特表 2024-539076 安定した組み込み部位を産生するために組み込まれたＣａｓ９遺伝子を含む哺乳動物細胞、並びに安定した組み込み部位及び他の部位を含む哺乳動物細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】安定した組み込み部位を産生するために組み込まれたＣａｓ９遺伝子を含む哺乳動物細胞、並びに安定した組み込み部位及び他の部位を含む哺乳動物細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20241018BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241018BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241018BHJP

   C12N 15/35 20060101ALI20241018BHJP

   C12N 15/34 20060101ALI20241018BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20241018BHJP

   C07K 14/015 20060101ALI20241018BHJP

   C07K 14/075 20060101ALI20241018BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N15/09 110

C12P21/02 C

C12N15/35

C12N15/34

C12N15/11 Z

C07K14/015

C07K14/075

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024523257

(86)(22)【出願日】2022-10-18

(85)【翻訳文提出日】2024-06-17

(86)【国際出願番号】 US2022078275

(87)【国際公開番号】W WO2023069931

(87)【国際公開日】2023-04-27

(31)【優先権主張番号】63/256,675

(32)【優先日】2021-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100195257

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 一志

(72)【発明者】

【氏名】ゴレン、 マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ブラコフ、 ダリャ

(72)【発明者】

【氏名】チェン、 ガン

(72)【発明者】

【氏名】ツァオ、 ユ

(72)【発明者】

【氏名】デシュパンデ、 ディパリ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA13

4B065AA90Y

4B065AA91X

4B065AA93X

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA46

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045CA50

4H045DA86

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、複数の安定した組み込み部位を含む哺乳動物細胞を提供する。本発明は、ゲノム的にゲノムセーフハーバーに導入された部位、及びその特定のゲノムセーフハーバーの外部（別のゲノムセーフハーバーを含むがこれに限定されない）にゲノム的に導入された部位を提供する。目的のポリペプチド又はＲＮＡをコードする目的のポリヌクレオチドは、本発明に従って提供された安定した組み込み部位に挿入することができる。本発明の細胞及び方法は、ウイルスタンパク質を含む任意のタンパク質の高収率産生のために使用することができる。追加的に、本発明の細胞及び方法は、ＡＡＶなどのウイルスベクター、抗体、及び他のタンパク質の産生に有用である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゲノムセーフハーバーに位置する第１の安定した組み込み部位、及び前記ゲノムセーフハーバーに位置しない第２の安定した組み込み部位を含む哺乳動物細胞であって、前記第１の安定した組み込み部位が、第１のレポータータンパク質をコードする第１のレポーター遺伝子を含み、前記第２の安定した組み込み部位が、第２のレポータータンパク質をコードする第２のレポーター遺伝子を含み、前記第１のレポータータンパク質と前記第２のレポータータンパク質とが異なる、哺乳動物細胞。

【請求項2】

前記第１の安定した組み込み部位及び前記第２の安定した組み込み部位が、リコンビナーゼ認識部位を含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項3】

前記第１のレポーター遺伝子が、ＳＶ４０プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項4】

前記第２のレポーター遺伝子が、ＳＶ４０プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項5】

前記第１のレポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする、請求項１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項6】

前記第２のレポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする、請求項１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項7】

前記細胞が、ＣＭＶプロモーターの制御下でリプレッサーをコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項8】

前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項9】

前記ヒト細胞が、ヒト羊膜上皮細胞である、請求項８に記載の哺乳動物細胞。

【請求項10】

前記ヒト細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項８に記載の哺乳動物細胞。

【請求項11】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項12】

前記リコンビナーゼ認識部位が、ｌｏｘ部位である、請求項２に記載の哺乳動物細胞。

【請求項13】

目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、前記第１の安定した組み込み部位又は前記第２の安定した組み込み部位に挿入される、請求項１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項14】

前記第２の安定した組み込み部位が、前記第１のゲノムセーフハーバーとは異なる第２のゲノムセーフハーバーに位置する、請求項１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項15】

前記第２の安定した組み込み部位が、ゲノムセーフハーバーではない領域に位置する、請求項１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項16】

ゲノムセーフハーバーに位置する第１の安定した組み込み部位、及び前記ゲノムセーフハーバーに位置しない第２の安定した組み込み部位を含む哺乳動物細胞であって、前記第１の安定した組み込み部位が、第１のタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２の安定した組み込み部位が、第２のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含む、哺乳動物細胞。

【請求項17】

前記第１のタンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項１６に記載の哺乳動物細胞。

【請求項18】

前記第２のタンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項１６に記載の哺乳動物細胞。

【請求項19】

前記第１のタンパク質が、アデノウイルス関連ウイルスタンパク質である、請求項１６に記載の哺乳動物細胞。

【請求項20】

前記第２のタンパク質が、アデノウイルス関連ウイルスタンパク質である、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。

【請求項21】

前記第１のタンパク質が、アデノウイルスタンパク質である、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。

【請求項22】

前記第２のタンパク質が、アデノウイルスタンパク質である、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。

【請求項23】

前記哺乳動物細胞が、アデノ随伴ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びアデノウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の哺乳動物細胞。

【請求項24】

前記第２の安定した組み込み部位が、前記第１のゲノムセーフハーバーとは異なる第２のゲノムセーフハーバーに位置する、請求項１６に記載の哺乳動物細胞。

【請求項25】

前記第２の安定した組み込み部位が、ゲノムセーフハーバーではない領域に位置する、請求項１６に記載の哺乳動物細胞。

【請求項26】

前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１６に記載の哺乳動物細胞。

【請求項27】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１６に記載の哺乳動物細胞。

【請求項28】

ゲノムセーフハーバーに位置する第１の安定した組み込み部位、及び前記ゲノムセーフハーバーに位置しない第２の安定した組み込み部位を含む哺乳動物細胞であって、前記第１の安定した組み込み部位が、第１のレポータータンパク質をコードする第１のレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、前記第２の安定した組み込み部位が、Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド及び第２のレポータータンパク質をコードする第２のレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、前記第１のレポータータンパク質と前記第２のレポータータンパク質とが異なる、哺乳動物細胞。

【請求項29】

前記第２の安定した組み込み部位が、選択マーカー遺伝子及び配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を更に含む、請求項２８に記載の哺乳動物細胞。

【請求項30】

前記第１の安定した組み込み部位及び前記第２の安定した組み込み部位が、リコンビナーゼ認識部位を含む、請求項２８に記載の哺乳動物細胞。

【請求項31】

前記哺乳動物細胞が、ヒト羊膜上皮細胞である、請求項２８に記載の哺乳動物細胞。

【請求項32】

前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項２８に記載の哺乳動物細胞。

【請求項33】

前記哺乳動物細胞が、ＢＨＫ細胞である、請求項２８に記載の哺乳動物細胞。

【請求項34】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項２８に記載の哺乳動物細胞。

【請求項35】

少なくとも１つの目的のタンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）第１のゲノムセーフハーバーに位置する第１の安定した組み込み部位、及び前記第１のゲノムセーフハーバーに位置しない第２の安定した組み込み部位を含む哺乳動物細胞を提供することであって、前記第１の安定した組み込み部位が、第１のレポータータンパク質をコードする第１のレポーター遺伝子を含み、前記第２の安定した組み込み部位が、第２のレポータータンパク質をコードする第２のレポーター遺伝子を含み、前記第１のレポータータンパク質と前記第２のレポータータンパク質とが異なり、前記第１の安定した組み込み部位及び前記第２の安定した組み込み部位が、リコンビナーゼ認識部位を含む、提供することと、
（ｂ）前記目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、リコンビナーゼ媒介性カセット交換によって、安定した組み込み部位に導入することと、
（ｃ）前記目的のポリヌクレオチドをコードする前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、前記哺乳動物細胞を培養することと、を含む、方法。

【請求項36】

前記哺乳動物細胞が、ヒト羊膜上皮細胞である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項３５に記載の方法。

【請求項39】

前記第１の安定した組み込み部位が、第１のタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２の安定した組み込み部位が、第２のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項40】

前記第１のタンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記第２のタンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項３９に記載の方法。

【請求項42】

前記哺乳動物細胞が、アデノ随伴ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びアデノウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項43】

前記第２の安定した組み込み部位が、前記第１のゲノムセーフハーバーとは異なる第２のゲノムセーフハーバーに位置する、請求項３５に記載の方法。

【請求項44】

複数の安定した組み込み部位を有する哺乳動物細胞を作製する方法であって、前記方法が、
（Ａ）５’から３’に向けて順番に、第１のｌｏｘ部位、プロモーター、選択マーカータンパク質をコードする選択マーカー遺伝子、ＩＲＥＳ、第１のレポータータンパク質をコードする第１のレポーター遺伝子、オペレーターに操作可能に連結されたプロモーター、Ｃａｓ９遺伝子、及び第２のｌｏｘ部位をコードするポリヌクレオチドを含む、第１のＤＮＡカセットを含む哺乳動物細胞を提供することと、
（Ｂ）５’から３’に向けて順番に、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ標的部位を含有する第１のゲノムセーフハーバー相同性アーム、第３のｌｏｘ部位、第２のレポータータンパク質をコードする第２のレポーター遺伝子、第４のｌｏｘ部位、及びＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ標的部位を含有する第２のゲノムセーフハーフハーバー相同性アームを含む、ポリヌクレオチドを含む第２のＤＮＡカセットを組み込むことであって、前記第１のｌｏｘ部位、前記第２のｌｏｘ部位、前記第３のｌｏｘ部位、及び前記第４のｌｏｘ部位が異なり、第１のガイドアーム及び第２のガイドアームが、変化を有する領域を含むことができ、前記第２のレポータータンパク質が、前記第１のレポータータンパク質とは異なる、組み込むことと、
（Ｃ）前記第１のＤＮＡカセットを第３のＤＮＡカセットと交換することであって、前記第３のＤＮＡカセットが、５’から３’に向けて順番に、前記第１のｌｏｘ部位、プロモーター、第３のレポータータンパク質をコードする第３のレポーター遺伝子、及び前記第２のｌｏｘ部位をコードするポリヌクレオチドを含み、前記第３のレポータータンパク質が、前記第２のレポータータンパク質とは異なる、交換することと、を含み、それによって、複数の安定した組み込み部位を有する前記哺乳動物細胞を提供する、方法。

【請求項45】

前記変化が、標的化可能な部位を再作製することを防止する、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項４４に記載の方法。

【請求項48】

ステップ（Ａ）の前記細胞が、ＣＭＶプロモーターの制御下でリプレッサーをコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項49】

ステップ（Ｂ）の前記細胞が、ＣＭＶプロモーターの制御下でリプレッサーをコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項50】

ステップ（Ｃ）の前記細胞が、ＣＭＶプロモーターの制御下でリプレッサーをコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項51】

改変ゲノムを含む哺乳動物細胞であって、前記ゲノムが、前記ゲノムの異なる領域内における少なくとも３つのＤＮＡカセットの挿入よって改変されており、前記改変ゲノムが、
（１）改変前に、配列番号１及び２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９０％同一である第１のデオキシリボ核酸配列と、
（２）改変前に、配列番号５～１０からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９０％同一である第２のデオキシリボ核酸配列と、
（３）改変前に、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９０％同一である第３のデオキシリボ核酸配列と、を含み、
前記第１のデオキシリボ核酸配列が、第１のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、前記第２のデオキシリボ核酸配列が、第２のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、前記第３のデオキシリボ核酸配列が、第３のＤＮＡカセットの挿入によって改変される、哺乳動物細胞。

【請求項52】

（１）前記第１のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号１及び２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であり、
（２）前記第２のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号５～１０からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一であり、
（３）前記第３のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９５％同一である、請求項５１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項53】

（１）前記第１のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号１及び２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９８％同一であり、
（２）前記第２のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号５～１０からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９８％同一であり、
（３）前記第３のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９８％同一である、請求項５１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項54】

（１）前記第１のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号１及び２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９９％同一であり、
（２）前記第２のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号５～１０からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９９％同一であり、
（３）前記第３のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９９％同一である、請求項５１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項55】

（ａ）前記第１のＤＮＡカセットが、プロモーターと、選択可能マーカー遺伝子及びレポーター遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つと、を含み、
（ｂ）前記第２のＤＮＡカセットが、プロモーターと、選択可能マーカー遺伝子及びレポーター遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つと、を含み、
（ｃ）前記第３のＤＮＡカセットが、プロモーターと、選択可能マーカー遺伝子及びレポーター遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つと、を含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。

【請求項56】

（ａ）前記第１のＤＮＡカセットが、プロモーター、選択可能マーカー遺伝子、及びレポーター遺伝子を含み、
（ｂ）前記第２のＤＮＡカセットが、プロモーター、選択可能マーカー遺伝子、及びレポーター遺伝子を含み、
（ｃ）前記第３のＤＮＡカセットが、プロモーター、選択可能マーカー遺伝子、及びレポーター遺伝子を含む、請求項５５に記載の哺乳動物細胞。

【請求項57】

前記第１のデオキシリボ核酸配列が、安定した組み込み部位を含む、請求項５５又は５６に記載の哺乳動物細胞。

【請求項58】

目的の遺伝子が、前記安定した組み込み部位に挿入されている、請求項５７に記載の哺乳動物細胞。

【請求項59】

前記目的の遺伝子が、抗体、抗体鎖、受容体、Ｆｃ含有タンパク質、トラップタンパク質、酵素、因子、抑制因子、活性化因子、リガンド、レポータータンパク質、選択タンパク質、タンパク質ホルモン、タンパク質毒素、構造タンパク質、貯蔵タンパク質、輸送タンパク質、神経伝達物質、及び収縮タンパク質からなる群から選択される目的のポリペプチドをコードする、請求項５７に記載の哺乳動物細胞。

【請求項60】

前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞であり、前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項５１～５９のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。

【請求項61】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２と少なくとも９０％同一である、請求項５１～５９のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。

【請求項62】

前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞であり、前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一である、請求項６０に記載の哺乳動物細胞。

【請求項63】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２と少なくとも９５％同一である、請求項６１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項64】

前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞であり、前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号１と少なくとも９８％同一である、請求項６２に記載の哺乳動物細胞。

【請求項65】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２と少なくとも９８％同一である、請求項６３に記載の哺乳動物細胞。

【請求項66】

前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞であり、前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号１と少なくとも９９％同一である、請求項６４に記載の哺乳動物細胞。

【請求項67】

前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２と少なくとも９９％同一である、請求項６５に記載の哺乳動物細胞。

【請求項68】

前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号１３～４１９からなる群から選択されるガイド配列を使用して産生された安定した組み込み部位を含む、請求項６１、６３、６５、又は６７のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。

【請求項69】

前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２の標的配列に相補的であるガイド配列を使用することによって産生された安定した組み込み部位を、（ａ）１～２０００、（ｂ）２００１～４０００、（ｃ）４００１～６０００、（ｄ）６００１～８０００、（ｅ）８００１～１０，０００、（ｆ）１０，００１～１２，０００、（ｇ）１２，００１～１４，０００、（ｈ）１４，００１～１６，０００、（ｉ）１６，００１～１８，０００、（ｊ）１８，００１～２０，０００、（ｋ）２０，００１～２２，０００、（ｌ）２２，００１～２４，０００、（ｍ）２４，００１～２６，０００、（ｎ）２６，００１～２８，０００、（ｏ）２８，００１～３０，０００、（ｐ）３０，００１～３２，０００、（ｑ）３２，００１～３４，０００、（ｒ）３４，００１～３６，０００、（ｓ）３６，００１～３８，０００、（ｔ）３８，００１～４０，０００、（ｕ）４０，００１～４２，０００、及び（ｖ）４２，００１～４４，２３２からなる群から選択されるヌクレオチド位置範囲で含む、請求項６１、６３、６５、又は６７のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。

【請求項70】

改変ゲノムを含む哺乳動物細胞であって、
前記改変ゲノムが、少なくとも１つのＤＮＡカセットの挿入によって改変されたＡＡＶＳ１様領域を含むデオキシリボ核酸配列を含み、
ガイド配列が、前記ＡＡＶＳ１様領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖に相補的である、配列番号１３～４１９からなる群から選択される、哺乳動物細胞。

【請求項71】

改変前に、配列番号５～１０からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９０％同一である第２のデオキシリボ核酸配列と、
改変前に、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９０％同一である、第３のデオキシリボ核酸配列と、を更に含み、
第１のデオキシリボ核酸配列が、第１のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、前記第２のデオキシリボ核酸配列が、第２のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、前記第３のデオキシリボ核酸配列が、第３のＤＮＡカセットの挿入によって改変される、請求項７０に記載の哺乳動物細胞。

【請求項72】

前記第２のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号５～１０からなる群から選択される１つからなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９０％～９９％、９５％～９９％、又は９８％～９９％同一であり、前記第３のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９０％～９９％、９５％～９９％、又は９８％～９９％同一である、請求項７１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項73】

前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２と少なくとも５０～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによって産生された安定した組み込み部位を、ヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で含む、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。

【請求項74】

前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２と少なくとも７５～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによって産生された安定した組み込み部位を、ヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で含む、請求項７３に記載の哺乳動物細胞。

【請求項75】

前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２と少なくとも８５～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによって産生された安定した組み込み部位を、ヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で含む、請求項７４に記載の哺乳動物細胞。

【請求項76】

前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２と少なくとも９０～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによって産生された安定した組み込み部位を、ヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で含む、請求項７５に記載の哺乳動物細胞。

【請求項77】

前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２と少なくとも９５～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによって産生された安定した組み込み部位を、ヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で含む、請求項７６に記載の哺乳動物細胞。

【請求項78】

前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２と少なくとも９８～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによって産生された安定した組み込み部位を、ヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で含む、請求項７７に記載の哺乳動物細胞。

【請求項79】

改変ゲノムを含む哺乳動物細胞であって、
前記改変ゲノムが、ＡＡＶＳ１様領域に安定した組み込み部位を含み、前記安定した組み込み部位が、配列番号２と少なくとも５０～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによってヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で産生される、哺乳動物細胞。

【請求項80】

前記改変ゲノムが、ＡＡＶＳ１様領域に安定した組み込み部位を含み、前記安定した組み込み部位が、配列番号２と少なくとも７５～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによってヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で産生される、請求項７９に記載の哺乳動物細胞。

【請求項81】

前記改変ゲノムが、ＡＡＶＳ１様領域に安定した組み込み部位を含み、前記安定した組み込み部位が、配列番号２と少なくとも８５～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによってヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で産生される、請求項８０に記載の哺乳動物細胞。

【請求項82】

前記改変ゲノムが、ＡＡＶＳ１様領域に安定した組み込み部位を含み、前記安定した組み込み部位が、配列番号２と少なくとも９０～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによってヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で産生される、請求項８１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項83】

前記改変ゲノムが、ＡＡＶＳ１様領域に安定した組み込み部位を含み、前記安定した組み込み部位が、配列番号２と少なくとも９５～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによってヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で産生される、請求項８２に記載の哺乳動物細胞。

【請求項84】

前記改変ゲノムが、ＡＡＶＳ１様領域に安定した組み込み部位を含み、前記安定した組み込み部位が、配列番号２と少なくとも９８～９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列と相補的であるガイド配列を使用することによってヌクレオチド位置：
（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で産生される、請求項８３に記載の哺乳動物細胞。

【請求項85】

改変前に、配列番号５～１０からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９０％同一である第２のデオキシリボ核酸配列と、
改変前に、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９０％同一である第３のデオキシリボ核酸配列と、を更に含み、
前記第１のデオキシリボ核酸配列が、第１のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、前記第２のデオキシリボ核酸配列が、第２のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、前記第３のデオキシリボ核酸配列が、第３のＤＮＡカセットの挿入によって改変される、請求項７８～８４のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。

【請求項86】

前記第２のデオキシリボ核酸配列が少なくとも、改変前に、前記配列番号５～１０からなる群から選択される１つからなる群から選択される少なくとも１つに対して９０％～９９％、９５％～９９％、又は９８％～９９％同一であり、前記第３のデオキシリボ核酸配列が、改変前に、前記配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも９０％～９９％、９５％～９９％、又は９８％～９９％同一である、請求項８５に記載の哺乳動物細胞。

【請求項87】

タンパク質を産生する方法であって、前記方法が、
（１）請求項５１～８６のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞を培養するステップと、
（２）前記タンパク質を収集するステップと、を含む、方法。

【請求項88】

前記方法のうちのいずれかによる、細胞。

【請求項89】

前記細胞のうちのいずれかを使用する、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年１０月１８日に出願された米国出願第６３／２５６，６７５号の優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、組み込まれたＣａｓ９遺伝子を使用して産生することができる、複数の安定した組み込み部位（ＳＩＳ）を含む、ヒト及びげっ歯類細胞（細胞株を含む）を含む、哺乳動物細胞（細胞株を含む）を提供する。本発明は、（１）ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）、例えば、ＡＡＶＳ１（アデノ随伴ウイルス組み込み部位１）及びＡＡＶＳ１様にゲノム的に導入され、かつ（２）異なるゲノムセーフハーバー又はゲノムセーフハーバーではない他の領域など、その特定のゲノムセーフハーバーの外部にゲノム的に導入された、安定した組み込み部位を提供する。目的のポリペプチド又はＲＮＡをコードする目的のポリデオキシリボヌクレオチドは、本発明に従って提供された安定した組み込み部位に挿入することができる。

【0002】

電子的配列表の参照
本出願は、．ＸＭＬ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年１０月７日に作成された当該．ＸＭＬコピーは、「１３５９７５－９７４０２．ｘｍｌ」と名付けられ、サイズは７０９，２０５バイトである。この．ＸＭＬファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

哺乳動物細胞株は、抗体などの治療用タンパク質の商業的な量を産生するための好ましいアプローチである。しかしながら、改変哺乳動物細胞は、多くの場合、遺伝子的及び後成的な不安定性のために産生減少を示すことが報告されている。Ｈｉｌｌｉａｒｄ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１８：６５９－７５（２０２１）。

【0004】

ポリヌクレオチドの組み込みは、形質転換した細胞を作製及び維持するための好ましいアプローチである。ヒトＡＡＶＳ１への特定の配列の組み込みが、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｏｔｅ，７：６２６（２０１４）及びＲａｍａｃｈａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：ｅ１０７（２０１１）で考察されている。ヒトＡＡＶＳ１は、ゲノムセーフハーバーとして知られている。Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４：６７８－８４（２０１６）。Ｇａｉｄｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６：４０７２－８６（２０１８）は、ランディングパッドへのＤＮＡ組み込みのための部位を開示している。

【0005】

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及び仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）が、治療用タンパク質の産生に使用され、ハムスターゲノムは広範囲に試験されている。Ｈａｍａｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｅは、安定した組み込みのための潜在的な部位としてＣＨＯ染色体遺伝子座を報告しており、それらを「ゲノムホットスポット」と呼んでいる。 Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．２２：１５２－６０（２０１８）の１５３ページ。表１において、Ｈａｍａｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｅは、３０個のホットスポット遺伝子座を特定し、そのうちの１７個は遺伝子によって特定され、１３個は注釈なしである。Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．２２：１５２－６０（２０１８）の１５４ページ。この研究は、エピゲノム分析を使用してＣＨＯにおけるセーフハーバー領域を特定しようと試みたＨｉｌｌｉａｒｄ ａｎｄ Ｌｅｅによって続けられた。Ｈｉｌｌｉａｒｄ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１８：６５９－７５（２０２１）。著者らは、ＣＨＯゲノムの１０．９％が、増強した遺伝子的及び後成的安定性を有するクロマチン構造を含んだことを決定した。著者らは更に、Ｈａｍａｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｅによって特定された表１の３０個のホットスポットのうちの５個が、ハイスループット染色体立体配座捕捉（Ｈｉ－Ｃ）によって決定された安定した領域と重複したことを決定した。領域に最も接近した遺伝子は、ＡＬＤＨ５Ａ１、ＳＭＡＤ６、及びＣＬＣＮ３であり、他の２つの領域は、注釈なしだった。Ｈｉｌｌｉａｒｄ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１８：６５９－７５（２０２１）のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｔａｂｌｅ３（Ｓ３）。Ｇａｉｄｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６：４０７２－８６（２０１８）のＴａｂｌｅ１も、ＣＨＯ細胞における組み込みのための遺伝子座を特定する。Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｓ．５：８５７２（２０１５）は、ＣＯＳＭＣ遺伝子座を特定する。

【0006】

本発明は、複数のＤＮＡカセット及び目的の他のポリデオキシリボヌクレオチドの安定した組み込みのために、複数の安定した組み込み部位を有する哺乳動物細胞を提供するように更に改変されている、哺乳動物細胞中間体を効率的に作製するために組み込まれたＣａｓ９遺伝子を有利に用いる。本発明により、安定した組み込み部位は、ゲノムセーフハーバー、又は新たに特定されたゲノムセーフハーバーを含む他の領域に位置することができる。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、哺乳動物細胞を提供し、その任意の細胞は、ゲノムセーフハーバーに位置する第１の安定した組み込み部位及びゲノムセーフハーバーに位置しない第２の安定した組み込み部位を含むことができ、第１の安定した組み込み部位は、第１のレポータータンパク質をコードする第１のレポーター遺伝子を含み、第２の安定した組み込み部位は、第２のレポータータンパク質をコードする第２のレポーター遺伝子を含み、第１のレポータータンパク質と第２のレポータータンパク質とは異なる。第１及び第２の安定な組み込み部位は、リコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）を含むことができる。第１及び第２のレポーター遺伝子は、ＳＶ４０プロモーターの制御下にあることができる。第１及び第２のレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質であることができる。細胞は、ＣＭＶプロモーターの制御下でリプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に含むことができる。細胞は、ヒト羊膜上皮細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又はＢＨＫ細胞であることができる。目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第１の安定した組み込み部位又は第２の安定した組み込み部位に挿入することができる。第２の安定した組み込み部位は、第１のゲノムセーフハーバーとは異なる第２のゲノムセーフハーバーに、又はゲノムセーフハーバーではない領域に位置することができる。

【0008】

本発明はまた、哺乳動物細胞を提供し、その任意の細胞は、ゲノムセーフハーバーに位置する第１の安定した組み込み部位、及び第１のゲノムセーフハーバーに位置しない第２の安定した組み込み部位を含むことができ、第１の安定した組み込み部位は、第１のタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを含み、第２の安定した組み込み部位は、第２のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含む。第１及び第２のタンパク質は、アデノウイルス関連ウイルスタンパク質又はアデノウイルスタンパク質などのウイルスタンパク質であることができる。例えば、哺乳動物細胞は、アデノ随伴ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びアデノウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドには、例えば、抗体遺伝子が含まれるが、これに限定されない。細胞は、第１の安定した組み込み部位が位置する第１のゲノムセーフハーバーとは異なる第２のゲノムセーフハーバーに、又はゲノムセーフハーバーではない領域に位置する第２の安定した組み込み部位を有することができる。

【0009】

本発明は更に、哺乳動物細胞を提供し、その任意の細胞は、ゲノムセーフハーバーに位置する第１の安定した組み込み部位及びゲノムセーフハーバーに位置しない第２の安定した組み込み部位を含むことができ、第１の安定した組み込み部位は、第１のレポータータンパク質をコードする第１のレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、第２の安定した組み込み部位は、Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド及び第２のレポータータンパク質をコードする第２のレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、第１のレポータータンパク質と第２のレポータータンパク質とは異なる。第２の安定した組み込み部位は、選択マーカー遺伝子及び配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を更に含むことができる。第１及び第２の安定した組み込み部位は、リコンビナーゼ認識部位を含むことができる。第１及び第２のレポーター遺伝子は、ＳＶ４０プロモーターの制御下にあることができる。第１及び第２のレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質であることができる。細胞は、プロモーター（例えば、ＣＭＶ）の制御下でリプレッサー（例えば、ＴｅｔＲ）をコードするポリヌクレオチドを更に含むことができる。細胞は、ヒト羊膜上皮細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又はＢＨＫ細胞であることができる。目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第１の安定した組み込み部位又は第２の安定した組み込み部位に挿入することができる。選択マーカータンパク質は、薬物耐性を付与することができる。第２のレポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、ＩＲＥＳ、及びＳＶ４０プロモーターは、ＤＮＡカセットに配置することができる。細胞は、プロモーター（例えば、ＣＭＶ）の制御下でリプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に含むことができる。第２の安定した組み込み部位は、第１の安定した組み込み部位が位置する第１のゲノムセーフハーバーとは異なる第２のゲノムセーフハーバーに、又はゲノムセーフハーバーではない領域に位置することができる。第１のレポーター遺伝子は、５’ゲノムセーフハーバー相同性アーム及び３’ゲノムセーフハーバー相同性アームに隣接し得る。５’ゲノムセーフハーバー相同性アームは、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ標的部位を含むことができ、３’ゲノムセーフハーバー相同性アームは、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ標的部位を含むことができる。

【0010】

本発明は、少なくとも１つの目的のタンパク質を作製するための方法を更に提供し、その任意の方法は、（ａ）ゲノムセーフハーバーに位置する第１の安定した組み込み部位、及び第１のゲノムセーフハーバーに位置しない第２の安定した組み込み部位を含む哺乳動物細胞を提供することであって、第１の安定した組み込み部位が、第１のレポータータンパク質をコードする第１のレポーター遺伝子を含み、第２の安定した組み込み部位が、第２のレポータータンパク質をコードする第２のレポーター遺伝子を含み、第１のレポータータンパク質と第２のレポータータンパク質とは異なり、第１及び第２の安定した組み込み部位が、リコンビナーゼ認識部位を含む、提供することと、（ｂ）目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、リコンビナーゼ媒介性カセット交換によって安定した組み込み部位に導入することと、（ｃ）目的のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、哺乳動物細胞を培養することと、を含むことができる。第１及び第２のレポーター遺伝子は、ＳＶ４０プロモーターの制御下にあることができる。第１及び第２のレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質であることができる。細胞は、ＣＭＶプロモーターの制御下でリプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に含むことができる。細胞は、ヒト羊膜上皮細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又はＢＨＫ細胞であることができる。目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第１の安定した組み込み部位又は第２の安定した組み込み部位に挿入することができる。第２の安定した組み込み部位は、第１の安定した組み込み部位が位置する第１のゲノムセーフハーバーとは異なる第２のゲノムセーフハーバーに、又はゲノムセーフハーバーではない領域に位置することができる。第１の安定した組み込み部位は、第１のタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを含み、第２の安定した組み込み部位は、第２のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含む。第１及び第２のタンパク質は、アデノウイルス関連ウイルスタンパク質又はアデノウイルスタンパク質などのウイルスタンパク質であることができる。例えば、哺乳動物細胞は、アデノ随伴ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びアデノウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドには、例えば、抗体遺伝子が含まれるが、これに限定されない。第２の安定した組み込み部位はまた、ゲノムセーフハーバーではない領域に位置することができる。

【0011】

本発明は、複数の安定した組み込み部位を有する哺乳動物細胞を作製する方法を更に提供し、その任意の方法は、（Ａ）５’から３’に向けて順番に、第１のｌｏｘ部位、プロモーター、選択マーカータンパク質をコードする選択マーカー遺伝子、ＩＲＥＳ、第１のレポータータンパク質をコードする第１のレポーター遺伝子、オペレーターに操作可能に連結されたプロモーター、Ｃａｓ９遺伝子、及び第２のｌｏｘ部位をコードするポリヌクレオチドを含む、第１のＤＮＡカセットを含む哺乳動物細胞を提供することと、（Ｂ）５’から３’に向けて順番に、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ標的部位を含む第１のゲノムセーフハーバー相同性アーム、第３のｌｏｘ部位、第２のレポータータンパク質をコードする第２のレポーター遺伝子、第４のｌｏｘ部位、及びＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ標的部位を含む第２のゲノムセーフハーバー相同性アームを含むポリヌクレオチドを含む、第２のＤＮＡカセットを組み込むことであって、第１のｌｏｘ部位、第２のｌｏｘ部位、第３のｌｏｘ部位、及び第４のｌｏｘ部位が異なり、第１及び第２のガイドアームが、変化を有する領域を含むことができ（必要に応じて、標的化可能部位を再作製することを回避する）、第２のレポータータンパク質が、第１のレポータータンパク質と異なる、組み込むことと、（Ｃ）第１のＤＮＡカセットを第３のＤＮＡカセットと交換することであって、第３のＤＮＡカセットが、５’から３’に向けて順番に、第１のｌｏｘ部位、プロモーター、第３のレポータータンパク質をコードする第３のレポーター遺伝子、及び第２のｌｏｘ部位をコードするポリヌクレオチドを含み、第３のレポータータンパク質が、第２のレポータータンパク質と異なる、交換することと、を含むことができ、これによって、複数の安定した組み込み部位を有する哺乳動物細胞を提供する。哺乳動物細胞は、ヒト羊膜上皮細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又はＢＨＫ細胞であることができる。使用のためのレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質であることができる。ステップ（Ａ）の細胞は、プロモーター（例えば、ＣＭＶ）の制御下でリプレッサー（例えば、ＴｅｔＲ）をコードするポリヌクレオチドを更に含むことができる。ステップ（Ｂ）の細胞は、プロモーター（例えば、ＣＭＶ）の制御下でリプレッサー（例えば、ＴｅｔＲ）をコードするポリヌクレオチドを更に含むことができる。ステップ（Ｃ）の細胞は、プロモーター（例えば、ＣＭＶ）の制御下でリプレッサー（例えば、ＴｅｔＲ）をコードするポリヌクレオチドを更に含むことができる。選択マーカータンパク質は、薬物耐性を付与することができる。ｌｏｘ部位は、最も一般的に使用されるタイプのＲＲＳであるが、異なるＲＲＳを同様に使用することができる。

【0012】

本発明はまた、複数のリコンビナーゼ媒介性カセット交換部位を有する哺乳動物細胞を作製する方法を提供し、その任意の方法は、（Ａ）プロモーター及びリプレッサーをコードするポリヌクレオチドを細胞ゲノムにランダムに組み込むことであって、リプレッサーがリガンドに結合することができる、組み込むことと、（Ｂ）５’から３’に向けて順番に、第１のｌｏｘ部位、プロモーター及び任意選択的にオペレーター、第１のレポータータンパク質をコードする第１のレポーター遺伝子、ＩＲＥＳ、第１の選択メーカータンパク質をコードする第１の選択マーカー遺伝子、並びに第２のｌｏｘ部位をコードするポリヌクレオチドを含む、第１のＤＮＡカセットを細胞ゲノムにランダムに組み込むことであって、第１のｌｏｘ部位と第２のｌｏｘ部位とが異なる、組み込むことと、（Ｃ）第１のＤＮＡカセットを第２のＤＮＡカセットと交換することであって、第２のＤＮＡカセットが、５’から３’に向けて順番に、第１のｌｏｘ部位、プロモーター、第２の選択マーカータンパク質をコードする第２の選択マーカー遺伝子、ＩＲＥＳ、第２のレポータータンパク質をコードする第２のレポーター遺伝子、プロモーター及び任意選択的にオペレーター、Ｃａｓ９遺伝子、並びに第２のｌｏｘ部位をコードするポリヌクレオチドを含み、第１の選択マーカータンパク質と第２の選択マーカータンパク質とが異なり、第１のレポータータンパク質と第２のレポータータンパク質とが異なる、交換することと、（Ｄ）５’から３’に向けて順番に、ｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）標的部位を含む第１のゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）相同性アーム、第３のｌｏｘ部位、第３のレポータータンパク質をコードする第３のレポーター遺伝子、第４のｌｏｘ部位、及びｓｇＲＮＡ標的部位を含む第２のＧＳＨ相同性アームを含むポリヌクレオチドを含む、第３のＤＮＡカセットを組み込むことであって、第１のｌｏｘ部位、第２のｌｏｘ部位、第３のｌｏｘ部位、及び第４のｌｏｘ部位が、異なり、第１及び第２のガイドアームが、変化を有する少なくとも１つの領域を含むことができ（必要に応じて、標的化可能な部位の再作製を回避するため）、第３のレポータータンパク質が、第２のレポータータンパク質とは異なり、第１のレポータータンパク質と同じか又は異なることができる、組み込むことと、（Ｅ）第２のＤＮＡカセットを第４のＤＮＡカセットと交換することであって、第４のＤＮＡカセットが、５’から３’に向けて順番に、第１のｌｏｘ部位、プロモーター、第４のレポータータンパク質をコードする第４のレポーター遺伝子、及び第２のｌｏｘ部位をコードするポリヌクレオチドを含み、第４のレポータータンパク質が、第３のレポータータンパク質及び第２のレポータータンパク質と異なり、好ましくは、第１のレポータータンパク質と異なる、交換することと、を含むことができ、それによって、複数の安定した組み込み部位を有する細胞を提供する。ｌｏｘ部位は、最も一般的に使用されるタイプのＲＲＳであるが、異なるＲＲＳを同様に使用することができる。

【0013】

本発明は更に、改変ゲノムを含む哺乳動物細胞を提供し、所与のゲノムは、ゲノムの異なる領域内における少なくとも３つのＤＮＡカセットの挿入によって改変され、改変ゲノムは、（１）改変前に、配列番号１及び２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、第１のデオキシリボ核酸配列と、（２）改変前に、配列番号５～１０からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、第２のデオキシリボ核酸配列と、（３）改変前に、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、第３のデオキシリボ核酸と、を含み、第１のデオキシリボ核酸配列は、第１のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、第２のデオキシリボ核酸配列は、第２のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、第３のデオキシリボ核酸配列は、第３のＤＮＡカセットの挿入によって改変される。哺乳動物細胞は、各々、（ａ）プロモーター、並びに選択可能マーカー遺伝子及びレポーター遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つを含む第１のＤＮＡカセットと、（ｂ）プロモーター、並びに選択可能マーカー遺伝子及びレポーター遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つを含む第２のＤＮＡカセットと、（ｃ）プロモーター、並びに選択可能マーカー遺伝子及びレポーター遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つを含む第３のＤＮＡカセットと、を有することができる。更に、哺乳動物細胞は、各々、（ａ）プロモーター、選択可能マーカー遺伝子、及びレポーター遺伝子を含む第１のＤＮＡカセットと、（ｂ）プロモーター、選択可能マーカー遺伝子、及びレポーター遺伝子を含む第２のＤＮＡカセットと、（ｃ）プロモーター、選択可能マーカー遺伝子、及びレポーター遺伝子を含む第３のＤＮＡカセットと、を有することができる。第１のデオキシリボ核酸配列は、安定した組み込み部位、及びそこに挿入された目的の遺伝子を含む。目的の遺伝子は、抗体、抗体鎖、受容体、Ｆｃ含有タンパク質、トラップタンパク質、酵素、因子、抑制因子、活性化因子、リガンド、レポータータンパク質、選択タンパク質、タンパク質ホルモン、タンパク質毒素、構造タンパク質、貯蔵タンパク質、輸送タンパク質、神経伝達物質、及び収縮タンパク質からなる群から選択される目的のポリペプチドをコードすることができる。哺乳動物細胞は、ヒト細胞であることができ、第１のデオキシリボ核酸配列は、配列番号１と少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。代替的に、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞であることができ、第１のデオキシリボ核酸配列は、配列番号２と少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。第１のデオキシリボ核酸配列は、配列番号１３～４１９からなる群から選択されるガイド配列を使用して産生された安定した組み込み部位を含むことができる。追加的に、第１のデオキシリボ核酸配列は、配列番号２の標的配列に結合し、かつ／又はそれに相補的であるガイド配列を使用することによって産生された安定した組み込み部位を、（ａ）１～２０００、（ｂ）２００１～４０００、（ｃ）４００１～６０００、（ｄ）６００１～８０００、（ｅ）８００１～１０，０００、（ｆ）１０，００１～１２，０００、（ｇ）１２，００１～１４，０００、（ｈ）１４，００１～１６，０００、（ｉ）１６，００１～１８，０００、（ｊ）１８，００１～２０，０００、（ｋ）２０，００１～２２，０００、（ｌ）２２，００１～２４，０００、（ｍ）２４，００１～２６，０００、（ｎ）２６，００１～２８，０００、（ｏ）２８，００１～３０，０００、（ｐ）３０，００１～３２，０００、（ｑ）３２，００１～３４，０００、（ｒ）３４，００１～３６，０００、（ｓ）３６，００１～３８，０００、（ｔ）３８，００１～４０，０００、（ｕ）４０，００１～４２，０００、及び（ｖ）４２，００１～末端（４４，２３２）からなる群から選択されるヌクレオチド位置範囲で含むことができる。

【0014】

追加的に、改変ゲノムを含む哺乳動物細胞が提供され、改変ゲノムは、少なくとも１つのＤＮＡカセットの挿入によって改変されたＡＡＶＳ１様領域を含むデオキシリボ核酸配列を含み、ガイド配列は、ＡＡＶＳ１様領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合し、かつ／又はそれに相補的である、配列番号１３～４１９からなる群から選択される。哺乳動物細胞は、改変前に、配列番号５～１０からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、第２のデオキシリボ核酸配列と、改変前に、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、第３のデオキシリボ核酸と、を含み、第１のデオキシリボ核酸配列は、第１のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、第２のデオキシリボ核酸配列は、第２のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、第３のデオキシリボ核酸配列は、第３のＤＮＡカセットの挿入によって改変される。第２のデオキシリボ核酸配列は、改変前に、配列番号５～１０からなる群から選択される少なくとも１つからなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり、第３のデオキシリボ核酸は、改変前に、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。第１のデオキシリボ核酸配列は、配列番号２と少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列に結合し、かつ／又は相補的であるガイド配列を使用することによって産生される安定した組み込み部位を、ヌクレオチド位置：（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で含む。

【0015】

また改変ゲノムを含む哺乳動物細胞が提供され、改変ゲノムは、ＡＡＶＳ１様領域に安定した組み込み部位を含み、安定した組み込み部位は、配列番号２と少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する少なくとも１つの標的配列に結合し、かつ／又は相補的であるガイド配列を使用することによって、ヌクレオチド位置：（ａ）１～２０００、又は（ｂ）２００１～４０００、又は（ｃ）４００１～６０００、又は（ｄ）６００１～８０００、又は（ｅ）８００１～１０，０００、又は（ｆ）１０，００１～１２，０００、又は（ｇ）１２，００１～１４，０００、又は（ｈ）１４，００１～１６，０００、又は（ｉ）１６，００１～１８，０００、又は（ｊ）１８，００１～２０，０００、又は（ｋ）２０，００１～２２，０００、又は（ｌ）２２，００１～２４，０００、又は（ｍ）２４，００１～２６，０００、又は（ｎ）２６，００１～２８，０００、又は（ｏ）２８，００１～３０，０００、又は（ｐ）３０，００１～３２，０００、又は（ｑ）３２，００１～３４，０００、又は（ｒ）３４，００１～３６，０００、又は（ｓ）３６，００１～３８，０００、又は（ｔ）３８，００１～４０，０００、又は（ｕ）４０，００１～４２，０００、又は（ｖ）４２，００１～４４，２３２で産生される。

【0016】

先行パラグラフによる哺乳動物細胞が更に提供され、改変前に、配列番号５～１０からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、第２のデオキシリボ核酸配列と、改変前に、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、第３のデオキシリボ核酸と、を更に含み、第１のデオキシリボ核酸配列は、第１のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、第２のデオキシリボ核酸配列は、第２のＤＮＡカセットの挿入によって改変され、第３のデオキシリボ核酸配列は、第３のＤＮＡカセットの挿入によって改変される。哺乳動物細胞は、改変前に、配列番号５～１０からなる群から選択される少なくとも１つからなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、第２のデオキシリボ核酸配列と、改変前に、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つに対して少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、第３のデオキシリボ核酸と、を含むことができる。

【0017】

追加的に、目的のタンパク質を産生する方法が提供され、方法は、（１）上記哺乳動物細胞を培養するステップと、（２）目的のタンパク質を収集するステップと、を含む。また、上記の方法のうちのいずれかに従って作製される細胞、並びに開示された細胞を使用する方法が提供される。

【0018】

以下の図は、ゲノムの異なる領域に安定した組み込み部位を有する細胞を作製し、その後、ゲノムの異なる領域に安定した組み込み部位を有する細胞を作製するのに有用な中間細胞の例示的な進行及び作製を示す。これらの図は、本発明の実施形態を例示し、いかなる手段でも本発明を限定しない。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】プロモーターの転写制御下でリプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチド及びポリアデニル化シグナルを有する細胞の改変を概略的に示し、ポリヌクレオチドは、細胞ゲノムにランダムに挿入される。

【0020】

【図2】図１の細胞の改変を、ＤＮＡカセット（１）が細胞ゲノムにランダムに、又は部位特異的に挿入された後に概略的に示す。ＤＮＡカセット（１）は、隣接するｌｏｘ部位（１及び２）、プロモーター、レポーター遺伝子（１）、ＩＲＥＳ、選択マーカー遺伝子（１）、及びポリアデニル化シグナルを含む。ｌｏｘ部位の代わりに、他のＲＲＳを同様に使用することができる。

【0021】

【図3】図２の細胞の改変を概略的に示し、ＤＮＡカセット（１）は、リコンビナーゼ媒介性カセット交換によってＤＮＡカセット（２）と置き換えられる。ＤＮＡカセット（２）は、隣接するｌｏｘ部位（１及び２）、プロモーター、選択マーカー遺伝子（２）、ＩＲＥＳ、及びレポーター遺伝子（２）、及びポリアデニル化シグナル、並びに第２のプロモーターの制御下（オペレーターは任意選択的である）で第２のポリアデニル化シグナルを有するＣａｓ９遺伝子を含む。ｌｏｘ部位の代わりに、他のＲＲＳを同様に使用することができる。

【0022】

【図4】ゲノムセーフハーバーに挿入されたプロモーターの制御下で、隣接するゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）相同性アーム、ｌｏｘ部位（３及び４）、及びポリアデニル化シグナルを有するレポーター遺伝子（３）を含む、ＤＮＡカセット（３）を有する図３の細胞の改変を概略的に示す。挿入は部位特異的組み込みであり、Ｌｏｘ３とＬｏｘ４との間に安定した組み込み部位を作製する。ｌｏｘ部位の代わりに、他のＲＲＳを同様に使用することができる。

【0023】

【図5】図４の細胞の改変を概略的に示し、ＤＮＡカセット（２）は、リコンビナーゼ媒介性カセット交換によってＤＮＡカセット（４）と置き換えられる。ＤＮＡカセット（４）は、プロモーターの制御下で、隣接するｌｏｘ部位（１及び２）、レポーター遺伝子（４）、及びポリアデニル化シグナルを含む。この交換は、Ｃａｓ９遺伝子を除去する。ｌｏｘ部位の代わりに、他のＲＲＳを同様に使用することができる。

【0024】

【図6】実施例６で使用されるｓｇＲＮＡプラスミドを概略的に示す。

【0025】

【図7】ＨＤＲテンプレートなし（対照）、１０４マーＨＤＲテンプレート、４０１マーＨＤＲテンプレート、及び１０３０マーＨＤＲテンプレートについて、緑色蛍光タンパク質陽性集団（Ｑ１）を示す実施例６のプロットを示す。ＧＦＰ陽性は垂直軸であり、ＣＦＰ陽性は水平軸である。

【0026】

【図8】Ｌｏｘ部位３及び４に隣接する安定して組み込まれたＣａｓ９遺伝子を有する哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）を概略的に示す。Ｃａｓ９遺伝子は、少なくともプロモーター（示されていない）の制御下にある。ＡＡＶＳ１も概略的に示される。ｌｏｘ部位の代わりに、他のＲＲＳを同様に使用することができる。プロモーターは、遺伝子の５’に存在するが、図示されない。

【0027】

【図9A】ｓｇＲＮＡ標的部位、ゲノムセーフハーバー（ここではＡＡＶＳ１）などの領域への挿入のための左側相同性アーム（ここでは、ＧＳＨ相同性アーム）、Ｌｏｘ１部位、レポーター遺伝子（色１）、Ｌｏｘ２部位、ゲノムセーフハーバー（ここでは、ＡＡＶＳ１）などの領域への挿入のための右側相同性アーム（ここでは、ＧＳＨ相同性アーム）を含む標的化プラスミドを概略的に示す。３’末端で、Ａは、レポーター遺伝子（色２）を概略的に示す。プロモーター及び任意選択的に他の部分（オペレーターなど）は、５’から３’方向に示される矢印によって表される。両方のプラスミドは、ゲノムセーフハーバーなどの領域に色１を挿入する。ｌｏｘ部位の代わりに、他のＲＲＳを同様に使用することができる。

【図9B】ｓｇＲＮＡ標的部位、ゲノムセーフハーバー（ここではＡＡＶＳ１）などの領域への挿入のための左側相同性アーム（ここでは、ＧＳＨ相同性アーム）、Ｌｏｘ１部位、レポーター遺伝子（色１）、Ｌｏｘ２部位、ゲノムセーフハーバー（ここでは、ＡＡＶＳ１）などの領域への挿入のための右側相同性アーム（ここでは、ＧＳＨ相同性アーム）を含む標的化プラスミドを概略的に示す。３’末端で、Ｂは、３’末端で陰性選択遺伝子（陰性選択１）を概略的に示す。プロモーター及び任意選択的に他の部分（オペレーターなど）は、５’から３’方向に示される矢印によって表される。両方のプラスミドは、ゲノムセーフハーバーなどの領域に色１を挿入する。ｌｏｘ部位の代わりに、他のＲＲＳを同様に使用することができる。

【0028】

【図10】哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）のゲノムセーフハーバー（ＡＡＶＳ１）へのＣａｓ９媒介性組み込み後の結果を概略的に示す。色１は、Ｌｏｘ１及びＬｏｘ２に隣接している。目的の遺伝子は、ＲＭＣＥを介して色１を置き換えることができる。図９Ａによる標的化プラスミドが適切に組み込まれるとき、細胞は色１陽性及び色２陰性になる。図９Ｂによる標的化プラスミドが適切に組み込まれるとき、細胞は色１陽性であり、陰性選択遺伝子が除去されるため、増殖できるようになる。ｌｏｘ部位の代わりに、他のＲＲＳを同様に使用することができる。プロモーター及び任意選択的に他の部分（オペレーターなど）は、５’から３’方向に示される矢印によって表される。

【0029】

【図11】図１０の挿入をより詳細に概略的に示す。ＡＡＶＳ１を含む細胞ゲノムは、インサート並びに５’末端及び３’末端に隣接している。色１は、Ｌｏｘ１及びＬｏｘ２に隣接している。図１１、左側は、５’ジャンクションＰＣＲで使用された５’ゲノムプライマー及び３’挿入プライマーの位置を示す。図１１、右側は、３’ジャンクションＰＣＲで使用された５’挿入プライマー及び３’ゲノムプライマーの位置を示す。ｌｏｘ部位の代わりに、他のＲＲＳを同様に使用することができる。色１遺伝子のプロモーター５’は、５’矢印として示される。

【0030】

【図12】正しいサイズの断片が、図１１に概略的に示されるジャンクションＰＣＲによって、ＨＥＫ２９３細胞で増幅されることを示す。安定したＣａｓ９標的化ＨＥＫ２９３細胞並びに５’ジャンクション及び３’ジャンクションが得られ、検出され、正しい挿入を確立する。

【0031】

【図13】正しいサイズの断片が、図１１に概略的に示されるジャンクションＰＣＲによって、ＣＨＯ細胞で増幅されることを示す。安定したＣａｓ９標的化ＣＨＯ細胞並びに５’ジャンクション及び３’ジャンクションが得られ、検出され、正しい挿入を確立する。ｌｏｘ部位の代わりに、他のＲＲＳを同様に使用することができる。

【0032】

【図14】隣接するＲＲＳ（ここでは、ｌｏｘ１及びｌｏｘ２）を有するゲノムの領域に組み込まれた３つのカセットを含む例示的な細胞を概略的に示す。細胞型に応じて、３つのカセットの各々は、位置Ａで概略的に示される異なる安定した組み込み部位（例えば、ＡＡＶＳ１様）、並びに位置Ｂ及びＣで概略的に示される他の利用可能な部位（例えば、安定部位１及び安定部位２）に組み込むことができる。レポーター遺伝子は、同じか又は異なることができる。陰性選択遺伝子は、同じか又は異なることができるが、好ましくは同じである。細胞は、本明細書に含まれる教示に従って、追加の安定した組み込み部位及び組み込まれたカセットを含むことができる。プロモーターは、遺伝子の５’に存在するが、図示されない。

【0033】

【図15】図１４の細胞の改変を、概略的に示した位置Ａ、Ｂ、及びＣで概略的に示す。３つのカセットは、各々、隣接するＲＲＳ（ここでは、ｌｏｘ１及びｌｏｘ２）、目的の遺伝子、陽性選択マーカー遺伝子、及びレポーター＊遺伝子を含む。陽性選択マーカー遺伝子は、同じか又は異なることができるが、好ましくは同じである。レポーター＊遺伝子は、同じか又は異なることができるが、各々は、図１４の細胞におけるレポーター遺伝子のうちのいずれかとは異ならなければならない。目的の遺伝子は、同じか又は異なることができる。図１４のカセットは、ＲＭＣＥによって図１５のカセットで置き換えられる。細胞は、本明細書に含まれる教示に従って、追加の安定した組み込み部位及び組み込まれたカセットを含むことができる。プロモーターは、遺伝子の５’に存在するが、図示されない。

【0034】

【図16】２部位ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｂ及びＣ）と比較した、３部位ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ａ、Ｂ、及びＣ）によって産生されたタンパク質を比較する棒グラフである。

【0035】

【図17】隣接するＲＲＳ（ここでは、ｌｏｘ１及びｌｏｘ２、又はｌｏｘ３及びｌｏｘ４）を有するゲノムの領域に組み込まれた４つのカセットを含む例示的な細胞を概略的に示す。細胞型に応じて、４つのカセットの各々は、異なる安定した組み込み部位（及び他の利用可能な部位（安定部位１及び安定部位２など）に組み込むことができ、位置Ａ及びＢ（ＳＩＳ）並びにＣ及びＤ（安定部位１及び２）として概略的に示される。レポーター遺伝子は、同じか又は異なることができる。陰性選択遺伝子は、同じか又は異なることができるが、好ましくは同じである。細胞は、本明細書に含まれる教示に従って、追加の安定した組み込み部位及び組み込まれたカセットを含むことができる。プロモーターは、遺伝子の５’に存在するが、図示されない。

【0036】

【図18】図１７の細胞の改変を、概略的に示した位置Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤで概略的に示す。４つのカセットは、各々、隣接するＲＲＳ（ここでは、ｌｏｘ１及びｌｏｘ２、又はｌｏｘ３及びｌｏｘ４）、目的の遺伝子、陽性選択マーカー遺伝子、及びレポーター＊遺伝子を含む。陽性選択マーカー遺伝子は、同じか又は異なることができるが、好ましくは同じである。レポーター＊遺伝子は、同じか又は異なることができるが、各々は、図１７の細胞におけるレポーター遺伝子のうちのいずれかとは異ならなければならない。目的の遺伝子は、同じか又は異なることができる。この図では、目的の遺伝子１の２つのコピー及び目的遺伝子２の２つのコピーがある。図１７のカセットは、ＲＭＣＥによって図１８のカセットに置き換えられる。細胞は、本明細書に含まれる教示に従って、追加の安定した組み込み部位及び組み込まれたカセットを含むことができる。プロモーターは、遺伝子の５’に存在するが、図示されない。

【発明を実施するための形態】

【0037】

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。

【0038】

数字で表す値及び範囲の文脈における「約」という用語は、本明細書に含まれる教示から明らかであるように、本発明が求められた速度、量、度合、増加、減少、又は発現、濃度、若しくは時間の程度を有するように行うことができるように、列挙された値又は範囲にほぼ近いか、若しくはごく近い値又は範囲を指す。したがって、この用語は、単に系統誤差から生じる値を超えた値を包含する。例えば、「約」は、行う能力に応じて、記載された値をおよそ＋／－１０％以上又はそれ以下の範囲で上回るか又は下回るいずれかの値を示すことができる。

【0039】

「ＡＡＶＳ１」は、ゲノムセーフハーバーであることができ、アデノ随伴ウイルス組み込み部位１を指し、天然のヒト染色体１９に位置し、およそ４．７キロ塩基を含むことが報告されている。ＡＡＶＳ１遺伝子座は、本発明に従って使用することができる。

【0040】

「ＡＡＶＳ１様」は、ＣＨＯ細胞に見出されるＡＡＶＳ１ホモログを指し、本明細書に開示される。ＡＡＶＳ１様ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）を含むＡＡＶＳ１様領域は、本発明に従って使用することができる。配列番号２は、ＡＡＶＳ１様領域の例である。

【0041】

「ＤＮＡカセット」又は「カセット」は、少なくともプロモーター、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム、及び任意選択的に、ポリアデニル化シグナル、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む、核酸部分のタイプである。オペレーターなどの他の核酸部分もまた、任意選択的である。したがって、ＤＮＡカセットは、２つ以上のより短いポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドである。カセットは、１つ以上の遺伝子、並びにプロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終結シグナル、リボソーム進入部位、イントロン、及びポリアデニル化シグナルを含むことができる。

【0042】

「ＣＯＳＭＣ」は、報告により、ハムスター細胞に見出されている。部分的又は全体的なＣＯＳＭＣ遺伝子座のホモログは、本発明による使用のための候補である。

【0043】

「ＣＣＲ５」は、Ｃ－Ｃケモカイン受容体５型遺伝子を指し、報告により、ヒト、マウス、及びラット細胞において見出されている。部分的又は全体的なＣＣＲ５遺伝子座のホモログは、本発明による使用のための候補である。

【0044】

「ゲノムセーフハーバー」又は「ＧＳＨ」は、ＤＮＡカセットなどのポリヌクレオチドの挿入に適応することができ、挿入されたポリヌクレオチドが機能することを可能にし、形質転換された細胞に過度の負担をかけない、細胞ゲノム内の部位を指す。したがって、ゲノムセーフハーバーは、本発明の実施を通じてＤＮＡカセットの挿入のための安定した組み込み部位を作製するための理想的な位置である。本明細書で利用することができるゲノムセーフハーバーには、ＡＡＶＳ１及びＡＡＶＳ１様が含まれるが、これらに限定されない。候補である報告された遺伝子座には、ＣＣＲ５、ＣＯＳＭＣ、及びＲｏｓａ２６が含まれるが、これらに限定されない。

【0045】

「ゲノムセーフハーバー相同性アーム」又は「ＧＳＨ相同性アーム」は、ゲノムセーフハーバーに由来し、ゲノムセーフハーバーに対して相同性を有する。好ましくは、ゲノムセーフハーバー相同性アームは、約１００～２０００塩基、より好ましくは約３００～１８００塩基、より好ましくは約４００～１６００塩基、より好ましくは約５００～１５００塩基、より好ましくは約５００～１３００塩基、より好ましくは約５００～１１００塩基、より好ましくは約５００～１０００塩基、より好ましくは約６００～１０００塩基、より好ましくは約７００～１０００塩基、より好ましくは約８００～１０００塩基、更により好ましくは約９００～１０００塩基を含む。典型的には、ゲノムセーフハーバーに挿入されるべきポリヌクレオチドは、５’ＧＳＨ相同性アーム及び３’ＧＳＨ相同性アームに隣接している。例えば、ＧＳＨ相同性アームに更に隣接しているｌｏｘ部位隣接ＤＮＡカセットを示す図４及び５を参照されたい。

【0046】

「ｈＲｏｓａ２６」は、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座（「逆方向スプライスアクセプタ」）のヒトホモログを指す。「Ｒｏｓａ２６」は、部分的又は全体的なＲｏｓａ２６遺伝子座を指し、報告により、マウス及びヒト細胞に加えて、ハムスター細胞に見出されている。部分的又は全体的なＲｏｓａ２６遺伝子座のホモログは、本発明による使用のための候補である。

【0047】

「イントロン」は、エクソン間に位置するＤＮＡの部分である。イントロンを除去して、成熟したメッセンジャーＲＮＡを形成する。好ましいイントロンは、翻訳の出発点に影響を与えることができるものであり、見本は、ｈＣＭＶ－ＩＥイントロン（ヒトサイトメガロウイルス最初期タンパク質）及びＦＭＤＶイントロン（口蹄疫ウイルス）である。

【0048】

「核酸部分」は、一本鎖又は二本鎖ヌクレオチド配列の任意の配置を含む。核酸部分には、ポリヌクレオチド、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終結シグナル、リボソーム進入部位、及びポリアデニル化シグナルを含むことができるが、これらに限定されない。

【0049】

「操作可能に連結された」とは、１つ以上の他のヌクレオチド配列と機能的関係にある１つ以上のヌクレオチド配列を指す。かかる機能的関係は、選択された設計に従って、作用又は活性を直接的又は間接的に制御、発生、調節、増強、促進、許可、減衰、抑制、又は遮断することができる。典型には、一本鎖又は二本鎖核酸部分が含まれ、配列（複数可）が他のもの（複数可）に少なくとも１つの機能的効果を及ぼすことができるように、所与の部分内に配置された２つ以上のヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド配列のコード領域に操作可能に連結されたプロモーターは、コード領域の転写を促進することができる。エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終結シグナル、リボソーム進入部位、及びポリアデニル化シグナルなどの他のエレメントも、目的のポリヌクレオチドと操作可能に連結されて、その発現を制御することができる。操作可能な連結を達成するための配置及び間隔は、ウェスタンブロット及びＲＴ－ＰＣＲを使用したスクリーニングなどの、当業者に利用可能なアプローチによって確認することができる。

【0050】

「オペレーター」は、ポリヌクレオチド配列が、オペレーターに結合することができる分子の相互作用によって調節され得るように、ポリヌクレオチド配列内又はその付近に導入され、結果として、場合によって、ポリヌクレオチド配列の転写を防止又は可能にする、ＤＮＡ配列を示す。当業者は、オペレーターが、プロモーターによる転写を制御するか又はそれに影響を及ぼすことができるように、プロモーターに十分近位に配置されなければならず、操作可能な連結のタイプとみなすことができることを認識するであろう。オペレーターは、プロモーターの下流又は上流のいずれかに配置され得る。これらには、ＬｅｘＡペプチド及びラクトースに結合するＥ．ｃｏｌｉのＬｅｘＡ遺伝子のオペレーター領域、並びにＥ．ｃｏｌｉのＬａｄ及びｔｒｐＲ遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質に結合する４５個のトリプトファンオペレーターが含まれるが、これらに限定されない。ラムダＰｉ及びファージＰ２２ Ｍｎｔからのバクテリオファージオペレーター並びにＡｒｃ。好ましいオペレーターは、Ｔｅｔ（テトラサイクリン）オペレーター（ＴｅｔＯ又はＴＯ）及びＡｒｃオペレーター（ＡｒｃＯ又はＡＯ）である。オペレーターは、ネイティブ配列又は変異体配列を有することができる。例えば、Ｔｅｔオペレーターの変異体配列は、Ｗｉｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４２５３－４２６６（１９８６）に開示されている。

【0051】

Ｔｅｔオペレーターが好ましく、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）などのリプレッサーを使用して転写を制御するために使用することができる。リプレッサーに対する適切なリガンドは、テトラサイクリン（ｔｅｔ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）、及びそれらの誘導体である。リガンドがＴｅｔＲに結合するとき、Ｔｅｔオペレーターに対するＴｅｔリプレッサーの親和性が低下し、Ｔｅｔリプレッサーがオペレーターから分離し、それによって、オペレーターは転写を許容するようになる。他のリプレッサーは、それら自体のそれぞれのオペレーターとの使用で対形成することができる。

【0052】

「同一性パーセント」又は「％同一な」という語句は、それらの様々な文法的形態において、配列を説明するとき、連続した相同性の領域に沿って列挙された同一性を示す相同配列を含むことを意味するが、比較された配列において相同体を有しないギャップ、欠失、又は挿入の存在は、同一性パーセントを計算する際に考慮されない。本明細書で使用される場合、相同体間の「同一性パーセント」又は「％同一な」決定は、相同体がアラインメントにおいて比較する相同配列を有しない配列の比較を含まない。したがって、「同一性パーセント」及び「％同一な」は、ギャップ、欠失、及び挿入に対するペナルティを含まない。

【0053】

核酸配列の文脈における様々な文法的形態での「相同配列」は、参照核酸配列と実質的に相同である配列を指す。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％～９９％、７５％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９８％、９８％～９９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上が、関連する伸長の残基にわたって同一である場合、実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連する伸長は、完全な（すなわち、全）配列である。

【0054】

「ポリヌクレオチド」は、共有結合したヌクレオチドの配列を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む。オリゴヌクレオチドは、より短いポリヌクレオチドとみなされる。遺伝子は、最終的にポリペプチドをコードするＤＮＡポリヌクレオチド（ポリデオキシリボ核酸）であり、典型的にはＤＮＡから転写された、ＲＮＡ（ポリリボ核酸）から翻訳される。ＤＮＡポリヌクレオチドはまた、翻訳されないＲＮＡポリヌクレオチドをコードすることができ、むしろＲＮＡ「産物」として機能する。ポリヌクレオチドのタイプ（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、用語の使用の文脈から明らかである。コードするポリペプチドによって言及されるか又は特定されるポリヌクレオチドは、コドン縮重に従って、全ての好適な配列を示し、網羅する。本明細書に開示されるものを含むポリヌクレオチドには、指示される場合、パーセント同一性配列及び相同配列が含まれる。

【0055】

「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、共有結合したアミノ酸の配列（複数可）を指す。ポリペプチドには、天然、半合成、及び合成タンパク質、並びにタンパク質断片が含まれる。「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換可能に使用することができる。オリゴペプチドは、より短いポリペプチドとみなされる。

【0056】

「プロモーター」は、それが操作可能に連結されている、すなわち、適切なシグナルが存在し、リプレッサーが不存在であるときに、目的のヌクレオチド配列の転写を可能にするような方法で連結されている、ＤＮＡ配列の転写を引き起こすＤＮＡ配列を示す。目的のポリヌクレオチドの発現は、当該技術分野で既知である任意のプロモーター又はエンハンサーエレメントの制御下に置かれ得る。真核生物プロモーターは、ＴＡＴＡボックスに操作可能に連結することができる。ＴＡＴＡボックスは、典型的には、転写開始部位の上流に位置する。

【0057】

使用され得る有用なプロモーターとしては、ＳＶ４０早期プロモーター領域、ＳＶ４０Ｅ／Ｌ（早期後期）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、マウス又はヒトサイトメガロウイルス主要前初期（ＣＭＶ－ＭＩＥ）プロモーター、並びにＣＭＶｍｉｎプロモーターを含む他のＣＭＶプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ノパリン合成酵素プロモーター領域、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、及び光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーターを含む植物発現ベクター；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、及び組織特異性を示し、トランスジェニック動物：エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、Ｃ－フェトタンパク質、Ｃ．１－抗トリプシン、３－グロビン、及びミオシノ軽鎖－２で利用されている動物転写制御領域などの酵母又は他の真菌からのプロモーターエレメント。様々な形態のＣＭＶプロモーターが、本発明に従って使用することができる。

【0058】

ＣＭＶｍｉｎプロモーターなどの最小限のプロモーターは、切断されたプロモーター又はコアプロモーターであることができ、制御された発現システムにおける使用のために好ましい。最小限のプロモーター及び開発アプローチは、広く知られており、例えば、Ｓａｘｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１６５１：２６３－７３（２０１７）、Ｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．５：３９５－４０４（２０１６）、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ．１１１：１６３８－４７（２０１４）、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ０：１－５（２０１２）、Ｌａｇｒａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：３４－４４（１９９８）に開示されている。本分野で報告された多くのＣＭＶｍｉｎプロモーターがある。

【0059】

「目的のタンパク質」又は「目的のポリペプチド」は、任意のアミノ酸配列を有することができ、任意のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド、並びにそれらの誘導体、構成要素、ドメイン、鎖、及び断片を含む。ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、植物タンパク質、及び動物（ヒトを含む）タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質タイプには、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体鎖（重鎖及び軽鎖を含む）、抗体断片、Ｆｖ断片、Ｆｃ断片、Ｆｃ含有タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、受容体Ｆｃ融合タンパク質、受容体、受容体ドメイン、トラップ及びミニトラップタンパク質、酵素、因子、抑制因子、活性化因子、リガンド、レポータータンパク質、選択タンパク質、タンパク質ホルモン、タンパク質毒素、構造タンパク質、貯蔵タンパク質、輸送タンパク質、神経伝達物質、並びに収縮タンパク質を含むことができるが、これらに限定されない。上記の誘導体、構成要素、鎖、及び断片もまた含まれる。配列は、天然、半合成、又は合成であることができる。目的のタンパク質及び目的のポリペプチドは、「目的のポリヌクレオチド」とも称することができる、「目的の遺伝子」によってコードされる。複数の遺伝子（同じ又は異なる）が組み込まれる場合、それらは、使用の文脈から明らかであるように、「第１の」、「第２の」、「第３の」、「第４の」、「第５の」、「第６の」、「第７の」、「第８の」、「第９の」、「第１０の」などと称することができる。

【0060】

「リコンビナーゼ認識部位」（ＲＲＳ）は、「異種特異的組換え部位」としても知られ、リコンビナーゼ媒介性カセット交換（ＲＭＣＥ）に使用される。例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、Ｄｒｅ／Ｒｏｘ、Ｖｒｅ／Ｖｌｏｘ、ＳＣｒｅ／Ｓｌｏｘ、及びＦｌｐ／Ｆｒｔが、好適なＲＲＳシステムである。本発明による使用に好適なＲＲＳとしては、ＬｏｘＰ、Ｌｏｘ６６、Ｌｏｘ７１、Ｌｏｘ５１１、Ｌｏｘ２２７２、Ｌｏｘ２３７２、Ｌｏｘ５１７１、ＬｏｘＭ２、ＬｏｘＭ３、ｌｏｘＭ７、及びＬｏｘＭ１１が挙げられる。これらの部位は、使用の文脈から明らかなように、一般に、第１（１）の、第２（２）の、第３（３）の、第４（４）の、第５（５）の、第６（６）の、第７（７）の、第８（８）の、第９（９）の、第１０（１０）のなどと称することができる。Ｃｒｅ／Ｌｏｘは、最も一般的に使用されるＲＲＳであるが、他のＲＲＳを、本発明によるＣｒｅ／Ｌｏｘの代わりに使用することができる。

【0061】

本明細書で使用される「レポータータンパク質」は、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に生成することができる任意のタンパク質を指す。レポータータンパク質は、典型的には、蛍光を発するか、又は比色反応若しくは蛍光反応を触媒し、しばしば「蛍光タンパク質」又は「カラータンパク質」と称される。しかしながら、レポータータンパク質はまた、蛍光リガンドで検出される細胞表面タンパク質などの別のタンパク質又は部分によって検出することができる限り、非酵素的及び非蛍光であることができる。レポータータンパク質はまた、蛍光性であるか、又は反応を触媒する、別のタンパク質との相互作用を介して機能的になる不活性タンパク質であることができる。したがって、当業者によって理解されるように、任意の好適なレポータータンパク質を使用することができる。いくつかの態様では、レポータータンパク質は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－ラクタマーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ユビキチン、及びそれらのバリアントから選択され得る。蛍光タンパク質は、場合によっては、首尾よく挿入及び／又は交換されているか又はされていない遺伝子カセットの認識に有用である。流体サイトメトリー及び蛍光活性化細胞ソーティングは、検出に好適である。蛍光タンパク質の例は当技術分野で周知であり、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｃｏｒａｌ（ＤｓＲｅｄ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアノ蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、増強シアノ蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、及び遠赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、又はＥ２－ｃｒｉｍｓｏｎが含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第９，８１６，１１０号を参照されたい。レポータータンパク質は、ポリヌクレオチドによってコードされ、本明細書では「レポーター遺伝子」又は「レポータータンパク質遺伝子」と称される。レポーター遺伝子及びタンパク質は、使用の文脈から明らかなように、一般に、第１（１）の、第２（２）の、第３（３）の、第４（４）の、第５（５）の、第６（６）の、第７（７）の、第８（８）の、第９（９）の、第１０（１０）のなどと称することができる。レポーターは、マーカーのタイプとみなすことができる。「色」又は「蛍光」は、それらの様々な文法的形態において、より具体的には、レポータータンパク質又は遺伝子を指して使用することもできる。

【0062】

「リプレッサータンパク質」は、「リプレッサー」とも称され、リプレッサー転写のためにＤＮＡに結合することができるタンパク質であり、本明細書では「リプレッサー遺伝子」又は「リプレッサータンパク質遺伝子」とも称されるポリヌクレオチドによってコードされる。リプレッサーは、真核生物起源及び原核生物起源のものである。原核生物リプレッサーが好ましい。リプレッサーファミリーの例としては、ＴｅｔＲ、ＬｙｓＲ、ＬａｃＩ、ＡｒｓＲ、ＩｃＩＲ、ＭｅｒＲ、ＡｓｎＣ、ＭａｒＲ、ＤｅｏＲ、ＧｎｔＲ、及びＣｒｐファミリーが挙げられる。ＴｅｔＲファミリーにおけるリプレッサータンパク質としては、ＡｒｃＲ、ＡｃｔＩＩ、ＡｍｅＲ、ＡｍｒＲ、ＡｒｐＲ、ＢｐｅＲ、ＥｎｖＲ、ＥｔｈＲ、ＨｅｍＲ、ＨｙｄＲ、ＩｆｅＲ、ＬａｎＫ、ＬｆｒＲ、ＬｍｒＡ、ＭｔｒＲ、Ｐｉｐ、ＰｑｒＡ、ＱａｃＲ、ＲｉｆＱ、ＲｍｒＲ、ＳｉｍＲｅｇ２、ＳｍｅＴ、ＳｒｐＲ、ＴｃｍＲ、ＴｅｔＲ、ＴｔｇＲ、ＴｒｇＷ、ＵｒｄＫ、ＶａｒＲ ＹｄｅＳ、ＡｒｐＡ、ＢａｒＡ、Ａｕｒ１Ｂ、ＣａｌＲ、ＣｐｒＢ、ＦａｒＡ、ＪａｄＲ＊、ＪａｄＲ２、ＭｐｈＢ、ＮｏｎＧ、ＰｈｌＦ、ＴｙｌＱ、ＶａｎＴ、ＴａｒＡ、ＴｙｌＰ、ＢＭ１Ｐ１、Ｂｍ３Ｒ１、ＢｕｔＲ、ＣａｍｐＲ、ＣａｍＲ、ＤｈａＲ、ＫｓｔＲ、ＬｅｘＡ様、ＡｃｎＲ、ＰａａＲＲ、ＰｓｂＩ、Ｔｈ１Ｒ、ＵｉｄＲ、ＹＤＨ１、ＢｅｔＩ、ＭｃｂＲ、ＭｐｈＲ、ＰｈａＤ、Ｑ９ＺＦ４５、ＴｔＫ、Ｙｈｇｄ、ＹｉｘＤ、ＣａｓＲ、ＩｃａＲ、ＬｉｔＲ、ＬｕｘＲ、ＬｕｘＴ、ＯｐａＲ、Ｏｒｆ２、ＳｍｃＲ、ＨａｐＲ、Ｅｆ０１１３、ＨｌｙＩＩＲ、ＢａｒＢ、ＳｃｂＲ、ＭｍｆＲ、ＡｍｔＲ、ＰｓｒＡ、及びＹｊｄＣタンパク質が挙げられる。Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６９：３２６－５６（２００５）を参照されたい。更に他のリプレッサーとしては、ＰｕｒＲ、ＬａｃＲ、ＭｅｔＪ、及びＰａｄＲが挙げられる。

【0063】

「選択可能な」又は「選択」マーカータンパク質には、薬物耐性又は他の選択的利点を含むがこれらに限定されない、特定の形質を付与するタンパク質が含まれる。選択マーカーは、特定の毒素、薬物、抗生物質、又は他の化合物に対して耐性である選択可能なマーカー遺伝子を受けている細胞をもたらすことができ、細胞が毒素、薬物、抗生物質、又は他の化合物の存在下でタンパク質を産生し、増殖することを可能にし、多くの場合、「陽性選択可能マーカー」と称される。抗生物質耐性マーカーの好適な例としては、カナマイシン、スペクチノマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン（Ｇ４１８）、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、及び／又はブラストサイジンなどの様々な抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。「陰性選択可能マーカー」としばしば称される、他の選択可能マーカーがあり、細胞に増殖を停止させるか、タンパク質産生を停止させるか、かつ／又は陰性選択可能マーカータンパク質の存在下で細胞に致命的である。チミジンキナーゼ及び特定の融合タンパク質は、ＧｙｒＢ－ＰＫＲを含むがこれに限定されない、陰性選択可能マーカーとして機能することができる。Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５０：３０３－３０９（Ｍａｙ ２０１１）を参照されたい。選択可能マーカータンパク質及び対応する遺伝子（選択可能マーカー遺伝子）は、使用の文脈から明らかなように、一般に、第１（１）の、第２（２）の、第３（３）の、第４（４）の、第５（５）の、第６（６）の、第７（７）の、第８（８）の、第９（９）の、第１０（１０）のなどと称することができる。図において、選択可能マーカーは、陰性（ｎｅｇ．）マーカーとして別途指定されない限り、陽性の選択可能マーカーである。

【0064】

「単一ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」は、Ｃａｓ９を部位に標的化するために使用され、通常、１７～２４ヌクレオチド長である。

【0065】

「安定した組み込み部位」又は「ＳＩＳ」は、目的のＤＮＡポリヌクレオチドの部位特異的組み込みのための領域であり、遺伝子及び／又は他のオープンリーディングフレーム、プロモーター、並びに任意選択的に他のエレメントを含むカセットを含む。安定した組み込み部位は、外因的に供給されたＤＮＡカセットを含み、本明細書に記載及び描写される本発明の方法に従って、好ましくはＧＳＨ中に作製することができる。構築物は、様々なアプローチによってＳＩＳに挿入することができる。複数の安定した組み込み部位を作製し、異なる染色体、同じ染色体の異なる領域、又は染色体の同じ領域における異なる位置に位置することができる。

【0066】

「テトラサイクリン応答エレメント」又は「ＴＲＥ」は、１７～１８ヌクレオチドを含むスペーサーによって離間された１９ヌクレオチドＴｅｔＯの７つのコピーを含み、市販されている。ＴｅｔＯ配列は変化することができ、ヌクレオチド置換は既知である。例えば、Ｔｅｔオペレーターに基づく変化した配列は、Ｗｉｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４２５３－６６（１９８６）に開示されている。スペーサーは、配列特異的ではない。スペーサーは、類似し得るが、全てが同一である必要はない。ＴＲＥは、本明細書で使用されるときにオペレーターのタイプとみなされる。

【0067】

本明細書に示される全ての数字で表す限度及び範囲は、範囲又は限度の数字の周辺又はそれらの間の全ての数字又は値を含む。本明細書に記載の範囲及び限度は、範囲又は限度によって定義され、包含される全ての整数、小数、及び分数値を明示的に表し、示す。本明細書に記載の範囲及び限度は、範囲又は限度によって定義され、包含される全ての整数、小数、及び分数値を明示的に表し、示す。したがって、本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、その範囲内にあるそれぞれの個別の値を個別に参照する簡略的な方法として機能することを単に意図しており、個別の各値は、あたかも本明細書に個別に記載されるかのように明細書に組み込まれる。

【0068】

詳細な説明
本発明は、複数の安定した組み込み部位を有する哺乳動物細胞を提供し、ウイルスタンパク質を含む目的のタンパク質の産生、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含むウイルスベクターの産生に好適である。１つ以上の安定した組み込み部位は、ゲノムセーフハーバー内にあることができ、１つ以上の安定した組み込み部位は、特定のゲノムセーフハーバーの外部にあることができる。複数の安定した組み込み部位を作製し、異なる染色体、同じ染色体の異なる領域、又は染色体の同じ領域における異なる位置に位置することができる。

【0069】

ゲノムセーフハーバーは、Ｐｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３０：８１４－２８（２０１９）、Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４：６７８－８４（２０１６）で考察されている。

【0070】

好ましくは、安定した組み込み部位は、リコンビナーゼ媒介性カセット交換（ＲＭＣＥ）を可能にする認識部位を含む。細胞ゲノムの改変は、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、Ｆｌｐ／Ｆｒｔ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼシステムなどの異種特異的組換え部位（ＲＲＳとしても知られている）を用いる既知のアプローチで行うことができる。米国特許第９，８１６，１１０号をｃｏｌｓ．１７－１８で、Ｓａｊｇｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９：ｅ９１４３５（２０１４）、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３９：ｅ４９（２０１１）を参照されたい。ヒト、マウス、及びラット細胞においてＢｘｂ１インテグラーゼを使用する組み込みもまた行うことができる。Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４０：４６０－６４（２００６）。

【0071】

リコンビナーゼ認識部位は、異種特異的組み込み部位としても知られ、使用の文脈から明らかなように、一般に、第１（１）の、第２（２）の、第３（３）の、第４（４）の、第５（５）の、第６（６）の、第７（７）の、第８（８）の、第９（９）の、第１０（１０）のなどと称することができる。本発明による使用に好適なＬｏｘ部位には、ＬｏｘＰ、Ｌｏｘ６６、Ｌｏｘ７１、Ｌｏｘ５１１、Ｌｏｘ２２７２、Ｌｏｘ２３７２、Ｌｏｘ５１７１、ＬｏｘＭ２、ＬｏｘＭ３、ｌｏｘＭ７、及びＬｏｘＭ１１が含まれるが、これらに限定されない。他のＲＲＳも同様に使用することができる。Ｌｏｘ部位は、最も一般的に使用されるタイプのＲＲＳであるが、異なるＲＲＳを同様に使用することができる。

【0072】

相同性アームは、好ましくは、約１０～２０塩基、より好ましくは１０～１５塩基の切断部位内で始まる。より大きい距離を同様に使用することができるが、より低い効率を有する。当業者によって決定された標的化可能な部位を、相同修復が潜在的に再作製し得る事象における安定性を、ゲノムセーフハーバーに挿入されたＤＮＡカセットが維持することを確実にするために、ＤＮＡカセットのガイドアーム領域は、ＣＲＩＳＰＲ標的部位の機能を破壊する変化（例えば、塩基のミスマッチ）を含むように作製することができる。独立して、又は一緒に用いることができる２つのアプローチがある。第１のアプローチは、ＣＲＩＳＰＲの２０塩基標的部位又は通常２～６塩基であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に塩基置換を挿入して塩基ミスマッチを作製することである。第２のアプローチは、挿入がＣＲＩＳＰＲ標的部位を分割するか、又はＣＲＩＳＰＲ標的部位をＰＡＭから分割するドナープラスミドを作製することである。

【0073】

ヒト細胞株には、羊膜細胞（ヒト羊膜上皮細胞など）、Ｈｅｌａ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、及びＨＥＫ２９３細胞が含まれる。ＨＥＫ２９３細胞の例としては、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３ＦＴＭ、ＨＥＫ２９３Ｈ、ＨＥＫ２９３ＭＳＲ、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３ＳＧ、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ、ＨＥＫ２９３Ｔ、並びにそれらの変異体及びバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、及びＣＨＯ細胞などのげっ歯類細胞株、並びにそれらの変異体及びバリアントも、本発明に従って使用することができる。ＣＨＯ細胞としては、ＣＨＯ－ｏｒｉ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ｓ、ＣＨＯ－ＤＨＢ１１、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ、並びにそれらの変異体及びバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。

【0074】

本発明の哺乳動物細胞は、リコンビナーゼ認識部位に隣接し、ＲＣＭＥを介してゲノムに組み込まれたＣａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むカセットを有する、細胞中間体を有利に産生及び利用することによって産生される。いかなる理論にも拘束されることなく、組み込まれたＣａｓ９遺伝子の本発明の使用は、発現されたとき、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって引き起こされるゲノムＤＮＡにおける切断の発生を増加させることによって、ゲノムセーフハーバーへの相同性アームの組み込みの効率を増加させるように思われる。本発明の安定して組み込まれたＣａｓ９遺伝子の使用は、安定して組み込まれたＣａｓ９遺伝子を有しないＨＤＲよりも１０、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、又は１０^１０高いＨＤＲ効率を提供する。最終的に、この中間細胞は、Ｃａｓ９遺伝子を含むカセットを除去するために、ＲＭＣＥに更に供され得る。

【0075】

細胞を操作するための出発点として、目的のポリヌクレオチド配列、並びに操作可能に連結されたプロモーター及び任意のオペレーターは、当該ポリヌクレオチド配列及びエレメントを含有するプラスミドのトランスフェクションによって細胞に導入され得る。したがって、本発明は、記載されるような細胞の生成を含む。

【0076】

好適なプラスミド構築物は、当業者によって作製することができる。既に報告されているか、又は当該技術分野において既知である有用な調節エレメントもまた、細胞をトランスフェクトするために使用されるプラスミド構築物に含むことができる。有用な調節エレメントのいくつかの非限定的な例としては、プロモーター、エンハンサー、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列が挙げられるが、これらに限定されない。好適なプラスミド構築物はまた、複製起点などの非転写エレメント、他の５’又は３’隣接非転写配列、並びにスプライスドナー及びアクセプタ部位などの５’又は３’非翻訳配列を含み得る。１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子も、組み込まれ得る。本発明で使用するのに有用な選択可能マーカータンパク質及びレポータータンパク質は既知であり、当業者は容易に特定することができる。

【0077】

目的の遺伝子をコードするプラスミド構築物は、ウイルスベクターを使用するか、又は非ウイルス的な移行方法を介して細胞に送達され得る。

【0078】

核酸移行の非ウイルス的方法としては、ネイキッド核酸、リポソーム、及びタンパク質／核酸コンジュゲートが挙げられる。細胞に導入されるプラスミド構築物は、直鎖状又は環状であり得、一本鎖又は二本鎖であり得、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの任意の改変若しくは組み合わせであり得る。

【0079】

プラスミド構築物は、トランスフェクションによって細胞に導入され得る。当業者は、多数の異なるトランスフェクションプロトコルを認識しており、細胞をトランスフェクトする際に使用するために適切なシステムを選択することができる。概して、トランスフェクション方法には、ウイルス形質導入、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、エレクトロポレーション、熱ショック、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、ナノ粒子、微粒子銃送達（遺伝子銃）、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｈｉｌｙｍａｘ、Ｆｕｇｅｎｅ、ｊｅｔＰＥＩ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ、又はＤｒｅａｍＦｅｃｔなどの所有権のあるトランスフェクション試薬が含まれるが、これらに限定されない。

【実施例】

【0080】

本発明は、本発明の多くの実施形態及び態様を例示する以下の実施例によって更に説明されるが、本発明をいかなる手段でも限定するものではない。実施例において、選択可能マーカーは、陰性（ｎｅｇ．）マーカーとして別途指定されない限り、陽性の選択可能マーカーである。

【0081】

実施例１
この実施例は、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターの制御下における、ＴｅｔＲなどのリプレッサーを含む哺乳動物細胞の作製に関する。図１を参照されたい。細胞は、プロモーター及びリプレッサー遺伝子を含むポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。ポリヌクレオチドが、細胞ゲノムにランダムに挿入される。ウェスタンブロット及びＴａｑｍａｎを細胞プールに使用して、形質転換体を特定し、平均コピー数を決定することができる。ＴｅｔＲなどのリプレッサーの組み込みは、プロモーター及びオペレーターの制御下にあるポリヌクレオチドの転写の制御を可能にする。

【0082】

実施例２
この実施例は、実施例１の細胞の更なる操作に関する。ＤＮＡカセット１が図２に概略的に示され、隣接するｌｏｘ部位（１及び２）を含み、５’から３’に向けて順番に、プロモーター、レポータータンパク質（１）をコードするレポーター遺伝子（１）、ＩＲＥＳ、及び選択マーカータンパク質（１）をコードする選択マーカー遺伝子（１）、並びにポリアデニル化シグナルを更に含む。ＤＮＡカセット（１）は、任意選択的に、プロモーターに操作可能に連結されたオペレーターを含むことができる。ＤＮＡカセット（１）は、ランダムに又は部位特異的に細胞ゲノムに挿入される。ＤＮＡカセット（１）での第１のｌｏｘ部位と第２のｌｏｘ部位とは、異なっている。

【0083】

ｔｅｔオペレーターがＤＮＡカセット（１）に使用される場合、－リガンド／＋リガンドソート及び単一細胞ソートの複数ラウンドは、ｄｏｘ調節発現のためのＬｏｘ部位安定細胞を特定する。したがって、ドキシサイクリン又はテトラサイクリンなどのリガンドが存在するとき、ＴｅｔＲはオペレーターに結合せず、したがって、条件は、レポーター遺伝子（１）及び選択マーカーポリヌクレオチド（１）の転写について許容する。

【0084】

実施例３
この実施例では、ＲＭＣＥを行って、実施例２の細胞におけるＤＮＡカセット（１）をＤＮＡカセット（２）に置き換える。図３に概略的に示されるように、ＤＮＡカセット（２）は、隣接するｌｏｘ部位（１及び２）を含み、５’から３’に向けて順番に、プロモーター、選択マーカータンパク質（２）をコードする選択マーカー遺伝子（２）、ＩＲＥＳ、並びに第２のプロモーター（任意選択的に、オペレーターに操作可能に連結される）の制御下でレポータータンパク質（２）及びＣａｓ９遺伝子をコードするレポーター遺伝子（２）を更に含む。

【0085】

一実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、ｔｅｔオペレーターに操作可能に連結されて、Ｃａｓ９遺伝子の転写を制御する。細胞がドキシサイクリン又はテトラサイクリンの存在下にあるとき、ＴｅｔＲはもはやｔｅｔオペレーターに結合することができず、したがって、Ｃａｓ９遺伝子の転写が生じることを可能にする。レポータータンパク質（１）は、レポータータンパク質（２）とは異なり、選択マーカータンパク質（１）は、選択マーカータンパク質（２）とは異なる。

【0086】

実施例４
この実施例は、ゲノムセーフハーバーへのＤＮＡカセット（３）の組み込みに関する。図４を参照されたい。ＤＮＡカセット（３）は、５’から３’に向けて順番に、ｓｇＲＮＡ標的部位を含む第１のゲノムセーフハーバー相同性アーム、ｌｏｘ部位（３）、レポータータンパク質（３）をコードするレポーター遺伝子（３）に操作可能に連結されたプロモーター、ポリアデニル化シグナル、ｌｏｘ部位（４）、及びｓｇＲＮＡ標的部位を含む第２のゲノムセーフハーフハーバー相同性アームを含む、ポリヌクレオチドを含み、第１及び第２のガイドアーム標的部位は、各々、標的化可能部位を再作製することを回避することが必要とされる場合、変化を有する領域を含むことができる。Ｌｏｘ部位（１）、ｌｏｘ部位（２）、ｌｏｘ部位（３）、及びｌｏｘ部位（４）は、互いに異なる。レポータータンパク質（３）は、レポータータンパク質（２）とは異なる。レポータータンパク質（３）とレポータータンパク質（１）とは、同じか又は異なることができる。約１０００塩基の相同性アームが、この例で使用される。

【0087】

Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが発現されるとき、ＤＮＡカセット３の組み込みの効率が増加する。いかなる理論にも拘束されることなく、組み込まれたＣａｓ９遺伝子の本発明の使用は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって引き起こされるゲノムＤＮＡにおける切断の発生を増加させることによって、組み込みの効率を増加させるように思われる。本発明の安定して組み込まれたＣａｓ９遺伝子の使用は、安定して組み込まれたＣａｓ９遺伝子を有しないＨＤＲよりも１０、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、又は１０^１０高いＨＤＲ効率を提供する。

【0088】

必要に応じて、第１及び第２のゲノムセーフハーバー相同性アームにおける変化は、標的化可能な部位の再作製を回避することによって、ＤＮＡカセット（３）が組み込まれたままであることに続く。それらにおけるより小さいカセット、すなわちｌｏｘ部位（３）とｌｏｘ部位（４）との間の領域は、ＲＭＣＥに利用可能であり、安定した組み込み部位と称される。

【0089】

実施例５
この実施例は、細胞株の最終形態に関するものであり、図５に概略的に示される。経時的な細胞株の安定性を確実にするために、Ｃａｓ９遺伝子を除去することが好ましい。したがって、ＤＮＡカセット（２）はＲＭＣＥによってＤＮＡカセット（４）と置き換えられ、Ｃａｓ９遺伝子を除去する。ＤＮＡカセット（４）は、プロモーターの制御下で、隣接するｌｏｘ部位（１及び２）及びレポータータンパク質（４）をコードするレポーター遺伝子（４）を含む。レポータータンパク質（４）は、レポータータンパク質（２）及びレポータータンパク質（３）とは異なり、好ましくは、レポータータンパク質（１）とは異なる。

【0090】

得られる細胞は、ゲノム内に２つの組み込み部位、ゲノムセーフハーバー内に１つの組み込み部位（例えば、安定した組み込み部位）、及びその特定のゲノムセーフハーバーの外部に１つの組み込み部位を有する。組み込まれたＣａｓ９遺伝子の使用及び追加の異なるＧＳＨ相同性アームの使用を含む、上述のアプローチを適用することによって、依然として更なる組み込み部位を作製することが可能である。

【0091】

実施例６
この実施例は、従来の相同組換え修復（ＨＤＲ）と比較した、本明細書に開示されるＨＤＲを有するＣａｓ９を使用する効率の比較である。文献に報告されているように、ＨＤＲは正確であるが、所望の組換え事象はまれに生じる：１０^６～１０^９個の細胞に１個（０．０００１％～０．００００００１％）。Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５７：１２６２－７８（２０１４）。

【0092】

安定して組み込まれたＣａｓ９遺伝子の利点を評価するために、米国特許第７，７７１，９９７号（「安定部位（Ｓｔａｂｌｅ Ｓｉｔｅ）１」）及び同第９，８１６，１１０号（「安定部位（Ｓｔａｂｌｅ Ｓｉｔｅ）２」）に開示されている部位を有するＣＨＯ細胞が改変された。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎは、ＥＥＳＹＲ（登録商標）と呼ばれる一連の商品及びサービスを提供する。安定部位１及び安定部位２に組み込まれた配列を有するＣＨＯ細胞は、ＵＳ２０１９／０２３３５４４Ａ１に開示されており、各々が、本明細書で「増強した発現遺伝子座」として称される。これらの特許並びに実施例１１及び１２に示される配列は、本明細書に記載及び示される発明に従って使用することができる。

【0093】

ＣＨＯ細胞は、安定部位１にプロモーターの制御下でシアノ蛍光タンパク質レポーター遺伝子、並びに安定部位２に同じプロモーターの制御下で選択マーカー遺伝子及び黄色蛍光タンパク質レポーター遺伝子を含むように改変された。追加的に、オペレーターを有する第２のプロモーターの制御下にあるＣａｓ９遺伝子も、安定部位２に挿入された。Ｃａｓ９遺伝子は、本明細書に含まれる教示に従って最終的に除去することができる。

【0094】

シアノ蛍光タンパク質は、６６位のチロシン残基をトリプトファンに変更することによって、蛍光緑色に変化することができる。ｓｇＲＮＡ送達プラスミドは、選択マーカー（アンピシリン耐性）、ＰＯＬ ＩＩＩプロモーター（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）、標的配列、及びｇＲＮＡスキャホルド、ＰＯＬ ＩＩＩターミネーター、並びに消化部位１及び２を含む。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、Ｈ１及びＵ６を含む。

【0095】

図６に示されるように、ｓｇＲＮＡ送達プラスミドは、ＨＤＲテンプレート：相同性アームを含む１０４マーインサート（５７ｂｐアーム及び４５ｂｐアームを有する）、４０１マーインサート（１９８ｂｐアーム及び２０１ｂｐアームを有する）、又は１０３０マー（５２４ｂｐアーム及び５０４ｂｐアームを有する）、及びシアノから緑色への変化をもたらす配列を含んで構築され、この実施例では、２つのヌクレオチド（「修復ヌクレオチド」）で構成された。ＨＤＲテンプレートをｓｇＲＮＡ送達プラスミドの消化部位（例えば、ＮｏｔＩ及び／又は他の適切な部位）に挿入して、ｓｇＲＮＡ標的プラスミドを形成した。インサートを有しないｓｇＲＮＡ送達プラスミド（ＨＤＲテンプレートなし）を対照として使用した。

【0096】

図７は、対照が緑色陽性をＱ１に表さなかったことを示す。ＨＤＲテンプレートを有する細胞は、緑色陽性をＱ１に示し、Ｑ１における緑色陽性集団は、ＨＤＲテンプレートのサイズの増加に伴って一貫して増加した（左から右に）。１０３０マーＨＤＲテンプレートを有する細胞は、修復に最大の効率を示し、約６．５％だった。

【0097】

この実施例の細胞は、本発明に従ってＧＳＨに作製された安定部位１及び安定部位２、並びにＳＩＳを有する。したがって、この細胞は、目的の遺伝子の安定した組み込みのために３つの部位を有する。

【0098】

実施例７－ゲノムセーフハーバー（ＡＡＶＳ１）に安定した組み込み部位を含む中間ヒト細胞の生成
本実施例では、出発点は、Ｌｏｘ部位３及び４に隣接した安定して組み込まれたＣａｓ９遺伝子を有するＨＥＫ２９３細胞である。Ｃａｓ９遺伝子は、少なくともプロモーター（示されていない）の制御下にある。ＡＡＶＳ１も概略的に示される。図８を参照されたい。この細胞は、実施例１～４及び図１～４に従って作製することができる。

【0099】

ｓｇＲＮＡ標的部位、ゲノムセーフハーバー（ここではＡＡＶＳ１）などの領域への挿入のための左側相同性アーム（ここでは、ＧＳＨ相同性アーム）、Ｌｏｘ１部位、レポーター遺伝子（色１）、Ｌｏｘ２部位、ゲノムセーフハーバー（ここでは、ＡＡＶＳ１）などの領域への挿入のための右側相同性アーム（ここでは、ＧＳＨ相同性アーム）を含む標的化プラスミド。代替的な標的化プラスミドについて、図９Ａ及び９Ｂを参照されたい。３’末端では、１つの標的プラスミドは、レポーター遺伝子（色２）を有し、図９Ａを参照されたい。他の標的プラスミドは、３’末端に陰性選択遺伝子（陰性選択１）を有する。図９Ｂを参照されたい。プロモーター及び任意選択的に他の部分（オペレーターなど）は、図９Ａ及び図９Ｂにおいて５’から３’方向に示される矢印によって表される。両方のプラスミドは、ゲノムセーフハーバー（ここではＡＡＶＳ１）などの領域に色１を挿入する。

【0100】

ＨＥＫ２９３細胞のゲノムセーフハーバー（ＡＡＶＳ１）への標的化プラスミド（例えば、図９Ａ又は図９Ｂ）のＣａｓ９媒介性組み込みが、図１０に概略的に示される。色１は、Ｌｏｘ１及びＬｏｘ２に隣接している。目的の遺伝子は、ＲＭＣＥを介して色１を置き換えることができる。

【0101】

図９Ａによる標的化プラスミドが適切に組み込まれると、細胞は色１陽性になり、色２陰性になる。図９Ｂによる標的化プラスミドが適切に組み込まれるとき、細胞は色１陽性になり、陰性選択遺伝子が除去されるため、増殖することができる。この細胞は、中間体とみなされる。最終的に、図８に示すように、細胞を更にｌｏｘ部位３及び４でＲＭＣＥに供して、Ｃａｓ９遺伝子を含むカセットを除去することができる。例えば、実施例５を参照されたい。

【0102】

本発明の方法論の精度が、図１０及び１１に示される。図１１は、図１０の挿入をより詳細に示す。ＡＡＶＳ１を含む細胞ゲノムは、インサート並びに５’末端及び３’末端に隣接している。色１は、Ｌｏｘ１及びＬｏｘ２に隣接している。図１１、左側は、５’ジャンクションＰＣＲで使用された５’ゲノムプライマー及び３’挿入プライマーの位置を特定する。図１１、右側は、３’ジャンクションＰＣＲで使用された５’挿入プライマー及び３’ゲノムプライマーの位置を特定する。

【0103】

ジャンクションＰＣＲは、正しいサイズの断片が増幅され、「安定したＣａｓ９標的細胞」として標識されることを示す。実施例１２及び１３を参照されたい。安定したＣａｓ９標的化細胞並びに５’ジャンクション及び３’ジャンクションが得られ、検出され、正しい挿入を確立する。陽性対照及び陰性対照は、各ゲルの右側のカラムである。

【0104】

実施例８－ＣＨＯ領域及び配列
ＣＨＯ細胞では、米国特許第７，７７１，９９７号（安定部位１）及び同第９，８１６，１１０（安定部位２）に示される配列を利用することができる。米国特許第７，７７１，９９７号及び同第９，８１６，１１０号の同一性パーセント値内の配列及び相同配列が、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示されるＡＡＶＳ１様領域を使用して、本発明による安定した組み込み部位を作製することができる。

【0105】

本発明による使用のための候補遺伝子座は、文献に報告されている。Ｈａｍａｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．２２：１５２－６０（２０１８）は、３０個のホットスポット遺伝子座を特定する。Ｈｉｌｌｉａｒｄ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１８：６５９－７５（２０２１）は、Ｈｉ－Ｃ安定領域についてエピゲノム解析を用いてＣＨＯにおけるセーフハーバー領域を特定することを試み、Ｈａｍａｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｅによって特定された３０の領域のうちの５つとの重複を見出した。Ｈｉｌｌｉａｒｄ ａｎｄ Ｌｅｅの補足表３を参照されたい。Ｇａｉｄｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６：４０７２－８６（２０１８）はまた、推定されるＲｏｓａ２６を含む、ＣＨＯ細胞における組み込みのための遺伝子座を特定する。Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｓ．５：８５７２（２０１５）は、ハムスター細胞内のＣＯＳＭＣ遺伝子座を報告した。要約すると、これらの論文は、ＣＨＯにおけるいくつかの注釈のない領域及び遺伝子領域を特定し、遺伝子領域は、以下に示される。

【表1】

【0106】

実施例９－３つ以上の挿入部位を有するＣＨＯ細胞
複数の挿入を含むＣＨＯ細胞を、ＵＳ２０１９／０２３３５４４Ａ１号に開示される細胞を使用して例証する。安定部位１及び安定部位２を、最初に、組み込まれたＣａｓ９遺伝子を利用する本明細書に含まれる教示に従って使用することができる。１つ以上の安定した組み込み部位が、ＡＡＶＳ１様領域（例えば、配列番号２を参照）及び対応するガイド配列（例えば、配列番号１３～４１９を参照）などのゲノムセーフハーバーに作製される。ガイド配列は、配列番号２の標的配列に、（ａ）１～２０００、（ｂ）２００１～４０００、（ｃ）４００１～６０００、（ｄ）６００１～８０００、（ｅ）８００１～１０，０００、（ｆ）１０，００１～１２，０００、（ｇ）１２，００１～１４，０００、（ｈ）１４，００１～１６，０００、（ｉ）１６，００１～１８，０００、（ｊ）１８，００１～２０，０００、（ｋ）２０，００１～２２，０００、（ｌ）２２，００１～２４，０００、（ｍ）２４，００１～２６，０００、（ｎ）２６，００１～２８，０００、（ｏ）２８，００１～３０，０００、（ｐ）３０，００１～３２，０００、（ｑ）３２，００１～３４，０００、（ｒ）３４，００１～３６，０００、（ｓ）３６，００１～３８，０００、（ｔ）３８，００１～４０，０００、（ｕ）４０，００１～４２，０００、及び（ｖ）４２，００１～４４，２３２からなる群から選択されるヌクレオチド位置範囲で結合することができる。

【0107】

米国特許第７，７７１，９９７号及び同第９，８１６，１１０号の安定部位１及び安定部位２は、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子の発現のために使用することができる。ＳＩＳを有する細胞は、最終的に、目的の遺伝子を発現するために３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の部位を有することができる。

【0108】

好ましくは、安定部位１及び２を含むＣＨＯ細胞を改変して、ゲノムセーフハーバーに第３の部位、すなわち、安定した組み込み部位を作製する。かかるＣＨＯ細胞の作製のための好ましいゲノムセーフハーバーは、ＡＡＶＳ１様領域にある。他のＣＨＯ細胞型を使用して、本明細書に含まれる教示による複数の部位を作製することができる。

【0109】

図１４は、隣接するＲＲＳ（ここでは、ｌｏｘ１及びｌｏｘ２）を有するゲノムの領域に組み込まれた３つのカセットを含む例示的な細胞を概略的に示す。細胞型に応じて、３つのカセットの各々は、異なる安定した組み込み部位、並びに位置Ａ、Ｂ、及びＣとして概略的に示される他の利用可能な部位（例えば、安定部位１及び安定部位２）に組み込むことができる。レポーター遺伝子は、同じか又は異なることができる。陰性選択遺伝子は、同じか又は異なることができるが、好ましくは同じである。細胞は、本明細書に含まれる教示による追加の安定した組み込み部位及び組み込まれたカセットを含むことができる。

【0110】

図１５は、図１４の細胞の改変を、概略的に示した位置Ａ、Ｂ、及びＣで概略的に示す。３つのカセットは、各々、隣接するＲＲＳ（ここでは、ｌｏｘ１及びｌｏｘ２）、目的の遺伝子、陽性選択マーカー遺伝子、及びレポーター＊遺伝子を含む。陽性選択マーカー遺伝子は、同じか又は異なることができるが、好ましくは同じである。レポーター＊遺伝子は、同じか又は異なることができるが、各々は、図１４の細胞におけるレポーター遺伝子のうちのいずれかとは異ならなければならない。目的の遺伝子は、同じか又は異なることができる。図１４のカセットは、ＲＭＣＥによって図１５のカセットに置き換えられる。細胞は、本明細書に含まれる教示に従って、追加の安定した組み込み部位及び組み込まれたカセットを含むことができる。

【0111】

陰性選択及び陽性選択の組み合わせは、全ての部位で組換えを受けた細胞の単離を確実にする。目的の遺伝子が３つのカセットの各々で同じである場合、細胞は、高収率タンパク質発現をもたらすことができる。例えば、１リットル当たり７、８、９、１０、又はそれ以上のグラム（ｇ／ｌ）のタンパク質産生が可能である。

【0112】

図１６は、２つの組み込み部位（安定部位１及び２）又は３つの組み込み部位（安定部位１、安定部位２、及びＡＡＶＳ１様（配列番号２を参照））のいずれかで操作されたＣＨＯ Ｋ１由来の宿主へのＣｒｅ－ｌｏｘ組換えを使用して安定して組み込まれた５つの異なるヒトＩｇＧ抗体の結果を示す。同質遺伝子的細胞株（ＩＣＬ）が、フローサイトメトリーを使用して単離された。ＩＣＬのフェドバッチ産生を化学的に定義された産生培地に接種し、産生培養を１３日間実行した。条件培地における抗体価は、プロテインＡ ＨＰＬＣベースの方法を使用して決定され、所与の抗体（１、２、３、４、又は５）を発現する各３部位細胞は、比較の２部位細胞よりも多くの量のタンパク質を発現した。３部位細胞は、２部位細胞を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、又はそれ以上超える増加を提供することができる。

【0113】

代替的に、異なる目的の遺伝子を、カセットで使用することができる。例えば、抗体の重鎖配列及び軽鎖配列が、目的の遺伝子であることができる。

【0114】

４部位細胞に目を向けると、好ましくは、安定部位１及び２を含むＣＨＯ細胞を改変して、ゲノムセーフハーバーに第３及び第４の部位、すなわち、安定した組み込み部位を作製する。かかるＣＨＯ細胞の作製のための好ましいゲノムセーフハーバーは、ＡＡＶＳ１様領域にあり、第３の部位であることができる。第４の部位は、他の遺伝子座に作製することができ、以下が含まれるが、これらに限定されない。

【表2】

【0115】

他のＣＨＯ細胞型を使用して、本明細書に含まれる教示による複数の部位を作製することができる。

【0116】

図１７は、隣接するＲＲＳ（ここでは、ｌｏｘ１及びｌｏｘ２、又はｌｏｘ３及びｌｏｘ４）を有するゲノムの領域に組み込まれた４つのカセットを含む例示的な細胞を概略的に示す。細胞型に応じて、４つのカセットの各々は、異なる安定した組み込み部位、並びに位置Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤとして概略的に示される他の利用可能な部位（例えば、安定部位１及び安定部位２）に組み込むことができる。レポーター遺伝子は、同じか又は異なることができる。陰性選択遺伝子は、同じか又は異なることができるが、好ましくは同じである。細胞は、本明細書に含まれる教示による追加の安定した組み込み部位及び組み込まれたカセットを含むことができる。

【0117】

図１８は、図１７の細胞の改変を、概略的に示した位置Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ
で概略的に示す。４つのカセットは、各々、隣接するＲＲＳ（ここでは、ｌｏｘ１及びｌｏｘ２、又はｌｏｘ３及びｌｏｘ４）、目的の遺伝子、陽性選択マーカー遺伝子、及びレポーター＊遺伝子を含む。陽性選択マーカー遺伝子は、同じか又は異なることができるが、好ましくは同じである。レポーター＊遺伝子は、同じか又は異なることができるが、各々は、図１７の細胞におけるレポーター遺伝子のうちのいずれかとは異ならなければならない。目的の遺伝子は、同じか又は異なることができる。この図では、目的の遺伝子１の２つのコピー及び目的遺伝子２の２つのコピーがある。図１７のカセットは、ＲＭＣＥによって図１８のカセットに置き換えられる。細胞は、本明細書に含まれる教示による追加の安定した組み込み部位及び組み込まれたカセットを含むことができる。

【0118】

陰性選択及び陽性選択の組み合わせは、全ての部位で組換えを受けた細胞の単離を確実にする。４部位細胞は、二重特異性抗体を作製するのに有用であり、２つの異なる重鎖／軽鎖プラスミドを、異なる部位に標的化することができる。

【0119】

実施例１０－ゲノムセーフハーバー配列
ゲノムセーフハーバー配列などが本明細書に記載されており、多くが文献にあり、公開されている。例示的な配列が以下に示される。
ヒトＡＡＶＳ１配列

（配列番号１）

CAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAGTTGGTCCTGAGTTCTAACTTTGGCTCTTCACCTTTCTAGNCCCCAATTTATATTGTTCCTCCGTGCGTCAGTTTTACCTGTGAGATAAGGCCAGTAGCCACCCCCGTCCTGGCAGGGCTGTGGTGAGGAGGGGGGTGTCCGTGTGGAAAACTCCCTTTGTGAGAATGGTGCGTCCTAGGTGTTCACCAGGTCGTGGCCGCCTCTACTCCCTTTCTCTTTCTCCATCCATCCTTCTTTCCTTAAAGAGCCCCCAGTGCTATCTGGACATATTCCTCCGCCCAGAGCAGGGTCCGCTTCCCTAAGGCCCTGCTCTGGGCTTCTGGGTTTGAGTCCTTGCAAGCCCAGGAGAGCGCTAGCTTCCCTGTCCCCCTTCCTCGTCCACCATCTCATGCCCTGGCTCTCCTGCCCCTTCCTACAGGGGTTCCTGGCTCTGCTCTTCAGACTGAGCCCCGTTCCCCTGCATCCCCGTTCCCCTGCATCCCCCTTCCCCTGCATCCCCCAGAGCCCCAGGCCACCTACTTGGCCTGGAACCCCACGAGAGGCCACCCCAGCCCTGTCTACCAGGCTGACCTTTTGGGTGATTCTCCTCCAACTGTGGGGTGACTGCTTGGGCAAACTCACTCTTCGGGGTATCCCAGGAGGCCTGGAGCATTGGGGTGGGCTGGGGTTCAGAGAGGAGGGATTCCCTCCAGGTTACGTGGCCAAGAAGCAGGGGAGCTGGGTTTGGGTCAGGCTGGGTGTGGGGTGACCAGCTTATGCTGTTTGCCCAGGACAGCCTAGTTTTAGCGCTGAAACCCTCAGTCCTAGGAAAACAGGGATGGTTGGTCACTGTCTCTGGGTGACTCTTGATTCCCGGCCAGTTTCTCCACCTGGGGCTGTGTTTCTCGTCCTGCATCCTTCTCCAGGCAGGTCCCCAAGCATCGCCCCCCTGGCTGTTCCCAAGTTCTTAGGTACCCCACGTGGGTTTATGAACCACTTGGTGAGGCTGGTACCCTGCCCCCATTCCTGCACCCCAATTGCCTTAGTGGCTAGGGGGTTGGGGGCTAGAGTAGGAGGGGCTGGAGCCAGGATTCTTAGGGCTGAACAGAGCCGAGCTGGGGGCCTGGGCTCCTGGGTTTGAGAGAGGAGGGGCTGGGGCCTGGACTCCTGGGTCCGAGGGAGGAGGGGCTGGGGCCTGGACTCCTGGGTCTGAGGGTGGAGGGACTGGGGGCCTGGACTCCTGGGTCCGAGGGAGGAGGGGCTGGGGCCTGGACTCGTGGGTCTGAGGGAGGAGGGGTCGGGGGCCTGGACTTCTGGGTCTTAGGGAGGCGGGGCTGGGCCTGGACCCCTGGGTCTGAATGGGGAGAGGCTGGGGGCCTGGACTCCTTCATCTGAGGGCGGAAGGGCTGGGGCCTGGCCTCCTGGGTTGAATGGGGAGGGGTTGGGCCTGGACTCTGGAGTCCCTGGTGCCCAGGCCTCAGGCATCTTTCACAGGGATGCCTGTAC

ＣＨＯ ＡＡＶＳ１様領域配列
（挿入のためのガイドは、実施例１３で以下に更に示される）
（配列番号２）
CCAGCACCCACATGGTGGCTCACAACTGTCCGTAACTCCAGTTCCAGAGGATCTGATGCCCTCTTCTGTCTCCCGCGAGCACCTGGCACACACGTGATGCACACTTAAACACATGCAAGCAAACCATCAGACACATAACTTTTTTTTCCAATTTTTTAAAGATTTAGTTATTATTATTTACTTAATAAATATTTATTATATTTATTACATATACAGTTTCTGCCTACATGCCAGCAGAGGGCACCAGATTGAATTGTAGATGGTTGTGAGCCACCATGTGGTTGCTGGGAATTGAACTCAGGACCCCTGGAAGAGCAGTCAGTGCTCTTAACCTCTGAGCCATCTCTCCAGCCCCTCCATTTTTTTTTTTTTAAATAAAGAAATGTAATGTCCTAAGTGGGGCTTAGAGAGTGGAAGCAGATAAAGAAAGATGGAGTTAAGAATTTTAAGAAGCCAGTTGGCGGTTGTGCATGCCAGCACTCAGGAGGCAGAGGCAGGTGGATGGATCTCTATGAGTTCGAGGCCAGCCTGGTCTACAGAGAGAGAGTTCCAGGACAGACTTCTCCAAAGCTACAGAGAAACCCTGTCTGAACCCACCACGACCACCACAAAGAAAAAAAGGATTTCAAGAGGAGAGCCAGGTTTATAGCAAGAGAGAAAGTTGTGAACTAATGCCCAGGGCTTAGTGTGGCCTACCTCTGGGCTGGGTCTCTCTCTGAACACAGGGTGGAGCTGCCCCGGGAGGAAGAAGCGGCTCCGTACAGTCCCGAATTCTACAGTGGCTGGGAGCCTCCCGCCACTGACCCGCAGGGCCGCGCCTGGGAGGACCCGGTGGAAAAACAGCTACAGCATGAGAAGAGGCGCAGGCAGGTGAGGCAGGGTTGCCGGGGGAGCACTGGGCTCCCCGTTTCTGCACAACATGGGCGAGCAGGACGTCTGAGGTCTAGCCTGCCTGACCCCAAGCTCTCTCTCTTCCCGCAGCAAAGCGCCCCCCAGATCGCTGTCAATGGGTGAGTGACCGCTGCAGGGTGGCCAGGGATGGGGTTGGGAGGACTGAGTCCCGGGGTCACCCCGGCTCTGACTCCGACCCTCCCCCTTTTTTCTTGTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACCTCTGCCTTCCCGGCTCTTTGCAGGTGGGTGAGGTGGTGAGGAGGCGGGGCTGGGGTGGGGGTGGGGGAGGAGCCAGGAGGGAGGGGGGGAGGAGCCCAGAACTCTGGGTCCAAGGGAAGAGGGAAAGGAGGCTTAGTTTGCTGAAGCTATGAGAGTTAGGGGCTGAAAGTGGGTGGGTCTAAAGGCTTGGACCCCACACCCCCACCCCCGGCATCCTCAAAAGATTGAAAAGGTGCAGTTTGGTGTTCTAGGACCTGGGAGAGCACCATGCTTGAGTCCCCAGAGCACAGAGCACTGGGTGTCAGAGAAAAAAAAAAAATGGAGACCAAAAAGCAGGGTTGGGACTTCCGAGGATTCAGGGACAAGTTTGAGGAAACGTGAGAAAGTGCTGGCATCCCTGGACCACTAACTGAGGTGGGACTTCCGGCTTCCTAATGCGCAAAGGAATAGCACGTACTGAGCAAACTGGAATGCTCCCAGGGCTGAAAGAATGGAGGAAATTGAAGGTCAAGGCACGGACTCCTGCCTAGGTCCCTGGGAAGGAAAGAACTAGGGACCTAAATTTACAGTTCTACCAAACTATGGAAGCTGAGGGCTGCAGGTCCAGGTGAGGAAGTGATGGAGAGGGGGTCACAGCCCTAGGATCCTTGGGGAAATAGGGGCCAGGAGTGGAGGGCGTGGATGTGGCTTGAGAACAAAATGATAGACTTGGAGGAGAGGAATTGGGGGCCTAGGTGAGAGCCCCAGCAGAGGGTCTCAGCAGGGACGGCATACTGGGAGCTGTCAGTCCCACACATGGGGCGCCGAGGCCCTGAAGAGTCCCCTCCTCCCTTCCACAGGTAGGCCTGATCCGGGATGAGGTCTCTCTTGCTGGGGGCGCCAGAGCTAATCGTCCCCCAGGCTGCCTGGTGCTGCAGGGCCCTCTTGTCTGTCTGTCTGCTTCTGAATCTTGGGCTCAGCACCTGCAAGCTGTTTACTCGCCTTCTCTGGCTGTAATTTCTTTGCCTGGAAGGGTGAGGACTCTCTGGCGCTGTAAGGGGCTTGCAAAGAGCTCAGTGCCGTGACTCAGCCTGAGTTCAAATCCAGCTGCATGAAGAACAGTACAGAGTGACCCTGACAAGGGCAGCCTAGGGCCAGCTCAGTCACACCTTTCTCTTTCTTGTGCACTGGCCGTTACTACAGTATCCCTCGGTTCCTTCATATAGAAAGAGAAATAGTGAGCCGGGCAGTGGTGGCGCACACCTTTAATCCCAGCACTTGGGAGGCAAAGGCAGGTGGACCTCTGTGAGTTCAAGACCAGCCTGGTCTACAAGAGCTAGTTCCAGGATAGTCTCCAAAGCCACAGAGAAACCCTGTCTCGAAAAACCAAAAAAGAAAAAAGAAAGAAAGAGAAATAGTGAGACCGGCAGTGGTGGTGCACGTCTTTAGTCCCAGCACTGGGGAGGCAGAGGCAGCCGGATTTCTGTGAGTTCAAGGATAGACTGGTCTACAGAGTGAGTTCCAAGACAGCCAGAACTAAACAGTGAAACCCTGTCTTGGAAAAAAAAAAAAGTGAAATAATGGCCATATTCTGGTGATGGTGTAGGCCTGTGGTCCCAGCTACTCAGAGACATGAAGCAGGAGAATAAAAATCAAGGCCTGCTTTGACTACAAAGTGAGCTTCAAAGGCCAGCCTGGGCAAAGCAACAAGGCCTTGCCTCAAAATGAAAAAATAAAAATAAAAGAGGCTGGAGAAATGGCTTAGTGGTTAAGAGTACTGGCCGCTCTTCCAGGGGACCAGGGTTCAATTCCCAGCACCCAGACATACAGCAGCTCACAACTCCAGTTTCAGGGAATCCGGTGTTCTCTCTGGTCTCTGTAGGCACCAGGCACTCAAGTTGTGCAGACATAAAATAACACAGAGGGCTGGGCTGGGGCTCAGTGGCAGGCATTTGCCCAGAATCCCCCAGTAAAGACATAGCTCAGTGAATCCAGAGCTGAGGGGCTGGGCGTATATTAATGGTGGAATCCTTGCCTAGAATTCAACCAGCGAAGGGCTGTGGCCGTGGCTCGGCTGTAGAACCCTGTCCTGGTATCTACCATGAAGGGCTGGGACATGGCTCAGAGATAAAACACTTGCCTAGACTCTACCGCTGAGAGCCTGGGGTGTGGATCAGTGGACAGTGCCCGCCTAGCATGCACAAGGCCCCTGGGTTCAATCCCCTGTACCACAAAAAAAAGGGGGGGTGGAGGGAGGGTAAGAGTGAGATCTCAGGAGAAGGAAGGAACCAAATTCATGGAACTACAAGGGAACTCCAGGAGAATCGAAGCGTTTCTGGCGTACGTTGCTGTGTAAGCACAAGGGTCGGCTATTTTTGCACCCTGTTCATTATCCTAGCGGGTGATGGGAATAGATCTGCTGTCTCTAGCCGATTCCTCATGATCCTCACTGATGAAAATGCAGGTGAGGGGCTGGAGAGATTAAGAACACTGTCTGCTCTGGCACTGGACCTAGGTTCATTCAGCTCCCCACAGCACATGGTGGCCCACAAATATCTGTAACTCCAGCTCTAAGAACCCAGGTCTAGGACACCCTCTCCTGGACTCTGTGGCTACTGCACACAGGTGATGCACATACACACACATGCATGCAGGCAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAATGCATGTGAACGACTGGGGATGAAGCTCGGAAGCTAAGCACTTCCCTGGCATGCACGGGCCCTGGGTTCAATCCCCAGCACCCCATAATGAATTAAATCGTTATCATGATACGGTGTGTTTACTGCATGGTGCCAGGCAAGGAAATGAGCTAACTCCATTCAAGCTGTGACTCCAGTGTCAAGCCTGTATTAACATATTAACCTGGGCCTCTGCTCTGACCCCCTGCTTGGCTCTAACCCCACCTCACACCTTAGAGTCCAGACCAGCAGGGCTGGCTACCTCCTAATCTCCTGCTGGTTTCTTTCTCCCCAGTCATCAAGATCCAGACCTGGAAGCCGCCGAGCTAGAAGAGAGAGCCAGAAAGTGGGTTCTGTGTAACTATGACTTCCAGGCCCGAAATAGCAGCGAGCTGTCTGTCAAGCACGGAGATGTGTTGGAGGTTAGCGGTGTGGGGGGCCTGAGACCCTGAAATTGGTCAATTTAGCCCTAGGTATAGAACCGGAGCGTGAATTCTCTCCTTATACGCCACCTAGGTCCTGGATGACAGGCGCAAGTGGTGGAAGGTTCGGGACCATCAGGGACAGGAGGGTTATGTACCCTATAACATCCTGACACCCCACCCTGGACCTCAGGTGCACCGCAGCCAAAGTCCTGCAGGAAACCTAGTAAGTCGGCGTGTTCTTGCTTCTTCGGGGAGAAAGGGGGGCAAGATCCTAGGTCCTGGGGATGAGGACAGAGAAAATCAGGTGTGAAGGTTGCTGTTTGGAAAGGGGGGGGGGTGGTCAGATGTTTATTGGGAAAGGAGCTGGAAGCCTCTCTTCATTCCCTTCCAGGAGACGAGTACTCCTCCTCCCCCACCCGCACCAGCTCCAGCCCCTGCTCAGGTGCGACCCCACTGGGACAGTTGCGACAGTCTCAACAATTTGGACCCCAGCGAGAAGGGTGAGTGGTGGAGCGTCACTCTGGGAAGTGATCCTTGTCTTCGCTTTTCAGGCTCCACCCTGGGCACCCTAGCGGCTCCCAGCCCCCTGACCCCAGAACCCCTGAGCGCGCACTCCCCTCCGCCCCCCCCCCTCACGGTTTCGCTTCTGCAGAGAAATTCTCCCAGATGCTCAGTGTCAATGAGGAGCTGCAGGCGCGCCTTGCGCAGGGCCGTTCGGGTCCCAGCCGGGTAGCCCCGGGA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ＣＣＲ５配列

（配列番号３）
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GGAGAGAGGTGAGGAAGCTGCAGAAGAAAAGTTTGAAGCTAGCGGAGGTTGGTTTGTGAGGTTTAATGAAAGACAACATCTCCATAACATAAAAATGCAAGATGAAGCAGCAAGTGCAAAGGGAGAAGCTGTGGCAAGTTATCCAGAAAATCTAGATAAGATAATTGATGAAAGTGTCTACACGAAACAACAGATTTTCAGTGTAGACAAAACAGTCTTATGTTGGAAGAAGATGCCATCCAGGACTTTCACAGCTAGAGAGGAGATGTCAAGGCAAGCTGCAAAGCTCCACAGGACAGGCTGACTCTCTTTTTAGAGGTGAATGCAGCTGATGACTTTAAGTTGAAGTAAATGTTCATTTACTATTTTGTAAATCCTGGTGTCATTAAGAATTATGCGAAATCTACTCTATCTGTGCTCCATAAATGGAACAATAAAGCCTGGATGACAACACATCTGTTTACAGCATGGTTTACTGAATATTTCAAGCCCACTATTGAGAACTATTGCTCAGAAAAAAAGATTCCTTTCAAAATATTACTGCTCTGCACCATGTCGATCAAGAGCTGTGTTGGAGATGTACGAGAATATTCATGTTGTTTTCATCCCTGCTAACACAAACATCCATTCTGCAGTCCATGGACCAAGACTTTCAAGTCTTATTAAGAAATATATTTCATAAGGCTATTAAGAAATAGCTATATATATATATATAGCCTTATATAGTTTATATAGCTACCATTGATAGTGATTCCATTGATGGATCTGAGCAAAGCAAATTGAAAAGCTTCTGGAAAGTAGTCATTATTCTAGATGCCATTAGGAACATTTGTAATTCATGGGAGGAGGTCAAAATACCAACATTAACAGGAGTGTGAAAGACATTGATTCCAACCCCCATAGATGACTTTCAGGGGTTCACGTCTTCAGTGGAGGAAGTCGCTGTAGATGTGGTGGAAACAGCAAGAGAACTAGAACTAGAAGTGGAGCCTGAAGTTGTGACTGAATTGCCGCACTCTCATGATCAAACTTGAACAGATGAAGAGTTGCTTCTTACATATGAGCAGTGAAAGTGGTCTCTTGAGATGGAATCTCCTCCTGGTGAAGATGCTGTGAACACGGTTAAAATGACAACAATCGATTTAGAATATTACATAAATTTAGTTAATAAAGCAGTGGCAGGGTTTGAGAGGATTGACTCCAATTTTGAAAGAAGTGGGTAAAATGCTATCAAATAGCATCACATGGTATGGAGAAATCTTTTGTGAAGGGAAGAGTCGACCAAGGTGGCAAATTGCATTGTCATCTTATTTTAAGAAATTGCCACAGCCACCCCCAGCTTTAGCAACCACCACCCTGATCAGTAAGCAGCCATCAACATCAAAACAAGACCGCCATCCTCTTCAGCAAAAACACTATGACTTGCTGAAGGCTCAGATGATGGTTAGCATTTTTAGCAATACAATATTTTTAATTAAGGTATGCACATTGGTTTTTCTGACATAATACTATTGCATACTTAATAGACTACAGTATAGGATAAACACAACTTTTATATGCACTGGGAAACCAAAAAGGTTATTTTTGAGATATTTGCTTTACTGTGGTGGTCTGAAGCTGAACTCACAATCTCACCAAGGTGTGCCTGAACCTCTTTAGCTAACTGGCCACTGCCACAGTCCACTCTGTGTTGGTCAAGATGCCCCAGAGTGGCAGGCACACTGTGTGGTCACATCCAAGGGCCTAGATATGGTGGGGGCTCCAAATGGATCTAGATATGTGAGATCTCTCTTTGATTTGACTTCTTCCAACCCACCATTTTCTGGGTGCTGGGCTCATCTCACCCAGAAAGTAGGACCCAATGTGACAGTTCCTGCCCAGTTCCCTCCTGTGGTAGCCACTTGACCCAGGGGCACTCTTGATCCTTGCAGCCTCACTTACACACCCTATCTCTACCCCTATTAACTCTCTCCAATCCCCACTCCCCCTGCTCAGCTTGTCTGCTGCCCAGTGGGGGCCCCACCCATGCTGGCCTCTCCTTTTGCAAGTCCCCATTCCTCATATGGTTTCTTCAGAGCCCCTTTCTTTGGCTTTGAGGAGAGATGCCCTCACTCGCTTCCCCACCAATCCTGCCCACTTCTACAATCCATTCATTATCCTAATTGCCTCCGTATACAGACTGGAGTGAGAGGAGTTGATGTGATGGGTGTGGATACAGGGCTGGTGCTGTCATCTTCTAGTAAGCCCTGGGAGAGGTGTCTGAGCCCAGGTGTCAGTGGTTTTCTTTGGAACTGTGAGTGCATAACACTTCTTTGCCTTCAGCCTTAGGCCATAGTTGCTAGTTCTGGGACAACCAGAAAAGCCCTACATAATCTCGTGTTATGTGCAGAGCTGAGTATAGAGCTCCAGGTATGATCTGACTCACTTAAGATCACAGTGAGTCTATTGTATTGTTGAACTGTTAGCTTAGACATCTGTTACTGTACCTACATGGCACTAGCCTCACGCCTAGACACCGATCTGAAAGAAATCCCCTAAATGCATAGAGAAGACTTCTCAGCTGAGCTAAGGGGCTCCCACCAGGTTTGAGCCTATCTAATGAATCCATGAGGTAGACAGCCTGCACATGTCCACTTGGTTTGATGAATTGCACAAATCCCTATGGGGGATGTGGTTCATGGGCTGGGAAGTGGGTTACCCTGGGAAAGGTCTACAGGACAGAGGCAGG
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ｈＲｏｓａ２６配列
（配列番号４）

ACCATTTAAACCTCAAATTAAGCAACCCACAGAACCAGGAAGTTCAAGGACCATGTCTGTTTTCACCACGATGTCTTTCCCCACCCCCCCACCCCCCACTCCACCCCCCACTAAGGGCAGGGTATTGTATCTGCCAGACTGGGTATTTGTTGAACAAGCGAGTATTTTCGCCTATTAGCTTAGTTTTTAAGGAAATCATTTTTTACTTGATTCATCATAGCTTTAATTCTATTACATACTACAATAAAAATTTGACAAGACTGATACAAATATGTAGTGGGCAATAGTTTGCCGTCTTCTTCCCTAGTATGGTGTTTTTCAATCTGGTGACTAGAATAGGCAGTGGGCTATAAGCAGGATTCATAAGGCCTGGAGCTGAGTTATATGTGACACTGCCACCTATTCATTGTGTGACCTTGGTTTTAACCTTCAAAGTGGGTCTCCTGGACTAAAAGAATGTGAAAAGATGGGGAAATAAATCTGTAATCTGAACATGGAATGACTTAGTTACAGACCAGACATATTGTTACTGGGAATGAAAAAGTCAATATATTTGAGGGGAAAAAAATGTAAATAAATATTGAGAAAGATTTTACAAATCTAATTAGGGGAAGATAGTTATCTCCCAATACTAGAGGGTACCAGAGTGCTTTTAAGGGGAACATTTGGTTACCCTTATTTCTTTAAAAAATGGCAGTTTAGGAAATTCTGCCCTAACTGTAGTCCCAATGTCAGATAGGACTCAGGTCTCCACTGCAAGGACCAAAATGTTAAGTTGAAGACTGAAAATGGGAAAATTTGGAAATGTCTTTGGAACCTCAAGTACATAAAAGCCTGTAAGTGCTTCATACTCATTAACAACATAGGCATAGAAAAAAGATATCCTTATTCTCAAGCATAGCCTTTTCTAATAAGTTCATGTTAGATGTCATGAAGTTTAGTGAGGAGTGAAAATCTATGAGGAAAAACATGAACCATTCTACTCTGGCAAA
AGTTCAGGACAAACACCATAGGCCTGTATACCAAATTTTAAACCATGTTGAATAATGTGAAAAAAAGCATCACATTGCTTATGAAAGGCTTTCCTGTCGCCCCTTAATACTTCTGTCTCAGGCTAACATGTTTGTTAATGAGTTACAGTGGTGAAGTTAAGGAAATCTGCTTCCTGTCCTAGCATGCCCATTATCCCAGCCATACAGATTTAATACCAGGAGTCACTTTAACTCCATGAAGTCATTCAACAGGTACTTGAGTATTTACTATGTGCGTTTGTGCTAGAGTAGCCATTTCTTAAACTTTGTGGCCTCAGAGAATCCCTTCACATTCTTAAAGATTGAGGGCCCCAAATCACTTTACTAGTATCTTACCATATTAGAAAGTAAAATATTTAAATATTATAGCAACAAATGCATATTTTTAAAAAAATAGGTGCATTGTTTTACATTTTGGCAATTGTTTCCCTAAATGTCTGACTTAAATAGAAGACAACTGAATTGTTTCTTTTGCATTCAATTGGTTACAATGTTACTAGCAGTTTTCTATAATCTCACGTATTAGTCATTAGGAAAATATAGCTTCACTGAGTTATGTCAATCTCCCAAATGTTGGCCCATTTTACTGTATACTACCTAAAATATCATTGGCCGGGCACAGTGGCTTAAACCTGTAATCCTAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCACCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGTACAGTGGTACACACCTGTAGTCCCAGTTATGCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGACAGAGGTTGCAGTCAGCCAGATGTCCCAAAAAAAAAAAAAAATTATTTTCAATATCACTATCTCATGAAGTATTGGGAAGCTGTCAAGTTCCTGATATTAGACACAAGTTTTCCCGAAATTCTGATTTTGACTCAACGTTTGGATTTTATCATTGAAAACAATTGCTGTCAGTTGTTAGGCTCCAAGGAAATAGCAGATAATTCAGCTTACATGAGTGCTTTTTCTTGAGACAACCATTTCAAAAAGTTATGTACTGTAGGGTTTAAGATTTAACAAAATGTCACTGCTTTCACAAGGACATTCTTGAGTGAAACTGGTTTTTTTCTTTTGTGGGGGTTCACACCACAAATGCATGGCAGTGAAAAATAACTTAGAGTTTGATGCCACTGCCACAGTTTGTGCCAAGGTGCCTGAAATTTTACTTTTACCTACTGTTGCCTTATCACCACTCTTATGTCAACATATAGTTTAGCATAAACCATGAGATTTTAAAAAGTTATTCTACACTTGCATTATTTCAGGACATGTGTTTGTTGCCAAGCTTTCACGTAAGAGTATCTTTAACTAGTTGGTGCTGATGCCTGGCAAATACAAGCCAAGTAACAAGTCCAGCCATGTTTATGCACGCATCCATTGATAACGTATTAGCACAGTCAGCCCTCCATATCCTCAGGTTCTGCATCTGCAGATTCAACCAAATGTGCTTGAAAATATTTGAGAATATTTAATACAATAGTACAAATATAAGTACACAATGTAACAACTATTTATATAGCATTCACATTGTATGAAGTATAAGAAATCTGGAAATGATTTAAAGTATATGGGAGGATGTGTGTAAGTTGTATGCAGATACAGCGCCATTTTATAAAAGGGAATTCAACATCCTTGGGTTTTGGTGTCCTTGGCAAATGGCCAGCAAGGGTGGGGGAGTGCTGTCCAGAAACCAATCCCAAAGCAAGGGACAAATATATACTTCTACAGATGAGATATTAACTCAGAATCCATGTCTGCACACACATCTTTAATGACAAGTTGCTTTATCACTCAACAGCGGCACTACTATGATCTTTTACTTACACTTCAGCCAGCAGAGACATTCAGCAGTGTGAGATTTTTTAAGTTTTTCAGCTATTGTGTATGTTTCTAGTGTATAATAAAGTAACTTATCCTTTAAGATACTTAAGTAGCTTTTCATTTCTAGCTTTAAAACCTGTTTTTTTTTTTTTCCCAGTAGTGGCATACCTGCATTAAAAAATAATGCCTTACCAAAAAAAGCACTCTGAATGATTGGTTTCAAAATGATGCCACAACATAGGTGGCACCAACACTATTCAAGATCATTCCATTCCCATCTCTAAAAAAATTTTTGGCTGGGTATGGTGGCTCACGCCTATTAACTCAACATTTTGAGAGGCCCAAAGCAAGATCACTCAGGGCTAGGAGTTGAAGACTAGCCTGAGCAACATGGCAAGATCCTGTCTCAAAATTCTTTTTAAAATTTTTTTAAAAGCCCAGGCTTGGTGGCGCATGCCTATAGTTCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGAAGGATCTCTTGAACCCAGGAGTTTCAGGCTGTAGTTCACTATGATGGCAGCTGTGAATAGCCTGGGCAACACAGCAAGACCTCATCTCCAAAAAAAGACAAAAGAACTAAATTATTCTACTGCAGAACATGATTAGGTAAATATCTCCAAAGCAGAAAGACAGGTTTCATATTTTCGTTAGTTTGAGTCAGTCCTTCCAAATCAAATCTTGTTTTTTATTAGTATACAGATGGTATAGCCAGTAAGTAAATGAGAAGCAGTCTTTTTAAGCCGATCCATTCTTAAATGAAAAAATATATAAATATTTTAGAATAAATTTATTAAATTCTAAAGTTGTAGAATTTTTAAATTTGGATATTTTGGGAAAATATTTAAACCACTATTGCAAACAAAACAACAAAATGTACTTATGTTTATACTTAGGCACAAAGAAAACTACAGTATTTTAAAGTAACCATTACACAATATTGAGGTTGCAAAGATTACTGAAGGCATAACCTAAAAAATGAGTTGATTTCTAAAAATGGGAAAAAGGAAAAAAATAATTTCTAAAAACAAGTATGCATACCTAAACCTACCTAATGACACCTTAGAAAATTCAAGTATAGCACCATTCATTAACATCAATGAGGATGTCATCACACATCATGTAGCCTCTGCACACCGTGAGAATAAATGAAAAAGACAGGCATCTTGCTATCATGACAATAGTTTTGACCTCGCAGACCTCTCTGT
GCTTACGCAACGGATAAAGCCATAAGAACTGTCCTGCCCTCAAGGAGCAACCTAAAGTAGGAAAAAAAAAACAAAATTACACAATTATTATTTACAATTGTGAGAAGAGCTCTTGACAACATTCAAATGGAGGATACAGTGTAGTAAGGGTGAGGGTATCAAGGCTTCCTTGAGAAGTGATGTTTTGAGGCCATTCTTTCTTCTCAATAACTGGTATTTGGTTCCTGAATCCTTTAACTTCCTTACCATTGTCACTCCTAAGCCAAATCTCATTACGTCATGTCTAGACTACTGTTAAGAGAACCACTTAAGTGGTCTCTGCAGCCCTCAATTTATTGGTGTTATCTATGGGAAAATTGCTCAAACTCTAAGCCTTAGTTTCCTACCCTATAAAATGGGGTTTTATATACAAGGAACATACTAAATACACAGGTATACCTCAGAAACACGGCAGGCTCAATTCCAGAGCACTACAATAAAGCGAATCTCATGAATTTGTTGGTTTCCCAGTGCATAAATTATGGTTACACTATACCATAGTCTATTAAGAAGTGTACAATAGCATTATGTATAATTGATAAATACATCACTGCTAAAAAAATGCTAACAATCTTTTTGCTGGTGGAGGGTCTTACGCCAACGTTAACGATGGCTACTGACTCATCAGGGTGGTGGTGGTTGAAGATTACGATAGCTGTGGCAATTTCTTAAAAGACAATGAAGTTTGCCACACTGACATCCTTTCACAAGACTTCTCTGTAGCATGTGATGCTGTTTGATAGCATGATAGCATTTTACCCACAGTAGAACTTTTTTTTCCTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTAAACGCAAGGTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGGGGCGCCATCTCGGCTTACTGCAACCTCCTCCTCCCTGGTTCAAGAGATTCTCCTGCCTCAGCTTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGGTGTGCACCACACCTGGCTAATTTGGTAGAGGTGGGGTTTCACCATGTTGGCAAGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTCAAATGATCTACCAGTCTCGGCCTCCTAAAGTACTGGGATTGCAGGTGTGAGCCACCACACCCAGCCAGTGGAACTTATTTCAAAATTGAAGTCAACTCTCTCACACCCTGGCACTGCTTTATCAACCAGGTTTCTGTAATTCCTAAATCCTTTATTGGCATTTTAACAATGTTCACAGCAACTTCACCAGTAGATTCCATCTCGAGAAACCACTTTCTTTGCTCATCCCTAAAAAGCAACTCCTCATCCATTCAAATTTGATCATGAGATTGCAGCAATTCAGTCACATCTTCAATGCTTTACTTCCAGTTCTAGTTCTCTTCCTGTTTCCACACCTGCAGTACACAAAAAGCATTCAATAACTATTACTTCATTTCTTCTACCTATGTTTCCATTAGCTTTTGCCTATAGTACGCACTAGAGTATGTTACCATTATTTGTTATAAGTAGTACCTCATTATTACACTATTCGTAAGCAATACCTCAAGGTCTAAGATTAGATTTTAAATCAAGGTCAGTAAAAATAGAAAAGGCTGTGAAGACTGTTGACTGACTTTACCAGAATCCATACACTAGAGGTGAGATTAGTTAGGTGATGAAATAACCATTCTATAAACATGATCTGAAACTCTGTTACTGTTGTCAGCAGGAAAAGCCAATGTTACATATGTTTAAAAAAGAAAAAAAAAACCCAAAACCAGAAAACAAAAGGTGACAAAGTATCAAGACAAAAGGTCACTGATGACTGATCTCTAGGAAAAGCTGGAAAGCAGGATTATTAAATGTAACCACGACTAAGATAAAAATCAGAGACAGAAAAGTCTTTGTCACCAAGAAGATATACTCCATGAGAGAGCAGAAACAATTCATCAGGTTTAACCCTGCTCTAGATAAAATAAAACTATCTGATTCAATACTCACACTTCTCTAATAATCCAATACATTATCCCATCTCAAGAAGAGAGAGTCACAGATAAGAAAAAAAAGGCTTCTTGAGAAGTATGTGCTCTAATATAAACTAATATGCCACTAAGAAAGCAACCTGCAAAGTCCAGTACCAGACTTCTGGATTTGTGACCTAACAAGGTGCTCTACAATTAACCTAACAGTCAAACCAGAGTGTTGTAAAAGAGAATTATGTAATTATGCCAAACCTCCACTCACAAAAAATATATGGAAGTAACCTAAGTTTACATTTTGCAAATCTCACACACACACTAGCCCTGACAAAAGTTTCACCAGCTTTCTCATCCAAGTACAAGCGTGTAATATACTTAATAAATTTGTCTTATAAGGGTAAGAAATAGTATGTAACTACTTGAAAAGGAGATAGGTAGCTGGTTAATTTAAACAAAAAGCCCAAGGAAGTAAGGTGCAGGAAAAGGATAACTGCAATGATTAGTACAGGAAACCCAAAGAAGAACTGAATGGTGGGATAGATGTACTCAGAGACCATGAGGCATCAGTTTCCTCTATGAATAGAATATTAGGAGATGTAGGTTAAATGGGACCCTGAAGTCTCTCCCAAAAAGCCTTGTTTATATGTTTTCTGAGCTTAACTATTACTTGAGAATCAATTTCACGTATAAACCAACAAAACTAACATTTATTGAGCTTCCAGCTCTGTGCTTAGGCACTGAAAAATCACTTTCCTTAAGGATTGCAATTAAGCAGGAGAAACACAAATAAGGTGAACTTCTCTTGTTCGAAAGAATATATTTCAACATTCCTTTTAAAAGGAAAACCTGACCTGCAAGTTTCCAAAAATATTAATTACTATTCCTCTTTGCCTCTCAAAATTCCCATTCTGTTATTTTTTAGGAGGAGGAAAAAACAGTTCATTTGAGGAAAAATTGAGGGTCACATACTATACAATTGAGAAGAGTTTCTCTGAAACTGTAATCATTTTTGGCAGGTAAATAGGCATATCCGAGTCAGCAAATGAACTTGAAGATACTGAGTTATACTGCCTGCCCTGTGGGGTTCCACCTTCCCCAAAAGAATTCAGAATTTTTGGGTGATCTGAGAATCTACATTAAGACAACTGTCTCCACACACAGGAGGCCTGAAGATCGCTGACATAAGGGTCTTTTTAAAAAGTATATTTAATGGCCTAG

CCGCGCAGTGGTTTCGCTCATGTGAGACTCGAGCCAGTAGCAAGGGCCCGGTCCCACAGCTTCGACAGCCAATCAGGTGTCGAAGACAAGCAGGCGGCGGGTAAACCGACTCCCCCGAAGGAAGGGGAGGGTGGGAGGACGCCCGCGCCAGAGCCGATTTCACTGACCCTCCCCTCCCGCCGCAGGAGGCCGGCCGCGCCCGCACACCCAGCATCTCTACACCCCACCTACCTACCCGCCCCACCCAGGGGGCAACGCGAGAGTCGCTAAGCGGCTGCGTACTCCCGACGGCGTAACTGACAGGAGCTTTACTCCAACCAGAATACGCCATTTGTGTTTTCACACACGGCGGGAGGAGAAACGGCCAATCGGCGACAAGAGGCTAGCCGGAAGCGCTCCTCCCTCTGCGAGAGCAATGGCTCCGTCCGGTTTCGAGCATTTTCCGCTCCCTTCTCCCTCCCCCTCCGGTTGCCGCAGGGCGGGCCTCCCTCCCGCCTGCATCCAGCCACCCCTTTCCCTCCCAACGTAACAAACATTATGTTCCCGACTTCCCACGGGAAAGGCAACCCCCGCAAGCCACCAGACGGCCCCCCTAGCCACCCATCCCCCCAGTGTACCGCACCTCCCCTCCCACCAGAGTTCCGCTCCCCTACCTAGCCGAGGCTCTCTGAGGAGCCGGAGCGCCGAAGCACAGCCTCTTCTCTAGGCGGCCCCGGCGGCTTCCGCTGATTGGCGGCGAGTGGGCCAATGGGTGCGGGGCGGTGGGCGGAGAGGCCAATGGCGCGGCGGGAGGGGGCGTGTCCCGGGTGCCCCTGGCGCCGGCGCTGGGAATCCCCGTGCGGTCAGTGGCGTTTCCGCTCGGGCAGCGGGCTGAGTGAGCTGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCTGCCGGGGGAGGGGCGGCCGCCGCCCGCCTGCGCTCAGAGACTCACGCAGCCCCAGTCCCGCCAGTCCGCCAACACAGTAGTGCCGGCCCCCCTCTTTCCCTGGCCCTGCCCCCCCTCCCCGCCTTTGGCTCGCTCCGCCTTTCTGCCCCCCACCCCCACCTCACGGGTACGGGCCATTCCCGGCCAGGAAACGCCGTGGCGCCGCGTTGGGCCTAACTCGAGTCCTGCCGCCTCCCGGGAGTGCCGTGCGCCGCAGCCCGGGCCCAGGCCCCGGCAGCGCCTGGGACAAGGTAAGGGTCCGACAGAAAAGAGACCGAACCTCACGATCGGGCCCCAGGGGAGGGAAGGGTCACCTCCTCCGTCTCCCCGCGCTCGCTCTCCTTGGGTCGTGGGCCTGGCCCTCCCCAAGCTCTTAGGAGGATGCTGCCACTTCTCACCCCCCTCGCCGCCTTGCACACACCGTTGCAACACCCCATTTTCCCAGGGAGAGAGATCCCCCTCTAATCTAGGCGACCCAACTCCCCCTTTCATGTTTTTCCTGGGTCAGGACGCTTCCCCTCCCCCAACGCCTCTTCACCCCCTTTCCTGGGAACTGCCTACTCCACGTTTACCTTTCCCTTGAGGAGAGGCCTCTTGCTGCCCTCCGCTCGAAATACACAGGCATACTTTTTTTCTCTCCCCGATCCCCCACTCCCTACCCCCGTTCTCGCGGCCTTGTGACAGACAACTCTGATCGCTCTGGGGGCCGCGATCTCCCCTCCGTAATCTTCCTGGACGCCTTCCCTCTCGTTTTCTGGCTTCCCACCTCAGATGGCTGCTTCCCAAAGGCATTACCTTCGCCACCCCCACCACACGTTCTCTGGCTCCCCGTGGCGTGTGCCACAGCGTGTCTGAGATAGCCTCGTTGAATGTGTAGGGTTCGAGCCTGGAGTTGAGCCAGATTGTGTCGTTTTACTTGCCTTGGGCGTGGAGAACGATCTTGTGAGAATATCTTCAAAGGCAGAAAAATATTCCCTTTATGAATTCTCTTTCCCTCTGCGTGTAAGTCGGGAATGTGAAGAGGAGTGTAGGAAAGAGCCCTGGTTCAAGTAGGTAAATCGCATGAGAGGGAAAGTTAAACTGTTGGGAAAGCCCCTTCTATGCTAATTGATTCTATAGAGTCCTTGCTTGTCTCACTTCTTGGGCGTCAGTGGTCTTTCTCTTGGATATGGATGCTGCAGTCAGCTCTGCTGGTCTGGGTCAGGGGTGCGTGTATGACCTGCATTTTCTGCTTTCTCATGTTACTTGTGCAATGTATTCACCGGTAACTCATTTCTTTCCCAGACCTCTGGGTTCCACTGGGCTTTGTCTATATTTAAGTTCATTTCTCCAGTTTCCTTCCTGCACATAGGTACTGAACGAATCCCCAAGTTCTGTGCTAATTACCTTCATCAGTTGACTAAACAAGTTTTTAGATGACATATTTGTGACCAAGGTCATATTTACATTTCTTTGTTGGACAGATGTTACATAGCTATACTTGTGATTGGGGAGGATCCAGCTGAGTGGAGTGTGCTGAGCTTTTTAGGAGAGTGTGTACTCCCTATTTGAAATTATTTTTTGGTTGTTAATTTTATATTATTAATGTTTTTAGGTCACAGAAAGTTCTAAGTGGTAATTTTAGATGTGTGGGATCTGAGCTAGGACTAAAGCAGAGAATACCCACGTAATCAGAGGTTTCTGGGCTCCATAGAGGACGTAGGGCTTTTTTTTTTCTATTGGATTTCTTCCAGTTTTCTCAGGATCATTAGTTCTCTTCTGTAGCCAAAAATTCTGGCCTGTTATGGGATTAGAGTCTTTAAGGTTTACTCAGACTGTCATTATGTGTAGAAAAATGAATTATGCCCTTTGGTAGGACATGACACAAGGCTCTGTTTCTAGCTGCAAATTTAAATTAGATTGTAGAGTGCTTGGGAAATTGGCTTTCAAAAGACCAAAGCTTAATCTTCACTCCTAAACTGCTGGCTTAATTAAAATGGATATTTAGAATTTGGTAAATGTTGATTTTTCTAATAAAAGGCCTTGGTTTAAAAGGGTGACCTTAGGATTGTTTCTTTCTTAAAAGCATAATTCCAGCCCTTCTGGCATGGAGCACTGGTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAGTGTGTGTAAGGAGTGGGGGTGGGGTAAAGAGAAGGTTGTTCCTTTGGGTTGGATCACAGGGGTGAGTATACAAGGCAGCAGCAGCTG
CTGGCTCTGGAGCTCTGGTTGCTACGTGAGAAGCTTGAGTAGTGCTGGCTGCTGTCTCCAGGGAAGGACAGCAGTGCAGCGTCCATTAATGCTGCTGGCTGCAGGGAGCAGCACTTAGGCGATGGCTGCTTCAGGACTAAGAAGAAACCTTGCTTTTCTGGGAATTTTCACTGCTGAGCTGGTTTGCTTTTTATTGGTGGGGAGATGGGAATTAGTAATTCATAATCTCCTACCCATTTATGGATATTGGCATCTGGAAACTGGATCATGGTTAAAGCCTTTCTTTTTTTGTTTGTTTGATTTGATTTTTGTTTTTTGGCAGATTTTTGTTTTTTATCTAGACATTTGTGCTTGGATAGGACTAAAAGTTCCATTAGAGTTTTAATTTTTCAATCAGTTTAAAAACCCAAGTAATAATTTTAAGAATCTTTCTGATAACCACAATAGGAAGAAAATAACAGGAATTTTTTCCTGCAGCTCACATATCATGCCTTCCTCCATCTCTTTAATCATAGAATCAATTCTTATTATTTTGTTATGTGTCTCCATCCTTTCGATTAGACCACATTTACCTTATAGACGATTTGCTAAACATTTTACTAAGCTTGAACTCTTAAACTCTAAAAAGGTGCCATTTTGGAGTGGTTTCTAAATAAATATTTTTAATTTGTATATTAGTAATAAACTTCTCCAGATTAGATATTTTCTTTGGAGTTTGACTTATAAGATTGATTCATTATATACATGTTGGATATAGCCTTCTGACATCACAAATATATGTCTTTGGCCATAATCCATCTGAAATGTAGGACAGACCAGAAGAAATATGCAGAAATCGAATAAGTCTAGTTCAGGATACTGAGAAGATGGCCTCTGAGCCCCTTAGGTGATCTCCCCTCCCCCACAACTCCTGAACATTAGGATGATCTCTGATTAAGCAAAACAGTCTGAGCGTGGAAAAACTTGAAGGAGAACCACCACCACCAATTATATGCAATACTGGACATATTCCTGTGTGCTGTTTTTCTTCCCCAAGACTCGTGTATCCTATACTTTTTTCTCTCAGAATTTTGATTTGTTCATTTTCGTGTAAATGTACTTAAATCTCACAAACATCTATAATTTGTAGTATCACTCTGGCATTTGTGGCAGAGAACCAAAAAGAATGGAAATGAGTTTTGTCATTCACAAATGTGGCTCACATTGTTTTCCCAGTAATAAAAGCAGACCAATGAAACAGAACCTTTAATGGATACTATTTTAGGAGGTTCCAATTCTTATTACTATCACATAGATAAGATGCAATAGCAGATAAATATGATTTCATGTATACTGGCTGTTTGACATACTTAGGGTTTAAGATAAAAATGTTTGTAGTTTTTTACTCTGTGGCTTAAGTTGCTATATAAAATAATTGCTTTTACACTCGAATTTCCTGTTGTTTGGAACCTTTTGTGCTCTTGATATTATCATTTTTTAGAGGATCATACAGGCCCTTTTCATAGAAGGATTTACTTAAGTTATACCCTTGAAAACTTTTTTATATCTTTTGATACTGTTTTGTGTCCAGGAACTGACTTTCTGAAATTATTCTGGCTTTTCTGGGGAGAATGACTATTTCATTTTTACCTTTGAATGGGGAAATAATAAAGTGCAAAGTACAGATTTGCAGATAATTACTTTTGCTTTATCCTCTCCATGTTGAAATAACTTATGAAAAATTAGGCCATAGTTAACAGCAGTCAATGACTATTGGATACATTTTATCAGAGGGGAACTGGATCATGAATAAAATAAAATTTTAAAAATAATTTTTGGCTGAACTCTGGTGATTCATCAGTTTAATTTGAAGTCAGAAGGTCTAGCAGTGAATTTTATTTATAAAAATTGTATTTCAAGTGTTGAAAACTGAAACTTCTTGACCAGTATATTTTGTTTGAGGCATCAAACTTTGCAAAATGTGCATCGTATATTTAGTGATATAACTGGTAGTCATTTGTAATTTAAAGTATTCTTTCAAAGGCACTCTTTAGAAAGTAATGTAGTGTACCCGTGATGGGCAGGGATTGGTACCATTCCTTACTGCCAAAAATTCCAAAATATGTGGCAAAATGATTGATTTATCTTGTGGGTGGGATTCTGGGAAGTTCATGAAAGGTGGAGAGAATATAGTTTCCTTCACTTGTCTATATACATTTTGTTAAATAAGTCTTAGGAAAACTGTTTTATTGTATCTTTAATTATGAATTGCGTAAAAGATACCCAGTAACTTTGGGGGGAGGTGCTGTTAGAAAGCATTACATTGGAGAGAATTCCCCTACCCTGGGACAAAATGCATTCTGTCTTTAATACTTAGCGAAGGGAACTATGGGATAAAATAAACAATGAAGGTAAGCTCAGTCTGCTTTATATGTGCCCTCACTGAGCAAGGAATTTGTAATCGCATCGTGCCTCATTCGTTTATACCATCATATTGATTTTGTTTGCTGAGTACCTGAGGGAATACCTTACTTAATGTAAGGTCACATTAAGTATGTTTGATATGAAGACAGGGAAAGGAATTTTCTGCTTCTTGGAGTAATGTCTTAGTATTTTTAAAACACTTAAGTTTTTACATCAGGCCAGTTTTGCCTGATGCTCATGTCTGTTGCTTTGGTTGGGCTGCTGCTTTCTCTTCTGTGTTCTTATGGGTTCGTTGTGGTATAAGGATTCCCACAGCTTTCATGGCAGTATGAAGTAATGAGAAGCATTGCCTTAGCCATGTTAGTTACATGTATACTTTTGGCCTATGTTATGAATCACAAAAAGCGGTAGCTATAGGAATGTATACAAAATAGATTTCTGTCTGGGGAATCAAGTTTTTGATTTGTGCTACCTAATGGAGGGGAAAATGCTGAATTTCTTGCTGCTCTGTTTGAGAAATAGATGGAAGCATGGGAGGAGCCAGAGACCTCTGCAGCAGGATTTGGTCTAAGTAGAAAAGGAAGATTTTTGTTTCAAATTGCCAGCTGCTTATGTCAGACTGACTCCCTTATTATGCCTCCAGTAGGCCTGTCAATATGGCCAAACAGCTAGATAAGTGCGGGGCAGGACAAAGGGCTCTTTGCACAGCAGGGAGGCAATGTTGGTGGGGGAGGGGCAGGAGGTAGGAAAGGCAAGAGG
AGGAGGTTCTTTTCCCTGGGAGATTATTCAGTTTGGCATACAATTAAAGAAATCATTTTTAGTTCCCACTCAAGCATTGAATTTTTGCCAACCACATACTATTAACCCCAAATTTGATACATTTCAGAATATCTTGTAGGGATCCATTCTCGCCAAGGAAAAATAAAAAAATAAATAAAGCTCTGTATAGGTTAAAATAAAATAAATCCCACACTCTGCACCCTCCTAGGTGCAAGTCACCTCCCGAGGAGACCCGTTCTAGAGCTGAATTCTCATTAAGAAATGGAAAAGAATACTCTATCTGAATAAAAACACATTGTAATACAATGTGTTTATTTGGGTTGGGATTGGACCTGAACATGTAGAATAATTTGTTTCCCTTTATGAAATAGTTGCTCGTAGTTGTCTACAATTTTATTTCATTAAGATAGGTAGCACATTACAGCTTTCATGTGTTGGGTTGCCATATGTAAAATGCTAACTGAAGAAAGGCTACTTTTTAATTTCAGCCTCATCCTTAGTTCCTGGAGAACCTGATATTTCCTGGAGATTACTCCCTCCCCCACCTTTTAGTTTAGGCAACCTCTTTTGATACATTTGTGTTCAGCTCGCATACAAGTGGGATAGTTGCATCCAGTTTATTAAGACTTAGTATGAATCATAGAGTTGGAAAAGATCTGTTGGTTATCTGGTCCTTTAAACCAAAATCATAATGAAATATTTTGAAATTTGGGTCCCTATTGAAGTTTTCATTAAAATGTTAAAGGATCGGTGTTCTGAACAACATTTTTAGTTACTTTTAAAATAAATGTTTTGCGTCAGTTCTTTTTTTAAAAATAAAGAATTTCATTTATAGGCAAATTAGCTGGCAATTATTTGAATTGTGATAGGATTTCTCTTTTATGAAGGAATATATGACAAGGTTTTTCAAAATGCTTAATATATTTTAAAAGACTTTAATTTTTAGAAATAATTGGTTTGAACAGTTTTCCAAGAGCACATTTGTTGCTTGGGTTGAGGTACCACCTATATTGCAATGTTACTAAACTAGCCTTAAAGTTTTCCCTTCTGTCTATACTGCATGCAACAATAAAGGGAACTGGAATGTTAATTTCCATTTATGGATTAGCAGAGGAGATGTTTTAACCGATTAATAACCAAAAAACTGCCTTTCGTACACGTAATATTAAGCAAGCCTGACCAAGTTTTGTGTTATTTCTCTCTGTTAAAGAAAACTGGATGTGTTACTACTTAACATTATATTGTTATTTAATGGTCTTGGCAGTAATGATATAATATTTCGACCAAAAGAAATTTTGAGTAATTAATTATTATTGTAATTAGTTGGAAGTTTCTCATCAGTAAAATAGCAACAGCATTAACACAAAATCTAGTGAGCTATATTTTATATTACTACAGAAATTTAGGGTAGTCATTTCTTTCTTTATAATTTATTCACATGGATTATTTCCATAAATTTGTGGGACTAAAATAGAAGCCATCTAGTCAAGCACCAGTCTCCATACCAGACAGTTTTCTCTGCATGTGCTATGACCCACATTGCCAGTATTAAACATCCTTTACACCCTCCCCCTTCCCAGATAATTAGAAATCTCTTCAGGGTAGCTTCCATTGCTCCTATTACCTGGATCTTGCTAGAGGCTCTAAGAAGTTCCTGGTAAAAGTGAGACAGTAAGGGACCACATTTTGATTCCAAAGGTTTTGATAACTGTTAGGGCTCCCCAAACAGCTAATCTCATTTTCACCAAGACTTAGCCAGCAGAGGGCTGGAATGGAGGTGAAACACAAGCACTGTACCTCATCTTGCCTGTGCAGCTGCTCCACCTTATTTCCTGCTATTATTATCTCACAACGCCTCCTCCCATCAAAAAGAAACTAGGACAAAGGGGGAAAATTGGATGGGCTAATGTGATTTTTATTATGCTAGGTTGTGGGCTTGTTTATATGTACTTAAATACAAAGCTAATTTGCCCCATTCTTAAAAGTCTTTAGTGATAGAGATTTTGTAACTTCTGTATCTTCTACTTTCTTTCTTGATAAACCATTTCAGATTCTCAGCCTTACAGAAAGAAAGGTTTTAAGCATACTTAATTTTCGTTGGCCGTTCACAGTCATTATTACCACCAGATGCCACTGTATTATTAGCTTGAAGAAAGGTGGGCTCTCTTCTGTACATAATATCTGCAATTTGTTTTGGAAAATACTAATTTGTATAAATCTGATTTATGACTAAAATAAGGTTAAAAATTAGACCTCTATGTATGTTTACCCTATTACCTTAGTGGGGGTGAAATTAATTAGCTCTTTGAACATAAATTTTTCATGTCTTAGAGTTCTTTTTTCAAGCTGCATAATTTATGTTCTTCAAGCCATTTTTATCCCATACCACCCCCACAAAGGGGGAAATTTTATTTTTTATCATTTTTATTGTCTTTCAATGGTGAGATTTTCGCCACCCCACTCCTGAAATGTGAAGACTCAAATAAAACTGAGTAATCTAATAAGGTATATGCGTTGCTGAATGTAGTAAGATGATTGTTTCATCATTCTTAGATATTATGATCTAGTTTGAATCTGGTTTCCAGTATCATGTTAGCATATTTAATACTGTTGATATGTTAATTTTAATACATGCCCAGGTGGATCTCCTTGCTTTCTATTTGTGCCCCTTGTTTGTCGTTTTGTATGAAGGGGGTTTTTGTTGTTGGATTTTCTTCCCCATCTCTGTGTCCTGTTATGTTCTTTGGCTTATGTTTCAAAAATTCTGTTTCCTACCACCAACCTCTGTACATGCCACAACACATACAATTTGTACTTTCACAGTTTCTGTGAAGTAGGATGATCTGCAGTTAATAATCAACTGTTTGGGCATTCTTGGTATCCAAGGAAGGTTTTACTTAGAAGGAAGAACCTGGAAGGACCTGTTGGCAATTAGACTACTTCTGCGTTTATTTTACATTTTCCCTTATTAACGTAGGCTGTTGAGAGTTGACTTGTTTTATAAGAGAAACCAGATTGACAGAGAAGACCCCCAATCAGATAGAGTTATTTTAAAAATAAATGTGTTTATTATGGTAAC
ATTTGGGGTAGAATCTAAAGGGCATATTTTTAAAAAAACTTTTAGTTCTAAAGACAAAAGAGTTTAACCTAAAACAGAACAAAGAGAAGGGCCTTTGAAGCAGTATGATTGATTATAT

実施例１１－ＣＨＯ及びマウス安定部位１配列－米国特許第７，７７１，９９７号
２１１＞６４７３
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ
＜４００＞１
（配列番号５）
tctagaaaca aaaccaaaaa tattaagtca ggcttggctt caggtgctgg ggtggagtgc 60
tgacaaaaat acacaaattc ctggctttct aaggcttttt cggggattca ggtattgggt 120
gatggtagaa taaaaatctg aaacataggt gatgtatctg ccatactgca tgggtgtgta 180
tgtgtgtgta tgtgtgtctg tgtgtgtgcc cagacagaaa taccatgaag gaaaaaaaca 240
cttcaaagac aggagagaag agtgacctgg gaaggactcc ccaatgagat gagaactgag 300
cacatgccag aggaggtgag gactgaacca ttcaacacaa gtggtgaata gtcctgcaga 360
cacagagagg gccagaagca ctcagaactc cagggggtca ggagtggttc tctggaggct 420
tctgcccttg gaggttcctg aggaggaggc ttccatattg aaaatgtagt tagtggccgt 480
ttccattagt acagtgacta gagagagctg agggaccact ggactgaggc ctagatgctc 540
agtcagatgg ccatgaaagc ctagacaagc acttccgggt ggaaaggaaa cagcaggtgt 600
gaggggtcag gggcaagtta gtgggagagg tcttccagat gaagtagcag gaacggagac 660
gcactggatg gccccacttg tcaaccagca aaagcttgga tcttgttcta agaggccagg 720
gacatgacaa gggtgatctc ggtttttaaa aggctttgtg ttacctaatc acttctatta 780
gtcagatact ttgtaacaca aatgagtact tggcctgtat tttagaaact tctgggatcc 840
tgaaaaaaca caatgacatt ctggctgcaa cacctggaga ctcccagcca ggccctggac 900
ccgggtccat tcatgcaaat actcagggac agattcttca ctaggtactg atgagctgtc 960
ttggatgcaa atgtggcctc ttcattttac tacaagtcac catgagtcag gaggtgctgt 1020
ttgcacagtg tgactaagtg atggagtgtt gactgcagcc attcccggcc ccagcttgtg 1080
agagagatcc ttttaaattg aaagtaagct caaagttacc acgaagccac acatgtataa 1140
actgtgtgaa taatctgtgc acatacacaa accatgtgaa taatctgtgt acatgtataa 1200
actgtgtgaa taatctgtgt gcagcctttc cttacctact accttccagt gatcaggttt 1260
ggactgcctg tgtgctactg gaccctgaat gtccccaccg ctgtcccctg tcttttacga 1320
ttctgacatt tttaataaat tcagcggctt cccctctgct ctgtgcctag ctataccttg 1380
gtactctgca ttttggtttc tgtgacattt ctctgtgact ctgctacatt ctcagatgac 1440
atgtgacaca gaaggtgttc cctctggaga catgtgatgt ccctgtcatt agtggaatca 1500
gatgccccca aactgttgtc cagtgtttgg gaaagtgaca cgtgaaggag gatcaggaaa 1560
agaggggtgg aaatcaagat gtgtctgagt atctcatgtc cctgagtggt ccaggctgct 1620
gacttcactc ccccaagtga gggaggccat ggtgagtaca cacacctcac acatactata 1680
tccaacacac acacacacac acacacacac acgcacgcac gcacgcacgc acgcacacat 1740
gcacacacac gaactacatt tcacaaacca catacgcata ttacacccca aacgtatcac 1800
ctatacatac cacacataca cacccctcca cacatcacac acataccaca cccacacaca 1860
gcacacacat acataggcac acattcacac accacacata tacatttgtg tatgcataca 1920
tgcatacaca cacaggcaca cagacaccac acacatgcat tgtgtacgca cacatgcata 1980
cacacacata ggcacacatt gagcacacac atacatttgt gtacgcacac tacatagaca 2040
tatatgcatt tgtatatgca cacatgcatg cacacataca taggcacaca tagagcacac 2100
acatacattt gtgtatgcac acatgcacac accaatcaca tgggaagact caggttcttc 2160
actaaggttc acatgaactt agcagttcct ggttatctcg tgaaacttgg aagattgctg 2220
tggagaagag gaagcgttgg cttgagccct ggcagcaatt aaccccgccc agaagaagta 2280
ggtttaaaaa tgagagggtc tcaatgtgga acccgcaggg cgccagttca gagaagagac 2340
ctacccaagc caactgagag caaaggcaga gggatgaacc tgggatgtag tttgaacctc 2400
tgtaccagct gggcttcatg ctattttgtt atatctttat taaatattct tttagtttta 2460
tgtgcgtgaa taccttgctt gcataaatgt atgggcactg tatgtgttct tggtgccggt 2520
ggaggccagg agagggcatg gatcctccgg agctggcgtt tgagacagtt gtgacccaca 2580
gtgtggggtc tgggaactgg gtcttagtgt tccgcaagtg cagctggggc tcttaacctc 2640
tgagccatcc ctccagcttc aagaaactta ttttcttagg acatggggga agggatccag 2700
ggctttaggc ttgtttgttc agcaaatact cttttcgtgt attttgaatt ttattttatt 2760
ttactttttt gggatagaat cacattctgc agctcaggct gggcctgaac tcatcaaaat 2820
cctcctgtct cagtctacca ggtgataaga ttactgatgt gagcctggct ttgacaagca 2880
ctttagagtc cccagccctt ctggacactt gttccaagta taatatatat atatatatat 2940
atatatatat atatatatat atatattgtg tgtgtgtgtt tgtgtgtgta tgagacactt 3000
gctctaaggg tatcatatat atccttgatt tgcttttaat ttatttttta attaaaaatg 3060
attagctaca tgtcacctgt atgcgtctgt atcatctata tatccttcct tccttctctc 3120
tctttctctc ttcttcttct cacccccaag catctatttt caaatccttg tgccgaggag 3180
atgccaagag tctcgttggg ggagatggtg agggggcgat acaggggaag agcaggagga 3240
aagggggaca gactggtgtg ggtctttgga gagctcagga gaatagcagc gatcttccct 3300
gtccctggtg tcacctctta cagccaacac cattttgtgg cctggcagaa gagttgtcaa 3360
gctggtcgca ggtctgccac acaaccccaa tctggcccca agaaaaggca cctgtgtgtg 3420
actctggggt taaaggcgct gcctggtcgt ctccagctgg acttgaaact cccgtttaat 3480
aaagagttct gcaaaataat acccgcagag tcacagtgcc aggttcccgt gctttcctga 3540
agcgccaggc acgggttccc taggaaatgg ggccttgctt gccaagctcc cacggcttgc 3600
cctgcaaacg gcctgaatga tctggcactc tgcgttgcca ctgggatgaa atggaaaaaa 3660
gaaaaagaag aagtgtctct ggaagcgggc gcgctcacac aaacccgcaa cgattgtgta 3720
aacactctcc attgagaatc tggagtgcgg ttgccctcta ctggggagct gaagacagct 3780
agtgggggcg gggggaggac cgtgctagca tccttccacg gtgctcgctg gctgtggtgc 3840
atgccgggaa ccgaaacgcg gaactaaagt caagtcttgc tttggtggaa ctgacaatca 3900
acgaaatcac ttcgattgtt ttcctctttt tactggaatt cttggatttg atagatgggg 3960
gaggatcaga gggggagggg aggggcgggg agacggaggg aggaggggag gaggggagga 4020
ggggaggagg ggaggagggg aagggatgga ggaaaatact aacttttcta attcaacatg 4080
acaaagattc ggagaaagtg caccgctagt gaccgggagg aggaatgccc tattgggcat 4140
tatattccct gtcgtctaat ggaatcaaac tcttggttcc agcaccaagg attctgagcc 4200
tatcctattc aagacagtaa ctacagccca cacggaagag gctatacaac tgaagaaata 4260
aaattttcac tttatttcat ttctgtgact gcatgttcac atgtagagag ccacctgtgt 4320
ctaggggctg atgtgctggg cagtagagtt ctgagcccgt taactggaac aacccagaac 4380
tcccaccaca gttagagctt gctgagagag ggaggccctt ggtgagattt ctttgtgtat 4440
ttatttagag acagggtctc atactgtagt ccaagctagc ctccagctca cagaaattct 4500
cctgttccgg tttccaaagt actggagtta tgagtgtgtg ttaattgaac gctaagaatt 4560
tgctgattga agaaaacctc aagtgggttt ggctaatccc cacgacccca gaggctgagg 4620
caggaggaat gagagaattc aaggtttgcc agagccacag ggtgagctca atgtggagac 4680
tgtgagggtg agctcaatgt ggagactgtg agggtgagct caatgtggag actgtgaggg 4740
tgagctcaat gtggagactg tgagggtgag ctcaatgtgg agactgtgag ggtgagctca 4800
atgtggagac ctgtatcaag ataataatag tagtagtaac aatgcaggcg agggtgtggt 4860
tgagtggtag agcagttagt tgatttgaca tgcttgaggt ctcccggtcc atctgtggcc 4920
ctgcaacagg aagggaggga ggaagggggg gaacgagaga gaggaaagag agacagaagc 4980
taagataggg aatgagagag gaaggaagaa acgggaagaa attcagactc cttcctgagt 5040
tccgccaacg cctagtgaca tcctgtgcac accctaaggt ggcctttgtg tggcactggc 5100
ttgggtggtc gggaaaggca ttttcagctt gttgcagaac tgccacagta gcatgctggg 5160
tccgtgaaag tttctgcccg ttaacaagaa gtctctacta cttgtgacct caccagtgaa 5220
aatttcttta attgtctcct ggtgttctgg gttttgcatt tttgtttcta aggatacatt 5280
cctgggtgat gtcatgaagt ccccaaagac acagtggggc tgtgttggat tgggaaagat 5340
gatttatctg gggtgtcaaa aggaaaagaa gggaaacagg cacttgggaa aatgtcctcc 5400
cgcccacccg aattttggct tggcaaccgt ggtggaggag caagaaacac gtggacgttt 5460
gaggaggcat ggggtcctag gaggacagga agcagaagga gagagctggg ctgacagcct 5520
gcaggcattg cacagtttca gaaggagatt acagcatgac tgagttttta gggatccaac 5580
agggacctgg gtagagattc tgtgggctct gaggcaactt gacctcagcc agatggtatt 5640
tgaataacct gctcttagag ggaaaacaga catagcaaac agagccacgt ttagtgatga 5700
aactctcact ttgcctgagt catgtgcggc catgcccagg ggtcaggctg acactcaact 5760
caaaaacaag tgagaaattg aagacaatcc gtggtggcag ctactggaag ggccaccaca 5820
tccccagaaa gagtggagct gctaaaaagc catttgtgat aggcacagtt atcttgaatg 5880
catggagcag agattacgga aaaatcgaga atgttaatga ggcaacattc gagttgagtc 5940
attcagtgtg ggaaacccag acgcttccat cccctaaaag gaacatcttg ctctcagtca 6000
aaatggaaat aaaaattggg gcttgaattt ggcaaatgat tcagaactct gtgtaggtat 6060
tttcacacgc acagtggata attttcatgt tggagtttat ttgtgctaaa aggcagaaaa 6120
gggtaaaaag cacatcttaa gagttatgag gttctacgaa taaaaataat gttacttaca 6180
gctattcctt aattagtacc cccttccacc tgtggtaatt tcctgagata gtcagtgggg 6240
aaaagatctc tccttctctt ctttctcccc ctcccctcct ctccctccct ccctccctcc 6300
ctccctcctc tccctccctc cccctttcct tctttctttg ctccttctcc tctgcctcct 6360
tctccctttc ttcttcattt attctaagta gcttttaaca gcacaccaat tacctgtgta 6420
taacgggaaa acacaggctc aagcagctta gagaagattg atctgtgttc act 6473
＜２１１＞７０４５
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ
＜４００＞２
（配列番号６）
actagcgtgc aattcagagg tgggtgaaga taaaaggcaa acatttgagg ccatttcctt 60
atttggcacg gcacttagga agtggaacat gcctaatcta ctggtttgta ccacctttcc 120
ctataatgga ctgtttggga agctcctggg caaccgattc tggcatctca ttggtcagag 180
gcctgttaaa tggtactctt atttgcaaag aaggctgtaa cttgtagctt taaaagcctc 240
tcctcaagaa agaagggaga aaggatatgg ctagacatat ctaatagact taaccactgt 300
gaaaagcctt agtatgaatc agatagaacc tatttttaac tcagttttga aaaaaataat 360
ctttatattt atttgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 420
gaaccacatg tagcaggtgc tggaggaggc cagaagaggg caccagatct cctggaactg 480
acaccacaca tggttatgag ctgcctgatg tgggtgctgg gaactgaact ctcgtgttct 540
gcaagagcag caactgttct cttaactgat gagccatctc tccagccccc cccataattt 600
taattgttca ttttagtaaa ttttattcat aatcaattat cacagtataa aacaatgatt 660
ttatatatat catatacata tcaaggatga cagtgagggg gatatgtgtg tgtgtgtgtg 720
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgttattt gtgtgtgtgc tttttaagaa ggtgccatag 780
tcactgcatt tctctgaagg atttcaaagg aatgagacat gtctgtctgc caggaaccct 840
atcttcctct ttgggaatct gacccaaatg aggtattctg aggaactgaa tgaagagctc 900
aagtagcagt gtcttaaacc caaatgtgct gtctagagaa agtcaacgtc atcagtgagc 960
tgaggagaga tttactgagc ggaagacaag cgctctttga tttaagtggc tcgaacagtc 1020
acggctgtgg agtggagcct gtgctcaggt ctgaggcagt ctttgctagc cagctgtgat 1080
gagcagtgaa gaaagggtgg agatggaggc agggtgggag cagggctatg gttcagacta 1140
ggtatcgtga gcacaccagc tggttgactt gtggtctgtg ggtcaggcgt tgtaaacgcc 1200
ctcagggtca ggcagtcaca ttgcttgaag ctgaatgggt gaggcaacac agagagtgca 1260
aagaaggcaa agtaccacct cttccccgac ccaggtcact tctgggttat agctgagact 1320
ccggacagca tgcaaccagc tggttagagc ttcagggaaa acttgatgtc tgcatgttgc 1380
tatgaaatgt gattcggtac atctggagaa aatttataat gctggctcag tcaagcactg 1440
aacaaaggta ccttggcttt gggagctaca tgacattgac ttgtaggcag actttttttt 1500
ttctgcccgc caattcccag ataaccaata tggaggctca atattaatta taaatgctcg 1560
gctgatagct caggcttgtt actagctaac tcttccaact taaatgaacc catttctatt 1620
atctacattc tgccacgtga ctttaccttg tacttcctgt ttcctctcct tgtctgactc 1680
tgcccttctg cttcccagag tccttagtct ggttctcctg cctaacctta tcctgcccag 1740
ctgctgacca agcatttata attaatatta agtctcccag tgagactctc atccagggag 1800
gacttgggtg ctcccccctc ctcattgcca tccgtgtctt cctcttccct cgcttccccc 1860
tcctcttcct gctcttcctc ctccacccct cctttcatag tattgatggc aagggtgttc 1920
tagaatggag gagtgcccat aggcatgcaa agaaaccagt taggatgctc tgtgaggggt 1980
tgtaatcata agcgatggac acaattcaag ccacagagtg aagacggaag gatgcactgt 2040
gctctagagc aacttctggg gcagaatcac agggtgagtt tctgacttga gggcgaagag 2100
gccacgagga agggagtgag tttgtctgag ctagaagcta cggcccacct cttggtagca 2160
gacctgccca caagcatgct ttgttaatca tgtgggatct gattttcctc taaatctatg 2220
ttcaactctt aagaaaatgt gaattctcac attaaaattt agatatacgt cttttggtgg 2280
ggggggtgta aaaaatcctc aagaatatgg atttctgggg gccggagaga tggctcagag 2340
gttaagagaa ctggttgctc ttctagacat tctgagttca attcccagca accacatggt 2400
ggctcacaac catctgtaat gcgacctggt gccatcttct gacatgcatg gatacatgca 2460
ggcagaaagc tgtatacata gtaaattgat aaatcttttt ttaaaaagag tatggattct 2520
gccgggtgtt ggtggcgcac gcctttaatc ccagcactct ggaggcagag gcaggtggat 2580
ctctgtgagt tcgagaccag cctggtctat aagagctagt tccaggacag cctccaaagc 2640
cacagagaaa ccctgtctcg aaaaaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 2700
gtatggattc taagaaagcc gtaacagctg gagctgtgta cggagttcag cgtggtacta 2760
gaagaacaga cattcatgat gaaacacccc aggattttta cttagtatct agtttccatt 2820
gttgttttga gaccggctct tatgctctcc aggctggcct caaactgctg atcttcccgc 2880
ctctacctct caagtcctgg gactacttgg ctcataaaac agtttttgtc gggctccctg 2940
aagttatggt tgtacaaacc gtgggggtca atatactcac ttgggcagag agagaaggtc 3000
tgaatcccag acaatgactg catctcagga cagttgggaa gaggacaatg gcagaaggac 3060
ttagaaaaga tagactggag ggtggaaaag cagcaggaac agagaaacaa aacaggaagc 3120
ttgctatcca gggccactct ggagtcctgt ggcaagatgg aagcgggcta ggggaataca 3180
tttgtgctac tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgat caatgcctat 3240
caatgttgaa ggggaaatat gtataccaca ttgattctgg gagcaattct cagtatctgg 3300
cctagagaaa ggaatggccc ctgcagaata gacagagtga atggtgccct ttatcatttg 3360
ctaaagtgaa ggagaaataa acatccttcc atagagtttc aggtaaatga accccacagt 3420
tcatctgtgc cgtggtggag gcctggccaa cagttaaaaa gattagacac ggacaaagtc 3480
tgaaggaaac acctcgaata ggaagaggag agccacctca ttctgtaact ttcctcaagg 3540
ggaagatgtt ccaagagtgg gaataaatgg tcaaaggggg gatttttaat taggaaaacg 3600
atttcctgta tcacttgtga aactggaggt tgatttgggg cataggacaa tagatttgat 3660
gctttgcaaa aagctgtttc aaagcagaga aatggaatag agacaattat gtagcgagga 3720
gggagggtgg ggcgaagatg gagacagaga agtggaagct gactttaggg aagaggaaca 3780
tagaccacag gggcggggcg gggggcaggg gcggggggcg gggctcaaag gaggcagtgg 3840
gaacgttgct agtgttcgca gcgtaagcgt gaatgtgcaa gcgtctttgt ggtgtgtgac 3900
caggagtagc gtggctggct tgtgtgctgc ttgtaatccc agtctttgag gtttccacac 3960
tgttccacag tgggtgtgat tttccctcgg agagcatgag ggctctgctt tccccacatc 4020
ctccccagcg ttcgttggta tttgtttcca agatgttagt gggtgagaca aagcctctct 4080
gttgatttgc ctttaacagg tgacaaaaaa agctcaacca ggagacattt ttgccttctt 4140
ggaaggtaat gctcccatgt agagcaatgg gacccatctc taaggtgagg ctactcttgc 4200
agtttgcacc cagctcttct gatgcaggaa ggaagttggt gggcaagcaa gactgtttgc 4260
ttcttgcgat ggacacattc tgcacacaaa ggctcaggag gggagaaggc tgtttgatgt 4320
ttagcactca ggaaggcccc tgatgcatct gtgattagct gtctccatct gtggagcaga 4380
cacggactaa ctaaaaacca gtgtttttaa attgtcaagc ctttaaggtg aggaaattga 4440
cttattgtgc tgggccatac gtagagcaag tgctctgcat tgggccaacc cccggctctg 4500
gtttctaggc accagaatgg cctagaacta actcacaatc ctcccattcc aggtctcagg 4560
tgctagaatg aaccactata ccagcctgcc tgcctgccta cctgccttcc taaattttaa 4620
atcatgggga gtaggggaga atacacttat cttagttagg gtttctattg ctgtgaagag 4680
acaccatgag catggcaact cttataaagg aaaacattta gttgggtggc agtttcagag 4740
gttttagtac attgtcatca tggctgggaa catgatggca tgcagacaga catggtgctg 4800
gagaaaggga tgagagtcct acatcttgca ggcaacagga cctcagctga gacactggct 4860
ggtaccctga gcataggaaa cctcacagcc caccctcaca gtgacatatt tccttcaaca 4920
aagccatacc tcctaatagt gccactccct atgagatgac agggccaatt acattcaaac 4980
tgctataaca ctttaaagta ttttattttt attattgtaa attatgtatg tagctgggtg 5040
gtggcagccg aggtgcacgc ctttaatccc agcacttggg aggcagaggc agatggatct 5100
ctgtgagttc aagaccagcc tggtctataa gagctagttg caaggaagga tatacaaaga 5160
acagttctag gatagccttc aaagccacag agaagtgctg tcttgaaaac caaaaattgt 5220
gctgggacct gtctctgctt tggttgcttc ccactccccc agagctggac tcttggtcaa 5280
cactgaatca gctgcaaaat aaactcctgg attcctctct tgtaacagga gcccgaagtc 5340
aggcgcccac ttgtcttctc gcaggattgc catagacttt ttctgtgtgc ccaccattcc 5400
agactgaagt agagatggca gtggcagaga ctgggaaggc tgcaacgaaa acaggaagtt 5460
attgcaccct gggaatagtc tggaaatgaa gcttcaaaac ttgcttcatg ttcagttgta 5520
cacagactca ctcccaggtt gactcacacg tgtaaatatt cctgactatg tctgcactgc 5580
ttttatctga tgcttccttc ccaaaatgcc aagtgtacaa ggtgagggaa tcacccttgg 5640
attcagagcc cagggtcgtc ctccttaacc tggacttgtc tttctccggc agcctctgac 5700
acccctcccc ccattttctc tatcagaagg tctgagcaga gttggggcac gctcatgtcc 5760
tgatacactc cttgtcttcc tgaagatcta acttctgacc cagaaagatg gctaaggtgg 5820
tgaagtgttt gacatgaaga cttggtctta agaactggag caggggaaaa aagtcggatg 5880
tggcagcatg tacccgaaat cccagaactg gggaggtaga gacggatgag tgcccggggc 5940
tagctggctg ctcagccagc ctagctgaat tgccaaattc caactcctat tgaaaaacct 6000
ttaccaaaca aacaaacaaa caaataataa caacaacaac aacaacaaac taccccatac 6060
aaggtgggcg gctcttggct cttgaggaat gactcaccca aacccaaagc ttgccacagc 6120
tgttctctgg cctaaatggg gtgggggtgg ggcagagaca gagacagaga gagacatgac 6180
ttcctgggct gggctgtgtg ctctaggcca ccaggaactt tcctgtcttg ctctctgtct 6240
ggcacagcca gagcaccagc acccagcagg tgcacacacc tccctccgtg cttcttgagc 6300
aaacacaggt gccttggtct gtctattgaa ccggagtaag ttcttgcaga tgtatgcatg 6360
gaaacaacat tgtcctggtt ttatttctac tgttgtgata aaaaccgggg aactccagga 6420
agcagctgag gcagaggcaa atgcaaggaa tgctgcctcc tagcttgctc cccatggctt 6480
gccgggcctg ctttctgcaa gcccttctct ccccattggc atgcctgaca tgaacagcgt 6540
ttgaaatgct ctcaaatgtc actttcaaag aaggcttctc tgatcttgct aactaaatca 6600
gaccatgttt caccgtgcat tatctttctg ctgtctgtct gtctgtctgt ctgtctatct 6660
gtctatcatc tatcaatcat ctatctatct atcttctatt tatctaccta tcattcaatc 6720
atctatcttc taactagtta tcatttattt atttgtttac ttactttttt tatttgagac 6780
agtatttctc tgagtgacag ccttggctgt cctggaaccc attctgtaac caggctgtcc 6840
tcaaactcac agagatccaa ctgcctctgc ctctctggtg ctggggttaa agacgtgcac 6900
caccaacgcc ccgctctatc atctatttat gtacttatta ttcagtcatt atctatcctc 6960
taactatcca tcatctgtct atccatcatc tatctatcta tctatctatc tatctatcta 7020
tctatcatcc atctataatc aattg 7045
＜２１１＞６４７３
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ
＜４００＞３
（配列番号７）
agtgaacaca gatcaatctt ctctaagctg cttgagcctg tgttttcccg ttatacacag 60
gtaattggtg tgctgttaaa agctacttag aataaatgaa gaagaaaggg agaaggaggc 120
agaggagaag gagcaaagaa agaaggaaag ggggagggag ggagaggagg gagggaggga 180
gggagggagg gagaggaggg gagggggaga aagaagagaa ggagagatct tttccccact 240
gactatctca ggaaattacc acaggtggaa gggggtacta attaaggaat agctgtaagt 300
aacattattt ttattcgtag aacctcataa ctcttaagat gtgcttttta cccttttctg 360
ccttttagca caaataaact ccaacatgaa aattatccac tgtgcgtgtg aaaataccta 420
cacagagttc tgaatcattt gccaaattca agccccaatt tttatttcca ttttgactga 480
gagcaagatg ttccttttag gggatggaag cgtctgggtt tcccacactg aatgactcaa 540
ctcgaatgtt gcctcattaa cattctcgat ttttccgtaa tctctgctcc atgcattcaa 600
gataactgtg cctatcacaa atggcttttt agcagctcca ctctttctgg ggatgtggtg 660
gcccttccag tagctgccac cacggattgt cttcaatttc tcacttgttt ttgagttgag 720
tgtcagcctg acccctgggc atggccgcac atgactcagg caaagtgaga gtttcatcac 780
taaacgtggc tctgtttgct atgtctgttt tccctctaag agcaggttat tcaaatacca 840
tctggctgag gtcaagttgc ctcagagccc acagaatctc tacccaggtc cctgttggat 900
ccctaaaaac tcagtcatgc tgtaatctcc ttctgaaact gtgcaatgcc tgcaggctgt 960
cagcccagct ctctccttct gcttcctgtc ctcctaggac cccatgcctc ctcaaacgtc 1020
cacgtgtttc ttgctcctcc accacggttg ccaagccaaa attcgggtgg gcgggaggac 1080
attttcccaa gtgcctgttt cccttctttt ccttttgaca ccccagataa atcatctttc 1140
ccaatccaac acagccccac tgtgtctttg gggacttcat gacatcaccc aggaatgtat 1200
ccttagaaac aaaaatgcaa aacccagaac accaggagac aattaaagaa attttcactg 1260
gtgaggtcac aagtagtaga gacttcttgt taacgggcag aaactttcac ggacccagca 1320
tgctactgtg gcagttctgc aacaagctga aaatgccttt cccgaccacc caagccagtg 1380
ccacacaaag gccaccttag ggtgtgcaca ggatgtcact aggcgttggc ggaactcagg 1440
aaggagtctg aatttcttcc cgtttcttcc ttcctctctc attccctatc ttagcttctg 1500
tctctctttc ctctctctcg ttccccccct tcctccctcc cttcctgttg cagggccaca 1560
gatggaccgg gagacctcaa gcatgtcaaa tcaactaact gctctaccac tcaaccacac 1620
cctcgcctgc attgttacta ctactattat tatcttgata caggtctcca cattgagctc 1680
accctcacag tctccacatt gagctcaccc tcacagtctc cacattgagc tcaccctcac 1740
agtctccaca ttgagctcac cctcacagtc tccacattga gctcaccctc acagtctcca 1800
cattgagctc accctgtggc tctggcaaac cttgaattct ctcattcctc ctgcctcagc 1860
ctctggggtc gtggggatta gccaaaccca cttgaggttt tcttcaatca gcaaattctt 1920
agcgttcaat taacacacac tcataactcc agtactttgg aaaccggaac aggagaattt 1980
ctgtgagctg gaggctagct tggactacag tatgagaccc tgtctctaaa taaatacaca 2040
aagaaatctc accaagggcc tccctctctc agcaagctct aactgtggtg ggagttctgg 2100
gttgttccag ttaacgggct cagaactcta ctgcccagca catcagcccc tagacacagg 2160
tggctctcta catgtgaaca tgcagtcaca gaaatgaaat aaagtgaaaa ttttatttct 2220
tcagttgtat agcctcttcc gtgtgggctg tagttactgt cttgaatagg ataggctcag 2280
aatccttggt gctggaacca agagtttgat tccattagac gacagggaat ataatgccca 2340
atagggcatt cctcctcccg gtcactagcg gtgcactttc tccgaatctt tgtcatgttg 2400
aattagaaaa gttagtattt tcctccatcc cttcccctcc tcccctcctc ccctcctccc 2460
ctcctcccct cctccctccg tctccccgcc cctcccctcc ccctctgatc ctcccccatc 2520
tatcaaatcc aagaattcca gtaaaaagag gaaaacaatc gaagtgattt cgttgattgt 2580
cagttccacc aaagcaagac ttgactttag ttccgcgttt cggttcccgg catgcaccac 2640
agccagcgag caccgtggaa ggatgctagc acggtcctcc ccccgccccc actagctgtc 2700
ttcagctccc cagtagaggg caaccgcact ccagattctc aatggagagt gtttacacaa 2760
tcgttgcggg tttgtgtgag cgcgcccgct tccagagaca cttcttcttt ttcttttttc 2820
catttcatcc cagtggcaac gcagagtgcc agatcattca ggccgtttgc agggcaagcc 2880
gtgggagctt ggcaagcaag gccccatttc ctagggaacc cgtgcctggc gcttcaggaa 2940
agcacgggaa cctggcactg tgactctgcg ggtattattt tgcagaactc tttattaaac 3000
gggagtttca agtccagctg gagacgacca ggcagcgcct ttaaccccag agtcacacac 3060
aggtgccttt tcttggggcc agattggggt tgtgtggcag acctgcgacc agcttgacaa 3120
ctcttctgcc aggccacaaa atggtgttgg ctgtaagagg tgacaccagg gacagggaag 3180
atcgctgcta ttctcctgag ctctccaaag acccacacca gtctgtcccc ctttcctcct 3240
gctcttcccc tgtatcgccc cctcaccatc tcccccaacg agactcttgg catctcctcg 3300
gcacaaggat ttgaaaatag atgcttgggg gtgagaagaa gaagagagaa agagagagaa 3360
ggaaggaagg atatatagat gatacagacg catacaggtg acatgtagct aatcattttt 3420
aattaaaaaa taaattaaaa gcaaatcaag gatatatatg atacccttag agcaagtgtc 3480
tcatacacac acaaacacac acacacaata tatatatata tatatatata tatatatata 3540
tatatatata ttatacttgg aacaagtgtc cagaagggct ggggactcta aagtgcttgt 3600
caaagccagg ctcacatcag taatcttatc acctggtaga ctgagacagg aggattttga 3660
tgagttcagg cccagcctga gctgcagaat gtgattctat cccaaaaaag taaaataaaa 3720
taaaattcaa aatacacgaa aagagtattt gctgaacaaa caagcctaaa gccctggatc 3780
ccttccccca tgtcctaaga aaataagttt cttgaagctg gagggatggc tcagaggtta 3840
agagccccag ctgcacttgc ggaacactaa gacccagttc ccagacccca cactgtgggt 3900
cacaactgtc tcaaacgcca gctccggagg atccatgccc tctcctggcc tccaccggca 3960
ccaagaacac atacagtgcc catacattta tgcaagcaag gtattcacgc acataaaact 4020
aaaagaatat ttaataaaga tataacaaaa tagcatgaag cccagctggt acagaggttc 4080
aaactacatc ccaggttcat ccctctgcct ttgctctcag ttggcttggg taggtctctt 4140
ctctgaactg gcgccctgcg ggttccacat tgagaccctc tcatttttaa acctacttct 4200
tctgggcggg gttaattgct gccagggctc aagccaacgc ttcctcttct ccacagcaat 4260
cttccaagtt tcacgagata accaggaact gctaagttca tgtgaacctt agtgaagaac 4320
ctgagtcttc ccatgtgatt ggtgtgtgca tgtgtgcata cacaaatgta tgtgtgtgct 4380
ctatgtgtgc ctatgtatgt gtgcatgcat gtgtgcatat acaaatgcat atatgtctat 4440
gtagtgtgcg tacacaaatg tatgtgtgtg ctcaatgtgt gcctatgtgt gtgtatgcat 4500
gtgtgcgtac acaatgcatg tgtgtggtgt ctgtgtgcct gtgtgtgtat gcatgtatgc 4560
atacacaaat gtatatgtgt ggtgtgtgaa tgtgtgccta tgtatgtgtg tgctgtgtgt 4620
gggtgtggta tgtgtgtgat gtgtggaggg gtgtgtatgt gtggtatgta taggtgatac 4680
gtttggggtg taatatgcgt atgtggtttg tgaaatgtag ttcgtgtgtg tgcatgtgtg 4740
cgtgcgtgcg tgcgtgcgtg cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt ggatatagta 4800
tgtgtgaggt gtgtgtactc accatggcct ccctcacttg ggggagtgaa gtcagcagcc 4860
tggaccactc agggacatga gatactcaga cacatcttga tttccacccc tcttttcctg 4920
atcctccttc acgtgtcact ttcccaaaca ctggacaaca gtttgggggc atctgattcc 4980
actaatgaca gggacatcac atgtctccag agggaacacc ttctgtgtca catgtcatct 5040
gagaatgtag cagagtcaca gagaaatgtc acagaaacca aaatgcagag taccaaggta 5100
tagctaggca cagagcagag gggaagccgc tgaatttatt aaaaatgtca gaatcgtaaa 5160
agacagggga cagcggtggg gacattcagg gtccagtagc acacaggcag tccaaacctg 5220
atcactggaa ggtagtaggt aaggaaaggc tgcacacaga ttattcacac agtttataca 5280
tgtacacaga ttattcacat ggtttgtgta tgtgcacaga ttattcacac agtttataca 5340
tgtgtggctt cgtggtaact ttgagcttac tttcaattta aaaggatctc tctcacaagc 5400
tggggccggg aatggctgca gtcaacactc catcacttag tcacactgtg caaacagcac 5460
ctcctgactc atggtgactt gtagtaaaat gaagaggcca catttgcatc caagacagct 5520
catcagtacc tagtgaagaa tctgtccctg agtatttgca tgaatggacc cgggtccagg 5580
gcctggctgg gagtctccag gtgttgcagc cagaatgtca ttgtgttttt tcaggatccc 5640
agaagtttct aaaatacagg ccaagtactc atttgtgtta caaagtatct gactaataga 5700
agtgattagg taacacaaag ccttttaaaa accgagatca cccttgtcat gtccctggcc 5760
tcttagaaca agatccaagc ttttgctggt tgacaagtgg ggccatccag tgcgtctccg 5820
ttcctgctac ttcatctgga agacctctcc cactaacttg cccctgaccc ctcacacctg 5880
ctgtttcctt tccacccgga agtgcttgtc taggctttca tggccatctg actgagcatc 5940
taggcctcag tccagtggtc cctcagctct ctctagtcac tgtactaatg gaaacggcca 6000
ctaactacat tttcaatatg gaagcctcct cctcaggaac ctccaagggc agaagcctcc 6060
agagaaccac tcctgacccc ctggagttct gagtgcttct ggccctctct gtgtctgcag 6120
gactattcac cacttgtgtt gaatggttca gtcctcacct cctctggcat gtgctcagtt 6180
ctcatctcat tggggagtcc ttcccaggtc actcttctct cctgtctttg aagtgttttt 6240
ttccttcatg gtatttctgt ctgggcacac acacagacac acatacacac acatacacac 6300
ccatgcagta tggcagatac atcacctatg tttcagattt ttattctacc atcacccaat 6360
acctgaatcc ccgaaaaagc cttagaaagc caggaatttg tgtatttttg tcagcactcc 6420
accccagcac ctgaagccaa gcctgactta atatttttgg ttttgtttct aga 6473

＜２１１＞７０４５
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ
＜４００＞４
（配列番号８）
caattgatta tagatggatg atagatagat agatagatag atagatagat agatagatga 60
tggatagaca gatgatggat agttagagga tagataatga ctgaataata agtacataaa 120
tagatgatag agcggggcgt tggtggtgca cgtctttaac cccagcacca gagaggcaga 180
ggcagttgga tctctgtgag tttgaggaca gcctggttac agaatgggtt ccaggacagc 240
caaggctgtc actcagagaa atactgtctc aaataaaaaa agtaagtaaa caaataaata 300
aatgataact agttagaaga tagatgattg aatgataggt agataaatag aagatagata 360
gatagatgat tgatagatga tagacagata gacagacaga cagacagaca gacagcagaa 420
agataatgca cggtgaaaca tggtctgatt tagttagcaa gatcagagaa gccttctttg 480
aaagtgacat ttgagagcat ttcaaacgct gttcatgtca ggcatgccaa tggggagaga 540
agggcttgca gaaagcaggc ccggcaagcc atggggagca agctaggagg cagcattcct 600
tgcatttgcc tctgcctcag ctgcttcctg gagttccccg gtttttatca caacagtaga 660
aataaaacca ggacaatgtt gtttccatgc atacatctgc aagaacttac tccggttcaa 720
tagacagacc aaggcacctg tgtttgctca agaagcacgg agggaggtgt gtgcacctgc 780
tgggtgctgg tgctctggct gtgccagaca gagagcaaga caggaaagtt cctggtggcc 840
tagagcacac agcccagccc aggaagtcat gtctctctct gtctctgtct ctgccccacc 900
cccaccccat ttaggccaga gaacagctgt ggcaagcttt gggtttgggt gagtcattcc 960
tcaagagcca agagccgccc accttgtatg gggtagtttg ttgttgttgt tgttgttatt 1020
atttgtttgt ttgtttgttt ggtaaaggtt tttcaatagg agttggaatt tggcaattca 1080
gctaggctgg ctgagcagcc agctagcccc gggcactcat ccgtctctac ctccccagtt 1140
ctgggatttc gggtacatgc tgccacatcc gacttttttc ccctgctcca gttcttaaga 1200
ccaagtcttc atgtcaaaca cttcaccacc ttagccatct ttctgggtca gaagttagat 1260
cttcaggaag acaaggagtg tatcaggaca tgagcgtgcc ccaactctgc tcagaccttc 1320
tgatagagaa aatgggggga ggggtgtcag aggctgccgg agaaagacaa gtccaggtta 1380
aggaggacga ccctgggctc tgaatccaag ggtgattccc tcaccttgta cacttggcat 1440
tttgggaagg aagcatcaga taaaagcagt gcagacatag tcaggaatat ttacacgtgt 1500
gagtcaacct gggagtgagt ctgtgtacaa ctgaacatga agcaagtttt gaagcttcat 1560
ttccagacta ttcccagggt gcaataactt cctgttttcg ttgcagcctt cccagtctct 1620
gccactgcca tctctacttc agtctggaat ggtgggcaca cagaaaaagt ctatggcaat 1680
cctgcgagaa gacaagtggg cgcctgactt cgggctcctg ttacaagaga ggaatccagg 1740
agtttatttt gcagctgatt cagtgttgac caagagtcca gctctggggg agtgggaagc 1800
aaccaaagca gagacaggtc ccagcacaat ttttggtttt caagacagca cttctctgtg 1860
gctttgaagg ctatcctaga actgttcttt gtatatcctt ccttgcaact agctcttata 1920
gaccaggctg gtcttgaact cacagagatc catctgcctc tgcctcccaa gtgctgggat 1980
taaaggcgtg cacctcggct gccaccaccc agctacatac ataatttaca ataataaaaa 2040
taaaatactt taaagtgtta tagcagtttg aatgtaattg gccctgtcat ctcataggga 2100
gtggcactat taggaggtat ggctttgttg aaggaaatat gtcactgtga gggtgggctg 2160
tgaggtttcc tatgctcagg gtaccagcca gtgtctcagc tgaggtcctg ttgcctgcaa 2220
gatgtaggac tctcatccct ttctccagca ccatgtctgt ctgcatgcca tcatgttccc 2280
agccatgatg acaatgtact aaaacctctg aaactgccac ccaactaaat gttttccttt 2340
ataagagttg ccatgctcat ggtgtctctt cacagcaata gaaaccctaa ctaagataag 2400
tgtattctcc cctactcccc atgatttaaa atttaggaag gcaggtaggc aggcaggcag 2460
gctggtatag tggttcattc tagcacctga gacctggaat gggaggattg tgagttagtt 2520
ctaggccatt ctggtgccta gaaaccagag ccgggggttg gcccaatgca gagcacttgc 2580
tctacgtatg gcccagcaca ataagtcaat ttcctcacct taaaggcttg acaatttaaa 2640
aacactggtt tttagttagt ccgtgtctgc tccacagatg gagacagcta atcacagatg 2700
catcaggggc cttcctgagt gctaaacatc aaacagcctt ctcccctcct gagcctttgt 2760
gtgcagaatg tgtccatcgc aagaagcaaa cagtcttgct tgcccaccaa cttccttcct 2820
gcatcagaag agctgggtgc aaactgcaag agtagcctca ccttagagat gggtcccatt 2880
gctctacatg ggagcattac cttccaagaa ggcaaaaatg tctcctggtt gagctttttt 2940
tgtcacctgt taaaggcaaa tcaacagaga ggctttgtct cacccactaa catcttggaa 3000
acaaatacca acgaacgctg gggaggatgt ggggaaagca gagccctcat gctctccgag 3060
ggaaaatcac acccactgtg gaacagtgtg gaaacctcaa agactgggat tacaagcagc 3120
acacaagcca gccacgctac tcctggtcac acaccacaaa gacgcttgca cattcacgct 3180
tacgctgcga acactagcaa cgttcccact gcctcctttg agccccgccc cccgcccctg 3240
ccccccgccc cgcccctgtg gtctatgttc ctcttcccta aagtcagctt ccacttctct 3300
gtctccatct tcgccccacc ctccctcctc gctacataat tgtctctatt ccatttctct 3360
gctttgaaac agctttttgc aaagcatcaa atctattgtc ctatgcccca aatcaacctc 3420
cagtttcaca agtgatacag gaaatcgttt tcctaattaa aaatcccccc tttgaccatt 3480
tattcccact cttggaacat cttccccttg aggaaagtta cagaatgagg tggctctcct 3540
cttcctattc gaggtgtttc cttcagactt tgtccgtgtc taatcttttt aactgttggc 3600
caggcctcca ccacggcaca gatgaactgt ggggttcatt tacctgaaac tctatggaag 3660
gatgtttatt tctccttcac tttagcaaat gataaagggc accattcact ctgtctattc 3720
tgcaggggcc attcctttct ctaggccaga tactgagaat tgctcccaga atcaatgtgg 3780
tatacatatt tccccttcaa cattgatagg cattgatcac acacacacac acacacacac 3840
acacacacac acacagtagc acaaatgtat tcccctagcc cgcttccatc ttgccacagg 3900
actccagagt ggccctggat agcaagcttc ctgttttgtt tctctgttcc tgctgctttt 3960
ccaccctcca gtctatcttt tctaagtcct tctgccattg tcctcttccc aactgtcctg 4020
agatgcagtc attgtctggg attcagacct tctctctctg cccaagtgag tatattgacc 4080
cccacggttt gtacaaccat aacttcaggg agcccgacaa aaactgtttt atgagccaag 4140
tagtcccagg acttgagagg tagaggcggg aagatcagca gtttgaggcc agcctggaga 4200
gcataagagc cggtctcaaa acaacaatgg aaactagata ctaagtaaaa atcctggggt 4260
gtttcatcat gaatgtctgt tcttctagta ccacgctgaa ctccgtacac agctccagct 4320
gttacggctt tcttagaatc catactcttt tttttttttt tttttttttt ttttttttgg 4380
tttttcgaga cagggtttct ctgtggcttt ggaggctgtc ctggaactag ctcttataga 4440
ccaggctggt ctcgaactca cagagatcca cctgcctctg cctccagagt gctgggatta 4500
aaggcgtgcg ccaccaacac ccggcagaat ccatactctt tttaaaaaaa gatttatcaa 4560
tttactatgt atacagcttt ctgcctgcat gtatccatgc atgtcagaag atggcaccag 4620
gtcgcattac agatggttgt gagccaccat gtggttgctg ggaattgaac tcagaatgtc 4680
tagaagagca accagttctc ttaacctctg agccatctct ccggccccca gaaatccata 4740
ttcttgagga ttttttacac cccccccacc aaaagacgta tatctaaatt ttaatgtgag 4800
aattcacatt ttcttaagag ttgaacatag atttagagga aaatcagatc ccacatgatt 4860
aacaaagcat gcttgtgggc aggtctgcta ccaagaggtg ggccgtagct tctagctcag 4920
acaaactcac tcccttcctc gtggcctctt cgccctcaag tcagaaactc accctgtgat 4980
tctgccccag aagttgctct agagcacagt gcatccttcc gtcttcactc tgtggcttga 5040
attgtgtcca tcgcttatga ttacaacccc tcacagagca tcctaactgg tttctttgca 5100
tgcctatggg cactcctcca ttctagaaca cccttgccat caatactatg aaaggagggg 5160
tggaggagga agagcaggaa gaggaggggg aagcgaggga agaggaagac acggatggca 5220
atgaggaggg gggagcaccc aagtcctccc tggatgagag tctcactggg agacttaata 5280
ttaattataa atgcttggtc agcagctggg caggataagg ttaggcagga gaaccagact 5340
aaggactctg ggaagcagaa gggcagagtc agacaaggag aggaaacagg aagtacaagg 5400
taaagtcacg tggcagaatg tagataatag aaatgggttc atttaagttg gaagagttag 5460
ctagtaacaa gcctgagcta tcagccgagc atttataatt aatattgagc ctccatattg 5520
gttatctggg aattggcggg cagaaaaaaa aaagtctgcc tacaagtcaa tgtcatgtag 5580
ctcccaaagc caaggtacct ttgttcagtg cttgactgag ccagcattat aaattttctc 5640
cagatgtacc gaatcacatt tcatagcaac atgcagacat caagttttcc ctgaagctct 5700
aaccagctgg ttgcatgctg tccggagtct cagctataac ccagaagtga cctgggtcgg 5760
ggaagaggtg gtactttgcc ttctttgcac tctctgtgtt gcctcaccca ttcagcttca 5820
agcaatgtga ctgcctgacc ctgagggcgt ttacaacgcc tgacccacag accacaagtc 5880
aaccagctgg tgtgctcacg atacctagtc tgaaccatag ccctgctccc accctgcctc 5940
catctccacc ctttcttcac tgctcatcac agctggctag caaagactgc ctcagacctg 6000
agcacaggct ccactccaca gccgtgactg ttcgagccac ttaaatcaaa gagcgcttgt 6060
cttccgctca gtaaatctct cctcagctca ctgatgacgt tgactttctc tagacagcac 6120
atttgggttt aagacactgc tacttgagct cttcattcag ttcctcagaa tacctcattt 6180
gggtcagatt cccaaagagg aagatagggt tcctggcaga cagacatgtc tcattccttt 6240
gaaatccttc agagaaatgc agtgactatg gcaccttctt aaaaagcaca cacacaaata 6300
acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac atatccccct cactgtcatc 6360
cttgatatgt atatgatata tataaaatca ttgttttata ctgtgataat tgattatgaa 6420
taaaatttac taaaatgaac aattaaaatt atgggggggg ctggagagat ggctcatcag 6480
ttaagagaac agttgctgct cttgcagaac acgagagttc agttcccagc acccacatca 6540
ggcagctcat aaccatgtgt ggtgtcagtt ccaggagatc tggtgccctc ttctggcctc 6600
ctccagcacc tgctacatgt ggttcacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 6660
cacacacaca caaataaata taaagattat ttttttcaaa actgagttaa aaataggttc 6720
tatctgattc atactaaggc ttttcacagt ggttaagtct attagatatg tctagccata 6780
tcctttctcc cttctttctt gaggagaggc ttttaaagct acaagttaca gccttctttg 6840
caaataagag taccatttaa caggcctctg accaatgaga tgccagaatc ggttgcccag 6900
gagcttccca aacagtccat tatagggaaa ggtggtacaa accagtagat taggcatgtt 6960
ccacttccta agtgccgtgc caaataagga aatggcctca aatgtttgcc ttttatcttc 7020
acccacctct gaattgcacg ctagt 7045

＜２１１＞１３５１５
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ
＜４００＞５
（配列番号９）
tctagaaaca aaaccaaaaa tattaagtca ggcttggctt caggtgctgg ggtggagtgc 60
tgacaaaaat acacaaattc ctggctttct aaggcttttt cggggattca ggtattgggt 120
gatggtagaa taaaaatctg aaacataggt gatgtatctg ccatactgca tgggtgtgta 180
tgtgtgtgta tgtgtgtctg tgtgtgtgcc cagacagaaa taccatgaag gaaaaaaaca 240
cttcaaagac aggagagaag agtgacctgg gaaggactcc ccaatgagat gagaactgag 300
cacatgccag aggaggtgag gactgaacca ttcaacacaa gtggtgaata gtcctgcaga 360
cacagagagg gccagaagca ctcagaactc cagggggtca ggagtggttc tctggaggct 420
tctgcccttg gaggttcctg aggaggaggc ttccatattg aaaatgtagt tagtggccgt 480
ttccattagt acagtgacta gagagagctg agggaccact ggactgaggc ctagatgctc 540
agtcagatgg ccatgaaagc ctagacaagc acttccgggt ggaaaggaaa cagcaggtgt 600
gaggggtcag gggcaagtta gtgggagagg tcttccagat gaagtagcag gaacggagac 660
gcactggatg gccccacttg tcaaccagca aaagcttgga tcttgttcta agaggccagg 720
gacatgacaa gggtgatctc ggtttttaaa aggctttgtg ttacctaatc acttctatta 780
gtcagatact ttgtaacaca aatgagtact tggcctgtat tttagaaact tctgggatcc 840
tgaaaaaaca caatgacatt ctggctgcaa cacctggaga ctcccagcca ggccctggac 900
ccgggtccat tcatgcaaat actcagggac agattcttca ctaggtactg atgagctgtc 960
ttggatgcaa atgtggcctc ttcattttac tacaagtcac catgagtcag gaggtgctgt 1020
ttgcacagtg tgactaagtg atggagtgtt gactgcagcc attcccggcc ccagcttgtg 1080
agagagatcc ttttaaattg aaagtaagct caaagttacc acgaagccac acatgtataa 1140
actgtgtgaa taatctgtgc acatacacaa accatgtgaa taatctgtgt acatgtataa 1200
actgtgtgaa taatctgtgt gcagcctttc cttacctact accttccagt gatcaggttt 1260
ggactgcctg tgtgctactg gaccctgaat gtccccaccg ctgtcccctg tcttttacga 1320
ttctgacatt tttaataaat tcagcggctt cccctctgct ctgtgcctag ctataccttg 1380
gtactctgca ttttggtttc tgtgacattt ctctgtgact ctgctacatt ctcagatgac 1440
atgtgacaca gaaggtgttc cctctggaga catgtgatgt ccctgtcatt agtggaatca 1500
gatgccccca aactgttgtc cagtgtttgg gaaagtgaca cgtgaaggag gatcaggaaa 1560
agaggggtgg aaatcaagat gtgtctgagt atctcatgtc cctgagtggt ccaggctgct 1620
gacttcactc ccccaagtga gggaggccat ggtgagtaca cacacctcac acatactata 1680
tccaacacac acacacacac acacacacac acgcacgcac gcacgcacgc acgcacacat 1740
gcacacacac gaactacatt tcacaaacca catacgcata ttacacccca aacgtatcac 1800
ctatacatac cacacataca cacccctcca cacatcacac acataccaca cccacacaca 1860
gcacacacat acataggcac acattcacac accacacata tacatttgtg tatgcataca 1920
tgcatacaca cacaggcaca cagacaccac acacatgcat tgtgtacgca cacatgcata 1980
cacacacata ggcacacatt gagcacacac atacatttgt gtacgcacac tacatagaca 2040
tatatgcatt tgtatatgca cacatgcatg cacacataca taggcacaca tagagcacac 2100
acatacattt gtgtatgcac acatgcacac accaatcaca tgggaagact caggttcttc 2160
actaaggttc acatgaactt agcagttcct ggttatctcg tgaaacttgg aagattgctg 2220
tggagaagag gaagcgttgg cttgagccct ggcagcaatt aaccccgccc agaagaagta 2280
ggtttaaaaa tgagagggtc tcaatgtgga acccgcaggg cgccagttca gagaagagac 2340
ctacccaagc caactgagag caaaggcaga gggatgaacc tgggatgtag tttgaacctc 2400
tgtaccagct gggcttcatg ctattttgtt atatctttat taaatattct tttagtttta 2460
tgtgcgtgaa taccttgctt gcataaatgt atgggcactg tatgtgttct tggtgccggt 2520
ggaggccagg agagggcatg gatcctccgg agctggcgtt tgagacagtt gtgacccaca 2580
gtgtggggtc tgggaactgg gtcttagtgt tccgcaagtg cagctggggc tcttaacctc 2640
tgagccatcc ctccagcttc aagaaactta ttttcttagg acatggggga agggatccag 2700
ggctttaggc ttgtttgttc agcaaatact cttttcgtgt attttgaatt ttattttatt 2760
ttactttttt gggatagaat cacattctgc agctcaggct gggcctgaac tcatcaaaat 2820
cctcctgtct cagtctacca ggtgataaga ttactgatgt gagcctggct ttgacaagca 2880
ctttagagtc cccagccctt ctggacactt gttccaagta taatatatat atatatatat 2940
atatatatat atatatatat atatattgtg tgtgtgtgtt tgtgtgtgta tgagacactt 3000
gctctaaggg tatcatatat atccttgatt tgcttttaat ttatttttta attaaaaatg 3060
attagctaca tgtcacctgt atgcgtctgt atcatctata tatccttcct tccttctctc 3120
tctttctctc ttcttcttct cacccccaag catctatttt caaatccttg tgccgaggag 3180
atgccaagag tctcgttggg ggagatggtg agggggcgat acaggggaag agcaggagga 3240
aagggggaca gactggtgtg ggtctttgga gagctcagga gaatagcagc gatcttccct 3300
gtccctggtg tcacctctta cagccaacac cattttgtgg cctggcagaa gagttgtcaa 3360
gctggtcgca ggtctgccac acaaccccaa tctggcccca agaaaaggca cctgtgtgtg 3420
actctggggt taaaggcgct gcctggtcgt ctccagctgg acttgaaact cccgtttaat 3480
aaagagttct gcaaaataat acccgcagag tcacagtgcc aggttcccgt gctttcctga 3540
agcgccaggc acgggttccc taggaaatgg ggccttgctt gccaagctcc cacggcttgc 3600
cctgcaaacg gcctgaatga tctggcactc tgcgttgcca ctgggatgaa atggaaaaaa 3660
gaaaaagaag aagtgtctct ggaagcgggc gcgctcacac aaacccgcaa cgattgtgta 3720
aacactctcc attgagaatc tggagtgcgg ttgccctcta ctggggagct gaagacagct 3780
agtgggggcg gggggaggac cgtgctagca tccttccacg gtgctcgctg gctgtggtgc 3840
atgccgggaa ccgaaacgcg gaactaaagt caagtcttgc tttggtggaa ctgacaatca 3900
acgaaatcac ttcgattgtt ttcctctttt tactggaatt cttggatttg atagatgggg 3960
gaggatcaga gggggagggg aggggcgggg agacggaggg aggaggggag gaggggagga 4020
ggggaggagg ggaggagggg aagggatgga ggaaaatact aacttttcta attcaacatg 4080
acaaagattc ggagaaagtg caccgctagt gaccgggagg aggaatgccc tattgggcat 4140
tatattccct gtcgtctaat ggaatcaaac tcttggttcc agcaccaagg attctgagcc 4200
tatcctattc aagacagtaa ctacagccca cacggaagag gctatacaac tgaagaaata 4260
aaattttcac tttatttcat ttctgtgact gcatgttcac atgtagagag ccacctgtgt 4320
ctaggggctg atgtgctggg cagtagagtt ctgagcccgt taactggaac aacccagaac 4380
tcccaccaca gttagagctt gctgagagag ggaggccctt ggtgagattt ctttgtgtat 4440
ttatttagag acagggtctc atactgtagt ccaagctagc ctccagctca cagaaattct 4500
cctgttccgg tttccaaagt actggagtta tgagtgtgtg ttaattgaac gctaagaatt 4560
tgctgattga agaaaacctc aagtgggttt ggctaatccc cacgacccca gaggctgagg 4620
caggaggaat gagagaattc aaggtttgcc agagccacag ggtgagctca atgtggagac 4680
tgtgagggtg agctcaatgt ggagactgtg agggtgagct caatgtggag actgtgaggg 4740
tgagctcaat gtggagactg tgagggtgag ctcaatgtgg agactgtgag ggtgagctca 4800
atgtggagac ctgtatcaag ataataatag tagtagtaac aatgcaggcg agggtgtggt 4860
tgagtggtag agcagttagt tgatttgaca tgcttgaggt ctcccggtcc atctgtggcc 4920
ctgcaacagg aagggaggga ggaagggggg gaacgagaga gaggaaagag agacagaagc 4980
taagataggg aatgagagag gaaggaagaa acgggaagaa attcagactc cttcctgagt 5040
tccgccaacg cctagtgaca tcctgtgcac accctaaggt ggcctttgtg tggcactggc 5100
ttgggtggtc gggaaaggca ttttcagctt gttgcagaac tgccacagta gcatgctggg 5160
tccgtgaaag tttctgcccg ttaacaagaa gtctctacta cttgtgacct caccagtgaa 5220
aatttcttta attgtctcct ggtgttctgg gttttgcatt tttgtttcta aggatacatt 5280
cctgggtgat gtcatgaagt ccccaaagac acagtggggc tgtgttggat tgggaaagat 5340
gatttatctg gggtgtcaaa aggaaaagaa gggaaacagg cacttgggaa aatgtcctcc 5400
cgcccacccg aattttggct tggcaaccgt ggtggaggag caagaaacac gtggacgttt 5460
gaggaggcat ggggtcctag gaggacagga agcagaagga gagagctggg ctgacagcct 5520
gcaggcattg cacagtttca gaaggagatt acagcatgac tgagttttta gggatccaac 5580
agggacctgg gtagagattc tgtgggctct gaggcaactt gacctcagcc agatggtatt 5640
tgaataacct gctcttagag ggaaaacaga catagcaaac agagccacgt ttagtgatga 5700
aactctcact ttgcctgagt catgtgcggc catgcccagg ggtcaggctg acactcaact 5760
caaaaacaag tgagaaattg aagacaatcc gtggtggcag ctactggaag ggccaccaca 5820
tccccagaaa gagtggagct gctaaaaagc catttgtgat aggcacagtt atcttgaatg 5880
catggagcag agattacgga aaaatcgaga atgttaatga ggcaacattc gagttgagtc 5940
attcagtgtg ggaaacccag acgcttccat cccctaaaag gaacatcttg ctctcagtca 6000
aaatggaaat aaaaattggg gcttgaattt ggcaaatgat tcagaactct gtgtaggtat 6060
tttcacacgc acagtggata attttcatgt tggagtttat ttgtgctaaa aggcagaaaa 6120
gggtaaaaag cacatcttaa gagttatgag gttctacgaa taaaaataat gttacttaca 6180
gctattcctt aattagtacc cccttccacc tgtggtaatt tcctgagata gtcagtgggg 6240
aaaagatctc tccttctctt ctttctcccc ctcccctcct ctccctccct ccctccctcc 6300
ctccctcctc tccctccctc cccctttcct tctttctttg ctccttctcc tctgcctcct 6360
tctccctttc ttcttcattt attctaagta gcttttaaca gcacaccaat tacctgtgta 6420
taacgggaaa acacaggctc aagcagctta gagaagattg atctgtgttc actagcgtgc 6480
aattcagagg tgggtgaaga taaaaggcaa acatttgagg ccatttcctt atttggcacg 6540
gcacttagga agtggaacat gcctaatcta ctggtttgta ccacctttcc ctataatgga 6600
ctgtttggga agctcctggg caaccgattc tggcatctca ttggtcagag gcctgttaaa 6660
tggtactctt atttgcaaag aaggctgtaa cttgtagctt taaaagcctc tcctcaagaa 6720
agaagggaga aaggatatgg ctagacatat ctaatagact taaccactgt gaaaagcctt 6780
agtatgaatc agatagaacc tatttttaac tcagttttga aaaaaataat ctttatattt 6840
atttgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gaaccacatg 6900
tagcaggtgc tggaggaggc cagaagaggg caccagatct cctggaactg acaccacaca 6960
tggttatgag ctgcctgatg tgggtgctgg gaactgaact ctcgtgttct gcaagagcag 7020
caactgttct cttaactgat gagccatctc tccagccccc cccataattt taattgttca 7080
ttttagtaaa ttttattcat aatcaattat cacagtataa aacaatgatt ttatatatat 7140
catatacata tcaaggatga cagtgagggg gatatgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 7200
tgtgtgtgtg tgtgttattt gtgtgtgtgc tttttaagaa ggtgccatag tcactgcatt 7260
tctctgaagg atttcaaagg aatgagacat gtctgtctgc caggaaccct atcttcctct 7320
ttgggaatct gacccaaatg aggtattctg aggaactgaa tgaagagctc aagtagcagt 7380
gtcttaaacc caaatgtgct gtctagagaa agtcaacgtc atcagtgagc tgaggagaga 7440
tttactgagc ggaagacaag cgctctttga tttaagtggc tcgaacagtc acggctgtgg 7500
agtggagcct gtgctcaggt ctgaggcagt ctttgctagc cagctgtgat gagcagtgaa 7560
gaaagggtgg agatggaggc agggtgggag cagggctatg gttcagacta ggtatcgtga 7620
gcacaccagc tggttgactt gtggtctgtg ggtcaggcgt tgtaaacgcc ctcagggtca 7680
ggcagtcaca ttgcttgaag ctgaatgggt gaggcaacac agagagtgca aagaaggcaa 7740
agtaccacct cttccccgac ccaggtcact tctgggttat agctgagact ccggacagca 7800
tgcaaccagc tggttagagc ttcagggaaa acttgatgtc tgcatgttgc tatgaaatgt 7860
gattcggtac atctggagaa aatttataat gctggctcag tcaagcactg aacaaaggta 7920
ccttggcttt gggagctaca tgacattgac ttgtaggcag actttttttt ttctgcccgc 7980
caattcccag ataaccaata tggaggctca atattaatta taaatgctcg gctgatagct 8040
caggcttgtt actagctaac tcttccaact taaatgaacc catttctatt atctacattc 8100
tgccacgtga ctttaccttg tacttcctgt ttcctctcct tgtctgactc tgcccttctg 8160
cttcccagag tccttagtct ggttctcctg cctaacctta tcctgcccag ctgctgacca 8220
agcatttata attaatatta agtctcccag tgagactctc atccagggag gacttgggtg 8280
ctcccccctc ctcattgcca tccgtgtctt cctcttccct cgcttccccc tcctcttcct 8340
gctcttcctc ctccacccct cctttcatag tattgatggc aagggtgttc tagaatggag 8400
gagtgcccat aggcatgcaa agaaaccagt taggatgctc tgtgaggggt tgtaatcata 8460
agcgatggac acaattcaag ccacagagtg aagacggaag gatgcactgt gctctagagc 8520
aacttctggg gcagaatcac agggtgagtt tctgacttga gggcgaagag gccacgagga 8580
agggagtgag tttgtctgag ctagaagcta cggcccacct cttggtagca gacctgccca 8640
caagcatgct ttgttaatca tgtgggatct gattttcctc taaatctatg ttcaactctt 8700
aagaaaatgt gaattctcac attaaaattt agatatacgt cttttggtgg ggggggtgta 8760
aaaaatcctc aagaatatgg atttctgggg gccggagaga tggctcagag gttaagagaa 8820
ctggttgctc ttctagacat tctgagttca attcccagca accacatggt ggctcacaac 8880
catctgtaat gcgacctggt gccatcttct gacatgcatg gatacatgca ggcagaaagc 8940
tgtatacata gtaaattgat aaatcttttt ttaaaaagag tatggattct gccgggtgtt 9000
ggtggcgcac gcctttaatc ccagcactct ggaggcagag gcaggtggat ctctgtgagt 9060
tcgagaccag cctggtctat aagagctagt tccaggacag cctccaaagc cacagagaaa 9120
ccctgtctcg aaaaaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga gtatggattc 9180
taagaaagcc gtaacagctg gagctgtgta cggagttcag cgtggtacta gaagaacaga 9240
cattcatgat gaaacacccc aggattttta cttagtatct agtttccatt gttgttttga 9300
gaccggctct tatgctctcc aggctggcct caaactgctg atcttcccgc ctctacctct 9360
caagtcctgg gactacttgg ctcataaaac agtttttgtc gggctccctg aagttatggt 9420
tgtacaaacc gtgggggtca atatactcac ttgggcagag agagaaggtc tgaatcccag 9480
acaatgactg catctcagga cagttgggaa gaggacaatg gcagaaggac ttagaaaaga 9540
tagactggag ggtggaaaag cagcaggaac agagaaacaa aacaggaagc ttgctatcca 9600
gggccactct ggagtcctgt ggcaagatgg aagcgggcta ggggaataca tttgtgctac 9660
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgat caatgcctat caatgttgaa 9720
ggggaaatat gtataccaca ttgattctgg gagcaattct cagtatctgg cctagagaaa 9780
ggaatggccc ctgcagaata gacagagtga atggtgccct ttatcatttg ctaaagtgaa 9840
ggagaaataa acatccttcc atagagtttc aggtaaatga accccacagt tcatctgtgc 9900
cgtggtggag gcctggccaa cagttaaaaa gattagacac ggacaaagtc tgaaggaaac 9960
acctcgaata ggaagaggag agccacctca ttctgtaact ttcctcaagg ggaagatgtt 10020
ccaagagtgg gaataaatgg tcaaaggggg gatttttaat taggaaaacg atttcctgta 10080
tcacttgtga aactggaggt tgatttgggg cataggacaa tagatttgat gctttgcaaa 10140
aagctgtttc aaagcagaga aatggaatag agacaattat gtagcgagga gggagggtgg 10200
ggcgaagatg gagacagaga agtggaagct gactttaggg aagaggaaca tagaccacag 10260
gggcggggcg gggggcaggg gcggggggcg gggctcaaag gaggcagtgg gaacgttgct 10320
agtgttcgca gcgtaagcgt gaatgtgcaa gcgtctttgt ggtgtgtgac caggagtagc 10380
gtggctggct tgtgtgctgc ttgtaatccc agtctttgag gtttccacac tgttccacag 10440
tgggtgtgat tttccctcgg agagcatgag ggctctgctt tccccacatc ctccccagcg 10500
ttcgttggta tttgtttcca agatgttagt gggtgagaca aagcctctct gttgatttgc 10560
ctttaacagg tgacaaaaaa agctcaacca ggagacattt ttgccttctt ggaaggtaat 10620
gctcccatgt agagcaatgg gacccatctc taaggtgagg ctactcttgc agtttgcacc 10680
cagctcttct gatgcaggaa ggaagttggt gggcaagcaa gactgtttgc ttcttgcgat 10740
ggacacattc tgcacacaaa ggctcaggag gggagaaggc tgtttgatgt ttagcactca 10800
ggaaggcccc tgatgcatct gtgattagct gtctccatct gtggagcaga cacggactaa 10860
ctaaaaacca gtgtttttaa attgtcaagc ctttaaggtg aggaaattga cttattgtgc 10920
tgggccatac gtagagcaag tgctctgcat tgggccaacc cccggctctg gtttctaggc 10980
accagaatgg cctagaacta actcacaatc ctcccattcc aggtctcagg tgctagaatg 11040
aaccactata ccagcctgcc tgcctgccta cctgccttcc taaattttaa atcatgggga 11100
gtaggggaga atacacttat cttagttagg gtttctattg ctgtgaagag acaccatgag 11160
catggcaact cttataaagg aaaacattta gttgggtggc agtttcagag gttttagtac 11220
attgtcatca tggctgggaa catgatggca tgcagacaga catggtgctg gagaaaggga 11280
tgagagtcct acatcttgca ggcaacagga cctcagctga gacactggct ggtaccctga 11340
gcataggaaa cctcacagcc caccctcaca gtgacatatt tccttcaaca aagccatacc 11400
tcctaatagt gccactccct atgagatgac agggccaatt acattcaaac tgctataaca 11460
ctttaaagta ttttattttt attattgtaa attatgtatg tagctgggtg gtggcagccg 11520
aggtgcacgc ctttaatccc agcacttggg aggcagaggc agatggatct ctgtgagttc 11580
aagaccagcc tggtctataa gagctagttg caaggaagga tatacaaaga acagttctag 11640
gatagccttc aaagccacag agaagtgctg tcttgaaaac caaaaattgt gctgggacct 11700
gtctctgctt tggttgcttc ccactccccc agagctggac tcttggtcaa cactgaatca 11760
gctgcaaaat aaactcctgg attcctctct tgtaacagga gcccgaagtc aggcgcccac 11820
ttgtcttctc gcaggattgc catagacttt ttctgtgtgc ccaccattcc agactgaagt 11880
agagatggca gtggcagaga ctgggaaggc tgcaacgaaa acaggaagtt attgcaccct 11940
gggaatagtc tggaaatgaa gcttcaaaac ttgcttcatg ttcagttgta cacagactca 12000
ctcccaggtt gactcacacg tgtaaatatt cctgactatg tctgcactgc ttttatctga 12060
tgcttccttc ccaaaatgcc aagtgtacaa ggtgagggaa tcacccttgg attcagagcc 12120
cagggtcgtc ctccttaacc tggacttgtc tttctccggc agcctctgac acccctcccc 12180
ccattttctc tatcagaagg tctgagcaga gttggggcac gctcatgtcc tgatacactc 12240
cttgtcttcc tgaagatcta acttctgacc cagaaagatg gctaaggtgg tgaagtgttt 12300
gacatgaaga cttggtctta agaactggag caggggaaaa aagtcggatg tggcagcatg 12360
tacccgaaat cccagaactg gggaggtaga gacggatgag tgcccggggc tagctggctg 12420
ctcagccagc ctagctgaat tgccaaattc caactcctat tgaaaaacct ttaccaaaca 12480
aacaaacaaa caaataataa caacaacaac aacaacaaac taccccatac aaggtgggcg 12540
gctcttggct cttgaggaat gactcaccca aacccaaagc ttgccacagc tgttctctgg 12600
cctaaatggg gtgggggtgg ggcagagaca gagacagaga gagacatgac ttcctgggct 12660
gggctgtgtg ctctaggcca ccaggaactt tcctgtcttg ctctctgtct ggcacagcca 12720
gagcaccagc acccagcagg tgcacacacc tccctccgtg cttcttgagc aaacacaggt 12780
gccttggtct gtctattgaa ccggagtaag ttcttgcaga tgtatgcatg gaaacaacat 12840
tgtcctggtt ttatttctac tgttgtgata aaaaccgggg aactccagga agcagctgag 12900
gcagaggcaa atgcaaggaa tgctgcctcc tagcttgctc cccatggctt gccgggcctg 12960
ctttctgcaa gcccttctct ccccattggc atgcctgaca tgaacagcgt ttgaaatgct 13020
ctcaaatgtc actttcaaag aaggcttctc tgatcttgct aactaaatca gaccatgttt 13080
caccgtgcat tatctttctg ctgtctgtct gtctgtctgt ctgtctatct gtctatcatc 13140
tatcaatcat ctatctatct atcttctatt tatctaccta tcattcaatc atctatcttc 13200
taactagtta tcatttattt atttgtttac ttactttttt tatttgagac agtatttctc 13260
tgagtgacag ccttggctgt cctggaaccc attctgtaac caggctgtcc tcaaactcac 13320
agagatccaa ctgcctctgc ctctctggtg ctggggttaa agacgtgcac caccaacgcc 13380
ccgctctatc atctatttat gtacttatta ttcagtcatt atctatcctc taactatcca 13440
tcatctgtct atccatcatc tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatcatcc 13500
atctataatc aattg 13515
＜２１１＞１４５５３
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞６
（配列番号１０）
cttgaagaac acatgttttc caagagggag cacccatgtt ggaatgacaa tgtagttagt 60
gctcctctcc tgtaggttag tgctcctttg ctataggtaa gtgctcctct cctataggtc 120
agtgctcctc tcctataggt tagtgctcct ctcctatagg ttagtgctcc tctcctacag 180
gttagtgctc ctctgctcta ggttagtcct gctctcctat agtacctaga gagctagggc 240
aaatgggcta ggcccgaagt gcagagacaa acagctatgg aagactgggt aagcacttcc 300
aagctacgaa agagcagtgt gaagggtcag ggcttgtgca gttagtaggg gagatcttcc 360
agttgaagaa acagaagaac tgagagccac tgggtatcat cctcctgcgc catgccttcc 420
tggatactgc catgctccca ccttgatgat aatggaatga acctctgaac ctgtaagcca 480
gccccaatga aatattgttt ttatgagagt tgccttggtc atgctgtctg ttcacagcag 540
taaaacccta aataaggcag aagttggtac cagtattgct gtgatagacc tgaccatgct 600
ttcctttgaa agaatgtgga tttggtgact ttggatttgc aacacagtgg aatgctttaa 660
atggagatta atgggtcatc aattcctagt aggaatatgg aagactttgt tgctgggagt 720
atttgaactg tgttgacctg gcctaagaga tttcaaagga gaagaatttc agaatgtggc 780
ataaagacag tttttgtggt attttggtga agaatgtggc tactttttgc ccttgtctga 840
aaagtctgcc tgagactaaa gtgaagagaa tcagattaat tgcattgaca agggaagttt 900
gtggctgcgc tatctggaaa cttacagcca gcctcttgga cctcgggtga cttacgcaaa 960
tactcaggga cagagatgct tgactctgta ctgatgagtt gtcttggatg caaatatggg 1020
ctcttcattt gactacatgt cacgatgagt caggagctgc tctctccaga gtgtgacaaa 1080
gcgaggggat gctgacggta gctgttctag ctttgaaggt aagcctgcac ttatgctaaa 1140
gtcacacata cacgagccgg gtggagaacc tgtctgtgtg gagacacctt tcattacctg 1200
tggcatccag cctctcaagc ttggactgcc tgtgtgctcc tggactctgg aggtcccact 1260
gctctgtcct ctgctgctta tgatactgac attttaaaag aatccagtgg ttcccccctg 1320
tactcggtgt ctacttctac ctggatgttc ctcatttatg ttctgtgaca cttctctgtg 1380
actctgctgc attcctgggt gacatgtgga caccctgtcc ctttgcagac catgatgtca 1440
ctgtcactag tggaatcaga tgccccaagt gttgtcctgt gtttgggaac gtgacaggca 1500
gtacagaagc agaagaggaa gggtgaaaac ggaaatgtca cagcagcatc tgatgtgtgc 1560
ctcagtcacg catgctgctg attggaacta ctcagcatga gagagggcca tggtgaatac 1620
acaaccctat acacactgtg tccatttctc tctctctctt acacagagag agagggagga 1680
gggggagggg gaggcggagg gggaggggga gggagaggga gtgggagagg gagagggaga 1740
gggagaggga gagggagagg gagagggaga gggagagttt aatgtctgtg aagagatacc 1800
atgaccaaag caactcttat aaaggacaac atttaattgg ggctggctta caggttcaga 1860
aattcagtcc attctcacca tggtgggaag catgcaggta gatgtggtgc tggaggaacc 1920
aagagttcta tatcctgatc tgaaggcagc caggagaaga ctgcctcttc tgcacagggc 1980
agagcttgag catagaacat caaagccctt ccccacactt cctccaacaa ggtcatacat 2040
acttcaacaa agacacacct cctaacggtg ccactccctg tggaccaacc atttaaacgc 2100
atgagtctat gagggtcaaa gctcttcaaa ccaccacact catgtacaca cacacacaca 2160
cacacacaca ctctcataca cacacacaca cacactcaca cacacacaca cacacacaca 2220
cacacacaca ccacacacac acacacacac agagttctat tttgcactgt ttcactgtca 2280
caaggttcta cttatctcag acacactgcc aggaattgtg tgggaagact ttcagtttct 2340
ttgggttcac atggacttag cagttcttgg tgatcctgaa agatttctgc agaaagaagc 2400
caaagtgttg agcccaaggc ctggccacac attagtcctg tctagatgaa caggggttta 2460
aaaataaggg ggcatcaagg tgaagccagc aggggctgac ttagagagga gacccaccca 2520
agccaactgc tcgaagtcaa aagcgatgaa tccccatatc cagctgtgcc cggtgctgtc 2580
ttgctacatc tttagtaaat gttcttttag ttgtatgcgt atgaatattt tgcttgcata 2640
tatttgtgta caccataggt gttcctaggg cctatggagg ccagaagagg gcatcagatc 2700
ctttggaact ggaattatag acacttgtta cccatagagt agattgtggg aaatgagcct 2760
ttagtcttcg agagcggcca gtgctcttaa cctttggtcg tttctccagg tctttgagac 2820
tttattttct tggacatcag gacaggatcc agggctttga gcttgtttct tcagccagct 2880
ttcttttcat gtatattaaa ttttatgtta ttttgctttc tttttcccca agacagaatc 2940
acactctata tagctcaggc tgggtttgaa ttcagtttcc ctgtctcagt ctaccgggta 3000
atatgattac agatgtgagt ctgactttgg tatcaaagtc cccagccctt ctggatatgt 3060
gttttaagga tatcagatat atccttgatt tgctttgaat tttcttttta gttacaacat 3120
aattagttcc gtgtcacctg aatatgtgta tgtcacctac atagtcttcc ttcttctctt 3180
cttccctctc ccaccttccc aggtacctgt ctgtcttcat atccttgtgc tgagagtctt 3240
gttgagggag atgatgaccg agacagagcc actggggaag ggagatgggc tagtgcaggt 3300
cttcagagag gagctcgtga atattgtagc ccctttagtc cctggcatgt cctcttgtat 3360
agccaccgcc atgctgtggc ctggcagaag tgaataagtt gtccagctgt tgacaggcct 3420
gccctccaga cccagtctga tcccaagaaa gggcatctgt gtctgtctct gaggccgtaa 3480
gtgctgcctg gttgtctcca gcttgacttg acactccctc cttaataaga gtaccacaga 3540
acagggtctg cagagtccct gggccaggtc cctgtgctgt cctggaatgc caggcgtgaa 3600
tttcctgtga agtaggactt tgctcgccaa gctcccacgg cttgcccttc agatagccag 3660
aattatctgg taccctgcat tgccgttcaa tacgcagagt atcactggaa gcgcgcgcgc 3720
gcacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacgcccac tccatcttta 3780
aaccccaccc cccagcaacg gcggtgtaaa cactctccat caggaagctg aaacgcagtt 3840
gccctctgct ggggagatga aggcagcttg ctgggggcga ggaccgtgct agcaaccttc 3900
cctggtgcac acgggctctg gtgcatgacg ggaacggaaa cgcggaacta aagtcagtcc 3960
tgcttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ggcgttggtg 4020
gtggactgag tgacaatcag tgaaatcact taggttgttt ttctcttctt cgttgggttt 4080
gatagacggt gggagagggt cagaggagaa ggggagggat ggggagagag ggaggaggga 4140
ggggcgggag gcggggggcg aggaaaacgt gctaacttct ccaatcctac aagacaaagg 4200
tttggagaaa gccgcactga gtgacccagc agaaggaatc caggaatgtc cgctggaatc 4260
tgactgttga ttccagcgcc atgcagagaa tctaggctgg taggaacatt ctttgtccta 4320
tccgacataa taactccaac caacacggaa aagaaaggct atacaagtga agaaatggca 4380
ttttcacttt catgactata caatcacttc caggtagtaa cacgtgtcta gcacagcggt 4440
tctcaacctg ggggtcacga tcccccactt ttctgcatat cagacatttt tacgttgtta 4500
ttcataacag tagcaaaatt gcagctatga agtaacaatg aaatgcattt atggtgcgtg 4560
tgtgtgtgtg tgggggggta tcaccttaac atttactgta agaaggttga gaatactgct 4620
ccagcagcta gtgtgttgga cttaggttct gggtatatta ttagcaatag ccaaccagaa 4680
tccccaccca ccacagcatt gaggccccat gcagggcttg ctgggagagg cactgataag 4740
acttctttat gtatttattt agagacgaat actcattagg taggccaagc tagcgtcaaa 4800
ctcatggcaa ttctcctcct ccagtttcct aagtactgga ctcaggagtg tgttgccatc 4860
atatacagta aggatttatt gactgaagaa aatctcaagt ggctttggtt aatccctact 4920
acgccagagg ctgaggcagg aggcgcgcaa ggtcaaggct tgcctgggct acatatagag 4980
tgagctcaat tttgacactt ggtgcggtgt tagtagtaat agtaaagatg aaggtgtggc 5040
tcaggtgggg ccggtgattg gacacacttg gggtctcctg gtccatctgc agctgtgcaa 5100
caggaagagc ggagaatgag aggaaagaga gaaaagacag aatgagagag agggaggaag 5160
agagaaaaag gaaaagagag aggaaaggaa aaaggaaaat gaggaaagcg agaaagaaga 5220
aatgagaaag aggaaaggga gaaagaaatg agagagagaa aagaaaagac agaatgcgag 5280
agagggagga agagagaaaa aggaaaagag agaggaaagg aaaaaggaaa atgaggaaag 5340
cgagaaagaa gaaatgagaa agaggaaagg gagaaagaaa tgagagagag aaaagaaaag 5400
acagaatgcg agagagggag gaagagagaa aaaggaaaag agagaggaag ggaaaaagga 5460
aaatgaggaa agcgagaaag aagaaatgag aaagaggaaa gggagaaaga aatgagagag 5520
agaaaagaaa agacagaatg cgagagaggg aggaagagag aaaaaggaaa agagagagga 5580
agggaaaaag gaaaatgagg aaagcgagaa agaagaaatg agaaagagga aagggagaaa 5640
gaaatgagag agagaaaaga aaagacagaa tgcgagagag ggaggaagag agaaaaagga 5700
aaagagagag gaagggaaaa tggaaaatga ggaaagcgag aaagaagaaa tgagaaagag 5760
gaaagggaga aagaaatgag cgagataaaa gacagaattt gagagaggga ggaagaaata 5820
ggaaaagaga ggaaaggatg gagaaaagag agaaagaaag agagatgaaa gagagaaagg 5880
agaaatgaaa tgagagagag agagagacac aaagagccag agagagaaga aaaaagggga 5940
aagagaaaga gaaagaggaa ggctcctctt ggacacatct tcctttatct ttccctgggg 6000
accgccaaag cctggtggca tactgtacat tctgtacact gttcattcaa aacaggctct 6060
gtcttaaaga tggtctgagc ggtcagaaaa gggtattgtt aacttgtttg caaaactgcc 6120
tcaggagagt gctgagtgcg tgaaagttgc tgcccgttaa ggagaagtct ctactacttg 6180
tgatctcacc atcgaaaatt tctttaattg tctcctggtg ttctgggttt tgcagttttg 6240
tttctaagga tacattcttg ggtgatgtca caaagtcccc aaagacacgg tggagctgtg 6300
ttagatgggg aaagacagtc tgctgaggat ttatctggaa ctgtcagaag gaaaagaagg 6360
taaatggggc acttgggaaa gtggcctcta gtttgacttc tggcttagca aaggttgtgg 6420
ggagataagg catacacagt agttagcagg aggcaacagg gtcctgggag gacgcgaggc 6480
agaaggagag gctgggctga cagcatgcaa tcattgcata gtctccaaag gagattgcaa 6540
catggctgag ttttcagagg tcctacagag cccgtggtag agattctgtg ggttctgaga 6600
caacttgact ttagccagat ggtatttgag taatctggga gagagaaaac agctacagca 6660
aacagggcca catttagtga cgaaactctc actttgactg ttgagtcatt tgcagtgggc 6720
cctgaggtca ggctggccct cagctcaaaa acaagcgagg aactgaagca attactcaga 6780
taatccacag ccacagccac tggaaagggc cacatcccca gagacagcac agcaggggtg 6840
ggggtggggc tatgagaaag ttagtgattg tagcagttat ctagaatgtg cggagcagag 6900
gaggttacac aaaaacctag aatgtcattc aatgtgggaa accgagaggc tcccaagccc 6960
taaaaggaac agtttgcttt cagccaaaat ggaaataaaa tttggggctt aaatctggca 7020
aatgattcag accttctgtg taggtgtctt taaatgcaca gcagattgat tttcatgttg 7080
gagtttattt gaactaaaag acagaaatgg tgaaaagcac acctgaagaa attgagatgc 7140
tatgaataaa atcatttact tacagctatc acttaattag tacctccttc caccttgctg 7200
atttattggg ctagtcaagg aagaaaagat cttccctcct ccttctctcc tcctccccct 7260
cctctcctcc tcccctcccc tccttgacct tcctctcctc cttttccctc ctccccctct 7320
tcttctcttc accccctcct cccctcccct cctctgtact cctccccttt cctcccaatc 7380
tcttttttct cccccttctt ctctttctcc cccctcctct tccctcctct tcctccctcc 7440
ctccctcctc ctcctcatcc tcctcttcct cttcatcctc ttctccttcc tccctctcct 7500
cctcctcctt ttccagccct acctaccttc cctttcttct tcatttattc aaagtagctt 7560
tgaacagcac tactcggttt agttgtgtat aaaaggaaaa tgcaggtcca agcagcttgg 7620
ggaagattgc tttttgctct ctggaggcag atgatgacag ttcaagatca ttccttttgc 7680
tccatgtcac aggaaggggg acatgccgaa tctaccagtt tgcagccacc tacacaggat 7740
ccaccttcac ttctaaggaa atgtttggga agctacctac caaccacttc tggcatctca 7800
tgggctagag gactcttaaa tggcactctt atttgtttaa taaaggaggt tgtgacgtgt 7860
agttttaaat cccttccaca caacaattgc tactctctga ccaaaaaaga agggagacag 7920
gatacggcta ggtgtctagt agactttacc actttgaaaa gccttaatat aaatcaggta 7980
gatacatctt tttaacttat tcttgtaaag acaaaaacaa aactttattt ttatttgtgt 8040
gtatgcttgt gtgtgtgtgc ctgtgtgtat accacatgtc gctggtgccg gagaacacca 8100
gaagagggga cctgatctcc tggagctaaa gctatccatg gttctgagct gcctgatgtg 8160
ggtgctggga acagaactct ggtcttctgc aagagcaaca agcctcctct taactacgaa 8220
tctcctcccc atccccccaa atacatttaa ttattcattt tagcagcttt atttcgtaac 8280
tacttatcac agcataaaac aaggatttta tatatattac atgcaatcga ggataagagt 8340
tgaggggaga tgcgtgtgct ccttctgggt gtctgtgctt ttgaagaatg taagcagtgc 8400
acaagggacc gaggcgtgcc tgtctgccag gagctgtctt cttcccttgg actctgagct 8460
gagtgcagtg ctccgaagaa gtaaaagacg acctcatgaa gcaatgtctt caacccaaac 8520
atgctgtcca gacaaagtcc agcttcatta gtgctctgag gagagactta ctgagcctca 8580
ggaaagcccc cctcagcatg gcgaaagtcc actttgattg aagtgactcg aaagccatgg 8640
cagtgcggcg gcggccgcgt ggagcttgtg ctcgagtcgg aagcggcatc tttgtcaggc 8700
ggctgtgatt agcacgggga ggcaggactg gagtgaagga agagttgggg gcggggctta 8760
gcgctctggt ctcctaagct gtagtcagcg cctcaagatt tgtaacctgc cttctgcctt 8820
cccagccagg cagtcaagtg gctccaagct gaagactgca aagtgcccct aaccttttgg 8880
ttatagcgag gctgaagaca ccgtgctctt tcatgaaagc cggatgtctg aaatccgatt 8940
tgataaatat ggataaaacg tataacgctc gatcaatcga atcgaaggag ctcacgattg 9000
gcaccacggc tttggggaca acagagtact gactcgttgg gaggacttgg atacttcccc 9060
tcctcttcca tctcttcccc tttcctcact tcctcctcct tccttctcca ttttctccct 9120
cttcactgtt tcttactatt tttacaaaag attttattta tttatttatt tatttattta 9180
tttatttatt tatttattta tttatttaat gtatgcgagt acactgtagc tgtcttcaga 9240
cacaccagaa gagggcgtca agttccatta gagatggttt cgagccacca tgtggttgct 9300
ggggcctctg gaaggaccgc cagtgctctt aacccctgag ccatttctcc agtacccttc 9360
tcaccgtttc tcttcaatct tcttcctctt ccttctccac tttccttgtc ttcttggttt 9420
cattatcttt ctccctttct tcctcttctc cccttcttcc tcctccactg tagttttcct 9480
tccctactct tttcctgcct ccctcctcct cccctctcat tccccctcct ctttcctcct 9540
tctccctcct cctccttcct tctccctctc ccctctcccc tctcccttct cccttctccc 9600
cctcctcttc ctctttctcc ttctccaccc ctcctgtcac agtatcaatg gcaagggtgt 9660
tctagaatgg aggagtgtcc cctaggcact aacgaaagcc agttaggatg ctctgagacg 9720
ggtacaattc agggagggcc gtggggatgg aagggttgtg ctgcgattca ttctggagca 9780
acccccaggc agaatcatga ggttggttcc ggattcgcag ggcacaattc agaagaggaa 9840
ggtttcagga aggacgagtt tgtctgagat aggagttaca tctgatgtct tggcagcaga 9900
gccactgtac aagcgtgctt tattaaccac gtgggattaa atcttctttt aaatttattt 9960
tcaactctta aggaaacgtg aactttcaca ttcaaattta gacttgcagc tcttatgggg 10020
aaaaaaaggg gatcttaaga atattaagca taggcggctg gagagatggc tcagcggtta 10080
agagcactct ctgctctccc agaggtcctg agttcaattc ctagcaacca cataatagtt 10140
aacaacagtc tttaatgaat tctaatgccc tcttctggtg tgtctgaaga cagttacagt 10200
gtactcatat aaataaaata aagaaattta aaaaaatgaa tattaggcat agattcctgg 10260
atcctaagaa agccatcaga gctggagcca tgtgtgggat cctgcttggt gctggagggg 10320
cagagttcat gcccccgggg tttttactta ttatcacatt ttcatcgttg ttttgaaaca 10380
gggtcttgtg tggtccaggc tggccttgaa ctcatctttc agcctctacc tcacaggttc 10440
tgggattact tggttcctaa aagtatctcc gtcaagctcc ctggtgttat ggctgtgcca 10500
accaggaggg tctatacact cgctcaggta gagggagaag atccgaatct ctgacaggga 10560
ctgctgcctc tcggggcaaa tggagtgaag gacagcggca gaaggattta ggaaagatgg 10620
acgggagagt ggaaatgctg cagaagccag aaaacaaagc aggaagcctg ctgtccagtg 10680
gggctcaaga gcggagggat gcgagggggc tgcgcaggaa catttagcgt ctgcgtctat 10740
gggggtaggg gcggggtgcc agcacctagt cacctgaagg ggaaatgctt gcccagggag 10800
caggtctcag tagctgacct agagaaagga gcggccccta cagaggagac acgggtcact 10860
gtttgttaaa gtgaaggaga aataaatatt ctttcaaaga atcttaggtg agcccagttc 10920
atctgcgctg tggaggcctg gggaacagtt aaaaagaccc tgacacacac ccaaggcaaa 10980
caagcaacac acggctcctt ccgtaagggt ccatgattct ctgaagaatc agccccggaa 11040
tcagccccgg aatcaggtag tccgtaaaca caatgagtgt tttactctgc agaagtccag 11100
cctgctggcg tctcccatta ccaaaataga gggatagtca cgtgagctca ccggctcgat 11160
ttaaggcacg tggttttcca gggtagatga gctttggctt ctggaaccat tatggggcac 11220
gaaggatgga gccaggattt tttttttttt tttttttttc tattagcaat tgatttgctt 11280
gggcttggct ggacttgccc agttcttagg cccagtcttc ttaactgccg atctgaagtc 11340
tgtcatggag tcagcctagc cttctcactt cccttcagct cgaataggaa gaggaggtgc 11400
acaccagatg gtctgagagc agggataaat ggtgtgcctt tgtctttcag tatttcgtta 11460
ttttaagtag gaagatgctt ttctgtatta cattgcttgt gaaaccggaa gttgattcgg 11520
ggcacaggac aatggatttg gtgttttgca aggactgttt cagaagagag aggagtggaa 11580
gggtggttag agtgaggagt ggggtgggac gggatggggg aagagaagga agggccagac 11640
aggctaggta gggctgagag gaggcggtgg gaacttcttg agttagcgca gcagtaaact 11700
tggatgtgcg tgtatctttg tgatatatga cccggagccg tgtagctggc tccgatagta 11760
ctgctaatgt cagtgtcggg gggggggggt cccatactgt tccacagggg ctgcacattc 11820
ccatcgagag caggagggct cctctctcca tacatcctcg ccagcattcc ttgttgtttc 11880
tgtgatgaca gggggtggga tgaaatctct ctgttggttt gagagaccgt gaagaagctc 11940
aaccccagga cattttgcag tcttggaagg cagtgcctcc atgtggagcc gtggagccca 12000
tctctgagtc caggtcactc ttgcagttcg cactcagctc ttcagatgca ggagagacgt 12060
tggtgggaaa gcaagattgt ttgcttgttg agatagacac attctccaca caaaggctca 12120
cgtggggcaa aggctgattg acgtacagcg ttcaggaacg cctgtggtag agctatgatt 12180
agctgtctcc atctatgaag cagacaaaga gttataaaaa aaatcaatgt tttcaaattg 12240
tcaaactttt aacccgacag caagcgctct gtccctgggc taatccctag ccctggtttc 12300
ttgagatggg gtcttttgtg cactagactg gcctagaact cacgatctta gtgttccagc 12360
ctcccagctg ctgggatgag ccgctataac cagtctgcct gccttcctaa attttaagtg 12420
atgggaagtg ggggagaata cagtttaaag tatgcagatc tgagagcagg aacctggcaa 12480
agccaagggg ccggagttac aggcggctaa catgggtgct gggaactgac ccaggtcctt 12540
gagaggagca gtgtgtactc ttgaccaaac aggtccgtct ctccagtccc cgtagtatta 12600
aaaataggta ctacgggcat ggtggtgcac acctttaatc ccagcactag ggaggcagag 12660
gcaggtggat ttctgagttt gaggccagcc tggtctacaa aatgagttcc aggacagcca 12720
cggctataca gagaaaccct gtcttgaaaa caaaacaaca acaaaatagg tactacaaag 12780
cgatgtaatt gtgctcaaac atgcaaaccg aggggactgt atgcataaga aagagaaaga 12840
cggccacact ggttctatct gggtgacagg aaatcagtat ttttattttt cacattcatt 12900
tttttgttgt tgttgttgac acagtgattt ttctatcaaa aacattattt cttttatagt 12960
tcccctgagg agctgttttt aaagccgtgc tttgaaaaac cattgaagga gcagaggcag 13020
ggagactcct gtgtggcagt cggtgaagca ggccctctgc aggcaggctg gccctggact 13080
tgggagtctc tttccctccc tcctgtgctc aaatagcaaa tgtcaggctt caatgtagct 13140
agaaggttct agaatgatta agtttccaag gctgaagagc ttccctgttt gcctttcact 13200
tccctggaga ggtcgttgtg tgttccggag tctgcaaggt gcctttggtg atgcgggtgg 13260
ttcatctcgg gagattccgc ctggaggacc caagttcaag ccctgcctga gctacagagt 13320
gactttcagg tcttctgcgc aattcagtga gacccagtct acaaataaaa agtaaaaaga 13380
aggctgtgga tggaactcgg tggtagagtt ctgggtttac tccctagagg aggggagaag 13440
gaggaggagg gaggaggaag aggaagaaag aagaagagaa gggaagagga gaaggaaggg 13500
agggaagggg ctgacaagaa gagagaagag ggagggaggg gagggaaagg aaggggaaag 13560
gaagggaggg aaggggctga caagaagaga gaagagggag ggaggggagg gaaaggaagg 13620
ggaaagaaga gaagggtaag aagaaactgt tccaatggtc tgggccacag agtgatggcc 13680
ttttgtggtg atcagctgta atccttgatt tgacacaacc tagaatctgg gaagcgagtt 13740
tctgtgaagg agcattcaca ctggctggcc tgtgggcgtg catgtgggag actgtcataa 13800
ttaggttcat taatacagga agtcccagcc cactacaaat ggcttcgttc catacccaag 13860
agatgctaac tgtagacggt tggagaaagc aagcaagctg tggatacccc acgctctttc 13920
acctcggctc ctggggggtg ggtgcactgt gtctcttggt attttaaagt cctgccttga 13980
cgtccctgct gtgacagact gtaactggaa ttgtgagctt tagtccttta gttttctacg 14040
ttggtttttc tcaggatatt ttatcgcagt aacagaaaca agaccaggac acttgatctc 14100
ctctgatcaa cactgaagag ttacaaaaca ggctgaggaa acaaactttc ttctccctct 14160
cccccttctg tccctcccct tccttctcgc tccctccctt gccccctctc tccctgtctc 14220
tgtctctgtc tctgtctctg tctctgtctc tgtctctgcc tctcccctcc cctcccctcc 14280
ctctgtctct gtctctgtct ctgtctctgt ctctgtctct gtctctgtcc ctttctcctc 14340
tatctcctaa atggctggag gccatgctag ctcaatgttg aactttgaac acgtatttag 14400
gaaatctttg ttcttaacag ttctgaagtg ctgaagtggt ggtttagtct ctcggcctga 14460
caagctcact tcctctcact ctgtcttaat gaccaaatct gccatttccc taaaacagca 14520
caggctccag ctccaggttg ctccggagcg gag 14553

実施例１２－ＣＨＯ安定部位２配列－米国特許第９，８１６，１１０号
＜２１１＞４００１
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ
＜４００＞１
（配列番号１１）
ccaagatgcc catcaactga ttaatagatg ataaaattat tgtacatttc agtgtaatat 60
tattcagttt ttaagaaaaa tgaaattatg taataagcat gtaaatggat atatcttgaa 120
acaaccattc cccattatat tacctaaaca ttgaaagtcc aaaatcatat gatcttttta 180
gtggatctac taatcttttg ctatatgtat tttattgaac tacccatgga tgtgagataa 240
ttggtaacaa cagcacatgg gagagcatgg gatcattcaa ggaagattag agagaatgca 300
ttttttagga gataatggag gagcaataga aaggattaaa tgaggttact gatgaaagtg 360
atggttagag aaggcaatat gaggagggat aactagcact tagggccttt tgaaaaagac 420
atagagaaaa tactattgta gaaacttcct ataattggtg tatagttata tacaccaaag 480
agctcagatg gagttaccct ataatggaaa tattaactac tttttatcac tgtgataaaa 540
catcctgaac agagcaacat agattgggaa gcatttactt tggcttacag ttctaacggg 600
ataaaaattc atgatgaaag aatgaatatg tcagcaaaca gcagtagcaa tggcctgaga 660
agcaggtgag agctcacatc ttgaagtgta agaatgtagc agagagaaca aactgcaaat 720
gaccagaaaa tgcttttgga tcagagccca tacccctctg actgacttct ccagaaattc 780
tgaacaaata aaactcccca aacagagcca taactgaagg tccagtgtct gagactacta 840
ggggtatttc ttattcaaac cactacaatg gggtgggggg agcaatcctc caagtaggca 900
ctacacacag acaaataaaa actctagtaa ctggaatgga ttgacttatt tgaattactt 960
gccagtggag ctacatagag cacaattatt gtatttaaat taccctttat gatcttacaa 1020
aacttgacag taagatcata ttgctaaaga aaccacatat ttgaatcagg gaacatggtg 1080
atatctagtt gttcttcaac tggaaacttc atgctttctg cccagcattc atgttgctgg 1140
aaagagcaat gtacactacc agtgtagaaa ttaaatcatc aatcttatca agatgtggat 1200
cctataagtt acaataaaaa ttagcctgat aagatatccc caccagaaga atattcacat 1260
aaatgctatg ggagcaacaa gctattttct aaattagctt taatcctatt ctacaagaga 1320
gaatccatat ctagaatagt tatagggatc aagaacccat ggcttgattg gtcataggcc 1380
caatgggaga tcctaatatt attgttctac aaaatgaaaa taactcctaa tgacttgttg 1440
ctgcagtaat aagttagtat gttgctcaac tctcacaaga gaagttttgt cttacaataa 1500
atggcaatta aagcagcccc acaagattta tatcataccg atctcctcat ggcctatgca 1560
tctagaagct aggaaacaaa gaggacccta agagagacat acatggtccc cctggagaag 1620
gggaaggggg caagacctcc aaagctaatt gggagcatgg gggaggggag agggagttag 1680
aagaaagaga aggggataaa aggagggaga ggaggacaag agagagaagg aagatctagt 1740
caagagaaga tagaggagag caagaaaaga gataccatag tagagggagc cttgtatgtt 1800
taaatagaaa actggcacta gggaattgtc caaagatcca caaggtccaa ctaataatct 1860
aagcaatagt cgagaggcta ccttaaaagc ctttctctga taatgagatt gatgactacc 1920
ttatatacca tcctagagcc ttcatccagt agctgatgga agcagaagca gacatctaca 1980
gctaaacact gagctagttg cagacaggga ggagtgatga gcaaagtcaa gaccaggctg 2040
gagaaacaca cagaaacagc agacctgaaa aaaatgttgc acatggaccc cagactgata 2100
gctgggagtc cagcatagga cttttctaga aaccctgaat gaggatatca gtttggaggt 2160
ctggttaatc tatggggaca ctggtagtgg atcaatattt atccctagtt catgactgga 2220
atttgggtac ccattccaca tggaggaatt ctctgtcagc ctagacacat gggggaggtt 2280
ctaggtcctg ctccaaataa tgtgttagac tttgaagaac tcccttgaga agactcaccc 2340
tccctgggga gcagaaaggg gatgggatga gggttggtga gggacaggag aggaggggag 2400
ggtgagggaa ctgggattga caagtaaatg atgcttgttt ctaatttaaa tgaataaagg 2460
aaaagtaaaa gaagaaaaga aaacaggcca aaagattata aaagacagag gtggtgggtg 2520
actataaaga aacactatta tctaaataaa aacatgtcag aagcacacat gaacttatag 2580
tgtttatgaa agtatgtata ataactacat aatctcaagc caagaaaaaa atatcatctt 2640
tcagtgatga aggtgatttt atttctccca gaattaaagc caaagaccta atgaaagtaa 2700
ttatcttcaa aaggttgaaa atacatactt tgcaatacac agatctgcct agaaatctca 2760
tgttcacaat acacatgatg ctcaattgaa ttccattcaa tgttacagtt tagataaaca 2820
gtttgtagat aaactcacaa tgtatcattt ctttttattt tttgaccaaa cagcttctca 2880
tctgttattc agaataattc ctcgatggca ggatatccat cccaattggg ggaaggggag 2940
aatttgaaga aaacctagac cacatacata tttgccattg ggaaacaaag tctaaaatga 3000
tgttgttcac atcttctcta ctagtcctct ccccgtccca aagaaccttg gtatatgtgc 3060
ctcattttac agagagagga aagcaggaac tgagcatccc ttacttgcca tcctcaaccc 3120
aaaatttgca tcattgctca gctctgccct tctcatatga cagttacaag tcaaggcttc 3180
caaagtccct ctgtcatgtt tggtgtcaat agtttataca gatgacttca tgtcttcata 3240
tctaatgtct tatatagatt aatattaaac aatgttattt ctctaaccac attttaaatt 3300
aatttaaaaa tccattaatt gtgtctataa aatgcagaca gagtgctgag acacaatata 3360
agcctgatga tctgaatttg aaactcacac ccaccacatg gagaatcaac ttccaaaaat 3420
tttcctatta cttccacact tacaccattg tacaaacaca ataataatga acaaaatgaa 3480
atgaaataaa aaattaagtc tctgtaggta atgctactgt gcagcaaaag taaaaatggc 3540
agcttaagct tgctttatgg ttacacttta ccatcttcca ttaattataa ggacttcaat 3600
catggcagaa ctatgctgtt attgtctcag tgtaacctaa ccaggtgttc cagatgttct 3660
taatgtggac acctaaacta tttgatattt gggttaagat ctttccctct ttcagaagaa 3720
acctcaggac agagggaatc ttgtctttta attttgagtc tgtagacttt ttccatttca 3780
aatatacatg aaacaagtga tgaagaaaat taatcaaaag gtgggaattg caatgatatt 3840
aggttcaata ttaagcttca atattatcat ggaatcgcct gttatacact gagtgtttgg 3900
caataaggga tttttagaag aaggagtttt tattctcaac aggttcctta agtttagctc 3960
aaataaatct aagcaatcca ctctagaatt aaatagtttc c 4001

＜２１１＞１４９３１
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ
＜２２０＞
＜２２１＞ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２２＞（２１７６）．．（２２３９）
＜２２３＞ｎはａ、ｃ、ｇ、ｔであるか、又はヌクレオチドが欠けている
＜４００＞４
（配列番号１２）
catgtacact tatgcaagta tgatatggcc caacacagta ttttacacca atttttatct 60
ataaaatata catgtacatc aaaatatatt attaataata acatcattat tctttctttc 120
caagtaataa acacatacac tgaaattttg gttcttgtgg ataattttaa tgaaacagga 180
aatgcaaatt tatcttagca tgtttacttc actttctttg catagataac cagtaatcac 240
attgatggat catgtagtga aatgtatttt taggtatcta aggaattttg gcttcgtttt 300
gtgcttgttg acactgaatt ctattcctaa caacagtgtg taaggattct gtctgatttc 360
ttttaccagt atttgtccat ttgcattttc tttattattc atggctgctg ttctagaaag 420
tggaaggtag tgtgtcaagt ctgtttaaca tgtttccctg atgatcagtg tcttaacacc 480
tctctgagta catgttggcc aatgtcgttt ctagacccat ctattcttgc ttgacttatc 540
ctggtacatg cctgccaaga aatttctcct catcctttct gtctcttcac tgatttactt 600
gatgtgtgga tttcacattg atcatatgga aatagaagat acaattttct ttattcacag 660
tttggaagac tttcaatctc atagatcatc attatttttt gctactgttc cctatgctat 720
ggtgaaattt ccatttgaat aattgcttaa acaattaaca agaaagaatc tatttttact 780
tgcaataact tccatttcag aacatttact acactgttac tatatccaaa aactagtttt 840
atatatcatg tgagaaatga ctaattcata atttggccat gacatttttt tcagaaacag 900
aaaaagtgac caatacatac acaatgctat aaatattaag acttcagcaa attaaatatt 960
tattcatgat atcacataaa attcatttat tatgttttat ttaaatgtgt ttttaaaaca 1020
gtggtatcac taaatattaa gttagatgtg tttatgtgct taatgaattt atattttaga 1080
atgttataag ttgtatatag tcaaatatgt aataaatttt attttttagg tctttctcat 1140
taaggtattt taattttggg tcccttttcc agagtgactc tagctcatga tgagttgaca 1200
taaaaactaa acagtacaaa atgtacattg cattcagtat tgcacttgat ctttgcactg 1260
aagtttgagt cagttcatac atttagtact tgggaagtac attaagctaa ctttcattgc 1320
tctggcaaaa tgctcgataa gataagagtc tattgtggaa agccatggca gcaggaaagt 1380
aagactgctg atgatgttta atccatagtc aagacgcaga aggagatgaa tgctggtatc 1440
caacattttt tgctgttcat tttctctaga accctagtcc ataaagatgt atgacttgca 1500
ttcaaaatgc gtccccttca gttgttcaac ttttctgtaa atatcctttc aggcatgtct 1560
agaagattgt ttcgcaaata cttctcaatc cattcaagtt gatagtgcag attaatcact 1620
gcagaataaa agcctgtaac ttggctcacg tgccaaggaa tatgcacact cctgacacat 1680
caataagtaa atcaaagtgt agcttttgcc tttaacattg ccagacttat gtaatgttct 1740
gcacgttctt cctccatcac tttttattct aatggtgttt ccttgacatt gaatcacgct 1800
gtggaagctg cttagaatta acattgaaat ctactgatat atttatgatg cagcaattta 1860
gatttactat tttacttaga attttttata attgagagaa tataatattt tcacagttat 1920
ctatctgctg taaatagagg attttaaaaa aaatctctat aacttttttt tacaacacac 1980
agtaaaatta agttaaaatt taataaagtc actatgttga tttcaaagtg tgctacgccc 2040
acggtggtca cgcaggtgta gcagaagatg ccactaaggt gggctaaggc cgatgggttg 2100
gggtctgcgc tccctggaga tgagccccag gcggttccct ggcaatcagc tgcgatcatg 2160
atgcccgatg agccannnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2220
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc tgggtgactt tatggaaaga atttgataga tttcatgatg 2280
tagaagaatt ttattaggct tattttacag gagactaaga ccctgggacc taaagatatc 2340
tgggtcctga gaatcaggaa atgggtagag acgtggttga tggtatgaga cagattttag 2400
agaactctta gatcatgggc aatgaccgca atctgatgct tagaatagat catctataaa 2460
caattatgct gttctttttc tttctgttgt atgatctgat gatgtagccc ccttgccaag 2520
ttccctgatc ccccttgcca agttccctga ttgtaacagt atataagcat tgcttgagag 2580
catattcaac tacattgagt gtgtctgtct gtcatttcct cgccgattcc tgatttctcc 2640
ttgagccttt tcccttgttc tccctcggtc ggtggtctcc acgagaggcg gtccgtggca 2700
aaagtgtata aatgttctaa aacatttgaa ctctaaaaca tgcaaaatga aaaattaaaa 2760
taaataaaca tgaaaattaa aatatattag ctgctaaaag ttaaacaata ctatataata 2820
ttttgttatt agaattcaaa atcacattag ttggatttaa tttgaacatt gcattctttc 2880
aataataatt tcaataaaaa aagtttcccc atgatagtag aaaataataa catatgtatc 2940
tatctattta tttaactaca catatatagc atttgtttca actaaaataa atgaatgagc 3000
aaagcaccta agtaattggt gtctattata tttatgaagc caatagtttc aaataaatta 3060
tcatgcataa ggaggtattg caaatgttaa accttttttg aaacagatat tcccagttac 3120
agaaattata atttctaatc tttcctataa gtagaatgat gataattaat ataggccatt 3180
tgtaaataat gttcagatta aaatattctc tatttcacta gagaagaatg atattaaatg 3240
tattatattt tatttcccat tttgtttgca ccactattct atatccctca gcagtttaaa 3300
tttgtttcac catatgtgtg tgtgtttgta tcttaaatat ggcactaaaa ttagaataat 3360
ttaatataaa tctttaggag aaaagatatt gaattatttt atgttgatag gaaaatatct 3420
tttaattgtc caagaatact ttttcttcta ttttaggact gatcagaccc aggactaata 3480
ttttatatgt actaattcta tgtaccaaaa tatgttatta tctcatgaat tctgtctcaa 3540
tattgaggta ataaaaatag tccatcatga actttaaaat taaaataatg attaattaat 3600
ttttattcat attttgtttg tatgaatggt tatacatcac atgtgtgcct ggtgactgtg 3660
aatgtcagga gaaggtatga aagccactgg aattggaata agagataata tttgagatgt 3720
tatgtgggtg ctgagaatta gacgcaagcc atcttcaaga atagccagca tactatacca 3780
ctgagtaatc cattcatccc tcaataatta tctttgtaga cagtaaatat atttctaaac 3840
tataaatgac cagaaaaatt aatgtattat taatgaagac attcatctca tgtgacacac 3900
ttcacctgtc taaatcagta acactctctc cactaattaa gattttctaa gtgcatgaca 3960
cttactattt ctaaagctgt ccaatggggg ccagtcccca gtcagcaccc agtgagataa 4020
tccatgaatg catttatatc ttaggaaaaa ttcttatcta tgtagtattt agaacatttt 4080
catgtgaggg gataaacaag gaagcacaga tgctttctga tagaaacttt ctctttaatt 4140
catctagaaa aaaaaaacct ctcaggaaaa tctctcttgc tctcctccca atgctctatt 4200
cagcatcttc tccctactta attctagatc tttttctcta tgcctccttg ctgctgccct 4260
gctggctctg ctctatgcct ccccatgtca cttttctttg ctatctcacc gttaccttct 4320
ctgcctcact ctctgccttc ttctctgctt ctcacatggc caggctctgg acaattatag 4380
ttatatgtta cattctcata acacatgata tgtcacatag tttctctcag gctagggata 4440
tcacaatgac tggccaatga gcaagtggcc ttgcatgtag ctctaagttg gtgatggttc 4500
ccagacagta agtagccatt tggttgaaat ttgaggttgg gtagtacatg aagactgaat 4560
tttcttcaaa ctctggcctt gaaatagtaa aacaacacct atgaaaatga cgacctgtat 4620
ttgtctttag aggcaaccac atattgtctg cagggcctgc tttgaatttg ctctgaagtt 4680
agcttgtttg tgtaaaagga agaatcctat atcagcctga gaaatgtaaa atatcctagc 4740
atttcaagtc atcaaaatta tatggagagt ataaatcatc cttctgacta ttcatagtca 4800
tatttgtgtc caccaagtat aaaacacact accaaagggc tgtggaaaaa atcgccataa 4860
ctgttcttat tagggaggca tagcagtggt acctgaggaa gttacagcaa caaccagtca 4920
tccagtcaat aaccccatgg ctttgccact tggaggtacc caataatgtt tggctttgcc 4980
gagtaggact ccaacaaatt cagagggtca atttttaaat gctggttgtc actgctgaac 5040
agtcccattg ccctctgcat aattccacaa tggaaagctt tttacactga ttgccaatca 5100
ttaaacagcc tactcagcat aaacaggtat gatattattc tgcattttgt tacattacta 5160
gatgaattcc tatttcttcc tacaatagtg gaactgaaaa aagatacaca atcatactac 5220
ccctctacta atcttatgac ttatatcatt tcaattttca gaccataatg caaactattg 5280
accaaaacat gtgaagatga aaaatagaaa tgtagaataa tattacatat aaaaagaaaa 5340
ggcggactta ttttgtttta tttcttagca tgcatagcaa tacatgattt gaggtttata 5400
taataaaggg acaataaatc ttcaagaaac ttacccctac tgaattaaaa tattaaagaa 5460
ggtcacacat ttactcaaat atattagact actgggcaaa tagacatgaa aagtagagtt 5520
aatattgagg taggccttct gtgaaatgtc taaggaaatt atgtttcata cagtgtgtaa 5580
ccaagtggga atcatatcag aaagcagtca aaagcttata ttacaagtaa cagatgcttg 5640
gttatatgac ctcccagagc ttgactgtct atacacaaaa agtggtgtta ataaaactgt 5700
aatttgggct atgttttttt aaatggcttc accaacatga aaggaaggga atgagcatgt 5760
catggatgct tagagattat gcttccagca agaagaattg agctttggct cttattacag 5820
aaacatgaca aggtgtgagt tttatttatt agaaattata taatatttta agctggggac 5880
taaaaatttt attgaaacaa acaggcaagg gataggcatg tactagaagc aaaaatagga 5940
tgtcaatgct gtaatgttat tttttggacc aaaatagtat ttcctataga aatgacaatg 6000
atcttaggtt attattcttc ataaagatga caagttcaca agatatccta gttcattaaa 6060
atcgttttag tcatttaata gagtgctgtg atagattaca caaaggaaag cacttacgat 6120
gagaaataat gatatccaca attattttct taattcttag aaacattcta ttgttatatc 6180
tcaatctcag aagccactta ttgctttatt attgaaacat atgaaattgt aagttatata 6240
ttgtctatgg tgacatttca aagaacatgt gacgtacagt gtagcacaga taaagaacat 6300
aactgcagct gaatcagtaa ctaaacttac atacattaaa tctgccatgt tggcaacagt 6360
gtgtgcacta ccaaaggatg tactaatgct cacgacactc ccctatgtca ccctttgttc 6420
atcattacat cataggtcta ttttgtttgc ttttgaaatc tagaccaagt cttttgtgtc 6480
tttccaagca cagagctcat taatttacct catagacttg ttaaacttct tctggttcat 6540
caattgaata gaaatactca ctactaatta tgtgagaccc tgccagtacc atagcacatg 6600
gataattttt acataaaaca tgcatacaag taagattatt cagactgaac atgaatttta 6660
gagaaatcag gaaggagtat atgggagtgg ttggagtgag actagagaaa tgtaattaaa 6720
ctataatctc aatacaaaga tctactaagc aaaaaacatg aaacattgtc attcaagtga 6780
aacatcagtc ttcaaattgg aaagatattt ttactaggaa aatgtctggt agatggttat 6840
tatctagaaa acacaaaaat tagaaaacgg taaactttaa taaaaagaat aatacaatga 6900
gactacatga aaagttctta actaatgaaa caaatatctt gaaacttttt tcttaaaagt 6960
ttaatatcaa taaccatcat ggaaattcaa attaaaacta tttacatatt acccctgaaa 7020
taataactaa tacccaataa aaataatata aacaaaaaat ggcaatgcat gccatcatgg 7080
atttgggaga gagaatgttc attgcagttc tgaatggata ctggtgccac cacggtgaaa 7140
atctctgtat aggtccttcc aaaagctgaa aatagacata tcacaagacc tgccacacat 7200
ttttcaagca aatacccaaa ggactctacc tgactgcaga gacactttct cataaaatat 7260
tattgttgat ctattcataa tatctggaaa atagaaacag ccaagatgcc catcaactga 7320
ttaatagatg ataaaattat tgtacatttc agtgtaatat tattcagttt ttaagaaaaa 7380
tgaaattatg taataagcat gtaaatggat atatcttgaa acaaccattc cccattatat 7440
tacctaaaca ttgaaagtcc aaaatcatat gatcttttta gtggatctac taatcttttg 7500
ctatatgtat tttattgaac tacccatgga tgtgagataa ttggtaacaa cagcacatgg 7560
gagagcatgg gatcattcaa ggaagattag agagaatgca ttttttagga gataatggag 7620
gagcaataga aaggattaaa tgaggttact gatgaaagtg atggttagag aaggcaatat 7680
gaggagggat aactagcact tagggccttt tgaaaaagac atagagaaaa tactattgta 7740
gaaacttcct ataattggtg tatagttata tacaccaaag agctcagatg gagttaccct 7800
ataatggaaa tattaactac tttttatcac tgtgataaaa catcctgaac agagcaacat 7860
agattgggaa gcatttactt tggcttacag ttctaacggg ataaaaattc atgatgaaag 7920
aatgaatatg tcagcaaaca gcagtagcaa tggcctgaga agcaggtgag agctcacatc 7980
ttgaagtgta agaatgtagc agagagaaca aactgcaaat gaccagaaaa tgcttttgga 8040
tcagagccca tacccctctg actgacttct ccagaaattc tgaacaaata aaactcccca 8100
aacagagcca taactgaagg tccagtgtct gagactacta ggggtatttc ttattcaaac 8160
cactacaatg gggtgggggg agcaatcctc caagtaggca ctacacacag acaaataaaa 8220
actctagtaa ctggaatgga ttgacttatt tgaattactt gccagtggag ctacatagag 8280
cacaattatt gtatttaaat taccctttat gatcttacaa aacttgacag taagatcata 8340
ttgctaaaga aaccacatat ttgaatcagg gaacatggtg atatctagtt gttcttcaac 8400
tggaaacttc atgctttctg cccagcattc atgttgctgg aaagagcaat gtacactacc 8460
agtgtagaaa ttaaatcatc aatcttatca agatgtggat cctataagtt acaataaaaa 8520
ttagcctgat aagatatccc caccagaaga atattcacat aaatgctatg ggagcaacaa 8580
gctattttct aaattagctt taatcctatt ctacaagaga gaatccatat ctagaatagt 8640
tatagggatc aagaacccat ggcttgattg gtcataggcc caatgggaga tcctaatatt 8700
attgttctac aaaatgaaaa taactcctaa tgacttgttg ctgcagtaat aagttagtat 8760
gttgctcaac tctcacaaga gaagttttgt cttacaataa atggcaatta aagcagcccc 8820
acaagattta tatcataccg atctcctcat ggcctatgca tctagaagct aggaaacaaa 8880
gaggacccta agagagacat acatggtccc cctggagaag gggaaggggg caagacctcc 8940
aaagctaatt gggagcatgg gggaggggag agggagttag aagaaagaga aggggataaa 9000
aggagggaga ggaggacaag agagagaagg aagatctagt caagagaaga tagaggagag 9060
caagaaaaga gataccatag tagagggagc cttgtatgtt taaatagaaa actggcacta 9120
gggaattgtc caaagatcca caaggtccaa ctaataatct aagcaatagt cgagaggcta 9180
ccttaaaagc ctttctctga taatgagatt gatgactacc ttatatacca tcctagagcc 9240
ttcatccagt agctgatgga agcagaagca gacatctaca gctaaacact gagctagttg 9300
cagacaggga ggagtgatga gcaaagtcaa gaccaggctg gagaaacaca cagaaacagc 9360
agacctgaaa aaaatgttgc acatggaccc cagactgata gctgggagtc cagcatagga 9420
cttttctaga aaccctgaat gaggatatca gtttggaggt ctggttaatc tatggggaca 9480
ctggtagtgg atcaatattt atccctagtt catgactgga atttgggtac ccattccaca 9540
tggaggaatt ctctgtcagc ctagacacat gggggaggtt ctaggtcctg ctccaaataa 9600
tgtgttagac tttgaagaac tcccttgaga agactcaccc tccctgggga gcagaaaggg 9660
gatgggatga gggttggtga gggacaggag aggaggggag ggtgagggaa ctgggattga 9720
caagtaaatg atgcttgttt ctaatttaaa tgaataaagg aaaagtaaaa gaagaaaaga 9780
aaacaggcca aaagattata aaagacagag gtggtgggtg actataaaga aacactatta 9840
tctaaataaa aatatgtcag aagcacacat gaacttatag tgtttatgaa agtatgtata 9900
ataactacat aatctcaagc caagaaaaaa atatcatctt tcagtgatga aggtgatttt 9960
atttctccca gaattaaagc caaagaccta atgaaagtaa ttatcttcaa aaggttgaaa 10020
atacatactt tgcaatacac agatctgcct agaaatctca tgttcacaat acacatgatg 10080
ctcaattgaa ttccattcaa tgttacagtt tagataaaca gtttgtagat aaactcacaa 10140
tgtatcattt ctttttattt tttgaccaaa cagcttctca tctgttattc agaataattc 10200
ctcgatggca ggatatccat cccaattggg ggaaggggag aatttgaaga aaacctagac 10260
cacatacata tttgccattg ggaaacaaag tctaaaatga tgttgttcac atcttctcta 10320
ctagtcctct ccccgtccca aagaaccttg gtatatgtgc ctcattttac agagagagga 10380
aagcaggaac tgagcatccc ttacttgcca tcctcaaccc aaaatttgca tcattgctca 10440
gctctgccct tctcatatga cagttacaag tcaaggcttc caaagtccct ctgtcatgtt 10500
tggtgtcaat agtttataca gatgacttca tgtcttcata tctaatgtct tatatagatt 10560
aatattaaac aatgttattt ctctaaccac attttaaatt aatttaaaaa tccattaatt 10620
gtgtctataa aatgcagaca gagtgctgag acacaatata agcctgatga tctgaatttg 10680
aaactcacac ccaccacatg gagaatcaac ttccaaaaat tttcctatta cttccacact 10740
tacaccattg tacaaacaca ataataatga acaaaatgaa atgaaataaa aaattaagtc 10800
tctgtaggta atgctactgt gcagcaaaag taaaaatggc agcttaagct tgctttatgg 10860
ttacacttta ccatcttcca ttaattataa ggacttcaat catggcagaa ctatgctgtt 10920
attgtctcag tgtaacctaa ccaggtgttc cagatgttct taatgtggac acctaaacta 10980
tttgatattt gggttaagat ctttccctct ttcagaagaa acctcaggac agagggaatc 11040
ttgtctttta attttgagtc tgtagacttt ttccatttca aatatacatg aaacaagtga 11100
tgaagaaaat taatcaaaag gtgggaattg caatgatatt aggttcaata ttaagcttca 11160
atattatcat ggaatcgcct gttatacact gagtgtttgg caataaggga tttttagaag 11220
aaggagtttt tattctcaac aggttcctta agtttagctc aaataaatct aagcaatcca 11280
ctctagaatt aaatagtttc ctaagggcac agctatgaat agagctcaat ttacatataa 11340
aattttgttc accatttatg tcattccagt tttcattagt acaaggaaaa tacaaaatat 11400
ttagatgtca atatcaagtg aatagttcat ctcctttttt aatatatatc acctaaatca 11460
ccattttctc agaaaaatct ggcctgaagt tctgtctgga acttcaacat gaaaaatatg 11520
cacagcttgc tattataaat cctagttgat ttttaagatt catgtctggt gtctgactca 11580
gaggggccag aggctagaca aatatttttt gaatcttcat tgtgaagatt tttaatgatt 11640
attttaatat aaataacaaa gatgatggat aatgtaactt tgtacagttc atagacgctg 11700
aactactttg tgcttaaaat gttagttccc tatcataaat gataggtgat aagtgtatgt 11760
ttaatacttt ccctctgagc tatattcatg tactagagaa ttattttaaa catgaaaaga 11820
ctgtgtttat agtctcagct cctgagaact ggtccaacct taggcaggtg aatgccagga 11880
gcaacgtttt tcttctacag aggatgcttt gctgccaagc aacctggttg tgtggaaatg 11940
ttcctttttt aatcaagttt aaagggtctt catcatgctg ttgctccaca tattttcagg 12000
ttagagcttg gtccttggag tattatcttt taccagaaaa ttcatagtat tctttcaata 12060
actaacaact aaacttttcg ataaaaaaga attggaattt caattttaaa gcctgagtaa 12120
aattcttgtg aatcaggata ttttatttta agtcttatct tttaaaaagt tattttattt 12180
tttaaaaaat tataatatac tttcataatt tccctccttc acttttcttt acaaacactt 12240
ctatagatca ccatgtgttt ttttttttac atttatggcc tctttctgtt cattgttatt 12300
acatacaaat agtcttgcct atagaagaac accacaattt gttacctgat aacaaattat 12360
caacccttaa aacctacaaa ctattgatat tactgaaaag actatactta tagatgtaaa 12420
gatatatgtg tgtgcacata tatagataca catatatgta ggatttttaa ttttagattt 12480
tagacatcaa aattatttat atgactgaga aactagacac tataaatgag cattcagtat 12540
tcaacaccgt gattttagat attgtcacaa tgacagaaaa ttttcttata gaaaatttta 12600
agttttgtga ttgctctgtg cacttagtga agtctcacag aaaaagaatc atagtatttt 12660
tagtttataa taaaaagtac atataattaa aatggttggc acaaaacaac atttgagcat 12720
ttttcctatt tactatcaag tagtatcatt ttgaaataat aatttgacta gtttcaaaaa 12780
tgaaaacaaa atttaaacta aatgcctaat ctagcctgat aacattttta tgaatgaaat 12840
tattcaatag tgttatcaat taggggccca aaacttttcc taaaataaaa cttttaattt 12900
ttttccattt ttatttaaat tagaaacaaa attgttttac atgtaaatca gagtttcctc 12960
accctcccct tctccctgtc cctcactaac accctacttg tcccatacca tttctgctcc 13020
ccagggaggg tgaggccttc catggggaaa cttcagagtc tgtctatcct ttcggatagg 13080
gcctaggccc tcacccattt gtctaggcta aggctcacaa agtttactcc tatgctagtg 13140
ataagtactg atctactaca agagacacca tagatttcct aggcttcctc actgacaccc 13200
atgttcatgg ggtctggaac aatcatatgc tagtttccta ggtatcagtc tggggaccat 13260
gagctccccc ttgttcaggt caactgtttc tgtgggtttc accaccctgg tcttgactgc 13320
tttgctcatc actcctccct ttctgtaact gggttccagt acaattccgt gtttagctgt 13380
gggtgtctac ttctactttc atcagcttct gggatggagc ctctaggata gcatacaatt 13440
agtcatcatc tcattatcag ggaagggcat ttaaagtagc ctctccattg ttgcttggat 13500
tgttagttgg tgtcatcttt gtagatctct ggacatttcc ctagtgccag atatctcttt 13560
aaacctacaa gactacctct attatggtat ctcttttctt gctctcgtct attcttccag 13620
acaaaatctt cctgctccct tatattttcc tctcccctcc tcttctcccc ttctcattct 13680
cctagatcca tcttcccttc ccccatgctc ccaagagaga tgttgctcag gagatcttgt 13740
tccttaaccc ttttcttggg gatctgtctc tcttagggtt gtccttgttt cctagcttct 13800
ctggaagtgt ggattgtaag ctggtaatca tttgctccat gtctaaaatc catatatgag 13860
tgatgtttgt ctttttgtga ctgggttacc tcactcaaaa tggtttcttc catatgtctg 13920
tggatttcaa tagcacaaac aacatacagt atcttggggc aacactaacc aaacaagtga 13980
aagaccagta tagcaagaac tttgagttta aagaaagaaa ttaaagaaga taccagaaaa 14040
tggaaagatc tcccatgctc tttgataggc agaatcaaca tagtaaaaat ggcaatcttg 14100
ccaaaatcca tctacagact caatgcaatc cccattaaat accagcacac ttcttcacag 14160
acctgaaaga ataatactta actttatatg gagaaacaaa agacccagga taggccaaac 14220
aaccctgtac aatgaaggca cttccagagg catccccatc cctgacttca agctctatta 14280
tagagtaata atcctgaaaa cagcttggta atggcacaaa aatagacagg tagaccaatg 14340
gaattgagtt gaaaaccctg atattaaccc acatatctat gaacacctga ctttgacaaa 14400
gaagctaagg ttatacaatg taagaaagaa agcatcttca acaaatcgtg ctggcataac 14460
tggatgctgg catgtagaag actgcagata gatccatgtc taatgccatg cacaaaactt 14520
aagtccaaat ggatcaaaaa cctcaacata aatccagcca cactgaacct catagaagag 14580
aaagtgggaa gtatccttga ataaattggt acaggagacc acatcttgaa cttaacacca 14640
gtagcacaga caatcagatc aataatcaat aaatgggacc tcctgaaact gagaagcttc 14700
tgtaaggcaa tggataagtc aacaggacaa aatggcagcc cacggaatgg gaaaagatat 14760
tcaccaatcc tatatctgac agagggctgc tctctatttg caaagaacac aataagctag 14820
tttttaaaac accaattaat ccgattataa agttgggtag agaactaaat aaagaattgt 14880
taacagagca atctaacttg gcagaaagac acataagaaa gtgctcacca t 14931

実施例１３－ＣＨＯにおけるＡＡＶＳ１様領域配列でのガイド配列
（以下のガイドは、センスガイド配列又はアンチセンスガイド配列であることができる）

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【表3-7】

【表3-8】

【表3-9】

【表3-10】

【表3-11】

【0120】

説明、具体的な実施例、及びデータは、例示的な実施形態を示しているが、例示として与えられ、本発明を限定することを意図するものではないことを理解されたい。実施形態を全体的及び部分的に組み合わせることを含む本発明内の様々な変更及び修正は、本明細書に含まれる考察、開示、及びデータから当業者に明らかとなり、したがって、本発明の一部とみなされる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

2024539076000001.xml

【国際調査報告】