▶ アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-23
(54)【発明の名称】均一酵素結合イムノアッセイ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20241016BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 545Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024522175
(86)(22)【出願日】2022-10-07
(85)【翻訳文提出日】2024-06-06
(86)【国際出願番号】 US2022046083
(87)【国際公開番号】W WO2023064185
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】63/256,030
(32)【優先日】2021-10-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】300004500
【氏名又は名称】アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】Ｏｎｅ ＩＤＥＸＸ Ｄｒｉｖｅ， Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ， Ｍａｉｎｅ ０４０９２， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】ガグナー，ジェニファー
(72)【発明者】
【氏名】カーレ，ディラージ
(72)【発明者】
【氏名】パッチ，ダニエル，ウェイン
(72)【発明者】
【氏名】ペック，エヴァン，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】サルター，ジェームズ，ロバート
(72)【発明者】
【氏名】ターメル，クリストファー，ピーター
(57)【要約】
本開示は、試料中の分析物の存在または量を決定する方法および該方法に使用するためのスライドに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の分析物の存在または量を決定するためのスライドであって、（ｉ）第１のポリマー中に分散された結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む第１の層であって、前記結合パートナー－酵素コンジュゲートは前記分析物に特異的である、第１の層と；
（ｉｉ）第２のポリマー中に分散された、分析物がその表面に結合した固体粒子を含む第２の層と；
（ｉｉｉ）第３のポリマー中に分散された、前記酵素の基質を含む第３の層と
を含み、前記基質と前記酵素の相互作用が検出可能なシグナルを生成する、スライド。
【請求項2】
前記結合パートナーが、抗体である、請求項１に記載のスライド。
【請求項3】
前記第１の層と前記第２の層の間または前記第２の層と前記第３の層の間の少なくとも一方に介在層をさらに含み、前記介在層が各層の間の試料の拡散を制限する、請求項１に記載のスライド。
【請求項4】
前記第１の層が、ポリエステル膜であり、前記ポリエステル膜の厚さが、約１００μｍである、請求項１に記載のスライド。
【請求項5】
前記第１のポリマー中に分散された前記結合パートナー－酵素コンジュゲートの濃度が、約５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬの範囲である、請求項１に記載のスライド。
【請求項6】
前記結合パートナー－酵素コンジュゲート中の前記酵素が、ラッカーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－ラクタマーゼ、およびルシフェラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のスライド。
【請求項7】
前記結合パートナー－酵素コンジュゲート中の前記酵素が、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、サーモセロマイセス・サーモフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ボトリチス・アクラダ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ａｃｌａｄａ）、ストレプトマイセス・シアネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｙａｎｅｓ）、およびサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からなる群から選択されるラッカーゼである、請求項１に記載のスライド。
【請求項8】
前記第２のポリマーが、細孔径０．８μｍのポリカーボネートを有するポリカーボネートトラックエッチド（ＰＣＴＥ）メンブレンである、請求項１に記載のスライド。
【請求項9】
前記固体粒子が、直径約０．５μｍ～約５．０μｍのラテックス粒子である、請求項１に記載のスライド。
【請求項10】
前記第２のポリマー中の、分析物がその表面に結合した前記固体粒子の濃度が、約５重量％～約３０重量％の範囲である、請求項１に記載のスライド。
【請求項11】
前記第２の層の厚さが、約２μｍ～約２０μｍの範囲である、請求項１に記載のスライド。
【請求項12】
前記第３の層が、セルロースポリマーである、請求項１に記載のスライド。
【請求項13】
前記第３のポリマー中の前記基質の濃度が、約０．１重量％～約５重量％の範囲である、請求項１に記載のスライド。
【請求項14】
前記第３の層の厚さが、約２５μｍ～約３００μｍの範囲である、請求項１に記載のスライド。
【請求項15】
前記結合パートナー－酵素コンジュゲート中の前記酵素が、ラッカーゼであり、前記基質が、ＴＭＢと二価酸との間で形成されたイオン対として存在する３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項１に記載のスライド。
【請求項16】
前記二価酸が、コハク酸、シュウ酸、マロン酸、グルタミン酸、アジピン酸、およびピメリン酸からなる群から選択される、請求項１５に記載のスライド。
【請求項17】
前記二価酸が、コハク酸である、請求項１６に記載のスライド。
【請求項18】
試料中の分析物の存在または量を決定するためのスライドであって、（ｉ）第１のポリマー中に分散された粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む第１の層であって、前記結合パートナー－酵素コンジュゲートは前記分析物に特異的である、第１の層と；
（ｉｉ）第２のポリマー中に分散された前記酵素の基質を含む第２の層と
を含み、前記基質と前記酵素の相互作用が検出可能なシグナルを生成する、スライド。
【請求項19】
前記結合パートナーが、抗体である、請求項１８に記載のスライド。
【請求項20】
前記第１の層と前記第２の層との間に介在層をさらに含み、前記介在層が、各層の間の試料の拡散を制限する、請求項１８に記載のスライド。
【請求項21】
前記第１の層が、ガラス繊維膜である、請求項１８に記載のスライド。
【請求項22】
前記第１のポリマー中の粒子の表面に付着した前記結合パートナー－酵素コンジュゲートの濃度が、約５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬの範囲である、請求項１８に記載のスライド。
【請求項23】
前記第１の層の厚さが、約５０μｍ～約５００μｍの範囲である、請求項１８に記載のスライド。
【請求項24】
前記第２の層が、セルロースポリマーである、請求項１８に記載のスライド。
【請求項25】
前記第２のポリマー中の前記基質の濃度が、約０．１重量％～約５重量％の範囲である、請求項１８に記載のスライド。
【請求項26】
前記第２の層の厚さが、約２５μｍ～約３００μｍの範囲である、請求項１８に記載のスライド。
【請求項27】
前記結合パートナー－酵素コンジュゲート中の前記酵素が、ラッカーゼであり、前記基質が、ＴＭＢと二価酸との間で形成されたイオン対として存在する３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項１８に記載のスライド。
【請求項28】
前記二価酸が、コハク酸、シュウ酸、マロン酸、グルタミン酸、アジピン酸、およびピメリン酸からなる群から選択される、請求項２７に記載のスライド。
【請求項29】
前記二価酸が、コハク酸である、請求項２８に記載のスライド。
【請求項30】
試料中の分析物の存在または量を決定する方法であって、（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）前記試料を請求項１に記載のスライドの第１の層と接触させるステップと；
（ｉｉｉ）検出可能なシグナルが存在するかどうかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項31】
前記検出可能なシグナルの強度を測定するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
試料中の分析物の存在または量を決定する方法であって、（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）前記試料を請求項１に記載のスライドの第１の層と接触させるステップと；
（ｉｉｉ）検出可能なシグナルが存在するかどうかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項33】
前記検出可能なシグナルの強度を測定するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
試料中の分析物の存在または量を決定する方法であって、（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）前記試料を粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートと接触させて、前記粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートおよび前記試料を含む混合物を得るステップであって、前記混合物中の分析物は、前記粒子の表面から前記結合パートナー－酵素コンジュゲートを移動させることができる、ステップと；
（ｉｉｉ）前記混合物から前記粒子を分離して、粒子を含まない混合物を得るステップと；
（ｉｖ）前記粒子を含まない混合物を、ポリマー中に分散された前記酵素の基質を含むポリマーと接触させるステップと
を含み、前記基質と前記酵素の相互作用が検出可能なシグナルを生成する、方法。
【請求項35】
乾燥されたラッカーゼを含む試料中の分析物の存在または量を決定するための乾式スライド。
【請求項36】
前記ラッカーゼが、前記分析物に特異的な抗体にコンジュゲートしている、請求項３５に記載のスライド。
【請求項37】
ＴＭＢおよびコハク酸をさらに含む、請求項３６に記載のスライド。
【請求項38】
ＴＭＢおよびコハク酸を含む試料中の分析物の存在または量を決定するための乾式スライド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２５６０３０号の利益を主張する。その内容は明示的に本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２５６０３０号の利益を主張する。その内容は明示的に本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
該当なし。
該当なし。
【0003】
コンパクトディスクによる提出資料の参照による援用
該当なし。
該当なし。
【背景技術】
【0004】
本技術は、スライドを使用し、洗浄ステップなどのいずれの分離ステップも要さない均一酵素イムノアッセイに関する。
【0005】
イムノアッセイは、物質の複雑な混合物を頻繁に含有する試験試料、典型的には溶液中の物質の存在または濃度を測定する技術である。典型的には、試験試料は血清または尿などの生体液である。イムノアッセイは、抗体または他のタンパク質が、１種または極めて限られたグループの分子に高い特異性で結合するユニークな能力に基づく。抗体に結合する分子は抗原と呼ばれる。イムノアッセイを行って抗原または抗体のいずれかの存在または濃度を測定することができる（すなわち、抗原または抗体のいずれかが分析物であり得る）。いずれの場合でも、アッセイの特異性は、分析物が、分析される試料中に存在し得る他の物質を除外して、その特異的結合パートナーに結合することができる程度に依存する。特異性の必要性に加えて、正確な測定を可能にするのに十分に高い分析物に対する親和性を有する結合パートナーを選択しなければならない。
【0006】
イムノアッセイの要件は、特異的結合イベントに応じて測定可能なシグナルを生成する手段である。これは、分析物がその結合パートナーに結合すると起こる、光散乱または屈折率などの一部の物理学的特性の変化を測定することによって達成することができる。多くのイムノアッセイは、検出可能な標識と会合している結合パートナーの使用に依存する。検出可能な標識と会合した結合パートナーはしばしばトレーサーと呼ばれる。放射性元素（ラジオイムノアッセイで使用される）；酵素；蛍光、燐光、および化学発光色素；ラテックスおよび磁性粒子；色素結晶子；金、銀、およびセレンコロイド粒子；金属キレート；補酵素；電気活性基；オリゴヌクレオチド、安定なラジカルなどを含む多種多様な検出可能な標識が使用されている。このような検出可能な標識は、遊離トレーサーと結合トレーサーの分離後に、または結合イベントがトレーサーによって生成されるシグナルの変化をもたらすように系を設計することによって、結合イベントの検出および定量化を可能にする。
【0007】
しばしば分離イムノアッセイまたは不均一イムノアッセイと呼ばれる、分離ステップを要するイムノアッセイは、複数のステップ、例えば、未結合トレーサーからその結合パートナーに結合しているトレーサーを分離するための表面の慎重な洗浄を典型的には要する。分離ステップなしで実行される、シグナルが結合によって影響を受けるイムノアッセイは、均一イムノアッセイと呼ばれる。均一イムノアッセイは、単に試薬と試料を混合し、物理的測定を行うことによって行われる。均一イムノアッセイは不均一イムノアッセイよりも実施するのが容易である。
【0008】
使用される方法にかかわらず、イムノアッセイで生成されるシグナルの解釈には、試料媒体の特性を模倣した標準を参照することが要求される。定性的アッセイの場合、標準は、分析物を含まない参照試料および検出可能と考えられる最低濃度の分析物を有する陽性試料からなり得る。定量的アッセイには、公知の分析物濃度を有する追加の標準が要求される。試験試料のアッセイ反応と標準によって生成されるアッセイ反応の比較によって、試料中の分析物の存在または濃度に関してシグナル強度を解釈することが可能になる。
【0009】
イムノアッセイは競合であっても非競合であってもよい。競合イムノアッセイでは、試料中の抗体が、抗原と結合するのにトレーサー（すなわち、検出可能な標識に連結した抗体）と競合する。そのため、抗体に結合したトレーサーの量を測定する。競合イムノアッセイでは、抗体に結合したトレーサーの量が、試料中の抗体の濃度に反比例する。これは、試料中に大量の抗体がある場合、より多くの抗原が試料中の抗体に結合し、トレーサーに結合するために利用可能な抗原が少なくなるからである。
【0010】
「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる非競合イムノアッセイでは、試料中の抗原を表面に固定された抗体に結合させ、次いで、検出可能な標識に付着している二次抗体を抗原に結合させる。次いで、結合した検出可能な標識の量を測定する。競合イムノアッセイと異なり、非競合イムノアッセイでは、反応が試料中の抗原の濃度に正比例する。これは、抗原が試料中に存在しない場合、二次抗体上の検出可能な標識は結合しないからである。
【0011】
これらの技術は抗体－抗原結合パートナーに限定されない。同様のアッセイを、タンパク質（抗体ではない）を使用して実施して、タンパク質に特異的に結合する基質の存在または濃度を決定することができる。これらのアッセイにおけるトレーサーは、例えば、タンパク質に連結した検出可能な標識またはタンパク質に結合する分子に連結した検出可能な標識であり得る。
【0012】
イムノアッセイは、例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの、試験試料中の物質の存在または濃度を測定する他の分析方法にしばしば関連する抽出および他の複雑な試料後処理手順および長いアッセイ時間を回避するので、これらの他の分析方法よりも有利である。
【0013】
しかしながら、改善の余地があり、例えば、より高い感度を示すイムノアッセイが、実施がより容易であり、および／または実施があまり高価でない。
【0014】
本発明のこれらのおよび他の特徴および利点は、本開示の残りの部分、特にその全てが本発明の原理を例として示す好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるだろう。
【0015】
本出願におけるいずれの参考文献の引用も、このような参考文献が本出願に対する先行文献であるものと解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
本技術は、スライドを使用し、洗浄ステップなどのいずれの分離ステップも要さない均一酵素イムノアッセイに関する。本技術はまた、該アッセイに使用されるスライドに関する。
【課題を解決するための手段】
【0017】
一実施形態では、試料中の分析物の存在または量を決定する方法は、
（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）試料を粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートと接触させて、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートおよび試料を含む混合物を得るステップであって、混合物中の分析物は、粒子の表面から結合パートナー－酵素コンジュゲートを移動させることができる、ステップと；
（ｉｉｉ）混合物から粒子を分離して、粒子を含まない混合物を得るステップと；
（ｉｖ）粒子を含まない混合物を、ポリマー中に分散された酵素の基質を含むポリマーと接触させるステップと
を含み、基質と酵素の相互作用が検出可能なシグナルを生成する。
（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）試料を粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートと接触させて、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートおよび試料を含む混合物を得るステップであって、混合物中の分析物は、粒子の表面から結合パートナー－酵素コンジュゲートを移動させることができる、ステップと；
（ｉｉｉ）混合物から粒子を分離して、粒子を含まない混合物を得るステップと；
（ｉｖ）粒子を含まない混合物を、ポリマー中に分散された酵素の基質を含むポリマーと接触させるステップと
を含み、基質と酵素の相互作用が検出可能なシグナルを生成する。
【0018】
一実施形態では、本方法は、２つの層を含むスライドを使用する。２つの層は、
（ｉ）第１のポリマー中に分散された粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む第１の層であって、結合パートナー－酵素コンジュゲートは分析物に特異的である、第１の層；および
（ｉｉｉ）第２のポリマー中に分散された酵素の基質を含む第２の層
であり、基質と酵素の相互作用が検出可能なシグナルを生成する。
（ｉ）第１のポリマー中に分散された粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む第１の層であって、結合パートナー－酵素コンジュゲートは分析物に特異的である、第１の層；および
（ｉｉｉ）第２のポリマー中に分散された酵素の基質を含む第２の層
であり、基質と酵素の相互作用が検出可能なシグナルを生成する。
【0019】
２つの層を含むスライドを使用して、試料中の分析物の存在または量を決定する方法は、
（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）試料をスライドの第１の層と接触させるステップと；
（ｉｉｉ）検出可能なシグナルが存在するかどうかを決定するステップと
を伴う。
（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）試料をスライドの第１の層と接触させるステップと；
（ｉｉｉ）検出可能なシグナルが存在するかどうかを決定するステップと
を伴う。
【0020】
一実施形態では、本方法は、３つの層を含むスライドを使用する。３つの層は、
（ｉ）第１のポリマー中に分散された結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む第１の層であって、結合パートナー－酵素コンジュゲートは分析物に特異的である、第１の層；
（ｉｉ）第２のポリマー中に分散された、分析物がその表面に結合した固体粒子を含む第２の層；および
（ｉｉｉ）第３のポリマー中に分散された、酵素の基質を含む第３の層
であり、基質と酵素の相互作用が検出可能なシグナルを生成する。
（ｉ）第１のポリマー中に分散された結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む第１の層であって、結合パートナー－酵素コンジュゲートは分析物に特異的である、第１の層；
（ｉｉ）第２のポリマー中に分散された、分析物がその表面に結合した固体粒子を含む第２の層；および
（ｉｉｉ）第３のポリマー中に分散された、酵素の基質を含む第３の層
であり、基質と酵素の相互作用が検出可能なシグナルを生成する。
【0021】
２つの層を含むスライドを使用して、試料中の分析物の存在または量を決定する方法は、
（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）試料をスライドの第１の層と接触させるステップと；
（ｉｉｉ）検出可能なシグナルが存在するかどうかを決定するステップと
を伴う。
（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）試料をスライドの第１の層と接触させるステップと；
（ｉｉｉ）検出可能なシグナルが存在するかどうかを決定するステップと
を伴う。
【0022】
一実施形態では、本方法は、検出可能なシグナルの強度を測定するステップをさらに含む。
【0023】
一実施形態では、本方法はいずれの分離ステップも要さない。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】本明細書に記載される酵素結合免疫吸着測定法に使用されるスライドの一般的な構造を示す図である。
【図2】本明細書に記載される酵素結合免疫吸着測定法が作用する原理を示す図である。
【図4A】本明細書に記載される酵素結合免疫吸着測定法に使用される２層スライドの一般的な構造を示す図である。
【図5a】本方法がスライドを使用する原理を示す図であり、（ｉ）粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層と、（ｉｉｉ）本明細書に記載される読み取り層とを含む。
【図6】第１の水性試料と第２の水性試料の適用の間の時間、ｔの関数としての、第１の水性試料を、溶解性両面テープによって分離されている結合パートナー－酵素コンジュゲート層と読み取り層を有するスライドに適用し、引き続いて第２の水性試料を適用した場合に湿っている読み取り層の面積パーセントのプロットである。
【図7】結合パートナー－酵素コンジュゲート層と読み取り層を有するスライドを用いて、ＳＤＭＡを含有する試料をＳＤＭＡについてアッセイした場合の応答対ＳＤＭＡ濃度のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本技術は、スライドを使用し、洗浄ステップなどのいずれの分離ステップも要さない均一酵素イムノアッセイを包含する。
【0026】
本技術はまた、酵素結合免疫吸着測定法に使用されるスライドを包含する。
【0027】
１．定義
「分析物」という用語は、この用語が本明細書で使用される場合、試料中のその存在または濃度を決定することを意図しており、結合パートナー（例えば、抗原または抗体）に結合する（すなわち、これと複合体を形成する）、生体液などの試料中に存在する分子（例えば、抗体または抗原）を指す。
「分析物」という用語は、この用語が本明細書で使用される場合、試料中のその存在または濃度を決定することを意図しており、結合パートナー（例えば、抗原または抗体）に結合する（すなわち、これと複合体を形成する）、生体液などの試料中に存在する分子（例えば、抗体または抗原）を指す。
【0028】
「複合体」は、この用語が本明細書で使用される場合、分子実体間の共有結合を伴わない２つ以上の分子実体（イオン性であっても帯電していなくてもよい）の会合によって形成される種である。複合体の例は、抗体と抗原の会合およびペプチドと受容体の会合である。
【0029】
「ハプテン」という用語は、この用語が本明細書で使用される場合、動物に注射した場合に抗体形成を誘導しないが、動物に注射した場合に担体タンパク質に連結して免疫応答を誘発する抗原（免疫原）を提供して、抗体の形成をもたらすことができる分子である。得られた抗体は、公知の抗体単離技術によって単離され得る。ハプテンは得られた抗体に結合する。
【0030】
「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、当技術分野で認識されている意味を有する、すなわち、体に導入した場合に、抗体の産生を刺激する物質である。
【0031】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、当技術分野で認識されている意味を有する、すなわち、抗原の体への導入のために産生されるタンパク質である。
【0032】
「結合パートナー」という句は、この句が本明細書で使用される場合、特異性を有して第２の分子に結合する分子を意味する。例えば、第２の分子が抗原／抗体であり得、「結合パートナー」が抗体／抗原であり得る。同様に、第２の分子が受容体のペプチドであり得、「結合パートナー」が受容体であり得るか、または第２の分子が受容体であり得、「結合パートナー」がペプチドであり得る。第２の分子が分析物であり得る。
【0033】
「特異性を有して」、「特異的に結合する」、「特異性を有して分析物に結合する」、「分析物に特異的である」という句、および同様の句は、本明細書で使用される場合、当技術分野で認識されている意味を有する、すなわち、結合パートナーが、分析物（または分析物のクラス）を認識し、他の非特異的分子に結合するよりも高い親和性でこれに結合する。例えば、他の非特異的分子よりも効率的に抗原に結合する、抗原に対して産生される抗体は、抗原に特異的に結合すると記載され得る。結合特異性は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはウエスタンブロットアッセイなどの当技術分野で公知の方法論を使用して試験することができる。非特異的分子は、分析物と共通のエピトープを共有しない分子である。
【0034】
「エピトープ」という句は、本明細書で使用される場合、分析物がその結合パートナーによって認識され、これに特異的に結合することができるように、分析物の１つまたは複数の決定基またはエピトープ部位を定義するような構造、空間、および極性配置を有する分析物の一部を意味する。「エピトープ部分」という句は、本明細書で使用される場合、エピトープ部分またはエピトープ部分を含む分子実体を意味する。
【0035】
「結合パートナー－酵素コンジュゲート」という句は、この用語が本明細書で使用される場合、検出可能な標識として作用する酵素に共有結合している結合パートナーを意味する。例えば、結合パートナー－酵素コンジュゲートは、抗原に特異的な抗体であって、検出可能な標識として作用する酵素にコンジュゲート（すなわち、共有結合）している抗体であり得る。抗原は、抗体が抗原に特異的に結合するように、抗体によって認識される１つまたは複数の決定基またはエピトープ部位（すなわち、「エピトープ部分」）を定義する原子の構造、空間、および極性配置を有する。
【0036】
「検出可能な標識」という句は、本明細書で使用される場合、結合パートナー－酵素コンジュゲートの検出および定量を可能にする結合パートナー－酵素コンジュゲートの部分を意味する。例えば、結合パートナー（例えば、抗体）に共有結合している酵素の基質と接触すると変色をもたらすことができる酵素は、抗体および酵素を含む結合パートナー－酵素コンジュゲートの「検出可能な標識」である。
【0037】
結合パートナー－酵素コンジュゲートは、酵素にコンジュゲートした抗体であり得る。結合パートナー－酵素コンジュゲートは、酵素にコンジュゲートしたペプチドの受容体であり得る。結合パートナー－酵素コンジュゲートは、酵素にコンジュゲートした抗原であり得る。結合パートナー－酵素コンジュゲートは、酵素にコンジュゲートした受容体に特異的なペプチドであり得る。
【0038】
「実質的に含まない」という句は、本明細書で使用される場合、１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満、最も好ましくは１％未満を意味する。
【0039】
「比例する」という句は、本明細書で使用される場合、測定された値と何かの量との間の対応または関係が存在することを意味する。例えば、「シグナルの強度は試料中の抗原の濃度に正比例する」という句は、シグナルの強度が試料中の抗原の濃度に対応することを意味する。測定された値および量は線形相関し得る。
【0040】
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±２％、最も好ましくは±１％を意味する。
【0041】
２．方法の説明
本技術は、試料中の分析物の存在または量を決定する方法に関する。本技術はまた、アッセイに使用されるスライドに関する。
本技術は、試料中の分析物の存在または量を決定する方法に関する。本技術はまた、アッセイに使用されるスライドに関する。
【0042】
１．読み取り層を含むスライドを使用したアッセイ方法
一実施形態では、試料中の分析物の存在または量を決定する方法は、
（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）試料を粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートと接触させて、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートおよび試料を含む混合物を得るステップであって、混合物中の分析物は、粒子の表面から結合パートナー－酵素コンジュゲートを移動させることができる、ステップと；
（ｉｉｉ）混合物から粒子を分離して、粒子を含まない混合物を得るステップと；
（ｉｖ）粒子を含まない混合物を、ポリマー中に分散された酵素の基質を含むポリマーと接触させるステップと
を含み、
基質と酵素の相互作用が検出可能なシグナルを生成する。
一実施形態では、試料中の分析物の存在または量を決定する方法は、
（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）試料を粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートと接触させて、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートおよび試料を含む混合物を得るステップであって、混合物中の分析物は、粒子の表面から結合パートナー－酵素コンジュゲートを移動させることができる、ステップと；
（ｉｉｉ）混合物から粒子を分離して、粒子を含まない混合物を得るステップと；
（ｉｖ）粒子を含まない混合物を、ポリマー中に分散された酵素の基質を含むポリマーと接触させるステップと
を含み、
基質と酵素の相互作用が検出可能なシグナルを生成する。
【0043】
ポリマー中に分散された酵素の基質を含むポリマーは、本明細書において読み取り層と呼ばれる。読み取り層は、酵素が基質と相互作用すると、検出可能なシグナル（変色など）を生成する酵素の基質を含む。この実施形態では、検出ステップを除いて、全ての反応を、反応容器中、スライド外で実施することができる。
【0044】
この実施形態では、結合パートナー－酵素コンジュゲートを、分析物がその表面に付着した粒子と共にインキュベートする。結合パートナー－酵素コンジュゲートは、粒子の表面上の分析物と複合体を形成して、結合パートナー－酵素コンジュゲートがその表面に付着した粒子を提供する。その存在または量を決定するつもりである分析物を含有することが疑われる試料を、結合パートナー－酵素コンジュゲートがその表面に付着した粒子と合わせる。試料中の分析物は、粒子の表面に結合した分析物と競合して、分析物と結合パートナー－酵素コンジュゲートの複合体を形成する（すなわち、結合パートナー－酵素コンジュゲートが分析物に結合し、粒子から放出される）。次いで、得られた溶液のアリコートを、粒子を除去することなく、取り出し、読み取り層に適用する。酵素は読み取り層中の基質と相互作用して、検出可能なシグナル（例えば、変色）を形成する。
【0045】
粒子から分離された、分析物と結合パートナー－酵素コンジュゲートの複合体を読み取り層に適用すると、結合パートナー－酵素コンジュゲートが、基質との反応を触媒して、発色などのシグナルを生成し、これを測定する。読み取り層でシグナルを測定する。シグナルの強度は試料中の分析物の濃度に正比例する、すなわち、試料中の分析物濃度が高いほど、シグナルが強くなる。
【0046】
試料と粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを、典型的には液体媒体中で接触させる。一実施形態では、液体媒体は水性媒体である。
【0047】
結合パートナーを酵素にコンジュゲートして結合パートナー－酵素コンジュゲートを得る多数の方法が存在する。
【0048】
一実施形態では、結合パートナーを酵素にコンジュゲートする方法は、結合パートナー（抗体であり得る）上のシステイン基を還元することによって、結合パートナー上にスルフヒドリル基を形成するステップを伴う。別の実施形態では、結合パートナーをＮ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）と接触させて、スルフヒドリル含有基を結合パートナー上の一級アミンに付加する。次いで、結合パートナーを酵素と接触させる。一実施形態では、酵素と結合パートナーのモル比は、約１：１～約２０：１の範囲である。一実施形態では、酵素と結合パートナーのモル比は、約４：１～約１２：１の範囲である。
【0049】
結合パートナーを酵素にコンジュゲートする他の方法も存在する。結合パートナーが抗体である場合、コンジュゲーションの方法は、例えば、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）ケミストリー、ＳＰＤＰ（スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）ケミストリー、過ヨウ素酸ケミストリー、およびテトラジンクリックケミストリーを含む。これらの方法の各々を行うための説明書に試薬を含有するキットは、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能である。
【0050】
一実施形態では、結合パートナーは、抗体である。換言すれば、結合パートナー－酵素コンジュゲート層は、抗体－酵素コンジュゲート層である。抗体－酵素コンジュゲート層は、抗体－酵素コンジュゲートを提供するように、検出可能な標識として作用する酵素にコンジュゲートしている、抗原に特異的な抗体を含む。
【0051】
抗体は、当技術分野で認識されている技術を使用して、抗原に対する動物の免疫応答を発達させることによって得ることができる。典型的には、ハプテン（目的の分析物と共通のエピトープ部分を有する）をウシ血清アルブミンなどの担体タンパク質にコンジュゲートして免疫原（抗原）を得て、これを、一連の注射によって、ウサギ、マウス、またはヒツジなどの動物に投与し、次いで、慣用的な技術を使用して得られた抗体を単離する。免疫原を形成するために使用することができる他の例示的なタンパク質担体には、それだけに限らないが、キーホールリンペットヘモシアニン、卵オボアルブミン、ウシガンマ－グロブリン、およびチロキシン結合グロブリンが含まれる。あるいは、ハプテンを、ハプテンと反応性の官能基を含有する合成または天然ポリマー材料にコンジュゲートすることによって、抗原を形成することができる。
【0052】
最初に分析物がその表面に付着した粒子を形成し、次いで、分析物がその表面に付着した粒子を結合パートナー－酵素コンジュゲートと合わせることによって、結合パートナー－酵素コンジュゲートを粒子の表面に付着させる。
【0053】
分析物を付着させることができる粒子には、それだけに限らないが、ラテックス粒子が含まれる。一実施形態では、粒子は、分析物で受動的にコーティングされた約０．５μｍ～約５．０μｍのラテックス粒子である。一実施形態では、粒子は、分析物で受動的にコーティングされた約１．０μｍ～約２．０μｍのラテックス粒子である。様々なサイズのラテックスビーズを米国マサチューセッツ州ウォルサム所在のＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入することができる。
【0054】
一実施形態では、分析物を、タンパク質を介して粒子の表面に付着させる。一部の実施形態では、タンパク質は、Ｇ６ＰＤＨである。一部の実施形態では、分析物を最初にＧ６ＰＤＨにコンジュゲートし、分析物－Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートを粒子の表面に非共有結合的に付着（コーティング）させる。特定の実施形態では、分析物は、ＭＭＡである。ＭＭＡのＧ６ＰＤＨへのコンジュゲーションおよびＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡコンジュゲートの粒子上へのコーティングの手順は、同時係属中の米国特許第１１４２２１３６号に記載されている。
【0055】
ある実施形態は、分析物は、その表面に付着した固体粒子を包含する。
【0056】
ある実施形態は、結合パートナー－酵素コンジュゲートは、粒子の表面に付着した固体粒子を包含する。
【0057】
読み取り層は、酵素が基質と相互作用すると、検出可能なシグナル（変色など）を生成する酵素の基質を含む。酵素の基質をポリマー中に分散して、読み取り層を得る。
【0058】
読み取り層に適したポリマーには、それだけに限らないが、セルロースが含まれる。
【0059】
典型的には、読み取り層中の酵素の基質の濃度は０．１％～約２．０％の範囲である。
【0060】
一実施形態では、読み取り層の厚さは、約２５μｍ～約３００μｍの範囲である。一実施形態では、読み取り層の厚さは、約５０μｍ～約２５０μｍの範囲である。一実施形態では、読み取り層の厚さは、約１００μｍ～約２００μｍの範囲である。一実施形態では、読み取り層の厚さは、約１５０μｍである。読み取り層の厚さは、部分的には、試料体積に依存する。例えば、試料が分析物の非常に希薄な溶液である場合、本方法はより大きな試料体積を要し、より大きな試料体積を収容するようにより厚い読み取り層が好まれる。
【0061】
読み取り層は、基質を溶媒に溶解／懸濁し、得られた溶液／懸濁液をポリマーの前もって形成されたシートに適用し、次いで、湿潤ポリマーを乾燥させることによって調製することができる。一実施形態では、溶液／懸濁液は、水溶液／水性懸濁液である。溶液／懸濁液中の基質の濃度は約０．０５％～約１．０％の範囲である。一実施形態では、読み取り層は、ポリマーの前もって形成されたシートを基質の溶液／懸濁液に浸漬することによって、または基質の溶液／懸濁液をポリマーに適用し、次いで、ポリマーを例えば約４５℃で約１０分間～約１５分間乾燥させることによって調製される。一実施形態では、ポリマーの前もって形成されたシートは、Ｗｈａｔｍａｎ ５９５濾過膜（ニュージャージー州ローウェー所在のＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから商業的に入手可能）である。Ｗｈａｔｍａｎ ５９５濾過膜はセルロース膜である。
【0062】
一実施形態では、ポリマーの前もって形成されたシート（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ５９５またはＷｈａｔｍａｎ ６またはＷｈａｔｍａｎ ５０濾過膜）を、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）層などの透明支持層に付着させる。他の光学的に半透明の材料のシートを支持層として使用してもよい。感圧接着剤を使用してポリマーの前もって形成されたシートを固体支持層に付着させることができる。
【0063】
一実施形態では、読み取り層は、透明支持層を、基質およびポリマー（例えば、セルロース）を含む溶液／懸濁液でコーティングし、次いで、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって調製される。読み取り層の成分を、混合しながら溶媒中で合わせて、溶液／懸濁液を得て、得られた溶液／懸濁液を透明支持層に適用し、溶媒を除去して透明支持層の上に読み取り層を提供する。あらゆるコーティング方法を使用して所望の厚さでスライドの各層を提供することができる。適切なコーティング技術は、「Ｌｉｑｕｉｄ Ｆｉｌｍ Ｃｏａｔｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｓｔｅｐｈａｎ Ｆ．ＫｉｓｔｌｅｒおよびＰｅｔｅｒ Ｍ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ編、第一版、著作権１９９７ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔに記載されている。一実施形態では、ナイフコーターを使用して読み取り層を適用する。一実施形態では、ループコーターを使用して読み取り層を適用する。
【0064】
一実施形態では、支持層は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）である。典型的には、支持層の厚さは約１５μｍ～約１５０μｍの範囲である。一実施形態では、支持層の厚さは、約２５μｍ～約１２５μｍの範囲である。一実施形態では、支持層の厚さは、約５０μｍ～約１００μｍの範囲である。一実施形態では、支持層の厚さは、約７５μｍである。
【0065】
一実施形態では、読み取り層を提供するための溶液／懸濁液は、以下の成分：約０．１～約１．０重量％、好ましくは約０．８重量％の濃度のコハク酸；約０．１～約０．２重量％、好ましくは約０．１３重量％の濃度の酵素の基質（例えば、酵素がラッカーゼである場合、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））；約０．９～約５重量％、好ましくは約３重量％の濃度のＤ４ヒドロゲル溶液（マサチューセッツ州ウィルミントンのＡｄｖａｎＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐから商業的に入手可能）；約２４～約３５重量％、好ましくは約２７重量％の濃度のセルロース；および場合により約０～約３重量％の濃度のヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を９０％エタノール中で合わせることによって調製される。得られた溶液／懸濁液のｐＨは約３．５～約４．０の範囲である。
【0066】
一実施形態では、読み取り層を提供するための溶液／懸濁液は、約１１６．４ｍｇのコハク酸を約６．０８ｇの９０％エタノール中で合わせ、混合しながら約１９．７ｍｇの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、混合しながら約４．９３ｇのＤ４ポリウレタンの９．１３％溶液を添加し、混合しながら約４．０９ｇのセルロースを添加することによって調製される。得られた溶液／懸濁液のｐＨは約３．５～約４．０の範囲である。
【0067】
次いで、得られた溶液／懸濁液を支持層上にコーティングし、溶液／懸濁液を乾燥させる。湿潤読み取り層の厚さは、典型的には約３１０μｍ～約３２０μｍの範囲である。乾燥読み取り層の厚さは、典型的には約１５５μｍ～約１６０μｍの範囲である。
【0068】
例示的な酵素には、それだけに限らないが、ラッカーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－ラクタマーゼ、およびルシフェラーゼが含まれる。一実施形態では、酵素はラッカーゼである。ラッカーゼは、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、サーモセロマイセス・サーモフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ボトリチス・アクラダ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ａｃｌａｄａ）、ストレプトマイセス・シアネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｙａｎｅｓ）、およびサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を含む様々な真菌種および細菌種で生じる。例示的なラッカーゼは、ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能なサーモセロマイセス・サーモフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）から精製されたラッカーゼであり、ｃｏｎＡセファロースカラムを使用して精製することができる。
【0069】
一実施形態では、ラッカーゼは、組換え的に発現されたラッカーゼである（例えば、サーモセロマイセス・サーモフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ボトリチス・アクラダ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ａｃｌａｄａ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ストレプトマイセス・シアネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｙａｎｅｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のクローニングラッカーゼ遺伝子）。一実施形態では、サーモセロマイセス・サーモフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００３６６３７４１．１）、ボトリチス・アクラダ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ａｃｌａｄａ）（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッションＨ８ＺＲＵ２）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００１３９２９５８．１）、ストレプトマイセス・シアネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｙａｎｅｓ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＤＸ９７４９２．１）、またはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＱ７２ＨＷ２）由来のラッカーゼをコードするＤＮＡ配列を、ｐＥＴ２８ａベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させる。一実施形態では、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＡＡＥ３３１７０．１）由来のラッカーゼをコードするＤＮＡ配列を、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）での発現に適したベクターにクローニングする。サーモセロマイセス・サーモフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ボトリチス・アクラダ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ａｃｌａｄａ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、およびミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来のラッカーゼは真菌ラッカーゼであり、ストレプトマイセス・シアネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｙａｎｅｓ）およびサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のラッカーゼは細菌ラッカーゼである。
【0070】
一実施形態では、酵素は非哺乳動物酵素である。非哺乳動物酵素を使用することにより、有利にも、哺乳動物酵素の基質であり得るが、非哺乳動物酵素の基質ではない哺乳動物試料中に存在する化合物からの潜在的な干渉が回避される。好ましい実施形態では、試料は哺乳動物から得られ、酵素は非哺乳動物酵素である。
【0071】
好ましい実施形態では、非哺乳動物酵素は真菌ラッカーゼであり、基質はＴＭＢである。真菌ラッカーゼは、ＴＭＢと反応して青色を形成する。青色の強度は、読み取り層に適用された結合パートナー－酵素コンジュゲートに比例し、これは試料中の分析物の量に正比例する。真菌ラッカーゼはまた、有利にも、空気中に存在する酸素を使用したＴＭＢの酸化を触媒するので、酵素反応の補因子として過酸化水素を使用しなければならないことが回避される。
【0072】
一実施形態では、分析物は、抗原であり；結合パートナー－酵素コンジュゲートは、抗体－酵素コンジュゲートであり、抗体は、抗原に特異的であり；酵素は、非哺乳動物酵素である。好ましい実施形態では、分析物は、抗原であり；結合パートナー－酵素コンジュゲートは、抗体－酵素コンジュゲートであり、抗体は、抗原に特異的であり；酵素は、真菌ラッカーゼである。
【0073】
特に好ましい実施形態では、非哺乳動物酵素は、真菌ラッカーゼであり、基質は、ＴＭＢとコハク酸などの二価酸との間で形成されたイオン対である。イオン対の構造は、
【0074】
【化1】
であり得る。
【0075】
適切な二価酸には、それだけに限らないが、コハク酸、シュウ酸、マロン酸、グルタミン酸、アジピン酸、およびピメリン酸が含まれる。コハク酸が好ましい二価酸である。
【0076】
ＴＭＢとコハク酸などの二価酸との間で形成されたイオン対を基質として使用すると、有利にも、読み取り層中の酵素とＴＭＢの反応から生成される青色が、読み取り層の中心と比較して読み取り層の周縁でより強力な色が観察される「コーヒーリング」効果を示すのが回避される。よって、ＴＭＢ単独を基質として使用する場合と比較して、ＴＭＢとコハク酸などの二価酸との間で形成されたイオン対を基質として使用した場合に、青色が読み取り層中により均一に分散される。図３Ａは、基質としてＴＢＭを使用したアッセイにおける読み取り層を示し、図３Ｂは、基質としてＴＭＢとコハク酸との間のイオン対を使用したアッセイにおける読み取り層を示す。図３を提供するために使用されたアッセイは、抗原としてのＳＤＭＡおよび抗体－酵素コンジュゲートを伴い、抗体がＳＤＭＡに対する抗体であり、酵素が真菌ラッカーゼであった。ＳＤＭＡに対する抗体は、例えば、米国特許第８４８１６９０号に記載されている。
【0077】
一実施形態では、読み取り層は、ラッカーゼの活性を増加させるための活性剤をさらに含む。例示的な活性剤には、それだけに限らないが、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）；３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシアセトフェノン；フェルラ酸；およびｐ－クマル酸が含まれる。
【0078】
一実施形態では、読み取り層は、酵素反応からのシグナルを増加させるための媒介物質をさらに含む。例示的な媒介物質には、それだけに限らないが、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴ）、２－ヒドロキシイソインドリン－１，３－ジオン（ＨＰＩ）；Ｎ－ヒドロキシ－Ｎ－フェニルアセトアミド（ＮＨＡ）；（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－イル）オキシル（ＴＥＭＰＯ）；およびビオルル酸が含まれる。
【0079】
基質がＴＭＢである一実施形態では、読み取り層は、Ｗｈａｔｍａｎ ５９５セルロース膜を、約２．５以下のｐＨの１００ｍＭコハク酸中１０００μｇ／ｍｌ ＴＭＢの溶液に浸漬し、次いで、膜を約４５℃で約１０分間～約１５分間乾燥させることによって調製される。ＴＭＢ－コハク酸溶液は２つの手順のいずれかによって調製することができる。
手順１：（ｉ）所望の体積のＴＭＢ緩衝液（ＴＭＢ濃度４００μｇ／ｍｌ）（マサチューセッツ州ウォルサム所在のＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を用意し、（ｉｉ）Ｔｈｅｒｍｏ ＴＭＢ緩衝液各１ｍＬ当たり、６００μｇの固体ＴＭＢ（ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）を添加し、（ｉｉｉ）得られた溶液各１ｍＬ当たり、１１．８ｍｇのコハク酸を添加して、１００ｍＭコハク酸および１０００μｇ／ｍｌ ＴＭＢの最終モル濃度を達成する。
手順２：（ｉ）１２００μＬの０．５Ｍコハク酸を６ｍｇのＴＭＢ粉末に添加し、（ｉｉ）４ｍＬの脱イオン水を添加し、（ｉｉｉ）約３０μＬの１Ｎ ＨＣｌを添加して、ＴＭＢ溶液のｐＨを約２．４に調整し、（ｉｖ）脱イオン水を用いて溶液を約６ｍＬの最終体積にして、１００ｍＭコハク酸および１０００μｇ／ｍｌ ＴＭＢの最終モル濃度を達成する。
手順１：（ｉ）所望の体積のＴＭＢ緩衝液（ＴＭＢ濃度４００μｇ／ｍｌ）（マサチューセッツ州ウォルサム所在のＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を用意し、（ｉｉ）Ｔｈｅｒｍｏ ＴＭＢ緩衝液各１ｍＬ当たり、６００μｇの固体ＴＭＢ（ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）を添加し、（ｉｉｉ）得られた溶液各１ｍＬ当たり、１１．８ｍｇのコハク酸を添加して、１００ｍＭコハク酸および１０００μｇ／ｍｌ ＴＭＢの最終モル濃度を達成する。
手順２：（ｉ）１２００μＬの０．５Ｍコハク酸を６ｍｇのＴＭＢ粉末に添加し、（ｉｉ）４ｍＬの脱イオン水を添加し、（ｉｉｉ）約３０μＬの１Ｎ ＨＣｌを添加して、ＴＭＢ溶液のｐＨを約２．４に調整し、（ｉｖ）脱イオン水を用いて溶液を約６ｍＬの最終体積にして、１００ｍＭコハク酸および１０００μｇ／ｍｌ ＴＭＢの最終モル濃度を達成する。
【0080】
一実施形態では、スライドは、下記のように、拡散層、反射層、およびカーボンブラック含有層のうちの１つまたは複数をさらに含む。
【0081】
２．（ｉ）粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層と、（ｉｉ）読み取り層とを含むスライドを使用したアッセイ方法
一実施形態では、本方法は、２つの層を含むスライドを使用する。２つの層は、（ｉ）粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層および（ｉｉｉ）読み取り層である。２つの層を含むスライドの概略図を図４Ａに示す。図４Ａでは、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層はガラス繊維層であり、読み取り層はＷｈａｔｍａｎ ５９５セルロース層である。
一実施形態では、本方法は、２つの層を含むスライドを使用する。２つの層は、（ｉ）粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層および（ｉｉｉ）読み取り層である。２つの層を含むスライドの概略図を図４Ａに示す。図４Ａでは、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層はガラス繊維層であり、読み取り層はＷｈａｔｍａｎ ５９５セルロース層である。
【0082】
本方法は、分析物を含有することが疑われる試料を、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層に適用するステップを伴う。
【0083】
操作中、その存在または量を決定するつもりである分析物（抗原であり得る）を含有することが疑われる試料を、粒子の表面に付着した結合パートナー（抗体であり得る）－酵素コンジュゲートを含む層に添加すると、試料中の分析物（例えば、抗原）が、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層中に存在する結合パートナー－酵素コンジュゲートと複合体を形成する。次いで、分析物と結合パートナー－酵素コンジュゲートの複合体が読み取り層に拡散し、結合パートナー－酵素コンジュゲート（分析物に結合している）上の酵素が基質との反応を触媒して、発色などのシグナルを生成し、これを測定する。シグナルは、読み取り層で測定される。
【0084】
シグナルの強度は試料中の分析物の濃度に正比例する、すなわち、試料中の分析物濃度が高いほど、シグナルがより強くなる。
【0085】
粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層は、ガラス繊維膜中に分散している粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む。
【0086】
一実施形態では、結合パートナー－酵素コンジュゲートは抗原に特異的な抗体を含み、抗体は、検出可能な標識として作用する酵素にコンジュゲート（すなわち、共有結合）している（すなわち、結合パートナー－酵素コンジュゲート層が抗体－酵素コンジュゲート層である）。
【0087】
結合パートナー－酵素コンジュゲートを形成する方法は上に論じられている。
【0088】
結合パートナー－酵素コンジュゲートが粒子の表面に付着した粒子を形成する方法は上に記載される。
【0089】
粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層
粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートをガラス繊維膜中に分散させる。粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層を形成するのに適した例示的なガラス繊維膜は、約３３０μｍの厚さを有するＷｈａｔｍａｎ ＬＦ１フィルター（マサチューセッツ州マールボロ所在のＣｙｔｉｖａから商業的に入手可能）である。
粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートをガラス繊維膜中に分散させる。粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層を形成するのに適した例示的なガラス繊維膜は、約３３０μｍの厚さを有するＷｈａｔｍａｎ ＬＦ１フィルター（マサチューセッツ州マールボロ所在のＣｙｔｉｖａから商業的に入手可能）である。
【0090】
粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートは、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートの溶液／懸濁液をガラス繊維膜上に直接スポットし、湿潤膜を乾燥させることによってガラス繊維膜中に分散させることができる。一実施形態では、溶液／懸濁液が水溶液／水性懸濁液である。一実施形態では、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートの溶液／懸濁液が、Ｎｏｒｄｓｏｎ ＥＦＤディスペンサー（ロードアイランド州イーストプロビデンス所在のＮｏｒｄｓｏｎ ＥＦＤから商業的に入手可能）を使用してガラス繊維膜上にスポットされる。一実施形態では、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートの溶液／懸濁液が、約０．５％～約５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度を有する粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートの溶液／懸濁液を使用してガラス繊維膜上にスポットされる。一実施形態では、結合パートナー－酵素コンジュゲートが、約１％～約４％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度を有する粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートの溶液／懸濁液を使用してガラス繊維膜上にスポットされる。一実施形態では、結合パートナー－酵素コンジュゲートが、約２％～約３％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度を有する粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートの溶液／懸濁液を使用してガラス繊維膜上にスポットされる。粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートの溶液／懸濁液をガラス繊維膜に適用した後、膜を例えば約３７℃で約３０分間乾燥させる。
【0091】
典型的には、ガラス繊維膜中の粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートの濃度は５μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬの範囲である。
【0092】
粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層の厚さは約２００μｍ～約５００μｍの範囲である。一実施形態では、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層の厚さは、約２５０μｍ～約４００μｍの範囲である。一実施形態では、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層の厚さは、約３００μｍ～約４００μｍの範囲である。一実施形態では、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層の厚さは、約３３０μｍである。粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層の厚さは、部分的には、試料体積に依存する。例えば、試料が分析物の非常に希薄な溶液である場合、本方法はより大きな試料体積を要し、より大きな試料体積を収容するように粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含むより厚い層が好まれる。
【0093】
読み取り層
読み取り層は上記のように形成することができる。
読み取り層は上記のように形成することができる。
【0094】
一実施形態では、読み取り層は、上記のように、基質を溶媒に溶解／懸濁し、得られた溶液／懸濁液を、Ｗｈａｔｍａｎ ５９５濾過膜（ニュージャージー州ローウェー所在のＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから商業的に入手可能）などの、ポリマーの前もって形成されたシートに適用することによって調製される。この実施形態では、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含むガラス繊維膜は、単にガラス繊維膜を読み取り層の上に配置し、プラスチックフレームなどのフレームを使用して保持された２つの層を一緒に保持することによって読み取り層に付着される。
【0095】
一実施形態では、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含むガラス繊維膜は、２つの層の間で感圧接着剤を使用して読み取り層に付着される。
【0096】
一実施形態では、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含むガラス繊維膜は、両面テープを使用して読み取り層に付着される。好ましくは、両面テープは溶解性両面テープである。このような構造を図４Ｂに示す。図４Ｂでは、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層が、溶解性両面テープを使用してＷｈａｔｍａｎ ５９５読み取り層に付着しているガラス繊維膜である。図４Ｂでは、読み取り層が、光学的に透明なＰＥＴ支持層の上に配置される。図４Ｃは、溶解性両面テープを使用してセルロース読み取り層に付着しているガラス繊維膜中に粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む同様の構造を示す。図４Ｃでは、セルロース読み取り層が、光学的に透明なＰＥＴ支持層上にコーティングされる。
【0097】
両面テープは、試料を粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層に適用した後、スライドの各層の間での試料の拡散を制限するように選択することができる。特に、両面テープは、試料中の分析物が、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層中に存在する結合パートナー－酵素コンジュゲートと複合体を形成することができるように、十分な時間が経過するまで、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層から読み取り層への試料の拡散を防ぐ。
【0098】
介在層を溶解するのに必要な時間は、少なくとも、介在層に適用される流体の体積、介在層の配合、および介在層の厚さに依存する。溶解性フィルムおよびテープが利用可能である。米国特許第７４７０３９７号は、診断装置用の崩壊性フィルムを開示している。米国特許第９４４１１４２号は、診断装置に使用するための粘着テープを開示している。米国特許第９９３７１２３号は、医薬用途または化粧品用途のための溶解性フィルムを開示している。診断装置に適した溶解性フィルムおよび接着剤は、ペンシルバニア州グレンロック所在のＡｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能である。好ましい実施形態では、介在層は、その内容が明示的に本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０２０／０１７２７６８号に記載されるような崩壊性／溶解性テープである。一実施形態では、介在標識は、ペンシルバニア州グレンロック所在のＡｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能な崩壊性／溶解性テープである。
【0099】
（ｉ）粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層と、（ｉｉｉ）読み取り層とを含み、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層と読み取り層が両面テープを使用して付着されており、支持層をさらに含むスライドを示す概略図を図４Ｂおよび図４Ｃに示す。図４Ｂでは、読み取り層は、ＰＥＴ支持層上のＷｈａｔｍａｎ ５９５膜である。図４Ｃでは、読み取り層は、ＰＥＴ支持体上にコーティングされたセルロースポリマーである。
【0100】
スライドを使用した分析方法
操作中、その存在または量を決定するつもりである分析物（抗原であり得る）を含有することが疑われる試料を、粒子の表面に付着した結合パートナー（抗体であり得る）－酵素コンジュゲートを含む層に添加すると、試料中の分析物（例えば、抗原）が、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層中に存在する結合パートナー－酵素コンジュゲートと複合体を形成する。次いで、分析物と結合パートナー－酵素コンジュゲートの複合体が読み取り層に拡散し、結合パートナー－酵素コンジュゲート（分析物に結合している）上の酵素が基質との反応を触媒して、発色などのシグナルを生成し、これを測定する。シグナルは、読み取り層で測定される。
操作中、その存在または量を決定するつもりである分析物（抗原であり得る）を含有することが疑われる試料を、粒子の表面に付着した結合パートナー（抗体であり得る）－酵素コンジュゲートを含む層に添加すると、試料中の分析物（例えば、抗原）が、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層中に存在する結合パートナー－酵素コンジュゲートと複合体を形成する。次いで、分析物と結合パートナー－酵素コンジュゲートの複合体が読み取り層に拡散し、結合パートナー－酵素コンジュゲート（分析物に結合している）上の酵素が基質との反応を触媒して、発色などのシグナルを生成し、これを測定する。シグナルは、読み取り層で測定される。
【0101】
シグナルの強度は試料中の分析物の濃度に正比例する、すなわち、試料中の分析物濃度が高いほど、シグナルがより強くなる。
【0102】
上記のように、両面テープを使用して、試料を粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層に適用した後、スライドの各層の間での試料の拡散を制限することができる。特に、両面テープは、試料中の分析物が、結合パートナー－酵素コンジュゲートと複合体を形成することができるように、十分な時間が経過するまで、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層から読み取り層への試料の拡散を制限する。
【0103】
一実施形態では、スライドは、下記のように、拡散層、反射層、およびカーボンブラック含有層のうちの１つまたは複数をさらに含む。
【0104】
図５Ａは、方法がスライドを使用する原理を示しており、（ｉ）粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層（図５Ａでは、「第１の層」および「コンジュゲート層」と呼ばれる）と、（ｉｉ）読み取り層（図５Ａでは、「第２の層」と呼ばれる）とを含む。ステップ（１）で、抗原がその表面に付着した粒子（Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子）を抗体－酵素コンジュゲート（ｍＡＢ－ラッカーゼ）と合わせる。この例示において、粒子の表面上の抗原はモノメチルアルギニン（ＭＭＡ）である。ＭＭＡを、リンカーとしてグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＤＰＨ）を使用して粒子の表面に付着させる。Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子とｍＡＢ－ラッカーゼを合わせ、３７℃で１０分間インキュベートし、洗浄して未結合ｍＡＢ－ラッカーゼを除去して、粒子の表面に付着した抗体－酵素コンジュゲートを得る。ステップ（２）で、得られた粒子の表面に付着した抗体－酵素コンジュゲートをガラス繊維膜中に分散して、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層（すなわち、「コンジュゲート層」）を得る。ステップ（３）で、ＳＤＭＡ（同様に抗体に結合する、すなわち、ｍＡＢラッカーゼ）を含有する試料をコンジュゲート層に適用する。ＳＤＭＡは、ｍＡＢ－ラッカーゼへの結合について粒子上のＭＭＡと競合して、ｍＡｂ－ラッカーゼとＳＤＭＡの複合体を提供する。ステップ（４）で、得られたｍＡｂ－ラッカーゼ－ＳＤＭＡ複合体が読み取り層（すなわち、第２の層）に拡散し、ｍＡＢ上のラッカーゼが読み取り層中の基質と反応して、試料中のＳＤＭＡの量に比例するシグナル（例えば、変色）を生成する。図５ｂは、図５ａに記載されるプロセスを示す概略図である。図５Ｂは、ＳＤＭＡを含有する試料を、スライドの結合パートナー－酵素コンジュゲート層に適用することを示す。結合パートナー－酵素コンジュゲート層は、抗体－酵素コンジュゲート（ｍＡＢ－ラッカーゼ）と合わされた、抗原がその表面に付着した粒子（Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子）を含有している。Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子とｍＡＢ－ラッカーゼを合わせ、３７℃で１０分間インキュベートし、洗浄して未結合ｍＡＢ－ラッカーゼを除去して、粒子の表面に付着した抗体－酵素コンジュゲートを得る。得られた粒子の表面に付着した抗体－酵素コンジュゲートをガラス繊維膜中に分散させて、粒子の表面に付着した結合パートナー－酵素コンジュゲートを含む層を得る。ＳＤＭＡを含有する試料を結合パートナー－酵素コンジュゲート層に添加すると、ＳＤＭＡが、ｍＡＢ－ラッカーゼへの結合について粒子上のＭＭＡと競合して、ｍＡｂ－ラッカーゼとＳＤＭＡの複合体を提供する。得られたｍＡｂ－ラッカーゼ－ＳＤＭＡ複合体は読み取り層（すなわち、第２の層）に拡散し、ｍＡＢ上のラッカーゼが読み取り層中の基質と反応して、試料中のＳＤＭＡの量に比例するシグナル（例えば、変色）を生成する。
【0105】
図７は、結合パートナー－酵素コンジュゲート層および読み取り層を有するスライドを使用してＳＤＭＡについてアッセイした実験からの結果を示す。図７は、結合パートナー－酵素コンジュゲート層および読み取り層を有するスライドを用いて、試料をＳＤＭＡについてアッセイした場合の、応答対ＳＤＭＡ含有試料中のＳＤＭＡ濃度のプロットである。図７は、応答（すなわち、シグナルの強度）が試料中のＳＤＭＡの濃度に比例する、すなわち、試料中のＳＤＭＡ濃度が高いほど、応答がより強くなることを示す。
【0106】
３．（ｉ）結合パートナー－酵素コンジュゲート層と、（ｉｉ）捕捉層と、（ｉｉｉ）読み取り層とを含むスライドを使用したアッセイ
一実施形態では、本方法は、３つの層を含むスライドを使用する。３つの層は、（ｉ）結合パートナー－酵素コンジュゲート層、（ｉｉ）捕捉層、および（ｉｉｉ）読み取り層である。結合パートナー－酵素コンジュゲート層は、分析物に特異的な結合パートナーを含み、結合パートナーは、検出可能な標識として作用する酵素にコンジュゲート（すなわち、共有結合）している。捕捉層は、分析物分子がその表面に結合した固体粒子を含む。読み取り層は、酵素が基質と相互作用すると、検出可能なシグナル（変色など）を生成する酵素の基質を含む。
一実施形態では、本方法は、３つの層を含むスライドを使用する。３つの層は、（ｉ）結合パートナー－酵素コンジュゲート層、（ｉｉ）捕捉層、および（ｉｉｉ）読み取り層である。結合パートナー－酵素コンジュゲート層は、分析物に特異的な結合パートナーを含み、結合パートナーは、検出可能な標識として作用する酵素にコンジュゲート（すなわち、共有結合）している。捕捉層は、分析物分子がその表面に結合した固体粒子を含む。読み取り層は、酵素が基質と相互作用すると、検出可能なシグナル（変色など）を生成する酵素の基質を含む。
【0107】
一実施形態では、結合パートナー－酵素コンジュゲート層は抗原に特異的な抗体を含み、抗体は、検出可能な標識として作用する酵素にコンジュゲート（すなわち、共有結合）しており（すなわち、結合パートナー－酵素コンジュゲート層が抗体－酵素コンジュゲート層である）、捕捉層は、抗原分子がその表面に結合した固体粒子を含み、読み取り層は、酵素が基質と相互作用すると、検出可能なシグナル（変色など）を生成する酵素の基質を含む。この実施形態では、３つの層は、（ｉ）抗体－酵素コンジュゲート層、（ｉｉ）捕捉層、および（ｉｉｉ）読み取り層である。スライドを均一酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に使用して、試料中の抗原の存在または量を決定することができる。
【0108】
スライドを使用して試料中の分析物の存在または量を決定する方法は、単に、その存在または量を決定するつもりである分析物を含有することが疑われる試料を、結合パートナー－酵素コンジュゲート層に添加するステップを伴う。アッセイが作用する原理を、分析物が対称ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）であり、抗体がＳＤＭＡに対する抗体であるアッセイについて図２に示す。
【0109】
図２に示されるように、その存在または量を決定するつもりである抗原を含有することが疑われる試料を、抗体－酵素コンジュゲート層に添加すると、試料中の抗原が、抗体－酵素コンジュゲート層中に存在する抗体－酵素コンジュゲートと複合体を形成する。抗体と抗体－酵素コンジュゲートの複合体、および任意の複合体化していない抗体－酵素コンジュゲートは捕捉層に拡散し、複合体化していない抗体－酵素コンジュゲートは固体粒子上の抗原と複合体を形成する。抗体と抗体－酵素コンジュゲートの複合体は読み取り層に拡散し、抗体－酵素コンジュゲート（抗原に結合している）上の酵素が、基質との反応を触媒して、発色などのシグナルを生成し、これを測定する。シグナルは、読み取り層で測定される。
【0110】
シグナルの強度は試料中の分析物の濃度に正比例する、すなわち、図１に示されるように、試料中の分析物濃度が高いほど、シグナルがより強くなる。一実施形態では、シグナルの強度と試料中の分析物の濃度との間に線形関係がある。
【0111】
本方法は、有利には、洗浄ステップなどのいずれの分離ステップも要さない。
【0112】
結合パートナー－酵素コンジュゲート層
結合パートナー－酵素コンジュゲート層は、結合パートナー－酵素コンジュゲートを提供するように、検出可能な標識として作用する酵素にコンジュゲートされた、分析物に特異的な結合パートナーを含む。
結合パートナー－酵素コンジュゲート層は、結合パートナー－酵素コンジュゲートを提供するように、検出可能な標識として作用する酵素にコンジュゲートされた、分析物に特異的な結合パートナーを含む。
【0113】
結合パートナー－酵素コンジュゲートをポリマー中に分散させて、結合パートナー－酵素コンジュゲート層を得る。結合パートナー－酵素コンジュゲート層に適したポリマーには、それだけに限らないが、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンおよびポリアミドが含まれる。結合パートナー－酵素コンジュゲート層のための適切な材料は、好ましくはタンパク質に結合する傾向が低い。
【0114】
典型的には、ポリマー中の結合パートナー－酵素コンジュゲートの濃度は５μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬの範囲である。
【0115】
結合パートナー－酵素コンジュゲート層の厚さは、典型的には約１０μｍ～約２５０μｍ、好ましくは約５０μｍ～約２００μｍ、より好ましくは約７０μｍ～約１５０μｍの範囲である。結合パートナー－酵素コンジュゲート層の厚さは、部分的には、試料体積に依存する。例えば、試料が分析物の非常に希薄な溶液である場合、本方法はより大きな試料体積を要し、より大きな試料体積を収容するようにより厚い結合パートナー－酵素コンジュゲート層が好まれる。
【0116】
一実施形態では、ポリマーは、商品名Ｈｏｌｌｙｔｅｘ（登録商標）３２５４（フィンランドのＡｈｌｓｔｒｏｍ Ｍｕｎｋｓｊｏから商業的に入手可能）で入手可能なポリエステル膜である。一実施形態では、Ｈｏｌｌｙｔｅｘ（登録商標）３２５４の厚さは、約１０２μｍである。
【0117】
結合パートナー－酵素コンジュゲート層は、結合パートナー－酵素コンジュゲートの溶液／懸濁液をポリマーに適用し、次いで、ポリマーを乾燥させることによって調製される。一実施形態では、溶媒は、水性溶媒である。溶液／懸濁液中の結合パートナー－酵素コンジュゲートの濃度は約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬの範囲である。一実施形態では、溶液／懸濁液中の結合パートナー－酵素コンジュゲートの濃度は、約２μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬの範囲である。一実施形態では、溶液／懸濁液中の結合パートナー－酵素コンジュゲートの濃度は、約５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、溶媒は、水性溶媒である。一実施形態では、溶媒は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。一実施形態では、結合パートナー－酵素コンジュゲートを含有する溶液／懸濁液は、ポリビニルピロリドンおよび／またはスクロースをさらに含む。一実施形態では、約１０μＬの溶液／懸濁液を、ポリマー材料の約８ミリリットル直径のディスクに適用する。一実施形態では、結合パートナー－酵素コンジュゲート層の溶液／懸濁液をポリマーに適用した後、ポリマーを例えば約４０℃で約２０分間乾燥させる。
【0118】
一実施形態では、結合パートナー酵素コンジュゲート層は、ポリエステル膜、Ｈｏｌｌｙｔｅｘ（登録商標）３２５４（フィンランドのＡｈｌｓｔｒｏｍ Ｍｕｎｋｓｊｏから商業的に入手可能）を取り、ＰＢＳ中約３％ Ｔｗｅｅｎ－２０の溶液（約０．５％～約５．０％の濃度を使用することができ；約０．５％が好ましい濃度である）を適用することによってこれを前処理して膜を親水性にすることによって調製される。前処理は、約１０μＬのＴｗｅｅｎ－２０溶液を約８ｍｍポリエステルディスク上に分配し、次いで、ディスクを約４０℃で約２０分間乾燥させることによって達成される。次いで、結合パートナー酵素コンジュゲートを含有する約１０μＬの溶液をディスク上に分配し、ディスクを約４０℃で約２０分間乾燥させる。一実施形態では、結合パートナー酵素コンジュゲートを含有する溶液は、約５μｇ／ｍＬ（約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬの範囲）の濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中結合パートナー酵素コンジュゲート、約１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、約０．５％スクロース、約０．５％トレハロース、約０．１％ ＰＥＧ６０００、約１０ｎＭヒスチジン、約１０ｎＭ酒石酸、約１０ｍＭ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７（四ホウ酸ナトリウム）、および約０．２５％ Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４（マサチューセッツ州バーリントン所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから商業的に入手可能）を含有する溶液である。ヒスチジンは任意選択であり、ｐＨを制御するために使用される。セリンおよびグリシンなどの他のアミノ酸をヒスチジンの代わりに使用することができる。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１４をＩｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ－６３０（ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）およびＴｗｅｅｎ－２０で置き換えることができる。クエン酸－リン酸緩衝液などの他の緩衝液をＰＢＳの代わりに使用することができる。一実施形態では、結合パートナー酵素コンジュゲートは、抗ＳＤＭＡ抗体にコンジュゲートしたラッカーゼである。
【0119】
結合パートナー－酵素コンジュゲートを形成する方法は上に論じられる。
【0120】
例示的な酵素は上に記載される。
【0121】
捕捉層
捕捉層は、分析物分子がその表面に付着した固体粒子を含む。分析物分子が付着した固体粒子をポリマー中に分散させて、捕捉層を得る。分析物分子が付着した固体粒子はポリマーに捕捉され、スライドの他の層に拡散することができない。
捕捉層は、分析物分子がその表面に付着した固体粒子を含む。分析物分子が付着した固体粒子をポリマー中に分散させて、捕捉層を得る。分析物分子が付着した固体粒子はポリマーに捕捉され、スライドの他の層に拡散することができない。
【0122】
分析物分子を付着させることができる固体粒子は上に記載される。
【0123】
分析物粒子を固体粒子に付着させる方法は上に記載される。
【0124】
捕捉層のための適切なポリマーには、それだけに限らないが、ポリカーボネートが含まれる。一実施形態では、捕捉層は、約０．８μｍの細孔径を有するポリカーボネートポリマーである。一実施形態では、ポリマーは、細孔径０．８μｍのポリカーボネートトラックエッチド（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ ｔｒａｃｋ ｅｔｃｈｅｄ）（ＰＣＴＥ）メンブレン（ニュージャージー州ピスカタウェイ所在のＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから商業的に入手可能）である。
【0125】
典型的には、ポリマーに適用される、分析物分子が付着した固体粒子の量は、５μＬの粒子の１％（ｗ／ｖ）懸濁液～５０μＬの粒子の１％（ｗ／ｖ）懸濁液の範囲である。
【0126】
捕捉層の厚さは、約２μｍ～約２０μｍ、好ましくは直径約５μｍ～約１５μｍ、より好ましくは直径約７μｍ～約１２μｍの範囲である。捕捉層の厚さは、部分的には、試料体積に依存する。例えば、試料が分析物の非常に希薄な溶液である場合、本方法はより大きな試料体積を要し、より大きな試料体積を収容するようにより厚い捕捉層が好まれる。
【0127】
捕捉層は、分析物がその表面に付着した固体粒子の溶液／懸濁液をポリマーに適用し、次いで、ポリマーを乾燥させることによって調製される。一実施形態では、溶媒は、水性溶媒である。溶液／懸濁液中の、分析物がその表面に結合した固体粒子の濃度は、約０．２％～約２．０％の範囲である。その表面に付着した分析物の溶液／懸濁液をポリマーに適用した後、ポリマーを例えば約３７℃で約２０分間乾燥させる。
【0128】
一実施形態では、捕捉層は、抗原分子がその表面に付着した固体粒子を含む。抗原分子が付着した固体粒子をポリマー中に分散させて、捕捉層を得る。
【0129】
ある実施形態は、抗原がその表面に付着した固体粒子を包含する。
【0130】
ある実施形態は、ポリマー中に分散された、抗原がその表面に付着した固体粒子を包含する。
【0131】
一実施形態では、ポリマー中に分散された、抗原がその表面に付着した固体粒子は、リンカーとしてグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＤＰＨ）を使用して粒子の表面に付着されたＳＤＭＡで受動的にコーティングされた、約１μｍ～約２μｍのラテックス粒子（すなわち、Ｇ６ＤＰＨ－ＳＤＭＡでコーティングされたラテックス粒子）である。一実施形態では、ポリマーは、細孔径０．８μｍのポリカーボネートトラックエッチド（ＰＣＴＥ）メンブレン（ニュージャージー州ピスカタウェイ所在のＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから商業的に入手可能）である。一実施形態では、Ｎｏｒｄｓｏｎ ＥＦＤディスペンサー（ロードアイランド州イーストプロビデンス所在のＮｏｒｄｓｏｎ ＥＦＤから商業的に入手可能）を使用して、約１８．５μＬのＧ６ＤＰＨ－ＳＤＭＡ粒子（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３、２．５％スクロース中１％ ｗ／ｖ粒子）をポリマーに適用する。
【0132】
別の実施形態では、ポリマー中に分散された、抗原がその表面に付着した固体粒子は、リンカーとしてグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＤＰＨ）を使用して粒子の表面に付着されたＭＭＡで受動的にコーティングされた、約１μｍ～約２μｍのラテックス粒子（すなわち、Ｇ６ＤＰＨ－ＭＭＡでコーティングされたラテックス粒子）である。
【0133】
読み取り層
読み取り層は上記のように形成することができる。
読み取り層は上記のように形成することができる。
【0134】
任意選択の介在層
一実施形態では、層は、例えば、両面テープなどの介在層によって分離される。一実施形態では、少なくとも結合パートナー－酵素コンジュゲート層は、介在層によって捕捉層から分離される。一実施形態では、少なくとも捕捉層は、介在層によって読み取り層から分離される。一実施形態では、結合パートナー－酵素コンジュゲート層は、介在層によって捕捉層から分離され、捕捉層は、介在層によって読み取り層から分離される。
一実施形態では、層は、例えば、両面テープなどの介在層によって分離される。一実施形態では、少なくとも結合パートナー－酵素コンジュゲート層は、介在層によって捕捉層から分離される。一実施形態では、少なくとも捕捉層は、介在層によって読み取り層から分離される。一実施形態では、結合パートナー－酵素コンジュゲート層は、介在層によって捕捉層から分離され、捕捉層は、介在層によって読み取り層から分離される。
【0135】
介在層は、試料を結合パートナー－酵素コンジュゲート層に適用した後、スライドの各層の間の試料の拡散を制限するように選択される。特に、結合パートナー－酵素コンジュゲート層と捕捉層との間の介在層は、試料中の分析物が結合パートナー－酵素コンジュゲート層中に存在する結合パートナー－酵素コンジュゲートと複合体を形成することができるように、十分な時間が経過するまで、結合パートナー－酵素コンジュゲート層から捕捉層への試料の拡散を防ぐ。同様に、捕捉層と読み取り層との間の介在層は、試料中の分析物と複合体を形成していない結合パートナー－酵素コンジュゲートが固体粒子上の分析物と複合体を形成することができるように、十分な時間が経過するまで、捕捉層から読み取り層への試料の拡散を防ぐ。
【0136】
試料中の抗原の量を決定するための、介在層を含むスライドの一般的な構造を図１に示す。
【0137】
一実施形態では、介在層は両面テープである。典型的には、両面テープの厚さは、約１０μｍ～約１００μｍ、好ましくは約１５μｍ～約９０μｍ、より好ましくは約２０μｍ～約８０μｍの範囲である。一実施形態では、両面テープの厚さは、約６０μｍである。
【0138】
最初に、両面テープは不透水性であるが、長期間水に曝露されると、テープは溶解する。テープが溶解するのに必要な時間は、テープの配合に依存する。溶解時間は数秒間から数分間まで変化し得る。一実施形態では、テープの溶解時間は、約１分間～約５分間の範囲である。一実施形態では、テープの溶解時間は、約２分間～約４分間の範囲である。適切な両面テープは上に記載される。
【0139】
一実施形態では、試料は、スライドに２回以上適用される。好ましい実施形態では、試料は、スライドに２回適用され、各適用は、期間ｔだけ離される。一実施形態では、期間ｔは、約５秒間～約１０分間の範囲である。一実施形態では、期間ｔは、約１分間～約５分間の範囲である。一実施形態では、期間ｔは、約２分間～約３分間の範囲である。一実施形態では、各適用中に適用される試料の量は、約１μＬ～約１００μＬの範囲である。一実施形態では、各適用中に適用される試料の量は、約２μＬ～約５０μＬの範囲である。一実施形態では、各適用中に適用される試料の量は、約３μＬ～約２５μＬの範囲である。一実施形態では、各適用中に適用される試料の量は、約５μＬ～約１５μＬの範囲である。一実施形態では、各適用中に適用される試料の量は、約６μＬ～約１１μＬの範囲である。
【0140】
理論によって拘束されることを望むものではないが、試料の単回適用は両面テープを溶解するのに不十分であると考えられる。しかしながら、二度目の試料の適用はテープを溶解するのに十分である。よって、試料の第１の適用と試料の第２の適用との間の時間を変化させることによって、例えば、試料が結合パートナー－酵素コンジュゲート層から捕捉層に拡散する前に、試料中の分析物が結合パートナー－酵素コンジュゲート層中に存在する結合パートナー－酵素コンジュゲートと複合体を形成する時間を制御することが可能である。一実施形態では、介在層は、その内容が明示的に本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０２０／０１７２７６８号に記載されるような崩壊性／溶解性テープである。一実施形態では、介在標識は、ペンシルバニア州グレンロック所在のＡｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能な崩壊性／溶解性テープである。
【0141】
図６は、第１の水性試料を、溶解性両面テープによって分離されている結合パートナー－酵素コンジュゲート層と読み取り層を有するスライドに適用し、引き続いて第１の水性試料と第２の水性試料の適用の間の期間ｔ後に、第２の水性試料を適用した場合の、湿っている読み取り層の面積パーセントのプロットである。読み取り層は湿っている場合、暗くなる。カメラを使用して読み取り層の湿り度を評価した。図６は、第１の水性試料がテープを溶解し、水が読み取り層に到達するのを可能にするのに不十分であることを示す。しかしながら、期間ｔ後の第２の水性試料の適用により、読み取り層の完全な湿潤がほぼすぐに完了する。溶解性両面テープの使用により、分析物を含有する試料が、読み取り層と接触する前に、結合パートナー－酵素コンジュゲート層にどれくらい長く残るかを慎重に制御することが可能になる。
【0142】
他の任意選択の層
スライドは、場合により、拡散層、反射層、およびカーボンブラック層のうちの１つまたは複数を含むことができる。
スライドは、場合により、拡散層、反射層、およびカーボンブラック層のうちの１つまたは複数を含むことができる。
【0143】
拡散層
一実施形態では、スライドは拡散層をさらに含む。拡散層は結合パートナー－酵素コンジュゲート層の上にコーティングされる。拡散層は水透過性である。拡散層は水透過性であり、等方的で多孔性である、すなわち、層内のあらゆる方向に多孔性である。
一実施形態では、スライドは拡散層をさらに含む。拡散層は結合パートナー－酵素コンジュゲート層の上にコーティングされる。拡散層は水透過性である。拡散層は水透過性であり、等方的で多孔性である、すなわち、層内のあらゆる方向に多孔性である。
【0144】
拡散層は、層の成分を混合しながら溶媒中で合わせて溶液／懸濁液を得て、溶液／懸濁液を結合パートナー－酵素コンジュゲート層に適用し、結合パートナー－酵素コンジュゲート層の上に拡散層を提供するように溶媒を除去することによって提供される。
【0145】
湿潤拡散層の厚さは、典型的には約１００μｍ～約５００μｍ、好ましくは約１５０μｍ～約４５０μｍ、より好ましくは約２００μｍ～約４００μｍ、最も好ましくは約２５０μｍ～約３５０μｍの範囲である。乾燥の場合、拡散層の厚さは、典型的には約２５μｍ～約２５０μｍ、好ましくは約５０μｍ～約２００μｍ、より好ましくは約７５μｍ～約１５０μｍの範囲である。拡散層の厚さは、一部は、試料体積に依存する。例えば、試料が分析物の非常に希薄な溶液である場合、アッセイはより大きな試料体積を要し、より大きな試料体積を収容するようにより厚い拡散層が好まれる。
【0146】
拡散層は、典型的には親水性ポリマーマトリックス中のセルロースの混合物である。適切な親水性ポリマーには、それだけに限らないが、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、およびポリエチレンイミンが含まれる。拡散層は、有利には液体試料をスライド上に均一に拡散および分散させる。
【0147】
湿潤拡散層中のセルロースの量は、典型的には層の約１重量％～約２０重量％、好ましくは５重量％～約１５重量％、より好ましくは約１０重量％の範囲である。乾燥の場合、乾燥拡散層中のセルロースの量は、典型的には層の約５０重量％～約９８重量％、好ましくは約６０重量％～約９５重量％、より好ましくは約７０重量％～約９０重量％の範囲である。一実施形態では、拡散層が１００％セルロースである。一実施形態では、セルロースが約３００μｍの粒径を有する。
【0148】
拡散層はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含み得る。湿潤拡散層中の重量によるＰＶＰの量は、典型的には層の約０．５重量％～約１０重量％、好ましくは約１重量％～約５重量％、より好ましくは約１．５重量％～約３重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤拡散層中のＰＶＰの量が約２重量％である。乾燥拡散層中の重量によるＰＶＰの量は、典型的には層の約１重量％～約３０重量％、好ましくは約５重量％～約２５重量％、より好ましくは約１０重量％～約２０重量％の範囲である。一実施形態では、乾燥拡散層中のＰＶＰの量が約１７重量％である。
【0149】
拡散層はテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）または他の適切な塩基を含み得る。ＴＭＡＨは拡散層のｐＨを調整するのに役立ち得る。理論によって拘束されることを望むものではないが、ＴＭＡＨが、拡散層がスライド全体にわたって試料を迅速に吸収および拡散する能力を増加させると考えられる。湿潤拡散層中の重量によるＴＭＡＨの量は、典型的には約０．０１重量％～約０．５重量％、好ましくは約０．０２５重量％～約０．２５重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤拡散層中のＴＭＡＨの量が約０．０５重量％である。乾燥拡散層中の重量によるＴＭＡＨの量は、典型的には約０．０８重量％～約４重量％、好ましくは約０．２重量％～約２重量％、より好ましくは約１０重量％の範囲である。一実施形態では、乾燥拡散層中のＴＭＡＨの量が約０．４重量％である。
【0150】
一実施形態では、約１０重量％のセルロース、約２重量％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、約６８重量％の水、約２０重量％のエタノール、約０．０６重量％のポリアクリル酸（ＰＡＡ）、および約０．０５重量％のテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）を含有する溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、拡散層を形成する。得られた乾燥拡散層は、約８２．６重量％のセルロース、約１６．５重量％のＰＶＰ、約０．５重量％のＰＡＡ、および約０．４重量％のＴＭＡＨを含有する。
【0151】
反射層
一実施形態では、スライドは反射層をさらに含む。反射層は結合パートナー－酵素コンジュゲート層の上にコーティングされる。一実施形態では、スライドは拡散層および反射層をさらに含む。スライドが拡散層と反射層の両方を含む場合、反射層は、拡散層と結合パートナー－酵素コンジュゲート層との間に配置される。
一実施形態では、スライドは反射層をさらに含む。反射層は結合パートナー－酵素コンジュゲート層の上にコーティングされる。一実施形態では、スライドは拡散層および反射層をさらに含む。スライドが拡散層と反射層の両方を含む場合、反射層は、拡散層と結合パートナー－酵素コンジュゲート層との間に配置される。
【0152】
反射層は、層の成分を混合しながら溶媒中で合わせて溶液／懸濁液を得て、溶液／懸濁液を結合パートナー－酵素コンジュゲート層に適用し、結合パートナー－酵素コンジュゲート層の上に拡散層を提供するように溶媒を除去することによって提供される。
【0153】
一実施形態では、反射層が酸化チタン（ＴｉＯ２）を含む。典型的には、二酸化チタンが、湿潤反射層の約２重量％～約３０重量％、好ましくは約５重量％～約２０重量％、より好ましくは約１０重量％～約２０重量％の範囲の量で湿潤反射層中に存在する。一実施形態では、酸化チタンが、湿潤反射層の約１４重量％の量で湿潤反射層中に存在する。典型的には、二酸化チタンが、乾燥反射層の約２０重量％～約６０重量％、好ましくは約２５重量％～約５５重量％、より好ましくは約３０重量％～約５０重量％の範囲の量で乾燥反射層中に存在する。一実施形態では、酸化チタンが、湿潤反射層の約４２重量％の量で湿潤反射層中に存在する。
【0154】
酸化チタン粒子の平均粒径は、典型的には約１０μｍ未満、好ましくは約５μｍ未満である。一実施形態では、酸化チタン粒子の平均粒径が約０．３５μｍである。
【0155】
酸化チタンは、他の反射材料で置き換えることができるか、またはこれと組み合わせて使用することができる。例示的な他の反射材料には、それだけに限らないが、硫酸バリウム、酸化亜鉛、粘土、およびケイ酸アルミニウムが含まれる。一実施形態では、反射材料が完全または部分的金属コーティング粒子である。適切な金属には、それだけに限らないが、アルミニウム、金、ニッケルまたは銀が含まれる。銀が好ましいコーティングである。これらの粒子は単独で、またはＴｉＯ２などの他の光反射材料と組み合わせて使用することができる。粒子（すなわち、コーティングされるコア）は、それだけに限らないが、固体および中空ガラス、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ならびにシリカを含む様々な材料であり得る。適切な金属コーティング粒子は、例えば、Ｃｏｓｐｈｅｒｉｃ ＬＬＣ（米国カリフォルニア州サンタバーバラ）から商業的に入手可能である。好ましい粒子は、例えばＣｏｓｐｈｅｒｉｃ ＬＬＣ製の銀コーティングシリカミクロスフェアである。
【0156】
一実施形態では、約７重量％のセルロース、約１４重量％の二酸化チタン、および約７９重量％のＤ４ヒドロゲル溶液（約１６重量％の等量の低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物を含有する）、約９０重量％のエタノール、および約１０重量％の水）を含有する溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、層を形成する。得られた乾燥フィルタリング層は、約２０重量％のセルロース、約４２重量％の二酸化チタン、および約３８重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４を含有する。ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４は、マサチューセッツ州ウィルミントンのＡｄｖａｎＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐから商業的に入手可能である。
【0157】
カーボンブラック層は散乱光を吸収するので、スライドが以下に記載されるカーボンブラック層を含む場合、反射層が特に有利である。反射層は、有利にはカーボンブラック層が散乱光を吸収するのを防ぎ、感度の改善をもたらすように、カーボンブラック層から離れて検出器に戻る光を反射する。
【0158】
カーボンブラック層
一実施形態では、スライドは、カーボンブラック層をさらに含む。カーボンブラック層は、反射層の上にコーティングされ、反射層と拡散層との間に配置される。カーボンブラック層は、有利にはシグナルの強度測定に干渉する環境からの迷光をフィルタリングする光バリアとして作用する。カーボンブラック層はまた、潜在的にアッセイに干渉し得る分析物以外の試料中に存在する化合物に結合するように機能することができ、これらの他の化合物が読み取り層に拡散するのを防ぐ。
一実施形態では、スライドは、カーボンブラック層をさらに含む。カーボンブラック層は、反射層の上にコーティングされ、反射層と拡散層との間に配置される。カーボンブラック層は、有利にはシグナルの強度測定に干渉する環境からの迷光をフィルタリングする光バリアとして作用する。カーボンブラック層はまた、潜在的にアッセイに干渉し得る分析物以外の試料中に存在する化合物に結合するように機能することができ、これらの他の化合物が読み取り層に拡散するのを防ぐ。
【0159】
カーボンブラックは、迷光をフィルタリングするための他の材料で置き換えることができるか、またはこれと組み合わせて使用することができる。例示的な他の材料には、それだけに限らないが、黒ラテックスビーズ、黒シリカビーズ、活性炭、Ｃ６０、グラフェン、または赤ラテックスビーズなどの他の有色材料が含まれる。
【0160】
カーボンブラック層は、ポリマー中に分散したカーボンブラックを含む。カーボンブラック層のための適切なポリマーには、それだけに限らないが、ポリウレタン（マサチューセッツ州ウィルミントンのＡｄｖａｎＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐから商業的に入手可能なＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４など）、ポリエチレンオキシド、シリコーン、ポリビニルアルコール、およびポリアクリルアミドが含まれる。一実施形態では、ポリマーは、ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４である。
【0161】
カーボンブラック層は、層の成分を混合しながら溶媒中で合わせて溶液／懸濁液を得て、溶液／懸濁液を反射層（または、反射層がない場合、結合パートナー－酵素コンジュゲート層）に適用し、反射層の上にカーボンブラック層を提供するように溶媒を除去することによって提供される。
【0162】
湿潤カーボンブラック層中のカーボンブラックの量は、典型的には層の約１重量％～約２０重量％、好ましくは約１．５重量％～約１５重量％、より好ましくは約２重量％～約１０重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤カーボンブラック層中のカーボンブラックの量は、層の約５重量％である。乾燥している場合、カーボンブラック層中のカーボンブラックの量は、典型的には層の約１０重量％～約４０重量％、好ましくは約１５重量％～約３５重量％、より好ましくは約２０重量％～約３０重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤カーボンブラック層中のカーボンブラックの量は、層の約２５重量％である。
【0163】
湿潤カーボンブラック層の厚さは、典型的には約５０μｍ～約３００μｍ、好ましくは約７５μｍ～約２５０μｍ、より好ましくは約１００μｍ～約２００μｍの範囲である。一実施形態では、湿潤カーボンブラックの厚さが約１４０μｍである。乾燥の場合、カーボンブラック層の厚さは、典型的には約５μｍ～約３０μｍ、好ましくは約７．５μｍ～約２５μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約２０μｍの範囲である。一実施形態では、湿潤カーボンブラックの厚さが約１４μｍである。
【0164】
一実施形態では、約４．７重量％のカーボンブラック、約９５．３重量％のＤ４ヒドロゲル溶液（約１６重量％の等量の低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物、約９０重量％のエタノール、および約１０重量％の水を含有する）を含有する溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、カーボンブラック層を形成する。得られた乾燥カーボンブラック層は、約２４重量％のカーボンブラックおよび約７６重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４を含有する。
【0165】
上述のように、スライドがカーボンブラック層を含む場合、スライドは、好ましくは反射層も含む。
【0166】
これらの任意選択の層およびこれらがどのように形成されるかの説明は、同時係属中の米国特許出願公開第２０２２／００８２５０１号に記載されている。
【0167】
典型的には、スライドの総厚さは５５０μｍ未満、好ましくは５００μｍ未満である。
【0168】
一実施形態では、スライドが、目的の分析物を含有する液体試料を装置の開口部に適用し、次いで、液体を、毛管輸送ゾーンを介して乾式スライドに運搬する装置の一部である。このような装置の例示的な例は、米国特許第４３２３５３６号および同第５７２６０１０号に記載される。
【0169】
４．方法の一般的な特徴
分析物の分子量は広範囲にわたって変化し得る。典型的には、分析物の分子量が５０ダルトンより高い。低分子である分析物については、分析物の分子量が典型的には約５０～約４０００ダルトン、好ましくは約１００～約２０００ダルトンの間である。分析物がタンパク質などのより大型の分子である場合、分子量は２０００ダルトンより高くてもよい。分析物がタンパク質などのより大型の分子である場合、分子量は４０００ダルトンダルトンより高いこともあり得る。本方法は、タンパク質などの大きな分子（例えば、２０００ダルトンを超える分子量）である分析物にうまく機能する。
分析物の分子量は広範囲にわたって変化し得る。典型的には、分析物の分子量が５０ダルトンより高い。低分子である分析物については、分析物の分子量が典型的には約５０～約４０００ダルトン、好ましくは約１００～約２０００ダルトンの間である。分析物がタンパク質などのより大型の分子である場合、分子量は２０００ダルトンより高くてもよい。分析物がタンパク質などのより大型の分子である場合、分子量は４０００ダルトンダルトンより高いこともあり得る。本方法は、タンパク質などの大きな分子（例えば、２０００ダルトンを超える分子量）である分析物にうまく機能する。
【0170】
本方法を使用して多種多様な分析物をアッセイすることができる。例示的な分析物には、それだけに限らないが、小分子（例えば、対称ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、非対称ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、モノメチルアルギニン（ＭＭＡ）、メラミン、抗体、Ｔ４、β－ラクタム抗生物質（ペニシリンなど）、サルファ薬、セファロスポリン、およびステロイド（例えば、プロゲステロンおよびコルチゾール））、ベータアミノイソ酪酸、シスタチン、線維芽細胞増殖因子、およびクラステリンが含まれる。
【0171】
好ましい実施形態では、分析物は、抗原であり、結合パートナーは、抗原に特異的な抗体である。
【0172】
一実施形態では、分析物は、ＳＤＭＡである。ＳＤＭＡの構造は、
【0173】
【化2】
【0174】
一実施形態では、分析物は、メラミンである。
【0175】
一実施形態では、分析物は、Ｔ４である。
【0176】
一実施形態では、分析物は、コルチゾールである。
【0177】
一実施形態では、分析物は、プロゲステロンである。
【0178】
一実施形態では、分析物は、シスタチン－Ｂである。
【0179】
一実施形態では、分析物は、モノメチルアルギニンである。
【0180】
一実施形態では、分析物は、維芽細胞増殖因子である。
【0181】
一実施形態では、分析物は、抗生物質である。例示的な抗生物質には、それだけに限らないが、アモキシシリン、アンピシリン、セファセトリル、セフキノム、セファゾリン、セフォペラゾン、セフチオフル、セファレキシン、セファロニウム、クロキサシリン、デスアセチルセファピリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、オキサシリン、セファピリン、デスフロイルセフチオフル、セフロキシム、およびペニシリンが含まれる。
【0182】
一実施形態では、分析物が、欧州連合によって要求される、牛乳において試験しなければならない抗生物質からなる群から選択される１種または複数の抗生物質である。
【0183】
一実施形態では、分析物が、ペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）、アンピシリン、アモキシシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、セファピリン、デスアセチルセファピリン、セフチオフル、デスフロイルセフチオフル、セフキノム、セファロニウム、セファゾリン、セファセトリル、セファレキシン、セフロキシム、およびセフォペラゾンからなる群から選択される１種または複数の抗生物質である。
【0184】
一実施形態では、分析物が、米国食品医薬品局によって要求される、牛乳において試験しなければならない抗生物質からなる群から選択される１種または複数の抗生物質である。
【0185】
一実施形態では、分析物が、ペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）、アンピシリン、アモキシシリン、クロキサシリン、セファピリン、セフチオフル、およびデスフロイルセフチオフルからなる群から選択される１種または複数の抗生物質である。
【0186】
一実施形態では、分析物は、ペプチドであり、結合パートナーは、ペプチドに特異的な受容体である。
【0187】
一実施形態では、分析物は、ペニシリンであり、結合パートナーは、ペニシリン結合タンパク質である。
【0188】
一実施形態では、分析物は、ステロイドであり、結合パートナーは、ステロイドに特異的なステロイド結合タンパク質である。
【0189】
一実施形態では、試料が水溶液である。
【0190】
一実施形態では、試料が尿である。
【0191】
一実施形態では、試料が血清である。
【0192】
一実施形態では、試料が牛乳である。
【0193】
一実施形態では、試料が唾液である。
【0194】
一実施形態では、試料が血漿である。
【0195】
一実施形態では、試料が全血である。
【0196】
一実施形態では、試料が汗である。
【0197】
一実施形態では、試料が涙である。
【0198】
一実施形態では、試料が脊髄液である。
【0199】
一実施形態では、試料が糞便試料または糞便抽出物である。
【0200】
一実施形態では、試料は、哺乳動物から得られる。
【0201】
典型的には、試料サイズは、約１μＬ～約１００μＬの範囲である。
【0202】
試料中の分析物の濃度は広範囲にわたって変化し得る。一般的に、試料中の分析物の濃度は約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬの範囲である。より濃縮された試料を適切な希釈剤で簡単に希釈してアッセイに適した濃度を有する希釈された試料を得ることができることが容易に理解されるだろう。本方法は、極めて高感度であり、一部の分析物については、１ｎｇ／ｍＬと低い濃度の分析物を検出するために使用することができる。
【0203】
実施例
本発明は、本発明の数個の態様の例示として意図されている実施例に開示される具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的な等価ないずれの実施形態も本発明の範囲内にある。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えた本発明の様々な修正が当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲の範囲に入ることが意図されている。当業者の眼内にある、現在公知であるまたは後に開発される全ての等価物の置換を含む、本発明のこのようなバリエーション、および実験設計における配合の変更または微量の変更は、本明細書に組み込まれる本発明の範囲に入ると考えられる。
本発明は、本発明の数個の態様の例示として意図されている実施例に開示される具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的な等価ないずれの実施形態も本発明の範囲内にある。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えた本発明の様々な修正が当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲の範囲に入ることが意図されている。当業者の眼内にある、現在公知であるまたは後に開発される全ての等価物の置換を含む、本発明のこのようなバリエーション、および実験設計における配合の変更または微量の変更は、本明細書に組み込まれる本発明の範囲に入ると考えられる。
【実施例1】
【0204】
ラッカーゼの抗ＳＤＭＡ抗体へのコンジュゲーション
以下の方法を使用してラッカーゼを抗ＳＤＭＡ抗体にコンジュゲートすることができる。
以下の方法を使用してラッカーゼを抗ＳＤＭＡ抗体にコンジュゲートすることができる。
【0205】
ステップ番号１：ラッカーゼ遊離チオールのキャッピング
３ｍＬのラッカーゼの溶液（ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ｐＨ７．４中９．１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能であり、ＣｏｎＡカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を使用して精製した）に、３６μＬのヨードアセトアミド溶液（ＤＭＳＯ中１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した。得られた溶液を箔で覆い、室温で１時間くるくる回転させた。キャッピングされたラッカーゼをＰＢＳ、ｐＨ７．４中４℃で透析し、４ＬのＰＢＳと３回交換した。透析後、２８０ｎｍで吸光度を測定することによって（吸光係数：２．１＝１．０ｍｇ／ｍＬ）、ラッカーゼの濃度を決定した。濃度は９．０ｍｇ／ｍＬと決定された。
３ｍＬのラッカーゼの溶液（ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ｐＨ７．４中９．１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能であり、ＣｏｎＡカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を使用して精製した）に、３６μＬのヨードアセトアミド溶液（ＤＭＳＯ中１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した。得られた溶液を箔で覆い、室温で１時間くるくる回転させた。キャッピングされたラッカーゼをＰＢＳ、ｐＨ７．４中４℃で透析し、４ＬのＰＢＳと３回交換した。透析後、２８０ｎｍで吸光度を測定することによって（吸光係数：２．１＝１．０ｍｇ／ｍＬ）、ラッカーゼの濃度を決定した。濃度は９．０ｍｇ／ｍＬと決定された。
【0206】
ステップ番号２：ＳＭＣＣによるラッカーゼの活性化
３ｍＬの濃度９．０ｍｇ／ｍＬのキャッピングされたラッカーゼの溶液に、７６μＬのスルホ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）溶液（ＤＭＳＯ中２０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。得られた溶液を室温で１時間くるくる回転させた。活性化されたラッカーゼをＰＢＳ、ｐＨ７．４中４℃で透析し、４ＬのＰＢＳと３回交換した。透析後、２８０ｎｍで吸光度を測定することによって（吸光係数：２．１＝１．０ｍｇ／ｍＬ）、ラッカーゼの濃度を決定した。濃度は８．５ｍｇ／ｍＬと決定された。
３ｍＬの濃度９．０ｍｇ／ｍＬのキャッピングされたラッカーゼの溶液に、７６μＬのスルホ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）溶液（ＤＭＳＯ中２０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。得られた溶液を室温で１時間くるくる回転させた。活性化されたラッカーゼをＰＢＳ、ｐＨ７．４中４℃で透析し、４ＬのＰＢＳと３回交換した。透析後、２８０ｎｍで吸光度を測定することによって（吸光係数：２．１＝１．０ｍｇ／ｍＬ）、ラッカーゼの濃度を決定した。濃度は８．５ｍｇ／ｍＬと決定された。
【0207】
ステップ番号３：ＤＴＴによる抗ＳＤＭＡ抗体の還元
３ｍＬの抗ＳＤＭＡ抗体の溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中５．４ｍｇ／ｍＬ、ミズーリ州フェントンのＬｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）に、３０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液および１２μＬのＤＴＴ（ジチオトレイトール）溶液（脱イオンＨ２Ｏ中５００ｍＭ、ｎｏ ｗｅｉｇｈ ｆｏｒｍａｔ）を添加した。得られた溶液を室温で１時間くるくる回転させた。溶離液としてＰＢＳ、ｐＨ７．４＋５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して、脱塩サイズ排除ＰＤ－１０カラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）を使用して、得られた溶液を精製した。画分を０．５ｍＬアリコートで回収した。２８０ｎｍでの吸光度を使用して、タンパク質の存在を決定した。タンパク質を含有する画分を合わせ、２８０ｎｍで吸光度を測定することによって（吸光係数：１．３７＝１．０ｍｇ／ｍＬ）、濃度を決定した。濃度は２．５ｍｇ／ｍＬと決定された。
３ｍＬの抗ＳＤＭＡ抗体の溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中５．４ｍｇ／ｍＬ、ミズーリ州フェントンのＬｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）に、３０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液および１２μＬのＤＴＴ（ジチオトレイトール）溶液（脱イオンＨ２Ｏ中５００ｍＭ、ｎｏ ｗｅｉｇｈ ｆｏｒｍａｔ）を添加した。得られた溶液を室温で１時間くるくる回転させた。溶離液としてＰＢＳ、ｐＨ７．４＋５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して、脱塩サイズ排除ＰＤ－１０カラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）を使用して、得られた溶液を精製した。画分を０．５ｍＬアリコートで回収した。２８０ｎｍでの吸光度を使用して、タンパク質の存在を決定した。タンパク質を含有する画分を合わせ、２８０ｎｍで吸光度を測定することによって（吸光係数：１．３７＝１．０ｍｇ／ｍＬ）、濃度を決定した。濃度は２．５ｍｇ／ｍＬと決定された。
【0208】
ステップ番号４：ラッカーゼの抗ＳＤＭＡ抗体へのコンジュゲーション
ＰＢＳ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ中２．５ｍｇ／ｍＬの２ｍＬの還元された抗ＳＤＭＡ抗体に、２．４ｍＬの８．５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ中活性化ラッカーゼを添加した。溶液を４℃で１８時間くるくる回転させた。次いで、２μＬの脱イオンＨ２Ｏ中０．５Ｍ Ｌ－システイン溶液を添加して、反応物をクエンチした。抗ＳＤＭＡ抗体とのラッカーゼコンジュゲートの得られた溶液を３０分間くるくる回転させ、次いで、さらに使用するまで４℃で保存した。
ＰＢＳ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ中２．５ｍｇ／ｍＬの２ｍＬの還元された抗ＳＤＭＡ抗体に、２．４ｍＬの８．５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ中活性化ラッカーゼを添加した。溶液を４℃で１８時間くるくる回転させた。次いで、２μＬの脱イオンＨ２Ｏ中０．５Ｍ Ｌ－システイン溶液を添加して、反応物をクエンチした。抗ＳＤＭＡ抗体とのラッカーゼコンジュゲートの得られた溶液を３０分間くるくる回転させ、次いで、さらに使用するまで４℃で保存した。
【実施例2】
【0209】
ＭＭＡコーティング粒子上へのラッカーゼ抗ＳＤＭＡコンジュゲートのコーティング
以下の方法を使用して、ＭＭＡコーティング粒子にラッカーゼ抗ＳＤＭＡコンジュゲートをコーティングした：
以下の方法を使用して、ＭＭＡコーティング粒子にラッカーゼ抗ＳＤＭＡコンジュゲートをコーティングした：
【0210】
材料
１．ラッカーゼ－抗ＳＤＭＡコンジュゲート、１．３３ｍｇ／ｍＬ抗ＳＤＭＡ、
２．Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ、１２．５当量、１．０μｍ、ｐＨ５．２ ＭＥＳ緩衝液
３．キャリブレータ希釈液、１％ ＢＳＡ、２００ｍＭリン酸緩衝液、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ、ｐＨ＝７．４、
４．１×洗浄緩衝液、ＤＩ Ｈ２Ｏ中０．１％ Ｔｗｅｅｎ
５．血清キャリブレータ、活性炭処理イヌ、０．２μｍ濾過、０μｇ／ｄＬ、７μｇ／ｄＬ、１４μｇ／ｄＬ、３０μｇ／ｄＬ、１００μｇ／ｄＬ、
６．ＴＭＢ溶液－０．５μｇ／ｍＬ ＴＭＢ、５０ｍＭコハク酸、１：１ ＰＢＳ、ｐＨ＝３．５。
１．ラッカーゼ－抗ＳＤＭＡコンジュゲート、１．３３ｍｇ／ｍＬ抗ＳＤＭＡ、
２．Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ、１２．５当量、１．０μｍ、ｐＨ５．２ ＭＥＳ緩衝液
３．キャリブレータ希釈液、１％ ＢＳＡ、２００ｍＭリン酸緩衝液、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ、ｐＨ＝７．４、
４．１×洗浄緩衝液、ＤＩ Ｈ２Ｏ中０．１％ Ｔｗｅｅｎ
５．血清キャリブレータ、活性炭処理イヌ、０．２μｍ濾過、０μｇ／ｄＬ、７μｇ／ｄＬ、１４μｇ／ｄＬ、３０μｇ／ｄＬ、１００μｇ／ｄＬ、
６．ＴＭＢ溶液－０．５μｇ／ｍＬ ＴＭＢ、５０ｍＭコハク酸、１：１ ＰＢＳ、ｐＨ＝３．５。
【0211】
以下の手順を使用して、上記のラッカーゼ－抗ＳＤＭＡコンジュゲートとＭＭＡ－Ｇ６ＰＤＨでコーティングされたラテックス粒子との間で免疫複合体を形成した：
１．７４６μＬの１．３４％ Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子を遠心管に入れた；
２．１３３００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去した；
３．４００μＬのキャリブレータ希釈液を添加し、ピペット操作によって粒子を再懸濁した；
４．１分間超音波処理した；
５．６０μＬのラッカーゼ－抗ＳＤＭＡコンジュゲート（全固形分＝２％）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした；
６．１３３００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去した；
７．５００μＬの１×洗浄液で洗浄し、上記のように遠心分離し、上清を除去した；
８．ステップ７の洗浄をさらに２回繰り返した。
１．７４６μＬの１．３４％ Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子を遠心管に入れた；
２．１３３００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去した；
３．４００μＬのキャリブレータ希釈液を添加し、ピペット操作によって粒子を再懸濁した；
４．１分間超音波処理した；
５．６０μＬのラッカーゼ－抗ＳＤＭＡコンジュゲート（全固形分＝２％）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした；
６．１３３００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去した；
７．５００μＬの１×洗浄液で洗浄し、上記のように遠心分離し、上清を除去した；
８．ステップ７の洗浄をさらに２回繰り返した。
【0212】
以下のように、競合アッセイプロトコルを使用して、免疫複合体粒子が首尾よく形成され、活性であることを確認した：
１．５００μＬのキャリブレータ希釈液を粒子に添加し、再懸濁し、２分間超音波処理した（２％固形分）；
２．５０μＬの複合体化粒子を管に分配し、上記のように遠心分離し、上清を除去した；
３．異なるレベルのＳＤＭＡを含有する５０μＬの試料を添加した。粒子を再懸濁し、短時間ボルテックスした；
４．３７℃で９０秒間インキュベートし、上記のように遠心分離した；
５．２５μＬの試料を９６ウェルプレートにプレーティングした；
６．１７５μＬのＴＭＢ溶液を添加し、６４５ｎｍにおいて３７℃で１５分間読み取った。
１．５００μＬのキャリブレータ希釈液を粒子に添加し、再懸濁し、２分間超音波処理した（２％固形分）；
２．５０μＬの複合体化粒子を管に分配し、上記のように遠心分離し、上清を除去した；
３．異なるレベルのＳＤＭＡを含有する５０μＬの試料を添加した。粒子を再懸濁し、短時間ボルテックスした；
４．３７℃で９０秒間インキュベートし、上記のように遠心分離した；
５．２５μＬの試料を９６ウェルプレートにプレーティングした；
６．１７５μＬのＴＭＢ溶液を添加し、６４５ｎｍにおいて３７℃で１５分間読み取った。
【0213】
引用されている全ての参考文献の開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5a】
【図5b】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】