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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-23
(54)【発明の名称】ノロウイルス反応性抗体を決定する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20241016BHJP
G01N 33/545 20060101ALI20241016BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20241016BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241016BHJP
C12N 7/04 20060101ALN20241016BHJP
C07K 14/08 20060101ALN20241016BHJP
C07K 16/10 20060101ALN20241016BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N ZNA
G01N33/545 A
G01N33/543 575
G01N33/569 L
C12N7/04
C07K14/08
C07K16/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024520590
(86)(22)【出願日】2022-10-04
(85)【翻訳文提出日】2024-05-31
(86)【国際出願番号】 US2022077540
(87)【国際公開番号】W WO2023060086
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】63/252,053
(32)【優先日】2021-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507028479
【氏名又は名称】タケダ ワクチン，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン，ラルフ
(72)【発明者】
【氏名】ブリンクマン，アマンダ
(72)【発明者】
【氏名】クルカルニ，アプルヴァ
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065CA24
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA70
4H045CA01
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA50
(57)【要約】
本開示は、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法に向けられる。対象は、ノロウイルスワクチンでワクチン接種されるか、またはノロウイルスに感染していてもよい。本開示は、ノロウイルス感染を診断するため、および、例えばノロウイルスワクチンでのワクチン接種後の、対象においてノロウイルス感染からの保護を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法にさらに関する。本開示は、試料中のノロウイルス反応性抗体を決定するためのキットにさらに向けられる。本開示は、ノロウイルスウイルス様粒子に連結されたマイクロスフェアを含むマイクロスフェア複合体にさらに向けられる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）に連結されたマイクロスフェアを含むマイクロスフェア複合体。
【請求項2】
前記ノロウイルスＶＬＰが、メジャーなウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１および任意選択によりマイナーなウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２を含む、請求項１に記載のマイクロスフェア複合体。
【請求項3】
前記メジャーなウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１が、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６または配列番号７または配列番号８または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１または配列番号１２または配列番号１３または配列番号１４または配列番号１５または配列番号１６または配列番号１７または配列番号１８または配列番号１９または配列番号２０または配列番号２１または配列番号２２に対して、少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％同一である、請求項２に記載のマイクロスフェア複合体。
【請求項4】
前記マイクロスフェアが、検出可能な標識を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のマイクロスフェア複合体。
【請求項5】
前記検出可能な標識が少なくとも１つの蛍光色素である、請求項４に記載のマイクロスフェア複合体。
【請求項6】
前記マイクロスフェアが、光源で照射したときに、前記少なくとも１つの蛍光色素の放出シグナルにより同定され得る、請求項５に記載のマイクロスフェア複合体。
【請求項7】
所定量の少なくとも１つの請求項１～６のいずれか１項に記載のマイクロスフェア複合体および任意選択により所定量の検出抗体を含むキット。
【請求項8】
－ 所定量の少なくとも１つの請求項１～６のいずれか１項に記載のマイクロスフェア複合体、および－ 所定量の、前記少なくとも１つのマイクロスフェア複合体の前記ノロウイルスＶＬＰに結合する少なくとも１つのレポーター抗体
を含むキット。
【請求項9】
前記少なくとも１つのレポーター抗体が、前記少なくとも１つのレポーター抗体の重鎖定常領域により、検出可能な標識に取り付けられている、請求項８に記載のキット。
【請求項10】
前記少なくとも１つのレポーター抗体が、前記少なくとも１つのレポーター抗体の前記重鎖定常領域により、前記検出可能な標識に間接的に取り付けられており、前記レポーター抗体が、検出可能な標識に直接的に取り付けられた二次レポーター抗体と反応する、請求項９に記載のキット。
【請求項11】
前記検出可能な標識が蛍光標識であり、好ましくは前記蛍光標識が、キサンテン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、シアニン、クマリン、およびこれらの任意の誘導体からなる群から選択される、請求項９または１０に記載のキット。
【請求項12】
前記少なくとも１つのレポーター抗体が、０．５μｇ／ｍＬ未満、または０．４μｇ／ｍＬ未満または０．３μｇ／ｍＬ未満または０．２μｇ／ｍＬ未満または０．１５μｇ／ｍＬ未満または０．１μｇ／ｍＬ未満または０．０９μｇ／ｍＬ未満または０．０８μｇ／ｍＬ未満または０．０７μｇ／ｍＬ未満または０．０５μｇ／ｍＬ未満または０．０３μｇ／ｍＬ未満または０．０２μｇ／ｍＬ未満または０．０１μｇ／ｍＬ未満の、前記少なくとも１つのマイクロスフェア複合体の前記ノロウイルスＶＬＰに対するＥＣ５０値を提供する、請求項８～１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項13】
前記少なくとも１つのレポーター抗体が、配列番号２７により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号２８により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、請求項８～１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項14】
前記少なくとも１つのレポーター抗体が、配列番号２９により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号３０により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、請求項８～１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項15】
所定量の２つの請求項１～６のいずれか１項に記載のマイクロスフェア複合体および所定量の２つのレポーター抗体を含み、第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、請求項８～１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項16】
前記第１または前記第２のレポーター抗体が、配列番号２７により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号２８により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；
または
配列番号２９により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号３０により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項17】
前記第１のノロウイルスＶＬＰがＧＩ．１ ＶＬＰであり、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子がＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰである、請求項１５に記載のキット。
【請求項18】
前記第２のレポーター抗体が、配列番号２９により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号３０により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含み；
任意選択により、前記第１のレポーター抗体が、
配列番号２７により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号２８により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項19】
所定量の１つの請求項１～６のいずれか１項に記載のマイクロスフェア複合体および所定量の１つの、前記マイクロスフェア複合体の前記ノロウイルスＶＬＰに結合するレポーター抗体を含む、請求項８～１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項20】
対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる検出抗体からのシグナルを検出する方法であって、工程１：所定量の請求項１～６のいずれか１項に記載のマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）に、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１における前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記ノロウイルス反応性抗体と接触させて、前記ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、前記検出抗体を結合させる工程であって、前記検出抗体が、前記検出抗体の可変領域を用いて前記ノロウイルス反応性抗体に結合し、前記検出抗体が、検出可能な標識に取り付けられている、工程、および
工程３：工程２における前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体からのシグナルを検出する工程
を含む、方法。
【請求項21】
以下のさらなる工程：工程４：工程３の前記シグナルから前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定された前記検出抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定するための、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる検出抗体からのシグナルを検出する方法であって、工程１：所定量の少なくとも２つの請求項１～６のいずれか１項に記載のマイクロスフェア複合体を、前記試料と接触させて、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なる、工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１における前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合した前記ノロウイルス反応性抗体と接触させて、前記ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、前記検出抗体を結合させる工程であって、前記検出抗体が、前記検出抗体の可変領域を用いて前記ノロウイルス反応性抗体に結合し、前記検出抗体が、第３の検出可能な標識に取り付けられている、工程、
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体からのシグナルを検出する工程、
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程、ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記検出抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、方法。
【請求項23】
以下のさらなる工程：工程６：工程５の前記要約されたシグナルから前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定された前記検出抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定するための、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
工程１において、所定量の少なくとも５個または少なくとも１０個または少なくとも１５個または少なくとも２０個のマイクロスフェア複合体が前記試料と接触させられる、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項25】
工程１において、所定量の、ＧＩ．１ ＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含む第１のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．２ ＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含む第２のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．３ ＶＬＰに連結された第３のマイクロスフェアを含む第３のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．４ ＶＬＰに連結された第４のマイクロスフェアを含む第４のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．５ ＶＬＰに連結された第５のマイクロスフェアを含む第５のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．６ ＶＬＰに連結された第６のマイクロスフェアを含む第６のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．７ ＶＬＰに連結された第７のマイクロスフェアを含む第７のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１ ＶＬＰに連結された第８のマイクロスフェアを含む第８のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．２ ＶＬＰに連結された第９のマイクロスフェアを含む第９のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．３ ＶＬＰに連結された第１０のマイクロスフェアを含む第１０のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰに連結された第１１のマイクロスフェアを含む第１１のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰに連結された第１２のマイクロスフェアを含む第１２のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ ＶＬＰに連結された第１３のマイクロスフェアを含む第１３のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ ＶＬＰに連結された第１４のマイクロスフェアを含む第１４のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｄｅｎ Ｈａａｇ ＶＬＰに連結された第１５のマイクロスフェアを含む第１５のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．６ ＶＬＰに連結された第１６のマイクロスフェアを含む第１６のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．７ ＶＬＰに連結された第１７のマイクロスフェアを含む第１７のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１２ ＶＬＰに連結された第１８のマイクロスフェアを含む第１８のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１７／１９７８ ＶＬＰに連結された第１９のマイクロスフェアを含む第１９のマイクロスフェア複合体、および所定量の、ＧＩＩ．１７／２０１５ ＶＬＰに連結された第２０のマイクロスフェアを含む第２０のマイクロスフェア複合体が前記試料と接触させられる、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記検出抗体が、前記検出抗体の重鎖定常領域により、前記検出可能な標識に直接的に取り付けられている、請求項２０～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記検出抗体が取り付けられた前記検出可能な標識が蛍光標識であり、好ましくは、前記蛍光標識が、キサンテン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、シアニン、クマリン、およびこれらの任意の誘導体からなる群から選択される、請求項２０～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となるレポーター抗体からのシグナルを検出する方法であって、工程１：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を含む、請求項１９に記載のキットを用意する工程、
工程２：前記所定量の前記マイクロスフェア複合体および前記所定量の前記レポーター抗体を前記試料と接触させて、前記レポーター抗体と競合しながら、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２における前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含む、方法。
【請求項29】
工程１：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を含む、請求項１９に記載のキットを用意する工程、工程２．１：工程１の前記所定量の前記マイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２．２：前記所定量の前記レポーター抗体を工程２．１の前記マイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記レポーター抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２．２における前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
工程１：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を含む、請求項１９に記載のキットを用意する工程、工程２．１：工程１の前記所定量の前記マイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２．２：前記所定量の前記レポーター抗体を工程２．１の前記マイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記レポーター抗体を結合させる工程、
工程２．３：工程２．２の前記所定量のレポーター抗体、前記所定量のマイクロスフェア複合体、および前記試料を所定量の二次レポーター抗体と接触させて、前記レポーター抗体の定常領域に、前記二次レポーター抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２．３における前記レポーター抗体に結合した前記二次レポーター抗体からのシグナルを検出する工程であって、前記レポーター抗体が工程２．２において前記ノロウイルスＶＬＰに結合している、工程
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
以下のさらなる工程：工程４：工程３の前記シグナルから前記レポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定された前記レポーター抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定するための、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となるレポーター抗体からのシグナルを検出する方法であって、工程１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を含む、請求項８～１８のいずれか１項に記載のキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２：前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記少なくとも２つのレポーター抗体と競合しながら、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記レポーター抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、方法。
【請求項33】
工程１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を含む、請求項８～１８のいずれか１項に記載のキットを用意する工程であって、第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２．１：前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程２．２：前記所定量の前記少なくとも２つのレポーター抗体を工程２．１の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記少なくとも２つのレポーター抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２．２における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記レポーター抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
以下の工程：工程１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を含む、請求項８～１８のいずれか１項に記載のキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２．１：前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程２．２：前記所定量の前記少なくとも２つのレポーター抗体を工程２．１の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記少なくとも２つのレポーター抗体を結合させる工程；
工程２．３：工程２．２の前記所定量の前記少なくとも２つのレポーター抗体、前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および前記試料を所定量の二次レポーター抗体と接触させて、前記少なくとも２つのレポーター抗体の定常領域に、前記二次レポーター抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２．３における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体に結合した前記二次レポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記二次レポーター抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
以下のさらなる工程：工程６：工程５の前記要約されたシグナルから前記レポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定された前記レポーター抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
工程１における前記キットが、所定量の２つのマイクロスフェア複合体および所定量の２つのレポーター抗体を提供する、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記第１のマイクロスフェア複合体が、ＧＩ．１ ＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、前記第２のマイクロスフェア複合体が、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
対象においてノロウイルス感染を診断する方法であって、以下の工程：工程１：前記対象の身体の外側に前記対象からの試料を用意する工程、
工程２：請求項２０～３７のいずれか１項に記載の試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：ノロウイルス反応性抗体の前記量を、ノロウイルスに感染した対象におけるノロウイルス反応性抗体の確立された量と比較することにより、感染を決定する工程
を含む、方法。
【請求項39】
ノロウイルス感染からの対象の保護を決定する方法であって、以下の工程：工程１：前記対象の身体の外側に前記対象からの試料を用意する工程、
工程２：請求項２０～３７のいずれか１項に記載の試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：工程２におけるノロウイルス反応性抗体の前記量をノロウイルス反応性抗体の保護的な量と比較することにより保護を決定する工程
を含む、方法。
【請求項40】
前記対象がヒトである、請求項２０～３９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、２０２１年１０月４日に出願された米国仮出願第６３／２５２，０５３号に対する優先権を主張し、該仮出願の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
[0001] 本出願は、２０２１年１０月４日に出願された米国仮出願第６３／２５２，０５３号に対する優先権を主張し、該仮出願の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
[0002] 本開示は、ノロウイルス反応性抗体を決定する方法に関する。本開示は、ノロウイルス感染を診断するためおよびノロウイルス感染からの保護を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法にさらに関する。
[0002] 本開示は、ノロウイルス反応性抗体を決定する方法に関する。本開示は、ノロウイルス感染を診断するためおよびノロウイルス感染からの保護を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法にさらに関する。
【0003】
電子的な配列表への参照
[0003] 本明細書と共に電子的に提出される電子的な配列表（ＬＩＧＯ＿０３１＿００ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ；サイズ：４５，０８５バイト；および作成日：２０２２年１０月３日）の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
[0003] 本明細書と共に電子的に提出される電子的な配列表（ＬＩＧＯ＿０３１＿００ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ；サイズ：４５，０８５バイト；および作成日：２０２２年１０月３日）の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
[0004] ノロウイルスは、世界中で下痢疾患の５分の１と関連付けられる非常に流行している病原体であり、各年に２００，０００人より多くの死を引き起こしている。ノロウイルスはすべての年齢群の人々に感染し、感染は通常は急性であり自己限定的であるが、疾患は、小児、高齢者、およびすべての年齢群の免疫不全の人々において生命を脅かすものとなり得る。個体の健康に影響する他に、ノロウイルス感染および疾患により引き起こされる世界中での経済的コストは、１年当たり約６００億ドルと概算されている（Ｈａｙｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９、１１、３９２、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１１０５０３９２）。
[0004] ノロウイルスは、世界中で下痢疾患の５分の１と関連付けられる非常に流行している病原体であり、各年に２００，０００人より多くの死を引き起こしている。ノロウイルスはすべての年齢群の人々に感染し、感染は通常は急性であり自己限定的であるが、疾患は、小児、高齢者、およびすべての年齢群の免疫不全の人々において生命を脅かすものとなり得る。個体の健康に影響する他に、ノロウイルス感染および疾患により引き起こされる世界中での経済的コストは、１年当たり約６００億ドルと概算されている（Ｈａｙｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９、１１、３９２、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１１０５０３９２）。
【0005】
[0005] ノロウイルスは、非セグメント化ゲノムを含有するカリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科の一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスである。ほとんどのノロウイルスのゲノムは、第４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するマウスノロウイルスを除いて、３つのＯＲＦ（ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、およびＯＲＦ３）をコードする。ＯＲＦ１は非構造タンパク質をコードするが、後者２つは、メジャーなウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１およびマイナーなウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２の産生を特定する。ＶＰ１はシェル（Ｓ）を有し、シェルはウイルスＲＮＡおよび突出（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ；Ｐ）ドメインを取り囲む。高度に可変的なＰ２サブドメインからなるＰドメインは、柔軟なヒンジ領域によりＳドメインに連結されている。Ｐ２サブドメインは、主要な中和エピトープを宿し、組織血液型抗原（ＨＢＧＡ）と相互作用する（Ｈｕｔｓｏｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００３、７７：４０５～４１５頁）。
【0006】
[0006] ノロウイルスは、遺伝学的におよび抗原的に多様であり、系統発生的に７つの異なる遺伝子型群（ＧＩ～ＧＶＩＩ）および少なくとも４１の異なる遺伝子型に現在分類されている。ＧＩ、ＧＩＩ、およびＧＩＶのウイルスはヒトに感染し、ＧＩおよびＧＩＩからのウイルスはほぼすべてのヒト感染の原因となる。１９９０年代半ば以降、遺伝子型群ＩＩ遺伝子型４（ＧＩＩ．４）からのウイルスは、２～３年毎の新たな変異型の出現と共に、大流行の大部分を引き起こしている。さらに、ＧＩＩ．４関連疾患は、他の遺伝子型により引き起こされるものよりも重度であることが報告されている。２０１２年に、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ変異型が出現し、それ以降、流布している変異型の間で優勢であり続けている（Ｖｉｎｊｅ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１５、５３：３７３～３８１頁）。新たなＧＩＩ．４変異型の経時的な出現は世界的な流行病の増加数と相関しており、これは、古い変異型が周期的に置き換えられるＡ型インフルエンザウイルスと同様にＧＩＩ．４変異型は進化し得るという事実をサポートする。
【0007】
[0007] ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトノロウイルスを培養するための多数の試みが為されてきたが、それらのいずれも、ウイルス増殖の堅牢であり再現性のあるシステムの確立を結果としてもたらしていない。したがって、２つの一般的なワクチンプラットフォーム、すなわち弱毒化または殺傷ウイルスワクチンは、ノロウイルスワクチンを開発するために利用可能となっていない。しかしながら、ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）の発見は、ノロウイルス感染、疾患およびワクチン製造を研究するための新たな扉を開いた。真核発現システム中で高いレベルで発現される場合、ノロウイルスのＶＰ１タンパク質は、ネイティブなノロウイルスビリオンを構造的に模倣するＶＬＰに自己集合する。ＶＬＰは、感染性遺伝材料を欠きながら、ウイルスカプシドタンパク質の真正確認（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を保存している。透過電子顕微鏡法により観察した場合、ＶＬＰは、ヒト糞便試料から単離された感染性ビリオンから形態学的に区別不可能である。結果的に、ＶＬＰは、細胞受容体とのウイルスの機能的な相互作用を模倣し、それにより、感染を再現するかまたは引き起こす能力を欠きながら適切な宿主免疫応答を誘発する能力を有する。したがって、ほとんどのワクチン候補は、ＶＬＰの異なるバリエーションに基づく。ノロウイルスの高い多様性に起因して、ノロウイルスワクチン開発における大きな目標は、複数の遺伝子型を広く中和する能力を有する交差反応性抗体応答を誘導する製剤を調製することである。チンパンジーでの交差負荷（Ｃｒｏｓｓ－ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ）研究は、ＧＩＩ．４ ＶＬＰでのワクチン接種をされた動物は、ＧＩ．１ノロウイルスで負荷された場合に感染から保護されないことを実証した（Ｂｏｋら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１１、１０８（１）：３２５～３０頁）。これを考慮して、Ｔａｋｅｄａ Ｖａｃｃｉｎｅｓは、主要なヒト遺伝子型群の各々を表すＶＬＰを含むノロウイルスに対する二価ＶＬＰベースワクチンを開発している。遺伝子型群Ｉ（ＧＩ）ＶＬＰは、最初に同定されたノロウイルスであるＮｏｒｗａｌｋウイルスに基づき、遺伝子型１（ＧＩ．１）である。第２のＶＬＰは、Ｈｏｕｓｔｏｎ（２００２）、Ｙｅｒｓｅｋｅ（２００６）およびＤｅｎ Ｈａａｇ（２００６）ＧＩＩ．４変異型からの配列を組み合わせることにより作製された「コンセンサス」ＧＩＩ．４ ＶＬＰである（Ｐａｒｒａら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１２、３０、３５８０～３５８６頁；Ｔｒｅａｎｏｒら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０１４、２１０、１７６３～１７７１頁）。ＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰは、３０年の期間にかけて流布している異なるＧＩＩ．４変異型のＶＬＰのパネルに対して高いＡｂ力価を誘導した（Ｐａｒｒａら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２０１２、３０（２４）：３５８０～３５８６頁）。
【0008】
[0008] 有望なワクチン製剤が開発されているが、ワクチン接種での抗体応答または自然感染後の抗体応答の測定は依然として課題のままである。いくつかのアッセイセットアップ、例えば中和および遮断アッセイが開発されているが、これらのアッセイは、時間を消費し、複雑であり、高価であり、ノロウイルスのある特定のタイプに依然として限定されている。
【0009】
[0009] 一般に、ウイルスが細胞に感染することを止める抗体を測定する中和アッセイは、ワクチンの有効性を評価するために最も一般的に使用される。ヒト腸管エンテロイド（ＨＩＥ）の応用によりヒトノロウイルスの培養を可能にするオルガノイドベース感染システムが、ごく最近になって利用可能となった（Ｅｔｔａｙｅｂｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６、３５３、１３８７～１３９３頁；Ｊｏｎｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１４、３４６、７５５～７５９頁）。これらのシステムは、中和ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を特徴付けるために価値のあるものとなっているが（Ａｌｖａｄｒｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１８、１５５（６）：１８９８～１９０７頁）、依然として高度に可変的で高価であり、ルーチンの試料試験のために必要とされる再現性および信頼性を有する中和アッセイを確立するために未だ好適でない。さらに、これらの感染システムは、取扱いが容易でなく、調べられる各々のノロウイルス株のために適合される必要がある。さらに、中和アッセイは、試験は生ウイルスおよびオルガノイドを使用するので、病院は言うまでもなく、ほとんどの実験室にとって利用可能でない可能性があるインフラストラクチャーを要求する。
【0010】
[0010] ノロウイルスは、細胞表面炭水化物、例えば重要な接着因子として同定されているＨＢＧＡと相互作用することが示されている（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１５、８９、２０２４～２０４０頁）。生ウイルスのための代用物としてノロウイルスＶＬＰを使用する遮断アッセイが、ウイルス中和アッセイのための代用として開発されている。これらのアッセイは、細胞表面炭水化物へのノロウイルスＶＬＰの結合を遮断する血清抗体の能力を測定する。ヒトにおけるノロウイルス免疫の相関はわずかにしか理解されていないが、遮断抗体は、ワクチン接種されたヒト対象が感染量のウイルスＲＮＡで負荷されたヒト感染および負荷モデルにおいて保護の相関が見出されている（Ａｔｍａｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１５、２２（８）：９２３～９２９頁；Ｒａｍａｎｉら、ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ２０１６、１２（４）：ｅ１００５３３４）。遮断アッセイにおいてＶＬＰ結合のために選択される基質は、いくつかのヒトＨＢＧＡを含有することからブタ胃ムチン（ＰＧＭ）である。しかしながら、遮断アッセイは高価であり、十分な再現性を依然として欠いている。さらに、大きな制限は、すべてのノロウイルスＶＬＰがＰＧＭに結合できるわけではないことであり、これはいくつかのノロウイルス株を診断から除外する（Ｌｉｎｄｅｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１２、８６、８７３～８８３頁）。
【0011】
[0011] 上記を考慮して、任意のノロウイルス株に応用可能であるノロウイルス反応性抗体を決定する信頼できる、迅速で安価な方法に対する緊急の必要性が存在する。
【0012】
[0012] 多数の参考文献が本明細書の全体を通じて参照される。本明細書において参照される参考文献の各々は、参照により全体が本明細書に個々に組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書の開示が優先される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
[0013] ノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法を提供することが本開示の目的である。
【0014】
[0014] ノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、良好な再現性、高い正確性および高い精度を提供する方法を提供することが本開示のさらなる目的である。
【0015】
[0015] ノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、良好な感度を提供する方法を提供することが本開示のさらなる目的である。
【0016】
[0016] ノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、高いコスト有効性および短いターンアラウンド時間に起因して、ハイスループット応用のための可能性を提供する方法を提供することが本開示のさらなる目的である。
【0017】
[0017] ノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、１つまたは複数のノロウイルスに対するワクチン接種後の免疫応答の質をモニターするための可能性を提供する方法を提供することが本開示のさらなる目的である。
【0018】
[0018] ノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、特定のノロウイルス株に限定されない方法を提供することが本開示のさらなる目的である。
【0019】
[0019] ノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、異なるアイソタイプ、例えばＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧからのノロウイルス反応性抗体の間で区別するための可能性を提供する方法を提供することが本開示のさらなる目的である。
【0020】
[0020] ノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、１つの単一の実験において複数の異なるノロウイルス、例えば遺伝子型群Ｉおよび遺伝子型群ＩＩのノロウイルスに対して反応性の抗体の存在および／または量を決定するための可能性を提供する方法を提供することが本開示のさらなる目的である。
【0021】
[0021] ノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、ノロウイルス中和および／またはノロウイルス遮断抗体を決定するための可能性を提供する方法を提供することが本開示のさらなる目的である。
【0022】
[0022] ノロウイルス感染を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を提供することが本開示のさらなる目的である。
【0023】
[0023] ノロウイルス感染からの保護を決定するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を提供することが本開示のさらなる目的である。
【0024】
[0024] ノロウイルスＶＬＰが固定化され得る結合パートナーを提供することが本開示のさらなる目的である。
【0025】
[0025] ノロウイルス反応性抗体を決定するためのキットを提供することが本開示のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【0026】
[0026] 本開示は、したがって、ノロウイルスＶＬＰに連結されたマイクロスフェアを含むマイクロスフェア複合体に向けられる。
【0027】
[0027] 本開示は、したがって、所定量の少なくとも１つの上述したマイクロスフェア複合体および任意選択により所定量の検出抗体を含むキットにさらに向けられる。追加的に、本開示は、したがって、所定量の少なくとも１つの上述したマイクロスフェア複合体および任意選択により所定量の、少なくとも１つのマイクロスフェア複合体のノロウイルスＶＬＰに結合する少なくとも１つのレポーター抗体を含むキットにさらに向けられる。
【0028】
[0028] 本開示は、したがって、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）に、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１におけるノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体と接触させて、ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、検出抗体を結合させる工程であって、検出抗体が、検出抗体の可変領域を用いてノロウイルス反応性抗体に結合し、検出抗体が、検出可能な標識に取り付けられている、工程、および
工程３：工程２におけるノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体からのシグナルを検出する工程
を含み、方法が、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定された検出抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、方法にさらに向けられる。
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）に、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１におけるノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体と接触させて、ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、検出抗体を結合させる工程であって、検出抗体が、検出抗体の可変領域を用いてノロウイルス反応性抗体に結合し、検出抗体が、検出可能な標識に取り付けられている、工程、および
工程３：工程２におけるノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体からのシグナルを検出する工程
を含み、方法が、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定された検出抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、方法にさらに向けられる。
【0029】
[0029] 本開示は、そのため、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体を、試料と接触させて、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なる、工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１における第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体と接触させて、ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、検出抗体を結合させる工程であって、検出抗体が、検出抗体の可変領域を用いてノロウイルス反応性抗体に結合し、検出抗体が、第３の検出可能な標識に取り付けられている、工程、
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体からのシグナルを検出する工程、
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程、ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における検出抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含み、方法が、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定された検出抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、方法にさらに向けられる。
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体を、試料と接触させて、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なる、工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１における第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体と接触させて、ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、検出抗体を結合させる工程であって、検出抗体が、検出抗体の可変領域を用いてノロウイルス反応性抗体に結合し、検出抗体が、第３の検出可能な標識に取り付けられている、工程、
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体からのシグナルを検出する工程、
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程、ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における検出抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含み、方法が、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定された検出抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、方法にさらに向けられる。
【0030】
[0030] 本開示は、したがって、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体および所定量の上述したレポーター抗体を含む、キットを用意する工程であって、レポーター抗体がマイクロスフェア複合体のノロウイルスＶＬＰに結合するものである、工程、
工程２：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を試料と接触させて、レポーター抗体と競合しながら、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２におけるノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含み、方法が、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、方法にさらに向けられる。
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体および所定量の上述したレポーター抗体を含む、キットを用意する工程であって、レポーター抗体がマイクロスフェア複合体のノロウイルスＶＬＰに結合するものである、工程、
工程２：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を試料と接触させて、レポーター抗体と競合しながら、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２におけるノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含み、方法が、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、方法にさらに向けられる。
【0031】
[0031] 本開示は、したがって、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法であって、
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体と、所定量の少なくとも２つの上述したレポーター抗体とを含むキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、少なくとも２つのレポーター抗体と競合しながら、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３におけるレポーター抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる工程
を含み、方法が、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む方法にさらに向けられる。
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体と、所定量の少なくとも２つの上述したレポーター抗体とを含むキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、少なくとも２つのレポーター抗体と競合しながら、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３におけるレポーター抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる工程
を含み、方法が、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む方法にさらに向けられる。
【0032】
略語および定義
略語
[0032] 「ＰＥ」はフィコエリトリンを表す。「ＶＬＰ」はウイルス様粒子を指す。「ＶＬＰｓ」はウイルス様粒子を指す。「ＭＦＩ」はメジアン蛍光強度を指す。「Ａｂ」および「Ａｂｓ」は抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）および抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を表す。「Ｉｇ」は免疫グロブリンを表す。「ｍＡｂ」はモノクローナル抗体を表す。「ＣＤＲ」は相補性決定領域を表す。「ＥＬＩＳＡ」は酵素連結免疫吸着アッセイを指す。「ＰＧＭ」はブタ胃ムチンを指す。「ＧＩ」、「ＧＩＩ」、「ＧＩＶ」は、それぞれ遺伝子型群Ｉ、ＩＩ、およびＩＶを指す。「ＶＰ１」はメジャーなウイルスカプシドタンパク質を表す。「ＶＰ２」はマイナーなウイルスカプシドタンパク質を表す。
略語
[0032] 「ＰＥ」はフィコエリトリンを表す。「ＶＬＰ」はウイルス様粒子を指す。「ＶＬＰｓ」はウイルス様粒子を指す。「ＭＦＩ」はメジアン蛍光強度を指す。「Ａｂ」および「Ａｂｓ」は抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）および抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を表す。「Ｉｇ」は免疫グロブリンを表す。「ｍＡｂ」はモノクローナル抗体を表す。「ＣＤＲ」は相補性決定領域を表す。「ＥＬＩＳＡ」は酵素連結免疫吸着アッセイを指す。「ＰＧＭ」はブタ胃ムチンを指す。「ＧＩ」、「ＧＩＩ」、「ＧＩＶ」は、それぞれ遺伝子型群Ｉ、ＩＩ、およびＩＶを指す。「ＶＰ１」はメジャーなウイルスカプシドタンパク質を表す。「ＶＰ２」はマイナーなウイルスカプシドタンパク質を表す。
【0033】
定義
[0033] 本開示および請求項において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に規定しなければ、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈される。
[0033] 本開示および請求項において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に規定しなければ、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈される。
【0034】
[0034] 用語「および／または」は、語句、例えば本明細書における「Ａおよび／またはＢ」において使用される場合、「ＡおよびＢ」、「Ａ」、ならびに「Ｂ」を含むことが意図される。
【0035】
[0035] オープンな用語、例えば「含む」（ｉｎｃｌｕｄｅ）、「含む」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、「含有する」（ｃｏｎｔａｉｎ）、および「含有する」（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）などは「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）を意味する。これらのオープンエンドの移行句は、追加の、記載されていない要素または方法工程を除外しない、要素または方法工程などのオープンエンドのリストを導入するために使用される。
【0036】
[0036] 他に指し示されなければ、本明細書および請求項において使用される成分、特性、例えば分子量、および反応条件などの量を表すすべての数は、すべての場合において用語「約」により修飾されているとして理解されるべきである。本明細書において使用される場合、用語「約」および「おおよそ」は数の１０～１５％以内を意味する。一部の実施形態において、「約」は数の５～１０％以内を意味する。
【0037】
抗体および関連する用語
[0037] 本明細書において使用される場合、用語「抗体（Ａｂ）」（複数：「抗体（Ａｂｓ）」）は、ジスルフィド結合により相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖である４つのポリペプチド鎖から一般に構成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（全長Ａｂ）を指し、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得られ得る、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。Ａｂは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得られ得る。全長Ａｂにおいて、各々の重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各々の軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域を差し挟まれた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域にさらに分けられ得る。各々のＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で並べられた、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。本開示のある特定の実施形態において、ＡｂのＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよいか、または天然にもしくは人工的に改変されていてもよい。用語ＡｂまたはＡｂｓはまた、その任意の機能性断片、突然変異体、変異型、または誘導体を指すことができる。そのような機能性断片、突然変異体、変異型、または誘導体の抗体フォーマットは当技術分野において公知である。Ａｂ断片、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片は、従来技術、例えば全長Ａｂのそれぞれパパインまたはペプシン消化を使用して、全長Ａｂから調製され得る。機能性断片は特に、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィドブリッジにより連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含む、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４～５４６頁、Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ国際公開第９０／０５１４４ Ａ１号パンフレット）；ならびに（ｖｉ）単離されたＣＤＲである。さらには、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらが作られることを可能にする合成リンカーにより接続され得る（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３頁を参照）。一部の実施形態において、ｓｃＦｖ分子は融合タンパク質中に組み込まれてもよい。単鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディもまた包含される。ダイアボディは二価の二特異性抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインは、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするためには短すぎるリンカーを使用しており、それにより、これらのドメインは別の鎖の相補的なドメインと対合することを強制され、２つの抗原結合性部位を作出する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４～６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１～１１２３頁を参照）。そのような機能性断片は当技術分野において公知である（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ７９０頁（ＩＳＢＮ ３－５４０－４１３５４－５））。Ａｂは、Ａｂがいずれの抗原に結合できるのかを表すために用語「抗抗原Ａｂ」により記載されることがある。例えば、「抗ノロウイルスＡｂ」は、ノロウイルス抗原に結合するＡｂを指す。ＡｂまたはＡｂｓは、一特異性、二特異性、または多特異性であってもよい。多特異性Ａｂは、１つの抗原の異なるエピトープに特異的に結合してもよいか、または２つもしくはより多くの関連しない抗原に特異的に結合してもよい。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０～６９頁；Ｋｕｆｅｒら、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８～２４４頁を参照。本開示の多特異性抗原結合性分子のいずれかを含むＡｂ、またはその変異型は、当業者に公知のように、標準的な分子生物学技術（例えば、組換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術）、例えば細胞内発現システムを使用して構築されてもよい。Ａｂは、２つまたはより多くの抗原結合性部位を含む多価Ａｂであってもよい。１つもしくは複数のＣＤＲ残基の置換または１つもしくは複数のＣＤＲの省略もまた可能である。Ａｂは、１または２つのＣＤＲが結合のためにほとんど効果を有さずに省かれ得ることが科学文献において記載されている。公開された結晶構造に基づく、Ａｂとそれらの抗原との間の接触領域の分析は、ＣＤＲ残基の約５分の１から３分の１のみが抗原と実際に接触することを明らかにした。さらに、多くのＡｂは、抗原と接触しているアミノ酸がない１または２つのＣＤＲを有する（Ｐａｄｌａｎら ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９５、９：１３３～１３９頁、Ｖａｊｄｏｓら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００２、３２０：４１５～４２８頁）。抗原と接触していないＣＤＲ残基は、分子モデリングによりかつ／または経験的に、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から、先行する研究に基づいて同定され得る（例えば重鎖のＣＤＲ２中の残基Ｈ６０～Ｈ６５は多くの場合に要求されない）。ＣＤＲまたはその残基が省略される場合、それは、通常は、別のヒトＡｂ配列中の対応する位置を占有するアミノ酸またはそのような配列のコンセンサスで置換される。ＣＤＲ内の置換のための位置および置換するためのアミノ酸はまた、経験的に選択され得る。経験的な置換は保存的または非保存的置換であることができる。用語ＡｂまたはＡｂｓは、ある特定の起源種を起源とするＡｂまたはＡｂｓを指すことができ、これは、例えば、ウサギ、マウス、ヒト、サル、またはラットを起源とするもの（ウサギＡｂ、マウスＡｂ、ヒトＡｂ、サルＡｂ、またはラットＡｂ）を含む。例えば、ウサギ起源は、ウサギ生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有するＡｂを含むことが意図され得る。Ａｂは、対応する生殖系列配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含んでもよい。Ａｂはまた、例えばＣＤＲ中に、起源種生殖系列免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異）を含んでもよい。本明細書において使用される場合、ある特定の起源種（例えばウサギ）を起源とするＡｂまたはＡｂｓはまた、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖系列に由来するＣＤＲまたは他の配列が起源種（例えばウサギ）フレームワーク領域（ＦＲ）配列にグラフトされているＡｂまたはＡｂｓを指すことができる。ＡｂはキメラＡｂであってもよい。キメラＡｂは、異なる種の生殖系列に由来する配列を包含してもよく、さらなるアミノ酸置換または挿入を含むこともできる。Ａｂは、最小の非ヒト（例えば、マウス）配列を含有するヒト免疫グロブリンであるヒト化Ａｂであってもよい。典型的には、ヒト化抗体において、ヒトＣＤＲからの残基は、非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターなど）のＣＤＲからの残基により置き換えられている（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ １９８６頁；３２１：５２２～５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ １９８８、３３２：３２３～３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８、２３９：１５３４～１５３頁）。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の非限定的な例は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９４、ＵＳＡ ９１：９６９～９７３頁；およびＲｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６；９：８９５～９０４頁において記載されている。Ａｂは、任意のクラスまたはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）ならびにサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のＡｂであることができる。一部の実施形態において、抗体はＩｇＧアイソタイプの抗体である。一部の実施形態において、ＡｂはＩｇＭアイソタイプのＡｂである。一部の実施形態において、ＡｂはＩｇＡアイソタイプのＡｂである。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および３次元構成を有する。Ａｂは、１つより多くのクラスまたはサブクラスからの配列を含んでもよい。用語ＡｂまたはＡｂｓは、中和もしくは非中和Ａｂまたは中和もしくは非中和Ａｂｓを指すことができる。用語ＡｂまたはＡｂｓはモノクローナルＡｂまたはモノクローナルＡｂｓを指すことができる。用語ＡｂまたはＡｂｓはレポーターＡｂまたはレポーターＡｂｓを指すことができる。用語ＡｂまたはＡｂｓは検出Ａｂまたは検出Ａｂｓを指すことができる。
[0037] 本明細書において使用される場合、用語「抗体（Ａｂ）」（複数：「抗体（Ａｂｓ）」）は、ジスルフィド結合により相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖である４つのポリペプチド鎖から一般に構成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（全長Ａｂ）を指し、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得られ得る、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。Ａｂは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得られ得る。全長Ａｂにおいて、各々の重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各々の軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域を差し挟まれた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域にさらに分けられ得る。各々のＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で並べられた、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。本開示のある特定の実施形態において、ＡｂのＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよいか、または天然にもしくは人工的に改変されていてもよい。用語ＡｂまたはＡｂｓはまた、その任意の機能性断片、突然変異体、変異型、または誘導体を指すことができる。そのような機能性断片、突然変異体、変異型、または誘導体の抗体フォーマットは当技術分野において公知である。Ａｂ断片、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片は、従来技術、例えば全長Ａｂのそれぞれパパインまたはペプシン消化を使用して、全長Ａｂから調製され得る。機能性断片は特に、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィドブリッジにより連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含む、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４～５４６頁、Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ国際公開第９０／０５１４４ Ａ１号パンフレット）；ならびに（ｖｉ）単離されたＣＤＲである。さらには、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらが作られることを可能にする合成リンカーにより接続され得る（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３頁を参照）。一部の実施形態において、ｓｃＦｖ分子は融合タンパク質中に組み込まれてもよい。単鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディもまた包含される。ダイアボディは二価の二特異性抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインは、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするためには短すぎるリンカーを使用しており、それにより、これらのドメインは別の鎖の相補的なドメインと対合することを強制され、２つの抗原結合性部位を作出する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４～６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１～１１２３頁を参照）。そのような機能性断片は当技術分野において公知である（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ７９０頁（ＩＳＢＮ ３－５４０－４１３５４－５））。Ａｂは、Ａｂがいずれの抗原に結合できるのかを表すために用語「抗抗原Ａｂ」により記載されることがある。例えば、「抗ノロウイルスＡｂ」は、ノロウイルス抗原に結合するＡｂを指す。ＡｂまたはＡｂｓは、一特異性、二特異性、または多特異性であってもよい。多特異性Ａｂは、１つの抗原の異なるエピトープに特異的に結合してもよいか、または２つもしくはより多くの関連しない抗原に特異的に結合してもよい。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０～６９頁；Ｋｕｆｅｒら、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８～２４４頁を参照。本開示の多特異性抗原結合性分子のいずれかを含むＡｂ、またはその変異型は、当業者に公知のように、標準的な分子生物学技術（例えば、組換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術）、例えば細胞内発現システムを使用して構築されてもよい。Ａｂは、２つまたはより多くの抗原結合性部位を含む多価Ａｂであってもよい。１つもしくは複数のＣＤＲ残基の置換または１つもしくは複数のＣＤＲの省略もまた可能である。Ａｂは、１または２つのＣＤＲが結合のためにほとんど効果を有さずに省かれ得ることが科学文献において記載されている。公開された結晶構造に基づく、Ａｂとそれらの抗原との間の接触領域の分析は、ＣＤＲ残基の約５分の１から３分の１のみが抗原と実際に接触することを明らかにした。さらに、多くのＡｂは、抗原と接触しているアミノ酸がない１または２つのＣＤＲを有する（Ｐａｄｌａｎら ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９５、９：１３３～１３９頁、Ｖａｊｄｏｓら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００２、３２０：４１５～４２８頁）。抗原と接触していないＣＤＲ残基は、分子モデリングによりかつ／または経験的に、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から、先行する研究に基づいて同定され得る（例えば重鎖のＣＤＲ２中の残基Ｈ６０～Ｈ６５は多くの場合に要求されない）。ＣＤＲまたはその残基が省略される場合、それは、通常は、別のヒトＡｂ配列中の対応する位置を占有するアミノ酸またはそのような配列のコンセンサスで置換される。ＣＤＲ内の置換のための位置および置換するためのアミノ酸はまた、経験的に選択され得る。経験的な置換は保存的または非保存的置換であることができる。用語ＡｂまたはＡｂｓは、ある特定の起源種を起源とするＡｂまたはＡｂｓを指すことができ、これは、例えば、ウサギ、マウス、ヒト、サル、またはラットを起源とするもの（ウサギＡｂ、マウスＡｂ、ヒトＡｂ、サルＡｂ、またはラットＡｂ）を含む。例えば、ウサギ起源は、ウサギ生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有するＡｂを含むことが意図され得る。Ａｂは、対応する生殖系列配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含んでもよい。Ａｂはまた、例えばＣＤＲ中に、起源種生殖系列免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異）を含んでもよい。本明細書において使用される場合、ある特定の起源種（例えばウサギ）を起源とするＡｂまたはＡｂｓはまた、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖系列に由来するＣＤＲまたは他の配列が起源種（例えばウサギ）フレームワーク領域（ＦＲ）配列にグラフトされているＡｂまたはＡｂｓを指すことができる。ＡｂはキメラＡｂであってもよい。キメラＡｂは、異なる種の生殖系列に由来する配列を包含してもよく、さらなるアミノ酸置換または挿入を含むこともできる。Ａｂは、最小の非ヒト（例えば、マウス）配列を含有するヒト免疫グロブリンであるヒト化Ａｂであってもよい。典型的には、ヒト化抗体において、ヒトＣＤＲからの残基は、非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターなど）のＣＤＲからの残基により置き換えられている（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ １９８６頁；３２１：５２２～５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ １９８８、３３２：３２３～３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８、２３９：１５３４～１５３頁）。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の非限定的な例は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９４、ＵＳＡ ９１：９６９～９７３頁；およびＲｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６；９：８９５～９０４頁において記載されている。Ａｂは、任意のクラスまたはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）ならびにサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のＡｂであることができる。一部の実施形態において、抗体はＩｇＧアイソタイプの抗体である。一部の実施形態において、ＡｂはＩｇＭアイソタイプのＡｂである。一部の実施形態において、ＡｂはＩｇＡアイソタイプのＡｂである。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および３次元構成を有する。Ａｂは、１つより多くのクラスまたはサブクラスからの配列を含んでもよい。用語ＡｂまたはＡｂｓは、中和もしくは非中和Ａｂまたは中和もしくは非中和Ａｂｓを指すことができる。用語ＡｂまたはＡｂｓはモノクローナルＡｂまたはモノクローナルＡｂｓを指すことができる。用語ＡｂまたはＡｂｓはレポーターＡｂまたはレポーターＡｂｓを指すことができる。用語ＡｂまたはＡｂｓは検出Ａｂまたは検出Ａｂｓを指すことができる。
【0038】
[0038] 本明細書において使用される場合、用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、Ａｂ可変配列内のＣＤＲを指す。重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の各々において３つのＣＤＲがあり、これらは、可変領域の各々について、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（または特にＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、およびＶＬ－ＣＤＲ３）と呼称される。用語ＣＤＲは、抗原に結合する能力を有する単一の可変領域中に存在する３つのＣＤＲの群を指すことができる。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なって定義され得る。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））により記載されるシステムは、抗体の任意の可変領域に応用可能な明瞭な残基システムを指すが、３つのＣＤＲを定義する精密な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとして参照されることがある。ＶＨ領域について、超可変領域は、ＶＨ－ＣＤＲ１についてアミノ酸３１～３５位、ＶＨ－ＣＤＲ２についてアミノ酸５０～６５位、およびＶＨ－ＣＤＲ３についてアミノ酸９５～１０２位の範囲に及ぶ。ＶＬ領域について、超可変領域は、ＶＬ－ＣＤＲ１についてアミノ酸２４～３４位、ＶＬ－ＣＤＲ２についてアミノ酸５０～５６位、およびＶＬ－ＣＤＲ３についてアミノ酸８９～９７位の範囲に及ぶ。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者ら（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７頁（１９８７）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７～８８３頁（１９８９））は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内のある特定のサブポーションは、アミノ酸配列のレベルにおいて大きい多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格配座を取ることを見出した。これらのサブポーションは、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と呼称され、「Ｌ」および「Ｈ」はそれぞれ軽鎖および重鎖領域を呼称する。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲとして参照されることがあり、これらはＫａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップする境界を有する。Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップするＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３～１３９頁（１９９５））およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２（５）：７３２～４５頁（１９９６））により記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は上記のシステムのものに厳密に従わないことがあるが、それにもかかわらずＫａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップし、但しそれらは、特有の残基もしくは残基の群またはＣＤＲ全体さえもが抗原結合に重大に影響しないという予測または実験的発見に照らして短縮または延長され得る。本明細書において使用される方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用してもよい。一部の実施形態において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａの方法に従って定義される。
【0039】
[0039] 本明細書において使用される場合、用語「フレームワーク」、「フレームワーク領域（ＦＲ）」または「フレームワーク配列」は、可変領域からＣＤＲを除いた残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は異なるシステムにより決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、対応的に異なる解釈に供される。６つのＣＤＲ（ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、およびＶＬ－ＣＤＲ３ならびにＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３）はまた、軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）上のフレームワーク領域を各々の鎖上の４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２との間、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３との間、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４との間に位置付けられる。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４として特有のサブ領域を特定することなく、フレームワーク領域は、他の者らにより言及されるように、単一の、天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わせられたＦＲｓを表す。本明細書において使用される場合、ＦＲは４つのサブ領域のうちの１つを表し、ＦＲｓは、フレームワーク領域を構成する４つのサブ領域のうちの２つまたはより多くを表す。
【0040】
[0040] 本明細書において使用される場合、Ａｂの用語「定常領域」は重鎖定常領域（ＣＨ）および／または軽鎖定常領域（ＣＬ）を指す。
【0041】
[0041] 本明細書において使用される場合、Ａｂの用語「可変領域」は重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を指す。
【0042】
[0042] 本明細書において使用される場合、用語「～に結合する」、「～に結合性の」、または「～に結合する能力を有する」は、～に結合するまたは結合性のまたは結合する能力を有するＡｂの文脈において、ある特定の抗原に結合することができるＡｂを指す。抗原はそれ自体が抗体であることができる。ある特定の抗原に結合する能力は、ＥＬＩＳＡ、またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を含む当技術分野において周知の方法により調べられ得る。一部の実施形態において、抗原に結合するまたは結合性のまたは結合する能力を有するＡｂは、好適な方法において抗原への結合について試験された場合にバックグラウンドシグナルよりも少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％高いシグナルを提供する。実施形態において、Ａｂは、Ａｂ可変領域を用いて抗原に結合することができる。
【0043】
[0043] 本明細書において使用される場合、用語「～に結合しない」は、ある特定の抗原に結合しないＡｂの文脈において、ある特定の抗原に結合することができないＡｂを指す。Ａｂがある特定の抗原「に結合しない」ことは、ＥＬＩＳＡ、またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を含む当技術分野において周知の方法において決定され得る。一部の実施形態において、ある特定の抗原に結合しないＡｂは、好適な方法において抗原への結合について試験された場合にバックグラウンドシグナルを下回るかまたはバックグラウンドシグナルをわずかにのみ上回るシグナルを提供する。
【0044】
[0044] 本明細書において使用される場合、用語「結合させる」は、Ａｂの文脈において、Ａｂが、マイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰまたは別のＡｂ、例えばレポーターＡｂのような抗原と、Ａｂが抗原に結合することを可能にするある特定の時間にわたりインキュベートされる状況を指す。Ａｂが抗原に結合しない場合、結合は起こらない。
【0045】
[0045] 本明細書において使用される場合、用語「～に結合した」は、～に結合したＡｂの文脈において、抗原に結合したＡｂを指す。Ａｂは、抗体可変領域を用いて抗原に結合している。その文脈における抗原はノロウイルスＶＬＰまたは別の抗体であってもよい。例えば、検出Ａｂは、検出Ａｂ可変領域を用いてレポーターＡｂに結合している。
【0046】
[0046] 本明細書において使用される場合、「ノロウイルス反応性抗体」は、ノロウイルス抗原に結合する能力を有するＡｂである。ノロウイルス反応性抗体はまた、ノロウイルス中和および／またはノロウイルス遮断Ａｂであってもよい。ノロウイルス反応性抗体は、１つのノロウイルスにのみ結合するＡｂまたは異なるノロウイルスに結合する能力を有するＡｂ、すなわち交差反応性Ａｂであってもよい。例えば、ノロウイルス反応性抗体は、遺伝子型群Ｉのノロウイルスからのノロウイルス抗原および遺伝子型群ＩＩのノロウイルスからのノロウイルス抗原に結合する能力を有してもよい。
【0047】
[0047] 「ノロウイルス中和Ａｂ」は、本明細書において使用される場合、ノロウイルス中和アッセイにおいて検出下限および／またはバックグラウンドを上回るシグナルを提供するＡｂを指すことが意図される。一部の実施形態において、シグナルは、ノロウイルス中和アッセイにおいて検出下限および／またはバックグラウンドを少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％上回る。ノロウイルス中和Ａｂは、単独でもしくは適切な製剤化において他の抗ウイルス剤との予防もしくは治療剤としての組合せで、または活性ワクチン接種との関連で、または診断ツールとして使用されてもよい。用語「ノロウイルス中和Ａｂ」は、宿主において感染を開始および／または永続化させるノロウイルスの能力を予防するか、阻害するか、低減させるか、妨害するか、またはそれに干渉するＡｂを指すことができる。ノロウイルス中和Ａｂが結合するエピトープは、「中和エピトープ」として参照されることがある。ノロウイルス中和Ａｂはまた、ノロウイルス遮断Ａｂであってもよい。
【0048】
[0048] 「ノロウイルス中和アッセイ」は、本明細書において使用される場合、ノロウイルス中和Ａｂを測定する任意のアッセイを指す。例えば、１つのノロウイルス中和アッセイはヒト腸管エンテロイド（ＨＩＥ）を使用する。このアッセイは、試料との生ノロウイルスのインキュベーションおよび生ノロウイルスによるオルガノイドの感染のモニタリングにより試料内の中和Ａｂを検出する。この方法は、例えば、Ｅｔｔａｙｅｂｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６、３５３、１３８７～１３９３頁；Ｊｏｎｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１４、３４６、７５５～７５９頁において記載されている。
【0049】
[0049] 「ノロウイルス遮断Ａｂ」は、本明細書において使用される場合、ノロウイルス遮断アッセイにおいて検出下限および／またはバックグラウンドを上回るシグナルを提供するＡｂを指すことが意図される。一部の実施形態において、シグナルは、ノロウイルス遮断アッセイにおいて検出下限および／またはバックグラウンドを少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％上回る。ノロウイルス遮断Ａｂは、細胞表面炭水化物、例えばＨＢＧＡへのノロウイルスＶＬＰおよび／またはノロウイルスの結合を遮断する。ノロウイルス遮断Ａｂはまた、ノロウイルス中和Ａｂであってもよい。
【0050】
[0050] 「ノロウイルス遮断アッセイ」は、本明細書において使用される場合、細胞表面炭水化物、例えばＨＢＧＡを使用するアッセイを指す。アッセイは、試料とのノロウイルスＶＬＰのインキュベーションおよび細胞表面炭水化物への前記ノロウイルスＶＬＰの結合のモニタリングにより試料内のノロウイルス遮断Ａｂを検出する。細胞表面炭水化物を含有する一般的に使用される基質はＰＧＭである（「ＰＧＭ遮断アッセイ」）。方法は、例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９、１１、３９２、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１１０５０３９２）において記載されている。
【0051】
[0051] 本明細書において使用される場合、用語「抗体力価」は、試料内のＡｂのある特定の量を指す。試料は、血漿、尿、血液、または血清試料であってもよい。抗体力価は、肯定的な試験結果を依然として与えるかまたは試験において半数最大シグナルを与える（段階希釈系列における）最も高い希釈として表され得る。抗体力価はまた、試料中のＡｂの存在の指標となる値が、対照の結果としてもたらされるある特定の値、例えば対照を用いて与えられる最大値の５０％で補間される、補間力価の形態において表されてもよい。結果的に、用語「遮断抗体力価」または「遮断力価」は、試料内のノロウイルス遮断Ａｂのある特定の量を指す。Ａｂ力価は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ノロウイルス遮断アッセイ（「遮断力価」を結果としてもたらす）、またはノロウイルス中和アッセイ（「中和力価」を結果としてもたらす）を含む当技術分野において公知の様々な方法により決定され得る。
【0052】
[0052] 本明細書において使用される場合、用語「酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）」は、ＥＬＩＳＡセットアップに依存してＡｂまたは抗原の測定のためのイムノアッセイを指す。すべてのＥＬＩＳＡセットアップの鍵となる特色は、Ａｂまたは抗原が固定化されるプレートの応用である。例えば、試料内のＡｂを決定するために、Ａｂが結合する対応する抗原はプレート上に固定化される。別のセットアップにおいて、Ａｂは、試料内の抗原を検出するためにプレート上に固定化される。ＥＬＩＳＡのシグナルは、例えば、分光光度的方法により検出され得る、シグナルを生じさせる、酵素反応により生成される。応用される酵素の一般的な例はホースラディッシュペルオキシダーゼである。一般的なＥＬＩＳＡセットアップは、直接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、および逆ＥＬＩＳＡを含む。
【0053】
[0053] 本明細書において使用される場合、用語「モノクローナルＡｂ」（「ｍＡｂ」）は、同じ抗原決定因子（エピトープ）に結合する実質的に均質なＡｂの集団から得られるＡｂを指す。「実質的に均質な」は、個々のＡｂが、微量で存在し得る天然に存在する可能性がある突然変異を除いて同一であることを意味する。これは、様々な、異なる抗原決定因子（エピトープ）に対して方向付けられた異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体とは対照的である。モノクローナルＡｂは、当技術分野において公知の方法によるハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ １９７５、２５６：４９５～４９７頁）、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物により生成されてもよい。
【0054】
[0054] 本明細書において使用される場合、用語「ポリクローナルＡｂ」は、免疫化された動物の試料、例えばマウスまたはウサギ血清から得られるＡｂを指す。ポリクローナルＡｂの混合物の特徴は、Ａｂがすべて同じエピトープに結合するわけではないことである。
【0055】
[0055] 本明細書において使用される場合、用語「検出Ａｂ」は、本開示の方法において応用されるＡｂの他に、本開示のキットの部分であるＡｂを指す。一部の実施形態において、検出Ａｂは、検出抗体の可変領域を用いて試料内のノロウイルス反応性抗体に結合する能力を有する。検出Ａｂは、抗原についてのその特異性とは独立して、検出可能な標識に取り付けられる。一部の実施形態において、検出Ａｂは、検出抗体の重鎖定常領域を介して検出可能な標識に取り付けられる。一部の実施形態において、検出可能な標識は、蛍光標識、例えばＰＥである。
【0056】
[0056] 本明細書において使用される場合、用語「レポーターＡｂ」は、本出願の方法において応用されるＡｂの他に、本開示のキットの部分であるＡｂを指す。レポーターＡｂは、レポーター抗体の可変領域を用いて１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰに結合する能力を有する。レポーターＡｂは、１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰへの結合について、例えば試料内に存在する、他のＡｂと競合する能力を有する。一部の実施形態において、レポーターＡｂは、検出可能な標識に直接的に取り付けられる。一部の実施形態において、レポーターＡｂは、検出抗体の重鎖定常領域を介して検出可能な標識に直接的に取り付けられる。これらの実施形態において、レポーターＡｂは、レポーターＡｂそれ自体が検出可能な標識により検出され得るので、二次レポーターＡｂの追加の使用なしに本開示の方法において応用される。他の実施形態において、レポーターＡｂは、検出可能な標識に間接的に取り付けられる。これらの他の実施形態において、レポーターＡｂは、二次レポーターＡｂと共に本開示の方法において応用される。レポーターＡｂは交差反応性抗体であってもよい。一部の実施形態において、レポーターＡｂは、ｍＡｂおよび／またはノロウイルス中和Ａｂおよび／またはノロウイルス遮断Ａｂである。レポーター抗体は、１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰに対するある特定のＥＣ５０値、例えば、２μｇ／ｍＬもしくはそれ未満、１μｇ／ｍＬもしくはそれ未満、０．５μｇ／ｍＬもしくはそれ未満、０．１μｇ／ｍＬもしくはそれ未満、０．０５μｇ／ｍＬもしくはそれ未満、または０．０１μｇ／ｍＬもしくはそれ未満のＥＣ５０値を示す。
【0057】
[0057] 本明細書において使用される場合、用語「二次レポーターＡｂ」は、レポーター抗体に結合する能力を有する抗体を指す。一部の実施形態において、二次レポーターＡｂは、二次レポーターＡｂの可変領域を用いてレポーター抗体の重鎖定常領域に結合する。本開示の意味において、二次レポーターＡｂは、検出可能な標識に直接的に取り付けられる。一部の実施形態において、検出可能な標識は、二次レポーター抗体の重鎖定常領域に取り付けられる。
【0058】
[0058] 本明細書において使用される場合、「交差反応性抗体」は、１つより多くの抗原に結合する能力を有するＡｂを指す。例えば、Ａｂは、ＧＩＩ．４ノロウイルスまたはノロウイルスＶＬＰに結合し、ＧＩＩ．１ノロウイルスまたはノロウイルスＶＬＰにも結合する場合に、「交差反応性抗体」として参照され得る。例えば、１つまたは複数のノロウイルス抗原に対して交差反応性の抗体は、２μｇ／ｍＬもしくはそれ未満、１μｇ／ｍＬもしくはそれ未満、０．５μｇ／ｍＬもしくはそれ未満、０．１μｇ／ｍＬもしくはそれ未満、０．０５μｇ／ｍＬもしくはそれ未満、または０．０１μｇ／ｍＬもしくはそれ未満の１つまたは複数のノロウイルス抗原に対するＥＣ５０値を示す。
【0059】
[0059] 本明細書において使用される場合、用語「ＥＣ５０値」は、マイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰに対する飽和における最大結合の５０％を達成するために要求されるＡｂ、例えばレポーターＡｂの濃度を指す。ＥＣ５０値は、ノロウイルスＶＬＰに対するＡｂの親和性についての尺度である。ＥＣ５０値がより低くなればなるほど親和性はより高くなる。
【0060】
[0060] 用語「競合性」または「～と競合する」は、本明細書において使用される場合、抗原（すなわちノロウイルスＶＬＰ）上の結合性部位について第１のＡｂが第２のＡｂと競合する状況を指す。該用語は、Ａｂが抗原に随伴的にまたは順々に応用される状況を含む。２つのＡｂのうちの１つはレポーターＡｂであってもよく、２つのＡｂのうちの他方は試料内に存在してもよい。特に、第１の方向性において、第１のＡｂは、ノロウイルスＶＬＰに結合することを可能とされ、続いてノロウイルスＶＬＰへの第２のＡｂの結合が評価される。第２の方向性において、第２のＡｂは、ノロウイルスＶＬＰに結合することを可能とされ、続いてノロウイルスＶＬＰへの第１のＡｂの結合が評価される。第３の方向性において、第１および第２のＡｂは、ノロウイルスＶＬＰに結合することを随伴的に可能とされる。Ａｂは、飽和条件下で結合させてもよい。当業者により理解されるように、第２のＡｂと結合について競合する第１のＡｂは、第２のＡｂと同じエピトープに必ずしも結合しなくてもよく、オーバーラップまたは隣接するエピトープに結合することにより第２のＡｂの結合を立体的に遮断してもよい。２つのＡｂは、各々が抗原への他方の結合を競合的に阻害（遮断）する場合に、同じまたはオーバーラップするエピトープに結合する。代替的に、２つのＡｂは、１つのＡｂの結合を低減させるかまたは排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸突然変異が他方の結合を低減させるかまたは排除する場合に、同じエピトープを有する。２つのＡｂは、１つの抗体の結合を低減させるかまたは排除する一部のアミノ酸突然変異が他方の結合を低減させるかまたは排除する場合に、オーバーラップするエピトープを有する。別のＡｂによる抗原の結合を阻害（遮断）する１つのＡｂの能力は、抗原についての２つのＡｂの親和性の比の尺度である。１つのＡｂが抗原への別のＡｂの結合を強く阻害（遮断）する場合、抗原についての１つのＡｂの親和性は抗原についての他のＡｂの親和性よりも高い。例えば、０．０５μｇ／ｍＬのノロウイルスＶＬＰに対するＥＣ５０値（これはノロウイルスＶＬＰについてのレポーターＡｂの親和性についての尺度である）を示すレポーターＡｂは、Ａｂが同じまたはオーバーラップするエピトープに結合する場合に、１μｇ／ｍＬのノロウイルスＶＬＰに対するＥＣ５０値を示す別の抗ノロウイルスＡｂの結合を強く阻害（遮断）する。
【0061】
検出システムおよび標識
[0061] 用語「検出可能な標識」は、本明細書において使用される場合、化学、物理または酵素反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的にまたは間接的に生成する１つまたは複数の適切な化学物質または酵素を含む任意の化合物または部分を指す。標識化は、当技術分野において周知の方法により達成され得る（例えば、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．、およびＺｏｒｂａｓ Ｈ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ ２０１２、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋを参照）。
[0061] 用語「検出可能な標識」は、本明細書において使用される場合、化学、物理または酵素反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的にまたは間接的に生成する１つまたは複数の適切な化学物質または酵素を含む任意の化合物または部分を指す。標識化は、当技術分野において周知の方法により達成され得る（例えば、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．、およびＺｏｒｂａｓ Ｈ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ ２０１２、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋを参照）。
【0062】
[0062] 本明細書において使用される場合、用語「抗体は検出可能な標識に取り付けられる」は、検出可能な標識に接続されるＡｂを指す。接続は共有結合性の接続であることができ、これは、例えば、抗体と検出可能な標識との間で結合したアミドの形成において起こる。接続のタイプは、Ａｂ上および検出可能な標識上で利用可能な官能基に依存する。一部の実施形態において、抗体は、抗体の重鎖定常領域を用いて検出可能な標識に取り付けられる。
【0063】
[0063] 本明細書において使用される場合、用語「検出システム」は、検出またはレポーター抗体の存在および／または量の指標となる値を決定するために好適である任意のシステムを指す。検出システムはまた、マイクロスフェアの存在および／または量の指標となる値を決定することができてもよい。マイクロスフェアは、検出可能な標識により個々に同定されてもよい。検出システムは１つまたは複数の光源を含む。
【0064】
[0064] 本明細書において使用される場合、用語「光源」は、照射し、それにより例えば蛍光色素としての検出可能な標識を励起するために好適である任意の光源を指す。一部の実施形態において、光源はレーザーであってもよい。一部の実施形態において、光源は発光ダイオード（ＬＥＤ）であってもよい。
【0065】
マイクロスフェアおよびイムノアッセイ
[0065] 本明細書において使用される場合、用語「マイクロスフェア」（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）または「マイクロスフェア」（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）は、抗原（すなわちＶＬＰ）のような分子が、本開示の方法における使用のために取り付けられ得る小さい粒子を指す。用語マイクロスフェア、マイクロ粒子、ビーズ、またはマイクロビーズは、交換可能に使用されて同等の意味を有することができる。マイクロスフェアは、検出可能な標識により同定されてもよい。
[0065] 本明細書において使用される場合、用語「マイクロスフェア」（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）または「マイクロスフェア」（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）は、抗原（すなわちＶＬＰ）のような分子が、本開示の方法における使用のために取り付けられ得る小さい粒子を指す。用語マイクロスフェア、マイクロ粒子、ビーズ、またはマイクロビーズは、交換可能に使用されて同等の意味を有することができる。マイクロスフェアは、検出可能な標識により同定されてもよい。
【0066】
[0066] 本明細書において使用される場合、用語「マイクロスフェア複合体」は、マイクロスフェアと抗原との複合体を指す。抗原は、マイクロスフェアに共有結合的に取り付けられてもよい。抗原は、ＶＬＰ、例えばノロウイルスＶＬＰであってもよい。抗原は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）を使用してカルボジイミドカップリングによりマイクロスフェアに取り付けられてもよい。
【0067】
[0067] 本明細書において使用される場合、用語「イムノアッセイ」は、Ａｂまたは抗原の使用を通じて分子の存在および／または量を検出、決定、同定、特徴付け、定量化、または他に測定するアッセイを指す。イムノアッセイにより検出される分子は、生物学的試料（例えば血清または血漿）中に存在することができる。イムノアッセイにより検出される分子は、それ自体がＡｂまたは抗原であってもよい。イムノアッセイは、例えば、技術、例えばＥＬＩＳＡ、免疫沈降アッセイ、またはマイクロスフェアイムノアッセイを使用する、直接または競合結合アッセイを含んでもよい。
【0068】
[0068] 本明細書において使用される場合、用語「マイクロスフェアイムノアッセイ」は、Ａｂが結合することができる抗原に連結されたマイクロスフェアの使用を伴うＡｂの存在および／または量を検出、決定、同定、特徴付け、定量化、または他に測定するアッセイを指す。マイクロスフェアイムノアッセイにより検出されるＡｂは、生物学的試料（例えば血清または血漿）中に存在することができる。
【0069】
[0069] 「競合的アッセイセットアップ」とも短縮される用語「競合的マイクロスフェアイムノアッセイ」は、Ａｂが結合することができる抗原に連結されたマイクロスフェアおよびレポーターＡｂを使用することによりＡｂの存在および／または量を検出、決定、同定、特徴付け、定量化、または他に測定するマイクロスフェアイムノアッセイを指す。競合的マイクロスフェアイムノアッセイにおいて、例えば、試料内に存在してもよい、Ａｂ、およびレポーターＡｂは、抗原への結合について競合する。抗原に結合したレポーターＡｂの存在および／または量は、そのため、応用されたレポーターＡｂと競合する能力を有するＡｂの存在および／または量の指標となる。そのため、競合的マイクロスフェアイムノアッセイは、「特異的な」Ａｂまたは抗体力価を決定するために使用可能であり、その文脈における「特異的な」は、試料中の検出されたＡｂが、抗原結合についてレポーター抗体と競合する能力を有することを意味する。それにより、「特異的な」免疫応答または免疫状態が決定されてもよく、その文脈における「特異的な」は、免疫応答または免疫状態が、抗原結合について応用されたレポーターＡｂと競合する能力を有する決定された「特異的な」Ａｂにより特徴付けられることを意味する。
【0070】
[0070] 「非競合的アッセイセットアップ」とも短縮される用語「非競合的マイクロスフェアイムノアッセイ」は、Ａｂが結合することができる抗原に連結されたマイクロスフェアおよびＡｂの重鎖定常領域に結合する検出Ａｂを使用することによりＡｂの存在および／または量を検出、決定、同定、特徴付け、定量化、または他に測定するマイクロスフェアイムノアッセイを指す。それにより、例えば、試料内に存在してもよい、Ａｂは、抗原にＡｂを結合させるためにマイクロスフェアとインキュベートされる。その後、検出Ａｂは、Ａｂの存在および／または量を検出、決定、同定、特徴付け、定量化、または他に測定するために加えられる。そのため、非競合的マイクロスフェアイムノアッセイは、マイクロスフェアが連結された抗原に結合する能力を有するＡｂの本質的にすべてまたは大部分を検出するので、「総」抗体力価または抗体量を決定するために使用され得る。それにより、「完全な」免疫応答が決定されてもよく、その文脈における「完全な」は、決定された免疫応答が、決定された「総」抗体力価または抗体量により特徴付けられることを意味する。
【0071】
ウイルス様粒子およびノロウイルス
[0071] 本明細書において使用される場合、用語「抗原」は、Ａｂにより結合され得る任意の物質を指す。抗原は対象において免疫応答を誘導してもよい。抗原は１つまたは複数のエピトープを有してもよい。抗原は、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはその組合せであってもよい。本明細書において使用される場合、抗原は、ノロウイルスＶＬＰまたはノロウイルスＶＬＰの部分を指すことができる。
[0071] 本明細書において使用される場合、用語「抗原」は、Ａｂにより結合され得る任意の物質を指す。抗原は対象において免疫応答を誘導してもよい。抗原は１つまたは複数のエピトープを有してもよい。抗原は、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはその組合せであってもよい。本明細書において使用される場合、抗原は、ノロウイルスＶＬＰまたはノロウイルスＶＬＰの部分を指すことができる。
【0072】
[0072] 本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」または「抗原決定因子」は、パラトープとして公知のＡｂ分子の可変領域中の特定の抗原結合性部位と相互作用する抗原の部分を指す。単一の抗原は１つより多くのエピトープを有してもよい。そのため、異なるＡｂは、抗原上の異なる区画に結合してもよく、異なる生物学的効果を有してもよい。例えば、用語「エピトープ」はまた、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。エピトープは、構造的または機能的として定義されてもよい。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接的に寄与する残基を有する。抗体が結合するエピトープは、抗原内に位置する２つまたはより多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはより多く）のアミノ酸の単一の連続する配列からなってもよく、すなわち、例えばＮＶ Ｅタンパク質のドメイン中の、リニアエピトープであってもよい。エピトープはまた、コンホメーショナルであってもよく、すなわち、複数の連続しないアミノ酸、すなわち、非線状アミノ酸配列から構成されてもよい。コンホメーショナルエピトープは、典型的には少なくとも３個のアミノ酸、より一般的には、少なくとも５個のアミノ酸、例えば、７～１０個のアミノ酸を独特の空間コンホメーションにおいて含む。一部の実施形態において、エピトープは、分子の化学的に活性の表面グルーピングである決定因子、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基を含んでもよく、一部の実施形態において、特定の電荷的特徴を有してもよい。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、変性溶媒への曝露で典型的には保持される一方、三次的なフォールディングにより形成されるエピトープは、変性溶媒での処理で典型的には喪失される。当業者に公知の様々な技術を使用して、抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の１つまたは複数のアミノ酸と相互作用するかどうかを決定することができる。例示的な技術は、例えば、部位特異的突然変異誘発（例えば、アラニンスキャニング突然変異分析）を含む。他の方法は、ルーチンの交差遮断アッセイ（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記載されているもの）、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３～６３頁）、ペプチド切断分析結晶学的研究およびＮＭＲ分析を含む。追加的に、方法、例えばエピトープ切除、エピトープ抽出および抗原の化学修飾が用いられ得る（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７～４９６頁）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用され得る別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般的に、水素／重水素交換方法は、関心対象のタンパク質を重水素標識すること、続いて抗体を重水素標識されたタンパク質に結合させることを伴う。次に、タンパク質／抗体複合体は水に移され、抗体複合体により保護されるアミノ酸内の交換可能なプロトンは、境界面の部分ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素－水素逆交換を起こす。結果として、タンパク質／抗体境界面の部分を形成するアミノ酸は、重水素を保持して、境界面中に含まれないアミノ酸と比較して相対的により高い質量を呈し得る。抗体の解離後に、標的タンパク質はプロテアーゼ切断および質量分析に供され、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識された残基が明らかにされる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２～２５９頁；ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ～２６５Ａを参照。抗原構造ベース抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ；ＡＳＡＰ）としても公知の改変補助プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ；ＭＡＰ）を使用して、同じ抗原に結合するＡｂを、異なるエピトープに結合するＡｂの群に選別してもよい。ＭＡＰは、化学的にまたは酵素的に修飾された抗原表面に対する各々の抗体の結合プロファイルの類似性に従って同じ抗原に対して方向付けられた多数のＡｂをカテゴライズする方法である（米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号明細書を参照）。各々のカテゴリーは、別のカテゴリーにより表されるエピトープとは明確に異なるか、またはそれと部分的にオーバーラップする独特のエピトープを反映し得る。この技術は、遺伝学的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能とし、その結果、特徴付けは、遺伝学的に別個の抗体に集中され得る。ハイブリドーマスクリーニングに応用される場合、ＭＡＰは、所望される特徴を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの同定を促し得る。Ａｂはまた、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用してそれらのエピトープに従ってカテゴライズされてもよい。
【0073】
[0073] 本明細書において使用される場合、用語「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」（ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）または「ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）」（ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、ウイルスに密接に似ているが、ウイルス遺伝材料を含有しないので非感染性である分子を指す。ＶＬＰは、次にＶＬＰに自己集合することができるウイルス構造タンパク質の発現を通じて組換えにより調製され得る。好適な発現システムは、哺乳動物または昆虫発現システムのような真核発現システムを含む。
【0074】
[0074] 本明細書において使用される場合、用語「ノロウイルスＶＬＰ」は、１つまたは複数のノロウイルスの構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２）のうちの少なくとも１つを含むＶＬＰを指す。構造タンパク質は、対応するノロウイルスの構造タンパク質を表すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％または１００％同一であってもよい。本出願および特許請求の範囲の全体を通じて、特定のノロウイルスＶＬＰは、表１において呼称されるように参照される。例えば、ＧＩ．１ ＶＬＰは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ５０４６６．２および配列番号１に示されているＶＰ１配列を有するＨｕ／ＧＩ．１／Ｎｏｒｗａｌｋ／１９６８／ＵＳノロウイルスに由来するノロウイルスＶＬＰを指し、ノロウイルスＶＬＰのＶＰ１タンパク質は、配列番号１に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％または１００％同一であってもよい。その文脈における「由来する」は、対応するノロウイルスのＶＰ１配列または該ＶＰ１配列に対して、少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％もしくは１００％同一であってもよい配列が、自己集合でＶＬＰを生成するために好適な発現システムにおいて発現されることを意味する。
【0075】
[0075] 本明細書において使用される場合、用語「ノロウイルス」（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）または「ノロウイルス」（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）は、カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科に属するノロウイルスの種のメンバーを指す。ノロウイルスはヒトにおいて急性胃腸炎を引き起こすことができる。ノロウイルスは現在、系統発生的に７つの異なる遺伝子型群（ＧＩ～ＧＶＩＩ）および４０より多くの異なる遺伝子型に分類されている。ＧＩ、ＧＩＩ、およびＧＩＶのウイルスはヒトに感染し、ＧＩおよびＧＩＩからのウイルスはほぼすべてのヒト感染を占める。１９９０年代半ば以降、遺伝子型群ＩＩ遺伝子型４（ＧＩＩ．４）からのウイルスは大流行の大部分を引き起こしている。遺伝子型群ＩＩ遺伝子型４（ＧＩＩ．４）からのノロウイルスは変異型にさらに分類されている。ノロウイルス株の非限定的な例は、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ＮＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ８７６６１）、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎウイルス（ＳＨＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ０７４１８）、Ｄｅｓｅｒｔ Ｓｈｉｅｌｄウイルス（ＤＳＶ、Ｕ０４４６９）、Ｈｅｓｓｅウイルス（ＨＳＶ）、Ｃｈｉｂａウイルス（ＣＨＶ、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０４２８０８）、Ｈａｗａｉｉウイルス（ＨＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ０７６１１）、Ｓｎｏｗ Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルス（ＳＭＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ７００５９）、Ｔｏｒｏｎｔｏウイルス（ＴＶ、Ｌｅｉｔｅら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４１：８６５～８７５頁）、Ｂｒｉｓｔｏｌウイルス（ＢＶ）、Ｊｅｎａウイルス（ＪＶ、ＡＪ０１０９９）、Ｍａｒｙｌａｎｄウイルス（ＭＶ、ＡＹ０３２６０５）、Ｓｅｔｏウイルス（ＳＶ、ＧｅｎＢａｎｋＡＢ０３１０１３）、Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ（ＣＶ、ＡＦ１４５８９６）、Ｌｏｒｄｓｄａｌｅウイルス（ＬＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ８６５５７）、Ｇｒｉｍｓｂｙウイルス（ＧｒＶ、ＡＪ００４８６４）、Ｍｅｘｉｃｏウイルス（ＭＸＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ２２４９８）、Ｂｏｘｅｒ（ＡＦ５３８６７９）、Ｃ５９（ＡＦ４３５８０７）、ＶＡ１１５（ＡＹ０３８５９８）、ＢＵＤＳ（ＡＹ６６０５６８）、Ｈｏｕｓｔｏｎウイルス（ＨｏＶ）、Ｍｉｎｅｒｖａ株（ＥＦ １２６９６３１）、Ｌａｕｒｅｎｓ株（ＥＦ １２６９６６１）、ＭＯＨ（ＡＦ３９７１５６）、Ｐａｒｒｉｓ Ｉｓｌａｎｄ（ＰｉＶ、ＡＹ６５２９７９）、ＶＡ３８７（ＡＹ０３８６００）、ＶＡ２０７（ＡＹ０３８５９９）、およびＯｐｅｒａｔｉｏｎ Ｉｒａｑｉ Ｆｒｅｅｄｏｍ（ＯＩＦ、ＡＹ６７５５５４）を含む。さらなる例は、Ｈｕ／ＧＩ．１／Ｎｏｒｗａｌｋ／１９６８／ＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ８７６６１）、Ｈｕ／ＧＩ．２／Ｊｉｎｇｚｈｏｕ／２０１３４０１／ＣＨＮ（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＦ３０６２１２）、Ｈｕ／ＧＩ．３／ＪＫＰＧ＿８８３／ＳＷＥ／２００７（ＧｅｎＢａｎｋ ＦＪ７１１１６４．１）、Ｈｕ／ＧＩ．４／１６４３／２００８／ＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＧＱ４１３９７０）、Ｈｕ／ＧＩ．５／Ｓｉｋｌｏｓ－ＨＵＮ５４０７／２０１３／ＨＵＮ（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＫＪ４０２２９５）、Ｈｕ／ＧＩ．６／ＴＣＨ－０９９／ＵＳＡ／２００３（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＣ９９８９５９）、Ｈｕ／ＧＩ．７／Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ１９１／２０１０／ＵＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＮ８９９２４３）、Ｈｕ／ＧＩＩ．３／ＮＩＨＩＣ８．１／２０１１／ＵＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＣ５９７１４０）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｈｏｕｓｔｏｎ／ＴＣＨ１８６／２００２／ＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＸ４５９９０８）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／ＤｅｎＨａａｇ８９／２００６／ＮＬ（ＧｅｎＢａｎｋ ＥＦ１２６９６５．１）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ３８／２００６／ＮＬ（ＧｅｎＢａｎｋ ＥＦ１２６９６３．１）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＸ４５９９０８）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／０３１６９３／ＵＳＡ／２００３（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＱ９６５８１０．１）、Ｈｕ／ＧＩＩ．６／Ｅｈｉｍｅ１２０２４６／２０１２／ＪＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ８１８４００）、Ｈｕ／ＧＩＩ．１２株Ｅ５１５２（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｈｕ／ＧＩＩ．１７／Ｃ１４２／ＧＦ／１９７８（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＮ６９９０４３）、Ｈｕ／ＧＩＩ．１７／ＪＰ／２０１４／Ｎａｇａｎｏ７－１（ＧｅｎＢａｎｋ ＬＣ０４３１３９）、およびＨｕ／ＧＩＩ．１７／ＨＫＧ／２０１５／ＣＵＨＫ－ＮＳ－５１３（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＰ６９８９３１．１）を含む。ノロウイルスのさらなる例は、国際公開第２０２０／０１７５４２号パンフレット、表１または下記のセクション「マイクロスフェア複合体」において列記される。本開示の全体を通じて、用語「ノロウイルス」は、任意の遺伝子型群または遺伝子型または変異型の任意のノロウイルス株を指すために使用され得る。用語「ノロウイルス」はまた、例えば、２つまたはより多くのノロウイルス、例えばＧＩＩ．４変異型からのノロウイルスコンセンサス配列を指すことができる。ノロウイルスコンセンサス配列の構築は、例えば、国際公開第２０１０／０１７５２４２号パンフレットおよびＰａｒｒａら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１２、３０（２４）：３５０～３５８６頁に示されている。本開示の意味において、「ノロウイルス株」は、任意の遺伝子型群または遺伝子型または変異型の任意のノロウイルスを指すために使用され得る。
【0076】
[0076] 本明細書において使用される場合、用語「遺伝子型群」は、系統発生クラスタリングによるノロウイルスの分類を指す。現在、ノロウイルスは７つの遺伝子型群（ＧＩ～ＧＶＩＩ）に分類されている。参照のために、例えばＫｒｏｎｅｍａｎら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ２０１３、１５８：２０５９～２０６８頁；Ｐｒｅｅｔｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１９、１００：１３９３～１４０６頁を参照。
【0077】
[0077] 本明細書において使用される場合、用語「遺伝子型」は、系統発生クラスタリングによるノロウイルス遺伝子型群のさらなる分割を指す。遺伝子型群は４０より多くの遺伝子型に分割された。例えば、遺伝子型群ＩＩおよび遺伝子型４のノロウイルスはＧＩＩ．４として呼称される。参照のために、例えばＫｒｏｎｅｍａｎら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ２０１３、１５８：２０５９～２０６８頁；Ｐｒｅｅｔｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１９、１００：１３９３～１４０６頁を参照。
【0078】
[0078] 本明細書において使用される場合、用語「変異型」は、系統発生クラスタリングによるノロウイルス遺伝子型のさらなる分割を指す。変異型へのＧＩＩ．４株のサブタイプ分類は系統発生クラスタリングに基づく。参照のために、例えばＫｒｏｎｅｍａｎら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ２０１３、１５８：２０５９～２０６８頁；Ｐｒｅｅｔｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１９、１００：１３９３～１４０６頁を参照。
【0079】
[0079] 本明細書において使用される場合、「コンセンサス配列」は、２つまたはより多くのウイルスのウイルスアミノ酸配列をアライメントおよび比較することにより決定される。コンセンサス配列はまた、２つまたはより多くのウイルスのヌクレオチド配列をアライメントおよび比較することにより決定されてもよい。コンセンサス配列は、２つまたはより多くの、３つまたはより多くの、４つまたはより多くの、５つまたはより多くの、６つまたはより多くの、７つまたはより多くの、８つまたはより多くの、９つまたはより多くの流布しているウイルスの株のヌクレオチドまたはアミノ酸配列から決定されてもよい。配列アライメントは、ある特定の配列位置において１つまたは複数の可変的なアミノ酸またはヌクレオチドを結果としてもたらすことがある。コンセンサス配列において、可変的な位置における２つまたはより多くのアミノ酸またはヌクレオチドのうちの１つが選択される。一部の実施形態において、選択されるアミノ酸またはヌクレオチドは、最近流布している株、または疾患とより一般的に関連付けられるかもしくは評価されている株の間でより一般的に存在する株のアミノ酸またはヌクレオチドである。
【0080】
[0080] 本明細書において使用される場合、用語「構造タンパク質」は、成熟したウイルスの構造的な構成要素であるウイルスタンパク質を指す。ノロウイルスの文脈において、構造タンパク質はＶＰ１およびＶＰ２タンパク質を含む。用語「構造タンパク質」は、そのため、ＶＰ１およびＶＰ２の両方、または両方のうちの１つのみを指すことができる。
【0081】
試料および対象
[0081] 本明細書において使用される場合、用語「試料」は、対象に由来する任意の試料を指す。本開示の意味において、試料は、対象の身体の外側に存在し、すなわち本開示の方法の間に対象から得られない。結果的に、診断方法はｉｎ ｖｉｔｒｏの診断方法であり、保護を決定する方法は、保護を決定するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。試料は、血液、尿、唾液、脳脊髄液、およびリンパ液であってもよい。一部の実施形態において、試料は血清または血漿試料である。本開示において、用語「血漿」（ｐｌａｓｍａ）は血漿（ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ）を指す。試料はノロウイルス反応性Ａｂを含有してもよい。試料は、本開示の方法における使用に先立って前処理されてもよい。前処理の方法は、精製、濾過、蒸留、濃縮、干渉性化合物の不活性化、および試薬の追加を伴うことができる。一部の実施形態において、試料は熱不活性化される。
[0081] 本明細書において使用される場合、用語「試料」は、対象に由来する任意の試料を指す。本開示の意味において、試料は、対象の身体の外側に存在し、すなわち本開示の方法の間に対象から得られない。結果的に、診断方法はｉｎ ｖｉｔｒｏの診断方法であり、保護を決定する方法は、保護を決定するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。試料は、血液、尿、唾液、脳脊髄液、およびリンパ液であってもよい。一部の実施形態において、試料は血清または血漿試料である。本開示において、用語「血漿」（ｐｌａｓｍａ）は血漿（ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ）を指す。試料はノロウイルス反応性Ａｂを含有してもよい。試料は、本開示の方法における使用に先立って前処理されてもよい。前処理の方法は、精製、濾過、蒸留、濃縮、干渉性化合物の不活性化、および試薬の追加を伴うことができる。一部の実施形態において、試料は熱不活性化される。
【0082】
[0082] 本明細書において使用される場合、用語「対象」（ｓｕｂｊｅｃｔ）または「対象」（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）は任意の個体を含むことができる。対象は哺乳動物であってもよい。哺乳動物は、マウス、霊長動物、非ヒト霊長動物、ヒト、ウサギ、ネコ、ラット、ウマ、ヒツジであってもよいが、それに限定されない。対象は、妊娠した哺乳動物、特に妊婦であってもよい。対象は、２か月齢までの新生児、または２か月齢～５歳の小児であってもよい。対象は、予防または療法が所望される患者であってもよい。対象は、ノロウイルスナイーブまたはノロウイルス曝露済みであってもよい。対象は、ノロウイルス流行地域またはノロウイルス非流行地域からの対象であってもよい。対象は、ノロウイルス流行地域を旅行しているノロウイルス非流行地域からの対象であってもよい。対象は、ノロウイルスワクチンを接種していてもよい。対象は、免疫抑制された人または７０歳を上回る人であってもよい。
【0083】
[0083] 用語「ノロウイルスナイーブ」または「ノロウイルス陰性」は、本明細書において使用される場合、ノロウイルス抗体力価、例えば遮断および／または中和力価を測定する試験において決定された場合に検出限界を上回るノロウイルスに対して方向付けられたＡｂを有しない対象を指す。ノロウイルスナイーブ対象は、ノロウイルスに曝露されていなくてもよく、したがってノロウイルスに対して方向付けられたＡｂを有しない。ノロウイルスナイーブ対象はまた、ノロウイルスにかつて曝露されており、ノロウイルスに対して方向付けられたＡｂをかつて有していたが、ノロウイルスに対して方向付けられたＡｂが経時的に消失した対象であってもよい。
【0084】
[0084] 本明細書において使用される場合、用語「ノロウイルス曝露済み」または「ノロウイルス陽性」は、ノロウイルス抗体力価、例えば遮断および／または中和力価を測定する試験において決定された場合に検出限界を上回るノロウイルスに対して方向付けられたＡｂを有する対象を指す。ノロウイルスに対して方向付けられたＡｂは、対象の免疫応答によるノロウイルスに対して方向付けられたＡｂの生成をトリガーするノロウイルス感染またはノロウイルスワクチンでのワクチン接種の結果であることができる。
【0085】
[0085] 本明細書において使用される場合、「免疫応答」は、ノロウイルス曝露に対する対象の免疫応答を指す。特に、免疫応答は、ノロウイルスに対するＡｂの形成を含む。免疫応答という用語はまた、ノロウイルスに対する中和および／または遮断Ａｂの形成を含んでもよい。それはまた、細胞媒介性応答の刺激または構造タンパク質、例えばＶＰ１タンパク質に対するＡｂの形成を含んでもよい。それはまた細胞媒介性応答の刺激を含んでもよい。
【0086】
[0086] 本明細書において使用される場合、「流行地域」は、疾患または感染性因子が常に存在し、かつ／またはこの地域内の集団において通常よく見られる地域を指す。本明細書において使用される場合、「非流行地域」は、疾患が存在しないか、または通常は流行していない地域を指す。よって、「ノロウイルス流行地域」は、ノロウイルスによる感染がベースラインレベルで常に維持される地理的区画を指す。「ノロウイルス非流行地域」は、ノロウイルスによる感染がベースラインレベルで常に維持されない地理的区画である。よって、「ノロウイルス流行地域から」または「ノロウイルス非流行地域から」の対象は、上記に定義されている地理的区画で暮らしている対象を指す。ある特定のノロウイルス株が、１つの区画において流布しており、他の区画において存在しないことがあり得る。そのため、地域は、１つのノロウイルス株について非流行性であるが他のノロウイルス株について流行性であり得る。
【0087】
[0087] 本明細書において使用される場合、「ワクチン接種された」は、疾患の１つまたは複数の症状を発症することから対象を予防する目的と共に、ワクチンを投与された対象を指す。
【0088】
[0088] 本明細書において使用される場合、用語「ワクチン」は、対象において免疫応答を導入する能力を有する少なくとも１つの抗原を提供する予防材料を指す。「ノロウイルスワクチン」は少なくとも１つのノロウイルス抗原を提供する。一部の実施形態において、ノロウイルス抗原はノロウイルスＶＬＰである。ノロウイルスワクチンは、例えば、Ｐａｒｒａら（Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１２、３０（２４）：３５８０～３５８６頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１２．０３．０５０）および国際公開第２０１０／０１７５４２号パンフレットにおいて記載されている。
【0089】
感染および診断
[0089] 用語「ノロウイルス感染」は、本明細書において使用される場合、通常は糞口経路により拡大される、ノロウイルスへの接触の結果としてもたらされる疾患または状態を指す。感染は、夾雑された食品もしくは水または人と人との間の接触を通じて起こり得る。それはまた、夾雑された表面との接触を通じて、または感染者の嘔吐物から空気を通じて起こり得る。リスク因子は、不衛生な食品準備および密な空間の共有を含む。ノロウイルスは胃腸炎を引き起こす。感染は、非血性下痢、嘔吐、および胃痛により特徴付けられる。発熱または頭痛もまた起こり得る。ノロウイルス感染はまた、ノロウイルス特異的な症状を伴わないことがあり、そのような場合、感染は無症候性または不顕性であり得る。ノロウイルス感染は急性または回復期であってもよい。
[0089] 用語「ノロウイルス感染」は、本明細書において使用される場合、通常は糞口経路により拡大される、ノロウイルスへの接触の結果としてもたらされる疾患または状態を指す。感染は、夾雑された食品もしくは水または人と人との間の接触を通じて起こり得る。それはまた、夾雑された表面との接触を通じて、または感染者の嘔吐物から空気を通じて起こり得る。リスク因子は、不衛生な食品準備および密な空間の共有を含む。ノロウイルスは胃腸炎を引き起こす。感染は、非血性下痢、嘔吐、および胃痛により特徴付けられる。発熱または頭痛もまた起こり得る。ノロウイルス感染はまた、ノロウイルス特異的な症状を伴わないことがあり、そのような場合、感染は無症候性または不顕性であり得る。ノロウイルス感染は急性または回復期であってもよい。
【0090】
[0090] 本明細書において使用される場合、用語「急性ノロウイルス感染」は、疾患の急速な開始、相対的に短い症状の期間、および数日以内の解消により特徴付けられるノロウイルス感染を指す。急速なノロウイルス感染は、感染性ビリオンの早期の産生および宿主免疫系による感染の排除を通常は伴う。急性ノロウイルス感染において、体液中のＡｂ力価は、回復期ウイルス感染と比較して高い。
【0091】
[0091] 本明細書において使用される場合、用語「回復期ノロウイルス感染」は、宿主免疫系により排除されたノロウイルス感染を指す。回復期ノロウイルス感染の特徴は、感染を引き起こしたノロウイルスに対するＡｂをコードするメモリーＢ細胞の存在である。回復期ノロウイルス感染において、体液中のＡｂ力価は、急性ノロウイルス感染と比較して低い。
【0092】
[0092] 本明細書において使用される場合、用語「診断する」は、患者が所与の疾患または状態、すなわちノロウイルス感染を患っているかまたは以前に患っていたかどうかの可能性を確認または決定するために使用され得る方法の応用を指す。本開示の意味において、診断方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの診断方法である。
【0093】
[0093] 本明細書において使用される場合、用語「ノロウイルス反応性抗体の確立された量」は、ノロウイルス感染の指標となるノロウイルス反応性抗体のある特定の量を指す。ノロウイルス感染後に、ノロウイルス反応性抗体が対象において産生され、これらのノロウイルス反応性抗体の量は、そのため、対象がノロウイルスに感染したことを決定することを可能にする。
【0094】
保護
[0094] 本明細書において使用される場合、用語「ノロウイルス感染からの保護」は、対象内のノロウイルス反応性Ａｂの量が、ノロウイルス反応性Ａｂの保護的な量に等しいかまたはそれよりも高い状態を指す。本明細書において使用される場合、用語「保護的な量」は、ノロウイルスとの接触により引き起こされる疾患の非存在と関連付けられるノロウイルス反応性Ａｂの量を指す。「保護的な量」は、対象のタイプに依存して異なってもよく、例えば、保護的な量は、ヒトとサルとで異なってもよく、さらには子供と成体とで異なってもよい。保護的な量のＡｂは、ワクチンを投与することにより誘導されてもよい。
[0094] 本明細書において使用される場合、用語「ノロウイルス感染からの保護」は、対象内のノロウイルス反応性Ａｂの量が、ノロウイルス反応性Ａｂの保護的な量に等しいかまたはそれよりも高い状態を指す。本明細書において使用される場合、用語「保護的な量」は、ノロウイルスとの接触により引き起こされる疾患の非存在と関連付けられるノロウイルス反応性Ａｂの量を指す。「保護的な量」は、対象のタイプに依存して異なってもよく、例えば、保護的な量は、ヒトとサルとで異なってもよく、さらには子供と成体とで異なってもよい。保護的な量のＡｂは、ワクチンを投与することにより誘導されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0095】
【図1】[0095]８つの異なる条件（表２を参照）を使用したマイクロスフェアへのＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰの連結有効性の評価。ＶＬＰ連結マイクロスフェアをポリクローナル抗ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙノロウイルス抗体とインキュベートし、ポリクローナル抗体に対して方向付けられた好適な検出抗体を使用して結合を検出した。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）をポリクローナル抗体希釈（ｌｏｇ（希釈係数））の依存度において提示している。
【図2】[0096]２０プレックス非競合的アッセイセットアップを使用した２０の異なるノロウイルスＶＬＰに対する対象＃１からのＩｇＭおよびＩｇＡ力価の評価。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を血清試料希釈（ｌｏｇ（希釈係数））の依存度において提示している。
【図3】[0097]２０プレックス非競合的アッセイセットアップを使用した２０の異なるノロウイルスＶＬＰに対する対象＃１からのＩｇＧ力価（図３Ａ）および対象＃２からのＩｇＭ力価（図３Ｂ）の評価。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を血清試料希釈（ｌｏｇ（希釈係数））の依存度において提示している。
【図4】[0098]２０プレックス非競合的アッセイセットアップを使用した２０の異なるノロウイルスＶＬＰに対する対象＃２からのＩｇＡおよびＩｇＧ力価の評価。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を血清試料希釈（ｌｏｇ（希釈係数））の依存度において提示している。
【図5】[0099]マウスｍＡｂを使用したエピトープビニング実験は４つの異なるクラスター（Ｉ～ＩＶ）を結果としてもたらした。１０個のｍＡｂをさらなる特徴付けのために選択した（丸で囲っている）。
【図6】[0100]選択された１０個のマウスｍＡｂおよび２つのヒトｍＡｂ（１２２７、１４３１）を使用したエピトープビニング実験。より少数の抗体が図６においてエピトープビニングのために使用されたので、一部のｍＡｂは、図５と比較した場合にわずかに異なるグルーピングを示した。
【図7】[0101]マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおけるＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰへのｍＡｂの結合。マイクロスフェアに連結されたＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰとの上昇ｍＡｂ濃度のインキュベーション。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を対数変換されたｍＡｂ濃度の関数として提示している。
【図8】[0102]異なるヒト血清試料の分析のためのｍＡｂ １１Ｆ０３を使用したシングルプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイ。マイクロスフェアに連結されたＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰとのヒト血清の段階希釈液のインキュベーション。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を対数変換された血清希釈の関数として提示している。
【図9】[0103]ヒト血清試料ＢＲＨ１４３４７９７（図９、上のパネル）、ＢＲＨ１４３４７９９（図９、下のパネル）、ＢＲＨ１４３４７９０（図１０、上のパネル）、ＢＲＨ１４３４８０５（図１０、下のパネル）、およびＢＲＨ１４３４８０６（図１１）を評価するための抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサスｍＡｂを使用したシングルプレックスおよびデュプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイ。ヒト血清試料の段階希釈液をマイクロスフェアに連結されたＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび／またはＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰとインキュベートした。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を対数変換された血清希釈の関数として提示している。ＮＷ：ＮＷ＋ＣＮは、ＧＩ．１ ＮｏｒｗａｌｋおよびＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアならびに抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）および抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂの混合物を含有するデュプレックスセットアップ内に存在するＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰ連結マイクロスフェアの分析を指す。ＣＮ：ＮＷ＋ＣＮは、ＧＩ．１ ＮｏｒｗａｌｋおよびＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアならびに抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）および抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂの混合物を含有するデュプレックスセットアップ内に存在するＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアの分析を指す。ＮＷ：ＣＮ、ＮＷ：ＮＷ、ＣＮ：ＮＷ、ＣＮ：ＣＮは、ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂ、ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）ｍＡｂ、ＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）ｍＡｂ、ならびにＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂをそれぞれ用いたシングルプレックスセットアップを指す。
【図10】ヒト血清試料ＢＲＨ１４３４７９７（図９、上のパネル）、ＢＲＨ１４３４７９９（図９、下のパネル）、ＢＲＨ１４３４７９０（図１０、上のパネル）、ＢＲＨ１４３４８０５（図１０、下のパネル）、およびＢＲＨ１４３４８０６（図１１）を評価するための抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサスｍＡｂを使用したシングルプレックスおよびデュプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイ。ヒト血清試料の段階希釈液をマイクロスフェアに連結されたＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび／またはＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰとインキュベートした。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を対数変換された血清希釈の関数として提示している。ＮＷ：ＮＷ＋ＣＮは、ＧＩ．１ ＮｏｒｗａｌｋおよびＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアならびに抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）および抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂの混合物を含有するデュプレックスセットアップ内に存在するＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰ連結マイクロスフェアの分析を指す。ＣＮ：ＮＷ＋ＣＮは、ＧＩ．１ ＮｏｒｗａｌｋおよびＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアならびに抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）および抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂの混合物を含有するデュプレックスセットアップ内に存在するＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアの分析を指す。ＮＷ：ＣＮ、ＮＷ：ＮＷ、ＣＮ：ＮＷ、ＣＮ：ＣＮは、ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂ、ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）ｍＡｂ、ＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）ｍＡｂ、ならびにＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂをそれぞれ用いたシングルプレックスセットアップを指す。
【図11】ヒト血清試料ＢＲＨ１４３４７９７（図９、上のパネル）、ＢＲＨ１４３４７９９（図９、下のパネル）、ＢＲＨ１４３４７９０（図１０、上のパネル）、ＢＲＨ１４３４８０５（図１０、下のパネル）、およびＢＲＨ１４３４８０６（図１１）を評価するための抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサスｍＡｂを使用したシングルプレックスおよびデュプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイ。ヒト血清試料の段階希釈液をマイクロスフェアに連結されたＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび／またはＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰとインキュベートした。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を対数変換された血清希釈の関数として提示している。ＮＷ：ＮＷ＋ＣＮは、ＧＩ．１ ＮｏｒｗａｌｋおよびＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアならびに抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）および抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂの混合物を含有するデュプレックスセットアップ内に存在するＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰ連結マイクロスフェアの分析を指す。ＣＮ：ＮＷ＋ＣＮは、ＧＩ．１ ＮｏｒｗａｌｋおよびＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアならびに抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）および抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂの混合物を含有するデュプレックスセットアップ内に存在するＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアの分析を指す。ＮＷ：ＣＮ、ＮＷ：ＮＷ、ＣＮ：ＮＷ、ＣＮ：ＣＮは、ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂ、ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）ｍＡｂ、ＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）ｍＡｂ、ならびにＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂをそれぞれ用いたシングルプレックスセットアップを指す。
【図12】[0104]ヒト血清試料を評価するための抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサスｍＡｂを使用したデュプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイ。マイクロスフェアに連結されたＧＩ．１ ＮｏｒｗａｌｋおよびＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰとのヒト血清の段階希釈液のインキュベーション。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を対数変換された血清希釈の関数として提示している。曲線は、ＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰ連結マイクロスフェアの分析の結果としてもたらされたＭＦＩ値を示す。追加的に、血清なしでｍＡｂのみを含む対照も含めた（「モノクローナルのみ」）。
【図13】[0105]ヒト血清試料を評価するための抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサスｍＡｂを使用したデュプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイ。マイクロスフェアに連結されたＧＩ．１ ＮｏｒｗａｌｋおよびＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰとのヒト血清の段階希釈液のインキュベーション。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を対数変換された血清希釈の関数として提示している。曲線は、ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰ連結マイクロスフェアの分析の結果としてもたらされたＭＦＩ値を示す。追加的に、血清なしでｍＡｂのみを含む対照も含めた（「モノクローナルのみ」）。
【発明を実施するための形態】
【0096】
詳細な説明
[0106] 以下のセクションにおいて、様々な実施形態を詳述するために様々な例示的な組成物および方法が記載される。様々な実施形態の実施は、本明細書において概説される特定の詳細のすべてを用いることまたは一部を用いることさえも要求しないことは当業者に自明であり、むしろ、濃度、時間および他の特定の詳細は、ルーチンの実験を通じて修飾され得る。これらのセクションにおいて記載される特定の実施形態は、当業者に自明なように組み合わせられ得る。
[0106] 以下のセクションにおいて、様々な実施形態を詳述するために様々な例示的な組成物および方法が記載される。様々な実施形態の実施は、本明細書において概説される特定の詳細のすべてを用いることまたは一部を用いることさえも要求しないことは当業者に自明であり、むしろ、濃度、時間および他の特定の詳細は、ルーチンの実験を通じて修飾され得る。これらのセクションにおいて記載される特定の実施形態は、当業者に自明なように組み合わせられ得る。
【0097】
マイクロスフェア複合体
[0107] 本出願の方法およびキットにおける使用のためのマイクロスフェア複合体は、ノロウイルスＶＬＰに連結されたマイクロスフェアを含む。このセクション内の仕様および実施形態は、以下のセクションの仕様および実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
[0107] 本出願の方法およびキットにおける使用のためのマイクロスフェア複合体は、ノロウイルスＶＬＰに連結されたマイクロスフェアを含む。このセクション内の仕様および実施形態は、以下のセクションの仕様および実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
【0098】
マイクロスフェア
[0108] 本開示のために有用なマイクロスフェアは約０．０１～約１００μｍのサイズの直径の範囲内である。一部の実施形態において、マイクロスフェアは約１～約１０μｍのサイズの範囲内である。一部の実施形態において、マイクロスフェアは約５～約７μｍのサイズの範囲内である。一部の実施形態において、マイクロスフェアは約６．５μｍの直径を有する。マイクロスフェアのサイズは、実際的に任意のフローサイトメトリー装置においていわゆる前方または小角散乱光により決定され得る。
[0108] 本開示のために有用なマイクロスフェアは約０．０１～約１００μｍのサイズの直径の範囲内である。一部の実施形態において、マイクロスフェアは約１～約１０μｍのサイズの範囲内である。一部の実施形態において、マイクロスフェアは約５～約７μｍのサイズの範囲内である。一部の実施形態において、マイクロスフェアは約６．５μｍの直径を有する。マイクロスフェアのサイズは、実際的に任意のフローサイトメトリー装置においていわゆる前方または小角散乱光により決定され得る。
【0099】
[0109] マイクロスフェアは、ＶＬＰのような分子が取り付けられ得る任意の材料から構築されてもよい。例えば、マイクロスフェアの構築のための許容される材料は、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリブタジエン、ポリジメチルシロキサン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリ塩化ビニルベンジル、ポリビニルトルエン、ポリ塩化ビニリデン、ポリジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート、またはその組合せを含むがそれに限定されない。本開示の一部の実施形態において、マイクロスフェアはポリスチレンから構築される。
【0100】
[0110] マイクロスフェアは、分子の取付けのための表面親和性基を含んでもよい。前記親和性基は、Ｎｉ２＋（Ｈｉｓタグ付加された分子の固定化のため）、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、抗ヒトＩｇＧ Ａｂ、抗ウサギＩｇＧ Ａｂ、抗マウスＩｇＧ Ａｂ、抗ヤギＩｇＧ Ａｂ、抗ＦＬＡＧ Ａｂ、ストレプトアビジン、アビジン、およびグルタチオンであってもよいが、それに限定されない。
【0101】
[0111] マイクロスフェアは、分子、例えば本開示のノロウイルスＶＬＰの取付けのために有用な表面上の官能基を含んでもよい。前記官能基は、カルボキシレート、エステル、アルコール、カルバミド、アルデヒド、アミン、酸化硫黄、酸化窒素、マレイミド、またはハロゲン化物であってもよいが、それに限定されない。一部の実施形態において、マイクロスフェアは、表面上にカルボキシレートを含む。ノロウイルスＶＬＰのような分子は、本明細書に記載される化学的な技術を使用してマイクロスフェアに共有結合的に連結され得る。一部の実施形態において、ノロウイルスＶＬＰのような分子は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）を使用するカルボジイミドカップリングによりマイクロスフェアに連結され得る。それにより、ＥＤＣは、マイクロスフェアの表面上のカルボキシレートと不安定なｏ－アシルイソ尿素エステルに反応する。不安定なｏ－アシルイソ尿素エステルはスルホ－ＮＨＳと容易に反応して、準安定なアミン反応性ＮＨＳ－エステルを形成する。ＮＨＳ－エステルは最後に、抗原により提供されるアミン基と反応し、それにより安定なアミド結合を形成する。
【0102】
[0112] 抗原により提供されるもの以外のアミン含有化合物、グリセロール、尿素、イミダゾール、アジド、および一部の界面活性剤はカルボジイミドカップリングに干渉し得るので、それらは、好適な緩衝剤交換方法を用いて抗原調製物から除去されるべきである。例えば、カルボジイミドカップリングのための好適な緩衝剤は、５０ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。連結のためのｐＨ値は約５～約９であってもよい。マイクロスフェアへの抗原の連結は、約２時間のインキュベーションにより実行されてもよい。
【0103】
[0113] マイクロスフェアは磁性であってもよい。一部の実施形態において、マイクロスフェアは超常磁性であってもよい。磁性マイクロスフェアは、例えばマイクロスフェアを洗浄するために、磁気プレート分離器（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｌａｔｅ ｓｅｐａｒａｔｏｒ）により容易に捕捉され得る。磁気プレート分離器は、磁性捕捉により９６ウェルプレートのウェル内の溶液から９６ウェルプレート内のマイクロスフェアを分離するために使用可能であり、９６ウェルプレートを保持するための構成を指す。磁気プレート分離器は、ユーザーが、磁性捕捉により９６ウェルプレートの底にマイクロスフェアを固定しながら、迅速にウェル内の上清をデカンテーションし、ウェルを洗浄することを可能にする。磁気プレート分離器の応用は、マイクロスフェアが洗浄手順の間に喪失されるリスクを低減させる。
【0104】
[0114] マイクロスフェアは、マイクロスフェアが検出システムの助けと共に同定され得るようにする検出可能な標識を含んでもよい。マイクロスフェアの同定は同様に、マイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰの同定を可能とする。
【0105】
[0115] 好適な検出システムを用いるそのような標識の検出に関して、セクション「検出システム」もまた参照される。
【0106】
[0116] 一部の実施形態において、検出可能な標識は少なくとも１つの蛍光色素である。少なくとも１つの蛍光色素は、スクアライン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、およびこれらの任意の誘導体からなる群から選択されてもよい。例えば、蛍光色素の誘導体は、任意の位置においてメチル基をさらに含む色素であってもよい。
【0107】
[0117] 一部の実施形態において、マイクロスフェアは１つの蛍光色素を含む。マイクロスフェアは、好適な光源で照射したときに、１つの蛍光色素の放出シグナルにより同定され得る。
【0108】
[0118] 他の実施形態において、マイクロスフェアは、同じ蛍光色素を含む他のマイクロスフェアとは異なる濃度において１つの蛍光色素を含む。そのような実施形態において、マイクロスフェアは、好適な光源で照射したときに、１つの蛍光色素の放出シグナルの強度により他のマイクロスフェアから同定および区別され得る。
【0109】
[0119] 一部の実施形態において、マイクロスフェアは２つまたはより多くの蛍光色素を含む。マイクロスフェアは、好適な光源で照射したときに、２つまたはより多くの蛍光色素の放出シグナルにより同定され得る。
【0110】
[0120] 一部の実施形態において、マイクロスフェアは、同じ蛍光色素を含む他のマイクロスフェアとは異なる濃度（異なる比）において２つまたはより多くの蛍光色素を含む。そのような実施形態において、マイクロスフェアは、好適な光源で照射したときに、２つまたはより多くの蛍光色素の放出シグナルの強度により他のマイクロスフェアから同定および区別され得る。
【0111】
[0121] マイクロスフェアが２つまたはより多くの蛍光色素を含む一部の実施形態において、２つまたはより多くの蛍光色素の放出シグナルは、単一の蛍光色素の放出シグナルのオーバーレイの結果としてもたらされる。放出シグナルの強度は、したがって、２つまたはより多くの蛍光色素の比およびしたがって対応するマイクロスフェアの指標となる。
【0112】
[0122] １つの実施形態において、１つのマイクロスフェアは、６７５ｎｍで最大の放出シグナルを有する２つの蛍光色素を含んでもよく、別のマイクロスフェアは、７００ｎｍで最大の放出シグナルを有する２つの異なる蛍光色素を含んでもよい。
【0113】
[0123] 少なくとも１つの蛍光色素は、マイクロスフェアの表面上に共有結合的に取り付けられ得るか、またはマイクロスフェア製造（すなわちポリスチレン重合）の間に内部に組み込まれ得るか、またはマイクロスフェアは、少なくとも１つの蛍光色素を含む好適な溶液中にマイクロスフェアを置くことにより製造後に色素付加され得る。少なくとも１つの蛍光色素を含む好適な溶液は例えば有機溶液である。
【0114】
[0124] 少なくとも１つの蛍光色素は、好適な検出システムを使用して例えばレーザーまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）としての任意の好適な光源で励起され得る。
【0115】
[0125] 一部の実施形態において、異なる濃度の蛍光色素を含む異なるマイクロスフェアは同じ光源により励起され得る（例えば、異なるマイクロスフェア中の特定の濃度の１つまたは複数の蛍光色素は同じ波長により励起可能である）。一部の実施形態において、異なるマイクロスフェアは、約６００～約６５０ｎｍの範囲内の波長で励起可能である。一部の実施形態において、異なるマイクロスフェアは、約６１５ｎｍ～約６４０ｎｍの波長で励起可能である。一部の実施形態において、異なるマイクロスフェアは、約６２０～約６３５ｎｍの波長で励起可能である。一部の実施形態において、異なるマイクロスフェアは、約６３５ｎｍの波長で励起可能である。そのようなセットアップの利点は、マイクロスフェア混合物内に存在するすべてのマイクロスフェアを区別するためにただ１つの光源が必要とされ、それにより、複数のノロウイルスＶＬＰが１つの単一の実験において応用され得るセットアップをさらに単純化するということである。
【0116】
[0126] 異なるマイクロスフェアが、好適な検出システムを使用して異なるサイズである場合に、マイクロスフェアはまた、それらのサイズにより同定されてもよい。マイクロスフェアのサイズは０．０１～１００μｍの直径の範囲内である。一部の実施形態において、マイクロスフェアのサイズは約１～約１０μｍの直径の範囲内である。例えば、１つのマイクロスフェアは約６μｍの直径であってもよく、別のマイクロスフェアは約６．５μｍの直径であってもよい。
【0117】
[0127] 異なるマイクロスフェアが、好適な検出システムを使用して異なる形状である場合に、マイクロスフェアはまた、マイクロスフェアの特定の形状により同定されてもよい。
【0118】
[0128] １つの単一の実験において異なるノロウイルスＶＬＰに対して反応性の抗体の同時の検出を可能とするために、異なるサイズまたは異なる検出可能な標識または異なる形状を有するマイクロスフェアは、異なるノロウイルスＶＬＰに連結され、混合される。同じノロウイルスＶＬＰに連結されたマイクロスフェアは、同じサイズまたは同じ検出可能な標識または同じ形状を有する。マイクロスフェアは混合されるが、各々のマイクロスフェアは、マイクロスフェアの特定のサイズまたは検出可能な標識または形状により同定され得る。それにより、マイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰは同時に同定され得る。
【0119】
[0129] マイクロスフェアは、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）により製造されるＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェア、ＭｉｃｒｏＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェア、ＬｕｍＡｖｉｄｉｎ（登録商標）マイクロスフェア、ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）－Ａｖｉｄｉｎマイクロスフェア、およびＳｅｒｏＭＡＰ（登録商標）マイクロスフェアからなるリストからのマイクロスフェアであってもよい。使用され得るマイクロスフェアのタイプは、応用される検出システムに依存する（セクション「検出システム」もまた参照される）。
【0120】
[0130] 一部の実施形態において、マイクロスフェアはＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアであり、これは、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）により製造される表面カルボキシル基および約６．５μｍの直径を有する超常磁性ポリスチレンマイクロスフェアである。ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアは、特定の濃度の２つまたはより多くの蛍光色素を含み、これは、各々のマイクロスフェアが、例えばＬｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）により製造されるＭＡＧＰＩＸ（登録商標）機器などの検出システムにより同定されることを可能とする。異なるＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアカタログ番号（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）のマイクロスフェアは、異なる濃度の２つまたはより多くの蛍光色素を含む。ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアは、同じ励起波長により励起可能であり、したがってただ１つの光源がマイクロスフェア同定のために要求される。一部の実施形態において、励起波長は約６００～約６５０ｎｍである。一部の実施形態において、励起波長は約６１５～約６４０ｎｍである。一部の実施形態において、励起波長は約６２０～約６３５ｎｍである。例えば、一部の実施形態において、励起波長は約６３５ｎｍである。
【0121】
ノロウイルスＶＬＰ
[0131] マイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰは、任意の遺伝子型群、遺伝子型、または変異型の任意のノロウイルスに由来してもよい。好適なノロウイルス株の非限定的な例は、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ＮＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ８７６６１）、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎウイルス（ＳＨＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ０７４１８）、Ｄｅｓｅｒｔ Ｓｈｉｅｌｄウイルス（ＤＳＶ、Ｕ０４４６９）、Ｈｅｓｓｅウイルス（ＨＳＶ）、Ｃｈｉｂａウイルス（ＣＨＶ、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０４２８０８）、Ｈａｗａｉｉウイルス（ＨＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ０７６１１）、Ｓｎｏｗ Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルス（ＳＭＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ７００５９）、Ｔｏｒｏｎｔｏウイルス（ＴＶ、Ｌｅｉｔｅら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４１：８６５～８７５頁）、Ｂｒｉｓｔｏｌウイルス（ＢＶ）、Ｊｅｎａウイルス（ＪＶ、ＡＪ０１０９９）、Ｍａｒｙｌａｎｄウイルス（ＭＶ、ＡＹ０３２６０５）、Ｓｅｔｏウイルス（ＳＶ、ＧｅｎＢａｎｋＡＢ０３１０１３）、Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ（ＣＶ、ＡＦ１４５８９６）、Ｌｏｒｄｓｄａｌｅウイルス（ＬＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ８６５５７）、Ｇｒｉｍｓｂｙウイルス（ＧｒＶ、ＡＪ００４８６４）、Ｍｅｘｉｃｏウイルス（ＭＸＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ２２４９８）、Ｂｏｘｅｒ（ＡＦ５３８６７９）、Ｃ５９（ＡＦ４３５８０７）、ＶＡ１１５（ＡＹ０３８５９８）、ＢＵＤＳ（ＡＹ６６０５６８）、Ｈｏｕｓｔｏｎウイルス（ＨｏＶ）、Ｍｉｎｅｒｖａ株（ＥＦ １２６９６３１）、Ｌａｕｒｅｎｓ株（ＥＦ １２６９６６１）、ＭＯＨ（ＡＦ３９７１５６）、Ｐａｒｒｉｓ Ｉｓｌａｎｄ（ＰｉＶ、ＡＹ６５２９７９）、ＶＡ３８７（ＡＹ０３８６００）、ＶＡ２０７（ＡＹ０３８５９９）、およびＯｐｅｒａｔｉｏｎ Ｉｒａｑｉ Ｆｒｅｅｄｏｍ（ＯＩＦ、ＡＹ６７５５５４）を含む。さらなる例は、Ｈｕ／ＧＩ．１／Ｎｏｒｗａｌｋ／１９６８／ＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ８７６６１）、Ｈｕ／ＧＩ．２／Ｊｉｎｇｚｈｏｕ／２０１３４０１／ＣＨＮ（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＦ３０６２１２）、Ｈｕ／ＧＩ．３／ＪＫＰＧ＿８８３／ＳＷＥ／２００７（ＧｅｎＢａｎｋ ＦＪ７１１１６４．１）、Ｈｕ／ＧＩ．４／１６４３／２００８／ＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＧＱ４１３９７０）、Ｈｕ／ＧＩ．５／Ｓｉｋｌｏｓ－ＨＵＮ５４０７／２０１３／ＨＵＮ（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＫＪ４０２２９５）、Ｈｕ／ＧＩ．６／ＴＣＨ－０９９／ＵＳＡ／２００３（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＣ９９８９５９）、Ｈｕ／ＧＩ．７／Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ１９１／２０１０／ＵＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＮ８９９２４３）、Ｈｕ／ＧＩＩ．３／ＮＩＨＩＣ８．１／２０１１／ＵＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＣ５９７１４０）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｈｏｕｓｔｏｎ／ＴＣＨ１８６／２００２／ＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＸ４５９９０８）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／ＤｅｎＨａａｇ８９／２００６／ＮＬ（ＧｅｎＢａｎｋ ＥＦ１２６９６５．１）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ３８／２００６／ＮＬ（ＧｅｎＢａｎｋ ＥＦ１２６９６３．１）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＸ４５９９０８）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／０３１６９３／ＵＳＡ／２００３（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＱ９６５８１０．１）、Ｈｕ／ＧＩＩ．６／Ｅｈｉｍｅ１２０２４６／２０１２／ＪＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ８１８４００）、Ｈｕ／ＧＩＩ．１２株Ｅ５１５２（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｈｕ／ＧＩＩ．１７／Ｃ１４２／ＧＦ／１９７８（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＮ６９９０４３）、Ｈｕ／ＧＩＩ．１７／ＪＰ／２０１４／Ｎａｇａｎｏ７－１（ＧｅｎＢａｎｋ ＬＣ０４３１３９）、およびＨｕ／ＧＩＩ．１７／ＨＫＧ／２０１５／ＣＵＨＫ－ＮＳ－５１３（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＰ６９８９３１．１）を含む。ノロウイルスのさらなる例は、ノロウイルス遺伝子型群１ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ／２００１／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１６；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｂｒａｄｄｏｃｋ Ｈｅｉｇｈｔｓ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１５；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｙｅｔｔｅ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１４；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１３；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｓａｎｄｕｓｋｙ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１２；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｃａｎｔｏｎ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１１；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｔｉｆｆｉｎ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１０；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－Ｅｌ／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００；ノロウイルス遺伝子型群１ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２００１／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００８；ノロウイルス遺伝子型群１ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－８４１／２００１／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００７；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｈｉｒａｍ／２０００／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００６；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｔｏｎｔｏｇａｎｙ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００５；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ．ｓｕｂ．－００１９５９；ノロウイルスＨｕ／ＧＩ／Ｏｔｏｆｕｋｅ／１９７９／ＪＰゲノムＲＮＡ、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ １８７５１４；ノロウイルスＨｕ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１３３／２００３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ２１２３０６；ノロウイルスＳｙｄｎｅｙ ２２１２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８１３２；ＮｏｒｗａｌｋウイルスＳＮ２０００ＪＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１９０４５７；Ｌｏｒｄｓｄａｌｅウイルス全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ８６５５７；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、Ｇｉｆｕ’９６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４５６０３；ＮｏｒｗａｌｋウイルスＶｉｅｔｎａｍ ０２６株、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０４６７１；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ．４／２００４／Ｎ／Ｌ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８８３０９６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｈｏｋｕｓｈｉｎ／０３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１９５２２７；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｋａｍｏ／０３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ １９５２２８；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｓｉｎｓｉｒｏ／９７／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ １９５２２６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｉｎａ／０２／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１９５２２５；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ＧＩＩ／Ｎｅｕｓｔｒｅｌｉｔｚ２６０／２０００／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７７２７３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｄｒｅｓｄｅｎｌ ７４／ｐＵＳ－ＮｏｒＩＩ／ｌ ９９７／ＧＥ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７４１８１１；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ２Ｓ１６／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８７９８９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ４Ｓ７／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８７９８７；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｗｉｔｎｅｙ／Ｂ７Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｂａｎｂｕｒｙ／Ｂ９Ｓ２３／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ＣｈｉｐｐｉｎｇＮｏｒｔｏｎ／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２８；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｄｉｄｃｏｔ／Ｂ９Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２７；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ８Ｓ５／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２６；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ４／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２５；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ５／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２４；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ５Ｓ２３／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２３；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２２；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ６／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＢｏ／ＴｈｉｒｓｋｌＯ／００／ＵＫ分離株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１２６４６８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＢｏ／Ｐｅｎｒｉｔｈ５５／００／ＵＫ分離株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１２６４７６；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＢｏ／Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ２４／００／ＵＫ分離株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ １２６４７５；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＢｏ／Ｄｕｍｆｒｉｅｓ／９４／ＵＫ分離株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１２６４７４；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ２０３６／２００３／Ｉｒａｑ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６７５５５５；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ１９９８／２００３／Ｉｒａｑ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６７５５５４；ノロウイルスＮＬＶ／ＢＵＤＳ／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６６０５６８；ノロウイルスＮＬＶ／Ｐａｒｉｓ Ｉｓｌａｎｄ／２００３／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６５２９７９；Ｓｎｏｗ Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルス、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１３４７４８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｆｏｒｔ Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ／５６０／１９９８／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２６；Ｈｕ／ノロウイルス／ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／１９９９／ＪＰ（９９１２－０２Ｆ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４４３６６；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス１ ＩＭＳＵ－ＭＷ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２７４８２０；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＢ－ＩＳＶＤ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２７４８１９；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ Ｈｉｌｌｓ／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２３；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－Ｇ４／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２２；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－Ｇ２／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２１；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－Ｇ１２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２０；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ａｎｃｈｏｒａｇｅ／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１９；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－Ｄｌ／２００２／ＣＡＮ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１８；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｇｅｒｍａｎｔｏｎ／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１７；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／ＧＩＩ／Ｌａｎｇｅｎｌ０６１／２００２／ＤＥ、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ４８５６４２；
マウスノロウイルス１ポリプロテイン、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２２８２３５；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６７５３６；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｍｅｘ７０７６／１９９９、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５４２０９０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｎ ４５５／０１／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５３９４４０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｈｅｒｚｂｅｒｇ ３８５／０１／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５３９４３９；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｂｏｘｅｒ／２００１／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５３８６７９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０８１７２３；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、全ゲノム、分離株：Ｓａｉｔａｍａ Ｕ２０１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３９７８２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、全ゲノム、分離株：Ｓａｉｔａｍａ Ｕｌ ８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３９７８１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、全ゲノム、分離株：Ｓａｉｔａｍａ Ｕ２５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３９７８０；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株：Ｕ２５ＧＩＩ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６７５４３；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株：Ｕ２０１ ＧＩＩ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６７５４２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス４１６／９７００３１５６／１９９６／ＬＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８０５５９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス４０８／９７００３０１２／１９９６／ＦＬ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８０５５８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｂｕｒｗａｓｈ Ｌａｎｄｉｎｇ／３３１／１９９５／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２５；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｍｉａｍｉ Ｂｅａｃｈ／３２６／１９９５／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２４；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｗｈｉｔｅ Ｒｉｖｅｒ／２９０／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２３；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ／３０６／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｐｏｒｔ Ｃａｎａｖｅｒａｌ／３０１／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｈｏｎｏｌｕｌｕ／３１４／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２０；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｒｉｃｈｍｏｎｄ／２８３／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｗｅｓｔｏｖｅｒ／３０２／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／ＵＫ３－ １７／１２７００／１９９２／ＧＢ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１７；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｍｉａｍｉ／８１／１９８６／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１６；Ｓｎｏｗ Ｍｏｕｎｔａｉｎ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７００５９；Ｄｅｓｅｒｔ ＳｈｉｅｌｄウイルスＤＳＶ３９５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４４６９；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９３７９７；Ｈａｗａｉｉカリシウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０７６１１；Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０７４１８；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ＳＲＳＶ－ＫＹ－８９／８９／Ｊ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２３８２８；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ＳＲＳＶ－ＳＭＡ／７６／ＵＳ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２３８３１；Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４６５００；ヒトカリシウイルスＭｅｌｋｓｈａｍ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ８１８７９；ヒトカリシウイルスＭＸ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２２４９８；ミニレオウイルスＴＶ２４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０２０３０；およびＮｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｇｗｙｎｅｄｄ／２７３／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４０９であり；（本出願の出願日までにエントリーされた）これらのすべての配列は参照により本明細書に組み込まれる。追加のノロウイルス配列は、以下の特許刊行物：国際公開第２００５／０３０８０６号パンフレット、国際公開第２０００／７９２８０号パンフレット、日本特許出願公開第２００２０２０３９９号明細書、米国特許出願公開第２００３１２９５８８号明細書、米国特許第６，５７２，８６２号明細書、国際公開第１９９４／０５７００号パンフレット、および国際公開第０５／０３２４５７号パンフレットにおいて開示されており、これらのすべては参照により全体が本明細書に組み込まれる。配列比較ならびにノロウイルスの遺伝的多様性および系統発生分析の議論のために、Ｇｒｅｅｎら（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、Ｖｏｌ．１８１（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ３２２～３３０頁；Ｗａｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．６８：５９８２～５９９０頁；Ｃｈｅｎら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７８：６４６９～６４７９頁；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７９：５５４～５６８頁；Ｈａｎｓｍａｎら（２００６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．８７：９０９～９１９頁；Ｂｕｌｌら（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．、Ｖｏｌ．４４（２）：３２７～３３３頁；Ｓｉｅｂｅｎｇａら（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．８１（１８）：９９３２～９９４１頁、およびＦａｎｋｈａｕｓｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、Ｖｏｌ．１７８：１５７１～１５７８頁も参照。本開示はまた、出願の時点において特徴付けもしくは発見されていないか、または出願の時点の後に出現し得るノロウイルスに向けられる。
[0131] マイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰは、任意の遺伝子型群、遺伝子型、または変異型の任意のノロウイルスに由来してもよい。好適なノロウイルス株の非限定的な例は、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ＮＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ８７６６１）、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎウイルス（ＳＨＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ０７４１８）、Ｄｅｓｅｒｔ Ｓｈｉｅｌｄウイルス（ＤＳＶ、Ｕ０４４６９）、Ｈｅｓｓｅウイルス（ＨＳＶ）、Ｃｈｉｂａウイルス（ＣＨＶ、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０４２８０８）、Ｈａｗａｉｉウイルス（ＨＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ０７６１１）、Ｓｎｏｗ Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルス（ＳＭＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ７００５９）、Ｔｏｒｏｎｔｏウイルス（ＴＶ、Ｌｅｉｔｅら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４１：８６５～８７５頁）、Ｂｒｉｓｔｏｌウイルス（ＢＶ）、Ｊｅｎａウイルス（ＪＶ、ＡＪ０１０９９）、Ｍａｒｙｌａｎｄウイルス（ＭＶ、ＡＹ０３２６０５）、Ｓｅｔｏウイルス（ＳＶ、ＧｅｎＢａｎｋＡＢ０３１０１３）、Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ（ＣＶ、ＡＦ１４５８９６）、Ｌｏｒｄｓｄａｌｅウイルス（ＬＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ８６５５７）、Ｇｒｉｍｓｂｙウイルス（ＧｒＶ、ＡＪ００４８６４）、Ｍｅｘｉｃｏウイルス（ＭＸＶ、ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ２２４９８）、Ｂｏｘｅｒ（ＡＦ５３８６７９）、Ｃ５９（ＡＦ４３５８０７）、ＶＡ１１５（ＡＹ０３８５９８）、ＢＵＤＳ（ＡＹ６６０５６８）、Ｈｏｕｓｔｏｎウイルス（ＨｏＶ）、Ｍｉｎｅｒｖａ株（ＥＦ １２６９６３１）、Ｌａｕｒｅｎｓ株（ＥＦ １２６９６６１）、ＭＯＨ（ＡＦ３９７１５６）、Ｐａｒｒｉｓ Ｉｓｌａｎｄ（ＰｉＶ、ＡＹ６５２９７９）、ＶＡ３８７（ＡＹ０３８６００）、ＶＡ２０７（ＡＹ０３８５９９）、およびＯｐｅｒａｔｉｏｎ Ｉｒａｑｉ Ｆｒｅｅｄｏｍ（ＯＩＦ、ＡＹ６７５５５４）を含む。さらなる例は、Ｈｕ／ＧＩ．１／Ｎｏｒｗａｌｋ／１９６８／ＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ８７６６１）、Ｈｕ／ＧＩ．２／Ｊｉｎｇｚｈｏｕ／２０１３４０１／ＣＨＮ（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＦ３０６２１２）、Ｈｕ／ＧＩ．３／ＪＫＰＧ＿８８３／ＳＷＥ／２００７（ＧｅｎＢａｎｋ ＦＪ７１１１６４．１）、Ｈｕ／ＧＩ．４／１６４３／２００８／ＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＧＱ４１３９７０）、Ｈｕ／ＧＩ．５／Ｓｉｋｌｏｓ－ＨＵＮ５４０７／２０１３／ＨＵＮ（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＫＪ４０２２９５）、Ｈｕ／ＧＩ．６／ＴＣＨ－０９９／ＵＳＡ／２００３（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＣ９９８９５９）、Ｈｕ／ＧＩ．７／Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ１９１／２０１０／ＵＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＮ８９９２４３）、Ｈｕ／ＧＩＩ．３／ＮＩＨＩＣ８．１／２０１１／ＵＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＣ５９７１４０）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｈｏｕｓｔｏｎ／ＴＣＨ１８６／２００２／ＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＸ４５９９０８）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／ＤｅｎＨａａｇ８９／２００６／ＮＬ（ＧｅｎＢａｎｋ ＥＦ１２６９６５．１）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ３８／２００６／ＮＬ（ＧｅｎＢａｎｋ ＥＦ１２６９６３．１）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＸ４５９９０８）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／０３１６９３／ＵＳＡ／２００３（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＱ９６５８１０．１）、Ｈｕ／ＧＩＩ．６／Ｅｈｉｍｅ１２０２４６／２０１２／ＪＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ８１８４００）、Ｈｕ／ＧＩＩ．１２株Ｅ５１５２（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｈｕ／ＧＩＩ．１７／Ｃ１４２／ＧＦ／１９７８（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＮ６９９０４３）、Ｈｕ／ＧＩＩ．１７／ＪＰ／２０１４／Ｎａｇａｎｏ７－１（ＧｅｎＢａｎｋ ＬＣ０４３１３９）、およびＨｕ／ＧＩＩ．１７／ＨＫＧ／２０１５／ＣＵＨＫ－ＮＳ－５１３（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＰ６９８９３１．１）を含む。ノロウイルスのさらなる例は、ノロウイルス遺伝子型群１ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ／２００１／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１６；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｂｒａｄｄｏｃｋ Ｈｅｉｇｈｔｓ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１５；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｙｅｔｔｅ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１４；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１３；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｓａｎｄｕｓｋｙ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１２；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｃａｎｔｏｎ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１１；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｔｉｆｆｉｎ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１０；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－Ｅｌ／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００；ノロウイルス遺伝子型群１ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２００１／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００８；ノロウイルス遺伝子型群１ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－８４１／２００１／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００７；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｈｉｒａｍ／２０００／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００６；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｔｏｎｔｏｇａｎｙ／１９９９／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００５；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ．ｓｕｂ．－００１９５９；ノロウイルスＨｕ／ＧＩ／Ｏｔｏｆｕｋｅ／１９７９／ＪＰゲノムＲＮＡ、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ １８７５１４；ノロウイルスＨｕ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１３３／２００３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ２１２３０６；ノロウイルスＳｙｄｎｅｙ ２２１２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８１３２；ＮｏｒｗａｌｋウイルスＳＮ２０００ＪＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１９０４５７；Ｌｏｒｄｓｄａｌｅウイルス全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ８６５５７；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、Ｇｉｆｕ’９６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４５６０３；ＮｏｒｗａｌｋウイルスＶｉｅｔｎａｍ ０２６株、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０４６７１；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ．４／２００４／Ｎ／Ｌ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８８３０９６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｈｏｋｕｓｈｉｎ／０３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１９５２２７；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｋａｍｏ／０３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ １９５２２８；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｓｉｎｓｉｒｏ／９７／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ １９５２２６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｉｎａ／０２／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１９５２２５；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ＧＩＩ／Ｎｅｕｓｔｒｅｌｉｔｚ２６０／２０００／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７７２７３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｄｒｅｓｄｅｎｌ ７４／ｐＵＳ－ＮｏｒＩＩ／ｌ ９９７／ＧＥ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７４１８１１；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ２Ｓ１６／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８７９８９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ４Ｓ７／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８７９８７；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｗｉｔｎｅｙ／Ｂ７Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｂａｎｂｕｒｙ／Ｂ９Ｓ２３／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ＣｈｉｐｐｉｎｇＮｏｒｔｏｎ／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２８；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｄｉｄｃｏｔ／Ｂ９Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２７；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ８Ｓ５／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２６；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ４／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２５；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ５／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２４；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ５Ｓ２３／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２３；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２２；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ６／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＢｏ／ＴｈｉｒｓｋｌＯ／００／ＵＫ分離株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１２６４６８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＢｏ／Ｐｅｎｒｉｔｈ５５／００／ＵＫ分離株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１２６４７６；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＢｏ／Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ２４／００／ＵＫ分離株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ １２６４７５；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＢｏ／Ｄｕｍｆｒｉｅｓ／９４／ＵＫ分離株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１２６４７４；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ２０３６／２００３／Ｉｒａｑ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６７５５５５；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ１９９８／２００３／Ｉｒａｑ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６７５５５４；ノロウイルスＮＬＶ／ＢＵＤＳ／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６６０５６８；ノロウイルスＮＬＶ／Ｐａｒｉｓ Ｉｓｌａｎｄ／２００３／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６５２９７９；Ｓｎｏｗ Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルス、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１３４７４８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｆｏｒｔ Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ／５６０／１９９８／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２６；Ｈｕ／ノロウイルス／ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／１９９９／ＪＰ（９９１２－０２Ｆ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４４３６６；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス１ ＩＭＳＵ－ＭＷ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２７４８２０；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＢ－ＩＳＶＤ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２７４８１９；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ Ｈｉｌｌｓ／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２３；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－Ｇ４／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２２；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－Ｇ２／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２１；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－Ｇ１２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２０；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ａｎｃｈｏｒａｇｅ／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１９；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ－Ｄｌ／２００２／ＣＡＮ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１８；ノロウイルス遺伝子型群２ Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｇｅｒｍａｎｔｏｎ／２００２／ＵＳＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１７；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／ＧＩＩ／Ｌａｎｇｅｎｌ０６１／２００２／ＤＥ、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ４８５６４２；
マウスノロウイルス１ポリプロテイン、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２２８２３５；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６７５３６；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｍｅｘ７０７６／１９９９、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５４２０９０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｎ ４５５／０１／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５３９４４０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｈｅｒｚｂｅｒｇ ３８５／０１／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５３９４３９；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｂｏｘｅｒ／２００１／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５３８６７９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０８１７２３；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、全ゲノム、分離株：Ｓａｉｔａｍａ Ｕ２０１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３９７８２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、全ゲノム、分離株：Ｓａｉｔａｍａ Ｕｌ ８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３９７８１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、全ゲノム、分離株：Ｓａｉｔａｍａ Ｕ２５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３９７８０；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株：Ｕ２５ＧＩＩ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６７５４３；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株：Ｕ２０１ ＧＩＩ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６７５４２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス４１６／９７００３１５６／１９９６／ＬＡ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８０５５９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス４０８／９７００３０１２／１９９６／ＦＬ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８０５５８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｂｕｒｗａｓｈ Ｌａｎｄｉｎｇ／３３１／１９９５／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２５；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｍｉａｍｉ Ｂｅａｃｈ／３２６／１９９５／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２４；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｗｈｉｔｅ Ｒｉｖｅｒ／２９０／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２３；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ／３０６／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｐｏｒｔ Ｃａｎａｖｅｒａｌ／３０１／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｈｏｎｏｌｕｌｕ／３１４／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２０；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｒｉｃｈｍｏｎｄ／２８３／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｗｅｓｔｏｖｅｒ／３０２／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／ＵＫ３－ １７／１２７００／１９９２／ＧＢ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１７；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｍｉａｍｉ／８１／１９８６／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１６；Ｓｎｏｗ Ｍｏｕｎｔａｉｎ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７００５９；Ｄｅｓｅｒｔ ＳｈｉｅｌｄウイルスＤＳＶ３９５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４４６９；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９３７９７；Ｈａｗａｉｉカリシウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０７６１１；Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０７４１８；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ＳＲＳＶ－ＫＹ－８９／８９／Ｊ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２３８２８；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ＳＲＳＶ－ＳＭＡ／７６／ＵＳ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２３８３１；Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４６５００；ヒトカリシウイルスＭｅｌｋｓｈａｍ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ８１８７９；ヒトカリシウイルスＭＸ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２２４９８；ミニレオウイルスＴＶ２４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０２０３０；およびＮｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｇｗｙｎｅｄｄ／２７３／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４０９であり；（本出願の出願日までにエントリーされた）これらのすべての配列は参照により本明細書に組み込まれる。追加のノロウイルス配列は、以下の特許刊行物：国際公開第２００５／０３０８０６号パンフレット、国際公開第２０００／７９２８０号パンフレット、日本特許出願公開第２００２０２０３９９号明細書、米国特許出願公開第２００３１２９５８８号明細書、米国特許第６，５７２，８６２号明細書、国際公開第１９９４／０５７００号パンフレット、および国際公開第０５／０３２４５７号パンフレットにおいて開示されており、これらのすべては参照により全体が本明細書に組み込まれる。配列比較ならびにノロウイルスの遺伝的多様性および系統発生分析の議論のために、Ｇｒｅｅｎら（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、Ｖｏｌ．１８１（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ３２２～３３０頁；Ｗａｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．６８：５９８２～５９９０頁；Ｃｈｅｎら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７８：６４６９～６４７９頁；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７９：５５４～５６８頁；Ｈａｎｓｍａｎら（２００６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．８７：９０９～９１９頁；Ｂｕｌｌら（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．、Ｖｏｌ．４４（２）：３２７～３３３頁；Ｓｉｅｂｅｎｇａら（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．８１（１８）：９９３２～９９４１頁、およびＦａｎｋｈａｕｓｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、Ｖｏｌ．１７８：１５７１～１５７８頁も参照。本開示はまた、出願の時点において特徴付けもしくは発見されていないか、または出願の時点の後に出現し得るノロウイルスに向けられる。
【0122】
[0132] ノロウイルスＶＬＰはさらに、２つまたはより多くのノロウイルス、例えばＧＩＩ．４変異型からのノロウイルスコンセンサス配列に由来してもよい。そのようなノロウイルスコンセンサス配列に由来するノロウイルスＶＬＰは、２つまたはより多くのノロウイルスの抗原特性を有する。コンセンサス配列は任意のノロウイルスから決定されてもよい。コンセンサス配列は、ノロウイルスの構造タンパク質をコードする配列、特にノロウイルスのＶＰ１タンパク質をコードする配列に由来してもよい（下記の実施例１も参照）。１つの実施形態において、コンセンサス配列は、例えば国際公開第２０１０／０１７５２４２号パンフレットおよびＰａｒｒａら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１２、３０（２４）：３５０～３５８６頁に記載されるようにＧＩＩ．４ノロウイルス：Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｈｏｕｓｔｏｎ／ＴＣＨ１８６／２００２／ＵＳ、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｄｅｎ Ｈａａｇ８９／２００６／ＮＬ、およびＨｕ／ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ３８／２００６／ＮＬのＶＰ１配列から構築される。結果としてもたらされるノロウイルスＶＬＰは、本出願においてＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰと呼称される（表１も参照）。別の実施形態において、コンセンサス配列は、ＧＩノロウイルス：Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（アクセッション番号：Ｍ８７６６１）、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ（アクセッション番号：Ｑ０４５４２）、およびＣｈｉｂａウイルス（アクセッション番号：ＢＡＢ１８２６７）の配列から構築される。
【0123】
[0133] ノロウイルスＶＬＰは、それが由来するノロウイルスの構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２）の少なくとも１つを含む。１つの実施形態において、ノロウイルスＶＬＰはメジャーな構造タンパク質（ＶＰ１）およびマイナーな構造タンパク質（ＶＰ２）を含有する。より特定の実施形態において、ノロウイルスＶＬＰはメジャーな構造タンパク質（ＶＰ１）を含有する。１つの特定の実施形態によれば、ノロウイルスＶＬＰは、ノロウイルスＶＬＰが由来するノロウイルスからのメジャーな構造タンパク質（ＶＰ１）配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％または１００％同一のＶＰ１配列を含む。
【0124】
[0134] 本開示のノロウイルスＶＬＰは、それが由来するノロウイルスの１つもしくは複数の全長構造タンパク質またはその切断されたバージョンのいずれかを含むことができる。切断されたバージョンは、構造タンパク質のある特定のドメインであってもよい。
【0125】
[0135] １つの実施形態によれば、本開示のノロウイルスＶＬＰは、１つのノロウイルスの１つまたは複数の構造タンパク質を含む。別の実施形態によれば、本開示のノロウイルスＶＬＰは、少なくとも２つの異なるノロウイルスの１つまたは複数の構造タンパク質を含む。例えば、ノロウイルスＶＬＰは、１つのノロウイルス株からのＶＰ１タンパク質および別のノロウイルス株からのＶＰ１タンパク質を含んでもよい。
【0126】
[0136] ノロウイルスＶＬＰは、少なくとも１つのカプシドタンパク質またはその切断されたバージョンをコードするノロウイルス核酸配列を使用して発現システムにおいて組換え製造される。所望される粒子形成性ポリペプチドのためのコーディング配列が一旦単離または合成されたら、それらは、発現のために任意の好適なベクターまたはレプリコンにクローニングされ得る。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択は当業者の技術的範囲内である。ベクターは次に、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。好適な組換え発現システムは、細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バキュロウイルス／昆虫、ワクシニア、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、アルファウイルス（例えば、シンドビス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ））、哺乳動物（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、マウス骨髄腫（ＳＢ２０）、およびサル腎臓細胞（ＣＯＳ））、酵母（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉおよび他のＰｉｃｈｉａ発現システム）、植物、ならびにＸｅｎｏｐｕｓ発現システムの他に、当技術分野において公知のその他のものを含むが、それに限定されない。
【0127】
[0137] 一部の実施形態において、ノロウイルスＶＬＰは、実質的に純粋な状態において使用される。選択される発現システムおよび宿主に依存して、ＶＬＰは、粒子形成性ポリペプチドが発現され、ＶＬＰが形成され得る条件下で発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることにより製造される。適切な増殖条件の選択は、当技術分野の技術的範囲内である。
【0128】
[0138] 本開示の１つの実施形態によれば、ノロウイルスＶＬＰは真核発現システムにおいて組換え製造される。
【0129】
[0139] 特有の実施形態において、ノロウイルスＶＬＰは哺乳動物発現システムにおいて製造される。哺乳動物細胞培養においてＶＬＰを製造するための手順は当技術分野において周知である。例えば、構造タンパク質をコードする哺乳動物コドン最適化ヌクレオチド配列を有する組換えアデノウイルスクローンが、哺乳動物細胞、例えばＶｅｒｏ細胞に感染させるために使用される。ＶＬＰは、細胞培養物から単離され得る。
【0130】
[0140] 他の特有の実施形態において、ノロウイルスＶＬＰは昆虫発現システムにおいて製造される。好適な昆虫細胞は、Ｓｆ９、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、ＴｎｉＰｒｏ、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉを含む。昆虫細胞培養においてＶＬＰを製造するための手順は当技術分野において周知である（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，９４２，８６５号明細書を参照）。簡潔に述べれば、カプシド配列を有する組換えバキュロウイルスが合成ｃＤＮＡから構築される。組換えバキュロウイルスは次に、昆虫細胞培養物（例えばＳｆ９、Ｈｉｇｈ ＦｉｖｅおよびＴｎｉＰｒｏ細胞）に感染させるために使用され、ＶＬＰは細胞培養物から単離され得る。
【0131】
[0141] ＶＬＰが細胞内に形成される場合、細胞は次に、細胞を溶解するがＶＬＰを実質的にインタクトに保つ化学的、物理的または機械的手段を使用して、破砕される。そのような方法は当業者に公知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、（Ｅ．Ｌ．Ｖ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ編、１９９０）において記載されている。
【0132】
[0142] 粒子は次に、その完全性を保存する方法、例えば、密度勾配遠心分離、例えば、スクロース勾配、ＰＥＧ沈殿、およびペレット化など（例えば、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒら Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６９２９～６９３６頁を参照）の他に、例えば、イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを含む、標準的な精製技術を使用して単離される（または実質的に精製される）。
【0133】
[0143] 本開示に応用可能な分子生物学技術、例えばクローニング、および突然変異などを記載する一般的なテキストは、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．）、Ｖｏｌ．１～３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．とのジョイントベンチャー（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）を含む。これらのテキストは、突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、ならびに、例えば、ノロウイルスのカプシドタンパク質のクローニングおよび発現に関する、多くの他の関連するトピックを記載する。
【0134】
[0144] 本出願および特許請求の範囲の全体を通じて、特定のノロウイルスＶＬＰは、表１において呼称されるように参照される。例えば、ＧＩ．１ ＶＬＰは、Ｈｕ／ＧＩ．１／Ｎｏｒｗａｌｋ／１９６８／ＵＳノロウイルスに由来するノロウイルスＶＬＰ、すなわちＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ５０４６６．２および配列番号１において提供される配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％または１００％同一の配列を有するメジャーなカプシドタンパク質ＶＰ１を含むものを指す。
【0135】
レポーター抗体、二次レポーター抗体、および検出抗体
[0145] このセクション内の仕様および実施形態は、先行および後続するセクションの仕様および実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
[0145] このセクション内の仕様および実施形態は、先行および後続するセクションの仕様および実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
【0136】
[0146] 本開示の方法およびキットにおける使用のためのレポーター、二次レポーター、および検出Ａｂは、組換えＡｂ、モノクローナルＡｂ、またはポリクローナルＡｂであってもよい。
【0137】
[0147] 本開示のある特定の実施形態によれば、レポーター、二次レポーター、および検出抗体は、ジスルフィド結合により相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖である４つのポリペプチド鎖を含む、全長免疫グロブリン（Ｉｇ）分子である。
【0138】
[0148] レポーター、二次レポーター、および検出Ａｂは任意の起源に由来してもよい。本開示のある特定の実施形態によれば、レポーター、二次レポーター、および検出Ａｂは、非ヒト起源、例えばヒツジ、マウス、ウサギ、ヤギ、またはロバに由来する。ある特定の実施形態において、レポーターＡｂはヒト起源に由来してもよい。この文脈における「～に由来する」は、Ａｂが、対応する起源において製造されたことを意味する。例えば、ヒツジに由来するＡｂは、ヒツジにおいて製造されたＡｂを指す。
【0139】
検出Ａｂ
[0149] 検出Ａｂは、非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップを使用する本開示の方法において応用され、該方法において、１つまたは複数の異なるマイクロスフェアが連結された１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰは試料と接触させられる（下記のサブセクション「非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップ」もまた参照される）。
[0149] 検出Ａｂは、非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップを使用する本開示の方法において応用され、該方法において、１つまたは複数の異なるマイクロスフェアが連結された１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰは試料と接触させられる（下記のサブセクション「非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップ」もまた参照される）。
【0140】
[0150] 本開示によれば、検出Ａｂは、試料中のノロウイルス反応性抗体に結合する能力を有する。特有の実施形態において、検出Ａｂは、検出Ａｂの可変領域を用いて試料中のノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に結合する能力を有する。
【0141】
[0151] ある特定の実施形態において、検出Ａｂは、アイソタイプＡからの抗体（ＩｇＡ）に結合し、他のアイソタイプからの抗体に結合しない。１つの実施形態において、レポーターＡｂは、アイソタイプＧからの抗体（ＩｇＧ）に結合し、他のアイソタイプからの抗体に結合しない。１つの実施形態において、レポーターＡｂは、アイソタイプＭからの抗体（ＩｇＭ）に結合し、他のアイソタイプからの抗体に結合しない。１つの実施形態において、レポーターＡｂは、アイソタイプＡ、Ｇ、およびＭからの抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に結合する。
【0142】
[0152] 本開示の実施形態において、検出Ａｂは、検出可能な標識に（直接的に）取り付けられる。一部の実施形態において、検出Ａｂは、検出Ａｂの重鎖定常領域により、検出可能な標識に取り付けられる。
【0143】
[0153] 検出Ａｂが取り付けられる検出可能な標識に関して、サブセクション「検出可能な標識」もまた参照される。
【0144】
レポーターＡｂ
[0154] レポーターＡｂは、競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップを使用する本開示の方法において応用され、該方法において、１つまたは複数の異なるマイクロスフェアが連結された１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰは試料と接触させられる（下記のサブセクション「競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップ」もまた参照される）。
[0154] レポーターＡｂは、競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップを使用する本開示の方法において応用され、該方法において、１つまたは複数の異なるマイクロスフェアが連結された１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰは試料と接触させられる（下記のサブセクション「競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップ」もまた参照される）。
【0145】
[0155] これらの実施形態において、レポーターＡｂは、１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰに結合する能力を有する。特有の実施形態において、レポーターＡｂは、レポーター抗体の可変領域を用いて１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰに結合する。それにより、レポーターＡｂは、１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰへの結合について試料中のノロウイルス反応性Ａｂと競合する能力を有する。
【0146】
[0156] １つの実施形態において、レポーターＡｂはモノクローナル抗体である。１つの実施形態において、レポーターＡｂは非ヒト起源に由来する。１つの実施形態において、レポーターＡｂはノロウイルス中和抗体である。１つの実施形態において、レポーターＡｂはノロウイルス遮断抗体である。１つの実施形態において、レポーターＡｂはノロウイルス遮断抗体およびノロウイルス中和抗体である。
【0147】
[0157] ２つまたはより多くのノロウイルスＶＬＰが試料と接触させられる一部の実施形態（マルチプレックスの方法）において、レポーター抗体は、２つまたはより多くのノロウイルスＶＬＰのうちの１つにのみ結合し、他のノロウイルスＶＬＰに結合しない。２つまたはより多くのノロウイルスＶＬＰが試料と接触させられるある特定の他の実施形態（マルチプレックスの方法）において、レポーター抗体は、２つまたはより多くのノロウイルスＶＬＰのうちの１つより多くに結合し、すなわちレポーターＡｂは交差反応性レポーターＡｂである。例えば、ｍＡｂ ５Ａ０４は、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰにのみ結合し、０．００４μｇ／ｍＬのＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰに対するＥＣ５０値を提供する。対照的に、ｍＡｂ ８Ａ０８は、それぞれ０．００９または０．００８μｇ／ｍＬのＧＩＩ．４／Ｄｅｎ ＨａａｇおよびＧＩＩ．４／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓに対するＥＣ５０値を提供し、したがって交差反応性レポーターＡｂである（表１０を参照）。
【0148】
[0158] 一部の実施形態において、レポーターＡｂは、配列番号２７により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および配列番号２８により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含む。対応するＤＮＡ配列および全長配列について、下記の実施例における添付文書セクションもまた参照される。
【0149】
[0159] 一部の実施形態において、レポーターＡｂは、配列番号２９により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および配列番号３０により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含む。対応するＤＮＡ配列および全長配列について、下記の実施例における添付文書セクションもまた参照される。
【0150】
[0160] 試料と接触させられる異なるノロウイルスＶＬＰに対して反応性の交差反応性レポーター抗体の応用により、異なるノロウイルスＶＬＰに対しても交差反応性の試料内の抗体は、１つのレポーターＡｂの応用により決定され得る。
【0151】
[0161] １つの実施形態において、レポーターＡｂは、０．５μｇ／ｍＬ未満、または０．４μｇ／ｍＬ未満または０．３μｇ／ｍＬ未満または０．２μｇ／ｍＬ未満または０．１５μｇ／ｍＬ未満または０．１μｇ／ｍＬ未満または０．０９μｇ／ｍＬ未満または０．０８μｇ／ｍＬ未満または０．０７μｇ／ｍＬ未満または０．０５μｇ／ｍＬ未満または０．０３μｇ／ｍＬ未満または０．０２μｇ／ｍＬ未満または０．０１μｇ／ｍＬ未満の本開示の方法において応用される１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰに対するＥＣ５０値を提供する。
【0152】
[0162] 一部の実施形態において、レポーターＡｂは、検出可能な標識に取り付けられる。一部の実施形態において、レポーター抗体は、レポーターＡｂの重鎖定常領域により、検出可能な標識に取り付けられる。
【0153】
[0163] ある特定の実施形態において、レポーターＡｂは、検出可能な標識に直接的に（すなわちそれ自体が）取り付けられる。一部の実施形態において、レポーターＡｂは、レポーターＡｂの重鎖定常領域により、検出可能な標識に直接的に取り付けられる。レポーターＡｂが、検出可能な標識にそれ自体が取り付けられる実施形態において、二次レポーターＡｂは必要でない。
【0154】
[0164] ある特定の実施形態において、レポーターＡｂは、検出可能な標識に直接的に取り付けられないが、間接的に取り付けられる。これらの実施形態において、二次レポーターＡｂは、レポーターＡｂの検出を可能にするために応用される。一部の実施形態において、レポーターＡｂは、少なくとも１つのレポーター抗体の重鎖定常領域により、検出可能な標識に間接的に取り付けられ、レポーター抗体は、検出可能な標識に直接的に取り付けられた二次レポーター抗体と反応する。
【0155】
[0165] 二次レポーター抗体に関して、下記のサブセクション「二次レポーターＡｂ」が参照される。レポーターＡｂが取り付けられる検出可能な標識に関して、サブセクション「検出可能な標識」もまた参照される。
【0156】
二次レポーターＡｂ
[0166] レポーター抗体が、検出可能な標識に間接的に取り付けられる実施形態において、レポーター抗体は二次レポーターＡｂとのインキュベーションにより検出され、二次レポーターＡｂはレポーターＡｂに結合する。一部の実施形態において、二次レポーターＡｂは、二次レポーターＡｂの可変領域を用いてレポーターＡｂの重鎖定常領域に結合する。
[0166] レポーター抗体が、検出可能な標識に間接的に取り付けられる実施形態において、レポーター抗体は二次レポーターＡｂとのインキュベーションにより検出され、二次レポーターＡｂはレポーターＡｂに結合する。一部の実施形態において、二次レポーターＡｂは、二次レポーターＡｂの可変領域を用いてレポーターＡｂの重鎖定常領域に結合する。
【0157】
[0167] 本開示の意味において、二次レポーターＡｂは、例えば、二次レポーターＡｂの重鎖定常領域を介して、検出可能な標識に（直接的に）取り付けられる。
【0158】
[0168] レポーターＡｂが取り付けられる検出可能な標識に関して、サブセクション「検出可能な標識」もまた参照される。
【0159】
検出可能な標識
[0169] 本開示の１つの実施形態によれば、検出、レポーター、および二次レポーター抗体が取り付けられる検出可能な標識は、化学、物理または酵素反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的にまたは間接的に生成する１つまたは複数の適切な化学物質または酵素を含む化合物または部分である。標識化は、当技術分野において周知の方法により達成され得る（例えば、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．、およびＺｏｒｂａｓ Ｈ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ ２０１２、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋを参照）。本開示による検出可能な標識は、好適な検出システムを用いて検出され得る。
[0169] 本開示の１つの実施形態によれば、検出、レポーター、および二次レポーター抗体が取り付けられる検出可能な標識は、化学、物理または酵素反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的にまたは間接的に生成する１つまたは複数の適切な化学物質または酵素を含む化合物または部分である。標識化は、当技術分野において周知の方法により達成され得る（例えば、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．、およびＺｏｒｂａｓ Ｈ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ ２０１２、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋを参照）。本開示による検出可能な標識は、好適な検出システムを用いて検出され得る。
【0160】
[0170] 本開示の１つの実施形態によれば、検出可能な標識は、蛍光標識、磁性標識、酵素標識、有色標識、色素産生性標識、発光標識、放射性標識、ハプテン、ビオチン、金属錯体、金属、および金コロイドからなる群から選択される。すべてのこれらの標識のタイプは当技術分野においてよく確立されている。
【0161】
[0171] 本開示の１つの実施形態によれば、検出可能な標識は、照射もしくは励起において蛍光もしくはリン光の放出または放射性標識を使用する場合にＸ線の放出を提供するようなものから選択される。
【0162】
[0172] 本開示の１つの実施形態によれば、検出可能な標識は酵素標識であり、酵素標識は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β－ガラクトシダーゼ、およびβ－ラクタマーゼを含むがそれに限定されない。酵素標識は、色素産生性反応生成物の形成を触媒する。
【0163】
[0173] 特定の実施形態において、検出可能な標識は蛍光標識である。多数の蛍光標識が当技術分野においてよく確立されており、異なる供給業者から商業的に入手可能である（例えば、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ － Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１０ｔｈ ｅｄ．（２００６）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡを参照）。蛍光標識の例は、キサンテン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン（ＰＥ）、シアニン、クマリン、およびこれらの任意の誘導体を含むがそれに限定されない。本開示の一部の実施形態によれば、蛍光標識はＰＥである。
【0164】
[0174] 検出および／またはレポーターＡｂが取り付けられる検出可能な標識が蛍光標識である実施形態において、蛍光標識は、検出システム内に存在する任意の好適な光源で照射／励起され得る。光源はレーザーまたはＬＥＤであってもよい。蛍光標識がＰＥである場合、光源の励起波長は、約５０５～約５３５ｎｍの範囲内、例えば約５１１ｎｍである。
【0165】
[0175] 好適な検出システムを用いるそのような検出可能な標識の検出に関して、セクション「検出システム」もまた参照される。
【0166】
検出システム
[0176] 本開示によれば、検出システムは、レポーター抗体または二次レポーター抗体または検出抗体の存在および／または量の指標となる値を決定するために好適な任意のシステムを指す。
[0176] 本開示によれば、検出システムは、レポーター抗体または二次レポーター抗体または検出抗体の存在および／または量の指標となる値を決定するために好適な任意のシステムを指す。
【0167】
[0177] 本開示によれば、検出システムはまた、マイクロスフェアの存在および／または量の指標となる値を決定することができてもよい。
【0168】
[0178] 好適な検出システムの選択は、いくつかのパラメーター、例えば検出のために使用される検出可能な標識のタイプ、または行われる分析の種類に依存する。様々な光学的および非光学的検出システムは当技術分野においてよく確立されている。方法と共に使用され得る検出システムの一般的な記載は、例えば、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．、およびＺｏｒｂａｓ Ｈ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ ２０１２、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋにおいて見出され得る。
【0169】
[0179] 本開示の１つの実施形態によれば、検出システムは光学的検出システムである。一部の実施形態において、方法の実行は、パラメーター、例えば蛍光、光学吸光度、および共鳴伝達などの測定に基づいてもよい、検出システムを伴う。
【0170】
[0180] 本開示の１つの実施形態によれば、検出システムは蛍光を測定する。そのようなシステムは、特徴的な吸収および放出挙動を結果としてもたらす特有の波長の光により励起された場合にそれら自体の光を放出する特有の分子の能力を測定する。特に、蛍光シグナルの定量的検出は、蛍光顕微鏡法の改変された方法の手段により行われる（総説のために、例えば、Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｊ．Ｗ．、およびＣｏｎｃｈｅｌｌｏ，Ｊ．Ａ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２、９１０～９１９頁；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ．（２００５）Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９５、２４５～２６５頁を参照）。それにより、それぞれ光吸収および光放出の結果としてもたらされるシグナルは、１つまたは複数のフィルターおよび／またはダイクロイト（ｄｉｃｈｒｏｉｔｅｓ）により分離され、好適な検出器においてイメージングされる。データ分析は、デジタル画像処理の手段により行われる。画像処理は、当技術分野において周知のいくつかのソフトウェアパッケージ（例えばＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、ＥＩＫＯＮＡ、またはＩｍａｇｅ－ＰＲＯ）を用いて達成されてもよい。そのような目的のための別の好適なソフトウェアはＩｃｏｎｏｃｌｕｓｔソフトウェア（Ｃｌｏｎｄｉａｇ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）である。好適な検出システムは、蛍光シグナルを測定するための「古典的な」方法、例えば落射蛍光または暗視野蛍光顕微鏡法に基づいてもよい（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．（１９９９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、ＮＹにおいて総説されている）。使用され得る別の光学的検出システムは共焦点蛍光顕微鏡法であり、これにおいて、対象物は点光源によりレンズの焦点面において照明される。重要なことに、点光源、対象物および点光検出器は、光学的に共役された面上に位置する。そのような共焦点システムの例は、例えば、Ｄｉａｓｐｒｏ，Ａ．（２００２）Ｃｏｎｆｏｃａｌ ａｎｄ ２－ｐｈｏｔｏｎ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ、Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｒｏｋｅｎ、ＮＪにおいて詳細に記載されている。蛍光光学システムは、通常は、自動焦点を有しない蛍光顕微鏡、例えば固定された焦点を有する蛍光顕微鏡である。使用され得るさらなる蛍光検出方法は、特に、全反射照明蛍光顕微鏡法（例えば、Ａｘｅｌｒｏｄ，Ｄ．（１９９９）Ｓｕｒｆａｃｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｉｔｈ ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ、Ｌａｃｅｙ，Ａ．（編）Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３９９～４２３頁を参照）、蛍光寿命イメージング顕微鏡法（例えば、Ｄｏｗｌｉｎｇ，Ｋ．ら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｄ．Ｏｐｔｉｃｓ ４６、１９９～２０９頁を参照）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ；例えば、Ｐｅｒｉａｓａｍｙ，Ａ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔｉｃｓ ６、２８７～２９１頁を参照）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ；例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．およびＨａｓｔｉｎｇｓ，Ｊ．Ｗ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４、１９７～２３０頁を参照）、ならびに蛍光相関分光法（例えば、Ｈｅｓｓ，Ｓ．Ｔ．ら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１、６９７～７０５頁を参照）である。一部の実施形態において、検出は、それぞれ蛍光または生物発光消光剤ペアの形成に基づくＦＲＥＴまたはＢＲＥＴを使用して行われる。ＦＲＥＴの使用はまた、例えば、Ｌｉｕ，Ｂ．ら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２、５８９～５９３頁；およびＳｚｏｌｌｏｓｉ，Ｊ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８２、２５１～２６６頁において記載されている。ＢＲＥＴの使用は、例えば、Ｐｒｉｎｚ，Ａ．ら（２００６）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．７、１００７～１０１２頁；およびＸｕ，Ｙ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、１５１～１５６頁において詳述されている。
【0171】
[0181] １つの実施形態において、検出システムは、約４００～約７００ｎｍの範囲内の励起波長を有する第１の光源、例えばアルゴンレーザーまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）、および約３００～約７００ｎｍの範囲内の励起波長を有する第２の光源、例えばアルゴンレーザーまたはＬＥＤ、および、例えばフォトダイオード、例えば光電子増倍管または電荷結合デバイス（ＣＣＤ）センサーと組み合わせたアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）としての、好適な検出構成要素を含む。第１の光源は、マイクロスフェアの検出可能な標識の同定のために使用されてもよく、検出可能な標識は、特定の濃度の１つまたは複数の蛍光色素であってもよい。第２の光源は、レポーターまたは二次レポーターまたは検出抗体の検出可能な標識の励起のために使用されてもよい。
【0172】
[0182] 一部の実施形態において、第１の光源、例えばアルゴンレーザーまたはＬＥＤは、約６００～約６５０ｎｍの範囲内の励起波長を有し、第２の光源、例えばアルゴンレーザーまたはＬＥＤは、約５００～約６００ｎｍの範囲内の励起波長を有する。一部の実施形態において、第１の光源、例えばアルゴンレーザーまたはＬＥＤは、約６１５～約６４０ｎｍの範囲内の励起波長を有し、第２の光源、例えばアルゴンレーザーまたはＬＥＤは、約５０５～約５４０ｎｍの範囲内の励起波長を有する。一部の実施形態において、第１の光源、例えばアルゴンレーザーまたはＬＥＤは、約６２０～約６３５ｎｍの範囲内の励起波長を有し、第２の光源、例えばアルゴンレーザーまたはＬＥＤは、約５１０～約５３５ｎｍの範囲内の励起波長を有する。例えば、検出システムは、約６３５ｎｍの励起波長を有する第１の光源、例えばアルゴンレーザーまたはＬＥＤ、および約５２５ｎｍの励起波長を有する第２の光源、例えばアルゴンレーザーまたはＬＥＤを含む。
【0173】
[0183] 検出システムはまた、マイクロスフェアの個々のサイズまたは形状を別のマイクロスフェアの個々のサイズまたは形状から区別し、それによりマイクロスフェアの個々の同定を可能とする能力を有してもよい。
【0174】
[0184] 検出システムは、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）、Ｌｕｍｉｎｅｘ ２００（登録商標）、およびＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ（登録商標）（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）からなる群のものであってもよい。一部の実施形態において、検出システムはＭＡＧＰＩＸ（登録商標）（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）である。
【0175】
[0185] 検出システムは、ｘＰＯＮＥＮＴ（登録商標）ソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）を含む、特定のソフトウェアにより作動されてもよい。
【0176】
[0186] 検出システムは、レポーターまたは二次レポーターまたは検出Ａｂの検出可能な標識からのシグナルと、マイクロスフェアの検出可能な標識からのシグナルとの両方を検出する能力を有してもよい。
【0177】
[0187] 検出システムは、例えばフローサイトメトリーベース検出システム（例えばＬｕｍｉｎｅｘ ２００（登録商標）およびＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ（登録商標））により、マイクロスフェアの検出可能な標識からのシグナルを検出することおよびレポーターまたは二次レポーターまたは検出抗体の検出可能な標識からのシグナルを検出することにより、次々にマイクロスフェアを分析し、それによりマイクロスフェアを同定する能力を有してもよい。フローサイトメトリーベース検出システムＬｕｍｉｎｅｘ ２００（登録商標）およびＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ（登録商標）は２つのレーザーを含み、各々のレーザーは、マイクロスフェアの検出可能な標識の照射のためおよびレポーターまたは二次レポーターまたは検出Ａｂの検出可能な標識の照射のためのものである。フローサイトメトリーベース検出システムは、磁石を用いてマイクロスフェアを捕捉していないので、Ｌｕｍｉｎｅｘ ２００（登録商標）およびＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ（登録商標）システムは、磁性マイクロスフェア、例えばＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアおよび非磁性マイクロスフェア、例えばＭｉｃｒｏｐｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアの両方と適合性である。Ｌｕｍｉｎｅｘ ２００（登録商標）およびＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ（登録商標）システムは、光電子増倍管（ＰＭＴ）と組み合わせたアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）によりマイクロスフェアおよびレポーターまたは二次レポーターまたは検出Ａｂからのシグナルを検出する。
【0178】
[0188] 代替的に、検出システムは、複数のマイクロスフェアを一度に分析する能力を有してもよい。したがって、磁性マイクロスフェアの単層は磁石により捕捉され、マイクロスフェアは、２つのＬＥＤを用いて励起され、１つのＬＥＤはマイクロスフェアの検出可能な標識の励起のためであり、他のＬＥＤはレポーターまたは検出Ａｂの検出可能な標識の励起のためである。マイクロスフェアおよびレポーターまたは検出ＡｂからのシグナルはＣＣＤイメージャーにより記録され、ＣＣＤイメージャーは、各々のマイクロスフェアおよびマイクロスフェアが連結された対応する抗原の同定を可能とする。ＬＥＤベース検出システムの例はＭＡＧＰＩＸ（登録商標）機器である。ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）機器での分析は磁石でのマイクロスフェアの捕捉を伴うので、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）機器は、磁性マイクロスフェア、例えばＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアとのみ適合性である。
【0179】
試料および対象
[0189] 以下のセクションは、本開示の方法において言及される試料および対象を特定することが意図される。このセクション内の仕様および実施形態は、先行および後続するセクションの仕様および実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
[0189] 以下のセクションは、本開示の方法において言及される試料および対象を特定することが意図される。このセクション内の仕様および実施形態は、先行および後続するセクションの仕様および実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
【0180】
試料
[0190] 本開示によれば、試料は、対象に由来する任意の試料であってもよい。一部の実施形態において、試料は、血液、尿、唾液、脳脊髄液、およびリンパ液からなる群から選択される。特有の実施形態において、試料は血清または血漿試料である。
[0190] 本開示によれば、試料は、対象に由来する任意の試料であってもよい。一部の実施形態において、試料は、血液、尿、唾液、脳脊髄液、およびリンパ液からなる群から選択される。特有の実施形態において、試料は血清または血漿試料である。
【0181】
[0191] ある特定の実施形態において、試料は、本出願の方法において応用されるノロウイルスＶＬＰに結合する能力を有するノロウイルス反応性Ａｂを含む。
【0182】
[0192] ある特定の実施形態において、試料は、本開示の方法における使用に先立って前処理されてもよい。前処理の方法は、精製、濾過、蒸留、濃縮、干渉性化合物の不活性化、および試薬の追加を伴うことができる。
【0183】
[0193] 特有の実施形態において、試料は、例えば、約５５～約６５℃で約３０～９０分間、熱不活性化される。一般に、熱不活性化は、分析されるべき試料のタイプに従って変更され得る。
【0184】
[0194] より特有の実施形態において、試料は、熱不活性化された血清または血漿試料である。
【0185】
対象
[0195] 本開示の１つの実施形態において、対象は哺乳動物である。特定の実施形態において、哺乳動物は、マウス、霊長動物、非ヒト霊長動物、ヒト、ウサギ、ネコ、ラット、ウマ、ヒツジからなる群から選択される。
[0195] 本開示の１つの実施形態において、対象は哺乳動物である。特定の実施形態において、哺乳動物は、マウス、霊長動物、非ヒト霊長動物、ヒト、ウサギ、ネコ、ラット、ウマ、ヒツジからなる群から選択される。
【0186】
[0196] ある特定の実施形態において、対象は、妊娠した哺乳動物であり、特有の実施形態において、妊婦である。
【0187】
[0197] 他の実施形態において、対象は、２か月齢までの新生児または小児であり、小児は２か月齢～５歳である。対象はまた、７０歳またはより高齢であってもよい。
【0188】
[0198] 一部の実施形態において、対象は、予防または療法が所望される患者である。
【0189】
[0199] 一部の実施形態において、対象は、ノロウイルスナイーブ、またはノロウイルス曝露済みである。
【0190】
[0200] 一部の実施形態において、対象は、ノロウイルス流行地域またはノロウイルス非流行地域からの対象である。一部の実施形態において、対象は、ノロウイルス流行地域を旅行しているノロウイルス非流行地域からの対象である。
【0191】
[0201] 一部の実施形態において、対象は、ノロウイルスワクチンでワクチン接種されている。
【0192】
ノロウイルス反応性抗体を決定する方法
[0202] 本開示は、非競合的および競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップを使用してノロウイルス反応性抗体を決定する様々な方法にさらに向けられる。マイクロスフェア複合体、検出システム、レポーター、二次レポーターおよび検出抗体の他に、対象および試料に関して、上記のそれぞれのチャプターが参照される。追加的に、ある特定の特定の実施形態はこのセクションにおいても概説されるが、限定的であるとして解釈されるべきではない。このセクションからの任意の実施形態は、先行または後続するセクションからの実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
[0202] 本開示は、非競合的および競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップを使用してノロウイルス反応性抗体を決定する様々な方法にさらに向けられる。マイクロスフェア複合体、検出システム、レポーター、二次レポーターおよび検出抗体の他に、対象および試料に関して、上記のそれぞれのチャプターが参照される。追加的に、ある特定の特定の実施形態はこのセクションにおいても概説されるが、限定的であるとして解釈されるべきではない。このセクションからの任意の実施形態は、先行または後続するセクションからの実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
【0193】
非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップ
[0203] 非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおいて、レポーター抗体は応用されない。試料中のノロウイルス反応性抗体を検出するために検出Ａｂが使用される。非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップは、１つのノロウイルスＶＬＰに対するノロウイルス反応性抗体の決定を可能にするため（シングルプレックスアッセイセットアップ）または１つの単一の実験において２つもしくはより多くのノロウイルスＶＬＰに対して反応性の抗体の随伴的な決定を可能にするため（マルチプレックスアッセイセットアップ）に改変され得る。
[0203] 非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおいて、レポーター抗体は応用されない。試料中のノロウイルス反応性抗体を検出するために検出Ａｂが使用される。非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップは、１つのノロウイルスＶＬＰに対するノロウイルス反応性抗体の決定を可能にするため（シングルプレックスアッセイセットアップ）または１つの単一の実験において２つもしくはより多くのノロウイルスＶＬＰに対して反応性の抗体の随伴的な決定を可能にするため（マルチプレックスアッセイセットアップ）に改変され得る。
【0194】
ノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法（シングルプレックスアッセイセットアップ）
[0204] 対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法は、
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）に、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１におけるノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体と接触させて、ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、検出抗体を結合させる工程であって、検出抗体が、検出抗体の可変領域を用いてノロウイルス反応性抗体に結合し、検出抗体が、検出可能な標識に取り付けられている工程、および
工程３：工程２におけるノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体からのシグナルを検出する工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定された検出抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
[0204] 対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法は、
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）に、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１におけるノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体と接触させて、ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、検出抗体を結合させる工程であって、検出抗体が、検出抗体の可変領域を用いてノロウイルス反応性抗体に結合し、検出抗体が、検出可能な標識に取り付けられている工程、および
工程３：工程２におけるノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体からのシグナルを検出する工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定された検出抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
【0195】
[0205] 一部の実施形態において、工程３における検出抗体からのシグナルは、検出抗体が取り付けられた検出可能な標識の結果としてもたらされる。
【0196】
[0206] 一部の実施形態において、工程１における接触は約１～約２４時間実行される。一部の実施形態において、工程１における接触は約９０分間実行される。一部の実施形態において、工程１における接触は、約１８～約２４時間、例えば、一部の実施形態において、約２１時間、実行される。
【0197】
[0207] 一部の実施形態において、工程１における接触は約２～約３０℃の温度で実行される。一部の実施形態において、工程１における接触は約２２℃の温度で実行される。他の特定の実施形態において、工程１における接触は約２～約８℃の温度で実行される。
【0198】
[0208] 一部の実施形態において、工程２における接触は、約３０～約９０分間、例えば、一部の実施形態において、約６０分間、実行される。
【0199】
異なるノロウイルスに対して反応性の抗体の存在および／または量の随伴的な決定方法（マルチプレックスアッセイセットアップ）
[0209] 対象からの試料中の異なるノロウイルスに対して反応性の抗体の存在および／または量の随伴的な決定方法は、
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体を、試料と接触させて、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なる、工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１における第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体と接触させて、ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、検出抗体を結合させる工程であって、検出抗体が、検出抗体の可変領域を用いてノロウイルス反応性抗体に結合し、検出抗体が、第３の検出可能な標識に取り付けられている工程、
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体からのシグナルを検出する工程、
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程、ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における検出抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定された検出抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
[0209] 対象からの試料中の異なるノロウイルスに対して反応性の抗体の存在および／または量の随伴的な決定方法は、
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体を、試料と接触させて、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なる、工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１における第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体と接触させて、ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、検出抗体を結合させる工程であって、検出抗体が、検出抗体の可変領域を用いてノロウイルス反応性抗体に結合し、検出抗体が、第３の検出可能な標識に取り付けられている工程、
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体からのシグナルを検出する工程、
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程、ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における検出抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからノロウイルス反応性抗体に結合した検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定された検出抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
【0200】
[0210] 一部の実施形態において、工程１において、所定量の少なくとも５個または少なくとも１０個または少なくとも１５個または少なくとも２０個のマイクロスフェア複合体が試料と接触させられる。好適なマイクロスフェア複合体は、例えば、表１に記載されているノロウイルスＶＬＰに連結されたマイクロスフェアを含む。
【0201】
[0211] 特有の実施形態において、工程１において、所定量の、ＧＩ．１ ＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含む第１のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．２ ＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含む第２のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．３ ＶＬＰに連結された第３のマイクロスフェアを含む第３のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．４ ＶＬＰに連結された第４のマイクロスフェアを含む第４のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．５ ＶＬＰに連結された第５のマイクロスフェアを含む第５のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．６ ＶＬＰに連結された第６のマイクロスフェアを含む第６のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．７ ＶＬＰに連結された第７のマイクロスフェアを含む第７のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１ ＶＬＰに連結された第８のマイクロスフェアを含む第８のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．２ ＶＬＰに連結された第９のマイクロスフェアを含む第９のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．３ ＶＬＰに連結された第１０のマイクロスフェアを含む第１０のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰに連結された第１１のマイクロスフェアを含む第１１のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰに連結された第１２のマイクロスフェアを含む第１２のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ ＶＬＰに連結された第１３のマイクロスフェアを含む第１３のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ ＶＬＰに連結された第１４のマイクロスフェアを含む第１４のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｄｅｎ Ｈａａｇ ＶＬＰに連結された第１５のマイクロスフェアを含む第１５のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．６ ＶＬＰに連結された第１６のマイクロスフェアを含む第１６のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．７ ＶＬＰに連結された第１７のマイクロスフェアを含む第１７のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１２ ＶＬＰに連結された第１８のマイクロスフェアを含む第１８のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１７／１９７８ ＶＬＰに連結された第１９のマイクロスフェアを含む第１９のマイクロスフェア複合体、および所定量の、ＧＩＩ．１７／２０１５ ＶＬＰに連結された第２０のマイクロスフェアを含む第２０のマイクロスフェア複合体が試料と接触させられる。
【0202】
[0212] 一部の実施形態において、工程３における検出抗体からのシグナルは、検出抗体が取り付けられた検出可能な標識の結果としてもたらされる。
【0203】
[0213] 一部の実施形態において、工程１における接触は約１～約２４時間実行される。一部の実施形態において、工程１における接触は約９０分間実行される。他の特定の実施形態において、工程１における接触は、約１８～約２４時間、例えば、一部の実施形態において、約２１時間、実行される。
【0204】
[0214] 一部の実施形態において、工程１における接触は約２～約３０℃の温度で実行される。一部の実施形態において、工程１における接触は約２２℃の温度で実行される。他の特定の実施形態において、工程１における接触は約２～約８℃の温度で実行される。
【0205】
[0215] 一部の実施形態において、工程２における接触は、約３０～約９０分間、例えば、一部の実施形態において、約６０分間、実行される。
【0206】
[0216] 一部の実施形態において、同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程４は繰り返される。
【0207】
[0217] 一部の実施形態において、上述した非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップ（シングルプレックスおよびマルチプレックスセットアップ）においてノロウイルス反応性抗体を決定する方法は、Ｂ細胞またはハイブリドーマ上清試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定するために応用され得る（下記の実施例５も参照）。これらの実施形態において、ノロウイルス反応性抗体はモノクローナル抗体であってもよい。それにより、上清試料は、ある特定のノロウイルス反応性抗体の存在についてスクリーニングされ得る。特に実施上の利点となるのは、マルチプレックスセットアップにおけるハイブリドーマまたはＢ細胞上清のスクリーニングであり、その理由は、上清が、１つの単一のアッセイにおいて、特異性が異なる抗体について評価され得るからである。
【0208】
競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップ
[0218] 競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおいて、１つまたは複数のレポーター抗体が応用される。競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップは、１つのノロウイルスＶＬＰに対するノロウイルス反応性抗体の決定を可能にするため（シングルプレックスアッセイセットアップ）または１つの単一の実験において２つもしくはより多くのノロウイルスＶＬＰに対して反応性の抗体の随伴的な決定を可能にするため（マルチプレックスアッセイセットアップ）に改変され得る。
[0218] 競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおいて、１つまたは複数のレポーター抗体が応用される。競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップは、１つのノロウイルスＶＬＰに対するノロウイルス反応性抗体の決定を可能にするため（シングルプレックスアッセイセットアップ）または１つの単一の実験において２つもしくはより多くのノロウイルスＶＬＰに対して反応性の抗体の随伴的な決定を可能にするため（マルチプレックスアッセイセットアップ）に改変され得る。
【0209】
ノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法（シングルプレックスアッセイセットアップ）
[0219] 対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法は、
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体および所定量の上述したレポーター抗体を含む、キットを用意する工程であって、レポーター抗体がマイクロスフェア複合体のノロウイルスＶＬＰに結合するものである、工程、
工程２：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を試料と接触させて、レポーター抗体と競合しながら、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２におけるノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
[0219] 対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する方法は、
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体および所定量の上述したレポーター抗体を含む、キットを用意する工程であって、レポーター抗体がマイクロスフェア複合体のノロウイルスＶＬＰに結合するものである、工程、
工程２：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を試料と接触させて、レポーター抗体と競合しながら、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２におけるノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
【0210】
[0220] 一部の実施形態において、工程２において、所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体は試料と随伴的に接触させられる。
【0211】
[0221] 一部の実施形態において、ノロウイルス反応性抗体を決定する方法は、
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体および所定量の上述したレポーター抗体を含む、キットを用意する工程であって、レポーター抗体がマイクロスフェア複合体のノロウイルスＶＬＰに結合するものである、工程、
工程２．１：工程１の所定量のマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２．２：所定量のレポーター抗体を工程２．１のマイクロスフェア複合体および試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、レポーター抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２．２におけるノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体および所定量の上述したレポーター抗体を含む、キットを用意する工程であって、レポーター抗体がマイクロスフェア複合体のノロウイルスＶＬＰに結合するものである、工程、
工程２．１：工程１の所定量のマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２．２：所定量のレポーター抗体を工程２．１のマイクロスフェア複合体および試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、レポーター抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２．２におけるノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
【0212】
[0222] 一部の実施形態において、ノロウイルス反応性抗体を決定する方法は、
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体および所定量の上述したレポーター抗体を含む、キットを用意する工程であって、レポーター抗体がマイクロスフェア複合体のノロウイルスＶＬＰに結合するものである、工程、
工程２．１：工程１の所定量のマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２．２：所定量のレポーター抗体を工程２．１のマイクロスフェア複合体および試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、レポーター抗体を結合させる工程、
工程２．３：工程２．２の所定量のレポーター抗体、所定量のマイクロスフェア複合体、および試料を所定量の二次レポーター抗体と接触させて、レポーター抗体の定常領域に、二次レポーター抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２．３におけるレポーター抗体に結合した二次レポーター抗体からのシグナルを検出する工程であって、レポーター抗体が工程２．２においてノロウイルスＶＬＰに結合している工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
工程１：所定量の上述したマイクロスフェア複合体および所定量の上述したレポーター抗体を含む、キットを用意する工程であって、レポーター抗体がマイクロスフェア複合体のノロウイルスＶＬＰに結合するものである、工程、
工程２．１：工程１の所定量のマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２．２：所定量のレポーター抗体を工程２．１のマイクロスフェア複合体および試料と接触させて、マイクロスフェア複合体中のマイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、レポーター抗体を結合させる工程、
工程２．３：工程２．２の所定量のレポーター抗体、所定量のマイクロスフェア複合体、および試料を所定量の二次レポーター抗体と接触させて、レポーター抗体の定常領域に、二次レポーター抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２．３におけるレポーター抗体に結合した二次レポーター抗体からのシグナルを検出する工程であって、レポーター抗体が工程２．２においてノロウイルスＶＬＰに結合している工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程４：工程３のシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
【0213】
[0223] 一部の実施形態において、ノロウイルスＶＬＰはＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰである。
【0214】
[0224] 一部の実施形態において、工程３におけるシグナルは、レポーター抗体が取り付けられた検出可能な標識の結果としてもたらされる。
【0215】
[0225] 一部の実施形態において、工程２．１における接触は、約５～約２３時間、例えば、一部の実施形態において、約８～約２１時間、より好ましくは約１６時間、実行される。一部の実施形態において、工程２．１における接触は、約２～約３０℃の温度で、好ましくは約４℃の温度で、実行される。
【0216】
[0226] 一部の実施形態において、工程２．２における接触は、約１０～約９０分間、好ましくは約６０分間、実行される。一部の実施形態において、工程２．２における接触は約２２℃で実行される。
【0217】
[0227] 一部の実施形態において、工程２．３における接触は、約１０～約９０分間、好ましくは約６０分間、実行される。一部の実施形態において、工程２．３における接触は約２２℃で実行される。
【0218】
異なるノロウイルスに対して反応性の抗体の存在および／または量の随伴的な決定方法（マルチプレックスアッセイセットアップ）
[0228] 対象からの試料中の異なるノロウイルスに対して反応性の抗体の存在および／または量の随伴的な決定方法は、
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体と、所定量の少なくとも２つの上述したレポーター抗体とを含むキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、少なくとも２つのレポーター抗体と競合しながら、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３におけるレポーター抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
[0228] 対象からの試料中の異なるノロウイルスに対して反応性の抗体の存在および／または量の随伴的な決定方法は、
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体と、所定量の少なくとも２つの上述したレポーター抗体とを含むキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、少なくとも２つのレポーター抗体と競合しながら、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３におけるレポーター抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
【0219】
[0229] 一部の実施形態において、工程２において、所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および所定量の少なくとも２つのレポーター抗体は試料と随伴的に接触させられる。
【0220】
[0230] 一部の実施形態において、方法は、
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体と、所定量の少なくとも２つの上述したレポーター抗体とを含むキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２．１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程２．２：所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を工程２．１の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および試料と接触させて、マイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、少なくとも２つのレポーター抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２．２における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３におけるレポーター抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体と、所定量の少なくとも２つの上述したレポーター抗体とを含むキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２．１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程２．２：所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を工程２．１の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および試料と接触させて、マイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、少なくとも２つのレポーター抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２．２における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３におけるレポーター抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
【0221】
[0231] 一部の実施形態において、方法は、
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体と、所定量の少なくとも２つの上述したレポーター抗体を含むキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２．１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程２．２：所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を工程２．１の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および試料と接触させて、マイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、少なくとも２つのレポーター抗体を結合させる工程；
工程２．３：工程２．２の所定量の少なくとも２つのレポーター抗体、所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および試料を所定量の二次レポーター抗体と接触させて、少なくとも２つのレポーター抗体の定常領域に、二次レポーター抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２．３における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体に結合した二次レポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における二次レポーター抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
工程１：所定量の少なくとも２つの上述したマイクロスフェア複合体と、所定量の少なくとも２つの上述したレポーター抗体を含むキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識の放出シグナルが第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２．１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を試料と接触させて、第１および／または第２のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程２．２：所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を工程２．１の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および試料と接触させて、マイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰに、少なくとも２つのレポーター抗体を結合させる工程；
工程２．３：工程２．２の所定量の少なくとも２つのレポーター抗体、所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および試料を所定量の二次レポーター抗体と接触させて、少なくとも２つのレポーター抗体の定常領域に、二次レポーター抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの検出可能な標識の放出シグナルを検出し、放出シグナルを、第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、少なくとも１つのマイクロスフェアおよび少なくとも１つのマイクロスフェアが連結されたノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２．３における少なくとも１つのマイクロスフェアのノロウイルスＶＬＰに結合したレポーター抗体に結合した二次レポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における二次レポーター抗体からの検出されたシグナルを要約する工程であって、要約されたシグナルが、試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる工程
を含み、方法は、任意選択により、以下のさらなる工程：
工程６：工程５の要約されたシグナルからレポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定されたレポーター抗体の存在および／または量から試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む。
【0222】
[0232] 一部の実施形態において、工程１におけるキットは、所定量の２つのマイクロスフェア複合体および所定量の２つのレポーター抗体を提供する。一部の実施形態において、第１のマイクロスフェア複合体は、ＧＩ．１ ＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体は、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含む。ＧＩ．１ ＶＬＰおよびＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰについて、表１もまた参照される。
【0223】
[0233] 一部の実施形態において、工程３におけるシグナルは、レポーター抗体が取り付けられた検出可能な標識の結果としてもたらされる。
【0224】
[0234] 一部の実施形態において、工程２．１における接触は、約５～約２３時間、好ましくは約８～約２１時間、より好ましくは約１６時間、実行される。一部の実施形態において、工程２．１における接触は、約２～約３０℃の温度で、好ましくは約４℃の温度で、実行される。
【0225】
[0235] 一部の実施形態において、工程２．２における接触は、約１０～約９０分間、好ましくは約６０分間、実行される。一部の実施形態において、工程２．２における接触は約２２℃で実行される。
【0226】
[0236] 一部の実施形態において、工程２．３における接触は、約１０～約９０分間、好ましくは約６０分間、実行される。一部の実施形態において、工程２．３における接触は約２２℃で実行される。
【0227】
[0237] 一部の実施形態において、同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程４は繰り返される。
【0228】
対象においてノロウイルス感染を診断する方法
[0238] 本開示は、対象においてノロウイルス感染を診断する方法にさらに向けられる。本開示の意味において、診断方法はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。マイクロスフェア複合体、検出システム、レポーター、二次レポーターおよび検出抗体、対象および試料の他に、ノロウイルス反応性抗体を決定する方法に関して、上記のそれぞれのチャプターが参照される。追加的に、ある特定の特定の実施形態はこのセクションにおいても概説されるが、限定的であるとして解釈されるべきではない。このセクションからの任意の実施形態は、先行または後続するセクションからの実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
[0238] 本開示は、対象においてノロウイルス感染を診断する方法にさらに向けられる。本開示の意味において、診断方法はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。マイクロスフェア複合体、検出システム、レポーター、二次レポーターおよび検出抗体、対象および試料の他に、ノロウイルス反応性抗体を決定する方法に関して、上記のそれぞれのチャプターが参照される。追加的に、ある特定の特定の実施形態はこのセクションにおいても概説されるが、限定的であるとして解釈されるべきではない。このセクションからの任意の実施形態は、先行または後続するセクションからの実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
【0229】
[0239] 対象においてノロウイルス感染を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法は、
工程１：対象の身体の外側に対象からの試料を用意する工程、
工程２：上述したノロウイルス反応性抗体を決定する方法に従って試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：ノロウイルス反応性抗体の量を、ノロウイルスに感染した対象におけるノロウイルス反応性抗体の確立された量と比較することにより、感染を決定する工程
を含む。
工程１：対象の身体の外側に対象からの試料を用意する工程、
工程２：上述したノロウイルス反応性抗体を決定する方法に従って試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：ノロウイルス反応性抗体の量を、ノロウイルスに感染した対象におけるノロウイルス反応性抗体の確立された量と比較することにより、感染を決定する工程
を含む。
【0230】
[0240] 一部の実施形態において、対象は哺乳動物であり、好ましくは、哺乳動物は、マウス、霊長動物、非ヒト霊長動物、ヒト、ウサギ、ネコ、ラット、ウマ、およびヒツジからなる群から選択される。一部の実施形態において、対象はヒトである。
【0231】
[0241] ある特定の実施形態において、試料は、血液試料、特に血漿または血清試料である。
【0232】
[0242] ある特定の実施形態において、ノロウイルス反応性Ａｂはノロウイルス中和Ａｂおよび／またはノロウイルス遮断Ａｂである。
【0233】
[0243] ある特定の実施形態において、ノロウイルス感染は回復期である。ある特定の実施形態において、ノロウイルス感染は急性である。
【0234】
[0244] 他の実施形態において、対象は、少なくとも２つの異なるノロウイルスにより感染されている。ノロウイルス感染は急性または回復期のいずれかであることができる。本出願のノロウイルス感染を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法は、少なくとも２つの異なるノロウイルス感染を診断する能力を有する。結果的に、本出願のノロウイルス感染を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法は、対象が１つまたは複数のノロウイルスに感染されたかどうかおよび対象がいずれのノロウイルスにより感染されたかを決定する能力を有する。
【0235】
対象においてノロウイルス感染からの保護を決定する方法
[0245] 本開示は、対象においてノロウイルス感染からの保護を決定する方法にさらに向けられる。本開示の意味において、保護を決定する方法はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。マイクロスフェア複合体、検出システム、レポーター、二次レポーターおよび検出抗体、対象および試料の他に、ノロウイルス反応性抗体を決定する方法に関して、上記のそれぞれのチャプターが参照される。追加的に、ある特定の特定の実施形態はこのセクションにおいても概説されるが、限定的であるとして解釈されるべきではない。このセクションからの任意の実施形態は、先行または後続するセクションからの実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
[0245] 本開示は、対象においてノロウイルス感染からの保護を決定する方法にさらに向けられる。本開示の意味において、保護を決定する方法はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。マイクロスフェア複合体、検出システム、レポーター、二次レポーターおよび検出抗体、対象および試料の他に、ノロウイルス反応性抗体を決定する方法に関して、上記のそれぞれのチャプターが参照される。追加的に、ある特定の特定の実施形態はこのセクションにおいても概説されるが、限定的であるとして解釈されるべきではない。このセクションからの任意の実施形態は、先行または後続するセクションからの実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
【0236】
[0246] 対象においてノロウイルス感染からの保護を決定するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法は、
工程１：対象の身体の外側に対象からの試料を用意する工程、
工程２：上述したノロウイルス反応性抗体を決定する方法に従って試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：工程２におけるノロウイルス反応性抗体の量をノロウイルス反応性抗体の保護的な量と比較することにより保護を決定する工程
を含む。
工程１：対象の身体の外側に対象からの試料を用意する工程、
工程２：上述したノロウイルス反応性抗体を決定する方法に従って試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：工程２におけるノロウイルス反応性抗体の量をノロウイルス反応性抗体の保護的な量と比較することにより保護を決定する工程
を含む。
【0237】
[0247] 一部の実施形態において、対象は哺乳動物であり、好ましくは、哺乳動物は、マウス、霊長動物、非ヒト霊長動物、ヒト、ウサギ、ネコ、ラット、ウマ、およびヒツジからなる群から選択される。一部の実施形態において、対象はヒトである。
【0238】
[0248] 他の実施形態において、対象はノロウイルスワクチンでワクチン接種される。一部の実施形態において、対象は、ノロウイルスワクチンでワクチン接種されたヒトである。
【0239】
[0249] ある特定の実施形態において、試料は、血液試料、特に血漿または血清試料である。
【0240】
[0250] ある特定の実施形態において、ノロウイルス反応性Ａｂはノロウイルス中和Ａｂおよび／またはノロウイルス遮断Ａｂである。
【0241】
[0251] ノロウイルス感染からの保護が競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップを用いて決定される実施形態において、レポーターまたは少なくとも１つのレポーターＡｂはノロウイルス中和および／またはノロウイルス遮断Ａｂであることが好ましい。
【0242】
[0252] 本出願のノロウイルス感染からの保護を決定するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法は、１つまたは複数の異なるノロウイルス感染に対する保護を決定する能力を有する。
【0243】
ノロウイルス感染を予防する方法
[0253] 本開示は、ヒト対象においてノロウイルス感染を予防する方法であって、
工程１：ヒト対象からの試料を得る工程、
工程２：セクション「ノロウイルス反応性抗体を決定する方法」の下で上述したようにヒト対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、
工程３：工程２において決定されたノロウイルス反応性抗体の量を、ヒト対象におけるノロウイルス感染からの保護の抗体相関物と比較することにより、ヒト対象が保護を付与する量のノロウイルス反応性抗体を有するかどうかを決定する工程、および
工程４：ヒト対象が、ヒト対象におけるノロウイルス感染からの保護の抗体相関物よりも低い量のノロウイルス反応性抗体を有する場合に、ヒト対象にノロウイルスワクチンを投与する工程
を含む方法にさらに向けられる。
[0253] 本開示は、ヒト対象においてノロウイルス感染を予防する方法であって、
工程１：ヒト対象からの試料を得る工程、
工程２：セクション「ノロウイルス反応性抗体を決定する方法」の下で上述したようにヒト対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、
工程３：工程２において決定されたノロウイルス反応性抗体の量を、ヒト対象におけるノロウイルス感染からの保護の抗体相関物と比較することにより、ヒト対象が保護を付与する量のノロウイルス反応性抗体を有するかどうかを決定する工程、および
工程４：ヒト対象が、ヒト対象におけるノロウイルス感染からの保護の抗体相関物よりも低い量のノロウイルス反応性抗体を有する場合に、ヒト対象にノロウイルスワクチンを投与する工程
を含む方法にさらに向けられる。
【0244】
[0254] その文脈における「保護を付与する」は、ヒト対象中に存在するノロウイルス反応性抗体の量が、ノロウイルス感染からヒト対象を予防するために十分であることを意味する。
【0245】
[0255] その文脈における「保護の抗体相関物」は、ノロウイルス感染からの保護を付与することが決定されたノロウイルス反応性抗体のある特定の量を意味する。保護の抗体相関物は、例えば、好適な動物モデルから、または、例えば、ノロウイルスワクチンでワクチン接種された後の、ノロウイルス感染からのヒト対象の保護をモニターすることにより決定され得る。
【0246】
[0256] 一部の実施形態において、ノロウイルス感染は症候性感染である。
【0247】
ノロウイルス感染の存在をアッセイする方法
[0257] 本開示は、対象におけるノロウイルス感染の存在をアッセイする方法であって、
工程１：対象からの試料を得る工程、
工程２：セクション「ノロウイルス反応性抗体を決定する方法」の下で上述したように試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：ノロウイルス反応性抗体の前記量を、ノロウイルスに感染した対象におけるノロウイルス反応性抗体の確立された量と比較することにより、ノロウイルス感染の存在を決定する工程
を含む方法にさらに向けられる。
[0257] 本開示は、対象におけるノロウイルス感染の存在をアッセイする方法であって、
工程１：対象からの試料を得る工程、
工程２：セクション「ノロウイルス反応性抗体を決定する方法」の下で上述したように試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：ノロウイルス反応性抗体の前記量を、ノロウイルスに感染した対象におけるノロウイルス反応性抗体の確立された量と比較することにより、ノロウイルス感染の存在を決定する工程
を含む方法にさらに向けられる。
【0248】
試料中のノロウイルス反応性抗体を決定するためのキット
[0258] 本開示は、キットにさらに向けられる。マイクロスフェア複合体、検出システム、レポーター、二次レポーターおよび検出抗体の他に、試料に関して、上記のそれぞれのチャプターが参照される。追加的に、ある特定の特定の実施形態はこのセクションにおいても概説されるが、限定的であるとして解釈されるべきではない。このセクションからの任意の実施形態は、先行するセクションからの実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
[0258] 本開示は、キットにさらに向けられる。マイクロスフェア複合体、検出システム、レポーター、二次レポーターおよび検出抗体の他に、試料に関して、上記のそれぞれのチャプターが参照される。追加的に、ある特定の特定の実施形態はこのセクションにおいても概説されるが、限定的であるとして解釈されるべきではない。このセクションからの任意の実施形態は、先行するセクションからの実施形態のいずれとも組み合わせられ得る。
【0249】
[0259] １つの実施形態において、キットは、所定量の少なくとも１つの上述したマイクロスフェア複合体および任意選択により所定量の上述した検出抗体を含む。
【0250】
[0260] 他の実施形態において、キットは、所定量の少なくとも１つの上述したマイクロスフェア複合体および所定量の少なくとも１つの上述したレポーター抗体を含み、レポーター抗体は少なくとも１つのマイクロスフェア複合体のノロウイルスＶＬＰに結合する。一部の実施形態において、キットは、所定量の上述した二次レポーター抗体を追加的に含み、二次レポーター抗体はレポーター抗体に結合する。
【0251】
[0261] キットは、キットの構成要素の混合物のための好適な容器をさらに含有してもよい。キットは、指示書を有するマニュアルをさらに含有してもよい。
【実施例】
【0252】
[0262] 以下の実施例は、請求項において記載されている開示のある特定の態様および実施形態を実証するために含まれる。しかしながら、以下の記載は実例的なものに過ぎず、いかなるようにも本開示の制限として解釈されるべきでないことが当業者により理解されるべきである。
【0253】
実施例１：ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造
[0263] Ｈａｙｎｅｓら（Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９、１１、３９２、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１１０５０３９２）、Ｐａｒｒａら（Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１２、３０（２４）：３５８０～３５８６頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１２．０３．０５０）および国際公開第２０１０／０１７５４２号パンフレットに記載されるように、メジャーなウイルスカプシドタンパク質、ＶＰ１からなるＶＬＰを製造した。対応する株およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含む、本明細書において使用されるノロウイルスＶＬＰの概要を表１に与える。
[0263] Ｈａｙｎｅｓら（Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９、１１、３９２、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１１０５０３９２）、Ｐａｒｒａら（Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１２、３０（２４）：３５８０～３５８６頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１２．０３．０５０）および国際公開第２０１０／０１７５４２号パンフレットに記載されるように、メジャーなウイルスカプシドタンパク質、ＶＰ１からなるＶＬＰを製造した。対応する株およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含む、本明細書において使用されるノロウイルスＶＬＰの概要を表１に与える。
【0254】
[0264] ＧＩＩ．４／Ｄｅｎ Ｈａａｇ、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ、ＧＩＩ．４／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙの他に、ＧＩＩ．７ ＶＬＰの製造のために、ＧｅｎＢａｎｋから得られたＶＰ１アミノ酸配列（表１）を使用して、各々の特有のＶＰ１タンパク質のための哺乳動物コドン最適化ヌクレオチド遺伝子配列を合成した（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ、ＵＳＡにおいて合成）。制限部位を合成遺伝子の末端上に操作して、組換えアデノウイルスクローンを製造するために使用したＡｇｉｌｅｎｔからのＡｄＥａｓｙ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔへのクローニングを促した。組換えアデノウイルスを使用して、３００の多重感染度でＶｅｒｏ細胞に感染させ、培養物を４日後に採取した。上清を細胞から除去し、付着細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）および０．１％ Ｔｗｅｅｎ溶液で５分間、室温で振盪と共に処理して細胞を溶解させた。溶解液を遠心分離（４００×ｇ）により清澄化し、０．４５μｍシリンジフィルターを通じて濾過し、次に超遠心分離機（１００，０００×ｇ）において４０％のスクロースクッション中にスピンした。ＶＬＰの純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価し、濃度をＢＣＡアッセイにより決定した。ＶＬＰを４０％のスクロース／ＰＢＳ緩衝剤中－８０℃で凍結させた。代替的に、哺乳動物細胞中で発現されたＶＬＰはまた、以下に記載されるようにバキュロウイルス細胞中で発現され得る。
【0255】
[0265] 表１に列記される残りのＶＬＰの製造のために、バキュロウイルス発現システムを使用した。以下のヒトノロウイルスＧＩＩ．４メジャーなカプシドタンパク質配列をアライメントし、各々の位置における「コンセンサス」アミノ酸残基を決定することによりＧＩＩ．４コンセンサスノロウイルスＶＬＰアミノ酸配列を設計した：Ｈｏｕｓｔｏｎ／ＴＣＨ１８６／２００２／ＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＹ２７５６０．１）、Ｄｅｎ Ｈａａｇ８９／２００６／ＮＬ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＬ７４３９５．１）、およびＹｅｒｓｅｋｅ３８／２００６／ＮＬ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＬ７４３９１．１）。異なる残基が各々の配列中に見出されたアミノ酸位置において、Ｙｅｒｓｅｋｅ３８配列中に見出されたアミノ酸残基を選択し、その理由は、３つの株の間でのコンセンサスを達成するためにより少ない置換が必要とされたからである。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９細胞のためのコドン最適化を有する対応するＶＰ１配列をコードする合成ＤＮＡ断片をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成し、ＶＬＰの発現のために組換えバキュロウイルス中に操作した。Ｓｆ９細胞に低い多重感染度（ＭＯＩ）で感染させ、上清を感染の約５日後に採取した。製造後に、複数の直交クロマトグラフィー処理を使用してＶＬＰを精製した。
【0256】
【表1】
【0257】
実施例２：マイクロスフェアへのノロウイルスＶＬＰの連結
[0266] 連結のために使用されたマイクロスフェアはＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）であった。ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアは、表面カルボキシル基を有する超常磁性ポリスチレンマイクロスフェアである。マイクロスフェアを４～４．１ｍＬの体積において１ｍＬ当たり１．２～１．３×１０７個のマイクロスフェア（マイクロスフェア／ｍＬ）の平均濃度で送達した。ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアは、いくつかの独特のリージョン（ｒｅｇｉｏｎ）において利用可能であり、すなわちマイクロスフェアは、他の独特のリージョンのマイクロスフェアからマイクロスフェアを区別するために定義された放出シグナル（検出可能な標識）を有する１つまたは複数の蛍光色素を含む。表面カルボキシル基を伴う連結機構はマイクロスフェアの検出可能な標識から独立しているので、異なる独特のリージョンのＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアは、実験セットアップにおけるバリエーションに従って交換されてもよい。
[0266] 連結のために使用されたマイクロスフェアはＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）であった。ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアは、表面カルボキシル基を有する超常磁性ポリスチレンマイクロスフェアである。マイクロスフェアを４～４．１ｍＬの体積において１ｍＬ当たり１．２～１．３×１０７個のマイクロスフェア（マイクロスフェア／ｍＬ）の平均濃度で送達した。ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアは、いくつかの独特のリージョン（ｒｅｇｉｏｎ）において利用可能であり、すなわちマイクロスフェアは、他の独特のリージョンのマイクロスフェアからマイクロスフェアを区別するために定義された放出シグナル（検出可能な標識）を有する１つまたは複数の蛍光色素を含む。表面カルボキシル基を伴う連結機構はマイクロスフェアの検出可能な標識から独立しているので、異なる独特のリージョンのＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェアは、実験セットアップにおけるバリエーションに従って交換されてもよい。
【0258】
[0267] 特定の放出シグナル（異なる独特のリージョン／検出可能な標識）を有する１つまたは複数の蛍光色素を含む異なるマイクロスフェアを、実施例１の下で記載されるような異なるノロウイルスＶＬＰの連結のために応用して、１つの試料内で分析された場合に連結されたＶＬＰに従ってマイクロスフェアを区別する可能性（マルチプレックス能力）を得た。例えば、ＧＩ．１ ＶＬＰをリージョン１４のＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェア（カタログ番号ＭＣ１００１４－０４、製造物ロットＢ６５３３０）に連結し、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰをリージョン２５のＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェア（カタログ番号ＭＣ１００２５－０４；製造物ロットＢ６７６３２）に連結し、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰをリージョン４７のＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェア（カタログ番号ＭＣ１００４７－０４、製造物ロットＢ６９９１１）に連結した。
【0259】
マイクロスフェアへのノロウイルス抗原の連結のための一般的手順
[0268] ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェア懸濁液（１．２～１．３×１０７マイクロスフェア／ｍＬ、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）の未連結ストックをボルテックス（３０秒）により再懸濁し、各々のストックの最大５×１０６個のマイクロスフェアを１．５ｍＬ微量遠心チューブに移し、１．５ｍＬチューブ磁性分離器（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４４５７８５７８）に入れた。懸濁液からのマイクロスフェアの分離は３０～６０秒間行った。チューブを依然として磁性分離器中に配置しながらマイクロスフェアペレットを破砕することなく上清を慎重に除去した。その後、チューブを磁性分離器から除去し、約２０秒間のボルテックスおよび音波処理によりマイクロスフェアを蒸留Ｈ２Ｏ（ｄＨ２Ｏ）１００μＬに再懸濁した。チューブを再び磁性分離器に入れ、懸濁液からのマイクロスフェアの分離を３０～６０秒間行った。チューブを依然として磁性分離器中に配置しながらマイクロスフェアペレットを破砕することなく上清を除去した。マイクロスフェアを活性化緩衝剤（０．１Ｍリン酸ナトリウム（一塩基性）、ｐＨ ６．５）８０μｌに再懸濁し、２０秒間のボルテックスおよび音波処理により混合した。次に、５０ｍｇ／ｍＬ Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ；４０μＬのｄＨ２Ｏ中２ｍｇのスルホ－ＮＨＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３９２６９、ロット番号ＴＪ２７２２１８）１０μＬを各々のマイクロスフェアチューブに加え、穏やかな混合をボルテックス（５秒）により実行した。さらに、５０ｍｇ／ｍＬ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；２０μＬのｄＨ２Ｏ中１ｍｇのＥＤＣ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３５３９１、ロット番号ＵＤ２７７５１３）１０μＬを各々のマイクロスフェアチューブに加え、穏やかな混合をボルテックス（５秒）により実行した。試料を回転下、室温で２０分間インキュベートした。チューブを磁性分離器に入れ、懸濁液からのマイクロスフェアの分離を３０～６０秒間行った。チューブを依然として磁性分離器中に配置しながらマイクロスフェアペレットを破砕することなく上清を除去した。チューブを磁性分離器から除去した。マイクロスフェアを１×リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ（無菌）３００μＬで２回洗浄し、約２０秒間ボルテックスおよび音波処理した。
[0268] ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェア懸濁液（１．２～１．３×１０７マイクロスフェア／ｍＬ、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）の未連結ストックをボルテックス（３０秒）により再懸濁し、各々のストックの最大５×１０６個のマイクロスフェアを１．５ｍＬ微量遠心チューブに移し、１．５ｍＬチューブ磁性分離器（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４４５７８５７８）に入れた。懸濁液からのマイクロスフェアの分離は３０～６０秒間行った。チューブを依然として磁性分離器中に配置しながらマイクロスフェアペレットを破砕することなく上清を慎重に除去した。その後、チューブを磁性分離器から除去し、約２０秒間のボルテックスおよび音波処理によりマイクロスフェアを蒸留Ｈ２Ｏ（ｄＨ２Ｏ）１００μＬに再懸濁した。チューブを再び磁性分離器に入れ、懸濁液からのマイクロスフェアの分離を３０～６０秒間行った。チューブを依然として磁性分離器中に配置しながらマイクロスフェアペレットを破砕することなく上清を除去した。マイクロスフェアを活性化緩衝剤（０．１Ｍリン酸ナトリウム（一塩基性）、ｐＨ ６．５）８０μｌに再懸濁し、２０秒間のボルテックスおよび音波処理により混合した。次に、５０ｍｇ／ｍＬ Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ；４０μＬのｄＨ２Ｏ中２ｍｇのスルホ－ＮＨＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３９２６９、ロット番号ＴＪ２７２２１８）１０μＬを各々のマイクロスフェアチューブに加え、穏やかな混合をボルテックス（５秒）により実行した。さらに、５０ｍｇ／ｍＬ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；２０μＬのｄＨ２Ｏ中１ｍｇのＥＤＣ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３５３９１、ロット番号ＵＤ２７７５１３）１０μＬを各々のマイクロスフェアチューブに加え、穏やかな混合をボルテックス（５秒）により実行した。試料を回転下、室温で２０分間インキュベートした。チューブを磁性分離器に入れ、懸濁液からのマイクロスフェアの分離を３０～６０秒間行った。チューブを依然として磁性分離器中に配置しながらマイクロスフェアペレットを破砕することなく上清を除去した。チューブを磁性分離器から除去した。マイクロスフェアを１×リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ（無菌）３００μＬで２回洗浄し、約２０秒間ボルテックスおよび音波処理した。
【0260】
[0269] （１×ＰＢＳ中に希釈された）ＶＬＰ ５００μＬを、活性化されたマイクロスフェアを含有するそれぞれの１．５ｍＬチューブに移して、５００μＬの総体積中１０６個のマイクロスフェア当たりＶＬＰ １．２μｇの比を得た。連結のために、試料を回転下、室温で２時間インキュベートした。チューブを磁性分離器に入れ、懸濁液からのマイクロスフェアの分離を３０～６０秒間行った。チューブを依然として磁性分離器中に配置しながらマイクロスフェアペレットを破砕することなく上清を除去した。チューブを磁性分離器から除去し、マイクロスフェアをｐＨ ７．４のＰＢＳ中の０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０ ５００μＬに約２０秒間再懸濁した。チューブを磁性分離器に入れ、懸濁液からのマイクロスフェアの分離を３０～６０秒間行った。チューブを依然として磁性分離器中に配置しながらマイクロスフェアペレットを破砕することなく上清を除去した。チューブを磁性分離器から除去し、マイクロスフェアを２０ｍＭヒスチジン緩衝剤２．０ｍＬに再懸濁した。
【0261】
[0270] 連結反応後に回収されたマイクロスフェアの数を、自動化細胞カウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭＱＡＸ１０００）を使用し、細胞カウンターにより提供される決定された「死細胞」濃度をマイクロスフェアに相関させることにより決定した。連結されたマイクロスフェアを暗所中２～８℃で貯蔵した。
【0262】
連結条件の最適化
[0271] 連結効率の他に、連結手順後の抗原の完全性は、様々な要因、例えば使用された緩衝剤および抗原量に依存する。連結手順の最適化は、抗原の３次元構造が妨げられないことを確実にするために重要である。緩衝剤条件は、使用される抗原のタイプに依存して変動し得る。
[0271] 連結効率の他に、連結手順後の抗原の完全性は、様々な要因、例えば使用された緩衝剤および抗原量に依存する。連結手順の最適化は、抗原の３次元構造が妨げられないことを確実にするために重要である。緩衝剤条件は、使用される抗原のタイプに依存して変動し得る。
【0263】
[0272] したがって、異なる連結緩衝剤、ＮＨＳおよびＥＤＣの量の他に、ＶＬＰの量を用いて、上述した一般的手順を実行した。１×ＰＢＳ中での連結に加えて、ｐＨ ５、６、および７の５０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）中でも連結を実行した。さらに、各々１０μＬのＮＨＳおよびＥＤＣの体積に加えて、２５μＬの体積もまた試験した。さらに、５×１０６個のマイクロスフェア当たりのＶＬＰの量を変更した（３、１０、３０μｇのＶＬＰ）。これらの改変以外は、連結を上記のように実行した。好適なポリクローナル抗体および対応する検出抗体を使用して実施例３の下で記載されるように非競合的アッセイセットアップにより連結有効性を評価した。ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙの連結についての最適化を例示的に示す（表２および図１）。
【0264】
【表2】
【0265】
[0273] ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰの連結は、条件５～８についてのみ効率的であり、例えば緩衝剤ｐＨに依存して連結有効性における有意差を指し示した。
【0266】
[0274] 下記の実施例において使用されたマイクロスフェアへのノロウイルスＶＬＰの連結について、上述した一般的手順（ＶＬＰ １．２μｇならびに各々１０μＬのＥＤＣおよびスルホ－ＮＨＳを含む１×ＰＢＳ中）を主に実行し、その理由は、この手順はすべてのＶＬＰのために効率的な連結を結果としてもたらしたからである。
【0267】
実施例３：非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおける抗体力価の決定
[0275] ヒト試料中の総抗ノロウイルス抗体量を決定するために、非競合的マルチプレックスマイクロスフェアイムノアッセイセットアップを開発した。簡潔に述べれば、ヒト血清試料を異なるマイクロスフェアの混合物とインキュベートし（「マルチプレックス」セットアップ）、ここで、各々のマイクロスフェアを異なるノロウイルスＶＬＰに連結して、対応するノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性Ａｂを結合させた。その後、フィコエリトリン（ＰＥ）に連結された対応する検出抗体を使用して総ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ量を決定した。その文脈における「総」（Ｔｏｔａｌ）は、非競合的マイクロスフェアイムノアッセイが、対応するノロウイルスＶＬＰに結合する能力を有する試料中のＡｂの本質的にすべてまたは大部分を検出することを意味する。
[0275] ヒト試料中の総抗ノロウイルス抗体量を決定するために、非競合的マルチプレックスマイクロスフェアイムノアッセイセットアップを開発した。簡潔に述べれば、ヒト血清試料を異なるマイクロスフェアの混合物とインキュベートし（「マルチプレックス」セットアップ）、ここで、各々のマイクロスフェアを異なるノロウイルスＶＬＰに連結して、対応するノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性Ａｂを結合させた。その後、フィコエリトリン（ＰＥ）に連結された対応する検出抗体を使用して総ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ量を決定した。その文脈における「総」（Ｔｏｔａｌ）は、非競合的マイクロスフェアイムノアッセイが、対応するノロウイルスＶＬＰに結合する能力を有する試料中のＡｂの本質的にすべてまたは大部分を検出することを意味する。
【0268】
[0276] このアッセイセットアップは、単一もしくは複数のノロウイルス感染後またはノロウイルスに対するワクチン接種後の完全な急性および回復期免疫応答の評価および特徴付けを可能とする。その文脈における「完全な」は、決定された免疫応答が、決定された「総」抗体力価または抗体量により特徴付けられることを意味する。免疫状態を決定することにより、自然感染およびワクチン接種は区別されてもよい。追加的に、経時的な免疫応答の進行および免疫状態の変化が分析され得る。アッセイは、保護された個体からの抗体力価と比較することにより抗体力価が保護的であるか否かを決定するためにさらに好適であり得る。さらに、アッセイは、ある特定のノロウイルスタイプによる感染後またはワクチン接種後の経時的な交差反応性抗体応答をモニターすることを可能にする。追加的に、アッセイは、第２のまたはさらなるノロウイルス感染後の抗体パターンの変化の評価を可能とする。アッセイはアイソタイプ特異的応答（ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ）の間の区別ができるので、いずれのアイソタイプが、感染もしくはワクチン接種後の免疫状態についての最良の指標であり得るのかを分析すること、またはノロウイルス感染もしくはワクチン接種後にアイソタイプの一時的な出現があるかどうかを決定すること（例えばＩｇＭは一般に第１の指標である）も可能である。さらに、アッセイは、乳児への母体抗体の受動的な移行の特徴付けのために好適である。
【0269】
一般的方法
[0277] ヒト試験試料（例えばヒト血清試料）および対照血清試料（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、カタログ番号ＨＵＭＡＮＳＲＭ１８０００４１）を試験に先立って５６±１℃の水浴中で３０±１分間、熱不活性化した。熱不活性化後に、試料をボルテックスし、氷上に置いた後にアッセイ緩衝剤、すなわち１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に希釈した。アッセイ緩衝剤の調製のために、ＢＳＡを１０％ストック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３７５２５）からＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００１０－０２３）中に希釈した。試料を段階希釈して、１００、４００、１６００、６４００、２５６００、１０２４００、４０９６００、および１６３８４００倍の希釈液を得た。希釈当たり各々１００μＬを９６ウェルプレート（ポリスチレン硬質黒色平底マイクロプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１５）中の２連のウェルにプレーティングした。次に、対応するノロウイルスＶＬＰ連結マイクロスフェアを希釈し、ボルテックスにより混合して、アッセイ緩衝剤中の各々のノロウイルスＶＬＰについて１０～３０マイクロスフェア／μＬの最終濃度を得た。応用される異なるマイクロスフェアタイプの数（例えばデュプレックス、トリプレックス、またはクアドルプレックスセットアップ）に依存して、各々のマイクロスフェアタイプの濃度を調整する。例えば、デュプレックスセットアップにおいて、マイクロスフェアタイプ当たりのより高いマイクロスフェア濃度が使用され得る一方、２０プレックスセットアップにおいて、マイクロスフェアタイプ当たりの濃度はより低く、その理由は、マイクロスフェアの総量はある特定の最大を上回るべきでないからである。その後、５０μＬ／ウェルのマイクロスフェア混合物をプレートに加えて１５０μＬの総体積を得た。プレートをホイルプレートシール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＡＢ０５５８）でシールし、２～８℃で２１±３時間インキュベートした。代替的に、プレートは、６００ｒｐｍのプレートシェーカー上、室温で９０±５分間インキュベートされ得る。
[0277] ヒト試験試料（例えばヒト血清試料）および対照血清試料（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、カタログ番号ＨＵＭＡＮＳＲＭ１８０００４１）を試験に先立って５６±１℃の水浴中で３０±１分間、熱不活性化した。熱不活性化後に、試料をボルテックスし、氷上に置いた後にアッセイ緩衝剤、すなわち１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に希釈した。アッセイ緩衝剤の調製のために、ＢＳＡを１０％ストック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３７５２５）からＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００１０－０２３）中に希釈した。試料を段階希釈して、１００、４００、１６００、６４００、２５６００、１０２４００、４０９６００、および１６３８４００倍の希釈液を得た。希釈当たり各々１００μＬを９６ウェルプレート（ポリスチレン硬質黒色平底マイクロプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１５）中の２連のウェルにプレーティングした。次に、対応するノロウイルスＶＬＰ連結マイクロスフェアを希釈し、ボルテックスにより混合して、アッセイ緩衝剤中の各々のノロウイルスＶＬＰについて１０～３０マイクロスフェア／μＬの最終濃度を得た。応用される異なるマイクロスフェアタイプの数（例えばデュプレックス、トリプレックス、またはクアドルプレックスセットアップ）に依存して、各々のマイクロスフェアタイプの濃度を調整する。例えば、デュプレックスセットアップにおいて、マイクロスフェアタイプ当たりのより高いマイクロスフェア濃度が使用され得る一方、２０プレックスセットアップにおいて、マイクロスフェアタイプ当たりの濃度はより低く、その理由は、マイクロスフェアの総量はある特定の最大を上回るべきでないからである。その後、５０μＬ／ウェルのマイクロスフェア混合物をプレートに加えて１５０μＬの総体積を得た。プレートをホイルプレートシール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＡＢ０５５８）でシールし、２～８℃で２１±３時間インキュベートした。代替的に、プレートは、６００ｒｐｍのプレートシェーカー上、室温で９０±５分間インキュベートされ得る。
【0270】
[0278] 次の工程において、検出抗体を検出のために加えた。好適な検出抗体は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡと反応するフィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートされたヤギ抗ヒト汎Ｉｇ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０１０－０９、ロット番号Ｃ２１１７－ＳＧ９８）、ならびにＰＥにコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、それぞれカタログ番号２０４０－０９、２０５０－０９、２０２０－０９）であった。すべての抗体は、０．１％アジ化ナトリウムおよび安定化剤を含有するＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬのストック濃度で送達した。検出抗体をアッセイ緩衝剤中に１：２５（ヤギ抗ヒト汎Ｉｇ抗体）または１：５０（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ抗体）で希釈した。インキュベーション後に、磁石を有するプレートウォッシャー（磁気プレート分離器、ＢｉｏＴｅｋ、ＥＬ－４０６ ／ ４０５－ＴＳ）を使用して洗浄緩衝剤（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）でプレートを洗浄した。ウェル当たり５０μＬの希釈された検出抗体を加え、プレートを再びホイルプレートシールを使用してシールした。プレートを、６００ｒｐｍに設定されたプレートシェーカー上、室温で６０±５分インキュベートした。インキュベーション後に、上述した洗浄緩衝剤を使用してプレートを再び洗浄した。最後に、９５μＬ／ウェルのシース液（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号４０－５００００）または１００μＬ／ウェルのアッセイ緩衝剤を加え、プレートを再びホイルプレートシールでシールし、分析まで６００ｒｐｍで振盪した。シース液はより高プレックスのセットアップのために好ましく、その理由は、それはマイクロスフェアの凝集の低減を助けるからである。代替的に、シース液を含むプレートを翌日の分析のために２～８℃で終夜貯蔵してもよい。プレートを２～８℃で貯蔵した場合、分析に先立って少なくとも３０分間、室温で６００ｒｐｍでプレートを振盪した。
【0271】
[0279] 異なるマイクロスフェアの各々についてのマイクロスフェアカウントを５０および試料体積をウェル当たり５０μＬに設定して、ｘＰＯＮＥＮＴ ４．２ ｓｏｆｔｗａｒｅと共にＦｌｅｘＭａｐ ３Ｄ Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ、ＦＭ３Ｄ）を使用してプレートを分析した。さらに、機器の取得設定を３０秒のタイムアウトとし、ゲーティングを７５００～１５０００に設定し、報告される取得を増強ＰＭＴ（ｈｉｇｈ）に設定した。記録されたメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）データを重複物から平均し、Ｐｒｉｓｍ（バージョン７．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してさらに分析した。各々のノロウイルスＶＬＰについてｘ軸上の対応するｌｏｇ１０変換された血清希釈に対してｙ軸上に平均されたＭＦＩ値をプロットした。４パラメーター曲線フィット分析を行った。得られた５０％有効濃度（ＥＣ５０）を曲線から補間し、試料力価として報告した。
【0272】
２０プレックスアッセイセットアップ
[0280] ヒト血清試料を２０プレックスアッセイセットアップにおいて分析した。２０プレックスアッセイセットアップにおいて使用したノロウイルスＶＬＰは、ＧＩ．１、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．４、ＧＩ．５、ＧＩ．６、ＧＩ．７、ＧＩＩ．１、ＧＩＩ．２、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４／コンセンサス、ＧＩＩ．４／Ｄｅｎ Ｈａａｇ、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ、ＧＩＩ．４／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ、ＧＩＩ．６、ＧＩＩ．７、ＧＩＩ．１２、ＧＩＩ．１７／１９７８、およびＧＩＩ．１７／２０１５であった（表１を参照）。実施例１および２の下で記載されるようにＶＬＰを調製し、マイクロスフェアに連結させた。２０プレックスアッセイセットアップは、一般的方法について上述したように実行した。２０プレックスアッセイセットアップのために、１０マイクロスフェア／μＬの、異なるノロウイルスＶＬＰに連結された各々のマイクロスフェアを応用し、ＶＬＰおよび血清希釈液を２～８℃で２１±３時間インキュベートし、９５μＬ／ウェルのシース液（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号４０－５００００）を分析前に加えた。上述したようにヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ抗体を使用してＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭを分析した。アッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）は、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭについて５９、６１および１１であると決定された。
[0280] ヒト血清試料を２０プレックスアッセイセットアップにおいて分析した。２０プレックスアッセイセットアップにおいて使用したノロウイルスＶＬＰは、ＧＩ．１、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．４、ＧＩ．５、ＧＩ．６、ＧＩ．７、ＧＩＩ．１、ＧＩＩ．２、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４／コンセンサス、ＧＩＩ．４／Ｄｅｎ Ｈａａｇ、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ、ＧＩＩ．４／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ、ＧＩＩ．６、ＧＩＩ．７、ＧＩＩ．１２、ＧＩＩ．１７／１９７８、およびＧＩＩ．１７／２０１５であった（表１を参照）。実施例１および２の下で記載されるようにＶＬＰを調製し、マイクロスフェアに連結させた。２０プレックスアッセイセットアップは、一般的方法について上述したように実行した。２０プレックスアッセイセットアップのために、１０マイクロスフェア／μＬの、異なるノロウイルスＶＬＰに連結された各々のマイクロスフェアを応用し、ＶＬＰおよび血清希釈液を２～８℃で２１±３時間インキュベートし、９５μＬ／ウェルのシース液（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号４０－５００００）を分析前に加えた。上述したようにヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ抗体を使用してＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭを分析した。アッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）は、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭについて５９、６１および１１であると決定された。
【0273】
[0281] 対象＃１および＃２の血清試料ではプラトーに達しなかったので（図２～４）、良好な４パラメーターフィットを可能とするために、曲線の最上部をＩｇＧおよびＩｇＭについて３００，０００ＭＦＩならびにＩｇＡについて２００，０００ＭＦＩにそれぞれ制限した。ＥＣ５０値を対象＃１の試料について表３に例示的に提示する。ノロウイルスに対する対象＃１および＃２の正確な曝露パターンは、試験に先立って知られていなかった。
【0274】
【表3】
【0275】
[0282] 要約すると、２０プレックスアッセイセットアップは、２０の異なるノロウイルスＶＬＰに対するアイソタイプＧ、Ｍ、およびＡについての抗体力価の信頼できる測定を可能にした。対象＃１および＃２の両方からの試料についてのＶＬＰの大部分について、ＩｇＧ力価が最も高く、続いてＩｇＡおよびＩｇＭ力価であった。２０プレックスアッセイセットアップは、各々のアイソタイプについて１７％を下回る変動係数（ＣＶ）を有する良好なアッセイ間およびアッセイ内精度ならびに各々のアイソタイプについて２～５％の範囲内のＣＶを有する良好な再現性を示した。
【0276】
[0283] ２０プレックスアッセイが経時的な免疫状態における変化を追跡するために好適であるかどうかをさらに評価するために、および母体抗体の他に、乳児におけるノロウイルス感染パターンを評価するために、生後２、３、および１２か月で採取した乳児からの血清試料を分析した。
【0277】
[0284] 対象＃Ａは、最初の１２か月の間にノロウイルス感染を有しない小児について予想されたパターンを有した（表４）。２か月時のＩｇＧ力価は、これらの力価は経時的に減衰するので母体抗体を構成する（３および１２か月を参照）。追加的に、ＩｇＡもしくはＩｇＭ力価は検出されなかったか、または非常に低いものに過ぎないＩｇＡもしくはＩｇＭ力価が検出されたが、これはそれらは母親から伝達されないからである。すべてのＶＬＰについて、力価は１２か月までに減衰し、ノロウイルスへの感染または曝露の指標となるであろう明確な増加をいずれも示さなかった。
【0278】
【表4】
【0279】
[0285] 対象＃Ｂもまた、調べたすべてのノロウイルスタイプに対して反応性の母体抗体（ＩｇＧ）を２か月時に示した（表５）。対象＃Ａと同様に、２４３６の力価まで増加したＧＩ．７に対するＩｇＧ抗体を除いて、ＩｇＧレベルは１２か月の経過にかけて低下した。ＩｇＧの増加はＧＩ．７ ＶＬＰに限定されるので、そのようなパターンは、ＧＩ．７ノロウイルスによる感染を示唆するであろう。
【0280】
【表5】
【0281】
[0286] さらに、出生コホートからの小児血清試料を２０プレックスアッセイセットアップで評価した。コホート中の小児を急性胃腸炎について追跡し、症候性疾患が見出された場合にノロウイルス感染について試験した。試験は、特有の小児がいずれのノロウイルス遺伝子型に感染したのかを明らかにしたので、２０プレックスアッセイの結果は、確認された感染と比較され得る。
【0282】
[0287] 対象＃Ｃは、９か月時にＧＩＩ．１２感染と診断され、感染の４か月前および９か月後に収集された試料を試験した（表６）。ＩｇＧおよびＩｇＡの両方は、感染後のＧＩＩ．１２ ＶＬＰに対する明確な増強を示し、アッセイは、特有のノロウイルス遺伝子型による感染を特異的に同定する能力を有することを裏付けた。ＩｇＧ力価について試験した場合に５か月時に母体抗体の証拠があるが、これらはほとんどのＶＬＰについて１８か月までに減少した。ＧＩＩ．１２についてのＩｇＧ力価は、感染に起因して１８か月時に非常に高い（７６２４）。
【0283】
【表6】
【0284】
[0288] 対象＃Ｄは、約６．５か月齢においてＧＩＩ．４ Ｓｙｄｎｅｙ感染と診断され、感染の１．５か月前および５．５か月後に収集された試料を試験した（表７）。ＧＩＩ．４ Ｓｙｄｎｅｙに対するＩｇＧ力価は１２か月時に著しく増加した。追加的に、予想されたように、他のＧＩＩ．４に対する力価もまた交差反応性に起因して増加した。さらに、ＧＩＩ．１２に対する非常に高いＩｇＧ力価もまた１２か月時に検出された。これは、小児は２回の採取日の間にノロウイルスＧＩＩ．１２にも感染したことを示唆する。ＧＩＩ．１２の感染は同定されなかったが、小児が症候性疾患を有する場合のみ感染は評価された。結果は、小児は実際にＧＩＩ．１２に感染したが、その感染は無症候性であったことを指し示す。追加的に、ＧＩＩ．１２およびＧＩＩ．４ Ｓｙｄｎｅｙに対して検出された力価よりも全体的に低かったが、ＩｇＧ力価の増加がいくつかの他のＧＩＩ ＶＬＰ（例えば、ＧＩＩ．１７など）について検出された。それらのノロウイルスへの追加の曝露の可能性もあるが、これらの増加したＩｇＧ力価は交差反応性抗体からの結果であると考えられる。複数のＶＬＰに対する交差反応性の増強は、複数の異なるノロウイルスタイプへの曝露により促進されると考えられる。そのため、成人は一般に小児よりもノロウイルス疾患に対してはるかに低い感受性であり、これは成人は、増加した数の異なるノロウイルスに曝露されており、交差反応性抗体の数も増加させているからである。
【0285】
【表7】
【0286】
[0289] 結果は、２０プレックスアッセイセットアップは疾患を引き起こしたノロウイルス感染を同定できることを裏付けるが、無症候性感染が検出され得ることも指し示す。症候性および無症候性感染に対する小児における抗体応答の他に、交差反応性応答の進化に関する情報は、疾患からの保護を指し示し得るパターンを同定するため、および追加的にワクチン接種に対する応答を評価するために価値がある。
【0287】
実施例４：競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおける抗体力価の決定
[0290] ヒト試料中の特定のノロウイルス反応性抗体の量を決定するために、競合的シングルまたはマルチプレックスマイクロスフェアイムノアッセイセットアップを開発した。簡潔に述べれば、ヒト血清試料を、異なるノロウイルスＶＬＰに連結された１つまたは複数の異なるマイクロスフェアとインキュベートして、対応する１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性Ａｂを結合させた。その後、ＶＬＰ結合について試料中の特定のノロウイルス反応性抗体と競合させるために１つまたは複数の異なる抗ノロウイルスレポーター抗体を加えた。次に、レポーター抗体に対して方向付けられたフィコエリトリン（ＰＥ）に連結された二次レポーター抗体を加えて、ＶＬＰに結合したレポーター抗体の量を検出した。それにより、ＶＬＰ結合についてレポーター抗体と競合する試料中の特定のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量が決定され得る。代替的に、ＰＥでのレポーター抗体の直接的な標識化もまた可能であり、それにより、二次レポーター抗体を応用する必要性が回避される。その文脈における「特定の」は、試料中の検出されたノロウイルス反応性抗体がＶＬＰ結合についてレポーター抗体と競合する能力を有することを意味する。
[0290] ヒト試料中の特定のノロウイルス反応性抗体の量を決定するために、競合的シングルまたはマルチプレックスマイクロスフェアイムノアッセイセットアップを開発した。簡潔に述べれば、ヒト血清試料を、異なるノロウイルスＶＬＰに連結された１つまたは複数の異なるマイクロスフェアとインキュベートして、対応する１つまたは複数のノロウイルスＶＬＰに、試料中のノロウイルス反応性Ａｂを結合させた。その後、ＶＬＰ結合について試料中の特定のノロウイルス反応性抗体と競合させるために１つまたは複数の異なる抗ノロウイルスレポーター抗体を加えた。次に、レポーター抗体に対して方向付けられたフィコエリトリン（ＰＥ）に連結された二次レポーター抗体を加えて、ＶＬＰに結合したレポーター抗体の量を検出した。それにより、ＶＬＰ結合についてレポーター抗体と競合する試料中の特定のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量が決定され得る。代替的に、ＰＥでのレポーター抗体の直接的な標識化もまた可能であり、それにより、二次レポーター抗体を応用する必要性が回避される。その文脈における「特定の」は、試料中の検出されたノロウイルス反応性抗体がＶＬＰ結合についてレポーター抗体と競合する能力を有することを意味する。
【0288】
[0291] このアッセイセットアップは、単一もしくは複数のノロウイルス感染後またはノロウイルスに対するワクチン接種後の特定の急性および回復期免疫応答の評価および特徴付けを可能とする。特定の免疫状態を決定することにより、自然感染およびワクチン接種が区別され得る。追加的に、経時的な特定の免疫応答の進行および特定の免疫状態の変化が分析され得る。保護された個体からの特定の抗体の力価と比較することにより特定の抗体の力価が保護的であるか否かを決定するためにアッセイはさらに適する。さらに、アッセイは、交差反応性レポーター抗体の応用によりある特定のノロウイルスタイプによる感染またはワクチン接種後に経時的に交差反応性抗体応答をモニターすることを可能にする。追加的に、アッセイは、第２のまたはさらなるノロウイルス感染後の特定の抗体のパターンにおける変化を評価することを可能にする。ノロウイルス中和および／またはノロウイルス遮断レポーター抗体が応用される場合、試料中のノロウイルス中和および／またはノロウイルス遮断抗体もまた検出可能であり、その理由は、ノロウイルス中和および／またはノロウイルス遮断レポーター抗体と競合する抗体は中和性および／または遮断性でもある可能性が最も高いからである。
【0289】
実施例４．１：マウスにおける抗ＧＩＩ．４／ＳｙｄｎｅｙレポーターｍＡｂの製造およびその特徴付け
[0292] 第１の工程において、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙノロウイルスに対して方向付けられたレポーター抗体（表１を参照）を製造した。
[0292] 第１の工程において、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙノロウイルスに対して方向付けられたレポーター抗体（表１を参照）を製造した。
【0290】
免疫化およびハイブリドーマ製造
[0293] したがって、アジュバントとして水中油エマルション（Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ６３２２－１ＶＬ）および媒体としてヒスチジン緩衝剤を使用して４匹の雌ＣＤ２Ｆ１マウスをＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰ（５μｇ／用量）で免疫化した。このアジュバントは、マウスにおける使用のために設計され、免疫系に対する強力な刺激を提供する細菌およびマイコバクテリウム細胞壁構成要素に由来する。各々のアジュバントバイアルは、２％の油（スクアレン）－Ｔｗｅｅｎ－８０－水中にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａからのモノホスホリルリピドＡ（解毒されたエンドトキシン）０．５ｍｇおよび合成トレハロースジコリノミコラート０．５ｍｇを含有する。０、３、７、１０、１４、１８、２１、および２８日目に、足蹠と同じリンパ節に排出する非体重負荷構造である、足首のすぐ上の外側足根領域である踵関節に免疫原を注入した（Ｋａｍａｌａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００７、３２８（１－２）：２０４～２１４頁）。
[0293] したがって、アジュバントとして水中油エマルション（Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ６３２２－１ＶＬ）および媒体としてヒスチジン緩衝剤を使用して４匹の雌ＣＤ２Ｆ１マウスをＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰ（５μｇ／用量）で免疫化した。このアジュバントは、マウスにおける使用のために設計され、免疫系に対する強力な刺激を提供する細菌およびマイコバクテリウム細胞壁構成要素に由来する。各々のアジュバントバイアルは、２％の油（スクアレン）－Ｔｗｅｅｎ－８０－水中にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａからのモノホスホリルリピドＡ（解毒されたエンドトキシン）０．５ｍｇおよび合成トレハロースジコリノミコラート０．５ｍｇを含有する。０、３、７、１０、１４、１８、２１、および２８日目に、足蹠と同じリンパ節に排出する非体重負荷構造である、足首のすぐ上の外側足根領域である踵関節に免疫原を注入した（Ｋａｍａｌａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００７、３２８（１－２）：２０４～２１４頁）。
【0291】
[0294] ２８日目に、脾臓および膝窩リンパ節を採取し、Ｂ細胞を組織摩砕および洗浄により単離した。エレクトロポレーションを使用してＢ細胞をＰ３Ｕ１骨髄腫細胞と融合させた。融合した細胞の選択のためにＨＡＴ（ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン）培地中で細胞を継代した。１０３６個のコロニーを選択し、各々のコロニーをさらに継代した。
【0292】
ＥＬＩＳＡを使用した一次抗原結合スクリーニング
[0295] ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰ被覆プレートを使用して酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）においてハイブリドーマ上清をスクリーニングした。非希釈の上清をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に連結されたヤギ抗マウスＡｂおよび基質としての２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）を使用してｍＡｂ結合を検出した。明確な陽性シグナルであると考えられる０．４より高いＯＤ値を結果としてもたらした５５個のハイブリドーマクローン上清を繁殖のために選択した。陽性対照として、終末期マウス出血からの血清を含めた。第２のスクリーニングにおいて、プレートに被覆されたＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙおよび追加的にＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰを使用して、上記のようにＥＬＩＳＡにおいて５５個のハイブリドーマ細胞の上清を試験した。ＧＩＩ．４／ＳｙｄｎｅｙおよびＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰへの結合を示した４０個のハイブリドーマクローンをさらなる特徴付けのために選択した。
[0295] ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰ被覆プレートを使用して酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）においてハイブリドーマ上清をスクリーニングした。非希釈の上清をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に連結されたヤギ抗マウスＡｂおよび基質としての２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）を使用してｍＡｂ結合を検出した。明確な陽性シグナルであると考えられる０．４より高いＯＤ値を結果としてもたらした５５個のハイブリドーマクローン上清を繁殖のために選択した。陽性対照として、終末期マウス出血からの血清を含めた。第２のスクリーニングにおいて、プレートに被覆されたＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙおよび追加的にＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰを使用して、上記のようにＥＬＩＳＡにおいて５５個のハイブリドーマ細胞の上清を試験した。ＧＩＩ．４／ＳｙｄｎｅｙおよびＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰへの結合を示した４０個のハイブリドーマクローンをさらなる特徴付けのために選択した。
【0293】
ＰＧＭ遮断アッセイにおけるｍＡｂの一次評価
[0296] 選択されたハイブリドーマ上清を、以前（Ｈａｙｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９、１１、３９２、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１１０５０３９２）に記載されたようにブタ胃ムチン（ＰＧＭ）遮断アッセイにおいてさらにスクリーニングした。簡潔に述べれば、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）をＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中のＰＧＭの５μｇ／ｍＬ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ、ＵＳＡ）１００μＬで４℃で終夜、または３７℃で１時間被覆した。被覆後に、プレートを３００μＬ／ウェルのＰＢＳおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、次に２００μＬ／ウェルのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて室温で１時間遮断した。プレートを使用の前にＰＢＳＴで３回洗浄した。非希釈のハイブリドーマ上清をそれぞれＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ、ＧＩＩ．４／コンセンサス、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ、ＧＩＩ．１７／２０１５、およびＧＩ．１ ＶＬＰ（表１を参照）と混合し、２２℃で終夜インキュベートした。混合物を、ＶＬＰ単独対照を含むＰＧＭ被覆プレートに移し、インキュベーションを２２℃または３７℃で１時間実行した。ＰＢＳＴでの３回の洗浄後に、対応するＶＬＰに特異的な検出抗体を加え、プレートを室温で１時間インキュベートし、次にＰＢＳＴで３回洗浄した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ；＃４０３０－０５）二次抗体を次に加え、インキュベーションを室温で１時間実行した。３回の洗浄後に、酵素基質（ＡＢＴＳ、ＫＰＬ）を加え、室温で１２分間反応させた。ＡＢＴＳ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ）を次に加え、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用してＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーにおいて４５０ｎｍの波長でプレートを読み取って各々のウェルの光学密度（ＯＤ）を得た。ＶＬＰ遮断のパーセンテージをＶＬＰ単独対照からのＯＤ値を参照して算出した（表８）。ｍＡｂのいずれもＧＩ．Ｉ／Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰの結合を遮断せず、これらのＡｂは遺伝子型群にわたり交差反応性でないことを示唆した。ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰに対する強い結合が観察された。さらに、すべてのｍＡｂはＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰの結合を遮断した。
[0296] 選択されたハイブリドーマ上清を、以前（Ｈａｙｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９、１１、３９２、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１１０５０３９２）に記載されたようにブタ胃ムチン（ＰＧＭ）遮断アッセイにおいてさらにスクリーニングした。簡潔に述べれば、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）をＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中のＰＧＭの５μｇ／ｍＬ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ、ＵＳＡ）１００μＬで４℃で終夜、または３７℃で１時間被覆した。被覆後に、プレートを３００μＬ／ウェルのＰＢＳおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、次に２００μＬ／ウェルのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて室温で１時間遮断した。プレートを使用の前にＰＢＳＴで３回洗浄した。非希釈のハイブリドーマ上清をそれぞれＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ、ＧＩＩ．４／コンセンサス、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ、ＧＩＩ．１７／２０１５、およびＧＩ．１ ＶＬＰ（表１を参照）と混合し、２２℃で終夜インキュベートした。混合物を、ＶＬＰ単独対照を含むＰＧＭ被覆プレートに移し、インキュベーションを２２℃または３７℃で１時間実行した。ＰＢＳＴでの３回の洗浄後に、対応するＶＬＰに特異的な検出抗体を加え、プレートを室温で１時間インキュベートし、次にＰＢＳＴで３回洗浄した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ；＃４０３０－０５）二次抗体を次に加え、インキュベーションを室温で１時間実行した。３回の洗浄後に、酵素基質（ＡＢＴＳ、ＫＰＬ）を加え、室温で１２分間反応させた。ＡＢＴＳ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ）を次に加え、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用してＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーにおいて４５０ｎｍの波長でプレートを読み取って各々のウェルの光学密度（ＯＤ）を得た。ＶＬＰ遮断のパーセンテージをＶＬＰ単独対照からのＯＤ値を参照して算出した（表８）。ｍＡｂのいずれもＧＩ．Ｉ／Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰの結合を遮断せず、これらのＡｂは遺伝子型群にわたり交差反応性でないことを示唆した。ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰに対する強い結合が観察された。さらに、すべてのｍＡｂはＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰの結合を遮断した。
【0294】
【表8-1】
【0295】
【表8-2】
【0296】
抗体精製
[0297] ハイブリドーマ上清からの抗体精製のために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ １４１９０－１４４）中のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ １７１２７９０３）の５０％スラリーを調製した。アイソタイプＩｇＧ２ａ、２ｂ、および３の場合にスラリー６００μＬを引き続いてハイブリドーマ上清５０ｍＬに加えた。代替的に、ＩｇＧ１の場合に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＲａｄ １５３－６１６１）２５ｍＬと混合されたスラリー３００μＬをハイブリドーマ上清２５ｍＬに加えた。試料を終夜４℃でインキュベートし、翌日に１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ（２４Ｗｅｌｌ １０ｍＬ ＧＥ ７７００－９９０４ １５０５７０６５）およびＭＡＰＳＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＩｇＧ１）またはＰＢＳ（他のアイソタイプ）のいずれかを使用してビーズを洗浄した。溶出は、０．１Ｍグリシン、０．３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ３．０で実行した。最後に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５ ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ濃縮装置を使用して緩衝剤をＰＢＳに交換した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより抗体濃度を決定した。
[0297] ハイブリドーマ上清からの抗体精製のために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ １４１９０－１４４）中のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ １７１２７９０３）の５０％スラリーを調製した。アイソタイプＩｇＧ２ａ、２ｂ、および３の場合にスラリー６００μＬを引き続いてハイブリドーマ上清５０ｍＬに加えた。代替的に、ＩｇＧ１の場合に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＲａｄ １５３－６１６１）２５ｍＬと混合されたスラリー３００μＬをハイブリドーマ上清２５ｍＬに加えた。試料を終夜４℃でインキュベートし、翌日に１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ（２４Ｗｅｌｌ １０ｍＬ ＧＥ ７７００－９９０４ １５０５７０６５）およびＭＡＰＳＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＩｇＧ１）またはＰＢＳ（他のアイソタイプ）のいずれかを使用してビーズを洗浄した。溶出は、０．１Ｍグリシン、０．３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ３．０で実行した。最後に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５ ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ濃縮装置を使用して緩衝剤をＰＢＳに交換した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより抗体濃度を決定した。
【0297】
エピトープビニング
[0298] 標準的な手順に従ってＯｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍを使用してバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて４０個のｍＡｂのうちの３５個のエピトープビニングを行った。ＢＬＩのために、精製された抗体を応用した（精製についての上記のセクションを参照）。ＢＬＩ技術は、特定の抗原上の別個のエピトープの結合を指し示すビンにＡｂを特徴付けおよび選別することを可能とする。簡潔に述べれば、第１のｍＡｂ（２０μｇ／ｍＬのストック濃度）を抗マウスＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＭＣ）バイオセンサー上に固定化した。マウスポリクローナルＩｇＧ対照（５０μｇ／ｍＬのストック濃度）を使用して遮断を行った。ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰ（１μｇ／ｍＬのストック濃度）を第２のｍＡｂ（４０μｇ／ｍＬのストック濃度）と１：１６（ｗ／ｗ）のＶＬＰ対ｍＡｂの比でインキュベートした。その後、この混合物をバイオセンサーに加え、応答を測定した。追加的に、第２のｍＡｂとのインキュベーションなしでＶＬＰのみを使用した対照を含めた。第２のｍＡｂとプレインキュベートされたＶＬＰとのインキュベーションによる結合応答をＶＬＰのみとのインキュベーションによる結合応答で割ることにより各々のｍＡｂについての結合値を算出した。分析は４つのビンへのｍＡｂのクラスタリングを明らかにし（図５）、１０個のｍＡｂ（０２Ａ０４、０４Ｈ０４、０５Ａ０４、０５Ａ０５、０５Ｂ０８、０６Ｆ０５、０８Ａ０８、０８Ｂ０４、１１Ｆ０３、０８Ｃ０９）をさらなる評価のために選択した。
[0298] 標準的な手順に従ってＯｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍを使用してバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて４０個のｍＡｂのうちの３５個のエピトープビニングを行った。ＢＬＩのために、精製された抗体を応用した（精製についての上記のセクションを参照）。ＢＬＩ技術は、特定の抗原上の別個のエピトープの結合を指し示すビンにＡｂを特徴付けおよび選別することを可能とする。簡潔に述べれば、第１のｍＡｂ（２０μｇ／ｍＬのストック濃度）を抗マウスＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＭＣ）バイオセンサー上に固定化した。マウスポリクローナルＩｇＧ対照（５０μｇ／ｍＬのストック濃度）を使用して遮断を行った。ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰ（１μｇ／ｍＬのストック濃度）を第２のｍＡｂ（４０μｇ／ｍＬのストック濃度）と１：１６（ｗ／ｗ）のＶＬＰ対ｍＡｂの比でインキュベートした。その後、この混合物をバイオセンサーに加え、応答を測定した。追加的に、第２のｍＡｂとのインキュベーションなしでＶＬＰのみを使用した対照を含めた。第２のｍＡｂとプレインキュベートされたＶＬＰとのインキュベーションによる結合応答をＶＬＰのみとのインキュベーションによる結合応答で割ることにより各々のｍＡｂについての結合値を算出した。分析は４つのビンへのｍＡｂのクラスタリングを明らかにし（図５）、１０個のｍＡｂ（０２Ａ０４、０４Ｈ０４、０５Ａ０４、０５Ａ０５、０５Ｂ０８、０６Ｆ０５、０８Ａ０８、０８Ｂ０４、１１Ｆ０３、０８Ｃ０９）をさらなる評価のために選択した。
【0298】
ＰＧＭ遮断アッセイにおける選択されたｍＡｂの評価
[0299] エピトープビニングから選択された１０個の精製されたｍＡｂを、ノロウイルスＶＬＰのより大きいパネルを使用してＰＧＭ遮断アッセイ（Ｈａｙｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９、１１、３９２、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１１０５０３９２）において再びスクリーニングした。追加的に、２つのヒトｍＡｂ（配列情報について、添付文書セクションが参照される；２つのｍＡｂに関して、Ｌｉｎｄｅｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１９、５０：１５３０～１５４１頁が参照される（Ａ１２２７およびＡ１４３１））を含めた。追加的に、１０個の選択されたｍＡｂおよびヒトｍＡｂを使用して上述したようにエピトープビニングを行った（図６）。
[0299] エピトープビニングから選択された１０個の精製されたｍＡｂを、ノロウイルスＶＬＰのより大きいパネルを使用してＰＧＭ遮断アッセイ（Ｈａｙｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９、１１、３９２、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１１０５０３９２）において再びスクリーニングした。追加的に、２つのヒトｍＡｂ（配列情報について、添付文書セクションが参照される；２つのｍＡｂに関して、Ｌｉｎｄｅｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１９、５０：１５３０～１５４１頁が参照される（Ａ１２２７およびＡ１４３１））を含めた。追加的に、１０個の選択されたｍＡｂおよびヒトｍＡｂを使用して上述したようにエピトープビニングを行った（図６）。
【0299】
[0300] ｍＡｂを段階希釈し、ＧＩＩ．６、ＧＩＩ．１７／２０１５、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ、ＧＩＩ．４／コンセンサス、ＧＩＩ．４／Ｄｅｎ Ｈａａｇ、ＧＩＩ．４／Ｈｏｕｓｔｏｎ、およびＧＩＩ．４／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ ＶＬＰの各々と２２℃で終夜インキュベートしたことを除いて、ＰＧＭ遮断アッセイを上記のように行った。翌日、ＶＬＰとインキュベートされた対応する希釈液をＰＧＭ被覆プレートに移した。ＯＤデータを曲線フィットし、プレートについての最大ＯＤの１／２で補間された上清希釈として遮断力価を算出した。遮断力価は、ＰＧＭへのＶＬＰ結合における５０％の低減を生成する上清希釈を表す。プレートについての最大ＯＤは、ＶＬＰのみの対照から算出した。遮断力価（表９）は、クローン０６Ｆ０５、１１Ｆ０３、および０５Ａ０４はＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰの結合を強く遮断することを示す。クローン０６Ｆ０５は、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰに対する類似した遮断力価を追加的に示した。ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰを認識する能力によりヒトモノクローナル抗体を選択したことから予想され得るように、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰについてのヒトｍＡｂ １４３１についても高い遮断力価が観察された。
【0300】
【表9】
【0301】
マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおける選択されたｍＡｂの評価
[0301] エピトープビニング実験から選択された１０個のｍＡｂ（０２Ａ０４、０４Ｈ０４、０５Ａ０４、０５Ａ０５、０５Ｂ０８、０６Ｆ０５、０８Ａ０８、０８Ｂ０４、１１Ｆ０３、０８Ｃ０９）ならびに２個のヒトｍＡｂ １４３１および１２２７を、異なるノロウイルスＶＬＰを使用するマルチプレックスマイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおいて異なるノロウイルスＶＬＰへの結合についてさらに評価した。
[0301] エピトープビニング実験から選択された１０個のｍＡｂ（０２Ａ０４、０４Ｈ０４、０５Ａ０４、０５Ａ０５、０５Ｂ０８、０６Ｆ０５、０８Ａ０８、０８Ｂ０４、１１Ｆ０３、０８Ｃ０９）ならびに２個のヒトｍＡｂ １４３１および１２２７を、異なるノロウイルスＶＬＰを使用するマルチプレックスマイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおいて異なるノロウイルスＶＬＰへの結合についてさらに評価した。
【0302】
[0302] 実施例２の下で記載されるようにＶＬＰ連結マイクロスフェアを調製した。連結されたマイクロスフェアのストックをアッセイ緩衝剤（１倍ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ ７．４）中３０マイクロスフェア／μＬの最終濃度に希釈することにより作業用マイクロスフェア混合物を調製した。作業用混合物をさらなる使用まで室温で保った。モノクローナル抗体をアッセイ緩衝剤中３７．５μｇ／ｍＬに希釈した。ウェル当たり１２５μＬの希釈されたモノクローナル抗体を黒色平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）の第１の列に加え、ウェル当たり１００μＬのアッセイ緩衝剤を残りのウェルに加えた。２５μＬを列１から列２へなどと移すことによりモノクローナル抗体をプレートの間で段階希釈した。５０μＬ／ウェルのマイクロスフェア作業用混合物をプレートのすべてのウェルに加えた。プレートをホイルシーリングシートで覆い、６００ｒｐｍのプレートシェーカー上、室温で６０分（±５分）間インキュベートした。インキュベーション後に、アッセイプレートを磁気プレートウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｄ．４０００７２）中ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ中の０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ ７．４）で２回洗浄した。プレートを９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｍａｇｎｅｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｄ．３２５１３）中に置き、プレートを覆いながら３０秒間インキュベートした。インキュベーション工程後に、上清を除去した。検出のために、Ｒ－ＰＥ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ検出Ａｂ（重鎖および軽鎖；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－１１６－１４６、ロット番号１４３８６７、０．５ｍｇ／ｍＬ）をアッセイ緩衝剤中に１：１００で希釈し、５秒間ボルテックスすることにより５μｇ／ｍＬの最終作用濃度を達成した。希釈された検出Ａｂ １００μＬを各々のウェルに加えた。プレートをホイルシーリングシートで覆い、６００ｒｐｍのプレートシェーカー上、室温で１時間（±２分）インキュベーションを実行した。アッセイプレートを磁気プレートウォッシャー中ＰＢＳ－Ｔで２回洗浄した。洗浄工程後に、プレートを９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｍａｇｎｅｔ中に置き、プレートを覆いながら３０秒間インキュベートした。インキュベーション工程後に、上清を除去した。マイクロスフェアをウェル当たり１００μＬのアッセイ緩衝剤に再懸濁した。この時点において、ホイルシーリングシートでシールされたプレートの４℃で終夜の貯蔵が可能である。試料リードアウトに先立って、４℃で終夜貯蔵された場合に、プレートを２０分間（±５分）室温に再平衡化させる。マイクロスフェアの完全な再懸濁を可能とするためにプレートを６００ｒｐｍのオービタルシェーカー上に少なくとも５分間置いた。最後に、プレートをマルチプレックス用ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）プレートリーダー（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）中に置いた。使用したプログラムはｘＰＯＮＥＮＴ（登録商標）（Ｂｕｉｌｄ ４．２．１７０５．０）であり、試料体積：５０μＬ／ウェル；プレートプロトコール：９６ウェルプレートフォーマット；およびマイクロスフェアプロトコール：Ｍａｐ、ＢＰ ５０ ｒｅｇｉｏｎｓ、Ｔｙｐｅ ＭａｇＰｌｅｘでセットアップする。マイクロスフェアカウントを５０に設定し、すなわち機器はマイクロスフェアタイプ当たり少なくとも５０個のマイクロスフェア（例えばＧＩＩ．４／コンセンサスに連結された少なくとも５０個のマイクロスフェア）を分析した。
【0303】
[0303] ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を使用してデータを分析およびプロットした。ｍＡｂの結合曲線をＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰについて例示的に示す（図７）。用量応答曲線によるシグモイドフィッティング（Ｓｉｇｍｏｉｄａｌ、４ＰＬ、Ｘ＝Ｌｏｇ（濃度））をメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）の対数変換および補間分析により実行した。非線形回帰のために使用された等式は「ｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．応答－可変勾配」であった。すべての調べたノロウイルスＶＬＰ連結マイクロスフェアと組み合わせて各々のｍＡｂについてＥＣ５０（ｍＡｂの５０％が抗原連結マイクロスフェアに結合する有効濃度）値を算出した（表１０）。
【0304】
【表10】
【0305】
[0304] ＧＩ．１ ＶＬＰ、ＧＩ．２ ＶＬＰ、ＧＩ．３ ＶＬＰ、ＧＩ．４ ＶＬＰ、ＧＩ．５ ＶＬＰ、ＧＩ．６ ＶＬＰ、およびＧＩ．７ ＶＬＰに対してそれぞれ０．００３、０．００２、０．００２、０．００２、０．００１、０．００２、および０．０２１μｇ／ｍＬのＥＣ５０値を提供したヒトｍＡｂ １２２７の例外と共に、遺伝子型群Ｉ（ＧＩ．１、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．４、ＧＩ．５、ＧＩ．６、およびＧＩ．７）の任意のノロウイルスＶＬＰへのｍＡｂの結合が不十分であるかまたは存在しないことに起因してシグモイドフィッティングは可能でなかった。すべてのｍＡｂはＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２ ＶＬＰに対する強い結合を示した。
【0306】
実施例４．２：抗ＧＩＩ．４／ＳｙｄｎｅｙレポーターｍＡｂを使用したシングルプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおけるヒト血清試料の評価
[0305] エピトープビニングから選択された１０個のｍＡｂ（０２Ａ０４、０４Ｈ０４、０５Ａ０４、０５Ａ０５、０５Ｂ０８、０６Ｆ０５、０８Ａ０８、０８Ｂ０４、１１Ｆ０３、０８Ｃ０９）（実施例４．１を参照）を、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰ連結マイクロスフェアを使用したシングルプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおいて異なる商用のヒト血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ カタログ＃ ＨＵＭＡＮＳＲＭ１８０００４１、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）の評価のためにさらに使用した。その文脈におけるシングルプレックスは、ウェル当たり１つのＶＬＰおよび１つのレポーターｍＡｂが応用されることを意味する。血清ドナーは、ノロウイルスに曝露されていてもよい、ワクチン接種を受けていないドナーであった。
[0305] エピトープビニングから選択された１０個のｍＡｂ（０２Ａ０４、０４Ｈ０４、０５Ａ０４、０５Ａ０５、０５Ｂ０８、０６Ｆ０５、０８Ａ０８、０８Ｂ０４、１１Ｆ０３、０８Ｃ０９）（実施例４．１を参照）を、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰ連結マイクロスフェアを使用したシングルプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおいて異なる商用のヒト血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ カタログ＃ ＨＵＭＡＮＳＲＭ１８０００４１、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）の評価のためにさらに使用した。その文脈におけるシングルプレックスは、ウェル当たり１つのＶＬＰおよび１つのレポーターｍＡｂが応用されることを意味する。血清ドナーは、ノロウイルスに曝露されていてもよい、ワクチン接種を受けていないドナーであった。
【0307】
[0306] 遮断力価（表１１）を決定するためにＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰおよび血清の段階希釈液を使用して、実施例４．１「ＰＧＭ遮断アッセイにおける選択されたｍＡｂの評価」の下で記載されるようにＰＧＭ遮断アッセイを用いて血清試料を予備特徴付けした。遮断活性に基づいて、番号７９７を陰性対照として割り当てた。
【0308】
[0307] 実施例１および２の下で記載されるようにＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰ連結マイクロスフェアを調製した。連結されたマイクロスフェアのストックをアッセイ緩衝剤（１倍ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ ７．４）中３０マイクロスフェア／μＬの最終濃度に希釈することによりマイクロスフェア作業用混合物を調製した。作業用混合物をさらなる使用まで氷上で保った。ウェル当たり３０μＬの非希釈ストック血清を黒色平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）の列１に加えた。ウェル当たり１２０μＬのアッセイ緩衝剤を列１中のすべてのウェルに、およびウェル当たり１００μＬを残りのプレートに加えた。５０μＬを行Ａから取り行Ｂに加えるなどにより血清をプレートの下へ１：３で希釈した。最後の５０μＬは廃棄した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の上限およびＶＬＰへのｍＡｂの最大結合を測定するためにアッセイ緩衝剤１００μＬをプレートの最後の列にピペットで加えることにより、血清を含まないモノクローナルのみの対照を含めた。次に、マイクロスフェア作業用混合物５０μＬをプレートのすべてのウェルに加えた。プレートをホイルシーリングシートで覆い、４℃で終夜インキュベートした。血清試料とのインキュベーション後に、マイクロスフェアを磁気プレートウォッシャー中ＰＢＳ－Ｔで２回洗浄した。
【0309】
[0308] ｍＡｂをアッセイ緩衝剤中で０．０５μｇ／ｍＬに希釈した。ウェル当たり１００μＬの希釈されたｍＡｂをすべてのウェルに加えた。追加の混合は行わなかった。プレートをホイルシーリングシートで覆い、６００ｒｐｍのプレートシェーカー上、室温で１時間±５分間インキュベートした。インキュベーション後に、アッセイプレートを磁気プレートウォッシャー中ＰＢＳ－Ｔで２回洗浄した。プレートを９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｍａｇｎｅｔ中に置き、プレートを覆いながら３０秒間インキュベートした。インキュベーション工程後に、上清を除去した。マウスｍＡｂの検出のために、Ｒ－ＰＥ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（重鎖および軽鎖；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－１１６－１４６、ロット番号１４３８６７、０．５ｍｇ／ｍＬ）検出Ａｂを応用した。検出Ａｂをアッセイ緩衝剤中に１：１００で希釈し、５秒間ボルテックスすることにより５μｇ／ｍＬの最終作用濃度を達成した。希釈された検出Ａｂ １００μＬを各々のウェルに加えた。プレートをホイルシーリングシートで覆い、６００ｒｐｍのプレートシェーカー上、室温で１時間（±５分）インキュベーションを実行した。アッセイプレートを磁気プレートウォッシャー中ＰＢＳ－Ｔで２回洗浄した。洗浄工程後に、プレートを９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｍａｇｎｅｔ中に置き、プレートを覆いながら３０秒間インキュベートした。インキュベーション工程後に、上清を除去した。マイクロスフェアをウェル当たり１００μＬのアッセイ緩衝剤に再懸濁した。この時点において、ホイルシーリングシートでシールされたプレートの４℃で終夜の貯蔵が可能であった。試料リードアウトの前に、４℃で終夜貯蔵された場合に、プレートを２０分間（±５分）室温に再平衡化させた。マイクロスフェアの完全な再懸濁を可能とするためにプレートを６００ｒｐｍのオービタルシェーカー上に少なくとも５分間置いた。プレートをマルチプレックス用ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）プレートリーダー（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）中に置いた。５０μＬ／ウェルに設定された試料体積；プレートプロトコール：９６ウェルプレートフォーマット；およびマイクロスフェアプロトコール：Ｍａｐ、ＢＰ ５０ ｒｅｇｉｏｎｓ、Ｔｙｐｅ ＭａｇＰｌｅｘと共にｘＰＯＮＥＮＴ（登録商標）（Ｂｕｉｌｄ ４．２．１７０５．０）プログラムを使用した。マイクロスフェアカウントを５０に設定し、すなわち機器はマイクロスフェアタイプ当たり少なくとも５０個のマイクロスフェアを分析した。
【0310】
[0309] ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用してデータを分析およびプロットした。最初に、モノクローナルのみの対照のすべての値の平均を算出した。すべての血清についてのＭＦＩ値の非線形回帰フィット［Ｓｉｇｍｏｉｄａｌ、４ＰＬ、Ｘ＝Ｌｏｇ（血漿希釈）］を行い、データをモノクローナルのみの対照の値の５０％で補間した。これらの値を表１１において補間力価として報告した。競合曲線をｍＡｂ １１Ｆ０３について例示的に示す（図８）。補間力価は、マイクロスフェアに連結されたノロウイルスＶＬＰへのｍＡｂの結合を遮断する各々の血清の能力の指標となる。抗ノロウイルスＡｂが試料内に存在しないので、血清希釈から独立した高い程度のｍＡｂ結合を指し示す陰性対照血清番号７９７について補間は可能ではなかった。対照的に、アッセイセットアップを検証して、ノロウイルス特異的Ａｂが試料中に存在することが予想されたので、ノロウイルスに予め曝露されたドナーからのヒト血清試料についてより高い力価が予想された。いくつかの試料は、ｍＡｂのすべてまたはほとんどに対して遮断を示し（例えば番号７９９、７９８、および８０２）、複数のタイプの選択的なかつ／または交差反応性の抗体が試料内に存在することを指し示した。
【0311】
【表11】
【0312】
[0310] ＰＧＭ遮断アッセイにおいて決定された遮断力価は、競合的マイクロスフェアイムノアッセイにおいて決定された補間力価と良好に相関し（表１１）、競合的マイクロスフェアイムノアッセイはＰＧＭ遮断アッセイと類似したデータアウトカムを提供することを指し示した。ＰＧＭ遮断アッセイとは対照的に、競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップは、例えば、特定のＶＬＰに限定されず、複数のＶＬＰの並列のスクリーニングを可能にし、それにより試料分析を促進および加速させる。
【0313】
実施例４．３：抗ＧＩ．１および抗ＧＩＩ．４／コンセンサスレポーターｍＡｂを使用したシングルプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおけるヒト血清試料の評価
[0311] 次の工程において、シングルプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイ（実施例４．２）およびそれぞれ１７－１－１または４－１－３と呼称される抗ＧＩ．１または抗ＧＩＩ．４／コンセンサスｍＡｂを使用してＧＩ．１およびＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰへのＡｂの結合について実施例４．２からのヒト血清試料を評価した。標準的な方法を使用して抗ＧＩ．１および抗ＧＩＩ．４／コンセンサスレポーターｍＡｂを製造および試験した（実施例４．１も参照）。その文脈における「シングルプレックス」は、ウェル当たり１つのＶＬＰおよび１つのｍＡｂが応用されることを意味する。補間力価を表１２に示す。２つの血清は抗ＧＩ．１ Ａｂの高い力価を含有すること（番号８０５および８０６）ならびに４つの血清は抗ＧＩＩ．４コンセンサスＡｂの高い力価を含有すること（番号７９０、７９９、７９８、および８０２）がそれぞれ実証された。
[0311] 次の工程において、シングルプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイ（実施例４．２）およびそれぞれ１７－１－１または４－１－３と呼称される抗ＧＩ．１または抗ＧＩＩ．４／コンセンサスｍＡｂを使用してＧＩ．１およびＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰへのＡｂの結合について実施例４．２からのヒト血清試料を評価した。標準的な方法を使用して抗ＧＩ．１および抗ＧＩＩ．４／コンセンサスレポーターｍＡｂを製造および試験した（実施例４．１も参照）。その文脈における「シングルプレックス」は、ウェル当たり１つのＶＬＰおよび１つのｍＡｂが応用されることを意味する。補間力価を表１２に示す。２つの血清は抗ＧＩ．１ Ａｂの高い力価を含有すること（番号８０５および８０６）ならびに４つの血清は抗ＧＩＩ．４コンセンサスＡｂの高い力価を含有すること（番号７９０、７９９、７９８、および８０２）がそれぞれ実証された。
【0314】
【表12】
【0315】
実施例４．４：抗ＧＩ．１および抗ＧＩＩ．４コンセンサスレポーターｍＡｂを使用したデュプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおけるヒト血清試料の評価
[0312] 次の工程において、ヒト血清試料番号７９７（陰性対照、ＮＣ）、８０５、８０６、７９０、および７９９をデュプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイにおいてさらに評価した。その文脈におけるデュプレックスは、マイクロスフェアに連結されたＧＩ．１ ＮｏｒｗａｌｋおよびＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰならびに抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）および抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂの混合物が１つのウェルにおいて応用されたことを意味する。それにより、試料内の抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサスＡｂは１つのウェルにおいて同時に決定され得る。
[0312] 次の工程において、ヒト血清試料番号７９７（陰性対照、ＮＣ）、８０５、８０６、７９０、および７９９をデュプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイにおいてさらに評価した。その文脈におけるデュプレックスは、マイクロスフェアに連結されたＧＩ．１ ＮｏｒｗａｌｋおよびＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰならびに抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）および抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂの混合物が１つのウェルにおいて応用されたことを意味する。それにより、試料内の抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサスＡｂは１つのウェルにおいて同時に決定され得る。
【0316】
[0313] 遮断力価を決定するためにＧＩ．１およびＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰならびに血清の段階希釈液を使用して、実施例４．１「ＰＧＭ遮断アッセイにおける選択されたｍＡｂの評価」の下で記載されるようにＰＧＭ遮断アッセイを用いて、選択された血清を最初に分析した（表１３）。血清試料番号８０５および番号８０６はＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰに対するより高い遮断力価を示した一方、ＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰについて遮断力価はより低かった。さらに、血清試料番号７９０および７９９はＧＩＩ．４コンセンサスＶＬＰに対する高い程度の遮断を示した一方、ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰについて遮断力価を決定することはできなかった。
【0317】
【表13】
【0318】
[0314] マイクロスフェアに連結されたＧＩ．１およびＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰならびに抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）および抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂの混合物をウェル毎に応用したという事実を除いて、実施例４．２においてシングルプレックスアッセイについて記載したようにデュプレックス競合的マイクロスフェアイムノアッセイを実行した。これは、ウェル当たり２５μＬの各々のＶＬＰ作業用混合物（各々６０マイクロスフェア／μＬのＧＩ．１およびＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰ）を加えて、シングルプレックスアッセイにおいて応用されたものと同じウェル当たりの総ＶＬＰ濃度としたことを意味する。さらに、ウェル当たり５０μＬの各々の希釈されたｍＡｂ（各々０．１μｇ／ｍＬの抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサスＡｂ）を応用して、シングルプレックスアッセイにおいて応用されたものと同じウェル当たりのｍＡｂ濃度とした。追加的に、ＧＩ．１またはＧＩＩ．４コンセンサス／ＶＬＰで被覆されたマイクロスフェアおよび抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋ（１７－１－１）ｍＡｂまたは抗ＧＩＩ．４コンセンサス（４－１－３）ｍＡｂのいずれかのみを含有するシングルプレックスアッセイセットアップを比較のために含めた。評価された血清試料についての結合曲線を図９～１１に示し、補間力価を表１４に示す。
【0319】
【表14】
【0320】
[0315] シングルプレックスおよびデュプレックスデータは、異なるノロウイルスＶＬＰを使用するマルチプレックス化を同等に可能にした。さらに、表１４において提示されるシングルプレックスデータは表１２におけるシングルプレックスデータにフィットし、低いアッセイ間変動を強調した。
【0321】
[0316] デュプレックスアッセイセットアップの評価をさらに拡張するために、他のヒト血清試料の別のパネル（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ カタログ＃Ｓ１００２０００４１６８、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）を抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサスＡｂについて評価した（図１２および図１３）。デュプレックスアッセイは、抗ＧＩ．１ Ｎｏｒｗａｌｋおよび抗ＧＩＩ．４コンセンサスＡｂを含有しないかまたは少量でのみ含有する試料（すなわち「欠けている値」、例えば試料ＨＭＮ３４５０８１）、より高い量で両方の抗体タイプを含有する試料（例えば試料ＨＭＮ３４５０９０）、ならびに２つのノロウイルスのうちの１つに対して方向付けられたＡｂを主に含有する試料（例えば試料ＨＭＮ３４５０９５およびＨＭＮ３４５０９９）との間で識別することができることを結果は示した（表１５）。
【0322】
【表15】
【0323】
実施例５：非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップにおけるＢ細胞上清中の抗体力価の決定
[0317] 実施例３による非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップを使用して、Ｂ細胞上清もまた、ノロウイルス反応性抗体の存在について、特に、特定のモノクローナルＡｂの存在について分析され得る。
[0317] 実施例３による非競合的マイクロスフェアイムノアッセイセットアップを使用して、Ｂ細胞上清もまた、ノロウイルス反応性抗体の存在について、特に、特定のモノクローナルＡｂの存在について分析され得る。
【0324】
[0318] 本質的に実施例３の下で記載されるように非競合的マイクロスフェアイムノアッセイを実行した。簡潔に述べれば、Ｂ細胞上清をアッセイ緩衝剤中に希釈し、希釈液１００μＬをアッセイプレート中のマイクロスフェア混合物５０μＬと混合した。Ｂ細胞上清およびマイクロスフェアを、６００ｒｐｍで振盪して室温で９０分間インキュベートした。プレートウォッシャーを使用してプレートを洗浄した。ウェル当たり５０μＬの抗ウサギＩｇＧ－ＰＥ検出抗体を加え、プレートを室温で６０分間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを洗浄し、プレートの測定に先立ってウェル当たり９５μＬのシース液を加えた。
【0325】
[0319] 表１６に列記されるノロウイルスＶＬＰに連結されたマイクロスフェアを使用したマルチプレックス非競合的アッセイセットアップにおいてノロウイルス反応性抗体についてＢ細胞上清をスクリーニングした。ＧＩＩ．２ ＯＨ ＶＬＰで免疫化されたウサギからＢ細胞を誘導した。例えば、Ｂ細胞上清＃１は、ＧＩＩ．２ ＯＨに対する特に高いＭＦＩ値およびすべての他のＶＬＰに対するより低い値を明らかにした。Ｂ細胞上清＃２は、対照的に、ほとんどのＶＬＰについて高いＭＦＩ値を示す。他の上清は、異なる特異性を有する抗体を指し示すＶＬＰについてのＭＦＩ値の異なるパターンを示す。
【0326】
【表16】
【0327】
添付文書：ｍＡｂ １２２７および１４３１ ＤＮＡならびに対応するアミノ酸配列
＃１２２７ ＩｇＨ発現挿入物（配列番号２３＝ｍＡｂ １２２７の可変重鎖のＤＮＡ配列）
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コザック配列－ ＩＬ－２シグナル配列－ ＶＨ－定常領域 ヒトＩｇＧ１ － 終止ＴＧＡ
＃１２２７ ＩｇＫ発現挿入物（配列番号２４＝ｍＡｂ １２２７の可変軽鎖のＤＮＡ配列）
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コザック配列－ ＩＬ－２シグナル配列－ ＶＬ－定常領域 ヒトＩｇＫ － 終止ＴＧＡ
＃１４３１ ＩｇＨ発現挿入物（配列番号２５＝ｍＡｂ １４３１の可変重鎖のＤＮＡ配列）
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コザック配列－ ＩＬ－２シグナル配列－ ＶＨ－定常領域 ヒトＩｇＧ１ － 終止ＴＧＡ
＃１４３１ ＩｇＫ発現挿入物（配列番号２６＝ｍＡｂ １４３１の可変軽鎖のＤＮＡ配列）
ＧＣＣＡＣＣａｔｇｔａｃａｇｇａｔｇｃａａｃｔｃｃｔｇｔｃｔｔｇｃａｔｔｇｃａｃｔａａｇｔｃｔｔｇｃａｃｔｔｇｔｃａｃａａａｃａｇｔＧＡＡＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＣＣＴＣＧＣＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＣＣＧＣＧＣＡＡＴＣＧＧＡＡＴＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣＣＡＴＡＴＣＴＡＡＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＧＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＴＣＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＡＧＧＴＣＧＡＡＡＴＴａａａｃｇａａｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔＴＧＡ
コザック配列－ ＩＬ－２シグナル配列－ ＶＬ－定常領域 ヒトＩｇＫ － 終止ＴＧＡ
＃１２２７ ＩｇＧ１（配列番号２７＝ｍＡｂ １２２７の可変重鎖のアミノ酸配列）
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コザック － ＩＬ２シグナルペプチド － ＶＨ－ 定常領域
＃１２２７ ＩｇＫ（配列番号２８＝ｍＡｂ １２２７の可変軽鎖のアミノ酸配列）
ＡＴＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＤＩＲＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＤＬＬＩＹＧＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＧＮＹＹＣＱＱＳＦＳＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
コザック － ＩＬ２シグナルペプチド － ＶＫ－ 定常領域
＃１４３１ ＩｇＧ１（配列番号２９＝ｍＡｂ １４３１の可変重鎖のアミノ酸配列）
ＡＴＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＮＨＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＧＳＴＧＡＩＨＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＳＬＤＬＱＭＮＳＬＧＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＰＲＰＤＧＴＧＹＡＧＰＳＮＤＹＷＧＱＧＴＬＶＳＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
コザック － ＩＬ２シグナルペプチド － ＶＨ－ 定常領域
＃１４３１ ＩｇＫ（配列番号３０＝ｍＡｂ １４３１の可変軽鎖のアミノ酸配列）
ＡＴＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＥＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＲＳＩＳＩＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＹＲＡＩＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＲＳＳＷＰＡＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
コザック － ＩＬ２シグナルペプチド － ＶＫ－ 定常領域
＃１２２７ ＩｇＨ発現挿入物（配列番号２３＝ｍＡｂ １２２７の可変重鎖のＤＮＡ配列）
ＧＣＣＡＣＣａｔｇｔａｃａｇｇａｔｇｃａａｃｔｃｃｔｇｔｃｔｔｇｃａｔｔｇｃａｃｔａａｇｔｃｔｔｇｃａｃｔｔｇｔｃａｃａａａｃａｇｔＣＡＡＧＴＡＣＡＡＴＴＧＧＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＴＡＣＡＡＣＣＣＧＧＴＧＧＴＴＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＧＣＣＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＴＡＣＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＧＧＧＧＡＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＡＴＧＧＧＴＣＴＣＣＴＣＡＡＴＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＡＡＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＣＧＣＴＴＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣＣＧＡＧＣＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＧＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＧＣＧＣＡＣＴＣＴＣＣＧＣＣＴＴＧＧＣＴＡＴＡＧＴＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＴＡＣＡＧＴＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＣＡｇｃｃｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃａｃｃｃｔｃｃｔｃｃａａｇａｇｃａｃｃｔｃｔｇｇｇｇｇｃａｃａｇｃｇｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｃｇｔｇａａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａａａｇｔｔｇａｇｃｃｃａａａｔｃｔｔｇｔｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｇｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａＴＧＡ
コザック配列－ ＩＬ－２シグナル配列－ ＶＨ－定常領域 ヒトＩｇＧ１ － 終止ＴＧＡ
＃１２２７ ＩｇＫ発現挿入物（配列番号２４＝ｍＡｂ １２２７の可変軽鎖のＤＮＡ配列）
ＧＣＣＡＣＣａｔｇｔａｃａｇｇａｔｇｃａａｃｔｃｃｔｇｔｃｔｔｇｃａｔｔｇｃａｃｔａａｇｔｃｔｔｇｃａｃｔｔｇｔｃａｃａａａｃａｇｔＧＡＴＡＴＡＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＴＣＣＣＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＡＧＴＡＡＣＧＡＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＴＡＡＧＣＴＣＴＴＡＣＣＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＡＧＧＣＴＣＣＣＧＡＣＣＴＣＣＴＴＡＴＡＴＡＣＧＧＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴＣＡＧＴＣＣＧＧＣＧＴＣＣＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＴＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＣＧＧＡＣＴＴＴＡＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＣＧＣＣＧＡＧＡＡＣＡＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＧＴＡＣＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＴＧＡａａｃｇａａｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔＴＧＡ
コザック配列－ ＩＬ－２シグナル配列－ ＶＬ－定常領域 ヒトＩｇＫ － 終止ＴＧＡ
＃１４３１ ＩｇＨ発現挿入物（配列番号２５＝ｍＡｂ １４３１の可変重鎖のＤＮＡ配列）
ＧＣＣＡＣＣａｔｇｔａｃａｇｇａｔｇｃａａｃｔｃｃｔｇｔｃｔｔｇｃａｔｔｇｃａｃｔａａｇｔｃｔｔｇｃａｃｔｔｇｔｃａｃａａａｃａｇｔＣＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＧＴＣＡＣＴＴＡＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＧＧＴＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＧＴＡＡＴＣＡＣＧＧＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＡＴＡＴＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＡＧＧＣＧＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡＣＧＣＴＡＡＣＴＣＡＧＴＡＡＡＡＧＧＧＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＡＣＧＧＴＡＣＧＧＧＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＡＡＣＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＴＧＡＧＴＡＧＣｇｃｃｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃａｃｃｃｔｃｃｔｃｃａａｇａｇｃａｃｃｔｃｔｇｇｇｇｇｃａｃａｇｃｇｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｃｇｔｇａａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａａａｇｔｔｇａｇｃｃｃａａａｔｃｔｔｇｔｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｇｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａＴＧＡ
コザック配列－ ＩＬ－２シグナル配列－ ＶＨ－定常領域 ヒトＩｇＧ１ － 終止ＴＧＡ
＃１４３１ ＩｇＫ発現挿入物（配列番号２６＝ｍＡｂ １４３１の可変軽鎖のＤＮＡ配列）
ＧＣＣＡＣＣａｔｇｔａｃａｇｇａｔｇｃａａｃｔｃｃｔｇｔｃｔｔｇｃａｔｔｇｃａｃｔａａｇｔｃｔｔｇｃａｃｔｔｇｔｃａｃａａａｃａｇｔＧＡＡＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＣＣＴＣＧＣＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＣＣＧＣＧＣＡＡＴＣＧＧＡＡＴＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣＣＡＴＡＴＣＴＡＡＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＧＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＴＣＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＡＧＧＴＣＧＡＡＡＴＴａａａｃｇａａｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔＴＧＡ
コザック配列－ ＩＬ－２シグナル配列－ ＶＬ－定常領域 ヒトＩｇＫ － 終止ＴＧＡ
＃１２２７ ＩｇＧ１（配列番号２７＝ｍＡｂ １２２７の可変重鎖のアミノ酸配列）
ＡＴＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＭＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＮＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＧＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＳＳＭＮＴＬＹＬＱＭＳＮＬＲＡＧＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＫＴＲＴＬＲＬＧＹＳＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
コザック － ＩＬ２シグナルペプチド － ＶＨ－ 定常領域
＃１２２７ ＩｇＫ（配列番号２８＝ｍＡｂ １２２７の可変軽鎖のアミノ酸配列）
ＡＴＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＤＩＲＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＤＬＬＩＹＧＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＧＮＹＹＣＱＱＳＦＳＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
コザック － ＩＬ２シグナルペプチド － ＶＫ－ 定常領域
＃１４３１ ＩｇＧ１（配列番号２９＝ｍＡｂ １４３１の可変重鎖のアミノ酸配列）
ＡＴＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＮＨＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＧＳＴＧＡＩＨＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＳＬＤＬＱＭＮＳＬＧＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＰＲＰＤＧＴＧＹＡＧＰＳＮＤＹＷＧＱＧＴＬＶＳＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
コザック － ＩＬ２シグナルペプチド － ＶＨ－ 定常領域
＃１４３１ ＩｇＫ（配列番号３０＝ｍＡｂ １４３１の可変軽鎖のアミノ酸配列）
ＡＴＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＥＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＲＳＩＳＩＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＹＲＡＩＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＲＳＳＷＰＡＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
コザック － ＩＬ２シグナルペプチド － ＶＫ－ 定常領域
【0328】
結論
[0320] 要約すると、複数のノロウイルスＶＬＰを用いた非競合的および競合的マイクロスフェアイムノアッセイのセットアップに成功した。多数の異なるヒト血清試料内のＡｂレベルを評価した場合の堅牢な性能が実証された。
[0320] 要約すると、複数のノロウイルスＶＬＰを用いた非競合的および競合的マイクロスフェアイムノアッセイのセットアップに成功した。多数の異なるヒト血清試料内のＡｂレベルを評価した場合の堅牢な性能が実証された。
【0329】
[0321] 非競合的マイクロスフェアイムノアッセイは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭレベルの決定を含む、対象の免疫状態の迅速な特徴付けを可能にした。例えばＰＧＭアッセイにおいて決定されるようなノロウイルス遮断特性および／またはヒト腸管エンテロイド（ＨＩＥ）中和アッセイ（Ａｔｍａｒら、２０１９、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏ－Ｂｌｏｏｄ Ｇｒｏｕｐ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｊ．ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）において決定されるようなノロウイルス中和特性を示す競合的セットアップにおけるｍＡｂの応用により、血清試料中のノロウイルス遮断および／またはノロウイルス中和活性を有する抗体は、信頼できる、相対的に高いスループットの、費用効果の高い（低い試料体積）、迅速な仕方で調べられ得る。マイクロスフェアイムノアッセイはｍＡｂおよび／またはＶＬＰのみを使用するので、それらは細胞ベースアッセイの複雑性およびスループット限度を克服する。
【0330】
[0322] 本出願において開発されたアッセイセットアップは、ワクチン接種後のヒト患者からの試料を含む、試料の迅速な分析のための扉を開く。このアッセイは、ＰＧＭアッセイにおいて使用され得ない任意のノロウイルスＶＬＰまで応用範囲を拡張するので、ＰＧＭ遮断アッセイの制限を克服する。追加的に、それは、この時点において、ほとんどのノロウイルス株について応用可能でない、細胞ベース中和アッセイの代替物を提供する。さらに、ＰＧＭアッセイおよび細胞ベース中和アッセイの両方は高価であり、臨床的なスループットのために好適でない。対照的に、マルチプレックス化の潜在能力を有する開発されたノロウイルスマイクロスフェアイムノアッセイは、信頼できる、迅速で費用効果の高い仕方において、任意の種類のノロウイルスに対する任意の種類の起源（例えばヒトまたはマウス）からの任意の種類の試料（例えば血清、血漿、尿）内の抗体を決定することができる。したがって、ハイスループットの潜在能力を有する本出願において開発されたアッセイセットアップは、例えばワクチン接種または感染後の、臨床試料の試験のための魅力的な方法である。
【0331】
本開示の番号付けされた実施形態
[0323] Ｉ．マイクロスフェア複合体
ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）に連結されたマイクロスフェアを含むマイクロスフェア複合体。
１．前記ノロウイルスＶＬＰが、メジャーなウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１および任意選択によりマイナーなウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２を含む、項目１のマイクロスフェア複合体。
２．前記メジャーなウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１が、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６または配列番号７または配列番号８または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１または配列番号１２または配列番号１３または配列番号１４または配列番号１５または配列番号１６または配列番号１７または配列番号１８または配列番号１９または配列番号２０または配列番号２１または配列番号２２に対して、少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％同一である、項目２のマイクロスフェア複合体。
３．前記ノロウイルスＶＬＰが、ＧＩ．１ ＶＬＰ、ＧＩ．２ ＶＬＰ、ＧＩ．３ ＶＬＰ、ＧＩ．４ ＶＬＰ、ＧＩ．５ ＶＬＰ、ＧＩ．６ ＶＬＰ、ＧＩ．７ ＶＬＰ、ＧＩＩ．１ ＶＬＰ、ＧＩＩ．２ ＶＬＰ、ＧＩＩ．３ ＶＬＰ、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰ、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰ、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ ＶＬＰ、ＧＩＩ．４／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ ＶＬＰ、ＧＩＩ．４／Ｄｅｎ Ｈａａｇ ＶＬＰ、ＧＩＩ．４／Ｈｏｕｓｔｏｎ ＶＬＰ、ＧＩＩ．６ ＶＬＰ、ＧＩＩ．７ ＶＬＰ、ＧＩＩ．１２ ＶＬＰ、ＧＩＩ．１７／１９７８ ＶＬＰ、ＧＩＩ．１７／２０１４ ＶＬＰ、およびＧＩＩ．１７／２０１５ ＶＬＰからなる群から選択される、項目１または２のマイクロスフェア複合体。
４．前記マイクロスフェアがポリスチレンマイクロスフェアである、項目１～４のいずれか１つのマイクロスフェア複合体。
５．前記マイクロスフェアが磁性である、項目１～５のいずれか１つのマイクロスフェア複合体。
６．前記マイクロスフェアが、約０．０１～約１００μｍの範囲内、好ましくは約１～１０μｍの範囲内の直径を有する、項目１～６のいずれか１つのマイクロスフェア複合体。
７．前記マイクロスフェアが、マイクロスフェア表面にカルボキシレート基を含有する、項目１～７のいずれか１つのマイクロスフェア複合体。
８．前記ノロウイルスＶＬＰへの前記マイクロスフェアの連結が、前記マイクロスフェアのカルボキシレート基と前記ノロウイルスＶＬＰのアミン基との間のアミド結合の形成により起こる、項目８のマイクロスフェア複合体。
９．前記マイクロスフェアが、検出可能な標識を含む、項目１～９のいずれか１つのマイクロスフェア複合体。
１０．前記検出可能な標識が少なくとも１つの蛍光色素である、項目１０のマイクロスフェア複合体。
１１．前記少なくとも１つの蛍光色素が、スクアライン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、およびこれらの任意の誘導体からなる群から選択される、項目１１のマイクロスフェア複合体。
１２．前記マイクロスフェアが、光源で照射したときに、前記少なくとも１つの蛍光色素の放出シグナルにより同定され得る、項目１１または１２のマイクロスフェア複合体。
[0323] Ｉ．マイクロスフェア複合体
ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）に連結されたマイクロスフェアを含むマイクロスフェア複合体。
１．前記ノロウイルスＶＬＰが、メジャーなウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１および任意選択によりマイナーなウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２を含む、項目１のマイクロスフェア複合体。
２．前記メジャーなウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１が、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６または配列番号７または配列番号８または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１または配列番号１２または配列番号１３または配列番号１４または配列番号１５または配列番号１６または配列番号１７または配列番号１８または配列番号１９または配列番号２０または配列番号２１または配列番号２２に対して、少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％同一である、項目２のマイクロスフェア複合体。
３．前記ノロウイルスＶＬＰが、ＧＩ．１ ＶＬＰ、ＧＩ．２ ＶＬＰ、ＧＩ．３ ＶＬＰ、ＧＩ．４ ＶＬＰ、ＧＩ．５ ＶＬＰ、ＧＩ．６ ＶＬＰ、ＧＩ．７ ＶＬＰ、ＧＩＩ．１ ＶＬＰ、ＧＩＩ．２ ＶＬＰ、ＧＩＩ．３ ＶＬＰ、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰ、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰ、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ ＶＬＰ、ＧＩＩ．４／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ ＶＬＰ、ＧＩＩ．４／Ｄｅｎ Ｈａａｇ ＶＬＰ、ＧＩＩ．４／Ｈｏｕｓｔｏｎ ＶＬＰ、ＧＩＩ．６ ＶＬＰ、ＧＩＩ．７ ＶＬＰ、ＧＩＩ．１２ ＶＬＰ、ＧＩＩ．１７／１９７８ ＶＬＰ、ＧＩＩ．１７／２０１４ ＶＬＰ、およびＧＩＩ．１７／２０１５ ＶＬＰからなる群から選択される、項目１または２のマイクロスフェア複合体。
４．前記マイクロスフェアがポリスチレンマイクロスフェアである、項目１～４のいずれか１つのマイクロスフェア複合体。
５．前記マイクロスフェアが磁性である、項目１～５のいずれか１つのマイクロスフェア複合体。
６．前記マイクロスフェアが、約０．０１～約１００μｍの範囲内、好ましくは約１～１０μｍの範囲内の直径を有する、項目１～６のいずれか１つのマイクロスフェア複合体。
７．前記マイクロスフェアが、マイクロスフェア表面にカルボキシレート基を含有する、項目１～７のいずれか１つのマイクロスフェア複合体。
８．前記ノロウイルスＶＬＰへの前記マイクロスフェアの連結が、前記マイクロスフェアのカルボキシレート基と前記ノロウイルスＶＬＰのアミン基との間のアミド結合の形成により起こる、項目８のマイクロスフェア複合体。
９．前記マイクロスフェアが、検出可能な標識を含む、項目１～９のいずれか１つのマイクロスフェア複合体。
１０．前記検出可能な標識が少なくとも１つの蛍光色素である、項目１０のマイクロスフェア複合体。
１１．前記少なくとも１つの蛍光色素が、スクアライン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、およびこれらの任意の誘導体からなる群から選択される、項目１１のマイクロスフェア複合体。
１２．前記マイクロスフェアが、光源で照射したときに、前記少なくとも１つの蛍光色素の放出シグナルにより同定され得る、項目１１または１２のマイクロスフェア複合体。
【0332】
[0324] ＩＩ．キット
所定量の少なくとも１つの項目１～１３のいずれか１つのマイクロスフェア複合体および任意選択により所定量の検出抗体を含むキット。
１３．
－ 所定量の少なくとも１つの項目１～１３のいずれか１つのマイクロスフェア複合体、および
－ 所定量の、前記少なくとも１つのマイクロスフェア複合体の前記ノロウイルスＶＬＰに結合する少なくとも１つのレポーター抗体
を含むキット。
１４．前記少なくとも１つのレポーター抗体がノロウイルス中和抗体である、項目１５に記載のキット。
１５．前記少なくとも１つのレポーター抗体がノロウイルス遮断抗体である、項目１５または１６に記載のキット。
１６．前記少なくとも１つのレポーター抗体がモノクローナル抗体である、項目１５～１７のいずれか１つに記載のキット。
１７．前記少なくとも１つのレポーター抗体が非ヒト起源に由来する、項目１５～１８のいずれか１つに記載のキット。
１８．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、前記少なくとも１つのレポーター抗体の重鎖定常領域により、検出可能な標識に取り付けられている、項目１５～１９のいずれか１つに記載のキット。
１９．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、前記少なくとも１つのレポーター抗体の前記重鎖定常領域により、前記検出可能な標識に間接的に取り付けられており、前記レポーター抗体が、検出可能な標識に直接的に取り付けられた二次レポーター抗体と反応する、項目２０のキット。
２０．前記二次レポーター抗体が、前記二次レポーター抗体の重鎖定常領域により、前記検出可能な標識に直接的に取り付けられている、項目２１のキット。
２１．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、前記少なくとも１つのレポーター抗体の前記重鎖定常領域により、前記検出可能な標識に直接的に取り付けられている、項目２０のキット。
２２．前記検出可能な標識が蛍光標識である、項目２０～２３のいずれかのキット。
２３．前記蛍光標識が、キサンテン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、シアニン、クマリン、およびこれらの任意の誘導体からなる群から選択される、項目２４のキット。
２４．前記検出可能な標識がフィコエリトリンである、項目２５のキット。
２５．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、０．５μｇ／ｍＬ未満、または０．４μｇ／ｍＬ未満または０．３μｇ／ｍＬ未満または０．２μｇ／ｍＬ未満または０．１５μｇ／ｍＬ未満または０．１μｇ／ｍＬ未満または０．０９μｇ／ｍＬ未満または０．０８μｇ／ｍＬ未満または０．０７μｇ／ｍＬ未満または０．０５μｇ／ｍＬ未満または０．０３μｇ／ｍＬ未満または０．０２μｇ／ｍＬ未満または０．０１μｇ／ｍＬ未満の、前記少なくとも１つのマイクロスフェア複合体の前記ノロウイルスＶＬＰに対するＥＣ５０値を提供する、項目１５～２６のいずれか１つに記載のキット。
２６．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、
配列番号２７により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号２８により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、項目１５～２７のいずれか１つに記載のキット。
２７．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、
配列番号２９により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号３０により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、項目１５～２７のいずれか１つに記載のキット。
２８．所定量の２つの項目１～１３のいずれか１つに記載のマイクロスフェア複合体および所定量の２つのレポーター抗体を含み、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、項目１５～２７のいずれか１つに記載のキット。
２９．前記第１または前記第２のレポーター抗体が、
配列番号２７により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号２８により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；
または
配列番号２９により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号３０により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、項目３０に記載のキット。
３０．前記第１のノロウイルスＶＬＰがＧＩ．１ ＶＬＰであり、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子がＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰである、項目３０に記載のキット。
３１．前記第２のレポーター抗体が、
配列番号２９により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号３０により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含み；
任意選択により、前記第１のレポーター抗体が、
配列番号２７により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号２８により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、項目３２に記載のキット。
３２．所定量の１つの項目１～１３のいずれか１つに記載のマイクロスフェア複合体、および所定量の１つの、前記マイクロスフェア複合体の前記ノロウイルスＶＬＰに結合するレポーター抗体を含む、項目１５～２９のいずれか１つに記載のキット。
所定量の少なくとも１つの項目１～１３のいずれか１つのマイクロスフェア複合体および任意選択により所定量の検出抗体を含むキット。
１３．
－ 所定量の少なくとも１つの項目１～１３のいずれか１つのマイクロスフェア複合体、および
－ 所定量の、前記少なくとも１つのマイクロスフェア複合体の前記ノロウイルスＶＬＰに結合する少なくとも１つのレポーター抗体
を含むキット。
１４．前記少なくとも１つのレポーター抗体がノロウイルス中和抗体である、項目１５に記載のキット。
１５．前記少なくとも１つのレポーター抗体がノロウイルス遮断抗体である、項目１５または１６に記載のキット。
１６．前記少なくとも１つのレポーター抗体がモノクローナル抗体である、項目１５～１７のいずれか１つに記載のキット。
１７．前記少なくとも１つのレポーター抗体が非ヒト起源に由来する、項目１５～１８のいずれか１つに記載のキット。
１８．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、前記少なくとも１つのレポーター抗体の重鎖定常領域により、検出可能な標識に取り付けられている、項目１５～１９のいずれか１つに記載のキット。
１９．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、前記少なくとも１つのレポーター抗体の前記重鎖定常領域により、前記検出可能な標識に間接的に取り付けられており、前記レポーター抗体が、検出可能な標識に直接的に取り付けられた二次レポーター抗体と反応する、項目２０のキット。
２０．前記二次レポーター抗体が、前記二次レポーター抗体の重鎖定常領域により、前記検出可能な標識に直接的に取り付けられている、項目２１のキット。
２１．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、前記少なくとも１つのレポーター抗体の前記重鎖定常領域により、前記検出可能な標識に直接的に取り付けられている、項目２０のキット。
２２．前記検出可能な標識が蛍光標識である、項目２０～２３のいずれかのキット。
２３．前記蛍光標識が、キサンテン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、シアニン、クマリン、およびこれらの任意の誘導体からなる群から選択される、項目２４のキット。
２４．前記検出可能な標識がフィコエリトリンである、項目２５のキット。
２５．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、０．５μｇ／ｍＬ未満、または０．４μｇ／ｍＬ未満または０．３μｇ／ｍＬ未満または０．２μｇ／ｍＬ未満または０．１５μｇ／ｍＬ未満または０．１μｇ／ｍＬ未満または０．０９μｇ／ｍＬ未満または０．０８μｇ／ｍＬ未満または０．０７μｇ／ｍＬ未満または０．０５μｇ／ｍＬ未満または０．０３μｇ／ｍＬ未満または０．０２μｇ／ｍＬ未満または０．０１μｇ／ｍＬ未満の、前記少なくとも１つのマイクロスフェア複合体の前記ノロウイルスＶＬＰに対するＥＣ５０値を提供する、項目１５～２６のいずれか１つに記載のキット。
２６．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、
配列番号２７により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号２８により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、項目１５～２７のいずれか１つに記載のキット。
２７．前記少なくとも１つのレポーター抗体が、
配列番号２９により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号３０により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、項目１５～２７のいずれか１つに記載のキット。
２８．所定量の２つの項目１～１３のいずれか１つに記載のマイクロスフェア複合体および所定量の２つのレポーター抗体を含み、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、項目１５～２７のいずれか１つに記載のキット。
２９．前記第１または前記第２のレポーター抗体が、
配列番号２７により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号２８により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列；
または
配列番号２９により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号３０により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、項目３０に記載のキット。
３０．前記第１のノロウイルスＶＬＰがＧＩ．１ ＶＬＰであり、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子がＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰである、項目３０に記載のキット。
３１．前記第２のレポーター抗体が、
配列番号２９により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号３０により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含み；
任意選択により、前記第１のレポーター抗体が、
配列番号２７により表される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および
配列番号２８により表される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列
を含む、項目３２に記載のキット。
３２．所定量の１つの項目１～１３のいずれか１つに記載のマイクロスフェア複合体、および所定量の１つの、前記マイクロスフェア複合体の前記ノロウイルスＶＬＰに結合するレポーター抗体を含む、項目１５～２９のいずれか１つに記載のキット。
【0333】
[0325] ＩＩＩ．総Ｉｇレベルを検出する方法（非競合的アッセイセットアップ）
ＩＩＩ．１ シングルプレックスアッセイセットアップ
３３．対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる検出抗体からのシグナルを検出する方法であって、
工程１：所定量の項目１～１３のいずれか１つに記載のマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）に、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１における前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記ノロウイルス反応性抗体と接触させて、前記ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、前記検出抗体を結合させる工程であって、前記検出抗体が、前記検出抗体の可変領域を用いて前記ノロウイルス反応性抗体に結合し、前記検出抗体が、検出可能な標識に取り付けられている、工程、および
工程３：工程２における前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体からのシグナルを検出する工程
を含む、方法。
３４．以下のさらなる工程：
工程４：工程３の前記シグナルから前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定された前記検出抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する項目３５に記載の方法。
ＩＩＩ．２ マルチプレックスアッセイセットアップ
３５．対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる検出抗体からのシグナルを検出する方法であって、
工程１：所定量の少なくとも２つの項目１～１３のいずれか１つに記載のマイクロスフェア複合体を、前記試料と接触させて、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なる、工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１における前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合した前記ノロウイルス反応性抗体と接触させて、前記ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、前記検出抗体を結合させる工程であって、前記検出抗体が、前記検出抗体の可変領域を用いて前記ノロウイルス反応性抗体に結合し、前記検出抗体が、第３の検出可能な標識に取り付けられている、工程、
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体からのシグナルを検出する工程、
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程、ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記検出抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、方法。
３６．以下のさらなる工程：
工程６：工程５の前記要約されたシグナルから前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定された前記検出抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する項目３７に記載の方法。
３７．工程１において、所定量の少なくとも５個または少なくとも１０個または少なくとも１５個または少なくとも２０個のマイクロスフェア複合体が前記試料と接触させられる、項目３７または３８の方法。
３８．工程１において、所定量の、ＧＩ．１ ＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含む第１のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．２ ＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含む第２のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．３ ＶＬＰに連結された第３のマイクロスフェアを含む第３のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．４ ＶＬＰに連結された第４のマイクロスフェアを含む第４のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．５ ＶＬＰに連結された第５のマイクロスフェアを含む第５のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．６ ＶＬＰに連結された第６のマイクロスフェアを含む第６のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．７ ＶＬＰに連結された第７のマイクロスフェアを含む第７のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１ ＶＬＰに連結された第８のマイクロスフェアを含む第８のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．２ ＶＬＰに連結された第９のマイクロスフェアを含む第９のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．３ ＶＬＰに連結された第１０のマイクロスフェアを含む第１０のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰに連結された第１１のマイクロスフェアを含む第１１のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰに連結された第１２のマイクロスフェアを含む第１２のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ ＶＬＰに連結された第１３のマイクロスフェアを含む第１３のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ ＶＬＰに連結された第１４のマイクロスフェアを含む第１４のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｄｅｎ Ｈａａｇ ＶＬＰに連結された第１５のマイクロスフェアを含む第１５のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．６ ＶＬＰに連結された第１６のマイクロスフェアを含む第１６のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．７ ＶＬＰに連結された第１７のマイクロスフェアを含む第１７のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１２ ＶＬＰに連結された第１８のマイクロスフェアを含む第１８のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１７／１９７８ ＶＬＰに連結された第１９のマイクロスフェアを含む第１９のマイクロスフェア複合体、および所定量の、ＧＩＩ．１７／２０１５ ＶＬＰに連結された第２０のマイクロスフェアを含む第２０のマイクロスフェア複合体が前記試料と接触させられる、項目３７～３９のいずれか１つの方法。
３９．前記検出抗体が、前記検出抗体の重鎖定常領域により、前記検出可能な標識に直接的に取り付けられている、項目３５～４０のいずれか１つに記載の方法。
４０．前記検出抗体が取り付けられた前記検出可能な標識が蛍光標識である、項目３５～４１のいずれか１つに記載の方法。
４１．前記蛍光標識が、キサンテン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、シアニン、クマリン、およびこれらの任意の誘導体からなる群から選択される、項目４２の方法。
４２．前記蛍光標識がフィコエリトリンである、項目４３の方法。
４３．工程３における前記検出抗体からの前記シグナルが、前記検出抗体が取り付けられた前記検出可能な標識の結果としてもたらされる、項目３５～４４のいずれか１つに記載の方法。
４４．工程１における接触が約１～約２４時間実行される、項目３５～４５のいずれか１つに記載の方法。
４５．工程１における接触が約９０分間実行される、項目４６に記載の方法。
４６．工程１における接触が、約１８～約２４時間、好ましくは約２１時間、実行される、項目４６に記載の方法。
４７．工程１における接触が約２～約３０℃の温度で実行される、項目３５～４８のいずれか１つに記載の方法。
４８．工程１における接触が約２２℃の温度で実行される、項目４９に記載の方法。
４９．工程１における接触が約２～約８℃の温度で実行される、項目４９に記載の方法。
５０．工程２における接触が、約３０～約９０分間、好ましくは約６０分間、実行される、項目３５～５１のいずれか１つに記載の方法。
５１．前記検出抗体が非ヒト起源に由来する、項目３５～５２のいずれか１つに記載の方法。
５２．前記検出抗体が、アイソタイプＡからの抗体（ＩｇＡ）に結合し、他のアイソタイプからの抗体に結合しない、項目３５～５３のいずれか１つに記載の方法。
５３．前記検出抗体が、アイソタイプＧからの抗体（ＩｇＧ）に結合し、他のアイソタイプからの抗体に結合しない、項目３５～５３のいずれか１つに記載の方法。
５４．前記検出抗体が、アイソタイプＭからの抗体（ＩｇＭ）に結合し、他のアイソタイプからの抗体に結合しない、項目３５～５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．前記検出抗体が、アイソタイプＡ、Ｇ、およびＭからの抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に結合する、項目３５～５３のいずれか１つに記載の方法。
ＩＩＩ．１ シングルプレックスアッセイセットアップ
３３．対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる検出抗体からのシグナルを検出する方法であって、
工程１：所定量の項目１～１３のいずれか１つに記載のマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）に、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１における前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記ノロウイルス反応性抗体と接触させて、前記ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、前記検出抗体を結合させる工程であって、前記検出抗体が、前記検出抗体の可変領域を用いて前記ノロウイルス反応性抗体に結合し、前記検出抗体が、検出可能な標識に取り付けられている、工程、および
工程３：工程２における前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体からのシグナルを検出する工程
を含む、方法。
３４．以下のさらなる工程：
工程４：工程３の前記シグナルから前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定された前記検出抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する項目３５に記載の方法。
ＩＩＩ．２ マルチプレックスアッセイセットアップ
３５．対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる検出抗体からのシグナルを検出する方法であって、
工程１：所定量の少なくとも２つの項目１～１３のいずれか１つに記載のマイクロスフェア複合体を、前記試料と接触させて、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なる、工程、
工程２：所定量の検出抗体を、工程１における前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合した前記ノロウイルス反応性抗体と接触させて、前記ノロウイルス反応性抗体の重鎖定常領域に、前記検出抗体を結合させる工程であって、前記検出抗体が、前記検出抗体の可変領域を用いて前記ノロウイルス反応性抗体に結合し、前記検出抗体が、第３の検出可能な標識に取り付けられている、工程、
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体からのシグナルを検出する工程、
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程、ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記検出抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、方法。
３６．以下のさらなる工程：
工程６：工程５の前記要約されたシグナルから前記ノロウイルス反応性抗体に結合した前記検出抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定された前記検出抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する項目３７に記載の方法。
３７．工程１において、所定量の少なくとも５個または少なくとも１０個または少なくとも１５個または少なくとも２０個のマイクロスフェア複合体が前記試料と接触させられる、項目３７または３８の方法。
３８．工程１において、所定量の、ＧＩ．１ ＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含む第１のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．２ ＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含む第２のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．３ ＶＬＰに連結された第３のマイクロスフェアを含む第３のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．４ ＶＬＰに連結された第４のマイクロスフェアを含む第４のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．５ ＶＬＰに連結された第５のマイクロスフェアを含む第５のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．６ ＶＬＰに連結された第６のマイクロスフェアを含む第６のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩ．７ ＶＬＰに連結された第７のマイクロスフェアを含む第７のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１ ＶＬＰに連結された第８のマイクロスフェアを含む第８のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．２ ＶＬＰに連結された第９のマイクロスフェアを含む第９のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．３ ＶＬＰに連結された第１０のマイクロスフェアを含む第１０のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰに連結された第１１のマイクロスフェアを含む第１１のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰに連結された第１２のマイクロスフェアを含む第１２のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ ＶＬＰに連結された第１３のマイクロスフェアを含む第１３のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｙｅｒｓｅｋｅ ＶＬＰに連結された第１４のマイクロスフェアを含む第１４のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．４／Ｄｅｎ Ｈａａｇ ＶＬＰに連結された第１５のマイクロスフェアを含む第１５のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．６ ＶＬＰに連結された第１６のマイクロスフェアを含む第１６のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．７ ＶＬＰに連結された第１７のマイクロスフェアを含む第１７のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１２ ＶＬＰに連結された第１８のマイクロスフェアを含む第１８のマイクロスフェア複合体、所定量の、ＧＩＩ．１７／１９７８ ＶＬＰに連結された第１９のマイクロスフェアを含む第１９のマイクロスフェア複合体、および所定量の、ＧＩＩ．１７／２０１５ ＶＬＰに連結された第２０のマイクロスフェアを含む第２０のマイクロスフェア複合体が前記試料と接触させられる、項目３７～３９のいずれか１つの方法。
３９．前記検出抗体が、前記検出抗体の重鎖定常領域により、前記検出可能な標識に直接的に取り付けられている、項目３５～４０のいずれか１つに記載の方法。
４０．前記検出抗体が取り付けられた前記検出可能な標識が蛍光標識である、項目３５～４１のいずれか１つに記載の方法。
４１．前記蛍光標識が、キサンテン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、シアニン、クマリン、およびこれらの任意の誘導体からなる群から選択される、項目４２の方法。
４２．前記蛍光標識がフィコエリトリンである、項目４３の方法。
４３．工程３における前記検出抗体からの前記シグナルが、前記検出抗体が取り付けられた前記検出可能な標識の結果としてもたらされる、項目３５～４４のいずれか１つに記載の方法。
４４．工程１における接触が約１～約２４時間実行される、項目３５～４５のいずれか１つに記載の方法。
４５．工程１における接触が約９０分間実行される、項目４６に記載の方法。
４６．工程１における接触が、約１８～約２４時間、好ましくは約２１時間、実行される、項目４６に記載の方法。
４７．工程１における接触が約２～約３０℃の温度で実行される、項目３５～４８のいずれか１つに記載の方法。
４８．工程１における接触が約２２℃の温度で実行される、項目４９に記載の方法。
４９．工程１における接触が約２～約８℃の温度で実行される、項目４９に記載の方法。
５０．工程２における接触が、約３０～約９０分間、好ましくは約６０分間、実行される、項目３５～５１のいずれか１つに記載の方法。
５１．前記検出抗体が非ヒト起源に由来する、項目３５～５２のいずれか１つに記載の方法。
５２．前記検出抗体が、アイソタイプＡからの抗体（ＩｇＡ）に結合し、他のアイソタイプからの抗体に結合しない、項目３５～５３のいずれか１つに記載の方法。
５３．前記検出抗体が、アイソタイプＧからの抗体（ＩｇＧ）に結合し、他のアイソタイプからの抗体に結合しない、項目３５～５３のいずれか１つに記載の方法。
５４．前記検出抗体が、アイソタイプＭからの抗体（ＩｇＭ）に結合し、他のアイソタイプからの抗体に結合しない、項目３５～５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．前記検出抗体が、アイソタイプＡ、Ｇ、およびＭからの抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に結合する、項目３５～５３のいずれか１つに記載の方法。
【0334】
[0326] ＩＶ．特異的Ｉｇレベルを決定する方法（競合的アッセイセットアップ）
ＩＶ．１ シングルプレックスアッセイセットアップ
５６．対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となるレポーター抗体からのシグナルを検出する方法であって、
工程１：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を含む、項目３４に記載のキットを用意する工程、
工程２：前記所定量の前記マイクロスフェア複合体および前記所定量の前記レポーター抗体を前記試料と接触させて、前記レポーター抗体と競合しながら、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２における前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含む、方法。
５７．工程２において、前記所定量の前記マイクロスフェア複合体および前記所定量の前記レポーター抗体が前記試料と随伴的に接触させられる、項目５８に記載の方法。
５８．工程１：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を含む、項目３４に記載のキットを用意する工程、
工程２．１：工程１の前記所定量の前記マイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２．２：前記所定量の前記レポーター抗体を工程２．１の前記マイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記レポーター抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２．２における前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含む、項目５８に記載の方法。
５９．工程１：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を含む、項目３４に記載のキットを用意する工程、
工程２．１：工程１の前記所定量の前記マイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２．２：前記所定量の前記レポーター抗体を工程２．１の前記マイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記レポーター抗体を結合させる工程、
工程２．３：工程２．２の前記所定量の前記レポーター抗体、前記所定量の前記マイクロスフェア複合体、および前記試料を所定量の二次レポーター抗体と接触させて、前記レポーター抗体の定常領域に、前記二次レポーター抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２．３における前記レポーター抗体に結合した前記二次レポーター抗体からのシグナルを検出する工程であって、前記レポーター抗体が工程２．２において前記ノロウイルスＶＬＰに結合している、工程
を含む、項目５８に記載の方法。
６０．以下のさらなる工程：
工程４：工程３の前記シグナルから前記レポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定された前記レポーター抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する項目５８～６１のいずれか１つに記載の方法。
６１．前記ノロウイルスＶＬＰがＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰである、項目５８～６２のいずれか１つに記載の方法。
ＩＶ．２マルチプレックスアッセイセットアップ
６２．対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となるレポーター抗体からのシグナルを検出する方法であって、
工程１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を含む、項目１５～３３のいずれか１つに記載のキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２：前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記少なくとも２つのレポーター抗体と競合しながら、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記レポーター抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、方法。
６３．工程２において、前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および前記所定量の前記少なくとも２つのレポーター抗体が前記試料と随伴的に接触させられる、項目６４に記載の方法。
６４．工程１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を含む、項目１５～３３のいずれか１つに記載のキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２．１：前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程２．２：前記所定量の前記少なくとも２つのレポーター抗体を工程２．１の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記少なくとも２つのレポーター抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２．２における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記レポーター抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、項目６４の方法。
６５．工程１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を含む、項目１５～３３のいずれか１つに記載のキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２．１：前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程２．２：前記所定量の前記少なくとも２つのレポーター抗体を工程２．１の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記少なくとも２つのレポーター抗体を結合させる工程；
工程２．３：工程２．２の前記所定量の前記少なくとも２つのレポーター抗体、前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および前記試料を所定量の二次レポーター抗体と接触させて、前記少なくとも２つのレポーター抗体の定常領域に、前記二次レポーター抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２．３における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体に結合した前記二次レポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記二次レポーター抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、項目６４の方法。
６６．以下のさらなる工程：
工程６：工程５の前記要約されたシグナルから前記レポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定された前記レポーター抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、項目６４～６７に記載の方法。
６７．工程１における前記キットが、所定量の２つのマイクロスフェア複合体および所定量の２つのレポーター抗体を提供する、項目６４～６８のいずれか１つに記載の方法。
６８．前記第１のマイクロスフェア複合体が、ＧＩ．１ ＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、前記第２のマイクロスフェア複合体が、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含む、項目６９の方法。
６９．工程３における前記シグナルが、前記レポーター抗体が取り付けられた前記検出可能な標識の結果としてもたらされる、項目５８～７０のいずれか１つに記載の方法。
７０．工程２．１における接触が約５～約２３時間実行される、項目６０～６３および６６～７１のいずれか１つに記載の方法。
７１．工程２．１における接触が、約８～約２１時間、好ましくは約１６時間、実行される、項目７２に記載の方法。
７２．工程２．１における接触が約２～約３０℃の温度で実行される、項目７２または７３に記載の方法。
７３．工程２．１における接触が約４℃の温度で実行される、項目７４に記載の方法。
７４．工程２．２における接触が、約１０～約９０分間、好ましくは約６０分間、実行される、項目６０～６３および６６～７５のいずれか１つに記載の方法。
７５．工程２．２における接触が約２２℃で実行される、項目７６に記載の方法。
７６．工程２．３における接触が、約１０～約９０分間、好ましくは約６０分間、実行される、項目６１～６３および６７～７７のいずれか１つに記載の方法。
７７．工程２．３における接触が約２２℃で実行される、項目７８に記載の方法。
ＩＶ．１ シングルプレックスアッセイセットアップ
５６．対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となるレポーター抗体からのシグナルを検出する方法であって、
工程１：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を含む、項目３４に記載のキットを用意する工程、
工程２：前記所定量の前記マイクロスフェア複合体および前記所定量の前記レポーター抗体を前記試料と接触させて、前記レポーター抗体と競合しながら、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２における前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含む、方法。
５７．工程２において、前記所定量の前記マイクロスフェア複合体および前記所定量の前記レポーター抗体が前記試料と随伴的に接触させられる、項目５８に記載の方法。
５８．工程１：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を含む、項目３４に記載のキットを用意する工程、
工程２．１：工程１の前記所定量の前記マイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２．２：前記所定量の前記レポーター抗体を工程２．１の前記マイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記レポーター抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２．２における前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程
を含む、項目５８に記載の方法。
５９．工程１：所定量のマイクロスフェア複合体および所定量のレポーター抗体を含む、項目３４に記載のキットを用意する工程、
工程２．１：工程１の前記所定量の前記マイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記試料中のノロウイルス反応性抗体を結合させる工程、
工程２．２：前記所定量の前記レポーター抗体を工程２．１の前記マイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェア複合体中の前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記レポーター抗体を結合させる工程、
工程２．３：工程２．２の前記所定量の前記レポーター抗体、前記所定量の前記マイクロスフェア複合体、および前記試料を所定量の二次レポーター抗体と接触させて、前記レポーター抗体の定常領域に、前記二次レポーター抗体を結合させる工程、ならびに
工程３：工程２．３における前記レポーター抗体に結合した前記二次レポーター抗体からのシグナルを検出する工程であって、前記レポーター抗体が工程２．２において前記ノロウイルスＶＬＰに結合している、工程
を含む、項目５８に記載の方法。
６０．以下のさらなる工程：
工程４：工程３の前記シグナルから前記レポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程５：工程４において決定された前記レポーター抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する項目５８～６１のいずれか１つに記載の方法。
６１．前記ノロウイルスＶＬＰがＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ＶＬＰである、項目５８～６２のいずれか１つに記載の方法。
ＩＶ．２マルチプレックスアッセイセットアップ
６２．対象からの試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となるレポーター抗体からのシグナルを検出する方法であって、
工程１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を含む、項目１５～３３のいずれか１つに記載のキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２：前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記少なくとも２つのレポーター抗体と競合しながら、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記レポーター抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、方法。
６３．工程２において、前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および前記所定量の前記少なくとも２つのレポーター抗体が前記試料と随伴的に接触させられる、項目６４に記載の方法。
６４．工程１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を含む、項目１５～３３のいずれか１つに記載のキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２．１：前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程２．２：前記所定量の前記少なくとも２つのレポーター抗体を工程２．１の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記少なくとも２つのレポーター抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２．２における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記レポーター抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、項目６４の方法。
６５．工程１：所定量の少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および所定量の少なくとも２つのレポーター抗体を含む、項目１５～３３のいずれか１つに記載のキットを用意する工程であって、
第１のマイクロスフェア複合体が、第１のノロウイルスＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、第２のマイクロスフェア複合体が、第２のノロウイルスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含み、
前記第１のマイクロスフェアが第１の検出可能な標識を含み、前記第２のマイクロスフェアが第２の検出可能な標識を含み、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルが前記第２の検出可能な標識の放出シグナルとは異なり、
第１のレポーター抗体が、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第２のノロウイルスウイルス様粒子に結合せず、
第２のレポーター抗体が、前記第２のノロウイルスＶＬＰに結合し、前記第１のノロウイルスＶＬＰに結合しない、工程；
工程２．１：前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体を前記試料と接触させて、前記第１および／または前記第２のノロウイルスＶＬＰに、前記試料中の前記ノロウイルス反応性抗体を結合させる工程；
工程２．２：前記所定量の前記少なくとも２つのレポーター抗体を工程２．１の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および前記試料と接触させて、前記マイクロスフェアに連結された前記ノロウイルスＶＬＰに、前記少なくとも２つのレポーター抗体を結合させる工程；
工程２．３：工程２．２の前記所定量の前記少なくとも２つのレポーター抗体、前記所定量の前記少なくとも２つのマイクロスフェア複合体および前記試料を所定量の二次レポーター抗体と接触させて、前記少なくとも２つのレポーター抗体の定常領域に、前記二次レポーター抗体を結合させる工程；
工程３：第１の光源で照射したときに、少なくとも１つのマイクロスフェアの前記検出可能な標識の放出シグナルを検出し、前記放出シグナルを、前記第１の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、さらに、前記第２の検出可能な標識の放出シグナルと比較し、それにより、前記少なくとも１つのマイクロスフェアおよび前記少なくとも１つのマイクロスフェアが連結された前記ノロウイルスＶＬＰを同定し、
同時に、第２の光源で照射したときに、工程２．３における前記少なくとも１つのマイクロスフェアの前記ノロウイルスＶＬＰに結合した前記レポーター抗体に結合した前記二次レポーター抗体からのシグナルを検出する工程；
工程４：同じノロウイルスＶＬＰに連結された少なくとも３０個のマイクロスフェアが同定されるまで工程３を繰り返す工程；ならびに
工程５：同じノロウイルスＶＬＰに連結されたすべての同定されたマイクロスフェアについての工程３における前記二次レポーター抗体からの前記検出されたシグナルを要約する工程であって、前記要約されたシグナルが、前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量の指標となる、工程
を含む、項目６４の方法。
６６．以下のさらなる工程：
工程６：工程５の前記要約されたシグナルから前記レポーター抗体の存在および／または量を決定する工程、ならびに
工程７：工程６において決定された前記レポーター抗体の存在および／または量から前記試料中のノロウイルス反応性抗体の存在および／または量を決定する工程
を含む、項目６４～６７に記載の方法。
６７．工程１における前記キットが、所定量の２つのマイクロスフェア複合体および所定量の２つのレポーター抗体を提供する、項目６４～６８のいずれか１つに記載の方法。
６８．前記第１のマイクロスフェア複合体が、ＧＩ．１ ＶＬＰに連結された第１のマイクロスフェアを含み、前記第２のマイクロスフェア複合体が、ＧＩＩ．４／コンセンサスＶＬＰに連結された第２のマイクロスフェアを含む、項目６９の方法。
６９．工程３における前記シグナルが、前記レポーター抗体が取り付けられた前記検出可能な標識の結果としてもたらされる、項目５８～７０のいずれか１つに記載の方法。
７０．工程２．１における接触が約５～約２３時間実行される、項目６０～６３および６６～７１のいずれか１つに記載の方法。
７１．工程２．１における接触が、約８～約２１時間、好ましくは約１６時間、実行される、項目７２に記載の方法。
７２．工程２．１における接触が約２～約３０℃の温度で実行される、項目７２または７３に記載の方法。
７３．工程２．１における接触が約４℃の温度で実行される、項目７４に記載の方法。
７４．工程２．２における接触が、約１０～約９０分間、好ましくは約６０分間、実行される、項目６０～６３および６６～７５のいずれか１つに記載の方法。
７５．工程２．２における接触が約２２℃で実行される、項目７６に記載の方法。
７６．工程２．３における接触が、約１０～約９０分間、好ましくは約６０分間、実行される、項目６１～６３および６７～７７のいずれか１つに記載の方法。
７７．工程２．３における接触が約２２℃で実行される、項目７８に記載の方法。
【0335】
[0327] Ｖ．診断方法
対象においてノロウイルス感染を診断する方法であって、
工程１：前記対象の身体の外側に前記対象からの試料を用意する工程、
工程２：項目３５～７９のいずれか１つに記載の試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：ノロウイルス反応性抗体の前記量を、ノロウイルスに感染した対象におけるノロウイルス反応性抗体の確立された量と比較することにより、感染を決定する工程
を含む、方法。
７８．前記対象が、少なくとも２つの異なるノロウイルスにより感染されている、項目８０に記載の方法。
７９．前記ノロウイルス感染が急性または回復期である、項目８０または８１に記載の方法。
対象においてノロウイルス感染を診断する方法であって、
工程１：前記対象の身体の外側に前記対象からの試料を用意する工程、
工程２：項目３５～７９のいずれか１つに記載の試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：ノロウイルス反応性抗体の前記量を、ノロウイルスに感染した対象におけるノロウイルス反応性抗体の確立された量と比較することにより、感染を決定する工程
を含む、方法。
７８．前記対象が、少なくとも２つの異なるノロウイルスにより感染されている、項目８０に記載の方法。
７９．前記ノロウイルス感染が急性または回復期である、項目８０または８１に記載の方法。
【0336】
[0328] ＶＩ．保護を決定する方法
ノロウイルス感染からの対象の保護を決定する方法であって、
工程１：前記対象の身体の外側に前記対象からの試料を用意する工程、
工程２：項目３５～７９のいずれか１つに記載の試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：工程２におけるノロウイルス反応性抗体の前記量をノロウイルス反応性抗体の保護的な量と比較することにより保護を決定する工程
を含む、方法。
８０．前記対象がノロウイルスワクチンでワクチン接種される、項目８３に記載の方法。
８１．前記ノロウイルス反応性抗体がノロウイルス中和抗体である、項目８３または８４の方法。
ノロウイルス感染からの対象の保護を決定する方法であって、
工程１：前記対象の身体の外側に前記対象からの試料を用意する工程、
工程２：項目３５～７９のいずれか１つに記載の試料中のノロウイルス反応性抗体の量を決定する工程、および
工程３：工程２におけるノロウイルス反応性抗体の前記量をノロウイルス反応性抗体の保護的な量と比較することにより保護を決定する工程
を含む、方法。
８０．前記対象がノロウイルスワクチンでワクチン接種される、項目８３に記載の方法。
８１．前記ノロウイルス反応性抗体がノロウイルス中和抗体である、項目８３または８４の方法。
【0337】
[0329] ＶＩＩ．対象および試料の仕様
前記試料が、血液、尿、唾液、脳脊髄液、およびリンパ液からなる群から選択される、項目３５～８５のいずれか１つに記載の方法。
８２．前記試料が血清または血漿試料である、項目８６に記載の方法。
８３．前記試料が熱不活性化される、項目８６または８７に記載の方法。
８４．前記対象が哺乳動物であり、好ましくは、前記哺乳動物が、マウス、霊長動物、非ヒト霊長動物、ヒト、ウサギ、ネコ、ラット、ウマ、およびヒツジからなる群から選択される、項目３５～８８のいずれか１つに記載の方法。
８５．前記対象がヒトである、項目８９に記載の方法。
８６．前記対象が２か月齢までの新生児または小児であり、小児が２か月齢～５歳である、項目９０に記載の方法。
前記試料が、血液、尿、唾液、脳脊髄液、およびリンパ液からなる群から選択される、項目３５～８５のいずれか１つに記載の方法。
８２．前記試料が血清または血漿試料である、項目８６に記載の方法。
８３．前記試料が熱不活性化される、項目８６または８７に記載の方法。
８４．前記対象が哺乳動物であり、好ましくは、前記哺乳動物が、マウス、霊長動物、非ヒト霊長動物、ヒト、ウサギ、ネコ、ラット、ウマ、およびヒツジからなる群から選択される、項目３５～８８のいずれか１つに記載の方法。
８５．前記対象がヒトである、項目８９に記載の方法。
８６．前記対象が２か月齢までの新生児または小児であり、小児が２か月齢～５歳である、項目９０に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】