特表 2024-539089 修飾複製可能ＲＮＡの機能および関連する組成物を増加させるための変異を決定する方法ならびにそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】修飾複製可能ＲＮＡの機能および関連する組成物を増加させるための変異を決定する方法ならびにそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20241018BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20241018BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALI20241018BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20241018BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20241018BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20241018BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20241018BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20241018BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 39/35 20060101ALI20241018BHJP

   C12N 15/40 20060101ALN20241018BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

C12N15/11 Z ZNA

C12Q1/48

C12N15/87 Z

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6869 Z

C12N9/12

C12N15/54

A61K31/7105

A61K31/711

A61K31/7115

A61K48/00

A61P37/04

A61P35/00

A61K47/44

A61K39/00

A61K39/00 H

A61K39/12

A61K39/02

A61K39/00 K

A61K39/35

C12N15/40

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024523403

(86)(22)【出願日】2022-10-17

(85)【翻訳文提出日】2024-06-17

(86)【国際出願番号】 EP2022078869

(87)【国際公開番号】W WO2023066874

(87)【国際公開日】2023-04-27

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2021/078828

(32)【優先日】2021-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】509146023

【氏名又は名称】バイオエヌテック エスエー

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＮＴＥＣＨ ＳＥ

【住所又は居所原語表記】Ａｎ ｄｅｒ Ｇｏｌｄｇｒｕｂｅ １２ ５５１３１ Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ

(71)【出願人】

【識別番号】515123258

【氏名又は名称】トロン－ トランスラショナル オンコロジー アン デア ウニヴェリジテーツメディツィン デア ヨハネス グーテンベルク－ウニヴェルシテート マインツ ゲマインニューツィゲ ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ＴＲＯＮ－ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｅ Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ ａｎ ｄｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔｓｍｅｄｉｚｉｎ ｄｅｒ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍａｉｎｚ ｇｅｍｅｉｎｎｕｅｔｚｉｇｅ ＧｍｂＨ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒｅｉｌｉｇｒａｔｈｓｔｒ． １２ ５５１３１ Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100110928

【弁理士】

【氏名又は名称】速水 進治

(72)【発明者】

【氏名】バイセルト， ティム

(72)【発明者】

【氏名】ペルコビッチ， マリオ

(72)【発明者】

【氏名】ガウレッタ， ステファニー

(72)【発明者】

【氏名】ソーン， パトリック

(72)【発明者】

【氏名】ブリル， シルケ

(72)【発明者】

【氏名】ネット， エヴリン

【テーマコード（参考）】

4B063

4C076

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ54

4B063QR32

4C076CC06

4C076CC27

4C076EE51

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB26

4C085AA03

4C085BA01

4C085BA07

4C085BA49

4C085BA51

4C085BB01

4C085DD62

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA05

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB26

(57)【要約】

本発明は、修飾ヌクレオチド含有複製可能ＲＮＡの複製および／または翻訳される能力を回復または改善するための方法に関する。この方法は、修飾ヌクレオチド含有複製可能ＲＮＡ分子の複製するおよび／または翻訳される能力の低下を補償する、複製可能ＲＮＡにおけるヌクレオチド変化を同定することを含む。本発明はまた、そのような同定されたヌクレオチド変化を組み込んだ修飾ヌクレオチド含有複製可能ＲＮＡ分子、および治療におけるそのような複製可能ＲＮＡ分子の使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾された複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の機能を少なくとも部分的に回復または増加させる修飾ヌクレオチドを含むｒＲＮＡ（修飾ｒＲＮＡ）における配列変化を同定するための方法であって、
（ａ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）を発現する細胞に、目的の遺伝子をコードする修飾ｒＲＮＡをトランスフェクトする工程；および
（ｂ）前記目的の遺伝子を発現する前記トランスフェクトされた細胞中に存在する前記目的の遺伝子をコードするｒＲＮＡ分子内の配列変化を同定する工程
を含む、方法。

【請求項2】

前記配列変化が、工程（ａ）でトランスフェクトされた前記修飾ｒＲＮＡの配列に対して決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程（ａ）が、トランスフェクト後に、前記目的の遺伝子をコードするｒＲＮＡ分子を、前記目的の遺伝子を発現する前記トランスフェクトされた細胞から単離して、単離されたｒＲＮＡ分子を提供することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

工程（ａ）が、前記レプリカーゼを発現する細胞に、前記目的の遺伝子をコードし、前記修飾ヌクレオチドを含むｒＲＮＡ分子の後続世代をトランスフェクトする工程をさらに含み、前記後続世代が、前記単離されたｒＲＮＡ分子を複製することによって提供される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

請求項３および４の工程を繰り返すことをさらに含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記工程をｎ回繰り返す、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ｎが少なくとも１の整数である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記単離されたｒＲＮＡ分子を複製することが、（ｉ）前記目的の遺伝子をコードする前記単離されたｒＲＮＡ分子を逆転写して、インビトロ転写され得るＤＮＡ分子を形成すること；および（ｉｉ）同じ修飾ヌクレオチドの存在下で前記ＤＮＡ分子をインビトロ転写して、前記修飾ヌクレオチドを含み、前記目的の遺伝子をコードする修飾ｒＲＮＡ分子の後続世代を生成することを含む、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

（ｃ）少なくとも１つの同定された配列変化を工程（ａ）の前記修飾ｒＲＮＡに組み込む工程；
（ｄ）前記レプリカーゼを発現する細胞に、工程（ｃ）で生成された前記修飾ｒＲＮＡをトランスフェクトする工程；および
（ｅ）工程（ｄ）で生成された前記目的の遺伝子を発現する前記トランスフェクト細胞から単離された前記ｒＲＮＡ分子内の配列変化を同定する工程
をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記修飾ｒＲＮＡ中の修飾ヌクレオチドの数が、前記ｒＲＮＡ中のヌクレオチドの総数の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記修飾ｒＲＮＡ中の修飾ヌクレオチドの数が、前記ｒＲＮＡ中のヌクレオチドの総数の少なくとも３０％である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記修飾ｒＲＮＡ中の修飾ヌクレオチドの数が、前記ｒＲＮＡ中のヌクレオチドの総数の少なくとも５０％である、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記修飾ヌクレオチドが、修飾ウリジン残基、修飾アデニン残基、修飾グアニン残基、修飾シトシン残基、または前述の２つ以上の任意の組合せである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記修飾ヌクレオチドが修飾ウリジンである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記修飾ウリジンがシュードウリジンである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記シュードウリジンがＮ１－メチル－シュードウリジンである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記インビトロ転写された修飾ｒＲＮＡ中のＮ１－メチル－シュードウリジン残基の数が、ウリジン残基の総数の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記インビトロ転写された修飾ｒＲＮＡ中のＮ１－メチル－シュードウリジン残基の数が、ウリジン残基の総数の少なくとも３０％である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記インビトロ転写された修飾ｒＲＮＡ中のＮ１－メチル－シュードウリジン残基の数が、ウリジン残基の総数の少なくとも５０％である、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記レプリカーゼが、自己複製ＲＮＡウイルス、好ましくはアルファウイルスに由来する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記アルファウイルスが、ＳＦＶまたはＶＥＥＶまたはＥＥＥＶまたはシンドビスウイルスである、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ｒＲＮＡが、開始コドンを有しない５’調節領域を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記レプリカーゼおよび複製のために前記レプリカーゼが必要とする前記ｒＲＮＡ中の調節配列が、同じアルファウイルスまたは異なるアルファウイルスに由来する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記コードされた目的の遺伝子が、細胞表面発現タンパク質またはルシフェラーゼまたはＧＦＰである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記細胞における前記レプリカーゼの発現が、一過性発現または構成的発現である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記細胞が、前記ｒＲＮＡのトランスフェクションの前に、トランスフェクションと同時に、またはトランスフェクションの後に、前記レプリカーゼをコードする核酸分子でトランスフェクトされ、好ましくは、前記核酸分子はＲＮＡである、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

工程（ａ）が、目的の遺伝子をコードする自己増幅ＲＮＡで細胞をトランスフェクトすることを含み、自己複製ＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

部分的に回復または増加する前記ｒＲＮＡの機能が、前記レプリカーゼによって複製される能力である、および／または翻訳される能力である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記機能が少なくとも１０％回復するか、または少なくとも１０％増加する、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記配列変化を同定する工程が、前記ｒＲＮＡ分子の少なくとも一部を配列決定することを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

配列決定される前記ｒＲＮＡの一部が５’調節領域である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

配列決定される前記ｒＲＮＡの一部が３’調節領域である、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

前記配列変化が、配列決定によって生成された配列特異的リード頻度を分析することによって決定される、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む自己増幅ＲＮＡの複製効率を高めるために実施される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記修飾ヌクレオチドを含む前記ｒＲＮＡまたは自己複製ＲＮＡの機能を部分的に回復または増加させる少なくとも１つの同定された配列変化を組み込むことによって、同じ修飾ヌクレオチドを含むｒＲＮＡまたは自己複製ＲＮＡのヌクレオチド配列を修飾することをさらに含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法によって得られる、複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子。

【請求項37】

修飾された複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の機能を少なくとも部分的に回復または増加させる配列変化を有するｒＲＮＡであって、
（ａ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）を発現する細胞に、目的の遺伝子をコードする修飾ｒＲＮＡをトランスフェクトする工程；および
（ｂ）前記目的の遺伝子を発現する前記トランスフェクト細胞に存在する前記目的の遺伝子をコードするｒＲＮＡ分子内の配列変化を同定する工程
を含む方法によって得られる、ｒＲＮＡ。

【請求項38】

自己複製ＲＮＡウイルスの修飾５’調節領域を含む複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子であって、前記修飾調節領域が、前記５’調節領域（配列番号２）の６７位、２４４位、２４５位、２４６位、２４８位の１つ以上に点突然変異を含む、複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子。

【請求項39】

前記自己複製ＲＮＡウイルスがアルファウイルスである、請求項３８に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項40】

前記５’調節領域（配列番号２）の６７位と、２４４位、２４５位、２４６位、２４８位の１つ以上とに点突然変異を含む、請求項３８または３９に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項41】

前記５’調節領域が、前記５’調節領域（配列番号２）の４位に点突然変異をさらに含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項42】

前記点突然変異が６７位にある、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項43】

前記点突然変異が６７位および２４４位にある、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項44】

前記点突然変異が６７位および２４６位にある、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項45】

前記点突然変異が６７位および２４８位にある、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項46】

前記点突然変異が６７位、２４５位および２４８位にある、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項47】

前記点突然変異が４位および６７位にある、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項48】

前記点突然変異が４位、６７位および２４４位にある、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項49】

前記点突然変異が４位、６７位および２４６位にある、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項50】

前記点突然変異が４位、６７位および２４８位にある、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項51】

前記点突然変異が４位、６７位、２４５位および２４８位にある、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項52】

前記点突然変異が、Ｇ４Ａ、Ａ６７Ｃ、Ｇ２４４Ａ、Ｃ２４５Ａ、Ｇ２４６Ａ、またはＣ２４８Ａである、請求項３８～５１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項53】

前記自己複製ＲＮＡウイルスが、ＳＦＶまたはＥＥＥＶまたはＶＥＥＶまたはシンドビスウイルスである、請求項３６～５２のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項54】

１つ以上のコード領域をさらに含む、請求項３６～５３のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項55】

目的の遺伝子をコードする、請求項３６～５４のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項56】

前記コードされた目的の遺伝子が、抗原または治療用タンパク質または核酸、好ましくは腫瘍、ウイルス、細菌もしくは真菌抗原、またはアレルゲンである、請求項５５に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項57】

ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）、好ましくはアルファウイルスレプリカーゼをコードする、請求項３６～５６のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項58】

５’調節領域を含み、レプリカーゼをコードする請求項３６～５７のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子であって、前記５’調節領域および前記コードされたレプリカーゼが同じ自己複製ＲＮＡウイルス、好ましくは同じアルファウイルスに由来する、ｒＲＮＡ分子。

【請求項59】

５’調節領域を含み、レプリカーゼをコードする請求項３６～５７のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子であって、前記５’調節領域および前記コードされたレプリカーゼが異なる自己複製ＲＮＡウイルスに由来する、ｒＲＮＡ分子。

【請求項60】

自己増幅ＲＮＡである、請求項３６～５９のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項61】

インビトロ転写ｒＲＮＡである、請求項３６～６０のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項62】

少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項３６～６１のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項63】

前記修飾ヌクレオチドがＮ１－メチル－シュードウリジンである、請求項６２に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項64】

全てのウリジン残基がＮ１－メチル－シュードウリジン残基である、請求項６３に記載のｒＲＮＡ分子。

【請求項65】

請求項３６～６４のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子。

【請求項66】

前記ｒＲＮＡまたはＤＮＡ分子が線状または環状である、請求項３６～６４のいずれか一項に記載のｒＲＮＡ分子または請求項６５に記載のＤＮＡ分子。

【請求項67】

脂質と共に製剤化される、請求項３６～６６のいずれか一項に記載のｒＲＮＡまたはＤＮＡ分子。

【請求項68】

請求項３６～６７のいずれか一項に記載のｒＲＮＡまたはＤＮＡ分子と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項69】

治療に使用するための、請求項３６～６７のいずれか一項に記載のｒＲＮＡもしくはＤＮＡ分子または請求項６８に記載の医薬組成物。

【請求項70】

対象において免疫応答を惹起するための方法であって、抗原をコードするｒＲＮＡ分子を前記対象に投与することを含み、前記ｒＲＮＡ分子が、自己複製ＲＮＡウイルス、好ましくはアルファウイルスの修飾５’調節領域を含み、前記修飾調節領域が、（配列番号２の）６７位、２４４位、２４５位、２４６位、２４８位の１つ以上に点突然変異を含む、方法。

【請求項71】

対象における癌を治療するための方法であって、腫瘍抗原をコードするｒＲＮＡ分子を前記対象に投与することを含み、前記ｒＲＮＡが自己複製ＲＮＡウイルス、好ましくはアルファウイルスの修飾５’調節領域を含み、前記修飾調節領域が、（配列番号２の）６７位、２４４位、２４５位、２４６位、２４８位の１つ以上に点突然変異を含む、方法。

【請求項72】

遺伝子機能を欠く対象にそのような遺伝子機能を提供するための方法であって、遺伝子産物（治療用タンパク質）をコードするｒＲＮＡ分子を前記対象に投与して前記遺伝子機能を提供することを含み、前記ｒＲＮＡ分子が自己複製ＲＮＡウイルス、好ましくはアルファウイルスの修飾５’調節領域を含み、前記修飾調節領域が、（配列番号２の）６７位、２４４位、２４５位、２４６位、２４８位の１つ以上に点突然変異を含む、方法。

【請求項73】

前記ｒＲＮＡ分子が、５’調節領域（配列番号２）の６７位と、２４４位、２４５位、２４６位、２４８位の１つ以上とに点突然変異を含む、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記ｒＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、好ましくはＮ１－メチル－シュードウリジンを含む自己増幅ＲＮＡ分子である、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、修飾ヌクレオチド含有複製可能ＲＮＡの複製および／または翻訳される能力を回復または改善するための方法に関する。この方法は、修飾ヌクレオチド含有複製可能ＲＮＡ分子の複製するおよび／または翻訳される能力の低下を補償する、例えば複製可能ＲＮＡにおけるヌクレオチド変化を同定することを含む。本発明はまた、そのような同定されたヌクレオチド変化を組み込んだ修飾ヌクレオチド含有複製可能ＲＮＡ分子、および治療におけるそのような複製可能ＲＮＡ分子の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

最近、ｍＲＮＡベースのワクチンは、Ｃｏｖｉｄ－１９の流行に対抗するための臨床試験においてそれらの免疫原性を証明した。これらのＲＮＡワクチンは非常に有効であり、非常に強いＴ細胞免疫応答および高レベルの中和抗体を誘導する（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３８３：２４３９－２４５０；Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎａｔｕｒｅ ５８６：５９４－５９９）。規制当局の承認を得た最初の２つのｍＲＮＡワクチンは、ウリジンの代わりに化学修飾されたヌクレオチド、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（１ｍψ）を含有する。この修飾は、インターフェロン応答をもたらす自然免疫経路の刺激をほとんど回避することによって、免疫担当細胞におけるｍＲＮＡの翻訳を改善する（Ａｎｄｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２１７：３３７－３４４）。

【0003】

これらの承認されたＲＮＡワクチンは、用量当たり３０～１００μｇのＲＮＡを必要とし、数週間の間隔を空けて２回の連続した投与を必要とする（プライムブーストレジメン）。これにより、１００万人を免疫するのに必要な６０～２００ｇのＲＮＡが得られる。したがって、１μｇ未満への用量減少は、新規病原体に対するワクチンを集団に供給するのに必要な生産時間に大きな影響を与えるであろう。

【0004】

有意な用量減少を達成することを約束する試験中のワクチンアプローチは、自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を使用することである。ｓａＲＮＡは、アルファウイルス構造遺伝子を免疫応答が所望される抗原で置き換えることによって、アルファウイルスゲノムから操作することができる。ｓａＲＮＡは、ｓａＲＮＡ分子を複製するための全ての酵素機能を有するアルファウイルスレプリカーゼをコードし、したがって投入ワクチン量の増幅をもたらす。残念なことに、ｓａＲＮＡによって引き起こされる自然免疫応答はｓａＲＮＡワクチンの有効性を強く阻害し、これが、非ヒト霊長動物におけるｓａＲＮＡ Ｃｏｖｉｄ－１９ワクチンの前臨床試験でかなり大量のｓａＲＮＡが使用された理由であり得る（Ｅｒａｓｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２：ｅａｂｃ９３９６）。

【0005】

アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的な代表である。アルファウイルスの宿主には、昆虫、魚、ならびに家畜およびヒトなどの哺乳動物を含む広範囲の生物が含まれる。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する（アルファウイルスの生活環の総説については、Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：８３７－８５６を参照）。多くのアルファウイルスの全ゲノム長は、典型的には１１，０００～１２，０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、典型的には５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）尾部を有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製ならびにタンパク質修飾に関与する）および構造タンパク質（ウイルス粒子を形成する）をコードする。典型的には、ゲノム中に２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～ｎｓＰ４）は、典型的には、ゲノムの５’末端付近から始まる第１のＯＲＦによって一緒にコードされ、一方アルファウイルスの構造タンパク質は、第１のＯＲＦの下流に見出され、ゲノムの３’末端付近に延びる第２のＯＲＦによって一緒にコードされる。典型的には、第１のＯＲＦは第２のＯＲＦよりも大きく、比率はおよそ２：１である。

【0006】

アルファウイルスに感染した細胞では、非構造タンパク質のみがゲノムＲＮＡから翻訳され、構造タンパク質は、真核生物メッセンジャＲＮＡに類似したＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である（ｍＲＮＡ；Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．８７：１１１－１２４）。感染後、すなわちウイルス生活環の初期段階には、（＋）鎖ゲノムＲＮＡは、非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャＲＮＡのように直接作用する。一部のアルファウイルスでは、ｎｓＰ３のコード配列とｎｓＰ４のコード配列との間にオパール終止コドンが存在する：翻訳がオパール終止コドンで終結すると、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ３を含むポリタンパク質Ｐ１２３が生成され、さらにこのオパールコドンのリードスルー時にｎｓＰ４も含むポリタンパク質Ｐ１２３４が生成される（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１－５６２；Ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９６：２４８３－２５００）。ｎｓＰ１２３４は、ｎｓＰ１２３断片およびｎｓＰ４断片へと自己タンパク質分解的に切断される。ポリペプチドｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４は会合して、（＋）鎖ゲノムＲＮＡを鋳型として使用して、（－）鎖ＲＮＡを転写する（－）鎖レプリカーゼ複合体を形成する。典型的には、後の段階で、ｎｓＰ１２３断片は、個別のタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３に完全に切断される（Ｓｈｉｒａｋｏ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１８７４－１８８５）。４つ全てのタンパク質が集合して、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して、新しい（＋）鎖ゲノムを合成する（＋）鎖レプリカーゼ複合体を形成する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２３：１５３－１６３，Ｖａｓｉｌｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４１６３６－４１６４５）。

【0007】

感染細胞では、ｎｓＰ１によってサブゲノムＲＮＡおよび新しいゲノムＲＮＡに５’キャップが与えられ（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５：４３５－４４３；Ｒｏｚａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：２１２９－２１３４）、ｎｓＰ４によってポリアデニル酸［ポリ（Ａ）］尾部が与えられる（Ｒｕｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８４：２０１－２０８）。したがって、サブゲノムＲＮＡとゲノムＲＮＡの両方がメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に類似する。

【0008】

アルファウイルス構造タンパク質（全てウイルス粒子の成分である、コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｅ２およびエンベロープタンパク質Ｅ１）は、典型的にはサブゲノムプロモータの制御下で単一のオープンリーディングフレームによってコードされる（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１－５６２）。サブゲノムプロモータは、シスで作用するアルファウイルス非構造タンパク質によって認識される。特に、アルファウイルスレプリカーゼは、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して（＋）鎖サブゲノム転写物を合成する。（＋）鎖サブゲノム転写物は、アルファウイルス構造タンパク質をコードする（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２３：１５３－１６３，Ｖａｓｉｌｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４１６３６－４１６４５）。サブゲノムＲＮＡ転写物は、構造タンパク質を１つのポリタンパク質としてコードするオープンリーディングフレームの翻訳のための鋳型として働き、ポリタンパク質は、切断されて構造タンパク質を生じる。宿主細胞におけるアルファウイルス感染の後期段階には、ｎｓＰ２のコード配列内に位置するパッケージングシグナルが、構造タンパク質によってパッケージングされた出芽ビリオンへのゲノムＲＮＡの選択的パッケージングを確実にする（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４３２０－４３２６）。

【0009】

感染細胞では、（－）鎖ＲＮＡの合成は、典型的には感染後最初の３～４時間にのみ観察され、後期段階では検出不能であり、この時点では（＋）鎖ＲＮＡ（ゲノムおよびサブゲノムの両方）のみの合成が観察される。Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ ７：１６３８－１６５１によれば、ＲＮＡ合成の調節についての一般的なモデルは、非構造ポリタンパク質のプロセシングへの依存性を示唆する：非構造ポリタンパク質ｎｓＰ１２３４の最初の切断はｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４を生じる；ｎｓＰ４は、（－）鎖合成には活性であるが、（＋）鎖ＲＮＡの生成には非効率的なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）として作用する。ｎｓＰ２／ｎｓＰ３接合部での切断を含む、ポリタンパク質ｎｓＰ１２３のさらなるプロセシングは、（＋）鎖ＲＮＡの合成を増加させ、（－）鎖ＲＮＡの合成を減少または終結させるようにレプリカーゼの鋳型特異性を変化させる。

【0010】

アルファウイルスＲＮＡの合成はまた、４つの保存配列要素（ＣＳＥ；Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１－５６２；およびＦｒｏｌｏｖ，２００１，ＲＮＡ ７：１６３８－１６５１）を含むシス作用性ＲＮＡ要素によって調節される。アルファウイルスゲノムは、宿主細胞におけるウイルスＲＮＡ複製に重要であると理解されている４つの保存配列要素（ＣＳＥ）を含む。ウイルスゲノムの５’末端またはその近くに見出されるＣＳＥ １は、（－）鎖鋳型からの（＋）鎖合成のためのプロモータとして機能すると考えられている。ＣＳＥ １の下流に位置するが、ｎｓＰ１のコード配列内のゲノムの５’末端に依然として近いＣＳＥ ２は、ゲノムＲＮＡ鋳型からの（－）鎖合成の開始のためのプロモータとして作用すると考えられている（ＣＳＥ ２を含まないサブゲノムＲＮＡ転写物は、（－）鎖合成のための鋳型として機能しないことに留意されたい）。ＣＳＥ ３は、非構造タンパク質および構造タンパク質のコード配列の間の接合領域に位置し、サブゲノム転写物の効率的な転写のためのコアプロモータとして作用する。最後に、アルファウイルスゲノムの３’非翻訳領域のポリ（Ａ）配列のすぐ上流に位置するＣＳＥ ４は、（－）鎖合成の開始のためのコアプロモータとして機能すると理解されている（Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：８３７－８５６）。アルファウイルスのＣＳＥ ４およびポリ（Ａ）尾部は、効率的な（－）鎖合成のために一緒に機能すると理解されている（Ｈａｒｄｙ＆Ｒｉｃｅ，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：４６３０－４６３９）。アルファウイルスタンパク質に加えて、おそらくはタンパク質である宿主細胞因子も、保存配列要素に結合し得る。アルファウイルスゲノムの５’複製認識配列は、翻訳開始に関与するだけでなく、ウイルスＲＮＡの合成に関与する２つの保存配列要素、ＣＳＥ １およびＣＳＥ ２も含む。ＣＳＥ １およびＣＳＥ ２の機能にとって、二次構造は直鎖状配列よりも重要であると考えられている（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１－５６２）。

【0011】

アルファウイルス由来のベクターは、外来遺伝情報を標的細胞または標的生物に送達するために提案されている。単純なアプローチでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームによって置き換える。アルファウイルスに基づくトランス複製系は、２つの別個の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列要素に依存する：一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし（典型的にはポリタンパク質ｎｓＰ１２３４として）、他方の核酸分子はトランスで前記レプリカーゼによって複製されることができる（したがってトランス複製系という名称）。トランス複製は、所与の宿主細胞中にこれらの両方の核酸分子が存在することを必要とする。トランスでレプリカーゼによって複製され得る核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能にするために特定のアルファウイルス配列要素を含まなければならない。

【0012】

修飾ｍＲＮＡワクチンの成功を考えると、自然免疫応答を低下させるためにｓａＲＮＡを修飾することは魅力的に見える。しかしながら、修飾ヌクレオチドは、ｓａＲＮＡの複製および翻訳を阻害することが観察されている（Ｅｒａｓｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２：ｅａｂｃ９３９６）。現在までのところ、ＲＮＡ修飾がｓａＲＮＡ機能と適合しない理由について公表された調査はない。したがって、修飾ヌクレオチドを含有するにもかかわらず、十分な複製および／または翻訳機能を有するｓａＲＮＡ分子が当技術分野で依然として必要とされている。本発明は、そのような必要性を満たす。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３８３：２４３９－２４５０

【非特許文献2】Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎａｔｕｒｅ ５８６：５９４－５９９

【非特許文献3】Ａｎｄｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２１７：３３７－３４４

【非特許文献4】Ｅｒａｓｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２：ｅａｂｃ９３９６

【非特許文献5】Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：８３７－８５６

【非特許文献6】Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１－１２４

【非特許文献7】Ｓｔｒａｕｓｓ ＆ Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１－５６２

【非特許文献8】Ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９６：２４８３－２５００

【非特許文献9】Ｓｈｉｒａｋｏ ＆ Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１８７４－１８８５

【非特許文献10】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２３：１５３－１６３

【非特許文献11】Ｖａｓｉｌｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４１６３６－４１６４５

【非特許文献12】Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５：４３５－４４３

【非特許文献13】Ｒｏｚａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：２１２９－２１３４

【非特許文献14】Ｒｕｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８４：２０１－２０８

【非特許文献15】Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４３２０－４３２６

【非特許文献16】Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ ７：１６３８－１６５１

【非特許文献17】Ｈａｒｄｙ ＆ Ｒｉｃｅ，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：４６３０－４６３９

【発明の概要】

【0014】

本発明は、一般に、ウラシル、アデノシン、シトシンおよびグアニン以外のヌクレオチドを含む、レプリコンまたは複製可能なＲＮＡ（ｒＲＮＡまたはｓａＲＮＡ）とも呼ばれる自己複製ＲＮＡ分子が、複製し、および／または翻訳されてコードされたタンパク質を発現する能力を改善することに関する。したがって、本発明は、修飾ヌクレオチドを含む複製可能ＲＮＡ分子の複製するおよび／または翻訳される能力の低下を回復または改善する配列変化を同定するための方法に関する。さらに、本発明は、これらの配列変化を含む複製可能ＲＮＡ分子、ならびに細胞内でタンパク質を発現させるための、または複製可能ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質に対する免疫応答、好ましくは細胞傷害性免疫応答を惹起するための、およびそのような免疫応答が疾患または障害のそのような治療または予防につながる／治療または予防をもたらす疾患または障害を治療または予防するための方法におけるそのような複製可能ＲＮＡ分子の使用に関する。

【0015】

本発明は、一部には、５’または３’保存配列要素（ＣＳＥ）内のＲＮＡ二次構造が、ヌクレオチドの修飾時にそれらの形状または安定性を変化させるという仮説に基づく。ＲＮＡ複製は、ＲＮＡ鋳型とレプリカーゼとの相互作用に依存する。したがって、ＲＮＡとレプリカーゼとの不適切な相互作用は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ転写に大きな影響を及ぼす。ＲＮＡ構造はヌクレオチド配列に依存するので、本発明者らは、修飾ＲＮＡが、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵのカノニカルヌクレオチドをＮ１－メチル－シュードウラシルなどの修飾ヌクレオチドで置換することによって、配列の変化時にレプリカーゼと適切に相互作用する構造を適合させることができると提案した。本発明者らは、本明細書に開示される実験結果によって実証されるように、インビトロ進化法が、ｒＲＮＡの機能を回復または改善させる配列変化の同定を可能にすることを示した。

【0016】

一態様では、本発明は、修飾された複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の機能を少なくとも部分的に回復または増加させる修飾ヌクレオチドを含むｒＲＮＡ（修飾ｒＲＮＡ）における配列変化を同定するための方法であって、（ａ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）を発現する細胞に、目的の遺伝子をコードする修飾ｒＲＮＡをトランスフェクトする工程；および（ｂ）目的の遺伝子を発現するトランスフェクトされた細胞中に存在する目的の遺伝子をコードするｒＲＮＡ分子内の配列変化を同定する工程を含む、方法に関する。ｒＲＮＡは、翻訳され得る（＋鎖）一本鎖ＲＮＡ分子であり得、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）をコードしてもコードしなくてもよいが、別個に提供されるレプリカーゼによってトランスで、または同じｒＲＮＡによってコードされるレプリカーゼによってシスで分子が複製されることを可能にするヌクレオチド配列を含む。ｒＲＮＡ分子は、トランスレプリコン（ＴＲ）またはレプリコンとも呼ばれ得る。さらに、ｒＲＮＡは、遺伝子配列、例えば抗原をコードする野生型またはコドン最適化配列を含み得、ｒＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してｒＲＮＡの最大有効性のために最適化された１つ以上の構造要素を含み得る（５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）尾部）。一実施形態では、配列変化は、レプリコンの５’調節領域に存在する。

【0017】

一実施形態では、ｒＲＮＡまたはヌクレオチド修飾ｒＲＮＡの機能の回復または改善は、例えばトランスフェクション後の一定期間後、例えばトランスフェクション後１、２、３、４、５、６、１２、１８、２４時間後またはトランスフェクション後１、２、３、４もしくは５日後に、目的の遺伝子の発現レベルの回復または改善によって決定され得る。一実施形態では、ｒＲＮＡの機能の回復または改善は、例えば、トランスフェクション後１、２、３、４、５、６、１２、１８、２４時間または１、２、３、４もしくは５日などの一定期間後のトランスフェクト細胞におけるｒＲＮＡの総コピー数によって測定される、ｒＲＮＡが複製される能力の回復または改善によって決定され得る。

【0018】

一実施形態では、配列変化は、工程（ａ）でトランスフェクトされた修飾ｒＲＮＡの配列に対して決定され得る。配列変化はまた、参照配列に対して決定され得る。一実施形態では、本方法の工程（ａ）は、トランスフェクト後に、目的の遺伝子を発現するトランスフェクト細胞から目的の遺伝子をコードするｒＲＮＡ分子を単離して、単離されたｒＲＮＡ分子を提供することをさらに含み得る。一実施形態では、工程（ａ）は、レプリカーゼを発現する細胞に、目的の遺伝子をコードし、修飾ヌクレオチドを含むｒＲＮＡ分子の後続世代をトランスフェクトする工程をさらに含み得、後続世代は、単離されたｒＲＮＡ分子を複製することによって提供され得る。

【0019】

一実施形態では、本方法は、目的の遺伝子を発現するトランスフェクトされた細胞から目的の遺伝子をコードするｒＲＮＡ分子を単離して、単離されたｒＲＮＡ分子を提供する工程、およびレプリカーゼを発現する細胞に、目的の遺伝子をコードし、修飾ヌクレオチドを含むｒＲＮＡ分子の後続世代をトランスフェクトする工程を反復することをさらに含み得、後続世代は、単離されたｒＲＮＡ分子を複製することによって提供され得る。工程は、（ｎ）回繰り返されてもよく、ｎは少なくとも１の整数であり得る。工程は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回またはそれ以上繰り返すことができる。一実施形態では、単離されたｒＲＮＡ分子を複製することは、（ｉ）目的の遺伝子をコードする単離されたｒＲＮＡ分子を逆転写して、インビトロ転写され得るＤＮＡ分子を形成すること；および（ｉｉ）同じ修飾ヌクレオチドの存在下でＤＮＡ分子をインビトロ転写して、修飾ヌクレオチドを含み、目的の遺伝子をコードする修飾ｒＲＮＡ分子の後続世代を生成することを含む。逆転写は、ワンステップ逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を含む方法によって達成され得る。

【0020】

一実施形態では、本方法は、（ｃ）少なくとも１つの同定された配列変化を工程（ａ）の修飾ｒＲＮＡに組み込む工程；（ｄ）レプリカーゼを発現する細胞に、工程（ｃ）で生成された修飾ｒＲＮＡをトランスフェクトする工程；および（ｅ）工程（ｄ）で生成された目的の遺伝子を発現するトランスフェクトされた細胞から単離されたｒＲＮＡ分子内の配列変化を同定する工程をさらに含み得る。一実施形態では、この方法において使用される細胞は、インターフェロン応答を伴わない細胞である。

【0021】

いくつかの実施形態では、複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）中の修飾ヌクレオチド（１つ以上）は、５’キャップ構造ではないか、または５’キャップ構造以外である。一実施形態では、本方法において有用な修飾ｒＲＮＡ中の修飾ヌクレオチドの数は、ｒＲＮＡ中のヌクレオチドの総数の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％であり得る。好ましくは、本方法において有用な修飾ｒＲＮＡ中の修飾ヌクレオチドの数は、ｒＲＮＡ中のヌクレオチドの総数の少なくとも３０％であり得る。より好ましくは、本方法において有用な修飾ｒＲＮＡ中の修飾ヌクレオチドの数は、ｒＲＮＡ中のヌクレオチドの総数の少なくとも５０％であり得る。修飾ヌクレオチドは、修飾ウリジン残基、修飾アデニン残基、修飾グアニン残基、修飾シトシン残基、または前述の２つ以上の任意の組合せであり得る。一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、シュードウリジンまたはＮ１－メチル－シュードウリジンなどの修飾ウリジンである。一実施形態では、インビトロ転写された修飾ｒＲＮＡ中の修飾ウリジン残基の数は、ウリジン残基の総数の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％であり得る。インビトロ転写された修飾ｒＲＮＡ中の修飾ウリジン残基（例えばシュードウリジンまたはＮ１－メチル－シュードウリジン残基）の数は、ウリジン残基の総数の少なくとも３０％であり得る。好ましくは、インビトロ転写された修飾ｒＲＮＡ中の修飾ウリジン残基（例えばシュードウリジンまたはＮ１－メチル－シュードウリジン残基）の数は、ウリジン残基の総数の少なくとも５０％であり得る。インビトロ転写された修飾ｒＲＮＡ中の修飾ウリジン残基（例えばシュードウリジンまたはＮ１－メチル－シュードウリジン残基）の数は、ウリジン残基の総数の約１００％（すなわち、実質的に全て）であり得る。一実施形態では、インビトロ転写された修飾ｒＲＮＡ中のＮ１－メチル－シュードウリジン残基の数は、ウリジン残基の総数の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％であり得る。好ましくは、インビトロ転写された修飾ｒＲＮＡ中のＮ１－メチル－シュードウリジン残基の数は、ウリジン残基の総数の少なくとも３０％であり得る。より好ましくは、インビトロ転写された修飾ｒＲＮＡ中のＮ１－メチル－シュードウリジン残基の数は、ウリジン残基の総数の少なくとも５０％であり得る。

【0022】

一実施形態では、本方法において有用なｒＲＮＡは、本質的に、ウイルスの機能的構造タンパク質をコードしていなくてもよい、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばアルファウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルスのゲノムである。

【0023】

一実施形態では、本方法において有用なレプリカーゼは、アルファウイルス、例えばセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、シンドビスウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス、またはチクングニアウイルスなどの自己複製ＲＮＡウイルスに由来し得る。一実施形態では、アルファウイルスは、ＳＦＶまたはＶＥＥＶまたはＥＥＥＶまたはシンドビスウイルスであり得る。

【0024】

一実施形態では、本方法において有用なｒＲＮＡは、開始コドンを有しない５’調節領域を含む。一実施形態では、レプリカーゼおよび複製のためにレプリカーゼが必要とする本方法において有用なｒＲＮＡ中の調節配列は、同じアルファウイルスまたは異なるアルファウイルスに由来する。

【0025】

ｒＲＮＡがレプリカーゼをコードするオープンリーディングフレームも含む実施形態では、レプリカーゼオープンリーディングフレームの翻訳を内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の翻訳制御下に置くことによって、レプリカーゼオープンリーディングフレームの翻訳を５’末端キャップから切り離す。一実施形態では、ｒＲＮＡはキャップされていなくてもよい。一実施形態では、ｒＲＮＡは、ＩＲＥＳの上流のさらなる遺伝子の発現のためのオープンリーディングフレームを有し得る。

【0026】

一実施形態では、コードされた目的の遺伝子は、抗原またはレポータ遺伝子、例えば細胞表面発現タンパク質またはルシフェラーゼまたはＧＦＰであり得る。

【0027】

一実施形態では、本方法において有用な細胞におけるレプリカーゼの発現は、一過性発現または構成的発現によるものであり得る。一実施形態では、細胞を、ｒＲＮＡ（必ずしもレプリカーゼをコードしない）のトランスフェクションの前に、トランスフェクションと同時に、またはトランスフェクションの後に、レプリカーゼをコードする核酸分子でトランスフェクトする。一実施形態では、レプリカーゼをコードする核酸分子は、ｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子である。一実施形態では、本方法の工程（ａ）は、目的の遺伝子をコードする自己増幅ＲＮＡで細胞をトランスフェクトすることを含み、自己複製ＲＮＡは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。

【0028】

一実施形態では、部分的に回復または増加されるｒＲＮＡの機能は、レプリカーゼによって複製される能力であり得、および／または、例えば５’調節領域によって指示される、翻訳される能力であり得る。一実施形態では、機能を少なくとも１０％回復させることができ、または少なくとも１０％増加させることができる。

【0029】

一実施形態では、配列変化を同定する工程は、ｒＲＮＡ分子の少なくとも一部を配列決定することを含み得る。一実施形態では、配列決定されるｒＲＮＡの一部は５’調節領域であり得、および／または配列決定されるｒＲＮＡの一部は３’調節領域である。一実施形態では、配列変化は、次世代シーケンシングなどの配列決定によって生成された配列特異的リード頻度を分析することによって決定され得る。

【0030】

一実施形態では、本方法は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む自己増幅ＲＮＡの複製効率を高めるために実施され得る。

【0031】

一実施形態では、本方法は、修飾ヌクレオチドを含むｒＲＮＡまたは自己複製ＲＮＡの機能を部分的に回復または増加させる少なくとも１つの同定された配列変化を組み込むことによって、同じ修飾ヌクレオチドを含むｒＲＮＡまたは自己複製ＲＮＡのヌクレオチド配列を修飾することをさらに含む。

【0032】

一態様では、本発明は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、上記の本発明の方法によって得られる複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子に関する。一実施形態では、得られるｒＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡウイルスの変異した５’調節領域を含む。一実施形態では、変異した５’調節領域は、１つ以上の点突然変異を含む。特定の実施形態では、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む本発明の方法によって得られるｒＲＮＡ分子は、この方法に供されない親ｒＲＮＡ分子と比較して増加したレベルでレプリカーゼによって複製／転写され得る。一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、ｒＲＮＡ分子の全ヌクレオチドのうちの少なくとも３０％、５０％、７５％の修飾ヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の本発明の方法によって得ることができる複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子であって、ｒＲＮＡ分子中のウリジン残基の総数の少なくとも５０％（好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは約１００％）が修飾ウリジン残基（例えばシュードウリジンまたはＮ１－メチル－シュードウリジン残基）であり、この方法に供されない親ｒＲＮＡ分子と比較して同様のまたは増加したレベルでレプリカーゼによって複製／転写され得る、複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子を提供する。いくつかの実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、ｒＲＮＡ分子の野生型５’調節領域を含む対応するｒＲＮＡ分子と比較して、任意で配列番号１または配列番号２を含む５’調節領域（ＶＥＥＶトリニダードロバ株（アクセッション番号Ｌ０１４４２）の５’調節領域の野生型または改変型）を有する対応するｒＲＮＡ分子と比較して、同様のまたは増加したレベルでレプリカーゼによって複製／転写され得る。レプリカーゼはアルファウイルスレプリカーゼであり得る。いくつかの実施形態では、レプリカーゼは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、またはチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、好ましくはＳＦＶ、ＶＥＥＶまたはＥＥＶ、より好ましくはＳＦＶ由来の非構造タンパク質を含む。

【0033】

本発明の一態様では、修飾された変異ｒＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡウイルスの修飾された５’調節領域を含み、この修飾された調節領域は、５’調節領域（配列番号２）の６７、２４４、２４５、２４６、２４８位、または配列番号２のそれらの位置に対応するアルファウイルスの５’調節領域の位置の１つ以上に点突然変異を含み得る。

【0034】

一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドを含み得る。

【0035】

配列番号２は、とりわけ、野生型配列の５’末端（配列番号１）と比較して、Ｇ残基の付加によってウイルス５’末端が改変されているＶＥＥＶトリニダードロバ株（アクセッション番号Ｌ０１４４２）の５’調節配列である。ＲＮＡのＤＮＡ鋳型におけるこの修飾は、Ｔ７ポリメラーゼを使用した効率的なインビトロ転写を可能にする。

【0036】

一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、５’調節領域において、５’調節領域（配列番号２）の４位または配列番号２のその位置に対応するアルファウイルスの５’調節領域の位置に点突然変異、好ましくはグアニン残基のアデノシン残基による置換（Ｇ４Ａ）をさらに含み得る。

【0037】

一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、５’調節領域において、５’調節領域（配列番号２）の４位または配列番号２のその位置に対応するアルファウイルスの５’調節領域の位置に点突然変異を含まず、好ましくはグアニン残基のアデノシン残基による置換（Ｇ４Ａ）を含まない。

【0038】

自己複製ＲＮＡウイルスはアルファウイルスであり得る。

【0039】

配列番号１は、最も５’側のＧ残基を含まない、ＶＥＥＶトリニダードロバ株（アクセッション番号Ｌ０１４４２）の野生型５’調節領域である。したがって、配列番号２の４、６７、２４４、２４５、２４６および２４８位は、それぞれ配列番号１の３、６６、２４３、２４４、２４５および２４７位に対応し、配列番号２の４、６７、２４４、２４５、２４６および２４８位におけるヌクレオチドの同一性は、それぞれ配列番号１の３、６６、２４３、２４４、２４５および２４７位におけるヌクレオチドの同一性と同じである。

【0040】

様々な実施形態では、点突然変異は、配列番号２の６７位、６７および２４４位、６７および２４６位、６７および２４８位、６７、２４５および２４８位、４および６７位、４、６７および２４４位、４、６７および２４６位、４、６７および２４８位、４、６７、２４５および２４８位、またはそれらの任意の組合せ、または配列番号２のそのような位置に対応するアルファウイルスの位置に存在し得る。

【0041】

様々な実施形態では、点突然変異は、配列番号２の以下の位置の１つ以上もしくは位置の組合せ、またはアルファウイルスの５’調節領域の対応する位置に存在し得る：
６７位；２４４位；２４５位；２４６位；２４８位；６７および２４４位；６７および２４５位；６７および２４６位；６７および２４８位；２４４および２４５位；２４４および２４６位；２４４および２４８位；２４５および２４６位；２４５および２４８位；２４６および２４８位；６７、２４４および２４５位；６７、２４４および２４６位；６７、２４４および２４８位；６７、２４５および２４６位；６７、２４５および２４８位；６７、２４６および２４８位；２４４、２４５および２４６位；２４４、２４５および２４８位；２４４、２４６および２４８位；２４５、２４６および２４８位；６７、２４４、２４５および２４６位；６７、２４４、２４５および２４８位；６７、２４４、２４６および２４８位；６７、２４５、２４６および２４８位；２４４、２４５、２４６および２４８位；６７、２４４、２４５、２４６および２４８位。

【0042】

一実施形態では、ｒＲＮＡ分子の修飾された調節領域は、配列番号２の６７位または配列番号２のこの位置に対応するアルファウイルスの５’調節領域の位置、および５’調節領域（配列番号２）の２４４、２４５、２４６、２４８位の１つ以上または配列番号２のそれらの位置に対応するアルファウイルスの５’調節領域の位置に点突然変異を含む。

【0043】

上記の各位置または位置の組合せにおいて、点突然変異は、配列番号２の４位またはアルファウイルスの５’調節領域の対応する位置にさらに存在し得る。

【0044】

一実施形態では、様々な位置における点突然変異は、Ｇ４Ａ、Ａ６７Ｃ、Ｇ２４４Ａ、Ｃ２４５Ａ、Ｇ２４６Ａ、またはＣ２４８Ａであり得る。

【0045】

一実施形態では、自己複製ＲＮＡウイルスは、ＳＦＶまたはＶＥＥＶまたはＥＥＥＶまたはシンドビスウイルスであり得る。

【0046】

一実施形態では、別のアルファウイルスの対応する位置は、５’調節領域の最初のヌクレオチドに対して同じ位置および／または他のアルファウイルスの５’調節領域に見出されるステム／ループ構造の１つに見出される同じ相対位置であり得る。

【0047】

一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、１つ以上のコード領域、例えば目的の遺伝子をコードする配列を含む１つ以上のコード領域をさらに含むことができる。コードされる目的の遺伝子は、例えば、抗原または治療用タンパク質または核酸またはレポータ遺伝子であり得る。一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原もしくは真菌抗原、またはアレルゲンである。

【0048】

一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）、例えばアルファウイルスレプリカーゼをコードすることができる。一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、５’調節領域およびレプリカーゼのコード配列を含むことができ、５’調節領域およびコードされたレプリカーゼは、同じ自己複製ＲＮＡウイルス、例えば同じアルファウイルスに由来する。一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、５’調節領域およびレプリカーゼのコード配列を含むことができ、５’調節領域およびコードされたレプリカーゼは、異なる自己複製ＲＮＡウイルス、例えば異なるアルファウイルスに由来する。

【0049】

一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、自己増幅ＲＮＡ、すなわちレプリカーゼをコードするものであり得る。一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、インビトロ転写反応で生成される、すなわち細胞内で生成されないインビトロ転写ｒＲＮＡであり得る。

【0050】

ｒＲＮＡがレプリカーゼをコードするオープンリーディングフレームも含む場合、レプリカーゼオープンリーディングフレームの翻訳を内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の翻訳制御下に置くことによって、レプリカーゼオープンリーディングフレームの翻訳を５’末端キャップから切り離すことができる。一実施形態では、ｒＲＮＡはキャップされていなくてもよい。一実施形態では、ｒＲＮＡは、ＩＲＥＳの上流のさらなる遺伝子の発現のためのオープンリーディングフレームを有し得る。

【0051】

一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、例えば上記のように、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、すなわちアデノシン、グアニン、シトシンまたはウラシルではないヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、修飾ヌクレオチドは、骨格結合、糖部分または塩基において修飾され得、修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、修飾ヌクレオチドはＮ１－メチル－シュードウリジンであり得る。一実施形態では、ｒＲＮＡのウリジン残基の全てがＮ１－メチル－シュードウリジン残基である。

【0052】

一実施形態では、ｒＲＮＡは安定化ｒＲＮＡであり得る。一実施形態では、ｒＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含むことができる。一実施形態では、ｒＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含むことができる。一実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψまたは１ｍＹ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択され得る。

【0053】

一態様では、本発明は、４、６７、２４４、２４５、２４６および２４８位の１つ以上が点突然変異を有する、配列番号２に示される配列を含むＲＮＡ分子に関する。様々な実施形態では、点突然変異は、６７位；２４４位；２４５位；２４６位；２４８位；６７および２４４位；６７および２４５位；６７および２４６位；６７および２４８位；２４４および２４５位；２４４および２４６位；２４４および２４８位；２４５および２４６位；２４５および２４８位；２４６および２４８位；６７、２４４および２４５位；６７、２４４および２４６位；６７、２４４および２４８位；６７、２４５および２４６位；６７、２４５および２４８位；６７、２４６および２４８位；２４４、２４５および２４６位；２４４、２４５および２４８位；２４４、２４６および２４８位；２４５、２４６および２４８位；６７、２４４、２４５および２４６位；６７、２４４、２４５および２４８位；６７、２４４、２４６および２４８位；６７、２４５、２４６および２４８位；２４４、２４５、２４６および２４８位；６７、２４４、２４５、２４６および２４８位に存在し得る。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、６７位ならびに４、２４４、２４５、２４６および２４８位の１つ以上が点突然変異を有する、配列番号２に示される配列を含む。前述の位置の各々または位置の組合せにおいて、さらなる点突然変異が４位に存在し得る。一実施形態では、点突然変異は、Ｇ４Ａ、Ａ６７Ｃ、Ｇ２４４Ａ、Ｃ２４５Ａ、Ｇ２４６Ａ、および／またはＣ２４８Ａであり得る。

【0054】

一態様では、本発明は、配列番号２の本明細書に開示される位置に１つ以上の点突然変異を含むｒＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子に関する。一実施形態では、ｒＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子は、直鎖状または環状であり得る。

【0055】

一実施形態では、ｒＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、ｒＲＮＡまたはＤＮＡ分子と共に粒子を形成することができる試薬を用いて製剤化されてもよく、例えば、試薬は脂質またはポリアルキレンイミンであり得る。様々な実施形態では、脂質はカチオン性頭部基を含むことができ、および／または脂質はｐＨ応答性脂質であり得、および／または脂質はＰＥＧ化脂質であり得る。一実施形態では、試薬をポリサルコシンにコンジュゲートすることができる。一実施形態では、ｒＲＮＡまたはＤＮＡ分子および試薬から形成される粒子は、ポリマーベースのポリプレックス（ＰＬＸ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であり得、ＬＮＰは、好ましくはリポプレックス（ＬＰＸ）またはリポソームである。一実施形態では、粒子は、少なくとも１つのホスファチジルセリンをさらに含み得る。一実施形態では、粒子は、ナノ粒子であって、（ｉ）ナノ粒子中の正電荷の数がナノ粒子中の負電荷の数を超えず、および／または（ｉｉ）ナノ粒子が中性もしくは正味の負電荷を有し、および／または（ｉｉｉ）ナノ粒子の正電荷対負電荷の電荷比が１．４：１以下であり、および／または（ｉｖ）ナノ粒子のゼータ電位が０以下である、ナノ粒子であり得る。一実施形態では、ナノ粒子中の正電荷対負電荷の電荷比は、１．４：１～１：８、好ましくは１．２：１～１：４であり得る。

【0056】

一実施形態では、ｒＲＮＡまたはＤＮＡは、液体、固体、またはそれらの組合せとして製剤化され得るか、または製剤化されるべきである。一実施形態では、ｒＲＮＡまたはＤＮＡは、注射用に製剤化され得るか、または製剤化されるべきである。一実施形態では、ｒＲＮＡまたはＤＮＡは、筋肉内投与用に製剤化され得るか、または製剤化されるべきである。一実施形態では、ｒＲＮＡまたはＤＮＡは、粒子として製剤化され得るか、または製剤化されるべきである。一実施形態では、粒子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）またはリポプレックス（ＬＰＸ）粒子である。一実施形態では、ＬＮＰ粒子は、（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、およびコレステロールを含む。

【0057】

一実施形態では、ｒＲＮＡリポプレックス粒子は、ｒＲＮＡをリポソームと混合することによって得ることができる。一実施形態では、ｒＲＮＡリポプレックス粒子は、ｒＲＮＡを脂質と混合することによって得ることができる。

【0058】

一実施形態では、ｒＲＮＡは、コロイドとして製剤化され得るか、または製剤化されるべきである。一実施形態では、ｒＲＮＡは、コロイドの分散相を形成する粒子として製剤化され得るか、または製剤化されるべきである。一実施形態では、５０％以上、７５％以上、または８５％以上のｒＲＮＡが分散相に存在する。一実施形態では、ｒＲＮＡは、ｒＲＮＡおよび脂質を含む粒子として製剤化され得るか、または製剤化されるべきである。一実施形態では、粒子は、水相に溶解したｒＲＮＡを有機相に溶解した脂質と共に曝露することによって形成され得る。一実施形態では、有機相はエタノールを含むことができる。一実施形態では、粒子は、水相に溶解したｒＲＮＡを水相に分散した脂質と共に曝露することによって形成され得る。一実施形態では、水相に分散した脂質はリポソームを形成する。

【0059】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の点突然変異を含むｒＲＮＡ分子またはそのようなｒＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。

【0060】

一態様では、本発明は、細胞内で目的の遺伝子産物を発現させるための方法であって、自己複製ＲＮＡウイルス、好ましくはアルファウイルスの修飾５’調節領域を含むｒＲＮＡを細胞に提供することを含み、修飾調節領域が、配列番号２の６７、２４４、２４５、２４６、２４８位の１つ以上、好ましくは配列番号２の６７位と、２４４、２４５、２４６、２４８位の１つ以上とに点突然変異、ならびに目的の遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを含む、方法に関する。

【0061】

一態様では、本発明は、治療において使用され得る、本明細書に記載の点突然変異を含むｒＲＮＡ、またはコードＤＮＡ分子、またはｒＲＮＡもしくはＤＮＡ分子を含む医薬組成物に関する。一態様では、本発明は、対象において免疫応答を惹起するための方法であって、抗原をコードするｒＲＮＡ分子を対象に投与することを含み、ｒＲＮＡ分子が自己複製ＲＮＡウイルス、好ましくはアルファウイルスの修飾５’調節領域を含み、修飾調節領域が、配列番号２の６７、２４４、２４５、２４６、２４８位の１つ以上、好ましくは配列番号２の６７位と、２４４、２４５、２４６、２４８位の１つ以上とに点突然変異を含む、方法に関する。

【0062】

一態様では、本発明は、対象における癌を治療するための方法であって、腫瘍抗原をコードするｒＲＮＡ分子を対象に投与することを含み、ｒＲＮＡが自己複製ＲＮＡウイルス、好ましくはアルファウイルスの修飾５’調節領域を含み、修飾調節領域が、配列番号２の６７、２４４、２４５、２４６、２４８位の１つ以上、好ましくは配列番号２の６７位と、２４４、２４５、２４６、２４８位の１つ以上とに点突然変異を含む、方法に関する。

【0063】

一態様では、本発明は、遺伝子機能を欠く対象にそのような遺伝子機能を提供するための方法であって、遺伝子産物（治療用タンパク質）をコードするｒＲＮＡ分子を対象に投与して遺伝子機能を提供することを含み、ｒＲＮＡ分子が自己複製ＲＮＡウイルス、好ましくはアルファウイルスの修飾５’調節領域を含み、修飾調節領域が、配列番号２の６７、２４４、２４５、２４６、２４８位の１つ以上、好ましくは配列番号２の６７位と、２４４、２４５、２４６、２４８位の１つ以上とに点突然変異を含む、方法に関する。

【0064】

一実施形態では、点突然変異は、配列番号２の４位にさらに存在し得る。一実施形態では、遺伝子産物の発現または治療に有用なｒＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えばＮ１－メチル－シュードウリジンを含む。そのようなｒＲＮＡは、レプリカーゼをコードする配列をさらに含むという点で、自己増幅ＲＮＡ分子であり得る。

【0065】

ｒＲＮＡ分子の前述の特徴のいずれもが、ｒＲＮＡの機能を回復または改善するための配列変化を同定するために使用される本発明の方法で使用されるｒＲＮＡ、ならびにその配列に組み込まれたそのような同定された配列変化を有するｒＲＮＡ分子に等しく適用され得る。

【図面の簡単な説明】

【0066】

【図1】ベクターの設計（縮尺通りに描かれていない）。（図１Ａ）アルファウイルスゲノムから構築された自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡまたはｒＲＮＡ）。ｓａＲＮＡは、アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）をコードする５’－オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および目的の遺伝子をコードする３’－オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するバイシストロン性ＲＮＡである。ＯＲＦはＡＵＧ開始コドンで印付けられている。ｓａＲＮＡのコード領域は、ウイルスの５’および３’非翻訳領域（ｖＵＴＲ）に隣接している。さらに、これは、ＲＮＡ複製に必要な保存配列要素（ＣＳＥ）（ゲノムプラス鎖プロモータ（５’複製認識配列ＲＲＳ）を含むＣＳＥ１および２、コアゲノムマイナス鎖プロモータＣＳＥ４ならびにサブゲノムプロモータＣＳＥ３）からなる調節領域を含む。注目すべきことに、５’－ＣＳＥと３’－ＣＳＥの両方が協同して、マイナス鎖合成を開始する。レプリカーゼのＯＲＦの開始コドンは５’調節領域内にある。（図１Ｂ）指向性進化に使用されるトランス増幅ＲＮＡ系。アルファウイルスレプリカーゼは、非ウイルス５’および３’ＵＴＲ、ならびに長いポリＡ尾部（ｐＡ）を有する非複製ｍＲＮＡによってコードされる。このｍＲＮＡを、選択可能な表面マーカとして使用される細胞表面発現ＣＤ９０．１をコードするトランスレプリコンと共に同時トランスフェクトする。トランスレプリコンは、５’ＲＲＳがＡＵＧを欠き、コード配列がそれら自体の明確なＡＵＧから始まって下流に挿入されるように構築した。構築物は、選択マーカ遺伝子に影響を及ぼすことなくヌクレオチドを変化させることを可能にする。

【図2】トランスレプリコン鋳型およびＲＮＡ合成。（図２Ａ）トランスレプリコンをコードするＣＤ９０．１を、Ｔ７－ＲＮＡポリメラーゼプロモータを５’末端に結合させるフォワードプライマ、および終結コドンと重複するＣＤ９０．１ ＯＲＦの３’末端に結合するリバースプライマによってＰＣＲ増幅されるプラスミドに挿入する。リバースプライマは、最小の３’ＣＳＥおよび短いポリＡ（３０個のアデノシン）を３’末端に結合する。得られたＰＣＲ産物は、通常のヌクレオチドＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、またはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＮ１－メチル－シュード－ＵＴＰのいずれかを使用して、Ｔ７ポリメラーゼ駆動ＲＮＡインビトロ転写（ＩＶＴ）の鋳型として機能する。（図２Ｂ）レプリカーゼｍＲＮＡ合成。Ｔ７プロモータ、５’ＵＴＲ、レプリカーゼＯＲＦ、３’ＵＴＲおよび長いポリＡ尾部（１００Ａ）をコードするプラスミドを、ポリＡ尾部の末端で制限酵素を用いて線状化する。通常のヌクレオチドを使用して、この線状化プラスミドを、レプリカーゼを発現する非修飾（ＵＴＰ含有）ｍＲＮＡにインビトロ転写する。

【図3】インビトロ進化手順。ＰＣＲ産物によって鋳型化されて、ＣＤ９０．１をコードする最初の（Ｎ＝０）トランスレプリコン（ＴＲ－ＣＤ９０．１）が、非修飾ＲＮＡ（ウリジン（Ｕ））含有、または修飾ＲＮＡ（Ｎ１－メチルシュードウリジン（１ｍＹ（もしくはｍ１ψ）含有）にインビトロ転写される（ＩＶＴ）。インビトロ転写ＲＮＡのそれぞれを、レプリカーゼコードｍＲＮＡと共に細胞にエレクトロポレーションする。翌日、ＣＤ９０．１の表面発現をフローサイトメトリによって評価する。最初に、Ｕを含む複製可能ＲＮＡまたはトランスレプリコン（ＴＲ）による発現は、理想化した棒グラフに示されているように、代わりに１ｍＹを含むＴＲによる発現よりもはるかに高い。修飾ＲＮＡ対非修飾ＲＮＡによる全発現の比（１ｍＹ指数）は１をはるかに下回る。次に、ＣＤ９０．１を発現する修飾ＴＲトランスフェクト細胞を磁気支援細胞選別（ＭＡＣＳ）によって濃縮し、溶解し、細胞ＴＲコピーを、ＴＲ特異的プライマを使用するワンステップＲＴ－ＰＣＲによってｃＤＮＡおよび新規ＰＣＲ産物に変換する。次いで、このサイクルＮ＋１ ＰＣＲ産物を再び使用して、細胞の新規エレクトロポレーションのためのＵおよび１ｍＹ ＴＲ－ＲＮＡを合成する。サイクル数の増加に伴う１ｍＹ指数の堅固で再現性のある増加が、理想化した棒グラフに示されているように観察されるまで、この手順をＮ回繰り返し、本明細書で実証されるように観察した。

【図4A】（図４）ＴＲ－ＣＤ９０．１は、１１サイクルのインビトロ進化後に１ｍＹ修飾との適合性の増加を獲得する。１１サイクルのインビトロ進化の後、得られた細胞抽出逆転写ＴＲを、ＵＴＰの代わりに漸増量の１ｍＹを使用してインビトロ転写した。これらの徐々に修飾されたＴＲを、レプリカーゼコードｍＲＮＡと共にＫ５６２細胞にエレクトロポレーションした。（図４Ａ）翌日、ＣＤ９０．１の発現をフローサイトメトリによって評価した。

【図4B】（図４Ｂおよび４Ｂ－１）図４Ｂ－１は、統計分析を伴う反復実験を表す）１ｍＹ指数を、非修飾ＴＲに対する修飾ＴＲによるＣＤ９０．１発現の比として計算した。

【図5】１１サイクルのインビトロ進化後の５’ＣＳＥ領域に関する点突然変異の蓄積。１１サイクルのインビトロ進化の後、得られた細胞抽出逆転写ＴＲをＰＣＲ増幅し、ＮＧＳによって配列決定した。変異ＴＲ転写物をそれらの頻度に従ってランク付けした。ここに示される突然変異は、４つの最も高頻度の転写物であるか、または４つの最も高頻度の転写物に存在し、さらなる分析のために選択した。他の全ての変異は、０．８５％未満の最大頻度で見出され、ここに列挙した。数はヌクレオチド位置に等しく、１は最初のインビトロ転写Ｇである。

【図6A】（図６）５’ＣＳＥ内で同定された点突然変異は、修飾されたトランスレプリコンの複製および発現を増加させる。（図６Ａ）Ｋ５６２細胞に、ＳＦＶレプリカーゼをコードする２．６μｇの非修飾ｍＲＮＡおよびＣＤ９０．１をコードする０．０３μｇの修飾（１ｍＹ）または非修飾（ＵＴＰ）ＶＥＥＶ－ＮＴＲをエレクトロポレーションした。ＮＴＲは、非変異体（ＷＴ）であるか、または示されるように５’ＣＳＥ内に同定されたインビトロ進化変異を有していた。

【図6B】（図６Ｂ）翌日、ＮＴＲに起因するＣＤ９０．１発現をフローサイトメトリによって評価した。トランスフェクション率は、ヒストグラム内のマーカバーの上の数字によって示されている。

【図6C】（６Ｃおよび６Ｃ－１）図６Ｃ－１は、統計分析による反復実験を表す。）フローサイトメトリデータに基づいて１ｍＹ指数を算出した。この指数は、非修飾ＮＴＲに対する修飾ＮＴＲによる発現の比を定量化する。

【図7A】（図７）ＶＥＥＶ－ＴＣ－８３株に由来する単一の５’ヌクレオチド交換は、ＳＦＶレプリカーゼに応答して修飾および非修飾トランスレプリコンの発現を改善する。（図７Ａ）Ｋ５６２細胞に、ＳＦＶレプリカーゼをコードする２．６μｇの非修飾ｍＲＮＡおよびＣＤ９０．１をコードする０．０３μｇの修飾（１ｍＹ）または非修飾（ＵＴＰ）ＶＥＥＶ－ＮＴＲをエレクトロポレーションした。ＮＴＲは、非変異体（ＷＴ）であるか、またはＴＣ－８３特異的５’変異（ベクターの５’末端Ｇから数えて４位でのＧのａへの交換）を有していた。

【図7B】（図７Ｂ）翌日、ＮＴＲに起因するＣＤ９０．１発現をフローサイトメトリによって評価した。トランスフェクション率は、ヒストグラム内のマーカの上の数字によって示されている。

【図7C】（図７Ｃ、７Ｃ－１）図７Ｃ－１は、統計分析による反復実験を表す。フローサイトメトリデータに基づいて１ｍＹ指数を算出した。この指数は、非修飾ＮＴＲに対する修飾ＮＴＲによる発現の比を定量化する。

【図8A】（図８）ＴＣ－８３特異的５’変異は、インビトロ進化によって同定された点突然変異と協働して、ＳＦＶレプリカーゼによって増幅された修飾トランスレプリコンの発現をさらに増加させる。（図８Ａ）Ｋ５６２細胞に、ＳＦＶレプリカーゼをコードする２．６μｇの非修飾ｍＲＮＡおよびＣＤ９０．１をコードする０．０３μｇの修飾（１ｍＹ）または非修飾（ＵＴＰ）ＶＥＥＶ－ＮＴＲをエレクトロポレーションした。ＮＴＲは、非変異体（ＷＴ）であるか、ＶＥＥＶ－ＴＣ－８３の５’変異（ＴＣ－８３）を担持するか、またはさらに、示されているように５’ＣＳＥ内の同定されたインビトロ進化変異を担持していた。

【図8B】（図８Ｂ）翌日、ＮＴＲに起因するＣＤ９０．１発現をフローサイトメトリによって評価した。トランスフェクション率は、ヒストグラム内のマーカバーの上の数字によって示されている。

【図8C】（図８Ｃ、８Ｃ－１）図８Ｃ－１は、統計分析による反復実験を表す。フローサイトメトリデータに基づいて１ｍＹ指数を算出した。この指数は、非修飾ＮＴＲに対する修飾ＮＴＲによる発現の比を定量化する。

【図9A】（図９）レプリカーゼｍＲＮＡおよびインビトロで進化したトランスレプリコンＲＮＡの両方が修飾されている場合、トランス増幅ＲＮＡ発現はヒト線維芽細胞において大幅に増加する。（図９Ａ）初代ヒト包皮線維芽細胞を５０，０００細胞／ウェルで１２ウェルプレートに播種し、翌日、４μｌのＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘおよび１μｇの総ＲＮＡ／ウェル（０．９μｇのＳＦＶレプリカーゼｍＲＮＡおよび０．１μｇのトランスレプリコン）でリポフェクトした。ＳＦＶレプリカーゼｍＲＮＡ（ＲＥＰＬ）またはＮＴＲを、示されているように様々なバリエーションで使用した。翌日、ＮＴＲに起因するＣＤ９０．１発現をフローサイトメトリによって評価した。トランスフェクション率は、ヒストグラム内のマーカの上の数字によって示されている。

【図9B】（図９Ｂ）棒グラフとして表示したトランスフェクション率。略語：ＵＴＰ：非修飾ＲＮＡ；１ｍＹ：修飾ＲＮＡ；ＷＴ：非変異体；－ｄｓＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡの除去；ＴＣ－８３：Ｇ４Ａ変異体；３ｘＭｕｔ＝６７、２４５、２４８位におけるインビトロ進化変異体）。

【図10A】（図１０）ＶＥＥＶ－ＴＣ－８３の５’ＣＳＥは、キメラＶＥＥＶ／ＳＦＶ修飾自己増幅ＲＮＡの発現を増加させる。（図１０Ａ）ルシフェラーゼをコードするキメラＶＥＥＶ／ＳＦＶ ｓａＲＮＡを構築するために、レプリカーゼＮ末端をコードする部分を含む、ＳＦＶ－ｓａＲＮＡの５’ＣＳＥを除去した。この部分は、欠失したレプリカーゼＮ末端に対応する配列によって置き換えられ、その前に開始コドンが枯渇したＶＥＥＶ ５’ＣＳＥが存在した。第２の同様の構築物は、ＶＥＥＶ－ＴＣ－８３特異的５’変異Ｇ４Ａを担持していた。

【図10B】（図１０Ｂ）両方の構築物のＲＮＡを、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用してＫ５６２細胞（１０Ｂ）または初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）（１０Ｃ）にリポフェクトした。ルシフェラーゼ発現を７２時間にわたって測定し、曲線下面積（ＡＵＣ）を線グラフから計算して、総発現を推定した。

【図10C】（図１０Ｃ）両方の構築物のＲＮＡを、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用してＫ５６２細胞（１０Ｂ）または初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）（１０Ｃ）にリポフェクトした。ルシフェラーゼ発現を７２時間にわたって測定し、曲線下面積（ＡＵＣ）を線グラフから計算して、総発現を推定した。

【図10D】（図１０Ｄ）Ｋ５６２またはＨＦＦ細胞に、図１０Ｂおよび１０Ｃと同等であるがＧＦＰをコードするＶＥＥＶ／ＳＦＶ ｓａＲＮＡを１２ウェルプレート中でリポフェクトした。細胞を２４時間後に回収し、トランスフェクション率をフローサイトメトリによって評価した。

【図10E】（図１０Ｅ）Ｋ５６２またはＨＦＦ細胞に、図１０Ｂおよび１０Ｃと同等であるがＧＦＰをコードするＶＥＥＶ／ＳＦＶ ｓａＲＮＡを１２ウェルプレート中でリポフェクトした。細胞を２４時間後に回収し、トランスフェクション率をフローサイトメトリによって評価した。

【図11】図１１Ａは、ＶＥＥＶトリニダードロバ株（アクセッション番号Ｌ０１４４２）の５’調節領域である配列番号１の配列を示す（４５～４７位はｎｓＰ１の開始コドンである）。 図１１Ｂは、実施例で使用される配列番号２の配列を示し、これは、ＶＥＥＶトリニダードロバ株（アクセッション番号Ｌ０１４４２）の５’調節領域の改変型である。例えば、１位のＧ残基を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用した効率的なインビトロ転写のために加えた。配列番号２の２８０～２８２位は、実施例におけるコードされたレポータ遺伝子の開始コドンである。一実施形態では、この開始コドンは、コードされたレプリカーゼにも使用することができる。

【図12A】（図１２）図１２Ａ～１２Ｄは、完全に修飾された１ｍＹ適合複製ＲＮＡがマウスにおいて堅固な免疫応答を誘導することを示す。マウスを免疫して、１００％修飾ｒＲＮＡをワクチン接種に使用できるかどうか、および性能が非修飾ｒＲＮＡに匹敵するかどうかを評価した。

【図12B】（図１２Ａ、図１２Ｂ）体液性免疫を（１２Ａ）ＥＬＩＳＡによって評価して、ＨＡ特異的ＩｇＧ抗体を定量化または（１２Ｂ）ウイルス中和力価（ＶＮＴ）によって評価した。

【図12C】（図１２Ｃ）Ｔ細胞免疫を、（１２Ｃ）ＭＨＣ－Ｉまたは（１２Ｄ）ＭＨＣ－ＩＩに特異的なＨＡペプチドで刺激した脾細胞を用いたＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。

【図12D】（図１２Ｄ）Ｔ細胞免疫を、（１２Ｃ）ＭＨＣ－Ｉまたは（１２Ｄ）ＭＨＣ－ＩＩに特異的なＨＡペプチドで刺激した脾細胞を用いたＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。略語：ＨＡ：Ａ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素；ＵＴＰ：非修飾ＲＮＡ；１ｍＹ：修飾ＲＮＡ；ＷＴ：非変異体；ＴＣ－８３：Ｇ４Ａ変異体；３ｘＭｕｔ：６７、２４５、２４８位におけるインビトロ進化変異体；ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ；ＥＬＩＳｐｏｔ：酵素結合免疫吸着スポット；ＩＦＮ－γ：インターフェロンガンマ；ＭＨＣ：主要組織適合遺伝子複合体。

【図13】（図１３）図１３Ａ～１３Ｃは、ＴＲ－３ｘｍｕｔが、ＥＥＥＶレプリカーゼと共に１８サイクルのインビトロ進化を受け、ＶＥＥＶレプリカーゼと共に１５サイクルのインビトロ進化を受けた場合に、１ｍＹ修飾との適合性の増加を獲得することを示す。（図１３Ａ）Ｋ５６２細胞に、ＳＦＶレプリカーゼまたはＶＥＥＶレプリカーゼをコードする２．６μｇのｍＲＮＡ、および抽出された細胞ＲＮＡからのＲＴ－ＰＣＲ産物から転写された５４ｎｇの修飾または非修飾ＴＲを、最終的にＴＲ－３ｘｍｕｔの同定をもたらした示されている回数のインビトロ進化プロセスの後にエレクトロポレーションした。翌日、コードされたＣＤ９０．１選択マーカの発現をフローサイトメトリによって評価し、１ｍＹ指数を先のように算出した。グラフは、３つの独立した実験の平均およびＳＤを示す。パネルＡの手順と同様に、Ｋ５６２細胞に、ＥＥＥＶ（図１３Ｂ）またはＶＥＥＶ（図１３Ｃ）のレプリカーゼをコードする１．３μｇのｍＲＮＡ、および示されているサイクルのインビトロ進化の後に細胞由来ｃＤＮＡから得られた５ｎｇまたは１５ｎｇの修飾および非修飾ＴＲをエレクトロポレーションした。ここで、ＴＲ－３ｘｍｕｔを出発ＴＲとして使用してインビトロ進化を開始した。再度、トランスフェクションの翌日に１ｍＹ指数を決定した。

【発明を実施するための形態】

【0067】

本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載される特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0068】

好ましくは、本明細書で使用される用語は、“Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。

【0069】

本発明の実施は、特に指示されない限り、当分野の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９を参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。

【0070】

以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を特定の実施形態と共に列挙するが、さらなる実施形態を創出するためにそれらを任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明示的に記載される実施形態を任意の数の開示される要素および／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願において記載される全ての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されているとみなされるべきである。

【0071】

「約」という用語は、およそまたはほぼを意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈では、好ましくは列挙または特許請求される数値または範囲の＋／－１０％を意味する。

【0072】

本発明を説明する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される「１つの」および「その」という用語および同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に入る各別個の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個々の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。

【0073】

特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかしながら、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本発明の特定の実施形態として企図され、すなわちこの実施形態の目的のためには、「含む」は「からなる」の意味を有すると理解されるべきである。

【0074】

総称によって特徴付けられる成分の相対量の表示は、前記総称でカバーされる全ての特定の変異体またはメンバーの合計量を指すことが意図されている。総称によって定義された特定の成分が特定の相対量で存在すると特定され、かつ、この成分が総称でカバーされる特定の変異体またはメンバーであるとさらに特徴付けられる場合、総称でカバーされる他の変異体またはメンバーが、総称でカバーされる成分の合計相対量が特定された相対量を超えるように付加的に存在しないこと、より好ましくは総称でカバーされる他の変異体またはメンバーが全く存在しないことを意味する。

【0075】

本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明がそのような開示に先行する権利を有さなかったことの承認と解釈されるべきではない。

【0076】

本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」などの用語は、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上のレベルの全体的な減少を引き起こす能力を意味する。「阻害する」という用語または同様の語句は、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの減少を含む。

【0077】

「増加させる」または「増強する」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％の増加または増強に関する。

【0078】

「正味電荷」という用語は、化合物または粒子などの物体全体の電荷を指す。

【0079】

全体的な正味の正電荷を有するイオンはカチオンであり、全体的な正味の負電荷を有するイオンはアニオンである。したがって、本発明によれば、アニオンは陽子よりも多くの電子を有するイオンであり、正味の負電荷を与え、カチオンは陽子よりも少ない電子を有するイオンであり、正味の正電荷を与える。

【0080】

所与の化合物または粒子に関して、「帯電した」、「正味電荷」、「負に帯電した」または「正に帯電した」という用語は、ｐＨ７．０の水に溶解または懸濁した場合の所与の化合物または粒子の正味の電荷を指す。

【0081】

本発明による「核酸」という用語はまた、ヌクレオチド塩基上、糖上またはリン酸塩上の核酸、ならびに非天然ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸の化学的誘導体化を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。一般に、核酸分子または核酸配列は、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である核酸を指す。本発明によれば、核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、組換えによって調製された分子および化学合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖の線状または共有結合閉環分子の形態であり得る。

【0082】

本発明によれば、「核酸配列」は、核酸、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のヌクレオチドの配列を指す。この用語は、核酸分子全体（核酸分子全体の一本鎖など）またはその一部（例えば断片）を指し得る。

【0083】

本発明によれば、「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基からなる分子に関する。「リボヌクレオチド」という用語は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的または完全に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡなどの組換え生産されたＲＮＡを含む。そのような改変は、例えばＲＮＡの末端（一方もしくは両方）または内部への、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、非天然のヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの非標準のヌクレオチドを含み得る。これらの改変されたＲＮＡは、類似体、特に天然に存在するＲＮＡの類似体と呼ばれ得る。

【0084】

本発明によれば、ＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡが好ましい。「一本鎖ＲＮＡ」という用語は、一般に、相補的な核酸分子（典型的には相補的なＲＮＡ分子）が結合していないＲＮＡ分子を指す。一本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡの一部が折り返され、塩基対、ステム、ステムループおよびバルジを含むがこれらに限定されない二次構造モチーフを形成することを可能にする自己相補的配列を含み得る。一本鎖ＲＮＡは、マイナス鎖［（－）鎖］またはプラス鎖［（＋）鎖］として存在することができる。（＋）鎖は、遺伝情報を含むかまたはコードする鎖である。遺伝情報は、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であり得る。（＋）鎖ＲＮＡがタンパク質をコードする場合、（＋）鎖は翻訳（タンパク質合成）の鋳型として直接機能し得る。（－）鎖は（＋）鎖の相補体である。二本鎖ＲＮＡの場合、（＋）鎖と（－）鎖は２つの別個のＲＮＡ分子であり、これらの両方のＲＮＡ分子が互いに会合して二本鎖ＲＮＡ（「二重鎖ＲＮＡ」）を形成する。

【0085】

ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量、または数の半分を除去するのに必要な期間に関する。本発明に関連して、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性の指標である。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の持続期間」に影響を及ぼし得る。長い半減期を有するＲＮＡは長期間発現されると予想することができる。

【0086】

「翻訳効率」という用語は、特定の期間内にＲＮＡ分子によって提供される翻訳産物の量に関する。

【0087】

核酸配列に関する「断片」は、核酸配列の一部、すなわち５’末端および／または３’末端で短縮された核酸配列を表す配列に関する。好ましくは、核酸配列の断片は、前記核酸配列からのヌクレオチド残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。本発明では、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を保持するＲＮＡ分子の断片が好ましい。

【0088】

アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関して、「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えば、オープンリーディングフレームの３’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始するように働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えばアミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。

【0089】

例えば、本発明による核酸およびアミノ酸配列に関する「変異体」という用語は、任意の変異体、特に突然変異体、ウイルス株変異体、スプライス変異体、立体配座、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。対立遺伝子変異体は、遺伝子の正常な配列の変化に関連し、その重要性はしばしば不明である。完全な遺伝子配列決定は、所与の遺伝子について多数の対立遺伝子変異体を同定することが多い。核酸分子に関して、「変異体」という用語は縮重核酸配列を含み、本発明による縮重核酸は、遺伝暗号の縮重のためにコドン配列が参照核酸とは異なる核酸である。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。ウイルスホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なるウイルスを起源とする核酸またはアミノ酸配列である。

【0090】

本発明によれば、核酸変異体は、参照核酸と比較して、単一または複数のヌクレオチドの欠失、付加、変異、置換および／または挿入を含む。欠失は、参照核酸からの１つ以上のヌクレオチドの除去を含む。付加変異体は、１つ以上のヌクレオチド、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０またはそれ以上のヌクレオチドの５’末端および／または３’末端融合を含む。置換の場合、配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが除去され、少なくとも１つの他のヌクレオチドがその場所に挿入される（トランスバージョンおよびトランジションなど）。変異には、脱塩基部位、架橋部位、および化学的に改変または修飾された塩基が含まれる。挿入には、参照核酸への少なくとも１つのヌクレオチドの付加が含まれる。

【0091】

本発明によれば、「ヌクレオチド変化」は、参照核酸と比較して、単一または複数のヌクレオチドの欠失、付加、変異、置換および／または挿入を指し得る。いくつかの実施形態では、「ヌクレオチド変化」は、参照核酸と比較して、単一ヌクレオチドの欠失、単一ヌクレオチドの付加、単一ヌクレオチドの変異、単一ヌクレオチドの置換および／または単一ヌクレオチドの挿入からなる群より選択される。本発明によれば、核酸変異体は、参照核酸と比較して１つ以上のヌクレオチド変化を含み得る。

【0092】

特定の核酸配列の変異体は、好ましくは前記特定の配列の少なくとも１つの機能的特性を有し、好ましくは前記特定の配列と機能的に等価であり、例えば特定の核酸配列の特性と同一または類似の特性を示す核酸配列である。

【0093】

以下に記載されるように、本発明のいくつかの実施形態は、とりわけ、他の核酸配列と相同な核酸配列によって特徴付けられる。これらの相同な配列は、他の核酸配列の変異体である。

【0094】

好ましくは、所与の核酸配列と前記所与の核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。同一性の程度は、好ましくは少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約４００ヌクレオチドの領域について与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度は、参照核酸配列の全長について与えられる。

【0095】

「配列類似性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのポリペプチドまたは核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸またはヌクレオチドの割合を示す。

【0096】

「％同一」という用語は、特に、比較する２つの配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチドのパーセンテージを指すことが意図されており、前記パーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間の相違は配列の全長にわたってランダムに分布していてもよく、比較する配列は、２つの配列間の最適なアラインメントを得るために、参照配列と比較して付加または欠失を含んでいてもよい。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメント後に、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して前記配列を比較することによって行われる。比較のための最適なアラインメントは、手作業によって、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索アルゴリズムを用いて、または前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して行われ得る。

【0097】

同一性パーセントは、比較する配列が一致する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除して、この結果に１００を乗じることによって得られる。

【0098】

例えば、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を使用し得る。

【0099】

２つの配列が互いに相補的である場合、核酸は別の核酸に「ハイブリダイズすることができる」または「ハイブリダイズする」。２つの配列が互いに安定な二重鎖を形成することができる場合、核酸は別の核酸に「相補的」である。本発明によれば、ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェントな条件）下で行われる。ストリンジェントな条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されており、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中６５°Ｃでのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜を、例えば室温で２×ＳＳＣ中で洗浄し、次いで６８℃までの温度で０．１～０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中で洗浄する。

【0100】

相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えばワトソン－クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の連続する残基の割合を示す（例えば、１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」または「全面的に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。好ましくは、本発明による相補性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、本発明による相補性の程度は１００％である。

【0101】

「誘導体」という用語は、ヌクレオチド塩基上、糖上またはリン酸塩上の核酸の任意の化学的誘導体化を含む。「誘導体」という用語はまた、天然には存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸を含む。好ましくは、核酸の誘導体化はその安定性を高める。

【0102】

「核酸配列に由来する核酸配列」とは、それが由来する核酸の変異体である核酸を指す。好ましくは、ＲＮＡ分子中の特定の配列を置換する場合、特定の配列に対する変異体である配列は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を保持する。

【0103】

「ｎｔ」は、１つのヌクレオチドの略語であるか、または複数のヌクレオチド、好ましくは核酸分子中の連続するヌクレオチドの略語である。

【0104】

本発明によれば、「コドン」という用語は、リボソームでのタンパク質合成中に次にどのアミノ酸が付加されるかを指定する、コード核酸中の塩基トリプレットを指す。

【0105】

「転写」および「転写する」という用語は、特定の核酸配列を有する核酸分子（「核酸鋳型」）がＲＮＡポリメラーゼによって読み取られ、その結果、ＲＮＡポリメラーゼが一本鎖ＲＮＡ分子を生成するプロセスに関する。転写中に、核酸鋳型中の遺伝情報が転写される。核酸鋳型はＤＮＡであってもよい；しかしながら、例えばアルファウイルス核酸鋳型からの転写の場合、鋳型は、典型的にはＲＮＡである。その後、転写されたＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞系においてインビトロで合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニングベクターが転写物の生成に適用される。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。クローニングベクターは、好ましくはプラスミドである。本発明によれば、ＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。

【0106】

転写中に生成される一本鎖核酸分子は、典型的には、鋳型の相補的配列である核酸配列を有する。

【0107】

本発明によれば、「鋳型」または「核酸鋳型」または「鋳型核酸」という用語は、一般に、複製または転写され得る核酸配列を指す。

【0108】

「核酸配列から転写された核酸配列」および同様の用語は、適切な場合、鋳型核酸配列の転写産物である完全なＲＮＡ分子の一部としての核酸配列を指す。典型的には、転写された核酸配列は一本鎖ＲＮＡ分子である。

【0109】

「核酸の３’末端」は、本発明によれば、遊離ヒドロキシ基を有するその末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図式的表示では、３’末端は常に右側にある。「核酸の５’末端」は、本発明によれば、遊離リン酸基を有するその末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図式的表示では、５’末端は常に左側にある。

【0110】

５’末端 ５’－－Ｐ－ＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＨ－３’ ３’末端
３’－ＨＯ－ＮＮＮＮＮＮＮ－Ｐ－－５’
「上流」は、核酸分子の第１の要素と第２の要素の両方が同じ核酸分子中に含まれ、核酸分子の第１の要素がその核酸分子の第２の要素よりも核酸分子の５’末端の近くに位置する、核酸分子の第１の要素の、その核酸分子の第２の要素に対する相対的な位置を表す。その場合、第２の要素は、その核酸分子の第１の要素の「下流」にあると言われる。第２の要素の「上流」に位置する要素は、同義的に、その第２の要素の「５’側」に位置すると呼ぶことができる。二本鎖核酸分子については、「上流」および「下流」のような指示は、「＋」鎖に関して与えられる。

【0111】

本発明によれば、「機能的連結」または「機能的に連結された」は、機能的関係内での連結に関する。核酸は、別の核酸配列と機能的に関連している場合、「機能的に連結されて」いる。例えば、プロモータは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、前記コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結された核酸は、典型的には互いに隣接しているが、適切な場合にはさらなる核酸配列によって分離されており、特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されて単一のＲＮＡ分子（共通転写物）を与える。

【0112】

特定の実施形態では、核酸は、本発明によれば、核酸に関して同種または異種であり得る発現制御配列に機能的に連結される。

【0113】

「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモータ、リボソーム結合配列、および遺伝子の転写または誘導されたＲＮＡの翻訳を制御する他の制御要素を含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列を調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、種または細胞型に応じて異なり得るが、通常、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写配列ならびに５’および３’非翻訳配列を含む。より具体的には、５’非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモータ配列を包含するプロモータ領域を含む。発現制御配列は、エンハンサ配列または上流活性化配列も含み得る。ＤＮＡ分子の発現制御配列は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの５’非転写配列ならびに５’および３’非翻訳配列を含む。アルファウイルスＲＮＡの発現制御配列は、サブゲノムプロモータおよび／または１つ以上の保存配列要素を含み得る。本発明による特定の発現制御配列は、本明細書に記載されるように、アルファウイルスのサブゲノムプロモータである。

【0114】

本明細書で特定される核酸配列、特に転写可能なコード核酸配列は、前記核酸配列と相同または異種であり得る任意の発現制御配列、特にプロモータと組み合わせてもよく、「相同」という用語は、核酸配列が天然でも発現制御配列に機能的に連結されているという事実を指し、「異種」という用語は、核酸配列が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないという事実を指す。

【0115】

転写可能な核酸配列、特にペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列と発現制御配列とは、それらが、転写可能な、特にコード核酸配列の転写または発現が発現制御配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸配列が機能的なペプチドまたはタンパク質に翻訳される場合、コード配列に機能的に連結された発現制御配列の誘導は、コード配列のフレームシフトを引き起こすことなく、またはコード配列が所望のペプチドまたはタンパク質に翻訳されるのを不可能にすることなく、前記コード配列の転写をもたらす。

【0116】

「プロモータ」または「プロモータ領域」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結合部位を提供することによって、転写物、例えばコード配列を含む転写物の合成を制御する核酸配列を指す。プロモータ領域は、前記遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のためのさらなる認識または結合部位を含み得る。プロモータは、原核生物または真核生物遺伝子の転写を制御し得る。プロモータは「誘導性」であり得、誘導物質に応答して転写を開始し得るか、または転写が誘導物質によって制御されない場合、「構成的」であり得る。誘導性プロモータは、誘導物質が存在しない場合、ごくわずかしか発現されないかまたは全く発現されない。誘導物質の存在下では、遺伝子の「スイッチが入る」か、または転写のレベルが増加する。これは通常、特定の転写因子の結合によって媒介される。本発明による特定のプロモータは、本明細書に記載されるように、例えばアルファウイルスのサブゲノムプロモータである。他の特定のプロモータは、例えばアルファウイルスのゲノムプラス鎖またはマイナス鎖プロモータである。

【0117】

「コアプロモータ」という用語は、プロモータに含まれる核酸配列を指す。コアプロモータは、典型的には、転写を適切に開始するのに必要なプロモータの最小部分である。コアプロモータは、典型的には、転写開始部位およびＲＮＡポリメラーゼの結合部位を含む。

【0118】

「ポリメラーゼ」は、一般に、モノマー構築ブロックからのポリマー分子の合成を触媒することができる分子実体を指す。「ＲＮＡポリメラーゼ」は、リボヌクレオチド構築ブロックからのＲＮＡ分子の合成を触媒することができる分子実体である。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチド構築ブロックからのＤＮＡ分子の合成を触媒することができる分子実体である。ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼの場合、分子実体は、典型的にはタンパク質または複数のタンパク質の集合体もしくは複合体である。典型的には、ＤＮＡポリメラーゼは、典型的にはＤＮＡ分子である鋳型核酸に基づいてＤＮＡ分子を合成する。典型的には、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ分子（その場合、ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤｄＲＰである）、またはＲＮＡ分子（その場合、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲｄＲＰである）のいずれかである鋳型核酸に基づいてＲＮＡ分子を合成する。

【0119】

「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「ＲｄＲＰ」または「レプリカーゼ」は、ＲＮＡ鋳型からのＲＮＡの転写を触媒する酵素である。アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの場合、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体および（＋）鎖ゲノムＲＮＡの逐次合成によってＲＮＡ複製がもたらされる。したがって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、同義的に「ＲＮＡレプリカーゼ」または単に「レプリカーゼ」と呼ばれる。自然界では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、典型的には、レトロウイルスを除く全てのＲＮＡウイルスによってコードされている。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするウイルスの典型的な代表はアルファウイルスである。

【0120】

本発明によれば、「ＲＮＡ複製」は、一般に、所与のＲＮＡ分子（鋳型ＲＮＡ分子）のヌクレオチド配列に基づいて合成されたＲＮＡ分子を指す。合成されるＲＮＡ分子は、例えば鋳型ＲＮＡ分子と同一または相補的であり得る。一般に、ＲＮＡ複製は、ＤＮＡ中間体の合成を介して起こり得るか、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって媒介されるＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製によって直接起こり得る。アルファウイルスの場合、ＲＮＡ複製はＤＮＡ中間体を介して起こるのではなく、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって媒介される：鋳型ＲＮＡ鎖（第１のＲＮＡ鎖）－またはその一部－は、第１のＲＮＡ鎖またはその一部に相補的な第２のＲＮＡ鎖の合成のための鋳型として働く。第２のＲＮＡ鎖－またはその一部－は、次に、任意で、第２のＲＮＡ鎖またはその一部に相補的な第３のＲＮＡ鎖の合成のための鋳型として働く。それにより、第３のＲＮＡ鎖は、第１のＲＮＡ鎖またはその一部と同一である。したがって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の相補的ＲＮＡ鎖を直接合成することができ、（相補的中間体鎖を介して）同一のＲＮＡ鎖を間接的に合成することができる。

【0121】

本発明によれば、「鋳型ＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写または複製され得るＲＮＡを指す。

【0122】

本発明によれば、「遺伝子」という用語は、１つ以上の細胞産物の産生および／または１つ以上の細胞間もしくは細胞内機能の達成を担う特定の核酸配列を指す。より具体的には、前記用語は、特定のタンパク質または機能的もしくは構造的ＲＮＡ分子をコードする核酸を含む核酸部分（典型的にはＤＮＡ；ただしＲＮＡウイルスの場合はＲＮＡ）に関する。

【0123】

本明細書で使用される「単離された分子」は、他の細胞物質などの他の分子を実質的に含まない分子を指すことが意図されている。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動分画によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換え技術による操作に利用可能な核酸である。

【0124】

「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、例えば核酸を原核生物および／または真核生物宿主細胞に導入し、適切な場合にはゲノムに組み込むことを可能にする、前記核酸のための任意の中間ビヒクルを含む。そのようなベクターは、好ましくは細胞内で複製および／または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、およびそれらの画分を含む。

【0125】

本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え細胞などの「組換え物」は、天然には存在しない。

【0126】

本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。「自然界で見出される」という用語は、「自然界に存在する」ことを意味し、公知の物体ならびに自然からまだ発見および／または単離されていないが、天然源から将来発見および／または単離される可能性がある物体を含む。

【0127】

本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の産生を含む。この用語はまた、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性または安定であり得る。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、コードＲＮＡ（例えばメッセンジャＲＮＡ）の鎖が、ペプチドまたはタンパク質を生成するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指示する、細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。

【0128】

本発明によれば、「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャＲＮＡ」を意味し、典型的にはＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され、ペプチドまたはタンパク質をコードする転写物に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、３’－ＵＴＲ、およびポリ（Ａ）配列を含む。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって生成され得る。インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。本発明によれば、ｍＲＮＡは、安定化修飾およびキャッピングによって修飾され得る。

【0129】

本発明によれば、「ポリ（Ａ）配列」または「ポリ（Ａ）尾部」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。連続的な配列は、連続するアデニル酸残基を特徴とする。自然界では、連続的なポリ（Ａ）配列が典型的である。ポリ（Ａ）配列は通常真核生物のＤＮＡにはコードされていないが、細胞核における真核生物の転写中に、転写後の鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの遊離３’末端に結合し、本発明は、ＤＮＡによってコードされるポリ（Ａ）配列を包含する。

【0130】

本発明によれば、核酸分子に関して「一次構造」という用語は、ヌクレオチドモノマーの直鎖状配列を指す。

【0131】

本発明によれば、核酸分子に関して「二次構造」という用語は、塩基対合、例えば一本鎖ＲＮＡ分子の場合、特に分子内塩基対合を反映する核酸分子の二次元表示を指す。各ＲＮＡ分子は単一のポリヌクレオチド鎖のみを有するが、分子は、典型的には（分子内）塩基対の領域を特徴とする。本発明によれば、「二次構造」という用語は、塩基対、ステム、ステムループ、バルジ、内部ループおよび多分岐ループなどのループを含むがこれらに限定されない構造モチーフを含む。核酸分子の二次構造は、塩基対合を示す二次元図面（平面グラフ）によって表すことができる（ＲＮＡ分子の二次構造の詳細については、Ａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｊ．Ｇｒａｐｈ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ Ａｐｐｌ．１０：３２９－３５１を参照）。本明細書に記載されるように、特定のＲＮＡ分子の二次構造は本発明の文脈に関連する。

【0132】

本発明によれば、核酸分子、特に一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造は、ＲＮＡ二次構造予測のためのウェブサーバ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／Ｓｅｒｖｅｒｓ／Ｐｒｅｄｉｃｔ１／Ｐｒｅｄｉｃｔ１．ｈｔｍｌ）を使用した予測によって決定される。好ましくは、本発明によれば、核酸分子に関して「二次構造」は、具体的には前記予測によって決定される二次構造を指す。予測はまた、ＭＦＯＬＤ構造予測（ｈｔｔｐ：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ）を使用して実施または確認し得る。

【0133】

本発明によれば、「塩基対」は、２つのヌクレオチド塩基が塩基上のドナー部位とアクセプタ部位との間の水素結合を介して互いに会合する二次構造の構造モチーフである。相補的な塩基であるＡ：ＵおよびＧ：Ｃは、塩基上のドナー部位とアクセプタ部位との間の水素結合を介して安定な塩基対を形成する；Ａ：ＵおよびＧ：Ｃ塩基対はワトソン－クリック塩基対と呼ばれる。より弱い塩基対（ウォブル塩基対と呼ばれる）は、塩基ＧおよびＵ（Ｇ：Ｕ）によって形成される。塩基対Ａ：ＵおよびＧ：Ｃは、カノニカル塩基対と呼ばれる。Ｇ：Ｕのような他の塩基対（ＲＮＡにはかなり頻繁に存在する）および他のまれな塩基対（例えばＡ：Ｃ；Ｕ：Ｕ）は、非カノニカル塩基対と呼ばれる。

【0134】

本発明によれば、「ヌクレオチド対合」は、２つのヌクレオチドの塩基が塩基対（カノニカルまたは非カノニカル塩基対、好ましくはカノニカル塩基対、最も好ましくはワトソン－クリック塩基対）を形成するように互いに会合する、２つのヌクレオチドを指す。

【0135】

本発明によれば、核酸分子に関して「ステムループ」または「ヘアピン」または「ヘアピンループ」という用語は、全て互換的に、核酸分子、典型的には一本鎖ＲＮＡなどの一本鎖核酸分子の特定の二次構造を指す。ステムループによって表される特定の二次構造は、ステムおよびヘアピンループとも呼ばれる（末端）ループを含む連続する核酸配列からなり、ステムは、ステム－ループ構造のループを形成する短い配列（例えば３～１０ヌクレオチド）によって分離された２つの隣接する完全にまたは部分的に相補的な配列要素によって形成される。２つの隣接する完全にまたは部分的に相補的な配列は、例えばステムループ要素のステム１およびステム２として定義され得る。ステムループは、これらの２つの隣接する完全にまたは部分的に逆相補的な配列、例えばステムループ要素のステム１とステム２とが互いに塩基対を形成する場合に形成され、ステムループ要素のステム１とステム２との間に位置する短い配列によって形成されるその末端に不対ループを含む二本鎖核酸配列をもたらす。したがって、ステムループは２つのステム（ステム１およびステム２）を含み、これらは、核酸分子の二次構造のレベルでは、互いに塩基対を形成し、核酸分子の一次構造のレベルでは、ステム１またはステム２の一部ではない短い配列によって分離されている。説明のために、ステムループの二次元表示はロリポップ形状の構造に類似している。ステムループ構造の形成は、それ自体で折り返して対合した二本鎖を形成することができる配列の存在を必要とする；対合した二本鎖はステム１とステム２によって形成される。対合したステムループ要素の安定性は、典型的には、長さ、すなわちステム２のヌクレオチドと塩基対（好ましくはカノニカル塩基対、より好ましくはワトソン－クリック塩基対）を形成することができるステム１のヌクレオチドの数に対する、ステム２のヌクレオチドとそのような塩基対を形成することができないステム１のヌクレオチド（ミスマッチまたはバルジ）の数によって決定される。本発明によれば、最適なループ長は３～１０ヌクレオチド、より好ましくは４～７ヌクレオチド、例えば４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドである。所与の核酸配列がステムループを特徴とする場合、それぞれの相補的な核酸配列も、典型的にはステムループを特徴とする。ステムループは、典型的には一本鎖ＲＮＡ分子によって形成される。例えば、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５’複製認識配列には、いくつかのステムループが存在する。

【0136】

本発明によれば、核酸分子の特定の二次構造（例えばステムループ）に関して「破壊」または「破壊する」とは、特定の二次構造が存在しないかまたは改変されていることを意味する。典型的には、二次構造は、二次構造の一部である少なくとも１つのヌクレオチドの変化の結果として破壊され得る。例えば、ステムループは、ステムを形成する１つ以上のヌクレオチドの変化によって破壊され得、その結果、ヌクレオチドの対合は不可能である。

【0137】

本発明によれば、「二次構造破壊を補償する」または「二次構造破壊の補償」とは、核酸配列中の１つ以上のヌクレオチド変化を指す；より典型的には、これは、核酸配列中の１つ以上の第２のヌクレオチド変化であって、１つ以上の第１のヌクレオチド変化が、１つ以上の第２のヌクレオチド変化の非存在下で、核酸配列の二次構造の破壊を引き起こすが、１つ以上の第１のヌクレオチド変化と１つ以上の第２のヌクレオチド変化との同時発生は、核酸の二次構造の破壊を引き起こさないことを特徴とする、１つ以上の第１のヌクレオチド変化も含む、核酸配列中の１つ以上の第２のヌクレオチド変化を指す。同時発生とは、１つ以上の第１のヌクレオチド変化および１つ以上の第２のヌクレオチド変化の両方の存在を意味する。典型的には、１つ以上の第１のヌクレオチド変化と１つ以上の第２のヌクレオチド変化は、同じ核酸分子内に一緒に存在する。特定の実施形態では、二次構造破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化は、１つ以上のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化である。したがって、一実施形態では、「二次構造破壊の補償」とは、「ヌクレオチド対合破壊の補償」、すなわち１つ以上のヌクレオチド対合破壊、例えば１つ以上のステムループ内の１つ以上のヌクレオチド対合破壊の補償を意味する。１つ以上のヌクレオチド対合破壊は、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入されていてもよい。二次構造破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化の各々は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加、置換および／または挿入からそれぞれ独立して選択され得るヌクレオチド変化である。例示的な例では、ヌクレオチド対合Ａ：ＵがＡからＣへの置換によって破壊されている場合（ＣおよびＵは、典型的にはヌクレオチド対を形成するのに適していない）、ヌクレオチド対合破壊を補償するヌクレオチド変化は、ＧによるＵの置換であり得、それによってＣ：Ｇヌクレオチド対合の形成が可能になる。したがって、ＧによるＵの置換は、ヌクレオチド対合破壊を補償する。代替的な例では、ヌクレオチド対合Ａ：ＵがＡからＣへの置換によって破壊された場合、ヌクレオチド対合破壊を補償するヌクレオチド変化は、ＡによるＣの置換であり得、それによって元のＡ：Ｕヌクレオチド対合の形成が回復される。一般に、本発明では、元の核酸配列を回復せず、新規のＡＵＧトリプレットも創出しない、二次構造破壊を補償するヌクレオチド変化が好ましい。上記の一連の例では、ＵからＧへの置換がＣからＡへの置換よりも好ましい。

【0138】

本発明によれば、核酸分子に関して「三次構造」という用語は、原子座標によって定義される核酸分子の三次元構造を指す。

【0139】

本発明によれば、ＲＮＡ、例えばｒＲＮＡなどの核酸は、ペプチドまたはタンパク質をコードし得る。したがって、転写可能な核酸配列またはその転写物は、ペプチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。

【0140】

本発明によれば、「ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸」という用語は、核酸が、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、翻訳プロセス中にペプチドまたはタンパク質を産生するようにアミノ酸のアセンブリを指示することができることを意味する。好ましくは、本発明によるコードＲＮＡは、コードＲＮＡの翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用して、ペプチドまたはタンパク質を生成することができる。

【0141】

本発明によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合を介して互いに連結された２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２０個以上、および最大で好ましくは５０個、好ましくは１００個または好ましくは１５０個までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。

【0142】

「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本発明によれば、アミノ酸成分だけでなく、糖およびリン酸構造体などの非アミノ酸成分も含有する物質を含み、エステル、チオエーテルまたはジスルフィド結合などの結合を含有する物質も含む。

【0143】

本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語は、同義的に、リボソームによって翻訳される最初のコドンである可能性があるＲＮＡ分子のコドン（塩基トリプレット）を指す。そのようなコドンは、典型的には、真核生物のアミノ酸メチオニンおよび原核生物の修飾メチオニンをコードする。真核生物および原核生物における最も一般的な開始コドンはＡＵＧである。ＡＵＧ以外の開始コドンを意味すると本明細書で特に明記されない限り、ＲＮＡ分子に関して「開始コドン」および「出発コドン」という用語はコドンＡＵＧを指す。本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語はまた、デオキシリボ核酸の対応する塩基トリプレット、すなわちＲＮＡの開始コドンをコードする塩基トリプレットを指すために使用される。メッセンジャＲＮＡの開始コドンがＡＵＧである場合、ＡＵＧをコードする塩基トリプレットはＡＴＧである。本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語は、好ましくは機能的な開始コドンまたは出発コドン、すなわち翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されるかまたは使用されるであろう開始コドンまたは出発コドンを指す。例えばコドンからキャップまでの距離が短いために、翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されないＡＵＧコドンがＲＮＡ分子中に存在し得る。これらのコドンは、機能的な開始コドンまたは出発コドンという用語には包含されない。

【0144】

本発明によれば、「オープンリーディングフレームの出発コドン」または「オープンリーディングフレームの開始コドン」という用語は、コード配列、例えば自然界で見出される核酸分子のコード配列におけるタンパク質合成のための開始コドンとして働く塩基トリプレットを指す。ＲＮＡ分子では、オープンリーディングフレームの開始コドンの前に５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）が存在することが多いが、これは厳密には必要ではない。

【0145】

本発明によれば、「オープンリーディングフレームの天然の出発コドン」または「オープンリーディングフレームの天然の開始コドン」という用語は、天然のコード配列におけるタンパク質合成のための開始コドンとして働く塩基トリプレットを指す。天然のコード配列は、例えば自然界で見出される核酸分子のコード配列であり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、天然の開始コドン（天然のコード配列中に存在する）が除去されている（その結果、変異体核酸分子には存在しない）ことを特徴とする、自然界で見出される核酸分子の変異体を提供する。

【0146】

本発明によれば、「最初のＡＵＧ」は、メッセンジャＲＮＡ分子の最も上流のＡＵＧ塩基トリプレット、好ましくは翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されるかまたは使用されるであろうメッセンジャＲＮＡ分子の最も上流のＡＵＧ塩基トリプレットを意味する。したがって、「最初のＡＴＧ」とは、最初のＡＵＧをコードするコードＤＮＡ配列のＡＴＧ塩基トリプレットを指す。いくつかの場合には、ｍＲＮＡ分子の最初のＡＵＧは、オープンリーディングフレームの開始コドン、すなわちリボソームタンパク質合成中に開始コドンとして使用されるコドンである。

【0147】

本発明によれば、核酸変異体の特定の要素に関して「除去を含む」または「除去を特徴とする」という用語および同様の用語は、参照核酸分子と比較して、前記特定の要素が核酸変異体において機能性でないかまたは存在しないことを意味する。限定されることなく、除去は、特定の要素の全部もしくは一部の欠失、特定の要素の全部もしくは一部の置換、または特定の要素の機能的もしくは構造的特性の改変で構成され得る。核酸配列の機能的要素の除去は、除去を含む核酸変異体の位置で機能が発揮されないことを必要とする。例えば、特定の開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡ変異体は、リボソームタンパク質合成が除去を特徴とするＲＮＡ変異体の位置で開始されないことを必要とする。核酸配列の構造要素の除去は、構造要素が除去を含む核酸変異体の位置に存在しないことを必要とする。例えば、特定のＡＵＧ塩基トリプレット、すなわち特定の位置のＡＵＧ塩基トリプレットの除去を特徴とするＲＮＡ変異体は、例えば、特定のＡＵＧ塩基トリプレット（例えばΔＡＵＧ）の一部もしくは全部の欠失、または特定のＡＵＧ塩基トリプレットの１つ以上のヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ）の、任意の１つ以上の異なるヌクレオチドによる置換を特徴とし得、その結果、得られる変異体のヌクレオチド配列は前記ＡＵＧ塩基トリプレットを含まない。１つのヌクレオチドの適切な置換は、ＡＵＧ塩基トリプレットをＧＵＧ、ＣＵＧもしくはＵＵＧ塩基トリプレットに、またはＡＡＧ、ＡＣＧもしくはＡＧＧ塩基トリプレットに、またはＡＵＡ、ＡＵＣもしくはＡＵＵ塩基トリプレットに変換するものである。それに応じて、より多くのヌクレオチドの適切な置換を選択することができる。

【0148】

本発明によれば、「自己複製ウイルス」という用語は、宿主細胞内で自律的に複製することができるＲＮＡウイルスを含む。自己複製ウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ゲノムを有し得、アルファウイルス、フラビウイルス、麻疹ウイルス（ＭＶ）およびラブドウイルスを含む。アルファウイルスおよびフラビウイルスは正の極性のゲノムを有するが、麻疹ウイルス（ＭＶ）およびラブドウイルスのゲノムはマイナス鎖ｓｓＲＮＡである。典型的には、自己複製ウイルスは、細胞の感染後に直接翻訳され得る（＋）鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスであり、この翻訳は、感染ＲＮＡからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を産生するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供する。以下では、自己複製ウイルス由来ベクターの例としてアルファウイルス由来のベクターを参照することによって本発明を説明する。しかしながら、本発明はアルファウイルス由来のベクターに限定されないことが理解されるべきである。

【0149】

本発明によれば、「アルファウイルス」という用語は広く理解されるべきであり、アルファウイルスの特徴を有する任意のウイルス粒子を含む。アルファウイルスの特徴には、ＲＮＡポリメラーゼ活性を含む、宿主細胞における複製に適した遺伝情報をコードする（＋）鎖ＲＮＡの存在が含まれる。多くのアルファウイルスのさらなる特徴は、例えば、Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１－５６２に記載されている。「アルファウイルス」という用語は、自然界で見出されるアルファウイルス、およびその任意の変異体または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、変異体または誘導体は自然界では見出されない。

【0150】

一実施形態では、アルファウイルスは、自然界で見出されるアルファウイルスである。典型的には、自然界で見出されるアルファウイルスは、動物（ヒトなどの脊椎動物、および昆虫などの節足動物を含む）などの任意の１つ以上の真核生物に感染性である。自然界で見出されるアルファウイルスは、好ましくは以下からなる群より選択される：バーマフォレストウイルス複合体（バーマフォレストウイルスを含む）；東部ウマ脳炎複合体（７つの抗原型の東部ウマ脳炎ウイルスを含む）；ミデルブルグウイルス複合体（ミデルブルグウイルスを含む）；ヌドゥムウイルス複合体（ヌドゥムウイルスを含む）；セムリキ森林ウイルス複合体（ベバルウイルス、チクングニアウイルス、マヤロウイルスおよびそのサブタイプであるウナウイルス、オニョンニョンウイルスおよびそのサブタイプであるイグボオラウイルス、ロスリバーウイルスおよびそのサブタイプであるベバルウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびそのサブタイプであるメトリウイルスを含む）；ベネズエラウマ脳炎複合体（カバソウウイルス、エバーグレーズウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、パラマナウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、トロカラウイルスおよびそのサブタイプであるビジューブリッジウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む）；西部ウマ脳炎複合体（アウラウイルス、ババンキーウイルス、キジラガッチェウイルス、シンドビスウイルス、オケルボウイルス、ワタロアウイルス、バギークリークウイルス、フォートモーガンウイルス、ハイランドＪウイルス、西部ウマ脳炎ウイルスを含む）；ならびにサケ膵臓病ウイルスを含むいくつかの未分類ウイルス；睡眠病ウイルス；ミナミゾウアザラシウイルス；トナテウイルス。より好ましくは、アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルス複合体（セムリキ森林ウイルスを含む、上記に示したウイルス型を含む）、西部ウマ脳炎複合体（シンドビスウイルスを含む、上記に示したウイルス型を含む）、東部ウマ脳炎ウイルス（上記に示したウイルス型を含む）、ベネズエラウマ脳炎複合体（ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む、上記に示したウイルス型を含む）からなる群より選択される。

【0151】

さらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはセムリキ森林ウイルスである。代替的なさらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはシンドビスウイルスである。代替的なさらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはベネズエラウマ脳炎ウイルスである。

【0152】

本発明のいくつかの実施形態では、アルファウイルスは、自然界で見出されるアルファウイルスではない。典型的には、自然界では見出されないアルファウイルスは、ヌクレオチド配列、すなわちゲノムＲＮＡの少なくとも１つの変異によって自然界で見出されるアルファウイルスとは区別される、自然界で見出されるアルファウイルスの変異体または誘導体である。ヌクレオチド配列における変異は、自然界で見出されるアルファウイルスと比較して、１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換または欠失から選択され得る。ヌクレオチド配列における変異は、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質における変異と関連していてもよく、または関連していなくてもよい。例えば、自然界では見出されないアルファウイルスは、弱毒化アルファウイルスであり得る。自然界では見出されない弱毒化アルファウイルスは、典型的にはそのヌクレオチド配列中に少なくとも１つの変異を有し、それによって自然界で見出されるアルファウイルスと区別され、全く感染性でないか、または感染性であるが疾患を引き起こす能力がより低いかもしくは疾患を引き起こす能力を全く有さないアルファウイルスである。例示的な例として、ＴＣ８３は、自然界で見出されるベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）とは区別される弱毒化アルファウイルスである（ＭｃＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９６３，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１２：５９７－６０３）。

【0153】

アルファウイルス属のメンバーはまた、ヒトにおけるそれらの相対的な臨床的特徴に基づいて、主に脳炎に関連するアルファウイルスと、主に発熱、発疹、および多発性関節炎に関連するアルファウイルスとに分類され得る。

【0154】

「アルファウイルス性」という用語は、アルファウイルスに見出されるか、またはアルファウイルスに由来するか、または例えば遺伝子操作によってアルファウイルスから誘導されることを意味する。

【0155】

本発明によれば、「ＳＦＶ」はセムリキ森林ウイルスを表す。本発明によれば、「ＳＩＮ」または「ＳＩＮＶ」はシンドビスウイルスを表す。本発明によれば、「ＶＥＥ」または「ＶＥＥＶ」はベネズエラウマ脳炎ウイルスを表す。

【0156】

本発明によれば、「アルファウイルスの」という用語は、アルファウイルスを起源とする実体を指す。説明のために、アルファウイルスのタンパク質は、アルファウイルスに見出されるタンパク質および／またはアルファウイルスによってコードされるタンパク質を指し得、アルファウイルスの核酸配列は、アルファウイルスに見出される核酸配列および／またはアルファウイルスによってコードされる核酸配列を指し得る。好ましくは、「アルファウイルスの」核酸配列は、「アルファウイルスのゲノムの」および／または「アルファウイルスのゲノムＲＮＡの」核酸配列を指す。

【0157】

本発明によれば、「アルファウイルスＲＮＡ」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡ（すなわち（＋）鎖）、アルファウイルスゲノムＲＮＡの相補体（すなわち（－）鎖）、およびサブゲノム転写物（すなわち（＋）鎖）のいずれか１つ以上、またはそれらのいずれかの断片を指す。

【0158】

本発明によれば、「アルファウイルスゲノム」は、アルファウイルスのゲノム（＋）鎖ＲＮＡを指す。

【0159】

本発明によれば、「天然のアルファウイルス配列」という用語および同様の用語は、典型的には、天然に存在するアルファウイルス（自然界で見出されるアルファウイルス）の（例えば核酸）配列を指す。いくつかの実施形態では、「天然のアルファウイルス配列」という用語は、弱毒化アルファウイルスの配列も含む。

【0160】

本発明によれば、「５’複製認識配列」という用語は、好ましくは、アルファウイルスゲノムなどの自己複製ウイルスのゲノムの５’断片と同一または相同である連続する核酸配列、好ましくはリボ核酸配列を指す。「５’複製認識配列」は、アルファウイルスレプリカーゼなどのレプリカーゼによって認識され得る核酸配列である。５’複製認識配列という用語は、天然の５’複製認識配列ならびにその機能的等価物、例えば自然界で見出される自己複製ウイルス、例えば自然界で見出されるアルファウイルスの５’複製認識配列の機能的変異体を含む。本発明によれば、機能的等価物は、本明細書に記載の少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とする５’複製認識配列の誘導体を含む。５’複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体の合成に必要であり、（－）鎖鋳型に基づく（＋）鎖ウイルスゲノムＲＮＡの合成に必要である。天然の５’複製認識配列は、典型的には少なくともｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするが、ｎｓＰ１２３４をコードするオープンリーディングフレーム全体は含まない。天然の５’複製認識配列が、典型的には少なくともｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするという事実を考慮すると、天然の５’複製認識配列は、典型的には少なくとも１つの開始コドン、典型的にはＡＵＧを含む。一実施形態では、５’複製認識配列は、アルファウイルスゲノムの保存配列要素１（ＣＳＥ １）またはその変異体、およびアルファウイルスゲノムの保存配列要素２（ＣＳＥ ２）またはその変異体を含む。５’複製認識配列は、典型的には４つのステムループ（ＳＬ）、すなわちＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４を形成することができる。これらのステムループの番号付けは、５’複製認識配列の５’末端から始まる。

【0161】

「保存配列要素」または「ＣＳＥ」という用語は、アルファウイルスＲＮＡに見出されるヌクレオチド配列を指す。これらの配列要素は、オルソログが異なるアルファウイルスのゲノムに存在し、異なるアルファウイルスのオルソログＣＳＥが、好ましくは高い割合の配列同一性および／または類似の二次もしくは三次構造を共有するため、「保存された」と呼ばれる。ＣＳＥという用語は、ＣＳＥ １、ＣＳＥ ２、ＣＳＥ ３およびＣＳＥ ４を含む。

【0162】

本発明によれば、「ＣＳＥ １」または「４４－ｎｔ ＣＳＥ」という用語は、同義的に、（－）鎖鋳型からの（＋）鎖合成に必要なヌクレオチド配列を指す。「ＣＳＥ １」という用語は、（＋）鎖上の配列を指し、ＣＳＥ １の相補配列（（－）鎖上）は、（＋）鎖合成のためのプロモータとして機能する。好ましくは、ＣＳＥ １という用語は、アルファウイルスゲノムの最も５’側のヌクレオチドを含む。ＣＳＥ １は、典型的には保存されたステムループ構造を形成する。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ １の場合、二次構造が一次構造、すなわち直鎖状配列よりも重要であると考えられている。モデルアルファウイルスであるシンドビスウイルスのゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ １は、ゲノムＲＮＡの最も５’側の４４個のヌクレオチドによって形成される、４４個のヌクレオチドの連続する配列からなる（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１－５６２）。

【0163】

本発明によれば、「ＣＳＥ ２」または「５１－ｎｔ ＣＳＥ」という用語は、同義的に、（＋）鎖鋳型からの（－）鎖合成に必要なヌクレオチド配列を指す。（＋）鎖鋳型は、典型的にはアルファウイルスゲノムＲＮＡまたはＲＮＡレプリコンである（ＣＳＥ ２を含まないサブゲノムＲＮＡ転写物は（－）鎖合成のための鋳型として機能しないことに留意されたい）。アルファウイルスのゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ ２は、典型的にはｎｓＰ１のコード配列内に局在する。モデルアルファウイルスであるシンドビスウイルスのゲノムＲＮＡでは、５１－ｎｔ ＣＳＥは、ゲノムＲＮＡのヌクレオチド位置１５５～２０５に位置する（Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１）。ＣＳＥ ２は、典型的には２つの保存されたステムループ構造を形成する。これらのステムループ構造は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５’末端から数えて、それぞれアルファウイルスゲノムＲＮＡの３番目および４番目の保存されたステムループであるため、ステムループ３（ＳＬ３）およびステムループ４（ＳＬ４）と呼ばれる。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ ２の場合、二次構造が一次構造、すなわち直鎖状配列よりも重要であると考えられている。

【0164】

本発明によれば、「ＣＳＥ ３」または「接合配列」という用語は、同義的に、アルファウイルスゲノムＲＮＡに由来し、サブゲノムＲＮＡの開始部位を含むヌクレオチド配列を指す。（－）鎖におけるこの配列の相補体は、サブゲノムＲＮＡ転写を促進するように作用する。アルファウイルスゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ ３は、典型的にはｎｓＰ４のＣ末端断片をコードする領域と重複し、構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの上流に位置する短い非コード領域にまで及ぶ。

【0165】

本発明によれば、「ＣＳＥ ４」または「１９－ｎｔ保存配列」または「１９－ｎｔ ＣＳＥ」という用語は、同義的に、アルファウイルスゲノムの３’非翻訳領域内のポリ（Ａ）配列のすぐ上流の、アルファウイルスゲノムＲＮＡからのヌクレオチド配列を指す。ＣＳＥ ４は、典型的には１９個の連続するヌクレオチドからなる。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ ４は、（－）鎖合成の開始のためのコアプロモータとして機能すると理解されており（Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：８３７－８５６）、および／またはアルファウイルスゲノムＲＮＡのＣＳＥ ４およびポリ（Ａ）尾部は、効率的な（－）鎖合成のために一緒に機能すると理解されている（Ｈａｒｄｙ＆Ｒｉｃｅ，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：４６３０－４６３９）。

【0166】

本発明によれば、「サブゲノムプロモータ」または「ＳＧＰ」という用語は、核酸配列（例えばコード配列）の上流（５’側）の核酸配列であって、ＲＮＡポリメラーゼ、典型的にはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、特に機能性アルファウイルス非構造タンパク質の認識および結合部位を提供することによって前記核酸配列の転写を制御する核酸配列を指す。ＳＧＰは、さらなる因子のためのさらなる認識または結合部位を含み得る。サブゲノムプロモータは、典型的にはアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルスの遺伝要素である。アルファウイルスのサブゲノムプロモータは、ウイルスゲノムＲＮＡに含まれる核酸配列である。サブゲノムプロモータは、一般に、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で転写の開始（ＲＮＡ合成）を可能にすることを特徴とする。ＲＮＡ（－）鎖、すなわちアルファウイルスゲノムＲＮＡの相補体は、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成のための鋳型として働き、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成は、典型的にはサブゲノムプロモータにおいてまたはその近傍で開始される。本明細書で使用される「サブゲノムプロモータ」という用語は、そのようなサブゲノムプロモータを含む核酸内の特定の局在化に限定されない。一部の実施形態では、ＳＧＰは、ＣＳＥ ３と同一であるか、ＣＳＥ ３と重複するか、またはＣＳＥ ３を含む。

【0167】

「サブゲノム転写物」または「サブゲノムＲＮＡ」という用語は、同義的に、ＲＮＡ分子を鋳型（「鋳型ＲＮＡ」）として使用した転写の結果として得られるＲＮＡ分子を指し、鋳型ＲＮＡは、サブゲノム転写物の転写を制御するサブゲノムプロモータを含む。サブゲノム転写物は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、特に機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で得ることができる。例えば、「サブゲノム転写物」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して、アルファウイルスに感染した細胞で調製されるＲＮＡ転写物を指し得る。しかしながら、本明細書で使用される「サブゲノム転写物」という用語はそれに限定されず、異種ＲＮＡを鋳型として使用することによって得られる転写物も含む。例えば、サブゲノム転写物は、本発明によるＳＧＰ含有レプリコンの（－）鎖相補体を鋳型として使用することによっても得ることができる。したがって、「サブゲノム転写物」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの断片を転写することによって得られるＲＮＡ分子、ならびに本発明によるレプリコンの断片を転写することによって得られるＲＮＡ分子を指し得る。

【0168】

「自己」という用語は、同じ対象に由来するものを表すために使用される。例えば、「自己細胞」は、同じ対象に由来する細胞を指す。自己細胞を対象に導入することは、これらの細胞が、さもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を克服するので、有利である。

【0169】

「同種異系」という用語は、同じ種の異なる個体に由来するものを表すために使用される。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。

【0170】

「同系」という用語は、同一の遺伝子型を有する個体もしくは組織、すなわち一卵性双生児もしくは同じ近交系の動物、またはそれらの組織もしくは細胞に由来するものを表すために使用される。

【0171】

「異種」という用語は、複数の異なる要素からなるものを表すために使用される。一例として、ある個体の細胞を異なる個体に導入することは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。

【0172】

配列変化を同定するための方法において使用され得る細胞は、ヌクレオチド修飾の有無にかかわらず、ｒＲＮＡが複製および／または翻訳され得る任意の適切な細胞である。細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞であり得る。細胞は、複製のためにｒＲＮＡ中に存在する配列を認識するレプリカーゼを構成的に発現し得るか、またはそのようなレプリカーゼを一過性に発現し得る。

【0173】

以下は、本発明の個々の特徴の特定のおよび／または好ましい変形を提供する。本発明はまた、特に好ましい実施形態として、本発明の特徴の２つ以上について記載される特定のおよび／または好ましい変形の２つ以上を組み合わせることによって生成される実施形態を企図する。

【0174】

ＲＮＡレプリコン
複製可能なＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、ＲＮＡが複製されるようにレプリカーゼによって認識され得るヌクレオチド配列を含むことによって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）によって複製され得るＲＮＡである。ｒＲＮＡは必ずしもレプリカーゼをコードしないので、ｒＲＮＡは、シスで（コードされたレプリカーゼによって）またはトランスで（別の方法で提供されるレプリカーゼ、例えば核酸をコードする別個のレプリカーゼによって）複製され得る。「ＲＮＡレプリコン」、「レプリコン」および「複製可能ＲＮＡ分子」という用語は互換的に使用することができる。

【0175】

一実施形態では、複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子は、参照修飾調節領域と比較して配列変化を含む自己複製一本鎖プラスセンスウイルスの修飾調節領域を含み、この配列変化は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むｒＲＮＡ分子の機能を回復または改善する。これらの変化は、そのような配列変化を同定するための本明細書に記載の方法によって同定され得る。一実施形態では、修飾調節領域は、アルファウイルス調節領域、例えば５’または３’調節領域である。一実施形態では、アルファウイルス５’調節領域の配列変化は、配列番号２の６７、２４４、２４５、２４６、２４８位に対応する１つ以上の位置に点突然変異を含む。一実施形態では、５’調節領域は、ＶＥＥＶアルファウイルス５’調節領域である。一実施形態では、５’調節領域は、配列番号１または２に示される配列を有する。一実施形態では、５’調節領域は、配列番号２に示される配列を有するＶＥＥＶ ５’調節領域の６７、２４４、２４５、２４６、２４８位の１つ以上、または配列番号２のそれらの位置に対応する別のアルファウイルスの５’調節領域の位置に点突然変異を含む。一実施形態では、ｒＲＮＡ分子は、５’調節領域において配列番号２の４位に点突然変異をさらに含む。

【0176】

様々な実施形態では、点突然変異は、配列番号２の６７位、６７および２４４位、６７および２４６位、６７および２４８位、６７、２４５および２４８位、４および６７位、４、６７および２４４位、４、６７および２４６位、４、６７および２４８位、４、６７、２４５および２４８位、またはそれらの任意の組合せ、または配列番号２のそのような位置に対応するアルファウイルスの位置に存在し得る。

【0177】

様々な実施形態では、点突然変異は、配列番号２の以下の位置の１つ以上もしくは位置の組合せ、またはアルファウイルスの５’調節領域の対応する位置に存在し得る：
６７位；２４４位；２４５位；２４６位；２４８位；６７および２４４位；６７および２４５位；６７および２４６位；６７および２４８位；２４４および２４５位；２４４および２４６位；２４４および２４８位；２４５および２４６位；２４５および２４８位；２４６および２４８位；６７、２４４および２４５位；６７、２４４および２４６位；６７、２４４および２４８位；６７、２４５および２４６位；６７、２４５および２４８位；６７、２４６および２４８位；２４４、２４５および２４６位；２４４、２４５および２４８位；２４４、２４６および２４８位；２４５、２４６および２４８位；６７、２４４、２４５および２４６位；６７、２４４、２４５および２４８位；６７、２４４、２４６および２４８位；６７、２４５、２４６および２４８位；２４４、２４５、２４６および２４８位；６７、２４４、２４５、２４６および２４８位。上記の各位置または位置の組合せにおいて、点突然変異は、配列番号２の４位またはアルファウイルスの５’調節領域の対応する位置にさらに存在し得る。

【0178】

一実施形態では、様々な位置における特定の点突然変異は、Ｇ４Ａ、Ａ６７Ｃ、Ｇ２４４Ａ、Ｃ２４５Ａ、Ｇ２４６Ａ、またはＣ２４８Ａであり得る。

【0179】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームとを含み得、ＩＲＥＳは機能性非構造タンパク質、例えばレプリカーゼの発現を制御する。好ましくは、ＲＮＡレプリコンは、機能性非構造タンパク質による複製を可能にする配列要素を含む。一実施形態では、自己複製ウイルスはアルファウイルスであり、機能性非構造タンパク質による複製を可能にする配列要素はアルファウイルスに由来する。

【0180】

アルファウイルスレプリカーゼはキャッピング酵素機能を有し、典型的には、ゲノムおよびサブゲノム（＋）鎖ＲＮＡがキャップされる。５’キャップは、ｍＲＮＡを分解から保護し、その後近傍の開始コドンから翻訳を開始することができるリボ核タンパク質複合体をｍＲＮＡ上に形成するために、リボソームサブユニットおよび細胞因子をｍＲＮＡに誘導するように働く。この複雑なプロセスは、文献に広く記載されている（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ；Ｖｏｌ １０；１１３－１２７）。キャップ依存性翻訳の非常に精巧で効率的な機構にもかかわらず、細胞は、５’キャップと完全にまたは部分的に独立して翻訳を開始する手段を有する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ２０１２；Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０：５５８－５６６）。それにより、キャップ依存性翻訳の全体的な下方制御をもたらす細胞ストレスの状況では、細胞は、しばしばＩＲＥＳの助けを借りて、選択された遺伝子を依然として選択的に発現し得る。

【0181】

ウイルスはまた、ウイルス遺伝子の翻訳のための細胞機構を利用するための異なる手段を進化させた。ウイルス感染は、細胞の抗ウイルス応答（インターフェロン応答；ストレス応答）をもたらす細胞によって感知されることが多いので、多くのウイルスはまた、キャップ非依存性翻訳、特にＲＮＡウイルスを利用する。キャップ非依存性翻訳は、ウイルスに、それらの生活環を全うし、感染細胞から放出される機会を与える、細胞ストレス応答時のウイルスＲＮＡ翻訳にとっての利点を保証する。

【0182】

内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、翻訳開始コドン、ＡＵＧなどの近傍に開始前複合体を誘引する適切な二次構造を形成するＲＮＡ配列である。共通の特徴を共有する４つのクラスのＩＲＥＳが文献に記載されている。原型ＩＲＥＳは、ポリオウイルスＩＲＥＳ（Ｉ型）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ（ＩＩ型）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＩＲＥＳ（ＩＩＩ型）およびジシストロウイルスの遺伝子間領域に見出されるＩＲＥＳ（ＩＶ型）である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２０１２；Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０：５５８－５６６；Ｌｏｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１８；Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：１８０１５５）。

【0183】

Ｉ型～ＩＩＩ型ＩＲＥＳは、ＡＵＧ開始コドンで翻訳を開始するという共通点を有するが、ＩＶ型ＩＲＥＳは非ＡＵＧコドン（例えばＧＣＵ）で開始する。それにより、Ｉ型～ＩＩＩ型は、ｅＩＦ２／ＧＴＰ（ｅＩＦ２／ＧＴＰ／Ｍｅｔ－ｔＲＮＡｉＭｅｔ）の助けによってメチオニンを送達するイニシエータｔＲＮＡを必要とする。ストレス下でのｅＩＦ２キナーゼの活性化は、ＡＵＧで開始する翻訳を阻害するｅＩＦ２のαサブユニットをリン酸化する。それにより、ＩＶ型ＩＲＥＳによって誘導される翻訳は、ｅＩＦ２リン酸化によって阻害されない。

【0184】

本発明によれば、「内部リボソーム進入部位」、略して「ＩＲＥＳ」という用語は、リボソームをｍＲＮＡの内部領域に動員して、キャップ非依存的に翻訳を開始するＲＮＡ要素に関する。ＩＲＥＳは、一般にＲＮＡウイルスの５’－ＵＴＲに位置する。しかしながら、ジシストロウイルス科（ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）由来のウイルスのｍＲＮＡは２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し、それぞれの翻訳は２つの異なるＩＲＥＳによって指示される。また、いくつかの哺乳動物細胞ｍＲＮＡもＩＲＥＳを有することが示唆されている。これらの細胞ＩＲＥＳ要素は、ストレス生存および生存に重要な他のプロセスに関与する遺伝子をコードする真核生物ｍＲＮＡに位置すると考えられている。ＩＲＥＳ要素の位置は、しばしば５’－ＵＴＲにあるが、ｍＲＮＡの他の場所にも存在し得る。

【0185】

「内部リボソーム侵入部位」という用語は、ポリオウイルス（ＰＶ）および脳心筋炎ウイルスなどのピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）のウイルスならびにヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）および口蹄疫ウイルスを含む病原性ウイルスに存在するＩＲＥＳを含む。これらのウイルスＩＲＥＳは多様な配列を含むが、それらの多くは同様の二次構造を有し、同様の機構を介して翻訳を開始する。さらに、ＩＲＥＳの活性は、ＩＲＥＳトランス作用因子（ＩＴＡＦ）として公知の他の因子からの支援をしばしば必要とする。翻訳開始因子（ＩＦ）およびＩＴＡＦの構造および必要条件に基づいて、ウイルスＩＲＥＳは、本明細書に記載される４つのタイプに分類される。これらのＩＲＥＳタイプのいずれもが、本発明によれば有用であり、ＩＶ型ＩＲＥＳが特に好ましい。

【0186】

ウイルスＩＲＥＳの２つの群、Ｉ型およびＩＩ型は、４０Ｓ小リボソームサブユニットに直接結合することができない。代わりに、それらは、異なるＩＴＡＦを介して４０Ｓ小リボソームサブユニットを動員し、キャップ依存性翻訳においてカノニカルＩＦを必要とする（すなわちｅＩＦ２、ｅＩＦ３、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｂ、およびｅＩＦ４Ｇ）。Ｉ型ＩＲＥＳとＩＩ型ＩＲＥＳとの間の主な違いは４０Ｓリボソームスキャニングの必要性であり、ＩＩ型ＩＲＥＳには４０Ｓリボソームスキャニングは不要である。Ｉ型ＩＲＥＳの例としては、ポリオウイルス（ＰＶ）およびライノウイルスに見出されるＩＲＥＳが挙げられる。ＩＩ型ＩＲＥＳの例としては、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびタイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）に見出されるＩＲＥＳが挙げられる。

【0187】

ＩＩＩ型ＩＲＥＳは、特殊なＲＮＡ構造を有する４０Ｓ小リボソームサブユニットと直接相互作用することができるが、それらの活性は、通常、ｅＩＦ２およびｅＩＦ３ならびにイニシエータＭｅｔ－ｔＲＮＡｉを含むいくつかのＩＦの支援を必要とする。例としては、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）および豚テスコウイルス（ＰＴＶ）に見出されるＩＲＥＳが挙げられる。

【0188】

ＩＶ型ウイルスＩＲＥＳは一般に強い活性を有し、さらなるＩＴＡＦまたはｅＩＦ２／Ｍｅｔ－ｔＲＮＡｉ／ＧＴＰ三元複合体さえも必要とせずに非ＡＵＧ開始コドンから翻訳を開始することができる。これらのＩＲＥＳは、４０Ｓ小リボソームサブユニットと直接相互作用するコンパクトな構造に折り畳まれる。例としては、コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、チャバネアオカメムシ（ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ）腸管ウイルス（ＰＳＩＶ）、およびタウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）などのジシストロウイルスに見出されるＩＲＥＳが挙げられる。

【0189】

「内部リボソーム進入部位」という用語はまた、細胞ｍＲＮＡに見出されるＩＲＥＳも含み、その多くは、例えばアポトーシス、有糸分裂、低酸素および栄養制限の状態でストレス応答に必要なタンパク質をコードする。細胞ＩＲＥＳは、リボソーム動員の機構に基づいて２つのタイプに大別することができる：Ｉ型ＩＲＥＳは、シスエレメント、例えばＲＮＡ結合モチーフに結合したＩＴＡＦおよびＮ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を介してリボソームと相互作用するが、ＩＩ型ＩＲＥＳは、１８Ｓ ｒＲＮＡと対合してリボソームを動員する短いシスエレメントを含む。

【0190】

一実施形態では、本明細書に記載のｒＲＮＡは、修飾されたヌクレオチド／ヌクレオシド／骨格修飾を有し得る。本明細書で使用される「ＲＮＡ修飾」という用語は、骨格修飾ならびに糖修飾または塩基修飾を含む化学修飾を指し得る。

【0191】

これに関連して、本明細書で定義される修飾ｒＲＮＡ分子は、ヌクレオチド類似体／修飾、例えば骨格修飾、糖修飾または塩基修飾を含み得る。本発明に関連する骨格修飾は、本明細書で定義されるｒＲＮＡ分子に含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾される修飾である。本発明に関連する糖修飾は、本明細書で定義されるｒＲＮＡ分子のヌクレオチドの糖の化学修飾である。さらに、本発明に関連する塩基修飾は、ｒＲＮＡ分子のヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。これに関連して、ヌクレオチド類似体または修飾は、好ましくは、転写および／または翻訳に適用可能なヌクレオチド類似体から選択される。

【0192】

糖修飾：本明細書に記載の修飾ｒＲＮＡ分子に組み込まれ得る修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖部分で修飾され得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換することができる。「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（－ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２ Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に結合している「ロックド」核酸（ＬＮＡ）；およびアミノ基（－Ｏ－アミノ、ここで、アミノ基、例えばＮＲＲは、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノもしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノであり得る）またはアミノアルコキシが挙げられるが、これらに限定されない。「デオキシ」修飾には、水素、アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノもしくはアミノ酸）が含まれ、またはアミノ基は、リンカーを介して糖に結合していてもよく、リンカーは原子Ｃ、ＮおよびＯのうちの１つ以上を含む。糖基はまた、リボース中の対応する炭素のものとは反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を含むことができる。したがって、修飾ＲＮＡ分子は、例えば糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。

【0193】

骨格修飾：リン酸骨格は、本明細書に記載の修飾ＲＮＡ分子に組み込まれ得る修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドでさらに修飾され得る。骨格のリン酸基は、酸素原子の１つ以上を異なる置換基で置換することによって修飾することができる。さらに、修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾リン酸による非修飾リン酸部分の完全な置換を含み得る。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホン酸アルキルまたはホスホン酸アリールおよびホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄で置換されている。リン酸リンカーはまた、結合している酸素を窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによって修飾することもできる。

【0194】

塩基修飾：本明細書に記載の修飾ｒＲＮＡ分子に組み込まれ得る修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、核酸塩基部分においてさらに修飾され得る。ＲＮＡに見出される核酸塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書に記載のヌクレオシドおよびヌクレオチドは、主溝面上で化学修飾することができる。いくつかの実施形態では、主溝化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、またはハロ基を含むことができる。

【0195】

本発明の特定の実施形態では、ヌクレオチド類似体／修飾は、好ましくは、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド－５’－三リン酸、２－アミノプリン－リボシド－５’－三リン酸、２－アミノアデノシン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－三リン酸、２－チオシチジン－５’－三リン酸、２－チオウリジン－５’－三リン酸、２’－フルオロチミジン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルイノシン－５’－三リン酸、４－チオ－ウリジン－５’－三リン酸、５－アミノアリルシチジン－５’－三リン酸、５－アミノアリルウリジン－５’－三リン酸、５－ブロモシチジン－５’－三リン酸、５－ブロモウリジン－５’－三リン酸、５－ブロモ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、５－ヨードシチジン－５’－三リン酸、５－ヨード－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－ヨードウリジン－５’－三リン酸、５－ヨード－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、５－プロピニル－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－プロピニル－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、６－アザシチジン－５’－三リン酸、６－アザウリジン－５’－三リン酸、６－クロロプリンリボシド－５’－三リン酸、７－デアザアデノシン－５’－三リン酸、７－デアザグアノシン－５’－三リン酸、８－アザアデノシン－５’－三リン酸、８－アジドアデノシン－５’－三リン酸、ベンズイミダゾール－リボシド－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルグアノシン－５’－三リン酸、Ｎ６－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｎ６－メチルグアノシン－５’－三リン酸、シュードウリジン－５’－三リン酸、またはピューロマイシン－５’－三リン酸、キサントシン－５’－三リン酸から選択される塩基修飾から選択される。５－メチルシチジン－５’－三リン酸、７－デアザグアノシン－５’－三リン酸、５－ブロモシチジン－５’－三リン酸、およびシュードウリジン－５’－三リン酸からなる塩基修飾ヌクレオチドの群より選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが特に好ましい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、１－タウリノメチル－４－チオウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロ－シュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、および４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンが挙げられる。

【0196】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、および４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジンが挙げられる。

【0197】

他の実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノ－プリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチル－チオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、および２－メトキシ－アデニンが挙げられる。他の実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンが挙げられる。

【0198】

いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、主溝面上で修飾することができ、ウラシルのＣ－５上の水素をメチル基またはハロ基で置換することを含み得る。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シチジン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－ウリジンまたは５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シュードウリジンである。

【0199】

さらなる実施形態では、修飾ｒＲＮＡは、６－アザ－シチジン、２－チオ－シチジン、ａ－チオ－シチジン、シュード－イソ－シチジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、ａ－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン、デオキシチミジン、５－メチル－ウリジン、ピロロ－シチジン、イノシン、ａ－チオ－グアノシン、６－メチル－グアノシン、５－メチル－シチジン、８－オキソ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、Ｎ１－メチル－アデノシン、２－アミノ－６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、シュード－イソ－シチジン、６－クロロ－プリン、Ｎ６－メチル－アデノシン、ａ－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデノシンから選択されるヌクレオシド修飾を含み得る。

【0200】

特定の好ましい実施形態では、ｒＲＮＡは、少なくとも１つの（例えば全ての）ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。

【0201】

本明細書で使用される「ウラシル」という用語は、ＲＮＡの核酸中に存在し得る核酸塩基の１つを表す。ウラシルの構造は：

【化1】

である。

【0202】

本明細書で使用される「ウリジン」という用語は、ＲＮＡ中に存在し得るヌクレオシドの１つを表す。ウリジンの構造は：

【化2】

である。

【0203】

ＵＴＰ（ウリジン５’－三リン酸）は、以下の構造：

【化3】

を有する。

【0204】

シュードＵＴＰ（シュードウリジン５’－三リン酸）は、以下の構造：

【化4】

を有する。

【0205】

「シュードウリジン」は、ウリジンの異性体である修飾ヌクレオシドの一例であり、ウラシルは、窒素－炭素グリコシド結合の代わりに炭素－炭素結合を介してペントース環に結合している。

【0206】

別の例示的な修飾ヌクレオシドはＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）であり、これは、構造：

【化5】

を有する。

【0207】

Ｎ１－メチル－シュードＵＴＰは、以下の構造：

【化6】

を有する。

【0208】

別の例示的な修飾ヌクレオシドは５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）であり、これは、構造：

【化7】

を有する。

【0209】

特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載のｒＲＮＡ中の１つ以上のウリジンは、修飾ヌクレオシドで置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。

【0210】

特定の好ましい実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。

【0211】

特定の好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドはＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２種類以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよく、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）およびＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。

【0212】

特定の好ましい実施形態では、ｒＲＮＡ中の１つ以上、例えば全てのウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、３－メチルウリジン（ｍ^３Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ^５Ｕ）、５－アザウリジン、６－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオウリジン（ｓ^２Ｕ）、４－チオウリジン（ｓ^４Ｕ）、４－チオシュードウリジン、２－チオシュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン（ｈｏ^５Ｕ）、５－アミノアリルウリジン、５－ハロウリジン（例えば５－ヨードウリジンもしくは５－ブロモウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ^５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルウリジン（ｃｍ^５Ｕ）、１－カルボキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ^５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオウリジン（ｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチルウリジン（ｍｎｍ^５Ｕ）、１－エチルシュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン（ｍｎｍ^５ｓｅ^２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｃｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルシュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン（τｍ^５Ｕ）、１－タウリノメチルシュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオシュードウリジン）、５－メチル－２－チオウリジン（ｍ^５ｓ^２Ｕ）、１－メチル－４－チオシュードウリジン（ｍ^１ｓ^４Ψ）、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、３－メチルシュードウリジン（ｍ^３Ψ）、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチルジヒドロウリジン（ｍ^５Ｄ）、２－チオジヒドロウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ^３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ^３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジン（ｉｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、α－チオウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ^５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｓ^２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｍｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ^３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｉｎｍ^５Ｕｍ）、１－チオウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、または当技術分野で公知の任意の他の修飾ウリジンのいずれか１つ以上であり得る。

【0213】

一実施形態では、ｒＲＮＡは、他の修飾ヌクレオシドを含むか、またはさらなる修飾ヌクレオシド、例えば上記のものなどの修飾シチジンを含む。例えば、一実施形態では、ｒＲＮＡにおいて、シチジンが５－メチルシチジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換されている。一実施形態では、ｒＲＮＡは、５－メチルシチジンと、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、および５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）から選択される１つ以上とを含む。一実施形態では、ｒＲＮＡは、５－メチルシチジンおよびＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ｒＲＮＡは、各シチジンの代わりに５－メチルシチジンを含み、各ウリジンの代わりにＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。

【0214】

機能性非構造タンパク質
「非構造タンパク質」という用語は、ウイルスによってコードされるがウイルス粒子の一部ではないタンパク質に関する。この用語は、典型的には、ＲＮＡレプリカーゼまたは他の鋳型指向性ポリメラーゼなどの、ウイルスがそれ自体を複製するために使用する様々な酵素および転写因子を含む。「非構造タンパク質」という用語は、非構造タンパク質の糖鎖修飾（グリコシル化など）および脂質修飾形態を含む、ありとあらゆる同時翻訳または翻訳後修飾形態を含み、好ましくは「アルファウイルス非構造タンパク質」に関する。

【0215】

いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」という用語は、アルファウイルス起源の個々の非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）のいずれか１つ以上、またはアルファウイルス起源の複数の非構造タンパク質のポリペプチド配列を含むポリタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３および／またはｎｓＰ４を指す。他の実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３４を指す。一実施形態では、オープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、単一の、任意で切断可能なポリタンパク質：ｎｓＰ１２３４としてのｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４の全てからなる。一実施形態では、オープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、単一の、任意で切断可能なポリタンパク質：ｎｓＰ１２３としてのｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３からなる。その実施形態では、ｎｓＰ４はさらなる目的のタンパク質であり得、さらなるオープンリーディングフレームによってコードされ得る。

【0216】

いくつかの実施形態では、非構造タンパク質は、例えば宿主細胞において、複合体または会合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３（同義的にＰ１２３）とｎｓＰ４の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ３の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４からなる群より選択されるいずれか１つ以上の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質は、少なくともｎｓＰ４を含む。

【0217】

「複合体」または「会合体」という用語は、空間的に近接している２つ以上の同じまたは異なるタンパク質分子を指す。複合体のタンパク質は、好ましくは、互いに直接または間接的に物理的または物理化学的に接触している。複合体または会合体は、複数の異なるタンパク質（ヘテロ多量体）および／または１つの特定のタンパク質の複数のコピー（ホモ多量体）で構成され得る。アルファウイルス非構造タンパク質の文脈において、「複合体または会合体」という用語は、多数の、そのうちの少なくとも１つがアルファウイルス非構造タンパク質である少なくとも２つのタンパク質分子を表す。複合体または会合体は、１つの特定のタンパク質の複数のコピー（ホモ多量体）および／または複数の異なるタンパク質の複数のコピー（ヘテロ多量体）で構成され得る。多量体の文脈において、「多」は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１０個超などの、１個より多いことを意味する。

【0218】

「機能性アルファウイルス非構造タンパク質」という用語は、レプリカーゼ機能を有する非構造タンパク質を含む。したがって、「機能性非構造タンパク質」は、アルファウイルスレプリカーゼを含む。「レプリカーゼ機能」は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、すなわち（＋）鎖ＲＮＡ鋳型に基づいて（－）鎖ＲＮＡの合成を触媒することができる、および／または（－）鎖ＲＮＡ鋳型に基づいて（＋）鎖ＲＮＡの合成を触媒することができる酵素の機能を含む。したがって、「機能性非構造タンパク質」という用語は、（＋）鎖（例えばゲノム）ＲＮＡを鋳型として使用して（－）鎖ＲＮＡを合成するタンパク質もしくは複合体、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して新しい（＋）鎖ＲＮＡを合成するタンパク質もしくは複合体、および／またはゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体の断片を鋳型として使用してサブゲノム転写物を合成するタンパク質もしくは複合体を指すことができる。機能性非構造タンパク質は、１つ以上のさらなる機能、例えばプロテアーゼ（自己切断のため）、ヘリカーゼ、末端アデニリルトランスフェラーゼ（ポリ（Ａ）尾部の付加のため）、メチルトランスフェラーゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ（核酸に５’キャップを提供するため）、核局在化部位、トリホスファターゼなどをさらに有し得る（Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．８７：１１１－１２４；Ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９６：２４８３－２５００）。

【0219】

「レプリカーゼ」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む。本発明によれば、「レプリカーゼ」という用語は、天然に存在するアルファウイルス（自然界で見出されるアルファウイルス）由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および弱毒化アルファウイルス由来などのアルファウイルスの変異体または誘導体由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む、「アルファウイルスレプリカーゼ」を含む。

【0220】

「レプリカーゼ」という用語は、アルファウイルス感染細胞によって発現されるか、またはアルファウイルスレプリカーゼをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞によって発現される、アルファウイルスレプリカーゼの全ての変異体、特に翻訳後修飾変異体、立体配座、アイソフォームおよびホモログを含む。さらに、「レプリカーゼ」という用語は、組換え法によって生成された、および生成され得る全ての形態のレプリカーゼを含む。例えば、実験室でのレプリカーゼの検出および／または精製を容易にするタグ、例えばｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはオリゴヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含むレプリカーゼは、組換え法によって生成され得る。

【0221】

任意で、アルファウイルスレプリカーゼは、アルファウイルスの保存配列要素１（ＣＳＥ １）またはその相補的な配列、保存配列要素２（ＣＳＥ ２）またはその相補的な配列、保存配列要素３（ＣＳＥ ３）またはその相補的な配列、保存配列要素４（ＣＳＥ ４）またはその相補的な配列のいずれか１つ以上に結合する能力によってさらに機能的に定義される。好ましくは、レプリカーゼは、ＣＳＥ ２［すなわち（＋）鎖］および／もしくはＣＳＥ ４［すなわち（＋）鎖］に結合することができるか、またはＣＳＥ １の相補体［すなわち（－）鎖］および／もしくはＣＳＥ ３の相補体［すなわち（－）鎖］に結合することができる。

【0222】

アルファウイルスレプリカーゼの起源は、特定のアルファウイルスに限定されない。好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するセムリキ森林ウイルスおよび弱毒化セムリキ森林ウイルスなどのセムリキ森林ウイルスの変異体または誘導体を含む、セムリキ森林ウイルス由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するシンドビスウイルスおよび弱毒シンドビスウイルスなどのシンドビスウイルスの変異体または誘導体を含む、シンドビスウイルス由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）および弱毒化ＶＥＥＶなどのＶＥＥＶの変異体または誘導体を含む、ＶＥＥＶ由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）および弱毒化ＣＨＩＫＶなどのＣＨＩＫＶの変異体または誘導体を含む、ＣＨＩＫＶ由来の非構造タンパク質を含む。

【0223】

レプリカーゼはまた、複数のウイルス、例えば複数のアルファウイルス由来の非構造タンパク質を含み得る。したがって、アルファウイルス非構造タンパク質を含み、レプリカーゼ機能を有する異種複合体または会合体も、同様に本発明に含まれる。単に例示目的のために、レプリカーゼは、第１のアルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質（例えばｎｓＰ１、ｎｓＰ２）、および第２のアルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質（ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）を含み得る。複数の異なるアルファウイルス由来の非構造タンパク質は、別個のオープンリーディングフレームによってコードされ得るか、またはポリタンパク質、例えばｎｓＰ１２３４として単一のオープンリーディングフレームによってコードされ得る。

【0224】

いくつかの実施形態では、機能性非構造タンパク質は、機能性非構造タンパク質が発現される細胞内で膜複製複合体および／または液胞を形成することができる。

【0225】

機能性非構造タンパク質、すなわちレプリカーゼ機能を有する非構造タンパク質が本発明による核酸分子によってコードされる場合、レプリコンのサブゲノムプロモータは、存在する場合、前記レプリカーゼと適合性であることが好ましい。この文脈において適合性であるとは、レプリカーゼが、サブゲノムプロモータが存在する場合、サブゲノムプロモータを認識できることを意味する。一実施形態では、これは、サブゲノムプロモータが、レプリカーゼが由来するウイルスに天然である、すなわちこれらの配列の天然起源が同じウイルスである場合に達成される。代替的な実施形態では、サブゲノムプロモータは、ウイルスレプリカーゼがサブゲノムプロモータを認識することができる限り、ウイルスレプリカーゼが由来するウイルスに天然ではない。言い換えれば、レプリカーゼはサブゲノムプロモータと適合性である（交差ウイルス適合性）。異なるアルファウイルスに由来するサブゲノムプロモータおよびレプリカーゼに関する交差ウイルス適合性の例は、当技術分野で公知である。交差ウイルス適合性が存在する限り、サブゲノムプロモータとレプリカーゼの任意の組合せが可能である。交差ウイルス適合性は、サブゲノムプロモータからのＲＮＡ合成に適した条件で、試験されるレプリカーゼを、試験されるサブゲノムプロモータを有するＲＮＡと共にインキュベートすることにより、本発明を実施する当業者によって容易に試験され得る。サブゲノム転写物が生成される場合、サブゲノムプロモータとレプリカーゼは適合性であると決定される。交差ウイルス適合性の様々な例が公知である。

【0226】

レプリコンは、好ましくは、機能性非構造タンパク質によって複製され得る。特に、機能性非構造タンパク質をコードするＲＮＡレプリコンは、レプリコンによってコードされる機能性非構造タンパク質によって複製され得る。好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、レプリコンは、目的のタンパク質をコードするさらなるオープンリーディングフレームを含む。この実施形態は、本発明による目的のタンパク質を生産するためのいくつかの方法に特に適する。一実施形態では、目的のタンパク質をコードするさらなるオープンリーディングフレームは、５’複製認識配列の下流かつＩＲＥＳの上流（および自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの上流）ならびに／または自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの下流に位置する。５’複製認識配列の下流かつＩＲＥＳの上流（および自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの上流）に位置する目的のタンパク質をコードするさらなるオープンリーディングフレームは、５’複製認識配列によってコードされる配列との融合タンパク質として発現され得る。５’複製認識配列の下流かつＩＲＥＳの上流（および自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの上流）に位置する目的のタンパク質をコードするさらなるオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータによって制御されてもよく、または制御されなくてもよい。自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの下流に位置する１つ以上の目的のタンパク質をコードする１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、一般に、サブゲノムプロモータによって制御される。

【0227】

機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、５’複製認識配列と重複しないことが好ましい。一実施形態では、機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータが存在する場合、サブゲノムプロモータと重複しない。その実施形態は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／１６２４６０号に開示されている。

【0228】

複製およびタンパク質コード領域に必要な配列エレメントの脱カップリング
ｎｓＰ１２３４をコードするオープンリーディングフレームは、アルファウイルスゲノムの５’複製認識配列（ｎｓＰ１のコード配列）と重複し、典型的にはＣＳＥ ３を含むサブゲノムプロモータ（ｎｓＰ４のコード配列）とも重複するため、多用途アルファウイルス由来のベクターを開発することは困難である。

【0229】

本明細書に記載のＲＮＡレプリコンは、一般に、レプリカーゼによる複製に必要な配列要素、特に５’複製認識配列を含む。一実施形態では、非構造タンパク質のコード配列はＩＲＥＳの制御下にあり、したがってＩＲＥＳは非構造タンパク質のコード配列の上流に位置する。したがって、一実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質のＮ末端断片のコード配列と通常重複する５’複製認識配列は、ＩＲＥＳの上流に位置し、非構造タンパク質のコード配列と重複しない。

【0230】

一実施形態では、ｎｓＰ１コード配列などの５’複製認識配列のコード配列は、ＩＲＥＳの上流に位置する目的の遺伝子にインフレームで融合される。

【0231】

一実施形態では、５’複製認識配列は、アルファウイルス非構造タンパク質またはその断片などのタンパク質またはその断片をコードしない。したがって、本発明によるＲＮＡレプリコンでは、レプリカーゼおよびタンパク質コード領域による複製に必要な配列要素は切り離されていてもよい。切り離しは、天然のウイルスゲノムＲＮＡ、例えば天然のアルファウイルスゲノムＲＮＡと比較して、５’複製認識配列中の少なくとも１つの開始コドンの除去によって達成され得る。

【0232】

したがって、ｒＲＮＡは５’複製認識配列を含み得、５’複製認識配列は、天然のウイルス５’複製認識配列、例えば天然のアルファウイルス５’複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。

【0233】

天然のウイルス５’複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする５’複製認識配列は、本明細書では「修飾５’複製認識配列」または「本発明による５’複製認識配列」と呼ばれ得る。本明細書で以下に記載されるように、本発明による５’複製認識配列は、任意で、本発明の方法によって検出されるものなどの１つ以上のさらなるヌクレオチド変化の存在を特徴とし得る。

【0234】

レプリカーゼ、好ましくはアルファウイルスレプリカーゼによって複製され得る核酸構築物は、複製可能なＲＮＡまたはレプリコンと呼ばれる。本発明によれば、「レプリコン」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製され、ＤＮＡ中間体なしで、ＲＮＡレプリコンの１つまたは複数の同一または本質的に同一のコピーを生じることができるＲＮＡ分子を定義する。「ＤＮＡ中間体なしで」とは、ＲＮＡレプリコンのコピーを形成する過程でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のコピーもしくはレプリコンの相補体が形成されないこと、および／またはＲＮＡレプリコンのコピーもしくはその相補体を形成する過程でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子が鋳型として使用されないことを意味する。レプリカーゼの機能は、典型的には、機能性非構造タンパク質、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって提供される。

【0235】

本発明によれば、「複製され得る」および「複製されることができる」という用語は、一般に、核酸の１つ以上の同一または本質的に同一のコピーを生成することができることを表す。「レプリカーゼ」という用語と共に使用される場合、例えば「レプリカーゼによって複製されることができる」などにおいて、「複製され得る」および「複製されることができる」という用語は、レプリカーゼに関する核酸分子、例えばＲＮＡレプリコンの機能的特徴を表す。これらの機能的特徴は、（ｉ）レプリカーゼがレプリコンを認識することができること、および（ｉｉ）レプリカーゼがＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）として作用することができることの少なくとも１つを含む。好ましくは、レプリカーゼは、（ｉ）レプリコンを認識すること、および（ｉｉ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとして作用することの両方が可能である。

【0236】

「認識することができる」という表現は、レプリカーゼがレプリコンと物理的に結合することができること、および好ましくは、レプリカーゼが、典型的には非共有結合的に、レプリコンに結合することができることを表す。「結合」という用語は、レプリカーゼが、保存配列要素１（ＣＳＥ １）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存配列要素２（ＣＳＥ ２）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存配列要素３（ＣＳＥ ３）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存配列要素４（ＣＳＥ ４）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）のいずれか１つ以上に結合する能力を有することを意味し得る。好ましくは、レプリカーゼは、ＣＳＥ ２［すなわち（＋）鎖］および／もしくはＣＳＥ ４［すなわち（＋）鎖］に結合することができるか、またはＣＳＥ １の相補体［すなわち（－）鎖］および／もしくはＣＳＥ ３の相補体［すなわち（－）鎖］に結合することができる。

【0237】

一実施形態では、「ＲｄＲＰとして作用することができる」という表現は、レプリカーゼがアルファウイルスゲノム（＋）鎖ＲＮＡの（－）鎖相補体の合成を触媒することができ、（＋）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有すること、および／またはレプリカーゼが（＋）鎖アルファウイルスゲノムＲＮＡの合成を触媒することができ、（－）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有することを意味する。一般に、「ＲｄＲＰとして作用することができる」という表現はまた、レプリカーゼが（＋）鎖サブゲノム転写物の合成を触媒することができ、（－）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有し、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成が、典型的にはサブゲノムプロモータで開始されることを含み得る。一実施形態では、ウイルスはアルファウイルスである。

【0238】

「結合することができる」および「ＲｄＲＰとして作用することができる」という表現は、通常の生理学的条件における能力を指す。特に、それらは、機能性非構造タンパク質を発現するか、または機能性非構造タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞内の状態を指す。細胞は、好ましくは真核細胞である。結合する能力および／またはＲｄＲＰとして作用する能力は、例えば無細胞インビトロ系または真核細胞において実験的に試験することができる。任意で、前記真核細胞は、レプリカーゼの起源である特定のウイルスが感染性である種に由来する細胞である。例えば、ヒトに対して感染性である特定のウイルス由来のウイルスレプリカーゼが使用される場合、通常の生理学的条件はヒト細胞内の条件である。より好ましくは、真核細胞（一例ではヒト細胞）は、レプリカーゼの起源である特定のウイルスが感染性である同じ組織または器官に由来する。

【0239】

本発明によれば、「天然のアルファウイルス配列と比較して」および同様の用語は、天然のアルファウイルス配列の変異体である配列を指す。変異体は、典型的にはそれ自体天然のアルファウイルス配列ではない。

【0240】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは３’複製認識配列を含む。３’複製認識配列は、機能性非構造タンパク質によって認識され得る核酸配列である。言い換えれば、機能性非構造タンパク質は３’複製認識配列を認識することができる。好ましくは、３’複製認識配列は、レプリコンの３’末端（レプリコンがポリ（Ａ）尾部を含まない場合）、またはポリ（Ａ）尾部のすぐ上流（レプリコンがポリ（Ａ）尾部を含む場合）に位置する。一実施形態では、３’複製認識配列は、ＣＳＥ ４からなるか、またはＣＳＥ ４を含む。

【0241】

一実施形態では、５’複製認識配列および３’複製認識配列は、機能性非構造タンパク質の存在下で本発明によるＲＮＡレプリコンの複製を指示することができる。したがって、単独でまたは好ましくは一緒に存在する場合、これらの認識配列は、機能性非構造タンパク質の存在下でＲＮＡレプリコンの複製を指示する。

【0242】

レプリコンの５’複製認識配列および３’複製認識配列の両方を認識することができる機能性非構造タンパク質が提供されることが好ましい。一実施形態では、これは、３’複製認識配列が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然である場合、および５’複製認識配列が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然であるか、または機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然である５’複製認識配列の変異体である場合に達成される。天然とは、これらの配列の天然の起源が同じアルファウイルスであることを意味する。代替的な実施形態では、５’複製認識配列および／または３’複製認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質がレプリコンの５’複製認識配列と３’複製認識配列の両方を認識することができる限り、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然ではない。言い換えれば、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、５’複製認識配列および３’複製認識配列に適合性である。非天然の機能性アルファウイルス非構造タンパク質がそれぞれの配列または配列要素を認識することができる場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は適合性であると言われる（交差ウイルス適合性）。（３’／５’）複製認識配列およびＣＳＥと、機能性アルファウイルス非構造タンパク質とのそれぞれ任意の組合せは、交差ウイルス適合性が存在する限り可能である。交差ウイルス適合性は、ＲＮＡ複製に適した条件で、例えば適切な宿主細胞において、試験される機能性アルファウイルス非構造タンパク質を、試験される３’および５’複製認識配列を有するＲＮＡと共にインキュベートすることにより、本発明を実施する当業者によって容易に試験され得る。複製が起こる場合、（３’／５’）複製認識配列と機能性アルファウイルス非構造タンパク質は適合性であると決定される。

【0243】

５’複製認識配列内の少なくとも１つの開始コドンの除去は、いくつかの利点を提供する。ｎｓＰ１＊（ｎｓＰ１のＮ末端断片）をコードする核酸配列に開始コドンが存在しないことは、典型的にはｎｓＰ１＊が翻訳されないことを引き起こす。さらに、ｎｓＰ１＊は翻訳されないので、目的のタンパク質（「ＧＯＩ ２」）をコードするオープンリーディングフレームは、リボソームがアクセス可能な最も上流のオープンリーディングフレームである；したがって、レプリコンが細胞内に存在する場合、翻訳は、目的の遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＲＮＡ）の最初のＡＵＧで開始される。

【0244】

少なくとも１つの開始コドンの除去は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって達成することができる。例えば、本発明によるレプリコンをコードする、すなわち開始コドンの除去を特徴とする適切なＤＮＡ分子をインシリコで設計し、その後インビトロで合成することができる（遺伝子合成）；あるいは、レプリコンをコードするＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発によって適切なＤＮＡ分子が得られ得る。いずれの場合も、それぞれのＤＮＡ分子はインビトロ転写のための鋳型として働くことができ、それによって本発明によるレプリコンを提供する。

【0245】

天然の５’複製認識配列と比較した少なくとも１つの開始コドンの除去は、特に限定されず、１つ以上のヌクレオチドの置換（ＤＮＡレベルで、開始コドンのＡおよび／またはＴおよび／またはＧの置換を含む）、１つ以上のヌクレオチドの欠失（ＤＮＡレベルで、開始コドンのＡおよび／またはＴおよび／またはＧの欠失を含む）、ならびに１つ以上のヌクレオチドの挿入（ＤＮＡレベルで、開始コドンのＡとＴとの間および／またはＴとＧとの間の１つ以上のヌクレオチドの挿入を含む）を含む、任意のヌクレオチド修飾から選択され得る。ヌクレオチド修飾が置換、挿入または欠失であるかどうかにかかわらず、ヌクレオチド修飾は新たな開始コドンの形成をもたらしてはならない（例示的な例として：ＤＮＡレベルでの挿入はＡＴＧの挿入であってはならない）。

【0246】

少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５’複製認識配列（すなわち本発明による修飾５’複製認識配列）は、好ましくは自然界で見出されるアルファウイルスのゲノムの５’複製認識配列の変異体である。一実施形態では、本発明による修飾５’複製認識配列は、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのゲノムの５’複製認識配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。

【0247】

一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とし得るＲＮＡレプリコンの５’複製認識配列は、アルファウイルスの５’末端、すなわちアルファウイルスゲノムの５’末端の約２５０個のヌクレオチドに相同な配列を含む。好ましい実施形態では、これは、アルファウイルスの５’末端、すなわちアルファウイルスゲノムの５’末端の約２５０～５００個、好ましくは約３００～５００個のヌクレオチドに相同な配列を含む。「アルファウイルスゲノムの５’末端」とは、アルファウイルスゲノムの最も上流のヌクレオチドから始まり、それを含む核酸配列を意味する。言い換えれば、アルファウイルスゲノムの最も上流のヌクレオチドは、ヌクレオチド番号１と呼ばれ、例えば「アルファウイルスゲノムの５’末端の２５０個のヌクレオチド」とは、アルファウイルスゲノムのヌクレオチド１～２５０を意味する。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンの５’複製認識配列は、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのゲノムの５’末端の少なくとも２５０個のヌクレオチドと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。少なくとも２５０個のヌクレオチドは、例えば２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチドを含む。

【0248】

自然界で見出されるアルファウイルスの５’複製認識配列は、典型的には、少なくとも１つの開始コドンおよび／または保存された二次構造モチーフを特徴とする。例えば、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）の天然の５’複製認識配列は、５つの特定のＡＵＧ塩基トリプレットを含む。Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ ７：１６３８－１６５１によれば、ＭＦＯＬＤによる分析は、セムリキ森林ウイルスの天然の５’複製認識配列が、ステムループ１～４（ＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４）と呼ばれる４つのステムループ（ＳＬ）を形成すると予測されることを明らかにした。Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．によれば、ＭＦＯＬＤによる分析は、異なるアルファウイルスであるシンドビスウイルスの天然の５’複製認識配列も、４つのステムループ：ＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４を形成すると予測されることを明らかにした。

【0249】

アルファウイルスゲノムの５’末端が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によるアルファウイルスゲノムの複製を可能にする配列要素を含むことは公知である。本発明の一実施形態では、ＲＮＡレプリコンの５’複製認識配列は、アルファウイルスの保存配列要素１（ＣＳＥ １）に相同な配列および／または保存配列要素２（ＣＳＥ ２）に相同な配列を含む。

【0250】

アルファウイルスゲノムＲＮＡの保存配列要素２（ＣＳＥ ２）は、典型的には、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１の最初のアミノ酸残基をコードする天然の開始コドンを少なくとも含むＳＬ２が先行するＳＬ３およびＳＬ４によって表される。しかしながら、この説明において、いくつかの実施形態では、アルファウイルスゲノムＲＮＡの保存配列要素２（ＣＳＥ ２）は、ＳＬ２からＳＬ４に及び、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１の最初のアミノ酸残基をコードする天然の開始コドンを含む領域を指す。好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、ＣＳＥ ２またはＣＳＥ ２に相同な配列を含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのＣＳＥ ２の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする、ＣＳＥ ２に相同な配列を含む。

【0251】

一実施形態では、５’複製認識配列は、アルファウイルスのＣＳＥ ２に相同な配列を含む。アルファウイルスのＣＳＥ ２は、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの断片を含み得る。

【0252】

したがって、一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含むことを特徴とする。非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、典型的には、自然界で見出されるアルファウイルスの非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片の変異体である。一実施形態では、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスの非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。

【0253】

一実施形態では、本発明のレプリコンに含まれる非構造タンパク質のオープンリーディングフレームに相同な配列は、非構造タンパク質の天然の開始コドンを含まず、より好ましくは非構造タンパク質のいかなる開始コドンも含まない。好ましい実施形態では、ＣＳＥ ２に相同な配列は、天然のアルファウイルスＣＳＥ ２配列と比較して全ての開始コドンの除去を特徴とする。したがって、ＣＳＥ ２に相同な配列は、好ましくはいかなる開始コドンも含まない。

【0254】

オープンリーディングフレームに相同な配列がいかなる開始コドンも含まない場合、オープンリーディングフレームに相同な配列は、翻訳の鋳型として機能しないので、それ自体オープンリーディングフレームではない。

【0255】

一実施形態では、５’複製認識配列は、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含み、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、天然のアルファウイルス配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。

【0256】

一実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの少なくとも天然の開始コドンの除去を含むことを特徴とする。好ましくは、前記配列は、ｎｓＰ１をコードするオープンリーディングフレームの少なくとも天然の開始コドンの除去を含むことを特徴とする。

【0257】

天然の開始コドンは、宿主細胞にＲＮＡが存在する場合に宿主細胞のリボソーム上での翻訳が始まるＡＵＧ塩基トリプレットである。言い換えれば、天然の開始コドンは、例えば天然の開始コドンを含むＲＮＡが接種された宿主細胞において、リボソームタンパク質合成中に翻訳される最初の塩基トリプレットである。一実施形態では、宿主細胞は、天然のアルファウイルス５’複製認識配列を含む特定のアルファウイルスの天然宿主である真核生物種由来の細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能な細胞株「ＢＨＫ２１［Ｃ１３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ１０（商標））」由来のＢＨＫ２１細胞である。

【0258】

多くのアルファウイルスのゲノムは完全に配列決定されており、公的にアクセス可能であり、これらのゲノムによってコードされる非構造タンパク質の配列も公的にアクセス可能である。そのような配列情報により、天然の開始コドンをインシリコで決定することが可能である。

【0259】

一実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然の開始コドン以外の１つ以上の開始コドンの除去を含むことを特徴とする。一実施形態では、前記核酸配列は、天然の開始コドンの除去をさらに特徴とする。例えば、天然の開始コドンの除去に加えて、任意の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは４つより多い（例えば５つの）開始コドンが除去されていてもよい。

【0260】

レプリコンが、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然の開始コドンの除去、および任意で天然の開始コドン以外の１つ以上の開始コドンの除去を特徴とする場合、オープンリーディングフレームに相同な配列は、翻訳のための鋳型として機能しないので、それ自体オープンリーディングフレームではない。

【0261】

好ましくは天然の開始コドンの除去に加えて、除去される天然の開始コドン以外の１つ以上の開始コドンは、好ましくは翻訳を開始する可能性を有するＡＵＧ塩基トリプレットから選択される。翻訳を開始する可能性を有するＡＵＧ塩基トリプレットは、「潜在的な開始コドン」と呼ばれ得る。所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかは、インシリコまたは細胞ベースのインビトロアッセイで決定することができる。

【0262】

一実施形態では、所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかはインシリコで決定される：その実施形態では、ヌクレオチド配列が調べられ、ＡＵＧ塩基トリプレットがＡＵＧＧ配列の一部、好ましくはコザック配列の一部である場合、塩基トリプレットは翻訳を開始する可能性を有すると決定される。

【0263】

一実施形態では、所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかは細胞ベースのインビトロアッセイで決定される：天然の開始コドンの除去を特徴とし、天然の開始コドンの除去位置の下流に所与のＡＵＧ塩基トリプレットを含むＲＮＡレプリコンが宿主細胞に導入される。一実施形態では、宿主細胞は、天然のアルファウイルス５’複製認識配列を含む特定のアルファウイルスの天然宿主である真核生物種由来の細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能な細胞株「ＢＨＫ２１［Ｃ１３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ１０（商標））」由来のＢＨＫ２１細胞である。天然の開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。天然の開始コドンの除去を特徴とし、所与のＡＵＧ塩基トリプレットを含むＲＮＡレプリコンの宿主細胞への移入後、翻訳が所与のＡＵＧ塩基トリプレットで開始される場合、所与のＡＵＧ塩基トリプレットは翻訳を開始する可能性を有すると決定される。翻訳が開始されるかどうかは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって決定され得る。例えば、レプリコンは、所与のＡＵＧ塩基トリプレットの下流に、所与のＡＵＧ塩基トリプレットとインフレームで、翻訳産物（存在する場合）の検出を容易にするタグ、例えばｍｙｃタグまたはＨＡタグをコードし得る；コードされたタグを有する発現産物が存在するかどうかは、例えばウェスタンブロットによって決定され得る。この実施形態では、所与のＡＵＧ塩基トリプレットとタグをコードする核酸配列との間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。細胞ベースのインビトロアッセイは、複数の所与のＡＵＧ塩基トリプレットについて個別に実施することができる：各々の場合に、天然の開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。これは、天然の開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間の全てのＡＵＧ塩基トリプレット（存在する場合）を除去することによって達成され得る。それにより、所与のＡＵＧ塩基トリプレットは、天然の開始コドンの除去位置の下流の最初のＡＵＧ塩基トリプレットである。

【0264】

好ましくは、本発明によるＲＮＡレプリコンの５’複製認識配列は、全ての潜在的な開始コドンの除去を特徴とする。したがって、本発明によれば、５’複製認識配列は、好ましくは、タンパク質に翻訳され得るオープンリーディングフレームを含まない。

【0265】

一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンの５’複製認識配列は、ウイルスゲノムＲＮＡの５’複製認識配列の（予測される）二次構造に相当する二次構造を特徴とする。この目的のために、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された１つ以上のステムループ内のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化を含み得る。

【0266】

一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンの５’複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５’複製認識配列の二次構造に相当する二次構造を特徴とする。好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンの５’複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５’複製認識配列の予測される二次構造に相当する予測二次構造を特徴とする。本発明によれば、ＲＮＡ分子の二次構造は、好ましくはＲＮＡ二次構造予測のためのウェブサーバ、ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／Ｓｅｒｖｅｒｓ／Ｐｒｅｄｉｃｔ１／Ｐｒｅｄｉｃｔ１．ｈｔｍｌによって予測される。

【0267】

天然のアルファウイルス５’複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５’複製認識配列の二次構造または予測二次構造を比較することによって、ヌクレオチド対合破壊の有無を同定することができる。例えば、天然のアルファウイルス５’複製認識配列と比較して、少なくとも１つの塩基対、例えばステムループ内、特にステムループのステム内の塩基対が所与の位置に存在しない場合がある。

【0268】

一実施形態では、５’複製認識配列の１つ以上のステムループは、欠失または破壊されない。より好ましくは、ステムループ３および４は欠失または破壊されない。好ましくは、５’複製認識配列のステムループのいずれも欠失または破壊されない。

【0269】

一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、５’複製認識配列の二次構造を破壊しない。代替的な実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、５’複製認識配列の二次構造を破壊する。この実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、天然の５’複製認識配列と比較して、所与の位置に少なくとも１つの塩基対、例えばステムループ内の塩基対が存在しない原因となり得る。ステムループ内に塩基対が存在しない場合、天然の５’複製認識配列と比較して、少なくとも１つの開始コドンの除去は、ステムループ内にヌクレオチド対合破壊を導入すると決定される。ステムループ内の塩基対は、典型的にはステムループのステム内の塩基対である。

【0270】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された１つ以上のステムループ内のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化を含む。

【0271】

少なくとも１つの開始コドンの除去がステムループ内にヌクレオチド対合破壊を導入する場合、天然の５’複製認識配列と比較して、ヌクレオチド対合破壊を補償すると予想される１つ以上のヌクレオチド変化が導入され得、それによって得られる二次構造または予測二次構造を天然の５’複製認識配列と比較し得る。

【0272】

共通の一般的知識および本明細書の開示に基づいて、特定のヌクレオチド変化は、ヌクレオチド対合破壊を補償すると当業者によって予想され得る。例えば、天然の５’複製認識配列と比較して、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの所与の５’複製認識配列の二次構造または予測二次構造の所与の位置で塩基対が破壊された場合、好ましくは開始コドンを再導入することなく、その位置で塩基対を復元するヌクレオチド変化は、ヌクレオチド対合破壊を補償すると予想される。

【0273】

一実施形態では、レプリコンの５’複製認識配列は、翻訳可能な核酸配列、すなわちペプチドもしくはタンパク質、特にｎｓＰ、特にｎｓＰ１、またはそのいずれかの断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。ヌクレオチド配列が「翻訳可能」であるためには、開始コドンの存在を必要とする；開始コドンは、ペプチドまたはタンパク質の最もＮ末端側のアミノ酸残基をコードする。一実施形態では、レプリコンの５’複製認識配列は、ｎｓＰ１のＮ末端断片をコードする翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。

【0274】

いくつかの状況では、ＲＮＡレプリコンは少なくとも１つのサブゲノムプロモータを含む。好ましい実施形態では、レプリコンのサブゲノムプロモータは、翻訳可能な核酸配列、すなわちペプチドもしくはタンパク質、特にｎｓＰ、特にｎｓＰ４、またはそのいずれかの断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。一実施形態では、レプリコンのサブゲノムプロモータは、ｎｓＰ４のＣ末端断片をコードする翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。翻訳可能な核酸配列、例えばｎｓＰ４のＣ末端断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まないサブゲノムプロモータを有するＲＮＡレプリコンは、ｎｓＰ４のコード配列の一部（典型的にはｎｓＰ４のＮ末端部分をコードする部分）を欠失させることによって、および／または欠失されていないｎｓＰ４のコード配列の一部のＡＵＧ塩基トリプレットを除去することによって生成され得る。ｎｓＰ４のコード配列またはその一部のＡＵＧ塩基トリプレットが除去される場合、除去されるＡＵＧ塩基トリプレットは、好ましくは潜在的な開始コドンである。あるいは、サブゲノムプロモータがｎｓＰ４をコードする核酸配列と重複しない場合、ｎｓＰ４をコードする核酸配列全体を欠失させてもよい。

【0275】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、トランケートされた非構造タンパク質、例えばトランケートされたアルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。この実施形態の文脈において、ＲＮＡレプリコンがｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするオープンリーディングフレームを含まず、任意でｎｓＰ４のＣ末端断片をコードするオープンリーディングフレームを含まないことが特に好ましい。ｎｓＰ１のＮ末端断片は、トランケートされたアルファウイルスタンパク質である；ｎｓＰ４のＣ末端断片も、トランケートされたアルファウイルスタンパク質である。

【0276】

いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは、アルファウイルスのゲノムの５’末端のステムループ２（ＳＬ２）を含まない。上記のＦｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．によれば、ステムループ２は、ＣＳＥ ２の上流の、アルファウイルスのゲノムの５’末端に見出される保存された二次構造であるが、複製に必須ではない。

【0277】

本発明によるＲＮＡレプリコンは、好ましくは一本鎖ＲＮＡ分子である。本発明によるＲＮＡレプリコンは、典型的には（＋）鎖ＲＮＡ分子である。一実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、単離された核酸分子である。本発明によるＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、好ましくは１つ以上の配列変化、特に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むｒＲＮＡの機能を回復または改善する配列変化を同定するための本明細書に開示される方法によって検出される配列変化を含む。

【0278】

少なくとも１つの目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム
一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、目的のペプチドまたは目的のタンパク質などの目的の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む。好ましくは、目的のタンパク質は異種核酸配列によってコードされる。目的のペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子は、同義的に「目的の遺伝子」または「導入遺伝子」と呼ばれる。様々な実施形態では、目的のペプチドまたはタンパク質は異種核酸配列によってコードされる。本発明によれば、「異種」という用語は、核酸配列が天然ではウイルス核酸配列、例えばアルファウイルス核酸配列に機能的または構造的に連結されていないという事実を指す。

【0279】

本発明によるレプリコンは、単一のポリペプチドまたは複数のポリペプチドをコードし得る。複数のポリペプチドは、単一のポリペプチド（融合ポリペプチド）として、または別個のポリペプチドとしてコードされ得る。いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは複数のオープンリーディングフレームを含み得、その各々は独立して、サブゲノムプロモータの制御下にあるか否かが選択され得る。あるいは、ポリタンパク質または融合ポリペプチドは、２Ａ自己切断ペプチド（例えば口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質由来）またはプロテアーゼ切断部位またはインテインによって分離された個々のポリペプチドを含む。

【0280】

目的のタンパク質は、例えば、レポータタンパク質、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質、細胞内インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達の阻害剤からなる群より選択され得る。本発明によれば、目的のタンパク質は、好ましくは、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質を含まない。

【0281】

レポータタンパク質
一実施形態では、オープンリーディングフレームは、レポータタンパク質、例えばＣＤ９０などの細胞表面発現タンパク質をコードする。その実施形態では、オープンリーディングフレームはレポータ遺伝子を含む。特定の遺伝子がそれらを発現する細胞または生物に付与する特徴は容易に同定および測定され得るため、またはそれらが選択マーカであるため、特定の遺伝子はレポータとして選択され得る。レポータ遺伝子は、特定の遺伝子が細胞または生物の集団によって取り込まれたかまたはそれらにおいて発現されたかどうかの指標として使用されることが多い。好ましくは、レポータ遺伝子の発現産物は視覚的に検出可能である。一般的な視覚的に検出可能なレポータタンパク質は、典型的には、蛍光または発光タンパク質を有する。具体的なレポータ遺伝子の例としては、それを発現する細胞を青色光下で緑色に発光させるクラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンとの反応を触媒して光を生成する酵素ルシフェラーゼ、および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードする遺伝子が挙げられる。これらの特異的レポータ遺伝子のいずれかの変異体は、視覚的に検出可能な特性を有する限り可能である。例えば、ｅＧＦＰはＧＦＰの点突然変異体である。レポータタンパク質の実施形態は、発現を試験するのに特に適する。

【0282】

ペプチドまたはタンパク質または核酸などの薬学的に活性な遺伝子産物
本発明によれば、一実施形態では、ｒＲＮＡは、薬学的に活性なｒＲＮＡを含むか、またはそれからなる。「薬学的に活性なＲＮＡ」は、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡであり得る。好ましくは、本発明によるＲＮＡレプリコンは、薬学的に活性なペプチドもしくはタンパク質または他の遺伝子産物をコードする。好ましくは、オープンリーディングフレームは、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードする。好ましくは、ＲＮＡレプリコンは、任意でサブゲノムプロモータの制御下で、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。

【0283】

「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」は、治療有効量で対象に投与された場合、対象の状態または病態に対してプラスのまたは有利な効果を及ぼす。好ましくは、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、治癒特性または緩和特性を有し、疾患または障害の１つ以上の症状を改善する、軽減する、緩和する、逆転させる、発症を遅延させるまたは重症度を軽減するために投与され得る。薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、予防特性を有し得、疾患の発症を遅延させるため、またはそのような疾患もしくは病的状態の重症度を軽減するために使用され得る。「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」という用語は、タンパク質またはポリペプチド全体を含み、その薬学的に活性な断片も指すことができる。この用語はまた、ペプチドまたはタンパク質の薬学的に活性な類似体を含み得る。「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」という用語は、抗原であるペプチドおよびタンパク質を含み、すなわち、ペプチドまたはタンパク質は、治療的または部分的もしくは完全に保護的であり得る免疫応答を対象において誘発する。

【0284】

一実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、免疫学的に活性な化合物または抗原またはエピトープであるか、またはそれらを含む。

【0285】

本発明によれば、「免疫学的に活性な化合物」という用語は、好ましくは免疫細胞の成熟を誘導および／もしくは抑制する、サイトカイン生合成を誘導および／もしくは抑制する、ならびに／またはＢ細胞による抗体産生を刺激することにより体液性免疫を変化させることによって、免疫応答を変化させる任意の化合物に関する。一実施形態では、免疫応答は、抗体応答（通常、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含む）の刺激を含む。免疫学的に活性な化合物は、抗ウイルス活性および抗腫瘍活性を含むがこれらに限定されない強力な免疫刺激活性を有し、また、免疫応答の他の局面を下方制御する、例えば免疫応答をＴｈ２免疫応答からシフトさせることもでき、これは、広範囲のＴｈ２媒介疾患を治療するのに有用である。

【0286】

本発明によれば、「抗原」または「免疫原」という用語は、免疫応答を誘発する任意の物質を包含する。特に、「抗原」は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する任意の物質に関する。本発明によれば、「抗原」という用語は、少なくとも１つのエピトープを含有する任意の分子を含む。好ましくは、本発明の文脈における抗原は、任意でプロセシング後に、好ましくは抗原に特異的な免疫反応を誘導する分子である。本発明によれば、免疫反応の候補である任意の適切な抗原を使用することができ、免疫反応は体液性および細胞性免疫反応の両方であり得る。本発明の実施形態の文脈において、抗原は、好ましくは細胞によって、好ましくは抗原提示細胞によって、ＭＨＣ分子に関連して提示され、抗原に対する免疫反応をもたらす。抗原は、好ましくは、天然に存在する抗原に対応するまたは由来する生成物である。そのような天然に存在する抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物ならびに他の感染性因子および病原体を含んでもよく、もしくはそれらに由来してもよく、または抗原は腫瘍抗原であってもよい。本発明によれば、抗原は、天然に存在する生成物、例えばウイルスタンパク質、またはその一部に対応し得る。好ましい実施形態では、抗原は、表面ポリペプチド、すなわち細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲン、または腫瘍の表面に天然に提示されるポリペプチドである。抗原は、細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲンまたは腫瘍に対する免疫応答を誘発し得る。

【0287】

「病原体」という用語は、生物、好ましくは脊椎動物において疾患を引き起こすことができる病原性の生物学的物質を指す。病原体には、細菌、単細胞真核生物（原生動物）、真菌、ならびにウイルスなどの微生物が含まれる。

【0288】

「エピトープ」、「抗原ペプチド」、「抗原エピトープ」、「免疫原性ペプチド」および「ＭＨＣ結合ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗原などの分子中の抗原決定基、すなわち免疫系によって認識される、例えば、特にＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識される、免疫学的に活性な化合物の一部または断片を指す。タンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続または不連続部分を含み、好ましくは５～１００、好ましくは５～５０、より好ましくは８～３０、最も好ましくは１０～２５アミノ酸長であり、例えばエピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。本発明によれば、エピトープは、細胞の表面上のＭＨＣ分子などのＭＨＣ分子に結合することができ、したがって、「ＭＨＣ結合ペプチド」または「抗原ペプチド」であり得る。「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全ての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面上に発現され、自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）および非自己抗原（例えば侵入微生物の断片）の両方をＴ細胞に表示する。好ましいそのような免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する。本明細書で使用される場合、免疫原性部分は、そのような結合が当技術分野で公知の任意のアッセイを使用して検出可能である場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に「結合する」と言われる。「ＭＨＣ結合ペプチド」という用語は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドに関する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には８～１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドが有効であり得る。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には１０～２５アミノ酸長であり、特に１３～１８アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドが有効であり得る。

【0289】

一実施形態では、本発明による目的のタンパク質は、標的生物のワクチン接種に適したエピトープを含む。当業者は、免疫生物学およびワクチン接種の原理の１つが、治療される疾患に関して免疫学的に関連する抗原で生物を免疫することによって疾患に対する免疫保護反応が生じるという事実に基づくことを理解している。本発明によれば、抗原は、自己抗原および非自己抗原を含む群から選択される。非自己抗原は、好ましくは細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、アレルゲンまたは寄生生物抗原である。抗原は、標的生物において免疫応答を誘発することができるエピトープを含むことが好ましい。例えば、エピトープは、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、アレルゲン、または腫瘍に対する免疫応答を誘発し得る。

【0290】

いくつかの実施形態では、非自己抗原は細菌抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、鳥類、魚類、および家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染する細菌に対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発される細菌は病原性細菌である。

【0291】

いくつかの実施形態では、非自己抗原はウイルス抗原である。ウイルス抗原は、例えばウイルス表面タンパク質由来のペプチド、例えばカプシドポリペプチドまたはスパイクポリペプチド、例えばコロナウイルス属（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）由来のペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、抗原は、鳥類、魚類および家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染するウイルスに対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発されるウイルスは病原性ウイルスである。

【0292】

いくつかの実施形態では、非自己抗原は、真菌由来のポリペプチドまたはタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗原は、鳥類、魚類および家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染する真菌に対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発される真菌は病原性真菌である。

【0293】

いくつかの実施形態では、非自己抗原は、単細胞真核生物寄生虫由来のポリペプチドまたはタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗原は、単細胞真核生物寄生虫、好ましくは病原性単細胞真核生物寄生虫に対する免疫応答を誘発する。病原性単細胞真核生物寄生虫は、例えば、プラスモジウム属（ｇｅｎｕｓ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、例えば熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）もしくは卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、リーシュマニア属（ｇｅｎｕｓ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、またはトリパノソーマ属（ｇｅｎｕｓ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、例えばクルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）もしくはブルーストリパノソーマ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）に由来し得る。

【0294】

いくつかの実施形態では、非自己抗原は、アレルゲン性ポリペプチドまたはアレルゲン性タンパク質である。アレルゲン性タンパク質またはアレルゲン性ポリペプチドは、減感作としても公知のアレルゲン免疫療法に適する。

【0295】

いくつかの実施形態では、抗原は自己抗原、特に腫瘍抗原である。腫瘍抗原およびそれらの決定は当業者に公知である。

【0296】

本発明に関連して、「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」という用語は、正常条件下では限られた数の組織および／もしくは器官において、または特定の発生段階において特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば腫瘍抗原は、正常条件下では胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器官、例えば精巣、栄養膜組織、例えば胎盤、または生殖系列細胞で特異的に発現され得、１つ以上の腫瘍または癌組織で発現されるかまたは異常発現される。これに関連して、「限られた数」は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下を意味する。本発明に関連して腫瘍抗原としては、例えば、分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち正常条件下では特定の分化段階で特定の細胞型において特異的に発現されるタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち正常条件下では精巣および時には胎盤において特異的に発現されるタンパク質、ならびに生殖系列特異的抗原が挙げられる。本発明に関連して、腫瘍抗原は、好ましくは癌細胞の細胞表面と会合しており、好ましくは正常組織では発現されないか、またはまれにしか発現されない。好ましくは、腫瘍抗原または腫瘍抗原の異常発現は、癌細胞を同定する。本発明に関連して、対象、例えば癌疾患に罹患している患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、好ましくは前記対象における自己タンパク質である。好ましい実施形態では、本発明に関連して腫瘍抗原は、正常条件下では非必須である組織もしくは器官、すなわち免疫系によって損傷された場合に対象の死をもたらさない組織もしくは器官において、または免疫系がアクセスできないかもしくはほとんどアクセスできない身体の器官もしくは構造において特異的に発現される。好ましくは、腫瘍抗原のアミノ酸配列は、正常組織で発現される腫瘍抗原と癌組織で発現される腫瘍抗原とで同一である。

【0297】

本発明において有用であり得る腫瘍抗原の例は、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、β－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン－６、クローディン－１８．２およびクローディン－１２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴである。特に好ましい腫瘍抗原としては、クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）およびクローディン６（ＣＬＤＮ６）が挙げられる。

【0298】

いくつかの実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、免疫応答を誘発する抗原である必要はない。適切な薬学的に活性なタンパク質またはペプチドは、サイトカインおよび免疫系タンパク質、例えば免疫学的に活性な化合物（例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレチン、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、免疫グロブリン）、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロピン、レプチンなど）、成長ホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、成長因子（例えば上皮成長因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子など）、成長因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成または分解性酵素、ステロイド産生酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、シトクロム、アデニル酸またはグアニル酸シクラーゼ、ノイラミニダーゼなど）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合タンパク質（成長ホルモンまたは成長因子結合タンパク質など）、転写および翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質（例えば血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（コラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン、ミオシンなど）、血液タンパク質（トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、フォン・ヴィレブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）または修飾第ＶＩＩＩ因子、抗凝固因子などからなる群より選択され得る。一実施形態では、本発明による薬学的に活性なタンパク質は、リンパ系ホメオスタシスの調節に関与するサイトカイン、好ましくはＴ細胞の発生、プライミング、拡大、分化および／または生存に関与し、好ましくはそれらを誘導または増強するサイトカインである。一実施形態では、サイトカインは、インターロイキン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１である。

【0299】

インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達の阻害剤
オープンリーディングフレームによってコードされる目的のさらなる適切なタンパク質は、インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達の阻害剤である。発現のためにＲＮＡが導入された細胞の生存能力が、特に細胞がＲＮＡで複数回トランスフェクトされた場合、低下し得ることが報告されているが、ＩＦＮ阻害剤は、ＲＮＡが発現される細胞の生存能力を高めることが見出された（国際公開第２０１４／０７１９６３ Ａ１号）。好ましくは、阻害剤は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤である。細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の係合を防止し、細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、細胞内でのＲＮＡの安定な発現を可能する。あるいはまたはさらに、細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の係合を防止し、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、特に細胞がＲＮＡで繰り返しトランスフェクトされる場合、細胞の生存を増強する。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞内ＩＦＮシグナル伝達は、翻訳の阻害および／またはＲＮＡ分解をもたらし得ることが想定される。これは、１つ以上のＩＦＮ誘導性の抗ウイルス活性エフェクタタンパク質を阻害することによって対処することができる。ＩＦＮ誘導性の抗ウイルス活性エフェクタタンパク質は、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、２’，５’－オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）およびＲＮａｓｅＬからなる群より選択することができる。細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、ＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路を阻害することを含み得る。目的の適切なタンパク質は、ＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路を阻害することができるタンパク質である。ＰＫＲ依存性経路を阻害することは、ｅＩＦ２－αリン酸化を阻害することを含み得る。ＰＫＲを阻害することは、少なくとも１つのＰＫＲ阻害剤で細胞を処理することを含み得る。ＰＫＲ阻害剤は、ＰＫＲのウイルス阻害剤であり得る。ＰＫＲの好ましいウイルス阻害剤は、ワクシニアウイルスＥ３である。ペプチドまたはタンパク質（例えばＥ３、Ｋ３）が細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するものである場合、ペプチドまたはタンパク質の細胞内発現が好ましい。ワクシニアウイルスＥ３は、ｄｓＲＮＡに結合し、これを隔離してＰＫＲおよびＯＡＳの活性化を妨げる２５ｋＤａのｄｓＲＮＡ結合タンパク質（遺伝子Ｅ３Ｌによってコードされる）である。Ｅ３は、ＰＫＲに直接結合することができ、その活性を阻害し、ｅＩＦ２－αのリン酸化の低減をもたらす。ＩＦＮシグナル伝達の他の適切な阻害剤は、単純ヘルペスウイルスＩＣＰ３４．５、インフルエンザウイルスＮＳ１、トスカナウイルスＮＳ、カイコ核多角体病ウイルスＰＫ２、およびＨＣＶ ＮＳ３４Ａである。

【0300】

ｒＲＮＡ分子中の少なくとも１つのオープンリーディングフレームの位置
ｒＲＮＡレプリコンは、任意でサブゲノムプロモータの制御下で、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現に適する。様々な実施形態が可能である。それぞれが目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームがＲＮＡレプリコン上に存在し得る。ＲＮＡレプリコンの最も上流のオープンリーディングフレームは、「第１のオープンリーディングフレーム」と呼ばれる。一実施形態では、目的のタンパク質をコードする第１のオープンリーディングフレームは、５’複製認識配列の下流かつＩＲＥＳ（および自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム）の上流に位置する。いくつかの実施形態では、「第１のオープンリーディングフレーム」は、ＲＮＡレプリコンの唯一のオープンリーディングフレームである。任意で、１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームが第１のオープンリーディングフレームの下流に存在してもよい。第１のオープンリーディングフレームの下流の１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、それらが第１のオープンリーディングフレームの下流に存在する順序（５’から３’へ）で、「第２のオープンリーディングフレーム」、「第３のオープンリーディングフレーム」などと呼ばれ得る。一実施形態では、１つ以上の目的のタンパク質をコードする１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、自己複製ウイルス由来の機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの下流に位置し、好ましくはサブゲノムプロモータによって制御される。好ましくは、各オープンリーディングフレームは、開始コドン（塩基トリプレット）、典型的にはＡＴＧ（それぞれのＤＮＡ分子中）に対応するＡＵＧ（ＲＮＡ分子中）を含む。

【0301】

レプリコンが３’複製認識配列を含む場合、全てのオープンリーディングフレームが３’複製認識配列の上流に局在することが好ましい。

【0302】

いくつかの実施形態では、レプリコンの少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータ、好ましくはアルファウイルスサブゲノムプロモータの制御下にある。アルファウイルスサブゲノムプロモータは非常に効率的であり、したがって高レベルでの異種遺伝子発現に適する。好ましくは、サブゲノムプロモータは、アルファウイルスにおけるサブゲノム転写物のためのプロモータである。これは、サブゲノムプロモータが、アルファウイルスに天然であり、好ましくは前記アルファウイルス中の１つ以上の構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの転写を制御するものであることを意味する。あるいは、サブゲノムプロモータは、アルファウイルスのサブゲノムプロモータの変異体であり、宿主細胞におけるサブゲノムＲＮＡ転写のためのプロモータとして機能する任意の変異体が適切である。レプリコンがサブゲノムプロモータを含む場合、レプリコンは、保存配列要素３（ＣＳＥ ３）またはその変異体を含むことが好ましい。

【0303】

好ましくは、サブゲノムプロモータの制御下にある少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータの下流に局在する。好ましくは、サブゲノムプロモータは、オープンリーディングフレームの転写物を含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御する。

【0304】

いくつかの実施形態では、第１のオープンリーディングフレームはサブゲノムプロモータの制御下にある。一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームがサブゲノムプロモータの制御下にある場合、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、レプリコンおよびそのサブゲノム転写物の両方から発現され得る（後者は機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で）。それぞれがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータの制御下にあり得る第１のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る。１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームによって、例えば第２のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、それぞれサブゲノムプロモータの制御下で、１つ以上のサブゲノム転写物から翻訳され得る。例えば、ＲＮＡレプリコンは、目的の第２のタンパク質をコードする転写物の産生を制御するサブゲノムプロモータを含み得る。

【0305】

他の実施形態では、第１のオープンリーディングフレームはサブゲノムプロモータの制御下にない。一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームがサブゲノムプロモータの制御下にない場合、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子はレプリコンから発現され得る。それぞれがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、第１のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る。１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、サブゲノム転写物から発現され得る。

【0306】

本発明によるレプリコンを含む細胞では、レプリコンは機能性非構造タンパク質によって増幅され得る。さらに、レプリコンがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のオープンリーディングフレームを含む場合、１つ以上のサブゲノム転写物は機能性非構造タンパク質によって生成されると予想される。

【0307】

レプリコンが目的のタンパク質をコードする複数のオープンリーディングフレームを含む場合、各オープンリーディングフレームは異なるタンパク質をコードすることが好ましい。例えば、第２のオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質は、第１のオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質とは異なる。

【0308】

本発明による複製可能なＲＮＡ分子の他の特徴
本発明によるＲＮＡ分子は、任意で、以下に詳述するように、さらなる特徴、例えば５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列、ならびに／またはＲＮＡ分子の最適化された翻訳および／もしくは安定化のためのコドン使用頻度の適合によって特徴付けられ得る。

【0309】

キャップ
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは５’キャップを含む。

【0310】

「５’’キャップ」、「キャップ」、「５’キャップ構造」、「キャップ構造」という用語は、前駆体メッセンジャＲＮＡなどのいくつかの真核生物一次転写物の５’末端に見出されるジヌクレオチドを指すために同義的に使用される。５’キャップは、（任意で修飾された）グアノシンが５’－５’三リン酸結合（または特定のキャップ類似体の場合は修飾三リン酸結合）を介してｍＲＮＡ分子の最初のヌクレオチドに結合している構造である。これらの用語は、従来のキャップまたはキャップ類似体を指すことができる。

【0311】

「５’キャップを含むＲＮＡ」または「５’キャップを備えたＲＮＡ」または「５’キャップで修飾されたＲＮＡ」または「キャップされたＲＮＡ」は、５’キャップを含むＲＮＡを指す。例えば、ＲＮＡに５’キャップを提供することは、前記５’キャップの存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成され得、前記５’キャップは、生成されたＲＮＡ鎖に共転写的に組み込まれるか、または、例えばインビトロ転写によってＲＮＡが生成され得、５’キャップは、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに結合され得る。キャップされたＲＮＡでは、（キャップされた）ＲＮＡ分子の最初の塩基の３’位置は、ホスホジエステル結合を介してＲＮＡ分子の次の塩基（「第２の塩基」）の５’位置に連結されている。

【0312】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは５’キャップを含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは５’キャップを含まない。

【0313】

「従来の５’キャップ」という用語は、天然に存在する５’キャップ、好ましくは７－メチルグアノシンキャップを指す。７－メチルグアノシンキャップでは、キャップのグアノシンは修飾グアノシンであり、修飾は７位のメチル化からなる。

【0314】

本発明の文脈において、「５’キャップ類似体」という用語は、従来の５’キャップに類似するが、好ましくはインビボおよび／または細胞内で、ＲＮＡに結合した場合にＲＮＡを安定化する能力を有するように修飾された分子構造を指す。キャップ類似体は従来の５’キャップではない。

【0315】

真核生物ｍＲＮＡの場合、５’キャップは一般にｍＲＮＡの効率的な翻訳に関与すると記載されている：一般に、真核生物では、翻訳は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が存在しない限り、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の５’末端でのみ開始される。真核細胞は、核内での転写中にＲＮＡに５’キャップを提供することができる：新たに合成されたｍＲＮＡは通常、例えば転写物が２０～３０ヌクレオチドの長さに達すると、５’キャップ構造で修飾される。最初に、５’末端ヌクレオチドｐｐｐＮ（ｐｐｐは三リン酸を表す；Ｎは任意のヌクレオシドを表す）は、ＲＮＡ ５’－トリホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性を有するキャッピング酵素によって細胞内で５’ＧｐｐｐＮに変換される。ＧｐｐｐＮは、その後、（グアニン－７）－メチルトランスフェラーゼ活性を有する第２の酵素によって細胞内でメチル化されて、モノメチル化ｍ^７ＧｐｐｐＮキャップを形成し得る。一実施形態では、本発明で使用される５’キャップは、天然の５’キャップである。

【0316】

本発明では、天然の５’キャップジヌクレオチドは、典型的には、非メチル化キャップジヌクレオチド（Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ；ＧｐｐｐＮとも呼ばれる）およびメチル化キャップジヌクレオチド（ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ；ｍ^７ＧｐｐｐＮとも呼ばれる）からなる群より選択される。ｍ^７ＧｐｐｐＮ（ＮはＧである）は、以下の式：

【化8】

によって表される。

【0317】

本発明のキャップされたＲＮＡは、インビトロで調製することができ、したがって、宿主細胞におけるキャッピング機構に依存しない。キャップされたＲＮＡをインビトロで作製するために最も頻繁に使用される方法は、４つ全てのリボヌクレオシド三リン酸およびｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ^７ＧｐｐｐＧとも呼ばれる）などのキャップジヌクレオチドの存在下で、細菌またはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのいずれかでＤＮＡ鋳型を転写することである。ＲＮＡポリメラーゼは、次の鋳型ヌクレオシド三リン酸（ｐｐｐＮ）のα－リン酸に対するｍ^７ＧｐｐｐＧのグアノシン部分の３’－ＯＨによる求核攻撃で転写を開始し、中間体ｍ^７ＧｐｐｐＧｐＮ（ＮはＲＮＡ分子の第２の塩基である）をもたらす。競合するＧＴＰ開始産物ｐｐｐＧｐＮの形成は、インビトロ転写中のキャップ対ＧＴＰのモル比を５～１０に設定することによって抑制される。

【0318】

本発明の好ましい実施形態では、５’キャップ（存在する場合）は５’キャップ類似体である。これらの実施形態は、ＲＮＡがインビトロ転写によって得られる、例えばインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）である場合に特に適する。キャップ類似体は、最初に、インビトロ転写によってＲＮＡ転写物の大規模合成を促進すると記載されている。

【0319】

メッセンジャＲＮＡについては、いくつかのキャップ類似体（合成キャップ）がこれまでに一般的に記載されており、それらは全て本発明の文脈で使用することができる。理想的には、より高い翻訳効率および／またはインビボ分解に対する増大した耐性および／またはインビトロ分解に対する増大した耐性に関連するキャップ類似体が選択される。

【0320】

好ましくは、一方向でのみＲＮＡ鎖に組み込むことができるキャップ類似体が使用される。Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５，ＲＮＡ Ｊ．１：９５７－９６７）は、インビトロ転写中に、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼが転写の開始のために７－メチルグアノシン単位を使用し、それによりキャップを有する転写物の約４０～５０％がキャップジヌクレオチドを逆方向に有する（すなわち最初の反応産物はＧｐｐｐｍ^７ＧｐＮである）ことを実証した。正しいキャップを有するＲＮＡと比較して、逆キャップを有するＲＮＡは、核酸配列のタンパク質への翻訳に関して機能的ではない。したがって、キャップを正しい方向に組み込むこと、すなわち、ｍ^７ＧｐｐｐＧｐＮなどに本質的に対応する構造を有するＲＮＡが得られることが望ましい。キャップジヌクレオチドの逆方向組み込みは、メチル化グアノシン単位の２’－ＯＨ基または３’－ＯＨ基のいずれかの置換によって阻害されることが示されている（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ Ｊ．７：１４８６－１４９５；Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２４：１６１－１６４）。そのような「アンチリバースキャップ類似体」の存在下で合成されるＲＮＡは、従来の５’キャップｍ^７ＧｐｐｐＧの存在下でインビトロ転写されるＲＮＡよりも効率的に翻訳される。そのために、メチル化グアノシン単位の３’ＯＨ基がＯＣＨ_３で置き換えられた１つのキャップ類似体が、例えば、Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ １０８：４００９－４０１７によって記載されている（７－メチル（３’－Ｏ－メチル）ＧｐｐｐＧ；アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ））。ＡＲＣＡは、本発明による適切なキャップジヌクレオチドである。

【化9】

【0321】

一実施形態では、本発明のＲＮＡは、本質的にキャップ除去を受けにくい。一般に、培養哺乳動物細胞に導入された合成ｍＲＮＡから産生されるタンパク質の量はｍＲＮＡの自然分解によって制限されるため、これは重要である。ｍＲＮＡ分解の１つのインビボ経路は、ｍＲＮＡキャップの除去から始まる。この除去は、調節サブユニット（Ｄｃｐ１）および触媒サブユニット（Ｄｃｐ２）を含むヘテロ二量体ピロホスファターゼによって触媒される。触媒サブユニットは、三リン酸架橋のαリン酸基とβリン酸基との間を切断する。本発明では、この種の切断を受けにくいか、またはより受けにくいキャップ類似体が選択され得るか、または存在し得る。この目的のための適切なキャップ類似体は、式（Ｉ）：

【化10】

に従うキャップジヌクレオチドから選択され得、
ここで、Ｒ^１は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択され、
Ｒ^２およびＲ^３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より独立して選択されるか、またはＲ^２とＲ^３は一緒になってＯ－Ｘ－Ｏ［Ｘは、置換されていてもよいＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）、およびＣ（ＣＨ_３）_２からなる群より選択される］を形成するか、またはＲ^２は、Ｒ^２が結合している環の４’位の水素原子と結合して－Ｏ－ＣＨ_２－または－ＣＨ_２－Ｏ－を形成し、
Ｒ^５は、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ_３からなるグループから選択され、
Ｒ^４およびＲ^６は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ_３からなる群より独立して選択される。

【0322】

ｎは、１、２、または３である。

【0323】

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６の好ましい実施形態は、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号に開示されており、本発明ではそれに応じて選択され得る。

【0324】

例えば、一実施形態では、本発明のＲＮＡは、ホスホロチオエートキャップ類似体を含む。ホスホロチオエートキャップ類似体は、三リン酸鎖の３つの非架橋Ｏ原子の１つがＳ原子で置換されている、すなわち式（Ｉ）のＲ^４、Ｒ^５またはＲ^６の１つがＳである特定のキャップ類似体である。ホスホロチオエートキャップ類似体は、望ましくないキャップ除去プロセスに対する解決策、したがってインビボでのＲＮＡの安定性を高めるための解決策として、Ｊ．Ｋｏｗａｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＲＮＡ，１４：１１１９－１１３１によって記載されている。特に、５’キャップのβリン酸基における硫黄原子を酸素原子に置換すると、Ｄｃｐ２に対する安定化をもたらす。本発明において好ましいその実施形態では、式（Ｉ）のＲ^５はＳであり、Ｒ^４およびＲ^６はＯである。

【0325】

さらなる実施形態では、本発明のＲＮＡは、ＲＮＡ ５’キャップのホスホロチオエート修飾が「アンチリバースキャップ類似体」（ＡＲＣＡ）修飾と組み合わされたホスホロチオエートキャップ類似体を含む。それぞれのＡＲＣＡ－ホスホロチオエートキャップ類似体は、国際公開第２００８／１５７６８８ Ａ２号に記載されており、それらは全て本発明のＲＮＡに使用することができる。その実施形態では、式（Ｉ）のＲ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＯＨではなく、好ましくはＲ^２およびＲ^３の一方はメトキシ（ＯＣＨ_３）であり、Ｒ^２およびＲ^３の他方は、好ましくはＯＨである。好ましい実施形態では、酸素原子は、βリン酸基において硫黄原子に置換される（したがって、式（Ｉ）のＲ^５はＳであり、Ｒ^４およびＲ^６はＯである）。ＡＲＣＡのホスホロチオエート修飾は、α、β、およびγホスホロチオエート基が翻訳機構およびキャップ除去機構の両方でキャップ結合タンパク質の活性部位内に正確に配置されることを確実にすると考えられている。これらの類似体の少なくともいくつかは、本質的にピロホスファターゼＤｃｐ１／Ｄｃｐ２に耐性である。ホスホロチオエート修飾ＡＲＣＡは、ホスホロチオエート基を欠く対応するＡＲＣＡよりも、ｅＩＦ４Ｅに対してはるかに高い親和性を有すると記載された。

【0326】

本発明において特に好ましいそれぞれのキャップ類似体、すなわちｍ_２’ ^{７，２’－Ｏ}Ｇｐｐ_ｓｐＧは、β－Ｓ－ＡＲＣＡと呼ばれる（国際公開第２００８／１５７６８８ Ａ２号；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：９６１－９７１）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明のＲＮＡはβ－Ｓ－ＡＲＣＡで修飾されている。β－Ｓ－ＡＲＣＡは以下の構造：

【化11】

によって表される。

【0327】

一般に、架橋リン酸塩の硫黄原子を酸素原子に置き換えると、ＨＰＬＣにおけるそれらの溶出パターンに基づいて、Ｄ１およびＤ２と呼ばれるホスホロチオエートジアステレオマーをもたらす。手短に言えば、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー」または「β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較してＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、したがってより短い保持時間を示すβ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーである。ＨＰＬＣによる立体化学的配置の決定は、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号に記載されている。

【0328】

本発明の第１の特に好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）ジアステレオマーで修飾される。β－Ｓ－ＡＲＣＡの２つのジアステレオマーは、ヌクレアーゼに対する感受性が異なる。β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーを担持するＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対してほぼ完全に耐性である（非修飾ＡＲＣＡ ５’キャップの存在下で合成されたＲＮＡと比較してわずか６％の切断）が、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）５’キャップを有するＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対して中程度の感受性を示す（７１％の切断）ことが示されている。Ｄｃｐ２切断に対する安定性の増加は、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現の増加と相関することがさらに示されている。特に、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップを担持するＲＮＡは、哺乳動物細胞においてβ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）キャップを担持するＲＮＡよりも効率的に翻訳されることが示されている。したがって、本発明の一実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーのＰ_β原子における立体化学的配置に対応する、式（Ｉ）の置換基Ｒ^５を含むＰ原子における立体化学的配置を特徴とする、式（Ｉ）に従うキャップ類似体で修飾される。その実施形態では、式（Ｉ）のＲ^５はＳであり、Ｒ^４およびＲ^６はＯである。さらに、式（Ｉ）のＲ^２またはＲ^３の少なくとも一方は、好ましくはＯＨではなく、好ましくはＲ^２およびＲ^３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ^２およびＲ^３の他方は、好ましくはＯＨである。

【0329】

第２の特に好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーで修飾されている。この実施形態は、ワクチン接種目的などのための、キャップされたＲＮＡの未成熟抗原提示細胞への移入に特に適する。β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーは、それぞれキャップされたＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入すると、ＲＮＡの安定性を高め、ＲＮＡの翻訳効率を高め、ＲＮＡの翻訳を延長し、ＲＮＡの総タンパク質発現を増加させ、および／または前記ＲＮＡによってコードされる抗原もしくは抗原ペプチドに対する免疫応答を増加させるのに特に適することが実証されている（Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：９６１－９７１）。したがって、本発明の代替的な実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰ_β原子における立体化学的配置に対応する、式（Ｉ）の置換基Ｒ^５を含むＰ原子における立体化学的配置を特徴とする、式（Ｉ）に従うキャップ類似体で修飾される。それぞれのキャップ類似体およびその実施形態は、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号およびＫｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：９６１－９７１に記載されている。置換基Ｒ^５を含むＰ原子における立体化学的配置がβ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰ_β原子における立体化学的配置に対応する、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号に記載されている任意のキャップ類似体を本発明で使用し得る。好ましくは、式（Ｉ）のＲ^５はＳであり、Ｒ^４およびＲ^６はＯである。さらに、式（Ｉ）のＲ^２またはＲ^３の少なくとも一方は、好ましくはＯＨではなく、好ましくはＲ^２およびＲ^３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ^２およびＲ^３の他方は、好ましくはＯＨである。

【0330】

一実施形態では、本発明のＲＮＡは、任意の１つのリン酸基がボラノホスフェート基またはホスホセレノエート基によって置換されている、式（Ｉ）に従う５’キャップ構造で修飾される。そのようなキャップは、インビトロおよびインビボの両方で安定性が増加している。任意で、それぞれの化合物は２’－Ｏ－または３’－Ｏ－アルキル基を有する（アルキルは、好ましくはメチルである）；それぞれのキャップ類似体は、ＢＨ_３－ＡＲＣＡまたはＳｅ－ＡＲＣＡと呼ばれる。ｍＲＮＡのキャッピングに特に適する化合物には、国際公開第２００９／１４９２５３ Ａ２号に記載されている、β－ＢＨ_３－ＡＲＣＡおよびβ－Ｓｅ－ＡＲＣＡが含まれる。これらの化合物については、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰ_β原子における立体化学的配置に対応する、式（Ｉ）の置換基Ｒ^５を含むＰ原子における立体化学的配置が好ましい。

【0331】

一実施形態では、５’キャップは、以下の構造：

【化12】

を有し得る。

【0332】

このタイプのキャップが使用される実施形態では、アルファウイルスの第２のヌクレオチドに対応するＵは、修飾から除外され、例えば、Ｎ１－メチル－シュードウリジンへの修飾から除外される。

【0333】

ＵＴＲ
「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５’側（上流）（５’－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３’側（下流）（３’－ＵＴＲ）に存在し得る。

【0334】

３’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の、遺伝子の３’末端に位置するが、「３’－ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリ（Ａ）尾部を含まない。したがって、３’－ＵＴＲはポリ（Ａ）尾部（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）尾部に直接隣接している。

【0335】

５’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の、遺伝子の５’末端に位置する。５’－ＵＴＲは５’キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５’キャップに直接隣接している。

【0336】

５’および／または３’非翻訳領域は、本発明によれば、これらの領域が、オープンリーディングフレームを含むＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高めるような方法でオープンリーディングフレームと会合するように、前記オープンリーディングフレームに機能的に連結され得る。

【0337】

いくつかの実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。

【0338】

ＵＴＲは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率に関与する。本明細書に記載の５’キャップおよび／または３’ポリ（Ａ）尾部に関する構造修飾に加えて、特定の５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を選択することによって、両方を改善することができる。ＵＴＲ内の配列要素は、一般に、翻訳効率（主に５’－ＵＴＲ）およびＲＮＡ安定性（主に３’－ＵＴＲ）に影響を及ぼすと理解されている。ＲＮＡレプリコンの翻訳効率および／または安定性を高めるために、活性な５’－ＵＴＲが存在することが好ましい。独立してまたはさらに、ＲＮＡレプリコンの翻訳効率および／または安定性を高めるために、活性な３’－ＵＴＲが存在することが好ましい。

【0339】

第１の核酸配列（例えばＵＴＲ）に関して、「翻訳効率を高めるために活性な」および／または「安定性を高めるために活性な」という用語は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列と共通の転写物において、前記第１の核酸配列の非存在下での前記第２の核酸配列の翻訳効率および／または安定性と比較して翻訳効率および／または安定性が増加するような方法で、前記第２の核酸配列の翻訳効率および／または安定性を改変することができることを意味する。

【0340】

一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに対して異種または非天然である５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。これは、所望の翻訳効率およびＲＮＡ安定性に従って非翻訳領域を設計することを可能にする。したがって、異種または非天然ＵＴＲは高度の柔軟性を可能にし、この柔軟性は、天然のアルファウイルスＵＴＲと比較して有利である。

【0341】

好ましくは、本発明によるＲＮＡレプリコンは、ウイルス起源ではない、特にアルファウイルス起源ではない５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、真核生物の５’－ＵＴＲに由来する５’－ＵＴＲおよび／または真核生物の３’－ＵＴＲに由来する３’－ＵＴＲを含む。

【0342】

本発明による５’－ＵＴＲは、任意でリンカーによって分離された、複数の核酸配列の任意の組合せを含み得る。本発明による３’－ＵＴＲは、任意でリンカーによって分離された、複数の核酸配列の任意の組合せを含み得る。

【0343】

本発明による「リンカー」という用語は、２つの核酸配列を連結するために前記２つの核酸配列の間に付加される核酸配列に関する。リンカー配列に関して特に制限はない。

【0344】

３’－ＵＴＲは、典型的には２００～２０００ヌクレオチド、例えば５００～１５００ヌクレオチドの長さを有する。免疫グロブリンｍＲＮＡの３’非翻訳領域は比較的短い（約３００ヌクレオチド未満）が、他の遺伝子の３’非翻訳領域は比較的長い。例えば、ｔＰＡの３’非翻訳領域は約８００ヌクレオチド長であり、第ＶＩＩＩ因子の３’非翻訳領域は約１８００ヌクレオチド長であり、エリスロポエチンの３’非翻訳領域は約５６０ヌクレオチド長である。哺乳動物ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は、典型的には、ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として公知の相同領域を有する。この配列は、おそらくポリ（Ａ）付着シグナルであり、ポリ（Ａ）付着部位の１０～３０塩基上流に位置することが多い。３’－非翻訳領域は、エキソリボヌクレアーゼに対するバリアとして働くかまたはＲＮＡ安定性を高めることが公知のタンパク質（例えばＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用するステムループ構造を与えるように折り畳むことができる、１つ以上の逆方向反復配列を含み得る。

【0345】

ヒトβグロビン３’－ＵＴＲ、特にヒトβグロビン３’－ＵＴＲの２つの連続する同一のコピーは、高い転写物安定性および翻訳効率に寄与する（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ １０８：４００９－４０１７）。したがって、一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、ヒトβグロビン３’－ＵＴＲの２つの連続する同一のコピーを含む。したがって、これは、５’→３’方向に：（ａ）任意で５’－ＵＴＲ；（ｂ）オープンリーディングフレーム；（ｃ）３’－ＵＴＲを含み、前記３’－ＵＴＲは、ヒトβ－グロビン３’－ＵＴＲ、その断片、またはヒトβ－グロビン３’－ＵＴＲの変異体もしくはその断片の２つの連続する同一のコピーを含む。

【0346】

一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、翻訳効率および／または安定性を高めるために活性であるが、ヒトβ－グロビン３’－ＵＴＲ、その断片、またはヒトβ－グロビン３’－ＵＴＲの変異体もしくはその断片ではない３’－ＵＴＲを含む。

【0347】

一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、翻訳効率および／または安定性を高めるために活性な５’－ＵＴＲを含む。

【0348】

ポリ（Ａ）配列
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは３’－ポリ（Ａ）配列を含む。レプリコンが保存配列要素４（ＣＳＥ ４）を含む場合、レプリコンの３’－ポリ（Ａ）配列は、好ましくはＣＳＥ ４の下流に存在し、最も好ましくはＣＳＥ ４に直接隣接する。

【0349】

本発明によれば、一実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２６個、好ましくは少なくとも４０個、好ましくは少なくとも８０個、好ましくは少なくとも１００個、および好ましくは最大５００個、好ましくは最大４００個、好ましくは最大３００個、好ましくは最大２００個、特に最大１５０個、特に最大約１２０個のＡヌクレオチドを含むか、または本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。この文脈において、「から本質的になる」とは、ポリ（Ａ）配列中のほとんどのヌクレオチド、典型的には「ポリ（Ａ）配列」中のヌクレオチド数で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％がＡヌクレオチド（アデニル酸）であるが、残りのヌクレオチドが、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、Ｃヌクレオチド（シチジル酸）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容することを意味する。この文脈において、「からなる」とは、ポリ（Ａ）配列中の全てのヌクレオチド、すなわちポリ（Ａ）配列中のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。

【0350】

実際に、約１２０個のＡヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）配列は、トランスフェクトされた真核細胞中のＲＮＡのレベル、ならびに３’ポリ（Ａ）配列の上流（５’側）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。

【0351】

アルファウイルスでは、少なくとも１１個の連続するアデニル酸残基、または少なくとも２５個の連続するアデニル酸残基の３’ポリ（Ａ）配列が、マイナス鎖の効率的な合成に重要であると考えられている。特に、アルファウイルスでは、少なくとも２５個の連続するアデニル酸残基の３’ポリ（Ａ）配列が、保存配列要素４（ＣＳＥ ４）と共に機能して（－）鎖の合成を促進すると理解されている（Ｈａｒｄｙ＆Ｒｉｃｅ，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：４６３０－４６３９）。

【0352】

本発明は、コード鎖に相補的な鎖内に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡの転写中、すなわちインビトロ転写ＲＮＡの生成中に付着される３’ポリ（Ａ）配列を提供する。ポリ（Ａ）配列をコードするＤＮＡ配列（コード鎖）は、ポリ（Ａ）カセットと呼ばれる。

【0353】

本発明の好ましい実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在する３’ポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）の等しい分布を有するランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、好ましくは１０～３０、より好ましくは１０～２０ヌクレオチド長であり得る。そのようなカセットは、国際公開第２０１６／００５００４ Ａ１号に開示されている。国際公開第２０１６／００５００４ Ａ１号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを本発明で使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）の等しい分布を有し、例えば５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダムな配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドＤＮＡの持続的な増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率の支持に関する有益な特性と依然として関連している。

【0354】

結果として、本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子に含まれる３’ポリ（Ａ）配列は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）の等しい分布を有するランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、好ましくは１０～３０、より好ましくは１０～２０ヌクレオチド長であり得る。

【0355】

コドン使用頻度
一般に、遺伝暗号の縮重は、同じコード能力を維持しながら（置換するコドンが置換されるコドンと同じアミノ酸をコードするように）、ＲＮＡ配列中に存在する特定のコドン（アミノ酸をコードする塩基トリプレット）を他のコドン（塩基トリプレット）で置換することを可能にする。本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子に含まれるオープンリーディングフレームの少なくとも１つのコドンは、オープンリーディングフレームが由来する種のそれぞれのオープンリーディングフレーム内のそれぞれのコドンとは異なる。その実施形態では、オープンリーディングフレームのコード配列は「適合された」または「改変された」と言われる。レプリコンに含まれるオープンリーディングフレームのコード配列を適合させ得る。

【0356】

例えば、オープンリーディングフレームのコード配列を適合させる場合、頻繁に使用されるコドンを選択し得る：国際公開第２００９／０２４５６７ Ａ１号は、より頻繁に使用されるコドンによる希少コドンの置換を含む、核酸分子のコード配列の適合を記載している。コドン使用頻度は宿主細胞または宿主生物に依存するので、この種の適合は、核酸配列を特定の宿主細胞または宿主生物における発現に適合させるのに適している。一般的に言えば、より頻繁に使用されるコドンは、典型的には、宿主細胞または宿主生物においてより効率的に翻訳されるが、オープンリーディングフレームの全てのコドンの適合は必ずしも必要ではない。

【0357】

例えば、オープンリーディングフレームのコード配列を適合させる場合、Ｇ（グアニル酸）残基およびＣ（シチジル酸）残基の含有量は、各アミノ酸について最も高いＧＣリッチ含有量を有するコドンを選択することによって変更し得る。ＧＣリッチなオープンリーディングフレームを有するＲＮＡ分子は、免疫活性化を低下させ、ＲＮＡの翻訳および半減期を改善する可能性を有することが報告された（Ｔｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３，１４５７－１４６５）。

【0358】

特に、非構造タンパク質のコード配列は、所望に応じて適合させることができる。非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームはレプリコンの５’複製認識配列と重複しないため、この自由度が可能である。

【0359】

本発明の実施形態の安全性特徴
以下の特徴は、単独でまたは任意の適切な組合せで、本発明において好ましい：
本発明のレプリコンは粒子形成性ではない。これは、本発明のレプリコンによる宿主細胞の接種後、宿主細胞が次世代ウイルス粒子などのウイルス粒子を産生しないことを意味する。一実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンは、ウイルス構造タンパク質、例えばコアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｐ６２、および／またはエンベロープタンパク質Ｅ１などのアルファウイルス構造タンパク質をコードする遺伝情報を全く含まない。好ましくは、本発明によるレプリコンは、ウイルスパッケージングシグナル、例えばアルファウイルスパッケージングシグナルを含まない。例えば、ＳＦＶのｎｓＰ２のコード領域に含まれるアルファウイルスパッケージングシグナル（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４３２０－４３２６）は、例えば欠失または突然変異によって除去し得る。アルファウイルスパッケージングシグナルを除去する適切な方法は、ｎｓＰ２のコード領域のコドン使用頻度の適合を含む。遺伝暗号の縮重は、コードされたｎｓＰ２のアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、パッケージングシグナルの機能を欠失させることを可能にし得る。

【0360】

ＤＮＡ
本発明はまた、本発明によるＲＮＡレプリコンをコードする核酸配列を含むＤＮＡを提供する。

【0361】

好ましくは、ＤＮＡは二本鎖である。

【0362】

好ましい実施形態では、ＤＮＡはプラスミドである。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二重鎖に関する。

【0363】

本発明のＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得るプロモータを含み得る。これは、コードされたＲＮＡ、例えば本発明のＲＮＡのインビボまたはインビトロでの転写を可能にする。ＩＶＴベクターは、インビトロ転写の鋳型として標準化された方法で使用され得る。本発明による好ましいプロモータの例は、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモータである。

【0364】

一実施形態では、本発明のＤＮＡは、単離された核酸分子である。

【0365】

ＲＮＡを調製する方法
本発明によるＲＮＡ分子は、インビトロ転写によって得られ得る。インビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）は、本発明において特に興味深い。ＩＶＴ－ＲＮＡは、核酸分子（特にＤＮＡ分子）からの転写によって得ることができる。本発明のＤＮＡ分子（１つ以上）は、特にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得るプロモータを含む場合、そのような目的に適する。

【0366】

本発明によるｒＲＮＡは、インビトロで合成することができる。これは、インビトロ転写反応にキャップ類似体を添加することを可能にする。典型的には、ポリ（Ａ）尾部は、ＤＮＡ鋳型上のポリ（ｄＴ）配列によってコードされる。あるいは、キャッピングおよびポリ（Ａ）尾部の付加は、転写後に酵素的に達成することができる。

【0367】

インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号に記載されているように、様々なインビトロ転写キットが市販されている。

【0368】

キット
本発明はまた、本発明によるＲＮＡレプリコンを含むキットを提供する。

【0369】

一実施形態では、キットの構成要素は別個の実体として存在する。例えば、キットの１つの構成要素が１つの実体に存在してもよく、キットの別の構成要素が別の実体に存在してもよい。例えば、開放容器または閉鎖容器は適切な実体である。閉鎖容器が好ましい。使用される容器は、好ましくはＲＮＡｓｅ不含であるかまたは本質的にＲＮＡｓｅ不含であるべきである。

【0370】

一実施形態では、本発明のキットは、細胞の接種および／またはヒトもしくは動物対象への投与のためのＲＮＡを含む。

【0371】

本発明によるキットは、任意でラベルまたは他の形態の情報要素、例えば電子データキャリアを含む。ラベルまたは情報要素は、好ましくは説明書、例えば印刷された書面の説明書、または任意で印刷可能な電子形式の説明書を含む。説明書は、キットの少なくとも１つの適切で可能な使用に言及し得る。

【0372】

医薬組成物
本明細書に記載のＲＮＡレプリコンは、医薬組成物の形態で存在し得る。本発明による医薬組成物は、本発明による少なくとも１つの核酸分子を含み得る。本発明による医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤および／または薬学的に許容される賦形剤および／または薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルを含む。薬学的に許容される担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤の選択は特に限定されない。当技術分野で公知の任意の適切な薬学的に許容される担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤を使用し得る。

【0373】

本発明の一実施形態では、医薬組成物は、水性溶媒またはｒＲＮＡの完全性を保存することを可能にする任意の溶媒などの溶媒をさらに含むことができる。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ＲＮＡを含む水溶液である。水溶液は、任意で溶質、例えば塩を含み得る。

【0374】

本発明の一実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥組成物の形態である。凍結乾燥組成物は、それぞれの水性組成物を凍結乾燥することによって得ることができる。

【0375】

一実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つのカチオン性実体を含む。一般に、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーおよび正電荷を有する他の物質は、負に帯電した核酸と複合体を形成し得る。カチオン性化合物、好ましくはポリカチオン性化合物、例えばカチオン性またはポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質などとの複合体化によって、本発明によるＲＮＡを安定化することが可能である。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－アルギニン、ヒストンまたはカチオン性脂質からなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性分子を含む。

【0376】

本発明によれば、カチオン性脂質は、カチオン性両親媒性分子、例えば、少なくとも１つの親水性および親油性部分を含む分子である。カチオン性脂質は、モノカチオン性またはポリカチオン性であり得る。カチオン性脂質は、典型的には、ステロール鎖、アシル鎖またはジアシル鎖などの親油性部分を有し、全体として正味の正電荷を有する。脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。カチオン性脂質は、好ましくは１～１０価の正電荷、より好ましくは１～３価の正電荷、より好ましくは１価の正電荷を有する。カチオン性脂質の例としては、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン、１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジミリストイルオキシプロピル－１，３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性脂質には、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含む、第三級アミン基を有する脂質も含まれる。カチオン性脂質は、リポソーム、エマルジョンおよびリポプレックスなどの本明細書に記載の脂質製剤にＲＮＡを製剤化するのに適している。典型的には、正電荷には少なくとも１つのカチオン性脂質が寄与し、負電荷にはＲＮＡが寄与する。一実施形態では、医薬組成物は、カチオン性脂質に加えて、少なくとも１つのヘルパー脂質を含む。ヘルパー脂質は、中性またはアニオン性脂質であり得る。ヘルパー脂質は、リン脂質などの天然脂質、または天然脂質の類似体、または完全合成脂質、または天然脂質と類似性のない脂質様分子であり得る。医薬組成物がカチオン性脂質とヘルパー脂質の両方を含む場合、カチオン性脂質対中性脂質のモル比は、製剤の安定性などを考慮して適切に決定することができる。

【0377】

一実施形態では、本発明による医薬組成物はプロタミンを含む。本発明によれば、プロタミンはカチオン性担体剤として有用である。「プロタミン」という用語は、アルギニンに富み、魚などの動物の精子細胞中で体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡと会合して見出される、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、複数のアルギニンモノマーを含む、魚の精子中で見出されるタンパク質を指す。本発明によれば、本明細書で使用される「プロタミン」という用語は、その断片を含む、天然源または生物源から得られるまたはそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列、および前記アミノ酸配列またはその断片の多量体形態を含むことが意図されている。さらに、この用語は、人工であり、特定の目的のために特別に設計され、天然源または生物源から単離することができない（合成された）ポリペプチドを包含する。

【0378】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上のアジュバントを含み得る。免疫系の応答を刺激するためにアジュバントをワクチンに添加してもよい；アジュバントは、典型的にはそれ自体免疫を提供しない。例示的なアジュバントとしては、限定されないが、以下が挙げられる：無機化合物（例えばミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム）；鉱油（例えばパラフィン油）、サイトカイン（例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２）；免疫刺激性ポリヌクレオチド（ＲＮＡもしくはＤＮＡ；例えばＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなど）；サポニン（例えばキラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ）、ダイズ、セネガ（Ｐｏｌｙｇａｌａ ｓｅｎｅｇａ）由来の植物サポニン）；油エマルジョンもしくはリポソーム；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤；ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；ムラミルペプチド；イミダゾキノロン化合物；チオセミカルバゾン化合物；Ｆｌｔ３リガンド（国際公開第２０１０／０６６４１８ Ａ１号）；または当業者に公知の任意の他のアジュバント。本発明によるＲＮＡの投与のための好ましいアジュバントは、Ｆｌｔ３リガンド（国際公開第２０１０／０６６４１８ Ａ１号）である。Ｆｌｔ３リガンドを、抗原をコードするＲＮＡと共に投与すると、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の強い増加が観察され得る。

【0379】

本発明による医薬組成物は緩衝化することができる（例えば酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液を用いて）。

【0380】

ＲＮＡ含有粒子
いくつかの実施形態では、保護されていないＲＮＡの不安定性のために、本発明のＲＮＡ分子を複合体または封入形態で提供することが有利である。それぞれの医薬組成物が本発明において提供される。特に、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、核酸含有粒子、好ましくはＲＮＡ含有粒子を含む。それぞれの医薬組成物は、粒子製剤と呼ばれる。本発明による粒子製剤では、粒子は、本発明による核酸と、核酸の送達に適した薬学的に許容される担体または薬学的に許容されるビヒクルとを含む。核酸含有粒子は、例えば、タンパク質性粒子の形態または脂質含有粒子の形態であり得る。適切なタンパク質または脂質は、粒子形成剤と呼ばれる。タンパク質性粒子および脂質含有粒子は、粒子形態のアルファウイルスＲＮＡの送達に適することが以前に記載されている（例えばＳｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１－５６２）。特に、アルファウイルス構造タンパク質（例えばヘルパーウイルスによって提供される）は、タンパク質性粒子の形態でＲＮＡを送達するための適切な担体である。

【0381】

一実施形態では、本発明の粒子製剤はナノ粒子製剤である。その実施形態では、本発明による組成物は、ナノ粒子の形態の本発明による核酸を含む。ナノ粒子製剤は、様々なプロトコルによって、および様々な複合体化化合物を用いて得ることができる。脂質、ポリマー、オリゴマー、または両親媒性物質は、ナノ粒子製剤の典型的な構成成分である。

【0382】

本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、粒子を、特に核酸の全身投与、特に非経口投与に適したものにする直径、典型的には１０００ナノメートル（ｎｍ）以下の直径を有する任意の粒子を指す。一実施形態では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約１０００ｎｍ、好ましくは約５０ｎｍ～約４００ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、例えば約１５０ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、約２００～約７００ｎｍ、約２００～約６００ｎｍ、好ましくは約２５０～約５５０ｎｍ、特に約３００～約５００ｎｍまたは約２００～約４００ｎｍの範囲の直径を有する。

【0383】

一実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子の多分散指数（ＰＩ）は、動的光散乱によって測定した場合、０．５以下、好ましくは０．４以下、さらにより好ましくは０．３以下である。「多分散指数」（ＰＩ）は、粒子混合物中の個々の粒子（リポソームなど）の均一または不均一なサイズ分布の測定値であり、混合物中の粒子分布の幅を示す。ＰＩは、例えば、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に記載されているように決定することができる。

【0384】

本明細書で使用される場合、「ナノ粒子製剤」という用語または同様の用語は、少なくとも１つのナノ粒子を含有する任意の粒子製剤を指す。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子の均一な集合体である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、リポソーム製剤またはエマルジョンなどの脂質含有医薬製剤である。

【0385】

脂質含有医薬組成物
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの脂質を含む。好ましくは、少なくとも１つの脂質はカチオン性脂質である。前記脂質含有医薬組成物は、本発明による核酸を含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、小胞、例えばリポソームに封入されたＲＮＡを含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、エマルジョンの形態のＲＮＡを含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、カチオン性化合物との複合体中にｒＲＮＡを含み、それにより、例えばいわゆるリポプレックスまたはポリプレックスを形成する。リポソームなどの小胞内へのＲＮＡの封入は、例えば脂質／ＲＮＡ複合体とは異なる。脂質／ＲＮＡ複合体は、例えば、ＲＮＡを、例えばあらかじめ形成されたリポソームと混合した場合に得ることができる。

【0386】

一実施形態では、本発明による医薬組成物は、小胞に封入されたｒＲＮＡを含む。そのような製剤は、本発明による特定の粒子製剤である。小胞は、球状の殻に巻かれた脂質二重層であり、小さな空間を囲み、その空間を小胞の外側の空間から分離する。典型的には、小胞内部の空間は水性空間であり、すなわち水を含む。典型的には、小胞の外側の空間は水性空間であり、すなわち水を含む。脂質二重層は、１つ以上の脂質（小胞形成脂質）によって形成される。小胞を取り囲む膜は、原形質膜と同様のラメラ相である。本発明による小胞は、多層小胞、単層小胞、またはそれらの混合物であり得る。小胞に封入された場合、ｒＲＮＡは、典型的には外部媒体から分離される。したがって、天然アルファウイルスの保護された形態と機能的に同等の、保護された形態で存在する。適切な小胞は、本明細書に記載の粒子、特にナノ粒子である。

【0387】

例えば、ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、リポソームに封入され得る。その実施形態では、医薬組成物はリポソーム製剤であるか、またはリポソーム製剤を含む。リポソーム内への封入は、典型的には、ＲＮＡをＲＮａｓｅ消化から保護する。リポソームは一部の外部ＲＮＡを含む（例えばその表面に）ことが可能であるが、ＲＮＡの少なくとも半分（理想的にはその全て）がリポソームのコア内に封入される。

【0388】

リポソームは、しばしばリン脂質などの小胞形成脂質の１つ以上の二重層を有する微視的脂質小胞であり、薬物、例えばＲＮＡを封入することができる。多重層小胞（ＭＬＶ）、小型単層小胞（ＳＵＶ）、大型単層小胞（ＬＵＶ）、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）、多小胞性小胞（ＭＶ）および大型多小胞性小胞（ＬＭＶ）、ならびに当技術分野で公知の他の二重層形態を含むがこれらに限定されない様々な種類のリポソームを本発明に関連して使用し得る。リポソームのサイズおよびラメラ性は、調製方法に依存する。ラメラ相、六方晶相および逆六方晶相、立方相、ミセル、単層からなる逆ミセルを含む、脂質が水性媒体中に存在し得るいくつかの他の形態の超分子構造が存在する。これらの相は、ＤＮＡまたはＲＮＡと組み合わせて得られてもよく、ＲＮＡおよびＤＮＡとの相互作用は、相状態に実質的に影響を及ぼし得る。そのような相は、本発明のナノ粒子ＲＮＡ製剤中に存在し得る。

【0389】

リポソームは、当業者に公知の標準的な方法を使用して形成され得る。それぞれの方法には、逆蒸発法、エタノール注入法、脱水－再水和法、超音波処理または他の適切な方法が含まれる。リポソームの形成後に、リポソームをサイズ分けして、実質的に均一なサイズ範囲を有するリポソームの集団を得ることができる。

【0390】

本発明の好ましい実施形態では、ｒＲＮＡは、少なくとも１つのカチオン性脂質を含むリポソーム中に存在する。それぞれのリポソームは、少なくとも１つのカチオン性脂質が使用されることを条件として、単一の脂質からまたは脂質の混合物から形成され得る。好ましいカチオン性脂質は、プロトン化され得る窒素原子を有し、好ましくは、そのようなカチオン性脂質は、第三級アミン基を有する脂質である。第三級アミン基を有する特に適切な脂質は、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）である。一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１２／００６３７８ Ａ１号に記載されているようなリポソーム製剤中に存在し、リポソームは、ＲＮＡを含む水性コアを封入する脂質二重層を有し、脂質二重層は、好ましくは第三級アミン基を有する、５．０～７．６の範囲のｐＫａを有する脂質を含む。第三級アミン基を有する好ましいカチオン性脂質には、ＤＬｉｎＤＭＡ（ｐＫａ ５．８）が含まれ、国際公開第２０１２／０３１０４６ Ａ２号に一般的に記載されている。国際公開第２０１２／０３１０４６ Ａ２号によれば、それぞれの化合物を含むリポソームは、ＲＮＡの封入、したがってＲＮＡのリポソーム送達に特に適している。一実施形態では、本発明によるＲＮＡはリポソーム製剤中に存在し、リポソームは、その頭部基が、プロトン化され得る少なくとも１つの窒素原子（Ｎ）を含む少なくとも１つのカチオン性脂質を含み、リポソームおよびＲＮＡは、１：１～２０：１のＮ：Ｐ比を有する。本発明によれば、「Ｎ：Ｐ比」は、国際公開第２０１３／００６８２５ Ａ１号に記載されているように、カチオン性脂質中の窒素原子（Ｎ）対脂質含有粒子（例えばリポソーム）に含まれるＲＮＡ中のリン酸原子（Ｐ）のモル比を指す。１：１～２０：１のＮ：Ｐ比は、リポソームの正味電荷および脊椎動物細胞へのＲＮＡの送達効率に関与する。

【0391】

一実施形態では、本発明によるｒＲＮＡは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む少なくとも１つの脂質を含むリポソーム製剤中に存在し、ＲＮＡは、国際公開第２０１２／０３１０４３ Ａ１号および国際公開第２０１３／０３３５６３ Ａ１号に記載されているように、ＰＥＧ部分がリポソームの外側に存在するようにＰＥＧ化リポソーム内に封入される。

【0392】

一実施形態では、本発明によるｒＲＮＡは、国際公開第２０１２／０３０９０１ Ａ１号に記載されているように、リポソームが６０～１８０ｎｍの範囲の直径を有するリポソーム製剤中に存在する。

【0393】

一実施形態では、本発明によるｒＲＮＡは、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に開示されているように、ｒＲＮＡ含有リポソームがゼロに近いまたは負の正味電荷を有するリポソーム製剤中に存在する。

【0394】

他の実施形態では、本発明によるｒＲＮＡは、エマルジョンの形態で存在する。エマルジョンは、ｒＲＮＡ分子などの核酸分子を細胞に送達するために使用されることが以前に記載されている。本明細書では、水中油型エマルジョンが好ましい。それぞれのエマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。本発明によるＲＮＡがエマルジョン粒子に複合体化されているカチオン性水中油型エマルジョンがより好ましい。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に帯電したｒＲＮＡと相互作用することができ、それによってｒＲＮＡをエマルジョン粒子に固定する。水中油型エマルジョンでは、エマルジョン粒子は水性連続相中に分散される。例えば、エマルジョン粒子の平均直径は、典型的には約８０ｎｍ～１８０ｎｍであり得る。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、国際公開第２０１２／００６３８０ Ａ２号に記載されているように、エマルジョン粒子が油コアおよびカチオン性脂質を含むカチオン性水中油型エマルジョンである。本発明によるｒＲＮＡは、国際公開第２０１３／００６８３４ Ａ１号に記載されているように、エマルジョンのＮ：Ｐ比が少なくとも４：１である、カチオン性脂質を含むエマルジョンの形態で存在し得る。本発明によるｒＲＮＡは、国際公開第２０１３／００６８３７ Ａ１号に記載されているように、カチオン性脂質エマルジョンの形態で存在し得る。特に、組成物は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体化したｒＲＮＡを含んでもよく、油／脂質の比は少なくとも約８：１（モル：モル）である。

【0395】

他の実施形態では、本発明による医薬組成物は、リポプレックスの形態のＲＮＡを含む。「リポプレックス」または「ＲＮＡリポプレックス」という用語は、脂質と、ＲＮＡなどの核酸との複合体を指す。リポプレックスは、カチオン性（正に帯電した）リポソームおよびアニオン性（負に帯電した）核酸から形成され得る。カチオン性リポソームは、中性の「ヘルパー」脂質も含み得る。最も単純な場合、特定の混合プロトコルで核酸をリポソームと混合することによってリポプレックスが自発的に形成されるが、様々な他のプロトコルも適用し得る。正に帯電したリポソームと負に帯電した核酸との間の静電的相互作用がリポプレックス形成の駆動力であることが理解されている（国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号）。本発明の一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の正味電荷はゼロに近いかまたは負である。ＲＮＡおよびリポソームの電気的に中性または負に帯電したリポプレックスは、全身投与後に脾臓樹状細胞（ＤＣ）における実質的なＲＮＡ発現をもたらし、正に帯電したリポソームおよびリポプレックスについて報告されている毒性の増加には関連しないことが公知である（国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号を参照）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明による医薬組成物は、（ｉ）ナノ粒子中正電荷の数がナノ粒子の負電荷の数を超えず、および／または（ｉｉ）ナノ粒子が中性もしくは正味の負電荷を有し、および／または（ｉｉｉ）ナノ粒子の正電荷対負電荷の電荷比が１．４：１以下であり、および／または（ｉｖ）ナノ粒子のゼータ電位が０以下である、ナノ粒子、好ましくはリポプレックスナノ粒子の形態のＲＮＡを含む。国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に記載されているように、ゼータ電位は、コロイド系における界面動電位の科学用語である。本発明では、（ａ）ゼータ電位および（ｂ）ナノ粒子中のＲＮＡに対するカチオン性脂質の電荷比の両方を、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に開示されているように計算することができる。要約すると、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に開示されているように、粒子の正味電荷がゼロに近いかまたは負である、定義された粒径を有するナノ粒子リポプレックス製剤である医薬組成物が、本発明に関連して好ましい医薬組成物である。

【0396】

一実施形態では、本明細書に記載のｒＲＮＡなどの核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態で投与される。ＬＮＰは、１つ以上の核酸分子が結合している、または１つ以上の核酸分子が封入されている粒子を形成することができる任意の脂質を含み得る。

【0397】

一実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上の安定化脂質とを含む。安定化脂質には、中性脂質およびペグ化脂質が含まれる。

【0398】

一実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、および脂質ナノ粒子内に封入された、または脂質ナノ粒子と会合したＲＮＡを含む。

【0399】

一実施形態では、ＬＮＰは、４０～５５ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、４１～４９ｍｏｌ％、４１～４８ｍｏｌ％、４２～４８ｍｏｌ％、４３～４８ｍｏｌ％、４４～４８ｍｏｌ％、４５～４８ｍｏｌ％、４６～４８ｍｏｌ％、４７～４８ｍｏｌ％、または４７．２～４７．８ｍｏｌ％のカチオン性脂質を含む。一実施形態では、ＬＮＰは、約４７．０、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９または４８．０ｍｏｌ％のカチオン性脂質を含む。

【0400】

一実施形態では、中性脂質は、５～１５ｍｏｌ％、７～１３ｍｏｌ％、または９～１１ｍｏｌ％の範囲の濃度で存在する。一実施形態では、中性脂質は、約９．５、１０または１０．５ｍｏｌ％の濃度で存在する。

【0401】

一実施形態では、ステロイドは、３０～５０ｍｏｌ％、３５～４５ｍｏｌ％または３８～４３ｍｏｌ％の範囲の濃度で存在する。一実施形態では、ステロイドは、約４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６ｍｏｌ％の濃度で存在する。

【0402】

一実施形態では、ＬＮＰは、１～１０ｍｏｌ％、１～５ｍｏｌ％、または１～２．５ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。

【0403】

一実施形態では、ＬＮＰは、４０～５０ｍｏｌ％のカチオン性脂質；５～１５ｍｏｌ％の中性脂質；３５～４５ｍｏｌ％のステロイド；１～１０ｍｏｌ％のポリマーコンジュゲート脂質；および脂質ナノ粒子内に封入された、または脂質ナノ粒子と会合したＲＮＡを含む。

【0404】

一実施形態では、モルパーセントは、脂質ナノ粒子中に存在する脂質の総モルに基づいて決定される。

【0405】

一実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥ、およびＳＭからなる群より選択される。一実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群より選択される。一実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。

【0406】

一実施形態では、ステロイドはコレステロールである。

【0407】

一実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。一実施形態では、ペグ化脂質は、以下の構造：

【化13】

またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体を有し、ここで、
Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含む直鎖または分岐の飽和または不飽和アルキル鎖であり、アルキル鎖は、１つ以上のエステル結合によって中断されていてもよく、ｗは、３０～６０の範囲の平均値を有する。一実施形態では、Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を含む直鎖の飽和アルキル鎖である。一実施形態では、ｗは、４０～５５の範囲の平均値を有する。一実施形態では、平均ｗは約４５である。一実施形態では、Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、約１４個の炭素原子を含む直鎖の飽和アルキル鎖であり、ｗは約４５の平均値を有する。

【0408】

一実施形態では、ペグ化脂質は、例えば以下の構造：

【化14】

を有する、ＤＭＧ－ＰＥＧ ２０００である。

【0409】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰのカチオン性脂質成分は、式（ＩＩＩ）の構造：

【化15】

またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有し、ここで、
Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ^１およびＧ^２は、それぞれ独立して、非置換Ｃ_１－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニレンであり；
Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルケニレンであり；
Ｒ^ａは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；
Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルまたはＣ_６－Ｃ_２４アルケニルであり；
Ｒ^３は、Ｈ、ＯＲ^５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＲ^５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^４であり；
Ｒ^４はＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；
Ｒ^５は、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり；ならびに
ｘは、０、１または２である。

【0410】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）の１つを有し：

【化16】

【化17】

ここで、
Ａは、３～８員のシクロアルキルまたはシクロアルキレン環であり；
Ｒ^６は、各出現において、独立して、Ｈ、ＯＨまたはＣ_１－Ｃ_２４アルキルであり；
ｎは、１～１５の範囲の整数である。

【0411】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は構造（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施形態では、脂質は構造（ＩＩＩＢ）を有する。

【0412】

式（ＩＩＩ）の他の実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）の１つを有し：

【化18】

【化19】

ここで、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、１～１２の範囲の整数である。

【0413】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ^１またはＬ^２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２の各々は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。前述のいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２の各々は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

【0414】

式（ＩＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）の１つを有する：

【化20】

【化21】

【0415】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）、または（ＩＩＩＪ）のうちの１つを有する：

【化22】

【化23】

【化24】

【化25】

【0416】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、ｎは、２～１２、例えば２～８または２～４の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｎは３である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは５である。いくつかの実施形態では、ｎは６である。

【0417】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかの他の実施形態では、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２～１０の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、４～９または４～６の範囲の整数である。

【0418】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ^６はＨである。前述の実施形態の他の実施形態では、Ｒ^６はＣ_１－Ｃ_２４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ^６はＯＨである。

【0419】

式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｇ^３は非置換である。他の実施形態では、Ｇ３は置換されている。様々な異なる実施形態では、Ｇ^３は、直鎖Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレンまたは直鎖Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレンである。

【0420】

式（ＩＩＩ）のいくつかの他の前述の実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方がＣ_６－Ｃ_２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、以下の構造を有し：

【化26】

ここで、
Ｒ^７ａおよびＲ^７ｂは、各出現において、独立して、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；ならびに
ａは２～１２の整数であり、
ここで、Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂおよびａはそれぞれ、Ｒ^１およびＲ^２がそれぞれ独立して６～２０個の炭素原子を含むように選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。

【0421】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ^７ａの少なくとも１つの出現はＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^７ａは、各出現においてＨである。前述の実施形態の他の異なる実施形態では、Ｒ^７ｂの少なくとも１つの出現はＣ_１－Ｃ_８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

【0422】

式（ＩＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方が、以下の構造の１つを有する。

【化27】

【0423】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ^３は、ＯＨ、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ^４である。いくつかの実施形態では、Ｒ^４は、メチルまたはエチルである。

【0424】

様々な異なる実施形態では、式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質は、以下の表に示される構造の１つを有する。

【0425】

式（ＩＩＩ）の代表的な化合物。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【0426】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）の脂質、ＲＮＡ、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質を含む。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ－３である。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかの実施形態では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質はＡＬＣ－０１５９である。

【0427】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に約４０～約５０ｍｏｌ％の量で存在する。一実施形態では、中性脂質は、ＬＮＰ中に約５～約１５ｍｏｌ％の量で存在する。一実施形態では、ステロイドは、ＬＮＰ中に約３５～約４５ｍｏｌ％の量で存在する。一実施形態では、ペグ化脂質は、ＬＮＰ中に約１～約１０ｍｏｌ％の量で存在する。

【0428】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４０～約５０ｍｏｌ％の量の化合物ＩＩＩ－３、約５～約１５ｍｏｌ％の量のＤＳＰＣ、約３５～約４５ｍｏｌ％の量のコレステロール、および約１～約１０ｍｏｌ％の量のＡＬＣ－０１５９を含む。

【0429】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４７．５ｍｏｌ％の量の化合物ＩＩＩ－３、約１０ｍｏｌ％の量のＤＳＰＣ、約４０．７ｍｏｌ％の量のコレステロール、および約１．８ｍｏｌ％の量のＡＬＣ－０１５９を含む。

【0430】

様々な異なる実施形態では、カチオン性脂質は、以下の表に示される構造の１つを有する。

【表7】

【表8】

【0431】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、上記の表に示されるカチオン性脂質、例えば式（Ｂ）または式（Ｄ）のカチオン性脂質、特に式（Ｄ）のカチオン性脂質、ＲＮＡ、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質を含む。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかの実施形態では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質はＤＭＧ－ＰＥＧ ２０００である。

【0432】

一実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能な脂質様物質（リピドイド）であるカチオン性脂質を含む。一実施形態では、カチオン性脂質は、以下の構造を有する：

【化28】

【0433】

Ｎ／Ｐ値は、好ましくは少なくとも約４である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ値は、４～２０、４～１２、４～１０、４～８、または５～７の範囲である。一実施形態では、Ｎ／Ｐ値は約６である。

【0434】

本明細書に記載のＬＮＰは、一実施形態では、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約６０ｎｍ～約１２０ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。

【0435】

ＲＮＡ標的化
本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示されるｒＲＮＡ（例えば、ワクチン抗原および／または免疫賦活剤をコードするＲＮＡ）の標的化送達を含む。

【0436】

一実施形態では、本開示は、肺を標的とすることを含む。投与されるＲＮＡがワクチン抗原をコードするＲＮＡである場合、肺を標的とすることが特に好ましい。ＲＮＡは、例えば、本明細書に記載の粒子、例えば脂質粒子として製剤化され得るＲＮＡを吸入によって投与することによって肺に送達され得る。

【0437】

一実施形態では、本開示は、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることを含む。投与されるＲＮＡがワクチン抗原をコードするＲＮＡである場合、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることが特に好ましい。

【0438】

一実施形態では、標的細胞は脾臓細胞である。一実施形態では、標的細胞は、脾臓内のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。一実施形態では、標的細胞は、脾臓の樹状細胞である。

【0439】

「リンパ系」は、循環系の一部であり、リンパを運ぶリンパ管のネットワークを含む免疫系の重要な部分である。リンパ系は、リンパ器官、リンパ管の伝導ネットワーク、および循環リンパからなる。一次または中枢リンパ器官は、未成熟な前駆細胞からリンパ球を生成する。胸腺および骨髄は、一次リンパ器官を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次または末梢リンパ器官は、成熟したナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始する。

【0440】

ＲＮＡは、いわゆるリポプレックス製剤によって脾臓に送達され得、製剤中でＲＮＡはカチオン性脂質および任意でさらなる脂質またはヘルパー脂質を含むリポソームに結合して、注射可能なナノ粒子製剤を形成する。リポソームは、脂質のエタノール溶液を水または適切な水相に注入することによって得られ得る。ＲＮＡリポプレックス粒子は、リポソームをＲＮＡと混合することによって調製され得る。脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１４３６８３号に記載されている。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的とするために使用し得ることが見出された。したがって、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は、全く起こらないかまたは本質的に起こらない。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓ではプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、そのような抗原提示細胞においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。

【0441】

本開示のＲＮＡリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質中に存在する電荷とＲＮＡ中に存在する電荷との合計である。電荷比は、少なくとも１つのカチオン性脂質中に存在する正電荷対ＲＮＡ中に存在する負電荷の比である。少なくとも１つのカチオン性脂質中に存在する正電荷対ＲＮＡ中に存在する負電荷の電荷比は、以下の式によって計算される：電荷比＝［（カチオン性脂質濃度（モル））＊（カチオン性脂質中の正電荷の総数）］／［（ＲＮＡ濃度（モル））＊（ＲＮＡ中の負電荷の総数）］。

【0442】

生理学的ｐＨでの本明細書に記載の脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、好ましくは、約１．９：２～約１：２、または約１．６：２～約１：２、または約１．６：２～約１．１：２の正電荷対負電荷の電荷比などの正味の負電荷を有する。特定の実施形態では、生理学的ｐＨでのＲＮＡリポプレックス粒子中の正電荷対負電荷の電荷比は、約１．９：２．０、約１．８：２．０、約１．７：２．０、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０、または約１：２．０である。

【0443】

免疫賦活剤は、肝臓または肝臓組織へのＲＮＡの選択的送達のための製剤中の免疫賦活剤をコードするＲＮＡを対象に投与する工程によって対象に提供され得る。そのような標的器官または組織へのＲＮＡの送達は、特に、大量の免疫賦活剤を発現することが望ましい場合、および／または免疫賦活剤の全身的な存在、特に有意な量での存在が望ましいもしくは必要とされる場合に好ましい。

【0444】

ＲＮＡ送達システムは、肝臓に対して固有の選択性を有する。これは、脂質ベースの粒子、カチオン性および中性ナノ粒子、特にリポソーム、ナノミセルおよびバイオコンジュゲート中の親油性リガンドなどの脂質ナノ粒子に関連する。肝臓蓄積は、肝血管系の不連続な性質または脂質代謝（リポソームおよび脂質もしくはコレステロールコンジュゲート）によって引き起こされる。

【0445】

肝臓へのＲＮＡのインビボ送達のために、薬物送達システムを使用して、その分解を防止することによってＲＮＡを肝臓に輸送し得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）被覆表面およびｍＲＮＡ含有コアからなるポリプレックスナノミセルは、生理学的条件下でＲＮＡの優れたインビボ安定性を提供するので、有用な系である。さらに、高密度ＰＥＧパリセードで構成されるポリプレックスナノミセル表面によって提供されるステルス特性は、宿主の免疫防御を有効に回避する。

【0446】

肝臓を標的とするための適切な免疫賦活剤の例は、Ｔ細胞の増殖および／または維持に関与するサイトカインである。適切なサイトカインの例としては、ＩＬ２またはＩＬ７、その断片および変異体、ならびにこれらのサイトカイン、断片および変異体の融合タンパク質、例えば延長ＰＫサイトカインが挙げられる。

【0447】

別の実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓へのＲＮＡの選択的送達のために製剤中で投与され得る。そのような標的組織への免疫賦活剤の送達は、特に、この器官または組織における免疫賦活剤の存在が望ましい（例えば、免疫応答を誘導するために、特にＴ細胞プライミング中にまたは常在免疫細胞の活性化のためにサイトカインなどの免疫賦活剤が必要とされる場合）が、免疫賦活剤が全身的に、特に有意な量で存在することは望ましくない（例えば、免疫賦活剤が全身毒性を有するため）場合に好ましい。

【0448】

適切な免疫賦活剤の例は、Ｔ細胞プライミングに関与するサイトカインである。適切なサイトカインの例としては、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＦＮ－α、またはＩＦＮ－β、その断片および変異体、ならびにこれらのサイトカイン、断片および変異体の融合タンパク質、例えば延長ＰＫサイトカインが挙げられる。

【0449】

タンパク質を生成するための方法
本発明はまた、細胞において目的のタンパク質を生成するための方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む本発明によるＲＮＡレプリコンを得る工程、および
（ｂ）ＲＮＡレプリコンを細胞に接種する工程
を含む、方法を提供する。

【0450】

本方法の様々な実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、ＲＮＡレプリコンが目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、任意で機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性非構造タンパク質によって複製され得る限り、本発明のＲＮＡレプリコンについて上記で定義された通りであり、ｒＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドと、修飾ｒＲＮＡの機能を回復または改善する調節配列中の１つ以上の点突然変異とを含み得る。

【0451】

１つ以上の核酸分子を接種することができる細胞は、「宿主細胞」と呼ばれ得る。本発明によれば、「宿主細胞」という用語は、外因性核酸分子で形質転換またはトランスフェクトすることができる任意の細胞を指す。「細胞」という用語は、好ましくは無傷の細胞、すなわち酵素、細胞小器官、または遺伝物質などのその正常な細胞内成分を放出していない無傷の膜を有する細胞である。無傷の細胞は、好ましくは生存細胞、すなわちその正常な代謝機能を実行することができる生細胞である。「宿主細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えばヒトおよび動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびヤギを含む家畜、ならびに霊長動物由来の細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は、多数の組織型に由来してもよく、初代細胞および細胞株を含み得る。具体的な例としては、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞および胚性幹細胞が挙げられる。他の実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。核酸は、単一またはいくつかのコピーで宿主細胞中に存在してもよく、一実施形態では、宿主細胞中で発現される。

【0452】

細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。原核細胞は、本明細書では、例えば本発明によるＤＮＡの増殖に適しており、真核細胞は、本明細書では、例えばレプリコンのオープンリーディングフレームの発現に適している。

【0453】

本発明の方法では、本発明によるＲＮＡレプリコン、または本発明によるキット、または本発明による医薬組成物のいずれかを使用することができる。ＲＮＡは、医薬組成物の形態で、または例えばエレクトロポレーションのための裸のＲＮＡとして使用することができる。

【0454】

本発明に従って細胞内でタンパク質を生成するための方法では、細胞は抗原提示細胞であり得、この方法は、抗原をコードするＲＮＡを発現させるために使用し得る。この目的のために、本発明は、抗原をコードするＲＮＡを樹状細胞などの抗原提示細胞に導入することを含み得る。樹状細胞などの抗原提示細胞のトランスフェクションには、抗原をコードするＲＮＡを含む医薬組成物を使用し得る。

【0455】

一実施形態では、細胞内でタンパク質を生成するための方法は、インビトロ法である。一実施形態では、細胞内でのタンパク質生成のための方法は、手術または治療によるヒトまたは動物対象からの細胞の除去を含まない。

【0456】

この実施形態では、本発明に従って接種された細胞は、対象においてタンパク質を生成し、対象にタンパク質を提供するために対象に投与され得る。細胞は、対象に関して自己、同系、同種異系または異種であり得る。

【0457】

他の実施形態では、細胞内でタンパク質を生成するための方法における細胞は、患者などの対象に存在し得る。これらの実施形態では、細胞内でタンパク質を生成するための方法は、ＲＮＡ分子を対象に投与することを含むインビボ法である。

【0458】

この点で、本発明はまた、対象において目的のタンパク質を生成するための方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む本発明によるＲＮＡレプリコンを得る工程、および
（ｂ）ＲＮＡレプリコンを対象に投与する工程
を含む、方法を提供する。

【0459】

本方法の様々な実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、ＲＮＡレプリコンが目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、任意で機能性非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性非構造タンパク質によって複製され得る限り、本発明のＲＮＡレプリコンについて上記で定義された通りであり、ｒＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドと、修飾ｒＲＮＡの機能を回復または改善する調節配列中の１つ以上の点突然変異とを含み得る。

【0460】

本発明によるＲＮＡレプリコン、または本発明によるキット、または本発明による医薬組成物のいずれも、本発明に従って対象においてタンパク質を生成するための方法で使用することができる。例えば、本発明の方法では、ＲＮＡは、例えば本明細書に記載の医薬組成物の形態で、または裸のＲＮＡとして使用することができる。

【0461】

対象に投与される能力を考慮して、本発明によるＲＮＡレプリコン、または本発明によるキット、または本発明による医薬組成物のそれぞれは、「薬剤」などと呼ばれ得る。本発明は、本発明のＲＮＡレプリコン、キット、医薬組成物が薬剤として使用するために提供されることを予測する。薬剤は、対象を治療するために使用することができる。「治療する」とは、本明細書に記載の化合物または組成物または他の実体を対象に投与することを意味する。この用語は、治療によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法を含む。

【0462】

上記の薬剤は、典型的にはＤＮＡを含まず、したがって、先行技術（例えば国際公開第２００８／１１９８２７ Ａ１号）に記載されているＤＮＡワクチンと比較してさらなる安全性の特徴を伴う。

【0463】

本発明による代替的な医学的用途は、本発明に従って細胞内でタンパク質を生成するための方法を含み、細胞は樹状細胞などの抗原提示細胞であり得、続いて前記細胞を対象に導入する。例えば、抗原などの薬学的に活性なタンパク質をコードするＲＮＡを、エクスビボで抗原提示細胞、例えば対象から採取された抗原提示細胞に導入（トランスフェクト）してもよく、任意でエクスビボでクローン増殖させた抗原提示細胞を同じまたは異なる対象に再導入してもよい。トランスフェクトされた細胞は、当技術分野で公知の任意の手段を使用して対象に再導入し得る。

【0464】

本発明による薬剤は、それを必要とする対象に投与され得る。本発明の薬剤は、対象の治療の予防的および治療的方法に使用することができる。

【0465】

本発明による薬剤は、有効量で投与される。「有効量」は、単独で、または他の用量と共に、反応または所望の効果を生じさせるのに十分な量に関する。対象における特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望の効果は、疾患進行の阻害である。これは、疾患進行の減速、特に疾患進行の中断を含む。疾患または状態の治療における所望の効果はまた、疾患の発症の遅延または疾患の発症の阻害であり得る。

【0466】

有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与方法ならびに他の因子に依存する。

【0467】

ワクチン接種
「免疫化」または「ワクチン接種」という用語は、一般に、治療上または予防上の理由で対象を治療するプロセスを指す。治療、特に予防的治療は、好ましくは、例えば１つ以上の抗原に対する対象の免疫応答を誘導または増強することを目的とする治療であるか、またはそれを含む。本発明によれば、本明細書に記載のｒＲＮＡを使用することによって免疫応答を誘導または増強することを所望する場合、免疫応答は、ｒＲＮＡによって誘発または増強され得る。一実施形態では、本発明は、好ましくは対象のワクチン接種であるかまたはそれを含む予防的治療を提供する。レプリコンが、目的のタンパク質として、免疫学的に活性な化合物または抗原である薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードする本発明の実施形態は、ワクチン接種に特に有用である。

【0468】

病原体または癌を含む外来因子に対するワクチン接種のためのＲＮＡは以前に記載されている（最近、Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ ３０：４４１４－４４１８によって総説されている）。先行技術の一般的なアプローチとは対照的に、本発明によるレプリコンは、本明細書に記載の機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製される能力のために、効率的なワクチン接種のための特に適切な要素である。本発明によるワクチン接種は、例えば弱免疫原性タンパク質に対する免疫応答の誘導に使用することができる。本発明によるＲＮＡワクチンの場合、タンパク質抗原は決して血清抗体に曝露されず、ＲＮＡの翻訳後にトランスフェクト細胞自体によって産生される。したがって、アナフィラキシーは問題ではないはずである。したがって、本発明は、アレルギー反応のリスクなしに患者の反復免疫化を可能にする。

【0469】

本発明によるワクチン接種を含む方法では、本発明の薬剤は、特に抗原が関与する疾患を有するか、または抗原が関与する疾患に罹患する危険性がある対象を治療することを所望する場合に、対象に投与される。

【0470】

本発明によるワクチン接種を含む方法では、本発明によるレプリコンによってコードされる目的のタンパク質は、例えば、免疫応答が向けられる細菌抗原、または免疫応答が向けられるウイルス抗原、または免疫応答が向けられる癌抗原、または免疫応答が向けられる単細胞生物の抗原をコードする。ワクチン接種の有効性は、生物由来の抗原特異的ＩｇＧ抗体の測定などの公知の標準的な方法によって評価することができる。本発明によるアレルゲン特異的免疫療法を含む方法では、本発明によるレプリコンによってコードされる目的のタンパク質は、アレルギーに関連する抗原をコードする。アレルゲン特異的免疫療法（減感作としても公知）は、原因アレルゲンへのその後の曝露に関連する症状が緩和された状態を達成するために、１つ以上のアレルギーを有する生物に、好ましくは漸増用量のアレルゲンワクチンを投与することと定義される。アレルゲン特異的免疫療法の有効性は、生物由来のアレルゲン特異的ＩｇＧおよびＩｇＥ抗体の測定などの公知の標準的な方法によって評価することができる。

【0471】

本発明の薬剤は、例えば対象のワクチン接種を含む対象の治療のために、対象に投与することができる。

【0472】

「対象」という用語は、脊椎動物、特に哺乳動物に関する。例えば、本発明の文脈における哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマなどの飼い慣らされた哺乳動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの実験動物、ならびに動物園の動物などの捕らわれている動物である。「対象」という用語はまた、鳥類（特にニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどの飼い慣らされた鳥）および魚類（特に養殖魚、例えばサケまたはナマズ）などの非哺乳類脊椎動物に関する。本明細書で使用される「動物」という用語は、ヒトも含む。

【0473】

いくつかの実施形態では、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどの家畜、または野生動物、例えばキツネへの投与が好ましい。例えば、本発明による予防的ワクチン接種は、例えば農業における動物集団または野生動物集団にワクチン接種するのに適し得る。愛玩動物または動物園の動物などの捕らわれている他の動物集団にワクチン接種し得る。

【0474】

投与方法
本発明による薬剤は、任意の適切な経路で対象に適用することができる。

【0475】

例えば、薬剤は、全身的に、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）または吸入によって投与され得る。

【0476】

一実施形態では、本発明による薬剤は、骨格筋などの筋肉組織、または皮膚、例えば皮下に投与される。皮膚または筋肉へのＲＮＡの移入は、体液性および細胞性免疫応答の強力な誘導と並行して、高くかつ持続的な局所発現をもたらすことが一般に理解されている（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．７：ｅ２９７３２；Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １０９：１４６０４－１４６０９）。

【0477】

筋肉組織または皮膚への投与の代替法には、皮内、鼻腔内、眼内、腹腔内、静脈内、間質、口腔内、経皮、または舌下投与が含まれるが、これらに限定されない。皮内および筋肉内投与が２つの好ましい経路である。

【0478】

投与は様々な方法で達成することができる。一実施形態では、本発明による薬剤は注射によって投与される。好ましい実施形態では、注射は針を介する。代替法として、無針注射を使用し得る。

【0479】

本発明を詳細に説明し、図面および実施例によって例示するが、これらは例示目的のためにのみに使用され、限定することを意図しない。説明および実施例によって、同様に本発明に含まれるさらなる実施形態が当業者にアクセス可能である。

【実施例】

【0480】

材料および方法
以下の材料および方法を実施例で使用した。

【0481】

プラスミドのクローニング、インビトロ転写、ＲＮＡ精製：標準的な技術を用いてプラスミドをクローニングした。本発明の実施例で使用される個々のプラスミドのクローニングに関する詳細は、国際公開第２０１７／１６２２６５ Ａ１号および国際公開第２０１７／１６２２６６ Ａ１号の実施例１に記載されている通りである。手短に言えば、１つのプラスミドは、非複製ｍＲＮＡの骨格に挿入されたベネズエラウマ脳炎ウイルストリニダードロバ株（ＶＥＥＶ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０１４４２）のレプリカーゼをコードし、第２のプラスミドは、マウスＣＤ９０．１を発現する複製可能ＲＮＡまたはトランスレプリコンＲＮＡ ＴＲ（ΔＡＴＧ－ＲＲＳ ΔＳＧＰ）をコードする。インビトロ進化手順中に同定された点突然変異を、遺伝子合成およびサブクローニングによって５’ΔＡＴＧ－ＲＲＳに挿入した。必要に応じて、ＣＤ９０．１ ＯＲＦをＧＦＰに交換した。「ＴＣ－８３」と命名されたベクター型は、ＶＥＥＶの弱毒化ワクチン株ＴＣ－８３において同定された５’末端付近の単一ヌクレオチド交換によって他と異なる。それにより、合成ＲＮＡの５’末端の最初の４ヌクレオチドは、５’ＧＡＵＧ（トリニダードロバ）または５’－ＧＡＵＡ（ＴＣ－８３）のいずれかである。

【0482】

インビトロ転写のために、これらのプラスミドをポリＡの下流での制限消化によって線状化するかまたはＰＣＲによって増幅し、Ｔ７ ＲＮＡ－ポリメラーゼの鋳型として使用した。ＲＮＡ合成および精製を以前に記載されているように実施した（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ １０８：４００９－４０１７；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：９６１－９７１）。二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ除去を、以前に記載されているようにセルロース精製によって行った（Ｂａｉｅｒｓｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １５：２６－３５）。必要に応じて、ＵＴＰを、示されているように異なる比率でＮ１－メチルシュード－ＵＴＰによって交換した。

【0483】

精製されたインビトロ転写ＲＮＡの品質を分光光度法によって評価し、５２００ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で分析した。実施例において細胞にトランスフェクトされた全てのＲＮＡは、インビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であった。

【0484】

細胞培養：特に明記される場合を除いて、全ての増殖培地、抗生物質および他の補助物質は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏによって供給された。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ヒト包皮線維芽細胞をＳｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手し（ＨＦＦ、新生児）、１５％ＦＣＳ、１％非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有する最少必須培地（ＭＥＭ）中、３７°Ｃで培養した。細胞を、５％ＣＯ２に平衡化した加湿雰囲気中、３７°Ｃで増殖させた。Ｋ－５６２細胞（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ－２４３）を、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ培地で増殖させた。

【0485】

エレクトロポレーションまたは脂質媒介トランスフェクションによって実施される細胞へのＲＮＡ移入。エレクトロポレーションのために、ＲＮＡを６２．５μｌ／ｍｍキュベットギャップサイズの最終容量で再懸濁し、矩形波エレクトロポレーション装置（ＢＴＸ ＥＣＭ ８３０、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して室温で細胞にエレクトロポレーションした。異なる細胞型について、以下の設定を適用した：ＨＦＦ（５００Ｖ／ｃｍ、２４ミリ秒（ｍｓ）の１パルス）；Ｋ５６２（６５０Ｖ／ｃｍ、８ｍｓの３パルスおよび４００ｍｓの間隔）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを製造業者の指示に従って使用して（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＲＮＡリポフェクションを実施した。接着細胞を約２０，０００細胞／ｃｍ^２の増殖領域に播種し、２４時間後に総量２５０ｎｇ／ｃｍ^２のＲＮＡおよび１μｌ／ｃｍ^２のＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸでトランスフェクトした。ＲＮＡ種をＲＮＡｓｅ不含のエッペンドルフチューブ中で混合した。

【0486】

ルシフェラーゼアッセイ：トランスフェクト細胞におけるルシフェラーゼの発現を評価するために、トランスフェクト細胞を９６ウェル黒色マイクロプレート（Ｎｕｎｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種した。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステムを製造業者の指示に従って用いて、ホタルルシフェラーゼの検出を実施した。生物発光を、マイクロプレートルミネセンスリーダＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して測定した。所与の時点で決定されたルシフェラーゼ活性を時間に対してプロットし、曲線下面積を台形公式によって計算した。ルシフェラーゼ陰性細胞を使用してバックグラウンドシグナルを評価した。

【0487】

磁気支援細胞選別（ＭＡＣＳ）：ＣＤ９０．１発現細胞を、最初に生細胞を選択し（死細胞除去キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ－Ｇｌａｄｂａｃｈ；Ｇｅｒｍａｎｙ）、続いて、抗ＣＤ９０．１マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ－Ｇｌａｄｂａｃｈ；Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の指示に従って使用するＭＡＣＳによってトランスフェクト細胞バルクから単離した。

【0488】

フローサイトメトリ（ＣＤ９０．１；ＧＦＰ）：フローサイトメトリのために、細胞を、ＣＤ９０．１／Ｔｈｙ－１．１－ＰＥ Ｃｌｏｎｅ ＯＸ－７抗体（ＢＤ；Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して染色したか、またはＧＦＰを発現している場合は染色しないままにした。マーカ発現を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータを使用して測定した。データ分析は、コンパニオンＦＡＣＳ ＤｉｖａソフトウェアまたはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行った。

【0489】

ワンステップ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ワンステップＲＴ－ＰＣＲ）：ＣＤ９０．１発現細胞を、ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ－ｑＰＣＲ試料調製試薬（ＢｉｏＲａｄ）を使用して溶解した。溶解物を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含むＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩワンステップＲＴ－ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、事前のＲＮＡ抽出なしでワンステップＲＴ－ＰＣＲに使用した。

【0490】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型を作製するために、ＴＲ（ΔＡＴＧ－ＲＲＳ ΔＳＧＰ）を、Ｔ７プロモータを含む特異的フォワードプライマ、およびＣＤ９０．１の３’末端に結合し、最小の３’ＣＳＥおよび３０個のアデノシン残基の短いポリＡを導入する特異的リバースプライマによって増幅した。ＰＣＲのために、Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を製造業者の指示に従って使用した。

【0491】

次世代シーケンシング：１１サイクルのインビトロ進化の際の変異の蓄積を同定するために、５’－ＲＲＳに対応するｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、得られた産物を、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑで配列決定した。

【0492】

実施例１
アルファウイルスゲノムから構築された自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）は、図１Ａに記載されているように、以下の必須構造ドメインおよびコード領域を特徴とする。コード領域に関して、その最も一般的な形態のｓａＲＮＡは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するバイシストロン性ＲＮＡである。５’－ＯＲＦは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ転写に必要な全ての酵素機能を有する４つのサブユニットからなるアルファウイルス非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ）をコードする。ｎｓＰは段階的に成熟し、細胞膜に関連するタンパク質複合体（いわゆるレプリカーゼ）へと構築され、そこでＲＮＡ増幅のための区画として機能する球状体を形成する。レプリカーゼＯＲＦの下流にあり、サブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）によってレプリカーゼＯＲＦから分離された第２のＯＲＦは、抗原であることが非常に多い目的の遺伝子の遺伝情報を取り込む。アルファウイルス種間で保存されたいくつかのＲＮＡ構造ドメイン（保存配列要素；ＣＳＥ）は、レプリカーゼとの相互作用を支配し、それによってＲＮＡ複製を支配する。５’末端において、２つのＣＳＥは、レプリカーゼのＯＲＦと重複するより長い高度に構造化された領域（５’複製認識配列と呼ばれる；ＲＲＳ）内にある。この領域は、他のより下流のＣＳＥ（ＣＳＥ ３＝サブゲノムプロモータおよびＣＳＥ ４＝３’末端ＣＳＥ）よりもはるかに長く、より構造化されている。さらに、ｓａＲＮＡは、５’キャップおよび３’ポリアデニル化されている。キャップはレプリカーゼ翻訳に必要であるが、さもなければ複製には必須ではない。レプリカーゼの効率的な翻訳を可能にすることに加えて、ポリＡ尾部の最初の約１５個のアデノシンは３’ＣＳＥの一部である。

【0493】

インビトロ進化の手順のために、本発明者らは、国際公開第２０１７／１６２２６５ Ａ１号に記載されているレプリカーゼを発現するための非複製ｍＲＮＡ（図１Ｂ）、およびレプリカーゼによってトランスで複製され得る短い複製可能ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）（トランスレプリコン；ＴＲ）を使用した。このＴＲは、５’－ＲＲＳを欠く開始コドン（ΔＡＴＧ－ＲＲＳ）を特徴とし、国際公開第２０１７／１６２２６６ Ａ１号に例示的に記載されているようなサブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）を有さず（ΔＳＧＰ）、下流には、検出可能なレポータ表面タンパク質（ここでは：ＣＤ９０．１）についてのＯＲＦが続き、３’末端には最小の３’ＣＳＥおよび３０個のアデノシンの短いポリＡが存在する。

【0494】

実施例２
プラスミドにクローニングされたＣＤ９０．１－ＴＲをＰＣＲ増幅する。フォワードプライマは、５’調節領域のすぐ上流の５’末端にＴ７－ＲＮＡポリメラーゼプロモータを結合する。リバースプライマは、ＣＤ９０．１ ＯＲＦの３’末端に相補的であり、最小の３’ＣＳＥおよび短いポリＡ（３０個のアデノシン）を含む非結合オーバーハングを有する。得られたＰＣＲ産物は、通常のヌクレオチドＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰまたはＮ１－メチルシュード－ＵＴＰのいずれかを使用したインビトロ転写のための鋳型ＤＮＡである（図２Ａ）。レプリカーゼをコードするｍＲＮＡは、非アルファウイルス５’ＵＴＲのすぐ上流にＴ７プロモータを有するプラスミドを使用して合成される。プラスミドを、ポリＡ尾部の末端で制限酵素を用いて線状化する。通常のヌクレオチドを使用して、この線状化プラスミドを、レプリカーゼを発現する非修飾（ＵＴＰ含有）ｍＲＮＡにインビトロで転写する（図２Ｂ）。

【0495】

実施例３
本明細書に記載のインビトロ進化は、インビトロ転写中にＮ１－メチルシュードウリジンなどの修飾ヌクレオチドを組み込む場合に複製能力を保存する自己複製またはトランス複製ＲＮＡを選択することを目的とする。そのような修飾ヌクレオチドの存在により、ＲＮＡは、自然免疫受容体を刺激する能力を大幅に喪失し、それによってインビトロ転写ＲＮＡに対する自然免疫応答を低下させ、したがってＲＮＡの投与による副作用を減少させる。しかしながら、そのような修飾ヌクレオチドの存在はまた、ＲＮＡが複製／翻訳されてレプリカーゼおよび／またはコードされた目的の遺伝子、例えば抗原を産生する能力の低下をもたらし得る。

【0496】

長さがより長いため、５’調節領域は、短く単純に構造化された３’ＣＳＥよりも配列進化のためのより多くの選択肢を提供するという仮説が立てられた。さらに、５’ＣＳＥは、修飾されたインビトロ転写ＲＮＡを鋳型として使用する最初のＲＮＡ転写であるマイナス鎖合成に関与する。トランスレプリコンおよびレプリカーゼ－ｍＲＮＡベクター、ならびに上記のＲＮＡ合成手順は、反復的で周期的な手順で５’調節領域を特異的に標的とする指向性進化戦略に適している（図３）。この手順は、非修飾（Ｕ）および修飾（１ｍＹ）ＲＮＡにインビトロ転写されるＣＤ９０．１をコードするトランスレプリコンにまたがる第１のＰＣＲ産物から開始する（サイクル数Ｎ＝０）。各ＲＮＡを、非修飾レプリカーゼをコードするｍＲＮＡと共にＫ５６２細胞にエレクトロポレーションする。翌日、ＣＤ９０．１の表面発現をフローサイトメトリによって評価する。最初に、ＴＲ（Ｕ）による発現はＴＲ（１ｍＹ）による発現よりもはるかに高く、修飾ＲＮＡ対非修飾ＲＮＡによる全発現の比（１ｍＹ指数）は１をはるかに下回る。次に、ＣＤ９０．１を発現する修飾ＴＲでトランスフェクトした細胞を磁気支援細胞選別（ＭＡＣＳ）によって濃縮し、溶解し、細胞ＴＲコピーを、ＴＲ特異的プライマを使用したワンステップＲＴ－ＰＣＲによってｃＤＮＡおよび新規ＰＣＲ産物に変換する。次いで、このサイクルＮ＋１ ＰＣＲ産物を再び使用して、細胞へのエレクトロポレーションのためのＵおよび１ｍＹ ＴＲ－ＲＮＡを合成する。この手順を繰り返すことによって、１ｍＹ指数が工程ごとに上昇すると予想される。

【0497】

実施例４
ＴＲ－ＣＤ９０．１は、１１サイクルのインビトロ進化後、１ｍＹ修飾との適合性の増加を獲得する。インビトロ進化手順は、１ｍＹ指数の堅固で再現性のある増加が観察されるまで実施した。１１サイクル後、ＣＤ９０．１を発現する細胞からのＴＲ－ＲＮＡを得、逆転写して、その後の分析のために十分な量のＰＣＲ産物を生成した。第一に、インビトロ進化手順から、ＴＲが、修飾率（修飾ヌクレオチドの割合）が増加する際に複製を維持するトランス複製ＲＮＡに進化したことを独立して確認することを目的とした。１１サイクルのインビトロ進化から得られたＴＲ（Ｎ＝１１）、ならびにＵＴＰの代わりに１ｍＹの増加率（５０～１００％）を使用した初期ＴＲ鋳型（Ｎ＝０）のインビトロ転写を実施した。徐々に修飾されたＴＲを、レプリカーゼコードｍＲＮＡと共にＫ５６２細胞にエレクトロポレーションした。翌日、初期ＴＲのＣＤ９０．１発現は、フローサイトメトリによって評価され、１ｍＹ指数の増加によって可視化されたように、１１サイクル後のＴＲと同様に１ｍＹ修飾の増加に対してより感受性であることが証明された（図４）。１ｍＹ指数が１ｍＹの全てのパーセンテージについて増加したので、本発明者らは、初期配列が実際に進化し、１ｍＹの組み込みのためのより大きな適合性を獲得したと結論付けた。

【0498】

実施例５
１１サイクルのインビトロ進化後の５’ＣＳＥ領域に関する点突然変異の蓄積が実証された。１１サイクルのインビトロ進化が１ｍＹ修飾に対する適合性を増加させることを実施例４で確認したので、ＰＣＲ産物を配列決定し、５’調節領域に関して特定の変異が蓄積していたかどうかを分析することを決定した。次世代シーケンス（ＮＧＳ）分析により、リードの数パーセントの頻度で存在する多数の点突然変異体が明らかになった。関連する変異を有する４つの配列の群が全リードの１７．４％に見出され、クローン頻度は５．１％～３．６％であった。これらの４つのクローンは二重または三重の変異を有しており、１番目は常に６７位でのＡからＣへの交換であり、２番目または３番目は２４４～２４８位でのヌクレオチド交換であった（図５）。全てに共通する変異Ａ６７Ｃは、それ自体は２４位にランク付けされていた。４つの最も高頻度のクローンおよび低頻度であるが共通の変異をクローン分析のために選択した。

【0499】

実施例６
５’ＣＳＥ内で同定された点突然変異は、修飾されたトランスレプリコンの複製および発現を増加させる。同定された変異残基を親ＴＲ配列に挿入し、試験した。全てのクローンの非修飾および修飾ＲＮＡを構築し、レプリカーゼコードｍＲＮＡと共にＫ５６２細胞に同時トランスフェクトした。翌日、トランスフェクション率および１ｍＹ指数をフローサイトメトリによって評価し、これは、全てのクローンが初期の非変異ＴＲ（ＷＴ）よりも１ｍＹによる修飾に対して耐性であることを示した（図６）。

【0500】

実施例７
ＶＥＥＶ－ＴＣ－８３株に由来する単一の５’ヌクレオチド交換は、ＳＦＶレプリカーゼに応答して修飾および非修飾トランスレプリコンの発現を改善する。トランスで複製する複製可能ＲＮＡは、アルファウイルスであるベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）から操作し、レプリカーゼをコードするｍＲＮＡは、アルファウイルスであるセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）に由来した。ＶＥＥＶについては、弱毒化表現型を示すワクチン株、いわゆるＴＣ－８３株が数十年前に選択された（Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９６１，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ７３：２０９－２１８）。ＴＣ－８３は、ＶＥＥＶの毒性トリニダードロバ株と比較していくつかの変異を有する。第１のＣＳＥ内の５’末端に近いヌクレオチド交換は非常によく特徴付けられている。この変異はＣＳＥ１の５’末端ステムループの二次構造を変化させ、これは、ＶＥＥＶ－ＴＣ－８３ゲノムＲＮＡの複製の増加と相関していた（Ｋｕｌａｓｅｇａｒａｎ－Ｓｈｙｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８７：２１１－２２１）。本発明者らは、この５’変異がＳＦＶレプリカーゼに応答してトランスでの複製を増強し、１ｍＹ修飾複製可能ＲＮＡの複製を増加させることを認めた。次いで、１１サイクルのインビトロ進化後にＴＲにＴＣ－８３ ５’変異が存在する場合、１ｍＹ指数がわずかにさらに増加することが観察された（図４Ｂおよび４Ｃ）。興味深いことに、ＶＥＥＶレプリカーゼをコードするｍＲＮＡに応答して、ＴＲの１ｍＹ指数は、ＴＣ－８３変異の組み込み時に変化しないままであった（図４Ｄ）。

【0501】

実施例８
ＴＣ－８３特異的５’変異は、インビトロ進化によって創出された点変異と協働して、ＳＦＶレプリカーゼによって増幅された修飾トランスレプリコンの発現をさらに増加させる。次に、ＴＣ－８３特異的５’変異がインビトロ進化によって選択された変異ＴＲクローンの適合性をさらに増加させるかどうかを評価した。ＰＣＲを使用して、ＴＣ－８３変異を有するおよび有しないクローンＴＲを、非修飾ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡのいずれかとして作製した。Ｋ５６２細胞に、レプリカーゼコードｍＲＮＡおよび同量の全てのクローンを同時エレクトロポレーションした。この場合もやはり、ＴＣ－８３特異的変異のみが、非修飾ＴＲと比較してより高いトランスフェクション率および１ｍＹ指数によって示される修飾ＴＲの発現を増加させることが観察された。さらに、インビトロ進化点変異体は、トランスフェクション率および１ｍＹ指数をさらに増加させることができた（図８）。

【0502】

実施例９
レプリカーゼおよびトランスレプリコンＲＮＡが修飾されており、インビトロ進化変異を担持している場合、トランス増幅ＲＮＡ発現はヒト線維芽細胞において大幅に増加する。インビトロ進化に使用されたＫ５６２細胞は、自己複製およびトランス複製ＲＮＡ分子の非常に効率的な発現を可能にし、これは、これらの細胞がＲＮＡに対して弱い抗ウイルス応答を有することを示す。そのような細胞系は、ヌクレオチド修飾に耐性である複製ＲＮＡを選択することを可能にするが、パターン認識受容体によって引き起こされる強力な細胞自然免疫応答の存在下で修飾ＲＮＡの発現を検討するのには適していない。したがって、初代ヒト包皮線維芽細胞を使用してインビトロで進化したＴＲの発現を検討した。実験の最初の分岐では、非修飾ＳＦＶレプリカーゼｍＲＮＡおよび非修飾または修飾ＴＲを使用して線維芽細胞をリポフェクトした。ＴＲは、初期非変異体配列（ＷＴ）、初期配列のＴＣ－８３変異体（ＴＣ－８３）、およびＴＣ－８３変異を有するか（ＴＣ－８３＋３ｘＭｕｔ）またはＴＣ－８３変異なし（ＷＴ＋３ｘＭｕｔ）のいずれかの、１０サイクルのインビトロ進化後に同定された三重変異体クローンのいずれかであった。実験の第２の分岐では、同じＲＮＡの組合せを同時リポフェクトしたが、レプリカーゼをコードするｍＲＮＡも１ｍＹ修飾し、さらに精製して二本鎖ＲＮＡ夾雑物を除去したという違いがあった（Ｂａｉｅｒｓｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １５：２６－３５）。修飾レプリカーゼと修飾ＴＲとを組み合わせた場合、ＲＮＡトランスフェクションは理論的に最も免疫原性が低い。線維芽細胞の最大のトランスフェクション率は、低免疫原性分岐内および三重変異体の修飾ＴＣ－８３変異体で達成されることが分かった（図９）。これらのデータは、複製を維持し、堅固な導入遺伝子発現を可能にする非免疫原性のトランス複製ＲＮＡが生成されたことを示す。

【0503】

実施例１０
ＶＥＥＶ－ＴＣ－８３ ５’ＣＳＥは、キメラＶＥＥＶ／ＳＦＶ修飾自己増幅ＲＮＡの発現を増加させる。修飾時にＲＮＡ複製を可能にする５’調節領域を同定したので、対応する自己複製ＲＮＡを構築することを目指した。最初に、ＶＥＥＶ ５’調節領域を使用して、ＳＦＶレプリカーゼによって複製されるＲＮＡを構築した。ＶＥＥＶとＳＦＶ ｓａＲＮＡとの間の５’末端領域の単純なドメイン交換は、非機能的ベクターをもたらす可能性が最も高いので、ＶＥＥＶまたはＶＥＥＶ－ＴＣ８３の完全な５’調節領域をＳＦＶ ｓａＲＮＡに融合した。より正確には、ＣＳＥ１を含むＳＦＶ非翻訳領域を欠失させ、ＶＥＥＶ配列をＳＦＶレプリカーゼ開始コドンのすぐ上流で融合させた。得られたＶＥＥＶ／ＳＦＶキメラｓａＲＮＡは、５’ＶＥＥＶ由来調節領域を有するが、ＳＦＶレプリカーゼならびにＳＦＶ由来のＣＳＥ３（ＳＧＰ）およびＣＳＥ４（３’ＣＳＥ）をコードする（図１０Ａ）。これらのベクターを、ウリジンの代わりに０％から１００％までの１ｍＹの増加率を有する非修飾または修飾ＲＮＡにインビトロ転写した。修飾の増加は、ＴＣ－８３特異的５’変異を含まない限り、Ｋ５６２細胞におけるキメラｓａＲＮＡの複製能力を低下させることが観察された（図１０Ｂ）。インターフェロンコンピテント初代線維芽細胞にリポフェクトした場合、キメラｓａＲＮＡのＴＣ－８３変異体はより良好に発現され、修飾に対して耐性であったが、非ＴＣ８３対応物は１００％修飾時に発現低下を示した（図１０Ｃ）。１ｍＹの存在による複製の阻害は、Ｋ５６２細胞よりも顕著でなく、これは、修飾ｓａＲＮＡの自然免疫刺激の減少から生じるバイアスに起因する可能性が最も高かった。全体として、これらのデータは、トランス複製ＲＮＡ中のヌクレオチド修飾に対する耐性が増加した５’調節領域が、自己複製ＲＮＡまたはシス複製ＲＮＡ上に成功裏に転位されたことを示す。

【0504】

ＧＦＰをコードする類似のキメラＶＥＥＶ／ＳＦＶ ｓａＲＮＡを用いて、同等の実験を行った。Ｋ５６２およびＨＦＦ細胞をリポフェクトし、翌日ＧＦＰ発現を評価して、細胞のトランスフェクション率を決定した。ＴＲＤの５’ＣＳＥによるＶＥＥＶ／ＳＦＶ ｓａＲＮＡのトランスフェクション率は、１ｍＹ取り込みの増加と共に減少したが、ＴＣ－８３の５’ＣＳＥは、１ｍＹ修飾に対する耐性、ならびに全体的なトランスフェクション率の増加を提供した（図１０Ｄ、１０Ｅ）。これらの結果は、ホタルルシフェラーゼをコードする構築物で確認された。

【0505】

本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認として意図されていない。これらの文書の内容に関する全ての記述は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。

【0506】

以下の説明は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。特定の装置、技術、および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な変更は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般的な原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書に記載され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲を与えられるべきである。

【0507】

実施例１１
材料および方法：
免疫：６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＦＥＬＡＳＡの勧告に従って、およびＧｅｒｍａｎ ａｎｉｍａｌ ｗｅｌｆａｒｅ ａｃｔ ａｎｄ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ２０１０／６３／ＥＵを遵守して、特定病原体除去条件下で飼育した。全ての作業は、参照番号Ｇ－２０－８－０４３の下にＬａｎｄｅｓｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｓａｍｔ Ｒｈｉｎｅｌａｎｄ－Ｐａｌａｔｉｎａｔｅによって承認された。マウスを、レプリカーゼ－ｍＲＮＡとインフルエンザウイルス、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨＡを抗原としてコードするＴＲとの１００ｎｇのＬＮＰ製剤化混合物を用いて前脛骨に筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫した。マウスを２８日間空けて２回免疫した。各注射のためのＲＮＡの組成は、１ｍＹを有する７８ｎｇのＳＦＶレプリカーゼｍＲＮＡおよびＵまたは１ｍＹのいずれかを有する２２ｎｇのそれぞれのＴＲであった。全てのＲＮＡを共転写的にキャップした。

【0508】

ＥＬＩＳｐｏｔ分析：脾細胞を５６日目に単離し、Ｍａｂｔｅｃｈ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキットを使用してＥＬＩＳｐｏｔ分析を実施した。脾細胞を予め被覆したＥＬＩＳｐｏｔプレートに播種し、３７°Ｃの加湿インキュベータ内で一晩、示されているペプチドプールで刺激した。

【表9】

【0509】

対照測定は、無関係のペプチドプール、培地のみまたはコンカナバリンＡを用いて行った。ビオチン結合抗ＩＦＮ－γ抗体でスポットを可視化し、続いてストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）および５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質とインキュベートした。ＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてプレートをスキャンし、ＩｍｍｕｎｏＣａｐｔｕｒｅ Ｖ６．３ソフトウェアによって分析した。全ての試験を３連で実施し、スポット数を各３連の中央値として要約した。

【0510】

抗体分析：抗体分析のために、最初の免疫後５６日目にイソフルラン麻酔下で血液試料を採取した。血清中の中和抗体を決定するためのウイルス中和試験（ＶＮＴ）を、ＷＨＯのＭａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（ＷＨＯ Ｇｌｏｂａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ）に基づいて実施した。ＨＡ中和抗体の血清レベルを、マウス血清の連続希釈物を１００組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ_５０）の活性Ｃｆ４／Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスと共に２時間インキュベートすることによって定量化し、次いで、９６ウェルプレート中のコンフルエントなＭＤＣＫ細胞単層上に適用した。ＭＤＣＫと３日間インキュベートした後、細胞培養上清を回収し、０．５％ニワトリ赤血球（ＲＢＣ；Ｌｏｈｍａｎｎ Ｔｉｅｒｚｕｃｈｔ，Ｃｕｘｈａｖｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と１：２で混合した。ＲＢＣ凝集を丸底９６ウェルプレートで視覚的に観察し、ＶＮ血清力価を、凝集を阻害した最低希釈の逆数として記録した（ＶＮＴ力価／５０μｌ血清）。

【0511】

ＥＬＩＳＡ：組換えＣｆ４／Ｈ１Ｎ１－ＨＡタンパク質（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｄｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏｒ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン化キットを供給業者のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って利用してビオチン化した。９６ウェルのストレプトアビジンプレート（ＶＷＲ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、４°Ｃで一晩ビオチン化ＨＡタンパク質で被覆した。洗浄およびブロッキングの際に、血清試料を３７°Ｃで１時間、プレート上でインキュベートすることによってＨＡ特異的抗体についてスクリーニングした。インキュベーション後、アッセイ対照を含めて、プレートをＨＲＰ標識二次抗マウスＩｇＧ抗体と３７°Ｃでさらに４５分間インキュベートした後、ＴＭＢ ｏｎｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢＩＯＴＲＥＮＤ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を適用した。比色検出を観測し、４５０ｎｍで読み取った光学密度を６２０ｎｍの波長基準（λ４５０～６２０ｎｍ）まで計算した。

【0512】

結果：ＴＣ－８３特異的５’変異および３ｘＭｕｔと略される３つの変異を有するインビトロで進化したＴＲ（ＴＣ－８３＋３ｘＭｕｔ）の使用が、ワクチンベクターとしての修飾複製ＲＮＡの効力を改善するかどうかの疑問に取り組むために、Ａ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素遺伝子をＴＲ－ＴＣ８３＋３ｘＭｕｔおよび親ＴＲ（ＷＴ）に挿入した。ＴＲ－ＴＣ８３＋３ｘＭｕｔ ＲＮＡを１ｍＹ－ＴＰの存在下で作製し、ＷＴ ＴＲについてはｍＲＮＡ ＵＴＰを使用した。各ＴＲを、１ｍＹを有するＳＦＶレプリカーゼｍＲＮＡと等モル比で合わせ、ＬＮＰに製剤化した。プライムブーストレジメンでのｉ．ｍ．ワクチン接種のために、注射当たり１００ｎｇの各混合物の総用量を使用した。５６日後、血液を採取して血清を得て、体液性免疫を決定し、脾細胞を単離して細胞性免疫を評価した。ＥＬＩＳＡによって測定されたＨＡ特異的抗体のエンドポイント滴定は、Ｕを含有するＷＴ－ＴＲと比較して、１ｍＹを含有するＴＲ－ＴＣ８３＋３ｘＭｕｔでワクチン接種したマウスの末梢血中の循環ＨＡ特異的ＩｇＧのより高い平均濃度を明らかにした（図１２Ａ）。抗体濃度の増加は、平均ウイルス中和力価（ＶＮＴ）の増加に反映された（図１２Ｂ）。（図１２Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞および（図１２Ｃ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞に特異的なＥＬＩＳｐｏｔ分析によって示されたように、Ｔ細胞免疫も増加した。

【0513】

要約すると、データは、１ｍＹ修飾ＴＲ－ＴＣ８３＋３ｘＭｕｔによる免疫が、免疫原性を誘導する能力を失うことなく、ワクチンベクターとして１００％の１ｍＹ修飾複製ＲＮＡの使用を可能にしたことを示す。

【0514】

実施例１２
ＳＦＶレプリカーゼを使用して１１サイクル実施したインビトロ進化手順は、１ｍＹで修飾した場合に堅固に複製されるＴＲをもたらした（図４Ｂ）。この修飾に対する適合性の増加がＳＦＶレプリカーゼに特異的であるかどうかを評価するために、数サイクルのインビトロ進化後にトランスフェクト細胞のｃＤＮＡから増幅された修飾および非修飾ＴＲをＳＦＶレプリカーゼまたはＶＥＥＶレプリカーゼと同時トランスフェクトした（図１３Ａ）。ＳＦＶレプリカーゼを使用した場合、１ｍＹ修飾への連続的な適応は、インビトロ進化のサイクルと共に連続する１ｍＹ指数に反映され、これは、同じ進化したＴＲを複製するためにＶＥＥＶレプリカーゼを使用した場合には観察されなかった。これは、進化過程中に使用されるレプリカーゼと併せて有効な適応を示唆する。しかしながら、インビトロ進化プロセスは、他のアルファウイルス種のレプリカーゼにも適用可能であるべきである。したがって、本発明者らは、ＳＦＶレプリカーゼ（３ｘｍｕｔと呼ばれる変異６７、２４５および２４８を獲得している）を使用して同定されたＴＲが、ＶＥＥＶ（ベネズエラウマ脳炎ウイルス）またはＥＥＥＶ（東部ウマ脳炎ウイルス）のレプリカーゼを使用して１ｍＹとのより良好な適合性へと進化するかどうかを評価することを目指した。したがって、ＴＲ－３ｘｍｕｔを、ＳＦＶレプリカーゼの代わりにＶＥＥＶおよびＥＥＥＶレプリカーゼをコードするｍＲＮＡを使用して、記載されているインビトロ進化のさらなるサイクルに供した。サイクル数をリセットし、各回のインビトロ進化の後に、非修飾ＴＲおよび修飾ＴＲによるＣＤ９０．１選択マーカ発現に基づいて１ｍＹ指数を決定した。本発明者らは、（図１３Ｂ）ＥＥＥＶレプリカーゼまたは（図１３Ｃ）ＶＥＥＶレプリカーゼを使用して実施されたサイクルが多いほど１ｍＹ指数が増加することを観察した。したがって、本明細書に記載のインビトロ進化プロセスは、使用されるレプリカーゼに関係なく、１ｍＹに適応したＴＲの複製をもたらす。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】