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特表2024-539136ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-28
(54)【発明の名称】ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/16 20060101AFI20241018BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241018BHJP
C07K 1/18 20060101ALI20241018BHJP
C07K 1/20 20060101ALI20241018BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20241018BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20241018BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20241018BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20241018BHJP
【ＦＩ】
C07K1/16
C07K19/00 ZNA
C07K1/18
C07K1/20
C07K16/00
C12P21/08
C12P21/02 C
C07K14/705
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024523614
(86)(22)【出願日】2022-10-18
(85)【翻訳文提出日】2024-05-02
(86)【国際出願番号】 KR2022015837
(87)【国際公開番号】W WO2023068740
(87)【国際公開日】2023-04-27
(31)【優先権主張番号】10-2021-0139445
(32)【優先日】2021-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517432732
【氏名又は名称】アルテオジェン・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】パク、スン ジェ
(72)【発明者】
【氏名】ピョン、ミンス
(72)【発明者】
【氏名】ナム、キ ソク
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064AG26
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B064CE11
4B064CE13
4B064DA01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045BA41
4H045DA50
4H045DA75
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA21
4H045GA23
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質含有原料に対するマルチモーダルクロマトグラフィー精製ステップを行うことにより、エンドトキシン＜０．０５ＥＵ／ｍｇ又はサイズ排除ＨＰＬＣ純度９８％以上のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を得る、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法、ア）ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を産生する細胞を培養するステップと、イ）前記ア）で培養した細胞からタンパク質を回収するステップと、ウ）前記イ）で回収したタンパク質を１次クロマトグラフィーにより精製するステップと、エ）前記ウ）で１次クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をマルチモーダルクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製するステップとを含み、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いない、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法、前記方法により精製した、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を含む組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質含有原料に対するマルチモーダル（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ）クロマトグラフィー精製ステップを行うことにより、エンドトキシン＜０．０５ＥＵ／ｍｇ又はサイズ排除ＨＰＬＣ純度９８％以上のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を得る、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項2】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー精製ステップをさらに含む、請求項１に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項3】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）クロマトグラフィー及び陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行わないものである、請求項１又は２に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項4】
前記マルチモーダルクロマトグラフィーのリガンドとして、イオン性結合、水素結合及び疎水性結合のマルチモーダル機能を有する物質を含む、請求項１に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項5】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドは、スルホン酸（－ＳＯ３）、スルホプロピル（Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）及びカルボキシメチル（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項6】
前記クロマトグラフィー精製ステップにおいて、溶出は、ｐＨ勾配を用いるものである、請求項１又は２に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項7】
前記クロマトグラフィーは、溶出ステップを含み、前記溶出ステップは、結合・溶出モード（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で行うものである、請求項１又は２に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項8】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質は血管内皮細胞増殖因子アンタゴニストである、請求項１又は２に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項9】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質はアフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）である、請求項１又は２に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項10】
ア）ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を産生する細胞を培養するステップと、イ）前記ア）で培養した細胞からタンパク質を回収するステップと、
ウ）前記イ）で回収したタンパク質を１次クロマトグラフィーにより精製するステップと、
エ）前記ウ）で１次クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をマルチモーダルクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製するステップとを含み、
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いない、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項11】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法で最終精製された、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質は、サイズ排除ＨＰＬＣ純度９８％以上、エンドトキシン＜０．０５ＥＵ／ｍｇ、又はｐＩ ６．０～８．０である、請求項１０に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項12】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質は血管内皮細胞増殖因子アンタゴニストである、請求項１０に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項13】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質はアフリベルセプトである、請求項１０に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項14】
前記エ）マルチモーダルクロマトグラフィーにより精製するステップは、（ａ）ｐＨ６～８の緩衝液で平衡化したマルチモーダルクロマトグラフィーカラムに１次クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をローディングするステップと、
（ｂ）前記（ａ）ステップのものより低いｐＨの緩衝液をクロマトグラフィーカラムに注入し、ｐＨ６～４の条件で精製タンパク質を溶出して収穫するステップとを含む、請求項１０に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項15】
前記マルチモーダルクロマトグラフィーのリガンドとして、イオン性結合、水素結合及び疎水性結合のマルチモーダル機能を有する物質を含む、請求項１０に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項16】
前記エ）陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製するステップは、（ａ）ｐＨ４～６の緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに先行クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をローディングするステップと、
（ｂ）前記（ａ）ステップの緩衝液より高いｐＨの緩衝液で溶出し、ｐＩ ６．０～８．０のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を収穫するステップとを含む、請求項１０に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項17】
前記（ｂ）ステップにおいて、（ａ）ステップの緩衝液より高いｐＨの緩衝液は、ｐＨ５～８である、請求項１６に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項18】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドは、スルホン酸（－ＳＯ３）、スルホプロピル（Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）及びカルボキシメチル（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１０に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項19】
前記マルチモーダルクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１つは、溶出ステップを含み、前記溶出ステップは、結合・溶出モード（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で行うものである、請求項１０に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項20】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法は、サイズ排除クロマトグラフィー及び疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）クロマトグラフィーを行わないものである、請求項１０に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項21】
前記ウ）及びエ）からなる群から選択される少なくとも１つのステップの前に、前記ステップの後に、又はそれらを組み合わせて、深層濾過ステップ、限外濾過ステップ、透析濾過ステップ及びウイルス不活化ステップからなる群から選択される少なくとも１つをさらに行うものである、請求項１０に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項22】
前記ウ）１次クロマトグラフィーにより精製するステップ、及びエ）マルチモーダルクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製するステップからなる群から選択される少なくとも１つのステップは、溶出ステップを含み、前記溶出ステップは、ｐＨ勾配を用いるものである、請求項１０に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法。
【請求項23】
請求項１又は１０に記載の精製方法により精製された、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を含む組成物。
【請求項24】
前記組成物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー分析の際に、５０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０である移動相Ａ、及び５０ｍＭリン酸ナトリウム、３０％アセトニトリル、ｐＨ７．０である移動相Ｂにおいて、移動相Ｂの割合が４０～４５％の区間で溶出するピーク１分画物を含む、請求項２３に記載のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を含む組成物。
【請求項25】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を含む組成物は、ピーク１分画物を５％以下の量で含むものである、請求項２４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質含有原料に対するマルチモーダルクロマトグラフィー精製ステップを行うことにより、エンドトキシン＜０．０５ＥＵ／ｍｇ又はサイズ排除ＨＰＬＣ純度９８％以上のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を得る、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法、ア）ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を産生する細胞を培養するステップと、イ）前記ア）で培養した細胞からタンパク質を回収するステップと、ウ）前記イ）で回収したタンパク質を１次クロマトグラフィーにより精製するステップと、エ）前記ウ）で１次クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をマルチモーダルクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製するステップとを含み、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いない、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法、前記方法により精製した、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、及び前記融合タンパク質を含む組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃドメインは、タンパク質の機能を有するドメインとの融合により、タンパク質医薬品に持続性を持たせる要素となる。よって、多くの商業用タンパク質医薬品がＦｃ融合タンパク質の形態で開発されている。
【0003】
血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）は、血管新生と血管透過性を亢進させる重要な因子である。特に、ＶＥＧＦは、腫瘍において過剰発現し、血管新生及び腫瘍増殖を異常に促進する（非特許文献１）。また、異常な血管新生は、腫瘍発生以外に、他の疾病にも深く関与することが報告されている。ＶＥＧＦ関連機序において、異常な血管新生は、眼科疾患である湿性黄斑変性、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞黄斑浮腫などに関与する（非特許文献２）。
【0004】
このような、眼科疾患に対する治療には、ペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ； ＲＮＡアプタマー）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ； モノクローナルＩｇＧ抗体断片（Ｆａｂ））、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ； モノクローナルＩｇＧ抗体）が用いられており、アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ； ＩｇＧ１ Ｆｃに融合されたＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２）が湿性黄斑変性の治療剤として２０１１年に米国で承認されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００４）２３，１７４５－１７５３
【非特許文献2】Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．（２０１４），５７（７），６１４－６２３
【非特許文献3】Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１２）２（３）１－２２，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１３）３（７），７１１－７２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明者らは、マルチモーダルクロマトグラフィー精製ステップを行うことにより、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を効果的に精製する方法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質含有原料に対するマルチモーダルクロマトグラフィー精製ステップを行うことにより、エンドトキシン＜０．０５ＥＵ／ｍｇ又はサイズ排除ＨＰＬＣ純度９８％以上のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を得る、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法を提供することを目的とする。
【0008】
また、本発明は、ア）ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を産生する細胞を培養するステップと、イ）前記ア）で培養した細胞からタンパク質を回収するステップと、ウ）前記イ）で回収したタンパク質を１次クロマトグラフィーにより精製するステップと、エ）前記ウ）で１次クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をマルチモーダルクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製するステップとを含み、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いない、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法を提供することを目的とする。
【0009】
さらに、本発明は、前記方法により精製した、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質又はそれを含む組成物を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0010】
本発明の精製方法を用いると、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を効率的かつ大量に生産及び供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトに対して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂を用いて、結合・溶出モードでＰｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーを行って得られたクロマトグラムである。
【図2】ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトに対して、図１の精製ステップ（タンパク質Ａクロマトグラフィー）後に、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂を用いて、結合・溶出モードでマルチモーダルクロマトグラフィーを行って得られたクロマトグラムである。
【図3】ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトに対して、図１及び図２の精製ステップ（タンパク質Ａクロマトグラフィー及びマルチモーダルクロマトグラフィー）後に、Ｃａｐｔｏ Ｓ樹脂を用いて、結合・溶出モードで陽イオン交換クロマトグラフィーを行って得られたクロマトグラムである。
【図4】図３の精製ステップ（Ｃａｐｔｏ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィー）で精製及び溶出した分画の等電点電気泳動（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）の分析結果を示す図である。Ｌａｎｅ １は内部標準１であり、Ｌａｎｅ ２は内部標準２である。Ｌａｎｅ ３はＣＥＸ（陽イオン交換クロマトグラフィー）の溶出体積３ＣＶを収集した試料の分析結果であり、また、Ｌａｎｅ ４、５、６、７及び８はＣＥＸの溶出体積を０．５ＣＶずつ増加させて収集した試料の分析結果である。
【図5】ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトに対して、図１及び図２の精製ステップ（タンパク質Ａクロマトグラフィー及びマルチモーダルクロマトグラフィー）後に、ＳＰ－５５０Ｃ樹脂を用いて、結合・溶出モードで陽イオン交換クロマトグラフィーを行って得られたクロマトグラムである。
【図6】図５の精製ステップ（ＳＰ－５５０Ｃ陽イオン交換クロマトグラフィー）で精製及び溶出した分画の等電点電気泳動（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）の分析結果を示す図である。Ｌａｎｅ １はＣＥＸの溶出体積４ＣＶを収集した試料の分析結果であり、また、Ｌａｎｅ ２及び３はＣＥＸの溶出体積を８ＣＶ及び１０ＣＶに増加させて収集した試料の分析結果である。
【図7】陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた塩勾配溶出クロマトグラムである。
【図8】陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた塩勾配溶出の各分画における等電点電気泳動の分析結果を示す図である。塩勾配溶出においては、アイソフォーム除去により標的タンパク質の収率が低下する。
【図9】Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂マルチモーダルクロマトグラフィーと比較評価するために、ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトに対して、Ｃａｐｔｏ Ｑ樹脂を用いて、フロースルーモードで陰イオンクロマトグラフィーを行って得られたクロマトグラムである。
【図10】Ｃａｐｔｏ Ｑ樹脂陰イオン交換クロマトグラフィーと比較評価するために、ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトに対して、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂を用いて、結合・溶出モードでマルチモーダルクロマトグラフィーを行って得られたクロマトグラムである。
【図11】陰イオンクロマトグラフィーとマルチモーダルクロマトグラフィーを比較評価するために、同一試料を添加して精製し、その後ＨＣＰ（Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）を分析した結果を示す図である。
【図12】本発明及び市販の精製アフリベルセプトにおけるメチオニン残基の酸化（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の分析結果を示す図である。
【図13】本発明及び市販の精製アフリベルセプトにおけるヒスチジン残基の酸化の分析結果を示す図である。
【図14】本発明及び市販の精製アフリベルセプトにおける各アミノ酸残基の脱アミド（Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）の分析結果を示す図である。
【図15】本発明及び市販の精製アフリベルセプトにおける各アミノ酸残基の脱水（Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）の分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明について具体的に説明する。なお、本発明で開示される一態様の説明及び実施形態は、共通事項について他の態様の説明及び実施形態にも適用される。また、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。さらに、本発明に引用される文献は、本発明に参照として組み込まれている。さらに、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【0013】
本発明の一態様は、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質含有原料に対するマルチモーダル（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ）クロマトグラフィー精製ステップを行うことにより、エンドトキシン＜０．０５ＥＵ／ｍｇ又はサイズ排除ＨＰＬＣ純度９８％以上のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を得る、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法を提供する。
【0014】
本発明における「ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質」とは、ＩｇＧ Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を意味する。本発明のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質含有原料は、動物細胞株を用いた細胞培養により生産されたものであるが、これに限定されるものではない。
【0015】
一実施例として、本発明の融合タンパク質は血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）アンタゴニストであるが、これに限定されるものではない。
【0016】
一実施例として、本発明の融合タンパク質は、ＩｇＧ Ｆｃドメインと、ＶＥＧＦ受容体１及び２とを含むものであるが、これに限定されるものではない。
一実施例として、前記ＶＥＧＦ受容体１及び２は、ＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）であるが、これに限定されるものではない。
一実施例として、前記ＶＥＧＦ受容体１及び２は、ＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）であるが、これに限定されるものではない。
【0017】
一実施例として、前記ＶＥＧＦ受容体はヒトＶＥＧＦ受容体であるが、これに限定されるものではない。
一実施例として、本発明の融合タンパク質はアフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）であるが、これに限定されるものではない。
一実施例として、本発明の融合タンパク質はアフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）であるが、これに限定されるものではない。
【0018】
本発明における「ＩｇＧ Ｆｃ」とは、免疫グロブリンＩｇＧの定常領域であるＦｃ領域を意味する。前記免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ領域は、前記タンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本発明に用いられることは言うまでもない。
【0019】
前記免疫グロブリンＩｇＧ Ｆｃは、ＩｇＧのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなるものであってもよく、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分を含むこともある。
また、本発明の免疫グロブリンＩｇＧ Ｆｃ領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列変異体（ｍｕｔａｎｔ）も含まれる。アミノ酸配列変異体とは、天然アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。
また、本発明の免疫グロブリンＩｇＧ Ｆｃ領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列変異体（ｍｕｔａｎｔ）も含まれる。アミノ酸配列変異体とは、天然アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。
【0020】
一実施例として、本発明のＩｇＧ ＦｃはヒトＩｇＧ Ｆｃであってもよい。
一実施例として、本発明のＩｇＧ Ｆｃは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃドメインであり、具体的にはＩｇＧ１のＦｃドメインであるが、これらに限定されるものではない。
一実施例として、本発明のＩｇＧ Ｆｃは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃドメインであり、具体的にはＩｇＧ１のＦｃドメインであるが、これらに限定されるものではない。
【0021】
本発明における「ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質含有原料」は、細胞培養などにより得られた、精製されていない細胞、その培養物、破砕物などであって、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を含むものであるが、これに限定されるものではない。
【0022】
本発明のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法は、マルチモーダル（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ）クロマトグラフィー精製ステップを含む。
本発明における「クロマトグラフィー」とは、混合物の成分が異なる速度で媒質を通過するように混合物に媒質を通過させ、混合物の成分を分離する任意のプロセスを意味する。前記クロマトグラフィーには、カラムクロマトグラフィー、平面（ｐｌａｎａｒ）クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（陽イオン交換クロマトグラフィー，陰イオン交換クロマトグラフィー）、サイズ排除クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどが含まれる。
本発明における「クロマトグラフィー」とは、混合物の成分が異なる速度で媒質を通過するように混合物に媒質を通過させ、混合物の成分を分離する任意のプロセスを意味する。前記クロマトグラフィーには、カラムクロマトグラフィー、平面（ｐｌａｎａｒ）クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（陽イオン交換クロマトグラフィー，陰イオン交換クロマトグラフィー）、サイズ排除クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどが含まれる。
【0023】
本発明の精製工程の各ステップにおいて、クロマトグラフィー工程又は装置の一例を開示しているが、これらは前述した全てのタイプのクロマトグラフィーに適用することができる。
【0024】
本発明の各ステップからなるクロマトグラフィーは、試料注入ステップと、平衡ステップと、洗浄ステップと、溶出ステップとを含んでもよい。ここで、各ステップは、順序を変えて行ってもよく、各ステップの前後又は間に他のステップ（例えば、平衡ステップ、洗浄ステップ）をさらに含んでもよく、１つのステップに他のステップが含まれてもよい。例えば、前記試料注入ステップの前に平衡ステップをさらに含んでもよく、前記洗浄ステップが前記平衡ステップに含まれてもよく、前記洗浄ステップに前記平衡ステップが含まれてもよい。本発明の平衡ステップは、平衡緩衝液をカラムに流して樹脂を平衡化するステップであってもよく、本発明の洗浄ステップは、緩衝液でカラムを洗浄して樹脂に吸着している不純物を除去するステップであってもよく、本発明の溶出ステップは、標的タンパク質を溶出及び／又は回収するステップであってもよい。
【0025】
例えば、本発明のクロマトグラフィーにおいて、緩衝液は、トロメタミン、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸及び酢酸からなる群から選択される少なくとも１つを含むものであるが、これに限定されるものではない。前記緩衝液は、平衡ステップ、洗浄ステップ及び溶出ステップにおいて用いるものであってもよい。
【0026】
一実施例として、本発明の溶出ステップは、塩勾配、ｐＨ勾配又はそれらの組み合わせを用いるものであってもよい。
一実施例として、本発明の溶出ステップは、結合・溶出モード（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で行うものであってもよい。
一実施例として、本発明の溶出ステップは、結合・溶出モード（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で行うものであってもよい。
【0027】
一実施例として、本発明の溶出ステップは、フロースルーモード（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅ）を用いないものであってもよい。
本発明における「フロースルー」とは、クロマトグラフィーにおいて通過液を収集するモードを意味し、本発明における「結合・溶出」とは、標的タンパク質を混合モードの相互作用により樹脂に結合したリガンドに結合させ、緩衝液の組成やｐＨなどを用いて前記樹脂から分子を放出させるモードを意味する。前記フロースルーモードは、特定条件でカラム樹脂に結合する物質のみ除去するモードであり、前記結合・溶出は、特定条件でカラム樹脂に結合しない物質を除去し、カラム樹脂に結合しない物質を回収するモードである。
本発明における「フロースルー」とは、クロマトグラフィーにおいて通過液を収集するモードを意味し、本発明における「結合・溶出」とは、標的タンパク質を混合モードの相互作用により樹脂に結合したリガンドに結合させ、緩衝液の組成やｐＨなどを用いて前記樹脂から分子を放出させるモードを意味する。前記フロースルーモードは、特定条件でカラム樹脂に結合する物質のみ除去するモードであり、前記結合・溶出は、特定条件でカラム樹脂に結合しない物質を除去し、カラム樹脂に結合しない物質を回収するモードである。
【0028】
本発明におけるＩｇＧ Ｆｃドメインを有する抗体及び融合タンパク質の精製は、一般に用いる陰イオン交換クロマトグラフィー又はマルチモーダル（Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ）クロマトグラフィーにおいて通過液を収集するフロースルーモード（Ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅ）を採用せず、マルチモーダルクロマトグラフィーにおいて結合・溶出モード（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で融合タンパク質を精製することにより、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又はマルチモーダルクロマトグラフィーにおけるフロースルーモードに比べて、宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、ウイルス、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ溶出液（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｌｅａｃｈａｔｅ）などを効果的に除去できることに意義がある。また、本発明の精製方法を用いると、簡単な３段階のクロマトグラフィー精製だけで高純度の融合タンパク質を生産することができ、等電点ｐＨ６～８の範囲を有するＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトを効果的に精製することができる。
【0029】
本発明における「マルチモーダルクロマトグラフィー（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」とは、標的タンパク質の分離のために、固定相と標的タンパク質間における少なくとも１つの相互作用を用いるクロマトグラフィーを意味する。前記相互作用には、タンパク質サイズ、電荷、疎水性、親水性及び／又は特異的相互作用などが含まれる。前記マルチモーダルクロマトグラフィーは、マルチモードクロマトグラフィー及び混合モードクロマトグラフィー（ｍｉｘｅｄ ｍｏｄｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｇｐｈｙ）と混用される。本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーには、物理的マルチモーダルクロマトグラフィー及び化学的マルチモーダルクロマトグラフィーが含まれる。
【0030】
本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーは、平衡ステップと、試料注入ステップと、洗浄ステップと、溶出ステップとを含んでもよい。
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの各ステップにおいて用いる緩衝液は、トロメタミン、リン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つを含むものであるが、これに限定されるものではない。
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの各ステップにおいて用いる緩衝液は、トロメタミン、リン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つを含むものであるが、これに限定されるものではない。
【0031】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの平衡ステップは、１００～２００ｃｍ／ｈｒ、１１０～１９０ｃｍ／ｈｒ、１２０～１８０ｃｍ／ｈｒ、１３０～１７０ｃｍ／ｈｒ、１４０～１６０ｃｍ／ｈｒ、又は１５０ｃｍ／ｈｒの流速で、１～１０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）、２～８ＣＶ、４～６ＣＶ、又は５ＣＶの緩衝液をカラムに流す過程を含むが、これに限定されるものではない。
【0032】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの平衡ステップは、約ｐＨ６～８、具体的にはｐＨ７で行うものであるが、これらに限定されるものではない。
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの平衡ステップにおいて用いる緩衝液は、約ｐＨ６～８、具体的にはｐＨ７の緩衝液であるが、これらに限定されるものではない。
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの平衡ステップにおいて用いる緩衝液は、約ｐＨ６～８、具体的にはｐＨ７の緩衝液であるが、これらに限定されるものではない。
【0033】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの平衡ステップにおいて用いる緩衝液は、トロメタミン、リン酸ナトリウム又はそれらの組み合わせを含むものであるが、これに限定されるものではない。
【0034】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの洗浄ステップは、１～１０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）、２～８ＣＶ、４～６ＣＶ、又は５ＣＶの緩衝液をカラムに流すものであるが、これらに限定されるものではない。
【0035】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの溶出ステップは、１～１０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）、３～９ＣＶ、５～８ＣＶ、又は７ＣＶの緩衝液をカラムに流す過程を含むが、これに限定されるものではない。
【0036】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの溶出ステップは、約ｐＨ３～７、約ｐＨ４～６、具体的には約ｐＨ５で行うものであるが、これらに限定されるものではない。
【0037】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの溶出ステップにおいて用いる緩衝液は、約ｐＨ３～７、約ｐＨ４～６、具体的には約ｐＨ５の緩衝液であるが、これらに限定されるものではない。
【0038】
本発明における「約（ａｂｏｕｔ）」は、特定の数値の前に用いられる。本発明における「約」とは、約という用語の後に続く正確な数値のみではなく、ほとんどその数値であるか、又はその数値に近い範囲をも含むものである。その数値が用いられた文脈を考慮すると、言及された具体的な数値と近いか、ほとんどその数値であるかを決定することができる。一例として、「約」は、所定の数値の－１０％～＋１０％の範囲を示す。他の例として、「約」は、所定の数値の－５％～＋５％の範囲を示す。しかし、これらに限定されるものではない。
【0039】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの溶出ステップにおいて用いる緩衝液は、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム又はそれらの組み合わせを含むものであるが、これに限定されるものではない。
【0040】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの溶出ステップは、塩勾配、ｐＨ勾配又はそれらの組み合わせ、具体的にはｐＨ勾配を用いるものであってもよい。
【0041】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの溶出ステップは、結合・溶出モード（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で行うものであってもよい。
【0042】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーの溶出ステップは、フロースルーモード（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅ）を用いないものであってもよい。
【0043】
例えば、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーに用いる樹脂は、Ｃａｐｔｏ ＡｄｈｅｒｅＴＭ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣＴＭ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓＴＭ、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓＴＭ、Ｎｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅ ４Ａ、Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ４００ＴＭ及びＣａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００ＴＭからなる群から選択される少なくとも１つであり、前記マルチモーダルリガンドは、具体的にはＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅであり、より具体的にはＮ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミン（Ｎ－Ｂｅｎｚｙｌ－Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）であるが、これらに限定されるものではない。
【0044】
一実施例として、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィーに用いるマルチモーダルリガンドは、イオン性結合、水素結合及び疎水性結合のマルチモーダル機能を有する物質を含むものであってもよい。
【0045】
本発明の一実施例においては、１５０ｃｍ／ｈｒの流速で５ＣＶの平衡緩衝液をカラムに流し、樹脂を平衡化した。平衡緩衝液としては、ｐＨ７程度のトロメタミン及び／又はリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。その後、得られた深層濾過回収液を注入し、５ＣＶの平衡緩衝液でカラムを洗浄した。７ＣＶの溶出緩衝液をカラムに流し、標的タンパク質を溶出し、回収した。溶出緩衝液としては、ｐＨ５程度のリン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液を用いた（実施例５）。
【0046】
本発明の精製方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー精製ステップをさらに含んでもよい。
一実施例として、本発明の精製方法は、マルチモーダルクロマトグラフィー精製ステップの前に、その後に、又はそれと同時に行う陽イオン交換クロマトグラフィー精製ステップを含んでもよい。具体的には、本発明の精製方法は、マルチモーダルクロマトグラフィー精製ステップの後に、陽イオン交換クロマトグラフィー精製ステップを含むが、これに限定されるものではない。
一実施例として、本発明の精製方法は、マルチモーダルクロマトグラフィー精製ステップの前に、その後に、又はそれと同時に行う陽イオン交換クロマトグラフィー精製ステップを含んでもよい。具体的には、本発明の精製方法は、マルチモーダルクロマトグラフィー精製ステップの後に、陽イオン交換クロマトグラフィー精製ステップを含むが、これに限定されるものではない。
【0047】
本発明における「イオン交換クロマトグラフィー」とは、媒質とタンパク質表面の正味電荷の可逆的な相互作用、すなわちイオン結合強度の差に基づく交換樹脂を用いるものを意味する。本発明に用いる陽イオン交換クロマトグラフィーとは、陽イオン交換樹脂を充填したカラムを用いるイオンクロマトグラフィーを意味する。前記ステップにおいては、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより、不純物をさらに除去することができ、目的とする等電点を有する同形体を選択的に分離することができる。
【0048】
本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーは、平衡ステップと、試料注入ステップと、第１洗浄ステップと、第２洗浄ステップと、溶出ステップとを含んでもよい。
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの各ステップにおいて用いる緩衝液は、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム又はそれらの組み合わせを含むものであるが、これに限定されるものではない。
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの各ステップにおいて用いる緩衝液は、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム又はそれらの組み合わせを含むものであるが、これに限定されるものではない。
【0049】
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡ステップは、１００～２００ｃｍ／ｈｒ、１１０～１９０ｃｍ／ｈｒ、１２０～１８０ｃｍ／ｈｒ、１３０～１７０ｃｍ／ｈｒ、１４０～１７０ｃｍ／ｈｒ、又は１６０ｃｍ／ｈｒの流速で、５～１５ＣＶ、７～１３ＣＶ、８～１２ＣＶ、９～１１ＣＶ、又は１０ＣＶの緩衝液をカラムに流す過程を含むが、これに限定されるものではない。
【0050】
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡ステップは、約ｐＨ３～７、約ｐＨ４～６、具体的にはｐＨ５で行うものであるが、これらに限定されるものではない。
【0051】
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡ステップにおいて用いる緩衝液は、約ｐＨ３～７、約ｐＨ４～６、具体的にはｐＨ５の緩衝液であるが、これらに限定されるものではない。
【0052】
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの第１洗浄ステップは、１～１０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）、２～８ＣＶ、４～６ＣＶ、又は５ＣＶの緩衝液をカラムに流すものであるが、これらに限定されるものではない。
【0053】
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの第２洗浄ステップは、標的タンパク質関連物質のうち酸性度が高い分画を除去するためのものであり、約ｐＨ３～７、約ｐＨ４～６、約ｐＨ５～６、具体的には約ｐＨ５．９の緩衝液を１～５ＣＶ、２～４ＣＶ、又は３ＣＶの分量でカラムに流すものであるが、これらに限定されるものではない。
【0054】
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出ステップは、５～１５ＣＶ、８～１２ＣＶ、又は１０ＣＶの緩衝液をカラムに流す過程を含むが、これに限定されるものではない。
【0055】
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出ステップは、約ｐＨ３～８、ｐＨ６～８、約ｐＨ４～７、ｐＨ５～７、ｐＨ６～７、具体的には約ｐＨ６．５で行うものであるが、これらに限定されるものではない。
【0056】
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出ステップにおいて用いる緩衝液は、約ｐＨ３～８、ｐＨ６～８、約ｐＨ４～７、ｐＨ５～７、ｐＨ６～７、具体的には約ｐＨ６．５の緩衝液であるが、これらに限定されるものではない。
【0057】
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出ステップは、塩勾配、ｐＨ勾配又はそれらの組み合わせ、具体的には塩勾配を用いるものであってもよい。
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出ステップは、結合・溶出モードで行うものであってもよい。
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出ステップは、結合・溶出モードで行うものであってもよい。
【0058】
一実施例として、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出ステップは、フロースルーモード（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅ）を用いないものであってもよい。
本発明の一実施例においては、１０ＣＶの平衡緩衝液を１６０ｃｍ／ｈｒの流速でカラムに流し、樹脂を平衡化した。平衡緩衝液としては、ｐＨ５程度の緩衝液を用いた。リン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液を用いることが好ましい。マルチモーダルクロマトグラフィーステップで得られた回収液を注入し、５ＣＶの平衡緩衝液でカラムを洗浄した。標的タンパク質関連物質（ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）のうち酸性度が高い分画を除去するために、ｐＨ５．９程度のリン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液３ＣＶの分量をカラムに流し、洗浄を行った。溶出緩衝液としてｐＨ６．５程度のリン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液１０ＣＶを用いて、標的タンパク質を回収した（実施例６）。本発明者らは、マルチモーダルクロマトグラフィーの結合・溶出モードステップの後に、陽イオン交換樹脂を用いて残量の宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、アフリベルセプト関連物質などをさらに除去することにより、等電点ｐＨ６～８の範囲を有する融合タンパク質を効果的に精製する方法を開発した。
本発明の一実施例においては、１０ＣＶの平衡緩衝液を１６０ｃｍ／ｈｒの流速でカラムに流し、樹脂を平衡化した。平衡緩衝液としては、ｐＨ５程度の緩衝液を用いた。リン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液を用いることが好ましい。マルチモーダルクロマトグラフィーステップで得られた回収液を注入し、５ＣＶの平衡緩衝液でカラムを洗浄した。標的タンパク質関連物質（ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）のうち酸性度が高い分画を除去するために、ｐＨ５．９程度のリン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液３ＣＶの分量をカラムに流し、洗浄を行った。溶出緩衝液としてｐＨ６．５程度のリン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液１０ＣＶを用いて、標的タンパク質を回収した（実施例６）。本発明者らは、マルチモーダルクロマトグラフィーの結合・溶出モードステップの後に、陽イオン交換樹脂を用いて残量の宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、アフリベルセプト関連物質などをさらに除去することにより、等電点ｐＨ６～８の範囲を有する融合タンパク質を効果的に精製する方法を開発した。
【0059】
例えば、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーに用いることのできる樹脂としては、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ ＳＰ、ＳＯＵＲＣＥ ３０ Ｓ、ＳＯＵＲＣＥ １５ Ｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ ＣＰＸ、Ｅｓｈｍｕｎｏ ＣＰ－ＦＴ、Ｅｓｈｍｕｎｏ ＣＰＳ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３－、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＥ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ２５ Ｓ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ＣＭ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、ＰＯＲＯＳＴＭ ＸＳ、ＰＯＲＯＳＴＭ ５０ ＨＳ、Ｎｕｖｉａ Ｓ Ｒｅｓｉｎ、Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓ、Ｎｕｖｉａ ｃＰｒｉｍ、Ｅｘｈｍｕｎｏ ＣＭＸＴＭ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓＴＭ、Ｎｕｖｉａ ｃＰｒｉｍｅ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｓ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ ＣＭ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｓａｌｆａｔｅ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＭｅｇａＣａｐ ＩＩ ＳＰ－５５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ－５５０が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーに用いる樹脂は、Ｃａｐｔｏ ＳＴＭ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ ＳＰ及びＥｓｈｍｕｎｏ ＣＰＳからなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【0060】
一実施例として、前記陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドは、スルホン酸（－ＳＯ３）、スルホプロピル（Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）及びカルボキシメチル（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）からなる群から選択される少なくとも１つ、具体的にはスルホン酸を含むものであってもよい。
【0061】
本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーの陽イオン交換樹脂とは、他の水溶液に添加されて水溶液中の特定の陽イオンと自らの陽イオンを交換する役割を果たす合成樹脂を意味し、陽イオン交換カラムは、等電点以上で陽イオンとなるタンパク質を吸着する。
【0062】
一実施例として、前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂の官能基は、スルホン酸メチル（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、ポリアスパラギン酸（Ｐｏｌｙ ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸（Ｐ）及びスルホン酸（Ｓ）からなる群から選択される１つであってもよい。
【0063】
本発明の精製方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを行わないものであるが、これに限定されるものではない。本発明において、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを行わないことにより、試料濃縮過程と精製規模のスケールアップの容易性が得られ、タンパク質構造の疎水性部分が塩に暴露されることを防止することができ、精製レベルを高めることができる。
【0064】
ここで、前記サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製ではない用途（例えば、融合タンパク質の純度の確認又は検証）には用いてもよい。
【0065】
一実施例として、本発明の精製方法は、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する抗体及び融合タンパク質の精製において一般に用いられる陰イオン交換クロマトグラフィーを用いないものであってもよい。
【0066】
本発明の陰イオン交換クロマトグラフィーとは、陰イオン交換樹脂を充填したカラムを用いるイオンクロマトグラフィーを意味する。
本発明のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法は、各ステップの前又は後に、濾過ステップをさらに含んでもよく、前記濾過ステップは、深層濾過、限外濾過及び透析濾過からなる群から選択されるいずれかであるが、これに限定されるものではない。前記濾過は、１回以上行われるものであってもよい。
本発明のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法は、各ステップの前又は後に、濾過ステップをさらに含んでもよく、前記濾過ステップは、深層濾過、限外濾過及び透析濾過からなる群から選択されるいずれかであるが、これに限定されるものではない。前記濾過は、１回以上行われるものであってもよい。
【0067】
本発明における「深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」とは、粒径が大きく、均等係数が小さい濾過材を用いて、濾層表面では濾過されずに通過したフロックを内部で捕捉する濾過を意味する。
【0068】
本発明における「限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」とは、圧力及び膜を用いて、液体中に溶解又は分散した物質を粒径や分子量の大きさによって分画する工程を意味する。
【0069】
本発明における「透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」とは、透析を用いて、溶媒と分子の大きさが異なる２つ以上の溶質を含む流体から一部の溶質だけ除去する方法を意味する。前記透析濾過は、定容濾過と混用される。
【0070】
本発明の他の態様は、ア）ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を産生する細胞を培養するステップと、イ）前記ア）で培養した細胞からタンパク質を回収するステップと、ウ）前記イ）で回収したタンパク質を１次クロマトグラフィーにより精製するステップと、エ）前記ウ）で１次クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をマルチモーダルクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製するステップとを含み、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いない、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法を提供する。前記エ）ステップにおいて、マルチモーダルクロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーの前に行ってもよく、陽イオン交換クロマトグラフィーの後に行ってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
【0071】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法で最終精製された、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質は、サイズ排除ＨＰＬＣ純度９８％以上であってもよく、エンドトキシン＜０．０５ＥＵ／ｍｇであってもよく、ｐＩ ６．０～８．０であってもよい。
【0072】
本発明の精製方法を用いると、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーなどを用いなくても、簡単な３段階のクロマトグラフィー精製だけで高純度の融合タンパク質を生産することができる。また、等電点ｐＨ６～８の範囲を有するＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトを効果的に精製することができる。
【0073】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、マルチモーダルクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーについては前述した通りである。
【0074】
本発明のア）ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を産生する細胞を培養するステップにおいて、前記細胞は、動物細胞、具体的にはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）であるが、これらに限定されるものではない。
【0075】
本発明における「培養」とは、前記細胞を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本発明の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される細胞の種類に応じて容易に調整して用いることができる。
【0076】
本発明のイ）前記ア）で培養した細胞からタンパク質を回収するステップにおいて、前記回収方法は、本発明の培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とするＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を回収（ｃｏｌｌｅｃｔ）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、深層濾過、抽出、限外濾過、透析などを組み合わせて用いることができ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は細胞から目的とするＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を回収することができる。
【0077】
本発明のウ）前記イ）で回収したタンパク質を１次クロマトグラフィーにより精製するステップにおいて、１次クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィーであり、具体的にはタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーであるが、これらに限定されるものではない。
【0078】
本発明における「アフィニティークロマトグラフィー」とは、標的分子とリガンド間の特異性の高い相互作用を用いるクロマトグラフィーを意味する。
本発明のアフィニティークロマトグラフィーは、平衡ステップと、試料注入ステップと、第１洗浄ステップと、第２洗浄ステップと、溶出ステップとを含んでもよい。
本発明のアフィニティークロマトグラフィーは、平衡ステップと、試料注入ステップと、第１洗浄ステップと、第２洗浄ステップと、溶出ステップとを含んでもよい。
【0079】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの各ステップにおいて用いる緩衝液は、トロメタミン、リン酸ナトリウム、酢酸及びクエン酸からなる群から選択される少なくとも１つを含む緩衝液であるが、これに限定されるものではない。
【0080】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの平衡ステップは、２～８ＣＶ、４～６ＣＶ、又は５ＣＶの緩衝液をカラムに流す過程を含むが、これに限定されるものではない。
【0081】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの平衡ステップは、約ｐＨ６～８、具体的にはｐＨ７で行うものであるが、これらに限定されるものではない。
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの平衡ステップにおいて用いる緩衝液は、約ｐＨ６～８、具体的にはｐＨ７の緩衝液であるが、これらに限定されるものではない。
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの平衡ステップにおいて用いる緩衝液は、約ｐＨ６～８、具体的にはｐＨ７の緩衝液であるが、これらに限定されるものではない。
【0082】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの平衡ステップにおいて用いる緩衝液は、トロメタミン、リン酸ナトリウム又はそれらの組み合わせを含むものであるが、これに限定されるものではない。
【0083】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの第１洗浄ステップにおいて用いる緩衝液は、クエン酸、酢酸又はそれらの組み合わせを含むものであってもよく、Ｌ－アルギニン（Ｌ－Ａｒｇｉｎｉｎｅ）及び／又は尿素（ｕｒｅａ）をさらに含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0084】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの第１洗浄ステップは、約ｐＨ３～７、約ｐＨ４～７、ｐＨ５～６．５、具体的には約ｐＨ５．９で行うものであるが、これらに限定されるものではない。
【0085】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの第１洗浄ステップは、約ｐＨ３～７、約ｐＨ４～７、ｐＨ５～６．５、具体的には約ｐＨ５．９の緩衝液を５～１５ＣＶ、７～１３ＣＶ、８～１２ＣＶ、９～１１ＣＶ、又は１０ＣＶの分量でカラムに流すものであるが、これらに限定されるものではない。
【0086】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの第２洗浄ステップにおいて用いる緩衝液は、クエン酸、酢酸又はそれらの組み合わせを含むものであるが、これに限定されるものではない。
【0087】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの第２洗浄ステップは、約ｐＨ３～７、約ｐＨ４～６、ｐＨ５～６、具体的には約ｐＨ５．６で行うものであるが、これらに限定されるものではない。
【0088】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの第２洗浄ステップは、約ｐＨ３～７、約ｐＨ４～６、ｐＨ５～６、具体的にはｐＨ５．６の緩衝液を１～７ＣＶ、又は３～５ＣＶの分量でカラムに流すものであるが、これらに限定されるものではない。
【0089】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの溶出ステップは、約ｐＨ１～５、約ｐＨ２～４、約ｐＨ３～４、具体的には約ｐＨ３．５で行うものであるが、これらに限定されるものではない。
【0090】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの溶出ステップは、約ｐＨ１～５、約ｐＨ２～４、約ｐＨ３～４、具体的には約ｐＨ３．５の緩衝液を１～７ＣＶ、又は３～５ＣＶの分量でカラムに流す過程を含むが、これに限定されるものではない。
【0091】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの溶出ステップにおいて用いる緩衝液は、クエン酸、酢酸又はそれらの組み合わせを含むものであるが、これに限定されるものではない。
【0092】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの溶出ステップは、塩勾配、ｐＨ勾配又はそれらの組み合わせ、具体的にはｐＨ勾配を用いるものであってもよい。
【0093】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの溶出ステップは、結合・溶出モード（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で行うものであってもよい。
【0094】
一実施例として、本発明のアフィニティークロマトグラフィーの溶出ステップは、フロースルーモード（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅ）を用いないものであってもよい。
【0095】
例えば、本発明のアフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡであってもよく、ＭａｂＳｅｌｅｃｔであってもよく、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａであってもよく、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅであってもよく、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸであってもよく、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｐｃｃであってもよく、ＭａｂＣａｐｔｕｒｅＣＴＭであってもよい。
【0096】
例えば、本発明のアフィニティークロマトグラフィーに用いる樹脂は、ａｌｋａｌｉ－ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ｄｅｒｉｖｅｄリガンドを有するＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅから選択される少なくとも１つであるが、これに限定されるものではない。
【0097】
本発明の一実施例においては、約５カラム体積（ＣＶ）の分量のｐＨ６～８、好ましくは約ｐＨ７のトロメタミン及び／又はリン酸ナトリウム緩衝液を滞留時間７．５分の流速でカラムに流し、樹脂を平衡化した。その後、実施例１で得られた細胞培養収穫液を平衡化したカラムに注入し、３ＣＶの平衡緩衝液でカラムを洗浄し、樹脂に吸着している不純物を除去した。その後、１０ＣＶの洗浄緩衝液１と３～５ＣＶの洗浄緩衝液２をカラムに順次流し、さらに不純物を除去した。洗浄緩衝液１としては、ｐＨ５～６．５、好ましくは約ｐＨ５．９のクエン酸及び／又は酢酸緩衝液を用いた。洗浄緩衝液１は、Ｌ－アルギニン（Ｌ－Ａｒｇｉｎｉｎｅ）及び／又は尿素（ｕｒｅａ）をさらに含んでもよい。洗浄緩衝液２としては、ｐＨ５．６程度のクエン酸及び／又は酢酸緩衝液を用いた。その後、溶出溶液として５ＣＶの分量のｐＨ３．５程度のクエン酸及び／又は酢酸緩衝液をカラムに流し、標的タンパク質を回収した（実施例２）。
【0098】
本発明のエ）前記ウ）で１次クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をマルチモーダルクロマトグラフィーにより精製するステップについては前述した通りである。
一実施例として、前記エ）マルチモーダルクロマトグラフィーにより精製するステップは、（ａ）ｐＨ６～８の緩衝液で平衡化したマルチモーダルクロマトグラフィーカラムに１次クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をローディングするステップと、（ｂ）前記（ａ）ステップのものより低いｐＨの緩衝液をクロマトグラフィーカラムに注入し、ｐＨ６～４の条件で精製タンパク質を溶出して収穫するステップとを含むが、これに限定されるものではない。
一実施例として、前記エ）マルチモーダルクロマトグラフィーにより精製するステップは、（ａ）ｐＨ６～８の緩衝液で平衡化したマルチモーダルクロマトグラフィーカラムに１次クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をローディングするステップと、（ｂ）前記（ａ）ステップのものより低いｐＨの緩衝液をクロマトグラフィーカラムに注入し、ｐＨ６～４の条件で精製タンパク質を溶出して収穫するステップとを含むが、これに限定されるものではない。
【0099】
本発明の前記エ）で陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製するステップについては前述した通りである。
一実施例として、前記陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製するステップは、（ａ）ｐＨ４～６の緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに先行クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をローディングするステップと、（ｂ）前記（ａ）ステップの緩衝液より高いｐＨの緩衝液で溶出し、ｐＩ ６．０～８．０のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を収穫するステップとを含むが、これに限定されるものではない。
一実施例として、前記陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製するステップは、（ａ）ｐＨ４～６の緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに先行クロマトグラフィーにより精製したタンパク質をローディングするステップと、（ｂ）前記（ａ）ステップの緩衝液より高いｐＨの緩衝液で溶出し、ｐＩ ６．０～８．０のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を収穫するステップとを含むが、これに限定されるものではない。
【0100】
一実施例として、前記（ｂ）ステップにおいて、（ａ）ステップの緩衝液より高いｐＨの緩衝液は、約ｐＨ５～９、約ｐＨ６～９、約ｐＨ５～８、具体的にはｐＨ６～８であるが、これらに限定されるものではない。
【0101】
一実施例として、前記ウ）及びエ）からなる群から選択される少なくとも１つのクロマトグラフィーにより精製するステップの前に、前記ステップの後に、又はそれらを組み合わせて、深層濾過ステップ、限外濾過ステップ、透析濾過ステップ及びウイルス不活化ステップからなる群から選択される少なくとも１つをさらに行うが、これに限定されるものではない。
【0102】
一実施例として、前記ウ）１次クロマトグラフィーにより精製するステップ、及びエ）マルチモーダルクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製するステップからなる群から選択される少なくとも１つのステップは、溶出ステップを含み、前記溶出ステップは、塩勾配、ｐＨ勾配又はそれらの組み合わせ、具体的にはｐＨ勾配を用いるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0103】
本発明のさらに他の態様は、本発明のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法により精製した、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【0104】
前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、その精製方法などについては前述した通りである。
本発明の組成物は、ピーク１分画物を含むものであってもよい。ここで、ピーク１分画物は、本発明のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法により精製した、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の疎水性相互作用クロマトグラフィー分析の際に、５０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０である移動相Ａ、及び５０ｍＭリン酸ナトリウム、３０％アセトニトリル、ｐＨ７．０である移動相Ｂにおいて、移動相Ｂの割合が４０～４５％の区間で溶出するものであってもよい。
本発明の組成物は、ピーク１分画物を含むものであってもよい。ここで、ピーク１分画物は、本発明のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の精製方法により精製した、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の疎水性相互作用クロマトグラフィー分析の際に、５０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０である移動相Ａ、及び５０ｍＭリン酸ナトリウム、３０％アセトニトリル、ｐＨ７．０である移動相Ｂにおいて、移動相Ｂの割合が４０～４５％の区間で溶出するものであってもよい。
【0105】
一実施例として、前記ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を含む組成物は、ピーク１分画物を５％以下の量で含むものであってもよく、０．００１％～５％含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0106】
一実施例として、ピーク１分画物は、配列番号１～配列番号４からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むものであってもよい。
本発明のさらに他の態様は、前記精製方法により精製された融合タンパク質を提供する。
本発明のさらに他の態様は、前記精製方法により精製された融合タンパク質を提供する。
【0107】
一実施例として、前記融合タンパク質はアフリベルセプトであるが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【0108】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示する好ましい実施形態にすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。なお、本明細書に記載されていない技術的事項は、本発明の技術分野又は類似技術分野における熟練した技術者が十分に理解し、容易に実施することのできるものである。
【実施例1】
【0109】
培養液の収穫及び前処理
標的タンパク質であるＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクトルを導入したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を培養することにより、培養液を準備した。融合タンパク質の代表例として、ＣＨＯ細胞には、アフリベルセプトをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを導入して培養した。
標的タンパク質であるＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクトルを導入したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を培養することにより、培養液を準備した。融合タンパク質の代表例として、ＣＨＯ細胞には、アフリベルセプトをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを導入して培養した。
【0110】
通常、培養液は、動物細胞をはじめとする不純物を含んでいる。よって、クロマトグラフィーを行う前に、深層濾過を行い、動物細胞をはじめとする不純物を除去した。この過程を経て、細胞培養収穫液（Ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌｕｉｄ； ＨＣＣＦ）を準備した。フィルター材料の表面で不純物と粒子を除去する表面濾過方式とは異なり、深層濾過を用いて粗い繊維構造と高い多孔性を有する３次元フィルターで不純物と粒子を除去する方式により、工程速度と効率性を向上させることができる。
【実施例2】
【0111】
タンパク質Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）アフィニティークロマトグラフィー精製
実施例１の前処理過程で得られた細胞培養収穫液から融合タンパク質（ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプト）を捕獲（ｄｉｒｅｃｔ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃａｐｔｕｒｅ）するために、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを行った。これは、抗体又はＦｃを有する融合タンパク質のＦｃドメインに結合する親和性リガンドを用いて精製するステップであり、ｐＨ３～５、好ましくはｐＨ３～４、より好ましくはｐＨ約３．５の緩衝液、例えばクエン酸及び／又は酢酸緩衝液を用いて、タンパク質を溶出し、回収した。
実施例１の前処理過程で得られた細胞培養収穫液から融合タンパク質（ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプト）を捕獲（ｄｉｒｅｃｔ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃａｐｔｕｒｅ）するために、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを行った。これは、抗体又はＦｃを有する融合タンパク質のＦｃドメインに結合する親和性リガンドを用いて精製するステップであり、ｐＨ３～５、好ましくはｐＨ３～４、より好ましくはｐＨ約３．５の緩衝液、例えばクエン酸及び／又は酢酸緩衝液を用いて、タンパク質を溶出し、回収した。
【0112】
そのために、約５カラム体積（ＣＶ，ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）の分量のｐＨ６～８、好ましくは約ｐＨ７のトロメタミン及び／又はリン酸ナトリウム緩衝液を滞留時間７．５分の流速でカラムに流し、樹脂を平衡化した。その後、実施例１で得られた細胞培養収穫液を平衡化したカラムに注入し、３ＣＶの平衡緩衝液でカラムを洗浄し、樹脂に吸着している不純物を除去した。その後、１０ＣＶの洗浄緩衝液１と３～５ＣＶの洗浄緩衝液２をカラムに順次流し、さらに不純物を除去した。洗浄緩衝液１としては、ｐＨ５～６．５、好ましくは約ｐＨ５．９のクエン酸及び／又は酢酸緩衝液を用いた。洗浄緩衝液１は、Ｌ－アルギニン（Ｌ－Ａｒｇｉｎｉｎｅ）及び／又は尿素（ｕｒｅａ）をさらに含んでもよい。洗浄緩衝液２としては、ｐＨ５．６程度のクエン酸及び／又は酢酸緩衝液を用いた。その後、溶出溶液として５ＣＶの分量のｐＨ３．５程度のクエン酸及び／又は酢酸緩衝液をカラムに流し、標的タンパク質を回収した。樹脂を再利用するために、標的タンパク質を回収した後に、ストリッピング緩衝液、０．１Ｍ水酸化ナトリウム、平衡緩衝液、保存緩衝液の順で洗浄を行い、次いで保管した。
【0113】
一方、本実施例のタンパク質Ａクロマトグラフィーは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂を用いて、結合・溶出モードで行った。
図１にタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて細胞培養収穫液を精製した結果を示す。
図１にタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて細胞培養収穫液を精製した結果を示す。
【実施例3】
【0114】
ウイルス不活化及び中和
タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー精製で得られた溶出液は、ｐＨ３．５±０．１に滴定して１～２時間放置することにより、潜在的ウイルスの不活化処理を行った。不活化反応後に、タンパク質溶液をｐＨ５．５±０．１の条件で中和し、微細濾過により凝集体などの不純物を除去した。
タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー精製で得られた溶出液は、ｐＨ３．５±０．１に滴定して１～２時間放置することにより、潜在的ウイルスの不活化処理を行った。不活化反応後に、タンパク質溶液をｐＨ５．５±０．１の条件で中和し、微細濾過により凝集体などの不純物を除去した。
【実施例4】
【0115】
深層濾過
深層濾過は、デプスフィルターを用いて、主に工程由来不純物を除去するステップである。
深層濾過は、デプスフィルターを用いて、主に工程由来不純物を除去するステップである。
【0116】
そのために、フィルターのホールドアップ体積（Ｈｏｌｄ－ｕｐ ｖｏｌｕｍｅ）の５倍の分量の平衡緩衝液を１５６ＬＭＨ（Ｌｉｔｅｒ／ｍ２／ｈ）の流速でフィルターに流し、平衡化を行った。平衡緩衝液としては、ｐＨ５．５程度のリン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液を用いた。平衡後に、タンパク質溶液をデプスフィルターに注入し、濾液を回収した。
【実施例5】
【0117】
マルチモーダルクロマトグラフィー
マルチモーダルクロマトグラフィーは、工程由来不純物、内毒素、潜在的ウイルスを除去するステップである。よって、ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトに対して、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂を用いて、結合・溶出モードでマルチモーダルクロマトグラフィーを行った。
マルチモーダルクロマトグラフィーは、工程由来不純物、内毒素、潜在的ウイルスを除去するステップである。よって、ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトに対して、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂を用いて、結合・溶出モードでマルチモーダルクロマトグラフィーを行った。
【0118】
そのために、１５０ｃｍ／ｈｒの流速で５ＣＶの平衡緩衝液をカラムに流し、樹脂を平衡化した。平衡緩衝液としては、ｐＨ７程度のトロメタミン及び／又はリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。その後、実施例４で得られた深層濾過回収液を注入し、５ＣＶの平衡緩衝液でカラムを洗浄した。７ＣＶの溶出緩衝液をカラムに流し、標的タンパク質を溶出し、回収した。溶出緩衝液としては、ｐＨ５程度のリン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液を用いた。樹脂を再利用するために、タンパク質を回収した後に、ストリッピング緩衝液、１Ｍ水酸化ナトリウム、平衡緩衝液、保存緩衝液の順でカラムを洗浄し、次いで保管した。図２に精製クロマトグラムの結果を示す。
【0119】
マルチモーダルクロマトグラフィーを行うと、ウイルス対数減少（Ｖｉｒｕｓ ｌｏｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）結果が得られた。その結果を実施例７の表５に示す。ここで、潜在的ウイルスにおいては、最大対数減少６以上の結果が得られ、効率的なウイルス除去効果を有することが確認された。
【実施例6】
【0120】
陽イオン交換クロマトグラフィー
陽イオン交換クロマトグラフィーは、特定の等電点範囲のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質のみ捕獲するための最終精製ステップである。
陽イオン交換クロマトグラフィーは、特定の等電点範囲のＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質のみ捕獲するための最終精製ステップである。
【0121】
そのために、１０ＣＶの平衡緩衝液を１６０ｃｍ／ｈｒの流速でカラムに流し、樹脂を平衡化した。平衡緩衝液としては、ｐＨ５程度の緩衝液を用いた。リン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液を用いることが好ましい。マルチモーダルクロマトグラフィーステップで得られた回収液を注入し、５ＣＶの平衡緩衝液でカラムを洗浄した。標的タンパク質関連物質（ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）のうち酸性度が高い分画を除去するために、ｐＨ５．９程度のリン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液を３ＣＶの分量でカラムに流し、洗浄を行った。溶出緩衝液としてｐＨ６．５程度のリン酸ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウム緩衝液１０ＣＶを用いて、標的タンパク質を回収した。最大ピークの８％までタンパク質を回収した。樹脂を再利用するために、タンパク質を回収した後に、ストリッピング緩衝液、１Ｍ水酸化ナトリウム、平衡緩衝液、保存緩衝液の順で洗浄を行い、次いで保管した。
【0122】
一方、陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーの種類とその精製条件の実験は、表１に示すように行った。
【0123】
【表1-1】
【0124】
【表1-2】
【0125】
ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトに対して、実施例５の精製ステップの後に（すなわち、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー及びマルチモーダルクロマトグラフィーの後に）、Ｃａｐｔｏ Ｓ樹脂を用いて、結合・溶出モードで陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。その結果を図３に示す。図４は図３のＣａｐｔｏ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィー精製ステップで精製及び溶出した分画の等電点電気泳動の分析結果を示す図である。図４のＬａｎｅ １、２は内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）であり、Ｌａｎｅ ３、４、５、６、７及び８はＣａｐｔｏ Ｓ溶出液の各収集区間の分析結果である。収集区間が増加しても、同等のＩＥＦ ｐａｔｔｅｒｎが生じることが確認された。
【0126】
また、ＣＨＯ細胞培養により得られた、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特にアフリベルセプトに対して、実施例５の精製ステップの後に（すなわち、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー及びマルチモーダルクロマトグラフィーの後に）、ＳＰ－５５０Ｃ樹脂を用いて、結合・溶出モードで陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。その結果を図５に示す。図６は図５のＳＰ－５５０Ｃ陽イオン交換クロマトグラフィー精製ステップで精製及び溶出した分画の等電点電気泳動（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）の分析結果を示す図である。
【0127】
一方、図７は陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた塩勾配溶出クロマトグラムである。図８は陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた塩勾配溶出の各分画における等電点電気泳動の分析結果を示す図である。塩勾配溶出においては、アイソフォーム除去により標的タンパク質の収率が低下する。
【実施例7】
【0128】
マルチモーダルクロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーの精製効率評価
マルチモーダルクロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーの精製効率を評価するために、Ｃａｐｔｏ ＡｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィーとＣａｐｔｏ Ｑ陰イオンクロマトグラフィーの結果を比較した。Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィー及びＣａｐｔｏ Ｑ陰イオンクロマトグラフィーを行うために、ＡＣ、深層濾過０１、深層濾過０２、ＨＩＣ、ＵＦ／ＤＦ、深層濾過０３を行い、その後試料を分注してＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィー及びＣａｐｔｏ Ｑ陰イオンクロマトグラフィーをそれぞれ行った。
マルチモーダルクロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーの精製効率を評価するために、Ｃａｐｔｏ ＡｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィーとＣａｐｔｏ Ｑ陰イオンクロマトグラフィーの結果を比較した。Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィー及びＣａｐｔｏ Ｑ陰イオンクロマトグラフィーを行うために、ＡＣ、深層濾過０１、深層濾過０２、ＨＩＣ、ＵＦ／ＤＦ、深層濾過０３を行い、その後試料を分注してＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィー及びＣａｐｔｏ Ｑ陰イオンクロマトグラフィーをそれぞれ行った。
【0129】
Ｃａｐｔｏ Ｑ及びＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーにより、ＩｇＧドメインを有する同一の融合タンパク質試料（特に、アフリベルセプト；実施例１～４で得られた試料）に対してそれぞれ精製を行い、それにより得られた溶出試料の残留ＨＣＰ（Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ； 不純物の一種）を分析し、各試料のＨＣＰ残存量を比較した。Ｃａｐｔｏ Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィー及びＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィーは、次の方法で行った。
【0130】
ＡＣクロマトグラフィー
深層濾過０１
深層濾過０２
疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＩＣ
ＵＦ／ＤＦ
Ｃａｐｔｏ Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィー
Ｃａｐｔｏ Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィーは、緩衝液としてＢｕｆｆｅｒ Ａ（Ｑ）（５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ ７．０）及びＢｕｆｆｅｒ Ｂ（Ｑ）（５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｐＨ ７．０）を用いて、フロースルーモードで行った。その結果を図９に示す。
深層濾過０１
深層濾過０２
疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＩＣ
ＵＦ／ＤＦ
Ｃａｐｔｏ Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィー
Ｃａｐｔｏ Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィーは、緩衝液としてＢｕｆｆｅｒ Ａ（Ｑ）（５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ ７．０）及びＢｕｆｆｅｒ Ｂ（Ｑ）（５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｐＨ ７．０）を用いて、フロースルーモードで行った。その結果を図９に示す。
【0131】
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィー
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィーは、緩衝液としてＢｕｆｆｅｒ Ａ（Ａｄ）（５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ ７．０）、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（Ａｄ）（５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ ５．０）及びＢｕｆｆｅｒ Ｃ（Ａｄ）（２０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｐＨ ２．０）を用いて、同一の試料をローディングする条件にて、結合・溶出モード（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で行った。その結果を図１０に示す。
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィーは、緩衝液としてＢｕｆｆｅｒ Ａ（Ａｄ）（５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ ７．０）、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（Ａｄ）（５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ ５．０）及びＢｕｆｆｅｒ Ｃ（Ａｄ）（２０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１５０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｐＨ ２．０）を用いて、同一の試料をローディングする条件にて、結合・溶出モード（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で行った。その結果を図１０に示す。
【0132】
Ｃａｐｔｏ Ｑクロマトグラフィー及びＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーで溶出した各試料の残留ＨＣＰ（Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ＣＨＯ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｔ（ＧＹＧＮＵＳ，Ｆ５５０）を用いて分析した。その分析結果を図１１に示す。また、表２はＨＩＣ（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＡＥＸ（Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）工程を含む各精製ステップで得られた残留ＨＣＰの結果値を示す表である。さらに、表３はマルチモーダルクロマトグラフィー工程を含む各精製ステップで得られた残留ＨＣＰの結果値を示す表である。ＨＣＰの結果値は、ＣＨＯ細胞のＨＣＰをＥＬＩＳＡ方法で検出する米国Ｃｙｇｎｕｓ社製品を用いて測定した。
【0133】
【表2】
【0134】
【表3】
【0135】
表２及び表３に示すように、表２の工程（陰イオン交換クロマトグラフィー利用）においては、深層濾過を２回行ってＨＣＰを低下させることができたのに対して、表３の工程（マルチモーダルクロマトグラフィー利用）においては、深層濾過を１回だけ行ってもＨＣＰを低下させることができた。
【0136】
表４は各精製ステップにおけるＨＣＰ、ＨＣＤ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ溶出液及びエンドトキシン含有量を示す表である。また、表５は各精製方法におけるウイルス残留量を示す表である。
【0137】
ＨＣＰは、ＣＨＯ細胞のＰｒｏｔｅｉｎをＥＬＩＳＡ方法で検出する米国Ｃｙｇｎｕｓ社製品を用いて測定し、ＨＣＤは、ＣＨＯ細胞のＤＮＡをＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）方法で検出するＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品を用いて測定した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ溶出液（ｌｅａｃｈａｔｅ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂のリガンドが溶出する含有量をＥＬＩＳＡ方法で検出するＲｅｐｌｉｇｅｎ社製品を用いて測定した。エンドトキシン含有量は、製品に含まれるエンドトキシンの含有量を米国薬局方の方法により検出するＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社製品を用いて測定した。
【0138】
ＬＲＶは、各工程がウイルスを除去する工程であるか否かを確認するために、所定量のウイルスを注入して各工程を行い、その後ウイルスの残量を測定するものであり、公知の方法を用いた。
【0139】
表５のＬｏｗ ｐＨ ｔｒｅａｔｍｅｎｔは実施例３の工程を示し、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅは実施例５の工程を示し、ウイルスフィルター（Ｖｉｒｕｓ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は実施例６以降に行う工程を示す。
【0140】
【表4】
【0141】
【表5】
【実施例8】
【0142】
精製アフリベルセプトのＯｘｉｄａｔｉｏｎ／Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ／Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ分析
本発明の方法により精製したアフリベルセプト試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ １）と市販のアフリベルセプト試料（Ａｆ；ｉｂｅｒｃｅｐｔ ２）を用いて、それらの酸化、脱アミド及び脱水を分析した。
本発明の方法により精製したアフリベルセプト試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ １）と市販のアフリベルセプト試料（Ａｆ；ｉｂｅｒｃｅｐｔ ２）を用いて、それらの酸化、脱アミド及び脱水を分析した。
【0143】
実施例１～６で得られた精製アフリベルセプト試料１ｍｇと１Ｍジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）１０ｕｌを混合した変性緩衝剤（７Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，０．２５ Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ８．４）を１ｍｌに調製し、３７℃で１時間反応させてタンパク質試料を還元した。その後、１Ｍヨードアセトアミド（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）１０ｕｌを前述したように還元した溶液に添加し、１時間反応させてアルキル化（Ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ）した。遠心フィルターチューブ（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｔｕｂｅ）を用いて、緩衝液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に置換し、前述したように作製した試料５０ｕｌと１ｍｇ／ｍＬトリプシン（Ｔｒｙｓｉｎ）２ｕｌを混合し、３７℃で１８時間反応させてタンパク質をペプチドに分解した。このようにして得られた各試料のペプチド試料は、ＲＰ－ＵＰＬＣ（Ｒｅｖｅｒｓｅ－ｐｈａｓｅ ｕｌｔｒａｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，米国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）及びＱ－ＴＯＦ（Ｏｎｌｉｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，米国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）によりＬＣ－ＭＳ分析及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析をそれぞれ行い、その結果をＢｙｏｎｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ（米国Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ社）により分析した。
【0144】
酸化（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の分析結果は、酸化されるアミノ酸の種類によって、メチオニン残基の酸化の分析結果（１０、１６３、１９２及び２３７番目のアミノ酸）を図１２に示し、ヒスチジン残基の酸化の分析結果を図１３（１９、２０９及び２５３番目のアミノ酸）に示す。脱アミド（Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）及び脱水（Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）の分析結果は、それぞれ図１４及び図１５に示す（８４、９１、９９、１５２、１８０、２６１、２７１、３００、３４６、３６９、３７４及び３７５番目のアミノ酸、及び２、４７、５２、１０２、１７３、１７９、２３４、２５０、２５５、２７９、３４１、３８４、３８６、３９８番目のアミノ酸）。
【0145】
図１２及び図１３に示すように、酸化（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）はほとんどメチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）残基において発生し、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）残基において一部観察されたが、トリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）残基においては観察されなかった。
【0146】
メチオニン酸化部位は、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ＃１０（Ｍ１０）、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ＃１６３（Ｍ１６３）、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ＃１９２（Ｍ１９２）及びＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ＃２３７（Ｍ２３７）の４つのアミノ酸残基において観察された。酸化の程度は全て１０％以下であり、本発明の方法により精製した試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ １）と市販の試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ ２）において同程度の結果が得られた。
【0147】
ヒスチジン酸化部位は、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ＃１９（Ｈ１９）、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ＃２０９（Ｈ２０９）及びＨｉｓｔｉｄｉｎｅ ＃２５３（Ｈ２５３）の３つのアミノ酸残基において観察された。酸化の程度は全て０．５％以下であり、本発明の方法により精製した試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ １）と市販の試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ ２）において同程度の結果が得られた。
【0148】
図１４に示すように、脱アミド（Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）は、アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）及びグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）残基において一部観察された。脱アミド部位は、Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ＃８４（Ｎ８４）、Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ＃９１（Ｎ９１）、Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ＃９９（Ｎ９９）、Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ＃１５２（Ｎ１５２）、Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ＃１８０（Ｑ１８０）、Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ＃２６１／＃２７１（Ｎ２６１／Ｎ２７１）、Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ＃３００（Ｎ３００）、Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ＃３４６（Ｎ３４６）及びＡｓｐａｒａｇｉｎｅ ＃３６９／＃３７４／＃７５３（Ｎ３６９／Ｎ３７４／Ｎ７５３）の９つのアミノ酸残基において観察された。Ｎ２６１／Ｎ２７１、Ｎ３６９／Ｎ３７４／Ｎ７５３は、併記されている位置のアスパラギン残基のいずれか１つで脱アミドが生じたことは確認されたが、正確にどの残基であるかまでは分析していない。これらのうち、Ｎ８４の脱アミドの程度が１２．８％及び１１．４％であることを除いて、全て１０％以下であり、本発明の方法により精製した試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ １）と市販の試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ ２）において同程度の結果が得られた。
【0149】
図１５に示すように、脱水（Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）は、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）残基において一部観察された。脱水部位は、Ａｓｐａｒｔａｔｅ ＃２（Ｄ２）、Ａｓｐａｒｔａｔｅ ＃３９（Ｄ３９）、Ａｓｐａｒｔａｔｅ ＃４７／＃５２（Ｄ４７／Ｄ５２）、Ａｓｐａｒｔａｔｅ ＃１０２（Ｄ１０２）、Ａｓｐａｒｔａｔｅ ＃１７３（Ｄ１７３）、Ａｓｐａｒｔａｔｅ ＃１７９（Ｄ１７９）、Ａｓｐａｒｔａｔｅ ＃２３４（Ｄ２３４）、Ａｓｐａｒｔａｔｅ ＃２５０／＃２５５（Ｄ２５０／Ｄ２５５）、Ａｓｐａｒｔａｔｅ ＃２９７（Ｄ２９７）、Ａｓｐａｒｔａｔｅ ＃３４１（Ｄ３４１）及びＡｓｐａｒｔａｔｅ ＃３８４／＃３８６（Ｄ３８４／３８６）の１１のアミノ酸残基において観察された。脱水の程度は全て１０％以下であり、本発明の方法により精製した試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ １）と市販の試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ ２）において同程度の結果が得られた。
【0150】
上記結果は、本発明の方法により精製したアフリベルセプト試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ １）と市販のアフリベルセプト試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ ２）がどちらも同様の傾向を示すので、本発明の精製方法も効果的にアフリベルセプトを精製できることを示唆するものである。
【実施例9】
【0151】
精製アフリベルセプトの疎水性相互作用クロマトグラフィー及び各分画分析
本発明の方法により精製したアフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ １）と市販の精製アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ ２）の疎水性相互作用クロマトグラフィー分析を行った。移動相Ａの組成は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０とし、移動相Ｂの組成は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３０％アセトニトリル、ｐＨ７．０とした。分析カラムはＴＳＫＧｅｌ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－５ＰＷ（ＴＯＳＯＨ，Ｃａｔ Ｎｏ．０００７５７３）であり、分析条件は、カラムオーブン温度３０℃にて、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で移動相Ｂの割合を０％から９０％に高めて１５分間溶出させるものとした。この分析には、本発明の方法により精製したアフリベルセプト試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ １）と市販のアフリベルセプト試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ ２）を用いた。表６の精製アフリベルセプトの疎水性相互作用クロマトグラフィーの各分画における割合に示すように、２つのアフリベルセプト試料において同程度の結果が得られた。Ｐｅａｋ １は移動相Ｂの割合が４０～４５％の区間で溶出し、Ｐｅａｋ ２は移動相Ｂの割合が５０～５５％の区間で溶出し、Ｐｅａｋ ３は移動相Ｂの割合が７０～８０％の区間で溶出した。
本発明の方法により精製したアフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ １）と市販の精製アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ ２）の疎水性相互作用クロマトグラフィー分析を行った。移動相Ａの組成は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０とし、移動相Ｂの組成は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３０％アセトニトリル、ｐＨ７．０とした。分析カラムはＴＳＫＧｅｌ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－５ＰＷ（ＴＯＳＯＨ，Ｃａｔ Ｎｏ．０００７５７３）であり、分析条件は、カラムオーブン温度３０℃にて、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で移動相Ｂの割合を０％から９０％に高めて１５分間溶出させるものとした。この分析には、本発明の方法により精製したアフリベルセプト試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ １）と市販のアフリベルセプト試料（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ ２）を用いた。表６の精製アフリベルセプトの疎水性相互作用クロマトグラフィーの各分画における割合に示すように、２つのアフリベルセプト試料において同程度の結果が得られた。Ｐｅａｋ １は移動相Ｂの割合が４０～４５％の区間で溶出し、Ｐｅａｋ ２は移動相Ｂの割合が５０～５５％の区間で溶出し、Ｐｅａｋ ３は移動相Ｂの割合が７０～８０％の区間で溶出した。
【0152】
【表6】
【0153】
ＨＩ－ＨＰＬＣ分析で観察されたＰｅａｋ １及びＰｅａｋ ２分画のタンパク質において、ＬＣ－ＭＳにより還元型（Ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｒｍ）及び脱グリコシル型（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｆｏｒｍ）のＩｎｔａｃｔ ｍａｓｓ分析を行った。Ｐｅａｋ １分画のＩｎｔａｃｔ ｍａｓｓの分析の結果、表７の精製アフリベルセプトの疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるＰｅａｋ １分画のタンパク質断片（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）の分析結果に示すアミノ酸配列を有するタンパク質断片が分析された。それらのうち、２０２－４３１ ｐｅｐｔｉｄｅがＭａｊｏｒ ｆｏｒｍであるものと分析され（ｐｅａｋ １－ｄ）、それは、ＶＥＧＦＲ１ ｄｏｍａｉｎ ２部分とＶＥＧＦＲ２ ｄｏｍａｉｎ ３部分がほとんど欠失した型であるものと予想される。Ｐｅａｋ ２分画は、さらにＰｅａｋ ２－１、Ｐｅａｋ ２－２、Ｐｅａｋ ２－３に分けられるが、当該分画のＩｎｔａｃｔ ｍａｓｓの分析結果においては差がなかった。
【0154】
【表7】
【0155】
ＨＩ－ＨＰＬＣ分析で観察されたＰｅａｋ １及びＰｅａｋ ２分画のタンパク質において、ＬＣ－ＭＳにより翻訳後修飾（Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）分析を行った。表８の精製アフリベルセプトの疎水性相互作用クロマトグラフィー分画のＤｅａｍｉｄａｔｉｏｎの分析結果に示すように、アスパラギン残基の脱アミドにおいて、Ｐｅａｋ １分画とＰｅａｋ ２分画に差がなく、同等であると分析された。
【0156】
【表8】
【0157】
表９の精製アフリベルセプトの疎水性相互作用クロマトグラフィー分画のＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎの分析結果に示すように、メチオニン残基の酸化において、Ｐｅａｋ ２分画のタンパク質に比べて、Ｐｅａｋ １分画のタンパク質が約２～３倍多く酸化されたことが確認された。Ｔ１ ｐｅｐｔｉｄｅのＭ１０／Ｍ２０と、Ｔ２８ペプチドのＭ２３７の両方において、酸化が増加した。
【0158】
【表9】
【実施例10】
【0159】
精製アフリベルセプトの疎水性相互作用クロマトグラフィー及び各分画のＡｎｔｉ－ＶＥＧＦ ｂｉｏａｓｓａｙ分析
ＨＩ－ＨＰＬＣ分析において観察されたＰｅａｋ １及びＰｅａｋ ２分画のタンパク質の活性を評価するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ Ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ｂｉｏａｓｓａｙ（米国Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ社）を行った。ＶＥＧＦに反応するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ細胞と精製アフリベルセプトの疎水性相互作用クロマトグラフィーの各分画を培養液に混合し、ＶＥＧＦの結合にいかなる影響を及ぼすかを標準品と比較し、各分画の活性を測定した。
ＨＩ－ＨＰＬＣ分析において観察されたＰｅａｋ １及びＰｅａｋ ２分画のタンパク質の活性を評価するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ Ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ｂｉｏａｓｓａｙ（米国Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ社）を行った。ＶＥＧＦに反応するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ細胞と精製アフリベルセプトの疎水性相互作用クロマトグラフィーの各分画を培養液に混合し、ＶＥＧＦの結合にいかなる影響を及ぼすかを標準品と比較し、各分画の活性を測定した。
【0160】
Ｐｅａｋ １分画において分析された相対力価が６．６％であったので、ＶＥＧＦＲ ｄｏｍａｉｎの欠失により活性が低下することが確認された。Ｐｅａｋ ２分画において分析された相対力価が維持されていたので、活性が低下しないことが確認された。
【0161】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれる変更又は変形された形態が全て含まれるものと解釈すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】