特表 2024-538669 抗ＬＡＧ３二重特異性抗体、医薬組成物、及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-23

(54)【発明の名称】抗ＬＡＧ３二重特異性抗体、医薬組成物、及び使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20241016BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241016BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241016BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241016BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241016BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20241016BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20241016BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

C07K16/18

C12N15/62

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P35/00

A61P35/02

A61P7/06

A61K39/395 D

A61K39/395 N

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520079

(86)(22)【出願日】2022-09-29

(85)【翻訳文提出日】2024-05-28

(86)【国際出願番号】 CN2022122556

(87)【国際公開番号】W WO2023051683

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】202111149114.9

(32)【優先日】2021-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524122657

【氏名又は名称】アケソ ホイコー（シャンハイ）カンパニー リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100231902

【弁理士】

【氏名又は名称】吉田 李花

(72)【発明者】

【氏名】チャン ポン

(72)【発明者】

【氏名】リー パイヨン

(72)【発明者】

【氏名】シア ユイ

(72)【発明者】

【氏名】ワン チョンミン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085EE01

4H045AA11

4H045BA41

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

生物医学の分野に属する、抗ＬＡＧ３抗体二重特異性抗体、その医薬組成物、及びその使用が提供される。具体的には、二重特異性抗体は、第１タンパク質機能ドメイン及び第２タンパク質機能ドメインを含み；第１タンパク質機能ドメインはＬＡＧ３を標的とし、第２タンパク質機能ドメインはＬＡＧ３以外の標的を標的とし；第１タンパク質機能ドメインは、抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号５～７によって表されるアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む。また、軽鎖可変領域は、配列番号８～１０によって表されるアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む。二重特異性抗体は優れた親和性と特異性を有し、応用性に優れている。
【選択図】 図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１タンパク質機能領域及び第２タンパク質機能領域を含む、二重特異性抗体であって、
前記第１タンパク質機能領域がＬＡＧ３を標的とし、
前記第２タンパク質機能領域がＬＡＧ３以外の標的（例えば、ＰＤ－１）を標的とし、
前記第１タンパク質機能領域が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片であり、
前記重鎖可変領域が、配列番号５～７に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、二重特異性抗体。

【請求項2】

前記抗ＬＡＧ３抗体が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項3】

前記抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、単鎖可変領域断片、ヒト化抗体、キメラ抗体、及びダイアボディから選択される、請求項１～２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項4】

前記抗ＬＡＧ３抗体が、ヒトＬＡＧ３－ｍＦｃに対して、０．２ｎＭ未満、例えば、０．１５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０８ｎＭ未満、０．０６ｎＭ未満、もしくは０．０５ｎＭ未満、又はそれ以下のＥＣ_５０値で結合し；好ましくは前記ＥＣ_５０値が間接ＥＬＩＳＡによって測定される、請求項１～３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

前記抗ＬＡＧ３抗体が、マウス以外の種に由来する、例えば、ヒト抗体に由来する非ＣＤＲ領域を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

前記抗ＬＡＧ３抗体が、ヒト抗体に由来する定常領域を含み；
好ましくは、前記抗体の前記定常領域がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の定常領域から選択される、
請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項7】

前記抗ＬＡＧ３抗体の重鎖定常領域が、Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（例えば、配列番号３９に記載されている）又はＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域（例えば、配列番号４５に記載されている）であり、前記抗ＬＡＧ３抗体の軽鎖定常領域が、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（例えば、配列番号４０に記載されている）である、請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、
前記抗ＬＡＧ３抗体がヒトＩｇＧ１サブタイプであり、
ここで、ＥＵ番号付けシステムによれば、前記抗体の重鎖定数領域が下記の変異：
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｌ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、
を有し；
好ましくは、前記抗ＬＡＧ３抗体が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、二重特異性抗体。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、
前記抗ＬＡＧ３抗体がヒトＩｇＧ４サブタイプであり、
ここで、ＥＵ番号付けシステムによれば、前記抗体の重鎖定数領域が下記の変異：
Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｆ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は
Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、
を有し；
好ましくは、前記抗ＬＡＧ３抗体が、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、二重特異性抗体。

【請求項10】

好ましくは前記二重特異性抗体がＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態である、請求項１～９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項11】

前記第１タンパク質機能領域が抗ＬＡＧ３抗体であり、前記第２タンパク質機能領域が単鎖可変領域断片である；又は
前記第１タンパク質機能領域が単鎖可変領域断片であり、前記第２タンパク質機能領域がＬＡＧ３以外の標的を標的とする抗体である、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項12】

前記第１タンパク質機能領域及び前記第２タンパク質機能領域が直接、又はリンカー断片によって連結しており；
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである；又は
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである、
請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項13】

前記第１タンパク質機能領域及び前記第２タンパク質機能領域の数が、それぞれ独立に１個、２個、又はそれ以上の個数である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項14】

前記単鎖可変領域断片が、前記抗体の重鎖のＣ末端に連結している、請求項１～１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項15】

ＬＡＧ３を標的とする第１タンパク質機能領域、及び
ＰＤ－１を標的とする第２タンパク質機能領域、
を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、
前記第１タンパク質機能領域が抗ＬＡＧ３抗体であり、前記抗ＬＡＧ３抗体が免疫グロブリン形態であり；
前記第２タンパク質機能領域が抗ＰＤ－１単鎖可変領域断片である、二重特異性抗体。

【請求項16】

前記抗ＰＤ－１単鎖可変領域断片が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が、配列番号２６～２８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み；及び
前記軽鎖可変領域が、配列番号２９～３１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、
請求項１５に記載の二重特異性抗体。

【請求項17】

前記抗ＰＤ－１単鎖可変領域断片において、
前記重鎖可変領域が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する；又は
前記重鎖可変領域が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号２１もしくは配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する、
請求項１５～１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項18】

前記抗ＰＤ－１単鎖可変領域断片における前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が直接、又はリンカー断片によって連結しており；
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである；又は
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである、
請求項１５～１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項19】

請求項１５～１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、
前記二重特異性抗体が、
ＬＡＧ３を標的とする第１タンパク質機能領域；及び
ＰＤ－１を標的とする第２タンパク質機能領域、
を含み；
前記第１タンパク質機能領域の数が１個であり、前記第２タンパク質機能領域の数が２個であり；
前記第１タンパク質機能領域が免疫グロブリンであり、前記第２タンパク質機能領域が単鎖可変領域断片であり；
前記免疫グロブリンが、配列番号１１又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み；
前記単鎖可変領域断片が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２１又は配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み；
前記単鎖可変領域断片が、前記免疫グロブリンの２個の重鎖のＣ末端に連結しており；
前記第１タンパク質機能領域が、第１リンカー断片を介して前記第２タンパク質機能領域に連結しており；前記単鎖可変領域断片の前記重鎖可変領域が、第２リンカー断片を介して前記単鎖可変領域断片の前記軽鎖可変領域に連結しており；前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片が同一であるか、あるいは異なっており；
好ましくは、前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片が、配列番号３５～３７からそれぞれ独立に選択されるアミノ酸配列を有しており；
好ましくは、前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片のアミノ酸配列が、配列番号３６に記載されている、二重特異性抗体。

【請求項20】

ＬＡＧ３を標的とする第１タンパク質機能領域、及び
ＰＤ－１を標的とする第２タンパク質機能領域、
を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、
前記第１タンパク質機能領域が抗ＬＡＧ３単鎖可変領域断片であり、前記第２タンパク質機能領域が抗ＰＤ－１抗体であり、前記抗ＰＤ－１抗体が免疫グロブリン形態であり、
前記抗ＬＡＧ３単鎖可変領域断片が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が、配列番号５～７に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み；及び
前記軽鎖可変領域が、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、二重特異性抗体。

【請求項21】

前記抗ＬＡＧ３単鎖可変領域断片において、
前記重鎖可変領域が配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、
前記軽鎖可変領域が配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、
請求項２０に記載の二重特異性抗体。

【請求項22】

前記抗ＬＡＧ３単鎖可変領域断片における前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が直接、又はリンカー断片によって連結しており；
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである；又は
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである、
請求項２０～２１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項23】

前記抗ＰＤ－１抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が、配列番号２６～２８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み；及び
前記軽鎖可変領域が、配列番号２９～３１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、
請求項２０～２２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項24】

前記抗ＰＤ－１抗体において、
前記重鎖可変領域が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する；又は
前記重鎖可変領域が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号２１もしくは配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する、
請求項２０～２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項25】

前記抗ＰＤ－１抗体の重鎖定常領域が、Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（例えば、配列番号３９に記載されている）又はＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域（例えば、配列番号４５に記載されている）であり、前記抗ＰＤ－１抗体の軽鎖定常領域が、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（例えば、配列番号４０に記載されている）である、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項26】

請求項２０～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、
前記抗ＰＤ－１抗体がヒトＩｇＧ１サブタイプであり、
ここで、ＥＵ番号付けシステムによれば、前記抗ＰＤ－１抗体が下記の変異：
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｌ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、
を有し；
好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体が、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、二重特異性抗体。

【請求項27】

請求項２０～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、
前記抗ＰＤ－１抗体がヒトＩｇＧ４サブタイプであり、
ここで、ＥＵ番号付けシステムによれば、前記抗ＰＤ－１抗体が下記の変異：
Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｆ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は
Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、
を有し；
好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体が、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、二重特異性抗体。

【請求項28】

請求項２０～２７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、
前記二重特異性抗体が、
ＬＡＧ３を標的とする第１タンパク質機能領域、及び
ＰＤ－１を標的とする第２タンパク質機能領域、
を含み；
前記第１タンパク質機能領域の数が１個であり、前記第２タンパク質機能領域の数が２個であり；
前記第１タンパク質機能領域が単鎖可変領域断片であり、前記第２タンパク質機能領域が免疫グロブリンであり；
前記単鎖可変領域断片が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み；
前記免疫グロブリンが、配列番号３４又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み；
前記単鎖可変領域断片が、前記免疫グロブリンの２個の重鎖のＣ末端に連結しており；
前記第１タンパク質機能領域が、第１リンカー断片を介して前記第２タンパク質機能領域に連結しており；前記単鎖可変領域断片の前記重鎖可変領域が、第２リンカー断片を介して前記単鎖可変領域断片の前記軽鎖可変領域に連結しており；前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片が同一であるか、あるいは異なっており；
好ましくは、前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片が、配列番号３５～３７からそれぞれ独立に選択されるアミノ酸配列を有しており；
好ましくは、前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片のアミノ酸配列が、配列番号３６に記載されており；
好ましくは、前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片のアミノ酸配列が、配列番号３７に記載されている、二重特異性抗体。

【請求項29】

請求項１～２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする、単離核酸分子。

【請求項30】

請求項２９に記載の単離核酸分子を含む、組換えベクター。

【請求項31】

請求項２９に記載の単離核酸分子又は請求項３０に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。

【請求項32】

請求項３１に記載の宿主細胞を適した条件下で培養すること、及び細胞培養物から前記二重特異性抗体を単離することを含む、請求項１３～３０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を調製する方法。

【請求項33】

請求項１～２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物が任意に、薬理学的に許容される副原料をさらに含む、医薬組成物。

【請求項34】

腫瘍又は貧血を治療及び／又は予防するための薬剤の調製における、請求項１～２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の使用であって、
好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである、二重特異性抗体の使用。

【請求項35】

腫瘍又は貧血の治療及び／又は予防における使用のための、請求項１～２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、
好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである、二重特異性抗体。

【請求項36】

腫瘍又は貧血を治療及び／又は予防する方法であって、前記方法が、請求項１～２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含み、
好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は生物医学の分野に属し、抗ＬＡＧ３二重特異性抗体及びその医薬組成物、並びにそれらの使用に関する。具体的には、二重特異性抗体は抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体である。

【背景技術】

【0002】

腫瘍、特に悪性腫瘍は、今日では、健康を脅かす世界的に深刻な疾患であり、各種疾患の中でも死因の第２位となっている。近年、これら疾患の罹患率が著しく増加している。悪性腫瘍は、治療反応性が悪く、後期の転移率が高く、また、予後が不良であることが特徴である。現在臨床的に採用されている従来の治療方法（例えば、放射線療法、化学療法、及び外科治療など）は、疼痛を大幅に緩和し、生存時間を延長するものであるが、それらの方法には大きな制約があり、それらの有効性をさらに向上させるのは困難である。

【0003】

リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、すなわちＣＤ２２３は、４９８アミノ酸から構成されるＩ型膜貫通タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである。ＬＡＧ３は主に、活性化ＣＤ４^＋ Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ Ｔ細胞で発現している。また、細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）、及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣｓ）などにおいてもＬＡＧ３が発現している（Ｒｕｆｆｏ Ｅｌｉｓａ， Ｗｕ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｃ， Ｂｒｕｎｏ Ｔｕｌｌｉａ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３ （ＬＡＧ３）： Ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． ［Ｊ］．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０１９， ４２： １０１３０５．）。

【0004】

ＬＡＧ３分子遺伝子はヒト第１２染色体（２０ｐ１３．３）上でＣＤ４分子遺伝子に隣接して位置し、両者とも同じエクソンとイントロンを有する。ＬＡＧ３分子とＣＤ４分子は構造的に類似性が高いが、両者間のアミノ酸配列相同性は２０％程度しかない。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）分子、肝類洞内皮細胞レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）分子、及びガレクチン－３分子はＬＡＧ３分子に対する関連リガンドである。ＭＨＣクラスＩＩ分子はＬＡＧ３に対する主要リガンドである。ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ３分子の親和性（Ｋｄ：６０ｎｍｏｌ・Ｌ^－１）はＣＤ４分子のものと比較して１００倍であり、このことは、ＬＡＧ３分子が、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合に関してＣＤ４分子と効果的に競合し、Ｔ細胞活性化を阻害しうるということを示している。

【0005】

腫瘍微小環境内においては、Ｔ細胞活性化の２４時間後に免疫抑制分子ＬＡＧ３の発現を検出することができ、これがひいてはＴ細胞の機能不全又はアポトーシスをもたらす。ＬＡＧ３分子は、そのＤ１ドメイン（プロリンに富む１個のループ構造を有する）を介して二量体を形成し、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞活性化の第１シグナル伝達軸（ｆｉｒｓｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｘｉｓ）である「ＣＤ３－ＴＣＲ－ＭＨＣＩＩ」においてＭＨＣクラスＩＩ分子に特異的に結合する。それにより、一方ではＴ細胞活性化のためのシグナル伝達経路がブロックされ、他方ではＬＡＧ３分子の細胞内セグメント（ＫＩＥＥＬＥモチーフ）が免疫抑制シグナルを生成して、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の活性を下方制御する。ＬＡＧ３分子はＴｒｅｇ細胞の分化を促進し、シグナル伝達兼転写活性化因子５の下流シグナル伝達に関与し、それによってＴｒｅｇ細胞の阻害効果を増強することができる。これは、腫瘍が免疫系による殺傷を回避するメカニズムの１つである（Ａｎｄｒｅｗｓ Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｐ， Ｍａｒｃｉｓｃａｎｏ Ａｒｉｅｌ Ｅ， Ｄｒａｋｅ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｇ， ｅｔ ａｌ．， ＬＡＧ３ （ＣＤ２２３） ａｓ ａ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔ． ［Ｊ］． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ， ２０１７， ２７６： ８０－９６．）。

【0006】

各種悪性腫瘍の腫瘍浸潤ＣＤ８^＋ Ｔ細胞においてＬＡＧ３が過剰発現していることが、複数の研究によって示されている。例えば、卵巣がんにおいては、ニューヨーク食道扁平上皮がん１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）抗原特異的腫瘍浸潤ＣＤ８^＋ Ｔ細胞が、ＰＤ－１及びＬＡＧ３を高度に発現し、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを産生する能力が減少しており、そのためリンパ球が不活性化されている。ガレクチン－３及びＬＳＥＣｔｉｎは、主にＬＡＧ３と相互作用し、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の活性化と機能を調節する。また、転移性メラノーマの患者から単離されたメラノーマ抗原特異的Ｔ細胞は、ＬＡＧ３並びに他の免疫チェックポイント分子ＣＴＬＡ－４及びＴＩＭ－３の発現の有意な上方制御を示す（Ｌｉｕ Ｈａｏ， Ｌｉ Ｘｉｎｙｉｎｇ， Ｌｕｏ Ｌｏｎｇｌｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ－３ （ＬＡＧ－３） ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＬＡＧ－３ ［Ｊ］． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ， ２０１９， ３３（０１）： ７０－７８．）。

【0007】

現在、複数のＬＡＧ３抗体薬が臨床研究段階に入っており、それらのうち、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社のレラトリマブは１０件の臨床研究が進行中であり、最も進展が見られる。これらの研究の大部分は、腫瘍、例えば、血液悪性腫瘍、メラノーマ、膠芽腫、腎細胞がん、非小細胞肺がん、及び同種のものなどの治療に用いられる、レラトリマブとニボルマブの併用療法を伴う。

【0008】

膜貫通受容体ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）はＣＤ２８ファミリーのメンバーであり、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄細胞で発現している。ＰＤ－１、ＰＤＬ１、及びＰＤＬ２の受容体はＢ７スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤＬ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、及び上皮細胞を含む様々な細胞で発現し、ＰＤＬ２は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞及びマクロファージなどにおいてのみ発現する。

【0009】

ＰＤ－１はＴ細胞の活性化を下方制御するのに非常に重要な役割を果たしており、ＰＤ－１を介したＴ細胞の下方制御は腫瘍免疫回避の重要なメカニズムの一つである。腫瘍表面に発現するＰＤ－Ｌ１は、免疫細胞表面のＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路を介して、免疫細胞による腫瘍組織の殺傷を阻害することができる。また、ＰＤ－Ｌ１高発現の腫瘍は、検出が困難ながんと関連している（Ｈａｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ２００７； １０４： ３３６０－５）。ＰＤ－１に拮抗してＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路を阻害する効果的な方法の一つは、抗ＰＤ－１抗体のインビボ注射である。

【0010】

ＰＤ－１抗体は、広範な抗腫瘍性を示す可能性があり、驚くべき有効性を示すことから、ＰＤ－１経路を標的とする抗体は、以下の各種の腫瘍の治療においてブレイクスルーをもたらすと考えられる：非小細胞肺がん、腎細胞がん、卵巣がん、及びメラノーマ（Ｈｏｍｅｔ Ｍ． Ｂ．， Ｐａｒｉｓｉ Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， ２０１５ Ｊｕｎ； ４２（３）： ４６６－４７３）、並びに血液系腫瘍及び貧血（Ｈｅｌｄ ＳＡ， Ｈｅｉｎｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ＣＭＬ． Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ， ２０１３ Ｓｅｐ； １３（７）： ７６８－７４）。

【0011】

二機能性抗体は、二重特異性抗体とも呼ばれ、２つの異なる抗原を同時に標的とする特異的抗体医薬であり、免疫選別（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｔｉｎｇ）及び精製により製造することができ、又は遺伝子工学によって得ることができる。遺伝子工学は、結合部位の最適化、合成形態、収率、及び同種のものの側面において柔軟性があり、一定の利点を有する。現在、二重特異性抗体は、４５を超える形態で存在することが示されている（Ｍｕｌｌｅｒ Ｄ， Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ． Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ． ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０１０； ２４： ８９－９８）。ＩｇＧ－ＳｃＦｖ形態、すなわちモリソン形態（Ｃｏｌｏｍａ ＭＪ， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９７； １５： １５９－１６３）は、天然に存在するＩｇＧ形態との類似性、並びに抗体の操作、発現、及び精製における利点から、二機能性抗体の理想的な形態であることが示されている（Ｍｉｌｌｅｒ ＢＲ， Ｄｅｍａｒｅｓｔ ＳＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｃＦｖｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ， ２０１０； ２３： ５４９－５７； Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｊ， Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ Ａ． Ｒａｔｉｏｎａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐａｔｈｗａｙｓ． ＭＡｂｓ， ２０１１； ３： ２９９－３０９）。

【0012】

現在、新規抗ＬＡＧ３抗体、及びＰＤ－１とＬＡＧ３とを同時に標的とする二機能性抗体医薬の開発が必要とされている。

【発明の概要】

【0013】

本願発明者らは鋭意研究を重ね、創造的な努力を行うことにより、抗ＬＡＧ３抗体を得て、それに基づき、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体を開発した。本願発明者らは驚くべきことに、本発明の抗ＬＡＧ３抗体（以下、前記抗体又は本発明の抗体と略す場合がある）及び本発明の抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体（以下、前記二重特異性抗体又は本発明の二重特異性抗体と略す場合がある）が、優れた親和性及び／又は特異性を有し、陽性対照抗体（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、レラトリマブ、及び同種のもの）と比べても、１つ以上の側面においてさらに優れたものであることを見出した。本発明を以下に詳細に説明する。

【0014】

本発明の一態様は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片（ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）であって、
前記重鎖可変領域が、配列番号５～７に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；
前記重鎖可変領域が、配列番号５～７に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号４６、及び配列番号４７に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；又は
前記重鎖可変領域が、配列番号５～７に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４８、配列番号４６、及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片に関する。

【0015】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する；
前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する；又は
前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する、
前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。

【0016】

本発明のいくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、単鎖可変領域断片（ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、及びダイアボディから選択される、前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。

【0017】

本発明のいくつかの実施形態では、前記抗体が、ヒトＬＡＧ３－ｍＦｃに対して、０．２ｎＭ未満、例えば、０．１５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０８ｎＭ未満、０．０６ｎＭ未満、もしくは０．０５ｎＭ未満、又はそれ以下のＥＣ_５０値で結合し；好ましくは前記ＥＣ_５０値が間接ＥＬＩＳＡによって測定される、前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。

【0018】

本発明のいくつかの実施形態では、前記抗体が、マウス以外の種に由来する、例えば、ヒト抗体に由来する非ＣＤＲ領域を含む、前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。

【0019】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗体がヒト抗体に由来する定常領域を含み；
好ましくは、前記抗体の定常領域がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の定常領域から選択される、
前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。

【0020】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＬＡＧ３抗体の重鎖定常領域が、Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（例えば、配列番号３９に記載されている）又はＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域（例えば、配列番号４５に記載されている）であり、前記抗ＬＡＧ３抗体の軽鎖定常領域が、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（例えば、配列番号４０に記載されている）である、
前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。

【0021】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗体がヒトＩｇＧ１サブタイプであり；
ここで、ＥＵ番号付けシステムによれば、前記抗体の重鎖定数領域は下記の変異：
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｌ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、
を有し；
好ましくは、前記抗体が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む；
前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。

【0022】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗体がヒトＩｇＧ４サブタイプであり；
ここで、ＥＵ番号付けシステムによれば、前記抗体の重鎖定数領域は下記の変異：
Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｆ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は
Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、
を有し；
好ましくは、前記抗体が、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む；
前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。

【0023】

本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＬＡＧ３抗体はモノクローナル抗体である。

【0024】

本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＬＡＧ３抗体は免疫グロブリン形態である。

【0025】

本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＬＡＧ３抗体は単鎖可変領域断片である。

【0026】

本発明の他の態様は、抗体又はその抗原結合性断片、及び小分子薬を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であって、前記抗体又はその抗原結合性断片が、本発明のいずれかの実施形態の抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片であり；好ましくは前記小分子薬が小分子細胞毒性薬であり；より好ましくは前記小分子薬が抗腫瘍化学療法薬である、抗体薬物複合体に関する。

【0027】

前記化学療法薬は、従来の抗腫瘍化学療法薬、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物系抗がん剤、ホルモン、及び免疫剤などであってよい。

【0028】

本発明の１つ又は複数の実施形態では、前記抗体薬物複合体が提供され、前記抗体又はその抗原結合性断片は、リンカーを介して小分子薬に連結されており；前記リンカーは当業者に公知のもの、例えば、ヒドラゾン結合、ジスルフィド結合、又はペプチド結合であってよい。

【0029】

本発明の１つ又は複数の実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片の前記小分子薬に対するモル比が、１：（２～４）、例えば、１：２、１：３、又は１：４である、前記抗体薬物複合体が提供される。

【0030】

本発明のさらなる他の一態様は、第１タンパク質機能領域及び第２タンパク質機能領域を含む、二重特異性抗体であって、
前記第１タンパク質機能領域がＬＡＧ３を標的とし、
前記第２タンパク質機能領域がＬＡＧ３以外の標的（例えば、ＰＤ－１）を標的とし、
前記第１タンパク質機能領域が本発明のいずれかの実施形態の抗体又はその抗原結合性断片であり；
好ましくは、前記二重特異性抗体がＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態であり；
好ましくは、前記第１タンパク質機能領域が本発明のいずれかの実施形態の抗体であり、前記第２タンパク質機能領域が単鎖可変領域断片である；又は
好ましくは、前記第１タンパク質機能領域が単鎖可変領域断片であり、前記第２タンパク質機能領域が本発明のいずれかの実施形態の抗体である、二重特異性抗体に関する。

【0031】

本発明の二重特異性抗体は、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体である。

【0032】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記第１タンパク質機能領域及び前記第２タンパク質機能領域が直接、又はリンカー断片によって連結しており；
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである；又は
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである；
前記二重特異性抗体が提供される。

【0033】

本発明のいくつかの実施形態では、前記第１タンパク質機能領域及び前記第２タンパク質機能領域の数が、それぞれ独立に１個、２個、又はそれ以上の個数である、前記二重特異性抗体が提供される。

【0034】

本発明のいくつかの実施形態では、前記単鎖可変領域断片が、前記抗体の重鎖のＣ末端に連結している、前記二重特異性抗体が提供される。

【0035】

本発明のいくつかの実施形態では、
ＬＡＧ３を標的とする第１タンパク質機能領域；及び
ＰＤ－１を標的とする第２タンパク質機能領域、
を含み、
前記第１タンパク質機能領域が本発明のいずれかの実施形態の抗ＬＡＧ３抗体であり、前記抗ＬＡＧ３抗体が免疫グロブリン形態であり；
前記第２タンパク質機能領域が抗ＰＤ－１単鎖可変領域断片である、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0036】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＰＤ－１単鎖可変領域断片が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が、配列番号２６～２８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み；及び
前記軽鎖可変領域が、配列番号２９～３１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0037】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＰＤ－１単鎖可変領域断片において、
前記重鎖可変領域が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する；又は
前記重鎖可変領域が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号２１もしくは配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0038】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＰＤ－１単鎖可変領域断片における前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が直接、又はリンカー断片によって連結しており；
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである；又は
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0039】

本発明のいくつかの実施形態では、
ＬＡＧ３を標的とする第１タンパク質機能領域、及び
ＰＤ－１を標的とする第２タンパク質機能領域、
を含み；
前記第１タンパク質機能領域の数が１個であり、前記第２タンパク質機能領域の数が２個であり；
前記第１タンパク質機能領域が免疫グロブリンであり、前記第２タンパク質機能領域が単鎖可変領域断片であり；
前記免疫グロブリンが、配列番号１１又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み；
前記単鎖可変領域断片が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２１又は配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み；
前記単鎖可変領域断片が、前記免疫グロブリンの２個の重鎖のＣ末端に連結しており；
前記第１タンパク質機能領域が、第１リンカー断片を介して前記第２タンパク質機能領域に連結しており；前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域が、第２リンカー断片を介して前記単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域に連結しており；前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片が同一であるか、あるいは異なっており；
好ましくは、前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片が、配列番号３５～３７からそれぞれ独立に選択されるアミノ酸配列を有しており；
好ましくは、前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片のアミノ酸配列が、配列番号３６に記載されている、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0040】

本発明のいくつかの実施形態では、
ＬＡＧ３を標的とする第１タンパク質機能領域、及び
ＰＤ－１を標的とする第２タンパク質機能領域、
を含み、
前記第１タンパク質機能領域が抗ＬＡＧ３単鎖可変領域断片であり、前記第２タンパク質機能領域が抗ＰＤ－１抗体であり、前記抗ＰＤ－１抗体が免疫グロブリン形態であり；
前記抗ＬＡＧ３単鎖可変領域断片が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み；
前記重鎖可変領域が、配列番号５～７に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み；
前記軽鎖可変領域が、配列番号８～１０に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0041】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＬＡＧ３単鎖可変領域断片において、
前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する；
前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する；又は
前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号４に記載４のアミノ酸配列を有する、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0042】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＬＡＧ３単鎖可変領域断片における重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が直接、又はリンカー断片によって連結しており；
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである；又は
好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｎＧであり、ｎが正の整数、例えば、１、２、３、４、５、もしくは６などである、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0043】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＰＤ－１抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が、配列番号２６～２８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み；
前記軽鎖可変領域が、配列番号２９～３１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0044】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＰＤ－１抗体において、
前記重鎖可変領域が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する；又は
前記重鎖可変領域が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号２１もしくは配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0045】

本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体の重鎖定常領域が、Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（例えば、配列番号３９に記載されている）又はＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域（例えば、配列番号４５に記載されている）であり、前記抗ＰＤ－１抗体の軽鎖定常領域が、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（例えば、配列番号４０に記載されている）である、前記二重特異性抗体が提供される。

【0046】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＰＤ－１抗体がヒトＩｇＧ１サブタイプであり、
ここで、ＥＵ番号付けシステムによれば、前記抗ＰＤ－１抗体は下記の変異：
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｌ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、
を有し；
好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体が、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0047】

本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗ＰＤ－１抗体がヒトＩｇＧ４サブタイプであり、
ここで、ＥＵ番号付けシステムによれば、前記抗ＰＤ－１抗体は下記の変異：
Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｆ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は
Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、
を有し；
好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体が、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0048】

本発明のいくつかの実施形態では、
ＬＡＧ３を標的とする第１タンパク質機能領域、及び
ＰＤ－１を標的とする第２タンパク質機能領域、
を含み；
前記第１タンパク質機能領域の数が１個であり、前記第２タンパク質機能領域の数が２個であり；
前記第１タンパク質機能領域が単鎖可変領域断片であり、前記第２タンパク質機能領域が免疫グロブリンであり；
前記単鎖可変領域断片が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含み；
前記免疫グロブリンが、配列番号３４又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み；
前記単鎖可変領域断片が、前記免疫グロブリンの２個の重鎖のＣ末端に連結しており；
前記第１タンパク質機能領域が、第１リンカー断片を介して前記第２タンパク質機能領域に連結しており；前記単鎖可変領域断片の重鎖可変領域が、第２リンカー断片を介して前記単鎖可変領域断片の軽鎖可変領域に連結しており；前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片が同一であるか、又は異なっており；
好ましくは、前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片が、配列番号３５～３７からそれぞれ独立に選択されるアミノ酸配列を有しており；
好ましくは、前記第１リンカー断片及び前記第２リンカー断片のアミノ酸配列が、配列番号３６に記載されている、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0049】

本発明のいくつかの実施形態では、
１個の免疫グロブリン分子が２個の単鎖可変領域断片分子に連結しており；
好ましくは、前記２個の単鎖可変領域断片分子が同一である、
前記二重特異性抗体が提供される。

【0050】

本発明のさらなる他の一態様は、本発明のいずれかの実施形態の抗ＬＡＧ３抗体、又は本発明のいずれかの実施形態の二重特異性抗体をコードする単離核酸分子に関する。

【0051】

本発明のさらなる他の一態様は、本発明の単離核酸分子を含む組換えベクターに関する。

【0052】

本発明のさらなる他の一態様は、本発明の単離核酸分子又は本発明の組換えベクターを含む、宿主細胞に関する。

【0053】

本発明のさらなる他の一態様は、本発明のいずれかの実施形態の抗体もしくはその抗原結合性断片、又は本発明のいずれかの実施形態の二重特異性抗体を調製する方法であって、本発明の宿主細胞を適した条件下で培養すること、及び細胞培養物から前記抗体もしくはその抗原結合性断片又は二重特異性抗体を単離することを含む、方法に関する。

【0054】

本発明のさらなる他の一態様は、本発明のいずれかの実施形態の抗体もしくはその抗原結合性断片、本発明のいずれかの実施形態の抗体薬物複合体、又は本発明のいずれかの実施形態の二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物が任意に、薬理学的に許容される副原料をさらに含む、医薬組成物に関する。

【0055】

本発明のさらなる他の一態様は、腫瘍又は貧血を治療及び／又は予防するための薬剤の調製における、本発明のいずれかの実施形態の抗体もしくはその抗原結合性断片、本発明のいずれかの実施形態の抗体薬物複合体、又は本発明のいずれかの実施形態の二重特異性抗体の使用であって、
好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである；
抗体もしくはその抗原結合性断片、抗体薬物複合体、又は二重特異性抗体の使用に関する。

【0056】

前記の本発明のいずれかの実施形態の抗体もしくはその抗原結合性断片、本発明のいずれかの実施形態の抗体薬物複合体、又は本発明のいずれかの実施形態の二重特異性抗体は、腫瘍又は貧血の治療及び／又は予防において使用するためのものであって、
好ましくは、前記腫瘍は卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんは非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍は白血病であり；
好ましくは、前記食道がんは食道扁平上皮がんである。

【0057】

本発明のさらなる他の一態様は、腫瘍又は貧血を治療及び／又は予防する方法であって、本発明のいずれかの実施形態の抗体もしくはその抗原結合性断片、本発明のいずれかの実施形態の抗体薬物複合体、又は本発明のいずれかの実施形態の二重特異性抗体の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含み、
好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである、方法に関する。

【0058】

本発明において、他に定義されない限り、本明細書内で使用される科学及び技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有する。また、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験室操作は、対応する分野で広く使用されるルーチン手順である。一方、本発明の理解を促すために、関連のある語の定義及び説明を以下に提供する。

【0059】

本明細書で使用されるＥＣ_５０という語は、最大効果の５０％に対する濃度、すなわち、最大効果の５０％を引き起こしうる濃度のことを指す。

【0060】

本明細書で使用される「抗体」という語は、一般に２対のポリペプチド鎖からなる（それぞれの対が１本の「軽」（Ｌ）鎖と１本の「重」（Ｈ）鎖を有する）免疫グロブリン分子のことを指す。抗体軽鎖はκ及びλ軽鎖へと分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、又はεへと分類される。抗体のアイソタイプはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義される。軽鎖及び重鎖において、可変領域と定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結しており、重鎖はさらに、約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫系の各種細胞（例えば、エフェクター細胞）の、古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への結合を含む、免疫グロブリンの宿主組織又は因子への結合を媒介することができる。ＶＨ及びＶＬ領域は、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）にさらに細かく分けることができ、超可変領域間にはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存的な領域が分布している。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端に向けて次の順番で並んだ、３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。各重鎖／軽鎖ペアの可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、抗原結合部位を形成する。領域又はドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍ．ｄ．， Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， （１９８７及び１９９１））もしくはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８７； １９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８９； ３４２：８７８－８８３、又はＩＭＧＴ番号付けシステムの定義、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ Ｆ， Ｋａａｓ Ｑ， Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐ．， ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ： ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ＭＨＣ， ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ［Ｊ］．， Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００９； ３８（ｓｕｐｐｌ＿１）：Ｄ３０１－Ｄ３０７における定義を参照、に基づいて行われる。

【0061】

特に、重鎖はさらに、３個を超える、例えば、６個、９個、又は１２個などのＣＤＲを有していてもよい。例えば、本発明の二重特異性抗体では、重鎖は１個のＳｃＦｖに連結したＣ末端を有するＩｇＧ抗体の重鎖であってよく、この場合、重鎖は９個のＣＤＲを含む。

【0062】

「抗体」という語は、抗体を製造するためのいかなる特定の方法によっても限定されない。例えば、抗体には、組換え抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体が含まれる。抗体は、ＩｇＧ（例えば、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭなどの、各種アイソタイプの抗体であってよい。

【0063】

本明細書で使用される「ｍＡｂ」及び「モノクローナル抗体」という語は、高度に相同な抗体のグループに由来する、すなわち、自然に生じうる天然の変異を例外として同一の抗体分子のグループに由来する、抗体又は抗体の断片のことを指す。モノクローナル抗体は、ある抗原上の単一のエピトープに対して高度に特異的である。モノクローナル抗体と異なり、ポリクローナル抗体は、通常、ある抗原上の異なるエピトープを一般に認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は一般に、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ， Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ． Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ， １９７５； ２５６（５５１７）： ４９５）によって最初に報告されたハイブリドーマ技術を用いて取得することができるが、組換えＤＮＡ技術を用いても取得することができる（例えば、米国特許第４８１６５６７号明細書を参照）。

【0064】

本明細書で使用される「ヒト化抗体」という語は、ヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）のＣＤＲの全体又は部分を非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲで置き換えた場合に得られる抗体又は抗体断片のことを指し、ドナー抗体は、期待される特異性、親和性、又は反応性を有する非ヒト（例えば、マウス、ラット、もしくはウサギ）抗体であってよい。さらに、レセプター抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）におけるいくつかのアミノ酸残基も、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基又は他の抗体のアミノ酸残基に置換し、抗体の性能をさらに改善又は最適化することができる。ヒト化抗体のさらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８６； ３２１：５２２－５２５、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８８； ３３２：３２３－３２９、Ｐｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， １９９２； ２：５９３－５９６；及びＣｌａｒｋ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， ２０００； ２１：３９７－４０２を参照のこと。いくつかのケースでは、抗体の抗原結合性断片はダイアボディであり、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現する。しかし、使用されるリンカーは短いため、同一鎖上の２つのドメインのペアリングは起こりえない。そのため、ドメインは他の鎖上の相補ドメインとペアリングすることとなり、２個の抗原結合部位が生成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９３； ９０：６４４４－６４４８及びＰｏｌｊａｋ Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， １９９４； ２：１１２１－１１２３を参照）。

【0065】

本明細書で使用される「単鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）」という語は、抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）がリンカーによって連結した分子のことを指す。Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインはペアを成し、それらドメインが単一ポリペプチド鎖を生成することを可能にするリンカーによって一価の分子が形成される（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８８； ２４２：４２３－４２６及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８８； ８５：５８７９－５８８３を参照）。このようなｓｃＦｖ分子は次の一般構造を有していてよい：ＮＨ２－Ｖ_Ｌ－リンカー断片－Ｖ_Ｈ－ＣＯＯＨ、又はＮＨ２－Ｖ_Ｈ－リンカー断片－Ｖ_Ｌ－ＣＯＯＨ。従来技術の適切なリンカーは、ＧＧＧＧＳアミノ酸配列の反復、又はそのバリアントからなる。例えば、（ＧＧＧＧＳ）４のアミノ酸配列を有するリンカーを用いてもよく、そのバリアントを用いてもよい（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９３； ９０：６４４４－６４４８）。本発明において使用できる他のリンカーが、Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．， １９９５； ８：７２５－７３１、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２００１； ３１：９４－１０６、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９９６； ５６：３０５５－３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９９； ２９３：４１－５６、及びＲｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ， ２００１， ５０（１）：５１－５９．に記載されている。

【0066】

本明細書で使用される「単離される」という語は、天然状態から人為手段によって取得されることを指す。特定の「単離される」物質又は成分が天然に存在する場合に、その天然環境において変化が生ずることであってもよく、天然環境から単離されることであってもよく、その両者であってもよい。例えば、単離されていない特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドが特定の動物生体中に天然に存在し、このような天然状態から高純度の同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドが単離された場合、それを単離ポリヌクレオチド又はポリペプチドと呼ぶ。「単離される」という語は、前記物質の活性に影響を及ぼさない、人工もしくは合成物質、又は他の不純物の存在を除外するものではない。

【0067】

本明細書で使用される「ベクター」という語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸ビヒクルのことを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、ベクターによって運ばれる遺伝物質エレメントが宿主細胞で発現できるように、形質転換、形質導入、又はトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができる。ベクターは当業者に周知であり、例として、プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）など；ファージ、例えば、ラムダファージ又はＭ１３ファージなど；及び動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用しうる動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０など）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、発現を調節するための各種エレメントを含んでいてよく、それらの例として、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、及びレポーター遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ベクターは、複製開始部位を含んでいてもよい。

【0068】

本明細書で使用される「宿主細胞」という語は、そこにベクターを導入できる細胞のことを指し、例として、原核細胞、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなど；真菌細胞、例えば、酵母細胞もしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなど；昆虫細胞、例えば、Ｓ２ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞もしくはＳｆ９など；又は動物細胞、例えば、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＳ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、もしくはヒト細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0069】

本明細書で使用される「特異的結合」という語は、２つの分子間の非無作為的な結合反応、例えば、抗体とその標的となる抗原との間の反応などのことを指す。いくつかの実施形態において、ある抗原に特異的に結合する抗体（又はある抗原に対して特異的な抗体）とは、抗体が約１０^－５Ｍ未満、例えば、約１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、もしくは１０^－１０Ｍ未満、又はそれ以下の親和性（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合することを意味する。

【0070】

本明細書で使用される「Ｋ_Ｄ」という語は、特異的抗体－抗原相互作用の解離平衡定数のことを指し、抗体と抗原との間の結合親和性を説明するために使用される。解離平衡定数が小さいことは、抗体－抗原結合が強く、抗体と抗原との間の親和性が高いことを表す。一般に、抗体は、約１０^－５Ｍ未満、例えば、約１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、もしくは１０^－１０Ｍ未満、又はそれ以下の解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）で抗原（例えば、ＰＤ－１タンパク質）に結合する。Ｋ_Ｄは、当業者に公知の方法、例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子相互作用機器の使用、を用いて決定することができる。

【0071】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という語と「ｍＡｂ」という語は同一の意味を有し、互換的に用いることができる。「ポリクローナル抗体」という語と「ｐＡｂ」という語は同一の意味を有し、互換的に用いることができる。また、本明細書において、アミノ酸は通常、当該分野で公知の１文字及び３文字略号を使用して表される。例えば、アラニンはＡ又はＡｌａで表すことができる。

【0072】

本明細書で使用される「薬理学的に許容される担体及び／又は賦形剤」という語は、対象及び活性成分に薬理学的及び／又は生理学的に適合した担体及び／又は賦形剤のことを指す。このような担体及び／又は賦形剤は当該分野で周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ， １９ｔｈ Ｅｄ．， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９５を参照）、例として、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、及びイオン強度増強剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤の限定されない例として、リン酸緩衝液が挙げられ；界面活性剤の限定されない例として、陽イオン、陰イオン、又は非イオン界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０などが挙げられ；イオン強度増強剤の限定されない例として、塩化ナトリウムが挙げられる。

【0073】

本明細書で使用される「有効量」という語は、所望の効果を得るのに、又は少なくとも部分的に得るのに充分な量のことを指す。例えば、疾患（例えば、腫瘍）に対する予防的有効量とは、その疾患（例えば、腫瘍）の発症を予防、抑止、又は遅延するのに充分な量のことを指し、治療有効量とは、その疾患に罹患している患者において、疾患又はその合併症を治癒又は少なくとも部分的に抑止するのに充分な量のことを指す。そのような有効量を決定することは、疑いもなく当業者の能力の範囲内である。例えば、治療目的における有効量は、治療しようとする疾患の重症度；患者自身の免疫系の全体的な状態；年齢、体重、及び性別などの患者の一般的な条件；投与経路；並びに同時に行われる他の治療、などによって決まる。

【0074】

本明細書において、ＰＤ－１タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００５０１８）といった場合、それは全長ＰＤ－１タンパク質、又はＰＤ－１の細胞外断片であるＰＤ－１ ＥＣＤ、又はＰＤ－１ ＥＣＤを含む断片のことも含んでおり、また、全長ＰＤ－１タンパク質の融合タンパク質又はＰＤ－１ ＥＣＤの融合タンパク質、例えば、マウス又はヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃもしくはｈＦｃ）と融合した断片のことも包含する。しかし、ＰＤ－１タンパク質のアミノ酸配列において、（置換、欠失、及び／又は付加を含むがそれらに限定されない）突然変異又は変異が、その生物学的機能に影響を与えることなく天然に生じうること、又は人工的に導入されうることを当業者は理解するであろう。したがって、本発明において、「ＰＤ－１タンパク質」という語は、それらの天然又は人工的なバリアントを含む、すべてのこのような配列を包含するものとする。また、ＰＤ－１タンパク質の配列断片について記述する際、それらの天然又は人工的なバリアント内の対応する配列断片のことも含んでいる。

【0075】

本明細書において、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）のアミノ酸配列といった場合、それは全長ＬＡＧ３タンパク質、又はＬＡＧ３の細胞外断片であるＬＡＧ３ ＥＣＤ、又はＬＡＧ３ ＥＣＤを含む断片のことも含んでおり、また、全長ＬＡＧ３タンパク質の融合タンパク質又はＬＡＧ３ ＥＣＤの融合タンパク質、例えば、マウス又はヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃもしくはｈＦｃ）と融合した断片のことも包含する。しかし、ＬＡＧ３タンパク質のアミノ酸配列において、（置換、欠失、及び／又は付加を含むがそれらに限定されない）突然変異又は変異が、その生物学的機能に影響を与えることなく天然に生じうること、又は人工的に導入されうることを当業者は理解するであろう。したがって、本発明において、「ＬＡＧ３タンパク質」という語は、それらの天然又は人工的なバリアントを含む、すべてのこのような配列を包含するものとする。また、ＬＡＧ３タンパク質の配列断片について記述する際、それらの天然又は人工的なバリアント内の対応する配列断片のことも含んでいる。

【0076】

本発明において、「第１」（例えば、第１タンパク質機能領域）及び「第２」（例えば、第２タンパク質機能領域）という語は、特に断りのない限り、表現上の区別又は明瞭性のために用いられ、典型的な順序の意味は有しない。

【発明の効果】

【0077】

本発明の有益な効果
本発明は、以下の効果のいずれか１つ以上を達成する：
（１）本発明の抗ＬＡＧ３抗体が、優れた親和性と特異性を有すること；
（２）本発明の二重特異性抗体（例えば、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、又はＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ）が、ＬＡＧ３に特異的に結合することができ、ＬＡＧ３のＭＨＣ ＩＩへの結合を効果的にブロックすることができ、生物におけるＬＡＧ３の免疫抑制を特異的に緩和できること；
（３）本発明の二重特異性抗体（例えば、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、又はＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ）が、ＰＤ－１に特異的に結合することができ、ＰＤ－１のＰＤＬ１への結合を効果的にブロックすることができ、生物におけるＰＤ－１の免疫抑制を特異的に緩和し、免疫応答を活性化できること；
（４）本発明の二重特異性抗体における第１タンパク質機能領域及び第２タンパク質機能領域が、相乗効果を有すること；
（５）本発明の二重特異性抗体、特にＢＳ－ＰＬ０２２Ｂが、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８、及び／又はＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するその結合活性を完全に取り除いたものであり、且つそのＡＤＣＣ活性又はＡＤＣＰ活性をさらに完全に取り除いたものであること；並びに
（６）本発明の二重特異性抗体、特にＢＳ－ＰＬ０２２Ｂが、補体Ｃ１ｑに対するその結合活性を完全に取り除いたものであり、且つそのＣＤＣ活性をさらに取り除いたものであること。

【図面の簡単な説明】

【0078】

【図1】図１は、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の、抗原ＰＤ－１－ｍＦｃに対する結合活性を、間接ＥＬＩＳＡによって分析した結果である。

【0079】

【図2】図２は、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、ＢＳ－ＰＬＶ０２、レラトリマブ、及びＨ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の、抗原ＬＡＧ３－ｍＦｃに対する結合活性を、間接ＥＬＩＳＡによって分析した結果である。

【0080】

【図3】図３は、ヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンへの結合に関してヒトＰＤＬ１－ｍＦｃと競合する、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の活性を、競合ＥＬＩＳＡによって分析した結果である。

【0081】

【図4】図４は、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の、２９３Ｔ－ＰＤ１膜表面上のＰＤ－１に対する結合活性を、ＦＡＣＳによって分析した結果である。

【0082】

【図5】図５は、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の、２９３Ｔ－ＬＡＧ３膜表面上のＬＡＧ３に対する結合活性を、ＦＡＣＳによって分析した結果である。

【0083】

【図6】図６は、細胞膜表面上の抗原ＰＤ－１への結合に関してＰＤＬ１と競合する、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の活性を、競合フローサイトメトリーによって分析した結果である。

【0084】

【図7】図７は、細胞膜表面上の抗原ＭＨＣ ＩＩへの結合に関してＬＡＧ３と競合する、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の活性を、競合フローサイトメトリーによって分析した結果である。

【0085】

【図8A】図８Ａは、ＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ３の結合をブロックする抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の分析の結果である。

【0086】

【図8B】図８Ｂは、ＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ３の結合をブロックする抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の分析の結果である。

【0087】

【図9A】図９Ａは、ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合をブロックする抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の分析の結果である。

【0088】

【図9B】図９Ｂは、ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合をブロックする抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の分析の結果である。

【0089】

【図10A】図１０Ａは、ＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ３の結合とＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合を同時にブロックする抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の分析の結果である。

【0090】

【図10B】図１０Ｂは、ＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ３の結合とＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合を同時にブロックする抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の分析の結果である。

【0091】

【図11】図１１は、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体のブリッジングアッセイ（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ａｓｓａｙ）の結果である。

【0092】

【図12A】図１２Ａは、ＩＦＮ－γ分泌の促進における抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の生物学的活性を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって分析した結果を示す。

【0093】

【図12B】図１２Ｂは、ＩＬ－２分泌の促進における抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の生物学的活性を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって分析した結果を示す。

【0094】

【図13】図１３は、ＦｃγＲＩに対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析の結果である。

【0095】

【図14】図１４は、ＦｃγＲＩに対する、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数の分析の結果である。

【0096】

【図15】図１５は、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析の結果である。

【0097】

【図16】図１６は、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数の分析の結果である。

【0098】

【図17】図１７は、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析の結果である。

【0099】

【図18】図１８は、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数の分析の結果である。

【0100】

【図19】図１９は、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析の結果である。

【0101】

【図20】図２０は、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数の分析の結果である。

【0102】

【図21】図２１は、ＦｃγＲＩＩｂに対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析の結果である。

【0103】

【図22】図２２は、ＦｃγＲＩＩｂに対する、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数の分析の結果である。

【0104】

【図23】図２３は、Ｃ１ｑに対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析の結果である。

【0105】

【図24】図２４は、Ｃ１ｑに対する、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数の分析の結果である。

【0106】

【図25】図２５は、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂに対するＡＤＣＰ効果分析の結果である。

【0107】

【図26】図２６は、ＣＴ２６腫瘍を移植したＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ１／ｈＬＡＧ３マウスモデルにおける、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の有効性である。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１；アイソタイプ対照群との比較（二元配置分散分析）。

【0108】

【図27】図２７は、ＣＴ２６腫瘍を移植したＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ１／ｈＬＡＧ３マウスモデルの体重に対する、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の効果である。

【発明を実施するための形態】

【0109】

詳細な説明
本発明の実施形態を、実施例を参照しながら以下に詳細に説明する。当業者は、以下の実施例が本発明の単なる例証のためのものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではないと理解するであろう。具体的な技術又は条件が記載されていない実施例は、当該分野の文献に記載された技術又は条件（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ａｕｔｈｏｒｅｄ ｂｙ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｂｙ Ｈｕａｎｇ Ｐｅｉｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓを参照）に従い、又は添付の使用説明書に従い、行われる。使用する試薬又は機器の製造者が記載されていない場合、それらは市販の従来の製品である。例えば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ８７－ＭＧ細胞はＡＴＣＣより購入可能であった。

【0110】

ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒより購入した。

【0111】

ニボルマブは、ＢＭＳより、ロット番号ＡＢＡ０３３０にて購入した。ニボルマブは抗ＰＤ－１抗体である。

【0112】

ペムブロリズマブは、ＭＳＤ Ｉｒｅｌａｎｄ（カーロー）より、ロット番号Ｓ０２３９４２にて購入した。ペムブロリズマブは抗ＰＤ－１抗体である。

【0113】

陽性対照抗体であるレラトリマブは、米国特許出願公開第２０１６０３２６２４８（Ａ１）号明細書に示される配列を有し、そのうち重鎖アミノ酸配列はこの特許文献の配列番号１に示されており、軽鎖アミノ酸配列はこの特許文献の配列番号２に示されている。レラトリマブは抗ＬＡＧ－３抗体である。

【0114】

細胞株２９３Ｔ－ＰＤ１は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株２９３Ｔ－ＰＤ１は、第３世代レンチウイルス系（例えば、Ａ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｕｌｌ Ｔ， Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｋｅｌｌｙ Ｍ， Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， １９９８． ７２（１１）： ８４６３－８４７１を参照）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウイルス感染によって製造された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＰＤ１ＦＬ－ＢＳＤ（ＰＤ１、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００５０１８；ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＢＳＤ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入、カタログ番号Ｋ５３１５－２０）であった。

【0115】

細胞株２９３Ｔ－ＬＡＧ３は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株２９３Ｔ－ＬＡＧ３は、第３世代レンチウイルス系（例えば、Ａ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｕｌｌ Ｔ， Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｋｅｌｌｙ Ｍ， Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， １９９８． ７２（１１）： ８４６３－８４７１を参照）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウイルス感染によって製造された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ｈｕＬＡＧ３ＦＬ－ＢＳＤ（ＬＡＧ３、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００２２７７．４；ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＢＳＤ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入、カタログ番号Ｋ５３１５－２０）であった。

【0116】

細胞株Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１は、第３世代レンチウイルス系（例えば、Ａ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｕｌｌ Ｔ， Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｋｅｌｌｙ Ｍ， Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， １９９８． ７２（１１）： ８４６３－８４７１を参照）を用いて、Ｒａｊｉ細胞のウイルス感染によって製造された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＰＤＬ１（ＰＤＬ１、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿０５４８６２．１；ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入、カタログ番号Ｋ５３１５－２０）であった。

【0117】

細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３は、第３世代レンチウイルス系（例えば、Ａ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｕｌｌ Ｔ， Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｋｅｌｌｙ Ｍ， Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， １９９８． ７２（１１）： ８４６３－８４７１を参照）を用いて、ＰＤ－１エフェクター細胞（ＣＰＭ、製造者：Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｊ１１２Ａ）のウイルス感染によって調製された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐＣＤＨ－ｈｕＬＡＧ３ＦＬ－ＲＦＰ－ＮＥＯ（ＬＡＧ３、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００２２７７．４；ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ＲＦＰ＋Ｎｅｏ、Ｙｏｕｂｉｏ社より購入、カタログ番号ＶＴ９００５）であった。

【0118】

細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１は、第３世代レンチウイルス系（例えば、Ａ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｕｌｌ Ｔ， Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｋｅｌｌｙ Ｍ， Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， １９９８． ７２（１１）： ８４６３－８４７１を参照）を用いて、ＣＨＯ－Ｋ１細胞のウイルス感染によって調製された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＰＤ－１ＦＬ－Ｐｕｒｏ（ＰＤ１、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００５０１８；ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－Ｐｕｒｏ、Ｙｏｕｂｉｏ社より購入、カタログ番号ＶＴ１４８０）であった。

【0119】

細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ＬＡＧ３は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ＬＡＧ３は、第３世代レンチウイルス系（例えば、Ａ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｕｌｌ Ｔ， Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｋｅｌｌｙ Ｍ， Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， １９９８． ７２（１１）： ８４６３－８４７１を参照）を用いて、ＣＨＯ－Ｋ１細胞のウイルス感染によって製造された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ｈｕＬＡＧ３ＦＬ－ＢＳＤ（ＬＡＧ３、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００２２７７．４；ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＢＳＤ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入、カタログ番号Ｋ５３１５－２０）であった。

【0120】

細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ６４－ＣＤ３２Ｒは、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ６４－ＣＤ３２Ｒは、第３世代レンチウイルス系（例えば、Ａ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｕｌｌ Ｔ， Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｋｅｌｌｙ Ｍ， Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， １９９８． ７２（１１）： ８４６３－８４７１を参照）を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞のウイルス感染によって調製された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐＣＤＨ－ＮＦＡＴ－Ｈｙｇｒｏ（ベクターｐＣＤＨ－Ｈｙｇｒｏ、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏ（Ｙｏｕｂｉｏ社より購入、カタログ番号ＶＴ１４８０）をもとに本願発明者らの研究室において改変により取得）、ｐｃＤＨ－ｈＦＣＧＲ１ＡＦＬ－Ｎｅｏ（ベクターｐＣＤＨ－Ｎｅｏ、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏ（Ｙｏｕｂｉｏ社より購入、カタログ番号ＶＴ１４８０）をもとに本願発明者らの研究室において改変により取得）、及びｐＣＤＨ－ｈＦＣＧＲ２Ａ（Ｈ１６７）－ｐｕｒｏ（ｈＦＣＧＲ２Ａ（Ｈ１６７）、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：Ｐ１２３１８；ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏ、Ｙｏｕｂｉｏ社より購入、カタログ番号ＶＴ１４８０）であった。

【0121】

細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１－ＬＡＧ３は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１－ＬＡＧ３は、第３世代レンチウイルス系（例えば、Ａ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｕｌｌ Ｔ， Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｋｅｌｌｙ Ｍ， Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， １９９８． ７２（１１）： ８４６３－８４７１を参照）を用いて、ＣＨＯ－Ｋ１細胞のウイルス感染によって調製された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐＣＤＨ－ｈＰＤ１－ＦＬ－ｐｕｒｏ（ＰＤ－１、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００５０１８；ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏ、Ｙｏｕｂｉｏ社より購入、カタログ番号ＶＴ１４８０）及びｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ｈｕＬＡＧ３ＦＬ－ＢＳＤ（ＬＡＧ３、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００２２７７．４；ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＢＳＤ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入、カタログ番号Ｋ５３１５－２０）であった。

【実施例】

【0122】

調製例１：抗ＬＡＧ３抗体の設計及び調製
１．抗体の設計
本願発明者らは、創意により、公知のＬＡＧ３タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２２７７．４）及びその三次元結晶構造などに基づき、一連の抗体配列を設計した。広範なスクリーニングと試験により、ＬＡＧ３に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体を最終的に取得し、それぞれＨ７Ｌ８、Ｈ７Ｌ９、及びＨ７Ｌ１０と命名した。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列、及びそれらのコード配列は、次の通りである。

【0123】

Ｈ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのヌクレオチド配列（３６０ｂｐ）：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＡＡＡＣＣＴＡＧＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＡＧＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＣＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＡＣＧＡＴＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号１）

【0124】

Ｈ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのアミノ酸配列（１２０ａａ）：
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＩＳＤＹＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＲＧＴＴＮＳＮＰＳＬＫＳＲＶＴＬＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）

【0125】

Ｈ７Ｌ８の軽鎖可変領域Ｌ８ｖのヌクレオチド配列（３２１ｂｐ）：
ＧＡＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号３）

【0126】

Ｈ７Ｌ８の軽鎖可変領域Ｌ８ｖのアミノ酸配列（１０７ａａ）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＴＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＩＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫ（配列番号４）

【0127】

Ｈ７Ｌ９の重鎖可変領域Ｈ７ｖのヌクレオチド配列は、配列番号１のＨ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのヌクレオチド配列と同一である。

【0128】

Ｈ７Ｌ９の重鎖可変領域Ｈ７ｖのアミノ酸配列は、配列番号２のＨ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのアミノ酸配列と同一である。

【0129】

Ｈ７Ｌ９の軽鎖可変領域Ｌ９ｖのヌクレオチド配列（３２１ｂｐ）：
ＧＡＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号４１）

【0130】

Ｈ７Ｌ９の軽鎖可変領域Ｌ９ｖのアミノ酸配列（１０７ｂｐ）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＴＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＧＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫ（配列番号４２）

【0131】

Ｈ７Ｌ１０の重鎖可変領域Ｈ７ｖのヌクレオチド配列は、配列番号１のＨ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのヌクレオチド配列と同一である。

【0132】

Ｈ７Ｌ１０の重鎖可変領域Ｈ７ｖのアミノ酸配列は、配列番号２のＨ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのアミノ酸配列と同一である。

【0133】

Ｈ７Ｌ１０の軽鎖可変領域Ｌ１０ｖのヌクレオチド配列（３２１ｂｐ）：
ＧＡＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号４３）

【0134】

Ｈ７Ｌ１０の軽鎖可変領域Ｌ１０ｖのアミノ酸配列（１０７ｂｐ）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＧＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＩＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫ（配列番号４４）

【0135】

抗体Ｈ７Ｌ８のＣＤＲのアミノ酸配列は次の通りである（ＩＭＧＴ番号付けシステムによる）：
ＨＣＤＲ１： ＧＧＳＩＳＤＹＹ（配列番号５）；
ＨＣＤＲ２： ＩＮＨＲＧＴＴ（配列番号６）；
ＨＣＤＲ３： ＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰ（配列番号７）；
ＬＣＤＲ１： ＱＴＩＳＳＹ（配列番号８）；
ＬＣＤＲ２： ＤＡＳ（配列番号９）；及び
ＬＣＤＲ３： ＱＱＲＳＮＷＰＩＴ（配列番号１０）。

【0136】

抗体Ｈ７Ｌ９のＣＤＲのアミノ酸配列は次の通りである（ＩＭＧＴ番号付けシステムによる）：
ＨＣＤＲ１： ＧＧＳＩＳＤＹＹ（配列番号５）；
ＨＣＤＲ２： ＩＮＨＲＧＴＴ（配列番号６）；
ＨＣＤＲ３： ＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰ（配列番号７）；
ＬＣＤＲ１： ＱＴＩＳＳＹ（配列番号８）；
ＬＣＤＲ２： ＤＧＳ（配列番号４６）；及び
ＬＣＤＲ３： ＱＱＲＳＮＷＰＬＴ（配列番号４７）。

【0137】

抗体Ｈ７Ｌ１０のＣＤＲのアミノ酸配列は次の通りである（ＩＭＧＴ番号付けシステムによる）：
ＨＣＤＲ１： ＧＧＳＩＳＤＹＹ（配列番号５）；
ＨＣＤＲ２： ＩＮＨＲＧＴＴ（配列番号６）；
ＨＣＤＲ３： ＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰ（配列番号７）；
ＬＣＤＲ１： ＱＳＩＳＳＹ（配列番号４８）；
ＬＣＤＲ２： ＤＧＳ（配列番号４６）；及び
ＬＣＤＲ３： ＱＱＲＳＮＷＰＩＴ（配列番号１０）。

【0138】

２．ヒト化抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の発現及び精製
Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の重鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号１に示した；定常領域はＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域、配列番号３９であった）及び軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号３に示した；定常領域はＰ０１８３４．１（ヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域、配列番号４０）であった）を別々にｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８をそれぞれ得た。プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８をそれぞれ消化した（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）。重鎖及び軽鎖を電気泳動で単離し、別々にｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。細胞培養７日後に培地を高速遠心分離で分離し、上清を濃縮して、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム上にロードした。タンパク質を、溶出緩衝液を用いてワンステップで溶出した。標的試料を単離し、緩衝液をＰＢＳへと交換した。

【0139】

Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の重鎖定常領域のアミノ酸配列
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３９）

【0140】

Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の軽鎖定常領域のアミノ酸配列
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４０）

【0141】

３．ヒト化抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＴＭ）の設計
本願発明者らは、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）をもとに、重鎖において２３４位（ＥＵ番号付けシステムによる；以下同様）のロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３５Ａ）、及び２３７位のグリシンからアラニンへの点変異（Ｇ２３７Ａ）を導入することにより、定常領域の変異を有するヒト化抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＴＭ）を得た。Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＴＭ）の重鎖Ｈ７（ｈＧ１ＴＭ）のアミノ酸配列を配列番号１１に示し、軽鎖Ｌ８のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。

【0142】

ヒト化抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＴＭ）は、上記工程２に記載の方法によって調製した。

【0143】

Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＴＭ）の重鎖Ｈ７（ｈＧ１ＴＭ）のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＩＳＤＹＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＲＧＴＴＮＳＮＰＳＬＫＳＲＶＴＬＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１１）

【0144】

Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＴＭ）の軽鎖Ｌ８のアミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＴＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＩＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１２）

【0145】

４．ヒト化抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＤＭ）の設計
本願発明者らは、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）をもとに、Ｉｇガンマ－４鎖Ｃ領域を重鎖定常領域として用い、重鎖定常領域において２３４位にフェニルアラニンからアラニンへの点変異（Ｆ２３４Ａ）を、また、２３５位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３５Ａ）を導入し、一方で抗体可変領域を変化させないことにより、定常領域の変異を有するヒト化抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＤＭ）を得た。Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＤＭ）の重鎖のアミノ酸配列を配列番号１３に示し、軽鎖のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。

【0146】

Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＤＭ）の重鎖Ｈ７（ｈＧ４ＤＭ）のアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＩＳＤＹＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＲＧＴＴＮＳＮＰＳＬＫＳＲＶＴＬＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１３）

【0147】

Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＤＭ）の軽鎖Ｌ８のアミノ酸配列は、配列番号１２のＨ７Ｌ８（ｈＧ１ＴＭ）の軽鎖のアミノ酸配列と同一である。

【0148】

５．ヒト化抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の発現及び精製
Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の重鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号１に示した；定常領域は配列番号４５のＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域であった）、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）の軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号３に示した；定常領域は配列番号４０のヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域であった）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）の軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号４２に示した；定常領域は配列番号４０のヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域であった）、並びにＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号４４に示した；定常領域は配列番号４０のヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域であった）を別々にｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ９、及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ１０をそれぞれ得た。プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ９、及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ１０をそれぞれ消化した（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）。重鎖及び軽鎖を電気泳動で単離し、別々にｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。細胞培養７日後に培地を高速遠心分離で分離し、上清を濃縮して、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム上にロードした。タンパク質を、溶出緩衝液を用いてワンステップで溶出した。標的試料を単離し、緩衝液をＰＢＳへと交換した。

【0149】

Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、又はＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の重鎖定常領域のアミノ酸配列
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号４５）

【0150】

Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、又はＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の軽鎖定常領域のアミノ酸配列：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４０）

【0151】

調製例２：抗ＰＤ－１抗体１４Ｃ１２及びそのヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の設計及び調製
抗ＰＤ－１抗体１４Ｃ１２及びそのヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列とコードヌクレオチド配列は、中国特許出願公開第１０６９６７１７２（Ａ）号明細書（又は第１０６９７７６０２（Ａ）号明細書）における１４Ｃ１２及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のそれらと、それぞれ同一である。

【0152】

（１）１４Ｃ１２の重鎖及び軽鎖可変領域配列
１４Ｃ１２の重鎖可変領域のヌクレオチド配列：（３５４ｂｐ）
ＧＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＴＣＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＣ（配列番号１４）

【0153】

１４Ｃ１２の重鎖可変領域のアミノ酸配列：（１１８ａａ）
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１５）

【0154】

１４Ｃ１２の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列：（３２１ｂｐ）
ＧＡＣＡＴＴＡＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＡＣＧＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号１６）

【0155】

１４Ｃ１２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列：（１０７ａａ）
ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＦＴＣＫＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号１７）

【0156】

（２）ヒト化モノクローナル抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の、重鎖及び軽鎖可変領域配列、並びに重鎖及び軽鎖配列
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域１４Ｃ１２Ｈ１ｖのヌクレオチド配列：（３５４ｂｐ）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＣＧＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴ（配列番号１８）

【0157】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域１４Ｃ１２Ｈ１ｖのアミノ酸配列：（１１８ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１９）

【0158】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖可変領域１４Ｃ１２Ｌ１ｖのヌクレオチド配列：（３２１ｂｐ）
ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧ（配列番号２０）

【0159】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖可変領域１４Ｃ１２Ｌ１ｖのアミノ酸配列：（１０７ａａ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＦＴＣＲＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＭＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号２１）

【0160】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖１４Ｃ１２Ｈ１のヌクレオチド配列：（１３４４ｂｐ）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＣＧＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＣＡＴＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＴＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＡＣＴＣＣＴＣＧＧＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号２２）

【0161】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖１４Ｃ１２Ｈ１のアミノ酸配列：（４４８ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２３）

【0162】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖１４Ｃ１２Ｌ１のヌクレオチド配列：（６４２ｂｐ）
ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＴＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＣＴＧＡＣＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＣＣＴＡＧＡＧＡＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＣＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＴＣＴＡＧＴＡＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＡＧＴＧＴＡＴＧＣＡＴＧＣＧＡＡＧＴＧＡＣＡＣＡＴＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＡＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＡＴＧＴ（配列番号２４）

【0163】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖１４Ｃ１２Ｌ１のアミノ酸配列：（２１４ａａ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＦＴＣＲＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＭＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２５）

【0164】

抗体１４Ｃ１２及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＣＤＲは次のものと同一である（ＩＭＧＴ番号付けシステムによる）：
ＨＣＤＲ１： ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号２６）
ＨＣＤＲ２： ＩＳＧＧＧＲＹＴ（配列番号２７）
ＨＣＤＲ３： ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ（配列番号２８）
ＬＣＤＲ１： ＱＤＩＮＴＹ（配列番号２９）
ＬＣＤＲ２： ＲＡＮ（配列番号３０）
ＬＣＤＲ３： ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３１）

【0165】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）の重鎖及び軽鎖可変領域配列
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）は、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１をもとに、フレームワーク領域（軽鎖）の特定のアミノ酸を変異させることによって得られた。

【0166】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）の重鎖可変領域１４Ｃ１２Ｈ１（Ｍ）は、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域１４Ｃ１２Ｈ１と同一である。すなわち、両者は配列番号１９のアミノ酸配列を有する。

【0167】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｍ）の軽鎖可変領域１４Ｃ１２Ｌ１（Ｍ）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＦＴＣＲＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＭＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号３８）

【0168】

調製例３：ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ４ＤＭ）の設計
本願発明者らは、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１をもとに、Ｉｇガンマ－４鎖Ｃ領域を重鎖定常領域として用い、重鎖定常領域において２３４位にフェニルアラニンからアラニンへの点変異（Ｆ２３４Ａ）を、また、２３５位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３５Ａ）を導入し、一方で抗体可変領域を変化させないことにより、定常領域の変異を有するヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ４ＤＭ）を得た。１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ４ＤＭ）の重鎖１４Ｃ１２Ｈ１（ｈＧ４ＤＭ）のアミノ酸配列を配列番号３２に示し、軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２５に示す。

【0169】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ４ＤＭ）の重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号３２）

【0170】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ４ＤＭ）の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２５の１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖１４Ｃ１２Ｌ１のアミノ酸配列と同一である。

【0171】

調製例４：ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の配列設計
本願発明者らは、ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１をもとに、重鎖のヒンジ領域において、ＥＵ番号付けシステムに従い、２３４位のロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３５Ａ）、及び２３７位のグリシンからアラニンへの点変異（Ｇ２３７Ａ）を導入することにより、ヒト化変異体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）を得た。

【0172】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の重鎖１４Ｃ１２Ｈ１（ｈＧ１ＴＭ）のヌクレオチド配列：（１３４４ｂｐ）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＣＧＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＣＡＴＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＴＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号３３）

【0173】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の重鎖１４Ｃ１２Ｈ１（ｈＧ１ＴＭ）のアミノ酸配列：（４４８ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３４）

【0174】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の軽鎖のヌクレオチド配列を、配列番号２４に示す。

【0175】

１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２５の１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖１４Ｃ１２Ｌ１のアミノ酸配列と同一である。

【0176】

調製例５：抗ＬＡＧ３／ＰＤ－１二機能性抗体の設計及び調製
１．配列設計
本発明の二機能性抗体ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、Ｂｓ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、及びＢｓ－ＰＬＶ０２の構造は、モリソン形態（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、すなわち、ＩｇＧ抗体の２個の重鎖のＣ末端がそれぞれ他の抗体のｓｃＦｖ断片に連結したものである。重鎖及び軽鎖の主な組成設計は以下の表１に示す通りである。

【表1】

【0177】

上記表１において：
（１）リンカー断片（ＧＧＧＧＳ）３のアミノ酸配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３５）
リンカー断片（ＧＧＧＧＳ）４のアミノ酸配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３６）
リンカー断片（ＧＧＧＧＳ）４Ｇのアミノ酸配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号３７）
（２）右下隅の「ｖ」という表示のあるものは、対応する重鎖の可変領域、又は対応する軽鎖の可変領域を表す。「ｖ」という表示のないものについては、対応する重鎖又は軽鎖は定常領域を含んだ全長である。上記調製例に記載の対応する配列は、これらの可変領域又は全長のアミノ酸配列、及びそれらをコードするヌクレオチド配列を表す。

【0178】

２．抗体の発現及び精製
Ｂｓ－ＰＬ０２１Ａ、Ｂｓ－ＰＬ０２２Ｂ、Ｂｓ－ＰＬ０２３Ｃ、及びＢｓ－ＰＬＶ０２の重鎖ｃＤＮＡ配列及び軽鎖ｃＤＮＡ配列を、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ製）に別々にクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２１ＡＨ／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２１ＡＬ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２２ＢＨ／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２２ＢＬ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２３ＣＨ／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２３ＣＬ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬＶ０２Ｈ／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬＶ０２Ｌ、及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｉ－ＰＧＶ０２／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｉ－ＰＧＶ０２をそれぞれ得た。

【0179】

前記プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２１ＡＨ／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２１ＡＬ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２２ＢＨ／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２２ＢＬ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２３ＣＨ／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬ０２３ＣＬ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬＶ０２Ｈ／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｓ－ＰＬＶ０２Ｌ、及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｉ－ＰＧＶ０２／ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｂｉ－ＰＧＶ０２を、それぞれ消化した（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）。重鎖及び軽鎖を電気泳動で単離し、別々にｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。細胞培養７日後に培地を高速遠心分離で分離し、上清を濃縮して、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム上にロードした。タンパク質を、溶出緩衝液を用いてワンステップで溶出した。標的試料を単離し、緩衝液をＰＢＳへと交換した。

【0180】

調製例６：融合タンパク質ＰＤ－１－ｍＦｃ、ＰＤ－１－ｈＦｃ、及びＰＤＬ１－ｈＦｃの調製
融合タンパク質ＰＤ－１－ｍＦｃ、ＰＤ－１－ｈＦｃ、及びＰＤＬ１－ｈＦｃの調製、並びにＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動による検出を、中国特許出願公開第１０６６３２６７４（Ａ）号明細書の調製例１の全体を参照することにより行った。

【0181】

この調製例の融合タンパク質ＰＤ－１－ｍＦｃ、ＰＤ－１－ｈＦｃ、及びＰＤＬ１－ｈＦｃのアミノ酸配列及びコードヌクレオチド配列は、中国特許出願公開第１０６６３２６７４（Ａ）号明細書の調製例１におけるＰＤ－１－ｍＦｃ、ＰＤ－１－ｈＦｃ、及びＰＤＬ１－ｈＦｃのものとそれぞれ同一である。

【0182】

融合タンパク質ＰＤ－１－ｍＦｃ、ＰＤ－１－ｈＦｃ、及びＰＤＬ１－ｈＦｃは、このようにして得られた。

【0183】

調製例７：ヒト抗鶏卵リゾチーム抗体の調製
ヒト抗鶏卵リゾチームＩｇＧ（抗ＨＥＬ、又はヒトＩｇＧ；ｈＩｇＧと略記する）抗体の配列を、“Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｖ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”と題したＡｃｉｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．による報告の研究（Ａｃｉｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ２００７； ３７４（１）： １３０－４６）における、Ｆａｂ Ｆ１０．６．６配列の可変領域配列から得た。調製法は次のとおりであった：

【0184】

Ｎａｎｊｉｎｇ Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ社への委託により、ヒトＩｇＧ抗体の重鎖及び軽鎖（完全配列又は可変領域）遺伝子のアミノ酸のコドン最適化及び遺伝子合成を行った。“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ （Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）”に紹介されている標準的な技術を参照することにより、また、標準的な分子クローニング技術、例えば、ＰＣＲ、酵素消化、ＤＮＡゲル抽出、ライゲーション形質転換、コロニーＰＣＲ、又は酵素消化識別などを使用することにより、重鎖及び軽鎖遺伝子を、哺乳類発現系の抗体重鎖発現ベクター及び抗体軽鎖発現ベクターにそれぞれサブクローニングした。組換え発現ベクターの重鎖及び軽鎖遺伝子をさらにシーケンシングして分析を行った。配列が正確であることを確認した後、エンドトキシンフリーの発現プラスミドを大量又は中程度の量を調製した。組換え抗体を発現させるために、重鎖及び軽鎖発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に対して一過性トランスフェクションした。７日間の培養後、細胞培養培地を回収し、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ）を用いて親和性精製行った。得られた抗体試料の品質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣの標準的な分析技術を用いて測定した。

【0185】

実験例１：抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の抗原に対する結合活性のＥＬＩＳＡによる分析
１．ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の抗原ＰＤ－１－ｍＦｃに対する結合活性の間接ＥＬＩＳＡによる分析
手順は以下の通りであった：

【0186】

ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－１－ｍＦｃでコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗原でコートされたＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング溶液として１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて３７℃にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表２に示す）を加えた。試験抗体を含むＥＬＩＳＡプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：５０００の割合で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦＣ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０３５－０９８）二次抗体のワーキング溶液を加え、次いでプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ社、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを直ちにＥＬＩＳＡプレートリーダーに入れ、ＥＬＩＳＡプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。

【0187】

分析結果を表２及び図１に示す。

【表2】

【0188】

図１から明らかなように、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）は、抗原ヒトＰＤ－１－ｍＦｃに対して用量依存的に効果的に結合することができた。結合した抗体の吸光度の定量分析に基づき、カーブフィッティング計算によって得られた抗体ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）（対照）の結合効率ＥＣ_５０値は、それぞれ０．０６６ｎＭ、０．０７４ｎＭ、０．０４６ｎＭ、０．１０３ｎＭ、及び０．０２ｎＭであった。

【0189】

この結果は、同一の実験条件下で、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、及びＢＳ－ＰＬ０２３ＣのＰＤ－１－ｍＦｃに対する結合活性が、陽性対照１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の同じ標的に対する結合活性に実質的に匹敵するものであったことを示しており、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、及びＢｓ－ＰＬＶ０２が、ＰＤ－１－ｍＦｃに対して効果的に結合する活性を有していたことが示唆された。

【0190】

２．ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、レラトリマブ、及びＨ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の抗原ＬＡＧ３－ｍＦｃに対する結合活性の間接ＥＬＩＳＡによる分析
手順は以下の通りであった：

【0191】

ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍＬのヒトＬＡＧ３－ｍＦｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社、ロット番号２０２００４１７）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗原でコートされたＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング溶液として１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて３７℃にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表３に示す）を加えた。試験抗体を含むＥＬＩＳＡプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：５０００の割合で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦＣ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０３５－０９８）二次抗体のワーキング溶液を加え、次いでプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ社、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを直ちにＥＬＩＳＡプレートリーダーに入れ、ＥＬＩＳＡプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。

【0192】

分析結果を表３及び図２に示す。

【表3】

【0193】

図２から明らかなように、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、レラトリマブ、及びＨ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）は、抗原ヒトＬＡＧ３－ｍＦｃに対して用量依存的に効果的に結合することができた。各用量に対する吸光度を表３に示す。結合した抗体の吸光度の定量分析に基づき、カーブフィッティング計算によって得られた抗体ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、レラトリマブ（陽性対照）、及びＨ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）（対照）の結合効率ＥＣ_５０値は、それぞれ０．０７３ｎＭ、０．０８１ｎＭ、０．３７７ｎＭ、０．６８５ｎＭ、０．１０６ｎＭ、及び０．０４５ｎＭであった。

【0194】

上記実験結果は、同一の実験条件下で、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、及びＨ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）がＬＡＧ３－ｍＦｃに効果的に結合する活性を有していたこと、並びに、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、及びＨ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）のヒトＬＡＧ３－ｍＦｃに対する結合活性が、陽性薬物レラトリマブの同じ標的に対する活性よりも強かったこと、特に、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）のヒトＬＡＧ３－ｍＦｃに対する結合活性が、陽性薬物レラトリマブの同じ標的に対する活性よりも有意に強かったことを示している。

【0195】

実験例２：ヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンへの結合に関してヒトＰＤＬ１－ｍＦｃと競合する抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の活性の、競合ＥＬＩＳＡによる分析
ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍＬのヒトＰＤＬ１－ｍＦｃ（ＰＤ－Ｌ１ Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿０５４８６２．１、ｍＦｃ 配列番号）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、ＥＬＩＳＡプレートを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で３７℃にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、プレートを３回洗浄し、乾燥した。抗体を、希釈プレート上で３倍の希釈率で段階希釈し、８０ｎＭ（最終濃度４０ｎＭ）を開始濃度として７種の濃度にした。また、ブランク対照を設定した。その後、１．２μｇ／ｍＬ（最終濃度０．６μｇ／ｍＬ）のヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチン溶液を等量加え、希釈済み抗体とよく混合した。その後、混合物を室温で１０分間インキュベートした。その後、コートしたＥＬＩＳＡプレートに反応後の混合物を加え、ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、乾燥した。ＳＡ－ＨＲＰ（ＫＰＬ、１４－３０－００）ワーキング溶液を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートを４回洗浄し、乾燥した。次いで、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを直ちにＥＬＩＳＡプレートリーダーに入れ、ＥＬＩＳＡプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。

【0196】

分析結果を図３に示す。全用量に対するＯＤ値を表４に示す。結合した抗体の吸光度の定量分析に基づき、カーブフィッティングを行い、ヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンとそのリガンドであるヒトＰＤＬ１－ｍＦｃの結合をブロックする、抗体の競合結合効率ＥＣ_５０値を得た（表４）。

【表4】

【0197】

結果は、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）（対照）が、抗原ヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンのそのリガンドであるヒトＰＤＬ１－ｍＦｃに対する結合を、用量依存的に、効果的にブロックできたことを示しており、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、ＢＳ－ＰＬ０２３Ｃ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）が、ヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンのそのリガンドであるヒトＰＤＬ１－ｍＦｃに対する結合をブロックする際のＥＣ_５０値は、それぞれ３．０３１ｎＭ、３．４６２ｎＭ、２．９８２ｎＭ、５．０４５ｎＭ、及び２．６０６ｎＭであった。ヒトＰＤ－１－ｍＦｃ－ビオチンのそのリガンドであるヒトＰＤＬ１－ｍＦｃに対する結合をブロックする、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、及びＢＳ－ＰＬ０２３Ｃの効率は、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の効率に実質的に匹敵するものであった。

【0198】

実験例３：抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の結合活性のＦＡＣＳによる分析
１．抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の、２９３Ｔ－ＰＤ１膜表面上のＰＤ－１に対する結合活性の、ＦＡＣＳによる分析
対数増殖期の２９３Ｔ－ＰＤ１細胞を回収し、Ｖ底９６ウェルプレートに３×１０^５細胞／ウェルで移した。その後、各ウェルに１００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を３５０×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去した。ＰＢＳＡで希釈した抗体１００μＬ（それぞれ、３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．１２３ｎＭ、及び０．０１２３ｎＭの最終濃度）を加えた。混合物を穏やかに均一に混ぜ、氷上で１時間インキュベートした。各ウェルに１００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を３５０×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去した。その後、プレートを２００μＬの１％ ＰＢＳＡで２回洗浄した。４００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０９５－０９８）を加え、再懸濁させた。混合物をよく混ぜ、暗所にて氷上で０．５時間インキュベートした。各ウェルに１００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を３５０×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去した。その後、プレートを２００μＬの１％ ＰＢＳＡで２回洗浄した。４００μＬの１％ ＰＢＳＡを各ウェルに加えて細胞ペレットを再懸濁し、混合物をフローサイトメトリーチューブに移してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒアッセイを行った。

【0199】

実験結果を表５及び図４に示す。１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、Ｂｉ－ＰＧＶ０２、ニボルマブ、及びペムブロリズマブが、いずれも２９３Ｔ－ＰＤ１細胞膜表面上のＰＤ－１受容体に特異的に結合できたことが示された。

【表5】

【0200】

同一の実験条件下において、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、Ｂｉ－ＰＧＶ０２、ニボルマブ、及びペムブロリズマブの、２９３Ｔ－ＰＤ１細胞への結合のＥＣ_５０値は、それぞれ５．３５１ｎＭ、６．８５１ｎＭ、６．０６６ｎＭ、６．８６６ｎＭ、７．２０６ｎＭ、３．０７３ｎＭ、及び３．９７０ｎＭであった。上記実験結果は、同一の実験条件下において、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、及びＢｉ－ＰＧＶ０２の、２９３Ｔ－ＰＤ１細胞への結合活性が、対照抗体ニボルマブ及びペムブロリズマブに匹敵するものであったことを示しており、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）、ＢＳ－ＰＬ０２１Ａ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、及びＢｉ－ＰＧＶ０２が、２９３Ｔ－ＰＤ１細胞膜表面上のＰＤ－１に対して効果的に結合する活性を有することが示唆された。

【0201】

２．抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の、２９３Ｔ－ＬＡＧ３細胞膜表面上のＬＡＧ３に対する結合活性のＦＡＣＳによる分析
対数増殖期の２９３Ｔ－ＬＡＧ３細胞を従来のパンクレアチンで消化し、Ｖ底９６ウェルプレートに３×１０^５細胞／ウェルで移した。その後、各ウェルに１００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を３５０×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去した。１％ ＰＢＳＡで希釈した抗体１００μＬ（それぞれ、３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．１２３ｎＭ、０．０１２３ｎＭ、及び０．００１２３ｎＭの最終濃度）を加えた。混合物をよく混ぜ、氷上で１時間インキュベートした。各ウェルに１００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を３５０×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去した。その後、プレートを２００μＬの１％ ＰＢＳＡで２回洗浄した。３００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０９５－０９８）を加え、再懸濁させた。混合物をよく混ぜ、暗所にて氷上で０．５時間インキュベートした。各ウェルに５００μＬのＰＢＳＡを加え、混合物を３５０×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去した。その後、プレートを２００μＬの１％ ＰＢＳＡで２回洗浄した。３００μＬの１％ ＰＢＳＡを各ウェルに加えて細胞ペレットを再懸濁し、混合物をフローサイトメトリーチューブに移してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒアッセイを行った。

【0202】

実験結果を表６及び図５に示す。

【表6】

【0203】

結果は、同一の実験条件下で、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ及びレラトリマブの、２９３Ｔ－ＬＡＧ３細胞膜表面上のＬＡＧ３への結合のＥＣ_５０値が、それぞれ３．２１３ｎＭ及び４．１１３ｎＭであり、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの２９３Ｔ－ＬＡＧ３細胞膜表面上のＬＡＧ３への結合活性が、レラトリマブよりも高かったことを示唆している。

【0204】

上記実験結果は、同じ標的に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ及び陽性薬物レラトリマブが、２９３Ｔ－ＬＡＧ３細胞膜表面上のＬＡＧ３に特異的に用量依存的に結合できたことを示しており、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂが、２９３Ｔ－ＬＡＧ３細胞膜表面上のＬＡＧ３に効果的に結合する活性を有していたこと、そして、その結合能がレラトリマブよりも強かったことが示唆された。

【0205】

実験例４：抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の、細胞膜表面上の抗原に対する競合的結合
１．細胞膜表面上の抗原ＰＤ－１への結合に関してＰＤＬ１と競合する、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の活性の競合フローサイトメトリーによる分析
２９３Ｔ－ＰＤ１細胞を従来法で消化し、Ｖ底９６ウェルプレートに３×１０^５細胞／ウェルで移した。その後、各ウェルに１００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を遠心分離及び洗浄した。対応する段階希釈した抗体（それぞれ、３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．１２３ｎＭ、及び０．０１２３ｎＭの最終濃度）を、それぞれ試料あたり１００μＬ加え、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。１００μＬのＰＤＬ－１－ｍＦｃを各ウェルに加え、混合物をよく混ぜて最終濃度２０ｎＭにした。その後、氷上で１時間インキュベートし、３５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去して２００μＬの１％ ＰＢＳＡで２回洗浄した。１００μＬの４００倍希釈のＦＩＴＣヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（ＢＤ社、カタログ番号５５５９８８）を加え、一方で１００μＬの１％ ＰＢＳＡをブランク試料に加えた。混合物をよく混ぜ、暗所にて氷上で３０分間インキュベートし、洗浄及び遠心分離を行った。細胞を再懸濁し、フローサイトメーター上の試験用サンプルローディングチューブに移した。

【0206】

結果を図６に示し、試料のＥＣ_５０値を表７に示す。蛍光定量分析及びカーブフィッティングにより、抗体ニボルマブ、ペムブロリズマブ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）、及びＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの競合結合ＥＣ_５０値は、それぞれ、３．６０８ｎＭ、２．７６９ｎＭ、２．５１１ｎＭ、及び５．１２３ｎＭと算出された。

【表7】

【0207】

結果は、２９３Ｔ－ＰＤ１宿主細胞表面上のＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を、抗体ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂが用量依存的に、効果的にブロックできたことを示す。

【0208】

２．細胞膜表面上の抗原ＭＨＣ ＩＩへの結合に関してＬＡＧ３－ｍＧ１Ｆｃと競合する、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の活性の競合フローサイトメトリーによる分析
実験設計に従い、各抗体及びＬＡＧ３－ｍＧ１Ｆｃを希釈し、１：１の割合で均一に混合して、ＬＡＧ３－ｍＧ１Ｆｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社製；ロット番号２０１９０５０８）の最終濃度が３ｎＭとなり、抗体の最終濃度が３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．１２３ｎＭ、０．０１２３ｎＭ、及び０．００１２３ｎＭとなるようにした。その後、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。Ｒａｊｉ細胞（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号ＴＣＨｕ ４４）を回収し、Ｖ底９６ウェルプレートに各試料３００，０００細胞となるように播種して、１％ ＰＢＳＡを加えた。混合物を５００×ｇで５分間遠心分離して、上清を除去した。各ウェルの細胞を、１００μＬの抗体－タンパク質プレインキュベーション溶液中に再懸濁した。ブランク対照（細胞＋ＰＢＳＡ＋ＰＢＳＡ）、陰性対照（細胞＋ＰＢＳＡ＋二次抗体）、及びアイソタイプ対照をデザインした。系を暗所にて氷上で１時間インキュベートした。その後、１００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を５００×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去した。各ウェルに２００μＬの１％ ＰＢＳＡを加えて細胞を再懸濁し、懸濁物を５００×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去して１回洗浄した。１００μＬのＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４０５３０８）（１：３００の割合で希釈）を各ウェルに加えて細胞を再懸濁し、一方でブランク対照を１００μＬの１％ ＰＢＳＡ中に再懸濁した。系を暗所にて氷上で３０分間インキュベートした。その後、１００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を５００×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去した。各ウェルに２００μＬの１％ ＰＢＳＡを加えて細胞を再懸濁し、懸濁物を５００×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去して１回洗浄した。２００μＬの１％ ＰＢＳＡを各ウェルに加えて細胞を再懸濁し、懸濁物をフローサイトメーター上の試験用サンプルローディングチューブに移した。

【0209】

結果を図７及び表８に示し、試料のＥＣ_５０値を表中に示す。蛍光定量分析及びカーブフィッティングにより、抗体レラトリマブ及びＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの競合結合ＥＣ_５０値は、それぞれ、０．９６８９ｎＭ及び１．３０６ｎＭと算出された。

【表8】

【0210】

結果は、Ｒａｊｉ宿主細胞の表面上のＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ－３の結合を、抗体ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂが用量依存的に、効果的にブロックできたことを示す。

【0211】

実験例５：抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体のブロッキング分析
１．ＬＡＧ３のＭＨＣ ＩＩへの結合をブロックする抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の分析
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３細胞（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築、Ｐ９、生存率：９７．７５％）及びＲａｊｉ細胞（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号ＴＣＨｕ ４４）を回収し、１１０×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去した。その後、細胞を１６４０培地（１０％ ＦＢＳ含有）中に再懸濁し、計数した。前記Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３細胞を、黒底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社；モデル番号３９１６）に、１０×１０^４細胞／ウェル（２５μＬ／ウェル）播種した。実験設計に従い、抗体（それぞれ９００ｎＭ、３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、３．３ｎＭ、０．３ｎＭ、０．０３ｎＭ、及び０．００３ｎＭの最終濃度）を３０μＬ／ウェル加え、混合物を５％ ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃で３０分間プレインキュベートした。ＳＥＥ（ブドウ球菌エンテロトキシンＥ）（最終濃度０．０５ｎｇ／ｍＬ、Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログ番号ＥＴ４０４）及びＲａｊｉ細胞を５％ ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃で３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベート後、Ｒａｊｉ細胞を、前記９６ウェルプレートに２×１０^４細胞／ウェル（２５μＬ／ウェル）加え、各ウェルの最終容量を８０μＬとした。混合物をよく混ぜ、５％ ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃で１６時間インキュベートした。その後、プレートを取り出し、室温に戻した。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｅ２６５０）を８０μＬ／ウェル加え、混合物を暗所で２分間インキュベートした。その後、ＲＬＵ値を読み取った。

【0212】

結果を図８Ａ、図８Ｂ、及び表９に示す。

【表9】

【0213】

結果は、ＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ３の結合をブロックする、Ｂｓ－ＰＬＶ０２、Ｂｉ－ＰＧＶ０２、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ、及びレラトリマブのＥＣ_５０値（ｎＭ）が、それぞれ１．２１ｎＭ、１．４８３ｎＭ、０．９７６２ｎＭ、及び８．５６３ｎＭであったことを示す。Ｂｓ－ＰＬＶ０２、Ｂｉ－ＰＧＶ０２、及びＢＳ－ＰＬ０２２Ｂは、陽性対照抗体レラトリマブと比べ、ＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ３の結合をブロックする能力が高かった。

【0214】

２．ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合をブロックする抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の分析
ＰＤＬ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｊ１０８１Ａ）を、平底９６ウェル黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社；モデル番号３９１６）に４×１０^４細胞／ウェル（１００μＬ／ウェル）播種し、一晩培養した（細胞増殖用培地中：Ｈａｍ Ｆ－１２＋１０％ ＦＢＳ）。翌日、プレート内の培地を除去し、ＰＤ１エフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｊ１１２１Ａ）を５×１０^４細胞／ウェル（４０μＬ／ウェル）（培地：１６４０＋１０％ ＦＢＳ）加えた。抗体（それぞれ、１０００ｎＭ、３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．１２３ｎＭ、及び０．０１２３ｎＭの最終濃度）を４０μＬ／ウェル加え、また、アイソタイプ対照及び陰性対照群を設定した。最終容量は８０μＬ／ウェルであった。プレートをインキュベーター内に置き、６時間インキュベートした。その後、プレートを取り出し、室温に戻した。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｅ２６５０）を８０μＬ／ウェル加え、混合物を暗所で２分間インキュベートした。その後、ＲＬＵ値を読み取った。

【0215】

結果を図９Ａ、図９Ｂ、及び表１０に示す。

【表10】

【0216】

結果は、ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合をブロックする、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）、及びＢＳ－ＰＬ０２２ＢのＥＣ_５０値（ｎＭ）が、それぞれ４．０８９ｎＭ、１．２８１ｎＭ、５．２１９ｎＭ、及び２０．０１ｎＭであったことを示す。結果は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）、及びＢＳ－ＰＬ０２２Ｂが、いずれも、ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合をブロック可能であったことを示している。

【0217】

３．ＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ－３の結合とＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合を同時にブロックする抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の分析
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３細胞及びＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を回収し、１１０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去した。その後、細胞を１６４０培地（１０％ ＦＢＳ含有）中に再懸濁し、計数した。

【0218】

前記Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３細胞を、黒底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社；モデル番号３９１６）に、１０×１０^４細胞／ウェル（２５μＬ／ウェル）播種した。実験設計に従い、抗体（それぞれ３０００ｎＭ、１０００ｎＭ、３００ｎＭ、３０ｎＭ、３ｎＭ、０．３ｎＭ、０．０３ｎＭ、及び０．００３ｎＭの最終濃度）を３０μＬ／ウェル加え、混合物を５％ ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃で３０分間プレインキュベートした。ＳＥＥ（ブドウ球菌エンテロトキシンＥ）（最終濃度０．１ｎｇ／ｍＬ）をＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞に加え、混合物を５％ ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃で３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベート後、Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を、前記９６ウェルプレートに３×１０^４細胞／ウェル（２５μＬ／ウェル）加え、各ウェルの最終容量を８０μＬとした。混合物をよく混ぜ、５％ ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃で１５時間インキュベートした。その後、プレートを取り出し、室温に戻した。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｅ２６５０）を８０μＬ／ウェル加え、混合物を暗所で５分間インキュベートした。その後、ＲＬＵ値を読み取った。

【0219】

結果を図１０Ａ、図１０Ｂ、及び表１１に示す。

【表11】

【0220】

結果は、ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ１の結合とＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ３の結合を同時にブロックする、ペムブロリズマブ、レラトリマブ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）＋レラトリマブ、及びＢＳ－ＰＬ０２２ＢのＥＣ_５０値（ｎＭ）が、それぞれ２４．０１ｎＭ、５．５２５ｎＭ、４４．８６ｎＭ、２９．７５ｎＭ、及び１６．２１ｎＭであったことを示す。ペムブロリズマブ、レラトリマブ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）＋レラトリマブ、及びＢｓ－ＰＬ０２２Ｂは、いずれも、ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合とＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ３の結合を同時にブロック可能であり、Ｂｓ－ＰＬ０２２Ｂのブロッキング能は、他の抗体よりも高かった。

【0221】

実験例６：抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体のブリッジングアッセイ
ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ０００００４）、ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築）、及びＣＨＯ－Ｋ１－ＬＡＧ３細胞（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築）を従来法で消化し、１７０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去した。その後、完全培地中に細胞を再懸濁して計数を行い、細胞生存率を決定した。ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞はＣＦＳＥ（ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｋｉｔ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４２３８０１）（処理濃度１μＭ、１ｍＬ／１０×１０^６細胞）によって染色し、ＣＨＯ－Ｋ１－ＬＡＧ３細胞はＦａｒ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社、カタログ番号Ｃ３４５６４）（処理濃度０．３μＭ、１ｍＬ／１０×１０^６細胞）によって染色し、ＣＨＯ－Ｋ１細胞はＦａｒ ｒｅｄ又はＣＦＳＥによって染色した。細胞をインキュベーター内で２０分間インキュベートして染色を行った。完全培地を加えることによって染色を停止し、混合物を１７０×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去した。追加の完全培地を加え、混合物をインキュベーター内で１０分間インキュベートし、１７０×ｇで５分間遠心分離を行った後、上清を除去し、１回洗浄した。その後、細胞を完全培地中に再懸濁し、計数した。染色後、ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１、ＣＨＯ－Ｋ１－ＬＡＧ３、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞を、別々にＶ底９６ウェルプレートに１．５×１０^５細胞／ウェル移し、緩衝液（ＰＢＳ＋１％ヒト血清）（ヒト血清はＺｈｏｎｇＫｅＣｈｅｎＹｕ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製；カタログ番号１６８０１４－１００ｍＬ）を加えた。混合物を遠心分離し、次いで上清を除去した。実験設計に従い、抗体（それぞれ３０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ、及び０．１ｎＭの最終濃度）をＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１細胞に１００μＬ／ウェル加え、緩衝液又は抗体（それぞれ３０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ、及び０．１ｎＭの最終濃度）をＣＨＯ－Ｋ１－ＬＡＧ３細胞に１００μＬ／ウェル加え、そして、緩衝液をＣＨＯ－Ｋ１細胞に１００μＬ／ウェル加えた。その後、系を氷上で６０分間インキュベートした。

【0222】

１００μＬの緩衝液を加え、混合物を３５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去し、２００μＬの緩衝液で２回洗浄した。各ウェル内のＣＨＯ－Ｋ１－ＬＡＧ３及びＣＨＯ－Ｋ１細胞を別々に１００μＬの緩衝液中に再懸濁し、懸濁物を、対応するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１試料ウェルに１．５×１０^５細胞／ウェルで移した。混合物をよく混ぜ、その後、暗所にて氷上で４０分間インキュベートした。２００μＬの緩衝液を各ウェルに加えて細胞を再懸濁し、懸濁物をフローサイトメーター上の試験用サンプルローディングチューブに移した。

【0223】

結果を図１１に示す。アイソタイプ対照との比較を行ったところ、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体は、ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１及びＣＨＯ－Ｋ１－ＬＡＧ３細胞に同時に結合し、２種類の細胞を架橋（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）することができたのに対し、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）及びレラトリマブは、併用した場合でさえもこの効果を有しなかった。

【0224】

実験例７：ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２分泌の促進における抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の生物学的活性の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）による分析
１．Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１混合リンパ球反応系でのＩＦＮ－γ分泌の促進における、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の生物学的活性の分析
Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を従来通り継代培養した。ＰＢＭＣを融解して１０ｍＬの１６４０完全培地中で培養し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）（Ｄｉａｎｏｔｅｃｈ社；カタログ番号Ｓ０１０２０１）で２日間刺激した。前記Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を、最終濃度２μｇ／ｍＬのＭＭＣ（Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ社；カタログ番号ＳＩＨ－２４６－１０ＭＧ）で処理し、５％ ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃で１時間インキュベートした。ＳＥＢで２日間刺激したＰＢＭＣ、及びＭＭＣで１時間処理したＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、これら２種の細胞を完全培地に再懸濁し、計数し、Ｕ字型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、モデル番号３７９９）に１０×１０^４細胞／ウェルでそれぞれ加え、同時培養を行った。実験設計に従い、抗体（それぞれ３００ｎＭ、３０ｎＭ、及び３ｎＭの最終濃度）を加えてインキュベーター内で３日間細胞を同時培養した。３日後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞培養上清を回収して、ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ－γの分析を行った。

【0225】

図１２Ａに示すように、ヒトＰＢＭＣとＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞の混合培養により、ＰＢＭＣにおけるＩＦＮ－γの分泌が有意に促進され、また、混合培養系への抗体の添加により、ＰＢＭＣにおいてＩＦＮ－γのさらなる分泌を有意に誘導することができた。ＩＦＮ－γ分泌を促進する活性の程度については、抗体ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂは、ＰＤ－１を単一の標的とする抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）及びＬＡＧ－３を単一の標的とする対照抗体レラトリマブよりも、優れたものであった。１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）とレラトリマブの併用と比較した場合においてさえも、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂは、２種の異なる抗体濃度水準（３０ｎＭ及び３００ｎＭ）において、ＩＦＮ－γ分泌を促進する能力がより高かった。

【0226】

２．Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１混合リンパ球反応系でのＩＬ－２分泌の促進における、抗ＬＡＧ－３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の生物学的活性の分析
Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を従来通り継代培養した。ＰＢＭＣを融解して１０ｍＬの１６４０完全培地中で培養し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）（Ｄｉａｎｏｔｅｃｈ社；カタログ番号Ｓ０１０２０１）で２日間刺激した。前記Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を、最終濃度２μｇ／ｍＬのＭＭＣ（Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ社；カタログ番号ＳＩＨ－２４６－１０ＭＧ）で処理し、５％ ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃で１時間インキュベートした。ＳＥＢで２日間刺激したＰＢＭＣ、及びＭＭＣで１時間処理したＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、これら２種の細胞を完全培地に再懸濁し、計数し、Ｕ字型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、モデル番号３７９９）に１０×１０^４細胞／ウェルでそれぞれ加え、同時培養を行った。実験設計に従い、抗体（それぞれ３００ｎＭ、３０ｎＭ、及び３ｎＭの最終濃度）を加えて３日間細胞を同時培養した。３日後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞培養上清を回収して、ＥＬＩＳＡによるＩＬ－２の分析を行った。

【0227】

図１２Ｂに示すように、ヒトＰＢＭＣとＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞の混合培養により、ＰＢＭＣにおけるＩＬ－２の分泌がある程度促進された。また、混合培養系への抗体の添加により、ＰＢＭＣにおいてＩＬ－２のさらなる分泌を有意に誘導することができ、それは有意な用量依存的関係を示した。ＩＬ－２分泌を促進する活性の程度については、ＰＤ－１を単一の標的とする抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）及びＬＡＧ－３を単一の標的とする対照抗体レラトリマブと比べ、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂは、３種の異なる抗体濃度水準において、ＩＬ－２分泌を促進する能力がより高かった。１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）とレラトリマブの併用と比較した場合においてさえも、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂは、３種の異なる抗体濃度水準において、ＩＬ－２分泌を促進する能力がより高かった。

【0228】

実験例８：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩに対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与している。Ｆｃ受容体への治療抗体の結合能は、抗体の安全性と有効性に影響を与えると思われる。この実験において、ＦｃγＲＩに対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

【0229】

ＦｃγＲＩに対する対応する抗体の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定した方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡの溶液であった。１μｇ／ｍＬの濃度のＦｃγＲＩ溶液（Ｓｉｎｏｂｉｏ社より購入）をＨＩＳ１Ｋセンサーに加え、ＦｃγＲＩをセンサー表面に５０秒間固定した。ＦｃγＲＩへの抗体の結合及び解離定数の両者を、３．１２～５０ｎＭ（２倍段階希釈）の抗体濃度の緩衝液中で測定した。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、フリーケンシー（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）は５．０Ｈｚであった。データは１：１モデルフィッティング（ｍｏｄｅｌ ｆｉｔｔｉｎｇ）で分析し、親和性定数を得た。

【0230】

ＦｃγＲＩに対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析結果を、表１２及び図１３～１４に示す。

【表12】

Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。

【0231】

結果は、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）がＦｃγＲＩに６．５９Ｅ－０９Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＢＳ－ＰＬ０２２ＢについてはＦｃγＲＩに結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。

【0232】

結果は、ＦｃγＲＩに対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの結合活性が効果的に排除されたことを示す。

【0233】

実験例９：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ及びそのサブタイプに対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性の分析
（１）ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８（ＣＤ１６ａ＿Ｖ１５８としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＡＤＣＣ効果を媒介することができる。この実験において、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

【0234】

対応する抗体の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定した方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡの溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８を、ＨＩＳ１Ｋセンサー上に６０秒間固定した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡化し、センサー上の固定化ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８の、３１．２５～５００ｎＭ（２倍段階希釈）の濃度の抗体に対する結合を６０秒間測定した。緩衝液中で抗体を６０秒間解離させた。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、フリーケンシーは５．０Ｈｚであった。データは１：１モデルフィッティングで分析し、親和性定数を得た。

【0235】

ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析結果を、表１３及び図１５～１６に示す。

【表13】

Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。

【0236】

結果は、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）がＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に８．７７Ｅ－０８Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＢＳ－ＰＬ０２２ＢについてはＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われなかったことを示す。

【0237】

結果は、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの結合活性が効果的に排除されたことを示す。

【0238】

（２）ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８（ＣＤ１６ａ＿Ｆ１５８としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＡＤＣＣ効果を媒介することができる。この実験において、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

【0239】

ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＴＦ０１の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定した方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡの溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８を、ＨＩＳ１Ｋセンサー上に１２０秒間固定した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡化し、センサー上の固定化ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８の、３１．２５～５００ｎＭ（２倍希釈）の濃度の抗体に対する結合を６０秒間測定した。緩衝液中で抗体を６０秒間解離させた。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、フリーケンシーは５．０Ｈｚであった。データは１：１モデルフィッティングで分析し、親和性定数を得た。

【0240】

ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析結果を、表１４及び図１７～１８に示す。

【表14】

Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。

【0241】

結果は、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）がＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に３．６４Ｅ－０７Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＢＳ－ＰＬ０２２ＢについてはＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。

【0242】

結果は、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの結合活性が効果的に排除されたことを示す。

【0243】

実験例１０：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ及びそのサブタイプに対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性の分析
（１）ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１（ＣＤ３２ａ＿Ｈ１３１としても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与している。Ｆｃ受容体への治療抗体の結合能は、抗体の安全性と有効性に影響を与えると思われる。この実験において、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、Ｆｃ受容体に対する試験抗体の結合能を評価した。

【0244】

ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定した方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡの溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１を、ＮＴＡセンサー上に約１．０ｎｍの固定高で固定した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡化し、センサー上の固定化ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１の、１２．５～２００ｎＭ（２倍段階希釈）の濃度の抗体に対する結合を６０秒間測定した。緩衝液中で抗体を６０秒間解離させた。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、フリーケンシーは５．０Ｈｚであった。データは１：１モデルフィッティングで分析し、親和性定数を得た。

【0245】

ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析結果を、表１５及び図１９～２０に示す。

【表15】

Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。

【0246】

結果は、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）がＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に１．７８Ｅ－０７Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＢＳ－ＰＬ０２２ＢについてはＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。

【0247】

結果は、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの結合活性が効果的に排除されたことを示す。

【0248】

実験例１１：ＦｃγＲＩＩｂに対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂとしても知られる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができる。この実験において、ＦｃγＲＩＩｂに対する試験抗体の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、Ｆｃ受容体に対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの結合能を評価した。

【0249】

ＦｃγＲＩＩｂに対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定した方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡの溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩｂを、ＮＴＡセンサー上に約１．０ｎｍの固定高で固定した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡化し、センサー上の固定化ｈＦＣＧＲ２Ｂ－ｈｉｓの、１２．５～２００ｎＭ（２倍段階希釈）の濃度の抗体に対する結合を６０秒間測定した。緩衝液中で抗体を６０秒間解離させた。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、フリーケンシーは５．０Ｈｚであった。データは１：１モデルフィッティングで分析し、親和性定数を得た。

【0250】

ＦｃγＲＩＩｂに対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析結果を、表１７及び図２１～２２に示す。

【表16】

Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。

【0251】

結果は、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）がＦｃγＲＩＩｂに１．２１Ｅ－０７Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＢＳ－ＰＬ０２２ＢについてはＦｃγＲＩＩｂに結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。

【0252】

結果は、ＦｃγＲＩＩｂに対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの結合活性が効果的に排除されたことを示す。

【0253】

実験例１２：Ｃ１ｑに対する、ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性の分析
血清補体Ｃ１ｑは、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＣＤＣ効果を媒介することができる。Ｃ１ｑに対する治療抗体の結合能は、抗体の安全性と有効性に影響を与えると思われる。この実験において、Ｃ１ｑに対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを用いて測定し、抗体のＣＤＣ活性を評価した。

【0254】

Ｃ１ｑに対する対応する抗体の親和性定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムによって測定した方法を、以下に簡単に記載する。試料希釈緩衝液は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＢＳＡの溶液であった。５０μｇ／ｍＬの各抗体を、ＦＡＢ２Ｇセンサー上に約２．０ｎｍの固定高で固定した。センサーを緩衝液中で６０秒間平衡化し、センサー上の固定化抗体の、０．６２５～１０ｎＭ（２倍段階希釈）の濃度の抗原Ｃ１ｑに対する結合を６０秒間測定した。抗原－抗体を緩衝液中で６０秒間解離させた。試料プレートの振とう速度は１０００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、フリーケンシーは５．０Ｈｚであった。データは１：１モデルフィッティングで分析し、親和性定数を得た。データ取得ソフトウェアはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ７．０であり、データ分析ソフトウェアはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０であった。

【0255】

Ｃ１ｑに対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの親和性定数の分析結果を、表１８及び図２３～２４に示す。

【表17】

Ｎ／Ａは、抗体が結合しなかったか、又は抗原に対するシグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。

【0256】

結果は、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）がＣ１ｑに１．７５Ｅ－０９Ｍの親和性定数で結合できたこと、そして、ＢＳ－ＰＬ０２２ＢについてはＣ１ｑに結合しなかった、又は結合シグナルが極めて弱かったため、結果の分析が行われず、対応するデータが得られなかったことを示す。

【0257】

結果は、Ｃ１ｑに対するＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの結合活性が効果的に排除されたことを示す。

【0258】

実験例１３：ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１－ＬＡＧ３の抗体依存性細胞貪食におけるＢＳ－ＰＬ０２２Ｂの活性
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ６４－ＣＤ３２Ｒ細胞（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築）及びＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１－ＬＡＧ３細胞（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築）を従来法で回収し、１１０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去した。その後、細胞を１６４０＋４％ ＦＢＳ中に再懸濁し、計数した。細胞生存率を決定し、細胞濃度を調整した。実験設計に従い、試験抗体を１６４０＋４％ ＦＢＳを用いて５０ｎＭ、５ｎＭ、及び０．５ｎＭ（使用濃度１０ｎＭ、１ｎＭ、及び０．１ｎＭ、又は５ｎＭ、０．５ｎＭ、及び０．０５ｎＭ）に希釈し、対照抗体を５０ｎＭ（使用濃度１０ｎＭ）に希釈した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ６４－ＣＤ３２Ｒ細胞懸濁液を、９６ウェル黒色プレートに４０μＬ／試料（４０，０００細胞／ウェル）加えた。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ６４－ＣＤ３２Ｒ細胞を既に含む前記試料に、標的細胞ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１－ＬＡＧ３を４０μＬ／試料（４０，０００細胞／ウェル）加えた。抗体を対応する試料に２０μＬ／ウェル加え、混合物をよく混ぜた。ブランク対照及びアイソタイプ対照も設定した。その後、プレートをインキュベーター内で５時間インキュベートし、Ｂｒｉｇｈｔ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｅ２６５０）を試料に５０μＬ／ウェル加えた。混合物をよく混ぜ、プレートの読み取りを行った。

【0259】

結果を図２５に示す。

【0260】

結果は、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（Ｇ１ＷＴ）＋Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）、及びニボルマブ＋レラトリマブが同一濃度でＡＤＣＰ効果を有していたのに対し、ＢＳ－ＰＬ０２２ＢがＡＤＣＰ効果を有しなかったことを示す。

【0261】

実験例１４：腫瘍細胞を皮下移植したマウスモデルにおける、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の薬力学的評価
抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の抗腫瘍活性をインビボで測定するため、まず、ＣＴ２６結腸がん細胞（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ社より購入）を７．１～７．３週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃ－ｈＰＤ１／ｈＬＡＧ３マウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ社より購入）の右後肢大腿に皮下接種した。移植の日をＤ０と定義した。投与経路は腹腔内注射（ｉｐ）であり、週に２回（ＢＩＷ）、計６回の投与を行った。モデリングと具体的な投与レジメンを表１８に示す。投与後、各群の腫瘍の長さ及び幅を測定し、腫瘍容積を算出した。

【表18】

【0262】

結果を図２６に示す。結果は、アイソタイプ対照抗体と比べ、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂ及び陽性対照抗体レラトリマブの両者が、マウスにおける腫瘍の成長を効果的に阻害できたことを示す。結果は、抗ＬＡＧ３／抗ＰＤ－１二重特異性抗体ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂが、陽性対照抗体レラトリマブよりも有意に優れた抗腫瘍効果を有していたことを示す。

【0263】

さらに、図２７に示すように、試験薬物ＢＳ－ＰＬ０２２Ｂは担がんマウスの忍容性が高く、各群で担がんマウスの体重への影響は見られなかった。

【0264】

本発明の具体的な実施形態を詳細に記載したが、当業者は、開示されたあらゆる教示に従い、それらの詳細に対して各種改変及び置換を行いうること、そして、これらの変更が全て本発明の保護範囲内に含まれることを理解するであろう。本発明の完全な範囲が、添付の請求の範囲及びその任意の等価物によって提供される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【配列表】

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【国際調査報告】