特表 2024-538751 優れた適応免疫細胞の集団を促進することによる養子細胞移入の増強

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-23

(54)【発明の名称】優れた適応免疫細胞の集団を促進することによる養子細胞移入の増強

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/078 20100101AFI20241016BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20241016BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241016BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20241016BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241016BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20241016BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20241016BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20241016BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241016BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20241016BHJP

   C07K 14/725 20060101ALN20241016BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20241016BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241016BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20241016BHJP

【ＦＩ】

C12N5/078

A61K35/17 ZNA

A61P35/00

A61P31/00

A61P29/00

A61P37/02

C12N5/0781

C12N5/0783

C12N5/10

C07K14/705

C07K14/725

C07K19/00

C12N15/12

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024521318

(86)(22)【出願日】2022-10-06

(85)【翻訳文提出日】2024-05-21

(86)【国際出願番号】 US2022077721

(87)【国際公開番号】W WO2023060212

(87)【国際公開日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】63/253,058

(32)【優先日】2021-10-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524131903

【氏名又は名称】セルヴィエ インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ドゥマウティオズ，ニナ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065CA24

4B065CA44

4C087AA01

4C087BB43

4C087BB64

4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB11

4C087ZB26

4C087ZB33

4C087ZB35

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045FA74

(57)【要約】

【解決手段】
本開示は、ミトコンドリア増強免疫細胞、それらの組成物および治療的使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト免疫細胞などの免疫細胞であって、
単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていない免疫細胞、例えば、免疫細胞と比較して、（ｉ）適応免疫細胞の生存率を増強する、（ｉｉ）前記適応免疫細胞の選択を促進する、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを行うのに有効な量の単離された生存可能なミトコンドリアで処置される、免疫細胞。

【請求項2】

ヒト免疫細胞などの免疫細胞であって、
外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含まない免疫細胞、例えば、ヒト適応免疫細胞と比較して、（ｉ）適応免疫細胞の生存率を増強する、（ｉｉ）前記適応免疫細胞の選択を促進する、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを行うのに有効な量の、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアなどの外因性のミトコンドリアを含む、免疫細胞。

【請求項3】

前記免疫細胞が、Ｂ細胞またはＴ細胞などのリンパ球、好ましくはＣＤ８免疫Ｔ細胞またはＣＤ４免疫Ｔ細胞などのＴ細胞である、請求項１または２に記載の免疫細胞。

【請求項4】

前記免疫細胞が、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）もしくは人工Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）サブユニット、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の免疫細胞。

【請求項5】

前記免疫細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで産生される、請求項１または２に記載の免疫細胞。

【請求項6】

前記適応免疫細胞が、ヒトメモリーＴ細胞などのメモリーＴ細胞である、請求項１または２に記載の適応免疫細胞。

【請求項7】

前記適応免疫細胞が、エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞またはエフェクターＣＤ４ Ｔ細胞などのエフェクター細胞、好ましくはヒトエフェクターＣＤ４ Ｔ細胞またはヒトエフェクターＣＤ８ Ｔ細胞である、請求項１または２に記載の適応免疫細胞。

【請求項8】

前記適応免疫細胞が、幹細胞様メモリー細胞、またはＣＤ８メモリー様細胞などのメモリー様細胞である、請求項１または２に記載の適応免疫細胞。

【請求項9】

前記適応免疫細胞がナイーブ細胞である、請求項１または２に記載の適応免疫細胞。

【請求項10】

前記適応免疫細胞が組織常在性メモリー細胞（Ｔｒｍ細胞）である、請求項１または２に記載の適応免疫細胞。

【請求項11】

前記適応免疫細胞がメモリーＣＤ８ Ｔ細胞である、請求項１、２、または６のいずれか一項に記載の適応免疫細胞。

【請求項12】

前記適応免疫細胞が、エフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項１、２、６、または１１のいずれか一項に記載の適応免疫細胞。

【請求項13】

前記適応免疫細胞が、Ｔｒｅｇ ＣＤ４ Ｔ細胞などの制御性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞である、請求項１または２に記載の適応免疫細胞。

【請求項14】

ヒト免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞などの、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫細胞を含む集団。

【請求項15】

前記ミトコンドリアが真核細胞ミトコンドリアに由来する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の免疫細胞。

【請求項16】

前記ミトコンドリアがヒト細胞株に由来する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の免疫細胞。

【請求項17】

前記ミトコンドリアが健常ボランティアに由来する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫細胞。

【請求項18】

前記ミトコンドリアが、がん患者などの患者に由来する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の免疫細胞。

【請求項19】

前記ミトコンドリアが、自己免疫疾患に罹患している患者などの患者に由来する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の免疫細胞。

【請求項20】

前記ミトコンドリアが、自己または同種異系である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の免疫細胞。

【請求項21】

前記ミトコンドリアが、遺伝子操作されたミトコンドリア、またはリポソームによって封入されたミトコンドリアもしくは特定の薬剤に結合されたミトコンドリアである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の免疫細胞。

【請求項22】

前記ミトコンドリアの有効量が、０．０００１ｎｇ～２．５ｎｇ、例えば０．００１ｎｇ～２．０ｎｇである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の免疫細胞。

【請求項23】

請求項１～２２のいずれか一項に記載の免疫細胞、例えば適応免疫細胞、または前記免疫細胞の集団と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、を含む組成物。

【請求項24】

前記薬学的に許容される担体が、ヒト免疫細胞への送達用に製剤化される、請求項２２に記載の組成物。

【請求項25】

前記組成物が、固形状または液体状で製剤化される、請求項２３または２４に記載の組成物。

【請求項26】

（ｉ）請求項１～２５のいずれか一項に記載の免疫細胞の生存率を増強する、（ｉｉ）前記免疫細胞の選択の促進する、またはそれらの組み合わせを行う方法であって、前記方法が、
（ａ）適応細胞（Ｔ細胞など）活性化を駆動することができる特異的活性化受容体アゴニスト抗体を含む無細胞培地中、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記免疫細胞を活性化する工程と、
（ｂ）前記免疫細胞を、単離された生存可能なミトコンドリアを含む医薬組成物に少なくとも５日間など、少なくとも３日間曝露する工程と
を含む、方法。

【請求項27】

（ｉ）請求項１～２６のいずれか一項に記載の免疫細胞の生存率を増強する、（ｉｉ）前記免疫細胞の選択を促進する、またはそれらの組み合わせを行う方法であって、前記方法が、
（ａ）任意選択で、ＩＬ－２などの組換えインターロイキンの存在下で、コーティングされたＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを有する無細胞培地中、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記免疫細胞を活性化する工程と、
（ｂ）前記免疫細胞を、単離された生存可能なミトコンドリアを含む医薬組成物に、少なくとも５日間など、少なくとも３日間曝露する工程と
を含む、方法。

【請求項28】

必要とする対象を処置する方法における使用のための、請求項１～２７のいずれか一項に記載の免疫細胞、例えばヒトＴ細胞などのヒト免疫細胞であって、前記方法が、前記対象に、請求項１～２７のいずれか一項に記載の免疫細胞または前記免疫細胞の集団を投与する工程を含む、免疫細胞。

【請求項29】

がん、感染性、炎症性、または自己免疫疾患を処置する方法における使用のための、請求項１～２８のいずれか一項に記載の免疫細胞、例えば、ヒトＴ細胞などのヒト免疫細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年１０月６日に出願された米国仮出願第６３／２５３，０５８号の利益を主張し、この文献は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0002】

分野
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的には、がん、感染症、および自己免疫疾患の治療に有用な方法に関する。具体的に、本発明は、限定されないが、ミトコンドリア増強適応免疫細胞（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）などのミトコンドリア増強免疫細胞を使用する治療的処置に関する。本発明は、がん、感染症、および自己免疫疾患の処置に使用するためのミトコンドリア増強免疫細胞に関する。具体的に、本発明の免疫細胞は、限定されないが、Ｔ免疫細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖したＴ細胞などの免疫細胞である。より具体的には、本発明の免疫細胞は、限定されないが、血液中を循環するＣＤ８免疫細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、操作されたＴ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、血液中を循環するＣＤ４免疫細胞、免疫抑制制御性Ｔ細胞（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ）（Ｔｒｅｇ細胞）、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、アルファ－ベータ Ｔ細胞（αβ Ｔ細胞）、およびガンマ－デルタ Ｔ細胞（γδ Ｔ細胞）などの免疫細胞である。ミトコンドリア増強免疫細胞は、改善された持続性、より高い生存率、および／または分化能（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ）を有する。より具体的には、本発明は、改善された持続性、より高い生存能力、および／またはより高い分化能を有するミトコンドリア増強メモリーＴ細胞（例えば、外因性ミトコンドリアを移植されたメモリーＴ細胞）に関する。本発明のミトコンドリア増強メモリーＴ細胞は、例えば、混合集団（ｂｕｌｋ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）中の高度に持続性のある細胞の割合の増強に起因して、養子細胞移入療法（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ）（ＡＣＴ）における有効性の増加を示す。本発明はさらに、自己免疫疾患および移植された臓器または組織拒絶反応の処置のための改善された生存能力、および／またはより高い分化能を有する、ミトコンドリア増強免疫抑制制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（例えば、外因性ミトコンドリアを移植されたＴｒｅｇ ＣＤ４ Ｔ細胞）を提供する。本発明は、ミトコンドリア増強免疫細胞を含む医薬組成物に関する。本発明は、改善された持続性、より高い生存能力、および／またはより高い分化能を有する、特定の分化段階でより高い割合の免疫Ｔ細胞またはより高い割合の免疫Ｔ細胞の生成をもたらす細胞技術の有効性の増大に関する。

【背景技術】

【0003】

がんおよび自己免疫は、共通の起源を共有するが、反対方向に働く強力な力を発揮する。両疾患は、身体の免疫系の不全に起因する。がんは多くの場合、免疫系が欠損細胞および／または形質転換細胞を認識および／または攻撃する役割を果たせず、該細胞が分裂および増殖することを可能にしてしまったために、発症する。逆に、自己免疫、つまり、大腸炎およびループスなどの疾患をもたらす免疫応答の不全（ｆａｕｌｔｙ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、免疫系が誤って健常細胞を攻撃した場合に起こる。心臓、脳、神経、筋肉、結合組織、皮膚、眼、肺、腎臓、消化管、血球、および血管を含む、身体のほとんどの部分が、免疫系によって標的化され得る。

【0004】

がんは先進国における主要な死因のひとつであり、米国では２０２１年に１９０万人が新たにがんと診断され、６０万８５７０人ががんにより死亡したと推定されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｃａｎｃｅｒ－ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｃａｎｃｅｒ－ｆａｃｔｓ－ａｎｄ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ／ａｎｎｕａｌ－ｃａｎｃｅｒ－ｆａｃｔｓ－ａｎｄ－ｆｉｇｕｒｅｓ／２０２１／ｃａｎｃｅｒ－ｆａｃｔｓ－ａｎｄ－ｆｉｇｕｒｅｓ－２０２１．ｐｄｆ）。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、がんは、世界中で主要な死因であり、２０２０年には約１，０００万人が死亡したとされる（Ｆｅｒｌａｙ Ｊ，Ｅｒｖｉｋ Ｍ，Ｌａｍ Ｆ，Ｃｏｌｏｍｂｅｔ Ｍ，Ｍｅｒｙ Ｌ，Ｐｉｎｅｒｏｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｏｂｓｅｒｖａｔｏｒｙ：Ｃａｎｃｅｒ Ｔｏｄａｙ．Ｌｙｏｎ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ；２０２０（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｃｏ．ｉａｒｃ．ｆｒ／ｔｏｄａｙ，ａｃｃｅｓｓｅｄ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０２１）。（がんの新規症例の観点から）２０２０年に最も多いがん罹患数は、乳がん（２２６万件）、肺がん（２２１万件）、結腸がんおよび直腸がん（１９３万件）、前立腺がん（１４１万件）、皮膚がん（非黒色腫）（１２０万件）、ならびに胃がん（１０９万件）であった。２０２０年に最も多いがんの死因は、肺（１８０万人）、結腸および直腸（９３５万人）、肝臓（８３万人）、胃（７６９万人）、および乳房（６８５万人）であった。

【0005】

がんは、突然変異を獲得した欠陥細胞に起因し、これは正常な細胞周期チェックポイントを回避させる。経時的に、突然変異した細胞の過剰増殖は、様々な細胞型から構成される異種腫瘍塊（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ｍａｓｓ）を作り出す。運動能や浸潤能、がん細胞の生存に有利なように環境を調節する能力など、転移の特徴を獲得すると、がん細胞は体内で広がり、元の腫瘍床から離れた遠隔転移を起こし得る。

【0006】

免疫細胞は、がん細胞および病原体を検出、制御、および根絶するための重要な役割を果たす。Ｔリンパ球の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＨＣ）分子上に提示される抗原性ペプチドフラグメントを認識する。急性感染症の間、侵入病原体に対して特異的なナイーブＴ細胞は、ＭＨＣ／抗原提示の状況においてそれらのＴＣＲを介して活性化され、クローン的に増殖し（ｃｌｏｎａｌｌｙ ｅｘｐａｎｄｅｄ）、エフェクター細胞を生じさせる。直接的な殺傷（ｄｉｒｅｃｔ ｋｉｌｌｉｎｇ）を通じて、エフェクター細胞は、感染細胞の体内からの除去を媒介する。病原体クリアランス時に、引き起こされた免疫応答は収縮し（ｔｈｅ ｍｏｕｎｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｏｎｔｒａｃｔｓ）、活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞の大部分のアポトーシスをもたらす。抗原特異的Ｔ細胞の一部はさらに分化して、個体に長期保護を提供するメモリーＴ細胞プールを生成する（図１）。注目すべきことに、メモリー細胞は、遭遇した病原体による再感染時に、増強された持続性、自己複製能、および効率的なリコール能などの異なる特徴を有する。同一の病原体による２回目の感染の場合では、メモリー細胞により誘発され、引き起こされた免疫応答は、ナイーブＴ細胞と比較して、より速く、より強く生じる（Ｖａｎｊａ Ｌａｚａｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，“Ｔ－ｂｅｔ：ａ ｂｒｉｄｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ｎｏｖ；１３（１１）：７７７－７８９）。

【0007】

興味深いことに、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞、およびメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の代謝は異なることが示されている。ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞は静止しており、それらのエネルギー需要を供給するために酸化的リン酸化（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）（ＯＸＰＨＯＳ）にほとんど依存している。活性化されると、エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞は解糖を優先し、それらのエフェクター機能およびクローン的増殖を維持する。実際、グルコース分子の分解は、それらの高い増殖度の要件を満たすために重要なビルディングブロックの生成に関与する。他方、メモリーＣＤ８ Ｔ細胞は、ＯＸＰＨＯＳおよび脂肪酸酸化（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）（ＦＡＯ）に依存する。メモリー細胞はナイーブＴ細胞よりも多くのミトコンドリア質量を有することが示された。メモリー細胞がＡＴＰ産生を維持するためにミトコンドリアに依存することは、メモリー細胞に生体エネルギー的な利点をもたらす。実際、メモリーＣＤ８ Ｔ細胞は、呼吸予備能（ｔｈｅ ｓｐａｒｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃａｐａｃｉｔｙ）（ＳＲＣ）として測定される呼吸予備力（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｅｒｖｅ）の増強を示す（Ｇｅｒｒｉｔｊｅ Ｊ．Ｗ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１２ Ｊａｎｕａｒｙ ２７；３６（１）：６８－７８；Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ Ｏ．Ｒａｎｇｅｌ Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８ Ｍａｒｃｈ ２０２１ ｜ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２１．６４５２４２）。

【0008】

メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の異なるサブセットは、相補的な役割または局在化を有する。
とりわけ、幹細胞様メモリー、エフェクターメモリー、セントラルメモリー、および組織常在性メモリーを強調することができる。幹細胞様メモリーＴ細胞およびセントラルメモリーＴ細胞の両方は、接着を媒介し、かつ二次リンパ組織へのホーミングを可能にするＬ－セレクチンであるＣＤ６２Ｌを発現する。リンパ節（ＬＮ）に入るこの特異な能力は、その表面に様々な抗原を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の最適化されたスクリーニング、およびセントラルメモリー細胞によって誘導される強力なリコール応答をもたらす。エフェクターメモリーＴ細胞は、血流への循環が制限されており、遭遇した病原体による再感染時に直接的な細胞傷害機能およびエフェクター機能を示す。逆に、組織常在性メモリー細胞は循環せず、代わりに皮膚、肺、および腸などの末梢組織に局在化し、多様な進入部位で病原体を効率的に遮断する。

【0009】

免疫系は、自己に耐性があり、かつ自己に対して反応しないように教育されており、その結果、がん細胞は、侵入する病原体と同じ強度で検出されない可能性がある。がん患者において、Ｔ細胞は通常、（ｉ）抗原性が乏しいため、（ｉｉ）形質転換細胞が表現型的に異物でないため、（ｉｉｉ）がんにしばしば関連する全般的な免疫抑制状態のため、同系遺伝子形質転換細胞に対して乏しいか全く応答しない（Ｍｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，“Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｍｏｕｎｔｉｎｇ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ”，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ １：６６－７５）。

【0010】

興味深いことに、チェックポイント遮断療法による特定の免疫抑制機構の標的化は、がんに対して引き起こされる免疫応答を増強する。さらに、がん細胞と浸潤免疫細胞との間の腫瘍部位において代謝競合（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）が存在し得る。解糖へのがん細胞の高い依存度がしばしば観察され、腫瘍内環境（ｉｎｔｒａ－ｔｕｍｏｒａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）からの１つの燃料源であるグルコースの減少につながる。エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞において解糖に関与することができないことは、それらのエフェクター機能および殺傷能力に劇的な負の影響を有する。

【0011】

Ｔ細胞ベースの免疫療法は、がん患者の免疫系を使用して、それ自体の腫瘍塊を標的化する。免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの腫瘍から直接抽出されるか、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの血液から直接抽出される。正しい抗腫瘍特異性を有するＴＩＬは、細胞培養法および有効な殺傷能力によって選択することができる。血液から抽出されたＣＤ８ Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などによって、腫瘍反応性を獲得するように修飾することができる。ＴＩＬまたはＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者に再注入される前に強力な増殖を促進する、高用量のＩＬ－２の存在下など、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養され、これは養子細胞移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＡＣＴ）と呼ばれる方法である（Ｒｏｈａａｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｗｉｌｇｅｎｈｏｆ，Ｓ．＆Ｈａａｎｅｎ，Ｊ．Ｂ．Ａ．Ｇ．，“Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｌａｎｄｓｃａｐｅ”，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ ４７４，４４９－４６１（２０１９）。ＡＣＴの１つの利点は、化学療法、放射線療法、および手術などの従来の療法と比較してその高い特異性にある。さらに、黒色腫および肺がんなど、いくつかのがんにおいて、自己ＴＩＬを有するＡＣＴは、患者を処置するための最も効率的な方法を表す。従来の化学療法で処置された進行性黒色腫患者は、１０％の全生存率を示す一方、ＡＣＴ後、全生存率は４１％に増加する（Ｌａｒｋｉｎ，Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．“Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｗｈｏ Ｒｅｃｅｉｖｅｄ Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ Ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ’ｓ Ｃｈｏｉｃｅ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ＣｈｅｃｋＭａｔｅ ０３７：Ａ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，Ｏｐｅｎ－Ｌａｂｅｌ Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ Ｔｒｉａｌ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．３６，４（２０１８）：３８３－３９０．ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１６．７１．８０２３；Ｄａｆｎｉ，Ｕ ｅｔ ａｌ．“Ｅｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｃｏｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｅｌａｎｏｍａ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．”Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．３０，１２（２０１９）：１９０２－１９１３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｚ３９８）。同様に、ＣＤ１９発現を標的化するＣＡＲ療法は、再発Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ｒｅｌａｐｓｅｄ Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（Ｂ－ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（Ｂ－ＣＬＬ）、および非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ）（ＮＨＬ）に罹患した小児および成人において一貫して高い抗腫瘍効力を示し、完全寛解の割合は、異なる臨床試験において７０～９４％の範囲である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １０：５３；Ｍｏｒｏｔｔｉ，Ｍ．，Ａｌｂｕｋｈａｒｉ，Ａ．，Ａｌｓａａｄｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｍｉｓｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｕｒｓ”，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １２４，１７５９－１７７６（２０２１））。ＡＣＴは、がん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全を含む多種多様な疾患を処置するためのその可能性をまだ実現していない。にもかかわらず、ＡＣＴ療法に関し、克服すべき障害は残ったままである。腫瘍浸潤Ｔ細胞を全く示さないか、または非常に少ない量の腫瘍浸潤Ｔ細胞を示す患者は、この療法から恩恵を得られないであろう。腫瘍は、「熱い（ｈｏｔ）」腫瘍、すなわち、Ｔ細胞浸潤のレベルが上昇した腫瘍、および「冷たい（ｃｏｌｄ）」腫瘍、すなわち、Ｔ細胞浸潤のレベルが低い腫瘍に類することができる。「熱い」腫瘍は、再注入前のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に十分な量のＣＤ８ Ｔ細胞の採取に好ましいであろう。さらに培養ＴＩＬは、ＡＣＴ時に、強い抗腫瘍反応を誘導するために、エフェクター機能、増殖能力、および自己複製能を維持しなければならない。その結果、限られた増殖および自己複製能を有する細胞などの最終分化ＴＩＬの注入は、患者の臨床転帰に関して有害である。重要なことに、記憶様表現型を示すＴＩＬの精選は、患者への移入後の抗腫瘍応答を改善する。抽出されたＴＩＬ内の１つのサブセットを標的化する現在の方法は時間がかかり、細胞の代謝が困難になり得、フローサイトメトリーによる選別などの表面蛍光標識を必要とし得る。

【0012】

血液悪性腫瘍に対する高い効力を実証するにもかかわらず、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって誘発される強い抗腫瘍応答は、しばしば毒性（すなわち、重篤なサイトカイン放出症候群および神経毒性）を伴う一方、ＣＡＲ－Ｔの増殖および持続性が乏しい患者は、持続的な寛解率の低下を示す。まとめると、単純かつ効率的な様式で、メモリー様ＴＩＬまたはＣＡＲ－Ｔ細胞を選択することは、媒介性応答の持続期間を改善する可能性により、臨床結果に劇的に有益となるであろう。

【0013】

大腸炎およびループスなどの疾患をもたらす免疫応答の不全である自己免疫は、免疫系が誤って健康な細胞を攻撃した場合に起こる。心臓、脳、神経、筋肉、結合組織、皮膚、眼、肺、腎臓、消化管血液細胞、および血管を含む、身体のほとんどの部分が免疫系によって標的化され得る。免疫系によって標的化される身体の部分に応じて変化するため、広範囲の自己免疫疾患が存在する。一般的な自己免疫疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、自己免疫性血管炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、重症筋無力症、悪性貧血、橋本甲状腺炎、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＳ）、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、乾癬、およびセリアック病が含まれる。現在まで、米国自己免疫関連疾患協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＡＡＲＤＡ）は、１００を超える自己免疫疾患を分類しており、米国において３番目に多い種類の疾患である。実際、自己免疫疾患は、世界人口の５～１０％、特に、男性よりも自己免疫疾患に罹患する可能性が２～１０倍高い女性に罹患する。ほとんどの疾患はどの年齢で起こり得るが、いくつかの疾患は主に、小児期および青年期（例えば、１型糖尿病）、成人期中期（例えば、重症筋無力症、多発性硬化症）、または、高齢者（例えば、関節リウマチ、原発性全身性血管炎）の間に起こり得る（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，“Ｈｕｍａｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｕｐｄａｔｅ”，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２７８：３６９－９５）。

【0014】

制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＣＤ４ Ｔ細胞コンパートメントに属し、自己免疫疾患を制御、低減、または処置するための重要な役割を果たす。それらは、機能およびエネルギー需要を支えるために、ミトコンドリアに依存している。Ｔｒｅｇは、引き起こされる免疫応答のバランスをとり、侵入する病原体に対する適切な応答を可能にし、免疫系によって標的化される組織損傷を回避または制限するように働く。それらは、（ｉ）免疫細胞への直接結合によって、（ｉｉ）ＩＬ－１０およびＩＬ－３５などの抗炎症性サイトカインを産生することによって、および（ｉｉｉ）生存シグナルＩＬ－２についてより高い親和性で競合することによって、免疫応答を弱めるその役割を媒介する。ポリクローナルＴｒｅｇ療法は、ＡＣＴと同じ原理を使用し、その結果、抽出された自己Ｔｒｅｇは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖され、その後、患者に再注入され、免疫応答のバランスを回復させることを目的とする（Ｐｅｔｅｒ Ｊ．Ｅｇｇｅｎｈｕｉｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒｅｇ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｔｏ Ｔｒｅａｔ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ”，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０２０ Ｏｃｔ；２１（１９）：７０１５）。

【0015】

したがって、本発明の根底にある技術的問題は、血液からの持続性またはメモリー様ＴＩＬおよびＣＤ８ Ｔ細胞、またはＣＤ４コンパートメントからのＴｒｅｇの選択のための新規治療および治療戦略を提供することである。本発明は、Ｔｒｅｇ療法のために選択されるＡＣＴまたはＴｒｅｇとの関連で使用される、より高い生存能力を有するＣＤ８ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖後の割合を増加させることを目的とする。上記技術的問題の解決は、特許請求の範囲に特徴付けられる実施形態を提供することによって達成される。

【発明の概要】

【0016】

本開示は、ミトコンドリア増強免疫細胞、それらの組成物、および治療的使用に関する。

【0017】

本開示は、免疫細胞を提供し、該免疫細胞は、単離された生存可能なミトコンドリア、または外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを用いて、適応免疫細胞、例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞などのヒト適応免疫細胞、好ましくは、ＣＤ４免疫Ｔ細胞またはＣＤ８免疫Ｔ細胞などのＴ細胞の生存率を高め、および／またはそれらの選択を促進するのに有効な量で処理され、適応免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞と比較して、単離された生存可能なミトコンドリア、または外因性の生存可能なミトコンドリアを用いて処理されない。いくつかの態様では、本開示のミトコンドリアは、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞などの、メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の生存率を増強し、かつ／またはその選択を促進する。いくつかの他の態様では、生存可能なミトコンドリアは、Ｔｒｅｇ ＣＤ４細胞などの制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の生存を増強し、および／またはそれらの選択を促進するのに有効な量である。

【0018】

本明細書に提供されるのは、単離された生存可能なミトコンドリア、または外因性の単離された生存可能なミトコンドリアで処理された免疫細胞の組成物である。組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含み得る。

【0019】

また、本明細書には、適応免疫細胞、例えばヒトＴ細胞などの免疫細胞または免疫細胞の集団の生存率を増強および／またはそれらの選択を促進する方法が提供され、該方法は、（ａ）適応細胞（Ｔ細胞など）活性化を駆動することができる特異的活性化受容体アゴニスト抗体を含む無細胞培地中でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫細胞の活性化する工程と、（ｂ）免疫細胞を、単離された生存可能なミトコンドリアを含む医薬組成物に少なくとも３日間曝露する工程とを含む。いくつかの態様では、免疫細胞または免疫細胞集団の生存率を増強および／またはそれらの選択を促進する方法は、（ａ）任意選択でＩＬ－２などの組換えインターロイキンの存在下で、コーティングされたＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを有する無細胞培地中、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫細胞を活性化する工程、（ｂ）免疫細胞を、単離された生存可能なミトコンドリアを含む医薬組成物に少なくとも３日間曝露する工程を、二者択一的に含む。

【0020】

また、本明細書には、免疫細胞、例えばヒトＴ細胞などのヒト免疫細胞、または免疫細胞の集団を、単離された生存可能なミトコンドリアで処理したもの、またはそれを必要とする対象を処置する方法において使用するための外因性の単離された生存可能なミトコンドリアからなるものが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】急性感染症に対して、引き起こされた免疫応答である。

【図2】組織または培養細胞からミトコンドリアを単離するための１つの例示的なプロトコルの概略図である。

【図3A】ミトコンドリア移植後９日目のセントラルＣＤ８^＋Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の増加。ミトコンドリア移植時のセントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の倍率変化の割合。バルク集団からのＣＤ８^＋Ｔ細胞を、活性化後１２日目に、１００万のＣＤ８^＋Ｔ細胞ごとに、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いて測定して、３０μｇおよび１００μｇの投与量レベルのミトコンドリアで、外因性ミトコンドリアを移植した。移植後９日目に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を染色し、ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーによって分析し、セントラルメモリー（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）およびエフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）として分類した。データは、３人のドナーの平均±ＳＤとして提示される３つの独立した実験を表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図3B】ミトコンドリア移植後９日目のセントラルＣＤ８^＋Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の増加。ミトコンドリア移植時のエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の倍率変化の割合。バルク集団からのＣＤ８^＋Ｔ細胞を、活性化後１２日目に、１００万のＣＤ８^＋Ｔ細胞ごとに、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いて測定して、３０μｇおよび１００μｇの投与量レベルのミトコンドリアで、外因性ミトコンドリアを移植した。移植後９日目に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を染色し、ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーによって分析し、セントラルメモリー（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）およびエフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）として分類した。データは、３人のドナーの平均±ＳＤとして提示される３つの独立した実験を表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【発明の詳細な説明】

【0022】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法、および他の科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合では、共通に理解される意味を有する用語は、明確にするために、および／または容易に参照するために本明細書で定義され、本明細書でのそのような定義の包含は、必ずしも、当該技術分野で概して理解されるものに対する差異を表すと解釈されるべきではない。本明細書で説明または参照される技法および手順は、概して、当業者によって、従来の方法論を使用して、よく理解され、通常採用され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４^ｔｈ ｅｄ．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載される広く利用される分子クローニング法などである。必要に応じて、市販のキットおよび試薬の使用を伴う手順は、概して、特に断りのない限り、製造業者定義のプロトコルおよび条件（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ－ｄｅｆｉｎｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）に従って行われる。

【0023】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を示していると判断されない限り、複数の指示対象を含む。「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」などの用語は、具体的に別段の定めのない限り、限定することなく包含を伝えることを意図している。

【0024】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語はまた、具体的に別段の指示がない限り、列挙された要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」実施形態、および列挙された要素「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」実施形態を具体的に含む。

【0025】

「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、示された値およびその値の上下の範囲を示し、包含する。特定の実施形態では、用語「約」は、指定値±１０％、±５％、または±１％を示す。特定の実施形態では、「約」という用語は、指定値±指定値の１標準偏差を示す。

【0026】

「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、天然の状態または環境から変化または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物または細胞に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離」される。

【0027】

本明細書で使用される「ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」または「ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ）」という用語は、例えば、細胞または細胞培養から単離／精製された外来真核細胞物質など、真核細胞物質を（本質的に）含まない生存可能なミトコンドリアを指す。したがって、最小量の細胞成分（ミトコンドリア以外）のみが、本明細書で使用されるミトコンドリア（の組成物）中に存在する。好ましくは、ミトコンドリア以外の細胞成分は、本明細書で使用されるミトコンドリア（の組成物）には存在しない。単離されたミトコンドリアは、好ましくは、実質的に精製された形態、例えば、その天然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された形態で存在した。この意味で、本明細書で使用される「ミトコンドリア」は「単離ミトコンドリア（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」であり、「ミトコンドリア」および「単離ミトコンドリア」という用語は互換的に使用することができる。ミトコンドリアの単離には、例えば、反復示差遠心分離（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（ＤＣ）または密度勾配遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（ＤＧＣ）による細胞下分画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎｉｎｇ）など、当該技術分野で公知の任意の技術を使用され得る。したがって、本発明のミトコンドリアは、好ましくは、生きているかまたは生存可能であり、負の膜電位を有する。本発明の意味では、「生きている（ｂｅｉｎｇ ａｌｉｖｅ）」とは、代謝または別の生物学的機能もしくは構造を有するかまたは維持することを意味する。

【0028】

本明細書で使用される場合、「生存可能なミトコンドリア（ｖｉａｂｌｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」という用語は、本明細書では、インタクトで（ｉｎｔａｃｔ）、活性があり、機能し、呼吸能力のあるミトコンドリアである生存可能なミトコンドリアを説明するために使用される。いくつかの実施形態によれば、「生存可能なミトコンドリア」は、例えば、呼吸、ならびにＡＴＰおよび／またはタンパク質合成などの生物学的機能を示すミトコンドリアを指す。

【0029】

本明細書で使用される場合、「インタクトなミトコンドリア（ｉｎｔａｃｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」という用語は、本明細書全体を通して、インテジャー（ｉｎｔｅｇｅｒ）外膜および内膜、インテジャーな膜間空間、インテジャーなクリスト（内膜によって形成される）、およびインテジャーなマトリックスを含むミトコンドリアを説明するために使用される。あるいは、インタクトなミトコンドリアは、それらの構造および超微細構造を保存するミトコンドリアである。別の態様では、インタクトなミトコンドリアは、内膜に埋め込まれた活性呼吸鎖複合体Ｉ－Ｖを含有し、膜電位、およびＡＴＰを合成する能力を維持する。

【0030】

本明細書で使用される場合、「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書全体を通して、臓器、組織、細胞塊、個々の細胞、または細胞小器官をレシピエントに移植するプロセスを説明するための一般的な用語として使用される。「細胞移植（ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書全体を通して、少なくとも１つの細胞、例えば、本明細書に記載の増強された免疫細胞をレシピエントに移植するプロセスを説明するための一般的な用語として使用される。該用語は、輸血を含む、当該技術分野で公知の移植の全てのカテゴリーを含む。移植は、ドナーとレシピエントとの間の部位および遺伝的関係によって分類される。該用語は、例えば、自己移植（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（患者の１つの位置から同じ対象の同じまたは別の位置への細胞または組織の除去および移植）、同種移植（ａｌｌｏｔｒｎａｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（同じ種のメンバー間の移植）、および異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（異なる種のメンバー間の移植）を含む。

【0031】

「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、および「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有する必要があり、タンパク質またはペプチド配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限は課されない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、該用語は、当該技術分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーなどとも一般に呼ばれる短鎖と、当該技術分野において、多くの種類が存在するタンパク質と一般に呼ばれる長鎖との両方を指す。「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。

【0032】

「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、本明細書においてその最も広い意味で使用され、抗原またはエピトープに特異的に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含む特定のタイプの免疫グロブリン分子を含む。この用語はまた、非免疫グロブリン抗原結合タンパク質分子、いわゆる抗体模倣物を含む。抗体は、具体的には、インタクトな抗体（例えば、インタクトな免疫グロブリンＧ、ＩｇＧ）、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、Ｖ_ＨＨ、ＮＡＲ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ｔａｎｄＡｂ、ミニボディ、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科動物Ｖ_ＨＨ）、当業者に公知の他の抗体フラグメントもしくはフォーマット、および抗体模倣物（例えば、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、ノッチンなど）を含む。抗体は、単一特異的、二重特異的、および多重特異的であり得る。

【0033】

「抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」という用語は、可変ドメインを介して抗原またはエピトープに特異的に結合することができる抗体またはＴ細胞受容体の部分を意味する。本明細書で使用する場合、「可変ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）」は、組換え事象から生じる可変ヌクレオチド配列を指し、例えば、活性化Ｔ細胞などのＴ細胞由来のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）配列のＶ、Ｊ、および／またはＤ領域を含むことができるか、あるいは抗体のＶ、Ｊ、および／またはＤ領域を含むことができる。「抗原結合フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」という用語は、抗原結合ドメイン、すなわち可変ドメインおよび超可変ループ、いわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有し、抗原およびその定義されたエピトープなどの標的への抗原結合フラグメントの認識および特異的結合を付与するのに十分な抗体もしくはＴＣＲまたはその組換え変異体の少なくとも一部分を指す。抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖフラグメント、単鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体フラグメント、線状抗体、単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」と略される）（Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈのいずれか）、ラクダ科動物Ｖ_ＨＨドメイン（ナノボディ）、抗体フラグメントから生成された多重特異性抗体、およびＴＣＲフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。例示的な抗体および抗体フラグメントフォーマットは、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（ＭＡＢＳ，２０１７，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．２，１８２－２１２）に詳細に記載されており、この文献は、教示するすべてについて参照により本明細書に援用される。

【0034】

「ｓｃＦｖ」という用語は、可撓性ポリペプチドリンカーを介して抗体軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変フラグメントのＮ末端とＣ末端で連結された抗体重鎖（Ｖ_Ｈ）の可変フラグメントを含み、かつ単一のポリペプチド鎖として発現され得る融合タンパク質を指し、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。

【0035】

ｓｃＦｖの文脈で使用される「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」および「可撓性ポリペプチドリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒ）」という用語は、可変重鎖領域と可変軽鎖領域とを連結するために、単独でまたは組み合わせて使用されるグリシンおよび／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態では、可撓性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎを含み、ここでｎは１以上の正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０である。一実施形態では、可撓性ポリペプチドリンカーには、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３または（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ_２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）、または（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）の複数の反復を含む。また、ＷＯ２０１２／１３８４７５（参照により本明細書に援用される）に記載されるリンカーも本発明の範囲内に含まれる。

【0036】

抗体に関する「重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）」または「Ｖ_Ｈ」（または、ラクダ科単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディの場合、「Ｖ_ＨＨ」）は、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られるフランキングストレッチの間に挿入された３つのＣＤＲを含有する重鎖のフラグメントを指し、これらのフレームワーク領域は、通常、ＣＤＲよりも保存されており、ＣＤＲを支持する足場を形成する。

【0037】

特定されない限り、本明細書で使用されるように、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、いずれかの順序でＶ_ＬおよびＶ_Ｈ可変領域を有し得、ｓｃＦｖは、Ｖ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈを含み得るか、またはＶ_Ｈ－リンカー－Ｖ_Ｌを含み得る。

【0038】

「抗体重鎖（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」という用語は、抗体分子中に、天然に存在する立体構造（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）で存在する２種類のポリペプチド鎖のうち大きい方を指し、概して、抗体が属する免疫グロブリンクラスを決定する。

【0039】

「抗体軽鎖（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」という用語は、抗体分子中に天然に存在する立体構造で存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。ｋａｐｐａ（「κ」）およびｌａｍｂｄａ（「λ」）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。

【0040】

「組換え抗体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、例えば、細菌、酵母、植物、または哺乳動物細胞によって発現される抗体など、組換えＤＮＡ技術を用いて生成される抗体を指す。該用語はまた、抗体をコード化するＤＮＡ分子の合成によって生成され、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質、または抗体を特定するアミノ酸配列を発現する抗体を意味すると解釈される必要があり、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、利用可能、かつ当該技術分野において周知である組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られている。

【0041】

「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」または「ａｇ」という用語は、身体に外来の分子を指し、このようなものは、抗体またはＴ細胞受容体によって結合され得る病原体上に存在する。抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示され得、状況下で免疫応答を誘発し得る。

【0042】

当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として役立ち得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコード化するヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、本明細書で使用される「抗原」をコード化することを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解するであろう。本開示は、限定されないが、複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコード化するように様々な組み合わせで配列されることが一目瞭然である。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子（ｇｅｎｅ）」によって全くコード化される必要がないことを理解するであろう。抗原が、化学合成によって生成され得るか、また、生物学的試料に由来し得るか、またはポリペプチド以外の巨大分子、例えば、脂質もしくは炭水化物であり得ることが一目瞭然である。このような生物学的試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞、または他の生物学的成分を有する流体が含まれるが、これらに限定されない。

【0043】

「抗腫瘍効果（ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ）」という用語は、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の増加、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存率の減少、またはがん状態に関連する様々な生理学的症状の改善を含むがこれらに限定されない様々な手段によって明らかにすることができる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、第一に、腫瘍の発生の予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、および抗体の能力によって明らかにされ得る。

【0044】

「免疫抑制効果（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ）」という用語は、正常な免疫機能を阻害または妨害することができる生物学的効果を指す。

【0045】

「ヒト抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「ヒトＴＣＲ（ｈｕｍａｎ ＴＣＲ）」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するか、またはヒト抗体もしくはＴＣＲレパートリーまたはヒト抗体／ＴＣＲコード配列（例えば、ヒト供給源から得られるか、またはデノボで設計される）を利用する非ヒト供給源に由来するものである。ヒト抗体およびＴＣＲは、それぞれヒト化抗体およびＴＣＲを特異的に除外する。

【0046】

抗体、ＴＣＲ、またはその抗原結合フラグメントの標的分子への結合に関して、特定の抗原（例えば、ポリペプチド標的）または特定の抗原上のエピトープに対する、「結合（ｂｉｎｄ）」、「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ ｔｏ）」、「特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ）」、「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｉｎｄｓ）」、および「選択的に（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ）」という用語は、非特異的または非選択的相互作用（例えば、非標的分子との）とは測定可能に異なる（ｍｅａｓｕｒａｂｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）結合を意味する。特異的結合は、例えば、標的分子への結合を測定し、かつそれを非標的分子への結合と比較することによって測定することができる。特異的結合はまた、標的分子上で認識されるエピトープを模倣する対照分子との競合によって決定することもできる。その場合、標的分子への抗体、ＴＣＲ、またはその抗原結合フラグメントの結合が対照分子によって競合的に阻害される場合、特異的結合が示される。特異的結合は、本明細書で使用する場合、Ｋ_Ｄ値が１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、または１０^－１０Ｍ未満である親和性を指し得る。親和性は、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））またはバイオレイヤー干渉法（例えば、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標））などの本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野において公知の共通の方法によって測定することができる。

【0047】

「自己由来（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の材料を指す。

【0048】

「同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）」という用語は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物または異なる患者に由来する任意の材料を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種であると言われる。いくつかの態様において、同じ種の個体に由来する同種異系物質は、抗原的に相互作用するには遺伝的に十分に異なり得る。

【0049】

「異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）」という用語は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。

【0050】

「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」（およびその変形、例えば「処置する（ｔｒｅａｔ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」）という用語は、それを必要とする対象における疾患または疾病の自然経過を変更する試みにおける臨床的介入を指す。処置は、予防のため、かつ臨床病理の経過中に行うことができる。処置の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行速度の減少、疾患状態の改善もしくは緩和、および寛解もしくは予後の改善が含まれる。

【0051】

本明細書で使用される場合、「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、組成物が投与される個体に有益な効果を提供するか、またはそうでなければ有害な非有益事象を低減するのに十分な組成物またはその活性成分の量である。本明細書における「治療有効用量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）」は、それが投与される１つ以上の所望のまたは望ましい（例えば、有益な）効果をもたらす用量であって、そのような投与が所与の期間にわたって１回以上起こる用量を意味する。正確な用量は、処置の目的次第であり、公知の技術を使用して当業者によって確認可能である（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、ａｎｄ Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照されたい）

【0052】

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」または「ＣＡＲ」という用語は、刺激様式（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍａｎｎｅｒ）で作用し、かつ免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）すなわち「ＩＴＡＭ」として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る、一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」とも呼ばれる）に融合した抗原結合部分（例えば、少なくとも抗原結合ドメインまたはその抗原結合フラグメントを有するポリペプチド）を含む様々なポリペプチドに由来する組換えポリペプチドを指す。本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例には、ＣＤ３ζ（ゼータ）、ＦｃＲγ（ガンマ）、ＦｃＲβ（ベータ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ（デルタ）、ＣＤ３ε（イプシロン）、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても知られる）、およびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれるが、これらに限定されない。ＣＡＲは、典型的には、抗体型特異性またはＴＣＲ型特異性を有するＴリンパ球などの、操作された免疫細胞を提供し、ＩＬ－２の産生、およびＴ細胞におけるシグナル伝達に続く標的細胞の溶解を含む、エフェクター細胞のいくつかまたは全ての機能を活性化する。

【0053】

本明細書に記載されるＣＡＲの抗原結合ドメインまたはその抗原結合フラグメントは、様々な形態で存在し得、例えば、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）もしくは重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、天然由来または合成のいずれかを含む、連続したポリペプチド鎖の一部として発現され、抗原に結合する。本明細書に記載のＣＡＲの抗原結合ドメインまたはその抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の抗体フォーマットまたは抗体フラグメントフォーマットのいずれかを含み得る。本明細書に記載のＣＡＲの抗原結合ドメインまたはその抗原結合フラグメントは、キメラまたは人工Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むがこれらに限定されない抗体に由来しない配列を含むことができる。これらのキメラ／人工ＴＣＲは、標的抗原を認識するポリペプチド配列を含み得、認識配列は、例えば、ＴＣＲまたはｓｃＦｖに由来する認識配列であり得るが、これらに限定されない。細胞内ドメインポリペプチドは、Ｔ細胞を活性化するように作用するもの。キメラ／人工ＴＣＲは、例えば、Ｇｒｏｓｓ，Ｇ．，ａｎｄ Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ．，ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：３３７０－３３７８（１９９２），ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ６：１－１３（２０１０）に記載されている。

【0054】

「ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌ）」は、本明細書に開示される方法に従って形質導入され、かつＣＡＲ遺伝子を発現するＴ細胞であり、例えば、ゲノムにランダムに組み込まれるか、またはＣＣＲ５およびＡＡＶＳ１遺伝子座、もしくはＴ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座に意図的に組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、またはＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、対象に関して自己由来、同種異系、または異種である。

【0055】

本明細書で使用される場合、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、哺乳動物の対象を意味する。「対象」という用語は、免疫応答が誘発され得る、生きている生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含むことが意図される。例示的な対象には、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、ヤギ、ウサギ、およびヒツジが含まれる。特定の実施形態では、対象はヒトである。「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、疾患、障害、もしくは疾病に罹患しているか、またはそれらを発症するリスクがあるか、あるいは本明細書に提供される組成物および方法を必要とする対象である。

【0056】

本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」とは、患者における疾患または疾病、例えば、腫瘍形成の予防を指す。例えば、腫瘍または他の形態のがんを発症するリスクがある個体が本発明の方法によって処置され、かつ後に腫瘍または他の形態のがんを発症しない場合、疾患は、その個体において、少なくともある期間にわたって予防される。

【0057】

本明細書で使用される場合、「ＣＤ１９」という用語は、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９、ＣＤ１９分子（クラスター分化１９）、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、Ｔ細胞表面抗原Ｌｅｕ－１２、およびＣＶＩＤ３は、ヒトにおいて遺伝子ＣＤ１９によってコード化される膜貫通タンパク質である。ヒトにおいて、ＣＤ１９は、形質細胞を除く全てのＢ系統細胞（Ｂ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌｓ）において、および濾胞樹状細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）において発現される。ＣＤ１９は、ヒトＢ細胞において２つの主要な役割を果たす。これは、細胞質シグナル伝達タンパク質を膜にリクルートするアダプタータンパク質として作用し、ＣＤ１９／ＣＤ２１複合体内で作用して、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路の閾値を減少させる。それがすべてのＢ細胞に存在することから、Ｂリンパ球の発生、リンパ腫診断のバイオマーカーであり、白血病やリンパ腫の免疫療法の標的として利用できる。

【0058】

「パッケージ挿入物（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）」という用語は、そのような治療用または診断用製品の使用に関する指示、使用法、用量、投与、併用療法、禁忌、および／または警告に関する情報を含む、治療用または診断用製品（例えば、キット）の市販のパッケージに慣習的に含まれる指示書を指すために使用される。

【0059】

「細胞傷害性薬剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞機能を阻害または予防し、および／あるいは細胞死または破壊を引き起こす物質を指す。

【0060】

「化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」は、がんの処置に有用な化合物を指す。化学療法剤には、「抗ホルモン剤（ａｎｔｉ－ｈｏｒｍｏｎａｌ ａｇｅｎｔｓ）」または「内分泌療法剤（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」が含まれ、これらは、がんの成長を促進することができるホルモンの効果を制御、低減、遮断、または阻害するように作用する。

【0061】

「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」という用語は、悪性であろうと良性であろうと、すべての新生物細胞の成長および増殖、ならびにすべての前がん細胞や前がん組織およびがん細胞やがん組織を指す。「がん（ｃａｎｃｅｒ）」、「がんの（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）」、「細胞増殖性障害（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」、「増殖性障害（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」、および「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、相互排他的ではない。「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。いくつかの実施形態では、細胞増殖性障害はがんである。いくつかの態様では、腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの態様では、腫瘍は血液悪性腫瘍（血液腫瘍）である。

【0062】

「医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という用語は、活性成分の生物学的活性を可能にし、かつ／またはその中に含有される生物学的実体（例えば、細胞）の生存率を維持もしくは改善して、対象を処置するのに有効であるような形態であり、および医薬組成物中に提供される量で対象に対して許容されないほど有毒である追加の成分を含有しない調製物を指す。

【0063】

「薬学的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」という用語には、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤など、薬学的投与に適合するものが含まれる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、クレブス緩衝液（Ｋｒｅｂｓ ｂｕｆｆｅｒ）、タイロード溶液（Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、造影剤、もしくはオムニパーク、またはそれらの混合物である。「薬学的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」という用語はまた、滅菌ミトコンドリア緩衝液（３００ｍＭスクロース、１０ｍＭ Ｋ＋－ＨＥＰＥＳ（カリウム緩衝（４－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－ピペラジンエタンスルホン酸）、ｐＨ７．２）、１ｍＭ Ｋ＋－ＥＧＴＡ（カリウム緩衝エチレングリコールテトラ酢酸、ｐＨ８．０）。該用語は、呼吸緩衝液（２５０ｍＭスクロース、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｈ、２０ｍＭ Ｋ－１５ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、および０．５ｍＭ Ｋ－ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０））をさらに含む。該用語は、Ｔ細胞培地、例えば、ＲＰＭＩ １６４０培地ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５００ｍｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、６１８７００１０）をさらに含む。

【0064】

「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」および「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」という用語は、列挙された変数を減少または阻害することか、あるいは、活性化または増加させることを指す。

【0065】

「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」、および「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」という用語は、列挙された変数の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、またはそれより大きい増加を指す。

【0066】

「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」および「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語は、列挙された変数の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０、倍２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれより大きい減少を指す。

【0067】

「アゴナイズする（ａｇｏｎｉｚｅ）」という用語は、受容体の活性化に関連する生物学的応答を誘導するための受容体シグナル伝達の活性化を指す。「アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）」は、受容体に結合し、受容体をアゴナイズする実体である。

【0068】

「アンタゴナイズする（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）」という用語は、受容体の活性化に関連する生物学的応答を阻害するための受容体シグナル伝達の阻害を指す。「アンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」は、受容体に結合し、受容体をアンタゴナイズする実体である。

【0069】

「免疫細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）」という用語は、感染またはがんなどの疾患から生物を保護するための免疫系に属する細胞を指す。「免疫細胞（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）」は、自然免疫応答と適応免疫応答との間に分類される。

【0070】

「免疫細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）」または「適応免疫細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）」という用語は、免疫細胞または適応免疫細胞の異種群（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ｇｒｏｕｐ ）を指す。

【0071】

「エフェクターＴ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ）」および「メモリーＴ細胞（ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）」は、Ｔヘルパー（すなわち、ＣＤ４^＋）細胞および細胞傷害性（すなわち、ＣＤ８^＋）Ｔ細胞を含む。ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞は、典型的には、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、いくつかの免疫学的プロセスの発生に寄与する。ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞は、典型的には、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を死滅させる。ＣＤ８^＋メモリーＴ細胞は、典型的には、増強されたリコール能力を介して、再感染またはがん再発に対する長期保護を提供する。エフェクターＴ細胞に関するさらなる情報については、参照によりその全体が援用される、Ｓｅｄｅｒ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ，２００３を参照されたい（Ｓｅｄｅｒ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ，２００３，“Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ＣＤ４＋ ａｎｄ ＣＤ８＋ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：８３５－４２）。ＣＤ８エフェクターメモリー細胞は、表面マーカーＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－を発現する。

【0072】

用語「セントラルメモリーＴ細胞」（「Ｔｃｍ細胞」）は、表面マーカーＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋を発現する細胞を指す。ＣＤ６２Ｌを構成的に発現するヒトＴｃｍ細胞は、高内皮細静脈（ＨＥＶ）を通じた細胞溢出および二次リンパ器官のＴ細胞領域への遊走に必要とされる。Ｔｃｍ細胞は、同じ抗原に２回目に遭遇した際に、リコール応答を効率的に媒介する。

【0073】

ＣＤ８エフェクターメモリー細胞などの「エフェクターメモリセル（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）」という用語は、表面マーカーＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋を発現し、炎症を起こした末梢組織に遊走し、エフェクター機能を示すことができる細胞を指す。

【0074】

「メモリー様Ｔ細胞（ｍｅｍｏｒｙ－ｌｉｋｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ）」などの、「メモリー様細胞（ｍｅｍｏｒｙ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ）」という用語は、メモリー細胞の特徴および特性を示す細胞を指す。それらは、１つ以上の表面マーカー発現を模倣し、リコール能力の増強、生存率、自己複製などのメモリー細胞の少なくとも１つ以上の特徴を示し得る。例えば、急性感染症の存在下では、Ｔ細胞は、その表面発現および挙動に応じて記憶として分類することができる。いくつかのＴ細胞は、抗腫瘍応答中に記憶様特性を示す（Ｓｈｉｋｉ Ｔａｋａｍｕｒａ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｉｓｓｕｅ ９，１ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０２０，Ｐａｇｅｓ ５７１－５８１）。

【0075】

「Ｔｓｃｍ細胞（Ｔｓｃｍ ｃｅｌｌ）」または「幹細胞様メモリー細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｍｅｍｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）」という用語は、その最も早期かつ長期間持続する発生段階にあり、幹細胞様特性を示し、ナイーブＴ細胞とセントラルメモリーＴ細胞との間の遺伝子プロファイルを示すメモリー細胞を指す。幹細胞様メモリー細胞は、表面マーカーＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋を発現する。

【0076】

「Ｔｒｍ細胞（Ｔｒｍ ｃｅｌｌ）」または「組織常在性Ｔ細胞（ｔｉｓｓｕｅ－ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｔ ｃｅｌｌ）」は、再循環することなく上皮および粘膜組織（皮膚、粘膜、肺、脳、膵臓、胃腸管）を占有する長期メモリーＴ細胞のサブセットを指す。Ｔｒｍ細胞は、血液、二次リンパ器官のＴ細胞ゾーン、リンパ組織、および非リンパ組織の間で再循環するセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）およびエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）とは転写的に、表現型的に、および機能的に異なる。Ｔｒｍ細胞自体は、常在組織の特殊化のために多様な集団を表す。

【0077】

「ナイーブ細胞（ｎａｉｖｅ ｃｅｌｌｓ）」という用語は、休止細胞（ｒｅｓｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）であり、かつ活性化されていない細胞を指す。例えば、ナイーブＴ細胞は抗原に遭遇しておらず、ＡＰＣによって提示されたペプチドをスクリーニングするために生体内を循環している。ナイーブＴ細胞は、表面マーカーＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－を発現する。

【0078】

「適応免疫細胞（ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ）」という用語は、「適応免疫系（ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）」または「後天性免疫系（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）」に属し、かつ適応免疫において重要な役割を果たす細胞を指す。適応免疫細胞は免疫細胞のサブセットであり、高度に特殊化された全身性の細胞である。具体的に、リンパ球Ｂ細胞およびＴ細胞は、適応免疫細胞である。適応免疫細胞は、病原体を排除するか、またはそれらの成長を防止する機能を有することができる。適応免疫は、特定の病原体に対する初期応答後に免疫記憶（例えば、メモリーＢ細胞またはメモリーＴ細胞）を作り出すことができ、その病原体との将来の遭遇に対する応答の増強をもたらす。「適応免疫細胞（ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）」および「適応細胞（ａｄａｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ）」という用語は、互換的に使用することができる。

【0079】

「ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ）」および「ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ）」という用語は、それぞれＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞を指す。「ＣＤ４ Ｔ細胞」、「ＣＤ４免疫Ｔ細胞（ＣＤ４ ｉｍｍｕｎｅ Ｔ ｃｅｌｌ）」、および「ＣＤ４免疫細胞（ＣＤ４ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ）」という用語は、互換的に使用することができる。「ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ）」、「ＣＤ８免疫Ｔ細胞（ＣＤ８ ｉｍｍｕｎｅ Ｔ ｃｅｌｌ）」、および「ＣＤ８免疫細胞（ＣＤ８ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ）」という用語は、互換的に使用することができる。

【0080】

用語「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」は、例えば、エフェクターＴ細胞を抑制することによって免疫寛容（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を調節する細胞を含む。いくつかの態様では、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋表現型を有する。いくつかの態様では、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋表現型を有する。制御性Ｔ細胞に関するさらなる情報については、参照によりその全体が援用される、Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１２，１６５：２０８９－２０９９を参照されたい。本明細書で使用される場合、「制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）」という用語は、好ましくは、免疫ホメオスタシスに重要であるＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットを示す。Ｔｒｅｇは、その発生および抑制機能に必須である転写因子フォークヘッドボックスタンパク質Ｐ３（Ｆｏｘｐ３）の発現によって定義される。Ｆｏｘｐ３機能の喪失は、重篤なリンパ増殖性疾患および自己免疫をもたらす。自己免疫および炎症性疾患を予防することに加えて、Ｔｒｅｇは、病原体に遭遇した際の、制御された免疫応答を確実にし、それによって免疫病態を予防する。逆に、Ｔｒｅｇによる過剰な抑制は、病原体クリアランスを妨害し、慢性感染を促進し得る。加えて、Ｔｒｅｇはまた、抗腫瘍免疫応答を抑制し、したがって、腫瘍進行を促進し得る。

【0081】

「樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）」という用語は、ナイーブＴ細胞を活性化し、かつＢ細胞の増殖および分化を刺激することができるプロフェッショナル抗原提示細胞を指す。

【0082】

「［標的］の発現に関連する疾患」という語句には、［標的］の発現に関連する疾患または［標的］を発現する細胞に関連する疾病、例えば、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または固形腫瘍もしくは血液腫瘍などの前がん疾病が含まれるが、これらに限定されない。［標的］の発現に関連する非がん関連適応症には、例えば、自己免疫疾患（例えば、ループス、関節リウマチ、大腸炎）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）、および移植が含まれるが、これらに限定されない。

【0083】

「刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの場合に、その同族リガンドまたは抗原非依存性ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの刺激ドメインまたは刺激分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ／ＣＤ３複合体）の結合によって誘導され、それによってシグナル伝達事象、例えば、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達を媒介する一次応答を指す。刺激は、特定の分子の発現の変化、および／または細胞骨格構造の再編成などを媒介することができる。

【0084】

「刺激分子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」または「刺激ドメイン（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）」という用語は、Ｔ細胞シグナル伝達経路などの、シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様について刺激様式で（ｉｎ ａ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｗａｙ）、ＴＣＲ／ＣＡＲ複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を提供する、Ｔ細胞または操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲを発現するように操作された免疫細胞）によって発現される分子またはその部分を指す。一態様では、一次シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドを負荷したＭＨＣ分子との結合によって開始され、これにより、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答の媒介がもたらされる。一態様では、一次シグナルは、例えば、ＣＡＲ（例えば、抗体フラグメントまたはキメラＴＣＲ）のその同族抗原またはエピトープへの結合によって開始される。

【0085】

「抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）」または「ＡＰＣ」という用語は、主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）（ＭＨＣ）と複合体形成した外来抗原をその表面上に提示するアクセサリー細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージなど）などの免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは、典型的には抗原を処理し、それらをＴ細胞に提示するが、前処理された抗原性ペプチドを「負荷され（ｌｏａｄｅｄ）」得る。

【0086】

「細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」は、この用語が本明細書で使用される場合、ＴＣＲまたはＣＡＲ発現Ｔ細胞のエフェクター機能などの免疫エフェクター機能を促進するシグナルの生成に関与する分子の細胞内部分を指す。「共刺激分子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、共刺激リガンド（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇａｎｄ）と特異的に結合し、それによってＴ細胞による共刺激応答、例えば、限定されないが、増殖を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要とされ得る、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられるが、これらに限定されない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリー、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、および活性化ＮＫ細胞受容体で表すことができる。このような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能的フラグメントを含み得る。「４－１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．ＡＡＡ６２４７８．２として提供されているアミノ酸配列、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの同等の残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」とは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４～２５５、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの同等な残基と定義される。

【0087】

「コード化する（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」という用語は、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を意味し、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどは、ヌクレオチドの定義された配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列のいずれかおよびそれから生じる生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として役立つ。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、そのタンパク質をコード化する。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、かつ通常配列表で提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコード化すると言及することができる。

【0088】

別段の定めがない限り、「アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、互いの縮重バージョン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｖｅｒｓｉｏｎｓ）であり、かつ同じアミノ酸配列をコード化する全てのヌクレオチド配列を含む。「タンパク質またはＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列」という語句はまた、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列がいくつかのバージョンにおいて１つ以上のイントロンを含み得る程度にイントロンを含み得る。

【0089】

「内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、生物、細胞、組織、もしくは系に由来するか、またはその内部で産生される任意の物質を指す。

【0090】

「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、生物、細胞、組織、もしくは系から導入されるか、またはその外側で産生される任意の物質を指す。患者の場合では、「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、患者、ドナー、または細胞培養由来の物質を指し得る。例えば、患者の筋肉組織から単離され、その後、患者の自己由来または自家由来（ａｕｔｏｇｅｎｉｃ）であり得る免疫細胞の集団に導入されるミトコンドリアは、外因性であると考えられる。「外因性ミトコンドリア（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」という用語は、自己起源、同種起源、および／または異種起源から単離された任意のミトコンドリアを指し、供給源の性質は、組織、血液、または培養細胞の性質であり得る。

【0091】

「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。

【0092】

本明細書で使用される場合、「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコード化する核酸配列を含有するベクターを指す。いくつかの場合において、ＲＮＡ分子は、次いで、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合では、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）またはリボザイムの産生において翻訳されない。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸のものまたはリポソーム中に含まれるもの）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む、当該技術分野において公知のすべてのものを含む。

【0093】

本明細書で使用される場合、「発現構築物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」または「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、遺伝子産物をコード化する核酸を含有する任意のタイプの遺伝子構築物として定義され、ここで、核酸コード配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の一部または全部は、ベクター中に挿入され得る。

【0094】

疾患、障害、または疾病に関して本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔ））」、「処置した（ｔｒｅａｔｅｄ）」、または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、予防および／または治療を指す。

【0095】

「レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）」という用語は、レトロウイルス科の属（ｇｅｎｕｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞（ｎｏｎ－ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）に感染することができるという点でレトロウイルスの中で特異であり、それらは宿主細胞のＤＮＡにかなりの量の遺伝情報を送達することができるので、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶはすべてレンチウイルスの例である。

【0096】

「レンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、特に、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）に提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。

【0097】

「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、２つのポリマー分子の間、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子の間、または２つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットによって占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、それらはその位置で相同または同一である。２つの配列間の相同性は、マッチングまたは相同位置の数の直接関数（ｄｉｒｅｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）であり、例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、長さ１０サブユニットのポリマー中の５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０個のうちの９個）がマッチングしているかまたは相同である場合、２つの配列は９０％相同である。

【0098】

本発明の文脈では、通常存在する核酸塩基の以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）を指し、「Ｃ」はシチジン（ｃｙｔｉｄｉｎｅ）を指し、「Ｇ」はグアノシン（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）を指し、「Ｔ」はチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を指し、「Ｕ」はウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）を指す。

【0099】

「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「転写制御（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、このことは、後者の発現をもたらす。

【0100】

免疫原性組成物の「非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）」投与という用語には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、鼻腔内もしくは胸骨内注射、腫瘍内、または注入技術が含まれる。

【0101】

「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」または「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそのポリマーを指す。特に限定しない限り、該用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補配列、ならびに明示的に示される配列を暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１ （１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；ａｎｄ Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドには、限定されるものではないが、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを用いた、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段などを含む、当該技術分野で利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの突然変異を含み、当該技術分野で周知の方法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの突然変異を含むが、これらに限定されない。核酸は、１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。

【0102】

「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始することができる、細胞の転写機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。

【0103】

「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）／調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に使用することができる核酸配列を指す。いくつかの例では、この配列はコアプロモーター配列であり得、他の場合では、この配列は、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列（ｅｎｈａｎｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および他の調節エレメント（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。

【0104】

「構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、遺伝子産物をコード化または特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で細胞において遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。

【0105】

「誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、遺伝子産物をコード化または特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、実質的にプロモーターに対応する誘導因子が細胞中に存在する場合にのみ、遺伝子産物を細胞中で産生させるヌクレオチド配列を指す。

【0106】

「組織特異的プロモーター（ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、遺伝子をコード化するかまたは遺伝子によって特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結される場合、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、実質的に細胞において遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。

【0107】

本明細書で使用する場合、「形質転換体（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）」とは、数時間、数日、または数週間の期間にわたる非組込み導入遺伝子の発現を指し、発現の期間は、ゲノムに組み込まれるか、または宿主細胞中の安定したプラスミドレプリコン内に含有される場合、遺伝子の発現の期間より短い。

【0108】

「シグナル伝達経路（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）」という用語は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす多様なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」という語句は、シグナルを受け取り、細胞膜を横切ってシグナルを送ることができる分子および分子の複合体を含む。

【0109】

「実質的に精製された（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」細胞という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態で通常関連する他の細胞型から分離された細胞を指す。いくつかの例では、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の同質な集団を指す。他の例では、この用語は、単に、天然の状態において天然に関連している細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。他の態様では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されない。

【0110】

「治療的（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」という用語は、本明細書で使用される場合、処置を意味する。治療効果は、疾患状態の低減、抑制、寛解、または根絶によって得られる。

【0111】

「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患または疾患状態の予防または防御処置を意味する。

【0112】

本発明の文脈では、「腫瘍抗原（ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ）」は、特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。特定の態様では、本発明の過剰増殖性障害抗原は、原発性黒色腫または転移性黒色腫、中皮腫、腎細胞がん、胃がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、子宮頸がん、脳腫瘍、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、子宮内膜がん、および胃がんを含むがこれらに限定されないがんに由来する。

【0113】

「トランスフェクトされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」または「形質転換された（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」または「形質導入された（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクトされたか、形質転換されたか、または形質導入されたものである。細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。

【0114】

「Ｔ細胞枯渇（Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）」および「枯渇Ｔ細胞（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ）」は、低応答性Ｔ細胞または「機能不全」Ｔ細胞のいずれかを指す。

【0115】

「活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）」または「免疫細胞の活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ）」は、特定の抗原を発現し、その抗原に特異的なＴＣＲまたはサイトカイン産生によって検出される標的細胞に対する細胞傷害活性などの細胞エフェクター機能を指す。それはさらに、代謝活性、増殖および分裂する増殖性能および能力、消耗に抵抗する能力、ならびに抑制活性を指す。

【0116】

細胞または細胞集団の「生存率（ｓｕｒｖｉｖａｌ）」という用語は、細胞持続性、細胞自己複製能、細胞耐久性を指すが、これらに限定されない。細胞生存率は、細胞の生存率および細胞プロセスの完全性を持続および維持するその能力を包含するプロセスとして定義することができる。生存メカニズム（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）は、細胞が適応し、複製、修復、および代謝などの細胞活性を継続することできることを確実にする。

【0117】

Ｔ細胞などの免疫細胞の「生存率の増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）」という用語は、例えば、免疫細胞の以下の特性、（ｉ）休止期および再刺激時に生存する能力、（ｉｉ）ＩＬ－７、ＩＬ－１５などのインターロイキンに対する応答性（例えば、細胞は、それらのインターロイキンに応答する受容体の発現を増加させる必要があるため、生存するためのシグナルが少なくなり得る）、（ｉｉｉ）活性化誘導細胞死に対する抵抗性（ＡＩＣＤ）、（ｉｖ）ＢＣＬ－ＸＬ、ＢＣＬ－２などの抗アポトーシス分子をアップレギュレートすることによるアポトーシスに対する抵抗性、（ｖ）ＦａｓおよびＦａｓＬ発現などのアポトーシス促進性分子（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）をダウンレギュレートすることによるアポトーシスに対する抵抗性、（ｖｉ）Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ２ｌ２、Ｍｃｌ１、Ｂｃｌ２ａ１ｄ、Ｂｉｒｃ２、Ｂｉｒｃ３、Ｘｉａｐ、Ｃｆｌａｒなどの特定の遺伝子の発現に影響を与え得る、エピジェネティックな修飾（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）および転写改変（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）、（ｖｉｉｉ）テロメアの長さの１つ以上の増強を示す。

【0118】

「選択を促進する（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、免疫細胞または免疫細胞集団の大部分に対する免疫細胞の１つ以上のサブセットの量の増加および／またはいくつかの特性の増強を指す。

【0119】

「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」または「細胞／細胞分化（ｃｅｌｌ／ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」という用語は、ある細胞型から別の細胞型に、典型的には、それだけではないが、あまり特殊化されていない型（幹細胞）からより特殊化された型に変化する細胞のプロセスを指す。分化、特に免疫細胞分化は、抗原曝露に応答して起こり得る。分化は、細胞のサイズ、形状、膜電位、代謝活性、およびシグナルに対する応答性を劇的に変化させ得る。

【0120】

「ミトコンドリアで処置された免疫細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」という用語は、ミトコンドリアに曝露された、ミトコンドリアと密接に接触した、ミトコンドリアと共インキュベートされた、またはミトコンドリアと移植された免疫細胞を指し得る。「ミトコンドリア処置（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、細胞をミトコンドリアに曝露する行為、または細胞をミトコンドリアと密接に接触させる／配置する行為、または細胞をミトコンドリアと共インキュベートする行為、またはミトコンドリアを細胞に移植する行為を指す。

【0121】

「自己複製能（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ）」または「細胞自己複製能（ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ）」という用語は、同じ細胞型の細胞を無制限に増やす細胞のプロセスを指す。自己複製は、母細胞のすべての特徴を分割および保持する能力である。自己複製は、細胞の数をほぼ同じにする。

【0122】

「リコール能力（ｒｅｃａｌｌ ｃａｐａｃｉｔｙ）」という用語は、迅速な増殖およびエフェクター細胞への分化をもたらす、メモリー細胞によって引き起こされる二次免疫応答を指す。このリコール応答は、感染症の程度を制御し、疾患を予防する上で重要である。

【0123】

「移植されたミトコンドリア（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」という用語は、標的細胞に実質的に組み込まれた（例えば、細胞に部分的または完全に組み込まれた）外因性ミトコンドリアを指す。「ミトコンドリア移植（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「ミトコンドリアの移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」、または「ミトコンドリアの移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」は、外因性ミトコンドリアを宿主細胞に組み込む／移入する行為を指す。

【0124】

範囲．本開示全体にわたって、本開示の様々な態様は、範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡潔さのためであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈される必要がないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、具体的に開示されたすべての可能な部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値を有すると見なされる必要がある。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を具体的に開示していると見なされる必要がある。別の例として、９５～９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するものを含み、９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％、および９８～９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。

【0125】

免疫細胞およびそれに関連する組成物の増強
以下、本発明をより詳細に説明する。具体的に、本発明は以下の項目に関する。
１．本開示は、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていない適応免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞と比較して、Ｂ細胞またはＴ細胞、好ましくはＣＤ８免疫細胞またはＣＤ４免疫細胞など、Ｔ細胞などの適応免疫細胞、例えば、ヒト適応免疫細胞の生存率を増強し、かつ／またはそれらの選択を促進するのに有効な量で、単離された生存可能なミトコンドリアで処理された免疫細胞、例えばヒト免疫細胞を提供する。
２．本開示は、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていない免疫細胞と比較して、適応免疫細胞、例えばメモリーＴ細胞のメモリー細胞分化および／またはメモリー細胞選択を促進するのに有効な量で、単離された生存可能なミトコンドリアで処理された免疫細胞、例えばヒト免疫細胞を提供する。
３．具体的に、本開示は、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていない免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞と比較して、メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の生存率を増強し、かつ／またはメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の選択を促進するのに有効な量で、単離された生存可能なミトコンドリアで処理された免疫細胞、例えばヒト免疫Ｔ細胞などのヒト免疫細胞を提供する。いくつかの特定の態様では、単離された生存可能なミトコンドリアは、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていない免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞と比較して、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の生存率を増強し、かつ／またはセントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の選択を促進するのに有効な量である。いくつかの他の特定の態様では、単離された生存可能なミトコンドリアは、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていない免疫細胞と比較して、エフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の生存率を増強し、および／またはエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の選択を促進するのに有効な量である。
４．具体的に、本開示は、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていない免疫細胞、例えばＣＤ４免疫細胞などのヒト適応免疫細胞と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の生存率を増強し、かつ／またはＴｒｅｇ細胞の選択を促進するのに有効な量で、単離された生存可能なミトコンドリアで処理された免疫細胞、例えばヒトＴ免疫細胞などのヒト免疫細胞を提供する。
５．本開示はまた、外来性の単離された生存可能なミトコンドリアを含まない適応免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞と比較して、Ｂ細胞またはＴ細胞、好ましくはＣＤ８またはＣＤ４免疫細胞などのＴ細胞などの適応免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞の生存率を増強し、かつ／またはそれらの選択を促進するのに有効な量で、外来性の単離された生存可能なミトコンドリア（例えば、細胞に部分的にまたは完全に統合されたミトコンドリアを含む）を含む、免疫細胞、例えばヒト免疫細胞を提供する。
６．本開示はさらに、外因性の単離された生存ミトコンドリアを含まない免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞と比較して、適応免疫細胞、例えばメモリーＴ細胞のメモリー細胞分化および／またはメモリー細胞選択を促進するのに有効な量で、外因性の単離された生存ミトコンドリアを含む免疫細胞、例えばヒト免疫Ｔ細胞を提供する。
７．具体的に、本開示は、単離された生存可能なミトコンドリアを含まない免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞と比較して、メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の生存率を増強し、かつ／またはメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の選択を促進するのに有効な量で、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含む免疫細胞、例えばヒトＴ免疫細胞を提供する。いくつかの特定の態様では、単離された生存可能なミトコンドリアは、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含まない免疫細胞と比較して、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の生存率を増強し、かつ／またはセントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の選択を促進するのに有効な量である。いくつかの他の特定の態様では、単離された生存可能なミトコンドリアは、単離された生存可能なミトコンドリアを含まない免疫細胞と比較して、エフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の生存率を増強し、かつ／またはエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の選択を促進するのに有効な量である。
８．具体的に、本開示は、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含まない免疫細胞、例えばＣＤ４免疫細胞などのヒト適応免疫細胞と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の生存率を増強し、かつ／またはＴｒｅｇ細胞の選択を促進するのに有効な量で、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含む免疫細胞、例えばヒトＴ免疫細胞などのヒト免疫細胞を提供する。
９．また、本明細書には、前記項目のいずれか１つに記載の免疫細胞、例えば、ヒト適応免疫細胞のヒト免疫細胞などを含む集団も提供される。
１０．本開示はまた、単離された生存可能ミトコンドリアで処理されていない適応免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞と比較して、Ｂ細胞またはＴ細胞、好ましくはＣＤ８免疫細胞またはＣＤ４免疫細胞などのＴ細胞などの適応免疫細胞、例えば、ヒト適応免疫細胞の生存率を増強し、かつ／またはそれらの選択を促進するのに有効な量で、単離された生存可能ミトコンドリアで処理された、ヒト免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞などの免疫細胞、または免疫細胞の組成物を含む組成物を提供する。具体的に、組成物は、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていない免疫細胞、例えば、ヒト適応免疫細胞と比較して、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ、エフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせなど、メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の生存率を増強および／または選択を促進するのに有効な量で、単離された生存可能なミトコンドリアで処理された免疫細胞、例えば、ヒト免疫細胞を含む。具体的に、組成物は、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていないＣＤ４免疫細胞などの免疫細胞、例えば、ヒト適応免疫細胞と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の生存率を増強および／またはその選択を促進するのに有効な量で、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されたヒト免疫細胞、例えば、ヒトＴ細胞などの免疫細胞を含む。
１１．本開示は、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていない免疫細胞と比較して、適応免疫細胞、例えばメモリーＴ細胞のメモリー細胞分化および／またはメモリー細胞選択を促進するのに有効な量で、単離された生存可能なミトコンドリアで処理された免疫細胞を含む組成物、または免疫細胞、例えばヒト免疫細胞の組成物を提供する。
１２．本開示は、免疫細胞を含む組成物または免疫細胞の組成物、例えばヒト免疫細胞を提供し、免疫細胞が、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含まない適応免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞と比較して、Ｂ細胞またはＴ細胞、好ましくはＣＤ８免疫細胞またはＣＤ４免疫細胞などのＴ細胞などの、例えばヒト適応免疫細胞の生存率を増強し、かつ／またはそれらの選択を促進するのに有効な量で、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含む。具体的に、組成物は、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含まない免疫細胞、例えば、ヒト適応免疫細胞と比較して、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせなどのメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の生存率を増強し、かつ／またはそれの選択を促進するのに有効な量で、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含む、免疫細胞、例えば、ヒト免疫細胞を含む。具体的に、組成物は、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含まないＣＤ４免疫細胞などの免疫細胞、例えばヒト免疫細胞と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の生存率を増強し、かつ／またはその選択を促進するのに有効な量で、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含む免疫細胞、例えばヒト免疫細胞を含む。
１３．本開示は、免疫細胞、例えばヒト免疫細胞を含む組成物または免疫細胞、例えばヒト免疫細胞の組成物を提供し、免疫細胞は、単離された生存可能なミトコンドリアを含まない免疫細胞と比較して、適応免疫細胞、例えばメモリーＴ細胞のメモリー細胞分化および／またはメモリー細胞選択を促進するのに有効な量で、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含む。
１４．本開示は、ミトコンドリアで処理されていない免疫細胞、例えばヒト免疫細胞の集団と比較して、Ｂ細胞またはＴ細胞、好ましくはＣＤ８免疫細胞またはＣＤ４免疫細胞などのＴ細胞などの適応免疫細胞の集団、例えばヒト適応免疫細胞の集団の生存率を増強し、かつ／またはそれらの選択を促進するのに有効な量で、単離された生存ミトコンドリアで処理された免疫細胞、例えばヒト免疫細胞を含む組成物、または免疫細胞、例えばヒト免疫細胞の組成物を提供する。
１５．本開示は、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていない免疫細胞の集団と比較して、適応免疫細胞、例えば、メモリーＴ細胞の集団のメモリー細胞分化を増強し、かつ／またはメモリー細胞選択を促進するのに有効な量で、単離された生存可能なミトコンドリアで処理された、免疫細胞、例えば、ヒト免疫細胞を含む組成物、または免疫細胞、例えば、ヒト免疫細胞の組成物を提供する。
１６．本開示は、単離された生存可能ミトコンドリアで処理されていない免疫細胞、例えば、適応免疫細胞と比較して、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせなどのメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の集団のメモリー細胞分化を増強し、かつ／またはその選択を促進するのに有効な量で、単離された生存可能ミトコンドリアで処理された、Ｔ細胞などの免疫細胞、例えば、ヒトＴ細胞を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、ミトコンドリアは、メモリー適応細胞、例えばセントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、またはエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の割合を少なくとも２０％、好ましくは最後の３０％、より好ましくは少なくとも５０％増強することができる。
１７．本開示はまた、免疫細胞、例えばヒト免疫細胞を含む組成物、または免疫細胞、例えばヒト免疫細胞の組成物を提供し、免疫細胞が、外因性の単離されたミトコンドリアを含まない免疫細胞、例えばヒト免疫細胞の集団と比較して、Ｂ細胞またはＴ細胞、好ましくはＣＤ８免疫細胞またはＣＤ４免疫細胞などのＴ細胞などの適応免疫細胞、例えばヒト適応免疫細胞の集団の生存率を増強し、および／またはそれらの選択を促進するのに有効な量で、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含む。
１８．本開示は、免疫細胞、例えばヒト免疫細胞を含む組成物、または免疫細胞の組成物を提供し、免疫細胞が、外因性ミトコンドリアを含まない免疫細胞、例えばメモリーＴ細胞の集団と比較して、メモリー細胞の分化を増強し、かつ／または適応免疫細胞の集団内の適応免疫細胞のメモリー細胞選択を促進するのに有効な量の外因性単離された生存ミトコンドリアを含む。
１９．具体的に、本開示は、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含まない免疫細胞、例えば適応免疫細胞と比較して、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、エフェクター記憶ＣＤ８ Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせなどのメモリーＣＤ８ Ｔ細胞の集団の生存率を増強する、かつ／またはその選択を促進するのに有効な量で、外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含む、免疫細胞、例えばヒトＴ細胞などのヒト免疫細胞を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、ミトコンドリアは、メモリー適応細胞、例えばセントラルメモリーＣＤ８Ｔ細胞またはエフェクターメモリーＣＤ８Ｔ細胞の割合を少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％増強することができる。
２０．前述の項目のいずれか１つに記載の組成物は、固形状または液体状、好ましくは液体状で製剤化することができる。
２１．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のメモリー免疫細胞（例えば、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）またはメモリー様細胞などの適応免疫細胞の生存率は、適応免疫細胞の自己複製能である。いくつかの他の態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のミトコンドリアによって選択が促進された適応免疫細胞の増強された生存率は、改善された自己複製能である。
２２．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のメモリー免疫細胞（例えば、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）、またはメモリー様免疫細胞などの適応免疫細胞の生存率は、休止期および再刺激時の適応免疫細胞の生存能力である。いくつかの他の態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のミトコンドリアによって選択が促進された適応免疫細胞の生存率の増強は、休止期および再刺激時の生存能力の改善である。
２３．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のメモリー免疫細胞（例えば、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）またはメモリー様免疫細胞などの適応免疫細胞の生存率は、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５のシグナル伝達などのインターロイキンシグナル伝達に応答する適応免疫細胞の能力にある。いくつかの他の態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のミトコンドリアによって選択が促進された適応免疫細胞の生存率の増強は、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５のシグナル伝達などのインターロイキンシグナル伝達に応答する能力の改善である。
２４．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のメモリー免疫細胞（例えば、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）またはメモリー様免疫細胞などの適応免疫細胞の生存率は、適応免疫細胞が活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に抵抗する能力にある。いくつかの他の態様では、適応免疫細胞の生存率の増強は、先行する項目のいずれか１つに記載のミトコンドリアによって選択が促進された適応免疫細胞の能力の改善に起因し、適応免疫の活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に抵抗する能力の改善である。
２５．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のメモリー免疫細胞（例えば、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）、またはメモリー様免疫細胞などの適応免疫細胞の生存率は、ＢＣＬ－ＸＬ、ＢＣＬ－２などの抗アポトーシス分子をアップレギュレートすることによってか、または、ＦａｓおよびＦａｓＬ発現などの、アポトーシス促進性分子をダウンレギュレートすることによって、アポトーシスに抵抗する適応免疫細胞の能力にある。いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のミトコンドリアによって選択が促進された適応免疫細胞の生存の増強は、ＢＣＬ－ＸＬ、ＢＣＬ－２などの抗アポトーシス分子をアップレギュレートすることによってか、またはＦａｓおよびＦａｓＬ発現などの、アポトーシス促進性分子をダウンレギュレートすることによって、アポトーシスに抵抗する能力の改善にある。
２６．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のメモリー免疫細胞（例えば、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）またはメモリー様免疫細胞などの適応免疫細胞の生存率は、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ２ｌ２、Ｍｃｌ１、Ｂｃｌ２ａ１ｄ、Ｂｉｒｃ２、Ｂｉｒｃ３、Ｘｉａｐ、およびＣｆｌａｒからなる群から選択される遺伝子の発現に影響を与えるエピジェネティックな修飾および転写改変を発現する適応免疫細胞の能力にある。いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のミトコンドリアによって選択が促進された適応免疫細胞の生存率の増強は、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ２ｌ２、Ｍｃｌ１、Ｂｃｌ２ａ１ｄ、Ｂｉｒｃ２、Ｂｉｒｃ３、ＸｉａｐおよびＣｆｌａｒからなる群から選択される遺伝子の発現に影響を与えるエピジェネティックな修飾および転写改変を産生する能力の改善にある。
２７．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のメモリー免疫細胞（例えば、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）またはメモリー様免疫細胞などの適応免疫細胞の生存率は、適応免疫細胞がその長いテロメアを維持する能力にある。いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のミトコンドリアのその選択が促進された適応免疫細胞の増強された生存率は、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていないか、または外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含まない免疫細胞と比較して、長いテロメアを維持する改善された能力にある。
２８．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のメモリー免疫細胞（例えば、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）またはメモリー様免疫細胞などの適応免疫細胞の生存率は、単離された生存可能なミトコンドリアで処理されていないか、または外因性ミトコンドリアを含まない免疫細胞と比較して、適応免疫細胞が増殖するか、または持続性を示す能力、またはそれらの組み合わせにある。
２９．いくつかの態様では、適応免疫細胞、例えば、前述の項目のいずれか１つに記載のメモリー免疫細胞（例えば、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）、またはメモリー様免疫細胞の生存率は、単離物生存可能なミトコンドリアで処理されていないか、または外因性ミトコンドリアを含まない免疫細胞と比較して、適応免疫細胞の消耗の減少にある。
３０．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の組成物は、医薬組成物である。いくつかの他の態様では、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、ヒト免疫細胞への送達用に製剤化される。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、ヒト組織および／または臓器への送達用に製剤化される。薬学的に許容される担体には、薬学的投与に適合する、生理食塩水、分散媒、等張剤などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、クレブス緩衝液、タイロード溶液、造影剤、もしくはオムニパック、またはそれらの混合物である。いくつかの他の態様では、担体は、３００ｍＭスクロース、１０ｍＭ Ｋ＋－ＨＥＰＥＳ（カリウム緩衝（４－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－ピペラジンエタンスルホン酸）、ｐＨ７．２）、１ｍＭ Ｋ＋－ＥＧＴＡ、（カリウム緩衝化エチレングリコールテトラ酢酸、ｐＨ８．０）を含む緩衝液、２５０ｍＭスクロース、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｈ、２０ｍＭ Ｋ－１５ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、および０．５ｍＭ Ｋ－ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）、またはＲＰＭＩ１６４０培地ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５００ｍｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、６１８７００１０）を含む緩衝液である。
３１．いくつかの態様では、前述の項目のいずれかに１つの記載の免疫細胞、例えば、適応免疫細胞などのヒト免疫細胞は、生物学的起源の血液および他の液体試料、固形組織試料、それに由来する細胞の組織培養物およびその子孫、生物学的試料から単離された細胞の群から選択される生体試料に由来する。
３２．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞は、生存可能な真核細胞から産生される。いくつかの他の態様では、免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで産生される。
３３．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞、例えば、適応免疫細胞などのヒト免疫細胞は、同種免疫細胞または自己免疫細胞である。いくつかの態様では、免疫細胞は異種である。
３４．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞、例えば適応免疫細胞などのヒト免疫細胞は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む幹細胞から産生される。
３５．いくつかの態様では、前述の項目のいずれかに係る免疫細胞は、好ましくは哺乳動物免疫細胞、より好ましくはヒト免疫細胞である。
３６．いくつかの態様では、免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、操作または増殖された天然の免疫細胞を含み得るが、これらに限定されない。
３７．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞は、好ましくは、Ｂリンパ球またはＴリンパ球、好ましくはＴリンパ球などの適応免疫細胞である。いくつかの態様では、適応免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖されたＢリンパ球またはＴリンパ球、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖されたＴリンパ球である。
３８．いくつかの態様では、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫細胞は、限定されないが、アルファ－ベータＴ細胞（αβＴ細胞）、ガンマ－デルタＴ細胞（γδＴ細胞）、ＣＤ４免疫細胞、ＣＤ８免疫細胞、またはそれらの組み合わせなどのＴリンパ球である。いくつかの態様では、Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞（例えば、組織常在性メモリー（Ｔｒｍ）細胞、Ｔｓｃｍ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクターメモリー細胞）、メモリー様Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせである。いくつかの他の態様では、Ｔ細胞は、好ましくはメモリーＴ細胞である。いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞、例えばヒト免疫細胞は、多能性幹細胞由来免疫細胞である。いくつかの他の態様では、Ｔリンパ球は、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈ）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、メモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである。いくつかの他の態様では、Ｔ細胞は、好ましくは制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。いくつかの態様では、免疫細胞は、粘膜関連インバリアントＴ細胞である。いくつかの他の態様では、免疫細胞は、血液中を循環するＴ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
３９．いくつかの態様では、前述の項目のいずれかの免疫細胞は、好ましくは、血液中を循環するＣＤ８ Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、例えばＣＤ８ ＴＩＬ、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞、メモリーＣＤ８ Ｔ細胞（例えば、Ｔｒｍ ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｔｓｃｍ ＣＤ８ Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）、メモリー様ＣＤ８ Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせなどであるがこれらに限定されない、ＣＤ８ Ｔ細胞である。いくつかの好ましい態様では、ＣＤ８ Ｔ細胞はＴＩＬである。いくつかのより好ましい態様では、免疫細胞は、メモリーＣＤ８ Ｔ細胞、特に、エフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせである。いくつかの好ましい態様では、免疫細胞は、メモリー様ＣＤ８ Ｔ細胞である。
４０．いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞、エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、またはＴｈ１７）、メモリーＣＤ４ Ｔ細胞、メモリー様ＣＤ４ Ｔ細胞、調節性ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、血液中を循環するＣＤ４ Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）ＣＤ４ Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせなどのＣＤ４ Ｔ細胞である。好ましくは、ＣＤ４ Ｔ細胞はＴｒｅｇ細胞、例えばヒト調節性（Ｔｒｅｇ）ＣＤ４ Ｔ細胞である。
４１．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞、例えば、ヒト免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８ ＣＡＲ－Ｔ細胞などがキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）および／または人工Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）サブユニットを発現する操作された免疫細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＣＡＲ Ｔ細胞は、典型的には、抗原結合部分（例えば、抗原結合ドメインまたはその抗原結合フラグメント）、膜貫通成分、およびその同族リガンド（ｃｏｇｎａｔｅ ｌｉｇａｎｄｓ）に結合する抗原結合部分に応答して免疫細胞を活性化するように選択された一次細胞質シグナル伝達配列を含む。いくつかの態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の基本成分としては、以下、（１）腫瘍特異的モノクローナル抗体の可変重鎖（Ｖ_Ｈ）および可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）は、Ｔ細胞受容体複合体由来のＣＤ３ζ鎖とインフレームで融合される。（２）Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、通常、柔軟なグリシン－セリンリンカーを用いて互いに連結され、次いでスペーサー（例えば、ＣＤ８ａストークまたはＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３定常ドメイン）によって膜貫通ドメインに結合されて、腫瘍抗原と容易に相互作用できるように細胞表面からｓｃＦｖを伸長させる。いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアを含む操作された免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞である。
４２．いくつかの態様では、ＣＡＲまたは人工ＴＣＲサブユニットは、レンチウイルスまたはアデノウイルスまたはレトロウイルスなどのウイルス、ナノ粒子、あるいは標的化部分に作動可能に結合されたナノ粒子を使用して免疫細胞に導入される。いくつかの態様では、ＣＡＲおよび／または人工ＴＣＲサブユニットをコード化する外因性ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫細胞に導入される。いくつかの態様では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはハイブリッドベクターに由来する。
４３．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞または免疫細胞の集団は、Ｂ細胞成熟抗原（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７としても知られるＢＣＭＡ、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、および１９Ａ２４とも呼ばれる）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１またはＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、Ｔｎ抗原（Ｔｎ ＡｇまたはＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ－１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロテアーゼセリン２１（ＴｅｓｔｉｓｉｎまたはＰＲＳＳ２１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイスＹ抗原、ＣＤ２４、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）、 ステージ特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、 受容体チロシン－タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、 細胞表面に関連するムチン１（ＭＵＣ１）、 上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、 神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、 プロスターゼ、 前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、 伸長因子２突然変異（ＥＬＦ２Ｍ）、 エフリンＢ２、 線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）、 インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、 プロテアソーム（Ｐｒｏｓｏｍｅ、Ｍａｃｒｏｐａｉｎ）サブユニット、β型、９（ＬＭＰ２）、 糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、 ブレークポイントクラスター領域（ＢＣＲ）からなるがん遺伝子融合タンパク質およびＡｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）（ＢＣＲ－Ａｂｌ）、 チロシナーゼ、 エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、 フコシルＧＭ１、 シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）、 ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）、 トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、 高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、 ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、 葉酸受容体β、 腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、 腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、 クローディン６（ＣＬＤＮ６）、 甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、 Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、 染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）、 ＣＤ９７、 ＣＤ１７９ａ、 未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、 ポリシアル酸、 胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）、 ＧｌｏｂｏＨグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分、 乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）、 ウロプラキン２（ＵＰＫ２）、 Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、 アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）、 パンネキシン３（ＰＡＮＸ３）、 Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、 リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）、 嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）、 ＴＣＲガンマ交互読み取り枠タンパク質（ＴＡＲＰ）、 ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、 がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、 がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）、 黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、 染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）、 精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）、 Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）、 アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）、 黒色腫がん精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）、 黒色腫がん精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）、 Ｆｏｓ関連抗原１、 腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、 ｐ５３変異体、 プロステイン、 生存、 テロメラーゼ、 前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１またはガレクチン８）、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）、 ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体、 ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、 肉腫転座ブレークポイント、 黒色腫アポトーシス阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）、 ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）、 Ｎ－アセチルグルコースアミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）、 対ボックスタンパク質ＰＡＸ－３（ＰＡＸ３）、 アンドロゲン受容体、 サイクリンＢ１、 ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルスがん遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）、 ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）、 チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）、 シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）、 ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳすなわちＢｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｓｉｔｅｓ）、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮がん抗原３（Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ｂｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ３）（ＳＡＲＴ３）、 ペアードボックスタンパク質ＰＡＸ－５（Ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｘ－５）（ＰＡＸ５）、 プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）、 リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、 Ａキナーゼアンカータンパク質（Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）（ＡＫＡＰ－４）、 滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、 糖化最終産物の受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ＲＡＧＥ－１）、 腎ユビキタス１（ＲＵ１）、 腎ユビキタス２（ＲＵ２）、 レグマイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）、 ヒトパピローマウイルスＥ６（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ Ｅ６）（ＨＰＶ Ｅ６）、 ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）、 腸由来カルボキシルエステラーゼ（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ）、 熱ショックタンパク質７０－２突然変異（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０－２ ｍｕｔａｔｅｄ）（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）、 ＣＤ７９ａ、 ＣＤ７９ｂ、 ＣＤ７２、 白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、 ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）、 白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｍｅｍｂｅｒ ２）（ＬＩＬＲＡ２）、 ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）、 Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、 骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、 ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＧＦ－ｌｉｋｅ ｍｏｄｕｌｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｕｃｉｎ－ｌｉｋｅ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ２）（ＥＭＲ２）、 リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、 グリピカン－３（ＧＰＣ３）、 Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、 および免疫グロブリンλ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１の群から選択される抗原を含むＣＡＲまたは人工ＴＣＲサブユニットを含む。いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞または免疫細胞の集団は、第１、第２、第３、または第４世代のＣＡＲを含む。
４４．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞の特異的リンパ球活性化受容体アゴニストは、細胞模倣無細胞支持体（ｃｅｌｌ ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ）にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、細胞模倣支持体は常磁性ビーズである。
４５．いくつかの態様では、先行する項目のいずれか１つに記載の免疫細胞は、抗腫瘍または免疫抑制および活性を有する当該技術分野で公知の細胞、例えばエフェクター細胞である。いくつかの他の態様では、免疫細胞は、免疫調節活性（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する細胞である。
４６．前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアは、好ましくは呼吸コンピテントミトコンドリアである。
４７．前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアの有効量は、標的細胞当たり０．０００１ｎｇ～２．５ｎｇのミトコンドリア、例えば、標的細胞あたり０．００１ｎｇ～２．０ｎｇ、例えば０．０１ｎｇ～１．５ｎｇまたは０．０５ｎｇ～１．０ｎｇ、例えば、０．１ｎｇ～０．５ｎｇなどのミトコンドリアである。
４８．前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアは、自己由来または同種異系ミトコンドリアであり得る。いくつかの他の態様では、それらは異種ミトコンドリアである。
４９．いくつかの他の態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアは、新たに単離されるか、または事前に単離され、その後使用まで保存され、例えば、０℃未満の温度で保存され得る。
５０．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアの供給源は、異なる性質のもの、例えば、組織、血液、より具体的には血液中を循環する細胞、または培養細胞であり得る。
５１．いくつかの態様では、単離された生存可能なミトコンドリアは真核細胞ミトコンドリア。いくつかの態様では、ミトコンドリアはヒト細胞株に由来する。
５２．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアは、健康なドナーに由来する。いくつかの態様では、単離された生存可能なミトコンドリアは、患者に由来する。いくつかの態様では、患者はがん患者である。いくつかの他の態様では、患者は、自己免疫疾患に罹患している患者である。いくつかの他の態様では、患者は、移植された患者である。いくつかの他の態様では、患者は、感染性および／または炎症性疾患に罹患している患者である。
５３．いくつかの態様では、単離された生存可能なミトコンドリアは、遺伝子改変を有する自己由来または自己由来の生存可能なミトコンドリアであり得る。いくつかの態様では、単離された生存可能なミトコンドリアは、遺伝子改変を有する同種異系の生存可能なミトコンドリアであり得る。
５４．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つにおいて開示される単離された生存可能なミトコンドリアは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、標的細胞、例えば、免疫細胞に送達され得る。
５５．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つにおいて開示される単離された生存可能なミトコンドリアは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、標的器官および／または組織に、例えば標的器官および／または組織の細胞に送達され得る。
５６．いくつかの態様では、生存可能なミトコンドリアは、以下に記載される単離方法のうちの１つを使用することによって単離され、各方法は、（ｉ）スブチリシンＡなどのエンドペプチダーゼを使用することによって培養細胞、組織、または器官からミトコンドリアを単離する工程、または（ｉｉ）１つ以上のフィルターを通してミトコンドリアを濾過する工程、あるいは（ｉ）スブチリシンＡなどのエンドペプチダーゼを使用することによって培養細胞、組織、または器官からミトコンドリアを単離し、続いて（ｉｉ）１つ以上のフィルターを通してミトコンドリアを濾過する工程を含む。
５７．いくつかの態様では、外因性の生存可能なミトコンドリアは、自己由来ミトコンドリアまたは同種異系ミトコンドリア、遺伝子操作されたミトコンドリア、またはリポソームによって封入されたか、もしくは特定の薬剤に結合されたミトコンドリアであるが、これらに限定されない。
５８．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のミトコンドリア、例えば単離された生存可能なミトコンドリアは、ミトコンドリアで処置されていない免疫細胞または免疫細胞の集団とそれぞれ比較して、適応免疫細胞または適応免疫細胞の集団の生存率を増強し、かつ／またはそれらの選択を促進することができ、ミトコンドリア処置後３日目、例えば、ミトコンドリア処置後３．５日目、または４日目から、好ましくはミトコンドリア処置後５日目から、例えばミトコンドリア処置後６日目、７日目、または８日目から、より好ましくはミトコンドリア処置後９日目から開始する。
５９．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載のミトコンドリア、例えば、単離された生存可能なミトコンドリアは、外因性ミトコンドリアを含まない免疫細胞または免疫細胞の集団とそれぞれ比較して、適応免疫細胞または適応免疫細胞の集団の生存率を増強し、かつ／またはそれらの選択を促進することができ、免疫細胞へのミトコンドリアのミトコンドリア移植後３日目、例えば、ミトコンドリア移植後３．５日目または４日目から、好ましくはミトコンドリア移植後５日目から、例えばミトコンドリア移植後６日目、７日目、または８日目から、より好ましくはミトコンドリア移植後９日目から開始する。
６０．いくつかの態様では、免疫細胞または免疫細胞の集団の生存の増強、例えば、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアでの処置において選択される、適応免疫細胞または適応免疫細胞の集団の生存率の増強は、ミトコンドリアで処置されていない免疫細胞と比較して少なくとも１．２倍である。いくつかの態様では、それは、ミトコンドリアで処理されていない免疫細胞と比較して少なくとも１．３倍、例えば少なくとも１．５倍または２倍である。いくつかの態様では、それは、ミトコンドリアで処置されていない免疫細胞、例えば、適応免疫細胞、または免疫細胞の集団とそれぞれ比較して、１．２倍～５０倍の範囲（倍数で表される）にあり、例えば、１．２～４５、１．２～４０、１．２～３０、１．２～２０、１．２～１５、１．２～１０、１．２～５、１．２～２．５、１．３～５０、１．３～４０、１．３～３０、１．３～２０、１．３～１０、１．３～５、１．３～３．５、１．５～３０、１．５～２５、１．５～２０、１．５～１５、１．５～１０、１．５～５、１．５～３、１．５～２．５、２～５０、２～４０、２～３０、２～２０、２～１５、２～１０、２～５、２～４、３～３０、３～２０、３～１０、３～５、５～５０、５～４０、５～３０、５～２０、５～１０、５～８、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２０、１０～１５、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２０、２０～５０、２０～３０、２０～２５、３０～３５、３０～４０、３０～４５、４０～５０である。
６１．いくつかの態様では、免疫細胞または免疫細胞の集団の生存の増強、例えば、前述の項目のいずれか１つに記載の外因性ミトコンドリアを移植した際に選択される適応免疫細胞または適応免疫細胞の集団の生存の増強は、外因性ミトコンドリアを移植していない免疫細胞と比較して少なくとも１．２倍である。いくつかの態様では、それは、外因性ミトコンドリアを移植されていない免疫細胞と比較して、少なくとも１．３倍、例えば少なくとも１．５倍または２倍である。いくつかの態様では、これは、免疫細胞、例えば、外因性ミトコンドリアを含まない（例えば、移植されない）適応免疫細胞に対して、１．２倍～５０倍の範囲（倍数で表される）にあり、例えば、１．２～４５、１．２～４０、１．２～３０、１．２～２０、１．２～１５、１．２～１０、１．２～５、１．２～２．５、１．３～５０、１．３～４０、１．３～３０、１．３～２０、１．３～１０、１．３～５、１．３～３．５、１．５～３０、１．５～２５、１．５～２０、１．５～１５、１．５～１０、１．５～５、１．５～３、１．５～２．５、２～５０、２～４０、２～３０、２～２０、２～１５、２～１０、２～５、２～４、３～３０、３～２０、３～１０、３～５、５～５０、５～４０、５～３０、５～２０、５～１０、５～８、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２０、１０～１５、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２０、２０～５０、２０～３０、２０～２５、３０～３５、３０～４０、３０～４５、４０～５０である。
６２．本明細書では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞または免疫細胞の集団の生存率を増強し、かつ／またはそれらの選択を促進する方法も提供され、該方法は、（ａ）適応細胞（Ｔ細胞など）活性化を駆動することができる特異的活性化受容体アゴニスト抗体を含む無細胞培地における、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫細胞の活性化する工程、（ｂ）免疫細胞を、単離された生存可能なミトコンドリアを含む医薬組成物に少なくとも３日間、例えば少なくとも５日間曝露する工程を含む。いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞または免疫細胞の集団の生存率を増強し、かつ／または選択を促進する方法は、（ａ）任意選択で、ＩＬ－２などの組換えインターロイキンの存在下で、コーティングされたＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを有する無細胞培地において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫細胞を活性化する工程、（ｂ）免疫細胞を、単離された生存可能なミトコンドリアを含む医薬組成物に少なくとも３日間、例えば少なくとも５日間曝露する工程を二者択一的に含む。
６３．また、本明細書では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞または免疫細胞の集団のメモリー分化および／またはメモリー選択を促進する方法も提供され、該方法は、（ａ）適応細胞（Ｔ細胞など）活性化を駆動することができる特異的活性化受容体アゴニスト抗体を含む無細胞培地において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫細胞の活性化する工程、（ｂ）免疫細胞を、少なくとも３日間、例えば少なくとも５日間、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアを含む医薬組成物に曝露する工程を含む。いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞または免疫細胞の集団のメモリー分化および／またはメモリー選択を促進する方法は、（ａ）任意選択で、ＩＬ－２などの組換えインターロイキンの存在下で、コーティングされたＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを有する無細胞培地における、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫細胞を活性化する工程、（ｂ）免疫細胞を、単離された生存可能なミトコンドリアを含む医薬組成物に少なくとも３日間、例えば少なくとも５日間曝露する工程を二者択一的に含む。
６４．前述の項目のいずれか１つに記載の方法において使用される医薬組成物は、単離された生存可能なミトコンドリアを含み、該ミトコンドリアは、前述の項目のいずれか１つに開示されている。該方法で使用される医薬組成物に含まれる単離された生存可能なミトコンドリアの有効量は、標的細胞あたり０．０００１ｎｇ～２．５ｎｇのミトコンドリア、例えば０．００１ｎｇ～２．０ｎｇ、例えば０．０１ｎｇ～１．５ｎｇまたは０．０５ｎｇ～１．０ｎｇ、例えば、標的細胞あたり０．１ｎｇ～０．５ｎｇのミトコンドリアである。いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の方法において使用される医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含む。担体には、生理食塩水、分散媒、等張剤など、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス緩衝液、タイロード液、造影剤、オムニパック、３００ｍＭスクロースを含む緩衝液、 １０ｍＭ Ｋ＋－ＨＥＰＥＳ（カリウム緩衝（４－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－ピペラジンエタンスルホン酸、ｐＨ７．２）、１ｍＭ Ｋ＋－ＥＧＴＡ（カリウム緩衝化エチレングリコールテトラ酢酸、ｐＨ８．０）、２５０ｍＭスクロース、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｈ、２０ｍＭ Ｋ－１５ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、および０．５ｍＭ Ｋ－ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液、またはＲＰＭＩ１６４０培地 ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５００ｍｌ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、６１８７００１０）が含まれるが、これらに限定されない。医薬組成物は、ミトコンドリアで処理されていないまたはミトコンドリアを移植されていない免疫細胞と比較して、適応性メモリーまたはメモリー様免疫細胞の割合を少なくとも１．１倍、例えば１．２倍、１．３倍、１．５倍、または２倍増強するのに有効な量で、１つ以上の薬学的に許容される担体および単離された生存可能なミトコンドリアを含む。いくつかの実施形態では、メモリーまたはメモリー様免疫細胞の割合の増強は、１．１倍～１００倍の範囲（倍数で表される）であり、例えば、１．１～９９、１．１～９０、１．１～８０、１．１～７０、１．１～６０、１．１～５０、１．１～４０、１．１～３０、１．１～２０、１．１～１０、１．１～５、１．１～２、１．１～１．８、１．１～１．５、１．２～９９、１．２～９０、１．２～８０、１．２～７０、１．２～６０、１．２～５０、１．２～２０、１．２～１０、１．２～５、１．２～２．５、１．３～９０、１．３～８０、１．３～７０、１．３～５０、１．３～４０、１．３～３０、１．３～２０、１．３～１０、１．３～５、１．３～１．５、１．４～１００、１．４～９５、１．４～９０、１．４～８０、１．４～７０、１．４～６０、１．４～５０、１．４～３０、１．４～２５、１．４～２０、１．４～１０、１．４～５、１．４～３、１．４～２．５、１．５～９９、１．５～９５、１．５～９０、１．５～８０、１．５～７０、１．５～６０、１．５～５０、１．５～５０、１．５～４０、１．５～３０、１．５～２０、１．５～１０、１．５～５、１．５～２．５、２～９９、２～９０、２～８０、２～７０、２～６０、２～５０、２～４０、２～３５、２～３０、２～２０、２～１０、２～５、２～４、２～２．５、３～９９、３～９０、３～８０、３～７０、３～６０、３～５０、３～４０、３～３０、３～２５、３～２０、３～１０、４～９９、４～８０、４～７０、４～６０、４～５０、４～５５、４～２５、４～２０、４～１５、４～１０、５～１００、５～８０、５～５０、５～３０、５～２０、５～１０、５．５～９、５．５～７、１０～９０、１０～５０、１０～２０、２０～１００、２０～５０、２５～４０、２０～３５、３０～１００、３０～５０、４０～１００、４０～７０、４０～６０、４０～５０、５０～１００、５０～９０、５０～８０、５０～７０、５５～６５、６０～８０、７５～９０、７５～１００、８０～９０、８０～８５、８５～１００である。
６５．必要とする対象を処置する方法において使用するための、前記項目のいずれか１項に記載の単離された生存ミトコンドリア、または外因性の単離された生存ミトコンドリアで処置された免疫細胞、例えば、ヒトＴ細胞などのヒト免疫細胞も本明細書において提供され、該方法は、対象に、前述の項目のいずれか１つに記載の免疫細胞、または免疫細胞の集団を投与する工程を含む。
６６．本開示はさらに、がん、感染性疾患、炎症性疾患、または自己免疫疾患の処置における使用のための、前記項目のいずれか１つに記載の単離された生存ミトコンドリア、または外因性の単離された生存ミトコンドリアで処置される、免疫細胞、例えばヒトＴ細胞などのヒト免疫細胞を提供する。
６７．また、本明細書において提供されるのは、組成物、例えば、単離された生存ミトコンドリアで処理された免疫細胞または外因性生存ミトコンドリアを含む免疫細胞を含む組成物などの、がん、感染性疾患、炎症性疾患、または自己免疫疾患の治療に使用するのに有効な量の、前記項目のいずれか１つに記載の組成物に係る医薬組成物である。
６８．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の、単離された生存可能なミトコンドリアで処理された、または外因性の単離された生存可能なミトコンドリアを含む免疫細胞または免疫細胞の集団は、必要とするヒト対象におけるがんの処置方法における使用に有効な量で医薬組成物中に製剤化される。
６９．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアで処理された、または外因性の生存可能なミトコンドリアを含む免疫細胞または免疫細胞の集団は、必要とするヒト対象における自己免疫疾患の処置方法における使用に有効な量で医薬組成物中に製剤化される。自己免疫疾患には、多発性硬化症、糖尿病、過敏性腸症候群、セリアック病、クローン病、ループス、乾癬、関節リウマチが含まれるが、これらに限定されない。
７０．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアで処置された、または外因性ミトコンドリアを含む免疫細胞または免疫細胞の集団は、必要とするヒト対象における炎症性疾患の処置方法における使用に有効な量で医薬組成物に製剤化される。
７１．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアで処置された、または外因性ミトコンドリアを含む免疫細胞または免疫細胞の集団は、必要とするヒト対象における移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ ｖｓ ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＧｖＨＤ）の処置方法における使用に有効な量で医薬組成物に製剤化される。
７２．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアで処置された、または外因性ミトコンドリアを含む免疫細胞、例えば抗腫瘍細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞、または免疫細胞の集団は、単離された生存可能なミトコンドリアで処置されないか、または外因性ミトコンドリアを欠く、同等の免疫細胞または同等の免疫細胞の集団よりも、腫瘍細胞をより効果的に、かつ／またはより長く殺傷することなど、腫瘍細胞を殺傷する際に使用するのに有効な量で、医薬組成物中に製剤化される。
７３．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアで処置された、またはミトコンドリアを含む免疫細胞または免疫細胞の集団は、自己免疫疾患における使用に有効な量で、例えば、異常な免疫応答の軽減または予防における使用に有効な量で医薬組成物中に製剤化される。具体的に、自己免疫疾患の場合など、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリア処理された、または外因性の単離されたミトコンドリアを含む免疫細胞または免疫細胞の集団の異常な免疫応答は、単離生存可能ミトコンドリアで処理されていないかまたは外因性ミトコンドリアを欠いている同等の免疫細胞または同等の免疫細胞の集団の応答と比較した場合、軽度（より少ない）および／または完全に存在しない。
７４．いくつかの態様では、前述の項目のいずれか１つに記載の単離された生存可能なミトコンドリアで処理された、または外因性ミトコンドリアを含む免疫細胞または免疫細胞の集団は、医薬組成物に製剤化され、自己細胞移植または同種異系細胞移植を介して、がんの処置を必要とするヒト対象においてがんを処置するのに有効な量で、がんの処置を必要とする対象に移植される。いくつかの態様では、同種異系細胞移植は、（ａ）ドナーから生存可能な血液のサンプルを得る工程、（ｂ）工程（ａ）で得られた血液試料から免疫細胞を分離する工程、（ｃ）免疫細胞に、ＣＡＲまたは人工ＴＣＲサブユニットをコード化する１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを形質導入する工程と、（ｄ）任意選択で、免疫細胞を小分子と接触させる工程と、（ｅ）修飾免疫細胞を、必要とする対象に投与する工程とを含む。
７５．本開示はさらに、必要とする対象におけるがん、感染性疾患、炎症性疾患、または自己免疫疾患の処置における使用に有効な量で、前述の項目のいずれか１つに記載の薬学的に許容される担体に製剤化された単離された生存可能なミトコンドリアを含む薬学的組成物と同時投与するために、免疫細胞、例えばヒト免疫細胞、または免疫細胞の集団を提供する。単離された生存可能なミトコンドリアを含む医薬組成物の同時投与は、免疫細胞の投与前、投与と同時、または投与後であり得る。いくつかの態様では、医薬組成物は、それを必要とする対象への静脈内注射によって免疫細胞と同時投与される。いくつかの態様では、医薬組成物は、腫瘍内注射によって免疫細胞と同時投与される。いくつかの態様では、医薬組成物は、臓器内注射によって、または臓器特異的血管系（ｏｒｇａｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）を介して免疫細胞と同時投与される。いくつかの態様では、対象は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胞巣型横紋筋肉腫（ａｌｖｅｏｌａｒ ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、膀胱がん（例えば、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、骨がん、脳がん（例えば、膠芽細胞腫）、乳がん、肛門、肛門管、または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢、または胸膜のがん、鼻、鼻腔、または中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、胃腸がん腫瘍、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がんおよび肺腺がん）、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、Ｂ慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、網、および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、および尿管がんからなる群から選択されるがんを有する。

【0126】

Ｔ細胞
一実施形態では、外因性ミトコンドリアを含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強される免疫細胞は、リンパ球と呼ばれる白血球の群に属するＴ細胞（Ｔリンパ球とも呼ばれる）である。リンパ球は通常、細胞性免疫に関与する。「Ｔ細胞」における「Ｔ」は、胸腺に由来するか、またはその成熟が胸腺によって影響を受ける細胞を指す。Ｔ細胞は、細胞の表面上に提示される抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる細胞表面タンパク質の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの他のリンパ球型と区別することができる。典型的な免疫応答の間、これらの抗原のＴ細胞受容体への結合は、ＭＨＣ抗原提示との関連で、Ｔ細胞活性化をもたらす細胞内変化を開始する。

【0127】

Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、αβＴ細胞およびγδＴ細胞によって２つの群に分けられる。ＴＣＲ２を有するαβＴ細胞は、主に細胞免疫および免疫調節を媒介する一方、ＴＣＲ１を有するγδＴ細胞は、局所微小環境における免疫ホメオスタシスの維持に加えて、創傷治癒、損傷または形質転換した上皮細胞の除去および過剰な炎症の緩和において重要な機能を果たす。αβＴ細胞およびγδＴ細胞は、自己免疫疾患、腫瘍、および血管疾患において異なる役割を果たす。αβＴ細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の６５～７５％からなる一方、γδＴ細胞は１０％未満を占める。それらは、ＣＤ４およびＣＤ８の異なる表面マーカーを発現し、例えば、αβＴ細胞の６０％はＣＤ４陽性であり、３０％はＣＤ８陽性であり、αβＴ細胞の１％未満が二重陽性（ｂｏｔｈ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）である。

【0128】

本明細書で使用される場合、「活性化Ｔ細胞（ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）」という用語は、例えば、クラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合（ＭＨＣ）マーカーとの関連で提示されるような抗原決定基の認識によって、免疫応答（例えば、活性化Ｔ細胞のクローン増殖）を生じるように刺激されたＴ細胞を指す。Ｔ細胞は、抗原決定基、サイトカイン、および／またはリンホカインならびに分化細胞表面タンパク質のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８など、およびそれらの組み合わせ）の存在によって活性化される。分化タンパク質のクラスターを発現する細胞は、多くの場合、Ｔ細胞の表面上のそのタンパク質の発現について「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」であると言われる（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８の発現について陽性の細胞は、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、またはＣＤ８^＋と呼ばれる）。ＣＤ３およびＣＤ４のタンパク質は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に直接的および／または間接的に関与し得る細胞表面受容体または共受容体である。

【0129】

いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアを含み、かつ／または外因性ミトコンドリアによって増強された免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団は、例えば、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３４などの特定のマーカー、受容体、または細胞表面糖タンパク質を発現する細胞型の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含むように選択または濃縮または精製される。

【0130】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団は、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むように濃縮される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むように濃縮される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団は、少なくとも９０％のＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むように濃縮される。したがって、いくつかの実施形態において、組成物中、遺伝子改変ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも多くの遺伝子改変ＣＤ８^＋Ｔ細胞が存在し、すなわち、ＣＤ４^＋細胞のＣＤ８^＋細胞に対する比は、１未満、例えば、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、または０．５未満である。

【0131】

濃縮免疫細胞集団
いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアを含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強された濃縮細胞集団が提供され、該濃縮細胞集団は、特定の比率またはパーセンテージの１つ以上の細胞型を含むように選択されている。「細胞集団（ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」または「改変細胞集団（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」とは、２個を超える細胞など、細胞の群を意味する。細胞集団は、同じタイプの細胞、またはそれぞれが同じマーカーを含む同質であり得るか、あるいは細胞集団は非同質であり得る。いくつかの例では、細胞集団は、対象から得られた試料に由来し、例えば、骨髄、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、末梢血、または任意の組織から調製された細胞を含む。いくつかの例では、細胞集団は、核酸と接触させられ、該核酸は、異種ポリヌクレオチド、例えば、キメラ抗原受容体をコード化するポリヌクレオチド、誘導性キメラアポトーシス促進性ポリペプチド、または共刺激ポリペプチド、例えば、キメラ骨髄分化一次応答８８（ＭｙＤ８８）または切断型ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドを含む。いくつかの例では、細胞集団および改変細胞集団は、異種ポリヌクレオチドを含む核酸と接触させた元の細胞の子孫である。細胞集団は、例えばＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３４のような、特定のマーカー、受容体、または細胞表面糖タンパク質を発現する細胞タイプを、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％含むように選択、または濃縮、または精製され得る。

【0132】

患者の切除腫瘍からのＴリンパ球の採取およびＴＩＬ細胞の濃縮
外因性ミトコンドリアによって増強されたＴＩＬなどのＴ細胞は、がん患者に由来し得る。ＴＩＬは、切除した腫瘍から得られ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる。適用される方法に依存して、ＴＩＬの単離は、「選択された（ｓｅｌｅｃｔｅｄ）」または「若い（ｙｏｕｎｇ）」ＴＩＬの再注入をもたらす。簡潔に述べると、切除された腫瘍は、酵素消化などによって処理され、ＴＩＬは増殖させられ、高用量のＩＬ－２中で培養される。適切な数の細胞が、自己ＴＩＬの再注入のために得られる必要がある。「選択された（ｓｅｌｅｃｔｅｄ）」ＴＩＬは、腫瘍細胞認識時にサイトカイン産生について試験されるが、「若い（ｙｏｕｎｇ）」ＴＩＬの腫瘍反応性は評価されない。一般に、「選択された（ｓｅｌｅｃｔｅｄ）」ＴＩＬは、がん患者に再導入される前に、培養から腫瘍反応性評価までに３６日までを必要とする。注目すべきことに、「若い」ＴＩＬの増殖プロセスは、１０～２２日間しか必要とせず、一方、「選択された」ＴＩＬと比較して同等の臨床応答を示す。本開示によれば、外因性ミトコンドリアを移植されたＴＩＬは、任意の腫瘍から切除することができ、増殖、再注入のための任意のプロトコルが適用され得る。

【0133】

改変細胞集団における細胞型の選択、濃縮、または精製は、任意の適切な方法によって達成され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合は、フローサイトメトリーによって決定することができる。いくつかの例では、ＭＡＣ列が使用され得る。いくつかの例では、改変細胞集団は、対象への投与前に凍結および解凍され、生存細胞は、対象への投与前に特定の細胞型のパーセンテージまたは比率について試験される。

【0134】

いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、または９９％を含むように選択または濃縮または精製される。

【0135】

本開示によれば、例えば、自己由来ミトコンドリア、同種異系ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、封入ミトコンドリア、または適切な遺伝子改変を有する自己由来ミトコンドリアを含むミトコンドリア調製物は、濃縮Ｔ細胞に送達され得る。

【0136】

患者の血液からのＴリンパ球の採取、およびＴ細胞の濃縮
外因性ミトコンドリアによって増強され、かつ／またはＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞などのＴ細胞は、任意の健康なドナーに由来し得る。ドナーは一般に成人（少なくとも１８歳）であるが、小児もＴ細胞ドナーとして適している（Ｓｔｙｃｚｙｎｓｋｉ，２０１８，“Ｙｏｕｎｇ ｃｈｉｌｄ ａｓ ａ ｄｏｎｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ”，Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ａｐｈｅｒ Ｓｃｉ ５７：３２３－３０）。ドナーからＴ細胞を得るための適切なプロセスの例は、（Ｄｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，“Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｓ ａ ｓａｆｅｔｙ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：１６７３－８３）に記載されている。概して、Ｔ細胞は、ドナーから得られ、遺伝子改変および選択に供され、次いで、レシピエント対象に投与され得る。Ｔ細胞の有用な供給源は、ドナーの末梢血である。末梢血試料は、概して、白血球が濃縮された試料を提供するために白血球除去療法（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）に供される。この濃縮試料（「ロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｋ）」としても知られる）は、単球、リンパ球、血小板、血漿、および赤血球を含む多様な血液細胞から構成され得る。赤血球、血小板、単球、および腫瘍細胞のような夾雑物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ）の排除は、当該技術分野で公知の方法を用いて一般に必要とされる多角的アプローチを必要とする。ロイコパックは、典型的には、静脈穿刺またはバフィーコート製品（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と比較して、より高い濃度の細胞を含有する。

【0137】

再発性がんを有する患者は、低いＴ細胞数を有し得、したがって、十分な自己Ｔ細胞を採取することを困難にする。この問題は、健常ドナーから採取された同種異系Ｔリンパ球を使用するなどにより、当該技術分野で公知の方法によって克服することができる。

【0138】

改変細胞集団における細胞型の選択、濃縮、または精製は、任意の適切な方法によって達成され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合は、フローサイトメトリーによって決定され得る。いくつかの例では、ＭＡＣ列が使用され得る。いくつかの例では、改変細胞集団は、対象への投与前に凍結および解凍され、生存細胞は、対象への投与前に特定の細胞型のパーセンテージまたは比について試験される。ロイコパックにおける、ＣＤ８^＋細胞に対するＣＤ４^＋細胞の比は、典型的には２を超えるが、いくつかの実施形態では、本発明の組成物における、ＣＤ８^＋細胞に対するＣＤ４^＋細胞の比は、２未満、例えば１．５未満である。いくつかの態様において、組成物中にＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも多くのＣＤ８^＋Ｔ細胞が存在し、すなわち、ＣＤ８^＋細胞に対するＣＤ４^＋細胞の比は、１未満、例えば、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、または０．５未満である。したがって、ドナー細胞から開始し、Ｔ細胞を産生する全体的な手順は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８^＋細胞Ｔ細胞を濃縮するように設計される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の６０％以上がＣＤ８^＋Ｔ細胞であり、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の６５％以上がＣＤ８^＋Ｔ細胞である。ＣＤ３^＋Ｔ細胞の集団内で、いくつかの実施形態では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセントは、５５～７５％、例えば、５５％～６５％、５５％～７０％、５６～７１％、６３～７３％、６０～７０％、５９％～７４％、６５～７１％、または６５～７５％である。いくつかの実施形態では、特定の細胞型と別の細胞型との比を含むように選択または濃縮または精製される細胞集団が提供され、例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ４^＋Ｔ細胞との比が、３：２、７：３、４：１、９：１、１９：１、または３９：１、あるいはそれ以上などである。いくつかの実施形態では、改変細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、または９９％のＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むように選択または濃縮または精製される。いくつかの実施形態では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞対ＣＤ４^＋Ｔ細胞の比は、４対１、または９対１、あるいはそれ以上である。

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の共刺激ポリペプチドを含む遺伝子改変ＣＤ３^＋Ｔ細胞の集団について、ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセントは、５５～７５％、例えば、５５～６５％、５５～７０％、５６～７１％、５９～７４％、６３～７３％、６０～７０％、６０～７５％、６５～７５％、または６５～７１％である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ４^＋Ｔ細胞との比は、３：２、７：３、４：１、９：１、１９：１、または３９：１、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドを含む改変細胞集団は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、または９９％のＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むように選択または濃縮または精製される。いくつかの実施形態では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ４^＋Ｔ細胞との比は、４対１、または９対１、あるいはそれ以上である。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＭｙＤ８８、またはＣＤ４０などの１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＭｙＤ８８、またはＣＤ４０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激ポリペプチドは、誘導性または構成的に活性化され得る。

【0140】

いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、または９９％がＣＤ８^＋Ｔ細胞である誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含むＣＡＲ－Ｔ細胞集団を含む組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む改変細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞集団は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド９０％ＣＤ８^＋Ｔ細胞を少なくとも含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、または９９％がＣＤ８^＋Ｔ細胞である、共刺激ポリペプチドおよび誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含むＣＡＲ－Ｔ細胞集団を含む組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドおよび誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む改変細胞集団は、少なくとも８０％がＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドおよび誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む改変細胞集団は、少なくとも９０％がＣＤ８^＋Ｔ細胞である。

【0142】

本開示によれば、例えば、自己由来ミトコンドリア、同種異系ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、封入ミトコンドリア、または適切な遺伝子改変が施された自己由来ミトコンドリアを含むミトコンドリア調製物は、遺伝子改変（例えば、ＣＡＲ遺伝子の導入）が行われる前、それと同時、またはその後に、濃縮Ｔ細胞に送達され得る。

【0143】

ミトコンドリア
本発明は、少なくとも部分的には、単離されたミトコンドリアを、細胞培養物に添加することによってか、あるいはそれらを患者の組織または組織につながる血管にそれぞれ注入することによって、培養細胞または患者の組織に送達（移植ともいう）することができるという発見に基づくものである（Ｃｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ｔｒａｎｓｉｔ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｃｅｌｌｓ”，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１７４５０；ＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ”，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ３４：１２７－３４）。

【0144】

ミトコンドリアは、目的の細胞にｅｘ ｖｉｖｏで送達することができる。目的の細胞には、本明細書に記載の培養細胞、予め操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）、またはさらに操作され（例えば、ＣＡＲもしくは人工ＴＣＲを発現するように）、かつ／または培養される（例えば、分化、活性化、処置、もしくはインキュベートされる）細胞のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。ミトコンドリアは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）など、合成リポソームを使用するリポソーム媒介性移入によってｅｘ ｖｉｖｏで送達することができる（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００８．“Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｌａｂｅｌｅｄ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｉｎｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ”，Ｅｔｈｎ．Ｄｉｓ．１８：Ｓ１－４３）。ミトコンドリアは、本明細書に記載の免疫細胞のいずれかなどの細胞の、ミトコンドリアとの共インキュベーション（すなわち、共培養）によって、２～２４時間の期間にわたって、ｅｘ ｖｉｖｏで送達することができる（Ｍａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，“Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ｆｒｏｍ ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ”，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４：Ｈ９６６－８２）。理論に束縛されることを望まないが、移植されたミトコンドリアは、アクチン依存性経路によって内部移行される。以前に心筋細胞で示されたようなミトコンドリアの内在化は、１時間の共インキュベーションで起こる可能性がある。（Ｐａｃａｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１５，“Ａｃｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，Ｂｉｏｌ Ｏｐｅｎ ４：６２２－６）。

【0145】

ミトコンドリアはまた、標的部位への直接注入によって、あるいは対象の冠動脈、対象の肺動脈、対象の肝門脈、対象の大膵動脈、対象の腎動脈、または対象の前立腺動脈などの臓器または組織特異的血管系を介した送達によって、臓器または組織に送達され得る。後者の場合、ミトコンドリアは下流の器官または組織に保持される。例えば、冠状動脈を介して投与される場合、ミトコンドリアはほぼ排他的に心臓に送達されるが（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９，“Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ”，ＪＡＣＣ：Ｂａｓｉｃ ｔｏ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．８，２０１９）、ミトコンドリアは肺動脈を介して肺に送達され得るか、または腎動脈を通じた送達によって腎臓に送達され得る。ミトコンドリアの直接注射は、注射されたミトコンドリアの局所的濃縮を可能にする。注射に使用されるミトコンドリアの数は、標的臓器または組織のサイズ、ならびに意図される用途に応じて変動し得る。ミトコンドリアをホモジナイズ緩衝液に懸濁し、例えば、２８～３２ゲージの針を有するツベルクリンシリンジを用いて様々な部位に注射することができる（Ｅｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ”，Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ １５４：２８６－９；ＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ”，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ３４：１２７－３４）。

【0146】

ｉｎ ｖｉｖｏでのミトコンドリア移植は、自己由来ミトコンドリアまたは異種ミトコンドリアの単回注入または連続注入を用いて行うことができ、直接的または間接的、急性または慢性の同種反応性、同種認識性、または損傷関連分子パターン分子は存在しない（Ｒａｍｉｒｅｚ－Ｂａｒｂｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９，“Ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｌｌｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ ａｎｄ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ”，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ４６：１０３－１５）。

【0147】

理論に束縛されることを望まないが、実行可能な、呼吸コンピテントミトコンドリアは、エンドサイトーシスによって虚血組織および非虚血組織の両方に取り込まれる（Ｃｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，“Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｈｅａｒｔ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ”， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１：ｅ０１６０８８９；Ｋｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ”，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２６０５７；Ｃｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ｔｒａｎｓｉｔ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｏｎｄｒｉａ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｃｅｌｌｓ”，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１７４５０）。

【0148】

熟練した医師は、比較的単純な医療手順を使用して、種々の目的のためにミトコンドリアを患者の組織および／または細胞に局所的におよび／または全体に分配することができる。ナノ粒子を含むいくつかの伝統的な治療レジメンと比較して、ミトコンドリアは毒性がなく、かついかなる実質的に有害な免疫応答または自己免疫応答も引き起こさないことがさらに注目される。

【0149】

いかなる理論にも拘束されることを意図しないが、注入されたミトコンドリアは、最初に内皮に付着することによって毛細血管壁を通って血管外遊出すると考えられる。それらが動脈に注射または注入された後、ミトコンドリアは血管の内皮を通過し、エンドソームアクチン依存性内在化プロセスを通して組織細胞によって取り込まれ得る。

【0150】

ｉｎ ｖｉｖｏでのミトコンドリア移植は、本明細書で提供される外因性ミトコンドリア（例えば、外因性の単離された生存可能なミトコンドリア）と共に、本明細書で記載される目的の細胞のいずれかの同時投与を含むことができる。いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞は、患者における疾患を治療するための目的の細胞の所望の治療効果を促進または増強するために同時投与される。目的の細胞には、本明細書に記載の免疫細胞、培養細胞、予め操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）、またはさらに操作される（例えば、ＣＡＲもしくは人工ＴＣＲを発現するように）細胞のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞が異なる医薬組成物に含まれる実施形態では、外因性ミトコンドリアの投与は、目的の細胞の投与前、投与と同時、または投与後に行うことができる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約１ヶ月以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約１週間以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約５、４、３または２日以内に起こる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約１日以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約１２時間以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約６時間以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約３時間以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約２時間以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約１時間以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約３０分以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに約１５分以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の投与は、互いに数分以内に行われる。いくつかの態様では、外因性ミトコンドリアおよび目的の細胞の同時投与は、外因性ミトコンドリアおよび／または目的の細胞の反復投与を含む。

【0151】

ミトコンドリアの単離
本明細書に記載の方法で使用するためのミトコンドリアは、任意の供給源から単離または提供すること、例えば、培養細胞または組織から単離することができる。例示的な細胞には、とりわけ、筋組織細胞、心臓線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞、前立腺がん細胞、酵母、およびそれらの任意の混合物が含まれるが、これらに限定されない。例示的な組織には、肝臓組織、骨格筋、心臓、脳、および脂肪組織が含まれるが、これらに限定されない。ミトコンドリアは、自己起源、同種起源、および／または異種起源の細胞または組織（例えば、生検材料）から単離することができる。いくつかの例では、ミトコンドリアは、遺伝子改変を有する細胞、例えば、修飾ｍｔＤＮＡまたは修飾核ＤＮＡを有する細胞から単離される。

【0152】

ミトコンドリアは、当業者に公知の任意の手段によって細胞または組織から単離することができる。一例では、組織試料または細胞試料は、採取され、次いでホモジナイズされる（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ）。均質化に続いて、ミトコンドリアは、反復遠心分離によって単離する（Ｋｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ”，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２６０５７）。あるいは、細胞ホモジネート（ｃｅｌｌ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）は、ナイロンメッシュフィルターを通して濾過することができる。ミトコンドリアを単離する典型的な方法は、例えば、ＭｃＣｕｌｌｙ ＪＤ，Ｃｏｗａｎ ＤＢ，Ｐａｃａｋ ＣＡ，Ｔｏｕｍｐｏｕｌｉｓ ＩＫ，Ｄａｙａｌａｎ Ｈ ａｎｄ Ｌｅｖｉｔｓｋｙ Ｓ，“Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ”，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６，Ｈ９４－Ｈ１０５ ＰＭＣ２６３７７８４（２００９）；Ｆｒｅｚｚａ，Ｃ．，Ｃｉｐｏｌａｔ，Ｓ．，＆Ｓｃｏｒｒａｎｏ，Ｌ，“Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ，ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｉｌｒｏｂｌａｓｔｓ”，Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２（２），２８７－２９５（２００７）、および“Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｉｓｏｌａｔｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ”という題名のＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３５５８４；ＷＯ ２０１５１９２０２０）、これらのそれぞれは、参照により援用される。

【0153】

治療において使用されるか、または医薬組成物に含まれるミトコンドリアは、自己起源、同種起源、または異種起源の細胞または組織から単離することができる。いくつかの場合では、ミトコンドリアは、対象の培養細胞または組織から採取され、これらのミトコンドリアは、同じ対象に投与して戻した（自己）。いくつかの他の場合において、ミトコンドリアは、第２の対象の培養細胞（例えば、ヒト心臓線維芽細胞）、または組織から採取され、これらのミトコンドリアは、第１の対象（同種異系）に投与される。いくつかの場合では、ミトコンドリアは、異なる種（例えば、マウス、ブタ、および酵母）（異種）由来の培養細胞または組織から採取される。

【0154】

本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、ミトコンドリアは、異なる供給源を有し得、例えば、外因性ミトコンドリアは、自己由来、自家由来、同種異系、または異種であり得る。特定の実施形態では、ミトコンドリアは新鮮に単離されている（組織生検試料を採取した後から１２０分以内、好ましくは６０分以内、より好ましくは３０分以内）。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアは単離され、その後、使用まで保存されている。特定の実施形態では、自己由来ミトコンドリアは、外因性ｍｔＤＮＡを有し得る。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアは、対象の第一度近親者に（ｓｕｂｊｅｃｔ’ｓ ｆｉｒｓｔ－ｄｅｇｒｅｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ）由来する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアはカプセルに封入されている。

【0155】

いくつかの実施形態では、記載される方法は、投与前に、細胞から単離されたミトコンドリアを採取する工程を含む。単離されたミトコンドリアは、目的の細胞、例えば、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞のいずれかに移植され得るか、または目的の細胞による処置と併せて対象に投与され得る。

【0156】

エンジニアリング発現構築物（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）
いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアを含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強される免疫細胞は、本明細書で使用されるＣＡＲを発現するように操作されるなどのように操作され、「ｃＤＮＡ」という用語は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して調製されたＤＮＡを指すことが意図される。ゲノムＤＮＡまたはゲノム、未処理または部分処理されたＲＮＡ鋳型から重合されたＤＮＡとは対象的に、ｃＤＮＡを使用する利点は、ｃＤＮＡが対応するタンパク質のコード配列を主に含有することである。非コード領域が最適な発現に必要とされる場合、またはイントロンなどの非コード領域がアンチセンス戦略において標的とされる場合など、完全または部分的なゲノム配列が使用される場合がある。

【0157】

いくつかの実施形態では、核酸構築物、例えば、本明細書に記載のキメラ抗原受容体のいずれも、ウイルスベクター内に含まれる。特定の実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、細胞をｅｘ ｖｉｖｏでウイルスベクターと接触させ、いくつかの実施形態では、細胞をｉｎ ｖｉｖｏでウイルスベクターと接触させることを理解されたい。したがって、発現構築物は、ベクター、例えばウイルスベクターまたはプラスミドに挿入され得る。提供される方法の工程は、任意の適切な方法を使用して実施され得、これらの方法は、本明細書に記載される、核酸を細胞に形質導入する方法、形質転換する方法、または別様に提供する方法を含むが、それらに限定されない。

【0158】

本明細書で使用される場合、「遺伝子（ｇｅｎｅ）」という用語は、機能的タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドコード化ユニットとして定義される。理解されるように、この機能的用語は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびに、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および／または突然変異体を発現するか、または発現するように適合される、より小さい操作された遺伝子セグメントを含む。

【0159】

プロモーターおよび他の調節エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。さらに、このプロモーターのリストは、網羅的または限定的であると解釈されるべきでなく、本明細書に開示されるプロモーターおよび方法と併せて使用される他のプロモーターである。

【0160】

ＣＡＲ遺伝子などの発現構築物は、ウイルス媒介性組み込みなどを介してゲノムにランダムに組み込まれ得るか、またはＣＣＲ５およびＡＡＶＳ１遺伝子座を含むがそれらに限定されないＴ細胞ゲノムなどの免疫細胞ゲノムの特定の部位、もしくはＴ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座に意図的に組み込まれ得る。標的化組み込み（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）ｓｙｓｔｅｍ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集系などの遺伝子編集ツールを使用することができる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９，“Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ”，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：４５６）。

【0161】

共刺激
いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアを含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強される免疫細胞は、共刺激ポリペプチドを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞などのＣＡＲを発現するように操作された免疫細胞である。いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアを含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強される免疫細胞は、共刺激ポリペプチドを含むＣＡＲ－Ｔ細胞である。ＣＡＲは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０を含むが、これらに限定されないＴ細胞共刺激分子の細胞質部分に由来するものなどの共刺激ドメインを含むように操作され得（例えば、Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６：３３６０－３３６５；Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：２７９１－２７９７；Ｈｏｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：６１２３－６１３１；Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：７０－７５；Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １８：６７６－６８４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １８：７１２－７２５；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３：５５６３－５５７４；Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：１４５３－１４６４；Ｙｖｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：５８５２－５８６０を参照されたい）、これにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的抗原のエンゲージメントの際に適切な共刺激を受けることを可能にする。

【0162】

本発明の共刺激ポリペプチドは、誘導性または構成的に活性化され得る。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＭｙＤ８８、もしくはＣＤ４０などの１つ以上の共刺激シグナル伝達領域、または、例えば、その細胞質領域を含むことができる。共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＭｙＤ８８、またはＣＤ４０によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する１つ以上の適切な共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激ポリペプチドには、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリー（すなわち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ－Ｒ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ）、およびＣＤ２８ファミリーメンバー（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）のＮＦ－κＢ経路、Ａｋｔ経路、および／またはｐ３８経路を活性化する任意の分子またはポリペプチドが含まれる。複数の共刺激ポリペプチドまたは共刺激ポリペプチド細胞質領域が、本明細書で論じられる改変Ｔ細胞において発現され得る。

【0163】

いくつかの実施形態では、誘導性キメラシグナル伝達ポリペプチドは、例えば、４－１ＢＢおよびＣＤ２８などの２つの共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域、またはＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０からなる群から選択される１つもしくは２つ以上の共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む。

【0164】

ベクター
いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリア（例えば、自己由来、同種異系ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、封入ミトコンドリア、または適切な遺伝子改変を伴う自家由来ミトコンドリアとして）を含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強される免疫細胞の集団は、ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、または環状ＲＮＡベクターから産生されるＣＡＲまたは人工ＴＣＲサブユニットを含む。本明細書で提供されるベクターは、領域の位置や順序を変えたり、ある領域を別の領域に置き換えたりするために、当該技術分野で公知の方法を用いて改変され得ることが理解され、ベクターが、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、Ｈｅｒ２、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１などの１つ以上の標的抗原に特異的な抗原結合ドメインを、例えば、ＣＡＲ構築物の一部としてコード化できる。ベクターはまた、本明細書で議論されるように、各ポリペプチド領域の適切な置換で修飾され得る。

【0165】

ベクターは、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＮＣＥ、およびＤＡＰ１０からなる群から選択されるものなど、１つまたは２つ以上の共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を、例えばＣＡＲ構築物の一部として、コード化することができる。ベクターは、例えば、ＣＡＲポリペプチドと共刺激ポリペプチドとの間のリンカーなどのＣＡＲ構築物の一部として、リンカーをコード化し得る。本発明のＴ細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）などの操作された免疫細胞は、誘導性自殺遺伝子または自殺スイッチとしても知られる安全スイッチを発現し得、これは、所望される場合、例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が発症する場合、操作された免疫細胞をｉｎ ｖｉｖｏで根絶するために使用され得る。いくつかの例では、キメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞は、オンターゲットオフ腫瘍毒性などの有害事象を誘発する患者に提供される。いくつかの治療的事例では、患者は、ＣＡＲ改変細胞を使用する治療中にいくつかの陰性症状を経験し得る。いくつかの場合は、これらの療法は、部分的には健康な組織に対する非特異的攻撃に起因する有害事象をもたらした。いくつかの例では、治療用に操作された免疫細胞（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）は、もはや必要とされ得ず、または治療は、指定の時間量にわたって意図され、例えば、治療用に操作された免疫細胞は、腫瘍細胞または腫瘍サイズを減少させるように作用され得、もはや必要とされ得ない。したがって、いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞が、誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドなどの安全スイッチも発現する核酸、細胞、および方法が提供される。当該技術分野で公知の他の自殺スイッチ系（ｓｕｉｃｉｄｅ ｓｗｉｔｃｈ ｓｙｓｔｅｍｓ）には、（ａ）非毒性プロドラッグガンシクロビル（ＧＣＶ）をＧＣＶ－トリホスフェートに変え、ＤＮＡ複製を停止することによって細胞死をもたらす単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）－ｔｋ、（ｂ）ｉＣａｓｐ９が小分子ＡＰ１９０３に結合し、内因性アポトーシス経路を活性化する二量体化（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）をもたらすこと、および（ｃ）形質導入されたｉＮＫＴ細胞において発現される、標的可能な表面抗原（例えば、ＣＤ２０および切断型ＥＧＦＲ）は、関連するモノクローナル抗体の投与後に補体／抗体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ／ＡＤＣＣ）を介して改変細胞を効率的に排除することを可能にすることが含まれるが、これらに限定されない。例えば、操作された免疫細胞の数を減少させる必要がある場合、誘導性リガンドは患者に投与され、それによって操作された免疫細胞のアポトーシスを誘導することができる。これらのスイッチは、操作された免疫細胞を根絶することが望まれる場合に供給され、かつ細胞死をもたらす（例えば、壊死またはアポトーシスを誘発することによって）薬剤などのトリガに応答する。これらの薬剤は、毒性遺伝子産物の発現をもたらすことができるが、操作された免疫細胞が、薬剤に応答して毒性形態に切り替えられるタンパク質をすでに発現する場合、より迅速な応答を得ることができる。

【0166】

選択マーカー
特定の実施形態では、発現構築物は、発現構築物中にマーカーを含めることによって、その発現がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで同定される核酸構築物を含む。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を与え、発現構築物を含有する細胞の容易な同定を可能にする。通常、薬物選択マーカーを含めることは、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素が使われる。細胞外非シグナル伝達ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ，ｎｏｎ－ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、または種々のタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）を含有する免疫学的表面マーカーもまた使用することができ、磁気または蛍光抗体媒介選別のための簡単な方法を可能にする。使用される選択可能なマーカーは、遺伝子産物をコード化する核酸と同時に発現することができる限り、重要であるとは考えられない。選択マーカーのさらなる例には、例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β－ｇａｌ、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーターが含まれる。

【0167】

リンカーポリペプチド
リンカーポリペプチドには、例えば、切断可能および非切断可能リンカーポリペプチドが含まれる。切断不可能なポリペプチドは、例えば、共刺激ポリペプチドの細胞質シグナル伝達領域と、キメラ抗原受容体（例えば、ＣＤ３ζ）のＩＴＡＭ部分との間で動作可能に連結され得る任意のポリペプチドを含み得る。リンカーポリペプチドには、例えば、約２～約３０アミノ酸からなるものが含まれる（例えば、（ＧＧＧＧＳ）_ｎなどのフューリン切断部位（ｆｕｒｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、またはグリシン－セリンリンカー）。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、約１８～２２のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは２０のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、集団中の改変細胞に外因性の酵素、例えば、トランスフェクションまたは形質導入によって細胞に導入されるポリヌクレオチドによってコード化される酵素によって、リンカーをコード化するポリヌクレオチドと同時にまたは異なる時点で、切断されるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、例えば、細胞において天然に発現される酵素、および、例えば、リゾチームなどの、細胞に天然のポリヌクレオチドによってコード化される酵素を含む、集団における改変細胞に対して内因性の酵素によって切断されるリンカーを含む。

【0168】

治療への応用
本明細書で提供される外因性ミトコンドリア、例えば外因性単離生存可能なミトコンドリアで増強された免疫細胞（自己由来ミトコンドリア、同種異系ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、封入ミトコンドリアまたは遺伝子改変を伴うミトコンドリアが移植された免疫細胞など）は、標的が関与する任意の疾患または疾病の処置に有用であり得る。本出願が免疫細胞（結合剤特異的ではない）の一般的な適用を開示する場合、標的細胞分子として「腫瘍関連抗原」（「ＴＡＡ」）を使用することができる。いくつかの実施形態では、疾患または疾病は、養子細胞療法による処置から利益を得ることができる疾患または疾病である。いくつかの実施形態では、疾患または疾病は、腫瘍である。いくつかの実施形態では、疾患または疾病は、細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態では、疾患または疾病は、がんである。いくつかの実施形態では、疾患または疾病は、ウイルス感染である。いくつかの実施形態では、疾患または疾病は、自己免疫疾患である。

【0169】

いくつかの実施態様では、本明細書には、疾患または疾病の処置を必要とする対象において疾患または疾病を処置する方法が提供され、該方法は、対象に、本明細書に提供される外因性ミトコンドリアで増強された免疫細胞、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏで外因性ミトコンドリアを事前に移植された免疫細胞を有効量で投与することによる。いくつかの実施態様では、本明細書には、疾患または疾病の処置を必要とする対象において疾患または疾病を処置する方法が提供され、該方法は、対象に、本明細書に提供される外因性ミトコンドリアと共に、免疫細胞を有効量で同時投与することによる。いくつかの態様では、疾患または疾病は、がんである。いくつかの態様では、疾患または疾病は、ウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、疾患または疾病は、自己免疫疾患である。

【0170】

任意の適切ながんは、本明細書で提供される外因性ミトコンドリアで増強された免疫細胞で処置され得る。例示的な適切ながんとしては、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、基底細胞がん、脳腫瘍、胆管がん、膀胱がん、骨がん、乳がん、気管腫瘍、原発不明のがん腫、心臓腫瘍、子宮頸がん、脊索腫、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、腺管がん、胚性腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼がん、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍、妊娠性栄養芽細胞性疾患、神経膠腫、頭頸部がん、肝細胞がん、組織球症、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、咽頭下がん、眼内黒色腫、島細胞腫、カポジ肉腫腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭がん、口唇および口腔がん、肝臓がん、上皮内小葉がん、肺がん、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、不顕性原発性を伴う転移性扁平上皮がん、ＮＵＴ遺伝子を伴う正中管がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、真菌症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および傍鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管がん、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、小腸がん、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、奇形腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫および胸腺がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、膣がん、外陰部がん、およびウィルムス腫瘍。

【0171】

併用療法
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される外因性ミトコンドリアで増強されたＴ細胞またはＣＡＲ Ｔ細胞などの免疫細胞は、少なくとも１つの追加の治療剤とともに投与される。外因性ミトコンドリアで増強された免疫細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで外因性ミトコンドリアを事前に移植された免疫細胞、またはｉｎ ｖｉｖｏで外因性ミトコンドリアが免疫細胞に移植されるように外因性ミトコンドリアと同時投与された免疫細胞を含み得る。任意の適切な追加の治療剤は、本明細書に提供される外因性ミトコンドリアで増強された免疫細胞と共に投与され得る。いくつかの態様では、追加の治療剤は、放射線、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、抗ホルモン剤、ＥＧＦＲ阻害剤、免疫刺激剤、抗血管新生剤、チェックポイント遮断剤、およびそれらの組み合わせから選択される。

【0172】

いくつかの実施形態では、追加の治療剤は免疫刺激剤を含む。

【0173】

いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、免疫細胞の阻害性受容体のシグナル伝達を遮断する薬剤またはそのリガンドである。いくつかの態様では、阻害受容体またはリガンドは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１またはＣＤ２７９としても知られる）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ２７４としても知られる）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＣＤ２２３としても知られるＬＡＧ－３）、Ｔｉｍ－３（Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２またはＨＡＶＣＲ２またはＣＤ３６６）、ニューリチン、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡまたはＣＤ２７２も）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、薬剤は、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ペンブロリズマブまたはニボルマブ）、および抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ）、抗ＴＩＭ３抗体、がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＣＡＭ－１、さらにＣＤ６６ａ）、および５（ＣＥＡＣＡＭ－５、またＣＤ６６ｅ）、ｖｓｅｔ免疫調節受容体（さらに、ＶＩＳＲまたはＶＩＳＴＡ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（さらに、ＬＡＩＲ１またはＣＤ３０５）、ＣＤ１６０、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（さらに、ＣＤ２４４またはＳＬＡＭＦ４）、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、薬剤はペンブロリズマブである。いくつかの態様では、薬剤はニボルマブである。いくつかの態様では、薬剤はアテゾリズマブである。

【0174】

いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤である。いくつかの態様では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する追加の治療剤は、抗体、ペプチド模倣体、および小分子から選択される。いくつかの態様では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する追加の治療剤は、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（商標））、ピジリズマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、スルファモノメトキシン１、およびスルファメチゾール２から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する追加の治療剤は、例えば、参照によりその全体が援用される、Ｗｅｉｎｍａｎｎら（Ｗｅｉｎｍａｎｎ，２０１６，“Ｃｏｒｒｉｇｅｎｄｕｍ：Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ”，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ １１：１５７６）に記載されるように、そのような活性を有することが当該技術分野において知られている任意の治療剤である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤は、本明細書に提供される抗体と同じ医薬組成物中に製剤化される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤は、本明細書で提供される抗体とは異なる医薬組成物に製剤化される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤は、本明細書で提供される抗体の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤は、本明細書で提供される抗体の投与後に投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤は、本明細書で提供される抗体と同時に投与されるが、薬剤および抗体は、別々の医薬組成物で投与される。

【0175】

いくつかの実施形態では、免疫刺激剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）は、免疫細胞の共刺激受容体のアゴニストである。いくつかの態様では、共刺激受容体は、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ－２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４０、ＳＴＩＮＧ、ｔｏｌｌ様受容体、ＲＩＧ－１、およびＮＯＤ様受容体から選択される。いくつかの実施形態では、アゴニストは抗体である。

【0176】

いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、アルギナーゼ、インドールアミン－２ ３－ジオキシゲナーゼ、またはアデノシンＡ２Ａ受容体の活性を調節する。

【0177】

いくつかの実施形態では、免疫刺激剤はサイトカインである。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、サイトカインはＩＬ－２である。

【0178】

いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は腫瘍溶解性ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ）である。いくつかの態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ワクシニアウイルス、およびマラバウイルスから選択される。

【0179】

追加の治療剤のさらなる例には、タキサン（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）、白金剤（例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン、および／またはシスプラチン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、および／またはミトキサントロン）、フォリン酸（例えば、ロイコボリン）、あるいはヌクレオシド代謝阻害剤（例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、および／またはゲムシタビン）が含まれる。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、フォリン酸、５－フルオロウラシル、および／またはオキサリプラチンである。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、５－フルオロウラシルおよびイリノテカンである。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、タキサンおよび白金剤である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、パクリタキセルおよびカルボプラチンである。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ペメトレキセドである。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＥＧＦＲ、ＲＡＦ、またはＭＥＫ標的化剤などの標的化治療剤である。

【0180】

追加の治療剤は、任意の適切な手段によって投与することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される薬剤（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）、および追加の治療剤は、同じ医薬組成物に含まれる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗体、および追加の治療剤は、異なる医薬組成物に含まれる。

【0181】

本明細書に提供される抗体および追加の治療剤が、異なる医薬組成物中に含まれる実施形態では、抗体の投与は、追加の治療剤の投与前、投与と同時、および／または投与後に行うことができる。いくつかの態様では、本明細書で提供される抗体および追加の治療剤の投与は、互いに約１ヶ月以内に行われる。いくつかの態様では、本明細書で提供される抗体および追加の治療剤の投与は、互いに約１週間以内に行われる。いくつかの局面において、本明細書において提供される抗体および追加の治療剤の投与は、互いに約１日以内に起こる。いくつかの局面において、本明細書において提供される抗体および追加の治療剤の投与は、互いに約１２時間以内に起こる。いくつかの局面において、本明細書において提供される抗体および追加の治療剤の投与は、互いに約１時間以内に起こる。

【0182】

使用方法
本明細書は、単離されたミトコンドリアまたは単離されたミトコンドリアの医薬組成物をｅｘ ｖｉｖｏで患者または同種異系ドナーの細胞に送達し、および／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで患者の組織に送達する方法を提供する。理論に束縛されることを望むものではないが、ミトコンドリアは、アクチン依存性エンドサイトーシスを介して組織細胞または培養細胞によって取り込まれ、それによって、医薬組成物を細胞に直接送達する方法を提供する。非限定的な例示的な例では、ミトコンドリアは、例えば、２～２４時間の期間にわたる、培養培地中の細胞（１０^６／ウェル）とのミトコンドリア（１００μｇ／ウェル）の共インキュベーションによって、標的免疫細胞に移植される。当業者は、ｅｘ ｖｉｖｏで免疫細胞に投与されるか、またはｉｎ ｖｉｖｏで患者の組織に投与されるミトコンドリアの投与量が、生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、生存率（ｓｕｒｖｉｖａｌ）、耐久性、自己複製能、および／または選択の最適化など、標的免疫細胞（単数または複数）を増強することに関して意図される結果に基づいて変動し得ることを認識できる。例えば、共インキュベーションによる、ｅｘ ｖｉｖｏで、ミトコンドリアの免疫細胞への送達において、ミトコンドリアの投与量は、標的細胞あたり０．０００１ｎｇのミトコンドリア～標的細胞あたり２．５ｎｇのミトコンドリアであり得る。患者の組織へのｉｎ ｖｉｖｏでのミトコンドリアの送達において、１ｍＬあたり１ミトコンドリア～１ｍＬあたり１０^７ミトコンドリアが送達され得る。

【0183】

本開示は、増強された免疫細胞（αβＴ細胞、γδＴ細胞、メモリー免疫細胞（例えば、セントラルメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞、またはメモリー様Ｔ細胞）、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、Ｔｒｅｇ ＣＤ４ Ｔ細胞）、ＣＡＲ－Ｔ細胞など）を含む組成物を企図し、該細胞は、外因性ミトコンドリアを含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強され、該外因性ミトコンドリアは、自己由来ミトコンドリア、同種異系ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、封入ミトコンドリア、または遺伝子改変を伴う自家由来ミトコンドリアであり得る。これらの細胞は、抗腫瘍活性を有する当該技術分野で公知の任意のエフェクター細胞または自己免疫を予防することができる免疫抑制免疫細胞のいずれかであり得る。したがって、本明細書は、外因性ミトコンドリアを含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強された免疫細胞、または外因性ミトコンドリアを含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強された免疫細胞の医薬組成物を、患者の細胞および／もしくは組織、または同種異系ドナーに由来する細胞に送達する方法を提供する。外因性ミトコンドリアを含むか、または外因性ミトコンドリアによって増強された免疫細胞は、様々な形態のがん、腫瘍、および自己免疫疾患を含むがこれらに限定されない様々な疾患を処置するために使用することができる。

【0184】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞の調製は、以下の工程を含み得る。
１．白血球除去療法によって患者の血液からＴリンパ球を採取する。
２．密度勾配遠心分離、水簸（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）、および免疫磁気ビーズ選択によるＴ細胞の濃縮。
３．エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、レトロウイルス／レンチウイルス形質導入、またはヌクレアーゼ媒介ゲノム編集（例えば、標的細胞のゲノムへのＣＡＲ遺伝子の導入）を使用する遺伝子改変。
４．当該技術分野で公知の方法を用いた人工抗原提示系（抗ＣＤ８／抗ＣＤ２８免疫磁気ビーズ／ＬＶ－ＡＰＣ）によるポリクローナル活性化によるＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化および増殖。一貫性は、概して、ｃＧＭＰ（医薬品適正製造基準）による原材料およびプロトコルの標準化および検証によって達成される。
５．品質保証（Ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ）－生存率、表現型決定、グラム染色、エンドトキシン、ならびに当該技術分野で公知の方法を用いたＦＤＡガイドラインに準拠した細菌、真菌、およびマイコプラズマ汚染物質の試験。
６．製剤および投与（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）－当該技術分野で公知の方法を用いて、臨床的に処方された用量および投与経路について試験する。治療用細胞の保存、パッケージング、輸送、受け取り、および投与は、概して、製品の安定性および保管の連鎖を維持する必要がある。

【0185】

特定の実施形態では、ミトコンドリア調製物は、（１）遺伝子改変（例えば、ＣＡＲ遺伝子の導入）が行われる前に、（２）遺伝子改変が行われると同時に、または（３）遺伝子改変が行われた後に、免疫細胞に送達される。特定の実施形態において、ミトコンドリア調製物は、ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子改変（例えば、ＣＡＲ遺伝子の導入）が行われる前、（２）遺伝子改変が行われると同時に、または（３）遺伝子改変が行われた後に、ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子改変を含む方法などにおいて、免疫細胞にｅｘ ｖｉｖｏで送達される。特定の実施形態では、ミトコンドリア調製物は、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子改変（例えば、ＣＡＲ遺伝子の導入）が行われる（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルス媒介遺伝子改変）前に、免疫細胞にｅｘ ｖｉｖｏで送達される。理論に束縛されることを望むものではないが、工程（１）は、典型的には、免疫無防備状態のがん患者から採取された自己Ｔ細胞（疲弊Ｔ細胞または老化Ｔ細胞）の再生に重要である。ミトコンドリアは、０．２：１～５０００：１の比で、例えば０．２：１、０．５：１、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、２００：１、５００：１、１０００：１、または５０００：１の比で、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞と共インキュベートすることができる。

【0186】

免疫細胞活性をブーストするため、ＣＡＲ－Ｔ細胞活性などのミトコンドリアもまた、ｉｎ ｖｉｖｏで、（４）免疫細胞とともに患者に送達することができる。特定の実施形態において、ミトコンドリア調製物は、（１）ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子改変（例えば、ＣＡＲ遺伝子の導入）が行われる前、（２）ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子改変と同時に、または（３）ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子改変後に免疫細胞にｉｎ ｖｉｖｏで送達される（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルス媒介遺伝子改変）。特定の実施形態では、ミトコンドリア調製物は、ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子改変（例えば、ＣＡＲ遺伝子の導入）が行われた後に、免疫細胞にｉｎ ｖｉｖｏで送達される。本発明の特定の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞または他の免疫細胞は、全身（静脈内）注入を介して送達されるが、ミトコンドリアは、（５）腫瘍内注射を介して、（６）臓器内注射を介して、（７）組織内注射を介して、または（８）臓器特異的もしくは組織特異的血管系を介して送達される。

【実施例】

【0187】

以下は、本発明の方法および組成物の例である。本明細書における一般的な説明から、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。

【0188】

実施例１ａ．組織試料または培養細胞からのミトコンドリアの単離
組織試料または培養細胞からミトコンドリアを単離するために実験を行った。

【0189】

調製
以下の溶液を調製して、インタクトで生存可能な呼吸能力のあるミトコンドリアを単離した。本方法を用いてミトコンドリアを首尾よく単離するために、溶液および組織試料を氷上に保持して、ミトコンドリア生存率を保存する必要がある。氷上で維持した場合でさえ、単離されたミトコンドリアは、経時的に機能活性の低下を示す（Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４２：３２５－３３２，１９６７）。以下の溶液は、可能であれば、事前に調製される必要がある。
－１Ｍ Ｋ－ＨＥＰＥＳストック溶液（ＫＯＨでｐＨを７．２に調整）。
－０．５Ｍ Ｋ－ＥＧＴＡストック溶液（ＫＯＨでｐＨを８．０に調整）。
－１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４ストック溶液。
－１Ｍ ＭｇＣｌ_２ストック溶液。
－ホモジナイズ緩衝液（ｐＨ７．２）、 ３００ｍＭスクロース、１０ｍＭ Ｋ－ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭ Ｋ－ＥＧＴＡ。４℃で保存した。
－１×ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１００１００３１）
－１００ｍＬの１０×ＰＢＳを１Ｌの再蒸留Ｈ_２Ｏ中にピペッティングすることによって、１×ＰＢＳを調製した。スブチリシンＡストック（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ａ Ｓｔｏｃｋ）は、２ｍｇのスブチリシンＡを１．５ｍＬの微量遠心管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）に秤量することによって調製した。使用するまで－２０℃で保存する。ホモジナイズ緩衝液（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）において、２ｍｇ／ｍｌで調製した。

【0190】

組織からのミトコンドリアの単離
組織解離および分画濾過を用いたミトコンドリアの単離における手順工程（ｐｒｏｃｅｄｕｒａｌ ｓｔｅｐｓ）を概説するスキームを図２に示す。骨格筋から採取した２つの６ｍｍ生検新鮮試料パンチ（ｂｉｏｐｓｙ ｆｒｅｓｈ ｓａｍｐｌｅ ｐｕｎｃｈｅｓ）を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＡ）中の５ｍＬのホモジナイズ緩衝液に移し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の１分間ホモジナイズプログラム（１－ｍｉｎｕｔｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ）を使用して試料をホモジナイズした。スブチリシンＡストック溶液（２５０μＬ）をｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブ中のホモジネートに添加し、氷上で１０分間インキュベートした。ホモジネートを７５０×ｇで４分間遠心分離した（任意選択の工程として）。その後、ホモジネートを、氷上の５０ｍＬコニカル遠心管中で、予め湿らせた４０μｍメッシュフィルターを通して濾過した。濾液を、氷上の５０ｍＬコニカル遠心分離機中で、予め湿らせた新しい４０μｍメッシュフィルターを通して再濾過した。濾液を、氷上の５０ｍＬコニカル遠心管中で、予め湿らせた新しい１０μｍメッシュフィルターを通して、再び再濾過した。濾液を、氷上の５０ｍＬコニカル遠心管中で、予め湿らせた新しい６μｍメッシュフィルターを通して再濾過した。得られた濾液を直ちに使用するか、または遠心分離により濃縮した。濃縮の場合では、濾液を１．５ｍＬの微量遠心管に移し、９０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離した。上清を除去し、ミトコンドリアを含有するペレットを再懸濁し、１ｍＬのホモジナイズ緩衝液に混合した。

【0191】

培養細胞からのミトコンドリアの単離
培養細胞から、例えばヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）細胞株（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手）からミトコンドリアも単離した。

【0192】

ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）細胞の培養
ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）を、供給業者の指示（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）に従って、ウシ胎児血清、線維芽細胞増殖サプリメント－２（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ－２）、および抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）溶液を含有する線維芽細胞培地－２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｍｅｄｉｕｍ－２）中で維持した。細胞を５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃で単層として維持し、９０％コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達した時点で継代した（ｐａｓｓａｇｅｄ）。

【0193】

ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）細胞の調製
８０％のコンフルエンシ（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）の２つのフラスコ（Ｔ１５０）からのＨＣＦ細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次いで、トリプシンを使用して、供給業者の説明書（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に従って細胞を剥離した。供給業者の説明書（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に従って、トリプシン中和溶液を添加することによって反応を停止させた。細胞を５０ｍｌ遠心管に回収し、１０００ｒｐｍ（１９０×ｇ）で５分間遠心分離した。上清を廃棄し、１×ＰＢＳで合計３回洗浄した。

【0194】

ＨＣＦとは異なる培養細胞の調製は、製造業者の指示に従って行われる必要がある。注目すべきことに、ミトコンドリアの供給源として使用される細胞は、接着性、半接着性、または懸濁状態であり得る。

【0195】

ミトコンドリア単離手順は、生検試料ではなくヒト線維芽細胞を使用したことを除いて、組織試料からミトコンドリアを単離するための手順と本質的に同じであった。

【0196】

あるいは、ミトコンドリアは、反復遠心分離によって単離することができる（Ｋｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ”，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２６０５７）。手短に言えば、トリプシン処理により細胞を回収し、ＰＢＳに懸濁し、遠心分離（５分、２５０×ｇ）を２回行った。ミトコンドリア単離手順を４℃または氷上で行った。遠心分離した細胞をミトコンドリア単離緩衝液（３２０ｍＭスクロース、５ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２ｍＭ ＥＧＴＡ）に再懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズした。核および細胞残屑を、３０００×ｇで５分間の２回の遠心分離によって除去し、上清を回収した（任意選択の工程）。次いで、上清を１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、ミトコンドリアペレットをミトコンドリア単離緩衝液に再懸濁した。ミトコンドリア濃度をブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）により決定した。

【0197】

ミトコンドリア数
単離ミトコンドリアのアリコート（１０μＬ）をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲｏｓ（５μｍｏｌ／Ｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識することによって、生存可能なミトコンドリア数を決定した。標識ミトコンドリアのアリコートをスライド上にスポットし、６３× Ｃ－アポクロマト対物レンズ（１．２Ｗ Ｋｏｒｒ／０．１７ＮＡ、Ｚｅｉｓｓ）を有するスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して計数した。ミトコンドリアをミトコンドリア特異的色素ＭｉｔｏＦｌｕｏｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で対比染色した。自己蛍光およびバックグラウンド蛍光の測定のために、未染色細胞および組織を用いて適切な波長を選択した。簡潔には、１μＬの標識ミトコンドリアを顕微鏡スライド上に置き、覆った。ミトコンドリア数を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、全標本領域をカバーする低（×１０）倍率で決定した。

【0198】

実施例１ｂ．培養細胞からのミトコンドリアの単離
培養細胞からミトコンドリアを単離するために実験を行った。

【0199】

調製
以下の溶液を調製して、インタクトで生存可能な呼吸能力のあるミトコンドリアを単離した。本方法を用いてミトコンドリアを首尾よく単離するために、溶液および組織試料を氷上に保持して、ミトコンドリア生存率を保存する必要がある。氷上で維持した場合でさえ、単離されたミトコンドリアは、経時的に機能活性の低下を示す（Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４２：３２５－３３２，１９６７）。以下の溶液は、可能であれば、事前に調製される必要がある。
－１Ｍ Ｋ－ＨＥＰＥＳストック溶液（ＫＯＨでｐＨを７．２に調整）。
－０．５Ｍ Ｋ－ＥＧＴＡストック溶液（ＫＯＨでｐＨを８．０に調整）。
－ホモジナイズ緩衝液（ｐＨ７．２）、 ３００ｍＭスクロース、１０ｍＭ Ｋ－ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭ Ｋ－ＥＧＴＡ。４℃で保存した。
－１×ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１００１００３１）
－スブチリシンＡストックは、２ｍｇのスブチリシンＡを１．５ｍＬの微量遠心管に秤量することによって調製した。使用するまで２０℃で保存する。ホモジナイズ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌで調製した。

【0200】

ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）細胞の培養
ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手）を実施例１ａに記載のように培養し、９０％コンフルエンスに達した時点で細胞を継代した。

【0201】

ＨＣＦとは異なる培養細胞の調製は、製造業者の指示に従って行われる必要がある。注目すべきことに、ミトコンドリアの供給源として使用される細胞は、接着性、半接着性、または懸濁状態であり得る。

【0202】

培養細胞からのミトコンドリアの単離
培養細胞、例えばヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）細胞株からミトコンドリアも単離した。ＨＣＦ細胞の調製は、実施例１ａの方法に従って行った。次いで、各フラスコからのＨＣＦ細胞を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃ Ｔｕｂｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ）中の５ｍＬのホモジナイズ緩衝液に移し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の１分間ホモジナイズプログラムを使用して試料をホモジナイズした。スブチリシンＡストック溶液（２５０μＬ）をｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブ中のホモジネートに添加し、氷上で１０分間インキュベートした。ホモジネートを、氷上の５０ｍＬコニカル遠心管中で、予め湿らせた４０μｍメッシュフィルターを通して濾過した。濾液を、氷上の５０ｍＬコニカル遠心分離機中で、新しい予め湿らせた４０μｍメッシュフィルターを通して再濾過した。濾液を、氷上の５０ｍＬコニカル遠心管中で、予め湿らせた新しい１０μｍメッシュフィルターを通して再び再濾過した。任意選択で、濾液を、氷上の５０ｍＬコニカル遠心管中で、新しい予め湿らせた５μｍメッシュフィルターを通して再び再濾過した。得られた濾液を直ちに使用するか、または遠心分離により濃縮した。濃縮の場合では、濾液を１．５ｍＬの微量遠心管に移し、４℃で５分間９５００×ｇで遠心分離した。同じ遠心分離速度で３回の洗浄を行った。

【0203】

単離されたミトコンドリアの定量
単離されたミトコンドリアを実施例１ｂのホモジナイズ緩衝液に懸濁し、使用するまで氷上に保持した。様々な用量投与のための調製物中のミトコンドリアの量を、製造業者の指示に従って、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ／ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて測定した。タンパク質濃度測定について、ミトコンドリアをＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１００１００３１）に再懸濁した。ミトコンドリア投与量は、μｇで表されるタンパク質含量に関して推定した。

【0204】

実施例２ Ｔ細胞単離、活性化および培養
ＣＤ８^＋Ｔ細胞を健常ドナーのバフィーコートから単離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者の指示に従ってＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（Ｃｙｔｉｖａ，１７１４４００２）を使用する密度勾配遠心分離によって採取した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ８^＋Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，１７９５３）およびｔｈｅ Ｂｉｇ Ｅａｓｙ ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍａｇｎｅｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，１８００１）を使用して、ＰＢＭＣからヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を回収した。単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，２００－０２）の存在下で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１１．３２Ｄ）を用いて１：１の比で活性化した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、１％Ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏｍＦｉｓｈｅｒ，２５０３００２４）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ，１５１４０１２２）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１１４００５０）、１％ピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１３６００７０）、１０％ウシ胎児血清、および０．１％の２β－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ，３１３５０－０１０）を補充した、ＲＰＭＩ１６４０培地ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５００ｍＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，６１８７００１０）中で培養した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を５０万細胞／ｍＬでプレーティングし、細胞が２００万細胞／ｍＬのコンフルエンシーに達した時点、または培地が黄色になった時点に分割した。

【0205】

実施例３．Ｔ細胞移植
ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ミトコンドリア移植の２４時間前に、２４ウェルプレートに５０万個／ｍＬでプレーティングした。ミトコンドリアを単離したら、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を回収し、１５００ｒｐｍ（４３０×ｇ）で５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を新鮮なＴ細胞培地に１００万細胞／１００μＬの濃度で再懸濁した。Ｔ細胞培地を実施例２に記載する。移植したＣＤ８^＋Ｔ細胞を、２４ウェルプレートの各ウェル中の２００μＬの最終容量のＴ細胞培地中のＣＤ８^＋Ｔ細胞の１００万当たり１０μｇ～１００μｇの範囲のタンパク質中、単離されたミトコンドリアと共に４時間インキュベートした。外因性ミトコンドリアおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞の共インキュベーションの４時間後、ウェルあたり１．８ｍｌの新鮮なＴ細胞培地を添加した。

【0206】

実施例４．ミトコンドリア標識および内在化
実施例４．１－染色単離ミトコンドリア（Ｓｔａｉｎｅｄ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）を用いたＴ細胞移植
ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ミトコンドリア移植の２４時間前に、２４ウェルプレートに５０万細胞／ｍＬで播種する。ミトコンドリアを実施例１ｂに記載の手順に従って単離する。次いで、ミトコンドリアを、実施例１ｂのホモジナイズ緩衝液中、２００ｎＭのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｍ７５１２）およびＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｍ７５１４）を用いて３７℃で１０～１５分間染色する。染色したミトコンドリアの３回の洗浄を、実施例１ｂのホモジナイズ緩衝液を用いて９５００×ｇ、５分間、４℃で行い、最後の洗浄の上清を対照として保存する。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を回収し、１５００ｒｐｍ（４３０×ｇ）で５分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を新鮮なＴ細胞培地に１００万細胞／１００μＬで再懸濁する。Ｔ細胞培地を実施例２に記載する。染色したミトコンドリアをＴ細胞に（直ちに）添加して、２４ウェルプレートのウェルあたり２００μＬの最終容量を得る。染色したミトコンドリアの最後の洗浄を、対照の非移植ＣＤ８^＋Ｔ細胞と等容量で添加する。染色したミトコンドリアの組み込みは、移植の５分後から２４時間後に、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得したデータ）によって、または蛍光顕微鏡法（Ｋｅｙｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＢＺ－Ｘ８１０）によって評価する。４時間より長い外因性ミトコンドリアおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞の共インキュベーションの場合、ウェルあたり１．８ｍｌの新鮮なＴ細胞培地を添加する。

【0207】

実施例４．２－ミトコンドリア移植後の染色
移植したＣＤ８^＋Ｔ細胞を、２４ウェルプレートの各ウェル中の最終容量２００μＬのＴ細胞培地中のＣＤ８^＋Ｔ細胞の１００万当たり１０μｇ～１００μｇの範囲のタンパク質の単離ミトコンドリアと共に４時間インキュベートする。外因性ミトコンドリアおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞の共インキュベーションの４時間後、ウェルあたり１．８ｍｌの新鮮なＴ細胞培地を添加する。ミトコンドリア呼吸および質量を、共インキュベーションの２４時間後に移植細胞において評価する。色素Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｍ７５１２）およびＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｍ７５１４）を、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ，１５１４０１２２）、５％ウシ胎児血清を補充した、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１８３５０３０）中で最終濃度１００ｎＭに希釈する。１００万のＣＤ８^＋Ｔ細胞あたり１００μｌの染色を添加し、染色を３７℃で１５分間行う。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１００１００３１）、２％ＦＢＳ、１％ＥＤＴＡ ０．５Ｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｅ６７５８））を用いて１５００ｒｐｍ（４３０×ｇ）で５分間２回洗浄する。上清を廃棄し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ機（ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得する。

【0208】

実施例５．ミトコンドリア移植時のｉｎ ｖｉｔｒｏでのメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の増加
メモリーＴ細胞の割合を、健常ドナーから単離し、かつ続いて培養したＣＤ８^＋Ｔ細胞への外因性ミトコンドリア移植後９日目にフローサイトメトリーによって評価した。

【0209】

手順
（ｉ）Ｔ細胞単離、活性化、および培養を、実施例２に記載されるように行った。
（ｉｉ）ミトコンドリアの単離 実施例１ｂに前述したように、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）からミトコンドリアを単離した。単離されたミトコンドリアを実施例１ｂのホモジナイズ緩衝液に懸濁し、使用するまで氷上に保持した。様々な用量投与のための調製物中のミトコンドリアの量を、製造業者の指示に従って、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて測定した。ミトコンドリア投与量は、μｇで表されるタンパク質含量に関して推定される。
（ｉｉｉ）移植後９日目、抗ヒトＣＤ４５ＲＡ ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３０４１１２）、抗ヒトＣＤ４５ＲＯ ＰＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３０４２２３）、および抗ヒトＣＤ６２Ｌ ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３０４８０４）を用いて、製造業者の指示に従って氷上で染色を行った。表面式に応じて、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ナイーブ（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－）、幹細胞様メモリー（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）またはエフェクター（ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－）として分類した。異なるサブセットの部分は、未処理ＣＤ８^＋Ｔ細胞と、外因性ミトコンドリアを移植されたＣＤ８^＋Ｔ細胞との間で比較される。

【0210】

結果
ミトコンドリア移植後９日目のセントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の増加
移植されたミトコンドリアが混合集団からのメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の生存率および／または分化および／または選択に有利に働く能力を調べるために、活性化後１２日目に、ミトコンドリアを、１００万のＣＤ８^＋Ｔ細胞あたり３０μｇおよび１００μｇの用量レベルでＣＤ８^＋Ｔ細胞に移植した。移植後９日目に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を染色し、ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーによって分析し、ナイーブ（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－）、幹細胞様メモリー（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）、またはエフェクター（ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－）として分類した。

【0211】

図３に示すように、未処理のＣＤ８^＋Ｔ細胞と比較して、ミトコンドリア移植の際に、セントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合が明らかに増加している。セントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の有意な増強が、３０μｇおよび１００μｇの用量のミトコンドリアで検出された。

【0212】

実施例６．ミトコンドリア移植の際のｉｎ ｖｉｖｏでのメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の増加
エフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞の割合を、急性感染症に対して引き起こされた免疫応答において経時的に評価する。オボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチドに拘束されたＣＤ４５．１マウスＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を活性化し、外因性ミトコンドリアを移植し、続いてＣＤ４５．２ Ｃ５７／Ｂ６マウスに注射し、その後リステリア－ＯＶＡに感染させる。処置群を、ミトコンドリアを移植していないＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の引き起こされた免疫応答と比較する。

【0213】

手段
（ｉ）マウスＣＤ８^＋Ｔ細胞の単離は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＣＤ８^＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ，Ｃａｔ．＃１９８５３）に従って行う。Ｔ細胞の活性化および増殖は、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．＃１１４５６．Ｄ）を１対１の比で、組換えＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）で使用することによって実施する。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を５０万細胞／ｍＬでプレーティングし、細胞が２００万細胞／ｍＬのコンフルエンシーに達した時点、または培地が黄色になった時点で分割する。
（ｉｉ）ＯＴ－Ｉマウスのミトコンドリアの単離 ミトコンドリアを、実施例１ａにおいて前述したように骨格筋から単離する。単離されたミトコンドリアを実施例１ａのホモジナイズ緩衝液に懸濁し、使用するまで氷上に維持する。ミトコンドリアの量は、様々な用量投与のための調製において、製造業者の指示に従って、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて測定される。ミトコンドリア投与量は、μｇで表されるタンパク質含量に関して推定される。
（ｉｉｉ）マウスＣＤ８^＋Ｔ細胞を、活性化後７日目に、実施例３に前述したように移植する。
（ｉｖ）マウス（ＣＤ４５．２）に、２４時間前に移植した２０，０００個のＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ４５．１）を注射し、続いて、２，０００個のコロニー形成単位（ｃｆｕ）のリステリア－ＯＶＡを感染させる。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の持続性およびメモリー分化を、動物の血液（７日目、１４日目、２１日目）および臓器（２１日目の脾臓、リンパ節（ＬＮ））において経時的に評価する。血液または処理された臓器からの染色 ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ ｄｙｅ Ａｑｕａ ＤＥＡＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｌ３４９５７）、抗マウスＣＤ８α ＰＥ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ａｂｃａｍ ａｂ２５２９４）、抗マウスＣＤ４５．１ＢＶ６５０（ＢＤ ５６３７５４）、抗マウスＣＤ４５．２ＢＶ４２１（ＢＤ ５６２８９５）、抗マウスＫＬＲＧ１ ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １３８４１５）、抗マウスＣＤ１２７ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １２１１１１）、抗マウスＣＤ４４ ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢＤ ５６０５６８）、抗マウスＣＤ６２Ｌ ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １０４４３１）。リステリア－ＯＶＡに対するＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の引き起こされた免疫応答は、短命エフェクター細胞（ＳＬＥＣ）（ＫＬＲＧ１＋ ＣＤ１２７－および／またはＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ－）およびメモリー前駆細胞（ＭＰＥＣ）（ＫＬＲＧ１－ＣＤ１２７＋および／またはＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ＋）として分類される。
（ｖ）サイトカイン産生を、ペプチド再刺激後４時間（ＯＶＡペプチド）の屠殺日（ｔｈｅ ｄａｙ ｏｆ ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）に評価する。細胞をホモジナイズした脾臓から回収し、ＬＮを９６ウェルプレートにプレーティングする。細胞を、１０μＭのＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）ペプチドまたはＰＭＡ／イオノマイシンと共に３０分間インキュベートし、続いてＧｏｌｇｉｓｔｏｐ（ＢＤ）およびＧｏｌｇｉｐｌｕｇ（ＢＤ）の存在下で、さらに４時間再刺激する。細胞を回収し、固定し、細胞内サイトカイン染色のために透過処理し、抗マウスＩＦＮγ ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ５０５８２１）、抗マウスＴＮＦα Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ５０６３１８）、抗マウスＩＬ－２ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ５０３８０７）、および抗マウスＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ５１５４０３）産生を評価する。

【0214】

結果
外因性ミトコンドリア移植は、引き起こされた免疫応答中のメモリー細胞の形成および持続を促進する。
経時的に、マウス短命エフェクター細胞（ＳＬＥＣ）（ＫＬＲＧ１＋ ＣＤ１２７－および／またはＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ－）の割合が減少し、メモリー前駆細胞（ＭＰＥＣ）（ＫＬＲＧ１－ＣＤ１２７＋および／またはＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ＋）が、移植されたＯＴ－１ ＣＤ８^＋Ｔ細胞を注射されたマウスにおいて増加する。ペプチド再刺激時、外因性ミトコンドリアを有する処置群におけるＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞のサイトカイン産生は、未処置群と比較してより高い。

【0215】

実施例７．ミトコンドリア移植の際の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、ＴＩＬからのメモリー様ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の増加
培養ヒトＴＩＬへの外因性ミトコンドリア移植後、経時的にメモリー様Ｔ細胞の割合をフローサイトメトリーで評価した。

【0216】

手段
（ｉ）ＴＩＬの単離および培養 外科的に切除された腫瘍塊を、ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＰｕｌｍｏｚｙｍｅ（Ｒｏｃｈｅ）などの酵素を用いて消化して、単細胞懸濁液を生成する。ＴＩＬは、前述したように高用量のＩＬ－２で増殖される（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ＪＨ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ２０２０；８：ｅ０００８４８，ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｉｔｃ－２０２０－０００８４８）。ＴＩＬ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合がバルクＴＩＬ集団の中で十分である場合、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の単離を実施例２に記載されるように行う。
（ｉｉ）ミトコンドリアの単離 ミトコンドリアを、実施例１ｂに前述したように、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）から単離する。単離されたミトコンドリアを実施例１ｂのホモジナイジング緩衝液に懸濁し、使用するまで氷上に維持する。ミトコンドリアの量は、様々な用量投与のための調製において、製造業者の指示に従って、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて測定される。ミトコンドリア投与量は、μｇで表されるタンパク質含量に関して推定される。
（ｉｉｉ）移植後４時間～２週間の範囲において、経時的に、抗ヒトＣＤ４５ＲＡ ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３０４１１２）、抗ヒトＣＤ４５ＲＯ ＰＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３０４２２３）、および抗ヒトＣＤ６２Ｌ ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３０４８０４）を用いて、製造業者の指示に従って氷上で染色を行う。表面発現に応じて、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ナイーブ（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）、幹細胞様メモリー（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）、またはエフェクター（ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－）として分類される。異なるサブセットの部分を、対照と外因性ミトコンドリアを移植したＴＩＬ ＣＤ８^＋Ｔ細胞との間で比較する。

【0217】

結果
ミトコンドリア移植後の記憶様ＴＩＬ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の増加
バルク集団からのＴＩＬへの外因性ミトコンドリアの移植は、メモリー様ＴＩＬの生存および選択を促進する。

【0218】

実施例８．担がんマウスで再投与した、あるいは急性感染時に移植されたＴＩＬの養子細胞移植移入は、リコール反応の増強を示す
ＯＶＡ発現腫瘍から抽出および単離されたＯＴ－Ｉ ＴＩＬに外因性ミトコンドリアを移植する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養後の選択されたメモリー様ＴＩＬの特性を評価するために、処置ＴＩＬまたは未処置ＴＩＬを養子移入し、腫瘍を有するマウスに、または急性感染時に再投与する。ＯＶＡで制限された担がんマウスにおいて、ＯＴ－Ｉ ＴＩＬｓのリコール能力は、腫瘍の成長、マウスの生存率、がん瘤（ｃａｎｃｅｒ ｍａｓｓ）およびリンパ系臓器に浸潤した移入細胞の持続性を測定することによって経時的に評価される。急性感染症の状況において、ＯＴ－Ｉ ＴＩＬは、動物に養子移入され、続いてＯＶＡ発現ウイルスまたは細菌に感染させた。引き起こされた免疫応答を、移植されたＴＩＬと未処置のＴＩＬとの間の血液およびリンパ器官において経時的に評価する。

【0219】

手段
（ｉ）マウスＴＩＬの生成および抽出 ＣＤ４５．２ Ｃ５７／Ｂ６マウスに、片側腹部に２００，０００個のＯＶＡ発現腫瘍細胞を皮下移植（ｅｎｇｒａｆｔｅｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）する。生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の６日後、１００，０００個のＣＤ４５．１ ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を静脈内に養子移入する。生着の２１日後および／または適切な腫瘍サイズに達した時点で、腫瘍を回収し、製造業者の指示に従って、Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（１３０－０９６－７３０，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて解離させる。腫瘍からマウスＣＤ８^＋Ｔ細胞を選択するために、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＣＤ８^＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ，Ｃａｔ．＃１９８５３）に従って単離を行う。ＯＴ－Ｉ ＴＩＬをさらに選択するために、ＦＡＣＳに基づく細胞選別をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ－、ＣＤ４５．１＋、ＣＤ８＋に従って行う。
（ｉｉ）マウスＯＴ－Ｉからのミトコンドリアの単離 ミトコンドリアを、実施例１ａにおいて前述したように骨格筋から単離する。単離されたミトコンドリアを実施例１ａのホモジナイズ緩衝液に懸濁し、使用するまで氷上に維持する。ミトコンドリアの量は、様々な用量投与のための調製において、製造業者の指示に従って、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて測定される。ミトコンドリア投与量は、μｇで表されるタンパク質含量に関して推定される。
（ｉｉｉ）マウスＣＤ８^＋Ｔ細胞を、実施例３において前述したように移植する。
（ｉｖ）腫瘍を有するマウスにおける再投与 ＣＤ４５．２ Ｃ５７／Ｂ６マウスに、片側腹部に２００，０００個のＯＶＡ発現腫瘍細胞を皮下移植する。生着の５日後、５Ｇｙの全身照射を適用する。生着の６日後、１０，０００個の移植ＣＤ４５．１ ＯＴ－Ｉ ＴＩＬを静脈内に養子移植する。腫瘍増殖を、キャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて２～３日毎に測定する。製造業者の指示に従って、生着の２１日後および／または適切な腫瘍サイズに達した時点で、腫瘍を回収し、腫瘍解離キット（Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（１３０－０９６－７３０，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて解離させる。腫瘍における浸潤およびリンパ器官における持続性を、以下の染色によるフローサイトメトリーによって評価する：ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ ｄｙｅ Ａｑｕａ ＤＥＡＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｌ３４９５７）、抗マウスＣＤ８α Ｐｅ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ａｂｃａｍ ａｂ２５２９４）、抗マウスＣＤ４５．１ ＢＶ６５０（ＢＤ ５６３７５４）、抗マウスＣＤ４５．２ ＢＶ４２１（ＢＤ ５６２８９５）、抗マウスＫＬＲＧ１ ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １３８４１５）、抗マウスＣＤ１２７ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １２１１１１）、抗マウスＣＤ４４ ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢＤ ５６０５６８）、抗マウスＣＤ６２Ｌ ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １０４４３１）。
（ｖ）急性感染症に対する再投与 マウス（ＣＤ４５．２）に、移植の１日後、１０，０００個のＯＴ－Ｉ ＴＩＬ（ＣＤ４５．１）を注射し、続いて２，０００ｃｆｕのリステリア－ＯＶＡを感染させる。ＯＴ－Ｉ ＴＩＬの持続性およびメモリー分化を、動物（７日目、１４日目、２１日目）および臓器（脾臓、２１日目のＬＮ）の血液中で経時的に評価する。血液または処理された臓器からの染色 ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定色素Ａｑｕａ ＤＥＡＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｌ３４９５７）、抗マウスＣＤ８α Ｐｅ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ａｂｃａｍ ａｂ２５２９４）、抗マウスＣＤ４５．１ ＢＶ６５０（ＢＤ ５６３７５４）、抗マウスＣＤ４５．２ ＢＶ４２１（ＢＤ ５６２８９５）、抗マウスＫＬＲＧ１ ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １３８４１５）、抗マウスＣＤ１２７ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １２１１１１）、抗マウスＣＤ４４ ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢＤ ５６０５６８）、抗マウスＣＤ６２Ｌ ＰｅｒＣＰ／シアニン５．５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １０４４３１）。リステリア－ＯＶＡに対するＯＴ－Ｉ ＴＩＬのリコール免疫応答は、短命エフェクター細胞（ＳＬＥＣ）（ＫＬＲＧ１＋ ＣＤ１２７－および／またはＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ－）およびメモリー前駆細胞（ＭＰＥＣ）（ＫＬＲＧ１－ＣＤ１２７＋および／またはＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋）として分類される。

【0220】

結果
移植されたＴＩＬは、腫瘍を有するマウスにおいて、急性感染時にリコール能力の改善を示す。
担がんマウスまたは感染マウスにおいて再投与された移植されたＴＩＬは、担がん動物における持続性の増強、リコール能力の改善および腫瘍制御の改善によって示されるように、メモリー細胞の顕著な特徴を示す。

【0221】

実施例９．移植されたＣＤ８^＋ Ｔ細胞は、生存シグナルについて競合する増強された能力を有する
移植されたＴ細胞が生存シグナルについて効率的に競合する能力を評価するために、処理された細胞と未処理の細胞との同時移植を同じ宿主内で実施する。オボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチドに対して制限されたＣＤ４５．１マウスＯＴ－Ｉ Ｔ細胞は活性化され、外因性ミトコンドリアで移植されるが、ＣＤ４５．１．２ ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞は移植されない。ＣＤ４５．１処置ＯＴ－ＩおよびＣＤ４５．１．２未処置ＯＴ－ＩをＣＤ４５．２ Ｃ５７／Ｂ６マウスに同時移入し、続いてＬｉｓｔｅｒｉａ－ＯＶＡに感染させた。処置群は、同じ宿主内でミトコンドリアを移植されず、かつ限定された生存シグナルについて競合するＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の引き起こされた免疫応答と比較される。

【0222】

手段
（ｉ）マウスＣＤ８^＋ Ｔ細胞単離は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＣＤ８^＋ Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ，Ｃａｔ．＃１９８５３）に従って行う。Ｔ細胞の活性化および増殖は、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．＃１１４５６．Ｄ）を１対１の比、および組換えＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）で使用することによって実施する。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を５０万細胞／ｍＬでプレーティングし、細胞が２００万細胞／ｍＬのコンフルエンシーに達した時点で、または培地が黄色になった時点で分割する。
（ｉｉ）ＯＴ－Ｉマウスのミトコンドリア単離 ミトコンドリアを、実施例１ａにおいて前述したように骨格筋から単離する。単離されたミトコンドリアを実施例１ａのホモジナイズ緩衝液に懸濁し、使用するまで氷上に維持する。ミトコンドリアの量は、様々な用量投与のための調製において、製造業者の指示に従って、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて測定される。ミトコンドリア投与量は、μｇで表されるタンパク質含量に関して推定される。
（ｉｉｉ）マウスＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、活性化後７日目に、実施例３に前述したように移植する。
（ｉｖ）マウス（ＣＤ４５．２）に、移植の１日後、１０，０００個のＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞（ＣＤ４５．１）、および未処置の１０，０００個のＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞（ＣＤ４５．１．２）を注射する。続いて、マウスを２，０００ｃｆｕのＬｉｓｔｅｒｉａ－ＯＶＡに感染させる。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の持続性およびメモリー分化を、動物の血液（７日目、１４日目、２１日目）および臓器（２１日目の脾臓、ＬＮ）において、経時的に評価する。血液または処理された臓器からの染色：ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ ｄｙｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｌ３４９５７）、抗マウスＣＤ８α Ｐｅ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ａｂｃａｍ ａｂ２５２９４）、抗マウスＣＤ４５．１ ＢＶ６５０（ＢＤ ５６３７５４）、抗マウスＣＤ４５．２ ＢＶ４２１（ＢＤ ５６２８９５）、抗マウスＫＬＲＧ１ ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １３８４１５）、抗マウスＣＤ１２７ Ｐｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １２１１１１）、抗マウスＣＤ４４ ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢＤ ５６０５６８）、抗マウスＣＤ６２Ｌ ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １０４４３１）。Ｌｉｓｔｅｒｉａ－ＯＶＡに対するＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の引き起こされた免疫応答は、短命エフェクター細胞（ＳＬＥＣ）（ＫＬＲＧ１＋ ＣＤ１２７－および／またはＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ－）およびメモリー前駆細胞（ＭＰＥＣ）（ＫＬＲＧ１－ ＣＤ１２７＋および／またはＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ＋）として分類される。

【0223】

結果
制限された生存シグナルについて競合する移植細胞の能力の増強
外因性ミトコンドリアを移植されたＯＴ－Ｉ Ｔ細胞は、急性感染症後の限られた生存シグナルについてより良好に競合する。その結果、血液およびリンパ器官中を循環する処置Ｔ細胞の割合は、未処置Ｔ細胞と比較して、増強される。

【0224】

実施例１０．ミトコンドリア移入は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性を増加させる
健常ドナー由来のバルクＣＤ８ Ｔ細胞に外因性ミトコンドリアを移植し、経時的に培養して、セントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＴ細胞を選択する。健常ドナー由来のＣＤ８ Ｔ細胞を形質導入して、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ構築物（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ，Ｐｒｏｍａｂ）を発現させる。ミトコンドリアで処理したまたは処理しなかったＣＡＲ－Ｔ細胞の引き起こされた免疫応答を、Ｂ細胞リンパ腫のマウス異種移植片モデルにおいて評価する。

【0225】

手段
（ｉ）ＣＡＲ－Ｔ細胞培養を、実施例２に記載されるように実施する。
（ｉｉ）ミトコンドリア単離 実施例１ｂに記載の手順に従って、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）からミトコンドリアを単離する。
（ｉｉｉ）単離されたミトコンドリアの定量化 ミトコンドリア投与量は、実施例１ｂに記載される手順に従って、μｇで表されるタンパク質含有量に関して推定される。
（ｉｖ）実施例３の手順に従うＣＡＲ－Ｔ細胞移植。３０μｇまたは１００μｇの量のミトコンドリアをＣＡＲ－Ｔ細胞に移植する。

【0226】

リンパ腫モデル
９週齢の雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（非肥満糖尿病、 Ｔ細胞、マクロファージおよびＮＫ細胞が欠損、 Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に、ヒトバーキットリンパ腫ＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞（２．５×１０^６細胞／マウス）を皮下（ｓ．ｃ．）注射する。腫瘍が６０～１００ｍｍ^３のサイズに達した時点で、動物を処置群に無作為化し、等しい腫瘍サイズを有する群あたり５～８匹のマウスを処置のために選択する。動物は、１０^７個の模擬形質導入Ｔ細胞、または抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、またはミトコンドリア増強抗ＣＤ１９^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の静脈内注射（ｉ．ｖ． ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）を受けた。腫瘍サイズを、キャリパー様機器を用いて二次元で測定する。個々の腫瘍体積（Ｖ）は、式Ｖ＝０．５６×（長さ＋幅）^２によって計算される。腫瘍体積が１，５００ｍｍ^３のヒトエンドポイントに達したら、頸部脱臼によって動物を屠殺する。ソフトウェアプログラムＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存プロットを作成し、ログランク（ｌｏｇ－ｒａｎｋ）（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて生存曲線を比較する。

【0227】

白血病モデル
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した、８週齢の雄性ＮＳＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンママウス、 Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞が欠損している）マウスを、滅菌ケージ内のビバリウムに収容する。１００μＬのＰＢＳ中のＲａｊｉ／Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞（１０^６）を、インスリンシリンジを用いて外側尾静脈を介して静脈内注射する（０日目として指定）。６日目に生物発光イメージングによってルシフェラーゼ活性を測定して、腫瘍量を評価する。７日目に、１０^７個の模擬形質導入Ｔ細胞、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、またはミトコンドリア増強抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を１００μＬのＰＢＳ中で調製し、インスリンシリンジを用いて静脈内注射する。腫瘍進行を、ＩＶＩＳイメージングシステムを用いた生物発光イメージングによってモニターする。６０日目に、生存マウスを安楽死させ、脾臓および骨髄細胞を回収し、総容積２ｍＬのフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）緩衝液（２％ＦＣＳを補充したＰＢＳ）に再懸濁する。次いで、２００マイクロリットルの細胞懸濁液を抗ヒトＣＤ３ ＰＥおよび抗ヒトＣＤ４５ ＡＰＣ抗体で標識し、フローサイトメトリーによって分析して、ヒトＴ細胞のパーセンテージを決定する。

【0228】

非増強ＣＡＲ－Ｔ細胞または対照ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、外因性ミトコンドリアで増強されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、処置マウスにおいてより高い抗腫瘍活性（より長い生存期間の中央値）を示す。

【0229】

実施例１１．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇ生存および選択に対するミトコンドリア移植の影響
健常ドナーから単離し、かつ続いて培養したＣＤ４^＋ Ｔ細胞混合集団への外因性ミトコンドリア移植後の経時的なフローサイトメトリーによって、Ｔｒｅｇの割合を評価する。

【0230】

手段
（ｉ）ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の単離、活性化、および培養 ＣＤ４^＋ Ｔ細胞は、健常ドナーのバフィーコートから単離される。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者の指示に従って、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（ｃｙｔｉｖａ，１７１４４００２）を使用する密度勾配遠心分離によって採取する。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌ，ｌ１７９５２）、および“Ｔｈｅ Ｂｉｇ Ｅａｓｙ”ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍａｇｎｅｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，１８００１）を使用して、ＰＢＭＣからヒトＣＤ４^＋ Ｔ細胞を回収する。単離されたＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１１．３２Ｄ）を用いて、１対１の比で、１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，２００－０２）の存在下で活性化する。ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、１％Ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏｍＦｉｓｈｅｒ，２５０３００２４）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍｌ，Ｇｉｂｃｏ，１５１４０１２２）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１１４００５０）、１％ピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１３６００７０）、１０％ウシ胎児血清、および０．１％ ２β－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ，３１３５０－０１０）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，６１８７００１０）中で培養する。ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を５０万細胞／ｍｌでプレーティングし、細胞が２００万細胞／ｍｌのコンフルエンシーに達した時点で、または培地が黄色になった時点で分割する。
（ｉｉ）ＣＤ４^＋ Ｔ細胞移植 ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、活性化後１日目～２０日目に、１０μｇ～１００μｇ／ｍｌの範囲のＣＤ４^＋ Ｔ細胞の種々の用量のミトコンドリアと共に移植する。
（ｉｉｉ）ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の移植後の染色 １日～２０日の範囲で、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を染色し、様々な時点でフローサイトメトリーによって分析する。製造業者の指示に従って、抗ヒトＣＤ４５ＲＡ ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３０４１１２）、抗ヒトＣＤ４５ＲＯ ＰＢ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３０４２２３）、抗ヒトＣＤ２５ ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３０２６０４）、および抗ヒトＣＤ１２７Ｐｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３５１３０４）を用いて、氷上で染色を行う。言及したマーカーの表面発現に応じて、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞は、ナイーブ（ＣＤ２５－、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－）、セントラルメモリー（ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ２５－、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋）、またはエフェクター（ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－、ＣＤ４５ＲＡ＋／－、ＣＤ４５ＲＯ＋／－）として分類される。異なるサブセットの部分を、対照と外因性ミトコンドリアを移植したＣＤ４^＋ Ｔ細胞との間で比較する。加えて、Ｔｒｅｇ集団におけるＦＯＸＰ３のレベルを、ミトコンドリア移植後に、製造業者の指示に従って、Ｔｒｕｅ－Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３２００２７）を使用して評価する。

【0231】

結果
外因性ミトコンドリアの移植は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の混合集団からのＴｒｅｇ選択を促進する
ミトコンドリア移植の際に、Ｔｒｅｇは、外因性ミトコンドリアで処置されていないＣＤ４^＋ Ｔ細胞と比較して、混合集団においてより高い割合で見られる。この選択方法を用いて、自己免疫疾患を処置する養子細胞療法のためのＣＤ４^＋ Ｔ細胞の混合集団からのＴｒｅｇの割合を増加させることができる。

【0232】

参照による援用
本明細書に引用される全ての特許および非特許刊行物の開示全体は、あらゆる目的のために参照によりその全体がそれぞれ援用される。

【0233】

他の実施の形態
上記の開示は、独立した有用性を有する複数の別個の発明を包含し得る。これらの発明の各々をその好ましい形態（複数可）で開示したが、本明細書における開示および図示のような特定の実施形態は、多数の変形が可能であるため、限定的な意味で考慮されるものではない。本発明の主題は、本明細書に開示される様々な要素、特徴、機能、および／または特性の全ての新規かつ非自明の組み合わせ、および部分的組み合わせを含む。以下の特許請求の範囲は、具体的に、新規かつ非自明と見なされる特定の組合せおよび部分的組合せを指摘する。特徴、機能、要素、および／または特性の他の組み合わせおよび部分的組み合わせで具現化される発明は、本出願において、本出願からの優先権を主張する出願において、または関連出願において主張され得る。そのような請求項はまた、異なる発明を対象とするか、または同じ発明を対象とするかにかかわらず、および元の請求項と比較して範囲がより広いか、より狭いか、等しいか、または異なるかにかかわらず、本開示の発明の主題内に含まれると見なされる。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【国際調査報告】