特表 2024-539097 ＧＰＡＭ発現を阻害するためのＲＮＡＩコンストラクト及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】ＧＰＡＭ発現を阻害するためのＲＮＡＩコンストラクト及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20241018BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241018BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 130Z

C12N15/113 ZNA

A61P1/16

A61P29/00

A61K31/7105

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024523434

(86)(22)【出願日】2022-10-21

(85)【翻訳文提出日】2024-04-25

(86)【国際出願番号】 US2022047491

(87)【国際公開番号】W WO2023069754

(87)【国際公開日】2023-04-27

(31)【優先権主張番号】63/270,813

(32)【優先日】2021-10-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500203709

【氏名又は名称】アムジェン インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ルリフソン， イングリッド

(72)【発明者】

【氏名】ミード， ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】ロング， ジェイソン シー．

(72)【発明者】

【氏名】マリー， ジャスティン ケー．

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA75

4C084ZB11

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA75

4C086ZB11

(57)【要約】

本開示は、ＧＰＡＭ遺伝子の発現を低下させるためのｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉコンストラクトに関する。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などの肝疾患を治療又は予防するためにこのようなＲＮＡｉコンストラクトを使用する方法も記載される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖が、表１に列挙されるグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア（ＧＰＡＭ）ｍＲＮＡ配列に相補的な領域を含み、前記ＲＮＡｉコンストラクトがＧＰＡＭの発現を阻害する、ＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項2】

表２に列挙されるアンチセンス配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを有する領域を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項3】

前記アンチセンス鎖が、表１に列挙されるＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする、請求項１又は請求項２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項4】

前記センス鎖が、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するために、前記アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項5】

前記二重鎖領域が、約１７～約２４塩基対長である、請求項４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項6】

前記二重鎖領域が、約１９～約２１塩基対長である、請求項４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項7】

前記二重鎖領域が、１９塩基対長である、請求項６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項8】

前記二重鎖領域が、２０塩基対長である、請求項６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項9】

前記二重鎖領域が、２１塩基対長である、請求項６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項10】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約１５～約３０ヌクレオチド長である、請求項４～１０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項11】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約１９～約２７ヌクレオチド長である、請求項１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項12】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約２１～約２５ヌクレオチド長である、請求項１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項13】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約２１～約２３ヌクレオチド長である、請求項１２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項14】

少なくとも１つの平滑末端を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項15】

１～４個の不対ヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項16】

前記ヌクレオチドオーバーハングが２つの不対ヌクレオチドを有する、請求項１５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項17】

前記ＲＮＡｉコンストラクトが、前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の３’末端、又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の両方の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１５又は１６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項18】

前記ヌクレオチドオーバーハングが、５’－ＵＵ－３’ジヌクレオチド又は５’－ｄＴｄＴ－３’ジヌクレオチドを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項19】

前記ＲＮＡｉコンストラクトが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項20】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－修飾ヌクレオチドである、請求項１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項21】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸、反転塩基又はこれらの組合せである、請求項１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項22】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド又はこれらの組合せである、請求項２１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項23】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項24】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド又はこれらの組合せである、請求項２３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項25】

少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項26】

前記センス鎖の３’末端に少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項27】

前記センス鎖の３’末端及び５’末端の両方に少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項28】

前記アンチセンス鎖が、表２に列挙されるアンチセンス配列から選択される配列を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項29】

前記センス鎖が、表２に列挙されるセンス配列から選択される配列を含む、請求項２８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項30】

表２に列挙される二重鎖化合物のいずれか１つである、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項31】

請求項１～３０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトであって、対照ＲＮＡｉコンストラクトとインキュベートされた肝細胞内でのＧＰＡＭ発現レベルと比較して、前記ＲＮＡｉコンストラクトとのインキュベーション後の肝細胞内でのＧＰＡＭの発現レベルを低下させる、ＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項32】

前記肝細胞がＨｅｐＧ２細胞である、請求項３１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項33】

インビトロでＨｅｐＧ２細胞において５ｎＭでＧＰＡＭ発現を少なくとも１０％阻害する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項34】

ＨｅｐＧ２細胞におけるＧＰＡＭ発現を約１ｎＭ未満のＩＣ５０で阻害する、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項35】

肝細胞の表面上に発現される１つ以上のタンパク質に結合するリガンドをさらに含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。

【請求項36】

請求項１～３５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトと、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤とを含む組成物。

【請求項37】

ＧＰＡＭの発現の低下を必要とする患者においてＧＰＡＭの発現を低下させるための方法であって、請求項１～３６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを前記患者に投与することを含む、方法。

【請求項38】

ＧＰＡＭの発現の低下を必要とする患者においてＧＰＡＭの発現を低下させるための方法であって、請求項３６に記載の組成物を前記患者に投与することを含む、方法。

【請求項39】

肝細胞におけるＧＰＡＭの発現レベルが、前記ＲＮＡｉコンストラクトを受けていない患者におけるＧＰＡＭ発現レベルと比較して、前記ＲＮＡｉコンストラクトの投与後の前記患者において低下している、請求項３７又は請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記患者が非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患している、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記患者が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

ＮＡＦＬＤの治療に使用するための、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト又は請求項３６に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア（ＧＰＡＭ）の肝臓発現を調節するための組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＧＰＡＭ発現を低下させるための核酸ベースの治療薬、及びそのような核酸ベースの治療薬を使用して、肝疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を処置又は予防する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、様々な肝臓病理を含む世界で最も一般的な慢性肝疾患であり、その有病率は過去２０年間で倍増し、現在では世界人口の２０％超が罹患していると推定される（Ｓａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＢＭＪ ３４９：ｇ４５９６；Ｌｏｏｍｂａ ａｎｄ Ｓａｎｙａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １０（１１）：６８６－６９０；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｋｉｍ（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １５（４）：４７４－４８５；Ｐｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ４８（３）：３３３－３４２；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１８）：２２３－２３８）。ＮＡＦＬＤは、肝臓中におけるトリグリセリドの蓄積から始まり、１）著しい飲酒歴がなく、且つ２）他の種類の肝疾患の診断が除外されている個体において、５％超の肝細胞に細胞質脂質小滴が存在することによって定義される（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２２（３６）：８２２６－３３；Ｒｉｎｅｌｌａ（２０１５）ＪＡＭＡ ３１３（２２）：２２６３－７３；Ｙｋｉ－Ｊａｒｖｉｎｅｎ（２０１６）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５９（６）：１１０４－１１）。一部の個体では、脂肪症と呼ばれる肝臓への異所性脂肪の蓄積により、炎症及び肝細胞損傷が誘発され、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれるより進行した段階の疾患が引き起こされる（Ｒｉｎｅｌｌａ、前掲）。２０１５年の時点で、７５００万～１億人のアメリカ人がＮＡＦＬＤを患っていると予測されており、ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤ診断のおよそ１０～３０％を占める（Ｒｉｎｅｌｌａ、前掲；Ｙｏｕｎｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６４（５）：１５７７－１５８６）。

【0003】

Ｇｅｎｂａｎｋ ＸＭ＿００５２６９９９８．１に見出される配列を有するグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア（ＧＰＡＭ、ＧＰＡＴ１）は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に関連する。ＧＰＡＭにおけるミスセンス変異は、過剰な肝臓脂肪の蓄積及び非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）関連表現型に関連する（Ｊａｍｉａｌａｈｍａｄｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ａｌａｎｉｎｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＧＰＡＭ ａｎｄ ＡＰＯＥ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０２１．１６０（５）：ｐ．１６３４－１６４６ ｅ７）．
現在、ＮＡＦＬＤ症状は、薬理学的処置が承認されていないので、減量及び任意の二次的症状の処置によって管理されている。従って、罹患した個体においてＮＡＦＬＤを処置する組成物及び方法が必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｓａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＢＭＪ ３４９：ｇ４５９６

【非特許文献2】Ｌｏｏｍｂａ ａｎｄ Ｓａｎｙａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １０（１１）：６８６－６９０

【非特許文献3】Ｋｉｍ ａｎｄ Ｋｉｍ（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １５（４）：４７４－４８５

【非特許文献4】Ｐｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ４８（３）：３３３－３４２

【非特許文献5】Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１８）：２２３－２３８

【非特許文献6】Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２２（３６）：８２２６－３３

【非特許文献7】Ｒｉｎｅｌｌａ（２０１５）ＪＡＭＡ ３１３（２２）：２２６３－７３

【非特許文献8】Ｙｋｉ－Ｊａｒｖｉｎｅｎ（２０１６）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５９（６）：１１０４－１１

【非特許文献9】Ｙｏｕｎｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６４（５）：１５７７－１５８６

【非特許文献10】Ｊａｍｉａｌａｈｍａｄｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ａｌａｎｉｎｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＧＰＡＭ ａｎｄ ＡＰＯＥ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０２１．１６０（５）：ｐ．１６３４－１６４６ ｅ７

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、アンチセンス鎖が、表１に記載のＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列などのＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する領域を含み、ＲＮＡｉコンストラクトがＧＰＡＭの発現を阻害するＲＮＡｉコンストラクトを提供する。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表２に列挙されるアンチセンス配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個の連続的なヌクレオチドを有する領域を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、表１に列挙されるＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする。

【0006】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、アンチセンス鎖の配列に十分に相補的な配列を含み、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成する。これら及び他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各々は、約１５～３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つの平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。このようなヌクレオチドオーバーハングは、少なくとも１～６個の不対ヌクレオチドを含み得、且つセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置し得る。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含み、且つセンス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。

【0007】

本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リボース環、核酸塩基又はホスホジエステル骨格に対する修飾を有するヌクレオチドを含む、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－修飾ヌクレオチドを含む。このような２’－修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、反転塩基（例えば、反転アデノシン）又はこれらの組合せを含み得る。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。

【0008】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、修飾ヌクレオチド間結合又はヌクレオシド間結合などの少なくとも１つの骨格修飾を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端に配置されてもよい。

【0009】

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖及び／又はセンス鎖は、表２に列挙されるアンチセンス配列及びセンス配列からの配列を含むか又はそれからなり得る。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表２に列挙される二重鎖化合物のいずれか１つであり得る。

【0010】

本開示はまた、前述のＲＮＡｉコンストラクト及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含む組成物、並びにそれを必要とする患者においてＧＰＡＭの発現を低下させる方法であって、前述のＲＮＡｉコンストラクト又は組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明は、ＧＰＡＭ遺伝子を標的化し、且つ肝細胞におけるＧＰＡＭの発現を低下させるＲＮＡｉコンストラクトの設計及び生成に部分的に基づく。ＧＰＡＭ発現の特異的阻害は、例えば、単純性脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（肝臓の不可逆的な進行した瘢痕）、又はＧＰＡＭ関連肥満といった肝臓関連疾患等のＧＰＡＭ発現と関連する症状を処置又は予防するのに有用である。

【0012】

本開示は、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア（ＧＰＡＭ）遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、この遺伝子は、細胞又は哺乳動物（例えば、ヒト）などの対象内に存在し得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＧＰＡＭ ｍＲＮＡを標的化し、且つ細胞又は哺乳動物におけるＧＰＡＭ発現を低下させるＲＮＡｉコンストラクトを含む。そのようなＲＮＡｉコンストラクトは、様々な形態の肝臓関連疾患、例えば単純脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（肝臓の不可逆的な進行性瘢痕化）、又はＧＰＡＭ関連肥満を治療又は予防するのに有用である。

【0013】

ヒトの遺伝的証拠は、ＧＰＡＭにおける一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ２７９２７５１（Ｔ）が「ＮＡＦＬＤ促進性」であることを示している。このＳＮＰは、ＧＰＡＭにおけるアミノ酸変化をもたらす一般的なミスセンス変異：Ｉｌｅ４３Ｖａｌである。このＳＮＰのキャリアは、磁気共鳴イメージングプロトン密度脂肪分率（ＭＲＩ－ＰＤＦＦ）の増加及び脂肪肝及び全原因性肝硬変によるリスクの増加（オッズ比、ＯＲ）を示す。担体はまた、血清総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド（ＴＧ）、ＡＬＴ及びＡＬＰの増加、好中球及び性ホルモン結合グロブリンレベルの増加を示す（Ｈａａｓ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｈｉｎｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｅｎａｂｌｅｓ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｌｉｖｅｒ ｆａｔ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．２０２０：ｍｅｄＲｘｉｖ ２０２０．０９．０３．２０１８７１９５；Ｊａｍｉａｌａｈｍａｄｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ａｌａｎｉｎｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ＧＰＡＭ ａｎｄ ＡＰＯＥ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０２１．１６０（５）：ｐ．１６３４－１６４６ ｅ７；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｌ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｈａｖｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ａｌｔｅｒｅｄ ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００２．２２（２３）：ｐ．８２０４－１４）。従って、ヒトデータの証拠は、ＮＡＳＨ患者を治療するためのＧＰＡＭ ｓｉＲＮＡ媒介療法の正しい方向性を示している。

【0014】

ＧＰＡＭの遺伝学は、その作用機構及び生物学について知られていることと一致している。ＧＰＡＭの機能的酵素的役割は十分に特徴付けられている（Ｇｉｍｅｎｏ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｊ．Ｃａｏ，Ｔｈｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｓｅｒｉｅｓ：ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄｓ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ：ｎｅｗ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ａｎ ｏｌｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，２００８．４９（１０）：ｐ．２０７９－８８；Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｂａｒｏ，Ｍ．Ｒ．，Ｔ．Ｍ．Ｌｅｗｉｎ、及びＲ．Ａ．Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ＩＩ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＧＰＡＴ１ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｃｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００７．２９２（５）：ｐ．Ｇ１１９５－９）。主に脂質生成組織で発現されるＧＰＡＭタンパク質は、ミトコンドリア外膜に局在し、アシル－ＣｏＡをグリセロール－３－リン酸からリゾホスファチジン酸に転移し、ＴＧ合成経路の開始に関与する律速段階として働く。ＧＰＡＭ欠損マウスは生存可能であり、生殖可能であり、肉眼的異常を示さない（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００２））。高脂肪食では、ＧＰＡＭ欠損マウスは、脂肪パッドの増加、肝臓ＴＧ蓄積、血清脂質の増加から保護され、肝細胞β酸化の増加、血漿ケトンレベル、及びＴＧ合成の減少を示す（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｌ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－１ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｅｘｃｅｓｓ ａｃｙｌ－ＣｏＡｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００５．２８０（２７）：ｐ．２５６２９－３６；Ｋｕｈａｊｄａ，Ｆ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ ａｎｄ ａｄｉｐｏｓｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｄｉｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｉｔｙ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１１．３０１（１）：ｐ．Ｒ１１６－３０；Ｗｅｎｄｅｌ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｏｂ／ｏｂ ｍｉｃｅ ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ ｂｕｔ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｒ ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１０．５９（６）：ｐ．１３２１－９；Ｘｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｉｃ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＧＰＡＴ１ ｉｎ ｏｂ／ｏｂ ｍｉｃｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００６．３４９（１）：ｐ．４３９－４８）。

【0015】

前臨床非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルにおけるＧＰＡＭの役割が記載されている（Ｌｉａｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１ Ｉｓ ａ Ｍｏｄｅｌ－Ａｇｎｏｓｔｉｃ Ｎｏｄｅ ｉｎ Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ，２０２０．５（２９）：ｐ．１８４６５－１８４７１）。ＮＡＳＨ及び線維症の程度の増加を誘導するために３つの異なる動物モデルを使用して、増加するＧＰＡＭ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現と、増加するＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）及び線維症との間の直接的な相関が観察された。ＧＰＡＭ欠損マウスはまた、肝細胞癌（ＨＣＣ）から保護されることが示されている（Ｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－１ ｈａｖｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ，２０１２．４０（３）：ｐ．５１３－２１）。従って、脂肪症の調節に加えて、データは、肝臓におけるＧＰＡＭのサイレンシングが重度の肝臓転帰を改善し得ることを示唆している（Ｌｉ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｕｎｖｅｉｌｓ ｎｏｖｅｌ ｄｒｉｖｅｒ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，２０１８．８（６）：ｐ．１７４０－１７５１；Ｎｇ，Ｃ．Ｋ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．２０２１：ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２１．０３．０５．４３４１４７）。

【0016】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞内に外来のＲＮＡを導入して、標的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの特異的な分解をもたらし、その結果としてタンパク質の発現を低減させるプロセスである。ＲＮＡｉ技術及び肝臓への送達の両方の進歩、並びに他のＲＮＡｉに基づく療法により増大する良好なアウトカムは、ＲＮＡｉがＧＰＡＭを直接標的化することによりＮＡＦＬＤを治療するための説得力のある手段であることを示唆している。

【0017】

本明細書中で用いられる用語「ＲＮＡｉコンストラクト」は、細胞中に導入された際にＲＮＡ干渉機構を介して標的遺伝子（例えばＧＰＡＭ）の発現を下方制御することができるＲＮＡ分子を含む剤を指す。ＲＮＡ干渉は、核酸分子が、例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、配列特異的に標的ＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子）の切断及び分解を誘導するプロセスである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するのに十分に互いに十分に相補的な、連続したヌクレオチドの２本の逆平行鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。二本鎖ＲＮＡｉコンストラクトは、ＲＮＡｉ「トリガー」と呼ばれることもある。用語「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、典型的には２つのポリヌクレオチドにおける相補的な塩基間の水素結合（例えば、ワトソン－クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合）を介した、相補的なポリヌクレオチドの対形成を指す。標的配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）と実質的に相補的な配列を有する領域を含む鎖は、「アンチセンス鎖」と称されている。「センス鎖」は、アンチセンス鎖のある領域に対して実質的に相補的な領域を含む鎖を指す。いくつかの実施形態において、センス鎖は、標的配列と実質的に同一の配列を有する領域を含み得る。

【0018】

特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するが、そうでなければ分離している別々の２つの分子であり得る。２つの別々の鎖から形成されるそのような二本鎖ＲＮＡ分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「短干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）と称される。ｓｉＲＮＡは、典型的には約２０～２７塩基対であり、ＲＮＡｉの中心である非コード二本鎖ＲＮＡ分子のクラスである。従って、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトはｓｉＲＮＡを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」又は「成熟ｍｉＲＮＡ」としても知られる）であり得る。ｍｉＲＮＡは、植物、動物及びいくつかのウイルスに存在する小さい（およそ１８～２４ヌクレオチド長）非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡはｓｉＲＮＡに似ているが、ｍｉＲＮＡはヘアピンｍＲＮＡ構造に由来する。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの相補的領域に対する塩基対形成によって遺伝子発現を調節する。

【0019】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＧＰＡＭを対象としたＲＮＡｉコンストラクトである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであり、アンチセンス鎖は、ＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列に相補的な領域を含む。ＲＮＡｉアンチセンス鎖の領域は、ＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列の任意の適切な領域に相補的であり得る。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、ＧＰＡＭ ｒｓ２７９２７５１（Ｔ）部位に結合する。しかしながら、開示されたＲＮＡｉコンストラクトは、特定のＧＰＡＭ ＳＮＰにハイブリダイズする必要はない。いくつかの態様において、ＲＮＡｉコンストラクトは、表１又は表２に示される配列のいずれかを含有するｓｉＲＮＡ分子である。

【0021】

二本鎖ＲＮＡｉ分子は、リボヌクレオチドのリボース糖、塩基、又は本明細書中に記載されるもの若しくは当技術分野において知られているもの等の骨格構成要素への修飾が挙げられる、リボヌクレオチドへの化学修飾を含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等）に用いられるようなあらゆる修飾が、本開示の目的のための用語「二本鎖ＲＮＡ」によって包含される。

【0022】

本明細書中で用いられる第１の配列は、生理的条件等のある種の条件下で、第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖領域を形成することができるならば、第２の配列に「相補的」である。他のそのような条件として、当業者に知られている中程度の、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が挙げられ得る。第１の配列は、第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドと、一方又は双方のヌクレオチド配列の全長にわたって、いかなるミスマッチもなく塩基対形成するならば、第２の配列に対して完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。配列は、標的配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％相補的であるならば、標的配列と「実質的に相補的」である。相補性パーセントは、第２の配列又は標的配列内の対応する位置の塩基に対して相補的な、第１の配列内の塩基の数を、第１の配列の全長で割ることによって算出することができる。また、２つの配列がハイブリダイズする場合に、３０塩基対の二重鎖領域の全体にわたって５、４、３、２、又は１つ以下のミスマッチが存在するならば、一方の配列が、もう一方の配列に対して実質的に相補的であると言うことができる。一般に、何らかのヌクレオチドオーバーハングが本明細書中で定義されるように存在するならば、そのようなオーバーハングの配列は、２つの配列間の相補性の程度を判定する際に、考慮されない。例として、ハイブリダイズして各鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有する１９塩基対二重鎖領域を形成する、２１ヌクレオチド長のセンス鎖及び２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖は、この用語が本明細書に使用される場合、完全に相補的であるとみなされることになる。

【0023】

いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の領域は、標的ＲＮＡ配列（例えばＧＰＡＭ ｍＲＮＡ）の領域と完全に相補的な配列を含む。そのような実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列に対して完全に相補的な配列を含み得る。他のそのような実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列に対して実質的に相補的な配列、例えばセンス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域内に１、２、３、４、又は５つのミスマッチを有する配列を含み得る。特定の実施形態では、任意のミスマッチが、末端領域内（例えば、鎖の５’及び／又は３’末端の６、５、４、３、２又は１個のヌクレオチド以内）に生じることが好ましい。一実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖から形成される二重鎖領域内の任意のミスマッチが、望ましくはアンチセンス鎖の５’末端の６、５、４、３、２、又は１ヌクレオチド以内に生じる。

【0024】

ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が別個のＲＮＡ分子によって構成される場合、それらの分子は、共有結合される必要はないが、共有結合することは可能である。２本の鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間で、ヌクレオチドの中断されていない鎖以外の手段によって共有結合されている場合、その結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じ又は異なる数のヌクレオチドを有してもよい。二重鎖内の塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最短の鎖のヌクレオチドから、二重鎖内に存在するあらゆるオーバーハングを差し引いた数である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。

【0025】

他の実施形態において、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の一部であり得、すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の自己相補的領域の一部である。そのような場合、単一ＲＮＡ分子は、二重鎖領域（ステム領域とも称される）及びループ領域を含む。センス鎖の３’末端は、不対ヌクレオチドの隣接配列によってアンチセンス鎖の５’末端に連結されて、ループ領域を形成することとなる。ループ領域は、典型的には、アンチセンス鎖がセンス鎖と塩基対を形成して二重鎖又はステム領域を形成し得るように、ＲＮＡ分子それ自体が再度折り畳まれることが可能なほど十分に長い。ループ領域は、約３～約２５、約５～約１５、又は約８～約１２個の不対ヌクレオチドを含み得る。本明細書で述べるように、少なくとも部分的に自己相補的な領域を有するそのようなＲＮＡ分子は、「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）と称される。いくつかの実施形態では、ループ領域は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、又は２５個の不対ヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、ループ領域は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下の不対ヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｈＲＮＡを含む。単一の、少なくとも部分的に自己相補的なＲＮＡ分子の長さは、約３５ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約８５ヌクレオチド、又は約５０～約６０ヌクレオチドであり得、本明細書に列挙される長さをそれぞれ有する二重鎖領域及びループ領域を含み得る。

【0026】

いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＧＰＡＭメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と実質的に、又は完全に相補的な配列を有する領域を含む。本明細書中で用いられる「ＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列」は、あらゆる種（例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒト）に由来するＧＰＡＭタンパク質のバリアント又はアイソフォームが挙げられるＧＰＡＭタンパク質をコードする、スプライスバリアントを含むあらゆるメッセンジャーＲＮＡ配列を指す。ＧＰＡＭタンパク質は、ＧＰＡＴ又はＧＰＡＴ１としても知られている。

【0027】

また、ＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列は、その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として発現される転写物配列を含む。ｃＤＮＡ配列は、ＲＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、ウラシル及びシトシン）ではなく、ＤＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、チミン及びシトシン）として表されるｍＲＮＡ転写産物の配列を指す。ゆえに、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、標的のＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列又はＧＰＡＭ ｃＤＮＡ配列と実質的に、又は完全に相補的な配列を有する領域を含み得る。ＧＰＡＭ ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１２４４９４９．２又はＮＭ＿０２０９１８．６に由来し得るものなどの任意のＧＰＡＭ ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。

【0028】

アンチセンス鎖の領域は、ＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと実質的に、又は完全に相補的であり得る。いくつかの実施形態において、相補性の領域をアンチセンス鎖が含むＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列の標的領域は、約１５～約３０個の連続したヌクレオチド、約１６～約２８個の連続したヌクレオチド、約１８～約２６個の連続したヌクレオチド、約１７～約２４個の連続したヌクレオチド、約１９～約２５個の連続したヌクレオチド、約１９～約２３個の連続したヌクレオチド、又は約１９～約２１個の連続したヌクレオチドに及んでよい。特定の実施形態では、ＧＰＡＭ ｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含むアンチセンス鎖の領域は、いくつかの実施形態において、表２に列挙されるアンチセンス配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、アンチセンス配列は、表２に列挙されるアンチセンス配列からの少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個又は少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、センス配列及び／又はアンチセンス配列は、表２に列挙される配列からの１、２、又は３個以下のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１５個のヌクレオチドを含む。

【0029】

ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、通常、２本の鎖が生理的条件下でハイブリダイズして二重鎖領域を形成するようにアンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。「二重鎖領域」は、ワトソン－クリック塩基対形成又は他の水素結合相互作用のいずれかによって互いに塩基対を形成して、２つのポリヌクレオチド間で二重鎖を作出する２つの相補的又は実質的に相補的なポリヌクレオチド内の領域を指す。ＲＮＡｉコンストラクトの二重鎖領域は、例えば、ダイサー酵素及び／又はＲＩＳＣ複合体が結合することにより（後述）、ＲＮＡｉコンストラクトがＲＮＡ干渉経路に入ることを可能にする十分な長さのものであるべきである。例えば、いくつかの実施形態において、二重鎖領域は、約１５～約３０塩基対長である。また、この範囲内の二重鎖領域の他の長さ、例えば約１５～約２８塩基対、約１５～約２６塩基対、約１５～約２４塩基対、約１５～約２２塩基対、約１７～約２８塩基対、約１７～約２６塩基対、約１７～約２４塩基対、約１７～約２３塩基対、約１７～約２１塩基対、約１９～約２５塩基対、約１９～約２３塩基対、又は約１９～約２１塩基対が適している。一実施形態において、二重鎖領域は、約１７～約２４塩基対長である。別の実施形態では、二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である。

【0030】

いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＧＰＡＭ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く約２４～約３０個のヌクレオチドの二重鎖領域を含有する。理論に束縛されるものではないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解され得る（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。ダイサーであるリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡを、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれるが、ここで、１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖を解いて、相補的なアンチセンス鎖が標的認識をガイドすることを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ１０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると直ぐに、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。

【0031】

センス鎖及びアンチセンス鎖が２つの別々の分子である（例えば、ｓｉＲＮＡ ＲＮＡｉコンストラクト）実施形態について、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二重鎖領域の長さと同じ長さである必要はない。例えば、一方の鎖又は双方の鎖が、二重鎖領域よりも長くてもよく、そして二重鎖領域の側面に位置する１個以上の不対ヌクレオチド又はミスマッチを有してもよい。ゆえに、いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。本明細書中で用いられる「ヌクレオチドオーバーハング」は、鎖の末端にて、二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチド又はヌクレオチドを指す。ヌクレオチドオーバーハングは、典型的には、一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延在するか、又は一方の鎖の５’末端が他方の鎖の３’末端を越えて延在する場合に生成される。ヌクレオチドオーバーハングの長さは、一般に、１～６ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～４ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～５ヌクレオチド、又は２～４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドオーバーハングは、１、２、３、４、５、又は６つのヌクレオチドを含む。特定の一実施形態において、ヌクレオチドオーバーハングは、１～４つのヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ヌクレオチドオーバーハングは、２つのヌクレオチドを含む。オーバーハングにおけるヌクレオチドは、本明細書に記載される通りのリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、５’－ウリジンウリジン－３’（５’－ＵＵ－３’）ジヌクレオチドを含む。そのような実施形態では、ＵＵジヌクレオチドは、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド、例えば２’－修飾ヌクレオチドを含んでもよい。他の実施形態では、オーバーハングは、５’－デオキシチミジン－デオキシチミジン－３’（５’－ｄＴｄＴ－３’）ジヌクレオチドを含む。

【0032】

ヌクレオチドオーバーハングは、一方又は両方の鎖の５’末端又は３’末端に存在してもよい。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。

【0033】

ＲＮＡｉコンストラクトは、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の末端に単一のヌクレオチドオーバーハングを含み、且つ他の末端に平滑末端を含み得る。「平滑末端」は、センス鎖及びアンチセンス鎖が分子の末端で完全に塩基対を形成しており、二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチドがないことを意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、二本鎖ＲＮＡ分子の両末端で平滑末端を含む。そのような実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は同じ長さを有し、二重鎖領域は、センス鎖及びアンチセンス鎖と同じ長さである（すなわち、分子は、その全長にわたって二本鎖である）。

【0034】

センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、任意の適当な長さ、例えば約１５～約３０ヌクレオチド長、約１８～約２８ヌクレオチド長、約１９～約２７ヌクレオチド長、約１９～約２５ヌクレオチド長、約１９～約２３ヌクレオチド長、約２１～約２５ヌクレオチド長、又は約２１～約２３ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４又は約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトが２つのヌクレオチドオーバーハングを有するように、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さであるが、これらの鎖よりも短い二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）１９塩基対長である二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方にある２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方にある２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、それらの全長にわたって、二本鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないように二重鎖領域を形成する。このような一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２３塩基対長である二重鎖領域を含む。

【0035】

他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトが少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含むように、センス鎖又はアンチセンス鎖がもう一方の鎖よりも長く、この２本の鎖は、短い方の鎖の長さに等しい長さを有する二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）１９ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２１ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端にある２個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）２１ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２３ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端にある２個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。

【0036】

本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、表２に列挙されたアンチセンス配列のいずれか１つの配列を含むことができる。

【0037】

修飾ヌクレオチド
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環、又はリン酸基への１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。本明細書で使用する場合、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、及びシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを包含しない。しかしながら、ＲＮＡｉコンストラクトは、修飾ヌクレオチド、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの組合せを含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子の一方又は双方の鎖中への修飾ヌクレオチドの組み込みは、例えば、ヌクレアーゼ及び他の分解プロセスに対する分子の感受性を低下させることによって、ＲＮＡ分子のインビボ安定性を向上させることができる。修飾ヌクレオチドの組み込みにより、標的遺伝子の発現を低下させるためのＲＮＡｉコンストラクトの効力を増強させることもできる。

【0038】

特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。これらの糖の修飾には、ペントース環の２’及び／又は５’位での修飾並びに二環式糖修飾が含まれ得る。２’－修飾ヌクレオチドは、Ｈ又はＯＨ以外の置換基を２’位に有するペントース環を有するヌクレオチドを指す。このような２’修飾としては、２’－Ｏ－アルキル（例えば、Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０又はＯ－Ｃ１～Ｃ１０置換アルキル）、２’－Ｏ－アリル（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル（ＯＣＨ３）、２’－Ｏ－メトキシエチル（Ｏ－（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、２’－ＯＣＦ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、２’－Ｏ－アミノアルキル、２’－アミノ（例えば、ＮＨ_２）、２’－Ｏ－エチルアミン及び２’－アジドが挙げられるが、これらに限定されない。ペントース環の５’位での修飾としては、５’－メチル（Ｒ又はＳ）、５’－ビニル及び５’－メトキシが挙げられるが、これらに限定されない。

【0039】

「二環式糖修飾」は、環の２個の原子を架橋により連結して第２の環を形成して二環式糖構造を生じさせる、ペントース環の修飾を指す。いくつかの実施形態では、二環式糖修飾は、ペントース環の４’炭素と２’炭素との間の架橋を含む。二環式糖修飾を有する糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書中で二環式核酸又はＢＮＡと称される。例示的な二環式糖修飾としては、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）二環式核酸（ＢＮＡ）；β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ（ロックド核酸又はＬＮＡとも称される）；エチレンオキシ（４’－（ＣＨ_２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ；アミノオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；オキシアミノ（４’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ；メチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束エチル又はｃＥｔとも称される）；メチレン－チオ（４’－ＣＨ_２－Ｓ－２’）ＢＮＡ；メチレン－アミノ（４’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；メチル炭素環式（４’－ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ３）－２’）ＢＮＡ；プロピレン炭素環式（４’－（ＣＨ_２）３－２’）ＢＮＡ；及びメトキシ（エチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＭｅ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束ＭＯＥ又はｃＭＯＥとも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるこれら及び他の糖修飾ヌクレオチドは、例えば、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９：９３７－９５４（２０１２）に記載されている。

【0040】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、又はこれらの組合せを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組合せを含む。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組合せを含む。

【0041】

ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、アンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。特定の他の実施形態において、センス鎖内の全てのヌクレオチド及びアンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。これら及び他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組合せであり得る。

【0042】

いくつかの実施形態において、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖においてアデノシンヌクレオチドの前にあるすべてのピリミジンヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。例えば、いずれかの鎖で配列５’－ＣＡ－３’又は５’－ＵＡ－３’が現れる場合、シチジン及びウリジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖内の全てのピリミジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）であり、アンチセンス鎖内に存在する全ての配列５’－ＣＡ－３’又は５’－ＵＡ－３’の５’ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）である。他の実施形態では、二重鎖領域内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。このような実施形態では、修飾ヌクレオチドは、好ましくは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド又はこれらの組合せである。

【0043】

ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドであり得る。一実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシチミジンである。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。例えば、いくつかの実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組合せである。

【0044】

本開示のＲＮＡｉコンストラクトはまた、１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「修飾ヌクレオチド間結合」は、天然の３’－５’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間の結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート（例えば、メチルホスホナート、３’－アルキレンホスホナート）、ホスフィナート、ホスホロアミダート（例えば、３’－アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダート）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル及びボラノホスフェートなどのリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、２’－５’ホスホジエステル結合である。他の実施形態において、修飾ヌクレオチド間結合は、リン非含有ヌクレオチド間結合であるため、修飾ヌクレオシド間結合と称され得る。そのようなリン非含有結合として、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン結合（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）_２－Ｏ－）；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン結合；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル結合；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンメチルイミノ（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－）及びメチレンヒドラジノ結合；スルホネート及びスルホンアミド結合；アミド結合；並びにＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２構成要素部分が混合された他のものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書、米国特許第５，７１４，３３１号明細書、及び米国特許第５，７１９，２６２号明細書に記載されているもの等のペプチド核酸又はＰＮＡを作出するためのペプチドベースの結合（例えばアミノエチルグリシン）である。開示されたＲＮＡｉコンストラクトに使用され得る他の適切な修飾されたヌクレオチド間及びヌクレオシド間結合は、米国特許第６，６９３，１８７号明細書及び第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、並びにＤｅｌｅａｖｅｙ及びＤａｍｈａ、上記に記載されている。

【0045】

特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖に存在し得る。例えば、いくつかの実施形態において、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに他の実施形態において、双方の鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端、５’末端又は３’末端及び５’末端の両方に１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。例えば、特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に、約１つ～約６つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６つ以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の５’末端に約１つ～約６つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６つ以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つアンチセンス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つセンス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の５’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つアンチセンス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合（すなわちアンチセンス鎖の３’末端における第１及び第２のヌクレオチド間結合でのホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つセンス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を（すなわちアンチセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方において第１及び第２のヌクレオチド間結合でのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方において第１及び第２のヌクレオチド間結合でのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を）含む。一方又は両方の鎖が１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む実施形態のいずれかでは、鎖内の残りのヌクレオチド間結合は、天然の３’－５’ホスホジエステル結合であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオチド間結合はホスホロチオエートである。

【0046】

ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態において、オーバーハング内の不対ヌクレオチドの２つ以上が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されていてよい。特定の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の３’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の５’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。更に他の実施形態では、あらゆるヌクレオチドオーバーハング内の全ての不対ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。

【0047】

特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの鎖の一方又は両方に組み込まれる修飾ヌクレオチドは、核酸塩基（本明細書では「塩基」とも称される）の修飾を有する。「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」は、天然に存在するプリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）以外の塩基を指す。修飾核酸塩基は、合成的な修飾又は天然に存在する修飾であってもよく、且つユニバーサル塩基、５ーメチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン（Ｘ）、ヒポキサンチン（Ｉ）、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル並びに他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオ、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンを含むことができるが、これらに限定されない。

【0048】

いくつかの実施形態において、修飾塩基はユニバーサル塩基である。「ユニバーサル塩基」は、結果として生じる二重鎖領域の二重らせん構造を変えることなく、ＲＮＡ及びＤＮＡ内の天然の塩基の全てと無差別に塩基対を形成する塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基は、当業者に知られており、これとして、イノシン、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチル、及び他の芳香族誘導体、アゾールカルボキサミド、並びに３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール、及び６－ニトロインドール等のニトロアゾール誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0049】

本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる他の好適な修飾塩基としては、例えばＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１０：２９７－３１０，２０００及びＰｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｒｎ．，７６：７２９５－７３００（２０１１）に記載のものが挙げられる。グアニン、シトシン、アデニン、チミン、及びウラシルは、上述の修飾核酸塩基等の他の核酸塩基によって置換され得る（但し、そのような置換核酸塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変えない）ことを当業者は十分に認識している。

【0050】

いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖、アンチセンス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方の５’末端は、ホスフェート部分を含む。本明細書中で用いられる用語「ホスファート部分」は、非修飾ホスファート（－Ｏ－Ｐ＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨ）及び修飾ホスファートを含む末端ホスファート基を指す。修飾ホスフェートは、Ｏ及びＯＨ基の１つ以上がＨ、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）又はアルキルで置換されており、ＲがＨ、アミノ保護基又は非置換若しくは置換アルキルであるホスフェートを含む。例示的なホスフェート部分としては、５’－モノホスフェート；５’ジホスフェート；５’－トリホスフェート；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化若しくは非メチル化）；５’－アデノシンキャップ又は任意の他の修飾若しくは非修飾ヌクレオチドキャップ構造；５’－モノチオホスフェート（ホスホロチオエート）；５’－モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート）；５’－α－チオトリホスフェート；５’－γ－チオトリホスフェート；５’－ホスホロアミダート；５’－ビニルホスフェート；５’－アルキルホスホナート（ここで、「アルキル」はメチル、エチル、イソプロピル、プロピルなどであり得る）；及び５’－アルキルエーテルホスホナート（ここで、「アルキルエーテル」はメトキシメチル、エトキシメチルなどであり得る）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0051】

本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載される２つ以上の化学修飾を有し得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、リボース糖への修飾及び核酸塩基への修飾を有し得る。例として、修飾ヌクレオチドは、２’糖修飾（例えば、２’－フルオロ又は２’－メチル）を含み得、修飾塩基（例えば、５－メチルシトシン又はシュードウラシル）を含み得る。他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、５’ホスフェートへの修飾と組み合わされた糖修飾を含んでもよく、これにより、修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれたときに、修飾されたヌクレオチド間又はヌクレオシド間結合を生成することになる。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、糖修飾、例えば２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾又は二環式糖修飾及び５’ホスホロチオエート基を含み得る。従って、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一方又は両方の鎖は、２’修飾ヌクレオチド又はＢＮＡ及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組合せを含む。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組合せを含む。修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド間結合を含む例示的なＲＮＡｉコンストラクトを表２に示す。

【0052】

ＲＮＡｉコンストラクトの機能
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、望ましくは、細胞、特に肝細胞におけるＧＰＡＭの発現を低下させるか又は阻害する。従って、一実施形態において、本発明は、細胞を本明細書中に記載されるあらゆるＲＮＡｉコンストラクトと接触させることによって、細胞内でのＧＰＡＭ発現を低下させる方法を提供する。細胞は、インビトロ又はインビボであり得る。ＧＰＡＭ発現は、ＧＰＡＭ ｍＲＮＡ、ＧＰＡＭタンパク質、又はＧＰＡＭ発現と関連する別のバイオマーカーの量又はレベルを測定することによって評価することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞又は動物におけるＧＰＡＭ発現の低下は、ＲＮＡｉコンストラクトで処理されていないか又は対照ＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞又は動物におけるＧＰＡＭ発現と比較して判定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＧＰＡＭ発現の低下は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置した肝細胞におけるＧＰＡＭ ｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝細胞に発現しないＲＮＡ分子を対象とするＲＮＡｉコンストラクト、又はナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクト）で処置した肝細胞、或いはコンストラクトなしで処置した肝細胞におけるＧＰＡＭ ｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）で処置した細胞から測定したＧＰＡＭ ｍＲＮＡレベルを、（ｂ）の対照細胞から測定したＧＰＡＭ ｍＲＮＡレベルと比較することによって評価する。処理された細胞及び対照細胞におけるＧＰＡＭ ｍＲＮＡレベルは、比較前に、対照遺伝子（例えば、１８Ｓ リボソームＲＮＡ）について、ＲＮＡレベルに関して正規化されてもよい。ＧＰＡＭ ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、及び定量ＰＣＲが挙げられる種々の方法によって測定することができる。

【0053】

他の実施形態では、ＧＰＡＭ発現の低下は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置した肝細胞におけるＧＰＡＭタンパク質の量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝細胞に発現しないＲＮＡ分子を対象とするＲＮＡｉコンストラクト、又はナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクト）で処置した肝細胞、或いはコンストラクトなしで処置した肝細胞におけるＧＰＡＭタンパク質の量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）で処置した細胞から測定したＧＰＡＭタンパク質レベルを、（ｂ）の対照細胞から測定したＧＰＡＭタンパク質レベルと比較することによって評価する。ＧＰＡＭタンパク質レベルは、ウエスタンブロット、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）及びフローサイトメトリーを含むがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の適切な方法を用いて測定することができる。ＧＰＡＭ ｍＲＮＡ又はタンパク質を測定する任意の適切な方法を使用して、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効性を評価することができる。

【0054】

いくつかの実施形態において、ＧＰＡＭ発現レベルを評価するための方法は、ＧＰＡＭを自然に発現する細胞（例えば肝細胞）又はＧＰＡＭを発現するように操作された細胞においてインビトロで実施される。特定の実施形態では、本方法は、肝細胞においてインビトロで実施される。適切な肝細胞としては、初代肝細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、又は齧歯類の肝細胞）、ＨｅｐＡＤ３８細胞、ＨｕＨ－６細胞、ＨｕＨ－７細胞、ＨｕＨ－５－２細胞、ＢＮＬＣＬ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、又はＨｅｐＧ２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、肝細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞である。別の実施形態では、肝細胞は、ＨｅｐＧ２細胞である。

【0055】

他の実施形態において、ＧＰＡＭ発現レベルを評価する方法は、インビボで実施される。例えば、ＲＮＡｉコンストラクト及び任意の対照ＲＮＡｉコンストラクトを動物（例えば、齧歯類又は非ヒト霊長類）に投与することができ、処置後の動物から採取した肝臓組織でＧＰＡＭ ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルを評価することができる。代わりに、又は加えて、ＧＰＡＭ発現と関連するバイオマーカー又は機能表現型を、処理した動物において評価することができる。

【0056】

特定の実施形態において、ＧＰＡＭの発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトによって、肝細胞内で少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％低下する。いくつかの実施形態において、ＧＰＡＭの発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトによって、肝細胞内で少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％低下する。他の実施形態において、ＧＰＡＭの発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトによって、肝細胞内で約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上低下する。ＧＰＡＭ発現の低下パーセントは、本明細書中に記載される方法のいずれか、又は当技術分野において知られている他の方法によって測定することができる。例えば、特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロでＨｅｐＧ２細胞（Ｉ４３Ｖ変異を有するＧＰＡＭを含む）において５ｎＭでＧＰＡＭ発現の少なくとも４５％を阻害する。関連する実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのＨｅｐＧ２細胞において５ｎＭでＧＰＡＭ発現の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％又は少なくとも７５％を阻害する。他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのＨｅｐＧ２細胞において５ｎＭでＧＰＡＭ発現の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、又は少なくとも９８％を阻害する。ＧＰＡＭの低下は、例えばＲＮＡ ＦＩＳＨ又は液滴デジタルＰＣＲを含む様々な技術を用いて測定することができる（例えばＫａｍｉｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７６８：４０１－４２２（２０１８）．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－４９３９－７７７８－９＿２３）を含む様々な技術を用いて測定することができる。

【0057】

いくつかの実施形態において、ＩＣ５０値を算出して、肝細胞内でのＧＰＡＭ発現の阻害について、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの効力を評価する。「ＩＣ５０値」は、生物学的又は生化学的機能の５０％阻害を達成するのに要求される用量／濃度である。任意の物質又はアンタゴニストのＩＣ５０値は、任意のアッセイにおいて、用量反応曲線を構築し、発現レベル又は機能活性に及ぼす種々の濃度の物質又はアンタゴニストの効果を試験することによって決定することができる。最大の生物学的応答又は本来の発現レベルの半分を阻害するのに必要な濃度を決定することにより、所与のアンタゴニスト又は物質のＩＣ５０値を計算することができる。従って、任意のＲＮＡｉコンストラクトについてのＩＣ５０値は、免疫アッセイ、ＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイ又は液滴デジタルＰＣＲアッセイなどの任意のアッセイにおいて、肝細胞における天然ＧＰＡＭ発現レベル（例えば、対照肝細胞におけるＧＰＡＭ発現レベル）の半分を阻害するのに必要なＲＮＡｉコンストラクトの濃度を決定することによって計算することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、約２０ｎＭ未満のＩＣ５０（例えば、約１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ又は１ｎＭ未満）で肝細胞（例えばＨｅｐＧ２細胞）におけるＧＰＡＭ発現を阻害し得る。例えば、開示されるＲＮＡｉコンストラクトは、約０．００１ｎＭ～約２０ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５ｎＭ又は約０．１ｎＭ～約１ｎＭのＩＣ５０で肝細胞におけるＧＰＡＭ発現を阻害し得る。特定の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、約１ｎＭ～約１０ｎＭのＩＣ５０で肝細胞（例えばＨｅｐＧ２細胞）内でのＧＰＡＭ発現を阻害する。

【0058】

本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、当技術分野において公知の技術を用いて、例えば従来の核酸固相合成法を用いて容易に作製することができる。ＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体（例えばホスホラミダイト）を利用して、適切な核酸合成装置でアセンブルすることができる。自動核酸合成装置が、いくつかのベンダーによって市販されており、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ，ＴＸ）のＭｅｒＭａｄｅ合成装置、及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ合成装置が挙げられる。

【0059】

リボヌクレオシドの５’位で酸解離性ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）とともに２’シリル保護基を使用して、ホスホラミダイト化学を介してオリゴヌクレオチドを合成することができる。最終脱保護条件は、ＲＮＡ産物を著しく分解しないことが知られている。全ての合成は、任意の自動又は手動合成装置により、大規模、中規模、又は小規模で行うことができる。また、合成は、複数のウェルプレート、カラム、又はスライドガラスにおいて実行することができる。

【0060】

２’－Ｏ－シリル基は、フッ化物イオンに曝露することによって除去することができ、フッ化物イオンは、フッ化物イオンの任意の供給源、例えば無機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化セシウム及びフッ化カリウム又は有機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウムを含むことができる。クラウンエーテル触媒が、脱保護反応において無機フッ化物と組み合わせて利用され得る。例示的なフッ化物イオン供給源としては、フッ化テトラブチルアンモニウム又はアミンヒドロフルオライド（例えば、双極性非プロトン溶媒、例えばジメチルホルムアミド中でトリエチルアミンと水性ＨＦとを組み合わせる）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

亜リン酸トリエステル及びホスホトリエステルに用いられる保護基の選択により、フッ化物に対するトリエステルの安定性を改変することができる。ホスホトリエステル又は亜リン酸トリエステルのメチル保護は、フッ化物イオンに対する結合を安定化させ、且つプロセス収率を向上させることができる。

【0062】

リボヌクレオシドは、反応性の２’ヒドロキシル置換基を有するため、ＲＮＡにおける反応性の２’位を、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル保護基に対して直交性である保護基、例えば酸処理に対して安定であるもので保護することが望ましい場合がある。シリル保護基が、この条件を満たしており、最終的なフッ化物脱保護工程において容易に除去され得、これにより、ＲＮＡ分解を最小減に抑えることが可能となる。

【0063】

テトラゾール触媒を、標準的なホスホラミダイトカップリング反応に用いることができる。例示的な触媒は、例えば、テトラゾール、Ｓ－エチル－テトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、及びｐ－ニトロフェニルテトラゾールを含む。

【0064】

本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを合成する更なる方法は当技術分野の当業者に明らかであろう。加えて、種々の合成工程を、代替の順番又は順序で実行して、所望の化合物を得ることができる。本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの合成において有用な他の合成化学転換、保護基（例えば、塩基に存在するヒドロキシル、アミノなどのための）及び保護基の手法（保護及び脱保護）は、当技術分野で知られており、例えばＲ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、並びにそれらの後続版に記載されるものが挙げられる。ＲＮＡｉコンストラクトのカスタム合成も、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、ＡｘｏＬａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含むいくつかの商業的ベンダーから入手可能である。

【0065】

本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リガンドを含み得る。本明細書で使用する場合、「リガンド」は、別の化合物又は分子と直接的又は間接的に相互作用することができる任意の化合物又は分子を指す。別の化合物又は分子とリガンドとの相互作用は、生物学的応答を誘発し得るか（例えば、シグナル伝達カスケードを惹起する、受容体媒介性のエンドサイトーシスを誘導する）、又はまさに物理的会合であり得る。リガンドは、結合する二本鎖ＲＮＡ分子の１つ以上の特性、例えばＲＮＡ分子の薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞内取り込み、電荷及び／又はクリアランス特性を修飾することができる。

【0066】

リガンドは、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質、グロブリン）、コレステロール部分、ビタミン（例えば、ビオチン、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２）、葉酸部分、ステロイド、胆汁酸（例えば、コール酸）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン若しくはヒアルロン酸）、グリコシド、リン脂質又は抗体若しくはその結合断片（例えば、肝細胞などの特定の細胞型に対するＲＮＡｉコンストラクトを標的化する全抗体若しくは結合断片）を含み得る。リガンドの他の例としては、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（例えば、ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子（例えば、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビスＯ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、０３－（オレオイル）リトコール酸、０３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）、ペプチド（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド）、アルキル化剤、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ポリアミノ酸及びポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン）が挙げられる。

【0067】

特定の実施形態では、リガンドは、エンドソーム不安定化特性を有する。エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームの溶解及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム不安定化リガンドは、ｐＨ依存性膜活性及び膜融合性を示すポリカチオンペプチド又はペプチド模倣体であり得る。一実施形態では、エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性型コンフォメーションを取る。「活性型」コンフォメーションは、エンドソーム不安定化リガンドが、エンドソームの溶解及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進するコンフォメーションである。例示的なエンドソーム不安定化リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６：２９６４－２９７２，１９８７）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｒｎ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１８：１５８１－１５８６，１９９６）及びこれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１５５９：５６－６８，２００２）が挙げられる。一実施形態では、エンドソーム溶解構成要素は、ｐＨの変化に応答して電荷又はプロトン化の変化を起こすことになる化学基（例えば、アミノ酸）を含有し得る。エンドソーム不安定化構成要素は、直鎖状又は分枝状であり得る。

【0068】

いくつかの実施形態では、リガンドは、脂質又は他の疎水性分子を含む。一実施形態では、リガンドは、コレステロール部分又は他のステロイドを含む。コレステロールコンジュゲート型オリゴヌクレオチドは、その非コンジュゲート型対応物よりも活性であると報告されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２：１０３－２２８，２００２）。核酸分子へのコンジュゲーションのためのコレステロール部分及び他の脂質を含むリガンドは、米国特許第７，８５１，６１５号明細書；米国特許第７，７４５，６０８号明細書；及び米国特許第７，８３３，９９２号明細書にも記載されている。別の実施形態において、リガンドは、葉酸部分を含み得る。葉酸部分にコンジュゲートしているポリヌクレオチドは、受容体依存性エンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれ得る。そのような葉酸－ポリヌクレオチドコンジュゲートは、例えば、米国特許第８，１８８，２４７号明細書に記載されている。

【0069】

ＧＰＡＭが肝細胞（ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌ）（例えば肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ））において発現されることを考慮すると、特定の実施形態において、当該肝細胞にＲＮＡｉコンストラクトを特異的に送達することが望ましい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、肝細胞の表面に発現されるタンパク質と結合又は相互作用するリガンドを採用することにより、肝臓に特異的に標的化され得る。例えば、特定の実施形態において、リガンドは、肝細胞上で発現される受容体に特異的に結合する１つ以上の抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその結合断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ））を含んでもよい。

【0070】

特定の実施形態では、リガンドは、炭水化物を含む。「炭水化物」は、酸素、窒素、又は硫黄原子が各炭素原子に結合されている少なくとも６つの炭素原子を有する１つ以上の単糖単位（直鎖状、分岐鎖状、又は環状であり得る）で構成される化合物を指す。炭水化物として、糖（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及び約４、５、６、７、８、又は９つの単糖単位を含有するオリゴ糖）、並びに多糖、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロース、及び多糖ガムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ペントース、ヘキソース又はヘプトースから選択される単糖並びにこのような単糖単位を含む二糖及び三糖である。他の実施形態では、リガンドに組み込まれている炭水化物は、アミノ糖であり、例えば、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン及びＮ－アセチルグルコサミンである。

【0071】

いくつかの実施形態では、リガンドは、ヘキソース又はヘキソサミンを含む。ヘキソースは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース又はフルクトースから選択され得る。ヘキソサミンは、フルクトサミン、ガラクトサミン、グルコサミン又はマンノサミンから選択され得る。特定の実施形態では、リガンドは、グルコース、ガラクトース、ガラクトサミン又はグルコサミンを含む。一実施形態では、リガンドは、グルコース、グルコサミン又はＮ－アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む。特定の実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンを含む。グルコース、ガラクトース及びＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含むリガンドは、化合物を肝細胞（例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ａｎｄ Ｄｅｖａｒａｊａｎ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ．２０３：１２６－１３９，２０１５）に標的化するのに特に有効である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるＧａｌＮＡｃ又はガラクトース含有リガンドの例は、米国特許第７，４９１，８０５号明細書；同第８，１０６，０２２号明細書；及び同第８，８７７，９１７号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１３０１８６号明細書；並びに国際公開第２０１３／１６６１５５号パンフレットに記載されている。

【0072】

特定の実施形態では、リガンドは、多価炭水化物部分を含む。本明細書中で用いられる「多価炭水化物部分」は、他の分子と独立して結合又は相互作用することができる２つ以上の炭水化物単位を含む部分を指す。例えば、多価炭水化物部分は、２つ以上の異なる分子、又は同じ分子上の２つ以上の異なる部位に結合することができる、炭水化物で構成される２つ以上の結合ドメインを含む。炭水化物部分の価数は、炭水化物部分内の個々の結合ドメインの数を示す。例えば、炭水化物部分に関する用語「一価」、「二価」、「三価」、及び「四価」は、それぞれ１、２、３、及び４つの結合ドメインを有する炭水化物部分を指す。多価炭水化物部分は、多価ラクトース部分、多価ガラクトース部分、多価グルコース部分、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分、多価Ｎ－アセチル－グルコサミン部分、多価マンノース部分、又は多価フコース部分を含み得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース部分を含む。他の実施形態では、リガンドは、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む。これら及び他の実施形態では、多価炭水化物部分は、二価、三価、又は四価である。そのような実施形態において、多価炭水化物部分は、二分岐又は三分岐であり得る。特定の一実施形態において、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分は、三価又は四価である。別の特定の実施形態において、多価ガラクトース部分は、三価又は四価である。本発明のＲＮＡｉコンストラクト中への組み込みのための例示的な三価又は四価のＧａｌＮＡｃ含有リガンドを、以下に詳述する。

【0073】

リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのＲＮＡ分子に直接的又は間接的に結合又はコンジュゲートされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に直接結合される。他の実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖にリンカーを介して共有結合的に結合される。リガンドは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖）の核酸塩基、糖部分又はヌクレオチド間結合に結合され得る。プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合は、環内原子及び環外原子が挙げられるあらゆる位置にて起こり得る。特定の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位又は８位がリガンドに結合される。また、ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合は、あらゆる位置にて起こり得る。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位及び６位がリガンドに結合され得る。ヌクレオチドの糖部分へのコンジュゲーション又は結合は、あらゆる炭素原子にて起こり得る。リガンドに結合され得る糖部分の例示的な炭素原子としては、２’、３’及び５’の炭素原子が挙げられる。塩基性残基等において、１’位もまた、リガンドに結合されてよい。ヌクレオチド間結合もリガンドの結合を支援することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートなど）の場合、リガンドは、リン原子に直接結合することができるか、又はリン原子に結合しているＯ原子、Ｎ原子若しくはＳ原子に結合することができる。アミン含有ヌクレオシド間結合又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）では、リガンドは、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合することができる。

【0074】

特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの３’又は５’末端に結合され得る。特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端に共有結合的に結合される。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に共有結合的に結合される。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドに結合される。このような特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’位で結合される。代替的な実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端近傍であるが、１つ以上の末端ヌクレオチドの前（すなわち１、２、３又は４つの末端ヌクレオチドの前）に結合される。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの糖の２’位で結合される。

【0075】

特定の実施形態では、リガンドは、リンカーを介してセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合される。「リンカー」は、リガンドをＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド構成要素に共有結合的に結合する原子又は原子の基である。リンカーは、約１～約３０原子長、約２～約２８原子長、約３～約２６原子長、約４～約２４原子長、約６～約２０原子長、約７～約２０原子長、約８～約２０原子長、約８～約１８原子長、約１０～約１８原子長、及び約１２～約１８原子長であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、２つの官能基を有するアルキル部分を一般に含む、二官能性結合部分を含み得る。官能基の一方は、目的の化合物（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖）に結合するように選択され、他方は、本明細書に記載されるようなリガンドなどの任意の選択された基に実質的に結合するように選択される。特定の実施形態において、リンカーは、エチレングリコール単位又はアミノ酸単位等の反復単位からなる鎖構造又はオリゴマーを含む。二官能性結合部分に典型的に使用される官能基の例として、求核性基と反応させるための求電子剤、及び求電子性基と反応させるための求核剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、二官能性結合部分として、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、不飽和（例えば、二重結合又は三重結合）等が挙げられる。

【0076】

リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するために使用することのできるリンカーは、ピロリジン、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート、６－アミノヘキサン酸、置換Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２－Ｃ_１０アルケニル又は置換若しくは非置換Ｃ_２－Ｃ_１０アルキニルを含むが、これらに限定されない。そのようなリンカーにとって好ましい置換基として、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0077】

特定の実施形態では、リンカーは、切断可能である。切断可能リンカーは、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞内への進入後に切断されて、リンカーが一体に保持している２つの部分を放出するものである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、標的細胞中又は第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下において、対象の血液中又は第２の参照条件（例えば、血液若しくは血清に見出される条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下よりも少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍若しくは９０倍以上又は少なくとも１００倍速く切断される。

【0078】

切断可能なリンカーは、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に対して感受性である。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内部で優勢であるか、又は高いレベル若しくは活性で見出される。このような分解性薬剤の例としては、例えば、細胞内に存在し、還元によって酸化還元切断可能リンカーを分解することができるメルカプタンなどの酸化酵素若しくは還元酵素又は還元剤を含む、特定の基質のために選択されるか、又は基質特異性のない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を生成することができる薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；一般的な酸として作用することによって酸切断可能リンカーを加水分解又は分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）及びホスファターゼが挙げられる。

【0079】

切断可能リンカーは、ｐＨに感受性のある部分を含み得る。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均的な細胞内ｐＨは、わずかにより低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、およそ５．０の更により酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断され、それによってリガンドから細胞内部又は細胞の所望の区画にＲＮＡ分子を放出する切断可能な基を有する。

【0080】

リンカーは、特定の酵素によって切断可能となる切断可能な基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な基の種類は、標的化される細胞に依存し得る。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してＲＮＡ分子に結合され得る。肝細胞はエステラーゼに富んでおり、従って、リンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型よりも肝細胞において効率的に切断されることとなる。エステラーゼに富む他の種類の細胞としては、肺、腎皮質及び精巣の細胞が挙げられる。肝細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞を標的化する場合、ペプチド結合を含有するリンカーを用いることができる。

【0081】

一般に、切断可能リンカー候補の適合性は、リンカー候補を切断する分解性薬剤の能力（又は条件）を試験することによって評価することができる。また、血液中又は他の非標的組織と接触する場合の切断に抵抗する能力について、切断可能なリンカー候補を試験することが望ましい。従って標的細胞内で切断を示すように選択される第１の条件と、他の組織又は体液、例えば血液又は血清内で切断を示すように選択される第２の条件との間で切断に対する相対的感受性を判断することができる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養物、臓器若しくは組織培養物中において又は動物全体で実行することができる。無細胞又は培養条件で初期評価を行い、更に動物全体で評価することによって確認することが有用であり得る。いくつかの実施形態では、有用なリンカー候補は、細胞において（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍又は１００倍速く切断される。

【0082】

他の実施形態では、酸化還元切断可能なリンカーが利用される。酸化還元切断可能リンカーは、還元又は酸化されると切断される。還元的に切断可能な基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能なリンカー候補が、好適な「還元的に切断可能なリンカー」であるかどうか、又は例えば特定のＲＮＡｉコンストラクト及び特定のリガンドと共に使用するのに好適であるかどうかを判定するために、本明細書に記載の１つ以上の方法を使用することができる。例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は例えば標的細胞などの細胞中で観察されるであろう切断速度を模倣する当技術分野で知られる他の還元剤と共にインキュベーションすることにより、リンカー候補を評価することができる。リンカー候補は、血液条件又は血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することもできる。特定の実施形態では、リンカー候補は、血液中で最大１０％切断される。他の実施形態では、有用なリンカー候補は、細胞（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）において、血液（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍、又は１００倍速く分解される。

【0083】

さらに他の実施形態では、ホスフェート系の切断可能リンカーは、ホスフェート基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でホスフェート基を加水分解する薬剤の例としては、細胞内のホスファターゼなどの酵素がある。ホスフェート系の切断可能な基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。特定の実施形態としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－ＳＰ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－が挙げられる。別の特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらのリンカー候補は、上記に記載されるものに類似する方法を用いて評価することができる。

【0084】

他の実施形態では、リンカーは、酸性条件下で切断される基である、酸切断可能な基を含み得る。いくつかの実施形態では、酸切断可能な基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０又はそれを下回る）の酸性環境において又は一般酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨオルガネラが、酸切断可能な基に切断環境を提供することができる。酸切断可能な結合基の例としては、ヒドラゾン、エステル及びアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ又は－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。特定の実施形態は、エステルの酸素に結合された炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基又は三級アルキル基、例えばジメチル、ペンチル又はｔ－ブチルである場合である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。

【0085】

他の実施形態では、リンカーは、細胞中のエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素によって切断されるエステル系の切断可能な基を含み得る。エステル系の切断可能な基の例としては、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステルの切断可能な基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらのリンカー候補は、上記に記載されるものに類似する方法を用いて評価することができる。

【0086】

更なる実施形態では、リンカーは、細胞中のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素によって切断されるペプチド系の切断可能な基を含み得る。ペプチド系の切断可能な基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを生じるような、アミノ酸間で形成されたペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレン又はアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチド及びタンパク質を生じるような、アミノ酸間で形成される特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。

【0087】

本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト中のセンス鎖又はアンチセンス鎖にリガンドを結合させるのに適した他の種類のリンカーは当技術分野で公知であり、例えば米国特許第７，７２３，５０９号明細書；同第８，０１７，７６２号明細書；同第８，８２８，９５６号明細書；同第８，８７７，９１７号明細書；及び同第９，１８１，５５１号明細書に記載のリンカーを含むことができる。

【0088】

特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に結合されるリガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分、例えば多価のＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の３’末端に結合される。他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の５’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の３’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の５’末端に結合される。

【0089】

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ＲＮＡｉコンストラクトの細胞内発現をコードし、且つ制御するベクターを投与することにより、目的の細胞又は組織に送達され得る。「ベクター」（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。多数のベクターが当技術分野で知られており、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。従って、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、生細胞内で複製されてもよいし、合成的に作製されてもよい。

【0090】

一般に、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを発現するためのベクターは、ＲＮＡｉコンストラクトをコードする配列に作動可能に連結された１つ以上のプロモーターを含むことになる。「作動可能に連結された」、「作動可能に連結された」又は「転写制御下で」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチド配列の発現を制御するために、プロモーターがポリヌクレオチド配列に対して正しい位置及び向きにあるときを示すために、本明細書では互換的に使用され得る。「プロモーター」は、細胞の合成装置によって認識されるか又は合成装置に導入され、特定の遺伝子配列の転写を開始するのに必要とされる配列を指す。適切なプロモーターとしては、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ＨＩ、又はＵ６ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、及びウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルスの長い末端反復）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＨＩ又はＵ６ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが使用される。プロモータは、組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーターであり得る。特に注目するのは、ヒトα１－アンチトリプシン遺伝子、アルブミン遺伝子、ヘモペキシン遺伝子、及び肝性リパーゼ遺伝子由来のプロモータ配列等の肝臓特異的プロモータである。誘導性プロモーターとしては、例えばエクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、及びイソプロピル－ＰＤ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって調節されるプロモーターが挙げられる。

【0091】

ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含む場合、別々の２つの鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）を、単一のベクターか、又は別々の２つのベクターから発現させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖をコードする配列は、第１のベクターのプロモーターに作動可能に連結され、アンチセンス鎖をコードする配列は、第２のベクターのプロモーターに作動可能に連結される。このような実施形態では、第１及び第２のベクターは、例えば、感染又はトランスフェクションによって標的細胞に同時に導入され、その結果、センス鎖及びアンチセンス鎖が転写されると、細胞内でハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ分子を形成することになる。別の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一のベクター内に位置する２つの別個のプロモーターから転写される。このような実施形態では、センス鎖をコードする配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され、アンチセンス鎖をコードする配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結されてもよく、第１及び第２のプロモーターは、単一のベクター内に配置されてもよい。一実施形態では、ベクターは、ｓｉＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結される第１のプロモーターと、同じ配列に逆方向で作動可能に連結される第２のプロモーターとを含み、その結果、第１のプロモーターからの配列の転写がｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の合成をもたらし、第２のプロモーターからの配列の転写がｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の合成をもたらす。

【0092】

ＲＮＡｉコンストラクトがｓｈＲＮＡを含む場合、単一の少なくとも部分的に自己相補的ＲＮＡ分子をコードする配列が、単一の転写物を生成するプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡをコードする配列は、リンカーポリヌクレオチド配列によって結合される逆方向反復を含み、転写後にｓｈＲＮＡのステム及びループ構造を生成する。

【0093】

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトをコードするベクターは、ウイルスベクターである。本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを発現するのに好適な様々なウイルスベクター系は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、マロニー（ｍａｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス）、アデノ随伴ウイルスベクター；単純ヘルペスウイルスベクター；ＳＶ４０ベクター；ポリオーマウイルスベクター；パピローマウイルスベクター；ピコルナウイルスベクター；及びポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。

【0094】

本発明での使用に適した様々なベクター、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ分子をコードする核酸配列をベクターに挿入する方法、及びベクターを目的の細胞に送達する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．，Ｖｏｌ．２：３０１－３１０，１９９５；Ｅｇｌｉｔｉｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．６：６０８－６１４，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ，ＨｕｍＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．，Ｖｏｌ．１：５－１４，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９２：２５－３０，１９９８；Ｒｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．３３：４０１－４０６，２００３；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９６：５５０－５５３，２００２；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２：２４３－２４７，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：５００－５０５，２００２；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：４９７－５００，２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ，Ｖｏｌ．１６：９４８－９５８，２００２；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：５０５－５０８，２００２；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９：５５１５－５５２０，２００２及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９：６０４７－６０５２，２００２を参照されたい）。

【0095】

組成物
本開示はまた、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトと、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤とを含む組成物及び製剤を提供する。そのような組成物及び製剤は、それを必要とする対象において、ＧＰＡＭの発現を低下させるのに有用である。臨床上の用途が想定される場合、医薬組成物及び製剤は、目的の用途に適切な形態で調製される。一般に、このことは、パイロジェンだけでなく、ヒト又は動物に有害となる虞のある他の不純物も本質的にない組成物の調製を伴うこととなる。

【0096】

語句「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」は、動物又はヒトに投与される場合の有害な、アレルギー性の、又は他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書中で用いられる「薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤」として、ヒトへの投与に適した医薬等の医薬の製剤化における使用に許容される溶媒、バッファ、溶液、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、並びに吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である。従来のあらゆる媒体又は薬剤が、本発明のＲＮＡｉコンストラクトと適合しない場合を除いて、治療組成物に使用されることが意図される。補助的な活性成分もまた、それらが組成物のベクター又はＲＮＡｉコンストラクトを不活化しないことを条件として、組成物中に組み込まれ得る。

【0097】

医薬組成物の製剤化のための組成物及び方法は、投与経路、処置されることとなる疾患若しくは障害の種類及び程度、又は投与されることとなる用量が挙げられるがこれらに限定されない、いくつかの基準に依存する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、意図される送達経路に基づいて製剤化される。例えば、特定の実施形態において、医薬組成物は、非経口送達用に製剤化される。非経口の送達形態として、静脈内、動脈内、皮下、髄腔内、腹腔内、及び筋肉内の注射又は注入が挙げられる。一実施形態において、医薬組成物は、静脈内送達用に製剤化される。そのような実施形態において、医薬組成物は、脂質ベースの送達ビヒクルを含んでよい。別の実施形態では、医薬組成物は皮下送達用に製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、標的化リガンド（例えば、本明細書に記載のＧａｌＮＡｃ含有リガンド）を含み得る。

【0098】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、有効量の本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトを含む。「有効量」は、有利な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象の肝細胞内でＧＰＡＭ発現を低下させるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、ＧＰＡＭ発現を、例えばヒトヘテロ接合体における野生型ＧＰＡＭ対立遺伝子の発現に匹敵するレベルにまで部分的にのみ低下させるのに十分な量であり得る。機能欠損型のＧＰＡＭバリアントアレルのヘテロ接合性ヒト保因者は、非保因者と比べて非ＨＤＬコレステロールの血清レベルが低く、且つ冠動脈疾患及び心筋梗塞のリスクが低いと報告された（Ｎｉｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３７４（２２）：２１３１－２１４１，２０１６）。従って、理論に束縛されることなく、ＧＰＡＭ発現の部分的な低下は、有利な血清非ＨＤＬコレステロールの低減並びに冠動脈疾患及び心筋梗塞のリスクの低減を実現するのに十分であり得ると考えられる。

【0099】

本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重～約７５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約２．５ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約５ｍｇ／ｋｇ体重～約１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの単回の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ又は約１０ｍｇ／ｋｇであり得る。有効量のＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物は、毎週、隔週、毎月、四半期毎又は半年毎に投与され得る。有効であると考えられる投与量及び投与頻度を正確に決定することは、患者の大きさ、年齢、性別、処置する障害の種類（例えば、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患、高コレステロール血症）、使用される特定のＲＮＡｉコンストラクト並びに投与経路を含むいくつかの要因に基づき得る。本発明の特定のあらゆるＲＮＡｉコンストラクトの有効投薬量及びインビボ半減期の推定値は、従来の方法及び／又は適切な動物モデルにおける試験を用いて確認することができる。

【0100】

水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ及び脂質ベースのなどのコロイド分散系を、本発明のＲＮＡｉコンストラクト又はそのようなコンストラクトをコードするベクターの送達ビヒクルとして使用してもよい。本発明の核酸の送達に好適な市販の脂肪エマルションとしては、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（登録商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（登録商標）ＩＩ、ＬＩＰＯＳＹＮ（登録商標）ＩＩＩ、ＮＵＴＲＩＬＩＰＩＤ及び他の類似の脂肪エマルションが挙げられる。インビボ送達ビヒクルとして用いられる好ましいコロイド系として、リポソーム（すなわち人工膜小胞）がある。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、カチオン性リポソームなどのリポソーム内に封入され得る。或いは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質、例えばカチオン性脂質に対して複合体形成され得る。適切な脂質及びリポソームとして、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、そしてカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が挙げられる。このようなコロイド分散系の調製及び使用は、当技術分野においてよく知られている。例示的な製剤はまた、例えば、米国特許第５，７８３，５６５号明細書；同第５，８３７，５３３号明細書；同第５，９８１，５０５号明細書；同第６，１２７，１７０号明細書；同第６，２１７，９００号明細書；同第６，３７９，９６５号明細書；同第６，３８３，５１２号明細書；同第６，７４７，０１４号明細書；同第７，２０２，２２７号明細書；及び国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットに開示されている。

【0101】

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質製剤に完全に封入されて、例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、又は他の核酸－脂質粒子を形成する。本明細書で使用する場合、用語「ＳＮＡＬＰ」は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸－脂質粒子を指す。本明細書で使用する場合、用語「ＳＰＬＰ」は、脂質小胞に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは典型的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を妨げる脂質（例えばＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、静脈内注射後に長期間の循環寿命を示し、且つ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）にて蓄積するため、全身投与に非常に有用である。ＳＰＬＰは、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載の封入された縮合剤－核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」を含む。核酸－脂質粒子は、典型的に、平均直径が約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、実質的に非毒性である。加えて、核酸－脂質粒子内に存在する核酸は、水溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に対して耐性があるのが望ましい。核酸－脂質粒子及びその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号明細書、米国特許第５，９８１，５０１号明細書、米国特許第６，５３４，４８４号明細書、米国特許第６，５８６，４１０号明細書、米国特許第６，８１５，４３２号明細書、及び国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。

【0102】

注射に好適な医薬組成物は、例えば、滅菌水溶液又は分散体及び注射用滅菌溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は、滅菌済みであり、容易に注射可能である程度の流体である。調製物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されていなければならない。適切な溶媒又は分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合液、及び植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（レシチンなど）を使用することによって、必要な粒径を維持することによって（分散液の場合）、及び／又は界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖又は塩化ナトリウム）が組成物に含まれ得る。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによってもたらされ得る。

【0103】

滅菌注射用溶液は、適切な量のＲＮＡｉコンストラクト（単独又はリガンドと複合体化）を、必要に応じて任意の他の成分（上記など）と共に溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散系は、塩基性分散媒体及び所望の他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された種々の活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、適切な調製方法として、その予め滅菌濾過した溶液から活性成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥技術及び凍結乾燥技術が挙げられる。

【0104】

本明細書で提供される組成物は、中性形態又は塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩として、例えば、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等）から誘導される酸付加塩（遊離アミノ基と共に形成される）が挙げられる。また、遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄）から、又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等）から誘導され得る。

【0105】

水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液は一般に適切に緩衝され、液体希釈剤は最初に、例えば、十分な生理食塩水又はグルコースと等張にされる。そのような水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に用いられ得る。当技術分野の当業者に知られているように、滅菌水性媒体を使用することが望ましい。実例として、単回用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解し、皮下注入液１０００ｍｌに添加し得るか、又は提示された注入部位に注射し得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照されたい）。ヒト投与について、調製物は、ＦＤＡ基準によって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たさなければならない。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、滅菌生理食塩水、及び本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクトを含むか、又はそれらからなる。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及び滅菌水（例えば、注射用水、ＷＦＩ）を含むか又はそれらからなる。さらに他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか又はこれからなる。

【0106】

いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、投与用デバイスでパッケージ化されるか又はその中に保存される。注射製剤用のデバイスとしては、注射ポート、プレフィルドシリンジ、自動注入装置、注射ポンプ、装着型注射器、及び注射ペンが挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾル化製剤又は粉末製剤用のデバイスとして、インヘラー、通気器、吸引器等が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、本明細書に記載される障害の１つ以上を治療又は予防するための本発明の医薬組成物を含む投与デバイスを含む。

【0107】

ＧＰＡＭ発現を阻害するための方法
本開示はまた、細胞におけるＧＰＡＭ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、ＲＮＡｉコンストラクト、例えば、二本鎖ＲＮＡｉコンストラクトと、細胞内でのＧＰＡＭの発現を阻害するのに有効な量で接触させることによって、細胞内でのＧＰＡＭの発現を阻害することを含む。細胞をＲＮＡｉコンストラクト、例えば二本鎖ＲＮＡｉコンストラクトと接触させることは、インビトロ又はインビボで行われ得る。細胞をインビボでＲＮＡｉコンストラクトと接触させることは、対象、例えばヒト対象内の細胞又は細胞群をＲＮＡｉコンストラクトと接触させることを含む。細胞を接触させるインビトロ及びインビボ方法の組合せも本開示の範囲内である。

【0108】

本発明は、ＧＰＡＭの発現の低下又は阻害を必要とする対象において、ＧＰＡＭの発現を低下させるか又は阻害する方法、及びＧＰＡＭ発現又は活性と関連する症状、疾患、又は障害を処置又は予防する方法を提供する。「ＧＰＡＭ発現と関連する症状、疾患、又は障害」は、ＧＰＡＭ発現レベルが変わるか、又はＧＰＡＭの発現レベルの上昇が、症状、疾患、若しくは障害の発症リスクの増大と関連する症状、疾患、又は障害を指す。

【0109】

細胞を接触させることは、上記で考察されるように、直接的であっても、又は間接的であってもよい。さらに、細胞を接触させることは、本明細書に記載されるか、又は当技術分野で知られるあらゆるリガンドを含む標的化リガンドを介して達成してもよい。好ましい実施形態では、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えばＧａｌＮＡｃリガンド、又は実施例１に示されるものなどの三分岐ＧａｌＮＡｃ構造、又はＲＮＡｉコンストラクトを目的の部位に指向させる任意の他のリガンドである。

【0110】

一実施形態では、細胞とＲＮＡｉの接触は、細胞への取り込み又は細胞への吸収を促進するか又は引き起こすことによって、「導入すること」又は「細胞にＲＮＡｉを送達すること」を含む。ＲＮＡｉの吸収又は取り込みは、補助なしの拡散性若しくは活性細胞性プロセスによって、又は補助剤若しくはデバイスによって起こすことができる。例えば、インビボでの導入のために、ＲＮＡｉを組織部位に注射してもよいし、全身投与してもよい。細胞へのインビトロ導入は、エレクトロポレーション及びリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法を使用して達成することができる。更なる方法は、本明細書において以下に記載されており、且つ／又は当技術分野において知られている。

【0111】

本明細書で使用する場合、用語「阻害する」は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」、及び他の類似用語と互換的に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。

【0112】

語句「ＧＰＡＭの発現を阻害する」は、任意のＧＰＡＭ遺伝子（例えば、マウスＧＰＡＭ遺伝子、ラットＧＰＡＭ遺伝子、サルＧＰＡＭ遺伝子、又はヒトＧＰＡＭ遺伝子など）及びＧＰＡＭ遺伝子のバリアント又は変異体の発現の阻害を指すものとする。従って、ＧＰＡＭ遺伝子は、野生型ＧＰＡＭ遺伝子、変異体ＧＰＡＭ遺伝子（アミロイド沈着を引き起こす変異体ＧＰＡＭ遺伝子など）、又は遺伝子操作細胞、細胞群、若しくは生物の文脈におけるトランスジェニックＧＰＡＭ遺伝子であってもよい。

【0113】

「ＧＰＡＭ遺伝子の発現を阻害する」には、ＧＰＡＭ遺伝子のあらゆるレベルの阻害、例えばＧＰＡＭ遺伝子の発現の少なくとも一部の抑制が含まれる。ＧＰＡＭ遺伝子の発現は、例えば、ＧＰＡＭ ｍＲＮＡレベル、ＧＰＡＭタンパク質レベル、又はアミロイド沈着物の数若しくは程度などのＧＰＡＭ遺伝子発現と関連する任意の変数のレベル、又はレベルの変化に基づいて評価され得る。このレベルは、例えば、対象に由来する試料を含む個々の細胞又は細胞群において評価され得る。

【0114】

阻害は、対照レベルと比較して、ＧＰＡＭ発現と関連する１つ以上の変数の絶対レベル又は相対レベルの低下によって評価され得る。対照レベルは、例えば、投与前のベースラインレベル、又は治療されていないか若しくは対照（例えば、緩衝液のみの対照又は不活性薬剤対照）で治療された類似対象、細胞、若しくは試料から決定されるレベルなどの当技術分野で利用される任意のタイプの対照レベルであり得る。いくつかの実施形態では、ＧＰＡＭ遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％ 少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％阻害される。

【0115】

ＧＰＡＭ遺伝子の発現の阻害は、第１の細胞又は細胞群と実質的に同一であるが、同様に処置されていない第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した場合の、ＧＰＡＭ遺伝子の発現が阻害されるように、ＧＰＡＭ遺伝子が転写され、且つ処置された（例えば、細胞を本発明のＲＮＡｉコンストラクトと接触させることにより、又はこの細胞が存在する、若しくは存在した対象に本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与することにより）第１の細胞又は細胞群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）により発現されるｍＲＮＡの量の減少によって明らかにされ得る。阻害は、以下の式を用いて、処置細胞中のｍＲＮＡレベルを対照細胞中のｍＲＮＡレベルの割合として表すことによって評価し得る。

【数1】

【0116】

或いは、ＧＰＡＭ遺伝子の発現の阻害は、ＧＰＡＭ遺伝子発現、例えば、ＧＰＡＭタンパク質発現又はヘッジホッグ経路タンパク質活性に機能的に関連するパラメーターの低下に関して評価されてもよい。ＧＰＡＭ遺伝子サイレンシングは、当技術分野で公知の任意のアッセイによって、内因的又は組換え的にＧＰＡＭを発現する任意の細胞において決定され得る。

【0117】

ＧＰＡＭタンパク質の発現の阻害は、細胞又は細胞群によって発現されるＧＰＡＭタンパク質のレベル（例えば、対象に由来するサンプル内で発現されるタンパク質のレベル）の低下によって明らかにされ得る。上記で説明されるように、ｍＲＮＡの抑制を評価するために、処置細胞又は細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、対照細胞又は細胞群におけるタンパク質のレベルのパーセンテージとして同様に表され得る。

【0118】

ＧＰＡＭ遺伝子の発現の阻害を評価するのに用いられ得る対照細胞又は細胞群として、本発明のＲＮＡｉコンストラクトとまだ接触していない細胞又は細胞群が挙げられる。例えば、対照細胞又は対照細胞群は、ＲＮＡｉコンストラクトによる対象の処置の前に、個々の対象（例えば、ヒト対象又は動物対象）から得てもよい。

【0119】

細胞又は細胞群によって発現されるＧＰＡＭ ｍＲＮＡのレベル、又は循環ＧＰＡＭ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当技術分野で公知の任意の方法、例えば上記の方法を使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、サンプル内でのＧＰＡＭの発現のレベルは、例えばＧＰＡＭ遺伝子のｍＲＮＡといった、転写ポリヌクレオチド又はその一部を検出することによって判定される。この点について、例えばＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の使用を含むＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式としては、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：７０３５）、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ分析が挙げられる。循環ＧＰＡＭ ｍＲＮＡは、国際公開第２０１２／１７７９０６号パンフレットに記載されている方法を使用して検出することができる。

【0120】

一実施形態では、ＧＰＡＭの発現のレベルは、核酸プローブを使用して決定される。用語「プローブ」は、本明細書で使用する場合、特定のＧＰＡＭ配列に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成することができるか、又は適切な生物学的調製物から誘導することができる。プローブは、標識するように特別に設計してもよい。プローブとして利用され得る分子の例としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体及び有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0121】

単離ｍＲＮＡは、サザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析及びプローブアレイを含むが、これらに限定されないハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用することができる。ｍＲＮＡレベルの一決定方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＧＰＡＭ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態では、例えば、アガロースゲル上で単離ｍＲＮＡを泳動させ、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に移すことによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。代替的な実施形態では、プローブは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイにおいて、固体表面上に固定化し、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者であれば、既知のｍＲＮＡ検出法を、ＧＰＡＭ ｍＲＮＡのレベルの判定での使用に容易に適合させることができる。

【0122】

サンプル中のＧＰＡＭの発現レベルを決定するための代替方法は、例えばＲＴ－ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書を参照されたい）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ、前出；及び米国特許第５，８５４，０３３号明細書）又は任意の他の核酸増幅方法を含み、これに続いて、当業者に周知の技術を使用して増幅された分子を検出する。これらの検出スキームは、特に、核酸分子が非常に少ない数で存在するときに、核酸分子を検出するのに有用である。本発明のいくつかの態様では、ＧＰＡＭの発現レベルは、定量的蛍光発生ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴＡＱＭＡＮ（商標）システム）によって決定され得る。ＧＰＡＭ ｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されているものなど）又はマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズ若しくはファイバー（又は結合核酸を含む任意の固体支持体）を使用してモニターされ得る（例えば米国特許第５，４４５，９３４号明細書；同第５，６７７，１９５号明細書；同第５，７７０，７２２号明細書；同第５，７４４，３０５号明細書；及び同第５，８７４，２１９号明細書参照のこと）。ＧＰＡＭ発現レベルの判定は、溶液中の核酸プローブの使用を含んでもよい。特定の実施形態において、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分枝状ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。

【0123】

ＧＰＡＭタンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための、当技術分野において知られているあらゆる方法を用いて判定され得る。このような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー、液体又はゲル沈降素反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散法（一元又は二元）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。

【0124】

いくつかの実施形態において、本発明の方法の有効性は、四肢、顔、喉頭、上気道、腹部、躯幹、及び性器の浮腫状腫脹、前駆症状；喉頭部浮腫；非掻痒性発疹；吐き気；嘔吐；又は腹痛の低減等のＧＰＡＭ疾患の病徴の低減を検出又は監視することによって監視することができる。これらの症状は、当技術分野で知られる任意の方法を使用してインビトロ又はインビボで評価され得る。

【0125】

いくつかの態様では、ＲＮＡｉコンストラクト又はＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物は、ＲＮＡｉコンストラクトが対象内の特定の部位に送達されるように対象に投与される。ＧＰＡＭの発現の阻害は、対象内の特定の部位由来の体液又は組織に由来するサンプル内でのＧＰＡＭ ｍＲＮＡ又はＧＰＡＭタンパク質のレベル又はレベルの変化の測定を用いて評価され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、肝臓、脈絡叢、網膜、及び膵臓などの部位に送達され得る。その部位は、前述の部位のいずれか１つに由来する細胞の小単位又は部分群であってもよい。また、当該部位は、特定の型の受容体を発現する細胞を含んでもよい。

【0126】

ＧＰＡＭ関連疾患を処置又は予防する方法
本発明は、ＧＰＡＭ関連の疾患、障害及び／若しくは状態を有するか、又はＧＰＡＭ関連の疾患、障害及び／若しくは状態を発症する傾向がある対象、ＲＮＡｉコンストラクト、ＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物（例えば、医薬組成物）、又は本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含むベクターに投与することを含む治療的及び予防的方法を提供する。ＧＰＡＭ関連疾患の非限定的な例として、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内での脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、及び非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が挙げられる。一実施形態において、ＧＰＡＭ関連疾患は、ＮＡＦＬＤである。別の実施形態において、ＧＰＡＭ関連疾患は、ＮＡＳＨである。別の実施形態において、ＧＰＡＭ関連疾患は、脂肪肝（脂肪症）である。別の実施形態において、ＧＰＡＭ関連疾患は、インスリン抵抗性である。別の実施形態において、ＧＰＡＭ関連疾患は、インスリン抵抗性ではない。

【0127】

特定の実施形態において、本発明は、ＧＰＡＭの発現の低下を必要とする患者においてＧＰＡＭの発現を低下させる方法であって、本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することを含む方法を提供する。本明細書中で用いられる用語「患者」は、ヒトが挙げられる哺乳動物を指し、用語「対象」と互換的に用いられ得る。患者の肝細胞内でのＧＰＡＭの発現レベルは、ＲＮＡｉコンストラクトを受けていない患者のＧＰＡＭ発現レベルと比較して、ＲＮＡｉコンストラクトの投与後に低下するのが望ましい。

【0128】

本発明の方法は、ＧＰＡＭ関連疾患を患っている対象、例えば、ＧＰＡＭ遺伝子発現及び／又はＧＰＡＭタンパク質産生の低下から利益を受けることとなる対象を処置するのに有用である。一態様では、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象におけるグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア（ＧＰＡＭ）遺伝子発現のレベルを低下させる方法を提供する。別の態様において、本発明は、ＮＡＦＬＤを患っている対象においてＧＰＡＭタンパク質のレベルを低下させる方法を提供する。また、本発明は、ＮＡＦＬＤを患っている対象において、ヘッジホッグ経路の活性のレベルを低下させる方法を提供する。

【0129】

本発明の処置方法（及び使用）は、対照、例えばヒトに、ＧＰＡＭ遺伝子を標的とする治療有効量の開示されたＲＮＡｉコンストラクト、ＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物、又はＲＮＡｉコンストラクトを含むベクターを投与することを含む。

【0130】

一態様では、本発明は、例えば、高められたヘッジホッグシグナル伝達経路の存在、疲労、衰弱、減量、食欲不振、吐き気、腹痛、クモ状血管、皮膚及び眼の黄色化（黄疸）、かゆみ、水分蓄積及び脚の腫脹（浮腫）、腹部膨満（腹水）、及び精神錯乱などの、ＮＡＦＬＤを有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。この方法は、予防有効量のＲＮＡｉコンストラクト、例えばｄｓＲＮＡ、ＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物、又はＲＮＡｉコンストラクトをコードするベクターを対象に投与し、それによってＧＰＡＭ遺伝子発現の低下から利益を得る障害を有する対象における少なくとも１つの症状を予防することを含む。「予防有効量」は、所望の予防結果（例えば、疾患発症の予防）を達成するために、必要な投与量及び期間で有効な量を指す。

【0131】

別の態様において、本発明は、対象、例えば、ＧＰＡＭ遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を受けることとなる対象を処置するための、治療有効量の本発明のＲＮＡｉコンストラクトの使用を提供する。更なる態様において、本発明は、ＧＰＡＭ遺伝子発現の低下から利益を受けることとなる、障害、例えば、ＧＰＡＭ関連疾患を患っている対象等の対象、例えば、ＧＰＡＭ遺伝子発現及び／又はＧＰＡＭタンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を受けることとなる対象を処置するための医薬の製造における、ＧＰＡＭ遺伝子を標的化する本発明のＲＮＡｉコンストラクト、例えば、ｄｓＲＮＡ、又はＧＰＡＭ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物の使用を提供する。

【0132】

本開示は、ＧＰＡＭ遺伝子発現及び／又はＧＰＡＭタンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を受けることとなる、障害に罹患している対象において少なくとも１つの病徴を予防するための、本発明のＲＮＡｉコンストラクト、例えば、ｄｓＲＮＡの使用を提供する。例えば、本開示は、ＮＡＦＬＤの処置における、本明細書中に記載のＲＮＡｉコンストラクト、それを含む組成物及びそれを含むベクターの使用を提供する。

【0133】

更なる態様では、本発明は、ＧＰＡＭ関連疾患などのＧＰＡＭ遺伝子発現及び／又はＧＰＡＭタンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を得る障害に罹患している対象における少なくとも１つの症状を予防するための医薬品の製造における、開示されるＲＮＡｉコンストラクト、それを含む組成物、又はそれを含むベクターの使用を提供する。

【0134】

一実施形態において、ＧＰＡＭを標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、ＲＮＡｉコンストラクトが対象に投与される場合、例えば、対象の細胞、組織、血液、又は他の組織若しくは体液におけるＧＰＡＭ遺伝子の発現が、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％以上低下するように、ＧＰＡＭ関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患っている対象に投与される。

【0135】

本発明の方法及び使用は、標的ＧＰＡＭ遺伝子の発現が、任意の適切な時間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、又は約８０時間低減するように、本明細書に記載の組成物を投与することを含む。一実施形態において、標的ＧＰＡＭ遺伝子の発現は、長期間、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７日以上、例えば、約１週、２週、３週、又は約４週以上減少する。

【0136】

本発明の方法及び使用に従うＲＮＡｉコンストラクトの投与は、ＧＰＡＭ関連疾患、例えば、ＮＡＦＬＤを患っている患者におけるそのような疾患又は障害の重症度、徴候、病徴、及び／又はマーカーの低減をもたらし得る。この文脈における「低減」は、このようなレベルの統計的に有意な低減を意味する。低減は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％であり得る。疾患の治療又は予防の有効性は、例えば、疾患進行、疾患寛解、病徴重症度、疼痛の低減、生活の質、治療効果を維持するのに必要な医薬の用量、疾患マーカーのレベル又は治療されているか若しくは予防の標的となる所与の疾患に適した他の任意の測定可能パラメーターを測定することによって評価され得る。このようなパラメーターのいずれか１つ又はパラメーターの任意の組合せを測定することにより、治療又は予防の有効性を観察することは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＮＡＦＬＤの処置の有効性は、例えば、ＮＡＦＬＤ病徴、肝臓脂肪レベル、又は下流遺伝子の発現を定期的に観察することよって評価することができる。最初の読取りと後の読取りとの比較は、治療が有効であるかどうかの指標を医師に提供する。このようなパラメーターのいずれか１つ又はパラメーターの任意の組合せを測定することにより、治療又は予防の有効性を観察することは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＧＰＡＭを標的化するＲＮＡｉ又はその医薬組成物の投与と関連して、ＧＰＡＭ関連疾患「に対して有効」とは、臨床的に適切な様式での投与が、少なくとも統計的に有意な割合の患者に、症状の改善、治癒、疾患の低減、延命、生活の質の改善、又はＮＡＦＬＤ及び／若しくはＧＰＡＭ関連疾患並びに関連原因の治療に精通している医者によって、好ましいと一般に認められている他の効果などの有益な効果をもたらすことを示す。

【0137】

治療又は予防効果は、病状の１つ以上のパラメーターにおいて統計的に有意な改善がある場合、又はそうでない場合に予期される症状が悪化又は発症しないことによって明らかとなる。一例として、疾患の測定可能なパラメーターの少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化が、有効な治療を意味し得る。所与のＲＮＡｉ薬物又はこの薬物の製剤の有効性は、当技術分野において知られている所与の疾患のための実験動物モデルを用いて判断することもできる。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、マーカー又は症状の統計的に有意な低減が観察される場合に証明される。

【0138】

対象には、任意の治療有効量のＲＮＡｉコンストラクトを投与することができる。ＲＮＡｉコンストラクトの例示的な治療有効量としては、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．７ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、２．９ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．１ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．３ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．７ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、３．９ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．１ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇ、４．３ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、４．６ｍｇ／ｋｇ、４．７ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、４．９ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．１ｍｇ／ｋｇ、５．２ｍｇ／ｋｇ、５．３ｍｇ／ｋｇ、５．４ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、５．６ｍｇ／ｋｇ、５．７ｍｇ／ｋｇ、５．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．９ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．１ｍｇ／ｋｇ、６．２ｍｇ／ｋｇ、６．３ｍｇ／ｋｇ、６．４ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、６．６ｍｇ／ｋｇ、６．７ｍｇ／ｋｇ、６．８ｍｇ／ｋｇ、６．９ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．１ｍｇ／ｋｇ、７．２ｍｇ／ｋｇ、７．３ｍｇ／ｋｇ、７．４ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、７．６ｍｇ／ｋｇ、７．７ｍｇ／ｋｇ、７．８ｍｇ／ｋｇ、７．９ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．１ｍｇ／ｋｇ、８．２ｍｇ／ｋｇ、８．３ｍｇ／ｋｇ、８．４ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、８．６ｍｇ／ｋｇ、８．７ｍｇ／ｋｇ、８．８ｍｇ／ｋｇ、８．９ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．１ｍｇ／ｋｇ、９．２ｍｇ／ｋｇ、９．３ｍｇ／ｋｇ、９．４ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、９．６ｍｇ／ｋｇ、９．７ｍｇ／ｋｇ、９．８ｍｇ／ｋｇ、９．９ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ又は約５０ｍｇ／ｋｇが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、対象には、０．５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉコンストラクトが投与され得る。列挙された値の中間の値及び範囲も本開示に含まれる。

【0139】

ＲＮＡｉコンストラクト又はそれを含む組成物の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿、又は他のコンパートメント内のＧＰＡＭタンパク質レベルの存在を、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％以上低下させ得る。

【0140】

ＲＮＡｉの総用量の投与前に、５％の注入液などのより少ない用量を患者に投与し、アレルギー反応などの有害作用についてモニターしてもよい。別の実施例では、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－アルファ又はＩＮＦ－アルファ）レベルの増大などの望ましくない免疫賦活作用について、患者を観察してもよい。

【0141】

ＧＰＡＭ発現に及ぼす阻害効果によって、本発明に従う組成物又はそれから調製される医薬組成物は、生活の質を高めることができる。

【0142】

本発明のＲＮＡｉは、「裸の」形態で投与されてもよく、この場合、修飾又は未修飾ＲＮＡｉコンストラクトは、「遊離ＲＮＡｉ」として、水性又は好適な緩衝溶液中に直接的に懸濁される。遊離ＲＮＡｉは、医薬組成物の不在下で投与される。遊離ＲＮＡｉは、好適な緩衝溶液中にあってもよい。バッファ溶液は、アセタート、シトラート、プロラミン、カルボナート、若しくはホスファート、又はそれらのあらゆる組合せを含んでもよい。一実施形態において、バッファ溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＲＮＡｉを含有する緩衝溶液のｐＨ及び重量オスモル濃度は、対象への投与に好適であるように調節され得る。

【0143】

或いは、本発明のＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与され得る。

【0144】

ＧＰＡＭ遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を受けることとなる対象は、本明細書中に記載される非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び／又はＧＰＡＭ関連疾患若しくは障害を患っている対象である。

【0145】

ＧＰＡＭ遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を受けることとなる対象の処置として、治療的及び予防的処置が挙げられる。

【0146】

本発明はさらに、例えば既知の医薬品及び／又は既知の治療法といった他の医薬品及び／又は他の治療法、例えば、これらの障害を処置するために現在利用されているものと組み合わせた、ＧＰＡＭ遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を受けることとなる対象、例えば、ＧＰＡＭ関連疾患を患っている対象を処置するための方法、並びにＲＮＡｉコンストラクト又はその医薬組成物の使用を提供する。

【0147】

例えば、特定の実施形態では、ＧＰＡＭ遺伝子を標的化するＲＮＡｉは、例えば、ＧＰＡＭ関連疾患を治療するのに有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＧＰＡＭ発現の低下から利益を得る対象、例えばＧＰＡＭ関連疾患を有する対象を治療するのに適した追加の治療薬及び治療方法には、ＧＰＡＭ遺伝子の異なる部分を標的とするＲＮＡｉコンストラクト、治療薬、及び／又はＧＰＡＭ関連疾患を治療するための手順、又は前述のいずれかの組合せが含まれる。特定の実施形態では、ＧＰＡＭ遺伝子を標的とする第１のＲＮＡｉコンストラクトは、ＧＰＡＭ遺伝子の異なる部分を標的とする第２のＲＮＡｉコンストラクトと組み合わせて投与される。例えば、第１のＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖領域を形成する第１のセンス鎖及び第１のアンチセンス鎖を含んでいてもよく、前記第１のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て、且つ第１のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、前記第１のセンス鎖は、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされており、当該リガンドは、二価又は三価の分枝状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体であり；且つ第２のＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖領域を形成する第２のセンス鎖及び第２のアンチセンス鎖を含み、第２のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て、且つ第２のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、第２のセンス鎖は、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされており、当該リガンドは、二価又は三価の分枝状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。一実施形態では、第１及び第２のセンス鎖のヌクレオチドの全て、並びに／又は第１及び第２のアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含む。修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドのいずれか１つ又は組合せであり得る。

【0148】

他の実施形態において、ＧＰＡＭ遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉコンストラクトは、ＧＰＡＭ遺伝子とは異なる遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉコンストラクトと組み合わせて投与される。例えば、ＧＰＡＭ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトと組み合わせて投与されてよい。ＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質）は、ＳＲＥＢＰファミリの転写因子の唯一知られている調節因子である。ＳＲＥＢＰ（ステロール応答要素結合タンパク質）ファミリは、肝臓内での新規の脂質生成及びトリグリセリド（ＴＧ）蓄積の調節において、重要な役割を果たす。ＧＰＡＭ遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉコンストラクト、及び異なる遺伝子、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉコンストラクトは、同じ医薬組成物の一部として投与されてよい。或いは、ＧＰＡＭ遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉコンストラクト、及び異なる遺伝子、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉコンストラクトは、異なる医薬組成物の一部として投与されてよい。これに加えて、又はこれに代えて、ＧＰＡＭ遺伝子を標的とする第１のＲＮＡｉコンストラクトは、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有（Ｐａｔａｔｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３、ＰＮＰＬＡ３）遺伝子を標的とする第２のＲＮＡｉコンストラクトと組み合わせて、又はＳＣＡＰを標的とする第２のＲＮＡｉ及びＰＮＰＬＡ３を標的とする第３のＲＮＡｉと組み合わせて投与することができる。以前にアディポニュートリン（ＡＤＰＮ）及びカルシウム非依存性ホスホリパーゼＡ２－イプシロン（ｉＰＬＡ（２）ε）として知られるパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）は、ＩＩ型膜貫通タンパク質である（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４７（９）：１９４０－９；Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９（４７）：４８９６８－７５）。マウスにおいて脂肪生成中に誘導される膜結合型の脂肪に富むタンパク質として脂肪細胞で最初に同定されたが、現在では肝臓を含む他の組織において発現していることが明らかになっている（（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，上掲；Ｂａｕｌａｎｄｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６（３６）：３３３３６－４４；Ｍｏｌｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １５５（３）：４６１－８；Ｆａｒａｊ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９１（２）：４２７－３５；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ８９（６）：２６８４－９；Ｌａｋｅ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４６（１１）：２４７７－８７）。無細胞生化学系において、組換え体ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、トリアシルグリセロールリパーゼ又はアシル交換反応活性のいずれかを示すことができる（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｋｕｍａｒｉ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １５（５）：６９１－７０２；Ｈｅ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５（９）：６７０６－１５）。肝細胞において、ＰＮＰＬＡ３は、小胞体及び脂質膜上に発現され、主にトリアシルグリセロールヒドロラーゼ活性を示す（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７（１７）：７８９２－７；Ｒｕｈａｎｅｎ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ５５（４）：７３９－４６；Ｐｉｎｇｉｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８４１（４）：５７４－８０）。分泌性シグナルを欠いているが、データは、ＰＮＰＬＡ３が分泌され、且つジスルフィド結合依存性多量体としてヒト血漿において見出され得ることを示す（Ｗｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４４６（４）：１１１４－９）。

【0149】

ＲＮＡｉコンストラクト及び追加の治療剤並びに／又は処置は、同時に、且つ／又は同じ組合せで、例えば、非経口的に投与してもよく、或いは、追加の治療剤が、別個の組成物の一部として、若しくは別々に、且つ／又は当技術分野において知られているか若しくは本明細書に記載される別の方法によって投与してもよい。

【0150】

本発明はまた、細胞内のＧＰＡＭ発現（遺伝子又はタンパク質発現）を低下させ、及び／又は阻害するために、本発明のＲＮＡｉコンストラクト及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含有する組成物を使用する方法も提供する。さらに他の態様において、細胞内のＧＰＡＭ遺伝子発現を低下させ、且つ／又は阻害する医薬の製造のための、本発明のＲＮＡｉコンストラクト及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物の使用が提供される。さらに他の態様では、本発明は、細胞内のＧＰＡＭタンパク質産生を低下させ、及び／又は阻害するのに使用するための、本発明のＲＮＡｉ及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物を提供する。さらに他の態様において、細胞内でのＧＰＡＭタンパク質産生を低下させ、且つ／又は阻害する医薬の製造のための、本発明のＲＮＡｉコンストラクト及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物の使用が提供される。本方法及び使用は、細胞を本発明のＲＮＡｉコンストラクト、例えばｄｓＲＮＡと接触させ、ＧＰＡＭ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって細胞を維持し、それにより細胞内のＧＰＡＭ遺伝子の発現を阻害するか又はＧＰＡＭタンパク質産生を阻害することを含む。遺伝子発現の低下は、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルを決定するための当技術分野で公知の又は本明細書に記載される任意の方法によって評価することができる。

【0151】

本発明の方法及び使用において、細胞は、インビトロで接触されてもインビボで接触されてもよい、すなわち、細胞は、対象の外側（例えば細胞培養中）にあっても又は対象内にあってもよい。本発明の方法を使用する処置に適した細胞は、ＧＰＡＭ遺伝子を発現するあらゆる細胞、例えば、ＮＡＦＬＤを患っている対象由来の細胞、又はＧＰＡＭ遺伝子若しくはＧＰＡＭ遺伝子の一部を含む発現ベクターを含む細胞であり得る。本開示の方法に用いるのに好適な細胞としては、例えば哺乳動物細胞、例えば霊長類細胞（ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞、例えばサル細胞若しくはチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞又はバッファロー細胞など）、鳥類細胞（例えば、アヒル細胞又はガチョウ細胞）又はクジラ細胞が挙げられる。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。

【0152】

ＧＰＡＭ遺伝子発現は、細胞内で、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％阻害され得る。

【0153】

ＧＰＡＭタンパク質の産生は、細胞内で少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は約１００％阻害され得る。

【0154】

本発明のインビボでの方法及び使用は、ＲＮＡｉコンストラクトを含有する組成物を対象に投与することを含んでもよく、ＲＮＡｉコンストラクトは、処置されることとなる対象のＧＰＡＭ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。治療対象の生物がヒトである場合、組成物は、当技術分野で知られる任意の手段によって投与してもよく、このような手段としては、皮下、静脈内、経口、腹腔内又は頭蓋内（例えば、脳室内、実質内及び髄腔内）、筋肉内、経皮、気道（噴霧剤）、経鼻、直腸を含む非経口経路並びに局所（頬側及び舌下を含む）投与が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、組成物は、皮下又は静脈内の注入又は注射によって投与される。一実施形態では、組成物は、皮下注射によって投与される。

【0155】

いくつかの実施形態では、投与は、デポ注射による。デポ注射は、長期間にわたってＲＮＡｉコンストラクトを一貫して放出し得る。ゆえに、デポ注射は、所望の効果、例えば、所望のＧＰＡＭの阻害、又は治療効果若しくは予防効果を得るのに必要な投与頻度を減少させ得る。デポ注射は、より一貫した血清濃度も提供し得る。デポ注射としては、皮下注射又は筋肉内注射が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、デポ注射は、皮下注射である。

【0156】

いくつかの実施形態では、投与は、ポンプによる。ポンプは、外部ポンプ又は外科的に埋め込まれるポンプであり得る。特定の実施形態では、ポンプは、皮下に埋め込まれる浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈又は硬膜外注入に用いられ得る。好ましい実施形態では、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、ＲＮＡｉを対象に送達する外科的に植え込まれたポンプである。

【0157】

投与様式は、局所性又は全身性の処置が所望されるかに基づいて、そして処置されることとなる領域に基づいて選択されてよい。投与経路及び投与部位は、標的化を高めるように選択され得る。

【0158】

方法及び使用は、哺乳動物の細胞内でＧＰＡＭ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクト、例えばｓｉＲＮＡを含む組成物を、哺乳動物、例えばヒトに投与することと、哺乳動物を、ＧＰＡＭ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持することによって、哺乳動物内でのＧＰＡＭ遺伝子の発現を阻害することとを含む。遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の低下は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される任意の方法によって、ＲＮＡｉコンストラクト投与対象から得られたサンプルで評価することができる。一実施形態において、組織サンプルは、ＧＰＡＭ遺伝子及び／又はタンパク質発現の低下を監視するための組織材料として機能する。別の実施形態において、血液サンプルは、ＧＰＡＭ遺伝子及び／又はタンパク質発現の低下を監視するための組織材料として機能する。

【0159】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトを投与した後のインビボにおける標的ｍＲＮＡ（例えばＧＰＡＭ ｍＲＮＡ）のＲＩＳＣ媒介性切断の検証は、５’－ＲＡＣＥ又は当技術分野で知られるプロトコルの改変（Ｌａｓｈａｍ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３８（３）ｐ－ｅｌ９；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－４）を実行することによって行われる。

【0160】

本明細書に開示される全てのリボ核酸配列は、配列中のウラシル塩基をチミン塩基で置換することにより、デオキシリボ核酸配列に変換することができることが理解される。同様に、本明細書に開示される全てのデオキシリボ核酸配列は、配列中のチミン塩基をウラシル塩基と置換することにより、リボ核酸配列に変換することができる。本明細書に開示される全ての配列のデオキシリボ核酸配列、リボ核酸配列並びにデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの混合物を含有する配列が本発明に含まれる。

【0161】

加えて、本明細書に開示されるあらゆる核酸配列は、化学修飾の任意の組合せによって修飾され得る。当技術分野の当業者は、特定の場合、修飾ポリヌクレオチドを記載するための「ＲＮＡ」又は「ＤＮＡ」のこのような指定が任意であることを容易に理解するであろう。例えば、リボース糖に２’－ＯＨ置換基及びチミン塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、修飾糖を有するＤＮＡ分子（ＤＮＡの天然の２’－Ｈに対して２’－ＯＨ）又は修飾塩基（ＲＮＡの天然のウラシルに対してチミン（メチル化ウラシル））を有するＲＮＡ分子と記載され得る。

【0162】

従って、配列表に記載のものを含むがこれらに限定されない本明細書に提供される核酸配列は、修飾核酸塩基を有するそのような核酸を含むが、これらに限定されない天然若しくは修飾ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの任意の組合せを含有する核酸を包含するように意図される。更なる例として、限定するものではないが、配列「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」を有するポリヌクレオチドは、修飾又は非修飾にかかわらないＲＮＡ塩基、例えば配列「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」を有するもの、並びに「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」などのいくつかのＤＮＡ塩基及びＲＮＡ塩基を有するもの、並びに「ＡＴｍｅＣＧＡＵＣＧ」などの他の修飾塩基を有するポリヌクレオチドを含むそのような化合物を含むが、これらに限定されないそのような配列を有する任意のポリヌクレオチドを包含し、配列中、ｍｅＣは、５位にメチル基を含むシトシン塩基を示す。

【0163】

実行された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示目的のためにのみ提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0164】

本明細書に記載される全ての動物実験は、Ａｍｇｅｎの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認され、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（Ｕ．Ｓ．））、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの更新のための委員会、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｕ．Ｓ．）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ（Ｕ．Ｓ．）（２０１１）Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ．８ｔｈ Ｅｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に従って管理された。マウスは、空調された空間において２２±２℃で１２時間明期；１２時間暗期のサイクル（０６００～１８００時間）で単独飼育した。動物には、別段の指示がない限り、通常の固形飼料食餌（Ｅｎｖｉｇｏ、２９２０Ｘ、又は別途明記された食餌）及び自動給水システムによる水（逆浸透精製）を自由に与えた。終了時に、深麻酔下で心臓穿刺によって血液を回収し、その後Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）ガイドラインに従って、二次的な物理的方法によって安楽死させた。

【0165】

実施例１：修飾ＧＰＡＭ ｓｉＲＮＡ分子の選択、設計、及び合成
グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア（ＧＰＡＭ）を標的とする治療用ｓｉＲＮＡ分子の最適な配列の同定及び選択を、ヒトＧＰＡＭ転写物（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００５２６９９９８．１）のバイオインフォマティクス解析を使用して同定した。表１は、治療特性を有すると同定された、センス鎖の３’末端に付加された逆位脱塩基ヌクレオチドを有するＧＰＡＭ ｍＲＮＡ標的配列を列挙する。

【0166】

【表1-1】

【0167】

【表1-2】

【0168】

【表1-3】

【0169】

【表1-4】

【0170】

【表1-5】

【0171】

【表1-6】

【0172】

【表1-7】

【0173】

【表1-8】

【0174】

【表1-9】

【0175】

【表1-10】

【0176】

【表1-11】

【0177】

【表1-12】

【0178】

【表1-13】

【0179】

【表1-14】

【0180】

【表1-15】

【0181】

【表1-16】

【0182】

【表1-17】

【0183】

ＧＰＡＭ ｓｉＲＮＡ配列の効力及びインビボ安定性を向上させるために、化学修飾をＧＰＡＭ ｓｉＲＮＡ分子中に組み込んだ。具体的には、リボース糖の２’－Ｏ－メチル及び２’－フルオロ修飾を、ＧＰＡＭ ｓｉＲＮＡ内の特定の位置に組み込んだ。また、アンチセンス配列及び／又はセンス配列の末端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を組み込んだ。

【0184】

生成したアンチセンス及びセンスｓｉＲＮＡ配列を表２に示す。表２及び本出願の他の部分のヌクレオチド配列は、以下の表記法に従って列挙されている。Ａ、Ｕ、Ｇ、及びＣ＝対応するリボヌクレオチド；ｄＴ＝デオキシチミジン；ｄＡ＝デオキシアデノシン；ｄＣ＝デオキシシチジン；ｄＧ＝デオキシグアノシン；ｉｎｖＤＴ＝反転デオキシチミジン；ｉｎｖＤＡ＝反転デオキシアデノシン；ｉｎｖＤＣ＝反転デオキシシチジン；ｉｎｖＤＧ＝反転デオキシグアノシン；ａ、ｕ、ｇ、及びｃ＝対応する２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド；Ａｆ、Ｕｆ、Ｇｆ、及びＣｆ＝対応する２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）リボヌクレオチド；Ａｂ＝脱塩基；ｉｎｖＡｂ＝反転脱塩基；ＭｅＯ－Ｉ＝２’メトキシイノシン；ＧＮＡ＝グリコール核酸；ｓＧＮＡ＝３’ホスホロチオエートを有するグリコール核酸；ＬＮＡ＝ロックド核酸。配列中の「ｓ」の挿入は、２つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）によって連結されることを示す。特に示されない限り、他の全てのヌクレオチドは、３’－５’ホスホジエステル基によって連結されている。表２中のｓｉＲＮＡ化合物の各々は、双方の鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、又は一方若しくは双方の末端に平滑末端を有する１９～２１塩基対の二重鎖領域を含む。各［ホスフェート］は、以下のＧａｌＮＡｃ構造に結合しており（ｓＧａｌＮＡｃ３）：

【化1】

式中、Ｘ＝Ｏ又はＳである。

【0185】

【表2-1】

【0186】

【表2-2】

【0187】

【表2-3】

【0188】

【表2-4】

【0189】

【表2-5】

【0190】

【表2-6】

【0191】

【表2-7】

【0192】

【表2-8】

【0193】

【表2-9】

【0194】

【表2-10】

【0195】

【表2-11】

【0196】

【表2-12】

【0197】

【表2-13】

【0198】

【表2-14】

【0199】

【表2-15】

【0200】

【表2-16】

【0201】

【表2-17】

【0202】

実施例２：ＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイにおける選択したＧＰＡＭ ｓｉＲＮＡ分子の有効性
実施例１からの完全に化学修飾されたｓｉＲＮＡのパネルを調製して、ｍＲＮＡノックダウンの効力及び選択性をインビトロで試験した。各ｓｉＲＮＡ二重鎖は、２つの鎖であるセンス鎖又は「パッセンジャー」鎖及びアンチセンス鎖又は「ガイド」鎖からなった。

【0203】

ＲＮＡ ＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）アッセイを実行して、ＧＰＡＭ ｍＲＮＡノックダウンを試験ｓｉＲＮＡによって測定した。ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６５）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ、コーニング）を補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（ＡＴＣＣ（登録商標）３０－２００３（商標））中で培養した。リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、逆トランスフェクションによりｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。Ｂｒａｖｏ自動液体処理プラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって、１μＬの試験ｓｉＲＮＡ（５００ｎＭの最終濃度で開始する１：３希釈で投与された１０データポイント中）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ビヒクル及び４μＬのサプリメントを含まないプレーンＥＭＥＭをＰＤＬ被覆ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ－３８４ Ｕｌｔｒａアッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に加えた。続いて、補充なしのプレーンＥＭＥＭに前希釈した５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（５μＬのＥＭＥＭ中０．０６μＬのＲＮＡｉＭＡＸ）を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ試薬分注器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってアッセイプレート中に分注した。室温（ＲＴ）でｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉＭＡＸ混合物を２０分インキュベートした後、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ－Ｓを補充したＥＭＥＭ中の３０μＬのＨｅｐＧ２細胞（１ウェルあたり２０００個の細胞）を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ試薬分注器を使用してトランスフェクション複合体に添加した。アッセイプレートを、インキュベーターに入れる前にＲＴで２０分間インキュベートした。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートした。

【0204】

ＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイを、自社内で組み立てた自動ＦＩＳＨアッセイプラットフォーム上で、製造者のアッセイ試薬及びプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）ＶｉｅｗＲＮＡ ＨＣ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ）を用いて、ｓｉＲＮＡトランスフェクションから７２時間後に実施した。簡潔に言えば、細胞を４％ホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でＲＴにて１５分間固定して、界面活性剤によりＲＴにて３分間透過処理してから、プロテアーゼ溶液によりＲＴで１０分間処理した。標的特異的プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶＡ６－３１７０３９２－ＶＣ（ＧＰＡＭ）及びＶＡ１－１０１４８－ＶＣ（ＰＰＩＢ）又はビヒクル（陰性対照として標的プローブを含まない標的プローブ希釈剤）を３時間インキュベートし、一方でプリアンプリファイアー、アンプリファイアー及び標識プローブを各１時間インキュベートした。全てのハイブリダイゼーション工程を、Ｃｙｔｏｍａｔ ２ Ｃ－ＬＩＮ自動インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で４０℃で実施した。

【0205】

ハイブリダイゼーション反応後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ及びＣｅｌｌＭａｓｋ Ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間染色してから、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントスクリーニングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で画像化した。画像を、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ｉｍａｇｅ ｄａｔａ ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析して、１細胞あたりの平均スポット数を得た。高（標的プローブを含むＰＢＳ）及び低（標的プローブを含まないＰＢＳ）対照ウェルを用いて、１細胞あたりの平均スポット数を正規化した。高対照及び低対照は、それぞれ１００及び０の正規化された値を有する。試験ｓｉＲＮＡ濃度に対する正規化された値を、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒデータ解析ソフトウェア（Ｇｅｎｅｄａｔａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して４パラメータシグモイダルモデルに当てはめて、ＩＣ５０値及び最大活性を得た。

【0206】

アッセイの結果を表３に示す。ＧＰＡＭノックダウンは、対照サンプルと比較したノックダウンのパーセンテージを提供する。負の値は、ＧＰＡＭレベルの低減を示す。

【0207】

【表3-1】

【0208】

【表3-2】

【0209】

【表3-3】

【0210】

【表3-4】

【0211】

【表3-5】

【0212】

【表3-6】

【0213】

【表3-7】

【0214】

【表3-8】

【0215】

実施例３：ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含むＡＡＶベースのマウスモデルにおける選択されたＰＮＰＬＡ３ ｓｉＲＮＡ分子の有効性スクリーニング
リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１４１９０－１３６）に希釈したアデノ随伴アデノウイルス（ＡＡＶ；血清型ＡＡＶＤＪ８；エンドトキシン非含有、Ａｍｇｅｎによって内部調製）を、１匹当たり１×１０^１２のウイルス粒子で、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ雄又は雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）の尾静脈に投与して、肝臓におけるヒトＧＰＡＭ配列の発現を駆動した。インビボスクリーニングのために、ＧＰＡＭ＿ＸＭ＿００５２６９９９８．１転写物から５つのＡＡＶコンストラクト；１つは、ＧＰＡＭ^Ｉ４３Ｖの全長コード配列を含むもの、並びに５’非翻訳領域、コード領域及び３’非翻訳領域のストレッチを含む４つの増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポーターコンストラクト（ヌクレオチド（ｎｔ）１～１７００、ｎｔ １６００～３３００、ｎｔ ３２００～４９００及びｎｔ ４８００～６５２７（ＡＡＶ－Ａ、ＡＡＶ－Ｂ、ＡＡＶ－Ｃ、及びＡＡＶ－Ｄ）を設計した。ｅＧＦＰ含有コンストラクトはまた、ＡＡＶ及び研究にわたるｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン有効性を比較するためのベンチマークｓｉＲＮＡ標的配列を含有した。

【0216】

表４に示すＧａｌＮＡｃ結合ｓｉＲＮＡをＧＰＡＭ^Ｉ４３Ｖ、ＡＡＶ－Ａ、ＡＡＶ－Ｂ、ＡＡＶ－Ｃ、又はＡＡＶ－Ｄに対して試験した。ＡＡＶ注射の２週間後、マウス（一般に１０～１２週齢及びｎ＝３～４匹／群）を、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１４１９０－１３６）で希釈した動物１キログラム当たり０．５、１．０、又は３．０ミリグラムで、皮下注射によって単回用量のｓｉＲＮＡで処置した。ｓｉＲＮＡ注射の２８日後、動物を安楽死させ、動物から肝臓を採取し、液体窒素中で急速凍結した。製造業者の指示に従って、ＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴ装置（Ｑｉａｇｅｎ，９００１７９３）及びＲＮｅａｓｙ ９６ ＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴキット（Ｑｉａｇｅｎ，７４１７１）を使用して、精製ＲＮＡについて肝臓の一部を処理した。試料は、ＱＩＡｘｐｅｒｔシステム（Ｑｉａｇｅｎ、９００２３４０）を使用して分析された。ＲＮＡは、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ－フリーＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ６１０１）で処理され、ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ（商標）１－ステップキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３９２６５３）を使用してリアルタイムｑＰＣＲのために調製された。リアルタイムｑＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏリアルタイムＰＣＲ装置上で実施された。結果は、ヒトＧＰＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈｓ００３２６０３９）、ＧＦＰ２（ＩＤＴカスタムアッセイ：フォワードプライマー：ＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＴＧＧＡＡＡＧ（センス、配列番号２８０１）、リバースプライマー：ＣＴＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣ（アンチセンス、配列番号２８０２）、プローブ：５’－６ＦＡＭ ＣＣＡＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＴＡＣＣＣＴＣＡＣＣ ＴＡＭＲＡ－３’（センス；配列番号２８０３）及び／又はウシ成長ホルモンのポリアデニル化（ＢｇｈｐＡ、これは各ＡＡＶコンストラクトに含まれる。ＩＤＴカスタムアッセイ：フォワード：５’－ＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴ－３’（配列番号２８０４）、リバース：５’－ＧＧＡＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡ－３’（配列番号２８０５）、プローブ：５’－６ＦＡＭ－ＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ ＴＡＭＲＡ－３’（配列番号２８０６）の遺伝子発現に基づいており、マウスＴＡＴＡ結合タンパク質（Ｔｂｐ）（ＩＤＴ，Ｈｅｘ Ｍｍ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８３９）に対して正規化され、マウスＴｂｐに対して正規化されたヒトＧＰＡＭ、ＧＦＰ、及び／又はＢｇｈｐＡ ｍＲＮＡ発現の相対的なノックダウンパーセントとして、ビヒクル処置対照動物と比較して示される。陰性結果はノックダウンを示す。（ｎｄ＝未決定）。

【0217】

【表4-1】

【0218】

【表4-2】

【0219】

【表4-3】

【0220】

【表4-4】

【0221】

【表4-5】

【0222】

【表4-6】

【0223】

【表4-7】

【0224】

【表4-8】

【0225】

本明細書において言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同程度に参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものと解釈されるべきではない。参照により組み込まれる参考文献において提供される定義又は用語のいずれかが、本明細書で提供される用語及び考察と異なる限りにおいて、本用語及び本定義が優先される。

【0226】

前述の本明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分なものであると考えられる。前述の説明及び実施例は、本発明のある特定の好ましい実施形態を詳細に説明し、本発明者らが企図する最良の形態を記載するものである。しかしながら、前述の内容がいかに詳細に記載されようとも、本発明を多くの方法で実施してもよく、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って本発明が解釈されるべきであることが理解されるであろう。

【国際調査報告】