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▶ リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-28
(54)【発明の名称】第ＸＩ因子Ａ２ドメイン結合抗体及びそれらの使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/36 20060101AFI20241018BHJP
C12N 15/06 20060101ALI20241018BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241018BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241018BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241018BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241018BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241018BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20241018BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241018BHJP
A61P 9/06 20060101ALI20241018BHJP
【ＦＩ】
C07K16/36 ZNA
C12N15/06 100
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P7/02
A61P43/00 111
A61P9/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024523663
(86)(22)【出願日】2022-10-21
(85)【翻訳文提出日】2024-05-20
(86)【国際出願番号】 US2022078530
(87)【国際公開番号】W WO2023070097
(87)【国際公開日】2023-04-27
(31)【優先権主張番号】63/270,629
(32)【優先日】2021-10-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】597160510
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】チャロソーン， ダン
(72)【発明者】
【氏名】モートン， ローリ
(72)【発明者】
【氏名】ライ， ケーディー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA43
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085CC01
4C085CC08
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA24
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）のＡ２ドメインに結合する抗体、及びそれらを使用する方法を提供する。ある特定の実施形態によれば、抗体は、ＰＴに影響を与えることなくａＰＴＴを延長する効果によって示されるように、止血に影響を与えることなく、内因性経路を介した血餅形成を阻害するアンタゴニスト抗体である。したがって、これらのアンタゴニスト抗体は、限定されないが、心房細動などのリスク因子として血餅形成を有する血液凝固疾患若しくは障害、又は治療レジメンを治療するために使用され得る。ある特定の実施形態では、本開示は、ＦＸＩに結合し、血餅形成又は血栓形成を媒介する抗体を含む。本開示の抗体は、完全ヒト非天然抗体であり得る。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）のａｐｐｌｅ ２（Ａ２）ドメインに結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片が、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、を含み、（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）前記ＬＣＤＲ２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、かつ
（ｆ）前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、又は
（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）前記ＬＣＤＲ２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、かつ
（ｆ）前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、単離された抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項2】
前記ＨＣＶＲが、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲが、配列番号１３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は前記ＨＣＶＲが、配列番号３１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲが、配列番号１３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記ＨＣＶＲが、配列番号３を含むアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲが、配列番号１３を含むアミノ酸配列を含むか、又は前記ＨＣＶＲが、配列番号３１を含むアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲが、配列番号１３を含むアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離された抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項4】
凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）のａｐｐｌｅ ２（Ａ２）ドメインに結合する単離された抗体、又はその抗原結合断片であって、前記抗体、又はその抗原結合断片が、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び配列番号１３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、又は
配列番号３１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び配列番号１３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、を含む、単離された抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項5】
前記ＨＣＶＲが、配列番号３を含むアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲが、配列番号１３を含むアミノ酸配列を含むか、又は前記ＨＣＶＲが、配列番号３１を含むアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲが、配列番号１３を含むアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の単離された抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項6】
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含むか、又は
（ａ）前記ＨＣＤＲ１が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２が、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）前記ＬＣＤＲ２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、かつ
（ｆ）前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１９のアミノ酸配列を含むことを含む、請求項４又は５に記載の単離された抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項7】
前記抗体又はその抗原結合断片が、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１，０００ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩに結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体、又は抗原結合断片。
【請求項8】
前記抗体又はその抗原結合断片が、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約８００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、又は約５０ｐＭ未満からなる群から選択されるＫＤでヒトＦＸＩに結合する、請求項７に記載の単離された抗体、又は抗原結合断片。
【請求項9】
前記抗体又はその抗原結合断片が、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１０分超、約６０分超、約５００分超、又は約１，０００分超からなる群から選択される解離半減期（ｔ１／２）を有するヒトＦＸＩに結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体、又は抗原結合断片。
【請求項10】
前記抗体又はその抗原結合断片が、約１０ｎＭ未満のＩＣ５０でヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）の活性化を阻害する、請求項１に記載の単離された抗体、又は抗原結合断片。
【請求項11】
前記抗体又はその抗原結合断片が、約４０ｐＭ未満のＩＣ５０でヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）の活性化を阻害する、先行請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体、又は抗原結合断片。
【請求項12】
前記抗体又はその抗原結合断片が、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を少なくとも２倍増加させる、先行請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体、又は抗原結合断片。
【請求項13】
前記抗体又はその抗原結合断片が、プロトロンビン時間（ＰＴ）を増加させない、請求項１２に記載の単離された抗体、又は抗原結合断片。
【請求項14】
前記抗体又はその抗原結合断片が、ＦＸＩａ媒介性トロンビン活性を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、又は５％～１５％阻害する、先行請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体、又は抗原結合断片。
【請求項15】
前記抗体又はその抗原結合断片が、１００ｎＭ以下、７５ｎＭ以下、又は５０ｎＭ以下の濃度のヒト血漿におけるａＰＴＴを、少なくとも２倍延長する、先行請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体、又は抗原結合断片。
【請求項16】
前記抗体又はその抗原結合断片が、ＰＴを延長しない、請求項１５に記載の単離された抗体、又は抗原結合断片。
【請求項17】
前記抗体又はその抗原結合断片が、外因性凝固経路を介したトロンビンの産生又は活性化に影響を与えることなく、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２５ｎＭ、又は少なくとも５０ｎＭの濃度のヒト血漿における内因性凝固経路を介したトロンビンの産生又は活性化を阻害する、先行請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項18】
結合について、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と競合する、単離された抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項19】
先行請求項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と同じエピトープに結合する、単離された抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項20】
先行請求項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含む、薬学的組成物。
【請求項21】
請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項22】
請求項２１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項23】
請求項２２に記載のベクター、又は請求項２１に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項24】
ＦＸＩによって媒介される生物学的活性を阻害するための方法であって、前記方法が、ＦＸＩ又はＦＸＩａを、生物学的有効量の、請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項２０に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項25】
前記生物学的活性が、血栓形成であり、血栓形成が、ＦＸＩを前記抗体又はその抗原結合断片と接触させることにより阻害される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記接触が、血漿におけるａＰＴＴの延長又はトロンビン活性の低減をもたらす、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
対象において、ＦＸＩの活性若しくは発現に関連する疾患若しくは障害を治療若しくは予防するか、又はＦＸＩの活性若しくは発現に関連する前記疾患若しくは障害に関連する少なくとも１つの症状を回復させるための方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項２０に記載の薬学的組成物を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項28】
前記疾患又は障害が、血液凝固の疾患若しくは障害、又は前記対象において血栓形成のリスクの増加をもたらす疾患若しくは障害である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記疾患又は障害が、心房細動である、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／２７０，６２９号に対する優先権の利益を主張し、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に明確に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／２７０，６２９号に対する優先権の利益を主張し、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該ＸＭＬコピーは、２０２２年１０月１９日に作成され、１１８００３－０１０２０．ＸＭＬという名称で、４５，４３７バイトのサイズである。
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該ＸＭＬコピーは、２０２２年１０月１９日に作成され、１１８００３－０１０２０．ＸＭＬという名称で、４５，４３７バイトのサイズである。
【0003】
本開示は、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）のａｐｐｌｅ ２（Ａ２）ドメインに結合する抗体、これらの抗体を含む組成物、及びそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【0004】
血餅（すなわち、血栓）の形成は、（ａ）接触経路又は（ｂ）外因性経路のいずれかを通して開始される。両方の経路は、（ｃ）可溶性フィブリノーゲンをフィブリンの不溶性鎖に変換するためのセリンプロテアーゼとして作用するトロンビンを活性化するための共通経路を通して収束する。架橋フィブリンタンパク質は、凝集した血小板及び赤血球と共に、血餅の主要な構成成分である。
【0005】
外因性経路は、血管損傷における止血を緩和する。ここで、曝露された組織因子（ＴＦ）は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）を活性化して、ＦＶＩＩａ－ＴＦ複合体を形成し、これは、共通経路で第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化して、トロンビン及びその後の血餅形成を生成するプロトロンビナーゼを生成する。
【0006】
接触経路は、止血にあまり関与しないが、それでも血餅形成に影響を及ぼすという点で、外因性経路とは異なる。ここで、凝固は、血小板からのポリリン酸塩の放出、又は第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）を活性化する好中球からのヒストン及びＤＮＡを含む好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の押し出しなどの内因性の事象によって開始される。活性化されたＦＸＩＩ（すなわち、ＦＸＩＩａ）は、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）を更に活性化してＦＸＩａを形成し、これは共通経路を介してトロンビンの生成をもたらす。トロンビン及び血小板産生ポリリン酸塩はまた、ＦＸＩをフィードフォワード様式で活性化して、血餅形成を増幅する。
【0007】
ＦＸＩは、ＦＩＸ活性化を介してトロンビン生成を維持する血漿プロテアーゼＦＸＩａの酵素原である。ＦＸＩは、１６０ｋＤａのジスルフィド結合ホモ二量体であり、各サブユニットは、Ｎ末端からＣ末端に、ａｐｐｌｅドメインＡ１～Ａ４、及び触媒ドメイン（ＣＤ）からなる。ジスルフィド結合は、各サブユニットのＡ４ドメイン間にある。ＦＸＩサブユニットは、Ａ４ドメインとＣＤドメインとの間に位置するＡｒｇ－Ｉｌｅ結合の一方又は両方の切断によって活性化されて、ＦＸＩａを形成する。一般に、Ａｒｇ－Ｉｌｅ結合の切断は、ＦＸＩＩａ及び／又はトロンビンによって触媒されると考えられる。
【発明の概要】
【0008】
本明細書では、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）のＡ２ドメインに結合する、例えば、特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体及びその抗原結合断片が提供される。本明細書に開示される実施形態のいずれかでは、抗体又はその抗原結合断片は、ＦＸＩのＡ２ドメインに特異的に結合し得る。本開示の単離された抗体及び抗原結合断片は、ＦＸＩの活性又は発現に関連する疾患及び障害を治療するのに有用である。
【0009】
その最も広い態様では、本開示は、ＦＸＩの活性又は活性化を遮断し、血餅形成を低減する抗ＦＸＩ抗体を提供する。これらの抗体は、血流又は組織における血餅形成を予防する、治療する、その発生を低減する、又はその悪影響を低減することを必要とする患者において、それらを行うために使用され得る。好ましくは、抗ＦＸＩ抗体は、止血を妨げることなく血栓症を減弱する。
【0010】
ある特定の実施形態では、抗ＦＸＩ抗体は、疾患の治療が抗凝固療法の使用を伴い、抗凝固療法の使用に起因して患者に出血のリスクがある様々な血液凝固障害又は疾患を治療するのに有用であり得る。これらの適応症、障害、又は疾患には、高リスク心房細動、原発性静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）予防、拡張ＶＴＥ治療、急性冠動脈症候群後の再発性虚血の予防、末期腎疾患、医療機器（例えば、機械的心臓弁、心室補助装置、小口径グラフト、中心静脈カテーテルなど）、体外回路などが含まれる。
【0011】
本開示の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であり得るか、又は抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又はｓｃＦｖ断片）のみを含み得、機能性に影響を与えるように修飾され得、例えば、残存エフェクター機能を排除するように修飾され得る（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５－１９３３）。
【0012】
本開示の例示的な抗ＦＸＩ抗体を、本明細書の表１に列挙する。表１は、例示的な抗ＦＸＩ抗体の例示的な重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）、及び軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子及び核酸配列識別子を示す。表１は、例示的な抗ＦＸＩ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の核酸配列識別子も記載する。
【0013】
本開示は、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0014】
本開示はまた、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0015】
本開示はまた、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかと対になっている表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含む、ＨＣＶＲとＬＣＶＲとのアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態によれば、本開示は、表１に列挙された例示的な抗ＦＸＩ抗体のうちのいずれかに含まれるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0016】
したがって、第１の態様では、本開示は、血清凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供し、抗体又はその抗原結合断片は、表１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）、又はそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、表１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）、又はそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、を含む。
【0017】
一実施形態では、抗ＦＸＩ抗体又はその抗原結合断片は、以下からなる群から選択される１つ以上の特性を示す。
（ａ）アンタゴニスト抗体である、
（ｂ）２５℃又は３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約３５ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩに結合する、
（ｃ）２５℃又は３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約７６５ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩａに結合する、
（ｄ）２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１，０００分超の解離半減期（ｔ１／２）を有するヒトＦＸＩに結合する、
（ｅ）２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約２３分超の解離半減期（ｔ１／２）を有するヒトＦＸＩａに結合する、
（ｆ）約３９ｐＭ未満のＩＣ５０で、正常な希釈血漿におけるＦＸＩによる第Ｘａ因子（ＦＸａ）の活性化を少なくとも約８５％阻害する、
（ｇ）約１０ｎＭ未満のＩＣ５０で、正常な希釈血漿におけるＦＸＩａによる第Ｘａ因子（ＦＸａ）の活性化を少なくとも約２５％阻害する、
（ｈ）ラベルフリーバイオレイヤー干渉法によって決定されるとき、全長ＦＸＩ、ＰＫＡ１、ＰＫＡ３、及びＰＫＡ４に対して、ＰＫＡ２ドメイン（すなわち、ａｐｐｌｅドメイン２又はＡ２）に優先的に結合する、
（ｉ）ＦＸＩ ＰＫＡ２ドメイン内のエピトープに特異的に結合し、かつＦＸＩ ＰＫＡ２ドメインと重複する抗体と、ＦＸＩへの結合について競合する、
（ｊ）外因性凝固時間の尺度であるプロトロンビン時間（ＰＴ）に測定可能な影響を与えることなく、インビボで、霊長類において、内因性凝固時間の尺度である活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を少なくとも２倍に増加させる、
（ｋ）インビボで、霊長類において内因性経路ピークトロンビン活性を５％～１５％阻害する、
（ｌ）ＰＴを倍加することなく、約３３ｎＭ以下の濃度のインビトロでのヒト血漿におけるａＰＴＴを約２倍に延長する、かつ／又は
ｍ）約３１ｎＭ以上の濃度でインビトロでのヒト血漿における内因性経路トロンビン産生を阻害し、最大約５００ｎＭの用量まで外因性経路トロンビン産生に影響を与えない。
（ａ）アンタゴニスト抗体である、
（ｂ）２５℃又は３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約３５ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩに結合する、
（ｃ）２５℃又は３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約７６５ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩａに結合する、
（ｄ）２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１，０００分超の解離半減期（ｔ１／２）を有するヒトＦＸＩに結合する、
（ｅ）２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約２３分超の解離半減期（ｔ１／２）を有するヒトＦＸＩａに結合する、
（ｆ）約３９ｐＭ未満のＩＣ５０で、正常な希釈血漿におけるＦＸＩによる第Ｘａ因子（ＦＸａ）の活性化を少なくとも約８５％阻害する、
（ｇ）約１０ｎＭ未満のＩＣ５０で、正常な希釈血漿におけるＦＸＩａによる第Ｘａ因子（ＦＸａ）の活性化を少なくとも約２５％阻害する、
（ｈ）ラベルフリーバイオレイヤー干渉法によって決定されるとき、全長ＦＸＩ、ＰＫＡ１、ＰＫＡ３、及びＰＫＡ４に対して、ＰＫＡ２ドメイン（すなわち、ａｐｐｌｅドメイン２又はＡ２）に優先的に結合する、
（ｉ）ＦＸＩ ＰＫＡ２ドメイン内のエピトープに特異的に結合し、かつＦＸＩ ＰＫＡ２ドメインと重複する抗体と、ＦＸＩへの結合について競合する、
（ｊ）外因性凝固時間の尺度であるプロトロンビン時間（ＰＴ）に測定可能な影響を与えることなく、インビボで、霊長類において、内因性凝固時間の尺度である活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を少なくとも２倍に増加させる、
（ｋ）インビボで、霊長類において内因性経路ピークトロンビン活性を５％～１５％阻害する、
（ｌ）ＰＴを倍加することなく、約３３ｎＭ以下の濃度のインビトロでのヒト血漿におけるａＰＴＴを約２倍に延長する、かつ／又は
ｍ）約３１ｎＭ以上の濃度でインビトロでのヒト血漿における内因性経路トロンビン産生を阻害し、最大約５００ｎＭの用量まで外因性経路トロンビン産生に影響を与えない。
【0018】
一実施形態では、本開示は、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）表１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、（ｂ）表１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む。
【0019】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３若しくは配列番号３１のＨＣＶＲ配列内に含まれる３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）、又はそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、配列番号１３のＬＣＶＲ配列内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）、又はそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、を含む。
【0020】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３又は配列番号３１のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
【0021】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを更に含む。
【0022】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３又は配列番号３１のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲと、を含む。
【0023】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３／１３又は配列番号３１／１３のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対のＣＤＲを含む。
【0024】
本開示はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ１アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0025】
本開示はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ２アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0026】
本開示はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0027】
本開示はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ１アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0028】
本開示はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ２アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0029】
本開示はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0030】
本開示はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかと対合される、表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかを含むＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態によれば、本開示は、表１に列挙された例示的な抗ＦＸＩ抗体のうちのいずれかに含まれるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号９／１９又は配列番号３７／１９である。
【0031】
本開示はまた、表１に列挙された例示的な抗ＦＸＩ抗体のうちのいずれかに含まれる６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む、ＦＸＩに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号５、７、９、１５、１７、及び１９、又は配列番号３３、３５、３７、１５、１７、及び１９である。
【0032】
ＨＣＶＲアミノ酸配列及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを特定するための方法及び技術は、当該技術分野で周知であり、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲアミノ酸配列及び／又はＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを特定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を特定するために使用することができる例示的な規則には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、及びＡｂＭ定義が含まれる。一般的に言えば、Ｋａｂａｔ定義は、配列多様性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔアプローチとＣｈｏｔｈｉａアプローチとの間の折衷である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。公開データベースは、抗体内のＣＤＲ配列を特定するためにも利用可能である。
【0033】
一実施形態では、本開示は、単離された抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、及び
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、を含む、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、及び
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、を含む、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0034】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５－７－９－１５－１７－１９の６つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む。
【0035】
一実施形態では、本開示は、単離された抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、及び
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、を含む、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、及び
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、を含む、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0036】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３３－３５－３７－１５－１７－１９の６つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む。
【0037】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、ＦＸＩへの結合について参照抗体と競合する抗体又はその抗原結合断片を含み、参照抗体は、ＦＸＩのＡｐｐｌｅ ２（Ａ２又はＰＫＡ２）に優先的に結合する。
【0038】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片を含み、参照抗体は、ＦＸＩのＡｐｐｌｅ ２（Ａ２又はＰＫＡ２）に優先的に結合する。
【0039】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１，０００ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩに結合する。
【0040】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約５００ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩに結合する。
【0041】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約２５０ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩに結合する。
【0042】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１００ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩに結合する。
【0043】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約５０ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩに結合する。
【0044】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約２５ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩに結合する。
【0045】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１０分超の解離半減期（ｔ１／２）を有するヒトＦＸＩに結合する。
【0046】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約２０分超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩに結合する。
【0047】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約６０分超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩに結合する。
【0048】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約２時間超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩに結合する。
【0049】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約５時間超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩに結合する。
【0050】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１０時間超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩに結合する。
【0051】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１５時間超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩに結合する。
【0052】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１６時間超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩに結合する。
【0053】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１，０００分超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩに結合する。
【0054】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１００ｎＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩａに結合する。
【0055】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１０ｎＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩａに結合する。
【0056】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１，０００ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩａに結合する。
【0057】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約５００ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩａに結合する。
【0058】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約５分超の解離半減期（ｔ１／２）を有するヒトＦＸＩａに結合する。
【0059】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１０分超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩａに結合する。
【0060】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１５分超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩに結合する。
【0061】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約２０分超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩａに結合する。
【0062】
一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約２５分超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩａに結合する。
【0063】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、約３９ｐＭ未満のＩＣ５０で、正常希釈血清におけるＦＸＩによる第Ｘａ因子（ＦＸａ）の活性化を少なくとも約８５％阻害する。
【0064】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、約１０ｎＭ未満のＩＣ５０で、正常希釈血清におけるＦＸＩａによる第Ｘａ因子（ＦＸａ）の活性化を少なくとも約２５％阻害する。
【0065】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、ラベルフリーバイオレイヤー干渉法によって決定されるとき、全長ＦＸＩ、ＰＫＡ１、ＰＫＡ３、及びＰＫＡ４に対して、ＰＫＡ２ドメイン（すなわち、ａｐｐｌｅドメイン２又はＡ２）に優先的に結合する、
【0066】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、ＦＸＩ ＰＫＡ２内のエピトープに特異的に結合し、ＦＸＩ ＰＫＡ２と重複する抗体と、ＦＸＩへの結合について競合する。
【0067】
一実施形態において、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、外因性凝固時間の尺度であるプロトロンビン時間（ＰＴ）に測定可能な影響を与えることなく、インビボで、霊長類において、内因性凝固時間の尺度である活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を少なくとも２倍増加させる。
【0068】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、インビボで、霊長類における内因性経路ピークトロンビン活性を、約５％～１５％、約１％～２０％、約０．５％～２５％、約３％～５％、約４％～６％、約５％～７％、約６％～８％、約７％～９％、約８％～１０％、約９％～１１％、約１０％～１２％、約１１％～１３％、約１２％～１４％、約１３％～１５％、約１４％～１６％、約１５％～１７％、約１６％～１８％、約１７％～１９％、又は約１８％～２０％阻害する。
【0069】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、約１００ｐＭ～１００ｎＭ、約１ｎＭ～５０ｎＭ、約５ｎＭ～４０ｎＭ、約１０ｎＭ～３５ｎＭ、６０ｎＭ以下、５５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３９ｎＭ以下、３８ｎＭ以下、３７ｎＭ以下、３６ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、３４ｎＭ以下、３３ｎＭ以下、３２ｎＭ以下、３１ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２５ｎＭ、又は２０ｎＭ以下の濃度で、インビトロでヒト血漿におけるａＰＴＴを約２倍に延長する。ここで、抗ＦＸＩは、ＰＴを倍加することなく、ａＰＴＴを約２倍に延長する。
【0070】
一実施形態では、ＦＸＩに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片は、約１０ｎＭ～１００ｎＭ、約１５ｎＭ～５００ｎＭ、約２０ｎＭ～６０ｎＭ、約２５ｎＭ～５０ｎＭ、２５ｎＭ以上、２６ｎＭ以上、２７ｎＭ以上、２８ｎＭ以上、２９ｎＭ以上、３０ｎＭ以上、３１ｎＭ以上、３２ｎＭ以上、３３ｎＭ以上、３４ｎＭ以上、３５ｎＭ以上、３６ｎＭ以上、３７ｎＭ以上、３８ｎＭ以上、３９ｎＭ以上、又は４０ｎＭ以上の濃度で、インビトロでヒト血漿における内因性経路トロンビン産生を阻害する。ここで、抗ＦＸＩは、最大約５００ｎＭの用量でも外因性経路トロンビン産生に対して効果なく、内因性経路トロンビン産生を阻害する。
【0071】
第２の態様では、本開示は、抗ＦＸＩ抗体又はその一部をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表１に列挙されたＨＣＶＲ核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【0072】
本開示はまた、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表１に列挙されたＬＣＶＲ核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【0073】
本開示はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ１アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表１に列挙されたＨＣＤＲ１核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0074】
本開示はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ２アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表１に列挙されたＨＣＤＲ２核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0075】
本開示はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表１に列挙されたＨＣＤＲ３核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0076】
本開示はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ１アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表１に列挙されたＬＣＤＲ１核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0077】
本開示はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ２アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表１に列挙されたＬＣＤＲ２核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0078】
本開示はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表１に列挙されたＬＣＤＲ３核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0079】
本開示はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列セットは、表１に列挙された例示的な抗ＦＸＩ抗体のうちのいずれかによって定義される通りである。
【0080】
本開示はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列セットは、表１に列挙された例示的な抗ＦＸＩ抗体のうちのいずれかによって定義される通りである。
【0081】
本開示はまた、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子を提供し、ＨＣＶＲは表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表１に列挙されたＨＣＶＲ核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列、及び表１に列挙されたＬＣＶＲ核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。本開示明のこの態様によるある特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードし、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、共に、表１に列挙された同じ抗ＦＸＩ抗体に由来する。
【0082】
第３の態様では、本開示は、抗ＦＸＩ抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組み換え発現ベクターを提供する。例えば、本開示は、上述の核酸分子のうちのいずれか、すなわち、表１に記載のＨＣＶＲ配列、ＬＣＶＲ配列、及び／又はＣＤＲ配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を含む、組換え発現ベクターを含む。また、そのようなベクターが導入されている宿主細胞、並びに抗体又は抗体断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって、及びそのように産生された抗体及び抗体断片を回収することによって、抗体又はその部分を産生する方法も本開示の範囲内に含まれる。
【0083】
本開示は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ＦＸＩ抗体を含む。いくつかの実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、又はオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠失している抗体は、例えば、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）機能を増加させるために有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照されたい）。他の用途において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
【0084】
第４の態様では、本開示は、ＦＸＩに特異的に結合する、本開示の少なくとも１つの抗体、又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物を提供する。
【0085】
関連する態様では、本開示は、抗ＦＸＩ抗体と第２の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＦＸＩ抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。第２の治療剤は、疾患又は障害の少なくとも１つの症状を緩和するのに有用であり得る。
【0086】
第５の態様では、本開示は、ＦＸＩによって媒介される生物学的活性を増強するための方法であって、ＦＸＩを、生物学的有効量の表１のアンタゴニスト抗ＦＸＩ抗体と接触させること、又はＦＸＩを、生物学的有効量の表１のアンタゴニスト抗ＦＸＩ抗体を含む薬学的組成物と接触させることを含む、方法を提供する。
【0087】
ある特定の実施形態では、生物学的活性は、血液凝固又は内因性凝固経路の結果としての血液凝固であり、外因性（すなわち、例えば、組織因子誘導）経路の結果としての血液凝固ではなく、血液凝固又は内因性凝固経路の結果としての血液凝固、及び外因性経路の結果としてではない血液凝固は、ＦＸＩ又はＦＸＩａとアンタゴニスト抗ＦＸＩ抗体との接触時に阻害されるか、又はそうでなければ低減される。
【0088】
第６の態様では、本開示は、本開示の抗ＦＸＩ抗体又は抗体の抗原結合部分を使用して、ＦＸＩ活性若しくは発現に関連する疾患若しくは障害、又は疾患若しくは障害に関連する少なくとも１つの症状を治療するための治療方法を提供する。本開示のこの態様による治療方法は、本開示の抗体又は抗体の抗原結合断片を含む治療有効量の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。治療される障害は、ＦＸＩを標的とすることによって、及び／又はＦＸＩ媒介血液凝固を不活性化することによって、改善、回復、阻止、又は予防される任意の疾患又は状態である。
【0089】
一実施形態では、本開示の抗ＦＸＩ抗体は、止血に悪影響を与えることなく、病理学的内因性凝固を治療する方法を提供し得る。一実施形態では、本開示の抗ＦＸＩ抗体は、第Ｖ因子ライデン、プロトロンビン遺伝子変異、凝固を阻止する天然タンパク質の欠乏（例えば、アンチトロンビン、プロテインＣ、及びプロテインＳ）、ホモシステインレベルの上昇、フィブリノーゲン又は機能不全フィブリノーゲンレベルの上昇（異常フィブリノーゲン血症）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び／又はＸＩのレベル上昇、プラズミノーゲン欠損症、プラズミノーゲン異常症、及びプラズミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ－１）レベルの上昇を含む異常な線溶系、心房細動、がん、タモキシフェン、ベバシズマブ、サリドマイド、及びレナリドマイドなど、がんの治療に使用されるいくつかの薬物の副作用、最近の外傷又は手術、中心静脈カテーテルの配置、肥満、妊娠、経口避妊薬（ｏｒａｌ ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ ｐｉｌｌ）（経口避妊薬（ｂｉｒｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｉｌｌ））を含むエストロゲンの補足使用、ホルモン補充療法、長時間のベッド安静又は不動、心臓発作、うっ血性心不全、脳卒中及び活動性の減少につながる他の疾患、ヘパリン誘導性血小板減少症（ヘパリン又は低分子量ヘパリン調製物による血液中の血小板減少）、長時間の飛行機旅行、抗リン脂質抗体症候群、深部静脈血栓症又は肺塞栓症、真性多血症又は本態性血小板増加症などの骨髄増殖性疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、炎症性腸症候群、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ネフローゼ症候群、ＣＯＶＩＤ－１９感染症又はスパイクタンパク質免疫作用などのうちのいずれか１つの疾患、障害、凝固副作用、間接凝固作用を治療する方法を提供し得る。
【0090】
本開示の第７の態様は、止血に悪影響を及ぼすことなく、対象における血栓症を予防する方法であって、本方法は、対象に、治療有効量の表１のＦＸＩアンタゴニスト抗体、又は治療有効量の抗体又はその抗原結合断片を含む薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0091】
一実施形態では、上述の方法は、アンタゴニスト抗ＦＸＩ抗体、又はその抗原結合断片を、それを必要とする対象に投与することによって達成され得、アンタゴニスト抗ＦＸＩ抗体は、表１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）、又はそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、表１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）、又はそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、を含む。
【0092】
一実施形態では、本開示の方法は、本開示のアンタゴニストＦＸＩ抗体を投与することによって達成され得、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３若しくは配列番号３１のＨＣＶＲ配列内に含まれる３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）、又はそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、配列番号１３のＬＣＶＲ配列内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）、又はそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、を含む。
【0093】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３又は配列番号３１のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
【0094】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【0095】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲと、を含む。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲと、を含む。
【0096】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３／１３又は配列番号３１／１３のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対のＣＤＲを含む。
【0097】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３／１３又は配列番号３１／１３のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【0098】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、及び
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、を含む。
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、及び
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、を含む。
【0099】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５－７－９－１５－１７－１９のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む。
【0100】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、及び
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、を含む。
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、及び
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、を含む。
【0101】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３３－３５－３７－１５－１７－１９のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む。
【0102】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＦＸＩに特異的に結合する。
【0103】
一実施形態では、本開示の抗ＦＸＩ抗体で治療される疾患又は障害は、血栓症、及び血栓症に起因する任意の合併症である。
【0104】
ＦＸＩの活性又は発現に関連する任意の疾患又は障害は、本開示の抗体による治療に適していると想定される。これらの障害には、有害な血餅形成がリスクである任意の疾患又は状態、特に、内因性凝固及び止血が患者にとってリスクである状態が含まれ得るが、これに限定されない。
【0105】
他の実施形態は、後述の詳細な説明の精査から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0106】
【図1】抗体の対数濃度の関数としてのａＰＴＴの倍率変化を示す折れ線グラフを描画する。塗りつぶされたピラミッドは、アイソタイプ対照抗体（上の頂点）又は本発明のＦＸＩ Ａ２抗体、ＲＥＧＮ９９３３（下の頂点、Ｈ４Ｈ２９７９０Ｐ２として表示される）のいずれかを描画する。塗りつぶされた円は、ＦＸＩ Ａ２に結合する比較対象抗体を描画する。
【図2】経時的なアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）の濃度の関数としてのトロンビン活性を示す折れ線グラフを描画する。
【図3】経時的なＦＸＩ Ａ２に結合する主題の抗体（ＲＥＧＮ９９３３）の濃度の関数としてのトロンビン活性を示す折れ線グラフを描画する。
【図4】経時的なＦＸＩ Ａ２に結合する比較対象抗体（ＣＯＭＰ３４４８）の濃度の関数としてのトロンビン活性を示す折れ線グラフを描画する。
【図5】経時的なアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）の濃度の関数としてのトロンビン活性を示す折れ線グラフを描画する。
【図6】経時的なＦＸＩ Ａ２に結合する主題の抗体（ＲＥＧＮ９９３３）の濃度の関数としてのトロンビン活性を示す折れ線グラフを描画する。
【図7】経時的なＦＸＩ Ａ２に結合する比較対象抗体（ＣＯＭＰ３４４８）の濃度の関数としてのトロンビン活性を示す折れ線グラフを描画する。
【図8A】抗体の対数濃度の関数としての活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の倍率変化を示す折れ線グラフを描画する。暗い色合いは、アイソタイプ対照を描画する。明るい色合いは、ＦＸＩ Ａ２に結合する主題の抗体ＲＥＧＮ９９３３を描画する。ａＰＴＴ凝固アッセイでは、ヒトドナー血漿を、ＲＥＧＮ９９３３又はＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照１９ｎＭ～１２００ｎＭのいずれかの２倍連続希釈液と共にインキュベートし、続いて、内因性凝固経路の特異的活性化因子であるエラグ酸（ＥＡ）を添加した。
【図8B】抗体の対数濃度の関数としてのプロトロンビン時間（ＰＴ）の倍率変化を示す折れ線グラフを描画する。ＰＴ凝固アッセイでは、ヒトドナー血漿を、６００ｎＭ及び１２００ｎＭでＲＥＧＮ９９３３又はＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照のいずれかと共にインキュベートし、続いて、外因性凝固経路の特異的活性化因子である組織因子（ＴＦ）を添加した。図８Ｂは、ＰＴ凝固アッセイのＲＥＧＮ９９３３及びＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照の線が重複することを示し、したがって、これらの線を区別することはできない。ベースライン（すなわち、非抗体対照）と比較したａＰＴＴ及びＰＴの変化を決定し、重複試料の平均変化を、試験した各抗体濃度についてプロットする。
【図9A】経時的なＦＸＩ Ａ２に結合する主題の抗体の濃度の関数としてのエラグ酸（ＥＡ）媒介トロンピン活性を示す折れ線グラフを描画する。
【図9B】経時的なアイソタイプ対照抗体の濃度の関数としてのＥＡ媒介トロンビン活性を示す折れ線グラフを描画する。
【図9C】経時的なＦＸＩ Ａ２に結合する主題の抗体、ＲＥＧＮ９９３３の濃度の関数としての組織因子（ＴＦ）媒介トロンビン活性を示す折れ線グラフを描画する。
【図9D】経時的なアイソタイプ対照抗体の濃度の関数としてのＴＦ媒介トロンビン活性を示す折れ線グラフを描画する。ヒトドナー血漿を、主題のｍＡｂ又はＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照１６ｎＭ～５００ｎＭのいずれかの２倍連続希釈液と共にインキュベートし、続いて、（図９Ａ及び９Ｂ）内因性凝固経路の特異的活性化因子であるエラグ酸（ＥＡ）、又は（図９Ｂ及び９Ｃ）外因性凝固経路の特異的活性化因子である組織因子（ＴＦ）を添加した。測定されたリアルタイムトロンビン濃度値を、時間に対してプロットして、試験した各抗体濃度並びに非抗体対照（すなわち、ＰＢＳ）についてトロンボグラムプロファイルを得た。
【図10】ＲＥＧＮ９９３３は、血漿中の総ＦＸＩレベルの増加に関連する。雌のカニクイザルに、ビヒクル（対照、ｎ＝３）、１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ９９３３（ｎ＝３）、３ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ９９３３（ｎ＝３）、又は１０ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ９９３３（ｎ＝３）の単回静脈内（ＩＶ）スローボーラス注射を投与し、投与後８週間監視した。投与前及び投与後５分、６時間、２日目、３日目、４日目、６日目、８日目、１１日目、１５日目、２２日目、２９日目、３６日目、４３日目、５０日目、及び５７日目に、全ての動物から血液試料を収集した。投与前の測定値は、各動物のベースラインとして機能した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。図１０Ａは、マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定された血清中の総ＲＥＧＮ９９３３を示す折れ線グラフを描画する。図１０ ２．１．１における薬物合計は、ヤギ抗ヒトＦＸＩ ｍＡｂを使用して、ＥＬＩＳＡを使用して測定された血漿中の総ＦＸＩを示す折れ線グラフを描画し、総ＦＸＩの倍率変化（ベースラインと比較して）が報告される。データは、群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。
【図11】ＲＥＧＮ９９３３は、ａＰＴＴを延長するが、ＰＴを延長せず、持続時間に用量依存的な効果を有する。雌のカニクイザルに、ビヒクル（対照、ｎ＝３）、１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ９９３３（ｎ＝３）、３ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ９９３３（ｎ＝３）、又は１０ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ９９３３（ｎ＝３）の単回静脈内（ＩＶ）スローボーラス注射を投与し、投与後８週間監視した。投与前及び投与後５分、６時間、２日目、３日目、４日目、６日目、８日目、１１日目、１５日目、２２日目、２９日目、３６日目、４３日目、５０日目、及び５７日目に、全ての動物から血液試料を収集した。投与前の測定値は、各動物のベースラインとして機能した。（図１１Ａ及び１１Ｂ）。図１１Ａは、経時的なａＰＴＴの倍率変化（ベースラインと比較して）の関数としてのＥＡ媒介ａＰＴＴを示す折れ線グラフを描画する。図１１Ｂは、経時的なＰＴの倍率変化（ベースラインと比較して）の関数としてのＴＦ媒介ＰＴを示す折れ線グラフを描画する。データは、群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。
【図12】ＲＥＧＮ９９３３は、内因性及び外因性凝固経路の内因性トロンビンｐ生成能を低減し、内因性経路における活性の持続時間に用量依存的な効果を有する。雌のカニクイザルに、ビヒクル（対照、ｎ＝３）、１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ９９３３（ｎ＝３）、３ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ９９３３（ｎ＝３）、又は１０ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ９９３３（ｎ＝３）の単回静脈内（ＩＶ）スローボーラス注射を投与し、投与後８週間監視した。投与前及び投与後５分、６時間、２日目、３日目、４日目、６日目、８日目、１１日目、１５日目、２２日目、２９日目、３６日目、４３日目、５０日目、及び５７日目に、全ての動物から血液試料を収集した。投与前の測定値は、各動物のベースラインとして機能した。トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を、それぞれ、内因性及び外因性の凝固経路の活性化因子としてエラグ酸（ＥＡ）及び組織因子（ＴＦ）を使用して血漿試料で行った（図１２Ａ及び１２Ｂ）。図１２Ａは、経時的な内因性トロンビン生成能（ＥＴＰ）の倍率変化（ベースラインと比較して）の関数としてのＥＡ媒介ａＰＴＴを示す折れ線グラフを描画する。図１２Ｂは、経時的なＥＴＰの倍率変化（ベースラインと比較して）の関数としてのＴＦ媒介ＰＴを示す折れ線グラフを描画する。データは、群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。
【発明を実施するための形態】
【0107】
本開示を説明する前に、本開示は、そのような方法及び条件が変化し得るため、特定の方法及び記載された実験条件に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0108】
別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現には、９９及び１０１、並びにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）が含まれる。
【0109】
本明細書に記載されているものと類似又は均等の任意の方法及び材料が、本開示の実施又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料をここで記載する。本明細書において言及される全ての特許、出願、及び非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0110】
定義
「凝固第ＸＩ因子」又は「第ＸＩ因子」としても知られる「ＦＸＩ」などの発現は、アクセッション番号ＮＰ＿０００１１９．１（配列番号２１）のアミノ酸残基１９～６２５に示されるアミノ酸配列を含むヒト血漿セリンプロテアーゼ（別の種からのものであると指定されている場合を除く）を指す。ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを含むヒトＦＸＩは、配列番号２２として示される（アミノ酸残基１～６０７はヒトＦＸＩであり、アミノ酸残基６０８～６３５はｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグである）。
「凝固第ＸＩ因子」又は「第ＸＩ因子」としても知られる「ＦＸＩ」などの発現は、アクセッション番号ＮＰ＿０００１１９．１（配列番号２１）のアミノ酸残基１９～６２５に示されるアミノ酸配列を含むヒト血漿セリンプロテアーゼ（別の種からのものであると指定されている場合を除く）を指す。ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを含むヒトＦＸＩは、配列番号２２として示される（アミノ酸残基１～６０７はヒトＦＸＩであり、アミノ酸残基６０８～６３５はｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグである）。
【0111】
ある特定の例では、ＦＸＩタンパク質、ＦＸＩタンパク質のサブユニット、及び１つ以上のＦＸＩサブユニット、タグ配列、及び血漿カリクレインタンパク質配列を含むキメラタンパク質を発現する細胞株を調製した。例えば、配列番号２３（構築物ｈＦＸＩ＿ＰＫＡ１）は、アミノ酸１～８５で、ヒトカリクレインＢ１のａｐｐｌｅ １ドメイン（ＰＫＡ１）（ヒトカリクレインＢ１のアミノ酸Ｇ２０～Ｃ１０４［配列番号２８］）、アミノ酸８６～６０６、ヒトＦＸＩのアミノ酸Ｈ１０５～Ｖ６２５（ｈＦＸＩ）、及びアミノ酸６０７～６３４で、ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサジスチジンタグを含むキメラである。
【0112】
例えば、配列番号２４（構築物ｈＦＸＩ＿ＰＫＡ２）は、アミノ酸１～９０で、ｈＦＸＩのアミノ酸Ｅ１９～Ｓ１０８、アミノ酸９１～１７４で、ｈＫＬＫＢ１のａｐｐｌｅ ２ドメイン（ＰＫＡ２、「Ａ２」とも称される）（アミノ酸Ｃ１１１～Ｃ１９３配列番号２８）、アミノ酸１７５～６０５で、ｈＦＸＩのアミノ酸Ａ１９５～Ｖ６２５、及びアミノ酸６０６～６３３で、ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサジスチジンタグを含むキメラである。
【0113】
例えば、配列番号２５（構築物ｈＦＸＩ＿ＰＫＡ３）は、アミノ酸１～１８０で、ｈＦＸＩのアミノ酸Ｅ１９～Ｌ１９８、アミノ酸１８１～２６４で、ｈＫＬＫＢ１のａｐｐｌｅ ３ドメイン（ＰＫＡ３）（アミノ酸Ｃ２０１～Ｃ２８４配列番号２８）、アミノ酸２６５～６０５で、ｈＦＸＩのアミノ酸Ｈ２８５～Ｖ６２５、及びアミノ酸６０６～６３３で、ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサジスチジンタグを含むキメラである。
【0114】
例えば、配列番号２６（構築物ｈＦＸＩ＿ＰＫＡ４）は、アミノ酸１～２７１で、ｈＦＸＩのアミノ酸Ｅ１９～Ｖ２８９、アミノ酸２７２～３５５で、ｈＫＬＫＢ１のａｐｐｌｅ ４ドメイン（ＰＫＡ４）（アミノ酸Ｃ２９２～Ｃ３７５配列番号２８）、アミノ酸３５６～６０５で、ｈＦＸＩのアミノ酸Ｍ３７６～Ｖ６２５、アミノ酸６０６～６３３で、ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサジスチジンタグを含むキメラである。
【0115】
例えば、配列番号２７（構築物ｈＫＬＫＢ１．ｍｍｈ）は、アミノ酸１～６１９で、ｈＫＬＫＢ１のアミノ酸Ｇ２０～Ａ６３８、及びアミノ酸６２０～６４７で、ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサジスチジンタグを含むキメラである。
【0116】
本明細書で使用される場合、「抗ＦＸＩ抗体」という表現は、単一特異性を有する一価抗体、並びにＦＸＩに結合する第１のアーム及び第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含む二重特異性抗体の両方を含み、抗ＦＸＩアームは、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列又はＣＤＲ配列のうちのいずれかを含む。「抗ＦＸＩ抗体」という表現はまた、薬物又は毒素（すなわち、細胞傷害性剤）にコンジュゲートされた抗ＦＸＩ抗体又はその抗原結合部分を含む、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）も含む。「抗ＦＸＩ抗体」という発現はまた、放射性核種にコンジュゲートされた抗ＦＸＩ抗体又はその抗原結合部分を含む抗体－放射性核種コンジュゲート（ＡＲＣ）を含む。
【0117】
本明細書で使用される場合、「抗ＦＸＩ抗体」という用語は、ＦＸＩ若しくはＦＸＩの一部分、又はＦＸＩのａｐｐｌｅ ２ドメイン若しくはＦＸＩのａｐｐｌｅ ２ドメイン内のエピトープに特異的に結合するか、又はそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子又は分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖である２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略す）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略す）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼称される、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される、超可変性の領域へと更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。本開示の異なる実施形態では、抗ＦＸＩ抗体（若しくはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、又は天然に若しくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義することができる。
【0118】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、全長抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」、及び同様の用語は、本明細書で使用される場合、任意の酵素処理で入手可能な、合成の、又は遺伝子操作された、抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変ドメイン及び任意選択的に抗体定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現に関与するタンパク質分解消化技法又は組換え遺伝子操作技法などの任意の好適な標準的な技法を使用して、完全抗体分子から得られ得る。かかるＤＮＡは既知であり、かつ／又は例えば、商業的供給元、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、若しくは合成され得る。ＤＮＡは、化学的又は分子生物学技術を使用して配列決定及び操作され、例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／又は定常ドメインを好適な配置に配置し、コドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、追加若しくは削除することができる。
【0119】
抗原結合断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、又は拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位、が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用する「抗原結合断片」という表現に包含される。
【0120】
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意の大きさ又はアミノ酸組成物のものであり得、概して、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか又は１つ以上のフレームワーク配列と共にインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗体結合断片において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ、又はＶＬ－ＶＬ二量体を含み得る。代替的に、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨドメイン又はＶＬドメインを含み得る。
【0121】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本開示の抗体の抗原結合断片内に見出すことができる可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的な例示的な配置としては、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、及び（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬ、が挙げられる。上に列挙される例示的な配置のうちのいずれかを含む、可変ドメイン及び定常ドメインの任意の配置において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結されているか、又は完全若しくは部分的ヒンジ領域若しくはリンカー領域によって連結されているかのいずれかであり得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメイン及び／又は定常ドメイン間の可撓性又は半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０以上）アミノ酸からなり得る。更に、本開示の抗体の抗原結合断片は、互いとの及び／又は１つ以上の単量体ＶＨドメイン若しくはＶＬドメイン（例えば、ジスルフィド結合（複数可）により）との非共有結合において、上に列挙した可変ドメイン配置及び定常ドメイン配置のいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含み得る。
【0122】
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異性又は多特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別個の抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体の形式を含む任意の多特異性抗体の形式は、当該技術分野で利用可能な慣例的技術を使用して、本開示の抗体の抗原結合断片の文脈での使用に適合され得る。
【0123】
ある特定の例では、例えば、血餅の形成を阻害するために、ＦＸＩをアンタゴナイズすることが望ましい場合がある。しかしながら、本開示の抗体は、ＦＸＩ又はＦＸＩａの活性の阻害剤として機能し、同時に内因性経路の血栓症／血餅形成の阻害剤として機能するアンタゴニスト抗体として機能する。本開示の抗体は、ＦＸＩとその上流活性剤凝固第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）及び／又は凝固第ＩＩ因子（ＦＩＩ又はトロンビン）との間の相互作用を防止することによって機能し得る。本開示の抗体はまた、ＦＸＩとその下流標的凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）との間の相互作用を防止することによって機能し得る。本開示の抗体はまた、患者の血流からＦＸＩを隔離することによっても機能し得る。
【0124】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在しないヒト抗体を含むことが意図される。この用語は、非ヒト哺乳動物又は非ヒト哺乳動物の細胞において組換え的に産生される抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、又はヒト対象において生成された抗体を含むよう意図されない。
【0125】
本開示の抗体は、いくつかの実施形態では、組換え抗体及び／又は天然に存在しないヒト抗体であり得る。本明細書で使用される場合、「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体などの組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離される全てのヒト抗体（後述）、組換え型コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体（後述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照されたい）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、若しくは単離された抗体を含むことが意図される。ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発）に供され、したがって、組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列及びＶＬ配列に関連している一方で、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー中に天然に存在しない場合がある配列である。
【0126】
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在することができる。一形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されているおよそ１５０～１６０ｋＤａの安定した四本鎖構築体を含む。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合によって連結されておらず、共有結合した軽鎖及び重鎖からなる約７５～８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後でさえも分離することが極めて困難とされている。
【0127】
様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで第２の形態の出現を大幅に低減することができる（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本開示は、ヒンジ、ＣＨ２領域又はＣＨ３領域において１つ以上の変異を有する抗体を包含し、それらは、例えば、産生において、所望の抗体形態の収率を改善するために望ましい場合がある。
【0128】
「ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ（特異的に結合する）」又は「ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｔｏ（に特異的に結合する）」などの用語は、抗体又はその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－６Ｍ以下の平衡解離定数によって特徴付けることができる（例えば、より小さいＫＤは、より密接な結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。本明細書に記載されるように、ＦＸＩに特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって特定されている。更に、本明細書で使用される場合、ＦＸＩ タンパク質及び１つ以上の追加の抗原に結合する多特異性抗体、又はＦＸＩの２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、それにもかかわらず「特異的に結合する」抗体とみなされる。
【0129】
本開示の抗体は、単離された抗体であってもよい。本明細書で使用される場合、「単離された抗体」は、特定された抗体、及びその天然環境の少なくとも１つの構成成分から分離及び／又は回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの構成成分から、又は抗体が自然に存在するか、若しくは自然に産生される組織若しくは細胞から分離されている、又は取り出された抗体は、本開示の目的で「単離された抗体」である。単離された抗体は、組換え細胞内のインサイチュの抗体も含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製又は単離ステップを受けている抗体である。ある特定の実施形態によれば、単離された抗体は他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【0130】
本明細書に開示される抗ＦＸＩ抗体は、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域において、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な配列と比較することによって容易に確認することができる。いったん得られれば、１つ以上の変異を含む抗体及び抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニスト又はアゴニストの生物学的特性の改善又は増強（場合によって）、免疫原性の低減などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られる抗体及び抗原結合断片は、本開示の範囲内に包含される。
【0131】
本開示はまた、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかのバリアントを含む、抗ＦＸＩ抗体を含む。例えば、本開示は、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、又は４個以下などの保存的アミノ酸置換を伴うＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＦＸＩ抗体を含む。
【0132】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座又は線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含み得る。
【0133】
「実質的な同一性」又は「実質的に同一である」という用語は、核酸又はその断片を指す場合、適切なヌクレオチドの挿入又は欠失を用いて別の核酸（又はその相補鎖）と最適に整列させたとき、以下で考察されるようにＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、又はＧａｐなどの配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定した場合、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは約９６％、９７％、約９８％、又は９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の例では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じ又は実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
【0134】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」又は「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用して、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによってなど最適に整列させたとき、少なくとも９５％の配列同一性、更により好ましくは、少なくとも９８％、又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないことになっている。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい（参照により本明細書に組み込まれる）。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに（７）システイン及びメチオニンである含硫側鎖が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、及びアスパラギン－グルタミンである。代替的に、保存的置換とは、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
【0135】
配列同一性とも称されるポリペプチドに対する配列類似性は、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の修飾へ割り当てられた類似の測定値を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物からの相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間の、又は野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の、配列相同性又は配列同一性を決定するための既定パラメータと共に使用することができるＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムである、既定パラメータ又は推奨パラメータを使用するＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列及びパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上記）。本開示の配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい（各々参照により本明細書に組み込まれる）。
【0136】
抗体の特徴
本開示は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約５００ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩのＡ２ドメインに結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、本開示は、ヒトＦＸＩに、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約３ｐＭ未満、又は約１ｐＭ未満のＫＤで結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。
本開示は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約５００ｐＭ未満のＫＤでヒトＦＸＩのＡ２ドメインに結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、本開示は、ヒトＦＸＩに、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約３ｐＭ未満、又は約１ｐＭ未満のＫＤで結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。
【0137】
本開示は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１，０００ｐＭ未満のＫＤで活性化ヒトＦＸＩ（ＦＸＩａ）に結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、本開示は、ヒトＦＸＩに、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約３ｐＭ未満、又は約１ｐＭ未満のＫＤで結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。
【0138】
本開示は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１０分超の解離半減期（ｔ１／２）を有するヒトＦＸＩに結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、本開示は、約２０分超、約５０分超、約１００分超、約１２０分超、約１５０分超、約３００分超、約３５０分超、約４００分超、約４５０分超、約５００分超、約５５０分超、約６００分超、約７００分超、約８００分超、約９００分超、約１０００分超、約１１００分超、又は約１２００分超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩに結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。
【0139】
本開示は、２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１０分超の解離半減期（ｔ１／２）を有するヒトＦＸＩａに結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、本開示は、約２０分超、約５０分超、約１００分超、約１２０分超、約１５０分超、約３００分超、約３５０分超、約４００分超、約４５０分超、約５００分超、約５５０分超、約６００分超、約７００分超、約８００分超、約９００分超、約１０００分超、約１１００分超、又は約１２００分超のｔ１／２を有するヒトＦＸＩに結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。
【0140】
本開示は、非ヒトＦＸＩに結合してもしなくてもよい抗ＦＸＩ抗体を含む。本明細書で使用される場合、抗体が、表面プラズモン共鳴などの抗原結合アッセイにおいて試験されたとき、そのようなアッセイにおいて、約１０００ｎＭ超のＫＤを示すか、又はいかなる抗原結合も示さない場合、抗体は、特定の抗原（例えば、サル、マウス、又はラットＦＸＩに「結合しない」。本開示のこの態様による、抗体が特定の抗原に結合するか、又は結合しないかを決定するために使用することができる別のアッセイ形式は、ＥＬＩＳＡである。
【0141】
活性化ＦＸＩ（ＦＸＩａ）が、ａｒｇ－ａｌａ及びａｒｇ－ｖａｌペプチド結合を選択的に切断することによって、第ＩＸ因子を活性化することは、当該技術分野で一般に知られている。第ＩＸａ因子は、次に、第ＶＩＩＩａ因子（ＦＩＸａ－ＦＶＩＩＩａ）と複合体を形成し、第Ｘ因子を活性化する。本開示は、約１００ｐＭ未満のＩＣ５０で、血漿におけるヒトＦＸのＦＸＩ媒介活性化を少なくとも約８５％阻害する抗ＦＸＩ抗体を含む。実施例４に記載のアッセイ形式、又は実質的に類似のアッセイ形式を使用して、ＩＣ５０値を、観察された最大半量のシグナルへのＦＸＩ媒介シグナル伝達を活性化するのに必要な抗体の濃度として計算することができる。したがって、ある特定の実施形態によれば、本明細書の実施例４に記載のアッセイ形式、又は実質的に類似のアッセイ形式を使用して測定されたとき、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、又は約５ｐＭ未満のＩＣ５０で、血漿におけるヒトＦＸのヒトＦＸＩ媒介活性化を少なくとも約８５％媒介する抗ＦＸＩ抗体を含む。
【0142】
本開示はまた、約５０ｐＭ未満のＩＣ５０で、血漿におけるヒトＦＸのＦＸＩａ媒介性活性化を少なくとも約２５％阻害する抗ＦＸＩ抗体も含む。実施例４に記載のアッセイ形式、又は実質的に類似のアッセイ形式を使用して、ＩＣ５０値を、観察された最大半量のシグナルへのＦＸＩａ媒介シグナル伝達を活性化するのに必要な抗体の濃度として計算することができる。したがって、ある特定の実施形態によれば、本明細書の実施例４に記載のアッセイ形式、又は実質的に類似のアッセイ形式を使用して測定されたとき、約２００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約９ｐＭ未満、約８ｐＭ未満、約７ｐＭ未満、約６ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約４ｐＭ未満、約３ｐＭ未満、約２ｐＭ未満、又は約１ｐＭ未満のＩＣ５０で、血漿におけるヒトＦＸのヒトＦＸＩａ媒介活性化を少なくとも約２５％媒介する抗ＦＸＩ抗体を含む。
【0143】
本開示は、それぞれ、実施例５及び実施例６に示されるように、Ａ２ドメイン構築物への直接結合によって、又は１つ以上の特異的Ａ２結合抗体と競合することによって実証されるように、ａｐｐｌｅ ２ドメイン（Ａ２）に優先的に結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。一実施形態では、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片は、ＦＸＩの触媒ドメインに結合しない。
【0144】
本開示は、ヒト血漿において、外因性経路血栓形成の尺度であるプロトロンビン時間（ＰＴ）に対して測定可能な効果を有しない一方で、内因性経路血栓形成の尺度である活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を延長する、抗ＦＸＩ抗体を含む。一実施形態では、ａＰＴＴは、エラグ酸で処理されたプールされたヒト血漿において測定され、ＰＴは、実施例７に例示されるように、止血分析器を使用して組織因子で処理されたプールされたヒト血漿において測定される。エラグ酸がインビトロで血栓形成の内因性経路を刺激し、組織因子が血栓形成の外因性経路を刺激することは、当該技術分野で一般に知られている。ここで、抗ＦＸＩ抗体は、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～５０ｎＭ、１００ｐＭ～５０ｎＭ、５ｎＭ～５０ｎＭ、５ｎＭ～４０ｎＭ、５ｎＭ～１５ｎＭ、１０ｎＭ～２０ｎＭ、１５ｎＭ～２５ｎＭ、２０ｎＭ～３０ｎＭ、２５ｎＭ～３５ｎＭ、３０ｎＭ～４０ｎＭ、３５ｎＭ～４５ｎＭ、４０ｎＭ～５０ｎＭ、４５ｎＭ～５５ｎＭ、５０ｎＭ～６０ｎＭ、５５ｎＭ～６５ｎＭ、６０ｎＭ～１００ｎＭ、６５ｎＭ～７５ｎＭ、７０ｎＭ～８０ｎＭ、７５ｎＭ～８５ｎＭ、８０ｎＭ～９０ｎＭ、８５ｎＭ～９５ｎＭ、９０ｎＭ～１００ｎＭ、又は９５ｎＭ～１０５ｎＭの濃度で、ＰＴを倍加せずに、ａＰＴＴを約２倍に延長する。
【0145】
本開示は、外因性経路（外因性トロンビン）を介したトロンビンの産生にほとんど又はまったく影響を与えずに、インビトロでヒト血漿における内因性経路（内因性トロンビン）を介したトロンビンの産生を阻害する抗ＦＸＩ抗体を含む。一実施形態では、経路特異的トロンビン産生は、実施例７に例示されるように、較正された自動トロンボグラムを使用して、トロンビン生成アッセイによってインビトロで決定される。ここで、トロンビン生成プロファイルが生成され、ピークトロンビン濃度は、抗ＦＸＩ抗体の有無にかかわらず、エラグ酸処理血漿及び組織因子処理血漿において決定される。したがって、一実施形態では、抗ＦＸＩ抗体は、０．１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、５ｎＭ～５００ｎＭ、５ｎＭ～１００ｎＭ、１０ｎＭ～１００ｎＭ、１０ｎＭ～５０ｎＭ、５ｎＭ～１５ｎＭ、１０ｎＭ～２０ｎＭ、２５ｎＭ～３５ｎＭ、３０ｎＭ～４０ｎＭ、３５ｎＭ～４５ｎＭ、４０ｎＭ～５０ｎＭ、４５ｎＭ～５５ｎＭ、５０ｎＭ～６０ｎＭ、５５ｎＭ～６５ｎＭ、６０ｎＭ～６５ｎＭ、２０ｎＭ以上、２５ｎＭ以上、３０ｎＭ以上、３５ｎＭ以上、４０ｎＭ以上、４５ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、５５ｎＭ以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、又は１５ｎＭ以上の濃度で内因性トロンビンの産生を阻害する。ここで、抗ＦＸＩ抗体は、最大５００ｎＭの任意の濃度で外因性トロンビンの産生に影響を与えない。
【0146】
本開示は、プロトロンビン時間（ＰＴ）に測定可能な影響を与えることなく、インビボで霊長類における活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を少なくとも２倍増加させる抗ＦＸＩ抗体を含む。ここで、霊長類に抗ＦＸＩ抗体を投与し、血漿を霊長類から得、血漿を、エラグ酸又は組織因子と接触させ、次いで、実施例８に例示されるように、それぞれ、アッセイにおいて、ａＰＴＴ又はＰＴが決定される。一実施形態では、霊長類は、ヒトである。一実施形態では、霊長類は、サルである。
【0147】
一実施形態では、抗ＦＸＩ抗体は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、又は約１５ｍｇ／ｋｇの用量で非経口投与される。
【0148】
一実施形態では、ａＰＴＴは、抗ＦＸＩ処置なしと比較して、抗ＦＸＩ処置で、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、又は少なくとも６倍延長される。
【0149】
一実施形態では、抗ＦＸＩ媒介ａＰＴＴ延長効果は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、又は少なくとも６ヶ月間、抗ＦＸＩ抗体の用量を受けた後も対象において持続する。
【0150】
本開示は、外因性経路ピークトロンビン活性に測定可能な影響を与えることなく、インビボで霊長類における内因性経路ピークトロンビン活性を阻害する抗ＦＸＩ抗体を含む。ここで、霊長類に抗ＦＸＩ抗体を投与し、血漿を霊長類から得、血漿を、エラグ酸又は組織因子と接触させ、次いで、内因性トロンビン又は外因性トロンビンの生成が、それぞれ、実施例８に例示されるトロンビン生成アッセイにおいて決定される。一実施形態では、霊長類は、ヒトである。一実施形態では、霊長類は、サルである。
【0151】
一実施形態では、抗ＦＸＩ抗体は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、又は約１５ｍｇ／ｋｇの用量で非経口投与される。
【0152】
一実施形態では、抗ＦＸＩ処置なしと比較して、抗ＦＸＩ処置におけるピーク内因性トロンビン（すなわち、エラグ酸を介して生成されるトロンビン）活性は、１％～１００％、５％～９５％、１０％～９０％、２０％～８０％、１％～１０％、５％～２０％、１０％～３０％、１５％～４０％、２０％～５０％、２５％～６０％、５％～１５％、１０％～２０％、１５％～２５％、２０％～３０％、２５％～３５％、３０％～４０％、３５％～４５％、４０％～５０％、４５％～５５％、５０％～６０％、５５％～６５％、６０％～７０％、６５％～７５％、７０％～８０％、７５％～８５％、８０％～９０％、８５％～９５％、９０％～１００％、９５％～１０５％、又は１００％以上阻害される。
【0153】
一実施形態では、ピーク内因性トロンビン活性の抗ＦＸＩ媒介阻害は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、又は少なくとも６ヶ月間、抗ＦＸＩ抗体の用量を受けた後も対象において持続する。
【0154】
本開示の抗体の結合特徴（例えば、上記の本明細書で言及される結合特徴のいずれか）は、「表面プラズモン共鳴によって測定される」という点で開示される場合、抗体と抗原との間の相互作用に関する関連する結合特徴が、本明細書の実施例３に例解される標準的なＢｉａｃｏｒｅアッセイ条件、又は実質的に類似のアッセイ形式を使用して、表面プラズモン共鳴機器（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定されることを意味する。ある特定の実施形態では、結合パラメータは、２５℃で測定されるが、他の実施形態では、結合パラメータは、３７℃で測定される。
【0155】
本開示は、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列及び／又はＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲを含む、ＦＸＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【0156】
本開示の抗体は、前述の生物学的特徴うちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを有し得る。本開示の抗体の生物学的特徴の前述のリストは、包括的であることを意図しない。本開示の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書の実施例を含む本開示の総説から、当業者には明らかであろう。
【0157】
エピトープマッピング及び関連技術
本開示の抗体が結合するエピトープは、ＦＸＩタンパク質の３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなってもよい。代替的に、エピトープは、ＦＸＩの複数の連続していないアミノ酸（又はアミノ酸配列）からなってもよい。いくつかの実施形態では、エピトープは、例えば、そのリガンド、例えば、ＦＸＩＩａ、トロンビン、及びＦＩＸのうちのいずれか１つと相互作用するドメイン内で、ＦＸＩの表面又はその付近に位置する。他の実施形態では、エピトープは、ＦＸＩリガンドと相互作用しないＦＸＩの表面又はその付近に、例えば、抗体が、そのようなエピトープに結合したときに、ＦＸＩとそのリガンドとの間の相互作用を妨げないＦＸＩの表面上の位置に位置する。
本開示の抗体が結合するエピトープは、ＦＸＩタンパク質の３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなってもよい。代替的に、エピトープは、ＦＸＩの複数の連続していないアミノ酸（又はアミノ酸配列）からなってもよい。いくつかの実施形態では、エピトープは、例えば、そのリガンド、例えば、ＦＸＩＩａ、トロンビン、及びＦＩＸのうちのいずれか１つと相互作用するドメイン内で、ＦＸＩの表面又はその付近に位置する。他の実施形態では、エピトープは、ＦＸＩリガンドと相互作用しないＦＸＩの表面又はその付近に、例えば、抗体が、そのようなエピトープに結合したときに、ＦＸＩとそのリガンドとの間の相互作用を妨げないＦＸＩの表面上の位置に位置する。
【0158】
当業者に既知の様々な技術を使用して、抗体が、ポリペプチド又はタンパク質内にある「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載されている慣例的なクロスブロッキングアッセイ、アラニンスキャニング変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－４６３）、及びペプチド切断分析が挙げられる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、及び抗原の化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチドの内部にあるアミノ酸を特定するために使用することができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的に言えば、水素／重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質へ結合させることを包含する。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体によって保護されている残基（重水素標識されたままである）を除く全ての残基で水素－重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析へ供し、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３／２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。
【0159】
本開示は、本明細書に記載の特定の例示的な抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＦＸＩ抗体（例えば、本明細書の表１に記載のアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）を含む。同様に、本開示はまた、ＦＸＩへの結合について本明細書に記載の特定の例示的な抗体のいずれかと競合する抗ＦＸＩ抗体（例えば、本明細書の表１に記載のアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）を含む。
【0160】
抗体が、参照抗ＦＸＩ抗体と同じエピトープに結合するか、又は結合について参照抗ＦＸＩ抗体と競合するかどうかは、当該技術分野で既知であり、本明細書で例示される慣例的方法を使用することによって、容易に決定することができる。例えば、試験抗体が、本開示の参照抗ＦＸＩ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を、ＦＸＩタンパク質に結合させる。次に、ＦＸＩ分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、参照抗ＦＸＩ抗体との飽和結合後にＦＸＩに結合することができる場合、試験抗体は、参照抗ＦＸＩ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。その一方、試験抗体が、参照抗ＦＸＩ抗体との飽和結合後にＦＸＩ分子に結合することができない場合、試験抗体は、本開示の参照抗ＦＸＩ抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合している可能性がある。次いで、試験抗体の結合の観察された欠失が、実際に、参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるかどうか、又は立体遮断（又は別の現象）が、観察された結合の欠失の原因であるかどうか、を確認するために、更なる慣例的な実験（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、又は当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的若しくは定性的な抗体結合アッセイを使用して行うことができる。本開示のある特定の実施形態によれば、競合結合アッセイで測定されたとき、１倍、５倍、１０倍、２０倍、又は１００倍過剰量の一方の抗体が、他方の結合を、少なくとも５０％、しかし、好ましくは７５％、９０％、又は更には９９％阻害する場合、２つの抗体は同じ（又は重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０：１４９５－１５０２を参照されたい）。代替的に、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原において本質的に全てのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合するとみなされる。一方の抗体の結合を低減又は排除するアミノ酸変異の一部のみが、他方の結合を低減又は除外する場合、２つの抗体は、「重複エピトープ」を有するとみなされる。
【0161】
抗体が、結合について、参照抗ＦＸＩ抗体と競合する（又は結合について交差競合する）かどうかを決定するために、上述の結合方法論を、２つの方向から行う。第１の方向性では、参照抗体を飽和条件下でＦＸＩタンパク質に結合させた後、試験抗体のＦＸＩ分子への結合を評価する。第２の方向性では、試験抗体を飽和条件下でＦＸＩタンパク質に結合させた後、参照抗体のＦＸＩ分子への結合を評価する。両方の方向性で、第１の（飽和）抗体のみがＦＸＩ分子に結合することができる場合、試験抗体及び参照抗体は、ＦＸＩへの結合について競合すると結論付けられる（例えば、ＦＸＩタンパク質がセンサー先端に捕捉され、ＦＸＩでコーティングされたセンサー先端が参照抗体［ｍＡｂ－１］及び試験抗ＦＸＩ抗体［ｍＡｂ－２］で連続的に及び両方の結合順序で処理される、本明細書の実施例に記載されるアッセイ形式を参照されたい）。当業者に理解されるように、結合について参照抗体と競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合する必要はないが、重複するエピトープ又は隣接するエピトープに結合することによって、参照抗体の結合を、立体的に遮断し得る。
【0162】
ヒト抗体の調製
本開示の抗ＦＸＩ抗体は、完全にヒトであるが、天然に存在しない抗体であり得る。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成するための方法は、当該技術分野で知られている。任意のそのような既知の方法は、ヒトＦＸＩに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本開示の文脈で使用され得る。
本開示の抗ＦＸＩ抗体は、完全にヒトであるが、天然に存在しない抗体であり得る。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成するための方法は、当該技術分野で知られている。任意のそのような既知の方法は、ヒトＦＸＩに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本開示の文脈で使用され得る。
【0163】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照されたい）又はモノクローナル抗体を生成するための任意の他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、アレルゲンに対して高親和性のキメラ抗体が最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域と、マウス定常領域と、を含む、抗体を産生するように、ヒト重鎖可変領域と、ヒト軽鎖可変領域と、を含む、ゲノムが内因性マウス定常領域座に動作可能に連結されたトランスジェニックマウスの生成を包含する。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに動作可能に連結する。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡを発現させる。
【0164】
概して、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに関心対象の抗原を負荷し、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）を回収する。リンパ細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製し得、関心対象の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定するためにこのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニング及び選択する。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し得、重鎖及び軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域へ連結することができる。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞において産生され得る。代替的に、抗原特異的キメラ抗体又は軽鎖及び重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを抗原特異的リンパ球から直接単離することができる。
【0165】
以下の実験セクションに記載されるように、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、単離される高親和性のキメラ抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けされ、選択される。マウス定常領域は、本開示の完全ヒト抗体、例えば、野生型又は修飾されたＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４を生成するために、所望のヒト定常領域と置換される。選択された定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴及び標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
【0166】
ある特定の実施形態では、ヒトＦＸＩ受容体を発現するように操作されているマウス又はラットにおいて、抗ヒトＦＸＩ抗体を試験することが望ましい場合がある。これらのマウス又はラットは、抗ＦＸＩ抗体がヒトＦＸＩにのみ結合し得るが、マウス又はラットＦＸＩと交差反応しない状況で有益であり得る。そのようなＦＸＩヒト化マウス及びラットを生成するために、当業者に既知の任意の方法を使用してもよい。
【0167】
一般に、本開示の抗体は、固相又は溶液相のいずれかに固定された抗原への結合によって測定されるとき、非常に高い親和性を有し、典型的には、約１０－１２～約１０－９ＭのＫＤを有する。
【0168】
生物学的等価物
本開示の抗ＦＸＩ抗体及び抗体断片は、記載された抗体のものとは異なるが、ヒトＦＸＩに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体及び抗体断片は、親配列と比較したとき、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、記載された抗体のものと本質的に等価である生物学的活性を示す。同様に、本開示の抗ＦＸＩ抗体をコードしているＤＮＡ配列は、開示された配列と比較したとき、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、本開示の抗ＦＸＩ抗体又は抗体断片と本質的に生物学的に等価である抗ＦＸＩ抗体又は抗体断片をコードする。そのようなバリアントアミノ酸配列及びＤＮＡ配列の例は、上で考察されている。
本開示の抗ＦＸＩ抗体及び抗体断片は、記載された抗体のものとは異なるが、ヒトＦＸＩに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体及び抗体断片は、親配列と比較したとき、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、記載された抗体のものと本質的に等価である生物学的活性を示す。同様に、本開示の抗ＦＸＩ抗体をコードしているＤＮＡ配列は、開示された配列と比較したとき、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、本開示の抗ＦＸＩ抗体又は抗体断片と本質的に生物学的に等価である抗ＦＸＩ抗体又は抗体断片をコードする。そのようなバリアントアミノ酸配列及びＤＮＡ配列の例は、上で考察されている。
【0169】
２つの抗原結合タンパク質又は抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量又は複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度及び吸収の程度が有意差を示さない薬学的等価物又は薬学的代替物である場合、生物学的等価物とみなされる。いくつかの抗体は、これらの吸収の程度は等価であるが吸収速度は等価ではなく、吸収速度のこのような差が意図的であり、標識することに反映されているので生物学的に等価とみなされ得る場合、等価物又は薬学的代替物とみなされることになっており、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬物濃度の達成に必須ではなく、研究された特定の製剤にとって医学的に有意ではないとみなされる。
【0170】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、及び有効性において臨床的に有意差がない場合、生物学的に等価である。
【0171】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化又は有効性の減退を含む有害作用のリスクの期待される上昇なしで参照生成物と生物学的生成物の間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者を１回以上切り替えられることができる場合、生物学的に等価である。
【0172】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、使用条件（複数可）についての共通の機序又は作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
【0173】
生物学的等価性は、インビボ及び／又はインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定法には、例えば、（ａ）抗体又はその代謝産物の濃度が血液、血漿、血清又は他の生物学的流体中で時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳類におけるインビボでの試験、（ｂ）ヒト生物学的利用能データと相関した、このデータを合理的に予測しているインビトロ試験、（ｃ）抗体（又はその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定されるヒト又は他の哺乳類におけるインビボ試験、及び（ｄ）抗体の安全性、効能、又は生物学的利用能若しくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。
【0174】
本開示の抗ＦＸＩ抗体の生物学的に等価なバリアントは、例えば、残基若しくは配列の様々な置換を作製すること、又は生物活性に必要とされない末端若しくは内部の残基若しくは配列を欠失することによって構築され得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失又は他のアミノ酸で置換することができる。他の文脈では、生物学的に等価な抗体は、抗体の特徴であるグリコシル化を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除又は除去する変異を含む抗ＦＸＩ抗体のバリアントを含み得る。
【0175】
種の選択性及び種の交差反応性
本開示は、ある特定の実施形態によれば、ヒトＦＸＩに結合するが、他の種からのＦＸＩには結合しない抗ＦＸＩ抗体を提供する。本開示はまた、ヒトＦＸＩ及び１つ以上の非ヒト種からのＦＸＩに結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。例えば、本開示の抗ＦＸＩ抗体は、ヒトＦＸＩに結合し得るが、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、又はチンパンジーＦＸＩのうちの１つ以上に結合してもしなくてもよい。本開示のある特定の例示的な実施形態によれば、ヒトＦＸＩに特異的に結合するが、マウス若しくはラットＦＸＩには結合しないか、又は弱くしか結合しない抗ＦＸＩ抗体が提供される。
本開示は、ある特定の実施形態によれば、ヒトＦＸＩに結合するが、他の種からのＦＸＩには結合しない抗ＦＸＩ抗体を提供する。本開示はまた、ヒトＦＸＩ及び１つ以上の非ヒト種からのＦＸＩに結合する抗ＦＸＩ抗体を含む。例えば、本開示の抗ＦＸＩ抗体は、ヒトＦＸＩに結合し得るが、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、又はチンパンジーＦＸＩのうちの１つ以上に結合してもしなくてもよい。本開示のある特定の例示的な実施形態によれば、ヒトＦＸＩに特異的に結合するが、マウス若しくはラットＦＸＩには結合しないか、又は弱くしか結合しない抗ＦＸＩ抗体が提供される。
【0176】
多特異性抗体
本開示の抗体は、単一特異性又は多特異性（例えば、二重特異性）であり得る。多特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、又は２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含み得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９；Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。本開示の抗ＦＸＩ抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質に連結されるか、又はそれと共発現される。例えば、抗体又はその断片は、別の抗体又は抗体断片などの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合、若しくは他の方法により）機能的に連結されて、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体又は多特異性抗体を産生することができる。
本開示の抗体は、単一特異性又は多特異性（例えば、二重特異性）であり得る。多特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、又は２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含み得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９；Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。本開示の抗ＦＸＩ抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質に連結されるか、又はそれと共発現される。例えば、抗体又はその断片は、別の抗体又は抗体断片などの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合、若しくは他の方法により）機能的に連結されて、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体又は多特異性抗体を産生することができる。
【0177】
本開示は、免疫グロブリンの一方のアームがヒトＦＸＩに結合し、免疫グロブリンの他方のアームが第２の抗原に特異的である、二重特異性抗体を含む。ＦＸＩ結合アームは、本明細書の表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列又はＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含み得る。
【0178】
本開示の文脈上で使用することができる例示的な二重特異性抗体の形式は、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン及び第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用を伴い、第１及び第２のＩｇＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸が互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違を欠く二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を低減する。一実施形態では、第１のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡを結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインはＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減又は消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵではＹ４３６Ｆ）を更に含み得る。第２のＣＨ３内に見出され得る更なる修飾としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵによればＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ、ＥＵによればＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）、並びにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵによればＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上述の二重特異性抗体形式のバリエーションは、本開示の範囲内であることが企図される。
【0179】
本開示の文脈で使用され得る他の例示的な二重特異性形式としては、例えば、ｓｃＦｖベース形式又はダイアボディ二重特異性形式、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ、ノブズ－イントゥ－ホールズ、共通の軽鎖（例えば、ノブズ－イントゥ－ホールズを備えた共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、及びＭａｂ２二重特異性形式が含まれるが、これらに限定されない（上述の形式の総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、及びそこに引用されている参考文献を参照されたい）。二重特異性抗体は、ペプチド／核酸結合を使用して構築することもでき、例えば、直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチド複合体を生成し、これが次に、規定される組成物、原子価及び幾何学的形状を有する多量体複合体へと自己集合する。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照されたい）。
【0180】
治療用製剤及び投与
本開示は、本開示の抗ＦＸＩ抗体又はその抗原結合断片を含む薬学的組成物を提供する。本開示の薬学的組成物は、好適な担体、賦形剤、及び移動、送達、耐容性の改善などをもたらす他の薬剤と共に製剤化される。多くの適切な製剤は、全ての薬剤師に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡなど）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型エマルション及び油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、並びにカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。
本開示は、本開示の抗ＦＸＩ抗体又はその抗原結合断片を含む薬学的組成物を提供する。本開示の薬学的組成物は、好適な担体、賦形剤、及び移動、送達、耐容性の改善などをもたらす他の薬剤と共に製剤化される。多くの適切な製剤は、全ての薬剤師に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡなど）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型エマルション及び油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、並びにカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。
【0181】
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢及び体格、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変動し得る。好ましい用量は、典型的には体重又は体表面積により計算される。成人患者では、本開示の抗体を、通常は約０．０１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で、より好ましくは約０．０２～約７、約０．０３～約５、又は約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重で静脈内投与することが有利であり得る。病態の重症度に応じて、治療の頻度及び期間を調整することができる。抗ＦＸＩ抗体を投与するための有効投薬量及びスケジュールは、経験的に決定され得、例えば、患者の進行は、定期的な評価によって監視され得、それに応じて用量が調整され得る。更に、投薬量の種間のスケーリングは、当該技術分野において周知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
【0182】
様々な送達系、例えば、リポソームにおける封入、微粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが知られており、本開示の薬学的組成物を投与するために使用され得る（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照されたい）。導入方法としては、硝子体内、眼内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入若しくはボーラス注射による、上皮又は粘膜皮膚内層（ｌｉｎｉｎｇ）（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収による任意の好都合な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は、全身又は局所であり得る。
【0183】
本開示の薬学的組成物は、標準的な針及び注射器を用いて皮下に又は静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本開示の薬学的組成物を送達する上での用途を容易に有する。かかるペン型送達デバイスは、再利用可能又は使い捨てであり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、概して、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含む新しいカートリッジと容易に交換することができる。ペン型送達デバイスは、次いで、再利用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスでは、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てのペン型送達デバイスは、デバイス内の貯蔵器に保持された薬学的組成物が事前に充填されている。貯蔵器の薬学的組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
【0184】
数多くの再利用可能なペン型送達デバイス及び自己注射器型送達デバイスは、本開示の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する。いくつか挙げると、例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつか挙げると、本開示の薬学的組成物の皮下送達に用途を有する使い捨てのペン型送達デバイスの例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射器（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ， Ｌ．Ｐ．）、及びＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0185】
ある特定の状況において、薬学的組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上記、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。更に別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、それによって全身用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照されたい）。他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３による総説において考察されている。
【0186】
注射可能な調製物としては、静脈内注射、硝子体内注射、眼内注射、皮下注射、皮内注射、及び筋肉内注射、点滴などのための剤形が含まれ得る。これらの注射可能な調製物は、公的に既知の方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来通り使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中に上述の抗体又はその塩を溶解、懸濁、又は乳化させることによって調製され得る。注射液のための水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースを含有する等張溶液及び他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、ベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用され得る、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが用いられている。このように調製された注射液は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
【0187】
有益なことに、上記に記載される経口又は非経口での使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するために好適な単位用量の剤形へと調製される。そのような単位用量の剤形には、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、注射（アンプル）、坐剤などが含まれる。含まれる前述の抗体の量は、概して、単位用量の剤形当たり約５～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、前述の抗体を約５～約１００ｍｇ含み、他の剤形については、約１０～約２５０ｍｇ含むことが好ましい。
【0188】
抗体の診断的使用
本開示は、方法であって、抗ＦＸＩ抗体（例えば、本明細書の表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列又はＣＤＲ配列のうちのいずれかを含む抗ＦＸＩ抗体）を含む治療用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示される抗ＦＸＩ抗体又はその抗原結合断片のうちのいずれか１つ以上と、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含むことができる。
本開示は、方法であって、抗ＦＸＩ抗体（例えば、本明細書の表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列又はＣＤＲ配列のうちのいずれかを含む抗ＦＸＩ抗体）を含む治療用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示される抗ＦＸＩ抗体又はその抗原結合断片のうちのいずれか１つ以上と、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、を含むことができる。
【0189】
本開示の抗体は、とりわけ、ＦＸＩ発現若しくは活性に関連するか又はそれによって媒介される任意の疾患若しくは障害の治療、予防、及び／又は改善のために有用である。本開示のＦＸＩアンタゴニスト抗体は、外因性経路を介した止血及び血餅形成に悪影響を及ぼすのを最小限に抑えながら、血栓症、特に内因性経路の血栓症を治療又は予防するために使用され得る。
【0190】
本開示は、本明細書の他の箇所に開示されるように、そのような治療を必要とする患者に抗ＦＸＩ抗体又はその抗原結合断片を投与することによって、血栓症を治療又は予防する方法を含む。
【0191】
一実施形態では、本開示の抗ＦＸＩ抗体は、第Ｖ因子ライデン、プロトロンビン遺伝子変異、凝固を阻止する天然タンパク質の欠乏（例えば、アンチトロンビン、プロテインＣ、及びプロテインＳ）、ホモシステインレベルの上昇、フィブリノーゲン又は機能不全フィブリノーゲンレベルの上昇（異常フィブリノーゲン血症）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び／又はＸＩのレベル上昇、プラズミノーゲン欠損症、プラズミノーゲン異常症、及びプラズミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ－１）レベルの上昇を含む異常な線溶系、心房細動、がん、タモキシフェン、ベバシズマブ、サリドマイド、及びレナリドマイドなど、がんの治療に使用されるいくつかの薬物の副作用、最近の外傷又は手術、中心静脈カテーテルの配置、肥満、妊娠、経口避妊薬（経口避妊薬）を含むエストロゲンの補足使用、ホルモン補充療法、長時間のベッド安静又は不動、心臓発作、うっ血性心不全、脳卒中及び活動性の減少につながる他の疾患、ヘパリン誘導性血小板減少症（ヘパリン又は低分子量ヘパリン調製物による血液中の血小板減少）、長時間の飛行機旅行、抗リン脂質抗体症候群、深部静脈血栓症又は肺塞栓症、真性多血症又は本態性血小板増加症などの骨髄増殖性疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、炎症性腸症候群、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ネフローゼ症候群、ＣＯＶＩＤ－１９感染症又はスパイクタンパク質免疫作用のうちの任意の１つ以上に関連する血栓症を治療又は予防する方法を提供し得る。
【0192】
本明細書に記載の治療の方法の文脈では、抗ＦＸＩ抗体は、単剤療法として（すなわち、唯一の治療剤として）、又は１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与され得る。
【0193】
併用療法及び製剤
本開示は、１つ以上の追加の治療活性成分と組み合わせて本明細書に記載の抗ＦＸＩ抗体のうちのいずれかを含む組成物及び治療用製剤、並びにそのような組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法を含む。
本開示は、１つ以上の追加の治療活性成分と組み合わせて本明細書に記載の抗ＦＸＩ抗体のうちのいずれかを含む組成物及び治療用製剤、並びにそのような組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法を含む。
【0194】
本開示の抗ＦＸＩ抗体は、第Ｖ因子ライデン、プロトロンビン遺伝子変異、凝固を阻止する天然タンパク質の欠乏（例えば、アンチトロンビン、プロテインＣ、及びプロテインＳ）、ホモシステインレベルの上昇、フィブリノーゲン又は機能不全フィブリノーゲンレベルの上昇（異常フィブリノーゲン血症）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び／又はＸＩのレベル上昇、プラズミノーゲン欠損症、プラズミノーゲン異常症、及びプラズミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ－１）レベルの上昇を含む異常な線溶系、心房細動、がん、タモキシフェン、ベバシズマブ、サリドマイド、及びレナリドマイドなど、がんの治療に使用されるいくつかの薬物の副作用、最近の外傷又は手術、中心静脈カテーテルの配置、肥満、妊娠、経口避妊薬（経口避妊薬）を含むエストロゲンの補足使用、ホルモン補充療法、長時間のベッド安静又は不動、心臓発作、うっ血性心不全、脳卒中及び活動性の減少につながる他の疾患、ヘパリン誘導性血小板減少症（ヘパリン又は低分子量ヘパリン調製物による血液中の血小板減少）、長時間の飛行機旅行、抗リン脂質抗体症候群、深部静脈血栓症又は肺塞栓症、真性多血症又は本態性血小板増加症などの骨髄増殖性疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、炎症性腸症候群、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ネフローゼ症候群、ＣＯＶＩＤ－１９感染症又はスパイクタンパク質免疫作用などを治療するために使用される１つ以上の薬物と共製剤化され得る。
【0195】
本開示の抗ＦＸＩ抗体はまた、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、抗酸化剤、ＣＯＸ阻害剤、及び／又はＮＳＡＩＤと組み合わせて投与及び／又は共製剤化されてもよい。抗ＦＸＩ抗体は、幹細胞療法、緑内障濾過手術、レーザー手術、又は遺伝子療法を含む他のタイプの療法と組み合わせて使用することもできる。
【0196】
追加の治療活性成分（複数可）、例えば、上に列記される薬剤又はそれらの誘導体のいずれかは、本開示の抗ＦＸＩ抗体の投与の直前に、投与と同時に、又は投与の直後に投与されてもよい（本開示の目的で、そのような投与レジメンは、追加の治療活性成分「と組み合わせた」抗ＦＸＩ抗体の投与とみなされる）。本開示には、本開示の抗ＦＸＩ抗体が、本明細書の他の箇所に記載される追加の治療活性成分（複数可）のうちの１つ以上と共製剤化される薬学的組成物が含まれる。
【0197】
投与レジメン
本開示のある特定の実施形態によれば、複数回用量の抗ＦＸＩ抗体（又は抗ＦＸＩ抗体と本明細書で言及される追加の治療活性剤のいずれかとの組み合わせを含む薬学的組成物）を所定の期間にわたって対象に投与することができる。本開示のこの態様による方法は、本開示の抗ＦＸＩ抗体の複数回用量を対象に連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与すること」は、抗ＦＸＩ抗体の各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間、又は数ヶ月）よって分けられた異なる日に、対象へ投与されることを意味する。本開示には、抗ＦＸＩ抗体の単回初回用量と、それに続く抗ＦＸＩ抗体の１回以上の２次用量、次いで任意選択的に抗ＦＸＩ抗体の１回以上の３次用量を患者に連続的に投与することを含む方法が含まれる。
本開示のある特定の実施形態によれば、複数回用量の抗ＦＸＩ抗体（又は抗ＦＸＩ抗体と本明細書で言及される追加の治療活性剤のいずれかとの組み合わせを含む薬学的組成物）を所定の期間にわたって対象に投与することができる。本開示のこの態様による方法は、本開示の抗ＦＸＩ抗体の複数回用量を対象に連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与すること」は、抗ＦＸＩ抗体の各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間、又は数ヶ月）よって分けられた異なる日に、対象へ投与されることを意味する。本開示には、抗ＦＸＩ抗体の単回初回用量と、それに続く抗ＦＸＩ抗体の１回以上の２次用量、次いで任意選択的に抗ＦＸＩ抗体の１回以上の３次用量を患者に連続的に投与することを含む方法が含まれる。
【0198】
「初回用量」、「２次用量」、及び「３次用量」という用語は、本開示の抗ＦＸＩ抗体の投与の時系列を指す。したがって、「初回用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも称される）であり、「２次用量」は、初回用量後に投与される用量であり、「３次用量」は、２次用量後に投与される用量である。初回用量、２次用量、及び３次用量は全て、同じ量の抗ＦＸＩ抗体を含み得るが、概して、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、ある特定の実施形態では、初回用量、２次用量、及び／又は３次用量に含まれる抗ＦＸＩ抗体の量は、治療経過の間に互いに異なる（例えば、必要に応じて加減される）。ある特定の実施形態では、２回以上（例えば、２、３、４、又は５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｓｅ）」として投与され、続いてより少ない頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
【0199】
本開示のある特定の例示的な実施形態では、各２次用量及び／又は３次用量は、直前の投与から１～２６（例えば、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、１５、１５１／２、１６、１６１／２、１７、１７１／２、１８、１８１／２、１９、１９１／２、２０、２０１／２、２１、２１１／２、２２、２２１／２、２３、２３１／２、２４、２４１／２、２５、２５１／２、２６、２６１／２、又はそれ以上）週間後に投与される。「直前の用量」という句は、本明細書で使用される場合、一連の複数回の投与において、介入用量のない順序での次の用量の投与の前に患者へ投与される抗ＦＸＩ抗体の用量を意味する。
【0200】
本開示のこの態様による方法は、任意の回数の２次用量及び／又は３次用量の抗ＦＸＩ抗体を患者に投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、単回の２次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回以上）の２次用量が、患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単回３次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回以上）の３次用量が、患者に投与される。投与レジメンは、特定の対象の生涯にわたって、又はそのような治療が治療的に必要でなくなるか、若しくは有利でなくなるまで無期限に実施され得る。
【0201】
複数回の２次用量を伴う実施形態では、各２次用量は、他の２次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各２次用量は、直前の用量の１～２週間後又は１～２ヶ月後に、患者に投与され得る。同様に、複数回の３次用量を伴う実施形態では、各３次用量は、他の３次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各３次用量は、直前の用量の２～１２週間後に患者に投与され得る。本開示のある特定の実施形態では、２次用量及び／又は３次用量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過中に調整され得る。
【0202】
本開示は、２～６回の負荷用量が第１の頻度（例えば、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回など）で患者に投与され、続いてより少ない頻度で２回以上の維持用量が患者に投与される、投与レジメンを含む。例えば、本開示のこの態様によれば、負荷用量が月に１回の頻度で投与される場合、維持用量は６週間に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回などで患者に投与されてもよい。
【0203】
抗体の診断的使用
本開示の抗ＦＸＩ抗体は、例えば、診断目的のために、試料中のＦＸＩ又はＦＸＩ発現細胞を検出及び／又は測定するために使用され得る。例えば、抗ＦＸＩ抗体又はその断片を使用して、ＦＸＩの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現欠如など）を特徴とする状態又は疾患を診断してもよい。ＦＸＩについての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を、本開示の抗ＦＸＩ抗体と接触させることを含み得、抗ＦＸＩ抗体は、検出可能な標識若しくはレポーター分子で標識される。代替的に、非標識抗ＦＸＩ抗体は、それ自体が検出可能に標識される二次抗体と組み合わせて、診断用途に使用することができる。検出可能な標識又はレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、若しくは１２５Ｉなどの放射性同位体、又はフルオレセインイソチオシアネート若しくはローダミンなどの蛍光部分若しくは化学発光部分、又はアルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、若しくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＦＸＩを検出又は測定するために使用することができる具体的な例示的アッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。
本開示の抗ＦＸＩ抗体は、例えば、診断目的のために、試料中のＦＸＩ又はＦＸＩ発現細胞を検出及び／又は測定するために使用され得る。例えば、抗ＦＸＩ抗体又はその断片を使用して、ＦＸＩの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現欠如など）を特徴とする状態又は疾患を診断してもよい。ＦＸＩについての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を、本開示の抗ＦＸＩ抗体と接触させることを含み得、抗ＦＸＩ抗体は、検出可能な標識若しくはレポーター分子で標識される。代替的に、非標識抗ＦＸＩ抗体は、それ自体が検出可能に標識される二次抗体と組み合わせて、診断用途に使用することができる。検出可能な標識又はレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、若しくは１２５Ｉなどの放射性同位体、又はフルオレセインイソチオシアネート若しくはローダミンなどの蛍光部分若しくは化学発光部分、又はアルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、若しくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＦＸＩを検出又は測定するために使用することができる具体的な例示的アッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。
【0204】
本開示によるＦＸＩ診断アッセイにおいて使用することができる試料には、正常条件又は病理学的条件下で、検出可能な量のＦＸＩタンパク質又はその断片を含む、患者から得ることのできる任意の組織又は体液試料が含まれる。一般に、健常な患者（例えば、異常なＦＸＩレベル又は活性と関連した疾患又は状態に罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＦＸＩのレベルは、ＦＸＩのベースラインレベル又は標準レベルを最初に確立するために測定される。次いで、このＦＸＩのベースラインレベルを、ＦＸＩに関連する疾患又は状態を有することが疑われる個体から得られた試料において測定されたＦＸＩのレベルに対して比較することができる。
【実施例】
【0205】
以下の実施例は、本開示の方法及び組成物をどのように作製及び使用するかに関する完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本開示とみなすことの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に指示しない限り、部（ｐａｒｔｓ）は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、気圧は大気圧又はそれに近い。
【0206】
実施例１
ＦＸＩのＡ２ドメインに対するヒト抗体の生成
ＦＸＩのＡ２ドメインに対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むマウスにおいて生成された。一実施形態では、ヒト抗体は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて生成された。一実施形態では、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）（ＶＩ）マウスを、ヒトＦＸＩで免疫化した。抗体の免疫応答を、ＦＸＩ特異的イムノアッセイにより監視した。例えば、血清を、精製された全長ＦＸＩに対する特定の抗体価についてアッセイした。抗体産生クローンを、Ｂ細胞選別技術（ＢＳＴ）及びハイブリドーマ法の両方を使用して単離した。例えば、所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングかつ選択して、ＦＸＩ特異的抗体を産生する細胞株を特定した。
ＦＸＩのＡ２ドメインに対するヒト抗体の生成
ＦＸＩのＡ２ドメインに対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むマウスにおいて生成された。一実施形態では、ヒト抗体は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて生成された。一実施形態では、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）（ＶＩ）マウスを、ヒトＦＸＩで免疫化した。抗体の免疫応答を、ＦＸＩ特異的イムノアッセイにより監視した。例えば、血清を、精製された全長ＦＸＩに対する特定の抗体価についてアッセイした。抗体産生クローンを、Ｂ細胞選別技術（ＢＳＴ）及びハイブリドーマ法の両方を使用して単離した。例えば、所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングかつ選択して、ＦＸＩ特異的抗体を産生する細胞株を特定した。
【0207】
抗ＦＸＩ抗体はまた、米国特許第７５８２２９８号（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されているように、骨髄腫細胞に融合することなく、抗原陽性マウスＢ細胞から直接単離した。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗ＦＸＩ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインを有する抗体）を得た。
【0208】
この実施例の方法により生成された例示的な抗体、対照、及び比較対象の生物学的特性を、以下に記載の実施例において詳細に記載する。
【0209】
実施例２
重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列
表１の列２及び４は、本開示の例示的な抗ＦＸＩ抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、並びにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。本開示の例示的な抗ＦＸＩ抗体の対応する核酸配列識別子を表１の列３及び５に記載する。
重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列
表１の列２及び４は、本開示の例示的な抗ＦＸＩ抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、並びにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。本開示の例示的な抗ＦＸＩ抗体の対応する核酸配列識別子を表１の列３及び５に記載する。
【表1】
【0210】
配列番号１７は、以下の１文字アミノ酸配列を含む：ＡＡＳ。
【0211】
配列番号１８は、以下のヌクレオチド配列を含む：ＧＣＴＧＣＡＴＣＣ。
【0212】
例示的な全長抗ＦＸＩ抗体は、完全ヒトＦｃガンマ４重鎖（すなわち、ＩｇＧ４ Ｆｃ）及び完全ヒト軽鎖配列を含む。しかしながら、当業者に理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換され得る（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換され得る等）が、いずれにしても、表１に示される数値識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は、同じままであり、抗原への結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず同一であるか、又は実質的に類似していると予測される。
【0213】
以下の実施例で使用される対照構築物
比較目的のために、ＣＯＭＰ３４４８と表示される対照構築物（抗ＦＸＩ Ａ２ドメイン抗体）を本明細書に開示される実験に含めた：米国特許第８，３８８，９５９号（その全容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載の抗体「１４Ｅ１１」のＶＨ／ＶＬ配列を有する「ｆＸＩに特異的なモノクローナル抗体」。
比較目的のために、ＣＯＭＰ３４４８と表示される対照構築物（抗ＦＸＩ Ａ２ドメイン抗体）を本明細書に開示される実験に含めた：米国特許第８，３８８，９５９号（その全容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載の抗体「１４Ｅ１１」のＶＨ／ＶＬ配列を有する「ｆＸＩに特異的なモノクローナル抗体」。
【0214】
実施例３
２５℃及び３７℃で測定された異なるＦＸＩ試薬に結合する抗ＦＸＩモノクローナル抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合速度論
精製された抗ＦＸＩモノクローナル抗体に結合する異なるＦＸＩ試薬の平衡解離定数（ＫＤ）は、リアルタイム表面プラズモン共鳴ベースのＢｉａｃｏｒｅ８Ｋバイオセンサーを使用して決定された。全ての結合研究は、２５℃及び３７℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－Ｐ）の泳動用緩衝液中で行われた。ＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサーチップの表面を、最初にマウス抗ヒトＦｃ特異的モノクローナル抗体（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ）とのアミンカップリングによって誘導体化して、抗ＦＸＩモノクローナル抗体を捕捉した。結合研究は、ヒトＦＸＩ（酵素原；第ＸＩ因子タンパク質、ヒト血漿、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ，ｃａｔＨＦＸＩ １１１１）及びＦＸＩａ（活性化；第ＸＩａ因子タンパク質、ヒト血漿、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ，ｃａｔ．ＨＦＸＩａ １１１１ａ）で行われた。異なる濃度のｈＦＸＩ及びｈＦＸＩａ（２５ｎＭ～０．３９ｎＭ、４倍連続希釈液）を、最初にＨＢＳ－Ｐ泳動用緩衝液において調製し、抗ヒトＦｃ捕捉抗ＦＸＩモノクローナル抗体の表面上に、３０μＬ／分の流量で３分間注入し、この間、モノクローナル抗体結合ＦＸＩ試薬の解離を、ＨＢＳ－Ｐ泳動用緩衝液中で１０分間監視した。会合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）の定数は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線あてはめソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、物質移動限界（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を有する１：１結合モデルにあてはめることによって決定された。結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）を、運動速度から以下のように計算した。
２５℃及び３７℃で測定された異なるＦＸＩ試薬に結合する抗ＦＸＩモノクローナル抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合速度論
精製された抗ＦＸＩモノクローナル抗体に結合する異なるＦＸＩ試薬の平衡解離定数（ＫＤ）は、リアルタイム表面プラズモン共鳴ベースのＢｉａｃｏｒｅ８Ｋバイオセンサーを使用して決定された。全ての結合研究は、２５℃及び３７℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－Ｐ）の泳動用緩衝液中で行われた。ＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサーチップの表面を、最初にマウス抗ヒトＦｃ特異的モノクローナル抗体（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ）とのアミンカップリングによって誘導体化して、抗ＦＸＩモノクローナル抗体を捕捉した。結合研究は、ヒトＦＸＩ（酵素原；第ＸＩ因子タンパク質、ヒト血漿、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ，ｃａｔＨＦＸＩ １１１１）及びＦＸＩａ（活性化；第ＸＩａ因子タンパク質、ヒト血漿、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ，ｃａｔ．ＨＦＸＩａ １１１１ａ）で行われた。異なる濃度のｈＦＸＩ及びｈＦＸＩａ（２５ｎＭ～０．３９ｎＭ、４倍連続希釈液）を、最初にＨＢＳ－Ｐ泳動用緩衝液において調製し、抗ヒトＦｃ捕捉抗ＦＸＩモノクローナル抗体の表面上に、３０μＬ／分の流量で３分間注入し、この間、モノクローナル抗体結合ＦＸＩ試薬の解離を、ＨＢＳ－Ｐ泳動用緩衝液中で１０分間監視した。会合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）の定数は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線あてはめソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、物質移動限界（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を有する１：１結合モデルにあてはめることによって決定された。結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）を、運動速度から以下のように計算した。
【数1】
【0215】
２５℃及び３７℃での本開示の主題の抗ＦＸＩモノクローナル抗体及びアイソタイプ対照に結合するｈＦＸＩ又はｈＦＸＩａの結合の結合動態パラメータを、表２及び３に示す。
【0216】
表２に示すように、抗ＦＸＩモノクローナル抗体は、２５℃で、３５．１ｐＭ～７．５３ｐＭの範囲のＫＤ値で、ｈＦＸＩに結合した。表２に示すように、抗ｈＦＸＩモノクローナル抗体は、３７℃で、１３．７ｐＭ～４８．３ｐＭの範囲のＫＤ値で、ｈＦＸＩに結合した。
【0217】
表３に示すように、抗ＦＸＩモノクローナル抗体は、２５℃で、２５７ｐＭ～２６９ｐＭの範囲のＫＤ値で、ｈＦＸＩａに結合した。表３に示すように、抗ＦＸＩモノクローナル抗体は、３７℃で、７６３ｐＭ～８９３ｐＭの範囲のＫＤ値で、ｈＦＸＩａに結合した。
【表2-1】
【表2-2】
【表3】
【0218】
実施例４
活性化部分トロンボプラスチン時間バイオアッセイ
実験手順：
ＢＩＯＰＨＥＮ第ＸＩａ因子キット（ＨＹＰＨＥＮ ＢｉｏＭｅｄ， Ｎｅｕｖｉｌｌｅ－ｓｕｒ－Ｏｉｓｅ，ＦＲ，ｃａｔ．＃２２０４１２）を使用して、活性第Ｘａ因子（ＦＸａ）の生成につながる、酵素原第ＦＸＩ因子（ＦＸＩ）又は事前に活性化されたＦＸＩａの活性を阻害する本開示の抗ＦＸＩ抗体の能力を評価した。本開示の抗体による阻害は、ＦＸａによって変換される発色基質の量の減少を測定することによって決定された（ＢＩＯＰＨＥＮキット成分Ｒ３）。試薬１Ｂ（ヒト第ＩＸ因子）及びＦＸＩａキャリブレータ（Ｃａｌ）を除き、ＢＩＯＰＨＥＮキット内の全ての試薬をアッセイで使用した。
活性化部分トロンボプラスチン時間バイオアッセイ
実験手順：
ＢＩＯＰＨＥＮ第ＸＩａ因子キット（ＨＹＰＨＥＮ ＢｉｏＭｅｄ， Ｎｅｕｖｉｌｌｅ－ｓｕｒ－Ｏｉｓｅ，ＦＲ，ｃａｔ．＃２２０４１２）を使用して、活性第Ｘａ因子（ＦＸａ）の生成につながる、酵素原第ＦＸＩ因子（ＦＸＩ）又は事前に活性化されたＦＸＩａの活性を阻害する本開示の抗ＦＸＩ抗体の能力を評価した。本開示の抗体による阻害は、ＦＸａによって変換される発色基質の量の減少を測定することによって決定された（ＢＩＯＰＨＥＮキット成分Ｒ３）。試薬１Ｂ（ヒト第ＩＸ因子）及びＦＸＩａキャリブレータ（Ｃａｌ）を除き、ＢＩＯＰＨＥＮキット内の全ての試薬をアッセイで使用した。
【0219】
ＦＸＩ又はＦＸＩａの用量依存的活性を試験するために、正常なヒト血漿を、最初に、提供されたＴｒｉｓ－ＢＳＡ緩衝液（アッセイのための希釈緩衝液として使用される）中で０．６５％の血漿に希釈し、次いで、無血漿対照と共に０．０２１％の血漿に連続的に希釈した。正常なヒト血漿も０．１３％又は０．１５％のいずれかの血漿に希釈した。抗体（抗ＦＸＩ、対照、及び比較対象）を、緩衝液単独試料を用いて、５００ｎＭ又は３００ｎＭのいずれかの開始濃度から５．１ｐＭの濃度に連続希釈した。酵素原ＦＸＩの阻害のために、抗ＦＸＩ抗体を、希釈した血漿と共に２５℃で３０分間事前にインキュベートし、続いて２５℃で０．３２μＭのａＰＴＴ－ＸＬエラグ酸と更に３０分間インキュベートした。活性ＦＸＩａの阻害のために、希釈した血漿を、０．３２μＭのａＰＴＴ－ＸＬエラグ酸で、２５℃で３０分間予め活性化し、続いて、抗ＦＸＩ抗体で、２５℃で３０分間インキュベートした。
【0220】
血漿をエラグ酸及び抗体とインキュベートした後、試薬１Ａ（Ｈｕｍａｎ ＦＸ、ＦＶＩＩＩ：Ｃ、フィブリン重合阻害剤）を添加し、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、試薬２（トロンビン、リン脂質、及びカルシウム）を添加し、３７℃で５分間インキュベートした。最後に、試薬３（ＳＸａ－１１ ＦＸａ基質）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。吸光度を、４０５ｎｍの波長でＦＬＥＸＳＴＡＴＩＯＮ ３ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で測定した。ＰＲＩＳＭ（登録商標）６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いた非線形回帰（４パラメータロジスティック）を使用して結果を分析して、ＥＣ５０及びＩＣ５０値を得た。阻害パーセントは、以下の等式２に基づいて計算した。
【数2】
【0221】
この等式では、「吸光度希釈血漿」は、いずれの抗体も添加せずにＦＸＩをＦＸＩａに切断するために、０．３２μＭのａＰＴＴ－ＸＬエラグ酸で活性化された希釈血漿（０．１３％又は０．１５％の血漿のいずれか）の４０５ｎｍでの吸光度測定を指す。「吸光度阻害」は、０．３２μＭのエラグ酸によって活性化された希釈血漿による特定の抗体の用量応答からの４０５ｎｍでの最小吸光度測定を指す。「吸光度無血漿対照」は、任意の血漿の不在下でのＴｒｉｓ－ＢＳＡ緩衝液単独の４０５ｎｍでの吸光度測定を指す。
【表4】
【0222】
表４に示すように、抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体は、３９～２２０ｐＭ（一実施例では、３９ｐＭ）の範囲のＩＣ５０値で希釈正常血漿におけるＦＸＩの阻害を示し、最大阻害は８５～８７％（一実施例では、８５％）の範囲であった。本開示の抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体はまた、６８０ｐＭ～１０ｎＭ超（一実施例では、１０ｎＭ）の範囲のＩＣ５０値で希釈血漿におけるＦＸＩａを阻害し、最大阻害は、２２％～２５％の範囲であり、一実施例では、２５％である）。比較対象ｍＡｂは、２７ｐＭ～２９ｐＭの範囲のＩＣ５０値を有するＦＸＩの阻害を示し、最大阻害は８６％～１０６％の範囲であった。比較対象ｍＡｂはまた、１０ｎＭ超～５ｎＭ超の範囲のＩＣ５０値でＦＸＩａの阻害を示し、最大阻害は３５％～３８％の範囲であった。アイソタイプ対照ｍＡｂは、ＦＸＩａの阻害を示さなかったが、抗体の高濃度でＦＸＩの阻害を示し、ＩＣ５０値は１００ｎＭ超～１２０ｎｍの範囲であり、最大阻害は５８～１０２％の範囲の阻害であった。
【0223】
実施例５
ＦＸＩサブユニットに対する抗ＦＸＩ結合特異性
ヒトＦＸＩの異なる切断ａｐｐｌｅドメインに対する様々な抗ＦＸＩモノクローナル抗体の結合特異性は、ＯＣＴＥＴＨＴＸバイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）でのリアルタイムラベルフリーバイオレイヤー干渉法アッセイを使用して決定された。実験は、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振盪しながら、２５℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％ ｖ／ｖの界面活性剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＢＴ）の緩衝液中で行われた。組換えヒトＦＸＩタンパク質上のそれらのそれぞれのエピトープへの抗ＦＸＩモノクローナル抗体の結合を、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＦＸＩ（ｈＦＸＩ－ｍｍｈ；配列番号２２）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＦＸＩ ＰＫＡ１ドメイン（ｈＦＸＩ－ＰＫＡ１－ｍｍｈ；配列番号２３）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＦＸＩ ＰＫＡ２ドメイン（ｈＦＸＩ－ＰＫＡ２－ｍｍｈ；配列番号２４）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＦＸＩ ＰＫＡ３ドメイン（ｈＦＸＩ－ＰＫＡ３－ｍｍｈ；配列番号２５）、及びＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＦＸＩ ＰＫＡ４ドメイン（ｈＦＸＩ－ＰＫＡ４－ｍｍｈ；配列番号２６）（まとめてＦＸＩ－ｍｍｈ試薬）を使用して試験した。ＰＫ（血漿カリクレイン）でマークされたＦＸＩ－ｍｍｈ試薬は、特定されたａｐｐｌｅドメインを対応するＰＫａｐｐｌｅドメインに置き換えており、結合特異性は、本明細書に記載の組換えヒトＦＸＩタンパク質上の抗体のそれぞれのエピトープへの非結合によって決定されることを意味する。例えば、ｈＦＸＩ－ＰＫＡ２－ｍｍｈが血漿カリクレインａｐｐｌｅドメイン２を発現するため、対象のｍＡｂは、ｈＦＸＩ－ＰＫＡ２－ｍｍｈではなく、ｈＦＸＩ－ＰＫＡ１－ｍｍｈ、ｈＦＸＩ－ＰＫＡ３－ｍｍｈ、及びｈＦＸＩ－ＰＫＡ４－ｍｍｈにのみ結合すると仮定される。
ＦＸＩサブユニットに対する抗ＦＸＩ結合特異性
ヒトＦＸＩの異なる切断ａｐｐｌｅドメインに対する様々な抗ＦＸＩモノクローナル抗体の結合特異性は、ＯＣＴＥＴＨＴＸバイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）でのリアルタイムラベルフリーバイオレイヤー干渉法アッセイを使用して決定された。実験は、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振盪しながら、２５℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％ ｖ／ｖの界面活性剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＢＴ）の緩衝液中で行われた。組換えヒトＦＸＩタンパク質上のそれらのそれぞれのエピトープへの抗ＦＸＩモノクローナル抗体の結合を、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＦＸＩ（ｈＦＸＩ－ｍｍｈ；配列番号２２）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＦＸＩ ＰＫＡ１ドメイン（ｈＦＸＩ－ＰＫＡ１－ｍｍｈ；配列番号２３）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＦＸＩ ＰＫＡ２ドメイン（ｈＦＸＩ－ＰＫＡ２－ｍｍｈ；配列番号２４）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＦＸＩ ＰＫＡ３ドメイン（ｈＦＸＩ－ＰＫＡ３－ｍｍｈ；配列番号２５）、及びＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現されたヒトＦＸＩ ＰＫＡ４ドメイン（ｈＦＸＩ－ＰＫＡ４－ｍｍｈ；配列番号２６）（まとめてＦＸＩ－ｍｍｈ試薬）を使用して試験した。ＰＫ（血漿カリクレイン）でマークされたＦＸＩ－ｍｍｈ試薬は、特定されたａｐｐｌｅドメインを対応するＰＫａｐｐｌｅドメインに置き換えており、結合特異性は、本明細書に記載の組換えヒトＦＸＩタンパク質上の抗体のそれぞれのエピトープへの非結合によって決定されることを意味する。例えば、ｈＦＸＩ－ＰＫＡ２－ｍｍｈが血漿カリクレインａｐｐｌｅドメイン２を発現するため、対象のｍＡｂは、ｈＦＸＩ－ＰＫＡ２－ｍｍｈではなく、ｈＦＸＩ－ＰＫＡ１－ｍｍｈ、ｈＦＸＩ－ＰＫＡ３－ｍｍｈ、及びｈＦＸＩ－ＰＫＡ４－ｍｍｈにのみ結合すると仮定される。
【0224】
ＦＸＩ－ｍｍｈ試薬を、まず、抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体でコーティングしたＯＣＴＥＴバイオセンサー先端（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ，ｃａｔ．＃１８－５１２２）上に、ヒトＦＸＩ－ｍｍｈ試薬の１００ｎＭの溶液を各々含むウェルにバイオセンサー先端を２分間浸すことによって個々に捕捉した。次いで、得られた抗原捕捉バイオセンサー先端を、１３３ｎＭの抗ＦＸＩモノクローナル抗体溶液を含むウェルに１８０秒間浸すことによって、各抗ＦＸＩモノクローナル抗体と個々に飽和させた。次いで、バイオセンサー先端を、実験の各ステップ間に、ＨＢＳ－ＥＴＢ緩衝液で洗浄した。リアルタイム結合応答を、実験の全過程中監視し、各ステップの終わりに結合応答を記録した。表５に示されるように、抗ＦＸＩモノクローナル抗体の結合特異性応答を、異なる切断ＦＸＩ－ｍｍｈ試薬と比較した。
【表5】
【0225】
実施例６
競合アッセイ
６．１：Ａｐｐｌｅ ２ドメインの競合結合
抗ＦＸＩモノクローナル抗体間の結合競合は、ＯＣＴＥＴＨＴＸバイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）でのリアルタイムラベルフリーバイオレイヤー干渉法アッセイを使用して決定した。全実験は、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振盪しながら、２５℃で、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｏｃｔｅｔ ＨＢＳ－Ｐ緩衝液）中で行われた。任意の２つの抗体が、ヒトＦＸＩ（ＥＲＬ）（ヒト血漿からの第ＸＩ因子タンパク質、Ｅｎｓｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ，ｃａｔ．＃ＨＦＸＩ １１１１）上のそれらのそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合することができるかを評価するために、約１．５～２．８ｎＭの抗ヒトＦＸＩモノクローナル抗体を、まず、先端を、５分間、５０μｇ／ｍＬの抗ヒトＦＸＩモノクローナル抗体（以降、第１のｍＡｂと称される）溶液を含むウェルに浸すことによって、抗ｈＦｃ抗体でコーティング（ＡＨＣ）したＯＣＴＥＴバイオセンサー先端（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．，＃１８－５０６０，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）上に捕捉した。次いで、抗体を捕捉したバイオセンサー先端を、５０μｇ／ｍＬの遮断ｍＡｂ溶液を含むウェルに４分間浸すことによって、遮断Ｈ４Ｈアイソタイプ（ヒトＩｇＧ４）対照モノクローナル抗体（以降、遮断ｍＡｂと称される）で飽和した。次いで、バイオセンサー先端を、事前に２時間インキュベートされた２５ｎＭのｈＦＸＩ（ＥＲＬ，＃ＨＦＸＩ １１１１）及び１μＭの第２の抗ヒトＦＸＩモノクローナル抗体（以降、第２のｍＡｂと称される）の共複合体化溶液を含むウェルに浸した。バイオセンサーチップは、実験の各ステップ間に、オクテットＨＢＳ－Ｐ緩衝液で洗浄した。
競合アッセイ
６．１：Ａｐｐｌｅ ２ドメインの競合結合
抗ＦＸＩモノクローナル抗体間の結合競合は、ＯＣＴＥＴＨＴＸバイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）でのリアルタイムラベルフリーバイオレイヤー干渉法アッセイを使用して決定した。全実験は、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振盪しながら、２５℃で、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｏｃｔｅｔ ＨＢＳ－Ｐ緩衝液）中で行われた。任意の２つの抗体が、ヒトＦＸＩ（ＥＲＬ）（ヒト血漿からの第ＸＩ因子タンパク質、Ｅｎｓｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ，ｃａｔ．＃ＨＦＸＩ １１１１）上のそれらのそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合することができるかを評価するために、約１．５～２．８ｎＭの抗ヒトＦＸＩモノクローナル抗体を、まず、先端を、５分間、５０μｇ／ｍＬの抗ヒトＦＸＩモノクローナル抗体（以降、第１のｍＡｂと称される）溶液を含むウェルに浸すことによって、抗ｈＦｃ抗体でコーティング（ＡＨＣ）したＯＣＴＥＴバイオセンサー先端（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．，＃１８－５０６０，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）上に捕捉した。次いで、抗体を捕捉したバイオセンサー先端を、５０μｇ／ｍＬの遮断ｍＡｂ溶液を含むウェルに４分間浸すことによって、遮断Ｈ４Ｈアイソタイプ（ヒトＩｇＧ４）対照モノクローナル抗体（以降、遮断ｍＡｂと称される）で飽和した。次いで、バイオセンサー先端を、事前に２時間インキュベートされた２５ｎＭのｈＦＸＩ（ＥＲＬ，＃ＨＦＸＩ １１１１）及び１μＭの第２の抗ヒトＦＸＩモノクローナル抗体（以降、第２のｍＡｂと称される）の共複合体化溶液を含むウェルに浸した。バイオセンサーチップは、実験の各ステップ間に、オクテットＨＢＳ－Ｐ緩衝液で洗浄した。
【0226】
リアルタイム結合応答を、実験の過程中監視し、各ステップの終わりに結合応答を記録した。第１のｍＡｂに結合する、ヒトＦＸＩと事前に複合体化された第２のｍＡｂの応答を、バックグラウンド結合について修正し、比較し、異なる抗ＦＸＩモノクローナル抗体の競合／非競合挙動を決定した。
【0227】
表６は、結合の順序に関係なく、両方向で競合する抗体の関係を明示的に定義する。ここで、抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、ＦＸＩのＡ２（ａｐｐｌｅ ２）ドメインに結合することが知られているＨ４Ｈ２９８０１Ｐ２と血漿由来のｈＦＸＩへの結合について競合する。
【表6】
【0228】
６．２：ＦＸＩ競合結合
抗ＦＸＩモノクローナル抗体と陰性アイソタイプ対照との間の第２の結合競合を、以下の材料及び方法を使用して実施した。
抗ＦＸＩモノクローナル抗体と陰性アイソタイプ対照との間の第２の結合競合を、以下の材料及び方法を使用して実施した。
【0229】
材料
使用された機器：Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ ３８４ ＲＥＤ
温度：２５℃
泳動用緩衝液：ＨＢＳ－Ｐ＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ ７．４
センサーのタイプ：ＦｏｒｔｅＢＩＯ Ａｎｔｉ－ｈＦｃ
捕捉流量／時間：１０００ｒｐｍ、３００秒（ｍＡｂ－１）、３００秒の会合（Ａｇ ｍＡｂ－２プレミックス）１８０秒の解離ｍＡｂ－２
使用された機器：Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ ３８４ ＲＥＤ
温度：２５℃
泳動用緩衝液：ＨＢＳ－Ｐ＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ ７．４
センサーのタイプ：ＦｏｒｔｅＢＩＯ Ａｎｔｉ－ｈＦｃ
捕捉流量／時間：１０００ｒｐｍ、３００秒（ｍＡｂ－１）、３００秒の会合（Ａｇ ｍＡｂ－２プレミックス）１８０秒の解離ｍＡｂ－２
【0230】
方法
約１．５～２．８ｎｍのα－ヒトＦＸＩ ｍＡｂを、５０μｇ／ｍＬのα－ヒトＦＸＩ ｍＡｂを含むウェルにα－ｈＦｃでコーティングされたＯｃｔｅｔバイオセンサーを５分間浸すことによって捕捉した。Ｈ４Ｈ ｈＦｃ（アイソタイプ対照）を、陰性対照として使用した。未占有のα－ｈＦｃ Ｏｃｔｅｔセンサーを、遮断ｍＡｂ溶液（５０μｇ／ｍＬのＨ４ＨヒトＦｃ（アイソタイプ対照）１）を含むウェルに４分間浸すことによって飽和した。２５ｎＭのｈＦＸＩ（ＥＲＬ）を、５０μｇ／ｍＬのＨ４Ｈ ｈＦｃを含む緩衝液中の１ｕＭのα－ＦＸＩ ｍＡｂと少なくとも１時間事前にインキュベートした。次に、遮断ｍＡｂ飽和Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを、αＣ５ ｍＡｂ及びｈＣ５のプレミックスを含むウェルに５分間浸した。各サイクルの終わりに、α－ｈＦｃ Ｏｃｔｅｔセンサーを、１０ｍＭのＨＣｌ中で再生した。分析中、自己－自己バックグラウンドシグナル（捕捉表面へのｍＡｂ結合）は、カラム全体から差し引かれた。ｍＡｂ－１の結合応答を記録し、競合／非競合ｍＡｂを、それらのそれぞれのｍＡｂ－２結合応答に基づいてビニングした。
約１．５～２．８ｎｍのα－ヒトＦＸＩ ｍＡｂを、５０μｇ／ｍＬのα－ヒトＦＸＩ ｍＡｂを含むウェルにα－ｈＦｃでコーティングされたＯｃｔｅｔバイオセンサーを５分間浸すことによって捕捉した。Ｈ４Ｈ ｈＦｃ（アイソタイプ対照）を、陰性対照として使用した。未占有のα－ｈＦｃ Ｏｃｔｅｔセンサーを、遮断ｍＡｂ溶液（５０μｇ／ｍＬのＨ４ＨヒトＦｃ（アイソタイプ対照）１）を含むウェルに４分間浸すことによって飽和した。２５ｎＭのｈＦＸＩ（ＥＲＬ）を、５０μｇ／ｍＬのＨ４Ｈ ｈＦｃを含む緩衝液中の１ｕＭのα－ＦＸＩ ｍＡｂと少なくとも１時間事前にインキュベートした。次に、遮断ｍＡｂ飽和Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを、αＣ５ ｍＡｂ及びｈＣ５のプレミックスを含むウェルに５分間浸した。各サイクルの終わりに、α－ｈＦｃ Ｏｃｔｅｔセンサーを、１０ｍＭのＨＣｌ中で再生した。分析中、自己－自己バックグラウンドシグナル（捕捉表面へのｍＡｂ結合）は、カラム全体から差し引かれた。ｍＡｂ－１の結合応答を記録し、競合／非競合ｍＡｂを、それらのそれぞれのｍＡｂ－２結合応答に基づいてビニングした。
【0231】
結果及び考察
【表7】
【表8】
【0232】
主題のｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３及びＨ４Ｈ２９８０１Ｐ２は、双方向に交差競合した。
【0233】
実施例７
凝固時間及びトロンビン生成（ＴＧＡ）のための機能的血漿アッセイ
凝固因子は、血小板と共に、血管損傷中の止血のプロセスに関連する血液成分である。調節（すなわち、産生及び／又は活性）で不均衡が発生した場合、これらの構成成分が血栓症の原動力となり得ることは十分に確立されている。血栓性疾患は主に（組織因子を介して）外因性経路の異常な活性化から生じると考えられていたが、最近では、Ｆ１１以前の膝関節形成術に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した臨床研究が、術後の静脈血栓症を予防することが見出された（Ｂuｌｌｅｒ ＨＲ，Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｃ，Ｂｈａｎｏｔ Ｓ，Ｇａｉｌａｎｉ Ｄ，Ｍｏｎｉａ ＢＰ，Ｒａｓｋｏｂ ＧＥ，Ｓｅｇｅｒｓ Ａ，Ｖｅｒｈａｍｍｅ Ｐ，Ｗｅｉｔｚ ＪＩ．Ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５ Ｊａｎ １５；３７２（３）：２３２－４０）。したがって、ＦＸＩ活性の阻害は、血栓性凝固の低減に重要である（Ｗｅｉｔｚ ＪＩ．Ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｎｅｗ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．２０１６ Ｍａｙ；１４１ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ４０－５）。
凝固時間及びトロンビン生成（ＴＧＡ）のための機能的血漿アッセイ
凝固因子は、血小板と共に、血管損傷中の止血のプロセスに関連する血液成分である。調節（すなわち、産生及び／又は活性）で不均衡が発生した場合、これらの構成成分が血栓症の原動力となり得ることは十分に確立されている。血栓性疾患は主に（組織因子を介して）外因性経路の異常な活性化から生じると考えられていたが、最近では、Ｆ１１以前の膝関節形成術に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した臨床研究が、術後の静脈血栓症を予防することが見出された（Ｂuｌｌｅｒ ＨＲ，Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｃ，Ｂｈａｎｏｔ Ｓ，Ｇａｉｌａｎｉ Ｄ，Ｍｏｎｉａ ＢＰ，Ｒａｓｋｏｂ ＧＥ，Ｓｅｇｅｒｓ Ａ，Ｖｅｒｈａｍｍｅ Ｐ，Ｗｅｉｔｚ ＪＩ．Ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５ Ｊａｎ １５；３７２（３）：２３２－４０）。したがって、ＦＸＩ活性の阻害は、血栓性凝固の低減に重要である（Ｗｅｉｔｚ ＪＩ．Ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｎｅｗ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．２０１６ Ｍａｙ；１４１ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ４０－５）。
【0234】
この実施例は、抗ＦＸＩ抗体が、４回の機能的血漿アッセイにおいてヒトＦＸＩに結合し、その活性を阻害することを実証する。エラグ酸によって誘発された１）活性化部分トロンボプラスチンの時間（ａＰＴＴ）、２）プロトロンビンの時間（ＰＴ）、３）トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）、及び組織因子によって誘発された４）ＴＧＡ。ａＰＴＴ試験は、カルシウム及びエラグ酸の添加後に凝固が形成される時間を測定することによって、凝固カスケードの内因性及び共通経路の全ての凝固因子を評価するが、ＰＴ試験は、カルシウム及び組織因子の添加後に凝固カスケードの外因性及び共通経路の全ての凝固因子を評価する。エラグ酸によって誘発されたＴＧＡは、内因性経路及び共通経路を介して生成されたトロンビンの速度及び量を測定するが、組織因子によって誘発されたＴＧＡは、外因性経路及び共通経路を介して生成されるトロンビンの速度及び量を測定する。
【0235】
実験手順：
ａＰＴＴは、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＳＴＡＧＯ ＳＴＡＲＴ４ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄａｉｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）で、以下の様式で決定された。合計５０μｌのプールされた正常ヒト血漿を３７℃でキュベットに添加した。１分後、５μｌの２倍連続希釈したＰＢＳ中の試験物質（抗体又は小分子阻害剤）をキュベットに添加し、５分間インキュベートした。次いで、５０μｌのＡＰＰＴ－ＸＬエラグ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を添加し、３００秒間インキュベートした後、５０μｌの２０ｍＭの塩化カルシウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を添加して、反応を開始させた。試験物質濃度の測定された凝固時間を、ベースライン（薬物なし）血漿凝固時間に正規化し、試験物質の対数モル濃度に対してプロットした。ＰＲＩＳＭ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いた非線形回帰（４パラメータロジスティクス）を使用して結果を分析して、倍加時間濃度を得た。
ａＰＴＴは、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＳＴＡＧＯ ＳＴＡＲＴ４ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄａｉｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）で、以下の様式で決定された。合計５０μｌのプールされた正常ヒト血漿を３７℃でキュベットに添加した。１分後、５μｌの２倍連続希釈したＰＢＳ中の試験物質（抗体又は小分子阻害剤）をキュベットに添加し、５分間インキュベートした。次いで、５０μｌのＡＰＰＴ－ＸＬエラグ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を添加し、３００秒間インキュベートした後、５０μｌの２０ｍＭの塩化カルシウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を添加して、反応を開始させた。試験物質濃度の測定された凝固時間を、ベースライン（薬物なし）血漿凝固時間に正規化し、試験物質の対数モル濃度に対してプロットした。ＰＲＩＳＭ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いた非線形回帰（４パラメータロジスティクス）を使用して結果を分析して、倍加時間濃度を得た。
【0236】
ＰＴは、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ ＳＴＡＲＴ４ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄａｉｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）で、以下の様式で決定された。合計５０μｌのプールされた正常ヒト血漿を３７℃でキュベットに添加した。１分後、５μｌの２倍連続希釈したＰＢＳ中の試験物質（抗体又は小分子阻害剤）をキュベットに添加し、５分間インキュベートした。次いで、１００ｕｌの組織因子（ＴｒｉｎｉＣＬＯＴ ＰＴ Ｅｘｃｅｌ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ，ｃａｔ．＃Ｔ１１０６）を添加して、反応を開始させた。試験物質濃度の測定された凝固時間を、ベースライン（薬物なし）血漿凝固時間に正規化し、試験物質の対数モル濃度に対してプロットした。ＰＲＩＳＭ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いた非線形回帰（４パラメータロジスティクス）を使用して結果を分析して、倍加時間濃度を得た。
【0237】
内因性凝固経路下でのトロンビン生成プロファイルを、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ（Ｓｔａｇｏ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）で、以下の様式で決定した。合計５５μｌのプールされた正常ヒト血漿を、３７℃でマイクロプレートのウェルに添加した。次いで、５μｌの２倍連続希釈したＰＢＳ中の試験物質（抗体又は小分子阻害剤）をマイクロプレートのウェルに添加し、３０分間インキュベートした。１５ｕｌのＡＰＰＴ－ＸＬエラグ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ｃａｔ．＃９５０５９－８０４）を微粒子（ＭＰ）試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，ｃａｔ．＃８６２２２）中に希釈し、次いでウェルに添加して、４５分間インキュベートした。次いで、１５μｌのＦｌｕｏ Ｆｌｕ Ｃａｌ基質（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，ｃａｔ．＃８６１９７）を、マイクロプレートの連続９０分読み取り直前に添加した。測定されたリアルタイムトロンビン濃度値を、時間に対してプロットして、使用した試験物質の各濃度についてトロンボグラム（ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ）を得た。
【0238】
外因性凝固経路下でのトロンビン生成プロファイルを、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）で、以下の様式で決定した。合計５５μｌのプールされた正常ヒト血漿を、３７℃でマイクロプレートのウェルに添加した。次いで、５μｌの２倍連続希釈したＰＢＳ中の試験物質（抗体又は小分子阻害剤）をマイクロプレートのウェルに添加し、３０分間インキュベートした。１５μｌの組織因子ＰＰＰ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，ｃａｔ．＃８６１９４）をウェルに添加し、４５分間インキュベートした。次いで、１５μｌのＦｌｕｏ Ｆｌｕ Ｃａｌ基質（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，ｃａｔ．＃８６１９７）を、マイクロプレートの連続９０分読み取り直前に添加した。測定されたリアルタイムトロンビン濃度値を、時間に対してプロットして、使用した試験物質の各濃度についてトロンボグラム（ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ）を得た。
【0239】
結果の概要及び結論：
用量反応曲線を生成して、血漿ａＰＴＴ及びＰＴに対する各薬物の効果を決定した。ＩｇＧ４アイソタイプ対照ｍＡｂ（対照ｍＡｂは、ａＰＴＴ（図１）又はＰＴに影響を及ぼさなかった。ＲＥＧＮ９９３３は、ＰＴ（図示せず）を増加させることなくａＰＴＴ（図１）を延長した。ＦＸＩ－Ａ２結合比較対象ｍＡｂ（ｃｏｍｐ ｍＡｂ）ＣＯＭＰ３４４８も、ＰＴを増加させることなくａＰＴＴを延長した。
用量反応曲線を生成して、血漿ａＰＴＴ及びＰＴに対する各薬物の効果を決定した。ＩｇＧ４アイソタイプ対照ｍＡｂ（対照ｍＡｂは、ａＰＴＴ（図１）又はＰＴに影響を及ぼさなかった。ＲＥＧＮ９９３３は、ＰＴ（図示せず）を増加させることなくａＰＴＴ（図１）を延長した。ＦＸＩ－Ａ２結合比較対象ｍＡｂ（ｃｏｍｐ ｍＡｂ）ＣＯＭＰ３４４８も、ＰＴを増加させることなくａＰＴＴを延長した。
【0240】
凝固活性を阻害する薬物の効率は、任意の「倍加時間」濃度又はＣ２ｘｔ（凝固時間をベースライン値よりも２倍延長するために必要な薬物の濃度）によってインデックス化する。薬物及び対照のこれらの外挿Ｃ２ｘｔ値（すなわち、「倍加時間線」を横切る曲線）を、以下で考察した。ＲＥＧＮ９９３３は、ａＰＴＴ（内因性経路）について３３ｎＭ以下でＣ２ｘｔに達した。試験された最大４μＭで、ＲＥＧＮ９９３３がＰＴ凝固時間を倍増することは見出されなかった。ｃｏｍｐ ｍＡｂ ＣＯＭＰ３４４８は、ａＰＴＴ Ｃ２ｘｔに達するために６２ｎＭを必要としたが、４μＭでＰＴ ＣＣ２ｘｔに達しなかった。これらのデータは、ＣＯＭＰ３４４８と比較して大幅に低い抗体濃度でＣ２ｘｔを達成することにおけるＲＥＧＮ９９３３の優位性を示す。
【0241】
血漿をエラグ酸又は組織因子によって誘発したとき、これらのｍＡｂの効果を、トロンビン生成を阻害するそれらの能力について評価した（すなわち、トロンビンの検出までの延長時間＝遅延時間、トロンビンピークの低減、及び生成されたトロンビンの総量の低減＝内因性トロンビン生成能）。対照ｍＡｂは、トロンビン生成に影響を与えなかった（図２）。主題の抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ ｍＡｂは、１６ｎＭでのトロンビン生成のわずかな低減を示したが、３１ｎＭ以上の濃度でのトロンビン産生を著しく又は完全に阻害し（図３）、これは、主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂが、次いでトロンビン生成を妨げる内因性経路の活性化を抑制することを示す。ｃｏｍｐ ｍＡｂは、３１ｎＭ以上でのほぼ完全な阻害で、トロンビン生成に関する主題の抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ ｍＡｂと同様の応答を示した（図４）。
【0242】
組織因子によって誘発されたトロンビン生成は、対照アイソタイプｍＡｂの影響を受けなかった（図５）。主題の抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、組織因子によって誘発されたトロンビン生成に対してわずかから軽度の阻害効果を有した（図６）。Ｃｏｍｐ ｍＡｂ ＣＯＭＰ３４４８は、組織因子によって誘発されたトロンビン生成に最も少ない効果を有した（図７）。
【0243】
凝固をエラグ酸又は組織因子によって活性化したときに、遅延時間を２倍延長し、トロンビンのピーク及びトロンビン生成の総量を半減するのに必要な試験物質の濃度を、表９に要約する。
【表9】
【0244】
実施例８
カニクイザルにおける主題の抗ＦＸＩ抗体原薬の薬物動態研究
本研究の目的は、８週間にわたるカニクイザルにおける抗ＦＸＩモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の静脈内単回用量薬力学／薬物動態（ＰＫ／ＰＤ）パラメータを決定することであった。
カニクイザルにおける主題の抗ＦＸＩ抗体原薬の薬物動態研究
本研究の目的は、８週間にわたるカニクイザルにおける抗ＦＸＩモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の静脈内単回用量薬力学／薬物動態（ＰＫ／ＰＤ）パラメータを決定することであった。
【0245】
２～４ｋｇの体重の２～４歳の雌カニクイザル（ｎ＝３９）を、ｍＡｂ投与の開始前に少なくとも２週間、実験室飼育に馴化させた。動物を、確立された社会群に基づいて投与群に割り当て、ここで、層別無作為化スキームを使用して、各社会単位からの１匹の動物からの体重を組み込んで、動物を研究群に割り当てた（表８）。動物を標準条件（それぞれ、１８℃～２９℃の温度、３０％～７０％の相対湿度）で飼育し、明（１２時間）／暗（１２時間）サイクルを維持した。食餌（ＰＭＩ ＬＡＢＤＩＥＴ ＦＩＢＥＲ－ＰＬＵＳ Ｍｏｎｋｅｙ Ｄｉｅｔ ５０４９ビスケット、ＬａｂＤｉｅｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１日２回提供し、水を自由に提供した。
【表10】
【0246】
対照群（群１）に、ビヒクル（１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０）を２ｍＬ／ｋｇの体積で静脈内投与した。２～７群に、１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇで適切なｍＡｂ（対象及び比較対象）を静脈内に投与した。各動物の２ｍＬ／ｋｇの用量体積は、つい最近の体重測定に基づいた。血液試料を、８週間の研究期間前及び研究期間にわたって複数回採取した（静脈採血）。血液を、血清の薬物レベルを測定するために、及び血漿の標的レベル及び凝固活性の両方を測定するために処理した。
【0247】
捕捉ｍＡｂとしてマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ、及び検出ｍＡｂとしてビオチン化抗ヒトＩｇカッパ軽鎖特異的を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、血清中の薬物レベルを測定した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）とコンジュゲートされたＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを使用して、ルミノール系基質を、総ＦＸＩ ｍＡｂ濃度の濃度に比例するシグナルに変換した。
【0248】
サルＦＸＩに交差するＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ＥＬＩＳＡキット（ＦＸＩ－ＡＧ）（Ａｎｃａｓｔｅｒ，ＯＮ）を使用して、血漿中の標的（ＦＸＩ）レベルを測定した。サルのＦＸＩ濃度を決定するために、製造元のプロトコルに従った。
【0249】
血漿の凝固活性は、凝固時間及びトロンビン生成を測定した機能的アッセイにおいて決定した。凝固時間を、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ ＳＴＡＲＴ ４ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）を使用して決定して、内因性経路活性化因子（エラグ酸）によって活性化された凝固を測定する活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、及び外因性経路活性化因子（組織因子）によって活性化された凝固を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定した。凝固までの時間は、ベースラインに対する倍率変化として報告された。トロンビン生成は、Ｓｔａｇｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ（ＣＡＴ）（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）で測定した。トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を、内因性経路活性化因子のエラグ酸（ＥＡ）又は外因性経路活性化因子の組織因子（ＴＦ）を用いて行った。ＴＧＡのデータは、以下のパラメータについてベースラインからのパーセンテージ変化として報告される：遅延時間、ピークトロンビン濃度、及びトロンビン総濃度。
【0250】
結果の概要及び結論：
薬物動態（ＰＫ）パラメータは、非コンパートメント分析及び集団コンパートメント分析を使用して推定された。静脈内ボーラス後のｍＡｂ濃度－時間プロファイルは、最初の短い分布相、続いて線形ベータ除去相、及び末端標的媒介除去相を特徴とした（表１１及び１２）。ｍＡｂ Ｃ最大の用量比例的増加は、静脈内投与で観察され（表１３）、用量正規化Ｃ最大（Ｃ最大／用量）は、ｍＡｂ投与群にわたって同等であることが見出された。用量（ＡＵＣｉｎｆ／用量）に正規化されたときの薬物曝露（ＡＵＣｉｎｆ）は、より高い用量で増加することが見出され、群にわたって曝露が用量比例的増加より大きいことを示し、これは、ｍＡｂの非線形動態と一致するであろう。これらの観察は、平行線形及び非線形標的媒介クリアランス（ＴＭＣ）と一致し、ここで観察されるクリアランスの減少は、用量の増加の関数である。血漿中の標的（ＦＸＩ）は、ｃｏｍｐ ｍＡｂ ＣＯＭＰ３４４８（Ａ２結合剤）を受けている動物を除く全ての動物でベースラインから約２～３倍増加した（表１４及び１５）。より高い用量のｍＡｂは、標的ＦＸＩ濃度の用量依存的保持を示さなかった。
薬物動態（ＰＫ）パラメータは、非コンパートメント分析及び集団コンパートメント分析を使用して推定された。静脈内ボーラス後のｍＡｂ濃度－時間プロファイルは、最初の短い分布相、続いて線形ベータ除去相、及び末端標的媒介除去相を特徴とした（表１１及び１２）。ｍＡｂ Ｃ最大の用量比例的増加は、静脈内投与で観察され（表１３）、用量正規化Ｃ最大（Ｃ最大／用量）は、ｍＡｂ投与群にわたって同等であることが見出された。用量（ＡＵＣｉｎｆ／用量）に正規化されたときの薬物曝露（ＡＵＣｉｎｆ）は、より高い用量で増加することが見出され、群にわたって曝露が用量比例的増加より大きいことを示し、これは、ｍＡｂの非線形動態と一致するであろう。これらの観察は、平行線形及び非線形標的媒介クリアランス（ＴＭＣ）と一致し、ここで観察されるクリアランスの減少は、用量の増加の関数である。血漿中の標的（ＦＸＩ）は、ｃｏｍｐ ｍＡｂ ＣＯＭＰ３４４８（Ａ２結合剤）を受けている動物を除く全ての動物でベースラインから約２～３倍増加した（表１４及び１５）。より高い用量のｍＡｂは、標的ＦＸＩ濃度の用量依存的保持を示さなかった。
【0251】
抗ＦＸＩ ｍＡｂの阻害活性（主題及び比較対象）を、血漿凝固時間又はトロンビン生成を測定する機能的アッセイによって評価した。各時点で、血漿のアリコートを使用して、それぞれ、内因性凝固活性及び外因性凝固活性の凝固活性を測定する、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）及びプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイによって評価される凝固時間を決定した。データを、ａＰＴＴ（表１６及び１７）及びＰＴ（表１８及び１９）のベースライン凝固時間に対する凝固時間として示す。ｃｏｍｐ ｍＡｂ及び主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂは、ａＰＴＴ凝固時間に対して同様の２倍の延長（すなわち、阻害効果）を示した。ＰＴ凝固時間のベースラインからの変化は、試験された任意のｍＡｂ、又は任意のｍＡｂの用量の増加によって影響を受けなかった。
【0252】
凝固活性はまた、内因性経路活性化因子（エラグ酸）又は外因性経路活性化因子（組織因子）によって活性化されたときのトロンビン生成のプロファイルを測定することによって評価された。トロンビン生成曲線からの１つの測定されたパラメータは、遅延時間であり、これは、活性化因子が血漿に添加された後にトロンビンを生成するのに必要な時間を評価する。データは、ベースライン遅延時間値からの倍率変化を表した。１ｍｇ／ｋｇ用量のｍＡｂは、エラグ酸で活性化した血漿中で約７日間、遅延時間を約２倍延長した（表２０及び２１）。エラグ酸で活性化されたときに、ｍＡｂの３及び１０ｍｇ／ｋｇの用量について、最大約３週間、遅延時間をベースライン時間の約３～４倍延長した。凝固の活性化因子として組織因子を使用した場合、遅延時間は延長されなかった（表２２及び２３）。
【0253】
トロンビン生成アッセイで測定された第２のパラメータは、トロンビンの生成がピークに達したときの濃度を評価するピークトロンビンであった。データは、ベースラインのトロンビンピークのパーセンテージとして表された。ｍＡｂは、使用される３つの濃度のｍＡｂで、トロンビンピーク濃度（エラグ酸によって誘導された場合）をベースラインの約５～１５％に顕著に阻害することができたが、効果は、１ｍｇ／ｋｇ用量で短命（約５日）であることが見出された（表２４及び２５）。３ｍｇ／ｋｇは最大２週間低減し、１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ用量は約４週間低減した。組織因子を活性化因子として使用したときのピークトロンビンに対するｍＡｂの効果は、ピークトロンビン濃度が５０％増加及び減少したため、可変であった（表２６及び２７）。
【0254】
トロンビン生成アッセイで測定された第３のパラメータは、活性の間に生成されたトロンビンの総濃度を評価する内因性トロンビン生成能であった。データは、ベースラインの総トロンビン生成のパーセンテージとして表された。ｍＡｂは、総トロンビン生成の阻害に対して、エラグ酸を使用して凝固を活性化したときのピークトロンビン阻害と同様の効果を示した（表２８及び２９）。同様に、結果は、組織因子を活性化因子で使用したときに可変であった（表３０及び３１）。
【表11】
【表12-1】
【表12-2】
【表13】
【表14-1】
【表14-2】
【表15】
【表16】
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【表21-1】
【表21-2】
【表22】
【表23-1】
【表23-2】
【表24】
【表25-1】
【表25-2】
【表26】
【表27-1】
【表27-2】
【表28】
【表29-1】
【表29-2】
【表30】
【表31-1】
【表31-2】
【0255】
実施例９
一次薬物動態
９．１：インビトロ薬理学
インビトロアッセイを使用して、ＲＥＧＮ９９３３の有効性及び安全性を評価するために一連の研究を行った。インビトロ研究の目的は、以下を含む。（ａ）ヒト及び非ヒト種、並びにヒトＦＸＩａからのＦＸＩに対するＲＥＧＮ９９３３結合親和性及び特異性の決定、（ｂ）ヒト及びカニクイザルのドナーからの血漿中の内因性及び外因性凝固経路のＲＥＧＮ９９３３媒介遮断の特徴付け、（ｃ）Ｃ１ｑへの結合についての主題のｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩ及び主題のｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩａ免疫複合体の評価、並びに（ｄ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）増殖及びサイトカイン放出を誘導するためのＲＥＧＮ９９３３などのＩｇＧ４Ｐ抗体の潜在的リスクの評価。
一次薬物動態
９．１：インビトロ薬理学
インビトロアッセイを使用して、ＲＥＧＮ９９３３の有効性及び安全性を評価するために一連の研究を行った。インビトロ研究の目的は、以下を含む。（ａ）ヒト及び非ヒト種、並びにヒトＦＸＩａからのＦＸＩに対するＲＥＧＮ９９３３結合親和性及び特異性の決定、（ｂ）ヒト及びカニクイザルのドナーからの血漿中の内因性及び外因性凝固経路のＲＥＧＮ９９３３媒介遮断の特徴付け、（ｃ）Ｃ１ｑへの結合についての主題のｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩ及び主題のｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩａ免疫複合体の評価、並びに（ｄ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）増殖及びサイトカイン放出を誘導するためのＲＥＧＮ９９３３などのＩｇＧ４Ｐ抗体の潜在的リスクの評価。
【0256】
ＲＥＧＮ９９３３とヒト、カニクイザル、ウサギ、及びマウスＦＸＩ又はヒトＦＸＩａとの間の結合相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイを使用して評価した。これらのアッセイでは、ＲＥＧＮ９９３３は、ヒトＦＸＩ及びＦＸＩａ、並びにカニクイザルＦＸＩにナノモル以下の親和性で結合した。ＲＥＧＮ９９３３はまた、ウサギＦＸＩに弱く結合したが、マウスＦＸＩには結合しなかった（実施例９．１．１）。
【0257】
ヒト又はカニクイザルのいずれかのドナーからのプールされた血漿における凝固経路を遮断するＲＥＧＮ９９３３の能力は、凝固アッセイ及びトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を使用してインビトロで評価された。これらのアッセイでは、ＲＥＧＮ９９３３は、ヒトのプールされた血漿における内因性凝固経路に対して濃度依存的な効果を発揮し、外因性経路にわずかな効果を有した。ＲＥＧＮ９９３３はまた、カニクイザルのプールされた血漿における内因性凝固経路に対して濃度依存的な効果を発揮したが、外因性凝固経路に対して濃度依存的な効果を発揮しなかった（実施例９．１．２．１）。
【0258】
ＲＥＧＮ９９３３は、ヒンジ安定化されたＩｇＧ４由来の重鎖断片結晶化可能（Ｆｃ）定常ドメイン（ＩｇＧ４Ｐと称される）を含み、ＩｇＧ４は、ＩｇＧ１と同様にＣ１ｑに結合しないため、Ｃ１ｑに結合することができる免疫複合体を形成する可能性は低い（Ｐａｔｅｌ，２０１５）。それにもかかわらず、ＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩ及びＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩａ複合体のＣ１ｑへの結合の可能性を評価するために、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＩＡ）を行った。このアッセイでは、ＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩ及びＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩａ複合体は、Ｃ１ｑへの陽性結合を実証しなかった（実施例９．１．２．２）。
【0259】
細胞ベースのインビトロ実験の結果は、ＲＥＧＮ９９３３などの免疫細胞表面分子を特異的に標的としないＩｇＧ４Ｐ抗体が、ＰＢＭＣのサイトカイン放出又は増殖を誘導する可能性が低いことを実証する（実施例９．１．３）。
【0260】
主題のｍＡｂのインビトロ機能特徴付け
９．１．１：ヒト、カニクイザル、ウサギ、及びマウスからのＦＸＩ及びヒトからのＦＸＩａとの主題のｍＡｂ相互作用の動態及び平衡結合パラメータの決定
この研究では、ＳＰＲ技術を使用して、血漿に由来するヒトＦＸＩ及びＦＸＩａタンパク質、並びにＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジン（ｍｍＨ）－タグで産生された組換えヒト、カニクイザル、ウサギ、及びマウスＦＸＩタンパク質に対するＲＥＧＮ９９３３の結合親和性を決定した。ヒトＦＸＩ（Ｅ１９－Ｖ６２５）は、それぞれ、カニクイザル、ウサギ、及びマウスＦＸＩと９６％、８６％、及び７９％のアミノ酸配列同一性を共有する。２５℃及びｐＨ７．４で、様々な濃度の可溶性ＦＸＩ又はＦＸＩａタンパク質を表面捕捉ＲＥＧＮ９９３３上に注入し、続いて解離相を注入した。ヒト、カニクイザル、及びマウスタンパク質の動態結合パラメータは、質量輸送制限を伴う１：１の結合モデルを使用して決定され、ウサギタンパク質の結合親和性は、１：１の定常状態結合モデルを使用して決定された。
９．１．１：ヒト、カニクイザル、ウサギ、及びマウスからのＦＸＩ及びヒトからのＦＸＩａとの主題のｍＡｂ相互作用の動態及び平衡結合パラメータの決定
この研究では、ＳＰＲ技術を使用して、血漿に由来するヒトＦＸＩ及びＦＸＩａタンパク質、並びにＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジン（ｍｍＨ）－タグで産生された組換えヒト、カニクイザル、ウサギ、及びマウスＦＸＩタンパク質に対するＲＥＧＮ９９３３の結合親和性を決定した。ヒトＦＸＩ（Ｅ１９－Ｖ６２５）は、それぞれ、カニクイザル、ウサギ、及びマウスＦＸＩと９６％、８６％、及び７９％のアミノ酸配列同一性を共有する。２５℃及びｐＨ７．４で、様々な濃度の可溶性ＦＸＩ又はＦＸＩａタンパク質を表面捕捉ＲＥＧＮ９９３３上に注入し、続いて解離相を注入した。ヒト、カニクイザル、及びマウスタンパク質の動態結合パラメータは、質量輸送制限を伴う１：１の結合モデルを使用して決定され、ウサギタンパク質の結合親和性は、１：１の定常状態結合モデルを使用して決定された。
【0261】
血漿由来のヒトタンパク質を使用した試験では、ＲＥＧＮ９９３３は、それぞれ、１４．４及び１４１ｐＭの平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＦＸＩ（ｈＦＸＩ）及びＦＸＩａ（ｈＦＸＩａ）に結合した（データ示さず）。
【0262】
ｍｍＨ－タグで産生された生成タンパク質を使用した試験では、主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、ＫＤ値が、それぞれ、１４４及び１０４ｐＭの組換えヒト（ｈＦＸＩ．ｍｍＨ）及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（ＭｆＦＸＩ．ｍｍＨ）ＦＸＩに結合し、ＫＤ値が１７１ｎＭの組換えウサギＦＸＩ（ｒｂＦＸＩ．ｍｍＨ）に弱いが検出可能な結合を示した。主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、試験した最高濃度（５０ｎＭ）まで、組換えマウスＦＸＩ（ｍＦＸＩ．ｍｍＨ）への検出可能な結合を示さなかった（データ示さず）。
【0263】
９．１．２．１：プールされたヒト又はカニクイザル血漿における凝固経路を遮断する主題の抗ＦＸＩ抗体原薬の能力のインビトロ評価
この研究では、ヒト又はカニクイザルのいずれかのドナーからのプールされた血漿における凝固経路を遮断するＲＥＧＮ９９３３の能力は、凝固アッセイ及びＴＧＡを使用してインビトロで評価された。これらのアッセイでは、それぞれ、ＥＡ又はＴＦのいずれかによって血漿において凝固を誘導して、内因性又は外因性の凝固経路に対するＲＥＧＮ９９３３の効果を測定した。
この研究では、ヒト又はカニクイザルのいずれかのドナーからのプールされた血漿における凝固経路を遮断するＲＥＧＮ９９３３の能力は、凝固アッセイ及びＴＧＡを使用してインビトロで評価された。これらのアッセイでは、それぞれ、ＥＡ又はＴＦのいずれかによって血漿において凝固を誘導して、内因性又は外因性の凝固経路に対するＲＥＧＮ９９３３の効果を測定した。
【0264】
ヒト及びカニクイザル血漿を使用した凝固アッセイ及びＴＧＡの結果の概要を表３２に示す。
【表32】
【0265】
凝固アッセイでは、主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、ベースライン（抗体なし）に対して、濃度依存的にａＰＴＴを増加させ、それぞれ、試験した抗体濃度の範囲（１９ｎＭ～１．２μＭ）で、ヒト（図８Ａ）及びカニクイザル（データ示さず）の血漿において最大２．７倍及び２．１倍の増加が観察された。ベースラインに対するａＰＴＴの倍加は、それぞれ、ヒト及びカニクイザルの血漿において２５ｎＭ及び１．１μＭで生じると推定された。試験した最大抗体濃度（１．２μＭ）で、ヒト又はカニクイザルのいずれかの血漿においてベースラインに対してＰＴの変化は観察されなかった（図８Ｂ）。
【0266】
トロンビン生成がヒト血漿における内因性経路を介してＥＡによって誘導されたＴＧＡにおいて、主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、トロンビン生成の遅延時間をベースラインに対して最大４．９倍に増加させ（抗体なし）、ピークトロンビンレベルをベースラインの８％まで低減し、内因性トロンビン生成能をベースラインの２８％まで低減した（図９Ａ及び９Ｂ）。主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、濃度依存的にこれらの効果を発揮し、２５０ｎＭ以上の濃度で最大の効果を達成した（図９Ａ）。トロンビン生成が外因性経路を介してＴＦによって誘導された場合、主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、ピークトロンビンレベルをベースラインの８６％までわずかに低減し、内因性トロンビン生成能をベースラインの８９％まで低減した（図９Ｃ及び９Ｄ）。主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、濃度依存的にこれらの効果を発揮し、１２５ｎＭ以上の濃度で最大の効果を達成した（図９Ｃ）。試験した最大抗体濃度（５００ｎＭ）まで、主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３では、トロンビン生成の遅延時間の濃度依存的な増加は観察されなかった（図９Ｃ）。
【0267】
トロンビン生成がカニクイザル血漿における内因性経路を介してＥＡによって誘導されたＴＧＡにおいて、主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、トロンビン生成の遅延時間をベースラインに対して最大２．２倍まで増加させ（抗体なし）、ピークトロンビンレベルをベースラインの４３％まで低減し、内因性トロンビン生成能をベースラインの６６％まで低減した（データ示さず）。主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、濃度依存的にこれらの効果を発揮し、６２ｎＭ以上の濃度で最大の効果を達成した。外因性経路を介してＴＦによってトロンビン生成が誘導された場合、試験した最大抗体濃度（５００ｎＭ）まで、主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３では、トロンビン生成の遅延時間の濃度依存的な増加、又はピークトロンビン若しくは内因性トロンビン生成能の減少は観察されなかった（データ示さず）。
【0268】
９．１．２．２：Ｃ１ｑに結合するための主題のｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩ及び－ＦＸＩａ免疫複合体の評価。
循環免疫複合体（ＣＩＣ）は、可溶性抗原による抗体の多量体化によって形成される。組織内のＣＩＣの堆積及びそれに伴う炎症反応は、堆積部位での組織損傷をもたらす可能性がある。大型免疫複合体はまた、血清中の補体成分Ｃ１ｑを活性化することができる（Ｒｏｊｋｏ，２０１４）。ＲＥＧＮ９９３３は、ヒンジ安定化されたＩｇＧ４由来の重鎖Ｆｃ定常ドメイン（ＩｇＧ４Ｐと称される）を含み、ＩｇＧ４は、ＩｇＧ１と同様にＣ１ｑに結合しないため、Ｃ１ｑに結合することができる免疫複合体を形成する可能性は低い（Ｐａｔｅｌ，２０１５）。それにもかかわらず、主題のｍＡｂ－ＦＸＩ及び主題のｍＡｂ－ＦＸＩａ複合体のＣ１ｑへの結合の可能性を評価するために、ＥＩＡを行った。
循環免疫複合体（ＣＩＣ）は、可溶性抗原による抗体の多量体化によって形成される。組織内のＣＩＣの堆積及びそれに伴う炎症反応は、堆積部位での組織損傷をもたらす可能性がある。大型免疫複合体はまた、血清中の補体成分Ｃ１ｑを活性化することができる（Ｒｏｊｋｏ，２０１４）。ＲＥＧＮ９９３３は、ヒンジ安定化されたＩｇＧ４由来の重鎖Ｆｃ定常ドメイン（ＩｇＧ４Ｐと称される）を含み、ＩｇＧ４は、ＩｇＧ１と同様にＣ１ｑに結合しないため、Ｃ１ｑに結合することができる免疫複合体を形成する可能性は低い（Ｐａｔｅｌ，２０１５）。それにもかかわらず、主題のｍＡｂ－ＦＸＩ及び主題のｍＡｂ－ＦＸＩａ複合体のＣ１ｑへの結合の可能性を評価するために、ＥＩＡを行った。
【0269】
この研究では、ＲＥＧＮ９９３３をヒトＦＸＩ又はＦＸＩａタンパク質でインキュベートし、プレート吸着Ｃ１ｑに添加し、続いて抗ヒトＩｇＧを使用して検出した。
【0270】
主題のｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩ及び主題のｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩａ複合体は、アッセイキットの仕様によって陽性とみなされる結合レベルを実証しなかった（データ示さず）。対照的に、Ｃ１ｑ結合は、陽性対照複合体、熱凝集ヒトガンマグロブリン（ＨＡＧＧ）について検出された。
【0271】
９．１．３：非免疫細胞表面結合ＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照抗体によるヒト末梢血単核細胞の処理後の増殖及びサイトカイン放出のインビトロ特徴付け
主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、免疫細胞表面分子を標的としないＩｇＧ４Ｐ抗体である。そのような非結合ＩｇＧ４Ｐが、ヒトＰＢＭＣにおいてサイトカインの放出又は増殖を誘導する能力を、ＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照抗体［ＲＥＧＮ１９４５］を使用して評価した。
主題の抗ＦＸＩ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３は、免疫細胞表面分子を標的としないＩｇＧ４Ｐ抗体である。そのような非結合ＩｇＧ４Ｐが、ヒトＰＢＭＣにおいてサイトカインの放出又は増殖を誘導する能力を、ＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照抗体［ＲＥＧＮ１９４５］を使用して評価した。
【0272】
ＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照抗体［ＲＥＧＮ１９４５］は、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体（ＴｅＧｅｎｅｒｏ ＴＧＮ１４１２）（Ｆｉｎｄｌａｙ，２０１０）（Ｖｅｓｓｉｌｌｉｅｒ，２０１５）によって誘導されるＰＢＭＣ増殖及びサイトカイン放出を検出する確立された方法に従って行われた社内研究（データ示さず）では、ＰＢＭＣサイトカイン放出又は増殖を誘導しなかった。このアッセイでは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－４、及びＩＬ－１２ｐ７０の蓄積を、ＰＢＭＣを試験抗体とインキュベートした後に評価した。ＴＧＮ１４１２と同じ一次配列（Ｓ２２８Ｐ置換を除いて）を有するＩｇＧ４Ｐ抗ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体［ＲＥＧＮ２３２９］、及び刺激性抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）は、陽性対照として機能した。０．４～１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度のＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照抗体［ＲＥＧＮ１９４５］は、いかなる試験条件下でも、ＰＢＭＣの増殖（データ示さず）又はサイトカイン放出（データ示さず）に影響を及ぼさなかった。対照的に、抗ＣＤ２８陽性対照抗体は、ＰＢＭＣの顕著な増殖及び顕著なサイトカイン放出を媒介したが、抗ＣＤ３陽性対照抗体は、顕著なサイトカイン放出を媒介した。
【0273】
要約すると、免疫細胞表面分子を特異的に標的としないＩｇＧ４Ｐ抗体は、標準的なインビトロアッセイにおいて、ＰＢＭＣからのサイトカイン放出又はＰＢＭＣの増殖を誘導しなかった。本研究は、免疫細胞表面分子を特異的に標的としないＩｇＧ４Ｐ抗体が、ヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘導する可能性が低いことを示す。
【0274】
９．１．４：考察
主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、ＦＸＩ／ＦＸＩａに結合し、ヒト血漿における外因性凝固経路にわずかな影響を伴う内因性凝固経路を選択的に阻害するヒトＩｇＧ４ベースのｍＡｂである。主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、血栓塞栓性疾患の予防及び治療のために開発されている。インビトロアッセイ及びインビボモデルを使用して、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の有効性及び安全性を評価するために一連の非臨床研究を行った。
主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、ＦＸＩ／ＦＸＩａに結合し、ヒト血漿における外因性凝固経路にわずかな影響を伴う内因性凝固経路を選択的に阻害するヒトＩｇＧ４ベースのｍＡｂである。主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、血栓塞栓性疾患の予防及び治療のために開発されている。インビトロアッセイ及びインビボモデルを使用して、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の有効性及び安全性を評価するために一連の非臨床研究を行った。
【0275】
ＳＰＲ研究は、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３が、ヒトＦＸＩ及びＦＸＩａ、並びにピコモル範囲のＫＤ値でカニクイザルＦＸＩに特異的に結合することを示した。主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３はまた、高いナノモルＫＤ値でウサギＦＸＩに弱く結合したが、マウスＦＸＩへの結合は検出されなかった。ヒト又はカニクイザルのドナーからのプールされた血漿を使用したインビトロ凝固時間アッセイ及びＴＧＡは、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３が、濃度依存的な効果を持続時間に対しては有するが、大きさに対しては有しない内因性凝固経路活性を遮断することを示した。ヒト血漿における外因性凝固経路活性へのわずかな影響が観察され、カニクイザル血漿における外因性凝固経路活性に対する効果は観察されなかった。併せて、これらのインビトロ結合及び活性研究は、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３が、ヒト及びサル血漿中のＦＸＩに結合し、内因性凝固経路活性を遮断することができ、それによって、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３を用いた薬理学研究及び／又は毒性学研究のための関連種としてのカニクイザルの使用を支持することができることを実証した。
【0276】
インビトロＥＩＡでは、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩ及び主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３－ＦＸＩａ複合体は、Ｃ１ｑへの結合の陽性レベルを実証せず、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３が、免疫複合体媒介性炎症応答を誘導する可能性が低いことを示唆する。
【0277】
９．２：インビボ薬理学
カニクイザルにおける凝固経路の主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３媒介遮断を、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ用量を評価するパイロットＰＫ／ＰＤ研究（実施例９．２．１）、及びＩＶ経路を介した主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の０．５、５、若しくは３０ｍｇ／ｋｇの単回用量、又はＳＣ経路を介した主題ｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の３０ｍｇ／ｋｇの単回用量を評価する研究（実施例９．２．２）において評価した。
カニクイザルにおける凝固経路の主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３媒介遮断を、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ用量を評価するパイロットＰＫ／ＰＤ研究（実施例９．２．１）、及びＩＶ経路を介した主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の０．５、５、若しくは３０ｍｇ／ｋｇの単回用量、又はＳＣ経路を介した主題ｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の３０ｍｇ／ｋｇの単回用量を評価する研究（実施例９．２．２）において評価した。
【0278】
主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ用量を受けたカニクイザルからの血漿を使用する凝固アッセイ及びＴＧＡ（実施例９．２．１）において、及び静脈内（ＩＶ）経路を介して主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の０．５、５、若しくは３０ｍｇ／ｋｇの単回用量、又は皮下（ＳＣ）経路を介して主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の３０ｍｇ／ｋｇの単回用量を受けたカニクイザルからの血漿を使用するＴＧＡ（実施例９．２．２）において、凝固経路のＲＥＧＮ９９３３媒介遮断を評価した。前述の各研究で行われた凝固アッセイにおいて、ＲＥＧＮ９９３３は、内因性凝固経路に対するＰＤ効果（すなわち、ベースラインに対する活性化部分トロンボプラスチン時間［ａＰＴＴ］の延長）を発揮し、外因性凝固経路に対する影響はなかった（すなわち、ベースラインに対するプロトロンビン時間［ＰＴ］に対する影響はなかった）。行われたＴＧＡにおいて、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、内因性凝固経路に対するＰＤ効果（すなわち、ベースラインに対して、トロンビン生成の延長された遅延時間、ピークトロンビンレベルの低減、及びエラグ酸［ＥＡ］によって誘導される内因性トロンビン生成能の低減）を発揮し、外因性凝固経路に対する効果は最小限であった（すなわち、トロンビン生成の遅延時間に対して効果はなく、ベースラインに対して、組織因子［ＴＦ］によって誘導されるピークトロンビンレベル及び内因性トロンビン生成能のわずかな低減）。両方の研究で、内因性凝固経路に対する効果（凝固アッセイ及びＴＧＡで観察される）の持続時間は、用量依存的であったが、外因性凝固経路に対するわずかな効果（ＴＧＡで観察される）は、用量依存的ではなかった。内因性凝固経路への影響は、ＦＸＩの濃度を低減するのではなく、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３濃度を増加させることによって駆動された可能性が高い。
【0279】
９．２．１：カニクイザルにおける凝固経路活性に関する主題のｍＡｂ ＩＶの１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇの単回用量のエクスビボ評価（Ｒ３４４８ ＰＫ １９０８５）
カニクイザルにおける凝固経路の主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３媒介遮断の特徴付けを、単回用量ＰＫ研究の一部として評価した（データ示さず）。雌カニクイザルに、ビヒクル（対照）又は主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の単回ＩＶスローボーラス注射を、１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇ（群当たりｎ＝３）の用量で投与し、投与後８週間監視した。投与前及び投与後５分、６時間、２日目、３日目、４日目、６日目、８日目、１１日目、１５日目、２２日目、２９日目、３６日目、４３日目、５０日目、及び５７日目に、全ての動物から血液試料を収集した。投与前の測定値は、各動物のベースラインとして機能した。血清中の主題の総ｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３（全ての薬物、標的の存在とは無関係）及び血漿中の総ＦＸＩ（主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３結合及び遊離）の濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。様々なＰＤ分析を血漿試料を使用して行い、これには、凝固アッセイ及びＴＧＡを使用した凝固経路に対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果の測定が含まれた。これらのアッセイでは、それぞれ、ＥＡ又はＴＦのいずれかによって血漿試料において凝固を誘導して、内因性又は外因性の凝固経路に対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果を測定した。総ＦＸＩ濃度、並びに凝固アッセイ及びＴＧＡからの測定値は、ベースラインに対して正規化され（すなわち、投与前測定値）、ベースラインに対する変化として表された。
カニクイザルにおける凝固経路の主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３媒介遮断の特徴付けを、単回用量ＰＫ研究の一部として評価した（データ示さず）。雌カニクイザルに、ビヒクル（対照）又は主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の単回ＩＶスローボーラス注射を、１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇ（群当たりｎ＝３）の用量で投与し、投与後８週間監視した。投与前及び投与後５分、６時間、２日目、３日目、４日目、６日目、８日目、１１日目、１５日目、２２日目、２９日目、３６日目、４３日目、５０日目、及び５７日目に、全ての動物から血液試料を収集した。投与前の測定値は、各動物のベースラインとして機能した。血清中の主題の総ｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３（全ての薬物、標的の存在とは無関係）及び血漿中の総ＦＸＩ（主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３結合及び遊離）の濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。様々なＰＤ分析を血漿試料を使用して行い、これには、凝固アッセイ及びＴＧＡを使用した凝固経路に対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果の測定が含まれた。これらのアッセイでは、それぞれ、ＥＡ又はＴＦのいずれかによって血漿試料において凝固を誘導して、内因性又は外因性の凝固経路に対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果を測定した。総ＦＸＩ濃度、並びに凝固アッセイ及びＴＧＡからの測定値は、ベースラインに対して正規化され（すなわち、投与前測定値）、ベースラインに対する変化として表された。
【0280】
９．２．１．１：血漿中の総ＦＸＩレベルに対する主題のｍＡｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果の評価
主題の総ｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の濃度－時間プロファイルは、最初の短い分布相、続いて短い線形ベータ除去相、及び末端標的媒介除去相を特徴とした。主題のピークｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３濃度は用量比例的に増加したが、用量正規化された主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３曝露は、用量群にわたって曝露の用量比例的増加よりも大きいことを示した（図１０Ａ）。
主題の総ｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の濃度－時間プロファイルは、最初の短い分布相、続いて短い線形ベータ除去相、及び末端標的媒介除去相を特徴とした。主題のピークｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３濃度は用量比例的に増加したが、用量正規化された主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３曝露は、用量群にわたって曝露の用量比例的増加よりも大きいことを示した（図１０Ａ）。
【0281】
ベースラインに対する総ＦＸＩの増加は、３ｍｇ／ｋｇ以上の主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３用量で観察された。ベースラインに対する総ＦＸＩの統計的に有意な増加は、対照群と比較して、１０ｍｇ／ｋｇの主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３群のみで観察された（図１０Ｂ）。これらの増加は、用量群にわたって主題の総ｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３への曝露の用量比例的増加よりも大きいことと関連していた。主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３と結合することによる循環中のＦＸＩの安定化に起因する可能性が高いため、血漿中の総ＦＸＩの濃度の減少と関連付けられなかった。
【0282】
９．２．１．２：血漿におけるａＰＴＴ及びＰＴに対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果の評価
主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、試験した全ての用量レベルのベースラインに対して、内因性経路活性の指標である活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を延長し、活性の持続時間に用量依存的な効果を有する。ベースラインに対する、外因性経路活性の指標であるプロトロンビン時間（ＰＴ）に対する効果は、試験した任意の用量レベルの主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３で観察されなかった（図１１Ｂ）。
主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、試験した全ての用量レベルのベースラインに対して、内因性経路活性の指標である活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を延長し、活性の持続時間に用量依存的な効果を有する。ベースラインに対する、外因性経路活性の指標であるプロトロンビン時間（ＰＴ）に対する効果は、試験した任意の用量レベルの主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３で観察されなかった（図１１Ｂ）。
【0283】
９．２．１．３：血漿中のトロンビン生成に対するＲＥＧＮ９９３３の効果の評価
ＥＡで誘導されたＴＧＡ（ＴＧＡ－ＥＡ）において、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、試験した全ての用量レベルで、ベースラインに対して、トロンビン生成の遅延時間を延長し（データ示さず）、ピークトロンビンレベルを低減し（データ示さず）、内因性経路によって媒介される内因性トロンビン生成能を低減し（図１２Ａ）、活性の持続時間に用量依存的効果を有した。ＴＦで誘導されたＴＧＡ（ＴＧＡ－ＴＦ）において、ベースラインに対して、外因性経路によって媒介されるトロンビン生成の遅延時間に対する効果は、試験した任意の用量レベルの主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３で観察されなかった（データ示さず）。主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、試験した全ての用量レベルで、ベースラインに対して、外因性経路によって媒介されるピークトロンビンレベル（データ示さず）及び内因性トロンビン生成能（図１２Ｂ）を低減した。しかしながら、外因性経路に対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果は、内因性経路に対する効果と比較して大きさが小さく、外因性経路に対する効果の大きさも持続時間も用量依存的ではないように見えた。
ＥＡで誘導されたＴＧＡ（ＴＧＡ－ＥＡ）において、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、試験した全ての用量レベルで、ベースラインに対して、トロンビン生成の遅延時間を延長し（データ示さず）、ピークトロンビンレベルを低減し（データ示さず）、内因性経路によって媒介される内因性トロンビン生成能を低減し（図１２Ａ）、活性の持続時間に用量依存的効果を有した。ＴＦで誘導されたＴＧＡ（ＴＧＡ－ＴＦ）において、ベースラインに対して、外因性経路によって媒介されるトロンビン生成の遅延時間に対する効果は、試験した任意の用量レベルの主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３で観察されなかった（データ示さず）。主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、試験した全ての用量レベルで、ベースラインに対して、外因性経路によって媒介されるピークトロンビンレベル（データ示さず）及び内因性トロンビン生成能（図１２Ｂ）を低減した。しかしながら、外因性経路に対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果は、内因性経路に対する効果と比較して大きさが小さく、外因性経路に対する効果の大きさも持続時間も用量依存的ではないように見えた。
【0284】
ＴＧＡで測定したベースラインに対して、内因性凝固経路に対する統計的に有意な効果は、対照群と比較して、それぞれ、１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇの主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３群で、最大６日目、１１日目、及び５０日目まで観察された（データ示さず）。全てのパラメータは、８週間の研究の終了までにベースライン又はベースラインレベルに近くに戻った。
【0285】
９．２．２：カニクイザルにおける凝固経路活性に対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３ ＩＶの０．５、５、若しくは３０ｍｇ／ｋｇの単回用量、又は主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３ ＳＣの３０ｍｇ／ｋｇの単回用量のエクスビボ評価
雌カニクイザルにおけるＰＫ／ＰＤ研究を行った（データ示さず）。１０週間の監視期間にわたって収集された血液試料を使用して、凝固に対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果を評価するために、エクスビボアッセイを行った。主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３を、０．５、５、又は３０ｍｇ／ｋｇ（群当たりｎ＝５）ＩＶ又は３０ｍｇ／ｋｇ（群当たりｎ＝５）ＳＣで動物に単回用量として与えた。
雌カニクイザルにおけるＰＫ／ＰＤ研究を行った（データ示さず）。１０週間の監視期間にわたって収集された血液試料を使用して、凝固に対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果を評価するために、エクスビボアッセイを行った。主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３を、０．５、５、又は３０ｍｇ／ｋｇ（群当たりｎ＝５）ＩＶ又は３０ｍｇ／ｋｇ（群当たりｎ＝５）ＳＣで動物に単回用量として与えた。
【0286】
９．２．２．１：血漿中の総ＦＸＩレベルに対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果の評価
主題の総ｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の濃度－時間プロファイルは、最初の短い分布相、続いて短い線形ベータ除去相、末端標的媒介除去相、及び標的媒介除去後相を特徴とした（データ示さず）。主題のピークｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３濃度は、用量比例的に増加した（データ示さず）。用量正規化された主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の曝露の用量比例増加よりも大きい増加は、用量群にわたって観察され、低用量及び濃度の主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３でより顕著である非線形動態と一致した（データ示さず）。これらの所見は、用量及び関連する濃度の増加に伴う観察されたクリアランスの減少と一致する。主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の投与後、血漿中の可溶性ＦＸＩの濃度は、ベースラインレベルと比較して、全ての用量群（ＩＶ及びＳＣ）にわたって１．０～１．９倍増加し、ベースラインに対して薬物効果があったことを示す。しかしながら、血清中の主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３濃度との相関はなかった（データ示さず）。
主題の総ｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の濃度－時間プロファイルは、最初の短い分布相、続いて短い線形ベータ除去相、末端標的媒介除去相、及び標的媒介除去後相を特徴とした（データ示さず）。主題のピークｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３濃度は、用量比例的に増加した（データ示さず）。用量正規化された主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の曝露の用量比例増加よりも大きい増加は、用量群にわたって観察され、低用量及び濃度の主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３でより顕著である非線形動態と一致した（データ示さず）。これらの所見は、用量及び関連する濃度の増加に伴う観察されたクリアランスの減少と一致する。主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の投与後、血漿中の可溶性ＦＸＩの濃度は、ベースラインレベルと比較して、全ての用量群（ＩＶ及びＳＣ）にわたって１．０～１．９倍増加し、ベースラインに対して薬物効果があったことを示す。しかしながら、血清中の主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３濃度との相関はなかった（データ示さず）。
【0287】
９．２．２：血漿におけるａＰＴＴ及びＰＴに対する主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の効果の評価
エクスビボ凝固時間アッセイを、経時的に収集された血液試料からの血漿を使用して行い、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の投与の、内因性経路活性の指標であるａＰＴＴ、及び外因性経路活性の指標であるＰＴに対する効果を決定した。３日目以前の血液試料収集は、誤った抗凝固剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて行ったが、３日目から７１日目までの試料収集は、凝固アッセイの性能にあまり干渉しない、好ましい抗凝固剤、クエン酸ナトリウムを用いて行った。したがって、３日目～７１日目までの血液試料について生成された値のみをプロットし、凝固アッセイにおける研究特異的投与前測定の代わりに、これとカニクイザルにおける以前のＰＫ／ＰＤ研究からの組み合わせ値（データ示さず）を使用して、ａＰＴＴ及びＰＴの過去のベースラインを決定した。
エクスビボ凝固時間アッセイを、経時的に収集された血液試料からの血漿を使用して行い、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の投与の、内因性経路活性の指標であるａＰＴＴ、及び外因性経路活性の指標であるＰＴに対する効果を決定した。３日目以前の血液試料収集は、誤った抗凝固剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて行ったが、３日目から７１日目までの試料収集は、凝固アッセイの性能にあまり干渉しない、好ましい抗凝固剤、クエン酸ナトリウムを用いて行った。したがって、３日目～７１日目までの血液試料について生成された値のみをプロットし、凝固アッセイにおける研究特異的投与前測定の代わりに、これとカニクイザルにおける以前のＰＫ／ＰＤ研究からの組み合わせ値（データ示さず）を使用して、ａＰＴＴ及びＰＴの過去のベースラインを決定した。
【0288】
主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、活性の持続時間に用量依存的な効果を有する過去のベースラインに対して１．５～２．１倍増加で平均ａＰＴＴを延長したが、試験した全ての投与群にわたって同様の大きさであった（データ示さず）。過去のベースラインに対するａＰＴＴの１．５倍以上の増加の最初の発生は、全ての用量レベルについて３日目に観察されたが、この効果は、それぞれ、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の０．５ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）、５ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）、及び３０ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の用量レベルの増加で、１、１９、又は５４日間の増加持続期間について観察された。加えて、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３を３０ｍｇ／ｋｇ（ＳＣ）で投与した後の４７日間、過去のベースラインに対して、ａＰＴＴの１．５倍以上の増加が観察された。全ての投与群にわたって、最大平均効果は、ａＰＴＴ延長において２．１倍の増加であった。
【0289】
試験した任意の用量レベルの主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３で、過去のベースラインに対してしてＰＴへの効果は観察されなかった（データ示さず）。
【0290】
９．２．３：考察
主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ用量を受けたカニクイザルからの血漿を使用する血液凝固アッセイ及びＴＧＡにおいて、及びＩＶを介して主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の０．５、５、若しくは３０ｍｇ／ｋｇの単回用量、又はＳＣを介して主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の３０ｍｇ／ｋｇの単回用量を受けたカニクイザルからの血漿を使用するＴＧＡにおいて、凝固経路の主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３媒介遮断を評価した。前述の各研究で行われた凝固アッセイにおいて、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、持続時間に用量依存的な効果を有するが、大きさは用量依存的な効果はなく、内因性凝固経路を遮断し、外因性凝固経路への効果は観察されなかった。行われたＴＧＡにおいて、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、持続時間に用量依存的な効果を有するが、大きさは用量依存的な効果はなく、内因性凝固経路を遮断し、外因性凝固経路に対する最小限の効果が観察された。
主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ用量を受けたカニクイザルからの血漿を使用する血液凝固アッセイ及びＴＧＡにおいて、及びＩＶを介して主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の０．５、５、若しくは３０ｍｇ／ｋｇの単回用量、又はＳＣを介して主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３の３０ｍｇ／ｋｇの単回用量を受けたカニクイザルからの血漿を使用するＴＧＡにおいて、凝固経路の主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３媒介遮断を評価した。前述の各研究で行われた凝固アッセイにおいて、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、持続時間に用量依存的な効果を有するが、大きさは用量依存的な効果はなく、内因性凝固経路を遮断し、外因性凝固経路への効果は観察されなかった。行われたＴＧＡにおいて、主題のｍ－Ａｂ ＲＥＧＮ９９３３は、持続時間に用量依存的な効果を有するが、大きさは用量依存的な効果はなく、内因性凝固経路を遮断し、外因性凝固経路に対する最小限の効果が観察された。
【0291】
実施例１０
安全性薬理学
安全性薬理学的エンドポイントは、カニクイザルで実施されたＧＬＰ反復投与毒性研究に組み込まれた（データ示さず）。投与された最高用量である１００ｍｇ／ｋｇ／週までの用量（ＳＣ又はＩＶ）で、試験試料関連の心血管系（心拍数、血圧、及び心電図）、呼吸器系（呼吸／分及びパルスオキシメトリ）、又は中枢神経系の変化は明らかではなかった。
安全性薬理学
安全性薬理学的エンドポイントは、カニクイザルで実施されたＧＬＰ反復投与毒性研究に組み込まれた（データ示さず）。投与された最高用量である１００ｍｇ／ｋｇ／週までの用量（ＳＣ又はＩＶ）で、試験試料関連の心血管系（心拍数、血圧、及び心電図）、呼吸器系（呼吸／分及びパルスオキシメトリ）、又は中枢神経系の変化は明らかではなかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】