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▶ インダストリー ファウンデーション オブ チョンナム ナショナル ユニバーシティーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-23
(54)【発明の名称】炎症性疾患治療用の薬学組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 33/32 20060101AFI20241016BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20241016BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20241016BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20241016BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20241016BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20241016BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20241016BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20241016BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20241016BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20241016BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20241016BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20241016BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20241016BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20241016BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20241016BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20241016BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 19/06 20060101ALI20241016BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20241016BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20241016BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20241016BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241016BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20241016BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241016BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241016BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20241016BHJP
【ＦＩ】
A61K33/32 ZNA
A61K47/10
A61K47/32
A61K47/34
A61K47/42
A61K47/36
A61K9/10
A61P29/00
A61P13/12
A61P17/04
A61P17/00
A61P37/08
A61P11/06
A61P27/02
A61P1/02
A61P11/02
A61P27/16
A61P11/00
A61P1/04
A61P1/00
A61P19/06
A61P19/08
A61P29/00 101
A61P37/02
A61P19/02
A61P21/00
A61P1/16
A61P13/10
A61P25/00
A61K45/00
C12N15/09 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024519271
(86)(22)【出願日】2022-06-24
(85)【翻訳文提出日】2024-03-28
(86)【国際出願番号】 KR2022009070
(87)【国際公開番号】W WO2023054849
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】10-2021-0128246
(32)【優先日】2021-09-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
３．ＷＩＮＤＯＷＳ
(71)【出願人】
【識別番号】308026861
【氏名又は名称】インダストリー ファウンデーション オブ チョンナム ナショナル ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100137095
【弁理士】
【氏名又は名称】江部 武史
(74)【代理人】
【識別番号】100091627
【弁理士】
【氏名又は名称】朝比 一夫
(72)【発明者】
【氏名】パク， イン キュ
(72)【発明者】
【氏名】サジ， ウタマン
(72)【発明者】
【氏名】アンスジャ， マチュー
(72)【発明者】
【氏名】キム， ス ワン
(72)【発明者】
【氏名】ベ， ウン ヒ
(72)【発明者】
【氏名】チェ， ホン サン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA17
4C076CC04
4C076EE09
4C076EE11
4C076EE23
4C076EE25
4C076EE30
4C076EE41
4C076FF70
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA21
4C084NA14
4C084ZA02
4C084ZA08
4C084ZA33
4C084ZA34
4C084ZA59
4C084ZA66
4C084ZA67
4C084ZA68
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4C084ZA81
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4C084ZA94
4C084ZA96
4C084ZB07
4C084ZB11
4C084ZB13
4C084ZB15
4C084ZC31
4C086AA01
4C086AA02
4C086HA09
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA21
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA08
4C086ZA33
4C086ZA34
4C086ZA59
4C086ZA66
4C086ZA67
4C086ZA68
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZA89
4C086ZA94
4C086ZA96
4C086ZB07
4C086ZB11
4C086ZB13
4C086ZB15
4C086ZC31
(57)【要約】
本発明の炎症性疾患治療用の薬学組成物は、疎水性酸化マンガンがミセルに担持されることによって生体内で安定的に保護され、標的部位への送達が容易である。また、ミセルの親水性部位と疎水性部位が活性酸素分解性リンカー（ＲＯＳ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）で結合されて炎症部位の活性酸素に反応して分解されることにより、効率よく疎水性酸化マンガン粒子を放出することができ、放出された疎水性酸化マンガンが酸素を発生させ、それによって標的部位の微小環境を変化させてミセルに担持された生理活性物質の効果を向上させることができる。
【選択図】図４
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
表面に疎水性置換基を有する酸化マンガン粒子と、前記酸化マンガン粒子を内部に担持し、親水性部位と疎水性部位が活性酸素分解性リンカー（ＲＯＳ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）で結合されたミセル形成分子で形成されたミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）とを含む、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【請求項2】
前記疎水性置換基は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ３０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ３０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ３０のアリール基、または置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ１～Ｃ３０のエステル基、またはハロゲン含有基である、請求項１に記載の炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【請求項3】
前記酸化マンガンは、ＭｎＯ、Ｍｎ２Ｏ３、ＭｎＯ２、Ｍｎ３Ｏ４およびＭｎ２Ｏ５のいずれかである、請求項１に記載の炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【請求項4】
前記酸化マンガン粒子は、粒径が１０～３０ｎｍである、請求項１に記載の炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【請求項5】
前記活性酸素分解性リンカーは、チオケタールリンカー（ｔｈｉｏｋｅｔａｌ）、ＴＳＰＢＡリンカー（Ｎ１－（４－ｂｏｒｏｎｏｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ３－（４－ｂｏｒｏｎｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉａｍｉｎｉｕｍ）、またはＡＡリンカー（ａｍｉｎｏａｃｒｙｌａｔｅ）である、請求項１に記載の炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【請求項6】
前記親水性部位は水溶性高分子を含み、前記疎水性部位は疎水性炭化水素基を含み、前記活性酸素分解性リンカーは、チオケタールリンカーである、請求項１に記載の炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【請求項7】
前記水溶性高分子は、ポリエチレングリコール、アクリル酸系重合体、メタクリル酸系重合体、ポリアミドアミン、ポリ（２－ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）系重合体、水溶性ポリペプチド、水溶性多糖体、またはポリグリセロールである、請求項６に記載の炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【請求項8】
前記疎水性炭化水素基は、ヘキサデシルアミン（ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ヘプタデシルアミン（ｈｅｐｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ステアラミン（ｓｔｅａｒａｍｉｎｅ）、ノナデシルアミン（ｎｏｎａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ドデシルアミン（ｄｏｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）ラウリルアミン（Ｎ，Ｎｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｌａｕｒｙｌａｍｉｎｅ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、リノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）、オレイルアミン（ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ）、ヘキサデカン酸（ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、エイコセン酸（ｅｉｃｏｓｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）またはエルカ酸（ｅｒｕｃｉｃ ａｃｉｄ）由来の炭化水素基である、請求項６に記載の炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【請求項9】
前記ミセル１００重量部に対して、前記酸化マンガン粒子を５～１０重量部含む、請求項１に記載の炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【請求項10】
前記ミセルは粒径が１５０～２５０ｎｍである、請求項１に記載の炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【請求項11】
前記炎症性疾患は、腎不全、アトピー性皮膚炎、浮腫、皮膚炎、アレルギー、喘息、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大膓炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、シェーグレン症候群（ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、または多発性硬化症である、請求項１に記載の炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【請求項12】
前記ミセルの内部に担持された生理活性物質をさらに含む、請求項１に記載の炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、炎症性疾患治療用の薬学組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
炎症は、外部からの物理的刺激、様々なアレルギー誘発物質との接触のような化学的刺激、あるいはバクテリア、カビまたはウイルスのような微生物の侵入などによって生体組織が損傷することを防ぐための生体の防御反応の一つである。
【0003】
炎症は、反応期間によって、急性炎症（ａｃｕｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、即時反応、非特異反応、数日～数週間）、慢性炎症（ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、遅延反応、特異反応、数週間以上）、亜急性炎症（ｓｕｂａｃｕｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、急性炎症と慢性炎症の中間段階、多核球と単核球の混合型産物の特徴）に分類される。
【0004】
急性腎不全は、腎機能が数時間～数日の短期間で急激に低下し、体液、電解質、酸塩基の不均衡、老廃物の体内への蓄積、さらには患者の死亡を引き起こす疾患である。急性腎不全は、病院入院患者の約２０％に出現するほど多く、軽度の腎機能低下から透析を必要とする重篤な疾患まで様々な経過を有する。透析を必要とする急性腎不全の場合は、致命率が５０％に達するが、急性腎不全に特異的な治療法はないのが現状である。急性腎不全の原因は様々であるが、共通の機序として組織の炎症が寄与することが知られており、損傷組織で発生する活性酸素種による酸化ストレスが主な原因の一つとして判明している。このため、酸化ストレスを制御する様々な治療法が試みられてきたが、短い半減期および全身副作用などの問題により、治療薬としては使用されていない。
【0005】
そこで、酸化ストレスによる炎症組織に効率的に送達され、低酸素環境を効果的に抑制し、それによって標的組織の微小環境を変化させ、薬物の効果を最大化できる製剤の研究が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、疎水性置換基で表面改質された酸化マンガン粒子がミセル内に担持され、生体内で安定性を維持して循環しながら炎症部位で放出され、活性酸素を分解して炎症の増幅を最小限に抑える炎症疾患治療用の薬学組成物を提供することを目的とする。
【0007】
本発明は、疎水性酸化マンガン粒子が炎症部位で活性酸素と反応して酸素発生を誘導し、それによって標的組織の微小環境を変化させ、ミセルに担持された生理活性物質の効果を向上させる炎症性疾患治療用の薬学組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
１．表面に疎水性置換基を有する酸化マンガン粒子と、前記酸化マンガン粒子を内部に担持し、親水性部位と疎水性部位が活性酸素分解性リンカー（ＲＯＳ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）で結合されたミセル形成分子で形成されたミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）とを含む、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【0009】
２．前記項目１において、前記疎水性置換基は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ３０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ３０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ３０のアリール基、または置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ１～Ｃ３０のエステル基、またはハロゲン含有基である、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【0010】
３．前記項目１において、前記酸化マンガンは、ＭｎＯ、Ｍｎ２Ｏ３、ＭｎＯ２、Ｍｎ３Ｏ４、およびＭｎ２Ｏ５のいずれかである、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【0011】
４．前記項目１において、前記酸化マンガン粒子は、粒径が１０～３０ｎｍである、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【0012】
５．前記項目１において、前記活性酸素分解性リンカーは、チオケタールリンカー（ｔｈｉｏｋｅｔａｌ）、ＴＳＰＢＡリンカー（Ｎ１－（４－ｂｏｒｏｎｏｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ３－（４－ｂｏｒｏｎｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉａｍｉｎｉｕｍ）またはＡＡリンカー（ａｍｉｎｏａｃｒｙｌａｔｅ）である、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【0013】
６．前記項目１において、前記親水性部位は水溶性高分子を含み、前記疎水性部位は疎水性炭化水素基を含み、前記活性酸素分解性リンカーは、チオケタールリンカーである、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【0014】
７．前記項目６において、前記水溶性高分子は、ポリエチレングリコール、アクリル酸系重合体、メタクリル酸系重合体、ポリアミドアミン、ポリ（２－ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）系重合体、水溶性ポリペプチド、水溶性多糖体、またはポリグリセロールである、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【0015】
８．前記項目６において、前記疎水性炭化水素基は、ヘキサデシルアミン（ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ヘプタデシルアミン（ｈｅｐｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ステアラミン（ｓｔｅａｒａｍｉｎｅ）、ノナデシルアミン（ｎｏｎａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ドデシルアミン（ｄｏｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）ラウリルアミン（Ｎ，Ｎｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｌａｕｒｙｌａｍｉｎｅ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、リノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）、オレイルアミン（ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ）、ヘキサデカン酸（ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、エイコセン酸（ｅｉｃｏｓｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）またはエルカ酸（ｅｒｕｃｉｃ ａｃｉｄ）由来の炭化水素基である、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【0016】
９．前記項目１において、前記ミセル１００重量部に対して、前記酸化マンガン粒子を５～１０重量部含む、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【0017】
１０．前記項目１において、前記ミセルは、粒径が１５０～２５０ｎｍである、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【0018】
１１．前記項目１において、前記炎症性疾患は、腎不全、アトピー性皮膚炎、浮腫、皮膚炎、アレルギー、喘息、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大膓炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、シェーグレン症候群（ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、または多発性硬化症である、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【0019】
１２．前記項目１において、前記ミセルの内部に担持された生理活性物質をさらに含む、炎症性疾患治療用の薬学組成物。
【発明の効果】
【0020】
本発明は、炎症性疾患治療用の薬学組成物に関するものであり、疎水性酸化マンガンがミセルに担持されることによって生体内で安定的に保護され、標的部位への送達が容易である。
【0021】
また、ミセルの親水性部位と疎水性部位が活性酸素分解性リンカー（ＲＯＳ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）で結合され、炎症部位の活性酸素に反応して分解されることにより、疎水性酸化マンガン粒子を効率的に放出することができ、放出された疎水性酸化マンガンが酸素を発生させて標的部位の微小環境を変化させることにより、ミセルに担持された生理活性物質の効果を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0024】
本発明は、炎症性疾患治療用の薬学組成物を提供する。
【0025】
本発明の組成物は、表面に疎水性置換基を有する酸化マンガン粒子（以下、「疎水性酸化マンガン」という。）を含む。
【0026】
疎水性酸化マンガン粒子は、酸化マンガンをミセル内に安定に担持するために、酸化マンガンの表面に疎水性置換基が存在するように処理される。
【0027】
疎水性置換基は、例えば、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ３０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ３０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ３０のアリール基、または置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ１～Ｃ３０のエステル基、またはハロゲン含有基などであってもよい。
【0028】
前記疎水性置換基は、例えば、ハロゲン原子、ニトロ、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、チオール、カルボキシル、アミド、ニトリル、スルフィド、ジスルフィド、スルフェニル、ホルミル、ホルミルオキシ、ホルミルアミノ、ホルミルアミノ、アリールで置換されていてもよい。
【0029】
本発明の一実施形態では、酸化マンガンは、例えば、１－ドデカンチオール（１－Ｄｏｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ）、１－オクタデカンチオール（１－Ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ）、または１－ヘキサンジオール（１－ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ）を処理して表面に疎水性置換基を有することができる。
【0030】
酸化マンガンは、これらに限定されるものではないが、ＭｎＯ、Ｍｎ２Ｏ３、ＭｎＯ２、Ｍｎ３Ｏ４およびＭｎ２Ｏ５のいずれかであってもよく、好ましくはＭｎ３Ｏ４であってもよい。
【0031】
本発明の一実施形態では、酸化マンガンは、塩化マンガンをアルカリ性溶液（例えば、ＮａＯＨ）で還元してＭｎ（ＯＨ）２を生成し、ＭｎＯに分解した後、大気中の酸素によって酸化されて合成されたＭｎ３Ｏ４であってもよい。
【0032】
酸化マンガン粒子は、前記のように疎水性置換基で表面改質され、ミセル内に安定に担持することができる。酸化マンガン粒子は、ミセル内の疎水性部位全体に広がっていてもよく、コアに担持されていてもよい。酸化マンガンが生体内で安定して循環しながら炎症部位で放出されるように、コアに担持されることがより好ましい。
【0033】
疎水性酸化マンガン粒子の粒径は１０～３０ｎｍであってもよい。疎水性酸化マンガン粒子の粒径が前記範囲であると、ミセル内で均一に分布して安定に担持され、標的部位での活性酸素との反応性が高くなり、酸素発生を増加させることができる。
【0034】
本発明は、親水性部位と疎水性部位が活性酸素分解性リンカー（ＲＯＳ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）で結合されたミセル形成分子で形成されたミセルを含む。
【0035】
ミセル形成分子は、親水性部位と疎水性部位が活性酸素分解性リンカーにより結合されたものであり、内部が疎水性を、外部が親水性を有するミセルを形成する。
【0036】
ミセル形成分子は、親水性部位が水溶性高分子を含み、疎水性部位が疎水性炭化水素基を含むことができる。
【0037】
リンカーは、親水性部位と疎水性部位を繋ぐ連結基であり、活性酸素に対する感受性が高く、活性酸素と反応してその結合を切断する。
【0038】
リンカーは、例えば、チオケタールリンカー（ｔｈｉｏｋｅｔａｌ）、ＴＳＰＢＡリンカー（Ｎ１－（４－ｂｏｒｏｎｏｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ３－（４－ｂｏｒｏｎｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉａｍｉｎｉｕｍ）、またはＡＡリンカー（ａｍｉｎｏａｃｒｙｌａｔｅ）などであってもよいが、これらに限定されない。
【0039】
ミセル形成分子は、水溶性高分子および疎水性炭化水素基がそれぞれチオケタールリンカー（ｔｈｉｏｋｅｔａｌ ｌｉｎｋｅｒ、ＴＬ）と共有結合した両親媒性高分子化合物であってもよい。具体的には、前記水溶性高分子の一端と疎水性炭化水素基の一端が、それぞれアミド基でチオケタールリンカーと共有結合し、水相中で自己集合（Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ）してミセルを形成することができる。
【0040】
チオケタールリンカーは、水溶性高分子と疎水性炭化水素基を繋ぐ連結基であり、活性酸素に対する感受性が非常に高く、正常な生理的条件下で優れた結合安定性を有し、血液循環中にミセルから疎水性酸化マンガン粒子が早期に放出されることを防止することができる。
【0041】
水溶性高分子は、重量平均分子量の範囲が５００～１０，０００ｇ／ｍｏｌであってもよく、好ましくは８００～５，０００ｇ／ｍｏｌであってもよく、より好ましくは１，０００～３，０００ｇ／ｍｏｌであってもよい。前記水溶性高分子は、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール、アクリル酸系重合体、メタクリル酸系重合体、ポリアミドアミン、ポリ（２－ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）系重合体、水溶性ポリペプチド、水溶性多糖体またはポリグリセロール、又はこれらの誘導体などであってもよい。
【0042】
水溶性ポリペプチドは、限定されるものではないが、具体的には、ポリグルタミン酸（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ポリアスパラギン酸（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリアスパルトアミド（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）、及びこれらの共重合体から選択できるが、これらに限定されるものではない。
【0043】
水溶性多糖体は、具体的には、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストラン、ペクチン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート及びこれらの誘導体から選択できるが、これらに限定されるものではない。
【0044】
疎水性炭化水素基は、疎水性炭化水素化合物由来の炭化水素基であり、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を有してもよく、前記炭化水素基は、脂肪族炭化水素基を有してもよく、具体的には、直鎖状の脂肪族炭化水素基を有してもよい。
【0045】
疎水性炭化水素化合物は、これらに限定されるものではないが、ヘキサデシルアミン（ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ヘプタデシルアミン（ｈｅｐｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ステアラミン（ｓｔｅａｒａｍｉｎｅ）、ノナデシルアミン（ｎｏｎａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ドデシルアミン（ｄｏｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）ラウリルアミン（Ｎ，Ｎｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｌａｕｒｙｌａｍｉｎｅ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、リノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）、オレイルアミン（ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ）、ヘキサデカン酸（ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、エイコセン酸（ｅｉｃｏｓｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、またはエルカ酸（ｅｒｕｃｉｃ ａｃｉｄ）などであってもよい。
【0046】
疎水性炭化水素化合物は、重量平均分子量の範囲が１００～５００ｇ／ｍｏｌであってもよく、好ましくは１５０～３５０ｇ／ｍｏｌであってもよく、より好ましくは１８０～３００ｇ／ｍｏｌであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0047】
疎水性炭化水素基が疎水性コアを形成することにより、疎水性コア部がある程度の流動性（ｆｌｕｉｄｉｔｙ）を有することができる。この流動性は、特に活性酸素に反応して疎水性コアに位置する疎水性酸化マンガンを迅速に放出できる点から、疎水性高分子が形成する流動性の低い疎水性コア部に比べて有利な利点を有する。長鎖の脂肪族炭化水素基が疎水性コアを形成することにより、疎水性コアに十分な疎水性を提供し、疎水性酸化マンガンを安定に担持しながらも、ある程度の流動性を提供することにより、活性酸素に分解性（ＲＯＳ－ｌａｂｉｌｅ）を有するチオケタールリンカーが標的組織の周辺の活性酸素に敏感に反応して容易に分解され得る。
【0048】
また、大きな疎水性高分子を用いた場合と比較して、水相で自己集合して形成されたミセルの大きさが相対的に小さくても、脂肪族炭化水素基のある程度の流動性により、疎水性コアに十分な量の疎水性酸化マンガンを安定的に捕集することができる。
【0049】
水溶性高分子と疎水性炭化水素化合物との重量平均分子量の比は、下記式１を満たすことができる。
【0050】
［式１］
０．０１＜ＨＣ／ＷＳＰ＜０．３
０．０１＜ＨＣ／ＷＳＰ＜０．３
【0051】
（前記式１中、ＷＳＰは水溶性高分子の重量平均分子量を意味し、ＨＣは疎水性炭化水素化合物の分子量を意味する。）
【0052】
前記式１において、ＨＣ／ＷＳＰの値は０．０１～０．３、具体的には０．０４～０．２５、より具体的には０．０８～０．２であってもよい。前記式１を満たす水溶性高分子と疎水性炭化水素基から形成されたミセルは、従来のミセルとは異なり、疎水性炭化水素基の分子量が小さく、疎水性物質を含む水相での自己集合性に優れ、速度論的に制御（ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）されるよりは熱力学的に制御（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）されることにより、再現性に優れているという利点を有する。さらに、生成されるミセルの疎水性領域の分子量が小さく、二次粒子に凝集せず、分散性および安定性にさらに優れており、粒子サイズが小さく、顕著に向上したコロイド安定性を有するため好ましい。
【0053】
本発明は、前記ミセル１００重量部に対して酸化マンガン粒子を５～１０重量部含むことができる。ミセルに疎水性酸化マンガンが前記範囲内で含まれると、ミセルは疎水性酸化マンガンを安定的に捕集することができ、炎症部位で疎水性酸化マンガンを効果的に放出することができる。また、疎水性酸化マンガンが適切な含有量で含まれ、標的部位で放出された疎水性酸化マンガンによる酸素発生量を増加させ、それによって標的部位の微小環境を変化させて生理活性物質の効果を向上させることができる。
【0054】
本発明のミセルは１５０～２５０ｎｍの直径を有することができる。ミセルの直径が前記範囲内にあることにより、生体内循環が容易であり、活性酸素によるチオケタールリンカーの分解および疎水性酸化マンガンの放出を良好に行うことができる。
【0055】
炎症性疾患とは、炎症によって媒介されるあらゆる疾患を意味する。例えば、腎不全、アトピー性皮膚炎、浮腫、皮膚炎、アレルギー、喘息、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大膓炎、痔、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、シェーグレン症候群（ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、多発性硬化症などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0056】
本発明は、前記ミセル内に担持された生理活性物質をさらに含む、炎症性疾患治療用の薬学組成物を提供する。
【0057】
本発明の組成物は、ミセル内に多様な生理活性物質が担持された組成物であってもよい。生理活性物質は、標的部位の低酸素部位で疎水性酸化マンガンと共に放出され、疎水性酸化マンガンによる酸素発生によって組織の微小環境を変化し、より高い効果を示すことができる。
【0058】
生理活性物質は、ミセル内に担持され、個体に送達されて活性を示すことができる生理活性物質／生体機能調節物質であり、低分子量薬物、遺伝子薬物、タンパク質薬物、抽出物、核酸、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、アプタマー、化学薬品、酵素、アミノ酸、糖、脂質、化合物（天然化合物及び／又は合成化合物）、及びこれらを構成する要素からなる群より選択される少なくとも一つであってもよく、例えば、ドキソルビシン、イリノテカン、ソラフェニブ、アドリアマイシン、ダウノマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、エピルビシン、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、アクラシノマイシン、ナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、タモキシフェン、バルルビシン、ピラルビシン、ミトザントロン、ゲムシタビン、イダルビシン、テモゾロミド、パクリタキセル、デキサメタゾン、アルデスロイキン、アベルマブ、ベバシズマブ、カルボプラチン、レゴラフェニブ、ドセタキセル、ドキシル、ゲフィチニブ、イマチニブメシレート、ハーセプチン、イマチニブ、アルデスロイキン、キイトルーダ、オプジーボ、マイトマイシンＣ、ニボルマブ、オラパリブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブ、スニチニブ、アテゾリズマブ、ラパチニブ、およびイピリムマブからなる群より選択される少なくとも一つであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0059】
生理活性物質は、ヒトまたは動物有機体に直接的または間接的、治療学的、生理学的及び／又は薬理学的な効果を提供できる治療学的活性剤であり得る。
【0060】
治療学的活性剤は、例えば、一般的な医薬、薬物、プロドラッグまたは標的基、または標的基を含む薬物またはプロドラッグであってもよい。
【0061】
治療学的活性剤は、例えば、抗炎症剤、特に非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）、より具体的にはＣＯＸ－２阻害剤；ステロイド系抗炎症剤；予防的抗炎症剤；アレルギー性鼻炎の医薬；抗関節炎薬剤；痛風の処置薬；抗痔核の処置薬；プロトンポンプ阻害剤のような胃潰瘍および炎症のための処置薬；心血管治療薬、特に抗高血圧剤（例えば、カルシウムチャネル遮断薬またはカルシウム拮抗薬）および抗不整脈剤；うっ血性心不全の医薬；強心剤；血管拡張薬；ＡＣＥ阻害剤；利尿薬；炭酸脱水酵素阻害剤；強心配糖体；ホスホジエステラーゼ阻害剤；遮断薬；β－遮断薬；ナトリウムチャネル遮断薬；カリウムチャネル遮断薬；β－アドレナリン作動薬；血小板阻害剤；アンギオテンシンＩＩ拮抗薬；抗凝固薬；血栓溶解剤；出血の処置薬；貧血の処置薬；トロンビン阻害剤； 抗寄生虫剤；抗菌剤；抗緑内障剤；マスト細胞安定剤；散瞳薬；呼吸器系に影響を及ぼす薬剤；αアドレナリン拮抗薬；コルチコステロイド；慢性閉塞性肺疾患の医薬；キサンチン－オキシダーゼ阻害剤；自能性薬物および自能性薬物拮抗薬；抗マイコバクテリア剤；抗真菌剤；抗原虫薬；駆虫剤；抗ウイルス剤、特に呼吸器抗ウイルス剤、ヘルペス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルスおよび肝炎感染のための抗ウイルス剤；白血病およびカポジ肉腫のための処置薬；疼痛管理剤、特に麻酔薬および鎮痛剤、オピオイド受容体作動薬、オピオイド受容体部分作動薬、オピオイド拮抗薬、オピオイド受容体混合作動薬－拮抗薬を含めたオピオイド類； 神経弛緩剤；交感神経刺激性の医薬；アドレナリン拮抗薬；神経伝達物質の取込みまたは放出に影響を及ぼす薬物；抗コリン作用医薬；放射線または化学療法の作用を防止または処置するための薬剤；脂肪生成薬物；脂肪を低減する処置薬；リパーゼ阻害剤のような抗肥満剤；交感神経刺激剤；プロスタグランジン；ＶＥＧＦ阻害剤； 抗過脂質血症剤、特にスタチン；中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を及ぼす薬物、例えば抗精神病薬、抗てんかん薬および抗発作薬（抗けいれん薬）、向精神薬物、刺激薬、抗不安薬および睡眠薬物、抗うつ薬物；抗パーキンソンの医薬；性ホルモンのようなホルモンおよびその断片；成長ホルモン拮抗薬；ゴナドトロピン放出ホルモンおよびその類似体；ステロイドホルモンおよびそれらの拮抗薬；選択的エストロゲンモジュレーター；成長因子；インスリン、インスリンフラグメント、インスリン類似体、グルカゴン様ペプチドおよび低血糖剤のような抗糖尿病の医薬；Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４抗ヒスタミン薬；ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、核酸およびオリゴヌクレオチド医薬；天然タンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸などの類似体、フラグメントおよび変異体；片頭痛を処置するために使用される薬剤；喘息の医薬；コリン性拮抗薬；グルココルチコイド；アンドロゲン；抗アンドロゲン；アドレノコルチコイド生合成の阻害剤；ビスホスホネートのような骨粗鬆症の処置薬；抗甲状腺の医薬；日焼け止め、日焼け防止薬およびフィルター；サイトカイン拮抗薬；抗がん薬物；抗アルツハイマー薬物；ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤；フィブレート系薬剤；コレステロール吸収阻害剤；ＨＤＬコレステロール上昇剤；トリグリセリド低減剤；老化防止または皺取り剤；ホルモン産生のための前駆体分子；コラーゲンおよびエラスチンのようなタンパク質；抗菌剤；抗座瘡剤；抗酸化剤；ヘアトリートメントおよび美白剤；日焼け止め、日焼け防止薬およびフィルター；ヒトアポリポタンパク質の変異体；ホルモン産生のための前駆体分子；タンパク質およびそのペプチド；アミノ酸；ブドウ種子エキスのような植物エキス；ＤＨＥＡ；イソフラボン；ビタミン、フィトステロールおよびイリドイドグリコシドを含めた栄養剤、セスキテルペンラクトン、テルペン、フェノール性グリコシド、トリテルペン、ヒドロキノン誘導体、フェニルアルカノン；レチノール、ならびにレチノイン酸および補酵素Ｑ１０を含むレチノイドのような抗酸化剤；オメガ－３－脂肪酸；グルコサミン；核酸、オリゴヌクレオチド、アンチセンス医薬；酵素；補酵素；サイトカイン類似体；サイトカイン作動薬；サイトカイン拮抗薬；免疫グロブリン；抗体；抗体医薬；遺伝子治療薬；リポタンパク質；エリスロポエチン；ワクチン；アレルギー／喘息、関節炎、がん、糖尿病、成長機能障害、心血管疾患、炎症、免疫学的障害、脱毛症、疼痛、眼疾患、てんかん、婦人科障害、ＣＮＳ疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、ＧＩ疾患、肥満、および血液疾患のようなヒトおよび動物の疾患の治療または予防のための小分子治療剤などがあるが、これらに限定されない。
【0062】
本発明の薬学組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬学組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。薬学的に許容される適切な担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．、１９９５）に詳細に記載されている。本発明の薬学的組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、通常の熟練した医師によって、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。なお、本発明の薬学組成物の投与量はこれに限定されず、１日当たり０．０１～２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）であってもよい。
【0063】
本発明の薬学組成物は、経口または非経口投与することができ、非経口投与される場合、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。本発明の薬学組成物は、適用される疾患の種類に応じて投与経路が決定されることが好ましい。本発明の薬学組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されてもよく、或いは多用量容器内に内入して製造されてもよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、またはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでもよい。
【0064】
以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明することとする。
【実施例】
【0065】
製造例
製造例１．疎水性酸化マンガンの製造
Ｃ６、Ｃ１２またはＣ１８アルキル基を有する疎水性酸化マンガン粒子を製造するために、下記表１の材料を使用した。疎水性酸化マンガン粒子の模式図およびアルキル基の長さによる疎水性酸化マンガンの製造工程は、図１及び２に示す通りである。
製造例１．疎水性酸化マンガンの製造
Ｃ６、Ｃ１２またはＣ１８アルキル基を有する疎水性酸化マンガン粒子を製造するために、下記表１の材料を使用した。疎水性酸化マンガン粒子の模式図およびアルキル基の長さによる疎水性酸化マンガンの製造工程は、図１及び２に示す通りである。
【0066】
【表1】
【0067】
ＭｎＣｌ２を完全に溶かし、２ｍｍｏｌのＭｎＣｌ２に４ｍｍｏｌのＮａＯＨを加えて強くかき混ぜ、還元してＭｎ（ＯＨ）２を得て、試料が褐色に変化することを確認した。その後、Ｍｎ（ＯＨ）２はＭｎＯに分解され、ＭｎＯは大気中の酸素によってＭｎ３Ｏ４に酸化した（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ工程）。
【0068】
前記で得られた４ｍｍｏｌのＭｎ３Ｏ４を強く撹拌しながら１－ヘキサンチオール、１－ドデカンチオール、又は１－オクタデカンチオールの１ｍｍｏｌを反応させ、Ｍｎ３Ｏ４の表面に各Ｃ６、Ｃ１２またはＣ１８アルキル基を有する疎水性酸化マンガン粒子（ｄＭｎ３Ｏ４）を製造した（安定化（Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）工程）。形成された沈殿物をエタノールで洗浄（５０００ｒｐｍ、５分、５回）した後、真空乾燥または空気風乾した。乾燥した沈殿物をさらに蒸留水で２回洗浄した後、凍結乾燥して、最終的に疎水性酸化マンガン粒子を得た（精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）工程）。
【0069】
製造例２．ミセルの製造
ステップ１：チオケタールリンカー（ＴＬ）の製造
４９ｍｍｏｌの３－メルカプトプロピオン酸（３－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を９８ｍｍｏｌの無水アセトンに溶解し、２３℃で６時間一定に撹拌しながら生成した生成物を結晶化するまで冷却した。結晶化した生成物をろ過し、ｎ－ヘキサン（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）ですすぎ、冷蒸留水でもう一度すすいだ後、凍結乾燥した。
ステップ１：チオケタールリンカー（ＴＬ）の製造
４９ｍｍｏｌの３－メルカプトプロピオン酸（３－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を９８ｍｍｏｌの無水アセトンに溶解し、２３℃で６時間一定に撹拌しながら生成した生成物を結晶化するまで冷却した。結晶化した生成物をろ過し、ｎ－ヘキサン（ｎ－ｈｅｘａｎｅ）ですすぎ、冷蒸留水でもう一度すすいだ後、凍結乾燥した。
【0070】
ステップ２：チオケタールリンカーで接合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＴＬ）の合成
前記ステップ１で製造したチオケタールリンカー（ＴＬ）の２５４ｍｇと分子量２ｋＤａのメトキシ－ポリエチレングリコールアミン（ＰＥＧ－ＡＭ）の２００ｍｇを１０ｍｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）に入れて室温で混合して混合溶液を製造した。その後、製造した混合溶液に、２７８ｍｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＥＤＣ）および３４５ｍｇのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）を加えた後、１６時間撹拌した。撹拌後、混合溶液を蒸留水に対して分子量カットオフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｕｔ－ｏｆｆ、ＭＷＣＯ）が１，０００の条件下で透析して反応副生物を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥した粉末を１ｍｌのＤＭＦに再溶解し、冷ジエチルエーテル（Ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）に５回繰り返し沈殿させた。その後、真空乾燥して、チオケタールリンカーが接合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＴＬ）を製造した。
前記ステップ１で製造したチオケタールリンカー（ＴＬ）の２５４ｍｇと分子量２ｋＤａのメトキシ－ポリエチレングリコールアミン（ＰＥＧ－ＡＭ）の２００ｍｇを１０ｍｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）に入れて室温で混合して混合溶液を製造した。その後、製造した混合溶液に、２７８ｍｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＥＤＣ）および３４５ｍｇのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）を加えた後、１６時間撹拌した。撹拌後、混合溶液を蒸留水に対して分子量カットオフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｕｔ－ｏｆｆ、ＭＷＣＯ）が１，０００の条件下で透析して反応副生物を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥した粉末を１ｍｌのＤＭＦに再溶解し、冷ジエチルエーテル（Ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）に５回繰り返し沈殿させた。その後、真空乾燥して、チオケタールリンカーが接合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＴＬ）を製造した。
【0071】
ステップ３：ポリエチレングリコール－ＴＬ－Ｃ１８（ＰＴＣ）の製造
前記ステップ２で製造したＰＥＧ－ＴＬの１００ｍｇ、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＴＥＡ）の８０ｍｌ、及びステアラミン（ｓｔｅａｒａｍｉｎｅ、ｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ、Ｃ１８）の８０ｍｇを１０ｍｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）に添加し、８０℃で混合した。完全に混合した混合溶液に、２４０ｍｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＥＤＣ）および１４５ｍｇのヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）を加え、一日間撹拌した。反応後、溶液を蒸留水に対して分子量カットオフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ－ｏｆｆ、ＭＷＣＯ）が１２－１４ｋＤａの条件下で２日間透析して精製し、凍結乾燥した。これにより、両端に親水性部位および疏水性部位を有し、中間にＲＯＳ感受性部位を有するポリエチレングリコール－ＴＬ－Ｃ１８（ＰＴＣ）を製造した（図３）。
前記ステップ２で製造したＰＥＧ－ＴＬの１００ｍｇ、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＴＥＡ）の８０ｍｌ、及びステアラミン（ｓｔｅａｒａｍｉｎｅ、ｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ、Ｃ１８）の８０ｍｇを１０ｍｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）に添加し、８０℃で混合した。完全に混合した混合溶液に、２４０ｍｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＥＤＣ）および１４５ｍｇのヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）を加え、一日間撹拌した。反応後、溶液を蒸留水に対して分子量カットオフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ－ｏｆｆ、ＭＷＣＯ）が１２－１４ｋＤａの条件下で２日間透析して精製し、凍結乾燥した。これにより、両端に親水性部位および疏水性部位を有し、中間にＲＯＳ感受性部位を有するポリエチレングリコール－ＴＬ－Ｃ１８（ＰＴＣ）を製造した（図３）。
【0072】
ＰＴＣから製造された高分子ミセルは、ＣＭＣ（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｍｉｃｅｌｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を測定するために、様々な濃度の高分子ミセルを含む水溶液を製造した。蛍光プローブとしては６×１０－７Ｍのピレン（ｐｙｒｅｎｅ）を使用し、蛍光分析器（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）における励起波長は３３６ｎｍに設定し、発光波長は３６０～４５０ｎｍの範囲で観察した。測定の結果、ＰＴＳ高分子ミセルのＣＭＣは０．２ｍｇ／ｍＬであった。
【0073】
高分子ミセルの形成を確認するために、Ｄ２Ｏ溶媒上でＰＴＣを自己集合した溶媒を製造した後、ＰＴＣのＤ２Ｏ溶液の１Ｈ－ＮＭＲを測定した。ＰＴＣは、Ｄ２Ｏ溶媒中でステアリック基が疎水性コアを形成することによってＤ２Ｏ中で完全に遮断（ｓｈｉｅｌｄｉｎｇ）され、アルキレン基によるピークであるδ＝０．８３及び１．２３でのピークがほとんどなくなっていた。この結果は、ＰＥＧが親水性シェルを形成し、ステアリック基が疎水性コアを形成して高分子ミセルを形成したことを示唆している。
【0074】
製造例３．疎水性酸化マンガン－ミセル複合体（ＰＴＣ－Ｍ）及びＰＣ－Ｍの製造
製造例１のＣ１２アルキル基を有する疎水性酸化マンガン２ｍｇを５００μＬの無水（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）ＤＭＳＯに溶解し、１０ｍｇのＰＴＳ高分子ミセルを５００μＬの無水ＤＭＳＯに溶解し、両溶液を混合して合計１ｍＬの混合溶液とする。２０ｍＬの三次蒸留水を５０ｍＬチューブに入れた後、プローブ超音波処理（Ｐｒｏｂｅ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）下で１ｍＬの混合溶液を１滴ずつ滴下する。このとき、プローブ超音波処理の条件は、３０％アンプリチュード（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）、５秒オン（ｏｎ）、５秒オフ（ｏｆｆ）パルスモードで５分間とした。前記の製造工程を経た溶液は、膜透析（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉａｌｙｓｉｓ、１２～１４ｋＤａ ＭＷＣＯ）を１日間行ってＤＭＳＯおよび残りの不純物を除去する。また、定性濾紙（６～１０μｍ）を用いて異常サイズの粒子をもう一度ろ過する。最終的にろ過した粒子を凍結乾燥して、固相の疎水性酸化マンガンが担持されたミセル複合体（ＰＴＣ－Ｍ）を得た（図４Ａ）。
同様の方法で、疎水性酸化マンガンナノ粒子をロードしたＲＯＳ非感受性ナノミセル（ＰＣ－Ｍ）を対照群として製造した。
製造例１のＣ１２アルキル基を有する疎水性酸化マンガン２ｍｇを５００μＬの無水（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）ＤＭＳＯに溶解し、１０ｍｇのＰＴＳ高分子ミセルを５００μＬの無水ＤＭＳＯに溶解し、両溶液を混合して合計１ｍＬの混合溶液とする。２０ｍＬの三次蒸留水を５０ｍＬチューブに入れた後、プローブ超音波処理（Ｐｒｏｂｅ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）下で１ｍＬの混合溶液を１滴ずつ滴下する。このとき、プローブ超音波処理の条件は、３０％アンプリチュード（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）、５秒オン（ｏｎ）、５秒オフ（ｏｆｆ）パルスモードで５分間とした。前記の製造工程を経た溶液は、膜透析（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉａｌｙｓｉｓ、１２～１４ｋＤａ ＭＷＣＯ）を１日間行ってＤＭＳＯおよび残りの不純物を除去する。また、定性濾紙（６～１０μｍ）を用いて異常サイズの粒子をもう一度ろ過する。最終的にろ過した粒子を凍結乾燥して、固相の疎水性酸化マンガンが担持されたミセル複合体（ＰＴＣ－Ｍ）を得た（図４Ａ）。
同様の方法で、疎水性酸化マンガンナノ粒子をロードしたＲＯＳ非感受性ナノミセル（ＰＣ－Ｍ）を対照群として製造した。
【0075】
製造例４．ポリエチレングリコール－Ｃ１８（ＰＣ）の製造
対照群として、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）をポリエチレングリコールアミン（ＰＥＧ－ＡＭ）に接合したＲＯＳ非感受性ポリマー（ＰＣ）を製造した。製造方法を簡単に説明すると、２００ｍｇのｍ－ＰＥＧアミンおよび１６０ｍｇのステアリン酸を、２０ｍｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）中の１６０μｌのトリエチルアミン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＴＥＡ）、４８０ｍｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド［１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＥＤＣ］、および２９０ｍｇのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）と窒素パージ（ｐｕｒｇｉｎｇ）下で撹拌しながら３７℃で一日間反応させた。反応後、溶液を蒸留水に対して分子量カットオフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｕｔ－ｏｆｆ、ＭＷＣＯ）が１２－１４ｋＤａの条件下で１日間透析して精製し、凍結乾燥した。これにより、ポリエチレングリコール－Ｃ１８（ＰＣ）を製造した。製造されたＰＴＣとＰＣの化学構造は、クロロホルム中でプロトン核磁気共鳴（Ｐｒｏｔｏｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）（１Ｈ ＮＭＲ）分光法（４００Ｈｚ、Ｂｒｕｋｅｒ：Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて確認した。ＲＯＳ非感受性ＰＣの空ミセルは、超音波処理および透析下でＰＣの自己集合によって製造された。
対照群として、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）をポリエチレングリコールアミン（ＰＥＧ－ＡＭ）に接合したＲＯＳ非感受性ポリマー（ＰＣ）を製造した。製造方法を簡単に説明すると、２００ｍｇのｍ－ＰＥＧアミンおよび１６０ｍｇのステアリン酸を、２０ｍｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）中の１６０μｌのトリエチルアミン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＴＥＡ）、４８０ｍｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド［１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＥＤＣ］、および２９０ｍｇのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）と窒素パージ（ｐｕｒｇｉｎｇ）下で撹拌しながら３７℃で一日間反応させた。反応後、溶液を蒸留水に対して分子量カットオフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｕｔ－ｏｆｆ、ＭＷＣＯ）が１２－１４ｋＤａの条件下で１日間透析して精製し、凍結乾燥した。これにより、ポリエチレングリコール－Ｃ１８（ＰＣ）を製造した。製造されたＰＴＣとＰＣの化学構造は、クロロホルム中でプロトン核磁気共鳴（Ｐｒｏｔｏｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）（１Ｈ ＮＭＲ）分光法（４００Ｈｚ、Ｂｒｕｋｅｒ：Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて確認した。ＲＯＳ非感受性ＰＣの空ミセルは、超音波処理および透析下でＰＣの自己集合によって製造された。
【0076】
実験方法
１．細胞培養および試薬
イン・ビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）研究では、簡単に説明すると、ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ＨＫ－２細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を使用した。ＨＫ－２細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびＨａｍｓ Ｆ－１２培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｄａｅｇｕ、Ｋｏｒｅａ）の組み合わせを含む１００ｍｍのディッシュで３～４日ごとに継代培養した。次いで、ＨＫ－２細胞を５％ＣＯ２および９５％空気の加湿雰囲気中で３７℃において２４時間培養し、７０～８０％合流するまで継代培養を行った。ＨＫ－２細胞を、１０％ＦＢＳを含む培地で６０ｍｍのディッシュにプレーティングし、２４時間インキュベートした。次いで、細胞をＦＢＳなしのＤＭＥＭ－Ｆ１２培地で培養し、さらにＨ２Ｏ２（１ｍＭ）で２４時間処理した（ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８の場合は１５分を除く）。ＰＴＣ－Ｍ（２μｇ）をＨ２Ｏ２処理の１時間前に添加した。再現性を決定するためにすべてのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を２回繰り返し、細胞の３０継代内に行った。
１．細胞培養および試薬
イン・ビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）研究では、簡単に説明すると、ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ＨＫ－２細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を使用した。ＨＫ－２細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびＨａｍｓ Ｆ－１２培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｄａｅｇｕ、Ｋｏｒｅａ）の組み合わせを含む１００ｍｍのディッシュで３～４日ごとに継代培養した。次いで、ＨＫ－２細胞を５％ＣＯ２および９５％空気の加湿雰囲気中で３７℃において２４時間培養し、７０～８０％合流するまで継代培養を行った。ＨＫ－２細胞を、１０％ＦＢＳを含む培地で６０ｍｍのディッシュにプレーティングし、２４時間インキュベートした。次いで、細胞をＦＢＳなしのＤＭＥＭ－Ｆ１２培地で培養し、さらにＨ２Ｏ２（１ｍＭ）で２４時間処理した（ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８の場合は１５分を除く）。ＰＴＣ－Ｍ（２μｇ）をＨ２Ｏ２処理の１時間前に添加した。再現性を決定するためにすべてのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を２回繰り返し、細胞の３０継代内に行った。
【0077】
２．細胞生存力
イン・ビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞生存力を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地で一晩インキュベートしたＨＫ－２細胞（１×１０４細胞／ウェル）で評価した。培地を吸引し、細胞を様々な濃度のＰＴＣ及びＰＴＣ－Ｍと共に２４時間培養した後、メーカーのプロトコルに従ってＷＳＴ－１分析を行った。ＴＫ結合の影響を比較するために、ＰＣ及びＰＣ－Ｍで処理した細胞の生存力も比較した。サンプルのＩＣ５０値は、細胞生存率データで分析した。未処理の細胞を陽性対照群とし、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ１００で処理した細胞を陰性対照群とした。
イン・ビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞生存力を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地で一晩インキュベートしたＨＫ－２細胞（１×１０４細胞／ウェル）で評価した。培地を吸引し、細胞を様々な濃度のＰＴＣ及びＰＴＣ－Ｍと共に２４時間培養した後、メーカーのプロトコルに従ってＷＳＴ－１分析を行った。ＴＫ結合の影響を比較するために、ＰＣ及びＰＣ－Ｍで処理した細胞の生存力も比較した。サンプルのＩＣ５０値は、細胞生存率データで分析した。未処理の細胞を陽性対照群とし、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ１００で処理した細胞を陰性対照群とした。
【0078】
３．細胞取り込み（ｕｐｔａｋｅ）
ＰＴＣにおける細胞内分布およびペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）放出を調べるために、近赤外（ＮＩＲ）染料であるＩＲ７８０ヨウ化物を備えたＰＴＣ（ＰＴＣ－ＩＲ７８０）を開発した。取り込みの研究のために、ＨＫ－２細胞（３×１０４細胞／ウェル）をＬａｂ－Ｔｅｋ（登録商標）チェンバースライド（Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅｓ）に接種し、一晩培養した。培地を吸引し、ウェル当たり４μｇ／ｍｌ等価のＩＲ７８０を含むＩＲ７８０、ＰＴＣ－ＩＲ７８０およびＰＣ－ＩＲ７８０の他のサンプルをウェルに添加し、４時間培養した。未処理の細胞を対照群として使用した。インキュベーションの後、培地を吸引し、ＤＰＢＳ洗浄および４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定を行った。次いで、細胞を４'，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、ＤＡＰＩ）で対比染色した。ＩＲ７８０の蛍光強度を蛍光顕微鏡（Ｅｖｏｓ ＦＬ Ａｕｔｏ ２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析して、細胞によるＩＲ７８０の取り込みを決定した。細胞内分布および放出におけるＲＯＳの効果を確認するために、２時間前に２００μＭのＨ２Ｏ２で細胞を処理するか、または処理前に２日間低酸素症のチャンバで細胞を培養してＲＯＳ条件を模倣した。細胞取り込みは、フローサイトメトリーによってさらに定量化した。簡単に説明すると、１×１０５のＨＫ－２細胞／ウェルを１２ウェルプレートに接種し、一晩インキュベートした。培地を吸引し、他のサンプルを加えて４時間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、遠心分離してペレットを得た後、２回のＤＰＢＳ洗浄を行った。次いで、細胞を、３％ＦＢＳを含有するＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を行い、各群の取り込み能力を測定した。データは、ＡＰＣ－Ｃｙ７フィルターでゲートした。最終のＰＴＣ－Ｍナノ複合体の細胞取り込みは、ＩＣＰ－ＭＳ分析によって決定した。簡単に説明すると、１×１０５個のＨＫ－２細胞／ウェルを１２ウェルプレートに接種した後、一晩インキュベートした。次いで、培地を除去し、異なる濃度のＰＴＣ－Ｍをウェルに添加し、さらに４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を収集し、遠心分離してペレットを得、それをＤＰＢＳで２回洗浄した。王水（Ａｑｕａ ｒｅｇｉａ）１ｍｌを消化のために最終のペレットに添加した後、サンプルを希釈し、ＩＣＰ－ＭＳによりマンガン含有量を分析した。未処理の細胞を対照群として使用した。
ＰＴＣにおける細胞内分布およびペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）放出を調べるために、近赤外（ＮＩＲ）染料であるＩＲ７８０ヨウ化物を備えたＰＴＣ（ＰＴＣ－ＩＲ７８０）を開発した。取り込みの研究のために、ＨＫ－２細胞（３×１０４細胞／ウェル）をＬａｂ－Ｔｅｋ（登録商標）チェンバースライド（Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅｓ）に接種し、一晩培養した。培地を吸引し、ウェル当たり４μｇ／ｍｌ等価のＩＲ７８０を含むＩＲ７８０、ＰＴＣ－ＩＲ７８０およびＰＣ－ＩＲ７８０の他のサンプルをウェルに添加し、４時間培養した。未処理の細胞を対照群として使用した。インキュベーションの後、培地を吸引し、ＤＰＢＳ洗浄および４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定を行った。次いで、細胞を４'，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、ＤＡＰＩ）で対比染色した。ＩＲ７８０の蛍光強度を蛍光顕微鏡（Ｅｖｏｓ ＦＬ Ａｕｔｏ ２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析して、細胞によるＩＲ７８０の取り込みを決定した。細胞内分布および放出におけるＲＯＳの効果を確認するために、２時間前に２００μＭのＨ２Ｏ２で細胞を処理するか、または処理前に２日間低酸素症のチャンバで細胞を培養してＲＯＳ条件を模倣した。細胞取り込みは、フローサイトメトリーによってさらに定量化した。簡単に説明すると、１×１０５のＨＫ－２細胞／ウェルを１２ウェルプレートに接種し、一晩インキュベートした。培地を吸引し、他のサンプルを加えて４時間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、遠心分離してペレットを得た後、２回のＤＰＢＳ洗浄を行った。次いで、細胞を、３％ＦＢＳを含有するＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を行い、各群の取り込み能力を測定した。データは、ＡＰＣ－Ｃｙ７フィルターでゲートした。最終のＰＴＣ－Ｍナノ複合体の細胞取り込みは、ＩＣＰ－ＭＳ分析によって決定した。簡単に説明すると、１×１０５個のＨＫ－２細胞／ウェルを１２ウェルプレートに接種した後、一晩インキュベートした。次いで、培地を除去し、異なる濃度のＰＴＣ－Ｍをウェルに添加し、さらに４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を収集し、遠心分離してペレットを得、それをＤＰＢＳで２回洗浄した。王水（Ａｑｕａ ｒｅｇｉａ）１ｍｌを消化のために最終のペレットに添加した後、サンプルを希釈し、ＩＣＰ－ＭＳによりマンガン含有量を分析した。未処理の細胞を対照群として使用した。
【0079】
４．フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、アネキシンＶ結合レベルを測定するために、メーカーの指示に従ってアネキシンＶ ＦＬＵＯＳ染色キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して行った。簡単に説明すると、２μｇのＰＴＣ－Ｍ前処理を行うかまたは行わずに、０または１ｍＭのＨ２Ｏ２で２４時間処理した後、ＨＫ－２細胞を回収し、予め冷却したリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、アネキシンＶを含有する結合緩衝液に再懸濁した。暗室で１５分間培養した後、細胞をフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析した。機器の設定を最適化し、Ｗｉｎｄｏｗｓベースのプラットフォームのゲーティングを決定するために、いくつかのコントロールが使用された。アポトーシス性細胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）は、ＰＩ陰性およびアネキシンＶ－ＦＩＴＣ陽性と定義された。
フローサイトメトリーは、アネキシンＶ結合レベルを測定するために、メーカーの指示に従ってアネキシンＶ ＦＬＵＯＳ染色キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して行った。簡単に説明すると、２μｇのＰＴＣ－Ｍ前処理を行うかまたは行わずに、０または１ｍＭのＨ２Ｏ２で２４時間処理した後、ＨＫ－２細胞を回収し、予め冷却したリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、アネキシンＶを含有する結合緩衝液に再懸濁した。暗室で１５分間培養した後、細胞をフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析した。機器の設定を最適化し、Ｗｉｎｄｏｗｓベースのプラットフォームのゲーティングを決定するために、いくつかのコントロールが使用された。アポトーシス性細胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）は、ＰＩ陰性およびアネキシンＶ－ＦＩＴＣ陽性と定義された。
【0080】
５．細胞内ＲＯＳ生成の決定
ＲＯＳ生成を決定するために、フルオロプローブＤＣＦ－ＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）を使用した。ＨＫ－２細胞を２μｇのＰＴＣ－Ｍ前処理を行うかまたは行わずに、０または１ｍＭのＨ２Ｏ２と共に２４時間インキュベートし、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２回洗浄し、ＤＣＦ－ＤＡを含むＨＢＳＳ（フェノールレッドを除く）と共に３７℃の暗室で３０分間インキュベートした。蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で画像を得た。
ＲＯＳ生成を決定するために、フルオロプローブＤＣＦ－ＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）を使用した。ＨＫ－２細胞を２μｇのＰＴＣ－Ｍ前処理を行うかまたは行わずに、０または１ｍＭのＨ２Ｏ２と共に２４時間インキュベートし、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２回洗浄し、ＤＣＦ－ＤＡを含むＨＢＳＳ（フェノールレッドを除く）と共に３７℃の暗室で３０分間インキュベートした。蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で画像を得た。
【0081】
６．実験動物及びプロトコル
全ての実験は、関連するガイドライン及び規定に従って行った。実験プロトコルは、韓国の全南大学病院の動物保護規定委員会の承認を受けた（ＣＮＵＨＩＡＣＵＣ－２０００９）。
全ての実験は、関連するガイドライン及び規定に従って行った。実験プロトコルは、韓国の全南大学病院の動物保護規定委員会の承認を受けた（ＣＮＵＨＩＡＣＵＣ－２０００９）。
【0082】
体重２０～２２ｇの７週齢雄Ｃ５７ＢＬ６マウスをＳａｍｔａｋｏ（韓国）から購入した。マウスは全南大学医科大学の動物保護施設で飼育され、水を自由に摂取できる標準食が与えられた。マウスを偽（ｎ＝４）、ＩＲＩ（ｎ＝４）、およびＰＴＣ－Ｍ処理を伴うＩＲＩ（ｎ＝４）の３つの群に分けた。ＩＲＩマウスモデルを誘導するために、以下のように手術を行った。ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）（７０ｍｇ／ｋｇ；Ｙｕｈａｎ、Ｓｅｏｕｌ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）及びキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（７ｍｇ／ｋｇ；Ｂａｙｅｒ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を腹腔内注射し、麻酔誘導した後、腹腔と両方の神経を露出させるために正中切開を行った。体温を維持するために、温度調節テーブル（３８．５℃）でマイクロクリップ（ＲＯＢＯＺ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）で３０分間固定した。偽群（ｎ＝４）はクリップを適用しなかったこと以外は同じ手順を実施した。
【0083】
７．生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）生体分布
生体分布分析のために、ＩＲＩ群に０．５ｍｇ／ｋｇ（ＩＲ７８０等価）の用量でＰＴＣ－ＩＲ７８０を静脈注射した。マウスを所定の時間（６、１２、２４及び４８時間）に安楽死させ、主要臓器を収集した。収集した臓器からの蛍光シグナルを、蛍光標識生物体バイオイメージング機器（ＦＯＢＩ、ＮＥＯ ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ、Ｋｏｒｅａ）を用いて分析した。ＰＴＣ－ＩＲ７８０の臓器蓄積を評価するために、解剖した主要臓器の蛍光強度を測定した。生体分布は、等価量のＩＲ７８０を投与した後、ＰＣ－ＩＲ７８０またはＩＲ７８０と追加に比較した。ＰＴＣ－ＩＲ７８０生体分布も静脈投与後の正常マウスで比較した。
生体分布分析のために、ＩＲＩ群に０．５ｍｇ／ｋｇ（ＩＲ７８０等価）の用量でＰＴＣ－ＩＲ７８０を静脈注射した。マウスを所定の時間（６、１２、２４及び４８時間）に安楽死させ、主要臓器を収集した。収集した臓器からの蛍光シグナルを、蛍光標識生物体バイオイメージング機器（ＦＯＢＩ、ＮＥＯ ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ、Ｋｏｒｅａ）を用いて分析した。ＰＴＣ－ＩＲ７８０の臓器蓄積を評価するために、解剖した主要臓器の蛍光強度を測定した。生体分布は、等価量のＩＲ７８０を投与した後、ＰＣ－ＩＲ７８０またはＩＲ７８０と追加に比較した。ＰＴＣ－ＩＲ７８０生体分布も静脈投与後の正常マウスで比較した。
【0084】
最終のＰＴＣ－Ｍサンプルの生体分布分析も行った。簡単に説明すると、ＩＲＩ群に０．５ｍｇ／ｋｇのＰＴＣ－Ｍ（Ｍｎ等価物）サンプルを注入し、前述の所定の時間間隔でマウスを安楽死させ、主要臓器を収集した。次いで、臓器をアクアレジアで処理し、ＩＣＰ－ＭＳを用いてサンプルを分析して組織のＭｎ濃度を決定した。
【0085】
ＰＴＣ－Ｍの生体内治療効果を確認するために、手術後、尾静脈注射により治療群に０．５ｍｇ／ｋｇのＰＴＣ－Ｍを単回投与した。４８時間の再灌流後、マウスを安楽死させた。心臓から血液サンプルを収集し、左腎臓を迅速に除去し、ウェスタンブロットのために処理するか、または免疫組織化学（ＩＨＣ）のために４％パラホルムアルデヒド溶液に固定した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の分析のために、右腎臓を－８０℃で凍結した。
【0086】
８．プラズマＮＧＡＬの測定
血漿好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）レベルは、メーカーによって提供されたプロトコルに従って市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を用いて測定した。血漿ＮＧＡＬを測定するために、１：４００のサンプル希釈を行った。
血漿好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）レベルは、メーカーによって提供されたプロトコルに従って市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を用いて測定した。血漿ＮＧＡＬを測定するために、１：４００のサンプル希釈を行った。
【0087】
９．半定量免疫ブロット（Ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）
ウェスタンブロット分析は、以下のように行った。腎臓組織を０．３Ｍのスクロース、２５ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、８．５ｍＭのロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、および１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ｐＨ７．２）を含有する氷のように冷たい分離溶液中で均質化した。均質物を４℃において１５分間４０００ｘｇで遠心分離して全細胞、核およびミトコンドリアを除去した。総タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ、ＢＣＡ）アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）によって測定した。全てのサンプルは、同じ最終タンパク質濃度に達するように調整した。次いで、それをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有サンプル緩衝液に６５℃で１５分間溶解し、－２０℃で保存した。タンパク質のローディングが等しいことを確認するために、初期のゲルをクマシーブルーで染色した。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は、９％または１２％ポリアクリルアミドゲルで行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、タンパク質を電気泳動によりニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬ ＲＰＮ３０３２Ｄ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）に移した。ブロットは、ＰＢＳ－Ｔ（８０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．５）中の５％ミルクで１時間ブロックした。一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、その後、二次抗ウサギ、抗マウスまたは抗ヤギホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ接合抗体と共にインキュベートした。次いで、免疫ブロットを、向上した化学発光システムを用いて可視化した。濃度計を用いてタンパク質レベルを定量化した。免疫ブロットシグナルの相対強度は、Ｗｉｎｄｏｗｓソフトウェア用のＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２０００－２００１．ｖｅｒｓｉｏｎ Ａｌｐｈａ ４．０．３．２．ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて濃度計で測定し、対照群に対する倍数変化として表した。免疫ブロットに使用される一次および二次抗体を表２に示す。
ウェスタンブロット分析は、以下のように行った。腎臓組織を０．３Ｍのスクロース、２５ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、８．５ｍＭのロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、および１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ｐＨ７．２）を含有する氷のように冷たい分離溶液中で均質化した。均質物を４℃において１５分間４０００ｘｇで遠心分離して全細胞、核およびミトコンドリアを除去した。総タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ、ＢＣＡ）アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）によって測定した。全てのサンプルは、同じ最終タンパク質濃度に達するように調整した。次いで、それをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有サンプル緩衝液に６５℃で１５分間溶解し、－２０℃で保存した。タンパク質のローディングが等しいことを確認するために、初期のゲルをクマシーブルーで染色した。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は、９％または１２％ポリアクリルアミドゲルで行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、タンパク質を電気泳動によりニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬ ＲＰＮ３０３２Ｄ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）に移した。ブロットは、ＰＢＳ－Ｔ（８０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．５）中の５％ミルクで１時間ブロックした。一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、その後、二次抗ウサギ、抗マウスまたは抗ヤギホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ接合抗体と共にインキュベートした。次いで、免疫ブロットを、向上した化学発光システムを用いて可視化した。濃度計を用いてタンパク質レベルを定量化した。免疫ブロットシグナルの相対強度は、Ｗｉｎｄｏｗｓソフトウェア用のＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２０００－２００１．ｖｅｒｓｉｏｎ Ａｌｐｈａ ４．０．３．２．ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて濃度計で測定し、対照群に対する倍数変化として表した。免疫ブロットに使用される一次および二次抗体を表２に示す。
【0088】
【表2】
【0089】
１０．リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）
ポリメラーゼ連鎖反応の分析は以下のように行った。腎皮質は、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で均質化した。ＲＮＡをクロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿して７５％エタノールで洗浄した後、蒸留水に溶解した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍにおける吸光度によって決定された（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ２０００；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。炎症性サイトカインおよび接着分子のｍＲＮＡ発現は、リアルタイムＰＣＲによって決定された。ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）プライミング及びスーパースクリプト・リバース・トランスクリプターゼＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて５μｇの全ＲＮＡを逆転写することによって作製した。ｃＤＮＡは、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて定量化し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを検出に使用した。各ＰＣＲ反応は、１０ｐＭのフォワードプライマー、１０ｐＭのリバースプライマー、２Ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ ＩＮＣ、Ｓｅｔａ ３－４－１、Ｊａｐａｎ）、０．５μｌのｃＤＮＡおよび水を用いて最終体積が２０μｌとなるように行った。ｍＲＮＡの相対レベルは、Ｒｏｔｏｒ－ＧｅｎｅＴＭ ３０００ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｒｂｅｔｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｏｒｔｌａｋｅ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてリアルタイムＰＣＲによって決定した。使用したプライマーの配列を表３に示す。
ポリメラーゼ連鎖反応の分析は以下のように行った。腎皮質は、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で均質化した。ＲＮＡをクロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿して７５％エタノールで洗浄した後、蒸留水に溶解した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍにおける吸光度によって決定された（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ２０００；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。炎症性サイトカインおよび接着分子のｍＲＮＡ発現は、リアルタイムＰＣＲによって決定された。ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）プライミング及びスーパースクリプト・リバース・トランスクリプターゼＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて５μｇの全ＲＮＡを逆転写することによって作製した。ｃＤＮＡは、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて定量化し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを検出に使用した。各ＰＣＲ反応は、１０ｐＭのフォワードプライマー、１０ｐＭのリバースプライマー、２Ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ ＩＮＣ、Ｓｅｔａ ３－４－１、Ｊａｐａｎ）、０．５μｌのｃＤＮＡおよび水を用いて最終体積が２０μｌとなるように行った。ｍＲＮＡの相対レベルは、Ｒｏｔｏｒ－ＧｅｎｅＴＭ ３０００ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｒｂｅｔｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｏｒｔｌａｋｅ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてリアルタイムＰＣＲによって決定した。使用したプライマーの配列を表３に示す。
【0090】
【表3】
【0091】
ＰＣＲは以下のステップにより行った：１）５分間９５℃；２）２０秒間９５℃；３）２０秒間５８～６０℃（各プライマー対に対して最適化）、４）ＳＹＢＲグリーンを検出するために３０秒間７２℃。ステップ２～４をさらに４０回繰り返し、最後の周期が終わると、温度を６０℃から９５℃に上げて溶融曲線を生成した。反応データを収集し、Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｆｔｗａｒｅで分析した。四重測定で得られた比較しきい値を用いて、内部対照群としてＧＡＰＤＨで正規化して遺伝子発現を計算した。増幅反応の特異性を高めるために溶融曲線分析を行った。
【0092】
１１．組織学
腎臓組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、３μｍ厚の切片に切断した。ＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ－Ｓｃｈｉｆｆ）染色は、メーカーの指示（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）に従って行った。免疫組織化学の場合は、脱パラフィン化した組織切片を１００℃で１５分間、クエン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で加熱して抗原を回収した。切片をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ［０．３％ ＰＢＳ－Ｔ］で製造した０．３％［ｖ／ｖ］Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に溶解した１％［ｗ／ｖ］ウシ血清アルブミン）で希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。切片を０．３％ＰＢＳ－Ｔで簡単に３回洗浄した後、ブロッキング緩衝液に希釈された二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。管損傷スコアは、以下のように計算した。管損傷スコアは、ＰＡＳ染色部位における皮質髄質接合部の≧１０ＨＰＦの検査（Ｘ ２００ ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって測定した（ｎ＝５～７）。免疫組織化学的な分析に使用した一次抗体および二次抗体を表４に示す。
腎臓組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、３μｍ厚の切片に切断した。ＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ－Ｓｃｈｉｆｆ）染色は、メーカーの指示（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）に従って行った。免疫組織化学の場合は、脱パラフィン化した組織切片を１００℃で１５分間、クエン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で加熱して抗原を回収した。切片をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ［０．３％ ＰＢＳ－Ｔ］で製造した０．３％［ｖ／ｖ］Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に溶解した１％［ｗ／ｖ］ウシ血清アルブミン）で希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。切片を０．３％ＰＢＳ－Ｔで簡単に３回洗浄した後、ブロッキング緩衝液に希釈された二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。管損傷スコアは、以下のように計算した。管損傷スコアは、ＰＡＳ染色部位における皮質髄質接合部の≧１０ＨＰＦの検査（Ｘ ２００ ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって測定した（ｎ＝５～７）。免疫組織化学的な分析に使用した一次抗体および二次抗体を表４に示す。
【0093】
【表4】
【0094】
メーカーの指示に従って、ＡｐｏｐＴａｇ Ｐｌｕｓ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたＴＵＮＥＬ染色により、管状上皮細胞のアポトーシスが検出された。すべての主要臓器の組織切片をパラフィンで包埋して収集し、組織学的な変化を比較するためにヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【0095】
１２．統計分析
結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表す。３つのグループ間の多重比較は、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）とｐｏｓｔ－ｈｏｃテューキー検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｈｏｎｅｓｔｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｓｔ）を用いて行った。ｐ-値が０．０５未満の差は有意と見なした。
結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表す。３つのグループ間の多重比較は、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）とｐｏｓｔ－ｈｏｃテューキー検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｈｏｎｅｓｔｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｓｔ）を用いて行った。ｐ-値が０．０５未満の差は有意と見なした。
【0096】
実験結果
１．疎水性酸化マンガンと高分子複合体の分析
製造例１の方法で製造された疎水性酸化マンガン粒子のＴＥＭ画像分析を行った。図５（スケールバー５０ｎｍ）に示すように、アルキル基の長さに関係なく疎水性酸化マンガンナノ粒子が安定して形成されることを確認できる。
１．疎水性酸化マンガンと高分子複合体の分析
製造例１の方法で製造された疎水性酸化マンガン粒子のＴＥＭ画像分析を行った。図５（スケールバー５０ｎｍ）に示すように、アルキル基の長さに関係なく疎水性酸化マンガンナノ粒子が安定して形成されることを確認できる。
【0097】
製造例１の方法で製造されたＣ１２アルキル基を有する疎水性酸化マンガン粒子（ｄＭｎ３Ｏ４ ＮＰｓ）のＸＰＳスペクトル分析、ＥＤＳ（Ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｘ－ｒａｙ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）元素分析、ＦＥ－ＴＥＭ画像分析およびＸＲＤ分析を行った。
【0098】
ＸＰＳスペクトル分析の結果（図６）、Ｍｎ ２ｐ、Ｏ １ｓおよびＣ １ｓで高いピークを確認した。Ｍｎ ２ＰのＸＰＳスペクトルは、６４１．４２ｅＶと６５３．２３ｅＶに位置する２つのピークで構成され、これらのピークは、Ｍｎ ２Ｐ３／２とＭｎ ２Ｐ１／２にそれぞれ起因することが分かった。これらの両ピークの間のエネルギー差は１１．８１ｅＶであり、これはＭｎ３Ｏ４に関する報告された文献とよく一致した。
【0099】
ＥＤＳ元素分析の結果（図７）、疎水性酸化マンガンナノ粒子の電子像（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｉｍａｇｅ）の位置と検出元素の位置比較によりＭｎ３Ｏ４にＭｎが存在することと、Ｓ及びＣ元素は疎水性酸化マンガンの表面を覆っているＳＨ－Ｃ１２に存在することが示された。
【0100】
ＦＥ－ＴＥＭ画像分析の結果（図８；スケールバー２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、２０ｎｍ）、疎水性酸化マンガンナノ粒子の実測サイズは２０ｎｍ未満（１８．０±０．６ｎｍ）であることが観察された。
【0101】
ＸＲＤ分析の結果（図９）、ｄＭｎ３Ｏ４ナノ粒子のＸＲＤ（Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）パターンで測定された全ての回折ピークは、ハウスマンナイト（Ｈａｕｓｍａｎｎｉｔｅ）Ｍｎ３Ｏ４の標準パターン［ＩＣＤＤ：＃００１－１１２７］とよく一致していた。これにより、前記ナノ粒子の高い結晶性を確認した。
【0102】
ｄＭｎ３Ｏ４ナノ粒子のＸ線回折パターンは、ＸＲＤパターンにおいて鋭い強いピークを示し、合成サンプルが本質的に高い結晶性を有することを示す。観察されたすべてのピークは、正方晶系の結晶構造によくインデックスされる。（ｈｋｌ）平面に相当する１８．０°、２８．９°、３２．５°、３６．１°、３８．１°、４４．６°、５０．９°、５８．７°、６０．０°及び６４．６°の２θ角度で回折ピーク（１０１）、（１１２）、（１０３）、（２１１）、（００４）、（２２０）、（１０５）、（３２１）、（２２４）、（３１４）は、正方晶系（ｔｅｔｒａｇｏｎａｌ）のスピネル（ｓｐｉｎｅｌ）構造であり、（Ｍｎ３Ｏ４）ハウスマンナイトの空間群は１４１／ａｍｄである。Ｘ線回折分析により、従来報告されている酸化マンガンの結晶構造を有することが分かった。
【0103】
ＰＴＣとＰＣの組成は、１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により分析した（図１０）。ＮＭＲスペクトルは、Ｃ１８のメチルおよびメチレンプロトンに相当するδ０．８３および１．２３ｐｐｍにおいて特徴的なピークを示した。δ３．６のピークは、ＰＥＧのＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－に相当する。ＰＴＣ及びＰＣにおけるＣ１８の置換度（ＤＳ％）は、それぞれ７８％および４６％と計算された。
【0104】
２．ＰＴＣ－Ｍナノ複合体の特性
ＰＴＣ－Ｍは、ＲＯＳ感受性ナノミセル（ＰＴＣ）にｄＭｎ３Ｏ４をロードして生成した。ＰＴＣ－Ｍの製造には、ＰＴＣのｄＭｎ３Ｏ４供給率（２０％）を使用した。準備したＰＴＣ及びＰＴＣ－Ｍの流体力学的直径（２５３．４±５２．２ｎｍ及び２７２．８±８６．４ｎｍ）、ゼータ電位（－５．０±２．６ｍＶ及び－５．３±１．８ｍＶ）およびＦＥ－ＴＥＭ画像（スケールバー１μｍ）を図１１に示す。ＰＴＣのＦＥ－ＴＥＭ画像は、粒子サイズが均一な球状のナノミセルを示した。ＰＴＣ－Ｍの流体力学的直径は、疎水性空間にｄＭｎ３Ｏ４が充填されているため、ｄＭｎ３Ｏ４をロードした後にわずかに増加したが、ゼータ電位はＰＥＧ遮蔽により両方のナノミセルで負に維持された。ＰＴＣとＰＴＣ－ＭのＦＥ－ＴＥＭ画像では、粒子が均一に分布していることが示さられた。質量分析により、ロード含有量およびカプセル化効率を計算したところ、それぞれ１０±３％及び１７±６％であった。ｄＭｎ３Ｏ４の存在は、ＰＴＣ－ＭのＦＥ－ＴＥＭ画像から明確に確認された。ＰＴＣ－ＭのＥＤＳ分析により、Ｍｎ３Ｏ４のＭｎ、ＳＨ－Ｃ１２の硫黄および炭素、ＰＥＧの炭素、窒素および酸素を示すことをさらに確認した。熱重量測定装置（ＴＧＡ）により、ｄＭｎ３Ｏ４ロードは１２％であると計算された（図１２）。
ＰＴＣ－Ｍは、ＲＯＳ感受性ナノミセル（ＰＴＣ）にｄＭｎ３Ｏ４をロードして生成した。ＰＴＣ－Ｍの製造には、ＰＴＣのｄＭｎ３Ｏ４供給率（２０％）を使用した。準備したＰＴＣ及びＰＴＣ－Ｍの流体力学的直径（２５３．４±５２．２ｎｍ及び２７２．８±８６．４ｎｍ）、ゼータ電位（－５．０±２．６ｍＶ及び－５．３±１．８ｍＶ）およびＦＥ－ＴＥＭ画像（スケールバー１μｍ）を図１１に示す。ＰＴＣのＦＥ－ＴＥＭ画像は、粒子サイズが均一な球状のナノミセルを示した。ＰＴＣ－Ｍの流体力学的直径は、疎水性空間にｄＭｎ３Ｏ４が充填されているため、ｄＭｎ３Ｏ４をロードした後にわずかに増加したが、ゼータ電位はＰＥＧ遮蔽により両方のナノミセルで負に維持された。ＰＴＣとＰＴＣ－ＭのＦＥ－ＴＥＭ画像では、粒子が均一に分布していることが示さられた。質量分析により、ロード含有量およびカプセル化効率を計算したところ、それぞれ１０±３％及び１７±６％であった。ｄＭｎ３Ｏ４の存在は、ＰＴＣ－ＭのＦＥ－ＴＥＭ画像から明確に確認された。ＰＴＣ－ＭのＥＤＳ分析により、Ｍｎ３Ｏ４のＭｎ、ＳＨ－Ｃ１２の硫黄および炭素、ＰＥＧの炭素、窒素および酸素を示すことをさらに確認した。熱重量測定装置（ＴＧＡ）により、ｄＭｎ３Ｏ４ロードは１２％であると計算された（図１２）。
【0105】
ＰＴＣ－ＭのＲＯＳ反応性の不安定化およびｄＭｎ３Ｏ４の放出におけるＴＫ結合の役割を確認するために、Ｈ２Ｏ２を添加してＰＴＣ－ＭをＲＯＳ条件に曝露した。対照群として、ＲＯＳ非感受性のＰＣ－Ｍを使用した。ＰＴＣ－ＭとＰＣ－Ｍはいずれも、ナノミセルにｄＭｎ３Ｏ４が密に充填された球状を示したが、Ｈ２Ｏ２処理後はＰＴＣ－Ｍの上部集合が歪み、ｄＭｎ３Ｏ４が放出されて凝集した。ＦＥ－ＴＥＭ画像に示されるように、ＰＣ－ＭはＨ２Ｏ２に曝露された後でも安定した構造を示した（図１３；スケールバー２００ｎｍ）。ＰＴＣ－ＭのＲＯＳ感受性は、表５および図１４に示すように、ＰＣ－Ｍの流体力学的直径およびゼータ電位の変化を比較することによってさらに確認した。ＲＯＳ非感受性ＰＣ－Ｍの流体力学的直径およびゼータ電位は、Ｈ２Ｏ２の添加後に有意な差を示さなかった。これに対し、ＲＯＳ感受性ＰＴＣ－Ｍは、ＴＫ破壊によるＰＥＧ遮蔽の除去により構造の不安定化が引き起こされ、流体力学的サイズの減少を示した。
【0106】
【表5】
【0107】
Ｈ２Ｏ２の添加後、ゼータ電位は陰電荷から陽電荷に戻ったが、これはＰＥＧの除去およびステアラミンへの曝露によるものである可能性がある。Ｈ２Ｏ２の存在有無にかかわらず、流体力学的直径を追跡して経時安定性を確認することによって、大きさの変化をさらに確認した（図１５）。Ｈ２Ｏ２の添加後、流体力学的直径は最大６日目まで経時変化を伴わずに１０秒以内に非常に減少したが、ＰＴＣ－Ｍ単独の場合は、実験中に安定した大きさを示した。これはＰＴＣ－Ｍの優れたコロイド安定性を示唆している。また、１０％ＦＢＳでの安定性を確認し、ＰＴＣ－Ｍが４日目まで良好な安定性を示すことを観察した（図１６）。流体力学的直径およびゼータ電位の変化は、表６および図１７に示すように、ＲＯＳ感受性および非感受性の空ナノミセルにおいても確認された。このようなＲＯＳの存在および不在下での比較研究は、製造されたナノミセルまたは最終ｄＭｎ３Ｏ４ ＰＴＣ－Ｍナノザイムの安定性およびＲＯＳ感受性を明確に証明した。
【0108】
【表6】
【0109】
ｄＭｎ３Ｏ４ ＮＰローディングによる最終ＰＴＣ－Ｍナノ複合体のＨ２Ｏ２除去特性をさらに確認した。これはテレフタル酸（ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ ａｃｉｄ、ＴＡ）を蛍光プローブとして使用してテストした。ＴＡはＨ２Ｏ２と反応して４２５ｎｍで蛍光ピークを有する２－ヒドロキシテレフタル酸を形成した。ｄＭｎ３Ｏ４は、Ｈ２Ｏ２を水と酸素に変換するので、蛍光強度が減少し、図１８Ａのようにカタラーゼのような活性を示す。ＰＴＣ－Ｍは、時間が経過するにつれて、Ｈ２Ｏ２が存在する空ミセルＰＴＣと比較して蛍光強度の強い減少を示した。ＰＴＣ－Ｍのカタラーゼ様活性度も、図１８Ｂに示されるように濃度依存的であった。ＰＴＣ－Ｍの酸素生産能力は、Ｈ２Ｏ２の存在状態でＯ２特異的蛍光プローブＲｕ（ｄｄｐ）を用いて追加に確認した。Ｒｕ（ｄｄｐ）の蛍光強度はＯ２の存在下で減少し、Ｏ２が効率的に生産されることを示唆している。図１９に示すように、Ｒｕ（ｄｄｐ）の蛍光強度は、ＰＴＣ－Ｍ群ではＨ２Ｏ２の存在下で時間と共に減少したが、ＰＴＣ単独群ではＨ２Ｏ２の存在は蛍光の減少をほとんど示さなかった。このことから、ＰＴＣ－Ｍで酸素生成を引き起こすカタラーゼ活性を確認することができた。最後に、酸素検出器を用いてＰＴＣ－ＭのＨ２Ｏ２除去性を確認した。図２０に示すように、ＰＴＣ－Ｍによる酸素生成は、初期時間内に増加して徐々に増加したのに対し、空ミセルＰＴＣは酸素生成を示さなかった。Ｈ２Ｏ２の不均衡は、図２１Ａに示すように、ＰＴＣ－Ｍ群において、Ｈ２Ｏ２の存在下の酸素気泡の形成によって観察された。さらに、ＰＴＣ－Ｍは、ｄＭｎ３Ｏ４単独よりも高い酸素生産を示すことも観察されたが（図２１Ｂ）、これはおそらく、ＰＴＣ－ＭにおけるｄＭｎ３Ｏ４の緻密な充填により、遊離のｄＭｎ３Ｏ４と比較して反応にさらに有用であるためである可能性がある。Ｈ２Ｏ２処理によりナノミセルが緩められたが、ＦＥ－ＴＥＭから確認できるように、ｄＭｎ３Ｏ４は依然としてＰＴＣ－Ｍの内部に存在し得るので、遊離のｄＭｎ３Ｏ４に比べてカタラーゼ活性が高い。これらの結果はすべてＰＴＣ－Ｍの優れたカタラーゼ模倣活性を確認した。
【0110】
３．試験管内（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞生存および細胞取り込み
細胞取り込みおよび細胞内分布されたＲＯＳ感受性ＰＴＣのＲＯＳ感受性およびペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）の放出パターンを確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件でＰＴＣをＰＣと比較した。まず、準備されたＰＴＣ、ＰＣ、ＰＴＣ－Ｍ、ＰＣ－Ｍの細胞生存率をＷＳＴ－１アッセイによりＨＫ－２細胞で確認した（図２２Ａ；各濃度における左のバー：ＰＴＣ－Ｍ、ＰＴＣ；右のバー：ＰＣ－Ｍ、ＰＣ）。空ミセルはアポトーシスがほとんどなく、ｄＭｎ３Ｏ４ローディング後の細胞生存力が減少したが、その変化は統計的に有意ではなかった。空ミセルは細胞毒性がなかったので、細胞生存力のわずかな変化は、表面に吸着したｄＭｎ３Ｏ４またはグループ内の予期せぬステアラミンへの曝露によるものである可能性がある。ＰＴＣ－Ｍ及びＰＣ－ＭのＩＣ５０値は、それぞれ１３０．４１および２４７．１７μｇ／ｍｌと測定された（図２２Ｂ）。ナノミセルの細胞内取り込みおよび分布を追加に調べるために、蛍光顕微鏡（Ｅｖｏｓ ＦＬ Ａｕｔｏ ２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用してＰＴＣ－ＩＲ７８０でＩＲ７８０の蛍光強度を可視化するために、ＩＲ７８０をロードしたナノミセルを準備した（図２３）。対照群として、ＲＯＳ非感受性のＰＣ－ＩＲ７８０の取り込みを分析した。ＰＣ－ＩＲ７８０と比較して、ＰＴＣ－ＩＲ７８０はＨＫ－２細胞においてより広範囲でより高い取り込み率を示した。非ＲＯＳ条件下でのＰＴＣ－ＩＲ７８０の向上した取り込みの正確な理由は明確ではないが、ＰＴＣが細胞培養条件下で正常なＲＯＳレベルにわずかな感受性を示す可能性があり、ＰＥＧが剥がれて表面電荷がわずかに陽電荷として残ったことによる可能性がある。ＰＣ－ＩＲ７８０は、Ｈ２Ｏ２処理によって誘導されたＲＯＳや低酸素状態で誘導されたＲＯＳ条件にかかわらず類似した取り込みパターンを示したが、ＰＴＣ－ＩＲ７８０は細胞内でのＩＲ７８０の向上した放出によって細胞内部で異なる分布パターンを示した。細胞生存率データから観察されたように、ステアラミンによるＰＴＣ取り込みの増加は、ＰＴＣ－Ｍによる 細胞死(アポトーシス)増加の原因でもあり得る。疎水性染料であるＩＲ７８０ ｉｏｄｉｄｅは、ナノミセルのローディングに関係なく、より高い取り込み率を示した。ＰＴＣ－ＩＲ７８０はＰＣ－ＩＲ７８０と比較してより高い蛍光強度を示した。蛍光顕微鏡から得られたデータを裏付ける蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析により、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を確認し、細胞取り込みを追加に分析した（図２４）。図に示すように、ＭＦＩは、他の群と比較してＲＯＳ感受性のＰＴＣ－ＩＲ７８０群で最も高かった。このことから、細胞におけるＩＲ７８０の放出が向上したことを確認することができた。ＰＣ－ＩＲ７８０はＲＯＳ誘導条件下でも細胞取り込みに有意差を示さなかったが、ＰＴＣ－ＩＲ７８０はＲＯＳ誘導条件下で処理した場合、細胞取り込みにおいて有意な増加を示したことを示唆する顕微鏡データを裏付ける様々なグループのＭＦＩをさらに定量化した（図２５；左のバーから順にＮｏｒｍａｌ、Ｈ２Ｏ２、Ｈｙｐｏｘｉａ）。ＰＴＣの細胞取り込みは、またＰＴＣ－Ｍで処理した後、細胞中の残留Ｍｎを確認することによって決定された。図２６に示すように、ＰＴＣ－ＭはＨＫ－２細胞において濃度依存的な取り込みを示した。このような結果は、ナノミセルの強化された内在化およびナノミセルのＲＯＳ媒介分解による細胞内のＩＲ７８０の加速化した放出を示唆している。
細胞取り込みおよび細胞内分布されたＲＯＳ感受性ＰＴＣのＲＯＳ感受性およびペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）の放出パターンを確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件でＰＴＣをＰＣと比較した。まず、準備されたＰＴＣ、ＰＣ、ＰＴＣ－Ｍ、ＰＣ－Ｍの細胞生存率をＷＳＴ－１アッセイによりＨＫ－２細胞で確認した（図２２Ａ；各濃度における左のバー：ＰＴＣ－Ｍ、ＰＴＣ；右のバー：ＰＣ－Ｍ、ＰＣ）。空ミセルはアポトーシスがほとんどなく、ｄＭｎ３Ｏ４ローディング後の細胞生存力が減少したが、その変化は統計的に有意ではなかった。空ミセルは細胞毒性がなかったので、細胞生存力のわずかな変化は、表面に吸着したｄＭｎ３Ｏ４またはグループ内の予期せぬステアラミンへの曝露によるものである可能性がある。ＰＴＣ－Ｍ及びＰＣ－ＭのＩＣ５０値は、それぞれ１３０．４１および２４７．１７μｇ／ｍｌと測定された（図２２Ｂ）。ナノミセルの細胞内取り込みおよび分布を追加に調べるために、蛍光顕微鏡（Ｅｖｏｓ ＦＬ Ａｕｔｏ ２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用してＰＴＣ－ＩＲ７８０でＩＲ７８０の蛍光強度を可視化するために、ＩＲ７８０をロードしたナノミセルを準備した（図２３）。対照群として、ＲＯＳ非感受性のＰＣ－ＩＲ７８０の取り込みを分析した。ＰＣ－ＩＲ７８０と比較して、ＰＴＣ－ＩＲ７８０はＨＫ－２細胞においてより広範囲でより高い取り込み率を示した。非ＲＯＳ条件下でのＰＴＣ－ＩＲ７８０の向上した取り込みの正確な理由は明確ではないが、ＰＴＣが細胞培養条件下で正常なＲＯＳレベルにわずかな感受性を示す可能性があり、ＰＥＧが剥がれて表面電荷がわずかに陽電荷として残ったことによる可能性がある。ＰＣ－ＩＲ７８０は、Ｈ２Ｏ２処理によって誘導されたＲＯＳや低酸素状態で誘導されたＲＯＳ条件にかかわらず類似した取り込みパターンを示したが、ＰＴＣ－ＩＲ７８０は細胞内でのＩＲ７８０の向上した放出によって細胞内部で異なる分布パターンを示した。細胞生存率データから観察されたように、ステアラミンによるＰＴＣ取り込みの増加は、ＰＴＣ－Ｍによる 細胞死(アポトーシス)増加の原因でもあり得る。疎水性染料であるＩＲ７８０ ｉｏｄｉｄｅは、ナノミセルのローディングに関係なく、より高い取り込み率を示した。ＰＴＣ－ＩＲ７８０はＰＣ－ＩＲ７８０と比較してより高い蛍光強度を示した。蛍光顕微鏡から得られたデータを裏付ける蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析により、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を確認し、細胞取り込みを追加に分析した（図２４）。図に示すように、ＭＦＩは、他の群と比較してＲＯＳ感受性のＰＴＣ－ＩＲ７８０群で最も高かった。このことから、細胞におけるＩＲ７８０の放出が向上したことを確認することができた。ＰＣ－ＩＲ７８０はＲＯＳ誘導条件下でも細胞取り込みに有意差を示さなかったが、ＰＴＣ－ＩＲ７８０はＲＯＳ誘導条件下で処理した場合、細胞取り込みにおいて有意な増加を示したことを示唆する顕微鏡データを裏付ける様々なグループのＭＦＩをさらに定量化した（図２５；左のバーから順にＮｏｒｍａｌ、Ｈ２Ｏ２、Ｈｙｐｏｘｉａ）。ＰＴＣの細胞取り込みは、またＰＴＣ－Ｍで処理した後、細胞中の残留Ｍｎを確認することによって決定された。図２６に示すように、ＰＴＣ－ＭはＨＫ－２細胞において濃度依存的な取り込みを示した。このような結果は、ナノミセルの強化された内在化およびナノミセルのＲＯＳ媒介分解による細胞内のＩＲ７８０の加速化した放出を示唆している。
【0111】
４．ＰＴＣ－Ｍナノ複合体が過酸化水素で刺激されたＨＫ－２細胞の炎症およびアポトーシスに及ぼす影響
細胞レベルでの酸化ストレス条件に対するＰＴＣ－Ｍの影響を調べるために、ＨＫ－２細胞でイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）研究を行った。ＨＫ－２細胞は、代表的なＲＯＳであるＨ２Ｏ２で刺激した。Ｈ２Ｏ２はヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）－１の発現を向上し、これはＰＴＣ－Ｍの同時処理によって改善された（図２７Ａ）。細胞内のＲＯＳの変化は、２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセイン・ジアセテート（ＤＣＦ－ＤＡ）アッセイにより確認した。Ｈ２Ｏ２により刺激されたＨＫ－２細胞は高い蛍光強度を示したが、ＰＴＣ－Ｍと共に処理した後は蛍光強度が減少した（図２７Ｂ）。Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ３／Ｃａｓｐａｓｅ３比、ｐＥｒｋ／Ｅｒｋ比、ｐＰ３８／Ｐ３８比、ＢＡＸ／ＢＣＬ－２比、およびｐＪｎｋ／Ｊｎｋ比は、Ｈ２Ｏ２処理によって増加した。これはＰＴＣ－Ｍの同時処理によっても回復し、アポトーシスに対する保護を示した（図２７Ｃ）。Ｈ２Ｏ２で処理したＨＫ－２細胞は、アネキシンＶ＋／ＰＩ－染色において有意な漸進的増加を示した。これはＰＴＣ－Ｍによって防止された（図２７Ｄ）。Ｈ２Ｏ２により誘導されたＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８リン酸化もＰＴＣ－Ｍとの同時処理によって抑制されたが、リン酸化Ｐ３８の有意な減少は観察されなかった（図２７Ｃ）。これらのデータは、ＰＴＣ－Ｍが腎尿細管上皮細胞におけるＲＯＳによって誘導されるアポトーシス過程を阻害することを示唆している。
細胞レベルでの酸化ストレス条件に対するＰＴＣ－Ｍの影響を調べるために、ＨＫ－２細胞でイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）研究を行った。ＨＫ－２細胞は、代表的なＲＯＳであるＨ２Ｏ２で刺激した。Ｈ２Ｏ２はヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）－１の発現を向上し、これはＰＴＣ－Ｍの同時処理によって改善された（図２７Ａ）。細胞内のＲＯＳの変化は、２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセイン・ジアセテート（ＤＣＦ－ＤＡ）アッセイにより確認した。Ｈ２Ｏ２により刺激されたＨＫ－２細胞は高い蛍光強度を示したが、ＰＴＣ－Ｍと共に処理した後は蛍光強度が減少した（図２７Ｂ）。Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ３／Ｃａｓｐａｓｅ３比、ｐＥｒｋ／Ｅｒｋ比、ｐＰ３８／Ｐ３８比、ＢＡＸ／ＢＣＬ－２比、およびｐＪｎｋ／Ｊｎｋ比は、Ｈ２Ｏ２処理によって増加した。これはＰＴＣ－Ｍの同時処理によっても回復し、アポトーシスに対する保護を示した（図２７Ｃ）。Ｈ２Ｏ２で処理したＨＫ－２細胞は、アネキシンＶ＋／ＰＩ－染色において有意な漸進的増加を示した。これはＰＴＣ－Ｍによって防止された（図２７Ｄ）。Ｈ２Ｏ２により誘導されたＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８リン酸化もＰＴＣ－Ｍとの同時処理によって抑制されたが、リン酸化Ｐ３８の有意な減少は観察されなかった（図２７Ｃ）。これらのデータは、ＰＴＣ－Ｍが腎尿細管上皮細胞におけるＲＯＳによって誘導されるアポトーシス過程を阻害することを示唆している。
【0112】
５．ＩＲＩマウスにおけるＰＴＣ－Ｍナノ複合体の生体分布
蛍光染料ＩＲ７８０をモデル薬物としてロードし、ＩＲＩマウスにおけるＰＴＣの生体分布を調べた（ＰＴＣ－ＩＲ７８０）。ＰＣ－ＩＲ７８０及びＩＲ７８０単独の生体分布を比較したところ、全群が主要臓器（肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓）で蛍光を示したが、ＰＴＣ－ＩＲ７８０は、ＰＣ－ＩＲ７８０またはＩＲ７８０群とは異なり、腎臓において向上した蓄積を示した（図２８）。また、正常マウスにおけるＰＴＣ－ＩＲ７８０の生体分布プロファイルを確認したところ、静脈注射後のナノ粒子において一般的なより高い肝臓蓄積を示したが、腎臓には多く蓄積しなかったことが見出された（図２９；肝臓、肺、腸、心臓、脾臓、腎臓）。このことから、ＰＴＣの向上した腎臓蓄積が主に腎炎症によって媒介されるという結論に至ることができた。本実施例において、ＰＴＣナノミセルは、血液を循環しながら炎症部位に徐々に蓄積するように設計されており、炎症部位に到達した後は強化されたＲＯＳの存在によりＰＴＣが不安定になり、腎臓に残っているロードされたＩＲ７８０がより長時間放出されて蛍光を向上させた。生体外蛍光強度を定量化して全群における腎臓蓄積を比較したところ、ＰＴＣは全身注射の場合に避けられない他の主要臓器で蛍光を示すが、優勢な腎臓蓄積を示すことを観察した（図３０；左のバーから順にＩＲ７８０、ＰＣ－ＩＲ７８０、ＰＴＣ－ＩＲ７８０）。
蛍光染料ＩＲ７８０をモデル薬物としてロードし、ＩＲＩマウスにおけるＰＴＣの生体分布を調べた（ＰＴＣ－ＩＲ７８０）。ＰＣ－ＩＲ７８０及びＩＲ７８０単独の生体分布を比較したところ、全群が主要臓器（肝臓、肺、心臓、脾臓、腎臓）で蛍光を示したが、ＰＴＣ－ＩＲ７８０は、ＰＣ－ＩＲ７８０またはＩＲ７８０群とは異なり、腎臓において向上した蓄積を示した（図２８）。また、正常マウスにおけるＰＴＣ－ＩＲ７８０の生体分布プロファイルを確認したところ、静脈注射後のナノ粒子において一般的なより高い肝臓蓄積を示したが、腎臓には多く蓄積しなかったことが見出された（図２９；肝臓、肺、腸、心臓、脾臓、腎臓）。このことから、ＰＴＣの向上した腎臓蓄積が主に腎炎症によって媒介されるという結論に至ることができた。本実施例において、ＰＴＣナノミセルは、血液を循環しながら炎症部位に徐々に蓄積するように設計されており、炎症部位に到達した後は強化されたＲＯＳの存在によりＰＴＣが不安定になり、腎臓に残っているロードされたＩＲ７８０がより長時間放出されて蛍光を向上させた。生体外蛍光強度を定量化して全群における腎臓蓄積を比較したところ、ＰＴＣは全身注射の場合に避けられない他の主要臓器で蛍光を示すが、優勢な腎臓蓄積を示すことを観察した（図３０；左のバーから順にＩＲ７８０、ＰＣ－ＩＲ７８０、ＰＴＣ－ＩＲ７８０）。
【0113】
図３１Ａに示すように、ＰＴＣ－ＩＲ７８０注入後６時間から腎臓において強いＩＲ７８０蛍光強度が観察された。主要臓器（肝臓、肺、脾臓、心臓、腎臓、脳）の蛍光強度は、肝臓、肺、脾臓、腎臓の順に高いことが示された。他の臓器の蛍光強度は時間が経過するにつれて減少したが、腎臓の蛍光強度は４８時間まで比較的一定に維持された。したがって、肝臓対腎臓の蛍光強度は、時間が経過するにつれて漸進的に増加する傾向にあった（図３１Ｂ）。生体分布は、誘導結合プラズマ質量分析計（ＩＣＰ－ＭＳ）の分析により、他の臓器のＭｎ含有量を確認することによって追加に確認した。図３１Ｃに示すように、両方の腎臓におけるＭｎ濃度は注射後６時間でピークに達し、４８時間まで徐々に減少した。組織のＭｎ濃度を他の主要臓器と比較すると、ある時点で腎臓が肝臓、肺、脾臓よりも高い組織Ｍｎ濃度に達した。ＰＣＴ－Ｍのクリアランスを確認するために、研究終了時と１週間後にすべての臓器、糞便および尿に対してＩＣＰ－ＭＳ分析を行ったところ、ほとんどのＭｎが腸と糞便中に出現したことを確認した（図３１Ｄ）。Ｍｎのクリアランスは、主に腎臓のクリアランスよりも肝胆道経路をとることが観察された。
【0114】
６．ＰＴＣ－Ｍナノ複合体は腎損傷マーカーを減少させ、ＩＲＩマウス腎臓の形態学的変化を軽減する。
腎臓ＩＲＩにおける腎損傷の軽減におけるＰＴＣ－Ｍの有効性を決定するために、生体内実験を行った（図３２Ａ）。ＩＲＩ腎臓の全体的な損傷状態を調べるために、ＡＫＩにおける尿細管損傷のよく知られたマーカーである血漿好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）を測定した。血漿ＮＧＡＬレベルは、偽群よりもＩＲＩ群の方が有意に高かったが、ＰＴＣ－Ｍ処理によって減少した（図３２Ｂ）。形態学的変化を確認するために、腎臓切片に対してＰＡＳ（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ－Ｓｃｈｉｆｆ）染色を行った（図３２Ｃ）。偽マウスとは対照的に、腎尿細管浮腫および壊死物質で満たされた腫れが観察された。ＩＲＩマウスの腎臓では、間質空間に浸潤している炎症細胞が観察された。これらの変化はＰＴＣ－Ｍ処理によって改善された。ＰＴＣ－Ｍを処理したＩＲＩマウスでは、尿細管浮腫、尿細管壊死物質および炎症細胞浸潤が相対的に軽減された。尿細管の変化とは異なり、各群の糸球体では形態学的に有意な差異が観察されなかった。
腎臓ＩＲＩにおける腎損傷の軽減におけるＰＴＣ－Ｍの有効性を決定するために、生体内実験を行った（図３２Ａ）。ＩＲＩ腎臓の全体的な損傷状態を調べるために、ＡＫＩにおける尿細管損傷のよく知られたマーカーである血漿好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）を測定した。血漿ＮＧＡＬレベルは、偽群よりもＩＲＩ群の方が有意に高かったが、ＰＴＣ－Ｍ処理によって減少した（図３２Ｂ）。形態学的変化を確認するために、腎臓切片に対してＰＡＳ（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ－Ｓｃｈｉｆｆ）染色を行った（図３２Ｃ）。偽マウスとは対照的に、腎尿細管浮腫および壊死物質で満たされた腫れが観察された。ＩＲＩマウスの腎臓では、間質空間に浸潤している炎症細胞が観察された。これらの変化はＰＴＣ－Ｍ処理によって改善された。ＰＴＣ－Ｍを処理したＩＲＩマウスでは、尿細管浮腫、尿細管壊死物質および炎症細胞浸潤が相対的に軽減された。尿細管の変化とは異なり、各群の糸球体では形態学的に有意な差異が観察されなかった。
【0115】
７．ＰＴＣ－Ｍは、ＩＲＩマウス腎臓における炎症とアポトーシスを改善する。
ＩＲＩマウス腎臓における酸化ストレスの程度を評価するために、免疫ブロット分析によってＨＯ－１の発現レベルを調べた。ＰＴＣ－Ｍ処理によって弱められたＩＲＩマウスの腎臓において、ＨＯ－１の増加した発現レベルを見出した（図３３Ａ）。ＨＯ－１に対する免疫組織化学染色は、糸球体のメサンギウム（ｍｅｓａｎｇｉｕｍ）、糸球体周囲空間およびＩＲＩマウス（Ｉ／Ｒ）腎臓の尿細管周囲の間質において増加した発現を示し、これはＰＴＣ－Ｍ処理されたマウス腎臓において非常に減少した（図３３Ｂ）。ＩＲＩマウス腎臓における活性炎症の証拠として、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析によって、前炎症性サイトカインおよび接着分子の転写体レベルがより高いこととして示された（図３３Ｃ）。インターロイキン（ＩＬ）－６、単球化学誘引物質タンパク質（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＣＰ）－１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）－１、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ－１）およびトランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＴＧＦ）－βのｍＲＮＡ発現レベルは、ＩＲＩマウスの腎臓において有意に増加し、ＰＴＣ－Ｍの投与はこの増加を抑制した（図３３Ｃ）。ｍｕｒｉｎｅマクロファージのマーカーであるＦ４／８０に対する免疫組織化学的染色は、ＩＲＩマウスの腎臓の糸球体周囲および間質空間で増加した発現を示したが、これもＰＴＣ－Ｍ処理によって弱められた（図３３Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＰＴＣ－ＭがＩＲＩマウスにおける腎炎症および酸化ストレスを抑制することを示唆している。
ＩＲＩマウス腎臓における酸化ストレスの程度を評価するために、免疫ブロット分析によってＨＯ－１の発現レベルを調べた。ＰＴＣ－Ｍ処理によって弱められたＩＲＩマウスの腎臓において、ＨＯ－１の増加した発現レベルを見出した（図３３Ａ）。ＨＯ－１に対する免疫組織化学染色は、糸球体のメサンギウム（ｍｅｓａｎｇｉｕｍ）、糸球体周囲空間およびＩＲＩマウス（Ｉ／Ｒ）腎臓の尿細管周囲の間質において増加した発現を示し、これはＰＴＣ－Ｍ処理されたマウス腎臓において非常に減少した（図３３Ｂ）。ＩＲＩマウス腎臓における活性炎症の証拠として、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析によって、前炎症性サイトカインおよび接着分子の転写体レベルがより高いこととして示された（図３３Ｃ）。インターロイキン（ＩＬ）－６、単球化学誘引物質タンパク質（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＣＰ）－１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）－１、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ－１）およびトランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＴＧＦ）－βのｍＲＮＡ発現レベルは、ＩＲＩマウスの腎臓において有意に増加し、ＰＴＣ－Ｍの投与はこの増加を抑制した（図３３Ｃ）。ｍｕｒｉｎｅマクロファージのマーカーであるＦ４／８０に対する免疫組織化学的染色は、ＩＲＩマウスの腎臓の糸球体周囲および間質空間で増加した発現を示したが、これもＰＴＣ－Ｍ処理によって弱められた（図３３Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＰＴＣ－ＭがＩＲＩマウスにおける腎炎症および酸化ストレスを抑制することを示唆している。
【0116】
ＩＲＩマウスにおける尿細管細胞死の程度を評価するために、アポトーシスタンパク質の変化を評価した。免疫ブロットは、ＩＲＩマウスの腎切片において増加したＢａｘ／Ｂｃｌ－２比および切断されたカスパーゼ３（ｃａｓｐａｓｅ３）／カスパーゼ３（ｃａｓｐａｓｅ３）比を示し、アポトーシスが悪化したことを示唆している（図３４Ａ）。この変化はＰＴＣ－Ｍで処理されたマウスでは観察されなかった。ＰＴＣ－Ｍの処理は、酸化ストレスによって誘発された腎尿細管細胞のアポトーシスの過程を明らかに減少させた。
【0117】
ＰＴＣ－Ｍが分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ；ＭＡＰＫ）によりＲＯＳ媒介アポトーシスを阻害するかどうかを確認するために、ＭＡＰＫシグナル伝達経路の変化を分析した。ＭＡＰＫ経路のメンバー及びリン酸化（活性化）された形態の免疫ブロット分析を行った（図３４Ｂ）。リン酸化されたＥＲＫ、ＪＮＫおよびＰ３８のレベルは、ＰＴＣ－Ｍによって弱められた偽マウスと比較してＩＲＩマウスの腎臓で向上したが、リン酸化されたＪＮＫの有意な減少は観察されなかった。ＴＵＮＥＬ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄＵＤＰ ｎｉｃｋｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）染色は、偽マウスと比較してＩＲＩマウスの腎皮質においてより多くのＴＵＮＥＬ陽性尿細管上皮細胞を示したが、ＰＣＴ－Ｍ処理はＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を減少させた（図３４ｃ）。
【0118】
これらの結果は、ＰＴＣ－ＭがＭＡＰＫシグナル伝達経路に影響を及ぼすことにより、ＩＲＩマウス腎臓におけるアポトーシスを減少させたことを示唆している。ＩＲＩマウス腎臓におけるこの発見は、Ｈ２Ｏ２で刺激されたヒト腎細胞の結果と一致しており、ＰＴＣ－Ｍ腎保護の一般的なメカニズムを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27a】
【図27b】
【図27c】
【図27d】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31a】
【図31b】
【図31c】
【図31d】
【図32a】
【図32b】
【図32c】
【図33a】
【図33b】
【図33c】
【図34a】
【図34b】
【図34c】
【配列表】
【国際調査報告】