特表 2024-539225 ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２、ＣＯＶＤ－１９疾患を引き起こすウイルスによる感染を抑制するペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２、ＣＯＶＤ－１９疾患を引き起こすウイルスによる感染を抑制するペプチド

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/16 20060101AFI20241018BHJP

   C07K 14/165 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20241018BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20241018BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20241018BHJP

【ＦＩ】

A61K38/16

C07K14/165 ZNA

A61K47/60

A61K47/54

A61P31/14

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024523931

(86)(22)【出願日】2022-10-21

(85)【翻訳文提出日】2024-06-18

(86)【国際出願番号】 US2022047449

(87)【国際公開番号】W WO2023069728

(87)【国際公開日】2023-04-27

(31)【優先権主張番号】63/270,851

(32)【優先日】2021-10-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591013274

【氏名又は名称】ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション

(71)【出願人】

【識別番号】306018457

【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク

(74)【代理人】

【識別番号】110001896

【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ゲルマン、サミュエル

(72)【発明者】

【氏名】アウトロー、ビクター

(72)【発明者】

【氏名】モスコナ、アン

(72)【発明者】

【氏名】ポロット、マッテオ

(72)【発明者】

【氏名】ユ、チェン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC35

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA01

4C084BA10

4C084BA19

4C084BA23

4C084BA36

4C084CA59

4C084NA14

4C084ZB33

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA19

4H045BA50

4H045BA57

4H045CA01

4H045EA20

4H045FA33

4H045GA01

4H045GA45

(57)【要約】

抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ α／βポリペプチド、それを含有する医薬組成物、および、ヒトを含む哺乳類におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害、処置、および改善する方法。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２に示されるポリペプチド、または、配列番号２との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％であるが１００％未満であるポリペプチド、を含む組成物であって、前記ポリペプチドにおける少なくとも１つのα－アミノ酸残基が、β－アミノ酸残基に置換されている、組成物。

【請求項2】

前記ポリペプチドにおける１つから１０個までのα－アミノ酸残基が、β－アミノ酸残基に置換されている、請求項１記載の組成物。

【請求項3】

前記ポリペプチドにおける少なくとも１つのα－アミノ酸残基が、環状に拘束されるβ－アミノ酸残基に置換されている、請求項１または２記載の組成物。

【請求項4】

前記ポリペプチドにおける少なくとも１つのα－アミノ酸残基が、２－アミノシクロペンタンカルボン酸および３－アミノピロリジン－４－カルボン酸からなる群から選択される環状に拘束されるβ－アミノ酸残基に置換されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

前記ポリペプチドにおける少なくとも１つのα－アミノ酸残基が、２－アミノイソ酪酸に置換されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

前記ポリペプチドは、脂質部分をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

前記ポリペプチドは、少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）部分をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

前記ポリペプチドは、脂質部分と、少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）部分と、をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項9】

前記脂質部分は、前記ポリペプチドの末端に結合される、請求項８記載の組成物。

【請求項10】

前記脂質部分は、コレステロール、トコフェロール、およびパルミテートからなる群から選択される、請求項６、８、または９記載の組成物。

【請求項11】

前記ポリペプチドは、配列番号５～３４からなる群から選択される化合物を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項12】

配列番号３４、または、配列番号３４との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％であるが配列番号７、２３、２４、３２、および３４との配列同一性が１００％未満であるポリペプチドを含む、組成物。

【請求項13】

ヒト対象を含む哺乳類の対象におけるＣｏＶ２による感染を阻害する方法であって、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物を、ＣｏＶ２の感染を阻害する量で、前記対象に投与すること、を含む方法。

【請求項14】

ヒト対象を含む哺乳類の対象におけるＣｏＶ２の感染の症状を改善する方法であって、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物を、ＣｏＶ２の症状を改善する量で、前記対象に投与すること、を含む方法。

【請求項15】

薬学的に適切な担体と組み合わせて請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物を含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

ゲルマン、サミュエル
アウトロー、ビクター
ユ、チェン
ポロット、マッテオ
モスコナ、アン

【0002】

［連邦政府からの資金提供であることの陳述文］
本発明は、米国の国立衛生研究所によって授与されたＡＩ１１４７３６、ＧＭ０５６４１４、およびＡＩ１２１３４９のもとでの政府の支援でなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

【0003】

［配列表］
本出願は、ＸＭＬファイルの形でパテントセンターを通じて米国特許商標庁に提出されたおよびその全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表、を含む。配列表のＸＭＬファイルは、２０２２年１０月６日に作成され、そのファイル名は「ＰＣＴ－－２２１０２２－－Ａｎｔｉ－Ｃｏｖｉｄ＿Ａｌｐｈａ＿Ｂｅｔａ＿Ｐｅｐｔｉｄｅｓ－－ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ」であり、そのサイズは９８キロバイトである。

【背景技術】

【0004】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（「ＣｏＶ２」）は、「エンベロープ」ウイルスである：各ウイルス粒子は、「エンベロープ」として知られる膜によって囲まれている。感染は、ウイルスのエンベロープが宿主の細胞膜と融合させられるまで起きることはできない。融合により、細胞の細胞質の中へのウイルスゲノムの導入が可能となる。ＣｏＶ２は、Ｉ型のメカニズムを使用して膜融合を引き起こす。融合は、ウイルス粒子の表面上の単一の三量体タンパク質（スパイク、即ち、「Ｓ」）によって引き起こされる。それによってウイルスが細胞に進入する融合プロセスが、図１に模式的に示される。融合プロセスにおいて、上記のＳタンパク質三量体は、膜融合を引き起こす重大なコンフォメーション変化を受ける（図２）。当該Ｓタンパク質の一時的な形態は、より安定的でコンパクトな「６－ヘリックスバンドル」（６ＨＢ）へと再配列される。６ＨＢの形成は、宿主細胞膜およびウイルスのエンベロープの融合のための推進力をもたらす。

【0005】

ウイルス融合のこのメカニズムは、ＣｏＶ２に特有のものではない。多くの病原性エンベロープウイルスは、細胞感染のためにＩ型のメカニズムを使用する。膜融合プロセスを画策するタンパク質は、これらウイルス間で相違する一方で、当該融合メカニズムの基本的な原理は、これらウイルス間で類似する。図３は、６ＨＢが、ＣｏＶ２と同様に、ＨＩＶ融合タンパク質およびＨＩＰＶ３融合タンパク質において形成される、ことを示す。ＨＩＶにおいて、たとえば、ウイルス性の融合を引き起こす鍵となるタンパク質は、ｇｐ４１である。エンフビルチドは、エイズを治療するための薬剤であるが、ｇｐ４１のＣＨＲドメイン由来の３６－残基のペプチドをその活性因子として有する。エンフビルチドは、ウイルスを細胞に融合させるのに必要な６ＨＢの形成を妨げることによってＨＩＶの感染を阻害する。この阻害のメカニズムが、図４に模式的に示される。

【0006】

エンフビルチドは、一生涯、１日に２回、注射によって投与されなければならない。この煩わしい投与スケジュールは、臨床的な使用を制限する。しかし、エンフビルチドは血流中において非常に急速に分解されるために、注射によって頻繁に行われるこの投与は必要とされる。プロテアーゼによる急速な分解が、従来のペプチド薬に共通する不利益である。タンパク質を構成するアルファ－アミノ酸残基のみを含むペプチドは、プロテアーゼにとって自然な基質であり、したがって、一般的に、非常に短い半減期を有する。

【0007】

ポリペプチド薬のｉｎ ｖｉｖо安定性は、非天然型アミノ酸残基を当該ポリペプチドの配列中へ置換することによって改善できる。たとえば、"Structural and Biological Mimicry of Protein Surface Recognition by a/b-Peptide Foldamers," W. S. Horne, L. M. Johnson, T. J. Ketas, P. J. Klasse, M. Lu, J. P. Moore and S. H. Gellman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009, 106, 14751 and "Enhancement of a-Helix Mimicry by an a/b-Peptide Foldamer via Incorporation of a Dense Ionic Side Chain Array," L. M. Johnson, D. E. Mortenson, H. G. Yun, W. S. Horne, T. J. Ketas, M. Lu, J. P. Moore and S. H. Gellman J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 7317を参照。Gellmanらに対する米国特許第１０，７２３，７７９号明細書、Horneらに対する米国特許第１０，６４７，７４３号明細書、および、Gellmanらに対する米国特許第１０，５０１，５１８号明細書も参照。

【発明の概要】

【0008】

ＣｏＶ２の感染力を阻害するポリペプチド化合物が、本明細書に開示される。本ペプチド化合物は、（環状に拘束されてもよいし、あるいは環状に拘束されなくてもよい）非天然型β－アミノ酸残基を含む。これらβ－アミノ酸残基の存在が、これら化合物を、ｉｎ ｖｉｖоでタンパク質分解に対して耐性があるようにし、したがって、それらの薬理活性を向上させる。主題の化合物のペプチド骨格は、α－アミノ酸残基をβ－アミノ酸残基に置換することによって変更される。β－アミノ酸残基を含ませるための骨格の変更は、プロテアーゼによる開裂への感受性を大いに減らす。

【0009】

ＣｏＶ２におけるスパイクタンパク質６ＨＢバンドルの構造は知られている。ＣｏＶ２スパイクタンパク質のＨＲ２ドメインをモデルにしたペプチドであって、スパイクタンパク質によって媒介される細胞融合の強力な阻害因子であるペプチドが、本明細書において開示される。

【0010】

改善された溶解性を有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲ２ペプチドの改良型が、本明細書に開示される。これら化合物は、コレステロール部分を担持するが、スパイクタンパク質が媒介する細胞融合の強力な阻害を発揮する。主題の化合物は、ヒトにおけるＣｏＶ２の感染を阻害し、ＣｏＶ２に感染したヒトを処置するのに有効でもあり、タンパク質分解酵素による分解に対するそれらの耐性により生体内においてより長く存続する。

【0011】

したがって、本明細書において、
配列番号２に示されるポリペプチド、または、配列番号２との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％であるが１００％未満であるポリペプチド、を含む組成物であって、上記のポリペプチドにおける少なくとも１つのα－アミノ酸残基が、β－アミノ酸残基に置換されている、組成物
が開示される。

【0012】

ある態様において、上記のポリペプチドにおける１つから１０個までのα－アミノ酸残基が、β－アミノ酸残基に置換されている。

【0013】

ある態様において、上記のポリペプチドにおける少なくとも１つのα－アミノ酸残基が、環状に拘束されるβ－アミノ酸残基に置換されている。

【0014】

いくつかの実施形態において、上記のポリペプチドにおける少なくとも１つのα－アミノ酸残基が、２－アミノシクロペンタンカルボン酸および３－アミノピロリジン－４－カルボン酸からなる群から選択される環状に拘束されるβ－アミノ酸残基に置換されている。

【0015】

いくつかの実施形態において、上記のポリペプチドにおける少なくとも１つのα－アミノ酸残基が、２－アミノイソ酪酸に置換されている。

【0016】

ある態様において、上記のポリペプチドは、脂質部分をさらに含む。

【0017】

ある態様において、上記のポリペプチドは、少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）部分をさらに含む。

【0018】

ある態様において、上記のポリペプチドは、脂質部分と、少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）部分と、をさらに含む。

【0019】

上記の脂質部分は、上記のポリペプチドの末端に結合される。

【0020】

いくつかの実施形態において、上記の脂質部分は、コレステロール、トコフェロール、およびパルミテートからなる群から選択される。

【0021】

ある態様において、上記のポリペプチドは、配列番号５～３４からなる群から選択される化合物を含む。

【0022】

配列番号３４、または、配列番号７、２３、２４、３２、および３４との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％であるが１００％未満であるポリペプチドを含む、組成物も、本明細書に開示される。

【0023】

ヒト対象を含む哺乳類の対象におけるＣｏＶ２による感染を阻害する方法であって、本開示に従う組成物を、ＣｏＶ２の感染を阻害する量で、上記の対象に投与することを含む方法も、本明細書に開示される。

【0024】

ヒト対象を含む哺乳類の対象におけるＣｏＶ２の感染の症状を改善する方法であって、本開示に従う組成物を、ＣｏＶ２の症状を改善する量で、上記の対象に投与することを含む方法も、本明細書に開示される。

【0025】

薬学的に適切な担体と組み合わせて、本開示に従う組成物を含む医薬組成物も、本明細書に記載される。

【0026】

本開示の目的および利点が、添付図面と併せてなされた本開示の好適実施形態の以下の詳細な記載から、より完全に現れる。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】細胞の中への入口孔をつくるためにウイルス性の融合タンパク質（それ自体、三量体）を用いて当該細胞に感染するエンベロープウイルスの模式的な図である。

【図2】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の、融合前のモデル（図２の左側）、および同様のタンパク質の、融合後のモデル（図２の右側）、を描写する。当該タンパク質は、ウイルス感染をもたらすために、複数のコンフォメーション変化を経なければならないことに注意する。

【図3】ＨＩＶ融合タンパク質、ＨＩＰＶ３融合タンパク質、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合タンパク質のモデルを描写し、６－ヘリックスバンドルが病原性ウイルスの間で一般的であるように見えることを示す。

【図4】孔形成プロセスを完了させるのに必要な６－ヘリックスバンドルをウイルス性の融合タンパク質三量体が形成することを阻害する作用物質を用いた当該孔形成プロセスの妨害を描写する模式的図である。エイズの薬であるエンフルビチドは、このメカニズムを介して作用すると考えられる。

【図5】ヒト気道上皮（「ＨＡＥ」）試験方法（当該方法については、実施例の項を参照）を用いた天然のＣｏＶ２ ＨＲＣペプチド（配列番号１）によるＣｏＶ２の広まり（ｅｘ ｖｉｖо）の阻害の結果を示す。当該ペプチドは、添加されたＣ末端コレステロール部分を有する。蛍光を放っているウイルス（明るいドット）の広まりが、ペプチド処理の有無にかかわらず、示された日にちにおいて示される。

【図6】天然のＣｏＶ２ ＨＲＣペプチド（配列番号１；－◆－）から修飾が行われたペプチド１（配列番号２；－■－）の細胞毒性および細胞融合の阻害を描写し、ＥＫ１（配列番号４；－●－）との比較も行われている。ＥＫ１の配列は、ヒトコロナウイルスＨＣｏＶ－ＯＣ４３ ＨＣＲドメインに由来し、ＣｏＶ２感染に対する阻害を発揮することが報告されている。ペプチド１およびＥＫ１は、天然のＣｏＶ２ ＨＲＣペプチドに比べて改善した溶解性を有する。天然のＣｏＶ２ ＨＲＣペプチド、ペプチド１、およびＥＫ１は、α－アミノ酸のみを含む。

【図7】その効力と半減期とを向上させるためにウイルス性の融合タンパク質阻害物質の中に組み込まれてもよい可能な残基変異体を描写する。

【図8】本開示に従う代表的な抗ＣｏＶ２ポリペプチドを示す。当該ポリペプチドは、Ｃ末端ポリ（エチレングリコール）－コレステロール「テール」とともに、脂肪族β－アミノ酸の置換、および環状に拘束されたβ－アミノ酸の置換、を含む。

【図9】Ｓタンパク質が媒介する細胞間融合の、本開示に従う代表的な抗ＣｏＶ２ポリペプチドによる阻害、を示す。これらポリペプチドはすべて、「ＧＳＧＳＧＣ」リンカーを通じて添加されたＣ末端ポリ（エチレングリコール）－コレステロール「テール」、を有する。「ＶＫＯ５１４４－ＳＡＲＳ２ ＨＲＣ ＱＥ ５ ｐｅｇ４ ｃｈｏｌ」：配列番号２２；「ＶＫＯ５１４６－ＳＡＲＳ２ ＨＲＣ ＱＥ ６ ｐｅｇ４ ｃｈｏｌ」：配列番号２３；「ＶＫＯ５１４８－ＳＡＲＳ２ ＨＲＣ ＱＥ ７ ｐｅｇ４ ｃｈｏｌ」：配列番号２４；「ＶＫＯ５１５０－ＳＡＲＳ２ ＨＲＣ ＱＥ ８ ｐｅｇ４ ｃｈｏｌ」：配列番号２５；「ＳＡＲＳ ｍｏｄ ｐｅｇ ４ ｃｈｏｌ ｄｉｍｅｒ」：対照の配列。

【図10A】Ｓタンパク質が媒介する細胞間融合を阻害するための代表的な抗ＣｏＶ２ポリペプチドのＩＣ₅₀を示す。楕円によって強調された「Ｚ」以外のアミノ酸残基は、それらのα－アミノ酸類似体と同じ側鎖を共有するβ²－またはβ³－アミノ酸残基を表す。楕円によって強調された「Ｚ」は、プロトンが付加されてもよいしあるいはプロトンが付加されなくてもよい（「ＡＰＣ」としても知られる）３－アミノピロリジン－４－カルボン酸である。

【図10B】Ｓタンパク質が媒介する細胞間融合を阻害するための代表的な抗ＣｏＶ２ポリペプチドのＩＣ₅₀を示す。楕円によって強調された「Ｚ」以外のアミノ酸残基は、それらのα－アミノ酸類似体と同じ側鎖を共有するβ²－またはβ³－アミノ酸残基を表す。楕円によって強調された「Ｚ」は、プロトンが付加されてもよいしあるいはプロトンが付加されなくてもよい（「ＡＰＣ」としても知られる）３－アミノピロリジン－４－カルボン酸である。

【図10C】Ｓタンパク質が媒介する細胞間融合を阻害するための代表的な抗ＣｏＶ２ポリペプチドのＩＣ₅₀を示す。楕円によって強調された「Ｚ」以外のアミノ酸残基は、それらのα－アミノ酸類似体と同じ側鎖を共有するβ²－またはβ³－アミノ酸残基を表す。楕円によって強調された「Ｚ」は、プロトンが付加されてもよいしあるいはプロトンが付加されなくてもよい（「ＡＰＣ」としても知られる）３－アミノピロリジン－４－カルボン酸である。

【発明を実施するための形態】

【0028】

略語および定義
ＡＣＰＣ＝２－アミノシクロペンタンカルボン酸。
Ａｉｂ＝２－アミノイソ酪酸（即ち、２－メチルアラニン）。
ＡＰＣ＝３－アミノピロリジン－４－カルボン酸。
βアミノ酸またはβアミノ酸残基に言及するとき、用語「環状に拘束される」は、βアミノ酸の骨格におけるα位のおよびβ位の炭素原子が置換または非置換のＣ₄～Ｃ₁₀シクロアルキル部分、置換または非置換のＣ₄～Ｃ₁₀シクロアルケニル部分、または置換または非置換のＣ₄～Ｃ₁₀複素環部分の中に組み込まれているβアミノ酸またはβアミノ酸残基、を意味し、ここで、複素環部分は、Ｎ、Ｓ、およびＯから成る群から選択される１つ、２つ、または３つのヘテロ原子を有してもよい。環状に拘束されるβアミノ酸のうち一般的に好ましいものは、ヘテロ原子として１つまたは複数のＮ、Ｓ、またはＯを有する置換または非置換のＣ₅～Ｃ₈シクロアルキル部分、置換または非置換のＣ₅～Ｃ₈シクロアルケニル部分、または置換または非置換のＣ₅～Ｃ₈複素環部分の中に組み込まれている骨格中のα位のおよびβ位の炭素原子、を有する。本明細書に開示される任意の所定の抗ＣｏＶ２ペプチドの範囲内において、環状に拘束されるβアミノ酸残基は、同じであってもよいし、または異なってもよい。

【0029】

本明細書に開示される化合物におけるアミノ酸残基は、それらのＤ型の立体配置またはそれらのＬ型の立体配置のいずれの型で存在してもよい。用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は同義的に使用され、アミド結合を介して結合されたアミノ酸の重合体を指す。

【0030】

用語「同一な」または「同一性」パーセントは、最大の一致に対して比較しアラインされたときに、以下の配列比較アルゴリズムのうちいずれかを用いてもしくは目視検査によって測定される、同一か特定の割合で同一のアミノ酸残基を有する２以上の配列について、言及する。配列比較については、一般的に、１つの配列は、被検配列と比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用するとき、被検配列および参照配列がコンピュータに入力され、もし必要であれば、配列の座標が指定され、そして、配列アルゴリズムのプログラムのパラメータが指定される。配列比較のアルゴリズムは、そのとき、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する（複数の）被検配列のパーセント配列同一性を算出する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482のローカル相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444の類似法の検索により、これらアルゴリズムのコンピュータへの実装により、または目視検査により、行われることができる。

【0031】

用語「薬学的に適切な塩」は、ヒトを含む哺乳類に投与されたときにその添加が望ましくない効果を有さない酸または塩基を用いて形成される塩、を意味する。ヒトへの使用に対する米国薬局方（または任意の他の一般的に認知されている薬局方）に載っている酸または塩基を有する塩が、好ましい。多くの薬学的に最適な塩が、従来技術において良く知られている。基本的な有効成分については、たとえば、特定の塩が精製および同定の目的のためのみに形成されるときに、またはイオン交換法によって薬学的に適切な塩を調製する際に当該特定の塩が中間体として使用されるときに、当該特定の塩が、それ自体、中間生成物としてのみ望まれるとしても、全ての酸付加塩が、遊離塩基形態の源として有用である。薬学的に適切な塩には、制限はないが、ハロゲン化水素が明示的に含まれる鉱酸または有機酸から誘導されたもの、たとえば、塩酸塩および臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マロン酸塩、シュウ酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マイレン酸塩、メチレン－ビス－ｂ－ヒドロキシナフトエート、ゲンチシン酸塩、イセチオン酸塩、ジ－ｐ－トルオイル酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、キナ酸塩、など、が含まれる。塩基付加塩には、トリエチルアミン、ピリジン、ピペリジン、モルホリン、Ｎ－メチルモルホリンなどの、アルカリ金属塩基もしくはアルカリ土類金属塩基または従来の有機塩基から誘導されたものが、含まれる。他の適切な塩は、たとえば、"Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, 2nd Ed." P.H. Stahl and C.G. Wermuch, Eds.,（コピーライト） 2011，Wiley-VCH (ISBN-13: 978-3906390512) および "Pharmaceutical Salts and Co-Crystals," Johan Wouters, Editor,（コピーライト） The Royal Society of Chemistry (U.K.) (ISBN-13: 978-1849731584)の中に見出される。

【0032】

本明細書において使用される、病気を「処置すること」または病気の「処置」は、病気を防ぐこと、病気の発症または病気の進行速度を遅らせること、病気の発症のリスクを減らすこと、病気に関連した症状の発症を防ぐまたは遅らせること、病気に関連した症状を軽減するまたは終わらせること、病気の完全なまたは部分的な退縮を引き起こすこと、またはそれらのいくつかの組み合わせ、を指すことができる。

【0033】

本明細書において使用される数値範囲は、具体的に開示されていようとなかろうと、その範囲内に含まれる全ての数値、およびその範囲内に含まれる数値のサブセットを含むように意図される。さらに、これら数値範囲は、その範囲内の任意の数値、またはその範囲内の数値の任意のサブセットに向けられる請求項に裏付けを与えるものと解釈されるべきである。たとえば、１つから１０個までの開示は、２個から８個までの、３個から７個までの、１つから９個までの、３．６個から４．６個までの、３．５個から９．９個までの、などの範囲を裏付けると解釈されるべきである。

【0034】

本発明の並外れた特徴または限定の全ての言及は、その中で言及がなされている文脈によってそれとは反対に特に明記されないかまたは明確に暗示されない限り、対応する複数の特徴または限定を含むべきであり、また、逆もまた同様である。

【0035】

本明細書において使用される方法またはプロセスのステップの全ての組み合わせは、その中で言及された組み合わせが行われる文脈によってそれとは反対に特に明記されないかまたは明確に暗示されない限り、任意の順番で行われることができる。

【0036】

本発明の方法は、本明細書に記載される方法の本質的要素および限定はもちろん、本明細書に記載されるかまたはさもなければ有機合成化学、薬学、薬理学などにおいて有用な任意の追加的なまたは選択的な構成要素、成分、もしくは限定、を含む、これら任意の追加的なまたは選択的な構成要素、成分、または限定から成る、またはこれら任意の追加的なまたは選択的な構成要素、成分、または限定から本質的に成ることができる。

【0037】

ＣｏＶ２感染を阻害する化合物
ＣｏＶ２の感染性を阻害するポリペプチド化合物を含有する組成物が、本明細書において開示される。当該ペプチドは、ＣｏＶ２のスパイクタンパク質の部分を擬態し、感染プロセスの間に生じる三量体の一時的な形態に結合する。ペプチド結合が、より安定でコンパクトな「６－ヘリックスバンドル」（６ＨＢ）へのＳの一時的な形態の再配列を防ぐ；当該ペプチドがないときには、６ＨＢの形成により、宿主細胞膜とウイルスエンベロープとの融合のための駆動力がもたらされる。

【0038】

Ｃｏｖ２におけるスパイクタンパク質６ＨＢバンドルの構造は、知られていて、ペプチドを設計するための分子標的をもたらす。ペプチドは、Ｃｏｖ２スパイクタンパク質のＨＲ２ドメインをもとにして形成される。Ｃｏｖ２ Ｓタンパク質のＨＲＣドメインの範囲内の残基１１６８～１２０３に対応する３６－残基ペプチド（配列番号：１）が、Ｓタンパク質によって媒介される細胞融合の強力な阻害因子であることが判明した。図５、およびOutlaw et al., mBio 2020, 11: e01935-20を参照。しかし、このペプチドは、低い溶解性のために、作製するには極めて困難である。ＣｏＶ２ＨＲ２ペプチドの修飾バージョンが、改善された溶解性を発揮するように設計された（配列番号：２～４）。図６、国際公開第２０２１／２１６８９１号、およびOutlaw et al., mBio 2020, 11: e01935-20を参照。完全にαアミノ酸から成る修飾ペプチドは、天然のペプチドの活性に匹敵する活性で、Ｓ媒介細胞融合の強力な阻害を発揮するが、プロテアーゼによって急速に分解される。

【0039】

したがって、非天然βアミノ酸残基を含むポリペプチド化合物が、本明細書に開示される。これらβアミノ酸残基の存在が、これら化合物を、生体内でプロテアーゼに対して耐性があるようにし、したがって、それらの薬理活性を向上させる。

【0040】

好ましい形態において、ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有するか、または、配列番号２との当該ポリペプチドの配列同一性が、少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％であるが１００％未満であり、上記のポリペプチドにおける少なくとも１つのα－アミノ酸残基が、β－アミノ酸残基に置換されている。

【0041】

様々な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％同一である配列同一性、を有し、上記のポリペプチドにおける少なくとも１つのα－アミノ酸残基が、β－アミノ酸残基に置換されている。

【0042】

様々な実施形態において、上記のポリペプチドにおける１つから１０個までのαアミノ酸残基が、β－アミノ酸残基に置換されていてもよく、たとえば、上記のポリペプチドにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０αアミノ酸残基が、β－アミノ酸残基に置換されている。

【0043】

β－アミノ酸残基は、骨格のα位もしくはβ位の炭素原子において（即ち、β²炭素原子もしくはβ³炭素原子において）直線状であってもよいし、置換されていなくてもよいし、もしくは置換されていてもよいし、または、挿入されたβ－アミノ酸残基のαおよびβ骨格炭素原子を取り囲む環状基によって立体配座的に制約されていてもよい（図７）。
環状に拘束されたβ－アミノ酸残基の例には、２－アミノシクロペンタンカルボン酸（ＡＣＰＣ）および３－アミノピロリジン－４－カルボン酸（ＡＰＣ）が、含まれる。

【0044】

いくつかの実施形態において、上記のポリペプチドにおける少なくとも１つのα－アミノ酸残基は、２－アミノイソ酪酸（即ち、２－メチルアラニン；「Ａｉｂ」としても知られる）に置換されている。

【0045】

好ましくは、本明細書に開示されるポリペプチドは、脂質部分をさらに含有する。脂質共役阻害ペプチドに関するより初期の研究が、脂質がペプチドを細胞膜へと向かわせて抗ウイルス効果を高める、ということを証明した（米国特許第８,６２９，１０１号明細書；Ingallinella et al. PNAS 2009, 106: 5801; Park and Gallagher, Virology 2017, 511: 9-18）。脂質部分の例には、コレステロール、トコフェロール、およびパルミチン酸塩が含まれる。脂質コンジュゲーションについては、上記のポリペプチドは、一般的に、Ｃ末端において、たとえば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓセグメント（配列番号３５）によって伸長される。介在するテトラエチレングリコールセグメントで脂質部分、たとえば、コレステロールを付加するために、システイン側鎖が、求核ハンドルとして使用される。脂質部分は、細胞膜にペプチドを固定させるように意図される。いくつかの実施形態において、Ｃ末端セグメント（たとえば、配列番号３５）の少なくとも１つのα－アミノ酸残基が、β－アミノ酸残基に置換されている。

【0046】

ポリ（エチレングリコール）部分（たとえば、ＰＥＧ４）が、上記のポリペプチドと上記の脂質部分との間に付加されることができる。上記のポリペプチドと上記の脂質部分との間に挿入された当該ＰＥＧ部分は、向上した広域スペクトル活性および効力をもたらすことが示された（国際公開第２０２１／２１６８９１号）。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＰＥＧ部分が、上記のポリペプチドと上記の脂質部分との間に付加される。

【0047】

表１において以下に示されるように、配列番号５～３４は、本開示に従う一連の例示的なポリペプチドである。当該ポリペプチドは、配列番号２から誘導され、少なくとも１つのα－アミノ酸残基をβ－アミノ酸残基に置換させられる。これら化合物は例示的であり、余すところなく記載しているわけではない。

【0048】

【表1】

【0049】

医薬組成物
本明細書に記載される抗ＣｏＶ２ポリペプチドまたはその薬学的に適切な塩を含有する医薬組成物も、本明細書に開示される。より具体的には、上記の医薬組成物は、抗ＣｏＶ２ポリペプチドはもちろん、標準的な良く知られた非毒性の薬学的に適切な担体、アジュバントまたは賦形剤、たとえば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤、または水／油エマルションなどのエマルション、などのアジュバントまたは賦形剤、のうちの１つまたは複数を含有することができる。本組成物は、液体、固体、または半固体の形態のいずれであってよい。たとえば、本組成物は、錠剤、カプセル、摂取可能な液体もしくは粉末、注入可能な座薬、または局所軟膏もしくはクリームの形態であってよい。たとえば、分散の場合において適切な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性が維持できる。等張剤、たとえば、糖類、塩化ナトリウム、などを含むことが望ましい場合もある。そのような不活性希釈剤以外に、本組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、香味剤、芳香剤などのアジュバントを含むこともできる。

【0050】

活性化合物に加えて、懸濁液が、たとえば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、またはこれら物質の混合物、などの懸濁化剤を含有することもできる。

【0051】

錠剤およびカプセルなどの固形の剤形が、薬学の技術において良く知られた技法を用いて作製できる。たとえば、本明細書に記載されるようにして作製された抗ＣｏＶ２ポリペプチドは、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤と、片栗粉またはアルギン酸などの崩壊剤と、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤と組み合わせて、ラクトース、スクロース、およびコーンスターチなどの従来のタブレットベースを用いて、錠剤化できる。カプセルは、これら賦形剤を酸化防止剤および上記の関連するポリペプチドとともにゼラチンカプセルの中に組み入れることによって、作製できる。

【0052】

静脈内投与の場合には、本ポリペプチドは、市販の製剤の中に組み入れられることができる。望ましい場合には、上記の製剤の個々の成分が、１回または複数回の使用のために、キットの形で、個々に供給されてもよい。

【0053】

本医薬組成物は、経口投与されることが可能である。たとえば、液体製剤が、経口投与されることが可能である。さらに、均質な混合物が、噴霧液または吸入剤を形成するために、水の中で完全に分散させられ、生理学的に許容される希釈剤、防腐剤、緩衝液、または推進剤と無菌状態下で混ぜられることができる。投与の経路は、もちろん、所望の効果および処置される対象者の医学的状態に依存するだろう。患者に投与されるべき本組成物の投与量は、当業者によって決定されることが可能であり、患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態、などの様々な要因に依存し、最終的には、処置を施す医療専門家の裁量に委ねられる。

【0054】

形態に関しては、本組成物は、たとえば、溶液、分散、懸濁液、エマルション、またはそれから再溶解される無菌パウダーであってもよい。本組成物は、毎日１回の服用または複数の服用で投与されてもよい。

【0055】

本開示は、本明細書に記載される抗ＣｏＶ２ポリペプチドのうちの１つまたは複数を、阻害する量および／またはＣｏＶ２症状を改善する量で、投与することによってヒトを含む哺乳類においてＣｏＶ２を処置することも、含む。特に、本開示の組成物は、任意のおよび全ての記載のＣｏＶ２状態を処置するために使用できる。

【0056】

上記の医薬組成物は、ヒトと同様に、国内向けおよび非国内向けの両方で、ヒト以外の動物に関連して使用できることに注意すべきである。

【実施例】

【0057】

本実施例において、例示的な抗ＣｏＶ２ポリペプチドが、ＣｏＶ２Ｓ－タンパク質媒介融合を阻害する際に評価された。本実施例において試験されたポリペプチドは、脂肪族β－アミノ酸置換および／または環状に拘束されたβ－アミノ酸置換を含み、「ＧＳＧＳＧＣ」（配列番号３５）のＣ末端リンカーを通じてポリ（エチレングリコール）－コレステロール「テール」に結合される。図８は、ポリ（エチレングリコール）－コレステロール「テール」を有する例示的なポリペプチドの１つを示す。

【0058】

図９は、細胞－細胞融合アッセイからの結果を示し、阻害率は、任意の阻害物質がない場合に観察される発光シグナルの抑制の程度に相当する（即ち、０％の阻害は、最大の発光シグナルに相当する）。

【0059】

ＳＡＲＳ２ ＨＲＣ ＱＥ６およびＱＥ７（配列番号２３－２４）は、約２０ｎＭの５０％阻害濃度(ＩＣ₅₀)および約１００ｎＭの９０％阻害濃度（ＩＣ₉₀）で、Ｓ媒介融合を強力に阻害した。ＳＡＲＳ２ ＨＲＣ ＱＥ８（配列番号２５）も、約１００ｎＭのＩＣ₅₀でＳ媒介融合を阻害する際に効果を示す。ＳＡＲＳ２ ＨＲＣ ＱＥ５（配列番号２２）は、約１０００ｎＭのＩＣ₅₀で効果が低い。

【0060】

図１０Ａ～１０Ｃは、より広範囲の例示的な抗ＣｏＶ２ポリペプチドを試験した細胞－細胞融合アッセイからのより多くの結果を示す。配列番号７、２４、および３４のポリペプチドは、Ｓ媒介融合を阻害する際に、約１０ｎＭのＩＣ₅₀で、最大の効力を示し、次いで、配列番号８、１０、および３２のポリペプチドが、約５０ｎＭのＩＣ₅₀で、効力を示す。

【0061】

方法
ペプチド合成。以前に報告された、Ｆｍｏｃに基づくペプチド固相合成のためのマイクロ波アシスト条件を用いて、ペプチドが、ＮｏｖａＰＥＧリンクアミドレジン（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡの完全所有子会社、ダルムシュタット、ドイツ）上に作製された。Horne, W.S., Boersma, M.D., Windsor, M.A. & Gellman, S.H. Sequence-Based Design of α/β-Peptide Foldamers that Mimic α-Helical BH3 Domains, Angew. Chem. Int. Ed. 47, 2853-6, (2008); Horne, W.S., Johnson, L.M., Ketas, T.J., Klasse, P.J., Lu, M., Moore, J.P., Gellman, S. H. Structural and biological mimicry of protein surface recognition by α/β-peptide foldamers. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 106, 14751-6, (2009); Johnson, L.M., Mortenson, D.E., Yun, H.G., Horne, W.S., Ketas, T.J., Lu, M., Moore, J.P., & Gellman, S.H. Enhancement of α-Helix Mimicry by an α/β-Peptide Foldamer via Incorporation of a Dense Ionic Side-Chain Array. J. Am. Chem. Soc. 134, 7317-20, (2012); Boersma, M.D., Haase, H.S., Peterson-Kaufman, K.J., Lee, E.F., Clarke, O.B., Colman, P.M., Smith, B.J., Horne, W.S., Fairlie, W.D., & Gellman, S.H. Evaluation of diverse α/β-backbone patterns for functional α-helix mimicry: analogues of the Bim BH3 domain. J. Am. Chem. Soc. 134, 315-23, (2012); and Horne, W.S., Price, J.L., & Gellman, S.H. Interplay among side chain sequence, backbone composition, and residue rigidification in polypeptide folding and assembly. Proc. Natl Acad Sci USA 105, 9151-6, (2008)を参照。

【0062】

鎖が組み立てられた後、ペプチドが上記のレジンから切断され、上記のレジンを、２ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５０μＬの水、および５０μＬのトリイソプロピルシランで、３時間処理することによって、側鎖が、脱保護された。ＴＦＡ溶液は、そのとき、脱保護されたペプチドを沈殿させるために、冷たいエーテルの中へとしたたり落とさせられる。ペプチドは、逆相－ＨＰＬＣを用いてｐｒｅｐ－Ｃ１８カラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）上で精製された。純度が、ＲＰ－ＨＰＬＣ（溶媒Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ、Ｃ１８分析カラム（４．６×２５０ｍｍ）、流速１ｍＬ／分、勾配５０分間にわたる１０～６０％Ｂ溶媒）によって評価された。質量が、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによって測定された（データは示さない）。

【0063】

ペプチドアッセイ。上記の文献からのＨＰＬＣ法が、選択された化合物へのプロテアーゼの作用を評価するために使用された。Murage, E.N., Gao, G.Z., Bisello, A., & Ahn, J.M. Development of Potent Glucagon-like Peptide-1 Agonists with High Enzyme Stability via Introduction of Multiple Lactam Bridges. J. Med. Chem. 53, 6412-20, (2010) を参照。

【0064】

プロテアーゼが添加される前に、２ｎｍｏｌの固体ペプチドが、４０μＬのＴＢＳ ｐＨ８．０に溶解させられた（ペプチドの結果生じる濃度＝４０μＭ）。キモトリプシンが、Ｐｒｏｍｅｇａフィッチバーグ、ウィスコンシン州、；カタログ＃Ｖ１０６２）から購入され、ネプリライシンが、Ｒｅｐｒｏｋｉｎｅ（バレー・コテージ、ニューヨーク州；カタログ＃ＲＫＰ０８４７３）から購入された；水中の２５０μｇ／ｍＬのキモトリプシン原液および２００μｇ／ｍＬのネプリライシンの原液が調製された。プロテアーゼ保存液の１０μＬのアリコートが、反応を開始させるために、４０μＬの４０μＭペプチド溶液に添加された。定期的に、上記の溶液の１０μＬのアリコートが除去され、プロテアテーゼの作用は、１００μＬの１％水性ＴＦＡ溶液にこのアリコートを添加することによって、止められた。急冷された上記の溶液の一部（１００μＬ）が、「ペプチド合成」の項において記載された条件を用いて、ＨＰＬＣカラム上に注入され、ピークが、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを用いて分析された。ペプチドの分解の時間的経過は、一連のＨＰＬＣトレースにおける各ピークのエリアを統合することによって、実験的に決定された。（初期トレースに対する）親ペプチドの面積パーセントが、各トレースに対して算出され、半減期の値を決定するために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトにおいて指数関数的減衰として曲線で表された。

【0065】

細胞。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞、およびＶｅｒｏ（アフリカミドリザルの腎臓）細胞が、５％ＣＯ₂中で１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において生育された。Ｖｅｒｏ Ｅ６ 細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８６）が、５％ＣＯ₂中で６％ＦＢＳおよび抗生物質で補われたアール塩（ＥＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）を用いて、最小必須培地において生育された。

【0066】

プラスミド。蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓに融合されたｈＡＣＥ２、蛍光タンパク質ＶｅｎｕｓおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓに融合されたジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）のためのｃＤＮＡのコーディング（哺乳類発現に対して最適化されたコドン）のクローンが、（セレクションのためのピューロマイシン耐性を有する）ｐＣＡＧＧＳの修飾バージョンにおいて作られた。

【0067】

ウイルス。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｔｒａｉｎ ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０が、テキサス大学医学部（ＵＴＭＢ）の新生のウイルスおよびアルボウイルスのためのワールドリファレンスセンタ（World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses：ＷＲＣＥＶＡ）から得られ、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に伝播された。ウイルスストックが、接種３日後または４日後に採取された浄化された細胞培養上清から、生成された。ネオングリーン（ｉｃＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｍＮＧ）を発現させる組換えウイルスが、Ｐｅｉ－Ｙｏｎｇ Ｓｈｉおよびその同僚によって開発され（Xie X. et al., An infectious cDNA clone of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe 27: 841-848.e3, 2020）、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に伝播された。感染ウイルスを用いた全ての作業（伝播、滴定、およびプラーク減少アッセイ）が、ＵＴＭＢのガルベストン国立研究所におけるバイオセーフティーレベル３（ＢＳＬ３）の施設において行われた。

【0068】

β－Ｇａｌ相補性に基づく融合アッセイ（細胞－細胞融合アッセイ）。我々は、以前、－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌ）のアルファ相補性に基づいて融合アッセイを適合させた（Porotto M. et al., Inhibition of Nipah virus infection in vivo: targeting an early stage of paramyxovirus fusion activation during viral entry. PLoS Pathog 6: e1001168, 2010）。このアッセイにおいて、ｈＡＣＥ２またはＤＤＰ４受容体を有しかつβ－Ｇａｌのオメガペプチドを発現させる細胞が、β－Ｇａｌの糖タンパク質Ｓおよびアルファペプチドを共発現させる細胞と混合させられ、細胞融合が、アルファ－オメガ相補性へと導く。融合は、細胞を溶解させることによって停止させられ、基質（Ｔｒｏｐｉｘ Ｇａｌａｃｔｏ－Ｓｔａｒ化学発光レポーターアッセイシステム；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）の追加後に、発光が、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００ＰＲＯマイクロプレートリーダー上で定量化される。

【0069】

ウイルス滴定およびプラーク減少中和アッセイ。ウイルスストックの力価は、６ウェル組織培養プレートにおいて培養されたＶｅｒｏ Ｅ６細胞において、プラークアッセイによって決定された。ウイルスストックは、ＰＢＳにおいて１０倍に段階希釈され、０．２ｍｌの各希釈物が、４ウェルへ播種され、１５分おきに揺動させて、３７℃で１時間、吸着された。単分子層が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）で濯がれ、それから、ＭＥＭ、５％ＦＢＳ、抗生物質、およびＭＥアガロース（０．６％）を含有する半固形培地で覆われた。培養菌が、３７℃で３日間培養され、染色剤としてニュートラルレッド（３．３３ｇ／リットル；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１０％）を含有するＤＰＢＳで覆われ、４～５時間後にプラークが数えられた。

【0070】

ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する阻害活性について、プラーク減少中和アッセイを用いて試験された。ペプチドは、分子生物学グレードの水（１０，０００ｎＭから５ｎＭまで、または１、０００ｎＭから０．５ｎＭまで）で段階希釈され、各ペプチド用量は、５００プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌのウイルス含量の等量と、ＭＥＭで混合され、そのペプチド／ウイルス混合物は、３７℃で１時間培養された。各ペプチド用量／ウイルス混合物は、６ウェルプレートのＶｅｒｏ Ｅ６細胞の３組の中へと撒かれ（１ウェル当たり０．２ｍｌ）、１５分ごとに揺動させて、３７℃で１時間、吸着された。ＭＥＭ、５％ＦＢＳ、抗生物質、およびＭＥアガロース（０．６％）を含有する培地への交換の前に、単分子層は、ＤＰＢＳでリンスされた。培養菌は、３７℃で３日間培養され、染色剤としてニュートラルレッドを含有する培地が重ねられ、プラークが、４～５時間後に数えられた。ウイルスコントロールは、ペプチドの代わりに滅菌水と混合されたものとした。

【0071】

ＨＡＥ培養物。ＥｐｉＡｉｒｗａｙ ＡＩＲ－１００システム（ＭａｔＴｅｋ）は、ｉｎ ｖｉｖоで上皮組織と極めて近い疑似重層の高分化型粘膜繊毛性上皮を形成するために培養された正常ヒト由来気管／気道上皮細胞からなる。製造業者から受け取ると、ＨＡＥ培養物は、我々が以前行ったように処理された（Outlaw V. K. et al., Dual inhibition of human parainfluenza type 3 and respiratory syncytial virus infectivity with a single agent. J Am Chem Soc 141: 12648-12656. 2019; Moscona A. et al., A recombinant sialidase fusion protein effectively inhibits human parainfluenza viral infection in vitro and in vivo. J Infect Dis 202: 234-241, 2010; Palermo L. M. et al., Human parainfluenza virus infection of the airway epithelium: the viral hemagglutinin-neuraminidase regulates fusion protein activation and modulates infectivity. J Virol 83: 6900-6908, 2009）。培養物は、一時的に、１ウェル当たり１．０ｍｌの培地（基底外側で培地交換、頂端面は空気に曝露されたままの状態で）を含む６ウェルプレートに移され、実験の前に、３７℃、５％ＣＯ₂下で２４時間、順化させられた。

【0072】

ＨＡＥのウイルス感染。ＨＡＥ培養物は、安定なｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ受容体遺伝子（ｉｃＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｍＮＧ）（Xie X. et al., An infectious cDNA clone of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe 27: 841-848.e3, 2020）を発現させる感染性クローン由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を２，０００ＰＦＵだけ含有する２００μｌのＥｐｉＡｉｒｗａｙリン酸緩衝生理食塩水（ＭａｔＴｅｋ ＴＥＥＲ緩衝液）を頂端面に３７℃で９０分間塗布することによって感染させられた。９０分の時点で、接種材料を含有する培地が除去され、上記の頂端面が、２００μｌのＴＥＥＲ緩衝液で洗浄され、２０μｌのペプチド（１０，０００ｎＭ）または相当量のＴＥＥＲ緩衝液のいずれかが、処理として添加された。採取後、培養物には、基底外側に毎日１．０ｍｌ培地を補充することによって、培地交換がなされた。最終的なペプチド濃度は、２００ｎＭであった。

【0073】

ウイルスは、１ウェル当たり２００μｌのＴＥＥＲ緩衝液をＨＡＥ培養物の頂端面に添加することによって採取され、３７℃で３０分間、平衡させられた。そのとき収集された懸濁液は、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で不活性化され、ＲＴ－ｑＰＣＲのために処理された。このウイルスの収集は、接種後毎日、細胞の同じウェルに対して順次行われた。頂端の懸濁液および基底外側の懸濁液を採取した後、細胞は、接種から７日目にＴＲＩｚｏｌを使用して溶解された。頂端側および基底外側から収集されたＨＡＥ上清からの感染性ウイルスの合計量は、１ウェル当たり０．１ｍｌで播種し１２ウェルプレートで培養されたＶｅｒｏ Ｅ６細胞のプラークアッセイによって決定された（３系列をＰＢＳでそれぞれ１０倍希釈）。

【0074】

定量ＲＴ－ＰＣＲ。細胞抽出物および上清液におけるウイルス力価が、定量ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって推定された。全ＲＮＡが、製造業者の取り扱い説明書に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、抽出された。逆転写は、ＧｏＳｃｒｉｐｔ逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行われた。得られたｃＤＮＡは、１：１０で希釈された。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＲＯＸキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにＰｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ－ＵＤＧを使用して行われた。ｑＰＣＲは、以下のプロトコルを用いて、ＡＢＩ７０００ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で動かされた：（ｉ）９５℃、５分；（ｉｉ）９５℃、１５秒と６０℃、１分 ４０サイクル；（ｉｉｉ）０．８℃間隔での９５℃までの融解曲線。標準的な参照（「ｔｈｅ ＣＤＣ ２０１９－ｎＣｏＶ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ」ｋｉｔからの２０１９－ｎＣｏＶ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ－ｎＣｏＶＰＣ）が、結果を標準化するために各実行に含まれた。

【0075】

細胞毒性アッセイ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＶｅｒｏ細胞は、３７℃で、ペプチドまたは溶媒（ジメチルスルホキシド）の所定の濃度で、培養された。細胞毒性は、製造業者の取り扱い説明書に従ってＶｙｂｒａｎｔ ＭＴＴ細胞増殖アッセイキットを使用して、２４時間後に決定された。吸光度は、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００ＰＲＯマイクロプレートリーダーを使用して、５４０ｎｍで読み取られた。ＨＡＥ培養物は、１、１０、または１００Ｍの濃度のペプチドの存在下または非存在下において、３７℃で培養された。ペプチドは、栄養供給培地に添加された。７日目の細胞生存率が、製造業者の取り扱い説明書に従ってＶｙｂｒａｎｔ ＭＴＴ細胞増殖アッセイキットを使用して、決定された。吸光度は、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００ＰＲＯマイクロプレートリーダーを使用して、５４０で読み取られた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【配列表】

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【国際調査報告】