▶ ラモット・アット・テル・アビブ・ユニバーシテイ・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-28
(54)【発明の名称】古細菌の発酵によるＰＨＡの生産方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/625 20220101AFI20241018BHJP
C12N 1/00 20060101ALN20241018BHJP
【ＦＩ】
C12P7/625
C12N1/00 P
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024524003
(86)(22)【出願日】2022-10-06
(85)【翻訳文提出日】2024-06-24
(86)【国際出願番号】 IL2022051061
(87)【国際公開番号】W WO2023073684
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/257,655
(32)【優先日】2021-10-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501177609
【氏名又は名称】ラモット・アット・テル・アビブ・ユニバーシテイ・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＡＭＯＴ ＡＴ ＴＥＬ ＡＶＩＶ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ゴルバーグ，アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】ゴーシュ，スプラティム
(72)【発明者】
【氏名】ゴジン，ミハエル
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AD83
4B064CA02
4B064CD09
4B064CD19
4B064CD24
4B065AA01X
4B065AC14
4B065BB18
4B065BB26
4B065BB40
4B065BC02
4B065BD01
4B065BD10
4B065BD14
4B065BD29
4B065CA12
4B065CA54
4B065CA55
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、ハロフェラックス・メディテラネイ（Haloferax mediterranei）などの古細菌の発酵によるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の大スケールでの生産方法であって、空気が、発酵槽中に、その底部から常にバブリングされて、培養培地の常時の通気及び混合、さらには二酸化炭素の除去が可能とされる、生産方法に関し、さらに、ＰＨＡと少なくとも２つの追加のポリマーとのブレンド、及び前記ブレンドを含む又は前記ブレンドから製造された物品も提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の、前記ＰＨＡを生産することができる古細菌の発酵による生産方法であって、前記方法は、（ｉ）少なくとも約５リットルの培養体積を有する発酵槽を提供する工程であって、前記発酵槽は、前記培養体積を占める培養培地を含み、前記培養培地は、炭素源及び窒素源が添加された塩水（例：海水）を含み、前記古細菌の培養に適するものである、工程、
（ｉｉ）前記培養培地に前記古細菌の種培養物を播種する工程、
（ｉｉｉ）前記発酵槽の内部でその底部から、前記培養培地の通気及び混合の両方が常に行われるように空気などの酸素含有気体混合物を少なくとも約０．２ｖｖｍの通気速度で常にバブリングしながら、前記培養培地中の前記古細菌の予め定められた濃度が得られるまで、前記古細菌を培養する工程、
（ｉｖ）前記培養培地から前記古細菌のバイオマスを採取する工程、及び
（ｖ）前記採取したバイオマスから前記ＰＨＡを濃縮、分離、及び／又は抽出する工程、
を含む、方法。
【請求項2】
前記古細菌が、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ハロフェラックス・メディテラネイが、ハロフェラックス・メディテラネイ ＡＴＣＣ ３３５００である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記培養培地が、炭素及び窒素を、各々独立して、乾燥質量基準で、約１重量％～約８０重量％の量で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記培養培地中の炭素の量が、乾燥質量基準で、少なくとも約1０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、又は７０重量％であり、前記培養培地中の窒素の量が、乾燥質量基準で、少なくとも約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記炭素源が、単糖類若しくは多糖類などの糖類、グリセロール及び脂肪酸、ビナス、蒸留廃液、糖蜜廃水、及びオリーブ工場廃水などの廃棄物、ポリオール、海藻加水分解物、オリーブ葉加水分解物、製紙廃棄物、農業廃棄物加水分解物、及びチーズホエイ加水分解物などの加水分解物、若しくはこれらの混合物を含み、並びに／又は、前記窒素源が、タンパク質、グリコシル化タンパク質、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、及び窒素含有オリゴ糖類を含むバイオポリマー、ペプチド、アミノ酸、及び窒素塩、海藻加水分解物、オリーブ葉加水分解物、農業廃棄物加水分解物、及びチーズホエイ加水分解物などの加水分解物、若しくはこれらの混合物などの有機又は無機窒素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記炭素源が、前記炭素源の少なくとも約１重量％、好ましくは約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、若しくはそれ以上を構成する海藻加水分解物を含み、及び／又は、前記窒素源が、前記窒素源の少なくとも約１重量％、好ましくは約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、若しくはそれ以上を構成する海藻加水分解物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記培養培地が、臭化物アニオンを含む塩などの塩、バッファー、リン、又はこれらの混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記培養培地が、前記炭素源、前記窒素源、及び所望に応じて前記リン、ハロゲン、又はそれらの混合物が添加された塩水、例えば海水を含み、前記培養培地中の炭素及び窒素の量が、各々独立して、乾燥質量基準で、約１重量％～約８０重量％であり、前記炭素源が、前記炭素源の少なくとも約１重量％を構成する海藻加水分解物を含み、前記窒素源が、前記窒素源の少なくとも約１重量％を構成する海藻加水分解物を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記培養培地中の炭素の量が、乾燥質量基準で、少なくとも約１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、又は７０重量％であり、前記培養培地中の窒素の量が、乾燥質量基準で、少なくとも約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％であり、前記炭素源が、前記炭素源の少なくとも約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、又はそれ以上を構成する海藻加水分解物を含み、前記窒素源が、前記窒素源の少なくとも約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、又はそれ以上を構成する海藻加水分解物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記海藻加水分解物が、ウルバ属種（Ulva sp.）加水分解物などの緑色大型藻類加水分解物である、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記播種工程（ｉｉ）の前の前記培養培地のｐＨが、最大８．５である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記播種工程（ｉｉ）の前の前記培養培地のｐＨが、約２～約８．５、好ましくは約６．８～約７．４の範囲内、例えば７．２である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記培養工程（ｉｉｉ）が、少なくとも４８時間、６０時間、又は７２時間にわたって行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記通気速度が、約０．８～約１．２ｖｖｍ、好ましくは約１ｖｖｍである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
工程（ｖ）が、水（加水分解）、高圧、パルス電場、及び遠心分離と濾過などの物理的手段；細胞溶解バッファー、深共晶溶媒、有機溶媒、二相溶媒系、及びイオン液体などの化学的手段；又はこれらの組み合わせによって前記ＰＨＡを抽出することを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
得られた前記ＰＨＡの分子量が、前記通気速度及び前記古細菌の培養期間に応じて変動する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
工程（ｖ）で得られた前記ＰＨＡを精製することによって精製ＰＨＡを得る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記精製工程が、得られた前記ＰＨＡを水、イオン液体、又はこれらの組み合わせで繰り返し洗浄することによって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
例えばドラム乾燥機、噴霧乾燥機、空気若しくは空気／窒素流乾燥、又は凍結乾燥機によって、前記精製ＰＨＡを乾燥させる工程をさらに含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項21】
前記精製ＰＨＡを、少なくとも１つのポリマーとブレンドする工程をさらに含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記少なくとも１つのポリマーが、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ケラチン、セルロース、キチン、リグニン、アミロース、アミロペクチン、及びムチンなどの生分解性ポリマー、又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ、ポリエステルとも称される）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリメタクリル酸又はそのエステル、ポリ（アクリロニトリル－ｃｏ－ブタジエン－ｃｏ－スチレン）（ＡＢＳ）、ポリアミド、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリシロキサン、グラフトポリマー、及びポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）などのデンドリマーなどの非生分解性ポリマー若しくはコポリマーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記発酵槽が、オープン発酵槽であり、及び前記古細菌の前記培養が、非滅菌条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記発酵槽が、ガラス、セラミック、プラスチック、セメントから作られている、又は前記発酵槽が、土製発酵槽（土手による池）である、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
連続的に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）及び少なくとも２つの追加のポリマーを含むブレンド。
【請求項27】
前記少なくとも２つの追加のポリマーが、各々独立して、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ケラチン、セルロース、キチン、リグニン、アミロース、アミロペクチン、ムチン、若しくは前記ＰＨＡとは異なるＰＨＡなどの生分解性ポリマー、又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ、ポリエステルとも称される）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリメタクリル酸若しくはそのエステル、ポリ（アクリロニトリル－ｃｏ－ブタジエン－ｃｏ－スチレン）（ＡＢＳ）、ポリアミド、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリシロキサン、グラフトポリマー、及びＰＡＭＡＭなどのデンドリマーなどの非生分解性ポリマーである、請求項２６に記載のブレンド。
【請求項28】
前記少なくとも２つの追加のポリマーが、ＰＬＡ及びケラチンを含む又はＰＬＡ及びケラチンから成る、請求項２７に記載のブレンド。
【請求項29】
ＰＨＡ：ＰＬＡの比が、それぞれ、重量基準で約１：９９～約９９：１である、請求項２８に記載のブレンド。
【請求項30】
前記ＰＨＡ：ＰＬＡの比が、それぞれ、重量基準で約２０：８０～約４０：６０、例えば約２５：７５、約３０：７０、又は約３５：６５である、請求項２９に記載のブレンド。
【請求項31】
前記少なくとも２つのポリマーのうちの１つが、ケラチンであり、前記ケラチンが、前記ブレンドの約１重量％～約９９重量％、好ましくは約１０重量％～約５０重量％を構成する、請求項２７に記載のブレンド。
【請求項32】
請求項２６～３１のいずれか一項に記載のブレンドを含む、又は前記ブレンドから製造された物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）などの古細菌の屋外発酵を含む発酵によるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の大スケールでの生産方法であって、空気が発酵槽中に、その底部から常にバブリングされて、培養培地の常時の通気及び混合、さらには二酸化炭素の除去が可能とさる、生産方法に関し、さらに、ＰＨＡと追加のポリマーとのブレンド、及びそれから製造された物品が提供される。
【背景技術】
【0002】
２０１６年における世界の石油化学プラスチック生産量は、年間３億３５００万トンであり、このことによって、使用済み廃棄物処理及びプラスチックによる環境汚染に関する切迫した懸念が高まっている。世界中で用いられるポリマーの２２～４３％が埋立地に廃棄され、毎年１０００万～２０００万トンのプラスチックが海洋へと流れ込む結果となり、このことは、生態系に対するダメージ、及びそれに伴う年間１３０億米ドルのコスト負担を引き起こしている。政府は現在、バイオプラスチックの使用を強制し、埋め立て処理禁止を導入することで、バイオベースの循環型経済を促進する戦略を支援している。バイオポリマーの中でも、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、その調整可能なコポリマー配合及び機械的特性、並びに海洋環境及び周囲土壌環境の両方における独特の分解性に起因して、卓越した持続可能材料として認識されている。加えて、他のバイオポリマーとは異なり、ＰＨＡポリマーは、疎水性、水不溶性、空気中で無期限に安定、無毒性、熱可塑性、及び／又は弾性であり、細胞内での非常に高い純度を有する。ＰＨＡポリマーファミリーは、バイオポリマーの広範な用途に対して高い可能性及び適応性を有している。したがって、ＰＨＡ蓄積の効率が高い微生物の探索は、今現在必要とされることである。野生型の菌株の中で、極端な好塩菌であるハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈｆｘ．メディテラネイ）は、最も重要な菌株である。この古細菌は、様々な基質を利用して、細胞内に多量のＰＨＡを蓄積することができる。さらに、高い耐塩性を特徴とするその好極限性により、この生物の非滅菌培養が可能となり、そのため、プロセスに必要なコスト及びエネルギーが削減される。
【0003】
数十年にわたる研究にもかかわらず、ＰＨＡプロセスの商業化は遅れている。これは、製品が市場に浸透する初期段階において高価値の用途が存在しないことで説明できる可能性があり、この場合、石油系プラスチックのコスト障壁が課題である。しかし、海藻からＰＨＡを生産するための塩生植物バイオリファイナリープロセスの開発は、依然として難しく、現行のプロセスと比較して明確な優位性を与えることになるこれらのプロセスのスケールアップの可能性には、ギャップが存在する。例えば、現在細菌によるＰＨＡ生産に用いられている密閉制御発酵槽は、高価であり、培養培地の混合のために多くの淡水及びエネルギーを必要とする（Mahler et al., 2018）。加えて、細菌バイオマスの採取は、
通常遠心分離機で行われるが、これは、ほとんどスケールアップの可能性がなく、極端な好塩菌の増殖に必要な腐食性の高塩濃度培地において安定ではない。さらに、極端な好塩古細菌に関する研究のほとんどは、シェイクフラスコ培養又は作業体積１～１０Ｌのバイオリアクターで行われてきた（Alsafadi and Al-Mashaqbeh, 2017；Hezayen et al., 2000）。したがって、様々な炭素基質を用いた好塩古細菌からのＰＨＡ生産のスケールアッ
プに焦点を当てる必要のある研究が必要とされている。培養培地の塩分濃度が高いことはまた、リアクターの構造材料に関する課題ももたらす。塩分濃度が高いほど腐食性条件がより強くなるため、耐腐食性のリアクターが必要となる（Hezayen et al., 2000）。酸素は、微生物の増殖及び他の代謝活動に必要不可欠である。これは、培地中の酸素の溶解度がさらに低下する高塩分条件では、より重要となる。ＰＨＡ生産の増強のために酸素制限
条件が研究されてきた一方で、酸素豊富条件は、バイオマス濃度を高めるのに役立ち、そのため高密度培養に繋がる（Maheshwari et al., 2018）。したがって、極端な好塩古細
菌の増殖、さらにはＰＨＡ生産に対する酸素濃度の役割を評価することが重要になってくる。
通常遠心分離機で行われるが、これは、ほとんどスケールアップの可能性がなく、極端な好塩菌の増殖に必要な腐食性の高塩濃度培地において安定ではない。さらに、極端な好塩古細菌に関する研究のほとんどは、シェイクフラスコ培養又は作業体積１～１０Ｌのバイオリアクターで行われてきた（Alsafadi and Al-Mashaqbeh, 2017；Hezayen et al., 2000）。したがって、様々な炭素基質を用いた好塩古細菌からのＰＨＡ生産のスケールアッ
プに焦点を当てる必要のある研究が必要とされている。培養培地の塩分濃度が高いことはまた、リアクターの構造材料に関する課題ももたらす。塩分濃度が高いほど腐食性条件がより強くなるため、耐腐食性のリアクターが必要となる（Hezayen et al., 2000）。酸素は、微生物の増殖及び他の代謝活動に必要不可欠である。これは、培地中の酸素の溶解度がさらに低下する高塩分条件では、より重要となる。ＰＨＡ生産の増強のために酸素制限
条件が研究されてきた一方で、酸素豊富条件は、バイオマス濃度を高めるのに役立ち、そのため高密度培養に繋がる（Maheshwari et al., 2018）。したがって、極端な好塩古細
菌の増殖、さらにはＰＨＡ生産に対する酸素濃度の役割を評価することが重要になってくる。
【0004】
細胞内産物であるＰＨＡは、高い細胞密度の培養を必要とするものであり、なぜなら、利用可能な細胞質内空間が限られていると、細胞内に蓄積可能なＰＨＡの最大量が制限されるからである。ＰＨＡの回収は、発酵培地から細胞を分離及び濃縮した後に開始する。好塩菌からのＰＨＡ回収は、水道水を用いた細胞溶解で簡単に行うことができるため、発酵培地からの細胞の分離が、ＰＨＡの回収全体での課題となる。一般に、細胞の分離は、実験室スケールでは遠心力を用いて行われる。発酵培地からの細胞の工業的分離には、高い効率の連続遠心分離機が必要である。これらの方法は、細胞外産物が必要とされる場合には適切であるが、大量の洗浄細菌が必要である場合には、連続フロー遠心分離機のローターの擦り落とし又は洗い流しが必要となるため、滅菌採取を実現することが難しくなる。同様に、フィルターが閉塞すること及び無菌的にフィルターから生物を洗い流すことが困難であることより、単純な濾過は、時間がかかり信頼性に欠ける。超音波定在波で細胞を採取することは、問題の多い従来の分離技術に対する別の選択肢の可能性を提供する。超音波を用いた非常に高い分離効率での微生物の分離について考察した様々な研究が成されてきた。最近では、培養培地からの微細藻類細胞の分離に超音波分離が利用されている。超音波処理は、Ｈｆｘ．メディテラネイからＰＨＡを回収するために、高度に局所的なキャビテーション及び細胞破壊を生じさせるものであり、超音波定在波に細胞を捕捉し、濃縮することとは根本的に異なる現象である。超音波定在波による細菌細胞の採取が、従来の脱水技術に対する別の選択肢として実行可能かどうかを判断するためには、その有効性及び必要なエネルギーについて調べる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本明細書に記載の研究は、ＰＨＡ生産における好塩菌の課題（酸素の必要性、屋外発酵）に対処することを目的としたものであり、空気攪拌式バイオリアクター中、屋外発酵で増殖させたＨｆｘ．メディテラネイを用い、大型藻類の加水分解物を用いた。発酵は、１ＬのＰＥＴボトル及び４０Ｌのプラスチックスリーブ中、非滅菌条件下で行い、これらをバブルカラムリアクター反応器として操作した。加水分解物から効率的にＰＨＡを生産するために、プロセス条件（通気速度、発酵時間）を最適化した。得られたＰＨＡの構造特性を、最終ポリマーの分子量と共に特定した。
【0006】
本研究は、大型藻類の加水分解物などの安価な基質からのＰＨＡ生産をスケールアップするための実現可能な方法を提供するものである。様々な培養パラメータの影響を調べ、ＰＨＡの生産性を向上させるのに好ましい条件を確立した。分子量分析から、得られたＰＨＡは、通気速度が低いほどより均質であることが示唆された。
【課題を解決するための手段】
【0007】
１つの態様において、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の、前記ＰＨＡを生産することができる古細菌の発酵による生産方法に関し、前記方法は、
（ｉ）少なくとも約５又は１０リットルの培養体積、すなわち作業体積を有する発酵槽を提供する工程であって、前記発酵槽は、前記培養体積を占める培養培地を含み、前記培養培地は、炭素源及び窒素源が添加された、海水などの塩水を含み、前記古細菌の培養、すなわち増殖及び生存の促進並びに支持に適するものである、工程、
（ｉｉ）前記培養培地に前記古細菌の種培養物を播種する工程、
（ｉｉｉ）発酵槽の内部でその底部から、前記培養培地の通気及び混合の両方が常に行われるように空気などの酸素含有気体混合物を少なくとも約０．２ｖｖｍの通気速度で常
にバブリングしながら、前記培養培地中の前記古細菌の予め定められた濃度が得られるまで、前記古細菌を培養する工程、
（ｉｖ）前記培養培地から前記古細菌のバイオマスを採取する工程、及び
（ｖ）採取したバイオマスから前記ＰＨＡを濃縮、分離及び／又は抽出する工程、
を含む。
（ｉ）少なくとも約５又は１０リットルの培養体積、すなわち作業体積を有する発酵槽を提供する工程であって、前記発酵槽は、前記培養体積を占める培養培地を含み、前記培養培地は、炭素源及び窒素源が添加された、海水などの塩水を含み、前記古細菌の培養、すなわち増殖及び生存の促進並びに支持に適するものである、工程、
（ｉｉ）前記培養培地に前記古細菌の種培養物を播種する工程、
（ｉｉｉ）発酵槽の内部でその底部から、前記培養培地の通気及び混合の両方が常に行われるように空気などの酸素含有気体混合物を少なくとも約０．２ｖｖｍの通気速度で常
にバブリングしながら、前記培養培地中の前記古細菌の予め定められた濃度が得られるまで、前記古細菌を培養する工程、
（ｉｖ）前記培養培地から前記古細菌のバイオマスを採取する工程、及び
（ｖ）採取したバイオマスから前記ＰＨＡを濃縮、分離及び／又は抽出する工程、
を含む。
【0008】
本明細書で開示される方法は、さらに、例えば水、イオン液体、又はこれらの組み合わせを用いた繰り返し洗浄によって、工程（ｖ）で得られたＰＨＡを精製して、精製ＰＨＡを得る工程、及び所望に応じて、このようにして得られた精製ＰＨＡを、例えばドラム乾燥機、噴霧乾燥機、又は凍結乾燥機によって、乾燥する工程、を含み得る。続いて、精製ＰＨＡは、乾燥の有無にかかわらず、生分解性ポリマー又は非生分解性ポリマーを例とする少なくとも１つのポリマーとブレンド、すなわち混合され得る。
【0009】
本発明の発酵プロセスは、バッチ式及び連続式のいずれで実施されてもよい。
【0010】
別の態様において、本発明は、ＰＨＡ及び少なくとも２つの追加のポリマーを含むブレンドを提供し、前記少なくとも２つの追加のポリマーの各々は、独立して、生分解性又は非生分解性ポリマーであってよい。ある特定の実施形態では、前記少なくとも２つの追加のポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びケラチンを含み、又はこれらから成り、前記ブレンド中のＰＨＡ：ＰＬＡ比は、それぞれ重量基準で、約１：９９～約９９：１、約２０：８０～約８０：２０、約３０：７０～約７０：３０、又は約４０：６０～約６０：４０の範囲内であってよいが、好ましくは、それぞれ重量基準で、約２０：８０～約４０：６０、例えば約２５：７５、約３０：７０、又は約３５：６５である（前記ブレンド内に含まれる他のポリマー、例えばケラチンの全体量にかかわらず）。他の実施形態では、前記少なくとも２つの追加のポリマーのうちの１つは、ケラチンであり、これは、前記ブレンドの約１重量％～約９９重量％、例えば約５重量％～約９０重量％、約１０重量％～約８０重量％、約１５重量％～約７０重量％、又は約２０重量％～約６０重量％を構成するが、好ましくは約１０重量％～約５０重量％を構成する。
【0011】
さらなる態様において、本発明は、本明細書で開示されるブレンドを含む、又はそのブレンドから製造された物品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1A】図１Ａ～１Ｄは、Ｈｆｘ．メディテラネイの屋外培養（１ＬのＰＥＴボトル）における通気速度の最適化のための実験セットアップ（１Ａ）；Ｈｆｘ．メディテラネイの４０Ｌスリーブでの培養のための実験セットアップ（１Ｂ）；１ＬのＰＥＴボトルでの培養システムの模式図［実験条件：流量：０．２５～２．０Ｌ×分－１；発酵体積：８００ｍＬ；温度：４２±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（１Ｃ）；及びＨｆｘ．メディテラネイの培養のための単一フォトバイオリアクターの模式図（４０Ｌ）［実験条件：流量：１．０Ｌ分－１；発酵体積：１０Ｌ；温度：４２±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（１Ｄ）を示す。
【図1B】図１Ａ～１Ｄは、Ｈｆｘ．メディテラネイの屋外培養（１ＬのＰＥＴボトル）における通気速度の最適化のための実験セットアップ（１Ａ）；Ｈｆｘ．メディテラネイの４０Ｌスリーブでの培養のための実験セットアップ（１Ｂ）；１ＬのＰＥＴボトルでの培養システムの模式図［実験条件：流量：０．２５～２．０Ｌ×分－１；発酵体積：８００ｍＬ；温度：４２±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（１Ｃ）；及びＨｆｘ．メディテラネイの培養のための単一フォトバイオリアクターの模式図（４０Ｌ）［実験条件：流量：１．０Ｌ分－１；発酵体積：１０Ｌ；温度：４２±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（１Ｄ）を示す。
【図1C】図１Ａ～１Ｄは、Ｈｆｘ．メディテラネイの屋外培養（１ＬのＰＥＴボトル）における通気速度の最適化のための実験セットアップ（１Ａ）；Ｈｆｘ．メディテラネイの４０Ｌスリーブでの培養のための実験セットアップ（１Ｂ）；１ＬのＰＥＴボトルでの培養システムの模式図［実験条件：流量：０．２５～２．０Ｌ×分－１；発酵体積：８００ｍＬ；温度：４２±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（１Ｃ）；及びＨｆｘ．メディテラネイの培養のための単一フォトバイオリアクターの模式図（４０Ｌ）［実験条件：流量：１．０Ｌ分－１；発酵体積：１０Ｌ；温度：４２±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（１Ｄ）を示す。
【図1D】図１Ａ～１Ｄは、Ｈｆｘ．メディテラネイの屋外培養（１ＬのＰＥＴボトル）における通気速度の最適化のための実験セットアップ（１Ａ）；Ｈｆｘ．メディテラネイの４０Ｌスリーブでの培養のための実験セットアップ（１Ｂ）；１ＬのＰＥＴボトルでの培養システムの模式図［実験条件：流量：０．２５～２．０Ｌ×分－１；発酵体積：８００ｍＬ；温度：４２±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（１Ｃ）；及びＨｆｘ．メディテラネイの培養のための単一フォトバイオリアクターの模式図（４０Ｌ）［実験条件：流量：１．０Ｌ分－１；発酵体積：１０Ｌ；温度：４２±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（１Ｄ）を示す。
【図2A】図２Ａ～２Ｆは、Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における、異なる通気速度での増殖及びＰＨＡ生産曲線［実験条件：流量：０．２５～２．０Ｌ×分－１；発酵体積：８００ｍＬ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ａ及び２Ｂ）；Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における屋外培養条件下での増殖及びＰＨＡ生産率［実験条件：流量：１．０Ｌ×分－１；発酵体積：１０Ｌ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ｃ及び２Ｄ）；並びにスリーブ１及びスリーブ２における時間に対するバイオマス中のＰＨＡ％の変化（それぞれ２Ｅ及び２Ｆ）を示す。
【図2B】図２Ａ～２Ｆは、Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における、異なる通気速度での増殖及びＰＨＡ生産曲線［実験条件：流量：０．２５～２．０Ｌ×分－１；発酵体積：８００ｍＬ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ａ及び２Ｂ）；Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における屋外培養条件下での増殖及びＰＨＡ生産率［実験条件：流量：１．０Ｌ×分－１；発酵体積：１０Ｌ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ｃ及び２Ｄ）；並びにスリーブ１及びスリーブ２における時間に対するバイオマス中のＰＨＡ％の変化（それぞれ２Ｅ及び２Ｆ）を示す。
【図2C】図２Ａ～２Ｆは、Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における、異なる通気速度での増殖及びＰＨＡ生産曲線［実験条件：流量：０．２５～２．０Ｌ×分－１；発酵体積：８００ｍＬ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ａ及び２Ｂ）；Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における屋外培養条件下での増殖及びＰＨＡ生産率［実験条件：流量：１．０Ｌ×分－１；発酵体積：１０Ｌ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ｃ及び２Ｄ）；並びにスリーブ１及びスリーブ２における時間に対するバイオマス中のＰＨＡ％の変化（それぞれ２Ｅ及び２Ｆ）を示す。
【図2D】図２Ａ～２Ｆは、Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における、異なる通気速度での増殖及びＰＨＡ生産曲線［実験条件：流量：０．２５～２．０Ｌ×分－１；発酵体積：８００ｍＬ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ａ及び２Ｂ）；Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における屋外培養条件下での増殖及びＰＨＡ生産率［実験条件：流量：１．０Ｌ×分－１；発酵体積：１０Ｌ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ｃ及び２Ｄ）；並びにスリーブ１及びスリーブ２における時間に対するバイオマス中のＰＨＡ％の変化（それぞれ２Ｅ及び２Ｆ）を示す。
【図2E】図２Ａ～２Ｆは、Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における、異なる通気速度での増殖及びＰＨＡ生産曲線［実験条件：流量：０．２５～２．０Ｌ×分－１；発酵体積：８００ｍＬ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ａ及び２Ｂ）；Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における屋外培養条件下での増殖及びＰＨＡ生産率［実験条件：流量：１．０Ｌ×分－１；発酵体積：１０Ｌ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ｃ及び２Ｄ）；並びにスリーブ１及びスリーブ２における時間に対するバイオマス中のＰＨＡ％の変化（それぞれ２Ｅ及び２Ｆ）を示す。
【図2F】図２Ａ～２Ｆは、Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における、異なる通気速度での増殖及びＰＨＡ生産曲線［実験条件：流量：０．２５～２．０Ｌ×分－１；発酵体積：８００ｍＬ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ａ及び２Ｂ）；Ｈｆｘ．メディテラネイを用いたＰＨＡ生産における屋外培養条件下での増殖及びＰＨＡ生産率［実験条件：流量：１．０Ｌ×分－１；発酵体積：１０Ｌ；水温：４２±２．５℃；空気温度：３７±２．５℃；播種菌液濃度：５０ｇ×Ｌ－１；初期ｐＨ：７．２］（それぞれ２Ｃ及び２Ｄ）；並びにスリーブ１及びスリーブ２における時間に対するバイオマス中のＰＨＡ％の変化（それぞれ２Ｅ及び２Ｆ）を示す。
【図3】図３は、ポリスチレン（ＰＳ）及びポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の２つの標準物質を用いた、Ｈｆｘ．メディテラネイによって生産されたＰＨＡの分子量（Ｍｎ、Ｍｗ、及びＭｚ）及び多分散性指数（ＰＤＩ）分布を示す。
【図11A】図１１Ａ～１１Ｇは、ＰＬＡ試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１１Ａ）は試験した全ＰＬＡ試験片、（１１Ｂ）はＰＬＡ試験片００３－１、（１１Ｃ）はそのヤング率、（１１Ｄ）はそのポアソン比、（１１Ｅ）はＰＬＡ試験片００３－２、（１１Ｆ）はそのヤング率、（１１Ｇ）はそのポアソン比である。
【図11B】図１１Ａ～１１Ｇは、ＰＬＡ試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１１Ａ）は試験した全ＰＬＡ試験片、（１１Ｂ）はＰＬＡ試験片００３－１、（１１Ｃ）はそのヤング率、（１１Ｄ）はそのポアソン比、（１１Ｅ）はＰＬＡ試験片００３－２、（１１Ｆ）はそのヤング率、（１１Ｇ）はそのポアソン比である。
【図11C】図１１Ａ～１１Ｇは、ＰＬＡ試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１１Ａ）は試験した全ＰＬＡ試験片、（１１Ｂ）はＰＬＡ試験片００３－１、（１１Ｃ）はそのヤング率、（１１Ｄ）はそのポアソン比、（１１Ｅ）はＰＬＡ試験片００３－２、（１１Ｆ）はそのヤング率、（１１Ｇ）はそのポアソン比である。
【図11D】図１１Ａ～１１Ｇは、ＰＬＡ試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１１Ａ）は試験した全ＰＬＡ試験片、（１１Ｂ）はＰＬＡ試験片００３－１、（１１Ｃ）はそのヤング率、（１１Ｄ）はそのポアソン比、（１１Ｅ）はＰＬＡ試験片００３－２、（１１Ｆ）はそのヤング率、（１１Ｇ）はそのポアソン比である。
【図11E】図１１Ａ～１１Ｇは、ＰＬＡ試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１１Ａ）は試験した全ＰＬＡ試験片、（１１Ｂ）はＰＬＡ試験片００３－１、（１１Ｃ）はそのヤング率、（１１Ｄ）はそのポアソン比、（１１Ｅ）はＰＬＡ試験片００３－２、（１１Ｆ）はそのヤング率、（１１Ｇ）はそのポアソン比である。
【図11F】図１１Ａ～１１Ｇは、ＰＬＡ試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１１Ａ）は試験した全ＰＬＡ試験片、（１１Ｂ）はＰＬＡ試験片００３－１、（１１Ｃ）はそのヤング率、（１１Ｄ）はそのポアソン比、（１１Ｅ）はＰＬＡ試験片００３－２、（１１Ｆ）はそのヤング率、（１１Ｇ）はそのポアソン比である。
【図11G】図１１Ａ～１１Ｇは、ＰＬＡ試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１１Ａ）は試験した全ＰＬＡ試験片、（１１Ｂ）はＰＬＡ試験片００３－１、（１１Ｃ）はそのヤング率、（１１Ｄ）はそのポアソン比、（１１Ｅ）はＰＬＡ試験片００３－２、（１１Ｆ）はそのヤング率、（１１Ｇ）はそのポアソン比である。
【図12A】図１２Ａ～１２Ｇは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１２Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片、（１２Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－１の応力－ひずみ曲線、（１２Ｃ）はそのヤング率、（１２Ｄ）はそのポアソン比、（１２Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－２の応力－ひずみ曲線、（１２Ｆ）はそのヤング率、及び（１２Ｇ）はそのポアソン比である。
【図12B】図１２Ａ～１２Ｇは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１２Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片、（１２Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－１の応力－ひずみ曲線、（１２Ｃ）はそのヤング率、（１２Ｄ）はそのポアソン比、（１２Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－２の応力－ひずみ曲線、（１２Ｆ）はそのヤング率、及び（１２Ｇ）はそのポアソン比である。
【図12C】図１２Ａ～１２Ｇは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１２Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片、（１２Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－１の応力－ひずみ曲線、（１２Ｃ）はそのヤング率、（１２Ｄ）はそのポアソン比、（１２Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－２の応力－ひずみ曲線、（１２Ｆ）はそのヤング率、及び（１２Ｇ）はそのポアソン比である。
【図12D】図１２Ａ～１２Ｇは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１２Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片、（１２Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－１の応力－ひずみ曲線、（１２Ｃ）はそのヤング率、（１２Ｄ）はそのポアソン比、（１２Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－２の応力－ひずみ曲線、（１２Ｆ）はそのヤング率、及び（１２Ｇ）はそのポアソン比である。
【図12E】図１２Ａ～１２Ｇは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１２Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片、（１２Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－１の応力－ひずみ曲線、（１２Ｃ）はそのヤング率、（１２Ｄ）はそのポアソン比、（１２Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－２の応力－ひずみ曲線、（１２Ｆ）はそのヤング率、及び（１２Ｇ）はそのポアソン比である。
【図12F】図１２Ａ～１２Ｇは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１２Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片、（１２Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－１の応力－ひずみ曲線、（１２Ｃ）はそのヤング率、（１２Ｄ）はそのポアソン比、（１２Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－２の応力－ひずみ曲線、（１２Ｆ）はそのヤング率、及び（１２Ｇ）はそのポアソン比である。
【図12G】図１２Ａ～１２Ｇは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１２Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片、（１２Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－１の応力－ひずみ曲線、（１２Ｃ）はそのヤング率、（１２Ｄ）はそのポアソン比、（１２Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）試験片１０２－２の応力－ひずみ曲線、（１２Ｆ）はそのヤング率、及び（１２Ｇ）はそのポアソン比である。
【図13A】図１３Ａ～１３Ｊは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１３Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片、（１３Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｃ）はそのヤング率、（１３Ｄ）はそのポアソン比、（１３Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－２の応力－ひずみ曲線、（１３Ｆ）はそのヤング率、（１３Ｇ）はそのポアソン比、（１３Ｈ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０３－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｉ）はそのヤング率、及び（１３Ｊ）はそのポアソン比である。
【図13B】図１３Ａ～１３Ｊは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１３Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片、（１３Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｃ）はそのヤング率、（１３Ｄ）はそのポアソン比、（１３Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－２の応力－ひずみ曲線、（１３Ｆ）はそのヤング率、（１３Ｇ）はそのポアソン比、（１３Ｈ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０３－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｉ）はそのヤング率、及び（１３Ｊ）はそのポアソン比である。
【図13C】図１３Ａ～１３Ｊは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１３Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片、（１３Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｃ）はそのヤング率、（１３Ｄ）はそのポアソン比、（１３Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－２の応力－ひずみ曲線、（１３Ｆ）はそのヤング率、（１３Ｇ）はそのポアソン比、（１３Ｈ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０３－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｉ）はそのヤング率、及び（１３Ｊ）はそのポアソン比である。
【図13D】図１３Ａ～１３Ｊは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１３Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片、（１３Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｃ）はそのヤング率、（１３Ｄ）はそのポアソン比、（１３Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－２の応力－ひずみ曲線、（１３Ｆ）はそのヤング率、（１３Ｇ）はそのポアソン比、（１３Ｈ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０３－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｉ）はそのヤング率、及び（１３Ｊ）はそのポアソン比である。
【図13E】図１３Ａ～１３Ｊは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１３Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片、（１３Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｃ）はそのヤング率、（１３Ｄ）はそのポアソン比、（１３Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－２の応力－ひずみ曲線、（１３Ｆ）はそのヤング率、（１３Ｇ）はそのポアソン比、（１３Ｈ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０３－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｉ）はそのヤング率、及び（１３Ｊ）はそのポアソン比である。
【図13F】図１３Ａ～１３Ｊは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１３Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片、（１３Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｃ）はそのヤング率、（１３Ｄ）はそのポアソン比、（１３Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－２の応力－ひずみ曲線、（１３Ｆ）はそのヤング率、（１３Ｇ）はそのポアソン比、（１３Ｈ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０３－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｉ）はそのヤング率、及び（１３Ｊ）はそのポアソン比である。
【図13G】図１３Ａ～１３Ｊは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１３Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片、（１３Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｃ）はそのヤング率、（１３Ｄ）はそのポアソン比、（１３Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－２の応力－ひずみ曲線、（１３Ｆ）はそのヤング率、（１３Ｇ）はそのポアソン比、（１３Ｈ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０３－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｉ）はそのヤング率、及び（１３Ｊ）はそのポアソン比である。
【図13H】図１３Ａ～１３Ｊは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１３Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片、（１３Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｃ）はそのヤング率、（１３Ｄ）はそのポアソン比、（１３Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－２の応力－ひずみ曲線、（１３Ｆ）はそのヤング率、（１３Ｇ）はそのポアソン比、（１３Ｈ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０３－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｉ）はそのヤング率、及び（１３Ｊ）はそのポアソン比である。
【図13I】図１３Ａ～１３Ｊは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１３Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片、（１３Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｃ）はそのヤング率、（１３Ｄ）はそのポアソン比、（１３Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－２の応力－ひずみ曲線、（１３Ｆ）はそのヤング率、（１３Ｇ）はそのポアソン比、（１３Ｈ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０３－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｉ）はそのヤング率、及び（１３Ｊ）はそのポアソン比である。
【図13J】図１３Ａ～１３Ｊは、試験した様々なＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片の応力－ひずみ曲線を示すグラフであり、（１３Ａ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片、（１３Ｂ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｃ）はそのヤング率、（１３Ｄ）はそのポアソン比、（１３Ｅ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０２－２の応力－ひずみ曲線、（１３Ｆ）はそのヤング率、（１３Ｇ）はそのポアソン比、（１３Ｈ）はＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）－７０／ケラチン－３０試験片４０３－１の応力－ひずみ曲線、（１３Ｉ）はそのヤング率、及び（１３Ｊ）はそのポアソン比である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
１つの態様において、本発明は、ＰＨＡの、前記ＰＨＡを生産することができる古細菌の発酵による生産方法に関し、その方法は、
（ｉ）少なくとも約５又は１０リットルの培養体積を有する発酵槽を提供する工程であって、前記発酵槽は、前記培養体積を占める培養培地を含み、前記培養培地は、炭素源及び窒素源が添加された海水などの塩水を含み、前記古細菌の培養に適するものである、工程、
（ｉｉ）前記培養培地に前記古細菌の種培養物を播種する工程、
（ｉｉｉ）発酵槽の内部でその底部から、前記培養培地の通気及び混合の両方が常に行われるように空気などの酸素含有気体混合物を少なくとも約０．２ｖｖｍの通気速度で常にバブリングしながら、前記培養培地中の前記古細菌の予め定められた濃度が得られるまで、前記古細菌を培養する工程、
（ｉｖ）前記培養培地から前記古細菌のバイオマスを採取する工程、及び
（ｖ）採取したバイオマスから前記ＰＨＡを濃縮、分離及び／又は抽出する工程、
を含む。
（ｉ）少なくとも約５又は１０リットルの培養体積を有する発酵槽を提供する工程であって、前記発酵槽は、前記培養体積を占める培養培地を含み、前記培養培地は、炭素源及び窒素源が添加された海水などの塩水を含み、前記古細菌の培養に適するものである、工程、
（ｉｉ）前記培養培地に前記古細菌の種培養物を播種する工程、
（ｉｉｉ）発酵槽の内部でその底部から、前記培養培地の通気及び混合の両方が常に行われるように空気などの酸素含有気体混合物を少なくとも約０．２ｖｖｍの通気速度で常にバブリングしながら、前記培養培地中の前記古細菌の予め定められた濃度が得られるまで、前記古細菌を培養する工程、
（ｉｖ）前記培養培地から前記古細菌のバイオマスを採取する工程、及び
（ｖ）採取したバイオマスから前記ＰＨＡを濃縮、分離及び／又は抽出する工程、
を含む。
【0014】
本明細書で用いられる場合、「ポリヒドロキシアルカノエート」（ＰＨＡ）の用語は、糖又は脂質の細菌／古細菌発酵によるものを含む、微生物によって自然界で生産されるポリエステルを意味する。このファミリー内では、１５０種類を超える異なるモノマーが組み合わされて、異なる特性を有する材料を得ることができる。ＰＨＡは、４０℃～１８０℃の範囲内の融点を有する生分解性の熱可塑性又はエラストマー材料である。微生物源、遺伝子組換え細菌、及び他の生物から得られる特定のＰＨＡは、各々が式［－Ｏ－Ｃ（Ｒ）Ｈ－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－］であるモノマーから成り、式中、Ｒは、Ｈ、又はアルキル、すなわち、例えば１～１２個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐鎖状のヒドロカルビルであり、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチ
ル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソアミル、２，２－ジメチル－プロピル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシルなどである。このようなＰＨＡの例としては、限定されるものではないが、ポリ（３－ヒドロキシプロピオネート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、ポリ（３－ヒドロキシバレレート）、ポリ（３－ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（３－ヒドロキシオクタノエート）、及びポリ（３－ヒドロキシドデカノエート）が挙げられ、この場合、ｎは１であり、Ｒは、それぞれ、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ペンチル、又はノニルであり、さらには、ポリ（４－ヒドロキシブチレート）及びポリ（５－ヒドロキシバレレート）が挙げられ、この場合、それぞれ、ｎは２又は３であり、ＲはＨである。
ル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソアミル、２，２－ジメチル－プロピル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシルなどである。このようなＰＨＡの例としては、限定されるものではないが、ポリ（３－ヒドロキシプロピオネート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、ポリ（３－ヒドロキシバレレート）、ポリ（３－ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（３－ヒドロキシオクタノエート）、及びポリ（３－ヒドロキシドデカノエート）が挙げられ、この場合、ｎは１であり、Ｒは、それぞれ、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ペンチル、又はノニルであり、さらには、ポリ（４－ヒドロキシブチレート）及びポリ（５－ヒドロキシバレレート）が挙げられ、この場合、それぞれ、ｎは２又は３であり、ＲはＨである。
【0015】
本明細書で用いられる場合、「古細菌」の用語は、細菌及び真核生物からそれを区別する明確な分子特性を有する単細胞原核生物のいずれかの群を意味する。古細菌の限定されない例としては、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）の種、メタン菌、好塩菌、及びピュロロブス・フマリイ（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｍａｒｉｉ）が挙げられる。本明細書で言及される特定の古細菌は、好塩古細菌である。ある特定の実施形態において、古細菌は、Ｈｆｘ．メディテラネイ、例えばＨｆｘ．メディテラネイ ＡＴＣＣ ３３５００である。
【0016】
本明細書で用いられる場合、「塩水」の用語は、主としてナトリウムイオン及び塩化物イオンから成る、少なくとも約２％から約３０、３５、又は４０％までの塩分濃度を有する水を意味する。ある特定の実施形態において、前記塩水は、海水、すなわち海又は海洋由来の水であり、平均約３．５％の塩分濃度を有する。他の実施形態では、前記塩水は、約４％若しくは５％～約１０％の範囲内の塩分濃度、又は１０％を超える塩分濃度、例えば約１５％、２０％、２５％、若しくは３０％までの塩分濃度を有する。
【0017】
本明細書で用いられる場合、「酸素含有気体混合物」の用語は、体積基準（体積／体積）で少なくとも約１５％、例えば約１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、又は２５％であるが、好ましくは約１９％、２０％、２１％、２２％、又は２３％の酸素と、窒素、二酸化炭素、並びにヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、及びキセノンなどの不活性ガスから選択され得る追加の気体とを含む気体混合物を意味する。特定のそのような気体混合物は、合わせて前記気体混合物の少なくとも９８体積％を構成する酸素、窒素、二酸化炭素、及びアルゴンを含む、空気様気体混合物である。より特定の実施形態では、開示される発酵プロセス中に発酵槽にバブリングされる酸素含有気体混合物は、空気であり、すなわち、約７８％の窒素、約２１％の酸素、約０．９％のアルゴン、約０．１％の二酸化炭素、及び少量の他の気体を含む気体混合物である。
【0018】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される発酵プロセスで用いられる培養培地は、炭素及び窒素を、各々独立して、乾燥質量、すなわち脱水質量基準で、約１重量％～約８０重量％の量で含む。「乾燥質量基準」の用語は、培養培地の乾燥重量、すなわち、前記培養培地を構成する固体成分全体の重量を意味する。特定の実施形態では、前記培養培地中の炭素の量は、乾燥（脱水）質量基準で、少なくとも約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、又は７０重量％であり、及び／又は前記培養培地中の窒素の量は、乾燥（脱水）質量基準で、少なくとも約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％である。
【0019】
ある特定の実施形態では、開示される発酵プロセスで用いられる培養培地に含まれる炭
素源は、糖類、より詳細には、グルコース、ガラクトース、フルクトース、及びキシロースなどであるがこれらに限定されない単糖類、若しくはデンプンなどの多糖類；グリセロール（バイオディーゼル製造プロセスにおける主要な副産物）、酢酸、酪酸、及びプロパン酸などの脂肪酸（酸生成発酵中の有機化合物の嫌気性分解時に生成され、例えばバイオディーゼル製造のための、淡水及び海洋の油脂生産微生物に対するフィードストックとして利用）、ビナス（vinnase）（糖又はエタノール産業の副産物）、蒸留廃液（stillage
）（エタノール蒸留後に残る廃液で、還元糖（フルクトース及びグルコース）と、酢酸、プロピオン酸、及び酪酸を含む脂肪酸とを含む）、糖蜜廃水、及びオリーブ工場廃水（オリーブ油製造の側流）などであるがこれらに限定されない廃棄物；ポリオール、すなわち、複数のヒドロキシル基を含む有機化合物、海藻加水分解物、オリーブ葉加水分解物、農業廃棄物加水分解物、及びチーズホエイ加水分解物などであるがこれらに限定されない加水分解物；若しくはこれらの混合物を含み；並びに／又は、前記培養培地に含まれる窒素源は、タンパク質、グリコシル化タンパク質、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、及び窒素含有オリゴ糖類を含むバイオポリマー、ペプチド、アミノ酸、及び窒素塩、海藻加水分解物、オリーブ葉加水分解物、製紙廃棄物、農業廃棄物加水分解物、及びチーズホエイ加水分解物などの加水分解物、若しくはこれらの混合物などの有機又は無機窒素を含む。特定の実施形態では、炭素源及び窒素源の両方が、海藻加水分解物を例とする加水分解物のみから成り、これが、古細菌の培養プロセスに必要とされるすべての炭素及び窒素を供給する。
素源は、糖類、より詳細には、グルコース、ガラクトース、フルクトース、及びキシロースなどであるがこれらに限定されない単糖類、若しくはデンプンなどの多糖類；グリセロール（バイオディーゼル製造プロセスにおける主要な副産物）、酢酸、酪酸、及びプロパン酸などの脂肪酸（酸生成発酵中の有機化合物の嫌気性分解時に生成され、例えばバイオディーゼル製造のための、淡水及び海洋の油脂生産微生物に対するフィードストックとして利用）、ビナス（vinnase）（糖又はエタノール産業の副産物）、蒸留廃液（stillage
）（エタノール蒸留後に残る廃液で、還元糖（フルクトース及びグルコース）と、酢酸、プロピオン酸、及び酪酸を含む脂肪酸とを含む）、糖蜜廃水、及びオリーブ工場廃水（オリーブ油製造の側流）などであるがこれらに限定されない廃棄物；ポリオール、すなわち、複数のヒドロキシル基を含む有機化合物、海藻加水分解物、オリーブ葉加水分解物、農業廃棄物加水分解物、及びチーズホエイ加水分解物などであるがこれらに限定されない加水分解物；若しくはこれらの混合物を含み；並びに／又は、前記培養培地に含まれる窒素源は、タンパク質、グリコシル化タンパク質、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、及び窒素含有オリゴ糖類を含むバイオポリマー、ペプチド、アミノ酸、及び窒素塩、海藻加水分解物、オリーブ葉加水分解物、製紙廃棄物、農業廃棄物加水分解物、及びチーズホエイ加水分解物などの加水分解物、若しくはこれらの混合物などの有機又は無機窒素を含む。特定の実施形態では、炭素源及び窒素源の両方が、海藻加水分解物を例とする加水分解物のみから成り、これが、古細菌の培養プロセスに必要とされるすべての炭素及び窒素を供給する。
【0020】
本明細書で用いられる場合、「バイオポリマー」の用語は、生物の細胞によって生産される天然ポリマー（共有結合したモノマー単位から成る）を意味する。このようなポリマーの主たる例は、用いられるモノマー及び形成されるバイオポリマーの構造に従って分類すると、ポリヌクレオチド、ポリペプチド及びタンパク質、並びに多糖類である。ＲＮＡ及びＤＮＡなどのポリヌクレオチドは、１３個以上のヌクレオチドモノマーから構成されるポリマーである。ポリペプチド及びタンパク質は、アミノ酸のポリマーであり、コラーゲン、アクチン、及びフィブリンを含む。多糖類は、直鎖状又は分岐鎖状のポリマー炭水化物であり、デンプン、セルロース、及びアルギナートを含む。バイオポリマーのさらなる例としては、天然ゴム（イソプレンのポリマー）、スベリン及びリグニン（複雑なポリフェノール系ポリマー）、クチン及びクタン（長鎖脂肪酸の複雑なポリマー）、並びにメラニンが挙げられる。本明細書で上述したポリマーは、グリコシル化、すなわち糖部分の結合によって修飾されていてもよい。
【0021】
本明細書で用いられる場合、「アミノ酸」の用語は、アミン官能基及びカルボン酸官能基の両方を含む有機化合物を意味し、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸のいずれであってもよく、Ｌ異性体及びＤ異性体の両方で存在する。タンパク質中に天然に存在する２２種類のアミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、及びピロリジン（Ｐｙｌ）である。他のアミノ酸の限定されない例としては、シトルリン（Ｃｉｔ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、アミノアジピン酸、β－アラニン、１－ナフチルアラニン、３－（１－ナフチル）アラニン、３－（２－ナフチル）アラニン、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、３－（アミノメチル）安息香酸、ｐ－エチニル－フェニルアラニン、ｍ－エチニル－フェニルアラニン、ｐ－クロロフェニルアラニン（４ＣｌＰｈｅ）、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－ヨードフェニルアラニン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、ｐ－アジドフェニルアラニン、ｐ－プロパルグリ－オキシ－フェニルアラニン（ｐ－ｐｒｏｐａｒｇｌｙ－ｏｘｙ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、インダニルグリシン（Ｉｇｌ）、（ベンジル）システ
イン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、アジドノルロイシン、６－エチニル－トリプトファン、５－エチニル－トリプトファン、３－（６－クロロインドリル）アラニン、３－（６－ブロモインドリル）アラニン、３－（５－ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、α－アミノカプリル酸、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｎ－アセチルガラクトサミン－α－スレオニン、及びＮ－アセチルガラクトサミン－α－セリンが挙げられる。
イン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、アジドノルロイシン、６－エチニル－トリプトファン、５－エチニル－トリプトファン、３－（６－クロロインドリル）アラニン、３－（６－ブロモインドリル）アラニン、３－（５－ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、α－アミノカプリル酸、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｎ－アセチルガラクトサミン－α－スレオニン、及びＮ－アセチルガラクトサミン－α－セリンが挙げられる。
【0022】
本明細書で用いられる場合、「アミノ酸残基」の用語は、アミノ酸のアミノ基、例えばそのα－アミノ基又は存在する場合には側鎖アミノ基から水素原子を除去し、及びアミノ酸のカルボキシル基、例えばそのα－カルボキシル基又は存在する場合には側鎖カルボキシル基から－ＯＨ基を除去した後のアミノ酸の残基を意味する。
【0023】
「ペプチド」の用語は、ペプチド（アミド）結合によって、すなわち、１つのアミノ酸のカルボキシル基が別のアミノ酸のアミノ基と反応する場合に形成される共有結合によって連結された、アミノ酸モノマー（残基）の短い鎖、例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上のアミノ酸残基から成る鎖、を意味する。本明細書で用いられる場合、「ペプチド部分」の用語は、そのカルボキシル基から、すなわちその末端又は側鎖カルボキシル基のいずれかから水素原子を除去し、及び／又はそのアミノ基から、すなわちその末端又は側鎖アミノ基から水素原子を除去した後の、本明細書で定義されるペプチドの部分を意味する。
【0024】
本明細書で用いられる場合、「ペプチド結合」又は「アミド結合」の用語は、２つの分子、例えば２つのアミノ酸の間に、その分子の一方のカルボキシル基が他方の分子のアミノ基と反応した場合に形成される共有結合－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－を意味し、水分子の放出を引き起こす。
【0025】
本明細書で用いられる場合、「加水分解物」の用語は、化学的又は酵素的に様々なサイズのペプチドに分解されたタンパク質を含む、加水分解の水性生成物を意味する。培養培地の炭素源及び／又は窒素源として用いられ得る加水分解物の例としては、海藻加水分解物、オリーブ葉加水分解物、農業廃棄物加水分解物、及びチーズホエイ加水分解物が挙げられる。特定の実施形態では、言及される加水分解物は、海藻加水分解物であり、これは炭素源及び窒素源のいずれか一方又は両方として用いられてよいが、好ましくは両方である。
【0026】
本明細書で用いられる場合、「海藻」の用語は、大型で多細胞の海洋藻類のいずれの種をも意味し、大型藻類の紅藻植物（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）（紅藻類）、褐藻植物（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）（褐藻類）、及び緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）（緑藻類）の種類を含む。特定の実施形態では、言及される海藻は、ウルバ属種（Ｕｌｖａ ｓｐｅｃｉｅｓ）などの緑色大型藻類である。
【0027】
ある特定の実施形態では、開示される発酵プロセスで用いられる培養培地に含まれる炭素源は、海藻加水分解物を含み、前記加水分解物は、前記炭素源の少なくとも約１重量％、好ましくは約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、若しくはそれ以上を構成し、及び／又は、前記培養培地に含まれる窒素源は、海藻加水分解物を含み、前記加水分解物は、前記窒素源の少なくとも約１重量％、好ましくは約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、若しくはそれ以上を構成する。特定の実施形態では、本明細書に例示されるように、炭素源及び窒素源の両方が、海藻加水分解物のみから成り、これが、前記古細菌の発酵プロセスに必要とされるすべての炭素及び窒素を供給する。
【0028】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される発酵プロセスで用いられる培養培地は、臭化物アニオンを含む塩などの塩、バッファー、リン、又はこれらの混合物をさらに含む。前記培養培地の調製に用いられ得るリン源としては、限定するものではないが、リン酸二水素カリウム及びリン酸水素二ナトリウムなどの溶解された無機リン酸塩、さらにはリン含有生体分子が挙げられ、用いられ得るハロゲン源としては、限定するものではないが、臭素が挙げられる。
【0029】
ある特定の実施形態では、前記の実施形態のいずれか１つによる、本明細書で開示される発酵プロセスで用いられる培養培地は、前記炭素源、前記窒素源、及び所望に応じて前記リン、ハロゲン、又はこれらの混合物が添加された海水を例とする塩水を含み、前記培養培地中の炭素及び窒素の量は、各々独立して、乾燥質量基準で、約１重量％～約８０重量％であり、前記炭素源は、前記炭素源の少なくとも約１重量％を構成する海藻加水分解物を含み、及び前記窒素源は、前記窒素源の少なくとも約１重量％を構成する海藻加水分解物を含む。
【0030】
特定のそのような実施形態では、前記培養培地中の炭素の量は、乾燥質量基準で、少なくとも約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、又は７０重量％であり、前記培養培地中の窒素の量は、乾燥質量基準で、少なくとも約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％であり、前記炭素源は、前記炭素源の少なくとも約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、又はそれ以上を構成する海藻加水分解物を含み、前記窒素源は、前記窒素源の少なくとも約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、又はそれ以上を構成する海藻加水分解物を含む。より特定のそのような実施形態では、前記炭素源及び前記窒素源の両方は、海藻加水分解物のみから成り、それが前記古細菌の発酵プロセスに必要とされるすべての炭素及び窒素を供給する。
【0031】
ある特定の実施形態では、前記の実施形態のいずれか１つによる、開示される発酵プロセスで用いられる培養培地に含まれる海藻加水分解物は、ウルバ属種加水分解物などの緑色大型藻類加水分解物である。
【0032】
ある特定の実施形態では、前記の実施形態のいずれか１つによる、播種工程（ｉｉ）の前の培養培地のｐＨは、最大８．５である。特定の実施形態では、播種工程（ｉｉ）の前の前記培養培地のｐＨは、約２～約８．５、好ましくは約６．８～約７．４、例えば７．２である。
【0033】
ある特定の実施形態では、前記の実施形態のいずれか１つによる、培養工程（ｉｉｉ）は、最大１４日間又は２１日間、例えば少なくとも４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、又は７２時間の期間にわたって行われる。
【0034】
本発明によると、培養培地の通気及び混合の両方が常に行われ、その結果として、古細菌によって生産される二酸化炭素も常に除去されるように、培養工程（ｉｉｉ）の過程で、発酵槽中にその底部から、空気などの酸素含有気体混合物が、少なくとも約０．２ｖｖｍの通気速度で常にバブリングされる。
【0035】
「通気速度」の用語は、体積／体積／分（ｖｖｍ）で測定され、酸素含有気体混合物の
体積流量/発酵槽作業体積、を表し、すなわち、１分あたりに発酵槽中にバブリングされ
る酸素含有気体混合物の体積と前記発酵槽の作業体積との間の比を意味する。ある特定の実施形態では、前記の実施形態のいずれか１つによる、通気速度は、約０．６、０．７、又は０．８～約１．２ｖｖｍ、好ましくは約０．９～約１．１ｖｖｍ、より好ましくは約１ｖｖｍである。
体積流量/発酵槽作業体積、を表し、すなわち、１分あたりに発酵槽中にバブリングされ
る酸素含有気体混合物の体積と前記発酵槽の作業体積との間の比を意味する。ある特定の実施形態では、前記の実施形態のいずれか１つによる、通気速度は、約０．６、０．７、又は０．８～約１．２ｖｖｍ、好ましくは約０．９～約１．１ｖｖｍ、より好ましくは約１ｖｖｍである。
【0036】
上述したように、培養工程（ｉｉｉ）の過程で発酵槽中に常にバブリングされる酸素含有気体混合物は、培養培地の通気及び混合の両方を行い、その結果として、前記培地から二酸化炭素を除去する。したがって、前記酸素含有気体混合物の通気速度は、発酵プロセスの過程で培養培地中に得られ得る最大古細菌濃度又は前記濃度を実現するのに必要な時間を例とする培養工程の有効性に大きく影響を及ぼし得る。
【0037】
本明細書で示されるように、前記酸素含有気体混合物の通気速度は、得られるＰＨＡの分子量にも、直線的ではないが影響を及ぼし、それは、通気速度及び古細菌の培養期間に応じて変動し、通気速度が高いほど高分子量のＰＨＡが明らかに観察された。
【0038】
本発明によると、培養工程（ｉｉｉ）の完了後、生産された古細菌のバイオマスが培養培地から採取され、次に、採取されたバイオマスから、ＰＨＡが濃縮、分離、及び／又は抽出される。ある特定の実施形態では、前記の実施形態のいずれか１つによる、採取されたバイオマスからのＰＨＡの抽出は、水（加水分解）、高圧、パルス電場（ＰＥＦ）、及び遠心分離と濾過などの物理的手段；細胞溶解バッファー、深共晶溶媒、有機溶媒、二相溶媒系、及びイオン液体などの化学的手段；又はこれらのいずれかの組み合わせによって行われる。
【0039】
本明細書で用いられる場合、「深共晶溶媒」の用語は、共晶混合物を形成するルイス酸又はブレンステッド酸と塩基との溶液、すなわち、いずれの構成成分の融点よりも低い単一の温度で溶融又は固化する物質の均質混合物を意味する。深共晶溶媒は、親成分の構造又は相対比を変化させることにより高度に調整可能であり、したがって分離を含む広く様々な潜在的用途を有する。
【0040】
採取されたバイオマスから様々な温度でＰＨＡを抽出することに関して本明細書で用いられる場合、「有機溶媒」の用語は、その分子構造中に炭素原子、水素原子、酸素原子、硫黄原子、及び窒素原子を含み得る無毒性で環境に優しい水溶性溶媒を意味する。このような有機溶媒の例としては、限定されるものではないが、ジメチルカーボネート及びジエチルカーボネートを含むカーボネートエステル；乳酸エチルを含む乳酸エステル；レブリン酸メチル及びレブリン酸エチルを含むレブリン酸エステル；γ－バレロラクトン；（１Ｒ）－７，８－ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン－２－オン（ｃｙｒｅｎｅ）；エタノール、イソプロパノール、及びエチレングリコールを含むアルコール、ジオール、及びポリオール；並びにメチルエチルケトンを含むケトンが挙げられる。
【0041】
採取されたバイオマスから様々な温度でＰＨＡを抽出することに関して本明細書で用いられる場合、「二相溶媒系」の用語は、界面層によって分離された２つの溶媒を含む溶媒系を意味し、前記２つの溶媒のうちの一方は、水性溶媒であり、前記２つの溶媒のうちの他方は、その分子構造中に炭素原子、水素原子、酸素原子、硫黄原子、及び窒素原子を含み得る無毒性で環境に優しく、部分的（又は貧）水溶性の溶媒であり、酢酸エチル及び酢酸ブチルを含む酢酸エステル、及び２－メチルテトラヒドロフランを含むエーテルなどであるがこれらに限定されない。
【0042】
採取されたバイオマスから様々な温度でＰＨＡを抽出することに関して本明細書で用いられる場合、「イオン液体」の用語は、その分子構造中に炭素原子、水素原子、酸素原子
、硫黄原子、窒素原子、及びハロゲン原子を含み得る、無毒性で環境に優しい有機塩を意味する。イオン液体の限定されない例としては、ジアルキル－イミダゾリウム、Ｎ－アルキル－ピリダジニウム、第四級アンモニウム、ジアルキル－ピロリジニウム、アルキル－グアニジニウム、及びアルキル－ピリジニウムのカチオンと、酢酸イオン、ギ酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、及び塩化物イオンなどの様々な環境に優しいアニオンと、を含む塩が挙げられる。
、硫黄原子、窒素原子、及びハロゲン原子を含み得る、無毒性で環境に優しい有機塩を意味する。イオン液体の限定されない例としては、ジアルキル－イミダゾリウム、Ｎ－アルキル－ピリダジニウム、第四級アンモニウム、ジアルキル－ピロリジニウム、アルキル－グアニジニウム、及びアルキル－ピリジニウムのカチオンと、酢酸イオン、ギ酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、及び塩化物イオンなどの様々な環境に優しいアニオンと、を含む塩が挙げられる。
【0043】
本明細書で開示される方法は、前記の実施形態のいずれか１つによる、さらに、例えば水、溶媒、イオン液体、又はこれらの組み合わせを用いた繰り返し洗浄によって、工程（ｖ）で得られたＰＨＡを精製して、精製ＰＨＡを得る工程、及び所望に応じて、このようにして得られた精製ＰＨＡを、例えばドラム乾燥機、噴霧乾燥機、空気若しくは空気／窒素流乾燥、又は凍結乾燥機によって、乾燥する工程、を含み得る。
【0044】
続いて、精製ＰＨＡは、乾燥の有無にかかわらず、少なくとも１つのポリマーとブレンド、すなわち混合され得る。ＰＨＡとのブレンドに適するポリマーの例としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ケラチン、セルロース、キチン、リグニン、アミロース、アミロペクチン、及びムチンなどの生分解性ポリマー、並びにポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ、ポリエステルとも称される）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリメタクリル酸又はそのエステル、ポリ（アクリロニトリル－ｃｏ－ブタジエン－ｃｏ－スチレン）（ＡＢＳ）、ポリアミド、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリシロキサン、グラフトポリマー、及びポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ、アミド官能性及びアミン官能性の繰り返し分岐鎖状サブユニットから成る）などのデンドリマーなどの非生分解性ポリマー又はコポリマーが挙げられる。
【0045】
本明細書に開示されるブレンドの調製は、例えばGarcia-Garcia et al., 2022；Charon
et al., 2022；及びLonge et al., 2022に開示されているように、ＰＨＡ又は調製され
たＰＨＡブレンドの特性を調節するために、様々な可塑剤及び／又は添加剤の添加を含み得る。ある特定の実施形態では、１又は複数の可塑剤及び／又は添加剤は、他のポリマーと混合する前にＰＨＡに添加されて、他のポリマーとブレンドする前に前記ＰＨＡの特性が調節される。他の実施形態では、１又は複数の可塑剤及び／又は添加剤は、ＰＨＡブレンドに、その調製後に添加されて、前記ブレンドの特性が調節される。
et al., 2022；及びLonge et al., 2022に開示されているように、ＰＨＡ又は調製され
たＰＨＡブレンドの特性を調節するために、様々な可塑剤及び／又は添加剤の添加を含み得る。ある特定の実施形態では、１又は複数の可塑剤及び／又は添加剤は、他のポリマーと混合する前にＰＨＡに添加されて、他のポリマーとブレンドする前に前記ＰＨＡの特性が調節される。他の実施形態では、１又は複数の可塑剤及び／又は添加剤は、ＰＨＡブレンドに、その調製後に添加されて、前記ブレンドの特性が調節される。
【0046】
ある特定の実施形態では、前記の実施形態のいずれか１つによる、本発明の方法で用いられる発酵槽は、前記古細菌の培養が非滅菌条件下で行われるように、オープン発酵槽である。
【0047】
ある特定の実施形態では、前記の実施形態のいずれか１つによる、本発明の方法で用いられる発酵槽は、ガラス、金属又は金属合金、セラミック、プラスチック、又はセメントから作られている。他の実施形態では、前記発酵槽は、土手による池（earthen-bank pond）又は土手構造（earthen-bank construction）とも称される土製発酵槽である。
【0048】
ある特定の実施形態では、本発明の発酵プロセスは、前記の実施形態のいずれか１つによる工程（ｉ）～（ｖ）に従ってバッチで行われる。他の実施形態では、前記発酵プロセスは、連続的に行われ、この場合、古細菌のバイオマスは、連続して又は間隔を空けて、培養培地から採取され（次いで、ＰＨＡの濃縮、分離、及び／又は抽出に供され）、新しい培養培地（採取のために除去された量に等しい量）が発酵槽に導入される。
【0049】
ＰＬＡとＰＨＡ又はケラチンのいずれかとの組み合わせを検討するための多くの研究が行われてきた。本研究は、これらの生分解性材料からバイオプラスチックを作り出す目的で、３つの材料すべてを一緒にした組み合わせを検討するために行った。本明細書の実験セクションに記載されるように、ＰＬＡ、ＰＨＡ、及びケラチンのブレンドを、３つの材料の粉末を用いて、それらを均質な粉末を形成するように組み合わせることによって調製した。続いて、このブレンド粉末を、オーブン中で溶融した。ＳＥＭ及びデジタル顕微鏡、ＤＳＣ、ＴＧＡ、ＦＴＩＲ、並びに引張実験により、ブレンドの形態、並びに熱的及び機械的特性を調べた。熱分析から、ケラチンの添加が、ブレンドの熱安定性に影響を与えることが示された。ケラチンの重量分率が増加するに従って、分解温度の有意な上昇及び試験片の重量損失の減少が見られた。非晶質材料と結晶性のより高い材料との違いは、ＦＴＩＲで見られ得る。ＰＬＡは主として非晶質であるのに対し、ＰＨＡ及びケラチンは結晶性がより高い。結晶構造は、一般に非常に規則正しく、それが構造に強度及び剛性を付与している。このような構造では、分子鎖が所定の位置に固定されるため、荷重が掛かった場合、曲がるのではなく破断する。非晶性ポリマーはその反対である。剛性である代わりに、分子がランダムに混ざり合っていることにより、ポリマーが引っ張られた場合、鎖は互いに横切って移動することができる。このことによって、非晶質ポリマーに柔軟性及び弾力性が付与されている。これらの特性は、引張試験の結果にも反映され、ＰＨＡ及びケラチンを含むＰＬＡの試験片は、全く変形することなく弾性領域で破断した。加えて、形態試験では、典型的な脆性破壊が見られ、可塑性の徴候はなかった。ＰＬＡにＰＨＡを添加すると試験片の延性が上昇し脆性が低下することを見出した他の研究とは対照的に、これらの実験では、ＰＬＡにＰＨＡを添加することで、その逆のことが引き起こされたことには注目されたい。これは、用いたＰＨＡの種類によって説明できる可能性が最も高く、ＰＨＡのモノマーが異なれば、異なる特性を持つ材料を得ることができる。この結果に対する別の説明は、製造プロセスの過程で恐らく形成されたものである細孔の存在であり得る。ブレンドの両相間の良好な接着性は非常に重要である。細孔は、ポリマー相間の接着性の低下を引き起こし、したがって材料の特性を変化させる。試験片に細孔が作り出されることを避けるためには、吸湿を抑える目的で、材料の粉末を使用するまでデシケータ中に保管するのが良い。ブレンドの特性評価に加えて、生分解試験も行った。合成されたバイオポリマーは、コンポスト化環境中の好気性条件下で、完全に生分解性であった。ＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチンブレンドが最も早く分解された。このことは、ケラチンが、材料の熱安定性を補助するだけでなく、材料をより高い生分解性としていることも示している。これらの試験によると、これらの材料は、環境に優しいと特徴付けることができる。これらの知見を補強するためには、さらに引張試験を繰り返し行うべきである。
【0050】
別の態様において、本発明は、したがって、ＰＨＡと少なくとも２つの追加のポリマーとを含むブレンドを提供する。
【0051】
本発明によると、ＰＨＡとブレンドされるポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ブチレンスクシネート）、ポリ（ブチレンスクシネートアジペート）、脂肪族－芳香族コポリエステル、ポリ（ブチレンアジペート／テレフタレート）及びポリ（メチレンアジペート／テレフタレート）、ケラチン、セルロース、キチン、リグニン、アミロース、アミロペクチン、ムチン、及び前記ＰＨＡとは異なるＰＨＡなどの生分解性ポリマー、並びにポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ、ポリエステルとも称される）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリメタクリル酸又はそのエステル若しくはアミド、ポリ（アクリロニトリル－ｃｏ－ブタジエン－ｃｏ－スチレン）（ＡＢＳ）、ポリアミド、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリシロキサン、グラフトポリマー、及びＰＡＭＡＭなどのデンドリマーなどの非生分解性ポリマーから選択され得る。
【0052】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるブレンドは、前記ＰＨＡと少なくとも２つの追加のポリマーとを含み、前記少なくとも２つの追加のポリマーは、ＰＬＡ及びケラチンを含む又はこれらから成る。ある特定のそのようなブレンドにおいて、ＰＨＡ：ＰＬＡの比は、それぞれ重量基準で、約１：９９～約９９：１、約２０：８０～約８０：２０、約３０：７０～約７０：３０、又は約４０：６０～約６０：４０の範囲であるが、好ましくは、それぞれ重量基準で、約２０：８０～約４０：６０、例えば約２５：７５、約３０：７０、又は約３５：６５である（前記ブレンド内に含まれる他のポリマー、例えばケラチンの全体量にかかわらず）。
【0053】
他の実施形態では、前記ＰＨＡとブレンドされる少なくとも２つの追加のポリマーのうちの１つは、ケラチンであり、これは、重量基準で、前記ブレンドの約１％～約９９％、例えば約５％～約９０％、約１０％～約８０％、約１５％～約７０％、又は約２０％～約６０％を構成するが、好ましくは約１０％～約５０％を構成する。
【0054】
ブレンド成分、これらの成分の供給源、並びに物理的及び化学的特性（限定されるものではないが、分子量、結晶化度、鎖コンフォメーション、疎水性及び親水性、加水分解に対する安定性、熱的特性、輸送特性、光学特性、靭性、弾性、粘弾性、熱、電磁放射伝導性、並びに電気伝導性）の変動は、得られるブレンドの前述した物理的及び化学的特性、ブレンドの均質性、並びに成分の接着性に影響を与え得る。例えば、ブレンドにＰＨＡを組み込むと、曲げ弾性率の低下、及び同時に引張弾性率の上昇がもたらされる。ケラチンの存在は、ブレンドの熱安定性及び靭性に影響を与え得る。ケラチンの重量分率が増加するにつれて、分解温度が著しく上昇し、試験片の重量損失が減少した。
【0055】
さらなる態様において、本発明は、前記の実施形態のいずれか１つに開示されるブレンドを含む、又はそれから製造された物品を提供する。そのような物品は、例えば本明細書の実験セクションに示されるように、本技術分野で公知の適切ないかなる技術によって製造されてもよい。
【0056】
特に断りのない限り、例えば本明細書で用いられる通気速度、培養培地中の炭素及び／又は窒素の量、前記培養培地のｐＨ、並びにブレンド中のポリマー間の比に言及するすべての数値は、すべての場合において「約」の用語によって修飾されているものとして理解されたい。したがって、反する内容が示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得ようとされる所望の特性に応じて、プラス又はマイナス１０％まで変動し得る近似値である。
【0057】
次に、本発明を以下の限定されない実施例によって例示する。
【実施例】
【0058】
材料及び方法
大型藻類バイオマス生産．ウルバ属種を、２０１６年９月１５日から１１月３日まで、［特別注文の］大型藻類フォトバイオリアクター（ＭＰＢＲ）（Ｐｏｌｙｔｉｖ，Ｉｓｒａｅｌ、長さ１００ｃｍ、厚さ２００ｍｍ、幅４０ｃｍ）中、制御された条件及び自然光線下で培養した。この海藻の成長に用いた条件は、これまでに最適であることが見出された条件であった。ウルバ属種のバイオマスの元素分析を、ＣＨＮＳ分析装置（Ｆｌａｓｈ
２０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて行った。灰分及び水分含量は、マッフル炉（Ｍ．Ｇ．Ｆｕｒｎａｃｅｓ，Ｆａｒｉｄａｂａｄ，Ｉｎｄｉａ）中、バイオマスを５５０℃で燃焼することによって特定し、デンプン含有量は、総デンプンアッセイを用いて分析した。
大型藻類バイオマス生産．ウルバ属種を、２０１６年９月１５日から１１月３日まで、［特別注文の］大型藻類フォトバイオリアクター（ＭＰＢＲ）（Ｐｏｌｙｔｉｖ，Ｉｓｒａｅｌ、長さ１００ｃｍ、厚さ２００ｍｍ、幅４０ｃｍ）中、制御された条件及び自然光線下で培養した。この海藻の成長に用いた条件は、これまでに最適であることが見出された条件であった。ウルバ属種のバイオマスの元素分析を、ＣＨＮＳ分析装置（Ｆｌａｓｈ
２０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて行った。灰分及び水分含量は、マッフル炉（Ｍ．Ｇ．Ｆｕｒｎａｃｅｓ，Ｆａｒｉｄａｂａｄ，Ｉｎｄｉａ）中、バイオマスを５５０℃で燃焼することによって特定し、デンプン含有量は、総デンプンアッセイを用いて分析した。
【0059】
大型藻類バイオマスの亜臨界加水分解．海藻バイオマスの加水分解を、電気加熱システムを備えたバッチリアクター（０．２５Ｌの作業体積）（ＣＪＦ－０．２５，Ｋｅｄａ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ，Ｃｈｉｎａ）中で行った。リアクター内部の温度及び圧力は、それぞれデジタル温度計（ＭＲＣ Ｌｔｄ．，Ｉｓｒａｅｌ）及び圧力計（ＭＲＣ Ｌｔｄ．，Ｉｓｒａｅｌ）を用いてモニタリングした。リアクター内部の高温スラリーを混合するために、チラー（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｔｅｙｕ Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ
Ｃｏ． Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｎａ）からの冷水を用いて冷却した攪拌機を設置した。リアクターから残留空気を除去するため、真空ポンプ（ＭＲＣ Ｌｔｄ．，Ｉｓｒａｅｌ）を使用した。加水分解の条件は、以下の通りとした：温度１７０℃、合計滞留時間２０分、塩分濃度３８ｇ×Ｌ－１、及び固体投入量５％。これらの条件は、糖収率の最適化のために選択した。加水分解物は、１０，０００ｒｐｍで３分間の遠心分離（Ｙｉｎｇｔａｉ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＴＧＬ－１８，Ｃｈｉｎａ）によって液相と固相とに分離した。
Ｃｏ． Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｎａ）からの冷水を用いて冷却した攪拌機を設置した。リアクターから残留空気を除去するため、真空ポンプ（ＭＲＣ Ｌｔｄ．，Ｉｓｒａｅｌ）を使用した。加水分解の条件は、以下の通りとした：温度１７０℃、合計滞留時間２０分、塩分濃度３８ｇ×Ｌ－１、及び固体投入量５％。これらの条件は、糖収率の最適化のために選択した。加水分解物は、１０，０００ｒｐｍで３分間の遠心分離（Ｙｉｎｇｔａｉ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＴＧＬ－１８，Ｃｈｉｎａ）によって液相と固相とに分離した。
【0060】
Ｈｆｘ．メディテラネイによるＰＨＡ生産．Ｈｆｘ．メディテラネイ ＡＴＣＣ ３３５００（ＮＣＩＭＢ ２１７７）の補助によるウルバ属種の加水分解物を用いたＰＨＡ生産を調べた。Ｈｆｘ．メディテラネイ株は、冨栄養培地（Ｈｖ－ＹＰＣ）で、通常の手順で増殖させた。培養物は、振とうインキュベーター（ＭＲＣ Ｌａｂｓ，Ｉｓｒａｅｌ）中、回転速度１８０ｒｐｍの４２℃で増殖させ、培地のｐＨは７．２に調整した。実験では、海藻の加水分解物（水相）を、これまでの研究（Ghosh et al., 2021）で見られた通りの２５体積／体積％の作業濃度で塩水（１４４ｇ ＮａＣｌ×Ｌ－１）に添加した。実験は、１ＬのＰＥＴ（ポリエチレンテラフタレート）ボトル（長さ０．２８５ｍ、幅０．０８ｍ）から作製した特別注文によるリアクターで行った。１５本のＰＥＴボトルのセットを用いて、異なる通気速度（０．２５～２．０Ｌ×分－１）でのＨｆｘ．メディテラネイの培養を３連で行った。個々のリアクターに流量計を接続して、リアクター内部の空気流を操作した。空気は、リアクター内部の流れを均一とするために、リアクターの底部からスパージした。リアクター上部には、気体用の出口を設けた。円筒形のスリーブ状ＭＰＢＲ（Ｐｏｌｙｔｉｖ，Ｉｓｒａｅｌ、長さ１．５５ｍ、厚さ０．０２ｍ、幅０．４ｍ）を用いて培養を１０Ｌまでさらにスケールアップし、それをウルバ属種の培養に用いた。Ｈｆｘ．メディテラネイの培養に用いたリアクター構成とその模式図を図１に示す。
【0061】
超音波分離試験のために、細胞を６００ｍＬの冨栄養Ｈｖ－ＹＰＣ培地（ｐＨ７．２）中、１Ｌのバッフル付き三角フラスコで増殖させた。フラスコを、１７０ｒｐｍの振とうインキュベーター中、４２℃でおよそ４８時間、指数増殖後期／定常期初期まで維持し、振とう器から取り出した。ベンチトップ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＡｑｕａＭＡＴＥ ＶＩＳ、光路長１ｃｍ）で測定した場合、培養物の光学濃度は５２０ｎｍで７．９であり、これは、無灰乾燥重量濃度（ash-free dry weight concentration）３．
９ｇ×Ｌ－１にほぼ相当する。Ｈｆｘ．メディテラネイ培養物を密閉容器に移し、培養物の粒径及び超音波応答を改善する可能性のある自己凝集の試験としてベンチトップで２週間保存した。静置培養では自動凝集は観察されなかったため、Ｃａ２＋を添加することによってＨｆｘ．メディテラネイ細胞の凝集促進を試みた。細胞を１，０００×ｇで１５分間の遠心分離によってペレット化し、続いてＴｒｉｓバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及び４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で２回洗浄した。その後、細胞を塩溶液（２７ｍＭ ＫＣｌ、０．２４ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．４９ｍＭ ＮａＢｒ、３．７ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、４．３Ｍ ＮａＣｌ、１８．５μＭ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０）中に、より高い濃度で懸濁した。第２の細胞懸濁液を、同じ手順に従って洗浄及びリンスしたが、最終塩溶液は、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含むように改変した。洗浄後の懸濁液の光学濃度は、５２０ｎｍで１１．８であり、これは、無灰乾燥重量濃度５．８ｇ×Ｌ－１に相当する。
９ｇ×Ｌ－１にほぼ相当する。Ｈｆｘ．メディテラネイ培養物を密閉容器に移し、培養物の粒径及び超音波応答を改善する可能性のある自己凝集の試験としてベンチトップで２週間保存した。静置培養では自動凝集は観察されなかったため、Ｃａ２＋を添加することによってＨｆｘ．メディテラネイ細胞の凝集促進を試みた。細胞を１，０００×ｇで１５分間の遠心分離によってペレット化し、続いてＴｒｉｓバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及び４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で２回洗浄した。その後、細胞を塩溶液（２７ｍＭ ＫＣｌ、０．２４ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．４９ｍＭ ＮａＢｒ、３．７ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、４．３Ｍ ＮａＣｌ、１８．５μＭ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０）中に、より高い濃度で懸濁した。第２の細胞懸濁液を、同じ手順に従って洗浄及びリンスしたが、最終塩溶液は、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含むように改変した。洗浄後の懸濁液の光学濃度は、５２０ｎｍで１１．８であり、これは、無灰乾燥重量濃度５．８ｇ×Ｌ－１に相当する。
【0062】
細胞内ＰＨＡ含有量の特定．細胞のＰＨＡ含有量は、ナイルレッド染色法を用いて測定した。簡潔に述べると、細胞を洗浄し、１０％の生理食塩水に懸濁した。さらに、この細胞懸濁液を、最終濃度３．１μｇ×ｍｌ－１のナイルレッド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）で染色した。細胞を３０分間インキュベートし、さらに１０％生理食塩水を用いて洗浄及び再懸濁を行った。懸濁液の蛍光を、９６ウェルプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により、励起波長及び発光波長それぞれ５３５ｎｍ及び６０５ｎｍで測定した。市販のＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を用いて、様々な濃度の標準物質を調製した（０．２～２．０ｇ×Ｌ－１）。これらの標準物質を、標準曲線の作成に用いた。標準曲線をプロットし、細胞中のＰＨＡの最終濃度を特定した。ＰＨＡの未知量は、１ポイントあたり２回の繰り返し測定により、標準曲線から特定した。このプロトコルについて、細胞内ＰＨＡ含有量を特定するためのクロトン酸アッセイを用いた検証も行った。ポリマー（ＰＨＡ）を含む乾燥細胞ペレットに、２ミリリットルの硫酸を添加した。この混合物を１００℃の水浴中で２０分間加熱することによって加水分解し、クロトン酸を得た。濃硫酸をブランクとして用い、２３５ｎｍでのＵＶ吸光度をマルチプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で記録することによって、蓄積されたポリマーの量を定量した。
【0063】
バイオマス及びＰＨＡの生産率の計算．体積バイオマス生産率（ＸＢｉｏｍａｓｓ、ｇ×Ｌ－１×時間－１）及び体積ＰＨＡ生産率（ＸＰＨＡ、ｇ×Ｌ－１×時間－１）を特定するために、以下の式を用い：
式中、Ｂ１及びＢ２は、それぞれ時間ｔ１（時間）及びｔ２（時間）でのバイオマス濃度（ｇ×Ｌ－１）を表し、Ｃ１及びＣ２は、それぞれ時間ｔ１（時間）及びｔ２（時間）でのＰＨＡ含有量（ｇ×Ｌ－１）を表す。ＰＨＡの生産率を特定するため、濃度はＰＨＡ抽出によって特定した。
【数1】
式中、Ｂ１及びＢ２は、それぞれ時間ｔ１（時間）及びｔ２（時間）でのバイオマス濃度（ｇ×Ｌ－１）を表し、Ｃ１及びＣ２は、それぞれ時間ｔ１（時間）及びｔ２（時間）でのＰＨＡ含有量（ｇ×Ｌ－１）を表す。ＰＨＡの生産率を特定するため、濃度はＰＨＡ抽出によって特定した。
【0064】
細胞からのＰＨＡの抽出．発酵後、ブロスを１０，０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離した（Ｙｉｎｇｔａｉ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＴＧＬ－１８，Ｃｈｉｎａ）。こうして形成された細胞ペレットを、対流式オーブン（ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）中、６０℃の温度で１２時間にわたって乾燥させた。細胞からＰＨＡを抽出するために、細胞ペレットを、蒸留水中の０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で処理し、３２℃で２４時間にわたってインキュベートした。これによって細胞の溶解を誘導して、細胞内ＰＨＡを水中に放出させた。懸濁液を、さらに９０００ｒｐｍで１５分間にわたって遠心分離して、ＰＨＡをペレットとして得た。このペレットを、蒸留水で、白色となるまで繰り返し洗浄し、続いてさらなる分析のために乾燥させた。個々の発酵から得られたＰＨＡを別々に分析した。
【0065】
ＰＨＡの特性評価
ＦＴＩＲ－ＡＴＲ分析．乾燥後に得られたＰＨＡ粉末を、減衰全反射（ＡＴＲ）アタッチメントを備えたフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＡＴＲ，ＵＳＡ）で分析した。スペクトルを、４００～４０００ｃｍ－１の範囲で記録した。
ＦＴＩＲ－ＡＴＲ分析．乾燥後に得られたＰＨＡ粉末を、減衰全反射（ＡＴＲ）アタッチメントを備えたフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＡＴＲ，ＵＳＡ）で分析した。スペクトルを、４００～４０００ｃｍ－１の範囲で記録した。
【0066】
熱重量分析／示差走査熱量測定（ＴＧＡ／ＤＳＣ）分析．５ｍｇの乾燥ＰＨＡ粉末を、密閉アルミパン中で秤量した。続いて、オートローダーを備えた示差走査熱量計（Ｊｕｐｉｔｅｒ ＳＴＡ ４４９ Ｆ５，ＮＥＴＺＳＣＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、パンを直線的な温度勾配（３０℃から６００℃まで）に掛けた。昇温速度は、１０℃×分－１で維持した。
【0067】
１Ｈ ＮＭＲ分析．生産されたＰＨＡを、１Ｈ ＮＭＲ分析に掛けた。粉末にしたＰＨＡを、ＣＤＣｌ３に溶解し（１０ｍｇ×ｍｌ－１）、続いて４００ＭＨｚ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ，ＵＳＡ）で分析した。
【0068】
ＧＣ－ＭＳ分析．ＰＨＡのブチルエステルを、オートサンプラー（６８９０／５９７７Ａ，Ｇ４５１３Ａ；Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）及びＨＰ－５ＭＳ ＵＩカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）を備えたＧＣ－ＭＳシステムを用いて分析した。カラムは、５％フェニル／メチルポリシロキサンの固定相から構成し、長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍであった。ヘリウム（９９．９９９％）をキャリアーガスとして用い、流量は１．０ｍＬ×分－１とした。試料を、２８０℃の温度に加熱したインジェクターに、スプリット比１：１９で注入した。サンプル注入量は０．２μＬとした。分析物の分離条件は以下の通りであり、初期オーブン温度７０℃を５分間保持し、その後２８０℃まで、１５℃×分－１の速度で直線的に昇温した。続いて、３０℃×分－１の速度で３２０℃まで直線的に昇温し、この最終温度の保持時間を５分間とした。質量スペクトル分析は、電子エネルギー７０ｅＶを用いたＥＩ陽イオンモードで行った。トランスファーライン温度及びイオン源温度は、それぞれ２８０℃及び２５０℃に維持した。得られた質量スペクトルデータは、フルスキャンモード（ｍ／ｚ ５０～４００）で収集し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析した。
【0069】
分子量分析．屈折率（ＲＩ）検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０，Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）及び２つのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を取り付け、４０℃のカラム温度で操作した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを用い、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析を行って、ＰＨＡバイオポリマー試料の重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、ｚ平均分子量（Ｍｚ）、及び多分散性指数（ＰＤＩ）を特定した。用いた移動相は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）であり、流量は１ｍＬ×分－１とした。試料は１０μＬの量で注入した。ＧＰＣシステムの較正は、内部標準物質として直鎖状ポリスチレン及びポリ（メチルメタクリレート）を用いて行った。
【0070】
例１．バイオマス及びＰＨＡの生産率に対する様々な通気速度の影響
Ｈｆｘ．メディテラネイの屋外培養での混合に必要とされる通気速度を、１ＬのＰＥＴボトル実験で最適化した。このＰＥＴボトルを、１００ｍＬの培養体積から１Ｌのリアクター体積までの段階的スケールアップ、さらには屋外培養条件下でのＰＨＡ生産試験のためのバブルカラムリアクターとして用いた。経時でのバイオマス及びＰＨＡ濃度のプロファイルを、それぞれ図２Ａ～図２Ｂに示す。７２時間の培養時間後、体積生産率を計算した。これは、ＰＨＡ生産の最大時間でもあった。通気速度１．０Ｌ×分－１（又は１．０ｖｖｍ）での最大体積バイオマス生産率及びＰＨＡ生産率は、それぞれ、６４．０３±０．１１ｍｇ×Ｌ－１×時間－１及び３４．０７±０．０３ｍｇ×Ｌ－１×時間－１であると推計された。これまでに観察された体積生産率と比較して、バイオマス生産率は１０～１５％の増加、ＰＨＡ生産率は６～８％の増加が観察された。
Ｈｆｘ．メディテラネイの屋外培養での混合に必要とされる通気速度を、１ＬのＰＥＴボトル実験で最適化した。このＰＥＴボトルを、１００ｍＬの培養体積から１Ｌのリアクター体積までの段階的スケールアップ、さらには屋外培養条件下でのＰＨＡ生産試験のためのバブルカラムリアクターとして用いた。経時でのバイオマス及びＰＨＡ濃度のプロファイルを、それぞれ図２Ａ～図２Ｂに示す。７２時間の培養時間後、体積生産率を計算した。これは、ＰＨＡ生産の最大時間でもあった。通気速度１．０Ｌ×分－１（又は１．０ｖｖｍ）での最大体積バイオマス生産率及びＰＨＡ生産率は、それぞれ、６４．０３±０．１１ｍｇ×Ｌ－１×時間－１及び３４．０７±０．０３ｍｇ×Ｌ－１×時間－１であると推計された。これまでに観察された体積生産率と比較して、バイオマス生産率は１０～１５％の増加、ＰＨＡ生産率は６～８％の増加が観察された。
【0071】
これまでの研究は、１００ｍＬのボトルで行われ、これは２５体積／体積％の海藻加水分解物を添加した培地で古細菌を増殖させるために用いられていた。古細菌は、振とうインキュベーター中、温度４２℃での１２０ｒｐｍの均一混合下で好気条件で培養された。
より低い通気速度（１．０Ｌ×分－１まで）は、バイオマス及びＰＨＡの生産に適していたが、より高い通気速度（１．０Ｌ×分－１超）は、ＰＨＡ蓄積よりもバイオマス生産に適していた。これらの研究から、１．０Ｌ×分－１が、ＰＨＡ蓄積にとってより適切な通気条件であることが示された。本発明者らの研究でも、生物の増殖と共にＰＨＡ生産を得ることができることが実証され、このことは、それが増殖に関連した産物形成であることを示唆している。グルコース及びグリセロールを基質として用いたポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）生産に関する研究から、様々な通気速度の効果に関する知見が得られ、より低い通気速度において、より高いＰＨＢ濃度が得られることが観察された。より高い通気速度は、様々な基質を用いて、より高いバイオマス生産をもたらしたが、より低い通気速度では、より高いＰＨＢ蓄積量が得られた（De Almeida et al., 2010）。カプリアビダス・
ネカトール（Cupriavidus necator）を用いた最大のバイオマス及びＰＨＡ生産のために
は、１ｖｖｍの通気速度が最適であることが観察された。酸素は水性培養ブロスにおいて部分的にしか可溶性でないことから、短時間の通気の中断でも、利用可能な酸素がすぐに枯渇する結果となり、培養物に対して不可逆的な損傷を引き起こす。Ｈｆｘ．メディテラネイの細胞中でＰＨＡが蓄積するのは、通気速度が低い場合に培養培地中の溶存酸素が制限されることが原因である可能性がある。培地中の炭素が過剰である状態で酸素が制限された条件下では、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性が低下し、それはさらに、全体としてのＮＡＤＰＨ濃度の上昇をもたらす。そして次に、これが、クエン酸シンターゼ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼを阻害し、それによって、培地中のアセチル－ＣｏＡ濃度が上昇することになる。過剰なアセチルＣｏＡは、したがって、脂質又はＰＨＡなどの細胞内の貯蔵産物の蓄積に向けられることになる。酸素制限に起因する高いＮＡＤＰＨ／ＮＡＤ比は、別の選択肢の電子受容体としての役割を果たすＰＨＢの合成を促進する。
より低い通気速度（１．０Ｌ×分－１まで）は、バイオマス及びＰＨＡの生産に適していたが、より高い通気速度（１．０Ｌ×分－１超）は、ＰＨＡ蓄積よりもバイオマス生産に適していた。これらの研究から、１．０Ｌ×分－１が、ＰＨＡ蓄積にとってより適切な通気条件であることが示された。本発明者らの研究でも、生物の増殖と共にＰＨＡ生産を得ることができることが実証され、このことは、それが増殖に関連した産物形成であることを示唆している。グルコース及びグリセロールを基質として用いたポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）生産に関する研究から、様々な通気速度の効果に関する知見が得られ、より低い通気速度において、より高いＰＨＢ濃度が得られることが観察された。より高い通気速度は、様々な基質を用いて、より高いバイオマス生産をもたらしたが、より低い通気速度では、より高いＰＨＢ蓄積量が得られた（De Almeida et al., 2010）。カプリアビダス・
ネカトール（Cupriavidus necator）を用いた最大のバイオマス及びＰＨＡ生産のために
は、１ｖｖｍの通気速度が最適であることが観察された。酸素は水性培養ブロスにおいて部分的にしか可溶性でないことから、短時間の通気の中断でも、利用可能な酸素がすぐに枯渇する結果となり、培養物に対して不可逆的な損傷を引き起こす。Ｈｆｘ．メディテラネイの細胞中でＰＨＡが蓄積するのは、通気速度が低い場合に培養培地中の溶存酸素が制限されることが原因である可能性がある。培地中の炭素が過剰である状態で酸素が制限された条件下では、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性が低下し、それはさらに、全体としてのＮＡＤＰＨ濃度の上昇をもたらす。そして次に、これが、クエン酸シンターゼ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼを阻害し、それによって、培地中のアセチル－ＣｏＡ濃度が上昇することになる。過剰なアセチルＣｏＡは、したがって、脂質又はＰＨＡなどの細胞内の貯蔵産物の蓄積に向けられることになる。酸素制限に起因する高いＮＡＤＰＨ／ＮＡＤ比は、別の選択肢の電子受容体としての役割を果たすＰＨＢの合成を促進する。
【0072】
例２．バイオマス及びＰＨＡの生産率に対する様々な培養時間の影響
様々な培養時間の影響を、１ＬのＰＥＴボトル中、１ｖｖｍの通気速度で試験した。実験は、最大１９６時間にわたって行った。生産率は、時間の増加と共に上昇し、７２時間の培養時間で、それぞれ６８．０１±０．１１ｍｇ×Ｌ－１×時間－１及び２８．０２±０．０３ｍｇ×Ｌ－１×時間－１の最大バイオマス生産率及びＰＨＡ生産率が観察された（図２Ｃ～図２Ｄ）。ＰＨＡの生産率は、７２時間後に著しく低下した。これは、飢餓期にＰＨＡが生物によって消費されたことに起因する可能性がある。Ｈｆｘ．メディテラネイは、貯蔵エネルギー産物としてＰＨＡを生産し、細胞内ＰＨＡ解重合酵素を有しており、そのことによって、ＰＨＡをストレス条件下での生存に利用することができる。培養時間は、廃グリセロールを基質として用いたＰＨＡ生産を促進するための重要なパラメータであると推定された。増殖期を制限することで、細胞に窒素ストレスが与えられ、その結果、細胞のＰＨＡ含量が高まることが観察された。ＰＨＡの蓄積は対数期から始まり、バイオマスと共に増加し、定常期の初めにピークに達する。ＰＨＡの合成は、バイオマスの成長に対して遅れ、指数期の終わりに最大合成率に達する。これは、過去の研究においても観察されている（Lillo and Rodriguez-Valera, 1990）。これらの知見から、本研究でのＰＨＡ生産は、増殖に関連していることが示唆される。これは、バッチ式培養を連続システムに転換し、それによってＰＨＡ生産を増加させるための重要な特性である可能性がある。
様々な培養時間の影響を、１ＬのＰＥＴボトル中、１ｖｖｍの通気速度で試験した。実験は、最大１９６時間にわたって行った。生産率は、時間の増加と共に上昇し、７２時間の培養時間で、それぞれ６８．０１±０．１１ｍｇ×Ｌ－１×時間－１及び２８．０２±０．０３ｍｇ×Ｌ－１×時間－１の最大バイオマス生産率及びＰＨＡ生産率が観察された（図２Ｃ～図２Ｄ）。ＰＨＡの生産率は、７２時間後に著しく低下した。これは、飢餓期にＰＨＡが生物によって消費されたことに起因する可能性がある。Ｈｆｘ．メディテラネイは、貯蔵エネルギー産物としてＰＨＡを生産し、細胞内ＰＨＡ解重合酵素を有しており、そのことによって、ＰＨＡをストレス条件下での生存に利用することができる。培養時間は、廃グリセロールを基質として用いたＰＨＡ生産を促進するための重要なパラメータであると推定された。増殖期を制限することで、細胞に窒素ストレスが与えられ、その結果、細胞のＰＨＡ含量が高まることが観察された。ＰＨＡの蓄積は対数期から始まり、バイオマスと共に増加し、定常期の初めにピークに達する。ＰＨＡの合成は、バイオマスの成長に対して遅れ、指数期の終わりに最大合成率に達する。これは、過去の研究においても観察されている（Lillo and Rodriguez-Valera, 1990）。これらの知見から、本研究でのＰＨＡ生産は、増殖に関連していることが示唆される。これは、バッチ式培養を連続システムに転換し、それによってＰＨＡ生産を増加させるための重要な特性である可能性がある。
【0073】
本研究では、ＰＨＡ生産のための別の選択肢としての戦略を提示する。通常、混合微生物コンソーシアム（ＭＭＣ）から安価にＰＨＡを生産するためには、好気性動的供給（aerobic dynamic feeding：ＡＤＦ）戦略が利用される。ＡＤＦプロセスは、過剰－欠乏（feast-famine：Ｆ－Ｆ）プロセスと称されることが多く、ここでは、細胞は、外部基質が
過剰に供給される初期段階を受け、続いて、その基質が存在しない後期段階を受ける（Cui et al., 2016）。本研究では、生物が増殖期に外部基質を利用することができることにより、ＰＨＡ生産のための追加工程を必要としない単一工程プロセスを用いる。これは、Ｈｆｘ．メディテラネイがハロバクテリウム（Halobacteriaceae）科の他の既知のメンバ
ーよりも培養が早い、及び極端な耐塩性も有するという統計値に基づくものであり得る。さらなる驚くべき詳細事項としては、その代謝適応性が高いことであり、すなわち、それは、複雑な培地及び単純な限定培地のいずれでも培養され、好塩性古細菌の中でも非常に多様な単一の炭素源を用いるものであり、タンパク質、多糖類、及び脂質を加水分解する細胞外酵素を分泌する。さらに、非常に高い塩分濃度（＞２５％）によって、このプロセスにおける汚染物質のレベルが低下し、そのため、濃縮工程が不要となる。ＡＤＦプロセスに関して報告されているＰＨＡ含有量は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）で２５～７０％の範囲内であり、これは本研究で観察された収率と同程度である。したがって、本発明の戦略は、廃棄物資源からの効率的で費用対効果の高いＰＨＡ生産に適している。
過剰に供給される初期段階を受け、続いて、その基質が存在しない後期段階を受ける（Cui et al., 2016）。本研究では、生物が増殖期に外部基質を利用することができることにより、ＰＨＡ生産のための追加工程を必要としない単一工程プロセスを用いる。これは、Ｈｆｘ．メディテラネイがハロバクテリウム（Halobacteriaceae）科の他の既知のメンバ
ーよりも培養が早い、及び極端な耐塩性も有するという統計値に基づくものであり得る。さらなる驚くべき詳細事項としては、その代謝適応性が高いことであり、すなわち、それは、複雑な培地及び単純な限定培地のいずれでも培養され、好塩性古細菌の中でも非常に多様な単一の炭素源を用いるものであり、タンパク質、多糖類、及び脂質を加水分解する細胞外酵素を分泌する。さらに、非常に高い塩分濃度（＞２５％）によって、このプロセスにおける汚染物質のレベルが低下し、そのため、濃縮工程が不要となる。ＡＤＦプロセスに関して報告されているＰＨＡ含有量は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）で２５～７０％の範囲内であり、これは本研究で観察された収率と同程度である。したがって、本発明の戦略は、廃棄物資源からの効率的で費用対効果の高いＰＨＡ生産に適している。
【0074】
例３．４０Ｌスリーブ中でのＨｆｘ．メディテラネイによるＰＨＡ生産のスケールアップ
本発明者らは、さらに、４０Ｌのプラスチックスリーブ中での培養によって、ＰＨＡ生産プロセスをスケールアップした。最初に試みた培養体積は１０Ｌであり、それを段階的に４０Ｌまでスケールアップした。実験条件は、最適化後に決定し、初期培養密度５０ｇ×Ｌ－１（Ghosh et al., 2021）、通気速度１ｖｖｍ、及び培養時間７２時間とした。バイオマス中に実現したＰＨＡの最大質量分率は、５６重量／重量％と計算された。観察された最大バイオマス生産率は、５０．１±０．１１ｍｇ×Ｌ－１×時間－１であり、ＰＨＡ生産率は、２７．０３±０．０１ｍｇ×Ｌ－１×時間－１であった。変換収率は、０．１０７ｇ ＰＨＡ×ｇ ウルバＤＷ －１と計算された。本研究からの炭素収支も計算した。ウルバ属種バイオマスの投入炭素含有量（ＣＨＮＳ分析によって計算した場合、３３．４％のＣ）のうち、３２．０３％がＨｆｘ．メディテラネイによるＰＨＡ生産に利用され、残りの含有量は、発酵中の揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）生産に利用されたか、又は培地中で利用されずに残る残留炭素であった。このことは、使用済み培地のさらなる分析によって確認した。１ＬのＰＥＴボトル培養と比較して、全体的な生産率（バイオマス及びＰＨＡ）の僅かな低下が観察されたが、これは、リアクター内での非効率な空気循環に起因する可能性がある（４０Ｌのバイオリアクター中で１０Ｌのバッチ発酵）。非効率な空気循環は、リアクター内の培地成分が利用不可となることに繋がり、このことは、細胞バイオマスの蓄積の減少をもたらして、体積バイオマス及びＰＨＡ生産率を実質的に低下させる可能性がある。この影響は、本発明者らの研究でも観察され、プロセスの段階的スケールアップの各段階での生産率の僅かな低下を説明するものである可能性がある。４０Ｌ培養への段階的スケールアップは、リアクター中でのバイオマス及びＰＨＡの生産率をさらに向上させる可能性がある。バイオマス及びＰＨＡの生産率は、７２時間の培養時間で最大の生産率となるベル型の曲線を示した。ＰＨＡ生産が、バイオマス生産率との類似性も示したことから、生産が、培養時間と共に減少する増殖依存性のプロセスであったことが示唆された。ＰＨＡ含有量の経時的減少は、ＰＨＡが古細菌細胞内でエネルギー貯蔵産物として生産されることから説明され得る。培養時間の増加と共に、細胞内の栄養ストレスが増加し、ＰＨＡ顆粒がエネルギー生成に用いられるようになる。様々な廃棄物がＰＨＡの生産に用いられてきた。バッチ培養実験では、２７ｍｇ×Ｌ－１×時間－１のＰＨＡ生産率が得られ、この場合の発酵実験では、マグロ凝縮水（tuna condensate）を基質として用
いた。
本発明者らは、さらに、４０Ｌのプラスチックスリーブ中での培養によって、ＰＨＡ生産プロセスをスケールアップした。最初に試みた培養体積は１０Ｌであり、それを段階的に４０Ｌまでスケールアップした。実験条件は、最適化後に決定し、初期培養密度５０ｇ×Ｌ－１（Ghosh et al., 2021）、通気速度１ｖｖｍ、及び培養時間７２時間とした。バイオマス中に実現したＰＨＡの最大質量分率は、５６重量／重量％と計算された。観察された最大バイオマス生産率は、５０．１±０．１１ｍｇ×Ｌ－１×時間－１であり、ＰＨＡ生産率は、２７．０３±０．０１ｍｇ×Ｌ－１×時間－１であった。変換収率は、０．１０７ｇ ＰＨＡ×ｇ ウルバＤＷ －１と計算された。本研究からの炭素収支も計算した。ウルバ属種バイオマスの投入炭素含有量（ＣＨＮＳ分析によって計算した場合、３３．４％のＣ）のうち、３２．０３％がＨｆｘ．メディテラネイによるＰＨＡ生産に利用され、残りの含有量は、発酵中の揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）生産に利用されたか、又は培地中で利用されずに残る残留炭素であった。このことは、使用済み培地のさらなる分析によって確認した。１ＬのＰＥＴボトル培養と比較して、全体的な生産率（バイオマス及びＰＨＡ）の僅かな低下が観察されたが、これは、リアクター内での非効率な空気循環に起因する可能性がある（４０Ｌのバイオリアクター中で１０Ｌのバッチ発酵）。非効率な空気循環は、リアクター内の培地成分が利用不可となることに繋がり、このことは、細胞バイオマスの蓄積の減少をもたらして、体積バイオマス及びＰＨＡ生産率を実質的に低下させる可能性がある。この影響は、本発明者らの研究でも観察され、プロセスの段階的スケールアップの各段階での生産率の僅かな低下を説明するものである可能性がある。４０Ｌ培養への段階的スケールアップは、リアクター中でのバイオマス及びＰＨＡの生産率をさらに向上させる可能性がある。バイオマス及びＰＨＡの生産率は、７２時間の培養時間で最大の生産率となるベル型の曲線を示した。ＰＨＡ生産が、バイオマス生産率との類似性も示したことから、生産が、培養時間と共に減少する増殖依存性のプロセスであったことが示唆された。ＰＨＡ含有量の経時的減少は、ＰＨＡが古細菌細胞内でエネルギー貯蔵産物として生産されることから説明され得る。培養時間の増加と共に、細胞内の栄養ストレスが増加し、ＰＨＡ顆粒がエネルギー生成に用いられるようになる。様々な廃棄物がＰＨＡの生産に用いられてきた。バッチ培養実験では、２７ｍｇ×Ｌ－１×時間－１のＰＨＡ生産率が得られ、この場合の発酵実験では、マグロ凝縮水（tuna condensate）を基質として用
いた。
【0075】
技術的には、ＰＨＡは、撹拌槽モード（ＳＴＲ）で運転されるバイオリアクター又は発酵槽中、制御された条件下で生産される。リアクターは、バッチ、繰り返しバッチ、フェッドバッチモードで不連続的に、又は連続撹拌槽リアクター（ＣＳＴＲ）として運転されてよく（Albuquerque et al., 2018）、所望に応じてカスケードであってもよい。リアクターは、一般的にステンレス鋼製であり、このことによって、より高い塩分濃度での（すなわち、塩分濃度２２％超）Ｈｆｘ．メディテラネイの培養において課題が生じる。これは、非腐食性であるポリマー及び／又はセラミック（ガラスを含む）製のリアクターを用いることによって克服可能である（Hezayen et al., 2000）。さらに、空気混合式リアク
ター（pneumatically mixed reactor）も、その構造及び設計が単純であることから、極
端な好塩菌によるＰＨＡ生産に利用され得る。混合は、リアクター内の空気バブリングによって行われ、そのことは、浮遊細胞に対して生ずるせん断応力を低下させ、物質移動に用いられるエネルギーを減少させる。最近では、エアリフトリアクター（ＡＬＲ）が、バッチシステムにおけるデンプン加水分解物からのＨ．ボリビエンシス（H.boliviensis）
によるＰＨＢ生産に用いられている。Ｈ．ボリビエンシスによる窒素欠乏培地中での様々な炭素源からのＰＨＢ生産において、ＡＬＲの使用の成功が実証されている（Ortiz-Veizan et al., 2020）。アゾヒドロモナス・アウストラリカ（Azohydromonas australica）
及びＣ．ネカトールは、約７２重量％のＰＨＢ、並びにそれぞれバイマス濃度１０及び３２ｇ×Ｌ－１に達したが（Gahlawat et al., 2012）、一方バークホルデリア・サッカリ
（Burkholderia sacchari）のＡＬＲ中での培養は、４１重量％のＰＨＢ及び最大バイオ
マス濃度１５０ｇ・Ｌ－１をもたらした（Pradella et al., 2010）。エアリフトリアク
ターと同様に、バブルカラムリアクターも、空気撹拌式バイオリアクターに関連する様々な利点から、極端な好塩菌によるＰＨＡ生産に利用され得る。これらの利点としては、撹拌槽リアクターと比較して、シンプルな設計及び構造、操作の容易さ、並びにより低いせん断応力が挙げられる。Ｈｆｘ．メディテラネイを用いた海藻加水分解物からのＰＨＡ生産のために空気撹拌式バイオリアクターを用いることに関する報告はない。
ター（pneumatically mixed reactor）も、その構造及び設計が単純であることから、極
端な好塩菌によるＰＨＡ生産に利用され得る。混合は、リアクター内の空気バブリングによって行われ、そのことは、浮遊細胞に対して生ずるせん断応力を低下させ、物質移動に用いられるエネルギーを減少させる。最近では、エアリフトリアクター（ＡＬＲ）が、バッチシステムにおけるデンプン加水分解物からのＨ．ボリビエンシス（H.boliviensis）
によるＰＨＢ生産に用いられている。Ｈ．ボリビエンシスによる窒素欠乏培地中での様々な炭素源からのＰＨＢ生産において、ＡＬＲの使用の成功が実証されている（Ortiz-Veizan et al., 2020）。アゾヒドロモナス・アウストラリカ（Azohydromonas australica）
及びＣ．ネカトールは、約７２重量％のＰＨＢ、並びにそれぞれバイマス濃度１０及び３２ｇ×Ｌ－１に達したが（Gahlawat et al., 2012）、一方バークホルデリア・サッカリ
（Burkholderia sacchari）のＡＬＲ中での培養は、４１重量％のＰＨＢ及び最大バイオ
マス濃度１５０ｇ・Ｌ－１をもたらした（Pradella et al., 2010）。エアリフトリアク
ターと同様に、バブルカラムリアクターも、空気撹拌式バイオリアクターに関連する様々な利点から、極端な好塩菌によるＰＨＡ生産に利用され得る。これらの利点としては、撹拌槽リアクターと比較して、シンプルな設計及び構造、操作の容易さ、並びにより低いせん断応力が挙げられる。Ｈｆｘ．メディテラネイを用いた海藻加水分解物からのＰＨＡ生産のために空気撹拌式バイオリアクターを用いることに関する報告はない。
【0076】
本発明者らは、ＰＥＴボトル（１Ｌ）、さらにはスリーブ状大型藻類フォトバイオリアクター（４０Ｌ）を用いたが、これらは、腐食を受けることがなく、メンテナンスコストを大幅に削減することができる。培地の塩分濃度が高いことで、汚染物質の増殖が抑制され、それによって、極端な好塩古細菌を用いた屋外培養の可能性が高まる。このようなプロセスは、実現可能であり、海藻養殖業者に対してより高い収益をもたらす可能性がある。現行のバイオプラスチック生産用フィードストックに対して温室効果ガス排出量を分析したところ、本発明者らの排出量が同等であることが分かった。培養システム（洋上及び陸上の両方）の効率的な設計が、このプロセスの実現可能性を決定する因子であり得る。プロセスの持続可能性を高めることができる別の方法は、バイオリファイナリーのコンセプトでＰＨＡ及びバイオ炭を同時に生産することによるものである。バイオ炭の生産と組み合わせると、経済的な実現可能性と持続可能性とが大幅に改善される（Ghosh et al., 2021）。本発明者らは、経済的に実現可能な方法で続いてＰＨＡ生産に用いられ得る、空気撹拌式リアクター中での海藻の陸上培養に対する持続可能なソリューションを提供したいと考えた。プロセスのさらなるスケールアップに関連する課題が存在する。培地の高い塩分濃度が、バイオプロセス全体の障害となり得る。塩水を濃縮するためのさらなるユニットが用いられる可能性があり、この場合、システムからの排出物が、培養システムに再循環され得る。加えて、及び上述したように、このプロセスは、バイオリファイナリーコンセプトで運転することができ、この場合、単一のバイオマス基質から様々な生成物を得ることができ、それによって、プロセスの費用対効果を高めることができる。
【0077】
例４．ＰＨＡ構造分析（ＦＴＩＲ、ＴＧＡ／ＤＳＣ、１Ｈ ＮＭＲ、ＧＣ－ＭＳ）
ＦＴＩＲ分光法．ＰＨＡのＦＴＩＲ試験では、いくつかの吸収ピークが見られた。３２９０ｃｍ－１付近にピークが検出され、これはヒドロキシル基の伸縮に帰属され得る。ＰＨＡに特徴的な結合振動（１７２０～１７４０ｃｍ－１）が観察され、これはカルボニル結合の振動に帰属され得る。メチル基及びメチレン基の伸縮は、それぞれ２９１４及び２８７９ｃｍ－１に検出された。他のピークは、１４５０～１０００ｃｍ－１の範囲内に観察された。これらのピークは、ＣＨ３基の変角、ＣＨ２基の縦ゆれ、並びにＣ－Ｏ、Ｃ－Ｃ、及びＣ－Ｏ－Ｃの伸縮など、様々な結合振動に帰属され得る。これらの観察結果から、分析されたポリマーが、ポリヒドロキシ－（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシバレレート）（Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ））であることが示された。バレレートを例とする３ＨＶ－構造関連前駆体化合物の添加なしにＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）コポリエステルが生産されることは、希少な特徴であり、典型的には、Ｈｆｘ．メディテラ
ネイなどのいくつかの好塩性古細菌に見られる。
ＦＴＩＲ分光法．ＰＨＡのＦＴＩＲ試験では、いくつかの吸収ピークが見られた。３２９０ｃｍ－１付近にピークが検出され、これはヒドロキシル基の伸縮に帰属され得る。ＰＨＡに特徴的な結合振動（１７２０～１７４０ｃｍ－１）が観察され、これはカルボニル結合の振動に帰属され得る。メチル基及びメチレン基の伸縮は、それぞれ２９１４及び２８７９ｃｍ－１に検出された。他のピークは、１４５０～１０００ｃｍ－１の範囲内に観察された。これらのピークは、ＣＨ３基の変角、ＣＨ２基の縦ゆれ、並びにＣ－Ｏ、Ｃ－Ｃ、及びＣ－Ｏ－Ｃの伸縮など、様々な結合振動に帰属され得る。これらの観察結果から、分析されたポリマーが、ポリヒドロキシ－（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシバレレート）（Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ））であることが示された。バレレートを例とする３ＨＶ－構造関連前駆体化合物の添加なしにＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）コポリエステルが生産されることは、希少な特徴であり、典型的には、Ｈｆｘ．メディテラ
ネイなどのいくつかの好塩性古細菌に見られる。
【0078】
ＴＧＡ／ＤＳＣ熱分析．Ｈｆｘ．メディテラネイ由来のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）の分解温度の極小値（Ｔｄ）は、２４８℃であることが分かった。分解プロセス中、ポリマーの重量は７０．３％減少した。溶融温度は、１７７．１℃であると観察された。
【0079】
ＧＣ－ＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲ分析．加水分解されたバイオポリマーのＧＣ－ＭＳ分析では、クロマトグラムに２つのピークが示され、その保持時間は、９．４６分及び１０．６５４分であった。質量スペクトル分析の後、これらのピークは、３－ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）及び３－ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）のブチルエステルであることが示唆された。ＧＣ－ＭＳ分析から、Ｈｆｘ．メディテラネイによって生産されたポリマーは、３ＨＢ及び３ＨＶのモノマーから構成されていることが示された。バイオポリマーの１Ｈ ＮＭＲスペクトルによると、０．８３ｐｐｍ及び１．２６ｐｐｍのピークは、２つの異なるＣＨ３基の存在を示唆しており、これらはそれぞれ、ポリマー中の３ＨＢ基及び３ＨＶ基の存在と関連し得る。２．５８ｐｐｍ及び２．４８ｐｐｍのピークは、それぞれ３ＨＶ及び３ＨＢのＣＨ２基に帰属された。５．２５ｐｐｍのピークは、ＣＨ基に帰属された。１Ｈ ＮＭＲスペクトルに従って、ＰＨＡのモノマー組成を計算した。これらの計算から、３ＨＢが９０．４％、３ＨＶが１０．６％の組成が示された。
【0080】
生産されたＰＨＡの分子量．異なる通気速度で生産されたＰＨＡの分子量を、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて特定した。表１は、様々な通気速度（０．２５～２．０Ｌ×分－１）におけるＨｆｘ．メディテラネイから抽出したＰＨＡの平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、Ｚ平均分子量（Ｍｚ）、及びＰＤＩを示す。ＰＨＡの最大平均Ｍｗ（ポリスチレン標準を用いると８１１ｋＤａ、ＰＭＭＡ標準を用いると７７０ｋＤａ）は、通気速度０．２５Ｌ・分－１で得られ、ＰＤＩは１．６０８（ポリスチレン）／１．５４４（ＰＭＭＡ）であった。得られた値は、Ｈｆｘ．メディテラネイからの高品質ＰＨＢＶ生産の過去の研究からの分子量に類似しており、この場合は、分子量が１０５７ｋＤａ及びＰＤＩが１．５のポリマーが得られていた（Koller et al., 2007）。本
発明者らの研究では、ポリスチレンを標準物質として用いた場合、平均Ｍｗは６７９～８１１ｋＤａの範囲内であり、ＰＤＩは１．６～２．１８の範囲内であった。ＰＭＭＡを標準物質として用いると、平均Ｍｗは６５６～７７０ｋＤａの範囲内であり、ＰＤＩは１．５４４～１．９５９の範囲内であった。対応する通気速度を上げた場合に、ＰＤＩの増加が観察され（図３）、このことは、より低い混合速度において、ポリマーがより均質であることを示唆している。屋外研究では、平均分子量が７１６ｋＤａ及びＰＤＩが１．５９２のＰＨＡが得られた。
発明者らの研究では、ポリスチレンを標準物質として用いた場合、平均Ｍｗは６７９～８１１ｋＤａの範囲内であり、ＰＤＩは１．６～２．１８の範囲内であった。ＰＭＭＡを標準物質として用いると、平均Ｍｗは６５６～７７０ｋＤａの範囲内であり、ＰＤＩは１．５４４～１．９５９の範囲内であった。対応する通気速度を上げた場合に、ＰＤＩの増加が観察され（図３）、このことは、より低い混合速度において、ポリマーがより均質であることを示唆している。屋外研究では、平均分子量が７１６ｋＤａ及びＰＤＩが１．５９２のＰＨＡが得られた。
【0081】
【表1】
【0082】
様々なパラメータがＰＨＡの分子量に与える影響を特定するために、並びにＰＨＡシンターゼ活性のＰＨＡの分子量分布及びＰＤＩへの依存性を調べるために、様々な研究が行われてきた。別の研究では、分子量は、用いられる基質の種類に依存すると主張した（Quagliano et al., 2001）。Kshirsagar et al., 2013によって、混合速度の違いによるＰ
ＨＡの分子量依存性が観察された。本発明者らの研究は、撹拌及び通気速度を制御することによって、生産されるＰＨＡの分子量及びＰＤＩが制御され得ることを実証するものである。ＰＨＡの分子量を制御できることは、ポリマーの製造及び加工において有利である。
ＨＡの分子量依存性が観察された。本発明者らの研究は、撹拌及び通気速度を制御することによって、生産されるＰＨＡの分子量及びＰＤＩが制御され得ることを実証するものである。ＰＨＡの分子量を制御できることは、ポリマーの製造及び加工において有利である。
【0083】
例５．ブレンドの調製
ＰＬＡ、ＰＨＡ、及びケラチンの溶解性試験
これら３つの材料を含むブレンドを調製するために、まず溶解度試験を行った。
ＰＬＡ、ＰＨＡ、及びケラチンの溶解性試験
これら３つの材料を含むブレンドを調製するために、まず溶解度試験を行った。
【0084】
ケラチンの溶解性．約１００ｍｇのケラチンを、酢酸又は蒸留水のいずれかに混合し（Ruzgar et al., 2020）、混合物を１２時間にわたって撹拌した。見出されたように、ケ
ラチンは、周囲条件下において、これらの溶媒のいずれにもまったく溶解しなかった。酢酸中のケラチンのコロイド分散体は、加熱することで得ることができた（表２）。
ラチンは、周囲条件下において、これらの溶媒のいずれにもまったく溶解しなかった。酢酸中のケラチンのコロイド分散体は、加熱することで得ることができた（表２）。
【0085】
ＰＨＡの溶解性．約１００ｍｇのＰＨＡを、クロロホルム、アセトン、蒸留水、又は酢酸と、別々に混合した。クロロホルム及びアセトンでは、部分的な溶解が観察された。対照的に、蒸留水及び酢酸を溶媒として用いた場合は、分散体しか観察されなかった（表２）。
【0086】
ＰＬＡの溶解性．３５ｍｌのクロロホルムと１５ｍｌのアセトンとの混合物を、ＰＬＡの溶解性について評価した。この溶媒混合物中では、周囲条件で１２時間撹拌した後に、ＰＬＡの僅かな溶解のみが観察された。１４ｍｌのクロロホルム及び６ｍｌのアセトンを含む混合物中では、加熱することでＰＬＡの部分的な溶解が観察された。アセトンを溶媒として用いた場合は、５５℃に１時間加熱することでＰＬＡを溶解することができた（表２）。
【0087】
【表2】
【0088】
まとめると、ケラチンコロイド分散体を調製するためには、酢酸を溶媒として用いるべきであり、及び混合物を加熱するべきである。ＰＨＡは、クロロホルム又はアセトンに部分的に溶解可能である。ＰＬＡは、継続的に混合しながら５５℃に加熱するとアセトンに溶解する。
【0089】
材料のブレンド
ＰＬＡとＰＨＡとの溶液の調製：７０重量％のＰＬＡ及び３０重量％のＰＨＡから構成される二成分ブレンドの１００ｍｇを作製し、このブレンドのアセトンへの溶解性を２つの異なるバイアルで試験して、溶媒への材料添加の順序が均質混合物の形成に影響し得るかどうかを判断した。第１のバイアルでは、ＰＬＡ及びＰＨＡの両方の固体を同時に１０ｍｌのアセトンに添加し、第２のバイアルでは、ＰＬＡを１０ｍｌのアセトンに添加し、溶解後にＰＨＡを添加した。観察されたように、ＰＬＡの溶解速度は、両方のバイアルにおいて、すなわちＰＨＡあり又はなしにおいて、同じであった。しかし、第１のバイアルでは、均質な溶液が得られたのに対し、第２のバイアルでは、ＰＨＡ添加後に暗色の沈殿物が形成された。結論として、これらの材料は、加熱前に同時にアセトンに添加されるべきである。
ＰＬＡとＰＨＡとの溶液の調製：７０重量％のＰＬＡ及び３０重量％のＰＨＡから構成される二成分ブレンドの１００ｍｇを作製し、このブレンドのアセトンへの溶解性を２つの異なるバイアルで試験して、溶媒への材料添加の順序が均質混合物の形成に影響し得るかどうかを判断した。第１のバイアルでは、ＰＬＡ及びＰＨＡの両方の固体を同時に１０ｍｌのアセトンに添加し、第２のバイアルでは、ＰＬＡを１０ｍｌのアセトンに添加し、溶解後にＰＨＡを添加した。観察されたように、ＰＬＡの溶解速度は、両方のバイアルにおいて、すなわちＰＨＡあり又はなしにおいて、同じであった。しかし、第１のバイアルでは、均質な溶液が得られたのに対し、第２のバイアルでは、ＰＨＡ添加後に暗色の沈殿物が形成された。結論として、これらの材料は、加熱前に同時にアセトンに添加されるべきである。
【0090】
アセトンが過剰に存在する場合の溶解速度を調べるため、別の試験を行った。１００ｍｇのＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）混合物を５０ｍｌのアセトンに溶解したところ、見出されたように、溶解速度が速くなった。
【0091】
この混合物を固体として用いることが可能であるかどうかを調べるために、材料をドッグボーン成形型に直接添加し、数分間ごとに混合した。この方法は、高温のオーブン中での材料の混合が難しく、それによって不均質な試験片となることから、都合良くなかった。
【0092】
結論として、ＰＬＡ／ＰＨＡ混合物を、過剰のアセトンに溶解するべきであり（ＰＬＡ／ＰＨＡ混合物１ｇに対してアセトン２５ｍｌの割合）、得られた混合物を、均質となるまで撹拌し、５５℃に加熱するべきである。
【0093】
例６．「ペーパー」の調製
アセトン中でＰＬＡ／ＰＨＡ溶液を調製した後に、溶媒を除去することができた。この溶液をドッグボーン成形型に入れると、アセトンの蒸発速度は非常に遅かった。したがって、アセトンの蒸発は、混合物をドッグボーン成形型に入れる前に行うべきである。アセトン中のＰＬＡ／ＰＨＡ溶液をトレイに移し、蒸発させるためにドラフトに入れた。アセトンが蒸発すると、ＰＬＡ及びＰＨＡを含む均質な「ペーパー」（フィルム）が得られた。
アセトン中でＰＬＡ／ＰＨＡ溶液を調製した後に、溶媒を除去することができた。この溶液をドッグボーン成形型に入れると、アセトンの蒸発速度は非常に遅かった。したがって、アセトンの蒸発は、混合物をドッグボーン成形型に入れる前に行うべきである。アセトン中のＰＬＡ／ＰＨＡ溶液をトレイに移し、蒸発させるためにドラフトに入れた。アセトンが蒸発すると、ＰＬＡ及びＰＨＡを含む均質な「ペーパー」（フィルム）が得られた。
【0094】
【表3】
【0095】
続いて、ＰＬＡ／ＰＨＡとケラチンとのブレンドを調製した。これらのブレンドでは、これまでの実験と同様に、７０％のＰＬＡ及び３０％のＰＨＡの比を維持し、様々なブレンド間の唯一の違いは、それらのケラチン含有量であった（表３）。
【0096】
例７．引張試験片の作製
ドッグボーン成形型Ｖタイプの試験片
試験片作製用の第１の成形型は、プラスチックの引張試験に関するＡＳＴＭ Ｄ６３８規格に従って作製した。選択したサイズは、出発材料の量を節約して最小のサンプルを作製することができるように、最も小さいサイズのタイプＶであった。
ドッグボーン成形型Ｖタイプの試験片
試験片作製用の第１の成形型は、プラスチックの引張試験に関するＡＳＴＭ Ｄ６３８規格に従って作製した。選択したサイズは、出発材料の量を節約して最小のサンプルを作製することができるように、最も小さいサイズのタイプＶであった。
【0097】
成形型は長方形であり、ＡＳＴＭに記載されているように、ドッグボーンの形状の同一のソケット部を４つ有していた（図４）。この成形型の作製には、ＡｌＳｌ３０４ステンレス鋼を選択した。このステンレス鋼は、高い耐食性を有し、その機械的特性のために広く用いられている。
【0098】
タイプＶの試験片を作製するために、まず、２グラムのＰＬＡ／ＰＨＡの「ペーパー」細片（はさみで切ったもの）を成形型に加えることができ、成形型を２２０℃に加熱したオーブンに入れた。細片の第１の部分が溶融したところで、さらに「ペーパー」細片を成形型に加えて、成形型の全容量を満たした。
【0099】
例８．ドッグボーン試験片タイプＩＶのための用いた成形型の再設計
作製したドッグボーン試験片の引張試験を、２ｋＮの荷重容量を用いた万能機械試験機で行った。また、ＡＳＴＭ Ｄ６３８のタイプＩＶに従う、これまでの試験片の２倍のサイズの新しい試験片も作製することにした（図５）。新しく設計した成形型では、すべての材料を１度に加えることができ、及び成形型内の材料を押圧することができる上部分を有するため、より均一な試験片を作製することができた。これらの試験片には、４グラム
の材料が必要であった。７０％のＰＬＡと３０％のＰＨＡとを含むブレンドを用いたが、ケラチンの含有量を表４に指定するように変化させた。
作製したドッグボーン試験片の引張試験を、２ｋＮの荷重容量を用いた万能機械試験機で行った。また、ＡＳＴＭ Ｄ６３８のタイプＩＶに従う、これまでの試験片の２倍のサイズの新しい試験片も作製することにした（図５）。新しく設計した成形型では、すべての材料を１度に加えることができ、及び成形型内の材料を押圧することができる上部分を有するため、より均一な試験片を作製することができた。これらの試験片には、４グラム
の材料が必要であった。７０％のＰＬＡと３０％のＰＨＡとを含むブレンドを用いたが、ケラチンの含有量を表４に指定するように変化させた。
【0100】
【表4】
【0101】
アセトン中の７０％ＰＬＡと３０％ＰＨＡとの溶液にケラチンを加える前に、ケラチンを微粉末に粉砕した。得られたＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチン混合物を、均質化のために１５分間撹拌し、続いて蒸発及び「ペーパー」形成のためにトレイに移した。形成されたＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチンの「ペーパー」を粉砕機で細断して微粉末とし、その粉末をタイプＩＶの成形型に添加した。粉末を入れた成形型を、オーブン中１７５℃で６０分間加熱し、その後２時間にわたって冷却して室温とした。
【0102】
続いて、得られたＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチンのタイプＩＶ試験片を成形型から取り出し、引張試験の前に、より良好な画像処理のために５０％の白色塗料と５０%の黒色塗料と
を用いてスプレー塗装を行った。
を用いてスプレー塗装を行った。
【0103】
例９．粉末の特性評価
熱分析
純材料及び各種ブレンドの溶融温度、並びにＰＨＡ及びＰＬＡ／ＰＨＡブレンドの分解温度及び質量変化に対するケラチン導入の影響を特定するために、様々な配合物のＤＳＣ及びＴＧＡ試験を行った（表５及び図６）。
熱分析
純材料及び各種ブレンドの溶融温度、並びにＰＨＡ及びＰＬＡ／ＰＨＡブレンドの分解温度及び質量変化に対するケラチン導入の影響を特定するために、様々な配合物のＤＳＣ及びＴＧＡ試験を行った（表５及び図６）。
【0104】
【表5】
【0105】
ＰＬＡの溶融温度が最も低く、次いでＰＨＡ及びケラチンの順である。分解温度が最も高いのはＰＬＡである。試験片の作製に選択した温度は、ＰＨＡの溶融温度よりも低くＰＬＡの溶融温度より高い１７５℃であったが、これは、これらの材料の分解を避けるためであった。本発明者らの試験片では、比較的低い温度でより長い時間加熱して、ＰＬＡを溶融させる方が好ましかった。実験の最初に、ＰＬＡを含まないブレンドを調製する可能性について調べた。したがって、ＤＳＣ及びＴＧＡ試験を、ＰＨＡ／ケラチンブレンドに対して行った。試験した試料には、純ＰＨＡ、１０重量％のケラチン、及び２５、５０、
７５、９０、１００重量％（純ケラチン）と増加する含有量のケラチンを含めた（表６及び図７）。
７５、９０、１００重量％（純ケラチン）と増加する含有量のケラチンを含めた（表６及び図７）。
【0106】
ブレンド中のケラチンの重量分率が増加するに従って、分解温度が上昇し、及び重量損失が減少した（図８）。見出されたように、ブレンドは、ＰＨＡとケラチンとだけに基づくものにすることはできなかった。発見されたように、ＰＬＡとＰＨＡとのブレンドは、７０：３０の比率とするべきであり、ケラチンの導入は、１０～５０重量％とするべきである（表７及び図９）。
【0107】
【表6】
【0108】
【表7】
【0109】
ケラチンの重量分率が増加すると、ＰＨＡの分解温度は著しく上昇したが、ＰＬＡの分解温度は大きく変化しなかった。加えて、ケラチンの重量分率を増加させると、重量損失の割合が減少した（図１０）。
【0110】
ケラチンを添加すると、分解温度が著しく上昇し、重量損失が減少したが、これは、ケラチンの添加が、ブレンドの熱安定性を向上させることを示している。
【0111】
ＰＬＡ単独では、１段階のプロセスで分解し、最大分解ピークは３６５℃であった。ＰＬＡにＰＨＡ及びケラチンを添加すると、２段階の分解挙動が観察された。第１のピーク（約２８０℃）は、ＰＨＡの熱分解によるものであり、一方第２のピーク（約３２０℃）は、ＰＬＡの熱分解によるものであった。さらに、ＰＬＡにＰＨＡを添加すると、ＰＬＡのみ（３６５℃）と比較して、主要分解ピークが低下した（３４４℃）。ブレンドにケラ
チンを添加すると、第１の分解ピークの温度が上昇した。これは、ケラチンが系の熱安定性を変化させることを証明している。
チンを添加すると、第１の分解ピークの温度が上昇した。これは、ケラチンが系の熱安定性を変化させることを証明している。
【0112】
ケラチンを２０重量％及び３０重量％添加しても、ＰＬＡ／ＰＨＡの熱安定性に大きな変化が得られなかったことには留意されたい。ＰＬＡの分解温度は、いずれの場合も３２３℃であり、ＰＨＡの分解温度は、２８３℃（ケラチン２０重量％）及び２８２℃（ケラチン３０重量％）であった。これらの結果に基づき、試験のために選択したブレンドは、３０重量％のケラチンを含むブレンドとした。
【0113】
ＦＴＩＲ
ＦＴＩＲを用いて試験した粉末は、ＰＬＡ、ＰＨＡ、及びケラチンの純粉末、さらにはＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）、及びＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）７０重量％とケラチン３０重量％、の２種類のブレンド粉末であった。
ＦＴＩＲを用いて試験した粉末は、ＰＬＡ、ＰＨＡ、及びケラチンの純粉末、さらにはＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）、及びＰＬＡ／ＰＨＡ（７０：３０）７０重量％とケラチン３０重量％、の２種類のブレンド粉末であった。
【0114】
ＦＴＩＲスペクトルは、ＰＬＡの典型的な吸収バンド、並びにＰＨＡ及びケラチンに特異的な複数の吸収バンドを示した。ＰＬＡは主として非晶質であるのに対し、ＰＨＡは結晶性がより高い。ポリマーの初期結晶化度の違いは、（Ｃ＝Ｏ）のバンド幅及び透過率の違いを引き起こす。（Ｃ＝Ｏ）のＦＴＩＲバンド特性は、ＰＬＡとＰＨＡとの間で大きく異なっていた。ＦＴＩＲスペクトルは、１７５０ｃｍ－１に強いピークを示したが、これは、ＰＬＡの非晶質カルボニル伸縮振動によるものである。このピークは、すべてのＰＬＡ／ＰＨＡブレンドで一定に維持されている。加えて、ＰＨＡブレンドのスペクトルにおいて、１７２０ｃｍ－１にシャープなピークが観察された。このピークは、結晶性カルボニル基の伸縮振動によるものである。ＰＬＡ／ＰＨＡブレンドのＦＴＩＲスペクトルは、ＰＬＡ及びＰＨＡの存在に起因する２つの主要なカルボニル伸縮バンドを示した。これら２つのバンドの強度比が組成比によって変化したことには注目すべきである。ケラチン含有ブレンドのＦＴＩＲスペクトルでは、主要なカルボニルピークに変化は見られなかった。ＦＴＩＲスペクトルを分析すると、他の官能基のピークがさらに見られる。すべてのスペクトルにおいて、２９３３～２９９６ｃｍ－１の範囲に（Ｃ－Ｈ）の低いピークが見られた。加えて、ＰＬＡ及びＰＨＡでは、１３７９ｃｍ－１にメチル基のピークが観察された。ケラチンのペプチド結合に由来するアミドＩ、ＩＩ、及びＩＩＩの振動が、それぞれ１６３３、１５３８、及び１２３３ｃｍ－１にピークをもたらした。これらのピークは、抽出されたケラチンが羽毛と同様のβシート二次構造を有することを示している。３２７２ｃｍ－１のピークは、ペプチド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）のＮ－Ｈ伸縮振動によるものである。
【0115】
例１０．試験片の特性評価
機械的特性試験－引張試験
引張試験から特定することができる機械的特性は、弾性率、応力、降伏ひずみ、及び破断ひずみである。各試験片組成物の分析は、少なくとも２回繰り返して行った。実験の過程で試験片のひずみを測定するために、試験片のゲージ長セグメントを、黒及び白のスプレー塗料で５０：５０の割合で塗装した。これは、ピクセル画像処理の精度を向上させるために行った。
機械的特性試験－引張試験
引張試験から特定することができる機械的特性は、弾性率、応力、降伏ひずみ、及び破断ひずみである。各試験片組成物の分析は、少なくとも２回繰り返して行った。実験の過程で試験片のひずみを測定するために、試験片のゲージ長セグメントを、黒及び白のスプレー塗料で５０：５０の割合で塗装した。これは、ピクセル画像処理の精度を向上させるために行った。
【0116】
実験中の試験片を撮影した。その後、画像処理を行って、試験片のひずみを計算した。
【0117】
【表8】
【0118】
ＰＬＡ：００３－１及び００３－２の２つの試験片を試験した。図１１に示すように、どちらも同様の結果を示した。
【0119】
ＰＬＡ／ＰＨＡ：１０２－１と１０２－２の２つの試験片を試験した。ポアソン比を除いて、どちらも同様の結果を示した。加えて、どちらの試験片も、塑性領域に達する前に破断した。これらの試験片は、塑性変形を伴わない弾性変形を呈するモノと思われる。これらの結果を図１２に示す。
【0120】
【表9】
【0121】
ＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチン：まず、４０２－１及び４０２－２の２つの試験片のみを試験した。結果が非常に異なっていたことから、追加の試験片４０３－１も試験した。各試験片は、異なる挙動を示した。例えば、塑性領域への進入を示す曲線がグラフ中に示される４０２－２及び４０３－１の試験片とは異なり、試験片４０２－１は、それが弾性領域のままであることを示すかなり直線的なグラフを示している。これは図１３に見ることができる。
【0122】
ＰＬＡ、ＰＬＡ／ＰＨＡ、及びＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチンの試験片に対する機械分析の
結果を、表９及び図１４にまとめて示す。
結果を、表９及び図１４にまとめて示す。
【0123】
各種ブレンド（ＰＬＡ、ＰＬＡ／ＰＨＡ、ＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチン）について、異なる試験片の結果を平均した。３つの試験片が非常にばらつきのある結果を呈したことから、平均の結果は算出しなかった。試験片４０２－２の結果が最良の結果を示したことから、これをＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチンブレンドを代表する結果として選択した（表１０）。
【0124】
【表10】
【0125】
まとめると、ＰＨＡの添加は、破断応力の低下から明らかなように、ＰＬＡの強度を大幅に低下させた。最大の弾性率は、ＰＬＡ／ＰＨＡブレンドで得られた。ケラチンを添加すると、弾性率の低下が観察され、ケラチンの添加が弾性変形に対する抵抗力の低下を引き起こすことが確認された。ＰＨＡ及びケラチンをＰＬＡに添加すると、試験片の破断時伸びが大きく低下し、ブレンドの延性の低下を呈した。ＰＬＡにＰＨＡを添加すると試験片がより延性になるという予想とは対照的に、試験片はより剛性となった。試験片は、全く変形することなく弾性領域で破断した。これは、用いたＰＨＡの種類、ＰＨＢ ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、に起因して発生した可能性が考えられる。純ＰＨＢは、そのかなり結晶性の構造に起因して剛性であるが、Ｐ３ＨＢ－ｃｏ－Ｐ４ＨＢなどの他のＰＨＡ組成物は、よりゴム状で可撓性である。ＰＨＡにＰ４ＨＢ（ポリ（４－ヒドロキシブチレート））を添加すると、結晶化度の割合が減少し、一方伸び及び破断のパーセントが増加する。本発明者らの実験に用いたＰＨＡの溶融温度（ＤＳＣ）は１７６℃であり、このことは、それが典型的な溶融温度１７８℃を有するＰＨＢであったことを示している（表１１）。
【0126】
機械的特性が低下するもうひとつの理由は、製造プロセスの過程で試験片に生じる細孔であり得る。そのような空隙は、材料間の接着力低下を引き起こし得る。
【0127】
ポアソン比の結果については、各種ブレンド間で大きな差はない。ＰＬＡが最も高いポアソン比を有し、続いてそれぞれＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチン、及びＰＬＡ／ＰＨＡであると思われる。高いポアソン比は、変形に対する強い抵抗性を示す。
【0128】
【表11】
【0129】
例１１．破断面の形態、微細構造、及び透明性
引張試験の実験後、各種ブレンド（ＰＬＡ、ＰＬＡ／ＰＨＡ、ＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチン）から１つずつの３つの試験片を、ＳＥＭ及びデジタル顕微鏡を用いて、破断面の形態、微細構造、及び透明性について試験した（データは示さず）。これらの試験から得られた画像は、ブレンドの機械的特性の変化の原因を示す証拠を提供する。これらの画像に見出されるように、すべての試験片において可塑性の証拠はなかった。これは純ＰＬＡでは非常に典型的であるが、ＰＬＡ／ＰＨＡではそうではなく、その場合、試験片は、破断する前に、実質的な延性的塑性変形及び伸びを起こすと予想された。異なるブレンドの試験片の２００ミクロン解像度のＳＥＭ画像を見ると、多くの細孔に容易に気づくことができるが、これらは、用いたＰＬＡ、ＰＨＡ、及びケラチンの原料粉末中の水分に由来する試験片内に閉じ込められた空気によって、製造プロセス中に形成された可能性が最も高い。ＰＬＡの試験片は半透明であったが、ＰＨＡ及びケラチンを含む試験片は非常により不透明であった。この不透明性は、半結晶性ポリマーに特徴的である。半透明のＰＬＡは、結晶性のＰＨＡがそのマトリックスに挿入されると、不透明になる。組み合わされたＰＬＡ／ＰＨＡのブレンドが不透明である理由は、ポリマーの境界での光の散乱である。ＰＬＡなどの非晶質材料は境界をほとんど含まないが、結晶性材料ではこのような境界の密度が高くなり、透明性の低下を引き起こす。したがって、試験片の透明性、又は透明性の欠如は、ポリマーの結晶化を示し得る。ＰＬＡ試験片の破断面のＳＥＭ画像は、非晶質ポリマーに典型的である滑らかで均一な面を示した。ＰＬＡ／ＰＨＡ試験片のＳＥＭ像は、ＰＬＡポリマーマトリックス中に直径が比較的小さく、典型的な海島状の形態を有するＰＨＡ粒子を示した。ケラチンの添加によって、ブレンドは細孔の量の減少を呈した。すべてのＳＥＭ画像は、ＰＬＡマトリックス中にＰＨＡ及びケラチンが均質に分布していることを示している。
引張試験の実験後、各種ブレンド（ＰＬＡ、ＰＬＡ／ＰＨＡ、ＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチン）から１つずつの３つの試験片を、ＳＥＭ及びデジタル顕微鏡を用いて、破断面の形態、微細構造、及び透明性について試験した（データは示さず）。これらの試験から得られた画像は、ブレンドの機械的特性の変化の原因を示す証拠を提供する。これらの画像に見出されるように、すべての試験片において可塑性の証拠はなかった。これは純ＰＬＡでは非常に典型的であるが、ＰＬＡ／ＰＨＡではそうではなく、その場合、試験片は、破断する前に、実質的な延性的塑性変形及び伸びを起こすと予想された。異なるブレンドの試験片の２００ミクロン解像度のＳＥＭ画像を見ると、多くの細孔に容易に気づくことができるが、これらは、用いたＰＬＡ、ＰＨＡ、及びケラチンの原料粉末中の水分に由来する試験片内に閉じ込められた空気によって、製造プロセス中に形成された可能性が最も高い。ＰＬＡの試験片は半透明であったが、ＰＨＡ及びケラチンを含む試験片は非常により不透明であった。この不透明性は、半結晶性ポリマーに特徴的である。半透明のＰＬＡは、結晶性のＰＨＡがそのマトリックスに挿入されると、不透明になる。組み合わされたＰＬＡ／ＰＨＡのブレンドが不透明である理由は、ポリマーの境界での光の散乱である。ＰＬＡなどの非晶質材料は境界をほとんど含まないが、結晶性材料ではこのような境界の密度が高くなり、透明性の低下を引き起こす。したがって、試験片の透明性、又は透明性の欠如は、ポリマーの結晶化を示し得る。ＰＬＡ試験片の破断面のＳＥＭ画像は、非晶質ポリマーに典型的である滑らかで均一な面を示した。ＰＬＡ／ＰＨＡ試験片のＳＥＭ像は、ＰＬＡポリマーマトリックス中に直径が比較的小さく、典型的な海島状の形態を有するＰＨＡ粒子を示した。ケラチンの添加によって、ブレンドは細孔の量の減少を呈した。すべてのＳＥＭ画像は、ＰＬＡマトリックス中にＰＨＡ及びケラチンが均質に分布していることを示している。
【0130】
例１２．生分解試験
図１５は、異なるサンプリング間隔で回収したドッグボーンの目視外観を示す。図から、ＰＬＡの分解が、ＰＨＡ／ケラチンとだけでなく、ＰＨＡとブレンドした場合にも促進されることが示される。最も早く分解したのはＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチン複合材で、４２日で崩壊した。次いでＰＬＡ／ＰＨＡ複合体（４９日）、最後がＰＬＡ（５６日）であった。
図１５は、異なるサンプリング間隔で回収したドッグボーンの目視外観を示す。図から、ＰＬＡの分解が、ＰＨＡ／ケラチンとだけでなく、ＰＨＡとブレンドした場合にも促進されることが示される。最も早く分解したのはＰＬＡ／ＰＨＡ／ケラチン複合材で、４２日で崩壊した。次いでＰＬＡ／ＰＨＡ複合体（４９日）、最後がＰＬＡ（５６日）であった。
【0131】
目視上の崩壊は、図１６に示すように、コンポスト化条件下での重量損失を計算することでも裏付けられた。試料崩壊性の目標は、生分解性材料に対する現行の法令に示される通り（Iso, 2015）、９０％と見なした（Arrieta et al., 2014）。ＰＬＡ複合材の分解
は、コンポスト化実験の第１４日に開始したが、ＰＬＡの目立った崩壊は、第２１日まで見られなかった。ＰＬＡ／ＰＨＢブレンドに関するこれまでの研究も、同様の分解傾向を示した。Arrieta, Lopez, Rayon and Jimenez (2014) は、可塑剤あり及びなしでのＰＬ
Ａ／ＰＨＢブレンドの分解について研究した。そこでは、ＰＬＡと可塑剤とのブレンドと共に、ＰＬＡの同様の分解プロファイルが示された（Arrieta et al., 2014）。ＰＨＢの分解、さらにはＰＬＡ／ケラチンの分解に関する研究においても、同様の観察結果が得られた（Poorna et al., 2019；Ahn et al., 2011）。
は、コンポスト化実験の第１４日に開始したが、ＰＬＡの目立った崩壊は、第２１日まで見られなかった。ＰＬＡ／ＰＨＢブレンドに関するこれまでの研究も、同様の分解傾向を示した。Arrieta, Lopez, Rayon and Jimenez (2014) は、可塑剤あり及びなしでのＰＬ
Ａ／ＰＨＢブレンドの分解について研究した。そこでは、ＰＬＡと可塑剤とのブレンドと共に、ＰＬＡの同様の分解プロファイルが示された（Arrieta et al., 2014）。ＰＨＢの分解、さらにはＰＬＡ／ケラチンの分解に関する研究においても、同様の観察結果が得られた（Poorna et al., 2019；Ahn et al., 2011）。
【0132】
例１３．生分解試験
生分解試験を、好熱菌の媒介によるコンポスト化環境中の好気性条件下で実施した（Iso, 2015）。異なる複合材のドッグボーンを用い、それらを、コンポスト化試験後に容易
に取り出すことができように、しかし水分及び微生物のアクセスも可能となるように、テキスタイルメッシュ中に入れた。これらを、コンポスト１０％、生野菜３０％、デンプン１０％、砂糖５％、トウモロコシ油４％、尿素１％、おがくず４０％、及び水含有量約５０％（重量／重量）の固形合成湿潤廃棄物を入れた５００ｍＬの密閉ガラスビーカー中、４～６ｃｍの深さに埋め、分解のために５８℃の好気性条件でインキュベートした。好気性条件は、固形合成湿潤廃棄物を定期的に混合することで確保した。完全な分解に到達するまで、７日間の間隔で複合材の試料を採取した。各サンプリング時点で、ドッグボーンを蒸留水で洗浄し、オーブンで２４時間乾燥させた後、再度秤量した。すべての試料について、コンポスト化培地から取り出すごとに、写真を撮影した。
生分解試験を、好熱菌の媒介によるコンポスト化環境中の好気性条件下で実施した（Iso, 2015）。異なる複合材のドッグボーンを用い、それらを、コンポスト化試験後に容易
に取り出すことができように、しかし水分及び微生物のアクセスも可能となるように、テキスタイルメッシュ中に入れた。これらを、コンポスト１０％、生野菜３０％、デンプン１０％、砂糖５％、トウモロコシ油４％、尿素１％、おがくず４０％、及び水含有量約５０％（重量／重量）の固形合成湿潤廃棄物を入れた５００ｍＬの密閉ガラスビーカー中、４～６ｃｍの深さに埋め、分解のために５８℃の好気性条件でインキュベートした。好気性条件は、固形合成湿潤廃棄物を定期的に混合することで確保した。完全な分解に到達するまで、７日間の間隔で複合材の試料を採取した。各サンプリング時点で、ドッグボーンを蒸留水で洗浄し、オーブンで２４時間乾燥させた後、再度秤量した。すべての試料について、コンポスト化培地から取り出すごとに、写真を撮影した。
【0133】
参考文献
Ahn, H.K.; Huda, M.S.; Smith, M.C.; Mulbry, W.; Schmidt, W.F.; Reeves III, J.B., Biodegradability of injection molded bioplastic pots containing polylactic acid and poultry feather fiber. Bioresource Technology, 2011, 102(7), 4930-4933
Alsafadi, D.; Al-Mashaqbeh, O., A one-stage cultivation process for the production of poly-3-(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) from olive mill wastewater by Haloferax mediterranei. N. Biotechnol., 2017, 34, 47-53
Arrieta M.P.; Lopez, j.; Rayon, e.; Jimenez, A., Disintegrability under composting conditions of plasticized PLA-PHB blends, Polymer Degradation and Stability, 2014, 108, 307
Charon, G.; Peixinho, J.; Michely, L.; Guinault, A.; Langlois, V., Rosin natural terpenes as processing aid for polyhydroxyalkanoate: Thermal, mechanical, and
viscoelastic properties. J Appl Polym Sci., 2022, e53052
Cui, Y.-W.; Zhang, H.-Y.; Lu, P.-F.; Peng, Y.-Z., Effects of carbon sources on
the enrichment of halophilic polyhydroxyalkanoate-storing mixed microbial culture in an aerobic dynamic feeding process. Sci. Rep., 2016, 6(1), 30766
de Almeida, A.; Giordano, A.M.; Nikel, P.I.; Pettinari, M.J., Effects of aeration on the synthesis of poly(3-hydroxybutyrate) from glycerol and glucose in recombinant Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 2010, 76(6), 2036-2040
Gahlawat, G.; Sengupta, B.; Srivastava, A.K., Enhanced production of poly(3- hydroxybutyrate) in a novel airlift reactor with in situ cell retention using Azohydromonas australica. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2012, 39(9), 1377-1384
Garcia-Garcia, D.; Quiles-Carillo, L.; Balart, R.; Torres-Giner, S.; Arrieta, M.P., Innovative solutions and challenges to increase the use of poly(3-hydroxybutyrate) in food packaging and disposables. European Polymer Journal, 2022, 178,
111505
Ghosh, S.; Greiserman, S.; Chemodanov, A.; Slegers, P.M.; Belgorodsky, B.; Epstein, M.; Kribus, A.; Gozin, M.; Chen, G.-Q.; Golberg, A., Polyhydroxyalkanoates
and biochar from green macroalgal Ulva sp. biomass subcritical hydrolysates: Process optimization and a priori economic and greenhouse emissions break-even analysis. Sci. Total Environ., 2021, 770, 145281
Hezayen, F.F.; Rehm, B.H.; Eberhardt, R.; Steinbuchel, A., Polymer production by two newly isolated extremely halophilic archaea: Application of a novel corrosion-resistant bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 54(3), 319-325
Iso, U., Determination of the degree of disintegration of plastic materials under simulated composting conditions in a laboratory-scale test. UNE-EN ISO-20200
2015
Koller, M., Hesse, P., Bona, R., Kutschera, C., Atlic, A., Braunegg, G., Biosynthesis of high quality polyhydroxyalkanoate Co- and terpolyesters for potential
medical application by the archaeon Haloferax mediterranei. Macromol. Symp., 2007, 253(1), 33-39
Kshirsagar, P., Suttar, R., Nilegaonkar, S., Kulkarni, S., Scale up production
of polyhydroxyalkanoate (PHA) at different aeration, agitation and controlled dissolved oxygen levels in fermenter using Halomonas campisalis MCM B-1027. J. Biochem. Technol., 2013, 4, 512-517
Lillo, J.G., Rodriguez-Valera, F., 1990. Effects of culture conditions on poly(beta- hydroxybutyric acid) production by Haloferax mediterranei. Appl. Environ.
Microbiol., 1990, 56(8), 2517-2521
Longe, L.F.; Michely, L.; Gallos. A.; De Anda, A.R.; Vahabi, H.; Renard, E.; Latroche, M.; Allais, F.; Langlois, V., Improved processability and antioxidant behavior of poly(3-hydroxybutyrate) in presence of ferulic acid-based additives. Bioengineering, 2022, 9(3), 100
Maheshwari, N., Kumar, M., Thakur, I.S., Srivastava, S., Production, process optimization and molecular characterization of polyhydroxyalkanoate (PHA) by CO2 sequestering B. cereus SS105. Bioresour. Technol., 2018, 254, 75-82
Mahler, N., Tschirren, S., Pflugl, S., Herwig, C., Optimized bioreactor setup for scale-up studies of extreme halophilic cultures. Biochem. Eng. J., 2018, 130, 39-46
Ortiz-Veizan, N., Daga-Quisbert, J., Perez-Zabaleta, M., Guevara-Martinez, M.,
Larsson, G., Quillaguaman, J., Improvements of poly(3-hydroxybutyrate) production in an air-lift reactor using simple production media. Bioresour. Bioprocess.,
2020, 7 (22)
Quagliano, J.C., Amarilla, F., Fernandes, E.G., Mata, D., Miyazaki, S.S., Effect of simple and complex carbon sources, low temperature culture and complex carbon feeding policies on poly-3-hydroxybutyric acid (PHB) content and molecular weight (Mw) from Azotobacter chroococcum 6B. World J. Microbiol. Biotechnol., 2001, 17, 9-14
Ruzgar, D.G.; Kurtoglu, S.A.; Bhullar, S.K., A Study on extraction and characterization of keratin films and nanofibers from waste wool fiber. Journal of Natural Fibers, 2020, 17(3)
Sabapathya, P.C., Devaraja, S., Parthipanb, A., Kathirvela, P., Polyhydroxyalkanoate production from statistically optimized media using rice mill effluent as
sustainable substrate with an analysis on the biopolymer’s degradation potential. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 126, 977-986
Ahn, H.K.; Huda, M.S.; Smith, M.C.; Mulbry, W.; Schmidt, W.F.; Reeves III, J.B., Biodegradability of injection molded bioplastic pots containing polylactic acid and poultry feather fiber. Bioresource Technology, 2011, 102(7), 4930-4933
Alsafadi, D.; Al-Mashaqbeh, O., A one-stage cultivation process for the production of poly-3-(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) from olive mill wastewater by Haloferax mediterranei. N. Biotechnol., 2017, 34, 47-53
Arrieta M.P.; Lopez, j.; Rayon, e.; Jimenez, A., Disintegrability under composting conditions of plasticized PLA-PHB blends, Polymer Degradation and Stability, 2014, 108, 307
Charon, G.; Peixinho, J.; Michely, L.; Guinault, A.; Langlois, V., Rosin natural terpenes as processing aid for polyhydroxyalkanoate: Thermal, mechanical, and
viscoelastic properties. J Appl Polym Sci., 2022, e53052
Cui, Y.-W.; Zhang, H.-Y.; Lu, P.-F.; Peng, Y.-Z., Effects of carbon sources on
the enrichment of halophilic polyhydroxyalkanoate-storing mixed microbial culture in an aerobic dynamic feeding process. Sci. Rep., 2016, 6(1), 30766
de Almeida, A.; Giordano, A.M.; Nikel, P.I.; Pettinari, M.J., Effects of aeration on the synthesis of poly(3-hydroxybutyrate) from glycerol and glucose in recombinant Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 2010, 76(6), 2036-2040
Gahlawat, G.; Sengupta, B.; Srivastava, A.K., Enhanced production of poly(3- hydroxybutyrate) in a novel airlift reactor with in situ cell retention using Azohydromonas australica. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2012, 39(9), 1377-1384
Garcia-Garcia, D.; Quiles-Carillo, L.; Balart, R.; Torres-Giner, S.; Arrieta, M.P., Innovative solutions and challenges to increase the use of poly(3-hydroxybutyrate) in food packaging and disposables. European Polymer Journal, 2022, 178,
111505
Ghosh, S.; Greiserman, S.; Chemodanov, A.; Slegers, P.M.; Belgorodsky, B.; Epstein, M.; Kribus, A.; Gozin, M.; Chen, G.-Q.; Golberg, A., Polyhydroxyalkanoates
and biochar from green macroalgal Ulva sp. biomass subcritical hydrolysates: Process optimization and a priori economic and greenhouse emissions break-even analysis. Sci. Total Environ., 2021, 770, 145281
Hezayen, F.F.; Rehm, B.H.; Eberhardt, R.; Steinbuchel, A., Polymer production by two newly isolated extremely halophilic archaea: Application of a novel corrosion-resistant bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 54(3), 319-325
Iso, U., Determination of the degree of disintegration of plastic materials under simulated composting conditions in a laboratory-scale test. UNE-EN ISO-20200
2015
Koller, M., Hesse, P., Bona, R., Kutschera, C., Atlic, A., Braunegg, G., Biosynthesis of high quality polyhydroxyalkanoate Co- and terpolyesters for potential
medical application by the archaeon Haloferax mediterranei. Macromol. Symp., 2007, 253(1), 33-39
Kshirsagar, P., Suttar, R., Nilegaonkar, S., Kulkarni, S., Scale up production
of polyhydroxyalkanoate (PHA) at different aeration, agitation and controlled dissolved oxygen levels in fermenter using Halomonas campisalis MCM B-1027. J. Biochem. Technol., 2013, 4, 512-517
Lillo, J.G., Rodriguez-Valera, F., 1990. Effects of culture conditions on poly(beta- hydroxybutyric acid) production by Haloferax mediterranei. Appl. Environ.
Microbiol., 1990, 56(8), 2517-2521
Longe, L.F.; Michely, L.; Gallos. A.; De Anda, A.R.; Vahabi, H.; Renard, E.; Latroche, M.; Allais, F.; Langlois, V., Improved processability and antioxidant behavior of poly(3-hydroxybutyrate) in presence of ferulic acid-based additives. Bioengineering, 2022, 9(3), 100
Maheshwari, N., Kumar, M., Thakur, I.S., Srivastava, S., Production, process optimization and molecular characterization of polyhydroxyalkanoate (PHA) by CO2 sequestering B. cereus SS105. Bioresour. Technol., 2018, 254, 75-82
Mahler, N., Tschirren, S., Pflugl, S., Herwig, C., Optimized bioreactor setup for scale-up studies of extreme halophilic cultures. Biochem. Eng. J., 2018, 130, 39-46
Ortiz-Veizan, N., Daga-Quisbert, J., Perez-Zabaleta, M., Guevara-Martinez, M.,
Larsson, G., Quillaguaman, J., Improvements of poly(3-hydroxybutyrate) production in an air-lift reactor using simple production media. Bioresour. Bioprocess.,
2020, 7 (22)
Quagliano, J.C., Amarilla, F., Fernandes, E.G., Mata, D., Miyazaki, S.S., Effect of simple and complex carbon sources, low temperature culture and complex carbon feeding policies on poly-3-hydroxybutyric acid (PHB) content and molecular weight (Mw) from Azotobacter chroococcum 6B. World J. Microbiol. Biotechnol., 2001, 17, 9-14
Ruzgar, D.G.; Kurtoglu, S.A.; Bhullar, S.K., A Study on extraction and characterization of keratin films and nanofibers from waste wool fiber. Journal of Natural Fibers, 2020, 17(3)
Sabapathya, P.C., Devaraja, S., Parthipanb, A., Kathirvela, P., Polyhydroxyalkanoate production from statistically optimized media using rice mill effluent as
sustainable substrate with an analysis on the biopolymer’s degradation potential. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 126, 977-986
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図11G】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図12F】
【図12G】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【図13G】
【図13H】
【図13I】
【図13J】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】