

【図9-3】Ｅ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡタンパク質のインビトロキモトリプシンタンパク質分解の評価を示す図である。Ｔ．ウラルツ（Ｕｒａｒｔｕ）Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ（Ｂ）タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生して親和性精製した後に、インビトロキモトリプシン消化および得られたペプチドセグメント（Ｅ）の質量分析を行った。関連エピトープの予想される９量体コア領域が一覧で示される。 Ｆ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡタンパク質のインビトロキモトリプシンタンパク質分解の評価を示す図である。Ｔ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）Ｑ９ＦＵＷ７＿ＷＨＥＡＴ（Ｃ）タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生して親和性精製した後に、インビトロキモトリプシン消化および得られたペプチドセグメント（Ｆ）の質量分析を行った。関連エピトープの予想される９量体コア領域が一覧で示される。

【図10-1】Ａ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープ候補に対するＣｅＤ由来グルテンペプチド特異的Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ：Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の結合の評価を示す図である。実証済みのＴ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）オメガＱ９ＦＵＷ７＿ＷＨＥＡＴおよびＴ．ウラルツ（ｕｒａｒｔｕ）Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープ候補配列と比較されたＣｅＤプロトタイプのグルテン特異的ＢＣＲ １Ｅ０１／１Ｅ０３の共通エピトープを示す。 Ｂ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープ候補に対するＣｅＤ由来グルテンペプチド特異的Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の結合の評価を示す図である。実証済みのＴ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）オメガＱ９ＦＵＷ７＿ＷＨＥＡＴおよびＴ．ウラルツ（ｕｒａｒｔｕ）Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープ候補配列と比較されたＣｅＤプロトタイプのグルテン特異的ＢＣＲ １Ｅ０１／１Ｅ０３の共通エピトープを示す。 Ｃ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープ候補に対するＣｅＤ由来グルテンペプチド特異的Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の結合の評価を示す図である。記載されるとおり、再編成された可溶性ＩｇＧの形態で、ＥＬＩＳＡにおける固定ペプチドに対する結合について、１Ｅ０１／１Ｅ０３ ＢＣＲを検査した。

【図10-2】Ｄ．Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープ候補に対するＣｅＤ由来グルテンペプチド特異的Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の結合の評価を示す図である。ペプチド捕獲（ｃａｔｃｈｅｒ）ＥＬＩＳＡにおける反応性ＰＣ２およびＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６ペプチドに対する１Ｅ０３ ＢＣＲ結合力の比較のためのＥＣ５０決定を示す。

【図11-1】Ａ．昆虫細胞において産生される組み換え可溶性ｐＨＬＡの産生を示す図である。１５ａａ合成リンカー（ＧＡＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６））を用いて共有結合されたグリアジンペプチドを備えたＨＬＡ－ＤＱ２．５外部ドメインの可溶性組み換えバージョンは、ジェンスクリプトによってＳｆ９昆虫細胞を用いて生成され、本質的に記載されるとおりにビオチン化された（カルステンら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２００１、１６７：４８６１）。等量のタンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって評価することで、完全性を評価した。それぞれのバージョンにおいて、次のグリアジンペプチドが用いられた。（Ａ）ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）。パネルＡ：ＤＱＢ１＊０２０１：ＤＱ２５＿ｇｌｉａ＿ａ１ａ＿ＤＱＡ１＊０５０１のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析。レーンＭ_１：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５１６、レーンＭ_２：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５２１、レーン１：ＢＳＡ（２．００μｇ）、レーン２：ＤＱＢ１＊０２０１：ＤＱ２５＿ｇｌｉａ＿ａ１ａ＿ＤＱＡ１＊０５０１（還元条件、２．００μｇ）、レーン３：ＤＱＢ１＊０２０１：ＤＱ２５＿ｇｌｉａ＿ａ１ａ＿ＤＱＡ１＊０５０１（還元条件）、一次抗体：マウス抗Ｈｉｓ ｍＡｂ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ００１８６）、一次抗体：マウス抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ００１８７）、一次抗体：ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）－ＨＲＰ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０００９１）。

【図11-2】Ｂ．昆虫細胞において産生される組み換え可溶性ｐＨＬＡの産生を示す図である。１５ａａ合成リンカー（ＧＡＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６））を用いて共有結合されたグリアジンペプチドを備えたＨＬＡ－ＤＱ２．５外部ドメインの可溶性組み換えバージョンは、ジェンスクリプトによってＳｆ９昆虫細胞を用いて生成され、本質的に記載されるとおりにビオチン化された（カルステンら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２００１、１６７：４８６１）。等量のタンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって評価することで、完全性を評価した。それぞれのバージョンにおいて、次のグリアジンペプチドが用いられた。（Ｂ）ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）。パネルＢ：ＤＱＢ１＊０２０１：ＤＱ２５＿ｇｌｉａ＿ａ１ａ＿ｍｕｔａｎｔ＿ＤＱＡ１＊０５０１のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析。レーンＭ_１：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５１６、レーンＭ_２：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５２１、レーン１：ＢＳＡ（２．００μｇ）、レーン２：ＤＱＢ１＊０２０１：ＤＱ２５＿ｇｌｉａ＿ａ１ａ＿ｍｕｔａｎｔ＿ＤＱＡ１＊０５０１（還元条件、２．００μｇ）、レーン３：ＤＱＢ１＊０２０１：ＤＱ２５＿ｇｌｉａ＿ａ１ａ＿ｍｕｔａｎｔ＿ＤＱＡ１＊０５０１（還元条件）、一次抗体：マウス抗Ｈｉｓ ｍＡｂ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ００１８６）、一次抗体：マウス抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ００１８７）、一次抗体：ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）－ＨＲＰ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０００９１）。

【図11-3】Ｃ．昆虫細胞において産生される組み換え可溶性ｐＨＬＡの産生を示す図である。１５ａａ合成リンカー（ＧＡＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６））を用いて共有結合されたグリアジンペプチドを備えたＨＬＡ－ＤＱ２．５外部ドメインの可溶性組み換えバージョンは、ジェンスクリプトによってＳｆ９昆虫細胞を用いて生成され、本質的に記載されるとおりにビオチン化された（カルステンら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２００１、１６７：４８６１）。等量のタンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって評価することで、完全性を評価した。それぞれのバージョンにおいて、次のグリアジンペプチドが用いられた。（Ｃ）ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）。パネルＣ：ＤＱＢ１＊０２０１：ＤＱ２５＿ｇｌｉａ＿ａ２＿ＤＱＡ１＊０５０１のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析。レーンＭ_１：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５１６、レーンＭ_２：タンパク質マーカー、ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５２１、レーン１：ＢＳＡ（２．００μｇ）、レーン２：ＤＱＢ１＊０２０１：ＤＱ２５＿ｇｌｉａ＿ａ２＿ＤＱＡ１＊０５０１（還元条件、２．００μｇ）、レーン３：ＤＱＢ１＊０２０１：ＤＱ２５＿ｇｌｉａ＿ａ２＿ＤＱＡ１＊０５０１（還元条件）、一次抗体：マウス抗Ｈｉｓ ｍＡｂ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ００１８６）、一次抗体：マウス抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ００１８７）、一次抗体：ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）－ＨＲＰ（ジェンスクリプト、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０００９１）。 Ｄ．昆虫細胞において産生される組み換え可溶性ｐＨＬＡの産生を示す図である。ＢＣＲおよびＴ細胞エピトープ候補配列の両方を含むＴ．ウラルツ（ｕｒａｒｔｕ）Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ同定配列の脱アミドバージョン（Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ－２Ｅ＿ｐ６Ｅ＿ｍｅｄｉｕｍ）をここでＤＱ２．５－グリア－ＮＴＰ－００１として再注記する。

【図12-1】Ａ．昆虫細胞において産生された組み換え可溶性ｐＨＬＡ（ｒｓ－ｐＨＬＡ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐＨＬＡ）に対する抗体結合の評価を示す図である。示されるペプチドを備えたＨＬＡ－ＤＱ２．５のビオチン化可溶性組み換えバージョンをニュートラアビジン（ｎｅｕｒａｖｉｄｉｎ）コーティングしたウェルに固定して、ＥＬＩＳＡにおける示された抗体（ｍＡｂ）との反応性を評価した。立体構造特異的なパン（ｐａｎ－）ＨＬＡ－ＤＱ（ｍＡｂ ＳＰＶＬ３）およびパンＨＬＡ－ＤＲ（ｍＡｂ Ｌ２４３）の使用によるｒｓ－ｐＨＬＡの検出を示す。 Ｂ．昆虫細胞において産生された組み換え可溶性ｐＨＬＡ（ｒｓ－ｐＨＬＡ）に対する抗体結合の評価を示す図である。示されるペプチドを備えたＨＬＡ－ＤＱ２．５のビオチン化可溶性組み換えバージョンをニュートラアビジン（ｎｅｕｒａｖｉｄｉｎ）コーティングしたウェルに固定して、ＥＬＩＳＡにおける示された抗体（ｍＡｂ）との反応性を評価した。立体構造特異的なパンＨＬＡ－ＤＱ（ｍＡｂ ＳＰＶＬ３）およびパンＨＬＡ－ＤＲ（ｍＡｂ Ｌ２４３）の使用によるｒｓ－ｐＨＬＡの検出を示す。

【図12-2】Ｃ．昆虫細胞において産生された組み換え可溶性ｐＨＬＡ（ｒｓ－ｐＨＬＡ）に対する抗体結合の評価を示す図である。示されるペプチドを備えたＨＬＡ－ＤＱ２．５のビオチン化可溶性組み換えバージョンをニュートラアビジン（ｎｅｕｒａｖｉｄｉｎ）コーティングしたウェルに固定して、ＥＬＩＳＡにおける示された抗体（ｍＡｂ）との反応性を評価した。立体構造特異的なパンＨＬＡ－ＤＱ（ｍＡｂ ＳＰＶＬ３）およびパンＨＬＡ－ＤＲ（ｍＡｂ Ｌ２４３）の使用によるｒｓ－ｐＨＬＡの検出を示す。 Ｄ．昆虫細胞において産生された組み換え可溶性ｐＨＬＡ（ｒｓ－ｐＨＬＡ）に対する抗体結合の評価を示す図である。示されるペプチドを備えたＨＬＡ－ＤＱ２．５のビオチン化可溶性組み換えバージョンをニュートラアビジン（ｎｅｕｒａｖｉｄｉｎ）コーティングしたウェルに固定して、ＥＬＩＳＡにおける示された抗体（ｍＡｂ）との反応性を評価した。ＴＣＲ様ｍＡｂ１０７、４．７Ｃ、および３．Ｃ１１それぞれの使用による個々のｒｓ－ｐＨＬＡの検出を示す。

【図12-3】Ｅ．昆虫細胞において産生された組み換え可溶性ｐＨＬＡ（ｒｓ－ｐＨＬＡ）に対する抗体結合の評価を示す図である。示されるペプチドを備えたＨＬＡ－ＤＱ２．５のビオチン化可溶性組み換えバージョンをニュートラアビジン（ｎｅｕｒａｖｉｄｉｎ）コーティングしたウェルに固定して、ＥＬＩＳＡにおける示された抗体（ｍＡｂ）との反応性を評価した。ＴＣＲ様ｍＡｂ１０７、４．７Ｃ、および３．Ｃ１１それぞれの使用による個々のｒｓ－ｐＨＬＡの検出を示す。 Ｆ．昆虫細胞において産生された組み換え可溶性ｐＨＬＡ（ｒｓ－ｐＨＬＡ）に対する抗体結合の評価を示す図である。示されるペプチドを備えたＨＬＡ－ＤＱ２．５のビオチン化可溶性組み換えバージョンをニュートラアビジン（ｎｅｕｒａｖｉｄｉｎ）コーティングしたウェルに固定して、ＥＬＩＳＡにおける示された抗体（ｍＡｂ）との反応性を評価した。ＴＣＲ様ｍＡｂ１０７、４．７Ｃ、および３．Ｃ１１それぞれの使用による個々のｒｓ－ｐＨＬＡの検出を示す。

【図13】ＣｅＤ患者由来のＴＣＲ再構築ＳＫＷ３ Ｔ細胞を用いたＴ細胞活性化の評価を示す図である。 （Ａ）Ｒａｊｉ Ｂ細胞にＤＱ２．５－グリア－α１ａペプチド（Ｎ－ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ－Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３））の段階希釈物を積載し、操作されたグリアジン特異的ＳＫＷ３ Ｔ細胞と共培養した。フローサイトメトリーにおけるＣＤ６９＋ＣＤ１９－細胞としてＴ細胞活性化を測定した。 （Ｂ）Ｒａｊｉ Ｂ細胞に１０μＭの示されるペプチドを積載し、操作されたグリアジン特異的ＳＫＷ３ Ｔ細胞と共培養した。フローサイトメトリーにおけるＣＤ６９＋ＣＤ１９－細胞としてＴ細胞活性化を測定した。以下のペプチドが使用された。それぞれＤＱ２．５－グリア－α２（Ｎ－ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥ－Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７））、Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ４Ｑ＿ｐ６Ｑ＿ｍｅｄｉｕｍ（Ｎ－ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ－Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０））、Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ４Ｑ＿ｐ６Ｅ＿ｍｅｄｉｕｍ（Ｎ－ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ－Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８））、Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ４Ｅ＿ｐ６Ｅ＿ｍｅｄｉｕｍ（Ｎ－ＱＰＱＱＰＹＰＥＱＥＱＰＹ－Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８））、Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ６Ｅ＿ｌｏｎｇ（Ｎ－ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ－Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０））。ペプチド非依存性の最大Ｔ細胞活性化を評価するための陽性対照としてホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ：Ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ）が用いられ、それぞれペプチドの不在下でＳＫＷ３およびＲａｊｉ細胞を共培養することによって、非活性化Ｔ細胞に対するベースライン閾値が設定された。

【図14】ＰＢＭＣを用いたＣＤ４ Ｔ細胞ペプチド刺激能力の細胞内ＩＦＮγフロー評価を示す図である。確認済みの健常対照（ＨＣ：ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌｓ）およびＣｅＤ患者由来の凍結保存されたＨＬＡ－ＤＱ２．５タイプのＰＢＭＣを購入し（ヘマケア（ＨｅｍａＣａｒｅ）－Ｃｅｌｌｅｒｏ）、自己インビトロＴ細胞ペプチド刺激アッセイに続くフローにおける細胞内ＩＦＮγ染色に用いた。（Ａ）ＣｅＤドナー５９５由来のＰＢＭＣを用いて、抗ＩＦＮγ－ＰＥを用いてＣＤ３／ＣＤ４ Ｔ細胞に対する細胞内ＩＦＮγベースライン検出ゲートを設定した。（ＢおよびＣ）Ａに示されるＣＤ４＋／ＩＦＮγ＋（Ｂ）およびＣＤ４－／ＩＦＮγ＋（Ｃ）ゲートにおける細胞内ＩＦＮγ検出を表す棒グラフである。ＣｅＤドナー５９５およびＨＣ５７５由来のＰＢＭＣを２０μＭのＤＱ２．５－グリア３３量体（Ｎ－ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ－Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９））およびＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ６Ｅ＿ｌｏｎｇ（Ｎ－ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ－Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０））によって４８時間刺激した後に、細胞内Ｔ細胞ＩＦＮγ検出を行った。

【図15】ＰＢＭＣを用いたＣＤ４ Ｔ細胞ペプチド刺激能力の細胞内ＩＦＮ－γフロー評価を示す図である。確認済みの健常対照（ＨＣ）およびＣｅＤ患者由来の凍結保存されたＨＬＡ－ＤＱ２．５タイプのＰＢＭＣを購入し（ヘマケア－Ｃｅｌｌｅｒｏ）、自己インビトロＴ細胞ペプチド刺激アッセイに続くフローにおける細胞内ＩＦＮ－γ染色に用いた。図１４と同様に、抗ＩＦＮ－γ－ＰＥを用いてＣＤ３／ＣＤ４ Ｔ細胞に対する細胞内ＩＦＮ－γベースライン検出ゲートを設定した。ＣｅＤドナー（５８５、５９５、および６００）およびＨＣ（５５７および５５８）由来のＰＢＭＣを２０μＭのＤＱ２．５－グリア３３量体（Ｎ－ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ－Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９））およびＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ６Ｅ＿ｌｏｎｇ（Ｎ－ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ－Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０））によって４８時間刺激した後に、細胞内Ｔ細胞ＩＦＮ－γ検出を行った（ＡおよびＢ）。値は平均値および±ＳＥＭとして提示される。

【発明を実施するための形態】

【0019】

よって、本発明のペプチドは上記の９アミノ酸配列（９量体）を含み、これはコア配列またはコアエピトープ配列とみなされ得る。しかし、こうしたコア配列がＭＨＣ分子に関連するとき、すなわちペプチド－ＭＨＣ（ｐ－ＭＨＣ：ｐｅｐｔｉｄｅ－ＭＨＣ）複合体が関与するときは、９量体のＮ末端および／またはＣ末端のフランキング残基も相互作用のために典型的に重要である。よって、たとえば上記の９量体を有し、かつＮ末端および／またはＣ末端に追加のアミノ酸を有するペプチドなどの、より長い配列を有するペプチドも予期される。任意の適切な数の追加フランキングアミノ酸残基が含まれ得る。たとえば、そのペプチドがたとえばＨＬＡ－ＤＱ２．５またはＨＬＡ－ＤＱ２．２などのＭＨＣ分子に関連付けられるか、またはそれと複合体を形成するか、またはそれと結合する能力を有するときに、こうした追加の残基が含まれ得る。好ましい例は、上記の９量体のＮ末端および／またはＣ末端にたとえば１、２、３、または４など最大４つのアミノ酸残基を有する配列を含む。他の好ましい例は、上記の９量体の位置９ならびに位置８および９がそれぞれＹまたはＰＹ残基によって終結する配列、すなわちＣ末端に任意のフランキング残基を有さない配列を含む。図９Ｅにいくつかの例示的配列が示される。

【0020】

９量体に直接隣接（フランキング）する２つの残基、すなわち位置－１または１０（９量体の９つのアミノ酸をＮ末端からＣ末端へ位置１～９と呼ぶとき）は、ペプチドとＭＨＣ分子との相互作用、たとえばペプチドとＭＨＣ分子のペプチド結合溝との相互作用などにとって特に重要であり得る。よって、本発明の好ましいペプチドは、位置－１のＱ残基および／または位置１０のＧ残基を含んでもよく、たとえばアミノ酸配列ＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、もしくはＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、またはその脱アミドバージョンなどを含んでもよい。ペプチドのこうした脱アミドバージョンまたは形態においては、任意の１つ以上のＱ残基がＥ残基に置換され得るが、脱アミド（またはＥ残基の位置決め）のために好ましい好都合の位置が下線で示される。

【0021】

本発明の他の好ましいペプチドは、９量体のＮ末端のＱＱおよび／または９量体のＣ末端のＧＴを含んでもよい。たとえば、こうしたペプチドはアミノ酸配列ＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、ＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、もしくはＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、またはその脱アミドバージョンを含む。いくつかの実施形態において、ＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、もしくはＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、またはその脱アミドバージョンを含むペプチドが好ましい。ペプチドのこうした脱アミドバージョンまたは形態においては、任意の１つ以上のＱ残基がＥ残基に置換され得るが、脱アミド（またはＥ残基の位置決め）のために好ましい好都合の位置が下線で示される。例示的ペプチドにおいて、Ｑ残基をＥ残基で置換するためにこれらの位置の一方または両方が脱アミド（または別様に提供）されてもよい。

【0022】

本発明の他の好ましいペプチドは、９量体のＮ末端のＰＱＱおよび／または９量体のＣ末端のＧＴＳを含んでもよい。たとえば、こうしたペプチドはアミノ酸配列ＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、もしくはＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、またはその脱アミドバージョンを含む。いくつかの実施形態において、ＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、もしくはＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、またはその脱アミドバージョンを含むペプチドが好ましい。ペプチドのこうした脱アミドバージョンまたは形態においては、任意の１つ以上のＱ残基がＥ残基に置換され得るが、脱アミド（またはＥ残基の位置決め）のために好ましい好都合の位置が下線で示される。例示的ペプチドにおいて、Ｑ残基をＥ残基で置換するためにこれらの位置の一方または両方が脱アミド（または別様に提供）されてもよい。

【0023】

本発明の他の好ましいペプチドは、９量体のＮ末端のＱＰＱＱおよび／または９量体のＣ末端のＧＴＳＬを含んでもよい。たとえば、こうしたペプチドはアミノ酸配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、もしくはＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、またはその脱アミドバージョンを含む。いくつかの実施形態において、ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、またはその脱アミドバージョンを含むペプチドが好ましい。ペプチドのこうした脱アミドバージョンまたは形態においては、任意の１つ以上のＱ残基がＥ残基に置換され得るが、脱アミド（またはＥ残基の位置決め）のために好ましい好都合の位置が下線で示される。例示的ペプチドにおいて、Ｑ残基をＥ残基で置換するためにこれらの位置の一方または両方が脱アミド（または別様に提供）されてもよい。

【0024】

上記の１、２、３、または４フランキング残基の例の組み合わせも提供される。よってたとえば、Ｎ末端またはＣ末端の１フランキング残基と、他方の末端の上述のフランキング残基の２、３、または４とを組み合わせることができ、あるいはＮ末端またはＣ末端の２フランキング残基と、他方の末端の上述のフランキング残基の１、３、または４とを組み合わせることができ、あるいはＮ末端またはＣ末端の３フランキング残基と、他方の末端の上述のフランキング残基の１、２、または４とを組み合わせることができ、あるいはＮ末端またはＣ末端の４フランキング残基と、他方の末端の上述のフランキング残基の１、２、または３とを組み合わせることができる。

【0025】

本発明の他の例示的ペプチドは、９量体のＮ末端のみに追加のアミノ酸を含む。
本発明のペプチドは、一般的に最大５０アミノ酸の長さ（または５０アミノ酸以下の長さ）である。よって好ましいペプチドは、最大で５０、４５、４０、３８、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、または９アミノ酸（またはそれ以下）の長さであるか、またはそれらの長さである。本発明のこの態様において、上記で概説されたたとえばコアＴ細胞エピトープ配列などのコア９量体エピトープ配列またはその脱アミド形態が包含されるように、ペプチドの最小の長さは９アミノ酸である。よって、好ましいペプチドは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸の長さであるか、あるいは少なくともその長さである。たとえば９から５０、４５、４０、３５、３０、または２５アミノ酸の長さなど、たとえば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７から５０、４５、４０、３５、３０、２５、または２０アミノ酸の長さなどである。他の好ましいペプチドは最大１５アミノ酸の長さ、たとえば９～１５アミノ酸の長さなど、たとえば１３アミノ酸の長さなどである。他の好ましいペプチドは最大２０アミノ酸の長さ、たとえば９～２０アミノ酸の長さなど、たとえば１７アミノ酸の長さなどである。他の好ましいペプチドは最大２５または３０アミノ酸の長さ、たとえば９～２５または９～３０アミノ酸の長さなど、たとえば１３または１７アミノ酸の長さなどである。他の好ましいペプチドは最大４０アミノ酸の長さ、たとえば９～４０または９～３８アミノ酸の長さなど、たとえば図９Ｅに示されるとおりの長さなどであり、図９Ｅは本発明のいくつかの例示的ペプチドの配列も示す。その脱アミド（またはＥ残基含有）バージョンが好ましいことがある。

【0026】

よって、本発明の実施形態は、アミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む（またはそれからなる）エピトープか、または１つ以上のＱ残基がＥ残基に置換されたアミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む（またはそれからなる）エピトープを含む、たとえば単離ペプチドなどのペプチドを提供し、このペプチドは５０アミノ酸以下の長さであり、上記および本明細書の他の場所に記載される好ましい長さおよび好ましい例示的な配列を有する。

【0027】

当然のことながら、本発明によるペプチドまたは単離ペプチドは、本発明のペプチドおよびエピトープが見出され得るトリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）由来の全長オメガグリアジンタンパク質（すなわち、野生型または自然に生じるオメガグリアジントリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）タンパク質）、または任意のその他の全長（野生型または自然に生じる）グリアジンタンパク質、またはオメガグリアジンファミリーの任意のその他の全長（野生型または自然に生じる）タンパク質、または任意のその他の全長（野生型または自然に生じる）タンパク質を含まない。よって、本発明によるペプチドまたは単離ペプチドは全長のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースのエントリー番号Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６）またはＵｎｉｐａｒｃアクセッション番号：ＵＰＩ０００６１８Ｄ０６Ａに対応するを含まない。

【0028】

本発明のペプチドまたは単離ペプチドはＣｅＤに関連することが提案されるため、それらのペプチドはグルテンタンパク質またはグリアジンタンパク質に見出され得るか、またはそれに由来し得る。したがって、こうした配列は一般的に自然に生じる配列であり、たとえば自然に生じる配列のフラグメントまたはその脱アミドバージョンなどである。

【0029】

よって、本発明のペプチドまたは単離ペプチドは、たとえば、グルテンまたはグリアジンタンパク質の領域またはフラグメント（またはエピトープ）など、たとえば全長（野生型または自然に生じる）オメガグリアジントリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）タンパク質（例、本明細書の他の場所に記載されるもの）あるいは代替的なグルテンまたはグリアジンタンパク質における同等または類似の配列などの、たとえば全体または全長のグルテンまたはグリアジンタンパク質の領域またはフラグメント（またはエピトープ）などに対応する（または本質的に対応する）。本発明のいくつかのペプチドは、それ自体が自然に生じる（すなわち、自身の自然に生じる対応物を有するか、またはたとえば自然に生じるフラグメントなどの自然に生じるものである）と考えられる。しかし、本発明のいくつかのペプチドは、それ自体が自然に生じない（すなわち、自身の自然に生じる対応物を有さないか、またはたとえば自然に生じるフラグメントではないなど、自然に生じるものではない）。よって、本発明のいくつかのペプチド（または前記ペプチドを含む複合体もしくはコンジュゲート）は人工ペプチド、または合成ペプチド、または人造ペプチド、または非天然ペプチドとみなされ得る。

【0030】

この文脈における「対応する」は、単離ペプチドのアミノ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）が、野生型（または自然に生じる）オメガグリアジントリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の同等の領域またはエピトープのアミノ酸配列と一致することを意味する。「本質的に対応する」は、ペプチドのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）が、野生型（または自然に生じる）オメガグリアジントリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の同等の領域またはエピトープの配列に基づく（またはそれに由来する、またはその修飾された形態の）ものであるとして同定可能であることを意味する。たとえば、野生型（または自然に生じる）オメガグリアジントリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）タンパク質の同等の領域またはエピトープに「本質的に対応する」配列を有するペプチドは、野生型（または自然に生じる）オメガグリアジントリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）タンパク質の同等の領域またはエピトープの配列に対応する（すなわち、正確に対応する）ペプチドと比較して、典型的に１つ以上（例、１、２、３、４、または５、好ましくは１、２、または３）アミノ酸の置換、付加、または欠失を有する。よって、野生型（または自然に生じる）オメガグリアジントリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）タンパク質の同等の領域またはエピトープに「本質的に対応する」配列を有するペプチドは、本明細書の他の場所において定義される「実質的に相同の」ペプチド配列とみなされてもよい。

【0031】

本発明の好ましいペプチドは、アミノ酸配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）（１３量体）、ＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（１４量体）、もしくはＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）（１７量体）、または前記配列において１つ以上の前記Ｑ残基がＥ残基に置換されたものを含む。

【0032】

本明細書の他の場所で言及されるとおり、ＣｅＤに関連するペプチドまたはエピトープは、一般的にＱがＥ残基に変更された１つ以上の残基を含有する。こうしたＥ含有配列はいくつかの態様において好ましく、それは本明細書において脱アミドペプチド、脱アミドバージョン、もしくは脱アミド形態、またはその他の類似もしくは同等の用語でも呼ばれる。よって、１つ以上またはすべてのＱ残基がＥ残基に置換された（またはＱ残基の代わりにＥ残基が存在する）ペプチド配列が本発明によって予期される。よって、本明細書に記載される９量体コア配列（ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８））を参照すると、この９量体の位置４、５、６、または７における（または対応する）１、２、３、または４つのＱ残基がＥ残基に置換され得る。しかし、９量体コア配列を参照すると、本発明の好ましいペプチドは、位置６のＱ残基がＥ残基に置換されたものである。本発明の他のペプチドは、位置４のＱ残基がＥ残基に置換されたものである。本発明の他のペプチドは、位置６のＱ残基および位置４のＱ残基がＥ残基に置換されたものである。この９量体がもっと長いペプチド内に存在するとき、Ｅ残基の適切な位置は、配列内のどこに９量体が存在するかに従って調整される。言い換えると、これらの位置（および、別様に示されているときを除き、本明細書に記載されるその他のアミノ酸の位置）は９量体コア配列に関連して定義され、それより長いペプチド配列は、９量体における上述の位置に対応する位置（例、位置６および／もしくは位置４、または位置６および／もしくは位置４に対応する位置）にＥ残基を有する。

【0033】

よって、本発明の好ましいペプチドは、配列ＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、ＰＹＰＥＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、またはＰＹＰＥＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）を含む。

【0034】

本明細書の他の場所に記載されるとおり、ＣｅＤ患者においてトランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）酵素は、ＣｅＤの進行中に観察されるグルテン由来配列の生理的脱アミドを担うと考えられている。よって、ＴＧ２酵素によって脱アミドされた配列を含むペプチドか、またはＴＧ２脱アミドによって得ることができる配列を含むペプチドか、またはＴＧ２酵素によって脱アミドされた配列に対応する配列を含むペプチドが好ましい。よってこれらの配列は、本発明の例示的な好ましい脱アミドペプチドを表す。ＴＧ２酵素はＱＸＰ残基を基質として用いて、脱アミド反応によってこの配列をＥＸＰに転換し得る（ソリッド、２００２、ネイチャー・レビューズ・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）２：６４７－６５５）。よって、上述の非脱アミド（健常または野生型）９量体ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）における位置６のＱ残基は、ＣｅＤ患者において脱アミドされる可能性が最も高い残基である。よって、配列ＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）を含むペプチドが特に好ましい。こうしたペプチドの具体例は、ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、またはＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）を含むペプチドである。

【0035】

これらのより長いペプチド、ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、またはＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、および本発明のその他のより長いペプチドのいくつかには、ＴＧ２酵素に対するさらなる古典的基質（ＱＸＰ配列／モチーフ）が存在し、すなわちここでは配列ＱＱＰが脱アミドされてＥＱＰとなり得る。このモチーフは上記の配列に示されており、脱アミドされてＥ残基となり得るＱが下線で示される。ここでも、この位置にＥ残基を有するペプチドがいくつかの態様において好ましい。

【0036】

他の実施形態において、本発明のペプチドは配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）を含み、ここで残基３の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または（たとえばＴ細胞エピトープなどの本発明のエピトープのコア９量体における位置６に対応する）残基１０の前記ＱがＥ残基に置換される。任意選択で、または付加的に、（たとえばＴ細胞エピトープなどの本発明のエピトープのコア９量体における位置４に対応する）残基８の前記ＱがＥ残基に置換される。

【0037】

よっていくつかの実施形態において、本発明のペプチドは配列ＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）を含み、ここで残基２の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または（たとえばＴ細胞エピトープなどの本発明のエピトープのコア９量体における位置６に対応する）残基９の前記ＱがＥ残基に置換される。任意選択で、または付加的に、（たとえばＴ細胞エピトープなどの本発明のエピトープのコア９量体における位置４に対応する）残基７の前記ＱがＥ残基に置換される。

【0038】

他の実施形態において、本発明のペプチドは配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を含み、ここで残基３の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または（たとえばＴ細胞エピトープなどの本発明のエピトープのコア９量体における位置６に対応する）残基１０の前記ＱがＥ残基に置換される。任意選択で、または付加的に、（たとえばＴ細胞エピトープなどの本発明のエピトープのコア９量体における位置４に対応する）残基８の前記ＱがＥ残基に置換される。

【0039】

こうした実施形態の好ましい例は、次の配列を含むペプチドである。
ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、
ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、
ＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、
ＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、または
ＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）。

【0040】

これらのペプチドにおいて２番目の下線の残基が、たとえばＴ細胞エピトープ９量体などの本発明のエピトープのコア９量体における位置６に対応する。
他の具体例は、たとえばＴ細胞エピトープ９量体などの本発明のエピトープのコア９量体における位置４に対応する位置に追加のＥ残基を含む上記ペプチドを含んでもよく、またはたとえばＴ細胞エピトープ９量体などの本発明のエピトープのコア９量体における位置４に対応する位置に唯一のＥ残基が存在する上記ペプチドを含んでもよい（言い換えると、上記に挙げられた９つのペプチドにおける下線の残基が両方ともＱ残基であり、たとえばＴ細胞エピトープ９量体などの本発明のエピトープのコア９量体における位置４に対応する位置がＥ残基である。

【0041】

本明細書の他の場所で言及されるとおり、ＣｅＤはＢ細胞およびＴ細胞応答の両方を伴うと考えられている。本明細書には、本発明のたとえばＴ細胞エピトープなどの新たに同定されたエピトープのコア９量体を含むペプチドが記載される。しかし、上記および本明細書の他の場所に記載されるペプチドのいくつかは、たとえばＢ細胞エピトープなどとして作用し得る第２のエピトープＱＰＱＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）も含有する。こうしたエピトープ、またはたとえばこのＢ細胞エピトープの位置１、３、もしくは４（またはこれらの位置に対応する位置）のＱ残基の１つ、２つ、もしくは３つなどの１つ以上のＱ残基がＥ残基に置換された、こうしたエピトープの脱アミドバージョン（またはＱ残基の代わりにＥ残基が存在するバージョン）を含むか、またはさらに含むペプチドが好ましい。

【0042】

たとえばＢ細胞エピトープなどのこのエピトープの配列ＱＰＱＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）の位置３のＱ残基が、ＴＧ２酵素に対する基質となる可能性が最も高い（それはＴＧ２酵素に対する古典的ＱＸＰモチーフであるモチーフＱＱＰの中に存在し、ＥＱＰに転換されるはずである）。よって、ＣｅＤの進行におけるＴＧ２の提案される役割のため、本発明のペプチドに見出される特に好ましい第２のエピトープまたはＢ細胞エピトープ配列は、配列ＱＰＥＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）を含む。

【0043】

よって、本発明の代替的な態様は、配列ＱＰＱＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）または上述のとおりのその脱アミドバージョン（またはＱ残基の代わりにＥ残基が存在するバージョン）、特にＱＰＥＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）を有する、たとえばＢ細胞エピトープなどのエピトープを提供する。たとえばＢ細胞エピトープなどのこのエピトープの配列ＱＰＱＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、または上述のとおりのその脱アミドバージョン、特にＱＰＥＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）を含むペプチド配列は、さらなる態様を提供する。

【0044】

たとえば本明細書において定義されるとおり、本発明のいくつかのペプチドは、たとえばＴ細胞エピトープなどの第１またはコア９量体含有エピトープと、たとえばＢ細胞エピトープなどの第２のエピトープとの両方を含む。好ましいこうしたペプチドは、たとえばＴ細胞エピトープなどの第１のエピトープと、たとえばＢ細胞エピトープなどの第２のエピトープとを重複して有する。言い換えると、こうした実施形態において、第１のエピトープまたはＴ細胞エピトープのアミノ酸残基の少なくとも１つが、第２のエピトープまたはＢ細胞エピトープの一部も形成し、逆も同様である。たとえば、本発明の特に好ましいペプチドにおいて、第２の（またはＢ細胞）エピトープの末端部のＰＹＰ残基は、第１の（またはＴ細胞）エピトープの一部も形成し、たとえば第１の（またはＴ細胞）エピトープの最初の３つのアミノ酸を提供する。こうした実施形態の好ましい例は、次の配列を含むペプチドである。

【0045】

ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、
ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、または
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）。

【0046】

この実施形態による特に好ましいペプチドは、配列ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）またはＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）を含む。他の例は、配列ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、またはその一方もしくは両方のＥ残基の代わりにＱ残基を有するバージョンを含む。

【0047】

食餌性グルテンは、摂取されるとたとえば小腸内腔などの腸空間内のプロテアーゼによって分解されて、部分的に消化されたグルテンペプチドまたはタンパク質分解耐性ペプチドが形成される。次いで、ＣｅＤ進行の機構の一部として、たとえば小腸の固有層などにおいてＴＧ２によるこれらのペプチドの脱アミドが起こり得る。こうした脱アミドペプチドをＴ細胞およびＢ細胞が認識することが、ＣｅＤに関与すると考えられる。よって、本発明のいくつかの実施形態において、好ましいペプチドは、こうした自然に生じる（天然）ペプチド、たとえば自然に生じる部分的に消化されたグルテンペプチドまたは自然に生じるタンパク質分解耐性ペプチド（またはその脱アミドバージョン、特にその自然に生じる脱アミドバージョン）などを含有するか、または含むか、またはそれからなるか、またはそれに対応する。本発明のペプチドのトリプシン消化解析は、ペプチド配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）および／もしくはＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、またはその自然に生じる変異体、たとえば実質的に相同の配列であって、たとえば実質的に相同の配列の最終（またはＣ末端）アミノ酸として（第１の配列の末端部に示される）ＹもしくはＰＹを有するもの、または実質的に相同の配列の最終（またはＣ末端）アミノ酸として（第２の配列の末端部に示される）ＬまたはＳＬを有するものなどが、小腸内で自然に生じる（または生成される）可能性が最も高いことを示した。よっていくつかの実施形態において、これらの配列、またはこれらの配列を含む（またはそれからなる）配列、またはたとえばトリプシンおよび／もしくはキモトリプシン消化などのトリプシン消化によって生成（例、インビトロ）もしくは予期（例、インシリコ）される配列、またはその自然に生じる変異体（または本明細書の他の場所に記載されるその脱アミドバージョン）が好ましい。図９Ｅに例示的なペプチド配列が示されており、これらの配列を有するペプチドまたはこれらの配列を含む（またはそれからなる）ペプチドは例示的配列であり、特にたとえば図９Ｅまたは本明細書の他の場所に記載されるものなどの残基ＰＹまたはＹで終わる（または終結する）ペプチドである。特に、こうしたペプチドの脱アミド（またはＥ残基含有）バージョンが提供され、好ましくはそのＥ残基は本明細書の他の場所に記載される位置に存在し、その位置はたとえば図９Ｅに示される９量体コア配列に関する位置６、－２、および４のうちの１つ以上、たとえば位置６および／または－２などである。

【0048】

本発明の好ましいペプチドまたはエピトープは、単離ペプチドまたはエピトープである。本発明の好ましいエピトープは、Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープ、特にＴ細胞エピトープである。よって、本発明の好ましいペプチドは、Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープの配列を含むか、または含有するか、またはそれからなるか、またはそれに対応する。本発明の他の好ましいペプチドは、Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープを含有する配列を含むか、または含有するか、またはそれからなるか、またはそれに対応する。

【0049】

本明細書において用いられる「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、適切なＭＨＣ／ＨＬＡ分子、ここではＨＬＡ－ＤＱ２．５またはＨＬＡ－ＤＱ２．２分子の抗原ペプチド溝と結合するか、関連付けられるか、複合体を形成するか、またはそこで提示されることが可能なアミノ酸配列を示す。加えてこうしたＴ細胞エピトープは、前記ＨＬＡ分子と関連付けられるときに、Ｔ細胞受容体によって認識または結合されることによって、たとえばＴ細胞の増殖を刺激するなどの、Ｔ細胞の活性化またはＴ細胞反応性の促進を行い得る。これらのＴ細胞は、本明細書においてグルテン特異的（またはグルテン反応性）Ｔ細胞またはグルテン特異的（またはグルテン反応性）ＣＤ４＋Ｔ細胞と呼ばれることもある。Ｔ細胞エピトープのコア領域の典型的な長さは、９アミノ酸である。

【0050】

本明細書において用いられる「Ｂ細胞エピトープ」という用語は、抗体分子（またはＢ細胞受容体）によって認識または結合され得るアミノ酸配列を示す。こうした抗体分子は、Ｂ細胞上に（Ｂ細胞受容体として）存在するか、または可溶性の形態で存在し得る。たとえばＢ細胞エピトープの長さなど、抗体に認識または結合されるペプチド配列の長さは、非常に可変である。上述のとおり、本明細書に記載される特定のＢ細胞エピトープは７アミノ酸を含むが、Ｂ細胞エピトープはこれより短くも長くもなり得る。

【0051】

たとえばＴ細胞エピトープなどの本発明のペプチドまたはエピトープは、グリアジン－オメガ（ω）ペプチドまたはエピトープと分類され得る。たとえばＴ細胞エピトープなどの本発明のペプチドまたはエピトープは、好ましくはＤＱ２．５拘束性である。言い換えると、それらはＭＨＣクラスＩＩ／ＨＬＡ分子ＨＬＡ－ＤＱ２．５と結合するか、または関連付けられるか、またはそれによって提示されることが可能なペプチドまたはエピトープである。代替的または付加的に、たとえばＴ細胞エピトープなどの本発明のペプチドまたはエピトープは、ＤＱ２．２拘束性であり得る。言い換えると、それらはＭＨＣクラスＩＩ／ＨＬＡ分子ＨＬＡ－ＤＱ２．２と結合するか、または関連付けられるか、またはそれによって提示されることが可能なペプチドまたはエピトープである。よって本発明のペプチドまたはエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ／ＨＬＡ分子ＨＬＡ－ＤＱ２．５またはＨＬＡ－ＤＱ２．２、好ましくはＨＬＡ－ＤＱ２．５と複合体（ｐＭＨＣ複合体）を形成し得る。

【0052】

ＨＬＡ－ＤＱ２．５（ＤＱＡ１＊０５およびＤＱＢ１＊０２によってコードされる）は、ＣｅＤとの強い関連性を有する特定のタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子である。ＨＬＡ－ＤＱ２．２（ＤＱＡ１＊０２：０１－ＤＱＢ１＊０２によってコードされる）は、ＣｅＤとの関連性を有する別の特定のタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子である。

【0053】

ＨＬＡ－ＤＱ２．５はα鎖（典型的にα_１ドメインおよびα_２ドメインを有し、典型的にＤＱＡ１＊０５によってコードされる）と、β鎖（典型的にβ_１ドメインおよびβ_２ドメインを有し、典型的にＤＱＢ１＊０２によってコードされる）とを含む。ＨＬＡ－ＤＱ２．５のα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列は、本明細書に示されている（α鎖配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、β鎖配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される）。

【0054】

ＨＬＡ－ＤＱ２．５（またはＨＬＡ－ＤＱ２．２）は、たとえばα－グリアジンまたはω－グリアジンのペプチドまたはエピトープなどのグリアジンペプチドまたはエピトープをＴ細胞（例、ＣＤ４＋Ｔ細胞）に提示し得る。ＨＬＡ－ＤＱ２．５（またはＨＬＡ－ＤＱ２．２）によって提示される好ましいペプチドまたはエピトープは、本明細書に記載される本発明のペプチドまたはエピトープ、たとえばＴ細胞エピトープなどである。本発明のさまざまな脱アミドＤＱ２．５エピトープおよびペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の他の場所に提供されている。本発明のＤＱ２．５エピトープおよびペプチドのこれらの脱アミド形態は、ＤＱ２．５エピトープおよびペプチドのＣｅＤ関連形態と考えられてもよく、それらは一般的に好ましい。

【0055】

たとえばＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、またはＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）（または本明細書に記載されるその脱アミドバージョン）などのペプチドなど、本発明のより長いペプチドはＨＬＡ－ＤＱ２．５（またはＨＬＡ－ＤＱ２．２）に関連付けられ（または結合し）得るが、ＨＬＡ－ＤＱ２．５（またはＨＬＡ－ＤＱ２．２）分子（すなわちＭＨＣ分子）の結合溝（または結合ポケットまたはペプチド溝、または抗原ペプチド溝）は、所与のときに単一の９量体エピトープ（例、ＤＱ２．５－コアエピトープＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、または本明細書に記載される脱アミドされた同等の配列）しか提示または収容できない。どのエピトープがＨＬＡ－ＤＱ２．５（またはＨＬＡ－ＤＱ２．２）によって提示されるかは、より長いペプチドがＨＬＡ－ＤＱ２．５（またはＨＬＡ－ＤＱ２．２）と結合（関連付け）される「レジスタ」（または位置）によって決定される。

【0056】

本発明のたとえばＤＱ２．５エピトープまたはペプチドなどのエピトープまたはペプチドの非疾患関連形態（または「天然」形態または非脱アミド形態または「健常」形態）は、配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む。

【0057】

本発明のたとえばＤＱ２．５エピトープまたはペプチドなどのエピトープまたはペプチドの好ましい疾患関連形態（脱アミド形態またはＣｅＤ関連形態または病原性形態）は、配列ＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）を含む。

【0058】

加えて、エピトープの非疾患関連形態は、たとえばタンパク質分解耐性のより長いペプチドなどのより長いペプチド上に存在してもよく、このより長いペプチドは配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）もしくはＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、またはその自然に生じる変異体を含む（またはそれからなる）。

【0059】

同様に、エピトープの疾患関連形態も、たとえばタンパク質分解耐性のより長いペプチドなどのより長いペプチド上に存在してもよく、それは配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）もしくはＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）の脱アミド形態、またはその自然に生じる変異体、たとえば次のものなどを含み（またはそれからなり）得る。

【0060】

ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、
ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、
または本明細書の他の場所に記載されるその他のＥ残基含有ペプチド、または上記のいずれかの自然に生じる変異体。

【0061】

本明細書において提供される任意の配列と実質的に相同の配列を含むペプチドまたはエピトープも提供される。

【0062】

本発明のペプチド配列の文脈において、所与のアミノ酸配列と「実質的に相同の」配列は、その所与のアミノ酸配列と比較したときに１、２、３、４、５、または６（好ましくは１、２、または３）アミノ酸の置換または欠失または付加を含有する配列を有する配列またはそれを含む配列であるか、あるいはその所与のアミノ酸配列に対する少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列であるか、あるいはその所与のアミノ酸配列の少なくとも６つの連続するアミノ酸を有する配列であってもよい。

【0063】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のペプチドと「実質的に相同の」アミノ酸配列は、所与のペプチドのアミノ酸配列と比較したときに１、２、または３アミノ酸の置換または付加または欠失（好ましくは１つまたは２つ、より好ましくは１つ）を有する配列を有する配列であるか、あるいはそれを含む配列である。

【0064】

本発明のペプチドと「実質的に相同の」アミノ酸配列は、単離ペプチドの少なくとも６つの連続するアミノ酸を含む（またはそれからなる）配列（あるいは単離ペプチドの少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、もしくは少なくとも３０の連続するアミノ酸を含むか、またはそれからなる配列）を含む。適切なＨＬＡ分子によって提示され、かつＴ細胞受容体によって認識または結合されるＴ細胞エピトープのコア領域の典型的な長さは、９アミノ酸である。たとえばＢ細胞エピトープの典型的な長さなど、抗体によって認識または結合されるペプチド／タンパク質配列の典型的な長さは、６または７アミノ酸以上であろう。本明細書の他の場所に記載されるとおり、Ｔ細胞および／またはＢ細胞エピトープを含むペプチド、たとえば配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）および／もしくはＱＰＱＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、またはその脱アミドバージョン（両方とも存在するときは、これらの配列が重複し得る）を含むペプチドなどが好ましい。よって、本発明の他の例示的ペプチドは、本明細書に記載されるＴ細胞および／またはＢ細胞エピトープを含む配列と実質的に相同の配列を含む。

【0065】

本発明の代替的なペプチドまたは実質的に相同のペプチドは、９アミノ酸より長く、かつ９量体コア配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む配列を含む。言い換えると、好ましい実質的に相同のペプチドは、本明細書において定義されるとおりのペプチド配列を有するが、たとえば本明細書に記載されるアミノ酸の置換、欠失、または付加（例、１、２、または３つの変更、好ましくは１または２、より好ましくは１）などのアミノ酸の変動は、９量体コア配列の外側に位置する。こうしたペプチドに対する適切な長さは、本明細書の他の場所に記載される。

【0066】

アミノ酸配列の変更は、保存的または非保存的アミノ酸によるものであり得る。好ましくは、前記変更はアミノ酸置換である。好ましくは、前記変更は保存的アミノ酸置換である。

【0067】

本明細書において用いられる「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されており、それは塩基性側鎖（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。

【0068】

「実質的に相同の」という用語は、本発明のアミノ酸配列と実質的に同じやり方で実質的に同じ機能を行う、本発明のアミノ酸配列の修飾物または化学的同等物も含む。たとえば、本発明によって包含される任意の実質的に相同のペプチドは、典型的には必要に応じてＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープとして作用する能力を保持するべきである。Ｔ細胞エピトープの場合、こうした実質的に相同のペプチドは、たとえばＭＨＣクラスＩＩ／ＨＬＡ分子、特にＨＬＡ－ＤＱ２、たとえばＨＬＡ－ＤＱ２．５（またはＨＬＡ－ＤＱ２．２）などと結合するか、または関連付けられる能力を保持する。

【0069】

代替的に、または付加的に（好ましくは付加的に）、こうした実質的に相同のペプチドは、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（好都合には非修飾または非変異配列と結合するか、またはそれを認識するＴＣＲ）と結合するか、それと相互作用するか、もしくはそれに認識される能力、および／または、たとえばＴ細胞の増殖もしくは炎症性サイトカイン産生などのＴ細胞応答を活性化もしくは刺激する能力を有する。

【0070】

Ｂ細胞エピトープの場合、こうした実質的に相同のペプチドは、たとえば抗グルテンまたは抗グリアジン（例、抗Ｔ．ウラルツ（Ｕｒａｒｔｕ）オメガグリアジン）抗体またはＢ細胞受容体、特に本発明のペプチド（例、非修飾または非変異ペプチド）と結合するかまたはそれを認識し得る抗体（またはＢＣＲ）に結合される能力を保持する。

【0071】

代替的に、または付加的に、こうした実質的に相同のペプチドは、自身に対して（または対抗して）、たとえばＴ．ウラルツ（Ｕｒａｒｔｕ）のオメガグリアジンなどのオメガグリアジンと結合する抗体が生成（または産生）され得るようなペプチドまたはエピトープとして作用する能力を保持する。

【0072】

本発明の実質的に相同のペプチドの上記の機能特性は、本発明の非修飾または野生型または親ペプチド配列と比較することによって好都合に評価され得る。典型的に、実質的に相同のペプチドのこうした機能特性は、非修飾、野生型、または親ペプチド配列によって観察されるものと（またはそれと比較されるときに）少なくとも同じ量、レベル、または程度まで観察されるだろう。

【0073】

（例、「実質的に相同の」配列を生成するための）アミノ酸の上述の操作を実行する方法は、当業者に周知である。
好ましくは、本発明のこうしたペプチドまたは実質的に相同のペプチドは、本明細書に記載されるコア９量体の位置６に対応する位置に、Ｑまたは好ましくはＥ残基を保持する。

【0074】

本発明の他の好ましいペプチドまたは実質的に相同のペプチドは、本明細書に記載されるコア９量体に関する位置１０か、または位置１０に対応する位置にＧ残基を含む。例示的なこうした配列は、位置１０にＧ残基を含むか、または位置１０および１１にそれぞれＧＴ残基を含むか、または位置１０および１３にそれぞれＧおよびＬ残基を含むか、または位置１０、１１、１２、および１３（または対応する位置）にそれぞれＧＴＳＬ残基を含むだろう。

【0075】

本発明の他の好ましいペプチドまたは実質的に相同のペプチドは、自然に生じるペプチド（またはそれと実質的に相同の配列）を含む。特に、本発明の好ましいペプチドは、小腸において見出されるペプチドに対応するもの、たとえば胃腸管内のプロテアーゼの作用によって得られるかまたは得ることができる、自然に生じるタンパク質分解フラグメント（またはタンパク質分解耐性ペプチド）などである。好ましい自然に生じるペプチド（または実質的に相同のペプチド）の配列を確認するために、たとえばトリプシン消化を実行することなどによって、こうしたプロテアーゼの作用をインビトロで模倣できる。こうした研究によって、本発明の好ましいペプチドまたは実質的に相同のペプチドは、最終（またはＣ末端）アミノ酸としてＹまたはＰＹを有することが示される。本発明の他の好ましいペプチドまたは実質的に相同のペプチドは、最終（またはＣ末端）アミノ酸としてＬまたはＳＬを有する。Ｙ残基は、たとえば本明細書に記載される９量体コアの位置９（または位置９に対応する位置）などに見出され得る。Ｌ残基は、たとえば本明細書に記載される９量体コアに関する位置１３（または位置１３に対応する位置）などに見出され得る。よって、これらの位置にこれらの残基を有するペプチドが好ましく、他の位置は変異アミノ酸配列を有してもよく、たとえば他の位置は任意のアミノ酸を含み得る。より好ましいペプチドは、９量体コアも含有する。

【0076】

本発明の他の好ましいペプチドまたは実質的に相同のペプチドは、９量体コアの位置４、５、６、および７に対応する位置にＱまたはＥ残基を有し、好ましくは位置９（または対応する残基）にＹ残基を有する。本明細書の他の場所に記載されるとおり、こうしたペプチドにおける位置４または６、好ましくは６のＥ残基が好ましく、この場合の例示的な位置４～７（または対応する残基）はＱＱＥＱまたはＥＱＥＱである。

【0077】

本発明の他の好ましいペプチドまたは実質的に相同のペプチドは、第１のエピトープもしくはＴ細胞エピトープの位置－２に対応する位置か、または第２のエピトープもしくはＢ細胞エピトープの位置３に対応する位置に、Ｑまたは好ましくはＥ残基を含む。好ましい実施形態において、このＱまたはＥ残基は、第１（Ｔ細胞）および第２（Ｂ細胞）のエピトープの両方において同じ残基である。

【0078】

本発明の他の好ましいペプチドまたは実質的に相同のペプチドは、第１のエピトープもしくはＴ細胞エピトープの位置２に対応する位置か、または第２のエピトープもしくはＢ細胞エピトープの位置６に対応する位置にＹ残基を含む。好ましい実施形態において、このＹ残基は、第１（Ｔ細胞）および第２（Ｂ細胞）のエピトープの両方において同じ残基である。

【0079】

本発明の他の好ましいペプチドまたは実質的に相同のペプチドは、１つ以上の位置においてグルタミン酸（Ｅ）残基の代わりにアスパラギン酸（Ｄ）残基を有し得る。
疑念を回避するために、本明細書における本発明のペプチドなどの脱アミドバージョンまたは形態への言及は、任意のプロセスによって生成されるこうした形態のペプチドを含んでおり、すなわちそれはＱ残基の脱アミドによって特定の位置に生成されたＥ残基のみを示すものではなく（適切であればそのようにペプチドが生成され得るが）、たとえばそれらのＥ残基を有するペプチドの合成または組み換えによる作製などの任意の適切な手段によって、１つ以上の位置のＱ残基の代わりにＥ残基が存在するペプチドまたはアミノ酸配列を示す。よって、本明細書において最も広く用いられるペプチドの脱アミドバージョンまたは形態への言及は、元のペプチド配列に存在する１つ以上のＱ残基の場所に、すなわちその代わりに存在する１つ以上のＥ残基を有する配列を示す。

【0080】

相同性（例、配列の同一性）は、任意の好都合な方法によって評価されてもよい。しかし、配列間の相同性（例、同一性）の程度を決定するためには、たとえばＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、２２：４６７３－４６８０、１９９４）などの、配列のマルチプルアライメントを行うコンピュータプログラムが有用である。もし所望であれば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムと、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８９：１０９１５－１０９１９、１９９２）ならびにギャップ開始ペナルティ１０およびギャップ伸長ペナルティ０．１とを共に用いることによって、一方の配列の全長の少なくとも５０％がアライメントに含まれている２つの配列間の最高オーダのマッチを得ることができる。配列をアライメントするために用いられ得る他の方法は、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）のアライメント法（ニードルマンおよびブンシュ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、４８：４４３、１９７０）がスミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）（スミスおよびウォーターマン、アドバンシズ・イン・アプライド・マスマティクス（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．）、２：４８２、１９８１）によって改訂されて、２つの配列間の最高オーダのマッチが得られ、かつ２つの配列間の同一アミノ酸の数が決定されるようになったものである。２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージを算出するための他の方法は、当該技術分野において一般的に認識されており、それはたとえば、カリロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）およびリプトン（Ｌｉｐｔｏｎ）（カリロおよびリプトン、ＳＩＡＭジャーナル・オン・アプライド・マスマティクス（ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、４８：１０７３、１９８８）に記載されるもの、および「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスク（Ｌｅｓｋ）、ｅ．ｄ．オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８８、「バイオコンピューティング：インフォマティクスおよびゲノミクスプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」に記載されるものなどを含む。

【0081】

一般的に、こうした計算のためにコンピュータプログラムが使用されることとなる。配列対を比較およびアライメントするプログラム、たとえばＡＬＩＧＮ（マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、ＣＡＢＩＯＳ、４：１１－１７、１９８８）、ＦＡＳＴＡ（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８５：２４４４－２４４８、１９８８；ピアソン、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１８３：６３－９８、１９９０）、およびギャップド（ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴ（アルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、２５：３３８９－３４０２、１９９７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＧＣＧ（デバロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）、ヘベルリ（Ｈａｅｂｅｒｌｉ）、スミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１２：３８７、１９８４）などもこの目的のために有用である。さらに、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＤａｌｉサーバは、タンパク質配列の構造に基づくアライメントを提供する（ホルム（Ｈｏｌｍ）、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２０：４７８－４８０、１９９５；ホルム、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、２３３：１２３－３８、１９９３；ホルム、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）、２６：３１６－９、１９９８）。

【0082】

基準点を提供するために、（たとえばインターネット上のＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバ、ＩＧＨ、モンペリエ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ）にて利用可能なものなどの）デフォルトパラメータを有するＡＬＩＧＮプログラムを用いて、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性、配列同一性などを有する本発明による配列が決定されてもよい。

【0083】

いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示されるたとえば単離ペプチドなどのペプチドの配列（またはそれと実質的に相同の配列）の伸長または切断されたバージョンを含む（またはそれからなる）、たとえば単離ペプチドなどのペプチドを提供する。

【0084】

本発明のペプチドは、本明細書に開示されるペプチド配列の伸長バージョンか、または本明細書に開示されるペプチド配列と実質的に相同のアミノ酸配列の伸長バージョンを含んでも（またはそれからなっても）よい。たとえば、１つ以上の追加のアミノ酸（例、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、もしくは少なくとも２５のアミノ酸、または１～５もしくは１～１０もしくは１～２０のアミノ酸）が、ペプチド配列（またはそれと実質的に相同の配列）の一方の末端部または両方の末端部に存在してもよい。

【0085】

本明細書において定義される本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体をコードするヌクレオチド配列を含む（またはそれからなる）核酸分子、あるいはそれと実質的に相同の核酸分子は、本発明のさらなる態様を形成する。本発明の核酸分子を含むベクターもしくは発現ベクター、または前記発現ベクターもしくは核酸分子を含むたとえば宿主細胞などの細胞は、さらなる態様を形成する。前記ベクターまたは細胞は、たとえば治療または診断用の使用および方法などにおいて、本明細書に記載される本発明のさまざまな態様における核酸分子の代替物として用いられ得る。

【0086】

本明細書において核酸配列に関連して用いられる「実質的に相同の」という用語は、出発核酸配列に対する少なくとも６５％、７０％、または７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0087】

本明細書において用いられる「核酸配列」または「核酸分子」という用語は、自然に生じる塩基と、糖と、糖間（骨格）リンケージとで構成されるヌクレオシドまたはヌクレオチド単量体の配列を示す。この用語は、自然に生じない単量体またはその一部分を含む修飾または置換配列も含む。本発明の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む自然に生じる塩基を含んでもよい。この配列は修飾塩基も含有してもよい。こうした修飾塩基の例は、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンを含む。核酸分子は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。核酸分子は、全体的または部分的に合成または組み換えであってもよい。

【0088】

ここに記載されるか、または本明細書の他の場所に記載される所望の配列をコードするために、１つ以上の核酸分子が用いられてもよい。

【0089】

本発明の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドもしくはエピトープもしくはコンジュゲートもしくは複合体のアミノ酸配列、またはそれと実質的に相同の配列からなるか、または本質的にそれからなるペプチドもしくはタンパク質、あるいは前記ペプチドもしくはエピトープもしくはコンジュゲートもしくは複合体をコードする核酸分子、またはそれと実質的に相同の核酸分子は、本発明のさらなる態様を形成する。

【0090】

本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはエピトープを含むコンジュゲート（または複合体）を提供する。典型的に、このコンジュゲート（または複合体）は、たとえばＣＤ４＋Ｔ細胞などのＴ細胞にペプチドまたはエピトープを提示するように構成される。典型的に、このコンジュゲート（または複合体）は、Ｔ細胞受容体にペプチドまたはエピトープを提示するように構成される。このコンジュゲート（または複合体）は、第２の構成要素または別の実体と結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）（例、連結または接続または接合またはコンジュゲートまたは結合（ｂｏｎｄｅｄ））されるか、または別様に関連付けられた、本明細書の他の場所において定義された本発明の少なくとも１つのペプチドまたはエピトープを含んでもよい。

【0091】

例示的なコンジュゲート（または複合体）は、本発明のペプチドまたはエピトープが、ＭＨＣ分子、典型的にはＭＨＣクラスＩＩ分子（ＨＬＡ分子）にたとえば物理的に結合されるなどして結合されて、ペプチド－ＭＨＣ（ｐ－ＭＨＣ）コンジュゲート／複合体を形成したものを含んでもよい。こうした結合は、当該技術分野において公知であり報告されている方法によって達成され得る。たとえば、本発明のペプチドまたはエピトープは、たとえばペプチドまたは他のリンカーまたはリンケージの手段（例、化学リンカーまたはリンケージ）などを介して、ＭＨＣまたはＭＨＣクラスＩＩ分子のαまたはβ鎖（またはそのフラグメントもしくは変異体、たとえば機能フラグメントもしくは変異体など、たとえば切断フラグメントもしくは変異体など）に結合され得る。よって、こうしたリンカーまたはリンケージは典型的に人工、合成、または自然に生じないリンカーまたはリンケージである。たとえば非天然配列または人工配列などの適切な配列を有するペプチドリンカーは、好ましくは好都合に遺伝子融合物として提供され得る。代替的に、こうしたリンケージを提供するために、たとえばソルターゼＡなどのクリックケミストリーの適用が用いられ得る。

【0092】

こうした結合または結合手段は、典型的かつ好都合には永続的な、共有結合の、または不可逆的なリンケージを介して実行され得る。同様に、前記結合はたとえば物理的関連付けなどの関連付けを介してもよく、ここではたとえば本発明のペプチドまたはエピトープが、物理的リンケージによって接合されることなく、たとえばＭＨＣ分子などの別の実体または第２の構成要素と結合または関連付けされ得る。よって、本発明の遊離または単離ペプチドは、好都合にＭＨＣ分子に積載（ｌｏａｄｅｄ）または結合され得る。

【0093】

ＭＨＣまたはＭＨＣクラスＩＩ分子の例示的な機能フラグメントまたは変異体は、本発明のペプチドまたはエピトープと結合するか、または別様に関連付けられる能力を保持するものである。たとえば、いくつかの操作されたＨＬＡ変異体、たとえば切断変異体などが当該技術分野において報告されており、これらのいずれかが用いられてもよい。

【0094】

本明細書の他の場所と同様に、こうしたコンジュゲート（または複合体）で用いるために好ましいＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＱ２分子（またはその鎖もしくはフラグメント）、特にＨＬＡ－ＤＱ２．５分子またはＨＬＡ－ＤＱ２．２分子（またはその鎖もしくはフラグメント）である。よってこうした分子はＭＨＣまたはＨＬＡ分子、たとえばＨＬＡ－ＤＱ２．５分子などを含み、それは本発明のたとえばω－グリアジンエピトープなどのたとえばグリアジンエピトープなどのペプチドまたはエピトープを提示（または「積載」）する。別の言い方をすると、こうしたコンジュゲートはＨＬＡ－ＤＱ２．５－ペプチドまたはＨＬＡ－ＤＱ２．２－ペプチドコンジュゲート／複合体（ｐＭＨＣ）であってもよく、ここで本発明のペプチドまたはエピトープは抗原結合溝において提示される（または抗原結合溝に収容される）。クラスＩＩ ＭＨＣ分子を含有するこうしたｐＭＨＣ複合体、たとえばＨＬＡ－ＤＱ２．５－ペプチドまたはＨＬＡ－ＤＱ２．２－ペプチド複合体などもｐＭＨＣＩＩと呼ばれ得る。こうしたｐＭＨＣ複合体は、たとえば単離または組み換え分子（例、組み換え可溶性ｐＭＨＣまたはｐＨＬＡ分子）などとして可溶性の形態で生成されてもよいし、別の実体または担体または調合物に関連付けられるか、またはその上もしくは中に積載されてもよく、たとえば本明細書の他の場所に記載されるナノ粒子または他の固体支持体などの固体支持体にコーティングまたは付着されてもよいし、たとえば組み換え発現などによって細胞において発現されてもよいし、他の粒子、担体、または調合物、たとえば脂質ベースの粒子、担体、または調合物など、たとえばリポソームまたはミセルなどに関連付けられてもよい。こうしたｐＭＨＣを含有する実体（以下および本明細書の他の場所に記載される多量体を含む）は、たとえばＴ細胞アネルギーの誘導などのために治療的に用いられてもよいし、本明細書の他の場所に記載される診断の適用または検出方法において、たとえばＴ細胞の検出（例、染色）など、またはたとえばＴ細胞の活性化などのために用いられてもよい。

【0095】

上述のとおり、本発明のコンジュゲートまたは複合体は、たとえばＭＨＣ分子などの第２の実体に結合された、本発明の２つ以上のペプチドまたはエピトープを含有し得る。よって、たとえば２、３、または４以上のペプチド－ＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）などを有するペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）多量体を含むコンジュゲートまたは複合体が提供される。特に好ましい多量体コンジュゲートは、たとえばそれぞれ２つまたは４つのペプチド－ＭＨＣコンジュゲート／複合体が単一の複合体または分子中に一緒に提供されている分子などの、二量体または四量体の形態を取る。２つ以上のペプチド－ＭＨＣ複合体を有するこれらのコンジュゲートに対して、任意の適切な構造または設計が用いられてもよく、当該技術分野において適切な形式が報告されている（たとえば、二量体はクレメンテ－カサレス（Ｃｌｅｍｅｎｔｅ－Ｃａｓａｒｅｓ）ら、２００２、ネイチャー・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）３、３８３－３９１に記載されている）。加えて四量体は、たとえば各ｐＭＨＣ複合体をビオチン含有部分に接合し、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を用いて４つの別個のｐＭＨＣ複合体を一緒に接合して四量体を形成する形式（たとえば、カルステン（Ｑｕａｒｓｔｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２００１、１６７（９）、４８６１－８などを参照）など、当該技術分野において報告されている任意の形式を取り得る。こうした多量体のコンジュゲートにおいて、コンストラクトの各ｐＭＨＣアーム、たとえば各個別のｐＭＨＣ複合体などが、たとえばＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上などのＴ細胞受容体と結合する能力を保持していることが好ましい。

【0096】

他のコンジュゲートは、本発明のペプチドまたはエピトープと、ペプチド担体とを含んでもよく、ここで前記ペプチドまたはエピトープは前記ペプチド担体と結合する。ペプチド担体は、典型的に免疫原性を増強するか、または免疫原性を増強するように選択され得る。よって、ペプチドまたはエピトープに対する抗原応答を誘導することが望まれるときは、こうしたコンジュゲートが特に有用である。したがってこうしたコンジュゲートは、本発明のペプチドまたはエピトープに対する抗体を生成または産生するのに適している。本明細書の他の場所に記載されるとおり、本発明のペプチドまたはエピトープと結合または特異的に結合し得るこうした抗体は、本発明のさらなる実施形態を提供する。

【0097】

こうしたコンジュゲートまたは複合体をコードする１つ以上の核酸分子も提供される。

【0098】

上記に示されるとおり、いくつかの実施形態において、本発明のペプチド（またはコンジュゲートまたは複合体、たとえばｐＭＨＣなど）は、固体支持体（例、粒子または平面状の支持体、たとえばビーズまたはマイクロビーズまたはナノ粒子またはプレートまたはマイクロタイタープレートなど）の上に存在し（すなわち付着または結合され）てもよい。よって１つの態様において、本発明は固体支持体を提供し、その固体支持体に本発明のペプチドまたはコンジュゲートまたは複合体が付着される（直接的または間接的に付着される）。典型的には、複数のコピーが付着されることとなる。こうした固体支持体は、インビトロ診断適用に使用するために特に好適であるか、またはそこで用いられる。

【0099】

上記に示され、かつ本明細書の他の場所に記載されるとおり、いくつかの実施形態において、本発明のペプチド（またはコンジュゲートまたは複合体、たとえばｐＭＨＣなど）は、たとえばリポソームまたはミセルなどの脂質ベースの調合物または担体など、他の実体、調合物、または担体と関連付けられて存在してもよい。よって、本発明のペプチド、コンジュゲート、または複合体を含む、たとえば脂質ベースの担体または調合物などの担体または調合物は、さらなる態様を形成する。

【0100】

さらなる態様は、本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体を含むか、提示するか、または積載する抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）またはその他の細胞を提供する。こうした実施形態において、本発明のペプチドまたはエピトープは典型的に、細胞表面上に位置するか、または細胞表面に関連付けられる。こうした細胞を調製する任意の適切な方法が用いられ得る。よって、ペプチドまたはエピトープと結合し得るＭＨＣクラスＩＩ分子を細胞が自身の表面上に自然に発現するか、または含むとき、その細胞に本発明のペプチドまたはエピトープを外部から積載し得る。代替的に、たとえば組み換え手段などによって、本発明のペプチドまたはエピトープを発現するように細胞を操作し得る。たとえば、表面上に適切なｐＭＨＣ（例、本発明のｐＭＨＣコンジュゲートまたは複合体）の発現をもたらすコンストラクトによって細胞をトランスフェクトしてもよく、たとえばこうした細胞は本発明の核酸分子を含み得る。本明細書の他の場所に記載されるとおり、こうした細胞は、たとえばＴ細胞アネルギーの誘導などのために治療的に用いられ得る。

【0101】

任意の適切な細胞型が用いられ得る。好ましいＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、またはＢリンパ球、特に形質細胞の形態を取ることがある。

【0102】

本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと結合するか、または特異的に結合する結合タンパク質を提供する。特に、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと特異的に結合する結合タンパク質が好ましい。本発明の脱アミド（またはＥ残基含有）ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと結合するか、または特異的に結合する結合タンパク質も提供され、それはいくつかの態様において好ましい。

【0103】

いくつかの実施形態において、前記結合タンパク質は細胞（細胞表面）上に存在するかまたは発現され、たとえば前記結合タンパク質を含むかまたは発現するたとえばＴ細胞またはＮＫ細胞などのたとえば真核細胞などの細胞などであってもよく、たとえばＣＡＲ Ｔ細胞またはＴＣＲ Ｔ細胞またはＴＣＲ－ＮＫ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞などであってもよい。

【0104】

よって、本発明のさらなる態様は、たとえばＴ細胞またはＮＫ細胞などの真核細胞などの細胞の表面上に本発明の結合タンパク質を発現させる方法を提供する。前記方法は、前記結合タンパク質をコードする核酸分子またはコンストラクトを細胞に提供して、細胞の表面上で前記結合タンパク質の発現が起こることを可能にするステップを好都合に含んでもよい。

【0105】

本発明の結合タンパク質はＣｅＤに関連するペプチドおよびエピトープを標的にし得るため、いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質は、たとえば他の有用な治療用の実体または部分などの他の実体と関連付けられるか、またはコンジュゲート（付着）されてもよい。

【0106】

たとえば、本発明の結合タンパク質（例、抗体またはＴ細胞受容体）は、たとえば抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）などの形態で、毒性もしくは細胞毒性部分か、またはたとえばｓｉＲＮＡ分子などのたとえば抑制性ＲＮＡ分子などの何らかの他のペイロードとコンジュゲートまたは関連付けされてもよい。いくつかの実施形態において、たとえば抗体分子などの本発明の結合タンパク質は、標的細胞に内部移行され得るか、または標的細胞への内部移行を可能にする。本発明の結合タンパク質はＡＰＣ上のｐＭＨＣ複合体を標的にし得るため、次いでその結合タンパク質が内部移行されるとき、これはペイロードが標的細胞に入ることを確実にする好都合なやり方を提供する。よって、選択されるペイロードに依存して、（例、ペイロードが細胞毒性分子または適切な抑制性ＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ分子であるときに）ｐＭＨＣ標的を発現するＡＰＣ（例、ＣｅＤに関連するＡＰＣ）を死滅させるかもしくは除去することができ、または（例、ペイロードが抑制性ＲＮＡ／ｓｉＲＮＡであるときに）遺伝子もしくはタンパク質レベルを変更できる。したがって、こうしたコンジュゲートは、たとえばＣｅＤの処置などにおいて、本明細書に記載されるとおりに治療的に使用される。

【0107】

代替的に、本発明の結合タンパク質（例、抗体、たとえばＴＣＲ様抗体など、またはＴ細胞受容体）は、たとえばエフェクター細胞などの別の実体に対する特異性を有する第２の結合タンパク質とコンジュゲートまたは関連付けされてもよく、次いでその実体が補充され得る。第２の結合タンパク質が特異性を有する適切なエフェクター細胞は、たとえばＴ細胞またはＮＫ細胞などの任意のタイプの細胞であり得る。よって、本発明の結合タンパク質を含む二重特異性分子、たとえば二重特異性抗体および細胞エンゲージャーなど、たとえば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子（ＢｉＴＥ：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）なども提供される。たとえば抗体またはＴ細胞受容体などの適切な第２の結合タンパク質は、標的とされる実体またはエフェクター細胞に依存して容易に選択可能であり、その例は当該技術分野において周知であり、報告されている。たとえば、標的がＴ細胞またはＮＫ細胞であるとき、たとえば抗体またはＴ細胞受容体などの第２の結合タンパク質は、必要に応じてＴ細胞表面タンパク質（例、ＣＤ３またはＣＤ１６、たとえば抗ＣＤ３または抗ＣＤ１６ユニットなど、たとえば抗ＣＤ３または抗ＣＤ１６抗体などの形態で）またはＮＫ細胞表面タンパク質（例、ＮＫＧ２Ｄ、たとえば抗ＮＫＧ２Ｄユニットなど、たとえば抗ＮＫＧ２Ｄ抗体などの形態で）と結合するように選択される。

【0108】

加えて、本発明の結合タンパク質は、検出され得るか、または検出を可能にする実体、たとえば標識またはその他の検出可能な部分に関連付けられ得る実体などに関連付けまたはコンジュゲート（付着）され得る。こうした標識された結合タンパク質または検出可能な結合タンパク質（例、抗体）は、次いで本発明のペプチド、エピトープ、またはｐＭＨＣ複合体を検出するために使用されてもよく、たとえばＭＨＣ分子に関連する本発明のペプチドまたはエピトープを表示するＡＰＣを検出するためなどに用いられてもよい。加えて、本発明の結合タンパク質は、たとえば抗原提示細胞の表面などにおけるＣｅＤに関連するペプチド、エピトープ、またはｐＭＨＣ複合体を標的にし得るため、このたとえば抗体などの結合タンパク質を用いて、Ｔ細胞（例、グルテン特異的Ｔ細胞または病原性Ｔ細胞）とｐＭＨＣ複合体との相互作用を遮断または阻害することによって、Ｔ細胞の活性化または増殖を阻害または低減し得る。

【0109】

よって、本発明の結合タンパク質も治療的に使用され、たとえば本明細書の他の場所に記載されるものなどの治療法に用いられ得る。

【0110】

好ましいこうした結合タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。前記Ｔ細胞受容体は細胞上に存在してもよく、たとえば自身の表面上に前記Ｔ細胞受容体を含むかまたは発現するたとえば真核細胞などの細胞などであってもよく、たとえばＴ細胞か、またはたとえば組み換え手段などによってＴＣＲを発現するＮＫ細胞もしくはその他の細胞型などであってもよく、または前記Ｔ細胞受容体は可溶性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であってもよく、たとえば組み換え手段などによって産生された細胞膜に関連付けられないＴＣＲなどであってもよい。よって、本発明のさらなる実施形態は、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと結合または特異的に結合し得る細胞表面ＴＣＲを有するかまたは発現する、たとえばＴ細胞またはＮＫ細胞などの細胞を提供する。他の実施形態は、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと結合または特異的に結合し得る可溶性ＴＣＲを提供する。特に、本発明のｐＭＨＣ複合体または分子と結合または特異的に結合し得るＴＣＲまたはＴ細胞が好ましい。特異的結合を示すＴＣＲまたはＴ細胞も好ましい。ＴＣＲのフラグメントも、たとえば本発明のｐＭＨＣ複合体または分子と結合または特異的に結合する能力などの機能活性を保持するものは含まれる。本発明の脱アミド（またはＥ残基含有）ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと結合または特異的に結合するＴＣＲも提供され、それはいくつかの態様において好ましい。

【0111】

別の好ましい結合タンパク質は、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと特異的に結合する抗体もしくは抗体の抗原結合ドメインであるか、またはそれを含む。ｐＭＨＣまたはｐＨＬＡ複合体と結合または特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合ドメインは、ＴＣＲ様抗体と呼ばれることがある。本発明のペプチドまたはエピトープ、特に本発明のＴ細胞エピトープを含むペプチド、たとえば９量体コア配列を有する本発明のＴ細胞エピトープを含むが、本発明のＢ細胞エピトープは含まないペプチドなど（例、たとえばｐＭＨＣなどの複合体またはコンジュゲートとは対照的な、ネイキッド、単離、または非複合型の形態のもの）と結合（または特異的に結合）する抗体または抗体の抗原結合ドメインであるか、またはそれを含む結合タンパク質も提供される。本発明の複合体またはコンジュゲート（例、ネイキッド、単離、または非複合型の形態の本発明のペプチドとは対照的な、ｐＭＨＣの形態の本発明のペプチド）と結合（または特異的に結合）する抗体または抗体の抗原結合ドメインであるか、またはそれを含む結合タンパク質も提供される。こうした実施形態において、ｐＭＨＣの前記ペプチドは、好ましくは本発明のＴ細胞エピトープを含み、たとえば９量体コア配列を有する本発明のＴ細胞エピトープを含むが、本発明のＢ細胞エピトープは含まない。

【0112】

こうした結合タンパク質は細胞上に存在してもよく、たとえば自身の表面上に前記抗体または抗体の抗原結合ドメインを含むかまたは発現するたとえば真核細胞などの細胞などであってもよく、たとえばＴ細胞などであってもよく、たとえばＣＡＲ Ｔ細胞の形態などであってもよく、またはこうした結合タンパク質は可溶性もしくは単離結合タンパク質であってもよく、たとえば組み換え手段などによって産生された細胞膜に関連付けられない抗体または抗体の抗原結合ドメインなどであってもよい。

【0113】

好ましくは、抗体の抗原結合ドメインを含む結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0114】

当業者に理解されることとなるとおり、「抗体」という用語によって包含される免疫学的結合試薬は、全抗体、二量体、三量体、および多量体の抗体；二重特異性抗体；キメラ抗体；組み換えおよび操作された抗体、ならびにそのフラグメントを含むすべての抗体およびその抗原結合フラグメントを含むか、またはそれに及ぶ。

【0115】

よって「抗体」という用語は、１つ以上のＣＤＲを含む抗原結合領域と、フレームワーク（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）領域（または１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＬ領域）とを有する任意の抗体様分子を示すために用いられ、この用語は、たとえばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２などの抗原結合ドメインを含む抗体フラグメント、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ：ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ＴａｎｄＡｂ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント、バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、トリボディ（ｓｃＦｖ－Ｆａｂ融合体、それぞれ二重特異性または三重特異性）；ｓｃ－ダイアボディ；カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ－ＣＬ融合体）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、Ｔ細胞を誘引するためのｓｃＦｖ－ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ－Ｉｇ（二重可変ドメイン（ｄｕａｌ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）抗体、二重特異性形式）；ＳＩＰ（小免疫タンパク質（ｓｍａｌｌ ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ミニボディの一種）；ＳＭＩＰ（「小モジュラー免疫医薬品（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）」ｓｃＦｖ－Ｆｃ二量体；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「二重親和性再標的化（Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ）」）；および小抗体模倣物を含む。

【0116】

本明細書において、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートの文脈において用いられる「特異的に結合する」または「特異的に認識する」という用語は、本発明のペプチドまたはエピトープ、たとえば配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）もしくはその脱アミド（またはＥ残基含有）バージョンを含むペプチドまたはエピトープなど、あるいは本発明の複合体またはコンジュゲート、たとえばＨＬＡ－ＤＱ２．５またはＨＬＡ－ＤＱ２．２に積載または提示された本発明の前記ペプチドまたはエピトープを含む複合体またはコンジュゲートなどと結合することができ、かつ他のペプチド、たとえば他のネイキッド、単離、もしくは非コンジュゲートのペプチド、またはＨＬＡ－ＤＱ２．５もしくはＨＬＡ－ＤＱ２．２に積載もしくは提示された他のペプチド（例、他のセリアック病関連ペプチド、または他のグリアジンもしくはグリアジン由来ペプチド、またはグリアジン由来ペプチドの変異体、または他のグルテン由来ペプチド）と交差反応しない（または結合しない）か、または有意に交差反応しない（または有意に結合しない）ような結合タンパク質（例、ＴＣＲ、抗体、または抗体の抗原結合ドメイン）を意味する。好ましくは、結合タンパク質（例、ＴＣＲ、抗体、または抗体の抗原結合ドメイン）は、ＤＱ２．５：ＤＱ２．５－グリア－α１ａと交差反応しない（または結合しない）か、または有意に交差反応しない（または有意に結合しない）。他の好ましい結合タンパク質（例、ＴＣＲ、抗体、または抗体の抗原結合ドメイン）は、本明細書に記載されるＢ細胞エピトープを含むが、本発明のコア９量体Ｔ細胞エピトープを含まないペプチド、たとえば本明細書に記載されるＢ細胞エピトープを含むネイキッド、単離、もしくは非コンジュゲートのペプチドか、またはたとえばＨＬＡ－ＤＱ２．５もしくはＨＬＡ－ＤＱ２．２などのＭＨＣ分子（ｐＭＨＣ）に積載もしくは提示された本明細書に記載されるＢ細胞エピトープを含むが、本発明のコア９量体Ｔ細胞エピトープを含まないペプチドなどと交差反応しない（または結合しない）か、または有意に交差反応しない（または有意に結合しない）。

【0117】

ＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５－グリア－α１ａは、ＤＱ２．５－グリア－α１ａエピトープ（ＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４））を提示（または「積載」）するＨＬＡ－ＤＱ２．５分子を意味する。別の言い方をすると、ＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５－グリア－α１ａは、ＤＱ２．５－グリア－α１ａエピトープを抗原結合溝において提示する（または抗原結合溝に収容する）ＨＬＡ－ＤＱ２．５－ペプチド複合体（ｐＭＨＣ）を意味する。

【0118】

他の好ましい結合タンパク質（例、ＴＣＲ、抗体、または抗体の抗原結合ドメイン）は、本発明の脱アミド（またはＥ残基含有）ペプチドに対して特異的である。こうした結合タンパク質は、単独（ネイキッドまたは単離の形態）であっても、ＭＨＣ分子と関連付けられたときでも、本発明の脱アミド（またはＥ残基含有）ペプチドと結合するが、本発明のペプチドの非脱アミド形態または健常形態とは交差反応しない（または結合しない）か、または有意に交差反応しない（または有意に結合しない）。

【0119】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質、特に抗体または抗体の抗原結合ドメインは、自身の抗原（例、本発明のペプチドまたはエピトープを含む本明細書に記載されるｐＭＨＣ）に対して、１ｎＭ以下（例、１ｐＭ～１ｎＭ、または１０ｐＭ～１ｎＭ、または２０ｐＭ～１ｎＭ、または５０ｐＭ～１ｎＭ、または１００ｐＭ～１ｎＭ、または１ｐＭ～５００ｐＭ、または１０ｐＭ～５００ｐＭ、または２０ｐＭ～５００ｐＭ、または５０ｐＭ～５００ｐＭ、または１００ｐＭ～５００ｐＭ、または１ｐＭ～１００ｐＭ、または１０ｐＭ～１００ｐＭ、または２０ｐＭ～１００ｐＭ、または５０ｐＭ～１００ｐＭ）、好ましくは９００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下（例、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、または１０ｐＭ以下）、または１００ｐＭ以下（例、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、または１ｐＭ以下）の結合親和性（Ｋ_Ｄ）で結合する。好ましくは、上述の結合親和性および親和性の範囲の値は、抗原結合タンパク質がｓｃＦｖ形式またはＦａｂ形式または全抗体形式であるときに適用される。

【0120】

結合親和性（Ｋ_Ｄ）は、当業者に周知であろう任意の適切な技術によって測定され得る。好都合な技術は、たとえばＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の使用であろう。

【0121】

よって、本発明の結合タンパク質は、本発明のペプチドまたはエピトープに見出される残基を認識するか、またはそれと結合する。よって、結合タンパク質はそのペプチドまたはエピトープの外側のいくつかの残基とも接触または相互作用することがあるが、本発明の結合タンパク質は、たとえば空のＭＨＣ分子またはペプチドを積載していないＭＨＣ分子などの単独のＭＨＣ分子とは結合しない。

【0122】

いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、抗体もしくはその抗原結合フラグメントではないか、またはそれを含まない。他の実施形態において、結合タンパク質は、抗体の抗原結合ドメインではないか、またはそれを含まない。

【0123】

いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、前記結合タンパク質がα１ａグリアジンペプチドを提示するＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５と結合しないという条件付きで、抗体もしくは抗体の抗原結合ドメインであるか、またはそれを含む。他の実施形態において、前記結合タンパク質は、α１ａグリアジンペプチドを提示するＨＬＡ－ＤＱ２．２とも結合しない。

【0124】

いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、前記結合タンパク質がα１ａグリアジンペプチドを提示するＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５と結合する抗体または抗原結合タンパク質またはドメインではないという条件付きで、抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）であるか、あるいはそれを含み、前記抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）は少なくとも１つの軽鎖可変ドメインと、少なくとも１つの重鎖可変ドメインとを含み、各ドメインは３つの相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）を含み、前記抗体または抗原結合タンパク質またはドメインは、
アミノ酸配列ＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含む可変重鎖（ＶＨ：ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ）ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＴＹＹＲＳＫＷＹＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＡＲＤＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＧＷＸ_９Ｘ_１０ＹＧＭＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、ここで
Ｘ_４が任意のアミノ酸であってもよく、好ましくはＳまたはＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）であり、
Ｘ_５が任意のアミノ酸であってもよく、好ましくはＳまたはＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）であり、
Ｘ_６が任意のアミノ酸であってもよく、好ましくはＳまたはＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）であり、
Ｘ_９が任意のアミノ酸であってもよく、好ましくはＨまたはＮまたはＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）であり、
Ｘ_１０が任意のアミノ酸であってもよく、好ましくはＰまたはＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、
アミノ酸配列ＨＤＩＳＳＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含む可変軽鎖（ＶＬ：ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ）ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＡＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、または前記配列に関する１アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＸ_２ＬＮＳＹＰＬＸ_９Ｘ_１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）を含む可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ３であって、ここで
Ｘ_２が任意のアミノ酸であってもよく、好ましくはＤまたはＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）であり、
Ｘ_９が任意のアミノ酸またはアミノ酸なしであってもよく、好ましくはアミノ酸なしまたはＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）であり、
Ｘ_１０が任意のアミノ酸またはアミノ酸なしであってもよく、好ましくはアミノ酸なしまたはＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）である、可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ３とを含む。

【0125】

他の実施形態において、α１ａグリアジンペプチドを提示するＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５と結合し、かつ上記のＣＤＲの１つ以上（例、１、２、３、４、５、または６つすべて）を含む抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）も、本発明の範囲から除外される。

【0126】

一般的に、いくつかの実施形態において、上記で定義されたＣＤＲ領域を有する抗体分子は、本発明の範囲から除外される。

【0127】

いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、前記結合タンパク質がα１ａグリアジンペプチドを提示するＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５と結合する抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）ではないという条件付きで、抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）であるか、あるいはそれを含み、前記抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）は少なくとも１つの軽鎖可変ドメインと、少なくとも１つの重鎖可変ドメインとを含み、各ドメインは３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）は、
アミノ酸配列ＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＴＹＹＲＳＫＷＹＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＡＲＤＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＧＷＸ_９Ｘ_１０ＹＧＭＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、ここで
Ｘ_４が任意のアミノ酸であってもよく、好ましくはＳまたはＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）であり、
Ｘ_５が任意のアミノ酸であってもよく、好ましくはＳまたはＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）であり、
Ｘ_６が任意のアミノ酸であってもよく、好ましくはＳまたはＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）であり、
Ｘ_９が任意のアミノ酸であってもよく、好ましくはＨまたはＮまたはＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）であり、
Ｘ_１０が任意のアミノ酸であってもよく、好ましくはＰまたはＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）であり、
より好ましくは前記（ＶＨ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＲＤＳＳＳＧＷＨＰＹＧＭＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）を含む、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、
アミノ酸配列ＨＤＩＳＳＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＡＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、または前記配列に関する１アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＤＬＮＳＹＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ３とを含む。

【0128】

他の実施形態において、α１ａグリアジンペプチドを提示するＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５と結合し、かつ上記のＣＤＲの１つ以上（例、１、２、３、４、５、または６つすべて）を含む抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）も、本発明の範囲から除外される。

【0129】

一般的に、いくつかの実施形態において、上記で定義されたＣＤＲ領域を有する抗体分子は、本発明の範囲から除外される。

【0130】

いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、前記結合タンパク質がα１ａグリアジンペプチドを提示するＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５と結合する抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）ではないという条件付きで、抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）であるか、あるいはそれを含み、前記抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）は少なくとも１つの軽鎖可変ドメインと、少なくとも１つの重鎖可変ドメインとを含み、各ドメインは３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）は、
アミノ酸配列ＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＴＹＹＲＳＫＷＹＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＡＲＤＲＴＴＧＷＨＰＹＧＭＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ３と、
アミノ酸配列ＨＤＩＳＳＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１と、
アミノ酸配列ＡＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、または前記配列に関する１アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含むＶＬ ＣＤＲ２と、
アミノ酸配列ＱＤＬＮＳＹＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、または前記配列に関する１、２、もしくは３アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を含有する配列を含むＶＬ ＣＤＲ３とを含む。

【0131】

他の実施形態において、α１ａグリアジンペプチドを提示するＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５と結合し、かつ上記のＣＤＲの１つ以上（例、１、２、３、４、５、または６つすべて）を含む抗体または抗原結合タンパク質（または抗体の抗原結合ドメイン）も、本発明の範囲から除外される。

【0132】

一般的に、いくつかの実施形態において、上記で定義されたＣＤＲ領域を有する抗体分子は、本発明の範囲から除外される。

【0133】

次のＣＤＲ配列の６つすべてを有する抗体：

【0134】

【表1】

【0135】

は、本明細書において１０７抗体とも呼ばれる。こうした抗体（またはこれらのＣＤＲ配列の６つすべてを有する他の結合タンパク質）、たとえば表１において定義される抗体など、たとえば表１に要約されたＶＨおよびＶＬドメインを有するか、または表１に要約されたその他の配列の１つ以上を有する抗体などは、本発明の範囲から除外される。

【0136】

他の実施形態において、表１中の所与のアミノ酸配列に対する少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬドメインを有する抗体（または他の結合タンパク質）は除外され、あるいは表１の６つのＣＤＲのセット（組み合わされたセット）、すなわち全体としてのＣＤＲのセットに対する少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する６つのＣＤＲドメインのセットを有する抗体（または他の結合タンパク質）は除外される。

【0137】

他の実施形態において、表１中の所与のアミノ酸配列に対する６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％未満の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬドメインを有する抗体（または他の結合タンパク質）が提供され、あるいは表１の６つのＣＤＲのセット（組み合わされたセット）、すなわち全体としてのＣＤＲのセットに対する６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％未満の配列同一性を有する６つのＣＤＲドメインのセットを有する抗体（または他の結合タンパク質）が提供される。

【0138】

次のＣＤＲ配列の６つすべてを有する抗体：

【0139】

【表2】

【0140】

は、本明細書において４．７Ｃ抗体とも呼ばれる。こうした抗体（またはこれらのＣＤＲ配列の６つすべてを有する他の結合タンパク質）、たとえば表２において定義される抗体など、たとえば表２に要約されたＶＨおよびＶＬドメインを有するか、または表２に要約されたその他の配列の１つ以上を有する抗体などは、本発明の範囲から除外される。

【0141】

他の実施形態において、表２中の所与のアミノ酸配列に対する少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬドメインを有する抗体（または他の結合タンパク質）は除外され、あるいは表２の６つのＣＤＲのセット（組み合わされたセット）、すなわち全体としてのＣＤＲのセットに対する少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する６つのＣＤＲドメインのセットを有する抗体（または他の結合タンパク質）は除外される。

【0142】

他の実施形態において、表２中の所与のアミノ酸配列に対する６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％未満の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬドメインを有する抗体（または他の結合タンパク質）が提供され、あるいは表２の６つのＣＤＲのセット（組み合わされたセット）、すなわち全体としてのＣＤＲのセットに対する６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％未満の配列同一性を有する６つのＣＤＲドメインのセットを有する抗体（または他の結合タンパク質）が提供される。

【0143】

他の実施形態において、国際公開第２０１９／１５８６０２号に記載される抗体（または他の結合タンパク質）は除外される。

【0144】

他の実施形態において、次のＶＨ：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＡＷＦＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＮＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＴＧＥＰＬＶＮＨＩＴＩＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）、
および／もしくは次のＶＬ：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＲＴＰＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）を有する抗体（または他の結合タンパク質）、
または本明細書において１Ｅ０３と呼ばれる抗体は、本発明の範囲から除外される。

【0145】

他の実施形態において、所与のアミノ酸配列に対する少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬドメインを有する抗体（または他の結合タンパク質）は除外される。

【0146】

他の実施形態において、所与のアミノ酸配列に対する６０％、７０％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％未満の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬドメインを有する抗体（または他の結合タンパク質）が提供される。

【0147】

本発明の好ましい例示的なペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートは、本明細書の他の場所に記載されており、本発明の結合タンパク質に関するこれらの態様を準用する。たとえば、いくつかの実施形態において、本発明の脱アミド（またはＥ残基含有）ペプチドまたはペプチド複合体（例、ｐＭＨＣ）と結合または特異的に結合する、たとえば抗体もしくは抗体の抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、またはＴＣＲなどの結合タンパク質が好ましい。

【0148】

本発明の結合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子も提供される。

【0149】

本発明のさらなる態様は、本発明のたとえば抗体、抗体の抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、ＴＣＲ（またはＴ細胞）などの結合タンパク質を産生（または作製または単離または同定または生成）する方法を提供し、前記方法は本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体（例、ｐＭＨＣ複合体）を使用する。代替的に見ると、本発明は、本発明のたとえば抗体、抗体の抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、ＴＣＲ（またはＴ細胞）などの結合タンパク質の同定（または単離または生成または産生）のために本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体（例、ｐＭＨＣ複合体）を使用することを提供する。

【0150】

よって本発明のさらなる態様は、本発明の抗体、あるいは本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体に結合し得る抗体を産生（または作製または単離または同定または生成）する方法を提供し、この方法は、本発明のペプチド（またはエピトープまたは複合体またはコンジュゲート）によってヒト以外の動物（例、ウサギ）を免疫化するステップを含む。好ましい方法は、前記動物から本発明のペプチド（またはエピトープまたは複合体またはコンジュゲート）に対して生成（または産生）された抗体を得るステップ、ならびに任意選択で、抗体産物の精製のステップ、および／または抗体もしくは産物（またはその抗原結合フラグメント）を、たとえば担体もしくは賦形剤など、たとえば薬学的に許容できる担体もしくは賦形剤などの少なくとも１つの追加の構成要素を含む組成物に配合するステップを含む。

【0151】

本発明のさらなる態様は、ハイブリドーマ技術（例、従来のハイブリドーマ技術）において本発明のペプチド、エピトープ、複合体、またはコンジュゲートを使用することによって、本発明の抗体、あるいは本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体に結合し得る抗体を産生（または作製または単離または同定または生成）する方法を提供する。代替的に見ると、本発明は、ハイブリドーマ技術を用いて、本発明の抗体、あるいは本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体に結合し得る抗体を同定（または単離または生成または産生）するために本発明のペプチド、エピトープ、複合体、またはコンジュゲートを使用することを提供する。いくつかの実施形態において、ヒト以外の動物（例、マウス）が本発明のペプチド、エピトープ、複合体、またはコンジュゲートによって免疫化され、前記免疫化された動物（例、マウス）から脾臓細胞が単離されて、ＨＧＰＲＴ発現を欠いた骨髄腫細胞（例、マウス骨髄腫細胞）（こうした骨髄腫細胞はＨＡＴ含有培地で増殖できない）と融合され、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミン（ＨＡＴ：ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ ａｎｄ ｔｈｙｍｉｎｅ）含有培地を用いてハイブリッド（すなわち融合またはハイブリドーマ）細胞が選択される。融合細胞のみがＨＡＴ含有培地で増殖する。

【0152】

本発明のさらなる態様は、本発明の抗体、あるいは本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体に結合し得る抗体を同定（または単離または生成）する方法を提供し、この方法は、本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体（例、ｐＭＨＣ複合体）を使用して、たとえば（ファージディスプレイ抗体ライブラリーによる）ファージディスプレイ技術などを用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングする。

【0153】

代替的に見ると、本発明は、（ファージディスプレイ抗体ライブラリーによる）ファージディスプレイ技術を用いて、本発明の抗体、あるいは本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体に結合し得る抗体を同定（または単離または生成または産生）するために、本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体を使用することを提供する。適切なファージディスプレイ技術およびライブラリーは、当該技術分野において周知でありかつ標準的である。たとえばいくつかの実施形態において、本発明のペプチド、エピトープ、複合体、またはコンジュゲート（典型的には、たとえばビーズまたはマイクロビーズまたはプレートまたはマイクロタイタープレートなどの固体支持体に固定されたもの）と、ファージ表面に抗体またはたとえばｓｃＦｖもしくはＦａｂフラグメントなどの抗体フラグメントのライブラリーを表示（または提示または発現）するファージディスプレイライブラリー（例、バクテリオファージライブラリー、典型的にはたとえばＭ１３またはｆｄファージライブラリーなどの繊維状バクテリオファージライブラリー）とを接触させる。任意の好適なファージディスプレイ抗体ライブラリーが用いられてもよく、当業者はこれらに精通している（加えて、たとえば商業的に入手可能なファージディスプレイ抗体ライブラリーなどが存在する）。次いで、結合ファージを溶出し、そのファージの核酸（または表示抗体をコードする核酸の少なくとも一部分）を単離および配列決定することによって、表示抗体の同一性が容易に決定されてもよい。いくつかの実施形態において、結合ファージの溶出後に、結合ファージの表示抗体を同定する前に、１つ以上（例、１、２、３、４、または５以上）の接触および溶出の追加ラウンドが行われる。こうした追加ラウンドは、典型的にライブラリーをさらに強化する。

【0154】

本発明の抗体またはＴ細胞／ＴＣＲ、あるいは本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体と結合し得る抗体を同定（または単離または生成）するための代替的なスクリーニング法は、本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体（例、ｐＭＨＣ複合体）を用いて、抗体またはＴ細胞／ＴＣＲの他の適切な供給源、たとえば対象由来の、特にたとえばＣｅＤ対象などのヒト対象由来の適切な抗体またはＴ細胞含有サンプルなどに対して、本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体（例、ｐＭＨＣ複合体）と結合または特異的に結合し得る抗体またはＴ細胞／ＴＣＲをスクリーニングすることを含んでもよい。適切な例示的サンプルは、本明細書の他の場所に記載される。代替的に、こうした標的を同定するためにＮＧＳおよびバイオインフォマティクスを用いた配列に基づくスクリーニング法が用いられ得る（たとえばナニーニ（Ｎａｎｎｉｎｉ）ら、２０２１、ＭＡｂｓ．１３（１）：１８６４０８４などを参照）。

【0155】

こうした方法において用いるために好ましいコンジュゲートまたは複合体は、ｐＭＨＣ複合体またはコンジュゲートである。こうした方法によって生成される本発明の好ましい抗体またはＴ細胞／ＴＣＲは本明細書の他の場所に記載されており、それはたとえば本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体（例、ｐＭＨＣ複合体）に特異的に結合する抗体またはＴ細胞／ＴＣＲなどである。

【0156】

さらなる態様は、本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体（例、ｐＭＨＣ複合体）を認識または特異的に認識する、たとえば本発明の結合タンパク質などの、たとえば抗体、または抗体の抗原結合ドメインを含むタンパク質、またはＴ細胞／ＴＣＲなどの結合タンパク質を用いて、前記ペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体（例、ｐＭＨＣ複合体）を検出する方法を提供する。前記方法はたとえば、結合タンパク質とペプチド、エピトープ、コンジュゲート、または複合体との複合体の形成を可能にするために有効な条件下で、前記ペプチド、エピトープ、コンジュゲート、または複合体を含有する可能性のあるサンプルと前記結合タンパク質とを接触させることと、そうして形成された複合体を検出することとを含む。

【0157】

別の態様において、本発明は、本発明のペプチド（またはコンジュゲートまたは複合体）か、あるいはこうしたペプチドまたはコンジュゲートまたは複合体をコードする核酸分子（または複数の分子）か、あるいは本発明のペプチド、コンジュゲート、または複合体を提示または積載する細胞またはその他の媒体（例、本明細書に記載される固体支持体、粒子／ナノ粒子、脂質ベースまたはその他の調合物）を含む組成物を提供する。こうした組成物は、好適な希釈剤、担体、賦形剤、および／または保存剤（例、薬学的に許容できる希釈剤、担体、賦形剤、および／または保存剤）をさらに（例、混合物中に）含んでもよい。よって、いくつかの実施形態において、前記組成物は薬学的に許容できる組成物である。

【0158】

いくつかの実施形態において、本発明のペプチドまたはエピトープは、たとえば単離または「遊離」ペプチドまたはエピトープなどとして、「ネイキッドの」非コンジュゲートまたは非複合型の形態で使用（例、治療または検出または診断のために使用）される。

【0159】

本発明による組成物は、たとえば、経口、鼻腔、非経口、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎａｌ）、局所、または直腸内投与のために好適な形態などで提供されてもよい。好ましい実施形態において、本発明による組成物は、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎａｌ）投与のために好適な形態で提供される。いくつかの実施形態において、本発明による組成物は、腹腔内（ｉ．ｐ．：ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）投与のために好適な形態で提供される。いくつかの実施形態において、本発明による組成物は、注射のために好適な形態で提供される。

【0160】

本明細書において定義される活性化合物は、たとえば錠剤、コーティングされた錠剤、点鼻薬、溶液、エマルション、ナノ調合物（ナノ粒子）、リポソーム、粉末、カプセル、または徐放性形態などの、従来の薬理学的投与形態で提供されてもよい。これらの形態の調製のために、従来の医薬賦形剤および通常の生産方法が使用されてもよい。

【0161】

注射溶液は、従来の方式で、たとえばｐ－ヒドロキシ安息香酸などの保存剤か、またはたとえばＥＤＴＡなどの安定剤を加えることなどによって生産されてもよい。次いで、その溶液が注射バイアルまたはアンプルに充填されてもよい。

【0162】

点鼻薬は、同様に水溶液として調合されて、エアロゾル噴霧剤と共に、または手動圧縮のための手段を備えられて、噴霧容器に詰められてもよい。

【0163】

本発明の医薬組成物（調合物）は、好ましくは任意の好適な手段によって非経口投与される。静脈内投与が好ましい。いくつかの実施形態において、投与は腹腔内（ｉ．ｐ．）投与である。非経口投与は、シリンジによる皮下、筋肉内、または静脈内注射によって行われてもよい。代替的に、非経口投与は、注入ポンプによって行われ得る。さらなる選択肢は、点鼻薬または肺（ｐｕｌｍｏｎａｌ）スプレーの形態の、ペプチドまたはペプチド含有複合体もしくはコンジュゲートの投与のための粉末または液体であり得る組成物である。加えてさらなる選択肢として、本発明のペプチドまたはペプチド含有複合体もしくはコンジュゲートは、たとえばパッチ、任意選択でイオン導入パッチなどによって経皮投与されることも、またはたとえば頬側などから経粘膜投与されることもあり得る。

【0164】

好適な投与単位は、当業者によって決定され得る。
たとえば医薬組成物などのこの組成物は、同時投与レジメンまたは組み合わせ（併用療法）レジメンの状況におけるさらなる活性成分（例、本明細書の他の場所に記載されるもの）を付加的に含んでもよい。たとえば、本発明の治療方法および使用は、ＣｅＤの処置または予防のために有用な任意のその他の適切な治療管理体制または治療剤と組み合わせて用いられてもよい。

【0165】

本発明のペプチド、エピトープ、複合体、またはコンジュゲートか、あるいはこうした実体をコードする核酸分子か、あるいは本発明の本明細書の他の場所に記載される細胞または他の媒体か、あるいはこうしたペプチド、エピトープ、複合体、コンジュゲート、核酸分子、または本明細書の他の場所に記載される細胞もしくは他の媒体を含む組成物または調合物の１つ以上を含むワクチンは、本発明のさらなる態様を形成する。こうしたワクチンまたはワクチン組成物、調合物、もしくは媒体は、任意選択で薬学的に許容できる担体および／またはアジュバントをさらに含む。

【0166】

本発明のエピトープまたはペプチドまたは複合体またはコンジュゲート、特に本発明のさまざまな脱アミド（またはＥ残基含有）エピトープまたはペプチドまたは複合体またはコンジュゲートはセリアック病と関連付けられ得るため、こうしたエピトープまたはペプチドまたは複合体またはコンジュゲート（あるいはより具体的には、こうしたエピトープまたはペプチドまたは複合体またはコンジュゲートの検出）はＣｅＤの診断に使用され得る。

【0167】

本発明はさらに、対象におけるＣｅＤを診断するための方法を提供し、前記方法は、対象由来のサンプルと、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとを接触させることと、前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートが前記サンプル中のＴ細胞と結合する（またはそれに認識される）かどうか、あるいは前記サンプルが前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと結合（またはそれを認識）する抗体を含有するかどうかを決定することとを含み、前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとＴ細胞との結合（またはＴ細胞の活性化）、あるいは（たとえば、前記抗体と前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとの結合などによって決定される）サンプル中の前記抗体の存在は、その対象がＣｅＤであるか、またはＣｅＤになりやすいことを示す。

【0168】

よって、こうした方法または診断方法を用いて、対象におけるＣｅＤの進行を決定またはモニタすることもでき、ここで前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとＴ細胞との結合、またはサンプル中の前記抗体の存在は、ＣｅＤが存在する（またはなおも存在する）ことを示す。典型的に、こうした方法は異なる時点におけるサンプルの解析を含み、前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとＴ細胞との結合（またはＴ細胞の活性化）、あるいは（たとえば、前記抗体と前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとの結合などによって決定される）サンプル中の前記抗体の存在が、前回の時点における同じ対象に対する前回の結果と比較して低減していること、好ましくは測定可能な程度または有意に低減していることを示す結果は、ＣｅＤが改善していることを示す。

【0169】

同様に、こうした方法を用いて、たとえば本発明のＣｅＤ治療法または任意のその他の形態のＣｅＤ治療法などのＣｅＤ治療法の有効性を決定またはモニタし得る。

【0170】

よって、こうした方法または診断方法を用いて、対象におけるＣｅＤ治療法の有効性を決定またはモニタすることもでき、ここで前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとＴ細胞との結合（またはＴ細胞の活性化）、あるいは（たとえば、前記抗体と前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとの結合などによって決定される）サンプル中の前記抗体の存在は、ＣｅＤが存在する（またはなおも存在する）ことを示す。典型的に、こうした方法は、たとえば処置の前後および／または処置後のいくつかの時点などの異なる時点におけるサンプルの解析を含み、前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとＴ細胞との結合（またはＴ細胞の活性化）、あるいは（たとえば、前記抗体と前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとの結合などによって決定される）サンプル中の前記抗体の存在が、前回の時点における同じ対象に対する前回の結果と比較して低減していること、好ましくは測定可能な程度または有意に低減していることを示す結果は、ＣｅＤが改善しているか、または効果的に処置されていることを示す。

【0171】

こうした方法または診断方法は、インビトロで好都合に実行され得るが、任意の適切な方法またはアッセイが用いられ得る。適切なインビトロアッセイは、たとえば本発明のペプチドまたはエピトープ、あるいはその適切な複合体またはコンジュゲート、たとえばｐＭＨＣ分子などを固体支持体に固定し、たとえばＥＬＩＳＡアッセイなどの適切な技術によってＴ細胞または抗体の結合を検出することなどによって実行され得る。同様に、こうした固体支持体を用いてＴ細胞の活性化を検出することもできる（たとえば、フリック（Ｆｒｉｃｋ）ら、２０２０、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍ．）５０（１）：１４２－１４５などを参照）。Ｔ細胞の活性化を測定することは、Ｔ細胞と本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとの結合を測定するための別の好都合なやり方である。こうした活性化を測定するための適切な方法は当業者に周知であり、これらの方法のいずれかが用いられてもよい。

【0172】

一実施形態において、本発明は対象におけるＣｅＤを診断する方法を提供し、この方法は次のステップを含む。
（ａ）前記対象から得られた検査サンプルと、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートの１つ以上とを接触させるステップ。

【0173】

さらなる実施形態において、本発明は対象におけるＣｅＤを診断する方法を提供し、この方法は次のステップを含む。
（ａ）前記対象から得られた検査サンプルと、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートの１つ以上とを接触させるステップ、
（ｂ）前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと結合（またはそれを認識）する検査サンプル中のＴ細胞または抗体の存在および／または量を測定するステップ、ならびに任意選択で、
（ｃ）検査サンプル中のＴ細胞または抗体の存在および／または量を対照と比較するステップ。

【0174】

上記の方法において、前記接触させるステップは、Ｔ細胞－ペプチド／エピトープ／複合体／コンジュゲートまたは抗体－ペプチド／エピトープ／複合体／コンジュゲートの複合体の形成（例、検出可能な形成）を可能にする条件下で実行される。適切な条件は、当業者によって容易に決定され得る。

【0175】

上記の方法において、たとえば血液または血清サンプル、生検細胞、ＣｅＤの罹患が疑われる組織もしくは器官（例、小腸）または組織切片由来の材料などの、任意の適切な検査サンプルまたは生物学的サンプルが用いられてもよい。

【0176】

上記の方法の特定のものにおいて、検査サンプル中に任意の量のＴ細胞－ペプチド／エピトープ／複合体／コンジュゲートまたは抗体－ペプチド／エピトープ／複合体／コンジュゲートの複合体が存在することは、ＣｅＤの存在を示すことになるだろう。好ましくは、陽性の診断を行うための検査サンプル中のＴ細胞－ペプチド／エピトープ／複合体／コンジュゲートまたは抗体－ペプチド／エピトープ／複合体／コンジュゲートの複合体の量は、適切な対照サンプルにおいて見出される量（対照値またはレベル）よりも大きく、好ましくは測定可能な程度または有意に大きい。より好ましくは、有意に大きいレベルは統計的に有意であり、好ましくは確率値＜０．０５を有する。統計的有意性を決定する適切な方法は、当該技術分野において周知であり、かつ実証されており、これらの方法のいずれかが用いられてもよい。

【0177】

適切な対照サンプルは、当業者によって容易に選択され得る。たとえば、ＣｅＤの診断の場合における適切な対照は、たとえば健常な対象などのＣｅＤでない対象由来のサンプルであろう。加えて、適切な対照「値」または「レベル」は、すべての検査において対照「サンプル」を実行することなく、たとえば当該技術分野において公知の正常または健常な対象に対する範囲を参照することなどによって容易に決定され得る。よって、対照値またはレベルは、適切な対照対象またはサンプルにおけるレベルに対応してもよく、たとえば対照または参照集団において見出されるカットオフレベルまたは範囲などに対応してもよい。代替的に、前記対照値またはレベルは、より早期の時点で測定された同じ個々の対象または前記対象由来のサンプルにおけるレベルに対応してもよい（例、その対象の「ベースライン」レベルとの比較）。このタイプの対照レベル（すなわち、個々の対象由来の対照レベル）は、たとえば対象のモニタリングを伴う実施形態などにおいて、レベルの変化を見出すために健常または病気の個体における連続的または定期的な測定が行われるような本発明の実施形態に対して、特に有用である。これに関して、適切な対照値またはレベルは、一般的な対照（例、健常）集団において見出される対照またはカットオフレベルではなく、その個体自身のベースライン、安定、ゼロ、または前回のレベル（必要に応じて）であり得る。対照レベルは「正常」レベルまたは「参照」レベルと呼ばれることもある。対照レベルは個別の数であっても、範囲であってもよい。

【0178】

比較のための対照値またはレベルは、適切な対照対象のセットを検査することによって導出され得るが、本発明の方法は、本発明の方法の一部として対照対象に能動的な検査を行うことを必ずしも伴わず、一般的には過去に対照対象から決定された、本発明の方法を行う人物にとって既知の対照レベルとの比較を伴うだろう。

【0179】

一実施形態において、セリアック病を診断する方法はインビトロの方法である。
一実施形態において、セリアック病を診断する方法はインビボの方法である。
代替的に見ると、本発明は、対象におけるセリアック病をスクリーニングするための方法を提供する。

【0180】

いくつかの実施形態において、本発明のエピトープまたはペプチドまたは複合体またはコンジュゲートは、コンパニオン診断薬として用いられ得る。

【0181】

本発明はさらに、対象由来のサンプルにおける、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと結合するＴ細胞または抗体の存在または量（レベル）を検出または決定または測定する方法を提供する。たとえば、前記方法は、対象由来のサンプルと、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとを接触させることと、前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートが前記サンプル中のＴ細胞と結合する（またはそれに認識される）かどうか、あるいは前記サンプルが前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと結合（またはそれを認識）する抗体を含有するかどうかを決定することとを含む。

【0182】

代替的に見ると、本発明は、対象由来のサンプルにおける、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと結合するＴ細胞または抗体の存在または不在またはレベルまたは量を分析する方法を提供する。たとえば、前記方法は、対象由来のサンプルと、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとを接触させることと、前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートが前記サンプル中のＴ細胞と結合する（またはそれに認識される）かどうか、あるいは前記サンプルが前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと結合（またはそれを認識）する抗体を含有するかどうかを決定することとを含む。

【0183】

本発明はさらに、サンプルにおける本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートの存在、不在、量（またはレベル）を検出または決定または測定するための方法を提供する。たとえばこうした方法は、たとえば対象由来のサンプルなど、たとえば生物学的サンプルなどのサンプルが本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートを含有するかどうか、あるいは前記ペプチドまたはエピトープの量（またはレベル）を検出することなどを含んでもよい。

【0184】

本明細書におけるＣｅＤの診断方法に関する特徴および考察は、上記の本発明の検出方法などに準用され得る。

【0185】

診断、モニタリング、決定、分析、スクリーニング、または検出に関する上記の実施形態において、本発明のエピトープまたはペプチドまたは複合体またはコンジュゲートは、Ｔ細胞または抗体に結合するために好適な任意の適切な形式、たとえば測定可能または検出可能な結合を可能にするために好適な形式などで提供され得る。よって、前記ペプチドまたはエピトープはネイキッド、遊離、または単離ペプチドとして提供され得る。しかし、エピトープまたはペプチドを、たとえばｐＭＨＣ複合体またはコンジュゲートなどとして提供される１つ以上のＭＨＣ分子との複合体またはコンジュゲート（例、単離または合成または組み換えによって生成された複合体またはコンジュゲート）として提供することも、たとえばｐＭＨＣのたとえば四量体などの多量体などの複数のｐＭＨＣ複合体が存在するより大きな複合体として提供することも有用であり得る。適切なｐＭＨＣ含有複合体は、本明細書の他の場所に記載される。本明細書の他の場所に記載されるとおり、ペプチドまたは複合体は、固体支持体または他の担体に好都合に付着されてもよく、あるいはたとえばｐＭＨＣなどとして細胞の表面に発現されるか、または細胞の表面に積載されてもよく、たとえばすでに適切なＭＨＣ分子を発現している細胞に本発明のペプチドまたはエピトープが積載されてもよい。

【0186】

上記の実施形態において、ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートとＴ細胞との結合は、ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートと、たとえばＴ細胞の表面上にあるか、または可溶性もしくは組み換え体の形式などのＴＣＲとの結合も含む。結合を検出するやり方として、（例、たとえば実施例などに記載されるとおりにたとえばフローサイトメトリーなどを用いてたとえばＩＬ－２レベル、細胞内ＩＦＮ－ガンマなどの適切なマーカーをモニタリングすること、またはたとえばフローサイトメトリーなどを用いて他の適切なサイトカインレベルをモニタリングすること、またはたとえば実施例などに記載されるとおりにたとえばフローサイトメトリーなどを用いてＣＤ６９の存在／アップレギュレーション、たとえばＣＤ１９陰性集団におけるＣＤ６９アップレギュレーションなどを評価することなどによって）Ｔ細胞の活性化が測定され得る。

【0187】

診断または検出に関する上記の実施形態において、本発明のエピトープまたはペプチドまたは複合体またはコンジュゲートは典型的にＣｅＤに関連するエピトープであるため、これらは典型的に脱アミドバージョン（またはＥ残基含有バージョン）である。

【0188】

診断または検出に関する上記の実施形態（または本明細書に記載される任意のその他の適切な実施形態）において、本発明のエピトープまたはペプチドまたは複合体またはコンジュゲートは、たとえば検出可能な標識などによって標識されるか、または別様に修飾されてもよく、言い換えると標識または修飾されたエピトープまたはペプチドまたは複合体またはコンジュゲートであり得る。本明細書に記載される本発明の結合タンパク質も、たとえば検出可能な標識などによって標識されてもよく、言い換えると標識された結合タンパク質であり得る。

【0189】

本発明はさらに、たとえば食品または他の摂取可能な材料などの組成物がＣｅＤを引き起こし得るかどうかを決定するための方法を提供し、前記方法は、前記組成物における本発明のペプチドまたはエピトープの存在を検出するステップを含む。本発明のペプチドまたはエピトープが、特に測定可能または有意なレベルで存在することは、その組成物がＣｅＤを引き起こし得ることを示す。

【0190】

本発明のさらなる態様は、治療に用いるための、本明細書において定義される本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲート（あるいは前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートをコードする核酸分子）を提供する。たとえば、エピトープ特異的免疫療法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を標的にして改変するために、抗原全体の代わりにペプチドを用いる抗原特異的免疫療法の形態である。

【0191】

本明細書において用いられる「治療（法）（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、任意の医学的状態の処置を意味する。本発明による疾患または状態の処置（たとえば、前から存在する疾患の処置など）は、前記疾患または状態の治癒、あるいは疾患または疾患の症状の任意の低減または軽減（例、疾患の重症度の低減）を含む。本発明（ｐｒｅｖｅｎｔ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）の治療方法および使用は、疾患の予防および疾患の積極的処置（たとえば、前から存在する疾患の処置など）のために好適である。よって、こうした処置は予防的（すなわち予防するもの）、治療的（または治療的であることを意図した処置）、または緩和的（すなわち、ある状態の症状を単に制限、軽減、または改善するために設計された処置）であってもよい。

【0192】

好ましくは、本明細書において定義される本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートは、ＣｅＤの処置または予防に用いるためのものである。
よって１つの態様において、本発明は、ＣｅＤの処置または予防に用いるための、本明細書において定義される本発明のペプチドまたはエピトープ（例、本発明の遊離または単離ペプチドまたはエピトープ）を提供する。

【0193】

別の態様において、本発明は、治療に用いるため、特にＣｅＤの処置または予防に用いるための本発明のコンジュゲートまたは複合体、特に本発明のエピトープまたはペプチドとＭＨＣ分子とのコンジュゲートまたは複合体（ｐＭＨＣ）を提供する。

【0194】

本明細書に記載される実施形態において、前記ペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体をコードする核酸分子が治療のために同様に用いられてもよい。

【0195】

本明細書に記載される、たとえば治療的な使用などのインビボの方法および使用は、一般的にヒトにおいて行われる。

【0196】

よって、本明細書において用いられる「動物」または「患者」または「対象」という用語は、典型的にはヒトを意味する。

【0197】

本発明の治療方法および使用は、任意の適切な形態を取ってもよく、そのいくつかが以下に考察される。加えて、本発明のペプチドまたはエピトープまたはコンジュゲートまたは複合体（あるいは前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートをコードする核酸分子）の任意の適切な調合物（医薬調合物）が用いられてもよく、その例が本明細書の他の場所に記載される。

【0198】

本発明の治療方法および使用は、ワクチン接種または寛容化治療の形態を取り得る。
たとえば、本発明のペプチドは、遊離もしくは単離ペプチドとして、またはＭＨＣ分子と関連付けられる（ｐＭＨＣ）ときに、対象をグルテンまたはグリアジンタンパク質に対して寛容化するために用いられてもよく、それはたとえば免疫応答を抑制または低減することなど、たとえば前記ペプチドに対するＴ細胞応答（例、ＣＤ４および／またはＣＤ８ Ｔ細胞応答）または抗体（Ｂ細胞）応答の生成を低減させることなどであり得る。よって、さらなる態様は、対象のグルテンまたはグリアジンペプチドに対する寛容化に用いるため、または免疫応答の抑制もしくは低減に用いるための本発明のペプチド、エピトープ、コンジュゲート、または複合体（あるいは前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートをコードする核酸分子）を提供する。

【0199】

次いで、こうした寛容化または抑制の方法を用いて、ＣｅＤを処置または予防し得る。
寛容化は、たとえば本発明のエピトープまたはペプチドを認識するＴ細胞および／またはＢ細胞などの免疫系による、そのエピトープまたはペプチドの認識の減少をもたらす。よって、こうした寛容化の後は、エピトープに応答するＴ細胞活性が減少するか、またはＴ細胞が非応答性（アネルギー）になる。代替的または付加的に、こうした寛容化の後は、エピトープが存在するときにそのエピトープに対して産生される抗体の量が減少する。こうした寛容化は、Ｔｒｅｇ細胞（例、抗原／エピトープ特異的またはグルテン特異的Ｔｒｅｇ細胞）の産生または誘導も伴うことによって、免疫応答をさらに抑制し得る。

【0200】

こうした使用において、本発明のペプチドおよびエピトープは寛容化の状況において免疫系に提示され、たとえばこうしたエピトープは抗原（エピトープ）特異的Ｔｒｅｇ（グルテン特異的Ｔｒｅｇ）の生成および増殖を促進して、免疫寛容を誘導し得る。こうした状況において免疫系に抗原（例、本発明のペプチドまたはエピトープ）を提示する方法は、当該技術分野において公知であり報告されている。これに関して、本発明のペプチドまたはエピトープは、遊離または単離ペプチドの形態（例、ペプチド自体としての形態、たとえばゴエル（Ｇｏｅｌ）ら、ランセット・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Ｌａｎｃｅｔ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．）、２０１７、２（７）：４７９－４９３などを参照）であってもよいし、たとえばｐＭＨＣ分子などの形態（たとえばクレメンテ－カサレスら、２００２、上記などを参照）であってもよい。

【0201】

本発明のペプチドおよびエピトープは、グルテンタンパク質由来であり（またはそれと非常に類似しており）、ＣｅＤと関連付けられ（または関連付けられるペプチドと非常に類似しており）、ＨＬＡ－ＤＱ２．５および／またはＨＬＡ－ＤＱ２．２と結合でき、かつそれら（あるいは実質的に相同のペプチドまたはエピトープ）はグルテン特異的またはグルテン反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞に認識され得るため、本発明のこうしたペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートを用いてこうしたＴ細胞と連結して、さらなる抗原の刺激に対するそれらの応答性を低くするか、または非応答性にし得る。

【0202】

こうした方法において、たとえば、ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートを、たとえば予め定められた最大許容用量、または徐々に増加する用量などのさまざまな用量で無グルテン食のＣｅＤ患者に投与した後に、彼らをグルテンに挑戦（チャレンジ）させ得る。最初の投与は、経口グルテンチャレンジと同様の症状をもたらすことがある。しかし、より遅い投与またはその後の投与において、最終的にこうした症状は存在しなくなるはずであり、たとえばプラセボ様の症状のみが観察されるか、または症状が観察されなくなるだろう。

【0203】

こうした方法において、グルテン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞はアネルギーに追い込まれ、これはそれらのグルテン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が抗原に応答することをやめるか、または抗原に対して非応答性となり、たとえばインターフェロン－γなどの炎症性サイトカインを産生しないか、または産生のレベルが有意に低減することなどを意味する。

【0204】

こうした方法に対して、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートを単独で用いることもできるし、たとえば本発明の他のペプチドまたはエピトープ（例、こうしたペプチドの混合物、たとえば２、３、４、または５つのこうしたペプチドの混合物など）などの他のＴ細胞エピトープまたはペプチドか、あるいは当該技術分野において公知であり報告されている異なるＴ細胞エピトープまたはペプチド、特にＣｅＤに関連付けられるかまたは特異的な他のＴ細胞エピトープまたはペプチド（例、非特許文献７に記載されるもの）と組み合わせて用いることもできる。こうしたＴ細胞エピトープまたはペプチドは、ＣｅＤ特異的Ｔ細胞と連結（または結合、またはそれを活性化）する能力（または機能）を有する。

【0205】

本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートを含むこうした組成物は、寛容化ワクチンまたはワクチン組成物とみなすことができ、ＣｅＤを処置または予防するために使用され得る。よって、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートを含むたとえばワクチン組成物などの組成物は、本発明のさらなる態様を形成する。

【0206】

他の寛容化治療は、ナノ粒子または他のタイプのナノ調合物の使用を伴い得る（たとえば、クレメンテ－カサレスら、２０１６、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）５３０、４３４－４４０２；フライターグ（Ｆｒｅｉｔａｇ）ら、２０２０、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）１５８（６）：１６６７－１６８１などを参照）。たとえば、ナノ粒子を、本発明のペプチドまたはエピトープの、たとえば単離、遊離、または非複合型のペプチドなどとして単独のものか、またはＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩＩ分子と関連付けたものによってコーティングまたは関連付けし得る。言い換えると、ナノ粒子は、本発明のペプチドまたはエピトープか、あるいはｐＭＨＣ分子によってコーティングまたは関連付けされ、このｐＭＨＣ分子におけるペプチド（ｐ）は本発明のペプチドまたはエピトープであり、ＭＨＣ分子は前記ペプチドまたはエピトープと結合し得るものである。したがって典型的に、本発明におけるこうしたＭＨＣ分子はＨＬＡ－ＤＱ２分子、特にＨＬＡ－ＤＱ２．５またはＨＬＡ－ＤＱ２．２である。ｐＭＨＣ分子のこうした記載は、本明細書の他の場所に記載される本発明の他の態様および実施形態に対して適切である。

【0207】

こうしたナノ粒子の投与によって、抗原特異的Ｔｒｅｇ（たとえばＴＲ１様細胞など）の生成および増殖を促進でき、次いで抗原特異的Ｔｒｅｇはたとえば、自己抗原積載ＡＰＣ、特に本発明のエピトープまたはペプチドを積載または提示するＭＨＣクラスＩＩ分子を含むＡＰＣを抑制するように作用し得る。よって、前記ナノ粒子は免疫応答を抑制するように作用し得る。

【0208】

よって、上述のとおりの、単独であるかまたはＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩＩ分子と関連付けられた本発明のペプチドまたはエピトープによってコーティングまたは関連付けされたこうしたナノ粒子、あるいは本発明のペプチドもしくはエピトープか、またはｐＭＨＣによってコーティングされたナノ粒子であって、このｐＭＨＣにおけるペプチド（ｐ）が本発明のペプチドまたはエピトープであり、ＭＨＣ分子が前記ペプチドまたはエピトープと結合し得るものである、ナノ粒子は、本発明のさらに好ましい態様を形成する。

【0209】

他のタイプの調合物、たとえば医薬調合物または医薬担体など、たとえばナノ調合物などを、ナノ粒子の代わりに同様に用いることができ、たとえばリポソームまたはミセルなどの脂質ベースの調合物などが用いられ得る。こうした調合物の内部またはコアに、本発明のペプチドまたはエピトープ、たとえば遊離または単離ペプチドまたはエピトープなど、あるいは上記および本明細書の他の場所に記載されるｐＭＨＣ複合体が積載され得る。同様に、本発明の前記ペプチドまたはエピトープあるいはｐＭＨＣ複合体を、脂質構造の外表面と関連付けまたはコンジュゲートし得る。寛容を促進するための他の実体も脂質調合物（または実際には本発明の他の調合物）に含まれてもよい。当業者に公知であるとおり、ミセルは水性の液体中の界面活性剤（例、脂肪酸）の凝集体であり、界面活性剤の親水性の頭部が凝集体の表面を形成し、疎水性の尾部がコアを形成する。リポソームは、水性のコアを包囲する脂質二重層によって形成される球形の小胞である。

【0210】

リポソームおよびミセルは、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて合成されてもよい。リポソーム合成および薬物積載のための好適な方法は、たとえばアクバルザデ（Ａｋｂａｒｚａｄｅｈ）ら、ナノスケール・リサーチ・レターズ（Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｒｅｓ Ｌｅｔｔ）８（１）：１０２、２０１３などに記載されている。たとえばレウレン（Ｒｅｕｌｅｎ）ら、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ）１８（２）：５９０－５９６、２００７；またはクン（Ｋｕｎｇ）およびレデマン（Ｒｅｄｅｍａｎｎ）、バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ）８６２（２）：４３５－４３９、１９８６に教示される方法などの当該技術分野において公知の方法を用いて、リポソームおよびミセルが適切なタンパク質とコンジュゲートされてもよい。

【0211】

一般的に、本発明のペプチドがｐＭＨＣ形式で用いられるとき、複数のｐＭＨＣ単位（多量体）を含む形式が作製されてもよく、それが好ましいときがある。たとえば、二量体または四量体ｐＭＨＣ形式が当該技術分野において公知であり、たとえば検出、診断、および治療の適用などにおいて好都合に用いられ得る。

【0212】

よって、本発明のさらなる態様は、治療、好ましくはＣｅＤの処置または予防に用いるための薬物または組成物の製造における、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲート（あるいは前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートをコードする核酸分子）の使用を提供する。

【0213】

本発明のさらなる態様は、たとえば本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートに対する対象の寛容化における使用、あるいは前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートに対する免疫応答の抑制または低減のための使用などのための、ワクチン接種または寛容化治療のための薬物または組成物の製造における、前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲート（あるいは前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートをコードする核酸分子）の使用を提供する。

【0214】

本発明のさらなる態様は、対象におけるＣｅＤを処置または予防する方法を提供し、前記方法は、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲート（あるいは前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートをコードする核酸分子）の有効量を前記対象に投与するステップを含む。

【0215】

本発明のさらなる態様は、対象におけるワクチン接種または寛容化治療の方法を提供し、前記方法は、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲート（あるいは前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートをコードする核酸分子）の有効量を前記対象に投与するステップを含む。

【0216】

本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートに対する対象の寛容化の方法を提供し、前記方法は、前記対象に本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲート（あるいは前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートをコードする核酸分子）の有効量を前記対象に投与するステップを含む。

【0217】

本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートに対する対象の免疫応答を抑制または低減する方法を提供し、前記方法は、前記対象に本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲート（あるいは前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートをコードする核酸分子）の有効量を前記対象に投与するステップを含む。

【0218】

前記方法または使用は、好ましくはそれを必要とする対象に、医薬的または生理的または治療的な有効量の本発明の前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲート（あるいは前記ペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートをコードする核酸分子）を投与することを伴う。

【0219】

「医薬的または生理的または治療的な有効量」は、対象の状態に対する利益を示すか、または対象における関連する生理的効果、たとえば免疫応答の寛容化もしくは低減などを示すために十分な量を意味する。ある量が、対象の状態に対する利益または対象における関連する生理的効果を示すために十分であるかどうかは、対象自身または医師が決定してもよい。

【0220】

本明細書の他の場所に記載される本発明の代替的な好ましい実施形態および特徴は、本発明の処置および使用のこれらの方法に同様に適用される。
いくつかの実施形態（例、検出の方法、診断または治療方法）において、対象（例、ヒト対象）は、ＣｅＤが進行するリスクがあるか、またはＣｅＤが出現するリスクがある対象、たとえば健常な対象もしくはセリアック病の任意の症状を表していない対象など、または任意のその他の適切な「リスクがある」対象、たとえばＣｅＤ患者の第一度近親者、またはたとえばＩ型糖尿病、選択的ＩｇＡ欠乏症、自己免疫性甲状腺炎、シェーグレン症候群、ダウン症候群、アジソン病、ターナー症候群、もしくはウィリアムズ症候群などの関連する高リスク障害のある対象などである。他の実施形態において、対象（例、ヒト対象）は、ＣｅＤである対象、またはＣｅＤである（またはそれが進行している）疑いがある対象、またはＣｅＤである（またはそれが進行している）可能性がある対象である。

【0221】

いくつかの実施形態において、（例、検出、診断、または治療に対する）適切な対象は、ＨＬＡ－ＤＱ２．５またはＨＬＡ－ＤＱ２．２陽性の対象である。
いくつかの態様において、本発明の方法（例、検出、診断、または治療方法）は、たとえばＣｅＤが進行するリスクがある対象、またはセリアック病が出現するリスクがある対象、またはセリアック病である対象、またはセリアック病である（またはそれが進行している）疑いがある対象、またはＣｅＤである（またはそれが進行している）可能性がある対象などの対象（例、ヒト対象）を選択する最初のステップをさらに含んでもよい。たとえば、対象（または対象由来のたとえば組織生検もしくは血液／血清サンプルなどのサンプル）が１つ以上のＣｅＤマーカーまたはリスク因子に対して陽性であることなどに基づいて、対象が選択されてもよい。

【0222】

いくつかの態様において、たとえば本発明のペプチドまたはエピトープの使用（または異なるＴ細胞エピトープもしくはペプチド、特にＣｅＤに関連するかもしくは特異的な代替的Ｔ細胞エピトープもしくはペプチドの使用）など、たとえば本明細書に記載される治療方法または任意のその他の適切な治療方法などの使用による治療法によってＣｅＤを処置するステップをさらに含む、本発明の診断（または類似の）方法が提供される。たとえば、本発明の診断（または類似の）方法の結果が対象におけるＣｅＤを示す（例、ＣｅＤ陽性の診断が行われる）とき、次いで治療法によってＣｅＤを処置する追加のステップが行われ得る。適切な治療方法は当該技術分野において報告されており、それは無グルテン食（ＧＦＤ：ｇｌｕｔｅｎ－ｆｒｅｅ ｄｉｅｔ）か、またはたとえばリツキシマブなどの抗ＣＤ２０抗体などによる抗体治療法を含む。

【0223】

他の態様において、本発明の診断（または類似の）方法は、ＣｅＤに対する適切な他の追加の診断方法と共に用いられ得る。たとえば当該技術分野において報告されている、たとえばＴＧ２抗体の測定もしくは評価、またはＣｅＤに関連する他のグルテンペプチドに対する抗体の測定もしくは評価、または小腸組織学的技術もしくは生検の使用を含むＣｅＤの血清学的検査など、任意のこうした追加の方法が用いられてもよい。

【0224】

他の態様において、本発明の治療方法は、ＣｅＤに対する適切な他の追加の治療方法と共に用いられ得る。たとえば当該技術分野において報告されている、たとえば無グルテン食（ＧＦＤ））、またはたとえばリツキシマブなどの抗ＣＤ２０抗体などによる抗体治療法、または（本明細書の他の場所に記載される）異なるＴ細胞エピトープもしくはペプチド、特にＣｅＤに関連するかもしくは特異的な代替的Ｔ細胞エピトープもしくはペプチドの使用による治療法など、任意のこうした追加の方法が用いられてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の治療方法は、偶発的なグルテン曝露後のレスキュー治療法として用いられ得る。

【0225】

本発明はさらに、本発明のペプチド、エピトープ、複合体、コンジュゲート（例、ｐＭＨＣコンジュゲート）、ワクチン、結合タンパク質、もしくは組成物の１つ以上か、またはこうした実体をコードする核酸分子の１つ以上を含むキットを含む。

【0226】

好ましくは前記キットは、たとえば本明細書に記載される治療または検出または診断方法などの本明細書に記載される方法および使用における使用のためか、あるいは本明細書に記載されるインビトロアッセイまたは方法における使用のためのものである。好ましくは前記キットは、本発明に従ってキットの構成要素を使用するための適切な指示を含む。好ましくは前記キットは、本明細書の他の場所に記載される疾患の処置もしくは診断のためか、または検出方法のためのものであり、任意選択で、こうした疾患の処置もしくは診断または検出のためにキットの構成要素を使用するための指示を含む。

【0227】

加えて、本明細書において定義される本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートは、インビトロまたはインビボの適用およびアッセイに対する分子ツールとして用いられてもよい。

【0228】

よって、本発明のさらなる態様は、本明細書において定義される本発明のペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートを含む試薬と、たとえばインビトロまたはインビボアッセイなどにおける分子ツールとしてのこうしたペプチドまたはエピトープまたは複合体またはコンジュゲートの使用とを提供する。特に好ましい分子ツールおよび試薬は、本明細書に記載されるＭＨＣ分子に関連付けられた本発明のペプチドまたはエピトープ（ｐＭＨＣ分子）を含むか、またはそれからなっていてもよく、そのｐＭＨＣ分子は、たとえば二量体または四量体の形態などの多量体の形態であってもよい。

【0229】

本出願全体にわたって用いられる「ａ」および「ａｎ」という用語は、以後に上限が具体的に記述されている場合を除いて、「少なくとも１つ」、「少なくとも第１」、「１つ以上」、または「複数」の参照される構成要素またはステップを意味するという意味で使用される。したがって、本明細書において用いられる「エピトープ（ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ）」、または「ペプチド（ａ ｐｅｐｔｉｄｅ）」などは、「少なくとも第１のエピトープ」または「少なくとも第１のペプチド」を意味する。任意の単一の薬剤の量に関する動作可能な限界および組み合わせのパラメータは、当業者が本開示に照らして知ることとなるだろう。

【0230】

加えて、本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、もしくは「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語、またはその他の同等の用語が用いられるとき、いくつかのより具体的な実施形態において、これらの用語は「からなる」もしくは「から本質的になる」という用語、またはその他の同等の用語を含む。特定のステップを含む方法は、適切な場合に、これらのステップからなる方法も含む。

【0231】

本発明のエピトープ、ペプチド、複合体、コンジュゲート、結合タンパク質、核酸分子、およびたとえばＡＰＣなどの細胞は、ヒトもしくは動物の体内、またはヒトもしくは動物の身体に由来する組織サンプル内にインサイツで存在し得る任意のこうした構成要素と区別される限りにおいて、一般的に「単離」または「精製」された分子である。しかし、その配列は、ヒトまたは動物の身体において見出される配列に対応するか、または実質的に相同であってもよい。よって、核酸分子または配列およびタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド、たとえばエピトープなどを参照して本明細書において用いられる「単離」または「精製」という用語は、たとえば（実際にそれらが自然に生じるときは）ヒトまたは動物の身体から単離または精製されるなどした、自身の天然の環境から単離、精製されるか、またはそれを実質的に含まないときのこうした分子を示すか、あるいは技術的プロセスによって生成されたとき、すなわち組み換えおよび合成によって生成された分子を含むときのこうした分子を示す。

【0232】

本明細書に記載される「増加」または「増強」という用語（または同等の用語）は、適切な対照と比較したときの任意の測定可能な増加または上昇を含む。適切な対照は当業者に容易に識別され、その適切な例が本明細書に記載される。好ましくは、適切な対照レベルまたは値と比較したときにその増加は有意となり、たとえば臨床的または統計的に有意となり、たとえば確率値≦０．０５などを有する。

【0233】

本明細書に記載される「減少」または「低減」という用語（または同等の用語）は、適切な対照と比較したときの任意の測定可能な減少または低減を含む。適切な対照は当業者に容易に識別され、その適切な例が本明細書に記載される。好ましくは、適切な対照レベルまたは値と比較したときにその減少は有意となり、たとえば臨床的または統計的に有意となり、たとえば確率値≦０．０５などを有する。

【0234】

対象の検査グループ間の差、または特定のパラメータのレベルもしくは値の差の統計的有意性を決定する方法は、当該技術分野において周知であり、かつ実証されている。たとえば、一般的に本明細書において減少または増加は、たとえば必要に応じてスチューデントｔ－検定、マンホイットニーＵ順位和検定、カイ２乗検定またはフィッシャーの正確確率検定、一元ＡＮＯＶＡまたは二元ＡＮＯＶＡ検定などの有意性検定を用いた統計的比較によって確率値≦０．０５が示されるときに、統計的に有意とみなされる。

【0235】

本明細書に開示されるいくつかのヌクレオチドおよびアミノ酸配列ならびにそれらの配列識別子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）のリスト
本明細書におけるすべてのヌクレオチド配列は、この技術分野の慣例に従って５’から３’に記述される。本明細書におけるすべてのアミノ酸配列は、この技術分野の慣例に従ってＮ末端からＣ末端に記述される。

【0236】

トリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｕｍ ｕｒａｒｔｕ）オメガグリアジンのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＵＰＩ０００６１８Ｄ０６Ａ（Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６）オメガ－グリアジントリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）
ＭＫＴＦＬＩＦＶＬＬＡＭＡＭＮＩＡＴＡＡＲＱＬＮＰＳＮＫＥＬＱＳＰＱＱＳＦＳＨＱＱＱＰＦＬＱＥＰＹＰＱＱＰＹＰＳＱＱＰＹＰＳＱＱＰＦＰＴＰＱＱＱＦＳＱＱＳＱＱＰＦＰＱＴＱＱＳＦＰＬＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＬＰＦＰＱＱＰＥＱＩＩＰＱＱＰＱＱＰＦＰＬＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＩＳＶＱＰＱＱＰＦＰＱＱＳＱＱＳＱＱＰＦＰＱＰＱＱＬＦＬＥＬＱＱＰＩＨＱＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＦＰＬＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＳＦＬＬＧＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＳＱＱＳＦＰＱＰＱＰＱＱＰＱＱＰＳＩＭＱＰＱＱＰＬＰＱＲＰＱＱＰＦＬＬＰＱＱＱＬＳＱＱＰＥＱＴＩＳＱＱＰＱＱＰＨＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬＴＳＩＧＧＱ
ＨＬＡ－ＤＱ２．５ＭＨＣ分子の成熟α鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）（ＩＭＧＴ－ＨＬＡアリル名：ＤＱＡ１＊０５：０１：０１：０１）
ＩＶＡＤＨＶＡＳＹＧＶＮＬＹＱＳＹＧＰＳＧＱＹＴＨＥＦＤＧＤＥＱＦＹＶＤＬＧＲＫＥＴＶＷＣＬＰＶＬＲＱＦＲＦＤＰＱＦＡＬＴＮＩＡＶＬＫＨＮＬＮＳＬＩＫＲＳＮＳＴＡＡＴＮＥＶＰＥＶＴＶＦＳＫＳＰＶＴＬＧＱＰＮＩＬＩＣＬＶＤＮＩＦＰＰＶＶＮＩＴＷＬＳＮＧＨＳＶＴＥＧＶＳＥＴＳＦＬＳＫＳＤＨＳＦＦＫＩＳＹＬＴＬＬＰＳＡＥＥＳＹＤＣＫＶＥＨＷＧＬＤＫＰＬＬＫＨＷＥＰＥＩＰＡＰＭＳＥＬＴＥＴＶＶＣＡＬＧＬＳＶＧＬＶＧＩＶＶＧＴＶＦＩＩＲＧＬＲＳＶＧＡＳＲＨＱＧＰＬ
ＨＬＡ－ＤＱ２．５ＭＨＣ分子の成熟β鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（ＩＭＧＴ－ＨＬＡアリル名：ＤＱＢ１＊０２：０１：０１）
ＲＤＳＰＥＤＦＶＹＱＦＫＧＭＣＹＦＴＮＧＴＥＲＶＲＬＶＳＲＳＩＹＮＲＥＥＩＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲＡＶＴＬＬＧＬＰＡＡＥＹＷＮＳＱＫＤＩＬＥＲＫＲＡＡＶＤＲＶＣＲＨＮＹＱＬＥＬＲＴＴＬＱＲＲＶＥＰＴＶＴＩＳＰＳＲＴＥＡＬＮＨＨＮＬＬＶＣＳＶＴＤＦＹＰＡＱＩＫＶＲＷＦＲＮＤＱＥＥＴＡＧＶＶＳＴＰＬＩＲＮＧＤＷＴＦＱＩＬＶＭＬＥＭＴＰＱＲＧＤＶＹＴＣＨＶＥＨＰＳＬＱＳＰＩＴＶＥＷＲＡＱＳＥＳＡＱＳＫＭＬＳＧＩＧＧＦＶＬＧＬＩＦＬＧＬＧＬＩＩＨＨＲＳＱＫＧＬＬＨ

【0237】

【表3-1】

【0238】

【表3-2】

【0239】

【表3-3】

【0240】

【表3-4】

【0241】

【表3-5】

【0242】

【表4-1】

【0243】

【表4-2】

【0244】

【表4-3】

【0245】

ここで以下の図面を参照して、以下の非限定的な実施例において本発明がさらに説明される。

【実施例】

【0246】

実施例１。セリアック病に関連する新たなＴ細胞エピトープの同定
材料および方法
ヒトＰＢＭＣ、ペプチド、および選択された抗体
確認済みのセリアック病（ＣｅＤ）患者および健常対照（ＨＣ）由来の凍結ＨＬＡタイプの精製ヒトＰＢＭＣをヘマケア－Ｃｅｌｌｅｒｏ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｅｌｌｅｒｏ．ｃｏｍ／）より購入した。

【0247】

すべてのペプチドは、≧８５％の純度にてジェンスクリプト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）より購入した。パン抗ＤＱ（ＳＰＶ－Ｌ３）およびパン抗ＤＲ（Ｌ２４３）抗体は、それぞれベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびサーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）より購入した。

【0248】

組み換えｐＨＬＡの発現、精製、および検証
Ｔ細胞エピトープＤＱ２．５－グリア－α１ａ（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）、下線は９量体コア配列）、ＤＱ２．５－グリア－α２（ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７））、ＤＱ２．５－グリア－ＮＴＰ－００１（ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１））を含有する共有結合されたグルテン由来ペプチドを有する組み換えＨＬＡ－ＤＱ２．５分子は、ジェンスクリプト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）によって、本質的に前に記載されるとおりに生成され（カルステン、Ｈ．ら、２００１、上記）、親和性精製および組み換えタンパク質検出を促進するためにαおよびβ鎖にＣ末端ＦＬＡＧおよびＨＩＳタグが付加された。簡潔にいうと、Ｓｆ９昆虫細胞が産生した可溶性のインビボビオチン化された組み換えｐＭＨＣは、抗ＦＬＡＧを用いて親和性精製され、濃縮され、分子量および純度測定のための標準的なプロトコルを用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによってタンパク質が解析された。

【0249】

組み換え抗体の発現、精製、および検証
組み換えヒトＩｇＧ１タンパク質は、ジェンスクリプト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）によって生成された。簡潔にいうと、遺伝子合成によってそれぞれの抗体可変（Ｖ：ｖａｒｉａｂｌｅ）遺伝子が作製され、真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４中のヒト定常重鎖（Ｈ：ｈｅａｖｙ）および軽鎖（Ｌ：ｌｉｇｈｔ）遺伝子にインフレームでクローニングされた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞においてタンパク質が産生され、プロテインＡおよびＳＥＣにて親和性精製された後に、分子量および純度測定のための標準的なプロトコルを用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットが行われた。クローン１０７および４．７Ｃに対するＶ遺伝子が表１および表２にそれぞれ示されており、ＰＤＢ ＩＤ ５ＩＨＺおよび５ＩＫ３由来のクローン１００２－１Ｅ０１および１００２－１Ｅ０３に対するものがそれぞれ示される（スニル（Ｓｎｉｒ）ら、２０１７、ＪＣＩインサイト（ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ）、２（１６）：ｅ９３９６１）。

【0250】

エピトープ候補パターンのサーチおよび同定
ＤＱ．２．５－グリア－α１ａエピトープ（ＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４））と異なるが類似性を有する推定的なグリアジン由来配列を同定するために、ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／）を用いてＵｎｉＰｒｏｔＫＢタンパク質データベースをサーチした。ＤＱ．２．５－グリア－α１ａエピトープの保存された主要残基以外は異なるモチーフが用いられ、いくつかのサーチでは９量体コアを越えたＮ末端およびＣ末端配列の長さの変動も可能にされた。より具体的には、ｐ１のプロリン（Ｐ）、ｐ６のグルタミン（Ｑ）、ｐ９のチロシン（Ｙ）を固定し、ｐ９のＹ（下線）の後の位置ｐ１０におけるＰは不可とした。サーチの出力に集中するために、出力をトリチクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）分類群に制限した。推定的ヒットの１４量体ペプチドを合成し、記載されるとおりにＲａｊｉ細胞に積載されたときの１０７および４．７Ｃ抗体との結合を検査した。いくつかの場合に、位置的な脱アミドを模倣するためにペプチド合成においてＱ残基をグルタミン酸（Ｅ）と交換した。

【0251】

組み換えグリアジンの発現、精製、および検証
組み換えコムギグリアジンタンパク質は、ジェンスクリプト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）によって本質的に記載されるとおりに生成された（アレンツ－ハンセン（Ａｒｅｎｔｚ－Ｈａｎｓｅｎ）ＥＨら、ガット（Ｇｕｔ）２０００；４６：４６－５１）。簡潔にいうと、それぞれのグリアジン遺伝子（ＵｎｉｐｒｏｔコードＱ９Ｍ４Ｌ６、Ｑ９ＦＵＷ７、およびＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６）を遺伝子合成によって作製してＣ末端ＨＩＳタグを付加し、細菌発現ベクターｐＥＴ１７ｂにインフレームでクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞においてタンパク質を産生させて、全細胞可溶化物から、エタノール沈殿および塩析による２段階精製を用いた変性条件下で精製した後、分子量および純度測定のための標準的なプロトコルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを行った。

【0252】

ＥＬＩＳＡ
以下のとおりにペプチド捕捉ＥＬＩＳＡを行った。簡潔にいうと、９６ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））を４℃にて一晩ニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）（アビディティ（Ａｖｉｄｉｔｙ）、５μｇ／ｍｌ ＰＢＳ溶液）でコーティングした後に、２％ビオチンフリー脱脂粉乳のＰＢＳ溶液（ｗ／ｖ）でブロッキングした。さまざまなペプチド（すべてビオチン化Ｎ末端ＧＳＧＳＧＳ伸長を伴って合成された）をＰＢＳＴＭ（ＰＢＳに２％ビオチンフリー脱脂粉乳（ｗ／ｖ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ｖ／ｖ）を加えたもの）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、ニュートラアビジンにおいて捕捉した。１Ｅ０１／１Ｅ０３抗体をＰＢＳＴＭで５μｇ／ｍｌに希釈し、ウェルに添加し、それぞれいずれかのポリクローナルウサギ抗ヒト（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、１：１００００）のＰＢＳＴＭ溶液によって検出し、それぞれＴＭＢ溶液（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））を加えた後に６２０ｎｍ（ＨＣｌ添加の場合は４５０ｎｍ）にて吸光度読取りを行うことによって現像した。アッセイは２つ組のウェルによってＲＴにて行った。各層の間に、プレートをＰＢＳＴで３～５ｘ洗浄した。

【0253】

以下のとおりにｐＨＬＡ特異的ＥＬＩＳＡを行った。簡潔にいうと、９６ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（ヌンク）を４℃にて一晩ニュートラアビジン（アビディティ、５μｇ／ｍｌ ＰＢＳ溶液）でコーティングした後に、２％ビオチンフリー脱脂粉乳のＰＢＳ溶液（ｗ／ｖ）でブロッキングした。さまざまなビオチン化ｐＨＬＡをＰＢＳＴＭで２０μｇ／ｍｌに希釈し、ニュートラアビジンにおいて捕捉した。さまざまな抗体をＰＢＳＴＭで５μｇ／ｍｌに希釈し、ウェルに添加し、それぞれポリクローナルウサギ抗ヒト（シグマ、１：１００００）または抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（シグマ、１：２０００）のいずれかのＰＢＳＴ溶液によって検出し、それぞれＴＭＢ溶液（カルバイオケム）を加えた後に６２０ｎｍ（ＨＣｌ添加の場合は４５０ｎｍ）にて吸光度読取りを行うことによって現像した。アッセイは２つ組のウェルによってＲＴにて行った。各層の間に、プレートをＰＢＳＴで３～５ｘ洗浄した。

【0254】

グリアジンタンパク質消化および質量分析（ＭＳ：ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）
組み換えグリアジンを本質的に記載されるとおりにインビトロでキモトリプシン消化した（モルバーグ（Ｍｏｌｂｅｒｇ）Ｏら、メソッズ・イン・モレキュラー・メディシン（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．）２０００；４１：１０５－２４）。簡潔にいうと、約１ｍｇの組み換えグリアジンを、２００：１（ｗ：ｗ）のキモトリプシン（シグマ）によって０．１Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３および２Ｍ尿素の溶液中で３７℃にて２４時間消化した後に、９５℃にて５分間の酵素不活性化を行い、さらに本質的に記載されるとおりのＭＳ解析に向かわせた（非特許文献３）。ＭＳ解析は、オスロ大学（ＵｉＯ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｓｌｏ）のバイオサイエンス学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロテオミクスコア施設によって行われた。ＰＥＡＫＳ ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（バイオインフォマティクス・ソリューションズ社（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．））を用いて、それぞれのグリアジンＵｎｉｐｒｏｔアクセッションコードによって作成された顧客データベース（ｄａｔａｂａｓｅｄ）に対してサーチすることによって、ＭＳスペクトルを解析した。

【0255】

ヒトＳＫＷ３ Ｔ細胞のレトロウイルストランスダクションおよびフローサイトメトリー
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が再構築されたＳＫＷ３クローンＳＫＷ３－３８０およびＳＫＷ３－３６４が報告されている（フリックＲ．ら、２０２１、サイエンス・イムノロジー（Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）６（６２）：ｅａｂｇ４９２５）。ＰＦＢ ＩＤ ４ＯＺＩ由来のＴＣＲ Ｖ遺伝子配列を用いて、本質的に同じやり方でＳＫＷ３－Ｓ２細胞が生成された（ピーターセン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）ら、ネイチャー・ストラクチュラル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ）２０１４、２１（５）、４８０－４８８）。簡潔にいうと、ジェンスクリプト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）によって、遺伝子合成によってヒト／マウスキメラＴＣＲとしてＴＣＲ Ｖ遺伝子配列が再構築され、ｐＭＳＣＶ（クロンテック・ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））にクローニングされた。Ｒｅｔｒｏ－Ｘユニバーサル・パッケージング・システム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（クロンテック）を用いて、製造者の指示に従って、ＳＫＷ３ヒトＴ細胞（ＣＬＳセル・ラインズ・サービス社（ＣＬＳ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ ＧｍｂＨ））のレトロウイルストランスダクションを行った。標準的な細胞増殖と、Ｈ５７－Ａｌｅｘａ６４７（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））抗体染色によって評価されたＴＣＲ発現レベルに基づくＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いたＦＡＣＳソーティングとによって、安定で均質なＴＣＲ発現ＳＫＷ３ Ｔ細胞が得られた。本質的に記載されるとおりに、抗原提示細胞としてＲａｊｉ細胞を用いて、ＴＣＲトランスダクションＳＫＷ３細胞のペプチド特異的活性化を検証した（フリック、Ｒ．ら、２０２１、上記）。抗ヒトＣＤ６９－ＡＰＣ（ＢＤバイオサイエンス）抗体染色によって評価されたＣＤ６９アップレギュレーションによって、Ｔ細胞活性化を測定した。データはＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６サイトメーター（ＢＤバイオサイエンス）において取得され、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアＶ１０（ツリー・スター（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ））を用いて解析された。

【0256】

Ｔ細胞の活性化および阻害アッセイ
Ｔ細胞活性化アッセイのために、５０，０００のＲａｊｉ Ｂ細胞を定められた量のＤＱ２．５－グリア－α１ａ（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３））ペプチドと共にＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で３７℃／ＯＮにてインキュベートし、その後洗浄して残りの遊離ペプチドを除去し、４０，０００のＳＫＷ３ Ｔ細胞を加えた。細胞を３７℃／ＯＮにて培養した後にフローサイトメトリーで解析した。対照として、ＰＭＡおよびイオノマイシン（ｅバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１：５００）を含有する細胞刺激カクテル（Ｃｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）を、ＳＫＷ３ Ｔ細胞のみを含有するウェルに加えた。Ｔ細胞活性化における確立された用量反応に基づいて、（ＣＤ１９ｎｅｇ集団に対するＣＤ６９アップレギュレーションとして測定された）約６０％のＴ細胞活性化をもたらすことが推定されるペプチド濃度を阻害アッセイのために選択した。上記と同様のペプチドとのＯＮインキュベーションおよび洗浄に続いて、１μＭ（最終濃度）の４．７Ｃまたは３．Ｃ１１のいずれかをＲａｊｉ細胞に加えた後、Ｔ細胞を加えてＯＮインキュベーションを続けた。結果としてもたらされたＴ細胞活性化を上記と同様に測定した。対照Ａｂとして、０．１μＭ（最終濃度）のパン抗ＤＲまたはパン抗ＤＱのいずれかを並行して加えた。

【0257】

ペプチド活性化ＰＢＭＣの細胞内ＩＦＮ－γフローサイトメトリー検出
バイオレジェンド（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ．ｃｏｍ／）による試薬および標準的プロトコルに従って、ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞内ＩＦＮ－γを評価した。簡潔にいうと、凍結保存されたヒトＨＬＡ－ＤＱ２．５^＋ＰＢＭＣ（ヘマケア－Ｃｅｌｌｅｒｏ）を穏やかに解凍して氷冷ＰＢＳ中で洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＣＳ（ｖ／ｖ）を補充したものに再懸濁し、その後１ｍｌの体積（約２×１０^７細胞）を２４ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク）にアリコートした。１セットのウェルは、いずれかの２０μＭのペプチド（Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ６Ｅ＿ｌｏｎｇ（ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０））または３３量体（ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５））のいずれか）を受け取った。残りの細胞は、ペプチドを何ら受け取らなかった。細胞を標準状態で３７℃にて３６時間増殖させた後に、ブレフェルジン（Ｂｒｅｆａｌｄｉｎ）Ａ（バイオレジェンド）およびモネンシン（バイオレジェンド）を加えて、インキュベーションをさらに１２時間続けた。次いで、フローによって細胞の細胞内ＩＦＮ－γを評価した。データはＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６サイトメーター（ＢＤバイオサイエンス）において取得され、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアＶ１０（ツリー・スター）を用いて解析された。

【0258】

結果
我々は過去にＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５－グリア－α１ａと結合し得るペプチド－ＭＨＣ（ｐ－ＭＨＣ）抗体を同定しており、すなわちこの抗体は、セリアック（ｃｏｅｌｉａｃ）病（ＣｅＤ）関連のグリア－α１ａエピトープ（ＰＦＰＱＰＱＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０））と関連付けられたときのＭＨＣクラスＩＩ分子ＨＬＡ－ＤＱ２．５と結合でき、すなわちこの抗体はｐＭＨＣ複合体と結合し得る。

【0259】

この抗体（１０７抗体と呼ばれる）は、ＣｅＤ患者から得られたサンプルと特異的に反応し、かつＨＬＡ特異的な方式で反応することが示されており、すなわちこの抗体はＣｅＤ特異的であり、かつＨＬＡ分子ＨＬＡ－ＤＱ２．５に対しても特異的である（図１を参照）。

【0260】

この抗体の親和性成熟バージョンも生成され（４．７Ｃ抗体と呼ばれる）、これはｐＭＨＣ複合体との結合に対して親抗体１０７よりも高い親和性を有する（図２を参照）。

【0261】

細胞表面ｐＭＨＣの検出
上記の実験は、可溶性の組み換えｐＭＨＣ分子との結合を評価することによって行われた。しかし、４．７Ｃ抗体は、α１ａペプチドおよび対照ペプチドと共有的に連結されたＨＬＡ－ＤＱ２．５の形態のｐＭＨＣ複合体を表面上に組み換え発現するように操作された抗原提示細胞（Ａ２０マウスＢ細胞）にも良好かつペプチド特異的に結合する能力を示した（図３Ａ）。最小のα１ａペプチド（下線）を含有する１２量体ペプチドが用いられた（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３））。この実験においては、ＣｅＤ関連の形態のエピトープ、すなわちＱ残基ではなくＥを含有するエピトープ（ＰＦＰＱＰＱＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）に対するＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４））が用いられた。

【0262】

興味深いことに、最小エピトープを含有する同じ１２量体を可溶性ペプチドとして外部から積載された（すなわちペプチドパルス細胞）、生理的レベルの天然ＭＨＣ発現を有するヒト抗原提示細胞（Ｒａｊｉ細胞）に対して抗体４．７Ｃを検査したとき、その結合は顕著に弱くなった（図３Ｂ）。加えて、グルテン３３量体ペプチドが外部から積載されたとき、この抗体はこれらの抗原提示細胞との結合を示さなかった（図３Ｂ）。自然に生じるフラグメントであると考えられ、かつＣｅＤに強く関連するα－グリアジン３３量体（ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５））は、１コピーの最小α１ａエピトープと、ＤＱ２．５－グリア－α２エピトープの３つの重複するコピーとを含む。組み換え発現されたα１ａペプチドに対する結合の結果を与えられたとき、これらの結果は驚くべきものであった。しかし、これに対する理由となり得るものがいくつか存在し、それは外来性ペプチドの積載後の１２量体または３３量体とＨＬＡ－ＤＱ２．５との相互作用が十分に安定でない可能性があること、または天然のＲａｊｉ細胞がｐＭＨＣを組み換えによって過剰発現する細胞ほど多くのＭＨＣを発現しないために細胞表面上のｐＭＨＣ複合体がかなり少ない（より低密度のｐＭＨＣ発現）だろうという事実を含む。これらの交絡パラメータの可能性にもかかわらず、３３量体はもっと短いペプチドよりも良好にＨＬＡ分子に結合することが公知であり、これはたとえばＴ細胞活性化アッセイ（グンナーセン（Ｇｕｎｎａｒｓｅｎ）ら、２０１７、ＪＣＩインサイト（ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ）；２（１７）：ｅ９５１９３）などにおいても明らかであり、よって１２量体と比較したときに、３３量体は１２量体よりも良好な染色を示すであろうことが期待されたが、そうではなかった。

【0263】

Ｔ細胞活性化の阻害
ＤＱ２．５－α１ａに対して特異的なＴＣＲを発現するヒトＴ細胞株（ＳＫＷ３８０）を用いて、抗体４．７ＣがインビトロでＴ細胞活性化を阻害する能力も検査した。定められた量の刺激グリアジンペプチド（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３））を積載したＲａｊｉ細胞をＳＫＷ３８０ Ｔ細胞と共培養し、フローサイトメトリーを用いてＳＫＷ３８０細胞におけるＣＤ６９発現を決定することによってＴ細胞活性化を測定した（図４Ａ）。６０％のＴ細胞活性化を誘導するペプチド濃度を以後の実験のために選択し、その実験ではペプチド積載Ｒａｊｉ細胞を抗体と共にインキュベートしたところにＳＫＷ３８０ Ｔ細胞を添加することによって、それらの抗体のＴ細胞阻害能力を評価した（図４Ｂ）。

【0264】

Ｔ細胞活性化の約２０％の阻害が観察され、この阻害は特異的なものであったが、その阻害レベルはもっと高くなることが期待されただろう。

【0265】

ヒト小腸生検材料の染色
未処置の確認済みのＨＬＡ－ＤＱ２．５＋のＣｅＤ患者および対照対象の炎症粘膜から得られた小腸生検サンプルに由来するＣＤ１９＋ＣＤ４５＋形質細胞を検査したとき、高親和性（４．７Ｃ）および親（１０７）抗体はＣｅＤ材料の良好な染色を示し、それらの抗体がＣｅＤ患者由来の細胞におけるＨＬＡ－ＤＱ２．５関連のグルテンペプチド提示を検出していることが示された（図５、各患者が別個の円として示される）。

【0266】

これらのデータは、過去に報告された１０７抗体の広範囲の特徴付け、ならびにそれが完全な疾患、ＨＬＡ、およびエピトープに対して類似のＣｅＤ患者の材料におけるペプチド提示を特異的に検出する能力と完全に一致した（ホイダール（Ｈｏｙｄａｈｌ）ら、２０１９、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）１５６（５）、１４２８－１４３９）。

【0267】

興味深いことに、４．７Ｃ抗体はＤＱ２．５－グリア－α１ａエピトープに対するより高親和性の結合のために選択された（図２Ａ）にもかかわらず、患者サンプルにおける染色のレベルは２つの抗体に対してほぼ同様であった（図５Ａ）。

【0268】

新たなＴ細胞エピトープ配列の可能性の調査
この結合挙動の明らかな相違およびＴ細胞活性化を阻害する能力が期待よりも低かったことに対するより良好な洞察を得るために、抗体４．７Ｃおよび１０７がＣｅＤ患者における追加のペプチド配列／Ｔ細胞エピトープも認識し得る可能性があるかどうかが考えられた。

【0269】

たとえば、行われた実験をより注意深く検討したとき、ペプチドパルス実験に用いられた１２量体はＣ末端部に９量体の最小Ｔ細胞エピトープを有し、すなわち（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３））であったのに対し、３３量体配列はより長く、Ｃ末端部に追加の配列を有する（ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５））ことが注目された。位置１０以降（すなわち、９量体の最小Ｔ細胞エピトープＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の後の位置）の残基がペプチドに結合する抗体の能力に影響しているかもしれない可能性、およびＣｅＤに関連しているがＣ末端部に（Ｐ以外の）代替残基が存在するような類似のＴ細胞エピトープ配列も抗体が認識し得るかもしれない可能性があるという仮説が立てられた。

【0270】

たとえば、他の結合調査では、最小ＤＱ２．５－グリア－α１ａエピトープのＣ末端から伸長するｐ１０に自然に生じるＰｒｏを有するものと比較して、位置１０のＧｌｙ（Ｇ）残基が４．７Ｃおよび１０７抗体との良好なレベルの抗体結合をもたらすことが示された（データは示さず）。

【0271】

まとめると、２つの抗体１０７および４．７Ｃそれぞれの結合特性を記述するデータは、それら両方が、可溶性組み換えｐＨＬＡおよびＣｅＤ患者材料由来の細胞を含む細胞上のｐＨＬＡとしてのＤＱ２．５－グリア－α１ａペプチドエピトープと特異的に結合する能力を有することを明瞭に示した。しかしこのデータは、コムギα－グリアジン由来の重要であると予想される３３量体ペプチドも含む、自然に生じるプロリン残基がｐ１０位置を占めるペプチドバージョンに存在するときのエピトープと結合する能力をどちらの抗体も有さないことも示した（ドルムら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ）２０１４年１１月１日、１９３（９）４４９７－４５０６）。ＣｅＤのエピトープの病識にはギャップがあることが認識されており、エピトープ解明において患者反応性の最大５０％しか占めることができない（非特許文献１０）。したがって、１０７および４．７Ｃ抗体の特異的かつ明確に定義された結合プロファイルに照らすと、それらがまだ発見されていないグルテンエピトープに付加的に結合したことによって、幾分の予期されない類似の患者材料の染色レベルがもたらされた可能性が出てきた。

【0272】

このことを試行および調査するために、元々の９量体Ｔ細胞エピトープ配列ＰＦＰＱＰＱＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）（および脱アミドバージョンＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４））と共に、Ｒａｊｉ細胞ペプチドパルス実験に用いられた１２量体配列ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）（および天然／健常バージョンＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））、およびたとえばＴ細胞反応性に対するｐ７のロイシンの明確な不変要件などのエピトープの特定の位置に共有される公知の重要性に基づくこれらの配列に対するさまざまなアミノ酸の変更を用いて、データベースサーチを行った（ピーターセンら、ネイチャー・ストラクチュラル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ）２０１４、２１（５）、４８０－４８８；ダハル－コイララ（Ｄａｈａｌ－Ｋｏｉｒａｌａ）ら、ムコサル・イムノロジー（Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ）９、５８７－５９６、２０１６）。特に、天然に存在するグリアジンペプチド（すなわち、コムギ由来のペプチド）の中で、α１ａ９量体／１２量体と類似しているが位置１０の伸長部に代替残基（すなわちプロリン以外）を有するもの、したがって抗体１０７および４．７Ｃによる良好な結合をもたらす可能性があり得るものを見出すことに焦点を合わせた。

【0273】

この作業の実行中に、多くの候補配列を同定および除外した。たとえば、位置１０にチロシン、セリン、およびアラニン残基を有する候補配列は、４．７Ｃ抗体との有意な結合を何ら示さないことが観察された。これらの観察は、概説された既知の結合プロファイルによって裏付けられた。

【0274】

最終的に、ＵｎｉＰｒｏｔナレッジベース（Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ｂａｓｅ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）のよりリベラルなＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／）パターン（ｐａｔｔｅｒ）サーチを通じて、いくつかのさらなる候補配列が同定され、それらの候補配列は９量体との類似性がより低く（しかしなおも妥当であり）、認識されるエピトープの立体構造にとって重要であり得るものとして同定された位置９のＹ残基を有するが、加えて位置１０にＧ残基を有する。これらの候補をさらに４．７Ｃ抗体との結合について検査し、これらの配列の１つが特に有望な結果を示した。

【0275】

この候補ペプチド（図６Ａ）は、赤色野生ヒトツブコムギ（ｒｅｄ ｗｉｌｄ ｅｉｎｋｏｒｎ）と名付けられた野生形態のコムギにおけるオメガグリアジンタンパク質の一部として見出される（トリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｔｕ）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ：Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、図６Ｂ）。

【0276】

このペプチドは、α１ａ９量体／１２量体といくらかの類似性を示したが、それに加えて９量体配列に関する位置１０にＧ残基を有する。この配列はコア９量体ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（図６Ａ）を有した。

【0277】

この配列は、α１ａエピトープといくらかの類似性を有し（実際にはオメガグリアジンと分類されるが）、かつコムギの形態で天然に生じるため、ＣｅＤ Ｔ細胞エピトープの候補となり得ると考えられた。加えて、ＣｅＤ患者においてＴＧ２酵素（ＱＸＰモチーフを標的とする、ソリッドら、２００２、ネイチャー・レビューズ・イムノロジー（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ）２、６４７－６５５）によってＥ残基に脱アミド修飾される標的となり得るグルタミン（Ｑ）残基が存在した。９量体の位置６（上記の下線部）および図６Ａを参照されたい。しかし、他の点では、この配列は古典的または公知のＣｅＤ Ｔ細胞エピトープに対応しない。実際に、認識されたＴ細胞エピトープ予測因子（ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ４．０）をこのＴ．ウラルツ（Ｕｒａｒｔｕ）配列に対して使用しても、この配列がＨＬＡ－ＤＱ２．５結合ペプチドであると予測されなかった。

【0278】

このペプチドの４つの異なる形態（図７Ａを参照）を、上述のとおりにＲａｊｉ細胞に積載し、ＦＡＣＳによって１０７および４．７Ｃ抗体の両方の結合を評価することによって検査した（図７Ｂ）。評価されたペプチドは、ｉ）ＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ４Ｑ＿ｐ６Ｑまたは「ＱＱ」と呼ばれ、候補Ｔ細胞エピトープ９量体の位置４および６にＱ残基を含有する天然／健常形態のペプチドに対応する）；ｉｉ）ＰＱＱＰＹＰＥＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）（Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ４Ｅ＿ｐ６Ｑまたは「ＥＱ」と呼ばれ、候補Ｔ細胞エピトープ９量体の位置４にＱ残基ではなくＥを含有する形態のペプチドに対応する）；ｉｉｉ）ＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）（Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ４Ｑ＿ｐ６Ｅまたは「ＱＥ」と呼ばれ、候補Ｔ細胞エピトープ９量体の位置６にＱ残基ではなくＥを含有する形態のペプチドに対応する）；ｉｖ）ＰＱＱＰＹＰＥＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）（Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ４Ｅ＿ｐ６Ｅまたは「ＥＥ」と呼ばれ、候補Ｔ細胞エピトープ９量体の位置４および６にＱ残基ではなくＥを含有する形態のペプチドに対応する）であった。どちらの抗体もＱＥおよびＥＥペプチドとは良好に結合するが、ＱＱおよびＥＱ形態とは結合しないことが示された（図７Ｂ）。Ｔ細胞９量体エピトープの位置６にＥを含有するペプチドの方がＣｅＤの患者に見出されやすいと考えられる。なぜなら、この残基は古典的なＴＧ２標的配列であるＱＸＰ（ここではＱＱＰ）の一部だからである。特に、古典的なＤＱ２．５－グリア－α１ａエピトープ、およびｐ１０グリシン伸長を含有する人工バージョンをこのアッセイの対照として含めた。予期されたとおり、抗体は人工バージョンに結合したのに対し、古典的形態には低レベルの結合が見られた。相同のＤＱ２．５－グリア－α２エピトープに対する結合は観察されなかった。

【0279】

Ｔ．ウラルツ（ｕｒａｔｕ）配列のインシリコのトリプシン／キモトリプシン消化を行うことによって、ＣｅＤ患者に存在すると考えられるバージョンであるこのペプチドのより生理的に現実的な形態と抗体とがどのように反応するかも評価した（図８Ａ）。対照として、３３量体ペプチドをコードするＴ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）α－グリアジン配列を並行して含ませた（図８Ｂ）。これによって、２つの生理的形態であり得る配列、ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）（本明細書において「中間（ｍｅｄｉｕｍ）」ペプチドと呼ばれることもある）およびＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）（本明細書において「長（ｌｏｎｇ）」ペプチドと呼ばれることもある）が同定された。これら２つのペプチドを、上述のＲａｊｉペプチド積載アッセイにおいて検査した（ｐ４Ｑ＿ｐ６Ｑ ｍｅｄｉｕｍ、ｐ４Ｑ＿ｐ６Ｅ ｍｅｄｉｕｍ、およびｐ４Ｑ＿ｐ６Ｅ ｌｏｎｇ（図８Ｃ）、ＣｅＤ患者に見出されるＴＧ２活性（ＱＸＰ）であり得るものに従ったＧｌｎ（Ｑ）からＧｌｕ（Ｅ）への置換を有する。

【0280】

実際に、１０７および４．７Ｃ抗体の両方が、これらの生理的に関連すると予想されるペプチドのＥバージョンと良好に結合することが示され、ｐ６脱アミド９量体は結合を示さなかったため、この結合にとっては長さが重要であった（図８Ｄ）。重要なことに、アイソタイプが一致したＤＱ２．５－グリア－α２特異的３．Ｃ１１抗体はＴ．ウラルツ（Ｕｒａｒｔｕ）配列のいずれにも何ら結合を示さず、１０７および４．７Ｃの特異的結合が証明された（図８Ｄ）。ここで興味深いのは、両方のｐ６脱アミド形態による結果が１０７および４．７Ｃ抗体に対して示した結合のレベルが、ＣｅＤ患者由来の材料（ＣＤ１９＋形質細胞の形態の抗原提示細胞）に対してこれらの抗体を検査したときに観察されたレベルを反映することである（図１および図５）。よって、ＣｅＤに関連する定義された９量体コアＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を有する新たなＴ細胞エピトープが、このエピトープを含有するより長いＣｅＤ関連ペプチドと共に同定されたと考えられる。

【0281】

胃および膵臓の酵素によるコムギの腸タンパク質分解は不均一であり、予測される酵素特異性は消化における実際の変化を部分的にしか反映していないことが十分に確証されている。よって、タンパク質フラグメント化パターンがどのようなものか、より現実的な概念を得るために、Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ、ならびに主要コムギω－グリアジンＱ９ＦＵＷ７＿ＷＨＥＡＴおよびα－グリアジンＱ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴタンパク質を作製して（図９Ａ～Ｃ）、本質的に記載されるとおりにインビトロキモトリプシン消化を行った（アレンツ－ハンセンＥＨら、ガット（Ｇｕｔ）２０００；４６：４６－５１およびモルバーグ（Ｍｏｌｂｅｒｇ）Ｏら、メソッズ・イン・モレキュラー・メディシン（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．）２０００；４１：１０５－２４）。次いで、これらのタンパク質消化物を本質的に記載されるとおりに質量分析によって解析した（ドルムら、２０１４、上記）、図９Ｄ～Ｆ。

【0282】

実際に、α－グリアジン対照タンパク質Ｑ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴはフラグメント化されて、十分に特徴付けられた３３量体マルチエピトープセグメント（シャン（Ｓｈａｎ）Ｌら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２００２、２９７（５５９０）：２２７５－９）を含むさまざまなより小さいペプチドフラグメントとなった（図９Ｄ）。観察された広範囲のタンパク質分解は、過去の報告（ドルムら、２０１４、上記）とよく一致する。Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡの同じタンパク質分解に取り組んだところ、このタンパク質もさまざまなより小さいペプチドにフラグメント化された（図９Ｅ）。重要なことに、この仮定された新規９量体コアペプチドの破壊的処理は観察されず、調査された複数の種は、前の解析（図８）においてすでに見られたものと一致するＨＬＡ－ＤＱ２．５結合能力を有することが期待された。Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡから同定された最小タンパク質分解セグメントは、仮定されたＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ４Ｑ＿ｐ６Ｑ＿ｍｅｄｉｕｍ１３量体ペプチドに対応した（図８Ｃおよび図９Ｅ）。トリチクム・ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ）は、現代の六倍体トリチクム・アエスチブム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）コムギ作物の二倍体Ａゲノム祖先であるため（マークセン（Ｍａｒｃｕｓｓｅｎ）ら、２０１４、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）：３４５（６１９４）、１２５００９２）、Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡをコードする遺伝子は非常に複雑な栽培作物のゲノムの一部として見出され、したがってヒト消費に対する関連食物源を表している可能性が高い（アペルス（Ａｐｐｅｌｓ）ら、２０１８、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）３６１（６４０３）、ｅａａｒ７１９１およびユハス（Ｊｕｈａｓｚ）ら、２０１８、サイエンス・アドバンシス（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ）４（８）、ｅａａｒ８６０２）。実際に、食物源解析によるシグネチャーモチーフは、こうした構成要素としてＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６を指し示している（スパダ（Ｓｐａｄａ）ら、２０２０、フロンティアズ・イン・ニュートリション（Ｆｒｏｎｔ．Ｎｕｔｒ．）７：９８）。したがって、主要な公知のω－グリアジンは、ＨＬＡに結合する９量体コアを構築するために必要な９つの残基のうちの８つしかコードしていないために、エピトープの遺伝源となり得ないことが分かる（図９Ｆ）。

【0283】

Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ ＭＳ解析（図９Ｅ）において、多くのペプチドがＤＱ２．５－グリア－α１ａエピトープ（図７）に対する効率的な４．７Ｃ結合のために必須と思われるｐ１０Ｇｌｙ残基を欠いていることにも我々は気付いた。よってこれらのデータは、これら２つのペプチドがＨＬＡ溝において異なる形状を取り、加えて異なる方式で４．７Ｃ抗体にデコードされることを強く示した。その後、アラニン走査実験によってこれを確認した。

【0284】

大規模な実験的証拠によって、ヒト免疫系がどのようにＣｅＤにおける病原性グルテンペプチドを提示する能力を取得するかに対する２つの主要な機構が示されている（非特許文献１）。これらの観察は、Ｂ細胞がこの疾患において有すると考えられる中心的役割を裏付けるものであり、その役割は主に２つのカテゴリ、すなわち組織トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）とグリアジン特異的Ｂ細胞とに分けられる。後者に関して、これらのグリアジンペプチド特異的Ｂ細胞のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の広範囲の特徴付けによって、特に高頻度の配列モチーフ（ＱＰＱＱＰＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４））が同定されており、この配列モチーフは、オメガグリアジン型であることが最も多いペプチドの一部であり（非特許文献３）、かつＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープのＮ末端伸長を形成する。Ｔ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）Ｑ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴおよびＴ．ウラルツ（Ｕｒａｒｔｕ）Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡタンパク質の両方のインシリコ（図８）およびＭＳ解析（図９）に基づいて、このＢＣＲ共通配列を欠いたＱ９Ｍ４Ｌ６＿ＷＨＥＡＴのα－グリアジン配列とは対照的に、Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡのω－グリアジン配列は、自身のＮ末端に密接に関係するＱＰＱＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）モチーフを有し、（Ｔ細胞エピトープと重複する）ＢＣＲエピトープのＱ／Ｅ位置はＨＬＡ９量体コアに従って注記されるときの位置ｐ－２に対応することに我々は注目した。したがって、Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープがこうしたＢＣＲに対する標的として働く能力を有するかどうかを調査するために、２つのＣｅＤ患者由来のプロトタイプ抗グリアジンペプチドＢＣＲ（１００２－１Ｅ０１および１００２－１Ｅ０３と名付けた）を可溶性抗体として再構築し、本質的に記載されるとおりに、ＥＬＩＳＡにおいてそれらとニュートラアビジン固定ペプチドとの結合を検査した（図１０）（スニルら、２０１７、ＪＣＩインサイト（ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ）、２（１６）：ｅ９３９６１）。

【0285】

選択された２つのＢＣＲは広範囲に報告されており、標的配列に対するそれらの結合プロファイルは異なる（図１０Ａ）。重要なことに、公知のＱＰＱＱＰＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）モチーフの重要な特徴は、ＴＧ２による脱アミド修飾によってＱＰＥＱＰＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）となることであり、これは健常個体とＣｅＤの個体とを分離するシグネチャー特徴である。２つのＢＣＲはこのＴＧ２修飾のための要件が異なっており、したがって我々のアプローチを実証するために、我々はこの位置にＧｌｎ（Ｑ）またはＧｌｕ（Ｅ）のいずれかを有する２つの陽性対照（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）ペプチドを含めた（ＰＣ１およびＰＣ２、図１０Ｂ）。実際にその結果は適切なＰＣに対するＢＣＲの強い反応性を示し（図１０Ｃ）、１００２－１Ｅ０３抗体はＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡエピトープに対して明らかに同等に良好な結合を示したが、ｐ－２にＧｌｕ（Ｅ）を有するものとしか結合しなかった。１００２－１Ｅ０１抗体はＰＣペプチドとのみ反応し、これはこの抗体が位置ｐ２のＰｈｅ（Ｆ）を強く要求することが実証されていることによって説明されるだろう。よって我々の結果によって、Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ Ｔ細胞エピトープが、ＣｅＤ患者に繰り返し共有されるＴＧ２感受性プロトタイプのグリアジンペプチド特異的ＢＣＲに対する優れた標的として働くＮ末端ＱＰＥＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）伸長を有することが実際に確認された（スニルら、２０１７、上記）。Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ配列に見られるものと比較して記載されるＢＣＲエピトープに相違があり、前者においてはＰｈｅ（Ｆ）残基がＴｙｒ（Ｙ）と交換されていることを考慮するとき、１００２－１Ｅ０３抗体がいずれかの配列に対する優先傾向を有するかという疑問が生じた。よって、我々は抗体の段階希釈物で実験を繰り返して、個々のＥＣ５０を推定した。実際に、その結果は両方の配列が同等に良好に認識されることを示した（図１０Ｄ）。

【0286】

まとめると、これらの結果は、Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ ＢＣＲエピトープが、Ｔ細胞エピトープの効果的な提示およびそれによるＢ細胞へのＴ細胞支援の確立によって強力な抗体応答の生成をもたらし得る、よく実証された機構を指し示す。この発見は、１０７および４．７Ｃ抗体を使用した我々の患者染色データ（図１および図５）が、ＣｅＤ患者の炎症性の腸における支配的なグルテンペプチド提示細胞としてＢ細胞およびその形質細胞（ＰＣ）の子孫を同定していることの妥当性をさらに強化するものである。Ｂ細胞がＣｅＤの特徴であるＧＩ組織破壊における必須の役割を果たすことは、ＣｅＤにおいて見られる絨毛萎縮を繰り返す唯一のマウスＣｅＤモデルにおいてさらに強力な証拠が得られ、ここではＢ細胞の欠乏によってグルテンに誘発される萎縮が完全に抑制された。まとめると、我々のデータは、ＣｅＤにおける病原性グルテンエピトープとなるための要件を満たすために必要な主な重要構成要素を完全に概括しており、かつＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ配列タンパク質を食物源として指し示している。

【0287】

組み換え可溶性ｐＨＬＡ分子の産生
組み換え可溶性ｐＨＬＡ（ｒｓ－ｐＨＬＡ）は免疫学的研究において有益な試薬であるが、ＨＬＡクラスＩとは異なり、これらの試薬は一般的にＨＬＡクラスＩＩに対して製造することがまだ非常に困難であり、ＨＬＡ－ＤＱは部分的に未知の理由からこの方式が特に困難であることが実証されている（デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、２０１１、ネイチャー・レビューズ・イムノロジー（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍ．）、１１、５５１－５５８）。他の報告において、天然のＨＬＡ－ＤＱ２．５は非常に狭いペプチドレパートリーを有し、異なる表現型は、ペプチドをＨＬＡと生産的に組み合わせ得るための特別な要件を指し示すことが十分に実証されている（ファラング（Ｆａｌｌａｎｇ）ら、２００９、ネイチャー・イムノロジー（Ｎａｔ．Ｉｍｍ．）、１０、１０９６－１１０１およびバーグセング（Ｂｅｒｇｓｅｎｇ）、Ｅ．ら、２０１５、イムノジェネティクス（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）６７、７３－８４）。Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ＴＲＩＵＡ Ｔ細胞エピトープ候補をさらに検証するために、我々は本質的に前に記載されるとおりにｒｓ－ｐＨＬＡ複合体を生成しようとした（カルステンら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２００１、１６７：４８６１）。その性能を評価するために、ＤＱ２．５－グリア－α１ａおよびＤＱ２．５－グリア－α２ Ｔ細胞エピトープをそれぞれ有する２つのすでに報告されているバージョンを含めた。

【0288】

実際に、合成リンカーを用いてＴ細胞エピトープとＨＬＡβ鎖のＮ末端とを共有結合すること、およびＳｆ９昆虫細胞において操作されたインビボビオチン化と同時に発現させることを含むこの方法によって、３つのｒｓ－ｐＨＬＡ複合体すべてを産生することが可能であった。これらの発現培養物から親和性精製（ＦＬＡＧタグ精製）された材料の収量および純度は、予期されたとおりに各ペプチド変異体間で変動したが、全体としてはこうした分子に対して見られる通常の範囲内であった（図１１Ｄ）。よって、本発明のＴ細胞エピトープ（ＤＱ２．５－グリア－ＮＴＰ－００１）を含有するｐＨＬＡを含むこれらの分子をかなり良好な均質性になるように作製するための純粋な（ｓｈｅｅｒ）能力（図１１Ａ～Ｃ）は、ＨＬＡ－ＤＱ２．５の状況における真のＴ細胞エピトープであることを強く示している。

【0289】

これらのｒｓ－ｐＨＬＡ複合体の完全性をさらに評価するために、選択された十分に実証済みのパンＨＬＡおよびＴＣＲ様抗体のパネルに対して、本質的に記載されるとおりにニュートラアビジン捕捉ＥＬＩＳＡ結合実験を行った（フリックＲ．ら、２０２１、サイエンス・イムノロジー（Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）６（６２）：ｅａｂｇ４９２５）。３つのバージョンすべてが立体構造特異的パンＤＱ抗体ＳＰＶ－Ｌ３に対する良好かつ濃度依存性の結合を示したのに対し、立体構造特異的パンＤＲ抗体Ｌ２４３に対するこうした結合は見られず（図１２Ａ～Ｃ）、正しく折り畳まれた分子が強く示された。ここで生成されたバージョンと非常に類似したＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５－グリア－α１ａのｒｓ－ｐＨＬＡを用いて、２つのＴＣＲ様抗体１０７および４．７Ｃを生じさせ、ＥＬＩＳＡにおいてこの複合体との結合を検査したときに、実際に予期されるとおりの非常に特異的かつ濃度依存性の結合が示され（図１２Ｄ）、これは前の実験と一致し（図１Ａおよび図２Ｂ）、かつ高親和性の４．７Ｃが低親和性の母クローン１０７よりも上位であるという結合序列とも一致した。この結合プロファイルは、ＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５－グリア－ＮＴＰ－００１によって繰り返されたときによく反映された（図１２Ｅ）。これとは対照的に、自身のＨＬＡ－ＤＱ２．５：ＤＱ２．５－グリア－α２標的（図１２Ｆ）とのみ特異的に結合する３．Ｃ１１抗体によるこれらの複合体との結合は見られなかった。集合的に、これらの結果は、３つのＨＬＡ複合体すべてが正しく折り畳まれて、厳密に立体構造依存性のリガンドのみに結合することを示す。

【0290】

よって、実際にＤＱ２．５－グリア－ＮＴＰ－００１（Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６＿ｐ－２Ｅ＿ｐ６Ｅ＿ｍｅｄｉｕｍ）エピトープ候補は、２つの他の公知の免疫優性ＣｅＤエピトープＤＱ２．５－グリア－α１ａおよびＤＱ２．５－グリア－α２と同等に、ＨＬＡ－２．５の状況において完全に機能するインタクトｒｓ－ｐＨＬＡＩＩとして正常に産生されるための厳密な要件を満たすものと我々は結論付ける。

【0291】

Ｔ細胞活性化
上述の一連の実験を通じてデータが明確に示すのは、新規のＤＱ２．５－グリア－ＮＴＰ－００１ペプチドが、ＣｅＤ患者材料において観察されるＴＣＲ様抗体の反応性の供給源となること（図５）、およびＣｅＤ病原性の一部として十分に実証された抗ＤＧＰ ＢＣＲともクロストークするＨＬＡ－ＤＱ２．５拘束性のＣｅＤ特異的Ｔ細胞エピトープを含有することによってこれを行うことの両方に対する厳密な要件のセットを満たすことである。我々は現時点で、高度に制御された方式でＴ細胞反応性の可能性を評価することを可能にするであろうＣｅＤ組織由来の定義されたＴ細胞クローン（ＴＣＣ：Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ）をまだ同定していない。しかし、かなり多くのＣｅＤ ＴＣＣが幾分乱交雑であり、複数のグルテンエピトープと容易に交差反応することが十分に実証されている（例、ダハル－コイララ、Ｓ．ら、２０１６、上記）。過去の研究により、我々はＳＫＷ－３再構築物としてこうしたＴＣＣのパネルを有する（フリックら、２０２１、上記、およびピーターセンら、２０１４、上記）。したがって我々は、こうしたＳＫＷ－３細胞に対するＴ細胞活性化アッセイにおいて異なるバージョンのＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６ペプチドを検査することを選択した。２つの公知のＤＱ２．５－グリア－α１ａ反応性クローン３８０およびＳ２ならびにＤＱ２．５－グリア－α２反応性３６４を含めた。特に、３８０クローンは２つの密接に関係するエピトープＤＱ２．５－グリア－α１ａおよびＤＱ２．５－グリア－ω１を区別しないことが公知である（グンナーセンら、２０１７、上記）。我々は最初にＤＱ２．５－グリア－α１ａに対するＳ２および３８０のペプチド感受性および特異性を推定し、両方とも特異的であることが確認され、Ｓ２クローンの方が幾分感受性が高かった（図１３Ａ）。

【0292】

次いで、図８Ｃで概説されたとおりに、今度はさまざまなＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６バージョンのパネルを用いてアッセイを繰り返した。これらのペプチドはいずれも何ら反応性を示さなかったのに対し、すべての対照ペプチドはＴ細胞を容易に活性化した（図１３Ｂ）。集合的に、これはＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６由来のペプチドが新規のＴ細胞エピトープを表すという見解を再び支持するものである。

【0293】

ＣｅＤ特異的Ｔ細胞の普及率は、異なる患者間ならびに各患者における空間的（組織対末梢）および時間的（時間）勾配において変動する。しかし、たとえ高炎症性状態であってもその絶対頻度は低いことが十分に実証されている（リスネス（Ｒｉｓｎｅｓ）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．）２０１８；１２８（６）：２６４２－２６５０）。最大で１～２％以下の組織存在量を有するこれらのＴ細胞の３０～５０％は未知の反応性を有する（非特許文献１０およびチャオ（Ｑｉａｏ）Ｓ－Ｗら、２０２１、フロンティアズ・イン・イムノロジー（Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１２：６４６１６３）。さらに、これらの細胞のいくつかは低頻度で血液と腸との間を移動するため、我々は、確認済みのＣｅＤ患者または健常対照（ＨＣ）のいずれかに由来するＨＬＡ－ＤＱ２．５タイプの末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）を用いてＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６由来候補に対する明らかなＣｅＤ特異的反応性を検出できるかどうかを評価するために、非常に感受性の高い細胞内ＩＦＮγサイトカインフローアッセイを用いることを選択した（図１４）。

【0294】

ＰＢＭＣ中のＴ細胞の総量は、４５～７５％の間で変動する。よって、最初に任意の外来性ペプチド不在下のＣｅＤ ＰＢＭＣ Ｔ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋）におけるベースラインＩＦＮ－γ検出レベルを確立した（図１４Ａ）。次いで、Ｔ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）α－グリアジン由来の十分に特徴付けられた脱アミド３３量体ペプチドか、またはＴ．ウラルツ（ｕｒａｒｔｕ）Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６ω－グリアジンの脱アミドされた長いバージョンのいずれかの存在下のＨＬＡ－ＤＱ２．５陽性ＣｅＤ（ドナー５９５）およびＨＣ（ドナー５５７）由来の４８時間培養されたＣｅＤおよびＨＣ ＰＢＭＣを用いた（図１４Ｂ）。実際に、ここでＣｅＤ材料における両方のペプチドに向けてＩＦＮ－γ陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の明らかな増殖が見られたのに対し、ＨＣにおいてはこうした増殖が見られなかった（図１４Ｂ）。この明確な増殖は、Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６ペプチドと比較して３３量体の方がわずかに高かった（平均４．２％対２．８％）。特に、ＣＤ３＋／ＣＤ４－細胞集団においては、ＩＮＦ－γ陽性細胞のこの明確な増殖が見られなかった（図１４Ｃ）。

【0295】

応答の個々の変動をよりよく理解するために、３人の異なるＣｅＤドナーおよび２人のＨＣをカバーする拡張した数のＰＢＭＣサンプルによって実験を繰り返した（図１５）。グルテンエピトープに対するＴ細胞の応答および振幅はＣｅＤ個体間で変動することが周知であり、腸生検材料と比較して血液中の応答は通常、Ｔ細胞存在量が少ないためにより可変であるため、この実験は重要である。最初に、ＣｅＤドナー５９５におけるペプチド特異的応答が確認され、こうしたアッセイにおいては絶対応答にしばしば変動が見られるにもかかわらず、ペプチド反応性の序列は本質的に同一のままであった（図１５Ａ）。さらに、ここで実際にＣｅＤドナー依存性のペプチド反応性の変動も観察され、ドナー６００はＡ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６ペプチドを優先するように見え、ドナー５９５は両方に対してほぼ等しく（統計的差異なし）、ドナー５８５はＴ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）α－グリアジン由来の公知の３３量体を優先するように見えた（図１５Ａ）。よって、これら２つのエピトープはどちらもドナー特異的応答を示し、検査されたＰＢＭＣ材料の各々２／３に存在した。重要なことに、２つのＨＣにおいて応答は見られなかった（図１５Ｂ）。まとめると、これらのデータは、Ｔ．ウラルツ（ｕｒａｒｔｕ）Ａ０Ａ０Ｅ３ＳＺＮ６配列が、Ｔ．アエスチブム（ａｅｓｔｉｖｕｍ）α－グリアジン由来の３３量体ペプチドと同等に、ＣｅＤに拘束されると考えられるＨＬＡ－ＤＱ２．５の状況における真のＴ細胞エピトープであることを強く示唆する。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2023-08-25

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含むエピトープ、または
１つ以上のＱ残基がＥ残基に置換されたアミノ酸配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含むエピトープ
を含むペプチドであって、前記ペプチドが最大で４０アミノ酸の長さである、ペプチド。

【請求項2】

前記ペプチドが、アミノ酸配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、もしくはＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、または１つ以上の前記Ｑ残基がＥ残基に置換されたアミノ酸配列、またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列を含み、
前記実質的に相同の配列が１、２、または３アミノ酸の置換、付加、または欠失を有する配列を含み、
前記アミノ酸の置換、付加、または欠失が、請求項１において定義されるコア配列ＰＹＰＱＱＱＱＰＹの外側に位置する、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

前記エピトープが、アミノ酸配列ＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、ＰＹＰＥＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、またはＰＹＰＥＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）を含む、請求項１または請求項２に記載のペプチド。

【請求項4】

前記ペプチドが、前記アミノ酸配列を脱アミドするトランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）によって得ることができる配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項5】

前記ペプチドがアミノ酸配列ＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）を含み、好ましくは前記ペプチドがＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、またはＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項6】

前記ペプチドがアミノ酸配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）を含み、かつ、
残基３の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基１０の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基８の前記ＱがＥ残基に置換される；
もしくは、
前記ペプチドがアミノ酸配列ＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）を含み、かつ、
残基２の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基９の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基７の前記ＱがＥ残基に置換される；
もしくは、
前記ペプチドがアミノ酸配列ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を含み、かつ、
残基３の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基１０の前記ＱがＥ残基に置換され、かつ／または、
残基８の前記ＱがＥ残基に置換される；
請求項１～５のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項7】

前記ペプチドが、アミノ酸配列：
ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、
ＱＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、
ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、
ＰＱＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、
ＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、または
ＰＥＱＰＹＰＱＱＱＱＰＹＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項8】

前記ペプチドが、アミノ酸配列ＱＰＱＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）またはＱＰＥＱＰＹＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項9】

前記ペプチドが、アミノ酸配列ＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）またはＱＰＥＱＰＹＰＱＱＥＱＰＹＧＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）を含む、請求項８に記載のペプチド。

【請求項10】

前記ペプチドが、位置１０または位置１０に対応する位置にＧ残基を含み、
好ましくは前記ペプチドが位置１０および１１または位置１０および１１に対応する位置に残基ＧおよびＴを含む、もしくは、
位置１０および１３、または位置１０および１３に対応する位置に残基ＧおよびＬを含み、
前記位置が請求項１において定義される９量体に関して定義される、請求項１～９のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項11】

ＭＨＣ分子と結合または関連付けされた請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチドを含む、コンジュゲートまたは複合体。

【請求項12】

請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、または
請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体をコードするヌクレオチド配列を含む、１つ以上の核酸分子。

【請求項13】

請求項１２に記載の核酸分子を含む発現ベクター、または前記発現ベクターを含む細胞、もしくは請求項１２に記載の核酸分子を含む細胞。

【請求項14】

請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、請求項１１において定義されるコンジュゲートまたは複合体、請求項１２において定義される核酸分子、もしくは請求項１３において定義される発現ベクターまたは細胞を含む組成物。

【請求項15】

前記組成物がワクチン組成物である、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

対象におけるセリアック病を診断するための方法であって、前記方法が、
前記対象由来のサンプルと、請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチドまたは請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体とを接触させること、および
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体が、前記サンプル中のＴ細胞と結合するかどうか、または
前記サンプルが前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体と結合する抗体を含有するかどうか、を決定することを含み、
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体がＴ細胞と前記結合すること、または前記サンプル中に前記抗体が前記存在することが、前記対象がセリアック病であること、もしくはセリアック病になりやすいことを示す、方法。

【請求項17】

治療に用いるため、好ましくはセリアック病の処置もしくは予防に用いるため、または
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体に対する対象の寛容化に用いるため、または
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体に対する免疫応答の抑制もしくは低減に用いるための、
請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、または請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体、または請求項１２において定義される核酸分子、または請求項１３において定義される発現ベクターもしくは細胞。

【請求項18】

治療に用いるため、好ましくはセリアック病の処置もしくは予防に用いるため、または
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体に対する対象の寛容化に用いるため、または
前記ペプチド、コンジュゲート、もしくは複合体に対する免疫応答の抑制もしくは低減に用いるための、
薬物もしくは組成物の製造における、請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、または請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体、または請求項１２において定義される核酸分子、または請求項１３において定義される発現ベクターもしくは細胞の使用。

【請求項19】

対象におけるＣｅＤを処置もしくは予防する方法、または対象の寛容化の方法、または対象における免疫応答を抑制する方法であって、
前記方法が、請求項１～１０のいずれか一項において定義されるペプチド、または請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体、または請求項１２において定義される核酸分子、または請求項１３において定義される発現ベクターもしくは細胞の有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項20】

請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体と特異的に結合する結合タンパク質。

【請求項21】

前記結合タンパク質が、Ｔ細胞受容体、または抗体、または抗体の抗原結合ドメインを含む、請求項２０に記載の結合タンパク質。

【請求項22】

前記Ｔ細胞受容体が可溶性Ｔ細胞受容体である、請求項２１に記載の結合タンパク質。

【請求項23】

前記結合タンパク質が、細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくはＴ細胞またはＮＫ細胞の表面に発現される、請求項２０または請求項２１に記載の結合タンパク質。

【請求項24】

前記結合タンパク質が、たとえば細胞毒性部分またはｓｉＲＮＡなどのペイロードと関連付けられるか、またはエフェクター細胞に対する特異性を有する第２の結合タンパク質と関連付けられる、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項25】

治療に用いるため、好ましくはセリアック病の処置または予防に用いるための、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項26】

治療に用いるため、好ましくはセリアック病の処置または予防に用いるための薬物または組成物の製造における、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の結合タンパク質の使用。

【請求項27】

対象におけるセリアック病を処置または予防する方法であって、
前記方法が、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の結合タンパク質の有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項28】

請求項２０～２２のいずれか一項に記載の結合タンパク質を産生する方法であって、
前記方法が、請求項１１において定義されるコンジュゲートもしくは複合体の使用を含む、方法。

【手続補正書】

【提出日】2024-06-12

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

2024538595000001.xml

【国際調査報告】