特表 2024-539012 白質ジストロフィーを治療するための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】白質ジストロフィーを治療するための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20241018BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 31/135 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 31/495 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 31/4402 20060101ALI20241018BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20241018BHJP

   G01N 33/66 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 38/50 20060101ALN20241018BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20241018BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20241018BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

A61P25/00

A61K48/00

A61K31/7088

A61K31/573

A61K31/135

A61K31/495

A61K31/4402

G01N33/68

G01N33/66 A

A61K38/50

C12N15/55 ZNA

C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522370

(86)(22)【出願日】2022-10-12

(85)【翻訳文提出日】2024-05-20

(86)【国際出願番号】 US2022077971

(87)【国際公開番号】W WO2023064811

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】63/254,885

(32)【優先日】2021-10-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/352,049

(32)【優先日】2022-06-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524139493

【氏名又は名称】ブリッジバイオ ジーン セラピー エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ラフォレ， ジュヌヴィエーヴ

(72)【発明者】

【氏名】シェイウィッツ， アダム

(72)【発明者】

【氏名】カービー， キャスリーン エム．

【テーマコード（参考）】

2G045

4C084

4C086

4C087

4C206

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB01

2G045CB30

2G045DA03

2G045DA04

2G045DA31

2G045DA35

2G045DA80

2G045FA40

2G045FB06

4C084AA13

4C084CA18

4C084DC01

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZA02

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC17

4C086BC50

4C086DA10

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086NA05

4C086NA13

4C086ZA02

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA05

4C087NA13

4C087ZA02

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA05

4C206MA03

4C206MA05

4C206NA05

4C206NA13

4C206ZA02

(57)【要約】

アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）タンパク質を発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクター及び白質ジストロフィーを治療するための関連する使用が、本明細書に開示される。本開示は、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）の発現を必要とする対象においてそうするように操作された、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。本開示の態様は、神経変性疾患（例えば、カナバン病などの白質ジストロフィー）の治療を必要とする対象におけるその方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、対象におけるＮ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）レベルを調節することを含む。ＮＡＡは、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）によって酢酸塩及びＬ－アスパラギン酸塩に代謝される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象に治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、
（ｉｉ）アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記治療有効量が、約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲である、方法。

【請求項2】

アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）の発現を必要とする対象におけるその方法であって、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記治療有効量が、約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲であり、それによって、前記対象においてＡＳＰＡを発現する、前記方法。

【請求項3】

アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）のレベルの増加を必要とする対象におけるその方法であって、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記治療有効量が、約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲であり、それによって、前記対象における前記ＡＳＰＡのレベルを増加させる、前記方法。

【請求項4】

前記対象が、ＡＳＰＡの発現を必要とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記対象が、ＡＳＰＡの低減したレベル及び／または機能を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記対象が、白質ジストロフィーを有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

白質ジストロフィーの治療を必要とする対象におけるその方法であって、前記対象に治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記治療有効量が、約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲であり、
それによって、前記対象における白質ジストロフィーを治療する、前記方法。

【請求項8】

前記白質ジストロフィーが、カナバン病、副腎脊髄ニューロパチー、アレキサンダー病、脳腱黄色腫症、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、ペリツェウス・メルツバッハー病、及びレフサム病からなる群から選択される状態に関連する、請求項６または請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記白質ジストロフィーが、カナバン病に関連する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ｒＡＡＶベクターを投与する前に、白質ジストロフィーを有する対象を選択することをさらに含む、請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

カナバン病の治療を必要とする対象におけるその方法であって、前記対象に治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記治療有効量が、約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲であり、
それによって、前記対象におけるカナバン病を治療する、前記方法。

【請求項12】

前記ｒＡＡＶベクターを投与する前に、カナバン病の対象を選択することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ｒＡＡＶベクターの投与が、前記対象の組織におけるＡＳＰＡの発現をもたらす、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記組織が、末梢組織または中枢神経系（ＣＮＳ）組織である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記対象において、解糖からベータ酸化への移行を含む代謝不均衡が存在することが判定されている、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記方法が、１つ以上の解糖及び／またはベータ酸化因子のレベルを評価することによって前記代謝不均衡を検出することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記１つ以上の解糖及び／またはベータ酸化因子のレベルが、前記対象から得られる中枢神経系（ＣＮＳ）液を使用して評価される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記方法が、
（ａ）前記対象からＣＮＳ液を得ることと、
（ｂ）前記ＣＮＳ液中のベータ酸化の増加を検出することと、
（ｃ）前記（ｂ）での検出に基づいて、前記ｒＡＡＶを前記対象に投与することと、をさらに含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記方法が、（ａ）前記対象から得られた生体試料の代謝プロファイルを測定することと、（ｂ）前記代謝プロファイルに基づいて、解糖からベータ酸化への移行を含む代謝不均衡を識別することと、をさらに含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記代謝プロファイルを測定することが、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、または超高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して前記生体試料をアッセイすることを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記生体試料が、血液、血清、ＣＮＳ組織、または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む、請求項１９または請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ＣＮＳ組織が、脳組織である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記代謝プロファイルが、グルコース、グルコース－６－リン酸、３－ホスホグリセリン酸、ピルビン酸、乳酸、及びホスホエノールピルビン酸からなる群から選択される第１のバイオマーカーのレベルを含む、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記代謝プロファイルが、カルニチン、マロニルカルニチン、ミリストイルカルニチン、パルミトイルカルニチン、マロニルカルニチン、及びベータヒドロキシ酪酸からなる群から選択される第２のバイオマーカーのレベルを含む、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記治療有効量が、約１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの範囲である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記治療有効量が、約１．３２×１０^１４ｖｇ／ｋｇである、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記治療有効量が、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇである、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記ｒＡＡＶが、注入によって投与される、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記ｒＡＡＶが、静脈内注入によって投与される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ｒＡＡＶが、注射によって投与される、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記注射が、静脈内注射、血管内注射、及び脳室内注射からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記対象が生後３０ヶ月以下である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

ＡＳＰＡが、ヒトＡＳＰＡタンパク質を含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

ＡＳＰＡが、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記プロモーターが、アストロサイト特異的プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、または強化型トリβ－アクチンプロモーターである、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記プロモーターが、サイトメガロウイルス／β－アクチンハイブリッドプロモーター、またはＰＧＫプロモーターである、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記サイトメガロウイルス／β－アクチンハイブリッドプロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＢ６プロモーター、またはＣＢＡプロモーターである、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

ＡＳＰＡをコードする前記非ＡＡＶヌクレオチド配列が、ヒトＡＳＰＡ ｃＤＮＡを含むか、またはそれからなる、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

ＡＳＰＡをコードする前記非ＡＡＶヌクレオチド配列が、コドン最適化ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

ＡＳＰＡをコードする前記非ＡＡＶヌクレオチド配列が、配列番号１を含むか、またはそれからなる、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記非ＡＡＶヌクレオチド配列が、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記核酸分子が、サイトメガロウイルス前初期エンハンサーを含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記核酸分子が、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルを含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記核酸分子が、Ｋｏｚａｋ配列を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記核酸分子が、ｍｉＲ－１２２結合部位を含む、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、またはｒｈ７４血清型ＩＴＲである、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、またはｒｈ７４血清型ｒＡＡＶである、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ９血清型ｒＡＡＶである、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記ｒＡＡＶが、自己相補性ｒＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記ｒＡＡＶが、一本鎖ｒＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

約１．３２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの組換え自己相補性アデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）ベクターを静脈内注入によって対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶ９ベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、及びウサギβ－グロビンポリＡシグナルを含む核酸分子と、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、前記対象におけるＡＳＰＡの発現を指示するＣＢ６プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記対象が生後３０ヶ月以下であり、前記対象がカナバン病を有する、方法。

【請求項52】

約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの組換え自己相補性アデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）ベクターを静脈内注入によって対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶ９ベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、及びウサギβ－グロビンポリＡシグナルを含む核酸分子と、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、前記対象におけるＡＳＰＡの発現を指示するＣＢ６プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記対象が生後３０ヶ月以下であり、前記対象がカナバン病を有する、方法。

【請求項53】

（ａ）前記対象に低分子代謝調節物質を投与すること、（ｂ）前記対象に食事介入を処方することであって、前記食事介入が、前記対象における解糖を促進し、及び／またはベータ酸化を低減する、前記処方すること、及び／または（ｃ）前記対象に免疫抑制剤を投与すること、をさらに含む、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

治療有効量のグルココルチコイドを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記グルココルチコイドが、前記ｒＡＡＶベクターの投与前、投与と同時、及び／または投与後に投与される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記グルココルチコイドが、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、またはそれらの組み合わせである、請求項５４または請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記対象に、治療有効量の抗ヒスタミン剤を投与することをさらに含む、請求項１～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記抗ヒスタミン剤が、前記ｒＡＡＶベクターの投与前、投与と同時、及び／または投与後に投与される、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記抗ヒスタミン剤が、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、クロルフェニラミン、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５７または請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記投与後、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び／または脳組織中のＮ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）レベルが低下する、請求項１～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

前記投与後、尿中のＮＡＡレベルが低下する、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記尿中のＮＡＡレベルが、少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上低下する、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記尿中のＮＡＡレベルが、少なくとも６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、またはそれ以上、治療前のレベルと比較して低減したままである、請求項６１または６２に記載の方法。

【請求項64】

前記投与後、ＣＳＦ中のＮＡＡレベルが低下する、請求項６０～６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

前記ＣＳＦ中のＮＡＡレベルが、少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上低下する、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記ＣＳＦ中のＮＡＡレベルが、少なくとも６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、またはそれ以上、治療前のレベルと比較して低下したままである、請求項６４または６５に記載の方法。

【請求項67】

前記投与後、脳組織中のＮＡＡレベルが低下する、請求項６０～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

前記脳組織中のＮＡＡレベルが、少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上低下する、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記脳組織中のＮＡＡレベルが、少なくとも６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、またはそれ以上、治療前のレベルと比較して低減したままである、請求項６７または６８に記載の方法。

【請求項70】

前記投与後、新規髄鞘形成が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用して観察可能である、請求項１～６９のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１２日に出願された米国仮出願第６３／２５４，８８５号、及び２０２２年６月１４日に出願された米国仮出願第６３／３５２，０４９号に対する優先権の利益を主張し、そのそれぞれの内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子配列表に対する言及
電子配列表の内容（ＡＳＰＡ＿００４＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ；サイズ：３２，４５０バイト；及び作成日：２０２２年１０月１１日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

白質ジストロフィーは、ミエリン及び中枢神経系（ＣＮＳ）白質の他の成分、例えば、乏突起膠細胞及びアストロサイトと呼ばれる細胞の異常な産生、処理、または発達に起因するまれな、主に遺伝性の神経障害の群である。ミエリン機能の低下は、神経機能の進行的喪失をもたらす。

【0004】

５０種類以上の白質ジストロフィーが同定されており、その中には次のものがある：自律神経疾患を伴うアレキサンダー病常染色体優勢白質ジストロフィー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ）（ＡＤＬＤ）、カナバン病、脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ペリツェウス・メルツバッハー病、及びレフサム病。白質ジストロフィーの具体的な症状は、疾患の種類よって大きく異なる。

【0005】

疾患の経過を著しく変える白質ジストロフィーの治療法はない。代わりに、治療は、症状を緩和し、いくつかの神経機能を維持することを目的としている。したがって、カナバン病などの白質ジストロフィー疾患タイプのための新しい治療剤を開発するための満たされていない需要が存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、遺伝子療法による白質ジストロフィーを有する対象の治療方法を提供する。遺伝子療法は、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターの投与を含み得る。

【0007】

ある態様では、本開示は、対象に治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、（ｉｉ）アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されている、非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含む、方法を提供する。

【0008】

関連する態様では、本開示は、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）の発現を必要とする対象におけるその方法であって、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを対象に投与することを含み、ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、方法を提供する。

【0009】

別の態様では、本開示は、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）のレベルの増加を必要とする対象におけるその方法であって、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを対象に投与することを含み、ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、方法を提供する。

【0010】

さらなる態様では、本開示は、白質ジストロフィーの治療を必要とする対象におけるその方法であって、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを対象に投与することを含み、ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、方法を提供する。

【0011】

別の態様では、本開示は、カナバン病の治療を必要とする対象におけるその方法であって、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを対象に投与することを含み、ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、方法を提供する。

【0012】

別の態様では、本開示は、白質ジストロフィーの治療における治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの使用であって、ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、使用を提供する。

【0013】

別の態様では、本開示は、カナバン病の治療における治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの使用であって、ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、使用を提供する。

【0014】

さらなる態様では、本開示は、白質ジストロフィーの治療のための組成物であって、カナバン病の治療における治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含み、ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、組成物を提供する。

【0015】

さらなる態様では、本開示は、カナバン病の治療のための組成物であって、カナバン病の治療における治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含み、ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、組成物を提供する。

【0016】

別の態様では、本開示は、白質ジストロフィーを治療するための物質の産生のための薬剤の製造における治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの使用方法であって、ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、方法を提供する。

【0017】

別の態様では、本開示は、カナバン病を治療するための物質の産生のための薬剤の製造における治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの使用方法であって、ｒＡＡＶベクターが、（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、方法を提供する。

【0018】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、白質ジストロフィーは、カナバン病、副腎脊髄ニューロパチー、アレキサンダー病、脳腱黄色腫症、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、ペリツェウス・メルツバッハー病、及びレフサム病からなる群から選択される状態に関連する。いくつかの実施形態では、白質ジストロフィーはカナバン病に関連している。

【0019】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、治療有効量は、約１０^１３ベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、約１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、少なくとも約１．３２×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、治療有効量は約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。

【0020】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、静脈内注入によって投与される。

【0021】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、生後３０ヶ月以下である。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ＣＢ６プロモーター及びヒトＡＳＰＡタンパク質をコードするコドン最適化された導入遺伝子を含む、「ｓｃＡＡＶ９－ＣＢ６－ｈＡＳＰＡｏｐｔ」と称される、実施例１の研究で使用される自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターの設計を示す。略語：ＣＭＶ：サイトメガロウイルス；ＩＥ：前初期；ＩＴＲ：逆位末端反復。

【0023】

【図2】ＢＢＰ－８１２の中用量及び高用量レジメンで処置した動物の体重を示す。最初の３２日間は隔日、その後は隔週で体重を測定した（それぞれｎ＝１０）。

【0024】

【図3】総クレアチン（ｔＣｒ）（ｎ＝３）に対して正規化された、総Ｎ－アセチルアスパラギン酸（ｔＮＡＡ）レベルを示す脳の磁気共鳴分光分析を示す。

【0025】

【図4】野生型（ＷＴ）マウス、未処置マウス、及びＢＢＰ－８１２で処置したマウスの、出生後日（ＰＮＤ）２７、９０、１８０、及び３６４における運動行動試験時間を示す。

【0026】

【図5A】２．６×１０^１３、８．８×１０^１３、及び２．６×１０^１４ベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）で、ＢＢＰ－８１２でＰＮＤ１で処置した、野生型及びＡｓｐａ－／－（ノックアウト、ＫＯ）マウスにおける脳組織学を示す。（ＣＡ３：アンモン角３；Ｃｅ：小脳；Ｃｘ：皮質；ＤＧ：歯状回）。

【図5B】２．６×１０^１３、８．８×１０^１３、及び２．６×１０^１４ベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）で、ＢＢＰ－８１２でＰＮＤ１で処置した、野生型及びＡｓｐａ－／－（ノックアウト、ＫＯ）マウスにおける脳組織学を示す。（ＣＡ３：アンモン角３；Ｃｅ：小脳；Ｃｘ：皮質；ＤＧ：歯状回）。

【0027】

【図6】ベクター投与後３６４日目において、ｄｄＰＣＲを使用した、細胞当たりのベクターゲノムコピー数について分析したＣＮＳの１１の異なる領域を示す。（ＢＳ：脳幹；ＣＢＬ：小脳；ＣＳＣ：頸部脊髄；ＣＮＳ：中枢神経系；Ｃｘ：皮質；ｄｄＰＣＲ：液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応；ＨＰＣ：海馬；ＬＭＮ：蓋板；ＬＳＣ：腰髄；ＭＢ：中脳）。

【0028】

【図7A】ＢＢＰ－８１２でＰＮＤ１（生後１日目）に処置した野生型Ａｓｐａ－／－マウスにおける脳組織学を示す。

【図7B】ＢＢＰ－８１２でＰＮＤ１（生後１日目）に処置した野生型Ａｓｐａ－／－マウスにおける脳組織学を示す。

【0029】

【図8】ＢＢＰ－８１２の生体内分布及びｈＡＳＰＡＯｐｔ導入遺伝子の発現を決定するために採取し、使用した試料の位置を示す。

【0030】

【図9】脳（図９Ａ）、脊髄（図９Ｂ）、肝臓（図９Ｃ）、心臓（図９Ｄ）、及び腎臓（図９Ｅ）におけるＢＢＰ－８１２の評価を示す。脳及び脊髄の場合、各個々の組織領域は、個々のデータ点としてプロットされる。

【0031】

【図10A】クレアチンキナーゼ（図１０Ａ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（図１０Ｂ）の測定値を示す。

【図10B】クレアチンキナーゼ（図１０Ａ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（図１０Ｂ）の測定値を示す。

【0032】

【図11】ビヒクル（Ｖ）、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ処置動物（Ｌ）、または３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ処置マウス（Ｈ）からの脾臓細胞の、培地（陰性対照）、ＣｏｎＡ（陽性対照）、及びペプチドプールの、ＡＡＶ９及びＡＳＰＡに対する反応性を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。（ＳＦＵ：スポット成形単位）。

【0033】

【図12】４週、１２週、及び２４週の生体内分布試料から３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ用量群で検出された、ベクターゲノム（上パネル）及び導入遺伝子ＲＮＡ（下パネル）を示す。

【0034】

【図13】カナバン病を治療するための遺伝子療法の第１／２相研究のタイムライン及び全体的な設計を示す。（ｄ：日；ＤＳＭＣ：データ及び安全性モニタリング委員会；ｋｇ：キログラム；ｍｏ：月；Ｎ：参加者数；ｖｇ：ベクターゲノム）。

【0035】

【図14】研究用量の設定、観察、及び登録拡大シーケンスを示す。

【0036】

【図15】グルココルチコイド予防及びテーパリングレジメンを示す。

【発明を実施するための形態】

【0037】

本開示は、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）の発現を必要とする対象においてそうするように操作された、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。本開示の態様は、神経変性疾患（例えば、カナバン病などの白質ジストロフィー）の治療を必要とする対象におけるその方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、対象におけるＮ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）レベルを調節することを含む。ＮＡＡは、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）によって酢酸塩及びＬ－アスパラギン酸塩に代謝される。

【0038】

本明細書に使用される見出しは、単に構成の目的のためであり、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、論説、書籍及び論文を含むが、これらに限定されない、本明細書で引用されている文書または文書の一部は全て、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。組み込まれた文書または文書の一部の１つ以上が、ある用語を定義し、それが本出願でのその用語の定義と矛盾する場合、本出願に記載される定義が優先する。しかしながら、本明細書で引用された任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成する、または世界の任意の国における一般的知識の一部を形成するという認識、または示唆の任意の形態ではなく、そのように受け取られるべきではない。

【0039】

本明細書において、いかなる濃度範囲、百分率範囲、比範囲、または整数範囲も、特に明記しない限り、記載された範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合には、その分数（例えば、整数の１０分の１及び１００分の１）を含むと理解されるべきである。用語「約」は、数または数字の直前にある場合、数または数字がプラスまたはマイナス１０％の範囲であることを意味する。本明細書で使用されるとき、用語「ａ」及び「ａｎ」は、特に明記しない限り、示される構成要素のうちの「１つ以上」を指すと理解されるべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のうちの一方、双方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。用語「及び／または」は、選択肢のちの一方または双方のいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同義的に使用される。

【0040】

組換えＡＡＶベクター及び粒子
ある態様では、本開示は、ＡＳＰＡをコードする核酸配列を細胞、例えば治療を必要とする細胞に送達するためのウイルスベクターを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及びＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（異種ポリヌクレオチドとも称される）を含む核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに関し、非ＡＡＶヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されている。

【0041】

本明細書で使用される場合、「作動可能な連結」または「作動可能に連結された」という用語は、それらが意図された様式で機能することを可能にするように記載された構成要素の物理的または機能的な並置を指す。ポリヌクレオチドと作動可能に連結した発現制御エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）の例では、関係は、制御要素が核酸の発現を調節するようなものである。より具体的には、例えば、２つのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列が作動可能に連結されていることは、２つのＤＮＡが、ＤＮＡ配列のうちの少なくとも１つが他の配列に生理学的効果を及ぼすことができるような関係で（シスまたはトランス）配置されていることを意味する。「作動可能に連結された」とは、連結されている核酸配列が連続している、または実質的に連続していることを意味し得、２つのタンパク質コード領域を連結するのに必要な場合には、連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味し得る。

【0042】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ヒトＡＳＰＡタンパク質であるＡＳＰＡタンパク質を発現する。いくつかの場合では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターによって発現されるＡＳＰＡタンパク質は、天然（例えば、野生型）ＡＳＰＡタンパク質である。ヌクレオチド配列によってコードされるＡＳＰＡタンパク質またはポリペプチドは、天然に存在するＡＳＰＡタンパク質と同様に、完全長の天然配列、ならびに機能的部分配列、修飾形態、または配列変異体を含み、ただし、その部分配列、修飾形態、または変異体は、天然の完全長ＡＳＰＡタンパク質のある程度の機能を保持する。本開示の方法及び使用において、ｒＡＡＶベクター中のヌクレオチド配列によってコードされるＡＳＰＡタンパク質及びポリペプチドは、治療された対象において欠損しているか、またはその発現が不十分であるか、または欠乏している内因性ＡＳＰＡタンパク質と同一であり得るが、必須ではない。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡは、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0043】

いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（例えば、異種配列）は、野生型ＡＳＰＡ遺伝子配列である。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（例えば、異種配列）は、野生型ＡＳＰＡ遺伝子配列に対してコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、本開示のＡＳＰＡをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化配列であり、配列番号１を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、ＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列は、配列番号１に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（例えば、異種配列）は、ヒトＡＳＰＡ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり、任意選択により、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグをコードするヌクレオチド配列に連結されている。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（例えば、異種配列）は、タグ、例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＵＡ、ｃＭｙｃ、または任意の好適なタグをコードするヌクレオチド配列に結合されている。

【0044】

コドン最適化は、遺伝暗号の冗長性を利用して、コードされたタンパク質の同じアミノ酸配列を維持しながらヌクレオチド配列を変更できるようにする。いくつかの実施形態では、コードされたタンパク質の発現の増加または減少を促進するためにコドン最適化が実行される。これは、ヌクレオチド配列におけるコドンの使用を特定の細胞型のものに合わせることによって達成され、したがって、細胞型における特定の転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）の相対存在量におけるバイアスに対応する細胞コドンのバイアスを利用する。ヌクレオチド配列のコドンを、対応するｔＲＮＡの相対存在量に合うように変更することで、発現を増加させることができる。逆に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型ではまれであることがわかっているコドンを選択することによって、発現を減少させることができる。

【0045】

いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡタンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、野生型ｃＤＮＡ配列よりも安定であり、それによって、非ＡＡＶヌクレオチド配列が遺伝子療法を通じて転写装置に導入される場合、交互にスプライシングされた変異体または切断されたタンパク質の生成を回避する。

【表1-1】

【表1-2】

【0046】

用語「相同」または「相同性」は、２つ以上の参照されるエンティティが定義された領域（例えば、領域、ドメイン、または部分）にわたって同じであることを意味する（例えば、エンティティが整列されている場合）。「整列された」配列とは、複数のポリヌクレオチドまたはタンパク質（アミノ酸）の配列を指し、参照配列と比べて欠落または追加の塩基またはアミノ酸（ギャップ）の補正を含有することが多い。２つの配列が少なくとも部分的に相同である場合、それらは少なくとも部分的な同一性を共有する。相同性または同一性の「領域（Ａｒｅａ）」、「領域（ｒｅｇｉｏｎ）」または「ドメイン」は、それらが相同性または同一性を共有するように、２つ以上の参照されるエンティティの一部が同一であることを意味する。したがって、２つの配列が１つ以上の配列領域にわたって同一である場合、それらはこれらの領域で同一性を共有する。例として、２つのポリペプチド配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照される領域または部分内で、同じアミノ酸配列を有する。同様に、２つのポリヌクレオチド配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照される領域または部分内で、同じポリヌクレオチド配列を有する。「実質的な相同性」は、参照分子の構造または機能（例えば、生物学的機能または活性）のうちの１つ以上、またはそれが相同性を共有する参照分子の関連する／対応する領域または部分の少なくとも部分的な構造または機能を有するか、または有すると予測されるように、分子が構造的にまたは機能的に保存されることを意味する。

【0047】

２つの配列間の同一性または相同性は、配列長全体または配列の一部にわたって延在し得る。いくつかの実施形態では、パーセント同一性を共有する配列の長さは、２個、３個、４個、５個、またはそれよりも多く連続したポリヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれよりも多くの連続したアミノ酸である。いくつかの実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、２０個以上の連続したポリヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、少なくとも２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、またはそれ以上の連続したアミノ酸である。いくつかの実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、３５以上の連続したポリヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、少なくとも３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、またはそれ以上の連続したアミノ酸である。いくつかの実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、５０以上の連続したポリヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、少なくとも５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～１００、１００～１１０、またはそれ以上の連続したポリヌクレオチドまたはアミノ酸である。

【0048】

２つの配列間の同一性（相同性）の程度は、コンピュータープログラム及び数学的アルゴリズムを使用して確認することができる。パーセント同一性は、初期設定のパラメータを使用するｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏから入手可能なアラインメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して算出することができる。例えば、Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆａｓｔ，ｓｃａｌａｂｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ．”（２０１１ Ｏｃｔｏｂｅｒ １１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ７：５３９を参照されたい。配列に対する同一性を計算するために、タグのような拡張は含まれない。

【0049】

本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノム配列を含むベクターゲノム配列は、１つ以上の「発現制御エレメント」を含むことができる。典型的には、発現制御エレメントは、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現に影響を与える核酸配列である。ベクター内に存在するプロモーター及びエンハンサー等の本明細書に記載の発現制御エレメントを含む制御エレメントは、適切な異種ポリヌクレオチド（例えば、ＡＳＰＡ遺伝子）の転写及び／または翻訳（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にするための遺伝子の正しい読み取りフレームの維持等）を容易にするために含まれる。発現制御エレメントには、適切な転写開始、終結、プロモーター、及びエンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡ処理シグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質安定性を高める配列、ならびに場合によっては、コードされた生成物（例えば、ＡＳＰＡ）の分泌を高める配列が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクターゲノム配列は、Ｋｏｚａｋ配列（例えば、ＲＮＡ Ｋｏｚａｋ配列に転写されるＤＮＡ配列）のようなコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクターゲノム配列は、ＡＳＰＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流にＫｏｚａｋ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ Ｋｏｚａｋ配列は、ＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号４４）、ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号４５）、ＣＣＡＣＣＡＵＧ（配列番号４６）、またはＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号４７）を含むかまたはそれからなる。

【0050】

発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルで行うことができる。典型的には、転写を調節する発現制御エレメントは、転写されたポリヌクレオチドの５’末端の近く（すなわち、「上流」）に並置される。発現制御エレメントはまた、転写配列の３’末端（すなわち、「下流」）に位置するか、または転写産物内（例えば、イントロン内）に位置することができる。発現制御エレメントは、かなりの距離であるが、転写された配列から離れた距離（例えば、ＡＳＰＡを発現するヌクレオチド配列からの１００～５００、５００～１０００、２０００～５０００、５０００～１０，０００、またはそれ以上のヌクレオチド）に位置することができる。それにもかかわらず、ポリヌクレオチド長の制限のために、ＡＡＶベクターについて、そのような発現制御エレメントは、典型的には、ＡＳＰＡをコードするヌクレオチド配列から１～１０００ヌクレオチド以内であろう。

【0051】

機能的には、ＡＳＰＡをコードする作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現は、エレメント（例えば、プロモーター）によって少なくとも部分的に制御可能であり、その結果、エレメントは、ヌクレオチド配列の転写を調節し、必要に応じて、転写産物の翻訳を調節する。発現制御エレメントの具体的な例はプロモーターであり、それは通常、転写された配列の５’に位置する。発現制御エレメントの別の例はエンハンサーであり、それは転写された配列の５’、転写された配列の３’、または転写配列内に位置することができる。

【0052】

本明細書で使用される「プロモーター」は、組換え産物（例えば、ＡＳＰＡ）をコードする核酸配列（例えば、異種ポリヌクレオチド）に隣接して位置する核酸配列を指すことができる。プロモーターは、典型的には、隣接する配列、例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。プロモーターは通常、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比べて、異種ポリヌクレオチドから発現される量を増加させる。

【0053】

本明細書で使用される「エンハンサー」は、ＡＳＰＡをコードするヌクレオチド配列に隣接して位置する配列を指すことができる。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントの上流に位置するが、機能的でもあり、ＤＮＡ配列（例えば、ＡＳＰＡをコードするヌクレオチド配列）の下流またはＤＮＡ配列内に位置し得る。したがって、エンハンサーエレメントは、異種ポリヌクレオチドの上流または下流に１００塩基対、２００塩基対、または３００以上の塩基対を配置することができる。エンハンサーエレメントは通常、プロモーター要素によってもたらされる発現増加のレベルを超えて、異種ポリヌクレオチドの発現を増加させる。

【0054】

いくつかの実施形態では、発現制御エレメントは、多くの異なる細胞型におけるポリヌクレオチドの発現を駆動することができるユビキタス、構成的または無差別プロモーター及び／またはエンハンサーを含む。そのような要素には、サイトメガロウイルス／β－アクチンハイブリッド（例えば、ＣＡＧ、ＣＢ６、またはＣＢＡ）プロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター及び／またはエンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター及び／またはエンハンサー配列、ならびに様々な哺乳動物細胞型で活性な他のウイルスプロモーター及び／またはエンハンサー、または天然に存在しない合成要素（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、トリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ１プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＢＡプロモーターと結合された前初期ＣＭＶエンハンサー（Ｂｅｌｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（９）：１１６２－１１７４（２０１０））、及びＣＢｈプロモーター（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２２（９）：１１４３－１１５３（２０１１））が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶは、ＣＭＶエンハンサーの一部、トリベータアクチンプロモーターの一部、及びＵＢＣエンハンサーの一部を含有する合成ＣＡＳＩプロモーターを含む。（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１２１１５９８０号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、プロモーターは、アストロサイト特異的プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、または強化型トリβ－アクチンプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス／β－アクチンハイブリッドプロモーター、またはＰＧＫプロモーターである。いくつかの実施形態では、サイトメガロウイルス／β－アクチンハイブリッドプロモーターは、ＣＡＧプロモーター、ＣＢ６プロモーター、またはＣＢＡプロモーターである。

【0055】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号２を含むＣＡＧプロモーター配列、または配列番号２に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号３を含むＰＧＫプロモーター配列、または配列番号３に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号４を含むＣＢ６プロモーター配列、または配列番号４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号５を含むＣＢＡプロモーター配列、または配列番号５に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。表１は、プロモーター配列の非限定的な例を含む。

【0056】

誘導性プロモーターは、遺伝子発現の制御を可能にし、外来的に供給される化合物、温度のような環境因子、もしくは特定の生理学的状態、急性期、細胞の特定の分化状態の存在によって、または複製している細胞のみにて調節され得る。誘導性プロモーター及び誘導系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＣｌｏｎｔｅｃｈを含むがこれらに限定されない、種々の市販の供給源から入手可能である。他の多くの系が記載されており、使用可能である。外来的に供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制系、テトラサイクリン誘導系、ＲＵ４８６誘導系、及びラパマイシン誘導系が挙げられる。厳密に調節され、ＡＳＰＡ発現が意図される特定の標的細胞型に特異的である任意の種類の誘導性プロモーターを使用してもよい。

【0057】

発現制御エレメント（例えば、プロモーター）は、本明細書において「組織特異的発現制御エレメント／プロモーター」と称される、特定の組織または細胞型において活性なものを含む。組織特異的発現制御エレメントは、典型的には、特定の細胞または組織（例えば、脳、中枢神経系、脊髄等）において活性である。発現制御エレメントは、特定の細胞、組織、または臓器タイプに固有である転写活性化タンパク質、または他の転写調節因子によって認識されるため、典型的には、これらの細胞、組織、または臓器において活性である。したがって、いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶベクターは、宿主細胞（例えば、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア細胞、アストロサイトもしくはニューロン等の神経細胞、または肝細胞等の非神経細胞）におけるＡＳＰＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指示するプロモーターを含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクターにおいて有用な調節配列はまた、イントロンを含有し、イントロンは任意選択によりプロモーター／エンハンサー配列とＡＳＰＡ遺伝子との間に位置する。いくつかの実施形態では、イントロン配列はＳＶ－４０に由来し、ＳＤ－ＳＡと呼ばれる１００ｂｐのミニイントロンスプライスドナー／スプライスアクセプターである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは転写後調節要素を含む。転写後調節要素の一例は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後エレメント（ＷＰＲＥ）である。（例えば、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｖｅｒｍａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６：３９０６－３９１０（１９９９）を参照されたい）。特定の実施形態では、転写後調節要素は、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＢＶＰＲＥ）またはＲＮＡ輸送要素（ＲＴＥ）である。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥまたはＨＢＶＰＲＥ配列は、米国特許第６，１３６，５９７号または米国特許第６，２８７，８１４号に開示されるＷＰＲＥまたはＨＢＶＰＲＥ配列のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥ配列は以下を含むかまたはそれらからなる：

【化1】

【0059】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ポリＡシグナルを含む。ポリＡシグナルは、ウサギ、ＳＶ－４０、ヒト、及びウシを含むがこれらに限定されない多くの好適な種に由来し得る。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルなどのウサギグロビンポリＡシグナルを含む。いくつかの実施形態では、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルは、配列番号１０１の核酸配列を有するか、または配列番号１０１（配列番号１０１－ａａｔａａａｇｇａａ ａｔｔｔａｔｔｔｔｃ ａｔｔｇｃａａｔａｇ ｔｇｔｇｔｔｇｇａａ ｔｔｔｔｔｔｇｔｇｔ ｃｔｃｔｃａ）と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を有する。

【0060】

ｒＡＡＶベクターに含まれてもよい別の有用な調節成分は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列または他の好適な系を使用して、単一の遺伝子転写物から２つ以上のポリペプチドを生成してもよい。ＩＲＥＳ（または他の好適な配列）を使用して、２つ以上のポリペプチド鎖を含有するタンパク質を生成する、または同じ細胞から、または同じ細胞内で、２つの異なるタンパク質を発現させる。例示的なＩＲＥＳは、ポリオウイルス配列内リボソーム進入配列である。ＩＲＥＳは、ｒＡＡＶベクター内のＡＳＰＡ導入遺伝子に対して５’または３’に位置し得る。他の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、単一のプロモーターからの複数のポリペプチドの発現を可能にする２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0061】

本明細書で使用される場合、組換え「ベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、ウイルスから野生型ゲノムを除去し、それを異種ポリヌクレオチド配列（例えば、ＡＳＰＡを発現する治療用遺伝子発現カセット）等の非天然核酸で置き換えるための分子方法を使用することによって、ＡＡＶ等のウイルスの野生型ゲノムに由来するベクターを指す。通常、ＡＡＶについては、野生型ＡＡＶゲノムの一方または双方の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列がＡＡＶベクター内に保持される。ウイルスゲノムの全て（または一部）がウイルスゲノム核酸に関して非ネイティブ配列に置換されているので、ｒＡＡＶベクターはウイルスゲノムと区別することができる。したがって、異種ポリヌクレオチドなどの非天然配列の組み込みは、ウイルスベクターを「組換え」ベクターとして定義し、ＡＡＶの場合には「ｒＡＡＶベクター」と称することができる。ＡＳＰＡをコードする核酸分子を含むｒＡＡＶベクターはまた、「ｓｃＡＡＶ９－ＣＢ６－ｈＡＳＰＡｏｐｔ」または「ＡＳＰＡベクター」と称されてもよい。文脈から明らかなように、「ベクター」は、単離された組換えヌクレオチド配列、または組換えヌクレオチド配列を含むＡＡＶ粒子もしくはビリオンを指してもよい。

【0062】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）に対するいかなる結合部位をも含まない。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＳＰＡタンパク質の発現が所望されない（すなわち、非標的化）細胞において発現されるｍｉＲＮＡに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｍｉＲ－１２２に対する１つ以上の結合部位を含む。ＡＳＰＡコード配列へのｍｉＲ－１２２の結合は、ｍｉＲ－１２２が非常に広く存在する肝細胞におけるこの配列の発現を低下させ得る（Ｔｈａｋｒａｌ ａｎｄ Ｇｈｏｓｈａｌ，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１５；１５（２）：１４２－１５０）。

【0063】

ｒＡＡＶ核酸配列を、エクスビボ、インビトロ、またはインビボにおける細胞のその後の感染（形質転換）のためにウイルス（本明細書において「粒子」または「ビリオン」とも称される）にパッケージ化することができる。組換えベクター配列がＡＡＶ粒子に封入またはパッケージ化されている場合、粒子は「ｒＡＡＶ」と称され得る。そのような粒子またはビリオンには通常、ベクターゲノムをカプシドで封入するまたはパッケージングするタンパク質が含まれる。特定の例には、ウイルスエンベロープタンパク質、及びＡＡＶの場合はカプシドタンパク質が含まれる。

【0064】

本明細書に記載されているｒＡＡＶベクター及びｒＡＡＶ粒子のＡＡＶ成分は、種々のＡＡＶ血清型から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｒｈ１０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはｒｈ７４血清型由来のＡＡＶ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９血清型由来のＡＡＶ核酸配列を含む。これらのＡＡＶ成分は、種々の技術を使用してＡＡＶ血清型から容易に単離され得る。そのようなＡＡＶは、単離されてもよく、または学術的、商業的、または公的な情報源から得られてもよい（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献中または例えばＧｅｎＢａｎｋ（商標）、ＰｕｂＭｅｄ等のデータベース中で利用可能であるような公表された配列を参照することによって、合成または他の好適な手段によって得られてもよい。

【0065】

ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９０６，１１１号または米国特許第７，６２９，３２２号に開示されるようなＡＡＶ核酸配列またはＡＡＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２８２，１９９号、第９，５８７，２５０号または第９，６７７，０８９号に開示されるような、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ８またはその変異体由来のＡＡＶ核酸配列またはＡＡＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１９８，９５１号に開示されるような、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ９またはその変異体由来のＡＡＶ核酸配列またはＡＡＶタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ｒｈ７４またはその変異型由来のＡＡＶ核酸配列またはＡＡＶタンパク質を含む。

【0066】

いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む核酸分子を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは２つのＩＴＲ配列を含み、これらのＩＴＲ配列は同じまたは異なるＡＡＶ血清型のものであってもよい。ＡＡＶ ＩＴＲは、ｒｈ１０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ７４、及び他のＡＡＶ血清型を含むがこれらに限定されない、任意の有用なＡＡＶ血清型の中から選択され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｒＡＡＶベクターは、１つまたは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含むゲノムを含む。

【0067】

本開示はさらに、本明細書に記載されているｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。したがって、いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ、及びＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（異種ポリヌクレオチドとも称される）を含む核酸分子を含むｒＡＡＶ粒子に関し、非ＡＡＶヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ｒｈ１０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ７４、及び他のＡＡＶ血清型からなる群から選択される少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。

【0068】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ヒトＡＳＰＡ ｃＤＮＡ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＣＢＡまたはＣＢ６プロモーター、及び任意選択により１つまたは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＡＳＰＡｏｐｔ、ＡＡＶ９－ＰＧＫ－ｈＡＳＰＡｏｐｔ、ＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｈＡＳＰＡｏｐｔまたはＡＡＶ９－ＣＢ６－ｈＡＳＰＡｏｐｔベクターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５、または配列番号２、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、Ｋｏｚａｋ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７を含むか、またはそれに転写することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＨＢＶＰＲＥ配列またはＷＰＲＥ配列（例えば、配列番号５１）をさらに含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、カプシド（「Ｃａｐ」）タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３及び超可変領域を含む）、ウイルス複製（「Ｒｅｐ」）タンパク質（例えば、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、またはｒｅｐ４０）、及び／または１つ以上のそのようなタンパク質をコードする配列を含む。これらのＡＡＶ成分は、様々なベクター系及び宿主細胞において容易に利用され得る。そのような構成成分は、単独で、他のＡＡＶ血清型配列もしくは成分と組み合わせて、または非ＡＡＶウイルス配列由来の要素と組み合わせて使用されてもよい。本明細書で使用されるとき、人工ＡＡＶ血清型は、限定するものではないが、天然に存在しないカプシドタンパク質を持つＡＡＶが含まれる。そのような人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を、異なる選択されたＡＡＶ血清型から、同じＡＡＶ血清型の非連続部分から、非ＡＡＶウイルス源から、または非ウイルス源から得られてもよい異種配列と組み合わせて使用して、任意の好適な技術によって生成されてもよい。人工ＡＡＶ血清型は、限定するものではないが、シュードＡＡＶ、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであってもよい。１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質で置換されているシュードベクターは本開示において有用である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ２／５である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ２／８である。例えば、Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（７）：６３７－６４５（２０１１）；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６（２）：７９１－８０１（２００２）を参照されたい。

【0070】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている組成物及び方法にて有用なベクターは、少なくとも、選択されたＡＡＶ血清型カプシドまたはその断片をコードする配列を含有する。いくつかの実施形態では、有用なベクターは、少なくとも、選択されたＡＡＶ血清型ｒｅｐタンパク質またはその断片をコードする配列を含有する。任意選択により、そのようなベクターはＡＡＶのｃａｐタンパク質とｒｅｐタンパク質の双方を含有してもよい。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐの双方が提供されているベクターでは、ＡＡＶのｒｅｐ配列及びＡＡＶのｃａｐ配列は双方とも１つの血清型であることができる。あるいは、ｒｅｐ配列が１つのＡＡＶ血清型に由来し、ｃａｐ配列が異なるＡＡＶ血清型に由来するベクターが使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、別個の供給源（例えば、別個のベクター、または宿主細胞及びベクター）から発現される。いくつかの実施形態では、これらのｒｅｐ配列は、異なるＡＡＶ血清型の配列をキャップするフレーム内で融合されて、米国特許第７，２８２，１９９号に記載されるＡＡＶ２／８などのキメラＡＡＶベクターを形成し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0071】

好適なｒＡＡＶは、本明細書に定義されるＡＡＶ血清型カプシドタンパク質、またはその断片をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、少なくともＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及びＡＳＰＡをコードする核酸配列からなる核酸分子、ならびに核酸分子のＡＡＶカプシドタンパク質へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することによって生成することができる。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されているｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子を含む宿主細胞を提供する。ｒＡＡＶベクターをＡＡＶカプシド内にパッケージングするために宿主細胞内に存在する必要がある成分は、トランスで宿主細胞に提供されてもよい。あるいは、必要な成分（例えば、ベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／またはヘルパー機能）のうちのいずれか１つ以上は、様々な方法を使用して必要な成分のうちの１つ以上を含有するように操作された安定した宿主細胞によって提供され得る。最も好適には、そのような安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下に必要とされる成分（複数可）を含有するであろう。しかしながら、必要とされる成分（複数可）は構成的プロモーターの制御下にあってもよい。非ＡＡＶヌクレオチド配列、すなわち、ＡＳＰＡとともに使用するのに適した調節要素の上記の議論において、好適な誘導性及び構成的プロモーターの例が本明細書に提供される。さらに別の代替では、選択された安定した宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された成分（複数可）と、１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された成分（複数可）とを含有し得る。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐタンパク質及び／またはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞が生成されてもよい。さらに他の安定な宿主細胞が生成されてもよい。

【0072】

本開示のｒＡＡＶを産生するために使用されるｒＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、その上に運ばれる配列を移す任意の遺伝要素の形態でパッケージング宿主細胞に送達され得る。選択された遺伝要素は、本明細書に記載されている方法を含む任意の好適な方法によって送達されてもよい。ｒＡＡＶ粒子の生成を含む、本開示の任意の実施形態を構築するのに使用される方法は、核酸操作の当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学及び合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（１９９３）；及びＵＳ ５，４７８，７４５を参照されたい。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。

【0073】

ある態様では、本開示は、ｒＡＡＶ粒子の産生方法を提供し、本方法は、（ａ）本明細書に記載のＡＳＰＡを発現するｒＡＡＶベクターゲノムを含むかまたはそれからなる核酸分子、（ｂ）ＡＡＶ ｒｅｐをコードする核酸分子、（ｃ）少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸分子、及び（ｄ）ｒＡＡＶベクターゲノムをｒＡＡＶ粒子にパッケージングするための十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。

【0074】

本開示のｒＡＡＶ粒子は種々の方法によって精製されてもよい。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルスは、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製されてもよい。例えば、米国特許公開第２０１８／０１６３１８３Ａ１号を参照されたい。本明細書に開示されるＡＡＶベクター及び粒子の構築及び特徴付けに関するさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１９／１４３８０３号に記載される。ＡＳＰＡをコードするｒＡＡＶ粒子に関するさらなる詳細は、米国特許第９，１０２，９４９号、米国特許公開第２０１９／０１２５８９９Ａ１号、及び米国特許公開第２０１８／０３１１３２３Ａ１号に見出すことができ、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0075】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるヒトＡＳＰＡ導入遺伝子の発現カセットを含有する非複製組換えＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）ベクターを含む組成物は、図２に示されるＡＡＶ－ｈＡＳＰＡｏｐｔ－Ｏｐｔベクター設計を有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの発現カセットは、配列番号１０２の核酸配列（配列番号１０２－ｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃ ｇｃｔｃｇｃｔｃａｃ ｔｇａｇｇｃｃｇｇｇ ｃｇａｃｃａａａｇｇ ｔｃｇｃｃｃｇａｃｇ ｃｃｃｇｇｇｃｔｔｔ ｇｃｃｃｇｇｇｃｇｇ ｃｃｔｃａｇｔｇａｇ ｃｇａｇｃｇａｇｃｇ ｃｇｃａｇａｇａｇｇ ｇａｇｔｇｇｃｃａａ ｃｔｃｃａｔｃａｃｔ ａｇｇｇｇｔｔｃｃｔ）を含む５’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの発現カセットは、配列番号１のｈＡＳＰＡをコードするコドン最適化された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの発現カセットは、配列番号１０１の核酸配列を含むウサギβ－グロビンポリＡを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの発現カセットは、配列番号１０３の核酸配列（配列番号１０３－ａｇｇａａｃｃｃｃｔ ａｇｔｇａｔｇｇａｇ ｔｔｇｇｃｃａｃｔｃ ｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇ ｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇ ｃｔｃａｃｔｇａｇｇ ｃｃｇｇｇｃｇａｃｃ ａａａｇｇｔｃｇｃｃ ｃｇａｃｇｃｃｃｇｇ ｇｃｔｔｔｇｃｃｃｇ ｇｇｃｇｇｃｃｔｃａ ｇｔｇａｇｃｇａｇｃ ｇａｇｃｇｃｇｃａｇ）を含む３’ＩＴＲを含む。

【0076】

薬学的組成物
本開示のｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。ある態様では、本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子（例えば、ＡＳＰＡをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ粒子）及び、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される」という用語は、確立された経路を使用して投与した場合に一般にアレルギー反応または他の重篤な有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。米国連邦政府または米国州政府の規制機関によって承認された、または米国薬局方または動物、より具体的にはヒトでの使用のために一般的に認識されている他の薬局方に記載されている分子実体及び組成物は、「薬学的に許容される」とみなされる。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意の及びあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含むことが意図されている。好適な担体は、当該分野における標準的な参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。そのような担体または希釈剤のいくつかの例として、限定されないが、水、食塩水、緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、５％ヒト血清アルブミン、及び適切な生理学的レベルでｐＨを維持するための他の緩衝剤、例えば、ＨＥＰＥＳが挙げられる。任意の媒体または薬剤が活性成分と不適合である限りを除き、組成物中でのそれらの使用が企図される。補助的活性化合物を組成物に組み込むこともできる。

【0077】

この説明全体を通して、「ｖｇ」は「ウイルスゲノム」または「ベクターゲノム」を指し得る。

【0078】

本明細書に開示されるｒＡＡＶの投与に使用され得る薬学的組成物及び送達系の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）２０^ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８^ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２^ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（１９９３），Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ ａｎｄ Ｓｔｏｋｌｏｓａ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１^ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８０），Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２５３－３１５に見出される。

【0079】

本開示の薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合するように製剤化されてもよい。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内投与、または注射が挙げられる。非経口（例えば、静脈内または注射による）適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化剤；アセテート、シトレートまたはホスフェート等の緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧を調整するための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチックでできた複数回用量バイアルに封入され得る。

【0080】

注射可能な使用に好適な薬学的組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液及び無菌の注射用溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。静脈内投与では、好適な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。組成物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、糖等の等張化剤、マンニトール及びソルビトール等の多価アルコール（例えば、ポリオール）、ならびに塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによってもたらすことができる。

【0081】

無菌注射液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて、上に列挙された原料のうちの１つまたはその組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上で列挙されたものからの必要とされる他の原料を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、有効成分に、予め無菌濾過したその溶液からの任意の追加的な成分を加えた粉末が得られる、真空乾燥及び凍結乾燥である。

【0082】

注射については、薬学的に許容される担体は液体とすることができる。例示的な生理学的に許容される担体には、発熱物質を含まない無菌水及び発熱物質を含まない無菌リン酸緩衝生理食塩水が含まれる。様々なそのような既知の担体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，６２９，３２２号に提供される。いくつかの実施形態では、担体は等張塩化ナトリウム溶液である。いくつかの実施形態では、担体は平衡塩類溶液である。いくつかの実施形態では、担体はＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリソルベート）を含む。ｒＡＡＶを長期間保管する場合、グリセロールまたはＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリソルベート）２０の存在下で凍結してもよい。

【0083】

投与の容易性及び投与量の均一性のために非経口組成物を投与量単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与量単位剤形は、治療される対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果がもたらされるように計算された所定の量の活性剤（例えば、ｒＡＡＶ）を含有する。本開示の投与量単位剤形の仕様は、活性剤（例えば、ｒＡＡＶ）固有の特徴及び達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の治療のためにそのような活性剤（例えば、ｒＡＡＶ）のを調合する技術分野に固有の制限によって必要とされ、かつそれらに直接依存する。単位剤形は、例えば、液体組成物、または凍結乾燥または凍結乾燥状態の組成物を含み得るアンプル及びバイアル内であり得、例えば、無菌液体担体は、インビボで投与または送達する前に添加することができる。個々の単位剤形は複数回用量のキットまたは容器に含めることができる。組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）配列、プラスミド、ベクターゲノム、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ）、及びそれらの薬学的組成物は、投与の容易さ及び投与量の均一性のために、単一または複数の単位剤形にパッケージ化することができる。

【0084】

ｒＡＡＶベクターを含む薬学的組成物またはＡＳＰＡをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ粒子は、容器、パック、またはディスペンサーに、投与のための指示書とともに含まれてもよい。

【0085】

いくつかの実施形態では、組成物は界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ポロキサマー１８８などのポロキサマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、増粘剤、可塑剤、及び／または凍結保護剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ソルビトールなどの糖アルコールを含む。いくつかの実施形態では、組成物は緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．０、５重量／体積（ｗ／ｖ）ソルビトール、０．００１％ｗ／ｖポロキサマー１８８中の無菌溶液として製剤化される。それは、２．５ｍＬの充填量で５ミリリットル（ｍＬ）のパイロジェンフリーバイアルで供給し、ラテックスフリーのゴムストッパーとアルミニウムフリップオフシールで密封してもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、１３７ミリモル（ｍＭ）の塩化ナトリウム、８．１ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム、５％ｗ／ｖのソルビトール、０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８、及び注射用水を含む無菌溶液として製剤化される。製剤化製品のベクター濃度は限定されず、約１０^１２ｖｇ／ｍＬ～約１０^１５ｖｇ／ｍＬ、例えば、約５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、約５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、約１×１０^１４ｖｇ／ｍＬ、約５×１０^１４ｖｇ／ｍＬの範囲であり得、これらの間に存在する全ての値及びサブ範囲を含む。いくつかの実施形態では、製剤化製品のベクター濃度は、約１．８×１０^１３ｖｇ／ｍＬ～約５．０×１０^１３ｖｇ／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、製剤化製品のベクター濃度は、約１．８×１０^１３ｖｇ／ｍＬ～約４．２×１０^１３ｖｇ／ｍＬの範囲である。バイアルは、使用可能になるまで－６０℃以下で凍結保存することができる。

【0086】

ある態様では、本開示は、ｒＡＡＶベクター、またはそれを含む粒子を含むキットを提供し、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及びＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、キットはさらに、ｒＡＡＶベクターを対象に投与するための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、静脈内注入によってｒＡＡＶベクターを投与するための説明書をさらに含む。

【0087】

別の態様では、本開示は、ｒＡＡＶベクター、またはそれを含む粒子を含む単位用量を提供し、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及びＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結され、治療有効量は、約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、約１．３２×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、治療有効量は、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、単位用量は液体製剤を含む。いくつかの実施形態では、単位用量は、静脈内注入によって対象に投与するように構成される。

【0088】

上記の態様のいくつかの実施形態では、ＡＳＰＡタンパク質は、ヒトＡＳＰＡタンパク質である。上記の態様のいくつかの実施形態では、ＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列は、ヒトＡＳＰＡ ｃＤＮＡを含むかまたはそれからなる。上記の態様のいくつかの実施形態では、ＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列は、コドン最適化ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。上記の態様のいくつかの実施形態では、ＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列は、配列番号１を含むかまたはそれからなる。上記の態様のいくつかの実施形態では、ＡＳＰＡタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列をコードする。上記の態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、神経細胞などの宿主細胞におけるＡＳＰＡタンパク質の発現を指示する。上記の態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス／β－アクチンハイブリッドプロモーター、またはＰＧＫプロモーターである。上記の態様のいくつかの実施形態では、サイトメガロウイルス／β－アクチンハイブリッドプロモーターは、ＣＡＧ、ＣＢ６、またはＣＢＡプロモーターである。上記の態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。上記の態様のいくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、またはｒｈ７４血清型ＩＴＲである。上記の態様のいくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、またはｒｈ７４の血清型である。上記の態様のいくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはＡＡＶ９血清型である。上記の態様のいくつかの実施形態では、核酸分子はさらにＫｏｚａｋ配列を含む。上記の態様のいくつかの実施形態では、核酸分子はさらにはｍｉＲ－１２２結合部位を含む。

【0089】

組換えＡＡＶベクター及び粒子の使用方法
本開示は、必要とする対象の治療などにおける、ＡＡＶ（例えば、組換えＡＡＶ）ベクターの使用を伴う方法を提供する。本明細書に提供される方法は、例えば、本明細書において開示される治療有効量のｒＡＡＶまたは組成物のうちのいずれか１つを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの投与は、対象の組織におけるＡＳＰＡの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、組織は末梢組織または中枢神経系（ＣＮＳ）組織である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの投与は、対象の細胞におけるＡＳＰＡの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞は神経細胞、例えば乏突起膠細胞である。

【0090】

いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、マウス、またはラットである。特定の実施形態では、対象はヒトである。ヒト対象は、ヒト女性またはヒト男性であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、以前にホルモン療法プログラムを受けたことがあるヒトである。いくつかの実施形態では、対象はホルモン療法プログラムを受けている。いくつかの実施形態では、対象は、支持療法または栄養管の使用などの物理療法または他の物理的介入を受けたか、または受けている。いくつかの実施形態では、対象は、カナバン病の１つ以上の症状、例えば、抗発作または抗けいれん薬による治療を受けているか、または受けた。いくつかの実施形態では、対象は、グルコン酸リチウム、グリセリルトリアセテート（ＧＴＡ）、臍帯血細胞療法、またはＡＳＰＡ遺伝子療法などのカナバン病の治験治療を受けたか、または受けている。いくつかの実施形態では、対象はヒト幼児である。ある特定の場合において、対象は、生後約１ヶ月、生後約２ヶ月、生後約３ヶ月、生後約４ヶ月、生後約５ヶ月、生後約６ヶ月、生後約７ヶ月、生後約８ヶ月、生後約９ヶ月、生後約１０ヶ月、生後約１１ヶ月、または生後約１年のヒト幼児である。いくつかの実施形態では、対象は、生後３ヶ月未満、生後６ヶ月未満、生後９ヶ月未満、生後１年未満、または生後１８ヶ月未満のヒト幼児である。いくつかの実施形態では、対象は生後３０ヶ月以下のヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、１３～１８歳、１２～１８歳、１０～１８歳、８～１８歳、６～１８歳、２～１８歳、１０～１３歳、８～１３歳、６～１３歳、２～１３歳、１０～１２歳、８～１２歳、６～１２歳、２～１２歳、６～１２歳、２～１２歳、２～１０歳、２～８歳、もしくは２～６歳、またはその中の任意の範囲の間の小児などのヒト小児（例えば、１８歳未満）である。いくつかの実施形態では、対象はヒト成人（例えば、１８歳以上）である。

【0091】

本明細書で使用される場合、「必要とする患者」または「必要とする対象」という用語は、白質ジストロフィーなど、ＡＳＰＡをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶまたは本明細書に提供されるそのようなｒＡＡＶを含む組成物で治療または改善することができる疾患、障害、または状態のリスクがあるか、またはそれに苦しんでいる患者または対象を指す。いくつかの実施形態では、「必要とする患者または対象」は、ＡＳＰＡの機能不全に関連する疾患、例えば、カナバン病を発症するリスクがある、またはそれに苦しんでいる患者または対象である。いくつかの実施形態では、「必要とする患者」または「必要とする対象」は、ＡＳＰＡ機能の改変をもたらすＡＳＰＡ遺伝子内の１つ以上のアミノ酸変異を有する。「対象」及び「患者」は、本明細書では相互交換可能に使用される。

【0092】

本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、障害、例えば、カナバン病などの白質ジストロフィー、またはその１つ以上の症状の重症度及び／または持続時間を軽減または改善し、障害の進行を予防し、障害の退縮を引き起こし、障害に関連する１つ以上の症状の再発、発症、発症または進行を予防し、障害を検出し、または別の療法（例えば、予防薬または治療薬）の予防または治療効果（複数可）を増強または改善するのに十分な薬剤、例えば、ｒＡＡＶの量を指す。いくつかの実施形態では、有効量のｒＡＡＶは、例えば、ＡＳＰＡの発現を増加させ、及び／または適切なＡＳＰＡレベル及び／または十分なＡＳＰＡ機能の欠乏に関連する疾患に関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減し得る。

【0093】

本開示は、ＡＳＰＡの欠損または機能不全を特徴とする障害または疾患を有する対象に治療上の利益を提供するための、本明細書に記載のＡＳＰＡをコードする核酸分子を含む、方法及びｒＡＡＶの使用を提供する。いくつかの態様では、方法は、治療有効量のｒＡＡＶまたは本明細書に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することによって、対象におけるＡＳＰＡの欠乏または機能不全を特徴とする障害または疾患を治療することを含む。

【0094】

いくつかの場合では、本開示は、ＡＳＰＡの発現を必要とする対象におけるその方法であって、治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含み、それによって対象においてＡＳＰＡを発現する、方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、対象におけるＡＳＰＡの発現の増加を必要とする対象におけるその方法であって、治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物を対象に投与することを含み、それによって対象におけるＡＳＰＡの発現を増加させる、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＡＳＰＡの発現をもたらすか、または対象の神経細胞におけるＡＳＰＡの発現を増加させる。

【0095】

いくつかの実施形態では、対象はＡＳＰＡの発現を必要とする。いくつかの実施形態では、対象はＡＳＰＡ欠損を有する。本開示は、対象に治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物を投与することを含み、それによって対象におけるＡＳＰＡ欠損を治療する、ＡＳＰＡの欠損を有する対象を治療する方法を提供する。本開示は、対象に治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物を投与し、それによって対象における白質ジストロフィーを治療することを含む、カナバン病などの白質ジストロフィーを有する対象を治療する方法を提供する。

【0096】

白質ジストロフィーは、神経学的機能の進行性の喪失をもたらすミエリン機能に影響を及ぼす５０以上のタイプの白質ジストロフィーを含む、医師によってそのように特定された任意の白質ジストロフィーであり得る。いくつかの実施形態では、白質ジストロフィーは、成人発症型常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、エカルディ－グティエール症候群、アレキサンダー病、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）、カナバン病、皮質下梗塞及び白質脳症を伴う脳常染色体劣性動脈症（ＣＡＲＡＳＩＬ）、脳腱黄色腫症、小児運動失調症、大脳ミエリン形成不全（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）（ＣＡＣＨ）／白質消失症（ＶＷＭＤ）、ファブリー病、フコシドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、クラッベ病、Ｌ－２ヒドロキシグルタル酸尿症、皮質下嚢胞を伴う大頭型白質脳症、異染性白質ジストロフィー、マルチプルスルファターゼ欠損症、ペリツェウス・メルツバッハー病、Ｐｏｌ ＩＩＩ 関連白質ジストロフィー、レフサム病、サラ病、（遊離サラ酸貯蔵症）、シェーグレン・ラルソン症候群、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィーまたはツェルウェーガー症候群スペクトラム障害を含む。

【0097】

本開示は、白質ジストロフィーを有する対象における白質ジストロフィー（例えば、カナバン病）を治療する、減少させる、改善する、進行を遅延させる、または症状を予防するための方法をさらに提供し、本方法は、対象に、治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物を投与することによって、対象における白質ジストロフィーを治療する、減少させる、改善する、進行を遅延させる、または症状を予防することを含む。白質ジストロフィーの症状の非限定的な例としては、バランス、呼吸、認知（学習、思考、記憶）、摂食及び嚥下、聴覚、運動、バランス及び協調、音声、及び視覚のうちの１つ以上に関する問題が挙げられる。

【0098】

いくつかの実施形態では、白質ジストロフィーはカナバン病である。本開示は、治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、カナバン病を有する対象の治療方法を提供し、それによって対象のカナバン病を治療する。いくつかの実施形態では、方法は、ｒＡＡＶベクターを投与する前に、カナバン病の対象を選択することをさらに含む。本開示は、カナバン病を有する対象におけるカナバン病を治療する、軽減する、改善する、進行を遅延する、または症状を予防する方法をさらに提供し、方法は、対象に、治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物を投与することを含み、それによって、対象におけるカナバン病を治療する、軽減する、改善する、進行を遅延する、または症状を予防する。カナバン病の症状の非限定的な例としては、以下のうちの１つ以上が挙げられ得る：運動発達の欠如；食事の困難；異常な筋緊張（脱力感またはこわばり）；異常に大きく、制御が不十分な頭部；麻痺、失明；または聴覚喪失。いくつかの実施形態では、カナバン病の症状は、頭部制御不良、大頭症（異常に大きい頭部）、筋緊張低下（筋緊張の低下）、無関心（無反応）、嗜眠、短気、嚥下障害（嚥下困難）、摂食障害、発達マイルストーンの到達の遅延、独立した歩行の失敗、精神運動退縮（能力及び協調の進行性の喪失）、精神遅滞、知的障害、発作、睡眠障害、鼻逆流、嘔吐に関連する場合がある逆流、視神経の悪化、視神経萎縮、視覚応答性の低下、聴覚喪失、痙攣、除脳硬直状態、麻痺、または尿中のＮＡＡの増加である。

【0099】

いくつかの実施形態では、方法は、ｒＡＡＶベクターを投与する前に、白質ジストロフィーを有する対象を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、対象は、疾患の１つ以上の症状を有さないにもかかわらず、対象をスクリーニングし、白質ジストロフィーを有する（例えば、遺伝子検査または生理学的検査によって）と識別または診断され得る。他の実施形態では、対象は、白質ジストロフィーの１つ以上の症状を有する。ある特定の実施形態では、対象は、カナバン病などの白質ジストロフィーに関連する遺伝子の変異を有する。いくつかの実施形態では、対象は、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）の発現及び／または機能を制御する遺伝子、例えば、ＡＳＰＡをコードする遺伝子における機能喪失変異を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＡＳＰＡのレベル、及び／またはＡＳＰＡをコードする遺伝子内の変異をスクリーニングする出生前血液検査に基づいてカナバン病を有すると診断される。

【0100】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物の投与前の対象の生体試料中のＮ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）のレベル、及び／または（ｂ）対照対象の生体試料中のＮＡＡのレベルと比較して、対象の生体試料中のＮＡＡのレベルを低下させることを含み、対照対象は、白質ジストロフィー（カナバン病など）を有し、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物を投与されない。いくつかの実施形態では、方法は、対象から得られる生体試料中のＮ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）のレベルを、（ａ）本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物の投与前の対象の生体試料中のＮＡＡのレベル、及び／または（ｂ）対照対象の生体試料中のＮＡＡのレベルと比較して、少なくとも約２％（例えば、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％（これらの間に存在する全ての値及びサブ範囲を含む））低下させることを含み、対照対象は白質ジストロフィー（カナバン病など）を有し、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物を投与されない。いくつかの実施形態では、生体試料は、血液、尿、末梢組織、ＣＮＳ液、またはＣＮＳ組織である。

【0101】

いくつかの実施形態では、対象において解糖からベータ酸化への移行を含む代謝不均衡があることが判定されている。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の解糖及び／またはベータ酸化因子のレベルを評価することによって代謝不均衡を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解糖及び／またはベータ酸化因子のレベルは、対象から得られる中枢神経系（ＣＮＳ）液を使用して評価される。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）対象からＣＮＳ液を得ることと、（ｂ）ＣＮＳ液中のベータ酸化の増加を検出することと、（ｃ）（ｂ）での検出に基づいて、ｒＡＡＶを対象に投与することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）対象から得られた生体試料の代謝プロファイルを測定することと、（ｂ）代謝プロファイルに基づいて解糖からベータ酸化への移行を含む代謝不均衡を特定することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、代謝プロファイルを測定することは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、または超高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して生体試料をアッセイすることを含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、ＣＮＳ組織または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＮＳ組織は脳組織である。いくつかの実施形態では、代謝プロファイルは、グルコース、グルコース－６－リン酸、３－ホスホグリセリン酸、ピルビン酸、乳酸、及びホスホエノールピルビン酸からなる群から選択される第１のバイオマーカーのレベルを含む。いくつかの実施形態では、代謝プロファイルは、カルニチン、マロニルカルニチン、ミリストイルカルニチン、パルミトイルカルニチン、マロニルカルニチン、及びベータヒドロキシ酪酸塩からなる群から選択される第２のバイオマーカーのレベルを含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする核酸分子を含むｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物が、対象に全身的に投与される。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする核酸分子を含むｒＡＡＶ粒子または粒子を含む薬学的組成物を、開腹手術または腹腔鏡検査を介した直接注射、カテーテル留置を介した動脈または静脈への注射によって、静脈内に対象に投与する。本明細書に記載の治療方法のいずれにおいても、ＡＳＰＡをコードする核酸分子を含むｒＡＡＶ粒子または本明細書に開示される粒子を含む薬学的組成物は、静脈内注入を使用して対象に投与してもよい。

【0103】

本開示は、対象におけるＡＳＰＡの機能不全または欠損を特徴とする障害または疾患を治療するための薬剤の製造における、本明細書に記載の薬剤（例えば、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶを含む薬学的組成物）の使用をさらに企図する。本開示はまた、対象におけるＡＳＰＡの機能不全または欠損を特徴とする障害または疾患を治療するための、本明細書に記載の薬剤（例えば、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶを含む薬学的組成物）の使用を含む。

【0104】

組成物は、治療される領域のサイズ、使用されるウイルス力価、投与経路、及び方法の所望の効果に応じて、範囲内の全ての数値を含む、約５０マイクロリットル（μＬ）～約１ｍＬの体積で送達されてもよい。いくつかの実施形態では、体積は約５０μＬである。別の実施形態では、容量は約７０μＬである。別の実施形態では、容量は約１００μＬである。別の実施形態では、容量は約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は約２００μＬである。別の実施形態では、容量は約２５０μＬである。別の実施形態では、容量は約３００μＬである。別の実施形態では、容量は約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は約５００μＬである。別の実施形態では、容量は約６００μＬである。別の実施形態では、容量は約７５０μＬである。別の実施形態では、容量は約８５０μＬである。別の実施形態では、容量は約１０００μＬである。

【0105】

いくつかの実施形態では、毒性または有害な免疫応答のような望ましくない影響のリスクを減らすために、ウイルスの最低有効濃度が利用される。これらの範囲内のさらに他の投与量は、治療されている対象（例えば、ヒト）の身体状態、対象の年齢、特定のＡＳＰＡ欠乏障害、及び障害が進行性である場合に発達した程度を考慮して、主治医によって選択され得る。

【0106】

いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、対象の約１０^１２～約１０^１６ｖｇ／ｋｇ体重、例えば、対象の約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、約１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの範囲の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、約１．３２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。

【0107】

いくつかの実施形態では、治療有効量は、約１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約５ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇの範囲、例えば、約１．１ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１．２ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１．３ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１．４ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１．５ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約２ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約２．５ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３．５ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約４ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約４．５ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇであり、これらの間に存在する全ての値及びサブ範囲を含む。いくつかの実施形態では、治療有効量は約１．３２×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、治療有効量は約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、治療有効量は、約１．３２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの範囲である。

【0108】

いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に開示されているｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、または組成物の単回用量が投与される。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に開示されているｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、または組成物の複数回用量、例えば、２回、３回、４回、または５回の用量が投与される。いくつかの実施形態では、対象は、静脈内注入によって、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、または組成物の単回用量が投与される。

【0109】

本明細書に開示されている組成物は、任意の頻度で対象に投与してもよい。いくつかの実施形態では、組成物は１日１回または１日２回以上、対象に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、対象に１日に２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、毎日、隔日、３日ごと、４日ごと、５日ごと、または６日ごとに対象に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、毎週、隔週、または３週間ごとに対象に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１ヶ月ごとに対象に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は毎年対象に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、１０、１５または２０年ごとに対象に投与されてもよい。特定の実施形態では、組成物は対象の生涯中に１回だけ対象に投与されてもよい。

【0110】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法のいずれか１つはさらに、治療有効量の免疫抑制剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量の本明細書に開示されているｒＡＡＶまたは組成物、及び治療有効量の免疫抑制剤を対象に投与することを含む。本開示は、治療有効量の本明細書に開示されているｒＡＡＶまたは組成物、及び治療有効量の免疫抑制剤を対象に投与する、治療方法を提供する。

【0111】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤はｒＡＡＶベクターの投与前に、投与と同時に、及び／または投与後に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤はｒＡＡＶベクターの投与前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤はｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも１２時間前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤はｒＡＡＶベクターの投与の約２日前に投与される。

【0112】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は非グルココルチコイド免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤はカルシニューリンの阻害剤である。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤はタクロリムスである。免疫抑制剤の他の非限定的な例には、ナイトロジェンマスタード（シクロホスファミド）のようなアルキル化剤、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサートのような葉酸類似体、アザチオプリン及びメルカプトプリンのようなプリン類似体、フルオロウラシルのようなピリミジン類似体、タンパク質合成阻害剤、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシンのような細胞傷害性抗体、Ｔリンパ球を阻害するポリクローナル抗体、バシリキシマブまたはダクリズマブのようなＩＬ－２受容体指向性モノクローナル抗体、ムロモナブのような抗ＣＤ３モノクローナル抗体、オピオイド、インフリキシマブ、エタネルセプト、またはアダリムマブのようなＴＮＦ－アルファ結合タンパク質、ミコフェノレート、フィンゴリモド、及びミリオシンが挙げられる。生物学的免疫抑制剤の他の例としては、モノクローナル抗体、例えば、共刺激経路を遮断するモノクローナル抗体（例えば、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ８０、ＯＸ４０、または他の標的に対する適切な抗体）、免疫刺激分子（例えば、サイトカイン）を標的とする干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、及びタンパク質（例えば、プロテアソーム阻害剤）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0113】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は経口投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤の治療有効量は、約０．００５ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）～約０．１ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０３５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇであり、これらの間に存在する全ての値及びサブ範囲を含む。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤の治療有効量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤の治療有効量は約０．０２５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、治療有効量の免疫抑制剤は１日２回投与される。

【0114】

いくつかの実施形態では、方法は治療有効量のステロイドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ステロイドはミネラルコルチコイドである。いくつかの実施形態では、ステロイドはグルココルチコイドである。いくつかの実施形態では、グルココルチコイドは、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、デオキシコルチコステロン（ＤＯＣＡ）、アルドステロン、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、ステロイドはヒドロコルチゾンである。いくつかの実施形態では、ステロイドは、ｒＡＡＶベクターの投与前に、投与と同時に、及び／または投与後に投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの投与前に対象に投与されるステロイドの治療有効量は、ｒＡＡＶ投与後に対象に投与されるステロイドの治療有効量よりも多い。

【0115】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のうちのいずれか１つは、治療有効量の抗ヒスタミン剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ヒスタミン剤は、ｒＡＡＶベクターの投与の前に、ｒＡＡＶベクターの投与と同時に、及び／またはｒＡＡＶベクターの投与の後に投与される。いくつかの実施形態では、抗ヒスタミン剤は、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、クロルフェニラミン、またはそれらの任意の組み合わせである。

【0116】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）対象に低分子代謝調節物質を投与すること、（ｂ）対象に食事介入を処方することであって、食事介入は、対象における解糖を促進し、及び／またはベータ酸化を低減する、処方すること、及び／または（ｃ）免疫抑制剤を対象に投与すること、をさらに含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクターを投与した後、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び／または脳組織中のＮ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）レベルが低下する。いくつかの実施形態では、投与後、尿中のＮＡＡレベルが低下する。いくつかの実施形態では、尿中のＮＡＡレベルは、少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、尿中のＮＡＡレベルは、治療前のレベルと比較して、少なくとも６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、またはそれ以上低下したままである。いくつかの実施形態では、投与後、ＣＳＦ中のＮＡＡレベルが低下する。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ中のＮＡＡレベルは、少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ中のＮＡＡレベルは、治療前のレベルと比較して、少なくとも６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、またはそれ以上低下したままである。いくつかの実施形態では、投与後、脳組織中のＮＡＡレベルは低下する。いくつかの実施形態では、脳組織中のＮＡＡレベルは、少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、脳組織中のＮＡＡレベルは、治療前のレベルと比較して、少なくとも６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、またはそれ以上低下したままである。

【0118】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるベクターを投与した後、新規髄鞘形成は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用して観察可能である。

【実施例】

【0119】

実施例１：カナバン病のためのＢＢＰ－８１２遺伝子療法ベクター
ＢＢＰ－８１２活性物質は、ヒトＡＳＰＡ導入遺伝子の自己相補性発現カセットを含有する非複製ｒＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）ベクターである。ｓｃＡＡＶ９－ＣＢ６－ｈＡＳＰＡｏｐｔベクター設計を図１に示す。それは、５’及び３’末端反復によって隣接されるサイトメガロウイルス前初期エンハンサーを含むＣＢ６プロモーターの制御下でコドン最適化されたヒトアスパルトアシラーゼ導入遺伝子を含有する。Ｒｅｐニッキングの部位は、５’逆位末端反復において除去され、それによって自己相補性ＡＡＶゲノムを作製する。

【0120】

ＢＢＰ－８１２は、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．０、５重量／体積（ｗ／ｖ）ソルビトール、０．００１％ｗ／ｖポロキサマー１８８中の注射用無菌溶液として製剤化される。これは、２．５ｍＬの充填量で５ミリリットル（ｍＬ）のパイロジェンフリーバイアルで供給され、ラテックスフリーのゴムストッパー及びアルミニウムフリップオフシールで密封されている。製剤化製品のベクター濃度は、１．８×１０^１３～５．０×１０^１３ｖｇ／ｍＬである。バイアルは、使用可能になるまで－６０℃以下で凍結保存される。

【0121】

ＢＢＰ－８１２製剤（ＤＰ）は、１．８×１０^１３～４．２×１０^１３ｖｇ／ｍＬの濃度の非複製組換えＡＡＶ９ベクターの単回用量、保存剤不使用、無菌溶液、静脈内（ＩＶ）注射である。ＢＢＰ－８１２ＤＰ溶液は、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、８．１ｍＭのリン酸二ナトリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム、５％ｗ／ｖソルビトール、０．００１％ｗ／ｖポロキサマー１８８、及び注射用水を含有する。ＢＢＰ－８１２ＤＰを、公称充填量２．５ｍＬのＣｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ（登録商標）（ＣＺ、環状オレフィンポリマー）バイアル５ｍＬに充填し、６０℃以下で保管する。

【0122】

この研究は、ＡＳＰＡをコードするＡＡＶ９ベクター（図１に示される）の２つの用量レベルの安全性、忍容性薬力学的（ＰＤ）活性、及び臨床活性を、生後３０ヶ月以下のカナバン病の小児患者について評価する。投薬は、参加者が生後３１ヶ月になる前の日付までに行われる。最初の６人の参加者におけるＢＢＰ－８１２の安全性、忍容性、ＰＤ活性、及び予備的臨床活性の評価は、用量選択、及び選択された用量で合計１５人の参加者までの登録拡大を通知する。全ての参加者は、ＢＢＰ－８１２による治療日から少なくとも５年間追跡される。

【0123】

ＢＢＰ－８１２を１．３２×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）／キログラム（ｋｇ）体重の用量でコホート１に、３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ体重の用量でコホート２に投与する。この研究では、プラセボは投与されない。最大１８人の参加者が研究に登録され、１５人の参加者の試料サイズが、選択された用量で治療される。

【0124】

薬力学的解析については、尿及びＣＮＳ組織におけるＢＢＰ－８１２投与後のＮ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）レベルの変化を測定する。臨床的変化については、例えば、脳イメージングを使用して、ＢＢＰ－８１２の投与後に運動、認知及び言語発達及び機能を評価する。

【0125】

実施例２：ＢＢＰ－８１２の非臨床試験
カナバン病の治療におけるＢＢＰ－８１２の治療可能性及び安全性の実証は、カナバン病のＡｓｐａ－／－マウスモデルにおける有効性、ならびに野生型マウス及び非ヒト霊長類における安全性評価を調べる非臨床研究によって提供される。以下に記載する有効性研究のために、ヘテロ接合性Ａｓｐａ＋／－マウスを交配して、ホモ接合性の子を生成した。動物を、尾部組織試料から調製されたゲノムデオキシリボ核酸（ｇＤＮＡ）テンプレートを利用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイを使用して、出生直後に遺伝子型決定した（ＰＮＤ０／１）。有効性研究のために、全てのマウスをＰＮＤ１上の顔面静脈へのＩＶ注射を介して処置した。ＢＢＰ－８１２で実施した非臨床安全性及び薬理学的研究を表２に要約する。研究の主な結果については、以下のセクションで考察する。

【表2】

【0126】

カナバン病マウスモデル
カナバン病のＡｓｐａ－／－マウスモデルを使用して、ＢＢＰ－８１２の安全性及び有効性を調べた。Ａｓｐａ－／－マウスは、カナバン病の最初に開発された動物モデルであり、カナバン病患者の臨床表現型を模倣し、生後１ヶ月以内に運動失調症、不安定、筋力低下、成長障害、頭蓋顔面異常、及び認知障害を呈する。介入なしでは、Ａｓｐａ－／－マウスは、ＰＮＤ２８付近で死亡する（Ａｈｍｅｄ ２０１３）。

【0127】

カナバン病の他のいくつかのマウスモデルが報告されているが、それらはそれほど重篤ではない表現型を示す（Ｃａｒｐｉｎｅｌｌｉ ２０１４，Ｍｅｒｓｍａｎｎ ２０１１，Ｔｒａｋａ ２００８）。特筆すべきことに、これらの他のモデルは全て正常な寿命を示し、測定可能な運動機能欠陥は生後数週間まで発症しない。この表現型は、より軽度のカナバン病を連想させる（Ｊａｎｓｏｎ ２００６ａ，Ｍｅｎｄｅｓ ２０１７，Ｙａｌｃｉｎｋａｙａ ２００５）。

【0128】

ＰｏＣ研究のために、Ａｓｐａ－／－マウスを、初期実験のためにＰＮＤ０と２０との間、及び最小有効用量（ＭＥＤ）の決定のためにＰＮＤ１で注入した。文献から、ＰＮＤ０～ＰＮＤ２０の範囲のマウスにおけるニューロン発達は、妊娠３５週～生後約２．５歳のヒトの神経発達と同等である（Ｄｕｔｔａ ２０１６）。したがって、ＰｏＣ研究における治療のタイミングは、第１／２相小児臨床試験（ＣＶＮ１０２）で、生後３０ヶ月以下の小児患者におけるＢＢＰ－８１２の使用を支持する。

【0129】

出生後１日目のＡｓｐａ－／－マウスにおける用量範囲設定有効性試験
動物疾患モデルにおけるＭＥＤを確立し、提案されている第１／２相小児臨床試験ＣＶＮ１０２の開始用量を決定するために、用量範囲設定試験（Ｇｅｓｓｌｅｒ ２０１７）が開始された。ＭＥＤを決定するための重要なパラメータには、生存及び体重増加、ＣＮＳ ＮＡＡレベルの低下、運動機能の改善、及び脳病理組織学の改善が含まれた。脳内の生体内分布も評価した。

【0130】

研究設計：無作為化及び用量の正当化
本研究で評価した用量は、２．６×１０^１３、８．８×１０^１３、及び２．６×１０^１４ｖｇ／ｋｇであった。最高用量は、以前の世代のベクターを用いた以前の研究に基づいていた（Ａｈｍｅｄ ２０１３）。中用量及び低用量は、ベクターの３倍及び１０倍の減少を表す。マウスは、顔面静脈にＰＮＤ１に単回ＩＶ注射を受けた。

【0131】

これらの研究について、動物は２０１４年３月から２０１６年１月の間に生まれた。無作為化は、同じように胎児の全ての動物に投薬することによって行われた。妊娠中の胎児のうちＡｓｐａ－／－である子はわずか２５％である。したがって、同じ胎児で複数の用量を試験することは必ずしも可能ではなかった。最初の投薬には、最高用量、ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）処置、及び未処置の動物が含まれた。有効性データが生成されるにつれて、最小有効用量を確立するための追加の胎児が生まれるため、より低い用量が試験された。しかしながら、試験期間中、無作為な胎児は、経時的及びベクターロットにわたって結果の一貫性を示すために、最高用量またはビヒクルを受けたか、または未処置のままであった。ＢＢＰ－８１２の開発及びＭＥＤの確立に使用される動物の完全なリストを表３に列挙した。

【表3】

【0132】

研究設計：研究で測定された有効性パラメータ
生存率と体重増加：生存率を毎日監視し、体重をＰＮＤ１からＰＮＤ３２まで隔日で測定し、次いでＰＮＤ４２（６週間）からＰＮＤ３６４（１年）まで隔週で測定した。

【0133】

ＣＮＳ及び末梢ＮＡＡレベルの減少：ＣＮＳ及び末梢ＮＡＡレベルの低下を、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）及び質量分析によって測定した。

【0134】

運動機能及び空間記憶試験：マウスの運動性能は、運動機能及び持久力のための加速ロータロッド、前庭機能及び運動失調症のためのバランスビーム、及びグリップ強度のための反転スクリーン（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｓｃｒｅｅｎ）を使用して評価した。ロータロッド（ロータロッドシリーズ８、ＩＩＴＣライフサイエンス、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ）を除き、機器はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｓｈｏｐによって製造された。各運動機能試験について、マウスは注入され、独立して試験された。これらの実験の対照としては、未処置のＡｓｐａ－／－マウス、０．９％生理食塩水で処置したＡｓｐａ－／－マウス、及び野生型（ＷＴ）マウスが含まれた。動物が受けた処置は、評価者に対して盲検化され、動物は、研究における全ての評価について２年間の期間を超えて試験された。

【0135】

加速ロータロッド：マウスを試験日の２日前に訓練し、各々３回ランした。試験日に、マウスをロータロッド上に配置し、１分間順応させた。各マウスを３回試験し、最良の値を分析に使用した。加速度及びタイミングを５分間にわたって４～４０ｒｐｍに設定した。

【0136】

バランスビーム：水平の木製バランスビーム（１．５×１００ｃｍ）の真ん中に動物を配置し、ビームから落下する可能性のあるマウスを保護するために、その下にパッドを配置した。低下の遅延を記録し、各試験に５分間の時間制限を設けた。このテストの厳密性を高めるために、カットオフ時間を以前使用していた３分から５分に延長した。動物を３回試験し、最良値をカウントした。

【0137】

反転スクリーン：マウスを、水平位置にグリッド（２５平方ミリメートル（ｍｍ^２）の穴を有する３０平方センチメートル（ｃｍ^２））の中心に配置し、１分間順応させた。マウスが逆さまにぶら下がるように、グリッドを１５秒以内に１２５度までゆっくりと回転させた。落ちるまでの時間を測定した。ＰＮＤ２７試験のカットオフは、以前に公開されたように３分であった。他の全ての時点において、テストの厳密さを増加させるためにカットオフは５分であった。各動物を３回試験し、最良の値をカウントした。

【0138】

脳病理組織学を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって評価した。

【0139】

生体内分布は、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）によって決定した。

【0140】

試験結果：生存率及び体重増加
ＢＢＰ－８１２処置は、未処置のＡｓｐａ－／－動物と比較して、生存率を増加させ、体重増加を促進した（図２）。未処置動物（赤線）は生後２週前後から体重が減り始め、生後４週までに死亡した。処置された動物は、ＷＴ動物と同等の体重を増加させ、実験の終了まで生存した。

【0141】

表４に概説されるように、治療に起因する予定外の死亡は、研究中に報告されなかった。死亡の原因には、不正咬合（ｎ＝２）及び幼児殺傷（ｎ＝５）が含まれた。これらの事象の性質を考慮して、さらなる病理学または病理組織学的評価は行われなかった。

【表4】

【0142】

試験結果：ＣＮＳ ＮＡＡレベルの減少
ＭＲＳ解析を使用して、ＢＢＰ－８１２を投与された動物を、ＮＡＡのＣＮＳレベルについてモニタリングした（図３及び表５）。８．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ及び２．６×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量のＢＢＰ－８１２を受けた動物は、ＣＮＳ ＮＡＡの減少を有し、２．６×１０^１４ｖｇ／ｋｇの処置群は、８．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇの群よりも統計的に優れていた。未処置のＡｓｐａ－／－動物と比較して、より低い２．６×１０^１３ｖｇ／ｋｇでは、ＮＡＡの変化は観察されなかった。

【表5】

【0143】

機能と空間記憶の試験
マウスを、３つの運動機能評価の改善について試験した。ＰＮＤ２７で、２．６×１０^１３ｖｇ／ｋｇを受けた動物は、未処置のＡｓｐａ－／－マウスと比較して改善を示したが、ＷＴ動物と同様には振る舞わなかった。８．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは２．６×１０^１４ｖｇ／ｋｇで処置したマウスにおける運動機能試験（ロータロッド、バランスビーム、及び反転スクリーン）は、３つの評価全てにおいて、ＰＮＤ２７及びＰＮＤ９０のＷＴマウスと同等であった。ＰＮＤ１８０及びＰＮＤ３６０の結果は、２．６×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＢＢＰ－８１２による運動機能レスキューの維持を示した。８．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇを受けたマウスは、ＰＮＤ１８０で運動機能の限られた改善を示し、最終時点では利益を示さなかった（図４）。

【0144】

試験結果：脳病理組織学
ＢＢＰ－８１２を受けた動物における脳病理組織学を、Ｈ＆Ｅ染色によって評価し、ＷＴ及び未処置のＡｓｐａ－／－マウス（図５Ａ及び図５Ｂ）と比較した。２．６×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量を受けた動物由来の病理学は、ＷＴ動物と区別できなかった。８．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量を投与された動物は、空胞形成の減少とともに顕著な改善を示したが、いくつかの疾患は依然として存在した（例として、脳橋（Ｐｏ）、小脳（Ｃｅ）、及び線条体（Ｓｔ）に留意されたい）。２．６×１０^１３ｖｇ／ｋｇで処置したマウスは、未処置のＡｓｐａ－／－マウスと比較して、あったとしてもごくわずかな改善を示した。

【0145】

試験結果：生体内分布
二倍体細胞（ｖｇ／細胞）当たりのベクターゲノムを、脳の異なる領域からの試料中のｄｄＰＣＲによって決定した（図６）。投薬後１年で０．５～１．５ｖｇ／細胞が検出され、ＢＢＰ－８１２のＩＶ投与が、試験した脳の全ての領域にアクセスし、持続することができることが実証された。

【0146】

有効性の最終決定として、ＢＢＰ－８１２を受けたＡｓｐａ－／－マウスにおける脳病理組織学をＨ＆Ｅ染色によって評価し、野生型及び未処置のＡｓｐａ－／－マウス（図７Ａ及び図７Ｂ）と比較した。２．６×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量を受けたＡｓｐａ－／－動物由来の病理組織学は、野生型動物と区別できなかった。８．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量を受けた動物は、未処置の対照と比較して顕著な改善を示し、空胞化は減少したが、いくつかの疾患特徴は依然として存在する（例として、脳橋［Ｐｏ］、小脳［Ｃｅ］、及び線条体［Ｓｔ］に留意されたい）。２．６×１０^１３ｖｇ／ｋｇで処置したＡｓｐａ－／－マウスは、処置していないマウスと比較して、あったとしてもごくわずかな改善を示した。

【0147】

これらの分析の結果は、２．６ｘ１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で疾患表現型の完全な回復を達成することができ、１０倍低い用量は運動機能に最小限の利益をもたらすが、ＮＡＡ代謝または病理組織学には利益をもたらさないことを示した。中間用量の８．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇは、全ての有効性エンドポイントを有意に改善するのに十分であったが、最高用量と同様ではなかった。これらの所見に基づいて、ＢＢＰ－８１２のＭＥＤは、約８．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。
非ヒト霊長類における安全性及び生体内分布
この研究の目的は、ＣＮＳ及び末梢組織におけるＢＢＰ－８１２の安全性（臨床観察、臨床化学［血清、尿、及びＣＳＦ］、血液学、免疫応答、及び病理組織学）及び生体内分布を評価することであった。この研究では、３つの投与経路を比較した。伏在静脈にＩＶ、腰部くも膜下腔内にくも膜下（ＩＴ）、左側脳室内に脳室内（ＩＣＶ）。投薬後３週目及び８週目に動物を屠殺した。全体的な研究設計を表６に概説する。

【表6】

【0148】

研究設計：用量の正当化
用量は、カナバン病のＡｓｐａ－／－マウスモデルにおけるＰｏＣ研究で特定された最小有効用量に基づいて選択された。ＩＶ投与経路をＩＴ及びＩＣＶ送達と直接比較して、どの経路が大型動物モデルにおける優れた全般的なＣＮＳ生体内分布を促進したかを決定した。

【0149】

研究設計：アウトカム測定
動物は、毎日の臨床観察によって、研究を通して定期的にモニタリングした。神経学的評価は、２２日目及び５７日目に実施した。投薬後－１日目、３日目、８日目、２２日目、３６日目、及び５７日目に、臨床病理及び血液学のために血液を採取した。ＡＡＶ９キャプシド及びＡＳＰＡタンパク質に対する抗体応答を、投薬前及び投薬後２２日目及び５７日目に、血清及びＣＳＦにおいて決定した。生体内分布は、導入遺伝子特異的ＴａｑＭａｎアッセイを用いて液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）によって測定した二倍体細胞当たりのベクターゲノムとして評価した。病理組織学には、全ての組織のＨ＆Ｅ染色が含まれ、ＣＮＳは、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ－１）及びグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）について追加の免疫染色を受けた。動物ごとに少なくとも８つの背根神経節及び関連する脊髄神経根を調査した。
試験結果：生体内分布
ＢＢＰ－８１２の生体内分布及びｈＡＳＰＡＯｐｔ導入遺伝子の発現を、群１、２、３、７、及び９の動物由来の試料において評価した。脳における発現を、３ｍｍ×３ｍｍの組織パンチから評価した。脳から収集及び分析（太字）された全てのパンチのリストは、図８において見ることができる。脊髄（胸部、腰部、及び頸部）及び末梢臓器を含む、分析された組織の完全なリストは、表７に示される。

【表7】

【0150】

静脈内に処置された動物は、ＣＮＳにわたるベクターゲノム及び末梢組織において用量依存的な増加を呈する。高用量群では、５７日目の剖検の脳パンチにおけるベクターゲノムは、０．２６～２．１６の範囲であった。ＢＢＰ－８１２のＩＴまたはＩＣＶ投与を受けた動物は、３回全てのＩＶ用量と比較して、ＣＮＳにおける形質導入のレベルが有意に低かった。最高用量のＩＶ動物において、ベクターは、各動物において試験された全ての脳領域において検出可能であった。ＩＴ及びＩＣＶ投薬群において、ベクターは、それぞれ５／３０及び１３／３０の脳パンチにおいて検出されなかった。末梢組織中のベクターゲノムの検出は、ＩＶ群についても用量依存的であり、肝臓及び心臓で検出されたレベルが最も高かった。ＢＢＰ－８１２のＩＴ及びＩＣＶ投与を受けた動物は、末梢組織において検出可能なゲノムを有したが、ＩＶ経路によって投与された動物よりもはるかに低いレベルであった（図９Ａ～９Ｅ）。静脈内投薬は、ＩＴまたはＩＣＶのいずれよりもはるかに優れ、深部皮質白質及びカナバン病で最も関連性があると考えられている他の全ての脳領域に浸透することが観察された。

【0151】

試験結果：抗ＡＡＶ９及び抗ＡＳＰＡ抗体の検出
全ての動物は、無作為化及び投薬前に、ＡＡＶ９に対する中和抗体について陰性であるとスクリーニングされた。ＡＡＶ９及びＡＳＰＡに対する総抗体を、適格な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、群１、２、３、７、及び９の動物において、投薬前及び投薬後に測定した。血清の分析には、投薬前及び投薬後２２日目及び５７日目に収集した試料が含まれた（表８）。投薬前にＡＡＶ９に対する抗体が陽性と検査された動物はいなかった。投薬後、１１／１２のＩＶ処置動物、５／６のＩＴ処置動物、及び５／６のＩＣＶ処置動物は、ＡＡＶ９に対する抗体を発現した。投薬前に、高用量ＩＶ群の１つの動物は、ＡＳＰＡに対する検出可能な抗体を有した。投薬後、１０／１２のＩＶ処置動物、１／６のＩＴ処置動物、及び１／６のＩＣＶ処置動物は、ＡＳＰＡに対する抗体を有した。

【表8】

【0152】

試験結果：神経学的検査
動物は、２２日目及び５７日目に神経学的検査を受けた。これには、一般的な感覚及び運動機能、脳反射、及び脊髄反射の評価が含まれた。これらの神経学的検査中にＢＢＰ－８１２関連の変化は見られなかった。

【0153】

試験結果：臨床化学及び血液学及び凝固評価
血液学的パラメータに決定的なＢＢＰ－８１２関連の変化はなく、凝固値は全ての群で顕著ではなかった。血清化学の変化は、高用量ＩＶ群における肝酵素の一過性上昇に限定された。これらの値は、介入なしで正常に戻った。いずれの動物についても、尿分析パラメータに顕著な変化はなかった。ＢＢＰ－８１２の投与後のＣＳＦ化学の変化には、ＩＶ経路を介して投与された動物の２２日目及び５７日目のアルブミンの減少が含まれた。

【0154】

試験結果：剖検と病理組織学的評価と所見
徹底的な病理組織学的検査を行った。剖検では、脳を３ｍｍの冠状切片厚で脳マトリックス内で切断した。第１のスライス及びその後の全ての他のスライスを、組織学的解析のために１０％中性緩衝ホルマリン中に固定した。脊髄（頸部、胸部、及び腰部）を１ｃｍの切片に切断し、カテーテル先端をＩＴ動物のゼロ点及びＩＶ動物の胸腰部接合部として定義した。第１の切片及びその後の全ての第２の切片（奇数番号）を、病理組織学的評価のために１０％中性緩衝ホルマリン中に固定した。分析された組織の完全なリスト、及びサンプリング及び分析に関する具体的な情報が、表９に提供される。

【表9】

【0155】

試験結果：病理組織学的所見
３．１４×１０^１４ｖｇ／ｋｇまでの用量のＢＢＰ－８１２のＩＶ投与後、ＮＨＰに有害な試験試料関連の顕微鏡的または機能的変化はなかった。試験試料関連の変化は、２２日目及び５７日目の剖検から１．８×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＢＢＰ－８１２ＩＶを投与された３匹の動物のうちの２匹の肝臓（門脈浸潤及び／または細胞性の増加［Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞］）においてのみ観察された。これらの変化は、ＡＡＶ製品のＩＶ投与を伴う研究において一般的に観察され、有害とみなされなかった。

【0156】

背根神経節（ＤＲＧ）における細胞浸潤の所見は、６匹のＢＢＰ－８１２処置されたＩＶ高用量動物のうちの３匹で報告され、４８匹のＤＲＧのうちの合計４匹に影響を及ぼした。浸潤は、神経変性及び／または壊死の証拠とは関連しておらず、対照ＮＨＰで日常的に観察される同じ所見とは区別できなかった。ＩＶ投与によってＢＢＰ－８１２を受けた動物のＤＲＧ所見は、有害ではなく、機能的活動に影響を及ぼさず、毒性学的結果をもたらさなかった。この研究から、３．１４×１０^１４ｖｇ／ｋｇの観察されない有害作用レベル（ＮＯＡＥＬ）を決定した。

【0157】

５．０×１０^１２個の総ｖｇ ＢＢＰ－８１２を含むＩＴ用量では、試験試料関連の有害な顕微鏡的変化はなかった。５．０×１０^１２個の総ｖｇＢＢＰ－８１２用量レベルで２つのあいまいな試験試料関連の変化が観察された。第一に、３匹の動物のうちの２匹の単一の背根神経節において、細胞充実度の軽度の増加があった（２２日目に犠牲）。これは、いかなるニューロンの変化とも関連しておらず、有害であると解釈されなかった。同様の変化は、５７日目に剖検した動物において観察されなかった。第二に、２２日目の屠殺では、腹側灰白質の両側の小膠細胞症（軽度）が３匹の動物のうちの１匹に存在した。この変化は、明らかなニューロンの喪失または変性とは関連しておらず、５７日目の動物を含む任意の他の動物には存在せず、居住ミクログリア細胞の増強された染色に厳密に起因していた可能性がある。このレベルの小膠細胞症は有害とはみなされなかった。

【0158】

非臨床毒性：研究設計
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＧＬＰに準拠した安全性及び生体内分布の研究を行った。この研究のための実験設計を表１０に示す。３群のＣ５７ＢＬ／６マウスは、０日目に後眼窩注射を介して低用量（１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）または高用量（３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）のＢＢＰ－８１２またはビヒクルを受け、２４週間モニタリングした。これらのＢＢＰ－８１２用量レベルは、臨床的に関連性があると考えられている。臨床観察、体重、及び食物摂取を研究期間中記録した。投薬後４、１２、及び２４週に動物を安楽死させた。組織を収集し、重量を量り、病理組織学、生体内分析、及び免疫原性のために保存した。血液学、臨床化学、生体内分布、及び免疫原性のために血液（末端収集）を収集した。

【表10】

【0159】

用量の正当化
用量は、カナバン病のＡｓｐａ－／－マウスモデルで実施された用量範囲発見研究に基づいて選択された。ＩＶ投与経路は、Ａｓｐａ－／－マウスで生成された有効性データ及びＮＨＰで観察されたＩＴ及びＩＣＶ投薬と比較した場合のＣＮＳへの改善された分布のために選択された。ＰｏＣ研究で使用されるベクターの濃度に基づいて、マウスで所望のより高い用量を達成するために必要なより大きな体積の投与を可能にするために、後眼窩経路を実施した。ＧＬＰ毒性試験で投与される用量は、提案された臨床投薬レジメンを支持する。介入の年齢はまた、基礎となる疾患病態を矯正した後の長期的な転帰の成功のための重要な要因である。

【0160】

２４週目までの転帰測定
動物は、毎日、次いで毎週の臨床観察を受けた。投薬後４週目、１２週目、及び２４週目に動物を屠殺し、そこで末梢血液試料を臨床病理及び血液学のために収集した。各剖検でＡＡＶ９及びＡＳＰＡに対する抗体を評価した免疫アッセイ及びＴ細胞反応性を、全長ＡＡＶ９及びヒトＡＳＰＡについてのペプチドプールに対する酵素結合免疫吸収スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）によって、全ての時点で決定した。ベクターゲノムについては定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、導入遺伝子ＲＮＡについては逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって生体内分布を評価した。Ｈ＆Ｅ染色による組織学的検査のために組織の包括的パネルを収集した。

【0161】

試験結果：２４週目までの臨床観察
詳細な臨床観察を、無作為化時、投薬前日、及び投薬後０日目、１日目、２日目、及び３日目、最初の１２週間は毎週、及び研究の残りの期間は隔週で実施した。同様に、体重は、無作為化、投薬前日、及び投与後０、１、２、及び３日目、最初の１２週間は毎週、及び研究の残りの期間は隔週で測定した。最終体重は剖検時に収集した。最後に、ケージ当たり及び週当たりの食物摂取を、投薬当日から開始する最初の１２週間にわたって毎週モニタリングし、その後、研究の残りの期間にわたって隔週でモニタリングした。試験試料関連の所見は認められなかった。
試験結果：２４週目までの血液学と臨床化学
血液学及び臨床化学パネルを、４、１２、及び２４週目に全ての群で評価した。臨床的に有意な試験試料関連の変更はなかった。クレアチンキナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼの用量依存的減少があり、これは、いかなる顕微鏡的変化とも関連しなかった（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。

【0162】

２４週目までの病理組織学
検査した組織に試験試料関連の観察はなかった。

【0163】

２４週目までの抗薬物抗体応答
血液試料を、４週、１２週、及び２４週の剖検におけるＡＡＶ９及びヒトＡＳＰＡに対する循環抗体の分析のために収集した。血液を血清に処理し、試料を分析まで＜－６０℃で保管した。抗体価を、適格なＥＬＩＳＡによって測定した。

【0164】

４週間で、動物は導入遺伝子に対する抗体応答を有さず、ＢＢＰ－８１２を受けた全ての動物は、ＡＡＶ９に対する抗体を発現した。

【0165】

１２及び２４週に、各時点で１匹のビヒクル処置動物がＡＡＶ９に対する抗体について陽性であるとスクリーニングされ、１２週のみが、ＢＢＰ－８１２を受けた１匹の動物が導入遺伝子に対する軽度の抗体応答を生じた。ＢＢＰ－８１２を受けた１匹を除く全ての動物が、ＡＡＶ９に対する抗体を発現した（１２週目）。データの概要を表１１に示し、陽性動物の数／試験動物の数として提示する。

【表11】

【0166】

ＡＡＶ９及びＡＳＰＡに対する細胞免疫応答を評価するために、１２週及び２４週の剖検において、各用量群の動物のコホートから脾臓細胞を単離した。細胞を、ＡＡＶ９及びＡＳＰＡの全長にわたる１５量体のペプチドプールで刺激し、ペプチド当たり２アミノ酸の重複を生じさせた。ペプチドプールへの反応性を、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定されるインターフェロンガンマ分泌によって測定した。Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（ＣｏｎＡ）を陽性対照として使用した。試験した全ての試料は、ＣｏｎＡに対する強力な応答を示し、これは媒体処置細胞には存在せず、細胞の健康及び応答性を示した。ＡＳＰＡペプチドに応答はなかった。ＡＡＶ９ペプチドプールのうちの２つは、対照群において観察されなかった処置マウスにおいて応答を示した。観察された値は、アッセイの検出限界をわずかに上回り、ＣｏｎＡで観察された値よりも＞２０倍低かった（図１１）。

【0167】

２４週目までの生体内分布
収集した組織を表１２に列挙した。各スケジュールされた剖検で組織を収集し、＜－６０℃で保存する前に液体窒素中でフラッシュ凍結した。＜－６０℃で保存する前に、血液をＫ_２ＥＤＴＡチューブに収集し、液体窒素中でフラッシュ凍結した。

【表12】

【0168】

ビヒクル処置動物由来の組織中に検出可能なベクターはなかった。処置された動物由来の全ての組織は、ベクターゲノム及び導入遺伝子ＲＮＡについて陽性であった（図１２）。最も高いレベルのベクターは、肝臓で検出された。導入遺伝子ＲＮＡの最高レベルは、心臓、骨格筋、及び肝臓であった。

【0169】

評価されたパラメータのいずれにおいても有害な所見がないため、この研究の条件下でのＢＢＰ－８１２のＮＯＡＥＬは、３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇであると決定された。

【0170】

実施例３：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の投与によるカナバン病に対する、遺伝子療法の安全性及び臨床活性に関する第１／２相非盲検試験
ヒトＡＳＰＡ遺伝子（本明細書において「ＢＢＰ－８１２」とも称される）をコードするアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）ベースの組換えベクターの投与による、カナバン病に対する遺伝子療法の安全性及び臨床活性の第１／２相非盲検試験を実施する。研究のタイムライン及び全体的な研究デザインを図１３に示す。

【0171】

非盲検、対照試験は、カナバン病の３０ヶ月以下の小児参加者に投与された２つの計画用量レベルのＢＢＰ－８１２の安全性、忍容性、薬力学的（ＰＤ）活性、及び臨床活性を評価するように設計されている。最初の６人の参加者におけるＢＢＰ－８１２の安全性、忍容性、ＰＤ活性、及び予備的臨床活性の評価は、用量選択、及び選択された用量で合計１５人の参加者までの登録拡大の情報を与える。全ての参加者は、ＢＢＰ－８１２による治療日から少なくとも５年間追跡される。

【0172】

スクリーニング期間
患者の親（複数可）及び／または法定後見人（複数可）が書面による同意を提供した後、患者は研究参加者となり、研究に登録されたとみなされる。治験参加者は、スクリーニング期間中に治療適格性について評価される。全ての参加者について、標準スクリーニング期間は最初のスクリーニング評価時に開始される。スクリーニング期間は、ＢＢＰ－８１２による治療の最大４２日前（０日目）である。必要に応じて、一過性の病気、避けられないロジスティクス上の課題、または治験責任医師が決定したその他の要因により、スクリーニング期間が延長される場合がある。主要なスクリーニング評価の間に＞９０日が経過すると、それらの評価が繰り返される（すなわち、再スクリーニング）。

【0173】

ベースライン、治療、及び急性フォローアップ期間
ベースライン、治療、及び急性フォローアップ期間の合計期間は５２週間になる予定である。その後の長期フォローアップ期間は、急性フォローアップ期間の終了後少なくとも４年間続く。合計で、全ての参加者は、ＢＢＰ－８１２による治療日から少なくとも５年間追跡される。

【0174】

スクリーニング手順の完了後、参加者の治療適格性はベースライン期間中に確認される。ＢＢＰ－８１２による治療に適格である参加者は、ＢＢＰ－８１２への潜在的な免疫応答を防止または抑制するために、ＢＢＰ－８１２投薬の前日にグルココルチコイド予防を開始し、ＢＢＰ－８１２投与の当日に、注入反応を防止するために抗ヒスタミン剤予防を受ける。参加者は、０日目に、治験依頼者指定の治療センターで入院中に実施される、ＢＢＰ－８１２の静脈内（ＩＶ）注入を受ける。参加者は、ＢＢＰ－８１２の単回投与のみを受ける。参加者は、ＢＢＰ－８１２を投与された後、治験責任医師の判断により医学的に示されているように、投薬終了後少なくとも７２時間、またはそれ以上、安全性観察のために治験依頼者指定の治療センターに滞在する。退院時に、参加者は、ＢＢＰ－８１２投与後の最初の１ヶ月間、グルココルチコイド予防を継続し、その後、プロトコルで定義されたテーパリングレジメンを継続する。

【0175】

本研究は、極めてまれな疾患を有するこの小児／幼児患者集団におけるウイルスベクター用量の選択に保守的なアプローチを使用する。合計で、少なくとも６人の参加者が、各用量レベルで計画された少なくとも３人の参加者とともに、用量設定フェーズ中に治療される。最初の参加者が開始用量でＢＢＰ－８１２を受けた後、その後の参加者の治療は、少なくとも投与後２８日目の来院までの最初の参加者の安全性データのレビュー後にのみ行われる。このレビューは、ＢＢＰ－８１２の安全性及び忍容性を評価するために、治験依頼者及びデータ及び安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＣ）によって実施される。各参加者が投与された後の進行中の治験依頼者安全性データレビューに加えて、ＤＳＭＣ及び治験依頼者は、投与量漸増、用量コホートにおける第２の参加者の投与、及び所与の用量レベルでのコホート拡大の前に、少なくとも４週間の全ての参加者の累積投薬後安全性データのレビューが必要である。さらに、用量漸増がコホート２に進む前に、コホート１の少なくとも１人の参加者からの３ヶ月目のＭＲＩ及びＣＳＦ結果を評価する。コホート２については、少なくとも３人の参加者が投与され、少なくとも４週間の安全性データがレビューされた後、用量拡大を考慮してもよい。用量拡大を進める前に、コホート１の少なくとも３人の参加者及びコホート２の少なくとも１人の参加者からの３ヶ月目のＭＲＩ及びＣＳＦ結果を評価する。コホート２で治療した第３の参加者から１２週間の投与後データが利用可能になった後、安全性及びＮＡＡレベルを含む試験参加者からの利用可能な全てのデータを評価して、用量選択を通知し、選択された用量レベルで合計１５人の参加者までの登録拡大を支援する。

【0176】

治療後最初の４週間は、全ての評価が治療センターで行われる。この期間を過ぎると、その後の評価はフォローアップセンターで許可され、評価の種類に応じて、参加者の自宅で許可される。

【0177】

有害事象（ＡＥ）及び併用薬の使用は、継続的にモニタリングされる。標準的な安全性評価、検査室測定、身体検査、標準的な１２誘導心電図（ＥＣＧ）、及びベースライン脳波図を実施する。参加者がＭＲＩ及びＭＲＳと一致する時点で鎮静／麻酔下にある間に、腰部穿刺を介して脳脊髄液（ＣＳＦ）試料を取得する。免疫原性は、カプシド及び導入遺伝子産物への抗体及びＴ細胞応答の発達を評価することによって評価する。血液中のＡＡＶ９ベクターの生体内分布、及び唾液、尿、及び糞便中のベクター排出をモニタリングする。ＢＢＰ－８１２による治療後の最初の１２週間、参加者の介護者は、そのような接触が予定された治験来院と一致しない場合、安全性の評価のために毎週、参加者の介護者に連絡される。

【0178】

ＢＢＰ－８１２による治療のＰＤ活性は、尿及びＣＮＳ中のＮＡＡレベルを測定することによって評価される。脳ＮＡＡレベルは、ＭＲＳによって非侵襲的に測定され、ＭＲＳ時点と一致する腰部穿刺によって得られた試料を介してＣＳＦにおいても直接測定される。同時に、脳解剖学的構造及び組織組成の特徴に対するＢＢＰ－８１２による処置の効果をＭＲＩによって評価する。

【0179】

機能的尺度は、精密及び肉眼的運動発達及び認知ならびに言語発達の尺度及び試験を通じて評価される。参加者の適応行動と家族／介護者（複数可）の生活の質（ＱＯＬ）には、小児集団で検証された方法が含まれる。カナバン病の評価尺度は、カナバン病の参加者の神経学的ドメインを評価するために特に使用される。

【0180】

カナバン病に関連する変化の評価のために標準的な神経学的検査を実施する。さらに、視覚誘発電位（ＶＥＰ）試験を含む眼科的評価が行われる。

【0181】

長期フォローアップ期間
治療及び急性フォローアップ期間の後、長期フォローアップ期間は少なくとも４年間続く。安全性に加えて、運動発達、認知及び言語発達、家族／介護者（複数可）の家族のＱＯＬ、神経学的状態、及びＮＡＡレベルの評価を追跡し、ＢＢＰ－８１２による治療の効果の持続性を評価する。合計で、全ての参加者は、ＢＢＰ－８１２による治療日から少なくとも５年間追跡される。長期フォローアップ監視計画には、ＤＳＭＣと協力して治験依頼者が実施する継続的な安全監視のプロセスが記載されている。

【0182】

安全性モニタリング
ＤＳＭＣは、試験安全管理計画及びＤＳＭＣ憲章に従って、試験中に発生するＡＥ、重篤な有害事象（ＳＡＥ）、及び用量後の毒性を監視及び評価する。ＤＳＭＣは、累積安全性データをレビューし、用量設定フェーズ中のコホート１及びコホート２における継続的な治療及び登録、用量選択、ならびに試験の登録拡大フェーズ中の登録及び治療に関連して、ＢＢＰ－８１２の安全性及び忍容性を評価する。

【0183】

停止規則、用量制限毒性、投薬調整
この試験は、治験依頼者によって一時停止、一時的に中断、または早期に終了される可能性がある。

【0184】

毒性は、有害事象の共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）ｖ５．０によって決定される。用量制限毒性の疑いには、ＢＢＰ－８１２に関連して治験責任医師によって評価され、カナバン病または他の原因に起因しないＳＡＥ、グレード≧３の有害事象、またはグレード≧３の臨床ＡＥが含まれるが、これらに限定されない。ＢＢＰ－８１２用量は、参加者ごとに調整されない。

【0185】

禁止薬
ＢＢＰ－８１２以外の任意の遺伝子療法の使用は、試験前及び試験中に禁止されている。カナバン病または他の病気の治療のための他の治験薬の使用は、ＢＢＰ－８１２投与前の３０日以内（または５半減期のいずれか長い方）は許可されない。任意の肝毒性剤は、ＢＢＰ－８１２を投与される前に少なくとも４週間、及び投与された後１２週間禁止される。参加者の親／介護者は、同じ期間中に参加者にアセトアミノフェンを投与しないように助言されるべきである。医学的に必要な場合、肝毒性を有する可能性のある薬剤の使用は、治験責任医師と治験依頼者との間の議論の後、個々の参加者に基づいて決定される。治験責任医師は、プロトコル指定の評価に必要な適切な抗てんかん薬及び鎮静剤または麻酔剤を選択することにより、肝毒性リスクを最小限に抑えるためにあらゆる努力を払う。免疫抑制剤は、プロトコルで別途定義されていない限り、研究中に使用することはできない。

【0186】

参加者数（予定）
計画された登録：最大１８人の用量を受けた参加者（合計）：
●用量設定フェーズ：６人以上の参加者
●登録拡大フェーズ：最大１２名の参加者

【0187】

参加基準及び参加除外基準
組み入れ基準：

【0188】

この臨床試験の参加資格を得るには、参加者は以下の全ての基準を満たす必要がある。
●ＢＢＰ－８１２注入の予測日で、男性または女性の生後３０ヶ月以下である。（すなわち、投薬は参加者が３１ヶ月になる前日まで発生する可能性がある）
●治験責任医師の見解では安定した健康状態を有し、急性または慢性の血液疾患、腎疾患、肝疾患、免疫、または神経疾患（カナバン病以外）がないことが病歴及び臨床試験で確認されている。
●カナバン病の生化学的及び遺伝的診断を受けている：
●スクリーニング時に決定された、または参加者の病歴に記録されたＡＳＰＡ遺伝子の尿中ＮＡＡ及び二対立遺伝子変異の上昇。
●カナバン病（筋緊張低下、発達遅延、及び大頭症を含むがこれらに限定されない）の臨床診断及び活動徴候を有する。
●地理的に適用可能なガイドライン（例：疾病管理予防センター、世界保健機関）に従って全ての予防接種について最新であり、参加者の親（複数可）及び／または法定後見人（複数可）は、臨床試験の過程で必要とされる標準及び研究特異的予防接種の投与に同意している。
●研究の性質が説明された後、及び研究関連の手順の実施前に、読み／理解することを希望し、それが可能な親（複数可）及び／または法定後見人（複数可）を有し、書面で署名されたインフォームドコンセントを提供することができる。
●参加者の臨床試験への参加を許可し、併用薬及びその他の治療制限を含む全ての臨床試験要件を遵守する意思があり、可能である親（複数可）及び／または法定後見人（複数可）がいること。

【0189】

除外基準：

【0190】

以下の基準のいずれかを満たす参加者は、この研究から除外される：
●酵素結合免疫吸着アッセイによって決定される、総抗ＡＡＶ９抗体（＞１：５０）試験が陽性である。
●ＡＡＶを伴う以前の遺伝子療法または他の療法（ワクチンを含む）を受けた。
●免疫抑制剤による高用量療法を受けている。
●以下を特徴とするカナバン病を有意に進行させている：
●連続的／一定の除脳または除皮質姿勢の存在、
●再発性てんかん重積状態、または
●３種類以上の抗てんかん薬を服用している間に反応しない不応性発作
●治験責任医師の判断に従って、軽度のカナバン病の表現型に関連することが知られるＡＳＰＡ遺伝子型を有する。
●スクリーニング中の病歴または臨床及び／または検査所見によって証明される肝疾患の病歴（例えば、肝硬変または現在の活動性肝機能不全）がある。
●治験責任医師によって臨床的に有意であるとみなされる異常な検査値がある：
●アラニンアミノトランスフェラーゼまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ＞正常上限（ＵＬＮ）
●共役ビリルビン＞ＵＬＮ
●ガンマグルタミルトランスフェラーゼ＞ＵＬＮ
●推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）が年齢の正常値の下限を下回っている
●ヘモグロビン＜８ｇ／ｄＬ
●年齢の正常範囲外の白血球（ＷＢＣ）数
●血小板数＜１５０，０００／μＬ
●基準範囲外の部分トロンボプラスチン時間
●基準範囲外の国際正規化比率
●重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ ＣｏＶ２；すなわち、コロナウイルス疾患－２０１９［ＣＯＶＩＤ１９］）、ヒト免疫不全ウイルス１型または２型（ＨＩＶ１またはＨＩＶ２）、Ｂ型またはＣ型肝炎、または結核の陽性スクリーニング検査を含む、臨床及び／または検査所見による活動性または潜伏感染の証拠がある。
●スクリーニング中のＡＬＤＯＢ遺伝子検査の結果に基づいて、遺伝性果糖不耐症の診断が確定している。
●現在別の介入性臨床試験に参加しているか、またはＢＢＰ－８１２投与前の３０日以内または５半減期（治験責任医師の裁量による）以内に治験薬またはデバイスを使用した別の臨床試験を完了している。
●治験責任医師の判断に従って、過去または現在の医学的または行動的状態、身体検査またはその他の医学的評価の所見、その可能性のあるその他の状況がある。
●治験中の参加者の安全性と健康に悪影響を及ぼす、
●治験手順またはフォローアップの完了を妨げる、または
●研究結果の混同する解釈。
●治験薬の賦形剤のいずれかに対して過敏症の病歴がある。

【0191】

治験薬とプラセボ、投与量、投与方法
予防：ＢＢＰ－８１２投薬の少なくとも２４時間前の－１日目に、参加者は、ＢＢＰ－８１２投与に関連する潜在的な免疫応答を予防または抑制するために、栄養管（既に存在する場合）を介したプレドニゾロンまたはＩＶ注入を介したメチルプレドニゾロンのいずれかでグルココルチコイド予防を開始する。参加者は、入院期間中、グルココルチコイド予防を継続する。ＢＢＰ－８１２投薬当日、参加者は注入反応を防ぐために抗ヒスタミン剤の予防投与を受ける。退院時に、参加者は、ＢＢＰ－８１２投与後の最初の１ヶ月間、プレドニゾロンによるグルココルチコイド予防（既に存在する場合は栄養管によって、または経口で）を受ける。代替のグルココルチコイドは、治験責任医師の判断に従って、及びメディカルモニターと相談した後に医学的に指示された場合に投与することができる。用量後２８日目の来院時に、治験責任医師は、プロトコル定義のガイドラインに従ってグルココルチコイドテーパリングを開始するかどうかを決定する。

【0192】

投薬：治療は以下のように投与される：ＢＢＰ－８１２コホート１：１．３２×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）／キログラム（ｋｇ）体重；ＢＢＰ－８１２コホート２：３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ体重。必要に応じて、ＢＢＰ－８１２の低用量または中間用量は、累積安全性及び活性データのレビューに基づいて治験依頼者によって選択され得る。参加者は、治療適格性の確認日に応じて、治療コホート１または２に順次割り当てられる。ＢＢＰ－８１２は、治験の０日目に１回の単回ＩＶ注入として治験依頼者指定の治療センターで投与される。注入の持続時間は、投与される用量レベルに依存する。

【0193】

投薬は、参加者が生後３１ヶ月になる前日まで（その日を含む）行われ得る。

【0194】

プラセボ：この研究においてプラセボは投与されない。

【0195】

治療の期間及び研究への参加
各治療適格参加者は、研究の０日目にＩＶ注入によって投与されるＢＢＰ－８１２の単回用量を受ける。

【0196】

本治験への参加の最大総期間は、少なくとも５年とする。

【0197】

スクリーニング期間：最大４２日間（必要に応じて、一過性の参加者の病気、避けられないロジスティクス上の課題、または治験責任医師が判断したその他の要因により、時間が延長される場合がある）

【0198】

治療及び急性フォローアップ期間：１年

【0199】

長期フォローアップ：少なくとも４年

【0200】

統計的方法
解析母集団：任意の量の治験薬を受けた全ての参加者は、安全性解析セットに含まれる。任意の量の治験薬を受け、少なくとも１回のベースライン後の有効性評価を有する全ての参加者は、修正された治療（ｍＩＴＴ）解析セットに含まれる。中止した参加者は、ベースライン後の有効性評価がない場合でも、ｍＩＴＴ解析セットに含まれる。主要なプロトコル違反のないｍＩＴＴ解析セットの全ての参加者は、プロトコルごとの解析セットに含まれる。

【0201】

データ表集計の一般的なプレゼンテーションは、年齢層別になる。連続変数の要約には、総数（Ｎ）、平均、中央値、標準偏差、最小、最大、及び両側９５％信頼区間（ＣＩ）が含まれる。カテゴリデータの要約には、カウントとパーセンテージ、及び両側９５％ＣＩが含まれる。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法を使用して、関連する両側９５％ＣＩを有する２５、５０（中央値）、及び７５パーセンタイルを含む事象までの時間エンドポイントを要約する。

【0202】

有効性パラメータの分析は、主にそれぞれの分析集団の全ての参加者に基づく。しかしながら、有効性は、診断時の参加者の年齢に依存し得るか、または診断から治療までの時間に依存し得るため、追加の探索的分析が行われ、それによって参加者は、年齢グループ及び診断からの時間（例えば、生後１２ヶ月以下及び＞生後１２～３０ヶ月；診断から１２ヶ月以下及び１２ヶ月超）などの適切なカテゴリに層別化される。治験ＣＶＮ－１０１から得られた自然病歴データとの比較は、マッチングされた患者データを使用して実施され、ペアマッチング、傾向スコアリンググループマッチングなどのマッチング方法の具体的な詳細は、統計解析計画で指定される。

【0203】

ＢＢＰ－８１２またはグルココルチコイド投薬に関連するＡＥの評価のベースラインは、投与開始直前として定義され、一般に、治療出現（すなわち、治療出現有害事象［ＴＥＡＥ］）としてのＡＥの指定は、治療開始の日／時に開始される。他の全ての変数／エンドポイントの変化の分析のためのベースラインは、製剤注入前の最も近い値として定義される。したがって、ベースラインは、特定の変数について、試験－１日目、－２日目、－３日目、－４日目、－５日目、－６日目、－７日目、－８日目、－９日目、－１０日目、またはスクリーニングのいずれかとして考慮される。縦断的データ（治験とフォローアップで時間をかけて連続的に収集）は、データの性質に応じて、毎月、四半期などの適切な時間間隔で提示される。

【0204】

参加者の配置と人口統計学的特徴
参加者の配置には、各年齢層に登録された参加者の数と、年齢層別の各分析集団に含まれる参加者の数と割合が含まれる。また、治験を早期に中止した参加者の頻度とパーセンテージ、及び中止の主な理由も要約する。年齢、性別、人種、民族、体重、長さ、及びボディマス指数（ＢＭＩ）を含む人口統計学及びベースライン特性、ならびに診断からの時間及び臨床徴候の発症を年齢グループ別に要約する。

【0205】

安全性分析
安全性解析のための統計的方法は、主に本質的に記述的であり、安全性解析セットで実施される。欠落している安全性データの補完は、欠落している日付または部分的な日付以外に実施されず、統計分析計画にさらに詳細に記載される。参加者は年齢別に分類される。

【0206】

Ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ２３．１（または必要に応じてそれ以降）を使用して、全てのＡＥをコードする。ＳＡＥ及びＴＥＡＥを含む有害事象は、年齢群別及び全体別に、全身臓器クラス及び推奨用語別に要約される。ＴＥＡＥは、ＢＢＰ－８１２の投与中または投与後に発生する任意のＡＥとして定義される。全てのＴＥＡＥ要約には、イベントを経験した参加者の数と割合、及び参加者が経験したＡＥの数が含まれる。パーセンテージは、各年齢グループ内の安全性解析セットの参加者数に基づいている。ＢＢＰ－８１２の遅延安全性効果の可能性は、計画された長期フォローアップ安全性評価の一部として評価される。重症度グレード３またはグレード４のＡＥ、及び発生率５％以上のＡＥを要約する。ＴＥＡＥとＢＢＰ－８１２及びグルココルチコイドとの関係を要約する。

【0207】

グルココルチコイド
全ての適格な参加者について、グルココルチコイド予防は、ＢＢＰ－８１２投与に関連する潜在的な免疫応答を予防または抑制するために投与される。投与レジメンを図１５に示す。ＡＡＶベクターへの抗原特異的Ｔ細胞応答は、遺伝子療法を受けた２～４週間後の小児患者において報告されている（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ２０２１、Ｍｅｎｄｅｌｌ ２０１７）。

【0208】

予防：－１日目に、ＢＢＰ－８１２の投薬の少なくとも２４時間前から開始し、入院時に継続して、参加者は、プレドニゾロンを用いたグルココルチコイド予防剤を栄養管（既に存在する場合）を経由して、またはＩＶ注入を経由してメチルプレドニゾロンを受ける。退院時に、参加者は、グルココルチコイド予防を、栄養管を介した経口プレドニゾロン（既に存在する場合）によって、または経口で、少なくとも治療後２８日間の来院まで受ける。治験責任医師は、臨床的に適応がある場合、異なるグルココルチコイドを選択することができる。安全性臨床試験及び参加者の臨床評価は、グルココルチコイド予防をテーパーすべきか、現在の用量で継続すべきか、または増加すべきか（最大２．０ｍｇ／ｋｇ／Ｄプレドニゾロンまたは当量の用量）を導くために使用される。現在推奨されている投薬とテーパリングのレジメンについては、以下を参照されたい。

【0209】

参加者は、個々の参加者の臨床状態及び地域のベストプラクティスの治験責任医師の評価に基づいたレジメンを使用して、任意の介入性熱性疾患または生理学的ストレスのためのストレス用量のステロイドを受ける。副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）刺激試験を実施し、視床下部－脳下垂体－副腎（ＨＰＡ）軸が損傷していないかどうか、及びストレスステロイドの使用がもはや必要ないかどうかを決定する。本研究のグルココルチコイドレジメンは、長期的な副腎機能不全を引き起こすことは予想されない。

【0210】

最初に投与された参加者からの安全性データのレビューに基づいて（実施例４を参照）、ＤＳＭＣは、以下に概説されるように、より高い開始用量のプレドニゾロン、ならびにより長いテーパー及び増加したモニタリングに移動することを推奨した。
●７日目まで２．０ｍｇ／ｋｇ／日
●２９日目まで１．５ｍｇ／ｋｇ／日
●５６日目まで１．０ｍｇ／ｋｇ／日（Ｍｏ２）
●テーパーを開始し、１週間当たり１５％以下の減少で少なくとも６週間継続する。
●少なくとも週に１回、または関連する傾向がある場合はそれ以上の頻度で肝機能検査を行う安全性検査室を監視する。
●ＡＳＴ／ＡＬＴ上昇の事象については、潜在的な非肝臓原因について評価するために、少なくとも１つのクレアチニンキナーゼレベルを取得する。

【0211】

上記のレジメンを、第２の用量を受けた参加者に使用し（実施例４を参照）、現在のベースケースを反映した。しかしながら、ＢＢＰ－８１２のさらなる臨床経験の自然増加に基づく追加の修正の対象となる。

【0212】

テーパリング
ＢＢＰ－８１２投与の１ヶ月後に肝臓炎症と一致する臨床的に有意な検査または他の所見がない場合、グルココルチコイド予防は、治験責任医師の判断及び少なくとも２８日間にわたる現地の臨床実践に従って、テーパーされ得る。２８日目の臨床試験来院結果で肝臓の異常が認められた場合、メディカルモニターと相談して、１日１回のグルココルチコイド予防を継続するか、異常が解消するまで経口プレドニゾロンの１日総用量２．０ｍｇ／ｋｇ／日に相当する最大量まで増やし、その後、治験責任医師及び現地の臨床実践に従って、用量レベル及び治療期間に基づいて適切にテーパリングする必要がある。

【0213】

グルココルチコイドテーパー中の参加者の安全性臨床試験及び臨床評価が推奨される。

【0214】

ＡＣＴＨ刺激試験を実施し、ＨＰＡ軸が損傷していないかどうかを決定する。上記の試験によって正常なＨＰＡ軸機能の回復が確認されるまで、参加者は、個々の参加者の臨床状態及び地域のベストプラクティスの治験責任医師の評価に基づいたレジメンを使用して、任意の介入性熱性疾患または生理学的ストレスのためのストレス用量ステロイドを受ける。プロトコルで義務付けられたグルココルチコイド投薬レジメンが、長期的な副腎機能不全をもたらすことは予想されない。

【0215】

さらに、グルココルチコイドの用量または持続時間に関係なく、テーパーの後期フェーズ中及びグルココルチコイド予防の中止前に、ＡＣＴＨ刺激試験を実施して、ＨＰＡ軸が損傷していないか、及びグルココルチコイド予防が完全に停止し得るかどうかを決定する。ＨＰＡ軸機能が完全に回復していない場合、患者は現在のグルココルチコイド用量を維持し、次の予定された治験来院時（約４週間以上後）に２回目のＡＣＴＨ刺激試験を実施する。ＡＣＴＨ刺激試験は、ＨＰＡ機能が正常化するまで治験来院時に継続され、その後、患者はグルココルチコイドを中止し、もはやストレスステロイドのカバレッジを必要としなくなる可能性がある（以下を参照）。検査のための特定の方法、基準範囲、収集時期、及びその他の詳細は、現地の実践基準及び治験責任医師の医学的判断に従う必要がある。上記の試験によって正常なＨＰＡ軸機能の回復が確認されるまで、参加者は、個々の参加者の臨床状態及び地域のベストプラクティスの治験責任医師の評価に基づいたレジメンを使用して、任意の介入性熱性疾患または生理学的ストレスのためのストレス用量ステロイドを受ける。プロトコルで義務付けられたグルココルチコイド投薬レジメンが、長期的な副腎機能不全をもたらすことは予想されない。

【0216】

抗ヒスタミン剤
全ての適格な参加者について、抗ヒスタミン剤予防は、ＢＢＰ－８１２への注入反応の予防のために使用される。承認された抗ヒスタミン剤としては、ジフェンヒドラミン（ＩＶ）、ヒドロキシジン（筋肉内［ＩＭ］）、及びクロルフェニラミン（ＩＶ）、または栄養管を介して投与される対応する経口製剤（既に存在する場合）が挙げられる。抗ヒスタミン剤、用量、及び投与経路の選択は、治験責任医師の医学的判断及び現地の施設の実践に基づいて行われる。

【0217】

その他の予防的治療及びレスキュー薬
アナフィラキシー反応の場合、治療センターの標準的な施設手順に従って、以下の治療薬を準備する：エピネフリン、クリスタロイド、抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、またはクロルフェニラミン）、及びヒドロコルチゾン。ＣＲＳの潜在的な発達に対処するために、サイトカインに対する抗体（例えば、トシリズマブ、ＩＬ－６Ｒ抗体）は、容易に使用可能である。加えて、補体媒介性血栓性微小血管症と一致するエピソードは、一部が抗補体療法を必要とする他の全身性ＡＡＶ９媒介性遺伝子療法製品（Ｐｆｉｚｅｒ ２０１９、Ｓｏｌｉｄ ２０１８、Ｓｏｌｉｄ ２０１９）とともに報告されているため、補体阻害剤（例えば、エクリズマブ、Ｃ５切断をブロックする抗体、及びＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）などの組換えまたは血漿由来のＣ１エステラーゼ阻害剤）も容易に利用可能でなければならない。これらの薬物の詳細については、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）［Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ２０１９］）、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）［Ａｌｅｘｉｏｎ ２０２０］）、及びＣ１エステラーゼ阻害剤（Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）［ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ２０１９］）の処方情報を参照されたい。

【0218】

注目すべきことに、エクリズマブは重篤な髄膜炎菌性感染症に関連しており、したがって、リスク評価及び緩和戦略（Ａｌｅｘｉｏｎ ２０２０）の下で制限されたプログラムを通じてのみ注文することができる。髄膜炎菌予防に関する情報及びエクリズマブを取得するための登録要件については、Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）（Ａｌｅｘｉｏｎ ２０２０）の処方情報を参照されたい。エクリズマブの使用及び補体活性化症候群／血栓性微小血管症の管理に経験のある医療専門家との相談が推奨される。

【0219】

身体検査所見、検査室評価、バイタルサイン、及びＥＣＧの臨床的に有意な変化は、ＡＥとして報告される。検査室及びバイタルサインデータは、年齢群ごとに要約される。全ての検査データとバイタルサインがリストされる。

【0220】

併用薬物データは、年齢群ごとにリストされ、要約される。治験薬曝露は、年齢群別に要約する。

【0221】

薬力学的活性解析
尿及びＣＮＳ（ＰＤマーカー）中のＮＡＡレベルの分析のいくつかの基本的な態様がある。固有の患者の経時的な可変性区別可能であるＢＢＰ－８１２投与後のＮＡＡレベルの変化、特にベースラインからの実質的な減少は、ＢＢＰ－８１２遺伝子療法の生理学的効果、すなわち、ＮＡＡが効果のバイオマーカーであることの検証のマーカーとみなされ得る。これらの分析では、ベースラインからの変化は、縦断的データ分析法を使用して評価することができる。さらに、ＮＡＡレベルの低下との相関を評価するための臨床活動尺度における絶対値及びベースラインから治療後までの変化の分析、ならびにベースラインＮＡＡレベルに関連し得る経時的な臨床転帰変化の潜在的な差異を評価する分析が行われる。

【0222】

ベースラインから特定の時点までのＮＡＡレベルの変化の統計的分析は、対応のあるｔ検定などの標準的な方法を使用して実行され、主要な時点分析は、ＢＢＰ－８１２による処置後１２ヶ月に変更される。ベースラインからの変化は、縦方向の反復測定のデータ分析方法を使用して評価することもできる。さらに、ＮＡＡレベルの低下との相関を評価するために、ベースラインから治療後までの臨床活動測定値の絶対値及び変化の分析が行われ、ベースラインＮＡＡレベルに関連し得る経時的な臨床転帰変化の潜在的な差異を評価する分析も行われる。ＰＤ及び臨床活動評価の詳細は、正式な統計解析計画において提供される。

【0223】

臨床活動：運動、認知、言語発達と機能；適応行動
ｍＩＴＴ解析セットは、臨床有効性の評価のために主要とみなされ、臨床有効性のベースライン後評価なしに試験を中止する参加者は、治療に応答しないとみなされる。そのような完全に欠落した結果の分析のためのいくつかの補完方法も使用することができ、これには、全ての処置された参加者にわたる最悪の値の割り当て（最悪の場合分析）、及び分析からのそのような参加者の除外（最良の場合分析）が含まれる。全ての臨床有効性解析について、参加者は、年齢群及び診断からの期間によって分類される。

【0224】

臨床解析は、発達試験における絶対データとベースラインからの経時的な変化の両方に基づいて行われる。潜在的な有効性シグナルを検出し、これらの絶対値及びベースラインからの変化の臨床的重要性を評価するために、臨床活性データを、治験ＣＶＮ－１０１のカナバン病の参加者の自然経過データベースで収集された同様のデータと比較してもよい。

【0225】

その他の評価：イメージング、介護者質問票
ｍＩＴＴ解析セットは、イメージング及び介護者質問票の評価のために主要とみなされる。ベースライン後イメージング評価または質問票回答なしに試験を中止する参加者は、治療に応答しないとみなされる。全てのイメージング及び質問票分析では、参加者は年齢グループ別に分類される。年齢グループによるデータを提示するために、記述統計が使用される。

【0226】

解析は、ベースライン時の脳ＭＲＩ及び脳ＭＲＳ、ならびにベースライン時の質問票回答、ならびにベースラインからの変化に関連するであろう。

【0227】

試料サイズ
治験への登録は最大１８人の用量を受ける参加者になる。選択された用量で治療された最大１５人の参加者の試料サイズは、ベースラインからの変化における０．４９３ｍｍｏｌの標準偏差が決定され、ベースラインからの２～３ｍｍｏｌの差を検出することが重要であると考えられた、以前に公開されたプロトコル（Ｌｅｏｎｅ ２０１２）で使用されたのと同様であるが、やや保守的な仮定に基づいて、ＮＡＡに対するＰＤ効果の評価に適切であろう。１．０ｍｍｏｌのより保存的な推定標準偏差及び２．０ｍｍｏｌの臨床的に関連する差を有するＮＡＡのベースラインからの変化についてのこれらの仮定を使用すると、１５の試料サイズは、９０％を超える検出力に対して十分以上である。

【0228】

研究スケジュール
スクリーニング及び長期追跡期間の事象のスケジュールを表１３及び表１４にそれぞれ示す。

【表13-1】

【表13-2】

【表13-3】

【表13-4】

【表13-5】

【表13-6】

【表13-7】

【表13-8】

【表13-9】

【表13-10】

【表13-11】

【表13-12】

【表13-13】

【表13-14】

【表14-1】

【表14-2】

【表14-3】

【表14-4】

【表14-5】

【0229】

実施例４：第１／２相非盲検臨床試験の暫定結果
２人の患者に、実施例３に記載されるようにＢＢＰ－８１２を投与した。磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）イメージングを使用して、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び脳組織中のＮ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）の堅牢で永続性のある処置後の減少を観察した。磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）で測定した新規髄鞘形成の徴候も観察された。脳ＮＡＡの減少は、静脈内（ＩＶ）投与されたＢＢＰ－８１２が血液脳関門の背後にあるその意図された標的に到達し、機能的アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）酵素を発現していることを示唆する早期シグナルである。科学文献には、より低いＮＡＡレベルがより軽度の疾患に関連しているというエビデンスがある。ＮＡＡのそれらの減少が臨床転帰にどのように変換されるかを確認するには、より多くの時間が必要である。

【0230】

ＢＢＰ－８１２の静脈内注入は忍容性が良好であり、これまでのところ、治療関連の重篤な有害事象を経験した参加者はいない。治療後６ヶ月で、参加者１は、ＣＳＦにおけるＮＡＡの７７％の低下、ＭＲＳイメージングによって測定された脳白質におけるＮＡＡの１５％の低下、及び尿ＮＡＡの約５０％の低下を示した。治療後３ヶ月で、参加者２は、ＣＳＦにおけるＮＡＡの８９％の低下、ＭＲＳイメージングによって測定された脳白質におけるＮＡＡの５０％を超える低下、及び尿ＮＡＡの８１％の低下を示した。これらの観察された生化学的変化は、ＢＢＰ－８１２が、この疾患のマイルストーンであるカナバン病プロセスに重要な細胞に到達していることを示唆している。これらのデータは暫定的な結果を表しており、治験遺伝子療法の最終的な安全性及び有効性プロファイルは完全に確立されていない。
＊＊＊＊＊＊＊

【0231】

本明細書において引用される全ての論文、出版物及び特許は、あたかも各々の個別の論文、出版物または特許が参照することによって援用されることが具体的かつ個別に指示されたかのように、参照することによって本明細書に援用され、引用された出版物に関連した方法及び／または材料を開示及び記述するために参照することによって本明細書に援用される。しかし、本明細書で引用されるいずれの参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願の言及も、それらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国で共通の一般知識の一部を形成するという承認または何らかの示唆ではなく、そのようにみなされるべきではない。

【0232】

本明細書において例証及び考察される実施形態は、本発明を作製し、使用するために本発明者らに既知の最善の方法を当業者に教示することのみを意図する。本発明の上記実施形態は、本発明から逸脱することなく、上記教示に照らして当業者によって理解されるように修正または変更され得る。したがって、特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内で、本発明は、具体的に記載されるものとは別の方法で実施され得ることが理解される。
列挙された実施形態
実施形態１．対象に治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、
（ｉｉ）アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記治療有効量が、約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲である、方法。
実施形態２．アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）の発現を必要とする対象におけるその方法であって、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記治療有効量が、約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲であり、それによって、前記対象においてＡＳＰＡを発現する、前記方法。
実施形態３．アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）のレベルの増加を必要とする対象におけるその方法であって、治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記治療有効量が、約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲であり、それによって、前記対象における前記ＡＳＰＡのレベルを増加させる、前記方法。
実施形態４．前記対象が、ＡＳＰＡの発現を必要とする、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５．前記対象が、ＡＳＰＡの低減したレベル及び／または機能を有する、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６．前記対象が、白質ジストロフィーを有する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７．白質ジストロフィーの治療を必要とする対象におけるその方法であって、前記対象に治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記治療有効量が、約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲であり、
それによって、前記対象における白質ジストロフィーを治療する、前記方法。
実施形態８．前記白質ジストロフィーが、カナバン病、副腎脊髄ニューロパチー、アレキサンダー病、脳腱黄色腫症、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、ペリツェウス・メルツバッハー病、及びレフサム病からなる群から選択される状態に関連する、実施形態６または実施形態７に記載の方法。
実施形態９．前記白質ジストロフィーが、カナバン病に関連する、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０．前記ｒＡＡＶベクターを投与する前に、白質ジストロフィーを有する対象を選択することをさらに含む、実施形態６～９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１．カナバン病の治療を必要とする対象におけるその方法であって、前記対象に治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、前記ｒＡＡＶベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸分子と、
（ｉｉ）ＡＳＰＡをコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記治療有効量が、約１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲であり、
それによって、前記対象におけるカナバン病を治療する、前記方法。
実施形態１２．前記ｒＡＡＶベクターを投与する前に、カナバン病の対象を選択することをさらに含む、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３．前記ｒＡＡＶベクターの投与が、前記対象の組織におけるＡＳＰＡの発現をもたらす、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４．前記組織が、末梢組織または中枢神経系（ＣＮＳ）組織である、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５．前記対象において、解糖からベータ酸化への移行を含む代謝不均衡が存在することが判定されている、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６．前記方法が、１つ以上の解糖及び／またはベータ酸化因子のレベルを評価することによって前記代謝不均衡を検出することをさらに含む、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１７．前記１つ以上の解糖及び／またはベータ酸化因子のレベルが、前記対象から得られる中枢神経系（ＣＮＳ）液を使用して評価される、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８．前記方法が、
（ａ）前記対象からＣＮＳ液を得ることと、
（ｂ）前記ＣＮＳ液中のベータ酸化の増加を検出することと、
（ｃ）前記（ｂ）での検出に基づいて、前記ｒＡＡＶを前記対象に投与することと、をさらに含む、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９．前記方法が、（ａ）前記対象から得られた生体試料の代謝プロファイルを測定することと、（ｂ）前記代謝プロファイルに基づいて、解糖からベータ酸化への移行を含む代謝不均衡を識別することと、をさらに含む、実施形態１５～１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０．前記代謝プロファイルを測定することが、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、または超高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して前記生体試料をアッセイすることを含む、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１．前記生体試料が、血液、血清、ＣＮＳ組織、または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む、実施形態１９または実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２．前記ＣＮＳ組織が、脳組織である、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３．前記代謝プロファイルが、グルコース、グルコース－６－リン酸、３－ホスホグリセリン酸、ピルビン酸、乳酸、及びホスホエノールピルビン酸からなる群から選択される第１のバイオマーカーのレベルを含む、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４．前記代謝プロファイルが、カルニチン、マロニルカルニチン、ミリストイルカルニチン、パルミトイルカルニチン、マロニルカルニチン、及びベータヒドロキシ酪酸からなる群から選択される第２のバイオマーカーのレベルを含む、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２５．前記治療有効量が、約１０^１４ｖｇ／ｋｇ～約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの範囲である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２６．前記治療有効量が、約１．３２×１０^１４ｖｇ／ｋｇである、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７．前記治療有効量が、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇである、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２８．前記ｒＡＡＶが、注入によって投与される、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９．前記ｒＡＡＶが、静脈内注入によって投与される、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３０．前記ｒＡＡＶが、注射によって投与される、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１．前記注射が、静脈内注射、血管内注射、及び脳室内注射からなる群から選択される、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２．前記対象が、生後３０ヶ月以下である、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３．ＡＳＰＡが、ヒトＡＳＰＡタンパク質を含む、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３４．ＡＳＰＡが、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３５．前記プロモーターが、アストロサイト特異的プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、または強化型トリβ－アクチンプロモーターである、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６．前記プロモーターが、サイトメガロウイルス／β－アクチンハイブリッドプロモーター、またはＰＧＫプロモーターである、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７．前記サイトメガロウイルス／β－アクチンハイブリッドプロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＢ６プロモーター、またはＣＢＡプロモーターである、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８．ＡＳＰＡをコードする前記非ＡＡＶヌクレオチド配列が、ヒトＡＳＰＡ ｃＤＮＡを含むか、またはそれからなる、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９．ＡＳＰＡをコードする前記非ＡＡＶヌクレオチド配列が、コドン最適化ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、実施形態１～３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４０．ＡＳＰＡをコードする前記非ＡＡＶヌクレオチド配列が、配列番号１を含むか、またはそれからなる、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４１．前記非ＡＡＶヌクレオチド配列が、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２．前記核酸分子が、サイトメガロウイルス前初期エンハンサーを含む、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３．前記核酸分子が、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルを含む、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４．前記核酸分子が、Ｋｏｚａｋ配列を含む、実施形態１～４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５．前記核酸分子が、ｍｉＲ－１２２結合部位を含む、実施形態１～４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６．前記ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、またはｒｈ７４血清型ＩＴＲである、実施形態１～４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７．前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、またはｒｈ７４血清型ｒＡＡＶである、実施形態１～４６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８．前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ９血清型ｒＡＡＶである、実施形態１～４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４９．前記ｒＡＡＶが、自己相補性ｒＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０．前記ｒＡＡＶが、一本鎖ｒＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である、実施形態１～４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５１．
約１．３２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの組換え自己相補性アデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）ベクターを静脈内注入によって対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶ９ベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、及びウサギβ－グロビンポリＡシグナルを含む核酸分子と、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、前記対象におけるＡＳＰＡの発現を指示するＣＢ６プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記対象が生後３０ヶ月以下であり、前記対象がカナバン病を有する、方法。
実施形態５２．
約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの組換え自己相補性アデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）ベクターを静脈内注入によって対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶ９ベクターが、
（ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、及びウサギβ－グロビンポリＡシグナルを含む核酸分子と、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列であって、前記対象におけるＡＳＰＡの発現を指示するＣＢ６プロモーターに作動可能に連結されている、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列と、を含み、
前記対象が生後３０ヶ月以下であり、前記対象がカナバン病を有する、方法。
実施形態５３．（ａ）前記対象に低分子代謝調節物質を投与すること、（ｂ）前記対象に食事介入を処方することであって、前記食事介入が、前記対象における解糖を促進し、及び／またはベータ酸化を低減する、前記処方すること、及び／または（ｃ）前記対象に免疫抑制剤を投与すること、をさらに含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４．治療有効量のグルココルチコイドを前記対象に投与することをさらに含む、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５．前記グルココルチコイドが、前記ｒＡＡＶベクターの投与前、投与と同時、及び／または投与後に投与される、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５６．前記グルココルチコイドが、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、またはそれらの組み合わせである、実施形態５４または実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．前記対象に、治療有効量の抗ヒスタミン剤を投与することをさらに含む、実施形態１～５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８．前記抗ヒスタミン剤が、前記ｒＡＡＶベクターの投与前、投与と同時、及び／または投与後に投与される、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９．前記抗ヒスタミン剤が、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、クロルフェニラミン、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態５７または実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０．前記投与後、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び／または脳組織中のＮ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）レベルが低下する、実施形態１～５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１．前記投与後、尿中のＮＡＡレベルが低下する、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２．前記尿中のＮＡＡレベルが、少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上低下する、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３．前記尿中のＮＡＡレベルが、少なくとも６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、またはそれ以上、治療前のレベルと比較して低減したままである、実施形態６１または６２に記載の方法。
実施形態６４．前記投与後、ＣＳＦ中のＮＡＡレベルが低下する、実施形態６０～６３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６５．前記ＣＳＦ中のＮＡＡレベルが、少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上低下する、実施形態６４に記載の方法。
実施形態６６．前記ＣＳＦ中のＮＡＡレベルが、少なくとも６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、またはそれ以上、治療前のレベルと比較して低減したままである、実施形態６４または６５に記載の方法。
実施形態６７．前記投与後、脳組織中のＮＡＡレベルが低下する、実施形態６０～６６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６８．前記脳組織中のＮＡＡレベルが、少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上低下する、実施形態６７に記載の方法。
実施形態６９．前記脳組織中のＮＡＡレベルが、少なくとも６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、またはそれ以上、治療前のレベルと比較して低減したままである、実施形態６７または６８に記載の方法。
実施形態７０．前記投与後、新規髄鞘形成が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用して観察可能である、実施形態１～６９のいずれか１つに記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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【国際調査報告】