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特表2024-539432インターロイキン１５を有効成分とする融合タンパク質構築物およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-28
(54)【発明の名称】インターロイキン１５を有効成分とする融合タンパク質構築物およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241018BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241018BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241018BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241018BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20241018BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241018BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241018BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241018BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20241018BHJP
C07K 14/54 20060101ALN20241018BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20241018BHJP
C12N 15/24 20060101ALN20241018BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20241018BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20241018BHJP
C07K 14/715 20060101ALN20241018BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241018BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C12N15/62 Z
C12P21/08
C12P21/02 C
C12P21/02 K
A61K38/20
A61K47/68
A61P35/00
A61K39/395 N
C07K16/28
C07K14/54
C12N15/13
C12N15/24
C12N15/63 Z
C12N5/10
C07K14/715
C12N15/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024529257
(86)(22)【出願日】2022-11-15
(85)【翻訳文提出日】2024-07-12
(86)【国際出願番号】 CN2022132019
(87)【国際公開番号】W WO2023083379
(87)【国際公開日】2023-05-19
(31)【優先権主張番号】202111346279.5
(32)【優先日】2021-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202211013404.5
(32)【優先日】2022-08-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】302037630
【氏名又は名称】中国科学院生物物理研究所
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１５， Ｄａｔｕｎ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１ ＣＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100201732
【弁理士】
【氏名又は名称】松縄 正登
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(74)【代理人】
【識別番号】100227019
【弁理士】
【氏名又は名称】安 修央
(72)【発明者】
【氏名】フ、ヤンシン
(72)【発明者】
【氏名】ペン、フア
(72)【発明者】
【氏名】シェン、ジャオ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG03
4B064AG20
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA06
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA41
4C084CA53
4C084DA12
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB41
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG06
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045DA02
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
インターロイキン１５を有効成分とする融合タンパク質構築物およびその使用に関する。具体的には、前記融合タンパク質構築物は、（１）インターロイキン１５（ＩＬ－１５）受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインである第１の構造単位と、（２）ＩＬ－１５である第２の構造単位と、（３）抗体Ｆｃまたは変異Ｆｃ断片である第３の構造単位と、重要なリンク断片１とを含み、前記リンク断片１のアミノ配列はＧＧＧＧＳの整数多重反復である。
【選択図】図２１
【選択図】図２１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）インターロイキン１５（ＩＬ－１５）受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインである第１の構造単位と、（２）ＩＬ－１５である第２の構造単位と、
（３）抗体のＦｃ断片または変異Ｆｃ断片である融合タンパク質のＮ末端に位置する第３の構造単位と、
（４）前記第１の構造単位と前記第２の構造単位を連結する第２リンカー、のブロックを含み、
第１リンカーは、前記融合タンパク質のＣ末端が前記第１の構造単位である場合、前記第２の構造単位と前記第３の構造単位を連結し、
前記第１リンカーは、前記融合タンパク質の前記Ｃ末端が前記第２の構造単位である場合、前記第１の構造単位と前記第３の構造単位を連結し、
前記第１リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎによって表されるＧＧＧＧＳの整数多重反復であるアミノ酸配列を有し、好ましくはｎは１～７の任意の整数であり、より好ましくはｎは１～５の任意の整数であり、最も好ましくはｎは３である、融合タンパク質。
【請求項2】
さらに（５）治療用抗体のＦａｂである前記第３の構造単位の前記Ｎ末端に連結された第４の構造単位、のブロックを含み、
前記治療用抗体は、特に限定されないが、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１抗体、Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、および抗ＥＧＦＲ抗体が挙げられ、
好ましくは、前記治療用抗体の前記Ｆａｂは、抗ＰＤ－１ Ｆａｂ（ＰＤ１抗体のＦａｂ）である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記抗ＰＤ－１ Ｆａｂは、重鎖（可変領域＋定常領域）および軽鎖（可変領域＋定常領域）を含み、前記重鎖は前記融合タンパク質の前記Ｎ末端に位置する、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記ＩＬ－１５は、配列番号１または配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するマウス由来またはヒト由来のＩＬ－１５であり、前記ＩＬ－１５受容体サブユニットαの前記ｓｕｓｈｉドメインは、マウス由来またはヒト由来のＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインであり、好ましくは、前記マウス由来またはヒト由来のＩＬ－１５受容体サブユニットαの前記ｓｕｓｈｉドメインは配列番号３または配列番号１７に示すアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｃ断片または変異Ｆｃ断片は、配列番号２または配列番号１６に示すアミノ酸配列を有し、
前記第２リンカーは、配列番号６に示すアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記抗ＰＤ－１ Ｆａｂは、マウス由来またはヒト由来の抗ＰＤ－１ Ｆａｂであり、好ましくは、前記抗ＰＤ－１ Ｆａｂは、配列番号４、配列番号１８、または配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を有し、
前記抗ＰＤ－１ Ｆａｂは、配列番号５、配列番号２０、または配列番号２１に示すアミノ酸配列を有する重鎖を有する、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
その単量体同士が前記第３の構造単位の二量体化を介して互いに連結されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質で構成されるホモ二量体。
【請求項7】
（１）ホモ二量体１（Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５）前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインと、第２リンカーと、ＩＬ－１５とを含み、好ましくは配列番号７に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体１、
（２）ホモ二量体２（Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体２、
（３）ホモ二量体３（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５）
前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインと、第２リンカーと、ＩＬ－１５とを含み、好ましくは、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体３、
（４）ホモ二量体４（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体４、
（５）ホモ二量体５（Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）３）と、マウス由来またはヒト由来ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体５、
（６）ホモ二量体６（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）３）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体６、
（７）ホモ二量体７（Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）５）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体７、または
（８）ホモ二量体８（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）５）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体８、である請求項６に記載のホモ二量体。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド断片。
【請求項9】
医薬の製造における、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項６～７のいずれか一項に記載のホモ二量体の使用であって、好ましくは、前記医薬が抗腫瘍医薬であり、最も好ましくは、前記医薬がＢ細胞リンパ腫、結腸直腸癌、黒色腫または肺癌に対する医薬である。
【請求項10】
（１）融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを構築する工程であって、好ましくは、前記発現ベクターがｐＥＥ１２．４発現ベクターである工程と、（２）宿主細胞を一過性にトランスフェクトすることによって前記発現ベクターを含む宿主細胞を構築する工程であって、好ましくは、前記宿主細胞が２９３Ｆ細胞である工程と、
（３）前記宿主細胞を培養し、細胞上清を回収する工程と、
（４）タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーカラムにより融合タンパク質を精製する工程と、を含む請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は医学および生物学の分野に属し、具体的には、インターロイキン１５を有効成分とする融合タンパク質構築物およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫チェックポイント療法の急速な発展に伴い、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断抗体は、臨床治療における重要な方法の１つとなっている。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫遮断抗体は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）上の腫瘍の阻害を軽減し、リンパ球の機能を再開して腫瘍を認識し、死滅させる。しかしながら、治療の後期段階では、過剰な活性化のために、Ｔ細胞は徐々に消耗状態に入り、その機能を失う。臨床試験において、腫瘍を有する患者は一般的に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法に対する応答率が低く、耐性または再発のリスクがある。したがって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の臨床適用におけるボトルネックをいかに除去するかが、現在の免疫療法における最も重要な課題となっている。
【0003】
Ｔ細胞増殖因子は、Ｔリンパ球を増殖させる能力のため、免疫療法の重要な標的となっている。その中でも、ＩＬ－２はＴ細胞の増殖に必要なサイトカインであり、悪性黒色腫および腎臓癌に対して米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された最も古い免疫療法薬の１つである。しかしながら、ＩＬ－２は、（１）半減期の短さ、（２）免疫抑制調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性化、（３）活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）による活性化エフェクターＴ細胞の排除、（４）血管内皮細胞の活性化によって引き起こされる重度の毒性副作用の理由から、臨床で広く使用されていない。ＩＬ－１５は別の重要なＴ細胞増殖因子かつ多面的サイトカインであり、自然免疫応答および適応免疫応答を維持および活性化することができる。ＩＬ－１５はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、増殖および生存を促進することができ、記憶Ｔ細胞を活性化および維持することができる。ＩＬ－１５はまた、ＮＫおよびＮＫＴ細胞の活性化および増殖を促進することができる。さらに、ＩＬ－１５はまた、自己分泌方式で樹状細胞の活性化、増殖および分化を促進し、ＭＨＣ－ＩＩおよびＣＤ８０／ＣＤ８６の発現を促進し、樹状細胞の抗原交差提示を改善することができる。ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－１５は腫瘍治療において、（１）ＩＬ－１５は活性化誘導性細胞死を回避し、長寿命記憶Ｔ細胞の生成および定常状態増殖を誘導することができる、（２）ＩＬ－１５はＴｒｅｇを増殖しない、（３）ＩＬ－２は血管内皮細胞に作用することにより全身毒性を引き起こすが、ＩＬ－１５はこの副作用を引き起こさない、という利点を有する。したがって、ＩＬ－１５は、現在、腫瘍免疫療法のための潜在的なサイトカインである。
【0004】
ＩＬ－１５の臨床使用は、主にその短い半減期および低い治療効果によって制限される。一部の研究者は、半減期を延長するためにＩＬ－１５変異をＩＬ－１５ＲαおよびＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（ＡＬＴ－８０３）に連結した。しかしながら、免疫チェックポイント阻害療法と比較して、ＡＬＴ－８０３との併用は大きな利点をもたらさない。同時に、全患者において、全身循環ＮＫ数およびＣＤ８＋Ｔ細胞数の増加が検出され、治療用量でのＩＬ－１５の有意な毒性副作用を示した。現在、多くの前臨床研究は、ＩＬ－１５のその受容体への結合を減少させるためにＩＬ－１５変異を使用する。それにより末梢ＮＫ細胞へのＩＬ－１５の結合を減少させることができるが、ＩＬ－１５の抗腫瘍活性にも影響を及ぼす。さらに、人工修飾ＩＬ－１５は、人体において抗ＩＬ－１５抗体を誘導する可能性も高く、それによって、ＩＬ－１５の治療効果をさらに損なう。
【0005】
一般的な標的として、ＰＤ－１自体は大きな利点を有する。ＰＤ－１は、全身の他の組織と比較して、腫瘍での発現がより高い。より重要なことには、腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞が高レベルのＰＤ－１を発現することにより、αＰＤ－１抗体がキラーＴ細胞集団に直接作用することができる。同時に、αＰＤ－１遮断抗体はまた、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の結合を遮断し、Ｔ細胞の阻害を軽減し、Ｔ細胞の抗腫瘍能力をさらに増強することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上述のように、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体遮断療法の効果は、おそらく漸進的なＴ細胞枯渇のため、有意ではない。Ｔ細胞アゴニストとして、ＩＬ－１５はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進することができるため、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体遮断療法中のＴ細胞の死滅能力を増強し得る。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体－サイトカイン融合タンパク質の概念は非常に一般的であるが、融合タンパク質のほとんどの形態は依然として有意な毒性副作用を生じる。その理由は、サイトカイン受容体（Ｔ細胞やＮＫ細胞に発現するＩＬ－１５受容体など）が広く分布していることと、サイトカインの受容体への親和性が高いこと（Ｋｄ～１０－９Ｍ）にある。結果として、抗体－サイトカイン融合タンパク質において、サイトカインと受容体との間の親和性は抗体と抗原との間の親和性よりも大きい可能性が高いため、有効な腫瘍標的化効果を生じさせることができず、全身注射中に有意な毒性副作用をもたらす。
【0007】
本開示において構築される融合タンパク質の利点は、ｈＩｇＧグロブリンとＩＬ－１５との間の第１リンカーの長さが、立体障害効果によってＩＬ－１５のその受容体ＩＬ－２／１５Ｒβ（ＣＤ１２２）への結合を妨げるように調節されることである。末梢循環する場合、融合タンパク質標的薬は、ＩＬ－１５受容体発現ＮＫ細胞への結合を減少させることにより、末梢毒性副作用を減少させる。腫瘍微小環境において、融合タンパク質はαＰＤ－１抗体を介してＰＤ－１を高発現するＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に結合し、同時に、αＰＤ－１抗体の高親和性を利用することによってＣＤ８＋Ｔ細胞上の受容体へのＩＬ－１５の結合を補助するが、これによりＣＤ８＋Ｔ細胞を特異的に活性化する。αＰＤ－１抗体を利用してＴ細胞上のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の阻害を遮断する一方で、融合タンパク質はＴ細胞の増殖をさらに促進してＩＬ－１５のシグナル伝達を介してＴ細胞の死滅能力を増強するため、末梢毒性副作用を排除しながら、融合タンパク質標的薬の抗腫瘍効果を増強することができる。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本開示は、融合タンパク質に関し、前記融合タンパク質は、
（１）インターロイキン１５（ＩＬ－１５）受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインである第１の構造単位と、
（２）ＩＬ－１５である第２の構造単位と、
（３）抗体のＦｃ断片または変異Ｆｃ断片である融合タンパク質のＮ末端に位置する第３の構造単位と、
（４）前記第１の構造単位と前記第２の構造単位を連結する第２リンカー、のブロックを含み、
第１リンカーは、前記融合タンパク質のＣ末端が前記第１の構造単位である場合、前記第２の構造単位と前記第３の構造単位を連結し、
前記第１リンカーは、前記融合タンパク質の前記Ｃ末端が前記第２の構造単位である場合、前記第１の構造単位と前記第３の構造単位を連結する。
（１）インターロイキン１５（ＩＬ－１５）受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインである第１の構造単位と、
（２）ＩＬ－１５である第２の構造単位と、
（３）抗体のＦｃ断片または変異Ｆｃ断片である融合タンパク質のＮ末端に位置する第３の構造単位と、
（４）前記第１の構造単位と前記第２の構造単位を連結する第２リンカー、のブロックを含み、
第１リンカーは、前記融合タンパク質のＣ末端が前記第１の構造単位である場合、前記第２の構造単位と前記第３の構造単位を連結し、
前記第１リンカーは、前記融合タンパク質の前記Ｃ末端が前記第２の構造単位である場合、前記第１の構造単位と前記第３の構造単位を連結する。
【0009】
前記第１リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎによって表されるＧＧＧＧＳの整数多重反復であるアミノ酸配列を有し、好ましくはｎは１～７の任意の整数であり、より好ましくはｎは１～５の任意の整数であり、最も好ましくはｎは３である。
【0010】
前記融合タンパク質はさらに
（５）治療用抗体のＦａｂである前記第３の構造単位の前記Ｎ末端に連結された第４の構造単位、のブロックを含み、
前記治療用抗体は、特に限定されないが、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１抗体、Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、および抗ＥＧＦＲ抗体が挙げられ、
好ましくは、前記治療用抗体の前記Ｆａｂは、抗ＰＤ－１ Ｆａｂ（ＰＤ１抗体のＦａｂ）である。
（５）治療用抗体のＦａｂである前記第３の構造単位の前記Ｎ末端に連結された第４の構造単位、のブロックを含み、
前記治療用抗体は、特に限定されないが、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１抗体、Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、および抗ＥＧＦＲ抗体が挙げられ、
好ましくは、前記治療用抗体の前記Ｆａｂは、抗ＰＤ－１ Ｆａｂ（ＰＤ１抗体のＦａｂ）である。
【0011】
前記抗ＰＤ－１ Ｆａｂは、重鎖（可変領域＋定常領域）および軽鎖（可変領域＋定常領域）を含み、前記重鎖は前記融合タンパク質の前記Ｎ末端に位置し、
好ましくは、前記抗ＰＤ－１ Ｆａｂは、マウス由来またはヒト由来の抗ＰＤ－１ Ｆａｂであり、
より好ましくは、前記マウス由来またはヒト由来の抗ＰＤ－１ Ｆａｂは、配列番号４、配列番号１８、または配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を有し、前記抗ＰＤ－１ Ｆａｂは、配列番号５、配列番号２０、または配列番号２１に示すアミノ酸配列を有する重鎖を有する。
配列番号４：
YELTQPPSASVNVGETVKITCSGDQLPKYFADWFHQRSDQTILQVIYDDNKRPSGIPERISGSSSGTTATLTIRDVRAEDEGDYYCFSGYVDSDSKLYVFGSGTQLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１８：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１９：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号５：
EVRLLESGGGLVKPEGSLKLSCVASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVAHIYTKSYNYATYYSGSVKGRFTISRDDSRSMVYLQMNNLRTEDTATYYCTRDGSGYPSLDFWGQGTQVTVSSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
配列番号２０：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV
配列番号２１：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESK
好ましくは、前記抗ＰＤ－１ Ｆａｂは、マウス由来またはヒト由来の抗ＰＤ－１ Ｆａｂであり、
より好ましくは、前記マウス由来またはヒト由来の抗ＰＤ－１ Ｆａｂは、配列番号４、配列番号１８、または配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を有し、前記抗ＰＤ－１ Ｆａｂは、配列番号５、配列番号２０、または配列番号２１に示すアミノ酸配列を有する重鎖を有する。
配列番号４：
YELTQPPSASVNVGETVKITCSGDQLPKYFADWFHQRSDQTILQVIYDDNKRPSGIPERISGSSSGTTATLTIRDVRAEDEGDYYCFSGYVDSDSKLYVFGSGTQLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１８：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１９：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号５：
EVRLLESGGGLVKPEGSLKLSCVASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVAHIYTKSYNYATYYSGSVKGRFTISRDDSRSMVYLQMNNLRTEDTATYYCTRDGSGYPSLDFWGQGTQVTVSSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
配列番号２０：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV
配列番号２１：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESK
【0012】
前記ＩＬ－１５は、配列番号１または配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するマウス由来またはヒト由来のＩＬ－１５である。
配列番号１：
NWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS
配列番号１５：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
配列番号１：
NWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS
配列番号１５：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
【0013】
前記マウス由来またはヒト由来のＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインは、配列番号３または配列番号１７に示すアミノ酸配列を有する。
配列番号３：
GTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
配列番号１７：
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPP
配列番号３：
GTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
配列番号１７：
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPP
【0014】
前記Ｆｃ断片または変異Ｆｃ断片は、配列番号２または配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する。
配列番号２：
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
配列番号１６：
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
配列番号２：
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
配列番号１６：
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
【0015】
前記第２リンカーは、配列番号６に示すアミノ酸配列を有する。
配列番号６：
SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ
配列番号６：
SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ
【0016】
また、本開示は、融合タンパク質で構成されるホモ二量体に関し、好ましくは、前記ホモ二量体の単量体同士が前記第３の構造単位の二量体化を介して互いに連結されている。
【0017】
より好ましくは、前記ホモ二量体は、
（１）ホモ二量体１（Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５）
前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインと、第２リンカーと、ＩＬ－１５とを含み、好ましくは配列番号７に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体１、
配列番号７：
KLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPTSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS
（２）ホモ二量体２（Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体２、
配列番号８：
KLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
（３）ホモ二量体３（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５）
前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインと、第２リンカーと、ＩＬ－１５とを含み、好ましくは、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体３、
配列番号９：
YELTQPPSASVNVGETVKITCSGDQLPKYFADWFHQRSDQTILQVIYDDNKRPSGIPERISGSSSGTTATLTIRDVRAEDEGDYYCFSGYVDSDSKLYVFGSGTQLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECKLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEVRLLESGGGLVKPEGSLKLSCVASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVAHIYTKSYNYA300
TYYSGSVKGRFTISRDDSRSMVYLQMNNLRTEDTATYYCTRDGSGYPSLDFWGQGTQVTVSSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCRTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPTSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS
（４）ホモ二量体４（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体４、
配列番号１０：
YELTQPPSASVNVGETVKITCSGDQLPKYFADWFHQRSDQTILQVIYDDNKRPSGIPERISGSSSGTTATLTIRDVRAEDEGDYYCFSGYVDSDSKLYVFGSGTQLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECKLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEVRLLESGGGLVKPEGSLKLSCVASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVAHIYTKSYNYATYYSGSVKGRFTISRDDSRSMVYLQMNNLRTEDTATYYCTRDGSGYPSLDFWGQGTQVTVSSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCRTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
（５）ホモ二量体５（Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）３）と、マウス由来またはヒト由来ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体５、
配列番号１１：
KLATMETDTL LLWVLLLWVP GSTGEPKSSD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKGG GGSGGGGSGG GGSNWIDVRY DLEKIESLIQ SIHIDTTLYT DSDFHPSCKV TAMNCFLLEL QVILHEYSNM TLNETVRNVL YLANSTLSSN KNVAESGCKE CEELEEKTFT EFLQSFIRIV QMFINTSSGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG SLQGTTCPPP VSIEHADIRV KNYSVNSRER YVCNSGFKRK AGTSTLIECV INKNTNVAHW TTPSLKCIRD PSLAHYSPVP T
（６）ホモ二量体６（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）３）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体６、
配列番号１２：
YELTQPPSASVNVGETVKITCSGDQLPKYFADWFHQRSDQTILQVIYDDNKRPSGIPERISGSSSGTTATLTIRDVRAEDEGDYYCFSGYVDSDSKLYVFGSGTQLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECKLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEVRLLESGGGLVKPEGSLKLSCVASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVAHIYTKSYNYATYYSGSVKGRFTISRDDSRSMVYLQMNNLRTEDTATYYCTRDGSGYPSLDFWGQGTQVTVSSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCRTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSGGGGSGGGGSNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
（７）ホモ二量体７（Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）５）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体７、または
配列番号１３：
KLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
（８）ホモ二量体８（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）５）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体８
配列番号１４：
YELTQPPSASVNVGETVKITCSGDQLPKYFADWFHQRSDQTILQVIYDDNKRPSGIPERISGSSSGTTATLTIRDVRAEDEGDYYCFSGYVDSDSKLYVFGSGTQLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECKLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEVRLLESGGGLVKPEGSLKLSCVASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVAHIYTKSYNYATYYSGSVKGRFTISRDDSRSMVYLQMNNLRTEDTATYYCTRDGSGYPSLDFWGQGTQVTVSSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCRTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
である。
（１）ホモ二量体１（Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５）
前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインと、第２リンカーと、ＩＬ－１５とを含み、好ましくは配列番号７に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体１、
配列番号７：
KLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPTSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS
（２）ホモ二量体２（Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体２、
配列番号８：
KLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
（３）ホモ二量体３（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５）
前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインと、第２リンカーと、ＩＬ－１５とを含み、好ましくは、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体３、
配列番号９：
YELTQPPSASVNVGETVKITCSGDQLPKYFADWFHQRSDQTILQVIYDDNKRPSGIPERISGSSSGTTATLTIRDVRAEDEGDYYCFSGYVDSDSKLYVFGSGTQLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECKLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEVRLLESGGGLVKPEGSLKLSCVASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVAHIYTKSYNYA300
TYYSGSVKGRFTISRDDSRSMVYLQMNNLRTEDTATYYCTRDGSGYPSLDFWGQGTQVTVSSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCRTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPTSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS
（４）ホモ二量体４（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体としての前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（Ｇ４Ｓ）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体４、
配列番号１０：
YELTQPPSASVNVGETVKITCSGDQLPKYFADWFHQRSDQTILQVIYDDNKRPSGIPERISGSSSGTTATLTIRDVRAEDEGDYYCFSGYVDSDSKLYVFGSGTQLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECKLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEVRLLESGGGLVKPEGSLKLSCVASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVAHIYTKSYNYATYYSGSVKGRFTISRDDSRSMVYLQMNNLRTEDTATYYCTRDGSGYPSLDFWGQGTQVTVSSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCRTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
（５）ホモ二量体５（Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）３）と、マウス由来またはヒト由来ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体５、
配列番号１１：
KLATMETDTL LLWVLLLWVP GSTGEPKSSD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKGG GGSGGGGSGG GGSNWIDVRY DLEKIESLIQ SIHIDTTLYT DSDFHPSCKV TAMNCFLLEL QVILHEYSNM TLNETVRNVL YLANSTLSSN KNVAESGCKE CEELEEKTFT EFLQSFIRIV QMFINTSSGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG SLQGTTCPPP VSIEHADIRV KNYSVNSRER YVCNSGFKRK AGTSTLIECV INKNTNVAHW TTPSLKCIRD PSLAHYSPVP T
（６）ホモ二量体６（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）３）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体６、
配列番号１２：
YELTQPPSASVNVGETVKITCSGDQLPKYFADWFHQRSDQTILQVIYDDNKRPSGIPERISGSSSGTTATLTIRDVRAEDEGDYYCFSGYVDSDSKLYVFGSGTQLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECKLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEVRLLESGGGLVKPEGSLKLSCVASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVAHIYTKSYNYATYYSGSVKGRFTISRDDSRSMVYLQMNNLRTEDTATYYCTRDGSGYPSLDFWGQGTQVTVSSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCRTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSGGGGSGGGGSNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
（７）ホモ二量体７（Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）５）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体７、または
配列番号１３：
KLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
（８）ホモ二量体８（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒα）
前記単量体が、Ｎ末端からＣ末端までに、抗ＰＤ－１ Ｆａｂと、ヒト由来ＩｇＧ１－Ｆｃと、第１リンカー（（Ｇ４Ｓ）５）と、ＩＬ－１５と、第２リンカーと、ＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインとを含み、好ましくは、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するホモ二量体８
配列番号１４：
YELTQPPSASVNVGETVKITCSGDQLPKYFADWFHQRSDQTILQVIYDDNKRPSGIPERISGSSSGTTATLTIRDVRAEDEGDYYCFSGYVDSDSKLYVFGSGTQLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECKLATMETDTLLLWVLLLWVPGSTGEVRLLESGGGLVKPEGSLKLSCVASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVAHIYTKSYNYATYYSGSVKGRFTISRDDSRSMVYLQMNNLRTEDTATYYCTRDGSGYPSLDFWGQGTQVTVSSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCRTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPT
である。
【0018】
本開示はまた、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド断片に関する。
【0019】
本開示はまた、医薬の製造における融合タンパク質および前記融合タンパク質から構成されるホモ二量体の使用に関し、好ましくは、前記医薬は抗腫瘍医薬であり、最も好ましくは、前記医薬はＢ細胞リンパ腫、結腸直腸癌、黒色腫または肺癌に対する医薬である。
【0020】
また、本開示は、融合タンパク質の調製方法に関し、前記融合タンパク質の調製方法は、
（１）融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを構築する工程であって、好ましくは、前記発現ベクターがｐＥＥ１２．４発現ベクターである工程と、
（２）宿主細胞を一過性にトランスフェクトすることによって前記発現ベクターを含む宿主細胞を構築する工程であって、好ましくは、前記宿主細胞が２９３Ｆ細胞である工程と、
（３）前記宿主細胞を培養し、細胞上清を回収する工程と、
（４）タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーカラムにより融合タンパク質を精製する工程と、を含む。
（１）融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを構築する工程であって、好ましくは、前記発現ベクターがｐＥＥ１２．４発現ベクターである工程と、
（２）宿主細胞を一過性にトランスフェクトすることによって前記発現ベクターを含む宿主細胞を構築する工程であって、好ましくは、前記宿主細胞が２９３Ｆ細胞である工程と、
（３）前記宿主細胞を培養し、細胞上清を回収する工程と、
（４）タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーカラムにより融合タンパク質を精製する工程と、を含む。
【発明の効果】
【0021】
本開示は、以下の有益な効果を有する。
１．類似の構造を有する２つの形態のＩＬ－１５融合タンパク質が設計され、ＩＬ－１５の位置およびＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインが、ＦｃのＣ末端で交換される。２つのＩＬ－１５融合タンパク質の生物学的活性は約１０，０００倍異なる。
２．様々なリンカー（第１リンカー）は、ＦｃのＣ末端をＩＬ－１５受容体サブユニットαのＩＬ－１５／ｓｕｓｈｉドメインに連結するように設計される。第１リンカーの基本単位は、５つのアミノ酸ＧＧＧＧＳから構成される。第１リンカーの長さはＩＬ－１５の生物学的活性に直接影響を及ぼし得る。
３．ＭＣ３８小腫瘍モデル（腫瘍細胞の接種の７日後、腫瘍サイズは約３０ｍｍ３）において、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質の全身注射後に腫瘍を完全に排除することができ、ＭＣ３８大腫瘍モデル（腫瘍細胞の接種の１４日後、腫瘍サイズは約１００ｍｍ３）において、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ －Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質の全身注射後に腫瘍を実質的にコントロールすることができる。
４．融合タンパク質標的薬で治療されたマウスは、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質を治療量の３倍で全身注射した後に体重が減少しない。
５．ＣＤ３４＋ヒト化マウスのＡ５４９肺癌腫瘍モデルにおいて、抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ヒトＩＬ－１５－Ｒαまたは抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ヒトＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質の全身注射後、腫瘍を実質的にコントロールすることができる。
１．類似の構造を有する２つの形態のＩＬ－１５融合タンパク質が設計され、ＩＬ－１５の位置およびＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインが、ＦｃのＣ末端で交換される。２つのＩＬ－１５融合タンパク質の生物学的活性は約１０，０００倍異なる。
２．様々なリンカー（第１リンカー）は、ＦｃのＣ末端をＩＬ－１５受容体サブユニットαのＩＬ－１５／ｓｕｓｈｉドメインに連結するように設計される。第１リンカーの基本単位は、５つのアミノ酸ＧＧＧＧＳから構成される。第１リンカーの長さはＩＬ－１５の生物学的活性に直接影響を及ぼし得る。
３．ＭＣ３８小腫瘍モデル（腫瘍細胞の接種の７日後、腫瘍サイズは約３０ｍｍ３）において、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質の全身注射後に腫瘍を完全に排除することができ、ＭＣ３８大腫瘍モデル（腫瘍細胞の接種の１４日後、腫瘍サイズは約１００ｍｍ３）において、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ －Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質の全身注射後に腫瘍を実質的にコントロールすることができる。
４．融合タンパク質標的薬で治療されたマウスは、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質を治療量の３倍で全身注射した後に体重が減少しない。
５．ＣＤ３４＋ヒト化マウスのＡ５４９肺癌腫瘍モデルにおいて、抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ヒトＩＬ－１５－Ｒαまたは抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ヒトＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質の全身注射後、腫瘍を実質的にコントロールすることができる。
【発明を実施するための形態】
【0022】
［用語の定義］
「融合タンパク質」という用語は、遺伝子組換え、化学的方法または他の適切な方法によって２つ以上の遺伝子のコード領域を連結し、同じ調節配列の制御下でこれらの遺伝子を組換え発現させることによって得られるタンパク質産物を指す。別段の指定がない限り、融合タンパク質のＮ末端における第１のブロック（ポリペプチド）のＣ末端は、次のブロック（またはリンカー）のＮ末端に連結され、以下同様に続く。したがって、融合タンパク質のＮ末端のブロックのＮ末端は融合タンパク質のＮ末端であり、融合タンパク質のＣ末端のブロックのＣ末端は、融合タンパク質のＣ末端である。
「融合タンパク質」という用語は、遺伝子組換え、化学的方法または他の適切な方法によって２つ以上の遺伝子のコード領域を連結し、同じ調節配列の制御下でこれらの遺伝子を組換え発現させることによって得られるタンパク質産物を指す。別段の指定がない限り、融合タンパク質のＮ末端における第１のブロック（ポリペプチド）のＣ末端は、次のブロック（またはリンカー）のＮ末端に連結され、以下同様に続く。したがって、融合タンパク質のＮ末端のブロックのＮ末端は融合タンパク質のＮ末端であり、融合タンパク質のＣ末端のブロックのＣ末端は、融合タンパク質のＣ末端である。
【0023】
「ＩＬ－１５野生型」または「野生型ＩＬ－１５」という用語は、天然由来のヒトＩＬ－１５または非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５または非哺乳動物ＩＬ－１５を指す。「ＩＬ－１５野生型」または「野生型ＩＬ－１５」という用語はまた、当技術分野における一般的なＩＬ－１５ポリペプチドを指してもよい。
【0024】
「ＩＬ－１５Ｒサブユニットα」という用語は、ヒトＩＬ－１５Ｒαまたは非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５Ｒαまたは非哺乳動物ＩＬ－１５Ｒαなどの任意の種のＩＬ－１５Ｒαまたはその機能的断片であってもよい。例示的な非ヒト哺乳動物としては、ブタ、ウサギ、サル、チンパンジー、マウスなどが挙げられる。非哺乳動物としては、ニワトリなどが挙げられる。好ましくは、ＩＬ－１５ＲサブユニットαはヒトＩＬ－１５Ｒα、好ましくはヒトＩＬ－１５Ｒαの細胞外ドメイン断片である。
【0025】
「ｓｕｓｈｉドメイン」という用語は少なくとも１つのｓｕｓｈｉポリペプチド含有ＩＬ－１５Ｒαまたはその断片の細胞外領域がＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインを含み、ＩＬ－１５Ｒαの細胞外領域がｓｕｓｈｉドメインと呼ばれるドメインを含むことを定義する（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２７７－２８２）。ＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインはβシート構造を有し、第１のエクソン２によってコードされるシステイン残基（Ｃ１）から始まり、第４のエクソン２によってコードされるシステイン残基（Ｃ４）で終わるＩＬ－１５Ｒαのエクソン２によってコードされる。標準的なＮ末端からＣ末端方向におけるＩＬ－１５Ｒαのタンパク質配列を考慮する場合、「ＩＬ－１５Ｒサブユニットαのｓｕｓｈｉドメイン」はシグナルペプチドの後の第１のシステイン残基（Ｃ１）から始まり、シグナルペプチドの後の第４のシステイン残基（Ｃ４）で終わるものとして定義することができ、残基Ｃ１および残基Ｃ４の両方をｓｕｓｈｉドメインの配列に含めることができる。
【0026】
「Ｆｃ」という用語は免疫グロブリンのＦｃ領域の略語であり、免疫グロブリンの定常領域、特に、抗原結合活性を有さず、抗体がエフェクター分子および細胞と相互作用する部位である、免疫グロブリンの重鎖定常領域のカルボキシ末端、またはその一部を指す。本開示における「Ｆｃ」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に由来する任意のＦｃまたはその変異体であり得る。例えば、Ｆｃは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４の２つ以上のドメインの組合せおよび免疫グロブリンヒンジ領域を含んでもよい。Ｆｃは、異なる種、好ましくはヒト免疫グロブリンに由来し得る。重鎖定常領域のアミノ酸配列によれば、免疫グロブリンは、異なるクラス、主にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む５つのクラスに分けることができる。いくつかのクラスは、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３およびＩｇＧ－４、またはＩｇＡ－１およびＩｇＡ－２などのサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けることができる。「Ｆｃ領域」は、好ましくはＩｇＧの少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。より好ましくは、「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、ならびにヒンジ領域の最初のアミノ酸位置を変更することができる免疫グロブリンヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ６４およびＣ１ｑタンパク質などのＦｃ受容体との結合親和性の増強または弱化に起因して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性が増加したＦｃを含む。他の実施形態においては、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を低下させるために、変異をＦｃドメインに含ませている。これらの変異は、Ｆｃドメインにおいて、（１）限定されないがＮ２９７ＡおよびＮ２９７ＧなどのＮ２９７における変異、（２）例えば、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３４ＧなどのＬ２３４における変異および／または例えば、Ｌ２３５ＡまたはＬ２３５ＧなどのＬ２３５における変異、（３）例えば、Ｐ３２９ＧなどのＰ３２９における変異、または（４）Ｄ２６５ＡなどのＤ２６５における変異、またはこれらの位置のいずれかまたはすべてにおける置換の組合せを含み得るが、これらに限定されない。他の実施形態において、Ｆｃ変異（全ての番号付けはＫａｂａｔ番号付けシステムのＥｕインデックスである）は、血清半減期を増加させる変異を含む。１つの実施形態において、ＦｃはＣＨ３におけるＴ２５０Ｑ、またはＭ４２８Ｌ、またはＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ二重変異の置換（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６，２００４）を有する。他の実施形態において、Ｆｃは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ三重変異（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ＷＦ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９（９）：５１７１－８０，２００２）を有する。他の実施形態において、ＦｃはＮ４３４Ａ変異（Ｐｅｔｋｏｖａ ＳＢ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８（１２）：１７５９－１７６９，２００６）、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ二重変異、またはＭ４２８／Ｎ４３４Ａ二重変異（Ｚａｌｅｖｓｋｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（２）：１５７-１５９，２０１０）を有する。他の実施形態において、Ｆｃ領域はその血清半減期を増加させるように改変されている。いくつかの実施形態において、血清半減期を増加させる修飾は、Ｍ４２８Ｌである。
【0027】
「抗体（Ａｂ）」という用語は標的抗原に特異的に結合するか、または標的抗原との免疫反応性を有する免疫グロブリン分子を指し、これにはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組み換え抗体およびその他の改変抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、異種結合抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体および四重特異性抗体、二特異性抗体、三特異性抗体および四特異性抗体）、抗体コンジュゲートおよび抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧおよびｓｃＦｖ断片）が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。
【0028】
「Ｆａｂ」断片という用語はパパインによる抗体の消化によって生成された２つの同一の抗原結合断片のうちの１つを指し、各Ｆａｂは、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域、ならびに軽鎖の定常領域および重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）を含む。したがって、本明細書における「Ｆａｂ」という用語は、軽鎖のＶＬ領域および定常領域（ＣＬ）ならびに重鎖のＶＨ領域および第１定常領域（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域から１つ以上のシステインを含む重鎖のＣＨ１領域のカルボキシ末端における少数の残基の付加においてＦａｂとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、重鎖の定常領域中のシステイン残基が遊離チオール基を保有するＦａｂ’断片である。Ｆ（ａｂ’）２は２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ）およびＦｃ領域の一部を有する抗体断片であり、インタクト抗体のペプシン処理によって産生される。
【0029】
「融合タンパク質」という用語は、遺伝子組換え、化学的方法または他の適切な方法によって２つ以上の遺伝子のコード領域を連結し、同じ調節配列の制御下でこれらの遺伝子を組換え発現させることによって得られるタンパク質産物を指す。本開示の融合タンパク質において、２つ以上の遺伝子のコード領域は、ペプチドリンカーまたはリンカーペプチドをコードする配列によって、１つまたはいくつかの位置で融合され得る。本開示の「融合タンパク質」という用語は、抗体／Ｆｃ融合タンパク質構築物／複合体、または非共有結合手段によって形成される抗体／Ｆｃ融合タンパク質構築物／複合体の成分をさらに含む。
【0030】
「第１／第２リンカー」という用語は本開示におけるタンパク質の正確なフォールディングおよび安定性を確実にするためにＩＬ－１５を別のタンパク質分子またはタンパク質断片と連結するペプチドを指す。前記別の分子としてはＩＬ－１５Ｒα、Ｆｃ、Ｆｃ変異、抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0031】
「ＰＤ１抗体」および「αＰＤ－１」という用語は、プログラム死タンパク質１（ＰＤ１）に対する抗体を指す。例示的な抗体としては、米国特許第７０２９６７４号明細書、米国特許第７４８８８０２号明細書、米国特許第７５２１０５１号明細書、米国特許第８００８４４９号明細書、米国特許第８３５４５０９号明細書、米国特許第８６１７５４６号明細書および米国特許第８７０９４１７号明細書に列挙されている抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体の具体的な実施形態としては、ＢＧＢ－Ａ３１７、ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社）、ｌａｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｍｅｒｃｋ社）、およびｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｍｅｒｃｋ社）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
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【0051】
【0052】
【0053】
【0054】
【実施例】
【0055】
［実施例１］融合タンパク質の設計および構築
１．以下の８種類の融合タンパク質の設計と構築
（１）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＲαおよびＦｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５融合タンパク質
Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ（以下、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαという）およびＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ－ＩＬ－１５（以下、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５という）は、図１Ａおよび図１Ｃに示すような構成を有する。ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉはＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインであり、配列番号３または１７に示すアミノ酸配列を有し、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉとＩＬ－１５との間の第２リンカーは配列番号６に示すアミノ酸配列を有し、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉまたはＩＬ－１５とＦｃとの間の第１リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎによって表されるＧＧＧＧＳの整数多重反復であり、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号８に示すアミノ酸配列を有し、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５は配列番号７に示すアミノ酸配列を有する。
（２）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの第１リンカーをさらに修飾して得たＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびＦｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質
Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびＦｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαの第１リンカーはそれぞれ、（ＧＧＧＧＳ）３および（ＧＧＧＧＳ）５であり、Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号１１に示すアミノ酸配列を有し、Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号１３に示すアミノ酸配列を有する。
（３）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５ＲαおよびＦｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５に抗ＰＤ－１ Ｆａｂをさらに融合して得たαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５
αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５は、図１Ｂおよび図１Ｃに示すような構成を有する。抗ＰＤ－１ Ｆａｂは配列番号４、１８または１９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号５、２０または２１に示すアミノ酸配列を有する重鎖を有し、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号１０に示すアミノ酸配列を有し、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５は配列番号９に示すアミノ酸配列を有する。
（４）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの第１リンカーをさらに修飾して得たαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質
αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαは、それぞれ（ＧＧＧＧＳ）３および（ＧＧＧＧＳ）５である第１リンカーを有し、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号１２に示すアミノ酸配列を有し、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する。
１．以下の８種類の融合タンパク質の設計と構築
（１）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＲαおよびＦｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５融合タンパク質
Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ（以下、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαという）およびＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ－ＩＬ－１５（以下、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５という）は、図１Ａおよび図１Ｃに示すような構成を有する。ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉはＩＬ－１５受容体サブユニットαのｓｕｓｈｉドメインであり、配列番号３または１７に示すアミノ酸配列を有し、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉとＩＬ－１５との間の第２リンカーは配列番号６に示すアミノ酸配列を有し、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉまたはＩＬ－１５とＦｃとの間の第１リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎによって表されるＧＧＧＧＳの整数多重反復であり、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号８に示すアミノ酸配列を有し、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５は配列番号７に示すアミノ酸配列を有する。
（２）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの第１リンカーをさらに修飾して得たＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびＦｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質
Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびＦｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαの第１リンカーはそれぞれ、（ＧＧＧＧＳ）３および（ＧＧＧＧＳ）５であり、Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号１１に示すアミノ酸配列を有し、Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号１３に示すアミノ酸配列を有する。
（３）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５ＲαおよびＦｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５に抗ＰＤ－１ Ｆａｂをさらに融合して得たαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５
αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５は、図１Ｂおよび図１Ｃに示すような構成を有する。抗ＰＤ－１ Ｆａｂは配列番号４、１８または１９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号５、２０または２１に示すアミノ酸配列を有する重鎖を有し、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号１０に示すアミノ酸配列を有し、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５は配列番号９に示すアミノ酸配列を有する。
（４）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの第１リンカーをさらに修飾して得たαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質
αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαは、それぞれ（ＧＧＧＧＳ）３および（ＧＧＧＧＳ）５である第１リンカーを有し、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号１２に示すアミノ酸配列を有し、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαは配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する。
【0056】
２．融合タンパク質の構築、トランスフェクション、発現、回収および精製
【0057】
融合タンパク質の上記４つの形態の遺伝子を真核生物発現ベクターに構築し、２９３Ｆ細胞において単一プラスミドまたは複数プラスミドによって一過性に発現させた。回収した細胞上清をタンパク質Ａで精製した。精製したタンパク質をＥＬＩＳＡおよびＮａｎｏｄｒｏｐで定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで純度を検出した（各サンプルに４μｇを充填）。
【0058】
具体的なプロトコールは以下の通りであった。
【0059】
２．１．プラスミド構築
【0060】
マウスＩｇＧκシグナルペプチドおよびヒトＩｇＧ１の定常領域配列を含むｐＥＥ１２．４－ＩｇＧκ－ｈＩｇＧ１ Ｆｃプラスミドを、本発明者らの研究室から得た。本出願に関与する全ての遺伝子（ＩＬ－１５、ＩＬ－１５ ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ）を、第三者の商用合成会社によって合成した後、酵素消化およびライゲーションまたは相同組換えによってｐＥＥ１２．４発現ベクターに挿入した。プラスミドをＴＩＡＮＧＥＮ社のプラスミド抽出キットで抽出し、－２０℃で保存した。
【0061】
２．２．目的のタンパク質の迅速な無血清発現のための一過性トランスフェクション
【0062】
（１）２９３Ｆ細胞をＳＭＭ２９３ＴＩＩ培地を用いて３７℃、ＣＯ２８％、１３５ｒｐｍで懸濁培養し、細胞密度が４～４．５×１０６細胞／ｍｌ、２００ｍｌに達した時点でトランスフェクションに用いることができた。
【0063】
（２）細胞を遠心分離により回収し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地で１回洗浄し、２００ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地で再懸濁した。
【0064】
（３）３６０μｇのプラスミドを６ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地で希釈した。２つのプラスミドを用いて細胞を共トランスフェクトしてαＰＤ－１融合タンパク質を得、αＰＤ－１重鎖を発現するプラスミドに対するαＰＤ－１軽鎖を発現するプラスミドの比は２：１（αＰＤ－１軽鎖を発現するプラスミド２４０μｇ＋αＰＤ－１重鎖を発現するプラスミド１２０μｇ）であり、０．２２μｍのフィルター膜を濾過および滅菌に用いた。
【0065】
（４）７２０μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を６ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地で希釈し、０．２２μｍのフィルター膜で濾過することにより滅菌した。
【0066】
（５）５ｍｌのＰＥＩをボルテックスしながら一滴ずつプラスミドに添加した後、５～１０分間放置した。
【0067】
（６）細胞懸濁液をプラスミド／ＰＥＩ混合物に添加し、３７℃、ＣＯ２８％、８５ｒｐｍ培養した。
【0068】
（７）４時間後、細胞懸濁液に２００ｍｌのＥＸ－ＣＥＬＬＴＭ ２９３培地と２ｍＭのＬ－グルタミンを添加し、回転速度を１３５ｒｐｍに調整してさらに培養した。
【0069】
（８）２４時間後、細胞増殖阻害剤である３．８ｍＭのバルプロ酸（ＶＰＡ）を添加し、トランスフェクション後６日目に８０００ｒｐｍ、４℃で２時間遠心分離して細胞を回収し、細胞上清を回収してさらに精製した。
【0070】
２．３．プロテインＡを用いた目的タンパク質の精製
【0071】
（１）サンプル調製：回収した細胞上清を０．２２μｍのフィルター膜で濾過し、細胞片を除去し、最終濃度０．０５％のＮａＮ３を添加した。
【0072】
（２）タンパク質Ａクロマトグラフィーカラムをすすぎ、カラム容量の１０倍の再蒸留水およびＰＢＳでそれぞれ平衡化した。
【0073】
（３）カラム体積／時間の１０倍の流速で一定流ポンプを使用することによって、サンプルを繰り返し充填した。
【0074】
（４）カラムをカラム容量の１０倍のＰＢＳで洗浄し、不純物タンパク質を除去した。
【0075】
（５）０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．７）を用いて溶出を行って溶出液を回収し、溶出したタンパク質をプールし、適量の中和緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９．０）で中和した（ｐＨ値はタンパク質溶液を観察して凝集性沈殿物がない程度に調整され、ｐＨは約４であった）。
【0076】
タンパク質はＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００およびＥＬＩＳＡにより濃度および純度を測定し、－８０℃でアリコートおよび保存したが、アリコートしたタンパク質を４℃でゆっくり解凍する必要があり、繰り返し凍結および解凍することはできない。
【0077】
αＰＤ－１ Ｆａｂ－Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－Ｒα－ＩＬ－１５、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の結果を図２２に示す。抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ヒトＩＬ－１５－Ｒαおよび抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ヒトＩＬ－１５－Ｒα融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の結果を図２３に示す。
［実施例２］αＰＤ－１－ＩＬ－１５融合タンパク質の生物学的機能研究
［実施例２］αＰＤ－１－ＩＬ－１５融合タンパク質の生物学的機能研究
【0078】
１．リンパ球生成促進機能
【0079】
リンパ球増殖促進試験（ＣＣＫ８試験）は、以下の工程を含む。
【0080】
（１）ＣＴＬＬ２細胞を、１００Ｕ／ｍｌの市販の組換えＩＬ２サイトカインを含有する１６４０完全培地で培養した。
【0081】
（２）試験を行い、ＩＬ２を含まない完全培地で細胞を２～３回洗浄し、２×１０４／ｍｌに希釈した。
【0082】
（３）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５、Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα、およびαＰＤ－１ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαのサンプルを、ＩＬ２を含まない完全培地で、５μｇ／ｍｌの初期濃度、５倍希釈、および１０倍希釈勾配で希釈した。
【0083】
（４）細胞懸濁液１００μｌとサンプル１００μｌを９６穴の細胞培養プレートに添加し、ピペットチップでピペッティングすることによりよく混合した。
【0084】
（５）７２時間培養後、細胞にＣＣＫ８を２０μｌ添加し、さらに３時間培養した後、マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍおよび６３０ｎｍのＯＤ値を検出した。
【0085】
検出結果を図２に示すが、以下のことが分かる。
（１）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５の生物学的活性は有意に増加し、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの生物学的活性よりも約１０，０００倍高く、このことは、ＩＬ－１５融合タンパク質の２つの形態の生物学的活性がＩＬ－１５およびＲαの相対的位置に関連することを示している。
（２）αＰＤ－１ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの生物学的活性はＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαと比較して変化せず、このことはαＰＤ－１抗体の導入がＰＤ－１の発現が低い細胞におけるＩＬ－１５の生物学的活性を変化させないことを示している。
（３）αＰＤ－１ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαの生物学的活性はαＰＤ－１ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの生物学的活性よりも高く、このことは融合タンパク質形態におけるＩＬ－１５の生物学的活性が第１リンカーの長さにも関連することを示している。
（１）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５の生物学的活性は有意に増加し、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの生物学的活性よりも約１０，０００倍高く、このことは、ＩＬ－１５融合タンパク質の２つの形態の生物学的活性がＩＬ－１５およびＲαの相対的位置に関連することを示している。
（２）αＰＤ－１ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの生物学的活性はＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαと比較して変化せず、このことはαＰＤ－１抗体の導入がＰＤ－１の発現が低い細胞におけるＩＬ－１５の生物学的活性を変化させないことを示している。
（３）αＰＤ－１ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαの生物学的活性はαＰＤ－１ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの生物学的活性よりも高く、このことは融合タンパク質形態におけるＩＬ－１５の生物学的活性が第１リンカーの長さにも関連することを示している。
【0086】
２．ＩＬ－１５融合タンパク質の結合能の検出
【0087】
Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５およびＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαのＩＬ－１５受容体に対する結合能をＣＴＬＬ２レポーター細胞株において検出し、その結果を図３に示すが、ＩＬ－１５のその受容体に対する結合能がその生物学的活性と正の相関があること、すなわち、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの生物学的活性が低いことはその受容体に対する親和性が低いことによることを示している。
【0088】
Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびａＥＧＦＲ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαのＭＣ３８腫瘍マウスの腫瘍から選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対する結合能を検出し、その結果を図４に示すが、ＰＤ－１ Ｆａｂ抗体がＣＤ８＋Ｔ細胞への結合タンパク質の結合を仲介することを示している。
【0089】
３．腫瘍モデルマウスにおけるＩＬ－１５およびαＰＤ－１－ＩＬ－１５融合タンパク質の治療効果および毒性副作用の検出
【0090】
３．１．ＭＣ３８腫瘍モデル（接種の７日後に投与を行った）
【0091】
方法１（投与量１５μｇ）
【0092】
５×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞をＣ５７マウスの左下に皮下接種した。腫瘍が４０ｍｍ３に成長すると、１５μｇのＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＲαまたはＦｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５を２日間隔で３回腹腔内投与し、同様にＰＢＳを対照群に投与した。腫瘍体積を測定し（体積＝長さ×幅×高さ／２）、マウスの体重変化および生存曲線を記録した。
【0093】
結果を図５、図６、図７および図８に示す。
（１）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍はコントロールされず、体重は変化せず、全てのマウスが生存した。これは、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαが有意な抗腫瘍効果を有さず、毒性副作用を有さないことを示す。
（２）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５の腹腔内投与により、腫瘍は有意にコントロールされたが、体重が大幅に減少し、４０％が死亡した。さらに、末梢血リンパ球において、ＣＤ８＋Ｔ、Ｂ２２０＋、ＮＫ、およびＮＫＴ細胞が増殖した。これは、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５が有意な抗腫瘍効果および重度の毒性副作用を有することを示す。
（１）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍はコントロールされず、体重は変化せず、全てのマウスが生存した。これは、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαが有意な抗腫瘍効果を有さず、毒性副作用を有さないことを示す。
（２）Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５の腹腔内投与により、腫瘍は有意にコントロールされたが、体重が大幅に減少し、４０％が死亡した。さらに、末梢血リンパ球において、ＣＤ８＋Ｔ、Ｂ２２０＋、ＮＫ、およびＮＫＴ細胞が増殖した。これは、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５が有意な抗腫瘍効果および重度の毒性副作用を有することを示す。
【0094】
方法２（投与量１５μｇ）
【0095】
５×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞をＣ５７マウスの左下に皮下接種した。腫瘍が４０ｍｍ３に成長すると、Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα（１５μｇ）またはαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα（等モル量３０μｇ）を２日間隔で３回腹腔内投与し、同様にＰＢＳを対照群に投与した。腫瘍体積を測定した（体積＝長さ×幅×高さ／２）。
【0096】
結果を図９に示す。腫瘍はＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与群ではコントロールされなかったが、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与群では有意にコントロールされたことがわかる。これは、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＲαがαＰＤ－１抗体の作用により治療効果を増強することができることを示す。
【0097】
方法３（投与量１５μｇ）
【0098】
５×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞をＣ５７マウスの左下に皮下接種した。腫瘍が４０ｍｍ３に成長すると、αＰＤ－１ Ｆａｂ（１５μｇ）＋Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα（１５μｇ）またはαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα（等モル量３０μｇ）を２日間隔で３回腹腔内投与し、同様にＰＢＳを対照群に投与した。腫瘍の体積を測定した（体積＝長さ×幅×高さ／２）。
【0099】
結果を図１０に示す。αＰＤ－１ Ｆａｂ＋Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与群では腫瘍はコントロールされなかったが、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与群では腫瘍は有意にコントロールされたことがわかる。これは、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの抗腫瘍効果がαＰＤ－１ ＦａｂとＩＬ－１５の融合タンパク質の共効果に依存することを示す。
【0100】
方法４（投与量３０μｇ）
【0101】
５×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞をＣ５７マウスの左下に皮下接種した。腫瘍が４０ｍｍ３に成長すると、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５またはαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαを２日間隔で３回腹腔内投与し、同様にＰＢＳを対照群に投与した。腫瘍体積を測定し（体積＝長さ×幅×高さ／２）、マウスの体重変化を記録した。
【0102】
結果を図１１、図１２および図１３に示す。
（１）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍は良好にコントロールされ、体重は変化せず、末梢血リンパ球は有意に増殖しなかった。これは、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαが毒性副作用なしに有意な抗腫瘍効果を有することを示す。
（２）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５の腹腔内投与により、腫瘍は良好にコントロールされたが、体重減少は顕著であった。さらに、末梢血リンパ球において、ＣＤ８＋Ｔ、Ｂ２２０＋、ＮＫ、およびＮＫＴ細胞が増殖した。これは、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５が有意な抗腫瘍効果および重度の毒性副作用を有することを示す。
（１）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍は良好にコントロールされ、体重は変化せず、末梢血リンパ球は有意に増殖しなかった。これは、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαが毒性副作用なしに有意な抗腫瘍効果を有することを示す。
（２）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５の腹腔内投与により、腫瘍は良好にコントロールされたが、体重減少は顕著であった。さらに、末梢血リンパ球において、ＣＤ８＋Ｔ、Ｂ２２０＋、ＮＫ、およびＮＫＴ細胞が増殖した。これは、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－Ｒα－ＩＬ－１５が有意な抗腫瘍効果および重度の毒性副作用を有することを示す。
【0103】
方法５（投与量３０μｇ）
【0104】
５×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞をＣ５７マウスの左下に皮下接種した。腫瘍が４０ｍｍ３に成長すると、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびａＥＧＦＲ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαを２日間隔で３回腹腔内投与し、同様にＰＢＳを対照群に投与した。腫瘍体積を測定し（体積＝長さ×幅×高さ／２）、マウスの体重変化を記録した。
【0105】
結果を図１４および図１５に示す。
（１）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα、およびαＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍は良好にコントロールされ、体重は有意に変化しなかった。これは、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα、およびαＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαが毒性副作用なしに有意な抗腫瘍効果を有することを示す。
（２）ａＥＧＦＲ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍はコントロールされず、体重は変化しなかった。これは、ａＥＧＦＲ抗体がαＰＤ－１抗体の代わりに抗腫瘍の役割を果たすことができないことを示す。
（１）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα、およびαＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍は良好にコントロールされ、体重は有意に変化しなかった。これは、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα、およびαＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαが毒性副作用なしに有意な抗腫瘍効果を有することを示す。
（２）ａＥＧＦＲ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍はコントロールされず、体重は変化しなかった。これは、ａＥＧＦＲ抗体がαＰＤ－１抗体の代わりに抗腫瘍の役割を果たすことができないことを示す。
【0106】
３．２．ＭＣ３８腫瘍モデル（接種の１４日後に投与を行った）
【0107】
方法１（投与量３０μｇ）
【0108】
５×１０５のＭＣ３８細胞を、Ｃ５７マウスの左下に皮下接種した。腫瘍が１００ｍｍ３に成長すると、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒα、αＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびａＥＧＦＲ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαを２日間隔で３回腹腔内投与し、ＰＢＳを対照群に投与した。腫瘍の体積を測定した（体積＝長さ×幅×高さ／２）。
【0109】
結果を図１６に示す。
（１）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍は良好にコントロールされた。このことは、第１リンカーが（Ｇ４Ｓ）３である場合、融合タンパク質がより良好な抗腫瘍効果を有することを示す。
（２）ａＥＧＦＲ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍はコントロールされず、体重は変化しなかった。これは、ａＥＧＦＲ抗体がαＰＤ－１抗体の代わりに抗腫瘍の役割を果たすことができないことを示す。
（３）、腹腔内投与したαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＲαとαＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαとの間には抗腫瘍効果に有意な差はなく、このことはｍＦｃが抗腫瘍処理に有意な役割を果たさないことを示す。
（１）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍は良好にコントロールされた。このことは、第１リンカーが（Ｇ４Ｓ）３である場合、融合タンパク質がより良好な抗腫瘍効果を有することを示す。
（２）ａＥＧＦＲ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍はコントロールされず、体重は変化しなかった。これは、ａＥＧＦＲ抗体がαＰＤ－１抗体の代わりに抗腫瘍の役割を果たすことができないことを示す。
（３）、腹腔内投与したαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－ＲαとαＰＤ－１ Ｆａｂ ｍＦｃ－Ｇ４Ｓ－ＩＬ－１５－Ｒαとの間には抗腫瘍効果に有意な差はなく、このことはｍＦｃが抗腫瘍処理に有意な役割を果たさないことを示す。
【0110】
方法２（投与量３０μｇ）
【0111】
５×１０５のＭＣ３８細胞を、Ｃ５７マウスの左下に皮下接種した。腫瘍が１００ｍｍ３に成長すると、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαおよびαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαを２日間隔で３回腹腔内投与し、同様にＰＢＳを対照群に投与した。腫瘍体積を測定し（体積＝長さ×幅×高さ／２）、マウスの体重変化を記録した。
【0112】
結果を図１７、図１８、および図１９に示す。
（１）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαとαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍は有意差なく良好にコントロールされた。これは、（Ｇ４Ｓ）５の第１リンカーを有する融合タンパク質が（Ｇ４Ｓ）３の第１リンカーを有する融合タンパク質と比較して、より良好な抗腫瘍効果を有さなかったことを示す。
（２）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、マウスは軽度の体重減少および末梢血リンパ球の有意な増殖を示した。これは、（Ｇ４Ｓ）５の第１リンカーを有する融合タンパク質が末梢毒性副作用を有することを示す。
（１）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－ＲαとαＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍は有意差なく良好にコントロールされた。これは、（Ｇ４Ｓ）５の第１リンカーを有する融合タンパク質が（Ｇ４Ｓ）３の第１リンカーを有する融合タンパク質と比較して、より良好な抗腫瘍効果を有さなかったことを示す。
（２）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）５－ＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、マウスは軽度の体重減少および末梢血リンパ球の有意な増殖を示した。これは、（Ｇ４Ｓ）５の第１リンカーを有する融合タンパク質が末梢毒性副作用を有することを示す。
【0113】
３．３．Ｂ１６腫瘍モデル（接種の７日後に投与を行った）
【0114】
（１）３×１０５のＢ１６細胞をＣ５７マウスの左下に皮下接種した。
【0115】
（２）腫瘍が３０ｍｍ３に成長すると、αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαを２日間隔で３回腫瘍内投与し、１回３０μｇを投与し、同様にＰＢＳを対照群に投与した。
【0116】
（３）腫瘍の体積を測定した（体積＝長さ×幅×高さ／２）。
【0117】
結果を図２０に示す。
（１）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの腫瘍内投与により、腫瘍はコントロールされた。このことは、融合タンパク質がＢ１６に対して一定の抗腫瘍効果を有することを示す。
（１）αＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１５－Ｒαの腫瘍内投与により、腫瘍はコントロールされた。このことは、融合タンパク質がＢ１６に対して一定の抗腫瘍効果を有することを示す。
【0118】
３．４．ＣＤ３４＋ヒト化マウスＡ５４９肺癌モデル
【0119】
（１）２×１０６のＡ５４９細胞を、ＣＤ３４＋ヒト化マウスの左下に皮下接種した。
【0120】
（２）腫瘍が３０ｍｍ３に成長すると、抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ヒトＩＬ－１５－Ｒαまたは抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ヒトＩＬ－１５Ｒαを、１０日目に１０μｇの投薬量で、１７日目および２０日目に２０μｇの投薬量で全身投与した。同様にＰＢＳを対照群に投与した。
【0121】
（３）腫瘍の体積を測定した（体積＝長さ×幅×高さ／２）。
【0122】
結果を図２１に示す。
（１）抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ヒトＩＬ－１５－Ｒαまたは抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ヒトＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍はコントロールされた。これは、融合タンパク質がヒト化マウスにおけるヒト由来Ａ５４９肺癌に対して抗腫瘍効果を有することを示す。
（１）抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－Ｇ４Ｓ－ヒトＩＬ－１５－Ｒαまたは抗ヒトＰＤ－１ Ｆａｂ Ｆｃ－（Ｇ４Ｓ）３－ヒトＩＬ－１５－Ｒαの腹腔内投与により、腫瘍はコントロールされた。これは、融合タンパク質がヒト化マウスにおけるヒト由来Ａ５４９肺癌に対して抗腫瘍効果を有することを示す。
【0123】
最後に、上記の実施形態は、当業者が本開示の本質を理解するのを助けるためにのみ使用され、本開示の保護範囲を限定することを意図するものではないことに留意されたい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
【国際調査報告】