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▶ オスロ ユニヴェルジテットサイケフス ホーエフの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-28
(54)【発明の名称】ＨＥＲ２バリアントＣＡＲ
(51)【国際特許分類】
C07K 16/30 20060101AFI20241018BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241018BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20241018BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20241018BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241018BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241018BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241018BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241018BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241018BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20241018BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20241018BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241018BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241018BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241018BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20241018BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20241018BHJP
【ＦＩ】
C07K16/30 ZNA
C07K19/00
C07K14/725
C07K14/705
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N5/0783
C07K16/46
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K31/7088
A61P35/00
A61K35/17
G01N33/574 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024523266
(86)(22)【出願日】2022-10-19
(85)【翻訳文提出日】2024-06-07
(86)【国際出願番号】 EP2022079110
(87)【国際公開番号】W WO2023067007
(87)【国際公開日】2023-04-27
(31)【優先権主張番号】2114938.0
(32)【優先日】2021-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515202863
【氏名又は名称】オスロ ユニヴェルジテットサイケフス ホーエフ
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】カイト、ヨン アムンド
(72)【発明者】
【氏名】ドラージ、エス．エスマエイル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92Y
4B065AA93Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045CA42
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA28
4H045EA51
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する、一緒になって抗原結合単位を形成する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む、結合分子であって、ＶＬは、それぞれ、アミノ酸配列の配列番号１、２及び３を含む３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、つまりＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ＶＨは、それぞれ、アミノ酸配列の配列番号４、５及び６を含む３つのＣＤＲ、つまりＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、結合分子を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する、一緒になって抗原結合単位を形成する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む、結合分子であって、前記ＶＬは、それぞれ、アミノ酸配列の配列番号１、２及び３を含む３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、つまりＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
前記ＶＨは、それぞれ、アミノ酸配列の配列番号４、５及び６を含む３つのＣＤＲ、つまりＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、
結合分子。
【請求項2】
前記ＶＨは、配列番号７に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、前記ＶＬは、配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項3】
抗体又はその断片である、請求項１又は２に記載の結合分子。
【請求項4】
前記抗原結合単位はｓｃＦｖである、請求項１又は２に記載の結合分子。
【請求項5】
請求項１、２又は４のいずれか一項に記載の抗原結合単位を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項6】
配列番号１１のヒトＣＤ８αヒンジ又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項7】
Ｎ末端からＣ末端へと、ヒトＣＤ８αヒンジ、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン、ヒト４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びヒトＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項６に記載のＣＡＲ。
【請求項8】
請求項１から４のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項５から７のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする、核酸。
【請求項9】
請求項８に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項10】
請求項５から７のいずれか一項に記載のＣＡＲを、その細胞膜において発現する、細胞傷害性免疫細胞。
【請求項11】
細胞傷害性Ｔ細胞又はＮＫ細胞である、請求項１０に記載の細胞傷害性免疫細胞。
【請求項12】
請求項１から４のいずれか一項に記載の結合分子を含む、医薬組成物。
【請求項13】
請求項８に記載の核酸又は請求項９に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項14】
請求項１０又は１１に記載の細胞傷害性免疫細胞を含む、医薬組成物。
【請求項15】
請求項１から４のいずれか一項に記載の結合分子、請求項１０若しくは１１に記載の細胞傷害性免疫細胞、又は請求項１２から１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、ヒト患者におけるがんの処置方法。
【請求項16】
ヒト患者におけるがんの処置方法であって、ａ．がん細胞を含む試料を前記患者から得るステップと、
ｂ．前記細胞を、検出に適切な部分をさらに含む請求項１から４のいずれか一項に記載の結合分子とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることにより、前記がん細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現しているかどうかを分析するステップと、
ｃ．前記がん細胞がｐ９５ＨＥＲ２陽性である場合、化学療法を前記患者に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項17】
がんの診断方法であって、ａ．細胞を含む試料をヒト患者から得るステップと、
ｂ．前記細胞を、検出に適切な部分を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の結合分子とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることにより、前記細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現しているかどうかを分析するステップと、
ｃ．前記細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現している場合、前記患者をがんと診断するステップと、
を含む、方法。
【請求項18】
療法での使用向けの、請求項１から４のいずれか一項に記載の結合分子、請求項５から７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１０若しくは１１に記載の細胞傷害性免疫細胞、又は請求項１２から１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項19】
配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むｐ９５ＨＥＲ２を発現するがんの処置での使用向けの、請求項１から４のいずれか一項に記載の結合分子、請求項５から７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１０若しくは１１に記載の細胞傷害性免疫細胞、又は請求項１２から１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項20】
前記がんは乳がんである、請求項１９に記載の使用向けの、結合分子、ＣＡＲ、細胞傷害性免疫細胞又は医薬組成物。
【請求項21】
対象におけるがんの診断方法であって、（ａ）前記対象からの細胞の試料を、検出部分をさらに含む請求項１から４のいずれか一項に記載の結合分子と接触させるステップと、
（ｂ）前記細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現しているかどうかを決定するステップと、
（ｃ）前記細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現している場合、患者をがんと診断するステップと、
を含む方法。
【請求項22】
配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する、一緒になって抗原結合単位を形成するヒト化軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とヒト化重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む、結合分子であって、前記ＶＬは、配列番号７２から７５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含み、
前記ＶＨは、配列番号７６から７９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、がん療法及び診断の分野に関する。特に、新規標的化単位、及びそれを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、標的化単位をコードする核酸、ＣＡＲをコードする核酸、ＣＡＲを発現する免疫細胞、及びがんの処置に対するそれらの有用性に関する。
【背景技術】
【0002】
多くのＨＥＲ２＋乳がんは、ｐ９５ＨＥＲ２と総称される、短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）カルボキシ末端断片（ＣＴＦ）を有する、ＨＥＲ２のアイソフォームを発現する。
【0003】
ｐ９５ＨＥＲ２に結合するいくつかの抗原結合単位が公知であるが、そのすべてがＣＡＲへの実施に適切であるわけではない。それは、２０１９年１０月１７日に公開された研究開示ＲＤ６６７０７０に記載の失敗作により示されている。
【0004】
治療用ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）を達成するためには、細胞が、十分な量のＣＡＲを細胞膜において発現させる必要があり、かつ抗原結合単位が、標的抗原に対する十分な親和性及び特異性を仲介する必要がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性を有するＣＡＲ－Ｔ細胞のうち、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍転移巣への遊走及び／又は固形腫瘍の敵対的腫瘍微小環境への浸潤に成功するのはごく一部であることが予想され得る。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで治療効果を発揮するためには、おそらくその活性を経時的に持続させる必要がある。したがって、ＣＡＲが免疫細胞の細胞膜において発現している場合にｉｎ ｖｉｖｏで固形腫瘍に対する治療効果をもたらし得る新規ＣＡＲを得ることは、些細ではなく、非常に望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
新規抗原結合単位を含む結合分子が、本明細書で提供される。前記抗原結合単位、及びそれを含む結合分子は、生理的条件下、ｐ９５ＨＥＲ２の超活性６１１－ＣＴＦアイソフォームを発現する細胞に特異的に結合することができる。ｐ９５ＨＥＲ２は、短縮型膜貫通受容体であるため、そのような抗原結合単位を得ることは些細ではない。本明細書の抗原結合単位は、生理的条件下で全長ＨＥＲ２への結合をほとんど示さないか、又はまったく示さない、かつ健常組織との交差反応性をほとんど示さないか、又はまったく示さない。新規抗原結合単位を含む抗体は、ｐ９５ＨＥＲ２に対して、およそ２ｎＭの親和性（ＫＤ）を示した。
【0006】
本明細書で実証されるように、抗原結合単位は、ＣＡＲへの実施に適切であり、かつそのフォーマットで、ｐ９５ＨＥＲ２に対する十分な親和性及び特異性を保持する。ＣＡＲは、Ｔ細胞内で十分に発現し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験によりその機能性が確証され、かつｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいてその治療効果が実証される。
【課題を解決するための手段】
【0007】
第１の態様では、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する、一緒になって抗原結合単位を形成するＶＬとＶＨとを含む、結合分子を提供し、ただし、ＶＬは、それぞれ、アミノ酸配列の配列番号１、２及び３を含む３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、つまりＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ＶＨは、それぞれ、アミノ酸配列の配列番号４、５及び６を含む３つのＣＤＲ、つまりＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【0008】
前記結合分子は、配列番号７に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むＶＨ、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むＶＬを含み得る。前記抗原結合単位はｓｃＦｖであり得る。
【0009】
第２の態様では、第１の態様による抗原結合単位を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲは、ヒトＣＤ８αヒンジを含み得る。
【0010】
ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へと、ヒトＣＤ８αヒンジ、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン、ヒト４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びヒトＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み得る。
【0011】
第３の態様では、第１の態様による結合分子又は第２の態様によるＣＡＲをコードする核酸を提供する。
【0012】
第４の態様では、第３の態様の核酸を含むベクターを提供する。
【0013】
第５の態様では、第２の態様によるＣＡＲを、その細胞膜において発現する細胞傷害性免疫細胞を提供する。
【0014】
第６の態様では、第１の態様による結合分子、第３の態様による核酸、第４の態様によるベクター、又は第５の態様による細胞傷害性免疫細胞、を含む医薬組成物を提供する。
【0015】
第７の態様では、第５の態様の細胞傷害性免疫細胞又は第６の態様の医薬組成物を投与するステップを含む、ヒト患者におけるがんの処置方法を提供する。
【0016】
第８の態様では、ヒト患者におけるがんの処置方法であって、（ａ）がん細胞を含む試料を患者から得るステップと、（ｂ）細胞を、検出に適切な部分をさらに含む第１の態様による結合分子とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることにより、がん細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現しているかどうかを分析するステップと、（ｃ）がん細胞がｐ９５ＨＥＲ２陽性である場合、承認済み化学療法を患者に投与するステップと、を含む方法を提供する。
【0017】
第９の態様では、がんの診断方法であって、（ａ）細胞を含む試料をヒト患者から得るステップと、（ｂ）細胞を、検出に適切な部分を含む第１の態様による結合分子とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることにより、細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現しているかどうかを分析するステップと、（ｃ）細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現している場合、患者をがんと診断するステップと、を含む方法を提供する。
【0018】
第１０の態様では、療法での使用向けの、第１の態様による結合分子、第２の態様によるＣＡＲ、第５の態様による細胞傷害性免疫細胞、又は第６の態様による医薬組成物を提供する。
【0019】
第１１の態様では、ｐ９５ＨＥＲ２を発現するがんの処置での使用向けの、第１の態様による結合分子、第２の態様によるＣＡＲ、第５の態様による細胞傷害性免疫細胞、又は第６の態様による医薬組成物を提供する。
【0020】
第１２の態様では、対象におけるがんの診断方法であって、（ａ）対象からの細胞の試料を、検出部分をさらに含む請求項１から４のいずれか一項に記載の結合分子と接触させるステップと、（ｂ）細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現しているかどうかを決定するステップと、（ｃ）細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現している場合、患者をがんと診断するステップと、を含む方法を提供する。したがって、第１２の態様の方法は、試料に対して行われるｅｘ ｖｉｖｏ方法である。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】図１は、ｐ９５ＨＥＲ２に対する抗体の反応性及び特異性の図である。１５種のＨＥＲ２＋／－細胞株のパネルに対するフローサイトメトリーを用いて、目的の抗体の反応性を試験した。抗体は、ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄ細胞株のみに結合し、全長ＨＥＲ２を発現する細胞株（ＨＥＲ２＋ ＳＫ－ＢＲ－３、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８及びＡ５４９）並びにＨＥＲ２－乳がん細胞株Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対しては反応性でなかった。この抗体は同じく、試験した他の悪性細胞株のいずれかに対しても反応性でなかった。
【図2】図２は、抗体結合親和性の図である。抗体の結合親和性を決定するために、ｐ９５ＨＥＲ２ペプチドをアナライトとして、０．６から２５００ｎＭまでの段階希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）で使用した。ＨＥＲ２細胞質ドメインに対する対照抗体（基準として）及び目的の抗体を、センサチップ上の２つの異なるフローセル表面に共有結合で固定化した。会合（ｋａ）速度は、ｐ９５ＨＥＲ２ペプチド濃度の上昇と共に上昇した。二分子相互作用モデル１：１は、目的の抗体に関し、最大結合レスポンス（Ｒｍａｘ）は１３７ＲＵと高い状態で低い平衡解離定数（ＫＤ＝２ ｎＭ）を示した。２つの独立した実験を行った。
【図3-1】図３は、エピトープマッピングの図である。（ａ）ｐ９５ＨＥＲ２細胞外ドメインに基づく連続重複合成ペプチド（三つ組）のマップ。連続したペプチドは１１ａａを共有する。（ｂ）シグナル強度に基づくと、目的の抗体は、全長ＨＥＲ２の３Ｄ構造において強調されているＭＰＩＷ（配列番号３３）（ｃ）を含有する唯一のペプチドであるペプチド１に対してだけ反応性であった。
【図3-2】（ｄ）Ｎ末端から短縮されているＣ末端伸長ｐ９５ＨＥＲ２ペプチド（ペプチド１～２０、各ペプチドは前のペプチドより１ａａ短い）、又はアラニンで２つのアミノ酸が置換されたペプチド（ペプチド２１～３９）のマップ。
【図3-3】（ｅ）短縮型ペプチドからのシグナル強度は、Ｗが軸であるＰＩＷが抗体結合に重要であることを示した。他方、置換は、ＫＦＰＤＥＥ（配列番号３４）も抗体結合に必要であることを明らかにした。連続重複ブロットには各ペプチドからの三つ組が含まれ、短縮化及び置換ブロットには各ペプチドからの二つ組が含まれる。
【図4】図４。（Ａ）は、ｐ９５ＨＥＲ２ ＣＡＲ構築物で形質導入されたＴ細胞の百分率を、非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）と比べて可視化する。（Ｂ）は、ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を実証する。ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞、対照ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞、及び非形質導入Ｔ細胞を、Ｔ４７Ｄ－ｐ９５ＨＥＲ２及びＴ４７Ｄ（ｐ９５ＨＥＲ２陰性）細胞と共培養した。ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔは、一晩で９０％超のＴ４７Ｄ－ｐ９５ＨＥＲ２標的細胞においてアポトーシスを誘導したが、Ｔ４７Ｄ細胞に対してはいかなる効果も有さなかった。同じく、Ｔ４７Ｄ－ｐ９５ＨＥＲ２又はＴ４７Ｄ細胞と共培養した、ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ又は非形質導入Ｔ細胞に関して、細胞傷害性は観察されなかった。ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔは、ｐ９５ＨＥＲ２ ＣＡＲと同じＣＡＲ骨格内にクローニングされたＣＤ１９特異的ｓｃＦｖを含み、ヒンジ、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインは同一である。
【図5】図５は、ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔのサイトカイン産生を可視化する。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔコンパートメントの両方とも、ｐ９５ＨＥＲ２を発現するＴ４７Ｄ細胞と共培養した場合、ｐ９５ＨＥＲ２陰性Ｔ４７Ｄ細胞と比べて著しく高いレベルのＴＮＦα及びＩＦＮγを発現した。非形質導入Ｔ細胞は、ｐ９５ＨＥＲ２陽性Ｔ４７Ｄ又はｐ９５ＨＥＲ２陰性Ｔ４７Ｄのいずれかと共培養した場合、いかなるサイトカインも発現しなかった。
【図6】図６は、ｉｎ ｖｉｖｏでのｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍効果を可視化する。整形外科的ｐ９５ＨＥＲ２乳がん担持ＮＳＧマウスモデルにおける腫瘍増殖に対する、ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ及びＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔの腫瘍制御を、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光イメージングにより評価した。ＣＡＲ－Ｔを、２回（腫瘍移植から２週間及び５週間後、矢印で表示）、各時点において５００万細胞、静脈内注射した。ｐ９５ＨＥＲ－ＣＡＲ－Ｔは、最初の注射からわずか２週間後に著しい腫瘍制御を示し、最初の注射から５週間後にはｐ９５ＨＥＲ＋腫瘍を完全に根絶した。ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔは、ｐ９５ＨＥＲ＋の腫瘍進行にいかなる効果も示さなかった。ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ群と腫瘍のみの群との間で、腫瘍増殖に差異はなかった。データは、３つの独立したレプリケート（ｎ＝１０）のうちの代表的実験の±ＳＥＭとして報告されている。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本明細書の新規抗原結合単位を含む結合分子は一般的に、１つ若しくは複数のタンパク質（すなわち、ポリペプチド鎖）を含む又はからなり、かつ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、免疫毒素、免疫複合体、二重特異性抗体、ＣＡＲ等を含む、いずれかの適切なフォーマットを有し得る。したがって、一実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、抗体又はその断片（すなわち、抗原結合断片）である。抗体の抗原結合断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘及びＦ（ａｂ）‘2 部分が含まれる。他の実施形態では、結合分子はｓｃＦｖである。さらに他の実施形態では、結合分子はＣＡＲである。
【0023】
本明細書で提供される結合分子は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列ＰＩＷＫＦＰＤＥＥを含むｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合する。以下にさらに詳述するように、配列番号１７は、本明細書で提供される結合分子により認識されるエピトープである。
【0024】
そのような結合分子、特に、可溶性結合分子、例えば、抗体、抗体の抗原結合断片、及びｓｃＦｖなどは、がん細胞を標的にするために、その「ネイキッド」形態（すなわち、第２の薬剤にコンジュゲートしていない）で使用され得る。あるいは、そのような結合分子は、毒性ペイロード、例えば細胞毒素（サポリン若しくはゲロニンなど）、又は放射性同位体、例えば、177Ｌｕ、224Ｒａ若しくは225Ａｃなどを含む部分を担持し得る（例えばそれにコンジュゲートされ得る）。毒性ペイロードにコンジュゲートした結合分子は、免疫毒素と呼ばれ得る。
【0025】
さらに、新規抗原結合単位は、例えば、ネイキッド抗体、又は蛍光若しくは放射性部分のような検出可能標識を含む結合分子の形態で、診断剤として使用され得る。検出可能標識は、検出部分、又は検出に適切な部分と呼ばれ得る。
【0026】
重鎖可変領域（ＶＨ）（配列番号７）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）（配列番号８）を含む抗体に関し、最大結合レスポンス（Ｒｍａｘ）は１３７ＲＵと高い状態で、低い平衡解離定数（ＫＤ＝２ｎＭ）が測定された。本明細書の抗原結合単位の標的エピトープは、配列ＰＩＷＫＦＰＤＥＥ（配列番号１７）であると思われる。前記エピトープは、６１１－ＨＥＲ２－ＣＴＦ（配列番号２０）と呼ばれるｐ９５ＨＥＲ２アイソフォーム中に位置する。
ＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＬＴＳＩＩＳＡＶＶＧＩＬＬＶＶＶＬＧＶＶＦＧＩＬＩＫＲＲＱＱＫＩＲＫＹＴＭＲＲＬＬＱＥＴＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＡＭＰＮＱＡＱＭＲＩＬＫＥＴＥＬＲＫＶＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫＩＰＶＡＩＫＶＬＲＥＮＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＶＴＱＬＭＰＹＧＣＬＬＤＨＶＲＥＮＲＧＲＬＧＳＱＤＬＬＮＷＣＭＱＩＡＫＧＭＳＹＬＥＤＶＲＬＶＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＶＫＳＰＮＨＶＫＩＴＤＦＧＬＡＲＬＬＤＩＤＥＴＥＹＨＡＤＧＧＫＶＰＩＫＷＭＡＬＥＳＩＬＲＲＲＦＴＨＱＳＤＶＷＳＹＧＶＴＶＷＥＬＭＴＦＧＡＫＰＹＤＧＩＰＡＲＥＩＰＤＬＬＥＫＧＥＲＬＰＱＰＰＩＣＴＩＤＶＹＭＩＭＶＫＣＷＭＩＤＳＥＣＲＰＲＦＲＥＬＶＳＥＦＳＲＭＡＲＤＰＱＲＦＶＶＩＱＮＥＤＬＧＰＡＳＰＬＤＳＴＦＹＲＳＬＬＥＤＤＤＭＧＤＬＶＤＡＥＥＹＬＶＰＱＱＧＦＦＣＰＤＰＡＰＧＡＧＧＭＶＨＨＲＨＲＳＳＳＴＲＳＧＧＧＤＬＴＬＧＬＥＰＳＥＥＥＡＰＲＳＰＬＡＰＳＥＧＡＧＳＤＶＦＤＧＤＬＧＭＧＡＡＫＧＬＱＳＬＰＴＨＤＰＳＰＬＱＲＹＳＥＤＰＴＶＰＬＰＳＥＴＤＧＹＶＡＰＬＴＣＳＰＱＰＥＹＶＮＱＰＤＶＲＰＱＰＰＳＰＲＥＧＰＬＰＡＡＲＰＡＧＡＴＬＥＲＰＫＴＬＳＰＧＫＮＧＶＶＫＤＶＦＡＦＧＧＡＶＥＮＰＥＹＬＴＰＱＧＧＡＡＰＱＰＨＰＰＰＡＦＳＰＡＦＤＮＬＹＹＷＤＱＤＰＰＥＲＧＡＰＰＳＴＦＫＧＴＰＴＡＥＮＰＥＹＬＧＬＤＶＰＶ（配列番号２０）
ＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＬＴＳＩＩＳＡＶＶＧＩＬＬＶＶＶＬＧＶＶＦＧＩＬＩＫＲＲＱＱＫＩＲＫＹＴＭＲＲＬＬＱＥＴＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＡＭＰＮＱＡＱＭＲＩＬＫＥＴＥＬＲＫＶＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫＩＰＶＡＩＫＶＬＲＥＮＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＶＴＱＬＭＰＹＧＣＬＬＤＨＶＲＥＮＲＧＲＬＧＳＱＤＬＬＮＷＣＭＱＩＡＫＧＭＳＹＬＥＤＶＲＬＶＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＶＫＳＰＮＨＶＫＩＴＤＦＧＬＡＲＬＬＤＩＤＥＴＥＹＨＡＤＧＧＫＶＰＩＫＷＭＡＬＥＳＩＬＲＲＲＦＴＨＱＳＤＶＷＳＹＧＶＴＶＷＥＬＭＴＦＧＡＫＰＹＤＧＩＰＡＲＥＩＰＤＬＬＥＫＧＥＲＬＰＱＰＰＩＣＴＩＤＶＹＭＩＭＶＫＣＷＭＩＤＳＥＣＲＰＲＦＲＥＬＶＳＥＦＳＲＭＡＲＤＰＱＲＦＶＶＩＱＮＥＤＬＧＰＡＳＰＬＤＳＴＦＹＲＳＬＬＥＤＤＤＭＧＤＬＶＤＡＥＥＹＬＶＰＱＱＧＦＦＣＰＤＰＡＰＧＡＧＧＭＶＨＨＲＨＲＳＳＳＴＲＳＧＧＧＤＬＴＬＧＬＥＰＳＥＥＥＡＰＲＳＰＬＡＰＳＥＧＡＧＳＤＶＦＤＧＤＬＧＭＧＡＡＫＧＬＱＳＬＰＴＨＤＰＳＰＬＱＲＹＳＥＤＰＴＶＰＬＰＳＥＴＤＧＹＶＡＰＬＴＣＳＰＱＰＥＹＶＮＱＰＤＶＲＰＱＰＰＳＰＲＥＧＰＬＰＡＡＲＰＡＧＡＴＬＥＲＰＫＴＬＳＰＧＫＮＧＶＶＫＤＶＦＡＦＧＧＡＶＥＮＰＥＹＬＴＰＱＧＧＡＡＰＱＰＨＰＰＰＡＦＳＰＡＦＤＮＬＹＹＷＤＱＤＰＰＥＲＧＡＰＰＳＴＦＫＧＴＰＴＡＥＮＰＥＹＬＧＬＤＶＰＶ（配列番号２０）
【0027】
したがって、生理的条件下、配列ＰＩＷＫＦＰＤＥＥ（配列番号１７）に特異的に結合できる抗原結合単位を提供する。一実施形態では、本明細書で提供される抗原結合単位を含む結合分子、例えば抗体は、少なくとも２ｎＭのＫＤを有する。
【0028】
本明細書で使用する「抗原結合単位」とは、生理的条件下、細胞外標的エピトープに結合することができる、１つ若しくは複数のタンパク質若しくはその一部を含む又はからなる部分である。本明細書の抗原結合単位は、腫瘍環境における生理的条件下、細胞外標的エピトープに結合することができ得る。本明細書の抗原結合単位は、生理的条件下、がん細胞上で発現するｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合することができる。すなわち、本明細書の抗原結合単位は、生理的条件下、全長ＨＥＲ２への結合をほとんど示さないか、又はまったく示さない。さらに、本明細書の抗原結合単位は、健常組織との交差反応性をほとんど示さないか、又はまったく示さない。
【0029】
特に、本明細書の抗原結合単位は、全長ＨＥＲ２ではマスクされているが、６１１－ＣＴＦでは露出しているエピトープに結合し得る。それが、超活性ｐ９５ＨＥＲ２アイソフォームに対して非常に特異的にさせる。特に、６１１－ＣＴＦは、悪性腫瘍の転移及び発生に関与する遺伝子の発現を広範囲に誘導する、ｐ９５ＨＥＲの唯一の公知のアイソフォームである。
【0030】
したがって、本明細書で提供される抗原結合単位を含む結合分子は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むｐ９５ＨＥＲ２に特異的に結合するため、配列番号１７のエピトープを含むｐ９５ＨＥＲ２アイソフォーム（ｐ９５ＨＥＲ２－６１１－ＣＴＦなど）を発現するがん細胞を結合（又は標的に）し得る。特に、そのような抗原結合単位を含む、本明細書で提供されるＣＡＲは、そのようながん細胞を破壊するために、それらのがん細胞に対するＣＡＲを発現する細胞傷害性細胞を対象にし得る。
【0031】
本明細書で提供される抗原結合単位は、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。このような可変ドメインは、当業者には周知である。ＶＬ及びＶＨを含む抗体の抗原結合単位は、Ｆｖと呼ばれる。本明細書で定義される抗原結合単位は、ＶＬ配列及びＶＨ配列の両方ともを含む単一ポリペプチド鎖を含み得るか（例えば、ｓｃＦｖの場合）、又はＶＬ及びＶＨが、別個のポリペプチド鎖上で準備され得る（Ｆｖの場合）。
【0032】
本明細書の各ＶＬ及びＶＨは、フレームワーク配列が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。フレームワーク配列は、ヒト配列、ヒト化配列、又はマウス配列であり得る。この６つのＣＤＲは、以下の配列：
ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号１）： ＫＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＮＬＡ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号２）： ＹＡＳＴＲＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号３）： ＬＱＨＹＳＳＰＹＴ
ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号４）： ＤＹＦＭＮ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５）： ＱＩＲＮＫＮＹＮＹＡＴＹＦＡＥＳＬＥＧ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号６）： ＬＲＹＤＹ
を含む又はからなる。
ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号１）： ＫＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＮＬＡ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号２）： ＹＡＳＴＲＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号３）： ＬＱＨＹＳＳＰＹＴ
ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号４）： ＤＹＦＭＮ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５）： ＱＩＲＮＫＮＹＮＹＡＴＹＦＡＥＳＬＥＧ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号６）： ＬＲＹＤＹ
を含む又はからなる。
【0033】
前記で指定したＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔシステムを用いて決定した。
【0034】
Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ１配列はＣＤＲ１に対するＮ末端であり、Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ２配列はＣＤＲ１とＣＤＲ２との間に位置し、Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ３配列はＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する。
【0035】
したがって、ＶＬ及びＶＨの両方とも、およそ次のように可視化され得て、ＣＤＲは枠で囲み、Ｎ末端はＮ－と示してある。
【化1】
【0036】
一実施形態では、抗原結合単位は、３つのＣＤＲが枠で囲まれた以下の配列（配列番号７）：
を含む又はからなるマウスＶＨを含む。
【化2】
【0037】
他の実施形態では、抗原結合単位は、配列番号７と少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有する配列を含む又はからなるＶＨを含む。
【0038】
一実施形態では、抗原結合単位は、３つのＣＤＲが枠で囲まれた以下の配列（配列番号８）：
を含む又はからなるマウスＶＬを含む。
【化3】
【0039】
他の実施形態では、抗原結合単位は、配列番号８と少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有する配列を含む又はからなるＶＬを含む。
【0040】
ＶＨ及びＶＬは、ジスルフィド架橋又はペプチドリンカーにより連結され得る。あるいは、２本の鎖は、抗体のＦａｂ断片（又は抗体の他のいずれかの抗原結合断片）、又は抗体それ自体の内部に位置し得る。一実施形態では、抗原結合単位は、ＶＬ－リンカー－ＶＨ（Ｎ末端からＣ末端へと）を含む又はからなる。他の実施形態では、抗原結合単位は、ＶＨ－リンカー－ＶＬ（Ｎ－末端からＣ－末端へと）を含む又はからなる。このような抗原結合単位は、しばしば一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）と呼ばれる。ＶＨとＶＬとが機能的な抗原結合単位を形成できるようにするためには、リンカーは、一定の長さを有する必要がある。一実施形態では、リンカーは、１０～３０アミノ酸残基を含む。一実施形態では、リンカーは、１５～２５アミノ酸残基、特に、グリシン及び／又はセリン残基を含む。
【0041】
特定の一実施形態では、リンカーは、Ｇ4Ｓリンカー、すなわち、配列ＧＧＧＧＳ（配列番号２１）を有する反復単位を含むペプチドリンカーである。例えば、リンカーは、（Ｇ4Ｓ）3（配列番号２２）、（Ｇ4Ｓ）4（配列番号２３）又は（Ｇ4Ｓ）5（配列番号２４）リンカー（すなわち、それぞれ、３、４又は５個の隣接する反復Ｇ4Ｓ単位を含むリンカー）であり得る。
【0042】
あるいは、リンカーは、１つ又は複数のＧ4Ｓ単位における１つ又は複数のアミノ酸置換（場合により、以下に定義する保存的アミノ酸置換）を含む修飾Ｇ4Ｓリンカーであり得る（好ましくは、１つ又は複数のＧ4Ｓ単位における最高１つまでのアミノ酸置換）。特に、修飾Ｇ4Ｓ単位は、１つ又は複数の、グリシンに代わるアラニンの置換を含み得る。以下に示す、適切なリンカーの一例は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有し、これは１つのグリシン残基がアラニンに置換された修飾（Ｇ4Ｓ）4リンカーである。
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８）
【0043】
抗原結合単位において、フレームワーク配列は、標的抗原に対する特異性及び親和性を破壊することなしに変化を許容し得る。例えば、アミノ酸残基の置換は、アミノ酸残基の欠失や付加よりも良好に許容され得る。マウスフレームワーク配列を、好ましくは同様の長さのヒトフレームワーク配列に置き換えることは、ヒト化として公知である。
【0044】
本明細書で使用する「保存的アミノ酸置換」という用語は、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換されているアミノ酸置換を指す。
【0045】
類似の側鎖を有するアミノ酸は、類似の特性を有する傾向があるため、ポリペプチドの構造又は機能にとって重要なアミノ酸の保存的置換は、ポリペプチドの構造／機能への影響が、同じ位置での非保存的アミノ酸置換よりも少ないと予想され得る。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、保存的アミノ酸置換とは、特定のアミノ酸残基が、同じファミリーの異なるアミノ酸残基に置換されている置換であると見なされ得る。特に、参照配列に対する保存的アミノ酸置換を含む生成物が、この用語により網羅される。
【0046】
一実施形態では、本明細書の各ＶＬ及びＶＨは、ヒトフレームワーク配列が隣接する３つのＣＤＲを含む。ヒトフレームワーク配列は、構造的に保存された領域であり、通常、生理的条件下で標的抗原に特異的に結合するためにＣＤＲを精巧に配置するβシート構造を形成する傾向がある。多くのヒトフレームワーク配列は、公知のヒト抗体、及び国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（免疫遺伝学）情報システム（ＩＭＧＴ）オンラインデータベース（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６、第３４巻、データベース特集号Ｄ７８１～Ｄ７８４を参照）から入手可能であるが、この用語は、アミノ酸置換を含むヒトフレームワーク配列も網羅する。ヒトフレームワーク配列の各々は、場合により、天然配列に対して０～５個のアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸置換とは、特定位置でのアミノ酸残基が、対応する位置において、異なるアミノ酸残基に置換されている配列であり、配列をアライメントすると明らかになる。ヒトフレームワーク配列の各々は、場合により、１つのアミノ酸置換を含み得る。ヒトフレームワーク配列の各々は、場合により、２つ又は最高２つまでのアミノ酸置換を含み得る。ヒトフレームワーク配列の各々は、場合により、３つ又は最高３つまでのアミノ酸置換を含み得る。ヒトフレームワーク配列の各々は、場合により、４つ又は最高４つまでのアミノ酸置換を含み得る。ヒトフレームワーク配列の各々は、場合により、５つ又は最高５つまでのアミノ酸置換を含み得る。置換は、保存的置換であり得る。たとえそのようなフレームワーク配列が、必ずしもヒト抗体から既知でなくても、マウスフレームワーク配列と比べて低い免疫原性リスクをもたらし得る。一実施形態では、ヒトフレームワーク配列中の０～５個のアミノ酸残基が、配列番号７及び８に見出されるマウス親配列からの対応するアミノ酸残基で置換される。
【0047】
一括して、マウス抗体由来のＣＤＲ及びヒトフレームワーク配列を含む、その各々は、場合により０～５個の置換を含み得るｓｃＦｖをヒト化ｓｃＦｖと呼ぶ。一部の実施形態では、置換のいくつかは、親マウスアミノ酸残基に戻ったものであり得る（「復帰変異」としても知られる）。
【0048】
一実施形態では、ヒトフレームワーク配列は、公知のヒト抗体から入手可能な成熟ヒトフレームワーク配列である。理論に拘束されることなく、そのようなフレームワーク配列は、抗原結合単位に対する不要な免疫原性応答を誘発するきわめて低いリスクを仲介し、同時に細胞系で良好に発現する安定な結合単位を得る可能性を高めることができる。
【0049】
概して、ヒト化ＶＨ及びＶＬ配列では、ＣＤＲは変更されず、親ＶＨ及びＶＬ配列と同様に保持される。しかしながら、当技術分野では公知のように、ＣＤＲ配列を決定するための異なるプログラム又はスキームが利用可能であり、それらは、すべての場合にまさに完全に一致した結果を与えるわけではないこともある。したがって、異なるＣＤＲ同定スキームは、異なるＣＤＲ配列をもたらし得る。例えば、ＶＨ配列又はＶＬ配列において、ＣＤＲ配列が短い若しくは長くあり得るか、又は位置がわずかに異なり得る（例えば、第２のスキームでは、ＣＤＲ配列は、第１のスキームに対して部分的に上流又は下流に移動し得る）。ヒト化は、同定されたＣＤＲの異なるバージョンを使用するＣＤＲ移植アルゴリズムを用いて行われ、それらのＣＤＲを、元のフレームワークから、選択されたヒト配列上へと移植することができる。したがって、ヒト化配列は、ＣＤＲ同定スキーム、例えばＫａｂａｔスキーム、ＩＭＧＴスキーム、及びＣｈｏｔｈｉａスキームのいずれかに従って同定されたＣＤＲを含有し得る。ＩＭＧＴ及びＣｈｏｔｈｉａのスキームにより決定された、対応するＣＤＲ配列は、下の表２に提示されている。したがって、ヒト化ＶＨ及びＶＬ配列、並びにそれらを含む抗原結合単位及び結合分子が本明細書に含まれ、それらは、前記又は下の表２に提示されるＣＤＲ配列を含む。すなわち、本明細書のＶＨ配列又はＶＬ配列は、本明細書で提示するＶＨ ＣＤＲ１～３又はＶＬ ＣＤＲ１～３のセットのいずれかを含み得る。
【0050】
ヒト化ＶＨの４つの異なるバリアントの例を配列番号７２～７５に記載する。
【0051】
ｈｕ－ＶＨ１（配列番号７２）
ＥＶＱＩＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＴＳＧＦＮＦＮＤＹＦＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＱＩＲＮＫＮＹＮＹＡＴＹＦＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＳＶＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＥＬＲＹＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＥＶＱＩＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＴＳＧＦＮＦＮＤＹＦＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＱＩＲＮＫＮＹＮＹＡＴＹＦＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＳＶＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＥＬＲＹＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
【0052】
ｈｕ－ＶＨ２（配列番号７３）
ＥＶＱＩＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＴＳＧＦＮＦＮＤＹＦＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＱＩＲＮＫＮＹＮＹＡＴＹＦＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＥＬＲＹＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＥＶＱＩＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＴＳＧＦＮＦＮＤＹＦＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＱＩＲＮＫＮＹＮＹＡＴＹＦＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＥＬＲＹＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
【0053】
ｈｕ－ＶＨ３（配列番号７４）
ＱＶＱＩＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＴＳＧＦＮＦＮＤＹＦＭＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＡＱＩＲＮＫＮＹＮＹＡＴＹＦＡＥＳＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＳＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＴＥＬＲＹＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＱＶＱＩＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＴＳＧＦＮＦＮＤＹＦＭＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＡＱＩＲＮＫＮＹＮＹＡＴＹＦＡＥＳＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＳＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＴＥＬＲＹＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
【0054】
ｈｕ－ＶＨ４（配列番号７５）
ＱＶＱＩＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＴＳＧＦＮＦＮＤＹＦＭＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＡＱＩＲＮＫＮＹＮＹＡＴＹＦＡＥＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＤＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＴＥＬＲＹＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＱＶＱＩＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＴＳＧＦＮＦＮＤＹＦＭＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＡＱＩＲＮＫＮＹＮＹＡＴＹＦＡＥＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＤＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＴＥＬＲＹＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
【0055】
ヒト化ＶＬの４つの異なるバリアントの例を配列番号７６～７９に記載する。
【0056】
ｈｕ－ＶＬ１（配列番号７６）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＹＡＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＤＹＹＣＬＱＨＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＹＡＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＤＹＹＣＬＱＨＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【0057】
ｈｕ－ＶＬ２（配列番号７７）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＹＡＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＬＱＨＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＹＡＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＬＱＨＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【0058】
ｈｕ－ＶＬ３（配列番号７８）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＮＬＡＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＹＡＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＤＹＹＣＬＱＨＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＮＬＡＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＹＡＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＤＹＹＣＬＱＨＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【0059】
ｈｕ－ＶＬ４（配列番号７９）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＮＬＡＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＹＡＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＬＱＨＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＮＬＡＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＹＡＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＬＱＨＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【0060】
前記のヒト化ＶＨ及びＶＬ配列では、ＣＤＲは、下の表２に提示するＩＭＧＴスキームにより決定されるとおりである。
【0061】
一実施形態では、抗原結合単位は、以下の、ヒト化ＶＨ及びＶＬ配列の組合せを含む。
【0062】
【表1】
【0063】
より一般的に、特定の態様では、表１に提示する、ヒト化ＶＨ及びＶＬ配列の組合せを含む、抗原結合単位、特に、抗原結合単位を含む結合分子、が同じく本明細書で提供される。
【0064】
一実施形態では、抗原結合単位は、以下の配列（配列番号９、ＣＤＲは枠で囲み、リンカーは斜字体）を含む若しくはからなるｓｃＦｖである又は含む。
【0065】
【化4】
【0066】
他の実施形態では、抗原結合単位は、配列番号９に記載のアミノ酸配列、若しくはそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む若しくはからなるｓｃＦｖである又は含む。
【0067】
一実施形態では、抗原結合単位は、以下の配列（配列番号１０、ＣＤＲは枠で囲み、リンカーは斜字体）を含む若しくはからなるｓｃＦｖである又は含む。
【0068】
【化5】
【0069】
他の実施形態では、抗原結合単位は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、若しくはそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む若しくはからなるｓｃＦｖである又は含む。
【0070】
明らかなように、配列番号９は、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号７のＶＨ、配列番号１８のリンカー、及び配列番号８のＶＬを含み、配列番号１０は、Ｎ末端からＣ末端へと、配列番号８のＶＬ、配列番号１８のリンカー、及び配列番号７のＶＨを含む。
【0071】
新規キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。本明細書のＣＡＲが免疫細胞の表面上で発現する場合、そのような免疫細胞は、医学で使用され得る。特に、前記免疫細胞は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むｐ９５ＨＥＲ２を発現する固形腫瘍の処置に使用され得る。一実施形態では、前記免疫細胞は、ｐ９５ＨＥＲ２陽性乳がん、ｐ９５ＨＥＲ２陽性グリオーマ、又は他のｐ９５ＨＥＲ２陽性がんの処置に使用される。
【0072】
本明細書で使用するＣＡＲは、細胞外抗原結合単位、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む人工受容体である。ＣＡＲにおける抗原結合単位は、通常、ｓｃＦｖである。
【0073】
抗原結合単位は、膜貫通ドメインに直接に付着した状態であり得る。しかしながら、ＣＡＲは、抗原結合単位を膜貫通ドメインと連結するヒンジドメインを含み得る。したがって、ヒンジドメインは、抗原結合単位の立体配座に影響を及ぼし得る。その結果、それがＣＡＲの、標的エピトープへの結合に続いて免疫細胞内へのシグナル伝達を誘発する能力に影響を及ぼし得る。標的エピトープが、標的細胞の細胞膜から離れすぎている場合、又は標的エピトープが、他のやり方で隠れている場合、ＣＡＲを発現する免疫細胞は効率的でない可能性がある。したがって、標的エピトープが、ＣＡＲを発現する免疫細胞にとって十分に接近しやすいことが好ましい。
【0074】
膜貫通ドメインは、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインと連結する。抗原結合単位及びヒンジドメインの両方とも細胞外ドメインである。すなわち、免疫細胞の細胞膜において発現している場合、一般的に細胞外環境に面している。本明細書で使用する「膜貫通ドメイン」とは、免疫エフェクタ細胞により発現される場合、細胞膜に埋め込まれる傾向がある、ＣＡＲの部分を意味する。適切な膜貫通ドメインは、当業者には周知である。特に、ヒトタンパク質ＣＤ８α、ＣＤ２８又はＩＣＯＳに由来する膜貫通ドメインが使用され得る。膜貫通ドメインは、抗原結合単位による標的の結合時に、免疫細胞内へとシグナルを伝えると見られている。
【0075】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、ＣＡＲが細胞膜において発現している場合、免疫細胞内側に位置する、ＣＡＲの一部を指す。これらのドメインは、標的の結合時にシグナルの伝達に関与する。様々なシグナル伝達ドメインが公知であり、免疫細胞での内因性シグナル伝達機構に合わせるために、それらを組み合わせて適合させることができる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトタンパク質ＣＤ３ζ、ＦｃＲ－γ、ＣＤ３ε等から得られるシグナル伝達ドメインのような「シグナル１」ドメインを含む。一般的に、「シグナル１」ドメイン（例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）は、抗原結合時にシグナルを伝達すると見られている。
【0076】
他の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはさらに共刺激ドメインを含む。そのようなドメインは周知であり、しばしば「シグナル２」ドメインと呼ばれ、「シグナル１」ドメインに続いて、共刺激分子を介してシグナルを伝達すると見られている。「シグナル２」は、シグナルの維持、及び細胞の生存にとって重要である。第一世代ＣＡＲにおけるように不在であると、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、殺滅及び早期サイトカイン放出の点では効率的であり得るが、頻繁には経時的に疲弊していく。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインは一般的に、「シグナル１」及び「シグナル２」ドメインの両方ともを含む。そのような一般的に使用されるヒト「シグナル２」ドメインの例には、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、及びＩＣＯＳシグナル伝達ドメインが含まれる。
【0077】
本開示におけるＣＡＲは、前記の抗原結合単位のいずれかを含み得る。例えば、本開示におけるＣＡＲは、配列番号９若しくは配列番号１０に記載のアミノ酸配列、若しくはそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有する配列を含む又はからなるｓｃＦｖを含み得る。
【0078】
特に、本開示におけるＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジに連結されたｓｃＦｖ（例えば、配列番号９又は配列番号１０のｓｃＦｖ）の形態で、前記の抗原結合単位のいずれかを含み得る。ＣＤ８αヒンジは一般的に、配列番号１１のヒトＣＤ８αヒンジ、又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するそのバリアントである。
【0079】
ＳＤＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦ（配列番号１１）
【0080】
特に、本開示におけるＣＡＲは、前記で定義したｓｃＦｖ（例えば、配列番号９又は配列番号１０のｓｃＦｖ）、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは一般的に、配列番号１４のヒトＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するそのバリアントである。
【0081】
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１４）
【0082】
特定の一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに加えて、前記で提示したようないずれかのドメインであり得る共刺激ドメインをさらに含むが、特定の一実施形態では、４１ＢＢ共刺激ドメインである。４１ＢＢ共刺激ドメインは一般的に、配列番号１３のヒト４１ＢＢ共刺激ドメイン、又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するそのバリアントである。
【0083】
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１３）
【0084】
本明細書で提供されるＣＡＲは、特に、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、特に、配列番号１２のヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン、又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【0085】
ＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１２）
【0086】
特定の一実施形態では、ＣＡＲは、前記のＣＤ８αヒンジ、及びＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。
【0087】
特に、本開示におけるＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジ（配列番号１１）に連結された、配列番号９又は配列番号１０のｓｃＦｖを含み得て、ただし、ＣＡＲは、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号１２）をさらに含み、かつ細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号１３）及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（配列番号１４）を含む又はからなる。そのようなＣＡＲは、配列番号１５：
に記載のアミノ酸配列を有する。
【化6】
【0088】
特定の一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、若しくはそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有する配列を含む又はからなる。
【0089】
配列同一性は、いずれかの便利な方法により評価され得る。しかしながら、配列間の配列同一性の程度を決定するためには、配列のペアワイズアライメント又はマルチプルアライメントを行うコンピュータプログラムが有用であり、例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ又はＥＭＢＯＳＳ ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ（両方ともＲｉｃｅ，Ｐ．ほか、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１６、（６）２７６～２７７頁、２０００）がペアワイズ配列アライメントに使用され得て、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ Ｆほか、Ｍｏｌ． Ｓｙｓｔ． Ｂｉｏｌ．７：５３９頁、２０１１）又はＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（５）：１７９２～１７９７頁、２００４）が多重配列アライメントに使用され得る。ただし、他の適切なプログラムを使用してもよい。他の適切なアライメントプログラムはＢＬＡＳＴで、タンパク質アライメントにはｂｌａｓｔｐアルゴリズムを、核酸アライメントにはｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用する。ペアワイズアライメントであろうとマルチプルアライメントであろうと、ローカルではなくグローバルに（すなわち参照配列の全体にわたって）行うべきである。
【0090】
配列アライメント、及び同一性％の計算は、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ標準パラメータ、つまり、Ｇｏｎｎｅｔ行列、ギャップオープニングペナルティ６、ギャップ伸長ペナルティ１を用いて決定され得る。あるいは、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ標準パラメータ、つまり、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５が使用され得る。あるいは、他のいずれかの適切なパラメータが使用され得る。
【0091】
本明細書のＣＡＲを発現する免疫細胞は、白血球除去又は他の適切な方法により、患者又は適合ドナーから単離され得る。そのような初代細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はマクロファージであり得る。特に、自家Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、又はそれらの混合物の両方）に、ＣＡＲをコードする核酸を形質導入又はトランスフェクトしてから、それらの細胞を含む医薬組成物を患者に投与して戻すことができる。ＣＡＲを発現する免疫細胞は、ＮＫ－９２細胞のような、臨床用に適切な細胞株でもあり得る。一般的に、ＣＡＲを発現する免疫細胞は（初代細胞であろうと細胞株であろうと）、Ｔ細胞（特に細胞傷害性Ｔ細胞）又はＮＫ細胞である。当然のことながら、対象となる患者がヒトである場合、好ましい細胞はヒトである。
【0092】
本明細書の医薬組成物は、患者への治療用細胞の投与に適切な組成物であり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞の最も一般的な投与経路は、静脈内投与である。したがって、前記医薬組成物は、例えば、中性ｐＨの無菌水溶液であり得る。例えば、患者の末梢血単核細胞は、標準的な白血球除去法で得られ得る。単核細胞は、ＣＡＲをコードする、レンチウイルスベクター又はｍＲＮＡで形質導入又はトランスフェクトする前に、Ｔ細胞に関して濃縮してもよい。次いで、前記細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コーティングビーズで活性化され得る。形質導入／トランスフェクトされたＴ細胞は、細胞培養中で増加させ、洗浄して、凍結保存可能である無菌懸濁液へと製剤化することができる。その場合、製品は、投与前に解凍される。
【0093】
腫瘍が限局性である場合、効果を改善するために、異なる投与方法を用いてもよい。例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の全身投与ではなく、局所投与が、効果を高め得る。
【0094】
医薬組成物は、本明細書の免疫細胞の薬学上有効用量を含み得る。薬学上有効用量は、例えば、ＣＡＲを発現する免疫細胞１×１０6～１×１０10個の範囲であり得る。薬学上有効用量は、例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞１×１０7～１×１０9個の範囲であり得る。薬学上有効用量は、例えば、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞１×１０7～１×１０9個の範囲であり得る。
【0095】
請求されるＣＡＲを、免疫細胞内で効率的に発現させるために、細胞膜での配置を促進する従来のリーダーペプチドが、Ｎ末端に導入され得る。適切なリーダーペプチドの一例は、ＭＥＳＱＴＱＡＬＩＳＬＬＬＷＶＹＧＴＹＧ（配列番号１６）である。リーダーペプチドは、切り取られると思われ、細胞膜における機能的ＣＡＲ中にはおそらく存在しない。
【0096】
したがって、第二世代ＣＡＲの発現には、以下をコードする核酸が使用され得る。
Ｎ－ＬＥＡＤＥＲ ＰＥＰＴＩＤＥ－ＶＨ－ＬＩＮＫＥＲ－ＶＬ－ＨＩＮＧＥ－ＴＲＡＮＳＭＥＭＢＲＡＮＥ ＤＯＭＡＩＮ－ＣＯＳＴＩＭＵＬＡＴＯＲＹ ＤＯＭＡＩＮ－ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＤＯＭＡＩＮ．
したがって、第二世代ＣＡＲの発現には、以下をコードする核酸も使用され得る。
Ｎ－ＬＥＡＤＥＲ ＰＥＰＴＩＤＥ－ＶＬ－ＬＩＮＫＥＲ－ＶＨ－ＨＩＮＧＥ－ＴＲＡＮＳＭＥＭＢＲＡＮＥ ＤＯＭＡＩＮ－ＣＯＳＴＩＭＵＬＡＴＯＲＹ ＤＯＭＡＩＮ－ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＤＯＭＡＩＮ
Ｎ－ＬＥＡＤＥＲ ＰＥＰＴＩＤＥ－ＶＨ－ＬＩＮＫＥＲ－ＶＬ－ＨＩＮＧＥ－ＴＲＡＮＳＭＥＭＢＲＡＮＥ ＤＯＭＡＩＮ－ＣＯＳＴＩＭＵＬＡＴＯＲＹ ＤＯＭＡＩＮ－ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＤＯＭＡＩＮ．
したがって、第二世代ＣＡＲの発現には、以下をコードする核酸も使用され得る。
Ｎ－ＬＥＡＤＥＲ ＰＥＰＴＩＤＥ－ＶＬ－ＬＩＮＫＥＲ－ＶＨ－ＨＩＮＧＥ－ＴＲＡＮＳＭＥＭＢＲＡＮＥ ＤＯＭＡＩＮ－ＣＯＳＴＩＭＵＬＡＴＯＲＹ ＤＯＭＡＩＮ－ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＤＯＭＡＩＮ
【0097】
請求されるＣＡＲをコードする核酸は、ｍＲＮＡなどの周知のＲＮＡ、又はＤＮＡ発現ベクターの形態であり得る。
【0098】
あるいは、本明細書で提供される医薬組成物は、本明細書で提供される結合分子（例えば抗体）の患者への投与に適切な組成物であり得る。そのような組成物は一般的に、当技術分野で公知の１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤等を含む。本明細書で提供される結合分子（抗体など）、又はそのような結合分子を含む医薬組成物は、医学／療法において、特に、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むｐ９５ＨＥＲ２を発現するがんを処置するために使用され得る。結合分子又は医薬組成物は、特に、固形がん、例えば、乳がん又はグリオーマの処置に使用され得る。
【0099】
特定の一実施形態では、ヒト患者におけるｐ９５ＨＥＲ２陽性がんの処置方法であって、ａ．Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はマクロファージに、本明細書のＣＡＲのいずれかをコードするｍＲＮＡを形質導入又はトランスフェクトするステップと、ｂ．前記細胞を含む医薬組成物の有効用量を、ｐ９５ＨＥＲ２陽性がんと診断された患者に繰り返し投与するステップと、を含む方法が提供される。
【0100】
特定の一実施形態では、ヒト患者におけるｐ９５ＨＥＲ２陽性がんの処置方法であって、ａ．Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はマクロファージに、ｐ９５ＨＥＲ２ ＣＡＲをコードするｍＲＮＡを形質導入するステップと、ｂ．前記細胞を含む医薬組成物の有効用量を、ｐ９５ＨＥＲ２陽性がんと診断された患者に繰り返し投与するステップと、を含む方法が提供される。
【0101】
特定の一実施形態では、乳がんと診断された患者の処置方法であって、ａ．がん細胞を含む試料を患者から得るステップと、ｂ．がん細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現しているかどうかを分析するステップと、ｃ．がん細胞がｐ９５ＨＥＲ２陽性である場合、本明細書に開示されるＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞、ＮＫ細胞又はマクロファージの薬学上有効用量を含む医薬組成物を投与するステップと、を含む方法が提供される。
【0102】
特定の一実施形態では、乳がんと診断された患者の処置方法であって、ａ．がん細胞を含む試料を患者から得るステップと、ｂ．がん細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現しているかどうかを分析するステップと、ｃ．がん細胞がｐ９５ＨＥＲ２陽性である場合、ｐ９５ＨＥＲ２ ＣＡＲを発現するＴ細胞、ＮＫ細胞又はマクロファージの薬学上有効用量を含む医薬組成物を投与するステップと、を含む方法が提供される。
【0103】
特定の一実施形態では、乳がんと診断された患者の処置方法であって、ａ．がん細胞を含む試料を患者から得るステップと、ｂ．細胞を、本明細書に記載される、ＶＬ及びＶＨを含む抗体とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることにより、がん細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現しているかどうかを分析するステップと、並びにｃ．がん細胞がｐ９５ＨＥＲ２陽性である場合、化学療法を患者に投与するステップと、を含む方法が提供される。
【0104】
前記のように、化学療法は、承認済み化学療法であり得る。化学療法は、ｐ９５ＨＥＲ２、又はそれを発現する細胞を特異的に標的とし得る。
【0105】
特定の一実施形態では、ヒト患者におけるがんの診断方法であって、ａ．細胞を含む試料を患者から得るステップと、ｂ．細胞を、検出に適切な部分を含む本明細書で提供される結合分子とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることにより、細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現しているかどうかを分析するステップと、ｃ．細胞がｐ９５ＨＥＲ２を発現している場合、患者をがんと診断するステップと、を含む方法が提供される。
【0106】
前記すべての態様及び実施形態では、特に指定しない限り、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔスキームを用いて同定される。
【0107】
他の態様では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａスキームを用いて同定され得る。特に、マウスＶＨ（配列番号７）及びマウスＶＬ（配列番号８）内に含まれるＩＭＧＴ及びＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ配列（配列番号８０～９１）を、下の表に提示する。
【0108】
【表2】
【0109】
前記すべての態様及び実施形態において、ＣＤＲは、この態様で指定するように、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲであってもよい。
【実施例】
【0110】
実施例１：抗体の特異性及び親和性
方法
方法
【0111】
細胞培養
細胞株は、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で培養した。培地には、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）及び１０％の非働化済みウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を補足した。細胞株は、５％ＣＯ2及び湿度１００％の３７℃でインキュベートした。
細胞株は、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で培養した。培地には、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）及び１０％の非働化済みウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を補足した。細胞株は、５％ＣＯ2及び湿度１００％の３７℃でインキュベートした。
【0112】
ｐ９５ＨＥＲ２抗体の作製
ｐ９５ＨＥＲ２抗体の開発は、６１１－ＣＴＦ－ＨＥＲ２を発現する細胞でラットを免疫化することにより行った。免疫化及びハイブリドーマ作製は、Ａｌｄｅｖｒｏｎ社（フライブルク、ドイツ）により行われた。簡単に言うと、８～１２週齢のラットに、金粒子に固定した、６１１－ＣＴＦ－ＨＥＲ２を発現する免疫化ベクターＤＮＡ １０μｇを皮内注射した。選択したハイブリドーマ候補は、限界希釈によりサブクローニングした。回収したモノクローナルハイブリドーマ上清を、フローサイトメトリー及び／又はＥＬＩＳＡによる最終スクリーニングに使用した。
ｐ９５ＨＥＲ２抗体の開発は、６１１－ＣＴＦ－ＨＥＲ２を発現する細胞でラットを免疫化することにより行った。免疫化及びハイブリドーマ作製は、Ａｌｄｅｖｒｏｎ社（フライブルク、ドイツ）により行われた。簡単に言うと、８～１２週齢のラットに、金粒子に固定した、６１１－ＣＴＦ－ＨＥＲ２を発現する免疫化ベクターＤＮＡ １０μｇを皮内注射した。選択したハイブリドーマ候補は、限界希釈によりサブクローニングした。回収したモノクローナルハイブリドーマ上清を、フローサイトメトリー及び／又はＥＬＩＳＡによる最終スクリーニングに使用した。
【0113】
フローサイトメトリー
細胞を洗浄し、ペレット化して、１００μｌのＦＡＣＳバッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７、２％ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有）中に再懸濁した。目的の抗体（１０μｇ／ｍｌ）を加え、４℃の暗所中、３０分間インキュベートした。細胞を、２回洗浄し、ヤギ抗ラットＰＥ二次抗体（０．２６μｇ／ｍｌ）及びＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０を含有する１００μＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、４℃の暗所中、３０分間インキュベートした。細胞を、洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁して、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）で解析した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ１０．７．１、ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ社）で解析した。
細胞を洗浄し、ペレット化して、１００μｌのＦＡＣＳバッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７、２％ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有）中に再懸濁した。目的の抗体（１０μｇ／ｍｌ）を加え、４℃の暗所中、３０分間インキュベートした。細胞を、２回洗浄し、ヤギ抗ラットＰＥ二次抗体（０．２６μｇ／ｍｌ）及びＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０を含有する１００μＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、４℃の暗所中、３０分間インキュベートした。細胞を、洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁して、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）で解析した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ１０．７．１、ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ社）で解析した。
【0114】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ＳＰＲは、Ｇｏｍｅｓ ＆ Ａｎｄｒｅｕ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５９： ２１７～２３０頁、２００２に以前に記載されたよう行った。簡単に言うと、アミンカップリングキット（ＢＲ－１０００－５０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）及びＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーを用いて、センサチップＣＭ５（２１０４９８８、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上の２つの異なるフローセルの表面に、対照の抗ＨＥＲ２抗体（５μｇ／ｍｌ）及び目的の抗体（５μｇ／ｍｌ）を共有結合で固定化した。Ｃ末端にポリヒスチジンタグを含むｐ９５ＨＥＲ２ペプチドの細胞外ドメイン（配列番号１９）をアナライトとして、０．６から２５００ｎＭまでの段階希釈で使用した。
ＳＰＲは、Ｇｏｍｅｓ ＆ Ａｎｄｒｅｕ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５９： ２１７～２３０頁、２００２に以前に記載されたよう行った。簡単に言うと、アミンカップリングキット（ＢＲ－１０００－５０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）及びＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーを用いて、センサチップＣＭ５（２１０４９８８、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上の２つの異なるフローセルの表面に、対照の抗ＨＥＲ２抗体（５μｇ／ｍｌ）及び目的の抗体（５μｇ／ｍｌ）を共有結合で固定化した。Ｃ末端にポリヒスチジンタグを含むｐ９５ＨＥＲ２ペプチドの細胞外ドメイン（配列番号１９）をアナライトとして、０．６から２５００ｎＭまでの段階希釈で使用した。
【0115】
ＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＬＴＨＨＨＨＨＨ（配列番号１９）
【0116】
分子間相互作用の動態は、１：１の二分子相互作用モデルへのグローバルカーブフィッティングにより処理した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して実験を行い、すべての手順は２５℃で行った。
【0117】
結果
ｐ９５ＨＥＲ２特異的Ａｂの作製は、６１１－ＨＥＲ２－ＣＴＦでトランスフェクトした細胞でラットを免疫化することにより行った。この目的のために、異なる６１１－ＨＥＲ２－ＣＴＦ構築物でＨＥＫ－２９３細胞をトランスフェクトし、抗タグ抗体、及び対照としての非関連（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）抗タグ抗体を使用して、ｐ９５ＨＥＲ２の表面発現を測定した。ｍＡｂハイブリドーマを作製するためのラットの免疫化は、ｐＢ１－６１１－ＣＴＦ－ｈｕｍ．ＥＣＤでトランスフェクトした細胞を用いて行った。ｐ９５ＨＥＲ２に対するポリクローナルハイブリドーマ培養上清（ＨＣＳ）の最初のスクリーニングは、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅフローサイトメトリープラットフォームを用いて行った。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値に基づいて、上位９つの陽性クローンを選択した。これらの９つのポリクローナルハイブリドーマ（ｐクローン）由来のＨＣＳを、次いでフローサイトメトリーにより、細胞株ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄ、ＳＫ－ＢＲ－３、Ｔ－４７Ｄ、及びＳＵＰ－Ｔ１との結合に関して試験した。ｐクローン１、２、３及び８に由来するＨＣＳは、ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄに結合するが、Ｔ４７Ｄには結合しないことが見出された。ｐクローン２及び８に由来するＨＣＳのみが、全長ＨＥＲ２を発現する細胞株であるＳＫ－ＢＲ－３に対する結合を示した。これらの結果を確証するために、ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄ、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＴ－４７Ｄを用いて免疫蛍光（ＩＦ）染色を行った。ここで、ｐクローン１、２及び３に由来するＨＣＳは、ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄを染色するが、Ｔ－４７Ｄ又はＳＫ－ＢＲ３は染色しないことが見出された。
ｐ９５ＨＥＲ２特異的Ａｂの作製は、６１１－ＨＥＲ２－ＣＴＦでトランスフェクトした細胞でラットを免疫化することにより行った。この目的のために、異なる６１１－ＨＥＲ２－ＣＴＦ構築物でＨＥＫ－２９３細胞をトランスフェクトし、抗タグ抗体、及び対照としての非関連（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）抗タグ抗体を使用して、ｐ９５ＨＥＲ２の表面発現を測定した。ｍＡｂハイブリドーマを作製するためのラットの免疫化は、ｐＢ１－６１１－ＣＴＦ－ｈｕｍ．ＥＣＤでトランスフェクトした細胞を用いて行った。ｐ９５ＨＥＲ２に対するポリクローナルハイブリドーマ培養上清（ＨＣＳ）の最初のスクリーニングは、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅフローサイトメトリープラットフォームを用いて行った。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値に基づいて、上位９つの陽性クローンを選択した。これらの９つのポリクローナルハイブリドーマ（ｐクローン）由来のＨＣＳを、次いでフローサイトメトリーにより、細胞株ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄ、ＳＫ－ＢＲ－３、Ｔ－４７Ｄ、及びＳＵＰ－Ｔ１との結合に関して試験した。ｐクローン１、２、３及び８に由来するＨＣＳは、ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄに結合するが、Ｔ４７Ｄには結合しないことが見出された。ｐクローン２及び８に由来するＨＣＳのみが、全長ＨＥＲ２を発現する細胞株であるＳＫ－ＢＲ－３に対する結合を示した。これらの結果を確証するために、ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄ、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＴ－４７Ｄを用いて免疫蛍光（ＩＦ）染色を行った。ここで、ｐクローン１、２及び３に由来するＨＣＳは、ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄを染色するが、Ｔ－４７Ｄ又はＳＫ－ＢＲ３は染色しないことが見出された。
【0118】
これらのデータに基づき、限界希釈系列による、モノクローナル培養物（ｍクローン）へのサブクローニングのために、ｐクローン１、２及び３を選択した。ｍクローン１、２及び３のＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅスクリーニングは、ｍクローン１のみがトランスフェクト細胞に特異的に結合し、ｍクローン２は非トランスフェクト細胞に非特異的に結合し、ｍクローン３は陰性であることを実証した。３つすべてのｍクローンをさらに試験するために、ＨＣＳを用いて、細胞株ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄ、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＴ－４７Ｄのフローサイトメトリー解析を行った。フローサイトメトリーの結果は、ｉＱｕｅのスクリーニングデータを確証した。ｍクローン１のみがｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄに特異的に結合し、ｍクローン２はｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄ及びＳＫ－ＢＲ－３の両方ともに結合した。さらに、ｍクローン１は、ＩＦで評価した場合、ｐクローン１と比べて、ｐ９５ＨＥＲ２に対するより強い反応性を示した。これらのスクリーニング結果に基づき、ｍＡｂ（本明細書ではＯｓｌｏ－２抗体と呼ぶ）を作製するためにｍクローン１を選択した。
【0119】
したがって、ｐ９５ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術を用いて、ラットから作製した。抗体の反応性及び特異性は、異なる固形腫瘍又は血液悪性腫瘍に由来するＨＥＲ２＋／－細胞株のパネルへの結合に基づき、フローサイトメトリーにより評価した（図１）。異なる乳がん細胞株にわたって、この抗体は、ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄ細胞株に対する強い反応性を示したが、ＨＥＲ２＋であるＳＫ－ＢＲ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８株、又はＨＥＲ２－であるＴ４７Ｄ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株には結合しなかった（図１）。さらに、この抗体は、ＨＥＲ２＋である肺がん細胞株Ａ５４９、又はＨＥＲ２－である前立腺がん、膵がん、リンパ腫、及び白血病の細胞株には結合しなかった（図１）。これは、抗体が、ｐ９５ＨＥＲ２に対して特異的であることを示した。
【0120】
配列番号１９のｐ９５ＨＥＲ２ペプチド（Ｃ末端Ｈｉｓタグを含む）に対する、抗体の結合親和性を決定するためにＳＰＲ解析を行った。抗体をチップ上に固定化し、段階濃度での、ｐ９５ＨＥＲ２の細胞外ドメインをアナライトとして用いて、分子間相互作用の動態を試験した。ＨＥＲ２の細胞質ドメインに結合する、対照の抗ＨＥＲ２ ｍＡｂ（ａｂ２１４２７５、Ａｂｃａｍ社、英国）を基準として用いた（図２）。目的の抗体に関する親和性データは、対照との差引きにより補正した。予想どおり、会合（ｋａ）速度は、ｐ９５ＨＥＲ２ペプチド濃度の上昇と共に上昇した。目的の抗体は、ｐ９５ＨＥＲ２ペプチドとの低い平衡解離定数（ＫＤ＝２ｎＭ）を示し、１３７ＲＵの最大結合レスポンス（Ｒｍａｘ）での高親和性相互作用を示した（図２）。
【0121】
実施例２：エピトープマッピング
目的の抗体により認識される特異的エピトープを同定するために、ｐ９５ＨＥＲ２完全細胞外ドメインを網羅する合成重複ペプチドを用いてエピトープマッピングを行った。重複ペプチド戦略では、４つのアミノ酸が重複する順次連続した１５ｍｅｒペプチドを作製し（図３Ａ）、セルロース膜上に固定化した。その結果は、抗体が、ペプチド１のみに結合したことを示し、４アミノ酸配列のＭＰＩＷ（配列番号３３）が結合にとって必須であることを示唆した（図３Ａ＆Ｂ）。これにより、結合エピトープは、全長ＨＥＲ２の６１１～６１４位に位置づけられる（図３Ｃ）。図３Ａに示す１５ｍｅｒペプチドに対応する配列番号を下の表に提示する。
目的の抗体により認識される特異的エピトープを同定するために、ｐ９５ＨＥＲ２完全細胞外ドメインを網羅する合成重複ペプチドを用いてエピトープマッピングを行った。重複ペプチド戦略では、４つのアミノ酸が重複する順次連続した１５ｍｅｒペプチドを作製し（図３Ａ）、セルロース膜上に固定化した。その結果は、抗体が、ペプチド１のみに結合したことを示し、４アミノ酸配列のＭＰＩＷ（配列番号３３）が結合にとって必須であることを示唆した（図３Ａ＆Ｂ）。これにより、結合エピトープは、全長ＨＥＲ２の６１１～６１４位に位置づけられる（図３Ｃ）。図３Ａに示す１５ｍｅｒペプチドに対応する配列番号を下の表に提示する。
【0122】
【表3】
【0123】
次に、抗体結合に関与するさらなるアミノ酸が存在するかどうかを調査したく、かつ結合エピトープが連続的又は不連続的であるかどうかを決定したいと考えた。この目的に向けて、ｐ９５ＨＥＲ２細胞外ドメインのＮ末端にまたがり、かつＭＰＩＷ ４ｍｅｒエピトープ（配列番号３３）を含有する、ＨＥＲ２中のグリシン－６０３からアラニン－６２２までの領域を選択した。この配列のＮ末端短縮化、又は各位置において２つのアラニン残基置換した連続ペプチドのいずれかを含有するペプチドを作製した。（図３Ｄ）。図３Ｄに示すペプチドに対応する配列番号を下の表に提示する。
【0124】
【表4】
【0125】
Ｎ末端短縮化は、抗体結合において、メチオニン－６１１が重要な役割を果たしていないことを示した。なぜなら、結合の最初の低下は、プロリン－６１２の損失以降にのみ観察されたからである。イソロイシン－６１３を欠失させると結合はさらに低下し、トリプトファン－６１４を除去すると結合は完全に失われた（ペプチド１１）（図３Ｅ）。ＭＰＩＷ（配列番号３３）エピトープの置換と同じ結果が、抗体結合が失われる二重アラニン置換により観察された。しかしながら、これらの研究はさらに、元のエピトープのリジン－６２２位からグルタミン酸－６２１位までにすぐ隣接するアミノ酸の置換も、抗体結合において重要であることを明らかにした（図３Ｅ）。したがって、これらの研究から、抗体の結合エピトープは、連続的であって配列ＰＩＷＫＦＰＤＥＥ（配列番号１７）を有すると結論する。全長ＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の３Ｄ構造は、このエピトープが、全長ＨＥＲ２では隠れていることを示す。
【0126】
実施例３：本発明の発現レベル及びｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
抗体からｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔを作製するために、レトロウイルス発現ベクター内にＲＱＲ８、シグナルペプチド、ｐ９５ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（抗体由来）、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ構築物を用いて活性化Ｔ細胞に形質導入した。ＲＱＲ８は、ＣＤ３４及びＣＤ２０抗原に由来する最小標的エピトープを含有する、コンパクトな、エピトープベースのマーカー／自殺遺伝子である。この遺伝子は、ＣＡＲと同じプロモータ下にあり、２Ａと呼ばれる自己切断タンパク質によりＣＡＲから分離されている。ＲＱＲ８を検出することにより（抗ＣＤ３４抗体－ＱＢＥＮＤを使用）、ＣＡＲ発現を評価した（図４Ａ）。ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔの機能性をｉｎ ｖｉｔｒｏで調査するために、ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ構築物で形質導入したＴ細胞、及び非形質導入Ｔ細胞を、関連（ｐ９５ＨＥＲ２＋）標的細胞及び非関連（ｐ９５ＨＥＲ－）標的細胞と共培養した。ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害性及びサイトカイン産生能を、異なるアッセイ法により評価した。ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔは、ｐ９５ＨＥＲ２＋標的細胞においてアポトーシスを誘導し得て（図４Ｂ）、炎症性サイトカインＴＮＦα及びＩＦＮγを分泌し得る（図５）ことが観察された。
抗体からｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔを作製するために、レトロウイルス発現ベクター内にＲＱＲ８、シグナルペプチド、ｐ９５ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（抗体由来）、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ構築物を用いて活性化Ｔ細胞に形質導入した。ＲＱＲ８は、ＣＤ３４及びＣＤ２０抗原に由来する最小標的エピトープを含有する、コンパクトな、エピトープベースのマーカー／自殺遺伝子である。この遺伝子は、ＣＡＲと同じプロモータ下にあり、２Ａと呼ばれる自己切断タンパク質によりＣＡＲから分離されている。ＲＱＲ８を検出することにより（抗ＣＤ３４抗体－ＱＢＥＮＤを使用）、ＣＡＲ発現を評価した（図４Ａ）。ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔの機能性をｉｎ ｖｉｔｒｏで調査するために、ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ構築物で形質導入したＴ細胞、及び非形質導入Ｔ細胞を、関連（ｐ９５ＨＥＲ２＋）標的細胞及び非関連（ｐ９５ＨＥＲ－）標的細胞と共培養した。ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害性及びサイトカイン産生能を、異なるアッセイ法により評価した。ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔは、ｐ９５ＨＥＲ２＋標的細胞においてアポトーシスを誘導し得て（図４Ｂ）、炎症性サイトカインＴＮＦα及びＩＦＮγを分泌し得る（図５）ことが観察された。
【0127】
実施例４：本発明に基づく、マウスでのモデルがんの処置方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験に成功したｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ（実施例３）をさらにｉｎ ｖｉｖｏで調べた。ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄ細胞を、乳腺脂肪体内へと整形外科的に導入することにより、当グループでは、ｐ９５ＨＥＲ２陽性の整形外科的異種移植片マウスモデルを確立した。ＣＡＲ－Ｔを、２回（腫瘍移植から２週間及び５週間後）、各時点において５００万細胞、静脈内注射した。腫瘍増殖は、処置の時間経過の間、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光イメージングにより評価した。注目に値する腫瘍縮小は、最初のｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ注射から早くも２週間後に観察され、最大の腫瘍制御（腫瘍消失）は、最初のｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ注射から５週間後に観察された（図６）。ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔは、最初の注射から比較的長期間（１０週間）にわたり、ｉｎ ｖｉｖｏで存続して増加することができた（図７）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験に成功したｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ（実施例３）をさらにｉｎ ｖｉｖｏで調べた。ｐ９５ＨＥＲ２－Ｔ４７Ｄ細胞を、乳腺脂肪体内へと整形外科的に導入することにより、当グループでは、ｐ９５ＨＥＲ２陽性の整形外科的異種移植片マウスモデルを確立した。ＣＡＲ－Ｔを、２回（腫瘍移植から２週間及び５週間後）、各時点において５００万細胞、静脈内注射した。腫瘍増殖は、処置の時間経過の間、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光イメージングにより評価した。注目に値する腫瘍縮小は、最初のｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ注射から早くも２週間後に観察され、最大の腫瘍制御（腫瘍消失）は、最初のｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ注射から５週間後に観察された（図６）。ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔは、最初の注射から比較的長期間（１０週間）にわたり、ｉｎ ｖｉｖｏで存続して増加することができた（図７）。
【0128】
図及び実施例において、「ｐ９５ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ」及び「ｐ９５ＨＥＲ－ＣＡＲ－Ｔ－４１ＢＢ」は両方とも、配列番号１５のＣＡＲを発現するＴ細胞を意味する。
【0129】
実施例５：抗体のヒト化
表２に提示した、本発明のＩＭＧＴ ＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ（配列番号８０～８４）を、ＣＤＲ移植アルゴリズムを用いて、ヒト生殖細胞系列配列に移植した。下の表５は、選択されたヒト生殖細胞系列配列に対する、親配列及びヒト化配列の同一性の百分率を提示する。
表２に提示した、本発明のＩＭＧＴ ＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ（配列番号８０～８４）を、ＣＤＲ移植アルゴリズムを用いて、ヒト生殖細胞系列配列に移植した。下の表５は、選択されたヒト生殖細胞系列配列に対する、親配列及びヒト化配列の同一性の百分率を提示する。
【0130】
【表5】
【0131】
配列傾向分析
非常に望ましくない配列傾向が、ヒト化配列に導入されていないことを確保するために、親配列及びヒト化配列を、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ社の配列傾向ツールにかけた。最も懸念される配列傾向は、グリコシル化部位及び遊離システインであるが、そのいずれも、それらの配列中には存在しない。脱アミド化及び異性化のモチーフが、配列中に存在する。それらの修飾は、高リスクと指定され、製造中に破壊を引き起こし得るが、頻繁には対処可能である。望ましければ、変異導入により、それらのモチーフを除去することが可能であり得る。中リスク及び低リスクの配列傾向も存在するものの、抗体製造工程において問題を引き起こすとはほとんど報告されていない。
非常に望ましくない配列傾向が、ヒト化配列に導入されていないことを確保するために、親配列及びヒト化配列を、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ社の配列傾向ツールにかけた。最も懸念される配列傾向は、グリコシル化部位及び遊離システインであるが、そのいずれも、それらの配列中には存在しない。脱アミド化及び異性化のモチーフが、配列中に存在する。それらの修飾は、高リスクと指定され、製造中に破壊を引き起こし得るが、頻繁には対処可能である。望ましければ、変異導入により、それらのモチーフを除去することが可能であり得る。中リスク及び低リスクの配列傾向も存在するものの、抗体製造工程において問題を引き起こすとはほとんど報告されていない。
【0132】
抗体クローニング
計４本のヒト化重鎖及び４本のヒト化軽鎖を設計した（配列番号７２～７９）。それらの各々を、別個に合成し、それぞれ、ヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトカッパ軽鎖発現ベクター内にクローニングした。トランスフェクションの時点で、ヒト化配列のあらゆる可能な組合せを作製し、上の表１に提示される計１６種の異なるヒト化抗体を創出した。
計４本のヒト化重鎖及び４本のヒト化軽鎖を設計した（配列番号７２～７９）。それらの各々を、別個に合成し、それぞれ、ヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトカッパ軽鎖発現ベクター内にクローニングした。トランスフェクションの時点で、ヒト化配列のあらゆる可能な組合せを作製し、上の表１に提示される計１６種の異なるヒト化抗体を創出した。
【0133】
抗体の発現及び精製
抗体を、発現させ、プロテインＡにより精製した。精製タンパク質は、緩衝液交換して濃縮した。すべての抗体は発現され、精製されたすべての生成物は、非還元及び還元のＳＤＳ－ＰＡＧＥ下、予想どおりに見えた。
抗体を、発現させ、プロテインＡにより精製した。精製タンパク質は、緩衝液交換して濃縮した。すべての抗体は発現され、精製されたすべての生成物は、非還元及び還元のＳＤＳ－ＰＡＧＥ下、予想どおりに見えた。
【0134】
凝集分析
精製した抗体を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、凝集及び断片化について分析した。すべての精製抗体は、良好なモノマー含量を示した。
精製した抗体を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、凝集及び断片化について分析した。すべての精製抗体は、良好なモノマー含量を示した。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】