特表 2024-539416 特にＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染を治療するための医薬組成物、薬物としてのその使用及び新規化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】特にＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染を治療するための医薬組成物、薬物としてのその使用及び新規化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 401/14 20060101AFI20241018BHJP

   A61K 31/4439 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/02 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/28 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 9/70 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20241018BHJP

【ＦＩ】

C07D401/14 CSP

A61K31/4439

A61P11/00

A61P31/14

A61P43/00 111

A61K9/08

A61K9/06

A61K9/02

A61K9/107

A61K9/12

A61K9/10

A61K9/14

A61K9/16

A61K9/20

A61K9/28

A61K9/48

A61K9/70

A61K9/70 401

A61K47/42

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024527201

(86)(22)【出願日】2022-11-03

(85)【翻訳文提出日】2024-05-28

(86)【国際出願番号】 EP2022080737

(87)【国際公開番号】W WO2023079033

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】21306547.7

(32)【優先日】2021-11-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】22305727.4

(32)【優先日】2022-05-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】506424209

【氏名又は名称】ユニベルシテ ドゥ ボルドー

(71)【出願人】

【識別番号】504007888

【氏名又は名称】センター ナショナル デ ラ レシェルシェ サイエンティフィーク

(71)【出願人】

【識別番号】523405465

【氏名又は名称】アンスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル

(71)【出願人】

【識別番号】520053762

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ

(71)【出願人】

【識別番号】524171806

【氏名又は名称】ユニベルシテ ド オルレアン

(71)【出願人】

【識別番号】521328847

【氏名又は名称】エコール ノルマル シュペリウール パリ－サクレー

(71)【出願人】

【識別番号】520018392

【氏名又は名称】ユニベルシテ パリ－サクレー

(71)【出願人】

【識別番号】524171817

【氏名又は名称】エフイムテ

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】パリッシ，ヴァンサン

(72)【発明者】

【氏名】ソウサ，セルジオ

(72)【発明者】

【氏名】ラパイユリ，デルフィーヌ

(72)【発明者】

【氏名】デレリス，オリヴィエ

(72)【発明者】

【氏名】メールテンス，ローラン

(72)【発明者】

【氏名】ギャロワ－モンブリュン，サラ

(72)【発明者】

【氏名】ルチエ，シルヴァン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA01

4C076AA06

4C076AA09

4C076AA12

4C076AA17

4C076AA22

4C076AA24

4C076AA27

4C076AA29

4C076AA30

4C076AA31

4C076AA36

4C076AA42

4C076AA49

4C076AA54

4C076AA72

4C076BB01

4C076BB02

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB22

4C076BB25

4C076BB29

4C076BB31

4C076CC15

4C076CC35

4C076EE42H

4C076FF70

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BC17

4C086GA07

4C086GA08

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA17

4C086MA22

4C086MA23

4C086MA28

4C086MA31

4C086MA32

4C086MA35

4C086MA36

4C086MA37

4C086MA41

4C086MA43

4C086MA44

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA56

4C086MA57

4C086MA59

4C086MA60

4C086MA63

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA59

4C086ZB33

4C086ZC41

(57)【要約】

本発明は、感染の予防又は治療における使用のための、式（Ｉ）（式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は定義されているとおりである）を有する化合物を含む化合物又はその薬学的に許容される塩に関する。本発明はまた、感染の予防又は治療における使用のための、本化合物を含む医薬組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

感染の予防又は治療における使用のための、以下の式（Ｉ）を有する化合物を含む化合物：

【化1】

（式中、
－Ｒ^１は、以下：

【化2】

を含む群から選択され
－Ｒ^２は、以下：

【化3】

（ｍは、２～６の整数である）
を含む群から選択され

【化4】

－Ｒ３は、以下：

【化5】

を含む群から選択され
ここで、Ｒ^２は、上記のとおり定義され、
Ｒ^４は、以下：

【化6】

の中から選択される）
又はその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

－Ｒ^２が、以下：

【化7】

を含む群から選択され
－Ｒ^３が、以下：
を含む群から選択される、請求項１に記載の化合物。

【化8】

【請求項3】

以下：

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

【化13】

【化14】

【化15】

【化16】

の中から選択される、請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。

【請求項4】

前記化合物は、経腸形態、非経口形態又は局所形態である、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項5】

前記化合物は、経口投与用形態、局所－経皮投与用形態、経鼻投与用形態、直腸投与用形態、皮下形態、筋肉内形態、気管内形態及び静脈内投与の中から選択される形態で投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項6】

前記化合物は、溶液剤、シロップ剤、懸濁液剤、エマルション剤、経口ドロップ剤、錠剤、顆粒剤及び散剤を含む群から選択される経口発泡性剤形、ビーズ剤、顆粒剤、ミニ錠剤及びマイクロ顆粒剤を含む群から選択される経口散剤又は多粒子系、口内分散性錠剤、
凍結乾燥ウェハース、薄層剤、チュアブル錠剤、錠剤、軟質ゲルカプセル剤及び医療用チューイングガム剤を含む群から選択される口内分散性剤形、口腔錠剤又は舌下錠剤、粘膜付着性調製物、ロゼンジ剤、口腔用ドロップ剤及びスプレー剤を含む群から選択される口腔経路及び舌下経路用形態、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、パッチ剤、発泡体剤の中から選択される形態で投与され、代替的に、例えば点鼻剤、鼻内噴霧剤、鼻腔用散剤を含む群から選択される経鼻投与用形態、坐剤、硬質ゼラチンカプセル剤であり得る、請求項４に記載の使用のための化合物。

【請求項7】

前記感染がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染である、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項8】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が起源株であるか、又はアルファ多様体、ベータ多様体、ガンマ多様体、デルタ多様体及びオミクロン多様体の中から選択される多様体である、請求項７に記載の使用のための化合物。

【請求項9】

スパイクタンパク質とＡＣＥ２タンパク質との間の相互作用を阻害するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項10】

感染の予防又は治療における使用のための、請求項１～３に記載の化合物を含む医薬組成物。

【請求項11】

前記感染がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染である、請求項１０に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項12】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が起源株であるか、又はアルファ多様体、ベータ多様体、ガンマ多様体、デルタ多様体及びオミクロン多様体の中から選択される多様体である、請求項１１に記載の使用のための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、感染の予防又は治療における使用のための、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防又は治療における使用のための、化合物又はその薬学的に許容される塩を指す。

【0002】

したがって、本発明は、医療分野、特に感染疾患の治療の分野において有用である。

【0003】

以下の説明では、角括弧（［］）内の参照は、本文書の末尾の参照文献のリストを指す。

【背景技術】

【0004】

重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ヒトにおける重症呼吸器症候群（ＣＯＶＩＤ－１９）のプラス鎖ＲＮＡウイルス原因因子である。

【0005】

細胞へのウイルスの侵入には、ウイルスのスパイクＳタンパク質と細胞膜表面のアンジオテンシン変換酵素２であるＡＣＥ２との間の相互作用が必要である。ＡＣＥ２は、２００３年の最初のＳＡＲＳ大流行の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶについて以前に示されたように、肺におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体として報告されている。ＡＣＥ２は、ヒト気道上皮、肺実質、血管内皮、腎細胞及び小腸細胞において発現されるが、脳ではわずかにしか検出されない。したがって、文献からの収束データは、Ｓ／ＡＣＥ２相互作用が依然としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中心的な侵入経路であることを示している。Ｓ／ＡＣＥ２複合体は、ウイルスと細胞との間の最初の接触点であるので、ウイルス感染の非常に初期の事象を阻止するための魅力的な標的を構成する。

【0006】

パンデミックの始まり以来、いくつかのワクチンが開発されてきたが、ウイルス複製プロセスの理解の欠如に部分的に起因して、臨床において使用可能なウイルス複製に対する強力な効果を有すると特定された効率的な薬物が存在しない。

【0007】

したがって、複製プロセスのより一層良好な理解及び新規の抗ウイル手法の探索が依然として重要である。

【0008】

したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による症状を治療するか、又は少なくとも軽減することを可能にする薬物が必要とされている。本発明は、上記及び他の必要を満たす。

【発明の概要】

【0009】

本出願人は、インドールに由来する化合物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター、並びに本来、感染し易い肺細胞を含むさまざまなヒト細胞系における野生型及び多様体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２循環株の感染性を遮断する能力を有することを驚くべきことに見出した。

【0010】

ＡｌｐｈａＬＩＳＡ及びバイオレイヤー干渉法により、Ｓ／ＡＣＥ２会合に対する化合物の直接的な阻害効果が確認された。

【0011】

したがって、広範にわたる研究の結果、本出願人は、本来感受性の高い細胞におけるウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製の阻害をもたらすＡＣＥ２／Ｓ相互作用を損なうことによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入工程を特異的に遮断することができる新規薬物を見出した。

【0012】

したがって、第１の態様では、本発明は、感染の予防又は治療における使用のための、以下の式（Ｉ）を有する化合物を含む化合物：

【0013】

【化1】

（式中、
－Ｒ^１は、以下：

【0014】

【化2】

を含む群から選択され
－Ｒ^２は、以下：

【0015】

【化3】

（ｍは、２～６の整数である）

【0016】

【化4】

を含む群から選択され
－Ｒ^３は、以下：

【0017】

【化5】

を含む群から選択され
ここで、Ｒ^２は、上記のとおり定義され、
Ｒ^４は、以下：

【0018】

【化6】

の中から選択される）
又はその薬学的に許容される塩を提供する。

【0019】

用語「薬学的に許容される塩」は、医薬品分野において一般的に使用される任意の塩であって、かつ当業者の一般的な技術知識に従って本発明において使用されるインドール誘導体に適合された上記の任意の塩を含むことが意図される。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸塩、酢酸塩、リン酸塩又はメタンスルホン酸塩、フマル酸塩及びシュウ酸塩とすることができる。

【0020】

本化合物は、例えば、Ｊａｃｑｕｅｍａｒｄらの文献（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ３，５－ｂｉｓ（２－ｉｎｄｏｌｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ ３－［（２－ｉｎｄｏｌｙｌ）－５－ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ ＣＤＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔｓ．（２００８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１６，４９３２－４９５３（［１］））、及びＭａｈｂｏｏｂｉらの文献（Ｂｉｓ（１Ｈ－２－ｉｎｄｏｌｙｌ）ｍｅｔｈａｎｏｎｅｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ２００２ ４５ １００２－１０１８（［１３］））に
おける、当分野で公知の方法によって調製され得る。

【0021】

本発明によれば、本化合物によって予防又は治療される感染は、例えば、細胞へのウイルス侵入がウイルスのスパイクＳタンパク質と細胞膜表面のアンジオテンシン変換酵素２であるＡＣＥ２との間の相互作用を必要とする、ウイルスによって引き起こされる感染であり得る。有利なことに、本化合物は、スパイクタンパク質とＡＣＥ２タンパク質との間の相互作用を阻害することができる。

【0022】

ウイルスは、例えば、コロナウイルス科から選択され得る。コロナウイルス科のウイルスは、例えば、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、コロナウイルスＳＡＲＳ、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルスＯＣ４３、コロナウイルスＨＫＵ１及びコロナウイルスＭＥＲＳ－ＣｏＶを含む群から選択され得る。本発明の好ましい実施形態では、ウイルス感染はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年にＷｕｈａｎ（中国）で出現した起源株であってもよく、又は、後に出現した、アルファ多様体、ベータ多様体、ガンマ多様体、デルタ多様体及びオミクロン多様体を含めた多様体であってもよい。

【0023】

有利には、本発明の使用のための化合物において：
－Ｒ^２は、以下：

【0024】

【化7】

を含む群から選択され得、
－Ｒ^３は、以下：

【0025】

【化8】

を含む群から選択され得る。

【0026】

有利には、本発明による使用のための特定の化合物は、以下の中：

【0027】

【化9】

【0028】

【化10】

【0029】

【化11】

【0030】

【化12】

【0031】

【化13】

【0032】

【化14】

【0033】

【化15】

【0034】

【化16】

又はその薬学的に許容される塩から選択され得る。

【0035】

本発明の使用によれば、本化合物は、経腸形態、非経口形態又は局所形態であり得る。本化合物は、例えば、経口投与用形態、例えば、経口溶液剤、シロップ剤、経口懸濁液剤、エマルション剤及び経口ドロップ剤を含む群から選択される形態であり得る。代替的に、本化合物は、錠剤、顆粒剤、散剤を含む群から選択される経口発泡性剤形であってもよい。代替的に、本化合物は、例えば、ビーズ剤、顆粒剤、ミニ錠剤及びマイクロ顆粒剤を含む群から選択される、経口散剤又は多粒子系の形態であってもよい。代替的に、本化合物は、口内分散性錠剤、凍結乾燥ウェハース、薄膜剤、チュアブル錠剤、錠剤及びカプセ
ル剤、医療用チューインガム剤を含む群から選択される口内分散性剤形の形態であり得る。代替的に、本化合物は、例えば、口腔錠剤又は舌下錠剤、粘膜付着性調製物、ロゼンジ剤、口腔用ドロップ剤及びスプレー剤を含む群から選択される、口腔経路及び舌下経路用の形態であり得る。代替的に、本化合物は、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、パッチ剤及び発泡体剤を含む群から選択される、局所－経皮投与用形態であり得る。代替的に、本化合物は、例えば、点鼻剤、鼻内噴霧剤、鼻腔用散剤を含む群から選択される鼻腔投与用形態であり得る。代替的に、本化合物は、直腸投与用形態、例えば、坐剤又は硬質ゼラチンカプセル剤であり得る。代替的に、本化合物は、非経口投与、例えば、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与用形態であってもよい。

【0036】

本発明の別の目的は、上記で定義した感染の予防又は治療における使用のための、上記で定義した化合物を含む医薬組成物に関する。

【0037】

用語「医薬組成物」は、本明細書において、少なくとも１種の活性薬及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、上記の障害及び疾患の治療のために動物及びヒトに投与することができる組成物を指す。

【0038】

本発明によれば、１種の活性薬は、上記で定義した化合物である。有利には、本医薬組成物は、例えば、デキサメタゾン、レムデシビル、アジトロマイシンの中から選択される少なくとも１つの他の活性薬を含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は、本発明の医薬組成物の活性成分と一緒に製剤化されるように適合された任意の物質であってもよい。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、付着防止剤、結合剤、コーティング剤、着色剤、崩壊剤、風味剤、流動促進剤、滑沢剤、保存剤、吸着剤、甘味剤、界面活性剤、脂質及びビヒクルの中から選択され得る。

【0039】

本薬学的組成物は、任意の医薬品形態（すなわち、経腸、非経口又は局所）であってもよい。本薬学的組成物は、例えば、溶液剤、シロップ剤、懸濁液剤、エマルション剤及び経口ドロップ剤を含む群から選択される経口投与用医薬であってもよい。代替的に、本医薬組成物は、錠剤、顆粒剤、散剤を含む群から選択される経口発泡性剤形の形態の医薬であってもよい。代替的に、本医薬組成物は、ビーズ剤、顆粒剤、ミニ錠剤及びマイクロ顆粒剤を含む群から選択される形態の経口散剤又は多粒子系であってもよい。代替的に、本医薬組成物は、口内分散性錠剤、凍結乾燥ウェハース、薄膜剤、チュアブル錠剤、錠剤及びカプセル剤、医療用チューインガム剤を含む群から選択される口内分散性剤形の形態の医薬であってもよい。代替的に、本医薬組成物は、例えば、口腔錠剤又は舌下錠剤、粘膜付着性調製物、ロゼンジ剤、口腔用ドロップ剤及びスプレー剤を含む群から選択される、口腔経路、気管内経路及び舌下経路用の医薬であってもよい。代替的に、本医薬組成物は、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、パッチ剤及び発泡体剤を含む群から選択される、局所－経皮投与又は局所投与用医薬であってもよい。代替的に、本医薬組成物は、例えば、点鼻剤、鼻内噴霧剤、鼻腔用散剤を含む群から選択される鼻腔投与用医薬であってもよい。代替的に、本医薬組成物は、直腸投与用医薬、例えば、坐剤又は硬質ゼラチンカプセル剤であってもよい。代替的に、本医薬組成物は、非経口投与、例えば、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与用医薬であってもよい。

【0040】

本発明の医薬組成物は、当業者によって公知の従来の技法を使用して調製され得る。例えば、バルク原薬は、上記の賦形剤の１種以上の存在下で好適な溶媒に溶解されて、混合され得る。

【0041】

有利には、本医薬組成物は、上記で定義した感染の予防又は治療のために、薬学的に許容される有効用量の化合物の送達を可能にすることができる。例えば、本医薬組成物は、１日あたり体重１ｋｇあたり１～５０ｍｇの化合物の用量、好ましくは１日あたり体重１
ｋｇあたり１～２０ｍｇの用量を含んでもよい。投与は、１日あたり１つ又は複数の用量を用いて行うことができる。

【0042】

本発明は、限定として解釈されるべきではない添付の図面に関して以下の実施例によって更に説明される。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】漸増濃度の薬物を使用した、ＡＢ－０００１１７７８化合物の特徴付けを表す図である。ＡＢ－０００１１７７８化合物又はＤＭＳＯの存在下でのＣＯＶ２又はＶＳＶｇの感染性（ＧＦＰ陽性細胞の％）（Ａ）。ＡＢ－０００１１７７８化合物の存在下でのＣＯＶ２又はＶＳＶｇの感染性（対照であるＤＭＳＯの％）（Ｂ）。データは、少なくとも３回の独立実験の平均値±標準偏差として示される。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図2】スパイク／ＡＣＥ２複合体及びスパイクタンパク質単独へのＡＢ－０００１１７７８化合物の分子ドッキングを表す図である。データは、Ｓ－ＲＤＢ及びＳ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面への化合物の予測結合ポーズから得た。相互作用アミノ酸残基が強調されている。（Ａ）スパイク／ＡＣＥ２複合体に結合したＡＢ－０００１１７７８化合物；（Ｂ）スパイク単独に結合したＡＢ－０００１１７７８。

【図3】さまざまな細胞系（ＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２、Ａ５４９－ＡＣＥ２、ＶＥＲＯ－Ｅ６、Ｃａｃｏ２、Ｃａｌｕ３）におけるＡＢ－０００１１７７８化合物の細胞毒性を表す図である。細胞の生存率（ＭＴＴアッセイにおいて４９２ｎｍの吸光度）を、漸増濃度の薬物に対してプロットした。データは、３回の独立実験の平均値として示されている。データは、少なくとも３回の独立実験の平均値±（照準偏差）として示されている。

【図4】ＡＣＥ２単独に結合したＡＢ－０００１１７７８の分子ドッキングを表す図である。界面領域周辺のＡＣＥ２に対する化合物の予測される結合ポーズからデータを得た。相互作用アミノ酸残基が強調されている。

【図5】ＡｌｐｈａＬＩＳＡ及びバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術を使用した、インビトロでのＳ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２相互作用に対するＡＢ－０００１１７７８化合物の効果を表す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６及びヒトＡＣＥ２－Ｂｉｏｔ相互作用を、（Ａ）３ｎＭの各タンパク質を使用してＡｌｐｈａＬＩＳＡによって最初にモニタリングした。漸増濃度のＡＢ－０００１１７７８薬を、Ｓ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６と３０分間、インキュベートした後に、ＡＣＥ２－Ｂｉｏｔと２時間、混合した。抗６Ｘ Ｈｉｓ受容体及びストレプトアビジン供与体ビーズと共に２時間、インキュベートした後にマイクロプレートの読取りを行った。化合物を用いて得られたデータを、ＤＭＳＯ対照と比較し、二連の２～３回の独立実験からの結合阻害率の平均値±標準偏差として報告する。^＊＊Ｐ＜０．０１。ストレプトアビジンバイオセンサー上に固定化されたビオチン化ＡＣＥ２へのＳ－ＲＢＤの結合動態に対する薬物の効果もまた、ＢＬＩ実験を使用して実施した（Ｂ）。反応緩衝液によるベースラインを６０秒間測定した。会合工程（３００秒）のために、ロードされたバイオセンサーの各々を、漸増濃度のＡＢ－０００１１７７８化合物と共に１５分間、事前インキュベートした５０ｎＭのＳ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６に浸漬した。その後、解離工程を３００秒間、測定した。（Ｂ）において示したセンサーグラム曲線は、Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してプロットした。Ｂｌｉｔｚ ｐｒｏ １．１ソフトウェアを用いた１：１結合モデルを使用して、会合及び解離実験曲線の局所当てはめを行った。速度論的結合パラメータ（ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ）及び平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、２～３回の独立実験の平均値として求め、（Ｃ）において報告した。データは、２～３回の独立実験の平均値±標準偏差として示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図6】細胞状況における、Ｓ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２相互作用に対するＡＢ－０００１１７７８化合物の効果を表す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－ＲＢＤ断片をＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２細胞の一方に０～６０分間添加し、抗（Ｈｉｓ）_６抗体とＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏ４８８に結合した二次抗体とを用いて免疫蛍光染色を行った。細胞をエピ蛍光顕微鏡によって観察した（Ａ）。フローサイトメトリーも使用して細胞を分析し、時間中のＦＩＴＣシグナルに対する陽性細胞の割合を検出した（Ｂ）。漸増濃度の可溶性ＡＣＥ２（Ｃ）又は薬物（Ｄ）の一方をＲＢＤに添加した。データは、少なくとも３～５回の独立実験からの陽性細胞の割合の平均値として報告する。^＊＊ｐ＜０．０５（スチューデント検定）。

【図7】ヒト肺細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に対するＡＢ－０００１１７７８化合物の効果を表す図である。Ａ５４９－ＡＣＥ２（Ａ）又はＣａｌｕ３（Ｂ）細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照株（ＭＯＩ＝１）及び漸増濃度の薬物と共にインキュベートした。２４時間後にウイルスゲノムコピーを定量することによって複製を評価した。データは、５回の独立実験からの平均値として報告し、対照ｗ／ｏ薬物の割合として表す（スチューデント検定）。

【図8】ヒト肺細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ、アルファ、デルタ及びオミクロンの複製に対するＡＢ－０００１１７７８の効果を表す図である。Ａ５４９－ＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳ２細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ、アルファ株、オミクロン株又はデルタ株（ＭＯＩ＝１）及び漸増濃度の薬物と共にインキュベートした。複製は、２４時間後にアクチンＲＮＡに対して正規化したウイルス遺伝子Ｅ（Ａ）及びＳ（Ｂ）ゲノムコピーを定量することによって評価した。代表的な実験を図に報告する。２～３回の独立実験からの平均値を（Ｃ）において報告し、分子を含まない対照の割合±標準偏差として表す。

【図9-1】ＡＢ－０００１１７８化合物からの化学誘導体を表す図である。最初に選択した薬物の構造を（Ａ）に報告する。いくつかの類似体を設計し、図２で行ったドッキング計算に基づいて合成した。

【図9-2】ＡＢ－０００１１７８化合物からの化学誘導体を表す図である。最初に選択した薬物の構造を（Ａ）に報告する。いくつかの類似体を設計し、図２で行ったドッキング計算に基づいて合成した。

【図10】ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型レンチウイルス（lenvirus）に対するＡＢ－０００１１７８及びその誘導体の効果を表す図である。１０μＭ濃度のＡＢ－０００１１７８誘導体（Ａ）並びに漸増濃度（０～１０μｌ）のＡＢ－０００１１７８、ＡＢ－０００１１７８＿２及びＡＤ－０００１１７８＿６（Ｂ）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型レンチウイルスベクター及びＨＥＫ２９３Ｔ－Ａｃｅ２細胞を用いた感染性アッセイに添加した。データは、３回の実験の平均値±標準偏差として報告する。

【図11】類似体の相互作用を表す図である。（Ａ）Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２を有するＡＢ－０００１１７７８＿２；（Ｂ）Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２を有するＡＢ－０００１１７７８＿６；（Ｃ）Ｓ－ＲＤＢを有するＡＢ－０００１１７７８＿２；（Ｄ）Ｓ－ＲＤＢを有するＡＢ－０００１１７７８＿６。

【図12】スパイク／ＡＣＥ２複合体及びスパイクタンパク質単独に対するＡＢ－０００１１７７８＿２及びＡＢ－０００１１７７８＿６の相互作用の分析を表す図である。（Ａ）Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２相互作用の詳細；（Ｂ）スパイク／ＡＣＥ２複合体に結合したＡＢ－０００１１７７８＿２；（Ｃ）スパイク／ＡＣＥ２複合体に結合したＡＢ－０００１１７７８＿６；（Ｄ）ＡＣＥ２の結晶学的位置対スパイクタンパク質単独に結合した場合のＡＢ－０００１１７７８＿２及びＡＢ－０００１１７７８＿６によって占有された位置の比較；（Ｅ）スパイク単独に結合したＡＢ－０００１１７７８＿２；（Ｆ）スパイク単独に結合したＡＢ－０００１１７７８＿６。

【図13】類似体の相互作用を表す図である。（Ａ）ＡＣＥ２単独の場合のＡＢ－０００１１７７８＿２；（Ｂ）ＡＣＥ２単独の場合のＡＢ－０００１１７７８＿６。

【図14】Ｓ－ＲＤＢの結晶学的位置と（Ａ）ＡＣＥ２単独に結合した場合のＡＢ－０００１１７７８＿２及びＡＢ－０００１１７７８＿６；（Ｂ）ＡＣＥ２単独に結合したＡＢ－０００１１７７８＿２；（Ｃ）ＡＣＥ２単独に結合したＡＢ－０００１１７７８＿６によって占有された位置との比較を表す図である。

【図15】ヒト肺Ａ５６９－ＡＣＥ２細胞における、２．５μＭの濃度（白色カラム）又は５μＭの濃度（黒色カラム）のＡＢ－０００１１７７８の１０種の類似体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質により偽型化されたレンチウイルスベクターの感染性を阻害する能力を表す図である。

【実施例】

【0044】

実施例１：複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ／ＡＣＥ２界面を標的とする新規抗ウイルス薬としての、本発明において定義されるインドール誘導体の効果
特異的Ｓ／ＡＣＥ２媒介性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入経路に関するインセルロでのスクリーニング。
以下の式のＡＢ－０００１１７７８化合物：

【0045】

【化17】

を選択し、実験室において以前に設定された、レンチウイルスベクターに基づいた細胞手法に関して最初に試験した（Ｌａｐａｉｌｌｅｒｉｅら（２０２１）Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌｏ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ／Ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２ Ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｖｉｒａｌ Ｅｎｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ．Ｖｉｒｕｓｅｓ、１３（［２］））。手短に述べると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＣｏＶ－２ ＬＶ）で偽型化されたレンチウイルスベクターを３種のプラスミド：マーカータンパク質を発現するレンチウイルス骨格（ＬＶ４４：ｐＲＲＬＳＩＮ－ＰＰＴ－ｈＰＧＫ－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ）をコードするプラスミド、スパイクタンパク質を発現するＨＤＭ＿
ＩＤＴＳｐｉｋｅ＿ｆｉｘＫプラスミド（Ｂｌｏｏｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの寄贈（Ｃｒａｗｆｏｒｄら（２０２０）Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ．Ｖｉｒｕｓｅｓ、１２（［４］）））及びビリオン形成に必要な他のＨＩＶタンパク質を発現するｐｓＰＡＸ２プラスミド（Ｔａｔ、Ｇａｇ－Ｐｏｌ及びＲｅｖ）をトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生した。ＡＣＥ２遺伝子の９つのコピーを含有するＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞は、そのゲノム中のヒトＡＣＥ２遺伝子のレンチウイルスベクターの挿入によって産生した（［２］）。ＣｏＶ－２ ＬＶは、ＬＶによってコードされるｅＧＦＰ遺伝子の統合及び発現をもたらす元の２９３Ｔ細胞とは対照的に、２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞だけを効率的に形質導入することが示された。これにより、ｅＧＦＰ陽性細胞の割合によってモニタリングされた形質導入効率が初期Ｓ／ＡＣＥ２相互作用に依存することが裏付けられる。対照的に、典型的なＶＳＶｇ偽型ＬＶは、２９３Ｔ細胞及び２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞の両方を形質導入することができ、Ｓ／ＡＣＥ２侵入に特異的な薬物の次の選択のための対照となる。可溶性ＡＣＥ２タンパク質を使用する阻害競合実験により、ＬＶ ＣｏＶ－２感染性のＳ／ＡＣＥ２依存性が完全に検証されたが、ＬＶ ＶＳＶｇはタンパク質によって影響を受けなかった（データは図示せず）（［２］）。

【0046】

したがって、ＡＢ－０００１１７７８化合物を、ＶＳＶｇ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＬＶ感染性の両方に対して試験し、Ｓ／ＡＣＥ２媒介侵入経路に対するその効果の可能性を判定した。１０μＭ濃度の薬物を使用した最初のスクリーニングにより、いくつかの分子がＣｏＶ－２ＬＶに対して有意な阻害作用があり、ＶＳＶｇ ＬＶに対する効果は何らないことが示された（図１Ａを参照）。ＡＢ－０００１１７７８は、ウイルス感染性の４０～８０％の低下を誘導することによって有効であることが見出された。漸増濃度を使用した化合物の阻害効果の更なる正確な分析により、０～２０μＭの範囲内で、ＶＳＶｇ ＬＶに対する有意な効果を伴わずにＣｏＶ－２ ＬＶ感染性を阻害するそれらの特異的能力が確認された（図１Ｂ）。ＭＴＴアッセイを使用して、ＨＥＫ－２９３Ｔ、Ａ５４９、Ｃａｌｕ３及びＣａｃｏ２細胞系を含むさまざまな細胞系において求められた分子の細胞毒性は、０～５０μＭの範囲内で細胞毒性を示さなかったか、又はわずかな細胞毒性しか示さなかった（図３を参照）。

【0047】

まとめると、本発明者らのデータにより、ＡＢ０００１１７７８化合物が初期のＳ／ＡＣＥ２媒介ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入過程を妨害したことが強く示唆された。これを確認するために、本発明者らは、次に、分子ドッキング及び生化学的手法を使用して、この阻害効果が、ＳとＡＣＥ２との間の物理的相互作用に対する薬物の直接的な効果に起因し得るかどうかを調査した。

【0048】

ＳとＡＣＥ２との薬物相互作用の分子ドッキング解析
標的タンパク質へのＡＢ－０００１１７７８化合物の結合をよりよく理解するために、分子ドッキング研究を行った。図２は、Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面及びＳ－ＲＢＤへの予測される結合ポーズからの結果を示しており、相互作用するアミノ酸残基を強調している。

【0049】

Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面へのＡＢ－０００１１７７８化合物のドッキング（図２Ａ）は、９２．０５のスコアをもたらした。Ｓ－ＲＤＢ残基であるＡｒｇ４０３、Ｇｌｎ４０９及びＬｙｓ４１７は、この分子と強力な水素結合を確立する。Ａｒｇ４０３は、３．００Åの距離でスルホニル基の１つに由来する１個の酸素と相互作用する。Ｇｌｎ４０９及びＬｙｓ４１７は、それぞれ３．７８Å及び３．５５Åの距離を有する中央のピリジンに由来する窒素と相互作用する。更に、ＡＣＥ２ Ｈｉｓ３４は、π－πスタッキング相互
作用を介してインドール基と相互作用する。ＡＣＥ２残基であるＬｙｓ２６、Ｌｅｕ２９及びＡｓｐ３８、並びにＳ－ＲＤＢ残基であるＬｙｓ４１７及びＧｌｎ４９３もまた、ＡＢ－０００１１７７８化合物との疎水性相互作用に関与している。ＡＢ－０００１１７７８化合物とアミノ酸残基ＡＣＥ２のＡｓｐ３８との相互作用、並びにＳ－ＲＤＢ Ｌｙｓ４１７及びＧｌｎ４９３との相互作用は、特に関連性がある。実際、Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面の以前のＭＤ研究（［２］）により、ＡＣＥ２に由来するＡｓｐ３８は、Ｓ－ＲＤＢのＴｙｒ４４９及びＧｌｎ４９８と重要な水素結合を確立することが示された。Ｓ－ＲＤＢのＬｙｓ４１７は、非常に安定な水素結合、及びＡＣＥ２に由来するＡｓｐ３０との荷電相互作用に関与することが示された一方、Ｓ－ＲＤＢのＧｌｎ４９３は、ＡＣＥ－２のＧｌｕ３５と重要な水素結合を形成した。ＡＢ－０００１１７７８化合物の結合によって引き起こされるこれらの相互作用の破壊は、Ｓ／ＡＣＥ２相互作用の遮断をもたらすはずであり、この分子がこの系の成功を収めた阻害剤である理由の１つであり得る。

【0050】

ＡＣＥ２の非存在下でのＳ－ＲＤＢタンパク質へのＡＢ－０００１１７７８化合物のドッキング（図２Ｂ）は、８９．１２のスコアをもたらした。得られたドッキングポーズは、１．９０Åの長さを有する、Ｇｌｙ５０２とＡＢ－０００１７７８のエーテル基の１つとの間に強い水素結合を形成することを示している。Ｔｙｒ５０５のインドール基とリガンドのフェニル基のうちの２つとの間に、π－πスタッキング相互作用も形成されている。最後に、Ｌｙｓ４１７、Ｌｅｕ４５５、Ａｓｎ５０１及びＴｙｒ５０５は、ＡＢ－０００１１７７８との疎水性相互作用に関与している。Ｇｌｙ５０２及びＴｙｒ５０５は、Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面のＭＤ研究において、ＡＣＥ２との間の非常に安定な水素結合に関わっており、シミュレーション時間のそれぞれ５７％及び５６％の間に、Ｇｌｙ５０２はＬｙｓ３５３と相互作用しており、Ｔｙｒ５０５はＡＣＥ２’のＧｌｕ３７と相互作用している（［２］）。したがって、ＡＢ－０００１１７７８化合物とこれらの２つの残基との相互作用は、Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２会合を有意に妨害する可能性が高い。

【0051】

更に、スパイクタンパク質と競合的にＡＣＥ２に結合するＡＢ－０００１１７７８化合物の能力を評価した。両方の分子をＡＣＥ２受容体に対してドッキングさせて、スパイクタンパク質と相互作用してこれを認識することが知られているＡＣＥ２の表面を潜在的結合領域と定義した。結果が図４に示されており、ＡＢ－０００１１７７８化合物が、Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面及びＳ－ＲＤＢ単独にドッキングした場合に観察されるものに匹敵する強力な結合スコアでＡＣＥ２に結合することができることを示している。

【0052】

ＡＣＥ２単独へのＡＢ－０００１１７７８化合物のドッキングは、８１．４１（ＧＯＬＤ／ＰＬＰ）のスコアをもたらした。最も安定なポーズにより、ＡＣＥ２とＡＢ－０００１１７７８化合物との間に複数の水素結合：（１）Ｔｙｒ４１と中央のピリジン基に由来する窒素との間（１．６６Åの長さを有する）；（２）リガンドのエーテル基の１つに由来する酸素と相互作用するＧｌｎ３２５とＧｌｙ３２６との間（それぞれ２．０４Å及び３．０９Åの長さを有する）；（３）Ａｓｎ３３０とスルホニル基の１つに由来する１つの酸素との間（２．１０Åの距離を有する）が形成されていることが明らかになった。Ｌｙｓ３５３とインドール基の１つに由来するフェニル環との間の１つのπ－カチオン相互作用の形成も観察することができる。Ｇｌｕ３７、Ｔｙｒ４１、Ｔｈｒ３２４、Ｇｌｎ３２５及びＬｙｓ３５３は、疎水性相互作用に関与している。Ｇｌｕ３７、Ｔｙｒ４１及びＬｙｓ３３５はまた、スパイクタンパク質への重要な水素結合に既に関連付けられており（Ｌａｐａｉｌｌｅｒｉｅら（［２］））、やはりまた、ＡＢ－０００１１７７８とこれらの残基との相互作用は、ＡＣＥ２がスパイクタンパク質に結合する能力を妨害し得ることを示唆する。

【0053】

Ｓ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２会合に対する作用
選択された薬物が、Ｓ／ＡＣＥ２複合体の形成を物理的に阻止し得ることを確認するた
めに、本発明者らは、次に、６ｘ－Ｈｉｓタグに融合した組換えＳ最小結合ドメイン（ＲＢＤ）（Ｓ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６）及びヒトＡＣＥ２タンパク質（ＡＣＥ２－Ｂｉｏｔ）を使用して、インビトロでのＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを行った。

【0054】

このために、以前に設定されたＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ（［２］）を使用し、結合条件を、２０μｌの最終反応体積で３８４ウェルマイクロプレートにおける使用のよう適合させた。各組換えタンパク質に関する３ｎＭの最適濃度は、交差滴定実験を用いて以前に確立された。競合アッセイのために、漸増濃度（１～２５μＭ）のＡＢ－０００１１７７８薬をプレートでＳ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６と共に事前インキュベートした後に、ＡＣＥ２－Ｂｉｏｔと２時間、混合した。複合体を捕捉するために、抗６ｘＨｉｓ受容体及びストレプトアビジン供与体ビーズを、２つのパートナーの２時間のインキュベート後に使用した。図５Ａに報告されるように、ＡｌｐｈａＬＩＳＡデータにより、ＡＢ－０００１１７７８化合物が、ＲＢＤ／ＡＣＥ２複合体の形成を同様に妨害し、両方の場合において、２５μＭの薬物で５０％阻害に達することが確認された。ＴｒｕＨｌｔｓカウンターアッセイ実験により、ＡＳシグナルに対して化合物が有意な作用を何ら示さず、Ｓ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２相互作用の特異的阻害が裏付けられた（データは図示せず）。Ｓ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２相互作用の動態に対する薬物の効果に関する追加情報を得るために、本発明者らは、以前に設定されたバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）実験を行った（［２］）。これらの競合結合アッセイにおいて、ビオチン化ＡＣＥ２をストレプトアビジンバイオセンサー上にロードし、結合速度を、物質及び方法の項目において記載した、漸増濃度のＡＢ－０００１１７７８化合物と事前プレインキュベートした５０ｎＭのＳ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６を用いて行った。ＢＬＩセンサーグラムにおける波長シフトによって示されるように、ＡＣＥ２へのＳ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６の強力な結合が観察された（図５Ｂ）。ＦｏｒｔｅＢｉｏ
Ｂｌｉｔｚ ｐｒｏ１．１ソフトウェアによる１：１結合モデルを使用して、会合曲線及び解離曲線の局所当てはめを行った後に、速度論的結合パラメータ（ｋ_ａ、ｋ_ｄ）及び平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を求めた。Ｋ_Ｄは、３．４２±０．４９ｎＭであることが分かり、以前のデータが裏付けられた（（［２］）；Ｌａｎら（２０２０）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ
ｄｏｍａｉｎ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ＡＣＥ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ、５８１、２１５－２２０（［３］））。ＡＢ－０００１１７７８化合物の添加は相互作用を阻害し、Ｋ_Ｄの、それぞれ、１１１±１６ｎＭ及び６８．８±５．１ｎＭへの大きな低下をもたらした（図５Ｃを参照）。薬物の非存在下又は存在下での速度定数の決定は、本化合物がＳ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２会合及び解離のステップの両方に対して妨害したことを示し、ドッキングモデルと一致して、それらの化合物が、Ｓ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２複合体の形成を阻止するだけでなく、その安定性も低下させることができることを示している。

【0055】

細胞の状況では、ＡＣＥ２及びＳの両方が、膜環境、すなわちウイルスエンベロープ及び細胞膜に埋め込まれている。したがって、本発明者らは、次に、本化合物がより生理学的な状況においてＳ／ＡＣＥ２相互作用も防止することができるかどうかを検討する。この目的のために、本発明者らは、以前に開発された細胞Ｓ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２相互作用モデルを使用した（［２］）。このモデルによって、抗Ｓ免疫蛍光法によって、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞表面における組換えＳ－ＲＢＤタンパク質と細胞膜ＡＣＥ２タンパク質との間の会合のモニタリングが可能になる（図６Ａ）。フローサイトメトリー解析は、ＡＣＥ２タンパク質への総合的なＳ－ＲＢＤ会合の定量を可能にし（図６Ｂ）、可溶性ＡＣＥ２タンパク質との競合は、相互作用の特異性を確認し、潜在的なＳ／ＡＣＥ２阻害剤を試験するためのアッセイを検証する（図６Ｃ）。ＡＢ－０００１４７７８化合物の添加は、細胞の表面におけるＳ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２会合の効率を低下させた（図６Ｄ）。ＡＢ－０００１４７７８化合物は、図１に報告されている感染性アッセイにおいて得られたデータと一致して、有効であることが見出された。

【0056】

まとめると、得られたデータは、選択された薬物がＳとＡＣＥ２との間の初期相互作用を遮断することを実証し、偽ウイルスを用いて得られたデータと連携すると、この相互作用によって媒介される初期侵入経路に対して、選択された化合物が有効であることを支持している。

【0057】

本来、感受性の高いヒト細胞に対する野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性に対する効果。
本発明者らは、次に、このＳ／ＡＣＥ２阻害効果が、本来、感染し易いさまざまな細胞系における野生型循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の複製を遮断するのに十分であり得るかどうかを検討する。

【0058】

薬物を、ヒトＡＣＥ２ウイルス受容体を過剰発現する、又は過剰発現しないさまざまな肺細胞系であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照株に感染させた、異なる肺細胞株において試験した。図７Ａに報告されるように、どちらの分子も、Ａ５４９－ＡＣＥ２細胞におけるウイルス複製の阻害を誘導し、ＡＢ－０００１１７７８化合物に対するＥＣ_５０は、それぞれ、２．５μＭ及び０．２５μＭであった。次に、薬物を、ＡＣＥ２受容体を天然に発現するＣａｌｕ３ヒト肺がん細胞系を使用する感染アッセイにおいて更に試験した。図７Ｂに報告されるように、ウイルス複製の阻害作用が両方の薬物に関して確認され、約１μＭの濃度でウイルス複製の５０％阻害という有意性をもたらした。

【0059】

表１に報告されるように、さまざまな細胞系において報告された見かけのＩＣ_５０及びＣＣ_５０に基づくと、２種の化合物が３０より高い選択性指数（ＳＩ）に到達し、それらの化合物が、良好な候補及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２選択薬物になった。ＡＢ－０００１１７７８は、Ａ５４９－ＡＣＥ２細胞において、ＳＩ＞１２０に達する有望な分子であることが見出された。こうして、本発明者らは、選択された薬物によるウイルス阻害の根底にある分子機構を更に検討した。

【0060】

【表1】

【0061】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２循環多様体形態に対する選択薬物の効果。
選択された薬物が、現在の主要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２多様体に対して有効であり得るかどうかを判定するため、本発明者らは、最初に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ／ＡＣＥ２複合体多様体であるアルファ、ベータ、ガンマ及びデルタのインシリコでのモデリング及び分子動力学シミュレーションを実施した。

【0062】

さまざまなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異体で形成されたＳ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２複合体のモデルを、ＡＣＥ２と複合体を形成した元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質受容体結合ドメインを表す、Ｘ線構造６Ｍ０Ｊ（分解能２．４５Å）（［３］）から出発して調製した。利用可能なＤｕｎｂｒａｃｋ回転異性体ライブラリーを使用し、Ｐｙｍｏｌ１．７．２．１ソフトウェアにおける突然変異誘発特徴を使用する、界面変異をモデル化することによって、突然変異多様体を調製した（Ｓｈａｐｏｖａｌｏｖ ａｎｄ Ｄｕｎｂｒａｃｋ（２０１１）Ａ ｓｍｏｏｔｈｅｄ ｂａｃｋｂｏｎｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎ
ｔ ｒｏｔａｍｅｒ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｄａｐｔｉｖｅ ｋｅｒｎｅｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｌｏｎｄ．Ｅｎｇｌ．１９９３、１９、８４４－８５８（［５］））。各突然変異体の最初のアミノ酸の立体配座の選別は、他の残基との衝突を除外して、予測される優性な配座異性体に基づいた。このコンピュータによる突然変異誘発プロトコルは、他の酵素の研究において以前に首尾よく使用されたものである（Ｓｅｒｒａｎｏら（２０２１）Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｅｐｉｓｔａｓｉｓ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｂｙｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１４０、１３２９－１３４２（［６］）；Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｐｏｗｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＤｓｚＤ Ｅｎｚｙｍｅ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｕｄｅ Ｏｉｌ
ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ－Ｆｅｒｒｅｉｒａ－２０１７－Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ－Ｗｉｌｅｙ Ｏｎｌｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（［７］））。モデル化した突然変異を表２に記載する。

【0063】

【表2】

【0064】

４つの系のすべてに、ＡＭＢＥＲ及びｆｆ１４ｓｂ力場を使用して、先に記載した同じ分子力学最小化及び分子動力学手順を施した。分子動力学シミュレーションを、各変異体について４００ｎｓ、実行した。骨格の二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）、形成された水素結合及びクラスター分析に関して、最終的な軌道を解析した。各突然変異体に対して行ったクラスター分析から、各突然変異体について得られた立体配座の優勢なクラスターからの代表的な構造を、ＡｍｂｅｒＴｏｏｌｓからのｃｐｐｔｒａｊを用いて選択して、分子ドッキング段階のために用意した。

【0065】

ＡＢ－０００１１７７８化合物を、５００回の独立した遺伝的アルゴリズム実行によるＧＯＬＤからのＰＬＰスコアリング関数を使用して、各変異体の構造にドッキングさせた。分子を（１）Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面；（２）Ｓ－ＲＤＢ単独にドッキングさせた。表３は、最初の非変異Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面に対して得られた値と比べた、２つの分子を異なる多様体にドッキングさせた場合に得られた最良のスコアを示す。オミクロン多様体の場合、クラスター分析は、Ｌｕｐａｌａらによって行われた５００ｎｓのＭＤシミュレーション軌道に対して行った（Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｎ ＲＢＤ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｏｍｉｃｒｏｎ ｖａｒｉａｎｔ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０２２）５９０、３４－４１（［１４］））。

【0066】

【表3】

【0067】

表３に示される結果は、分子が高いドッキングスコアで、異なる変異体に一貫して結合することができることを示しており、これらの分子がさまざまな変異体においてＳ／ＡＣＥ２会合を損なうのに有効となり得るという考えを補強している。

【0068】

これを確認するために、本発明者らは、肺Ａ５４９－ＡＣＥ２において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の４つの主要な循環型、すなわち、元のＷｕｈａｎ株、アルファ、デルタ及びオミクロンウイルスに対してＡＢ－０００１１７７８薬を試験した。分子はまた、Ｗｕｈａｎ株と比べ、非常に類似した有効性ですべての多様体のウイルス複製を遮断することができることが判明し、ＩＣ_５０＝０．５～１μＭをもたらした（図８を参照）。注目すべきことに、図８に示されるように、同様の効果が、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳ２膜プロテアーゼの両方を発現するＡ５４９細胞において観察され、このことは、この薬物が、初期のＳ／ＡＣＥ２会合に対するその効果から予想されるように、天然のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入経路を阻害するのに有効であることを示唆する。

【0069】

まとめると、これらのデータにより、ＡＢ－０００１１７７８が主要な現在のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効であり、可能性として、個別のＳ／ＡＣＥ２界面に同時に作用することによって、元の侵入阻害機構を示すことが示される。したがって、この化合物は、新しいＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入阻害剤として、ＡＣＥ２ヒト化動物モデル及び将来の臨床試験における更なる評価のための強力な候補を構成する。

【0070】

効率的なＡＢ０００１１７７８類似体の選択
この分子の化学構造に基づいて、本発明者らは、最初のＡＢ－０００１１７７８化合物からいくつかの誘導体を設計する（図９－１と図９－２における、それらの名称及び構造を参照）。

【0071】

選択化合物を、最初に、１０μＭ濃度を使用して図１０のように、又は２．５μＭ及び５μＭ濃度を使用して図１５のように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＬＶ感染性アッセイにおいてスクリーニングした。試験したすべての薬物のうち、３つが細胞毒性であることが判明し、更に検討することができなかった。３つの誘導体、すなわちＡＢ－０００１１７８＿４、ＡＢ－０００１１７８＿２及びＡＢ－０００１１７８＿６は、ＨＥＫ－２９３Ｔ－ＡＣＥ２又はＡ５６９－ＡＣＥ２細胞モデルにおけるＬＶ感染性の阻害において、主要化合物よりも効率的であった（図１０Ａ及び１５）。一層幅広い濃度範囲で行った感染性アッセイにより、どちらの類似体も最初の分子よりも４～６倍、有効であることが認められた（図１０Ｂ）。

【0072】

類似体とＳ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２、Ｓ－ＲＤＢ単独との相互作用、及びＡＣＥ２単独への比較ドッキングの分析。
実験的研究から浮上する仮説の１つは、界面の異なる構成成分、すなわち（１）Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面；（２）Ｓ－ＲＤＢ単独；（３）ＡＣＥ２単独選択分子に同時に結合して標的する能力であった。これらの３つの会合様式の複合効果が、観察された阻害作用に寄与し得ることが示唆された。その仮説を評価するために、ＡＢ－０００１１７７８化合物を：（１）Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面；（２）Ｓ－ＲＤＢ単独；（３）ＡＣＥ２単独にドッキングした。（２）及び（３）に関すると、ドッキングのための空洞は、形成された複合体における他のパートナーの既知の結合領域（すなわち、Ｓ－ＲＤＢモデル（２）の場合、ＡＣＥ２、及びＡＣＥ２モデル（３）の場合、Ｓ－ＲＤＢ、プラス１０Åの半径）に基づいて画定した。ＧＯＬＤからのＰＬＰスコアリング関数を、５００回の独立した遺伝的アルゴリズム実行と共に使用した。後に、同じ手順をＡＢ－０００１１７７８＿２及びＡＢ－０００１１７７８＿６に拡張した。結果が、表４に示されている。

【0073】

【表4】

【0074】

表４に示されている結果は、最良のドッキングスコアが、Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面に対するすべての分子について観察されるが、これらの分子はすべて、Ｓ－ＲＤＢ単独に対して、興味深いことにＡＣＥ２単独に対して高い親和性を示すことを示している。ＡＢ－０００１１７７８＿２及びＡＢ－０００１１７７８＿６に関すると、Ｓ－ＲＤＢ及びＡＣＥ２単独に対して得られたスコア値は非常に類似する。総合的に、これらの結果は、これらの分子がＳ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２会合に関与する異なる成分を標的することができるという提案された仮説と一致し、観察された効果が、界面及び個々の構成成分に対する異なる結合様式の組合せ作用から生じ得ることを示唆する。

【0075】

相互作用解析に関して（図１１～１２を参照）、Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２間の界面におけるＡＢ－０００１１７７８＿２の最良ドッキングポーズは、ＧＯＬＤ／ＰＬＰスコアリング関数を使用すると、７２．１５のスコアをもたらした。複数の水素結合が確立される。残基ＡＣＥ２のＬｙｓ３５３、並びにＳ－ＲＤＢのＳｅｒ４９４及びＧｌｙ４９６は、フェノール基の１つと、１．８４Å、３．２８Å及び２．６７Åの相互作用距離で相互作用する。ＡＣＥ２のＡｓｎ３３は、２．３８Åの距離で第三級アミンの１つと相互作用する。最後に、Ｓ－ＲＤＢのＡｒｇ４０３は、３．６０Åの距離で他の第三級アミンと相互作用する。残基ＡＣＥのＡｓｐ３０及びＳ－ＲＤＢのＧｌｕ４０６もまた、第三級アミンと相互作用する。ＡＣＥ２のＨｉｓ３４は、インドール基とのπ－πスタッキング相互作用を確立し、Ｓ－ＲＤＢのＬｙｓ４１７は、π－カチオン相互作用を介して他のインドール基と相互作用する。最後に、ＡＣＥ２のＧｌｕ３７及びＳ－ＲＤＢのＬｙｓ４１７は、疎水性相互作用する。

【0076】

Ｓ－ＲＤＢ単独へのＡＢ－０００１１７７８＿２のドッキングは、６３．９０のスコアをもたらした。水素結合が、Ｇｌｙ４９６とフェノール基の１つとの間に形成され、１．８２Åの長さを有する。他方のフェノール基は、Ｇｌｎ４０９及びＬｙｓ４１７と水素結
合を確立し、２．５５Å及び２．２０Åの長さを有する。Ｔｙｒ５０５は、π－πスタッキング相互作用を介してインドール基と相互作用する。ＡＢ－０００１１７７８＿２とＬｙｓ４１７との間に疎水性相互作用が生じる。

【0077】

Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面へのＡＢ－０００１１７７８＿６の最良のドッキングポーズは、６９．５６のスコアを生じた。複数の水素結合が、ＡＢ－０００１１７７８＿６と２つのタンパク質との間に形成されていることを観察することができる。ＡＣＥ２のＡｓｐ３８及びＳ－ＲＤＢのＧｌｙ４９６は、フェノール基の１つと、それぞれ４．０２Å及び２．０９Åの相互作用距離で水素結合を確立している。ＡＣＥ２のＡｓｎ３３は、２．５７Åの距離で第三級アミン基と相互作用する。最後に、Ｓ－ＲＤＢのＡｒｇ４０３は、インドール基からの窒素と２．５２Å長の水素結合を形成する。ＡＣＥ２のＡｓｐ３０と第三級アミンとの間に１つの塩橋が形成され、Ｌｙｓ４１７とインドール基の１つとの間にπ－カチオン相互作用が生じる。ＡＣＥ２のＧｌｕ３７及びＴｙｒ７８もまた、疎水性相互作用を介してＡ０３－６と相互作用する。

【0078】

Ｓ－ＲＤＢとドッキングしたＡＢ－０００１１７７８＿６は、６０．３４のスコアを有した。ＡＢ－０００１１７７８＿６とＳ－ＲＤＢとの相互作用は、ＡＢ－０００１１７７８＿２で観察されたものと非常に類似している。Ｇｌｙ４９６は、１．８４Åの長さでフェノール基の１つと相互作用し、Ｇｌｎ４０９及びＬｙｓ４１７は２．５８Å及び２．１４Åの相互作用の長さで、他のフェノール基と相互作用する。Ｔｙｒ５０５もまた、π－πスタッキング相互作用を介してインドール基の１つと相互作用する。Ｌｙｓ４１７は、疎水性相互作用を介して、Ａ０３－６と相互作用する。

【0079】

次に、２つの類似体とＡＣＥタンパク質単独との相互作用を調べた（図１３～１４を参照）。ＡＣＥ２タンパク質単独へのＡＢ－０００１１７７８＿２のドッキングの最良の立体配座は、６１．５０のスコアをもたらした。Ｌｙｓ３１とフェノール基の１つとの間に、２．６９Åの長さで水素結合が形成され、Ｔｙｒ８３と中央のピリジン基に由来する窒素との間に、２．８４Åの距離で水素結合が形成される。Ａｓｐ３０は、第三級アミンの１つと塩橋を形成し、Ｌｙｓ３１は、インドール基の１つとπ－カチオン相互作用を確立する。ＡＢ－０００１１７７８＿２とＡＣＥ２のＧｌｎ２４及びＬｙｓ３１との間に疎水性相互作用が生じる。

【0080】

ＡＣＥ２へのＡＢ－０００１１７７８＿６のドッキングは、５９．７４という最良スコアをもたらした。Ａｓｐ３０とフェノール基の１つとの間に、１．６４Åの距離で水素結合が形成される。Ｌｙｓ３１と中央のピリジン基との間に、１．９６Åの長さの他の水素結合を確立した。Ｇｌｕ３５は、インドール基の１つに由来する窒素と３．０８Åの距離で相互作用する。１．８４Åの長さを有する最後の水素結合の１つは、Ｌｙｓ３５３と他のフェノール基との間に形成される。最後に、疎水性相互作用が、ＡＢ－０００１１７７８＿６とＴｈｒ２７、Ｌｙｓ３１、Ｈｉｓ３４及びＡｓｐ３８との間で起こる。３つの残基が、ＡＣＥ２とＳ－ＲＤＢとの間の相互作用に関与することが報告されているので、これらは非常に重要である。これらは、Ｇｌｕ３５、Ａｓｐ３８及びＬｙｓ３５３である。

【0081】

まとめると、これらのすべてのデータにより、本選択薬物が現在のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のすべてに対して有効であり、可能性として、個別のＳ／ＡＣＥ２界面に同時に作用することによって、元の侵入阻害機構を示すことが示される。

【0082】

考察
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ／ＡＣＥ２媒介性侵入は、依然として、治療においてまだ利用されていない主要な抗ウイルス標的である。本発明者らは、レンチウイルスベースの偽ウイルス感染性アッセイにおいて強力な侵入阻害を示す薬物を特定した。ＶＳＶｇ ＬＶ
と比較した場合のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＬＶ感染性の特異的阻害は、選択薬物が、このモデルにおいて繰り返された初期Ｓ／ＡＣＥ２依存性侵入過程を標的とすることを示唆した。阻害機構に対する最も簡単な説明は、Ｓ／ＡＣＥ２界面への薬物の結合によるＳ／ＡＣＥ２会合が遮断されることである。生化学的手法により、Ｓ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２相互作用の遮断に薬物の直接的な効果があることが確認された。２つの化合物はまた、可溶性Ｓ－ＲＢＤとＨＥＫ－２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞の表面で発現されるＡＣＥ２受容体との間の相互作用を阻害することが示され、生理学的条件においてＳ／ＡＣＥ２複合体の形成を妨害するそれらの能力が裏付けられた。Ｓ／ＡＣＥ２複合体形成の速度論的パラメータに対する薬物の効果の詳細な分析により、それらの薬物が２つのパートナー間の会合を阻止するだけでなく、複合体の安定性も低下させることができることが示された。これらのデータは、Ｓ／ＡＣＥ２複合体構造に対して、並びにＳ－ＲＤＢ及びＡＣＥ２タンパク質単独に対して行われた分子ドッキング計算と完全に一致しており、どちらの薬物もウイルスタンパク質及び細胞タンパク質と接触し得ることを示している。

【0083】

選択薬物が潜在的な抗ウイルスリード化合物になり得るかどうかを判定するため、本発明者らは、元来、感受性の高い細胞を含むさまざまな細胞系を使用して野生型ウイルス複製に対して上記の選択薬物を試験した。データは、どちらの薬物も肺のＡ５４９－ＡＣＥ２及びＣａｌｕ３細胞におけるウイルスの複製を遮断又は低減することができたことを裏付けている。ＡＢ－０００１１７７８化合物は、１μＭにおいて、６０～４０％阻害に達する効率的な遮断効果を維持した。全体として、本薬物は、有意な細胞毒性を示すことなく、すべての細胞株の間で０．２５～５μＭのＩＣ_５０を示し、これらの薬物が選択性指数＞１０に達することが可能であった。特に、ＡＢ－０００１１７７８化合物は、すべての細胞系において、ＳＩ＞３０～１２０で阻害効果があることを示した。ＡＢ－０００１１７７８化合物の阻害効果を更に分析した結果、この化合物はまた、ウイルス侵入を指示することが示されたＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳ２の両方を発現するものを含む、肺細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の主要な循環形態であるＷｕｈａｎ、アルファ、デルタ及びオミクロンの複製を遮断することができることが分かった（Ｋｏｃｈら（２０２１）ＴＭＰＲＳＳ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｉｃｔａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｎｔｒｙ ｒｏｕｔｅ
ｕｓｅｄ ｂｙ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．、４０（［８］））。これらのデータは、薬物がウイルスの異なる侵入経路を遮断することができることを示す。これらのデータをまとめた結果、ＡＢ－０００１１７７８化合物が更なる開発のための良好なリード化合物候補であることが判明した。

【0084】

より深い分子ドッキング分析により、本発明者らは新規な潜在的に有効な分子を設計することが可能となった。特に、ＡＢ－０００１１７７８のインドール構造は、以前に報告された合成手法（［１］）を使用する新規化合物の設計のための興味深い骨格を提供する。これらの新しい設計に基づくと、本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞におけるＳＡＲＳ－ｃｏＶ－２ ＬＶ感染性の遮断において最初の化合物よりも４～６倍、有効な２つの更なる誘導体、すなわちＡＢ－０００１１７７８＿２及びＡＢ－０００１１７７８＿６を選択した。これにより、構造活性相関研究の間に、ＡＢ－０００１１７７８のリード化合物の位置、及び一層高い阻害能力を有する新規分子を特定することができることが完全に裏付けられた。注目すべきことに、野生型ウイルス複製に対して活性な分子の選択はまた、この研究において使用される総合的な戦略及びスクリーニングパイプラインを検証する。これは、選択化合物のリストが、まだ検証されていないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入阻害剤としての更なる潜在的な候補を提供し得ることを示唆している。

【0085】

興味深いことに、この研究において報告された分子モデル化研究は、選択された薬物がＳ及びＡＣＥ２タンパク質のどちらとも相互作用し得ることを示唆している。これは、分子がＳ／ＡＣＥ２複合体の形成を妨害し、形成された複合体の安定性を低下させるおそれがあることを示すＢＬＩデータと完全に一致する。これは、耐性緊急性を低下させること
に加えて、阻害効力を向上させるさまざまなＳ／ＡＣＥ２界面の同時遮断の独自の阻害機構を構成し得る。

【0086】

最近、認可されたレムデシビル及びＰａｘｌｏｖｉｄ（登録商標）とは別に、潜在的なＣＯＶＩＤ治療剤として有効な薬物は検証されていない。本明細書において報告される化合物は、Ｓ／ＡＣＥ２界面を特異的に標的化することによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入ステップに作用する最初の分子を構成し、これらの化合物は非常に有望な薬剤となる。ＡＢ－０００１１７７８とレムデシビルとリトナビル（Ｐａｘｌｏｖｉｄ（登録商標）に含まれる２種の抗プロテアーゼの１種）との間の比較は、レムデシビルが、依然として、本発明者らのアッセイにおいて最も有効な分子であるが、ＡＢ－０００１１７７８は、ヒト肺Ａ５４９－ＡＣＥ２細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製の阻害において、リトナビル分子よりも有効であったことを示した。注目すべきことに、異なる複製工程に作用する別目的のレメデシビル（Remedesivir）薬及びリトナビル薬とは対照的に、ＡＢ－０００
１１７７８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入を遮断するために特に選択され、まだ最適化されていない元の分子である。さまざまな細胞系においてこれらの分子に観察された細胞毒性の欠如又は低さはまた、それらの抗ウイルス特性及び治療効力を完全に評価するため、将来の動物モデル研究及び臨床試験への道を開く。選択薬物によるＳ／ＡＣＥ２相互作用の阻害の根底にある分子機構の更なる特徴付けにより、この元の抗ウイルスプロセスの最適化が確実に可能になり、新規な有望薬剤につながる。

【0087】

物質及び方法
リード化合物の分子ドッキング
ＡＢ－０００１１７７８化合物の分子ドッキングを行うため、ＧＯＬＤからのＰＬＰスコアリング関数を５００回の独立した遺伝的アルゴリズム実行と共に使用した。分子を以下：（１）Ｓ－ＲＤＢ／ＡＣＥ２界面；（２）Ｓ－ＲＤＢ単独；（３）ＡＣＥ－２単独にドッキングさせた。（２）及び（３）に関すると、ドッキングのための空洞は、形成された複合体における他のパートナーの既知の結合領域（すなわち、Ｓ－ＲＤＢモデル（２）の場合、ＡＣＥ２、及びＡＣＥ２モデル（３）の場合、Ｓ－ＲＤＢ、プラス１０Åの半径）に基づいて画定した。後に、同じ手順をＡＢ－０００１１７７８＿２及びＡＢ－０００１１７７８＿６に拡張した。相互作用の分析は、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｒを活用して行った（Ａｄａｓｍｅら（２０２１）ＰＬＩＰ ２０２１：ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｃｏｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｒ ｔｏ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、４９、Ｗ５３０－Ｗ５３４（［９］））。

【0088】

化学物質
ビス－インドリルピリジン及びその誘導体は、Ｊａｃｑｕｅｍａｒｄら（［１］）及びＭａｈｂｏｏｂｉら（［１３］）によって以前に報告されたとおりに合成した。すべての薬物を１００％ＤＭＳＯであらかじめ希釈し、同じＤＭＳＯ濃度を維持し、かつ薬物の沈殿を回避するために、同じ体積の各連続予備希釈物をアッセイに加えた。

【0089】

タンパク質及び抗体
既に記載した最小受容体結合モチーフを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（４３８－５１６）Ｓ－ＲＢＤ（ＨｉＳ）_６（（［３］）；Ｗｒａｐｐら（２０２０）Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ２０１９－ｎＣｏＶ ｓｐｉｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６７、１２６０－１２６３（［１０］））、及びビオチン化（biotynilated）ヒトＡＣＥ２は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した（各参照番号１６５３４２０４及び１６５４５１６４）。モノクローナル抗６×Ｈｉｓタグ抗体は、ＡＢＣＡＭから購入した（参照番号ａｂ１
８１８４、希釈１／２００）。抗α－チューブリン抗体は、Ｓｉｇｍａから購入した（参照番号Ｔ６１９９、希釈１／５００）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８に結合した二次ヤギ抗マウス抗体は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した（参照番号Ａｌｌｏ２ｇ、希釈１／４００）。

【0090】

ＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合アッセイ
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ開発を、６ｘ－Ｈｉｓタグに融合した組換えＳ最小結合ドメイン（ＲＢＤ）（Ｓ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６）及びビオチン化ヒトＡＣＥ２タンパク質（ＡＣＥ２－Ｂｉｏｔ）を使用して、以前（［２］）に記載されたとおりに行った。結合条件は、２０μｌの最終反応体積で３８４ウェルプレート（ｗｈｉｔｅ ＯｐｔｉＰｌａｔｅ、参照番号６００７２９０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）における使用するよう適合させた。各組換えタンパク質について、交差滴定実験を用いて、３ｎＭの最適最終濃度をあらかじめ確立した。タンパク質を結合緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）に希釈した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ競合アッセイを行うため、漸増濃度のＡＢ－０００１１７７８薬（１～２５μＭ、１％ＤＭＳＯ最終濃度）をＳ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６と共に３０分間、事前インキュベートした後、ＡＣＥ２－Ｂｉｏｔと室温で回転させながら、２時間、混合した。次に、５μＬの抗６×Ｈｉｓ受容体タービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、参照番号ＡＬ１７８）を添加し、回転させながら室温で１時間インキュベートした後、５μＬのストレプトアビジン供与体受容体ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、参照番号６７６０００２）もウェルに混合した。これにより、各ビーズについて２０μｇ／ｍＬの最終濃度が確立された。次いで、プレートを暗所中、室温で１時間、インキュベートした後、ＥｎＳｐｉｒｅマルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナルを検出した。結合緩衝液を含むネガティブ対照を使用して、アッセイ品質を制御した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０１ソフトウェアで分析した。化合物を用いて得られたＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合データを、１％ＤＭＳＯ対照条件と比較した。

【0091】

ヒット検証のため、ＴｒｕＨｉｔカウンターアッセイキット（参照番号ＡＬ９００Ｄ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合アッセイと同じ作業希釈でビオチン－ＢＳＡ受容体及びストレプトアビジン供与体ビーズと共にＡＢ－０００１１７７８薬をインキュベートすることによって実施した。この検証アッセイでは、本化合物がシグナルの低下を引き起こす場合、これは、この化合物が、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ読み出しを妨害し、したがって、この化合物が目的の特定の標的に関連しないことを意味する。

【0092】

バイオレイヤー干渉法結合アッセイ
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）実験は、ＢＬＩｔｚ機器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）で行い、Ｓ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６のＡＣＥ２－Ｂｉｏｔへの結合を測定した。ＢＬＩアッセイは、薬物を用いた競合結合分析用に、一部の改変を伴う以前に記載されたように（［２］）設定した。すべての試料希釈及びベースライン工程は、同じ反応緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）を用いて行った。ストレプトアビジンバイオセンサー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、参照番号１８－５０１９）を最初に反応緩衝液で１０分間、あらかじめ湿潤し、次いで、約３ｎｍの結合値に達するよう、１μＭのＡＣＥ２－Ｂｉｏｔをコーティングされたバイオセンサー上に、５００秒間、ロードした。競合動態分析のために、本発明者らの以前のＢＬＩ結合研究に準拠して、タンパク質試料を５０ｎＭのＳ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６の濃度で調製し、漸増濃度（０～２５μＭ）のＡＢ－０００１１７７８薬と共に室温で１５分間、プレインキュベートした。結合速度を３段階に分けた。最初に、反応緩衝液によるベースラインを６０秒間、測定した。会合工程のために、それぞれロードしたバイオセンサーを、薬物又は対照としてのＤＭＳＯを含むＳ－ＲＢＤ試料中に、２
２００ｒｐｍの振とう速度で３００秒間、浸漬した。最後に、バイオセンサーを反応緩衝液中に戻して３００秒間、浸漬することによって、結合したＳ－ＲＢＤ（Ｈｉｓ）_６の解離工程をモニタリングした。系統的ベースラインドリフト補正は、ＡＣＥ２をロードしたが反応緩衝液とインキュベートしたバイオセンサーに対して記録されたシフトを減算することによって行った。会合及び解離実験曲線を、Ｂｌｉｔｚ ｐｒｏ １．１ソフトウェアを用いる１：１の結合モデルを使用して局所当てはめを行い、速度論的結合パラメータ（ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ）を２～３回の独立実験の平均値として求めた。Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして計算される、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）。センサーグラム曲線は、Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してプロットした。

【0093】

細胞及びレンチウイルスベクターの産生
レンチウイルスベクターの産生は、サービスプラットフォームＶｅｃｔ’ＵＢ（ＩＮＳＥＲＭ ＵＳ ００５－ＣＮＲＳ ＵＭＳ ３４２７－ＴＢＭ－Ｃｏｒｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｂｏｒｄｅａｕｘ、フランス）によって行った。レンチウイルス粒子を、標準的なプロトコルに従って、ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児由来腎臓細胞）の一過性トランスフェクションによって産生した。簡潔に述べると、サブコンフルエントＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、レンチウイルスゲノム（ｐｓＰＡＸ２）（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏからの贈与（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２２６０））、エンベロープコードプラスミド（ｐＭＤ２Ｇ－ＶＳＶＧ又は野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＨＤＭ＿ＩＤＴスパイク＿ｆｉｘＫ（Ｂｌｏｏｍ’ｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの贈与）（［４］）））及びベクター構築物（４４：ｐＲＲＬＳＩＮ－ＰＰＴ－ｈＰＧＫ－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ又はｐＨＡＧＥ＿ＥＦ１ａｌｎｔ＿ＡＣＥ２＿ＷＴ）を用いてリン酸カルシウム沈殿によって同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にＬＶを回収し、超遠心分離によって濃縮した。ＶＳＶ－ｇ偽型ｐＬＶレンチベクターのウイルス力価を、ウイルス上清の段階希釈によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入することによって求め、ｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリー分析によって５日後に定量した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク偽型に関しては、酵素結合免疫吸着検査法（Ｉｎｎｏｔｅｓｔ ＨＩＶ Ａｇ ｎＡｂ；Ｆｕｇｉｂｉｏ、フランス）によって、ｐ２４抗原レベルを濃縮後のウイルス上清中で測定し、各レンチウイルス上清のｐ２４抗原レベルを、同時に産生された同様のＶＳＶ－ｇ偽型レンチウイルス上清と比較することによってウイルス力価を推定した。

【0094】

ＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞系は、ｐＨａｇｅ＿ＥＦ１ａｌｎｔ＿ＡＣＥ２＿ＷＴプラスミド（Ｂｌｏｏｍ ｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの寄贈（［４］））を用いたレンチウイルス形質導入によって産生した。次いで、６ウェルプレートにおいて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０００００個の細胞）に最適化濃度のＡＣＥ２レンチウイルス粒子を形質導入した。形質導入の有効性を、感染させて１０日後にリアルタイムＰＣＲを用いて評価した。１コピー細胞系と比較するΔＣｔ法を用いるｑ－ＰＣＲによって、この細胞系由来のＡＣＥ２プロウイルスＤＮＡを定量した。プロウイルスの単一統合コピーを含む、２種の異なる細胞クローン（ヒト２９３Ｔ及びＫ５６２細胞）由来のＤＮＡを標準化細胞系として使用した。ＨＥＫ２９３Ｔを、１％ペニシリン－ストレプトマイシン及びＦＢＳ（ウシ胎児血清）１０％を補給したＤＭＥＭ培地中で培養した。

【0095】

１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補給したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、Ａ５４９細胞（ヒト肺胞基底上皮癌）、Ｃａｌｕ３（ヒト気管支上皮癌）及びＶｅｒｏ Ｅ６細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）を維持した。

【0096】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２相互作用のインセルロでのイメージング
。
１００００個のＨＥＫ２９３Ｔ及びＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２を、ポリ－Ｌ－リジン溶液０．０１％（Ｓｉｇｍａ、参照Ｐ４８３２）により、５分間、室温で事前処理したカバーガラス上にプレーティングした。２４時間後、ＲＢＤ組換えタンパク質（４～４０ ｐｍｏｌｅ）を１００μＩのＰＢＳ中の細胞に加えた。次に、細胞を洗浄し、さまざまな時間点において固定した（ＰＦＡ４％）。細胞イメージングを上記のとおり実施した。

【0097】

細胞状況におけるＳ－ＲＢＤ／ＡＣＥ２相互作用を定量するために、４５０００個のＨＥＫ２９３Ｔ及びＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞を、１００μｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）及び漸増濃度のＲＢＤ組換えタンパク質中、３７℃で４５分間、インキュベートした。１ｍｌのＰＢＳを添加し、細胞を２，５００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。ＤＥＭＥ中の５０μｌの抗Ｈｉｓ抗体（１／２００）を添加し、細胞を３７℃で４５分間更にインキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、二次抗体の１／４００ＤＭＥＭ溶液５０μｌを添加し、細胞を３７℃で３０分間、インキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、細胞を２００μｌのＰＢＳ、ＦＢＳ２％、ＥＤＴＡ２ｍＭに再懸濁し、ＦＩＴＣ陽性細胞の割合をフローサイトメトリーによって定量した。

【0098】

細胞毒性アッセイ
ＭＴＴ細胞生存率アッセイを、提供者のプロトコルにしたがって行った。１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、米国）及び１％Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、米国）を補給した１００μＬの完全ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、米国）を含有する９６ウェルプレートに、２０，０００個の細胞／ウェルの密度で細胞を播種した。細胞を、接着のため、加湿５％ＣＯ_２インキュベータ中、３７℃で１２時間インキュベートした。１２時間のインキュベーション後、培地を新しい培地と交換し、細胞を化合物で処理した。未処理細胞をネガティブ対照とみなし、ＤＭＳＯ処理細胞をビヒクルとみなした。処理後、細胞を加湿５％ＣＯ_２インキュベータ中、３７℃でインキュベートした。処理４８時間後、２０μＬのＭＴＴ基質（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、暗所中、３７℃で更に４時間、インキュベートした。次に、培地を注意深く除去し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。

【0099】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２産生
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株である２２０＿９５（ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４６９２８４）は、Ｓｅｒｖｉｃｅ ｄｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｐａｒｉｓ）で採集された鼻咽頭スワブ検体から単離され、既に記載されたように増殖させた（Ｏｎｏｄｉら、（２０２１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｐｒｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｖｉａ ＵＮＣ９３Ｂ ａｎｄ ＩＲＡＫ４．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２１８（［１１］））。手短に述べると、ウイルスを、ＤＭＥＭ－２％（２％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓを補給したＤＭＥＭ）中、Ｖｅｒｏ Ｅ６上で増殖させた。８０，０００×ｇ、４℃で２時間の超遠心分離によって、２０％スクロースクッションに通してウイルスを精製した。ペレットを、一定分量に分けたＨＮＥ １Ｘ（ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ、ＮａＣＩ１００ｍＭ ＥＤＴＡ０．５ｍＭ）に再懸濁し、－８０℃で保存した。

【0100】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染アッセイ
１２ウェルプレートにおいて、増殖させたＡ５４９－Ａｃｅ２及びＣａｌｕ３細胞を、表示した薬物の存在下、０．０５のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により、又は対照としてＤＭＳＯにより試した。３時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、新しい培地でインキュベートした。感染の過程全体を通して化合物を維持した。

【0101】

生産的ウイルス複製を評価するために、本発明者らは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって、感染
して２４時間後、感染している間の感染性ウイルス粒子の放出量を定量した。ウイルスは、最初に、上清ｖ／ｖをＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）と共に室温で撹拌しながら３０分間インキュベートすることによって不活化した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０サーモサイクラー（Ｒｏｃｈｅ）において、Ｌｕｎａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、Ｅ遺伝子を標的とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的プライマーを使用することによって、ウイルスＲＮＡの収量をリアルタイムｑＰＣＲによって定量した。ウイルスゲノムの数はＰＦＵ当量／ｍｌとして表し、Ｇｏｒｄｏｎらによって記載されている既知の力価を有するウイルス保存液から同様に処理した上清を用いて標準曲線を行うことによって計算した（Ｇｏｒｄｏｎら（２０２０）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｈｏｓｔ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｒｅｖｅａｌ ｐａｎ－ｖｉｒａｌ ｄｉｓｅａｓｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｅ９４０３（［１２］））。

【0102】

参照文献リスト
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【0103】

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【0104】

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１４．Ｌｕｐａｌａ，Ｃ．Ｓ．，Ｙｅ，Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｓｕ，Ｘ．－Ｄ．ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｈ．（２０２２）Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｎ ＲＢＤ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｏｍｉｃｒｏｎ ｖａｒｉａｎｔ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５９０，３４－４１．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【国際調査報告】