特表 2024-539411 細胞内送達組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】細胞内送達組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/59 20170101AFI20241018BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20241018BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241018BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20241018BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20241018BHJP

【ＦＩ】

A61K47/59

A61K47/64

A61P35/00

A61K39/395 T

A61K39/395 E

C07K19/00 ZNA

C07K16/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024527063

(86)(22)【出願日】2022-11-03

(85)【翻訳文提出日】2024-07-01

(86)【国際出願番号】 IL2022051164

(87)【国際公開番号】W WO2023079553

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】63/275,049

(32)【優先日】2021-11-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/348,114

(32)【優先日】2022-06-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524167887

【氏名又は名称】ビオンド バイオロジクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】シロヴィツキー，オリット

(72)【発明者】

【氏名】チェン ゼルツバーグ，ライラック

(72)【発明者】

【氏名】ウザン グエタ，ロジ ラビト

(72)【発明者】

【氏名】ルーコウィッツ，アヤラ

(72)【発明者】

【氏名】ゴットフリード，ヨッシ

(72)【発明者】

【氏名】ファイゲンボイム‐オルナイ，ロテム

(72)【発明者】

【氏名】エイロン，バット－ヘン

(72)【発明者】

【氏名】フレイリッヒ，シャイ

(72)【発明者】

【氏名】ハキム，モッティ

(72)【発明者】

【氏名】サピル，ヤイール

(72)【発明者】

【氏名】マンデル，イラナ

(72)【発明者】

【氏名】ベン‐モシェ，テヒラ

(72)【発明者】

【氏名】シュルマン，アビドール

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB13

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA21

4C085BB01

4C085EE01

4C085GG02

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA72

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA50

(57)【要約】

複数のアミン基、細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロードおよびこれらを連結するリンカーを含むタンパク質担体を含み、アミン基の少なくとも一部は、保護基に結合される、タンパク質コンジュゲートが提供される。タンパク質コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびにタンパク質コンジュゲートを使用するおよび産生する方法も提供される。
【選択図】図３２Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロードを含むタンパク質コンジュゲートであって、前記生物学的ペイロードは、複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合され、前記アミン基の少なくとも一部は、保護基に結合されかつ前記保護基は、７未満のｐＨ値で切断を受けることができ；かつ負のゼータ電位により特徴づけられる、タンパク質コンジュゲート。

【請求項2】

ａ．複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合されるタンパク質担体；
ｂ．細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロード；および
ｃ．前記タンパク質担体と前記生物学的ペイロードの間のリンカー、
を含む、タンパク質コンジュゲートであって、
前記アミン基の少なくとも一部は、保護基に結合され；
前記保護基は、７未満のｐＨ値で切断を受けることができ；
および負のゼータ電位により特徴づけられる、タンパク質コンジュゲート。

【請求項3】

前記保護基を欠く類似のタンパク質コンジュゲートに比べて高められた血液中安定性により特徴づけられる、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項4】

前記保護基を欠く類似のタンパク質コンジュゲートに比べて、７未満のｐＨ値を有する生体組織内での増大した蓄積により特徴づけられ、任意に前記生体組織は、腫瘍である、請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項5】

前記複数のアミン基は、一級アミン、二級アミン、または両方を含み；かつ複数のアミン基の少なくとも５０％は、前記保護基に結合される、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項6】

前記リンカーは、共有結合により前記担体、前記ペイロードまたは両方に連結される、請求項２～５のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項7】

前記保護基は、６～８の間のｐＨで負に荷電される部分を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項8】

前記部分は、カルボキシ基を含む、請求項７に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項9】

前記保護基は、式１：

【化1】

、により表され、式中、ｎは、０～５の範囲の整数であり；

【化2】

は、前記アミン基への付着点を表し、および

【化3】

は、単結合または二重結合を表し；ＲおよびＲ_１はそれぞれ独立に、Ｈ、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるシクロアルキル、任意に置換されるアリールまたはヘテロアリール、およびカルボキシアルキル、またはこれらの組み合わせから選択される置換基を表し；またはＲおよびＲ_１は、環を形成するように一緒に結合される、請求項７または８に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項10】

ＲおよびＲ_１の１個は、ＨでありかつＲおよびＲ_１の別の１個は、アルキルまたはカルボキシアルキルを含む、請求項９に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項11】

前記保護基は、

【化4】

であって、その任意の塩を含み、ＲおよびＲ_１は、Ｈおよびメチルから選択され、かつＲまたはＲ_１は、メチルであり、任意に前記保護基は、無水シトラコン酸由来である、請求項７～１０のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項12】

前記細胞浸透性部分は、ポリアミンおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）から選択される陽イオンポリマーを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項13】

前記ＰＥＩは、２０００ダルトン未満の分子量を有する直鎖ＰＥＩまたは分岐ＰＥＩである、請求項１２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項14】

前記ＰＥＩは、１００～１０００ダルトンの分子量を含む、請求項１２または１３に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項15】

前記生物学的ペイロードは、前記細胞内標的を結合する抗原結合分子である、請求項１～１４のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項16】

前記生物学的ペイロードは、切断されると前記細胞内標的との相互作用を減らすジスルフィド結合を欠く、請求項１～１５のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項17】

前記抗原結合分子は、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、可変重鎖ホモダイマー（ＶＨＨ）、ナノボディ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）および抗体ミメティックタンパク質から選択される、請求項１５または１６に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項18】

前記抗原結合分子は、ＶＨＨおよびＤＡＲＰｉｎから選択される、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項19】

前記タンパク質担体または生物学的ペイロードは、複数のＰＥＩ分子を含み、任意に前記タンパク質担体は、２～３０個のＰＥＩ分子を含む、請求項２～１８のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項20】

前記タンパク質担体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、請求項２～１９のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項21】

前記ＨＳＡは、３～１０個のＰＥＩ分子を含む、請求項２０に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項22】

前記リンカーは、生体適合性ポリマー、生分解性ポリマーまたは両方を含む、請求項２～２１のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項23】

前記生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、任意に前記生分解性ポリマーは、ポリアミノ酸を含み、前記リンカーは、（ｉ）前記生体適合性ポリマーまたは前記生分解性ポリマーにおよび（ｉｉ）前記タンパク質担体に共有結合されるスペーサーを更に含み、かつ共有結合は、クリック反応生成物を介する、請求項２２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項24】

前記リンカーは、生体切断可能な結合を含み、任意に前記生体切断可能な結合は、ジスルフィド結合を含む、請求項２～２３のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項25】

前記リンカーは、少なくとも２４時間にわたり血液中で実質的に安定であり、かつ前記リンカーは、ペプチドリンカーである、請求項２～２４のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項26】

安定は、２４時間後に血液中で２５％未満の切断を含む、請求項２５に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項27】

前記生体切断可能な結合は、立体的に障害される、請求項２４～２６のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項28】

前記ＨＳＡは、配列番号１のアミノ酸配列、またはシステイン３４（Ｃ３４）を含むそのフラグメントまたは相同体を含む、請求項２１～２７のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項29】

前記リンカーは、ジスルフィド結合を介して前記ＨＳＡに結合される、請求項２８に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項30】

前記リンカーは、ＨＳＡの前記Ｃ３４に結合される、請求項２９に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項31】

前記ジスルフィド結合は、前記Ｃ３４の近位にある、請求項９に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項32】

前記近位は、５～１５オングストロームの範囲の前記Ｃ３４からの距離である、請求項３１に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項33】

前記タンパク質担体は、ＤＮＡを欠く、請求項１～３２のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項34】

前記生物学的ペイロードは、細胞表面タンパク質を結合しない、請求項１～３３のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項35】

前記タンパク質コンジュゲートは、－１ｍＶ未満の負のゼータ電位により特徴づけられる、請求項１～３４のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項36】

検出可能なタグを更に含み、任意に前記タグは、前記生物学的ペイロードにコンジュゲートされる、請求項１～３５のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項37】

前記タンパク質コンジュゲートは、細胞浸透性コンジュゲートである、請求項１～３６のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項38】

前記保護基は、無水シトラコン酸由来であり、任意にクリック反応生成物は、スクシンイミドチオエーテルである、請求項１～３７のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項39】

標的細胞の表面上で発現されるタンパク質に結合するターゲティング部分を更に含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項40】

前記ターゲティング部分は、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、可変重鎖ホモダイマー（ＶＨＨ）、ナノボディ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）および抗体ミメティックタンパク質から選択される、請求項３９に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項41】

前記ターゲティング部分は、リンカーを介して前記タンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項３９または４０に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項42】

前記ターゲティング部分および前記生物学的ペイロードは、単一ポリペプチドに含まれ、任意に前記ターゲッティング部分および前記生物学的ペイロードは、リンカーにより分離される、請求項３９または４０に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項43】

前記ターゲティング部分は、前記生物学的ペイロードに対しＮ末端でありまたは前記生物学的ペイロードは、前記ターゲティング部分に対しＮ末端である、請求項４２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項44】

細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する方法であって、
ａ．前記細胞内標的を結合する生物学的ペイロードを提供することであって、前記生物学的ペイロードは、複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合される、提供すること；および
ｂ．保護アミン基を含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを得るために、７未満のｐＨ値で切断を受けることができる保護基により前記アミン基の少なくとも一部を保護するのに十分な条件下で生物学的ペイロードを提供すること、
を含み、それにより細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する、方法。

【請求項45】

細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する方法であって、
ａ．前記細胞内標的に結合する生物学的ペイロードを提供すること；
ｂ．複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体を提供すること；
ｃ．タンパク質コンジュゲートを産生するためにリンカーを介して前記タンパク質担体に前記生物学的ペイロードを共有結合させるのに十分な条件下で前記生物学的ペイロードおよび前記タンパク質担体を提供すること；および
ｄ．保護アミン基を含む前記電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを得るために、７未満のｐＨ値で切断を受けることができる保護基により前記アミン基の少なくとも一部を保護するのに十分な条件下で前記タンパク質担体を提供すること、
を含み、
それにより細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する、方法。

【請求項46】

ヒト血液、血漿または血清中でおよび細胞質条件中で前記リンカーの安定性を決定すること；およびヒト血液、血漿または血清中で安定でありかつ前記細胞質条件中で不安定であるリンカーを含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを選択することを更に含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

中性または塩基性ｐＨでおよび酸性ｐＨで前記保護アミン基の安定性を決定することおよび中性または塩基性ｐＨで安定でありかつ酸性ｐＨで不安定である保護されたアミン基を含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを選択することを更に含む、請求項４５または４６に記載の方法。

【請求項48】

保護するために十分な条件下で前記タンパク質担体を前記提供することは、前記タンパク質担体へ前記生物学的ペイロードを前記結合することの前にまたは前記タンパク質担体へ前記生物学的ペイロードを前記結合することの後に起こる、請求項４５～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記決定することは、前記タンパク質コンジュゲートの形成の前にまたは前記電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートの形成の後で実施される、請求項４７に記載の方法。

【請求項50】

前記タンパク質担体は、ＨＳＡを含む、請求項４５～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記細胞浸透性部分は、少なくとも１個のＰＥＩを含む、請求項４４～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

前記電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、負のゼータ電位により特徴づけられる、請求項４４～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記複数のアミン基は、一級アミン、二級アミン、または両方を含み；かつ前記複数のアミン基の少なくとも８０％は、保護されたアミン基である、請求項４４～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記保護基は、６～８の間のｐＨで負に荷電される部分を含む、請求項４４～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記部分は、カルボキシ基を含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記タンパク質担体または生物学的ペイロードは、少なくとも２分子のＰＥＩに共有結合され、任意に前記タンパク質担体は、少なくとも８分子のＰＥＩに共有結合される、請求項４４～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記生物学的ペイロードは、切断されると前記細胞内標的への結合を減らすジスルフィド結合を欠く、請求項４４～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを細胞と接触させることおよび前記生物学的ペイロードが前記細胞の細胞質に侵入することを確認することを更に含む、請求項４４～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

安定は、２４時間後に血液中での２５％未満の切断を含みかつ不安定は、２４時間後に細胞質条件での少なくとも５０％の切断を含む、請求項４６～５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

前記リンカーは、生体適合性ポリマーを含む、請求項４５～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

前記共有的に連結することは、クリック反応を介する、請求項４５～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記生物学的ペイロードは、第１の反応基を含むリンカーに共有結合され；かつ前記タンパク質担体は、前記第１の反応基に対し反応性を有する第２の反応基を含むリンカーに共有結合され；かつタンパク質担体に前記生物学的ペイロードを共有結合させるために十分な前記条件は、前記第１の反応基を前記第２の反応基と反応させることを含み、それにより前記生物学的製剤および前記タンパク質担体を共有的に連結する、請求項４５～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記リンカーは、生体切断可能な結合を含む、請求項４５～６２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項64】

前記共有的に連結することは、ジスルフィド結合形成を含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

（ｉ）前記生物学的ペイロードは、前記タンパク質担体のシステインとジスルフィド結合を生成できるリンカーに共有結合される；または（ｉｉ）前記タンパク質担体は、前記生物学的ペイロードのシステインとジスルフィド結合を生成できるリンカーに共有結合され、かつ結合されるは任意に、ジスルフィド結合を介する、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

標的細胞の表面上で発現されるタンパク質に結合するターゲティング部分を選択することおよび前記生物学的ペイロード、前記タンパク質担体または前記タンパク質コンジュゲートに前記ターゲティング部分をコンジュゲートすることを更に含む、請求項４４～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記ターゲティング部分は、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、可変重鎖ホモダイマー（ＶＨＨ）、ナノボディ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）および抗体ミメティックタンパク質から選択される、請求項６６に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項68】

前記ターゲティング部分および前記生物学的ペイロードは、単一ポリペプチドに含まれ、任意に前記ターゲティング部分および前記生物学的ペイロードは、リンカーにより分離される、請求項６６または６７に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項69】

前記ターゲティング部分は、前記生物学的ペイロードに対しＮ末端でありまたは前記生物学的ペイロードは、前記ターゲティング部分に対しＮ末端である、請求項６８に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項70】

前記電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、請求項１～４３のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲートである、請求項４４～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

請求項４４～７０のいずれか１項に記載の方法により産生されたタンパク質コンジュゲート。

【請求項72】

請求項１～４３および７１のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲートおよび薬学的に許容可能な担体、賦形剤または補助剤を含む、医薬組成物。

【請求項73】

全身投与用に処方される、請求項７２に記載の医薬組成物。

【請求項74】

前記組成物は、徐放性組成物でありかつ投与後少なくとも２～３日間にわたり標的細胞の細胞質中に前記生物学的ペイロードを放出する、請求項７２または７３に記載の医薬組成物。

【請求項75】

細胞内標的を結合する方法であって、前記細胞内標的を発現する細胞を請求項１～４３および７１のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲートまたは請求項７２～７４のいずれか１項に記載の医薬組成物と接触させることを含み、前記生物学的ペイロードは、前記細胞内標的を結合し、それにより前記細胞内標的を結合する、方法。

【請求項76】

細胞内標的を検出する方法でありかつ前記タンパク質コンジュゲートは、検出可能なタグを含み、かつ前記検出可能なタグを検出することを更に含む、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記細胞内標的を調節する方法でありかつ前記生物学的ペイロードは、前記細胞内標的の作動薬または拮抗薬である、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記細胞は、対象中にありかつ前記接触させることは、前記対象に請求項１～４３および７０のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲートまたは請求項７１～７３のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、請求項７５～７７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項79】

前記細胞は、標的表面タンパク質を発現しかつ前記タンパク質コンジュゲートは、前記標的表面タンパク質に結合するターゲティング部分を含む、請求項７５～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

それを必要としている対象における状態を治療する方法であり、前記状態は、前記細胞内標的の調節により治療可能である、請求項７８または７９に記載の方法。

【請求項81】

前記状態は、癌または炎症を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記状態は、癌であり、前記細胞内標的は、発癌性でありかつ前記生物学的ペイロードは、拮抗薬であり、任意で前記癌は、癌特異的抗原である標的表面タンパク質を含む、請求項８０または８１に記載の方法。

【請求項83】

前記接触させることは、前記細胞への前記タンパク質コンジュゲートの浸透を誘導するように設計された前記担体タンパク質以外の薬剤の存在下ではない、請求項７５～８２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

前記対象内の特異的組織に生物学的ペイロードを送達するためであり、前記特異的組織は、７未満のｐＨ値により特徴づけられ、任意で前記特異的組織は、腫瘍である、請求項７５～８３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月３日に出願された米国特許仮出願第６３／２７５，０４９号および２０２２年６月２に出願された米国特許仮出願第６３／３４８，１１４号の優先権の利益を主張する。これら仮出願の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、タンパク質の細胞内送達の分野に属する。

【背景技術】

【0002】

新規で強力な治療標的の検索において、特に腫瘍学の分野では、細胞内標的、特に「新薬の開発に繋がらない」と思われる標的を対象にすることは極めて困難である。このような標的は、小分子薬物により標的化され得ず、なぜなら主に必要とされる治療的介入はタンパク質－タンパク質相互作用の妨害を伴い、小分子薬物は、有効性および／または十分な選択性を発揮できないからである。このような標的および生物学的過程は、生物学的製剤、例えば、モノクローナル抗体、受容体、インターロイキン、ならびにこれらの誘導体および組み合わせにより伝統的な方法で、効率的に対処されるが、このような薬剤は、生細胞中に、特に、細胞質、核、小胞体（ＥＲ）などの臨床的に意味のある細胞内コンパートメント中に、容易には侵入できない。これは、外側細胞膜がタンパク質ベースの分子に対して不浸透性であるためである。

【0003】

タンパク質ベースの分子が天然エンドサイトーシスベースの機序により生細胞中に内部移行する場合には、このタンパク質ベースの分子は、エンドソーム経路に侵入し、これは、リソソーム分解につながる。従って、この経路は天然では、リソソーム障害の治療、または抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のみに適切である。前者では、治療タンパク質ベースの薬剤は通常、エンドソームまたはリソソーム中でその活性を発揮することを目的とし、かつエンドソーム／リソソームの条件に耐えるように設計される、または天然に適合される。後者では、抗体は、特定細胞への小分子薬物の標的化／送達のために単に使用され、抗体担体のリソソーム分解は、小分子薬物、通常は細胞毒を放出する。

【0004】

しかし、タンパク質がそれ自身治療薬であり単なるターゲティング部分でない場合、本発明の技術は、いわゆる「エンドソーム脱出」を更に可能にしなければならない。この重要なステップは、この細胞機構による治療薬の異化作用を回避するために、エンドソーム経路の異なる段階の小胞、即ち、初期または後期エンドソームおよびリソソームから治療薬生物製剤を遊離する。

【0005】

エンドソームからの良好な脱出の後、治療薬は、細胞の細胞質に放出される。しかし、細胞質は、密集した環境であり、現在採用されている、例えば、モノクローナル抗体ならびにこれらの誘導体である、ほとんどの生物学的治療薬を受け入れることができない。治療生物製剤は、その治療標的を見つけ結合するために、あるいは、核、ＥＲ、ミトコンドリアなどの標的細胞内オルガネラに到達するために、細胞質中に効率的に分散されなければならない。

【0006】

伝統的で、最も研究された細胞内送達技術の１つは、高められた正電荷の使用を含む。ほとんどの古典的な手法は、ウィルスにより採用される細胞内取り込み機序の理解から進化した。後者は、有名なＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１６））などの、アルギニンおよびリジンアミノ酸に富む、正に荷電されたペプチドを用いる。この手法は、種々のペイロードに縮合されたまたは化学的にコンジュゲートされた、または種々のナノ粒子を装飾するために使用される、異なる電荷、アミノ酸配列、追加の修飾および構造（直鎖の、環状の、など）を有する多数の細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）をもたらした。ＣＰＰは、細胞中に内部移行する能力を示すが、これらのエンドソーム脱出の効率は、未だ論争中であり、これらの全体的な効率は、実際の医薬品用途での使用には不十分であると思われる。電荷ベースの細胞浸透を利用する代替法は、高度に正に荷電されたポリマーを用いて生物製剤または担体を修飾することである。１つのこのようなポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。

【0007】

適切なＰＫおよび体内分布プロファイルは、いずれかの薬物、特に生物製剤についての有効性を確保するために重要である。しかし、強力な正電荷を特徴とするＰＥＩまたは類似の分子による化学修飾は、ＰＫおよび体内分布に対し劇的な干渉効果を有する場合がある。大部分の循環タンパク質ならびに血管の内側は、負に荷電されるので、血流中に導入される全ての正に荷電されたタンパク質は、これらの血液成分に付着し、そのＰＫおよび体内分布を妨害するであろう。さらに、このような付着はまた、注入部位での投与された正に荷電されたタンパク質の「トラップ」にもつながり得る。最小レベルの修飾の利用は、ＰＫおよび注入部位での「トラップ」に対する正電荷の影響を最小化し得るが、さらなる解決策がまだ必要である。従って、血液中または健康な組織中で充分に安定でありかつ標的組織中で迅速で選択的な脱マスキング／脱保護を受け、生物学的治療薬の細胞浸透および細胞内の送達を可能にする、好適な電荷マスキング基の開発に対する未充足のニーズが存在する。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、複数のアミン基、細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロードおよびこれらを連結するリンカーを含むタンパク質担体を含むタンパク質コンジュゲートを提供し、アミン基の少なくとも一部は、保護基に結合される。タンパク質コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびにタンパク質コンジュゲートを使用するおよび産生する方法も提供される。

【0009】

第１の態様では、細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロードを含むタンパク質コンジュゲートが提供され、生物学的ペイロードは、複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合され、アミン基の少なくとも一部は、保護基に結合され、保護基は、７未満のｐＨ値で切断を受けることができ；タンパク質コンジュゲートは、負のゼータ電位により特徴づけられる。

【0010】

別の態様では：
ａ．複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体；
ｂ．細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロード；および
ｃ．タンパク質担体と生物学的ペイロードの間のリンカー、
を含む、タンパク質コンジュゲートが提供され、
アミン基の少なくとも一部は、保護基に結合され；
保護基は、７未満のｐＨ値で切断を受けることができ、および
タンパク質コンジュゲートは、負のゼータ電位により特徴づけられる。
いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、保護基を欠く類似のタンパク質コンジュゲートに比べて、高められた血液中安定性を特徴とする。
いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、保護基を欠く類似のタンパク質コンジュゲートに比べて、７未満のｐＨ値を有する生体組織内での増大した蓄積を特徴とする。

【0011】

いくつかの実施形態では、複数のアミン基は、一級アミン、二級アミン、またはこれらの両方を含み、複数のアミン基の少なくとも５０％は、保護基に結合される。
いくつかの実施形態では、リンカーは、共有結合により担体、ペイロードまたはこれらの両方に連結される。

【0012】

いくつかの実施形態では、保護基は、６～８の間のｐＨで負に荷電される部分を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、部分は、カルボキシ基を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、保護基は、式１：

【化1】

、により表され、式中、ｎは、０～５の範囲の整数であり；

【化2】

は、アミン基に対する付着点を表し、および

【化3】

は、単結合または二重結合を表し；ＲおよびＲ_１はそれぞれ独立に、Ｈ、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるシクロアルキル、任意に置換されるアリールまたはヘテロアリール、およびカルボキシアルキル、またはこれらの組み合わせから選択される置換基を表し；またはＲおよびＲ_１は環を形成するように一緒に結合される。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＲおよびＲ_１の１個は、Ｈであり、ＲおよびＲ_１の別の１個は、アルキルまたはカルボキシアルキルを含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、保護基は、

【化4】

であり、これらの任意の塩を含み、ＲおよびＲ_１は、Ｈおよびメチルから選択され、ＲまたはＲ_１は、メチルである。

【0017】

いくつかの実施形態では、細胞浸透性部分は、アルキルアミン、陽イオンポリマー、またはこれらの組み合わせを含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、陽イオンポリマーは、ポリアミンおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）から選択される。

【0019】

いくつかの実施形態では、ＰＥＩは、２０００ダルトン未満の分子量を有する直鎖ＰＥＩまたは分岐ＰＥＩである。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＰＥＩは、１００～１０００ダルトンの分子量を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、細胞内標的を結合する抗原結合分子である。

【0022】

いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、切断されると細胞内標的との相互作用を減らすジスルフィド結合を欠く。

【0023】

いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、可変重鎖ホモダイマー（ＶＨＨ）、ナノボディ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）および抗体ミメティックタンパク質から選択される。

【0024】

いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、ＶＨＨおよびＤＡＲＰｉｎから選択される。

【0025】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体または生物学的ペイロードは、複数のＰＥＩ分子を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、２～３０個のＰＥＩ分子を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。

【0027】

いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、３～１０個のＰＥＩ分子を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、リンカーは、生体適合性ポリマー、生分解性ポリマーまたはこれらの両方を含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、生分解性ポリマーは、ポリアミノ酸を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、リンカーは、（ｉ）生体適合性ポリマーまたは生分解性ポリマーに、および（ｉｉ）タンパク質担体に共有結合されるスペーサーを更に含む。いくつかの実施形態では、共有結合は、クリック反応生成物を経由する。

【0031】

いくつかの実施形態では、リンカーは、生体切断可能な（ｂｉｏ ｃｌｅａｖａｂｌｅ）結合を含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、生体切断可能な結合は、ジスルフィド結合を含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも２４時間血液中で実質的に安定である。

【0034】

いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。

【0035】

いくつかの実施形態では、安定は、２４時間後に血液中で２５％未満の切断を含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、生体切断可能な結合は、立体的に障害される。

【0037】

いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、配列番号１のアミノ酸配列、またはシステイン３４（Ｃ３４）を含むそのフラグメントもしくは相同体を含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合を介してＨＳＡに結合される。

【0039】

いくつかの実施形態では、リンカーは、ＨＳＡのＣ３４に結合される。

【0040】

いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合は、Ｃ３４の近位にある。

【0041】

いくつかの実施形態では、近位は、５～１５オングストロームの範囲のＣ３４からの距離である。

【0042】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、ＤＮＡを欠く。

【0043】

いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、細胞表面タンパク質を結合しない。

【0044】

いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、－１ｍＶ未満の負のゼータ電位を特徴とする。

【0045】

いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、検出可能なタグを更に含む。いくつかの実施形態では、タグは、生物学的ペイロードにコンジュゲートされる。

【0046】

いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、細胞浸透性コンジュゲートである。

【0047】

いくつかの実施形態では、保護基は、無水シトラコン酸である。いくつかの実施形態では、保護基は、無水シトラコン酸由来である。

【0048】

いくつかの実施形態では、クリック反応生成物は、スクシンイミド－チオエーテルである。

【0049】

いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、標的細胞の表面上で発現されるタンパク質に結合するターゲティング部分を更に含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、可変重鎖ホモダイマー（ＶＨＨ）、ナノボディ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）および抗体ミメティックタンパク質から選択される。

【0051】

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、リンカーを介してタンパク質担体にコンジュゲートされる。

【0052】

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分および生物学的ペイロードは、単一ポリペプチドに含まれる。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分および生物学的ペイロードは、リンカーにより分離される。

【0053】

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、生物学的ペイロードに対しＮ末端であるか、または生物学的ペイロードは、ターゲティング部分に対しＮ末端である。

【0054】

別の態様では、細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する方法が提供され、方法は、
ａ．細胞内標的に結合する生物学的ペイロードを提供することであって、生物学的ペイロードは、複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合される、提供すること；および
ｂ．７未満のｐＨ値で切断を受けることができる保護基によりアミン基の少なくとも一部を保護するために十分な条件下で生物学的ペイロードを提供して、保護アミン基を含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを得ること、
を含み、
それにより細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する。

【0055】

別の態様では、細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する方法が提供され、方法は、
ａ．細胞内標的を結合する生物学的ペイロードを提供すること；
ｂ．複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体を提供すること；
ｃ．生物学的ペイロードをリンカーを介してタンパク質担体に共有結合させるのに十分な条件下で生物学的ペイロードおよびタンパク質担体を提供して、タンパク質コンジュゲートを産生すること；および
ｄ．７未満のｐＨ値で切断を受けることができる保護基によりアミン基の少なくとも一部を保護するのに十分な条件下でタンパク質コンジュゲートを提供して、保護アミン基を含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを得ること、
を含み、
それにより細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する。

【0056】

いくつかの実施形態では、方法は、ヒト血液、血漿または血清中で、および細胞質条件中でリンカーの安定性を決定すること；およびヒト血液、血漿または血清中で安定でありかつ細胞質条件中で不安定であるリンカーを含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを選択することを更に含む。

【0057】

いくつかの実施形態では、方法は、中性または塩基性ｐＨで、および酸性ｐＨで保護アミン基の安定性を決定すること、および中性または塩基性ｐＨで安定でありかつ酸性ｐＨで不安定である保護アミン基を含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを選択することを更に含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、保護するために十分な条件下でタンパク質担体を提供することは、タンパク質担体に生物学的ペイロードを結合する前に起こる。

【0059】

いくつかの実施形態では、保護するために十分な条件下でタンパク質担体を提供することは、タンパク質担体に生物学的ペイロードを結合した後で起こる。

【0060】

いくつかの実施形態では、決定することは、タンパク質コンジュゲートの形成の前で、または電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートの形成の後で実施される。

【0061】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、ＨＳＡを含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、細胞浸透性部分は、少なくとも１個のＰＥＩを含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、負のゼータ電位を特徴とする。

【0064】

いくつかの実施形態では、複数のアミン基は、一級アミン、二級アミン、またはこれらの両方を含み、複数のアミン基の少なくとも８０％は、保護されたアミン基である。

【0065】

いくつかの実施形態では、保護基は、６～８の間のｐＨで負に荷電される部分を含む。

【0066】

いくつかの実施形態では、部分は、カルボキシ基を含む。

【0067】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体または生物学的ペイロードは、少なくとも２分子のＰＥＩに共有結合される。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、少なくとも８分子のＰＥＩに共有結合される。

【0068】

いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、切断されると細胞内標的への結合を減らすジスルフィド結合を欠く。

【0069】

いくつかの実施形態では、方法は、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを細胞と接触させること、および生物学的ペイロードが細胞の細胞質に侵入することを確認することを更に含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、安定は、２４時間後に血液中で２５％未満の切断を含み、不安定は、２４時間後に細胞質条件中で少なくとも５０％の切断を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、リンカーは、生体適合性ポリマーを含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、共有結合的に連結することは、クリック反応を経由する。

【0073】

いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、第１の反応基を含むリンカーに共有結合され、タンパク質担体は、第１の反応基に対し反応性を有する第２の反応基を含むリンカーに共有結合され；生物学的ペイロードをタンパク質担体に共有結合させるために十分な条件は、第１の反応基を第２の反応基と反応させること、それにより生物学的製剤およびタンパク質担体を共有結合的に連結することを含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、リンカーは、生体切断性結合を含む。

【0075】

いくつかの実施形態では、共有結合的に連結することは、ジスルフィド結合形成を含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、（ｉ）生物学的ペイロードは、タンパク質担体のシステインとジスルフィド結合を生成できるリンカーに共有結合される；または（ｉｉ）タンパク質担体は、生物学的ペイロードのシステインとジスルフィド結合を生成できるリンカーに共有結合される。いくつかの実施形態では、結合されるは、ジスルフィド結合を経由する。

【0077】

いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞の表面上で発現されるタンパク質に結合するターゲティング部分を選択することおよびターゲティング部分を生物学的ペイロード、タンパク質担体またはタンパク質コンジュゲートにコンジュゲートすることを更に含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、可変重鎖ホモダイマー（ＶＨＨ）、ナノボディ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）および抗体ミメティックタンパク質から選択される。

【0079】

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分および生物学的ペイロードは、単一ポリペプチドに含まれる。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分および生物学的ペイロードは、リンカーにより分離される。

【0080】

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、生物学的ペイロードに対しＮ末端である、または生物学的ペイロードは、ターゲティング部分に対しＮ末端である。
いくつかの実施形態では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、本発明のタンパク質コンジュゲートである。

【0081】

別の態様では、本発明の方法により産生されるタンパク質コンジュゲートが提供される。

【0082】

別の態様では、本発明のタンパク質コンジュゲート、および薬学的に許容可能な担体、賦形剤または補助剤を含む、医薬組成物が提供される。

【0083】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与用に処方される。

【0084】

別の態様では、細胞内標的を結合する方法が提供され、方法は、細胞内標的を発現している細胞を本発明のタンパク質コンジュゲートまたは本発明の医薬組成物と接触させることを含み、生物学的ペイロードは、細胞内標的を結合し、それにより細胞内標的を結合する。

【0085】

いくつかの実施形態では、方法は、細胞内標的を検出する方法であり、タンパク質コンジュゲートは、検出可能なタグを含み、方法は、検出可能なタグを検出することを更に含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、方法は、細胞内標的を調節する方法であり、生物学的ペイロードは、細胞内標的の作動薬または拮抗薬である。

【0087】

いくつかの実施形態では、細胞は、対象中にあり、接触させることは、対象に本発明のタンパク質コンジュゲートまたは本発明の医薬組成物を投与することを含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、細胞は、標的表面タンパク質を発現し、タンパク質コンジュゲートは、標的表面タンパク質に結合するターゲティング部分を含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、方法は、それを必要としている対象において状態を治療する方法であり、状態は、細胞内標的の調節により治療可能である。

【0090】

いくつかの実施形態では、状態は、癌または炎症を含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、状態は、癌であり、細胞内標的は、発癌性であり、生物学的ペイロードは、拮抗薬である。

【0092】

いくつかの実施形態では、癌は、癌特異的抗原である標的表面タンパク質を含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、接触させることは、細胞へのタンパク質コンジュゲートの浸透を誘導するように設計された担体タンパク質以外の薬剤の存在下ではない。

【0094】

いくつかの実施形態では、方法は、生物学的ペイロードを対象内の特異的組織に送達するためであり、特異的組織は、７未満のｐＨ値を特徴とする。いくつかの実施形態では、特異的組織は、腫瘍である。

【0095】

本発明のさらなる実施形態および適用可能な全ての範囲は、以降で示される詳細な説明から明らかになろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内で様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体的例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示としてのみ与えられると理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0096】

【図1】修飾されないおよび種々の修飾レベルでＰＥＩ修飾されたマウスＩｇＧのＭＡＬＤＩ－ＴｏＦスペクトル。

【図2】Ａ３７５細胞中へのＰＥＩ修飾されたまたは修飾されないマウスＩｇＧの内部移行の顕微鏡写真（青－核、緑－染色マウスＩｇＧ）。天然ＩｇＧは、修飾されておらず、全ての他のパネルは、次第に上昇するＰＥＩによる修飾のレベルを示す。各パネルのコーナーの数字は、ＩｇＧ分子当りのＰＥＩ分子の平均数を表す。

【図3A-3B】（３Ａ）ＨＥＫ細胞（６０μｇ／ｍＬ）および（３Ｂ）Ａ３７５細胞（５μｇ／ｍＬ）中へのＰＥＩ修飾されたＧＦＰ（ＧＦＰ分子当たり平均６．５ＰＥＩ）の内部移行の顕微鏡写真。

【図4】培地中のＩｇＧレベルの特異的ＥＬＩＳＡにより測定した、種々の修飾レベルでのＰＥＩ修飾されたＩｇＧ（初期培地濃度２μｇ／ｍＬ）の細胞取り込み効率の棒グラフ。

【図5】ＰＥＩ修飾されたＩｇＧ（４．５ＰＥＩ）のカベオリン媒介エンドサイトーシス内部移行の阻害を示すヒストグラム。ＮＣ－修飾されないＩｇＧ。

【図6】エンドソームマーカー（上段パネル）またはリソソームマーカー（下段パネル）を発現しているＨＥＫ２９３細胞の、５μｇ／ｍＬのＰＥＩ修飾ＩｇＧ（３ｘＰＥＩ、左パネル；４．５ｘＰＥＩ、中央パネルおよび７ｘＰＥＩ、右パネル）とのこれらのインキュベーション（５時間）後の染色の顕微鏡写真。エンドソームおよびリソソームマーカーは、緑色で、ＰＥＩ修飾されたＩｇＧは、赤色であり、核は、青色に染色される。

【図7】２ｘ１０^４ＨｅＬａ細胞との１０μｇ／ｍＬでのＰＥＩ修飾ＩｇＧの一晩のインキュベーション後のｐＨ感受性色素（５（６）－カルボキシナフトフルオレセイン、赤）で標識したＰＥＩ修飾されたＩｇＧ（４．５ｘＰＥＩ）のライブイメージング共焦点顕微鏡を用いたエンドソーム脱出モニタリングの顕微鏡写真。緑－チューブリン染色、青－核染色。

【図8】ＰＥＩ修飾されたｍＡｂ（４．５ｘＰＥＩ）である抗ＣＤ２４７の内部移行後のＩＦＮγ分泌の用量依存性増大により反映されるＣＤ３細胞活性化の棒グラフ。ＩＦＮγレベルの変化は、評価した濃度範囲での内部移行ＰＥＩ修飾マウスＩｇＧについて観察されなかった。

【図9】ＰＥＩでカチオン化された担体タンパク質が治療薬（この例では抗体）に化学的に連結される、担体およびペイロード法の概略図。この例では、リンカーは、そのＣＤＲから離れた、抗体のＦｃ領域にコンジュゲートされ、リンカーは、細胞質中で還元されかつ切断され得るジスルフィド結合を含み、カチオン化担体から治療薬ペイロードを放出し、自由な細胞質ゾル輸送を可能にする。

【図10】ＰＥＩ修飾されたＨＳＡ（７ｘＰＥＩ）にＰＥＧベースのジスルフィドを含むリンカーによりコンジュゲートされたＧＦＰとのＡ３７５細胞のインキュベーション後のＧＦＰの細胞内プロファイルを示す顕微鏡写真。細胞は、共焦点顕微鏡により観察されるように、インキュベーション後の２４時間（左）および４８時間（右）で分散されたＧＦＰプロファイルを示す（緑－ＧＦＰ；青－核）。

【図11】蛍光標識された（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７）抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて共焦点顕微鏡により検出した、Ａ３７５との一晩のインキュベーション後にジスルフィド結合を含むＰＥＧリンカーを介してＰＥＩ修飾ＨＳＡ（１１ｘＰＥＩ）にコンジュゲートされた抗ＴＮＦα抗体の顕微鏡写真。

【図12】１０ｍＭのＧＳＨ含有ＰＢＳ中で４時間後（レーン５～７）および４時間後一晩（レーン１～４）の、ＰＢＳ７．４（レーン８、９）中の完全マウスＩｇＧのＳＤＳ－ＰＡＧＥウェスタンブロット分析。ゲルを、抗マウス軽鎖抗体で処理した。

【図13】ＨＳＡをＰＥＩで修飾すること、それに続くＮＨＳ－ＰＥＧ_４－ＳＰＤＰによるＨＳＡの修飾により生成したＶＨＨ－ＰＥＩ修飾ＨＳＡ構築物の産生、精製およびキャラクタリゼーションの例示的結果。ＳＰＤＰ修飾されたＨＳＡ－ＰＥＩは、Ｃ末端遊離システインを有するＶＨＨと更に反応させられる。後者は、任意に還元剤（例えば、ＴＣＥＰ）で前処理され、全てのシステインが遊離であることを確実にできる。レーン１－ＨＳＡ－８ｘＰＥＩ、レーン２－ＨＳＡ－８ｘＰＥＩ－Ｓ－Ｓ－ＶＨＨ（矢印は異なる反応生成物を指す）、レーン３－ＤＴＴで還元後の反応生成物（ＨＳＡとＶＨＨの間の結合は不安定なジスルフィド結合であることを示唆する）、レーン７－９－プロテインＡレジンで精製後の（過剰なＨＳＡ－８ｘＰＥＩの除去）ＶＨＨ－ＨＳＡコンジュゲートの画分である。ＭＳスペクトルは、ＶＨＨ－ＨＳＡ－０ｘＰＥＩ（上段）、ＶＨＨ－ＨＳＡ－４ｘＰＥＩ（中段）およびＶＨＨ－ＨＳＡ－８ｘＰＥＩ（下段）の生成物のプロファイルを示し、全ては、大部分の生成物が単一ＶＨＨに付着されたＨＳＡを含むことを示す。

【図14】Ａ３７５細胞の存在下（暗い陰影）またはこれらの不在下（明るい陰影）での、ＨＳＡ当り平均３．５個（青）または８個（赤）のＰＥＩを有するＰＥＩ修飾されたＨＳＡにコンジュゲートされた抗ビメンチンＶＨＨの培地レベルの棒グラフ。

【図15A-15C】ＰＥＩ修飾されたＨＳＡに可逆的にコンジュゲートした抗ビメンチンとのインキュベーションの２４時間後のＶＨＨ（１５Ａ）、ビメンチン（１５Ｂ）および両方のマージ（１５Ｃ）について染色したＡ３７５細胞の共焦点顕微鏡画像化の顕微鏡写真。核は、青で染色される。

【図16A-16B】ＰＥＩ修飾されたＨＳＡ可逆的にコンジュゲートした抗ビメンチンＶＨＨ（１６Ａ）またはコンジュゲートされない抗ビメンチンＶＨＨ（１６Ｂ）との２４時間のインキュベーション後のＶＨＨについて染色した（緑）Ａ３７５細胞の共焦点顕微鏡画像化の顕微鏡写真。核は、青で染色される。

【図17】ＨｅＬａ増殖指数の棒グラフ。ＨｅＬａ（ＨＰＶ＋）細胞を、培地（黒色バー）または抗Ｅ７ ＶＨＨを補充した培地（灰色バー）または種々の濃度でＰＥＩ修飾されたＨＳＡ（平均３．５ＰＥＩ／ＨＳＡ）にコンジュゲートした抗Ｅ７ ＶＨＨを補充した培地（緑バー）中で４８時間インキュベートした。インキュベーション後のＨｅＬａ細胞増殖を、標準的ＭＴＴアッセイにより測定した。

【図18】チミジン細胞周期同期後のＳ、Ｇ２およびＭ細胞期でのＨＰＶ陽性ＨｅＬａ ＦＵＣＣＩ細胞のパーセントを示す折れ線グラフ。細胞を、平均３．５ＰＥＩで修飾されたＨＳＡ細胞にコンジュゲートした抗Ｅ７ ＶＨＨ、および種々の対照処理で処理した。対照は：処理なし（ｗｏ）、修飾されないＶＨＨ抗Ｅ７、修飾されないＨＳＡにコンジュゲートした抗Ｅ７ ＶＨＨ、無関係のＶＨＨ（抗ビメンチン）にコンジュゲートした修飾されたＨＳＡ、修飾されたＨＳＡ担体単独、および細胞周期阻害剤（ＤＰ、ＣＤＫ４／６阻害剤）であった。

【図19】ＨＰＶ陽性ＨｅＬａ ＦＵＣＣＩ細胞に対する異なる処理の効果の顕微鏡写真。平均３．５のＰＥＩで修飾されたＨＳＡにコンジュゲートされた無関係のＶＨＨ（抗ビメンチン）で処理した細胞は、未処理細胞（左の画像）と同じプロファイルを示すが、同じＨＳＡ担体にコンジュゲートされた抗Ｅ７ ＶＨＨは、ＣＤＫ４／６阻害剤の処理後に観察されるもの（右画像）に類似の、劇的な細胞死をもたらした。

【図20】肺腺癌細胞中に内部移行されたＰＥＩ修飾ＨＳＡ担体にコンジュゲートされた抗Ｋ－Ｒａｓ Ｈｉｓタグ付きＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７タンパク質の代表的顕微鏡写真。ＤＡＲＰｉｎは、抗Ｈｉｓタグ抗体で染色後、Ｋ－Ｒａｓ部位（細胞膜の内側）に局在する。

【図21】アポトーシスの折れ線グラフ。ＰＥＩ修飾ＨＳＡ担体にコンジュゲートされた、ＫＲＡＳ ＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７は、ＳＵ８６８６細胞に内部移行され、これらのアポトーシス状態を、アネキシンＶを使って、連続的なＩｎｃｕｃｙｔｅシステムを用いて評価した。８個のＰＥＩ分子で修飾された担体（担体Ｉ）にコンジュゲートされたＤＡＲＰｉｎに曝露された細胞は、高レベルのアポトーシスを示し、一方で３．５個のＰＥＩ分子を有する担体（担体ＩＩ）にコンジュゲートされたＤＡＲＰｉｎに曝露された細胞もまた、明確なアポトーシスを示すが、より低い程度である。未処理細胞、修飾されないＤＡＲＰｉｎに曝露された細胞および８個のＰＥＩで修飾されたＨＳＡに曝露された細胞は全て、ベースラインのアポトーシスを示す。

【図22A-22B】それらの核中でＧＦＰを構成的に発現しているＨｅＬａ細胞の増殖（２２Ａ）およびアポトーシス（２２Ｂ）に対するＰＥＩ修飾ＨＳＡ担体にコンジュゲートされた抗ＫＲＡＳ ＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７の効果を示す折れ線グラフ。汎ＲＡＳ阻害剤を陽性対照として使用し、非処理を陰性対照として使用した。細胞をまた、修飾されないＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７、ＰＥＩ修飾されたＨＳＡ担体単独、修飾されないＨＳＡ担体にコンジュゲートされたＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７およびＰＥＩ修飾されたＨＳＡ担体にコンジュゲートされた抗ビメンチンＶＨＨで処理した。

【図23】それらの核中でＧＦＰを構成的に発現しているＨｅＬａ細胞のアポトーシスに対するＰＥＩ修飾ＨＳＡ担体にコンジュゲートされたＫＲＡＳ ＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７の影響を示す顕微鏡写真。

【図24】反応において一定のモル過剰のＰＥＩを用いかつ、カルボジイミドカップリング剤、ＥＤＣのレベルを調節することにより、修飾のレベルを制御して、種々のレベルのＰＥＩ（６００Ｄａ）で修飾されたＨＳＡの質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ）スペクトル。ＨＳＡに対するＰＥＩ分子の平均レベルを、黒色で示す。

【図25】種々のレベルのＰＥＩ修飾を有するＨＳＡ担体にコンジュゲートされたＶＨＨの４８時間のインキュベーション後のＡ３７５細胞の内側の抗ビメンチンＶＨＨの共焦点顕微鏡像。ＨＳＡ担体に対するＰＥＩ分子の平均数が、各ボックス枠中に示される。細胞内のＶＨＨは、抗ＶＨＨ抗体を用いて可視化される。

【図26】コンジュゲートとインキュベートしたＡ３７５細胞の培地中の特異的ＥＬＩＳＡにより測定した、培地中に残っているＨＳＡ当り、８個（オレンジ）または３．５個（青）のＰＥＩ分子を有するＶＨＨ担体コンジュゲートの残留レベルの棒グラフ。

【図27A-27B】マスクされない担体またはマスクされた担体の２種の投与の１つを受けた全体マウス（２７Ａ）およびマウスから採取した臓器（２７Ｂ）のＩＶＩＳ像。相対的シグナル強度を、目的の領域（２７Ａ－全ての動物のライブイメージング；２７Ｂ－それぞれの臓器のエクスビボイメージング）のピクセル当りの放射効率（放射光［光子／秒／ｃｍ^２／ｓｔｒ］／励起光［μＷ／ｃｍ^２］ｘ１０^９）として計算した。相対的シグナル強度を、カラースケールとして提示する。色は、注入されたものの局在と濃度を表し、黄色は増大した蛍光強度を示し、暗赤色は低減した蛍光強度を示す。

【図28A-28F】下記との２４時間のインキュベーション後のＨｅＬａ ＧＦＰ細胞の共焦点顕微鏡像：（２８Ａ～２８Ｃ）抗Ｅ７－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５、または（２８Ｄ～２８Ｅ）α－Ｅ７－マスクされた－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５。抗ＶＨＨ抗体を用いた免疫蛍光染色－赤；核染色－（ＧＦＰ）－緑。（２８Ａ、Ｄ）－核染色；（２８Ｂ、Ｅ）－ＶＨＨ染色；（２８Ｃ、Ｆ）－マージ。細胞内ＶＨＨ染色は、マスクされないコンジュゲートでのみ観察される。細胞内ＶＨＨ染色は、主に細胞質中で観察される。

【図29A-29F】下記との２４時間のインキュベーション後のＢ１６細胞の共焦点顕微鏡像：Ｂ１６細胞とのインキュベーションの前に、マスキングの除去のために、酸性条件で前処理した、（２Ａ）ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８；（２Ｂ）ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８－ＣＡまたは（２Ｃ）ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８－ＭＳＡ、または（２Ｄ）ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８；（２Ｅ）ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８－ＣＡまたは（２Ｆ）ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８－ＭＳＡ。担体染色－赤；核染色（ＤＡＰＩ）－青。

【図30A-30B】（３０Ａ）８時間のマスキング除去の前後での、１Ｃ５－マスクされないＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５または１Ｃ５－マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５のいずれかで処理後の生存ＭＥＬ－５２６細胞のパーセンテージ。計算を、処理のない細胞と比較して実施した。細胞を、６日間６μＭでそれぞれの薬剤に曝露した。（３０Ｂ）１Ｃ５－マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５、除去後（１時間の除去工程）の１Ｃ５－マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５、１Ｃ５－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５のいずれかで処理後の、または処理なしの、生存ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞のパーセンテージ。細胞を、６日間１０μＭでそれぞれの薬剤に曝露した。

【図31A-31B】（３１Ａ）マスキングの有無での修飾されたＨＳＡ（８／３．５ＰＥＩ単位）の薬物動態学を示す折れ線グラフ。折れ線は、ｌｏｇ ＨＳＡ血漿中濃度［μｇ／ｍＬ］の平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。両側スチューデントのｔ検定は、マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８対ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８およびＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５の間で有意差を生じる。＊ｐ＜０．０１＊＊（３１Ｂ）ＨＳＡ－ＰＥＩ誘導体のインビボでの血漿曝露を表す棒グラフ。

【図32A-32B】（３２Ａ）インビボでのＨＳＡ－ＰＥＩ誘導体の種々の臓器での曝露レベルの棒グラフ。（３２Ｂ）ＩＶ注入の１４４０分後でのマスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８の体内分布の棒グラフ。バーは、ＨＳＡ濃度［μｇ／ｍＬ］の平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。１元配置分散分析は、臓器間の体内分布の有意差を生ずる。事後的ダネット検定は、それぞれの臓器検定に比較して、腫瘍ＨＳＡ濃度の間のｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）の有意性を示した。類似の結果を、他の時点でも得た。

【図33】尿中で検出されたＨＳＡ－ＰＥＩ誘導体のプロット。

【図34】マスキングの有無での修飾されたＩｇＧ（４ＰＥＩ単位）の薬物動態学を示す折れ線グラフ。

【図35】マスキングの有無での直接修飾されたＶＨＨ（ＰＥＩ １８００）の薬物動態学を示す折れ線グラフ。

【図36A-36D】（３６Ａ）ＨｅＬａ細胞を播種し、かつ１５日間毎日、３５０ｎｍｏｌ／ｋｇのαＥ７－ＶＨＨ－Ｓ－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－Ｓ－ＨＳＡｘ３．５コンジュゲートまたはαＥ７－ＶＨＨ－Ｓ－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－Ｓ－ＨＳＡまたはビークル（ＰＢＳ）のみで治療したマウス中の平均腫瘍体積の折れ線グラフ。（３６Ｂ～３６Ｃ）ＨｅＬａ細胞を播種し、かつ（３６Ｂ）１日置きに５日間２５０ｎｍｏｌ／ｋｇのαＥ７－ＶＨＨ－Ｓ－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－Ｓ－ＨＳＡｘ３．５無水シトラコン酸マスクコンジュゲート、マスクされた担体単独またはＰＢＳで、それに続く毎日５回注入で治療した、または（３６Ｃ）１５日間毎日３５０ｎｍｏｌ／ｋｇのαＥ７－ＶＨＨ－Ｓ－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－Ｓ－ＨＳＡｘ３．５マスクコンジュゲート、マスクされた担体単独、またはＰＢＳ、で治療したマウス中の腫瘍体積の折れ線グラフ。（３６Ｄ）実験全体にわたりマスクされた担体対照と比較した、マスクされたコンジュゲートによるパーセント腫瘍阻害の棒グラフ。

【図37A-37B】ＰＢＳ（左）、無水シトラコン酸マスクされたＰＥＩ修飾担体（中央）、および本発明のマスクされたコンジュゲート（右）で治療したマウス由来の腫瘍切片における（３７Ａ）ＶＨＨペイロードおよび（３７Ｂ）ＨＳＡ修飾されたＰＥＩ担体の免疫組織化学的検出の顕微鏡写真。

【図38A-38B】（３８Ａ）Ｂ１６細胞または（３８Ｂ）ＭＥＬ－５２６細胞を接種し、かつ３５０ｎｍｏｌ／ｋｇの無水シトラコン酸でマスクされた１Ｃ５－ＶＨＨ－Ｓ－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－Ｓ－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５コンジュゲート（αＢＲＡＦ（１Ｃ５）－マスク担体３．５）またはマスクされた担体単独で１５日間の毎日のＩＶ注入により治療したマウスの腫瘍体積の折れ線グラフ。＊ｐ値＜０．０５。

【図39】ＰＥＩのレベルおよびペイロード－担体結合の可逆性またはマスクの可逆性が異なる、マスクされた担体にコンジュゲートされた抗Ｅ７ ＶＨＨの種々のコンジュゲートの薬物動態プロファイルの折れ線グラフ。

【図40】臓器曝露レベル（ＡＵＣ）として提示される、腫瘍を含む種々の臓器の異なるマスクされたコンジュゲートの体内分布の棒グラフ。

【図41A-41B】（４１Ａ～４１Ｂ）（４１Ａ）Ａｔｔｏ５４２－ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}ＣＡおよび（４１Ｂ）Ａｔｔｏ５４２－ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}ＭＳＡの注入の６時間後の頸部腫瘍（ＨｅＬａ－ＧＦＰ）担持無胸腺ヌードＦｏｘｎ１ｎｕマウス由来の腫瘍組織の共焦点顕微鏡像（Ｘ６３）。担体シグナル（赤）；核染色（青）。（４１Ｃ～４１Ｅ）（４１Ｃ）Ａｔｔｏ５４２－ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}ＣＡ、（４１Ｄ）Ａｔｔｏ５４２－ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}ＭＳＡおよび（４１Ｅ）Ａｔｔｏ５４２－非マスクＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}の注入の６時間後のＢ１６腫瘍担持Ｃ５７ＢＬマウス由来の腫瘍組織の共焦点顕微鏡像（Ｘ６３）。担体シグナル（赤）；核染色（青）。

【図42A-42D】（４２Ａ～４２Ｂ）Ａｔｔｏ５４２－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８ ＭＳＡ注入の６時間後の頸部腫瘍（ＨｅＬａ－ＧＦＰ）担持無胸腺ヌードＦｏｘｎ１ｎｕマウス由来の腫瘍組織の共焦点顕微鏡像（Ｘ４０）。担体染色（赤）；核染色（青）；核染色（青）；腫瘍中の緑色蛍光タンパク質からの核染色（緑）。（４２Ａ）担体の染色（赤）および腫瘍細胞核（緑）。（４２Ｂ）担体の染色（赤）および一般細胞核染色（青）。（４２Ｃ～４２Ｄ）（４２Ｃ）Ａｔｔｏ５４２－ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}ＣＡおよび（４２Ｄ）Ａｔｔｏ５４２－ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８} ＭＳＡの注入の６時間後のＢ１６腫瘍担持Ｃ５７ＢＬマウス由来の肝臓組織の共焦点顕微鏡像（Ｘ６３）。担体シグナル（赤）；核染色（青）。

【図43A-43B】（４３Ａ）マスク除去前後でのマスクされた抗ＢＲＡＦ ＶＨＨ、１Ｃ５によるＢＲＡＦ結合の棒グラフ。（４３Ｂ）８時間のマスク除去の前後での、１Ｃ５－Ｈｅｌ－非マスクＨＳＡ－ＰＥＩｘ８または完全マスクされた１Ｃ５－Ｈｅｌ－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８で処理後の生存ＭＥＬ－５２６細胞のパーセンテージの棒グラフ。計算を、処理なしの細胞と比較して実施した。細胞を、６日間６μＭでそれぞれの薬剤に曝露した。

【図44】マスキングなしのＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５の内部移行のレベルと比較した、異なるマスキングレベルでのＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５の内部移行パーセントを表す棒グラフ。

【図45A-45B】マスク担体を含まない（４５Ａ）、およびこれを含む（４５Ｂ）抗ＰＳＭＡターゲティング部分を含むタンタンデム型薬剤のＰＳＭＡ陽性および陰性細胞に対する結合のＦＡＣＳデータをまとめた棒グラフ。

【図46】ＢＲＡＦに対する抗ＰＳＭＡターゲティング部分を含む薬剤の結合の折れ線グラフ。

【図47】細胞力価Ｇｌｏ生存率アッセイにより測定した、担体（３．５ＰＥＩ）へのコンジュゲート後の細胞に対する、抗ＢＲＡＦ ＶＨＨ単独または抗ＰＳＭＡ ＶＨＨと直列に発現された抗ＢＲＡＦ ＶＨＨの細胞毒性効果の棒グラフ。

【発明を実施するための形態】

【0097】

本発明は、いくつかの実施形態で、細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体を提供し、細胞浸透性部分は、複数のアミン基を含み；アミン基の少なくとも一部は、保護基に結合され；保護基は、７を超えるｐＨ値で安定であり、かつ７未満のｐＨ値でアミン基の部分から解離させることができる。いくつかの実施形態では、保護されたタンパク質担体は、負のゼータ電位により特徴づけられる。

【0098】

本発明は、標的化される細胞内送達に好適な一過的マスキング技術の発見に基づく。この技術は、「注入部位脱出」ならびに担体およびそのペイロードが血液中を循環し、かつ標的部位に到達するのに十分な時間を許容する、注入後数分間、好ましくは、数時間の治療薬または担体の正電荷のマスキングを可能にする。電荷マスキングは、共有結合マスキングに基づく。この手法は、プロドラッグに類似し、その場合、薬物分子上の「問題がある」基は、共有結合で置換され、それにより元の基の性質、即ち、その極性、溶解度または電荷が変更される。置換は、一般生理的状態下で、または特異的ｐＨもしくは特異的酵素の存在下などの特定の条件下で、不安定であるように設計される。不安定な置換は従って、標的条件中で除去され、内部移行される正に荷電された分子および細胞質に送達されるペイロードを残す。

【0099】

第１の態様では、細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロードに共有結合されたタンパク質担体を含むタンパク質コンジュゲートが、提供される。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、電荷マスクされたコンジュゲートである。

【0100】

別の態様では、細胞浸透性部分および保護基に結合された細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロードが、提供される。いくつかの実施形態では、生物学的ペイロード、細胞浸透性部分および保護基は、タンパク質コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、生物学的ペイロード、細胞浸透性部分および保護基は、組成物に含まれる。

【0101】

別の態様では、細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体；細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロード；およびタンパク質担体と生物学的ペイロードの間のリンカーを含むタンパク質コンジュゲートが提供され、生物学的ペイロードは、切断されると細胞内標的との相互作用を減らすジスルフィド結合を欠き；リンカーは、生体切断可能な結合を含み；細胞浸透性部分は、複数のアミン基を含み、アミン基の少なくとも一部は、保護基に結合され；保護基は、７を超えるｐＨ値で安定であり、かつ７未満のｐＨ値でアミン基の部分から解離させることができる。いくつかの実施形態では、アミン基の少なくとも一部は、保護されたアミンを生ずるように保護基に結合され、保護されないアミンに対する保護されたアミンのモル比は、本発明のタンパク質コンジュゲートが、少なくとも－０．１ｍＶ、少なくとも－０．５ｍＶ、少なくとも－１ｍＶ、少なくとも－２ｍＶ、少なくとも－３ｍＶ、少なくとも－５ｍＶ、－０．１～－５０ｍＶ、－０．５～－５０ｍＶまたは－０．５～－３０ｍＶ（これらの間の任意の範囲を含む）の負のゼータ電位により特徴づけられるようなモル比である。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートにおける保護されないアミンに対する保護されたアミンのモル比は、少なくとも約７：１０、少なくとも約８：１０、少なくとも約９：１０、少なくとも約１：１、または約１：１～１００：１（これらの間の任意の範囲を含む）である。

【0102】

別の態様では、細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体；細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロード；およびタンパク質担体と生物学的ペイロードの間のリンカーを含むタンパク質コンジュゲートが提供され；細胞浸透性部分は、複数のアミン基を含み；（ｉ）少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、約４０～約９５％、約４０～約１００％、約４０～約７０％、約４０～約８０％、約４０～約９０％、約４０～約９５％、または約４０～約９９％（これらの間の任意の範囲を含む）のアミン基は、保護基に結合され、（ｉｉ）生物学的ペイロードは、１種または複数の保護基に結合され、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方であり；保護基は、７を超えるｐＨ値（例えば、７．０～１０、または７．２～１０）で安定であり、かつ７未満のｐＨ値（例えば、約５～約６．８、約３～約６．８、約５～約７．０、約３～約７．０（これらの間の任意の範囲を含む））で切断でき、タンパク質コンジュゲートは、負のゼータ電位により特徴づけられる。

【0103】

別の態様では、細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体；細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロード；およびタンパク質担体と生物学的ペイロードの間のリンカーを含むタンパク質コンジュゲートが提供され；細胞浸透性部分は、複数のアミン基を含み；（ｉ）少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％のアミン基は、保護基に結合され、（ｉｉ）生物学的ペイロードは、１種または複数の保護基に結合され、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方であり；各保護基は、独立に式２により表され；タンパク質コンジュゲートは、少なくとも－０．１ｍＶ、少なくとも－０．５ｍＶ、少なくとも－１ｍＶ、少なくとも－２ｍＶ、少なくとも－３ｍＶ、少なくとも－５ｍＶ、－０．１～－５０ｍＶ、－０．５～－５０ｍＶ、－０．５～－３０ｍＶ（これらの間の任意の範囲を含む）の負のゼータ電位により特徴づけられる。

【0104】

別の態様では、細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体；細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロード；およびタンパク質担体と生物学的ペイロードの間のリンカーを含むタンパク質コンジュゲートが提供され；細胞浸透性部分は、１個または複数のＰＥＩ分子（例えば、単一タンパク質担体当り３～１０個のＰＥＩ分子）であるか、またはそれを含み；（ｉ）１個または複数のＰＥＩ分子は、１種または複数の保護基に結合され、それによりタンパク質コンジュゲートは、負のゼータ電位により特徴づけられ、（ｉｉ）生物学的ペイロードは、１種または複数の保護基に結合され、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方であり；保護基は、無水シトラコン酸由来である。

【0105】

別の態様では、細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体；細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロード；およびタンパク質担体と生物学的ペイロードの間のリンカーを含むタンパク質コンジュゲートが提供され；細胞浸透性部分は、１個または複数のＰＥＩ分子（例えば、単一タンパク質担体当り３～１０個、または４～１０個のＰＥＩ分子）であるか、またはそれを含み；（ｉ）１個または複数のＰＥＩ分子の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、約４０～約９５％、約４０～約１００％、約４０～約７０％、約４０～約８０％、約４０～約９０％、約４０～約９５％、または約４０～約９９％のアミン基は、保護基に共有結合され、それによりタンパク質コンジュゲートは、負のゼータ電位により特徴づけられ、（ｉｉ）生物学的ペイロードは、１種または複数の保護基に結合され、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方であり；保護基は、無水シトラコン酸由来である。

【0106】

別の態様により、細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体；細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロード；およびタンパク質担体と生物学的ペイロードとの間のリンカーを含むタンパク質コンジュゲートが提供され；保護基は、７未満のｐＨで切断を受け；タンパク質コンジュゲートは、負のゼータ電位により特徴づけられる。

【0107】

いくつかの実施形態では、リンカーは、タンパク質担体および生物学的ペイロードに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、共有結合により担体に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、共有結合により担体に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、共有結合によりペイロードに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、共有結合によりペイロードに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、結合を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、結合である。いくつかの実施形態では、リンカーは、フレキシブルなリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、剛性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペイロードと担体の間で立体障害を起こさないように、充分な長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、バイオ切断可能な結合へのアクセスを可能にするために充分な長さである。いくつかの実施形態では、アクセスは、バイオ切断可能な結合を切断する薬剤によるアクセスである。いくつかの実施形態では、薬剤は、酵素である。いくつかの実施形態では、薬剤は、反応種である。いくつかの実施形態では、薬剤は、還元剤である。

【0108】

いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００原子結合の長さを含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「原子結合」という用語は、炭素－炭素（Ｃ－Ｃ）結合の長さ、例えば、単一Ｃ－Ｃ結合の長さを指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００オングストローム（Å）の長さを含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0109】

いくつかの実施形態では、リンカーは、バイオ切断可能な結合を含む。いくつかの実施形態では、共有結合は、バイオ切断可能な結合である。いくつかの実施形態では、リンカーは、バイオ切断可能な結合である。いくつかの実施形態では、リンカーは、バイオ切断可能な結合によりペイロードに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、バイオ切断可能な結合によりペイロードに結合される。いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、負のゼータ電位を特徴とする。いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、細胞内で生物学的ペイロードを放出するように構成される。いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、細胞質ゾル中で生物学的ペイロードを放出するように構成される。

【0110】

いくつかの実施形態では、リンカーは、担体がペイロードの機能を妨害しないように、充分に長い。いくつかの実施形態では、リンカーは、担体がペイロード結合と干渉しないように、充分に長い。いくつかの実施形態では、結合は、細胞内標的への結合である。いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞浸透性部分が干渉しないように、充分に長い。いくつかの実施形態では、リンカーは、担体がペイロード結合に対し立体障害を形成しないように、充分に長い。

【0111】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、長い血清半減期を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、血液中で見出されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも６０ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも６５ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも７０ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、または７０ｋＤａ未満の分子量を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、最大で７の等電点を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、アルブミンである。いくつかの実施形態では、アルブミンは、血清アルブミンである。いくつかの実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。

【0112】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、１個または複数の細胞浸透性部分に共有結合される。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、単一の細胞浸透性部分に共有結合される。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、複数の細胞浸透性部分に共有結合される。いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、１個または複数の細胞浸透性部分に共有結合される。いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、単一の細胞浸透性部分に共有結合される。いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、複数の細胞浸透性部分に共有結合される。

【0113】

いくつかの実施形態では、細胞浸透性部分は、細胞内移行分子を含む。いくつかの実施形態では、細胞浸透性部分は、本発明のタンパク質コンジュゲートを細胞中に内部移行させるように構成される。いくつかの実施形態では、細胞浸透性部分は、本発明のタンパク質コンジュゲートの細胞内部移行を誘導するまたは高めるように構成される。いくつかの実施形態では、細胞浸透性部分は、対照（例えば、細胞浸透性部分のないタンパク質コンジュゲート）に比べて、本発明のタンパク質コンジュゲートの細胞浸透または細胞内部移行を高めるように構成される。いくつかの実施形態では、細胞内部移行は、細胞膜横断を含む。いくつかの実施形態では、細胞内部移行は、細胞質ゾルへの送達を含む。いくつかの実施形態では、細胞内部移行は、細胞質への送達を含む。いくつかの実施形態では、細胞内部移行は、エンドソーム脱出を含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、高めるは、対照に比べて、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％、少なくとも１０００００％（これらの間の任意の範囲を含む）高めることである。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0115】

いくつかの実施形態では、解離は、結合解除である。いくつかの実施形態では、解離は、ＰＧの切断である。いくつかの実施形態では、保護基は、７未満のｐＨ値で切断を受けることができる。いくつかの実施形態では、保護基は、約７未満のｐＨ値（例えば、０～約７、３～約７、約５～約７、約５～約６．８、約３～約７（これらの間の任意の範囲を含む））で切断される。いくつかの実施形態では、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の保護基は、約７未満のｐＨ値（例えば、０～約７、約３～約７、約５～約７、約５～約７（これらの間の任意の範囲を含む））で、最大０．１時間、最大０．５時間、最大１時間（これらの間の任意の範囲を含む）以内に切断を受ける。当業者は、保護基のいくらかの切断はまた、より高いｐＨ値で（低い反応速度で、従って、効率的切断を達成するために長い時間を必要とする）起こり得ることを理解するであろう。さらに、ｐＨの低下（７未満）は、保護基の切断を加速することは明らかなはずである。

【0116】

いくつかの実施形態では、切断は、７未満のｐＨ値で加速される。いくつかの実施形態では、保護基は、７を超えるｐＨ値では十分に切断されない。いくつかの実施形態では、解離は、複数のアミン基を脱保護することである。保護基は、中性および塩基性ｐＨで複数のアミン基を保護するが、７未満のｐＨで複数のアミン基は脱保護されるようになることが、当業者には理解されよう。脱保護は、アミンからのＰＧの解離に起因する。いくつかの実施形態では、解離は、ＰＧの切断により誘導される。いくつかの実施形態では、解離は、マスクされないコンジュゲートを産生する。いくつかの実施形態では、マスクされないコンジュゲートは、陽性のゼータ電位を特徴とする。いくつかの実施形態では、マスクされないコンジュゲートは、陽性のゼータ電位を含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、本発明の細胞浸透性部分は、電荷マスクされた部分である。いくつかの実施形態では、保護基は、マスキングである。いくつかの実施形態では、本発明の細胞浸透性部分は、アルキルアミン、陽イオンポリマー、およびこれらの誘導体または任意の組み合わせを含む電荷マスクされた部分であり、誘導体は、アミン保護基に結合されたアルキルアミンおよび／または陽イオンポリマーを含む。いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分は、本発明の保護基（ＰＧ）に結合された陽イオンポリマーを含み、ＰＧは、７未満のｐＨ値で切断を受けることができるアミン保護基である。いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分は、ＰＧによりによって保護されたアルキルアミンを含み、保護されたアミンは、７．０未満、６．９未満、６．８未満、６．７未満、６．５未満、６．３未満、６．０未満、５．５未満、５未満、３未満（これらの間の任意の範囲を含む）のｐＨ値で脱保護を受けることができる。いくつかの実施形態では、保護されたアミンは、ＰＧに共有結合されたアミン塩（例えば、脱プロトン化アミン）を含む。

【0118】

いくつかの実施形態では、陽イオンポリマー（例えば、保護されない陽イオンポリマー）は、複数のアミン基を含む。いくつかの実施形態では、陽イオンポリマーは、一級アミン基、二級アミン基、三級アミン基、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、陽イオンポリマーは、陽イオンポリマーのアミン基のｐＫａ値未満のｐＨ値を有する溶液内でイオン化（正イオン化）を受けることができる。いくつかの実施形態では、陽イオンポリマーは、陽イオンポリマーのアミン基のｐＫａ値未満のｐＨ値を有する溶液内（例えば、９未満、または８未満のｐＨで）でプロトン化を受けることができる。

【0119】

いくつかの実施形態では、少なくとも５０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９９重量％の陽イオンポリマー（例えば、保護されない陽イオンポリマー）は、陽イオンポリマーのアミン基のｐＫａ値未満のｐＨ値、例えば、９未満、８未満、７．５未満、７未満、６未満、５未満（これらの間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する溶液内で正に帯電（またはプロトン化）する。いくつかの実施形態では、陽イオンポリマー（例えば、保護されない陽イオンポリマー）は、溶液内で複数のプロトン化を受け、複数の陽性表面電荷を生じ、溶液は、本明細書で記載の通りである。

【0120】

いくつかの実施形態では、陽イオンポリマーは、ポリアミンを含む。いくつかの実施形態では、陽イオンポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンは、一級アミンを含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンは、二級アミンを含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンは、三級アミンを含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンは、一級、二級および三級アミンを含む。ポリアミンは、当該技術分野において周知であり、例えば、いくつか例を挙げると、ポリエチレンイミンおよびポリプロピレンイミンを含む。

【0121】

いくつかの実施形態では、陽イオンポリマー（例えば、保護されない陽イオンポリマー）は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であるか、またはそれを含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、ＰＥＩは、直鎖ＰＥＩを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＩは、分岐ＰＥＩを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＩ（例えば、分岐または直鎖のＰＥＩ）は、５０００Ｄａ未満、４０００Ｄａ未満、３０００Ｄａ未満、２０００Ｄａ未満、１５００Ｄａ未満、１０００Ｄａ未満、８００Ｄａ未満（これらの間の任意の範囲を含む）の数平均モル質量（Ｍｎ）により特徴づけられる。

【0123】

いくつかの実施形態では、本発明の細胞浸透性部分は、１００～２０００Ｄａ、２００～５０００Ｄａ、２００～３０００Ｄａ、５００～５０００Ｄａ、５００～２０００Ｄａ、５００～３０００Ｄａ、１００～３００Ｄａ、３００～４００Ｄａ、４００～５００Ｄａ、５００～６００Ｄａ、６００～７００Ｄａ、７００～１０００Ｄａ（これらの間の任意の範囲を含む）のＭＷ（例えば、平均分子量）により特徴づけられる。

【0124】

いくつかの実施形態では、ＰＥＩは、１００～２０００Ｄａ、２００～５０００Ｄａ、２００～３０００Ｄａ、５００～５０００Ｄａ、５００～２０００Ｄａ、５００～３０００Ｄａ、１００～３００Ｄａ、３００～４００Ｄａ、４００～５００Ｄａ、５００～６００Ｄａ、６００～７００Ｄａ、７００～１０００Ｄａ（これらの間の任意の範囲を含む）のＭｎにより特徴づけられる。いくつかの実施形態では、本発明の細胞浸透性部分は、５００～７００Ｄａ、または５００～２０００ＤａのＭｎにより特徴づけられる分岐ＰＥＩを含む。

【0125】

いくつかの実施形態では、本発明の細胞浸透性部分は、複数のＰＥＩを含み、複数のＰＥＩは、本発明の単一タンパク質担体（例えば、ＨＳＡ）に共有結合された３～１０個、４～１０個、２～１０個、４～２０個、４～５０個、４～１００個、２～１００個、２～５０個、２～２０個、４～８個、６～１０個、６～９個、６～８個（これらの間の任意の範囲を含む）のＰＥＩ分子を含む。

【0126】

いくつかの実施形態では、本発明の細胞浸透性部分は、少なくとも１種の保護アミンを含む電荷マスクされた部分である。いくつかの実施形態では、細胞浸透性部分（例えば、ＰＥＩ）のアミン基（例えば、一級および／または二級アミン）は、実質的に保護され（例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、約４０～約９５％、約４０～約１００％、約４０～約７０％、約４０～約８０％、約４０～約９０％、約４０～約９５％、または約４０～約９９％のアミン基は、保護基に共有結合される）、保護基は、式２により表される（場合により、保護基は、無水シトラコン酸に由来する）。いくつかの実施形態では、本発明の細胞浸透性部分は、複数のＰＧに共有結合され、複数のＰＧのそれぞれは、同じ化学構造を有する。いくつかの実施形態では、本発明の細胞浸透性部分は、複数のＰＧに共有結合され、複数のＰＧは、化学的に別個のＰＧ種であるか、またはこれらを含む。

【0127】

いくつかの実施形態では、本発明のペイロードを含む電荷マスクされた部分は、ＰＧに結合される。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１個または複数のＰＧに結合される。いくつかの実施形態では、ペイロードは、複数のＰＧに結合され、ＰＧは、化学的に同一の種であるか、または化学的に別個の種である。いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲート内の各ペイロード分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、２～１０、２～５、１～１０、１～５、１～８、２～８個（これらの間の任意の範囲を含む）のＰＧなどの１個または複数のＰＧに共有結合される。

【0128】

いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分は、７～１０のｐＨ範囲で、プロトン化および／または正電荷（例えば、水溶液中で）を実質的に欠いている。いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分および／または保護された複数のアミン基は、７～１０のｐＨ範囲で、実質的に荷電されないまたは負に荷電され（例えば、水溶液中で）、かつ７未満、６．８未満、６．５未満、６未満（これらの間の任意の範囲を含む）のｐＨ範囲で正に荷電される。いくつかの実施形態では、細胞浸透性部分の複数のアミン基は、７～１０のｐＨ範囲で、実質的に荷電されないまたは負に荷電され（例えば、水溶液中で）、かつ７未満、６．８未満、６．５未満、６未満（これらの間の任意の範囲を含む）のｐＨ範囲で正に荷電される。いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分は、７～１０のｐＨ範囲で、プロトン化できるアミン（例えば、一次および／または二次アミン）を実質的に欠いている。いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分は、マスクされない細胞浸透性部分（ＰＧを欠く）に比べて、７～１０のｐＨ範囲で、プロトン化を受ける能力を実質的に低減させた。

【0129】

いくつかの実施形態では、本発明の電荷マスクされた部分は、１個または複数の保護されたＰＥＩ（ＰＥＩのアミンの少なくとも一部はＰＧに結合される）を含む。いくつかの実施形態では、保護されたＰＥＩは、本発明の保護基に結合されたＰＥＩの１個または複数のアミン（例えば、脱プロトン化されたアミン）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞浸透性部分は、少なくとも１％、少なくとも５％の直鎖または分岐のＰＥＩを含み、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または５０～９９％、５０～９７％、５０～９５％、５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％（これらの間の任意の範囲を含む）のアミン基（例えば、一級アミンおよび／または二級アミン）は、本発明の保護基に共有結合される。

【0130】

いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分、本発明のタンパク質コンジュゲート、および本発明のタンパク質担体のいずれかは、７～１０、７．２～１０、または７．５～１０のｐＨ（これらの間の任意の範囲を含む）、または７を超えるｐＨで、負に荷電される。いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分、本発明のタンパク質コンジュゲート、および本発明のタンパク質担体のいずれかは、約７．４のｐＨで、負に荷電される。

【0131】

いくつかの実施形態では、細胞浸透性部分、本発明のタンパク質コンジュゲート、ペイロード、および本発明のタンパク質担体のいずれかは、－０．１ｍＶ未満、－０．５ｍＶ未満、－１ｍＶ未満、－５ｍＶ未満、－１０ｍＶ未満、－１２未満、－１４ｍＶ未満、－２０ｍＶ未満（これらの間の任意の範囲を含む）のゼータ電位を特徴とする。いくつかの実施形態では、負のゼータ電位は、０未満のゼータ電位である。いくつかの実施形態では、負のゼータ電位は、－１ｍＶ以下のゼータ電位である。いくつかの実施形態では、負のゼータ電位は、－２ｍＶ以下のゼータ電位である。いくつかの実施形態では、負のゼータ電位は、－３ｍＶ以下のゼータ電位である。いくつかの実施形態では、負のゼータ電位は、－４ｍＶ以下のゼータ電位である。いくつかの実施形態では、負のゼータ電位は、－５ｍＶ以下のゼータ電位である。

【0132】

いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分内のＰＧと陽イオンポリマー（例えば、ＰＥＩ）の間のモル比は、１００，０００：１～０．８：１、５０，０００：１～１：１、２５，０００：１～１：１、１０，０００：１～１：１、８，０００：１～１：１、５，０００：１～１：１、３，０００：１～１：１、２，０００：１～１：１、１，０００：１～１：１、９００：１～１：１、８００：１、～１：１、７００：１～１：１、６００：１～１：１、５００：１～１：１、４００：１～１：１、３００：１～０．８：１、２５０：１～１：１、２００：１～０．８：１、１５０：１～１：１、１２５：１～１：１、１００：１～０．８：１、１００：１～８０：１、８０：１～５０：１、５０：１～３０：１、３０：１～１０：１、１０：１～５：１、１０：１～０．８：１、５：１～１：１、１：１～０．８：１（これらの間の任意の範囲を含む）である。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＰＧと担体（例えば、ＨＳＡ）の間のモル比は、１００，０００：１、～１：１、５０，０００：１～１：１、２５，０００：１～１：１、１０，０００：１～１：１、８，０００：１～１：１、５，０００：１～１：１、３，０００：１～１：１、２，０００：１～１：１、１，０００：１～１：１、９００：１～１：１、８００：１、～１：１、７００：１～１：１、６００：１～１：１、５００：１～１：１、４００：１～１：１、３００：１～１：１、２５０：１～１：１、２００：１～１：１、１５０：１～１：１、１２５：１～１：１、１００：１～１：１、１００：１～８０：１、８０：１～５０：１、５０：１～３０：１、３０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～１：１（これらの間の任意の範囲を含む）である。

【0134】

いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分の保護されたアミンは、中性および／または塩基性ｐＨで実質的に安定である（脱保護がない）。いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分の少なくとも５０モル％、少なくとも６０モル％、少なくとも７０モル％、少なくとも８０モル％、少なくとも９０モル％、少なくとも９５モル％（これらの間の任意の範囲を含む）の保護されたアミンは、中性および／または塩基性ｐＨで、後述する時間にわたり安定なままである。

【0135】

いくつかの実施形態では、保護されたアミンは、７．０～１４、７．０～７．２、７．２～７．５、７．５～８、８～９、９～１２、１２～１４の範囲（これらの間の任意の範囲を含む）のｐＨで実質的に安定である。いくつかの実施形態では、保護されたアミンは、約７．４のｐＨで実質的に安定である。いくつかの実施形態では、保護されたアミンは、７．０～１４の範囲（これらの間の任意の範囲を含む）のｐＨ値で、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも１０時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間（これらの間の任意の範囲を含む）にわたり、実質的に安定である。

【0136】

いくつかの実施形態では、保護されたアミンは、脱保護（またはそれからのＰＧの切断を介する分解）を受けて、脱保護されたアミン（例えば、荷電されないまたは正に荷電されたプロトン化アミン）を生じる。いくつかの実施形態では、保護されたアミンは、０～６．９、０～６．８、６～６．８、５～６、０～３、３～５、５～６．８の範囲（これらの間の任意の範囲を含む）のｐＨで実質的に脱保護される。いくつかの実施形態では、保護されたアミンは、約６．８のｐＨで実質的に脱保護される。いくつかの実施形態では、保護されたアミンは、癌微小環境中で実質的に脱保護される。いくつかの実施形態では、癌微小環境は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）である。いくつかの実施形態では、少なくとも１０モル％、少なくとも２０モル％、少なくとも３０モル％、少なくとも４０モル％、少なくとも５０モル％、少なくとも６０モル％、少なくとも７０モル％、少なくとも８０モル％、少なくとも９０モル％、少なくとも９５モル％（これらの間の任意の範囲を含む）の保護されたアミンは、７未満（例えば、０～６．９）のｐＨで脱保護される。いくつかの実施形態では、保護されたアミンは、７未満（例えば、０～６．９、０～６．８、６～６．８、５～６、０～３、３～５、５～６．８（これらの間の任意の範囲を含む））のｐＨで、１秒～１時間、１～３０秒、３０～６０秒、６０秒～２分、２～１０分、１分～１時間、１分～２４時間、１分～１２時間、１分～８時間、１分～６時間、１分～４時間、１分～３時間、１分～２時間、１秒～２４時間、１秒～１２時間、１秒～８時間、１秒～６時間、１秒～４時間、１秒～３時間、１秒～２時間の範囲（これらの間の任意の範囲を含む）の時間にわたり実質的に脱保護される。いくつかの実施形態では、７未満のｐＨは、約６．８である。

【0137】

保護基
いくつかの実施形態では、保護されたアミンは、アミンに共有結合された本発明のＰＧを含む。いくつかの実施形態では、保護されたアミンは、ＰＧ前駆物質をアミンと反応させることにより得られる。いくつかの実施形態では、ＰＧ前駆物質は、アミン（例えば、一級アミン、二級アミンまたはこれらの両方）に対する反応性を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧ前駆物質は、任意に置換されてよい（例えば、後述するＲおよびＲ_１で）、環状無水物（例えば、不飽和であってもよい５～６員環状無水物）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＰＧ前駆物質は、安定な保護されたアミンを形成するように、アミンと反応できる。いくつかの実施形態では、保護されたアミン（例えば、電荷マスクされた部分内の）は、中性および／または塩基性ｐＨ条件下で安定である。いくつかの実施形態では、ＰＧ前駆物質は、アミン基（一級および／または二級アミン）と反応でき、それにより、アミン基を保護されたアミン（アミドなど）へと変換できる。いくつかの実施形態では、ＰＧ前駆物質は、式：

【化5】

の環状無水物であり、式中、ｎ、Ｒ、Ｒ_１およびＲ_２は、本明細書で前述の通りである。

【0138】

いくつかの実施形態では、本発明のＰＧは、アミンに共有結合され、アミンは、（ｉ）ペイロードのアミン基、（ｉｉ）細胞浸透性部分のアミン基、または（ｉ）または（ｉｉ）の両方から選択される。

【0139】

いくつかの実施形態では、ＰＧ（アミンまたは脱プロトン化アミンに結合された保護基）は、５を超えるｐＨで負電荷を有する１個または複数の部分（例えば、１、２、３、または４個の部分）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＧは、４～８、４～５、５～６、６～７、７～８以上（これらの間の任意の範囲を含む）のｐＨで負電荷を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧは、対象の組織内、または生体液内で実質的に負に荷電され、組織および／または生体液は、４～８、または５～９（これらの間の任意の範囲を含む）のｐＨにより特徴づけられる。

【0140】

いくつかの実施形態では、ＰＧの少なくとも５０モル％、少なくとも６０モル％、少なくとも７０モル％、少なくとも８０モル％、少なくとも９０モル％、少なくとも９５モル％は、その部分のｐＫａ値を越えるｐＨで、負に荷電される。いくつかの実施形態では、部分は、カルボキシまたはその塩であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＰＧは、カルボキシおよび／またはその塩を含み、ＰＧは、４～８もしくは５～８のｐＨ、または８を超えるｐＨで、負に荷電される。

【0141】

いくつかの実施形態では、ＰＧは、式１：

【化6】

、により表され、式中、ｎは０～５の範囲の整数であり；

【化7】

は、アミン基への付着点（例えば、保護されたアミンの窒素原子）を表し、および

【化8】

は、単結合または二重結合を表し；ＲおよびＲ_１はそれぞれ独立に、Ｈ、任意に置換されるアルキル（例えば、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、またはＣ_１－Ｃ_５アルキル）、ハロ、任意に置換されるシクロアルキル、任意に置換されるアリールまたはヘテロアリール、およびカルボキシアルキル（例えば、Ｃ_１－Ｃ_１０カルボキシアルキル、またはＣ_１－Ｃ_５カルボキシアルキル）、またはこれらの組み合わせから選択される１個または複数の置換基を表し；またはＲおよびＲ_１は、環を形成するように一緒に結合される。

【0142】

いくつかの実施形態では、ＲおよびＲ_１はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルケニル、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、カルボニル、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＲ’_２、－ＣＮＮＲ’_２、－ＣＳＮＲ’_２、－ＣＯＮＨ－ＯＨ，－ＣＯＮＨ－ＮＨ_２、－ＮＨＣＯＲ’、－ＮＨＣＳＲ’、－ＮＨＣＮＲ’、－ＮＣ（＝Ｏ）ＯＲ’、－ＮＣ（＝Ｏ）ＮＲ’、－ＮＣ（＝Ｓ）ＯＲ’、－ＮＣ（＝Ｓ）ＮＲ’、－ＳＯ_２Ｒ’、－ＳＯＲ’、－ＳＲ’、－ＳＯ_２ＯＲ’、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ’）_２、－ＮＨＮＲ’_２、－ＮＮＲ’、－ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）_２、Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１０ハロアルコキシ、ヒドロキシ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ）、アルコキシ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）、アルコキシ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ）、アミノ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）、－ＣＯＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）、－ＣＯＮ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）_２、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＯＣＯＲ’、－ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ’、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’、－ＯＣ（＝Ｓ）ＯＲ’、－ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’、ヘテロ原子、任意に置換されるシクロアルキル、任意に置換されるヘテロシクリル、またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個または複数の置換基を表し；各Ｒ’は独立に、水素、任意に置換されるＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意に置換されるシクロアルキル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるベンジルまたはこれらの組み合わせを含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、ｎは、０～５、０～１、１～５、１～３、３～５（これらの間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、各Ｒおよび／またはＲ_１は、１個または複数の置換基を表す。いくつかの実施形態において、ＲおよびＲ_１は、同じまたは異なる置換基である。いくつかの実施形態では、カルボキシアルキルは、－アルキル－ＣＯＯＨを含む。いくつかの実施形態では、カルボキシアルキルは、－（Ｃ_１－Ｃ_１０）アルキル－ＣＯＯＨ、または－（Ｃ_１－Ｃ_５）アルキル－ＣＯＯＨ（これらの間の任意の範囲を含む）を含み、アルキルは、任意に置換される。

【0144】

いくつかの実施形態では、ＰＧは、式２：

【化9】

、により表され、式中、ｎ、ＲおよびＲ_１は、本明細書で記載の通りであり、各Ｒ_２は独立に、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルケニル、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、カルボニル、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＲ’_２、－ＣＮＮＲ’_２、－ＣＳＮＲ’_２、－ＣＯＮＨ－ＯＨ，－ＣＯＮＨ－ＮＨ_２、－ＮＨＣＯＲ’、－ＮＨＣＳＲ’、－ＮＨＣＮＲ’、－ＮＣ（＝Ｏ）ＯＲ’、－ＮＣ（＝Ｏ）ＮＲ’、－ＮＣ（＝Ｓ）ＯＲ’、－ＮＣ（＝Ｓ）ＮＲ’、－ＳＯ_２Ｒ’、－ＳＯＲ’、－ＳＲ’、－ＳＯ_２ＯＲ’、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ’）_２、－ＮＨＮＲ’_２、－ＮＮＲ’、－ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）_２、Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１０ハロアルコキシ、ヒドロキシ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ）、アルコキシ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）、アルコキシ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ）、アミノ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）、－ＣＯＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）、－ＣＯＮ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）_２、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＯＣＯＲ’、－ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ’、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’、－ＯＣ（＝Ｓ）ＯＲ’、－ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’、ヘテロ原子、任意に置換されるシクロアルキル、任意に置換されるヘテロシクリル、またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個または複数の置換基（例えば、１個または２個の置換基）を含み；各Ｒ’は独立に、水素、任意に置換されるＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意に置換されてもよいシクロアルキル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるベンジルまたはこれらの組み合わせを含む。

【0145】

いくつかの実施形態では、ＲおよびＲ_１の１個は、Ｈであり、ＲおよびＲ_１の別の１個は、アルキルまたはカルボキシアルキルを含む。いくつかの実施形態では、各ＲおよびＲ_１は独立に、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル（分岐または直鎖）、またはカルボキシアルキルを含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、ＰＧは、式２により表され、式中、ｎは、０であり；Ｒは、ＣＨ_２ＣＯＯＨ、メチル、およびエチルから選択され；Ｒ_１は、Ｈ、およびＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨから選択される。

【0147】

いくつかの実施形態では、ＰＧは、式２Ａ：

【化10】

、により表され、ＲおよびＲ_１は、Ｈおよびメチルから選択され、ＲまたはＲ_１は、メチルである。

【0148】

いくつかの実施形態では、ＰＧは、本明細書で開示の式のいずれかにより表され、その任意の塩（例えば、カルボン酸塩）、任意の誘導体、任意の互変異性体、任意の同位体、または任意の構造異性体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＧは、本明細書の以降で開示される保護基である。いくつかの実施形態では、ＰＧは、無水マレイン酸誘導体である。いくつかの実施形態では、ＰＧは、無水シトラコン酸由来である。いくつかの実施形態では、ＰＧは、無水マレイン酸である。いくつかの実施形態では、ＰＧは、アコニット酸無水物由来である。いくつかの実施形態では、ＰＧは、ジメチルマレイン酸無水物由来である。

【0149】

本明細書で使用される場合、「由来（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」という用語は、アミン基によるＰＧ前駆物質（例えば、環状無水物）の求核置換を介して得られる分子を包含する。いくつかの実施形態では、ＰＧは、無水シトラコン酸由来であり、保護基は、式２Ａにより表され、ＲまたはＲ_１は、メチルである。いくつかの実施形態では、ＰＧは、無水シトラコン酸であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＰＧは、無水シトラコン酸由来であり、式２Ａの形状を有する。

【0150】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、それに共有結合された複数のＰＥＩ分子を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、それに共有結合された、３～１０個、または４～１０個、２～１００個、３～１００個、３～９０個、４～１００個、４～９０個、４～１０個、４～４０個、４～２０個、２０～１００個、２０～４０個、４０～６０個、６０～１００個、６～１００個、６～２０個、６～４０個、６～５０個、４～１５個、３～１５個、３～１０個、３～８個、４～８個、６～１０個（これらの間の任意の範囲を含む）のＰＥＩ分子を含む。

【0151】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、それに共有結合された３～１０個のＰＥＩ分子、３～５個のＰＥＩ分子、５～８個のＰＥＩ分子、８～１０個のＰＥＩ分子、１０～１５個のＰＥＩ分子、１５～２０個（これらの間の任意の範囲を含む）のＰＥＩ分子を含む。

【0152】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０ＫＤａのサイズを含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、５０ＫＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、６０ＫＤａのサイズを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、６５ＫＤａのサイズを含む。

【0153】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、血中内因性タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、血液中で天然に見出される。いくつかの実施形態では、血液は、血漿である。いくつかの実施形態では、血液は、哺乳類血液である。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ヒトである。いくつかの実施形態では、血中内因性タンパク質は、アルブミンである。いくつかの実施形態では、血中内因性タンパク質は、グロブリンである。いくつかの実施形態では、血中内因性タンパク質は、フィブリノーゲンである。いくつかの実施形態では、グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）である。いくつかの実施形態では、Ｉｇは、ＩｇＧである。いくつかの実施形態では、Ｉｇは、ＩｇＡである。いくつかの実施形態では、Ｉｇは、ＩｇＭである。いくつかの実施形態では、血中内因性タンパク質は、ＨＳＡ、フィブリノーゲン、およびＩｇＧから選択される。いくつかの実施形態では、血中内因性タンパク質は、凝血タンパク質ではない。血中内因性タンパク質は当該技術分野において周知であり、少し例を挙げれば、例えば、プレアルブミン（トランスサイレチン）、α１抗トリプシン、α－１－糖タンパク質、α－１－フェトプロテイン、α２－マクログロブリン、γグロブリン、β－２ミクログロブリン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、補体成分３、補体成分４、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、リポタンパク質、（カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）、トランスフェリン、プロトロンビン、およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、フィブリノーゲン、ＩｇＧ、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）から選択される。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質は、緑（ＧＦＰ）、赤（ＲＦＰ）、青（ＢＦＰ）および黄（ＹＦＰ）から選択される。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質は、ＧＦＰである。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、ＨＳＡである。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、フィブリノーゲンである。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、ＩｇＧである。

【0154】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、ＨＳＡであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、ＰＥＩ修飾されたＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、リンカーを介してタンパク質担体に結合されたペイロードを含み、リンカーは、本明細書で記載の通りであり、タンパク質担体は、３～２０個、３．５～２０個、３～１０個、３．５～１０個、３～８個、３．５～８個、３～５個、５～８個、８～１０個、１０～１５個、３～１０個、３～１５個、４～２０個、４～１０個、３．５～６個、３．５～１５個、３．５～８個、３．５～１２個、３～１２個、３～１７個、３．５～１７個、３．５～１５個、４～８個、６～１０個のＰＥＩ分子に共有結合された（またはＰＥＩ分子により修飾された）ＨＳＡであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で記載のＰＥＩ分子の数は、平均値である。いくつかの実施形態では、ＰＥＩ分子は、１００～２０００Ｄａ、２００～５０００Ｄａ、２００～３０００Ｄａ、５００～５０００Ｄａ、５００～２０００Ｄａ、５００～３０００Ｄａ、１００～３００Ｄａ、３００～４００Ｄａ、４００～５００Ｄａ、５００～６００Ｄａ、６００～７００Ｄａ、７００～１０００Ｄａ（これらの間の任意の範囲を含む）の平均ＭＷを特徴とする。いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、ＰＥＩを含み、１５～５０、１５～４５、１５～３５、１５～３０、１５～２５、２０～５０、２０～４５、２０～４０、２０～３５、２０～２５、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、３０～５０、３０～４５、３０～４０、３０～３５、３５～５０、３５～４５、３５～４０、４０～５０、４０～４５、または４５～５０分子（これらの間の任意の範囲を含む）のＰＧによりマスクされる。

【0155】

いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、少なくとも２分子のＰＥＩに共有結合される。いくつかの実施形態では、タンパク質担体は、少なくとも８分子のＰＥＩに共有結合される。いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、１分子のＰＥＩに共有結合される。いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、少なくとも３分子のＰＥＩに共有結合される。いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、少なくとも８分子のＰＥＩに共有結合される。いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、少なくとも９８分子のＰＥＩに共有結合される。

【0156】

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ペイロードを含む。本明細書で使用される場合、「ペイロード」という用語は、標的細胞の細胞質中に送達される任意の分子を指す。いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞内標的を結合する。いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞内標的と相互作用する。いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞内標的を調節する。いくつかの実施形態では、細胞内は、細胞質である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、切断されると細胞内標的との相互作用を減らすジスルフィド結合を欠く。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ジスルフィド結合を欠く。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、生物学的ペイロードである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、生体分子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、有機物である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、治療分子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、検出可能分な子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、標的に結合できる分子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、生物製剤である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、薬物である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、タンパク質またはペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、単離されたタンパク質またはペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、ペプチドまたはタンパク質部分である。タンパク質は、完全なタンパク質である必要はなく、タンパク質の部分またはフラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、ペイロードは、アミノ酸を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、単一アミノ酸鎖である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、複数のアミノ酸鎖である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、生理活性分子である。いくつかの実施形態では、生理活性は、生物活性剤である。

【0157】

いくつかの実施形態では、ペイロードは、核酸分子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸分子は、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、アプタマーである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、プライマーである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、調節ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、プラスミドである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的細胞中で発現するように構成される。いくつかの実施形態では、ペイロードは、遺伝子療法剤である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、オープンリーディングフレームを含む。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、治療タンパク質をコードする。核酸分子核酸分子を化学的およびアミノ酸リンカーにコンジュゲートする方法は、当技術分野で周知であり、いずれかのこのような方法を、採用し得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、タンパク質および核酸分子から選択される。

【0158】

用語「核酸」は、当該技術分野においてよく知られている。本明細書で使用される場合、「核酸」は一般的に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡの分子、またはその誘導体もしくは類似体を指す。核酸塩基は、例えば、ＤＮＡ中で認められる天然起源のプリンまたはピリミジン塩基（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）またはＲＮＡ中で認められる天然起源のプリンまたはピリミジン塩基（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）を含む。

【0159】

用語「核酸分子」としては、限定されないが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび他の短干渉核酸などの小型ＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｎＲＮＡ、小型ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、循環核酸、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメント、分解核酸、リボザイム、ウィルスＲＮＡまたはＤＮＡ、感染源の核酸、増幅産物、修飾核酸、プラスミドまたはオルガネラ核酸およびオリゴヌクレオチドなどの人工核酸が挙げられる。

【0160】

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い（例えば、１００塩基以下の）化学的に合成された一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ライゲーション反応によるなど、核酸分子の５’または３’末端に付着される。

【0161】

用語の「発現」は、遺伝子産物の生合成を指し、上記遺伝子産物の転写および／または翻訳を含む。従って、核酸分子の発現は、核酸フラグメントの転写（例えば、転写はｍＲＮＡまたは他の機能性ＲＮＡを生ずる）および／または前駆物質または成熟タンパク質（ポリペプチド）へのＲＮＡの翻訳を指し得る。

【0162】

細胞内での遺伝子の発現は、当業者に周知であり、本明細書では、その送達は、本発明の方法により、または本発明の組成物を使って実施され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、プラスミドまたはウィルスベクターなどの発現ベクター中にある。ベクターは、ウィルスベクターであり得る。ウィルスベクターは、レトロウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクターまたはポックスウィルスベクターであってよい。プロモーターは、哺乳類細胞において活性であり得る。プロモーターは、ウィルスプロモーターであってよい。

【0163】

いくつかの実施形態では、遺伝子またはオープンリーディングフレームは、プロモーターまたは他の調節エレメントに動作可能に連結される。「作動可能に連結される」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、または本発明の方法によりベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）を可能にするように調節エレメントに連結されることを意味すると意図される。いくつかの実施形態では、調節エレメントまたはプロモーターは、標的細胞中で活性である。

【0164】

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼ、即ち、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための開始部位の周りに集まっている一群の転写制御モジュールを意味する。プロモーターは、別々の機能的モジュールから構成され、それぞれは、約７～２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写活性化因子またはリプレッサータンパク質に対する１種または複数の認識部位を含む。

【0165】

いくつかの実施形態では、核酸配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩおよびＰｏｌ ＩＩ）により転写される。ＲＮＡＰ ＩＩは、真核細胞で見出される酵素である。それは、ＤＮＡの転写を触媒して、ｍＲＮＡおよびほとんどのｓｎＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの前駆物質を合成する。

【0166】

いくつかの実施形態では、哺乳類発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（±）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（±）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶおよびｐＢＫ－ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびに、これらの誘導体を含むが、これらに限定されない。

【0167】

いくつかの実施形態では、レトロウィルスなどの真核生物ウィルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターが、本発明で用いられる。ＳＶ４０ベクターは、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２を含む。いくつかの実施形態では、ウシパピローマウィルス由来のベクターは、ｐＢＶ－１ＭＴＨＡを含み、エプスタイン・バーウィルス由来のベクターは、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５を含む。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウィルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ－４０初期プロモーター、ＳＶ－４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウィルスプロモーター、ラウス肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞での発現に有効性を示す他のプロモーターの指示により、タンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。

【0168】

いくつかの実施形態では、水平感染および標的特異性などの利点を提供する組み換えウィルスベクターが、インビボ発現に有用である。一実施形態では、水平感染は、例えば、レトロウィルスのライフサイクルに固有であり、それにより単一の感染細胞が多くの子孫ビリオンを生成し、これらが母体から分離して隣接細胞に感染するプロセスである。一実施形態では、結果は、広い領域が急速に感染されるようになることであり、そのほとんどは元のウィルス粒子により初期に感染されたものではなかった。一実施形態では、水平に伝染できないウィルスベクターが生成される。一実施形態では、この特徴は、望ましい目的が限局数の標的細胞にのみ特定の遺伝子を導入することである場合有用であり得る。

【0169】

用語「生理活性」は、細胞または組織に対し効果を発揮する分子または薬剤を指す。生物活性剤のタイプの代表的な例は、限定されないが、治療薬、ビタミン、電解質、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、炭水化物、脂質、ポリサッカライド、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、成長因子、分化因子、ホルモン、神経伝達物質、プロスタグランジン、免疫グロブリン、サイトカイン、および抗原を含む。これらの分子の各種組み合わせを使用できる。サイトカインの例は、マクロファージ由来ケモカイン、マクロファージ炎症性タンパク質、インターロイキン、腫瘍壊死因子を含む。タンパク質の例は、繊維状タンパク質（例えば、コラーゲン、エラスチン）および接着タンパク質（例えば、アクチン、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、セレクチン、細胞内接着分子、およびインテグリン）を含む。種々の事例では、生物活性剤は、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンジン、テネイシンＣ、レプチン、白血病抑制因子、ＲＧＤペプチド、抗ＴＮＦ、エンドスタチン、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、骨形成タンパク質－１、骨形成タンパク質、オステオネクチン、ソマトメジン様ペプチド、オステオカルシン、インターフェロン、およびインターロイキンから選択され得る。いくつかの実施形態では、生物活性剤は、成長因子、分化因子、またはこれらの組み合わせを含む。

【0170】

本明細書で使用される場合、「単離されたペプチド」という用語は、炭水化物、脂質、または天然のペプチドに関連する他のタンパク質性不純物などの汚染細胞成分を基本的に含まないペプチドを指す。典型的には、単離されたペプチドの配合物は、高度に精製された形態の、即ち、少なくとも約８０％純度の、少なくとも約９０％純度の、少なくとも約９５％純度の、９５％を超える純度の、または９９％を超える純度のペプチドを含む。

【0171】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、同じ意味で用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。別の実施形態では、本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、天然ペプチド、ペプチド模倣体（典型的には、非ペプチド結合または他の合成修飾を含む）およびペプチド類似体ペプトイドおよびセミペプトイドまたはこれらの任意の組み合わせを包含する。別の実施形態では、記載されたペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、これらをより安定にするが身体中で細胞中へより浸透可能にする修飾を有する。一実施形態では、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、天然起源のアミノ酸ポリマーに適用される。別の実施形態では、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、１個または複数のアミノ酸残基が対応する天然起源のアミノ酸の人工の化学的類似体である、アミノ酸ポリマーに適用される。

【0172】

いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞質標的を結合する。いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞質標的に特異的である。いくつかの実施形態では、特異的は、任意の他の標的へのそれほど多くない結合を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、結合分子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、その標的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ペイロードは、その標的に相補的である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、標的を結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体の構造は、よく知られており、当業者は、抗体がそのＣＤＲ配列のみによりどの標的に対し結合するかを知らない可能性があるが、抗体の一般的構造およびその抗原結合領域は、当業者により認識され得る。

【0173】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、内部表面形状および抗原の抗原決定基の特徴に相補的な電荷分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖の折り畳みから形成される少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドまたはポリペプチド群を指す。抗体は典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含む四量体形態を有し、各対は、１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。抗体は、オリゴクローナル、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ラクダ化、ＣＤＲグラフト化、多重特異性、二重特異性、触媒性、ヒト化、完全ヒト型、抗イディオタイプであってよく、および可溶または結合型で標識できる抗体、ならびに、単独でまたは他のアミノ酸配列と組み合わせた、そのエピトープ結合フラグメント、バリアントまたは誘導体を含むフラグメントであってよい。抗体は、いずれの種由来であってよもい。抗体という用語はまた、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（ダイアボディ）、およびジスルフィド結合可変領域（ｄｓＦｖ）を含むがこれらに限定されない、結合フラグメントも含む。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち抗原結合部位を含む分子を含む。抗体フラグメントは、Ｆｃ領域またはそのフラグメントを含むがこれらに限定されない別の免疫グロブリンドメインに融合されてよく、または融合されなくてもよい。当業者は、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、可変領域（例えば、ＶＬおよびＶＨ）－Ｆｃ融合体およびｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体を含むがこれらに限定されない他の融合産物が生成され得ることを更に理解する。

【0174】

免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってよい。

【0175】

いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ラクダ科動物抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、サメ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖のみの抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体ミメティックである。いくつかの実施形態では、結合分子または抗体ミメティックは、ＤＡＲＰｉｎである。ＣＤＲに関係なく、本抗体、抗体フラグメント、ＳｃＦｖ、ナノボディ、ＶＨＨ、単一ドメイン抗体、ＤＡＲＰｉｎなどは、これらの非可変領域により構造的に認識され得る。従って、特定の標的に限定されることなく、本発明の組成物は、これらの分子をペイロードとして含むことが理解され得る。

【0176】

いくつかの実施形態では、ペイロードは、Ｃ末端システインアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ペイロードのＣ末端の近位にあるシステインアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、近位は、末端の１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のアミノ酸以内である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0177】

いくつかの実施形態では、ペイロードは、２個以上の分子を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、２個以上の生理活性分子を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、二重特異性である。本明細書で使用される場合、「二重特異性」という用語は、２個の異なる標的に対し機能を有することを指す。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の分子を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ペイロードは、２つの細胞内標的に対し少なくとも２個の分子を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つは、２つである。いくつかの実施形態では、２つの標的は、同じ標的である。いくつかの実施形態では、２つの標的は、異なる標的である。いつかの実施形態では、ペイロードは、少なくとも２つのＶＨＨを含む。いつかの実施形態では、少なくとも２つのＶＨＨは、異なる細胞内タンパク質に対して特異的である。

【0178】

いつかの実施形態では、少なくとも２個の分子は、リンカーにより分離される。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞質中で切断可能である。いくつかの実施形態では、リンカーは、フレキシブルである。いくつかの実施形態では、リンカーの切断は、各分子がその標的に到達することを可能にする。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能でない。いくつかの実施形態では、２個の分子は、２つの標的細胞内タンパク質を一緒に運ぶ。

【0179】

いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、リンカーを介してタンパク質担体に結合されたペイロードを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、融合タンパク質ではない。ペイロードおよび担体が別のリンカーで相互にコンジュゲートされることは、当業者なら理解するであろう。リンカーは、担体の一部ではなく、かつペイロードの一部でもないが、むしろそれぞれに付着され（コンジュゲートされ）、それによりこれらを連結する。

【0180】

いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、少なくとも２、少なくとも１０、少なくとも２４、少なくとも４８時間（これらの間の任意の範囲を含む）にわたり生体液（例えば、ヒト血液、血漿または血清）中で実質的に安定である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、血液中で実質的に安定である。いくつかの実施形態では、血液は、ヒト血液である。いくつかの実施形態では、血液は、マウス血液である。いくつかの実施形態では、血液は、げっ歯類血液である。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、ラットである。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、マウスである。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３６、４８または７２時間にわたり、ヒト血液中で実質的に安定である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0181】

いくつかの実施形態では、本発明のリンカーおよび／または電荷マスクされた部分は、細胞質条件への曝露下で不安定である。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、細胞質ゾルに生物学的ペイロードを放出するように、細胞質条件への曝露下で切断可能である。

【0182】

いくつかの実施形態では、電荷マスクされた部分は、脱保護された細胞浸透性部分（例えば、脱保護されたＰＥＩ分子）を含むタンパク質担体（例えば、ＨＳＡ）を生じるように、６～７のｐＨを含む条件への暴露下で切断または脱保護を受ける。いくつかの実施形態では、６～７のｐＨは、約６．８である。

【0183】

いくつかの実施形態では、脱保護された細胞浸透性部分（例えば、脱保護されたＰＥＩ分子）を含むタンパク質担体は、少なくとも５ｍＶ、少なくとも６ｍＶ、少なくとも７ｍＶ、少なくとも８ｍＶ、少なくとも８．５ｍＶ、少なくとも９ｍＶ、少なくとも９．５ｍＶ、少なくとも１０ｍＶ、少なくとも１２ｍＶ、または８～４０ｍＶ、８．５～４０ｍＶ、８～２０ｍＶ、８．５～２０ｍＶ、１０～４０ｍＶ、１０～２０ｍＶ、１０～３０ｍＶ、５～５０ｍＶ、６～５０ｍＶ、７～５０ｍＶ、８～５０ｍＶ、８～４０ｍＶ、８～３０ｍＶ、８～２０ｍＶ、１０～５０ｍＶ、１０～４０ｍＶ、１０～３０ｍＶ、１０～２０ｍＶ、２０～５０ｍＶ、３０～５０ｍＶ（これらの間の任意の範囲を含む）の正のゼータ電位値により特徴づけられる。当業者は、コンジュゲートの正確なゼータ電位値は、タンパク質担体、ペイロード、または両方のＭＷおよび／またはサイズに応じて、変化し得ることを理解するであろう。

【0184】

いくつかの実施形態では、脱保護された細胞浸透性部分（例えば、脱保護されたＰＥＩ分子）を含むタンパク質コンジュゲートは、少なくとも６ｍＶ、少なくとも７ｍＶ、少なくとも８ｍＶ、少なくとも８．５ｍＶ、少なくとも９ｍＶ、少なくとも９．５ｍＶ、少なくとも１０ｍＶ、少なくとも１２ｍＶ、または８～４０ｍＶ、８．５～４０ｍＶ、８～２０ｍＶ、８．５～２０ｍＶ、１０～４０ｍＶ、１０～２０ｍＶ、１０～３０ｍＶ（これらの間の任意の範囲を含む）の正のゼータ電位値により特徴づけられる。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0185】

ゼータ電位は、当該技術分野において既知の任意の方法により測定され得る。本明細書では、次のプロトコルを使用し、これは、分子が本明細書で詳述の範囲でゼータ電位を含むかどうかを決定するための標準法と考えることができる。ゼータ電位測定を、Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて実施した。試料の緩衝液を、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、１ｍＭのＮａＣｌに交換した。各試料からの２０μＬを、ゼータセル（ＤＴＳ１０７０）にロードし、各試料について５回反復して測定し、ｍＶでの平均ゼータ電位を、各反復について得た。５回の測定の平均を、標準偏差と共に報告する。測定を、次の条件下で実施した：温度２５℃；各反復に対する実験数１０～４０；平衡時間：６０秒、下位実験後の休止無し；反復間に６０秒の休止；電圧を自動的に選択し、単峰性分析法をデータ処理で使用。いくつかの実施形態では、ゼータ電位を、約１ｍＭの塩中で測定する。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、ゼータ電位を、約１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で測定する。

【0186】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、リンカーを介してペイロードに共有結合されたタンパク質担体を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、リンカーに共有結合される。いくつかの実施形態では、担体は、リンカーに共有結合される。いくつかの実施形態では、共有結合は、ペプチド結合ではない。いくつかの実施形態では、リンカーとペイロード間の少なくとも１つの結合、およびリンカーと担体の間の結合は、ペプチド結合ではない。いくつかの実施形態では、担体、リンカーおよびペイロードは、単一アミノ酸鎖中に含まれない。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、リンカーを介してペイロードに共有結合されたタンパク質担体を含み、リンカーは、少なくとも１つの切断可能な結合を含む合成リンカーである。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、リンカーを介してペイロードに共有結合されたタンパク質担体を含み、リンカーは、切断可能な結合を欠く合成リンカーである。いくつかの実施形態では、担体およびペイロードは、同じタンパク質由来ではない。いくつかの実施形態では、リンカーおよび担体は、同じタンパク質由来ではない。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーであり、かつ担体が基づくタンパク質のアミノ酸配列中に存在しない配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーであり、かつペイロードが基づくタンパク質のアミノ酸配列中に存在しない配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーおよびペイロードは、同じタンパク質由来ではない。いくつかの実施形態では、ペイロードは、天然起源の分子ではない。いくつかの実施形態では、ペイロードは、人工である。いくつかの実施形態では、リンカーは、天然起源ではない。いくつかの実施形態では、リンカーは、人工である。いくつかの実施形態では、担体は、天然起源タンパク質またはそのフラグメントである。

【0187】

いくつかの実施形態では、リンカーは、タンパク質リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、剛性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、フレキシブルなリンカーである。いくつかの実施形態では、剛性リンカーは、アルファヘリックスペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、フレキシブルなリンカーである。いくつかの実施形態では、フレキシブルなリンカーは、ＧＧＧＧＳリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ末端システインアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカーのＣ末端の近位にあるシステインアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、近位は、末端の１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のアミノ酸以内である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｎ末端システインアミノ酸を含み、ペイロードは、Ｃ末端システインを含む。システインの側鎖は、切断可能なジスルフィド結合を生成するために使用できる硫黄原子を含むことは、当業者により理解されよう。例えば、システインは、ＨＳＡのシステイン３４とジスルフィド結合を形成できる。

【0188】

いくつかの実施形態では、アルファヘリックスペプチドは、ＡＡＡＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＡＡＧＳＧ（配列番号６）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、アルファヘリックスペプチドは、ＡＡＡＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＡＡＧＳＧＬＣ（配列番号１０）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、アルファヘリックスペプチドは、ＡＡＡＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＡＡＧＳＧＬ（配列番号１４）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、フレキシブルなリンカーは、ＧＧＧＧＳリンカーである。いくつかの実施形態では、フレキシブルなリンカーは、１～５個のＧＧＧＧＳ反復を含む。いくつかの実施形態では、１～５個は、１～３個である。いくつかの実施形態では、１～５個は、１個である。いくつかの実施形態では、１～５個は、２個である。いくつかの実施形態では、１～５個は、３個である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＬＣ（配列番号４）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＬＧＣ（配列番号５）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＬＧ（配列番号７）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣ（配列番号８）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＣ（配列番号９）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＬＧＣ（配列番号１１）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＬＧ（配列番号１５）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号４～１５から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

【0189】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、バイオ切断可能な結合（例えば、細胞質条件へのンパク質コンジュゲートの暴露下で切断可能な結合）を実質的に欠く。いくつかの実施形態では、リンカーは、バイオ切断可能な結合を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、リンカーは、バイオ切断可能でない結合（例えば、アミド結合、クリック反応生成物、チオエーテル結合、など）を介して、タンパク質担体および／またはペイロードに付着される。

【0190】

いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、生体切断可能な結合を含む。いくつかの実施形態では、生体切断可能な結合は、少なくとも２時間、少なくとも１０時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間（これらの間の任意の範囲を含む）にわたり生体液（例えば、ヒト血液、血漿または血清）内で実質的に安定である。いくつかの実施形態では、切断可能なは、細胞質中で切断可能なことである。いくつかの実施形態では、切断可能なは、血清または血液中で切断可能ではない。いくつかの実施形態では、切断可能でないは、実質的に切断可能ではない。いくつかの実施形態では、細胞質中で生体切断可能なは、血液中でよりも、細胞質中で顕著により多く切断される。

【0191】

いくつかの実施形態では、生体切断可能な結合は、細胞質条件への暴露下で、切断可能である。いくつかの実施形態では、生体切断可能な結合は、細胞質条件（例えば、特に酸性ｐＨ条件および／またはグルタチオンなどの還元剤を含む、細胞内コンパートメント）への暴露下で、還元可能である。

【0192】

生体切断可能な結合は、当該技術分野において周知であり、細胞に侵入後に選択的に切断（細胞内切断）される結合を指す。細胞内での薬物放出にとって好ましい結合は、リソソーム中に認められるもののような、酸性条件中で切断可能な結合である。一例は、ジスルフィド結合である。ジスルフィド結合は、細胞に侵入時にグルタチオンにより切断されると想定される。いくつかの実施形態では、生体切断可能な結合は、細胞内で切断される結合である。いくつかの実施形態では、細胞内で切断されるは、細胞の内部で切断されることである。いくつかの実施形態では、細胞の内部は、細胞の細胞質である。いくつかの実施形態では、細胞の内部は、細胞の小胞中である。いくつかの実施形態では、小胞は、エンドソームである。いくつかの実施形態では、小胞は、リソソームである。いくつかの実施形態では、小胞は、ゴルジの小胞である。いくつかの実施形態では、切断は、選択的切断である。いくつかの実施形態では、選択的は、細胞外切断に比較してのことである。いくつかの実施形態では、細胞外は、細胞の外側である。いくつかの実施形態では、細胞の外側は、生体液中である。

【0193】

いくつかの実施形態では、生体切断可能な結合は、ジスルフィド結合であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、生体切断可能な結合は、複数のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、生体切断可能な結合は、立体的に障害される。いくつかの実施形態では、生体切断可能な結合は、立体的に障害されるジスルフィド結合であるか、またはそれを含む。

【0194】

いくつかの実施形態では、生体液は、体液である。いくつかの実施形態では、生体液は、血清、血漿、胃液、腸液、唾液、胆汁、腫瘍液、母乳、尿、間質液、脳脊髄液および便の少なくとも１種より選択される。いくつかの実施形態では、生体液は、血液である。いくつかの実施形態では、生体液は、血清である。いくつかの実施形態では、生体液は、血漿である。

【0195】

いくつかの実施形態では、立体的に障害されるジスルフィド結合は、側鎖またはそれに隣接する嵩高い部分を含む。いくつかの実施形態では、側鎖または嵩高い部分は、ジスルフィド結合の少なくとも１つの硫黄原子に近接して位置する。いくつかの実施形態では、隣接してまたは近接しては、０～１０個、０～２個、２～５個、５～１０個の原子結合の範囲（これらの間の任意の範囲を含む）の距離を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、用語「原子結合」は、炭素－炭素（Ｃ－Ｃ）結合の長さ、例えば、単一Ｃ－Ｃ結合の長さを指す。

【0196】

いくつかの実施形態では、立体的に障害されるジスルフィド結合は、側鎖またはそれに隣接する嵩高い部分（例えば、ジスルフィド結合の硫黄原子から１～１５Å、１～３Å、３～５Å、５～１０Å、１０～１５Åの範囲の距離に配置される）を含む。

【0197】

いくつかの実施形態では、側鎖または嵩高い部分は、アルキル（例えば、一級、二級または三級Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルで、任意に不飽和結合および／または置換基を含む）、芳香環、または立体障害型側鎖を含むアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン、およびトリプトファン）、またはタンパク質、これらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、側鎖または嵩高い部分は、ジスルフィド結合に隣接するメチレン基に共有結合される。

【0198】

いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合は、本発明の生物学的ペイロードおよび／またはタンパク質担体に隣接して配置され、隣接しては、本明細書で記載の通りである。いくつかの実施形態では、本発明の生物学的ペイロードおよび／またはタンパク質担体は、ジスルフィド結合を介して、リンカーに結合される。いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合は、タンパク質担体の近位にある、または隣接している。

【0199】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質担体（例えば、ＨＳＡ）は、ジスルフィド結合を介して、リンカーに結合される。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１）のアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは相同体を含む。配列番号１は、シグナルペプチドのないＨＳＡの配列を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、ＨＳＡのフラグメントである。いくつかの実施形態では、フラグメントは、ＨＳＡの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、フラグメントは、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００個のＨＳＡ由来のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、連続アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、ＨＳＡの相同体である。いくつかの実施形態では、ＨＳＡの相同体は、配列番号１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、配列番号１と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、配列番号１またはそのフラグメントまたは相同体からなる。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、配列番号１と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、配列番号１からなる。いくつかの実施形態では、ＨＳＡは、遊離システインを含む。いくつかの実施形態では、遊離システインは、システインＣ３４である。特定の実施形態では、遊離システインは、単一の遊離システインのみである。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、ジスルフィド結合を介して、ＨＳＡのＣ３４に結合される。

【0200】

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、フィブリノーゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）である。いくつかの実施形態では、ＦＧＡは、ＡＤＳＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲＧＰＲＶＶＥＲＨＱＳＡＣＫＤＳＤＷＰＦＣＳＤＥＤＷＮＹＫＣＰＳＧＣＲＭＫＧＬＩＤＥＶＮＱＤＦＴＮＲＩＮＫＬＫＮＳＬＦＥＹＱＫＮＮＫＤＳＨＳＬＴＴＮＩＭＥＩＬＲＧＤＦＳＳＡＮＮＲＤＮＴＹＮＲＶＳＥＤＬＲＳＲＩＥＶＬＫＲＫＶＩＥＫＶＱＨＩＱＬＬＱＫＮＶＲＡＱＬＶＤＭＫＲＬＥＶＤＩＤＩＫＩＲＳＣＲＧＳＣＳＲＡＬＡＲＥＶＤＬＫＤＹＥＤＱＱＫＱＬＥＱＶＩＡＫＤＬＬＰＳＲＤＲＱＨＬＰＬＩＫＭＫＰＶＰＤＬＶＰＧＮＦＫＳＱＬＱＫＶＰＰＥＷＫＡＬＴＤＭＰＱＭＲＭＥＬＥＲＰＧＧＮＥＩＴＲＧＧＳＴＳＹＧＴＧＳＥＴＥＳＰＲＮＰＳＳＡＧＳＷＮＳＧＳＳＧＰＧＳＴＧＮＲＮＰＧＳＳＧＴＧＧＴＡＴＷＫＰＧＳＳＧＰＧＳＴＧＳＷＮＳＧＳＳＧＴＧＳＴＧＮＱＮＰＧＳＰＲＰＧＳＴＧＴＷＮＰＧＳＳＥＲＧＳＡＧＨＷＴＳＥＳＳＶＳＧＳＴＧＱＷＨＳＥＳＧＳＦＲＰＤＳＰＧＳＧＮＡＲＰＮＮＰＤＷＧＴＦＥＥＶＳＧＮＶＳＰＧＴＲＲＥＹＨＴＥＫＬＶＴＳＫＧＤＫＥＬＲＴＧＫＥＫＶＴＳＧＳＴＴＴＴＲＲＳＣＳＫＴＶＴＫＴＶＩＧＰＤＧＨＫＥＶＴＫＥＶＶＴＳＥＤＧＳＤＣＰＥＡＭＤＬＧＴＬＳＧＩＧＴＬＤＧＦＲＨＲＨＰＤＥＡＡＦＦＤＴＡＳＴＧＫＴＦＰＧＦＦＳＰＭＬＧＥＦＶＳＥＴＥＳＲＧＳＥＳＧＩＦＴＮＴＫＥＳＳＳＨＨＰＧＩＡＥＦＰＳＲＧＫＳＳＳＹＳＫＱＦＴＳＳＴＳＹＮＲＧＤＳＴＦＥＳＫＳＹＫＭＡＤＥＡＧＳＥＡＤＨＥＧＴＨＳＴＫＲＧＨＡＫＳＲＰＶＲＤＣＤＤＶＬＱＴＨＰＳＧＴＱＳＧＩＦＮＩＫＬＰＧＳＳＫＩＦＳＶＹＣＤＱＥＴＳＬＧＧＷＬＬＩＱＱＲＭＤＧＳＬＮＦＮＲＴＷＱＤＹＫＲＧＦＧＳＬＮＤＥＧＥＧＥＦＷＬＧＮＤＹＬＨＬＬＴＱＲＧＳＶＬＲＶＥＬＥＤＷＡＧＮＥＡＹＡＥＹＨＦＲＶＧＳＥＡＥＧＹＡＬＱＶＳＳＹＥＧＴＡＧＤＡＬＩＥＧＳＶＥＥＧＡＥＹＴＳＨＮＮＭＱＦＳＴＦＤＲＤＡＤＱＷＥＥＮＣＡＥＶＹＧＧＧＷＷＹＮＮＣＱＡＡＮＬＮＧＩＹＹＰＧＧＳＹＤＰＲＮＮＳＰＹＥＩＥＮＧＶＶＷＶＳＦＲＧＡＤＹＳＬＲＡＶＲＭＫＩＲＰＬＶＴＱ（配列番号２）のアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは相同体を含む。配列番号２は、シグナルペプチドのないフィブリノーゲンの配列を提供する。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＦＳＭＲＩＶＣＬＶＬＳＶＶＧＴＡＷＴ（配列番号３）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＦＧＡは、ＦＧＡのフラグメントである。いくつかの実施形態では、フラグメントは、ＦＧＡの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、フラグメントは、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００または８５０個のＦＧＡ由来のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、連続アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＦＧＡは、ＦＧＡの相同体である。いくつかの実施形態では、相同性は、配列同一性である。いくつかの実施形態では、ＦＧＡの相同体は、配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＦＧＡは、配列番号２またはそのフラグメントまたは相同体からなる。いくつかの実施形態では、ＦＧＡは、配列番号２と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＦＧＡは、配列番号２からなる。

【0201】

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、フィブリノーゲンβ鎖（ＦＧＢ）である。いくつかの実施形態では、ＦＧＢは、ＱＧＶＮＤＮＥＥＧＦＦＳＡＲＧＨＲＰＬＤＫＫＲＥＥＡＰＳＬＲＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＲＡＲＰＡＫＡＡＡＴＱＫＫＶＥＲＫＡＰＤＡＧＧＣＬＨＡＤＰＤＬＧＶＬＣＰＴＧＣＱＬＱＥＡＬＬＱＱＥＲＰＩＲＮＳＶＤＥＬＮＮＮＶＥＡＶＳＱＴＳＳＳＳＦＱＹＭＹＬＬＫＤＬＷＱＫＲＱＫＱＶＫＤＮＥＮＶＶＮＥＹＳＳＥＬＥＫＨＱＬＹＩＤＥＴＶＮＳＮＩＰＴＮＬＲＶＬＲＳＩＬＥＮＬＲＳＫＩＱＫＬＥＳＤＶＳＡＱＭＥＹＣＲＴＰＣＴＶＳＣＮＩＰＶＶＳＧＫＥＣＥＥＩＩＲＫＧＧＥＴＳＥＭＹＬＩＱＰＤＳＳＶＫＰＹＲＶＹＣＤＭＮＴＥＮＧＧＷＴＶＩＱＮＲＱＤＧＳＶＤＦＧＲＫＷＤＰＹＫＱＧＦＧＮＶＡＴＮＴＤＧＫＮＹＣＧＬＰＧＥＹＷＬＧＮＤＫＩＳＱＬＴＲＭＧＰＴＥＬＬＩＥＭＥＤＷＫＧＤＫＶＫＡＨＹＧＧＦＴＶＱＮＥＡＮＫＹＱＩＳＶＮＫＹＲＧＴＡＧＮＡＬＭＤＧＡＳＱＬＭＧＥＮＲＴＭＴＩＨＮＧＭＦＦＳＴＹＤＲＤＮＤＧＷＬＴＳＤＰＲＫＱＣＳＫＥＤＧＧＧＷＷＹＮＲＣＨＡＡＮＰＮＧＲＹＹＷＧＧＱＹＴＷＤＭＡＫＨＧＴＤＤＧＶＶＷＭＮＷＫＧＳＷＹＳＭＲＫＭＳＭＫＩＲＰＦＦＰＱＱ（配列番号１９）のアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは相同体を含む。配列番号１９は、シグナルペプチドのないフィブリノーゲンの配列を提供する。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＫＲＭＶＳＷＳＦＨＫＬＫＴＭＫＨＬＬＬＬＬＬＣＶＦＬＶＫＳ（配列番号１８）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＦＧＢは、ＦＧＢのフラグメントである。いくつかの実施形態では、フラグメントは、ＦＧＢの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、フラグメントは、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または４８０個のＦＧＢ由来のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、連続アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＦＧＢは、ＦＧＢの相同体である。いくつかの実施形態では、相同性は、配列同一性である。いくつかの実施形態では、ＦＧＢの相同体は、配列番号１９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＦＧＢは、配列番号１９またはそのフラグメントもしくは相同体からなる。いくつかの実施形態では、ＦＧＢは、配列番号１９と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＦＧＢは、配列番号１９からなる。

【0202】

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、フィブリノーゲンγ鎖（ＦＧＧ）である。いくつかの実施形態では、ＦＧＧは、ＹＶＡＴＲＤＮＣＣＩＬＤＥＲＦＧＳＹＣＰＴＴＣＧＩＡＤＦＬＳＴＹＱＴＫＶＤＫＤＬＱＳＬＥＤＩＬＨＱＶＥＮＫＴＳＥＶＫＱＬＩＫＡＩＱＬＴＹＮＰＤＥＳＳＫＰＮＭＩＤＡＡＴＬＫＳＲＫＭＬＥＥＩＭＫＹＥＡＳＩＬＴＨＤＳＳＩＲＹＬＱＥＩＹＮＳＮＮＱＫＩＶＮＬＫＥＫＶＡＱＬＥＡＱＣＱＥＰＣＫＤＴＶＱＩＨＤＩＴＧＫＤＣＱＤＩＡＮＫＧＡＫＱＳＧＬＹＦＩＫＰＬＫＡＮＱＱＦＬＶＹＣＥＩＤＧＳＧＮＧＷＴＶＦＱＫＲＬＤＧＳＶＤＦＫＫＮＷＩＱＹＫＥＧＦＧＨＬＳＰＴＧＴＴＥＦＷＬＧＮＥＫＩＨＬＩＳＴＱＳＡＩＰＹＡＬＲＶＥＬＥＤＷＮＧＲＴＳＴＡＤＹＡＭＦＫＶＧＰＥＡＤＫＹＲＬＴＹＡＹＦＡＧＧＤＡＧＤＡＦＤＧＦＤＦＧＤＤＰＳＤＫＦＦＴＳＨＮＧＭＱＦＳＴＷＤＮＤＮＤＫＦＥＧＮＣＡＥＱＤＧＳＧＷＷＭＮＫＣＨＡＧＨＬＮＧＶＹＹＱＧＧＴＹＳＫＡＳＴＰＮＧＹＤＮＧＩＩＷＡＴＷＫＴＲＷＹＳＭＫＫＴＴＭＫＩＩＰＦＮＲＬＴＩＧＥＧＱＱＨＨＬＧＧＡＫＱＶＲＰＥＨＰＡＥＴＥＹＤＳＬＹＰＥＤＤＬ（配列番号２１）のアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは相同体を含む。配列番号２１は、シグナルペプチドのないフィブリノーゲンの配列を提供する。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＳＷＳＬＨＰＲＮＬＩＬＹＦＹＡＬＬＦＬＳＳＴＣＶＡ（配列番号２０）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＦＧＧは、ＦＧＧのフラグメントである。いくつかの実施形態では、フラグメントは、ＦＧＧの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、フラグメントは、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または４８０個のＦＧＧ由来のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、連続アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＦＧＧは、ＦＧＧの相同体である。いくつかの実施形態では、相同性は、配列同一性である。いくつかの実施形態では、ＦＧＧの相同体は、配列番号２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＦＧＧは、配列番号２１またはそのフラグメントもしくは相同体からなる。いくつかの実施形態では、ＦＧＧは、配列番号２１と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＦＧＧは、配列番号２１からなる。

【0203】

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、フィブリノーゲンの混合物である。いくつかの実施形態では、混合物は、ＦＧＡ、ＦＧＢおよびＦＧＧの少なくとも２種の混合物である。いくつかの実施形態では、混合物は、ＦＧＡ、ＦＧＢおよびＦＧＧの３種全ての混合物である。いくつかの実施形態では、ＦＧＡ、ＦＧＢおよびＦＧＧは、ヒト血液中で認められるような比率である。いくつかの実施形態では、血液は、血漿である。ヒト血漿由来のフィブリノーゲンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号３４１５７８などから商業的に入手できる。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、遊離システインを含む。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、遊離リジンを含む。フィブリノーゲンへのコンジュゲーションは、本明細書で記載のように、または当該技術分野において既知の任意の手段により実施できる。コンジュゲーションは、本明細書で記載のようにランダムであっても、または部位特異的であってもよい。

【0204】

いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、直鎖または分枝の鎖を含む。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、１種または複数の上記鎖を任意に含む主鎖であるか、またはそれを含む。

【0205】

いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、スペーサー（例えば、天然のおよび／または非天然のアミノ酸、アルキル、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、尿素結合、およびこれらの任意の誘導体または組み合わせを含む）である。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、生体適合性ポリマーまたは生体適合性部分を含む。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは、少なくとも部分的に生分解性ポリマーである。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは、ポリグリコールエーテル、ポリエステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ペプチドおよび／またはこれらの誘導体またはこれらの任意の組み合わせであるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態では、ポリグリコールエーテルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、１００～５０００Ｄａ（これらの間の任意の範囲を含む）のＭｎにより特徴づけられるＰＥＧを含む。

【0206】

いくつかの実施形態では、生体適合性部分は、アミド、エステル、グリコール、アミノ酸、またはこれらの任意の組み合わせであるか、またはこれらを含む。

【0207】

いくつかの実施形態では、ポリアミノ酸またはその誘導体は、２～５０個、４～５０個、５～５０個、５～５０個、４～２０個、４～３０個、４～４０個、５～２０個、５～３０個、５～４０個、６～５０個、６～３０個、６～４０個、６～２０個、８～５０個、８～３０個、８～２０個、８～４０個（これらの間の任意の範囲を含む）のアミノ酸を含む。

【0208】

本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、天然ペプチド、βペプチドなどのペプチド誘導体、ペプチド模倣体（典型的には、非ペプチド結合または他の合成修飾を含む）ならびにペプチド類似体ペプトイドおよびセミペプトイドまたはこれらの任意の組み合わせを包含する。別の実施形態では、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、少なくとも１個のアミノ酸残基が対応する天然起源のアミノ酸の人工の化学的類似体である、アミノ酸ポリマーに適用される。

【0209】

用語「誘導体」または「化学誘導体」は、ペプチド内の側鎖または任意の官能基上の１個または複数の化学的に誘導された残基を有するポリペプチドの任意の化学誘導体を含む。そのような誘導体化分子は、例えば、１個または複数の保護基（例えば、側鎖保護基および／またはＮ末端保護基）を有するペプチド、および／または遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ－トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ－ブトキシカルボニル基、アセチル基、またはホルミル基を形成するペプチドを含む。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、そのアミド、塩、メチルおよびエチルエステル、または他の種類のエステルまたはヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されてＯ－アシルまたはＯ－アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化されてＮ－イン－ベンジルヒスチジンを形成し得る。また、化学的な誘導体として包含されるのは、２０個の標準アミノ酸残基の１個または複数の天然起源のアミノ酸の誘導体を含有するペプチドである。例えば、４－ヒドロキシプロリンは、プロリンと置換されてよく；５－ヒドロキシリシンは、リジンと置換されてよく；３－メチルヒスチジンは、ヒスチジンと置換されてよく；ホモセリンは、セリンと置換されてよく；およびＤａｂ、Ｄａａ、および／またはオルニチン（Ｏ）は、リジンと置換されてよい。

【0210】

加えて、ペプチド誘導体は、限定されないが、末端－ＮＨ_２アシル化、アセチル化、またはチオグリコール酸アミド化を含む化学修飾により、および末端および／または側鎖カルボキシ基の、例えば、アンモニア、メチルアミン、などを用いたアミド化により、本発明のペプチドの天然配列とは異なり得る。ペプチドは、当該技術分野において既知の方法を使用して実現できる任意の立体配座を有する、直鎖の、環状の、または分岐したなどのいずれかであり得る。

【0211】

いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、スペーサー（例えば、天然のおよび／または非天然のアミノ酸、アルキル、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、尿素結合、およびこれらの任意の誘導体または組み合わせを含む）を更に含む。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、ジスルフィド結合を更に含む。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、クリック反応生成物（例えば、クリック反応を介して形成された環化反応生成物、および／またはスクシンイミド－チオエーテル部分）を含む。

【0212】

クリック反応は、当該技術分野において周知であり、特に、マレイミドおよびチオールのマイケル付加（スクシンイミド－チオエーテルの形成を生じる）；アジドアルキン環化付加；ディールスアルダー反応（例えば、直接および／または逆電子要求ディールスアルダー）；ジベンジルシクロオクチン １，３－ニトロン（またはアジド）環化付加；アルケンテトラゾール光クリック反応、などを含む。

【0213】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式１：

【化11】

により表され、ＰＣは、本発明のタンパク質担体（即ち、マスクされたタンパク質担体）を表し；ＢＰは、本発明の生物学的ペイロードを表し；各ｒおよびｍは独立に、０～１０（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；ｌは、１～１０（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；およびｐは、２～１００（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；各Ｒは独立に、嵩高い部分またはＨを表し；各Ａは独立に、１個または複数のリンカーを表し、各リンカーは独立に、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＮＲ_３、またはＳ）、カルボニル誘導体（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（ＮＲ_３）ＮＲ_３－、－Ｃ（ＮＲ_３）Ｏ－，－Ｃ（ＮＲ_３）Ｓ－）、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１０メルカプトアルキル、またはこれらの任意の組み合わせを含むクリック反応生成物、のいずれかを含む、またはＡは、存在しない。

【0214】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式１：

【化12】

により表され、ＰＣは、本発明のタンパク質担体（または、電荷マスクされた部分）を表し；ＢＰは、本発明の生物学的ペイロードを表し；各ｊ、ｋ、ｒ、ｏ、ｎおよびｍは独立に、０～１０（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；ｌは、１～１０（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；およびｐは、２～１００（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；各Ｒは独立に、嵩高い部分またはＨを表し；各Ｘは独立に、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、またはＳ）、カルボニル誘導体（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－、－Ｃ（ＮＨ）Ｏ－，－Ｃ（ＮＨ）Ｓ－）、スペーサー（例えば、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１０メルカプトアルキル、またはクリック反応生成物）またはこれらの組み合わせを表し、またはＸは、存在しない。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＲは、メチルである。

【0215】

いくつかの実施形態では、クリック反応生成物は、クリック反応を介して形成された部分を含み、クリック反応は、本明細書で前述の通りである。いくつかの実施形態では、クリック反応生成物は、マレイミドおよびチオールのマイケル付加（スクシンイミド－チオエーテルの形成を生じる）；アジドアルキン環化付加；ディールスアルダー反応（例えば、直接および／または逆電子要求ディールスアルダー反応）；ジベンジルシクロオクチン １，３－ニトロン（またはアジド）環化付加；アルケンテトラゾール光クリック反応、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより形成された生成物を含む。

【0216】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式１Ａ：

【化13】

により表され、Ｒ、ｎ、ｋ、ｌ、ｐ、ｍ、およびｒは、本明細書で記載の通りであり、各Ｘは独立に、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、またはＳ）、スペーサー（例えば、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１０メルカプトアルキル、またはクリック反応生成物）またはこれらの組み合わせを表し、またはＸは、存在しない。

【0217】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式Ａ：

【化14】

により表され、ＰＣは、本発明のタンパク質担体（または電荷マスクされた部分）を表し；ＢＰは、本発明の生物学的ペイロード（即ち、ペイロード）を表し；各ｒおよびｍは独立に、０～１０（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；各Ｒ_３は独立に、置換基またはＨを表し、Ｈｅｔは、ヘテロ原子を表し、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、およびＳからそれぞれ独立に選択され；各Ａは独立に、（ｉ）生体適合性部分または生体適合性ポリマー；および／または（ｉｉ）１個または複数のリンカーを表し、各リンカーは独立に、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、またはＳ）、カルボニル誘導体（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－、－Ｃ（ＮＨ）Ｏ－，－Ｃ（ＮＨ）Ｓ－）、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１０メルカプトアルキル、またはこれらの任意の組み合わせを含むクリック反応生成物、のいずれかを含む、またはＡは、存在しない。いくつかの実施形態では、ｒまたはｍの少なくとも１つは、１～１０、１～３、１～５、または１、２、３、４、５、６、または１０である（これらの間の任意の範囲を含む）。

【0218】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式Ｂ：

【化15】

、または式Ｃ：

【化16】

により表され、ＰＣは、本発明のタンパク質担体を表し；ＢＰは、本発明の生物学的ペイロードを表し；各ｒおよびｍは独立に、０～１０（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；ｐは、０～１００（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；Ｐｏｌは、生体適合性部分または生体適合性ポリマーを表し；各Ｒ_３は独立に、置換基またはＨを表し、Ｈｅｔは、ヘテロ原子を表し、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、およびＳからそれぞれ独立に選択され；各Ａは独立に、１個または複数のリンカーを表し、各リンカーは独立に、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、またはＳ）、カルボニル誘導体（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－、－Ｃ（ＮＨ）Ｏ－，－Ｃ（ＮＨ）Ｓ－）、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１０メルカプトアルキル、またはこれらの任意の組み合わせを含むクリック反応生成物、のいずれかを含む、またはＡは、存在しない。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式Ａ～Ｃのいずれか１つにより表され、リンカーは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも５００、５～５００、５～１００、１０～１００、５～５０、５０～１００、１００～５００個の（これらの間の任意の範囲を含む）原子結合の長さを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｐは、１～１００、１～２０、１０～１００、２～２０、３～２０、３～１５、１０～２０、２０～５０、５０～１００、または１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１５、または２０である（これらの間の任意の範囲を含む）。

【0219】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式１：

【化17】

により表され、ＰＣ、ＢＰおよびＰｏｌは、本明細書で記載の通りであり；各ｒおよびｍは独立に、０～１０（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；ｌは、１～１０（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；およびｐは、２～１００（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；各Ｒは独立に、嵩高い部分またはＨを表し；各Ａは独立に、１個または複数のリンカーを表し、各リンカーは独立に、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、ＮＲ_３、またはＳ）、カルボニル誘導体（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（ＮＲ_３）ＮＲ_３－、－Ｃ（ＮＲ_３）Ｏ－，－Ｃ（ＮＲ_３）Ｓ－）、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１０メルカプトアルキル、またはこれらの任意の組み合わせを含むクリック反応生成物、のいずれかを含む、またはＡは、存在しない。

【0220】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式：

【化18】

により表され、ＰＣ、ＢＰ、Ｈｅｔ、Ａ、Ｐｏｌ、およびｐは、本明細書で記載の通りであり；各ｒ、ｒ’、ｍおよびｍ’は独立に、０～１０（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；各Ｒ_３およびＲ_３’は独立に、１つまたは複数の嵩高い部分、１個または複数の置換基またはＨを表し；各Ｘ_１は、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、ＮＲ_３、またはＳ）、カルボニル誘導体（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（ＮＲ_３）ＮＲ_３－、－Ｃ（ＮＲ_３）Ｏ－，－Ｃ（ＮＲ_３）Ｓ－）、これらの任意の組み合わせを含むクリック反応生成物を表し、ＨｅｔがＳである場合、少なくとも１個のＸ_１は、Ｓである。いくつかの実施形態では、ＨｅｔおよびＸ_１が両方ともＳの場合、少なくとも１つのＲ_３は、１つまたは複数の嵩高い部分であり；少なくとも１つのｍ’およびｒ’は、０ではない。

【0221】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式：

【化19】

により表され、ＰＣ、ＢＰ、Ｈｅｔ、Ａ、Ｐｏｌ、Ｒ_３、ｒ、ｍ、およびｐは、結合価により許容される限り、本明細書で記載の通りである。いくつかの実施形態では、ＨｅｔおよびＸ_１が両方ともＳの場合、少なくとも１つのＲ_３は、１つまたは複数の嵩高い部分であり；少なくとも１つのｍ’およびｒ’は、０ではない。

【0222】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式：

【化20】

により表され、Ｈｅｔは、ＳまたはＮＨを含み、Ｘは、カルボニル誘導体、クリック反応生成物、または結合を表し、Ｐｅｐは、ペプチドを表す。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＢＰのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｈｅｔは、Ｓであり、ペプチドは、システイン（例えば、Ｃ末端システイン）を介してＰＣに結合される。

【0223】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式：

【化21】

、

【化22】

のいずれか１つにより表され、ＰＣ、ＢＰ、Ｐｏｌは、本明細書記載の通りであり；各ｊ、ｋ、ｒ、ｏ、ｎおよびｍは独立に、０～１０（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；ｌは、１～１０（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；およびｐは、２～１００（これらの間の任意の範囲を含む）の範囲の整数を表し；各Ｒは独立に、嵩高い部分またはＨを表し；各Ｘは独立に、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、またはＳ）、カルボニル誘導体（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－、－Ｃ（ＮＨ）Ｏ－，－Ｃ（ＮＨ）Ｓ－）、スペーサー（例えば、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１０メルカプトアルキル、またはクリック反応生成物）またはこれらの組み合わせを表し、またはＸは、存在しない。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＲは、メチルである。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌは、ペプチド、アミノ酸またはこれらの脱水誘導体、ＰＥＧ、または、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－を表す。いくつかの実施形態では、アミノ酸の脱水誘導体は：

【化23】

を包含し、波形結合は、リンカーまたはその後に続くモノマーへの結合点を表し、Ｒは、アミノ酸側鎖（任意にＲおよびＮＨは、プロリンにおけるようなＮＨの脱プロトン化を生じる環を形成するように相互結合される）を表す。

【0224】

いくつかの実施形態では、クリック反応生成物は、クリック反応を介して形成された部分を含み、クリック反応は、本明細書で前述の通りである。いくつかの実施形態では、クリック反応生成物は、マレイミドおよびチオールのマイケル付加（スクシンイミド－チオエーテルの形成を生じる）；アジドアルキン環化付加；ディールスアルダー反応（例えば、直接および／または逆電子要求ディールスアルダー反応）；ジベンジルシクロオクチン１，３－ニトロン（またはアジド）環化付加；アルケンテトラゾール光クリック反応、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより形成された生成物を含む。いくつかの実施形態では、クリック反応生成物は、スクシンイミド－チオエーテルである。

【0225】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、上述した式のいずれかにより表され、ＸまたはＸ_１は、クリック反応生成物であり、任意にクリック反応生成物は、スクシンイミド－チオエーテルである。

【0226】

いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、下式２：

【化24】

により表され、Ｐｏｌは、生体適合性部分または生体適合性ポリマー（例えば、Ｃ末端システインを含むペプチド）を表し；Ａは、スペーサー、または、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、またはＳ）、カルボニル誘導体（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ－、－Ｃ（ＮＨ）Ｏ－，－Ｃ（ＮＨ）Ｓ－）、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１０メルカプトアルキル、ＰＥＧ、アルキル－ＰＥＧ、アルキル－ＰＥＧ－アルキル、アルキルアミド－ＰＥＧ－アルキルアミド、またはこれらの任意の組み合わせを含むクリック反応生成物のいずれかを表し、またはＡは、存在せず；アルキルは、任意に（ｉ）１個または複数のヘテロ原子、（ｉｉ）１種または複数のカルボニル誘導体、（ｉｉｉ）１つまたは複数のジスルフィド結合、（ｉｖ）１種または複数のクリック反応生成物、の１種または複数を含むＣ_１－Ｃ_１０アルキルである。

【0227】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、式１Ａ：

【化25】

により表され、Ｒ、ｎ、ｋ、ｌ、ｐ、ｍ、Ｐｏｌ、およびｒは、本明細書で記載の通りであり、各Ｘは独立に、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、またはＳ）、スペーサー（例えば、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アミノアルキル、Ｃ_１－Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１０メルカプトアルキル、またはクリック反応生成物）またはこれらの組み合わせを表し、またはＸは、存在しない。
いくつかの実施形態では、Ｐｏｌは、アミノ酸またはこれらの脱水誘導体、または、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－を表す。

【0228】

いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、ジスルフィド結合を介してＨＳＡに結合される。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、アミノ基、または本発明の生物学的ペイロードのチオール基に共有結合される。いくつかの実施形態では、各ＨＳＡは、単一の生物学的ペイロードに結合される。いくつかの実施形態では、各ＨＳＡは、複数の生物学的ペイロードに結合される。

【0229】

いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、ジスルフィド結合を介してＨＳＡに結合される。いくつかの実施形態では、本発明のリンカーは、アミノ基、または本発明の生物学的ペイロードのチオール基に共有結合される。いくつかの実施形態では、各ＨＳＡは、単一の生物学的ペイロードに結合される。いくつかの実施形態では、各ＨＳＡは、複数の生物学的ペイロードに結合される。本発明の例示的タンパク質コンジュゲートは、図９により、および実施例セクションで示される。

【0230】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートは、少なくとも２時間、少なくとも１０時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間（これらの間の任意の範囲を含む）にわたり生体液中で実質的に安定である。

【0231】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートの、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％（これらの間の任意の範囲を含む）は、実質的に安定である。

【0232】

本明細書で使用される場合、「安定な」という用語は、（ｉ）その化学的一貫性（例えば、切断および／または脱保護を実質的に欠く）、および（ｉｉ）対象の組織および／または生体液内でその初期濃度および／または生物活性、を維持する本発明のタンパク質コンジュゲートまたはリンカーの能力を指す。

【0233】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートおよび／または本発明のタンパク質担体は、対照（例えば、保護アミンを欠く類似のタンパク質コンジュゲートまたはタンパク質担体）に比べて、増大された安定性により特徴づけられる。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートおよび／または本発明のタンパク質担体は、対照に比較して、生体液内でおよび／または組織（例えば、７を超えるｐＨを有する健康な組織）内での増大された安定性により特徴づけられ、増大されるは、対象に比較して、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１０，０００％、またはそれを超えて（これらの間の任意の範囲を含む）、増大されることである。

【0234】

いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質コンジュゲートおよび／または本発明のタンパク質担体は、７未満、６．８未満、６．５未満のｐＨ値を有する標的組織内での増大された蓄積を特徴とし；増大されるは、対照（例えば、保護基を欠く類似のタンパク質コンジュゲートまたはタンパク質担体）に比較して、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも５００％、少なくとも１，０００％、少なくとも１０，０００％、またはそれを超えて（これらの間の任意の範囲を含む）、増大されることである。

【0235】

いくつかの実施形態では、標的組織は、癌組織、炎症性組織、またはそれらの両方を含む。いくつかの実施形態では、標的組織は、癌を含む。いくつかの実施形態では、標的組織は、炎症を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、癌である。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌である。いくつかの実施形態では、標的組織は、炎症性組織である。

【0236】

ターゲティング部分
いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、ターゲティング部分を更に含む。本明細書で使用される場合、「ターゲティング部分」という用語は、標的抗原に特異的に結合できる任意の分子を指す。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、標的細胞の表面上で発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、表面タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、受容体である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、癌特異的抗原である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、標的細胞のための表面マーカーである。いくつかの実施形態では、標的細胞は、標的細胞型である。いくつかの実施形態では、細胞型は、疾患細胞型である。いくつかの実施形態では、結合は、特異的結合である。いくつかの実施形態では、標的への特異的結合は、別の標的への結合を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、実質的には、有意にである。いくつかの実施形態では、実質的に結合しないは、別の標的タンパク質への最大で０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、５、７、または１０％の結合である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0237】

本明細書で使用される場合、用語の「部分」は、部分構造として全官能基または官能基の一部を含み得る分子の部分に関する。用語「部分」は、対応する分子に類似の、特定のセットの化学的および／または薬理的特性を示す分子の一部も更に意味する。この場合、特性は、標的タンパク質への結合である。

【0238】

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、抗原結合分子である。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、表面標的を結合する抗原結合分子である。いくつかの実施形態では、標的は、タンパク質である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、可変重鎖ホモダイマー（ＶＨＨ）、ナノボディ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）および抗体ミメティックタンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、ＶＨＨである。

【0239】

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、標的タンパク質を調節する。いくつかの実施形態では、調節することは、標的タンパク質を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、調節することは、標的タンパク質を阻害することを含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、標的タンパク質の作動薬である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、標的タンパク質の拮抗薬である。

【0240】

いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、タンパク質担体にコンジュゲートされる。いつかの実施形態では、コンジュゲートされるは、リンカーによりコンジュゲートされるある。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、生物学的ペイロードにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ターゲティング部分、生物学的ペイロードおよびタンパク質担体をコンジュゲートする分岐リンカーである。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分および生物学的ペイロードは、単一ポリペプチドに含まれる。いくつかの実施形態では、単一ポリペプチドは、単鎖である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分および生物学的ペイロードは、リンカーにより分離される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、生物学的ペイロードに対しＮ末端である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、生物学的ペイロードに対しＣ末端である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、ポリペプチドのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、ポリペプチドのＣ末端にある。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、Ｃ末端システイン残基によりＣ末端から分離される。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、Ｃ末端リンカーによりＣ末端から分離される。

【0241】

キット
別の態様では、第１の部分および生物学的ペイロードに共有結合されたタンパク質担体を含むキットが提供され、第１の部分は、生物学的ペイロードへの反応性により特徴づけられ、タンパク質担体は、本発明の電荷マスクされた部分を含む。いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、第２の部分に共有結合され、第１の部分および第２の部分は、相互に反応性を有する（例えば、クリック反応を介して）。いくつかの実施形態では、キットは、ＰＧを更に含む。

【0242】

いくつかの実施形態では、第１の部分に結合されたタンパク質担体は、式２：

【化26】

、または式２Ａ：

【化27】

により表され、Ｒ、ｎ、ｊ、ｌ、ｐ、ｍ、およびｒは、本明細書で記載の通りであり、Ａは、Ｏ、ＮＲ、およびＳから選択されるヘテロ原子であるか、それを含み、Ｒ_１は、第１の部分を表す。

【0243】

いくつかの実施形態では、第２の部分に共有結合された生物学的ペイロードは、式３：

【化28】

、または式４：

【化29】

により表され、Ｒ、Ｘ、ｊ、ｌ、ｎ、ｍ、およびｐは、本明細書で記載の通りであり、Ａは、Ｏ、ＮＲ、およびＳから選択されるヘテロ原子であるか、それを含み、Ｒ_２は、第２の部分を表す。

【0244】

いくつかの実施形態では、第１の部分または第２の部分は、１，３－ニトロン、アジド、ジエン、テトラジン、活性エステル（例えば、エステル、ペンタフルオロフェニル（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アシルハロゲン化物、クロロホルメート、無水物、アルデヒド、エポキシド、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、カーボネート、スルホニルクロリド、ヨードアセトアミド、アシルアジド、イミドエステル、ビニルスルホン、オルトピリジルジスルフィド、またはこれらの任意の組み合わせであるか、これらを含む。

【0245】

いくつかの実施形態では、第１の部分または第２の部分は、求核基（例えば、アミン、チオール、ホスフィン、ヒドロキシル）、求ジエン体、アルケン、およびアルキン（例えば、アセチレン、ジベンジルシクロオクチン、など）、またはこれらの任意の組み合わせであるか、またはこれらを含む。

【0246】

いくつかの実施形態では、本発明のキットは、ＨＳＡに対する（例えば、そのシステインまたはリジンに対する）反応性を有する官能基を含むリンカーに共有結合された生物学的ペイロード；およびＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、生物学的ペイロードに対する（例えば、そのシステインまたはリジンに対する）反応性を有する官能基を含むリンカーに共有結合されたＨＳＡ；および生物学的ペイロードを含む。いくつかの実施形態では、官能基は、ヨードアセトアミド、活性エステル、オルトピリジルジスルフィド、マレイミド、またはこれらの組み合わせのいずれかであるか、またはそれを含む。

【0247】

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、血液中で安定なコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、細胞に浸透するコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、マスクされたコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、マスクできるコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、細胞膜を横断するコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、細胞に侵入できる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、エンドソーム脱出可能である。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ペイロードの細胞内送達が可能である。いくつかの実施形態では、細胞内送達は、細胞質送達である。いくつかの実施形態では、細胞内送達は、ペイロードからの担体の解離を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、細胞質中で分離するように構成される。いくつかの実施形態では、解離は、ペイロードからの担体の解離である。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、細胞内標的を調節することにおける使用のためである。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、細胞内標的に変化をもたらすことにおける使用のためである。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは細胞内標的と相互作用することにおける使用のためである。

【0248】

方法
別の態様では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する方法が提供され、方法は、保護されたアミン基を含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを得るために、細胞内標的を結合する生物学的薬剤を提供すること；細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体を提供することであって、細胞浸透性部分は、複数のアミン基を含む、提供すること；タンパク質コンジュゲートを産生するためにリンカーを介してタンパク質担体に上記生物学的ペイロードを共有結合させるために十分な条件下で、生物学的ペイロードおよびタンパク質担体を提供すること；７未満のｐＨ値で切断（脱保護）を受けることができる保護基により、アミン基の少なくとも一部を保護するために十分な条件下でタンパク質担体を提供すること、を含む。

【0249】

いくつかの実施形態では、方法は、生体液中および細胞質条件下でリンカーの安定性を決定すること；および生体液中で安定であり細胞質条件下で不安定なリンカーを含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを選択することを更に含み、それにより細胞内標的に結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する。いくつかの実施形態では、アミン基の少なくとも一部を保護するステップは、（ｉ）タンパク質コンジュゲートの産生のステップを実施する前に；または（ｉｉ）タンパク質コンジュゲートの産生のステップの後に、実施される。いくつかの実施形態では、保護するために十分な条件下でタンパク質担体を提供することは、タンパク質担体に生物学的ペイロードを結合する前に起こる。いくつかの実施形態では、保護するために十分な条件下でタンパク質担体を提供することは、タンパク質担体に生物学的ペイロードを結合した後に起こる。いくつかの実施形態では、提供することは、連結されないタンパク質担体を提供することである。いくつかの実施形態では、提供することは、タンパク質コンジュゲートを提供することである。当業者には、タンパク質コンジュゲートは、タンパク質コンジュゲートが保護される場合、ペイロードおよびリンカー上の塩基性残基もまた保護され、従って、全コンジュゲートが保護されることが理解されよう。いくつかの実施形態では、方法は、本発明の電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生するためである。いくつかの実施形態では、用語「電荷マスクされたタンパク質コンジュゲート」および「タンパク質コンジュゲート」は、本明細書で同義に使用される。いくつかの実施形態では、選択することは、細胞質条件中でよりも生体液中で安定な電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを選択することである。いくつかの実施形態では、より安定なは、少なくとも、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００％のより高い安定性である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0250】

別の態様では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する方法が提供され、方法は、細胞内標的を結合する生物学的薬剤を提供すること；細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体を提供することであって、細胞浸透性部分は、複数のアミン基を含む、提供すること、かつその後、７未満のｐＨ値で切断（脱保護）を受けることができる保護基によりアミン基の少なくとも一部を保護するために十分な条件下でタンパク質コンジュゲートを提供して、保護されたアミン基を含むマスクされたタンパク質担体を得ること；リンカーを介してタンパク質担体に生物学的ペイロードを共有結合させるために十分な条件下で上記生物学的ペイロードおよびマスクタンパク質担体を提供すること、を含む。

【0251】

別の態様では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する方法が提供され、方法は、細胞内標的を結合する生物学的薬剤を提供すること；細胞浸透性部分に共有結合されたマスクされたタンパク質担体を提供することであって、細胞浸透性部分は、複数の保護されたアミン基を含む、提供すること；タンパク質コンジュゲートを産生するために少なくとも１つのバイオ切断可能な結合を含むリンカーを介して生物学的ペイロードをタンパク質担体に共有結合させるために十分な条件下で生物学的ペイロードおよびタンパク質担体を提供すること、を含む。

【0252】

別の態様では、電荷マスクされたタンパク質を産生する方法が提供され、方法は、細胞内標的を結合する生物学的薬剤を提供すること、細胞浸透性部分に生物学的製剤を結合させること、および細胞浸透性部分の少なくとも一部を保護するために十分な条件下で細胞浸透性部分に結合された生物学的製剤を提供すること、を含む。いくつかの実施形態では、細胞浸透性部分は、複数のアミン基を含む。いくつかの実施形態では、アミン基の少なくとも一部は、保護される。いくつかの実施形態では、保護基は、７未満のｐＨ値で切断（脱保護）を受けることができる。

【0253】

別の態様では、電荷マスクされたタンパク質を産生する方法が提供され、方法は、細胞内標的を結合する生物学的薬剤を提供すること、細胞浸透性部分に生物学的製剤を結合させることであって、細胞浸透性部分は、複数の保護されたアミン基を含む、結合させること、を含む。

【0254】

いくつかの実施形態では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、細胞内標的に結合できる。いくつかの実施形態では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、細胞の細胞質に侵入できる。いくつかの実施形態では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、生物学的製剤の細胞内送達ができる。いくつかの実施形態では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、生物学的製剤の細胞内送達を可能にする。いくつかの実施形態では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、細胞内標的を調節できる。いくつかの実施形態では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、細胞内標的を調節するように構成される。いくつかの実施形態では、生物学的製剤は、ジスルフィド結合を欠く。いくつかの実施形態では、生物学的製剤は、生物学的製剤の構造に必要とされるジスルフィド結合を欠く。いくつかの実施形態では、生物学的製剤は、生物学的製剤の機能に必要とされるジスルフィド結合を欠く。いくつかの実施形態では、生物学的製剤は、生物学的製剤の結合に必要とされるジスルフィド結合を欠く。いくつかの実施形態では、生物学的製剤は、切断されると結合を減らすジスルフィド結合を欠く。いくつかの実施形態では、結合は、細胞内標的への結合である。

【0255】

いくつかの実施形態では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、治療薬である。いくつかの実施形態では、治療薬は、生物学的治療薬である。いくつかの実施形態では、治療薬は、生物製剤である。いくつかの実施形態では、治療薬は、細胞内標的に対する薬剤である。いくつかの実施形態では、治療薬は、細胞内標的を標的にする。いくつかの実施形態では、治療薬は、細胞内標的を調節する。

【0256】

いくつかの実施形態では、本発明の電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを合成する方法がある。いくつかの実施形態では、方法は、本発明のキットを提供することおよび第１の部分と第２の部分を反応させること（例えば、任意に金属系触媒および／またはＵＶ照射、熱照射を含む、好適な条件下で）を含む。

【0257】

いくつかの実施形態では、本発明の電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを合成する方法は、（ｉ）第１の部分に共有結合されたタンパク質担体、および第２の部分に共有結合された生物学的ペイロードを提供することであって、第１の部分および第２の部分は、相互に反応性を有する（例えば、クリック反応を介して、チオール－マレイミド結合形成を介して、アミンの活性エステルとのカップリング（ａｍｉｎｅ ｔｏ ａｃｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を介して、ＳＰＤＰまたはニトロ－ＳＰＤＰとチオールとの反応などのＳ－Ｓ結合形成を介して）、提供すること；（ｉｉ）第１の部分および第２の部分の間の反応に好適な条件下でタンパク質担体および生物学的ペイロードを提供すること、それによりタンパク質コンジュゲートを合成すること；および（ｉｉｉ）その後に続くＰＧによる少なくとも一部のアミンの保護に好適な条件下でタンパク質コンジュゲートをＰＧ前駆物質と反応させること、それにより本発明の電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを得ること、を含む。

【0258】

別の態様では、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する方法が提供され、方法は、（ｉ）第１の部分に共有結合されたタンパク質担体、および第２の部分に共有結合された生物学的ペイロードを提供すること、および（ｉｉ）反応に好適な条件下でマスクされたタンパク質担体および生物学的ペイロードを提供すること、それによりタンパク質コンジュゲートを合成すること、を含み、マスクされたタンパク質担体は、少なくとも一部のアミンをＰＧで保護するのに好適な条件下でタンパク質コンジュゲートをＰＧ前駆物質と反応させることにより合成される。

【0259】

いくつかの実施形態では、保護するために好適な条件は、アミンをＰＧ前駆物質と反応させるために好適な反応条件を含み、それにより、保護されたアミンを得る。いくつかの実施形態では、保護するために好適な条件は、中性または塩基性のｐＨ；少なくとも－１０℃、少なくとも０℃、少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも５０℃（これらの間の任意の範囲を含む）の温度；ならびに、タンパク質コンジュゲートに対して、９０および少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００モル当量、少なくとも３００モル当量、少なくとも５００モル当量（これらの間の任意の範囲を含む）のＰＧ前駆物質を含む。

【0260】

いくつかの実施形態では、方法のステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）は、溶液（例えば、有機溶媒、水性溶媒またはこれらの組み合わせ）中で実施される。
いくつかの実施形態では、第１の部分および第２の部分は、本明細書で記載の通りである。いくつかの実施形態では、反応は、クリック反応を含む。

【0261】

いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）生物学的ペイロードに対する（例えば、そのシステインまたはリジンに対する）反応性を有する官能基を含むリンカーに共有結合されたタンパク質担体および生物学的ペイロードを提供すること；（ｉｉ）官能基を生物学的ペイロードと反応させること、それによりタンパク質コンジュゲートを合成すること；（ｉｉｉ）タンパク質コンジュゲートをＰＧ前駆物質と反応させて、電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを得ること、を含む。

【0262】

いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）タンパク質担体に対する（例えば、そのシステインまたはリジンに対する）反応性を有する官能基を含むリンカーに共有結合された生物学的ペイロードおよびタンパク質担体を提供すること；（ｉｉ）官能基をタンパク質担体と反応させること、それによりタンパク質コンジュゲートを合成すること；（ｉｉｉ）本明細書で記載の条件下で細胞浸透性部分のアミンをＰＧで保護して、本発明の電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを得ること、を含む。

【0263】

いくつかの実施形態では、方法は、マスクされたコンジュゲートの細胞浸透を試験することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞への送達時の生物学的ペイロードの機能を試験することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、マスクされたコンジュゲートの体内分布を試験することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞中の生物学的ペイロードのインビボ機能を試験することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、生体液中および細胞質条件でのリンカーの安定性を決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、生体液中で安定であり細胞質条件中で不安定であるリンカーを含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを選択することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、生物学的ｐＨおよび酸性のｐＨでの保護されたアミン基の安定性を測定することを含む。いくつかの実施形態では、生物学的ｐＨは、中性ｐＨである。いくつかの実施形態では、生物学的ｐＨは、中性または塩基性のｐＨである。いくつかの実施形態では、生物学的ｐＨは、約７．４のｐＨである。いくつかの実施形態では、酸性のｐＨは、約６．８のｐＨである。いくつかの実施形態では、酸性のｐＨは、７未満のｐＨである。いくつかの実施形態では、酸性のｐＨは、６．８のｐＨであるか、それ未満のｐＨである。いくつかの実施形態では、方法は、生物学的ｐＨで安定であり酸性ｐＨで不安定である保護されたアミン基を含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを選択することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、７未満のｐＨで切断（脱保護）される保護基を選択することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内標的に結合する生物学的製剤を選択することを含む。いくつかの実施形態では、選択することは、細胞内標的に結合する生物学的製剤を決定するまたは測定することを含む。このような試験を実施する方法は、本明細書の以降で提供され、いずれかのこのような試験が実施され得る。

【0264】

いくつかの実施形態では、方法は、ターゲティング部分を選択することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞の表面上の目的のタンパク質に結合する部分を選択することを更に含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、目的の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、疾患細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、生物学的ペイロードに選択されたターゲティング部分をコンジュゲートすることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、タンパク質担体に選択されたターゲティング部分をコンジュゲートすることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、マスクされたタンパク質担体に選択されたターゲティング部分をコンジュゲートすることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、タンパク質コンジュゲートに選択されたターゲティング部分をコンジュゲートすることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、マスクされたタンパク質コンジュゲートに選択されたターゲティング部分をコンジュゲートすることを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートすることは、リンカーを介する。いくつかの実施形態では、コンジュゲートすることは、ターゲティング部分および生物学的ペイロードを含む単一ポリペプチドを構築することである。いくつかの実施形態では、構築することは、生物学的ペイロード中にターゲティング部分を挿入することを含む。

【0265】

いくつかの実施形態では、方法は、標的タンパク質へのターゲティング部分の結合を試験することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、標的タンパク質へのマスクされたタンパク質コンジュゲートの結合を試験することを含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質へは、その表面で標的タンパク質を発現する細胞へである。いくつかの実施形態では、試験することは、特異的結合を試験することである。いくつかの実施形態では、試験することは、その表面に標的タンパク質を含まない細胞への結合の欠如を試験することを含む。このような試験を実施する方法は、本明細書の以降で提供され、いずれかのこのような試験が、実施され得る。

【0266】

別の態様では、本発明の方法により産生されるタンパク質コンジュゲートが提供される。
別の態様では、本発明の方法により産生されるタンパク質が提供される。

【0267】

組成物
別の態様では、本発明のタンパク質コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
別の態様では、本発明のタンパク質を含む医薬組成物が提供される。

【0268】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または補助剤を含む。本明細書で使用される場合、「担体」、「賦形剤」、または「補助剤」という用語は、活性薬剤ではない医薬組成物のいずれかの成分を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、非毒性の不活性固体、半固体液体充填剤、希釈剤、封入材料、任意の種類の製剤補助剤、または単に生理食塩水などの無菌水性媒体を指す。薬学的に許容可能な担体として役立ち得る材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖、プロピレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；発熱物質を含まない水；等張食塩水、リンガー溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬製剤で使用される他の非毒性適合性物質である。本明細書において担体として機能し得る物質のいくつかの非限定例は、糖、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、ポリオール、発熱物質を含まない水、等張生理食塩水、リン酸緩衝液、および他の医薬製剤で使用される他の非毒性の医薬適合性物質を含む。ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤および滑剤、ならびに賦形剤、安定剤、抗酸化剤、および保存剤も存在し得る。任意の非毒性、不活性および有効な担体が、本明細書で意図される組成物を製剤化するために使用され得る。
担体は、全体で、本明細書に提示される医薬組成物の約０．１重量％～約９９．９９９９９重量％を構成し得る。

【0269】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療的有効量の本発明のタンパク質コンジュゲートを含む。用語「治療的有効量」は、哺乳動物の疾患または障害を治療するために効果的な薬物の量を指す。用語「治療的有効量」は、所望の治療または予防薬結果を達成するために、必要な投与量でかつ必要な期間に、有効な量を指す。正確な剤形および投与計画は、患者の状態に応じて、医師により決定されるであろう。

【0270】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与用に処方される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与用に処方される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与用に処方される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象への投与用に処方される。

【0271】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、徐放性組成物である。いくつかの実施形態では、リンカーは、生体切断可能な結合を欠き、組成物は、徐放性組成物である。いくつかの実施形態では、徐放は、投与後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日のペイロード送達を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、徐放は、投与後少なくとも１日のペイロード送達を含む。いくつかの実施形態では、徐放は、投与後少なくとも３日のペイロード送達を含む。いくつかの実施形態では、徐放は、投与後少なくとも５日のペイロード送達を含む。

【0272】

いくつかの実施形態では、本発明の特定の化合物は、治療のための遊離型で、または薬学的に許容可能な塩として存在し得る。

【0273】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な塩」は、任意の非毒性の本発明の化合物の塩を指し、これは、対象、例えば、ヒトへの投与時に、直接にまたは間接的に、本発明の化合物または阻害活性のあるその代謝物または残留物を提供できる。例えば、「薬学的に許容可能な」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局により承認されたまたは米国薬局方または動物および更に限定すればヒトでの使用について他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味し得る。

【0274】

薬学的に許容可能な塩は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９７７，６６，１－１９、中で薬学的に許容可能な塩について詳細に記載している。本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩は、好適な無機および有機酸ならびに塩基から誘導されるものを含む。これらの塩は、本発明の化合物の最終単離および精製中にｉｎ ｓｉｔｕで調製可能である。酸付加塩は、１）遊離塩基型の精製化合物を好適な有機または無機酸と反応させること、および２）これにより形成された塩を単離すること、により調製できる。

【0275】

薬学的に許容可能な塩の非限定例は、限定されないが、酢酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、ハロゲン化物（臭化物、塩化物、ヨウ化物、フッ化物など）、酒石酸水素塩、クエン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、デカン酸塩、エデト酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、および乳酸塩またはこれらの任意の組み合わせを含む。

【0276】

薬学的に許容可能な無毒性酸付加塩の追加の例は、アミノ基と、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸との塩、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸との塩、またはイオン交換などの当該技術分野において使用される他の方法の使用による塩である。

【0277】

その他の薬学的に許容可能な塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、蟻酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸、グリセロ燐酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。

【0278】

塩基付加塩は、１）その酸型での精製化合物を好適な有機または無機の無機塩基と反応させること、および２）これにより形成された塩を単離すること、により調製できる。適切な塩基から誘導される塩は、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、リチウム、およびカリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウムおよびカルシウム）、アンモニウムおよびＮ^＋（Ｃ_１－４アルキル）_４の塩を含む。本発明はまた、本明細書で開示の化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化も想定する。水または油に可溶なまたは分散性の生成物を、このような四級化により得てもよい。

【0279】

さらなる薬学的に許容可能な塩は、適切な場合には、無毒性アンモニウム、四級アンモニウム、ならびにハライド、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩などの対イオンの使用により形成される、アミンカチオンを含む。他の酸および塩基が、其れ自体は薬学的に許容可能ではないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容可能な酸または塩基付加塩を得るために中間体として有用である塩の調製において採用され得る。

【0280】

いくつかの実施形態では、用語「１または複数」は、１、２、３、４、５、または６から選択される任意の数値を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、ＮＨ、またはＳのいずれかを含む。

【0281】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載の化合物は、キラル化合物（即ち、不斉炭素原子を有する）である。いくつかの実施形態では、ジアステレオマー、幾何異性体および個別の異性体は、本発明の範囲内に包含される。いくつかの実施形態では、本明細書で記載のキラル化合物は、ラセミ混合物の形態である。いくつかの実施形態では、キラル化合物は、Ｒ配置を有する不斉炭素を含む単一鏡像異性体の形態である。いくつかの実施形態では、キラル化合物は、本明細書で前述のＳ配置を有する不斉炭素を含む単一鏡像異性体の形態である。

【0282】

いくつかの実施形態では、キラル化合物は、７０％を越える鏡像異性体純度を有する単一鏡像異性体の形態である。いくつかの実施形態では、キラル化合物は、８０％を越える鏡像異性体純度を有する単一鏡像異性体の形態である。いくつかの実施形態では、キラル化合物は、９０％を越える鏡像異性体純度を有する単一鏡像異性体の形態である。いくつかの実施形態では、キラル化合物は、９５％を越える鏡像異性体純度を有する単一鏡像異性体の形態である。

【0283】

いくつかの実施形態では、不飽和結合を含む本発明の化合物は、トランスまたはシス異性体の形態である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書で前述される、シスおよびトランス異性体の混合物を含む。

【0284】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載の化合物は、非溶媒和型ならびに水和型を含む溶媒和型で存在できる。一般に、溶媒和型は、非溶媒和型と同等であり、本発明の範囲内に包含される。本発明の特定の化合物は、複数の結晶型または非晶質型で存在し得る。一般に、全ての物理的形態は、本発明で意図される使用に関し等価であり、本発明の範囲内に包含されることが意図される。

【0285】

用語「溶媒和物」は、可変化学量論（例えば、ジ、トリ、テトラ、ペンタ、ヘキサ、等）の複合体を指し、それは、溶質（本明細書で記載のコンジュゲート）と溶媒により形成され、それにより溶媒は、溶質の生物活性を妨害しない。好適な溶媒は、例えば、エタノール、酢酸などを含む。
用語「水和物」は、溶媒が水の場合の、本明細書の上で定義されるような溶媒和物を指す。

【0286】

別に定める場合を除き、本明細書で示す構造は、構造の全ての異性体（例えば、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、幾何学的異性体、および回転異性体）型を含むことが意図される。例えば、各不斉中心に対するＲおよびＳ立体配置、（Ｚ）および（Ｅ）二重結合異性体、および（Ｚ）および（Ｅ）配座異性体が、本発明に含まれる。当業者には理解されるように、置換基は、任意の回転可能結合の周りで自由に回転できる。したがって、本化合物の単一立体化学的異性体ならびに鏡像異性体、ジアステレオ異性体、および幾何学的異性体、立体構造異性体、および回転異性体混合物は、本発明の範囲内にある。

【0287】

特に指示がない限り、本発明の化合物の全ての互変異性型は、本発明の範囲内にある。

【0288】

さらに、別段の指示がない限り、本明細書で示す構造はまた、１個または複数の同位体的に濃縮された原子の存在のみにおいて異なる化合物を含むことも意図される。例えば、重水素またはトリチウムによる水素の置換、または^１８Ｆによる水素の置換、または^１３Ｃもしくは^１４Ｃ濃縮炭素による炭素の置換を除き本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内にある。このような化合物は、例えば、イメージングプローブとして有用である。

【0289】

使用方法
別の態様では、細胞内標的を結合する方法が提供され、方法は、細胞内標的を発現している細胞を本発明のタンパク質コンジュゲート、本発明のタンパク質または本発明の医薬組成物と接触させること、それにより細胞内標的を結合するることを含む。

【0290】

いくつかの実施形態では、方法は、細胞内標的を調節する方法である。いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、細胞内標的を結合する。いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、細胞内標的を調節する。いくつかの実施形態では、修正すること（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）は、作動させることである。いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、細胞内標的の作動薬である。いくつかの実施形態では、修正することは、拮抗することである。いくつかの実施形態では、生物学的ペイロードは、拮抗薬である。調節する（即ち、拮抗するまたは作動させる）分子は、当技術分野で周知であり、いずれかのこのような分子を採用し得る。いくつかの実施形態では、生物学的標的は、細胞内標的に特異的である。

【0291】

いくつかの実施形態では、方法は、細胞内標的を検出する方法である。いくつかの実施形態では、タンパク質コンジュゲートは、検出可能なタグを含む。いくつかの実施形態では、タグは、検出可能な部分である。いくつかの実施形態では、方法は、タンパク質コンジュゲートを検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、検出可能なタグを検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、検出可能なタグは、蛍光タグである。検出可能なタグおよび部分は、当該技術分野において周知であり、非限定例としては、フルオロフォア（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ルシフェラーゼ、など）、放射性タグ、および着色タグが挙げられる。いずれかのこのような既知のタグを、採用し得る。

【0292】

いくつかの実施形態では、細胞は、対象内にある。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、疾患または状態に罹患している。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、細胞内標的に接触させることにより治療可能である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、細胞内標的を調節することにより治療可能である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、細胞内標的を作動させることにより治療可能である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、細胞内標的に拮抗することにより治療可能である。いくつかの実施形態では、対象は、細胞内標的を調節することを必要としている。いくつかの実施形態では、対象は、治療を必要としている。いくつかの実施形態では、対象は、それを必要としている対象である。

【0293】

いくつかの実施形態では、方法は、本発明のタンパク質コンジュゲートを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0294】

本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与」などの用語は、健全な医療行為において、治療効果を提供するように対象に活性剤を含む組成物を送達する、任意の方法を指す。本発明の主題の一態様は、それを必要としている患者への本発明の主題の組成物の治療的有効量の静脈内投与を提供する。他の好適な投与経路は、非経口、皮下、経口、筋肉内、腫瘍内または腹腔内を含み得る。

【0295】

投与量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、同時治療の種類、もしあれば、治療の頻度、および所望の効果の性質に依存する。

【0296】

いくつかの実施形態では、疾患または状態は、癌である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、炎症である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、虚血である。いくつかの実施形態では、細胞内標的は、癌遺伝子であり、生物学的ペイロードは、拮抗薬である。いくつかの実施形態では、細胞内標的は、腫瘍抑制因子であり、生物学的ペイロードは、作動薬である。

【0297】

いくつかの実施形態では、接触させることは、細胞中へのタンパク質コンジュゲートの浸透を誘導するように設計された薬剤の存在下ではない。いくつかの実施形態では、浸透を誘導するように設計された薬剤は、担体タンパク質以外の薬剤である。いくつかの実施形態では、本発明の方法以外の細胞浸透を誘導する別の方法は、採用されない。いくつかの実施形態では、接触させることは、投与後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日間持続する。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、接触させることは、投与後、少なくとも１日持続する。いくつかの実施形態では、接触させることは、投与後、少なくとも３日持続する。いくつかの実施形態では、接触させることは、投与後、少なくとも５日持続する。いくつかの実施形態では、投与後の持続的な接触は、ペイロード／治療薬の徐放である。

【0298】

いくつかの実施形態では、疾患または状態の細胞は、標的タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分を含むタンパク質コンジュゲートは、疾患または状態の細胞上の標的タンパク質の発現により特徴づけられる疾患または状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、疾患または状態のマーカーである。いくつかの実施形態では、疾患は、癌であり、標的タンパク質は、癌特異的抗原である。癌特異的抗原およびそれらを結合する抗原結合分子は、当該技術分野において周知であり、いずれかのこのような分子を、本発明の方法で使用できる。いくつかの実施形態では、癌特異的抗原は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。

【0299】

本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、直鎖および分枝鎖基を含み通常１～３０個、または１～１０個の炭素原子を含む、脂肪族炭化水素を表す。本明細書で使用される場合、用語「アルキル」はまた、飽和または不飽和の炭化水素を包含し、従って、この用語はさらに、アルケニルおよびアルキニルを包含する。

【0300】

用語「アルケニル」は、本明細書で定義の、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する不飽和アルキルを表す。アルケニルは、本明細書で前述されるように、１個または複数の置換基により置換されても、置換されなくてもよい。

【0301】

本明細書で定義の用語「アルキニル」は、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する不飽和アルキルを表す。アルキニルは、本明細書で前述されるように、１個または複数の置換基により置換されても、置換されなくてもよい。

【0302】

用語「シクロアルキル」は、全炭素単環式のまたは、１個または複数の環が完全に共役したπ電子系を有しない縮合環（即ち、隣接する炭素原子対を共有する環）の基を表す。シクロアルキル基は、本明細書で示されるように、置換されても、置換されなくてもよい。

【0303】

用語「アリール」は、全炭素単環式のまたは、完全に共役したπ電子系を有する縮合多環式（即ち、隣接する炭素原子対を共有する環）の基を表す。アリール基は、本明細書で示されるように、置換されても、置換されなくてもよい。

【0304】

用語「アルコキシ」は、本明細書で定義のように、Ｏ－アルキルおよび－Ｏ－シクロアルキル基の両方を表す。用語「アリールオキシ」は、本明細書で定義のように、－Ｏ－アリールを表す。

【0305】

本明細書では、一般式中のアルキル、シクロアルキルおよびアリール基は、１個または複数の置換基により置換されてもよく、それにより各置換基は独立に、例えば、置換基およびその分子内の位置に応じて、ハロゲン化物、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、チオアルコキシ、カルボキシ、アミド、アリール、およびアリールオキシであってよい。追加の置換基もまた、意図される。

【0306】

用語「ハロゲン化物」、「ハロゲン」またな「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を表す。用語「ハロアルキル」は、本明細書で使用される場合、１個または複数のハロゲン化物で更に置換された、本明細書で定義のアルキル基を表す。用語「ハロアルコキシ」は、本明細書で使用される場合、１個または複数のハロゲン化物で更に置換された、本明細書で定義のアルコキシ基を表す。用語「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」は、本明細書で使用される場合、－ＯＨ基を表す。用語「メルカプト」または「チオール」は、－ＳＨ基を表す。用語「チオアルコキシ」は、本明細書で定義のように、－Ｓ－アルキル基および－Ｓ－シクロアルキル基の両方を表す。用語「チオアリールオキシ」は、本明細書で定義のように、－Ｓ－アリールおよび－Ｓ－ヘテロアリール基の両方を表す。用語「アミノ」は、－ＮＲ’Ｒ”基またはその塩を表し、Ｒ’およびＲ”は、本明細書で記載の通りである。

【0307】

用語「ヘテロシクリル」は、１個または複数の窒素、酸素および硫黄などの原子を環中に有する単環式のまたは縮合環の基を表す。環はまた、１個または複数個の二重結合を有してもよい。しかし、環は、完全に共役したπ電子系を有しない。代表例は、ピペリジン、ピペラジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、モルホリノ、などである。

【0308】

用語「カルボキシ」は、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’基、またはそのカルボン酸塩を表し、Ｒ’は、本明細書で定義のように、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を介して結合される）またはヘテロシクリル（環炭素を介して結合される）または「カルボキシレート」である。

【0309】

用語「カルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’基を表し、Ｒ’は、本明細書の上で定義の通りである。上記の用語はまた、それらのチオ誘導体（チオカルボキシおよびチオカルボニル）を包含する。

【0310】

用語「チオカルボニル」は、－Ｃ（Ｓ）Ｒ’基を表し、Ｒ’は、本明細書の上で定義の通りである。用語「チオカルボキシ」基は、－Ｃ（Ｓ）ＯＲ’基を表し、Ｒ’は、本明細書で定義の通りである。用語「スルフィニル」基は、－Ｓ（Ｓ）Ｒ’基を表し、Ｒ’は、本明細書で定義の通りである。用語「スルホニル」または「スルホン酸」基は、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’基を表し、Ｒ’は、本明細書で定義の通りである。

【0311】

用語「カルバミル」または「カルバミン酸」基は、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”基を表し、Ｒ’は、本明細書で定義の通りであり、Ｒ”は、Ｒ’について定義される通りである。「ニトロ」基は、－ＮＯ_２基を指す。本明細書で使われる用語「アミド」は、Ｃ－アミドおよびＮ－アミドを包含する。用語「Ｃ－アミド」は、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”末端基または－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’連結基を表し、これらの語句は、本明細書の上で定義の通りであり、Ｒ’およびＲ”は、本明細書で定義の通りである。用語「Ｎ－アミド」は、－ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’末端基または－ＮＲ’Ｃ（Ｏ）－連結基を表し、これらの語句は、本明細書の上で定義の通りであり、Ｒ’およびＲ”は、本明細書で定義の通りである。

【0312】

「シアノ」または「ニトリル」基は、－ＣＮ基を指す。用語「アゾ」または「ジアゾ」は、－Ｎ＝ＮＲ’末端基または－Ｎ＝Ｎ－連結基を表し、これらの語句は、本明細書の上で定義の通りであり、Ｒ’は、本明細書の上で定義の通りである。用語「グアニジン」は、－Ｒ’ＮＣ（Ｎ）ＮＲ”Ｒ”’末端基または－Ｒ’ＮＣ（Ｎ）ＮＲ”－ 連結基を表し、これらの語句は、本明細書の上で定義の通りであり、Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は、本明細書で定義の通りである。本明細書で使用される場合、用語「アジド」は、－Ｎ_３基を指す。用語「スルホンアミド」は、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ”基を指し、Ｒ’およびＲ”は、本明細書で定義の通りである。

【0313】

用語「ホスホニル」または「ホスホン酸」基は、－ＯＰ（Ｏ）－（ＯＲ’）_２基を表し、Ｒ’は、本明細書の上で定義の通りである。用語「ホスフィニル」は、－ＰＲ’Ｒ”基を表し、Ｒ’およびＲ”は、本明細書の上で定義の通りである。用語「アルキルアリール」は、本明細書で定義のアルキルを表し、それは、本明細書で記載のアリールで置換される。例示的アルキルアリールは、ベンジルである。

【0314】

用語「ヘテロアリール」は、環中に例えば、窒素、酸素および硫黄などの１個または複数の原子を有し、加えて、完全に共役されたπ電子系を有する、単環式のまたは縮合環（即ち、隣接する原子対を共有する環）の基を表す。本明細書で使用するとき、用語「ヘテロアリール」は、芳香環を形成する少なくとも１個の原子がヘテロ原子である芳香環を指す。ヘテロアリール環は、３、４、５、６、７、８、９および９個を越える原子により形成できる。ヘテロアリール基は、任意に置換されてもよい。ヘテロアリール基の例は、限定されないが、１個の酸素または硫黄原子、または２個の酸素原子、または２個の硫黄原子、または最大４個の窒素原子、または１個の酸素または硫黄原子および最大２個の窒素原子の組み合わせ、およびそれらの置換ならびに、例えば、１個の環形成炭素原子を介して連結されたベンゾおよびピリド縮合誘導体を含む、芳香族Ｃ_３－８ヘテロ環基を含む。特定の実施形態では、ヘテロアリールは、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジナール、ピラジニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニルまたはキノキサリニルから選択される。

【0315】

いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、ピロリル、フラニル（フリル）、チオフェニル（チエニル）、イミダゾリル、ピラゾリル、１，２，３－トリアゾリル、１，２，４－トリアゾリル、１，３－オキサゾリル（オキサゾリル）、１，２－オキサゾリル（イソオキサゾリル）、オキサジアゾリル、１，３－チアゾリル（チアゾリル）、１，２－チアゾリル（イソチアゾリル）、テトラゾリル、ピリジニル（ピリジル）、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、１，２，３－トリアジニル、１，２，４－トリアジニル、１，３，５－トリアジニル、１，２，４，５－テトラジニル、インダゾリル、インドリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾジオキソリル、アクリジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、チエノチオフェニル、１，８－ナフチリジニル、オテル ナフチリジニルス、プテリジニルまたはフェノチアジニルから選択される。ヘテロアリール基が２個以上の環を含む場合、各追加の環は、飽和型（ペルヒドロ型）または部分的に不飽和型（例えば、ジヒドロ型またはテトラヒドロ型）または最大限に不飽和（非芳香族）型である。用語ヘテロアリールは従って、２つの環が芳香族である二環式ラジカル、および１個のみの環が芳香族である二環式ラジカルを含む。ヘテロアリールのこのような例は、３Ｈ－インドリニル、２（１Ｈ）キノリノニル、４－オキソ－１，４－ジヒドロキノリニル、２Ｈ－１－オキソイソキノリル、１，２－ジヒドロキノリニル、（２Ｈ）キノリニル Ｎ－オキシド、３，４－ジヒドロキノリニル、１，２－ジヒドロイソキノリニル、３，４－ジヒドロイソキノリニル、クロモニル、３，４－ジヒドロイソ－キノキサリニル、４－（３Ｈ）キナゾリノニル、４Ｈ－クロメニル、４－クロマノニル、オキシンドリル、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリニル、１，２，３，４－テトラヒドロ－キノリニル、１Ｈ－２，３－ジヒドロイソインドリル、２，３－ジヒドロベンゾ［ｆ］イソインドリル、１，２，３，４－テトラヒドロベンゾ［ｇ］イソキノリニル、１，２，３，４－テトラヒドロ－ベンゾ［ｇ］イソキノリニル、クロマニル、イソクロマノニル、２，３－ジヒドロクロモニル、１，４－ベンゾジオキサニル、１，２，３，４－テトラヒドロキノキサリニル、５，６－ジヒドロキノリル、５，６－ジヒドロイソキノリル、５，６－ジヒドロキノキサリニル、５，６－ジヒドロキナゾリニル、４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾイミダゾリル、４，５－ジヒドロベンゾオキサゾリル、１，４－ナフトキノリル、５，６，７，８－テトラヒドロキノリニル、５，６，７，８－テトラヒドロイソキノリル、５，６，７，８－テトラヒドロキノキサリニル、５，６，７，８－テトラヒドロキナゾリル、４，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－ベンゾイミダゾリル、４，５，６，７－テトラヒドロベンゾオキサゾリル、１Ｈ－４－オキサ－１，５－ジアザナフタレン－２－オニル、１，３－ジヒドロイミジゾロ［４，５］ピリジン－２－オニル、２，３－ジヒドロ－１，４－ジナフトキノニル、２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール［３，４－ｂ］キノリニル、１，２，３，４－テトラヒドロベンゾ［ｂ］［１，７］ナフチリジニル、１，２，３，４－テトラ－ヒドロベンゾ［ｂ］［１，６］ナフチリジニル、１，２，３，４－テトラヒドロ－９Ｈ－ピリド［３，４－ｂ］インドリル、１，２，３，４－テトラヒドロ－９Ｈ－ピリド［４，３－ｂ］インドリル、２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［３，４－ｂ］インドリル、１Ｈ－２，３，４，５－テトラヒドロアゼピノ［３，４－ｂ］インドリル、１Ｈ－２，３，４，５－テトラヒドロアゼピノ［４，３－ｂ］インドリル、１Ｈ－２，３，４，５－テトラヒドロ－アゼピノ［４，５－ｂ］インドリル、５，６，７，８－テトラヒドロ［１，７］ナプチリジニル、１，２，３，４－テトラヒドロ［２，７］ナフチリジル、２，３－ジヒドロ［１，４］ジオキシノ［２，３－ｂ］ピリジル、２，３－ジヒドロ［１，４］－ジオキシノ［２，３－ｂ］プリイジル、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１－オキサ［４，６］ジアザナフタレニル、４，５，６，７－テトラヒドロ－３Ｈ－イミダゾ－［４，５－ｃ］ピリジル、６，７－ジヒドロ［５，８］ジアザナフタレニル、１，２，３，４－テトラヒドロ［１，５］ナプチリジニル、１，２，３，４－テトラヒドロ［１，６］ナプチリジニル、１，２，３，４－テトラヒドロ［１，７］ナプチリジニル、１，２，３，４－テトラヒドロ［１，８］ナプチリジニルまたは１，２，３，４－テトラヒドロ［２，６］ナプチリジニルを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は任意に置換される。一実施形態では、１個または複数の置換基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、アルキルアミド、アシル、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６ハロアルキル、Ｃ_１－６ヒドロキシアルキル、Ｃ_１－６アミノアルキル、Ｃ_１－６アルキルアミノ、アルキルスルフェニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、スルファモイル、またはトリフルオロメチル、からそれぞれ独立に選択される。

【0316】

ヘテロアリール基の例は、限定されないが、フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、ピロール、ピリジン、インドール、オキサゾール、ベンゾキサゾール、イソオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、ピラゾール、インダゾール、テトラゾール、キノリン、イソキノリン、ピリダジン、ピリミジン、プリンおよびピラジン、フラザン、１，２，３－オキサジアゾール、１，２，３－チアジアゾール、１，２，４－チアジアゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、プテリジン、フェノキサゾール、オキサジアゾール、ベンゾピラゾール、キノリジン、シンノリン、フタラジン、キナゾリンおよびキノキサリンの非置換およびモノまたはジ置換置換誘導体を含む。いくつかの実施形態では、置換基は、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、Ｏ－Ｃ_１－６－アルキル、Ｃ_１－６－アルキル、ヒドロキシ－Ｃ_１－６－アルキルおよびアミノ－Ｃ_１－６－アルキルである。

【0317】

本明細書で使用される場合、「ハロ」および「ハロゲン化物」という用語は、本明細書では、同義を指し、本明細書においてフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物とも呼ばれる、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である、ハロゲンの原子を表す。

【0318】

いくつかの実施形態では、用語「置換された」は、官能基および／または分子に共有結合された１個または複数の置換基を包含する。いくつかの実施形態では、置換基は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、ハロ、－ＮＯ_２、ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、カルボニル、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＲ’_２、－ＣＮＮＲ_２、－ＣＳＮＲ_２、－ＣＯＮＨ－ＯＨ、－ＣＯＮＨ－ＮＨ_２、－ＮＨＣＯＲ’、－ＮＨＣＳＲ’、－ＮＨＣＮＲ’、－ＮＣ（＝Ｏ）ＯＲ’、－ＮＣ（＝Ｏ）ＮＲ’、－ＮＣ（＝Ｓ）ＯＲ’、－ＮＣ（＝Ｓ）ＮＲ’、－ＳＯ_２Ｒ’、－ＳＯＲ’、－ＳＲ’、－ＳＯ_２ＯＲ’、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ’）_２、－ＮＨＮＲ’_２、－ＮＮＲ’、－ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_２、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_６ハロアルコキシ、ヒドロキシ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ）、アルコキシ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、アルコキシ（Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ）、アミノ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、－ＣＯＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、－ＣＯＮ（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）_２、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＯＣＯＲ’、－ＯＣＯＲ’、－ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ’、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’、－ＯＣ（＝Ｓ）ＯＲ’、－ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’からなる群よりそれぞれ独立に選択される、１個または複数の置換基を含み、それぞれのＲ’は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ原子、任意に置換されるシクロアルキル任意に置換されてもよいシクロアルキル、任意に置換されるヘテロシクリル、またはこれらの任意の組み合わせから独立に選択される。

【0319】

本明細書で使用される場合、値と組み合わせたときの「約」という用語は、参照値のプラスおよびマイナス１０％を指す。例えば、約１０００ナノメートル（ｎｍ）の長さは、１０００ｎｍ±１００ｎｍの長さを指す。

【0320】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別の意味が明示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、複数のこのようなポリヌクレオチドを含み、「ポリペプチド（ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１つまたは複数のポリペプチドおよび当業者に既知のその同等物などへの言及を含む。特許請求の範囲は、いずれか任意の要素を除外するように記載されてもよいことに、さらに留意されたい。したがって、この記述は、請求要素の列挙、または「否定的な」制限の使用に関連して、「単独（ｓｏｌｅｌｙ）」、「唯一（ｏｎｌｙ）」などの排他的な用語を使用するための先行基準として機能することが意図される。

【0321】

「Ａ、Ｂ、およびＣ等の少なくとも１つ」に類似した慣例が使用される事例では、概して、このような構造は、当業者が慣例を理解するであろうという意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、ならびにＣの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に等を有する系を含むがこれらに限定されないであろう）。明細書、特許請求の範囲、または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替的な用語を提示する実質的にどのような離接的な単語および／または句が、用語の１つ、用語のいずれか、またはいずれの用語も含む可能性を企図すると理解されるべきであることは、当業者によって更に理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」もしくは「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されるであろう。

【0322】

明確にするために別個の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態として説明される本発明の種々の特徴は、別々にまたは任意の好適な副組み合わせで提供され得る。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、全ての組み合わせが個別に、かつ明示的に開示されたかのように、本明細書において開示される。さらに、様々な実施形態およびその要素のすべての部分的組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、すべてのそのような部分的組み合わせが本明細書で個別に、かつ明示的に開示されたかのように、本明細書において開示される。

【0323】

本発明の追加の目的、利点、および新規の特徴は、限定することを意図しない、以下の実施例を考察することにより、当業者には明らかになるであろう。さらに、上記で説明されおよび以下の特許請求の範囲のセクションで請求される、本発明の様々な実施形態および態様の各々は、以下の実施例において実験的に裏付けられる。

【0324】

上で説明され、以下の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的に裏付けられる。

【0325】

実施例
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験手順は、分子の、生化学の、微生物学のおよび組換えＤＮＡの技術を含む。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）”Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載されている方法論；”Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；”Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ－Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ” ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ” ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、を参照されたい。これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる。その他の一般的な参考文献は、本明細書全体を通して提供される。

【0326】

実施例１：直接化学修飾
正電荷はエンドサイトーシス経路を介して細胞内送達を促進するので、いくつかの低分子ポリアミン誘導体を、試験した。ＧＦＰ／ＩｇＧを、テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のいずれかと直接コンジュゲートし、細胞中へのタンパク質の取込みを、モニターした。ＰＥＩが遙かに優れていることが明らかになったので（データは示さず）、全てのさらなる実験をＰＥＩを用いて実施した。

【0327】

ＰＥＩは、直鎖または分岐状の通常１０ＫＤａを越える分子量を有し、既存のポリマー中で最高のカチオン電荷密度を有するとして特徴付けられる。このことは、遺伝子導入剤としてのそれらの使用につながり、それらの高い正電荷は、負に荷電されたＤＮＡまたはＲＮＡの複合体形成のために、および更に細胞中へのこれらの核酸の内部移行のために使用される。これらの高分子量遺伝子導入剤は、インビトロ用途では効率的である一方で、それらは、インビボ用途ではそれほど有用でない。従って、極低分子量ＰＥＩ部分、即ち、６００～１８００Ｄａ（質量分析により測定）の範囲の分子量の分岐ＰＥＩ分子、を採用した。これらの極低分子量ＰＥＩは、内部移行されるタンパク質ペイロードに化学的におよび共有結合的にコンジュゲートできる。

【0328】

主に６００Ｄａの、極低分子量ＰＥＩを、ＩｇＧおよびＧＦＰにコンジュゲートした。ＰＥＩは多くの一級アミンを含むので、グルタミン酸およびアスパラギン酸のタンパク質のカルボン酸残基への、ならびにＣ末端カルボキシ基へのコンジュゲーションを、カルボジイミドコンジュゲーション化学を用いて実施した。反応を、過剰のＰＥＩ、即ち、３５００モル過剰のＰＥＩで実施し、修飾のレベルの制御を、反応系中のカルボジイミド薬剤（Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ））のレベルを調節することにより達成した。修飾のレベルを、ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ質量分析により測定した（図１）。ＩｇＧベースのタンパク質の場合、修飾の平均レベルは、ＩｇＧ分子当り１～約１０分子のＰＥＩ（６００Ｄａ）の範囲であり、これは、それぞれ、２５～４００モル当量の範囲の過剰レベルのＥＤＣで達成された。ＰＥＩ修飾は位置選択的ではないので、それは、ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦスペクトルで観察されるように、ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ分子量部分の広い分布を生じる（図１）。平均修飾レベルを、（測定されたピーク頂点での分子量値）マイナス（非修飾タンパク質の測定されたピーク頂点での分子量値）（これは、加えたＰＥＩの重量を与える）に基づいて計算した。この値を、修飾に使用された単一ＰＥＩ分子の分子量で除算することにより、加えられた分子の平均数を与える。

【0329】

次に、ＰＥＩ修飾されたおよび修飾されないマウスＩｇＧを、Ａ３７５細胞と２時間インキュベートした。遺伝子導入／内部移行のための追加の誘導剤は、添加しなかった。（エラー、参照源が見つからない（Ｅｒｒｏｒ！ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｏｕｒｃｅ ｎｏｔ ｆｏｕｎｄ．））で見られるように、修飾されないマウスＩｇＧは、Ａ３７５細胞に侵入しなかった。対照的に、低レベルのＰＥＩ修飾（ＩｇＧ分子当り、平均３ＰＥＩ分子、Ｘ３）であっても、内部移行を可能にし、一方で修飾の平均レベルを増大させることは、細胞の内側で観察されるＩｇＧのレベルを比例的に増大させた。類似の結果を、フローサイトメトリーを用いて内部移行を測定した場合に観察した（データは示さず）。
類似の内部移行効率および修飾レベルに対する依存性を、他のＩｇＧ（データは示さず）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（図３Ａ～３Ｂ）を含む他のペイロードについても観察した。

【0330】

実施例２：膜横断効率
細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）を用いた多数の研究は、ある程度の細胞内部移行を示したが、ほとんどの事例で細胞への初期取込みの効率は、かなり低かった。なぜなら培地中の高レベルのペイロードが、細胞中へ実際に内部移行されたわずかな低い比率の分子を生じるために必要とされたからである。初期内部移行ステップの効率を評価するために、特異的ＥＬＩＳＡを用いて、時間の関数として培地中のペイロード、ＰＥＩ修飾マウスＩｇＧのレベルを測定した。図４で見られるように、高レベルのＰＥＩ修飾（約７）で、ほとんど全ての修飾されたＩｇＧが、内部移行され（９５％）、およびほとんどの内部移行は、インキュベーションの最初の２４時間中に起こる（灰色バー）。より低レベルの修飾（約４．５および３）であっても、内部移行ステップは、極めて効率的であり、インキュベーションの５日後に総ペイロードの約７５％の全体取込みを示し（図４、青およびオレンジバー）、かつ高度修飾されたＩｇＧと類似の動力学に従う。不完全で、より遅い取込みは、平均修飾レベルより遙かに少なく修飾されるＩｇＧにおそらく関連する。ＰＥＩ修飾は、修飾された部分の幾分広い分布を生じ（図１参照）、修飾されないまたは低く修飾された（３未満）これらの分子はおそらく、５日後であっても、培地中にまだ存在する。この細胞膜横断効率は、０．２～４０μｇ／ｍＬの範囲の初期培地濃度で観察された。

【0331】

実施例３：ＰＥＩ修飾されたタンパク質により利用されるエンドサイトーシス経路
カチオン化された部分は、天然のエンドサイトーシス機序を用いて内部移行すると考えられる。２つの関連エンドサイトーシス機序は、カベオリン媒介およびクラスリン媒介のエンドサイトーシスである。内部移行の正確な機序は、既知の特異的エンドサイトーシス阻害剤の存在下で、ＰＥＩ修飾されたＩｇＧの内部移行を実施することにより解明された。Ａ３７５細胞を、クラスリン阻害剤（アマンタジンまたはクロルプロマジン）またはカベオリン阻害剤（ゲニステイン）の存在下で、ＰＥＩ修飾されたマウスＩｇＧ（４．５ＰＥＩ）と一晩インキュベートした。既知のカベオリン阻害剤であるゲニステインは実際に、ＰＥＩ修飾されたＩｇＧの内部移行を阻害した（エラー、参照源が見つからない）。極めて興味深いことに、既知のクラスリン阻害剤であるクロルプロマジンの添加は、増大した内部移行を生じた。このことは、クラスリン媒介エンドサイトーシスの阻害が細胞においてカベオリン媒介エンドサイトーシスの代償性増大を引き起こしたので、カベオリン媒介エンドサイトーシスが、内部移行のためにＰＥＩ修飾されたペイロードにより利用されることを実証する。

【0332】

実施例４：エンドソーム脱出
上述のように、おそらく、生物製剤の細胞内送達における最も難度が高いハードルは、治療薬の異化作用を回避するためのそれらのエンドソーム脱出である。ＰＥＩ修飾されたタンパク質がエンドソームから脱出できるか否かを評価するために、それらの内部移行を、共焦点顕微鏡およびエンドソームおよびリソソームマーカーの対比染色を用いて追跡した。ＰＥＩ修飾されたＩｇＧを、蛍光エンドソーム／リソソームマーカーを発現しているＨＥＫ２９３細胞と５時間インキュベートした。細胞を、蛍光顕微鏡により分析した。エンドソームおよびリソソームに、緑色蛍光マーカー（Ｃｅｌｌ ｌｉｇｈｔ Ｅｎｄｏｓｏｍｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｃ１０５８６またはＣｅｌｌ ｌｉｇｈｔ Ｌｙｓｏｓｏｍｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｃ１０５９６）を遺伝子導入し、一方でＩｇＧを、赤色蛍光の抗マウス抗体で染色した。（エラー、参照源が見つからない）で見られるように、内部移行されたＩｇＧと初期エンドソームまたはリソソーム小胞の間で大きな共局在は、観察されなかった。これは、実際にＰＥＩ修飾されたＰＥＩ修飾ペイロードが、エンドソームをうまく脱出したことを実証する。これらの実験を、エンドソーム／リソソームマーカーＥＥＡ１、トランスフェリンおよびカルセインを用いて繰り返し、同じ結果を観察した（データは示さず）。共局在化は、初期エンドソームでも観察されず、ＰＥＩ修飾タンパク質のエンドソーム脱出は、エンドソーム経路の極めて初期に急速に起こることを示唆することに留意されたい。

【0333】

共局在は、ＰＥＩ修飾されたＩｇＧと種々のエンドソームおよびリソソームマーカーの間で観察されないが、これらのＩｇＧの染色は、天然で点状に現れる。点状プロファイルは、ある種の小胞中の内部移行されたＩｇＧの含有を示唆し得る。ＰＥＩ修飾されたタンパク質のエンドソーム脱出を更に実証するために、タンパク質を、ｐＨ感受性蛍光染料、５（６）－カルボキシナフトフルオレセインで標識した。この色素は、７を超えるｐＨ値でのみ蛍光を発する。初期エンドソームのｐＨは既に７未満であり、かつエンドソームがリソソームへと成熟するに伴い低下するのみであるので、エンドソーム経路の全ての小胞は、酸性である。ＰＥＩ修飾された、ｐＨ感受性標識されたＩｇＧを、ＨｅＬａ細胞とインキュベートし、細胞を、共焦点顕微鏡により分析した。細胞は、ｐＨ感受性色素のユニークな赤色蛍光を明確に示し、ＰＥＩ修飾されたタンパク質が細胞質中などの非酸性コンパートメント中に存在することを示す（図７）。これは、ＰＥＩ修飾されたタンパク質がエンドソーム経路を効率的に脱出するという更なる証拠である。

【0334】

最後に、機能的アッセイを用いて、ＰＥＩ修飾されたタンパク質がそれらの内部移行後にエンドソームを効率的に脱出することを検証した。この目的のために、ＣＤ３ゼータ鎖としても知られる、ＣＤ２４７に対する機能的モノクローナル抗体を、ＰＥＩで修飾し、ＣＤ３＋一次細胞中に内部移行させた。ＣＤ３受容体の細胞内ドメインは、その免疫受容体チロシン活性化モチーフ免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介して、Ｔ細胞活性化に関与する。選択したモノクローナル抗ＣＤ３ゼータ鎖抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｃｌｏｎｅ ＺＴ－１０、カタログ番号ＳＡＢ４２００４４６）は、ＣＤ３ゼータ鎖中のＩＴＡＭの１つを結合する。

【0335】

ＰＥＩ修飾された抗ＣＤ２４７および陰性対照としてＰＥＩ修飾されたマウスＩｇＧの内部移行を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコートしたビーズで事前刺激したＣＤ３＋細胞中へ実施した。培地を、細胞の活性化レベルの変化に対するマーカーとしてインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）分泌についてモニターした。完全抗体は、構造上不可欠なジスルフィド結合の存在に起因して細胞質中で安定であると予測できないであろうが、この抗体の結合は、結果的にＩＦＮγ分泌をもたらすであろうシグナル伝達カスケードを活性化するはずである。従って、少量の初期活性化でも、定量化できるサイトカインレベルの増大をもたらすであろう。従って、その予測される細胞質不安定性を有しても、抗体の内部移行は、観察可能なＩＦＮγ応答を生成することが予測され得る。

【0336】

修飾された抗体のＣＤ３＋細胞中への内部移行を、細胞内ＦＡＣＳ分析により実証した（データは示さず）。抗ＣＤ２４７ ＰＥＩ修飾ｍＡｂ（４．５ｘＰＥＩ）の内部移行は、ＩＦＮγ分泌（図８）の増加により測定されるように、ＣＤ３細胞の用量依存的活性化もたらした。ＰＥＩ修飾されたマウスＩｇＧは、この実験で使用した抗体濃度範囲で、いかなるＣＤ３細胞活性化も起こさなかった。この結果は、ＰＥＩ修飾されたタンパク質のエンドソーム脱出および標的細胞中で生物学的および臨床的効果を発揮するそれらの能力を更に実証する。

【0337】

実施例５：細胞質ゾルでの分散性およびペイロード担体溶液
ＰＥＩ修飾されたタンパク質のエンドソーム脱出は明確に起こるが、種々の内部移行タンパク質の顕微鏡画像は、点状プロファイルを示す（図２、３、６および７）。ＰＥＩ修飾は、細胞膜横断およびエンドソーム脱出において極めて効率的である一方で、同じ修飾は、ＰＥＩ修飾されたタンパク質が細胞質中で効率的に分散することを妨害することが想定された。この分散性の問題は、強くカチオン化された内部移行タンパク質と、種々の細胞質タンパク質、主に細胞骨格のタンパク質（これらのほとんどは、負に帯電される）の間の強力な静電相互作用の結果である可能性がある。低い細胞質分散性は、細胞質中または他の細胞内コンパートメントまたはオルガネラ中に関係なく、薬剤がその細胞内標的に到達できない可能性があるので、いずれかの細胞内の生物学的製剤の有効性に負に影響するであろう。

【0338】

この細胞内分散性のハードルを克服するために、ジスルフィド結合を、治療薬とＰＥＩで事前修飾した汎用担体の間のリンカー中に組み込んだ。選択した結合は、ジスルフィド結合を組み込んだ、化学リンカーであった。この不安定なジスルフィド結合は、主にその高い濃度のグルタチオンに起因して、細胞質の高い還元電位のためエンドソーム脱出時に切断され、従ってそのカチオン化担体から治療薬を放出し、細胞の細胞質中での治療薬の自由運動を可能にする。担体の使用はまた、ＰＥＩが機能性部位にコンジュゲートされ得るおよび／またはそれが治療薬の機能を阻害するというリスクを取り除く利点を有する。特定の部位またはドメインでの治療薬へのリンカーに対する選択的コンジュゲーション化学を用いることにより、リンカーコンジュゲーションの正確な位置を制御でき、それを治療薬の活性ドメインからそらすことができる。

【0339】

この担体およびペイロード方法の略図を、図９に示す。図で見られるように、担体タンパク質は、ＰＥＩ基を有し、膜横断およびエンドソーム脱出に関与する。これらの基は、ランダムにまたは部位選択的にのいずれかで担体タンパク質にコンジュゲートできる。ランダムコンジュゲーションの場合、コンジュゲーションのレベルは、本明細書で前述のように、特定の反応条件を選択することにより制御できる。

【0340】

担体タンパク質それ自体は好ましくは、免疫原性問題を回避するために、ヒト内因性タンパク質のリストから選択される。さらに、血液中に共通に見出され、かつ天然で長い循環半減期を有するタンパク質が、好ましい。最後に、そのペイロードを身体中の治療薬が望まれる領域に送達できるタンパク質が、好都合であろう。身体中のこのような領域の例は、腫瘍およびそれらの微小環境、ならびに自己免疫疾患および多くの他の病的状態のために重要な炎症部位を含み得る。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を従って、選択した。ＨＳＡは、長い半減期を有する循環タンパク質であり、腫瘍および炎症部位への出入りが示され、更には、細胞外環境のみにではあるが、ペイロードをこれらの部位に送達することが示されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２，１２：６８；Ｋｒａｔｚ，Ｆ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １３２（２００８）１７１－１８３；Ｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１９，１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｏｎｊｃｈｅｍ．９ｂ００７６０，Ｗｕｎｄｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１７０：４７９３－４８０１；Ｙａｚａｋｉ Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３５（２００８）１５１－１５８）。

【0341】

治療薬は、生物学的製剤のポリペプチド鎖に沿った単一のコンジュゲーション部位で単一リンカーにコンジュゲートされる。このコンジュゲーション部位は、それが薬剤の活性を妨害しない位置に配置される。リンカーは、ペプチドリンカー、化学リンカーまたはこれらの組み合わせから選択できる。ポリマーベースのリンカーである、ＰＥＧが、選択された。上で考察したように、細胞の細胞質中の特定の条件に感受性である、不安定な結合もまた、組み込まれる。

【0342】

担体－ペイロード方法の効率を評価するために、ＧＦＰを、ジスルフィド結合を組み込むＰＥＧベースのリンカーを介してＰＥＩカチオン化ＨＳＡにコンジュゲートした。ｅＧＦＰ（Ｂｉｏｒｂｙｔ，カタログ番号ｏｒｂ８４８４０）を、ＮＨＳ－ＰＥＧ_４－ＳＰＤＰで修飾した。ＰＥＩ修飾されたＨＳＡ（１１ｘＰＥＩ）もまた、ＤＴＴを用いる遊離チオールへのこのＳＰＤＰの還元後に、ＮＨＳ－ＰＥＧ_４－ＳＰＤＰと更に反応させた。ＳＰＤＰ活性化ｅＧＦＰを、ＨＳＡ－ＰＥＩ－遊離チオールと反応させて、リンカー中に組み込まれた不安定なジスルフィド結合を有するＧＦＰ－ＨＳＡコンジュゲートを生成した。

【0343】

内部移行されたＰＥＩ修飾ＧＦＰの点状プロファイル（図３）とは反対に、ＰＥＩカチオン化ＨＳＡにジスルフィド連結したＧＦＰを細胞に内部移行させた場合、それは、斑点のない完全に分散されたプロファイルを生じた（図１０）。内部移行された治療薬ペイロードの効率的な分散を検証するために、完全治療薬抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（ヒュミラ（登録商標））を、ジスルフィド結合を組み込むＰＥＧベースのリンカーを介してＰＥＩ修飾ＨＳＡに連結した。ＧＦＰと同様に、抗体は、ＮＨＳ－ＰＥＧ_４－ＳＰＤＰで修飾された。ＰＥＩ修飾されたＨＳＡ（１１ｘＰＥＩ）もまた、ＤＴＴを用いる遊離チオールへのＳＰＤＰの還元後に、ＮＨＳ－ＰＥＧ_４－ＳＰＤＰと更に反応させた。ＳＰＤＰ活性化抗体を、ＨＳＡ－ＰＥＩ－遊離チオールと反応させて、リンカー中に組み込まれた不安定なジスルフィド結合を有する抗体－ＨＳＡコンジュゲートを生成した。図１１で見られるように、内部移行されたモノクローナル抗体は、細胞質全体に分散し、再度、直接のカチオン化は、細胞質中の自由分散を妨害したという仮説を確証し、ペイロードをそのカチオン化された担体から分離する溶液の有効性を実証する。

【0344】

実施例６：細胞質ゾルでの安定性
治療薬は、標的細胞の細胞質に侵入するのみでなく、それらの生物活性を発揮する必要がある。他の細胞内の場所（核、ＥＲ、ミトコンドリア、など）に輸送される分子であっても、依然として細胞質を通過するはずである。多くの生物学的治療薬は、抗体の骨格またはその誘導体に基づいている。多くの場合、これらの治療薬は、特異的標的を結合し、その標的と拮抗するまたはそれを作動させる。これらの薬剤の結合活性は、それらの三次および四次構造に完全に依存する。抗体ベースの分子、完全なＩｇＧまたはそれらの短縮された誘導体（Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、など）のいずれかでは、これらの構造は、鎖内または鎖間のいずれかのジスルフィド結合に基づき、かつそれにより安定化される。しかし、前述のように、細胞質、ならびに他の細胞内オルガネラおよびコンパートメントは、高度に還元的な環境により特徴づけられる。主要な還元剤である、グルタチオンは、１～１１ｍＭの範囲の細胞質ゾル濃度を有する。対照的に、その血漿中濃度は、低いミクロモルの値である。細胞質のこの特性は、抗体ベースの薬剤、ならびに治療の細胞内の効率的な経路としてそれらの構造中のジスルフィド結合を利用する他の生物学的製剤の使用を妨害している。

【0345】

インビトロ実験は、細胞質ゾルのレベルのグルタチオン（ＧＳＨ）への抗体の曝露が、抗軽鎖抗体により検出されるＳＤＳ－ＰＡＧＥウェスタンブロット上の複数バンドの出現により解るように、ほんの数時間後にジスルフィド結合の還元をもたらすことを示した（レーン５～７、図１２）。一晩の曝露は、おそらく３Ｄ構造の喪失あるいは凝集および沈降による、ウェスタンブロットでの抗体検出の欠如をもたらす（レーン１～４、図１２）。後者は、細胞内で発現される抗体ならびにこれらの誘導体の既知の現象である（Ｋａｂａｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０２０，（１１），３３６）。細胞内生物学的製剤に対するいずれかのこのような影響は、生物学的標的を結合する、および治療効果を発揮するその能力にとって有害であるはずである。

【0346】

これらの細胞内安定性の問題の観点から、単一ドメイン抗体を、治療薬ペイロードとして選択した。単一ドメイン抗体は、他のタンパク質に結合する能力を有する単鎖タンパク質ベースの分子である。それらの構造は、すべての不可欠なジスルフィド結合を欠き、それらを細胞質ゾルの還元性環境に対し耐性にしている。このような単一ドメイン結合タンパク質は、重鎖抗体の切断型（ＨｃＡｂ）、ナノボディとしても知られるラクダ科動物ベースの可変重鎖ホモダイマー（ＶＨＨ）、またはサメベースの免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）を含む。このような単一ドメイン結合タンパク質の他の例は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、および遺伝子操作された抗体ミメティックタンパク質を含む。

【0347】

単一ドメイン結合タンパク質、および特にＶＨＨは、ペイロードとして充分好適である。それらの構造上不可欠なジスルフィド結合の欠如は、それらを細胞質条件に対し耐性にする。それらは、極端に小さく、ＶＨＨは約１５ＫＤａまたはＤＡＲＰｉｎは２０ＫＤａであり、それらの細胞質ゾルでの分散性を支援する事実である。それらの単一ドメイン特性は、それらがなんらかの偶発的な細胞内架橋効果を引き起こさないであろうことを決定づける。それらは、異なる構成で２個以上の部分を含むように容易に操作されて、より複雑な結合プロファイルを可能にする。それらは、免疫原性とは見なされず、良好な安全性プロファイルを有する。主要な特徴は、担体への部位選択的コンジュゲーションとのそれらの適合性である。例えば、ＶＨＨおよびＤＡＲＰｉｎの両方で、それらのＣ末端は、それらの抗原結合領域（ＣＤＲ）から離れて配置され、抗原結合に影響することなくコンジュゲーションのためのこの部位の利用を可能にする。さらに、Ｃ末端は、コンジュゲーションのための遊離スルフヒドリル基を有する単一システインアミノ酸を含むように容易に操作できる。この基は、チオール反応性基を備えた担体にコンジュゲートできる。Ｃ末端の遊離スルフヒドリルは、担体に直接、あるいはリンカーを介して、コンジュゲートできる。

【0348】

そのＣ末端に単一システインアミノ酸を含む市販の抗ビメンチンＶＨＨ（ＱＶＱ、Ｑ６０ｃ）を、チオール反応性基で更に修飾されたＰＥＩ修飾ＨＳＡ担体にコンジュゲートした。ＰＥＩ修飾されたＨＳＡを、２－ピリジルジチオ基（ＮＨＳ－ＰＥＧ_ｎ－ＳＰＤＰ、ｎ＝４）を有するＮＨＳ活性化ＰＥＧリンカーに結合させた。ＳＰＤＰは、ＶＨＨの遊離チオールと容易に反応し、ＶＨＨ－ＨＳＡ部分を生成し、ＶＨＨペイロードとＨＳＡ担体の間の結合はジスルフィド結合を含む。図１３は、精製の前後の反応混合物のプロファイル、ならびに還元条件下で切断される担体とペイロードの間の結合の能力を示す。ＶＨＨへのコンジュゲートは、ＰＥＩのレベルに関係なく類似であった。さらに、全ての反応で、ペイロードは、細胞質ゾルの還元条件を模倣する、５ｍＭのＧＳＨによる処理後に、効率的に切断された。

【0349】

抗ビメンチン－ＰＥＩ修飾ＨＳＡコンジュゲートの細胞内部移行効率を、コンジュゲートとのＡ３７５細胞のインキュベーション時の、培地からのコンジュゲーションの消失により評価した。ＶＨＨを、２種のレベルでＰＥＩにより修飾された（平均でＨＳＡ当り、３．５個のＰＥＩ分子および８個のＰＥＩ分子）ＨＳＡにコンジュゲートした。ＰＥＩ修飾されたＩｇＧ（図４）について既に認められたように、ＶＨＨ－担体コンジュゲートは、細胞により効率的に内部移行され（図１４）、最初の２４時間のインキュベーション中にほぼ８０％のコンジュゲートが内部移行した。コンジュゲートのレベルを、ＨＳＡにコンジュゲートされたＶＨＨのみを測定する自社開発の両側ＥＬＩＳＡを用いて、捕捉抗体として抗ＶＨＨ抗体および検出のために抗ＨＳＡ抗体を利用して、測定した。驚くべきことに、両方のＰＥＩ修飾レベルは、非常に類似した内部移行効率および動力学を示し、８－ＰＥＩ修飾が極めてわずかな優位性を有した。細胞のない細胞培地中のこれらのＶＨＨ－ＨＳＡコンジュゲートのレベルを、観察されたそれらのレベルの低下が分解に起因しないことを確かめるために、評価した。ほんのわずかな低下が、細胞が存在しない場合に観察され（図１４）、実際に細胞の存在下でのＶＨＨレベルの劇的な低下は、ＶＨＨ内部移行が原因であったことを示唆する。

【0350】

エンドソーム脱出の効率、ならびに細胞質中のペイロードＶＨＨの分散性を更に評価するために、ＰＥＩ修飾されたＨＳＡにコンジュゲートされた抗ビメンチン－ＶＨＨ（ＨＳＡ分子当り平均１１－ＰＥＩ）を、２４時間Ａ３７５細胞とインキュベートし、細胞を、共焦点顕微鏡により分析した（図１５Ａ～１５Ｃ）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７にコンジュゲートした抗ＶＨＨ抗体を使用して、分散プロファイルで細胞の内側のＶＨＨの存在を示した（図１５Ａ）。細胞を、標準の蛍光標識された抗ビメンチン抗体を用いてビメンチンについて共染色した（図１５Ｂ）。２つの画像の注意深い検査は、抗ＶＨＨ染色により得られたプロファイルがビメンチン染色と実質的に同一であることを明確に示し、抗ビメンチンＶＨＨが細胞の細胞質にうまく送達され、そこで、それはその担体から放出され、その標的を見つけ、結合できることを示唆する（図１５Ｃ）。この結合に対するさらなる証拠は、図１６Ａで見ることができ、ＰＥＩ修飾されたＨＳＡにコンジュゲートされた抗ビメンチンＶＨＨに曝露された細胞の１つのクローズアップは、抗ＶＨＨ抗体染色により可視化されたビメンチン細胞骨格パターンを明確に示す。図１６Ｂは、担体コンジュゲーションなしに、ただ抗ビメンチンＶＨＨに曝露された細胞は細胞内ＶＨＨ染色を示さないことを示す。

【0351】

内部移行された抗ビメンチンＶＨＨのそのビメンチン標的への結合（図１５Ａ、図１６Ａ）はまた、ＶＨＨ薬剤が、細胞質の内側でその構造的安定性を維持したことを実証する。標的に結合する能力は、全ての結合性生物学的製剤の場合と同様に、その構造およびこの構造の安定性に強くに依存する。このデータは従って、本発明のペイロード薬剤としての単一ドメイン結合タンパク質の選択を支持する。

【0352】

本発明の送達系の別の重要な特性は、培地中の全ての細胞が内部移行を示すという点で、内部移行の効率および均一性である。これは、特に図１５Ａ～１５Ｃを含む、異なる顕微鏡像全体を通して認めることができる。文献で既知のタンパク質の細胞内の送達の多くの試みは、細胞の一部のみがタンパク質に内部移行する結果を示し、非常に低い効率を示唆する。

【0353】

実施例７：インビトロの機能的概念実証
細胞内送達生物製剤の機能性の更なる評価を、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）のＥ７タンパク質に対するＶＨＨを用いて実施した。ほぼ全ての子宮頸癌は、症例の７０％を占める２種のタイプ：ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８を有するヒトパピローマ（ＨＰＶ）感染と関連する。ＨＰＶの原発性腫瘍性タンパク質の１つは、Ｅ７タンパク質である。Ｅ７は、網膜芽細胞腫タンパク質（ＲＢ１）とのその相互作用を通して、悪性の表現型を誘導しおよび維持する。Ｅ７は、宿主ＲＢ１タンパク質の機能を破壊し制御されない細胞増殖の刺激をもたらす。Ｅ７はまた、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２により媒介される宿主ヒストン脱アセチル化を妨害し、転写活性化をもたらす。以前の研究は、Ｅ７機能の阻害は、ＨＰＶ陽性子宮頸癌細胞の増殖を抑制することを示唆した。Ｌｉら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１９，１０９，１２－１９）は、ＨＰＶ陽性細胞中のＥ７タンパク質に対するＶＨＨをコードするプラスミドの遺伝子導入（タンパク質其れ自体のための効率的細胞内の送達系の欠如のために使用された）が、Ｅ７活性を妨害し得（Ｅ７－ＲＢ１相互作用を破壊する）、ＨＰＶ陽性細胞の増殖の低下をもたらしたことを示した。発明者らは、Ｃ末端システインの添加を有する同じ抗Ｅ７ ＶＨＨを発現しおよび精製し、それを本発明の細胞内の担体にコンジュゲートした。ＨＰＶ陽性ＨｅＬａ細胞を、修飾されない抗Ｅ７ ＶＨＨまたは切断可能なリンカーによりＨＳＡ分子当り平均３．５ＰＥＩ分子を有するＰＥＩ修飾されたＨＳＡにコンジュゲートされたＶＨＨとインキュベートした。インキュベーション後、細胞の生存率を、標準ＭＴＴ生存率アッセイを用いて測定した。修飾されないＶＨＨは、増殖に対し効果を有しなかったが、ＰＥＩ修飾された担体にコンジュゲートされたＶＨＨとインキュベートした細胞は、細胞生存率における用量依存性低下を示し、抗Ｅ７ ＶＨＨがうまく内部移行され、かつＨｅＬａ細胞中でＥ７の効果を阻害できたことを示す（図１７）。

【0354】

ＨＰＶ陽性細胞株中のＥ７阻害の細胞内効果の大きさを確認するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）などの生細胞分析システムを、採用した。Ｅ７は細胞周期調節に影響を与えるので、蛍光ユビキチン化ベースのＣｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ（ＦＵＣＣＩ）と呼ばれる、特異的ＨＰＶ陽性ヒーラ細胞株を、使用した。ＦＵＣＣＩレポーターシステムは、細胞の異なる細胞周期ステージの追跡を可能にする。Ｇ１の細胞は、赤色蛍光を発し、ＳまたはＧ２またはＭの細胞は、緑色蛍光を発する。細胞を、細胞の培地中への異なる治療の導入の前に、２４時間にわたりチミジンと同期させた。細胞を、切断可能なリンカーによりＰＥＩ修飾されたＨＳＡにコンジュゲートされた抗Ｅ７ ＶＨＨにより、および次の対照：治療なし、修飾されたＨＳＡ、無関係のＶＨＨ（抗ビメンチン）にコンジュゲートされた修飾されたＨＳＡ、修飾されない抗Ｅ７ ＶＨＨ、修飾されないＨＳＡにコンジュゲートされた抗Ｅ７ ＶＨＨおよび細胞周期阻害剤（ＤＰ、ＣＤＫ４／６阻害剤）により治療した。図１８で見られるように、全ての対照は、治療されない細胞と類似のままである細胞周期に対し影響を有しないが、ＰＥＩ修飾されたＨＳＡ（３．５ＰＥＩ）にコンジュゲートされた抗Ｅ７ ＶＨＨは、劇的な効果を有し、直接細胞周期阻害剤の使用に類似の細胞周期停止をもたらした。市販のＥ７阻害剤は存在しないので、細胞周期停止を起こすことが知られている、ＣＤＫ４／６阻害剤、パルボシクリブイセチオン酸塩（ＰＤ０３３２９９１、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＺ０１９９）を、陽性対照として使用した。修飾されたＨＳＡにコンジュゲートされた抗Ｅ７ ＶＨＨは、唯一異なる動力学で、阻害剤と類似の効果をもたらした。さらに、図１９で見られるように、この停止は、ＨＰＶ陽性細胞の死滅につながった。

【0355】

抗ビメンチンおよび抗Ｅ７ ＶＨＨの両方は、細胞質の還元性環境中でそれらの耐久性を示した。それらの構造を安定化しおよび維持するためにジスルフィド結合に依存しない、単一ドメイン結合タンパク質の適合性を更に例示するために、発明者らは、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を結合物質として使用した。ＤＡＲＰｉｎは、遺伝子操作された抗体ミメティックタンパク質であり、通常、高特異性および高親和性標的タンパク質結合を示す。それらは、天然で最も一般的なクラスの結合タンパク質の１種である、天然アンキリンタンパク質由来であり、細胞のシグナル伝達、細胞の調節および構造的完全性などの多様な機能に関与する。ＤＡＲＰｉｎは、いくつかの反復モチーフからなり、それらの分子量は、約１４～１８ＫＤａ（キロダルトン）である。それらはまた、ＶＨＨと同様に、それらの構造的完全性についてジスルフィド結合に依存しないことを特徴とする。

【0356】

この目的のために、Ｋ－ＲＡＳに対するＤＡＲＰｉｎを、選択した。ＲＡＳタンパク質は、分子スイッチとしてシグナル伝達で重要な役割を果たす。ＲＡＳは、細胞形質転換における最も重要な標的であり、ＲＡＦ－ＭＥＫ－ＥＲＫカスケードを通して細胞増殖および分化、およびＰＩ３Ｋの活性化を通して細胞生存に関与する。ＲＡＳタンパク質（Ｋ－、Ｈ－、またはＮ－ＲＡＳ）の変異は、シグナル非依存性様式で細胞形質転換を促進する構成的に活性化されるＧＴＰ結合型を作成する。活性化ＲＡＳ遺伝子変異は、ヒトの癌の３０％もの多くに見出され、膵臓、結腸および肺腺癌で最も頻度が高い。発癌性ＲＡＳは、早期発症型の腫瘍にとって不可欠でありかつ腫瘍生存率の維持に必要であることが示されている。ＲＡＳ変異の最も中心の位置は、Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｖなどの、グリシン１２にある。

【0357】

Ｇｕｉｌｌａｒｄら（Ｇｕｉｌｌａｒｄ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７，８，１６１１１）は、抗体ミメティックであるＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７を生成した。これは、ＲＡＳのヌクレオチド交換を阻害する。Ｋ２７は、４ｎＭのＫｄを有して不活性Ｒａｓ ＧＤＰ型に選択的に結合し、構造的試験は、不活性Ｒａｓに対するその選択性を裏付ける。ＤＡＲＰｉｎコードベクターの遺伝子導入によるＫ２７の細胞内発現は、活性Ｒａｓの量を大きく減らし、下流シグナル伝達、特にリン酸化ＥＲＫのレベルを抑制し、およびＨＣＴ１１６細胞の軟寒天中の成長を遅らせることが示された。このグループは、「バリアーは、Ｒａｓが細胞内であるという事実から生ずる」と述べている。ＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７は、細胞に侵入する固有の能力を有さず、従って、ＤＡＲＰｉｎが細胞外で加えられる場合、Ｒａｓにアクセスできない。細胞の細胞質へのＤＡＲＰｉｎの送達の報告が存在するが、効率の大幅な増大が、この手法を治療用途に実行可能にするために必要とされるであろう。ＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７と同じ部位で結合する低分子阻害剤の開発は、難度が高い可能性がある。理由は、足場が、ポケットを画定するのではなく、広い表面にわたり結合するためである。

【0358】

ＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７は、報告された配列に基づき発現され、平均３．５ＰＥＩ分子で修飾されたＨＳＡ担体にコンジュゲートされた。内部移行およびＫＲＡＳ結合は、共焦点顕微鏡で評価された（図２０）。Ｋ２７ ＤＡＲＰｉｎは、細胞質中に分散されず、むしろ、ＫＲＡＳの主要な位置である細胞膜の内側に局在した。興味深いことに、いくらかの細胞は、内部移行されたＤＡＲＰｉｎに関して、点状プロファイルおよび内膜局在の両方を示した。点在は、エンドソームをまだ脱出していないか、または自由にその標的を見つけるように担体からまだ分離されなかったＤＡＲＰｉｎの結果であり得る。

【0359】

更なる試験では、膵管癌細胞（ＳＵ８６８６）を、ＨＳＡ担体にコンジュゲートされた抗ＫＲＡＳ ＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７とインキュベートした。担体は、８または３．５ＰＥＩ分子で修飾された。細胞のアポトーシス状態を、伝統的Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｓｓａｙを用いてモニターし、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）連続細胞モニタリングシステムを用いて可視化した。切断可能なリンカーを介してＰＥＩ修飾されたＨＳＡにコンジュゲートされたＤＡＲＰｉｎに曝露された細胞は、特に、高レベルのＰＥＩ修飾を有する担体にコンジュゲートされたＤＡＲＰｉｎに対し、アポトーシスの劇的な上昇を示した（図２１）。これは、高められた内部移行およびより迅速な動力学に起因すると思われる。対照的に、治療されない、修飾されないＤＡＲＰｉｎで治療された、またはＰＥＩ修飾されたＨＳＡ（８分子）単独で治療された細胞は、ベースラインレベルのアポトーシスを示し、ＤＡＲＰｉｎの細胞内効果を強調する。

【0360】

Ｇｕｉｌｌａｒｄらは、ＫＲＡＳ ＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７が、主にＧ１２位置で、天然の非変異体不活性ＫＲＡＳ、および異なる変異を有するＫＲＡＳに結合することを示した。従って、抗ＫＲＡＳ ＤＡＲＰｉｎ Ｋ２７を、ヒーラ細胞株の増殖およびアポトーシスに対するその細胞内効果について評価した。この細胞株は、その核中でのＧＦＰの構成的発現により特徴づけられ、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）などの連続画像モニタリング法を用いる、これらの細胞の容易な追跡を可能にする。抗ＫＲＡＳ ＤＡＲＰｉｎの２種の異なる調製物を、８ＰＥＩ分子を有するＨＳＡにコンジュゲートし、ＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞に対するその効果を、次の対照治療：陰性対照として治療なし、陽性対照として汎Ｒａｓ阻害剤での治療、修飾されないＤＡＲＰｉｎでの治療、修飾されないＨＳＡにコンジュゲートされたＤＡＲＰｉｎでの治療、８ＰＥＩ分子で修飾されたＨＳＡ担体での治療、および８ＰＥＩ分子で修飾されたＨＳＡにコンジュゲートされた抗ビメンチンＶＨＨでの治療、と比較した。図２２Ａ～２２Ｂで見られるように、８ＰＥＩ分子を有するＨＳＡにコンジュゲートされた抗ＫＲＡＳ ＤＡＲＰｉｎの両調製物は、ＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞の増殖（図２２Ａ）およびアポトーシス（図２２Ｂ）の両方に劇的に影響を与えた。対照治療のいずれも、これらのパラメーターに対し何らの影響もなかった。アポトーシスに対する効果はまた、図２３でも認めることができ、ＰＥＩ修飾ＨＳＡにコンジュゲートされた抗ＤＡＲＰｉｎで治療した細胞の赤色染色（アポトーシス細胞）および細胞の死滅に伴うＧＦＰの喪失が、明確に観察される。

【0361】

実施例８：薬物動態学および体内分布（ＰＫおよびＢＤ）
ＰＥＩ修飾は、担体タンパク質に濃縮されたおよび強力な正電荷を付与する。対照的に、血漿成分および細胞膜は通常、負に帯電される。正に荷電されたタンパク質は、これらの負に荷電された成分との静電結合に起因して、「粘着性」であることが知られている。この「粘着性」は、短い半減期および体内分布に関する問題につながり得る。この現象は、天然で正に荷電され、かつ若干の塩基性等電点（ｐＩ）により特徴づけられるタンパク質において既知である。ＰＥＩ修飾されたタンパク質の薬物動態学的および体内分布プロファイルは、その強力な正電荷により影響を受け得る。さらに、このような粘着性はまた、注入部位での投与された正に荷電されたタンパク質の「トラップ」にもつながり得る。これらの影響を回避する、または少なくとも最小化するために、ＰＥＩ修飾のレベルの影響を検査した。

【0362】

細胞膜を横断することにおいて、およびエンドソーム脱出を可能にすることにおいて依然として効果的である最低レベルのＰＥＩ修飾を特定することおよび利用することにより、本発明のタンパク質のＰＫおよび体内分布を改善できる。この修飾レベルを特定するために、ＨＳＡ担体を、次の平均レベルのＰＥＩ修飾：２．０、３．６、５．２、６．２、８．０および９．４で産生した。これらのレベルを、ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ質量分析を用いる得られた修飾ＨＳＡの分析により確認した（図２４）。これらの担体を、抗ビメンチンＶＨＨに更にコンジュゲートし、これらのコンジュゲートの内部移行を、共焦点顕微鏡を用いて評価した（図２５）。共焦点顕微鏡共焦点顕微鏡結果で認められるように、２．０および３．６個のＰＥＩ分子を有するＨＳＡにコンジュゲートされたＶＨＨでさえ、細胞内の明確な存在を示す。より高レベルのＰＥＩで修飾された担体の使用は、明らかなより高レベルの細胞内ＶＨＨにつながるように思われるが、それらの場合内部移行されたＶＨＨのプロファイルは、より点状で、それほど分散されず、おそらく、より高い正電荷によるＶＨＨの担体からのより遅い脱離に起因するのであろう。３．６ＰＥＩ／ＨＳＡを超えて修飾されたＨＳＡの場合の細胞内のＶＨＨのより強い染色は、濃縮点状プロファイルに起因するより強い画像化の結果であり得、必ずしも、絶対的により高レベルを示していない可能性がある。

【0363】

共焦点顕微鏡の結果をまた、特異的ＥＬＩＳＡを用いて細胞の培地中のコンジュゲートの残留レベルを測定することにより、これらのコンジュゲートの内部移行レベルと相互に関連付けた（図２６）。ＰＥＩで直接修飾されたＩｇＧで観察された結果（図４）と異なり、ＨＳＡ担体（コンジュゲートされたＶＨＨを有する）のレベルおよび動力学は、修飾のレベルによりそれほど影響されない。３．５および８分子のＰＥＩで、内部移行は、効率的であり、その大きさおよび速度は、非常に類似している。これらの結果は、実際に、担体として使用されるＨＳＡが、丁度３．５個の、あるいはさらに少ない、ＰＥＩ分子で修飾できることを示唆し、循環中でのＨＳＡ担体の粘着性を低減すると思われる事実である。

【0364】

実施例９：電荷マスキング（非共有結合）
非共有結合電荷マスキングは、ＰＥＩへの負に荷電された分子の静電結合などによりＰＥＩの陽性表面電荷を中和することにより達成できる。具体的には、発明者らは、フィチン酸などの複数の負電荷を有する分子が、ＰＥＩの複数の正電荷と静電気的に相互作用してインビボで効率的な電荷マスキングを樹立し得ることを想定した。

【0365】

ＰＥＩ修飾されたＨＳＡの薬物動態学および体内分布に対する電荷マスキングの効果を評価するために、ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８を、２０ｍＭのフィチン酸で処理し、透析して過剰フィチン酸を除去し、マウスの静脈内に注入した。非処理のＨＳＡ－ＰＥＩｘ８を、対照として投与した。ＨＳＡの濃度を、自社製ＥＬＩＳＡを用いてＢａｌｂ－ｃマウスの血漿中で測定し、結果を、注入された投与量からのパーセントとして示す。発明者らは、ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８が、投与後５分でも注入された投与量の３５％のみが定量できるという事実により明らかなように、循環から素早く消えることを観察した。３０分で、ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８の９５％は、治療マウスの血漿中で見出されない。マスキングは循環からの更に高速なクリアランスをもたらしたが、フィチン酸マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８は、しかし、マスクされないＨＳＡ－ＰＥＩｘ８とは全く異なった挙動をする。

【0366】

これらの効果をより良く理解するために、近赤外蛍光標識（ＶｉｖｏＴａｇ ７５０－Ｓ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）バージョンの上記試験粒子を、調製し、ＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を利用するＰＫ実験で使用した。無胸腺ヌードマウスに、２種のレベルのＨＳＡ－ＰＥＩｘ８（１２５および２５０ｎｍｏｌ／Ｋｇ）および１２５ｎｍｏｌ／Ｋｇで投与したフィチン酸（５ｍＭ）でマスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８を、投与した。動物を、ＩＶＩＳシステムにより異なる時点で投与の４８時間後まで撮像した（図２７Ａ）。

【0367】

蛍光標識は標識タンパク質のＰＫおよび体内分布に影響したように見える（データは示さず）が、マスクされないタンパク質に対するフィチン酸マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８の比較は、マスキングの劇的な効果を示す。ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８は、動物の腎臓および肝臓中で急速に濃縮されるが、フィチン酸マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８は、この結果を回避する。これらの効果はまた、注入の４８時間後に採取した動物の異なる臓器の撮像の場合にも明らかである（図２７Ｂ）。

【0368】

これらの結果ならびに他の結果に基づき、インビトロ設定での非共有結合フィチン酸マスキングの一時的効果は極めて満足できるものであった（結果は示さず）が、インビボ設定ではフィチン酸のマスキング効果は極めて急速に失われることが、発明者らの理解である。フィチン酸がインビボで効率的電荷マスキングを確立できないことはおそらく、フィチン酸に対し高親和性を有するカルシウムおよびマグネシウムなどの種々の二価の金属イオンによる激しい競争に起因するということが想定される。さらに、ゼータ電位測定は、フィチン酸がＰＥＩ修飾されたＨＳＡの電荷を劇的に低下させることを示したが、正電荷は基本的に、マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩの表面電荷がほぼゼロになるように中和されることに留意されたい。約ゼロの表面電荷を有するタンパク質は、溶液中で不安定であることが知られており、更に、ゼロ電荷のタンパク質は、効率的な薬物動態プロファイルを有することは知られていない。
非共有結合マスキングのこれらの洞察および欠点は、発明者らに共有結合マスキングをベースにしたマスキングの解決策を探させることになった。

【0369】

実施例１０：電荷マスキング（共有結合保護基を介する）
無水マレイン酸およびその誘導体が、ＰＥＩ（および場合によっては、担体のリジン残基）のアミノ保護基として、発明者らにより実現された。下記スキームは、一級アミンの無水マレイン酸誘導体との一般反応を示す。スキームから解るように、生理学的ｐＨで正電荷を有する、アミン基は、それがアミド基に変換されると、中性になる。同時に、反応は、生理学的ｐＨでの負電荷により特徴づけられる遊離カルボキシル基を生じる。

【化30】

【0370】

このような無水物誘導体は、本発明のＨＳＡ担体上のＰＥＩ修飾の一級アミン、ならびにそのリジン側鎖のアミンおよびＮ末端遊離アミンと反応できる。

【0371】

これらの保護基の安定性は、二重結合上の置換基により制御でき、より多くの置換基およびより大きな置換基は、より低い安定性をもたらす。このより低い安定性を本発明で利用して、電荷マスキングの所望の一過的効果を生成できる。これらの潜在的な共有結合のマスキング剤はより低いｐＨ値でそれほど安定でないので、この特性を使用して、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中のマスクされたＰＥＩ修飾担体のより高い蓄積をもたらすことができる。理由は、このようなＴＭＥは通常、正常で健康な細胞外または血漿環境よりもより低いｐＨにより特徴づけられるためである。後者は、約７．３～７．４のｐＨを有するが、ＴＭＥは、約６．８～７．０および更に低いｐＨ値を有し得る。より低いｐＨに起因するＴＭＥ中のこれらのマスキング剤の高められた除去は、ＰＥＩのカチオンを曝露させ、細胞接着および内部移行をもたらすであろう。

【0372】

発明者らは、種々の無水物誘導体（マレイン酸－Ｒ^１＝Ｈ、Ｒ^２＝Ｈ；シトラコン酸－Ｒ^１＝Ｍｅ、Ｒ^２＝Ｈおよびジメチルマレイン酸－Ｒ^１＝Ｍｅ、Ｒ^２＝Ｍｅ、シス－アコニット酸（Ｒ^１＝ＣＨ_２ＣＯＯＨ、Ｒ^２＝Ｈ）、３－（４－メチル－２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）プロパン酸（Ｒ^１＝Ｍｅ、Ｒ^２＝ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ）、および３－エチルフラン－２，５－ジオン（Ｒ^１＝ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｒ^２＝Ｈ））による電荷マスキングの効果を、タンパク質のｐＩを示す等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルを用いて評価した。天然のＨＳＡは、約４．８のｐＩを特徴とし、ＰＥＩ修飾は、極端に高い８を超えるｐＩをもたらし、このゲルを用いて測定できない。無水マレイン酸および無水シトラコン酸の両方は、ＰＥＩ修飾ＨＳＡのｐＩを劇的に低下させ、さらに天然のものより幾分低いｐＩを示した。約７のｐＨでもその既知の不安定性を有するジメチルマレイン酸無水物は、スミアーを与え、おそらく、この分析の前のおよび分析中のこのマスキングの除去を示唆している。この不安定性のため、更なる実験を、ジメチルマレイン酸無水物で実施しなかった。ＩＥＦの結果は、ゼータ電位測定（Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を裏付けた。これらの分析は、天然のＨＳＡに対する－１４．４のゼータ電位値を示した。ＰＥＩ修飾（ｘ８）は、ゼータ電位をほぼ＋１３に増大させたが、無水シトラコン酸によるマスキングは、８５当量のモル過剰を用いた場合、ＰＥＩ修飾ＨＳＡのゼータ電位を－１２に低下させた。

【0373】

マスキング手順は以下の通り：
１ｍｇ／ｍＬ超の濃度でマスクされるタンパク質の溶液に、無水物を５０～５００当量の範囲のモル過剰で加える。反応は、自然発生的であり、追加の触媒または試薬を必要としない。反応を、数分～数時間維持できる。

【0374】

種々の無水物誘導体（マレイン酸、シトラコン酸、シス－アコニット酸（Ｒ^１＝ＣＨ_２ＣＯＯＨ、Ｒ^２＝Ｈ）、３－（４－メチル－２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）プロパン酸（Ｒ^１＝Ｍｅ、Ｒ^２＝ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ）、および３－エチルフラン－２，５－ジオン（Ｒ^１＝ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｒ^２＝Ｈ））によるＨＳＡ－ＰＥＩｘ８のマスキングを、異なるモル過剰の無水物誘導体を用いて較正した。その後、発明者らは、ＩＥＦゲル電気泳動法を用いて上述した無水物誘導体のマスキング効率を試験した。７５～２００当量の範囲の異なるモル過剰の無水シトラコン酸でマスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８の得られたＩＥＦプロファイル（データは示さず）を、天然の、修飾されないＨＳＡと比較した。発明者らは、マスクされたタンパク質のｐＩのさらなる変化は、１００当量のモル過剰を越える場合では観察できないと結論付けた。同様の結果が、他の無水物でも得られた（データは示さず）。

【0375】

８５モル過剰の無水シトラコン酸でマスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８は、天然のＨＳＡと類似のＩＥＦプロファイルを示した。このマスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８を、異なるｐＨ環境でのマスクの安定性の評価で更に使用した。無水シトラコン酸マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８を、異なるｐＨでインキュベートし、試料を、ＩＥＦ分析のために０、２４および７２時間で回収した。発明者らは、ｐＨ４でマスキングは、ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８に比べて、極めて不安定であり、かつ実際に２４時間で除去されることを見出した。発明者らは、このマスキング剤が、ｐＨ６でも不安定性を示すことに気付いた。興味深い観察は、この薬剤が、ＴＭＥに特徴的であるｐＨ６．８で徐々に除去され、除去のレベルは、７２時間で微量のみの除去が示されるｐＨ７．４で観察されるよりもはるかに大きいことである。これは、無水シトラコン酸が、本発明のＰＥＩ修飾された担体の共有結合マスキング剤として潜在能力を有することを示唆している。無水マレイン酸は対照的に、完全除去が９６時間で観察されたがわずかな除去のみがこのｐＨへの初期の暴露時間で観察されるｐＨ４以外の全てのｐＨで、高い安定性を示す。

【0376】

無水シトラコン酸は、それが１つのメチル置換を有するので、非対称無水物である。この非対称を考慮すると、無水シトラコン酸とアミンの反応は、動力学的生成物および熱力学的生成物として知られる、２種の構造的生成物を有することができ、前者は、得られる立体障害のために、幾分低い安定性であることが予測されている。ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８を、熱力学的条件（２０℃、２時間）および動力学的条件（５℃、１０分）で、無水シトラコン酸でマスクした。動力学的条件の生成物は、おそらく全てが動力学的生成物ではないが、むしろ動力学的生成物が濃縮されている。両生成物を、２～８℃で更に保持し、インビボ設定に関連するレベルのｐＨ７．４および６．８でＩＥＦによりそれらの安定性について更に評価した。

【0377】

熱力学的生成物および動力学的生成物（対応するｐＨでの４８時間のインキュベーション）を、ＩＥＦゲルにて各時間で並行して分析した（データは示さず）。両方の生成物のＩＥＦプロファイルは、実験の開始時には極めて類似しているように見えるが、動力学的生成物が濃縮されたマスクされた調製物は、全ての時点でかなり安定性が低い。

【0378】

ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８を、それらの薬物動態プロファイルおよび体内分布の評価について、インビボ設定で無水シトラコン酸マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８比較した。マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８を、１５０当量のモル過剰で用いて、上述の動力学的条件下で産生した。ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ ＭＳ分析を用いて、ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８に共有結合したマスキング剤の数を定量化した。ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ ＭＳに基づいて、発明者らは、マスキングが約４４モルの無水シトラコン酸の付加に相当すると計算される顕著な質量シフトをもたらしたと結論付けた（表２参照）。

【0379】

ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５およびＨＳＡ－ＰＥＩｘ８を、いくつかの無水マレイン酸誘導体で修飾した。マスキングのレベルを、反応系中の等価量のマスキング剤により制御した。マスキングのレベルおよび分子の電荷に与える効果を、質量分析およびゼータ電位によりそれぞれ評価した（表１のゼータ電位結果および表２のＭＳ結果を参照）。腫瘍微小環境（報告されたｐＨは約６．８）内で切断されるマスキング剤の潜在力を調査するために、マスクされた担体（ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５またはＨＳＡ－ＰＥＩｘ８）の安定性を、３７℃で異なるｐＨでのインキュベーションにより、インビトロで試験した。ＩＥＦゲルを用いて、マスキング除去を評価した。マスキングの除去は、タンパク質のｐＩの増大を生じた。

【0380】

実験結果に基づいて、無水シトラコン酸由来のマスキング基が、そのｐＨ７．４での安定性、およびｐＨ６．８での経時的な段階的脱保護のために、意外にも好都合であると見出された。他の保護基は、ｐＨ７．４（より大きな脱保護）またはｐＨ６．８（低い脱保護）で劣った安定性を示した。

【表1】

【表2】

【0381】

表１に示すように、ジメチルマレイン酸無水物マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩは、マスクされないＨＳＡ－ＰＥＩのゼータ電位とほぼ同一の、強い正のゼータ電位を有する。発明者らは、これは、ジメチルマレイン酸無水物の不安定性（急速脱保護）に起因すると想定している。類似の現象は、アコニット酸無水物マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩでも観察され、これは、表１に示されるゼータ電位値により確認されるように、部分的脱保護を示した。従って、発明者らは、無水マレイン酸と共に無水シトラコン酸は、十分な化学的安定性により特徴づけられると想定している。さらに、上で開示されるように、無水シトラコン酸は、中性以上のｐＨ（約７超、または７．４超）でのその安定性および約６．８以下のわずかに酸性のｐＨでの実質的脱保護が理由で、優先されるべきように見えた。

【0382】

酸性ｐＨで起こるこの脱保護は、細胞内送達に不可欠であることが判明した。抗Ｅ７ ＶＨＨ（本明細書で前述の）を、無水シトラコン酸でマスクされたおよびマスクされないＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５の両方にコンジュゲートした。両方のコンジュゲートを、細胞中へ内部移行するそれらの能力について評価した。マスクされないコンジュゲートは、明確な細胞内部移行を示す（図２８Ａ～２８Ｃ）が、マスクされたコンジュゲートは、全く内部移行されなかった（図２８Ｅ～２８Ｆ）。これは、ＰＥＩ修飾の正電荷のない場合、コンジュゲートは、細胞膜に付着するおよび内部移行のためにエンドサイトーシス機序を利用するその能力を完全に失うことを示す。

【0383】

内部移行に対する非マスキングの不可欠性を更に試験するために、無水シトラコン酸（ＣＡ、一過的酸感受性マスキング剤）またはメチル無水コハク酸（ＭＳＡ、安定なマスキング剤）でマスクされた蛍光標識担体（ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}）を、使用した。蛍光標識を、ＨＳＡの位置３４の遊離システイン上の修飾に向けられたマレイミド部分を有する２．５モル過剰のＡｔｔｏ－５４２（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ、カタログ番号ＡＤ５４２）を用いて、ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}に対し実施した。質量スペクトル測定は、わずか１つの修飾のみが観察されることを示した（データは示さず）。マスキング除去を、３７℃、ｐＨ４で８時間のインキュベーションにより、３種全ての担体（ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}；ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}ＣＡ；ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}ＭＳＡ）に対し実施した。マスキング除去の前後の標識されたタンパク質を、２４時間のインキュベーション中に、Ｂ１６メラノーマ細胞中へ内部移行するそれらの能力について試験した。内部移行の検出を、以前のように共焦点顕微鏡により行った。図２９Ａ～２９Ｆで見られるように、細胞内の蛍光は、マスクされない担体（図２９Ａ、２Ｄ）、またはマスク除去後のＣＡマスクされた担体（図２９Ｅ）とのインキュベーションからのみ観察される。実際に、一過性でない安定なマスキングでマスクされた担体は、酸性処理後であっても、細胞中に侵入できなかった（図２９Ｃ、２９Ｆ）。

【0384】

次に、インビトロマスク除去（ｐＨ４、３７℃で８時間のインキュベーション）後にペイロード－マスクされた担体コンジュゲートが、細胞中に内部移行するのみでなく、機能を発揮できるかどうかも調べた。このインビトロ処理を使って、腫瘍環境中、ならびに種々の健康状態で起こる他の酸性環境で見い出される酸性条件の効果を模倣した。機能性を試験するために、平均３．５ＰＥＩ修飾を有する無水シトラコン酸マスクされた担体にリンカーを介してコンジュゲートされた、抗ＢＲＡＦ ＶＨＨ、１Ｃ５（１Ｃ５－Ｈｅｌ－マスクされたＨＳＡ^{ＰＥＩｘ３．５}）を、使用した。異なる癌細胞株を、インビトロマスキング除去（ｐＨ４、３７℃、１または８時間）の前後で、この薬剤で治療した。そのマスクされない対応物を、対照として使用した。図３０Ａで見られるように、マスクされないコンジュゲートは、ＢＲＡＦ薬剤の細胞内送達が予測されるので、治療ＭＥＬ－５２６メラノーマ細胞に対し細胞毒性効果を有した。マスキング除去はこの場合、除去するマスクがないので、効果がなかった。マスクされたコンジュゲートはしかし、マスキングが内部移行を効率的に妨げたので、処理された細胞に対して効果がなかった（図３０Ａ）。インビトロ酸性処理は、マスキングを除去でき、ＰＥＩ修飾を曝露させ、細胞へのコンジュゲートの内部移行を再度可能にした。これは、細胞死滅により見ることができ、これは、マスクされないコンジュゲートで達成された死滅に極めて近い（図３０Ａ）。図３０Ｂで見られるように、類似の結果が、ＳＫ－ＭＥＬ－２８メラノーマ細胞でも観察された。この場合もまた、マスクされた担体（３．５ＰＥＩ）に非可逆的にコンジュゲートされた抗ＢＲＡＦ １Ｃ５は、これらの細胞に対し効果を有しなかったが、インビトロ酸性処理後の同じ薬剤は、これらの細胞に対し劇的な細胞毒性効果（マスクされないコンジュゲートにより産生されたものにその大きさが類似の効果）を有した。

【0385】

マウスでのインビボ実験を実施して、マスキングの効果を確認した。ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５、ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８および無水シトラコン酸でマスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８を、Ｂ－１６マウスメラノーマ癌細胞を皮下に移植したＣ５７マウスにＩＶ注入（５８ｎｍｏｌ／ｋｇ）した。生着を、異なるＨＳＡ－ＰＥＩ誘導体の投与前の２週間、実施した。各誘導体を、１５匹のマウスに注入し、各時点で３匹の動物を、採血した。いくつかの時点で、動物をまた、屠殺し、異なる臓器を、体内分布分析のために取得した。ＨＳＡ－ＰＥＩのレベルを、自社製ＥＬＩＳＡを用いて血漿および臓器溶解物中で測定した。無水シトラコン酸マスキングはまたＥＬＩＳＡによる検出を妨害するので、マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩを注入した動物の試料を、マスキング剤の完全除去のためにそれらのＥＬＩＳＡ分析前に約１時間ｐＨ４で処理した。

【0386】

得られたＨＳＡ－ＰＥＩ誘導体の薬物動態プロファイを、図３１Ａで見ることができる。ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８は、血漿からの極めて急速なクリアランスにより特徴づけられる。いくらかの残留量は、更にゆっくり排出され、約１５時間の見かけ上の半減期をもたらす。対照的に、無水シトラコン酸でマスクされた同じＨＳＡ－ＰＥＩｘ８は、遙かに遅く排出され、ほぼ２７時間の半減期を与える。マスキング効果は、曲線下面積（ＡＵＣ）として計算される血漿曝露を試験すると、なおさらに劇的である。マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８の血漿曝露は、マスクされないＨＳＡ－ＰＥＩｘ８の曝露レベルよりも、５０倍高い。ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５は、１３時間の半減期を与え、そのＰＫプロファイルは、ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８よりも好ましいように見える。しかしそれでも、その血漿曝露は、マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８より５倍低い（図３１Ｂ）。

【0387】

動物の臓器での異なるＨＳＡ－ＰＥＩ誘導体のレベルの試験は、ＰＥＩ修飾されたＨＳＡの低い血漿曝露への更なる洞察を提供する。図３２Ａで見られるように、臓器曝露レベル（ＡＵＣ）では、ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５およびＨＳＡ－ＰＥＩｘ８の両方は、クリアランス臓器、即ち、肝臓、腎臓および脾臓中である種の捕捉を受けるように見える。ＰＥＩ修飾されたＨＳＡの注入量のほとんどは、これらの臓器中で見出すことができる。対照的に、無水シトラコン酸マスキングは、この捕捉を除去し、マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８が動物の血流中でより長く循環することおよび異なる臓器および組織中でより均質に分布することを可能にする。この知見は、極めて意外であり、かつ重要である。組成物を望ましくない臓器から離すよう誘導する能力は、治療効力にとって不可欠である。それはまた、遥かに低い投与量の送達を可能にする。かつ、これらの態様の両方は、望ましくない副作用およびオフターゲット効果を減らすであろう。さらに、マスクされた剤の分布は、臓器中でむしろ均質に見えるが、１つの組織は、マスクされた剤により多く曝露されるように見え、これは、腫瘍である（図３２Ａ）。腫瘍は、他の臓器より２～７倍多くマスクされたＨＳＡ－ＰＥＩに曝露された（図３２Ｂ）。これは、腫瘍の酸性環境に対するマスキング剤の感受性に起因し、これは、その反転をもたらし、正に荷電されたＰＥＩ修飾を曝露し、それが次に細胞接着および細胞質ゾル送達の開始をもたらす。発明者らは、血漿の中性ｐＨでも、マスキングは遅い反転を受けることを上で示したが、この効果は、より酸性の腫瘍環境中でより急速であり、これは、この特定の環境中で、本発明の担体の濃縮をもたらす。

【0388】

腎臓中の低い量のマスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ８が尿を介したクリアランスの結果ではないことを確実にするために、このインビボ試験での動物を、代謝ケージ中で治療し、それらの尿を、実験の最初の１４時間にわたり収集した。図３３に示すように、初期投与量の０．１％未満の、注入された担体の極端に少ない量のみが、投与された動物の尿中で検出された。このデータの全てをまとめて、ＰＥＩの保護は、十分な血清半減期および適切な体内分布を確保するために必要であるが、ＰＥＩの脱保護は、細胞内送達を促進するために標的細胞（例えば、腫瘍）において必要であることを強調する。

【0389】

実施例１１：追加のタンパク質担体を含むタンパク質コンジュゲートのインビボ結果
代替担体（ＨＳＡでない担体）のインビボ適合性を評価するために、ＩｇＧタンパク質（ヒュミラ（登録商標）、Ａｂｂｖｉｅ）を、ＥＤＣの存在下にてＰＥＩ（６００Ｄａ）で修飾して、４ＰＥＩ修飾を得て、ＩｇＧ－ＰＥＩｘ４と名付けた。修飾されたＩｇＧタンパク質を、無水シトラコン酸と更に反応させてＰＥＩの正電荷のマスキングを生じ、マスクされたＩｇＧ－ＰＥＩｘ４と名付けた。

【0390】

２種のＩｇＧ担体、ＩｇＧ－ＰＥＩｘ４およびマスクされたＩｇＧ－ＰＥＩｘ４のＰＫ、ゼータ電位および質量を、評価した。表３で見られるように、ＰＥＩ修飾は、ＩｇＧのゼータ電位値を劇的に増大させたが、マスキングは、修飾されない元のＩｇＧのゼータ電位値より遥かに低い負の値にこの値を変えた。

【表3】

【0391】

Ｂａｌｂ－Ｃマウスに、１２０ｎｍｏｌ／Ｋｇの投与量で試験試料ＩｇＧ－ＰＥＩｘ４またはマスクされたＩｇＧ－ＰＥＩｘ４をＩＶ注入した。試験した時点で、マウスを採血し、血液中の試料濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（コーティング：ヤギ抗ヒトＦａｂ２（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－００５－０９７）；検出：ロバ抗ヒトＦＣ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号７０９－０３５－０９８））により評価した。図３４（および表３）で見られるように、ＰＥＩで修飾されたＩｇＧ担体は、ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５と類似のＰＫパラメーター（ＡＵＣおよびＣＬ）を提示し、特徴的な急速な除去、低いＡＵＣおよび高いクリアランスを示した。ＨＳＡ担体と同様に、マスクされたＩｇＧ担体は、その長い半減期、極めて高いＡＵＣおよび低いクリアランスを回復し、再度、無水マレイン酸誘導体、および特に無水シトラコン酸によるマスキングは、ＩｇＧなどの本発明のＰＥＩ修飾担体に、臨床的に好ましい薬物動態プロファイルを与える。

【0392】

実施例１２：タンパク質担体なしにＰＥＩ修飾された抗体のインビボ結果
高いクリアランスおよび短い血漿半減期をなくすため一過性マスキングの能力を更に試験するために、ＰＥＩで直接的に修飾された単一ドメイン抗体を、無水シトラコン酸で更にマスクした。具体的には、上述の活性抗Ｅ７ ＶＨＨを、担体なしで生成し、非可逆的方式で、ペイロードのＣ末端（Ｃ末端にＧＧＧＧＳＣリンカーを加えた）でＰＥＩ（１８００Ｄａ）により修飾し、これは、ここでは、ＶＨＨ αＥ７－ＰＥＩ１８００と呼ばれる。ＰＥＩ修飾されたＶＨＨを、無水シトラコン酸で更にマスクして、マスクされたＰＥＩ修飾タンパク質を得、マスクされたＶＨＨ αＥ７－ＰＥＩ１８００と命名した。

【0393】

２種の化合物：ＶＨＨ αＥ７－ＰＥＩ１８００およびマスクされたＶＨＨ αＥ７－ＰＥＩ１８００、のゼータ電位を比較し、天然の修飾されないＶＨＨと比較した。さらに、ＰＥＩ修飾されたＶＨＨおよびそのマスクされた対応物のＰＫを、マウスで評価した。Ｂａｌｂ－Ｃマウスに、１２０ｎｍｏｌ／Ｋｇの投与量で試験試料（ＶＨＨ αＥ７－ＰＥＩ１８００またはマスクされたＶＨＨ αＥ７－ＰＥＩ１８００）をＩＶ注入した。試験時点で、マウスを採血し、血液中の試料濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（コーティング：ストレプトアビジン（Ｐｒｏｓｐｅｃ、カタログ番号Ｐｒｏ－７９１－ｂ）、続いてウサギ抗ＶＨＨ＋ビオチン（Ａ２Ｓ、カタログ番号Ａ０１９９５－２００）、検出：ウサギ抗ＶＨＨカクテル－ＨＲＰ（Ａ２Ｓ、カタログ番号Ａ０２０１６－２００））により評価した。

【0394】

下表表４および図３５で見られるように、ＰＥＩ修飾されたＶＨＨは、マウス血漿からの極めて高いクリアランスおよび極めて低いＡＵＣを有した。本発明の担体中のＰＥＩ修飾の有害なＰＫ効果を回復すると示された、正電荷のマスキングは、ＰＥＩ修飾されたＶＨＨのＰＫパラメーターを改善した。より大きな担体、例えば、ＨＳＡおよびＩｇＧ、に対するマスキングの効果は、極めて顕著であったが、低分子ＰＥＩ修飾タンパク質に対する効果は、それほどではなかった。マスキングそれ自体は、強力な正電荷の効果、即ち、肝臓、脾臓および腎臓中での捕捉、を抑止したが、その小サイズは依然として、単純なサイズに関連する理由のために、高いクリアランスをもたらした。

【0395】

この目的のために、発明者らは、マスキング剤の使用に加えて、本発明のタンパク質コンジュゲートは、ペイロードの対象内の標的部位への送達を促進するために担体を含まなければならないと想定した。

【表4】

【0396】

実施例１３：抗ＨＰＶ－Ｅ７ ＶＨＨのインビボ結果
以前に記載された抗ＨＰＶ－Ｅ７ ＶＨＨを、ＰＥＧ１１鎖を含み、両方がチオール基に対し反応性である２つの末端マレイミド基を有する、切断不能なリンカー経由でＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５にコンジュゲートした。Ｃ末端システイン（Ｃ末端にＧＧＧＧＳＣリンカー）を有するＶＨＨを、還元剤（ＴＣＥＰ）で処理して、末端システインを遊離させ、その後、ビス－Ｍａｌ薬剤と反応させた。クロマトグラフ精製後、今や末端マレイミド基を有するＶＨＨを、予めＰＥＩで修飾されたＨＳＡ（ＨＳＡ当り平均３．５）、およびマスキングのためにシトラコン酸と反応させて、以下に概略図で示す、本発明の例示的タンパク質コンジュゲート（αＥ７－ＶＨＨ－Ｓ－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－Ｓ－ＨＳＡｘ３．５）を得た：

【化31】

【0397】

得られたマスクされたαＥ７－ＶＨＨ－Ｓ－Ｍａｌ－ＰＥＧ１１－Ｍａｌ－Ｓ－ＨＳＡｘ３．５を使って、皮下にＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞を移植した無胸腺ヌードマウスを治療した。ＰＥＩ修飾のない同じ分子を、陰性対照として使用した。ＰＥＩ修飾のない本発明のコンジュゲートは、腫瘍増殖に対し予測通り効果を示さなかった（図３６Ａ）。ＰＥＩ修飾されたコンジュゲートは、腫瘍増殖に対し最小限の効果を有し、マスキングなしでは、腫瘍細胞に対する薬剤の利用能は最小限であることを示唆する。これはおそらく、マスクされない担体（図３１Ａ～３１Ｂおよび３２Ａ）について例示された不十分な薬物動態学的および体内分布プロファイルにおいて上で例示したように、正に荷電されたコンジュゲートの粘着性に起因するのであろう。

【0398】

次に、マスクされたαＥ７－ＶＨＨ－Ｓ－Ｍａｌ－ＰＥＧ１１－Ｍａｌ－Ｓ－ＨＳＡｘ３．５を、腫瘍生着後に腫瘍が約１００ｍｍ^３の平均体積に達したときにマウスの静脈内に注入した（２５０ｎｍｏｌ／Ｋｇ）。治療は、薬剤および対照の定期的投与を含んだ。無水シトラコン酸マスクされたＨＳＡｘ３．５、およびビークル（ＰＢＳ）を、対照として投与した。マスクされたαＥ７－ＶＨＨ－Ｓ－Ｍａｌ－ＰＥＧ１１－Ｍａｌ－Ｓ－ＨＳＡｘ３．５で治療したマウスは、対照と比較して有意な腫瘍成長抑制を示した（図３６Ｂ、両側ｔ検定 ｐ＜０．０５ マスクされた担体ｖｓマスクされたαＥ７－担体）。さらに、治療は、なんらかの有害事象の欠如および動物の正常な重量（データは示さず）から明らかなように、全ての動物により良好に許容された。

【0399】

幾分限定された腫瘍増殖抑制は、抗Ｅ７ ＶＨＨが１μＭを越える推定Ｋ_Ｄを有してＥ７タンパク質に対する限られた親和性を有する、という事実に帰することができる。

【0400】

実験を、以下の変更を含む同じプロトコルに従って繰り返した：１）薬剤の投与量を３５０ｎｍｏｌ／Ｋｇに増やし、２）注入を毎日、１５連続日にわたり実施した。動物を、追加の２４時間にわたり腫瘍体積についてモニターし続けた。図３６Ｃで見られるように、第１の試験と類似の腫瘍増殖抑制が、治療開始の初期腫瘍体積が９７ｍｍ^３未満であった治療動物の腫瘍体積の試験をした場合に観察された。投与のより高い量およびより高い頻度から予測されるように、腫瘍増殖抑制は最初に、より早期の時点で観察され、効果の大きさはまた、より大きかった。

【0401】

驚くべきことに、抑制効果は、薬剤の投与が停止された後でも持続した（図３６Ｄ）。実際に、最大の効果は、更に５日間維持され、治療の休止の２４日後にも存在した。ここで使用した抗Ｅ７薬剤は、担体に永続的に連結された。我々は過去に、担体が、エンドソームから脱出時に、クラスターまたは凝集体を生成することを観察した（図２８Ｂ）。これは、抑制効果の持続性を説明し得る。なぜなら凝集体は、追加の薬剤を細胞質中へ経時的にゆっくり放出する、ある種のデポーとして作用し得るからである。

【0402】

初期試験の治療動物由来の腫瘍を取得し、免疫組織化学的検査を用いて、ＶＨＨ薬剤およびＨＳＡ担体の存在について分析した。断面を、Ｈ＆ＥによりおよびＶＨＨまたはＨＳＡ^ＰＥＩに対する抗体（ＨＳＡ其れ自体ではなく、ＰＥＩ修飾ＨＳＡに対し産生した抗体）により染色した。ＰＢＳで治療した動物由来の腫瘍（図３７Ａ～３７Ｂ）は、ＶＨＨまたは担体に対して染色を示さなかった。マスクされた担体で治療した動物由来の腫瘍は、担体に対して明確で強力な染色を示すが、ＶＨＨペイロード（図３７Ａ～３７Ｂ、中央）に対しては染色を示さない。マスクされた担体にコンジュゲートされた抗Ｅ７ ＶＨＨで治療した動物由来の腫瘍は、担体およびＶＨＨペイロードの両方に対し明確に染色を示す（図３７Ａ～３７Ｂ、右）。最も興味深いことに、染色は、腫瘍壊死領域でより顕著である。さらに、担体および完全なコンジュゲート両方の存在は、腫瘍全体を通して観察され、特定の領域、例えば、主要血管近く、に限定されない。この後者の観察は、腫瘍組織全体にわたるペイロード－担体コンジュゲートの効率的な分布を示唆する。

【0403】

腫瘍組織中で観察された染色が実際に、特異的染色であり、かつ壊死領域のバックグラウンド染色ではないことを確認するために、同位体対照染色を、試験した全ての組織に対し実施し、全ての治療間で比較した。全ての試料でネガティブ染色が、アイソタイプ対照（抗ウサギＩＣウサギ（ＤＡ１Ｅ）ｍＡｂ ＩｇＧ ＸＰアイソタイプ対照＃３９００、正常ヤギＩｇＧ、ｓｉｇｍａ ＮＩ０２－１００ＵＧ）を使用した場合に観察された（データは示さず）。これは、特異的壊死領域染色を確証する。

【0404】

これらの切片での担体の検出が、修飾されないＨＳＡと交差反応しないＰＥＩ修飾されたＨＳＡに対して産生されたポリクローナル抗体を用いて実現されたことは、強調されるべきである。さらに、無水シトラコン酸によるＰＥＩ修飾されたＨＳＡのマスキングは実際に、マスク担体をこのポリクローナル抗体により検出できないようにする。従って、担体、ＰＥＩ修飾されたＨＳＡが、これらの腫瘍切片中で明確に検出されるという事実は、実際にマスキングが腫瘍微小環境で除去され、その暴露されたＰＥＩ修飾を用いて本発明の薬剤が細胞に侵入するのを可能にすることを示す。

【0405】

実施例１４：抗ＢＲＡＦ ＶＨＨのインビボ結果
マスクされた薬剤を使った細胞内送達のインビボ有効性をまた、第２のＶＨＨを用いて試験した。抗ＢＲＡＦ ＶＨＨ（１Ｃ５）を、マスクされたＨＳＡ（３．５ｘＰＥＩ）に非可逆的にコンジュゲートした。マウスに対する１Ｃ５－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－マスク－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５の毒性を、評価し、担体のみ（マスクされたＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５）の効果と比較した。２種の系統のマウス（Ｃ５７ＢＬおよびＮＯＤ－Ｓｃｉｄ）は、用量漸増ルーチンを受けた。試験薬剤を、注入当り２００μＬの薬剤投与で、静脈内注入した。用量漸増を、５０、１００、２５０、および３５０ｎｍｏｌ／Ｋｇの１日おき投与で開始し、続いて３回の３５０ｎｍｏｌ／Ｋｇの１日おきＶＩ注入、および最後に、毎日の５日間の３５０ｎｍｏｌ／ＫｇのＩＶ注入を実施した。マウスを、皮膚、毛皮、眼、粘膜、歩調、分泌排泄の発生、体重減少および全体的健康の変化などの病的状態または死亡の臨床徴候についてモニターした。臨床的徴候は、試験したマウスのいずれでも観察されなかった。加えて、用量漸増および反復投与の終わりに、全てのマウスは、ケタミン－キシラジンカクテル（ＩＰ）により終末麻酔を受けた。動物を、ＰＢＳ、続いて４％ＰＦＡを用いて、心臓経由灌流固定した。臓器（肝臓、心臓、腎臓、肺、脳、脾臓）を、採集し、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。病理学的変化は、２つの群の間で認められなかった。

【0406】

この評価で使用したペイロードは、非選択的抗ＢＲＡＦ剤であり、これは、ヒトおよびマウス両起源の野生型および変異されたＢＲＡＦの両方を阻害することが示された。発明者らは、本発明のペイロード－マスクされた担体コンジュゲートが、投与後に実質的に全ての臓器および組織にバイオ分布されたことを既に示した。従って、重要な細胞の酵素のこのような非選択的阻害剤が治療される動物に対して明らかな毒性効果を有しないことは、少々意外である。しかし、マスキングは、正電荷の効果を相殺し、従って、マスキング剤が除去されない限り細胞内送達を妨げることに留意されたい。マスキングはｐＨ感受性であるので、体内分布結果は、より多くのコンジュゲートが、正常で健康な臓器および組織より低いｐＨ環境により特徴づけられる腫瘍組織に到達したことを示した。コンジュゲートは全ての臓器および組織に到着するが、それはそこで、中性または中性よりわずかに高いｐＨ条件（生理学的ｐＨ）に遭遇し、従ってマスキングは比較的安定であり、コンジュゲートの内部移行およびその毒性のペイロードは抑制される、ということが従って、発明者らの仮説である。これらの動物は、接種された腫瘍を有しないので、コンジュゲートは、酸性の腫瘍微小環境に遭遇せず、細胞内部移行を示さなかった。たとえ、いくらかのマスキング除去が、健康な臓器および組織中で、小さい程度に生じたとしても、このような細胞に侵入する量は、極めて少なく、かつ無効であるように思われる。

【0407】

この点を更に調べるために、担体（マスクされたＨＳＡ^{ＰＥＩｘ３．５}）と比較して、腫瘍増殖を抑制する１Ｃ５－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－マスクされたＨＳＡ^{ＰＥＩｘ３．５}の能力を、両系統のマウスで評価した。Ｃ５７ＢＬマウスに、Ｂ１６腫瘍細胞（マウスメラノーマ）を皮下で注入し、ＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウスに、ＭＥＬ－５２６（ヒトＢＲＡＦ過剰発現メラノーマ細胞）を皮下で注入した。Ｃ５７ＢＬマウスでの試験を、腫瘍が十分に確立（１１５ｍｍ^３）されると実施し、一方でＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウスでの試験を、腫瘍が初期増殖段階（約６ｍｍ^３）にある間に実施した。これらのモデルは従って、癌を治療するならびに予防する能力を示す。両方の事例で、試験された薬剤、１Ｃ５－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－マスクされたＨＳＡ^{ＰＥＩｘ３．５}は、単なるペイロードのないマスクされたＨＳＡ^{ＰＥＩｘ３．５}に比較して、腫瘍増殖の抑制を示した（図３８Ａ～３８Ｂ）。１Ｃ５－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－マスクされたＨＳＡ^{ＰＥＩｘ３．５}（αＢＲＡＦ－Ｍ－担体）は、Ｂ１６の増殖に対しわずかな抑制効果を有した（図３８Ａ）。Ｂ１６腫瘍は極めて高悪性度であり、かつそれらの増殖速度は急速であったことに留意されたい。従って、このわずかな増殖抑制であっても依然として、腫瘍増殖に対するマスクされたコンジュゲートの大幅な機能的効果を示す。ＮＯＤ－Ｓｃｉｄマウスに接種されたＭＥＬ－５２６腫瘍の場合、マスクされたコンジュゲートは、腫瘍に対するより有意な抑制効果を有し、測定の最後で４７％の腫瘍体積の減少を示した（図３８Ｂ）。

【0408】

このデータは更に、腫瘍中などの酸性環境下でのマスキングの選択的除去を示した。非特異的抗ＢＲＡＦ ＶＨＨは、健康なマウスに対して測定可能な効果を有しなかったが、酸性ＴＭＥに対する曝露により、抗腫瘍効果をもたらした。これは、作用部位特異性および非選択的ペイロードの使用を可能にし、これらの低ｐＨ環境で見出される細胞に対してのみ、細胞傷害性または生物学的効果を付与する。さらに、これは、本発明のコンジュゲートは全ての臓器および組織に到達するが、それらは実際に、これらの臓器および組織の細胞中に侵入しないことを示唆する。ペイロードは細胞内標的に向けられるので、健康な組織中のこれらのコンジュゲートによる作用は示されず、オフターゲット効果のリスクを大きく低減する。

【0409】

実施例１５：αＥ７ ＶＨＨペイロードを有する異なる構築物のＰＫおよび体内分布
異なるマスクされた構築物の薬物動態プロファイルおよび体内分布を、Ｂ１６腫瘍を接種したマウスで評価した。全ての構築物は、ペイロードとして抗Ｅ７ ＶＨＨ（ＭＡＬ構築物におけるような１回反復またはＰＥＰ構築物におけるような３回反復のＧ_４ＳＣリンカーを有する）を保有した。このＶＨＨを、３．５または８個のＰＥＩで修飾された担体にコンジュゲートし、一過性マスキング剤である、無水シトラコン酸（ＣＡ）でマスクした。ＶＨＨを、可逆的なジスルフィド結合、またはマレイミド化学を利用する非可逆的結合を介して、これらの担体にコンジュゲートした。抗Ｅ７ ＶＨＨをまた、非可逆的なマスキング剤である、メチル無水コハク酸（ＭＳＡ）（これは、その構造において無水シトラコン酸に類似しているが、二重結合を欠く）で事前にマスクした８ＰＥＩで修飾した担体に非可逆的にコンジュゲートした。

【0410】

Ｂ１６腫瘍担持Ｃ５７ＢＬマウスを用いて、上記薬剤の体内分布および薬物動態プロファイルを評価した。腫瘍が１０５ｍｍ^３の平均体積に発達すると、マウスは、２５０ｎｍｏｌ／Ｋｇで種々の薬剤の単回ＩＶ注入を受けた。血漿および臓器試料を、投与後の５および３０分、ならびに２、６、２４、４８、および７２時間に採取した。血漿および臓器の両方での構築物の分析を、ＶＨＨのための自社製のＥＬＩＳＡを用いて、ペイロード単独に対して実施した。図３９は、接種された動物中の異なる構築物の薬物動態プロファイルを示す。表５は、各構築物の薬物動態学的パラメーターを要約する。

【表5】

【0411】

薬物動態プロファイルおよびパラメーターは、異なる構築物間で極めて類似している。これはおそらく、最終構築物の類似のｐＩおよびそれらの実質的に同一のサイズの結果であろう。重要なことに、マスキングの効果は、ＰＥＩ修飾のレベルに関わらず、実質的に同じであるである。同様に、異なるリンカーは、何らの効果もないように見える。ＭＳＡでマスクされた構築物は実際に、幾分より長い血漿中滞留時間およびより低いクリアランスを示し、これはおそらく、そのマスキングが除去されず、従って細胞中へのその取り込みが最小であるか、ないしは存在しないという事実によるということに留意されたい。それは、従って、血漿中により高いレベルで残存する。

【0412】

腫瘍を含む異なる臓器を、採取し、ＶＨＨのレベルを、適切な自社製ＶＨＨ ＥＬＩＳＡにより分析した。図４０は、異なるコンジュゲートの臓器曝露を要約する。これらの体内分布データは、コンジュゲート間で劇的な差異を示さない。可逆的リンカーコンジュゲートについての腎臓曝露データは、材料が遊離ＶＨＨの混入を含んだので、過剰推定であることに留意されたい。この遊離ＶＨＨは腎臓を通して速やかに循環から排出されるが、この臓器での初期測定は、この遊離ＶＨＨを測定し、全体ＡＵＣ分析に影響する。いずれの場合でも、他の臓器に比べて、腫瘍中のペイロードの濃縮があることを認めることができる。これは、担体単独で観察された濃縮と一致する。

【0413】

薬物動態学および体内分布データは、ＰＥＩレベルおよびリンカーの可逆性の異なる、異なるマスクされたコンジュゲート間で劇的な差異を示さない一方で、ＥＬＩＳＡは、組織／腫瘍中に存在する薬剤の総量のみを示すが、外部のペイロードと細胞内部移行したペイロードを区別できない。この目的のために、上記の蛍光標識された担体分子を、インビボで試験した。ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}ＣＡおよびＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}ＭＳＡを、ＨｅＬａ－ＧＰＦ腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスＦｏｘｎ１ｎｕマウスに注入した。異なる担体を、２００μＬ中の１８０ｎｍｏｌ／Ｋｇの投与量で注入し、６時間後、腫瘍を採取し、異なる担体の分布を、共焦点顕微鏡で評価した。図４１Ａで見られるように、蛍光標識されたＣＡマスクされた担体（ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}ＣＡ）は、腫瘍細胞の内側で明確に検出された（腫瘍細胞は、ＧＦＰ蛍光により特定された）。実際に、担体は、細胞の核を覆っているように見え、それが、これらの細胞の細胞質中に分散されていることを示している。対照的に、蛍光標識されたＭＳＡマスクされた担体（ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ８}ＭＳＡ）は、細胞の外側および細胞間でのみ検出され、それらの細胞質中では検出されなかった（図４１Ｂ、矢印は、赤く染色されない、腫瘍細胞周辺の細胞質を示す）。担体は永久的マスキングを有して腫瘍細胞中に効率的に侵入できないので、一過性マスキングの有効性が、明確に示される。類似の結果が、ＣＡマスクされたコンジュゲート（図４１Ｃ）、ＭＳＡマスクされたコンジュゲート（図４１Ｄ）およびマスクされないコンジュゲート（図４２Ｅ）で治療されたマウスのＢ１６腫瘍でも観察された。腫瘍細胞は、この腫瘍中で蛍光を発しなかったが、コンジュゲートは、一過性マスキングを用いた場合のみ細胞に有意に侵入し、永久的マスキングでは、侵入しなかったことは明らかである。さらに、マスキングは、腫瘍に到達したコンジュゲートの量を明確に濃縮した。

【0414】

さらに図４２Ａ～４２Ｂで見られるように、ＭＳＡマスクされた担体は、腫瘍細胞中で実質的に検出されない。腫瘍細胞は、それらの核の二重染色（緑と青）により特徴づけられる。しかし、担体は、非腫瘍マウス細胞（単一青色核染色を特徴とする）を含む領域でのみ容易に検出できる。それらの形状および形態に基づき、これらの細胞は、血管の内皮細胞である。このことは、このマスキングの非一過的な特性のため、負に荷電されたマスクされた担体は、内皮バリアーを効率的に横断し腫瘍組織中および腫瘍細胞中に分布できないことを示唆している。非腫瘍組織、すなわち酸性の微小環境のない組織（例えば、肝臓）を検査した場合、コンジュゲートの局在化は、それが細胞に侵入できず主に細胞間に局在化されるという点で、２種のマスキング剤間で類似していた（図４２Ｃ～４２Ｄ）。まとめると、このデータは、一過的にマスクされた担体およびコンジュゲートの薬物動態学および体内分布プロファイルは、対応する非一過的マスクコンジュゲートのプロファイルに極めて類似しているが、健康な細胞への曝露を回避している間の、腫瘍組織中のそれらの分布およびそれらの腫瘍標的細胞中への内部移行能力において劇的な差異が存在することを明確に示す。これらの差異は、細胞の内部または外部にある部分を識別できない、ＥＬＩＳＡなどの検出ツールを用いることにより確認できない。

【0415】

実施例１６：完全マスキング
今まで、担体それ自体に対するマスキングのみを試験してきた。活性の選択性をさらに増強するために、ペイロードを含む全コンジュゲートのマスキングを、試験した。このようなマスキングは、このマスキングが作用部位近傍で除去されるまで、またはエンドソーム中でのさらなるマスキング除去後に細胞其れ自体への内部移行のちょうど後まで、ペイロードの活性を低下または完全に阻害する可能性があり、したがってオフターゲット効果を回避する。全コンジュゲートのマスキングはまた、種々のプロセスに関連した利点も有し得る。このために、１Ｃ５－Ｓ－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－Ｓ－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５および１Ｃ５－Ｓ－Ｍａｌ－ＰＥＧ_１１－Ｍａｌ－Ｓ－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８を、マスキングステップで用いられる過剰の無水シトラコン酸（ＣＡ）により制御される、異なるマスキングレベルでマスクした。得られたマスキングレベルを、ＩＥＦおよびゼータ電位測定により評価した。さらに、薬剤にコンジュゲートされたマスキング部分の数もまた、ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ質量分析により分析しおよび定量化した。対応するＩＥＦゲル（データは示さず）で裏付けられた、下表６で見られるように、全コンジュゲートのマスキングはまた、ＰＥＩ修飾を相殺でき、かつ負電荷を生じることができ、従ってこれらのコンジュゲートのゼータ電位を低下させる。

【表6】

【0416】

担体だけのマスキングでのように、完コンジュゲートのマスキングは、３７℃でクエン酸緩衝液とｐＨ４にてインキュベーションすることにより、インビトロで除去できる。８時間後、完全なマスキング除去が、担体上のＰＥＩレベルに関係なく達成された（ＩＥＦ結果は示されない）。

【0417】

マスクされたペイロードの活性を、マスキング除去後に更に試験した。このために、ＢＲＡＦへの結合ＥＬＩＳＡを、マスキング除去後に抗ＢＲＡＦペイロード（１Ｃ５）に対し実施した。このアッセイでは、担体（ＨＳＡ－ＰＥＩ）の存在は、おそらくＥＬＩＳＡプレートへの高度に正に荷電されたタンパク質の粘着性のため、高い無関係シグナルを与えることが観察された。従って、この場合のみに、ペイロード、１Ｃ５－Ｈｅｌ－ＬＣを、使用し、無水シトラコン酸でマスクした（ペイロード中の陽性リジン残基を介するマスキング）。マスクされたペイロードを、マスキング除去の前後で、ＢＲＡＦを結合するその能力について試験し、抗ＢＲＡＦ ＶＨＨの結合能力は、マスキング後に実質的に消失された（図４３Ａ）。しかし、マスキング除去は、結合を完全に回復した。加えて、マスキングおよびマスキング除去の後のペイロード電荷の変化を、ＩＥＦにより（データは示さず）およびゼータ電位により（表６）により評価し、そのマスキング後のペイロードのゼータ電位の低下を明確に見ることができ、これは、使用した過剰のマスキング剤と関連する。さらに、酸性条件は、ペイロードのゼータ電位がその元の値に回復するので、マスキングを完全に除去したことを、明確に見ることができる。

【0418】

担体のみがマスクされたコンジュゲート（図３０Ａ～３０Ｂ）と同様に、完全にマスクされたコンジュゲートもまた、マスキング除去後に、それらのインビトロ細胞傷害活性を回復すると示された。図４３Ｂで見られるように、剛性のヘリカルリンカーと共に発現され３．５ＰＥＩを有する担体に更にコンジュゲートされた１Ｃ５ペイロードは、マスキング除去後に、その活性を回復した。さらに、完全マスクされた１Ｃ５－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５および完全マスクされた１Ｃ５－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ８は、ＭＥＬ－５２６細胞に対し影響を有しない。これらのコンジュゲートは、インビトロマスキング除去後に、それらの活性（全くマスクされなかった１Ｃ５のコンジュゲートと同等の活性）を回復した（図４３Ｂ、ＰＥＩｘ３．５のデータは示していない）。

【0419】

実施例１７：部分的マスキング
内部移行を妨げるマスキングのレベル、または、言い換えれば、内部移行に必要とされる正電荷のレベルを特定するために、ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５を、適切な蛍光染料（ＡＴＴＯ５４２またはＡＴＴＯ６４７Ｎ）で標識し、標識されたタンパク質をその後、異なるモル当量で非可逆的なマスキング剤、メチル無水コハク酸（ＭＳＡ）でマスクして、様々な異なるレベルのマスキングを有する担体を得た。各タンパク質についてのマスキングのレベルを、ＩＥＦおよびゼータ電位により評価した。細胞中に内部移行する異なるマスキングレベルで標識された担体の能力を、Ａ３７５細胞との１６時間インキュベーションにより、続いてフローサイトメトリーによる蛍光シグナルを有する細胞の検出により評価した。蛍光標識を、ＨＳＡの位置３４の遊離システイン上の修飾に向けられたマレイミド部分を有する２．５モル過剰のＡＴＴＯ－５４２（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ、カタログ番号ＡＤ５４２）を用いてＨＳＡ^{ＰＥＩｘ３．５}に対し、またはマレイミド部分を有する５モル過剰のＡＴＴＯ－６４７Ｎ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ、カタログ番号ＡＤ６４７－４１）を用いてＨＳＡ^{ＰＥＩｘ３．５}に対して実施した。このアッセイのために、可逆的マスキング（無水シトラコン酸による）ではなく、非可逆的マスキングを使用して、内部移行アッセイ中のマスキング除去の可能性を回避した。ＩＥＦ分析は、ｐＩと、マスキング反応に使用したＭＳＡ試薬のレベルの間の強い相関を示した（データは示さず）。ＡＴＴＯ５４２の結果を、表７に要約する。

【表7】

【0420】

ゼータ電位測定を、ＡＴＴＯ６４７Ｎ標識構築物（マスクされないおよび種々のモル過剰のＭＳＡでマスクされた）に対し実施し、類似の結果を生じ、最大で６０モル過剰のＭＳＡは正のゼータ電位を示し、および８０モル以上（最大で２００モル当量）の過剰のＭＳＡは負のゼータ電位を示した。

【0421】

Ａ３７５細胞（ウェル当り０．５ｘ１０^６）を、１２時間播種し、その後２０（または５０）ｎｇの標識された担体（ＨＳＡ^{ＰＥＩｘ３．５}ＡＴＴＯ６４７Ｎ）を、ウェルに加えた。試料を、１６時間インキュベートした。取込み期間の終わりに、上部培地を、洗い流し、細胞を、プレートから剥離させ、冷却したＰＢＳで洗浄した。細胞中に内部移行された担体の量を、同位体対照試料と比較して、フローサイトメトリーでのＡＴＴＯ６４７Ｎ検出により評価した。内部移行は、マスキングレベルの増大に応じて減少した（図４４）。さらに、マスキングなしのＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５で達成された少なくとも２０％の内部移行と同等の内部移行レベルが、６０モル過剰以下のＭＳＡが反応で使用された場合に達成された。全てのこれらの試料は、ゼータ電位分析で正の値を与え、一方で負の値を有する試料は、１０％の内部移行でさえも示さなかった。従って、ゼロ未満のゼータ電位が、機能的なマスキングのために必要とされる。無水シトラコン酸マスキングはコンジュゲートに負電荷を導入するという事実に基づき、アミン基（例えば、ＰＥＩのアミン基）の約５０％以上がマスクされる必要があることが推定される。従って、発明者らは、本発明のタンパク質コンジュゲート中（例えば、細胞浸透性部分内）の保護されないアミンに対する保護されたアミンのモル比は、少なくとも約７：１０、少なくとも約１：１であり、または約１：１～１００：１（これらの間の任意の範囲を含む）などの、過剰の保護アミンを含むと推定した。

【0422】

実施例１８：腫瘍標的化－抗ＰＳＭＡ
マスキングは、酸性の標的領域でコンジュゲートの濃縮をもたらすが、追加の標的化が有益な場合がある。この目的のために、発明者らは、追加のターゲティング部分の使用を調査した。これは、標的細胞上の細胞外マーカーを結合するその能力で選択される任意のタンパク質ドメイン、または抗体様構造であり得る。第２のＶＨＨを、ターゲティング部分として選択し、細胞内標的を標的にするペイロードＶＨＨと直列に発現させた。マスキングは、それが強力な静電気的結合を除去するのでターゲティング部分の使用を可能にし、かつマスクされたコンジュゲートが血漿および臓器を動き回ってターゲティング部分の標的を見つけることを可能にする。

【0423】

ＪＶＺ－００７として知られる前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を、ターゲティング部分として選択した。ＰＳＭＡは、前立腺癌細胞上に提示されることが知られており、かつ前立腺腫瘍へと種々の造影剤を向けるために広範に使用されてきた。直列型薬剤を、ＪＶＺ－００７および抗ＢＲＡＦ、１Ｃ５、ＶＨＨを含んで生成した。２種の直列に発現された薬剤を、生成し、１種はＮ末端でおよび１種はＣ末端で発現される抗ＰＳＭＡ ＶＨＨを有し、、それぞれ、αＰＳＭＡ（ＪＶＺ－００７）－Ｈｅｌ－αＢＲＡＦ（１Ｃ５）－Ｈｅｌ－Ｌ－ＣｙｓおよびαＢＲＡＦ（１Ｃ５）－Ｈｅｌ－αＰＳＭＡ（ＪＶＺ－００７）－Ｈｅｌ－Ｌ－Ｃｙｓを作成する。Ｃ末端システインを有する両方の末端は、担体へのコンジュゲーションを可能にする。

【0424】

ＰＳＭＡ陽性細胞（ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ、前立腺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１７４０）への２種の構築物の結合（担体へのコンジュゲーションの前）を、ＦＡＣＳにより評価し、ＰＳＭＡ陰性細胞（ＰＣ－３、前立腺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１４３５）へのこれらの構築物の結合と比較した。これらの細胞への活性なＶＨＨ、１Ｃ５、単独の結合もまた、評価した。

【0425】

予想通り、抗ＰＳＭＡ ＶＨＨは、ＰＳＭＡ陽性細胞を強力に結合し、ＰＳＭＡ陰性細胞の結合を示さない。興味深いことに、抗ＢＲＡＦ ＶＨＨと直列で発現された抗ＰＳＭＡ ＶＨＨを含む両方の薬剤はまた、ＰＳＭＡ陽性細胞に対する極めて強力な結合を示し、ＰＳＭＡ陰性細胞に対する結合を示さない（図４５Ａ）。両方の構築物は、ＰＳＭＡ陽性細胞に対し同じレベルの結合を示した。また予測される通り、抗ＢＲＡＦ １Ｃ５ ＶＨＨは、ＰＳＭＡ陰性または陽性細胞への結合を示さない。これらの結果は、ターゲティング部分の別の活性部分との直列型発現は、その標的を認識し結合するターゲティング部分の能力に悪影響を与えないことを示す。

【0426】

記載された薬剤を、本発明のマスク担体に更にコンジュゲートし、ＰＳＭＡ陽性細胞へのそれらの結合を、以前と同様にＦＡＣＳにより評価した。コンジュゲート（ＪＶＺ－１Ｃ５－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５－ＣＡ）を含む抗ＰＳＭＡは、ＰＳＭＡ陽性細胞（ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞）の結合を示し、陰性細胞（ＭＥＬ－５２６メラノーマ癌細胞）の結合を示さなかった（図４５Ｂ）。これは、マスクされた担体へのコンジュゲーションは、標的への結合を阻害しないことを示す。コンジュゲートされたペイロードと同等にＰＳＭＡ陽性細胞に結合された、コンジュゲートされないペイロード、ＪＶＺ－１Ｃ５は、担体がターゲティング部分の結合に影響しなかったことを示す。コンジュゲート（１Ｃ５－ＪＶＺ－ＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５－ＣＡ）を含む他の抗ＰＳＭＡもまた、ＬＮＣａＰ細胞の結合を示し、ＰＳＭＡ陰性細胞の結合を示さなかった（データは示さず）。試験した薬剤のいずれも、ＰＳＭＡ陰性であるＰＣ３前立腺癌細胞への結合を示さなかった（データは示さず）。

【0427】

抗ＢＲＡＦ部分と直列で抗ＰＳＭＡ部分を発現することは、ＰＳＭＡを結合するその能力を妨害しないことを示したので、抗ＢＲＡＦ部分を介してＢＲＡＦを依然として認識し結合する直列型構造の能力を試験した。これを、組換え型ＢＲＡＦ結合ＥＬＩＳＡにより実施した。図４６で見られるように、結合は親抗ＢＲＡＦ ＶＨＨ単独と比較して若干弱められるが、抗ＢＲＡＦおよび抗ＰＳＭＡ部分を直列に発現する両方の構築物は、ＢＲＡＦを結合するそれらの能力を維持した。

【0428】

次に、細胞内のＢＲＡＦを阻害し細胞死滅を引き起こすマスクされない担体を有する直列型構築物の能力を、評価した。ターゲティング部分を有して発現された抗ＢＲＡＦ薬剤の細胞傷害活性を、２種の異なる細胞株、ＭＥＬ－５２６（ＰＳＭＡ陰性）およびＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ陽性）で評価した。両方の細胞株で、直列型薬剤は、細胞傷害性を示し、表面部分への結合に関係なく構築物が内部移行され、エンドソームを脱出し、ＢＲＡＦを調節できることを示した（図４７）。この細胞傷害性は、同じ担体にコンジュゲートされた抗ＢＲＡＦ ＶＨＨ単独で示されたものと類似の大きさであった。これらの結果は、送達薬剤として機能するターゲティング部分および活性部分の両方を組み込むこれらの薬剤の潜在力を示す。

【0429】

直列で発現された抗ＰＳＭＡ－抗ＢＲＡＦ（ＪＶＺ－１Ｃ５）を、マスクされた担体に更にコンジュゲートし、そのインビボ体内分布を、評価する。無胸腺ヌードＦｏｘｎ１ｎｕマウスに、ＰＳＭＡ陽性癌細胞（例えば、ＬＮＣａＰ腫瘍細胞）を注入する。細胞を、１０^７細胞／１００μＬで、または腫瘍開始をもたらす適切な量で皮下に注入する。マウスに、２００μＬ中の２５０ｎｍｏｌ／Ｋｇの投与量で１Ｃ５－マスクＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５またはＪＶＺ－１Ｃ５－マスクＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５を注入する。臓器および腫瘍を、注入からの異なる時点（例えば、２、２４、および４８時間後）で採取し、腫瘍中および他の臓器中のコンジュゲートの量を、評価する。ＥＬＩＳＡ（例えば、抗ＶＨＨ ＥＬＩＳＡ）を用いて、存在する本発明の総ペイロードを評価する。画像化をまた、上述のように実施し、腫瘍内および腫瘍細胞内の分布を、評価する。２セットの治療されたマウスの総腫瘍重量腿もまた、モニターする。腫瘍へのおよび腫瘍細胞中への増大した送達が、送達部分が腫瘍への標的化を増大させるに伴い、直列型ＪＶＺ－１Ｃ５－マスクＨＳＡ－ＰＥＩｘ３．５薬剤で観察される。腫瘍での増大はまた、他の健康な組織での付随する減少につながる。腫瘍量の減少により測定される、腫瘍細胞死滅の増大もまた、ターゲティング部分を含む直列型分子で観察される。

【0430】

本発明はその特定の実施形態と共に説明されてきたが、多くの代替物、修正物および変形物があることは当業者には明らかであろう。従って、本発明は、添付の請求項の範囲の趣旨と広い範囲に入るこのような代替物、修正物および変形物のすべてを包含することが意図される。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図28D】

【図28E】

【図28F】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図29D】

【図29E】

【図29F】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36A】

【図36B】

【図36C】

【図36D】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41A】

【図41B】

【図41C】

【図41D】

【図41E】

【図42A】

【図42B】

【図42C】

【図42D】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-07-04

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロードを含むタンパク質コンジュゲートであって、前記生物学的ペイロードは、複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合され、前記アミン基の少なくとも一部は、保護基に結合されかつ前記保護基は、７未満のｐＨ値で切断を受けることができ；かつ負のゼータ電位により特徴づけられる、タンパク質コンジュゲート。

【請求項2】

ａ．複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合されるタンパク質担体；
ｂ．細胞内標的と相互作用する生物学的ペイロード；および
ｃ．前記タンパク質担体と前記生物学的ペイロードの間のリンカー、
を含む、タンパク質コンジュゲートであって、
前記アミン基の少なくとも一部は、保護基に結合され；
前記保護基は、７未満のｐＨ値で切断を受けることができ；
および負のゼータ電位により特徴づけられる、タンパク質コンジュゲート。

【請求項3】

前記保護基を欠く類似のタンパク質コンジュゲートに比べて高められた血液中安定性、または前記保護基を欠く類似のタンパク質コンジュゲートに比べて、７未満のｐＨ値を有する生体組織内での増大した蓄積により特徴づけられ、任意に前記生体組織は、腫瘍である、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項4】

前記複数のアミン基は、一級アミン、二級アミン、または両方を含み；かつ複数のアミン基の少なくとも５０％は、前記保護基に結合される、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項5】

前記リンカーは、共有結合により前記担体、前記ペイロードまたは両方に連結される、請求項２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項6】

前記保護基は、６～８の間のｐＨで負に荷電される部分を含む、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項7】

前記部分は、カルボキシ基を含む、請求項６に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項8】

前記保護基は、式１：

【化1】

、により表され、式中、ｎは、０～５の範囲の整数であり；

【化2】

は、前記アミン基への付着点を表し、および

【化3】

は、単結合または二重結合を表し；ＲおよびＲ_１はそれぞれ独立に、Ｈ、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるシクロアルキル、任意に置換されるアリールまたはヘテロアリール、およびカルボキシアルキル、またはこれらの組み合わせから選択される置換基を表し；またはＲおよびＲ_１は、環を形成するように一緒に結合される、請求項６または７に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項9】

ＲおよびＲ_１の１個は、ＨでありかつＲおよびＲ_１の別の１個は、アルキルまたはカルボキシアルキルを含む、請求項８に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項10】

前記保護基は、

【化4】

であって、その任意の塩を含み、ＲおよびＲ_１は、Ｈおよびメチルから選択され、かつＲまたはＲ_１は、メチルであり、任意に前記保護基は、無水シトラコン酸由来である、請求項６または７に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項11】

前記細胞浸透性部分は、ポリアミンおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）から選択される陽イオンポリマーを含む、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項12】

前記ＰＥＩは、直鎖ＰＥＩ、２０００ダルトン未満の分子量を有する分岐ＰＥＩ、または１００～１０００ダルトンの分子量を含むＰＥＩである、請求項１１に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項13】

ａ．前記生物学的ペイロードは、前記細胞内標的を結合する抗原結合分子である、
ｂ．前記生物学的ペイロードは、切断されると前記細胞内標的との相互作用を減らすジスルフィド結合を欠く、ならびに
ｃ．前記抗原結合分子は、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、可変重鎖ホモダイマー（ＶＨＨ）、ナノボディ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）および抗体ミメティックタンパク質から選択される、
の少なくとも１つである、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項14】

前記タンパク質担体または生物学的ペイロードは、複数のＰＥＩ分子を含み、任意に前記タンパク質担体は、２～３０個のＰＥＩ分子を含む、請求項２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項15】

前記タンパク質担体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、任意に前記ＨＳＡは、３～１０個のＰＥＩ分子を含む、請求項２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項16】

前記リンカーは、生体適合性ポリマー、生分解性ポリマーまたは両方を含む、請求項２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項17】

前記生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、任意に前記生分解性ポリマーは、ポリアミノ酸を含み、前記リンカーは、（ｉ）前記生体適合性ポリマーまたは前記生分解性ポリマーにおよび（ｉｉ）前記タンパク質担体に共有結合されるスペーサーを更に含み、かつ共有結合は、クリック反応生成物を介する、請求項１６に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項18】

前記リンカーは、生体切断可能な結合を含み、任意に前記生体切断可能な結合は、ジスルフィド結合を含む、請求項２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項19】

前記リンカーは、少なくとも２４時間にわたり血液中で実質的に安定であり、かつ前記リンカーは、ペプチドリンカーであり、任意に安定は、２４時間後に血液中で２５％未満の切断を含む、請求項２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項20】

前記生体切断可能な結合は、立体的に障害される、請求項１８または１９に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項21】

前記ＨＳＡは、配列番号１のアミノ酸配列、またはシステイン３４（Ｃ３４）を含むそのフラグメントまたは相同体を含む、請求項１５～１９のいずれか１項に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項22】

前記リンカーは、ジスルフィド結合を介して前記ＨＳＡに結合され、任意に前記リンカーは、ＨＳＡの前記Ｃ３４に結合される、請求項２１に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項23】

前記ジスルフィド結合は、前記Ｃ３４の近位にあり、近位は、５～１５オングストロームの範囲の前記Ｃ３４からの距離である、請求項２２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項24】

前記タンパク質担体は、ＤＮＡを欠く、または前記生物学的ペイロードは、細胞表面タンパク質を結合しない、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項25】

前記タンパク質コンジュゲートは、－１ｍＶ未満の負のゼータ電位により特徴づけられる、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項26】

検出可能なタグを更に含み、任意に前記タグは、前記生物学的ペイロードにコンジュゲートされる、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項27】

前記タンパク質コンジュゲートは、細胞浸透性コンジュゲートである、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項28】

前記保護基は、無水シトラコン酸由来であり、任意にクリック反応生成物は、スクシンイミドチオエーテルである、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項29】

標的細胞の表面上で発現されるタンパク質に結合するターゲティング部分を更に含む、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項30】

ａ．前記ターゲティング部分は、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、可変重鎖ホモダイマー（ＶＨＨ）、ナノボディ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）および抗体ミメティックタンパク質から選択される、
ｂ．前記ターゲティング部分は、リンカーを介して前記タンパク質担体にコンジュゲートされる、ならびに
ｃ．前記ターゲティング部分および前記生物学的ペイロードは、単一ポリペプチドに含まれ、任意に前記ターゲッティング部分および前記生物学的ペイロードは、リンカーにより分離される、
の少なくとも１つである、請求項２９に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項31】

細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する方法であって、
ａ．前記細胞内標的を結合する生物学的ペイロードを提供することであって、前記生物学的ペイロードは、複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合される、提供すること；および
ｂ．保護アミン基を含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを得るために、７未満のｐＨ値で切断を受けることができる保護基により前記アミン基の少なくとも一部を保護するのに十分な条件下で生物学的ペイロードを提供すること、
を含み、それにより細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する、方法。

【請求項32】

細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する方法であって、
ａ．前記細胞内標的に結合する生物学的ペイロードを提供すること；
ｂ．複数のアミン基を含む細胞浸透性部分に共有結合されたタンパク質担体を提供すること；
ｃ．タンパク質コンジュゲートを産生するためにリンカーを介して前記タンパク質担体に前記生物学的ペイロードを共有結合させるのに十分な条件下で前記生物学的ペイロードおよび前記タンパク質担体を提供すること；および
ｄ．保護アミン基を含む前記電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを得るために、７未満のｐＨ値で切断を受けることができる保護基により前記アミン基の少なくとも一部を保護するのに十分な条件下で前記タンパク質担体を提供すること、
を含み、
それにより細胞内標的を結合できる電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを産生する、方法。

【請求項33】

ヒト血液、血漿または血清中でおよび細胞質条件中で前記リンカーの安定性を決定すること；およびヒト血液、血漿または血清中で安定でありかつ前記細胞質条件中で不安定であるリンカーを含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを選択することを更に含み、任意に安定は、２４時間後に血液中で２５％未満の切断を含み、不安定は、２４時間後に前記細胞質条件中で少なくとも５０％の切断を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

中性または塩基性ｐＨでおよび酸性ｐＨで前記保護アミン基の安定性を決定することおよび中性または塩基性ｐＨで安定でありかつ酸性ｐＨで不安定である保護されたアミン基を含む電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを選択することを更に含む、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項35】

保護するために十分な条件下で前記タンパク質担体を前記提供することは、前記タンパク質担体へ前記生物学的ペイロードを前記結合することの前にまたは前記タンパク質担体へ前記生物学的ペイロードを前記結合することの後に起こる、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項36】

前記決定することは、前記タンパク質コンジュゲートの形成の前にまたは前記電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートの形成の後で実施される、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

前記タンパク質担体は、ＨＳＡを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項38】

前記細胞浸透性部分は、少なくとも１個のＰＥＩを含む、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項39】

前記電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、負のゼータ電位により特徴づけられる、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項40】

前記複数のアミン基は、一級アミン、二級アミン、または両方を含み；かつ前記複数のアミン基の少なくとも８０％は、保護されたアミン基である、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項41】

前記保護基は、６～８の間のｐＨで負に荷電される部分を含み、任意に前記部分は、カルボキシ基を含む、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項42】

前記タンパク質担体または生物学的ペイロードは、少なくとも２分子のＰＥＩに共有結合され、任意に前記タンパク質担体は、少なくとも８分子のＰＥＩに共有結合される、または前記生物学的ペイロードは、切断されると前記細胞内標的への結合を減らすジスルフィド結合を欠く、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項43】

前記電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートを細胞と接触させることおよび前記生物学的ペイロードが前記細胞の細胞質に侵入することを確認することを更に含む、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項44】

前記リンカーは、生体適合性ポリマーまたは生体切断可能な結合を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項45】

前記共有的に連結することは、クリック反応を介する、またはジスルフィド結合形成を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項46】

前記生物学的ペイロードは、第１の反応基を含むリンカーに共有結合され；かつ前記タンパク質担体は、前記第１の反応基に対し反応性を有する第２の反応基を含むリンカーに共有結合され；かつタンパク質担体に前記生物学的ペイロードを共有結合させるために十分な前記条件は、前記第１の反応基を前記第２の反応基と反応させることを含み、それにより前記生物学的製剤および前記タンパク質担体を共有的に連結する、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項47】

（ｉ）前記生物学的ペイロードは、前記タンパク質担体のシステインとジスルフィド結合を生成できるリンカーに共有結合される；または（ｉｉ）前記タンパク質担体は、前記生物学的ペイロードのシステインとジスルフィド結合を生成できるリンカーに共有結合され、かつ結合されるは任意に、ジスルフィド結合を介する、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

標的細胞の表面上で発現されるタンパク質に結合するターゲティング部分を選択することおよび前記生物学的ペイロード、前記タンパク質担体または前記タンパク質コンジュゲートに前記ターゲティング部分をコンジュゲートすることを更に含む、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項49】

ａ．前記ターゲティング部分は、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、可変重鎖ホモダイマー（ＶＨＨ）、ナノボディ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）および抗体ミメティックタンパク質から選択される、ならびに
ｂ．前記ターゲティング部分および前記生物学的ペイロードは、単一ポリペプチドに含まれ、任意に前記ターゲティング部分および前記生物学的ペイロードは、リンカーにより分離される、
の少なくとも１つである、請求項４８に記載のタンパク質コンジュゲート。

【請求項50】

前記電荷マスクされたタンパク質コンジュゲートは、請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲートである、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項51】

請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲートおよび薬学的に許容可能な担体、賦形剤または補助剤を含む、医薬組成物。

【請求項52】

全身投与用に処方される、請求項５１に記載の医薬組成物。

【請求項53】

前記組成物は、徐放性組成物でありかつ投与後少なくとも２～３日間にわたり標的細胞の細胞質中に前記生物学的ペイロードを放出する、請求項５１に記載の医薬組成物。

【請求項54】

細胞内標的を結合するインビトロの方法であって、前記細胞内標的を発現する細胞を請求項１または２に記載のタンパク質コンジュゲートまたは請求項５１に記載の医薬組成物と接触させることを含み、前記生物学的ペイロードは、前記細胞内標的を結合し、それにより前記細胞内標的を結合する、方法。

【請求項55】

ａ．細胞内標的を検出する方法でありかつ前記タンパク質コンジュゲートは、検出可能なタグを含み、かつ前記検出可能なタグを検出することを更に含む、
ｂ．前記細胞内標的を調節する方法でありかつ前記生物学的ペイロードは、前記細胞内標的の作動薬または拮抗薬である、ならびに
ｃ．前記細胞は、標的表面タンパク質を発現しかつ前記タンパク質コンジュゲートは、前記標的表面タンパク質に結合するターゲティング部分を含む、
の少なくとも１つである、請求項５４に記載の方法。

【国際調査報告】