特表 2024-539026 がん治療の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】がん治療の方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/09 20100101AFI20241018BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20241018BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20241018BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20241018BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20241018BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20241018BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20241018BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALN20241018BHJP

   C12N 15/86 20060101ALN20241018BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241018BHJP

【ＦＩ】

C12N5/09

A61P11/00

A61P1/00

A61P35/00

A61P43/00 121

A61P43/00 111

A61K35/15

A61K45/00

A61K39/395 U

A61K31/704

G01N33/53 Y

G01N33/53 P

G01N33/543 545A

C07K16/28

C12N5/10

C12N5/0786

C12N15/86 Z

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522563

(86)(22)【出願日】2022-10-14

(85)【翻訳文提出日】2024-06-05

(86)【国際出願番号】 US2022046781

(87)【国際公開番号】W WO2023064597

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】63/256,391

(32)【優先日】2021-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519349562

【氏名又は名称】ツェンラン・チュー

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100188374

【弁理士】

【氏名又は名称】一宮 維幸

(72)【発明者】

【氏名】ツェンラン・チュー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BB19

4B065CA44

4C084AA17

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZA591

4C084ZA592

4C084ZA661

4C084ZA662

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC412

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB11

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA10

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZA59

4C086ZA66

4C086ZB26

4C086ZC75

4C087AA01

4C087BB37

4C087BB65

4C087MA02

4C087NA05

4C087ZA59

4C087ZA66

4C087ZB26

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

(57)【要約】

本明細書に記載の本発明は、がんを治療するための潜在的な治療方法の迅速、効率的、かつ正確に評価するためにそれらを使用するための、固形腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養物のための方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

固形腫瘍／がん（ＮＳＣＬＣを含む肺がんなど）の治療に対する治療方法の効力を試験するための前記腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養物であって、好適な哺乳動物組織培養培地中で培養された前記固形腫瘍／がんの新しく単離された組織試料を含み、前記新しく単離された組織試料のサイズが、最大寸法で約１～１０ｍｍ（例えば、２～８ｍｍ、３～６ｍｍ、約５ｍｍ）に縮小される、エクスビボ培養モデル又は一括培養物。

【請求項2】

前記哺乳動物組織培養培地が、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＲＰＭＩ１６４０完全培地などの浮遊細胞培養のために配合される、請求項１に記載のエクスビボ培養モデル又は一括培養物。

【請求項3】

前記哺乳動物組織培養培地が、２～１０％のＦＢＳで補充され、任意選択で、前記哺乳動物組織培養培地が、１～２．５％の抗生物質－抗真菌剤溶液などの抗生物質で更に補充される、請求項１又は２に記載のエクスビボ培養モデル又は一括培養物。

【請求項4】

前記固形腫瘍／がんの前記新しく単離された組織試料が、２４ウェル組織培養プレート内の前記好適な哺乳動物組織培養培地中で培養される、請求項１～３のいずれか一項に記載のエクスビボ培養モデル又は一括培養物。

【請求項5】

前記新しく単離された組織試料が、サイズが縮小される前に、最初に抗生物質を含む１×ＰＢＳ緩衝液などの緩衝液中で洗浄される、請求項１～４のいずれか一項に記載のエクスビボ培養モデル又は一括培養物。

【請求項6】

固形腫瘍／がんを有する対象における前記固形腫瘍／がんを治療するために、療法の効力又は有効性を評価する方法であって、前記方法が、前記療法のための治療剤を、前記対象から単離された前記固形腫瘍／がんの、請求項１～５のいずれか一項に記載のエクスビボ培養モデル又は一括培養物と接触させることと、十分な期間後に好ましい転帰を識別することと、を含み、前記好ましい転帰が、前記対象が前記療法によって治療されるのに適していることを示し、かつ／又は前記方法が、前記好ましい転帰の観察の際に、前記療法による治療のために前記対象を選択することを更に含み、前記好ましい転帰が、
（１）化学療法剤（前記固形腫瘍／がんを治療するのに不十分な治療量以下の用量の化学療法剤など）を含む治療剤に関しては、（前記治療剤に接触しないＨｏｍ－１発現と比較して）前記エクスビボ培養モデル又は一括培養物における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１発現の上昇／増加を含み、又は、
（２）免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を含む治療剤に関しては、腫瘍／がん細胞に対する殺細胞効果；細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化；炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－８、ＩＬ－１２Ｂ及びＴＮＦ－αなど）の発現及び／若しくは分泌の上昇、並びに／又は免疫抑制性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ１３及びＴＧＦ－βなど）の発現の低下、並びに／又は組織培養物における腫瘍細胞の死を含む、方法。

【請求項7】

前記固形腫瘍／がんが、ＮＳＣＬＣなどの肺がんである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記療法が化学療法であり、任意選択で、前記治療剤が、ドキソルビシン（ＤＯＸ）などの化学療法剤を含む、請求項６又は７に記載の方法。

【請求項9】

前記療法が、免疫療法であり、任意選択で、前記治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ＩＣＩが、抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記抗体又はその抗原結合断片が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３／ＣＤ２７６、Ｂ７－Ｈ４／ＶＴＣＮ１、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ガレクチン－９、ＳＩＧＬＥＣ７／ＣＤ３２８、又はＳＩＧＬＥＣ９などの抑制性免疫チェックポイント標的に特異的である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記抗体又はその抗原結合断片が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２に特異的である、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記抗体又はその抗原結合断片が、ＰＤ－１に特異的であり、例えば１μｇ／ｍＬのペムブロリズマブである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記固形腫瘍／がんの前記エクスビボ培養モデル又は一括培養物を、前記治療剤と少なくとも１～２日間接触させる、請求項６～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記方法が、前記固形腫瘍／がんの前記エクスビボ培養モデル又は一括培養物を第２の治療剤と接触させることを更に含む、請求項６～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記第２の治療剤は、Ｈｏｍ－１発現が上昇／増加した（例えば、Ｈｏｍ－１を発現するように誘導又は修飾されている）マクロファージ又は単球を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記マクロファージ又は単球が、前記固形腫瘍／がんが単離された対象と同じ対象由来の自己マクロファージ又は単球である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記マクロファージ又は単球が、Ｈｏｍ－１をコードする異種構築物を前記マクロファージ又は単球に導入することによって、インビトロでＨｏｍ－１を発現するように誘導される、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項19】

前記Ｈｏｍ－１をコードする異種構築物が、Ｈｏｍ－１をコードするプラスミドを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記Ｈｏｍ－１をコードする異種構築物が、Ｈｏｍ－１をコードするｍＲＮＡを包含するナノ粒子を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記Ｈｏｍ－１をコードする異種構築物が、Ｈｏｍ－１をコードするウイルスベクター（ＡＡＶベクターなど）を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記十分な期間が、３７℃及び５％ＣＯ_２下で、約３～６日間、例えば、３、４、５、６、７、又は８日間培養することを含む、請求項６～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記転帰が、前記固形腫瘍／がんの前記エクスビボ培養モデル又は一括培養物から単一の細胞を単離することによって決定される、請求項６～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記好ましい転帰を決定することが、がん細胞の生存率又は死亡を評価すること；前記エクスビボ培養モデル若しくは一括培養物におけるＣＤ８^＋及び／若しくはＣＤ４^＋リンパ球の数及び／若しくは機能（任意選択でＴ_ｒｅｇの数を含む）及び／若しくはマクロファージ（ＴＡＭを含む）の数／機能、細胞表面チェックポイント阻害剤（ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４など）の発現、エフェクター分子（ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢなど）の発現、前記ＴＡＭのＭ１若しくはＭ２様表現型、免疫抑制性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ１３及びＴＧＦ－βなど）の発現、並びに／又は炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－８、ＩＬ－１２Ｂ及びＴＮＦ－αなど）の発現、を評価すること、を含む、請求項６～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記好ましい転帰を決定することが、前記エクスビボ培養モデル若しくは一括培養物からの単離された単一細胞のＦＡＣＳ分析、及び／又は前記エクスビボ培養物モデル若しくは一括培養物からの培養上清のＥＬＩＳＡ分析（例えば、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ発現のＥＬＩＳＡ分析）を含む、請求項６～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記好ましい転帰を決定することが、ＴＡＭ上のＣＤ６８及びＣＤ２０６の細胞表面発現（例えば、ＦＡＣＳを介して）、並びに／又はＨｏｍ－１発現レベル（例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を介して）を決定することを含む、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記好ましい転帰を決定することが、例えばＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋細胞のパーセンテージ変化のＦＡＣＳ分析によって、Ｔ_ｒｅｇ細胞のパーセンテージを決定することを含む、請求項６～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記好ましい転帰を決定することが、前記治療剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体などのＩＣＩ抗体）による接触時のＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化の変化又は増強を決定することを含む、請求項６～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記方法が、前記好ましい転帰を、前記療法のための対照治療剤を前記固形腫瘍／がんの前記エクスビボ培養モデル又は一括培養物と接触させることによって得られる対照転帰の転帰と比較することを含む、請求項６～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記治療剤が、抗体又はその抗原結合断片であり、前記対照治療剤が、アイソタイプが一致した対照抗体又はその抗原結合断片（ＩｇＧ１又はＩｇＧ４など）である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

固形がん／腫瘍（例えば、ＮＳＣＬＣを含む肺がん）などのがんを治療する方法であって、前記方法は、前記がんを有する対象に療法を施すことを含み、前記対象が、前記固形腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養物を使用して前記固形腫瘍／がんを治療するための前記療法の効力又は有効性を評価するための、請求項６～３０のいずれか一項に記載の方法における好ましい転帰に従って、前記療法による治療に応答することが検証されている、方法。

【請求項32】

前記療法が、ドキソルビシン（ＤＯＸ）を前記対象に投与することを含む化学療法である、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

前記療法が、ＩＣＩを前記対象に投与することを含む免疫療法である、請求項３０に記載の方法。

【請求項34】

前記ＩＣＩが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３／ＣＤ２７６、Ｂ７－Ｈ４／ＶＴＣＮ１、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ガレクチン－９、ＳＩＧＬＥＣ７／ＣＤ３２８、又はＳＩＧＬＥＣ９などの抑制性免疫チェックポイント標的に特異的な抗体又はその抗原結合断片である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記抗体又はその抗原結合断片が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２に特異的である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記抗体又はその抗原結合断片が、ＰＤ－１に特異的である、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

前記療法が、前記対象に、Ｈｏｍ－１発現が上昇／増加したマクロファージ又は単球（例えば、前記マクロファージ又は単球におけるＨｏｍ－１発現をエクスビボで増加するように修飾されている）を投与することを含む、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記マクロファージ又は単球が、前記がんを有する前記対象から単離された自己マクロファージ又は単球である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記マクロファージ又は単球が、前記がんを有する前記対象とＨＬＡが一致した健康な個体から単離された非自己マクロファージ又は単球である、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記マクロファージ又は単球が、Ｈｏｍ－１をコードするプラスミドをトランスフェクションすることによって、Ｈｏｍ－１発現を増加させるようにエクスビボで修飾される、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記マクロファージ又は単球が、Ｈｏｍ－１ ｍＲＮＡを封入するナノ粒子と接触させることによって、Ｈｏｍ－１発現を増加させるようにエクスビボで修飾される、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記マクロファージ又は単球が、Ｈｏｍ－１をコードするウイルスベクター（ＡＡＶウイルスベクターなど）による感染によって、Ｈｏｍ－１発現を増加させるようにエクスビボで修飾される、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記好ましい転帰が、前記固形腫瘍／がんの前記エクスビボ培養モデル又は一括培養物を使用して前記固形腫瘍／がんを治療するための前記療法の効力又は有効性を評価する方法において、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍以上増強されたＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化を示す、請求項３１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記治療が、最適以下又は治療量以下の用量の第１の治療剤及び第２の治療剤を含み、前記第１の治療剤が、前記がんを治療するのに有効なＩＣＩ抗体又は化学療法剤であるが、前記最適以下又は治療量以下の用量の前記ＩＣＩ抗体又は化学療法剤は、前記がんを単独で治療するのには無効であり、前記第２の治療剤が、Ｈｏｍ－１を発現するように（例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化を増強するために、前記がんにおける腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を変化させるのに十分なレベルまで）修飾又は誘導されたマクロファージ又は単球を含む、請求項３１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

対象におけるがんの免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）媒介療法又は化学療法（例えば、ＮＳＣＬＣの治療）を増強する方法であって、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を介して、がんの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進することを含む、方法。

【請求項46】

対象における免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）媒介療法又はがんの化学療法（例えば、ＮＳＣＬＣの治療）に対する耐性を打破する方法であって、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を介して、がんの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進することを含む、方法。

【請求項47】

Ｈｏｍ－１活性化が、前記ＴＡＭによるがん細胞の食作用を促進する、請求項４５又は４６に記載の方法。

【請求項48】

（１）腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を促進／誘導／増強することであって、例えば、前記ＴＡＭを、治療量以下の用量のＨｏｍ－１を活性化する化学療法剤（ドキソルビシンなど）と接触させることによるものであり、前記治療量以下の用量の前記化学療法剤が、前記がんを単独で治療するには不十分である、促進／誘導／増強することと、
（２）がん細胞を、（１）の増加したＨｏｍ－１活性又は発現を有する前記ＴＡＭと接触させて、前記がん細胞の食作用を増強することと、
（３）ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、（２）の前記ＴＡＭと接触させて、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化することと、を含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

（４）エクスビボ又はインビトロで活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増殖させることを更に含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

エクスビボ法である、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

インビボ法である、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記ＩＣＩ媒介療法が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３／ＣＤ２７６、Ｂ７－Ｈ４／ＶＴＣＮ１、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ガレクチン－９、ＳＩＧＬＥＣ７／ＣＤ３２８、又はＳＩＧＬＥＣ９などの抑制性免疫チェックポイント標的に特異的な抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む、請求項４５～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記抗体又はその抗原結合断片が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２に特異的である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記抗体又はその抗原結合断片が、ＰＤ－１に特異的である、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記ＴＡＭが、前記Ｈｏｍ－１活性化の前に、下方制御されたＨｏｍ－１の発現を有する、請求項４５～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

対象におけるがん（例えば、肺がん又は結腸直腸がん）を治療するための療法（例えば、化学療法剤、標的療法、免疫療法治療、放射線療法、又はそれらの組み合わせ）の有効用量を選択する方法であって、前記方法は、前記がんを前記療法と接触させた際に、（例えば、エクスビボ、インビボ、又はその両方での）前記がんの腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を決定することを含み、Ｈｏｍ－１活性化をもたらす前記療法の最小有効用量、又はより高い用量が、有効用量となるように選択される、方法。

【請求項57】

対象におけるがん（例えば、肺がん又は結腸直腸がん）を治療するための療法（例えば、化学療法剤、標的療法、免疫療法治療、放射線療法、又はそれらの組み合わせ）の有効用量を選択する方法であって、前記がんを前記療法と接触させて、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を介して、前記がんの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進する前記療法の最小有効用量を特定することを含む、方法。

【請求項58】

前記対象を、前記有効用量で前記療法により治療することを更に含む、請求項５６又は５７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１５日出願の米国仮特許出願第６３／２５６，３９１号の優先権及び出願日の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

肺がんは、世界中でがん関連死の主要な原因であり、生存期間の中央値は約１年であり、全５年生存率は２０％未満である。新たに診断された症例の５５％以上を占める遠隔転移患者では、５年生存率は５％まで急激に低下する。病理学的には、肺がんの約８５％が非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）であり、そのうちの約７０％が腺がん（Ｌ－ＡＤＣＡ）であり、２０％が扁平上皮がん（Ｌ－ＳＣＣＡ）である。

【0003】

補助化学療法の惨めな効果とは異なり、最近のＦＤＡ承認の免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）治療は、ＮＳＣＬＣに対して前例のない成功を示しています。それにもかかわらず、全体として、ＩＣＩに反応するＮＳＣＬＣ患者はわずか２０％である。更に、応答者の大部分は、長期の５年間のフォローアップ中に最終的に疾患が再発し、死亡する。したがって、ＮＳＣＬＣに対するＩＣＩの効力を改善するための更なる戦略を開発するためには、ＩＣＩベースの肺がん治療の改善が、部分的にはＩＣＩ耐性の機構的理解と洞察に基づいて、緊急に必要とされている。

【0004】

ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、腫瘍免疫学における重要な免疫エフェクター細胞である。ＣＤ８^＋Ｔ細胞機能は、共刺激分子及び共抑制分子によって調節され、外来抗原／腫瘍抗原に対する免疫反応と過剰な自己免疫炎症応答に対する防御との間の適切なバランスを確保する。共抑制性チェックポイント受容体と、腫瘍及び間質細胞上のそれらのリガンドとの相互作用は、腫瘍関連ＣＤ８^＋Ｔ細胞の阻害／枯渇、及びＮＳＣＬＣの免疫病態発生中の免疫破壊からの腫瘍細胞の回避を説明する。ＰＤ－１抗体及びＣＴＬＡ－４抗体などのＩＣＩは、部分的には、ＣＤ８阻害をブロックすることによって機能するため、ＣＤ８^＋ＣＴＬを再活性化する。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内での不十分な抗原提示及びＣＤ８^＋ＣＴＬの免疫抑制は、ＩＣＩ治療失敗の２つの考えられる理由として提案されている。しかしながら、免疫細胞プロファイリングに関する知識は限られており、ＴＭＥ内のＩＣＩと免疫細胞の機能的相互作用を解析するためのプラットフォームが欠如しているため、ＮＳＣＬＣに対するＩＣＩの効力を高めるためにＴＭＥを標的とすることは依然として理論的根拠のままであり、生化学的データのサポートと臨床試験の承認を待っている。

【発明の概要】

【0005】

腫瘍抗原認識及びＣＴＬ活性化は、がん免疫療法の最前線にある。ＩＣＩによるＣＤ８^＋ＣＴＬの全身刺激は、がん免疫療法において前例のない成功をもたらしたが、がん（ＮＳＣＬＣなど）に対するＩＣＩの効力は依然として限定的であり、ＩＣＩ誘発性ｉｒＡＥは重篤となる可能性がある。ＴＭＥの免疫抑制は、ＩＣＩ耐性の中心的プレーヤーとして認識されているが、ＴＭＥを標的とする取り組みは、１つにはＴＭＥの組成及び制御メカニズムの理解が限られているために、ＮＳＣＬＣ及び他の固形腫瘍の治療においてインパクトのある結果を生み出していない。

【0006】

したがって、本発明の一態様は、固形腫瘍／がん（ＮＳＣＬＣを含む肺がんなど）の治療に対する治療方法の効力を試験するための腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養物であって、好適な哺乳動物組織培養培地中で培養された固形腫瘍／がんの新しく単離された組織試料を含み、新しく単離された組織試料のサイズが、最大寸法で約１～１０ｍｍ（例えば、２～８ｍｍ、３～６ｍｍ、約５ｍｍ）に縮小される、エクスビボ培養モデル又は一括培養を提供する。

【0007】

本発明の別の態様は、固形腫瘍／がんを有する対象における当該固形腫瘍／がんを治療するための療法の効力又は有効性を評価する方法を提供し、本方法は、療法のための治療剤を、当該対象から単離された当該固形腫瘍／がんの、対象となるエクスビボ培養モデル又は一括培養物と接触させることと、十分な期間後に好ましい転帰を識別することと、を含み、好ましい転帰が、当該対象が当該療法によって治療されるのに適していることを示し、かつ／又は本方法が、好ましい転帰の観察の際に、当該療法による治療のために当該対象を選択することを更に含み、好ましい転帰は、（１）化学療法剤（当該固形腫瘍／がんを治療するのに不十分な治療量以下の用量の化学療法剤など）を含む治療剤に関しては、（治療剤に接触しないＨｏｍ－１発現と比較して）当該エクスビボ培養モデル又は一括培養物における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１発現の上昇／増加を含み、又は（２）免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を含む治療剤に関しては、腫瘍／がん細胞に対する殺細胞効果；細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化；炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－８、ＩＬ－１２Ｂ及びＴＮＦ－αなど）発現及び／若しくは分泌の上昇、並びに／又は免疫抑制性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ１３及びＴＧＦ－βなど）の発現の低下、並びに／又は組織培養における腫瘍細胞の死を含む。

【0008】

本発明の別の態様は、固形がん／腫瘍（例えば、ＮＳＣＬＣを含む肺がん）などのがんを治療する方法を提供し、本方法は、当該がんを有する対象に療法を施すことを含み、対象が、当該固形腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養物を使用して当該固形腫瘍／がんを治療するための療法の効力又は有効性を評価する対象方法のいずれか１つの好ましい転帰に従って、当該療法による治療に応答することが検証されている。

【0009】

本発明の別の態様は、対象におけるがんの免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）媒介療法（例えば、ＮＳＣＬＣの治療）を増強する方法を提供し、本方法は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を介して、がんの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進することを含む。

【0010】

本発明の別の態様は、対象におけるがんの免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）媒介療法（例えば、ＮＳＣＬＣの治療）に対する耐性を打破する方法を提供し、本方法は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を介して、がんの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進することを含む。

【0011】

本発明の別の態様は、対象におけるがんの化学療法剤療法（例えば、結腸直腸がんの治療）の効力を増強する方法を提供し、本方法は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を介して、がんの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進することを含む。

【0012】

本発明の別の態様は、対象におけるがんの化学療法耐性（例えば、結腸直腸がんの治療）に対する耐性を打破する方法を提供し、本方法は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を介して、がんの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進することを含む。

【0013】

本発明の別の態様は、対象のがん（例えば、肺がん又は大腸がん）を治療するための療法（例えば、化学療法剤、標的療法、免疫療法治療、放射線療法、又はそれらの組み合わせ）の有効用量を選択する方法を提供し、この方法は、がんを当該療法と接触させた際に、当該がんの腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を（例えば、エクスビボ、インビボ、又はその両方で）決定することを含み、Ｈｏｍ－１活性化をもたらす当該療法の最小有効用量、又はより高い用量が、有効用量となるように選択される。

【0014】

本発明の別の態様は、対象のがん（例えば、肺がん又は大腸がん）を治療するための療法（例えば、化学療法剤、標的療法、免疫療法治療、放射線療法、又はそれらの組み合わせ）の有効用量を選択する方法を提供し、この方法は、がんを当該療法と接触させて、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を介して、当該がんの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進する当該療法の最小有効用量を特定することを含む。

【0015】

実施例又は特許請求の範囲にのみ記載される実施形態を含む、本明細書に記載される任意の実施形態は、明示的に否認されるか、又は不適切でない限り、本発明の任意の他の１つ以上の実施形態と組み合わせることができる。

【発明を実施するための形態】

【0016】

１．概要
本明細書に記載の本発明は、部分的に、ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥの分子及び細胞組成の特徴付け、並びにＮＳＣＬＣ－ＴＭＥ内のＩＣＩ及び免疫細胞の機能的相互作用の分析に基づいている。

【0017】

本明細書に提示されるデータは、ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥが、枯渇した表現型を呈示する豊富なＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むことを示した。ＰＤ－１抗体の適用は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化するが、ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥの免疫状況に限定的な効果を及ぼす。更に、マクロファージ可塑性及び免疫極性のマスターレギュレーターとしてのホメオボックス遺伝子Ｈｏｍ－１の発現は、ＮＳＣＬＣの腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）において著しく下方制御される。

【0018】

本明細書で使用される場合、（用語が優先出願ＵＳＳＮ６３／２５６，３９１で使用されるように）「Ｈｏｍ－１」は、「ＶｅｎｔＸ」と互換的に使用される。

【0019】

一方、ＮＳＣＬＣ－ＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現の回復は、ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥの免疫状況を免疫抑制から活性化に変換し、Ｈｏｍ－１調節ＴＡＭは、ＮＳＣＬＣに対するＰＤ－１抗体の殺腫瘍効果を４～５倍促進し、ＴＡＭ／マクロファージ／単球におけるＨｏｍ－１発現を活性化することができる化学療法剤（ＮＦ－κＢ媒介Ｈｏｍ－１発現を上方制御することができる化学療法剤、例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ）など）の殺腫瘍効果を約１０倍促進するが、全て正常組織に対する細胞傷害性効果をもたらすことはない。ある特定の実施形態では、化学療法剤は、細胞傷害性に必要な濃度よりも低い、例えば、はるかに低い濃度で、例えば、それ自体ではその細胞傷害性を介してがんを治療するのに十分ではない治療量以下の用量で、Ｈｏｍ－１発現を活性化することができる。このように、免疫療法及び化学療法は、その治療目的を達成するために、非細胞傷害性又は最適以下又は治療量以下の用量で適用することができる。

【0020】

更に、Ｈｏｍ－１調節ＴＡＭは、個々の原発性ＮＳＣＬＣの前臨床ＮＳＧ－ＰＤＸモデルにおいて、ＮＳＣＬＣ腫瘍形成に対するＰＤ－１抗体の効力を促進することができた。

【0021】

したがって、本明細書に記載の本発明は、対象におけるがんの免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）媒介療法又は化学療法（例えば、ＮＳＣＬＣの治療）を増強する方法を提供し、本方法は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を介して、がんの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進することを含む。

【0022】

関連する態様では、本明細書に記載の本発明は、対象におけるがんの免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）媒介療法（例えば、ＮＳＣＬＣの治療）に対する耐性を打破する方法を提供し、本方法は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を介して、がんの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進することを含む。

【0023】

ある特定の実施形態では、Ｈｏｍ－１活性化は、当該ＴＡＭによってがん細胞の食作用を促進する。

【0024】

ある特定の実施形態では、方法は、（１）腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）のＨｏｍ－１活性化又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を促進／誘導／増強することであって、例えば、当該ＴＡＭを、治療量以下の用量のＨｏｍ－１の発現を誘導する化学療法剤（ドキソルビシンなど）と接触させることによるものであり、当該治療量以下の用量の化学療法剤が、それ自体では当該がんを単独で治療するには不十分である、促進／誘導／増強することと、（２）がん細胞を、（１）の増加したＨｏｍ－１活性又は発現を有する当該ＴＡＭと接触させて、当該がん細胞の食作用を増強することと、（３）ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、（２）の当該ＴＡＭと接触させて、当該ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化することと、を含む。

【0025】

ある特定の実施形態では、本方法は、（４）エクスビボ又はインビトロで活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増殖させることを更に含む。

【0026】

ある特定の実施形態では、本方法は、エクスビボ法である。例えば、ＴＡＭ／単球／マクロファージは、患者の腫瘍／がん試料から単離でき、任意選択で、標準培養条件下、インビトロで増殖／培養することができる。次いで、このようなＴＡＭ単球／マクロファージは、修飾／活性化するか、又は誘導して、Ｈｏｍ－１を発現させることができる。次いで、Ｈｏｍ－１発現が増加したＴＡＭ単球／マクロファージをがん細胞と接触させて、がん細胞の食作用を可能にすることができる。続いて、そのようなＴＡＭ単球／マクロファージを、がんを有する同じ患者から単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞などのＣＤ８^＋Ｔ細胞、又はＴＩＬと接触させて、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化させることができる。このように活性化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が単離されている患者に再投与される前に、標準的な組織培養条件下、任意選択で増殖され得る。

【0027】

他の実施形態では、本方法は、インビボ法である。例えば、ＴＡＭ単球／マクロファージが、例えば、ＮＦ－κＢシグナル伝達の刺激を通じて、Ｈｏｍ－１発現を上昇させるそのような減量用量の化学療法剤に曝露されるように、治療を必要とする患者に減量用量（例えば、それ自体ではがんを治療するか、又は殺腫瘍効果を引き起こすのに不十分である、治療量以下の有効な用量）を、投与してもよい。

【0028】

ある特定の実施形態では、当該ＩＣＩ媒介療法は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３／ＣＤ２７６、Ｂ７－Ｈ４／ＶＴＣＮ１、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ガレクチン－９、ＳＩＧＬＥＣ７／ＣＤ３２８、又はＳＩＧＬＥＣ９などの抑制性免疫チェックポイント標的に特異的な抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む。

【0029】

ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２に特異的である。ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ－１に特異的である。

【0030】

ある特定の実施形態では、ＴＡＭは、当該Ｈｏｍ－１活性化の前に、Ｈｏｍ－１の下方制御された発現（例えば、ＴＭＥにおける）を有する。

【0031】

ある特定の実施形態では、がんは、ＮＳＣＬＣなどの肺がんである。

【0032】

本発明の別の態様は、好適な哺乳動物組織培養培地中で培養された固形腫瘍／がんの新しく単離された（任意選択で凍結されている）組織試料を含む、腫瘍／がんの治療方法の効力を試験するための、ＮＳＣＬＣなどの固形腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養を提供し、新しく単離された組織試料は、サイズが最大寸法で約１～１０ｍｍ（例えば、２～８ｍｍ、３～６ｍｍ、約５ｍｍ）に縮小される。

【0033】

ある特定の実施形態では、哺乳動物組織培養培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＲＰＭＩ１６４０完全培地など浮遊細胞培養のために配合される。

【0034】

ある特定の実施形態では、哺乳動物組織培養培地は、２～１０％のＦＢＳで補充され、任意選択で、哺乳動物組織培養培地は、１～２．５％の抗生物質－抗真菌溶液などの抗生物質で更に補充される。

【0035】

ある特定の実施形態では、固形腫瘍／がんの新しく単離された組織試料は、２４ウェルの組織培養プレート内の好適な哺乳動物組織培養培地中で培養される。

【0036】

ある特定の実施形態では、新しく単離された組織試料は、サイズを縮小する前に、最初に、抗生物質を用いた１×ＰＢＳ緩衝液などの緩衝液中で洗浄される。

【0037】

本発明の別の態様は、固形腫瘍／がんを有する対象における当該固形腫瘍／がんを治療するための療法の効力又は有効性を評価する方法を提供し、本方法は、療法のための治療剤（又は薬剤の組み合わせ）を、当該対象から単離された当該固形腫瘍／がんの、対象となるエクスビボ培養モデル又は一括培養物と接触させることと、十分な期間後に好ましい転帰を識別することと、を含み、好ましい転帰が、当該対象が当該療法によって治療されるのに適していることを示し、かつ／又は本方法が、好ましい転帰の観察の際に、当該療法による治療のために当該対象を選択することを更に含み、好ましい転帰は、（１）化学療法剤（当該固形腫瘍／がんを治療するのに不十分な治療量以下の用量の化学療法剤など）を含む治療剤に関しては、（治療剤に接触しないＨｏｍ－１発現と比較して）当該エクスビボ培養モデル又は一括培養物における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１発現の上昇／増加を含み、又は（２）免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を含む治療剤に関しては、腫瘍／がん細胞に対する殺細胞効果；細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化；及び／若しくは炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－８、ＩＬ－１２Ｂ及びＴＮＦ－αなど）の発現及び／若しくは分泌の上昇、並びに／又は免疫抑制性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ１３及びＴＧＦ－βなど）の発現の低下を含む。

【0038】

本発明の方法は、化学療法剤又はＩＣＩ媒介療法に限定されないことに留意されたい。放射線療法、Ｃａｒ－Ｔベースの免疫療法などの治療的介入も、そのような療法が、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化をもたらし得る限り、本発明の方法から利益を得ることができる。

【0039】

したがって、ある特定の実施形態では、好ましい転帰は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を含む。

【0040】

ある特定の実施形態では、固形腫瘍／がんは、ＮＳＣＬＣなどの肺がんである。

【0041】

ある特定の実施形態では、治療は化学療法であり、任意選択で、治療剤は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）などの化学療法剤を含む。

【0042】

ある特定の実施形態では、治療は免疫療法であり、任意選択で、治療剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を含む。

【0043】

他の実施形態では、免疫療法は、抗原ベースのアプローチ、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた療法、又は腫瘍抗原刺激を含む療法を含む。

【0044】

ある特定の実施形態では、ＩＣＩは、抗体又はその抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３／ＣＤ２７６、Ｂ７－Ｈ４／ＶＴＣＮ１、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ガレクチン－９、ＳＩＧＬＥＣ７／ＣＤ３２８、又はＳＩＧＬＥＣ９などの抑制性免疫チェックポイント標的に特異的である。

【0045】

ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２に特異的である。ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ－１に特異的であり、例えば１μｇ／ｍＬのペムブロリズマブである。

【0046】

ある特定の実施形態では、当該固形腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養物を、当該治療剤と少なくとも１～２日間接触させる。

【0047】

ある特定の実施形態では、本方法は、固形腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養物を第２の治療剤と接触させることを更に含む。

【0048】

ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、Ｈｏｍ－１発現が上昇／増加した（例えば、Ｈｏｍ－１を発現するように誘導又は修飾されている）マクロファージ又は単球を含む。

【0049】

ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、免疫治療剤、化学療法剤、標的療法剤、放射線法／薬剤を含む。

【0050】

ある特定の実施形態では、マクロファージ又は単球は、固形腫瘍／がんが単離された対象と同じ対象由来の自己マクロファージ又は単球である。

【0051】

ある特定の実施形態では、マクロファージ又は単球は、Ｈｏｍ－１の上昇したレベルを発現するように修飾される。

【0052】

ある特定の実施形態では、マクロファージ又は単球は、Ｈｏｍ－１を発現するように誘導される。

【0053】

ある特定の実施形態では、マクロファージ又は単球は、Ｈｏｍ－１をコードする異種構築物をマクロファージ又は単球に導入することによって、Ｈｏｍ－１を発現するように修飾される。

【0054】

ある特定の実施形態では、Ｈｏｍ－１をコードする異種構築物は、Ｈｏｍ－１をコードするプラスミドを含む。

【0055】

ある特定の実施形態では、Ｈｏｍ－１をコードする異種構築物は、Ｈｏｍ－１をコードするｍＲＮＡを包含するナノ粒子を含む。

【0056】

ある特定の実施形態では、Ｈｏｍ－１をコードする異種構築物は、Ｈｏｍ－１をコードするウイルスベクター（ＡＡＶベクターなど）を含む。

【0057】

ある特定の実施形態では、方法は、マクロファージ又は単球に異種Ｈｏｍ－１タンパク質を導入することを含む。

【0058】

ある特定の実施形態では、十分な期間は、３７℃及び５％ＣＯ_２下で、約３～６日間、例えば、３、４、５、６、７、又は８日間培養することを含む。

【0059】

ある特定の実施形態では、転帰は、当該固形腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養物から単一の細胞を単離することによって決定される。

【0060】

特定の実施形態では、好ましい転帰を決定することは、がん細胞の生存率又は死亡を評価すること；エクスビボ培養モデル若しくは一括培養物におけるＣＤ８^＋及び／若しくはＣＤ４^＋リンパ球の数及び／若しくは機能（任意選択でＴ_ｒｅｇの数を含む）及び／若しくはマクロファージ（ＴＡＭを含む）の数／機能、細胞表面チェックポイント抑制剤（ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４など）の発現、エフェクター分子（ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢなど）の発現、ＴＡＭのＭ１又はＭ２様表現型、免疫抑制性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ１３及びＴＧＦ－βなど）の発現、並びに／又は炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－８、ＩＬ－１２Ｂ及びＴＮＦ－αなど）の発現を評価することを含む。

【0061】

ある特定の実施形態では、好ましい転帰を決定することは、エクスビボ培養モデル若しくは一括培養物からの単離された単一細胞のＦＡＣＳ分析、及び／又はエクスビボ培養モデル若しくは一括培養物からの培養上清のＥＬＩＳＡ分析（例えば、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ発現のＥＬＩＳＡ分析）を含む。

【0062】

ある特定の実施形態では、好ましい転帰を決定することは、ＴＡＭ上のＣＤ６８及びＣＤ２０６の細胞表面発現（例えば、ＦＡＣＳを介して）、及び／又はＨｏｍ－１発現レベル（例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を介して）を決定することを含む。

【0063】

ある特定の実施形態では、好ましい転帰を決定することは、Ｔ_ｒｅｇ細胞のパーセンテージを、例えば、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋細胞のパーセンテージ変化のＦＡＣＳ分析によって、決定することを含む。

【0064】

ある特定の実施形態では、好ましい転帰を決定することは、治療剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体などのＩＣＩ抗体）による接触時のＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化の変化又は増強を決定することを含む。

【0065】

ある特定の実施形態では、好ましい転帰を決定することは、生存若しくは残存するがん細胞のパーセンテージ、及び／又はがん細胞の生存率を決定することを含む。

【0066】

ある特定の実施形態では、好ましい転帰を決定することは、生存若しくは残存するがん細胞のパーセンテージ、及び／又はがん細胞の生存率を決定することを含む。例えば、これには、腫瘍において発現レベルが上昇しているマーカーの免疫組織化学分析を含むことができる。

【0067】

ある特定の実施形態では、本方法は、好ましい転帰を、治療のための対照治療剤を当該固形腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養物と接触させることによって得られる対照転帰の転帰と比較することを含む。

【0068】

ある特定の実施形態では、治療剤は、抗体又はその抗原結合断片であり、対照治療剤は、アイソタイプが一致した対照抗体又はその抗原結合断片（ＩｇＧ１又はＩｇＧ４など）である。

【0069】

本発明の別の態様は、固形がん／腫瘍（例えば、ＮＳＣＬＣを含む肺がん）などのがんを治療する方法を提供し、本方法は、当該がんを有する対象に療法を施すことを含み、対象は、当該固形腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養物を使用して、当該固形腫瘍／がんを治療するための療法の効力又は有効性を評価する方法における好ましい転帰に従って、当該療法による治療に応答することが検証されている。

【0070】

ある特定の実施形態では、療法は、化学療法剤を単独で又は併用して当該対象に投与することを含む化学療法である。

【0071】

ある特定の実施形態では、療法は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）を当該対象に投与することを含む化学療法である。

【0072】

ある特定の実施形態では、療法は、当該対象にＩＣＩを投与することを含む免疫療法である。

【0073】

ある特定の実施形態では、ＩＣＩは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３／ＣＤ２７６、Ｂ７－Ｈ４／ＶＴＣＮ１、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ガレクチン－９、ＳＩＧＬＥＣ７／ＣＤ３２８、又はＳＩＧＬＥＣ９などの抑制性免疫チェックポイント標的に特異的な抗体又はその抗原結合断片である。

【0074】

ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２に特異的である。ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ－１に特異的である。

【0075】

ある特定の実施形態では、本療法は、対象に、Ｈｏｍ－１発現が上昇又は増加したマクロファージ又は単球（例えば、当該マクロファージ又は単球におけるＨｏｍ－１発現を増加させるようにエクスビボで修飾されている）を投与することを含む。

【0076】

ある特定の実施形態では、マクロファージ又は単球は、当該がんを有する対象から単離された自己マクロファージ又は単球である。

【0077】

ある特定の実施形態では、マクロファージ又は単球は、当該がんを有する当該対象とＨＬＡが一致する健康な個体から単離された非自己マクロファージ又は単球である。

【0078】

ある特定の実施形態では、マクロファージ又は単球は、Ｈｏｍ－１発現を増加させるようにエクスビボで修飾される（例えば、細胞透過性リーダー配列を有するＨｏｍ－１ポリペプチドで誘導又は処理される）。

【0079】

ある特定の実施形態では、マクロファージ又は単球は、Ｈｏｍ－１をコードするプラスミドをトランスフェクションすることによって、Ｈｏｍ－１発現を増加させるようにエクスビボで修飾される。

【0080】

ある特定の実施形態では、マクロファージ又は単球は、Ｈｏｍ－１ ｍＲＮＡを封入するナノ粒子と接触することによって、Ｈｏｍ－１発現を増加させるようにエクスビボで修飾される。

【0081】

ある特定の実施形態では、マクロファージ又は単球は、Ｈｏｍ－１をコードするウイルスベクター（ＡＡＶウイルスベクターなど）による感染によって、Ｈｏｍ－１発現を増加させるようにエクスビボで修飾される。

【0082】

ある特定の実施形態では、好ましい転帰は、当該固形腫瘍／がんのエクスビボ培養モデル又は一括培養を使用して、当該固形腫瘍／がんを治療するための療法の効力又は有効性を評価する方法において、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍以上増強されたＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化を示す。

【0083】

ある特定の実施形態では、治療は、最適以下又は治療量以下の用量の第１の治療剤及び第２の治療剤を含み、当該第１の治療剤は、当該がんを治療するのに有効なＩＣＩ抗体又は化学療法薬であるが、当該ＩＣＩ抗体又は化学療法薬の当該最適以下又は治療量以下の用量は、当該がんを単独で治療するのには無効であり、当該第２の治療剤は、Ｈｏｍ－１を発現するように修飾又は誘導されたマクロファージ又は単球を含む。例えば、Ｈｏｍ－１発現は、がん特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化を増強するために、当該がんにおける腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を変化させるのに十分なレベルまで増加又は誘導され得る。

【0084】

ある特定の実施形態では、ＩＣＩ抗体の最適以下又は治療量以下の用量は、治療有効用量よりも約２～８倍（例えば、３～５倍、又は４～５倍）低い。

【0085】

ある特定の実施形態では、化学療法薬の最適以下又は治療量以下の用量は、治療有効用量よりも約２～１５倍（例えば、５～１２倍、又は約９倍若しくは１０倍）低い。

【0086】

本発明の別の態様は、対象のがん（例えば、肺がん又は大腸がん）を治療するための療法（例えば、化学療法剤、標的療法、免疫療法治療、放射線療法、又はそれらの組み合わせ）の有効用量を選択する方法を提供し、この方法は、がんを当該療法と接触させた際に、当該がんの腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を（例えば、エクスビボ、インビボ、又はその両方で）決定することを含み、Ｈｏｍ－１活性化をもたらす当該療法の最小有効用量、又はより高い用量が、有効用量となるように選択される。

【0087】

本発明の別の態様は、対象のがん（例えば、肺がん又は大腸がん）を治療するための療法（例えば、化学療法剤、標的療法、免疫療法治療、放射線療法、又はそれらの組み合わせ）の有効用量を選択する方法を提供し、この方法は、がんを当該療法と接触させて、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）におけるＨｏｍ－１活性化、又はＴＡＭのＨｏｍ－１媒介活性化を介して、当該がんの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進する当該療法の最小有効用量を特定することを含む。

【0088】

ある特定の実施形態では、本方法は、対象を有効用量の療法で治療することを更に含む。

【0089】

ある特定の実施形態では、本方法は、本発明のエクスビボ培養モデル又は一括培養物を使用して実行される。

【0090】

上に記載された本発明の一般原理により、以下の実施例は、本発明の範囲内の実用的な実施形態を提供し、いかなるの点においても限定的なものではない。

【実施例】

【0091】

実施例１ ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥの特徴付け－ＮＳＣＬＣ－ＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現の減少
ＩＣＩは、部分的に、ＣＤ８枯渇を救済することによって、その機能を発揮する。一方、ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥ内の免疫抑制はＩＣＩ耐性に関与している。

【0092】

ＮＳＣＬＥ－ＴＭＥにおける免疫細胞の豊富さ及び多様性にもかかわらず、未知のメカニズムを介して、腫瘍は、それらの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を介して免疫細胞に免疫抑制を及ぼすことができる。

【0093】

新しく単離された組織を使用して、同じ患者からの対合ＮＳＣＬＣと対照非関与肺組織（ｎＬｕｎｇ）の免疫細胞プロファイルを比較した。免疫的に「冷たい」ＰＤＡ及びＣＲＣにおける出願人の以前の所見とは異なり、肺Ｌ－ＡＤＣＡ及びＬ－ＳＣＣＡにおけるＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋リンパ球数の有意な減少は観察されなかった（データ図示せず）。それにもかかわらず、ＮＳＣＬＣ ＣＤ８^＋Ｔ細胞は免疫枯渇表現型を示し、細胞表面チェックポイント阻害剤ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４の発現が上昇し、刺激時にＩＦＮ－γ及びグランザイムＢなどのエフェクター分子の発現が減少した（データ図示せず）。

【0094】

一方、ＮＳＣＬＣは、対照ｎＬｕｎｇ組織と比較して、Ｔ_ｒｅｇの増加した数が含まれていた（データ図示せず）。

【0095】

ＴＡＭは、ＴＭＥにおける先天性免疫と適応性免疫の両方の重要な執行者である。免疫的に「冷たい」腫瘍のＴＡＭ可塑性は、Ｈｏｍ－１（「ＶｅｎｔＸ」としても知られる）によって制御されることが示される。組織の手がかりがマクロファージ生物学に大きな影響を与えるため、ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥの顕著な組織微小環境と、ＮＳＣＬＣの病因における慢性炎症の影響は、ＮＳＣＬＣ－ＴＡＭの分布と表現型の更なる特徴づけにつながった。

【0096】

対照ｎＬｕｎｇと比較して、Ｌ－ＡＤＣＡ及びＬ－ＳＣＣＡの両方で有意に増加した数のマクロファージを含有することが見出された（データ図示せず）。更に、ＮＳＣＬＣ－ＴＡＭは、Ｍ２マーカー並びにＩＣＩリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の発現が増加する、特徴的な免疫抑制性Ｍ２様表現型（データ図示せず）を示す。ＮＳＣＬＣ－ＴＡＭはまた、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ１３及びＴＧＦ－βなどの免疫抑制性サイトカインの発現の上昇を呈示したが、炎症性サイトカイン、ＩＬ－１β、ＩＬ－８、ＩＬ－１２Ｂ及びＴＮＦ－αのレベルは減少した（データ図示せず）。

【0097】

Ｈｏｍ－１がＮＳＣＬＣ－ＴＡＭの中心的な調節因子であるという考えと一致して、この実施例は、ＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現が、研究における全てのＮＳＣＬＣの試験症例において有意に減少したことを示した（データ図示せず）。

【0098】

実施例２ ＰＤ－１抗体は、ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥ中の細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞を活性化する
この実施例は、ＴＭＥにおけるＩＣＩ機能に対処するためのインビトロプラットフォームを提供する。このプラットフォームは、例えば、前臨床動物モデル及び初期段階の臨床試験の前に、ＩＣＩコンジュゲート併用療法の効力を評価及び査定するために使用することができ、したがって、前臨床動物モデル及び初期段階の臨床試験の前に、より速く、より効率的で、かつ費用対効果の高い手段を提供する。

【0099】

単に例示するために、この実施例は、ＮＳＣＬＣの一括培養物が、ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥの状況下で、ＰＤ－１抗体（及び任意の他の免疫チェックポイント阻害剤又は「ＩＣＩ」）の機能を査定するために使用され得ることを示す。

【0100】

簡単に説明すると、新しく単離されたＮＳＣＬＣ又はｎＬｕｎｇ組織の小片をＲＰＭＩベースの培地中でインキュベートし、指定された時間ＰＤ－１抗体処理に供した（データ図示せず）。次いで、腫瘍浸潤Ｔ（ＴＩＬ）細胞及びＴＡＭを単離し、それらの機能状態をＦＡＣＳ分析によって決定した。

【0101】

具体的には、一括ＮＳＣＬＣ又はｎＬｕｎｇ組織を２４ウェルプレートで培養し、１μｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ、又は対照としてヒトＩｇＧ４を２４時間又は４８時間処理した。次いで、単一細胞懸濁液を生成し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ８抗体で染色した。次に、細胞を固定し、透過処理し、ＰＥコンジュゲート抗ＩＬ２又は抗ＩＦＮγ抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。

【0102】

ＰＤ－１抗体による炎症性サイトカイン分泌の投与量依存的な刺激を評価するために、上述の一括ＮＳＣＬＣ及びｎＬｕｎｇ組織培養物を、様々な試験濃度でペムブロリズマブ又はヒトＩｇＧ４対照で処理した。培養培地を４８時間後に収集した。ＩＬ－２及びＩＦＮ－γのレベルを、ＥＬＩＳＡキットを使用して定量化し、統計的有意性を、二元配置分散分析によって決定した。

【0103】

ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥにおけるＴＡＭに対するＰＤ－１抗体の効果を評価するために、一括ＮＳＣＬＣ又はｎＬｕｎｇ組織を１μｇ／ｍＬのペムブロリズマブ又はヒトＩｇＧ４で処理し、４８時間後に上記のように単一細胞懸濁液を得た。ＴＡＭに対する処理の効果は、ＣＤ６８及びＣＤ２０６の細胞表面発現のＦＡＣＳ分析、並びにＨｏｍ－１発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって決定した。

【0104】

ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥにおけるＴ_ｒｅｇに対するＰＤ－１抗体の効果を評価するために、上記のペムブロリズマブ又はヒトＩｇＧ４処理後の一括培養物におけるＴ_ｒｅｇ細胞のパーセンテージを、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋細胞のパーセンテージ変化のＦＡＣＳ分析によって決定した。

【0105】

ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ発現及び分泌の上昇によって明らかになったように、ＰＤ－１抗体処理がＴＭＥ中のＣＤ８Ｔ細胞を活性化することが見出された（データ図示せず）。ＣＤ８活性化におけるＰＤ－１抗体の生理学的役割と一致して、ＣＤ８Ｔ細胞活性化に対するＰＤ－１抗体の効果が用量依存性であることも見出された（データ図示せず）。しかしながら、他のインビトロアッセイとは異なり、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＤ－１抗体活性化におけるＴＭＥの機能は、ＰＤ－１抗体の適用が、追加の抗原及びサイトカイン刺激を必要とせずに、ＴＭＥにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を直接もたらしたという知見によって示された。

【0106】

このデータは、本発明の一括ＮＳＣＬＣ培養物が、ＴＭＥの生理学的状況下でのＩＣＩの機能評価のための優れた機会を提供することを実証した。

【0107】

アッセイプラットフォームの特異性は、一括ＮＳＣＬＣ培養物へのＰＤ－１抗体の適用がＴ_ｒｅｇ細胞及びＴＡＭの顕著な表現型変化を引き起こさず、ＴＡＭにおけるＨｏｍ－１の発現を変化させない（データ図示せず）という知見によって更に示された。

【0108】

実施例３ Ｈｏｍ－１制御ＴＡＭは、ＣＤ８Ｔ細胞のＰＤ－１抗体再活性化を促進する。
この実施例は、Ｈｏｍ－１がＴＡＭの可塑性を調節し、それがＴＩＬの分化を指示することによって、ＴＭＥの免疫状況を再プログラムすることを実証する。

【0109】

ＮＳＣＬＣには、豊富な免疫細胞と炎症性サイトカインを有する独特のＴＭＥが含まれている。ＴＡＭ分化は環境的なきっかけによって調節され、単球分化に対するＨｏｍ－１効果は細胞外シグナル伝達によって調節されるため、ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥの独特の特性により、ＮＳＣＬＣ－ＴＡＭ表現型に対するＨｏｍ－１の役割の検討が行われた。

【0110】

具体的には、一括ＮＳＣＬＣ組織を、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１又はＧＦＰ対照でトランスフェクトされた自己ＴＡＭで最大５日間インキュベートした。次いで、単一細胞懸濁液を機械的破壊によって生成し、腫瘍内因性ＴＡＭを分析し、Ｍ１及びＭ２様ＴＡＭのパーセンテージを、それぞれＣＤ８０及びＣＤ２０６のＦＡＣＳ分析によって決定した。Ｔ_ｒｅｇ分化に対するインキュベーションの効果は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞のパーセンテージのＦＡＣＳ分析によって決定した。一括ＮＳＣＬＣ組織を、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１又はＧＦＰ対照でトランスフェクトした自己ＴＡＭ、及び１μｇ／ｍＬのペムブロリズマブとともに５日間インキュベートした。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化を、ＡＰＣコンジュゲート抗ＩＦＮγ又はＰＥコンジュゲート抗グランザイムＢ抗体を使用して、ＦＡＣＳによって分析した。

【0111】

この目的のために、ＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現の回復が、ＮＳＣＬＣ－ＴＡＭのプロ腫瘍（ｐｒｏ－ｔｕｍｏｒ）Ｍ２様表現型から抗腫瘍Ｍ１様表現型への分極を促進することが見出された（データ図示せず）。

【0112】

Ｈｏｍ－１制御ＴＡＭ（Ｈｏｍ－１－ＴＡＭ）は、ＮＳＣＬＣ－ＴＡＭ及びＣＤ４Ｔ細胞の分化を調節することによって、免疫状況を抑制から活性化に再プログラムすることが更に見出された（データ図示せず）。

【0113】

Ｍ２－ＴＡＭ及びＴ_ｒｅｇが、ＴＭＥにおけるＣＤ８の枯渇に関与していることから、ＣＤ８Ｔ細胞のＰＤ－１抗体の再活性化を増強するためのＨｏｍ－１－ＴＡＭの能力が調査された。一括ＮＳＣＬＣ培養物へのＨｏｍ－１－ＴＡＭの適用が、ＰＤ－１抗体誘導性ＣＤ８Ｔ細胞活性化の３～４倍増幅をもたらしたことが見出された。

【0114】

実施例４ Ｈｏｍ－１制御ＴＡＭは、ＣＤ８＋ＣＴＬの腫瘍特異的活性化を介して、ＮＳＣＬＣに対するＰＤ－１抗体の効力を促進する。
臨床的には、ＰＤ－１抗体治療は、ＮＳＣＬＣ患者の約２０％で全奏功を有している。ＰＤ－１抗体が一括ＮＳＣＬＣ培養物中でＣＤ８Ｔ細胞を活性化するという今回の知見は、一括ＮＳＣＬＣが、エクスビボでＮＳＣＬＣに対するＰＤ－１抗体の効力を査定するために使用できるという調査及びその後の実証を促した。

【0115】

簡単に説明すると、ＰＤ－１抗体を一括ＮＳＣＬＣ及びｎｌｕｎｇ組織培養物に５日間適用し、ＮＳＣＬＣがん及び正常な肺上皮細胞の生存率を、ＰＩ染色及びＦＡＣＳ分析によって決定した。

【0116】

具体的には、一括ＮＳＣＬＳ又は対照ｎＬｕｎｇ組織を、１μｇ／ｍＬのペムブロリズマブ又は対照ヒトＩｇＧ４抗体で処理し、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１又は対照ＧＦＰでトランスフェクトした自己ＴＡＭと５日間共培養した。次いで、機械的破壊によって単一細胞懸濁液を得た。腫瘍細胞を固定し、透過処理し、ＣＫ７抗体で染色し、非腫瘍上皮細胞をＥＰ４抗体で染色した。細胞をＰＩで標識し、ＰＩ陽性細胞の割合をＦＡＣＳ分析によって決定した。

【0117】

臨床転帰と一致して、エクスビボ一括ＮＳＣＬＣ培養物への抗ＰＤ－１抗体の適用は、腫瘍細胞のＰＩ染色の若干の増加をもたらしたが、ｎｌｕｎｇ組織の正常上皮細胞のＰＩ染色ではもたらさなかったことが見出された（データ図示せず）。

【0118】

ＴＭＥはＩＣＩ耐性に関与しているため、次に、ＮＳＣＬＣ－ＴＭＥにおける免疫抑制の反転が、ＰＤ－１抗体の効力を増加させることが示された。具体的には、一括ＮＳＣＬＣ又は対照ｎＬｕｎｇ組織をＰＤ－１又は対照抗体で処理し、Ｈｏｍ－１又は対照ＧＦＰでトランスフェクトされた自己ＴＡＭと共培養した。共培養の効果を、がん又は正常上皮細胞生存率のＦＡＣＳ分析によって決定した。

【0119】

ＮＳＣＬＣ－ＴＡＭを単離し、ＧＦＰ又はＧＰ－Ｈｏｍ－１をコードするプラスミドでトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされたＴＡＭを、１μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋ Ｙｅｌｌｏｗ標識がん又は正常上皮細胞と、１：１の比率で２４時間インキュベートした。次いで、食作用の速度を、フローサイトメトリーによって決定した。

【0120】

Ｈｏｍ－１－ＴＡＭによるＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖のがん特異的刺激を示すために、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭを、がん又は正常上皮細胞と２４時間混合し、次いで、ＣｅｌｌＴｒａｃｋ Ｙｅｌｌｏｗ標識自己ＣＤ８^＋ＴＩＬと１：１０の比率で、５日間共培養した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖に対するインキュベーションの効果を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。

【0121】

更に、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭを、がん又は正常上皮細胞と２４時間混合し、次いで、１：１０（Ｍ：Ｔ）の比率で自己ＣＤ８^＋ＴＩＬと５日間共培養した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化に対するインキュベーションの効果を、ＡＰＣコンジュゲート抗ＩＦＮγ又はＰＥコンジュゲート抗グランザイムＢ抗体を使用するＦＡＣＳによって決定した。

【0122】

Ｈｏｍ－１－ＴＡＭは、ＮＳＣＬＣに対するＰＤ－１抗体の殺細胞効果を４～５倍促進することが見出された。比較すると、正常上皮細胞の死の有意な増加はなかった（データ図示せず）。

【0123】

Ｈｏｍ－１が食作用を調節するため、ＮＳＣＬＣに対するＰＤ－１抗体の効力を促進するＨｏｍ－１－ＴＡＭのメカニズムは、Ｈｏｍ－１がＮＳＣＬＣ腫瘍細胞のＮＳＣＬＣ－ＴＡＭ食作用を促進する可能性があり、これにより、がん特異的な方法でＣＤ８Ｔ細胞の活性化が促進される可能性がある。この目的のために、ＴＡＭをＧＦＰ又はＧＦＰ－Ｈｏｍ－１でトランスフェクトし、次いで、ＣＦＳＥ標識精製ＮＳＣＬＣ細胞又は正常上皮細胞で２４時間インキュベートした（データ図示せず）。ＴＡＭの食作用に対するＨｏｍ－１の効果を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。

【0124】

結果は、Ｈｏｍ－１ががん細胞と正常上皮細胞の両方の食作用を促進することを示した。更に、Ｈｏｍ－１が、食作用ステップの後、クロスプライミングを介してＣＤ８Ｔ細胞のＴＡＭの活性化を促進することが示された。具体的には、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭを自己ＣＤ８Ｔ細胞とともにインキュベートした。Ｈｏｍ－１－ＴＡＭのクロスプライミング機能と一致して、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭによる正常上皮細胞ではなくがんの食作用が、ＣＤ８Ｔ細胞増殖及び活性化の４～５倍の増強をもたらすことが見出された（データ図示せず）。

【0125】

実施例５ Ｈｏｍ－１制御ＴＡＭは、インビボでＮＳＣＬＣに対するＰＤ－１抗体の効力を促進する。
患者由来異種移植片のＮＳＧモデル（ＮＳＧ－ＰＤＸ）は、抗がん剤開発のための重要なツールとなりつつある。同系マウスモデルと比較して、原発性ヒト腫瘍のＮＳＧ－ＰＤＸモデルは、関連するＴＭＥを有するという利点を有し、ＣＲＣ及びＰＤＡの腫瘍形成に対する修飾されたＴＡＭの効果を評価するために首尾よく使用されている。

【0126】

この実施例は、原発性ＮＳＣＬＣのＮＳＧ－ＰＤＸモデルを使用して、ＮＳＣＬＣに対するＰＤ－１抗体の機能をインビボで査定することができることを実証する。

【0127】

具体的には、原発性ＮＳＣＬＣの個々のＮＳＧ－ＰＤＸモデルは、原発性ＮＳＣＬＣ組織の小片をＮＳＧマウスの背側外側の皮下空間に移植することによって生成した。ＮＳＧマウスにおける腫瘍増殖を最大６週間観察した（データ図示せず）。

【0128】

モデルにおけるヒトリンパ球の存在を決定するために、移植に成功した腫瘍を興奮させ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の存在をＦＡＣＳによって決定した。移植されたＮＳＣＬＣ腫瘍は、顕著な数の初代ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むことが見出された（データ図示せず）。移植された腫瘍における機能性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の存在と一致して、ＰＤ－１抗体の注入が原発性ＮＳＣＬＣのこれらの個々のＮＳＧ－ＰＤＸモデルにおいて腫瘍形成の若干の阻害を引き起こすことが見出された（データ図示せず）。

【0129】

Ｈｏｍ－１－ＴＡＭが、ＩＣＩ耐性に関与するＴＭＥの免疫抑制を反転させるため、ＮＳＣＬＣに対するＰＤ－１抗体の効力を促進する際のＨｏｍ－１－ＴＡＭの潜在的な機能が決定された。ＰＤ－１抗体及びＨｏｍ－１－ＴＡＭの混注により、原発性ＮＳＣＬＣのＮＳＧ－ＰＤＸモデルにおいてＮＳＣＬＣ腫瘍形成に対するＰＤ－１抗体の効力が４～５倍増強されることが見出された。したがって、データは、ＮＳＣＬＣのＩＣＩコンジュゲート併用療法におけるＨｏｍ－１－ＴＡＭの潜在的な機能を示唆した。

【0130】

上記の実施例では、一括ＮＳＣＬＣのエクスビボ培養モデルを使用して、ＮＳＣＬＣのＩＣＩ治療におけるＴＭＥの機能を研究した。エクスビボ培養物へのＰＤ－１抗体の適用は、ＣＤ８^＋ＣＴＬを活性化し、がん細胞に対して若干の殺腫瘍効果を発揮することが見出された。ＩＣＩ治療におけるＴＭＥの生理学的機能を反映したモデルの真正性は、他の細胞ベースのインビトロアッセイとは異なり、ＴＭＥにおけるＣＤ８^＋ＣＴＬのＰＤ－１抗体活性化に抗原又はサイトカインは必要とされないという知見によって示された。

【0131】

エクスビボ培養モデルを使用して、Ｈｏｍ－１調節ＴＡＭによるＴＭＥの再プログラミングは、ＣＤ８Ｔ細胞の再活性化及びＰＤ－１抗体の殺細胞効果を腫瘍特異的様式で４～５倍増強することが実証された（データ図示せず）。

【0132】

ＮＳＣＬＣに対するＩＣＩの腫瘍特異的増強の潜在的メカニズムとして、Ｈｏｍ－１がＮＳＣＬＣがん細胞のＴＡＭ食作用を促進し、ひいては腫瘍特異的様式でＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化することが実証された（データ図示せず）。

【0133】

この知見は、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の既存のプールの概念、及び腫瘍特異的ＣＤ８^＋Ｔをクロスプライムし活性化するための腫瘍抗原の交差提示におけるＨｏｍ－１修復型ＴＡＭの能力と一致する。データはまた、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭによるＣＴＬの腫瘍特異的活性化が、ＰＤ－１抗体によって更に２倍増幅され得ることを示し、ＮＳＣＬＣ処理における併用免疫療法の可能性を実証する。

【0134】

したがって、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭベースの併用療法は、他の免疫的に「熱い」及び「冷たい」腫瘍の治療において同様の効果を発揮する可能性があり、したがって、がん免疫療法の効力を改善する新たな機会を提供する。

【0135】

実施例６ 一括組織培養における化学療法剤ＤＯＸの殺腫瘍効果
ドキソルビシン（ＤＯＸ）は、広域化学療法剤であり、がん細胞及びマクロファージの両方においてＨｏｍ－１発現の強力な誘導物質である（データ図示せず）。この実施例は、本発明の一括組織培養モデルが、ＴＭＥとの関連でＤＯＸの殺腫瘍機能の根底にあるメカニズムを研究するために使用できることを実証する。

【0136】

この目的のために、同じ患者からの一括結腸直腸がん（ＣＲＣ）又は対照非腫瘍結腸粘膜組織を、ＲＰＭＩベースの培地中でインキュベートし、ＤＯＸで３日間処理した。次に、腫瘍又は正常細胞に対する処理の効果を、ＰＩ染色及びＦＡＣＳ分析によって決定した。

【0137】

結果は、ＤＯＸ処理が、一括腫瘍培養物における腫瘍細胞に対して投与量依存的な殺細胞効果をもたらすことを示した（データ図示せず）。適応性ストレス応答及び細胞死を制御するメカニズムの異常に起因する化学療法剤に対するがん細胞の優越性（ｖｅｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ）と一致して、ＤＯＸ処理は組織微小環境の状況で正常上皮細胞に対してより少ない細胞傷害性効果を及ぼすことが見出された（データ図示せず）。ＴＭＥにおけるＤＯＸ誘発性殺腫瘍効果におけるＨｏｍ－１の潜在的関与と一致して、ＤＯＸが一括ＣＲＣ培養物においてＴＡＭ Ｈｏｍ－１発現を用量依存的に誘導したことが見出された（データ図示せず）。

【0138】

実施例７ Ｈｏｍ－１は、腫瘍微小環境の免疫状況に対するＤＯＸ効果を媒介する。
ＤＯＸは、一括ＣＲＣ培養物中のＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現を誘導するため（データ図示せず）、この実施例は、ＤＯＸの治療効果の媒介におけるＨｏｍ－１の関与を示す。一括ＣＲＣ培養モデルを使用して、ＤＯＸ処理がＭ１マーカー及びサイトカインの発現を促進することによってＴＡＭの集団をＭ２様表現型からＭ１様表現型にシフトさせたが、ＴＡＭにおけるＭ２マーカー及びサイトカインの発現を阻害することが示された（データ図示せず）。

【0139】

ＴＡＭ可塑性に対するＤＯＸ効果に対応して、ＴＭＥの免疫状況に対するＤＯＸの効果は、ＣＤ８Ｔ細胞活性化は増加するが、ＣＤ４Ｔ細胞のＴ_ｒｅｇ細胞への分化は低下するなど、ＴＩＬ分化の交代によって更に明らかにされた（データ図示せず）。ＴＡＭ可塑性及びＴＭＥの免疫状況に対するＤＯＸ効果の媒介におけるＨｏｍ－１の主要な制御的役割と一致して、ＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現のノックダウンが、Ｍ１及びＭ２マーカーの発現に対するＤＯＸ効果を減弱させ、炎症性サイトカインのＤＯＸ誘導分泌を阻害することが示された（データ図示せず）。免疫状況に対するＤＯＸ効果の媒介におけるＨｏｍ－１調節ＴＡＭの効果は、Ｈｏｍ－１修飾ＴＡＭによるＴＩＬ分化のＤＯＸ誘導の交代の廃止によって更に明らかにされた（データ図示せず）。

【0140】

実施例８ ＮＦκＢは、ＴＡＭにおけるＤＯＸ誘導性Ｈｏｍ－１発現を媒介する。
ＤＯＸ誘導Ｈｏｍ－１発現のメカニズムを決定するために、Ｈｏｍ－１プロモーターをＥＣＲブラウザで分析し、３つの潜在的なＮＦκＢ結合部位の同定を得た（データ図示せず）。ＮＦκＢは、炎症及びがんの病因におけるマクロファージ機能の主要レギュレーターである。

【0141】

ＮＦκＢが単球におけるＨｏｍ－１発現のＤＯＸ活性化に役割を果たすかどうかを決定するために、初代単球におけるＮＦκＢ発現に対するＤＯＸの効果を決定した。ＤＯＸが投与量依存的様式で初代ヒト単球におけるＮＦκＢ発現を誘導することが見出された（データ図示せず）。

【0142】

Ｈｏｍ－１発現のＤＯＸ誘導を媒介するＮＦκＢの役割と一致して、ＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現がＤＯＸ誘導性ＮＦκＢ発現と相関し、ＮＦκＢ阻害剤によってブロックされることが見出された（データ図示せず）。ＮＦκＢがＨｏｍ－１発現のＤＯＸ誘導を媒介する転写因子であるという考えと一致して、ＣＨＩＰ分析によって示されるように、ＤＯＸがＮＦκＢとＨｏｍ－１プロモーターとの相互作用を促進し、ＮＦκＢとＨｏｍ－１プロモーターとの間の増強された結合がＮＦκＢ阻害剤によって廃止されたことが見出された（データ図示せず）。

【0143】

実施例９ Ｈｏｍ－１－ＴＡＭは、腫瘍特異的な様式でＤＯＸの殺腫瘍効果を促進する
Ｈｏｍ－１制御ＴＡＭがＴＭＥで免疫を支配するため、ＤＯＸがＴＡＭでＨｏｍ－１発現を誘導するという知見は、Ｈｏｍ－１制御ＴＡＭ（Ｈｏｍ－１－ＴＡＭ）がＤＯＸの治療効力を促進するかどうかの調査につながった。

【0144】

この目的のために、一括ＣＲＣ腫瘍又は対照結腸粘膜組織を、低い非細胞傷害性用量のＤＯＸで処理し、次いで、Ｈｏｍ－１又は対照ＧＦＰでトランスフェクトされたＴＡＭと共培養した。５日間の共培養後、腫瘍又は対照正常上皮細胞の生存に対する処理の効果を、ＰＩ染色及びＦＡＣＳ分析によって決定した。

【0145】

非細胞傷害性濃度では、ＤＯＸ単独では、腫瘍細胞に対する殺細胞効果をほとんど発揮しないことが見出された。しかしながら、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭを処理に含めた場合、腫瘍細胞に対するＤＯＸの効力は１０倍以上増加した（データ図示せず）。驚くべきことに、ＤＯＸに対するＨｏｍ－１－ＴＡＭの効果は、腫瘍特異的であることが見出された。腫瘍組織に対するその効果と比較して、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭは、正常上皮細胞に対するＤＯＸの細胞傷害性効果を有意に促進しなかった（データ図示せず）。

【0146】

更なる実験では、Ｈｏｍ－１が、ＣＲＣ腫瘍細胞のＣＲＣ－ＴＡＭ食作用を促進し、その結果、がん特異的な方法で細胞傷害性ＣＤ８Ｔリンパ球を活性化することが実証された。この目的のために、ＣＲＣ－ＴＡＭをＧＦＰ又はＧＦＰ－Ｈｏｍ－１でトランスフェクトし、次いで、ＣＦＳＥ標識精製ＣＲＣがん細胞又は正常上皮細胞で２４時間インキュベートした。ＴＡＭの食作用に対するＨｏｍ－１の効果を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。結果は、Ｈｏｍ－１ががん細胞と正常上皮細胞の両方の食作用を促進することを示した。

【0147】

Ｈｏｍ－１がクロスプライミングを介してＣＤ８Ｔ細胞のＴＡＭ活性化を促進することができることを示すために、食作用ステップの後、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭを自己ＣＤ８Ｔ細胞とともにインキュベートした。Ｈｏｍ－１－ＴＡＭのクロスプライミング機能と一致して、正常上皮細胞ではなく、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭによるがん細胞の食作用が、ＣＤ８Ｔ細胞増殖及び活性化の有意な増強をもたらすことが見出された（データ図示せず）。

【0148】

実施例１０ Ｈｏｍ－１－ＴＡＭは、原発性ヒトＣＲＣのＮＳＧ－ＰＤＸモデルにおけるＣＲＣ腫瘍形成のＤＯＸ阻害を促進する
原発性ヒト腫瘍のＮＳＧ－ＰＤＸモデルは、化学療法剤の治療効力を評価するための強力なツールである。原発性ヒト腫瘍のＮＳＧ－ＰＤＸモデルを使用した研究に基づいて、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭは、用量依存的様式で原発性ＣＲＣの腫瘍形成に対して強い阻害を発揮することが示された。Ｈｏｍ－１－ＴＡＭが、エクスビボでＤＯＸの殺腫瘍効果を促進するという知見は、インビボでのＣＲＣの併用療法におけるＨｏｍ－１－ＴＡＭとＤＯＸとの間の潜在的な相乗効果の検討につながり、この実施例で実証された。

【0149】

この目的のために、原発性ヒトＣＲＣのＮＳＧ－ＰＤＸモデルを、確立された方法に従って確立した。原発性ＣＲＣ腫瘍の移植の１週間後、マウスに、低用量のＨｏｍ－１－ＴＡＭを尾静脈注射した。３日後、１．５ｍｇ／ｋｇの低用量のＤＯＸを尾静脈注射によって投与し、２週間後にＤＯＸ注射を繰り返した。移植された腫瘍の増殖は、最大６週間観察された。

【0150】

結果は、低用量のＤＯＸが、インビボで、ＣＲＣ腫瘍形成に対してわずかに識別可能な阻害を発揮する一方で、低用量のＨｏｍ－１－ＴＡＭによって、ＣＲＣ腫瘍形成に対する低用量のＤＯＸの阻害効果が有意に増強されたことを示した。低用量のＤＯＸ及びＨｏｍ－１－ＴＡＭの併用レジメンは、良好な耐容性があり、化学療法剤の治療効力を改善する新規のアプローチを示唆している。

【0151】

実施例１１ Ｈｏｍ－１－ＴＡＭは、広範囲の腫瘍タイプに対する化学療法剤の殺腫瘍機能を促進する。
この実施例は、本発明の一括腫瘍培養モデルが、ＴＭＥとの関連で化学療法剤の殺腫瘍機能を査定するための一般的なツールとして使用できること、及びＨｏｍ－１－ＴＡＭが他の化学療法剤の殺腫瘍効果を促進し得ることを実証する。

【0152】

ＣＲＣに加えて、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭはＰＤＡＣ及びＮＳＣＬＣ ＴＭＥの免疫極性を逆転させる（データ図示せず）。ＤＯＸの殺腫瘍効果に対するＨｏｍ－１－ＴＡＭの効果は、ＰＤＡＣ、ＮＳＬＣ、食道がん及び胃がんなどの他の腫瘍タイプで更に調査された。ＣＲＣの場合と同様に、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭは、これらの試験された腫瘍タイプ全てに対して低用量ＤＯＸの殺腫瘍機能を促進することが見出された（データ図示せず）。

【0153】

ＤＯＸ以外の、５－ＦＵなどの他の化学療法剤の殺腫瘍機能も、本発明の一括腫瘍モデル用いて査定／実証することができる。具体的には、ＤＯＸに対するその効果と同様に、５－ＦＵは、ＣＲＣの一括腫瘍培養物中の腫瘍細胞に対して投与量依存的な殺細胞効果を発揮した（データ図示せず）。

【0154】

更なるデータは、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭが５－ＦＵ及び他の化学療法剤の殺腫瘍効果を促進することを示した。具体的には、様々な腫瘍タイプの一括培養モデルを使用して、データは、Ｈｏｍ－１－ＴＡＭがＣＲＣに対する５－ＦＵ殺腫瘍効果、ＰＤＡＣに対するゲムシタビン殺腫瘍効果、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、食道がんに対するシスプラチン殺腫瘍効果、胃がん及び卵巣がんに対するタキソール効果を促進したことを示した（データ図示せず）。本試験で使用される追加の化学試薬を以下に列挙する。

【表1】

【0155】

まとめると、本明細書に提示されるデートは、本発明の一括腫瘍培養モデルが、化学療法剤の効力及び安全性を改善するために、腫瘍微小環境との関連で多くの異なる化学療法剤の殺腫瘍効果及びＴＭＥにおける免疫を調節する効果を査定するための効果的なツールとして使用できることを示唆した。

【0156】

実施例１～１１で使用される特定の手順及び材料は、例示を目的として以下に提供され、いかなる点においても限定するものではない。

【0157】

しかしながら、本明細書で使用される特定の条件及び試薬は、特定の実施形態として本発明の組成物及び方法で使用されることが明確に企図されており、参照により組成物及び方法の説明に組み込まれる。

【0158】

材料及び方法
肺組織試料の収集
外科的切除を予定していた合計２０名のＮＳＣＬＣ患者が、研究目的で切除された組織及び血液の一部を採取することに同意した。全ての患者は、病院の治験審査委員会によって承認されたインフォームドコンセント文書に署名した。腫瘍塊、又は非関与肺組織から約５～１０グラムの組織を収集した。腫瘍試料及び対照組織は、施設の委員会認定病理学者によって検証された。

【0159】

及び腫瘍組織からのリンパ球及びマクロファージの調製
リンパ球を基本的に標準プロトコールに従って単離した。簡潔に述べると、解剖された新鮮な腫瘍及び肺組織を、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する、Ｃａ^２＋フリー及びＭｇ^２＋フリーのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、１０ｃｍペトリ皿中ですすいだ。次に、肺及び腫瘍組織を、カミソリ刃によって約０．１ｃｍの小片に切断し、５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する５ｍＬのＨＢＳＳ中、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、組織をグレーメッシュ（１００ミクロン）に通した。次に、リンパ球及び上皮細胞を含有するフロースルーをフローサイトメーターによって分析した。

【0160】

マクロファージを単離するために、腫瘍及び肺組織をＨＢＳＳですすぎ、カミソリ刃によって約０．１ｃｍの小片に切断し、次いで、２％のＦＢＳ、１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）、０．１ｍｇ／ｍＬのＤｎａｓｅ Ｉを含有するＨＢＳＳ（Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋を含む）中で、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、消化された組織をグレーメッシュ（７０ミクロン）フィルターに通した。フロースルーを収集し、洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁した。正常組織マクロファージ及びＴＡＭを、製造業者の指示に従い、ＣＤ１６を枯渇させることなく、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒト単球／マクロファージ濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１９０８５）を使用して更に精製した。単離プロセスは、マクロファージの活性化をもたらさず、単離されたマクロファージの純度は９５％を超えていた。本技術によって単離された細胞の９８％以上は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色試験によって生存可能であった。

【0161】

ＦＡＣＳ分析
マクロファージ及びリンパ球の表現型分析は、蛍光色素コンジュゲート抗体による細胞の免疫標識後にフローサイトメトリーを使用して行った。細胞外染色を４℃で３０分間行い、次いで、２％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞内染色については、製造業者によって提供されたプロトコールに従って、固定／透過化溶液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞を固定及び透過化し、次いで抗体染色に供した。同位体対照標識を並行して行った。抗体は、供給業者の推奨に従って希釈した。ヨウ化プロピジン（ｐｒｏｐｉｄｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅ）（ＰＩ）染色を伴う実験では、染色ステップの後、細胞を洗浄し、５μＬのＰＩ染色溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した２００μＬのＦＡＣＳ染色溶液に１５分間再懸濁した後、ＦＡＣＳ分析に供した。標識細胞を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）備えたＤａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのフローサイトメトリーコアでＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを使用して取得し、ＦｌｏｗＪｏ１０．１ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して分析した。典型的には、標準的なＦＡＣＳ分析手順に従って、試料ごとに２０，０００個の細胞を分析した。補償は、抗体染色の２つ以上の蛍光で実行し、機器は、ＣＳ＆Ｔビーズを使用して毎日較正した。ゲーティングは、生活単一細胞（ｌｉｆｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）に対して実行された。結果は、陽性細胞のパーセンテージとして表される。

【0162】

定量的ＲＴ－ＰＣＲ
総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって単離し、ＲＮＡ量をＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。等量のＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた第１鎖ｃＤＮＡ合成に使用した。ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、従来のＰＣＲでＨｏｍ－１ ｃＤＮＡを増幅した。Ｈｏｍ－１及び他のｃＤＮＡの定量的測定は、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｓ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用してＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いて、行った。ＧＡＰＤＨは、ｍＲＮＡ発現を正規化するためのハウスキーピング遺伝子として使用された。ｍＲＮＡの相対的発現プロファイルを、比較Ｃｔ法（ＤＤＣＴ法）を使用して計算した。

【0163】

サイトカイン測定
ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αのレベルを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得たＥＬＩＳＡキットを使用して定量した。分析は、製造業者の説明に従って行われた。各条件ごとに３つのウェルをプレーティングした。

【0164】

トランスフェクションアッセイ
ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１及びＧＦＰのマクロファージへのトランスフェクションは、Ｈｕｍａｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（カタログ番号：ＶＶＰＡ－１００８、Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して実行された。簡潔に述べると、２×１０^６細胞を、５μｇのプラスミドＤＮＡを有する１００μＬのヌクレオフェクター溶液に、氷上で２０分間再懸濁した。トランスフェクションは、Ｎｃｕｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）で実施した。トランスフェクション後、細胞を直ちに氷上に１分間置き、次に、１０％のＦＢＳ及び１％の抗生物質－抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５２４００６２）を含有する、予熱したＲＰＭＩ１６４０完全培地で２４～４８時間培養し、その後トランスフェクトされた細胞を実験に使用した。

【0165】

一括組織培養及び処理
腫瘍組織を１×ＰＢＳ緩衝液＋抗生物質で洗浄し、次いで０．５ｃｍの小片に切断した。組織を、２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の２～１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）及び１％の抗生物質－抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ）を補充した２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。培養物を、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。一括組織培養物におけるＰＤ－１抗体の機能評価のために、ペムブロリズマブ（ヒト化抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）又はヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照を指定された濃度でウェルに添加し、免疫細胞活性及び腫瘍細胞生存に対する効果を記載されているように決定した。化学療法剤の効果を査定するために、抗ＰＤ－１抗体の代わりに、指定された濃度の化学試薬又はＰＢＳを使用した。一括組織及びマクロファージ共培養アッセイでは、同じ患者の０．２５ｘ１０^６個のＧＦＰ－Ｈｏｍ－１又は対照ＧＦＰトランスフェクト自己マクロファージを一括組織培養ウェルに添加した。穏やかに振盪した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で３～５日間インキュベートした。次いで、記載されているように、一括組織を単一１細胞単離及び分析に供した。

【0166】

腫瘍及び正常上皮細胞の単離
腫瘍及び正常な肺組織を、カミソリの刃によって約０．１ｃｍの小片に切断し、機械的破壊によって単一細胞懸濁液を生成し、続いて細胞懸濁液を７０μｍのナイロンメッシュを通して濾過した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＲＰＭＩのみの培地に再懸濁し、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中のＦｉｃｏｌｌ溶液の上部に置いた。次いで、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ卓上遠心分離機で、２０００ｒｐｍで３０分間、低い加速度及び減速度でチューブを遠心分離した。次に、細胞をＦａｌｃｏｎチューブの底部から収集し、赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって除去した。ＰＢＳで洗浄した後、腫瘍細胞及び正常上皮細胞をＲＰＭＩ完全培地に収集した。単離された細胞を、ＣＫ７及びＥＰ４抗体染色及びＦＡＣＳ分析によって更に特徴付けた。

【0167】

食作用アッセイ
ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞又は正常上皮細胞を、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、１μＭのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｙｅｌｌｏｗで標識した。次いで、標識細胞を、ＧＦＰ又はＧＦＰ－Ｈｏｍ－１でトランスフェクトした２×１０^５個の自己ＴＡＭと、１２ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｉｎｇ）中で、１：１の比率で混合し、ＲＰＭＩ完全培地＋１０％ＦＢＳ、１％抗生物質－抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５２４００６２）中でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、ＴＡＭを洗浄し、セルスクレーパーで回収し、フローサイトメーターによって食作用を分析した。

【0168】

Ｔ細胞増殖及び活性化アッセイ
増殖アッセイでは、ＮＳＣＬＣ患者のＣＤ８^＋ＴＩＬを、製造業者の指示に従って、ＥａｓｙｓｅｐヒトＣＤ８濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ１９０５３）によって単離し、次いで、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、１μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅで標識した。ＴＡＭを調製するために、１０^５個のＧＦＰ－Ｈｏｍ－１又はＧＦＰトランスフェクトＴＡＭを、同じ患者由来の同量の腫瘍細胞又は正常上皮細胞と混合し、ＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＢＳ、１％抗生物質－抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５２４００６２）を含む１２ウェルプレートで、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間培養した。次いで、１×１０^６個の標識ＣＤ８ＴＩＬ及びＴＡＭを１０：１の比率で混合し、次いで、３７℃、５％ＣＯ_２で５日間培養した。次いで、細胞を抗ＣＤ８－ＡＰＣコンジュゲート抗体で染色し、フローサイトメーターによって分析した。活性化アッセイでは、ＣＤ８^＋ＴＩＬを、処理したＴＡＭと１０：１の比率で混合し、次いで、３７℃、５％ＣＯ_２で３日間培養した。次に、細胞を抗ＣＤ８－ＡＰＣコンジュゲート抗体で染色し、記載されるように、細胞内ＩＮＦ－γ及びグランザイムＢの存在をＦＡＣＳによって決定した。

【0169】

原発性ヒトＮＳＣＬＣの個々のＮＳＧ－ＰＤＸモデル
原発性ヒト肺がんの個々のＮＳＧ－ＰＤＸモデルを、標準的な手順に従って開発した。全ての動物実験は、施設内動物実験委員会によって承認された。簡潔に述べると、８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪマウス（一般に、ＮＯＤｓｃｉｄガンマ、又はＮＳＧマウスとして知られている）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、特定の病原体を含まない条件下で維持した。ＮＳＣＬＣ腫瘍を約０．５ｃｍの小片に切断し、次いでＮＳＧマウスの背側の皮下空間に外科的に移植した。移植の１週間後、動物を、示されるように、ＰＤ－１抗体又はＨｏｍ－１－ＴＡＭ又は対照で処理した。ＰＤ－１抗体処理群では、１５０μｇのペムブロリズマブ（ヒト化抗ＰＤ－１抗体）又はヒトＩｇＧ４対照を、指示されるように最大５週間、週に１回尾静脈注射した；Ｈｏｍ－１－ＴＡＭ処理群では、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１又は対照ＧＦＰでトランスフェクトされた０．２５×１０^６のＴＡＭを、指示されるように１回尾静脈注射した。腫瘍増殖を毎週２回モニタリングし、６週間にわたってキャリパーによって測定した。腫瘍体積は、式１／２（長さ×幅^２）に従って計算した。

【0170】

原発性ヒト大腸直腸がんのＮＳＧ－ＰＤＸモデル
原発性ヒト結腸がんの動物モデルは、以前に開発された。簡単に言えば、８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪマウス（一般にＮＯＤｓｃｉｄガンマ、又はＮＳＧマウスとして知られている）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、特定の病原体を含まない条件下で維持した。腫瘍を約０．５ｃｍの小片に切断し、次いで外科的にＮＳＧマウスの脇腹の皮下空間に移植した。移植の１週間後、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１又は対照ＧＦＰでトランスフェクトされた０．２５×１０^６個のＴＡＭを、尾静脈を介してマウスに注射した。３日後、１．５ｍｇ／ＫｇのＤＯＸ又はＰＢＳ対照を尾静脈注射し、次いで２週間後に繰り返した。腫瘍増殖を毎週２回モニタリングし、６週間にわたってキャリパーによって測定した。腫瘍体積は、式１／２（長さ×幅^２）に従って計算した。

【0171】

免疫組織化学
免疫組織化学は、確立されたプロトコールに従って実行した。簡潔に述べると、肺又は結腸の腫瘍又は正常組織をホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）中で少なくとも４８時間固定した。次いで、組織をパラフィンに包埋し、切片化した。

【0172】

ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った後、スライド全体の画像をＰａｎｎｏｒａｍｉｃ ＭＩＤＩ ＩＩデジタルスライドスキャナによって走査し、 Ｃａｓｅｖｉｅｗｅｒ及びＱｕａｎｔ ｃｅｎｔｅｒソフトウェア（３ＤＨｉｓｔｅｃｈ）で分析した。

【0173】

多重免疫蛍光法
多重免疫蛍光法（ＩＦ）を、ＢＯＮＤ ＲＸ全自動染色装置（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。厚さ５μｍのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片を６０℃で３時間ベーキングした後、ＢＯＮＤ ＲＸに装填した。組織切片を脱パラフィン化し（ＢＯＮＤ ＤｅＷａｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログＡＲ９５９０）、一連の段階的エタノールから脱イオン水で再水和させた。抗原賦活化を、ＢＯＮＤ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ｐＨ６）又は２（ｐＨ９）、以下に示される（ＥＲ１、ＥＲ２、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログＡＲ９９６１、ＡＲ９６４０）で、９５℃で行った。脱パラフィン、再水和及び抗原賦活化は全て事前にプログラムされ、ＢＯＮＤ ＲＸによって実行された。次に、スライドを、抗ＣＤ８（クローン４Ｂ１１；Ｌｅｉｃａ、希釈１：２００）などの一次抗体で連続的に染色した。一次抗体当たりのインキュベーション時間は３０分であった。続いて、抗マウス＋抗ウサギオパールポリマーホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｏｐａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ ＨＲＰ Ｍｓ＋Ｒｂ、Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログＡＲＨ１００１ＥＡ）を、二次標識として１０分のインキュベーション時間で適用した。抗体複合体のシグナルは、スライドを１０分間インキュベートすることによって、対応するオパールフルオロフォア試薬（Ａｋｏｙａ）によって標識され、視覚化された。スライドを、Ｓｐｅｃｔｒａｌ ＤＡＰＩ溶液（Ａｋｏｙａ）中で１０分間インキュベートし、風乾し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉ－ｆａｄｅ封入剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログＰ３６９６５）で封入し、撮像前に４℃で遮光ボックスで保管した。標的抗原、抗体クローン、マーカーの希釈、及び抗原賦活化の詳細を補足表２に列挙する。

【0174】

画像取得は、Ｖｅｃｔｒａ Ｐｏｌａｒｉｓマルチスペクトルイメージングプラットフォーム（Ｖｅｃｔｒａ Ｐｏｌａｒｉｓ，Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して行った。代表的な関心領域が病理学者によって選択され、３～５つの視野（ＦＯＶ）が２０倍の解像度でマルチスペクトル画像として取得された。細胞同定は、前述のように行われた。要するに、画像キャプチャ後、ＦＯＶをスペクトル的に非混合にし、次いで、Ｉｎｆｏｒｍ ２．４（Ａｋｏｙａ）内の教師付き機械学習アルゴリズムを使用して分析した。この画像解析ソフトウェアは、セグメント化された核（ＤＡＰＩシグナル）に関連付けられた免疫蛍光特性の組み合わせに基づいて、画像内の全ての細胞に表現型を割り当てる。各細胞表現型特異的アルゴリズムは、反復トレーニング／試験プロセスに基づいており、対象となる各表現型の最も代表的なものとして、少数の細胞（トレーニング段階、典型的には１５～２０個の細胞）が手動で選択され、次いで、アルゴリズムが、残りの全ての細胞の表現型を予測する（試験段階）。病理学者は、表現型が最適化されるまで、ソフトウェアによって行われた決定を覆して、精度を改善することができる。「陽性」染色の閾値及び表現型アルゴリズムの精度を、各症例について、病理医によって最適化し、確認した。

【0175】

細胞生存アッセイ
一括組織培養から生成された単一細胞懸濁液を、ＦＡＣＳ染色溶液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で洗浄し、固定及び透過処理し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、次いで、正常上皮細胞についてはＢｅｒ－ＥＰ４抗体で、がん細胞についてはＣＫ７、ＣＫ１９及びＣＫ２０で、氷上で３０分間染色した。ＦＡＣＳ染色溶液で洗浄した後、細胞をＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体で、氷上で３０分間染色した。次に、細胞をＦＡＣＳ染色溶液で洗浄し、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで３０分間又は一晩固定した。細胞を洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳ染色溶液に再懸濁し、５μＬのＰＩ染色溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を溶液中に１５分間添加した。次いで、細胞生存率をフローサイトメトリーで分析した。

【0176】

ＣｈＩＰアッセイ
ヒト単球を１μＭのＤＯＸ又はＰＢＳ対照で２４時間処理し、ＣｈＩＰアッセイのために収集した。ＣｈＩＰ手順は、製造業者の指示に従って、Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのキットを使用して実行した。免疫沈降には、ＮＦκＢｐ６５抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号８２４２）を使用した。ウサギＩｇＧ抗体を陰性対照として提供した。推定上ＮＦκＢ結合部位を含有するＨｏｍ－１プロモーター領域を、特異的プライマー５’－ＣＧＣＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡ－３’及び５’－ＴＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧＧＴ－３’で増幅した。全てのＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。

【0177】

ＮＦ－κＢ活性化アッセイ
ヒト単球を、指示された濃度のＤＯＸ又はＰＢＳ対照で処理した。処理の２４時間後、核抽出物キット（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、カタログ４００１０）を使用して核抽出物を調製した。ＮＦ－κＢｐ６５のＤＮＡ結合活性は、製造業者の取扱説明書に従ってＴｒａｎｓＡｍアッセイ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、カタログ４００９７）を使用して決定した。簡潔に述べると、各試料の２．５μｇの核抽出物を、固定化したＮＦ－κＢ特異的オリゴヌクレオチドとともに１時間インキュベートした。次に、ＤＮＡに結合したｐ６５タンパク質を、ｐ６５特異的抗体、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体、及び現像液でインキュベートすることによって視覚化し、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0178】

統計分析
Ｐｒｉｓｍバージョン９（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）での統計分析には、スチューデントの検定又は一元配置分散分析が使用された。データを平均±標準偏差（ＳＤ）として提示した。腫瘍増殖曲線は、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用した、反復測定二元配置分散分析によって分析された。有意水準はｐ値で示した。

【0179】

参考文献：
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３５．Ｗｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｈｏｍ－１ ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｐ５３ ａｎｄ ｐ１６ｉｎｋ４ａ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６，１２６９３－７０１（２０１１）．
３６．Ｇａｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｈｏｍ－１ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ／Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７，２９９７９－８７（２０１２）．
３７．Ｇａｏ，Ｈ．，Ｗｕ，Ｂ．，Ｌｅ，Ｙ．＆ Ｚｈｕ，Ｚ．Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｍ－１ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐ５３－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１６）．
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３９．Ｗａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｎｉｖｏｌｕｍａｂ，ＢＭＳ－９３６５５８，ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２，８４６－５６（２０１４）．
４０．Ｇｅｒｍｅａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０１，２４１－８（２００５）．
４１．Ｋａｍａｄａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｑｕｅ ＣＤ１４ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｒｏｈｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉａ ＩＬ－２３／ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ａｘｉｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１８，２２６９－８０（２００８）．
４２．Ｒｏｇｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｃ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１２，２０５－１５（１９９８）．
４３．Ｅｒｕｓｌａｎｏｖ，Ｅ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２４，５４６６－８０（２０１４）．
４４．Ｍｉｔｔａｌ，Ｖ．Ｋ．，Ｂｈｕｌｌａｒ，Ｊ．Ｓ．＆ Ｊａｙａｎｔ，Ｋ．Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ，ｕｓｅｓ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２１，１１８５４－６１（２０１５）．
４５．Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｈ．＆ Ｃｈｕ，Ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｏｎｃｏｌ ３，２６２－８４（２０１２）．
４６．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｗ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｒｓｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ－ｄｏｓｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｆｔｅｒ ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ＣＡＬＧＢ ９０８２，ＳＷＯＧ ９１１４，ａｎｄ ＮＣＩＣ ＭＡ－１３．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３，２１９１－２００（２００５）．
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４９．Ｎｏｙ，Ｒ．＆ Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ｆｒｏｍ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１，４９－６１（２０１４）．
５０．Ｄｅ Ｐａｌｍａ，Ｍ．＆ Ｌｅｗｉｓ，Ｃ．Ｅ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２３，２７７－８６（２０１３）．
５１．Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｌ．，Ｂｕｑｕｅ，Ａ．，Ｋｅｐｐ，Ｏ．，Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，Ｌ．＆ Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２８，６９０－７１４（２０１５）．
５２．Ｂｒａｃｃｉ，Ｌ．，Ｓｃｈｉａｖｏｎｉ，Ｇ．，Ｓｉｓｔｉｇｕ，Ａ．＆ Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉ，Ｆ．Ｉｍｍｕｎｅ－ｂａｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｒａｔｉｏｎａｌｅ－ｂａｓｅｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ２１，１５－２５（２０１４）．
５３．Ｓｏｌｉｍｉｎｉ，Ｎ．Ｌ．，Ｌｕｏ，Ｊ．＆ Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｓ．Ｊ．Ｎｏｎ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｄｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １３０，９８６－８（２００７）．
５４．Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ａ．，Ｐｏｌｅｎｔａｒｕｔｔｉ，Ｎ．，Ｌｕｉｎｉ，Ｗ．，Ｐｅｒｉ，Ｇ．＆ Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ，Ｆ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｍｅｒｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ６３，６１－６（１９７９）．
５５．Ｂｅｎ－Ｎｅｒｉａｈ，Ｙ．＆ Ｋａｒｉｎ，Ｍ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｍｅｅｔｓ ｃａｎｃｅｒ，ｗｉｔｈ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ａｓ ｔｈｅ ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２，７１５－２３（２０１１）．
５６．Ｂｉｓｗａｓ，Ｓ．Ｋ．＆ Ｌｅｗｉｓ，Ｃ．Ｅ．ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ａｓ ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ８８，８７７－８４（２０１０）．
５７．Ａｒｌｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ（ＶＰ１６）ｏｒ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０，８５９－６８（２００１）．
５８．Ｗａｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ－ｋａｐｐａＢ ｄｕｒｉｎｇ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｓ ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３６７，７２９－４０（２００２）．
５９．Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．，Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｌ．，Ｋｅｐｐ，Ｏ．＆ Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，Ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１，５１－７２（２０１３）．
６０．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ａ．Ｅ．＆ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｉｎ ｖｉｖｏ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８３，２６９４－８（１９８６）．
６１．Ｖｅｓｃｉｏ，Ｒ．Ａ．，Ｃｏｎｎｏｒｓ，Ｋ．Ｍ．，Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ．＆ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｎａｔｉｖｅ－ｓｔａｔｅ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｈｉｓｔｏｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８８，５１６３－６（１９９１）．
６２．Ｙｏｓｈｉｍａｓｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｃｕｌｔｕｒｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｓｓａｙ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ １３３，３０３－８（２００７）．
６３．Ｙｏｓｈｉｍａｓｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅ ｆｏｒ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １４，４０１－５（２００７）．
６４．Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｂｅｔａ－ｔｕｂｕｌｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｒｅｓｅｃｔｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ４８，２０３－８（２００９）．
６５．Ｍａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３８，７２９－４１（２０１３）．
６６．Ｃｏｒｒｅａｌｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｒｏｓｓ－ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｇｉｍｅｎ ｗｉｔｈ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ，ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ，５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ａｎｄ ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ，ｅｌｉｃｉｔｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５，８２０－８（２００５）．
６７．Ｃａｒｅｙ，Ｃ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ＰＤ－Ｌ１－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｎｉｃｈｅ ｆｏｒ Ｒｅｅｄ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ １３０，２４２０－２４３０（２０１７）．

【国際調査報告】