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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-23
(54)【発明の名称】精子エクステンダー培地
(51)【国際特許分類】
C12N 5/076 20100101AFI20241016BHJP
A01K 67/02 20060101ALI20241016BHJP
C12N 5/07 20100101ALI20241016BHJP
【ＦＩ】
C12N5/076
A01K67/02
C12N5/07
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024521775
(86)(22)【出願日】2022-10-13
(85)【翻訳文提出日】2024-06-05
(86)【国際出願番号】 AU2022051229
(87)【国際公開番号】W WO2023060310
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】2021903289
(32)【優先日】2021-10-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516062950
【氏名又は名称】ミート アンド ライブストック オーストラリア リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ギブ，ザミラ
(72)【発明者】
【氏名】クライン，エリン
(72)【発明者】
【氏名】エイトケン，ロバート ジョン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BB02
4B065BB04
4B065BB08
4B065BB12
4B065BB15
4B065BD12
4B065CA60
(57)【要約】
精子の液体保存中にウシ精子の受精能を延長するための精子エクステンダー培地が提供される。培地は、精子のための単糖エネルギー源を含む。１つ以上のαアミノ酸オスモライト又はβアミノ酸オスモライトは、モノアミノカルボン酸及びモノアミノスルホン酸から選択され、各々独立して、Ｈと、分岐Ｃ３及びより長い脂肪族鎖を除く、非極性で中性の脂肪族開鎖と、からなる群から選択されるＲ側基を有する。培地はまた、１つ以上の抗酸化剤と、精子生存率を維持するための生理学的に許容される無機塩と、を含み、ｐＨを約７．０～約８．５の範囲に維持するために緩衝される。更に、実施形態において、培地は、約９５ｍＭ未満のナトリウムイオンの濃度、及び約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲のモル浸透圧濃度を有する。培地中の精子を含む調製物、培地を調製する方法、及び卵子を精子エクステンダー培地中に投与された精子と接触させることを含む卵子の受精のための方法も提供される。
【選択図】図６
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏｏｎ）の液体保存中に前記精子の受精能を延長するための精子エクステンダー（ｓｐｅｒｍ ｅｘｔｅｎｄｅｒ）培地であって、前記精子のための単糖エネルギー源と、
モノアミノカルボン酸及びモノアミノスルホン酸から選択される１つ以上のαアミノ酸オスモライト又はβアミノ酸オスモライトであって、各々独立して、Ｈと、分岐Ｃ３及びより長い脂肪族鎖を除く、非極性で中性の脂肪族開鎖（ｏｐｅｎ ａｌｉｐｈａｔｉｃ ｃｈａｉｎ）と、からなる群から選択されるＲ側基を有する、１つ以上のαアミノ酸オスモライト又はβアミノ酸オスモライトと、
１つ以上の抗酸化剤と、
精子生存率を維持するための生理学的に許容される無機塩と、を含み、
前記培地が、前記培地のｐＨを約７．０～約８．５の範囲に維持するために緩衝され、前記培地が、約９５ｍＭ未満のナトリウムイオンの濃度、及び約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲のモル浸透圧濃度を有する、精子エクステンダー培地。
【請求項2】
各前記アミノ酸オスモライトが、独立して、非置換であるか、又はＨ以外の単一のＲ側基で一置換されている、請求項１に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項3】
各アミノ酸オスモライトの前記Ｒ側基が、独立して、Ｈ、脂肪族Ｃ１－Ｃ２基、又は非分岐Ｃ３鎖のいずれかである、請求項１又は２に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項4】
前記Ｒ側基が、独立して、Ｈ又はＣ１－Ｃ２アルキルのいずれかである、請求項３に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項5】
各アミノ酸オスモライトが、独立して、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－Ｃ２Ｈ３（Ｒ）－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、及びＨ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ（Ｏ）２ＯＨからなる群から選択される式を有し、式中、Ｒが、前記Ｒ側基であり、Ｈ以外である、請求項１～４のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項6】
前記１つ以上のアミノ酸オスモライトが、前記エクステンダー培地中のαアミノ酸及び／又はβアミノ酸（複数可）の少なくとも大部分を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項7】
前記１つ以上のアミノ酸オスモライトが、約５．９６～約６．０の等電点を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項8】
前記１つ以上のアミノ酸オスモライトが、各々糖原性アミノ酸である、請求項１～７のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項9】
前記アミノ酸オスモライト（複数可）のうちの１つ以上が、Ｌ－アミノ酸である、請求項１～８のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項10】
前記１つ以上のアミノ酸オスモライトが、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、及び上記の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項11】
ピルビン酸、乳酸、及び更なる有機オスモライトのうちの１つ以上から選択される１つ以上の薬剤を更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項12】
ピルビン酸、乳酸、及びＬ－カルニチンを更に含む、請求項１１に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項13】
前記精子による前記単糖エネルギー源の取り込みを促進するための生理学的に許容される血糖降下剤を更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項14】
前記血糖降下剤が、ロシグリタゾンである、請求項１３に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項15】
前記単糖エネルギー源が、フルクトース、グルコース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項16】
前記１つ以上の抗酸化剤が、コエンザイムＱ１０を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項17】
精子抗凝集剤（複数可）、酸度調整剤（複数可）、緩衝剤（複数可）、及び抗菌剤（複数可）を更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項18】
前記生理学的に許容される塩が、溶液中のＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ－、ＳＯ４２－及びＰＯ４２－から選択されるイオンを提供するためのものである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項19】
前記精子の凍結保存の不在下で、３日を超える期間にわたって前記精子の受精能を維持するためのものである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項20】
前記精子の凍結保存の不在下で、少なくとも５日の期間にわたって前記精子の受精能を維持するためのものである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項21】
周囲温度での前記精子の液体保存のためのものである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項22】
前記周囲温度が、約１７℃～約２５℃の範囲にある、請求項１～２１のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項23】
前記培地が、ヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）及びヤギ（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）から選択される他の家畜動物の受精能を延長する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項24】
ウシ動物がＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ動物である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地。
【請求項25】
家畜動物の精子の調製物であって、前記精子が、請求項１～２４のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地中にある、調製物。
【請求項26】
家畜動物の卵子を受精させるための方法であって、前記卵子を、請求項１～２４のいずれか一項に記載の精子エクステンダー培地中に投与された前記動物の精子と接触させることを含み、前記卵子及び精子が同じ動物種類のものである、方法。
【請求項27】
受精のインビトロ又はインビボでの方法である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、精漿から分離された精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）の受精能を延長するための精子エクステンダー（ｓｐｅｒｍ ｅｘｔｅｎｄｅｒ）培地に関する。本発明はまた、卵子のインビトロ又はインビボでの受精のためにエクステンダー培地中に維持された精子の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
オーストラリア北部及び他の遠隔地における肉牛群の遺伝子改良のための人工授精（ＡＩ）の使用は、地理的に隔離された農場で人工授精（ＡＩ）プログラムを実施することの物流上の制約、凍結保存精子の受精能の低下、及び発情同期化レジメンの限界によって制限される。凍結保存が解凍後の精子の生存率及び受精能に及ぼす有害な影響に加えて、凍結保存精子の使用は、特別な保存及び輸送要件、並びに液体窒素への依存を更に伴う。
【0003】
種牡馬用の精液エクステンダーであるＩＮＲＡ９６（商標）（ｉｍｖ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇｒｏｕｐ）は、以前に雄牛精子の液体保存に最適であるとされていたが、それにもかかわらず、室温でのウシ（ｂｏｖｉｎｅ）精子の受精能は、最大約３日間維持されただけであった（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．２０１７）。これは多くの状況において十分であるとは言い難く、その適用が制限される。
【0004】
ウシ精子、並びにヒツジ及びヤギ等の他の家畜動物の精子の液体保存のためのエクステンダー培地に対する必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【0005】
広義には、本開示は、精漿から分離された後の精子の液体保存のための精子エクステンダー培地の提供に関する。したがって、エクステンダー培地は、精液の凍結保存等のために精液試料に添加するための精液エクステンダー培地とは異なり、精漿の実質的な不在下で、新鮮な精子とともに使用するためのものである。
【0006】
本発明に到達する際に、本発明者らは、ウマ用ＩＮＲＡ９６（商標）エクステンダー培地が、限定された期間を超えて周囲温度でウシ精子の受精能を維持するには不十分であることを確認した。本発明者らはまた、彼らの研究グループが８年の期間にわたって開発した、最適化された独自のウマ用精子エクステンダー培地も、ウシ精子の生存率及び運動性を十分に維持することができないことを見出し、ウシ精子が、ウマのために開発された精子エクステンダー製剤によっては満たされない特定の要件を有することが示唆された。本発明者らは、彼らの独自のウマ用エクステンダー培地が、周囲温度での液体保存中にウシ精子の受精能を十分に延長するのに好適であると考えられていたため、この結果は予想外であった。
【0007】
更なる研究の結果として、本発明者らは、ウシ精子用に配合された精子エクステンダー培地中のオスモライト（複数可）としての特定のアミノ酸（複数可）の使用が、精子の凍結保存の不在下で、周囲温度／室温で新鮮なウシ精子の受精能を実質的に延長することができることを見出した。特に、本明細書に記載されるように、本発明者らは、ウシ精子の受精能が、ＩＮＲＡ９６（商標）の使用で以前に報告された周囲温度で３日をはるかに超えて延長され得、凍結保存精子と同等であるか又はそれより優れた受精能を有することを示した。本発明者らは、これが、３日より長い満足のいく精子の受精能力を保持しながら、凍結保存を用いずに周囲温度で、液体形態で保存されているウシ精子の最初の報告であると考える。
【0008】
しかしながら、本開示は、ウシ精子とエクステンダー培地のみを用いた精子エクステンダー培地の使用に限定されず、家畜のヒツジ及びヤギ等の他の反芻家畜動物の精子との使用にまで及ぶ。
【0009】
より具体的には、本発明の一態様では、ウシ精子の液体保存中に精子の受精能を延長するための精子エクステンダー培地が提供され、培地は、精子のための栄養溶液中に１つ以上のアミノ酸オスモライトを含み、１つ以上のアミノ酸オスモライトは、モノアミノカルボン酸及びモノアミノスルホン酸から選択され、各々独立して、Ｈと、分岐Ｃ３及びより長い脂肪族鎖を除く、非極性で中性の脂肪族開鎖（ｏｐｅｎ ａｌｉｐｈａｔｉｃ ｃｈａｉｎ）と、からなる群から選択されるＲ側基を有し、培地は、培地のｐＨを約７．０～約８．５の範囲に維持するために緩衝され、培地は、約９５ｍＭ未満のナトリウムイオンの濃度、及び約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲のモル浸透圧濃度を有する。
【0010】
典型的には、栄養溶液は、精子のための１つ以上のエネルギー源を含む。
【0011】
少なくともいくつかの実施形態において、栄養溶液はまた、１つ以上の抗酸化剤を含むことができる。
【0012】
本発明の別の態様では、家畜動物の精子の液体保存中に精子の受精能を延長するための精子エクステンダー培地が提供され、動物は、ウシ、ヒツジ及びヤギ動物から選択され、培地は、
精子のための単糖エネルギー源と、
モノアミノカルボン酸及びモノアミノスルホン酸から選択される１つ以上のαアミノ酸オスモライト又はβアミノ酸オスモライトであって、各々独立して、Ｈと、分岐Ｃ３及びより長い脂肪族鎖を除く、非極性で中性の脂肪族開鎖と、からなる群から選択されるＲ側基を有する、１つ以上のαアミノ酸オスモライト又はβアミノ酸オスモライトと、
１つ以上の抗酸化剤と、
精子生存率を維持するための生理学的に許容される無機塩と、を含み、
培地は、培地のｐＨを約７．０～約８．５の範囲に維持するために緩衝され、培地は、約９５ｍＭ未満のナトリウムイオンの濃度、及び約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲のモル浸透圧濃度を有する。
精子のための単糖エネルギー源と、
モノアミノカルボン酸及びモノアミノスルホン酸から選択される１つ以上のαアミノ酸オスモライト又はβアミノ酸オスモライトであって、各々独立して、Ｈと、分岐Ｃ３及びより長い脂肪族鎖を除く、非極性で中性の脂肪族開鎖と、からなる群から選択されるＲ側基を有する、１つ以上のαアミノ酸オスモライト又はβアミノ酸オスモライトと、
１つ以上の抗酸化剤と、
精子生存率を維持するための生理学的に許容される無機塩と、を含み、
培地は、培地のｐＨを約７．０～約８．５の範囲に維持するために緩衝され、培地は、約９５ｍＭ未満のナトリウムイオンの濃度、及び約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲のモル浸透圧濃度を有する。
【0013】
典型的には、本開示の実施形態において、各アミノ酸オスモライトは、独立して、非置換であるか、又はＨ以外の単一のＲ側基で一置換されている。
【0014】
典型的には、本開示による各アミノ酸オスモライトのＲ側基は、独立して、Ｈ、脂肪族Ｃ１－Ｃ２基、又は非分岐Ｃ３鎖のいずれかである。
【0015】
Ｒ側基がＣ２鎖である場合、Ｃ２鎖は、Ｃ１基で、典型的にはメチル基で一置換され得る。
【0016】
典型的には、Ｒ側基は、独立して、Ｈ又はＣ１－Ｃ２アルキルのいずれかである。
【0017】
典型的には、各アミノ酸オスモライトは、独立して、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨＲ－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－Ｃ２Ｈ３（Ｒ）－ＳＯ２ＯＨ、及びＨ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＯ２ＯＨからなる群から選択される式を有し、式中、Ｒは、Ｒ側基であり、Ｈ以外である。
【0018】
特に好ましい実施形態において、各アミノ酸オスモライトは、独立して、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＯＯＨ、又はＨ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＯ２ＯＨのアミノ酸であり、最も好ましくは、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ又はＨ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＯＯＨのアミノ酸であり、式中、ＲはＨ以外である。
【0019】
典型的には、本発明による精子エクステンダー培地中で使用されるアミノ酸オスモライトは、約５．９６～約６．０の等電点を有し、等電点は、アミノ酸が正味の電荷を有しないｐＨである。
【0020】
本発明の別の態様では、家畜動物であるウシの精子の液体保存中に精子の受精能を延長するための精子エクステンダー培地が提供され、培地は、精子のための栄養溶液中に１つ以上のアミノ酸オスモライトを含み、各上記アミノ酸オスモライトは、独立して、約５．９６～約６．０の等電点を有し、培地は、培地のｐＨを約７．０～約８．５の範囲に維持するために緩衝され、培地は、約９５ｍＭ未満のナトリウムイオンの濃度、及び約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲のモル浸透圧濃度を有する。
【0021】
典型的には、本発明によって具現化された精子エクステンダー培地中の少なくとも１つのアミノ酸オスモライトは、濃度に関してエクステンダー培地中のαアミノ酸及び／又はβアミノ酸（複数可）の少なくとも大部分を含む。特に好ましい実施形態において、エクステンダー培地は、１つ以上のアミノ酸オスモライトを超えるあらゆる更なるαアミノ酸及び／又はβアミノ酸（複数可）を含まない。
【0022】
特に好ましい実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸オスモライトは、グリシン、アラニン、バリン、タウリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0023】
本発明の別の態様では、ウシ精子の液体保存中に精子の受精能を延長するための精子エクステンダー培地が提供され、培地は、精子のための栄養溶液中に１つ以上のアミノ酸オスモライトを含み、１つ以上のアミノ酸オスモライトは、グリシン、アラニン、バリン、及びタウリンからなる群から選択され、培地は、培地のｐＨを約７．０～約８．５の範囲に維持するために緩衝され、培地は、約９５ｍＭ未満のナトリウムイオンの濃度、及び約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲のモル浸透圧濃度を有する。
【0024】
１つ以上のアミノ酸オスモライトの立体異性体が存在する場合、アミノ酸のＬ型が、一般に精子エクステンダー培地で使用される。
【0025】
典型的には、本発明による精子エクステンダー培地中の少なくとも１つのアミノ酸オスモライトは、糖原性アミノ酸である。
【0026】
より好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸オスモライトは、グリシン、アラニン、バリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0027】
最も典型的には、少なくとも１つのアミノ酸オスモライトは、グリシンである。
【0028】
本開示の実施形態はまた、更なる有機オスモライト、精子による単糖エネルギー源の取り込みを促進するための血糖降下剤、精子抗凝集剤、緩衝剤、及び抗菌剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含んでもよい。
【0029】
本明細書に記載の精子エクステンダー培地は、周囲温度での液体保存中にウシ精子の受精能を延長するための用途を有するが、他の実施形態において、精子エクステンダー培地は、ヒツジ及びヤギから選択される他の反芻家畜動物の精子の受精能を延長するために使用されてもよい。
【0030】
したがって、本開示の別の態様では、本明細書に記載の培地中での精子の液体保存中に家畜動物の精子の受精能を延長するための精子エクステンダー培地のための組成物が提供され、動物は、ウシ、ヒツジ、及びヤギ動物から選択され、組成物は、精子エクステンダー培地を提供するための所定量の水に添加するための、１つ以上のαアミノ酸オスモライト又はβアミノ酸オスモライト、１つ以上の抗酸化剤、及び精子生存率を維持するための生理学的に許容される無機塩を含む。組成物はまた、記載されるように、エクステンダー培地の他の成分（複数可）を含むことができる。
【0031】
別の態様では、家畜動物の精子の液体保存中に精子の受精能を延長するための精子エクステンダー培地を調製するための方法が提供され、動物は、ウシ、ヒツジ、及びヤギ動物から選択され、方法は、本開示によって具現化された精子エクステンダー培地を提供する際に、液体培地中で１つ以上のαアミノ酸オスモライト又はβアミノ酸オスモライトを混合することを含み、αアミノ酸オスモライト又はβアミノ酸オスモライトは、モノアミノカルボン酸及びモノアミノスルホン酸から選択され、各々独立して、本明細書に記載されるように、Ｈと、分岐Ｃ３及びより長い脂肪族鎖を除く、非極性で中性の脂肪族開鎖と、からなる群から選択されるＲ側基を有する。
【0032】
別の態様では、本開示による精子エクステンダー培地中に家畜の精子の調製物が提供される。
【0033】
典型的には、動物の精液は、本開示による精子エクステンダー培地に精子を再懸濁する前に、実質的に全ての精漿から精子を分離するために処理される。
【0034】
少なくともいくつかの実施形態において、精子は、精液を密度勾配で遠心分離して精漿から精液を分離し、本開示による精子エクステンダー培地に精子を再懸濁することによって調製され得る。
【0035】
本開示の別の態様では、家畜動物の卵子の受精のための方法であって、卵子を、本明細書に記載の精子エクステンダー培地中に投与された精子と接触させることを含み、精子は、卵子と同じ動物種類のものである、方法が提供される。この方法は、受精のインビトロ又はインビボでの方法（例えば、人工授精）を含むことができる。
【0036】
少なくともいくつかの実施形態において、本明細書に記載の精子の受精能は、精子の凍結保存の不在下で、３日を超える期間にわたって、典型的には、少なくとも５日間、少なくとも７日間、又は更には少なくとも１０日間、周囲温度で本開示によるエクステンダー培地に保持され得る。
【0037】
家畜動物は、任意の品種の家畜牛（すなわち、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、又は例えば、Ｂｏｓ ｉｎｄｉｃｕｓ）であり得るか、又は家畜ヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）若しくはヤギ（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）であり得、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）は、Ｂｏｖｉｄａｅ動物亜科のメンバーである
【0038】
本開示によるアミノ酸オスモライトのＲ側基に関連して本明細書で使用される場合、「脂肪族開鎖」という用語は、環を形成しないか、あるいはプロリン、トリプトファン、及びフェニルアラニン等の環状基若しくはアリール環基又は構造を含有しない直線又は分岐炭素鎖を意味し、環状炭素又はアリール基で置換された炭素側基（例えば、Ｃ１－Ｃ３基）を除外するものと解釈されたい。本発明を説明する目的のために、脂肪族開鎖という用語は、例えば、硫黄原子、又は酸素、窒素、若しくはリン（すなわち、Ｏ、Ｎ、又はＰ）から選択される他のヘテロ原子で置換されるか、又はそれに直接連結された炭素Ｃ１－Ｃ３基を除外し、したがって、例えば、システイン、ホモシステイン、及びメチオニンの硫黄含有Ｒ側基も除外すると解釈されたい。分岐脂肪族Ｃ３又はそれよりも長い（Ｃ４等）脂肪族鎖は、本開示によるウシ用エクステンダー培地から除外されるため、ロイシン及びイソロイシン等のアミノ酸も使用から除外される。
【0039】
本明細書に記載の精子エクステンダー培地を利用して、周囲温度で家畜動物の精子の受精能を延長することにより、精子の凍結保存の不在下で、精子調製物を収集して地理的な遠隔地に輸送するための物流上の障害を改善することができる。更に、本開示の１つ以上の実施形態に従って凍結保存の必要性を低減又は回避することにより、精子が周囲温度でより長い期間にわたって受精能を保持し得るだけでなく、精子の受精能が、対応する凍結保存精子よりも優れている場合がある。
【0040】
本明細書で使用される場合、精子の「受精能を延長する」とは、精子の生存率及び運動性を延長することを意味し、それによって、精子は、同じ動物種の卵子を受精させることが依然として可能である。
【0041】
本開示の文脈における「重量モル濃度」と比較した「容積モル濃度」に関する濃度の記述における差は、全ての実用的な目的のために無視することができる。したがって、「容積モル濃度」に関して本明細書に記載又は定義される濃度は、「重量モル濃度」に関して同じであるとみなされるべきである。すなわち、例えば、「ＸｍＯｓｍ／Ｌ」の濃度は、全ての目的のために、関連する溶液又は培地の「ＸｍＯｓｍ／ｋｇ」と同じであるとみなされるべきである。
【0042】
本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、記載される要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数、整数若しくはステップの群の除外は意味しないことを理解されたい。
【0043】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス、物品等のいかなる考察も、本発明の文脈を提供する目的のためだけのものである。これらの事項のいずれか又は全てが、先行技術の基礎の一部を形成していること、又は本出願の優先日前にオーストラリア若しくは他の場所に存在したものとして、本発明に関連する分野における共通の一般知識であったことの承認であるとはみなされないものとする。
【0044】
本開示の特徴及び利点は、添付の図面とともに、非限定的な実施形態の以下の詳細な説明から更に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0045】
【図1】真菌増殖を制御するためのナイスタチンを用いて又は用いずに、室温（ＲＴ）又は１７℃のいずれかで８日間にわたってウシ用エクステンダー基礎液に保存したウシ精子（Ｎ＝８）の（Ａ）総運動性及び（Ｂ）前進運動性。
【図2】５℃のＩＮＲＡ９６（商標）及び室温のウシ用エクステンダー基礎液のいずれかで３日間及び７日間保存したウシ精子の総運動性及び前進運動性（左）、並びに生存率及び先体完全性（右）。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図3】可溶性アミノ酸、ＮａＣｌ、又は塩化コリンから選択されるオスモライトを補充したウシ用エクステンダー基礎培地にＲＴで７日間保存した後の、保存されたウシ精子の総運動性及び前進運動性。ＮａＣｌ対照と比較した有意差。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１ ＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図4】ウシ精液の採取中に精子への低温ショックを防ぐために、採取管の周りに簡素なウォータージャケットを使用していることを例解している。
【図5】ＮａＣｌ、塩化コリン、グリシン、バリン、又はアラニンを補充したウシ用エクステンダー基礎液に、ＲＴで３日間、７日間、１０日間、又は１４日間保存した後の、保存されたウシ精子の総運動性及び前進運動性。ＮａＣｌ対照と比較した有意差。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１ ＊＊＊Ｐ≦０．００１ ＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。
【図6】ＡｎｄｒｏＭｅｄ（商標）中に凍結保存された精子と比較した、グリシン（８２．２ｍＭ）を含有する新規ウシ用エクステンダー培地に７日間及び１４日間保存した精子の総運動性及び前進運動性。異なる上付き文字は有意差を示す。個体差：新規７対Ｃｒｙｏの総運動性Ｐ≦０．０００１、前進運動性Ｐ≦０．０５；新規７対新規１４の総運動性Ｐ≦０．００１、前進運動性Ｐ≦０．０５．いずれのパラメータについても、Ｃｒｙｏと新規１４との間に有意差はない。
【図7】ＡｎｄｒｏＭｅｄ（商標）中に凍結保存された精子と比較した、グリシン（８２．２ｍＭ）を含有する新規ウシ用エクステンダー培地に７日間及び１４日間保存した精子を使用したＩＶＦ後の受精率（２つの前核を有する推定接合体のパーセンテージとして表される；２ＰＮ）。＊＊＊は、Ｐ≦０．００１を示す。
【発明を実施するための形態】
【0046】
本発明に到達する際に、本発明者らは、ウシ精子が、精子の液体保存中に、種牡馬精子と比較して受精能力の維持に驚くほど異なる要件を有すること、及び、本明細書に記載のウシ動物に由来するような精子の受精能力が、いくつかのアミノ酸オスモライトの使用によって、エクステンダー培地中で他と比較して顕著に延長され得ることを見出した。
【0047】
本発明によって具現化された精子エクステンダー培地中で利用され得るアミノ酸オスモライトの例は、グリシン、アラニン、バリン、及びタウリンである。これらのアミノ酸の最初の３つは、αモノアミノカルボン酸であり、タウリン（２－アミノエタン－１－スルホン酸）は、本明細書に記載の好適なβモノアミノスルホン酸の一例である。グリシン及びタウリンは非置換であるが（したがって、それらのアミノ酸のＲ側基はＨである）、アラニンのＲ側基はメチル（Ｃ１基）であり、バリンのＲ側基は１－メチル－エチル（置換Ｃ２鎖）である。グリシンの水素Ｒ基、並びにアラニン、バリン、及びタウリンの各々のＲ側基は、全て非極性の中性側基である。
【0048】
予想外に、グリシン、アラニン、及びバリンの非極性Ｒ側基に起因して非極性であると分類された７つの一般的な他のα－アミノ酸、すなわち、ロイシン、イソロイシン、プロリン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンは、室温でウシ精子の運動性を延長する能力を示さなかったか、又は比較的限定された能力を示したのみであった。同様に、以下の実施例に更に記載されるように、Ｒ側鎖に基づいて極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は酸性アミノ酸に分類される残りの１０個の一般的なα－アミノ酸については、比較的良くない結果が見られた。
【0049】
本開示による精子エクステンダー培地での使用のために選択される各アミノ酸オスモライトは、糖原性であることが特に好ましい。「糖原性」アミノ酸とは、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクル（クレブスサイクルとしても知られる）においてグルコース、ピルビン酸、又は中間体に変換され得るため、細胞エネルギーを提供するためのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の産生に利用され得るアミノ酸を意味する。したがって、有利には、糖原性アミノ酸は、オスモライトとして作用するだけでなく、ＡＴＰの産生のための炭素エネルギー源としても作用することができ、ウシ精子の運動性、ひいては受精能を延長する。
【0050】
本開示による精子エクステンダー培地に有用なアミノ酸オスモライト（複数可）は、典型的には、独立して、Ｈ、メチル、及び１－メチル－エチルから選択される単一のＲ側基を有する。本明細書に記載される２つ以上の好適な生理学的に許容されるアミノ酸オスモライトの混合物が利用されてもよいが、単一のそのようなαアミノ酸オスモライト又はβアミノ酸オスモライトのみが、培地中に存在してもよい。
【0051】
典型的には、本明細書に記載の精子エクステンダー培地に有用なアミノ酸オスモライトの等電点（ｐＩ）は、約５．９６～約６．０である。例えば、グリシンのｐＩは５．９７であり、アラニンのｐＩは６．０である。バリンのｐＩは５．９６である。これは、イソロイシン（ｐＩ＝６．０２）、プロリン（ｐＩ＝６．３）、システイン（ｐＩ＝５．０７）、メチオニン（ｐＩ＝５．７４）、フェニルアラニン（ｐＩ＝５．４８）、及びトリプトファン（ｐＩ＝５．８９）といった他の極性アミノ酸と対照的である（Ｌｉｄｅ ＤＲ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，７２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９１）。
【0052】
典型的には、本明細書に記載の実施形態において、本明細書に記載の培地中のαアミノ酸オスモライト及び／又はβアミノ酸オスモライト（複数可）の総濃度又は合わせた全体濃度は、一般に４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、より通常には約７０ｍＭ～約９０ｍＭの範囲であり、典型的には、約７５ｍＭ、７６ｍＭ、７７ｍＭ、７８ｍＭ、７９ｍＭ、８０ｍＭ、８１ｍＭ、８２ｍＭ、８３ｍＭ、８４ｍＭ又は約８５ｍＭである。
【0053】
αアミノ酸オスモライト及び／又はβアミノ酸オスモライト（複数可）は、一般に、濃度に関して、エクステンダー培地中のαアミノ酸及び／又はβアミノ酸（複数可）の５０％超、一般に、５５％、６０％、６５％、若しくは７０％超を含み、より通常には、培地中のαアミノ酸及び／又はβアミノ酸（複数可）の少なくとも約７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、若しくは９５％以上を含む。典型的には、１つ以上のアミノ酸オスモライトは、エクステンダー培地中のαアミノ酸及び／又はβアミノ酸（複数可）の１００％を含む。
【0054】
特に好ましい実施形態において、１つ以上の更なる有機オスモライトをエクステンダー培地に含めることができ、例えば、Ｌ－カルニチン、コリン（典型的には塩化物塩として）、ミオイノシトール、他のαアミノ酸オスモライト及びβアミノ酸オスモライト、並びにそれらの組み合わせから選択され得る。例えば、Ｌ－カルニチンは、エネルギー産生のために長鎖脂肪酸を細胞のミトコンドリアに輸送することが知られており、抗酸化剤である。本明細書に記載の実施形態において、本発明のエクステンダー培地におけるアミノ酸オスモライト（複数可）と組み合わせたＬ－カルニチンの使用が特に好ましい。典型的には、本発明によるウシ用エクステンダー培地中の更なる有機オスモライト（複数可）の全体濃度は、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、より通常には約８０～約１１０ｍＭ、好ましくは、約８５ｍＭ～約１０５ｍＭの範囲（例えば、８５ｍＭ、８６ｍＭ、８７ｍＭ、８８ｍＭ、８９ｍＭ、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１０１ｍＭ、１０２ｍＭ、１０３ｍＭ、１０４ｍＭ、又は１０５ｍＭ）である。
【0055】
ウシ精子のための任意の好適な単糖エネルギー源が、本発明によるエクステンダー培地に利用され得るが、本開示の少なくともいくつかの実施形態における単糖エネルギー源は、フルクトース、グルコース、ガラクトース、マンノース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。典型的には、利用される単糖（複数可）は、約４ｍＭ～約１０ｍＭ、より通常には、約５ｍＭ～約６ｍＭ、又は５．２５ｍＭ～約５．７５ｍＭ、好ましくは、約５．０ｍＭ～約５．６ｍＭの総濃度（例えば、５．０ｍＭ、５．１ｍＭ、５．２ｍＭ、５．３ｍＭ、５．４ｍＭ、又は５．５ｍＭ、５．６ｍＭ、５．７ｍＭ、５．８ｍＭ、５．９ｍＭ、又は６．０ｍＭ）でエクステンダー培地中に存在する。
【0056】
エクステンダー培地はまた、精子による単糖（複数可）の取り込みを促進するために、１つ以上の生理学的に許容される血糖降下剤を含むことができる。ロシグリタゾンは、例えば、凍結保存を用いずに周囲温度でウマ精子の受精能を延長することが報告されているチアゾリジンジオン血糖降下剤であり、アデノシン５’－リン酸プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）及びプロテインキナーゼＢ（Ａｔｋ）の活性化因子である（Ｓｗｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１６；Ｏｒｔｉｚ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，２０１９）。ロシグリタゾンは、ウシ用エクステンダー培地に利用され得る好ましい血糖降下剤であるが、本発明はそれに限定されず、任意の他の好適なチアゾリジンジオン、又はＡＭＰＫ及び／若しくはＡｋｔを活性化することができる他のそのような薬剤を含む、他の血糖降下剤が利用されてもよい。典型的には、エクステンダー培地に使用される場合、血糖降下剤（複数可）は、約１ｍＭ～約６０ｍＭ、より通常には約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、より好ましくは約１５～３０ｍＭの範囲、例えば、約１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ又は３０ｍＭの濃度で存在する。
【0057】
少なくともいくつかの形態のエクステンダー培地はまた、単糖（複数可）以外の１つ以上の有機炭素エネルギー源を含み得る。更なるそのようなエネルギー源の例としては、ピルビン酸ナトリウム等の、任意の生理学的に許容される塩の形態で添加され得るピルビン酸が挙げられる。存在する場合、ピルビン酸は、一般に、約０．５ｍＭ～約１０又は２０ｍＭの濃度範囲で用いられる。より典型的には、ピルビン酸は、約３ｍＭ～約８ｍＭ、より通常には約４．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約６ｍＭの濃度（例えば、５．０ｍＭ、５．１ｍＭ、５．２ｍＭ、５．３ｍＭ、５．４ｍＭ、５．５ｍＭ、５．６ｍＭ、５．７ｍＭ、５．８ｍＭ、５．９ｍＭ又は６．０ｍＭ）でエクステンダー培地中に存在する。
【0058】
本発明のエクステンダー培地の実施形態における抗酸化剤（複数可）の役割は、主に、フリーラジカル、特に、過酸化物、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、及び一重項酸素種等の活性酸素種（ＲＯＳ）を除去することである。本発明によって具現化されたエクステンダー培地中で利用され得る好適な更なる抗酸化剤（複数可）には、コエンザイムＱ１０が含まれる。利用され得る他の抗酸化剤としては、α－トコフェロール、メラトニン、及びビタミンＣが挙げられる。そのような更なる抗酸化剤は、典型的には、約１０ｍＭ～約１７５ｍＭ、より通常には約９０ｍＭ～約１５０ｍＭ、好ましくは、約１００ｍＭ～約１４０ｍＭの合計総濃度（例えば、１００ｍＭ、１０５ｍＭ、１１０ｍＭ、１１５ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ又は１４０ｍＭ）で存在する。
【0059】
本明細書に記載の精子エクステンダー培地に含めることができる精子のための別の炭素エネルギー源は、乳酸である。乳酸はまた、酸性度調整剤として作用することによってｐＨを維持するのに役立ち得る。典型的には、使用される場合、乳酸は、約１０ｍＭ～約３０ｍＭの範囲、より通常には約１５ｍＭ～約２５ｍＭの範囲の濃度（例えば、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ又は２５ｍＭ）でエクステンダー培地中に存在し得る。
【0060】
エクステンダー培地に利用され得る他の酸性度調整剤としては、典型的にはナトリウム塩として利用されるビカルボナート（例えば、約５ｍＭ～約４５ｍＭの濃度、より通常には約１０ｍＭ～約４０ｍＭ又は１５～３５ｍＭの範囲、好ましくは約２０ｍＭ～約３０ｍＭの範囲の濃度）が挙げられる。
【0061】
利用され得る緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）（例えば、Ｇｉｂｃｏ）が挙げられ、通常、約１～５ｍＭ、より通常には約１ｍＭ～約３．０ｍＭ、最も好ましくは、約２ｍＭの濃度で用いられる。ＨＥＰＥＳは、本発明によるウシ用精子エクステンダー培地のｐＨを緩衝するために好ましく使用されるが、他の好適な従来の生理学的に許容される両性イオン緩衝剤又は両性イオン緩衝系が用いられてもよい。
【0062】
本明細書に記載の精子エクステンダー培地は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等の精子抗凝集剤、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン及びアミカシン等の抗菌剤、並びにナイスタチン及びフルコナゾール等の抗真菌剤から選択され得る薬剤を更に含むことができる。
【0063】
エクステンダー培地における精子生存率を維持するための生理学的に許容される無機塩は、典型的には、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びナトリウムといった無機塩、例えば、それらの塩化物塩、リン酸塩、及び硫酸塩から選択される。エクステンダー培地に含めることができる特定の塩としては、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、及びＮａＣｌが挙げられる。そのような塩は、例えば、細胞膜電位を維持し、細胞栄養所要量を提供するために、溶液中にＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ－、ＳＯ４２－及び／又はＰＯ４２－のイオンを提供するために細胞及び胚培養培地で一般的に使用される。典型的には、ウシ用エクステンダー培地中のそれぞれの無機塩の濃度は、約１ｍＭ～約５ｍＭの範囲である。マグネシウムは、精液中に比較的高い量で見出されるが、典型的には、約５５ｍＭ～約６５ｍＭの範囲の濃度（例えば、５５ｍＭ、５６ｍＭ、５７ｍＭ、５８ｍＭ、５９ｍＭ、６０ｍＭ、６１ｍＭ、６２ｍＭ、６３ｍＭ、６４ｍＭ、又は６５ｍＭ）で、本発明のウシ用精子エクステンダー培地（例えば、ＭｇＳＯ４として提供される）の少なくともいくつかの実施形態に提供される。
【0064】
しかしながら、以下に更に記載されるように、ナトリウムイオン濃度は、インビトロでの精子寿命に有害であると報告されており、本発明者らは、それが細胞恒常性を維持するためのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅの活性による細胞アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）レベルの枯渇に起因するものであると考える。本発明の実施形態において、ウシ用エクステンダー培地中のナトリウムイオンの濃度は、望ましくは、約９５ｍＭ、９０ｍＭ、８５ｍＭ、又は８０ｍＭ未満のレベル、より通常には、約７０ｍＭ以下、６５ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、及び最も好ましくは、約５０ｍＭ以下のレベルまで最小化される。
【0065】
典型的には、培地は、エクステンダー培地で利用される緩衝剤（複数可）と酸性度調整剤（複数可）との組み合わせによって形成される緩衝系によって、約７．０～約８．５のｐＨ範囲内に緩衝され、より好ましくは約７．５～約８．５のｐＨ範囲内に緩衝される。培地のｐＨは、ＨＣｌ又はＫＯＨ等の好適な酸又は塩基の使用により、この範囲内に調整することができるが、培地の最終ｐＨは、使用される特定のアミノ酸オスモライト（複数可）によって決定される。
【0066】
精子エクステンダー培地のモル浸透圧濃度は、一般に、約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ～約４００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲であり、より通常には、約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ～約３９０ｍＯｓｍ／Ｌ、約３８０ｍＯｓｍ／Ｌ、３７０ｍＯｓｍ／Ｌ、３６０ｍＯｓｍ／Ｌ、３５０ｍＯｓｍ／Ｌ若しくは３４０ｍＯｓｍ／Ｌ、又は約３００ｍＯｓｍ／Ｌ～約３４０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲であり、例えば、３００ｍＯｓｍ／Ｌ、３０５ｍＯｓｍ／Ｌ、３１０ｍＯｓｍ／Ｌ、３１５ｍＯｓｍ／Ｌ、３２０ｍＯｓｍ／Ｌ、３２５ｍＯｓｍ／Ｌ、３３０ｍＯｓｍ／Ｌ、３３５ｍＯｓｍ／Ｌ又は３４０ｍＯｓｍ／Ｌである。
【0067】
本開示による精子エクステンダー培地の構成成分の特定の濃度範囲が上に記載されているが、記載された濃度範囲の上限及び下限を有する関連構成成分の全ての濃度が、本明細書に明示的に提供されることが理解されるであろう。
【0068】
本明細書に記載されるように、本開示によって具現化された精子エクステンダー培地は、従来知られている凍結保存のような技術を用いたインビトロ又はインビボでの受精のために精子を使用するまで、凍結保存の不在下で、周囲温度で家畜動物の精子の受精能を延長するために使用され得る。特に好ましい実施形態において、精子エクステンダー培地は、精子の凍結保存の不在下で、３日を超える期間にわたって、好ましい実施形態において、少なくとも５日間、周囲温度で液体保存中の家畜動物の精子の受精能を維持することができる。
【0069】
典型的には、精液は、好適な採取容器（例えば、市販されている円錐形の不活性プラスチック製の遠心管）内の生理学的に許容される培地中に採取されるか、又はさもなければ、好適なそのような容器に採取され、選択された生理学的に許容される培地（例えば、好適な細胞培養液、又はウマ若しくはウシ用の精子エクステンダー培地）で希釈された後、好ましくは密度勾配遠心分離プロトコルを用いた遠心分離により精漿から精子が分離され、分離された精子が再懸濁され、更なる遠心分離により精子が１回以上洗浄され、使用されるまで周囲温度で液体保存するために本発明によって具現化された精子エクステンダー培地に最終的に再懸濁される。望ましくは、ウシ血清が採取される生理学的に許容される培地は、必要に応じて、例えば、約２５℃～約３７℃の範囲（例えば、３０℃）の適切な温度まで予備加温される。洗浄ステップ（複数可）に使用される培地も、同様に予備加温することができる。特に好ましい実施形態において、本発明による精子エクステンダー培地は、精液が採取される生理学的に許容される培地としてだけでなく、洗浄ステップ（複数可）のためにも使用される。
【0070】
使用するまで精子が保存される周囲温度又は室温（ＲＴ）は、望ましくは、例えば、１７℃～約２５℃の範囲であり、好ましくは約２２℃である。精子は、使用するまで、例えば、空調管理された部屋若しくは環境、又は、一般的に既知であるような従来の冷たいゲル若しくはアイスパックによって冷却された絶縁運搬容器に保存することができる。
【0071】
本明細書に記載の精子エクステンダー製剤は、本発明によるエクステンダー培地を形成するように一緒に添加又は混合されるために、固体（例えば、粉末として）又は部分的に固体の形態で提供され得る。例えば、二重蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）又は脱イオン水中に、培地のそれぞれの構成成分の所定濃度で最終体積に一緒に混合されるように、例えば、エクステンダー培地のいくつかの構成成分は、溶液で提供されてもよく、他の構成成分は粉末形態で提供されてもよい。更に、本発明による精子エクステンダー培地のいくつかの実施形態は、コエンザイムＱ１０及びロシグリタゾン等の構成成分を含んでもよく、これらは低い水溶性を有するため、好適な溶媒及び／又は熱を使用して事前に可溶化する必要があり得る。例えば、コエンザイムＱ１０を４２℃のジメチルホルムアミドに溶解させる一方で、ロシグリタゾンを同じ温度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させて、後に使用するためのストック溶液を提供することができる。加えて、エクステンダー製剤の構成成分は、凍結乾燥させて、ｄｄＨ２Ｏ又は脱イオン水で再構成することができ、施設内で使用するために別々に提供される。
【0072】
本発明は、精子エクステンダー培地のいくつかの非限定的な例を参照して以下に更に説明されるが、本開示はそれに限定されず、本開示による実施形態は、家畜ヒツジ又はヤギの精子等の、液体保存中の他の反芻家畜動物種の精子の生存率を延長するために使用され得る。
【0073】
実施例１：精液エクステンダー培地の最適化
１．一般的な方法論
ウマ用精子エクステンダー培地ＩＮＲＡ９６は、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（Ｂａｌｌａｒａｔ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入し、実験１（セクション２を参照）で精子を単離するために使用したＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）（Ｎｉｄａｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）は、Ｔｅｋ Ｅｖｅｎｔ（Ｒｏｕｎｄ Ｃｏｒｎｅｒ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。特に明記しない限り、他の全ての化学物質及び試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃａｓｔｌｅ Ｈｉｌｌ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。
１．一般的な方法論
ウマ用精子エクステンダー培地ＩＮＲＡ９６は、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（Ｂａｌｌａｒａｔ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入し、実験１（セクション２を参照）で精子を単離するために使用したＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）（Ｎｉｄａｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）は、Ｔｅｋ Ｅｖｅｎｔ（Ｒｏｕｎｄ Ｃｏｒｎｅｒ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。特に明記しない限り、他の全ての化学物質及び試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃａｓｔｌｅ Ｈｉｌｌ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。
【0074】
１．１ 培地ＢＷＷ
約３１０ｍＯｓｍ／Ｌのモル浸透圧濃度を有する、９５ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．７ｍＭのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、５．６ｍＭのＤ－グルコース、２７５μＭのピルビン酸ナトリウム、３．７μｌ／ｍｌの６０％乳酸ナトリウムシロップ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、緑膿菌の増殖を防止するための０．２５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ａｕｒｉｃｈ ａｎｄ Ｓｐｅｒｇｓｅｒ ２００７）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコールを含有する、改変されたビガーズ・ウィッテン・ウィッティンガム培地（ＢＷＷ）培地（Ｂｉｇｇｅｒｓ，Ｗｈｉｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．１９７１）を、本研究を通して対照培地として使用した。
約３１０ｍＯｓｍ／Ｌのモル浸透圧濃度を有する、９５ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．７ｍＭのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、５．６ｍＭのＤ－グルコース、２７５μＭのピルビン酸ナトリウム、３．７μｌ／ｍｌの６０％乳酸ナトリウムシロップ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、緑膿菌の増殖を防止するための０．２５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ａｕｒｉｃｈ ａｎｄ Ｓｐｅｒｇｓｅｒ ２００７）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコールを含有する、改変されたビガーズ・ウィッテン・ウィッティンガム培地（ＢＷＷ）培地（Ｂｉｇｇｅｒｓ，Ｗｈｉｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．１９７１）を、本研究を通して対照培地として使用した。
【0075】
１．２ 勾配遠心分離
高品質の雄牛精子の選択は、４５％及び９０％の不連続Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｓｔｌｅ Ｈｉｌｌ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）又はＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）遠心分離勾配を使用して達成した。この手順のために、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）（９０ｍＬ）に、１０ｍＬのＨａｍ’ｓ Ｆ１０溶液、３７０μＬの乳酸ナトリウムシロップ、３ｍｇのピルビン酸ナトリウム、２１０ｍｇの炭酸水素ナトリウム、及び１００ｍｇのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を補充した。この等張性Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）溶液又はＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）をＢＷＷで希釈し、不連続勾配を作製した（４５％及び９０％の等張性Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）／ＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）：それぞれ、５５％及び１０％のＢＷＷ）。１５ｍＬの円錐遠心管（ＢＤＦａｌｃｏｎ）中で、３ｍＬの９０％溶液を、３ｍＬの４５％溶液の下に重層した。
高品質の雄牛精子の選択は、４５％及び９０％の不連続Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｓｔｌｅ Ｈｉｌｌ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）又はＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）遠心分離勾配を使用して達成した。この手順のために、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）（９０ｍＬ）に、１０ｍＬのＨａｍ’ｓ Ｆ１０溶液、３７０μＬの乳酸ナトリウムシロップ、３ｍｇのピルビン酸ナトリウム、２１０ｍｇの炭酸水素ナトリウム、及び１００ｍｇのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を補充した。この等張性Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）溶液又はＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）をＢＷＷで希釈し、不連続勾配を作製した（４５％及び９０％の等張性Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）／ＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）：それぞれ、５５％及び１０％のＢＷＷ）。１５ｍＬの円錐遠心管（ＢＤＦａｌｃｏｎ）中で、３ｍＬの９０％溶液を、３ｍＬの４５％溶液の下に重層した。
【0076】
１．３ 精子の採取及び調製
本研究における動物材料の使用について、施設及びＮｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ州政府の倫理的承認を確保した。本研究は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓｔｕｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｗａｇｇａ Ｗａｇｇａ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の機関で承認された施設で行われた、受精能が証明されている１７頭の正常精子アンガス雄牛（３～７歳）からの射精液に基づいていた。電気射精によって精液を採取し、射精液を未希釈のままにした（実験１）か、又はＩＮＲＡ９６で直ちに希釈した（２：１、エクステンダー：精液）（実験２及び３－セクション２及び３）。この初期希釈は、処理中に毒性の精漿タンパク質によって引き起こされる精子への損傷を軽減するのに有益であることが見出された（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ａｎｄ Ｍａｎｊｕｎａｔｈ ２００６）。精液の採取及び希釈中、機器及びエクステンダー培地を３０℃～３７℃の温度に維持した。次いで、更なる処理の前に、希釈保存した精液の管を、研究室内で最大３０分間、ＲＴ（約２０～２５℃）で保持した。実験１では、最大６ｍＬの希釈保存した精液を直接遠心分離する（７００×ｇで１０分間）か、又はＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）勾配の上に重層し、７００×ｇで２０分間遠心分離し、実験２及び３では、最大５ｍＬの希釈保存した精液をＰｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配の上に重層し、７００×ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、精漿及び密度勾配培地を除去し、廃棄した。管の底部から精子を回収し、２ｍＬのＢＷＷに再懸濁し、ＢＷＷとともに遠心分離（５００×ｇで５分間）することによって洗浄した。次いで、これらのペレット化された細胞を、実験用エクステンダー培地中で５０×１０６精子／ｍＬの濃度で再懸濁した。
本研究における動物材料の使用について、施設及びＮｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ州政府の倫理的承認を確保した。本研究は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓｔｕｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｗａｇｇａ Ｗａｇｇａ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の機関で承認された施設で行われた、受精能が証明されている１７頭の正常精子アンガス雄牛（３～７歳）からの射精液に基づいていた。電気射精によって精液を採取し、射精液を未希釈のままにした（実験１）か、又はＩＮＲＡ９６で直ちに希釈した（２：１、エクステンダー：精液）（実験２及び３－セクション２及び３）。この初期希釈は、処理中に毒性の精漿タンパク質によって引き起こされる精子への損傷を軽減するのに有益であることが見出された（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ａｎｄ Ｍａｎｊｕｎａｔｈ ２００６）。精液の採取及び希釈中、機器及びエクステンダー培地を３０℃～３７℃の温度に維持した。次いで、更なる処理の前に、希釈保存した精液の管を、研究室内で最大３０分間、ＲＴ（約２０～２５℃）で保持した。実験１では、最大６ｍＬの希釈保存した精液を直接遠心分離する（７００×ｇで１０分間）か、又はＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）勾配の上に重層し、７００×ｇで２０分間遠心分離し、実験２及び３では、最大５ｍＬの希釈保存した精液をＰｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配の上に重層し、７００×ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、精漿及び密度勾配培地を除去し、廃棄した。管の底部から精子を回収し、２ｍＬのＢＷＷに再懸濁し、ＢＷＷとともに遠心分離（５００×ｇで５分間）することによって洗浄した。次いで、これらのペレット化された細胞を、実験用エクステンダー培地中で５０×１０６精子／ｍＬの濃度で再懸濁した。
【0077】
１．４ 精子運動性分析
精子運動性は、以下の設定を使用したコンピュータ支援精子分析（ＣＡＳＡ；ＩＶＯＳ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｔｈｏｒｎｅ、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）により客観的に決定した：負の位相コントラスト光学、６０フレーム／秒の記録速度、７０の最小コントラスト、４ピクセルの最小セルサイズ、０．１７の低サイズゲート、２．９の高サイズゲート、０．６の低強度ゲート、１．７４の高強度ゲート、１０ピクセルの非運動頭部サイズ、１３５の非運動頭部の輝度、５０μｍ／秒の前進性ＶＡＰ閾値、２０μｍ／秒の遅い（静的）細胞のＶＡＰ閾値、０μｍ／秒の遅い（静的）細胞のＶＳＬ閾値、及び７５％の閾値ＳＴＲ。≧５０μｍ／秒のＶＡＰ及び≧７５のＳＴＲを呈する細胞は、前進性とみなした。前進性細胞の平均ＶＡＰよりも高いＶＡＰを有する細胞を「高速」とみなした。Ｌｅｊａの標準的な２０μｍ計数スライド（Ｇｙｔｅｃｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）及び３７℃の段階温度を使用して、少なくとも５つのフィールドで少なくとも２００個の精子を評価した。
精子運動性は、以下の設定を使用したコンピュータ支援精子分析（ＣＡＳＡ；ＩＶＯＳ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｔｈｏｒｎｅ、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）により客観的に決定した：負の位相コントラスト光学、６０フレーム／秒の記録速度、７０の最小コントラスト、４ピクセルの最小セルサイズ、０．１７の低サイズゲート、２．９の高サイズゲート、０．６の低強度ゲート、１．７４の高強度ゲート、１０ピクセルの非運動頭部サイズ、１３５の非運動頭部の輝度、５０μｍ／秒の前進性ＶＡＰ閾値、２０μｍ／秒の遅い（静的）細胞のＶＡＰ閾値、０μｍ／秒の遅い（静的）細胞のＶＳＬ閾値、及び７５％の閾値ＳＴＲ。≧５０μｍ／秒のＶＡＰ及び≧７５のＳＴＲを呈する細胞は、前進性とみなした。前進性細胞の平均ＶＡＰよりも高いＶＡＰを有する細胞を「高速」とみなした。Ｌｅｊａの標準的な２０μｍ計数スライド（Ｇｙｔｅｃｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）及び３７℃の段階温度を使用して、少なくとも５つのフィールドで少なくとも２００個の精子を評価した。
【0078】
１．５ フローサイトメトリーによる生存率及び先体完全性の分析
精子試料の１００μＬアリコートを、遠心分離（３００×ｇで３分間）によってペレット化し、ＦＩＴＣ－ＰＮＡ（０．８μｇ／ｍＬ）及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｓｔａｉｎ（０．５μＬ／ｍＬ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含有する２００μＬのＢＷＷに再懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートした。染色後、精子を遠心分離によってペレット化し、フローサイトメトリー分析のためにＢＷＷに再懸濁した。全てのフローサイトメトリーは、４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザーを用いてＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して行った。放射測定は、５３０／３０バンドパスフィルタ（緑色／ＦＬ－１）及び＞６７０ロングパスフィルタ（近赤外／ＦＬ－４）を使用して行った。前方散乱光／側方散乱光のドットプロットを使用してデブリをゲートアウトし、試料ごとに少なくとも１００００個の細胞を分析した。全てのデータを、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して分析した。精子は、先体が無傷の生存精子（緑色蛍光でも赤色蛍光のいずれでもない）、先体が損傷している生存精子（緑色蛍光のみ）、先体が無傷の死滅精子（赤色蛍光のみ）、又は先体が損傷している死滅精子（赤色及び緑色蛍光）のいずれかに分類された。
精子試料の１００μＬアリコートを、遠心分離（３００×ｇで３分間）によってペレット化し、ＦＩＴＣ－ＰＮＡ（０．８μｇ／ｍＬ）及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｓｔａｉｎ（０．５μＬ／ｍＬ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含有する２００μＬのＢＷＷに再懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートした。染色後、精子を遠心分離によってペレット化し、フローサイトメトリー分析のためにＢＷＷに再懸濁した。全てのフローサイトメトリーは、４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザーを用いてＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して行った。放射測定は、５３０／３０バンドパスフィルタ（緑色／ＦＬ－１）及び＞６７０ロングパスフィルタ（近赤外／ＦＬ－４）を使用して行った。前方散乱光／側方散乱光のドットプロットを使用してデブリをゲートアウトし、試料ごとに少なくとも１００００個の細胞を分析した。全てのデータを、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して分析した。精子は、先体が無傷の生存精子（緑色蛍光でも赤色蛍光のいずれでもない）、先体が損傷している生存精子（緑色蛍光のみ）、先体が無傷の死滅精子（赤色蛍光のみ）、又は先体が損傷している死滅精子（赤色及び緑色蛍光）のいずれかに分類された。
【0079】
１．５ 統計分析
本研究で使用された全てのデータは、分析の前に正規分布について検定した。正規分布に適合するようにデータを変換することができない場合は、ノンパラメトリック検定を行った。全ての実験データは、ＪＭＰ、バージョン１４．０ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。著しい処理効果がＡＮＯＶＡによって特定された場合（α＝０．０５）、平均比較を行った。全ての実験において、様々な処理培地に保存された精子のパラメータ間の差異は、平均値のペアワイズ比較のためのスチューデントのｔ検定を使用して特定した（α＝０．０５）。
本研究で使用された全てのデータは、分析の前に正規分布について検定した。正規分布に適合するようにデータを変換することができない場合は、ノンパラメトリック検定を行った。全ての実験データは、ＪＭＰ、バージョン１４．０ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。著しい処理効果がＡＮＯＶＡによって特定された場合（α＝０．０５）、平均比較を行った。全ての実験において、様々な処理培地に保存された精子のパラメータ間の差異は、平均値のペアワイズ比較のためのスチューデントのｔ検定を使用して特定した（α＝０．０５）。
【0080】
２．実験１－精子調製プロトコルの最適化及び雄牛精子に対する独自の種牡馬用エクステンダー培地の試験
本研究の目的は、本発明者の研究グループによって８年間にわたって開発されている独自の周囲温度向け種牡馬用精子エクステンダー（以下「独自の」ウマ用エクステンダー培地と称される）中で、ウシ精子を室温（ＲＴ）で効果的に保存することができるかどうか、及びＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）遠心分離ステップを使用して死滅細胞、精漿、及び微生物汚染物質から高品質の精子を単離することが、ＲＴで保存中の精子寿命に有益であるかどうかを確認するための予備調査を実施することであった。ＩＮＲＡ９６（商標）は、ウシ精子の液体保存に最適であることが以前に報告されている市販の種牡馬用精液エクステンダーであり（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．２０１７）、本研究の対照培地として利用した。
本研究の目的は、本発明者の研究グループによって８年間にわたって開発されている独自の周囲温度向け種牡馬用精子エクステンダー（以下「独自の」ウマ用エクステンダー培地と称される）中で、ウシ精子を室温（ＲＴ）で効果的に保存することができるかどうか、及びＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）遠心分離ステップを使用して死滅細胞、精漿、及び微生物汚染物質から高品質の精子を単離することが、ＲＴで保存中の精子寿命に有益であるかどうかを確認するための予備調査を実施することであった。ＩＮＲＡ９６（商標）は、ウシ精子の液体保存に最適であることが以前に報告されている市販の種牡馬用精液エクステンダーであり（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．２０１７）、本研究の対照培地として利用した。
【0081】
６頭の雄牛からの精子を上に概説したように処理し、１７℃で３日間の液体保存後にＣＡＳＡ運動性分析を行った。
【0082】
遠心処理と精子保存培地との間の統計的交互作用は観察されなかったため、更なる分析のためにデータをプールした。ＩＮＲＡ９６（商標）に保存された精子の前進運動性及び総運動性は、独自のウマ用エクステンダー培地に保存されたものよりも著しく高く（総運動性及び前進運動性は、それぞれ、７１対３１％及び６３．３対２７％；Ｐ≦０．０００１）、ＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）を使用した精子の単離は、直接遠心分離に単独と比較して有意に改善された総運動性及び前進運動性をもたらした（それぞれ、５９．１対４３．５％及び５２．２対３８．１％；Ｐ≦０．０１）。
【0083】
これらの結果は、ウシ精子が明らかに、ウマ精子と比較してインビトロ保存中の特有の要件を有することを示す。加えて、本発明者らは、密度勾配遠心分離を使用したウシ精子の単離が、保存中の精子の質を著しく改善したことを観察した。ＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）及びＰｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配によってウシ精子を処理することが実際に精子の質を改善すると報告している他の報告もあるが（Ａｒｉａｓ，Ａｎｄａｒａ ｅｔ ａｌ．２０１７；Ｓａｍａｒｄｚｉｊａ，Ｋａｒａｄｊｏｌｅ ｅｔ ａｌ．２００６ａ；Ｓａｍａｒｄｚｉｊａ，Ｋａｒａｄｊｏｌｅ ｅｔ ａｌ．２００６ｂ）、液体保存を意図した精子に対する密度勾配遠心分離の長期的な影響を示している研究はない。このステップは、残りの生存細胞の酸化ストレスに寄与する死滅細胞及び死滅しかけた細胞を除去するだけでなく（Ａｉｔｋｅｎ、Ｎａｕｍｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１５；Ｕｐｒｅｔｉ、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９８）、生の射精液中に存在し得る微生物及びウイルス汚染物質を著しく減少させる（Ｇａｌｕｐｐｏ、Ｊｕｎｉｏｒ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｖａｒｅｌａ、Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１８）、精子をより高い温度で保存する場合に重要なステップである。
【0084】
３．実験２－ウシ精子の液体保存のためのエクステンダー培地要件の決定
独自のウマ用エクステンダー製剤に保存された雄牛精子の運動性が、ＩＮＲＡ９６（商標）ウマ用精液エクステンダーに保存されたものよりも著しく低かったという、上記の実験１の結果に基づいて、ＲＴで２４時間後のウシ精子の運動性に異なる構成成分が与える影響を調査するための研究が行われた。
独自のウマ用エクステンダー製剤に保存された雄牛精子の運動性が、ＩＮＲＡ９６（商標）ウマ用精液エクステンダーに保存されたものよりも著しく低かったという、上記の実験１の結果に基づいて、ＲＴで２４時間後のウシ精子の運動性に異なる構成成分が与える影響を調査するための研究が行われた。
【0085】
とりわけ、ｐＨ、重炭酸ナトリウム含有量、ピルビン酸ナトリウム用量、及びオスモライト源（例えば、ＮａＣｌ、Ｌ－カルニチン、塩化コリン）を含む、一般的な細胞培地パラメータ及び成分の影響を本研究中に観察した。
【0086】
７．５～８．５のｐＨが、総運動性及び前進運動性の両方にとって好ましいことが見出された。０ｍＭ、０．２７５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、及び２０ｍＭのピルビン酸ナトリウム濃度を評価した。ピルビン酸ナトリウムの不在と、評価した０．２７５ｍＭ～２０ｍＭの各試験濃度との間で、精子の運動性に有意差は観察されなかった。
【0087】
ＮａＣｌは、培養培地中で最も一般的に利用されるオスモライトであるが、発明者らは最近、Ｌ－カルニチン又は塩化コリン等の代替オスモライトが、ＲＴでの液体保存中に精子の寿命をより良好に維持し得ることを見出した。特に、本研究において、発明者らは、ＮａＣｌの５０％をＬ－カルニチン（１００ｍＭ）又は塩化コリン（９５ｍＭ）のいずれかで置き換えたときに、ウシ精子の総運動性及び前進運動性の両方が改善されたことを見出した。
【0088】
ＣＡＳＡによって決定される２４時間の印でのフィールド条件下では、評価された濃度（０～１００μＭ）でのロシグリタゾン用量、糖源（例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、又はラフィノース）、又はコエンザイムＱ１０の著しい影響は記録されなかった。しかしながら、試験試料を連日にわたって主観的に監視し、最大の精子寿命を呈する処理（事実上、光学顕微鏡下で評価したときに、全ての細胞が不動になるのに最も長くかかったもの）を、ウシ用エクステンダー基礎液に含めるために選択し、本発明者らは、これがウシ用エクステンダー基礎液での使用に好適であると考えた。基礎液の構成成分を下の表１に列挙する。
【表1】
【0089】
４．実験３－ウシ用エクステンダー基礎液とＩＮＲＡ９６との比較
ウシ用エクステンダー基礎液を、ＩＮＲＡ９６（商標）に保存された冷蔵（５℃）精子に対して試験した。基礎液の追加の処理は、１７℃又はＲＴ（２０～２５℃）のいずれかで精子を培地に保存し、上記の実験１及び実験２中に散発的に観察された真菌の増殖を阻害するためのナイスタチン（１００Ｕ／ｍＬ）を用いて又は用いずに補充することであった。合計８頭の雄牛からの精子を上記のように処理し、８日間にわたって２４時間ごとにＣＡＳＡ運動性測定を行い、３日目及び７日目に冷蔵精子を評価した。全ての試料については３日目に、最適化された雄牛精子のエクステンダー処理については７日目に、先体完全性分析を行った。
ウシ用エクステンダー基礎液を、ＩＮＲＡ９６（商標）に保存された冷蔵（５℃）精子に対して試験した。基礎液の追加の処理は、１７℃又はＲＴ（２０～２５℃）のいずれかで精子を培地に保存し、上記の実験１及び実験２中に散発的に観察された真菌の増殖を阻害するためのナイスタチン（１００Ｕ／ｍＬ）を用いて又は用いずに補充することであった。合計８頭の雄牛からの精子を上記のように処理し、８日間にわたって２４時間ごとにＣＡＳＡ運動性測定を行い、３日目及び７日目に冷蔵精子を評価した。全ての試料については３日目に、最適化された雄牛精子のエクステンダー処理については７日目に、先体完全性分析を行った。
【0090】
ＲＴでウシ用エクステンダー基礎培地に保存された雄牛精子の総運動性及び前進運動性は、１週間の保存にわたって著しく低下しなかった（図１）。ＲＴ保存温度（ナイスタチンなし）は、他のいずれの処理よりも一貫して高い結果をもたらしたが、これらは保存の３日目にのみ有意であり、ＲＴ及びＲＴ＋ナイスタチン処理の両方の前進運動性は、両方の１７℃での処理よりも著しく高いことが観察された。
【0091】
ＩＮＲＡ９６（商標）に保存された冷蔵精子と比較した場合、３日及び７日の保存後、総運動性及び前進運動性は、ウシ用エクステンダー基礎液において著しく高かった。先体完全性及び生存率についても同様のパターンが観察された。３日間の保存後（冷蔵後の精子受精能の最大値と考えられる）、ウシ用エクステンダー基礎液に保存された精子は、ＩＮＲＡ９６（商標）に保存された冷蔵精子よりも著しく高い生存率及び先体完全性を有していた（図２）。
【0092】
これは、室温でのウシ精子の液体保存の成功を実証する最初の研究であり、ＩＮＲＡ９６（商標）に３日より長く保存された冷蔵ウシ精子のインビトロ評価を行った最初の研究であると考えられる（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｅｉｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．２０１８）。
【0093】
丸々１週間の室温での保存にわたって、ウシ用エクステンダー基礎培地に保存された精子の運動性に著しい低下がなかったという事実は、これらの細胞の受精能が維持され、人工授精（ＡＩ）プログラムにおける使用に好適であることを示唆している。
【0094】
実施例２：ウシ用エクステンダー培地の開発及び受精研究
１．精液の採取及び処理
雄牛精液（動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓｔｕｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｗａｇｇａ Ｗａｇｇａ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａで飼育された）を電気射精によって採取し、ウマ用ＩＮＲＡ９６（商標）精液エクステンダーで２：１（エクステンダー：精液）に直ちに希釈し、更に処理する前に室温（ＲＴ）で維持した。次いで、希釈保存した精液を不連続（４５／９０％）Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配上に重層し、７００×ｇで３０分間遠心分離して、以下に記載する保存実験に使用される高品質の精子を単離した。高品質のペレット化した精子を、次いで、改変されたビガーズ・ウィッテン・ウィッティンガム（ＢＷＷ）培地に再懸濁し（Ｇｉｂｂ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、遠心分離（３００×ｇで５分間）によって再び洗浄した。次いで、ペレット化した精子を、各実験に記載される様々な製剤に再懸濁し、それらが評価されるまで、暗所で、５ｍＬのＳａｒｓｔｅｄｔ社製の検体ポットにＲＴ（２１～２３℃）で保存した。
１．精液の採取及び処理
雄牛精液（動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓｔｕｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｗａｇｇａ Ｗａｇｇａ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａで飼育された）を電気射精によって採取し、ウマ用ＩＮＲＡ９６（商標）精液エクステンダーで２：１（エクステンダー：精液）に直ちに希釈し、更に処理する前に室温（ＲＴ）で維持した。次いで、希釈保存した精液を不連続（４５／９０％）Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配上に重層し、７００×ｇで３０分間遠心分離して、以下に記載する保存実験に使用される高品質の精子を単離した。高品質のペレット化した精子を、次いで、改変されたビガーズ・ウィッテン・ウィッティンガム（ＢＷＷ）培地に再懸濁し（Ｇｉｂｂ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、遠心分離（３００×ｇで５分間）によって再び洗浄した。次いで、ペレット化した精子を、各実験に記載される様々な製剤に再懸濁し、それらが評価されるまで、暗所で、５ｍＬのＳａｒｓｔｅｄｔ社製の検体ポットにＲＴ（２１～２３℃）で保存した。
【0095】
２．ウシ精子の運動性に関する異なるアミノ酸の比較
塩化ナトリウムは、恒常性のためのＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの使用に起因して、インビトロでの哺乳動物の星状細胞の寿命に有害であることが示されており（Ｓｉｌｖｅｒ ａｎｄ Ｅｒｅｃｉｎｅｓｋａ，１９９７）、種牡馬精子保存用培地中のＮａＣｌの除去は、改善されたエネルギー（ＡＴＰ）保持により細胞寿命を著しく改善することができる（Ｇｉｂｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｉｂｂ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本発明者らはまた、ＮａＣｌをＬ－カルニチン等の有機オスモライトに置き換えることが、種牡馬（Ｇｉｂｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｉｂｂ ｅｔ ａｌ．, ２０１６）及び雄牛（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）の両方の精子の保存中に有益であり得ることを以前に示している。本発明に至る際に、本発明者らによって、ウシ用エクステンダー培地中のオスモライト（複数可）として使用するための可溶性アミノ酸の適合性をスクリーニングするための研究が行われた。
塩化ナトリウムは、恒常性のためのＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの使用に起因して、インビトロでの哺乳動物の星状細胞の寿命に有害であることが示されており（Ｓｉｌｖｅｒ ａｎｄ Ｅｒｅｃｉｎｅｓｋａ，１９９７）、種牡馬精子保存用培地中のＮａＣｌの除去は、改善されたエネルギー（ＡＴＰ）保持により細胞寿命を著しく改善することができる（Ｇｉｂｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｉｂｂ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本発明者らはまた、ＮａＣｌをＬ－カルニチン等の有機オスモライトに置き換えることが、種牡馬（Ｇｉｂｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｉｂｂ ｅｔ ａｌ．, ２０１６）及び雄牛（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）の両方の精子の保存中に有益であり得ることを以前に示している。本発明に至る際に、本発明者らによって、ウシ用エクステンダー培地中のオスモライト（複数可）として使用するための可溶性アミノ酸の適合性をスクリーニングするための研究が行われた。
【0096】
本研究は２部構成で行われた。第１部は、可溶性アミノ酸（ｎ＝１０頭の雄牛の分割射精からの精子）のスクリーニングであり、第２部は、最も成功した３つのアミノ酸（ｎ＝９頭の雄牛の分割射精液からの精子）のみを使用して第１部の結果を確認することであった。塩化ナトリウム及び塩化コリンをオスモライト対照として使用した。塩化コリンは、前述のナトリウムポンプの機能によるＡＴＰ損失を悪化させない、非代謝的に活性なオスモライトである（Ｇｉｂｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
【0097】
試験アミノ酸又は塩化コリンのいずれかを添加した基礎液に４１．１ｍＭのＮａＣｌが含まれていないことを除いて、上記のウシ用エクステンダー基礎液（実施例１、実験３）を、これらの評価の目的で利用した。試験アミノ酸を８２．２ｍＭの最終濃度まで基礎液に添加し、対照は、４１．１ｍＭの最終濃度までＮａＣｌ又は塩化コリンのいずれかを含有していた。溶液の初期ｐＨは７～１０と様々であり、ＫＯＨ又はＨＣｌのいずれかで７．５～８．０に調整した。全ての試験培地に１００Ｕ／ｍｌのナイスタチンを補充して、真菌の増殖を制御した。精子の運動性を、実施例１のように評価した。
【0098】
研究の第１部では、室温（ＲＴ）での７日間の液体保存後に運動性を評価した。研究の第２部では、ＲＴでの３、７、１０及び１４日間の液体保存で精子の運動性を評価した。ＪＭＰ ｖ１４ソフトウェア（ＡＮＯＶＡ）を使用して再びデータを分析した。
【0099】
研究の第１部で、異なるオスモライトがウシ精子の運動性に与える影響の初期評価の結果を図３のグラフに示す。グラフ内の列番号によるそれぞれの試験物質のアイデンティティは、以下の通りである。１．アスパラギン、２．メチオニン、３．グリシン、４．タウリン、５．スレオニン、６．ロイシン、７．リジン、８．プロリン、９．システイン、１０．アルギニン、１１．セリン、１２．塩化コリン、１３．トリプトファン、１４．バリン、１５．ＮａＣｌ、１６．ヒスチジン、１７．アラニン、１８．フェニルアラニン、１９．グルタミン、２０．アスパラギン酸、２１．チロシン、２２．グルタミン酸、及び２３．イソロイシン。利用したアミノ酸は、Ｄ形態及びＬ形態を有しないタウリン及びグリシン以外の全てのＬ－アミノ酸である。
【0100】
図３から、グリシン（処理番号３）、タウリン（処理番号４）、又はアラニン（処理番号１７）のいずれかを使用した浸透圧的にバランスのとれた培地に保存された精子の総運動性及び前進運動性は、ＮａＣｌ（処理番号１２）及び塩化コリン（処理番号１５）対照の両方を含む他の全ての処理よりも著しく高かったことがわかる。バリン（処理番号１４）を含有する試験培地に保存された精子もまた、残りの処理よりも実質的に良好な総運動性及び前進運動性を示したことが見て取れる。ウシ精子は、液体保存の３日目に、タウリンを含有するエクステンダー基礎液においてより良好な総運動性及び前進運動性を示すが、精子は、１４日目に、バリンを含有する溶液において、タウリンよりも良好な運動性を有することが発明者らによって見出された（日付は示さず）。
【0101】
全ての群における全体的な運動性の低さは、採取時の精子の低温ショックによるものであると考えられた。本研究の第２部は、精液採取条件の最適化（以下のセクション３を参照）の後に実施され、再びＮａＣｌ及び塩化コリンを対照として用いた。
【0102】
上述したように、ウシ用エクステンダー基礎液をグリシン、バリン、又はアラニンのいずれかで補充した場合、ＲＴでの保存の３～１０日目には、精子に運動性の著しい喪失は見られなかったが、１４日目までには運動性が著しく低下していた。グリシン、バリン、又はアラニンのいずれかに曝露された精子の運動性は、全ての時点でどちらの対照よりも著しく高かった。１４日目までに、グリシン含有培地に保存された精子の総運動性及び前進運動性のＮａＣｌ対照との差は、他の２つのアミノ酸処理よりも非常に有意であった（図４）。したがって、グリシンは、バリン及びアラニンの各々と比較して、ウシ精子のための好ましいオスモライトであるとみなされた。
【0103】
ＮａＣｌを添加せずに（すなわち、表１に示される製剤中に４１．１ｍＭ濃度のＮａＣｌを含まない）いずれかのグリシン（８２．２ｍＭ）を補充したエクステンダー基礎液を含むエクステンダー培地は、以下において「新規ウシ用エクステンダー培地」と称される。
【0104】
３．精液採取条件の最適化
すぐ上に記載したように、低い周囲温度が精子の質に影響を与え、全ての処理にわたって低い運動性をもたらすことが明らかになった。このため、実験の第２部（第１部の２週間後に実施）では、図５に概略的に例解されるように、３７℃の水で満たされたウォータージャケット内の予備加温した管への精液の採取を含む、試料を確実に保温するための追加の手順が取られた。
すぐ上に記載したように、低い周囲温度が精子の質に影響を与え、全ての処理にわたって低い運動性をもたらすことが明らかになった。このため、実験の第２部（第１部の２週間後に実施）では、図５に概略的に例解されるように、３７℃の水で満たされたウォータージャケット内の予備加温した管への精液の採取を含む、試料を確実に保温するための追加の手順が取られた。
【0105】
４．殺真菌剤の比較
室温での精液試料の保存は、冷蔵及び凍結保存の場合のように熱的制約によって抑制されない微生物汚染によって複雑になる。ナイスタチンは、真菌の増殖を阻害するためにウマ用精子エクステンダー培地で使用されてきたが、この殺真菌剤は雄牛精子に有害であり得ることが示唆されている（Ｆｏｏｔｅ，２００２）。より最近の研究では、抗真菌剤フルコナゾールが、酵母汚染を抑制するのに有効である一方で、雄羊精子に有害な影響を及ぼさないことが示されている（Ｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。したがって、以前に使用された用量のナイスタチン（１００Ｕ／ｍＬ）がウシ精子の運動性に与える影響を、２つの用量のフルコナゾール（１２．５ｍｇ／Ｌ及び２５ｍｇ／Ｌ）とともに、抗真菌剤を有しない対照に対して比較した。
室温での精液試料の保存は、冷蔵及び凍結保存の場合のように熱的制約によって抑制されない微生物汚染によって複雑になる。ナイスタチンは、真菌の増殖を阻害するためにウマ用精子エクステンダー培地で使用されてきたが、この殺真菌剤は雄牛精子に有害であり得ることが示唆されている（Ｆｏｏｔｅ，２００２）。より最近の研究では、抗真菌剤フルコナゾールが、酵母汚染を抑制するのに有効である一方で、雄羊精子に有害な影響を及ぼさないことが示されている（Ｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。したがって、以前に使用された用量のナイスタチン（１００Ｕ／ｍＬ）がウシ精子の運動性に与える影響を、２つの用量のフルコナゾール（１２．５ｍｇ／Ｌ及び２５ｍｇ／Ｌ）とともに、抗真菌剤を有しない対照に対して比較した。
【0106】
精液は、上記の通りに採取、処理、及び保存した（実施例２、セクション１．１）。８２．２ｍＭの最終濃度までグリシンを補充した（培地のｐＨは７．９）記載されるようなエクステンダー基礎液（実施例２、実験２）中で、１、３、７、１０及び１４日間ＲＴで保存した後、上記のようにＣＡＳＡを使用して精子の運動性を評価した。ＪＭＰ ｖ１４ソフトウェア（ＡＮＯＶＡ）を使用してデータを分析した。
【0107】
いずれの処理間にも有意差は観察されなかった。フルコナゾール（２５ｍｇ／Ｌ）は、保存に有害な影響を及ぼさず、より効果的な増殖の阻害剤であるため（Ｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、残りの実験でエクステンダー製剤に利用された。
【0108】
実施例３：凍結保存精子と比較した、新規ウシ用エクステンダー培地に保存された雄牛精子の運動性及び受精能
８２．２ｍＭ（かつＮａＣｌを含有しない）の最終濃度までグリシンを補充したウシ用エクステンダー基礎液（実施例２、実験２）に７日間及び１４日間保存されたウシ精子の機能性及び受精能を、ＡｎｄｒｏＭｅｄ（商標）精液エクステンダー（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ｓｍｙｔｈｅｓｄａｌｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で標準的な市販プロトコルを使用して凍結保存した精子と比較するために研究を実施した。精子を採取して処理した後（実施例２、セクション１）、２つのアリコートに分割し、凍結保存するか、又は新規ウシ用エクステンダー培地にＲＴ（ポリスチレンボックス中２２℃）で保存した。
８２．２ｍＭ（かつＮａＣｌを含有しない）の最終濃度までグリシンを補充したウシ用エクステンダー基礎液（実施例２、実験２）に７日間及び１４日間保存されたウシ精子の機能性及び受精能を、ＡｎｄｒｏＭｅｄ（商標）精液エクステンダー（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ｓｍｙｔｈｅｓｄａｌｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で標準的な市販プロトコルを使用して凍結保存した精子と比較するために研究を実施した。精子を採取して処理した後（実施例２、セクション１）、２つのアリコートに分割し、凍結保存するか、又は新規ウシ用エクステンダー培地にＲＴ（ポリスチレンボックス中２２℃）で保存した。
【0109】
７日間及び１４日間保存した後、精子を（実施例１の通りに）運動性について分析し、ＩＶＦに使用した。ＩＶＦ研究では、食肉処理場由来の卵母細胞を組織培養培地１９９（ＴＣＭ－１９９）＋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２２～２４時間成熟させ、剥離して受精させた。精子の添加後１８～２０時間の２前核率（２ＰＮ）を使用して受精能を測定した。推定接合子を４％のＰＦＡで固定し、０．３％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘで透過化し、ＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡法を使用して評価した。運動性及び受精データは、ＪＭＰ ｖ１４ソフトウェア及びＡＮＯＶＡを使用して分析した。
【0110】
保存の７日後、グリシンを含有する新規ウシ用精子エクステンダー培地に保存された精子の総運動性及び前進運動性は、凍結保存精子のものよりも著しく高かった（総運動性及び前進運動性は、それぞれ、Ｐ≦０．０００１及び０．０５）。保存の１４日目までに、新規ウシ用エクステンダー培地に保存された精子の運動性は著しく低下したが、それらは依然として凍結保存精子の運動性に類似していた（図６）。しかしながら、新規ウシ用エクステンダー培地は、少なくとも１０日間、精子の寿命及び受精能を支持することが判明した。
【0111】
同様のパターンで、凍結保存精子と比較して、新規エクステンダー培地に７日間保存された精子のインビトロ受精率が高かったが（４４対３４％の受精卵母細胞）、恐らく試料サイズを考慮すると有意に高いわけではなく、１４日目までには、受精率は、凍結保存精子を使用して得られた受精率よりも著しく低かった（図７）。ＩＶＦシステムを使用したこれら２つの保存処理間の比較は、精子を凍結及び解凍する行為が、精子が卵母細胞を認識し、結合して受精する能力を獲得する成熟の最終段階である受精能獲得プロセスを模倣する変化を誘導する、という事実によって若干混乱する。このため、精子を解凍する際、精子は、卵との共インキュベーションの前に、新鮮な精子を利用した場合に必要になるのと同じ大規模な化学的に誘導される受精能獲得を受ける必要はない。受精能獲得は、人工授精後に女性生殖管で自然に起こるプロセスである。しかしながら、発明者らは、新規ウシ用精子エクステンダーに保存されたウシ精子の受精能獲得様変化の欠如が、人工授精（ＡＩ）後の精子の寿命に有利であると考える。
【0112】
要約すると、本研究では、温度を制御するための特定のデバイスを使用することなく、ＲＴでウシ精子を保存した。これにより、現場での使用のための冷蔵及び凍結保存精子の輸送に関連する物流上の制約が著しく軽減される。更に、新規ウシ用エクステンダー培地は、いずれの機能も喪失することなく少なくとも１０日間、また、凍結保存精子と比較して同等の又は優れたインビトロ受精能を伴って７日間、雄牛精子を室温で保存することを可能にした。本発明者らは更に、凍結保存を回避することで、人工授精後のウシ生殖管内における精子の寿命を改善することができると考える。
【0113】
実施例４：人工授精（ＡＩ）研究
８２．２ｍＭのグリシンを含有する新規ウシ用精子エクステンダー培地に保存された精子の受精能を小規模フィールド試験で確認した。この試験では、３頭の雄牛から電気射精によってウシ精液を採取した。４５／９０の不連続ＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）密度勾配を使用して高品質の精子を選択し、新規ウシ用エクステンダー培地に約５０００万／ｍＬの濃度で再懸濁し、暗所において周囲温度（約２２℃）で保存した。保存された精子は、７日後に総運動性又は前進運動性の著しい低下を示さなかった（総運動性（ＴＭ）：８３．３±３．０６対７３±３．１８；前進運動性（ＰＭ）：８２．８±２．８３対７０．９±３．９７；それぞれ、０日目及び７日目でＰ＞０．０５）。７日目に、０．５ｍＬの授精用量（１５．７５～１８．７５×１０６の前進運動精子）を使用して、２歳の未交尾の未経産牛１８頭に対して、発情同期化後に定時ＡＩを行った。
８２．２ｍＭのグリシンを含有する新規ウシ用精子エクステンダー培地に保存された精子の受精能を小規模フィールド試験で確認した。この試験では、３頭の雄牛から電気射精によってウシ精液を採取した。４５／９０の不連続ＢｏｖｉＰｕｒｅ（商標）密度勾配を使用して高品質の精子を選択し、新規ウシ用エクステンダー培地に約５０００万／ｍＬの濃度で再懸濁し、暗所において周囲温度（約２２℃）で保存した。保存された精子は、７日後に総運動性又は前進運動性の著しい低下を示さなかった（総運動性（ＴＭ）：８３．３±３．０６対７３±３．１８；前進運動性（ＰＭ）：８２．８±２．８３対７０．９±３．９７；それぞれ、０日目及び７日目でＰ＞０．０５）。７日目に、０．５ｍＬの授精用量（１５．７５～１８．７５×１０６の前進運動精子）を使用して、２歳の未交尾の未経産牛１８頭に対して、発情同期化後に定時ＡＩを行った。
【0114】
授精後３３日目の超音波妊娠診断で、１８頭の雌のうち１４頭が妊娠していることが確認された。
【0115】
実施例５：更なる人工授精（ＡＩ）研究
発情同期化に続いて、１２頭の未経産牛に対して更なる定時人工授精（ＡＩ）のフィールド試験を行った。試験は、Ｃｅｓｓｎｏｃｋ，Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ近郊で実施された。端的に述べると、電気射精によって単一のＳａｎｔａ Ｇｅｒｔｒｕｄｉｓ雄牛から精液を採取し、高品質の精子を選択し、実施例４に記載のプロトコルに従って、８２．２ｍＭのグリシンを含有する新規ウシ用エクステンダー培地中約５０００万／ｍｌの濃度で、周囲室温（約２２℃）で７日間保存した。この場合も同様に、保存された精子は、７日後に総運動性又は前進運動性の著しい低下を示さなかった。７日目に未経産牛に授精し、授精後３５日目に、超音波妊娠診断で、未経産牛のうち６頭が妊娠していることが示された。妊娠した未経産牛は全て、２０２２年８月末に出産した。全ての子牛は、生存出産であり、健康であった。
発情同期化に続いて、１２頭の未経産牛に対して更なる定時人工授精（ＡＩ）のフィールド試験を行った。試験は、Ｃｅｓｓｎｏｃｋ，Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ近郊で実施された。端的に述べると、電気射精によって単一のＳａｎｔａ Ｇｅｒｔｒｕｄｉｓ雄牛から精液を採取し、高品質の精子を選択し、実施例４に記載のプロトコルに従って、８２．２ｍＭのグリシンを含有する新規ウシ用エクステンダー培地中約５０００万／ｍｌの濃度で、周囲室温（約２２℃）で７日間保存した。この場合も同様に、保存された精子は、７日後に総運動性又は前進運動性の著しい低下を示さなかった。７日目に未経産牛に授精し、授精後３５日目に、超音波妊娠診断で、未経産牛のうち６頭が妊娠していることが示された。妊娠した未経産牛は全て、２０２２年８月末に出産した。全ての子牛は、生存出産であり、健康であった。
【0116】
Ｓａｎｔａ Ｇｅｒｔｒｕｄｉｓは、ゼブー牛及びヨーロッパ牛の両方に由来するタウリン－インディシン（ｉｎｄｉｃｉｎｅ）のハイブリッド牛の品種であり、強いＢｏｓ ｉｎｄｉｃｕｓの特性を有する。本発明の試験では、妊娠した未経産牛のうち３頭は純血のサンタガートルーディス、２頭はＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ（Ｆｒｉｅｓｉａｎ交雑種）、１頭はＢｒａｈｍａｎ／Ｓａｎｔａ Ｇｅｒｔｒｕｄｉｓ交雑種であった。
【0117】
本試験は、Ｂｏｓ ｉｎｄｉｃｕｓの精子を、受精能を保持しながら、本発明によって具現化された新規ウシ用エクステンダー培地中で７日間、周囲温度で保存することができ、Ｂｏｓ ｉｎｄｉｃｕｓ未経産牛が、精子を利用した定時ＡＩを用いて妊娠を達成することができることを示すものである。
【0118】
引用文献
Ａｉｔｋｅｎ ＪＢ，Ｎａｕｍｏｖｓｋｉ Ｎ，Ｃｕｒｒｙ Ｂ，Ｇｒｕｐｅｎ ＣＧ，Ｇｉｂｂ Ｚ，Ａｉｔｋｅｎ ＲＪ（２０１５）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｌ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ９２（５）（１２５），１－１３．
Ａｒｉａｓ ＭＥ，Ａｎｄａｒａ Ｋ，Ｂｒｉｏｎｅｓ Ｅ，Ｆｅｌｍｅｒ Ｒ（２０１７）Ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｗｉｍ－ｕｐ ａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ（Ｐｅｒｃｏｌｌ ａｎｄ ＢｏｖｉＰｕｒｅ）：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｐｅｒｍ ｑｕａｌｉｔｙ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．
Ａｕｒｉｃｈ Ｃ，Ｓｐｅｒｇｓｅｒ Ｊ（２００７）Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ ｏｎ ｃｏｏｌｅｄ－ｓｔｏｒｅｄ ｓｔａｌｌｉｏｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ６７（５），９１２－９１８．
Ｂｅｒｇｅｒｏｎ Ａ，Ｍａｎｊｕｎａｔｈ Ｐ（２００６）Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｇｇ ｙｏｌｋ ａｎｄ ｍｉｌｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ７３（１０），１３３８－１３４４．
Ｂｉｇｇｅｒｓ ＪＤ，Ｗｈｉｔｔｅｎ ＷＫ，Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ ＤＧ（１９７１）Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｉｎ ’Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ．’Ｅｄ．ＪＣ Ｄａｎｉｅｌｓ）ｐｐ．８６－１１６．（Ｆｒｅｅｍａｎ：Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ）
Ｆｏｏｔｅ，ＲＨ（２００２）Ｓｐｅｒｍｉｃｉｄａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ ａｎｄ ｎｙｓｔａｔｉｎ ｏｎ ｂｕｌｌ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ｓｐｅｒｍ ａｎｄ ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ．Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ ６６，１９３－１９７．
Ｇａｌｕｐｐｏ ＡＧ，Ｊｕｎｉｏｒ ＮＢ，Ａｒｒｕｄａ ＮＳ，Ｃｏｒｂｅｌｌｉｎｉ ＡＯ，Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ ＣＭ，Ｐａｖａｏ ＤＬ，Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ Ｍ，Ｃａｎａｌ ＣＷ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ＪＬ（２０１３）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｓｅｍｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｅｍｅｎ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８７（２），４４３－８．
Ｇｉｂｂ，Ｚ，Ｌａｍｂｏｕｒｎｅ，ＳＲ，Ｑｕａｄｒｅｌｌｉ，Ｊ，Ｓｍｉｔｈ，ＮＤ，Ａｉｔｋｅｎ，ＲＪ（２０１５）Ｌ－Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ａｎｄ ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｒｅ ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｓｔａｌｌｉｏｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ９３（４），１－９．
Ｇｉｂｂ，Ｚ，Ｌａｍｂｏｕｒｎｅ，ＳＲ，Ｑｕａｄｒｅｌｌｉ，Ｊ，Ａｉｔｋｅｎ，ＲＪ（２０１６）Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｏｓｍｏｌｙｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｓｔａｌｌｉｏｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，Ｉｎ：１８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｏｕｒｓ，Ｆｒａｎｃｅ．
Ｋｌｅｉｎ，ＥＫ，Ｇｕｎｎ，ＡＪ，Ｓｔｅｐｈｅｎ，ＣＰ，Ｓｗｅｇｅｎ，Ａ，Ａｉｔｋｅｎ，ＲＪ，Ｇｉｂｂ，Ｚ（２０１９）Ｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｉｓ ａ ｐｒｏ－ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｂｕｌｌ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，Ｉｎ：５０ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＥＳＡ－ＳＲＢ－ＡＯＴＡ）．’Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，１８ｔｈ－２１ｓｔ Ａｕｇｕｓｔ，２０１９．
Ｌｅ Ｇｕｉｌｌｏｕ Ｊ，Ｒｏｐｅｒｓ ＭＨ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ：Ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ Ｂ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ １４０，５２３－５３０．
Ｌｕｓｉｇｎａｎ ＭＦ， Ｂｅｒｇｅｒｏｎ Ａ，Ｌａｆｌｅｕｒ Ｍ，Ｍａｎｊｕｎａｔｈ Ｐ（２０１１）Ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｃａｓｅｉｎｓ ａｎｄ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｍｉｌｋ ｅｘｔｅｎｄｅｒ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ８５（３），４５７－６４．
Ｍｕｒｐｈｙ ＥＭ，Ｍｕｒｐｈｙ Ｃ，Ｏ’Ｍｅａｒａ Ｃ，Ｄｕｎｎｅ Ｇ，Ｅｉｖｅｒｓ Ｂ，Ｌｏｎｅｒｇａｎ Ｐ， Ｆａｉｒ Ｓ（２０１７）Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｍｅｎ ｄｉｌｕｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｂｕｌｌ ｓｅｍｅｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ １００（２），１５４１－１５５４．
Ｍｕｒｐｈｙ ＥＭ，Ｅｉｖｅｒｓ Ｂ，Ｏ’Ｍｅａｒａ ＣＭ，Ｌｏｎｅｒｇａｎ Ｐ，Ｆａｉｒ Ｓ（２０１８）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｔｏｒａｇｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｇａｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｓｐｅｒｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｍｅｎ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｂｕｌｌ ｓｅｍｅｎ ｓｔｏｒｅｄ ｉｎ ＩＮＲＡ９６．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ １０８，２２３－２２８．
Ｏｒｔｉｚ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＭ，Ｂａｌａｏ ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｃ，Ｍａｓｏｔ Ｊ，Ｒｅｄｏｎｄｏ Ｅ，Ｇａｚｑｕｅｚ Ａ，Ｔａｐｉａ ＪＡ，Ｇｉｌ Ｃ，Ｏｒｔｅｇａ－Ｆｅｒｒｕｓｏｌａ Ｃ，Ｐｅ▲ｎ▼ａ ＦＪ．Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈａｗｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｌｌｉｏｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ａｋｔ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ ３．ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１９；１４：ｅ０２１１９９４．
Ｏｔｈｍａｎ，ＦＭ，Ｍｏｈａｍｅｄ，ＭＩ，Ｅｌ－Ｂａｄｒｙ，ＤｕＤＡ，Ｓｈａｋｅｒ，ＭＨ，Ｋｏｔｂ，ＭｈＲ，Ｔｕｒｋｙ，ＨＡ（２０１６）Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｓｈｅｅｐ ｆｒｏｚｅｎ ｓｅｍｅｎ ｅｘｔｅｎｄｅｒｓ．Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４８，７７－８２．
Ｓａｍａｒｄｚｉｊａ Ｍ，Ｋａｒａｄｊｏｌｅ Ｍ，Ｇｅｔｚ Ｉ，Ｍａｋｅｋ Ｚ，Ｃｅｒｇｏｌｊ Ｍ，Ｄｏｂｒａｎｉｃ Ｔ（２００６ａ）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ４，５８．
Ｓａｍａｒｄｚｉｊａ Ｍ，Ｋａｒａｄｊｏｌｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２００６ｂ）Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＢｏｖｉＰｕｒｅ（Ｒ）ａｎｄ Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｒ）ｏｎ ｂｕｌｌ ｓｐｅｒｍ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ＩＶＦ．Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９１（３－４），２３７－２４７．
Ｓｉｌｖｅｒ， ＩＡ，Ｅｒｅｃｉｎｅｓｋａ，Ｍ（１９９７）Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ｄｅｍａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｇｌｉａ ２１，３５－４５．
Ｓｗｅｇｅｎ Ａ，Ｌａｍｂｏｕｒｎｅ ＳＲ，Ａｉｔｋｅｎ ＲＪ，Ｇｉｂｂ Ｚ．Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｓｔａｌｌｉｏｎ Ｓｐｅｒｍ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ，ＡＴＰ Ｃｏｎｔｅｎｔ，ａｎｄ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２０１６；９５（５）：１０７：１－１２．
Ｕｐｒｅｔｉ ＧＣ，Ｊｅｎｓｅｎ Ｋ，Ｍｕｎｄａｙ Ｒ，Ｄｕｇａｎｚｉｃｈ ＤＭ，Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈ Ｒ，Ｓｍｉｔｈ ＪＦ（１９９８）Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｒａｍ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｓ ａｎ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ．Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５１（４），２７５－２８７．
Ｖａｒｅｌａ Ｅ，Ｒｅｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｈｏｗ ｄｏｅｓ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌｏａｄ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｅｑｕｉｎｅ ｃｏｏｌ－ｓｔｏｒｅｄ ｓｅｍｅｎ？ Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ １１４，２１２－２２０．
Ａｉｔｋｅｎ ＪＢ，Ｎａｕｍｏｖｓｋｉ Ｎ，Ｃｕｒｒｙ Ｂ，Ｇｒｕｐｅｎ ＣＧ，Ｇｉｂｂ Ｚ，Ａｉｔｋｅｎ ＲＪ（２０１５）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｌ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ９２（５）（１２５），１－１３．
Ａｒｉａｓ ＭＥ，Ａｎｄａｒａ Ｋ，Ｂｒｉｏｎｅｓ Ｅ，Ｆｅｌｍｅｒ Ｒ（２０１７）Ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｗｉｍ－ｕｐ ａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ（Ｐｅｒｃｏｌｌ ａｎｄ ＢｏｖｉＰｕｒｅ）：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｐｅｒｍ ｑｕａｌｉｔｙ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．
Ａｕｒｉｃｈ Ｃ，Ｓｐｅｒｇｓｅｒ Ｊ（２００７）Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ ｏｎ ｃｏｏｌｅｄ－ｓｔｏｒｅｄ ｓｔａｌｌｉｏｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ６７（５），９１２－９１８．
Ｂｅｒｇｅｒｏｎ Ａ，Ｍａｎｊｕｎａｔｈ Ｐ（２００６）Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｇｇ ｙｏｌｋ ａｎｄ ｍｉｌｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ７３（１０），１３３８－１３４４．
Ｂｉｇｇｅｒｓ ＪＤ，Ｗｈｉｔｔｅｎ ＷＫ，Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ ＤＧ（１９７１）Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｉｎ ’Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ．’Ｅｄ．ＪＣ Ｄａｎｉｅｌｓ）ｐｐ．８６－１１６．（Ｆｒｅｅｍａｎ：Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ）
Ｆｏｏｔｅ，ＲＨ（２００２）Ｓｐｅｒｍｉｃｉｄａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ ａｎｄ ｎｙｓｔａｔｉｎ ｏｎ ｂｕｌｌ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ｓｐｅｒｍ ａｎｄ ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ．Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ ６６，１９３－１９７．
Ｇａｌｕｐｐｏ ＡＧ，Ｊｕｎｉｏｒ ＮＢ，Ａｒｒｕｄａ ＮＳ，Ｃｏｒｂｅｌｌｉｎｉ ＡＯ，Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ ＣＭ，Ｐａｖａｏ ＤＬ，Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ Ｍ，Ｃａｎａｌ ＣＷ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ＪＬ（２０１３）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｓｅｍｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｅｍｅｎ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８７（２），４４３－８．
Ｇｉｂｂ，Ｚ，Ｌａｍｂｏｕｒｎｅ，ＳＲ，Ｑｕａｄｒｅｌｌｉ，Ｊ，Ｓｍｉｔｈ，ＮＤ，Ａｉｔｋｅｎ，ＲＪ（２０１５）Ｌ－Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ａｎｄ ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｒｅ ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｓｔａｌｌｉｏｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ９３（４），１－９．
Ｇｉｂｂ，Ｚ，Ｌａｍｂｏｕｒｎｅ，ＳＲ，Ｑｕａｄｒｅｌｌｉ，Ｊ，Ａｉｔｋｅｎ，ＲＪ（２０１６）Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｏｓｍｏｌｙｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｓｔａｌｌｉｏｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，Ｉｎ：１８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｏｕｒｓ，Ｆｒａｎｃｅ．
Ｋｌｅｉｎ，ＥＫ，Ｇｕｎｎ，ＡＪ，Ｓｔｅｐｈｅｎ，ＣＰ，Ｓｗｅｇｅｎ，Ａ，Ａｉｔｋｅｎ，ＲＪ，Ｇｉｂｂ，Ｚ（２０１９）Ｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｉｓ ａ ｐｒｏ－ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｂｕｌｌ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，Ｉｎ：５０ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＥＳＡ－ＳＲＢ－ＡＯＴＡ）．’Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，１８ｔｈ－２１ｓｔ Ａｕｇｕｓｔ，２０１９．
Ｌｅ Ｇｕｉｌｌｏｕ Ｊ，Ｒｏｐｅｒｓ ＭＨ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ：Ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ Ｂ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ １４０，５２３－５３０．
Ｌｕｓｉｇｎａｎ ＭＦ， Ｂｅｒｇｅｒｏｎ Ａ，Ｌａｆｌｅｕｒ Ｍ，Ｍａｎｊｕｎａｔｈ Ｐ（２０１１）Ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｃａｓｅｉｎｓ ａｎｄ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｍｉｌｋ ｅｘｔｅｎｄｅｒ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ８５（３），４５７－６４．
Ｍｕｒｐｈｙ ＥＭ，Ｍｕｒｐｈｙ Ｃ，Ｏ’Ｍｅａｒａ Ｃ，Ｄｕｎｎｅ Ｇ，Ｅｉｖｅｒｓ Ｂ，Ｌｏｎｅｒｇａｎ Ｐ， Ｆａｉｒ Ｓ（２０１７）Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｍｅｎ ｄｉｌｕｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｂｕｌｌ ｓｅｍｅｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ １００（２），１５４１－１５５４．
Ｍｕｒｐｈｙ ＥＭ，Ｅｉｖｅｒｓ Ｂ，Ｏ’Ｍｅａｒａ ＣＭ，Ｌｏｎｅｒｇａｎ Ｐ，Ｆａｉｒ Ｓ（２０１８）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｔｏｒａｇｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｇａｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｓｐｅｒｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｍｅｎ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｂｕｌｌ ｓｅｍｅｎ ｓｔｏｒｅｄ ｉｎ ＩＮＲＡ９６．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ １０８，２２３－２２８．
Ｏｒｔｉｚ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＭ，Ｂａｌａｏ ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｃ，Ｍａｓｏｔ Ｊ，Ｒｅｄｏｎｄｏ Ｅ，Ｇａｚｑｕｅｚ Ａ，Ｔａｐｉａ ＪＡ，Ｇｉｌ Ｃ，Ｏｒｔｅｇａ－Ｆｅｒｒｕｓｏｌａ Ｃ，Ｐｅ▲ｎ▼ａ ＦＪ．Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈａｗｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｌｌｉｏｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ａｋｔ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ ３．ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１９；１４：ｅ０２１１９９４．
Ｏｔｈｍａｎ，ＦＭ，Ｍｏｈａｍｅｄ，ＭＩ，Ｅｌ－Ｂａｄｒｙ，ＤｕＤＡ，Ｓｈａｋｅｒ，ＭＨ，Ｋｏｔｂ，ＭｈＲ，Ｔｕｒｋｙ，ＨＡ（２０１６）Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｓｈｅｅｐ ｆｒｏｚｅｎ ｓｅｍｅｎ ｅｘｔｅｎｄｅｒｓ．Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４８，７７－８２．
Ｓａｍａｒｄｚｉｊａ Ｍ，Ｋａｒａｄｊｏｌｅ Ｍ，Ｇｅｔｚ Ｉ，Ｍａｋｅｋ Ｚ，Ｃｅｒｇｏｌｊ Ｍ，Ｄｏｂｒａｎｉｃ Ｔ（２００６ａ）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ４，５８．
Ｓａｍａｒｄｚｉｊａ Ｍ，Ｋａｒａｄｊｏｌｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２００６ｂ）Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＢｏｖｉＰｕｒｅ（Ｒ）ａｎｄ Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｒ）ｏｎ ｂｕｌｌ ｓｐｅｒｍ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ＩＶＦ．Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９１（３－４），２３７－２４７．
Ｓｉｌｖｅｒ， ＩＡ，Ｅｒｅｃｉｎｅｓｋａ，Ｍ（１９９７）Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ｄｅｍａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｇｌｉａ ２１，３５－４５．
Ｓｗｅｇｅｎ Ａ，Ｌａｍｂｏｕｒｎｅ ＳＲ，Ａｉｔｋｅｎ ＲＪ，Ｇｉｂｂ Ｚ．Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｓｔａｌｌｉｏｎ Ｓｐｅｒｍ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ，ＡＴＰ Ｃｏｎｔｅｎｔ，ａｎｄ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２０１６；９５（５）：１０７：１－１２．
Ｕｐｒｅｔｉ ＧＣ，Ｊｅｎｓｅｎ Ｋ，Ｍｕｎｄａｙ Ｒ，Ｄｕｇａｎｚｉｃｈ ＤＭ，Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈ Ｒ，Ｓｍｉｔｈ ＪＦ（１９９８）Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｒａｍ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｓ ａｎ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ．Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５１（４），２７５－２８７．
Ｖａｒｅｌａ Ｅ，Ｒｅｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｈｏｗ ｄｏｅｓ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌｏａｄ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｅｑｕｉｎｅ ｃｏｏｌ－ｓｔｏｒｅｄ ｓｅｍｅｎ？ Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ １１４，２１２－２２０．
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】