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特表2024-539393基質に結合可能なタンパク質配列の、フィブリンの集合を阻害する製品の製造における応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-28
(54)【発明の名称】基質に結合可能なタンパク質配列の、フィブリンの集合を阻害する製品の製造における応用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/75 20060101AFI20241018BHJP
A61K 38/36 20060101ALI20241018BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20241018BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241018BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241018BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241018BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241018BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241018BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241018BHJP
【ＦＩ】
C07K14/75 ZNA
A61K38/36
A61P7/02
C12N15/12
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526724
(86)(22)【出願日】2021-11-05
(85)【翻訳文提出日】2024-05-01
(86)【国際出願番号】 CN2021128944
(87)【国際公開番号】W WO2023077413
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】202111290823.9
(32)【優先日】2021-11-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515190906
【氏名又は名称】南京大学
(71)【出願人】
【識別番号】520304664
【氏名又は名称】中国科学院分子細胞科学卓越創新中心
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＥＲ ＦＯＲ ＥＸＣＥＬＬＥＮＣＥ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＥＬＬ ＳＣＩＥＮＣＥ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３５， ３２０ Ｙｕｅ Ｙａｎｇ Ｒｏａｄ， Ｘｕｈｕｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３１ Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】516071929
【氏名又は名称】華中農業大学
(74)【代理人】
【識別番号】110003823
【氏名又は名称】弁理士法人柳野国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】董咸池
(72)【発明者】
【氏名】劉▲ぶん▼
(72)【発明者】
【氏名】丁建平
(72)【発明者】
【氏名】石雨
(72)【発明者】
【氏名】徐曙▲とう▼
(72)【発明者】
【氏名】徐建波
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE07
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA53
4C084NA14
4C084ZA541
4C084ZA542
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA65
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、基質ＧＰＲＰペプチドに結合可能なアミノ酸配列を含むタンパク質、このアミノ酸配列を含むフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）及びそのフィブリノーゲンタンパク質ドメイン（ＦＤ）を提供し、且つ単独のＦＤドメインタンパク質も、ＦＧＬ１と同じまたは類似の機能を有する。ＦＧＬ１とＦＤは、従来の薬物とは異なる作用機序を有し、フィブリン基質結合ポケットを競合することにより、血栓形成中のフィブリンの集合を阻害することができ、突然変異により基質親和性を強くすることができ、血栓治療用薬物の使用効果を効果的に高めることができる。
【選択図】図１1
【選択図】図１1
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質であって、基質ＧＰＲＰペプチドに結合可能なアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列の構造は、トリプトファン－ＡＡｎ１－チロシン－ＡＡｎ２－システイン－ＡＡｎ３－グルタミン酸－アスパラギン酸－ＡＡｎ４－システイン－ヒスチジン－ＡＡｎ５－アスパラギン酸－ＡＡｎ６－チロシン－ＡＡｎ７－トリプトファンであり、ここで、ＡＡはアミノ酸であり、ｎ１～ｎ７はアミノ酸数であり、ｎ１＝１６～１８個、ｎ２＝２～４個、ｎ３＝１～３個、ｎ４＝７～９個、ｎ５＝１６～１８個、ｎ６＝４～６個であり、ｎ７＝３～５個であり、好ましくは、前記アミノ酸数はｎ１＝１７個、ｎ２＝３個、ｎ３＝２個、ｎ４＝８個、ｎ５＝１７個、ｎ６＝５個、ｎ７＝４個であることを特徴とするタンパク質。
【請求項2】
フィブリノーゲン関連タンパク質１であって、（ａ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のようなアミノ酸配列の４８～２９０位で示されるタンパク質、
（ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の４８～２９０位で示されるアミノ酸配列を、１個又は数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は付加による、同じ機能を有するタンパク質、
（ａ３）（ａ１）～（ａ２）のいずれか一つで限定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上または８０％以上の相同性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質、
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれか一つで限定されるタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端にタグを付着させた後に得られる融合タンパク質のいずれか１項に示すタンパク質であり、かつ請求項１に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするフィブリノーゲン関連タンパク質１。
【請求項3】
請求項２に記載のフィブリノーゲン関連タンパク質１をコードする核酸分子であって、前記核酸分子は遺伝子であり、前記遺伝子は、（ｂ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の１４２～８７０位で示されるＤＮＡ分子、
（ｂ２）ストリンジェントな条件下で（ｂ１）で限定されるＤＮＡ分子とハイブリダイズし、かつ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、
（ｂ３）（ｂ１）～（ｂ２）で限定されるＤＮＡ配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上または８０％以上の相同性を有し、かつ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、
（ｂ４）（ａ３）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ分子のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子であることを特徴とする核酸分子。
【請求項4】
請求項３に記載の核酸分子を含む発現カセット、組換え体、組換え細菌またはトランスジェニック細胞株。
【請求項5】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のフィブリノーゲン関連タンパク質１又は請求項３に記載の核酸分子、又は請求項４に記載の組換え体、組換え細菌又はトランスジェニック細胞株の応用であって、（ｃ１）血栓の発生を阻害するための製品の製造
（ｃ２）血栓程度を阻害するための製品の製造
（ｃ３）血漿中のフィブリン活性を阻害するための製品の製造
（ｃ４）血漿中のフィブリノーゲン集合を阻害するための製品の製造
（ｃ５）線溶能力を高めるための製品の製造
（ｃ６）血漿の活性化部分のトロンビン時間及び／またはプロトロンビン時間及び／またはトロンビン時間を延長するための製品の製造の少なくとも一つであることを特徴とする応用。
【請求項6】
前記タンパク質の製造方法は、前記タンパク質のコード遺伝子を真核発現ベクターにクローニングし、真核細胞を無血清培地で培養して前記タンパク質を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ親和力カラムを用いて精製し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムを用いてゲル濾過により更にタンパク質を精製し、高純度精製タンパク質を得ることであることを特徴とする請求項５に記載の応用。
【請求項7】
前記製品は、ワクチン製品を含む薬物製品であり、好ましくは、前記薬物製品の種類は、ｍＲＮＡ薬物、ＤＮＡ薬物、タンパク質薬物またはアデノウイルス薬物を含む、ことを特徴とする請求項５または６に記載の応用。
【請求項8】
前記製品には、血液脳関門を通過するための構造がさらに修飾されており、好ましくは、前記修飾された、血液脳関門を通過する構造は、脳標的化リガンドであり、好ましくは、前記脳標的化リガンドは、ＲＶＧペプチド、ステアリン酸－トランスフェリン、キャリアプロテインＥを含むが、それらに限定されない、ことを特徴とする請求項５または６に記載の応用。
【請求項9】
前記薬物には、併用可能な治療用薬物がさらに含まれ、好ましくは、前記併用可能な治療用薬物は、それぞれウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アテプラーゼ、レチプラーゼまたは組織性フィブリノーゲン活性化因子である、ことを特徴とする請求項８に記載の応用。
【請求項10】
生物材料であって、前記生物材料は、請求項１に記載のタンパク質の核酸分子又は請求項２に記載のフィブリノーゲン関連タンパク質１を発現可能な核酸分子又は前記核酸分子を含む発現カセット、組換え体、組換え細菌またはトランスジェニック細胞株である、ことを特徴とする生物材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、基質に結合可能なタンパク質配列、このタンパク質配列を含むフィブリノーゲン関連タンパク質１及びその活性ドメインのフィブリンの集合を阻害する製品の製造における応用に関する。
【背景技術】
【0002】
血栓は、心臓血管系の血管内面の剥離または修復箇所の表面において血流で形成される小さな塊である。可変な流動依存型（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｌｏｗ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ）では、血栓は不溶性のフィブリン、沈着した血小板、蓄積した白血球と陥没した赤血球で構成されている。血栓形成は１セットの遺伝と環境因子の相互作用、相互影響の多因子変化過程である。臨床でよく見られる血栓患者は、最も主な特徴が家族遺伝性、反復発作性、症状の重症性、血栓形成部位の異常性及び発症時期の若者化である。抗血栓療法は血栓溶解薬、抗血小板薬、抗凝固剤を用いて血栓の形成を阻害したり、形成された血栓を分解したりすることである。
【0003】
抗血栓薬は抗凝血薬、抗血小板凝集薬と血栓溶解薬の三つの種類に分けられる。
Ａ、抗凝血薬（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ）は、凝血因子を妨害し、血液凝固を阻止する薬物であり、主に血栓塞栓性疾患の予防と治療に用いられる。
Ｂ、抗血小板凝集薬は、３世代に分けられ、アスピリンが第一世代、チクロピジンが第二世代、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニストが第三世代である。ここで、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニストの登場は抗血小板治療における重要なマイルストーンである。
Ｃ、凝血中に形成されたフィブリンは、プラスミン作用によってアルギニン－リジン結合から可溶性産物に分解され、血栓を溶解させることができる。線溶薬（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇｓ）は、プラスミンを活性化して線溶を促進し、血栓溶解薬（ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇｓ）とも呼ばれ、急性血栓塞栓性疾患の治療に用いられる。第一世代の血栓溶解薬であるストレプトキナーゼ（ＳＫ）とウロキナーゼ（ＵＫ）は、現在も国内外で最も広く使用されている品種であり、プロウロキナーゼ（Ｐｒｏ－ＵＫ）などの新世代の血栓溶解薬の登場により、このような薬は臨床で普及しつつある。
Ａ、抗凝血薬（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ）は、凝血因子を妨害し、血液凝固を阻止する薬物であり、主に血栓塞栓性疾患の予防と治療に用いられる。
Ｂ、抗血小板凝集薬は、３世代に分けられ、アスピリンが第一世代、チクロピジンが第二世代、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニストが第三世代である。ここで、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニストの登場は抗血小板治療における重要なマイルストーンである。
Ｃ、凝血中に形成されたフィブリンは、プラスミン作用によってアルギニン－リジン結合から可溶性産物に分解され、血栓を溶解させることができる。線溶薬（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇｓ）は、プラスミンを活性化して線溶を促進し、血栓溶解薬（ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇｓ）とも呼ばれ、急性血栓塞栓性疾患の治療に用いられる。第一世代の血栓溶解薬であるストレプトキナーゼ（ＳＫ）とウロキナーゼ（ＵＫ）は、現在も国内外で最も広く使用されている品種であり、プロウロキナーゼ（Ｐｒｏ－ＵＫ）などの新世代の血栓溶解薬の登場により、このような薬は臨床で普及しつつある。
【0004】
フィブリノーゲン（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ、繊維素原とも呼ばれる）は、肝細胞によって合成され、分泌される糖タンパク質（α２β２γ２）であり、血液凝固と止血過程に参与する重要な蛋白フィブリンである。血凝固過程において、トロンビンがフィブリノーゲン内のフィブリノペプチドＡ及びＢを切除して生成する単量体タンパク質である。高フィブリノーゲンは、各種の血栓性疾患の重要な危険因子であり、臨床では疾患状態のマーカーと認識されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、基質ＧＰＲＰペプチドセグメントに結合可能なアミノ酸配列を含むタンパク質、このアミノ酸配列を含むフィブリノーゲン関連タンパク質１（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １、ＦＧＬ１と略称する）及びそのフィブリノーゲンドメイン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＦＧＬ１、ＦＤと略称する）を提供し、それは従来の薬物と異なる作用機序を有し、フィブリンγサブユニットを競合することによってフィブリノペプチドＡと結合することにより、血栓形成中のフィブリン集合を阻害することができる。
【0006】
本発明の上記目的は、以下の技術的解決手段により達成されることができる。
【0007】
本発明の第１の発明は、タンパク質を提供するものであり、前記タンパク質は、基質ＧＰＲＰペプチドに結合可能なアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列の構造は、トリプトファン－ＡＡｎ１－チロシン－ＡＡｎ２－システイン－ＡＡｎ３－グルタミン酸－アスパラギン酸－ＡＡｎ４－システイン－ヒスチジン－ＡＡｎ５－アスパラギン酸－ＡＡｎ６－チロシン－ＡＡｎ７－トリプトファンであり、ここで、ＡＡはアミノ酸であり、ｎ１－ｎ７はアミノ酸数であり、ｎ１＝１６～１８個、ｎ２＝２～４個、ｎ３＝１～３個、ｎ４＝７～９個、ｎ５＝１６～１８個、ｎ６＝４～６個であり、ｎ７＝３～５個であり。
【0008】
上記タンパク質は、前記アミノ酸数ｎ１＝１７個、ｎ２＝３個、ｎ３＝２個、ｎ４＝８個、ｎ５＝１７個、ｎ６＝５個、ｎ７＝４個である。
【0009】
すなわち、アミノ酸配列の構造は、トリプトファン－１７個のアミノ酸－チロシン－３個のアミノ酸－システイン－２個のアミノ酸－グルタミン酸－アスパラギン酸－８個のアミノ酸－システイン－ヒスチジン－１７個のアミノ酸－アスパラギン酸－５個のアミノ酸－チロシン－４個のアミノ酸－トリプトファンである。
【0010】
トリプトファンとチロシンの間に任意の１７個のアミノ酸が連結され、チロシンとシステインの間に任意の３個のアミノ酸が連結され、システインとグルタミン酸の間に任意の２個のアミノ酸が連結され、グルタミン酸とアスパラギン酸が直接連結され、アスパラギン酸と他のシステインとの間に任意の８個のアミノ酸が連結され、他のシステインとヒスチジンが直接連結され、ヒスチジンと別のアスパラギン酸との間に任意の１７個のアミノ酸が連結され、他のアスパラギン酸と他のチロシンとの間に任意の５個のアミノ酸が連結され、他のチロシンと他のトリプトファンとの間には、任意の４個のアミノ酸が連結されることが示されている。
【0011】
このタンパク質に含まれる基質ＧＰＲＰペプチドに結合可能なアミノ酸配列は、このアミノ酸配列の肝心な位置の存在及び構造が同じ、または８０％同じであることを保証する場合、アミノ酸配列中のＡＡは、任意の機能性アミノ酸であってもよく、異なる機能のＡＡを採用し、前記タンパク質に異なる複合効果をもたらすことができる。同時に、このタンパク質のアミノ酸配列におけるいくつかの重要な部位を突然変異させると、血栓形成機能の阻害効果の向上を実現することができ、例えば、２０４位及び／又は２６９位のトリプトファンがアラニンに突然変異した場合、突然変異体による凝集したフィブリンの開裂は、非突然変異形態と比較して、明らかに強化された（図２７参照）。
【0012】
具体的には、本発明によるフィブリノーゲン関連タンパク質１において、アミノ酸配列は２０４位トリプトファン、２２２位チロシン、２２６位システイン、２２９位グルタミン酸、２３０位アスパラギン酸、２３９位システイン、２４０位ヒスチジン、２５８位アスパラギン酸、２６４位チロシン、２６９位トリプトファンである。
上記のアミノ酸配列に列挙したアミノ酸部位は、基質ＧＰＲＰ（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）ペプチドセグメントに結合可能な重要なアミノ酸部位であり、アミノ酸配列は、これらの重要なアミノ酸部位を介して基質ＧＰＲＰと疎水結合、水素結合または塩結合特異性で競合的に結合することができ、図２６に示すように、フィブリノペプチドＡに結合可能な結合部位を競合的に占有することにより、フィブリンの集合を阻害することで、フィブリンの活性を阻害し、血栓形成の阻害または血栓形成の進行を遅らせる効果を実現した。
上記のアミノ酸配列に列挙したアミノ酸部位は、基質ＧＰＲＰ（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）ペプチドセグメントに結合可能な重要なアミノ酸部位であり、アミノ酸配列は、これらの重要なアミノ酸部位を介して基質ＧＰＲＰと疎水結合、水素結合または塩結合特異性で競合的に結合することができ、図２６に示すように、フィブリノペプチドＡに結合可能な結合部位を競合的に占有することにより、フィブリンの集合を阻害することで、フィブリンの活性を阻害し、血栓形成の阻害または血栓形成の進行を遅らせる効果を実現した。
【0013】
本発明の第２の発明は、フィブリノーゲン関連タンパク質１を提供するものであり、下記のいずれか一つで表されるタンパク質であり、かつ前記アミノ酸配列を含む：
（ａ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のようなアミノ酸配列４８～２９０位（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）で示されるタンパク質。
（ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の４８～２９０位で示されるアミノ酸配列を、１個又は数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は付加による同じ機能を有するタンパク質、
（ａ３）（ａ１）～（ａ２）のいずれか一つで限定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上または８０％以上の相同性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質、
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれか一つで限定されるタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端にタグを付着させた後に得られる融合タンパク質。
（ａ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のようなアミノ酸配列４８～２９０位（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）で示されるタンパク質。
（ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の４８～２９０位で示されるアミノ酸配列を、１個又は数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は付加による同じ機能を有するタンパク質、
（ａ３）（ａ１）～（ａ２）のいずれか一つで限定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上または８０％以上の相同性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質、
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれか一つで限定されるタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端にタグを付着させた後に得られる融合タンパク質。
【0014】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）は、フィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）を含み、単独のＦＤドメインタンパク質は、ＦＧＬ１と同じまたは類似の機能を有する。ここで、ＦＧＬ１のアミノ酸配列は、配列表のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すとおりであり、単独のＦＤドメインタンパク質のアミノ酸配列は、配列表のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の４８～２９０位で示すとおりである。
【0015】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のアミノ酸配列は以下のとおりであり、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：
ＬＥＤＣＡＱＥＱＭＲＬＲＡＱＶＲＬＬＥＴＲＶＫＱＱＱＶＫＩＫＱＬＬＱＥＮＥＶＱＦＬＤＫＧＤＥＮＴＶＩＤＬＧＳＫＲＱＹＡＤＣＳＥＩＦＮＤＧＹＫＬＳＧＦＹＫＩＫＰＬＱＳＰＡＥＦＳＶＹＣＤＭＳＤＧＧＧＷＴＶＩＱＲＲＳＤＧＳＥＮＦＮＲＧＷＫＤＹＥＮＧＦＧＮＦＶＱＫＨＧＥＹＷＬＧＮＫＮＬＨＦＬＴＴＱＥＤＹＴＬＫＩＤＬＡＤＦＥＫＮＳＲＹＡＱＹＫＮＦＫＶＧＤＥＫＮＦＹＥＬＮＩＧＥＹＳＧＴＡＧＤＳＬＡＧＮＦＨＰＥＶＱＷＷＡＳＨＱＲＭＫＦＳＴＷＤＲＤＨＤＮＹＥＧＮＣＡＥＥＤＱＳＧＷＷＦＮＲＣＨＳＡＮＬＮＧＶＹＹＳＧＰＹＴＡＫＴＤＮＧＩＶＷＹＴＷＨＧＷＷＹＳＬＫＳＶＶＭＫＩＲＰＮＤＦＩＰＮＶＩ。
ＬＥＤＣＡＱＥＱＭＲＬＲＡＱＶＲＬＬＥＴＲＶＫＱＱＱＶＫＩＫＱＬＬＱＥＮＥＶＱＦＬＤＫＧＤＥＮＴＶＩＤＬＧＳＫＲＱＹＡＤＣＳＥＩＦＮＤＧＹＫＬＳＧＦＹＫＩＫＰＬＱＳＰＡＥＦＳＶＹＣＤＭＳＤＧＧＧＷＴＶＩＱＲＲＳＤＧＳＥＮＦＮＲＧＷＫＤＹＥＮＧＦＧＮＦＶＱＫＨＧＥＹＷＬＧＮＫＮＬＨＦＬＴＴＱＥＤＹＴＬＫＩＤＬＡＤＦＥＫＮＳＲＹＡＱＹＫＮＦＫＶＧＤＥＫＮＦＹＥＬＮＩＧＥＹＳＧＴＡＧＤＳＬＡＧＮＦＨＰＥＶＱＷＷＡＳＨＱＲＭＫＦＳＴＷＤＲＤＨＤＮＹＥＧＮＣＡＥＥＤＱＳＧＷＷＦＮＲＣＨＳＡＮＬＮＧＶＹＹＳＧＰＹＴＡＫＴＤＮＧＩＶＷＹＴＷＨＧＷＷＹＳＬＫＳＶＶＭＫＩＲＰＮＤＦＩＰＮＶＩ。
【0016】
フィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）のアミノ酸配列は以下のとおりであり、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３：
ＴＶＩＤＬＧＳＫＲＱＹＡＤＣＳＥＩＦＮＤＧＹＫＬＳＧＦＹＫＩＫＰＬＱＳＰＡＥＦＳＶＹＣＤＭＳＤＧＧＧＷＴＶＩＱＲＲＳＤＧＳＥＮＦＮＲＧＷＫＤＹＥＮＧＦＧＮＦＶＱＫＨＧＥＹＷＬＧＮＫＮＬＨＦＬＴＴＱＥＤＹＴＬＫＩＤＬＡＤＦＥＫＮＳＲＹＡＱＹＫＮＦＫＶＧＤＥＫＮＦＹＥＬＮＩＧＥＹＳＧＴＡＧＤＳＬＡＧＮＦＨＰＥＶＱＷＷＡＳＨＱＲＭＫＦＳＴＷＤＲＤＨＤＮＹＥＧＮＣＡＥＥＤＱＳＧＷＷＦＮＲＣＨＳＡＮＬＮＧＶＹＹＳＧＰＹＴＡＫＴＤＮＧＩＶＷＹＴＷＨＧＷＷＹＳＬＫＳＶＶＭＫＩＲＰＮＤＦＩＰＮＶＩ。
ＴＶＩＤＬＧＳＫＲＱＹＡＤＣＳＥＩＦＮＤＧＹＫＬＳＧＦＹＫＩＫＰＬＱＳＰＡＥＦＳＶＹＣＤＭＳＤＧＧＧＷＴＶＩＱＲＲＳＤＧＳＥＮＦＮＲＧＷＫＤＹＥＮＧＦＧＮＦＶＱＫＨＧＥＹＷＬＧＮＫＮＬＨＦＬＴＴＱＥＤＹＴＬＫＩＤＬＡＤＦＥＫＮＳＲＹＡＱＹＫＮＦＫＶＧＤＥＫＮＦＹＥＬＮＩＧＥＹＳＧＴＡＧＤＳＬＡＧＮＦＨＰＥＶＱＷＷＡＳＨＱＲＭＫＦＳＴＷＤＲＤＨＤＮＹＥＧＮＣＡＥＥＤＱＳＧＷＷＦＮＲＣＨＳＡＮＬＮＧＶＹＹＳＧＰＹＴＡＫＴＤＮＧＩＶＷＹＴＷＨＧＷＷＹＳＬＫＳＶＶＭＫＩＲＰＮＤＦＩＰＮＶＩ。
【0017】
本発明の第３の発明は、上記フィブリノーゲン関連タンパク質１をコードする核酸分子を提供するものである。
【0018】
さらに、前記核酸分子は遺伝子であり、前記遺伝子は、以下のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子である：
（ｂ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の１４２～８７０位（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）で示されるＤＮＡ分子
（ｂ２）ストリンジェントな条件下で（ｂ１）で限定されるＤＮＡ分子とハイブリダイズし、かつ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、
（ｂ３）（ｂ１）～（ｂ２）で限定されるＤＮＡ配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上または８０％以上の相同性を有し、かつ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、
（ｂ４）（ａ３）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
（ｂ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の１４２～８７０位（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）で示されるＤＮＡ分子
（ｂ２）ストリンジェントな条件下で（ｂ１）で限定されるＤＮＡ分子とハイブリダイズし、かつ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、
（ｂ３）（ｂ１）～（ｂ２）で限定されるＤＮＡ配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上または８０％以上の相同性を有し、かつ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、
（ｂ４）（ａ３）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【0019】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の核酸配列は以下のとおりであり、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：
ｃｔｃｇａｇｇａｃｔｇｔｇｃｃｃａｇｇａｇｃａｇａｔｇｃｇｇｃｔｃａｇａｇｃｃｃａｇｇｔｇｃｇｃｃｔｇｃｔｔｇａｇａｃｃｃｇｇｇｔｃａａａｃａｇｃａａｃａｇｇｔｃａａｇａｔｃａａｇｃａｇｃｔｔｔｔｇｃａｇｇａｇａａｔｇａａｇｔｃｃａｇｔｔｃｃｔｔｇａｔａａａｇｇａｇａｔｇａｇａａｔａｃｔｇｔｃａｔｔｇａｔｃｔｔｇｇａａｇｃａａｇａｇｇｃａｇｔａｔｇｃａｇａｔｔｇｔｔｃａｇａｇａｔｔｔｔｃａａｔｇａｔｇｇｇｔａｔａａｇｃｔｃａｇｔｇｇａｔｔｔｔａｃａａａａｔｃａａａｃｃｔｃｔｃｃａｇａｇｃｃｃａｇｃａｇａａｔｔｔｔｃｔｇｔｔｔａｔｔｇｔｇａｃａｔｇｔｃｃｇａｔｇｇａｇｇａｇｇａｔｇｇａｃｔｇｔａａｔｔｃａｇａｇａｃｇａｔｃｔｇａｔｇｇｃａｇｔｇａａａａｃｔｔｔａａｃａｇａｇｇａｔｇｇａａａｇａｃｔａｔｇａａａａｔｇｇｃｔｔｔｇｇａａａｔｔｔｔｇｔｃｃａａａａａｃａｔｇｇｔｇａａｔａｔｔｇｇｃｔｇｇｇｃａａｔａａａａａｔｃｔｔｃａｃｔｔｃｔｔｇａｃｃａｃｔｃａａｇａａｇａｃｔａｃａｃｔｔｔａａａａａｔｃｇａｃｃｔｔｇｃａｇａｔｔｔｔｇａａａａａａａｔａｇｃｃｇｔｔａｔｇｃａｃａａｔａｔａａｇａａｔｔｔｃａａａｇｔｔｇｇａｇａｔｇａａａａｇａａｔｔｔｃｔａｃｇａｇｔｔｇａａｔａｔｔｇｇｇｇａａｔａｔｔｃｔｇｇａａｃａｇｃｔｇｇａｇａｔｔｃｃｃｔｔｇｃｇｇｇｇａａｔｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａｇｇｔｇｃａｇｔｇｇｔｇｇｇｃｔａｇｔｃａｃｃａａａｇａａｔｇａａａｔｔｃａｇｃａｃｇｔｇｇｇａｃａｇａｇａｔｃａｔｇａｃａａｃｔａｔｇａａｇｇｇａａｃｔｇｃｇｃａｇａａｇａａｇａｔｃａｇｔｃｔｇｇｃｔｇｇｔｇｇｔｔｔａａｃａｇｇｔｇｔｃａｃｔｃｔｇｃａａａｃｃｔｇａａｔｇｇｔｇｔａｔａｃｔａｃａｇｃｇｇｃｃｃｃｔａｃａｃｇｇｃｔａａａａｃａｇａｃａａｔｇｇｇａｔｔｇｔｃｔｇｇｔａｃａｃｃｔｇｇｃａｔｇｇｇｔｇｇｔｇｇｔａｔｔｃｔｃｔｇａａａｔｃｔｇｔｇｇｔｔａｔｇａａａａｔｔａｇｇｃｃａａａｔｇａｔｔｔｔａｔｔｃｃａａａｔｇｔａａｔｔ。
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【0020】
フィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）の核酸配列は、以下のとおりであり、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４：
ａｃｔｇｔｇａｇａｇａｇｇｃａｇｔａｔｔｇｇａａａｇｇｔａｔｇｃａｇａｔｔｇｔｔｃｃａａａａａａｃａｔｇｔｇｇａａａａａｔｃｔｔｇｇａｃｃａａａａａｔｃｔｔｇｃｃａｇａａｇａｃｔｔｃｔｔｔａａａａａｔｃｇａｃｃｔｔｇａａａａａｔｃｇａｃｃｔｔｇａａａａａａｔｔｇｃｃａｇｇｇａａａａｔｔｔｔｇａａａｇｃｔｔｇｃａａａｇｃｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔ
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【0021】
本発明の第４の発明は、上記核酸分子の発現カセット、組換え菌、組換え細菌またはトランスジェニック細胞株を提供するものである。
【0022】
本発明の第５の発明は、上記フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）又は上記核酸分子又は前記組換え菌、組換え菌又はトランスジェニック細胞株の応用を提供するものであり、前記応用は、少なくとも以下のいずれか一つである：
（ｃ１）血栓の発生を阻害するための製品の製造、
（ｃ２）血栓程度を阻害するための製品の製造、
（ｃ３）血漿中のフィブリン活性を阻害するための製品の製造、
（ｃ４）血漿中のフィブリノーゲン集合を阻害するための製品の製造、
（ｃ５）線溶能力を高めるための製品の製造、
（ｃ６）血漿の活性化部分のトロンビン時間及び／またはプロトロンビン時間及び／またはトロンビン時間を延長するための製品の製造。
（ｃ１）血栓の発生を阻害するための製品の製造、
（ｃ２）血栓程度を阻害するための製品の製造、
（ｃ３）血漿中のフィブリン活性を阻害するための製品の製造、
（ｃ４）血漿中のフィブリノーゲン集合を阻害するための製品の製造、
（ｃ５）線溶能力を高めるための製品の製造、
（ｃ６）血漿の活性化部分のトロンビン時間及び／またはプロトロンビン時間及び／またはトロンビン時間を延長するための製品の製造。
【0023】
本発明の研究により、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）またはフィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）が血栓形成中のフィブリンの集合を阻害し、血栓関連疾患を治療する薬物の製造に用いることができることが示される。
【0024】
ここで、前記の、血栓関連疾患を治療する薬物は、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）またはフィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）を活性成分とする薬物である。前記の、血栓関連症を治療する薬物は多種の原因による血栓症を治療するために用いられてもよく、血栓症の発生を予防するために用いられてもよく、同時に、フィブリンとの活性上昇、線溶能力の低下及び血漿の活性化部分トロンビン時間及び／またはプロトロンビン時間及び／またはトロンビン時間の短縮に関する多種の疾患の予防と治療に用いられてもよい。
【0025】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）は、フィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）を含み、その作用機序は、フィブリンγサブユニットと競合することによりフィブリノペプチドＡと結合することで、血栓形成中のフィブリン集合を阻害することができることである。
【0026】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）に対して突然変異を行うことによって、フィブリノペプチドＡとの親和力を高めることにより、薬効を向上させる目的を達成することができる。
【0027】
さらに、上記の応用において、前記タンパク質の製造方法は、以下のとおりである：前記タンパク質のコーディング遺伝子を真核発現ベクターにクローンし、無血清培養基で真核細胞を培養して前記タンパク質を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ親和力カラムを採用して精製し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムでゲル濾過によってタンパク質をさらに精製し、高純度精製タンパク質を得る。
【0028】
さらに、上記応用において、前記製品は、ワクチン製品を含む薬物製品である。
【0029】
さらに、上記応用において、前記薬物製品のタイプは、ＤＮＡ薬物、ｍＲＮＡ薬物、タンパク質薬物またはアデノウイルス薬物を含む。前記の、血栓系疾患の予防または治療のための薬物製品は、上記のタイプの製品を含むが、それらに限定されるものではなく、プラスミド被覆、微小球被覆、外分泌体携帯などの様々なキャリア形態で投与することができ、また、タンパク質と化合物の結合投与、タンパク質とペプチドの結合投与、タンパク質と小分子の結合投与などの様々な形態のキャリア形態で投与することができ、その最終的な目的は、本発明のフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）またはフィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）の生物活性を保証するために、異なる投与方式で活性成分を取り込んで、フィブリノーゲンの組み立てを阻害することである。
【0030】
さらに、上記の応用において、前記製品には、血液脳関門を通過するための構造がさらに修飾される。
【0031】
さらに、上記の応用において、前記修飾された、血液脳関門を通過する構造は、脳標的化リガンドである。
【0032】
さらに、上記の応用において、前記脳標的化リガンドは、ＲＶＧペプチド、ステアリン酸－トランスフェリン、キャリアプロテインＥを含むが、それらに限定されない。
【0033】
上記記載に基づいて、本発明に記載の、血栓系疾患の予防または治療のための薬物製品は、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）またはフィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）の生物活性を保証する前提で、さらにそれを多種の標的リガンドと結合することができ、比較的突出した標的リガンド修飾は、タンパク質またはドメインタンパク質を大脳標的化リガンドと結合して、血液脳関門（ＢＢＢ）を突破することに有利であり、それによって脳血栓の生体薬剤供給治療を実現するが、本発明の作用は、これに限定されず、同様に他の構造または形式の標的リガンドと結合することにより、異なる病巣に対する標的治療を実現することができる。
【0034】
さらに、上記の応用において、前記薬物には、併用可能な治療用薬物がさらに含まれる。
【0035】
さらに、上記の応用において、前記併用可能な治療用薬は、それぞれウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アルテプラーゼ、レチプラーゼまたは組織性フィブリノーゲン活性化因子である。
【0036】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）及びその突然変異体は、従来の抗血栓薬物（ウロキナーゼと組織型フィブリノーゲン活性化因子など）と効果的に協力し、かつ従来の抗血栓薬物の使用量を低減し、その毒性副作用を緩和することができる。
【0037】
本発明の第６の発明は、前記フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）を発現可能な核酸分子又はそれを含む発現カセット、組換え菌、組換え細菌またはトランスジェニック細胞株である生物材料を提供する。
【0038】
現在従来の抗血栓薬は、作用機序によって３種類に分けられ、それぞれ以下のとおりである。
１）抗凝固薬：機序は、凝血過程を阻害することであり、副作用は組織出血を引き起こしやすいことである。
２）抗血小板薬物：機序は血小板凝集を阻害することであり、副作用は組織出血を引き起こすことである。
３）線溶性薬物：機序はフィブリン分解を誘導することにより、すでに形成された血栓を溶解させることであり、副作用は同様に出血合併症である。
１）抗凝固薬：機序は、凝血過程を阻害することであり、副作用は組織出血を引き起こしやすいことである。
２）抗血小板薬物：機序は血小板凝集を阻害することであり、副作用は組織出血を引き起こすことである。
３）線溶性薬物：機序はフィブリン分解を誘導することにより、すでに形成された血栓を溶解させることであり、副作用は同様に出血合併症である。
【0039】
本発明の特徴及び利点は以下のとおりである：本発明は、基質ＧＰＲＰペプチドセグメントに結合可能なアミノ酸配列を含むタンパク質、このアミノ酸配列を含むフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）及びその活性ドメイン（ＦＤ）、及びフィブリンの集合を阻害する製品の製造における上記タンパク質の応用を提供し、前記の、基質ＧＰＲＰペプチドセグメントに結合可能なアミノ酸配列を含むタンパク質、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）、そのフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）及びその突然変異体は、従来の薬物と異なる作用メカニズムを有し、フィブリン基質結合ポケットを競合することによって、血栓形成中のフィブリンの集合を阻害することができ、突然変異によって、それにより強い基質親和性を持たせることができ、血栓治療用薬物の使用効果を効果的に高めることができる。ＦＧＬ１とＦＤの作用機序は、フィブリンの集合過程を破壊するため、従来の血栓溶解薬に比べて血栓溶解効果に優れるが、血栓溶解過程はより緩やかであり、出血などの副作用はほとんどない。すなわち、本発明は、フィブリノーゲンではなくフィブリノーゲンに作用し、従来の血栓治療用薬物が使用中にフィブリノーゲンに作用するため、薬物副作用の大出血を引き起こしやすいという技術的難題を回避し、このような作用機序のため、本発明によるＦＧＬ１とＦＤを複数の従来の血栓治療用薬物（例えばアジュプシーゼなど）と併用すると、血栓系疾患を相乗的に治療することができると同時に、従来の抗血栓薬の普遍的出血副作用の発生確率を大幅に低下させることができ、血栓系疾患の治療に新たな道を開拓した。
【図面の簡単な説明】
【0040】
本発明の実施例における技術的解決手段をより明確に説明するために、以下、実施例の記述において使用する必要のある図面を簡単に説明するが、以下の記述における図面は、本発明のいくつかの実施例に過ぎず、当業者にとっては、創造的な労力を払うことなく、これらの図面に基づいて他の図も得ることができることが明らかである。
【図1】フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のＮｉ－ＮＴＡ親和性カラム精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ図である。
【図2】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムによるフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の精製を示す図であり、ここで、グラフの縦軸はＡ２８０タンパク質吸収値であり、横軸は体積数である。
【図3】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムによる精製後のフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ図であり、ここで、レーン１－１２はそれぞれ、１－タンパク質標準品、２－収集管１、３－収集管２、４－収集管３、５－収集管４、６－収集管５、７－収集管６、８－収集管７、９－収集管８、１０－収集管９、１１－収集管１０、１２－タンパク質標準品を示す。
【図4】フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）Ｎｉ－ＮＴＡ親和性カラム精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ図である。
【図5】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムによるフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）の精製を示し、縦軸はＡ２８０タンパク質吸収値であり、横軸は体積数である。
【図6】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムによる精製後のフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ図であり、ここで、レーン１９－２９はそれぞれ、１９－収集管１９、２０－収集管２０、２１－収集管２１、２２－収集管２２、２３－収集管２３、２４－収集管２４、２５－収集管２５、２６－収集管２６、２７－収集管２７、２８－収集管２８、２９－タンパク質標準品である。
【図7】塩化カルシウムの非存在下でのフィブリン凝集に対するフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の効果を示す。
【図8】塩化カルシウムの存在下でのフィブリン凝集に対するフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の効果を示す。
【図9】塩化カルシウムの非存在下でのフィブリノーゲン凝集に対するフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）の効果を示す。
【図10】塩化カルシウムの存在下でのフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のフィブリン凝集に対する効果を示す。
【図11】走査型電子顕微鏡から見たフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のフィブリン凝集に対する効果の比較図を示す。
【図12】走査型電子顕微鏡から見たフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のフィブリン凝集に対する効果の比較図であり、ここで、フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）の処理によりフィブリン凝集による栓が細くなり、構造が緩くなることが明らかとなる。
【図13】走査型電子顕微鏡から見たマウス血栓形態に対するフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の影響の比較図である。
【図14】走査型電子顕微鏡から見たマウスの血栓形態に対するフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）の影響の比較図であり、ここで、フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）の処理により血栓が細くなり、構造が緩くなることが明らかとなる。
【図15】フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）による凝集フィブリン分解作用の比較図を示す。
【図16】フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）による凝集フィブリン分解作用の比較図を示す。
【図17】フィブリン凝集をフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）と組織型プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡとが相乗的溶解する比較図である。
【図18】フィブリン凝集をフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）と組織型プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡとが相乗的溶解する比較図である。
【図19】フィブリン凝集をフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）とウロキナーゼｕＰＡとが相乗的溶解する比較図である。
【図20】フィブリン凝集をフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）とウロキナーゼｕＰＡとが相乗的溶解する比較図である。
【図21】フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のマウスへのプラスミド注射過剰発現によるトロンビン誘発性血栓症の改善を示すデータ統計図であり、ここで、（Ａ）は、ＥＬＩＳＡによるフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）プラスミド注射過剰発現の比較図であり、（Ｂ）は、マウス生存率を有意に高めるフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の過剰発現の比較図である。
【図22】フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のマウスへのプラスミド注射過剰発現によるトロンビン誘発性血栓症の改善を示すデータ統計図であり、ここで、（Ａ）は、ＥＬＩＳＡによるフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）プラスミド注射過剰発現の比較図であり、（Ｂ）は、マウス生存率を有意に高めるフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）の過剰発現の比較図である。
【図23】ＲＶＧペプチド及びＣｙ５．５蛍光を用いてフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）を修飾する操作フローを示す。
【図24】ＲＶＧペプチド修飾が、マウス脳組織におけるフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の分布を促進する結果を示す図である。
【図25】フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）及びウィチノゲンドメイン（ＦＤ）が、フィブリノーゲンの欠失（Ａ）及び出血時間（Ｂ）に有意な効果（毒性副作用なし）を有さないことを示す。
【図26】フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）（緑色）及び基質ＧＰＲＰペプチドセグメント結合（オレンジ色）を示す構造図であり、ここで、標識が示すアミノ酸は、基質結合の重要な部位であり、それぞれ２０４位トリプトファン、２２２位チロシン、２２６位システイン、２２９位グルタミン酸、２３０位アスパラギン酸、２３９位システイン、２４０位ヒスチジン、２５８位アスパラギン酸、２６４位チロシン、２６９位トリプトファンであり、図２６Ｂは、図２６ＡのＹ軸に沿って７０°回転して得られたものである。
【図27】フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）突然変異体による凝集フィブリンの分解効果の比較図であり、ここで、突然変異部位は２０４位と２６９位のトリプトファンであり、アラニンに突然変異し、突然変異後のフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）突然変異体の分解効果は明らかに高まる。
【発明を実施するための形態】
【0041】
以下、本発明の実施例における図面を結び付けて本発明の実施例における技術的解決手段について、明確かつ完全に説明するが、説明する実施例が本発明の一部の実施例に過ぎず、全ての実施例ではないことが明らかである。本発明の実施例に基づいて、当業者が創造的な努力をすることなく得る他のすべての実施例は、いずれも本発明の保護範囲に属する。
【0042】
実施例１：
タンパク質であって、基質ＧＰＲＰペプチドに結合可能なアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列の構造は、トリプトファン－ＡＡｎ１－チロシン－ＡＡｎ２－システイン－ＡＡｎ３－グルタミン酸－アスパラギン酸－ＡＡｎ４－システイン－ヒスチジン－ＡＡｎ５－アスパラギン酸－ＡＡｎ６－チロシン－ＡＡｎ７－トリプトファンであり、ここで、ＡＡはアミノ酸であり、ｎ１－ｎ７はアミノ酸数であり、ｎ１＝１６～１８個、ｎ２＝２～４個、ｎ３＝１～３個、ｎ４＝７～９個、ｎ５＝１６～１８個、ｎ６＝４～６個であり、ｎ７＝３～５個である。
タンパク質であって、基質ＧＰＲＰペプチドに結合可能なアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列の構造は、トリプトファン－ＡＡｎ１－チロシン－ＡＡｎ２－システイン－ＡＡｎ３－グルタミン酸－アスパラギン酸－ＡＡｎ４－システイン－ヒスチジン－ＡＡｎ５－アスパラギン酸－ＡＡｎ６－チロシン－ＡＡｎ７－トリプトファンであり、ここで、ＡＡはアミノ酸であり、ｎ１－ｎ７はアミノ酸数であり、ｎ１＝１６～１８個、ｎ２＝２～４個、ｎ３＝１～３個、ｎ４＝７～９個、ｎ５＝１６～１８個、ｎ６＝４～６個であり、ｎ７＝３～５個である。
【0043】
好ましくは、前記アミノ酸数ｎ１＝１７個、ｎ２＝３個、ｎ３＝２個、ｎ４＝８個、ｎ５＝１７個、ｎ６＝５個、ｎ７＝４個である。
【0044】
すなわち、アミノ酸配列の構造は、トリプトファン－１７個のアミノ酸－チロシン－３個のアミノ酸－システイン－２個のアミノ酸－グルタミン酸－アスパラギン酸－８個のアミノ酸－システイン－ヒスチジン－１７個のアミノ酸－アスパラギン酸－５個のアミノ酸－チロシン－４個のアミノ酸－トリプトファンである。
【0045】
トリプトファンとチロシンの間に任意の１７個のアミノ酸が連結され、チロシンとシステインの間に任意の３個のアミノ酸が連結され、システインとグルタミン酸の間に任意の２個のアミノ酸が連結され、グルタミン酸とアスパラギン酸が直接連結され、アスパラギン酸と他のシステインとの間に任意の８個のアミノ酸が連結され、他のシステインとヒスチジンが直接連結され、ヒスチジンと別のアスパラギン酸との間に任意の１７個のアミノ酸が連結され、他のアスパラギン酸と他のチロシンとの間に任意の５個のアミノ酸が連結され、他のチロシンと他のトリプトファンとの間には、任意の４個のアミノ酸が連結されることが示される。
【0046】
実施例２：
フィブリノーゲン関連タンパク質１であって、以下のいずれか１項に示す実施例１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
（ａ１）例えばＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のアミノ酸配列の４８～２９０位で示されるタンパク質、
（ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の４８～２９０位で示されるアミノ酸配列を、１個又は数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は付加による同じ機能を有するタンパク質、
（ａ３）（ａ１）～（ａ２）のいずれか一つで限定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上または８０％以上の相同性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質、
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれか一つで限定されるタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端にタグを付着させた後に得られる融合タンパク質。
フィブリノーゲン関連タンパク質１であって、以下のいずれか１項に示す実施例１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
（ａ１）例えばＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のアミノ酸配列の４８～２９０位で示されるタンパク質、
（ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の４８～２９０位で示されるアミノ酸配列を、１個又は数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は付加による同じ機能を有するタンパク質、
（ａ３）（ａ１）～（ａ２）のいずれか一つで限定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上または８０％以上の相同性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質、
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれか一つで限定されるタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端にタグを付着させた後に得られる融合タンパク質。
【0047】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）はフィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）を含み、単独のＦＤドメインタンパク質は、フィブリノーゲンＦＧＬ１と同じまたは類似の機能を有する。ここで、フィブリノーゲンＦＧＬ１のアミノ酸配列は、配列表のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すとおりであり、単独のＦＤドメインタンパク質のアミノ酸配列は、配列表のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の４０～２７２位で示すとおりである。
【0048】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＬＥＤＣＡＱＥＱＭＲＬＲＡＱＶＲＬＬＥＴＲＶＫＱＱＱＶＫＩＫＱＬＬＱＥＮＥＶＱＦＬＤＫＧＤＥＮＴＶＩＤＬＧＳＫＲＱＹＡＤＣＳＥＩＦＮＤＧＹＫＬＳＧＦＹＫＩＫＰＬＱＳＰＡＥＦＳＶＹＣＤＭＳＤＧＧＧＷＴＶＩＱＲＲＳＤＧＳＥＮＦＮＲＧＷＫＤＹＥＮＧＦＧＮＦＶＱＫＨＧＥＹＷＬＧＮＫＮＬＨＦＬＴＴＱＥＤＹＴＬＫＩＤＬＡＤＦＥＫＮＳＲＹＡＱＹＫＮＦＫＶＧＤＥＫＮＦＹＥＬＮＩＧＥＹＳＧＴＡＧＤＳＬＡＧＮＦＨＰＥＶＱＷＷＡＳＨＱＲＭＫＦＳＴＷＤＲＤＨＤＮＹＥＧＮＣＡＥＥＤＱＳＧＷＷＦＮＲＣＨＳＡＮＬＮＧＶＹＹＳＧＰＹＴＡＫＴＤＮＧＩＶＷＹＴＷＨＧＷＷＹＳＬＫＳＶＶＭＫＩＲＰＮＤＦＩＰＮＶＩ。
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【0049】
フィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）のアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＴＶＩＤＬＧＳＫＲＱＹＡＤＣＳＥＩＦＮＤＧＹＫＬＳＧＦＹＫＩＫＰＬＱＳＰＡＥＦＳＶＹＣＤＭＳＤＧＧＧＷＴＶＩＱＲＲＳＤＧＳＥＮＦＮＲＧＷＫＤＹＥＮＧＦＧＮＦＶＱＫＨＧＥＹＷＬＧＮＫＮＬＨＦＬＴＴＱＥＤＹＴＬＫＩＤＬＡＤＦＥＫＮＳＲＹＡＱＹＫＮＦＫＶＧＤＥＫＮＦＹＥＬＮＩＧＥＹＳＧＴＡＧＤＳＬＡＧＮＦＨＰＥＶＱＷＷＡＳＨＱＲＭＫＦＳＴＷＤＲＤＨＤＮＹＥＧＮＣＡＥＥＤＱＳＧＷＷＦＮＲＣＨＳＡＮＬＮＧＶＹＹＳＧＰＹＴＡＫＴＤＮＧＩＶＷＹＴＷＨＧＷＷＹＳＬＫＳＶＶＭＫＩＲＰＮＤＦＩＰＮＶＩ。
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【0050】
具体的には、本発明によるフィブリノーゲン関連タンパク質１において、アミノ酸配列は２０４位トリプトファン、２２２位チロシン、２２６位システイン、２２９位グルタミン酸、２３０位アスパラギン酸、２３９位システイン、２４０位ヒスチジン、２５８位アスパラギン酸、２６４位チロシン、２６９位トリプトファンである。
上記のアミノ酸配列に列挙したアミノ酸位置は、基質ＧＰＲＰ（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）ペプチドセグメントに結合可能な重要なアミノ酸部位であり、アミノ酸配列は、これらの重要なアミノ酸部位を介して基質ＧＰＲＰと特異性で競合的に結合することができ、図２６に示すように、フィブリノペプチドＡに結合可能な結合部位を競合的に占有することにより、フィブリンの集合を阻害することで、フィブリンの活性を阻害し、血栓形成の阻害または血栓形成の進行を遅らせる効果を実現した。
上記のアミノ酸配列に列挙したアミノ酸位置は、基質ＧＰＲＰ（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ）ペプチドセグメントに結合可能な重要なアミノ酸部位であり、アミノ酸配列は、これらの重要なアミノ酸部位を介して基質ＧＰＲＰと特異性で競合的に結合することができ、図２６に示すように、フィブリノペプチドＡに結合可能な結合部位を競合的に占有することにより、フィブリンの集合を阻害することで、フィブリンの活性を阻害し、血栓形成の阻害または血栓形成の進行を遅らせる効果を実現した。
【0051】
実施例３：
本発明は、上記フィブリノーゲン関連タンパク質１をコードする核酸分子をさらに提供し、核酸分子は遺伝子であり、前記遺伝子は、以下のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子である：
（ｂ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の１４２～８７０位で示されるＤＮＡ分子、
（ｂ２）ストリンジェントな条件下で（ｂ１）で限定されるＤＮＡ分子とハイブリダイズし、かつ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、
（ｂ３）（ｂ１）～（ｂ２）で限定されるＤＮＡ配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上または８０％以上の相同性を有し、かつ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子。
本発明は、上記フィブリノーゲン関連タンパク質１をコードする核酸分子をさらに提供し、核酸分子は遺伝子であり、前記遺伝子は、以下のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子である：
（ｂ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の１４２～８７０位で示されるＤＮＡ分子、
（ｂ２）ストリンジェントな条件下で（ｂ１）で限定されるＤＮＡ分子とハイブリダイズし、かつ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、
（ｂ３）（ｂ１）～（ｂ２）で限定されるＤＮＡ配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上または８０％以上の相同性を有し、かつ前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【0052】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の核酸配列は以下のとおりであり：
ｃｔｃｇａｇｇａｃｔｇｔｇｃｃｃａｇｇａｇｃａｇａｔｇｃｇｇｃｔｃａｇａｇｃｃｃａｇｇｔｇｃｇｃｃｔｇｃｔｔｇａｇａｃｃｃｇｇｇｔｃａａａｃａｇｃａａｃａｇｇｔｃａａｇａｔｃａａｇｃａｇｃｔｔｔｔｇｃａｇｇａｇａａｔｇａａｇｔｃｃａｇｔｔｃｃｔｔｇａｔａａａｇｇａｇａｔｇａｇａａｔａｃｔｇｔｃａｔｔｇａｔｃｔｔｇｇａａｇｃａａｇａｇｇｃａｇｔａｔｇｃａｇａｔｔｇｔｔｃａｇａｇａｔｔｔｔｃａａｔｇａｔｇｇｇｔａｔａａｇｃｔｃａｇｔｇｇａｔｔｔｔａｃａａａａｔｃａａａｃｃｔｃｔｃｃａｇａｇｃｃｃａｇｃａｇａａｔｔｔｔｃｔｇｔｔｔａｔｔｇｔｇａｃａｔｇｔｃｃｇａｔｇｇａｇｇａｇｇａｔｇｇａｃｔｇｔａａｔｔｃａｇａｇａｃｇａｔｃｔｇａｔｇｇｃａｇｔｇａａａａｃｔｔｔａａｃａｇａｇｇａｔｇｇａａａｇａｃｔａｔｇａａａａｔｇｇｃｔｔｔｇｇａａａｔｔｔｔｇｔｃｃａａａａａｃａｔｇｇｔｇａａｔａｔｔｇｇｃｔｇｇｇｃａａｔａａａａａｔｃｔｔｃａｃｔｔｃｔｔｇａｃｃａｃｔｃａａｇａａｇａｃｔａｃａｃｔｔｔａａａａａｔｃｇａｃｃｔｔｇｃａｇａｔｔｔｔｇａａａａａａａｔａｇｃｃｇｔｔａｔｇｃａｃａａｔａｔａａｇａａｔｔｔｃａａａｇｔｔｇｇａｇａｔｇａａａａｇａａｔｔｔｃｔａｃｇａｇｔｔｇａａｔａｔｔｇｇｇｇａａｔａｔｔｃｔｇｇａａｃａｇｃｔｇｇａｇａｔｔｃｃｃｔｔｇｃｇｇｇｇａａｔｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａｇｇｔｇｃａｇｔｇｇｔｇｇｇｃｔａｇｔｃａｃｃａａａｇａａｔｇａａａｔｔｃａｇｃａｃｇｔｇｇｇａｃａｇａｇａｔｃａｔｇａｃａａｃｔａｔｇａａｇｇｇａａｃｔｇｃｇｃａｇａａｇａａｇａｔｃａｇｔｃｔｇｇｃｔｇｇｔｇｇｔｔｔａａｃａｇｇｔｇｔｃａｃｔｃｔｇｃａａａｃｃｔｇａａｔｇｇｔｇｔａｔａｃｔａｃａｇｃｇｇｃｃｃｃｔａｃａｃｇｇｃｔａａａａｃａｇａｃａａｔｇｇｇａｔｔｇｔｃｔｇｇｔａｃａｃｃｔｇｇｃａｔｇｇｇｔｇｇｔｇｇｔａｔｔｃｔｃｔｇａａａｔｃｔｇｔｇｇｔｔａｔｇａａａａｔｔａｇｇｃｃａａａｔｇａｔｔｔｔａｔｔｃｃａａａｔｇｔａａｔｔ。
ｃｔｃｇａｇｇａｃｔｇｔｇｃｃｃａｇｇａｇｃａｇａｔｇｃｇｇｃｔｃａｇａｇｃｃｃａｇｇｔｇｃｇｃｃｔｇｃｔｔｇａｇａｃｃｃｇｇｇｔｃａａａｃａｇｃａａｃａｇｇｔｃａａｇａｔｃａａｇｃａｇｃｔｔｔｔｇｃａｇｇａｇａａｔｇａａｇｔｃｃａｇｔｔｃｃｔｔｇａｔａａａｇｇａｇａｔｇａｇａａｔａｃｔｇｔｃａｔｔｇａｔｃｔｔｇｇａａｇｃａａｇａｇｇｃａｇｔａｔｇｃａｇａｔｔｇｔｔｃａｇａｇａｔｔｔｔｃａａｔｇａｔｇｇｇｔａｔａａｇｃｔｃａｇｔｇｇａｔｔｔｔａｃａａａａｔｃａａａｃｃｔｃｔｃｃａｇａｇｃｃｃａｇｃａｇａａｔｔｔｔｃｔｇｔｔｔａｔｔｇｔｇａｃａｔｇｔｃｃｇａｔｇｇａｇｇａｇｇａｔｇｇａｃｔｇｔａａｔｔｃａｇａｇａｃｇａｔｃｔｇａｔｇｇｃａｇｔｇａａａａｃｔｔｔａａｃａｇａｇｇａｔｇｇａａａｇａｃｔａｔｇａａａａｔｇｇｃｔｔｔｇｇａａａｔｔｔｔｇｔｃｃａａａａａｃａｔｇｇｔｇａａｔａｔｔｇｇｃｔｇｇｇｃａａｔａａａａａｔｃｔｔｃａｃｔｔｃｔｔｇａｃｃａｃｔｃａａｇａａｇａｃｔａｃａｃｔｔｔａａａａａｔｃｇａｃｃｔｔｇｃａｇａｔｔｔｔｇａａａａａａａｔａｇｃｃｇｔｔａｔｇｃａｃａａｔａｔａａｇａａｔｔｔｃａａａｇｔｔｇｇａｇａｔｇａａａａｇａａｔｔｔｃｔａｃｇａｇｔｔｇａａｔａｔｔｇｇｇｇａａｔａｔｔｃｔｇｇａａｃａｇｃｔｇｇａｇａｔｔｃｃｃｔｔｇｃｇｇｇｇａａｔｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａｇｇｔｇｃａｇｔｇｇｔｇｇｇｃｔａｇｔｃａｃｃａａａｇａａｔｇａａａｔｔｃａｇｃａｃｇｔｇｇｇａｃａｇａｇａｔｃａｔｇａｃａａｃｔａｔｇａａｇｇｇａａｃｔｇｃｇｃａｇａａｇａａｇａｔｃａｇｔｃｔｇｇｃｔｇｇｔｇｇｔｔｔａａｃａｇｇｔｇｔｃａｃｔｃｔｇｃａａａｃｃｔｇａａｔｇｇｔｇｔａｔａｃｔａｃａｇｃｇｇｃｃｃｃｔａｃａｃｇｇｃｔａａａａｃａｇａｃａａｔｇｇｇａｔｔｇｔｃｔｇｇｔａｃａｃｃｔｇｇｃａｔｇｇｇｔｇｇｔｇｇｔａｔｔｃｔｃｔｇａａａｔｃｔｇｔｇｇｔｔａｔｇａａａａｔｔａｇｇｃｃａａａｔｇａｔｔｔｔａｔｔｃｃａａａｔｇｔａａｔｔ。
【0053】
フィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）の核酸配列は、以下のとおりであり：
ａｃｔｇｔｇａｇａｇａｇｇｃａｇｔａｔｔｇｇａａａｇｇｔａｔｇｃａｇａｔｔｇｔｔｃｃａａａａａａｃａｔｇｔｇｇａａａａａｔｃｔｔｇｇａｃｃａａａａａｔｃｔｔｇｃｃａｇａａｇａｃｔｔｃｔｔｔａａａａａｔｃｇａｃｃｔｔｇａａａａａｔｃｇａｃｃｔｔｇａａａａａａｔｔｇｃｃａｇｇｇａａａａｔｔｔｔｇａａａｇｃｔｔｇｃａａａｇｃｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａａａｇｃｔｔｔ
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【0054】
本発明、上記核酸分子の発現カセット、組換え菌、組換え細菌またはトランスジェニック細胞株を同時に提供した。
【0055】
実施例４：
上記フィブリノーゲン関連タンパク質１又は上記核酸分子又は前記組換え菌、組換え菌又はトランスジェニック細胞株の応用を提供するものであり、前記応用は、少なくとも以下のいずれか一つである：
（ｃ１）血栓の発生を阻害するための製品の製造、
（ｃ２）血栓程度を阻害するための製品の製造、
（ｃ３）血漿中のフィブリン活性を阻害するための製品の製造、
（ｃ４）血漿中のフィブリノーゲン集合を阻害するための製品の製造、
（ｃ５）線溶能力を高めるための製品の製造、
（ｃ６）血漿の活性化部分のトロンビン時間及び／またはプロトロンビン時間及び／またはトロンビン時間を延長するための製品の製造。
上記フィブリノーゲン関連タンパク質１又は上記核酸分子又は前記組換え菌、組換え菌又はトランスジェニック細胞株の応用を提供するものであり、前記応用は、少なくとも以下のいずれか一つである：
（ｃ１）血栓の発生を阻害するための製品の製造、
（ｃ２）血栓程度を阻害するための製品の製造、
（ｃ３）血漿中のフィブリン活性を阻害するための製品の製造、
（ｃ４）血漿中のフィブリノーゲン集合を阻害するための製品の製造、
（ｃ５）線溶能力を高めるための製品の製造、
（ｃ６）血漿の活性化部分のトロンビン時間及び／またはプロトロンビン時間及び／またはトロンビン時間を延長するための製品の製造。
【0056】
研究により、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）またはフィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）が血栓形成中のフィブリンの集合を阻害し、血栓関連疾患を治療する薬物の製造に用いることができることが示される。
【0057】
ここで、前記の、血栓関連疾患を治療する薬物は、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）またはフィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）を活性成分とする薬物である。前記の、血栓関連症を治療する薬物は多種の原因による血栓症を治療ために用いられてもよく、また血栓症の発生を予防するために用いられてもよく、同時に、フィブリンとの活性上昇、線溶能力の低下及び血漿の活性化部分トロンビン時間及び／またはプロトロンビン時間及び／またはトロンビン時間の短縮に関する多種の疾患の予防と治療に用いられてもよい。
【0058】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）は、フィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）を含み、その作用機序は、フィブリンγサブユニットと競合することによりフィブリノペプチドＡと結合することで、血栓形成中のフィブリン集合を阻害することができることである。
【0059】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）に対して突然変異を行って、フィブリノペプチドＡとの親和力を高め、薬効を向上させる目的を達成することができる。
【0060】
前記タンパク質の製造方法は以下のとおりである：前記タンパク質のコーディング遺伝子を真核発現ベクターにクローンして、無血清培養基で真核細胞を培養して前記タンパク質を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ親和力カラムを採用して精製し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬカラムでゲル濾過によってタンパク質をさらに精製し、高純度精製タンパク質を得る。
【0061】
前記製品は、ワクチン製品を含む薬物製品である。
【0062】
前記薬物製品タイプは、ＤＮＡ薬物、ｍＲＮＡ薬物、タンパク質薬物またはアデノウイルス薬物を含む。前記の、血栓系疾患の予防または治療のための薬物製品は、上記のタイプの製品を含むが、それらに限定されるものではなく、プラスミド被覆、微小球被覆、外分泌体携帯などの様々なキャリア形態で投与することができ、また、タンパク質と化合物の結合投与、タンパク質とペプチドの結合投与、タンパク質と小分子の結合投与などの様々な形態のキャリア形態で投与することができ、その最終的な目的は、本発明のフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）またはフィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）の生物活性を保証するために、異なる投与方式で活性成分を取り込んで、フィブリノーゲンの組み立てを阻害することである。
【0063】
前記製品には、血液脳関門を通過するための構造がさらに修飾される。
【0064】
前記修飾された、血液脳関門を通過する構造は脳標的化リガンドである。
【0065】
前記脳標的化リガンドは、ＲＶＧペプチド、ステアリン酸－トランスフェリン、キャリアプロテインＥを含むが、それらに限定されない。
【0066】
上記記載に基づいて、本発明に記載の、血栓系疾患の予防または治療のための薬物製品は、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）またはフィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）の生物活性を保証する前提で、さらにそれを多種の標的リガンドと結合することができ、比較的突出した標的リガンド修飾は、タンパク質またはドメインタンパク質を大脳標的化リガンドと結合し、血液脳関門（ＢＢＢ）を突破することに有利であり、それによって脳血栓の生体薬剤供給治療を実現するが、本発明の作用はこれに限定されず、同様に他の構造または形式の標的リガンドと結合することにより、異なる病巣に対する標的治療を実現することができる。
【0067】
前記薬物には、併用可能な治療用薬物がさらに含まれる。
【0068】
前記併用可能な治療用薬は、それぞれウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アルテプラーゼ、レチプラーゼまたは組織性フィブリノーゲン活性化因子である。
【0069】
フィブリノーゲン関連タンパク質１及びその突然変異体は、従来の抗血栓薬物（ウロキナーゼと組織型フィブリノーゲン活性化因子など）と効果的に協力し、かつ従来の抗血栓薬物の使用量を低減し、その毒副作用を緩和することができる。
【0070】
本発明は、前記タンパク質を発現可能な核酸分子又はそれを含む発現カセット、組換え菌、組換え細菌またはトランスジェニック細胞株を同時に提供した。
【0071】
実施例５：
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）とフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）は、フィブリン凝集を阻害する：
ａ．フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の製造：
フィブリノーゲン関連蛋白質１（ＦＧＬ１）タンパク質のコード遺伝子を真核発現ベクターにクローニングして、無血清培地で真核細胞を培養して前記蛋白質を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性カラムを用いて精製し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムを用いてゲル濾過により蛋白質を精製し、高純度精製された蛋白質を得て、ＳＤＳ－ＰＡＧＥはその純度を検証する。
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）とフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）は、フィブリン凝集を阻害する：
ａ．フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の製造：
フィブリノーゲン関連蛋白質１（ＦＧＬ１）タンパク質のコード遺伝子を真核発現ベクターにクローニングして、無血清培地で真核細胞を培養して前記蛋白質を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性カラムを用いて精製し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムを用いてゲル濾過により蛋白質を精製し、高純度精製された蛋白質を得て、ＳＤＳ－ＰＡＧＥはその純度を検証する。
【0072】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）Ｎｉ－ＮＴＡ親和力カラム精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥを図１に示す。
【0073】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）分子篩を図２に示す。
【0074】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）に分子篩をかけた後のＳＤＳ－ＰＡＧＥを図３に示す。
ｂ．フィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）は以下の方法で得られる：
フィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）の発現と精製：フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）タンパク質のコード遺伝子をテンプレートとして、ＰＣＲ及び相同組換え法を用いて発現ベクターを得る。無血清培養基で真核細胞を培養して前記タンパク質を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ親和力カラムを採用して精製し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムでゲル濾過によってタンパク質をさらに精製し、高純度精製タンパク質を得て、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでその純度を検証する。
ｂ．フィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）は以下の方法で得られる：
フィブリノーゲンドメインタンパク質（ＦＤ）の発現と精製：フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）タンパク質のコード遺伝子をテンプレートとして、ＰＣＲ及び相同組換え法を用いて発現ベクターを得る。無血清培養基で真核細胞を培養して前記タンパク質を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ親和力カラムを採用して精製し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムでゲル濾過によってタンパク質をさらに精製し、高純度精製タンパク質を得て、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでその純度を検証する。
【0075】
フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）Ｎｉ－ＮＴＡ親和性カラム精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥを図４に示す。
【0076】
【0077】
【0078】
ｃ．フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）はフィブリン凝集を阻害する：
【0079】
フィブリノプロテインは凝固因子Ｉとも呼ばれ、α２β２γ２の３つのサブユニットからなる六量体複合体は、血栓の重要な構成部分である。フィブリン凝集は、主にトロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎ及び凝固因子１３によって媒介される。凝固因子１３は、αまたはγサブユニットのＣ末端ドメインのアミノ酸の共有結合を触媒する。トロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎは、フィブリノプロテインのαとβサブユニット切断により、フィブリノペプチドＡ（Ｋｎｏｂ Ａ）及びフィブリノペプチドＢ（Ｋｎｏｂ Ｂ）を露出させる。露出したフィブリノペプチドＡ（Ｋｎｏｂ Ａ）とフィブリンＢ（Ｋｎｏｂ Ｂ）は、それぞれ別のフィブリン分子のγとβサブユニットのＣ末端ドメインに挿入されることにより、フィブリン凝集を促進する。組織型プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡは、直接にフィブリンを標的分解することができるが、一部の阻害因子の作用により、臨床上、その使用量は極めて大きく、それによる副作用は、主に神経毒性と出血である。研究によると、緩く構造化されたフィブリンが組織型プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡの分解効果の増強に寄与することが示される。フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）は、フィブリンの標的化によってフィブリン凝集を阻害することができる。
【0080】
実験方法は以下のとおりである．
【0081】
多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯは光散乱過程を測定し、計器の励起光を３５０ｎｍで、放射光を３５０ｎｍに調整する。対照群は３．３μＭのフィブリン、モデル群は３．３μＭのフィブリン＋２．５Ｕ／ｍｌトロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎ、投与群は３．３μＭのフィブリノーゲンタンパク質＋２．５Ｕ／ｍｌのトロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎ＋各用量のフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）である。以上の系はすべて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ±５ｍＭ ＣａＣｌ２溶液にあり、体積は１００マイクロリットル／ウェル（９６ウェルプレート）である。２５℃で１分ごとに１回試験し、動力学曲線を測定する。
【0082】
塩化カルシウムの非存在下でのフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のフィブリン凝集への影響を図７に示す。
【0083】
塩化カルシウムの存在下でのフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のフィブリン凝集への影響を図８に示す。
【0084】
走査型電子顕微鏡から見たフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）によるフィブリン凝集に対する比較を図１１に示す。
【0085】
ｄ．フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）はフィブリン凝集を阻害する：
【0086】
同様に、フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）は、フィブリンの標的化によってフィブリン凝集を阻害することができる。
【0087】
実験方法は以下のとおりである。
【0088】
多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯは光散乱過程を測定し、計器の励起光を３５０ｎｍで、放射光を３５０ｎｍに調整する。対照群は３．３μＭのフィブリン、モデル群は３．３μＭのフィブリン＋２．５Ｕ／ｍｌトロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎ、投与群は３．３μＭのフィブリノーゲンタンパク質＋２．５Ｕ／ｍｌのトロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎ＋各用量のフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）である。以上の系はすべて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ±５ｍＭ ＣａＣｌ２溶液にある。２５℃で１分ごとに１回Ａ３５０吸光値を検出し、動力学曲線を測定する。
【0089】
塩化カルシウムの非存在下でのフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のフィブリン凝集への影響を図９に示す。
【0090】
塩化カルシウムの存在下でのフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のフィブリン凝集への影響を図１０に示す。
【0091】
走査型電子顕微鏡から見たフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のフィブリノーゲン凝集への影響の比較を図１２に示し、ここで、フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）の処理下でフィブリノーゲンが凝集して形成された栓が細くなり、構造が緩くなることが明らかになる。
【0092】
実施例６：
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）及びフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のマウスへのプラスミド注射過剰発現によるトロンビン誘発性血栓症に対する保護作用：
１、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のマウスへのプラスミド注射過剰発現によるトロンビン誘発性血栓症に対する保護作用：
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）及びフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のマウスへのプラスミド注射過剰発現によるトロンビン誘発性血栓症に対する保護作用：
１、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のマウスへのプラスミド注射過剰発現によるトロンビン誘発性血栓症に対する保護作用：
【0093】
ａ．マウスの群分け：
雌性８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（１８－２２ ｇ）をランダムに３群に分け、正常対照群、モデル群、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）プラスミド注射群である。
雌性８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（１８－２２ ｇ）をランダムに３群に分け、正常対照群、モデル群、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）プラスミド注射群である。
【0094】
ｂ．フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）プラスミド注射及び過剰発現系の検証：
ｐｃＤＮＡ３．１キャリアのＦＧＬ１発現プラスミドを構築し、プラスミドをマウスの尾に静脈注射し、１００μｇ／２ ｍｌ ＰＢＳ／匹マウス、１８時間後にマウスの血漿を採取し、ＥＬＩＳＡにより血漿中の過剰発現ＦＧＬ１含有量を測定する。
ｐｃＤＮＡ３．１キャリアのＦＧＬ１発現プラスミドを構築し、プラスミドをマウスの尾に静脈注射し、１００μｇ／２ ｍｌ ＰＢＳ／匹マウス、１８時間後にマウスの血漿を採取し、ＥＬＩＳＡにより血漿中の過剰発現ＦＧＬ１含有量を測定する。
【0095】
ｃ．フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のトロンビン誘発性血栓モデルに対する保護作用：
トロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎ １５ Ｕ／２００μｌ ＰＢＳ／匹マウスの尾にモデルを静脈注射し、注射後１時間以内に各群のマウスの死亡数を記録し、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の過剰発現に対する保護率を計算する。
トロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎ １５ Ｕ／２００μｌ ＰＢＳ／匹マウスの尾にモデルを静脈注射し、注射後１時間以内に各群のマウスの死亡数を記録し、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の過剰発現に対する保護率を計算する。
【0096】
走査型電子顕微鏡から見たフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のマウス血栓形態への影響比較を図１３に示す。
【0097】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の凝集フィブリンに対する分解作用の対照を図１６に示す。
【0098】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）のマウスへのプラスミド注射過剰発現によるトロンビン誘導性血栓モデルの改善データの統計を図２１に示す。
【0099】
２、フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のマウスへのプラスミド注射過剰発現によるトロンビン誘導性血栓モデルに対する保護作用
【0100】
具体的な操作方法は前記ＦＧＬ１と同じである。
【0101】
走査型電子顕微鏡から見たフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のマウス血栓形態への影響の比較を図１４に示すが、ここで、フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）の処理により血栓が細く、構造が緩くなることが明らかである。
【0102】
フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）による凝集フィブリンに対する分解作用の対照を図１５に示す。
【0103】
フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）のマウスへのプラスミド注射過剰発現によるトロンビン誘導性血栓モデルの改善データの統計を図２２に示す。
【0104】
実施例７：
ＲＶＧペプチド修飾は、マウス血液脳関門へのフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の進入を促進する：
ＲＶＧペプチド修飾は、マウス血液脳関門へのフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の進入を促進する：
【0105】
ａ．試験材料：
ＲＶＧ２９－Ｃｙｓ （ＹＴＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧＧＧＧＧＧＣ）ポリペプチドは南京金斯瑞によって合成され、ａ－ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ｕ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ （ＭＡＬ－ＰＥＧ－ＮＨＳ、分子量２．１ ｋＤａ）はアメリカのＣｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ社から購入され、ＮＨＳ－ｃｙ５．５染料はサイマー社が購入された。
ＲＶＧ２９－Ｃｙｓ （ＹＴＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧＧＧＧＧＧＣ）ポリペプチドは南京金斯瑞によって合成され、ａ－ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ｕ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ （ＭＡＬ－ＰＥＧ－ＮＨＳ、分子量２．１ ｋＤａ）はアメリカのＣｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ社から購入され、ＮＨＳ－ｃｙ５．５染料はサイマー社が購入された。
【0106】
ｂ．ＭＡＬ－ＰＥＧ修飾フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）（ＭＡＬ－ＰＥＧ－ＦＧＬ１）の製造：
ＭＡＬ－ＰＥＧ－ＮＨＳとフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）を、ＰＢＳ（ｐＨ ８．０、０．３ ｍＬ）中においてモル比１：２で室温で３時間反応させ、１０ｋＤａの濃縮管で濃縮して未反応のＭＡＬ－ＰＥＧ－ＮＨＳを置換する。
ＭＡＬ－ＰＥＧ－ＮＨＳとフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）を、ＰＢＳ（ｐＨ ８．０、０．３ ｍＬ）中においてモル比１：２で室温で３時間反応させ、１０ｋＤａの濃縮管で濃縮して未反応のＭＡＬ－ＰＥＧ－ＮＨＳを置換する。
【0107】
ｃ．ＲＶＧ２９－Ｃｙｓ－ＰＥＧ修飾フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）（ＲＶＧ２９－Ｃｙｓ－ＰＥＧ－ＦＧＬ１）の製造：
ＲＶＧ２９－ＣｙｓペプチドとＭＡＬ－ＰＥＧ－ＦＧＬ１をＰＢＳ（ｐＨ７．０、０．３ｍＬ）中においてモル比５：１で室温で２４時間反応させ、１０ｋＤａの濃縮管で濃縮して未反応のＲＶＧ２９－Ｃｙｓペプチドを置換する。
ＲＶＧ２９－ＣｙｓペプチドとＭＡＬ－ＰＥＧ－ＦＧＬ１をＰＢＳ（ｐＨ７．０、０．３ｍＬ）中においてモル比５：１で室温で２４時間反応させ、１０ｋＤａの濃縮管で濃縮して未反応のＲＶＧ２９－Ｃｙｓペプチドを置換する。
【0108】
ｄ．ＮＨＳ－ｃｙ５．５で標識したＲＶＧ２９－Ｃｙｓ－ＰＥＧ－ＦＧＬ１タンパク質の製造：
【0109】
１０μｇのＮＨＳ－ｃｙ５．５と１０ｍｇのＲＶＧ２９－Ｃｙｓ－ＰＥＧ－ＦＧＬ１をＰＢＳ（ｐＨ８．０、０．３ｍＬ）中において室温で１時間反応させ、１０ｋＤａの濃縮管で濃縮して未反応のＮＨＳ－ｃｙ５．５を置換する。
【0110】
ｅ．ＮＨＳ－ｃｙ５．５で標識したＲＶＧ２９－Ｃｙｓ－ＰＥＧ－ＦＧＬ１タンパク質の脳組織中の蛍光含有量を観察する。
【0111】
雌性８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（１８－２２ｇ）匹は、ランダムに３群、すなわち正常対照群、ＮＨＳ－ｃｙ５．５で標識したＦＧＬ１群とＮＨＳ－ｃｙ５．５で標識したＲＶＧ２９－Ｃｙｓ－ＰＥＧ－ＦＧＬ１群に分けられ、マウスの尾に１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質を静脈注射し、１時間、２時間、６時間後に小動物イメージャ（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲ）を用いてマウス器官中のタンパク質の分布を観察する。
【0112】
ＲＶＧペプチドとＣｙ５．５蛍光を用いたフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）を修飾する操作フローを図２３に示す。
【0113】
マウス脳組織におけるＲＶＧペプチド修飾促進フィブリノーゲン相関タンパク質１（ＦＧＬ１）の分布検出結果を図２４に示す。
【0114】
実施例８：
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）と組織型フィブリノーゲン活性化因子ｔＰＡの相乗的使用：
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）と組織型フィブリノーゲン活性化因子ｔＰＡの相乗的使用：
【0115】
ａ．フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）と組織型フィブリノーゲン活性化因子ｔＰＡの相乗的使用によりフィブリンの凝集を促進する：
【0116】
実験方法は以下のとおりである：
【0117】
多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯは光散乱過程を測定し、計器の励起光を３５０ｎｍで、放射光を３５０ｎｍに調整する。対照群は３．３μＭのフィブリン、モデル群は３．３μＭのフィブリン＋２．５Ｕ／ｍｌトロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎである。上記系はすべて２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ±１０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液にあり、体積は１００マイクロリットル／ウェル（９６ウェルプレート）である。ゲル状のフィブリン形成１時間後、２ ｎＭ 組織型プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡ ＋ 各用量のフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）を添加する。２５℃で、１分間ごとに１回、Ａ３５０吸光値を測定し、動力学曲線を測定する。
【0118】
ｂ．フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）と組織型フィブリノーゲン活性化因子ｔＰＡの相乗的使用による血栓溶解促進：
【0119】
方法は次のとおりである。
【0120】
1）血栓の製造：
【0121】
最初に９６ウェルプレートに５マイクロリットルの血栓促進滴液（Ｉｎｎｏｖｉｎ＋ＣａＣｌ２）をウェル壁底部に沿って添加し、次に２５マイクロリットルの新鮮なマウス血液をウェル壁底部に添加する。３７℃で３０分間インキュベートすると、新たに製造した血栓サンプルが得られる。
【0122】
2）血栓の溶解：
【0123】
対照群は試薬対照であり、投与群は、２ｎＭ組織型フィブリノーゲン活性化因子ｔＰＡ、各用量のフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の単独用及び併用群である。３７℃で、多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯを用いて、５１０ｎｍの励起光の吸光度を１分に１回測定し、動力学曲線を測定する。
【0124】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）と組織型フィブリノーゲン活性化因子ｔＰＡとの相乗的使用によるフィブリン凝集の溶解の比較を図１７に示す。
【0125】
実施例９：
フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）と組織型プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡとの相乗的使用：
ａ．フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）と組織型プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡとの相乗的使用によってフィブリン凝集を促進する
フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）と組織型プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡとの相乗的使用：
ａ．フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）と組織型プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡとの相乗的使用によってフィブリン凝集を促進する
【0126】
実験方法は以下のとおりである：
多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯは光散乱過程を測定し、計器の励起光を３５０ｎｍで、放射光を３５０ｎｍに調整する。対照群は３．３μＭのフィブリン、モデル群は３．３μＭのフィブリン＋２．５Ｕ／ｍｌトロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎである。上記系はすべて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ±１０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液にあり、体積は１００マイクロリットル／ウェル（９６ウェルプレート）である。ゲル状のフィブリン形成１時間後、１００マイクロリットル、２ｎＭ組織型フィブリノーゲン活性化因子ｔＰＡ＋各用量のフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）を添加する。２５℃で、１分間ごとに１回、Ａ３５０吸光値を測定し、動力学曲線を測定する。
多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯは光散乱過程を測定し、計器の励起光を３５０ｎｍで、放射光を３５０ｎｍに調整する。対照群は３．３μＭのフィブリン、モデル群は３．３μＭのフィブリン＋２．５Ｕ／ｍｌトロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎである。上記系はすべて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ±１０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液にあり、体積は１００マイクロリットル／ウェル（９６ウェルプレート）である。ゲル状のフィブリン形成１時間後、１００マイクロリットル、２ｎＭ組織型フィブリノーゲン活性化因子ｔＰＡ＋各用量のフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）を添加する。２５℃で、１分間ごとに１回、Ａ３５０吸光値を測定し、動力学曲線を測定する。
【0127】
ｂ．フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）と組織型プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡとの相乗的使用によって血栓の溶解を促進する：
【0128】
方法は次のとおりである。
【0129】
1）血栓の製造：
【0130】
最初に９６ウェルプレートに５マイクロリットルの血栓促進滴液（Ｉｎｎｏｖｉｎ＋ＣａＣｌ２）をウェル壁の底部に沿って添加し、次に２５マイクロリットルの新鮮なマウス血液をウェル壁底部に添加する。３７℃で３０分間インキュベートすると、新たに製造した血栓サンプルが得られる。
【0131】
2）血栓の溶解：
【0132】
対照群は試薬対照であり、投与群は、２ｎＭ組織型フィブリノーゲン活性化因子ｔＰＡ、各用量のフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）の単独用及び併用群である。３７℃で、多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯを用いて、５１０ｎｍの励起光の吸光度を１分に１回測定し、動力学曲線を測定する。
【0133】
フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）と組織型フィブリノーゲン活性化因子ｔＰＡとの相乗的使用によるフィブリン凝集の溶解の比較を図１８に示す。
【0134】
実施例１０：
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）とウレキナーゼｕＰＡの相乗的使用：
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）とウレキナーゼｕＰＡの相乗的使用：
【0135】
ａ．フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）とウレキナーゼｕＰＡの相乗的使用によりフィブリンの凝集を促進する：
【0136】
実験方法は以下のとおりである：
【0137】
多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯは光散乱過程を測定し、計器の励起光を３５０ｎｍで、放射光を３５０ｎｍに調整する。対照群は３．３μＭのフィブリン、モデル群は３．３μＭのフィブリン＋２．５Ｕ／ｍｌトロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎである。上記系はすべて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ±１０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液にあり、体積は１００マイクロリットル／ウェル（９６ウェルプレート）である。ゲル状のフィブリン形成１時間後、１００マイクロリットル、８００Ｕ／ｍｌウレキナーゼｕＰＡ＋各用量のフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）を添加した。２５℃で、１分間ごとに１回、Ａ３５０吸光値を測定し、動力学曲線を測定する。
【0138】
ｂ．フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）とウレキナーゼｕＰＡの相乗的使用により血栓の溶解を促進する：
【0139】
方法は次のとおりである。
【0140】
1）血栓の製造：
最初に９６ウェルプレートに５マイクロリットルの血栓促進滴液（Ｉｎｎｏｖｉｎ＋ＣａＣｌ２）をウェル壁底部に沿って添加し、次に２５マイクロリットルの新鮮なマウス血液をウェル壁底部に添加する。３７℃で３０分間インキュベートすると、新たに製造した血栓サンプルが得られる。
最初に９６ウェルプレートに５マイクロリットルの血栓促進滴液（Ｉｎｎｏｖｉｎ＋ＣａＣｌ２）をウェル壁底部に沿って添加し、次に２５マイクロリットルの新鮮なマウス血液をウェル壁底部に添加する。３７℃で３０分間インキュベートすると、新たに製造した血栓サンプルが得られる。
【0141】
2）血栓の溶解：
【0142】
対照群は試薬対照であり、投与群は８００Ｕ／ｍｌウレキナーゼｕＰＡ、各用量のフィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）の単独用及び併用群である。３７℃で、多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯを用いて、５１０ｎｍの励起光の吸光度を１分に１回測定し、動力学曲線を測定する。
【0143】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）とウレキナーゼｕＰＡとの相乗的使用によるフィブリン凝集の溶解の比較を図１９に示す。
【0144】
実施例１１：
【0145】
フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）とウロキナーゼｕＰＡの相乗的使用：
ａ．フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）とウレキナーゼｕＰＡの相乗的使用によりフィブリンの凝集を促進する：
ａ．フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）とウレキナーゼｕＰＡの相乗的使用によりフィブリンの凝集を促進する：
【0146】
実験方法は以下のとおりである：
多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯは光散乱過程を測定し、計器の励起光を３５０ｎｍで、放射光を３５０ｎｍに調整する。対照群は３．３μＭのフィブリン、モデル群は３．３μＭのフィブリン＋２．５Ｕ／ｍｌトロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎである。上記系はすべて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ±１０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液にあり、体積は１００マイクロリットル／ウェル（９６ウェルプレート）である。ゲル状のフィブリン形成１時間後、１００マイクロリットル、２８００Ｕ／ｍｌウレキナーゼｕＰＡ＋各用量のフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）を添加する。２５℃で、１分間ごとに１回、Ａ３５０吸光値を測定し、動力学曲線を測定する。
多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯは光散乱過程を測定し、計器の励起光を３５０ｎｍで、放射光を３５０ｎｍに調整する。対照群は３．３μＭのフィブリン、モデル群は３．３μＭのフィブリン＋２．５Ｕ／ｍｌトロンビンＴｈｒｏｍｂｉｎである。上記系はすべて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ±１０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液にあり、体積は１００マイクロリットル／ウェル（９６ウェルプレート）である。ゲル状のフィブリン形成１時間後、１００マイクロリットル、２８００Ｕ／ｍｌウレキナーゼｕＰＡ＋各用量のフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）を添加する。２５℃で、１分間ごとに１回、Ａ３５０吸光値を測定し、動力学曲線を測定する。
【0147】
ｂ．フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）とウロキナーゼｕＰＡの相乗的使用によって血栓溶解を促進する
【0148】
方法は次のとおりである。
【0149】
1）血栓の製造：
最初に９６ウェルプレートに５マイクロリットルの血栓促進滴液（Ｉｎｎｏｖｉｎ＋ＣａＣｌ２）をウェル壁底部に沿って添加し、次に２５マイクロリットルの新鮮なマウス血液をウェル壁底部に添加する。３７℃で３０分間インキュベートすると、新たに製造した血栓サンプルが得られる。
最初に９６ウェルプレートに５マイクロリットルの血栓促進滴液（Ｉｎｎｏｖｉｎ＋ＣａＣｌ２）をウェル壁底部に沿って添加し、次に２５マイクロリットルの新鮮なマウス血液をウェル壁底部に添加する。３７℃で３０分間インキュベートすると、新たに製造した血栓サンプルが得られる。
【0150】
2）血栓の溶解：
対照群は試薬対照であり、投与群は８００Ｕ／ｍｌウレキナーゼｕＰＡ、各用量のフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）の単独用及び併用群である。３７℃で、多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯを用いて、５１０ｎｍの励起光の吸光度を１分に１回測定し、動力学曲線を測定する。
対照群は試薬対照であり、投与群は８００Ｕ／ｍｌウレキナーゼｕＰＡ、各用量のフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）の単独用及び併用群である。３７℃で、多機能マイクロプレートリーダーＭ２００ＰＲＯを用いて、５１０ｎｍの励起光の吸光度を１分に１回測定し、動力学曲線を測定する。
【0151】
フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）とウレキナーゼｕＰＡとの相乗的使用によるフィブリン凝集の溶解の比較を図２０に示す。
【0152】
実施例１２：
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）及びフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）は、比較的に低い毒性副作用がある：
雌性８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（１８－２２ｇ）６０匹、ランダムに５群に分け、すなわち正常対照群、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）１００ｍｇ／ｋｇ、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）３０ｍｇ／ｋｇ、フィブリノーゲン構造ドメイン（ＦＤ）１００ｍｇ／ｋｇ、フィブリノーゲン構造ドメイン（ＦＤ）３０ｍｇ／ｋｇ、アジプラーゼ１０ｍｇ／ｋｇ、尾静脈投与１時間、ペントバルビタールナトリウムでマウスを麻酔し、出血時間測定を行う。マウスの尾の先端から５ ｍｍで切断し、同時にストップウォッチで計時を開始する。血痕が濾紙シートに印刷されなくなるまで、１０秒おきに清潔な濾紙片で断端を拭き取り、計時を停止し、所要時間を記録する。これがマウス尾出血時間である。２時間後、マウス血漿を採取し、血漿中のフィブリノーゲン含有量を測定する。
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）及びフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）は、比較的に低い毒性副作用がある：
雌性８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（１８－２２ｇ）６０匹、ランダムに５群に分け、すなわち正常対照群、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）１００ｍｇ／ｋｇ、フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）３０ｍｇ／ｋｇ、フィブリノーゲン構造ドメイン（ＦＤ）１００ｍｇ／ｋｇ、フィブリノーゲン構造ドメイン（ＦＤ）３０ｍｇ／ｋｇ、アジプラーゼ１０ｍｇ／ｋｇ、尾静脈投与１時間、ペントバルビタールナトリウムでマウスを麻酔し、出血時間測定を行う。マウスの尾の先端から５ ｍｍで切断し、同時にストップウォッチで計時を開始する。血痕が濾紙シートに印刷されなくなるまで、１０秒おきに清潔な濾紙片で断端を拭き取り、計時を停止し、所要時間を記録する。これがマウス尾出血時間である。２時間後、マウス血漿を採取し、血漿中のフィブリノーゲン含有量を測定する。
【0153】
フィブリノーゲン関連タンパク質１（ＦＧＬ１）とウィチノゲンドメイン（ＦＤ）はフィブリノーゲンの損失（Ａ）と流血時間（Ｂ）に対して明らかな影響がなく（毒性副作用無し）、結果を図２５に示す。
【0154】
実施例１３：
このタンパク質アミノ酸配列におけるいくつかの重要な部位を突然変異させ、血栓形成阻害機能を強化する効果も実現することができ、本実施例において、２０４位と２６９位の重要な部位のセリン突起を突然変異処理し、アラニンに突然変異し、さらに実施例６の方法を用いて突然変異後のフィブリノーゲン構造ドメイン（ＦＤ）を処理し、得られたフィブリノーゲン構造ドメイン（ＦＤ）突然変異体の凝集フィブリノーゲンに対する分解作用の対照を図２７に示す。図２７の比較結果から、突然変異体による凝集フィブリンの分解は、非突然変異形態に比べて明らかに高まることが明らかになる。
このタンパク質アミノ酸配列におけるいくつかの重要な部位を突然変異させ、血栓形成阻害機能を強化する効果も実現することができ、本実施例において、２０４位と２６９位の重要な部位のセリン突起を突然変異処理し、アラニンに突然変異し、さらに実施例６の方法を用いて突然変異後のフィブリノーゲン構造ドメイン（ＦＤ）を処理し、得られたフィブリノーゲン構造ドメイン（ＦＤ）突然変異体の凝集フィブリノーゲンに対する分解作用の対照を図２７に示す。図２７の比較結果から、突然変異体による凝集フィブリンの分解は、非突然変異形態に比べて明らかに高まることが明らかになる。
【0155】
最後に説明すべきこととして、以上の各実施例は、本発明の技術的解決手段を説明するためにのみ使用され、それを制限するのではなく、前記各実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、当業者は、前記各実施例に記載された技術的解決手段を修正したり、その一部またはすべての技術的特徴を同等に置換することができ、これらの修正または置換は、それぞれの技術的解決手段の本質を本発明の各実施例の技術的解決手段の範囲から逸脱させるものではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】