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▶ コーニンクレイケ ネーデルランセ アカデミー ファン ウェテンスハッペンの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-23
(54)【発明の名称】哺乳動物の心臓再生
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20241016BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241016BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20241016BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20241016BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20241016BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241016BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20241016BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241016BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20241016BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241016BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241016BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47 ZNA
C12N15/12
C12N15/86 Z
C12N15/861 Z
C12N15/864 100Z
C12P21/02 C
C12N5/077
C12N5/10
A61K38/17
A61K35/76
A61K48/00
A61P9/00
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024544355
(86)(22)【出願日】2022-10-03
(85)【翻訳文提出日】2024-05-28
(86)【国際出願番号】 NL2022050553
(87)【国際公開番号】W WO2023055239
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】21200545.8
(32)【優先日】2021-10-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524123942
【氏名又は名称】コーニンクレイケ ネーデルランセ アカデミー ファン ウェテンスハッペン
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】バッケルス、イェルン ペートルス ヴィルヘルムス マリア
(72)【発明者】
【氏名】デ バッケル、デニス エデュアルト マリア
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA02
4C084CA18
4C084NA14
4C084ZA36
4C084ZB21
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA36
4C087ZB21
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA00
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、構造的心筋欠損に罹患している個体を処置する方法であって、個体の心筋の少なくとも一部分の心筋細胞に高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質を提供し、それにより前記心筋細胞の増殖を促進することを含む方法に関する。本発明はさらに、前記ＨＭＧＡタンパク質の機能的発現のための発現構築物、ＨＭＧＡ又は前記発現構築物を含む医薬組成物、及び、インビトロで心筋細胞を培養する方法であって、ＨＭＧＡタンパク質又は発現構築物を心筋細胞に提供することを含む方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
構造的心筋欠損に罹患している個体における心筋細胞増殖を促進する方法において使用するための高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質であって、前記方法が、前記個体の心筋の少なくとも一部分の心筋細胞に前記ＨＭＧＡタンパク質を提供することを含み、それにより前記心筋細胞の増殖を促進する、ＨＭＧＡタンパク質。
【請求項2】
全身投与又は局所投与によって前記心筋細胞に提供される、請求項１に記載のＨＭＧＡタンパク質。
【請求項3】
前記心筋への注射又は注入によって前記心筋細胞に提供される、請求項１又は請求項２に記載のＨＭＧＡタンパク質。
【請求項4】
ＨＭＧＡ１、配列番号１の少なくとも２１番目～８９番目のアミノ酸残基を含むＨＭＧＡ１の一部分、又は配列全体にわたって配列番号１の２１番目～８９番目のアミノ酸残基と７５％以上同一であるタンパク質を含む、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のＨＭＧＡタンパク質。
【請求項5】
前記心筋細胞において前記ＨＭＧＡタンパク質を発現する発現構築物によって前記心筋細胞に提供される、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のＨＭＧＡタンパク質。
【請求項6】
前記発現構築物がウイルスベクター又は核酸構築物である、請求項５に記載のＨＭＧＡタンパク質。
【請求項7】
前記構造的心筋欠損が先天性心欠損である、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載のＨＭＧＡタンパク質。
【請求項8】
前記構造的心筋欠損が左心低形成症候群又は右心低形成症候群である、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載のＨＭＧＡタンパク質。
【請求項9】
前記個体が、心筋梗塞又は心不全に罹患している成人である、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載のＨＭＧＡタンパク質。
【請求項10】
心筋細胞における、高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質の機能的発現のための、好ましくはＨＭＧＡ１、配列番号１の少なくとも２１番目～８９番目のアミノ酸残基を含むＨＭＧＡ１の一部分、又は配列全体にわたって配列番号１の２１番目～８９番目のアミノ酸残基と７５％以上同一であるタンパク質の機能的発現のための、発現構築物。
【請求項11】
高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質又は請求項１０に記載の発現構築物と、薬理学的に許容される添加剤と
を含む、医薬組成物。
【請求項12】
前記発現構築物がウイルスベクター又は核酸構築物である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記発現構築物がアデノウイルス系ベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系ベクターである、請求項１１又は請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記ベクターがｍＲＮＡベースの構築物である、請求項１１又は請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項15】
インビトロで心筋細胞を培養する方法であって、ＨＭＧＡタンパク質又は請求項１０に記載の発現構築物を心筋細胞に提供すること、及び
前記心筋細胞を培養すること
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医療処置の分野に関する。本発明は、具体的には、構造的心筋欠損（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｄｅｆｅｃｔ）に罹患している個体の処置方法に関する。本発明はさらに、これらの方法での使用に適した医薬製剤に関する。
【背景技術】
【0002】
心血管疾患は、心筋梗塞の帰結であるものを含め、西洋における依然として最大の死因である（ＷＨＯ、２０１９年、Ｌａｎｃｅｔ ７巻：Ｅ１３３２－Ｅ１３４５頁）。心筋梗塞に罹患している患者は、しばしば最初の損傷を乗り越えるが、数百万個の心筋細胞を永久に失う。実際、心臓は永久的な瘢痕の形成によって損傷を効率的に修復することができるが、新しい心筋細胞はほとんど再生されず（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒら、２０１８年、ＰＮＡＳ １１５巻：Ｅ１２２４５～Ｅ１２２５４頁）、虚血性心損傷を慢性的な苦痛として引き起こす。虚血性損傷を有する心臓は最終的に心不全を発症するため、この分野では、失われた心筋の再生及び／又は完全な機能の回復に焦点を合わせた処置が切実に必要とされている。
【0003】
興味深いことに、ゼブラフィッシュを含むいくつかの種は、心臓を再生する堅牢な内因性能力を有する（Ｐｏｓｓら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８巻：２１８８～２１９０頁）。ゼブラフィッシュでは、損傷区域に隣接する生存している心筋細胞（ＣＭ）は、境界域（ＢＺ）としても知られ、胚様状態に向かって脱分化し、増殖して失われた心筋細胞に置き換わる（Ｈｏｎｋｏｏｐら、２０１９年、ＥＬｉｆｅ、８巻：１～２７頁；Ｊｏｐｌｉｎｇら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ ４６４巻：６０６～６０９頁；Ｋｉｋｕｃｈｉら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻：６０１～６０５頁；Ｗｕら、２０１５年、Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｃｅｌｌ ３６巻：３６～４９頁）。さらに、ＢＺ ＣＭは、それらの再生応答の根底にあるそれらのクロマチン構成の堅牢な変化を受ける（Ｂｅｉｓａｗら、２０２０年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓ １２６巻：１７６０～１７７８頁）。
【0004】
これは、なぜゼブラフィッシュＢＺ ＣＭが細胞周期にリエントリーする一方で、哺乳動物ＢＺ ＣＭはリエントリーしないのかという疑問を提起する。心筋細胞核の固有の特性を見ると、潜在的な答えが形成され得る。哺乳動物ＣＭは主に多倍数体（ヒト）又は多核（マウス）であるところ、ゼブラフィッシュＣＭは単核及び二倍体であり、これらは効率的な増殖及びゼブラフィッシュ心臓再生に有害であることが示されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｒｏｓａら、２０１８年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ ４４巻：４３３～４４６頁；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、２０１７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ、４９巻：１３４６～１３５３頁；Ｗｉｎｄｍｕｅｌｌｅｒら、２０２０年、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３０巻：３１０５～３１１６頁）。
【0005】
これらの制約にもかかわらず、成人ヒト心臓における低レベルの内因性ＣＭ代謝回転が観察された（Ｂｅｒｇｍａｎｎら、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４巻：９８～１０２頁）。さらに、新生仔マウス心臓は、生後の短い時間窓でＣＭ増殖及び心臓再生を誘導する能力を含むことが示されている（Ｐｏｒｒｅｌｌｏら、２０１１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３１巻：１０７８～１０８０頁）。まとめると、これらの観察結果は、哺乳動物の心臓が再生する潜在能力を保持し得ることを示唆している。
【0006】
実際、マウスにおける研究は、ＨＩＰＰＯシグナル伝達経路の阻害が哺乳動物の心臓の再生能力を解明し得ることを示している（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４０巻：４６８３～４６９０頁；Ｌｅａｃｈら、２０１７年、Ｎａｔｕｒｅ ５５０巻：２６０～２６４頁）。さらに、構成的に活性なＥｒｂｂ２受容体の過剰発現は、マウスにおいて効率的な心筋細胞増殖を誘導し、損傷した心臓のほぼ完全な再生を可能にする（Ｄ’Ｕｖａら、２０１５年、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１７巻：６２７～６３８頁）。
【0007】
これらの研究は、とりわけ、ＢＺ心筋細胞が刺激を受けると最も増殖しやすいことを報告している（Ｄ’Ｕｖａら、２０１５年、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１７巻：６２７～６３８頁；Ｌｅａｃｈら、２０１７年、Ｎａｔｕｒｅ ５５０巻：２６０～２６４頁；Ｌｉｎら、２０１４年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓ １１５巻：３５４～３６３頁；Ｐａｓｕｍａｒｔｈｉら、２００５年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓ ９６巻：１１０～１１８頁；Ｘｉａｎｇら、２０１６年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １３３巻：１０８１～１０９２頁）。哺乳動物ＢＺ ＣＭは、ゼブラフィッシュＢＺ ＣＭのように内因的に増殖を開始しないが、トランスクリプトーム及び染色体構成において劇的な変化を受け（ｖａｎ Ｄｕｉｊｖｅｎｂｏｄｅｎら、２０１９年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １４０巻：８６４～８７９頁）、分裂促進刺激に対する感受性を増強する可能性がある。
【0008】
Ｗｕら、２０１９年（Ｗｕら、２０１９年、Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １２８巻：１６０～１７８頁）は、圧過負荷誘導性心臓リモデリングにおけるＨＭＧＡ２の役割を記載している。著者らは、ＨＭＧＡ２の過剰発現、続いて大動脈の結紮が、細胞表面積の減少、心臓重量対体重比の減少及び肥大マーカーの発現の減少によって証明されるように、マウスの心筋肥大を減少させることを示した。対照的に、ＨＭＧＡ２のノックダウン、続いて大動脈の結紮は、心筋肥大の増加及び心臓重量対体重比の増加をもたらした。さらに、Ｗｕら、２０２０年（Ｗｕら、２０２０年、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ １６０巻：１～１３頁）は、マウス心臓におけるＨＭＧＡ１の過剰発現がアポトーシスを増加させ、心機能障害を悪化させたことを報告した。これらの文献はいずれも、ＨＭＧＡが細胞分裂の調節に関与することを開示せず、示唆すらしておらず、ＨＭＧＡの上方制御が心筋細胞増殖を促進することも開示又は示唆していないことは言うまでもない。
【0009】
しかしながら、本発明者らは、ゼブラフィッシュ心臓と哺乳動物心臓との再生能力の顕著な違いを完全に理解するにはまだ程遠い。したがって、これらの種間のＢＺの分子差を研究することは、哺乳動物の心臓再生を刺激する可能性を有する因子の同定につながり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
再生中のゼブラフィッシュ心臓と非再生マウス心臓との間の転写の差を同定するためにスクリーニングを実施した。これにより、２つの種の間で重複及び分岐する様々な遺伝子及びプロセスの広範なリストが得られた。このデータセットは、心臓再生能力の新しいドライバーを同定するための豊富なリソースを形成する。この比較の生物学的関連性を機能的に検証し、心筋細胞（ＣＭ）増殖の重要なドライバーとして、高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質、特にＨｍｇａ１を同定した。これらの結果は、ゼブラフィッシュ心臓再生中、Ｈｍｇａ１ａが、クロマチン接近可能性（chromatin accessibility）を変化させ、深遠な遺伝子発現プログラムを誘導することによって、Ｎｒｇ１シグナル伝達の下流でＣＭ増殖を駆動することを実証している。さらに、損傷したマウス心臓のＣＭにおける強制的なＨｍｇａ１発現は、ＣＭ増殖を促進し、その結果、機能的回復が増強される。
【課題を解決するための手段】
【0011】
したがって、本発明は、構造的心筋欠損に罹患している個体における心筋細胞増殖を促進する方法に使用するための高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質であって、前記方法は前記個体の心筋の少なくとも一部分の心筋細胞に前記ＨＭＧＡタンパク質を提供することを含み、それにより前記心筋細胞の増殖を促進する、高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質を提供する。
【0012】
前記ＨＭＧＡタンパク質は、好ましくは、全身投与又は局所投与によって前記心筋細胞に提供される。前記ＨＭＧＡタンパク質は、好ましくは、前記心筋への注射又は注入を含む局所投与によって提供される。
【0013】
前記ＨＭＧＡタンパク質は、好ましくは、ＨＭＧＡ１、配列番号１の少なくとも２１番目～８９番目のアミノ酸残基を含むＨＭＧＡ１の一部分、又は配列全体にわたって配列番号１の２１番目～８９番目のアミノ酸残基と７５％以上同一であるタンパク質であるか、又はそれを含む。
【0014】
一実施形態では、前記ＨＭＧＡタンパク質は、前記心筋細胞内で前記ＨＭＧＡタンパク質を発現する発現構築物によって前記心筋細胞に提供される。前記発現構築物は、好ましくはウイルスベクター又は核酸構築物である。
【0015】
一実施形態では、前記構造的心筋欠損は、左心低形成症候群又は右心低形成症候群などの先天性心欠損である。
【0016】
一実施形態では、前記構造的心筋欠損は、心筋梗塞又は心不全に罹患している成人におけるものである。
【0017】
本発明はさらに、心筋細胞における、高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質の機能的発現のための、好ましくはＨＭＧＡ１、配列番号１の少なくとも２１番目～８９番目のアミノ酸残基を含むＨＭＧＡ１の一部分、又は配列全体にわたって配列番号１の２１番目～８９番目のアミノ酸残基と７５％以上同一であるタンパク質の機能的発現のための発現構築物を提供する。
【0018】
本発明はさらに、本発明による発現構築物と、薬理学的に許容される添加剤（excipient）とを含む医薬組成物を提供する。前記発現構築物は、好ましくは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス系ベクター若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系ベクター、又は核酸構築物、例えばｍＲＮＡベースの構築物である。
【0019】
本発明はさらに、インビトロで心筋細胞を培養する方法であって、ＨＭＧＡタンパク質又は本発明による発現構築物を心筋細胞に提供すること、及び前記心筋細胞を培養することとを含む、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1-1】図１：（Ａ）損傷したマウス心臓における転写的に異なる領域（transcriptionally distinct regions）がＴｏｍｏ－ｓｅｑによって明らかとなる。ワークフローの概略図。（Ｂ）ゼブラフィッシュの境界域とマウスの境界域との間の転写比較により、重複した多様な遺伝子発現が同定される。ワークフローの概略図。（Ｃ）相同遺伝子対についてのＬｏｇＦＣで示される、境界域発現を比較する散布図分析。
【図1-2】同上
【図2A】図２：ｈｍｇａ１ａ発現は潜在的再生能力（regenerative potential）と相関する。（Ａ）ｑＰＣＲ分析を、種々の出生後時点での全マウス心臓由来のｃＤＮＡライブラリーに対して行った。一元配置ＡＮＯＶＡ分析は、異なる時点間でＨｍｇａ１発現に有意差があることを示す（ｐ値＝０．０００２）。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して、どの特定のカラムがＰ１時点と有意に異なるかを特定した。（Ｂ）（ＬＡＤ閉塞によって誘導された）心筋梗塞の３、７又は１４日後の損傷したマウス心臓の単離された境界域（ＢＺ）及び遠隔心筋（ＲＭ）組織から得られたｃＤＮＡライブラリーについて、定量的ＰＣＲで候補遺伝子を分析した。Ｈｍｇａ１（Ｐ＝０．２６３）、Ｆｏｘｐ４（Ｐ＝０．１３４）及びＩｇｆ２（Ｐ＝０．１４３）について、ＢＺとＲＭとの間の差は観察されなかった。Ｇｐｃ１では、有意差が観察され、ＢＺと比較して有意に高い発現がＲＭで見られた（Ｐ＜０．００１）。二元配置ＡＮＯＶＡ試験を用いてＰ値を得た。提示された遺伝子のいずれについても、域とｄｐｉの有意な相互作用は観察されなかった。
【図2B】同上
【図3】図３：８ｂｐ欠失はｈｍｇａ１ａコード領域にフレームシフトを引き起こし、損傷境界域におけるｈｍｇａ１ａ ｍＲＮＡ発現の強い減少をもたらす。（Ａ）３つのＡＴフックＤＮＡ結合ドメイン及びＣ末端酸性尾部を含む、Ｈｍｇａ１ａタンパク質構造。（Ｂ）開始コドンの後方のＴＡＬＥＮベースの８ｂｐ欠失は、早期終始コドンを導くフレームシフトを引き起こす。（Ｃ、Ｄ）野生型心臓又はｈｍｇａ１ａ－／－心臓における（Ｃ）ｈｍｇａ１ａ又は（Ｄ）ｈｍｇａ１ｂに対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。各条件についてｎ＝３。点線は損傷区域を示す。スケールバーは１００μｍを表す。
【図4-1】図４：ゼブラフィッシュｈｍｇａ１ａは、心臓再生に必要であり、境界域心筋細胞が特定の細胞状態をとることを可能にする。（Ａ）ｈｍｇａ１ａ－／－心臓及び兄弟心臓の酸性フクシンオレンジＧ（ＡＦＯＧ）染色、３０ｄｐｉ。スケールバーは１００μｍを表す。（Ｂ）瘢痕サイズの定量。（Ｃ）７ｄｐｉでの野生型心臓及びｈｍｇａ１ａ－／－心臓からのｎｐｐａ：ｍＣｉｔｒｉｎｅ＋心筋細胞の単離及び選別のワークフロー。（Ｄ）擬似時間分析。ｚスコアの一次元ＳＯＭにより、ＳｔｅｍＩＤ分析によって生じた分化軌跡に沿って発現プロファイルを変換した。Ｙ軸は、差次的に発現した遺伝子を有する８つのモジュールを表す。Ｘ軸は、細胞が並べられた擬似時間を表す。（Ｅ）擬似時間にわたる遺伝子型寄与の分布。（Ｆ）特定のモジュールにおける発現を示す遺伝子を表す遺伝子オントロジー。（Ｇ）ゼブラフィッシュ境界域におけるヘキソキナーゼ１（ｈｋ１）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。点線は損傷境界を示す。スケールバーは５０μｍを示す。（Ｈ）３００μｍの野生型及び変異体境界域におけるトロポミオシン＋領域に対するリン酸化リボソームＳ６タンパク質陽性（ｐＳ６＋）区域のパーセンテージ（左）。野生型境界域及び変異体境界域における基礎となるトロポミオシンシグナルに対するｐＳ６シグナルの強度（右）。（Ｉ）トロポミオシン（最上段、１行目）及びｐＳ６（２行目）の免疫蛍光染色。心筋のｐＳ６シグナル（３行目）は、トロポミオシンについての総ｐＳ６のマスキング後に得られた。スケールバーは２００μｍを示す。
【図4-2】同上
【図4-3】同上
【図5A】図５：ゼブラフィッシュｈｍｇａ１ａは、損傷及びＮＲＧ１で誘導される心筋細胞増殖に必要である。（Ａ）増殖境界域心筋細胞の定量。（Ｂ）ＰＢＳ又はＮＲＧ１注射ゼブラフィッシュにおける、ｈｍｇａ１ａ－／－心臓又は野生型兄弟心臓のいずれかにおける増殖心筋細胞の定量。
【図5B】同上
【図6A】図６：ゼブラフィッシュｈｍｇａ１ａの過剰発現は、心筋細胞において増殖を誘導するのに十分である。増殖細胞の定量。（Ａ）総心臓表面（心筋＋内腔）。（Ｂ）心筋で覆われた総心臓表面のパーセンテージ。（Ｃ）増殖ＣＭのパーセンテージ。（Ｄ）心筋細胞核の密度。（Ｅ）１年超後の対照心臓とＨｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰ過剰発現心臓との間の心筋で覆われた表面積の定量。
【図6B】同上
【図6C】同上
【図6D】同上
【図6E】同上
【図7A】図７：Ｈｍｇａ１過剰発現は、哺乳動物心筋細胞の細胞周期リエントリーを刺激し、ＭＩ後の機能的回復を促進する。（Ａ）（Ｂ～Ｄ）で使用される新生仔ラット心筋細胞におけるＨｍｇａ１－ｅＧＦＰ過剰発現のワークフロー。（Ｂ～Ｄ）ｅＧＦＰのみをトランスフェクトされた細胞又はＨｍｇａ１－ｅＧＦＰをトランスフェクトされた細胞での増殖マーカー定量。ＥｄＵ、Ｋｉ６７及びｐＨＨ３の定量のために、２回の技術的反復のみが利用可能であったｐＨＨ３ Ｈｍｇａ１－ｅＧＦＰ条件を除いて、３回の技術的反復を条件ごとに定量した。（Ｅ）ＨＡ－Ｈｍｇａ１をトランスフェクトされた心臓の境界域（ＢＺ）又は遠隔心筋（ＲＭ）内のＥｄＵ＋細胞の定量。心臓１つあたり少なくとも３つの心臓切片を定量した。（Ｆ、Ｈ）駆出率（Ｆ）又は短縮率（Ｈ）を、ＢＺ（損傷区域から２００μｍ以下と定義）中に見出されるトランスフェクトされた細胞の平均量に対してプロットした。心臓１つあたり少なくとも３つの心臓切片を定量した。縦の灰色の線は、使用されたトランスフェクション効率のカットオフを示す。（Ｇ、Ｉ）偽手術心臓、又は対照ウイルス若しくはＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１）のいずれかを注射したＭＩ心臓の駆出率（Ｇ）又は短縮率（Ｉ）の定量。無効なトランスフェクションを示した心臓を除外した（平均で３０個未満のトランスフェクトされたＢＺ細胞）。
【図7B】同上
【図7C】同上
【図7D】同上
【図7E】同上
【図7F】同上
【図7G】同上
【図7H】同上
【図7I】同上
【図8A】図８：Ｈｍｇａ１過剰発現は、マウス心筋細胞の細胞周期リエントリーを刺激し、ＭＩ後の機能的回復を促進する。ＨＡ－Ｈｍｇａ１又はＧＦＰを形質導入した心臓の境界域（ＢＺ）内のＥｄＵ＋（Ａ）細胞又はＫｉ６７＋（Ｂ）細胞の定量。心臓１つあたり３つの心臓切片を定量した。統計量は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較検定を用いて得た。（Ｃ）４２ｄｐｉでの代表的なＨＡ－Ｈｍｇａ１及びＧＦＰ形質導入心臓のマッソントリクローム染色。切片間の距離は４００ｕｍである。スケールバーは１ｍｍを表す。ＨＡ－Ｈｍｇａ１又はＧＦＰを形質導入した心臓の平均角瘢痕サイズ（Ｄ）又はＭＩ長／正中線ＬＶ長の平均％（Ｅ）の瘢痕定量、４２ｄｐｉ。統計量は、対応のないｔ検定を用いて得た。ＨＡ－Ｈｍｇａ１又はＧＦＰを形質導入した心臓のＭＩ長／正中線ＬＶ長の平均％（Ｄ）の４２ｄｐｉの瘢痕定量。ＨＡ－Ｈｍｇａ１又はＧＦＰ対照ウイルスを形質導入した偽心臓及びＭＩ心臓の４２ｄｐｉでの駆出率（Ｅ）、短縮率（Ｆ）、心拍出量（Ｇ）及び一回拍出量（Ｈ）の定量。統計量は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較検定を用いて得た。
【図8B】同上
【図8C】同上
【図8D】同上
【図8E】同上
【図8F】同上
【図8G】同上
【図8H】同上
【発明を実施するための形態】
【0021】
４．１ 定義
本明細書で使用される「高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質」という用語は、遺伝子転写の調節に関与するクロマチン関連タンパク質を指す。このタンパク質は、二本鎖ＤＮＡ中のＡＴリッチ領域の副溝に優先的に結合する。結合は、３つのいわゆるＡ－Ｔフックの存在によって媒介される。ＨＭＧＡという用語は、Ａ－Ｔフックを含むタンパク質の少なくとも中心部分を含む機能的変異体への言及を含む。２つの哺乳動物ＨＭＧＡタンパク質、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２が存在する。ＨＭＧＡ１をコードする遺伝子はヒト染色体６ｐ２１．３１上に存在し、ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）受託番号５０１０、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ受託番号３１５９及びＥｎｓｅｍｂｌ受託番号ＥＮＳＧ０００００１３７３０９によって特徴付けられる。コードされたタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１７０９６によって特徴付けられる。ＨＭＧＡ２をコードする遺伝子は、ヒト染色体１２ｑ１４．３上に存在し、ＨＧＮＣ受託番号５００９、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ受託番号８０９１及びＥｎｓｅｍｂｌ受託番号ＥＮＳＧ ０００００１４９９４８によって特徴付けられる。コードされたタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ５２９２６によって特徴付けられる。好ましいＨＭＧＡタンパク質は、ＨＭＧＡ１、配列番号１の少なくとも２１番目～８９番目のアミノ酸残基を含むＨＭＧＡ１の一部分、又は配列全体にわたって少なくとも配列番号１の２１番目～８９番目のアミノ酸残基と７５％以上同一であるタンパク質によって提供される。
本明細書で使用される「高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質」という用語は、遺伝子転写の調節に関与するクロマチン関連タンパク質を指す。このタンパク質は、二本鎖ＤＮＡ中のＡＴリッチ領域の副溝に優先的に結合する。結合は、３つのいわゆるＡ－Ｔフックの存在によって媒介される。ＨＭＧＡという用語は、Ａ－Ｔフックを含むタンパク質の少なくとも中心部分を含む機能的変異体への言及を含む。２つの哺乳動物ＨＭＧＡタンパク質、ＨＭＧＡ１及びＨＭＧＡ２が存在する。ＨＭＧＡ１をコードする遺伝子はヒト染色体６ｐ２１．３１上に存在し、ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）受託番号５０１０、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ受託番号３１５９及びＥｎｓｅｍｂｌ受託番号ＥＮＳＧ０００００１３７３０９によって特徴付けられる。コードされたタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１７０９６によって特徴付けられる。ＨＭＧＡ２をコードする遺伝子は、ヒト染色体１２ｑ１４．３上に存在し、ＨＧＮＣ受託番号５００９、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ受託番号８０９１及びＥｎｓｅｍｂｌ受託番号ＥＮＳＧ ０００００１４９９４８によって特徴付けられる。コードされたタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ５２９２６によって特徴付けられる。好ましいＨＭＧＡタンパク質は、ＨＭＧＡ１、配列番号１の少なくとも２１番目～８９番目のアミノ酸残基を含むＨＭＧＡ１の一部分、又は配列全体にわたって少なくとも配列番号１の２１番目～８９番目のアミノ酸残基と７５％以上同一であるタンパク質によって提供される。
【0022】
本明細書で使用される「構造的心筋欠損（structural cardiac muscle defect）」という用語は、心筋細胞と呼ばれる筋細胞に関連する欠損又は障害を指す。構造的心筋欠損は先天性であるか、又は加齢、損傷又は感染の結果として後年に発症する。例としては、肥大型心筋症、心低形成症候群及び卵円孔開存が挙げられる。
【0023】
「心筋梗塞」又は心臓発作という用語は、心筋組織の突然の虚血死を指す。長時間の心筋虚血は、梗塞した心臓における心筋細胞のアポトーシス及び壊死をもたらす。成体哺乳動物の心臓は、再生能力をほとんど有していない。したがって、梗塞した心筋は、線維化、すなわち瘢痕の形成によって治癒する。梗塞の治癒は、拡張、生存セグメントの肥大、及び進行性機能不全によって特徴付けられる。
【0024】
本明細書で使用される「心不全」という用語は、心臓を十分な血液で満たすことができないため、又は心臓が適度に送り出すには弱すぎるために、心臓が十分な血液を送り出すことができないときに発症する状態を指す。心不全は、冠動脈心疾患、心臓炎症、高血圧、心筋症、又は不規則な心拍によって引き起こされ得る。
【0025】
本明細書で使用される「肥大型心筋症（ＨＣＭ）」という用語は、収縮不全及び潜在的に致命的な不整脈に関連する、通常は左心室の心臓壁の肥厚を指す。ＨＣＭは、３５歳未満の個体における心臓突然死の最も一般的な原因である。ＨＣＭはしばしば心不全の発症に先行する。
【0026】
本明細書で使用される「左心低形成症候群」という用語は、心臓を通る正常な血流に影響を及ぼす一連の先天性心欠損を指す。左心室の発達が不十分であり過度に小さいことは、左心低形成症候群の症状の１つである。
【0027】
本明細書で使用される「右心低形成症候群」という用語は、心臓を通る正常な血流に影響を及ぼす一連の先天性心欠損を指す。右心室が存在しない、又は発達が不十分であり過度に小さいことは、右心低形成症候群の症状の１つである。
【0028】
４．２ 処置方法
構造的心筋欠損に罹患している個体を処置する方法は、心筋細胞の増殖能を少なくとも部分的に誘導することを目的とする。処置方法は、心筋細胞における高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質の発現を増加させる手段を含む。個体の心筋細胞におけるＨＭＧＡタンパク質の発現レベルの増加の提供は、個体の心筋細胞に前記ＨＭＧＡタンパク質又は前記ＨＭＧＡタンパク質をコードする核酸分子を提供することを含む。前記提供は好ましくは一過性であり、これは、心筋細胞におけるＨＭＧＡタンパク質の発現の前記増加が一時的、例えば１日～６ヶ月間、例えば１週間～３ヶ月間、であることを意味する。
構造的心筋欠損に罹患している個体を処置する方法は、心筋細胞の増殖能を少なくとも部分的に誘導することを目的とする。処置方法は、心筋細胞における高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質の発現を増加させる手段を含む。個体の心筋細胞におけるＨＭＧＡタンパク質の発現レベルの増加の提供は、個体の心筋細胞に前記ＨＭＧＡタンパク質又は前記ＨＭＧＡタンパク質をコードする核酸分子を提供することを含む。前記提供は好ましくは一過性であり、これは、心筋細胞におけるＨＭＧＡタンパク質の発現の前記増加が一時的、例えば１日～６ヶ月間、例えば１週間～３ヶ月間、であることを意味する。
【0029】
個体の心筋の少なくとも一部分の心筋細胞にＨＭＧＡタンパク質を提供することは、前記心筋細胞、特に損傷境界域の心筋細胞の増殖を刺激すると考えられる。これらの細胞におけるＨＭＧＡの存在の増加は、クロマチン再編成を促進し、ストレス応答、細胞外マトリックス産生、代謝再プログラミング及び細胞増殖における役割を有する遺伝子の誘導をもたらす。
【0030】
したがって、本発明は、構造的心筋欠損に罹患している個体における心筋細胞増殖を促進するための医薬品の調製における、高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質の使用を提供する。前記個体の心筋の少なくとも一部分の心筋細胞に前記ＨＭＧＡタンパク質を提供することにより、前記心筋細胞の増殖が促進される。
【0031】
ＨＭＧＡは、ゼブラフィッシュ境界域（ＢＺ）で上方制御されるがマウスＢＺでは上方制御されない遺伝子についてのスクリーニングで同定された。合計３７１個の遺伝子が同定された（表１参照）。３７１個の遺伝子には、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子識別子ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３３９７１、ｐａｉｒｅｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １（ｐｒｒｘ１）が含まれ、これは、損傷したゼブラフィッシュ心臓の線維化と再生のバランスをとる重要な転写因子であることが示されている（ｄｅ Ｂａｋｋｅｒら、２０２１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４８巻（１９号）：ｄｅｖ１９８９３７頁）。ＥＮＳＤＡＲＧ００００００２８３３５（ｈｍｇａ１ａ）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００７６１２０（フォークヘッドボックスｐ４；ｆｏｘｐ４）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３３３０７（インスリン様増殖因子２；ｉｇｆ２）及びＥＮＳＤＡＲＧ００００００９０５８５（グリピカン１；ｇｐｃ１）について、ゼブラフィッシュにおいてＢＺが豊富に発現していることを、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び定量的ＰＣＲ分析を用いたマウスＢＺにおけるＢＺ富化の欠如によって確認した（図２Ｂ及びデータは示さず）。興味深いのは、心筋細胞、特に損傷境界域の心筋細胞の増殖を刺激すると考えられている遺伝子ＥＮＳＤＡＲＧ００００００７６１２０（ｆｏｘｐ４）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３３３０７（ｉｇｆ２）、ＥＮＳＤＡＲＧ０００００１０１４８２（ヘキソキナーゼ２；ｈｋ２）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３６０９６（ｓｍａｄファミリーメンバー３ａ；ｓｍａｄ３ａ）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３４８９５（形質転換増殖因子ベータ１；ｔｇｆｂ１）及びＥＮＳＤＡＲＧ００００００６１５０８（形質転換増殖因子ベータ受容体関連タンパク質１；ｔｇｆｂｒａｐ１）、特にＥＮＳＤＡＲＧ００００００７６１２０（ｆｏｘｐ４）及びＥＮＳＤＡＲＧ０００００１０１４８２（ｈｋ２）である。ｆｏｘｐ４、ｉｇｆ２及びｈｋ２遺伝子は、損傷境界域におけるＣＭ増殖に必要とされる、インスリン増殖因子シグナル伝達、及び解糖の調節を介したエネルギー代謝の調節において役割を果たす（Ｈｕａｎｇら、２０１３年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、８巻：ｅ６７２６６頁；Ｈｏｎｋｏｏｐら、２０１９年、Ｅｌｉｆｅ ８巻：ｅ５０１６３頁；Ｆｕｋｕｄａら、２０２０年、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ２１巻：ｅ４９７５２頁）。ｓｍａｄ３ａ、ｔｇｆｂ１及びｔｇｆｂｒａｐ１遺伝子は、損傷境界域におけるＣＭ増殖のための必須経路であるＴＧＦ－β増殖因子経路を介したシグナルの伝達において役割を果たす（Ｃｈａｂｌａｉｓ及びＪａｚｗｉｎｓｋａ，２０１２年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３９巻：１９２１～１９３０頁；Ｐｅｎｇら、２０２１年、Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ９巻：６３２３７２頁）。個体の心筋の少なくとも一部分の心筋細胞における、表１に列挙される遺伝子のいずれか１つ、特にＥＮＳＤＡＲＧ００００００７６１２０（ｆｏｘｐ４）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３３３０７（ｉｇｆ２）、ＥＮＳＤＡＲＧ０００００１０１４８２（ｈｋ２）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３６０９６（ｓｍａｄ３ａ）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３４８９５（ｔｇｆｂ１）及びＥＮＳＤＡＲＧ００００００６１５０８（ｔｇｆｂｒａｐ１）、特にＥＮＳＤＡＲＧ００００００７６１２０（ｆｏｘｐ４）及びＥＮＳＤＡＲＧ０００００１０１４８２（ｈｋ２）の過剰発現は、前記心筋細胞、特に損傷境界域の心筋細胞の増殖を刺激する。
【0032】
４．２．１ ＨＭＧＡタンパク質の上方制御
ＨＭＧＡタンパク質は、全身投与又は局所投与によって心筋細胞の増殖を誘導するために提供され得る。前記ＨＭＧＡタンパク質は、好ましくは宿主細胞において発現される。異種タンパク質産生のために一般的に使用される発現系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バキュロウイルス、酵母及び哺乳動物細胞が挙げられる。異種系における組換えタンパク質の発現の効率は、転写レベル及び翻訳レベルの両方の多くの因子に依存する。
ＨＭＧＡタンパク質は、全身投与又は局所投与によって心筋細胞の増殖を誘導するために提供され得る。前記ＨＭＧＡタンパク質は、好ましくは宿主細胞において発現される。異種タンパク質産生のために一般的に使用される発現系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バキュロウイルス、酵母及び哺乳動物細胞が挙げられる。異種系における組換えタンパク質の発現の効率は、転写レベル及び翻訳レベルの両方の多くの因子に依存する。
【0033】
ＨＭＧＡタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む糸状菌又は酵母などの真菌において産生され得る。
【0034】
ＨＭＧＡタンパク質は、好ましくは、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞及びそれらの誘導体、例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ－２９３Ｆ及びＨＥＫ－２９３ＦＴ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、ニューヨーク州、米国）を含むＨＥＫ２９３細胞、並びにＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、米国）において産生される。
【0035】
ＨＭＧＡタンパク質の産生は、好ましくは、前記ＨＭＧＡタンパク質をコードする核酸分子を目的の細胞に提供することによって産生される。前記核酸、好ましくはＤＮＡは、好ましくは、当業者に公知のように、ポリメラーゼ、制限酵素、及びリガーゼの使用を含む組換え技術によって産生される。或いは前記核酸は、当業者に公知のように、人工遺伝子合成によって、例えば部分的若しくは完全に重複するオリゴヌクレオチドの合成によって、又は有機化学と組換え技術との組み合わせによって提供される。前記核酸は、好ましくは、選択された細胞又は細胞系統におけるＨＭＧＡタンパク質の発現を増強するためにコドン最適化される。さらなる最適化には、好ましくは、潜在的スプライス部位の除去、潜在的ポリＡテールの除去及び／又はｍＲＮＡの好ましくないフォールディングをもたらす配列の除去が含まれる。スプライス部位に隣接するイントロンの存在は、核からの搬出を促進し得る。さらに、核酸は、好ましくは、細胞から原核生物のペリプラズム又は増殖培地へのＨＭＧＡタンパク質の分泌のためのタンパク質搬出シグナルをコードし、ＨＭＧＡタンパク質の効率的な精製を可能にする。
【0036】
ＨＭＧＡタンパク質の精製方法は当技術分野で公知であり、一般に、汚染物質（contaminants）を除去するためのイオン交換などのクロマトグラフィーに基づく。汚染物質に加えて、分解生成物及び凝集物などの生成物自体の望ましくない誘導体を除去することも必要であり得る。適切な精製プロセス工程は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ及びＷａｌｔｅｒ、１９９４年、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２２巻：１３５～１５０頁に提供されている。
【0037】
代替として、又はさらに、組換えＨＭＧＡタンパク質は、遺伝子工学によって特定のタグでタグ付けされて、タンパク質が前記タグに特異的なカラムに結合することを可能にし、したがって不純物から単離され得る。次いで、精製されたタンパク質は、アフィニティーカラムからデカップリング試薬で交換される。この方法は、組換えタンパク質の精製に適用されている。ヒスチジンタグなどのタンパク質の従来のタグは、タグを特異的に捕捉するアフィニティーカラム（例えば、ヒスチジンタグについてはＮｉ－ＩＤＡカラム）と共に使用されて、不純物からタンパク質を単離する。次いで、タンパク質は、特異的タグに応じたデカップリング試薬（例えば、ヒスチジンタグについてはイミダゾール）を使用して、カラムから交換される。この方法は、従来の精製方法と比較すると、より特異的である。適切なさらなるタグとしては、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ、２００６年、Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７巻：３５３～３５８頁）に提示されているように、ｃ－ｍｙｃドメイン、ヘマグルチニンタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ＦＬＡＧタグペプチド、ビオチンアクセプターペプチド、ストレプトアビジン結合ペプチド及びカルモジュリン結合ペプチドが挙げられる。これらのタグを採用する方法は当技術分野で公知であり、ＨＭＧＡタンパク質を精製するために使用され得る。
【0038】
前記ＨＭＧＡタンパク質は、心筋細胞への前記タンパク質の送達を促進するために細胞透過性ペプチドによって提供されてもよい。このために、前記ＨＭＧＡタンパク質は、オルニチン、リジン又はアルギニンなどの正に荷電したアミノ酸を含む、極性の荷電したアミノ酸と非極性の疎水性アミノ酸との交互パターンを含む配列を含む、又は無極性アミノ酸残基のみを含む、３～５０アミノ酸、好ましくは５～２０アミノ酸、例えば６～１２アミノ酸のペプチドに融合されてもよい。適切なペプチドとしては、ヒト免疫不全ウイルス１ ｔａｔの一部、単純ヘルペスウイルス１のテグメントタンパク質ＶＰ２２、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディア、ポリアルギニンペプチド、ポリメチオニンペプチド、ポリグリシンペプチド、環状ポリアルギニン、アミノ酸配列ＲＭＲＲＭＲＲＭＲＲを有するペプチド、及びそれらの変異体又は組み合わせが含まれる。
【0039】
前記ＨＭＧＡタンパク質、好ましくは精製ＨＭＧＡタンパク質は、全身投与又は局所投与によって、好ましくは局所投与によって提供され得る。前記ＨＭＧＡタンパク質は、心筋への注射又は注入によって、例えばカテーテルを採用することによって提供され得る。前記注射又は注入は、外部ポンプ又は完全に埋め込み可能な装置の使用によって達成されてもよい。前記外部ポンプは、好ましくは、トンネル型若しくは非トンネル型の経皮カテーテルを備えているか、又は皮下注射ポート及び埋め込み型カテーテルを備えている。
【0040】
代替として、前記ＨＭＧＡタンパク質、好ましくは精製ＨＭＧＡタンパク質は、構造的心筋欠損を含む領域に血液を供給する冠動脈内に提供される。
【0041】
同様に、前記心筋細胞、特に損傷境界域の心筋細胞の増殖を刺激するために、発現系で産生される、表１に列挙された遺伝子のいずれか１つ、特にＥＮＳＤＡＲＧ００００００７６１２０（ｆｏｘｐ４）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３３３０７（ｉｇｆ２）、ＥＮＳＤＡＲＧ０００００１０１４８２（ｈｋ２）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３６０９６（ｓｍａｄ３ａ）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３４８９５（ｔｇｆｂ１）及びＥＮＳＤＡＲＧ００００００６１５０８（ｔｇｆｂｒａｐ１）、特にＥＮＳＤＡＲＧ００００００７６１２０（ｆｏｘｐ４）及びＥＮＳＤＡＲＧ０００００１０１４８２（ｈｋ２）のタンパク質産物は、全身又は局所投与によって心筋細胞に投与されてもよい。前記タンパク質は、細胞透過性ペプチドでタグ付けされてもよく、及び／又は細胞透過性ペプチドが備わっていても良い。
【0042】
４．２．２ ＨＭＧＡタンパク質の発現
代替として、心筋細胞におけるＨＭＧＡの発現は、心筋細胞におけるＨＭＧＡの機能的発現のための発現構築物によって提供されてもよい。前記発現構築物は、好ましくは心筋細胞におけるＨＭＧＡの機能的発現、好ましくは心筋細胞におけるＨＭＧＡの特異的発現を可能にする。前記心筋細胞特異的発現は、例えば、心筋トロポニンＴ（Ｔｎｎｔ２）プロモーター（Ｗｕら、２０１０年、Ｇｅｎｅｓｉｓ ４８巻：６３～７２頁）、心筋細胞特異的Ｎａ（＋）－Ｃａ（２＋）交換プロモーター（Ａｇｏｓｔｉｎｉら、２０１３年、Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ、２０１３年：８４５８１６頁）又は心臓ミオシン軽鎖２プロモーター（Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉら、１９９７年、Ｃ Ｒ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＩＩＩ ３２０巻：１０３～１１２頁）などの心筋細胞特異的プロモーターの制御下でＨＭＧＡを発現させることによって提供され得る。
代替として、心筋細胞におけるＨＭＧＡの発現は、心筋細胞におけるＨＭＧＡの機能的発現のための発現構築物によって提供されてもよい。前記発現構築物は、好ましくは心筋細胞におけるＨＭＧＡの機能的発現、好ましくは心筋細胞におけるＨＭＧＡの特異的発現を可能にする。前記心筋細胞特異的発現は、例えば、心筋トロポニンＴ（Ｔｎｎｔ２）プロモーター（Ｗｕら、２０１０年、Ｇｅｎｅｓｉｓ ４８巻：６３～７２頁）、心筋細胞特異的Ｎａ（＋）－Ｃａ（２＋）交換プロモーター（Ａｇｏｓｔｉｎｉら、２０１３年、Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ、２０１３年：８４５８１６頁）又は心臓ミオシン軽鎖２プロモーター（Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉら、１９９７年、Ｃ Ｒ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＩＩＩ ３２０巻：１０３～１１２頁）などの心筋細胞特異的プロモーターの制御下でＨＭＧＡを発現させることによって提供され得る。
【0043】
前記発現構築物は、核酸分子として提供されてもよく、又は核酸分子を個体の心筋細胞に送達するためのベクター、特にウイルスベクターによって提供されてもよい。前記ウイルスベクターは、好ましくは、核酸分子の一時的発現を提供する。前記ウイルスベクターは、好ましくは、組換えアデノウイルス系ベクター、アデノウイルス関連ウイルス系ベクター、アルファウイルス系ベクター、単純ヘルペスウイルス系ベクター、又はポックスウイルス系ベクターである。前記ウイルスベクターは、最も好ましくは、アデノウイルス系ベクター又は自己増幅性アルファウイルス系レプリコンベクターである（Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ及びＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍ、２０１５年、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １４巻：１７７～１９４頁）。
【0044】
構造遺伝子及びパッケージング遺伝子を発現するパッケージング細胞のトランスフェクションを含む、ウイルス粒子又はウイルス様粒子中へのウイルスベクターのパッケージングは、当技術分野で公知である。
【0045】
ＨＭＧＡを心筋細胞に形質導入するウイルスベクターの送達方法には、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、リンパ内、及び節内投与などの非経口経路による投与が含まれる。ＨＭＧＡを形質導入する前記ウイルスベクターは、好ましくは、例えば心筋内、又は構造的心筋欠損を含む領域に血液を供給する冠動脈内への局所投与によって提供される。
【0046】
前記核酸分子はまた、心筋細胞に送達されると前記ＨＭＧＡを発現するＤＮＡ分子として提供されてもよい。前記ＤＮＡ分子は、例えば分子の半減期を増加させるために修飾ヌクレオチドを含んでもよい。例えば、前記核酸分子は、プラスミド中に、又は直鎖状ＤＮＡとして提供され得る。本発明によるＤＮＡ分子の非ウイルス媒介送達には、リポフェクション、マイクロインジェクション、及びＤＮＡの薬剤増強取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号及び第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、及びＳＡＩＮＴ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的なリポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質には、国際公開第９１／１７４２４号及び国際公開第９１／１６０２４号のものが含まれる。送達は、細胞への送達（例えば、インビトロ投与又はエクスビボ投与）又は標的組織への送達（例えば、インビボ投与であり得る。前記ＤＮＡ分子はまた、前記ＤＮＡ分子の送達を必要とする個体への当該送達の前に、例えば、ビロソーム、リポソーム又はイムノリポソームなどの脂質小胞にパッケージングされてもよい。
【0047】
前記核酸分子はまた、心筋細胞に送達されるとＨＭＧＡを発現するＲＮＡ分子として提供されてもよい。前記ＲＮＡ分子は、例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、又はそれらの変異体などのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロで合成され得る。そのような変異体としては、例えば、カノニカル及び非カノニカルなリボヌクレオチド及びデオキシヌクレオチドの両方を基質として利用することができる変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｓｔｙｕｋら、１９９５年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６９巻：１６５～１６８頁；Ｐａｄｉｌｌａら、２００２年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０巻（２４号）：ｅ１３８頁）、又はより高い熱安定性を示すＲＮＡポリメラーゼ変異体、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからのＨｉ－Ｔ７（商標）ＲＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｕｌａｉｎら、２０１３年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２６巻（１１号）：７２５～７３４頁）が挙げられ得る。
【0048】
前記ＲＮＡ分子は、例えば、合成キャップ類似体（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉら、２００１年、ＲＮＡ ７巻：１４８６～１４９５頁）、前記ＲＮＡ分子を安定化し、及び／若しくはタンパク質翻訳を増加させる５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／若しくは３’ＵＴＲ内の１又は複数の調節エレメント（Ｒｏｓｓ及びＳｕｌｌｉｖａｎ、１９８５年、Ｂｌｏｏｄ ６６巻：１１４９～１１５４頁）、並びに／又は安定性及び／若しくは翻訳を増加させる（Ｋａｒｉｋｏら、２００８年、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６巻：１８３３～１８４０頁）ための、及び／若しくは炎症応答を減少させる（Ｋａｒｉｋｏら、２００５年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３巻：１６５～１７５頁）（２００５年）ための修飾ヌクレオシドを包含し得る。さらに、前記ＲＮＡ分子は、好ましくは、ＲＮＡ分子を安定化し、及び／又はタンパク質翻訳を増加させるためのポリ（Ａ）テール（Ｇａｌｌｉｅ、１９９１年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ５巻：２１０８～２１１６頁）を包含する。
【0049】
前記核酸分子は、担体の存在下又は非存在下で個体に送達され得る。前記担体は、好ましくは、心筋細胞におけるＨＭＧＡタンパク質のインビボでの長期発現を可能にする。前記担体は、プロタミン、プロタミンリポソーム、多糖、カチオン、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール、及びデンドリマーなどのカチオン性タンパク質の１つ又は複数であり得る。例えば、前記ＲＮＡ分子は、Ｐａｒｄｉら、２０１８年、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １７巻：２６１～２７９頁に記載されているように、ネイキッドＲＮＡ分子として、プロタミンと複合体化して、正に帯電した水中油型カチオン性ナノエマルジョンと会合して、化学修飾されたデンドリマーと会合して、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質と複合体化して、ＰＥＧ－脂質ナノ粒子中のプロタミンと複合体化して、ポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーと会合して、ＰＥＩなどのカチオン性ポリマー及び脂質成分と会合して、又は例えば、１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）脂質などのカチオン性脂質ナノ粒子中、例えばキトサンなどの多糖と会合して、カチオン性脂質及びコレステロールと複合体化して、並びにカチオン性脂質、コレステロール及びＰＥＧ－脂質と複合体化さして、送達され得る。
【0050】
核酸を細胞に導入する方法には、リポフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及びＤＮＡの薬剤増強取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号及び第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、及びＳＡＩＮＴ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質には、国際公開第９１／１７４２４号及び国際公開第９１／１６０２４号のものが含まれる。標的組織への送達は、好ましくは、心筋細胞を含む領域への全身投与又は好ましくは局所投与によるものである。
【0051】
心筋細胞への送達時にＨＭＧＡを発現する前記核酸分子は、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、リンパ内、節内投与を含む非経口経路によって投与され得る。当業者に公知のように、望ましい結果を達成するために、特定の投与様式に適した担体を選択することができる。
【0052】
同様に、前記心筋細胞、特に損傷境界域の心筋細胞の増殖を刺激するために、表１に列挙された遺伝子のいずれか１つ、特にＥＮＳＤＡＲＧ００００００７６１２０（ｆｏｘｐ４）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３３３０７（ｉｇｆ２）、ＥＮＳＤＡＲＧ０００００１０１４８２（ｈｋ２）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３６０９６（ｓｍａｄ３ａ）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３４８９５（ｔｇｆｂ１）及びＥＮＳＤＡＲＧ００００００６１５０８（ｔｇｆｂｒａｐ１）、特にＥＮＳＤＡＲＧ００００００７６１２０（ｆｏｘｐ４）及びＥＮＳＤＡＲＧ０００００１０１４８２（ｈｋ２）のタンパク質産物をコードする核酸分子は、心筋細胞において発現するように、全身又は局所投与によって投与され得る。
【0053】
４．２．３ 医薬組成物
さらに、ＨＭＧＡタンパク質を含むか、又は、心筋細胞における高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質の機能的発現のための、好ましくはＨＭＧＡ１、配列番号１の少なくとも２１番目～８９番目のアミノ酸残基を含むＨＭＧＡ１の一部分、又は配列全体にわたって配列番号１の２１番目～８９番目のアミノ酸残基と７５％以上同一であるタンパク質の機能的発現のための発現構築物と、薬理学的に許容される添加剤と、を含む医薬組成物が提供される。前記医薬組成物は、好ましくは滅菌等張溶液である。
さらに、ＨＭＧＡタンパク質を含むか、又は、心筋細胞における高移動度群Ａ（ＨＭＧＡ）タンパク質の機能的発現のための、好ましくはＨＭＧＡ１、配列番号１の少なくとも２１番目～８９番目のアミノ酸残基を含むＨＭＧＡ１の一部分、又は配列全体にわたって配列番号１の２１番目～８９番目のアミノ酸残基と７５％以上同一であるタンパク質の機能的発現のための発現構築物と、薬理学的に許容される添加剤と、を含む医薬組成物が提供される。前記医薬組成物は、好ましくは滅菌等張溶液である。
【0054】
前記医薬的に許容される添加剤は、好ましくは、希釈剤、結合剤又は造粒成分、例えばデンプンのような炭水化物、例えば酢酸デンプン及び／又はマルトデキストリンのようなデンプン誘導体、例えばキシリトール、ソルビトール及び／又はマンニトールのようなポリオール、例えばα－ラクトース一水和物、無水α－ラクトース、無水β－ラクトース、噴霧乾燥ラクトース及び／又は凝集ラクトースのようなラクトース、例えばデキストロース、マルトース、デキストレート及び／又はイヌリンのような糖、流動促進剤（流動助剤）及び潤滑剤、並びにそれらの組み合わせから選択される。
【0055】
ＨＭＧＡを含む医薬組成物は、好ましくは、タンパク質の安定性、溶解性、及び医薬的許容性を維持するための添加剤を含む。前記添加剤は、好ましくは、尿素、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－セリン、Ｌ－グルタミン、ポリソルベート、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、又は上記の２つ以上の組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。塩及び緩衝剤は、濃度の増加及びｐＨ変化の可能性のために、特に凍結溶液及び凍結乾燥固体においてタンパク質安定性をもたらすことが知られている。さらに、様々な糖は、水溶液中及び凍結乾燥中のタンパク質の立体配座を保護することができる。例えば、スクロース及びトレハロースなどの非還元性二糖は、水溶液及び凍結乾燥固体中のタンパク質立体配座を保護するための強力且つ有用な添加剤であるが、マルトース及びラクトースなどの還元性糖は、貯蔵中にタンパク質を分解する可能性がある。前記添加剤は、イノシトールなどの糖アルコールをさらに含んでもよく、及び／又はアルギニンなどのアミノ酸は、脱水ストレスからタンパク質立体配座を保護し得る。さらなる添加剤は、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤、及び／又はヒドロキシエチルデンプンなどのポリマーを含み得る。
【0056】
前記発現構築物は、好ましくは、例えば心筋細胞特異的プロモーターの制御下でＨＭＧＡを発現させることによって、心筋細胞におけるＨＭＧＡの特異的発現を媒介する。
【0057】
前記発現構築物は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子などの核酸分子、又はウイルスベクターのいずれかである。前記ウイルスベクターは、好ましくは、心筋細胞における核酸分子の一時的発現を提供する。前記ウイルスベクターは、好ましくは、組換えアデノウイルス系ベクター、アデノウイルス関連ウイルス系ベクター、アルファウイルス系ベクター、単純ヘルペスウイルス系ベクター、又はポックスウイルス系ベクターである。前記ウイルスベクターは、最も好ましくは、アデノウイルス系ベクター、自己増幅性アルファウイルス系レプリコンベクター（Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ及びＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍ、２０１５年、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １４巻：１７７～１９４頁）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系ベクターである。
【0058】
代替として、前記発現構築物はｍＲＮＡベースの発現構築物である。本明細書で上記に示されるように、前記ｍＲＮＡベースの発現構築物又はＲＮＡ分子は、例えば、合成キャップ類似体（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉら、２００１年、ＲＮＡ ７巻：１４８６～１４９５頁）、前記ＲＮＡ分子を安定化し、及び／若しくはタンパク質翻訳を増加させる５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／若しくは３’ＵＴＲ内の１又は複数の調節エレメント（Ｒｏｓｓ及びＳｕｌｌｉｖａｎ、１９８５年、Ｂｌｏｏｄ ６６巻：１１４９～１１５４頁）、並びに／又は安定性及び／若しくは翻訳を増加させる（Ｋａｒｉｋｏら、２００８年、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６巻：１８３３～１８４０頁）ための、及び／若しくは炎症応答を減少させる（Ｋａｒｉｋｏら、２００５年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３巻：１６５～１７５頁）ための修飾ヌクレオシドを包含し得る。さらに、前記ＲＮＡ分子は、好ましくは、ＲＮＡ分子を安定化し、及び／又はタンパク質翻訳を増加させるためのポリ（Ａ）テール（Ｇａｌｌｉｅ、１９９１年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ５巻：２１０８～２１１６頁）を包含する。
【0059】
ｍＲＮＡベースの発現構築物などの発現構築物としての核酸分子のための添加剤には、脂質、脂質様化合物、及び脂質誘導体、特にカチオン性脂質材料又はイオン化可能な脂質材料、ポリアミン、デンドリマー、及びコポリマーを含むポリマー材料、特にポリエチレンイミン及び／又はポリアミドアミンなどのカチオン性ポリマー、並びにプロタミンなどのペプチドが含まれる。
【0060】
ネイキッドｍＲＮＡ発現分子などのネイキッド核酸分子を発現構築物として含む医薬組成物は、当業者に公知のように、好ましくはリンゲル溶液及び乳酸リンゲル液などの添加剤を含む。
【0061】
同様に、前記医薬組成物は、表１に列挙された遺伝子のいずれか１つ、特にＥＮＳＤＡＲＧ００００００７６１２０（ｆｏｘｐ４）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３３３０７（ｉｇｆ２）、ＥＮＳＤＡＲＧ０００００１０１４８２（ｈｋ２）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３６０９６（ｓｍａｄ３ａ）、ＥＮＳＤＡＲＧ００００００３４８９５（ｔｇｆｂ１）及びＥＮＳＤＡＲＧ００００００６１５０８（ｔｇｆｂｒａｐ１）、特にＥＮＳＤＡＲＧ００００００７６１２０（ｆｏｘｐ４）及びＥＮＳＤＡＲＧ０００００１０１４８２（ｈｋ２）のタンパク質産物、又は前記タンパク質産物をコードする核酸分子の発現のための発現構築物を含み得る。
【実施例】
【0062】
実施例１
（材料及び方法）
動物実験
動物に関与する全ての手順は、地元の動物実験委員会によって承認され、国及び欧州の法律に従って動物福祉法、ガイドライン、及び方針に従って実施された。
（材料及び方法）
動物実験
動物に関与する全ての手順は、地元の動物実験委員会によって承認され、国及び欧州の法律に従って動物福祉法、ガイドライン、及び方針に従って実施された。
【0063】
ゼブラフィッシュ系統及びマウス系統
以下のゼブラフィッシュ系統を使用した：ＴＬ、ＴｇＢＡＣ（ｎｐｐａ：ｍＣｉｔｒｉｎｅ）（Ｈｏｎｋｏｏｐら、２０１９年、ＥＬｉｆｅ、８巻：１～２７頁）、Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲ）ｐｄ１０（Ｋｉｋｕｃｈｉら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻：６０１～６０５頁）、Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＤｓＲｅｄ２－ＮＬＳ）（Ｍａｂｌｙら、２００３年、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ、１３巻：２１３８～２１４７頁）。ｈｍｇａ１ａ－／－は、ＴＡＬＥＮベースの戦略を使用して、転写開始部位に隣接する領域を標的とし、フレームシフト及び初期終止コドンをもたらすように産生された（データは示さず）。ｔｇ（ｕｂｉ：Ｌｏｘｐ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰ）は、ｐＤＥＳＴｐ３Ａデスティネーションベクター（Ｋｗａｎら、２００７年、Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３６巻：３０８８～３０９９頁）及びｐ５Ｅ ｕｂｉプロモーター（Ｍｏｓｉｍａｎｎら、２０１１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３８巻：１６９～１７７頁）を使用して、ｇＢｌｏｃｋｓ及びＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙを使用して産生された。以下のマウス系統を使用した：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、ｔｇ（Ｎｐｐｂ：ｋａｔｕｓｈｋａ）（Ｓｅｒｇｅｅｖａら、２０１４年、Ｃａｒｄｉｏｖａｓ Ｒｅｓ １０１巻：７８～８６頁）。
以下のゼブラフィッシュ系統を使用した：ＴＬ、ＴｇＢＡＣ（ｎｐｐａ：ｍＣｉｔｒｉｎｅ）（Ｈｏｎｋｏｏｐら、２０１９年、ＥＬｉｆｅ、８巻：１～２７頁）、Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲ）ｐｄ１０（Ｋｉｋｕｃｈｉら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻：６０１～６０５頁）、Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＤｓＲｅｄ２－ＮＬＳ）（Ｍａｂｌｙら、２００３年、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ、１３巻：２１３８～２１４７頁）。ｈｍｇａ１ａ－／－は、ＴＡＬＥＮベースの戦略を使用して、転写開始部位に隣接する領域を標的とし、フレームシフト及び初期終止コドンをもたらすように産生された（データは示さず）。ｔｇ（ｕｂｉ：Ｌｏｘｐ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰ）は、ｐＤＥＳＴｐ３Ａデスティネーションベクター（Ｋｗａｎら、２００７年、Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３６巻：３０８８～３０９９頁）及びｐ５Ｅ ｕｂｉプロモーター（Ｍｏｓｉｍａｎｎら、２０１１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３８巻：１６９～１７７頁）を使用して、ｇＢｌｏｃｋｓ及びＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙを使用して産生された。以下のマウス系統を使用した：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、ｔｇ（Ｎｐｐｂ：ｋａｔｕｓｈｋａ）（Ｓｅｒｇｅｅｖａら、２０１４年、Ｃａｒｄｉｏｖａｓ Ｒｅｓ １０１巻：７８～８６頁）。
【0064】
マウスにおける心筋梗塞
心臓虚血性損傷は、７～１２週齢の成体雄マウスを使用して、以前に（Ｓｅｒｇｅｅｖａら、２０１４年、Ｃａｒｄｉｏｖａｓ Ｒｅｓ １０１巻：７８～８６頁）に記載された左前下行枝（ＬＡＤ）の永久閉塞によって達成された。
心臓虚血性損傷は、７～１２週齢の成体雄マウスを使用して、以前に（Ｓｅｒｇｅｅｖａら、２０１４年、Ｃａｒｄｉｏｖａｓ Ｒｅｓ １０１巻：７８～８６頁）に記載された左前下行枝（ＬＡＤ）の永久閉塞によって達成された。
【0065】
経胸壁心エコー検査
経胸壁心エコー検査を実施して心機能に取り組んだ。手短に述べると、ＩＰ注射によってケタミンとキシラジンの混合物でマウスを麻酔し、胸郭から毛を剃毛した。３０ＭＨｚトランスデューサ（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．、カナダ、トロント）を備えたＶｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄシステムを使用した、鎮静状態の成体マウス（２％イソフルラン）に対する気管チューブ二次元経胸壁心エコー検査。Ｍｍｏｄｅ測定値を記録し、心拍数、壁厚、並びに拡張末期径及び収縮末期径を決定するために、心臓を乳頭筋のレベルで胸骨傍長軸及び短軸視野で撮像した。短縮率（拡張末期径から拡張末期径に対して正規化された収縮末期径を引いたものとして定義される）並びに駆出率（拡張末期容積に対して正規化された一回拍出量として定義される）を心収縮機能の指標として使用した。
経胸壁心エコー検査を実施して心機能に取り組んだ。手短に述べると、ＩＰ注射によってケタミンとキシラジンの混合物でマウスを麻酔し、胸郭から毛を剃毛した。３０ＭＨｚトランスデューサ（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．、カナダ、トロント）を備えたＶｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄシステムを使用した、鎮静状態の成体マウス（２％イソフルラン）に対する気管チューブ二次元経胸壁心エコー検査。Ｍｍｏｄｅ測定値を記録し、心拍数、壁厚、並びに拡張末期径及び収縮末期径を決定するために、心臓を乳頭筋のレベルで胸骨傍長軸及び短軸視野で撮像した。短縮率（拡張末期径から拡張末期径に対して正規化された収縮末期径を引いたものとして定義される）並びに駆出率（拡張末期容積に対して正規化された一回拍出量として定義される）を心収縮機能の指標として使用した。
【0066】
新生仔ラット心筋細胞におけるＨｍｇａ１のウイルス媒介過剰発現
１日齢の新生仔ラット心臓の心筋細胞をトリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１５４０００５４）による酵素解離によって単離し、Ｇｌａｄｋａら、２０２１年（Ｇｌａｄｋａら、２０２１年、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ １２巻：８４頁）に記載されているように培養した。Ｈｍｇａ１の過剰発現を、ｐＨＡＧＥ２－ＥＦ１ａ：Ｈｍｇａ１－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ構築物のレンチウイルス媒介送達によって達成した。
１日齢の新生仔ラット心臓の心筋細胞をトリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１５４０００５４）による酵素解離によって単離し、Ｇｌａｄｋａら、２０２１年（Ｇｌａｄｋａら、２０２１年、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ １２巻：８４頁）に記載されているように培養した。Ｈｍｇａ１の過剰発現を、ｐＨＡＧＥ２－ＥＦ１ａ：Ｈｍｇａ１－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ構築物のレンチウイルス媒介送達によって達成した。
【0067】
マウスへのウイルス注射
Ｈｍｇａ１発現を誘導するために、本発明者らは、ＣＭを優先的に標的とし、ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１カセットを担持する、ＡＡＶ９ウイルスを採用した。心筋梗塞に際しては、心臓に、虚血性損傷のリスクのある区域に接する領域に１５μｌのウイルス（１×１０＾１１ウイルス粒子／マウス）を２回注射した。
Ｈｍｇａ１発現を誘導するために、本発明者らは、ＣＭを優先的に標的とし、ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１カセットを担持する、ＡＡＶ９ウイルスを採用した。心筋梗塞に際しては、心臓に、虚血性損傷のリスクのある区域に接する領域に１５μｌのウイルス（１×１０＾１１ウイルス粒子／マウス）を２回注射した。
【0068】
マウスへの５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ）注射
ＭＩの１４日後の細胞周期リエントリーを評価するために、成体マウスに２日目から開始して１日２回の腹腔内注射を行った（マウス１匹あたり合計６回のＥｄＵ注射となる）。ＥｄＵ濃度を、各マウスの個々の体重（５０μｇ／ｇ）に基づいて決定した。
ＭＩの１４日後の細胞周期リエントリーを評価するために、成体マウスに２日目から開始して１日２回の腹腔内注射を行った（マウス１匹あたり合計６回のＥｄＵ注射となる）。ＥｄＵ濃度を、各マウスの個々の体重（５０μｇ／ｇ）に基づいて決定した。
【0069】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
パラフィン切片：４％ ＰＦＡでのｏ／ｎ固定後、心臓をＰＢＳで２回洗浄し、ＥｔＯＨで脱水し、パラフィンに包埋した。連続切片を１０μｍの厚さで作製した。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、使用したハイブリダイゼーション緩衝液がヘパリン及び酵母総ＲＮＡを含有しなかったことを除いて、以前に記載されたように（Ｍｏｏｒｍａｎら、２００１年、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ４９巻：１～８頁）パラフィン切片上で実施した。凍結切片を先に記載されたように得た。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをパラフィンについて実施したが、切片をプロテイナーゼＫ処置前に４％ＰＦＡ＋０．２５％グルタルアルデヒド中で１０分間予め固定した。さらに、スライドを染色直後に４％ＰＦＡ中で１時間固定した。
パラフィン切片：４％ ＰＦＡでのｏ／ｎ固定後、心臓をＰＢＳで２回洗浄し、ＥｔＯＨで脱水し、パラフィンに包埋した。連続切片を１０μｍの厚さで作製した。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、使用したハイブリダイゼーション緩衝液がヘパリン及び酵母総ＲＮＡを含有しなかったことを除いて、以前に記載されたように（Ｍｏｏｒｍａｎら、２００１年、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ４９巻：１～８頁）パラフィン切片上で実施した。凍結切片を先に記載されたように得た。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをパラフィンについて実施したが、切片をプロテイナーゼＫ処置前に４％ＰＦＡ＋０．２５％グルタルアルデヒド中で１０分間予め固定した。さらに、スライドを染色直後に４％ＰＦＡ中で１時間固定した。
【0070】
ｑＰＣＲ
総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を製造者の説明書に従って使用して心室から単離した。総ＲＮＡ（１μｇ）を、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、ｉＱ ＳＹＢＲｇｒｅｅｎキット及びＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲＡＤ）を使用して実施した。ハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈ又はＨｐｒｔ及びＥｅｆｅ１ｅを使用してデータを正規化した。
総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を製造者の説明書に従って使用して心室から単離した。総ＲＮＡ（１μｇ）を、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、ｉＱ ＳＹＢＲｇｒｅｅｎキット及びＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲＡＤ）を使用して実施した。ハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈ又はＨｐｒｔ及びＥｅｆｅ１ｅを使用してデータを正規化した。
【0071】
（免疫）組織化学
成体ゼブラフィッシュの心室を単離し、４％ＰＦＡ（シェーカー上で４℃ Ｏ／Ｎ）で固定した。翌日、心臓を４％スクロースリン酸緩衝液で３×１０分間洗浄し、その後、心臓が浮遊するまで３０％スクロースリン酸緩衝液中室温で少なくとも５時間インキュベートした。次いで、それらを低温培地に包埋した（ＯＣＴ）。心臓の凍結切片化を１０ミクロン厚で実施した。使用される一次抗体には、抗ＰＣＮＡ（Ｄａｋｏ ＃Ｍ０８７９、１：８００）、抗ＧＦＰ（Ａｖｅｓ Ｌａｂｓ ＃ＧＦＰ－１０１０、１：１０００）及び抗Ｍｅｆ２ｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＃ＳＣ３１３、Ｂｉｏｒｂｙｔ ＃ｏｒｂ２５６６８２、両方とも１：１０００）が含まれる。心臓切片を含むスライドを、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）中、８５℃で１５分間加熱することによって、抗原賦活化を実施した。マウスパラフィン切片に対して：４％ ＰＦＡ中でｏ／ｎ固定した後、心臓をＰＢＳ中で２回洗浄し、ＥｔＯＨ及びキシレン中で脱水し、パラフィン中に包埋した。連続切片を６μｍで作製した。心臓切片を含むスライドを、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）中、加圧下、１２０℃で１時間加熱することによって、抗原賦活化を実施した。使用した一次抗体は、抗ＨＭＧＡ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＃ｓｃ３９３２１３）、抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ９１１１）及び抗ＰＣＭ（Ｓｉｇｍａ ＃ＨＰＡ０２３３７０）であった。ＥｄＵを、説明書に従って、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ細胞増殖イメージングキット、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ｃ１０３４０を用いて可視化した。マウス組織及びゼブラフィッシュ組織の両方について、二次抗体には、１：５００の希釈で使用される抗ニワトリＡｌｅｘａ４８８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ２１１３３、１：５００）、抗ウサギＡｌｅｘａ５５５（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ２１１２７、１：５００）、抗マウスＣｙ５（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲ、＃１１８０９０、１：５００）が含まれる。ＤＡＢ染色は、ＤＡＢ基質キット（ＳＫ－４１００）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて実施した。核をＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）染色によって示した。免疫蛍光染色の画像は、Ｌｅｉｃａ Ｓｐ８顕微鏡で取得した単一の光学面である。
成体ゼブラフィッシュの心室を単離し、４％ＰＦＡ（シェーカー上で４℃ Ｏ／Ｎ）で固定した。翌日、心臓を４％スクロースリン酸緩衝液で３×１０分間洗浄し、その後、心臓が浮遊するまで３０％スクロースリン酸緩衝液中室温で少なくとも５時間インキュベートした。次いで、それらを低温培地に包埋した（ＯＣＴ）。心臓の凍結切片化を１０ミクロン厚で実施した。使用される一次抗体には、抗ＰＣＮＡ（Ｄａｋｏ ＃Ｍ０８７９、１：８００）、抗ＧＦＰ（Ａｖｅｓ Ｌａｂｓ ＃ＧＦＰ－１０１０、１：１０００）及び抗Ｍｅｆ２ｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＃ＳＣ３１３、Ｂｉｏｒｂｙｔ ＃ｏｒｂ２５６６８２、両方とも１：１０００）が含まれる。心臓切片を含むスライドを、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）中、８５℃で１５分間加熱することによって、抗原賦活化を実施した。マウスパラフィン切片に対して：４％ ＰＦＡ中でｏ／ｎ固定した後、心臓をＰＢＳ中で２回洗浄し、ＥｔＯＨ及びキシレン中で脱水し、パラフィン中に包埋した。連続切片を６μｍで作製した。心臓切片を含むスライドを、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）中、加圧下、１２０℃で１時間加熱することによって、抗原賦活化を実施した。使用した一次抗体は、抗ＨＭＧＡ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＃ｓｃ３９３２１３）、抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ９１１１）及び抗ＰＣＭ（Ｓｉｇｍａ ＃ＨＰＡ０２３３７０）であった。ＥｄＵを、説明書に従って、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ細胞増殖イメージングキット、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ｃ１０３４０を用いて可視化した。マウス組織及びゼブラフィッシュ組織の両方について、二次抗体には、１：５００の希釈で使用される抗ニワトリＡｌｅｘａ４８８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ２１１３３、１：５００）、抗ウサギＡｌｅｘａ５５５（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ２１１２７、１：５００）、抗マウスＣｙ５（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲ、＃１１８０９０、１：５００）が含まれる。ＤＡＢ染色は、ＤＡＢ基質キット（ＳＫ－４１００）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて実施した。核をＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）染色によって示した。免疫蛍光染色の画像は、Ｌｅｉｃａ Ｓｐ８顕微鏡で取得した単一の光学面である。
【0072】
定量及び統計
全てのデータを二重盲検様式で定量した。特に明記しない限り、統計的検定は対応のないＴ検定によって実施した。少なくとも３つの心臓の、心臓１つあたり３つの切片の創傷境界から１５０μｍ以内に位置する心筋細胞に対して、境界域特異的集団の組織学的定量化を実施した。出生後の発達を通してＨｍｇａ１発現を比較するｑＰＣＲの結果（図２）を、一元配置ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して統計的に試験した。異なる時点での標的遺伝子発現を比較するｑＰＣＲの結果を、二元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的に試験した。
全てのデータを二重盲検様式で定量した。特に明記しない限り、統計的検定は対応のないＴ検定によって実施した。少なくとも３つの心臓の、心臓１つあたり３つの切片の創傷境界から１５０μｍ以内に位置する心筋細胞に対して、境界域特異的集団の組織学的定量化を実施した。出生後の発達を通してＨｍｇａ１発現を比較するｑＰＣＲの結果（図２）を、一元配置ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して統計的に試験した。異なる時点での標的遺伝子発現を比較するｑＰＣＲの結果を、二元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的に試験した。
【0073】
ＮＲＧ１のゼブラフィッシュ腹腔内注射
ヒト組換えＮＲＧ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：組換えヒトヘレグリン－ｂ１、カタログ番号：１００－０３）の腹腔内注射を、Ｋｉｎｋｅｌら（Ｋｉｎｋｅｌら、２０１０年、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ４２巻：ｅ２１２６頁）によって記載されるように実施した。ＭＳ２２２（０．０３２％ ｗｔ／ｖｏｌ）を使用して魚を鎮静させた。ハミルトンシリンジ（ゲージ３０）を使用し、使用前に７０％エタノールで洗浄し、引き続いてＰＢＳで２回洗浄して、注射を実施した。注入量を魚の重量（３０μｌ／ｇ）に対して調整し、単回注射には６０μｇ／ｋｇのヒト組換えＮＲＧ１（ＰＢＳ／ＢＳＡ ０．１％で希釈）を含めた。
ヒト組換えＮＲＧ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：組換えヒトヘレグリン－ｂ１、カタログ番号：１００－０３）の腹腔内注射を、Ｋｉｎｋｅｌら（Ｋｉｎｋｅｌら、２０１０年、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ４２巻：ｅ２１２６頁）によって記載されるように実施した。ＭＳ２２２（０．０３２％ ｗｔ／ｖｏｌ）を使用して魚を鎮静させた。ハミルトンシリンジ（ゲージ３０）を使用し、使用前に７０％エタノールで洗浄し、引き続いてＰＢＳで２回洗浄して、注射を実施した。注入量を魚の重量（３０μｌ／ｇ）に対して調整し、単回注射には６０μｇ／ｋｇのヒト組換えＮＲＧ１（ＰＢＳ／ＢＳＡ ０．１％で希釈）を含めた。
【0074】
Ｔｏｍｏ配列決定
蛍光立体視鏡下で、損傷したマウス心臓を単離し、長手方向に切開し、ｋａｔｕｓｈｋａシグナルに基づいて組織を選択した。損傷の一部分、ｋａｔｕｓｈｋａシグナル及び遠隔心筋の一部分をそれぞれ含む損傷した心臓（ｎ＝３）から組織を単離した。Ｔｏｍｏ－ｓｅｑを以前に記載されたように実施し（Ｊｕｎｋｅｒら、２０１４年、Ｃｅｌｌ １５９巻：６６２～６７５頁）、これにより組織をＪｕｎｇ組織凍結培地（Ｌｅｉｃａ）に包埋し、損傷した区域から遠隔心筋まで２０ｕｍで切片化し、そのうち切片を５つごとに単一のチューブに回収した。下流処理中の技術的変動を補正するために規定量のスパイクインＲＮＡを添加した後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して各チューブからＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ－ｓｅｑを、チューブ特異的バーコードを含有するプライマーを使用した逆転写を含め、以前に記載されたように（Ｊｕｎｋｅｒら、２０１４年、Ｃｅｌｌ １５９巻：６６２～６７５頁）実施した。後でバーコードを使用して標識転写物の位置的起源を決定することができるので、ｃＤＮＡのバーコード化により材料のプールを可能にした。ｃＤＮＡのプール後、線形増幅及び配列決定を行った。
蛍光立体視鏡下で、損傷したマウス心臓を単離し、長手方向に切開し、ｋａｔｕｓｈｋａシグナルに基づいて組織を選択した。損傷の一部分、ｋａｔｕｓｈｋａシグナル及び遠隔心筋の一部分をそれぞれ含む損傷した心臓（ｎ＝３）から組織を単離した。Ｔｏｍｏ－ｓｅｑを以前に記載されたように実施し（Ｊｕｎｋｅｒら、２０１４年、Ｃｅｌｌ １５９巻：６６２～６７５頁）、これにより組織をＪｕｎｇ組織凍結培地（Ｌｅｉｃａ）に包埋し、損傷した区域から遠隔心筋まで２０ｕｍで切片化し、そのうち切片を５つごとに単一のチューブに回収した。下流処理中の技術的変動を補正するために規定量のスパイクインＲＮＡを添加した後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して各チューブからＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ－ｓｅｑを、チューブ特異的バーコードを含有するプライマーを使用した逆転写を含め、以前に記載されたように（Ｊｕｎｋｅｒら、２０１４年、Ｃｅｌｌ １５９巻：６６２～６７５頁）実施した。後でバーコードを使用して標識転写物の位置的起源を決定することができるので、ｃＤＮＡのバーコード化により材料のプールを可能にした。ｃＤＮＡのプール後、線形増幅及び配列決定を行った。
【0075】
単一細胞ＲＮＡ配列決定
高いｍＣｉｔｒｉｎｅ発現を示すＴｇ（ｎｐｐａ：ｍＣｉｔｒｉｎｅ）陽性細胞を、損傷した（ｃｙｏｉｎｊｕｒｅｄ）ゼブラフィッシュ心臓から単離した（損傷７日後）。１２個のｈｍｇａ１ａ－／－変異心臓から、７６８個の細胞を単離した。１２個のｈｍｇａ１ａ＋／＋野生型心臓から、７６８個の細胞を単離した。ＳＯＲＴ－ｓｅｑ（Ｍｕｒａｒｏら、２０１６年、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ３巻：３８５～３９４頁）を使用して単一細胞配列決定ライブラリーを調製した。生細胞を、バーコード化プライマー、スパイクインＲＮＡ及びｄＮＴＰを含む液滴を含有するベーパーロック油（Ｖａｐｏｒ－Ｌｏｃｋ ｏｉｌ）を含む３８４ウェルプレートに選別し、続いてロボット液体ハンドラーを使用して熱誘導細胞溶解及びｃＤＮＡ合成を行った。プライマーは、２４ｂｐポリＴストレッチ、４ｂｐランダム分子バーコード（ＵＭＩ）、細胞特異的８ｂｐバーコード、５’Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ低分子ＲＮＡキットアダプター及びＴ７プロモーターからなるものであった。６５℃で５分間の細胞溶解後、ＲＴ及び第２の鎖混合物をＮａｎｏｄｒｏｐ ＩＩ液体処理プラットフォーム（Ｉｎｎｏｖａｄｙｎｅ）で分配した。１つのライブラリーに全ての細胞をプールした後、水相を油相から分離し、続いてＩＶＴ転写を行った。ＣＥＬ－Ｓｅｑ２プロトコルをライブラリー調製に使用した（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙら、２０１６年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １７巻：１～７頁）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ低分子ＲＮＡプライマー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームで７５ｂｐのリード長でペアエンド配列決定した。
高いｍＣｉｔｒｉｎｅ発現を示すＴｇ（ｎｐｐａ：ｍＣｉｔｒｉｎｅ）陽性細胞を、損傷した（ｃｙｏｉｎｊｕｒｅｄ）ゼブラフィッシュ心臓から単離した（損傷７日後）。１２個のｈｍｇａ１ａ－／－変異心臓から、７６８個の細胞を単離した。１２個のｈｍｇａ１ａ＋／＋野生型心臓から、７６８個の細胞を単離した。ＳＯＲＴ－ｓｅｑ（Ｍｕｒａｒｏら、２０１６年、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ３巻：３８５～３９４頁）を使用して単一細胞配列決定ライブラリーを調製した。生細胞を、バーコード化プライマー、スパイクインＲＮＡ及びｄＮＴＰを含む液滴を含有するベーパーロック油（Ｖａｐｏｒ－Ｌｏｃｋ ｏｉｌ）を含む３８４ウェルプレートに選別し、続いてロボット液体ハンドラーを使用して熱誘導細胞溶解及びｃＤＮＡ合成を行った。プライマーは、２４ｂｐポリＴストレッチ、４ｂｐランダム分子バーコード（ＵＭＩ）、細胞特異的８ｂｐバーコード、５’Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ低分子ＲＮＡキットアダプター及びＴ７プロモーターからなるものであった。６５℃で５分間の細胞溶解後、ＲＴ及び第２の鎖混合物をＮａｎｏｄｒｏｐ ＩＩ液体処理プラットフォーム（Ｉｎｎｏｖａｄｙｎｅ）で分配した。１つのライブラリーに全ての細胞をプールした後、水相を油相から分離し、続いてＩＶＴ転写を行った。ＣＥＬ－Ｓｅｑ２プロトコルをライブラリー調製に使用した（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙら、２０１６年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １７巻：１～７頁）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ低分子ＲＮＡプライマー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームで７５ｂｐのリード長でペアエンド配列決定した。
【0076】
ＡＴＡＣ配列決定及びＲＮＡ配列決定
タモキシフェン処置の１４日後に全ゼブラフィッシュ心臓に対して核単離を実施した。魚に、ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰの心筋細胞特異的過剰発現を可能にする３つの導入遺伝子、ｔｇ（ｕｂｉ：Ｌｏｘｐ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰ）、Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＤｓＲｅｄ２－ＮＬＳ）；Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲ）ｐｄ１０を含ませるか、又は２つの導入遺伝子（Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＤｓＲｅｄ２－ＮＬＳ）；Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲ）ｐｄ１０）のみを含有する対照魚を形成した。両方ともそれぞれ２０個の心臓に由来する、合計５０，０００個のＤｓＲｅｄ陽性対照核及び４５，０００個のＤｓＲｅｄ／ＧＦＰ＋ｈｍｇａ１ａ核を選別した。ＤＮＡを単離し、Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏら、２０１３年（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏら、２０１３年、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０巻：１２１３～１２１８頁）に以前に記載されたように、トランスポザーゼＴＤＥ１（ＮｅｘｔｅｒａキットからのＮｅｘｔｅｒａ Ｔｎ５トランスポザーゼ；Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＦＣ－１２１－１０３０）で処置した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリーを作製し、ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームを用いて配列決定した。タモキシフェン処置の１４日後に全ゼブラフィッシュ心室に対してバルクＲＮＡ配列決定を実施した。魚に、ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰの心筋細胞特異的過剰発現を可能にする２つの導入遺伝子、ｔｇ（ｕｂｉ：Ｌｏｘｐ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰ）；Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲ）ｐｄ１０を含ませるか、又は１つの導入遺伝子（Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲ）ｐｄ１０）のみを含有する対照魚を形成した。Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＲＮＡを単離した。ライブラリーの調製を、（Ｊｕｎｋｅｒら、２０１４年、Ｃｅｌｌ １５９巻：６６２～６７５頁）に記載されるＣＥＬ－Ｓｅｑ１プロトコルに従って実施した。ここでも、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリーを生成し、ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームを用いて配列決定した。
タモキシフェン処置の１４日後に全ゼブラフィッシュ心臓に対して核単離を実施した。魚に、ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰの心筋細胞特異的過剰発現を可能にする３つの導入遺伝子、ｔｇ（ｕｂｉ：Ｌｏｘｐ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰ）、Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＤｓＲｅｄ２－ＮＬＳ）；Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲ）ｐｄ１０を含ませるか、又は２つの導入遺伝子（Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＤｓＲｅｄ２－ＮＬＳ）；Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲ）ｐｄ１０）のみを含有する対照魚を形成した。両方ともそれぞれ２０個の心臓に由来する、合計５０，０００個のＤｓＲｅｄ陽性対照核及び４５，０００個のＤｓＲｅｄ／ＧＦＰ＋ｈｍｇａ１ａ核を選別した。ＤＮＡを単離し、Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏら、２０１３年（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏら、２０１３年、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０巻：１２１３～１２１８頁）に以前に記載されたように、トランスポザーゼＴＤＥ１（ＮｅｘｔｅｒａキットからのＮｅｘｔｅｒａ Ｔｎ５トランスポザーゼ；Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＦＣ－１２１－１０３０）で処置した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリーを作製し、ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームを用いて配列決定した。タモキシフェン処置の１４日後に全ゼブラフィッシュ心室に対してバルクＲＮＡ配列決定を実施した。魚に、ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰの心筋細胞特異的過剰発現を可能にする２つの導入遺伝子、ｔｇ（ｕｂｉ：Ｌｏｘｐ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰ）；Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲ）ｐｄ１０を含ませるか、又は１つの導入遺伝子（Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲ）ｐｄ１０）のみを含有する対照魚を形成した。Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＲＮＡを単離した。ライブラリーの調製を、（Ｊｕｎｋｅｒら、２０１４年、Ｃｅｌｌ １５９巻：６６２～６７５頁）に記載されるＣＥＬ－Ｓｅｑ１プロトコルに従って実施した。ここでも、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリーを生成し、ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームを用いて配列決定した。
【0077】
生物情報学的分析：Ｔｏｍｏ配列決定データ
マッピングを、ゼブラフィッシュ参照アセンブリバージョン９（Ｚｖ９）及びマウス参照アセンブリバージョン９（ｍｍ９）に対して実施した。全ての遺伝子のＺスコア（平均を上回る標準偏差の数）のｌｏｇ２変換された倍数変化（ｚｌｆｃ）に基づいて、Ｔｏｍｏ配列決定分析を行った。バイオインフォマティクス分析の大部分は、カスタムコード（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２０１３年）を使用してＲソフトウェアで実施した。全データセット（Ｚスコア変換後）に対する階層的クラスタ分析を、４未満の連続切片（Ｚスコア＞１）にピークを有する全ての遺伝子に対して実施した。マーカー遺伝子発現（ＢＺマーカーＮｐｐａ、Ｎｐｐｂ、Ｄｅｓ）と共に、階層的クラスタリング分析に基づいて、本発明者らは、本発明者らのデータセット内の損傷区域（ＩＡ）、境界域（ＢＺ）及び遠隔心筋（ＲＭ）の位置を定義した。ゼブラフィッシュの境界域とマウスの境界域とを転写的に比較する（transcriptionally compare）ために、本発明者らは最初に、異なる時点からの全ての損傷区域、境界域及び遠隔領域を種ごとに１つの種固有のデータセットにプールし、ゼブラフィッシュのデータセットで１４（ＩＡ）、４３（ＢＺ）及び４３（ＲＭ）の切片、並びにマウスのデータセットで１４（ＩＡ）、６５（ＢＺ）及び５４（ＲＭ）の切片を得た。ＲパッケージｅｄｇｅＲ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２００９年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６巻：１３９～１４０頁）を使用して、これらの組み合わせリストに対して遺伝子オントロジー分析を実施した。これらの遺伝子リストを、オンラインツールＤＡＶＩＤ（Ｈｕａｎｇら、２００９年、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、４巻：４４～５７頁）を使用してＧＯ分析に供した。ゼブラフィッシュの境界域とマウスの境界域との間の転写比較を、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｖ８９）で注釈を付けた注釈付き遺伝子対を散布図でプロットすることによって実施した。注釈付きホモログを有しない遺伝子を分析から除外した。複数の注釈付きホモログを有する遺伝子を、別々の遺伝子対としてプロットした。次に、以下の閾値を使用して遺伝子対を選択した。マウスＢＺ及びゼブラフィッシュＢＺの両方で上方制御：ゼブラフィッシュ ｌｏｇＦＣ＞０．５、Ｐ値＜０．０５；マウス：ｌｏｇＦＣ＞０．５、Ｐ値＜０．０５。マウスＢＺ及びゼブラフィッシュＢＺの両方で下方制御：ゼブラフィッシュ：ｌｏｇＦＣ＜－０．５、Ｐ値＜０．０５；マウス：ｌｏｇＦＣ＜－０．５、Ｐ値＜０．０５。ゼブラフィッシュＢＺで上方制御されたがマウスＢＺではそうではない：ゼブラフィッシュ：ｌｏｇＦＣ＞０．５、Ｐ値＜０．０５；マウス：ｌｏｇＦＣ＜０。マウスＢＺで上方制御されたがゼブラフィッシュＢＺではそうではない：ゼブラフィッシュｌｏｇＦＣ＜０；マウス：ｌｏｇＦＣ＞０．５、Ｐ値＜０．０５。さらに、ゼブラフィッシュ及びマウス特異的遺伝子対を決定した後、パラロガス遺伝子間の冗長な機能を考慮して、少なくとも１つのパラロガス遺伝子が選択閾値外の発現を示した遺伝子対を除去した。これらの遺伝子対を、オンラインツールＤＡＶＩＤ（Ｈｕａｎｇら、２００９年、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、４巻：４４～５７頁）においてそれらのマウス名を使用してＧＯ分析に供した。
マッピングを、ゼブラフィッシュ参照アセンブリバージョン９（Ｚｖ９）及びマウス参照アセンブリバージョン９（ｍｍ９）に対して実施した。全ての遺伝子のＺスコア（平均を上回る標準偏差の数）のｌｏｇ２変換された倍数変化（ｚｌｆｃ）に基づいて、Ｔｏｍｏ配列決定分析を行った。バイオインフォマティクス分析の大部分は、カスタムコード（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２０１３年）を使用してＲソフトウェアで実施した。全データセット（Ｚスコア変換後）に対する階層的クラスタ分析を、４未満の連続切片（Ｚスコア＞１）にピークを有する全ての遺伝子に対して実施した。マーカー遺伝子発現（ＢＺマーカーＮｐｐａ、Ｎｐｐｂ、Ｄｅｓ）と共に、階層的クラスタリング分析に基づいて、本発明者らは、本発明者らのデータセット内の損傷区域（ＩＡ）、境界域（ＢＺ）及び遠隔心筋（ＲＭ）の位置を定義した。ゼブラフィッシュの境界域とマウスの境界域とを転写的に比較する（transcriptionally compare）ために、本発明者らは最初に、異なる時点からの全ての損傷区域、境界域及び遠隔領域を種ごとに１つの種固有のデータセットにプールし、ゼブラフィッシュのデータセットで１４（ＩＡ）、４３（ＢＺ）及び４３（ＲＭ）の切片、並びにマウスのデータセットで１４（ＩＡ）、６５（ＢＺ）及び５４（ＲＭ）の切片を得た。ＲパッケージｅｄｇｅＲ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２００９年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６巻：１３９～１４０頁）を使用して、これらの組み合わせリストに対して遺伝子オントロジー分析を実施した。これらの遺伝子リストを、オンラインツールＤＡＶＩＤ（Ｈｕａｎｇら、２００９年、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、４巻：４４～５７頁）を使用してＧＯ分析に供した。ゼブラフィッシュの境界域とマウスの境界域との間の転写比較を、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｖ８９）で注釈を付けた注釈付き遺伝子対を散布図でプロットすることによって実施した。注釈付きホモログを有しない遺伝子を分析から除外した。複数の注釈付きホモログを有する遺伝子を、別々の遺伝子対としてプロットした。次に、以下の閾値を使用して遺伝子対を選択した。マウスＢＺ及びゼブラフィッシュＢＺの両方で上方制御：ゼブラフィッシュ ｌｏｇＦＣ＞０．５、Ｐ値＜０．０５；マウス：ｌｏｇＦＣ＞０．５、Ｐ値＜０．０５。マウスＢＺ及びゼブラフィッシュＢＺの両方で下方制御：ゼブラフィッシュ：ｌｏｇＦＣ＜－０．５、Ｐ値＜０．０５；マウス：ｌｏｇＦＣ＜－０．５、Ｐ値＜０．０５。ゼブラフィッシュＢＺで上方制御されたがマウスＢＺではそうではない：ゼブラフィッシュ：ｌｏｇＦＣ＞０．５、Ｐ値＜０．０５；マウス：ｌｏｇＦＣ＜０。マウスＢＺで上方制御されたがゼブラフィッシュＢＺではそうではない：ゼブラフィッシュｌｏｇＦＣ＜０；マウス：ｌｏｇＦＣ＞０．５、Ｐ値＜０．０５。さらに、ゼブラフィッシュ及びマウス特異的遺伝子対を決定した後、パラロガス遺伝子間の冗長な機能を考慮して、少なくとも１つのパラロガス遺伝子が選択閾値外の発現を示した遺伝子対を除去した。これらの遺伝子対を、オンラインツールＤＡＶＩＤ（Ｈｕａｎｇら、２００９年、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、４巻：４４～５７頁）においてそれらのマウス名を使用してＧＯ分析に供した。
【0078】
生物情報学的分析：単一細胞ＲＮＡ配列決定データ
ウェルあたり１つの細胞を含有する、合計で８つの３８４ウェルプレートを配列決定した。遺伝子型（ｈｍｇａ１ａ－／－又は野生型）ごとに４つのプレートを得た。野生型含有プレートのうちの１つの配列決定が失敗したので、データは得られなかった。マッピングは、ゼブラフィッシュ参照アセンブリバージョン９（Ｚｖ９）に対して実施した。頻度に対してプロットされたｌｏｇ１０総リードの分布に基づいて、本発明者らは、さらなる分析の前に細胞あたり最低６００リードでカットオフを導入し、分析する細胞の量を野生型細胞６５３個及びｈｍｇａ１ａ－／－細胞６５８個（合計１３１１個の細胞）に減少させた。バッチ効果を分析したところ、特定のクラスタのプレート特異的クラスタリングは示されなかった。次に、単一細胞ＲＮＡ配列決定データを、以前に公開されたＲａｃｅＩＤアルゴリズム（Ｇｒｕｎら、２０１５年、Ｎａｔｕｒｅ ５２５巻：２５１～２５５頁）の更新版（ＲａｃｅＩＤ２）を使用して分析し、転写的に異なる特徴（transcriptionally distinct characteristics）を有する６つの主要な細胞クラスタの特徴解析結果を得た。以前に公開されたように（Ｇｒｕｎら、２０１６年、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９巻：２６６～２７７頁）ＳｔｅｍＩＤによって識別されるクラスタ間の一連の有意なリンクとして定義される特定の分化軌跡に沿って共発現遺伝子のモジュールを同定するために、これらのリンクに割り当てられた全ての細胞を、それらの投影座標（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）に基づいて擬似時間的順序で組み立てた。次に、少なくとも１つの細胞に少なくとも２つの転写物が存在しない全ての遺伝子を、その後の分析から破棄する。次に、各遺伝子のｚ変換された発現プロファイルの局所回帰を分化軌跡に沿って計算する。これらの擬似時間的遺伝子発現プロファイルを、１０００個のノードを有する一次元自己組織化マップ（ＳＯＭ）を計算することによって位相的に順序付ける。クラスタ化されたプロファイルの数に対してノードの数が多いため、同様のプロファイルが同じノードに割り当てられる。共発現遺伝子モジュールの可視化のために、３つを超える割り当てられたプロファイルを有するノードのみが保持される。ピアソンの相関係数＞０．９を示す平均プロファイルを有する隣接ノードを、共通の遺伝子発現モジュールにマージする。これらのモジュールは、最終擬似時間マップに示されている。分析を、以前に公開されているように実施した（Ｇｒｕｎら、２０１６年、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９巻：２６６～２７７頁）。
ウェルあたり１つの細胞を含有する、合計で８つの３８４ウェルプレートを配列決定した。遺伝子型（ｈｍｇａ１ａ－／－又は野生型）ごとに４つのプレートを得た。野生型含有プレートのうちの１つの配列決定が失敗したので、データは得られなかった。マッピングは、ゼブラフィッシュ参照アセンブリバージョン９（Ｚｖ９）に対して実施した。頻度に対してプロットされたｌｏｇ１０総リードの分布に基づいて、本発明者らは、さらなる分析の前に細胞あたり最低６００リードでカットオフを導入し、分析する細胞の量を野生型細胞６５３個及びｈｍｇａ１ａ－／－細胞６５８個（合計１３１１個の細胞）に減少させた。バッチ効果を分析したところ、特定のクラスタのプレート特異的クラスタリングは示されなかった。次に、単一細胞ＲＮＡ配列決定データを、以前に公開されたＲａｃｅＩＤアルゴリズム（Ｇｒｕｎら、２０１５年、Ｎａｔｕｒｅ ５２５巻：２５１～２５５頁）の更新版（ＲａｃｅＩＤ２）を使用して分析し、転写的に異なる特徴（transcriptionally distinct characteristics）を有する６つの主要な細胞クラスタの特徴解析結果を得た。以前に公開されたように（Ｇｒｕｎら、２０１６年、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９巻：２６６～２７７頁）ＳｔｅｍＩＤによって識別されるクラスタ間の一連の有意なリンクとして定義される特定の分化軌跡に沿って共発現遺伝子のモジュールを同定するために、これらのリンクに割り当てられた全ての細胞を、それらの投影座標（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）に基づいて擬似時間的順序で組み立てた。次に、少なくとも１つの細胞に少なくとも２つの転写物が存在しない全ての遺伝子を、その後の分析から破棄する。次に、各遺伝子のｚ変換された発現プロファイルの局所回帰を分化軌跡に沿って計算する。これらの擬似時間的遺伝子発現プロファイルを、１０００個のノードを有する一次元自己組織化マップ（ＳＯＭ）を計算することによって位相的に順序付ける。クラスタ化されたプロファイルの数に対してノードの数が多いため、同様のプロファイルが同じノードに割り当てられる。共発現遺伝子モジュールの可視化のために、３つを超える割り当てられたプロファイルを有するノードのみが保持される。ピアソンの相関係数＞０．９を示す平均プロファイルを有する隣接ノードを、共通の遺伝子発現モジュールにマージする。これらのモジュールは、最終擬似時間マップに示されている。分析を、以前に公開されているように実施した（Ｇｒｕｎら、２０１６年、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９巻：２６６～２７７頁）。
【0079】
生物情報学的分析：ＡＴＡＣ配列決定データ及びＲＮＡ配列決定データ
ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータ及びＲＮＡ－ｓｅｑデータの両方を、ゼブラフィッシュ参照アセンブリバージョン１０（ＤａｎＲｅｒ１０）に対してマッピングした。ＡＴＡＣ配列決定データをＧａｌａｘｙウェブプラットフォームにアップロードし、本発明者らはｕｓｅｇａｌａｘｙ．ｏｒｇの公開サーバを使用してデータを分析した（Ａｕｇｈａｎら、２０１６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４巻：Ｗ３～Ｗ１０頁）。Ｂｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ及びＳａｌｚｂｅｒｇ、２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９巻：３５７～９５９頁）を用いて、ＡＴＡＣ配列決定データのマッピングを行った。有意領域をコールするために０．０５（最小ＦＤＲ）カットオフの最小ｑ値を使用して、ＭＡＣＳ２ピークコーリングを使用してピークをコールした。Ｑ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順（－－ｑ値）を用いてｐ値から計算した。接近可能な領域のゲノム分布を、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＢｉｏＭａｒｔ，ＤａｎＲｅｒ１０ビルドの注釈を使用して定義した。プロモーター接近可能性分析のために、ＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナルを、１５００ｂｐ上流及び５００ｂｐのカノニカルＴＳＳとして定義されるプロモータービンに分配した（ＢｉｏＭａｒｔ、ＤａｎＲｅｒ１０ビルド）。モチーフ濃縮分析を、ウェブベースのＭＥＭＥ ｓｕｉｔｅ ｔｏｏｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｔｉｆ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＡＭＥ ｖ５．３．０）（Ｂａｉｌｅｙら、２００９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、４３巻：Ｗ３９～Ｗ４９頁；ＭｃＬｅａｙ＆Ｂａｉｌｅｙ、２０１０年、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１１巻：１６５頁）を使用して実施した。差次的に発現した遺伝子を、ＲパッケージｅｄｇｅＲ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２００９年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６巻：１３９～１４０頁）を使用してＲＮＡ配列決定データから得た。これらの遺伝子リストを、オンラインツールＤＡＶＩＤ（Ｈｕａｎｇら、２００９年、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、４巻：４４～５７頁）を使用してＧＯ分析に供した。
ＡＴＡＣ－ｓｅｑデータ及びＲＮＡ－ｓｅｑデータの両方を、ゼブラフィッシュ参照アセンブリバージョン１０（ＤａｎＲｅｒ１０）に対してマッピングした。ＡＴＡＣ配列決定データをＧａｌａｘｙウェブプラットフォームにアップロードし、本発明者らはｕｓｅｇａｌａｘｙ．ｏｒｇの公開サーバを使用してデータを分析した（Ａｕｇｈａｎら、２０１６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４巻：Ｗ３～Ｗ１０頁）。Ｂｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ及びＳａｌｚｂｅｒｇ、２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９巻：３５７～９５９頁）を用いて、ＡＴＡＣ配列決定データのマッピングを行った。有意領域をコールするために０．０５（最小ＦＤＲ）カットオフの最小ｑ値を使用して、ＭＡＣＳ２ピークコーリングを使用してピークをコールした。Ｑ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順（－－ｑ値）を用いてｐ値から計算した。接近可能な領域のゲノム分布を、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＢｉｏＭａｒｔ，ＤａｎＲｅｒ１０ビルドの注釈を使用して定義した。プロモーター接近可能性分析のために、ＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナルを、１５００ｂｐ上流及び５００ｂｐのカノニカルＴＳＳとして定義されるプロモータービンに分配した（ＢｉｏＭａｒｔ、ＤａｎＲｅｒ１０ビルド）。モチーフ濃縮分析を、ウェブベースのＭＥＭＥ ｓｕｉｔｅ ｔｏｏｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｔｉｆ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＡＭＥ ｖ５．３．０）（Ｂａｉｌｅｙら、２００９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、４３巻：Ｗ３９～Ｗ４９頁；ＭｃＬｅａｙ＆Ｂａｉｌｅｙ、２０１０年、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１１巻：１６５頁）を使用して実施した。差次的に発現した遺伝子を、ＲパッケージｅｄｇｅＲ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２００９年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６巻：１３９～１４０頁）を使用してＲＮＡ配列決定データから得た。これらの遺伝子リストを、オンラインツールＤＡＶＩＤ（Ｈｕａｎｇら、２００９年、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、４巻：４４～５７頁）を使用してＧＯ分析に供した。
【0080】
（結果）
転写境界域プロファイルの比較により、種特異的遺伝子発現が明らかとなる
本発明者らは、以前に、空間分解トランスクリプトミクス（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ）（ＴＯＭＯ－ｓｅｑ）を使用して、損傷の３、７、及び１４日後（ｄｐｉ）のゼブラフィッシュＢＺにおける遺伝子発現を決定した（Ｊｕｎｋｅｒら、２０１４年、Ｃｅｌｌ １５９巻：６６２～６７５頁；Ｗｕら、２０１５年、Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｃｅｌｌ ３６巻：３６～４９頁）。ゼブラフィッシュＢＺとマウスＢＺとの比較を可能にするために、本発明者らは、損傷したマウス心臓に対して同様のＴＯＭＯ－ｓｅｑ実験を実施した。マウスを、左冠動脈前下行枝の永久閉塞による心筋梗塞（myocardial infarction：ＭＩ）に供した。ＢＡＣ－Ｎｐｐｂ－ＫａｔｕｓｈｋａマウスにおけるＮｐｐｂ／Ｋａｔｕｓｈｋａの空間パターンにより、ＢＺの位置特定が可能となり（Ｓｅｒｇｅｅｖａら、２０１４年）、周囲の損傷区域及び遠隔心筋（remote myocardium）を伴うＢＺをＭＩの３、７及び１４日後に単離した（図１Ａ）。次に、単離した組織を損傷区域から遠隔区域まで凍結切片化し、各切片をＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）に供した。切片の各ペアワイズ組み合わせに対する全ての遺伝子にわたるピアソンの相関分析により、発現が異なる区域にある遺伝子のクラスタが明らかになった。これらの遺伝子クラスタ並びにマーカー遺伝子発現に基づいて、本発明者らは、ＴＯＭＯ－ｓｅｑデータセット（Ｌａｃｒａｚら、２０１７年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １３６巻：１３９６～１４０９頁；ｖａｎ Ｄｕｉｊｖｅｎｂｏｄｅｎら、２０１９年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １４０巻：８６４～８７９頁）内の損傷区域（クラスタ１、Ｒｈｏｃ、Ｆｓｔｌ１、Ｔｍｓｂ４ｘ）、境界域（クラスタ２、Ｎｐｐａ、Ｄｅｓ、Ａｎｋｒｄ１）及び遠隔心筋（クラスタ３、Ｔｎｎｔ２、Ｔｎｎｉ３、Ｅｃｈ１）の位置を同定し、これをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検証した（データは示さず）。
転写境界域プロファイルの比較により、種特異的遺伝子発現が明らかとなる
本発明者らは、以前に、空間分解トランスクリプトミクス（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ）（ＴＯＭＯ－ｓｅｑ）を使用して、損傷の３、７、及び１４日後（ｄｐｉ）のゼブラフィッシュＢＺにおける遺伝子発現を決定した（Ｊｕｎｋｅｒら、２０１４年、Ｃｅｌｌ １５９巻：６６２～６７５頁；Ｗｕら、２０１５年、Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｃｅｌｌ ３６巻：３６～４９頁）。ゼブラフィッシュＢＺとマウスＢＺとの比較を可能にするために、本発明者らは、損傷したマウス心臓に対して同様のＴＯＭＯ－ｓｅｑ実験を実施した。マウスを、左冠動脈前下行枝の永久閉塞による心筋梗塞（myocardial infarction：ＭＩ）に供した。ＢＡＣ－Ｎｐｐｂ－ＫａｔｕｓｈｋａマウスにおけるＮｐｐｂ／Ｋａｔｕｓｈｋａの空間パターンにより、ＢＺの位置特定が可能となり（Ｓｅｒｇｅｅｖａら、２０１４年）、周囲の損傷区域及び遠隔心筋（remote myocardium）を伴うＢＺをＭＩの３、７及び１４日後に単離した（図１Ａ）。次に、単離した組織を損傷区域から遠隔区域まで凍結切片化し、各切片をＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）に供した。切片の各ペアワイズ組み合わせに対する全ての遺伝子にわたるピアソンの相関分析により、発現が異なる区域にある遺伝子のクラスタが明らかになった。これらの遺伝子クラスタ並びにマーカー遺伝子発現に基づいて、本発明者らは、ＴＯＭＯ－ｓｅｑデータセット（Ｌａｃｒａｚら、２０１７年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １３６巻：１３９６～１４０９頁；ｖａｎ Ｄｕｉｊｖｅｎｂｏｄｅｎら、２０１９年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １４０巻：８６４～８７９頁）内の損傷区域（クラスタ１、Ｒｈｏｃ、Ｆｓｔｌ１、Ｔｍｓｂ４ｘ）、境界域（クラスタ２、Ｎｐｐａ、Ｄｅｓ、Ａｎｋｒｄ１）及び遠隔心筋（クラスタ３、Ｔｎｎｔ２、Ｔｎｎｉ３、Ｅｃｈ１）の位置を同定し、これをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検証した（データは示さず）。
【0081】
次に、本発明者らは、ＥｄｇｅＲアルゴリズムを使用して、損傷区域及び遠隔区域と比較してマウスＢＺにおいて差次的に発現した全ての遺伝子を同定した（データは示さず）。損傷したゼブラフィッシュ心臓の以前に生成されたＴＯＭＯ配列決定データセットに対して同様の分析を実施した（データは示さず。図１Ｂ参照）（Ｗｕら、２０１５年、Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｃｅｌｌ ３６巻：３６～４９頁）。異なる時点（３、７及び１４ｄｐｉ）からのマウスＢＺ及びゼブラフィッシュＢＺにおける差次的に発現した遺伝子をプールして、両種間の時間差を軽減した。マウス遺伝子及びゼブラフィッシュ遺伝子の発現を比較するために、本発明者らは、最初に、マウスゲノム及びゼブラフィッシュゲノムにおいて注釈付きホモログを有する全ての差次的に発現したＢＺ遺伝子を同定し、１１７７９のホモログ遺伝子対を得た。次に、本発明者らは、これらの全ての遺伝子対についてそれらのＬｏｇ倍数変化（ＬｏｇＦＣ）（ＢＺ対組織の残りの部分）を散布図にプロットし（図１Ｃ参照）、Ｐ値が０．０５未満且つＬｏｇＦＣが０．５を超える全ての遺伝子を選択した。これにより、両種のＢＺにおいて発現が増強された３３１個の遺伝子対及び両種のＢＺにおいて発現が減少した３２６個の遺伝子対が明らかになった。遺伝子オントロジー分析により、前記３３１個の上方制御された遺伝子においてはカルシウム結合及びアポトーシスの調節という細胞外マトリックスにおける機能を有する遺伝子が豊富であり、一方前記３２６個の下方制御された遺伝子対は酸化的リン酸化及び好気性呼吸などのミトコンドリアにおける機能を有することが明らかになった（データは示さず）。まとめると、これらの結果は、ゼブラフィッシュＢＺ細胞及びマウスＢＺ細胞の両方がそれらの酸素依存性代謝の下方制御を通じて損傷に応答していることを示し、以前の研究と一致しており、ゼブラフィッシュＢＺ ＣＭ及びマウスＢＺ ＣＭの両方が酸化的リン酸化における役割で遺伝子を下方制御することを示している（Ｈｏｎｋｏｏｐら、２０１９年、ＥＬｉｆｅ、８巻：１～２７頁；ｖａｎ Ｄｕｉｊｖｅｎｂｏｄｅｎら、２０１９年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １４０巻：８６４～８７９頁；Ｗｕら、２０１５年、Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｃｅｌｌ ３６巻：３６～４９頁）。
【0082】
ゼブラフィッシュ境界域とマウス境界域との間で観察された差異（データは示さず）は、損傷した哺乳動物の心臓の限られた再生能力に光を当て得るものであるためより興味深い。本発明者らは、マウスＢＺでは上方制御されるが、ゼブラフィッシュＢＺでは上方制御されない３６６の遺伝子対を同定した。これらの遺伝子対は、創傷治癒、細胞外マトリックスの構成及びＴＧＦｂシグナル伝達における機能を有し、これらは共に、ゼブラフィッシュＢＺとマウスＢＺとの間の線維化促進応答における大きな違いを示唆している（Ｉｋｅｕｃｈｉら、２００４年、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ ６４巻：５２６～５３５頁；Ｏｋａｄａら、２００５年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１１巻：２４３０～２４３７頁；Ｃｈａｂｌａｉｓ＆Ｊａｚｗｉｎｓｋａ，２０１２年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３９巻：１９２１～１９３０頁）。逆も同様に、本発明者らは、ゼブラフィッシュＢＺでは上方制御されるがマウスＢＺでは上方制御されない３７１個の遺伝子対を同定した（表１参照）。これらの遺伝子のいくつかについて、本発明者らは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを通してゼブラフィッシュにおいてＢＺが豊富に発現していること（BZ-enriched expression）を確認し、定量的ＰＣＲ分析を使用して、マウスＢＺにおけるＢＺ富化（BZ enrichment）の欠如を確認した（図２Ｂ、及びデータは示さず）。ゼブラフィッシュＢＺに特異的な３７１個の遺伝子対は、収縮装置のリモデリングに関連し得るアクチンフィラメント結合及びミオシン複合体などのプロセスにおける機能を有する。さらに、インスリン刺激に対する応答などの遺伝子オントロジーは、ゼブラフィッシュ心臓再生中のＣＭ増殖の調節におけるインスリンシグナル伝達及び代謝再プログラミングの重要な役割と一致している（Ｆｕｋｕｄａら、２０２０年、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ２１巻：ｅ４９７５２頁；Ｈｏｎｋｏｏｐら、２０１９年、ＥＬｉｆｅ、８巻：１～２７頁；Ｙ．Ｈｕａｎｇら、２０１３年、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、８巻：ｅ６７２６６頁）。
【0083】
要約すると、本発明者らは、ＴＯＭＯ－ｓｅｑを使用して損傷した成体マウス心臓のＢＺのトランスクリプトームを解明し、これを再生中のゼブラフィッシュ心臓のＢＺと比較した。ＢＺトランスクリプトームの比較により、ミトコンドリア酸化的リン酸化の減少などが共有されているプロセスであり、マウスＢＺにおける線維化応答の変化やゼブラフィッシュＢＺにおけるインスリンシグナル伝達などが種特異的なプロセスであることが明らかになった。まとめると、これらの結果は、心臓再生を促進するプロセス及び経路の同定につながり得る。
【0084】
Ｈｍｇａ１ａはゼブラフィッシュ心臓再生に必要である
本発明者らは、ゼブラフィッシュ特異的ＢＺ遺伝子のリストからｈｍｇａ１ａを選択したが、これはｈｍｇａ１ａがクロマチンに結合してクロマチンを弛緩させて細胞多能性及び自己再生を誘導及び維持する構造タンパク質をコードし（Ｂａｔｔｉｓｔａら、２００３年、ＦＡＳＥＢ Ｊ １７巻：１～２７頁；Ｋｉｓｈｉら、２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１５巻：１１２７～１１３３頁；Ｓｈａｈら、２０１２年、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７巻：ｅ４８５３３頁、Ｘｉａｎら、２０１７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ、８巻：１５００８頁）、心臓再生の調節における初期の役割を示唆しているためである。ＴＯＭＯ－ｓｅｑの結果を確認するために、本発明者らは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、損傷したゼブラフィッシュ及びマウス心臓におけるｈｍｇａ１ａ／Ｈｍｇａ１発現の空間的及び時間的な動態を特定した。損傷を受けていないゼブラフィッシュ心臓及び１ｄｐｉのゼブラフィッシュ心臓の両方において、ｈｍｇａ１ａ発現は検出不能であった（データは示さず）。３ｄｐｉでは、ｈｍｇａ１ａ発現は弱いが、ＢＺでは一貫しており、ＢＺ ＣＭでは７ｄｐｉでさらに増加し、堅牢なｈｍｇａ１ａ発現があった。対照的に、ゼブラフィッシュパラログｈｍｇａ１ｂは、ＢＺ ＣＭにおいて発現を示さなかった（データは示さず）。さらに、Ｈｍｇａ１発現は、損傷した成体マウス心臓のＢＺではほぼ検出不能であり（データは示さず）、これはｑＰＣＲによって確認された（データは示さず）。次に、本発明者らは、Ｈｍｇａ１発現が再生中の新生仔マウス心臓の再生窓と相関するかどうかを考えた。実際、本発明者らは、損傷を受けていない新生仔Ｐ１心臓全体でモザイクＨｍｇａ１発現を観察した（データは示さず）。重要なことに、ｑＰＣＲ分析により、Ｈｍｇａ１発現レベルは生後１週間で急速に低下し、マウス心臓の再生能力の喪失と一致することが実証された（図２）（Ｐｏｒｒｅｌｌｏら、２０１１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３１巻：１０７８～１０８０頁）。これらの結果から、本発明者らは、ゼブラフィッシュｈｍｇａ１ａ及びマウスＨｍｇａ１の時間的及び空間的に制限された発現が、再生プロセスにおけるＨｍｇａ１の潜在的役割とよく相関すると結論付ける。
本発明者らは、ゼブラフィッシュ特異的ＢＺ遺伝子のリストからｈｍｇａ１ａを選択したが、これはｈｍｇａ１ａがクロマチンに結合してクロマチンを弛緩させて細胞多能性及び自己再生を誘導及び維持する構造タンパク質をコードし（Ｂａｔｔｉｓｔａら、２００３年、ＦＡＳＥＢ Ｊ １７巻：１～２７頁；Ｋｉｓｈｉら、２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１５巻：１１２７～１１３３頁；Ｓｈａｈら、２０１２年、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７巻：ｅ４８５３３頁、Ｘｉａｎら、２０１７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ、８巻：１５００８頁）、心臓再生の調節における初期の役割を示唆しているためである。ＴＯＭＯ－ｓｅｑの結果を確認するために、本発明者らは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、損傷したゼブラフィッシュ及びマウス心臓におけるｈｍｇａ１ａ／Ｈｍｇａ１発現の空間的及び時間的な動態を特定した。損傷を受けていないゼブラフィッシュ心臓及び１ｄｐｉのゼブラフィッシュ心臓の両方において、ｈｍｇａ１ａ発現は検出不能であった（データは示さず）。３ｄｐｉでは、ｈｍｇａ１ａ発現は弱いが、ＢＺでは一貫しており、ＢＺ ＣＭでは７ｄｐｉでさらに増加し、堅牢なｈｍｇａ１ａ発現があった。対照的に、ゼブラフィッシュパラログｈｍｇａ１ｂは、ＢＺ ＣＭにおいて発現を示さなかった（データは示さず）。さらに、Ｈｍｇａ１発現は、損傷した成体マウス心臓のＢＺではほぼ検出不能であり（データは示さず）、これはｑＰＣＲによって確認された（データは示さず）。次に、本発明者らは、Ｈｍｇａ１発現が再生中の新生仔マウス心臓の再生窓と相関するかどうかを考えた。実際、本発明者らは、損傷を受けていない新生仔Ｐ１心臓全体でモザイクＨｍｇａ１発現を観察した（データは示さず）。重要なことに、ｑＰＣＲ分析により、Ｈｍｇａ１発現レベルは生後１週間で急速に低下し、マウス心臓の再生能力の喪失と一致することが実証された（図２）（Ｐｏｒｒｅｌｌｏら、２０１１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３１巻：１０７８～１０８０頁）。これらの結果から、本発明者らは、ゼブラフィッシュｈｍｇａ１ａ及びマウスＨｍｇａ１の時間的及び空間的に制限された発現が、再生プロセスにおけるＨｍｇａ１の潜在的役割とよく相関すると結論付ける。
【0085】
Ｈｍｇａ１がゼブラフィッシュ心臓再生に必須であるかどうかを調査するために、本発明者らは、ＴＡＬＥＮベースの戦略を用いてｈｍｇａ１ａの第１エクソンの開始を標的とすることによって機能喪失変異体系統を作製した。開始コドンの直後に生じる８ｂｐ欠失は、フレームシフト及び成熟前終止コドンの導入を引き起こし、短縮Ｈｍｇａ１ａタンパク質をもたらす（１０１ａａの代わりに７ａａ、図３Ａ、Ｂ）。ホモ接合ｈｍｇａ１ａ変異胚は正常に発達し、心臓再生中のＨｍｇａ１の潜在的役割を研究するために成体期まで成長させることができた。重要なことに、ｈｍｇａ１ａの発現は、野生型兄弟（wild-type siblings）と比較して、ｈｍｇａ１ａ－／－魚の損傷した心臓では強く低下し（図３Ｃ）、これはおそらくナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊に起因し、Ｈｍｇａ１ａ機能の喪失と一致する。ｈｍｇａ１ａ－／－心臓ではｈｍｇａ１ｂの上方制御は観察されず、ｈｍｇａ１ｂがｈｍｇａ１ａの喪失を補償していないことを示唆した（図３Ｄ）。
【0086】
次に、本発明者らは、凍結損傷の３０日後に、損傷した心臓においてＡＦＯＧにより線維化を可視化することによって、ｈｍｇａ１ａ－／－魚が心臓再生不全を有するかどうかを評価した。実際、ｈｍｇａ１ａ－／－心臓では、その兄弟と比較して３０ｄｐｉでの瘢痕サイズが有意に増加し、再生障害を示し（図４Ａ、Ｂ）、ｈｍｇａ１ａがゼブラフィッシュ心臓再生に必要であることを示している。
【0087】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【0088】
Ｈｍｇａ１ａは心筋細胞増殖に必要である
心臓再生中のｈｍｇａ１ａの機能についての洞察を得るために、本発明者らは、ＢＺ ＣＭにおいてｈｍｇａ１ａに依存してどのプロセスが起こるかを特定することを目的とした。これを達成するために、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ－／－変異体を、ＢＺ ＣＭを示す以前に公開されたｎｐｐａ：ｍＣｉｔｒｉｎｅレポーター系統（Ｈｏｎｋｏｏｐら、２０１９年、ＥＬｉｆｅ、８巻：１～２７頁）と交雑させた。これにより、ＦＡＣｓｏｒｔｉｎｇを使用して、７ｄｐｉのｈｍｇａ１ａ－／－心臓及び兄弟心臓のＢＺ ＣＭ（高ｍＣｉｔｒｉｎｅ）を選別することができた。次に、本発明者らは、ＳＯＲＴ－ｓｅｑ（ＳＯｒｔｉｎｇ ａｎｄ Ｒｏｂｏｔ－ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＳＥＱｕｅｎｃｉｎｇ）プラットフォームを使用して単離細胞を単一細胞ＲＮＡ配列決定にかけた（図４Ｃ）（Ｍｕｒａｒｏら、２０１６年、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ３巻：３８５～３９４頁）。本発明者らはＲａｃｅ－ＩＤ３アルゴリズムを使用して、細胞あたり６００を超えるリードを有する１３１１個の細胞を分析し、その結果、それらのトランスクリプトームの特徴に基づいてグループ化された６つの細胞クラスタを同定した。分析された全ての細胞は、心筋細胞マーカーｍｙｌ７のリードを含んでおり、本発明者らがＣＭを特異的に選別したことを立証している。さらに、クラスタ５を除く全てのクラスタは、ＢＺマーカーｎｐｐａ及びｄｅｓｍａの発現を示し、これらの細胞がＢＺ ＣＭを表すことを示している。クラスタ５細胞は代わりに、ＮＣ＿００２３３３．１７などの高レベルのミトコンドリアｍＲＮＡを発現し、これは起源がより遠いことを示唆している（データは示さず）。
心臓再生中のｈｍｇａ１ａの機能についての洞察を得るために、本発明者らは、ＢＺ ＣＭにおいてｈｍｇａ１ａに依存してどのプロセスが起こるかを特定することを目的とした。これを達成するために、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ－／－変異体を、ＢＺ ＣＭを示す以前に公開されたｎｐｐａ：ｍＣｉｔｒｉｎｅレポーター系統（Ｈｏｎｋｏｏｐら、２０１９年、ＥＬｉｆｅ、８巻：１～２７頁）と交雑させた。これにより、ＦＡＣｓｏｒｔｉｎｇを使用して、７ｄｐｉのｈｍｇａ１ａ－／－心臓及び兄弟心臓のＢＺ ＣＭ（高ｍＣｉｔｒｉｎｅ）を選別することができた。次に、本発明者らは、ＳＯＲＴ－ｓｅｑ（ＳＯｒｔｉｎｇ ａｎｄ Ｒｏｂｏｔ－ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＳＥＱｕｅｎｃｉｎｇ）プラットフォームを使用して単離細胞を単一細胞ＲＮＡ配列決定にかけた（図４Ｃ）（Ｍｕｒａｒｏら、２０１６年、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ３巻：３８５～３９４頁）。本発明者らはＲａｃｅ－ＩＤ３アルゴリズムを使用して、細胞あたり６００を超えるリードを有する１３１１個の細胞を分析し、その結果、それらのトランスクリプトームの特徴に基づいてグループ化された６つの細胞クラスタを同定した。分析された全ての細胞は、心筋細胞マーカーｍｙｌ７のリードを含んでおり、本発明者らがＣＭを特異的に選別したことを立証している。さらに、クラスタ５を除く全てのクラスタは、ＢＺマーカーｎｐｐａ及びｄｅｓｍａの発現を示し、これらの細胞がＢＺ ＣＭを表すことを示している。クラスタ５細胞は代わりに、ＮＣ＿００２３３３．１７などの高レベルのミトコンドリアｍＲＮＡを発現し、これは起源がより遠いことを示唆している（データは示さず）。
【0089】
ｈｍｇａ１ａ－／－細胞がｔ－ＳＮＥマップにおいてどこに表されるかを調査するために、本発明者らは遺伝子型特異的寄与をプロットした。クラスタあたりの遺伝子型寄与の定量化（図４Ｄ）は、ｈｍｇａ１ａ－／－細胞については大部分のクラスタがわずかに富化されているが、クラスタ１及び６はほぼ排他的に野生型ＣＭによって形成されることを示す。本発明者らは、クラスタ６富化遺伝子ｆｔｈ１ａ、ｕｂａ５２及びｇａｍｔについてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってこれを検証し（データは示さず）、実際に、ｈｍｇａ１ａ－／－心臓のＢＺ ＣＭにおいてこれらの遺伝子の発現の減少を観察した。細胞クラスタ間の転写の差に取り組むために、本発明者らは、クラスタ富化遺伝子について遺伝子オントロジー分析を実施した。重要なことに、クラスタ１及び６に特異的な遺伝子においては、細胞周期調節における役割を有する遺伝子が豊富であり、ｈｍｇａ１ａ－／－心臓においてＣＭ増殖が影響を受けることを示唆している。
【0090】
Ｈｍｇａ１ａによって調節されるプロセスについての洞察を得るために、本発明者らは、単一細胞の教師なし擬似時間順序付け（unsupervised pseudo-time ordering）を実施した。次に、遺伝子発現プロファイルを、同様に発現した遺伝子の自己組織化モジュール（ＳＯＭ）に不偏に（unbiasedly）一緒にグループ化し、８つの転写的に異なるモジュール（transcriptionally distinct modules）を得た（データは示さず；図４Ｅ参照）。モジュール１は、擬似タイムラインの開始時に高発現する、呼吸鎖における役割を有する遺伝子を表し、これが最も分化したＣＭ状態を表すことを示す。重要なことに、モジュール５は、ｈｍｇａ１ａと、細胞周期制御における役割を有する遺伝子（例えばｐｃｎａ及びｃｄｃ１４）とを含有し、これはＨｍｇａ１ａとＣＭ増殖との間の密接な相関と一致する。次に、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ－／－細胞が擬似タイムラインにわたってどのように分布しているのかを考えた。この目的のために、本発明者らは、擬似時間を構成する１００個のビンにわたる相対遺伝子型寄与をプロットした。興味深いことに、擬似時間が進むにつれて、ｈｍｇａ１ａ－／－細胞の寄与が徐々に失われる傾向が観察される。驚くべきことに、モジュール５の後、擬似タイムラインに寄与するｈｍｇａ１ａ－／－細胞の数は、約５０％（モジュール５の間）から約２８％（モジュール６～８）に低下する。変異体細胞寄与の低下に直接先行して、変異細胞寄与のピークがモジュール５の端部で観察される（データは示さず）。これらのデータは、ｈｍｇａ１ａ－／－ＢＺ ＣＭは擬似時間では進行（progress）せず、代わりに初期段階で停止することを示唆している。実際、ｈｋ１（モジュール６マーカー）及びａｋ１（モジュール７マーカー）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、７ｄｐｉでのｈｍｇａ１ａ－／－心臓における発現の低下が明らかになった（図４Ｇ；データは示さず）。ｈｍｇａ１ａと細胞周期調節因子との共発現、及びｈｍｇａ１ａ－／－心臓における律速解糖酵素ヘキソキナーゼをコードするｈｋ１の発現低下は、Ｈｍｇａ１ａが細胞周期の誘導及び／又は進行に特に必要であることをさらに示唆した。
【0091】
モジュール７及び８は、酸化代謝の翻訳及び再使用に関与する遺伝子から主になっていた。翻訳及び酸化的リン酸化の速度の増加は、有糸分裂に向かう細胞周期進行と相関している。ｈｍｇａ１ａ変異体におけるこれらの様々な遺伝子の誘導障害は、観察されたＣＭ増殖の減少を十分に説明し得る。損傷したｈｍｇａ１ａ変異体心臓において翻訳が影響を受けるかどうかを検証するために、本発明者らは最初に、翻訳の読み出しとして境界域ＣＭにおけるリン酸化Ｓ６（ｐＳ６、Ｓｅｒ２５３／２６３）のレベルを評価した（図４Ｉ）。リボソームＳ６タンパク質は４０Ｓリボソームサブユニットの一部であり、そのＳｅｒ２３５／Ｓｅｒ２３６残基でのリン酸化が翻訳開始速度を向上させる。境界域ではｐＳ６の増加が観察されたが、心筋細胞に限定されていなかった。そのため、本発明者らは、心筋の寄与のみをサブセット化するために、トロポミオシン対比染色を使用してマスキングを実施した。本発明者らは、心筋ｐＳ６の区域及び強度の両方が変異体の境界域で有意に減少したことを観察し（図４Ｈ）、これは翻訳速度がｈｍｇａ１ａ変異体心臓の境界域ＣＭで影響を受けることを示唆する。まとめると、これらの結果は、Ｈｍｇａ１ａが、細胞周期リエントリー、解糖への代謝シフト及びタンパク質翻訳を活性化するために重要であることを示している。
【0092】
これを検証するために、本発明者らは、ＰＣＮＡを用いた免疫組織化学によってＢＺ ＣＭ増殖を評価し、実際に、ｈｍｇａ１ａ－／－心臓においてはそれらの兄弟と比較してＰＣＮＡ＋ＣＭが有意に減少していることを観察した（図５Ａ）。まとめると、これらのデータは、ｈｍｇａ１ａがＢＺにおけるＣＭ増殖を促進するが、損傷に対するＢＺ ＣＭの早期応答には必須ではないことを示している。
【0093】
Ｈｍｇａ１ａはＮｒｇ１シグナル伝達の下流で作用する
Ｎｒｇ１増殖因子は、心臓損傷に応答して心外膜由来細胞によって産生及び分泌され、ＣＭ増殖を誘導する（Ｇｅｍｂｅｒｌｉｎｇら、２０１５年、ＥＬｉｆｅ ４巻：１～１７頁）。本発明者らによってＢＺ ＣＭ増殖がＨｍｇａ１ａを必要とすることが観察されたので、本発明者らは、Ｎｒｇ１がｈｍｇａ１ａ発現を誘導するかどうか、及びＨｍｇａ１ａがＮｒｇ１誘導ＣＭ増殖にも必要であるかどうかに取り組んだ。そのため、本発明者らは、魚にヒト組換えＮＲＧ１を１日１回、３日間連続して腹腔内注射した。遺伝的ｎｒｇ１過剰発現モデルについて報告された（Ｇｅｍｂｅｒｌｉｎｇら、２０１５年、ＥＬｉｆｅ、４巻：１～１７頁）ものと同様に、心筋細胞増殖の増加がＮＲＧ１注射時に観察され、これは心臓の最も外側の心筋層で最も顕著であった（データは示さず）。さらに、異所ＮＲＧ１（ectopic NRG1）は、最も外側の心筋層を含む心臓全体にわたってｈｍｇａ１ａ発現を誘導した（データは示さず）。ＮＲＧ１誘導ＣＭ増殖がｈｍｇａ１ａに依存するかどうかを調査するために、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ－／－魚にＮＲＧ１を注射した。重要なことに、ＮＲＧ１は野生型兄弟においてＣＭ増殖を誘導したが、異所ＮＲＧ１はｈｍｇａ１ａ－／－心臓においてＣＭ増殖を誘導することができなかった（図５Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ｈｍｇａ１がＮｒｇ１シグナル伝達の下流で作用してＣＭ増殖を誘導することを示している。Ｈｍｇａ１ａは、クロマチン接近可能性を変化させ、損傷関連遺伝子プログラムを誘導する。Ｈｍｇａ１は、ＡＴリッチドメインに優先的に結合する構造クロマチンタンパク質であり、インビトロ実験によって、Ｈｍｇａ１がヒストンＨ１とＤＮＡ結合について競合することが実証されている（Ｃａｔｅｚら、２００４年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２４巻：４３２１～４３２８頁）。クロマチン結合すると、Ｈｍｇａ１は、クロマチンリモデリング複合体及び転写因子の結合を促進して、遺伝子転写を誘導する（Ｃａｔｅｚら、２００４年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２４巻：４３２１～４３２８頁；Ｏｚｔｕｒｋら、２０１４年、Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｂｉｏｌ ２巻：５頁；Ｒｅｅｖｅｓ、２００１年、Ｇｅｎｅ ２７７巻：６３～８１頁）。ゼブラフィッシュＣＭにおけるｈｍｇａ１ａ過剰発現がクロマチン接近可能性及び遺伝子発現の変化をもたらすかどうかを明らかにするために、本発明者らは、Ｔｇ（ｕｂｉ：Ｌｏｘｐ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰ）系統を作製し、これは、タモキシフェン処置と組み合わせてＴｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲＴ２）と交雑した場合、Ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰのＣＭ特異的過剰発現をもたらす。本発明者らは、組換え１４日後のｈｍｇａ１ａ過剰発現心臓及びＣｒｅのみの対照心臓から核を単離し、ＣＭ核レポーター系統Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＤｓＲｅｄ－ｎｌｓ）を使用してＣＭ核をＦＡＣ選別（ＦＡＣｓｏｒｔ）した。次に、ＣＭ核を、配列決定を使用したトランスポザーゼ接近可能クロマチンについてのアッセイ（ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ－ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｕｓｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏら、２０１３年、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０巻：１２１３～１２１８頁）に供し、ゼブラフィッシュゲノム（ＧＲＣｚ１０）にマッピングされた３１１，９６８，７９０個の配列決定リードを得た。ゲノム領域を、Ｂｏｗｔｉｅ２を使用してマッピングし、接近可能な領域を、ＭＡＣＳ２ピークコーリングを使用して同定した。全体で、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ過剰発現データセットにおける３５，０１４個の接近可能な領域及び対照データセットにおける３７，７１８個の接近可能な領域を同定した（ｑ値＞０．０５、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を用いて計算；Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ、１９９５年、Ｊ Ｒ Ｓｔａｔ Ｓｏｃ Ｂ ５７巻：２８９～３００頁）。接近可能な領域の大部分は、遺伝子間領域及び遺伝子内領域にあるが、より小さい画分がプロモーター領域に見出された（データは示さず）。これらの接近可能なプロモーター領域の大部分（ｎ＝１，３０８）は、対照データセットとｈｍｇａ１ａ過剰発現データセットとの間で共有される（データは示さず）。本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ過剰発現時に出現している接近可能なクロマチン領域１２，９０６個と消失している接近可能なクロマチン領域１５，８５５個とを同定したが、２２，４３０個のクロマチン領域は安定して接近可能なままであった。これらの結果は、クロマチン接近可能性を変化させることにおけるＨｍｇａ１ａの役割を支持するので、本発明者らは次に、これらの領域がこれらの領域に結合し得る特異的転写因子と相関するかどうかを知りたいと考えた。そのため、本発明者らは、ウェブベースのＭＥＭＥ ｓｕｉｔｅ ｔｏｏｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｔｉｆ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＡＭＥ ｖ ５．３．０）（Ｂａｉｌｅｙら、２００９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、４３巻：Ｗ３９～Ｗ４９頁；ＭｃＬｅａｙ＆Ｂａｉｌｅｙ、２０１０年、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１１巻：１６５頁）を使用して、出現するピーク及び消失するピーク内で富化されている転写因子の結合モチーフを同定した。驚くべきことに、出現するピーク及び消失するピークの両方が、転写因子ＮＦ－ＹＡ、ＦＯＸＫ１及びＦＯＸＫ２の結合モチーフにおいて強い富化を示し、Ｈｍｇａ１ａ過剰発現がそれらのそれぞれの結合部位を調節することを示した（データは示さず）。
Ｎｒｇ１増殖因子は、心臓損傷に応答して心外膜由来細胞によって産生及び分泌され、ＣＭ増殖を誘導する（Ｇｅｍｂｅｒｌｉｎｇら、２０１５年、ＥＬｉｆｅ ４巻：１～１７頁）。本発明者らによってＢＺ ＣＭ増殖がＨｍｇａ１ａを必要とすることが観察されたので、本発明者らは、Ｎｒｇ１がｈｍｇａ１ａ発現を誘導するかどうか、及びＨｍｇａ１ａがＮｒｇ１誘導ＣＭ増殖にも必要であるかどうかに取り組んだ。そのため、本発明者らは、魚にヒト組換えＮＲＧ１を１日１回、３日間連続して腹腔内注射した。遺伝的ｎｒｇ１過剰発現モデルについて報告された（Ｇｅｍｂｅｒｌｉｎｇら、２０１５年、ＥＬｉｆｅ、４巻：１～１７頁）ものと同様に、心筋細胞増殖の増加がＮＲＧ１注射時に観察され、これは心臓の最も外側の心筋層で最も顕著であった（データは示さず）。さらに、異所ＮＲＧ１（ectopic NRG1）は、最も外側の心筋層を含む心臓全体にわたってｈｍｇａ１ａ発現を誘導した（データは示さず）。ＮＲＧ１誘導ＣＭ増殖がｈｍｇａ１ａに依存するかどうかを調査するために、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ－／－魚にＮＲＧ１を注射した。重要なことに、ＮＲＧ１は野生型兄弟においてＣＭ増殖を誘導したが、異所ＮＲＧ１はｈｍｇａ１ａ－／－心臓においてＣＭ増殖を誘導することができなかった（図５Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ｈｍｇａ１がＮｒｇ１シグナル伝達の下流で作用してＣＭ増殖を誘導することを示している。Ｈｍｇａ１ａは、クロマチン接近可能性を変化させ、損傷関連遺伝子プログラムを誘導する。Ｈｍｇａ１は、ＡＴリッチドメインに優先的に結合する構造クロマチンタンパク質であり、インビトロ実験によって、Ｈｍｇａ１がヒストンＨ１とＤＮＡ結合について競合することが実証されている（Ｃａｔｅｚら、２００４年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２４巻：４３２１～４３２８頁）。クロマチン結合すると、Ｈｍｇａ１は、クロマチンリモデリング複合体及び転写因子の結合を促進して、遺伝子転写を誘導する（Ｃａｔｅｚら、２００４年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２４巻：４３２１～４３２８頁；Ｏｚｔｕｒｋら、２０１４年、Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｂｉｏｌ ２巻：５頁；Ｒｅｅｖｅｓ、２００１年、Ｇｅｎｅ ２７７巻：６３～８１頁）。ゼブラフィッシュＣＭにおけるｈｍｇａ１ａ過剰発現がクロマチン接近可能性及び遺伝子発現の変化をもたらすかどうかを明らかにするために、本発明者らは、Ｔｇ（ｕｂｉ：Ｌｏｘｐ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰ）系統を作製し、これは、タモキシフェン処置と組み合わせてＴｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲＴ２）と交雑した場合、Ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰのＣＭ特異的過剰発現をもたらす。本発明者らは、組換え１４日後のｈｍｇａ１ａ過剰発現心臓及びＣｒｅのみの対照心臓から核を単離し、ＣＭ核レポーター系統Ｔｇ（ｍｙｌ７：ＤｓＲｅｄ－ｎｌｓ）を使用してＣＭ核をＦＡＣ選別（ＦＡＣｓｏｒｔ）した。次に、ＣＭ核を、配列決定を使用したトランスポザーゼ接近可能クロマチンについてのアッセイ（ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ－ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｕｓｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏら、２０１３年、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０巻：１２１３～１２１８頁）に供し、ゼブラフィッシュゲノム（ＧＲＣｚ１０）にマッピングされた３１１，９６８，７９０個の配列決定リードを得た。ゲノム領域を、Ｂｏｗｔｉｅ２を使用してマッピングし、接近可能な領域を、ＭＡＣＳ２ピークコーリングを使用して同定した。全体で、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ過剰発現データセットにおける３５，０１４個の接近可能な領域及び対照データセットにおける３７，７１８個の接近可能な領域を同定した（ｑ値＞０．０５、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を用いて計算；Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ、１９９５年、Ｊ Ｒ Ｓｔａｔ Ｓｏｃ Ｂ ５７巻：２８９～３００頁）。接近可能な領域の大部分は、遺伝子間領域及び遺伝子内領域にあるが、より小さい画分がプロモーター領域に見出された（データは示さず）。これらの接近可能なプロモーター領域の大部分（ｎ＝１，３０８）は、対照データセットとｈｍｇａ１ａ過剰発現データセットとの間で共有される（データは示さず）。本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ過剰発現時に出現している接近可能なクロマチン領域１２，９０６個と消失している接近可能なクロマチン領域１５，８５５個とを同定したが、２２，４３０個のクロマチン領域は安定して接近可能なままであった。これらの結果は、クロマチン接近可能性を変化させることにおけるＨｍｇａ１ａの役割を支持するので、本発明者らは次に、これらの領域がこれらの領域に結合し得る特異的転写因子と相関するかどうかを知りたいと考えた。そのため、本発明者らは、ウェブベースのＭＥＭＥ ｓｕｉｔｅ ｔｏｏｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｔｉｆ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＡＭＥ ｖ ５．３．０）（Ｂａｉｌｅｙら、２００９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、４３巻：Ｗ３９～Ｗ４９頁；ＭｃＬｅａｙ＆Ｂａｉｌｅｙ、２０１０年、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１１巻：１６５頁）を使用して、出現するピーク及び消失するピーク内で富化されている転写因子の結合モチーフを同定した。驚くべきことに、出現するピーク及び消失するピークの両方が、転写因子ＮＦ－ＹＡ、ＦＯＸＫ１及びＦＯＸＫ２の結合モチーフにおいて強い富化を示し、Ｈｍｇａ１ａ過剰発現がそれらのそれぞれの結合部位を調節することを示した（データは示さず）。
【0094】
プロモーターの接近可能性と転写との間の相関を調査するために、本発明者らはまた、ｈｍｇａ１ａ過剰発現心臓及び対照心臓に対してＲＮＡ－ｓｅｑを実施し、これらのデータをＡＴＡＣ－ｓｅｑデータと統合した。本発明者らは、接近可能なプロモーター領域を有する遺伝子について有意により高いＲＮＡ発現が観察されたので（データは示さず）、プロモーター接近可能性及び転写が対照データセット及びｈｍｇａ１ａ過剰発現データセットの両方において十分に相関することを見出した。ｈｍｇａ１ａ過剰発現心臓では、１，６４７個の遺伝子が上方制御され（ｐ値＜０．０５、ＬｏｇＦＣ＞０．５）、これはＤＮＡ複製における役割を有する遺伝子を含み、細胞増殖におけるＨｍｇａ１ａの役割を裏付けている。驚くべきことに、ナトリウム利尿ペプチド遺伝子もｈｍｇａ１ａ過剰発現によって誘導される。これは、分析に使用された心臓が損傷を受けていなかったが、損傷応答プログラムが誘導されたことを示すので、驚くべきことである。これは、ミトコンドリア酸化的リン酸化における機能を有する多くの遺伝子の下方制御と一致している。これらの適応は、損傷後にゼブラフィッシュＢＺで起こるプロセスを非常によく連想させるので、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ過剰発現トランスクリプトームをＢＺトランスクリプトームと比較した。驚くべきことに、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ誘導遺伝子及び損傷ＢＺにおいて上方制御された遺伝子（１１．５％の重複、ｐ＝６．６ｅ－５）、並びにｈｍｇａ１ａ抑制遺伝子及び損傷ＢＺにおいて下方制御された遺伝子（１８，２％の重複、ｐ＝４．０ｅ－１１）について、有意な重複を観察した（Ｂａｉｌｅｙら、２００９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、４３巻：Ｗ３９～Ｗ４９頁；ＭｃＬｅａｙ＆Ｂａｉｌｅｙ、２０１０年、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１１巻：１６５頁）。要約すると、これらの結果は、ＣＭにおけるｈｍｇａ１ａ発現が、クロマチン接近可能性における大きな変化、及びその後の、ゼブラフィッシュＢＺにおいて見出される損傷誘導遺伝子発現プログラムと相関する遺伝子発現プログラムの調節をもたらすことを実証している。
【0095】
Ｈｍｇａ１ａ過剰発現は、ゼブラフィッシュ心筋細胞における増殖を駆動するのに十分である
ｈｍｇａ１ａ過剰発現は損傷関連遺伝子発現プログラムを誘導するので、本発明者らは、心臓の形態に対するｈｍｇａ１ａ過剰発現の効果を調査したいと考えた。最初に、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａの過剰発現がゼブラフィッシュＣＭにおいて増殖を駆動するのに十分であるかどうかに取り組んだ。ｈｍｇａ１ａ過剰発現の影響を分析するために、本発明者らは、４～６月齢のＴｇ（ｕｂｉ：Ｌｏｘｐ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰ、ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲＴ２）及びＴｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲＴ２）対照魚をタモキシフェンで処置し、誘導の１４日後に心臓を摘出し、続いてＰＣＮＡ発現によるＣＭ増殖の定量を行った。これにより、対照の約７％からｈｍｇａ１ａ過剰発現心臓の約１８％への、心臓全体のＰＣＮＡ＋ＣＭの有意な増加が明らかになった（データは示さず）。次に、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ過剰発現の長期効果を決定し、誘導の１年後の心臓を分析した。本発明者らは、心筋表面積の有意な増加（データは示さず）を観察し、これは心臓の総表面積（心臓内腔を含む）のわずかであるが有意ではない増加と一致した（図６Ａ）。この心筋表面積の増加は、主に心臓内腔を犠牲にした肉柱領域の拡大に起因するものである（図６Ｂ）。さらに、肉柱組織の増加は、ＣＭ増殖の中程度であるが有意な増加（図６Ｃ）に起因する可能性が高いが、ＣＭサイズの増加によるものではない（図６Ｄ）。
ｈｍｇａ１ａ過剰発現は損傷関連遺伝子発現プログラムを誘導するので、本発明者らは、心臓の形態に対するｈｍｇａ１ａ過剰発現の効果を調査したいと考えた。最初に、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａの過剰発現がゼブラフィッシュＣＭにおいて増殖を駆動するのに十分であるかどうかに取り組んだ。ｈｍｇａ１ａ過剰発現の影響を分析するために、本発明者らは、４～６月齢のＴｇ（ｕｂｉ：Ｌｏｘｐ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｈｍｇａ１ａ－ｅＧＦＰ、ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲＴ２）及びＴｇ（ｍｙｌ７：ＣｒｅＥＲＴ２）対照魚をタモキシフェンで処置し、誘導の１４日後に心臓を摘出し、続いてＰＣＮＡ発現によるＣＭ増殖の定量を行った。これにより、対照の約７％からｈｍｇａ１ａ過剰発現心臓の約１８％への、心臓全体のＰＣＮＡ＋ＣＭの有意な増加が明らかになった（データは示さず）。次に、本発明者らは、ｈｍｇａ１ａ過剰発現の長期効果を決定し、誘導の１年後の心臓を分析した。本発明者らは、心筋表面積の有意な増加（データは示さず）を観察し、これは心臓の総表面積（心臓内腔を含む）のわずかであるが有意ではない増加と一致した（図６Ａ）。この心筋表面積の増加は、主に心臓内腔を犠牲にした肉柱領域の拡大に起因するものである（図６Ｂ）。さらに、肉柱組織の増加は、ＣＭ増殖の中程度であるが有意な増加（図６Ｃ）に起因する可能性が高いが、ＣＭサイズの増加によるものではない（図６Ｄ）。
【0096】
Ｈｍｇａ１ａ過剰発現ＯＥ心筋細胞における心臓発生に関連するゲノム領域の活性化は、ヒストン修飾の変化と並行していた。ヒストンＨ３タンパク質の４番目のリジン残基でのトリメチル化を示すＨ３ｋ４ｍｅ３（活性化ヒストンマーク）及びヒストンＨ３タンパク質上のリジン２７のトリメチル化を示すＨ３ｋ２７ｍｅ３（抑制性ヒストンマーク）のデータを、それぞれ対照心筋細胞（ｍｙｌ７：ＬｉｆｅＡｃｔ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）及びＨｍｇａ１ａ ＯＥ心筋細胞（ｍｙｌ７：ＬｉｆｅＡｃｔ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋／ｍｙｌ７：Ｈｍｇａ１ａ－ＥＧＦＰ＋）に対してバルク（１００細胞）選別支援単一細胞クロマチン免疫切断（ｓｏｒｔ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｌｅａｖａｇｅ）（ｓｏｒｔＣｈｉｃ；Ｚｅｌｌｅｒら、２０２１年、ｂｉｏＲｘｉｖ １０．１１０１／２０２１．０４．２６．４４０６０６頁）を実施することによって得た。リードをゼブラフィッシュ参照ゲノム（ｄａｎＲｅｒ１０）に対してマッピングし、Ｇａｌａｘｙを使用して可視化した。続いて、Ｈ３ｋ４ｍｅ３トラックに対して不偏ＭＡＣＳ２ピークコーリングを実施して、このヒストンマークが富化されている領域を同定した。胚性心臓転写因子ｔｂｘ５及びｎｋｘ２．５のプロモーター領域のピークは、Ｈｍｇａ１ａ ＯＥ心筋細胞でのみコールされ、胚性心臓遺伝子がＨｍｇａ１ａ ＯＥ心筋細胞で再発現することを示した。
【0097】
まとめると、これらの結果は、ｈｍｇａ１ａの過剰発現がＣＭ増殖を誘導し、これが心臓の形態に大きな影響を及ぼすことを示している。
【0098】
Ｈｍｇａ１は、心筋梗塞後の哺乳動物心筋細胞の細胞周期リエントリー及び機能的回復を誘導する
本発明者らの以前の結果は、ゼブラフィッシュにおいて、Ｈｍｇａ１ａが効率的な心臓再生に必要であり、Ｈｍｇａ１ａ過剰発現がＣＭ増殖を誘導するのに十分であることを実証している。ゼブラフィッシュとは異なり、マウスＨｍｇａ１発現は心臓損傷によって誘導されず、これはＮｒｇ１に誘導されるＥｒｂＢ２シグナル伝達活性化の不在によって説明され得る（Ｄ’Ｕｖａら、２０１５年、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１７巻：６２７～６３８頁）。そのため、本発明者らは最初に、マウス心筋細胞におけるＥｒｂＢ２シグナル伝達の活性化がＨｍｇａ１発現を誘導するかどうかを調査したいと考えた。実際、構成的に活性な（ｃａ）ＥＲＢＢ２受容体を発現するマウス心臓では、本発明者らにより、核Ｈｍｇａ１タンパク質蓄積の増強が観察された（データは示さず）。
本発明者らの以前の結果は、ゼブラフィッシュにおいて、Ｈｍｇａ１ａが効率的な心臓再生に必要であり、Ｈｍｇａ１ａ過剰発現がＣＭ増殖を誘導するのに十分であることを実証している。ゼブラフィッシュとは異なり、マウスＨｍｇａ１発現は心臓損傷によって誘導されず、これはＮｒｇ１に誘導されるＥｒｂＢ２シグナル伝達活性化の不在によって説明され得る（Ｄ’Ｕｖａら、２０１５年、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１７巻：６２７～６３８頁）。そのため、本発明者らは最初に、マウス心筋細胞におけるＥｒｂＢ２シグナル伝達の活性化がＨｍｇａ１発現を誘導するかどうかを調査したいと考えた。実際、構成的に活性な（ｃａ）ＥＲＢＢ２受容体を発現するマウス心臓では、本発明者らにより、核Ｈｍｇａ１タンパク質蓄積の増強が観察された（データは示さず）。
【0099】
Ｈｍｇａ１が哺乳動物ＣＭにおいて増殖を刺激することができるかどうかに取り組むために、本発明者らは、初代単離新生仔ラット心筋細胞（ＮＲＣＭ）において異所Ｈｍｇａ１発現（ectopic Hmga1 expression）を誘導した（図７Ａ）。ＣＭをＰ１新生仔ラットから単離し、ウイルス処置前に２日間インキュベートした。Ｈｍｇａ１－ｅＧＦＰ過剰発現ウイルス（ＥＦ１ａ：Ｈｍｇａ１－ｅＧＦＰ）又はＧＦＰのみの対照ウイルス（ＥＦ１ａ：ｅＧＦＰ）を培地に投与するとともに、新たに合成されたＤＮＡを追跡するためにＥｄＵを投与した。さらに２日間のインキュベーション後、細胞を固定し、増殖マーカーについて分析した。興味深いことに、ｅＧＦＰのみをトランスフェクトされたＣＭと比較して、Ｈｍｇａ１－ｅＧＦＰをトランスフェクトされたＣＭでは、ＥｄＵ及びＫｉ６７の有意な増加が観察された（図７Ｂ、Ｃ）。さらに、Ｈｍｇａ１－ｅＧＦＰをトランスフェクトされた細胞における有糸分裂マーカーｐＨＨ３の増加について正の傾向が見出された（ｐ値＝０．０６４）（図７Ｄ）。まとめると、これらの結果は、哺乳動物ＣＭにおけるＨｍｇａ１過剰発現がそれらの増殖能力を増加させ得ることを示している。
【0100】
次に、本発明者らは、成体マウス心臓における異所Ｈｍｇａ１発現がインビボでＣＭ細胞周期リエントリーを誘導するかどうかに取り組みたいと考えた。Ｈｍｇａ１発現を誘導するために、本発明者らは、ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１カセットを担持しＣＭを優先的に標的とするアデノ随伴ウイルス９（ＡＡＶ９）（Ｂｉｓｈら、２００８年、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９巻：１３５９～１３６８頁）を使用した。ＭＩ時に、心臓に、虚血性損傷のリスクのある区域に接する領域に１５μｌのウイルス（１×１０＾１１ウイルス粒子／マウス）を２回注射した。さらに、ＣＭ細胞周期活性を評価するために、マウスにＥｄＵをＭＩ後２週間にわたって１日２回注射した。ＭＩ及びウイルス注射の１４日後、心臓を単離し、切片化し、ＥｄＵ（新たに合成されたＤＮＡを示す）、ＰＣＭ－１（ＣＭ核をマークする）及びＨＡタグ（ＨＡ－Ｈｍｇａ１過剰発現を有する細胞をマークする）について染色した（データは示さず）。重要なことに、遠隔区域に位置するＣＭにおけるＥｄＵ取り込みはＨＡ－Ｈｍｇａ１発現の影響を受けなかったが、ＢＺに位置するＣＭにおけるＥｄＵ取り込みは、ＨＡ－Ｈｍｇａ１を発現するＣＭにおいて５倍増加した（０．２％から１．２％）（図７Ｅ）。
【0101】
次に、本発明者らは、ＨＡ－Ｈｍｇａ１の過剰発現がＭＩ後の機能的改善をもたらし得るかどうかを考えた。そのため、ウイルス処置マウスを４２ｄｐｉで心エコー検査に供し、その後、心臓を単離し、組織学的分析のために切片化した。境界域におけるトランスフェクション効率を評価するために、ＨＡタグに対する免疫組織化学を実施した。トランスフェクション効率は心臓間で高い変動性を示したので、トランスフェクション効率と瘢痕サイズ並びに心臓機能性との間の相関分析を実施した。さらに、非効率的にトランスフェクトされた心臓（平均で３０個未満のトランスフェクトＢＺ細胞）を、ＡＡＶ９（空）処置心臓とＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１）処置心臓とを比較するときに除外した。トランスフェクション効率と駆出率並びに短縮率との間に有意な相関が見出され、トランスフェクトされたＢＺ細胞の数が多い心臓は機能性の改善を示していた（図７Ｆ、Ｈ）。ＡＡＶ９（空）処置心臓と効果的にトランスフェクトされたＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１）処置心臓との間の直接比較は、駆出率の有意な増加（Ｐ値＝０．０１５）（図７Ｇ）並びに短縮率の正の傾向（ｐ値＝０．０８４）を示す（図７Ｉ）。まとめると、これらの結果は、損傷した哺乳動物心臓における異所Ｈｍｇａ１発現が心筋細胞の細胞周期リエントリーを促進することを示しており、これが心筋梗塞後の機能的回復を刺激することを示唆する。
【0102】
より高いトランスフェクション効率がより良好な機能的回復をもたらすかどうかに取り組むために、ＭＩを誘導した後、１０倍高い用量のＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１）ウイルス（１×１０＾１２ウイルス粒子／マウス）をマウス心臓のＢＺに注射した。さらに、偽手術マウス心臓にＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１）ウイルスを注射し、対照ウイルスとしてＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＧＦＰ）ウイルスを使用した。ＭＩ及びＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１）又はＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＧＦＰ）対照ウイルス心臓内送達の１４日後に、心筋細胞増殖をさらに分析した。ＰＣＭ－１（ＣＭ核をマークする）、ＨＡ（ＨＡ－Ｈｍｇａ１を発現するトランスフェクトされた細胞をマークする）及びＥｄＵ（新たに合成されたＤＮＡを示す）に対する抗体染色は、ＨＡ－Ｈｍｇａ１又はＧＦＰを形質導入した心臓の境界域（ＢＺ）内にＥｄＵ＋（図８Ａ）又はＫｉ６７＋（図８Ｂ）細胞があることを示していた。心臓１個あたり心臓切片３個を定量した。これらのデータは、損傷した哺乳動物心臓における異所Ｈｍｇａ１発現が、少なくとも１４日間、心筋細胞の細胞周期リエントリーを促進することを明確に示している。
【0103】
ＣＭ増殖の増加が機能の改善及び瘢痕サイズの減少をもたらすかどうかに取り組むために、ＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１）ウイルス又はＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＧＦＰ）対照ウイルスを注射したマウスを心エコー検査に供し、その後、心臓を組織学的分析のために摘出した。心臓を、線維性瘢痕を可視化するためにマッソントリクロームを使用して染色して頂端から基部まで切片化した。瘢痕サイズを、２つの独立した方法を使用して定量した。第１の方法では、心筋を有する瘢痕の境界から心臓内腔の中央まで２本の線を引き、それらの角度を連続切片で測定した（データは示さず）。第２の方法では、瘢痕の長さを測定し、影響を受けていない左心室の壁の長さで割った（図８Ｄ）。両方法とも、ＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１）ウイルスを注射したＭＩ心臓の瘢痕サイズが、ＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＧＦＰ）対照ウイルスを注射したＭＩ心臓で形成された瘢痕と比較して小さいことを示した。心エコー検査データを使用して機能的回復を測定した。ＭＩの４２日後、ＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＧＦＰ）対照ウイルスを注射したＭＩ心臓と比較して、ＡＡＶ９（ＣＭＶ：ＨＡ－Ｈｍｇａ１）ウイルスを注射したＭＩ心臓では、心駆出率（図８Ｅ）、短縮率（図８Ｆ）、心拍出量（図８Ｇ）及び一回拍出量（図８Ｈ）の有意な改善が観察された。まとめると、これらの結果は、損傷した哺乳動物心臓における異所Ｈｍｇａ１発現が心筋細胞の細胞周期リエントリーを促進すること、及びこれが心筋梗塞後の機能的改善をもたらすことを実証している。
【0104】
配列
配列番号１ ＨＭＧＡ１
10 20 30 40 50
MSESSSKSSQ PLASKQEKDG TEKRGRGRPR KQPPVSPGTA LVGSQKEPSE
60 70 80 90 100
VPTPKRPRGR PKGSKNKGAA KTRKTTTTPG RKPRGRPKKL EKEEEEGISQ
ESSEEEQ
配列番号２ ＨＭＧＡ２
10 20 30 40 50
MSARGEGAGQ PSTSAQGQPA APAPQKRGRG RPRKQQQEPT GEPSPKRPRG
60 70 80 90 100
RPKGSKNKSP SKAAQKKAEA TGEKRPRGRP RKWPQQVVQK KPAQEETEET
SSQESAEED
配列番号１ ＨＭＧＡ１
10 20 30 40 50
MSESSSKSSQ PLASKQEKDG TEKRGRGRPR KQPPVSPGTA LVGSQKEPSE
60 70 80 90 100
VPTPKRPRGR PKGSKNKGAA KTRKTTTTPG RKPRGRPKKL EKEEEEGISQ
ESSEEEQ
配列番号２ ＨＭＧＡ２
10 20 30 40 50
MSARGEGAGQ PSTSAQGQPA APAPQKRGRG RPRKQQQEPT GEPSPKRPRG
60 70 80 90 100
RPKGSKNKSP SKAAQKKAEA TGEKRPRGRP RKWPQQVVQK KPAQEETEET
SSQESAEED
【図1-1】
【図1-2】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図7H】
【図7I】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図8H】
【配列表】
【国際調査報告】