特表 2024-539138 多価効果を持つペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】多価効果を持つペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/745 20060101AFI20241018BHJP

【ＦＩ】

C07K14/745 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024523623

(86)(22)【出願日】2022-10-21

(85)【翻訳文提出日】2024-05-29

(86)【国際出願番号】 EP2022079429

(87)【国際公開番号】W WO2023067167

(87)【国際公開日】2023-04-27

(31)【優先権主張番号】21204274.1

(32)【優先日】2021-10-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522243624

【氏名又は名称】イントゥーキュア エービー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】シュミッチェン，アルトゥール

(72)【発明者】

【氏名】ペットラック，ガンナ

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045CA42

4H045EA20

4H045FA20

(57)【要約】

本発明は、２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの内部共有結合を含むトロンビン由来ペプチドに関する。ペプチドは抗炎症作用を有する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１のトロンビン由来の１０～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含むペプチドであって、
ｉ）１０～４０個のアミノ酸の全長を有し、
ｉｉ）２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの内部共有結合を含み、ここで前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、
ｉｉｉ）さらに少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含み、
ただし、前記ペプチドが、２４～４０個のアミノ酸の全長を有する場合は、２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも２つの内部共有結合を含み、第１の内部共有結合の前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、第２の内部共有結合の前記アミノ酸は、Ｘ_３及びＸ_４で示される、前記ペプチド。

【請求項2】

前記ペプチドが、少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｒ２４５、Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含む、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

前記ペプチドが、１０～２３個のアミノ酸の全長を有する、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項4】

前記ペプチドが、１３～２３個のアミノ酸の全長を有する、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項5】

前記ペプチドが、アミノ酸配列：
－Ｕ－Ｕ－（Ｚ）_ｎ－Ｉ－Ｑ－Ｋ－Ｖ－Ｉ－Ｄ－Ｑ－（Ｚ）_ｍ－
を含むか、またはそれからなり、式中、
各Ｚは、個別に任意の標準アミノ酸であり、
Ｕは、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
ｎは、０～１０の範囲の整数であり、
ｍは０～５の範囲の整数であり、
前記アミノ酸のうちの２つは、アルケニル化アミノ酸に置換されており、その側鎖は、共有結合によって結合されている、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項6】

アミノ酸Ｘ_１が、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２が、ｎ＋３位、またはｎ＋４位、またはｎ＋５位、またはｎ＋６位、またはｎ＋７位、またはｎ＋８位、またはｎ＋９位、またはｎ＋１０位、またはｎ＋１１位に位置し、式中、ｎは、２～１８の範囲の整数である、請求項１に記載のペプチド。

【請求項7】

前記ペプチドの配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合、
ａ）Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＡｒｇ１１と一致しないこと、
ｂ）Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しないこと、
ｃ）Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しないこと、
ｄ）Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１８と一致しないこと、及び
ｅ）Ｘ_１が配列番号１２のＬｙｓ１８と一致する場合、Ｘ_２は、Ｇｌｎ２２と一致しないことを条件とする、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項8】

前記共有結合が、炭化水素ステープルである、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項9】

Ｘ_１及びＸ_２が、２つのα－置換アルケニルアミノ酸及び／またはα，α－二置換アルケニルアミノ酸などの２つのＣ－アルケニル化アミノ酸などのアルケニル化アミノ酸であり、前記共有結合が、前記アルケニル残基間に形成されるオレフィンテザーである、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項10】

Ｘ_３及びＸ_４がラクタム架橋によって共有結合しており、場合により、前記ラクタム架橋が、Ｘ_３のＮ末端アミン基とＸ_４の側鎖カルボン酸との間に形成される、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項11】

Ｘ_１及び／またはＸ_２が、テザーによって連結されており、前記テザーが、Ｃ－アルファ炭素から数えて１０個の炭素原子のアルケン鎖である、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項12】

前記内部炭化水素ステープルが、２つの（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンを結合することによって形成される、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項13】

前記ペプチドが、１４～２２個のアミノ酸長、例えば１３～１８個のアミノ酸長、例えば１５～２１個のアミノ酸長、例えば１６～２０個のアミノ酸長、例えば１７～２０個のアミノ酸長を有する、先行請求項のいずれか１項の記載のペプチド。

【請求項14】

前記ペプチドが、前記ペプチドの末端またはその近くに挿入された１～５個、例えば１～４個、例えば１～３個、例えば１～２個、例えば２個の正に荷電したアミノ酸をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項15】

前記ペプチドが、前記Ｎ末端またはその近く、例えば、前記ペプチドのＮ末端に対して１、２及び／または３位から選択される位置に挿入されている、２個の正に荷電したアミノ酸を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項16】

前記ペプチドが、配列番号１のトロンビンの１５～２０個の範囲の連続アミノ酸からなり、２個のアミノ酸が、内部炭化水素ステープルを形成するアルケニル化アミノ酸で置換されており、２～５個の範囲の追加のＮ末端アミノ酸である、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項17】

前記ペプチドが、
ｉ）配列番号３、
ｉｉ）配列番号４、
ｉｉｉ）配列番号５、
ｉｖ）配列番号６、
ｖ）配列番号７、
ｖｉ）配列番号８、
ｖｉｉ）配列番号９、
ｖｉｉｉ）配列番号１０、
ｉｘ）配列番号１１、
ｘ）配列番号１４、
ｘｉ）配列番号１７、
ｘｉｉ）配列番号１８、
ｘｉｉｉ）配列番号１９、
ｘｉｖ）配列番号２０、
ｘｖ）配列番号２１、
ｘｖｉ）配列番号２２、
ｘｖｉｉ）配列番号２３、
ｘｖｉｉｉ）配列番号２４、
ｘｉｘ）配列番号２５、または
ｘｘ）配列番号２６
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、共有結合によって結合されたアミノ酸であり、Ｘ_３及びＸ_４は、共有結合によって結合されたアミノ酸である、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項18】

前記ペプチドが、
ｉ）配列番号３、
ｉｉ）配列番号５、
ｉｉｉ）配列番号６、または
ｉｖ）配列番号７
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合されており、場合により、Ｘ_１及びＸ_２は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンであり、その側鎖は、互いに反応してアルケニルテザーを形成しており、さらに場合により、Ｘ_１及びＸ_２は、Ａｌａであり、その側鎖は、１つの二重結合を含むＣ_８アルケニルテザーによって互いに共有結合している、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項19】

前記ペプチドが、
ｉ）配列番号３、または
ｉｉ）配列番号５
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンであり、その側鎖は、互いに反応してアルケニルテザーを形成しており、場合により、Ｘ_１及びＸ_２は、Ａｌａであり、その側鎖は、１つの二重結合を含むＣ_８アルケニルテザーによって互いに共有結合している、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項20】

前記ペプチドが、インビトロでＬＰＳ刺激血液中のＴＮＦ－α放出を５０％減少させるペプチド濃度において、新鮮な全血中、最大１０％、好ましくは最大５％の溶血活性を有する、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項21】

医薬として使用するための、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項22】

炎症及び／または感染症の治療及び／または予防を必要とする個体における、炎症及び／または感染症の治療及び／または予防の方法で使用するための、先行請求項のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項23】

前記ペプチドが、急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性鼻炎、その他の種類の鼻炎、血管炎、血栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、胃腸炎、及び肺炎症からなる群から選択される疾患の治療または予防の方法で使用するためのものである、請求項２２に記載のペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、炎症及び／または感染症の治療のためのペプチドの分野に属する。特に、本発明は、良好な安定性、高い抗炎症活性及び／または抗菌活性を有するペプチドを提供する。

【背景技術】

【0002】

Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）によるリポ多糖（ＬＰＳ）の感知は、感染症に対する初期反応において重要であり、その後のＮＦ－κＢ活性化は、サイトカイン、ケモカインの放出、及びその後の有害な止血障害を含む、敗血症やＡＲＤＳに関連するさまざまな生物学的影響を引き起こし、凝固因子や他のメディエーターの消費につながる。興味深いことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の主要な細胞外タンパク質であるスパイク糖タンパク質は、インビトロ及び動物モデルでＬＰＳ反応を促進し、ＣＯＶＩＤ－１９で見られるＡＲＤＳの分子的説明を提供し（Ｐｅｔｒｕｋ ｅｔ ａｌ．，ＪＭＣＢ，２０２０）、制御されていないＬＰＳ反応は、局所的な過剰な炎症を引き起こすだけでなく、感染症に対する重度の全身反応も引き起こす。したがって、ＬＰＳの感知は初期の宿主防御反応にとって重要であるが、過度の炎症及び臓器損傷を避けるためには、この分子のクリアランスと制御が重要である。

【0003】

抗生物質及び抗ウイルス薬に基づく現在の治療法は微生物のみを標的としており、敗血症で見られるような、それに伴う免疫応答の過剰活性化は標的としていない。これは米国単独では主な死因であり、毎年推定７０万人以上の症例があり、敗血症性ショック患者の死亡率は３０～５０％となっている。したがって、細菌だけでなく過剰な免疫応答も標的とする、自然界独自の生来の防御戦略に基づいた治療概念は、大きな治療の可能性を有し得る。約２ｋＤａのトロンビン由来Ｃ末端ペプチド（ＴＣＰ）は、インビトロ及びインビボで抗エンドトキシン機能を発揮することが実証されている。このような小さなペプチドは、宿主防御ペプチド（ＨＤＰ）の多様なファミリーに属しており、これには好中球由来α－ディフェンシン及びカテリシジンＬＬ－３７を含み、全て免疫調節活性を示すことが知られている。天然ＴＣＰの配列を包含するＴＣＰ－２５（配列番号１２）は、実験動物モデルにおいて、主に全身性サイトカイン反応の低下を介して、インビトロでＬＰＳを中和し、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ敗血症及びＬＰＳ媒介性ショックから保護することを示している（Ｋａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，２０１１）。

【0004】

ＴＣＰ－２５はＬＰＳに結合し、単球及びマクロファージと直接相互作用し、ＣＤ１４シグナル伝達及びＴＬＲ４／ＭＤ２二量体化を妨げ、その結果、微生物由来のアゴニスト及び無傷の細菌に反応したＴＬＲ４及びＴＬＲ２誘発性のＮＦ－κＢ活性化を阻害する（Ｓａｒａｖａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ，２０１８）。ＴＣＰは、細菌膜及びＬＰＳとの相互作用とは別に、ＣＤ１４のＬＰＳ結合溝にも結合する（Ｓａｒａｖａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ，２０１８）。ＴＣＰが、ＬＰＳ及びＣＤ１４に対してすべてμＭの範囲にある複数の比較的弱い親和性を発揮するという事実により、感染症に対する宿主応答の調節が可能になる。多価性、複数の標的、高いオフレート、及びμＭレベルのＫ_ｄ値によって定義される一過性薬剤と多くの特徴を共有していることから、ＴＣＰは、自然にインスピレーションを得た新規抗炎症療法の開発において興味深い。

【0005】

しかし、多くのペプチドベースの治療薬と同様に、ＴＣＰ－２５は内因性プロテアーゼによって分解される（Ｐｕｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。全身投与または吸入投与が必要な敗血症やＡＲＤＳなどの疾患の場合、急速に分解されるペプチドは非常に大量の投与と頻繁な投与が必要となるであろう。さらに、薬理学的な観点からは、その標的受容体であるＣＤ１４に対する向上した親和性が所望され、これにより必要な有効濃度が低減されるであろう。最後に、ＴＣＰ－２５は高濃度でオリゴマー及び凝集体を形成するため、薬物送達の観点からは溶解度の向上が利点となるであろう。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、以下の１つ以上を含むいくつかの有利な特性を有するペプチドを提供する：
・高いインビボ安定性
・ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエラスターゼ（ＰＥ）、及び／またはトリプシンなどのプロテアーゼの存在下での増加した安定性
・高い抗炎症活性（例えば、ＴＮＦ－α及び／またはＩＬ－１βなどの炎症性サイトカインの減少した放出、または減少したＮＦ－κＢ活性によって決定される）
・抗菌活性、例えば、グラム陰性菌及び／またはグラム陽性菌に対する殺菌活性
・血液中の低い溶血活性
・赤血球に対する低い溶血活性
・低毒性

【0007】

特に、本発明のペプチドは、ペプチドが高い抗炎症活性を有する濃度では、血液中で低い溶血活性を有する。

【0008】

本発明の好ましいペプチドは、前述の特性をすべて有する。高いインビボ安定性、プロテアーゼに対する増加した安定性、及び低い溶血活性により、本発明のペプチドは、全身投与に特に有用となる。特に、本発明は、高い抗炎症活性を有する濃度において、赤血球（ＲＢＣ）に対して低い溶血活性を有するペプチドを提供する。

【0009】

より具体的には、本発明のペプチドはトロンビン由来ペプチドに基づいており、その構造は２つの非隣接アミノ酸間の共有結合によってロックされている。興味深いことに、本発明のペプチドは、前述の有利な特性のいくつか、好ましくはすべてを有する。トロンビン由来の直鎖ペプチドの多くは、抗炎症活性と抗菌活性の両方を有するが、一般にインビボ安定性が低い。

【0010】

安定化された構造を有する本発明のペプチドは、一般にらせん構造（複数可）を含む。これらは、安定化されたプロテアーゼ耐性構造を有し、抗菌活性を発揮し、一般に向上した抗炎症効果を有し得る。したがって、本発明のペプチドは、興味深い主要な抗炎症ペプチド模倣物である。一般に、本ペプチドは天然のＴＣＰと比較してオリゴマー化する傾向が低い。薬剤のオリゴマー化はよく知られた現象であり、凝集を引き起こし、効果を低下させ、遅延免疫反応のリスクを高める可能性がある。したがって、本発明のペプチドは、一般に有意に少ないオリゴマー化を示し、これは薬剤の観点から有利である。

【0011】

内因性ＴＣＰ ＨＶＦ１８は、低いｐＨでＬＰＳに対してより高い親和性を発揮する。本発明の好ましいペプチドは、例えば、カチオン性Ｋ残基及びＲ残基の付加により、Ｎ末端の増大した極性及び電荷を有する。本発明は、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、生物物理学、質量分析、微生物学、細胞、及びインビボ研究の組み合わせを利用して、毒性が高く、低下した抗炎症活性を有する、より長いカチオン性ストレッチを持つペプチドとは対照的に、電荷の増加、特に電荷が＋２増加することが最適な効果及び高い治療指数をもたらし得ることを示している。

【0012】

ペプチドをステープル化すると、そのタンパク質分解安定性を向上させ得るが、驚くべきことに、特定のトロンビン由来ペプチドをステープル化すると、望ましくない効果も引き起こす。例えば、ＧＫＹ２５を単一の位置でステープル化すると、高い溶血活性を持つペプチドの生成をもたらし、これは望ましくない。ＧＫＹ２５を単一の位置でステープル化するとさらに、ステープル化されていないＧＫＹ２５と比較して抗炎症効果が低下したペプチドをもたらす。

【0013】

驚くべきことに、本発明は、ＧＫＹ２５などのより長いペプチドとは対照的に、１３～２３個のアミノ酸などの全長１０～２３個のアミノ酸を有するより短いトロンビン由来ペプチドが、前述の有利な特性のほとんど、及びしばしばすべてを有することを開示する。

【0014】

さらに、本発明は、少なくとも２つの位置で２４～４０アミノ酸の長さを有するより長いトロンビン由来ペプチドをステープル化することにより、前述の有利な特性のいくつかを有するペプチドを与えることを開示する。

【0015】

本発明はさらに、追加の正に荷電したアミノ酸を含むペプチドが、さらに優れた抗炎症効果を有することを示す。

【0016】

さらに、本発明のペプチドは、抗凝固活性も有し得る。本発明は、追加の正に荷電したアミノ酸を含むペプチドが、さらに優れた抗凝固活性を有し得ることを示す。

【0017】

本発明は、最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１のトロンビン由来の１０～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含むペプチドを提供し、前記ペプチドは、
ｉ）１０～４０個のアミノ酸の全長を有し、
ｉｉ）２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの内部共有結合を含み、ここで前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、
ｉｉｉ）さらに少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含み、
ただし、ペプチドが、２４～４０個のアミノ酸の全長を有する場合は、２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも２つの内部共有結合を含み、第１の内部共有結合のアミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、第２の内部共有結合のアミノ酸は、Ｘ_３及びＸ_４で示される。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】異なるプロテアーゼによる、異なる時間の長さの無傷のペプチド及び消化ペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥ。３つの独立した実験からの１つの代表的な画像を示す（ｎ＝３）。

【図2】ａ）漸増濃度の直鎖及びステープル化ＧＫＹ２５の存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２０時間後の、ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ－ＣＤ１４レポーター細胞におけるＮＦ－κＢ活性化及び細胞生存率。結果は、４回の実験の平均値±ＳＤとして表示される（ｎ＝４）。有意性は、通常の二元配置分散分析、その後のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用したＴｕｋｅｙの多重比較検定によって確立した。ｂ）漸増濃度のＧＫＹ２５及びｓＧＫＹ２５の存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２４時間後の、ヒト血液から放出されたサイトカイン。結果は、平均値±ＳＥＭとして表示される。毎回異なるドナーからの血液を使用した（ｎ＝４）。有意性は、通常の二元配置分散分析、その後のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用したＴｕｋｅｙの多重比較検定によって確立した。

【図3】左パネル：漸増濃度のＨＶＦ１８及びｓＨＶＦ１８の存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２０時間後の、ＴＨＰ－１単球におけるＮＦ－κＢ活性化及び細胞生存率。結果は、４回の実験の平均値±ＳＤとして表示される（ｎ＝４）。有意性は、通常の二元配置分散分析、その後のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用したＴｕｋｅｙの多重比較検定によって確立した。右パネル：漸増濃度のＨＶＦ１８及びｓＨＶＦ１８の存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２４時間後の、ヒト血液からの放出されたサイトカイン。結果は、平均値±ＳＥＭとして表示される。毎回異なるドナーからの血液を使用した（ｎ＝４）。有意性は、通常の二元配置分散分析、その後のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用したＴｕｋｅｙの多重比較検定によって確立した。

【図4】ヒートマップは、赤血球（ＲＢＣ）または全血におけるペプチドの溶血活性を示す。数字は溶血活性％を示す。データは、３つの独立した実験の平均として表示され、それぞれの実験は、異なるドナーからの血液を使用して実行した（ｎ＝３）。Ａ）ＧＫＹ２５及びｓＧＫＹ２５、Ｂ）ＨＶＦ１８及びｓＨＶＦ１８。

【図5】ペプチドの抗炎症活性に対するステープル化の効果を示す。ａ、ＭＳＴによって得られた、ＮａＣｌの存在下または非存在下でのＣＤ１４とＧＫＹ２５、ＨＶＦ１８またはｓＨＶＦ１８の間の代表的な結合曲線。ＫｄはＭＳＴ曲線から計算した。データは、６つの異なる測定値の平均±ＳＤとして表示される（ｎ＝６）。有意性は、通常の一元配置分散分析、その後のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用したＴｕｋｅｙの多重比較検定によって確立した。

【図6】直鎖及びステープル化ＨＶＦ１８の抗炎症活性を示す。ａ、１０μＭの直鎖及びステープル化ＨＶＦ１８の存在または非存在で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ（ＬＰＳ_Ｅｃ）、１μｇ ｍＬ^－１のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＬＴＡ（ＬＴＡ_Ｓａ）、１μｇ ｍＬ^－１Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＧＮ（ＰＧＮ_ＥＢ）、１μｇ ｍＬ^－１Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ（ＰＧＮ_Ｓａ）、１０μｇ ｍＬ^－１Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｚｙｍｏｓａｎ（Ｚｙｍ_Ｓｃ）で刺激してから２０時間後のＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ－ＣＤ１４レポーター細胞におけるＮＦ－κＢの活性化と細胞生存率。結果は、４回の実験の平均値±ＳＤとして表示される（ｎ＝４）。有意性は、通常の一元配置分散分析、その後のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によって確立した。

【図7】血液中の直鎖及びステープル化ＨＶＦ１８の抗炎症活性を示す。ａ）漸増用量のＨＶＦ１８またはｓＨＶＦ１８と混合した１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２４時間後のヒト血液から放出されたサイトカイン。ｂ）１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで３０分間刺激し、その後、漸増用量のＨＶＦ１８またはｓＨＶＦ１８とインキュベートした、刺激から２４時間後の、ヒト血液から放出されたサイトカイン。結果は、平均±ＳＥＭとして表示される。毎回異なるドナーからの血液を使用した（ｎ＝４）。有意性は、通常の二元配置分散分析、その後のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用したＴｕｋｅｙの多重比較検定によって確立した。

【図8a】実験マウスモデルにおけるエンドトキシン反応に対するステープル化ペプチドの効果を示す。ＮＦ－κＢレポーターマウスにおけるＩＶＩＳによる代表的なインビボ炎症イメージング。トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－κＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポーターマウスの背中に皮下注射する直前に、ＨＶＦ１８またはｓＨＶＦ１８をＬＰＳと混合した。インビボイメージングは、皮下沈着後３、６、２４時間でＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍバイオイメージングシステムを使用して取得した。棒グラフは、これらのマウスから放出される測定された生物発光強度を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝８各群）として表示される。Ｐ値は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用して決定した。

【図8b】実験マウスモデルにおけるエンドトキシン反応に対するステープル化ペプチドの効果を示す。腹腔内投与（ｉ．ｐ．）による致死未満量のＬＰＳで刺激し、その後、ｓＨＶＦ１８ｉ．ｐ．で処理したＣ５７ＢＬ／６マウスから８時間後及び２０時間後に採取した血漿からのサイトカイン放出。データは、平均±ＳＥＭとして表示される（各丸は１匹のマウスを表す）。Ｐ値は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定に続いて通常の一元配置分散分析を使用して決定した。

【図9】実験マウスモデルにおけるエンドトキシン反応に対する直鎖及びステープル化ペプチドの効果を示す。ＮＦ－κＢレポーターマウスにおけるＩＶＩＳによる代表的なインビボ炎症イメージング。トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ Ｔｇ（ＮＦ－κＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポーターマウスの背中に皮下注射する直前に、２００μｇのＨＶＦ１８またはｓＨＶＦ１８を２５μｇのＬＰＳと混合した。インビボイメージングは、皮下沈着後３、６、２４時間でＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍバイオイメージングシステムを使用して取得した。棒グラフは、これらのマウスから放出される測定された生物発光強度を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５各群）として表示される。Ｐ値は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用して決定した。ｂ、ｉ．ｐ．による致死未満量のＬＰＳで刺激し、その後、漸増用量のｓＨＶＦ１８ｉ．ｐ．で処理したＣ５７ＢＬ／６マウスから２０時間後に採取した血漿からのサイトカイン放出。データは、平均±ＳＥＭとして表示される（各丸は１匹のマウスを表す）。Ｐ値は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定に続いて通常の一元配置分散分析を使用して決定した。

【図10A】ＨＶＦ１８の抗菌活性に対するステープル化の効果を示す。ヒートマップは、ＲＤＡにより決定される漸増濃度のＨＶＦ１８及びｓＨＶＦ１８の抗菌活性を示す。活性は、ＮａＣｌの非存在下及び存在下の両方で、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｏ１、及びＳ．ａｕｒｅｕｓについて評価した。データはクリアランスゾーンとして表示される。グレースケール及び各ボックスの値は平均値を表す（ｎ＝４）。

【図10B】ＨＶＦ１８の抗菌活性に対するステープル化の効果を示す。ＶＣＡによって評価された、単独またはＮａＣｌもしくは２５％のヒト血漿を補足したＴｒｉｓ緩衝液中のＨＶＦ１８及びｓＨＶＦ１８の殺傷効果。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として表示される。

【図10C】ＨＶＦ１８の抗菌活性に対するステープル化の効果を示す。ＶＣＡによって評価された、Ｔｒｉｓ緩衝液中のＳ．ａｕｒｅｕｓに対するｓＨＶＦ１８の殺傷効果。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として表示される。

【図10D】ＨＶＦ１８の抗菌活性に対するステープル化の効果を示す。Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｏ１、及びＳ．ａｕｒｅｕｓのＨＶＦ１８及びｓＨＶＦ１８についてのＭＩＣ値。実験を４回繰り返し、同様の結果を得た（ｎ＝４）。

【図10E】ＨＶＦ１８の抗菌活性に対するステープル化の効果を示す。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｏ１及びＳ．ａｕｒｅｕｓの臨床分離株についてのＭＩＣ値。実験を４回繰り返し、同様の結果を得た（ｎ＝４）。

【図11】ｓＨＶＦ１８及びそのＫ及びＲ変異体の二次構造の評価を示す。すべてのペプチドを、１ｍＭストック溶液から１０μＭの最終濃度でｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓに希釈した。スペクトルを２５℃で取得した。結果は、３回の異なる実験の平均として表示される。

【図12a】インビトロでの異なるステープル化ペプチドの溶血特性の評価を示す。ヒストグラムは、赤血球（ａ）または全血（ｂ）に対する異なる濃度でのｓＨＶＦ１８Ｋ及びＲ変異体の溶血活性を示す。データは、４回の独立した実験の平均±ＳＤである（点で表示）。（ｃ）では、全血に対するＧＫＹ２５、ｓＧＫＹ２５、及び２ｓＧＫＹ２５の溶血活性が示されている。データは、２回の独立した実験の平均±ＳＤである。すべてのグラフにおいて、破線は１００μＭ ｓＨＶＦ１８の溶血活性を表し、点線は１０％の溶解に相当する。

【図12b】インビトロでの異なるステープル化ペプチドの溶血特性の評価を示す。ヒストグラムは、赤血球（ａ）または全血（ｂ）に対する異なる濃度でのｓＨＶＦ１８Ｋ及びＲ変異体の溶血活性を示す。データは、４回の独立した実験の平均±ＳＤである（点で表示）。（ｃ）では、全血に対するＧＫＹ２５、ｓＧＫＹ２５、及び２ｓＧＫＹ２５の溶血活性が示されている。データは、２回の独立した実験の平均±ＳＤである。すべてのグラフにおいて、破線は１００μＭ ｓＨＶＦ１８の溶血活性を表し、点線は１０％の溶解に相当する。

【図12c】インビトロでの異なるステープル化ペプチドの溶血特性の評価を示す。ヒストグラムは、赤血球（ａ）または全血（ｂ）に対する異なる濃度でのｓＨＶＦ１８Ｋ及びＲ変異体の溶血活性を示す。データは、４回の独立した実験の平均±ＳＤである（点で表示）。（ｃ）では、全血に対するＧＫＹ２５、ｓＧＫＹ２５、及び２ｓＧＫＹ２５の溶血活性が示されている。データは、２回の独立した実験の平均±ＳＤである。すべてのグラフにおいて、破線は１００μＭ ｓＨＶＦ１８の溶血活性を表し、点線は１０％の溶解に相当する。

【図13A】ｓＨＶＦ１８及びそのＫ及びＲ変異体のＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ－ＣＤ１４レポーター細胞における抗炎症活性の評価を示している。Ｋ（ａ）及びＲ（ｂ）漸増濃度のｓＨＶＦ１８変異体の存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２０時間後の、ＴＨＰ－１単球におけるＮＦ－κＢ活性化及び細胞生存率。結果は、４回の実験の平均±ＳＤとして表示される（ｎ＝４）。ＬＰＳ存在下での１０μＭ ｓＨＶＦ１８を、比較のために使用した。

【図13B】ｓＨＶＦ１８及びそのＫ及びＲ変異体のＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ－ＣＤ１４レポーター細胞における抗炎症活性の評価を示している。Ｋ（ａ）及びＲ（ｂ）漸増濃度のｓＨＶＦ１８変異体の存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２０時間後の、ＴＨＰ－１単球におけるＮＦ－κＢ活性化及び細胞生存率。結果は、４回の実験の平均±ＳＤとして表示される（ｎ＝４）。ＬＰＳ存在下での１０μＭ ｓＨＶＦ１８を、比較のために使用した。

【図14A】ヒト血液中のステープル化ペプチドの抗炎症活性の評価を示す。漸増濃度のＫ（ａ）及びＲ（ｂ）ｓＨＶＦ１８変異体、またはＧＫＹ２５及びそのステープル化変異体（ｃ）の存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２４時間後の、ヒト血液からの放出されたサイトカイン。結果は、平均値±ＳＥＭとして表示される。毎回異なるドナーからの血液を使用した（ｎ＝４）。

【図14B】ヒト血液中のステープル化ペプチドの抗炎症活性の評価を示す。漸増濃度のＫ（ａ）及びＲ（ｂ）ｓＨＶＦ１８変異体、またはＧＫＹ２５及びそのステープル化変異体（ｃ）の存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２４時間後の、ヒト血液からの放出されたサイトカイン。結果は、平均値±ＳＥＭとして表示される。毎回異なるドナーからの血液を使用した（ｎ＝４）。

【図14C】ヒト血液中のステープル化ペプチドの抗炎症活性の評価を示す。漸増濃度のＫ（ａ）及びＲ（ｂ）ｓＨＶＦ１８変異体、またはＧＫＹ２５及びそのステープル化変異体（ｃ）の存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２４時間後の、ヒト血液からの放出されたサイトカイン。結果は、平均値±ＳＥＭとして表示される。毎回異なるドナーからの血液を使用した（ｎ＝４）。

【図15】マウスエンドトキシンモデルにおけるｓＨＶＦ１８及びそのＫ及びＲ変異体の抗炎症活性の評価を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを致死未満量のＬＰＳで刺激し、３０分後に１０μｇのｓＨＶＦ１８、ｓＫＶＦ１８、ｓＫＫＶＦ１８、ｓＲＶＦ１８またはｓＲＲＶＦ１８で処理した。２０時間後、マウスをイソフルランで深く麻酔し、心臓穿刺によって血液を採取した。サイトカイン放出プロファイルを、ヒストグラムとして示す。データは、平均±ＳＥＭとして表示される（ｎ＝７、ｓＨＶＦ１８及びＬＰＳの一部ｎ＝１３、及び未処置ｎ＝２）。Ｐ値は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定に続いて通常の一元配置分散分析を使用して決定した。

【図16】ｓＨＶＦ１８Ｋ及びＲ変異体の抗菌活性の評価を示す。ヒートマップは、ＲＤＡによって決定される漸増濃度のペプチドの抗菌活性を示す。活性は、ＮａＣｌの非存在下（ａ）及び存在下（ｂ）の両方で、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｏ１（ＰＡＯ１）、及びＳ．ａｕｒｅｕｓについて評価した。データは、ｍｍで表されるクリアランスゾーンとして表示される。グレースケール及び各ボックスの値は、平均値を表す（ｎ＝４）。

【図17】溶液中のｓＨＶＦ１８Ｋ及びＲ変異体の抗菌活性の評価を示す。ｐＨ７．４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓにおける、ＶＣＡによって評価される、単独（ａ）またはＮａＣｌを補足した（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｏ１（ＰＡＯ１）、及びＳ．ａｕｒｅｕｓに対するｓＨＶＦ１８及びその変異体の殺菌効果。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として表示される。

【図18】凝固に対する異なるペプチドの効果を示す。活性化部分トロンビン時間（ａＰＴＴ）及びプロトロンビン時間（ＰＴ）を、図に示すように異なるステープル化ペプチドの増加濃度を、ヒトクエン酸血漿に加えた後に決定した（ｎ＝２）。

【図19】オリゴマー化の尺度として異なるペプチドの流体力学的半径（Ｒｈ）を示している。ペプチドを、１ｍＭで最終濃度として、ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＴｒｉｓまたはｐＨ５．０の１０ｍＭ ＮａＯＡｃ中に再懸濁した。各サンプル３０μＬを使用して、溶液中の粒子の流体力学的半径（ｎｍで）を測定した。各サンプルについて、マルチモーダルモードを使用して１０回のサブランでスペクトルを３回記録した。各実験を３回実行した（ｎ＝３）。Ｐ値は、一元配置分散分析とともにＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して決定した。＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。

【図20A】改善された抗炎症活性を有するステープル化ペプチドの選択を示す。ａ、ヒートマップは、全血または赤血球（ＲＢＣ）に対するペプチドの溶血活性を示す。４人の異なるドナーからの赤血球または血液に対して行われた実験のデータは、平均（ｎ＝４）として表示される。ｂ、ヒートマップは、漸増濃度の異なるペプチドの存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２４時間後の、ヒト血液から放出されたサイトカインを示す。結果は、平均として表示される。毎回異なるドナーからの血液を使用した（ｎ＝４）。ｃ、（ａ）及び（ｂ）からのデータを組み合わせて得たグラフであり、示されているように、異なるサイトカインに対するペプチドのＩＣ_５０の関数としてのペプチドの溶血活性を表す。ＩＣ_５０＞１０のペプチドについては、２０μＭでの溶血活性が示されている。ｄ、ＴＮＦ－αに対するペプチドのＩＣ_５０の関数としてのペプチドの溶血活性。グラフは、実施例１及び２に記載のように得られた結果を要約する。ＩＣ_５０＞１０μＭのペプチドについては、正確なＩＣ_５０が不明であるが、５０μＭでの溶血活性を示すように選択した。

【図20B】改善された抗炎症活性を有するステープル化ペプチドの選択を示す。ａ、ヒートマップは、全血または赤血球（ＲＢＣ）に対するペプチドの溶血活性を示す。４人の異なるドナーからの赤血球または血液に対して行われた実験のデータは、平均（ｎ＝４）として表示される。ｂ、ヒートマップは、漸増濃度の異なるペプチドの存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２４時間後の、ヒト血液から放出されたサイトカインを示す。結果は、平均として表示される。毎回異なるドナーからの血液を使用した（ｎ＝４）。ｃ、（ａ）及び（ｂ）からのデータを組み合わせて得たグラフであり、示されているように、異なるサイトカインに対するペプチドのＩＣ_５０の関数としてのペプチドの溶血活性を表す。ＩＣ_５０＞１０のペプチドについては、２０μＭでの溶血活性が示されている。ｄ、ＴＮＦ－αに対するペプチドのＩＣ_５０の関数としてのペプチドの溶血活性。グラフは、実施例１及び２に記載のように得られた結果を要約する。ＩＣ_５０＞１０μＭのペプチドについては、正確なＩＣ_５０が不明であるが、５０μＭでの溶血活性を示すように選択した。

【図20C】改善された抗炎症活性を有するステープル化ペプチドの選択を示す。ａ、ヒートマップは、全血または赤血球（ＲＢＣ）に対するペプチドの溶血活性を示す。４人の異なるドナーからの赤血球または血液に対して行われた実験のデータは、平均（ｎ＝４）として表示される。ｂ、ヒートマップは、漸増濃度の異なるペプチドの存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２４時間後の、ヒト血液から放出されたサイトカインを示す。結果は、平均として表示される。毎回異なるドナーからの血液を使用した（ｎ＝４）。ｃ、（ａ）及び（ｂ）からのデータを組み合わせて得たグラフであり、示されているように、異なるサイトカインに対するペプチドのＩＣ_５０の関数としてのペプチドの溶血活性を表す。ＩＣ_５０＞１０のペプチドについては、２０μＭでの溶血活性が示されている。ｄ、ＴＮＦ－αに対するペプチドのＩＣ_５０の関数としてのペプチドの溶血活性。グラフは、実施例１及び２に記載のように得られた結果を要約する。ＩＣ_５０＞１０μＭのペプチドについては、正確なＩＣ_５０が不明であるが、５０μＭでの溶血活性を示すように選択した。

【図20D】改善された抗炎症活性を有するステープル化ペプチドの選択を示す。ａ、ヒートマップは、全血または赤血球（ＲＢＣ）に対するペプチドの溶血活性を示す。４人の異なるドナーからの赤血球または血液に対して行われた実験のデータは、平均（ｎ＝４）として表示される。ｂ、ヒートマップは、漸増濃度の異なるペプチドの存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２４時間後の、ヒト血液から放出されたサイトカインを示す。結果は、平均として表示される。毎回異なるドナーからの血液を使用した（ｎ＝４）。ｃ、（ａ）及び（ｂ）からのデータを組み合わせて得たグラフであり、示されているように、異なるサイトカインに対するペプチドのＩＣ_５０の関数としてのペプチドの溶血活性を表す。ＩＣ_５０＞１０のペプチドについては、２０μＭでの溶血活性が示されている。ｄ、ＴＮＦ－αに対するペプチドのＩＣ_５０の関数としてのペプチドの溶血活性。グラフは、実施例１及び２に記載のように得られた結果を要約する。ＩＣ_５０＞１０μＭのペプチドについては、正確なＩＣ_５０が不明であるが、５０μＭでの溶血活性を示すように選択した。

【図21】ｓＫＫＷ１３のＫ及びＲ変異体の溶血活性及び抗炎症活性を示す。ａ、ヒートマップは、全血に対するペプチドの溶血活性を示す。４人の異なるドナーからの血液に対して行われた実験のデータは、平均（ｎ＝４）として表示される。ｂ、ヒートマップは、漸増濃度の異なるペプチドの存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳで刺激してから２４時間後の、ヒト血液から放出されたサイトカインを示す。結果は、平均として表示される。毎回異なるドナーからの血液を使用した（ｎ＝４）。

【図22A】ｓＨＶＦ１８の静脈内投与が、ブタにおける敗血症様状態を改善し、重篤な状態のＡＲＤＳの進行を妨げたことを示す。図は、ｓＨＶＦ１８ありまたは無しで処置した急性肺損傷及びＡＲＤＳのブタの結果を示している。（ａ）図は実験セットアップの概要を示している。ブタは人工呼吸器で麻酔され、動脈ライン及びスワンガンツカテーテルを使用して継続的にモニタリングした。ＬＰＳを静脈内投与し、処置動物にはｓＨＶＦ１８を投与した。血行動態、バイタル、及び肺ガス交換は、実験期間中継続的に追跡した。（ｂ）は、処置したブタ（ｎ＝５）と未処置のブタ（ｎ＝５）間の肺ガス交換をＰａＯ_２ ＦｉＯ_２ ^－１比として示す。未処置動物はすべて、軽度から中等度のＡＲＤＳを発症した。心拍出量の有意な増加（ｃ）、尿量の有意な減少（ｄ）、変力補助の必要性の有意な増加（ｅ）、及び乳酸レベルの有意な増加（ｆ）が未処置動物で見られたが、処置動物では見られず、敗血症のような状態の重篤な段階を示している。（ｇ）健康な対照（ｎ＝５）（左）、未処置（中央）（ｎ＝５）及びｓＨＶＦ１８処置（右）（ｎ＝５）肺のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）組織学のｎ＝１５サンプルを表す画像。大きな画像のスケールバーは０．５ｍｍを表す。吹き出しは、組織の拡大部分を示し、スケールバーは、０．２ｍｍを表す。（ｈ）組織像の累積盲検スコアリングの結果。未処置群と処置群間の統計的有意差は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定で、またグループ内では両側配置分散分析で検定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての値は、平均±標準偏差を表す。

【図22B】ｓＨＶＦ１８の静脈内投与が、ブタにおける敗血症様状態を改善し、重篤な状態のＡＲＤＳの進行を妨げたことを示す。図は、ｓＨＶＦ１８ありまたは無しで処置した急性肺損傷及びＡＲＤＳのブタの結果を示している。（ａ）図は実験セットアップの概要を示している。ブタは人工呼吸器で麻酔され、動脈ライン及びスワンガンツカテーテルを使用して継続的にモニタリングした。ＬＰＳを静脈内投与し、処置動物にはｓＨＶＦ１８を投与した。血行動態、バイタル、及び肺ガス交換は、実験期間中継続的に追跡した。（ｂ）は、処置したブタ（ｎ＝５）と未処置のブタ（ｎ＝５）間の肺ガス交換をＰａＯ_２ ＦｉＯ_２ ^－１比として示す。未処置動物はすべて、軽度から中等度のＡＲＤＳを発症した。心拍出量の有意な増加（ｃ）、尿量の有意な減少（ｄ）、変力補助の必要性の有意な増加（ｅ）、及び乳酸レベルの有意な増加（ｆ）が未処置動物で見られたが、処置動物では見られず、敗血症のような状態の重篤な段階を示している。（ｇ）健康な対照（ｎ＝５）（左）、未処置（中央）（ｎ＝５）及びｓＨＶＦ１８処置（右）（ｎ＝５）肺のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）組織学のｎ＝１５サンプルを表す画像。大きな画像のスケールバーは０．５ｍｍを表す。吹き出しは、組織の拡大部分を示し、スケールバーは、０．２ｍｍを表す。（ｈ）組織像の累積盲検スコアリングの結果。未処置群と処置群間の統計的有意差は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定で、またグループ内では両側配置分散分析で検定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての値は、平均±標準偏差を表す。

【図22C】ｓＨＶＦ１８の静脈内投与が、ブタにおける敗血症様状態を改善し、重篤な状態のＡＲＤＳの進行を妨げたことを示す。図は、ｓＨＶＦ１８ありまたは無しで処置した急性肺損傷及びＡＲＤＳのブタの結果を示している。（ａ）図は実験セットアップの概要を示している。ブタは人工呼吸器で麻酔され、動脈ライン及びスワンガンツカテーテルを使用して継続的にモニタリングした。ＬＰＳを静脈内投与し、処置動物にはｓＨＶＦ１８を投与した。血行動態、バイタル、及び肺ガス交換は、実験期間中継続的に追跡した。（ｂ）は、処置したブタ（ｎ＝５）と未処置のブタ（ｎ＝５）間の肺ガス交換をＰａＯ_２ ＦｉＯ_２ ^－１比として示す。未処置動物はすべて、軽度から中等度のＡＲＤＳを発症した。心拍出量の有意な増加（ｃ）、尿量の有意な減少（ｄ）、変力補助の必要性の有意な増加（ｅ）、及び乳酸レベルの有意な増加（ｆ）が未処置動物で見られたが、処置動物では見られず、敗血症のような状態の重篤な段階を示している。（ｇ）健康な対照（ｎ＝５）（左）、未処置（中央）（ｎ＝５）及びｓＨＶＦ１８処置（右）（ｎ＝５）肺のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）組織学のｎ＝１５サンプルを表す画像。大きな画像のスケールバーは０．５ｍｍを表す。吹き出しは、組織の拡大部分を示し、スケールバーは、０．２ｍｍを表す。（ｈ）組織像の累積盲検スコアリングの結果。未処置群と処置群間の統計的有意差は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定で、またグループ内では両側配置分散分析で検定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての値は、平均±標準偏差を表す。

【図22D】ｓＨＶＦ１８の静脈内投与が、ブタにおける敗血症様状態を改善し、重篤な状態のＡＲＤＳの進行を妨げたことを示す。図は、ｓＨＶＦ１８ありまたは無しで処置した急性肺損傷及びＡＲＤＳのブタの結果を示している。（ａ）図は実験セットアップの概要を示している。ブタは人工呼吸器で麻酔され、動脈ライン及びスワンガンツカテーテルを使用して継続的にモニタリングした。ＬＰＳを静脈内投与し、処置動物にはｓＨＶＦ１８を投与した。血行動態、バイタル、及び肺ガス交換は、実験期間中継続的に追跡した。（ｂ）は、処置したブタ（ｎ＝５）と未処置のブタ（ｎ＝５）間の肺ガス交換をＰａＯ_２ ＦｉＯ_２ ^－１比として示す。未処置動物はすべて、軽度から中等度のＡＲＤＳを発症した。心拍出量の有意な増加（ｃ）、尿量の有意な減少（ｄ）、変力補助の必要性の有意な増加（ｅ）、及び乳酸レベルの有意な増加（ｆ）が未処置動物で見られたが、処置動物では見られず、敗血症のような状態の重篤な段階を示している。（ｇ）健康な対照（ｎ＝５）（左）、未処置（中央）（ｎ＝５）及びｓＨＶＦ１８処置（右）（ｎ＝５）肺のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）組織学のｎ＝１５サンプルを表す画像。大きな画像のスケールバーは０．５ｍｍを表す。吹き出しは、組織の拡大部分を示し、スケールバーは、０．２ｍｍを表す。（ｈ）組織像の累積盲検スコアリングの結果。未処置群と処置群間の統計的有意差は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定で、またグループ内では両側配置分散分析で検定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての値は、平均±標準偏差を表す。

【図22E】ｓＨＶＦ１８の静脈内投与が、ブタにおける敗血症様状態を改善し、重篤な状態のＡＲＤＳの進行を妨げたことを示す。図は、ｓＨＶＦ１８ありまたは無しで処置した急性肺損傷及びＡＲＤＳのブタの結果を示している。（ａ）図は実験セットアップの概要を示している。ブタは人工呼吸器で麻酔され、動脈ライン及びスワンガンツカテーテルを使用して継続的にモニタリングした。ＬＰＳを静脈内投与し、処置動物にはｓＨＶＦ１８を投与した。血行動態、バイタル、及び肺ガス交換は、実験期間中継続的に追跡した。（ｂ）は、処置したブタ（ｎ＝５）と未処置のブタ（ｎ＝５）間の肺ガス交換をＰａＯ_２ ＦｉＯ_２ ^－１比として示す。未処置動物はすべて、軽度から中等度のＡＲＤＳを発症した。心拍出量の有意な増加（ｃ）、尿量の有意な減少（ｄ）、変力補助の必要性の有意な増加（ｅ）、及び乳酸レベルの有意な増加（ｆ）が未処置動物で見られたが、処置動物では見られず、敗血症のような状態の重篤な段階を示している。（ｇ）健康な対照（ｎ＝５）（左）、未処置（中央）（ｎ＝５）及びｓＨＶＦ１８処置（右）（ｎ＝５）肺のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）組織学のｎ＝１５サンプルを表す画像。大きな画像のスケールバーは０．５ｍｍを表す。吹き出しは、組織の拡大部分を示し、スケールバーは、０．２ｍｍを表す。（ｈ）組織像の累積盲検スコアリングの結果。未処置群と処置群間の統計的有意差は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定で、またグループ内では両側配置分散分析で検定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての値は、平均±標準偏差を表す。

【図22F】ｓＨＶＦ１８の静脈内投与が、ブタにおける敗血症様状態を改善し、重篤な状態のＡＲＤＳの進行を妨げたことを示す。図は、ｓＨＶＦ１８ありまたは無しで処置した急性肺損傷及びＡＲＤＳのブタの結果を示している。（ａ）図は実験セットアップの概要を示している。ブタは人工呼吸器で麻酔され、動脈ライン及びスワンガンツカテーテルを使用して継続的にモニタリングした。ＬＰＳを静脈内投与し、処置動物にはｓＨＶＦ１８を投与した。血行動態、バイタル、及び肺ガス交換は、実験期間中継続的に追跡した。（ｂ）は、処置したブタ（ｎ＝５）と未処置のブタ（ｎ＝５）間の肺ガス交換をＰａＯ_２ ＦｉＯ_２ ^－１比として示す。未処置動物はすべて、軽度から中等度のＡＲＤＳを発症した。心拍出量の有意な増加（ｃ）、尿量の有意な減少（ｄ）、変力補助の必要性の有意な増加（ｅ）、及び乳酸レベルの有意な増加（ｆ）が未処置動物で見られたが、処置動物では見られず、敗血症のような状態の重篤な段階を示している。（ｇ）健康な対照（ｎ＝５）（左）、未処置（中央）（ｎ＝５）及びｓＨＶＦ１８処置（右）（ｎ＝５）肺のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）組織学のｎ＝１５サンプルを表す画像。大きな画像のスケールバーは０．５ｍｍを表す。吹き出しは、組織の拡大部分を示し、スケールバーは、０．２ｍｍを表す。（ｈ）組織像の累積盲検スコアリングの結果。未処置群と処置群間の統計的有意差は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定で、またグループ内では両側配置分散分析で検定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての値は、平均±標準偏差を表す。

【図22G】ｓＨＶＦ１８の静脈内投与が、ブタにおける敗血症様状態を改善し、重篤な状態のＡＲＤＳの進行を妨げたことを示す。図は、ｓＨＶＦ１８ありまたは無しで処置した急性肺損傷及びＡＲＤＳのブタの結果を示している。（ａ）図は実験セットアップの概要を示している。ブタは人工呼吸器で麻酔され、動脈ライン及びスワンガンツカテーテルを使用して継続的にモニタリングした。ＬＰＳを静脈内投与し、処置動物にはｓＨＶＦ１８を投与した。血行動態、バイタル、及び肺ガス交換は、実験期間中継続的に追跡した。（ｂ）は、処置したブタ（ｎ＝５）と未処置のブタ（ｎ＝５）間の肺ガス交換をＰａＯ_２ ＦｉＯ_２ ^－１比として示す。未処置動物はすべて、軽度から中等度のＡＲＤＳを発症した。心拍出量の有意な増加（ｃ）、尿量の有意な減少（ｄ）、変力補助の必要性の有意な増加（ｅ）、及び乳酸レベルの有意な増加（ｆ）が未処置動物で見られたが、処置動物では見られず、敗血症のような状態の重篤な段階を示している。（ｇ）健康な対照（ｎ＝５）（左）、未処置（中央）（ｎ＝５）及びｓＨＶＦ１８処置（右）（ｎ＝５）肺のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）組織学のｎ＝１５サンプルを表す画像。大きな画像のスケールバーは０．５ｍｍを表す。吹き出しは、組織の拡大部分を示し、スケールバーは、０．２ｍｍを表す。（ｈ）組織像の累積盲検スコアリングの結果。未処置群と処置群間の統計的有意差は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定で、またグループ内では両側配置分散分析で検定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての値は、平均±標準偏差を表す。

【図22H】ｓＨＶＦ１８の静脈内投与が、ブタにおける敗血症様状態を改善し、重篤な状態のＡＲＤＳの進行を妨げたことを示す。図は、ｓＨＶＦ１８ありまたは無しで処置した急性肺損傷及びＡＲＤＳのブタの結果を示している。（ａ）図は実験セットアップの概要を示している。ブタは人工呼吸器で麻酔され、動脈ライン及びスワンガンツカテーテルを使用して継続的にモニタリングした。ＬＰＳを静脈内投与し、処置動物にはｓＨＶＦ１８を投与した。血行動態、バイタル、及び肺ガス交換は、実験期間中継続的に追跡した。（ｂ）は、処置したブタ（ｎ＝５）と未処置のブタ（ｎ＝５）間の肺ガス交換をＰａＯ_２ ＦｉＯ_２ ^－１比として示す。未処置動物はすべて、軽度から中等度のＡＲＤＳを発症した。心拍出量の有意な増加（ｃ）、尿量の有意な減少（ｄ）、変力補助の必要性の有意な増加（ｅ）、及び乳酸レベルの有意な増加（ｆ）が未処置動物で見られたが、処置動物では見られず、敗血症のような状態の重篤な段階を示している。（ｇ）健康な対照（ｎ＝５）（左）、未処置（中央）（ｎ＝５）及びｓＨＶＦ１８処置（右）（ｎ＝５）肺のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）組織学のｎ＝１５サンプルを表す画像。大きな画像のスケールバーは０．５ｍｍを表す。吹き出しは、組織の拡大部分を示し、スケールバーは、０．２ｍｍを表す。（ｈ）組織像の累積盲検スコアリングの結果。未処置群と処置群間の統計的有意差は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定で、またグループ内では両側配置分散分析で検定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての値は、平均±標準偏差を表す。

【図23】ステープル位置のインシリコ解析を示す。（ａ）ＨＶＦ１８をＣＤ１４にドッキングし、Ｎ末端ＧＫＹＧＦＹＴ残基をモデル化してＧＫＹ２５ペプチドを形成した。ＧＫＹ２５のＣＤ１４への結合エネルギーは、ＭＭＰＢＳＡを使用して計算した。示されたアミノ酸はペンテニルアラニンで置換され、ペプチドの配列に沿って残基ｉとｉ＋３を接続するためにステープルが付加された。ＭＭＰＢＳＡを使用して、ステープル化ペプチドのＣＤ１４への結合エネルギーを計算した。グラフは、すべてのステープル位置における、非ステープル化ＧＫＹ２５とステープル化ＧＫＹ２５との結合エネルギーの差を示している。正の値は結合が悪化していることを示し、負の値はステープル化ペプチドの結合がより良好であることを示す。（ｂ）残基ｉとｉ＋４を接続するためにステープルを付加することによって、同様の分析を実行した。（ｃ及びｄ）より短いＨＶＦ１８ペプチドについても同様の分析を実行した。

【発明を実施するための形態】

【0019】

定義
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、任意の標準アミノ酸及び非標準アミノ酸などの任意のアミノ酸を指す。

【0020】

本明細書で使用される「標準アミノ酸」という用語は、タンパク質形成アミノ酸を指す。好ましくは、タンパク質形成アミノ酸は、標準的な遺伝暗号によってコードされる２０個のアミノ酸のうちの１つである。ＩＵＰＡＣの１文字コードと３文字コードが、アミノ酸の名前に使用される。

【0021】

本明細書で使用されるアミノ酸の２つの側鎖間の「共有結合」という用語は、前記側鎖間の共有結合であるか、または前記側鎖が共有的にリンカーの各末端に結合しているかのいずれかであり、そのため側鎖を連結するすべての結合が共有であることを指す。

【0022】

本明細書で使用される「炭化水素ステープル」という用語は、アミノ酸側鎖に結合するアルキルまたはアルケニル部分を指す。典型的には、「炭化水素ステープル」は、１つ以上の二重結合を含むＣ_６～１６アルケニル部分である。

【0023】

ペプチド内のアミノ酸に関して本明細書で使用される「内部」という用語は、そのアミノ酸が、ペプチドの一次配列において最もＮ末端のアミノ酸としても最もＣ末端のアミノ酸としても位置していないことを指す。

【0024】

ペプチド内のアミノ酸に関して本明細書で使用される「非隣接」という用語は、２つのアミノ酸が、ペプチドの一次配列において互いに隣り合って位置していないことを指す。

【0025】

ペプチド内のアミノ酸に関して本明細書で使用される「ｎ位」という用語は、最もＮ末端のアミノ酸がｎ位を有する一次配列内の位置を指す。

【0026】

本明細書で使用される「ステープル化ペプチド」という用語は、２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの共有結合を含むペプチドを指す。特に、ステープル化ペプチドは、炭化水素ステープルを含み得る。

【0027】

内部共有結合を含むペプチド
本発明は、最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１のトロンビン由来の１０～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含むペプチドを提供し、前記ペプチドは、
ｉ）１０～４０アミノ酸の全長、好ましくは１０～２３の全長、より好ましくは１３～２３の全長を有し；
ｉｉ）２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの内部共有結合を含み、ここで前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、
ｉｉｉ）さらに少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含み、
ただし、ペプチドが、２４～４０個のアミノ酸の全長を有する場合は、２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも２つの内部共有結合を含み、第１の内部共有結合のアミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、第２の内部共有結合のアミノ酸は、Ｘ_３及びＸ_４で示される。

【0028】

本発明はさらに、最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１のトロンビン由来の１０～４０個の範囲のアミノ酸の連続配列を含むペプチドを提供し、前記ペプチドは、
ｉ）１０～４０アミノ酸の全長、好ましくは１０～２３の全長、より好ましくは１３～２３の全長を有し；
ｉｉ）２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの内部共有結合を含み、ここで前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、
ｉｉｉ）さらに少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含み、
ただし、ペプチドが、２４～４０個のアミノ酸の全長を有する場合は、２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも２つの内部共有結合を含み、第１の内部共有結合のアミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、第２の内部共有結合のアミノ酸は、Ｘ_３及びＸ_４で示される。

【0029】

本発明はさらに、最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むかまたは最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列からなるペプチドを提供し、前記ペプチドは、
ｉ）１０～２３個のアミノ酸の全長を有し、
ｉｉ）２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの共有結合を含み、ここで前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、
ｉｉｉ）さらに少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８、Ｋ２５２を含む。

【0030】

本発明はさらに、最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むかまたは最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列からなるペプチドを提供し、前記ペプチドは、
ｉ）１３～２３個のアミノ酸の全長を有し、
ｉｉ）２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの共有結合を含み、ここで前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、
ｉｉｉ）さらに少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８、Ｋ２５２を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｒ２４５、Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含む。

【0032】

内部共有結合は、本明細書の以下の「内部共有結合」の項に記載されているとおりであり得る。

【0033】

好ましくは、ペプチドは、本明細書の上記の「概要」または以下の「ペプチド機能」の項に記載される１つ以上の有利な特性を有する。

【0034】

ペプチドは、例えば「治療の方法」の項に記載されているように、炎症及び／または感染症の治療に有用である。

【0035】

プロトロンビンの配列は、本明細書では配列番号１６として提供される。プロトロンビンは、Ａｒｇ^２７１で切断され得る。この切断により、フラグメント１・２として知られる２つのフラグメントが生成され、プロトロンビンの最初の２７１残基と、残基２７２～５７９で構成される中間プレトロンビン２を含む。フラグメント１・２は活性化ペプチドとして放出され、プレトロンビン２はＡｒｇ^３２０で切断され、活性トロンビンを生成する。活性トロンビンの配列は、本明細書では配列番号１として提供される。

【0036】

内部共有結合
本発明のペプチドの１つの特徴は、それらが２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に共有結合を含むことである。したがって、前記共有結合は、前記アミノ酸の側鎖間の直接共有結合であるか、または側鎖がリンカーを介して互いに共有結合しているかのいずれかである。換言すれば、ペプチド骨格における共有結合は、本発明によれば、「２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間の共有結合」とはみなされない。

【0037】

より短いペプチド
ペプチドが、そのような共有結合を２つ以上含むことも可能であるが、前記ペプチドが１０～２３個のアミノ酸である場合、ペプチドが、２つの非隣接の内部アミノ酸の間に共有結合を１つだけ含むことが好ましい。側鎖間に内部結合を有するアミノ酸は、本明細書ではＸ_１及びＸ_２とも表される。

【0038】

本発明のペプチドにおいて、Ｘ_１及びＸ_２は共有結合によって互いに結合しているが、本明細書では、Ｘ_１及びＸ_２を遊離の非結合形態で記載することがあり得る。当業者であれば、Ｘ_１及びＸ_２が非結合形態で記載されている場合でも、本発明の最終ペプチドでは、それらが妥当な共有結合を形成していることを理解するであろう。例として、Ｘ_１及びＸ_２はそれぞれ「（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニン」と記載される場合があるが、本発明のペプチドでは、ペンテニル基は、典型的には環閉メタセシスによって、反応し、二重結合を１つだけ持つ８炭素長のアルケニルからなるリンカーを形成している。

【0039】

２つの非隣接の内部アミノ酸間に共有結合を含むペプチドは、「ステープル化」ペプチドとしても知られている。

【0040】

当業者に周知のステープル化ペプチドを形成する多くの異なる方法があり、本発明のペプチドは、ペプチドステープル化に有用な２つの非隣接の内部アミノ酸間に、任意の種類の共有結合を含み得る。例えば、ペプチドは、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０または国際特許出願第ＷＯ２０１９０１８４９９号に記載されるステープルのいずれかを含み得、その両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0041】

アミノ酸Ｘ_１がｎ位に位置する場合、アミノ酸Ｘ_２は、ｎ＋３位、またはｎ＋４位、またはｎ＋５位、またはｎ＋６位、またはｎ＋７位、またはｎ＋８位、またはｎ＋９位、またはｎ＋１０位、またはｎ＋１１位に位置することが好ましく、式中、ｎは整数である。より好ましくは、アミノ酸Ｘ_１がｎ位に位置する場合、アミノ酸Ｘ_２は、ｎ＋３位、またはｎ＋４位、またはｎ＋７位、またはｎ＋１１位に位置し、式中、ｎは整数である。さらにより好ましくは、アミノ酸Ｘ_１がｎ位に位置する場合、アミノ酸Ｘ_２は、ｎ＋４位、またはｎ＋７位に位置し、式中、ｎは整数である。後者の配置パターンは、ペプチドのα－ヘリックス構造をサポートするのに特に役立つ。典型的には、ｎは２～１８の範囲の整数であるが、ｎは、Ｘ_１が最Ｎ末端に位置しないように、より好ましくは、Ｘ_１またはＸ_２のいずれも最Ｎ末端または最Ｃ末端に位置しないように選択されなければならない。

【0042】

原則として、Ｘ_１は、最Ｎ末端以外のペプチド内の任意の位置に位置することができる。ただし、ペプチド内の特定の位置が、他の位置よりもより有利である場合があり得る。本発明のペプチドは、配列番号１のトロンビンまたは配列番号１２のＧＫＹ２５由来のアミノ酸の連続配列を含む。以下において、アミノ酸の位置は、配列番号１２のＧＫＹ２５のアミノ酸番号付けに関連して与えられる。したがって、アラインメント後、配列番号１２のＧＫＹ２５における特定のアミノ酸と同じ位置を有する任意のアミノ酸は、ＧＫＹ２５の当該アミノ酸に「一致する」と称される。

【0043】

一実施形態では、本発明のペプチドの配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントした後は、
ａ．Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓと一致しない、及び
ｂ．Ｘ_１がＬｙｓと一致する場合、Ｘ_２は、Ｇｌｎと一致しないことが好まれる。

【0044】

一実施形態では、本発明のペプチドの配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントした後は、
ｉ）Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＡｒｇ１１と一致しない、
ｉｉ）Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しない、
ｉｉｉ）Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しない、
ｉｖ）Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１８と一致しない、及び
ｖ）Ｘ_１が配列番号１２のＬｙｓ１８と一致する場合、Ｘ_２は、Ｇｌｎ２２と一致しないことが好まれる。

【0045】

一実施形態では、アミノ酸Ｘ_１はｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２はｎ＋３位に位置し、式中、ｎは、２～１８の範囲の整数であり、本発明のペプチドの配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントした後は、
ｉ）Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＡｒｇ１１と一致しない、
ｉｉ）Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しない、及び
ｉｉｉ）Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しない。

【0046】

一実施形態では、アミノ酸Ｘ_１はｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２はｎ＋４位に位置し、式中、ｎは、２～１８の範囲の整数であり、本発明のペプチドの配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントした後は、
ｉ）Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＡｒｇ１１と一致しない、
ｉｉ）Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｅｕ１２と一致しない、
ｉｉｉ）Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しない、
ｉｖ）Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しない、
ｖ）Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１８と一致しない、及び
ｖｉ）Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１８と一致しない。

【0047】

好ましい実施形態では、アミノ酸Ｘ_１はｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２はｎ＋３位に位置し、式中、ｎは、２～１８の範囲の整数であり、本発明のペプチドの配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合は、Ｘ_１及びＸ_２は、配列番号１２の
Ｖａｌ９及びＬｅｕ１２；または
Ｐｈｅ１０及びＬｙｓ１３；または
Ｌｅｕ１２及びＴｒｐ１５；または
Ｌｙｓ１３及びＩｌｅ１６；または
Ｉｌｅ１６及びＶａｌ１９；または
Ｇｌｎ１７及びＩｌｅ２０；または
Ｌｙｓ１８及びＡｓｐ２１；または
Ｖａｌ１９及びＧｌｎ２２；または
Ｉｌｅ２０及びＰｈｅ２３；または
Ａｓｐ２１及びＧｌｙ２４；または
Ｇｌｎ２２及びＧｌｕ２５に対応する。

【0048】

別の好ましい実施形態では、アミノ酸Ｘ_１はｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２はｎ＋４位に位置し、式中、ｎは、２～１８の範囲の整数であり、本発明のペプチドの配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合は、Ｘ_１及びＸ_２は、配列番号１２の
Ｖａｌ９及びＬｙｓ１３；または
Ｌｙｓ１３及びＧｌｎ１７；または
Ｔｒｐ１５及びＶａｌ１９；または
Ｉｌｅ１６及びＩｌｅ２０；または
Ｇｌｎ１７及びＡｓｐ２１；または
Ｖａｌ１９及びＰｈｅ２３；または
Ｉｌｅ２０及びＧｌｙ２４；または
Ａｓｐ２１及びＧｌｕ１８に対応する。

【0049】

非常に好ましい実施形態では、アミノ酸Ｘ_１はｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２はｎ＋４位に位置し、式中、ｎは、２～１８の範囲の整数であり、本発明のペプチドの配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合は、Ｘ_１及びＸ_２は、Ｇｌｎ１７及びＡｓｐ２１にそれぞれ対応する。

【0050】

一実施形態では、Ｘ_１及びＸ_２は、共有結合を形成するための反応前の標準アミノ酸である。例えば、Ｘ_１及びＸ_２は、共有結合を形成するための反応の前に、以下からなる群から選択され得る：
ｉ）Ｘ_１は、Ｌｙｓであり、Ｘ_２は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ及びＴｙｒからなる群から選択される；
ｉｉ）Ｘ_１は、Ｃｙｓであり、Ｘ_２は、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ及びＭｅｔからなる群から選択される；
ｉｉｉ）Ｘ_１は、Ａｓｐであり、Ｘ_２は、Ｌｙｓである；
ｉｖ）Ｘ_１は、Ｇｌｕであり、Ｘ_２は、Ｌｙｓ及びＧｌｕからなる群から選択される；
ｖ）Ｘ_１は、Ｔｙｒであり、Ｘ_２は、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ及びＴｒｐからなる群から選択される；
ｖｉ）Ｘ_１は、Ｍｅｔであり、Ｘ_２は、Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる群から選択される；
ｖｉｉ）Ｘ_１は、Ｈｉｓであり、Ｘ_２は、Ｈｉｓである；
ｖｉｉｉ）Ｘ_１は、Ｐｈｅであり、Ｘ_２は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｌａ及びＴｒｐからなる群から選択される；
ｉｘ）Ｘ_１は、Ａｌａであり、Ｘ_２は、ＰｈｅまたはＴｙｒである；
ｘ）Ｘ_１はＴｒｐであり、Ｘ_２はＴｒｐ、Ｐｈｅ及びＴｙｒからなる群から選択される。

【0051】

一実施形態では、Ｘ_１及びＸ_２は、共有結合を形成するための反応の前に、以下の通りであり得る：
Ｘ_１は、Ｌｙｓであり、Ｘ_２は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＣｙｓまたはＬｙｓであるか、またはその逆である、
Ｘ_１及びＸ_２は、Ｃｙｓである。

【0052】

共有結合は、標準アミノ酸の側鎖間の直接反応によって形成される場合もあれば、架橋剤を介して形成される場合もある。Ｘ_１及びＸ_２がＣｙｓである場合、共有結合は、ジスルフィド架橋であり得るか、または架橋剤を介して形成され得、例えば、架橋剤は、少なくとも２つの（ブロモメチル）置換基を含むリンカーなどのビスアルキル化剤である。

【0053】

好ましい実施形態では、Ｘ_１及びＸ_２は、誘導体化された標準アミノ酸である。共有結合を形成するための反応の前に、Ｘ_１及び／またはＸ_２は、例えば、Ｓｅｒ誘導体及びＡｌａ誘導体からなる群から選択され得る。

【0054】

一実施形態では、共有結合は、２つの非標準アミノ酸を結合することによって形成される。例えば、共有結合は、トロンビン由来の連続配列の２つの天然アミノ酸を置換した２つの非標準アミノ酸を連結することによって形成され得る。

【0055】

一実施形態では、共有結合は炭化水素ステープルである。

【0056】

好ましい一実施形態では、共有結合を形成するための反応前のＸ_１及びＸ_２は、２つのα－置換アルケニルアミノ酸及び／またはα，α－二置換アルケニルアミノなどの２つのＣ－アルケニル化アミノ酸などのアルケニル化アミノ酸であり、共有結合は、前記アルケニル残基間に形成されるオレフィンテザーである。

【0057】

前記アルケニル化アミノ酸は、アルケニル化されたトロンビンに固有のアミノ酸であり得る。あるいは、前記アルケニル化アミノ酸は、トロンビンに固有のアミノ酸を置換するアミノ酸であってもよい。

【0058】

好ましい一実施形態では、共有結合を形成するための反応前のＸ_１及びＸ_２は、アルケニル化Ａｌａ、アルケニル化Ｌｅｕ、アルケニル化Ｍｅｔ、アルケニル化Ｓｅｒ、アルケニル化Ｔｙｒ、アルケニル化Ｌｙｓ、アルケニル化Ａｒｇ及びアルケニル化Ｐｈｅからなる群から個別に選択され得る。このような場合、共有結合は、前記アルケニル残基間に形成されるオレフィンテザーである。

【0059】

好ましい一実施形態では、共有結合を形成するための反応前のＸ_１及びＸ_２の一方は、アルケニル化Ａｌａであり得、他方は、アルケニル化Ａｌａ、アルケニル化Ｌｅｕ、アルケニル化Ｍｅｔ、アルケニル化Ｓｅｒ、アルケニル化Ｔｙｒ、アルケニル化Ｌｙｓ、アルケニル化Ａｒｇ及びアルケニル化Ｐｈｅからなる群から個別に選択され得る。このような場合、共有結合は、前記アルケニル残基間に形成されるオレフィンテザーである。

【0060】

好ましい一実施形態では、Ｘ_１及びＸ_２は、α－アルケニルオレフィン末端アミノ酸及び／またはα，α－二置換アルケニルオレフィン末端アミノ酸である。

【0061】

好ましい一実施形態では、共有結合を形成するための反応前のＸ_１及びＸ_２は、アルケニル化アラニン、好ましくはα－置換アルケニルまたはα，α－二置換アルケニル化アラニンであり得る。そのような場合、共有結合は、前記アルケニル残基間に形成されるオレフィンテザーである。

【0062】

好ましい一実施形態では、共有結合を形成するための反応前のＸ_１及びＸ_２は、Ｏ－アルケニル化Ｓｅｒなどのアルケニル化Ｓｅｒであり得る。

【0063】

前記アルケニル化アミノ酸は、アルケニル鎖中に２～１０個の炭素、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素、好ましくは４、５または６個の炭素を含む。前記アルケニル化アミノ酸は、１つ以上の二重結合を含み得るが、好ましくは１つのみの二重結合を含む。二重結合が、アルケニルの自由端に位置することがさらに好ましい。２つのアルケニル残基の自由端に位置する２つの二重結合は、ＲＣＭによって反応してオレフィンテザーを形成することができる。

【0064】

したがって、Ｘ_１及びＸ_２は、前記アルケニル残基間に形成されるオレフィンテザーによって結合されるアミノ酸であることが好ましい。前記オレフィンテザーは、Ｃ_８～１４アルケニルなどのＣ_６～１６アルケニル、例えば、例えばＣ_８またはＣ_１４アルケニルテザーであり得る。前記テザーは、１つ以上の二重結合、好ましくは、１つの二重結合を含み得る。

【0065】

好ましい一実施形態では、共有結合を形成するための反応前のＸ_１及びＸ_２は、α，α－二置換Ｓ－もしくはＲ－ペンテニルアラニン（Ｓ５またはＲ５）、またはＳ－もしくはＲ－オクテニルアラニン（Ｓ８またはＲ８）アラニンであり得る。したがって、内部炭化水素ステープルは、２つのα，α－二置換Ｓ－もしくはＲ－ペンテニルアラニン（Ｓ５またはＲ５）、またはＳ－もしくはＲ－オクテニルアラニン（Ｓ８またはＲ８）アラニンを結合することによって形成され得る。

【0066】

好 ましい一実施形態では、共有結合を形成するための反応前のＸ_１及びＸ_２は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンであり得る。したがって、内部炭化水素ステープルは、２つの（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンを結合することによって形成され得る。

【0067】

一実施形態では、共有結合は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）などの閉環を通じて確立される。

【0068】

好ましい一実施形態では、共有結合を形成するための反応前のＸ_１及びＸ_２の一方は、非標準アジド末端アミノ酸であり、他方は、非標準イン末端アミノ酸であり得る。

【0069】

より長いペプチド
２４アミノ酸以上である本発明のペプチドは、少なくとも２つのステープルを含むことが好ましい。言い換えれば、２４～４０アミノ酸などの２４アミノ酸以上ある本発明のペプチドは、２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも２つの内部共有結合を含むことが好ましく、第１の内部共有結合のアミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、上記の通りであり、第２の内部共有結合のアミノ酸は、Ｘ_３及びＸ_４で示される。

【0070】

配列番号１２のＧＫＹ２５の最もＮ末端の４つのアミノ酸を含むペプチドが、少なくとも２つのステープルも含むことも好ましく、第１の内部共有結合のアミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、上記の通りであり、第２の内部共有結合のアミノ酸は、Ｘ_３及びＸ_４で示される。

【0071】

Ｘ_３及びＸ_４は、「より短いペプチド」の項で上述した通りであり得る。好ましくは、Ｘ_３及びＸ_４は、Ｘ_１及びＸ_２と比較してＮ末端により近い。特に、Ｘ_３及びＸ_４は、Ｘ_３が最初の４つのアミノ酸のうちの１つに位置するように位置し得る。ペプチドが、配列番号１２のＧＫＹ２５の最もＮ末端の４つのアミノ酸を含む場合、Ｘ_３は、配列番号１２のＧＫＹ２５の最もＮ末端の４つのアミノ酸のうち１つに対応する位置に位置することが好ましい。

【0072】

いくつかの実施形態では、アミノ酸Ｘ_３は、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_４は、ｎ＋３位、またはｎ＋４位、またはｎ＋５位に位置し、式中、ｎは整数である。好ましい実施形態では、アミノ酸Ｘ_３は、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_４は、ｎ＋４位に位置し、式中、ｎは１～１８の範囲、好ましくは１～１０の範囲、より好ましくは１～５の範囲の整数である。したがって、Ｘ_１は最Ｎ末端に位置しないことが好ましい一方で、Ｘ_３は、最Ｎ末端に位置され得る。

【0073】

Ｘ_３が最Ｎ末端に位置する場合、ステープルが、Ｎ末端－ＮＨ_２基とアミノ酸の側鎖、好ましくはＧｌｕまたはＡｓｐの側鎖、より好ましくはＧｌｕの側鎖との間に形成され得る。

【0074】

特定の実施形態では、アミノ酸Ｘ_３は、ペプチドの最Ｎ末端に位置する。好ましい実施形態では、アミノ酸Ｘ_３は、最Ｎ末端に位置し、アミノ酸Ｘ_４は、ｎ＋４位に位置する。非常に好ましい実施形態では、本発明のペプチドの配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合は、Ｘ_３及びＸ４は、配列番号１２のＧＫＹ２５のＧｌｙ１及びＰｈｅ５に対応し、Ｐｈｅ５は、ＧｌｕまたはＡｓｐのいずれか、好ましくはＧｌｕで置換される。後者のＸ_３及びＸ_４の位置パターンは、ペプチドのプロテアーゼ部位を保護またはマスキングするのに特に有用である。

【0075】

Ｘ_３とＸ_４の共有結合は、例えば、カルボン酸部分とアミンとの間に形成されるアミド結合であり得る。いくつかの実施形態では、カルボン酸部分は、グルタミン酸側鎖である。いくつかの実施形態では、アミンはアミノ酸側鎖である。他の実施形態では、アミンは、ペプチド骨格のＮ末端アミン基である。いくつかの実施形態では、Ｘ_３及びＸ_４の共有結合は、Ｎ末端アミン基と前記それぞれのアミノ酸の側鎖カルボン酸との間に形成されるラクタム架橋である。

【0076】

好ましい実施形態では、配列番号１２のＧＫＹ２５のＰｈｅ５は、Ｇｌｕ５によって置換される。このような実施形態では、Ｘ_３及びＸ_４は、配列番号１４のＧｌｙ１及びＧｌｕ５に対応する。

【0077】

ペプチド特性
本発明のペプチドは、以下の特性のうちの１つ以上を有し得る。

【0078】

本発明は、単一のステープルを含む、ＧＫＹ２５などのステープル化されたより長いトロンビン由来ペプチドが、いくつかのあまり望ましくない特性を有することを示す。したがって、１つのステープルを含むＧＫＹ２５は、血液中での溶血活性が高く、抗炎症活性が低いため、インビボでの使用は不可能である。

【0079】

対照的に、ステープル化されたＨＶＦ１８などの、ステープル化されたより短いトロンビン由来ペプチドは、血液中での溶血活性が比較的低く、血液中での抗炎症活性が高い。

【0080】

さらに、２つのステープルを有するＧＫＹ２５などの、二重ステープルを有するより長いトロンビン由来ペプチドは、単一ステープルのＧＫＹ２５と比較して血液中での溶血活性が低く、非ステープルのＧＫＹ２５と比較してより高い安定性を有する。

【0081】

より短いペプチド
したがって、本発明のペプチドは適切な長さを有することが好ましい。したがって、好ましくは、本発明のペプチドは、１０～２３個のアミノ酸、例えば１３～１８個のアミノ酸、例えば１２～２２個のアミノ酸、例えば１４～２２個のアミノ酸、例えば１５～２１個のアミノ酸、例えば１６～２０個のアミノ酸、例えば１７～２０個のアミノ酸の長さを有する。

【0082】

特に、ペプチドは、１８または１９個のアミノ酸など、１８～２０個のアミノ酸の長さを有し得る。

【0083】

ペプチドの長さは、ペプチドの全長を示す。したがって、たとえペプチドが１つ以上の追加の部分に結合し得るとしても、ペプチドは、示された数を超えるアミノ酸を含まないことが好ましい。

【0084】

さらに、本発明のペプチドが、適切な長さを有する配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むことも好ましい。したがって、好ましくは、本発明のペプチドは、配列番号１のトロンビン由来の、１０～２３個のアミノ酸の範囲、例えば１３～２３個のアミノ酸、例えば１３～１８個のアミノ酸、例えば１４～２２個のアミノ酸、例えば１５～２１個のアミノ酸、例えば１６～２０個のアミノ酸、例えば１７～２０個のアミノ酸、好ましくは１７～１８個のアミノ酸、より好ましくは１８～１９個のアミノ酸の連続したアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0085】

本発明によるペプチドは、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなり、最大６個のアミノ酸が交換され得る。換言すれば、ペプチドは、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなり得るが、しかし、前記連続配列内のアミノ酸の１～６個が、別のアミノ酸に置換され得る。しかしながら、ペプチドが、少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８、Ｋ２５２を含むことが重要である。換言すれば、前記アミノ酸は、置換されるべきではない。

【0086】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｒ２４５、Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含む。

【0087】

本発明によるペプチドは、特に、１０～２３個のアミノ酸の全長を有し、配列番号１２のＧＫＹ２５由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなり、最大６個のアミノ酸が交換され得る。換言すれば、ペプチドは、配列番号１２のＧＫＹ２５由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなり得るが、しかし、前記連続配列内のアミノ酸の１～６個が、別のアミノ酸に置換され得る。しかしながら、少なくともペプチドが配列番号１２のＧＫＹ２５のアミノ酸Ｋ１３、Ｋ１４及びＫ１８を含むことが重要である。換言すれば、前記アミノ酸は、置換されるべきではない。

【0088】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも配列番号１２のＧＫＹ２５のアミノ酸Ｒ１１、Ｋ１３、Ｋ１４、及びＫ１８を含む。

【0089】

本発明によるペプチドは、好ましくは、１６～２１個のアミノ酸の範囲、より好ましくは、１７～１８個のアミノ酸の範囲の配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなる。

【0090】

連続配列は、最大６個のアミノ酸置換を含み得る。例えば、前記ペプチドは、トロンビンの連続配列と比較して、少なくとも２つのアミノ酸置換、例えば３つのアミノ酸置換、例えば４つのアミノ酸置換、例えば５つのアミノ酸置換を含み得る。好ましくは、連続配列は、最大４個のアミノ酸置換を含み、さらにより好ましくは、連続配列は、最大２個のアミノ酸置換を含み得る。１つ以上の前記置換は、保存的置換であり得、例えば、１、２、３または４つのアミノ酸置換は、保存的置換であり得る。

【0091】

非常に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなり、一方のアミノ酸は、アミノ酸Ｘ_１（例えば、「内部共有結合」の項に記載のＸ_１のいずれか）で置換されており、別のアミノ酸は、Ｘ_２（例えば、「内部共有結合」の項に記載のＸ_２のいずれか）で置換されている。置換された前記アミノ酸は、「内部共有結合」の項で、アミノ酸Ｘ_１及びＸ_２について記載したように、互いに関連して位置することが好ましい。

【0092】

さらに、配列番号１の連続配列に加えて、本発明のペプチドは、１つ以上の追加のアミノ酸を含み得る。好ましくは、ペプチドは、最大４個の追加アミノ酸、例えば、２個の追加アミノ酸など、最大３個の追加アミノ酸を含み得る。前記追加のアミノ酸は、例えば、以下の「正に荷電したアミノ酸」の項に記載されるアミノ酸のいずれかであり得る。

【0093】

一実施形態では、本発明によるペプチドは、最大２個のアミノ酸置換を含む、１７～１８個の範囲のアミノ酸の、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなり、ペプチドは、最大４つの追加アミノ酸を含み得る。

【0094】

一実施形態では、本発明によるペプチドは、アミノ酸Ｘ_１について１つのアミノ酸の置換、及びアミノ酸Ｘ_２について１つのアミノ酸の置換を含む、１７～１８個の範囲のアミノ酸の、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなり、ペプチドは、最大４つの追加アミノ酸を含み得る。

【0095】

したがって、一実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号１のトロンビンの１５～２０個の連続アミノ酸からなり、２個のアミノ酸が、Ｘ_１及びＸ_２で置換されており、Ｘ_１及びＸ_２は、内部炭化水素ステープルを形成するアルケニル化アミノ酸であり、２～５個の範囲、好ましくは２個の追加のＮ末端アミノ酸である。

【0096】

一実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号１のトロンビンの１６～１８個の連続アミノ酸からなり、２個のアミノ酸が、Ｘ_１及びＸ_２で置換されており、Ｘ_１及びＸ_２は、内部炭化水素ステープルを形成するアルケニル化アミノ酸であり、２～５個の範囲の追加のＮ末端アミノ酸であり、好ましくは２個の追加のＮ末端アミノ酸である。

【0097】

一実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号１のトロンビンの１７個の連続アミノ酸からなり、２個のアミノ酸が、Ｘ_１及びＸ_２で置換されており、Ｘ_１及びＸ_２は、内部炭化水素ステープルを形成するアルケニル化アミノ酸であり、２～３個の範囲の追加のＮ末端アミノ酸である。

【0098】

前記追加のＮ末端アミノ酸は、好ましくは正に荷電したアミノ酸、例えばＬｙｓまたはＡｒｇである。

【0099】

本発明のペプチドは、前記ペプチドに結合した１つ以上の部分をさらに含み得る。前記部分は、場合により、リンカーを介してペプチドに連結され得る。前記１つ以上の結合部分は、例えば、アルキル、アリール、ヘテロアリール、オレフィン、脂肪酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類、及び多糖類からなる群から選択され得る。

【0100】

より長いペプチド
しかしながら、本発明のペプチドは、より長くもあり得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、２４～４０個のアミノ酸、例えば２５～３５個のアミノ酸、例えば２５～３０個のアミノ酸、例えば２８～３４個のアミノ酸の長さを有する。

【0101】

特に、ペプチドは、２５個または２６個のアミノ酸など、２４～２８個のアミノ酸の長さを有し得る。

【0102】

２４個のアミノ酸またはそれ以上である本発明のペプチドは、少なくとも２つのステープルを含む。

【0103】

２４～４０個のアミノ酸の長さを有する本発明のペプチドは、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含む。したがって、好ましくは、本発明のより長いペプチドは、２４～４０個の範囲のアミノ酸、例えば２５～３５個のアミノ酸、例えば２５～３０個のアミノ酸、例えば２８～３４個のアミノ酸、好ましくは２４～２８個のアミノ酸、さらにより好ましくは２５個及び２６個のアミノ酸の、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなる。

【0104】

本発明のより長いペプチドは、上記の「ペプチドの特性－より短いペプチド」の項で定義したとおりであり得る。

【0105】

したがって、本発明によるより長いペプチドは、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなり、最大６個のアミノ酸が交換され得る。しかしながら、ペプチドが、少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８、及びＫ２５２を含むことが重要である。換言すれば、前記アミノ酸は、置換されるべきではない。いくつかの実施形態では、本発明によるより長いペプチドは、配列番号１のトロンビンのＲ２４５、Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含む。

【0106】

非常に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなり、１つのアミノ酸は、アミノ酸Ｘ_１（例えば、「内部共有結合」の項に記載のＸ_１のいずれか）で置換されており、別のアミノ酸は、Ｘ_２（例えば、「内部共有結合」の項に記載のＸ_２のいずれか）で置換されており、別のアミノ酸は、Ｘ_３（例えば、「内部共有結合」の項に記載のＸ_３のいずれか）で置換されており、及び、別のアミノ酸は、Ｘ_４（例えば、「内部共有結合」の項に記載のＸ_４のいずれか）で置換されている。置換された前記アミノ酸は、「内部共有結合」の項で、アミノ酸Ｘ_１、及びＸ_２、及びＸ_３、及びＸ_４について記載したように、互いに関連して位置することが好ましい。

【0107】

正に荷電したアミノ酸
興味深いことに、本発明は、１つ以上の正に荷電したアミノ酸の挿入により、ペプチドの抗炎症効果を有意に増強し得ることを示す。

【0108】

したがって、好ましい実施形態における本発明によるペプチドは、ペプチドの末端またはその近くに挿入された１～５個（１～４個など）、例えば１～３個、例えば１～２個（２個など）の正に荷電したアミノ酸を含む。

【0109】

特に、前記正に荷電したアミノ酸は、ペプチドのＮ末端に対して１位、２位、３位、４位及び／または５位から選択される位置など、Ｎ末端またはＮ末端付近に挿入され得る。

【0110】

好ましい実施形態では、正に荷電したアミノ酸は、Ｎ末端に挿入される。

【0111】

一実施形態では、本発明のペプチドは、ペプチドのＮ末端に対して１位、２位、及び／または３位から選択される位置など、Ｎ末端またはＮ末端付近に挿入された２つの正に荷電したアミノ酸を含む。

【0112】

前記正に荷電したアミノ酸は、好ましくは、アルギニン、リジン及びヒスチジンからなる群から選択され得る。好ましくは、正に荷電したアミノ酸は、アルギニン及び／またはリジンであり、さらにより好ましくは、正に荷電したアミノ酸はリジンである。

【0113】

ペプチド配列
本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドは、本明細書のこのセクションに記載されるペプチド配列のうちの１つを有し得る。このセクションに記載される配列を有するペプチドに加えて、ペプチドは、以下であることも好ましい：
・配列番号１のトロンビン由来の１０～２３個の範囲のアミノ酸、好ましくは、１３～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含む
・１０～４０個のアミノ酸の全長を有する
・少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含む、より好ましくは、少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｒ２４５、Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含む
ただし、ペプチドの全長が２４～４０個のアミノ酸の場合、２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも２つの内部共有結合を含むことを条件とする。

【0114】

より短いペプチド
本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドは、本明細書のこのセクションに記載されるペプチド配列のうちの１つを有し得る。このセクションに記載される配列を有するペプチドに加えて、ペプチドは、以下であることも好ましい：
・配列番号１のトロンビン由来の１０～２３個の範囲のアミノ酸、好ましくは、１３～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含む
・１０～２３個のアミノ酸、好ましくは、１３～２３個のアミノ酸の全長を有する
・少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含む、より好ましくは、少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｒ２４５、Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含む。

【0115】

本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドは、本明細書のこのセクションに記載されるペプチド配列のうちの１つを有し得る。このセクションに記載される配列を有するペプチドに加えて、ペプチドは、以下であることも好ましい：
・配列番号１２のＧＫＹ２５由来の１０～２３個の範囲のアミノ酸、好ましくは、１３～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含む
・１０～２３個のアミノ酸、好ましくは、１３～２３個のアミノ酸の全長を有する
・少なくとも配列番号１２のＧＫＹ２５のアミノ酸Ｋ１３、Ｋ１４、及びＫ１８を含む、より好ましくは、少なくとも配列番号１２のＧＫＹ２５のアミノ酸Ｒ１１、Ｋ１３、Ｋ１４、及びＫ１８を含む。

【0116】

このセクションの配列におけるＸ_１及びＸ_２は、例えば、本明細書の上記「内部共有結合」のセクションに記載されている通りであり得る。

【0117】

このセクションの配列におけるＵは、例えば、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、好ましくは、ＡｒｇまたはＬｙｓであり得る。

【0118】

このセクションの配列におけるＺは、個別に任意の標準アミノ酸であり得る。好ましい実施形態では、配列のほとんどまたはすべてのＺが、配列番号１２のＧＫＹ２５のアミノ酸に対応するように選択される。

【0119】

一実施形態では、本発明によるペプチドは、配列：
－Ｋ－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_１－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_２－Ｚ
を含み、式中、
Ｚは、任意の標準アミノ酸であり、
Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合されている。

【0120】

一実施形態では、本発明によるペプチドは、アミノ酸配列：
－Ｕ－Ｕ－（Ｚ）_ｎ－Ｉ－Ｑ－Ｋ－Ｖ－Ｉ－Ｄ－Ｑ－（Ｚ）_ｍ－
を含むか、またはそれからなり、式中、
ペプチドは、１０～２３個のアミノ酸の全長を有し、
各Ｚは、個別に任意の標準アミノ酸であり、
Ｕは、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
ｎは、０～１０の範囲の整数であり、
ｍは、０～５の範囲の整数であり、
アミノ酸のうちの２つは、アルケニル化アミノ酸に置換されており、その側鎖は、共有結合によって結合されている。

【0121】

一実施形態では、本発明によるペプチドは、配列：
Ｕ－Ｕ－（Ｚ）_ｎ－Ｋ－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_１－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_２－Ｚ
または、配列：Ｕ－Ｕ－Ｚ－Ｚ－Ｒ－Ｚ－Ｋ－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_１－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_２－Ｚ
を含むか、またはそれからなり、式中、
Ｚは、任意の標準アミノ酸であり、
Ｕは、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
ｎは、０～１０の範囲の整数であり、
Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合されている。

【0122】

一実施形態では、本発明によるペプチドは、配列：
Ｕ－Ｖ－Ｆ－Ｒ－Ｌ－Ｋ－Ｋ－Ｗ－Ｉ－Ｘ_１－Ｋ－Ｖ－Ｉ－Ｘ_２－Ｚ－Ｆ－Ｇ－Ｚ
を含むか、またはそれからなり、式中、
Ｚは、任意の標準アミノ酸であり、
Ｕは、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合されている。

【0123】

一実施形態では、本発明によるペプチドは、配列：
Ｖ－Ｆ－Ｒ－Ｌ－Ｋ－Ｋ－Ｗ－Ｉ－Ｘ_１－Ｋ－Ｖ－Ｉ－Ｘ_２－Ｑ－Ｆ－Ｇ－Ｅ
を含むか、またはそれからなり、式中、
Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合されている。

【0124】

一実施形態では、ペプチドは、配列：
Ｕ－Ｕ－Ｖ－Ｆ－Ｒ－Ｌ－Ｋ－Ｋ－Ｗ－Ｉ－Ｘ_１－Ｋ－Ｖ－Ｉ－Ｘ_２－Ｚ－Ｆ－Ｇ－Ｚ
を含むか、またはそれからなり、式中、
Ｚは、任意の標準アミノ酸であり、
Ｕは、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合されている。

【0125】

一実施形態では、ペプチドは、配列：
Ｕ－Ｕ－Ｖ－Ｆ－Ｒ－Ｌ－Ｋ－Ｋ－Ｗ－Ｉ－Ｘ１－Ｋ－Ｖ－Ｉ－Ｘ２－Ｑ－Ｆ－Ｇ－Ｅ
を含むか、またはそれからなり、式中、
Ｕは、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合されている。

【0126】

本発明の一実施形態では、ペプチドは、
ｉ）配列番号３、
ｉｉ）配列番号４、
ｉｉｉ）配列番号５、
ｉｖ）配列番号６、
ｖ）配列番号７、
ｖｉ）配列番号８、
ｖｉｉ）配列番号９、
ｖｉｉｉ）配列番号１０、
ｉｘ）配列番号１１、
ｘ）配列番号１７、
ｘｉ）配列番号１８、
ｘｉｉ）配列番号１９、
ｘｉｉｉ）配列番号２０、
ｘｉｖ）配列番号２１、
ｘｖ）配列番号２２、
ｘｖｉ）配列番号２３、
ｘｖｉｉ）配列番号２４、または
ｘｖｉｉｉ）配列番号２５
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合している。

【0127】

本発明の一実施形態では、ペプチドは、
ｉ）配列番号３、
ｉｉ）配列番号４、
ｉｉｉ）配列番号５、
ｉｖ）配列番号８、または
ｖ）配列番号９
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合している。

【0128】

一実施形態では、ペプチドは、
ｉ）配列番号３、
ｉｉ）配列番号４、
ｉｉｉ）配列番号５、
ｉｖ）配列番号８、または
ｖ）配列番号９
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンであり、その側鎖は、互いに反応してアルケニルテザーを形成している。

【0129】

一実施形態では、ペプチドは、
ｉ）配列番号３、
ｉｉ）配列番号４、
ｉｉｉ）配列番号５、
ｉｖ）配列番号８、または
ｖ）配列番号９
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、Ａｌａであり、その側鎖は、１つの二重結合を含むＣ_８アルケニルテザーによって互いに共有結合している。

【0130】

一実施形態では、ペプチドは、
ｉ）配列番号３、
ｉｉ）配列番号５
ｉｉｉ）配列番号６、または
ｉｖ）配列番号７
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合している。

【0131】

一実施形態では、ペプチドは、
ｖ）配列番号３、
ｖｉ）配列番号５、
ｖｉｉ）配列番号６、または
ｖｉｉｉ）配列番号７
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンであり、その側鎖は、互いに反応してアルケニルテザーを形成している。

【0132】

一実施形態では、ペプチドは、
ｉｘ）配列番号３、
ｘ）配列番号５、
ｘｉ）配列番号６、または
ｘｉｉ）配列番号７
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、Ａｌａであり、その側鎖は、１つの二重結合を含むＣ_８アルケニルテザーによって互いに共有結合している。

【0133】

一実施形態では、ペプチドは、
ｉ）配列番号３、または
ｉｉ）配列番号５
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合している。

【0134】

一実施形態では、ペプチドは、
ｉ）配列番号３、または
ｉｉ）配列番号５
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンであり、その側鎖は、互いに反応してアルケニルテザーを形成している。

【0135】

一実施形態では、ペプチドは、
ｉ）配列番号３、または
ｉｉ）配列番号５
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、Ａｌａであり、その側鎖は、１つの二重結合を含むＣ_８アルケニルテザーによって互いに共有結合している。

【0136】

より長いペプチド
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、少なくとも２つのステープル、及び配列番号１のトロンビン由来の２４～４０個のアミノ酸を含むより長いペプチドであり、本明細書のこのセクションに記載されるペプチド配列のうちの１つを有し得る。このセクションに記載される配列を有するペプチドに加えて、ペプチドは、以下であることも好ましい：
・配列番号１のトロンビン由来の２４～４０個の範囲のアミノ酸、好ましくは、２５～３０個の範囲のアミノ酸の連続配列を含む
・２４～４０個のアミノ酸、好ましくは、２５～３０個のアミノ酸の全長を有する
・少なくとも配列番号１のアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含む、好ましくは、少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｒ２４５、Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含む。

【0137】

本発明のいくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、少なくとも２つのステープルを含むより長いペプチドである。このセクションに記載される配列を有するペプチドに加えて、ペプチドは、以下であることも好ましい：
・配列番号１２のＧＫＹ２５由来の２４～２５個の範囲のアミノ酸の連続配列を含む
・２４～４０個のアミノ酸、好ましくは、２５～３０個のアミノ酸の全長を有する
・少なくとも配列番号１２のＧＫＹ２５のアミノ酸Ｋ１３、Ｋ１４、及びＫ１８を含む、好ましくは、少なくとも配列番号１２のＧＫＹ２５のアミノ酸Ｒ１１、Ｋ１３、Ｋ１４、及びＫ１８を含む。

【0138】

好ましい実施形態では、本発明のより長いペプチドは、
ｉ）配列番号１４、または
ｉｉ）配列番号２６
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は共有結合によって結合されており、さらに、Ｘ_３及びＸ_４は、アミノ酸であり、その側鎖は共有結合によって結合されている。このセクションの配列におけるＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_３及びＸ_４は、例えば、本明細書の上記「内部共有結合」のセクションに記載されている通りであり得る。好ましくは、Ｘ_１及びＸ_２は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンであり、その側鎖は互いに反応してアルケニルテザーを形成しており、Ｘ_３及びＸ_４は、それぞれＧｌｙ及びＧｌｕであり、相互に反応してラクタム架橋を形成している。

【0139】

ペプチド機能
本明細書において上述したように、ペプチドは以下の機能のうちの１つ以上を有し得る。

【0140】

高いインビボ及び／またはインビトロ安定性
好ましくは、ペプチドは高いインビボ安定性を有する。したがって、本発明によるペプチドは、好ましくは、アミノ酸Ｘ_１及びＸ_２が、共有結合を欠く他のアミノ酸に交換されている以外は同じ配列を有するペプチドと比較して、前記ペプチドを同じ条件下で試験した場合に、インビボ及び／またはインビトロでの増加した安定性を有する。

【0141】

インビボ安定性は、例えば、ペプチドを経時的に投与した後のマウスにおける抗炎症活性を決定することによって決定することができる。有意な抗炎症活性が、例えば、２４時間後も維持される場合に、ペプチドは高いインビボ安定性を有する。

【0142】

特に、ペプチドの抗炎症効果は、好ましくは、ペプチドの全身投与後２４時間インビボで維持され得る。

【0143】

インビボ安定性は、例えば、本明細書の以下の実施例１に記載されるように決定することができる。

【0144】

プロテアーゼ耐性の増加
好ましくは、本発明のペプチドは、増加したプロテアーゼ耐性を有する。したがって、このペプチドは、アミノ酸Ｘ_１及びＸ_２が、共有結合を欠く他のアミノ酸に交換されている以外は同じ配列を有するペプチドと比較して、増加した１つ以上のプロテアーゼに対する耐性を有し得る。

【0145】

好ましくは、本発明のペプチドは、アミノ酸Ｘ_１及びＸ_２が、共有結合を欠く他のアミノ酸に交換されている以外は同じ配列のペプチドと比較して、前記ペプチドを同じ条件下で試験した場合に、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエラスターゼ（ＰＥ）、及び／またはトリプシンなどのプロテアーゼの存在下で増加した安定性を有する。

【0146】

プロテアーゼに対する前記耐性は、例えば、以下の実施例１に記載されるように決定され得る。

【0147】

高い抗炎症活性
好ましくは、本発明のペプチドは、高い抗炎症活性を有する。さらにより好ましくは、本発明のペプチドは、抗菌活性及び抗炎症活性の両方を有する。

【0148】

抗炎症活性は、さまざまな方法で決定することができるが、特に、制御された方法で炎症を誘発し、炎症が軽減されるかどうかを決定することによって決定することができる。炎症は、例えば、インビトロでレポーター細胞または血液サンプルをＬＰＳと接触させることによって、または動物にＬＰＳを投与することによって誘発することができる。炎症は、例えば、１つ以上の炎症誘発性サイトカインのレベルを測定することによって、または、ＮＦ－κＢ活性を決定することによって決定され得る。

【0149】

したがって、本発明によるペプチドは、ＬＰＳなどの１つ以上のエンドトキシンの存在下で炎症誘発性サイトカインの分泌を減少させることが好ましい。特に、ペプチドは、ＬＰＳなどの１つ以上のエンドトキシンを含む血液中の炎症誘発性サイトカインの分泌を、インビボで減少させることが好ましい。

【0150】

前記炎症誘発性サイトカインは、例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インターロイキンβ（ＩＬ－１β）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターフェロン（ＩＦＮ－γ）及び／または単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）からなる群から選択され得る。好ましくは、炎症性サイトカインは、ＴＮＦ－α及び／またはＩＬ－１βである。

【0151】

本発明によるペプチドは、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓペプチドグリカン（ＳＡ－ＰＧＮ）及び／またはザイモサンなどのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストの存在下で、ＮＦ－κＢ活性を低下させることが好ましい。

【0152】

１０μＭの濃度の本発明のペプチドは、ＬＰＳの存在下で新鮮な血液中でインキュベートした後、ＴＮＦ－α及び／またはＩＬ－１βの分泌を、アミノ酸Ｘ_１及びＸ_２が、共有結合を欠く他のアミノ酸に交換されている以外は同じ配列のペプチドと比較して、前記ペプチドを同じ条件下で試験した場合に、少なくとも５０％（少なくとも６０％など）、例えば、少なくとも７０％減少させることが好ましい。

【0153】

一実施形態では、本発明のペプチドは、１０μＭ未満（７μＭ未満など）、例えば、１～１０μＭの範囲（１～７μＭの範囲の濃度など）で、ＬＰＳで刺激した血液中のＴＮＦ－αの放出を５０％減少させることができる。

【0154】

抗炎症活性は、本明細書の以下の実施例１及び２に記載される方法の１つによって試験され得る。

【0155】

抗菌活性
本発明のペプチドは、好ましくは抗菌活性を有する。ペプチドは、他のトロンビン由来ペプチドと比較して改善された抗菌活性を有していない場合があるが、増加した抗炎症活性と組み合わせて少なくともある程度の抗菌活性を有することが好ましい。

【0156】

したがって、本発明のペプチドは、グラム陰性菌及び／またはグラム陽性菌に対して殺菌活性を有し得る。興味深いことに、本発明のペプチドは、グラム陰性菌に対して有効であることが示されている。理論に束縛されるものではないが、この効果は、ＬＰＳ及び／または他の膜構造へのペプチドの結合によってもたらされると考えられる。本発明のペプチドは、グラム陽性菌に対しても有効であることが示されている。理論に束縛されるものではないが、この効果は、ＬＴＡ及び／または他の膜構造の結合によってもたらされると考えられる。

【0157】

したがって、ペプチドは、細菌膜を損傷することによって細菌を殺すことができるペプチドを介して媒介される殺菌活性を有し得る。

【0158】

特に、本発明のペプチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからなる群より選択される１種以上の細菌に対して殺菌効果を有することが好ましい。好ましくは、ペプチドは、前述の細菌のすべてに対して殺菌効果を有する。

【0159】

抗菌活性または殺菌活性は、例えば、放射状拡散アッセイまたは生菌数アッセイによって決定され得る。前記アッセイは、例えば、本明細書の以下の実施例１及び２に記載されるように実施され得る。

【0160】

血液中の低い溶血活性
本発明のペプチドは、血液中で低い溶血活性を有することが非常に好ましい。高い溶血活性を有するペプチドは、有毒であり得、それゆえ全身投与にはあまり適していない。

【0161】

一般に、最大１０％の溶血活性が許容される。したがって、本発明のペプチドの溶血活性は、１０％未満であることが好ましく、特に、新鮮な全血における本発明のペプチドの溶血活性は、１０％未満であることが好ましい。

【0162】

より好ましくは、本発明のペプチドの溶血活性は、有効な抗炎症活性を有するペプチド濃度において１０％未満である。好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、抗炎症活性を５０％低下させるペプチド濃度で１０％未満の溶血活性を有する。前記抗炎症活性は、好ましくは、ＬＰＳで刺激した血液中のＴＮＦ－αの放出として決定される。

【0163】

したがって、本発明のペプチドの溶血活性は、ＬＰＳで刺激した血液中のＴＮＦ－αの放出を５０％減少させることができるペプチド濃度で、１０％未満であることが好ましい。

【0164】

一実施形態では、本発明のペプチドの溶血活性は、ＬＰＳで刺激した血液中のＴＮＦ－αの放出を５０％減少させることができるペプチド濃度で、５％未満であることが好ましい。

【0165】

ＬＰＳで刺激した血液中のＴＮＦ－αの放出は、好ましくは、本明細書の以下の実施例１または２に記載されるように決定され得る。

【0166】

いくつかの実施形態では、５０μＭのペプチドを、新鮮な全血中でインキュベートした場合、溶血活性は、最大５％（最大４％など）、例えば、最大３％（最大２％など）である。

【0167】

いくつかの実施形態では、２０μＭのペプチドを、２５％の新鮮な全血中でインキュベートした場合、溶血活性は、最大５％（最大４％など）である。

【0168】

溶血活性は、好ましくは、新鮮な血液を本発明のペプチドとインキュベートし、溶血を決定し、新鮮な血液をＴｗｅｅｎ－２０などの界面活性剤とインキュベートすることによって調製された対照における新鮮な血液の溶血と比較することによって決定される。好ましくは、溶血活性は、対照と比較した溶血％として提供される。

【0169】

溶血活性は、特に、本明細書の以下の実施例１及び２に記載されるように決定され得る。

【0170】

低毒性
本発明のペプチドは、好ましくは、ペプチドの全身投与を可能にする低毒性も有する。

【0171】

構造
本発明のペプチドは、水溶液中で実質的にアルファヘリックス二次構造を有することが好ましい。前記実質的にアルファヘリックス二次構造は、クラスター分化１４（ＣＤ１４）などの標的分子との結合時に維持されることが好ましい。

【0172】

水溶液中のアルファヘリックス二次構造は、好ましくは、円二色性分光法によって決定される。

【0173】

さらに、ペプチドは、低いオリゴマー化度を有することが好ましい。流体力学的半径はオリゴマー化の指標であり、したがって、本発明のペプチドは、低い流体力学的半径を有することが好ましい。好ましくは、本発明のペプチドは、ｐＨ７．４で１５０ｎｍ未満、及び／またはｐＨ５で１００ｎｍ未満の流体力学的半径を有する。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、ｐＨ７．４で１００ｎｍ未満、及び／またはｐＨ５で８０ｎｍ未満の流体力学的半径を有することが好ましい。

【0174】

前記流体力学的半径は、以下の実施例４に記載されるように、動的光散乱によって決定されることが好ましい。

【0175】

抗凝固活性
本発明のペプチドは、抗凝固活性も有し得る。したがって、好ましくは、本発明のペプチドは、血液が血栓を形成する時間を増加させる能力を有する。特に、ペプチドが内因系凝固経路の凝固時間を延長できることが好ましい。前記凝固時間は、好ましくは、「活性化部分トロンボプラスチン凝固時間」（ａＰＴＴ）を決定することによって決定され得る。好ましくは、本発明のペプチドは、ａＰＰＴによって決定される凝固時間を、６０μＭの濃度で少なくとも１００％増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、ａＰＰＴによって決定される凝固時間を、４０μＭの濃度ペプチドで少なくとも９０％増加させる。凝固時間の前記増加は、ペプチドの非存在下での凝固時間と比較される。

【0176】

前記凝固時間は、特に、本明細書の以下の実施例３に記載されるように、ａＰＴＴによって決定され得る。

【0177】

低下した精製ＲＢＣに対する溶血活性
本発明のペプチドは、好ましくは、有効な抗炎症活性を有するペプチド濃度で精製ＲＢＣに対して低い溶血活性を有する。したがって、本発明のペプチドは、ＬＰＳで刺激された血液中のＴＮＦ－α放出及び／またはＩＬ－β放出に関してＩＣ_５０に相当する濃度で、精製ＲＢＣに対して７５％未満、より好ましくは６５％未満、例えば６０％未満の溶血活性を有することが好ましい。精製されたＲＢＣに対する前記溶血活性は、好ましくは、溶血アッセイの項の実施例１に記載されているように決定され得る。

【0178】

治療方法
本発明のペプチドは、さまざまな臨床状態の治療に有用である。したがって、本発明は、薬剤として使用するための本明細書に開示されるペプチドを提供する。

【0179】

特に、本発明のペプチドは、炎症の治療及び／または予防を必要とする個体における、炎症の治療及び／または予防の方法で使用するためのものであり得る。前記方法は、通常、治療的有効量のペプチドを前記個体に投与することを含む。

【0180】

本発明のペプチドは、感染症の治療及び／または予防を必要とする個体における、感染症の治療及び／または予防の方法で使用するためのものでもあり得る。

【0181】

特に、本発明のペプチドは、炎症及び感染症の併用治療または予防、例えば、それを必要とする個体における感染症に関連する炎症の治療に有用である。

【0182】

ペプチドは、任意の有用な方法によって投与することができるが、ペプチドは、非経口投与などの全身投与に特に有用である。例えば、ペプチドは、皮下投与または静脈内投与用であり得る。ペプチドは、肺投与、例えば、吸入によって投与され得る。他の投与経路には、気管内投与及び腹腔内投与が含まれる。

【0183】

治療を受ける個体は、それを必要とする任意の個体、例えば、人間であり得る。

【0184】

本発明のペプチドで治療される感染症は、細菌、真菌、ウイルス及び原生動物からなる群から選択される微生物による感染などの微生物による感染であり得る。したがって、例えば、ペプチドは、細菌感染、真菌感染、もしくはウイルス感染の治療、またはそのような感染に関連する症状の治療に使用するためのものであり得る。

【0185】

したがって、個人は、細菌感染症に罹患し得る。細菌感染症は、急性または慢性の細菌感染症であり得る。本発明のペプチドで治療される症状の非限定的な例には、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎または敗血症が挙げられる。

【0186】

一実施形態では、本発明のペプチドは、炎症性疾患の治療に使用するためのものである。前記炎症性疾患は、例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、胃腸炎、及び肺炎症、例えば、肺炎または肺組織の炎症からなる群から選択され得る。

【0187】

本発明のペプチドで治療される感染症は、あらゆる感染性細菌の感染症であり得る。例えば、細菌は、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌であり得る。したがって、細菌は、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のものであり得る。

【0188】

一実施形態では、治療される個体は、ＬＰＳ、ＬＴＡ、ザイモサン及び／またはＳＡ－ＰＧＮのレベルの増加など、エンドトキシンの増加したレベルを有する。前記個体は、１つ以上の体液中のエンドトキシンの増加したレベルを有し得る。前記体液は、例えば、血液、血清、唾液、鼻咽頭スワブサンプル及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）サンプルからなる群から選択され得る。前記エンドトキシンは、特にＬＰＳであり得る。前記増加したＬＰＳレベルは、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌのレベル、例えば、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌのＬＰＳの血清レベルであり得る。

【0189】

個体はまた、ウイルス感染症、例えば、スパイク糖タンパク質含有ウイルス（本明細書では「Ｓタンパク質ウイルス」とも呼ばれる）、例えば、コロナウイルス科のウイルスによる感染症にも罹患する可能性があり、例えば、ウイルスは以下からなる群から選択される：
ＰｏｒＣｏｖ－ＨＫＵ１５、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、
ＨＣｏＶ ＮＬ６３
ＨＫＵ１、
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、及び
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ。

【0190】

本発明のペプチドは、単独で、または抗生物質、抗炎症剤、または防腐剤（抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤及び抗寄生虫剤など）などの他の治療剤と組み合わせて投与され得る。

【0191】

本発明は、ヒト、及び、特に馬、犬、猫、牛、豚、ラクダなどの他の哺乳動物の両方に関する。したがって、本発明のペプチドは、ヒトの治療及び獣医学への用途の両方に使用するためのものである。このような治療に適した対象物は、発熱、脈拍、微生物の培養等、感染症の確立された特徴によって特定され得る。当該分子で治療され得る感染症には、微生物に起因する感染症が含まれる。微生物の例には、細菌（例えば、グラム陽性またはグラム陰性）、真菌（例えば、酵母及びカビ）、寄生虫（例えば、原生動物、線虫、条虫及び吸虫）、ウイルス、及びプリオン及びそれらの混合物が挙げられる。これらのクラスの特定の微生物はよく知られている（例えば、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３．ｓｕｐ．ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｒｐｅｒ＆Ｒｏｗ，１９８０を参照のこと）。

【0192】

本発明の一実施形態では、本明細書に開示されるペプチドは、疾患、病気または症状の治療または予防に使用するためのものであり、例えば、以下に記載する疾患、病気または症状のいずれかであり得る。

【0193】

全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、ＡＲＤＳ、敗血症、重篤な敗血症、尿路敗血症、敗血症性ショックなどの、感染性要素の有無にかかわらず、急性全身性炎症性疾患。髄膜炎、関節炎、トキシックショック症候群、憩室炎、虫垂炎、膵炎、胆嚢炎、大腸炎、肺炎、尿路感染症、及び腹膜炎を含む、他の侵襲性感染症及び炎症性疾患。

【0194】

嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ及びその他の肺疾患、慢性胃潰瘍を含む胃腸疾患を含む、慢性炎症性疾患及び／または感染症。

【0195】

血栓症及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を含む、炎症性及び凝固障害。さらに、血管炎関連の炎症性疾患、及びアレルギー性鼻炎や喘息を含むアレルギー。

【0196】

脳卒中、ＥＣＭＯなどの体外循環処置、心肺バイパス、またはエクスビボ肺灌流プロセスに関連する炎症、ただしこれらに限定されない。

【0197】

脳卒中、ＥＣＭＯなどの体外循環処置、心肺バイパス、またはエクスビボ肺灌流プロセスに関連する過剰な接触活性及び／または凝固、ただしこれらに限定されない。

【0198】

抗菌治療による過剰な炎症
例えば、本発明のペプチドは、急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性鼻炎、その他の種類の鼻炎、血管炎、血栓症、及び／または播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の治療または予防における使用のためのものであり得る。

【0199】

一実施形態では、本発明のペプチドは、抗炎症活性と抗凝固活性の両方を呈し、炎症及び凝固の併用治療または予防に使用され得る。このようなペプチドは、ＡＲＤＳ、敗血症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、血栓症、ＤＩＣ、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）など、炎症プロセスと凝固プロセスの両方を合わせて阻害することが望ましい症状の治療と予防に特に適し得る。さらに、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性鼻炎及び他の種類の鼻炎、ならびに血管炎など、過剰な炎症及び凝固変化に関連する他の疾患も、ペプチドによる治療から恩恵を受ける得る。

【0200】

ペプチドの調製
ペプチドの製造方法は当技術分野でよく知られている。

【0201】

ペプチドは、当技術分野で周知の組換え法によって産生され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。

【0202】

あるいは、ペプチドは、例えば、アミド結合を介して複数のアミノ酸を結合することによって化学的に合成され得る。通常、ペプチドは、あるアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基の縮合反応によって化学的に合成される。さまざまなアミノ酸側鎖との望ましくない副反応を防ぐために保護基戦略が使用され得る。

【0203】

よく知られる液相または固相ペプチド合成技術は当業者に周知である（標準的なｆ－ＢｏｃまたはＦｍｏｃ固相ペプチド合成など）。

【0204】

２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖の共有結合は、当業者に周知の任意の方法、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０に記載された方法のいずれかによって導入され得る。

【0205】

Ｘ_１及びＸ_２が、オレフィン末端アミノ酸などのアルケニル化アミノ酸である場合は、炭化水素ステープルが、閉環メタセシス（ＲＣＭ）、例えば、ルテニウム触媒による閉環メタセシス、または１，２－ジクロロエタン中のＧｒｕｂｂｓ第１世代触媒を使用したＲＣＭによって導入され得る。ＲＣＭは、溶液中または固体担体上で実行され得、複数の方法がＬｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０及び実施例１に記載されている。

【0206】

同様に、Ｘ_３及びＸ_４が、オレフィン末端アミノ酸などのアルケニル化アミノ酸である場合は、炭化水素ステープルが、閉環メタセシス（ＲＣＭ）、例えば、ルテニウム触媒による閉環メタセシス、または１，２－ジクロロエタン中のＧｒｕｂｂｓ第１世代触媒を使用したＲＣＭによって導入され得る。ＲＣＭは、溶液中または固体担体上で実行され得、複数の方法がＬｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０及び実施例１に記載されている。

【0207】

Ｘ_３が、Ｎ末端アミノ酸及び／またはアミン基を含むアミノ酸であり、Ｘ_４が、カルボン酸側鎖を含むアミノ酸である場合、共有結合は、前記アミンと前記カルボン酸との間のアミド結合であり得る。換言すれば、共有結合は、前記アミンとカルボン酸との間のアミド結合、すなわちラクタム架橋であり得る。このような環化は固相上で実施され得る。

【0208】

本発明によるペプチドは、カスタムメイドペプチドの製造を専門とする会社、例えば、ＡｍｂｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｃ．（ＵＳ）から注文することもできる。

【実施例】

【0209】

実施例１
材料及び方法
ペプチド
ペプチドＧＫＹ２５（ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ）（配列番号１２）、ＨＶＦ１８（ＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ）（配列番号２）、ならびに、ｓＧＫＹ２５（ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＸＫＶＩＸＱＦＧＥ）（配列番号１３）、２ｓＧＫＹ２５（ｃｙｃｌｏ［ＧＫＹＧＥ］ＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＸＫＶＩＸＱＦＧＥ）（配列番号１４）及びｓＨＶＦ１８（ＨＶＦＲＬＫＫＷＩＸＫＶＩＸＱＦＧＥ）（配列番号３）と示されるそれぞれのステープル化バージョンが、ＡｍｂｉｏＰｈａｒｍ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）により合成された。簡単に言うと、標準的な９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成（ＳＰＳＳ）を使用した。炭化水素ステープル化ペプチドを得るために、オレフィン含有（Ｓ）－２－（４’ペンテニル）－アラニンを、配列番号３及び１３のそれぞれのペプチド配列の特定の位置（Ｘで示される）に挿入した。オレフィンメタセシス反応は、１，２－ジクロロエタン中のＧｒｕｂｂｓ第１世代触媒を使用して固体担体上で実行した。生成ペプチドを樹脂から切断し、ＲＰ－ＨＰＬＣによってさらに精製した。ペプチドは、酢酸塩として得られ、純度は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで確認した（＞９５％）。２ｓＧＫＹ２５の環化は、固相条件を用いて、前記ペプチドのＧｌｙ１のＮ末端アミンとＧｌｕ５のカルボン酸側鎖との間にアミド結合、すなわちラクタム架橋を形成することによって実施した。

【0210】

生体材料
書面によるインフォームドコンセントを得た後、健康なドナーから静脈血を採取した。採取後、全血またはその分画（血漿や血清など）は、すぐに使用するか、－８０℃で保存した。血液の使用は、Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ倫理委員会によって承認を受けた（許可番号：ＤＮＲ２０１５／８０１）。

【0211】

円二色性分光法
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）由来のリポ多糖有りまたは無しの、ＧＫＹ２５、ＨＶＦ１８、及びそれぞれのステープル化バージョンの二次構造を、円二色性（ＣＤ）によって評価した。ペプチドを、ｐＨ７．４で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ中で１０μＭに希釈し、１００μｇ ｍＬ^－１ＬＰＳとともに３７℃で３０分間インキュベートした。２５℃に設定したＪａｓｃｏ ＣＤＦ－４２６Ｓ Ｐｅｌｔｉｅｒを備えたＪａｓｃｏ Ｊ－８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、ＵＳＡ）を使用して測定を実行した。スペクトルは、０．２ｃｍクォーツキュベット（Ｈｅｌｌｍａ，ＧｍｂＨ＆Ｃｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内での５回の測定の平均として、１９０～２６０ｎｍ（走査速度：２０ｎｍ分^－１）の間で記録した。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｔｔｅ ｅｔ ａｌによって報告されているように、ベースライン（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４±１００μｇ ｍＬ^－１ＬＰＳ）を、各スペクトルから差し引き、最終シグナルを平均残基楕円率θ（ｍｄｅｇ ｃｍ^２ｄｍｏｌ^－１）に変換した。

【0212】

別の実験のセットでは、ＨＶＦ１８の直鎖及びステープル化バージョンを２５または５０％ＴＦＥと混合するか、または１００μｇ ｍＬ^－１ＬＰＳを含む水中で混合し、その後、上で示したようにスペクトルを取得した。

【0213】

ＲＰ－ＨＰＬＣ
ＨＶＦ１８及びそのステープル化バージョン（２．５μｇ）を、Ｐｅｔｒｕｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０２０）により報告されたプロトコルに従い、Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、逆相Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ５０×２．１ｍｍ ２．６μＭ、孔径１００Å、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に注入した。簡単に説明すると、ＭｉｌｌｉＱ中に０．２５％のＴＦＡを含有する９５％の緩衝液Ａ、及びアセトニトリル中に０．２５％のＴＦＡ含有する５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを平衡化した。カラムにロードする５分前に、ペプチドを緩衝液Ａ（１：３）と事前混合した。

【0214】

以下に説明するように、ペプチドをさまざまなプロテアーゼでさまざまな時間消化し、その後、逆相Ｃ１８カラムに注入した。分析は上記のように実行した。２つの異なる消化からのサンプルを分析した。

【0215】

インビトロでのペプチドのタンパク質分解
ペプチドを、エンドトキシンを含まない水に１ｍＭの濃度で再懸濁した。次に、２０μｇのＧＫＹ２５及びｓＧＫＹ２５または１４．７μｇのＨＶＦ１８及びｓＨＶＦ１８を、０．２μｇのヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標），Ｍｅｒｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエラスターゼ（ＰＥ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標），Ｍｅｒｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｖ８由来のグルタミル－Ｃエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２．１１．９）（ＢｉｏＣｏｌ ＧｍｂＨ，Ｍｉｃｈｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはトリプシン（Ｔｒｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）と一緒に、さまざまな時間の長さ（０～１８時間）、最終量２０μＬでインキュベートした。インキュベーションの最後に、ＴｒｉｃｉｎｅＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び質量分析法（ＧＫＹ２５、ｓＧＫＹ２５、ＨＶＦ１８、及びｓＨＶＦ１８について）、及びＲＰ－ＨＰＬＣ（ＨＶＦ１８及びｓＨＶＦ１８について）によって消化を評価した。すべての消化は、３つの独立した実験で実行した。

【0216】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
各条件からの２μｇのペプチドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＵＳＡ）からの１０～２０％のＮｏｖｅｘ Ｔｒｉｃｉｎｅプレキャストゲルにロードした。１００Ｖで１００分間実行した。ゲルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて染色した。画像は、Ｇｅｌ Ｄｏｃ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）を使用して取得した。３つの独立した消化からのサンプルを分析した。

【0217】

ＮＭＲ分光法
ＮＭＲ実験は、ＱＣＩクライオプローブ及び磁場勾配パルスを備えた７００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ分光計（Ｓｗｅｄｉｓｈ ＮＭＲ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）で実行した。サンプルは、１０％のＤ_２Ｏ、２００μＭのＤＳＳ、０．０２体積％のＮａＮ_３を補充した５０％の２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）に１．６ｍＭのｓＨＶＦ１８をｐＨ４．５で溶解することによって調製した。^１Ｈスペクトルは、２９８Ｋでサンプルから取得した。^１Ｈスペクトル及びＴＯＣＳＹスペクトル（混合時間８０分）に基づいて、一連のＴＯＣＳＹ（混合時間４０及び８０分）、ＮＯＥＳＹ（混合時間１００及び１５０分）、ＲＯＥＳＹ（混合時間１００及び１５０分）、ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、^１３Ｃ編集ＨＳＱＣ、^１５Ｎ－ＳＯＦＡＳＴ－ＨＭＱＣ、^１３Ｃ ＨＳＱＣＴＯＣＳＹ、及び^１３Ｃ－ＨＭＢＣスペクトルを取得した。スペクトルは、二乗コサインアポダイゼーション及び両次元のゼロフィリングでｎｍｒＰｉｐｅを使用して処理した。スペクトルは、ＣＣＰＮＭＲ ｖ２．４を使用して分析し割り当てた。スピン系は、ＮＯＥＳＹスペクトル及びＴＯＣＳＹスペクトルの組み合わせを使用して同定し、ＮＯＥＳＹクロスピークを使用して残基間の結合を割り当てた。

【0218】

ＮＦ－κＢ活性化アッセイ
４つのペプチドの抗炎症活性を、ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ－ＣＤ１４レポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）で試験した。簡単に説明すると、１８０，０００細胞ウェル^－１を、１０％（ｖ ｖ^－１）熱不活化ＦＢＳ及び１％（ｖ ｖ^－１）抗生物質－抗真菌溶液（ＡＡ）を補充したフェノールレッドＲＰＭＩ培地の９６ウェルプレートに播種した。次いで、異なる濃度（１～２０μＭ）のペプチドを含む及び含まない１００ｎｇ ｍｌ^－１のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を添加した。ＮＦ－κＢ活性は、製造業者（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）の指示に従って、２０時間のインキュベーション後に、つまり２０μＬの上清を１８０μＬのＳＥＡＰ検出試薬（Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）、Ｉｎｖｉｖｏ－Ｇｅｎ）と混合し、続いて６００ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。示されているデータは、すべて３連で行われた少なくとも４つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。別の実験のセットでは、細胞を、１０μＭの直鎖及びステープル化ＨＶＦ１８の存在下または非存在下で、１００ｎｇ ｍｌ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ、１μｇ ｍＬ^－１のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＬＴＡ、１μｇ ｍＬ^－１のＥ．ｃｏｌｉ ＰＧＮ、１μｇ ｍＬｌ^－１のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＰＧＮ、１０μｇ ｍＬ^－１のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｚｙｍｏｓａｎで刺激した。実験は上記のように実行した。ＮＦ－κＢの活性を前述のように評価した。

【0219】

溶血アッセイ
健康なドナーからの新鮮な静脈血を、レピルジンチューブに収集した（５０μｇ ｍＬ^－１）。次いで、５０μＬの血液を、フェノールレッド（Ｇｉｂｃｏ）を含まないＲＰＭＩ－１６４０－ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉで予め希釈した１５０μＬのペプチドを含む丸底９６ウェルプレートに移した。１：４に希釈した血液を対照として使用した。１５０μｌの５％Ｔｗｅｅｎ－２０と混合した５０μＬの血液を、陽性対照として使用した。３７℃及び５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした後、プレートを８００ｇで遠心分離し、各サンプル１５０μＬを平底９６ウェルプレートに移し、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。溶血のパーセンテージは、以下に報告する式に従って計算した：

【数1】

【0220】

赤血球に対するペプチドの溶血効果を評価するために、上で報告したように血液を採取し、２５０ｇで１０分間遠心分離した。次いで、血漿を廃棄し、赤血球を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４中の１５０ｍＭ ＮａＣｌで３回洗浄した。次に、ペレットを、生理食塩水Ｔｒｉｓ緩衝液で１００倍に希釈した。この溶液１００μＬを、生理食塩水Ｔｒｉｓ緩衝液で予め希釈したペプチド１００μＬを含有した丸底９６ウェルプレートに加えた。３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした後、プレートを遠心分離し、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、上で報告した式を使用して赤血球溶解の割合を決定した。

【0221】

ＣＤ１４発現及び精製
ヒトＨｉｓタグＣＤ１４（ｈＣＤ１４－ｈｉｓ）を、以前の報告のように昆虫細胞で生成し、精製した^２３。

【0222】

マイクロスケール熱泳動
ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５装置（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を実行した。Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴタンパク質標識キットＲＥＤ－ＮＨＳ（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って６８７μＬ（２０μＭ）の組換えｈＣＤ１４を標識した。ｈＣＤ１４（５μＬの２１ｎＭ）を、１５０ｍＭ ＮａＣｌの有りまたは無し、１：１の比率で、ｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ中で、漸増濃度のＧＫＹ２５、ＨＶＦ１８及びそれらのステープル化バージョン（０．０３～１０００μＭ）とインキュベートした。次に、サンプルを標準的なガラスキャピラリー（Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ、Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードし、ＭＳＴ分析を実行した（発光ダイオードと赤外線レーザーの設定は８０％）。表示された結果は、６回の測定の平均値±ＳＤである。

【0223】

全血アッセイ
レピルジン（５０μｇ ｍＬ^－１）の存在下で健康なドナーから新鮮な静脈血を採取した。血液をＲＰＭＩ－１６４０－ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）で１：４に希釈し、この溶液１ｍＬを２４ウェルプレートに移し、漸増濃度のＧＫＹ２５、ＨＶＦ１８及びそれらのステープル化バージョンを加えた直後に１００ｎｇ ｍｌ^－１のＬＰＳで刺激した。５％ＣＯ_２中、３７℃で２４時間インキュベートした後、プレートを１０００ｇで５分間遠心分離し、その後上清を収集し、分析まで８０℃で保存した。実験は、毎回異なるドナーからの血液を使用して少なくとも４回行った。ペプチドの治癒特性を評価するために、血液を１００ｎｇ ｍｌ^－１ＬＰＳで刺激し、３７℃で３０分間インキュベートした後、漸増用量の４つのペプチドで処理した。最後の実験のセットでは、血液を、漸増濃度のＧＫＹ２５、ＨＶＦ１８、及びそれらのステープル化バージョンに３０分間曝露することによって、ペプチドの予防的抗炎症活性を評価した。次に、血液を１００ｎｇ ｍｌ^－１のＬＰＳで刺激した。

【0224】

サイトカインアッセイ
血液実験から得た血漿を使用してサイトカイン放出を評価した。ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βに特異的な、ヒト炎症ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者の指示に従って使用した。吸光度は、波長４５０ｎｍで測定した。示されているデータは、すべて２連で行われた少なくとも４つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0225】

ネズミ血漿中のＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－１０、及びＩＬ－６のレベルを、マウス炎症キット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＡＢ）を製造者の指示に従って使用して評価した。

【0226】

マウス炎症モデル
ＨＶＦ１８及びｓＨＶＦ１８の免疫調節効果を、ＢＡＬＢ／ｃ ｔｇ（ＮＦ－κＢ－ＲＥ－Ｌｕｃ）－Ｘｅｎレポーターマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、１０～１２週齢）で研究した。ペプチド（５０μｇマウス^－１）を、最終体積２００μＬにてＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ（２５μｇマウス^－１）と同時に皮下注射した。マウス（治療群あたり８匹のマウス）の背側を丁寧に剃り、清潔にした。注射後、動物をすぐに個別に換気されたケージに移し、３時間後に画像を撮影した。ＮＦ－κＢ活性化の測定にＩｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。マウスからの生物発光は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．０ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して検出及び定量化した。ＩＶＩＳイメージングの１５分前に、マウスに１００μＬのＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与した。

【0227】

インビボＬＰＳモデル
Ｅ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４ ＬＰＳを１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４に再懸濁した。次に、致死未満量（体重１ｋｇあたり６ｍｇ）を雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１１～１２週、２２＋／－５ｇ）に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。３０分後、マウス１匹あたり１０、２０、５０、１００または５００μｇのｓＨＶＦ１８（１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５中）をマウスに腹腔内注射した。ＬＰＳ投与から８時間後及び２０時間後、マウスをイソフルランで深く麻酔し、心臓穿刺により血液を採取し、さらなる分析まで－８０℃で保存した。

【0228】

細菌細胞培養
１つのＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２９２１３、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｏ１のコロニー、ならびに８つのＳ．ａｕｒｅｕｓの臨床分離株及び７つのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを、５ｍＬのＴｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ（ＴＨ）培地に３７℃で振盪しながら一晩播種した。翌日、細菌細胞培養物を新鮮なＴＨ培地で１：５０に希釈し、対数期中期まで増殖させた。次に、細菌を３５００ｇで１０分間遠心分離し、洗浄し、その後２×１０^９コロニー形成単位（ＣＦＵ）ｍＬ^－１の最終濃度で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４に再懸濁した。

【0229】

放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）
細菌を上記のように増殖及び調製した。次に、微生物（４×１０^６ＣＦＵ）を、０．０３％（ｗ／ｖ）のＴＳＢ、１％（ｗ／ｖ）の低電気浸透型アガロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び０．０２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる１５ｍＬのアンダーレイアガロースゲルに加えた。アンダーレイゲルを直径１４４ｍｍのペトリ皿に注いだ。アガロースが固化した後、直径４ｍｍのウェルに穴を開け、６μＬの必要な濃度のペプチド溶液を各ウェルに加えた。プレートを３７℃で３時間インキュベートしてペプチドを拡散させた。次いで、アンダーレイゲルを、１５ｍＬの溶融オーバーレイゲル（蒸留Ｈ_２Ｏ中の６％のＴＳＢ及び１％の低電気浸透型アガロース）で覆った。ペプチドの活性を、明確なゾーンからウェルまでの直径として表示する（４ｍｍウェルを除く）。すべての実験は、少なくとも４回実行した。

【0230】

生菌数アッセイ（ＶＣＡ）
細菌を上記のように増殖及び調製した。次に、細菌懸濁液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４で２×１０^６ＣＦＵｍＬ^－１の濃度で１：１０００に希釈した。細菌（５０μＬ）を、１５０ｍＭのＮａＣｌまたは２５％のヒトクエン酸血漿の存在下または非存在下で、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４中で異なる濃度のＧＫＹ２５、ｓＧＫＹ２５、ＨＶＦ１８及びｓＨＶＦ１８（１～２０μＭ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、サンプルの段階希釈物をＴＨ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートし、ＣＦＵを計算した。それぞれの緩衝液で処理した細菌を対照として使用した。すべての実験は、少なくとも４回実行した。示されるデータは平均±ＳＥＭである。

【0231】

生／死アッセイ
細菌膜の透過性は、以前に記載^２４されているように、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって評価した。簡単に言えば、細菌懸濁液を、ＶＣＡと同様に調製した。次に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｏ１懸濁液（５０μＬ）を、それぞれ１μＭまたは５μＭのＨＶＦ１８、及びそのステープル化バージョンによって、ｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ中で処理した。陰性対照として緩衝液を用いた。２時間後、製造会社のプロトコルに示されるように、サンプルを、細菌懸濁液１ｍＬあたり１μＬの色素混合物と混合し、暗所において室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、５μＬの染色された細菌懸濁液をスライドと１８ｍｍ四方のカバースリップの間に挟んだ。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＳｃｏｐｅ Ａ．１蛍光顕微鏡（対物レンズ：Ｚｅｉｓｓ ＥＣ Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ１００／１．３オイル；カメラ：Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｍ、取得ソフトウェア：Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ ２．６（ｂｌｕｅ ｅｄｉｔｉｏｎ））を使用して、３つの独立したサンプル調製物から得た載置サンプルの１０個の視野範囲（１×１ｍｍ）を検査した。

【0232】

透過電子顕微鏡法
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｏ１膜に対するペプチドの効果を、ネガティブ染色と組み合わせた透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）（Ｊｅｏｌ Ｊｅｍ １２３０；Ｊｅｏｌ，Ｊａｐａｎ）によってさらに評価した。特に、ＶＣＡからの５μＬの細菌懸濁液を炭素被覆グリッド（銅メッシュ、４００）上に６０秒間吸着させ、７μＬの２％酢酸ウラニルで３０秒間染色した。グリッドは、低気圧でのグロー放電によって親水性にした。分析は、３つの独立した実験から得たグリッド（ピッチ６２μｍ）上に乗せたサンプルの１０個の視野範囲（倍率’４２００）で行った。

【0233】

ＭＩＣ及びＭＢＣアッセイ
最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、Ｗｉｅｇａｎｄ ｅｔ ａｌ．によって報告されたプロトコルに従って決定した。細菌を上記のように増殖及び希釈した。次に、細菌を、２×ＢＢＬ（商標）Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ＩＩ（ＭＨ）、カチオン調整ブロス（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｐａｒｋｓ，ＵＳＡ）でさらに１：１０００に希釈した。５０μＬの２×ＭＨブロス（対照）を含むかまたは２×２．５～３２０μＭの範囲の濃度のペプチド（ＨＶＦ１８またはｓＨＶＦ１８）を含有するＭＨブロスを含む９６ウェル丸底ポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＩＮＣ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ、ＵＳＡ）に細菌（５０μＬ）を加えた。－次いで、プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。ＭＩＣは、目に見える細菌の増殖が観察されない最低濃度として検証した。ＭＩＣの分析後、同じプレートを使用して最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を決定した。この目的のために、各条件のサンプルをピペットチップを使用して再懸濁し、１０μＬの液滴をＴＨＡプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。ＭＢＣは細菌コロニー形成が観察されない濃度で決定した。

【0234】

結果
タンパク質分解安定性が向上した二重作用ペプチドの設計
トロンビンＣ末端ペプチドＧＫＹ２５は、細菌感染及び関連するＴＬＲによる炎症の両方を標的とする二重作用があることが証明されている。ペプチドの安定性を高める１つのアプローチは、ペプチド炭化水素ステープル化であり、これは、側鎖共有結合炭化水素架橋を使用してペプチドの二次構造を安定化する修飾である。ステープル化は他のペプチドにも適用されているが、ステープル化の効果を予測するのは困難である。特定のアミノ酸を（Ｓ）－２－（４’ペンテニル）－アラニンで置換することにより、炭化水素ステープル部分をＧＫＹ２５の配列（ＧＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ）に導入した。ステープル化の位置は、表１にまとめたＧＫＹ２５の情報に基づいて決定した。
表１

【表1】

【0235】

さらに、中央に位置するリジン残基（Ｋ１３、Ｋ１４、及びＫ１８－このセクションの番号はＧＫＹ２５配列（配列番号１２）を指す）は、ＧＫＹ２５の抗菌活性にとって重要であり得る。さらに、ｐＨ５．５でのＨ８のプロトン化により、膜破壊によるＧＫＹ２５のグラム陰性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに対する抗菌活性が増加する。ＧＫＹ２５は、ＬＰＳ及びＣＤ１４のＬＰＳ結合疎水性ポケットに結合する。ＬＰＳとＣＤ１４の相互作用に関与する残基を表１に示している。研究では、ＣＤ１４においてＫ１４がＫ８７に架橋することが実証されており、インシリコドッキング研究では、Ｑ１７、Ｋ１８、Ｄ２１、Ｑ２２、及びＥ２５のＣ末端残基が溶媒に暴露されることを示している。ＮＭＲ研究により、Ｃ末端α－ヘリックスがＩ１６から始まるＬＰＳ結合立体配座（ＰＤＢコード５ｚ５ｘ）を決定した。ＬＰＳとの相互作用は、疎水性残基及び正に荷電した残基Ｈ８、Ｒ１１、Ｋ１３、及びＫ１４によって媒介される。前述の活性のいずれかを有する可能性があるＧＫＹ２５のアミノ酸を無視すると、アミノ酸Ｑ１７、Ｄ２１、Ｑ２２、及びＥ２５が残った。Ｑ２２とＥ２５が末端に近いため、Ｑ１７とＤ２１の位置にステープル化が導入された。

【0236】

ステープル化ＧＫＹ２５（本明細書ではｓＧＫＹ２５と表記される）の、その天然バージョンと比較したヘリシティを、円二色性（ＣＤ）を使用して分析した。ＬＰＳ存在下でのＧＫＹ２５のスペクトルを陽性対照として使用した。ｓＧＫＹ２５は、α－ヘリックス構造を示し、ＬＰＳに結合した場合のヘリシティ内容はＧＫＹ２５と同等であった。ＬＰＳとのｓＧＫＹ２５の場合、α－ヘリックス内容に変化はなかった。ステープル化がペプチドのタンパク質分解安定性を高めていることを確認するために、ペプチドをさまざまなプロテアーゼに異なる時間曝露し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分析した。図１ａに示すように、ステープル化は、ＨＮＥの存在下で最大６時間、ＧＫＹ２５の安定性を向上させた。さらにトリプシンに対する安定性も向上した。実際、６時間の消化後でも、無傷のｓＧＫＹ２５を検出することは可能であった。興味深いことに、その切断部位が配列中に存在するにもかかわらず、どのペプチドもＶ８消化の影響を受けなかった。天然型と比較して、消化されたｓＧＫＹ２５からどの領域が放出されたかを理解するために、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用した。予想通り、直鎖ペプチドは、３０分の消化後にすでに放出された多種多様なフラグメントを示した。一方、ステープル化はｓＧＫＹ２５に部分的な保護を与えていた。分析した時点では、ＰＥでの消化後にｓＧＫＹ２５のＣ末端部分に対応するフラグメントはほとんど見つからず、ＨＮＥではまったく見つからなかった。ＧＫＹ２５のＮ末端部分はより柔軟性があり、タンパク質分解を受けやすいことが知られているため、これは驚くべきことではない。ＧＫＹ２５をステープル化すると、特に赤血球（ＲＢＣ）に対してより溶血性の高い構築物が得られたが（図４ａ）、ｓＧＫＹ２５は全血においても顕著な溶血活性を示した（図４ａ）。５０μＭの濃度でも、ｓＧＫＹ２５は全血中で１０％を超える溶血活性を示し、これは通常、許容される溶血活性の上限である。

【0237】

ＬＰＳで刺激したＴＨＰ－Ｉ細胞で抗炎症活性を試験したところ、ｓＧＫＹ２５は直鎖ペプチドに関して顕著な改善を示したが、より高濃度では高い毒性も示した（図２ａ）。より生理的な状態、すなわち血液中では、ステープル化ｓＧＫＹ２５ペプチドは、ＬＰＳによって誘発される炎症を全くブロックできなかった（図２ｂ）。

【0238】

ステープル化ＨＶＦ１８（ｓＨＶＦ１８）のヘリシティは、ＣＤ及びＲＰ－ＨＰＬＣの特徴などの疎水性環境によって確認した。ｓＨＶＦ１８は、機能的結合表面がロッキングにより増加したため、直鎖ＨＶＦ１８（８．０３分）と比較した場合、より長い保持時間（９．４２分）を示した。続いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１ｂ）、ＨＰＬＣ、及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってプロテアーゼ切断に対する耐性を試験した。ステープル化により、ＨＮＥ及びＰＥを使用した場合、ＨＶＦ１８の安定性が最大１８時間向上した。さらにトリプシンに対する安定性も向上した。実際、１８時間後でも無傷のｓＨＶＦ１８を検出することは可能であった。直鎖及びステープル化ＧＫＹ２５と同様に、ＨＶＦ１８変異体はＶ８消化の影響を受けなかった。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの結果により、ＨＶＦ１８のステープル化がペプチドにタンパク質分解に対する完全な保護を与えていることが確認された。ｓＨＶＦ１８のヘリックス安定性を、ペプチドを高温に暴露しＣＤによる二次構造を分析することでさらに試験した。８０℃に曝露した後でも、ｓＨＶＦ１８は依然としてα－ヘリックススペクトル、すなわち２０８及び２２２ｎｍに２つの特徴的な最小値を示すことが判明した。注目すべきことに、ｓＨＶＦ１８は、ｓＧＫＹ２５と比較した場合、より低い溶血活性を示した（図４ｂと図４ａを比較）。特に、ｓＨＶＦ１８は、ｓＧＫＹ２５と比較して、全血中で有意に低い溶血活性を示した。

【0239】

ステープルが正しい位置に挿入されていることは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって確認した。ｓＨＶＦ１８は、二次構造を増加させることが知られている５０％ＴＦＥに溶解し、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、^１３Ｃ－ＨＳＱＣ及び^１５Ｎ－ＳＯＦＡＳＴ－ＨＭＱＣスペクトルを収集した。二次構造の推定は、ＣＣＰＮＭＲスイートのＤＡＮＧＬＥ二面角及び化学シフト指数（ＣＳＩ）モジュールを使用して行い、ｓＨＶＦ１８には７～１４個の残基からなるα－ヘリックスが含まれていると推定した。

【0240】

ｓＨＶＦ１８の詳細な核磁気共鳴（ＮＭＲ）研究を実施した。ペプチドを、５０％ＴＦＥに溶解した。ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、^１３Ｃ－ＨＳＱＣ、及び^１５Ｎ－ＳＯＦＡＳＴ－ＨＭＱＣスペクトルを５０％ＴＦＥ中のｓＨＶＦ１８で収集した。ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、及びＲＯＥＳＹスペクトルはよく分散したピークを示し、ＴＯＣＳＹスペクトルで、アミノ酸の種類を簡単に識別することができる。ＮＯＥＳＹ及びＲＯＥＳＹスペクトルには多くのＨＮ－Ｈα及びＨＮ－ＨＮクロスピークが示されており、ペプチドの連続的な割り当てを容易にする。^１３Ｃ ＨＳＱＣスペクトルはよく分散したピークを示す。アミド骨格原子に対応する１６個のクロスピークが^１５Ｎ ＳＯＦＡＳＴ－ＨＭＱＣスペクトルにおいて検出でき、さらに８Ｔｒｐ及び１５Ｇｌｎの側鎖クロスピークも検出できた。^１５Ｎ ＨＭＱＣ及び^１３Ｃ ＨＳＱＣスペクトルは、ｓＨＶＦ１８サンプルが、これらの条件下で明確な立体配座状態を有することを示している。複数のＨＮ－ＨＮ（Ｉ，ｉ＋２）及びＨＮ－Ｈα（Ｉ，ｉ＋２／３）の存在は、明確な二次構造の存在を示す。割り当てが行われ、利用可能な^１Ｈ共鳴の９７％を特定することができた。二次構造の推定は、ＣＣＰＮＭＲスイートのＤＡＮＧＬＥ二面角推定及び化学シフト指数（ＣＳＩ）モジュールを使用して行い、ｓＨＶＦ１８には７～１４個の残基からなるα－ヘリックスが含まれていると推定し、これはＮＯＥパターンにも一致している。ステープル化リンカーは、ステープルの芳香族性によりＮＯＥＳＹスペクトルで容易に確認でき、ＴＯＣＳＹスペクトルに基づいてステープルの存在を確認することができる。構造アンサンブルは、残基Ｖａｌ２－Ｌｅｕ５及びＬｙｓ１１－Ｇｌｙ１７からなる２つのα－ヘリックスを持つＬ字型構造を形成する。Ｎ末端及びＣ末端のα－ヘリックスは、構造的に明確であるが、２つのα－ヘリックスの互いの方向には比較的大きなばらつきがある。ＴＦＥ中のｓＨＶＦ１８の構造をＬＰＳ存在下でのＨＶＦ１８と比較した場合、２．２Åの骨格ＲＭＳＤを持つ同様のＬ字型三次構造を観察することができる。主な違いはＨＶＦ１８のＮ末端部分に見られ、ここではｓＨＶＦ１８で見られるα－ヘリックスは観察されない。しかし、これは、ＣＤ分析によって示されるように、ＬＰＳがＨＶＦ１８を螺旋構造に誘発するよりも、ＴＦＥがｓＨＶＦ１８をより螺旋構造に誘発することに起因する可能性がある。ｓＨＶＦ１８では、ｓＨＶＦ１８のＮ末端部分が、ＨＶＦ１８よりも規則的になっているように見える。ＨＶＦ１８のＣ末端α－ヘリックスは、残基Ｉｌｅ９～Ｇｌｙ１７におよんでおり、これはｓＨＶＦ１８よりもアミノ酸２個分長い。ｓＨＶＦ１８構造アンサンブルからは、ステープルがα－ヘリックスを破壊しているように見える。ｓＨＶＦ１８について取得されたＮＯＥをより詳細に調べ、これらをＨＶＦ１８アンサンブル構造の距離と比較すると、残基５Ｌｅｕ、７Ｌｙｓ、８Ｔｒｐ、９Ｉｌｅ、及び１１ＬｙｓのＮＯＥ距離は、ＨＶＦ１８構造アンサンブルとは一致せず、ｓＨＶＦ１８とＨＶＦ１８との構造の違いを示している。

【0241】

ペプチドの抗炎症活性に対するステープル化の効果
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を使用してＫ_ｄを決定した。ＣＤ１４に対するｓＨＶＦ１８のＫ_ｄは、塩の存在下でさえ顕著に減少した（図５）。ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ－ＣＤ１４レポーター細胞を、漸増濃度の直鎖及びステープル化ＨＶＦ１８の存在下でＬＰＳで刺激し、ＮＦ－κＢ活性化を評価した。図３は、ｓＨＶＦ１８の抗炎症活性が、有意に改善したことを明らかに示している。さらに、これは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＬＴＡ及びＰＧＮ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＰＧＮ、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のザイモサンなどの他のＴＬＲアゴニストにも当てはまった（図６ａ）。ＴＨＰ－１細胞では、ｓＨＶＦ１８によるＬＰＳ誘発性のＮＦ－κＢ／ＡＰ－１活性化のより強い阻害が、その直鎖形態と比較して観察された（図３）。２５％の新鮮なヒト静脈血を、ステープル化ＨＶＦ１８または直鎖ＨＶＦ１８とインキュベートし、同時に、ＬＰＳで２４時間刺激した。本発明者らは、特にＬＰＳによる刺激前またはＬＰＳと一緒にペプチドを添加した場合に、ｓＨＶＦ１８が効率的かつ用量依存的にＴＮＦ－α及びＩＬ－１β分泌を減少させることを見出した（図３及び図７ａ）。血液を最初にＬＰＳで３０分間刺激し、その後、漸増用量のペプチドで処理した場合、ｓＨＶＦ１８の阻害はより低かったが、依然として有意であった（図７ｂ）。

【0242】

実験マウスモデルにおけるエンドトキシン反応に対するステープル化ペプチドの効果。
第１の実験のセットでは、ｓＨＶＦ１８が、ＮＦ－κＢレポーターマウスにおけるＬＰＳ誘発性の局所炎症を抑制できるかどうかを調査した。同量のステープル化または直鎖ペプチドを皮下注射し、同時にＬＰＳを添加し、次いで、ＮＦ－κＢ活性化を経時的に測定した（図８ａ及び９）。インビトロデータと一致して、ｓＨＶＦ１８は、５０μｇですでに強力な抗炎症活性を示したが、その直鎖対応物は効果がなかった（図８ａ及び図９）。実際、より高濃度のＨＶＦ１８が必要であった（２００μｇ）。さらに、直鎖ペプチドの活性は、時間の経過とともに不安定になり、ＬＰＳによって誘発される炎症誘発効果の阻害が減少した。第２の実験のセットでは、エンドトキシン誘発性ショックのマウスモデルでｓＨＶＦ１８の活性を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに致死未満量のＬＰＳをｉ．ｐ．注射し、３０分後に漸増用量のｓＨＶＦ１８で処理した。２０時間後、マウスを屠殺し、血液サンプル中のサイトカインレベルを分析した（図９ｂ）。２０、５０、及び１００μｇのｓＨＶＦ１８において、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、及びＭＣＰ－１などの炎症誘発性サイトカインが有意に減少したことが観察された（図９ｂ）。興味深いことに、５００μｇのｓＨＶＦ１８は、サイトカインレベルをまったく低下させることができなかった。次に、８時間という短い時点を使用して、５０及び１００μｇのｓＨＶＦ１８の効果を調査した（図８ｂ）。両方の濃度のｓＨＶＦ１８において、サイトカインレベルの低いながらも有意な低下が観察された。

【0243】

ペプチドの抗菌活性に対するステープル化の効果
放射状拡散アッセイ（ＲＤＡ）を使用することにより、ｓＨＶＦ１８は、条件、つまりＮａＣｌの有無に関係なく同様に活性であるのに対し、塩なしの実験では、直鎖ペプチドの方が優れた細菌死滅性を示したことが注目された。実際、ＮａＣｌの存在下では、活性の低下が観察された（図１０ａ）。溶液中の抗菌活性を試験すると、評価したすべての菌株においてｓＨＶＦ１８がＨＶＦ１８よりも殺菌性が高いことが判明した（図１０ｂ、左パネル）。さらに、それはＳ．ａｕｒｅｕｓに対して顕著な親和性を示し、１μＭ未満の濃度でそれを死滅させた（図１０ｃ）。この研究の１つの目標は、ｓＨＶＦ１８を全身薬として使用することであったため、塩またはヒト血漿の存在などのより複雑な状況においてもペプチドの活性を評価した（図１０ｂ、中央及び右パネル）。両方のペプチドの抗菌活性は、培地の複雑さが増加するにつれて低下したが、それにもかかわらず、ｓＨＶＦ１８は、その直鎖形態よりも強い殺傷効果を示した（図１０ｂ、中央及び右パネル）。

【0244】

ｓＨＶＦ１８の抗菌活性は、標準的な最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）アッセイでさらに確認した（図１０ｄ、ｅ）。ＶＣＡと同様に、ｓＨＶＦ１８は、グラム陽性菌に対してより強い活性を示した。

【0245】

総合すると、これらの結果は、ｓＨＶＦ１８が、グラム陰性菌に対する抗菌活性を、その直鎖形態と比較した場合、保持していることを示している。さらに、より活性が高いものになり、したがって、グラム陽性菌に対する選択性も高まる。最後に、死滅は、細菌の膜透過性と破壊によってもたらされる。

【0246】

実施例２
材料及び方法
ペプチド
ペプチドＧＫＹ２５（ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥ）（配列番号１２）、ｓＧＫＹ２５（ＧＫＹＧＦＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＸＫＶＩＸＱＦＧＥ）（配列番号１３）、２ｓＧＫＹ２５（ｃｉｃｌｏ［ＧＫＹＧＥ］ＹＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＸＫＶＩＸＱＦＧＥ）（配列番号１４）、ｓＨＶＦ１８（ＨＶＦＲＬＫＫＷＩＸＫＶＩＸＱＦＧＥ）（配列番号３）、ｓＫＶＦ１８（ＫＶＦＲＬＫＫＷＩＸＫＶＩＸＱＦＧＥ）（配列番号４）、ｓＫＫＶＦ１８（配列番号５）、ｓＫＫＫＶＦ１８（配列番号６）、ｓＫＫＫＫＶＦ１８（配列番号７）、ｓＲＶＦ１８（ＲＶＦＲＬＫＫＷＩＸＫＶＩＸＱＦＧＥ）（配列番号８）、ｓＲＲＶＦ１８（配列番号９）、ｓＲＲＲＶＦ１８（配列番号１０）及びｓＲＲＲＲＶＦ１８（配列番号１１）は、ｓＨＶＦ１８について示しているように、ＡｍｂｉｏＰｈａｒｍ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）によって合成及び精製された。ペプチドは、酢酸塩として得られ、純度は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで確認した（＞９５％）。

【0247】

円二色性分光法
すべてのステープル化ペプチドの二次構造は、円二色性（ＣＤ）によって評価した。ペプチドを、ｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓで１０μＭに希釈し、ｓＨＶＦ１８について示しているように、２５℃に設定されたＪａｓｃｏ ＣＤＦ－４２６Ｓ Ｐｅｌｔｉｅｒを備えたＪａｓｃｏ Ｊ－８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ，ＵＳＡ）によってスペクトルを測定した。示されているデータは、３回の独立した実験から得た平均値である。

【0248】

ＮＦ－κＢ活性化アッセイ
全てのステープル化ペプチドの抗炎症活性を、ＴＨＰ１－ＸＢｌｕｅ－ＣＤ１４レポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）で試験した。実験は、各ペプチドの最終濃度が１～１０μＭであることを除いて、ｓＨＶＦ１８について示しているように実施した。示されているデータは、すべて３連で行われた４つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0249】

溶血アッセイ
赤血球または全血に対するステープル化ペプチドの溶血効果を、ｓＨＶＦ１８について示しているように試験した。示されているデータは、すべて３連で行われた少なくとも４つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。各実験では、異なるドナーからの血液を使用した。

【0250】

全血アッセイ
血中のさまざまなステープル化ペプチドの抗炎症効果を、ｓＨＶＦ１８について示しているように実施した。各実験では、異なるドナーからの血液を使用した。

【0251】

サイトカインアッセイ
血液実験から得た血漿を使用してサイトカイン放出を評価した。ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βに特異的な、ヒト炎症ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者の指示に従って使用した。吸光度は、波長４５０ｎｍで測定した。示されているデータは、４回の独立した実験から得た平均値±ＳＥＭである。２ｓＧＫＹ２５については、示されているデータは、２回の独立した実験から得た平均値±ＳＥＭである。

【0252】

ネズミ血漿中のＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－１０、及びＩＬ－６のレベルを、マウス炎症キット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＡＢ）を製造者の指示に従って使用して評価した。

【0253】

インビボＬＰＳモデル
Ｅ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４ ＬＰＳをｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓに再懸濁した。次に、致死未満量（体重１ｋｇあたり６ｍｇ）を雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１１～１２週、２２＋／－５ｇ）に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。３０分後、マウス１匹あたり１０μｇのｓＨＶＦ１８、ｓＫＶＦ１８、ｓＫＫＶＦ１８、ｓＲＶＦ１８またはｓＲＲＶＦ１８（ｐＨ５の１０ｍＭ ＮａＯＡｃ中）をマウスに腹腔内注射した。未処置のマウスの場合、３０分前にｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ１００μＬを注射し、３０分後にｐＨ５の１０ｍＭ ＮａＯＡｃ１００μＬを注射した。ＬＰＳ投与から２０時間後、マウスをイソフルランで深く麻酔し、心臓穿刺により血液を採取し、さらなる分析まで－８０℃で保存した。

【0254】

抗菌作用
Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２９２１３及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｏ１に対するさまざまなステープル化ペプチドの抗菌活性を、放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）または生菌数アッセイ（ＶＣＡ）により、ｓＨＶＦ１８と同様に実施した。ただし、各ペプチドの最高試験濃度は、ＲＤＡ及びＶＣＡについてそれぞれ２０μＭ及び１０μＭであった。

【0255】

結果
ステープル化ペプチドの構造と溶血活性の解析
実施例１に示すように、ＨＶＦ１８のステープル化は、タンパク質分解に対するその安定性を高め、その抗炎症活性（インビトロ及びインビボ）を大幅に改善し、その抗菌活性を維持したが、主にグラム陽性菌に対して活性を向けると同時に、低い溶血活性を有した。ｓＨＶＦ１８のさまざまな変異体が作製され、Ｎ末端Ｈｉｓ残基は、１～４個のＬｙｓまたはＡｒｇ残基に置換した。さらに、ステープル化ＧＫＹ２５の別の変異体（２ｓＧＫＹ２５）が作製され、これは２つのステープル領域を有し、１つの変異体はｓＧＫＹ２５と同様にＣ末端領域にあるが、Ｎ末端領域に追加のステープルを有する。実施例１に記載したように、ｓＧＫＹ２５は、ヒト血液のような複雑な環境においてＬＰＳ誘発性炎症を阻止できなかったため（図２ｂ参照）、二重ステープルの目的は、２ｓＧＫＹ２５が何らかの抗炎症活性を示すことができるかどうかを評価することであった。

【0256】

ｓＨＶＦ１８とその変異体の二次構造を円二色性（ＣＤ）によって評価した。図１１では、ｓＨＶＦ１８のＫ及びＲ変異体がさらに明確なαへリックス構造を持ち、２０８ｎｍに１つ、２２２ｎｍに１つ、２つの最小値があることが見て取れる。これらのペプチドの溶血活性を赤血球（ＲＢＣ）と全血で比較した（それぞれ図１２ａとｂ）。すべてのペプチドが、赤血球に対して溶血性であることが判明した。この点においては、Ｋ残基とＲ残基の量の差による違いは生じなかった（図１２ａ）。同じ分析を全血で実施した場合、陽性残基の数が１または２と比較して３または４の場合に、Ｋ及びＲ変異体の溶血活性が有意に増加することが観察された（図１２ｂ）。全血中の２ｓＧＫＹ２５の溶血活性を分析すると、溶血活性はｓＧＫＹ２５よりもわずかに低いが、ｓＨＶＦ１８よりは明らかに高いことが注目された（図１２ｃ－破線を参照）。図１２の点線は、１０％の溶血活性を示す。一般に、ペプチドの溶血活性が１０％未満であることが好ましい。

【0257】

インビトロ及びインビボでのステープル化ペプチドの抗炎症活性の評価
ＬＰＳ誘発性炎症に対抗するステープル化ペプチドの能力は、ＴＨＰ－１－ＸＢｌｕｅ－ＣＤ１４レポーター細胞で最初に評価した。Ｋを含むＨＶＦ１８の変異体についてのデータを図１３ａに、Ｒを含む変異体について図１３ｂにデータを示す。最終濃度１０μＭで試験した場合、すべてのペプチドが元のｓＨＶＦ１８よりも向上した活性を示した。３つ及び４つのＫまたはＲを有する変異体は、１０μＭのｓＨＶＦ１８と比較して、すでにそれぞれ２μＭ及び５μＭで、より良好な活性を示した。次に、より生理的な環境、つまり２５％の全血における抗炎症活性を評価した。血液を、異なるペプチドの存在下または非存在下でＬＰＳで刺激し、次いで、血漿中のＴＮＦ－α及びＩＬ－１βの放出をＥＬＩＳＡによって定量した（図１４ａ及びｂ）。驚くべきことに、ここでは、３つ及び４つのＫまたはＲを有するペプチドの活性は、１つまたは２つの正に荷電した残基を有するペプチドよりも低かった。特に、２つのＫまたはＲを有するペプチドは改善された効果を示した。特に、これらのペプチドは、１～２μＭという非常に低濃度でもＴＮＦ－α放出を大幅に減少させ、５～１０μＭペプチドでは、ＴＮＦ－α放出がほぼ完全に消失することがわかった。これらのペプチドは、２～５μＭでＩＬ－１β放出を大幅に減少させることもわかった。また、本発明者らは、ＬＰＳで刺激された血液中での、その直線及び単一ステープル型バージョンに関する二重ステープル型ＧＫＹ２５の活性を試験した（図１４ｃ）。Ｎ末端領域でもＧＫＹ２５を閉鎖すると、ＧＫＹ２５よりもＬＰＳ誘発性のＴＮＦ－α及びＩＬ－１β放出がよりよく抑制されることが判明したが、ｓＨＶＦ１８の変異体と比較した場合、より高い用量が必要であった。

【0258】

１つ及び２つのＫまたはＲ変異体を有する１０μｇのｓＨＶＦ１８の活性を、ＬＰＳで刺激されたマウスにおいて比較した。ペプチドで処置したマウスでは、すべてのペプチドがさまざまなサイトカインのレベルを低下させることができることを発見した。２つのＫ及びＲの変異体は、サイトカイン減少に対して最も強い効果を示した（図１５）。

【0259】

インビトロでのステープル化ペプチドの抗菌活性の評価
抗菌ペプチドの活性は、その特定の配列特性と強く関連している。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｏ１及びＳ．ａｕｒｅｕｓに対する活性に対する、ステープル化ｓＨＶＦ１８変異体におけるＫ及びＲの追加の影響を測定した。クリアランスゾーンを、ＮａＣｌの非存在下（図１６ａ）及び１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下（図１６ｂ）で測定した。一般に、正の正味電荷が低いペプチドは塩を含まない培地中でより活性であり、その逆も同様であることが判明した。さらに、ｓＨＶＦ１８Ｋ及びＲ変異体のＮａＣｌなしでプレート上の細菌を除去する能力は、一般に、元のｓＨＶＦ１８と比較した場合、より低濃度でより優れていた。インビボの状況により類似しているＮａＣｌを含むプレートにおいて、特に、Ｋの数が増加した変異体が、大幅に向上した抗菌活性を示した。溶液中のペプチドの殺菌活性を、再度ＮａＣｌの非存在下（図１７ａ）及び存在下（図１７ｂ）で調査した。ここで、Ｋ及びＲ変異を有するｓＨＶＦ１８は、特に塩の存在下で、元のｓＨＶＦ１８と比較して、すべての細菌株に対してより活性であることが見られた。さらに、ペプチドの正味電荷が増加するにつれて活性もより高くなった。

【0260】

結論
実施例１及び２で調査した異なる直鎖及びステープル化ペプチドについての全体的な結果を表２及び図２０ｄに要約する。ステープル化ペプチドの抗炎症活性は、ヒト血液などの複雑な環境において大幅に増加することが実証された。特に、２ＲまたはＫを有するｓＨＶＦ１８の変異体は、優れた結果を示した。一方で、Ｈｉｓを３及び４ＲまたはＫで置換した場合、抗炎症効果は、１及び２ＲまたはＫをもつ変異体よりも低くなり、これは、溶血の結果によって示されるように、おそらくこれらのペプチドの毒性が高いことによる。これらの結果は、ペプチド構造に挿入できる最適な量の正に荷電した残基が存在することを示しており、この場合、これはＫまたはＲの２つの残基に相当する。これらの変異体は両方とも、より高い治療指数、つまり治療濃度と毒性を引き起こす用量との差が大きいことを示した。抗菌活性の保持に関しては、元のｓＨＶＦ１８と比較した場合、Ｈｉｓを１つ以上のＬｙｓまたはＡｒｇ残基で置換すると、これらの変異体の殺菌効果が、特に塩の存在下で、増強されることが観察された。

【0261】

表２：直鎖及びステープル化ペプチドの溶血活性、抗炎症活性及び抗菌活性の比較

【表2】

＊ＩＣ_５０＞１０μＭのペプチドについては、正確なＩＣ_５０が不明であるが、５０μＭで溶血活性を示すように選択した。

【0262】

実施例３－ペプチドの抗凝固特性
材料及び方法
凝固アッセイ
すべての凝固時間の測定に、凝固計（Ａｍｅｌｕｎｇ，Ｌｅｍｇｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。全ての実験に、新しく収集したヒトクエン酸血漿を使用した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定するために、１００μＬのカオリン含有溶液（Ｄａｐｔｔｉｎ、Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ）及び血漿ペプチドミックスを、３７℃で、２００秒間インキュベートし、次いで、１００μＬの３０ｍＭの新鮮なＣａＣｌ_２溶液を添加することによって血餅形成を開始した。プロトロンビン凝固時間（ＰＴ、トロンボプラスチン試薬（Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ））は、１００μＬのあらかじめ温めた（３７℃で６０秒）血漿－ペプチド混合物に、１００μＬの凝固試薬を添加することで記録した。

【0263】

結果
ペプチドの抗凝固特性の評価
ペプチドｓＨＶＦ１８、ｓＫＶＦ１８、ｓＫＫＶＦ１８、ｓＲＶＦ１８、及びｓＲＲＶＦ１８を凝固アッセイで試験した。これらのペプチドの配列を以下の配列概要に示す。結果を図１８に示す。

【0264】

ＬＰＳ及び細菌誘発性接触活性化を介した凝固カスケードの過剰な活性化は、敗血症及び敗血症ショック中に観察される有害な影響の一因となる。したがって、本発明者らは、凝固経路に対する本発明のペプチドの考えられる効果を調査した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）及びプロトロンビン時間（ＰＴ）に対するペプチドの効果を分析したところ、すべてのペプチド変異体がインビトロでのヒト血漿凝固の内因系経路（ａＰＴＴ）の活性化を用量依存的に阻害してはいたが、ＲＲ及びＫＫ変異体ｓＨＶＦ１８は、特に効果的であった（図１８、上パネル）。対照的に、プロトロンビン時間（ＰＴ）を測定することによってモニタリングされた凝固の外因性経路は、試験したどの用量でも影響を受けなかった（図１８、下パネル）。

【0265】

結論
凝固の活性化、線維素溶解の阻害、及び凝固阻害剤の消費は、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）によって合併する可能性のある疾患であるＡＲＤＳ及び敗血症で観察されるように、凝固促進状態をもたらし、微小血管内にフィブリンの沈着をもたらす。結果として、微小血管血栓症は、臓器の機能不全の促進に寄与する。さらに、過剰な接触活性化は、炎症誘発性ペプチドであるブラジキニンの放出とその後の炎症反応の誘発を引き起こし、低血圧や血管漏出などの重篤な合併症の一因となる。したがって、生物学的に関連した状況で、ｓＨＶＦ１８、特にＫＫ及びＲＲ変異体で実証されたような、炎症や凝固を含むいくつかの経路を調節するペプチドは、ＡＲＤＳ、敗血症、その他の全身性炎症性疾患に見られるものなど、これらの経路の過剰な活性化を示す患者に対し、ペプチドに基づく将来の治療法を開発するにあたり、興味深いものである。さらに、接触システムの活性化は、いくつかの非感染性疾患で起こるため、ペプチドによる干渉は凝固機能不全を伴う他の症状にも有益であり得る。

【0266】

実施例４－ペプチドのオリゴマー化
材料及び方法
動的光散乱（ＤＬＳ）
溶液中の粒子の流体力学的半径を、温度制御されたチャンバー（２５℃）を備えたＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅリーダー（ＷＹＡＴＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して測定した。ペプチド（ＨＶＦ１８、ｓＨＶＦ１８、ｓＫＶＦ１８、ｓＫＫＶＦ１８、ｓＲＶＦ１８、及びｓＲＲＶＦ１８－配列は以下の配列概要に記載）を、分析の直前に、最終濃度として１ｍＭでｐＨ７．４の１０ｍＭ ＴｒｉｓまたはｐＨ５の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに再懸濁した。分析には、各サンプル３０μＬを使用した。各測定は、１０回のサブランで３連で実施した。流体力学的半径は、Ｄｙｎａｍｉｃｓ７．１９ソフトウェアを使用して分析した。結果は、３回の独立した実験から得られた平均値±ＤＳとして表される。

【0267】

結果
ペプチドのオリゴマー化
結果を図１９に示す。ペプチドのオリゴマー化は、多くの場合、毒性や免疫原性、さらには活性の低下と関連しているため、不利であると考えられている。ＴＣＰ－２５及びＨＶＦ１８はオリゴマー化する。ペプチドのオリゴマー化に対するステープル化の影響を測定した。溶液中の粒子の流体力学的半径（ｎｍで）のサイズは、ペプチドを、ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＴｒｉｓまたはｐＨ５の１０ｍＭ ＮａＯＡｃに溶解した直後に、動的光散乱（ＤＬＳ）によって評価した。酸性ｐＨでは、ＴＣＰ－２５のオリゴマー化が阻害されることを以前報告している。さらに、このｐＨでは、ペプチドはまったく構造化されていない。ＨＶＦ１８の粒子は、ｐＨ５よりもｐＨ７．４の方が大きかった。一方、ｓＨＶＦ１８は、両方のｐＨにおいて、ＨＶＦ１８と比較してサイズが大幅に小さい粒子を示した。ｓＨＶＦ１８のＫ及びＲ変異体の流体力学的半径を分析すると、粒子のサイズはさらに小さく、ｐＨにまったく依存しておらず、このことは、ステープル化及び正電荷の両方によりペプチドがオリゴマー化しにくくなることを示唆している。興味深いことに、Ｋ変異体とＲ変異体の間で、及び配列内のこれらの正に荷電したアミノ酸の数で、有意な差は観察されなかった。

【0268】

実施例５
材料及び方法
ペプチド
ペプチドｓＨＶＦ１８（ＨＶＦＲＬＫＫＷＩＸＫＶＩＸＱＦＧＥ）（配列番号３）、その短いバージョン（ｓＶＦＲ１７、ｓＦＲＬ１６、ｓＲＬＫ１５、ｓＬＫＫ１４、ｓＫＫＷ１３として示される）、ｓＫＫＷ１３の変異体（ｓＫＫＫ１４、ｓＫＫＫ１５、ｓＲＫＫ１４、ｓＲＲＫ１５として示される）、２ｓＧＫＹ２５として示される二重．ステープル化ＧＫＹ２５（ｃｙｃｌｏ（ＧＫＹＧＦＹ）ＴＨＶＦＲＬＫＫＷＩＸＫＶＩＸＱＦＧＥ）は、ＡｍｂｉｏＰｈａｒｍ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）により合成された。簡単に言うと、標準的な９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成（ＳＰＳＳ）を使用した。炭化水素ステープル化ペプチドを得るために、オレフィン含有（Ｓ）－２－（４’ペンテニル）－アラニンを、配列番号３及び１３のそれぞれのペプチド配列の特定の位置（Ｘで示される）に挿入した。オレフィンメタセシス反応は、１，２－ジクロロエタン中のＧｒｕｂｂｓ第１世代触媒を使用して固体担体上で実行した。生成ペプチドを樹脂から切断し、ＲＰ－ＨＰＬＣによってさらに精製した。ペプチドは、酢酸塩として得られ、純度は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで確認した（＞９５％）。

【0269】

溶血アッセイ
赤血球及び／または全血に対するステープル化ペプチドの溶血効果を、ｓＨＶＦ１８について示しているように試験した。示されているデータは、すべて３連で行われた少なくとも４つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。各実験では、異なるドナーからの血液を使用した。

【0270】

全血アッセイ
血中のさまざまなステープル化ペプチドの抗炎症効果を、ｓＨＶＦ１８について示しているように実施した。各実験では、異なるドナーからの血液を使用した。

【0271】

サイトカインアッセイ
血液実験から得た血漿を使用してサイトカイン放出を評価した。ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βに特異的な、ヒト炎症ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者の指示に従って使用した。吸光度は、波長４５０ｎｍで測定した。示されているデータは、４回の独立した実験から得た平均値±ＳＥＭである。

【0272】

ブタＡＲＤＳモデル
動物の準備：農場で飼育された野生型アメリカヨークシャー豚（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）の成体雌豚と雄豚が研究に含まれた。動物を治療群または非治療群に階層化した。平均体重４５ｋｇの合計１０頭のブタに、ケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｏｌ（登録商標）獣医用１００ｍｇ／ｍＬ；Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ Ｇｅｌｌｉｎｉ Ｓ．ｐ．Ａ．，Ａｐｒｉｌｉａ，Ｉｔａｌｙ；２０ｍｇ ｋｇ^－１）及びキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）獣医用２０ｍｇ ｍＬ^－１；Ｂａｙｅｒ ＡＧ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；２ｍｇ ｋｇ^－１）を事前投薬した。尿道カテーテルを膀胱に挿入した。末梢静脈（ＩＶ）ラインを耳たぶに設置し、ケタミン（ケタミノール（登録商標）獣医用、ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｗｅｄｅｎ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ミダゾラム（ミダゾラムパンファーマ（登録商標）、Ｐａｎｐｈａｒｍａ Ｎｏｒｄｉｃｓ ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）及びフェンタニル（Ｌｅｐｔａｎａｌ（登録商標）、Ｐｉｒａｍａｌ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｂ．Ｖ．，Ｖｏｏｒｓｃｈｏｔｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で全身麻酔を維持した。Ｓｉｅｍｅｎｓ－Ｅｌｅｍａ人工呼吸器（Ｓｅｒｖｏ９００Ｃ，Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、挿管用の７．５サイズの気管内チューブで機械換気を確立した。メーカーの指示に従って、ピーク圧力を下げる「定流量」のフローパターンスイッチを備えた量調節換気（ＶＣＶ）が使用した。Ｉ：Ｅ比１：２を達成するために、吸気時間を２５％、休止時間を１０％に設定し、二酸化炭素レベル（ＰａＣＯ_２）を３３～４１ｍｍＨｇに維持するように換気を調整した。一回換気量（Ｖｔ）は、６～８ｍＬ ｋｇ^－１に維持した。式（ａ）を使用して動的コンプライアンスを決定した。

【数2】

【0273】

さらに、動脈ライン（Ｓｅｃａｌｏｎ－Ｔ（商標），Ｍｅｒｉｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄ，Ｇａｌｗａｙ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を右総頚動脈に挿入した。肺動脈カテーテル（Ｓｗａｎ－Ｇａｎｚ ＣＣＯｍｂｏ Ｖ ａｎｄ Ｉｎｔｒｏｆｌｅｘ，Ｅｄｗａｒｄｓ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＧｍｂＨ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を右内頸静脈に配置した。

【0274】

リポ多糖によるＡＲＤＳ誘発：ベルリン基準（Ｆｏｒｃｅ ｅｔ ａｌ．）に従ってＡＲＤＳを誘発するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ（Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を静脈内に使用した。投与前に、ＬＰＳを生理食塩水で希釈した（２μｇ ｋｇ^－１分^－１）。ＬＰＳ投与の結果、すべての動物は血行動態不安定となり、ノルエピネフリン（４０μｇ ｍＬ^－１、０．０５～２μｇ ｋｇ^－１分^－１；Ｐｆｉｚｅｒ ＡＢ、Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）及びドブタミン（２ｍｇ ｍＬ^－１、２．５～５μｇ ｋｇ^－１分^－１；Ｈａｍｅｌｎ Ｐｈａｒｍａ Ｐｌｕｓ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｅｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を点滴する、継続的な変力補助を必要とした。酢酸リンゲル剤（Ｂａｘｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＢ，Ｋｉｓｔａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を体液損失を補うために使用した。ベルリンの定義（Ｆｏｒｃｅ ｅｔ ａｌ．）に従って、測定されたＰａＯ２ ＦｉＯ_２ ^－１比に基づいて、さまざまなＡＲＤＳ段階を定義した：比が２０１～３００ｍｍＨｇの場合は軽度のＡＲＤＳ、比が１０１～２００ｍｍＨｇの場合は中程度のＡＲＤＳ、比が≦１００ｍｍＨｇの場合は重度のＡＲＤＳ。ＡＲＤＳ状態は、１５分間隔以内に測定された２つの別々の動脈血ガス測定値が、ベルリンの定義のＰａＯ_２ ＦｉＯ_２ ^－１の範囲内に収まった場合に確定とみなした。

【0275】

ｓＨＶＦ１８治療：治療コホートでは、各動物に、上大静脈内の中心静脈カテーテルを使用して、ペプチド溶液（５０ｍＬ中１２ｍｇ）を３０分間かけて２回静脈内投与した。

【0276】

動脈血ガス分析：動脈血を３０分ごとに収集し、ＡＢＬ ９０ ＦＬＥＸ血液ガス分析装置（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡｐＳ，Ｂｒｏｎｓｈｏｊ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で分析した。臨床基準に従って、測定値は３７℃の血液温度に正規化した。

【0277】

血行動態測定：動物を注意深く観察し、ＡＲＤＳ誘発の開始前とその後３０分ごとに、スワンガンツカテーテルと動脈ラインによる熱希釈を使用して血行動態パラメータを測定及び記録した。記録されたパラメータは、心拍数（ＨＲ）、収縮期血圧（ＳＢＰ）、拡張期血圧（ＤＢＰ）、平均動脈圧（ＭＡＰ）、中心静脈圧（ＣＶＰ）、心拍出量（ＣＯ）、収縮期肺血圧（ＳＰＰ）、拡張期肺圧（ＤＰＰ）、平均肺圧（ＭＰＰ）、肺動脈楔入圧（ＰＡＷＰ）、全身血管抵抗（ＳＶＲ）、及び肺血管抵抗（ＰＶＲ）であった。

【0278】

組織病理学的分析：ＡＲＤＳが確認された後、右下葉の生検体を採取した。生検体を直ちに１０％中性緩衝ホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）に移し、４℃で一晩固定した。ホルマリン固定組織は、パラフィン包埋（Ｈｉｓｔｏｌａｂ）前に、段階的エタノールシリーズ（溶液はＨｉｓｔｏｌａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＡＢ，Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎから取得）及び透明溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。４μｍの切片を切り出し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ）に移した。切片を室温で一晩乾燥させた。脱パラフィン後、切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（いずれもＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色し、続いて連続的に段階的エタノール及びキシレン溶液（Ｈｉｓｔｏｌａｂ）中で脱水した。染色された切片は、最終的にＰｅｒｔｅｘ溶液（Ｈｉｓｔｏｌａｂ）で封入した。明視野画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＫＸ５３顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｓｈｉｎｊｕｋｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって取得した。各動物からの画像は、５つのパラメータ：肺胞腔及び間質腔内の免疫細胞の数、タンパク性残骸の発生、肺胞中隔の肥厚及び構造的変化の提示、最後に出血、硝子膜、または損傷の増強のその他の兆候の提示、に基づいて、盲検での３人のスコアラーによって肺損傷について独立して採点した。スコアは、各基準の０～６のスケールに基づいて与えられた。スコアは、各サンプルの特性スコアの合計の平均として表示される。

【0279】

結果
ｓＨＶＦ１８のより短い変異体の溶血活性及び抗炎症活性の分析
実施例１に示すように、ＨＶＦ１８のステープル化は、タンパク質分解に対するその安定性を高め、その抗炎症活性（インビトロ及びインビボ）を大幅に改善し、その抗菌活性を維持しながら、主にグラム陽性菌に対して活性を向けると同時に、溶血活性が低かった。活性ペプチドをどの程度小さくできるかを評価するために、ｓＨＶＦ１８のより短い変異体を作製した。ダブルステープル化ＧＫＹ２５（２ｓＧＫＹ２５）、すなわち、ｓＧＫＹ２５と同様にＣ末端領域に１つと、Ｎ末端領域に１つを比較のために使用した。

【0280】

異なるステープル化されたペプチドのライブラリーを生成し、次いでそれらの溶血効果（図２０ａ）対抗炎症活性（図２０ｂ）についてスクリーニングした。ＬＰＳ刺激血液中のＴＮＦ－α及びＩＬ－１βのＩＣ_５０に必要な同じペプチドの濃度の関数として、赤血球に対するすべてのペプチドの溶血活性の割合を示すと、特にｓＨＶＦ１８が有望であることが判明した（図２０ｃ）。

【0281】

ｓＫＫＷ１３変異体の溶血活性及び抗炎症活性の分析
ｓＬＫＫ１４及びｓＫＫＷ１３は、両方とも低い溶血活性を示した（図２０ａ）が、ｓＬＫＫ１４は、溶液に入るとオリゴマー化し、同時にその免疫調節効果を失う傾向があったが、一方、ｓＫＫＷ１３はそうではなかった（図２０ｂ）。したがって、本発明者らは、ｓＫＫＷ１３に１つまたは２つのＫ及びＲ残基を追加すると、その抗炎症活性が向上するのではないかという仮説を立てた。本発明者らはまず、これらの新しいペプチドの溶血活性を、元のペプチド及びｓＨＶＦ１８と全血に対して比較した（図２１ａ）。Ｋ及びＲ変異体は、はるかに高い溶血活性を示した。次に、ＬＰＳで刺激された血液中のサイトカイン産生を減少させるそれらの能力を試験した（図２１ｂ）。Ｋ及びＲ変異体はすべて、ｓＨＶＦ１８よりも活性が低く、ｓＫＫＷ１３と比較した場合、大きな改善は得られなかった。

【0282】

ブタＡＲＤＳモデルにおけるｓＨＶＦ１８の効果
確立されたＡＲＤＳの前臨床ブタモデルにおけるｓＨＶＦ１８の治療効果をさらに調査した。ＡＲＤＳを、Ｅ．ｃｏｌｉのＬＰＳを静脈内注射することで誘発した（研究概要を図２２ａに示す）。すべてのブタは、血行動態不安定となり、ＬＰＳ投与後にノルエピネフリンによる変力補助を必要とした（変力補助とは、血行動態安定を維持するという臨床目的でのドブタミン及びノルエピネフリンの薬剤の使用を指す）。この血行動態不安定だけでなく、実験の経時的な処置したブタと未処置のブタの差異についても、ＰａＯ_２／ＦｉＯ_２比（図２２ｂ）、心拍出量（図２２ｃ）、尿量（図２２ｄ）、ノルエピネフリン（ＮＡ、図２２ｅ）、及び乳酸レベル（図２２ｆ）によって示される。

【0283】

全体として、ｓＨＶＦ１８の静脈内投与後、処置した動物は血行動態が安定し、未処置の動物と比較して変力補助の必要性が大幅に減少した。処置した動物は、ＰａＯ_２／ＦｉＯ_２比において未処置の動物ほど悪化せず、血液ガスによれば、５頭の処置した動物のうち１頭だけが軽度のＡＲＤＳを示した（ベルリンの定義のＡＲＤＳによる）。

【0284】

実験のエンドポイントで肺組織サンプルを右下葉から採取し、５頭の健康な対照ブタからの肺組織サンプルと比較した。組織学的分析のために健康な対照から採取した肺生検体は、異常がなく、正常であるように見えた（図２２ｇ、左パネル）。実験のエンドポイントで処置した動物と未処置の動物の両方から採取されたすべての生検体において、免疫細胞の浸潤と、肺胞内出血による肺胞毛細血管障壁の肥厚などのびまん性肺胞損傷の兆候が示されたが、処置したブタではそれが少なかった（図２２ｇ、中央及び右パネル）。肺組織学の主観的な分析に加えて、３人の独立した観察者によってすべてのブタに対して盲検スコアリングを実行した。健康な対照と比較して、未処置群における累積肺損傷スコアの有意な増加が見られ、これは、ＬＰＳ投与による急性肺損傷発症後の肺損傷の複数の兆候を説明する。処置したブタと未処置のブタの間には有意な差が見られ（図２２ｈ）、処置ブタでは肺損傷の兆候が少なかった。

【0285】

実施例６
材料及び方法
ペプチドステープル位置のインシリコ解析
ＨＶＦ１８のＮＭＲ構造（ＰＤＢ：５Ｚ５Ｘ）（Ｓａｒａｖａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）を、ＣｌｕｓＰｒｏウェブサーバーを使用してヒトＣＤ１４のモデル化された構造にドッキングした（Ｋｏｚａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。Ｓａｒａｖａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８に記載されるものと同様の結果が得られ、それによってペプチドは、ＣＤ１４のＮ末端に結合する。最高得点のドッキングポーズの構造をテンプレートとして選択し、ＧＫＹ２５をモデル化した。Ｎ末端ＧＫＹＧＦＹＴ残基は、Ｍｏｄｅｌｌｅｒバージョン９．２１を使用してモデル化し、個別に最適化されたタンパク質エネルギースコアが最も低いモデル（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００６）を選択した。（Ｊｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）に記載されているように、ＣＨＡＲＭＭ－ＧＵＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｉｌｄｅｒを使用して、ＧＫＹ２５－ＣＤ１４複合体をＴＩＰ３Ｐ水及びＮａＣｌ塩で溶媒和した。最急降下エネルギーの最小化と１２５ｐｓの平衡シミュレーション（それにより、タンパク質及びペプチドの主鎖原子に位置制限が適用される）を、標準ＣＨＡＲＭＭ－ＧＵＩプロトコルに従って実行した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。平衡化後の最終スナップショットを抽出し、分子力学ポアソンボルツマン表面積（ＭＭＰＢＳＡ）法を使用してＧＫＹ２５とＣＤ１４間の結合エネルギーを計算した（Ｋｕｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＣＨＡＲＭＭ－ＧＵＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｉｌｄｅｒ（Ｊｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）を使用して、位置ｉ及びｉ＋３の残基をアラニンに変異させ、それらを２つのペンテンセグメントと連結することによって、疎水性ステープルをＧＫＹ２５ペプチドに付加した。次いで、ＣＤ１４に結合したステープル化ＧＫＹ２５を、上記と同じ溶媒和、最小化及び平衡化手順に供し、その後、それらの結合エネルギーをＭＭＰＢＳＡを使用して決定した。同様のプロトコルを、位置ｉ及びｉ＋４にステープルを付加するために実行した。次に、非ステープル化ＧＫＹ２５に対する結合エネルギーの差を計算した。ペプチドステープル位置の同様の分析を、より短いＨＶＦ１８ペプチドに対しても実施した。

【0286】

結果
タンパク質分解安定性が向上した二重作用ペプチドの設計
次に、ペプチドステープル位置のインシリコ解析を実行し、残基ｉとｉ＋３または残基ｉとｉ＋４を連結する短い疎水性ペンテニルアラニンステープルをＧＫＹ２５の配列に沿って付加した。ＣＤ１４への結合に対するこのステープル付加の効果を決定するために、次に、ペプチドの非ステープル化バージョンとステープル化バージョンとの間の結合エネルギーの差を計算した。その結果を図２３に示す。本発明者らは、より長いＧＫＹ２５ペプチドのほとんどの位置、特にペプチドのＮ末端領域にステープルを付加すると、正の結合エネルギー差によって示されるように結合が低下することを見出した（図２３Ａ及びＢの結果を参照）。親和性の低下は、ペプチドとＣＤ１４の間の相互作用を混乱させるステープルによって引き起こされた可能性がある。いくつかのステープルは、ＣＤ１４への結合を改善した。ｉ－ｉ＋３構成では、これらにはＩ１６－Ｖ１９、Ｖ１９－Ｑ２２、Ｉ２０－Ｄ２３、及びＤ２１－Ｇ２４が含まれ、ｉ－ｉ＋４構成では、これらにはＶ９－Ｋ１３及びＱ１７－Ｄ２１が含まれる。Ｑ１７－Ｄ２１ステープルを除き、ＣＤ１４へのより好ましい結合をもたらしたすべてのステープルは、ＬＰＳとの相互作用に重要である可能性のある疎水性残基を含んでいる。

【0287】

対照的に、より短いＨＶＦ１８ペプチドでは、ほとんどのステープルで親和性の向上が見られた（図２３Ｃ及びＤを参照）。ｉ－ｉ＋３構成では、少なくとも次のステープルにて親和性が向上した：Ｖ２－Ｌ５、Ｆ３－Ｋ６、Ｌ５－Ｗ８、Ｋ６－Ｉ９、Ｉ９－Ｖ１２、Ｑ１０－Ｉ１３、Ｋ１１－Ｄ１４、Ｖ１２－Ｑ１５、Ｉ１３－Ｆ１６、Ｄ１４－Ｇ１７、及びＱ１５－Ｅ１８。ｉ－ｉ＋４構成では、少なくとも次のステープルにて親和性が向上した：Ｖ２－Ｋ６、Ｋ６－Ｑ１０、Ｗ８－Ｖ１２、Ｉ９－Ｉ１３、Ｑ１０－Ｄ１４、Ｖ１２－Ｆ１６、Ｉ１３－Ｇ１７、及びＤ１４－Ｅ１８。結合の改善をもたらしたステープルでは、Ｑ１０－Ｄ１４（ＧＫＹ２５のＱ１７－Ｄ２１に相当）が、最も負の結合エネルギー差のうちの１つを有する。

【0288】

参考文献
Ｆｏｒｃｅ，Ａ．Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｔｈｅ Ｂｅｒｌｉｎ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ．ＪＡＭＡ ３０７，２５２６－２５３３（２０１２）．

Ｊｏ，Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｔ．，Ｉｙｅｒ，Ｖ．＆Ｉｍ，Ｗ．ＣＨＡＲＭＭ－ＧＵＩ：Ａ Ｗｅｂ－Ｂａｓｅｄ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｕｓｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｆｏｒ ＣＨＡＲＭＭ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２９，１８５９－１８６５（２００８）．

Ｋａｌｌｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｈｏｃｋ ａｎｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｓｅｐｓｉｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７，ｅ５１３１３（２０１２）．

Ｋｏｚａｋｏｖ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＣｌｕｓＰｒｏ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｃｋｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１２，２５５－２７８（２０１７）．

Ｋｕｍａｒｉ，Ｒ．，Ｋｕｍａｒ，Ｒ．＆ Ｌｙｎｎ，Ａ．Ｇ－ｍｍｐｂｓａ －Ａ ＧＲＯＭＡＣＳ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＭＭ－ＰＢＳＡ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．５４，１９５１－１９６２（２０１４）．

Ｌｅｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＣＨＡＲＭＭ－ＧＵＩ Ｉｎｐｕｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ ｆｏｒ ＮＡＭＤ，ＧＲＯＭＡＣＳ，ＡＭＢＥＲ，ＯｐｅｎＭＭ，ａｎｄ ＣＨＡＲＭＭ／ＯｐｅｎＭＭ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＨＡＲＭＭ３６ Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｆｏｒｃｅ Ｆｉｅｌｄ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏｒｙ Ｃｏｍｐｕｔ．１２，４０５－４１３（２０１６）．

Ｌｉ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｐｌｅｄ Ｈｅｌｉｃａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｂｅａｒｉｎｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０２０，１２０，１００７９－１０１４４

Ｍｏｒｒｉｓｅｔｔ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａｐｏＬＰ－ａｌａｎｉｎｅ） ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２，１２９０－１２９９（１９７３）．

Ｐａｐａｒｅｄｄｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｎｏｖｅｌ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ６，ｅ１０００８５７（２０１０）．

Ｐｅｔｒｕｋ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ ｂｏｏｓｔｓ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２（１２） ９１６－９３２（２０２０）．

Ｐｅｔｒｕｋ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ａｎｄ ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ＴＣＰ－２５．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１０（１１），１５７２（２０２０）．

Ｐｕｔｈｉａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｄｕａｌ－ａｃｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｗｏｕｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（２０２０）．

Ｐｕｔｈｉａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｄｕａｌ－ａｃｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｗｏｕｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２（５２４）（２０２０）．

Ｓａｒａｖａｎａｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，９（１），１－１４（２０１８）．

Ｓｈｅｎ，Ｍ．，Ｄｅｖｏｓ，Ｄ．，Ｍｅｌｏ，Ｆ．＆ Ｓａｌｉ，Ａ．Ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｓｃｏｒｅ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１５，１６５３－１６６６（２００６）．

Ｓｈｉ，Ｘ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８５，１１１８５－１１１８８（２０１３）．

Ｓｔｒｏｍｄａｈｌ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｃｏａｔｅｄ ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｒｅｄｕｃｅｓ ｗｏｕｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ（２０２１）．

【表3】

【0289】

略記：
ＡＭＰ、抗菌ペプチド；ＡＭＲ、抗菌耐性；ＣＤ、円二色性；ＰＡＭＰ、病原体関連分子パターン；ＴＣＰ－２５、２５アミノ酸のトロンビンＣ末端ペプチド；ＴＥＭ、透過型電子顕微鏡；ＴＬＲ、ｔｏｌｌ様受容体。

【0290】

配列の概要

【表4】

【0291】

上記の配列リストにおいて、Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ最初は（Ｓ）－２－（４’ペンテニル）－アラニンであり、ＲＣＭによって互いに反応してオレフィンテザーを形成する。配列表には、未反応のペプチドの配列が示されている。当業者であれば、たとえ未反応の配列が提供されても、一般にペプチドはステープル化形式で、すなわちＲＣＭによってオレフィンテザーが形成された後に使用されることを理解するであろう。また、Ｘ_３及びＸ_４は、それぞれグリシン及びグルタミン酸であり、互いに反応してラクタム架橋の形態で共有結合を形成する。

【0292】

項目
本発明は、以下の項目にいずれか１つによってさらに定義され得る：
１．最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１のトロンビン由来の１０～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含むペプチドであって、
ｉ）１０～４０個のアミノ酸の全長を有し、
ｉｉ）２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの内部共有結合を含み、ここで前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、
ｉｉｉ）さらに少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含み、
ただし、前記ペプチドが、２４～４０個のアミノ酸の全長を有する場合は、２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも２つの内部共有結合を含み、第１の内部共有結合の前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、第２の内部共有結合の前記アミノ酸は、Ｘ_３及びＸ_４で示される、前記ペプチド。

【0293】

２．前記ペプチドが、配列番号１のトロンビン由来の１０～４０個の範囲のアミノ酸の連続配列を含む、項目１に記載のペプチド。

【0294】

３．最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１のトロンビン由来の１０～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含むペプチドであって、前記ペプチドは、
ｉ）１０～２３個のアミノ酸の全長を有し、
ｉｉ）２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの内部共有結合を含み、前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、
ｉｉｉ）少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｋ２４７、Ｋ２４８及びＫ２５２を含む、前記ペプチド。

【0295】

４．最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１２のＧＫＹ２５由来の１０～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含むペプチドであって、前記ペプチドは、
ｉ）１０～２３個のアミノ酸の全長を有し、
ｉｉ）２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの内部共有結合を含み、前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、
ｉｉｉ）少なくとも配列番号１２のＧＫＹ２５のアミノ酸Ｋ１３、Ｋ１４及びＫ１８を含む、前記ペプチド。

【0296】

５．ペプチドが、配列番号１のトロンビンまたは配列番号１２のＧＫＹ２５由来の１３～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含む、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0297】

６．アミノ酸配列：
－Ｕ－Ｕ－（Ｚ）_ｎ－Ｉ－Ｑ－Ｋ－Ｖ－Ｉ－Ｄ－Ｑ－（Ｚ）_ｍ－
を含むか、またはそれからなるペプチドであって、
前記ペプチドは、１０～２３個のアミノ酸の全長を有し、式中、
各Ｚは、個別に任意の標準アミノ酸であり、
Ｕは、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
ｎは、０～１０の範囲の整数であり、
ｍは、０～５の範囲の整数であり、
前記アミノ酸のうちの２つは、アルケニル化アミノ酸に置換されており、その側鎖は、共有結合によって結合されている、前記ペプチド。

【0298】

７．前記ペプチドが、１３～２３個のアミノ酸の全長を有する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0299】

８．最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１のトロンビン由来の１３～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含むペプチドであって、前記ペプチドは、
ｉ）１３～２３個のアミノ酸の全長を有し、
ｉｉ）２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの内部共有結合を含み、前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、
ｉｉｉ）少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｒ２４５、Ｋ２４７、Ｋ２４８、Ｋ２５２を含む、前記ペプチド。

【0300】

９．前記ペプチドが、少なくとも配列番号１のトロンビンのアミノ酸Ｒ２４５、Ｋ２４７、Ｋ２４８、Ｋ２５２を含む、項目１及び８のいずれか１つに記載のペプチド。

【0301】

１０．最大６個のアミノ酸置換を含有する配列番号１２のＧＫＹ２５由来の１３～２３個の範囲のアミノ酸の連続配列を含むペプチドであって、前記ペプチドは、
ｉ）１３～２３個のアミノ酸の全長を有し、
ｉｉ）２つの非隣接の内部アミノ酸の側鎖間に少なくとも１つの内部共有結合を含み、前記アミノ酸は、Ｘ_１及びＸ_２で示され、
ｉｉｉ）少なくとも配列番号１２のＧＫＹ２５のアミノ酸Ｋ１３、Ｋ１４及びＫ１８を含む、前記ペプチド。

【0302】

１１．前記ペプチドが、少なくとも配列番号１２のトロンビンのアミノ酸Ｒ１１、Ｋ１３、Ｋ１４及びＫ１８を含む、項目１０に記載のペプチド。

【0303】

１２．前記ペプチドが、２つの非隣接の内部アミノ酸間に１つのみの内部共有結合を含む、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0304】

１３．アミノ酸Ｘ_１が、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２が、ｎ＋３位、またはｎ＋４位、またはｎ＋５位、またはｎ＋６位、またはｎ＋７位、またはｎ＋８位、またはｎ＋９位、またはｎ＋１０位、またはｎ＋１１位に位置し、式中、ｎは、２～１８の範囲の整数である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0305】

１４．アミノ酸Ｘ_１が、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２が、ｎ＋３位、またはｎ＋４位、またはｎ＋７位、またはｎ＋１１位に位置し、式中、ｎは、２～１８の範囲の整数である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0306】

１５．アミノ酸Ｘ_１が、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２が、ｎ＋３位、またはｎ＋４位、またはｎ＋７位に位置し、式中、ｎは、２～１８の範囲の整数である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0307】

１６．アミノ酸Ｘ_１が、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２が、ｎ＋４位、またはｎ＋７位に位置し、式中、ｎは、２～１８の範囲の整数である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0308】

１７．前記ペプチド配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合、
ａ．Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓと一致しないこと、
ｂ．Ｘ_１がＬｙｓと一致する場合、Ｘ_２は、Ｇｌｎと一致しないことを条件とする、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0309】

１８．前記ペプチド配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合、
ａ．Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＡｒｇ１１と一致しないこと、
ｂ．Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しないこと、
ｃ．Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しないこと、
ｄ．Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１８と一致しないこと、及び
ｅ．Ｘ_１が配列番号１２のＬｙｓ１８と一致する場合、Ｘ_２は、Ｇｌｎ２２と一致しないことを条件とする、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0310】

１９．アミノ酸Ｘ_１が、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２が、ｎ＋３位に位置し、式中、ｎが、２～１８の範囲の整数であるが、ただし、前記ペプチド配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合、
ａ．Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＡｒｇ１１と一致しないこと、
ｂ．Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しないこと、及び
ｃ．Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しないことを条件とする、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0311】

２０．アミノ酸Ｘ_１が、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２が、ｎ＋４位に位置し、式中、ｎが、２～１８の範囲の整数であるが、ただし、前記ペプチド配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合、
ａ．Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＡｒｇ１１と一致しないこと、
ｂ．Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｅｕ１２と一致しないこと、
ｃ．Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しないこと、
ｄ．Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１４と一致しないこと、
ｅ．Ｘ_１は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１８と一致しないこと、及び
ｆ．Ｘ_２は、配列番号１２のＧＫＹ２５内のＬｙｓ１８と一致しないことを条件とする、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0312】

２１．アミノ酸Ｘ_１が、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２が、ｎ＋３位に位置し、式中、ｎが、２～１８の範囲の整数であり、前記ペプチド配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合、Ｘ_１及びＸ_２は、配列番号１２のＶａｌ９及びＬｅｕ１２；またはＰｈｅ１０及びＬｙｓ１３；またはＬｅｕ１２及びＴｒｐ１５；またはＬｙｓ１３及びＩｌｅ１６；またはＩｌｅ１６及びＶａｌ１９；またはＧｌｎ１７及びＩｌｅ２０；またはＬｙｓ１８及びＡｓｐ２１；またはＶａｌ１９及びＧｌｎ２２；またはＩｌｅ２０及びＰｈｅ２３；またはＡｓｐ２１及びＧｌｙ２４；またはＧｌｎ２２及びＧｌｕ２５に対応する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0313】

２２．アミノ酸Ｘ_１が、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２が、ｎ＋４位に位置し、式中、ｎが、２～１８の範囲の整数であり、前記ペプチド配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合、Ｘ_１及びＸ_２は、配列番号１２のＶａｌ９及びＬｙｓ１３；またはＬｙｓ１３及びＧｌｎ１７；またはＴｒｐ１５及びＶａｌ１９；またはＩｌｅ１６及びＩｌｅ２０；またはＧｌｎ１７及びＡｓｐ２１；またはＶａｌ１９及びＰｈｅ２３；またはＩｌｅ２０及びＧｌｙ２４；またはＡｓｐ２１及びＧｌｕ１８に対応する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0314】

２３．アミノ酸Ｘ_１が、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_２が、ｎ＋４位に位置し、式中、ｎが、２～１８の範囲の整数であり、前記ペプチド配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合、Ｘ_１及びＸ_２は、配列番号１２のＧｌｎ１７及びＡｓｐ２１に対応する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0315】

２４．Ｘ_１及びＸ_２が、以下からなる群から選択される、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド：
ｉ）Ｘ_１は、Ｌｙｓであり、Ｘ_２は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ及びＴｙｒからなる群から選択される；
ｉｉ）Ｘ_１は、Ｃｙｓであり、Ｘ_２は、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ及びＭｅｔからなる群から選択される；
ｉｉｉ）Ｘ_１は、Ａｓｐであり、Ｘ_２は、Ｌｙｓである；
ｉｖ）Ｘ_１は、Ｇｌｕであり、Ｘ_２は、Ｌｙｓ及びＧｌｕからなる群から選択される；
ｖ）Ｘ_１は、Ｔｙｒであり、Ｘ_２は、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ及びＴｒｐからなる群から選択される；
ｖｉ）Ｘ_１は、Ｍｅｔであり、Ｘ_２は、Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる群から選択される；
ｖｉｉ）Ｘ_１は、Ｈｉｓであり、Ｘ_２は、Ｈｉｓである；
ｖｉｉｉ）Ｘ_１は、Ｐｈｅであり、Ｘ_２は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｌａ及びＴｒｐからなる群から選択される；
ｉｘ）Ｘ_１は、Ａｌａであり、Ｘ_２は、ＰｈｅまたはＴｙｒである；
ｘ）Ｘ_１は、Ｔｒｐであり、Ｘ_２は、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ及びＴｙｒからなる群から選択される；
ｘｉ）Ｘ_１は、Ｇｌｙであり、Ｘ_２はＧｌｕである。

【0316】

２５．Ｘ_１が、Ｌｙｓであり、Ｘ_２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＣｙｓもしくはＬｙｓであるか、またはその逆である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0317】

２６．Ｘ_１及びＸ_２が、Ｃｙｓであり、前記共有結合が、直接共有結合（すなわち、ジスルフィド架橋）または架橋剤を介するかのいずれかであり、前記架橋剤が、例えば、ビス－アルキル化剤、例えば少なくとも２つの（ブロモメチル）置換基を含むリンカーである、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0318】

２７．Ｘ_１またはＸ_２のいずれかが、例えばＳｅｒ誘導体及びＡｌａ誘導体からなる群から選択される誘導体化標準アミノ酸である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0319】

２８．前記共有結合が、２つの非標準アミノ酸を連結することによって形成され、場合により、前記非標準アミノ酸が、トロンビンの２つの天然アミノ酸を置換している、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0320】

２９．前記共有結合が、炭化水素ステープルである、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0321】

３０．Ｘ_１及びＸ_２が、２つのα－置換アルケニルアミノ酸及び／またはα，α－二置換アルケニルアミノなどの２つのＣ－アルケニル化アミノ酸などのアルケニル化アミノ酸であり、前記共有結合が、前記アルケニル残基間に形成されるオレフィンテザーである、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0322】

３１．前記アルケニル化アミノ酸が、アルケニル化されたトロンビン固有のアミノ酸、及び／またはトロンビン固有のアミノ酸を置換したアルケニル化アミノ酸である、項目３０に記載のペプチド。

【0323】

３２．Ｘ_１及びＸ_２が、アルケニル化Ａｌａ、アルケニル化Ｌｅｕ、アルケニル化Ｍｅｔ、アルケニル化Ｓｅｒ、アルケニル化Ｔｙｒ、アルケニル化Ｌｙｓ、アルケニル化Ａｒｇ及びアルケニル化Ｐｈｅからなる群から個別に選択される、先行項目のいずれか１項に記載のペプチド。

【0324】

３３．Ｘ_１またはＸ_２の一方が、アルケニル化Ａｌａであり、他方が、アルケニル化Ａｌａ、アルケニル化Ｌｅｕ、アルケニル化Ｍｅｔ、アルケニル化Ｓｅｒ、アルケニル化Ｔｙｒ、アルケニル化Ｌｙｓ、アルケニル化Ａｒｇ及びアルケニル化Ｐｈｅからなる群から選択される、先行項目のいずれか１項に記載のペプチド。

【0325】

３４．Ｘ_１及び／またはＸ_２が、アルケニル化アラニンである、先行項目のいずれかに１つに記載のペプチド。

【0326】

３５．Ｘ_１及び／またはＸ_２が、α，α－二置換アルケニル化アラニンであり、前記共有結合が、前記アルケニル残基間に形成されるオレフィンテザーである、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0327】

３６．Ｘ_１及び／またはＸ_２が、テザーによって連結されており、前記テザーが、Ｃ－アルファ炭素から数えて１０個の炭素原子のアルケン鎖である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0328】

３７．Ｘ_１及び／またはＸ_２が、アルケンテザーを形成する閉環メタセシスによって互いに連結されているアルケニル化アラニンであり、前記テザーが、Ｃ－アルファ炭素から数えて１０個の炭素原子のアルケン鎖である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0329】

３８．前記アルケン鎖が、非分岐アルケン鎖である、項目３６または３７に記載のペプチド。

【0330】

３９．Ｘ_１及び／またはＸ_２が、Ｏ－アルケニル化Ｓｅｒなどのアルケニル化Ｓｅｒである、先行項目のいずれかに１つに記載のペプチド。

【0331】

４０．前記アルケニル化アミノ酸が、アルケニル鎖中に２～１０個の炭素、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素、好ましくは４、５または６個の炭素を含む、項目３０～３９のいずれか１つに記載のペプチド。

【0332】

４１．前記アルケニル化アミノ酸が、α－置換アルケニルオレフィン末端アミノ酸及び／またはα，α－二置換アルケニルオレフィン末端アミノ酸である、項目３０～４０のいずれか１つに記載のペプチド。

【0333】

４２．Ｘ_１及び／またはＸ_２が、α，α－二置換Ｓ－またはＲ－ペンテニルアラニン（Ｓ５またはＲ５）及びＳ－またはＲ－オクテニルアラニン（Ｓ８またはＲ８）アラニンである、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0334】

４３．前記内部炭化水素ステープルが、２つの（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンを結合することによって形成される、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0335】

４４．前記共有結合が、閉環によって確立される、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0336】

４５．前記共有結合が、閉環メタセシス（ＲＣＭ）によって確立される、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0337】

４６．Ｘ_１が、非標準的なアジド末端アミノ酸であり、Ｘ_２が、非標準的なイン末端アミノ酸であるか、またはその逆である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0338】

４７．Ｘ_３及びＸ_４が、Ｘ_１及びＸ_２と比べてＮ末端に近い、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0339】

４８．アミノ酸Ｘ_３が、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_４が、ｎ＋３位、またはｎ＋４位、またはｎ＋５位に位置し、式中、ｎが、整数である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。好ましい実施形態では、アミノ酸Ｘ_３は、ｎ位に位置し、アミノ酸Ｘ_４は、ｎ＋４位に位置する。

【0340】

４９．アミノ酸Ｘ_３が、前記ペプチドの最Ｎ末端に位置する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0341】

５０．アミノ酸Ｘ_３が、前記ペプチドの最Ｎ末端に位置し、アミノ酸Ｘ_４が、ｎ＋４位に位置する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0342】

５１．前記内部共有結合が、アミンとカルボン酸との反応により形成されるアミド結合である、先行項目のいずれかに１つに記載のペプチド。

【0343】

５２．前記内部共有結合が、アミンとカルボン酸との反応により形成されるラクタム架橋である、先行項目のいずれかに１つに記載のペプチド。

【0344】

５３．Ｘ_３が、Ｎ末端アミン基を有するＮ末端アミノ酸であり、Ｘ_４が、カルボン酸側鎖を有するアミノ酸であり、Ｘ_３及びＸ_４が、前記アミンと前記カルボン酸とを反応させることによって形成される内部共有結合によって結合される、先行項目のいずれか１つの記載のペプチド。

【0345】

５４．本発明の前記ペプチドの配列を、配列番号１２のＧＫＹ２５の配列とアラインメントする場合は、Ｘ_３及びＸ_４は、配列番号１２のＧＫＹ２５のＧｌｙ１及びＰｈｅ５に対応する、先行項目のいずれか１つの記載のペプチド。

【0346】

５５．Ｘ_３及びＸ_４が、配列番号１４のＧｌｙ１及びＧｌｕ５に対応する、先行項目のいずれか１つの記載のペプチド。

【0347】

５６．前記ペプチドが、１４～２２個のアミノ酸長、例えば１５～２１個のアミノ酸長、例えば１６～２０個のアミノ酸長、例えば１７～２０個のアミノ酸長を有する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0348】

５７．前記ペプチドが、１８～２０個のアミノ酸長、例えば１８個または１９個のアミノ酸長を有する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0349】

５８．前記ペプチドが、配列番号１のトロンビン由来の、１４～２２個のアミノ酸、例えば１３～１８個のアミノ酸、例えば１５～２１個のアミノ酸、例えば１６～２０個のアミノ酸、例えば１７～２０個のアミノ酸、好ましくは１７～１８個のアミノ酸の連続したアミノ酸配列を含む、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0350】

５９．前記ペプチドが、２４～４０個のアミノ酸長、例えば２５～３５個のアミノ酸長、例えば２５～３０個のアミノ酸長、例えば２８～３４個のアミノ酸長を有する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0351】

６０．前記ペプチドが、最大６個のアミノ酸置換を含む、１６～２１個の範囲のアミノ酸の、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含む、またはそれからなる、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0352】

６１．前記ペプチドが、最大２個のアミノ酸置換を含む、１７～１８個の範囲のアミノ酸の、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなり、前記ペプチドは、最大４つの追加アミノ酸を含み得る、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0353】

６２．前記ペプチドは、アミノ酸Ｘ_１について１つのアミノ酸の置換、及びアミノ酸Ｘ_２について１つのアミノ酸の置換を含む、１７～１８個の範囲のアミノ酸の、配列番号１のトロンビン由来のアミノ酸の連続配列を含むか、またはそれからなり、前記ペプチドは、最大４つの追加アミノ酸を含み得る、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0354】

６３．前記ペプチドは、トロンビンの連続配列と比較して、少なくとも２つのアミノ酸置換、例えば３つのアミノ酸置換、例えば４つのアミノ酸置換、例えば５つのアミノ酸置換を含む、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0355】

６４．１つ以上の前記置換が、保存的置換であり、例えば、１、２、３または４つのアミノ酸置換が、保存的置換である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0356】

６５．前記ペプチドが、前記ペプチドに結合した１つ以上の部分をさらに含み、場合により、前記ペプチド及び前記１つ以上の部分が、リンカーによって互いに結合しており、前記１つ以上の部分が、アルキル、アリール、ヘテロアリール、オレフィン、脂肪酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類、及び多糖類からなる群から選択される、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0357】

６６．前記ペプチドが、前記ペプチドの末端またはその近くに挿入された１～５個、例えば１～４個、例えば１～３個、例えば１～２個、例えば２個の正に荷電したアミノ酸をさらに含む、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0358】

６７．前記正に荷電したアミノ酸が、前記Ｎ末端またはその近く、例えば、前記ペプチドのＮ末端に対して１、２、３、４及び／または５位から選択される位置に挿入されている、項目６６に記載のペプチド。

【0359】

６８．前記正に荷電したアミノ酸が、Ｎ末端に挿入されている、項目６６または６７に記載のペプチド。

【0360】

６９．前記ペプチドが、前記Ｎ末端またはその近く、例えば、前記ペプチドのＮ末端に対して１、２及び／または３位から選択される位置に挿入されている、２個の正に荷電したアミノ酸を含む、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0361】

７０．前記ペプチドが、配列番号１のトロンビンの１５～２０個の範囲の連続アミノ酸からなり、２個のアミノ酸が、内部炭化水素ステープルを形成するアルケニル化アミノ酸で置換されており、２～５個の範囲の追加のＮ末端アミノ酸である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0362】

７１．前記ペプチドが、配列番号１のトロンビンの１６～１８個の範囲の連続アミノ酸からなり、２個のアミノ酸が、内部炭化水素ステープルを形成するアルケニル化アミノ酸で置換されており、２～５個の範囲の追加のＮ末端アミノ酸である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0363】

７２．前記ペプチドが、配列番号１のトロンビンの１７個の連続アミノ酸からなり、２個のアミノ酸が、内部炭化水素ステープルを形成するアルケニル化アミノ酸で置換されており、２～３個の範囲の追加のＮ末端アミノ酸である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0364】

７３．前記追加のＮ末端アミノ酸が、正に荷電している、項目６６～７２のいずれか１つに記載のペプチド。

【0365】

７４．前記正に荷電したアミノ酸が、アルギニン、リジン及びヒスチジンからなる群から選択され、好ましくは、前記正に荷電したアミノ酸が、アルギニン及び／またはリジンであり、さらにより好ましくは、前記正に荷電したアミノ酸が、リジンである、項目６６～７３のいずれか１つに記載のペプチド。

【0366】

７５．前記アルケニル化アミノ酸が、項目３０～４３のいずれか１つに記載のとおりである、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0367】

７６．前記ペプチドが、配列：
－Ｋ－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_１－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_２－Ｚ
を含み、式中、
各Ｚは、個別に任意の標準アミノ酸であり、
Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合されている、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0368】

７７．前記ペプチドが、配列：
Ｕ－Ｕ－（Ｚ）_ｎ－Ｋ－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_１－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_２－Ｚ
を含み、式中、
各Ｚは、個別に任意の標準アミノ酸であり、
Ｕは、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
ｎは、０～１０の範囲の整数であり、
Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は、共有結合によって結合されている、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0369】

７８．前記ペプチドが、配列：

を含み、式中、
各Ｚは、個別に任意の標準アミノ酸であり、
Ｘ_１及びＸ_２は、共有結合によって結合されたアミノ酸である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0370】

７９．前記ペプチドが、配列：
Ｕ－Ｕ－Ｚ－Ｚ－Ｒ－Ｚ－Ｋ－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_１－Ｋ－Ｚ－Ｚ－Ｘ_２－Ｚ
を含むか、またはそれからなり、式中、
各Ｚは、個別に任意の標準アミノ酸であり、
Ｕは、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、
Ｘ_１及びＸ_２は、共有結合によって結合されたアミノ酸である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0371】

８０．前記ペプチドが、配列：
Ｖ－Ｆ－Ｒ－Ｌ－Ｋ－Ｋ－Ｗ－Ｉ－Ｘ_１－Ｋ－Ｖ－Ｉ－Ｘ_２－Ｑ－Ｆ－Ｇ－Ｅ
を含むか、またはそれからなり、式中、
Ｘ_１及びＸ_２は、共有結合によって結合されたアミノ酸である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0372】

８１．前記ペプチドが、配列：
Ｕ－Ｕ－Ｖ－Ｆ－Ｒ－Ｌ－Ｋ－Ｋ－Ｗ－Ｉ－Ｘ_１－Ｋ－Ｖ－Ｉ－Ｘ_２－Ｑ－Ｆ－Ｇ－Ｅ
を含むか、またはそれからなり、式中、
Ｕは、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、
Ｘ_１及びＸ_２は、共有結合によって結合されたアミノ酸である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0373】

８２．式中、ＵがＬｙｓまたはＡｒｇである、項目７６～８１のいずれか１つに記載のペプチド。

【0374】

８３．前記ペプチドが、
ｉ）配列番号３、
ｉｉ）配列番号４、
ｉｉｉ）配列番号５、
ｉｖ）配列番号６、
ｖ）配列番号７、
ｖｉ）配列番号８、
ｖｉｉ）配列番号９、
ｖｉｉｉ）配列番号１０、
ｉｘ）配列番号１１、
ｘ）配列番号１７、
ｘｉ）配列番号１８、
ｘｉｉ）配列番号１９、
ｘｉｉｉ）配列番号２０、
ｘｉｖ）配列番号２１、
ｘｖ）配列番号２２、
ｘｖｉ）配列番号２３、
ｘｖｉｉ）配列番号２４、
ｘｖｉｉｉ）配列番号２５、または
ｘｉｘ）配列番号２６
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、共有結合によって結合されたアミノ酸であり、Ｘ_３及びＸ_４は、共有結合によって結合されたアミノ酸である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0375】

８４．前記ペプチドが、
ｉｖ）配列番号３、
ｖ）配列番号４、
ｖｉ）配列番号５、
ｖｉｉ）配列番号８、または
ｖｉｉｉ）配列番号９
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、共有結合によって結合されたアミノ酸である、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0376】

８５．前記ペプチドが、
ｉ）配列番号３、
ｉｉ）配列番号５、
ｉｉｉ）配列番号６、または
ｉｖ）配列番号７
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は共有結合によって結合されており、場合により、Ｘ_１及びＸ_２は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンであり、その側鎖は、互いに反応してアルケニルテザーを形成しており、さらに場合により、Ｘ_１及びＸ_２は、Ａｌａであり、その側鎖は、１つの二重結合を含むＣ_８アルケニルテザーによって互いに共有結合している、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0377】

８６．前記ペプチドが、
ｉ）配列番号３、または
ｉｉ）配列番号５
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２は、アミノ酸であり、その側鎖は共有結合によって結合されており、場合によりＸ_１及びＸ_２は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンであり、その側鎖は、互いに反応してアルケニルテザーを形成しており、さらに場合により、Ｘ_１及びＸ_２は、Ａｌａであり、その側鎖は、１つの二重結合を含むＣ_８アルケニルテザーによって互いに共有結合している、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0378】

８７．前記ペプチドが、
ｉ）配列番号１４、または
ｉｉ）配列番号２６
に記載される配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ_１及びＸ_２はアミノ酸であり、その側鎖は共有結合によって結合されており、さらに、Ｘ_３及びＸ_４はアミノ酸であり、その側鎖は共有結合によって結合されており、好ましくはＸ_１及びＸ_２は（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）－アラニンであり、その側鎖は互いに反応してアルケニルテザーを形成し、Ｘ_３及びＸ_４はそれぞれＧｌｙ及びＧｌｕであり、互いに反応してラクタム架橋を形成している、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0379】

８８．Ｘ_１及びＸ_２が、項目１３～４７のいずれか１つに記載のとおりである、項目４９～５５のいずれか１つに記載のペプチド。

【0380】

８９．Ｘ_３及びＸ_４が、項目１３～５５のいずれか１つに記載のとおりである、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0381】

９０．前記ペプチドが、水溶液中で少なくとも１つのアルファヘリックス二次構造単位を含む、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0382】

９１．前記アルファヘリックス二次構造単位が、クラスター分化１４（ＣＤ１４）などの標的分子との結合時に維持される、項目９０に記載のペプチド。

【0383】

９２．前記ペプチドが、１５０ｎｍ未満、例えばｐＨ７．４で１００ｎｍ未満、及び／または１００ｎｍ未満、例えばｐＨ５で８０ｎｍ未満の流体力学的半径を有する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0384】

９３．前記ペプチドは、アミノ酸Ｘ_１及びＸ_２が共有結合を欠く他のアミノ酸に交換されている以外は同じ配列を有するペプチドと比較して、前記ペプチドを同じ条件下で試験した場合に、インビボ及び／またはインビトロでの増加した安定性を有する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0385】

９４．前記ペプチドは、例えば、アミノ酸Ｘ_１及びＸ_２が共有結合を欠く他のアミノ酸に交換されている以外は同じ配列を有するペプチドと比較して、前記ペプチドを同じ条件下で試験した場合に、セリンプロテアーゼの存在下で増加した安定性を有する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0386】

９５．５０μＭの前記ペプチドが、新鮮な全血中において、最大５％（最大４％など）、例えば、最大３％（最大２％など）の溶血活性を有する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0387】

９６．インビトロでＬＰＳ刺激血液中のＴＮＦ－α放出を５０％減少させるペプチド濃度において、新鮮な全血中、最大１０％、好ましくは最大５％の溶血活性を有する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0388】

９７．前記ペプチドが、抗凝固活性を有する、先行項目のいずれか１つペプチド。

【0389】

９８．前記ペプチドが、６０μＭの濃度でａＰＰＴによって測定される凝固時間を少なくとも１００％増加させる、及び／またはａＰＰＴによって測定される凝固時間を４０μＭのペプチド濃度で少なくとも９０％増加させる、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0390】

９９．前記ペプチドが、炎症及び／または感染を軽減する、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0391】

１００．前記ペプチドが、ＬＰＳなどの１つ以上のエンドトキシンの存在下で炎症誘発性サイトカインの分泌を減少させる、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0392】

１０１．前記ペプチドが、ＬＰＳなどの１つ以上のエンドトキシンを含む血液中の炎症誘発性サイトカインの分泌をインビボで減少させる、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0393】

１０２．前記炎症誘発性サイトカインが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インターロイキンβ（ＩＬ－１β）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターフェロン（ＩＦＮ－γ）及び／または単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）からなる群から選択される、項目１００または１０２に記載のペプチド。

【0394】

１０３．前記ペプチドが、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓペプチドグリカン（ＳＡ－ＰＧＮ）及び／またはザイモサンなどのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストの存在下で、ＮＦ－κＢ活性を低下させる、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0395】

１０４．１０μＭの濃度のペプチドが、ＬＰＳの存在下で新鮮な血液中でインキュベートした後、ＴＮＦ－α及び／またはＩＬ－１βの分泌を、前記アミノ酸Ｘ_１及びＸ_２が共有結合を欠く他のアミノ酸に交換されている以外は同じ配列のペプチドと比較して、前記ペプチドを同じ条件下で試験した場合に、少なくとも５０％（少なくとも６０％など）、例えば、少なくとも７０％減少させる、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0396】

１０５．前記ペプチドが、殺菌性であり、例えば、前記ペプチドが、細菌膜を損傷することによって細菌を殺すことができる、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0397】

１０６．前記細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからなる群より選択される、項目１０５に記載のペプチド。

【0398】

１０７．前記ペプチドの抗炎症効果が、前記ペプチドの全身投与後２４時間インビボで維持される、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0399】

１０８．医薬として使用するための、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0400】

１０９．炎症及び／または感染症の治療及び／または予防を必要とする個体における、炎症及び／または感染症の治療及び／または予防の方法で使用するための、先行項目のいずれか１つに記載のペプチド。

【0401】

１１０．前記炎症が、感染症に関連する、項目１０９に記載の使用のためのペプチド。

【0402】

１１１．急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性鼻炎、その他の種類の鼻炎、血管炎、血栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、胃腸炎、及び肺炎症からなる群から選択される疾患の治療または予防の方法で使用するための、項目１～１０８のいずれか１つに記載のペプチド。

【0403】

１１２．前記炎症が、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、胃腸炎、及び肺炎症からなる群から選択される、項目１０９または１１０に記載の使用のためのペプチド。

【0404】

１１３．前記炎症が、ＡＲＤＳである、項目１０９または１１０に記載の使用のためのペプチド。

【0405】

１１４．前記治療が全身的である、項目１０９～１１３のいずれか１つに記載の使用のためのペプチド。

【0406】

１１５．前記方法が、皮下投与または静脈内投与などの前記ペプチドの非経口投与を含む、項目１０９～１１４のいずれか１つに記載の使用のためのペプチド。

【0407】

１１６．前記個体が、ヒトである、項目１０９～１１５のいずれか１つに記載の使用のためのペプチド。

【0408】

１１７．前記感染症が、細菌感染症またはウイルス感染症などの微生物による感染症である、項目１０９～１１６のいずれか１つに記載の使用のためのペプチド。

【0409】

１１８．前記個体が、細菌感染症に罹患している、項目１０９～１１７のいずれか１つに記載の使用のためのペプチド。

【0410】

１１９．前記細菌感染症が、急性または慢性細菌感染症、例えば、グラム陰性細菌による感染症である、項目１１８に記載の使用のためのペプチド。

【0411】

１２０．前記個体が、ＬＰＳ、ＬＴＡ及び／またはＳＡ－ＰＧＮの増加したレベルのなど、エンドトキシンの増加したレベルを有する、項目１０９～１１９のいずれか１つに記載の使用のためのペプチド。

【0412】

１２１．前記個体が、１つ以上の体液中の増加したレベルのエンドトキシンを有し、場合により、前記体液は、血液、血清、唾液、鼻咽頭スワブサンプル及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）サンプルからなる群から選択され、さらに場合により、前記エンドトキシンが、ＬＰＳである、項目１０９～１２０のいずれか１つに記載の使用のためのペプチド。

【0413】

１２２．前記ＬＰＳの増加したレベルが、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌのＬＰＳの血清レベルなど、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌのレベルである、項目１０９～１２１のいずれか１つに記載の使用のためのペプチド。

【0414】

１２３．前記個体が、ウイルス感染症に罹患している、項目１０９～１２２のいずれか１つに記載の使用のためのペプチド。

【0415】

１２４．前記ウイルス感染症が、Ｓタンパク質ウイルス、例えば、コロナウイルス科のウイルスによる感染症であり、前記ウイルスは、以下からなる群から選択される、項目１２３に記載の使用のためのペプチド：
ＰｏｒＣｏｖ－ＨＫＵ１５、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、
ＨＣｏＶ ＮＬ６３、
ＨＫＵ１、
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２、及び
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ。

【0416】

１２５．必要とする固体における、炎症及び／または感染症の治療及び／または予防の方法であって、治療有効量の項目１～１０７のいずれか１つに記載のペプチドを、前記個体に投与することを含む、前記方法。

【0417】

１２６．前記治療、前記炎症、前記感染及び／または前記個体が、項目１１０～１２４のいずれか１つに定義される、項目１２５に記載の方法。

【0418】

１２７．必要とする個体における、炎症及び／または感染症の治療及び／または予防のための医薬を調製するための、項目１～１０７のいずれか１つに記載のペプチドの使用。

【0419】

１２８．前記治療、前記炎症、前記感染及び／または前記個体が、項目１１０～１２４のいずれか１つに定義される、項目１２７に記載の使用。

【0420】

１２９．項目１～１０７のいずれか１つに記載のペプチドを含む医薬組成物。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8a】

【図8b】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11】

【図12a】

【図12b】

【図12c】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図22E】

【図22F】

【図22G】

【図22H】

【図23】

【配列表】

2024539138000001.xml

【国際調査報告】