特表 2024-539145 Ｂ／Ｃドメインスワッピングを有する組換え古典的豚熱ウイルスＥ２タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】Ｂ／Ｃドメインスワッピングを有する組換え古典的豚熱ウイルスＥ２タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/11 20060101AFI20241018BHJP

   C12N 15/44 20060101ALI20241018BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241018BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20241018BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20241018BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241018BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241018BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241018BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241018BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241018BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20241018BHJP

   G01N 33/531 20060101ALI20241018BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20241018BHJP

   C07K 16/10 20060101ALN20241018BHJP

【ＦＩ】

C07K14/11 ZNA

C12N15/44

C12N5/10

C12N7/01

C07K1/14

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12P21/02 C

C12Q1/70

A61K39/12

A61P31/14

A61K48/00

A61K35/76

A61K31/7088

A61P37/04

G01N33/569 L

G01N33/531 A

C12P21/08

C07K16/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024523640

(86)(22)【出願日】2022-10-18

(85)【翻訳文提出日】2024-04-19

(86)【国際出願番号】 CN2022125849

(87)【国際公開番号】W WO2023066229

(87)【国際公開日】2023-04-27

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/124797

(32)【優先日】2021-10-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520359778

【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ （チャイナ） カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100137626

【弁理士】

【氏名又は名称】田代 玄

(72)【発明者】

【氏名】チェン ニン

(72)【発明者】

【氏名】リウ フアンフアン

(72)【発明者】

【氏名】ワン ジアイン

(72)【発明者】

【氏名】トン チャオ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QQ10

4B063QR79

4B064AG27

4B065AA90X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065BD14

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB331

4C084ZB332

4C085AA03

4C085BA51

4C085BB23

4C085DD62

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB33

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB33

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045BA09

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA22

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、動物衛生の分野に関する。特に、本発明は、組換え古典的豚熱ウイルスＥ２タンパク質であって、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に関する。さらに、本発明は、本発明の組換えＥ２タンパク質を含む免疫原性組成物、並びに動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防及び／又は処置するための免疫原性組成物の使用を提供する。さらに、本発明は、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するための方法及びキットを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）Ｅ２タンパク質であって、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項2】

置き換えが、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質中に、６Ｂ８モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の結合が特異的に阻害される変異６Ｂ８エピトープをもたらす、請求項１に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項3】

Ｃ株、ＱＺ０７、ＧＤ１８及びＧＤ１９１から選択される株からの野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に由来する、請求項１又は２に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項4】

野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、配列番号９～１２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項5】

ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープが、６Ｂ８モノクローナル抗体による特異的な認識及び／又は結合を受け、前記６Ｂ８モノクローナル抗体は、
（ｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生される、又は
（ｉｉ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む、又は
（ｉｉｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体のＣＤＲを含む、又は
（ｉｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、
請求項１～４のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項6】

ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸が、少なくとも、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位、２２位、２４位、２４／２５位、１０位、４１位及び／又は６４位のアミノ酸を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項7】

ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＢ／Ｃドメイン又はその断片である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項8】

ｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３８位の配列；
ｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３９位の配列；
ｉｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸５６位の配列；
ｉｖ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸８０位の配列；
ｖ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸９０位の配列；
ｖｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１０９位の配列；又は
ｖｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１１０位の配列
が、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられている、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項9】

ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスが、ＢＶＤＶ－２を含むウシウイルス性下痢症ウイルス；スイス、ＢＤＶ－１、ＢＤＶ－２、ＢＤＶ－３、ＢＤＶ－４、ＢＤＶ－５、ＢＤＶ－６、シャモア、イタリア、シチメンチョウ、及びチュニジアヒツジウイルス（ＴＳＶ）を含むボーダー病ウイルス；並びにキリンペスチウイルス、ＢＶＤＶ－３、プロングホーン、バンゴーワンナウイルス及びノルウェーラットペスチウイルスを含む非定型ペスチウイルスから選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項10】

ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスが、キリンペスチウイルスＰＧ２株、ＢＤＶ－２ トナカイＶ６０、ノルウェーラットペスチウイルス単離体ＮｒＰＶ／ＮＹＣ－Ｄ２３、ＴＳＶ９５５２、バンゴーワンナ６７７８、及びＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎから選択される、請求項９に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項11】

ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質が、配列番号２１～２７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項12】

ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸位置に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、それにより、６Ｂ８モノクローナル抗体のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質への結合が特異的に阻害される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項13】

ｉ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、表１～７で定義されるアミノ酸位置にアミノ酸変異を含む、
ｉｉ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸が、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましい、
ｉｉｉ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸が、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましく、かつ、２５位のアミノ酸が、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ及びＶが好ましい、
ｉｖ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸が、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＲであり、Ｋが好ましい；
ｖ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸が、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ又はＳであり、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＳが好ましい、
ｖｉ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１０位のアミノ酸が、Ａ又はＰである、
ｖｉｉ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の４１位のアミノ酸が、Ａ、Ｎ又はＥである、及び／又は
ｖｉｉｉ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６４位のアミノ酸が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ又はＷであり、Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項14】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸が、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸が、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましく、かつ、２５位のアミノ酸が、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ及びＶが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸が、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＲであり、Ｋが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸が、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ又はＳであり、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＳが好ましい、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項15】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸がＲであり、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸がＤであり、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸がＫであり、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸がＡである、請求項１４に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項16】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、配列番号２７～４８及び７１～７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項17】

Ｆｃ断片、例えば豚Ｆｃ断片が、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に連結されており；好ましくは、Ｆｃ断片、例えば豚Ｆｃ断片が、Ｅ２タンパク質のＣ末端に連結されており、好ましくはペプチドリンカーを介して連結されている、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項18】

Ｆｃ断片が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項19】

ペプチドリンカーが、配列番号１６～１９から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７又は１８に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項20】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、配列番号４９～７０及び７５～７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；好ましくは配列番号５３、６８及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；より好ましくは配列番号５３及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項21】

６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている、ＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列を含む、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項22】

ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３８位の配列が、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される；又は
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３９位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される；又は
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸５６位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される；又は
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸８０位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される；又は
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸９０位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される；又は
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１０９位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される、
請求項２１に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項23】

ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片と比較して、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、１０位、１４位、２２位、２４位、２５位、２４／２５位、４１位及び／又は６４位に少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含み；好ましくは、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、表１～７で定義されるアミノ酸位置にアミノ酸変異をさらに含み；好ましくは、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位、２４位、２５位又は６４位に単一のアミノ酸変異をさらに含む、請求項２２に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項24】

－ 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸が、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＲであり、Ｋが好ましい；
－ 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６４位のアミノ酸が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ又はＷであり、Ｋが好ましい；
－ 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸が、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましい；
－ 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸が、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｄが好ましい；
－ 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸が、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｎが好ましい；又は
－ 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸が、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｒが好ましい、
請求項２３に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項25】

Ｆｃ断片、例えば豚Ｆｃ断片が、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に連結されており；好ましくは、Ｆｃ断片、例えば豚Ｆｃ断片が、Ｅ２タンパク質のＣ末端に連結されており、好ましくはペプチドリンカーを介して連結されている、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項26】

Ｆｃ断片が、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；及び／又はペプチドリンカーが、配列番号１６～１９から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項27】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、配列番号９６～１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり；好ましくは組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、配列番号９６により示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項２６に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項28】

請求項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする組換え核酸。

【請求項29】

請求項２８に記載の核酸を含むベクター。

【請求項30】

請求項２８に記載の核酸又は請求項２９に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である宿主細胞。

【請求項31】

請求項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法であって、
（ｉ）請求項３０に記載の宿主細胞を、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、及び
（ｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を単離し、任意で精製するステップ
を含む方法。

【請求項32】

請求項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含む組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）。

【請求項33】

弱毒化されている、請求項３２に記載の組換えＣＳＦＶ。

【請求項34】

請求項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、請求項２８に記載の組換え核酸、請求項２９に記載のベクター、及び／又は請求項３２若しくは３３に記載の組換えＣＳＦＶを含む免疫原性組成物。

【請求項35】

ワクチン、例えばマーカーワクチン又はＤＩＶＡ（感染した動物とワクチン接種された動物との間の区別）ワクチンである、請求項３４に記載の免疫原性組成物。

【請求項36】

動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を防止及び／又は処置する方法における使用のための請求項３４又は３５に記載の免疫原性組成物であって、前記方法は、請求項３４又は３５に記載の免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む、免疫原性組成物。

【請求項37】

動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を防止及び／又は処置する方法であって、請求項３４又は３５に記載の免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む方法。

【請求項38】

ＣＳＦＶに感染した動物を、請求項３４又は３５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別する方法であって、
ａ）サンプルを得るステップ、及び
ｂ）前記サンプルを、免疫試験において試験するステップ
を含む方法。

【請求項39】

免疫試験が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質又はその抗原結合断片の６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体が、サンプル中のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に結合できるかどうかを試験するステップを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

免疫試験が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体が、サンプル中に存在するかどうかを試験するステップ、及び／又は組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の変異６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体が、サンプル中に存在するかどうかを試験するステップを含む、請求項３８又は３９に記載の方法。

【請求項41】

免疫試験が、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）であり、好ましくは二重競合ＥＬＩＳＡである、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体が、
（ｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生される、又は
（ｉｉ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む、又は
（ｉｉｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体のＣＤＲを含む、又は
（ｉｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、
請求項３９～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ又はその抗原結合断片を特異的に認識する抗体を含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、請求項３４又は３５に記載の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するためのキット。

【請求項44】

ＣＨＯ細胞において請求項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法であって、
ａ）ＣＨＯ細胞を培地での高密度懸濁培養に適応させるステップ；
ｂ）ステップａ）の適応させたＣＨＯ細胞に、請求項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ；
ｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意で精製するステップ
を含む方法。

【請求項45】

ＣＨＯ細胞において請求項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法であって、
ａ）高密度懸濁培養物になるまでＣＨＯ細胞を培地で増殖させるステップ；
ｂ）ステップａ）のＣＨＯ細胞に、請求項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ；及び
ｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意で精製するステップ
を含む方法。

【請求項46】

ステップｃ）において、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞が、約３２～３７℃、好ましくは約３２℃で培養される、請求項４４又は４５に記載の方法。

【請求項47】

ステップｃ）において、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞が、約５～８％ＣＯ₂の加湿雰囲気で培養される、請求項４４～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、トランスフェクションの約２～１４日後、例えば、トランスフェクションの約４～１２日後、又はトランスフェクションの約８～１０日後に回収される、請求項４４～４７のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、動物の健康の分野に関する。特に、本発明は、組換え古典的豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）Ｅ２タンパク質であって、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に関する。さらに、本発明は、本発明の組換えＥ２タンパク質を含む免疫原性組成物、並びに動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防及び／又は処置するための免疫原性組成物の使用を提供する。さらに、本発明は、本発明の組換えＥ２タンパク質を含む組換えＣＳＦＶ、好ましくは弱毒化された形態の組換えＣＳＦＶを提供する。さらに、本発明は、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するための方法及びキットを提供する。

【背景技術】

【0002】

古典的豚熱（ＣＳＦ）は、著しい経済損失を生じさせる、豚及びイノシシの高伝染性の疾患である。この疾患の原因物質は、古典的豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）である。中国では、予防的ワクチン接種及び根絶戦略の組み合わせが、ＣＳＦのアウトブレイクを制御するために実行されている。しかし、孤発性のＣＳＦアウトブレイク及び持続的な感染が、中国のほとんどの地域において依然として報告されている。

【発明の概要】

【0003】

当技術分野において、安全で、効果的で、かつ、それをワクチン接種された動物を、野生型の野外株に感染している動物から区別することができる、新規なＣＳＦＶワクチンが依然として必要とされている。
一態様において、本発明は、組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）Ｅ２タンパク質であって、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を提供する。
一態様において、本発明は、６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている、ＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列を含む、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を提供する。
一態様において、本発明は、ＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１０９位の配列が、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている、ＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質であって、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を提供する。

【0004】

一態様において、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられているＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１０９位の配列が、免疫グロブリンＦｃ断片にさらに連結されている、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
一態様において、免疫グロブリンＦｃ断片に連結された組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含む、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられているＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１０９位の配列が、本明細書でさらに定義される通りＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位、１４位、２２位、２４位、２５位、２４／２５位、４１位及び／又は６４位にさらなる変異を含む、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。一態様において、本発明は、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする組換え核酸を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
一態様において、本発明は、本発明の核酸又は本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0005】

一態様において、本発明は、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法であって、（ｉ）本発明の宿主細胞を、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、及び（ｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を単離し、任意で精製するステップを含む方法を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含む組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、本発明の組換え核酸、本発明のベクター、及び／又は本発明の組換えＣＳＦＶを含む免疫原性組成物を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の免疫原性組成物をそれを必要とする動物に投与するステップを含む、動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防及び／又は処置する方法を提供する。
一態様において、本発明は、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別する方法であって、ａ）サンプルを得るステップ、及びｂ）前記サンプルを、免疫試験において試験するステップを含む方法を提供する。

【0006】

一態様において、本発明は、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するためのキットであって、免疫原性組成物は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質又はその抗原結合断片の６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体を含むキットを提供する。
一態様において、本発明は、ＣＨＯ細胞において本明細書に記載される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法であって、前記方法は、ａ）ＣＨＯ細胞を培地での高密度懸濁培養に適応させるステップ；ｂ）ステップａ）の適応させたＣＨＯ細胞に、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ；及びｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意で精製するステップを含む方法を提供する。
一態様において、本発明は、ＣＨＯ細胞において本明細書に記載される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法であって、ａ）ＣＨＯ細胞を培地で増殖させるステップ；ｂ）ステップａ）のＣＨＯ細胞に、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ；及びｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意で精製するステップを含む方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】ペスチウイルスの系統発生学的な分析及び分類（Peterhans, et al., Vet. Res. Vol. 41(6).の改訂版）を示す図である。

【図2】組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の構造を示す図である。

【図3】ＱＺ０７Ｅ２－トナカイ（Ｒｅｉｎｄｅｅｒ）Ｖ６０ １１－１１０キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－５６ ＫＡＲＤキメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＰＧ２ １１－５６キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＴＳＶ９５５２ １１－３８ ＫＡＲＤキメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＴＳＶ９５５２ １１－１０９キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－５６キメラＦＣ及びＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－８０キメラＦＣのウェスタンブロットの結果を示す図である。

【図4】Ｅ２における６Ｂ８結合のための追加の重要な残基の同定を示す図である。ＣＨＯ細胞発現系におけるＥ２タンパク質の変異形態のＩＦＡ検出は、１０、４１、又は６４位のアミノ酸残基が、ｍＡｂ ６Ｂ８結合に重要であることを示す。

【図5】ＣＨＯ細胞発現系におけるＥ２タンパク質の変異形態のウェスタンブロット検出を示す図である。

【図6】Ｅ２における６Ｂ８結合を阻害するための２２位の追加のアミノ酸の同定を示す図である。

【図7】Ｅ２における６Ｂ８結合を阻害するための２４位の追加のアミノ酸の同定を示す図である。

【図8】Ｅ２における６Ｂ８結合を阻害するための２５位の追加のアミノ酸の同定を示す図である。

【図9】Ｅ２における６Ｂ８結合を阻害するための６４位の追加のアミノ酸の同定を示す図である。

【図10】Ｅ２における６Ｂ８結合を阻害するための１４位の追加のアミノ酸の同定を示す図である。

【図11】ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＥ１４Ｋ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＲ６４Ｋ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＴ２４Ｒ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＧ２５Ｄ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＧ２５Ｎ ＦＣ、及びＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＧ２５Ｒ ＦＣの構築物から発現される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の構造を示す図である。

【図12】ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＥ１４Ｋ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＴ２４Ｒ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＲ６４Ｋ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＧ２５Ｄ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＧ２５Ｎ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＧ２５Ｒ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＦＣ、及びＱＺ０７Ｅ２－ＷＴ３３０ＦＣの構築物の発現から調製された上清のウェスタンブロットの結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明の態様を記載する前に、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、複数形での言及を含むことに留意されなくてはならない。したがって、例えば、「エピトープ（ａ ｏｒ ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ）」への言及は複数のエピトープを含み、「ウイルス」への言及は、１つ又は複数のウイルス及び当業者に公知のこれらの同等物への言及であり、他もまた同様である。用語「及び／又は」は、この用語によって接続される項目の任意の組み合わせを包含することを意図しており、全ての組み合わせを個別に列挙していることに等しい。例えば、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ及びＢ」、「Ａ及びＣ」、「Ｂ及びＣ」、並びに「Ａ及びＢ及びＣ」を包含する。別段の規定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものに類似の又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法、装置、及び材料がここでは記載される。本明細書において言及される全ての刊行物は、本発明に関連して使用され得る刊行物において報告されているウイルス株、細胞系、ベクター、及び方法論を記載及び開示する目的で、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書において記載されるいずれの刊行物も、先行発明を理由に本発明がこのような開示に先行する権利を有するものではないと承認すると解釈されるものではない。

【0009】

動物衛生分野における所望の新規なワクチンの主要な特徴、特にＣＳＦＶサブユニットワクチンにおける主要な特徴は、感染した動物を、ワクチン接種された動物から区別（ＤＩＶＡ）するその能力である。ＤＩＶＡ特徴は、従来のＣＳＦＶ Ｅ２サブユニットワクチンからの本質的な改善であり、重要な技術的利点を有する。
発明者らは、免疫優性のＥ２タンパク質表面に１つ又は複数の重要なエピトープを変更するためにＤＩＶＡの特徴を導入し、さらに、ワクチン接種の指標として野生型エピトープを認識する抗体の不在を示すためにＥＬＩＳＡを使用する戦略を開発した（負のＤＩＶＡ）、（ＷＯ２０２０２１１８０２Ａの全体の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる）。この戦略を実行するために、発明者らは、強力に中和性のマウスｍＡｂ ６Ｂ８を選択した。６Ｂ８抗体は、少なくとも、２４位、２５位、１４位、２２位、１０位、４１位及び／又は６４位のアミノ酸を含むＥ２タンパク質のＢ／Ｃドメイン内の６Ｂ８エピトープを認識し、それに結合する。
一態様において、本発明は、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質であって、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、６Ｂ８エピトープと結合できない、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を提供する。
本明細書において使用される用語「ＣＳＦＶ」は、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科のペスチウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）属の古典的豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）種に属する全てのウイルスを指す。

【0010】

用語「組換え」は、遺伝子操作によって改変されている、再配列されている、又は修飾されているタンパク質又は核酸を指す。しかし、この用語は、自然発生的な変異などの天然の事象の結果生じるポリヌクレオチド、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列における改変は指さない。用語「キメラ」は、１つの種のタンパク質又は核酸が他の種のタンパク質又は核酸を含むことを指す。用語「キメラ」はまた、「組換え」の一例とみなすこともできる。
一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は単離される。
ポリペプチド又は核酸分子は、これらのネイティブな生物学的由来源及び／又はこれらが得られた元である反応培地若しくは培養培地中においてこれらに通常付随している少なくとも１種の他の成分、例えば、別のタンパク質／ポリペプチド、別の核酸、別の生物学的成分若しくは高分子、又は少なくとも１種の汚染物質、不純物、若しくは微量成分から、これらが分離されている場合、例えば前記由来源又は培地と比較して、「単離されている」とみなされる。特に、ポリペプチド又は核酸分子は、それが少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、さらに特に少なくとも１００倍、及び最大１０００倍、又はそれを超えて精製されている場合、「単離されている」とみなされる。「単離された形態の」ポリペプチド又は核酸分子は、適切な技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの適切なクロマトグラフィー技術を使用して決定すると、好ましくは本質的に均質である。

【0011】

用語「ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質」は、ＣＳＦＶのポリタンパク質（Ｎｐｒｏ－Ｃ－Ｅｒｎｓ－Ｅ１－Ｅ２－ｐ７－ＮＳ２－ＮＳ３－ＮＳ４Ａ－ＮＳ４Ｂ－ＮＳ５Ａ－ＮＳ５Ｂ）からの最終的な切断産物として生じるプロセシングされたＥ２タンパク質を指す。当業者は、本発明ではＣＳＦＶのいずれのＥ２タンパク質も使用できることを認識しているであろう。本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識される６Ｂ８エピトープを有する野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に由来する。例えば、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、公知のＣＳＦＶ株、例えばＣ株、ＱＺ０７、ＧＤ１８又はＧＤ１９１由来であってもよい。例えば、野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有し、野外株ＧＤ１８のＥ２タンパク質は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有し、野外株ＧＤ１９１のＥ２タンパク質は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し、Ｃ株のＥ２タンパク質は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する。
本発明で使用される場合、アミノ酸（ａｍｎｉｏ ａｃｉｄ）残基の番号付けは、Ｎ末端からのプロセシングされたＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質におけるアミノ酸位置を指し、例えば、具体的に別段の指定がない限り、配列番号１０に提供されるアミノ酸位置を指す。

【0012】

「ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ」は、本明細書において、本明細書で開示される６Ｂ８モノクローナル抗体による特異的な認識及び／又は結合を受けるＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のエピトープを指す。６Ｂ８エピトープは、コンフォメーショナルエピトープであり得る。６Ｂ８エピトープは、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位、２５位、１４位、２２位、１０位、４１位及び／又は６４位に定義されたアミノ酸を含んでいてもよい。例えば、６Ｂ８エピトープは、少なくとも、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位、２２位、及び２４／２５位に定義されたアミノ酸を含んでいてもよい。ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸位置は、少なくとも、Ｅ２タンパク質の１４位、２２位、２４位、２４／２５位、１０位、４１位及び／又は６４位を含む。例えば、６Ｂ８エピトープは、Ｅ２タンパク質の１４位にＳ、２２位にＧ、２４位にＥ若しくはＧ、２５位にＧ、１０位にＹ、４１位にＤ、及び／又は６４位にＲを含み得る。

【0013】

用語「６Ｂ８モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ ６Ｂ８」は、６Ｂ８モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を指し、６Ｂ８モノクローナル抗体は、６Ｂ８エピトープ、特にＥ２タンパク質の１４位にアミノ酸Ｓ、２２位にＧ、２４位にＥ若しくはＧ、２５位にＧ、１０位にＹ、４１位にＤ、及び／又は６４位にＲを少なくとも含む６Ｂ８エピトープを特異的に認識する。好ましくは、６Ｂ８モノクローナル抗体という用語は、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲを含むモノクローナル抗体を指す。好ましくは、６Ｂ８モノクローナル抗体という用語は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３の可変領域を含むモノクローナル抗体を指す。さらに好ましくは、６Ｂ８モノクローナル抗体という用語は、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）及び配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含むモノクローナル抗体を指す。さらに好ましくは、６Ｂ８モノクローナル抗体という用語は、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を指す。

【0014】

本明細書において使用される場合、「抗体」は、完全長免疫グロブリンの結合特異性能力を保持する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を含有するその任意の断片を含む、天然の、又は部分的に若しくは完全に合成によって産生された、例えば組換えによって産生された、免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片を指す。したがって、抗体には、免疫グロブリンの抗原結合ドメインに相同な又は実質的に相同な結合ドメイン（抗体結合部位）を有するあらゆるタンパク質が含まれる。抗体には、抗体断片が含まれる。本明細書において使用される場合、抗体という用語としては、したがって、合成抗体、組換産生抗体、多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、及び抗体断片が含まれる。本明細書において提供される抗体には、任意の免疫グロブリン型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）のメンバーが含まれる。

【0015】

本明細書において使用される用語「可変領域」は、当技術分野において及び以下で「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」とそれぞれ呼ばれる４つの「フレームワーク領域」から基本的になる免疫グロブリンドメインを意味する。これらのフレームワーク領域には、当技術分野において及び以下で「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」とそれぞれ呼ばれる３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」が介在している。したがって、免疫グロブリン可変領域の一般的な構造又は配列は、以下のように示すことができる：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。ＶＨ又はＶ_Hは重鎖可変領域を指し、ＶＬ又はＶ_Lは軽鎖可変領域を指す。同様に、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３は、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ指す。ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をそれぞれ指す。

【0016】

本明細書において使用される場合、「抗体断片」又は抗体の「抗原結合断片」は、完全長よりは短いが、抗原を結合する抗体可変領域の少なくとも一部分（例えば、１つ若しくは複数のＣＤＲ及び／又は１つ若しくは複数の抗体結合部位）を有し、したがって完全長抗体の結合特異性、及び特異的結合能力の少なくとも一部を保持する、完全長抗体の任意の部分を指す。したがって、抗原結合断片は、抗体断片が由来する元である抗体と同一の抗原に結合する抗原結合部分を有する抗体断片を指す。抗体断片には、完全長抗体の酵素処理によって産生された抗体誘導体、並びに合成によって、例えば組換えによって産生された誘導体が含まれる。抗体断片は、抗体に含まれる。抗体断片の例としては、限定はしないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、Ｆｄ及びＦｄ’断片、並びに、修飾断片を含む他の断片が含まれる（例えば、Methods in Molecular Biology， Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003)； Chapter 1； p 3-25， Kipriyanovを参照されたい）。断片は、例えばジスルフィド架橋及び／又はペプチドリンカーによって共に連結された複数の鎖を含み得る。抗原結合断片は、（例えば、対応する領域を置き換えることによって）抗体フレームワークに挿入されると、抗原に免疫特異的に結合する（すなわち、少なくとも又は少なくとも約１０⁷～１０⁸Ｍ^-1のＫａを示す）抗体を生じさせる、任意の抗体断片を含む。

【0017】

用語「６Ｂ８モノクローナル抗体の抗原結合断片」は、６Ｂ８モノクローナル抗体の断片を指すか、又は６Ｂ８エピトープ、特にＥ２タンパク質の１４位にアミノ酸Ｓ、２２位にＧ、２４位にＥ若しくはＧ、２５位にＧ、１０位にＹ、４１位にＤ、及び／又は６４位にＲを少なくとも含む６Ｂ８エピトープを特異的に認識するアミノ酸配列を少なくともコードする。この用語は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、並びに／又は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸断片をさらに包含する。さらに、この用語はまた、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）、及び／又は配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含むアミノ酸断片も包含する。さらに好ましくは、この用語は、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によってコードされるアミノ酸断片を包含し、このアミノ酸断片は、６Ｂ８エピトープに特異的に結合する。

【0018】

一態様において、置き換えは、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質において変異６Ｂ８エピトープをもたらし、例えば、６Ｂ８モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の結合が特異的に阻害される変異６Ｂ８エピトープをもたらす。本明細書において、「置き換え／置き換えられた／置き換えること」の使用は、別段の指定がない限り、「スワップ／スワップされた／スワッピング」を意味する。一態様において、このような置き換えは、６Ｂ８モノクローナル抗体又はその抗原結合断片への組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の結合が、対応する野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質と比較して特異的に阻害されることをもたらす。

【0019】

用語「特異的に阻害される」又は「特異的な阻害」は、６Ｂ８抗体が、改変されていない６Ｂ８エピトープと比較して、特に、Ｅ２タンパク質の１４位にアミノ酸Ｓ、２２位にＧ、２４位にＥ又はＧ、２５位にＧ、１０位にＹ、４１位にＤ、６４位にＲ、又はそれらの組合せを有する改変されていない６Ｂ８エピトープと比較して、少なくとも２分の１、好ましくは５分の１、より好ましくは１０分の１、より一層好ましくは５０分の１親和性で変異６Ｂ８エピトープに結合することを意味する。「親和性」は、抗体分子上の単一の抗原結合部位と、単一のエピトープとの間の相互作用である。これは、会合定数ＫＡ＝ｋａｓｓ／ｋｄｉｓｓ、又は解離定数ＫＤ＝ｋｄｉｓｓ／ｋａｓｓによって表される。より好ましくは、用語「特異的に阻害される」又は「特異的な阻害」は、６Ｂ８モノクローナル抗体、特に、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体が、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）アッセイ若しくは二重競合ＥＬＩＳＡアッセイ、又はドットブロットアッセイにおいて、本発明による変異６Ｂ８エピトープに検出可能に結合しないことを意味する。
用語「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルス」は、本明細書で使用される場合、ＣＳＦＶ以外のフラビウイルス科内のペスチウイルス属の全ての他のウイルスを指す。
一態様において、「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルス」のＥ２タンパク質は、６Ｂ８モノクローナル抗体又はその抗原結合断片による特異的な認識及び／又は結合を受けることができない。

【0020】

ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスとしては、これらに限定されないが、ウシウイルス性下痢症（ｄｉａｒｒａｈｅａ）ウイルス、ボーダー病ウイルス、及び非定型ペスチウイルスからなる群から選択される種が挙げられ；好ましくは、ＢＶＤＶ－２を含む、ウシウイルス性下痢症ウイルス；スイス、ＢＤＶ－１、ＢＤＶ－２、ＢＤＶ－３、ＢＤＶ－４、ＢＤＶ－５、ＢＤＶ－６、シャモア、イタリア、シチメンチョウ、及びチュニジアヒツジウイルス（Ｔｕｎｉｓｉａｎ＿ｓｈｅｅｐ＿ｖｉｒｕｓ：ＴＳＶ）を含む、ボーダー病ウイルス；並びにキリンペスチウイルス、ＢＶＤＶ－３、プロングホーン（Ｐｒｏｎｇｈｏｒｎ ａｎｔｅｌｏｐｅ）、バンゴーワンナ（Ｂｕｎｇｏｗａｎｎａｈ）ウイルス及びノルウェーラットペスチウイルスを含む非定型ペスチウイルスから選択される。ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスの一部の特定の株としては、これらに限定されないが、キリンペスチウイルスＰＧ２株、ＢＤＶ－２ トナカイＶ６０、ノルウェーラットペスチウイルス単離体ＮｒＰＶ／ＮＹＣ－Ｄ２３、チュニジアヒツジウイルス９５５２（ＴＳＶ９５５２）、バンゴーワンナ６７７８、又はＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎが挙げられる。
一態様において、「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルス」は、キリンペスチウイルスＰＧ２株であり、その例示的なＥ２タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。一態様において、「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルス」は、ＢＤＶ－２ トナカイＶ６０株であり、その例示的なＥ２タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。一態様において、「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルス」は、ノルウェーラットペスチウイルス単離体ＮｒＰＶ／ＮＹＣ－Ｄ２３であり、その例示的なＥ２タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。一態様において、「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルス」は、バンゴーワンナウイルス６７７８であり、その例示的なＥ２タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。一態様において、「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルス」は、ＴＳＶ９５５２株であり、その例示的なＥ２タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。一態様において、「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルス」は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株であり、その例示的なＥ２タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。

【0021】

ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、４つの抗原性ドメインであるＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、及びＤドメインを有し、これらのドメインの全ては、Ｅ２タンパク質のＮ末端に位置する。これら４つのドメインは、一方がＢ／Ｃドメインの単位であり、他方がＡ／Ｄドメインを含む、２つの独立した抗原性単位を構成している。Ｂ／Ｃドメインは、アミノ酸１位から１１１位周辺までであり、Ｄ／Ａドメインは、アミノ酸７７位から１７７位周辺までに位置している。番号付けは、典型的な様式で、ＱＺ０７ ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）の位置の番号に基づいて決定される。Ｂ／Ｃドメインは、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するほとんどの主要なアミノ酸をカバーする。
一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＢ／Ｃドメイン又はその断片である。一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＢ／Ｃドメインは、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１位からアミノ酸１１１位周辺までの配列を含む。

【0022】

一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３８位の配列は、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられている。一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３９位の配列は、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられている。一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸５６位の配列は、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられている。一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸８０位の配列は、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられている。一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸９０位の配列は、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられている。一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１０９位の配列は、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられている。一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１１０位の配列は、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられている。

【0023】

「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する配列」は、配列アライメントにおいて置き換えようとするＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質中の配列とアライメントされる、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質中の配列を意味する。
２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列をアライメントするための方法は当業界において周知である。配列分析ソフトウェアは、配列アライメントを実行するのに使用されることが多い。例えば、配列アライメントは、ＮＣＢＩデータベースでＢＬＡＳＴプログラムを使用することによって行うことができる。
例えば、配列番号１０のアミノ酸１１位～１１０位の配列（ＱＺ０７ ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質）は、配列番号２４のアミノ酸１０位～１１１位（バンゴーワンナＥ２タンパク質）の配列と、ペアワイズ配列アライメントでアライメントされ、次いで、配列番号２４のアミノ酸１０位～１１１位の配列（１０２ａａ）（バンゴーワンナＥ２タンパク質）は、配列番号１０のアミノ酸１１位～１１０位の配列（１００ａａ）（ＱＺ０７ ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質）を置き換えるのに使用することができる。

【0024】

本発明の好ましい態様において、本明細書で開示される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、免疫原性であり、好ましくは、ＣＳＦＶに対する防御免疫を付与する。上述した４つの抗原性ドメイン（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤドメイン）の１つのみを含有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は免疫原性のままであり、感染性のＣＳＦＶ攻撃から豚を保護することができることが報告されている。したがって、本発明の好ましい態様において、本明細書において記載される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、上記の抗原性ドメインのうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも１つを保持している。好ましくは、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、ＣＳＦＶに対する防御免疫を付与し得る。一態様において、置き換えは、ＣＳＦＶに対する組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の防御免疫原性にほとんど影響することなく導入することができる。

【0025】

本発明の一態様において、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープは、少なくともＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位、２２位、２４位、２４及び２５（「２４／２５」）位、１０位、４１位、並びに／又は６４位のアミノ酸残基によって定義される。
本発明の一態様において、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープは、例えば単離体ＱＺ０７、ＧＤ１８、又はＧＤ１９１では、少なくともＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸残基Ｓ１４、Ｇ２２、Ｅ２４、Ｅ２４／Ｇ２５、Ｙ１０、Ｄ４１、及び／又はＲ６４によって定義される。本発明の一態様において、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープは、例えばＣ株では、少なくともＥ２タンパク質のアミノ酸残基Ｓ１４、Ｇ２２、Ｇ２４、Ｅ２４／Ｇ２５、Ｙ１０、Ｄ４１、及び／又はＲ６４によって定義される。
本発明の一態様において、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質と比較して、本発明による組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、６Ｂ８モノクローナル抗体のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質への結合を特異的に阻害する、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸位置（例えば、１４位、２２位、２４位、２４位及び２５位（「２４／２５」）、１０位、４１位及び／又は６４位）に少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。

【0026】

本発明の発明者らは、驚くべきことに、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片を、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えること、並びに組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質中の１０位、１４位、２２位、２４位、２５位、２４／２５位、４１位及び／又は６４位におけるアミノ酸変異の組み込みは、ＣＳＦに対する組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の防御免疫原性又は効能に実質的に影響しなかったことを見出した。さらに、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の、アミノ酸１０位、１４位、２２位、２４位、２５位、２４／２５位、４１位、及び／又は６４位における変異はさらに、区別する能力を確実にするか、又はそのＤＩＶＡの特徴（通常６Ｂ８エピトープを認識し、それに結合する６Ｂ８抗体の結合の阻害）に関するこのような組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＤＩＶＡの信頼度を増加させる。

【0027】

一部の実施形態において、前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、上述の置き換えによって導入される。例えば、本発明の一態様において、「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片」は、６Ｂ８モノクローナル抗体のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質への結合を特異的に阻害する、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸位置（例えば、１４位、２２位、２４位、２４位及び２５位（「２４／２５」）、１０位、４１位及び／又は６４位）に少なくとも１つのアミノ酸残基を含むか；又は「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片」は、野生型配列が前記アミノ酸を含まない場合、６Ｂ８モノクローナル抗体のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質への結合を特異的に阻害する、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸位置（例えば、１４位、２２位、２４位、２４位及び２５位（「２４／２５」）、１０位、４１位及び／又は６４位）に少なくとも１つのアミノ酸残基を含むように操作される（変異される）。
一部の実施形態において、「ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片」での置き換えに加えて、６Ｂ８モノクローナル抗体の結合を特異的に阻害する少なくとも１つのアミノ酸残基が、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に追加で導入される。例えば、６Ｂ８モノクローナル抗体の結合を特異的に阻害する少なくとも１つのアミノ酸残基は、置き換えようとする断片の外側に位置している。

【0028】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸は、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸は、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましく、かつ、２５位のアミノ酸は、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ及びＶが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＲであり、Ｋが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ又はＳであり、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＳが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１０位のアミノ酸は、Ａ又はＰであり、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の４１位のアミノ酸は、Ａ、Ｎ又はＥであり、及び／又は組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６４位のアミノ酸は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ又はＷであり、Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい。これらのアミノ酸は、個々に、又は組合せで、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質への６Ｂ８モノクローナル抗体の結合を特異的に阻害すると実証されてきた。本発明の一態様において、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片は、対応する位置で１つ又は複数の前記アミノ酸を導入するように変異される。
本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸は、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましい。

【0029】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸は、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましく、かつ、２５位のアミノ酸は、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ及びＶが好ましい。
一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＲであり、Ｋが好ましい。
一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ又はＳであり、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＳが好ましい。
一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１０位のアミノ酸は、Ａ又はＰである。
一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の４１位のアミノ酸は、Ａ、Ｎ又はＥである。
一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６４位のアミノ酸は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ又はＷであり、Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい。

【0030】

本発明の一態様において、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片は、対応する位置で１つ又は複数の前記アミノ酸を導入するように変異される。例えば、本発明の一態様において、本発明による組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、以下の表１～７で定義される通り、Ｅ２タンパク質のアミノ酸位置に変異を含む。例えば、表１の２行目は、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位（「１０位」）に変異を含むことを意味し、表１の３行目は、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位及び１４位に変異を含むことを意味する、などである。

【0031】

【表1】

【0032】

【表2】

【0033】

【表3】

【0034】

【表4】

【0035】

【表5】

【0036】

【表6】

【0037】

【表7】

【0038】

【表8】

【0039】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸は、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸は、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましく、かつ、２５位のアミノ酸は、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ及びＶが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＲであり、Ｋが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ又はＳであり、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＳが好ましい。

【0040】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸はＲであり、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸はＤであり、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸はＫであり、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸はＡである（以降、「ＫＡＲＤ変異」と称する）。
本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号２７～４８及び７１～７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様において、可溶性組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を得るために、本発明による組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、膜貫通ドメインを除去するためにトランケートすることができる。例えば、無傷の本発明に従ったＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＣ末端の最後の約４０個のアミノ酸（例えば、４２個又は４３個のアミノ酸）を欠失させてもよい。

【0041】

本発明の一態様において、分泌形式の本発明に従った組換えＥ２タンパク質を得るために、シグナルペプチドをＥ２タンパク質のＮ末端に付加することができる。例えば、Ｅ１タンパク質からの、最後の約２０個のアミノ酸、特に最後の１６個のアミノ酸（例えば、Ｃ株の場合）又は２１～２３個のアミノ酸（例えば、ＧＤ１８又はＱＺ０７の場合）を、本発明に従った組換えＥ２タンパク質のＮ末端に付加することができる。一態様において、シグナルペプチドは、配列番号１３～１５から選択されるアミノ酸配列を含み得る。当業者には、隠れた発現を可能にする他のシグナルペプチドもまた本発明において適用され得ることが認識されよう。
本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、膜貫通ドメインを除去するためにトランケートすることができ、可溶性の分泌された組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が得られるように、シグナルペプチドを、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＮ末端に付加することができ、例えば、無傷の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の最後の４３個のアミノ酸を欠失させることができ、Ｅ１タンパク質からの最後の１６個のアミノ酸又は２１～２３個のアミノ酸を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＮ末端に付加することができる。

【0042】

本発明の一態様において、組換えＥ２タンパク質はまた、同定及び／又は精製のための融合タグも含み得る。Ｈｉｓタグ又はＦＬＡＧタグなどのこのようなタグは、当技術分野において周知である。
本発明の一態様において、免疫グロブリンＦｃ断片は、Ｅ２タンパク質に連結されていてもよい。本明細書において使用される用語「免疫グロブリンＦｃ断片」は、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含み、さらに特に、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域並びに軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含まないタンパク質を指す。この用語は、免疫グロブリンのヒンジ領域又はヒンジ領域の部分（つまり、重鎖定常領域のヒンジ領域）をさらに含んでもよい。また、免疫グロブリンＦｃ断片は、重鎖定常領域１（ＣＨ１）の一部を含んでもよい。本明細書において使用される用語「免疫グロブリンＦｃ断片」は、「Ｆｃ断片」と等価であることが理解される。

【0043】

本明細書において使用される用語「連結された」は、特に、ポリペプチド内で免疫グロブリンＦｃ断片を組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＣ末端又はＮ末端に接続するためのあらゆる手段を指す。連結手段の例には、免疫グロブリンＦｃ断片とＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質との共有結合による直接連結が含まれ得る。一態様において、Ｆｃ断片は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＣ末端に連結され得る。
一態様において、免疫グロブリンＦｃ断片は、ペプチドリンカーを介してＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に連結され得る。本明細書において使用される用語「ペプチドリンカー」は、１つ又は複数のアミノ酸残基を含むペプチドを指す。さらに特に、本明細書において使用される用語「ペプチドリンカー」は、２つの可変タンパク質及び／又はドメイン、例えばＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質及び免疫グロブリンＦｃ断片を接続し得るペプチドを指す。本明細書において言及されるペプチドリンカーは、好ましくは、長さが３～２０アミノ酸残基であるアミノ酸配列である。例えば、リンカー部分は、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸残基であるペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーの例示的な配列は、ＧＧＳ、ＧＳＧＧＳＧ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり得る。一態様では、ペプチドリンカーのアミノ酸配列はＧＧＳ（配列番号１６）である。

【0044】

一態様では、免疫グロブリンＦｃ断片は豚ＩｇＧ Ｆｃ断片である。一態様において、Ｆｃ断片は、Ｅ２タンパク質のＣ末端又はＮ末端に連結されていてもよい。一態様において、Ｆｃ断片は、ペプチドリンカーを介してＥ２タンパク質のＣ末端に連結され得る。一態様では、豚Ｆｃ断片のアミノ酸配列は、配列番号２０によって示される。
本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号４９～７０、７５～７８、及び９６～１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれからなる。一実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号５３、６８及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれからなる。一実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号５３及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれからなる。一実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号５３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号７５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。

【0045】

本明細書に記載されるＦｃ断片のいずれか、特に配列番号２０を有するＦｃ断片は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられており、本明細書で定義される通りアミノ酸１０位、１４位、２２位、２４位、２５位、２４／２５位、４１位及び／又は６４位に追加の変異を有する本明細書で開示される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のいずれかに連結されていてもよいことが当業者によって理解される。ペプチドリンカーは、あらゆるリンカーであってもよく、一部の実施形態において、リンカーは、配列番号１６～１９から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。

【0046】

一態様において、本発明は、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含む組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）を提供する。本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶは弱毒化されている。
当業者には、６Ｂ８エピトープが様々なＣＳＦＶ株の間で進化的に保存されていることから、本発明の組換えＣＳＦＶが様々なＣＳＦＶ単離体に由来し得ることが認識されよう。本発明の一態様において、本発明の組換えＣＳＦＶは、ジェノグループ２．１の単離体に由来する。本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶは、例えば野外株ＧＤ１８又はＱＺ０７に由来する。本発明の一態様において、本発明の組換えＣＳＦＶは、ジェノグループ１の単離体に由来する。本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶは、当技術分野において周知のＣ株に由来する。
一態様において、本発明は、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質であって、６Ｂ６エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている、ＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列を含む、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を提供する。

【0047】

一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３８位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される。
一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３９位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される。

【0048】

一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸５６位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される。
一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸８０位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される。
一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸９０位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される。

【0049】

一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１０９位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される。
一態様において、ＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１０９位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される。

【0050】

一部の実施形態において、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片と比較して、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、１０位、１４位、２２位、２４位、２５位、２４／２５位、４１位及び／又は６４位に少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含む。一部の実施形態において、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片と比較して、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位、２４位、２５位又は６４位に単一のアミノ酸変異をさらに含む。
一部の実施形態において、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片と比較して、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、表１～７で定義される通りアミノ酸１０位、１４位、２２位、２４位、２５位、２４／２５位、４１位及び／又は６４位に変異をさらに含む。

【0051】

一部の実施形態において、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＲであり；好ましくは、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸は、Ｋである。一部の実施形態において、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６４位のアミノ酸は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ又はＷであり；好ましくは、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６４位のアミノ酸は、Ｋである。一部の実施形態において、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸は、Ｒ、Ｄ又はＩであり；好ましくは、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸は、Ｒである。一部の実施形態において、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸は、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり；好ましくは、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸は、Ｄである。一部の実施形態において、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸は、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり；好ましくは、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸は、Ｎである。一部の実施形態において、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸は、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり；好ましくは、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の断片を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸は、Ｒである。

【0052】

一部の実施形態において、Ｆｃ断片、例えば豚Ｆｃ断片は、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に連結されており、特に６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含むＣＳＦＶの断片が、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に連結されている。一部の実施形態において、Ｆｃ断片、例えば豚Ｆｃ断片は、Ｅ２タンパク質のＣ末端に連結されている。一部の実施形態において、Ｆｃ断片、例えば豚Ｆｃ断片は、ペプチドリンカーを介して、Ｅ２タンパク質のＣ末端に連結されている。
一部の実施形態において、Ｆｃ断片は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号１６～１９から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。

【0053】

一部の実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号９６～１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号９６により示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号９７により示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号９８により示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号９９により示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号１００により示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号１０１により示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。

【0054】

一部の実施形態において、上述される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のそれぞれの配列は、別の非ＣＳＦＶペスチウイルス配列の対応する配列で置き換えられていてもよく、例えば本明細書で列挙された株のいずれか（例えばキリンペスチウイルスＰＧ２株、ＢＤＶ－２ トナカイＶ６０、ノルウェーラットペスチウイルス単離体ＮｒＰＶ／ＮＹＣ－Ｄ２３、チュニジアヒツジウイルス９５５２（ＴＳＶ９５５２）、バンゴーワンナ６７７８）で置き換えられていてもよいことが十分理解される。一部の実施形態において、このような他の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、表１～７で定義されるアミノ酸１０位、１４位、２２位、２４位、２４／２５位、４１位及び／又は６４位に、１つ又は複数の変異をさらに含んでいてもよいことがさらに十分理解される。さらに、一部の実施形態において、このような組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質はいずれも、Ｆｃ断片に連結されたていてもよいことも理解される。

【0055】

一態様において、本発明はまた、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質及び／又は本発明の組換えＣＳＦＶを含む免疫原性組成物を提供する。
本明細書において使用される用語「免疫原性組成物」は、免疫原性組成物が投与される宿主において免疫学的応答を引き起こす少なくとも１種の抗原を含む組成物を指す。このような免疫学的応答は、本発明の免疫原性組成物に対する細胞性及び／又は抗体介在性の免疫応答であり得る。宿主はまた、「対象」とも記載される。好ましくは、本明細書において記載又は言及される宿主又は対象はいずれも、動物である。
通常、「免疫学的応答」には、限定はしないが、以下の影響の１つ又は複数が含まれる：本発明の免疫原性組成物に含まれる１種又は複数種の抗原に特異的に向けられる抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、並びに／又は細胞傷害性Ｔ細胞及び／若しくはガンマ－デルタＴ細胞の産生又は活性化。好ましくは、宿主は、防御免疫応答又は治療応答のいずれかを示す。

【0056】

「防御免疫応答」は、感染した宿主によって通常示される臨床徴候の低減又は欠如のいずれか、より短い回復時間及び／若しくは感染期間の短縮、又は、感染した宿主の組織若しくは体液若しくは排出物における病原体力価の低下によって示される。
本明細書において使用される「抗原」は、限定はしないが、このような抗原又はその免疫学的に活性な成分を含む、宿主において目的の免疫原性組成物又はワクチンに対する免疫学的応答を引き起こす成分を指す。
宿主が防御免疫応答を示し、その結果、新たな感染に対する耐性が増強される及び／又は疾患の臨床的重症度が低減するケースでは、免疫原性組成物は「ワクチン」と記載される。
一態様において、本発明の免疫原性組成物はワクチンである。

【0057】

本明細書において理解される用語「ワクチン」は、抗原性物質を含む獣医学的使用のためのワクチンであり、ＣＳＦＶ感染によって引き起こされる疾患に対する特異的かつ活性な免疫を誘発する目的で投与される。
好ましくは、本発明に従ったワクチンは、宿主動物において防御免疫応答を引き起こす、好ましくは本明細書において記載されるような組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含む、サブユニットＣＳＦＶワクチンである。
ワクチンは、医薬組成物に典型的なさらなる成分をさらに含み得る。

【0058】

免疫応答を増強させるためのさらなる成分は、「アジュバント」と一般に呼ばれる構成成分、又は、ワクチンに添加される、若しくはこのようなさらなる成分によるそれぞれの誘導の後に身体によって生成される、補助分子、例えば限定はしないが、インターフェロン、インターロイキン、若しくは成長因子である。本明細書において使用される「アジュバント」としては、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ－２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＧＰＩ－０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンが含まれ得る。エマルジョンは、特に、軽質流動パラフィン油（欧州薬局方型）；スクアラン又はスクアレンなどのイソプレノイド油；アルケンの、特にイソブテン又はデセンのオリゴマー化の結果生じる油；直鎖状アルキル基を有する酸又はアルコールのエステル、さらに特に、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリレート／カプレート）、グリセリルトリ（カプリレート／カプレート）、又はプロピレングリコールジオレエート；分枝鎖状の脂肪酸又はアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルをベースにしているものであり得る。油は、エマルジョンを形成するために乳化剤と組み合わせて使用される。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特に、任意でエトキシ化されている、ソルビタンの、マンニド（例えば、アンヒドロマンニトールオレエート）の、グリコールの、ポリグリセロールの、プロピレングリコールの、及びオレイン酸、イソステアリン酸、リシンオレイン酸、又はヒドロキシステアリン酸のエステル、並びにポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニック製品、特にＬ１２１である。Hunter et al.， The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull， D. E. S.)， JohnWiley and Sons， NY， pp51-94 (1995)、及びTodd et al.， Vaccine 15:564-570 (1997)を参照されたい。典型的なアジュバントは、“Vaccine Design， The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M. Powell and M. Newman， Plenum Press， 1995の第１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、及びこれと同一の本の第１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。

【0059】

アジュバントのさらなる例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー及び無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルと架橋している、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語で知られている（Phameuropa Vol. 8， No. 2， June 1996）。当業者はまた、少なくとも３つの、好ましくは８つ以下のヒドロキシル基を有し、これら少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が、少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって置き換えられているポリヒドロキシル化化合物と架橋している、このようなアクリルポリマーを記載している、米国特許第２，９０９，４６２号を参照することもできる。好ましいラジカルは、２～４個の炭素原子を有するラジカル、例えば、ビニル、アリル、及び他のエチレン不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体、メチルなどの他の置換基を有し得る。カーボポールという名称で市販されている製品（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）が特に適切である。これらは、アリルショ糖又はアリルペンタエリスリトールと架橋している。これらのうち、カーボポール９７４Ｐ、９３４Ｐ、及び９７１Ｐに言及することができる。最も好ましいものは、カーボポール９７１Ｐの使用である。無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーとしては、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）があり、これは、無水マレイン酸及びエチレンのコポリマーである。水中にこれらのポリマーを溶解すると酸性の溶液が生じ、この溶液は、免疫原性の免疫学的組成物又はワクチン組成物自体を組み込むアジュバント溶液を作製するために、好ましくは生理学的ｐＨに中和される。

【0060】

さらなる適切なアジュバントとしては、数ある中でとりわけ、限定はしないが、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）、ＳＡＦ－Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質－アミンアジュバント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（組換え又はその他）の易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４若しくはムラミルジペプチド、或いは、天然の若しくは組換えのサイトカイン若しくはこれらの類似体又は内因性サイトカイン放出の刺激物質が含まれる。

【0061】

一態様において、免疫原性組成物は、適切なアジュバントと共に、油中水型エマルジョンに製剤される。アジュバントは、油及び界面活性剤を含み得る。一態様において、アジュバントは、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ ７１Ｒ ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ Ｉｎｃによる製造、カタログ番号：３６５１８７）である。一態様において、アジュバントは、Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡ ２０６である。アジュバントは、用量当たり約１００μｇ～約１０ｍｇの量で添加され得る。またさらに好ましくは、アジュバントは、用量当たり約１００μｇ～約１０ｍｇの量で添加される。またさらに好ましくは、アジュバントは、用量当たり約５００μｇ～約５ｍｇの量で添加される。またさらに好ましくは、アジュバントは、用量当たり約７５０μｇ～約２．５ｍｇの量で添加される。最も好ましくは、アジュバントは、用量当たり約１ｍｇの量で添加される。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、用量当たり、アジュバントを含有する約７割の油相、及び本発明のＥ２タンパク質を含有する約３割の水相を含む。

【0062】

本発明の一態様において、本明細書で開示される置き換えによって生じるＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の変異６Ｂ８エピトープは、マーカーとして使用される。
本明細書において使用される用語「マーカー」は、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープを指す。本発明に従った変異６Ｂ８エピトープは、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ配列（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）と異なる。したがって、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープによって、典型的な免疫試験及び／又はゲノム解析試験を使用して、変異していない６Ｂ８エピトープを有する天然に感染した動物を、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープを有するワクチン接種された動物から区別することが可能となる。
本発明の一態様において、本発明の免疫原性組成物は、マーカーワクチン又はＤＩＶＡ（感染した動物とワクチン接種された動物との間の区別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ））ワクチンである。

【0063】

用語「マーカーワクチン」又は「ＤＩＶＡ（感染した動物とワクチン接種された動物との間の区別）」は、上記に示すマーカーを有するワクチンを指す。したがって、マーカーワクチンは、ワクチン接種された動物を天然に感染した動物から区別するために使用することができる。本発明の免疫原性組成物はマーカーワクチンとして作用するが、それは、野生型ＣＳＦＶでの感染とは対照的に、本発明のワクチンを接種された動物において、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープが検出され得るためである。典型的な免疫試験及び／又はゲノム解析試験によって、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープは、野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープ配列（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）から区別され得る。最後に、マーカーエピトープは、家畜内に存在し得る他の生物によって誘導される偽陽性の血清学的結果を避けるために、病原体に特異的であるべきである。しかし、６Ｂ８エピトープは進化的に保存されている（配列アラインメントによる）ため、ＣＳＦＶに特異的である（６Ｂ８ ｍＡｂはＢＶＤＶに結合しない）。したがって、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープは、マーカーワクチンにおける使用に非常に適している。
有効なマーカーワクチンの主な利点は、ワクチンが、急性に感染した豚、又はワクチン接種された豚集団においてサンプルを採取するある程度（例えば、少なくとも約３週間）前に感染した豚の検出を可能とし、したがって、豚集団におけるＣＳＦＶの拡大又は再導入をモニタリングする能力を提供することである。したがって、ワクチンは、ある程度の信頼レベルで、実験室での試験結果に基づいて、ワクチン接種された豚集団がＣＳＦＶを有していないと断言することを可能にする。

【0064】

本発明のマーカーワクチンは、豚の発熱の検出又はアウトブレイクのケースにおける緊急のワクチン接種に理想的に適している。マーカーワクチンは、迅速かつ効果的な投与を容易にし、野外ウイルス（疾患に関連する）に感染した動物とワクチン接種された動物との間の区別を可能にする。
本発明の一態様において、本発明の免疫原性組成物で処置された動物は、天然の豚熱ウイルスに感染した動物から、免疫試験及び／又はゲノム解析試験を使用する前記動物から得たサンプルの分析を介して、区別され得る。
用語「サンプル」は、体液のサンプル、分離された細胞のサンプル、又は組織若しくは器官のサンプルを指す。体液のサンプルは周知の技術によって得ることができ、これには、好ましくは、血液、血漿、血清、又は尿のサンプル、さらに好ましくは、血液、血漿、又は血清のサンプルが含まれる。組織又は器官のサンプルは、例えば生検によって、任意の組織又は器官から得ることができる。分離された細胞は、遠心分離又は細胞選別などの分離技術によって、体液又は組織又は器官から得ることができる。
「得られた」という用語は、沈殿、カラムなどを好ましくは使用する、当業者に公知の単離及び／又は精製ステップを含み得る。
用語「免疫試験」及び「ゲノム解析試験」は、以下に詳述される。しかし、前記「免疫試験」及び「ゲノム解析試験」の分析はそれぞれ、本発明に従った免疫原性組成物をワクチン接種された動物と、天然の（疾患に関連する）豚熱ウイルスに感染した動物とを区別するための基礎である。

【0065】

本発明の一態様において、前記免疫原性組成物は、単回用量投与のために製剤される。
有利には、本発明によって提供される実験データは、本発明の免疫原性組成物の単回用量投与が防御免疫応答を確実にかつ効果的に刺激したことを開示している。したがって、本発明の一態様において、前記免疫原性組成物は、単回用量投与のために製剤され、単回用量投与によって効果的である。
また、本発明は、医薬品として使用するための本発明の免疫原性組成物の使用も提供する。
一態様において、本発明は、本発明に従った免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む、動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防及び／又は処置する方法を提供する。一態様において、ＣＳＦＶに関連する疾患は、ＣＳＦである。
本発明はまた、本発明に従った免疫原性組成物のいずれかを動物に投与することを含む、動物を免疫化するための方法に関する。本発明はまた、本発明に従った免疫原性組成物のいずれかを動物に単回投与することを含む、動物を免疫化するための方法に関する。好ましくは、動物を免疫化するための方法は、このような動物への本発明に従った免疫原性組成物の単回投与によって効果的である。

【0066】

用語「免疫化」は、免疫化される動物に免疫原性組成物を投与し、これによって、このような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫学的応答を生じさせることによる、能動免疫化に関連する。
免疫化は、群れにおける特定のＣＳＦＶ感染の発生の減少、又は、特定のＣＳＦＶ感染によって生じる若しくは特定のＣＳＦＶ感染に関連する臨床徴候の重症度の低減をもたらす。好ましくは、免疫化は、本発明に従った免疫原性組成物の単回投与によって、群れにおける特定のＣＳＦＶ感染の発生の減少、又は、特定のＣＳＦＶ感染によって生じる若しくは特定のＣＳＦＶ感染に関連する臨床徴候の重症度の低減をもたらす。
本発明の一態様に従うと、本明細書で提供される免疫原性組成物での、必要とする動物の免疫化は、好ましくは本発明に従った免疫原性組成物の単回投与によって、ＣＳＦＶ感染による対象の感染の予防をもたらす。またさらに好ましくは、免疫化は、ＣＳＦＶ感染に対する効果的な、長期の、免疫学的応答をもたらす。前記期間は、２カ月間超、好ましくは３カ月間超、さらに好ましくは４カ月間超、さらに好ましくは５カ月間超、さらに好ましくは６カ月間超、継続することが理解されよう。免疫化は、免疫化された動物の全てにおいて効果的でなくてもよいことが理解される。しかし、この用語は、群れにおける有意な割合の動物が効果的に免疫化されることを要する。

【0067】

好ましくは、この文脈において、通常は、すなわち免疫化されていないと、ＣＳＦＶ感染によって通常生じる又はＣＳＦＶ感染に関連する臨床徴候を発症する動物の群れが想定される。群れの動物が効果的に免疫化されているかどうかは、当業者によって、さらなる苦労を伴うことなく決定され得る。好ましくは、免疫化は、所与の群れの動物の少なくとも３３％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％における臨床徴候が、発生又は重症度において、免疫化されていない又は本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で免疫化されているがその後ＣＳＦＶに感染している動物と比較して少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、またさらに好ましくは少なくとも３０％、またさらに好ましくは少なくとも４０％、またさらに好ましくは少なくとも５０％、またさらに好ましくは少なくとも６０％、またさらに好ましくは少なくとも７０％、またさらに好ましくは少なくとも８０％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％低下している場合、効果的であるとされるべきである。

【0068】

本発明の一態様において、動物は豚である。一態様において、動物は子豚である。子豚は通常、３～４週齢よりも若い。一態様において、子豚は、１～４週齢の間にワクチン接種される。一態様において、動物は雌豚である。一態様において、動物は、妊娠中の雌豚である。
本発明の一態様において、免疫原性組成物は、真皮内、気管内、膣内、筋肉内、鼻腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、経口、髄腔内、皮下、皮内、心臓内、葉内（ｉｎｔｒａｌｏｂａｌ）、髄内、肺内、及びこれらの組み合わせで投与される。しかし、化合物の性質及び作用機序に応じて、免疫原性組成物は、他の経路でも投与され得る。
本発明はまた、本発明に従った免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む、ＣＳＦに関連する１つ又は複数の臨床徴候の発生又は動物における重症度を低減させる方法であって、１つ又は複数の臨床徴候の発生又は重症度の低減が、免疫原性組成物を投与されていない動物と比較される方法を提供する。好ましくは、本方法は、単回用量の免疫原性組成物の投与を含み、また、免疫原性組成物のこのような単回投与によって、１つ又は複数の臨床徴候の発生又は重症度の低減において効果的である。

【0069】

本明細書において使用される用語「臨床徴候」は、動物のＣＳＦＶ感染の徴候を指す。臨床徴候は、以下でさらに定義される。しかし、臨床徴候としてはまた、限定はしないが、生きている動物から直接観察可能な臨床徴候も含まれる。生きている動物から直接観察可能な臨床徴候の例には、鼻及び眼の排出物、嗜眠、咳、喘鳴、動悸、発熱、体重増加又は体重減少、脱水、下痢、関節の腫れ、跛行、衰弱、皮膚の蒼白、発育不全、及びそれに類するものが含まれる。Ｍｉｔｔｅｌｈｏｌｚｅｒら（Vet.Microbiol., 2000. 74(4): p. 293-308）は、ＣＳＦの動物実験において臨床スコアを決定するためのチェックリストを開発した。このチェックリストは、活気、身体の緊張、体形、呼吸、歩行、皮膚、眼／結膜、食欲、排便、及び強制給餌の食べ残しというパラメータを含む。
好ましくは、臨床徴候は、発生又は重症度において、処置されていない又は本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で処置されているがその後ＣＳＦＶに感染している対象と比較して少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、またさらに好ましくは少なくとも３０％、またさらに好ましくは少なくとも４０％、またさらに好ましくは少なくとも５０％、またさらに好ましくは少なくとも６０％、またさらに好ましくは少なくとも７０％、またさらに好ましくは少なくとも８０％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％低下する。

【0070】

本発明の一態様において、免疫原性組成物は１回投与され、また、このような単回投与によって有効である。
しかし、単回用量投与が好ましいものの、免疫原性組成物は２回又は数回投与することもでき、第１の用量は、第２の（ブースター）用量の投与の前に投与される。好ましくは、第２の用量は、第１の用量の少なくとも１５日後に投与される。さらに好ましくは、第２の用量は、第１の用量の１５～４０日後の間に投与される。またさらに好ましくは、第２の用量は、第１の用量の少なくとも１７日後に投与される。またさらに好ましくは、第２の用量は、第１の用量の１７～３０日後の間に投与される。またさらに好ましくは、第２の用量は、第１の用量の少なくとも１９日後に投与される。またさらに好ましくは、第２の用量は、第１の用量の１９～２５日後の間に投与される。最も好ましくは、第２の用量は、第１の用量の少なくとも２１日後に投与される。２回投与レジメンの好ましい態様において、免疫原性組成物の第１の用量及び第２の用量の両方は、同一の量で投与される。第１及び第２の用量レジメンに加えて、別の実施形態は、さらなるその後の用量を含む。例えば、第３、第４、又は第５の用量を、これらの態様において投与することができる。好ましくは、その後の第３、第４、及び第５の用量のレジメンは、第１の用量と同一の量で投与され、用量間の時間枠は、上記の第１の用量と第２の用量との間の時間と一致する。

【0071】

本発明の一態様において、１つ又は複数の臨床徴候は、呼吸窮迫、努力呼吸、咳、くしゃみ、鼻炎、頻呼吸、呼吸困難、肺炎、耳及び外陰部の赤／青の変色、黄疸、リンパ球浸潤、リンパ節腫脹、肝炎、腎炎、食欲不振、発熱、嗜眠、乳汁分泌不全（ａｇａｌａｔｉａ）、下痢、鼻からの排出物、結膜炎、進行性の体重減少、体重増加の低減、皮膚の蒼白、胃潰瘍、器官及び組織での肉眼的及び顕微鏡的な病変、リンパの病変、死亡を免れない状態、ウイルス誘発性の流産、死産、子豚の奇形、ミイラ変性、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
一態様において、本発明はまた、
ａ）サンプルを得るステップ、及び
ｂ）前記サンプルを免疫試験において試験するステップ
を含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明に従った免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別する方法も提供する。

【0072】

用語「免疫試験」は、ＣＳＦＶのＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープに特異的な抗体を含む試験を指す。抗体は、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープに、又は野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に特異的であり得る。しかし、用語「免疫試験」は、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープペプチド又は野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープペプチド（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）を含む試験も指す。免疫試験の例としては、任意の酵素免疫学的又は免疫化学的な検出方法、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、二重競合ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、サンドイッチ酵素免疫試験、蛍光抗体試験（ＦＡＴ）、電気化学発光サンドイッチ免疫アッセイ（ＥＣＬＩＡ）、解離－増強ランタニドフルオロ免疫アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）又は固相免疫試験、免疫蛍光試験（ＩＦＴ）、免疫組織染色、ウェスタンブロット分析、又は当業者に利用可能なあらゆる他の適切な方法などが含まれる。使用するアッセイに応じて、抗原又は抗体は、酵素、フルオロフォア、又は放射性同位体によって標識することができる。例えば、Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1994);及びFrye et al., Oncogen 4: 1153-1157, 1987を参照されたい。

【0073】

好ましくは、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープに特異的な抗体は、野生型ＣＳＦＶに感染していることが疑われる、又は本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むワクチンを接種された動物（豚など）の血清中細胞（白血球など）又は単離された器官（扁桃腺、脾臓、腎臓、リンパ節、回腸の遠位部分など）のクリオスタット切片におけるＣＳＦＶ抗原を検出するために使用される。このようなケースでは、野生型ＣＳＦＶに感染した動物のサンプルのみが、前記６Ｂ８エピトープ特異的抗体による陽性結果を示す。逆に、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むワクチンを接種された動物のサンプルは、本発明に従った６Ｂ８エピトープ内での変異を理由に、前記６Ｂ８エピトープ特異的抗体による結果を示さない。代替的な試験では、ＣＳＦＶは、例えば、野生型ＣＳＦＶに感染した、感染していることが疑われる、又はワクチン接種された動物の器官（動物の扁桃腺など）又は血清中細胞（白血球など）から単離され、ウイルスでの細胞の感染のために、適切な細胞系（ＳＫ－６細胞又はＰＫ－１５細胞など）とインキュベートされる。複製したウイルスはその後、野外（野生型、疾患に関連する）ＣＳＦＶと本発明に従った組換えＣＳＦＶとの間を区別する６Ｂ８エピトープ特異的抗体を使用して、細胞において検出される。さらに、ペプチドを、非特異的な交差反応性をブロックするために使用することができる。さらに、野生型ＣＳＦＶの他のエピトープに特異的な抗体を、ポジティブコントロールとして使用することができる。

【0074】

さらに好ましくはＥＬＩＳＡが使用され、この場合、感染した豚を、本発明に従ったワクチンを接種された豚から区別するために、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に特異的な抗体がマイクロウェルアッセイプレートに架橋される。前記架橋は、好ましくは、例えばポリ－Ｌ－リジンなどのアンカータンパク質を介して行われる。このような架橋を利用するＥＬＩＳＡは、通常、受動的にコーティングされる技術を利用するＥＬＩＳＡと比較した場合、感度が高い。野生型（疾患に関連する）ＣＳＦＶは、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に特異的な抗体に結合する。野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープに特異的な抗体への野生型ＣＳＦＶウイルスの結合の検出は、ＣＳＦＶに特異的なさらなる抗体によって行うことができる。このようなケースでは、感染した豚のサンプルのみが、６Ｂ８エピトープ特異的抗体による陽性結果を示す。さらに、ペプチドを、非特異的な交差反応性をブロックするために使用することができる。さらに、野生型ＣＳＦＶの他のエピトープに特異的な抗体を、ポジティブコントロールとして使用することができる。
或いは、マイクロウェルアッセイプレートを、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に特異的な抗体以外の、ＣＳＦＶに特異的な抗体と架橋させてもよい。野生型（疾患に関連する）ＣＳＦＶは、架橋した抗体に結合する。架橋した抗体への野生型ＣＳＦＶの結合の検出は、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に特異的な抗体によって行うことができる。

【0075】

上記で既に示したように、６Ｂ８エピトープは進化的に保存されており、野生型ＣＳＦＶに特異的である。
したがって、さらに好ましくは、ＥＬＩＳＡは、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープ又は野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に対する抗体をサンプルにおいて検出するために使用される。このような試験は、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープペプチド又は野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープペプチド（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）を含む。
このような試験は、マイクロウェルアッセイプレートに架橋した本発明に従った変異６Ｂ８エピトープ又は野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）を有するウェルを例えば含み得る。前記架橋は、好ましくは、例えばポリ－Ｌ－リジンなどのアンカータンパク質を介して行われる。変異体又は野生型６Ｂ８エピトープを得るための発現系は、当業者に周知である。或いは、前記６Ｂ８エピトープは、化学的に合成することができる。変異６Ｂ８エピトープ又は野生型６Ｂ８エピトープはこうして、本発明に従った試験において使用することができるが、完全なＥ２タンパク質を含むタンパク質又は前記６Ｂ８エピトープを含むＥ２タンパク質の断片を、比較的短いエピトープの代わりにそのまま使用することが都合が良い可能性があることが理解されるべきである。特に、エピトープが、標準的なＥＬＩＳＡ試験におけるウェルのコーティング剤に例えば使用される場合、エピトープを含む、より大きなタンパク質をコーティングステップに使用することが、より効率的であり得る。

【0076】

本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むワクチンを接種された動物は、野生型６Ｂ８エピトープに対する抗体を産生しなかった。しかし、このような動物は、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープに対する抗体を産生している。その結果、野生型６Ｂ８エピトープでコーティングしたウェルに結合する抗体はない。逆に、ウェルが本発明に従った変異６Ｂ８エピトープでコーティングされている場合、抗体は、前記変異６Ｂ８エピトープに結合する。
野生型ＣＳＦＶに感染した動物は、しかし、ＣＳＦＶの野生型エピトープに対する抗体を産生している。しかし、このような動物は、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープに対する抗体を産生していない。その結果、本発明に従った変異６Ｂ８エピトープでコーティングされたウェルに結合する抗体はない。逆に、ウェルが野生型６Ｂ８エピトープでコーティングされている場合、抗体は、野生型６Ｂ８エピトープに結合する。

【0077】

本発明に従った変異６Ｂ８エピトープ又は野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）への抗体の結合は、当業者に周知の方法によって行うことができる。
好ましくは、ＥＬＩＳＡは、サンドイッチタイプのＥＬＩＳＡである。さらに好ましくは、ＥＬＩＳＡは競合ＥＬＩＳＡである。最も好ましくは、ＥＬＩＳＡは二重競合ＥＬＩＳＡである。しかし、様々なＥＬＩＳＡ技術が当業者に周知である。ＥＬＩＳＡは典型的には、Wensvoort G. et al., 1988 (Vet. Microbiol. 17(2): 129-140)によって、Robiolo B. et al., 2010 (J. Virol. Methods. 166(1-2): 21-27)によって、及びColijn, E.O. et al., 1997 (Vet. Microbiology 59: 15-25)によって記載されている。

【0078】

本発明の一態様において、免疫試験は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の無傷の６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に結合しているかどうかの試験を含む。本発明の一態様において、免疫試験は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中に存在するかどうかの試験、及び／又は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の変異６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中に存在するかどうかの試験を含む。このような変異６Ｂ８エピトープは、本明細書において定義される６Ｂ８エピトープにおける変異を含む。
本発明の一態様において、免疫学的試験は、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）である。本発明の一態様において、ＥＬＩＳＡは、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、又は二重競合ＥＬＩＳＡであり、好ましくは二重競合ＥＬＩＳＡである。
一態様において、本発明はまた、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸も提供する。

【0079】

用語「核酸」は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、又は誘導体を含むポリヌクレオチドを指す。この用語は、一本鎖ポリヌクレオチドも二本鎖ポリヌクレオチドも包含する。本発明の核酸は、組換えポリヌクレオチド（すなわち、その天然の背景からの組換え）及び遺伝子修飾された形態を包含する。さらに、天然の修飾されたポリヌクレオチド、例えばグリコシル化若しくはメチル化されたポリヌクレオチド、又は人工的に修飾されたポリヌクレオチド、例えばビオチン化されたポリヌクレオチドを含む、化学的に修飾されたポリヌクレオチドも含まれる。さらに、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、縮重した遺伝子コードを理由として多くのポリヌクレオチドによってコードされ得ることを理解されたい。本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸は、核酸が導入されることになる宿主細胞に応じてコドン最適化されている。
一態様において、本発明はまた、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸を含むベクターも提供する。一態様において、ベクターは発現ベクターである。

【0080】

用語「ベクター」は、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、又はレトロウイルスベクター、及び人工染色体、例えば細菌又は酵母の人工染色体を包含する。さらに、この用語はまた、ゲノムＤＮＡへの標的化構築物のランダムな又は部位特異的な組み込みを可能にする、標的化構築物も指す。このような標的構築物は、好ましくは、以下に詳述するような相同組換え又は非相同組換えに十分な長さのＤＮＡを含む。本発明の核酸を包含するベクターは、好ましくは、宿主における増殖及び／又は選択のための選択マーカーをさらに含む。ベクターは、当技術分野において周知の様々な技術によって宿主細胞に組み込むことができる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿若しくは塩化ルビジウム沈殿などの沈殿に、又は荷電した脂質との複合体に、又はフラーレンなどの炭素ベースのクラスターに、導入することができる。或いは、プラスミドベクターは、熱ショック又はエレクトロポレーション技術によって導入することができる。ベクターがウイルスである場合には、ベクターは、宿主細胞に適用する前に、適切なパッケージング細胞系を使用してインビトロでパッケージングしてよい。レトロウイルスベクターは、複製増殖型又は複製欠損型であり得る。後者のケースでは、ウイルス増殖は一般に、補完性の宿主／細胞でのみ生じる。さらに好ましくは、ポリヌクレオチドは発現制御配列に作動可能に連結しており、その結果、原核細胞若しくは真核細胞又はこれらの単離画分における発現を可能にする。前記ポリヌクレオチドの発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの、ポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当技術分野において周知である。これらは、好ましくは、転写の開始を確実にする調節配列、並びに任意に、転写の終結及び転写産物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。さらなる調節エレメントには、転写エンハンサー及び翻訳エンハンサーが含まれ得る。原核宿主細胞における発現を可能にする、考えられる調節エレメントは、例えば、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、又はｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母のＡＯＸ１若しくはＧＡＬ１プロモーター、又は、哺乳動物細胞及び他の動物細胞のＣＭＶ－プロモーター、ＳＶ４０－プロモーター、ＲＳＶ－プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ－エンハンサー、ＳＶ４０－エンハンサー、若しくはグロビンイントロンである。さらに、誘導性の発現制御配列を、本発明によって包含される発現ベクターにおいて使用してもよい。このような誘導性ベクターは、ｔｅｔ若しくはｌａｃオペレーター配列、又は熱ショック若しくは他の環境因子によって誘導可能な配列を含み得る。適切な発現制御配列は、当技術分野において周知である。例えば、この技術は、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)において記載されている。好ましくは、本発明のベクターは、バキュロウイルスベクターである。さらに好ましくは、本発明のベクターは、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞における発現のための哺乳動物発現ベクターである。

【0081】

一態様において、本発明はまた、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞も提供する。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞、又は例えば昆虫（ｉｎｓｅｔ）細胞などの真核細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞はＳＦ９細胞である。さらに好ましくは、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である。
一態様において、本発明はまた、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法であって、
（ｉ）宿主細胞、好ましくは本明細書において定義されるＣＨＯ細胞を、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、及び
（ｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を単離し、任意で精製するステップ
を含む方法も提供する。
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の精製は、例えば、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に付着した融合タグ又は融合ペプチドを介して、例えばＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、又は存在する場合はＦｃ断片を介して行うことができる。
一態様において、本発明はまた、（ｉ）Ｅ２タンパク質を発現し得る発現ベクターを有する細胞を培養すること、及び（ｉｉ）本明細書において上記で定義されているＥ２タンパク質又は当該Ｅ２タンパク質を含む細胞培養物全体を採取することを含む、免疫原性組成物を調製する方法も提供する。

【0082】

本発明の一態様において、発現ベクターは、本発明の核酸分子を含む組換え哺乳動物発現ベクターである。一態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、商品に由来する。一態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来する。一態様において、細胞は哺乳動物細胞である。一態様において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
一態様において、この方法は、ユーザーマニュアル（改訂版Ｄ．０、２０１８年５月２５日、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）に従って、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１３３）を使用することによって実施される。一実施形態において、ＣＨＯ細胞は、Ｇｉｂｉｃｏからカタログ番号Ａ２９１２７で販売されているＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞である。一実施形態において、この方法は、哺乳動物細胞を、例えばＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１２９）を使用して、本発明の組換え哺乳動物発現ベクターに感染させるステップを含む。
本発明の一態様において、発現ベクターは、本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスである。一態様において、組換えバキュロウイルスは、商品に由来する。一態様において、組換えバキュロウイルスは、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルスという商標で販売されている商品（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に由来する。一態様において、細胞は昆虫細胞である。一態様において、昆虫細胞はＳＦ＋細胞である。一実施形態において、ＳＦ＋細胞は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）によって販売されている商品である。

【0083】

本発明の一態様において、本方法は、本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスを調製するステップを含む。一態様において、組換えバキュロウイルスは、商品に由来する。一態様において、組換えバキュロウイルスは、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルス（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）という商標で販売されている商品に由来する。
本発明の一態様において、本方法は、本発明の組換えバキュロウイルスで細胞を感染させるステップを含む。一実施形態において、細胞は昆虫細胞である。一実施形態において、昆虫細胞はＳＦ＋細胞である。一実施形態において、ＳＦ＋細胞は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）によって販売されている商品である。

【0084】

本発明の一態様において、本方法は、本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスを調製すること、及び組換えバキュロウイルスで昆虫細胞を感染させることを含む。一実施形態において、組換えバキュロウイルスは、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルス（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）という商標で販売されている商品に由来する。一実施形態において、昆虫細胞はＳＦ＋細胞である。一実施形態において、ＳＦ＋細胞は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）によって販売されている商品である。
本発明の一態様において、本方法は、（ｉ）本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスを調製すること、（ｉｉ）組換えバキュロウイルスで昆虫細胞を感染させること、（ｉｉｉ）昆虫細胞を培養培地において培養すること、及び（ｉｖ）本発明のＥ２タンパク質又は本発明のＥ２タンパク質を含む細胞培養物全体を採取することを含む。一態様において、組換えバキュロウイルスは、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルス（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）という商標で販売されている商品に由来する。一実施形態において、昆虫細胞はＳＦ＋細胞である。一実施形態において、ＳＦ＋細胞は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）によって販売されている商品である。

【0085】

本発明の一態様において、本発明の細胞を培養するための培養培地は、当業者によって決定される。一態様において、培養培地は、無血清昆虫細胞培地である。一態様において、培養培地は、Ｅｘ－ＣＥＬＬ ４２０（昆虫細胞用のＥｘ－ＣＥＬＬ（登録商標）４２０無血清培養培地、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１４４２０Ｃ）である。
本発明の一態様において、昆虫細胞は、Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養される。一態様において、昆虫細胞は、最長１０日間、好ましくは約２日間～約１０日間、さらに好ましくは約４日間～約９日間、及びまたさらに好ましくは約５日間～約８日間の期間にわたりインキュベートされる。一態様において、昆虫細胞の培養に適した条件は、約２２～３２℃の間、好ましくは約２４～３０℃の間、さらに好ましくは約２５～２９℃の間、またさらに好ましくは約２６～２８℃の間、及び最も好ましくは約２７℃の温度を含む。
本発明の一態様において、本方法は、本発明の細胞培養物を不活化するステップをさらに含む。限定はしないが化学的及び／又は物理学的処理を含む任意の従来の不活化方法を、本発明の目的に使用することができる。
一態様において、不活化ステップは、好ましくは約１～約２０ｍＭの、好ましくは約２～約１０ｍＭの、さらに好ましくは約５ｍＭ又は１０ｍＭの濃度の、環化バイナリエチレンイミン（ＢＥＩ）の添加を含む。一実施形態において、不活化ステップは、ＮａＯＨ中で環化してＢＥＩを形成する２－ブロモエチレンアミンヒドロブロミドの溶液の添加を含む。

【0086】

一態様において、不活化ステップは、２５～４０℃の間、好ましくは２８～３９℃の間、さらに好ましくは３０～３９℃の間、さらに好ましくは３５～３９℃の間で行われる。一実施形態において、不活化ステップは、２４～７２時間、好ましくは３０～７２時間、さらに好ましくは４８～７２時間行われる。通常、不活化ステップは、検出可能なウイルスベクターの複製がなくなるまで行われる。
本発明の一態様において、本方法は、不活化ステップの後に中和ステップをさらに含む。中和ステップは、溶液中の不活化剤を中和する等量の薬剤の添加を含む。一実施形態において、不活化剤はＢＥＩである。一態様において、中和剤はチオ硫酸ナトリウムである。一態様において、不活化剤がＢＥＩである場合、等量のチオ硫酸ナトリウムが添加される。例えば、ＢＥＩが最終濃度５ｍＭまで添加される場合、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶液が、全ての残留ＢＥＩを中和するための最終最小濃度５ｍＭとなるまで添加される。一態様において、中和ステップは、不活化剤がＢＥＩである場合、チオ硫酸ナトリウム溶液を最終濃度１～２０ｍＭ、好ましくは２～１０ｍＭ、さらに好ましくは５ｍＭ又は１０ｍＭまで添加することを含む。一態様において、中和剤は、不活化ステップが完了した後、すなわち、ウイルスベクターの複製が検出され得なくなった後に添加される。一態様において、中和剤は、不活化ステップが２４時間行われた後に添加される。一態様において、中和剤は、不活化ステップが３０時間行われた後に添加される。一態様において、中和剤は、不活化ステップが４８時間行われた後に添加される。一態様において、中和剤は、不活化ステップが７２時間行われた後に添加される。

【0087】

本発明の一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質はさらに精製される。例えば、本発明に従ったＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に付着している、例えばＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、又はＦｃ断片などの融合ペプチドを含み得る。Ｈｉｓタグを有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性（ニトリロ三酢酸にカップリングされたニッケル²⁺イオン）によって精製することができる。ＦＬＡＧタグ（例えばＤＹＫＤＤＤＤＫ）を有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、ＦＬＡＧタグに特異的に結合するモノクローナル抗体によって精製することもできる（市販のキットは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である（Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ１アガロース（Ａｇａｒｓｏｓｅ）親和性ゲル））。Ｆｃ断片に連結されたＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えばプロテインＡ又はプロテインＧ親和性のいずれかによって精製することができる。

【0088】

一態様において、本発明はまた、ＣＨＯ細胞において本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法であって、
ａ）ＣＨＯ細胞を培地で増殖させるステップ；
ｂ）ステップａ）の細胞に、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む組換え哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ；
ｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意で精製するステップ
を含む方法も提供する。
一実施形態において、ＣＨＯ細胞は、高密度懸濁培養物になるまで培地で増殖するように適応させる。
一実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来する。
一実施形態において、ＣＨＯ細胞は、Ｇｉｂｉｃｏからカタログ番号Ａ２９１２７で販売されているＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞である。
一実施形態において、この方法で使用される培地は、Ｇｉｂｉｃｏからカタログ番号Ａ２９１００で販売されているＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地である。

【0089】

一実施形態において、適応させたＣＨＯ細胞は、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１２９）を使用することによってトランスフェクトされる。
一実施形態において、ステップｃ）では、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、約３２～３７℃、好ましくは約３２℃で培養される。
一実施形態において、ステップｃ）では、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、約５～８％ＣＯ₂の加湿雰囲気で培養される。
一実施形態において、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサー及びＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄが、ステップｃ）にて添加される。
一実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、トランスフェクションの約２～１４日後、例えば、トランスフェクションの約４～１２日後、又はトランスフェクションの約８～１０日後に回収される。
一態様において、本発明は、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するためのキットを提供する。一態様において、キットは、本明細書で定義される抗体若しくはその抗原結合断片、変異６Ｂ８エピトープを有する本発明の組換えＥ２タンパク質、及び／又は本明細書で定義される６Ｂ８エピトープを含むＣＳＦＶの野生型Ｅ２タンパク質を含む。キットはまた、使用説明書も含み得る。

【0090】

本発明の一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質はさらに精製される。例えば、本発明に従ったＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に付着している、例えばＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、又はＦｃ断片などの融合ペプチドを含み得る。Ｈｉｓタグを有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性（ニトリロ三酢酸にカップリングされたニッケル²⁺イオン）によって精製することができる。ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫなど）を有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、ＦＬＡＧタグに特異的に結合するモノクローナル抗体によって精製することができる（市販のキットは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である（Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ１アガロース親和性ゲル））。Ｆｃ断片に連結されたＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、プロテインＡ親和性又はプロテインＧ親和性のいずれかによって精製することができる。

【0091】

以下の項もまた本明細書に記載され、本発明の開示の一部である。
項
以下の項もまた本明細書に記載され、本発明の開示の一部である。
１． 組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）Ｅ２タンパク質であって、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
２． 置き換えが、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質中に、６Ｂ８モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の結合が特異的に阻害される変異６Ｂ８エピトープをもたらす、項１に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
３． Ｃ株、ＱＺ０７、ＧＤ１８及びＧＤ１９１から選択される株からの野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に由来する、項１又は２に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
４． 野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、配列番号９～１２から選択されるアミノ酸配列を含む、項１～３のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0092】

５． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープが、６Ｂ８モノクローナル抗体による特異的な認識及び／又は結合を受け、６Ｂ８モノクローナル抗体は、
（ｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生される、又は
（ｉｉ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む、又は
（ｉｉｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体のＣＤＲを含む、又は
（ｉｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、項１～４のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
６． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸が、少なくとも、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位、２２位、２４位、２４／２５位、１０位、４１位及び／又は６４位のアミノ酸を含む、項１～５のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0093】

７． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＢ／Ｃドメイン又はその断片である、項１～６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
８． ｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３８位の配列；
ｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３９位の配列；
ｉｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸５６位の配列；
ｉｖ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸８０位の配列；
ｖ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸９０位の配列；
ｖｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１０９位の配列；又は
ｖｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１１０位の配列
が、ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられている、項１～７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
９． ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスが、ＢＶＤＶ－２を含むウシウイルス性下痢症ウイルス；スイス、ＢＤＶ－１、ＢＤＶ－２、ＢＤＶ－３、ＢＤＶ－４、ＢＤＶ－５、ＢＤＶ－６、シャモア、イタリア、シチメンチョウ、及びチュニジアヒツジウイルス（ＴＳＶ）を含むボーダー病ウイルス；並びにキリンペスチウイルス、ＢＶＤＶ－３、プロングホーン、バンゴーワンナウイルス及びノルウェーラットペスチウイルスを含む非定型ペスチウイルスから選択される、項１～８のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0094】

１０． ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスが、キリンペスチウイルスＰＧ２株、ＢＤＶ－２ トナカイＶ６０、ノルウェーラットペスチウイルス単離体ＮｒＰＶ／ＮＹＣ－Ｄ２３、ＴＳＶ９５５２、バンゴーワンナ６７７８、及びＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎから選択される、項９に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
１１． ＣＳＦＶ以外のペスチウイルスからのＥ２タンパク質が、配列番号２１～２６から選択されるアミノ酸配列を含む、項１～１０のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
１２． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸位置に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、それにより６Ｂ８モノクローナル抗体のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質への結合が特異的に阻害される、項１～１１のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0095】

１３． ｉ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、表１～７で定義されるアミノ酸位置にアミノ酸変異を含む、
ｉｉ．組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸が、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましい、
ｉｉｉ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸が、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましく、かつ、２５位のアミノ酸が、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ及びＶが好ましい、
ｉｖ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸が、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＲであり、Ｋが好ましい、
ｖ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸が、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ又はＳであり、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＳが好ましい、
ｖｉ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１０位のアミノ酸が、Ａ又はＰである、
ｖｉｉ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の４１位のアミノ酸が、Ａ、Ｎ又はＥである、及び／又は
ｖｉｉｉ． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６４位のアミノ酸が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ又はＷであり、Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい、項１２に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0096】

１４． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸が、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸が、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましく、かつ、２５位のアミノ酸が、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ及びＶが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸が、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＲであり、Ｋが好ましく、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸が、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ又はＳであり、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＳが好ましい、項１～１３のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
１５． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸がＲであり、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸がＤであり、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸がＫであり、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸がＡである、項１４に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
１６． 配列番号２７～４８及び７１～７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項１～１５のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0097】

１７． Ｆｃ断片、例えば豚Ｆｃ断片が、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に連結されており；好ましくは、Ｆｃ断片、例えば豚Ｆｃ断片が、Ｅ２タンパク質のＣ末端に連結されており、好ましくはペプチドリンカーを介して連結されている、項１～１６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
１８． Ｆｃ断片が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、項１７に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
１９． ペプチドリンカーが、配列番号１６～１９から選択されるアミノ酸配列を含む、項１７又は１８に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
２０． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、配列番号４９～７０及び７５～７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；好ましくは配列番号５３、６８及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；より好ましくは配列番号５３及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項１７～１９のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
２１． ６Ｂ８エピトープを定義するアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む断片が、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片で置き換えられている、ＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列を含む、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0098】

２２． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３８位の配列が、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される；又は
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸３９位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される；又は
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸５６位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される；又は
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸８０位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される；又は
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸９０位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される；又は
ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸１１位からアミノ酸１０９位の配列は、ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株からのＥ２タンパク質の対応する配列で置き換えられており、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１０により示されるＣＳＦＶ野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質のアミノ酸配列の位置の番号に基づいて決定される、項２１に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0099】

２３． ＢＶＤＶ３ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ株のＥ２タンパク質の対応する断片と比較して、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、１０位、１４位、２２位、２４位、２５位、２４／２５位、４１位及び／又は６４位に少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含み；好ましくは、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、表１～７で定義されるアミノ酸位置にアミノ酸変異をさらに含み；好ましくは、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位、２４位、２５位又は６４位に単一のアミノ酸変異をさらに含む、項２１又は２２に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
２４． － 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸が、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＲであり、Ｋが好ましい；
－ 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６４位のアミノ酸が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ又はＷであり、Ｋが好ましい；
－ 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸が、Ｒ、Ｄ又はＩであり、Ｒが好ましい；
－ 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸が、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｄが好ましい；
－ 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸が、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｎが好ましい；又は
－ 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸が、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ又はＰであり、Ｒが好ましい、項２３に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0100】

２５． Ｆｃ断片、例えば豚Ｆｃ断片が、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に連結されており；好ましくは、Ｆｃ断片、例えば豚Ｆｃ断片が、Ｅ２タンパク質のＣ末端に連結されており、好ましくはペプチドリンカーを介して連結されている、項２１～２４のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
２６． Ｆｃ断片が、配列番号２０のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり；及び／又はペプチドリンカーが、配列番号１６～１９から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、項２５に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0101】

２７． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、配列番号９６～１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり；好ましくは組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、配列番号９６により示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、項２６に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
２８． 項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする組換え核酸。
２９． 項２８の核酸を含むベクター。
３０． 項２８に記載の核酸又は項２９に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である宿主細胞。

【0102】

３１． 項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法であって、
（ｉ）項３０に記載の宿主細胞を、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、及び
（ｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を単離し、任意で精製するステップ
を含む方法。
３２． 項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含む組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）。
３３． 弱毒化されている、項３２に記載の組換えＣＳＦＶ。
３４． 項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、項２８に記載の組換え核酸、項２９に記載のベクター、及び／又は項３２若しくは３３に記載の組換えＣＳＦＶを含む免疫原性組成物。
３５． ワクチン、例えばマーカーワクチン又はＤＩＶＡ（感染した動物とワクチン接種された動物との間の区別）ワクチンである、項３４に記載の免疫原性組成物。
３６． 動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を防止及び／又は処置する方法における使用のための項３４又は３５に記載の免疫原性組成物であって、前記方法は、項３４又は３５に記載の免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む、免疫原性組成物。

【0103】

３７． 項３４又は３５に記載の免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む、動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防及び／又は処置する方法。
３８． ａ）サンプルを得るステップ、及び
ｂ）前記サンプルを免疫試験において試験するステップ
を含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、項３４又は３５に記載の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別する方法。
３９． 免疫試験が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ又はその抗原結合断片を特異的に認識する抗体がサンプル中のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に結合し得るかどうかを試験するステップを含む、項３８に記載の方法。
４０． 免疫試験が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中に存在するかどうかを試験するステップ、及び／又は組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の変異６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中に存在するかどうかを試験するステップを含む、項３８又は３９に記載の方法。
４１． 免疫試験が、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、好ましくは二重競合ＥＬＩＳＡである、項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。

【0104】

４２． ６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体が、
（ｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生される、又は
（ｉｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）及び配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む、又は
（ｉｉｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲを含む、又は
（ｉｖ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、
項３９～４１のいずれか１項に記載の方法。
４３． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ又はその抗原結合断片を特異的に認識する抗体を含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、項３４又は３５に記載の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するためのキット。

【0105】

４４． ＣＨＯ細胞において項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法であって、
ａ）ＣＨＯ細胞を培地での高密度懸濁培養に適応させるステップ；
ｂ）ステップａ）の適応させたＣＨＯ細胞に、項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ；及び
ｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意で精製するステップ
を含む方法。
４５． 項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を、ＣＨＯ細胞において産生するための方法であって、
ａ）培地での高密度懸濁培養にＣＨＯ細胞を増殖させるステップ、
ｂ）ステップａ）のＣＨＯ細胞に、項１～２７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、及び
ｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意で精製するステップ
を含む方法。

【0106】

４６． ステップｃ）において、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞が、約３２～３７℃、好ましくは、約３２℃で培養される、項４４又は４５に記載の方法。
４７． ステップｃ）において、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞が、約５～８％ＣＯ₂の加湿雰囲気で培養される、項４４～４６のいずれか１項に記載の方法。
４８． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、トランスフェクションの約２～１４日後、例えば、トランスフェクションの約４～１２日後、又はトランスフェクションの約８～１０日後に回収される、項４４～４７のいずれか１項に記載の方法。
４９． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質がさらに精製される、項４４～４８のいずれか１項に記載の方法。
５０． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が融合ペプチドを含み、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の精製が、融合ペプチドに特異的に結合するマトリックスに対する親和性によって行われる、項４４～４９のいずれか１項に記載の方法。
５１． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、Ｈｉｓタグを融合ペプチドとして含み、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をＨｉｓタグを介してＮｉ－ＮＴＡに結合させ、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をＮｉ－ＮＴＡから放出させることによって精製される、項４４～５０のいずれか１項に記載の方法。

【0107】

５２． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、ＦＬＡＧタグを融合ペプチドとして含み、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を、ＦＬＡＧタグを介して、ＦＬＡＧタグに特異的に結合するモノクローナル抗体に結合させ、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をそのようなモノクローナル抗体から放出させることによって精製される、項４４～５０のいずれか１項に記載の方法。
５３． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質がＦｃ断片に連結されており、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をＦｃ断片を介してプロテインＡ又はプロテインＧに結合させ、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をプロテインＡ又はプロテインＧから放出させることによって精製される、項４４～５０のいずれか１項に記載の方法。

【実施例】

【0108】

以下の実施例は、本発明を例示的な様式でさらに説明する。本発明は以下に記載されるような実施例のいずれかに限定されるものではないことを理解されたい。当業者には、これらの実施例の性能、結果、及び所見が本発明の全体的な記載に照らしてより広い意味で適合及び適用され得ることが理解される。

【0109】

（実施例１）
６Ｂ８エピトープに基づくＢ／Ｃドメインスワッピングを用いた組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現のための構築物の構築
１．１ スワッピングのためのＥ２タンパク質のＢ／Ｃドメイン又はＢ／Ｃドメインの断片
６Ｂ８エピトープに基づくＢ／Ｃドメインスワッピングを用いて組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現のための構築物を調製するために、ＣＳＦＶ以外の７つのペスチウイルス株を、スワッピングのためのＥ２タンパク質のＢ／Ｃドメイン又はＢ／Ｃドメインの断片のアミノ酸配列を提供するための、Ernst Peterhansの刊行物（図１、Peterhans, et al., Cytopathic bovine viral diarrhea viruses (BVDV): emerging pestiviruses doomed to extinction. Vet. Res. Vol. 41(6)からの改訂版）に基づいて選択し、７つのペスチウイルス株は、以下の通りであった：
－ トナカイＶ６０（ウイルス株のポリタンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＡＡＦ０２５２４．２であり；ウイルス株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２２によって示される）、
－ チュニジアヒツジウイルス９５５２（ＴＳＶ９５５２）（ウイルス株のポリタンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＡＡＲ２４３７５．１であり；ウイルス株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２５によって示される）、
－ ＰＧ２（ウイルス株のポリタンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＡＨＷ５７６１０．１であり；ウイルス株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２１によって示される）、
－ Ｈｏｂｉ様Ｔｈ／０４ ＫｈｏｎＫａｅｎ（以下、「Ｈｏｂｉ様」と名付けられた）（ウイルス株のポリタンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＡＣＭ７９９３４．１であり；ウイルス株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２６によって示される）、
－ バンゴーワンナ６７７８（以下、「バンゴーワンナ」と名付けられた）（ウイルス株のポリタンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＡＢＫ５８６３９．１であり；ウイルス株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２４によって示される）；及び
－ ノルウェーラットＮｒＰＶ／ＮＹＣ－Ｄ２３（以下、「ノルウェーラット」と名付けられた）（ウイルス株のポリタンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＹＰ＿００９１０９５６７であり；ウイルス株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２３によって示される）。

【0110】

１．２ ６Ｂ８エピトープに基づくＢ／Ｃドメインスワッピングを用いた組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現のための構築物の構築
６Ｂ８エピトープに基づくＢ／Ｃドメインスワッピングを用いた組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、ＣＳＦＶ ＱＺ０７株からのＥ２タンパク質（配列番号１０）及びスワッピングのための実施例１．１で開示されたペスチウイルス株からのＥ２タンパク質のＢ／Ｃドメインの断片を含む。組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質はまた、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＣ末端にＦｃ断片（配列番号２０）を含んでいてもよいし、Ｆｃ断片とＥ２タンパク質との間にペプチドリンカー（配列番号１６）を含んでいてもよい。組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質はまた、ＫＡＲＤ変異を含んでいてもよい。図２に、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の構造を模式的に示した。

【0111】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸配列のそれぞれを、構築物としての対応するヌクレオチド配列の設計のために使用し（表８にそれぞれの構築物の名称を列挙した）、次いで設計されたヌクレオチド配列をコドンが最適化し、ＣＨＯ発現系（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の説明書に従って合成した。可溶性及び分泌型Ｅ２タンパク質を得るために、Ｅ２の最後の４３個のアミノ酸（ａａ）を、最終的な最適化された配列において欠失させ、一方でＥ１タンパク質からの最後の２１個のａａをシグナルペプチドとして付加した（配列番号１４）。それぞれ合成された配列をｐＣＤＮＡ３．４プラスミドにクローニングした。ＱＺ０７Ｅ２株の３３０アミノ酸の長さを有する野生型Ｅ２タンパク質を発現させるための構築物（ＱＺ０７Ｅ２－ＷＴ３３０ＦＣ）も構築した。

【0112】

表８に、スワッピングのためのアミノ酸配列の由来となるウイルス株の名称、スワッピングのためのアミノ酸配列、ウイルス株の元の６Ｂ８エピトープ、構築物の名称、及び構築物を設計するための組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸配列を列挙した。
スワッピングのためのアミノ酸配列に関して、表８に列挙されたそれらの位置の番号、例えば「１１～３９、１１～５６など」は、ＱＺ０７ ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）の位置の番号に基づいて決定される。例えば、「ＰＧ２ １１－３９」は、配列番号１０（ＱＺ０７ ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質）のアミノ酸１１位～３９位のアミノ酸配列を、ペアワイズ配列アライメントでＰＧ２株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列とアライメントし、次いで、ＰＧ２株のＥ２タンパク質の対応するアライメントされた配列を使用して、配列番号１０（ＱＺ０７ ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質）のアミノ酸１１位～３９位の配列をスワッピングすることを指す。

【0113】

構築物の名称に関して（構築物の類似の学術名は、類似の意味を有する）、例えば、
－ 「ＱＺ０７Ｅ２－ＰＧ２ １１－１１０キメラＦＣ」は、配列番号１０のアミノ酸１１位～１１０位（ＱＺ０７ ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質）のアミノ酸配列を、ＰＧ２株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列とペアワイズ配列アライメントでアライメントし、次いで、ＰＧ２株のＥ２タンパク質の対応するアライメントされた配列を使用して、配列番号１０のアミノ酸１１位～１１０位（すなわち「ＱＺ０７Ｅ２－ＰＧ２ １１－１１０キメラ」）の配列をスワッピングし、構築物の対応するヌクレオチド配列を設計するために得られた配列を使用することによって、構築物を設計したことを意味する。構築物はまた、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＣ末端にＦｃ断片をコードするヌクレオチド配列（配列番号２０）（すなわち「ＦＣ」）も含む。ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列及びシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列も構築物中に存在する。

【0114】

－ 「ＱＺ０７Ｅ２－ＰＧ２ １１－３９キメラ」は、配列番号１０のアミノ酸１１位～３９位（ＱＺ０７ ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質）のアミノ酸配列を、ＰＧ２株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列とペアワイズ配列アライメントでアライメントし、次いで、ＰＧ２株のＥ２タンパク質の対応するアライメントされた配列を使用して、配列番号１０のアミノ酸１１位～３９位（すなわち「ＱＺ０７Ｅ２－ＰＧ２ １１－３９キメラ」）の配列をスワッピングし、構築物の対応するヌクレオチド配列を設計するために得られた配列を使用することによって、構築物を設計したことを意味する。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列も構築物中に存在する。しかしながら、構築物はまた、Ｆｃ断片をコードするヌクレオチド配列及びペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を含まない。

【0115】

－ 「ＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－５６ ＫＡＲＤキメラＦＣ」は、配列番号１０のアミノ酸１１位～５６位（ＱＺ０７ ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質）のアミノ酸配列を、トナカイＶ６０株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列とペアワイズ配列アライメントでアライメントし、次いで、トナカイＶ６０株のＥ２タンパク質の対応するアライメントされた配列を使用して、配列番号１０のアミノ酸１１位～５６位（すなわち「ＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－５６キメラ」）の配列をスワッピングし、構築物の対応するヌクレオチド配列を設計するために得られた配列を使用することによって、構築物を設計したことを意味する。構築物はまた、ＫＡＲＤ変異（すなわち「ＫＡＲＤ」）にするヌクレオチド変異も含む。構築物はまた、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＣ末端にＦｃ断片をコードするヌクレオチド配列（配列番号２０）（すなわち「ＦＣ」）も含む。ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列及びシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列も構築物中に存在する。

【0116】

【表9】

【0117】

（実施例２）
ＣＨＯ細胞における組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のための構築物の発現
表８に列挙された構築物を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現のためのＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション及び培養を、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒからのＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系ガイドの説明書に従って実行した。最後に、細胞培養培地を、４℃で、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって回収し、上清を回収した。

【0118】

上清に含有される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の収量を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを使用することによって検出した。各上清からの９０μｌのサンプルを、３０μｌのローディング緩衝液と混合し、９５℃で１０分沸騰させ、遠心分離の後、１０μｌの各サンプルを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのウェルに分子量マーカーと共にローディングした。その後、以下のステップ：色素の先頭がゲルの底部に達するまで（約９０分）１５０Ｖでゲルを泳動するステップ、装置から泳動したゲルを除去するステップ、及び約２０ｍｌの染色溶液を添加することによって１つのゲルを小さいトレイに置くステップ、及び穏やかに振盪しながら６０分より長く染色するステップ、ゲルが視覚的に脱色するまで（２時間より長く）穏やかに振盪しながらＨ₂Ｏによって脱色するステップを実行した。ウェスタンブロットゲルの場合、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に移動させた後、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中の５％スキムミルク）を使用して、室温で１時間又は４℃で一晩、膜をブロックするステップ、次いでブロッキング緩衝液での一次抗体ＷＨ３０３（ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に結合することも可能な抗体）及び６Ｂ８の適切な希釈物と共に膜をインキュベートするステップ、それぞれ５分間のＰＢＳＴの３回の洗浄で膜を洗浄するステップ、ブロッキング緩衝液中の推奨された希釈率のコンジュゲートした二次抗体と共に膜を室温で１時間インキュベートするステップ、次いでそれぞれ５分間のＰＢＳＴの３回の洗浄で膜を洗浄するステップ、及びシグナル発生に供するステップ。

【0119】

さらなるウェスタンブロッティング実験、又はＤＩＶＡ及び効能評価のための候補として、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の１７種の上清をランダムに選択した。上清は、以下の構築物：ＱＺ０７Ｅ２－ＰＧ２ １１－３９キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＰＧ２ １１－５６キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－３８キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－５６キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－５６ ＫＡＲＤキメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－８０キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－１１０キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＴＳＶ１１－３８キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＴＳＶ９５５２ １１－３８ ＫＡＲＤキメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＴＳＶ９５５２ １１－５６キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＴＳＶ９５５２ １１－５６ ＫＡＲＤキメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＴＳＶ９５５２ １１－８０キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＴＳＶ９５５２ １１－１０９キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－３９キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－５６キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＦＣ、及びＱＺ０７Ｅ２－バンゴーワンナ１１－３８キメラＦＣの発現から調製されたものであった。構築物ＱＺ０７Ｅ２－ＷＴ３３０ＦＣの発現から調製された上清も調製し、さらなる試験に使用した。

【0120】

（実施例３）
６Ｂ８抗体結合の阻害に関する試験
この実施例の目的は、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＢ／Ｃドメインのスワッピング又は組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＢ／Ｃドメインのスワッピングが、ＫＡＲＤ変異と共に、６Ｂ８抗体の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質への結合ブロックできるかどうかをインビトロで評価することであった。
実施例２に列挙された上記の１７種の候補をウェスタンブロッティング実験に供して、ＤＩＶＡの主要な特徴である６Ｂ８抗体結合の阻害を決定した。ウェスタンブロッティング実験の詳細なステップは、実施例２を参照することができる。
全ての上清が、６Ｂ８抗体への抗体結合を示さなかったが、ＷＨ３０３抗体への結合は示した。図３Ａ及び３Ｂは、ＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－１１０キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－５６ ＫＡＲＤキメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＰＧ２ １１－５６キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＴＳＶ９５５２ １１－３８ ＫＡＲＤキメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－ＴＳＶ９５５２ １１－１０９キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－５６キメラＦＣ及びＱＺ０７Ｅ２－トナカイＶ６０ １１－８０キメラＦＣのウェスタンブロットの結果を示した。図３Ａ及び３Ｂからわかるように、図３Ａのレーン１～３及び図３Ｂのレーン２～６は、６Ｂ８抗体結合を示さなかった；図３Ｂのレーン１において、ＱＺ０７Ｅ２株の野生型Ｅ２タンパク質からの上清を添加したところ、６Ｂ８抗体結合が示される；レーン中の全てのバンドは、ＷＨ３０３抗体に結合することができ、これは、全てのタンパク質が十分発現され、存在していたことを意味する。これらのタンパク質と６Ｂ８抗体との反応性の無効化が、ＫＡＲＤ変異を含んでも、又は含まなくても、Ｂ／Ｃドメインのスワッピングによって直接引き起こされたことが実証された。

【0121】

（実施例４）
効能評価
この実施例の目的は、典型的な様式で実施例２の上清から調製された組成物を使用することによって、組換えＥ２タンパク質の効能を評価することであった。実施例３の８種の上清を候補としてランダムに選択した。
簡単に言えば、合計６０頭の市販の混合品種の２１±７日齢（３週齢）の子豚を、１１群に割り振った：
－ ５頭の子豚を含有する群１は、ＤＩＶＡの特徴なしのＥ２コントロールとして機能した；
－ 各群につき５頭の子豚を含有する群２～９は、効能評価のために使用された；
－ ５頭の子豚を含有する群１０は、チャレンジコントロールとして機能した；
－ ５頭の子豚を含有する群１１は、厳密な（ネガティブ）コントロールとして機能した。

【0122】

表９に、組換えＥ２タンパク質の各群の名称及び効能評価を列挙した。実施例２から調製された上清をそれぞれ、免疫原性組成物が調製されるようにＳｅｐｐｉｃ ＩＳＡ ２０６アジュバントと混合した。５５～６５μｇの未精製組換えＥ２タンパク質を、投与のための組成物の１用量（２ｍｌ）に含有させ、これをこのような実験で使用した。組成物中において、上清に含有される組換えＥ２タンパク質とＳｅｐｐｉｃ ＩＳＡ ２０６アジュバントとの質量比は、約１：１である。

【表10】

【0123】

０日目に、群１～９の子豚にそれぞれ、子豚１頭当たり２ｍＬのＳｅｐｐｉｃ ＩＳＡ ２０６アジュバントを含む組成物を接種した（ＩＭ）。０日目に、群１０に、チャレンジコントロールとして機能する２ｍＬのＰＢＳ＋アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡ ２０６）を接種した（ＩＭ）。２１日目に、群１～１０の子豚に、感染性ＣＳＦＶシメン（Ｓｈｉｍｅｎ）株（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって提供された）を１０⁵ＭＬＤ／ｍＬ以上の用量で接種した（ＩＭ）。全ての子豚は臨床的に健康であり、０日目に、ＣＳＦＶ及びＰＲＲＳＶ抗体を有しておらず、ＢＶＤＶ、ＰＲＶを含む抗原を有していなかった。全ての子豚が、免疫化の時点で健康であった。

【0124】

血清サンプルを、－０日目から開始して７日毎に回収した。２１、２４、２８、３１及び３７日目に（チャレンジ後０、３、７、１０、１６日目（ＤＰＣ））、全ての子豚の全血サンプルを回収した。ワクチン効能を決定するための主要なパラメーターは死亡率であった。死亡率は、重度の典型的な豚熱（ＣＳＦ）感染症に関連する。
以下の表１０で示されるように、チャレンジコントロール群（群１０）において子豚は全て死亡した。群４、５及び８について、それらは全て２０％の死亡率を示したが、それでもなおチャレンジ群よりかなり優れており、他の群は全てシメン株チャレンジに対して１００％の死亡からの保護を示した。結果から、他のペスチウイルスからの対応する断片での置き換え及び組換えＥ２タンパク質におけるアミノ酸変異の組み込みは、ワクチン効能に影響を与えなかったことが示された。したがって、全てのワクチン候補がワクチン効能を示した。

【0125】

以下の表１０に、全ての候補の効能評価の結果を要約した。

【表11】

【0126】

（実施例５）
免疫応答評価
この実施例において、表９の構築物から調製された組換えＥ２タンパク質（群２～９）を免疫応答評価に供した。これらの組換えＥ２タンパク質の免疫原性組成物の調製方法及び子豚の群分けや免疫化の投薬量などを含むそれに続く実験設計は、実施例４に記載された方法と同じであった。群１～１０の子豚を、２１日目に、１０⁵ＭＬＤ／ｍＬ以上の用量で、感染性ＣＳＦＶシメン株（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって提供された）を接種すること（ＩＭ）によってチャレンジした。
血清サンプルを、０日目から開始してチャレンジ後１６日目（ＤＰＣ１６）までに、７日毎に回収した。ワクチン接種後の抗体応答を評価するための主要なパラメーターは、ワクチン接種された子豚の抗体レベルを反映する抗体ブロック率であった。抗体ブロック率の値を、ＩＤＥＸＸ ＣＳＦＶ Ａｂ ＥＬＩＳＡアッセイキット（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ）のプロトコールに従って決定した。

【0127】

表１１は、異なる日における各群のワクチン接種された子豚の平均抗体ブロック率（％）を示す。

【表12】

【0128】

表１１で示されるように、２つのコントロール群１０～１１を除いて、１４日目に、ワクチン接種された群１～９の抗体ブロック率は陽性になり始め（ブロック率＞４０％、これは、大量の抗体が血清サンプル中に存在することを意味する）、次いで２１日目まで急速に上昇し、ＤＰＣ７に、ワクチン接種された群１～９の抗体ブロック率はピーク値に達した。さらに、ワクチン接種された群２～９の抗体ブロック率は、ＤＰＣ７からＤＰＣ１６にかけてワクチン接種された群１の抗体ブロック率と同等であった。これらの結果から、表９に列挙された構築物から調製された組換えＥ２タンパク質は、ワクチン接種された子豚において抗体応答をうまく惹起し、他のペスチウイルスからの対応する断片での置き換え、及びアミノ酸変異の組み込みは、ワクチンの免疫原性に影響を与えなかったことが示された。

【0129】

（実施例６）
インビボでのＤＩＶＡ試験
この実施例において、表９の構築物から調製された組換えＥ２タンパク質（群２～９）は、インビボでのＤＩＶＡ試験に供された。これらの組換えＥ２タンパク質の免疫原性組成物の調製方法及び子豚の群分けや免疫化の投薬量などを含むそれに続く実験設計は、実施例４に記載された方法と同じであった。群１～１０の子豚を、２１日目に、１０⁵ＭＬＤ／ｍＬ以上の用量で、感染性ＣＳＦＶシメン株（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって提供された）を接種すること（ＩＭ）によってチャレンジした。ＤＩＶＡ試験のために、２１日目（Ｄ２１）及びチャレンジ後１６日目（ＤＰＣ１６）に血清サンプルを回収した。

【0130】

血清サンプルを二重競合ＥＬＩＳＡ（ｄｃＥＬＩＳＡ）方法に供して、ＤＩＶＡマーカーとして使用された６Ｂ８抗体に対する抗体応答を検出した。ｄｃＥＬＩＳＡ方法を、Bruderer U., J Immunol Methods. 2015 May; 420:18-23に従って実行し、６Ｂ８モノクローナル抗体を、ｄｃＥＬＩＳＡ方法において競合抗体として使用した。ワクチン接種された子豚の抗体レベルを評価するための値は、抗体ブロック率であり、これは、各群につきＯＤ４５０で血清サンプル及び厳密なコントロールの平均吸光度値を測定し、次いで厳密なコントロールのＯＤ４５０値と血清サンプルのＯＤ４５０値との間の差の値を厳密なコントロールのＯＤ４５０値で割ることによって、抗体ブロック率を計算することによって得られた。試験血清サンプルは、＞３０％のブロックのパーセンテージを示す場合、陽性である（６Ｂ８抗体が存在する）。試験血清サンプルは、≦３０％のブロックのパーセンテージを示す場合、陰性である（６Ｂ８抗体は存在しない）。

【0131】

表１２は、Ｄ２１及びＤＰＣ１６における各群のワクチン接種された子豚の平均抗体ブロック率（％）を示す。

【表13】

表１２で示されるように、群１を除いて、ワクチン接種された群２～９の６Ｂ８抗体ブロック率は、ワクチン接種後のＤ２１に陰性であり、ＤＰＣ１６に、全ての群１～９の６Ｂ８抗体ブロック率は陽性になり始めた。これらの結果から、他のペスチウイルスからのキメラＥ２断片を含む組換えＥ２タンパク質は、ＤＩＶＡ能力を有し、アミノ酸変異のさらなる組み込みは、ＤＩＶＡ能力を確実にできることが示された。したがって、表９に列挙された構築物から調製された組換えＥ２タンパク質は、ＤＩＶＡ能力を有する。

【0132】

（実施例７）
Ｅ２タンパク質における６Ｂ８結合に関する重要なアミノ酸位置の同定
ＷＯ２０２０２１１８０２Ａにおいて（ＷＯ２０２０２１１８０２Ａの全体の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる）、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質におけるアミノ酸１４位、２２位、２４位、及び２４／２５位は、６Ｂ８モノクローナル抗体の結合にとって重要であるとしてすでに同定されている。具体的には、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位におけるＥ又はＧのＲ又はＫへの置換、アミノ酸２４位におけるＥ又はＧのＲ又はＫへの置換、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸２５位におけるＧのＤへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位におけるＳのＫ、Ｑ又はＲへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸２２位におけるＧのＡ、Ｒ、Ｑ、又はＥへの置換は、６Ｂ８抗体のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質への結合を特異的に阻害すると実証された。
以下の実施例は、Ｅ２タンパク質における６Ｂ８結合に関する追加の重要なアミノ酸位置を同定するためである。
この実施例において、Ｅ２におけるアミノ酸１０位、４１位及び６４位が、６Ｂ８ ｍＡｂ結合に関する追加の重要な位置としてさらに同定された。

【0133】

変異ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質は、それぞれＹ１０Ａ、Ｙ１０Ｐ、Ｄ４１Ａ、Ｄ４１Ｎ、Ｄ４１Ｅ、Ｒ６４Ａ、Ｒ６４Ｓ、又はＲ６４Ｅ（それぞれ配列番号７９～８６に示されるアミノ酸配列；コドン最適化されたコード配列がそれぞれ配列番号８７～９４に示される）を含有する。変異を有さないＱＺ０７－Ｅ２タンパク質のコドン最適化されたコード配列は、配列番号９５に示されていた。それぞれのコドン最適化された配列を合成し、次いでＢａｍＨ Ｉ及びＥｃｏＲ ＩによってｐＶＬ１３９３シャトルプラスミドにクローニングして、さらなるコトランスフェクションのためのｐＶＬ１３９３－シャトルプラスミドを完成させた。可溶性及び分泌型Ｅ２タンパク質を得るために、最終的な配列においてＥ２の最後の４２個のアミノ酸を欠失させ、一方でシグナルペプチドとしてＥ１タンパク質からの最後の１６個のアミノ酸を付加した。タンパク質のさらなる発現のために、ＣＨＯ発現系（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用した。６Ｂ８ ｍＡｂの、変異６Ｂ８エピトープを有する変異ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質への結合を決定するための免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｌｕｏｓｃｅｎｔ）アッセイ（ＩＦＡ）。変異ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質を構築し発現させる詳細な方法、加えてＩＦＡ試験は、ＷＯ２０２０２１１８０２Ａを参照することができる。

【0134】

結果は図４に示され、結果は、置換Ｙ１０Ａ、Ｙ１０Ｐ、Ｄ４１Ａ、Ｄ４１Ｎ、Ｄ４１Ｅ、Ｒ６４Ａ、Ｒ６４Ｓ、及びＲ６４Ｅがそれぞれ、６Ｂ８ ｍＡｂ結合を阻害できることを示す。Ｙ１０Ａ、Ｙ１０Ｐ、Ｄ４１Ａ、Ｄ４１Ｎ、Ｄ４１Ｅ、Ｒ６４Ａ、Ｒ６４Ｓ、又はＲ６４Ｅを含む変異体ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質の発現を、ウェスタンブロッティングによって検出した。結果は図５に示され、結果は、変異Ｒ６４Ａ及びＲ６４Ｓが、ＣＨＯ細胞系においてタンパク質の発現分泌にわずかしか影響しないことを示す。

【0135】

（実施例８）
Ｅ２タンパク質における６Ｂ８結合を阻害するための追加のアミノ酸変異の同定
この実施例において、Ｅ２におけるアミノ酸１４位、２２位、２４位、２５位及び６４位におけるさらなる変異が、６Ｂ８ ｍＡｂ結合を阻害することに関して追加で重要であるとして同定された。
１４位、２２位、２４位、２５位及び６４位に様々な変異を含有する変異ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質をそれぞれ設計し、変異ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質の対応するコード配列をコドンが最適化し、ＣＨＯ発現系（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の説明書に従って合成した。可溶性及び分泌型Ｅ２タンパク質を得るために、Ｅ２の最後の４３個のアミノ酸を、最終的な最適化された配列において欠失させ、一方でＥ１タンパク質からの最後の２１個のアミノ酸をシグナルペプチドとして付加した。変異ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質のさらなる発現のために、ＣＨＯ発現系（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用した。変異ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質を構築し発現させる詳細な方法は、上記の実施例１及びＷＯ２０２０２１１８０２Ａの実施例１～３に従った。

【0136】

変異体ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－Ｒ６４Ｄ、変異体ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－Ｒ６４Ｈ、変異体ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－Ｒ６４Ｔ、変異体ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－Ｒ６４Ｇ、変異体ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－Ｒ６４Ｋを含む一部の変異体を、タンパク質発現を増強するために変異体Ｅ２のＣ末端をＦｃ断片にさらに連結することによって調製した。ペプチドリンカーも、Ｅ２タンパク質とＦｃ断片との間に付加した。変異ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃタンパク質のコドン最適化された配列を、ｐＣＤＮＡ３．４プラスミドにクローニングした。

【0137】

組換えｐＣＤＮＡ３．４プラスミドのトランスフェクション及び培養もまた、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒからのＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系ガイドの説明書に従ってなされた。
トランスフェクションの前日（－１日目）、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）培養物を、３×１０⁶～４×１０⁶生存細胞／ｍＬの最終密度に分割し、細胞の一晩増殖を可能にした。トランスフェクションの当日（０日目）に、生存細胞密度及び生存率を決定した。細胞が約７×１０⁶～１０×１０⁶生存細胞／ｍＬの密度に達し、生存率が９５～９９％だったら、細胞を、新鮮なＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地で６×１０⁶生存細胞／ｍＬの最終密度に希釈した。フラスコを穏やかに回旋させて細胞を混合した。冷却試薬（４℃）を使用してＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を調製した。試薬を単に冷蔵庫から取り出し、ＤＮＡ複合体形成を開始させた。以下のステップが含まれていた：ａ）ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬ボトルを４～５回を穏やかに逆さにして混合するステップ、ｂ）プラスミドＤＮＡを冷却ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈し、チューブを回旋させることによって及び／又は逆さにすることによって混合するステップ、ｃ）ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬をＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈し、チューブを回旋させることによって及び／又は逆さにすることによって又は２～３回穏やかにピペッティングすることによって混合し、チューブを回旋させることによって又は逆さにすることによって混合し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体（ステップｄからの）を室温で１～５分間インキュベートし、次いで溶液をゆっくりとシェーカーフラスコに移し、添加中はフラスコを穏やかに旋回させるステップ。１日目、トランスフェクションの翌日（１日目、トランスフェクションの１８～２２時間後）、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサー及びＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄをフラスコに添加し（ガイドに従った容積を添加）、続いて添加中はフラスコを穏やかに回旋させた。フラスコを、空気中５％ＣＯ₂の加湿雰囲気を有する３２℃インキュベーターに移し、振盪しながら６～１０日間培養した。細胞培養培地を、４℃にて１５分間４０００ｒｐｍで遠心分離することによって回収した。

【0138】

変異ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃタンパク質の精製を、それぞれＴｈｅｒｍｏからのプロテインＡアガロースを使用することによって実行した。精製溶液は、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）を含む。精製プロセスは、以下のステップを含む：プロテインアガロース及び全ての緩衝液を室温に平衡化するステップ；カラムに付属の使用説明書に従って、カラムに、０．５ｍｌ（６４位の変異などのＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ変異のため）の樹脂スラリーを慎重に充填するステップ；５ｍｌの結合緩衝液を添加することによってカラムを平衡化し、溶液がカラムから排出されることを可能にするステップ；サンプルをプロテインＡカラムにアプライする前に結合緩衝液で１：２に希釈して、最適な結合のために適正なイオン強度及びｐＨを維持するステップ；希釈したサンプルをカラムにアプライし、サンプルが樹脂へと完全に流れ込むことを可能にするステップ；１０ｍｌの結合緩衝液でプロテインＡカラムを洗浄するステップ；５ｍＬの溶出緩衝液で抗体を溶出し、画分を回収するステップ；１００μｌの中和緩衝液を１ｍｌの溶出物に添加することによって、溶出画分を生理学的ｐＨへと直ちに調整するステップ；溶出物を遠心分離フィルターに移し、６ｍｌのＰＢＳを添加するステップ；チューブを１５分間４０００ｒｐｍで遠心分離するステップ；１０ｍｌのＰＢＳを使用してチューブを洗浄するステップ；遠心分離ステップを繰り返して、サンプルを１～２ｍｌに濃縮するステップ；Ｑｕｂｉｔキットを使用して、精製緩衝液交換サンプルを測定するステップ；並びにＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析によって産物を確認するステップ。

【0139】

変異ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質及び変異ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃタンパク質の精製生成物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析によって確認した。結果は図６～１０に示される。
アミノ酸２２位の場合、Ｇ２２Ａ、Ｇ２２Ｑ、Ｇ２２Ｄ、Ｇ２２Ｅ、Ｇ２２Ｎ、及びＧ２２Ｓが、収量及びｍＡｂ ６Ｂ８との反応性の両方の点で置換候補であり得る。
アミノ酸２４位の場合、Ｇ２４Ｒは、依然としてｍＡｂ ６Ｂ８との弱い反応性を示し、Ｇ２４Ｄ及びＧ２４Ｉ変異体は、ｍＡｂ ６Ｂ８と反応することができないが、収量が低い。

【0140】

アミノ酸２５位の場合、Ｇ２５Ｄ、Ｇ２５Ｋ、Ｇ２５Ｌ、Ｇ２５Ｎ、Ｇ２５Ｒ、Ｇ２５Ｔ、及びＧ２５Ｖが、収量及びｍＡｂ ６Ｂ８との反応性の両方の点で置換候補であり得る。
アミノ酸６４位の場合、Ｒ６４Ａ、Ｒ６４Ｋ、及びＲ６４Ｗが、収量及びｍＡｂ ６Ｂ８との反応性の点で変異体候補である。
アミノ酸１４位について、Ｓ１４Ａ、Ｓ１４Ｑ、Ｓ１４Ｒ、Ｓ１４Ｅは、非常に弱いｍＡｂ ６Ｂ８との反応性を示したことから、これらの変異は、収量とｍＡｂ ６Ｂ８との反応性の両方に関して好適な候補置換である。ｍＡｂ ６Ｂ８との非常に弱い反応性は、ｍＡｂ ６Ｂ８陽性の反応性とｍＡｂ ６Ｂ８陰性の反応性とを明確に区別して、カットオフ値を定義することを可能にする。

【0141】

（実施例９）
Ｂ／Ｃドメインスワッピング及び１つの単一の変異を有する組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現のための追加の構築物の構築及び発現
この実施例において、実施例１及び２に記載された方法に従って、６つの追加の構築物を調製し、次いでＣＨＯ細胞において発現させた。構築物は、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＥ１４Ｋ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＲ６４Ｋ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＴ２４Ｒ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＧ２５Ｄ ＦＣ、ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＧ２５Ｎ ＦＣ、及びＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＧ２５Ｒ ＦＣと名付けられた。

【0142】

配列番号１０のアミノ酸１１位～１０９位（ＱＺ０７ ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質）のアミノ酸配列を、Ｈｏｂｉ様株のＥ２タンパク質のアミノ酸配列とペアワイズ配列アライメントでアライメントし、次いで、Ｈｏｂｉ様株のＥ２タンパク質の対応するアライメントされた配列を使用して、配列番号１０のアミノ酸１１位～１０９位の配列をスワッピングし、得られたアミノ酸配列を使用して、構築物の対応するヌクレオチド配列を設計することによって、構築物ＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＥ１４Ｋ ＦＣを調製した。またＥ１４Ｋ変異をもたらすヌクレオチド変異も、構築物の対応するヌクレオチド配列に導入した。またＦｃ断片をコードするヌクレオチド配列（配列番号２０）、及びペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）、及びシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）も構築物に付加した。他の構築物を同じ方法で調製した。
これらの構築物によって発現された組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、実施例７～８において６Ｂ８ ｍＡｂ結合を阻害することにとって重要であると同定された位置にＢ／Ｃドメインスワッピング及び単一のアミノ酸変異を有する。実施例２に記載された方法に従って、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含有する上清を得て、回収した。

【0143】

図１１において、これらの構築物から発現された組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の構造を図式化した。組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を発現させるためのこれらの構築物のヌクレオチド配列、及び構築物から発現される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のアミノ酸配列（発現後にシグナルペプチドは除去された）を表１３に列挙した。

【表14】

【0144】

（実施例１０）
６Ｂ８抗体結合の阻害に関するインビトロでの試験
この実施例において、実施例９の６つの構築物の発現から調製された上清は、ＱＺ０７Ｅ２－ＷＴ３３０ＦＣ及びＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＦＣと共に、６Ｂ８抗体結合の阻害を決定するためにウェスタンブロッティング実験に供された。ウェスタンブロッティング実験は、実施例２～３に記載された方法に従って実行した。
図１２は、これらの構築物の発現から調製された上清のウェスタンブロットの結果を示す。図１２のレーン１～８に結合ブロットが存在していたことから（左の図）、構築物の全てから調製された上清がＷＨ３０３モノクローナル抗体と反応できることが示される。図１２のレーン１～７に結合ブロットは存在しなかったことから（右の図）、対応する構築物から調製された上清が６Ｂ８モノクローナル抗体と反応できないことが示される。これらの結果から、これらのタンパク質の６Ｂ８モノクローナル抗体との反応性の無効化は、Ｂ／Ｃドメインのスワッピング及び単一の変異によって直接的に引き起こされることが示され、これは、これらの構築物から発現される組換えＥ２タンパク質が、野生型野外株に感染した動物からのワクチン接種された動物の区別に使用できることを示唆する。

【0145】

（実施例１１）
免疫応答評価
この実施例において、表１３の構築物から調製された組換えＥ２タンパク質を、免疫応答評価に供した。２１±７日齢（３週齢）の合計３９頭の市販の混合品種の子豚（Ｒｕｇａｏ Ｂｏｙｉ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、ＮａｎＴｏｎｇ、Ｃｈｉｎａより）を９群に割り振った：
－ 各群につき５頭の子豚を含有する群１～７を免疫応答評価に使用した；
－ ２頭の子豚を含有する群８は、ＤＩＶＡの特徴なしのＥ２コントロールとして機能した；
－ ２頭の子豚を含有する群９は、厳密な（ネガティブ）コントロールとして機能した。

【0146】

実施例８の６つの構築物の発現から調製された上清を、ＱＺ０７Ｅ２－ＷＴ３３０ＦＣ及びＱＺ０７Ｅ２－Ｈｏｂｉ様１１－１０９キメラＦＣと共に、免疫原性組成物が調製されるように、Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡ ２０６アジュバントとそれぞれ混合した。免疫原性組成物のそれぞれにおいて、上清に含有される組換えＥ２タンパク質と、Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡ ２０６アジュバントとの質量比は、約１：１である。各子豚に免疫原性組成物（２ｍｌ）の１つの用量を投与した。表１４に、免疫原性組成物の１つの用量に含有される組換えＥ２タンパク質の量を列挙した。

【表15】

０日目に、群１～８の各子豚に、２ｍＬの組成物を接種した（ＩＭ）。０日目に、群９に、２ｍＬのＰＢＳ＋アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡ ２０６）を接種し（ＩＭ）、厳密なコントロールとして機能させた。２１日目に、群１～９の子豚を、０日目に使用したのと同じ抗原でブーストした。全ての子豚は臨床的に健康であり、０日目に、ＣＳＦＶ及びＰＲＲＳＶ抗体を有しておらず、ＢＶＤＶ、ＰＲＶを含む抗原を有していなかった。全ての子豚が、免疫化の時点で健康であった。

【0147】

血清サンプルを、０日目から開始して５６日目までに、７日毎に回収した。ワクチン接種後の抗体応答を評価するための主要なパラメーターを、ワクチン接種された子豚の抗体レベルを反映する抗体ブロック率と称した。抗体ブロック率の値を、ＩＤＥＸＸ ＣＳＦＶ Ａｂ ＥＬＩＳＡアッセイキット（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ）のプロトコールに従って決定した。

【0148】

表１５は、異なる日における各群のワクチン接種された子豚の平均抗体ブロック率（％）を示す。表１５に示されるように、コントロール群９を除いて、２１日目に、ワクチン接種された群１～８の抗体ブロック率は、陽性になり始め（ブロック率＞４０％）、ブースト免疫化の後、ワクチン接種された群１～８の抗体ブロック率は連続的に増加し、次いでピーク値に達した。さらに、２１日目から５６日目まで、ワクチン接種された群１～７の抗体ブロック率は、ワクチン接種された群８の抗体ブロック率と同等であった。これらの結果から、他のペスチウイルスからの対応する断片での置き換え、及びアミノ酸変異の組み込みは、ワクチンの免疫原性に影響を与えず、構築物から調製された組換えＥ２タンパク質は、ワクチン接種された子豚において良好な抗体応答をうまく惹起したことが示された。

【0149】

【表16】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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【国際調査報告】