特表 2024-539435 がんの免疫療法的治療のためのｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ及びＳＴＡＴ３経路変調のための球状核酸

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】がんの免疫療法的治療のためのｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ及びＳＴＡＴ３経路変調のための球状核酸

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20241018BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 47/50 20170101ALI20241018BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241018BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241018BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K31/713

A61K47/50

A61P35/00

A61P37/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024529322

(86)(22)【出願日】2022-11-17

(85)【翻訳文提出日】2024-05-23

(86)【国際出願番号】 US2022080086

(87)【国際公開番号】W WO2023092040

(87)【国際公開日】2023-05-25

(31)【優先権主張番号】63/280,499

(32)【優先日】2021-11-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500041019

【氏名又は名称】ノースウェスタン ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100134784

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和美

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンダー エイチ．ステフ

(72)【発明者】

【氏名】チャド エー．マーキン

(72)【発明者】

【氏名】アカンクシャ サンジェイ マハジャン

(72)【発明者】

【氏名】ミシェル ホープ テプレンスキー

(72)【発明者】

【氏名】ジョンス パク

(72)【発明者】

【氏名】マシュー クオ バッシャー

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー ジョーゼフ シネグラ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB14

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB25

4C076CC50

4C076DD21

4C076EE24

4C076EE49

4C076EE59

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA59

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZB02

4C086ZB09

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZC19

(57)【要約】

本開示は、概して、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）が挙げられるが、これらに限定されない、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化することができるオリゴヌクレオチドの放射状提示によって囲まれたコアを有するナノ構造である球状核酸（ＳＮＡ）を対象とする。いくつかの実施形態では、ＳＮＡはまた、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）が挙げられるが、これに限定されない、転写因子を不活性化する。ＳＮＡを作製及び使用する方法もまた本明細書で提供される。いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、二本鎖又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

球状核酸（ＳＮＡ）であって、
（ａ）ナノ粒子コアと、
（ｂ）前記ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）。

【請求項2】

前記オリゴヌクレオチドのシェルが、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、請求項１に記載のＳＮＡ。

【請求項3】

前記オリゴヌクレオチドのシェルが、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、請求項１に記載のＳＮＡ。

【請求項4】

前記オリゴヌクレオチドのシェルが、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、前記複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの各々が、配列番号３を含む１つの鎖及び配列番号４を含む別の鎖を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項5】

前記オリゴヌクレオチドのシェルが、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、前記複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの各々が、配列番号３を含む１つの鎖及び配列番号４を含む別の鎖を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項6】

前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドが、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化する、請求項１～５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項7】

前記オリゴヌクレオチドのシェルが、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項8】

前記オリゴヌクレオチドのシェルが、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項9】

前記ナノ粒子コアが、金属コア、半導体コア、絶縁体コア、アップコンバーティングコア、ミセルコア、デンドリマーコア、リポソームコア、ポリマーコア、金属－有機構造体コア、脂質ナノ粒子コア、タンパク質コア、又はそれらの組み合わせである、請求項１～８のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項10】

前記ポリマーが、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリアクリレート、アルギネート、アルブミン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリエチレンイミン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、又はキトサンである、請求項９に記載のＳＮＡ。

【請求項11】

前記ナノ粒子コアが、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、セレン化カドミウム、酸化鉄、フラーレン、金属－有機構造体、シリカ、硫化亜鉛、又はニッケルを含む、請求項９に記載のＳＮＡ。

【請求項12】

前記脂質ナノ粒子コアが、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートを含む、請求項９に記載のＳＮＡ。

【請求項13】

前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、前記脂質－ＰＥＧコンジュゲートを通して前記脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している、請求項１２に記載のＳＮＡ。

【請求項14】

前記リポソームコアが、複数の脂質基を含む、請求項９に記載のＳＮＡ。

【請求項15】

前記複数の脂質基が、脂質のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルエタノールアミンのファミリーからなる群から選択される脂質を含む、請求項１４に記載のＳＮＡ。

【請求項16】

前記脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）からなる群から選択される、請求項１５に記載のＳＮＡ。

【請求項17】

前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが、脂質アンカー基を通して前記リポソームコア又は脂質ナノ粒子コアの外部に結合している、請求項９～１６のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項18】

前記脂質アンカー基が、前記少なくとも１個のオリゴヌクレオチドの５’終端又は３’終端に結合している、請求項１７に記載のＳＮＡ。

【請求項19】

前記脂質アンカー基が、トコフェロール、ＤＯＰＥ脂質、又はコレステロールである、請求項１７又は１８に記載のＳＮＡ。

【請求項20】

前記オリゴヌクレオチドのシェルが、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項21】

前記１個以上の追加のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２０に記載のＳＮＡ。

【請求項22】

前記１個以上の追加のオリゴヌクレオチドが、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２０又は２１に記載のＳＮＡ。

【請求項23】

前記１個以上の追加のオリゴヌクレオチドが、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、阻害性オリゴヌクレオチド、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化するオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせである、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項24】

前記阻害性オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである、請求項２３に記載のＳＮＡ。

【請求項25】

前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項２３又は２４に記載のＳＮＡ。

【請求項26】

前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項27】

前記ＴＬＲが、ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）、ｔｏｌｌ様受容体６（ＴＬＲ６）、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）、ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ｔｏｌｌ様受容体１０（ＴＬＲ１０）、ｔｏｌｌ様受容体１１（ＴＬＲ１１）、ｔｏｌｌ様受容体１２（ＴＬＲ１２）、及びｔｏｌｌ様受容体１３（ＴＬＲ１３）からなる群から選ばれる、請求項２６に記載のＳＮＡ。

【請求項28】

前記阻害性オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである、請求項２３～２７のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項29】

抗原を更に含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項30】

前記抗原が、前記オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している、請求項２９に記載のＳＮＡ。

【請求項31】

前記抗原が、前記ＳＮＡの表面に結合している、請求項２９又は３０に記載のＳＮＡ。

【請求項32】

前記抗原が、前記ナノ粒子コアに封入されている、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項33】

前記抗原が、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、ネオ抗原、又はそれらの組み合わせである、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項34】

前記抗原が、ＯＶＡ１、ＭＳＬＮ、Ｐ５３、Ｒａｓ、変異型ＩＤＨ１（ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ）、黒色腫関連抗原、ＨＰＶ関連抗原、前立腺がん関連抗原、膠芽腫抗原、グレードＩＶ星細胞腫抗原、卵巣がん関連抗原、乳がん関連抗原、肝細胞がん腫関連抗原、大腸がん関連抗原、又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７核タンパク質である、請求項３３に記載のＳＮＡ。

【請求項35】

前記ＳＮＡが、直径が約１～約１５０ナノメートル（ｎｍ）である、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項36】

前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約４～約２５０個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項37】

前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約１５～約１００塩基対長である、請求項１～３６のいずれか一項に記載のＳＮＡ。

【請求項38】

請求項１～３７のいずれか一項に記載の複数の球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物。

【請求項39】

対象においてがんに対する免疫応答を産生する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１～３７のいずれか一項に記載の球状核酸（ＳＮＡ）、請求項３８に記載の組成物、又はそれらの組み合わせを投与し、それによって、前記対象においてがんに対する免疫応答を産生することを含む、方法。

【請求項40】

対象においてがんを治療及び／又は改善する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１～３７のいずれか一項に記載のＳＮＡ、請求項３８に記載の組成物、又はそれらの組み合わせを投与することを含む、方法。

【請求項41】

前記がんが、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、眼がん、肝臓がん、膵臓がん、喉頭がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、脳がん、又はそれらの組み合わせである、請求項３９又は４０に記載の方法。

【請求項42】

前記がんが、膠芽腫である、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記投与することが、経口投与、局所投与、静脈内投与、動脈内投与、粘膜投与、腹腔内投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、非経口投与、皮内投与、鼻腔内投与、皮下投与、又はそれらの組み合わせによるものである、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記投与することが、直接的な頭蓋内／腫瘍内投与によるものである、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記対象が、女性である、請求項３９～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記投与することが、鼻腔内投与によるものである、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記投与することが、集束超音波（ＦＵＳ）と組み合わされる、請求項３９～４６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２８０，４９９号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

政府関心対象に関する記述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号１Ｒ０１ＣＡ２０８７８３－０１Ａ１及び５Ｕ５４ＣＡ１９９０９１－０５の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

【0003】

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本開示の一部である配列表を、明細書と同時にテキストファイルとして提出する。配列表を含むテキストファイルの名称は、「２０２１－２２１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」であり、これは２０２２年１１月１７日に作成され、サイズが９，６９３バイトである。配列表の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0004】

本開示は、概して、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化することができるオリゴヌクレオチドの放射状提示によって囲まれたコアを有するナノ構造である球状核酸（ＳＮＡ）に関する。いくつかの実施形態では、ＳＮＡはまた、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化する。ＳＮＡを作製及び使用する方法もまた本明細書で提供される。

【背景技術】

【0005】

インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路の活性化は、腫瘍に対する先天性及び適応性免疫応答を促進する主要な免疫感知メカニズムのうちの１つを表す^１。腫瘍由来ＤＮＡは、抗原提示細胞において、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）によって認識される。核酸認識時に、ｃＧＡＳは、環状ジヌクレオチドＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）を生成する。ｃＧＡＭＰは、次に、アダプタータンパク質ＳＴＩＮＧに結合し、それを活性化し、インターフェロン制御因子３（ＩＲＦ３）及び核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）依存性転写を誘起して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、炎症誘発性マクロファージ、及びＴ細胞の活性化を促進する^１。

【発明の概要】

【0006】

ＳＴＩＮＧ拮抗性環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）の腫瘍内投与は、同所性膠芽腫（ＧＢＭ）モデルを含む複数個のがんモデルにおける腫瘍進行に拮抗し^２、現在、進行性非ＣＮＳがんを有する患者における第Ｉ相臨床試験で試験されている。しかしながら、不十分な親油性と合わせて、限定された安定性及びバイオアベイラビリティは、特に、非侵襲的治療手法を考慮すると、臨床的ＣＤＮ開発を限定する。

【0007】

球状核酸（ＳＮＡ）は、放射状に配向されたオリゴヌクレオチドのシェルで高密度に機能化されたナノ粒子コアを含むモジュール構造である^３。独自の３次元アーキテクチャは、ヌクレアーゼ媒介分解に対して強化された耐性を付与し、補助送達ビヒクルを必要とすることなく、確実な細胞侵入及びバイオアベイラビリティを可能にする。膠芽腫（ＧＢＭ）におけるｓｉＲＮＡベースのＳＮＡ（ＳＮＡ^{ｓｉＲＮＡ}）^４、及び固形がんにおけるＣｐＧリッチＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＳＮＡ^ＣｐＧ）を担持するｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９拮抗性ＳＮＡ^５、６の早期臨床試験により、ＳＮＡがＧＢＭ及び他の固形腫瘍における遺伝子調節及び免疫刺激のための安全な脳透過性療法を表すという最初の臨床的証拠が提供された。

【0008】

本明細書で提供される技術の利点には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・ｃＧＡＳを直接的に活性化するためにインターフェロン刺激性（ＩＳＤ）オリゴヌクレオチド（ＳＮＡ^ＩＳＤ）とコンジュゲートされたＳＮＡは、特に、非侵襲的送達手法を考慮する場合、現在臨床開発下にあるＳＴＩＮＧを標的とするＣＤＮよりも優れている。
・ｃＧＡＳ及びＳＴＡＴ３タンパク質（ＳＮＡ^{ＩＳＤ／ＳＴＡＴ３ｉ}）の両方に関与するように設計された二峰性ＳＮＡは、付随的に、より効果的な抗腫瘍免疫を達成するために直交シグナル伝達経路を標的とする。

【0009】

したがって、いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含み、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなり、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの各々が、配列番号３を含む１つの鎖及び配列番号４を含む別の鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの各々が、配列番号３を含む１つの鎖及び配列番号４を含む別の鎖を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドは、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化する。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化する。いくつかの実施形態では、一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドは、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化しシグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。様々な実施形態では、ナノ粒子コアは、金属コア、半導体コア、絶縁体コア、アップコンバーティングコア、ミセルコア、デンドリマーコア、リポソームコア、ポリマーコア、金属－有機構造体コア、脂質ナノ粒子コア、タンパク質コア、又はそれらの組み合わせである。更なる実施形態では、ポリマーは、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリアクリレート、アルギネート、アルブミン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリエチレンイミン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、又はキトサンである。様々な実施形態では、ナノ粒子コアは、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、セレン化カドミウム、酸化鉄、フラーレン、金属－有機構造体、シリカ、硫化亜鉛、又はニッケルを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子コアは、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートを含む。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを通して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。いくつかの実施形態では、リポソームコアは、複数の脂質基を含む。更なる実施形態では、複数の脂質基は、脂質のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルエタノールアミンのファミリーからなる群から選択される脂質を含む。様々な実施形態では、脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を通してリポソームコア又は脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。いくつかの実施形態では、脂質アンカー基は、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドの５’終端又は３’終端に結合している。更なる実施形態では、脂質アンカー基は、トコフェロール、ＤＯＰＥ脂質、又はコレステロールである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む。更なる実施形態では、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む。なお更なる実施形態では、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドは、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、阻害性オリゴヌクレオチド、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化するオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである。いくつかの実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。様々な実施形態では、ＴＬＲは、ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）、ｔｏｌｌ様受容体６（ＴＬＲ６）、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）、ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ｔｏｌｌ様受容体１０（ＴＬＲ１０）、ｔｏｌｌ様受容体１１（ＴＬＲ１１）、ｔｏｌｌ様受容体１２（ＴＬＲ１２）、及びｔｏｌｌ様受容体１３（ＴＬＲ１３）からなる群から選ばれる。更なる実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである。いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＡは、抗原を更に含む。いくつかの実施形態では、抗原は、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの実施形態では、抗原は、ＳＮＡの表面に結合している。いくつかの実施形態では、抗原は、ナノ粒子コアに封入されている。様々な実施形態では、抗原は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、ネオ抗原、又はそれらの組み合わせである。更なる実施形態では、抗原は、ＯＶＡ１、ＭＳＬＮ、Ｐ５３、Ｒａｓ、変異型ＩＤＨ１（ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ）、黒色腫関連抗原、ＨＰＶ関連抗原、前立腺がん関連抗原、膠芽腫抗原、グレードＩＶ星細胞腫抗原、卵巣がん関連抗原、乳がん関連抗原、肝細胞がん腫関連抗原、大腸がん関連抗原、又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７核タンパク質である。様々な実施形態では、ＳＮＡは、直径が約１～約１５０ナノメートル（ｎｍ）である。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約４～約２５０個のオリゴヌクレオチドを含む。なお更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約１５～約１００塩基対長である。

【0010】

いくつかの態様では、本開示は、本開示の複数の球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物を提供する。

【0011】

更なる態様では、本開示は、対象においてがんに対する免疫応答を産生する方法であって、対象に、有効量の本開示の球状核酸（ＳＮＡ）、本開示の組成物、又はそれらの組み合わせを投与し、それによって、対象においてがんに対する免疫応答を産生することを含む、方法を提供する。なお更なる態様では、本開示は、対象においてがんを治療及び／又は改善する方法であって、対象に、有効量の本開示のＳＮＡ、本開示の組成物、又はそれらの組み合わせを投与することを含む、方法を提供する。様々な実施形態では、がんは、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、眼がん、肝臓がん、膵臓がん、喉頭がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、脳がん、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、がんは、膠芽腫である。様々な実施形態では、投与することは、経口投与、局所投与、静脈内投与、動脈内投与、粘膜投与、腹腔内投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、非経口投与、皮内投与、鼻腔内投与、皮下投与、又はそれらの組み合わせによるものである。いくつかの実施形態では、投与することは、直接的な頭蓋内／腫瘍内投与によるものである。いくつかの実施形態では、投与することは、集束超音波（ＦＵＳ）、血液脳関門を一時的に開放するためのマイクロバブルの同時投与、又はそれらの組み合わせと組み合わされる。いくつかの実施形態では、対象は、女性である。いくつかの実施形態では、対象は、男性である。いくつかの実施形態では、投与することは、鼻腔内投与によるものである。

【0012】

更なる態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。更なる実施形態では、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写因子を不活性化する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、転写因子を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、１個以上のＧ－カルテットオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれからなる。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、転写因子を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。様々な実施形態では、細胞質ＤＮＡセンサーは、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）、ＡＩＭ２（黒色腫－２には存在しない）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＡＩ（ＩＦＮ－調節因子のＤＮＡ依存性活性化因子）、ＩＦＩ１６（インターフェロン－γ－誘導性タンパク質１６）、又はそれらの組み合わせである。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、転写因子は、がんの進行を促進する。様々な実施形態では、転写因子は、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）、ｃＭｙｃ、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの各々が、配列番号３を含む１つの鎖及び配列番号４を含む別の鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、複数の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの各々が、配列番号３を含む１つの鎖及び配列番号４を含む別の鎖を含む。様々な実施形態では、ナノ粒子コアは、金属コア、半導体コア、絶縁体コア、アップコンバーティングコア、ミセルコア、デンドリマーコア、リポソームコア、ポリマーコア、金属－有機構造体コア、脂質ナノ粒子コア、タンパク質コア、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、ポリマーは、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリアクリレート、アルギネート、アルブミン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリエチレンイミン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、又はキトサンである。様々な実施形態では、ナノ粒子コアは、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、セレン化カドミウム、酸化鉄、フラーレン、金属－有機構造体、シリカ、硫化亜鉛、又はニッケルを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子コアは、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを通して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。いくつかの実施形態では、リポソームコアは、複数の脂質基を含む。更なる実施形態では、複数の脂質基は、脂質のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルエタノールアミンのファミリーからなる群から選択される脂質を含む。なお更なる実施形態では、脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）からなる群から選択される。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を通してリポソームコア又は脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。いくつかの実施形態では、脂質アンカー基は、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドの５’終端又は３’終端に結合している。いくつかの実施形態では、脂質アンカー基は、トコフェロール、ＤＯＰＥ脂質、又はコレステロールである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む。更なる実施形態では、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドは、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、阻害性オリゴヌクレオチド、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化するオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである。更なる実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。様々な実施形態では、ＴＬＲは、ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）、ｔｏｌｌ様受容体６（ＴＬＲ６）、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）、ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ｔｏｌｌ様受容体１０（ＴＬＲ１０）、ｔｏｌｌ様受容体１１（ＴＬＲ１１）、ｔｏｌｌ様受容体１２（ＴＬＲ１２）、及びｔｏｌｌ様受容体１３（ＴＬＲ１３）からなる群から選ばれる。様々な実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである。いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＡは、抗原を更に含む。様々な実施形態では、抗原は、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの実施形態では、抗原は、ＳＮＡの表面に結合している。いくつかの実施形態では、抗原は、ナノ粒子コアに封入されている。様々な実施形態では、抗原は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、ネオ抗原、又はそれらの組み合わせである。更なる実施形態では、抗原は、ＯＶＡ１、ＭＳＬＮ、Ｐ５３、Ｒａｓ、変異型ＩＤＨ１（ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ）、変異型テロメラーゼ逆転写酵素、黒色腫関連抗原、ＨＰＶ関連抗原、前立腺がん関連抗原、膠芽腫抗原、グレードＩＶ星細胞腫抗原、卵巣がん関連抗原、乳がん関連抗原、肝細胞がん腫関連抗原、大腸がん関連抗原、又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７核タンパク質である。様々な実施形態では、変異型テロメラーゼ逆転写酵素は、ＴＥＲＴ；Ｃ２２８Ｔ、Ｃ２５０Ｔ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＳＮＡは、直径が約１～約１５０ナノメートル（ｎｍ）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約４～約２５０個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約１５～約１００塩基対長である。いくつかの態様では、本開示は、本開示の複数の球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、対象においてがんに対する免疫応答を産生する方法であって、対象に、有効量の本開示の球状核酸（ＳＮＡ）、本開示の組成物、又はそれらの組み合わせを投与し、それによって、対象においてがんに対する免疫応答を産生することを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、対象においてがんを治療及び／又は改善する方法であって、対象に、有効量の本開示のＳＮＡ、本開示の組成物、又はそれらの組み合わせを投与することを含む、方法を提供する。様々な実施形態では、がんは、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、眼がん、肝臓がん、膵臓がん、喉頭がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、脳がん、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、がんは、膠芽腫である。様々な実施形態では、投与することは、直接的な頭蓋内／腫瘍内投与、経口投与、局所投与、静脈内投与、動脈内投与、粘膜投与、腹腔内投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、非経口投与、皮内投与、鼻腔内投与、皮下投与、又はそれらの組み合わせによるものである。いくつかの実施形態では、対象は、女性である。いくつかの実施形態では、対象は、男性である。いくつかの実施形態では、投与することは、鼻腔内投与によるものである。更なる実施形態では、投与することは、集束超音波（ＦＵＳ）、血液脳関門を一時的に開放するためのマイクロバブルの同時投与、又はそれらの組み合わせと組み合わされる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ＩＳＤ４５－ＳＮＡがｃＧＡＳに直接的に関与することを示す。（Ａ）ＳＮＡアーキテクチャの概略図。（Ｂ）無細胞ｃＧＡＳ活性化アッセイ。（Ｃ）ＩＲＦ誘導中央値＋／－標準偏差を定量化するレポーターアッセイが示されている。＊ｐ＜０．０５。

【図2】ＩＳＤ４５ ＳＮＡがＩＲＦ及び炎症誘発性サイトカインを誘導することを示す。（Ａ）ＩＳＤ４５－ＳＮＡで治療した細胞における金の細胞レベルを定量化するためのＩＣＰ－ＭＳ。（Ｂ～Ｄ）ＲＡＷ－Ｌｕｃｉａ（商標）マクロファージ（Ｂ）、ＴＨＰ細胞（Ｃ）、並びにＷＴ、ｃＧＡＳ－、ＳＴＩＮＧ－、及びＩＲＦ－欠損ＲＡＷ－Ｌｕｃｉａ（商標）マクロファージにおけるＩＲＦ誘導を定量化するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ。ＴＦＸ、トランスフェクション剤。中央値＋／－標準偏差が示されている。＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）ＲＡＷ－Ｌｕｃｉａ（商標）マクロファージにおけるＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ＥＬＩＳＡベース及び（Ｆ）抗体アレイベースのサイトカインプロファイリング。

【図3】ｃＧＡＳアゴニズムが、コア材料及びサイズとは独立してオリゴヌクレオチドシェルによって媒介されることを示す（Ａ）ＰＬＧＡ－ＳＮＡの概略図。（Ｂ）サイトカラシンＤ又はフコイダンで事前治療したＲＡＷ Ｌｕｃｉａ（商標）マクロファージにおけるＰＬＧＡ^Ｃｙ５ベースのＩＳＤ４５－ＳＮＡの取り込み。（Ｃ）ＲＡＷ Ｌｕｃｉａ（商標）マクロファージにおけるルシフェラーゼレポーターアッセイ。（Ｄ）ＰＬＧＡベースのＩＳＤ４５－ＳＮＡ及びＡｄｕｒｏＳ１００に応答する用量依存性ＩＲＦ３活性化。

【図4】ＩＳＤ４５－ＳＮＡがＧＢＭ保有マウスのＭ１マクロファージ分極化、腫瘍細胞死、及び生存を促進することを示す。（Ａ）示されるｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ－経路成分の豊富さを示すマクロファージ溶解物の免疫ブロット。（Ｂ）細胞上清中で決定した亜硝酸塩レベルは、下部に示される。（Ｃ）マクロファージと共培養するか、又は未治療のまま放置するか、又はｓｓＤＮＡ^４５－ＳＮＡ若しくはＩＳＤ４５－ＳＮＡで治療したマクロファージからの上清に曝露された、ＣＴ２Ａ腫瘍細胞の成長曲線。（Ｄ）マクロファージ上清とともにインキュベートしたＣＴ２Ａ腫瘍細胞のＭＴＴ生存率アッセイ。中央値＋／－標準偏差が示されている。（Ｅ）Ｇｄ（ＩＩＩ）で標識されたＳＮＡで（直接的な腫瘍内投与を介して）注射した腫瘍保有マウスの脳のＨ＆Ｅ染色及びＭＲＩスキャン。（Ｆ）ＣＴ２Ａ神経膠腫腫瘍細胞を接種し、直接的な腫瘍内投与を介してｓｓＤＮＡ４５－又はＩＳＤ４５－ＳＮＡで治療した、雌ＢＬ６／Ｃ５７マウスのカプラン－マイヤー生存曲線。＊ｐ＜０．０５。

【図5】ＩＳＤ４５－ＳＮＡの鼻から脳への送達を示す。（Ａ）ＣＮＳへの薬物送達のための鼻腔及び嗅神経／三叉神経経路の概略図。（Ｂ）肺、肝臓、腎臓、脾臓、及び鼻腔／口腔を含む異なる臓器における金のＩＣＰ－ＭＳ分析によれば、金ＩＳＤ４５－ＳＮＡは、脳／脳腫瘍実質内に蓄積する。（Ｃ）Ｃｙ５で標識された金ベースのＩＳＤ４５－ＳＮＡ。（Ｄ～Ｅ）腫瘍細胞又は三叉神経の断面の蛍光マイクロコピー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ）は、Ｃｙ５で標識されたＩＳＤ４５－ＳＮＡの腫瘍内での蓄積、及び三叉神経の神経上膜内で局在化したものを示している。（Ｆ）Ｃｙ５で標識されたＰＬＧＡ－ＳＮＡの概略図。注記、Ｃｙ５は、コアに結合している。（Ｇ）頭部（鼻腔を含む）及び脳のＩＶＩＳ画像。（Ｈ）断面の蛍光顕微鏡検査は、嗅球及び異なる腫瘍切片内でのＰＬＧＡ－ＳＮＡＣｙ５蓄積を示す。（Ｉ）単離された三叉神経のＩＶＩＳ及び蛍光画像。横断面及び縦断面が示されている。（Ａ）Ｂａｌｙａｓｎｉｋｏｖａ ａｎｄ ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２０１８から取られたもの。

【図6】鼻腔内送達されたＩＳＤ４５－ＳＮＡの抗腫瘍効果がＳＴＩＮＧに依存し、チェックポイント阻害によって増強され得ることを示す。（Ａ～Ｂ）ＣＴ２Ａ保有Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔマウス（Ａ）及びＳＴＩＮＧ^{ｇｔ／ｇｔ}マウス（Ｂ）における生物発光の定量化。（Ｃ）未治療のまま放置されるか、又はｓｓＤＮＡ４５－ＳＮＡ、ＩＳＤ４５－ＳＮＡ、若しくはＣＤＮ ＡｄｕｒｏＳ１００のいずれかで治療されたＣＴ２Ａ保有Ｃ５７ＢＬ／６－ｗｔマウスの生物発光の定量化。平均＋／－標準偏差が示されている。（Ｄ～Ｇ）ＣＴ２Ａ保有Ｃ５７ＢＬ／６－ｗｔマウス（Ｆ）、ＳＴＩＮＧ^{ｇｔ／ｇｔ}マウス（Ｅ）、及びＳＮＡ及びチェックポイント阻害剤で共治療されたＣＴ２Ａ保有Ｃ５７ＢＬ／６－ｗｔマウス（Ｇ）におけるカプランマイヤー生存時間分析。パネルＤでは、全生存時間、及び雌及び雄の動物対象における生存時間が示されている。パネルＥでは、生存時間中央値が日数で示されている。

【図7】ＩＳＤ４５－ＳＮＡ抗腫瘍効果がチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）との共治療によって増強され得ることを示す。（Ａ）ＣＴ２Ａ腫瘍保有マウスのカプラン－マイヤー生存曲線（全体、雌及び雄の動物対象）。（Ｂ）長期生存者（女性、パネルＡでの実験において識別した）を、対側半球に移植したＣＴ２Ａ腫瘍細胞で再試験を行った。生存時間を、カプラン－マイヤー法を使用して分析した。

【図8】ＩＳＤ４５－ＳＮＡの鼻から脳への送達時の免疫プロファイルを示す。（Ａ～Ｂ）未治療のまま放置するか、又はｓｓＤＮＡ４５－及びＩＳＤ４５－ＳＮＡで鼻腔内治療したマウスから単離した腫瘍におけるエフェクターＴ細胞（Ａ）及びＴＡＭ含有量（Ｂ）を比較するヒートマップ。（Ｃ～Ｆ）ＩＳＤ４５－ＳＮＡで治療したマウスからの深頸部流入領域リンパ節におけるＮＫ細胞集団の濃縮を示す最小重量スパニングツリー（Ｃ）及びヒストグラム（Ｄ～Ｆ）。平均＋／－標準偏差が示されている。＊ｐ＜０．０５。

【図9】二峰性ＳＮＡ^{ＩＳＤ／ＳＴＡＴ３ｉ}を示す。（Ａ）単官能性ｄｓＩＳＤ^４５－ＳＮＡと比較して、二峰性ｃＧＡＳ及びＳＴＡＴ３変調のために設計されたＳＮＡアーキテクチャの概略図。（Ｂ）ＳＴＡＴ３トランス活性化活性を監視するためのＳＴＡＴ３レポーターアッセイ。（Ｃ）ＲＡＷ－ＬｕｃｉａマクロファージにおけるＩＲＦレポーターアッセイ。（Ｄ）リン酸化ＳＴＡＴ３の細胞内分布を示す免疫蛍光顕微鏡。ＤＡＰＩ、核対比染色。（Ｅ）異なるＳＮＡアーキテクチャでの治療時の神経膠腫幹細胞球サイズの評価。（Ｆ）示されるＳＮＡのｉ．ｃ．投与を介して治療されたＣＴ２Ａ保有ＢＬ／６マウスのカプランマイヤー生存曲線。平均＋／－標準偏差が示されている。＊ｐ＜０．０５。

【図10】付随するｃＧＡＳ活性化及びＳＴＡＴ３阻害のための二峰性ＳＮＡの開発を示す。（Ａ）ｃＧＡＳ活性化及びＳＴＡＴ３阻害のために金ナノ粒子コアにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの配列。ｓｓＤＮＡ４５オリゴヌクレオチドを陰性対照として使用した。配列：ｓｓＤＮＡ^Ｔ４５＝５’－ＴＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＴＡＣＡ－３’（配列番号５）；ＩＳＤ^４５センス＝５’－ＴＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＴＡＣＡ－３’（配列番号１０）；ＩＳＤ^４５アンチセンス＝５’－ＡＣＡＴＣＴＡＧＴＡＣＡＴＧＴＣＴＡＧＴＣＡＧＴＡＴＣＴＡＧＴＧＡＴＣＡＴＣＡＧＡＣＡ－３’（配列番号６）；ＳＴＡＴ３ｉセンス＝５’－ＣＴＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＴＡＣ－３’（配列番号７）；ＳＴＡＴ３ｉアンチセンス＝５’－ＧＴＡＡＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＧ－３’（配列番号８）；ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ＝５’－ＴＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＣＧＴＡＡＡＴＣＧＧＧＧＧＧＡＴＴＴＡ ＣＧＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＴＡ－３’（配列番号９）（Ｂ～Ｅ）ヒト組換えｃＧＡＳ（Ｂ～Ｃ）及びＳＴＡＴ３（Ｄ～Ｅ）へのＳＮＡ結合を評価するために改変されたゲルシフトアッセイ及びヒル－ラングミュアコンピューティング。（Ｆ～Ｇ）全てのＳＮＡ、すなわち、ＩＳＤ４５－ＳＮＡ、ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ、及びＳＴＡＴ３ｉ^１５ＳＮＡアーキテクチャがＩＲＦ３活性化を誘導したことを示す、無細胞及び細胞ベースのＩＲＦ３レポーターアッセイ。（Ｈ）ＩＳＤ^１５ＳＴＡＴ３ｉ及びＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡはＳＴＡＴ３ 駆動型ＩＬ－６トランス活性化を抑制するが、ＩＳＤ４５－ＳＮＡはそれを抑制しないことを示す、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ６レポーター細胞におけるＩＬ６レポーターアッセイ。

【図11】単峰性又は二峰性ＳＮＡの抗腫瘍効果の根底にある性的二形を示す。（Ａ）ＣＴ２Ａ保有、（Ｂ）ＱＰＰ７保有、又は（Ｃ）ＱＰＰ４保有のＣ５７ＢＬ／６雄及び雌のマウスを、頭蓋内投与（１５μモルのＡｕ）を介して、腫瘍細胞移植の８日後に投薬されるＰＢＳ、ｓｓＤＮＡ４５－ＳＮＡ、ＩＳＤ４５－ＳＮＡ、ＩＳＤ^１５ＳＴＡＴ３ｉ、又はＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡで治療した。ケプラン－マイヤー生存曲線を示す。Ｐ値を、ログランク（マンテル－コックス）検定を使用して計算した。＊ｐ＜０．０５。

【図12】ＳＮＡ治療後のＱＰＰ４腫瘍を保有する、雄ではなく雌の動物対象における免疫細胞活性化を明らかにするナノストリング発現プロファイリングを示す。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｐａｎｅｌを使用して、発現プロファイリングを実行した。総ＲＮＡを、腫瘍細胞移植の３０日後に腫瘍浸潤免疫細胞から単離した。（Ａ、Ｂ）雌及び雄の宿主における治療群ＰＢＳ、ｓｓＤＮＡ４５－ＳＮＡ、ＩＳＤ４５－ＳＮＡ、ＳＴＡＴ３ｉ^１５－ＳＮＡ、ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡの７３０個の遺伝子全てについてのｚスコアデータの教師なしクラスタリングを示すヒートマップ。ヒートマップに列挙される選択された遺伝子は、免疫活性化又は免疫抑制を担う明確なクラスターを表す。（Ｃ、Ｄ）雄及び雌の免疫細胞集団のためのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ遺伝子セット経路分析。（Ｅ）ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡで治療した雄マウス対雌マウス（ｎ＝３の生物学的複製）についてのｚスコアでランク付けされた遺伝子発現のヒートマップ。（Ｆ）ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡ治療群についての、雌対雄における発現変動遺伝子のボルケーノプロット（Ｌｏｇ２ ＦＣ＞１．５及びｐ値＜０．０５）。ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡ治療について雄と比較した、雌における上方制御された鍵遺伝子が示されている。（Ｇ）遺伝子オントロジー分析は、ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡ治療群について雄と比較した、雌における生物学的経路の富化を明らかにした。ＳｈｉｎｙＧＯツール（Ｇｅ ＳＸ，Ｊｕｎｇ Ｄ ＆ Ｙａｏ Ｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０２０）を使用して、データを分析した。

【図13】ｃＧＡＳタンパク質が、雄マウスに対して雌マウスにおいてより高いレベルで発現することを示す。（Ａ）脾臓のウェスタンブロット分析、及び（Ｂ）雄又は雌マウスに由来するＢＭＤＭ溶解物。β－アクチンをロードコントロールとして示す。（Ｃ）雄又は雌のＰＢＳ－、ｓｓＤＮＡ４５－ＳＮＡ－、又はＩＳＤ４５－ＳＮＡで治療したＣＴ２Ａ保有マウスから単離した腫瘍関連骨髄細胞（ＴＡＭＣ）中のｃＧＡＳタンパク質レベルのフローサイトメトリーに基づく定量化。

【発明を実施するための形態】

【0014】

腫瘍に対する免疫系を活性化するワクチン、薬物、及び改変されたヒト細胞は、ある種のがんと診断された患者の転帰を向上させ、寿命を延ばすことができるが、膠芽腫（ＧＢＭ）を有する患者に生存利益を提供することができない。インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路の活性化は、腫瘍に対するナチュラルキラー（ＮＫ）及びＴ細胞プライミングを可能にする、主な先天性免疫感知経路のうちの１つを表す。

【0015】

本開示は、ＳＮＡ構造へのオリゴヌクレオチドの配合（例えば、ナノ粒子の表面上の高密度でのオリゴヌクレオチドの提示）が、線状（「遊離」）オリゴヌクレオチドのものとは根本的に異なる生化学的及び生物学的特性につながることを示す。これらの特性としては、多種多様な細胞によるＳＮＡの細胞取り込み、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドで機能化されたＳＮＡの遺伝子調節活性、及び免疫刺激性オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされたＳＮＡのＴＬＲアゴニスト活性が挙げられる。第一世代のｓｉＲＮＡベースのＳＮＡ（ＮＣＴ０３０２００１７；ＧＢＭ）、及びｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストＳＮＡ（ＮＣＴ０３０８６２７８；固形がん）を用いた臨床試験が最近完了した。

【0016】

したがって、様々な態様では、本開示は、高い表面密度でインターフェロン刺激ＤＮＡ（ＩＳＤ）オリゴヌクレオチドを提示するＳＮＡを用いて、ＳＴＩＮＧの上流の細胞質性ｄｓＤＮＡのセンサーであるｃＧＡＳを標的とすることによってｃＧＡＳアゴニスト免疫療法を提供し、臨床神経腫瘍学で使用するための免疫刺激療法の新規の分類としてのＳＮＡ^ＩＳＤの潜在性を判定するために提供する。この手法は、小分子（ＣＤＮを含む）を有するＳＴＩＮＧ経路を標的とする他の現在の手法とは区別される。理論に束縛されることを望むものではないが、ｃＧＡＳを標的とすることにより、ＳＮＡ^ＩＳＤを使用する戦略は、ｄｓＤＮＡを送達し、内因性ＣＤＮの触媒産生を誘導することによってＳＴＩＮＧ応答を引き起こすｃＧＡＳの能力を活用する。本明細書で提供されるようなＳＮＡの使用は、ＳＮＡとして配合された核酸の強化された取り込みを通して治療用核酸の送達の課題に対処し、更に、ナノ粒子テンプレート上で高密度でのオリゴヌクレオチドの多価提示を活用する。したがって、本明細書に示されるように、ＳＮＡの表面上の密接に配置された隣接するｄｓＤＮＡ分子の結合は、強力なｃＧＡＳ活性化につながる。いくつかの態様では、本開示は、強力な型のＩＦＮ応答を誘発することと、細胞の細胞質ゾル中のＳＴＡＴ３を隔離／不活性化して、効果的な抗腫瘍免疫を達成することと、の両方を可能にする、二峰性ｃＧＡＳ活性化及びＳＴＡＴ３阻害性ＳＮＡを提供する。様々な実施形態では、そのような二峰性ＳＮＡは、１個以上のｃＧＡＳ活性化オリゴヌクレオチド、ＳＴＡＴ３を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、ｃＧＡＳを活性化してＳＴＡＴ３を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。更なる態様では、本開示は、有効な型のＩＦＮ応答を誘発することと、細胞の細胞質ゾル中の転写因子（例えば、ＳＴＡＴ３）を隔離／不活性化して、効果的な抗腫瘍免疫を達成することと、の両方を可能にする、二峰性細胞質ＤＮＡセンサー活性化及び転写因子阻害性ＳＮＡを提供する。様々な実施形態では、そのような二峰性ＳＮＡは、１個以上の細胞質ＤＮＡセンサー活性化オリゴヌクレオチド、転写因子（例えば、ＳＴＡＴ３）を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化して転写因子を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。

【0017】

専門用語
「～から」、「～まで」、「最大」、「少なくとも」、「～より大きい」、「～より小さい」などの全ての言語は、列挙された数を含み、その後部分的な範囲に分解することができる範囲を指す。

【0018】

範囲には、各個々のメンバーが含まれる。したがって、例えば、１～３つのメンバーを有する群は、１つ、２つ、又は３つのメンバーを有する群を指す。同様に、６つのメンバーを有する群は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は６つのメンバーを有する群を指す。

【0019】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的対象のうちの１つ又は２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指す。

【0020】

「約」及び「およそ」とは、一般に、測定の性質又は精度を考慮して測定された量について許容される誤差の程度を意味するものとする。例示的な誤差の程度は、２０～２５パーセント（％）以内、例えば、記載された値又は値の範囲の２０パーセント以内、１０パーセント以内、５パーセント以内、４パーセント以内、３パーセント以内、２パーセント以内、又は１パーセント以内である。

【0021】

「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合には交換可能である。

【0022】

「対象」は、脊椎動物生物である。対象は、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、又は非ヒト霊長類）であり得るか、又は対象は、ヒト対象であり得る。

【0023】

本明細書で使用される「投与すること」、「投与する」、「投与」などの用語は、ＳＮＡを、そのような薬剤による治療を必要とする対象に移送、送達、導入、又は輸送する任意のモードを指す。そのようなモードとしては、経口、局所、静脈内、動脈内、粘膜、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、非経口、皮内、鼻腔内、及び皮下投与が挙げられるが、これらに限定されない。集束超音波（ＦＵＳ）と組み合わされた異なる投与ルートの組み合わせと同様に、別個に又は同時に、異なる投与ルートの組み合わせも本開示によって企図される。

【0024】

本明細書で使用される場合、「治療すること」及び「治療」は、障害に関連する症状の重症度及び／又は発症の任意の低減を指す。したがって、「治療すること」及び「治療」には、治療的及び予防的手段が含まれる。当業者は、障害からの任意の程度の保護又は改善が、ヒト患者などの対象に有益であることを理解するであろう。患者の生活の質は、対象における症状の重症度を任意の程度まで低減し、かつ／又は症状の出現を遅らせるか、若しくは阻止することによって向上させる。

【0025】

物質の「有効量」又は「十分量」は、臨床結果を含む、有益な又は所望の結果をもたらすために必要な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用される文脈に依存する。例えば、限定するものではないが、本開示のＳＮＡの有効量は、免疫応答を誘発し、遺伝子発現を阻害し、かつ／又はがんを治療するのに十分である量である。有効量は、１つ以上の用量で投与され得る。有効性は、実験的又は臨床的な試験において、例えば、実験対照と比較して、目的の物質を用いて達成された結果を比較することによって、示され得る。

【0026】

本開示のＳＮＡに関して本明細書で使用される「用量」という用語は、任意の一度に対象によって取られる（対象に投与されるか、又は対象によって摂取される）ＳＮＡ（例えば、薬学的製剤として）の測定された部分を指す。

【0027】

「抗原性組成物」は、特異的な免疫応答を誘発することができる、ヒト又は動物対象への投与（例えば、実験的又は臨床的な設定での）に好適な物質の組成物である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、がん関連抗原などの抗原に対して誘発される。したがって、いくつかの実施形態では、抗原性組成物は、１つ以上の抗原又は抗原エピトープを含む。抗原性組成物はまた、いくつかの実施形態では、賦形剤、担体、及び／又はアジュバントなどの、免疫応答を誘発又は強化することができる１つ以上の追加の成分を含み得る。

【0028】

「免疫応答」は、抗原（例えば、抗原性組成物として配合された）などの刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又は単球などの免疫系の応答（例えば、インターフェロン応答）又は免疫系の細胞の応答である。本開示のＳＮＡでの治療からもたらされる免疫応答は、（１）神経膠腫腫瘍微小環境内のＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤及び活性化、（２）マクロファージのＭ２／Ｍ０～Ｍ１再教育、並びに（３）ＮＫ及びＮＫＴ細胞の活性化のうちの１つ以上を誘起し得る。免疫応答は、Ｂ細胞応答であり得、これは、抗原特異的中和抗体などの特異的抗体の産生をもたらす。免疫応答はまた、ＣＤ４＋応答又はＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答であり得る。Ｂ細胞及びＴ細胞応答は、「細胞性」免疫応答の態様である。免疫応答はまた、抗体によって媒介される「体液性」免疫応答であり得る。いくつかの場合では、応答は、特定の抗原に特異的である（すなわち、「抗原特異的応答」）。

【0029】

本明細書で使用される場合、「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」は、免疫応答（例えば、インターフェロン応答）を刺激（例えば、誘導又は強化）することができるオリゴヌクレオチドである。本明細書に記載されるように、本開示は、ｃＧＡＳを活性化する免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むＳＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化する免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むＳＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＡは、ｃＧＡＳを活性化するオリゴヌクレオチド、及び追加のＤＮＡセンサー又はパターン認識受容体を標的とする１個以上の追加の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。免疫刺激性オリゴヌクレオチドの典型的な例は、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、及びＡＩＭ２（黒色腫－２には存在しない）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＡＩ（ＩＦＮ－調節因子のＤＮＡ依存性活性化因子）、ＩＦＩ１６（インターフェロン－γ誘導性タンパク質１６）、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、追加のＤＮＡセンサーを標的とする二本鎖若しくは一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態では、ＴＬＲは、ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）、ｔｏｌｌ様受容体６（ＴＬＲ６）、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）、ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ｔｏｌｌ様受容体１０（ＴＬＲ１０）、ｔｏｌｌ様受容体１１（ＴＬＲ１１）、ｔｏｌｌ様受容体１２（ＴＬＲ１２）、及びｔｏｌｌ様受容体１３（ＴＬＲ１３）からなる群から選ばれる。「ＣｐＧモチーフ」は、シトシン－グアニンジヌクレオチド配列である。様々な実施形態では、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＳＮＡのナノ粒子コアに封入されるか、ナノ粒子コアの外部表面に結合するか、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子コアに封入され、及び／又はナノ粒子コアの外部表面に結合する。いくつかの実施形態では、１個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＳＮＡに会合しておらず、ＳＮＡと同じ組成物又は別個の組成物のいずれかで別個に投与される。

【0030】

「阻害性オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、ｍＲＮＡをリボソーム内のタンパク質に翻訳することを妨げることによって、又は１つ以上の標的遺伝子若しくはｍＲＮＡに特異的に結合（ハイブリダイズ）し、それによって標的タンパク質の発現又は生物学的活性を低減する、１つ以上の標的タンパク質をコードする遺伝子又はｍＲＮＡのいずれかに十分に相補的である、タンパク質の産生又は発現を低減するオリゴヌクレオチドを指す。阻害性オリゴヌクレオチドとしては、限定するものではないが、単離又は合成の短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＤＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ、キメラアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ模倣物、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（Ｃａｓ９送達と組み合わせたｓｇＲＮＡ）、先天性免疫受容体のＤＮＡ又はＲＮＡ阻害剤、アプタマー、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムが挙げられる。いくつかの実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、受容体に結合するが受容体を活性化せず、それによって受容体がリガンドに更に結合して活性化されるのを阻害するオリゴヌクレオチドである。

【0031】

本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、本明細書の全体を包含し得る。

【0032】

球状核酸（ＳＮＡ）
本明細書で使用される「球状核酸」（ＳＮＡ）は、高度に配向されたオリゴヌクレオチドシェルで機能化された球状又は実質的に球状のナノ粒子コアを含む。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、ＳＮＡは、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む。いくつかの態様では、本開示のＳＮＡは、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、ＳＮＡは、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、（ｉ）環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、（ｉｉ）シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１５塩基対長である、１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む。いくつかの態様では、本開示のＳＮＡは、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、（ｉ）細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、（ｉｉ）転写因子を不活性化し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１５塩基対長である、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む。いくつかの態様では、ＳＮＡは、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む。いくつかの態様では、ＳＮＡは、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む。いくつかの態様では、ＳＮＡは、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、（ｉ）環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、（ｉｉ）シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１５塩基対長である、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む。いくつかの態様では、ＳＮＡは、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、（ｉ）細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、（ｉｉ）転写因子を不活性化し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１５塩基対長である、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む。いくつかの態様では、ＳＮＡは、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、（ｉ）環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）又は他のＤＮＡセンサーを活性化し、（ｉｉ）シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）又は他の転写因子を不活性化し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１５塩基対長である、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む。

【0033】

いくつかの態様では、本開示は、ｃＧＡＳを活性化することと、ＳＴＡＴ３を不活性化することと、の両方を可能にする、二峰性ｃＧＡＳ活性化及びＳＴＡＴ３阻害性ＳＮＡを提供する。様々な実施形態では、そのような二峰性ＳＮＡは、１個以上のｃＧＡＳ活性化オリゴヌクレオチド、ＳＴＡＴ３を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、ｃＧＡＳを活性化してＳＴＡＴ３を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、本開示は、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化することと、転写因子を不活性化することと、の両方を可能にする、二峰性細胞質ＤＮＡセンサー活性化及び転写因子阻害性ＳＮＡを提供する。様々な実施形態では、そのような二峰性ＳＮＡは、１個以上の細胞質ＤＮＡセンサー活性化オリゴヌクレオチド、転写因子を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化して転写因子を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、タンパク質コアである。様々な実施形態では、タンパク質コアは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含むか、又はそれからなるタンパク質コアは、それに結合した１個以上のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、リポソームコアである。本開示のリポソームコアは、少なくとも実質的に球状の形状、内側及び外側を有し、脂質二重層を含む。脂質二重層は、様々な実施形態では、複数の脂質基を含む。複数の脂質基は、様々な実施形態では、脂質のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、及び／又はホスファチジルエタノールアミンのファミリーからの脂質を含む。限定することを意味するものではないが、様々な実施形態では、脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、又はそれらの組み合わせである。

【0036】

ＳＮＡのナノ粒子コアは、約１ナノメートル（ｎｍ）～約５００ｎｍ、約１ｎｍ～約４００ｎｍ、約１ｎｍ～約３００ｎｍ、約１ｎｍ～約２００ｎｍ、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１０ｎｍ～約４００ｎｍ、約１０ｎｍ～約３００ｎｍ、約１０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、約１０ｎｍ～約４０ｎｍ、約２０ｎｍ～約５０ｎｍ、約２０ｎｍ～約４０ｎｍ、約２０ｎｍ～約３０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約１５０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約１４０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約１３０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約１２０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約１１０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約９０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約８０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約７０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約６０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約４０ｎｍ、直径約１０ｎｍ～約３０ｎｍ、又は直径約１０ｎｍ～約２０ｎｍのサイズの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、金属コア（例えば、金）であり、直径が約１４ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、ポリマーコア（例えば、ＰＬＧＡ）であり、直径が約７０ｎｍである。他の態様では、本開示は、各々がナノ粒子コアを含む複数のＳＮＡを提供する。これらの態様では、複数のナノ粒子コアのサイズは、約１０ｎｍ～約１５０ｎｍ（平均直径）、平均直径約１０ｎｍ～約１４０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約１３０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約１２０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約１１０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約９０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約８０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約７０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約６０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約４０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約３０ｎｍ、平均直径約１０ｎｍ～約２０ｎｍ、又は平均直径約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、平均直径約２０ｎｍ～約９０ｎｍ、平均直径約２０ｎｍ～約８０ｎｍ、平均直径約２０ｎｍ～約７０ｎｍ、平均直径約２０ｎｍ～約６０ｎｍ、平均直径約２０ｎｍ～約５０ｎｍ、平均直径約２０ｎｍ～約４０ｎｍ、若しくは平均直径約２０ｎｍ～約３０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアの直径（又は複数のナノ粒子コアについては平均直径）は、約１０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、又は約４０～約８０ｎｍである。いくつかの実施形態では、方法で使用されるナノ粒子コアのサイズは、それらの特定の使用又は用途によって必要に応じて変動する。サイズの変動は、有利には、例えば、ナノ粒子の特定の物理的特徴、例えば、本明細書に記載されるように機能化され得る光学特性又は表面積の量を最適化するために使用される。更なる実施形態では、複数のＳＮＡが産生され、複数の中のＳＮＡは、約１５０ナノメートル以下（例えば、約１０ナノメートル～約１５０ナノメートル）、又は約１００ナノメートル以下（例えば、約１０ナノメートル～約１００ナノメートル）、又は約８０ナノメートル以下（例えば、約１０ナノメートル～約８０ナノメートル）の平均直径を有する。更なる実施形態では、本開示の方法によって作成される複数の中のナノ粒子コアは、約２０ナノメートル以下、又は約２５ナノメートル以下、又は約３０ナノメートル以下、又は約３５ナノメートル以下、又は約４０ナノメートル以下、又は約４５ナノメートル以下、又は約５０ナノメートル以下、又は約５５ナノメートル以下、又は約６０ナノメートル以下、又は約６５ナノメートル以下、又は約７０ナノメートル以下、又は約７５ナノメートル以下、又は約８０ナノメートル以下、又は約８５ナノメートル以下、又は約９０ナノメートル以下、又は約９５ナノメートル以下、又は約１００ナノメートル以下、又は約１００ナノメートル以下、又は約１２０ナノメートル以下、又は約１３０ナノメートル以下、又は約１４０ナノメートル以下、又は約１５０ナノメートル以下の直径又は平均直径を有する。ナノ粒子コアの前述の直径のうちのいずれも、ナノ粒子コア自体の直径、又はＳＮＡ（すなわち、ナノ粒子コア、及びナノ粒子コアの外部表面に結合するオリゴヌクレオチドのシェル）の直径に適用することができることが理解されるであろう。

【0037】

本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、ＳＮＡのナノ粒子コアは、リポソームコアである。したがって、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６８４２９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるようなリポソーム粒子もまた、本開示によって提供される。本開示のリポソーム粒子は、少なくとも実質的に球状の形状、内側及び外側を有し、複数の脂質基を含む。様々な実施形態では、複数の脂質基は、脂質のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルエタノールアミンのファミリーからなる群から選択される脂質を含む。本開示によって企図される脂質としては、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、カルジオリピン、脂質Ａ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を通してリポソームコアの外部表面に結合している。更なる実施形態では、脂質アンカー基は、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドの５’終端又は３’終端に結合している。なお更なる実施形態では、脂質アンカー基は、トコフェロール又はコレステロールである。したがって、様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、脂質アンカー基を含有するオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートであり、該脂質アンカー基は、脂質二重層に吸着される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの全てが、脂質アンカー基を含有するオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートであり、該脂質アンカー基は、脂質二重層に吸着される。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、脂質アンカー基を通してリポソームコアの外部表面に結合（例えば、吸着）している。脂質アンカー基は、様々な実施形態では、トコフェロール、パルミトイル、ジパルミトイル、ステアリル、ジステアリル、又はコレステロールを含む。限定することを意味するものではないが、アミド結合又はクリックケミストリーを含む、当業者に既知の任意の化学を使用して、脂質アンカーをオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リポソームＳＮＡを作製する方法は、一般に、知られている（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷａｎｇ，Ｓ．；Ｑｉｎ，Ｌ．；Ｙａｍａｎｋｕｒｔ，Ｇ．；Ｓｋａｋｕｊ，Ｋ．；Ｈｕａｎｇ，Ｚ．；Ｃｈｅｎ，Ｐ．－Ｃ．；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｄ．；Ｌｅｅ，Ａ．；Ｚｈａｎｇ，Ｂ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１９，１１６（２１），１０４７３－１０４８１を参照されたい）。

【0038】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、脂質ナノ粒子コアである。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）球状核酸は、オリゴヌクレオチドのシェルで装飾された脂質ナノ粒子コア（例えば、固体脂質ナノ粒子コア）を含む。脂質ナノ粒子コアは、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートを含む。オリゴヌクレオチドのシェルは、脂質ナノ粒子コアの外部表面に結合し、本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、１個以上のｃＧＡＳ活性化オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、ｃＧＡＳを活性化してＳＴＡＴ３を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドシェルの球状アーキテクチャは、トランスフェクション剤とは独立したほぼ全ての細胞への侵入、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、配列に基づく機能、標的化、及び診断を含む、従来の核酸送達方法よりも独自の利点を与える。

【0039】

様々な実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、Ｃ１２－２００、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、同様の脂質／リピドイド構造、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジヘキサデカノイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、又はそれらの組み合わせである。更なる実施形態では、ステロールは、３β－ヒドロキシコレスト－５－エン（コレステロール）、９，１０－セココレスタ－５，７，１０（１９）－トリエン－３β－オール（ビタミンＤ３）、９，１０－セコエルゴスタ－５，７，１０（１９），２２－テトラエン－３β－オール（ビタミンＤ２）、カルシポトリオール、２４－エチル－５，２２－コレスタジエン－３β－オール（スチグマステロール）、２２，２３－ジヒドロスチグマステロール（β－シトステロール）、３，２８－ジヒドロキシ－ルペオール（ベツリン）、ルペオール、ウルゾール酸、オレアノール酸、２４α－メチルコレステロール（カンペステロール）、２４－エチルコレスタ－５，２４（２８）Ｅ－ジエン－３β－オール（フコステロール）、２４－メチルコレスタ－５，２２－ジエン－３β－オール（ブラシカステロール）、２４－メチルコレスタ－５，７，２２－トリエン－３β－オール（エルゴステロール）、９，１１－デヒドロエルゴステロール、ダウコステロール、又は１つ以上のアミノ酸で修飾された前述のステロールのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートは、２０００ダルトン（Ｄａ）のポリエチレングリコールを含む。更なる実施形態では、脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートは、脂質－ＰＥＧ－マレイミドである。なお更なる実施形態では、脂質－ＰＥＧ－マレイミドは、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジパルミトリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、又はそれらの組み合わせである。

【0040】

本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートへの共有結合を介して、脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを通して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される脂質アンカー基を通して脂質ナノ粒子コアの外部に結合（又は吸着）している。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、本明細書に記載される脂質基を通して脂質ナノ粒子コアの外部に結合（又は吸着）している。脂質アンカー基は、様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’又は３’終端に結合している。様々な実施形態では、脂質アンカー基は、トコフェロール、パルミトイル、ジパルミトイル、ステアリル、ジステアリル、又はコレステロールである。

【0041】

オリゴヌクレオチド
いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、二本鎖又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。様々な実施形態では、細胞質ＤＮＡセンサーは、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）、ＡＩＭ２（黒色腫－２には存在しない）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＡＩ（ＩＦＮ－調節因子のＤＮＡ依存性活性化因子）、ＩＦＩ１６（インターフェロン－γ－誘導性タンパク質１６）、又はそれらの組み合わせである。いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、（ｉ）環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、（ｉｉ）シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１５塩基対長である、１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、（ｉ）細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、（ｉｉ）転写因子を不活性化し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１５塩基対長である、１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、転写因子は、がんの進行を促進する。様々な実施形態では、転写因子は、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）、ｃＭｙｃ、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、ＳＴＡＴ３を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。なお更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、ＳＴＡＴ３を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、転写因子を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。なお更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、転写因子を不活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＡは、ナノ粒子コアに封入された１個以上の追加のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドを含み、１つ個以上の追加のオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドは、各々、同じヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、１個以上の追加のオリゴヌクレオチドは、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、追加のオリゴヌクレオチドは、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、阻害性オリゴヌクレオチド、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化するオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせである。オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドは、任意の手段（例えば、共有結合又は非共有結合）を通してナノ粒子コアに結合し得る。オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドは、その５’終端又は３’終端を介してナノ粒子コアに結合し得る。

【0042】

「環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化する」オリゴヌクレオチド又は「ｃＧＡＳ活性化オリゴヌクレオチド」などは、ｃＧＡＳを活性化し、かつインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、下流ＩＲＦ３、及びＮＦ－ＫＢシグナル伝達の活性化、並びに炎症誘発性メディエーター及びＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の放出につながり得るオリゴヌクレオチドを指す。そのようなオリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも約１５塩基対（ｂｐ）長であり、任意選択でＣｐＧリッチモチーフを含有しない、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。したがって、本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、ＳＮＡの表面上のオリゴヌクレオチドのシェルは、ｃＧＡＳを活性化する１個以上のオリゴヌクレオチドを含み、１個以上のオリゴヌクレオチドは、Ｇ－カルテットオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＳＮＡの表面上のオリゴヌクレオチドのシェルは、ｃＧＡＳを活性化する複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＳＮＡの外部表面上の１個以上の又は全てのオリゴヌクレオチドは、ｃＧＡＳを活性化してＳＴＡＴ３を不活性化する。ｃＧＡＳ活性化オリゴヌクレオチドを識別するためのアッセイは、当技術分野で知られており（例えば、Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）アッセイ（ＢｅｌｌＢｒｏｏｋ Ｌａｂｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｈｅｒｚｎｅｒ ＡＭ．ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｎｓｏｒ ｃＧＡＳ ｂｙ Ｙ－ｆｏｒｍ ＤＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ＨＩＶ－１ ｃＤＮＡ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１０）：１０２５－３３も参照されたい）、本明細書に記載される。

【0043】

「シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化する」オリゴヌクレオチドは、転写因子ＳＴＡＴ３を不活性化又は阻害することができるものである。様々な実施形態では、ＳＴＡＴ３を不活性化するオリゴヌクレオチドは、転写因子デコイ、Ｇ－カルテットオリゴヌクレオチド、アプタマー、阻害性オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせである。転写因子デコイは、問題になっている転写因子（すなわち、ＳＴＡＴ３）によって認識及び結合される保存されたゲノム調節エレメントに由来するヌクレオチド配列を含む。デコイは、ゲノムＤＮＡ内の対応するシスエレメントへの転写因子の結合を競合的に阻害することによって作用し、標的遺伝子の発現を阻止する。ＳＴＡＴ３を不活性化することができるオリゴヌクレオチドを識別するためのアッセイは、一般に、当技術分野で知られている（例えば、Ｌｅｏｎｇ ＰＬ，Ａｎｄｒｅｗｓ ＧＡ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＥ，ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｔ３ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｃｏｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｂｒｏｇａｔｅｓ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００３；１００（７）：４１３８－４１４３．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５３４７６４１００；Ｋ．Ｌａｕ Ｙ－Ｔ，Ｒａｍａｉｙｅｒ Ｍ，Ｅ．Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｄ，Ｒ．Ｇｒａｎｄｉｓ Ｊ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＳＴＡＴ３ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃａｎｃｅｒｓ．２０１９；１１（１１）：１６８１）。本開示に従って使用することができるＳＴＡＴ３デコイの非限定的な例は、以下の通りである。

【表1】

【0044】

様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドには、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、それらの修飾形態、又はそれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖である。

【0045】

本明細書に記載されるように、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を有するものを含む、オリゴヌクレオチドの修飾形態もまた、本開示によって企図される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、全て又は部分的にペプチド核酸である。他の修飾ヌクレオシド間結合は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。更に他の修飾オリゴヌクレオチドとしては、１つ以上のユニバーサル塩基を含むものが挙げられる。「ユニバーサル塩基」とは、著しい構造不安定化を伴わずに水素結合を形成することによって、核酸中のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵのうちのいずれか１つへの結合を置き換えることができる分子を指す。ユニバーサル塩基類似体と組み込まれたオリゴヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして機能することができる。ユニバーサル塩基の例としては、５’－ニトロインドール－２’－デオキシリボシド、３－ニトロピロール、イノシン、及びヒポキサンチンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0046】

本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語又はその複数形は、本明細書で論じられ、それ以外は当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。本明細書で使用される「核酸塩基」という用語又はその複数形は、本明細書で論じられ、それ以外は当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。ヌクレオチド又は核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、及びＵを含む。天然に存在しない核酸塩基としては、例えば、限定するものではないが、キサンチン、ジアミノプリン、８－オキソ－Ｎ６－メチルアデニン、７－デアザキサンチン、７－デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４－エタノシトシン、Ｎ’、Ｎ’－エタノ－２，６－ジアミノプリン、５－メチルシトシン（ｍＣ）、５－（Ｃ３～Ｃ６）－アルキニル－シトシン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２－ヒドロキシ－５－メチル－４－トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、並びにＢｅｎｎｅｒら、米国特許第５，４３２，２７２号及びにＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ－Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ ４４２９－４４４３に記載の「天然に存在しない」核酸塩基が挙げられる。「核酸塩基」という用語には、既知のプリン及びピリミジン複素環だけでなく、その複素環類似体及び互変異性体も含まれる。更に、天然に存在する及び天然に存在しない核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３の１５章、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３－７２２（特に、６２２及び６２３頁を参照されたい）、並びにｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９、Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９１，６，５８５－６０７において参照されたく、これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、最も古典的な意味でのヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する、特定の「ユニバーサル塩基」を含む核酸塩基のように機能し得る複素環式化合物などの化合物を含む天然に存在しないヌクレオチドのカテゴリーである１つ以上の「ヌクレオシド塩基」又は「塩基単位」も含む。ユニバーサル塩基には、３－ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール（例えば、５－ニトロインドール）、及び任意選択で置換されたヒポキサンチンが含まれる。他の望ましいユニバーサル塩基には、当技術分野において既知のユニバーサル塩基を含む、ピロール、ジアゾール、又はトリアゾール誘導体が挙げられる。

【0047】

オリゴヌクレオチドの例には、修飾された骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含有するものが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を有するもの及び骨格にリン原子を有さないものが含まれる。ヌクレオシド間骨格にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味の範囲内であるとみなされる。

【0048】

リン原子を含む修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び正常な３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、並びに１つ以上のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’、又は２’から２’結合である逆向きの極性を有するものが挙げられる。最も３’のヌクレオチド間結合において単一の３’から３’結合を含む逆極性を有するオリゴヌクレオチド、すなわち、脱塩基性であり得る（ヌクレオチドが欠落しているか、又はその代わりにヒドロキシル基を有する）単一の逆ヌクレオシド残基も企図される。塩、混合塩、及び遊離酸形態も企図される。上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号及び同第５，６２５，０５０号が挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0049】

その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキルとが混合されたヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖のヘテロ原子若しくは複素環のヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有する骨格；シロキサン骨格；スルフィド、スルフォキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びメチレンチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びにＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ_２構成要素部分が混在するその他の骨格がある。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号及び同第５，６７７，４３９号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0050】

なお更なる実施形態では、１つ以上の糖及び／又はヌクレオチド単位の１つ以上のヌクレオチド間結合の両方が「天然に存在しない」基で置き換えられている、オリゴヌクレオチド模倣物がある。オリゴヌクレオチドの塩基は、ハイブリダイゼーションのために維持される。いくつかの態様では、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を企図する。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格で置き換えられる。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号、並びにＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0051】

なお更なる実施形態では、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドが提供され、米国特許第５，４８９，６７７号及び同第５，６０２，２４０号に記載の－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－、及び－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－を含む。米国特許第５，０３４，５０６号に記載のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも企図される。

【0052】

様々な形態では、オリゴヌクレオチド中の２つの連続するモノマー間の結合は、－ＣＨ_２－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ^Ｈ－、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲ^Ｈ、＞Ｃ＝Ｓ、－Ｓｉ（Ｒ”）_２－、－ＳＯ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｐ（Ｏ）_２－、－ＰＯ（ＢＨ_３）－、－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－、－Ｐ（Ｓ）_２－、－ＰＯ（Ｒ”）－、－ＰＯ（ＯＣＨ_３）－、及び－ＰＯ（ＮＨＲ^Ｈ）から選択される２～４個の、望ましくは３個の基／原子からなり、式中、Ｒ^Ｈは、水素及びＣ_１－４－アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ_１－６－アルキル及びフェニルから選択される。そのような結合の例示的な例は、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＯ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ＝（後続のモノマーへの結合として使用されるときＲ^５を含む）、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－、－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－ＣＨ_２－ －、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＳ－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－Ｃ（＝ＮＲ^Ｈ）－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＯ－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＯ－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－、－ＣＨ＝Ｎ－Ｏ－、－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－Ｏ－、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ＝（後続のモノマーへの結合として使用される場合Ｒ^５を含む）、－ＣＨ_２－Ｏ－ＮＲ^Ｈ－、－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－Ｏ－、－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－ＣＯ－、－Ｏ－ＮＲ^Ｈ－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＮＲ^Ｈ、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ_２－Ｏ－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ＝（後続のモノマーへの結合として使用される場合Ｒ^５を含む）、－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＳＯ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＳＯ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＳＯ－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_２－；－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）_２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）_２－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）_２－Ｓ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｒ”）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ_３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｏ ＣＨ_２ＣＨ_３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｏ ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ－Ｒ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＢＨ_３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＨＲ^Ｎ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）_２－ＮＲ^ＨＨ－，－ＮＲ^Ｈ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，ＮＲ^Ｈ）－Ｏ－、－ＣＨ_２－Ｐ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）_２－ＣＨ_２－、及び－Ｏ－Ｓｉ（Ｒ”）_２－Ｏ－であり、これらの中でとりわけ、－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－、－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｏ－Ｏ－Ｐ（－Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）_２－Ｏ－、－ＮＲ^ＨＰ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，ＮＲ^Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｒ”）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＣＨ_３）－Ｏ－、及び－Ｏ－ＰＯ（ＮＨＲ^Ｎ）－Ｏ－（式中、Ｒ^Ｈは、水素及びＣ_１－４－アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ_１－６－アルキル及びフェニルから選択される）が企図される。更なる例示は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５，５，３４３－３５５及びＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ－Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，ｖｏｌ ２５，ｐｐ ４４２９－４４４３に提供されている。

【0053】

オリゴヌクレオチドのなお他の修飾形態は、米国特許出願第２００４／０２１９５６５号に詳細に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0054】

修飾オリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の置換糖部分を含有してもよい。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、以下のうちの１つを２’位に含み：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルキニル；又はＯ－アルキル－Ｏ－アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ_１～Ｃ_１０アルキル又はＣ_２～Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルであり得る。他の実施形態には、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２が含まれ、式中、ｎ及びｍは、１～約１０である。他のオリゴヌクレオチドは、以下のうちの１つを２’位に含む：Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又はＲＮＡ切断基。一態様では、修飾としては、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）又は２’－ＭＯＥとしても知られる、２’－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。他の修飾としては、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において、２’－Ｏ－ジメチル－アミノ－エトキシ－エチル又は２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）_２が挙げられる。

【0055】

更に他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ_３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、２’－アリル（２’－ＣＨ_２－ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’－Ｏ－アリル（２’－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ＝ＣＨ_２）、及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。２’修飾は、アラビノ（上）位又はリボ（下）位にあってもよい。一態様では、２’－アラビノ修飾は、２’－Ｆである。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、例えば、３’終端ヌクレオチド上の糖の３’位、又は２’－５’結合オリゴヌクレオチド中、及び５’終端ヌクレオチドの５’位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有していてもよい。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、及び同第５，７００，９２０号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0056】

いくつかの態様では、糖の修飾には、２’－ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に結合し、それにより、二環式糖部分を形成する、ロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる。特定の態様では、結合は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（－ＣＨ_２－）_ｎであり、式中、ｎは１又は２である。ＬＮＡ及びその調製は、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。

【0057】

修飾ヌクレオチドは、ＥＰ１０７２６７９及びＷＯ９７／１２８９６に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾核酸塩基には、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン、及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル並びに他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル並びに他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。更なる修飾塩基としては、三環系のピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）のようなＧ－クランプ（Ｇ－ｃｌａｍｐ）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）が挙げられる。修飾塩基には、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、及び２－ピリドンで置き換えられたものも含まれ得る。追加の核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されているもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものが挙げられる。これらの塩基のいくつかは、結合親和性を高めるのに有用であり、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、並びにＮ－２、Ｎ－６、及びＯ－６置換プリンを含み、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、及び５－プロピニルシトシンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃上昇させることが示されており、特定の態様では、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，７５０，６９２号及び同第５，６８１，９４１号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0058】

所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）及びＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。固相合成法は、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドの両方に適している（ＤＮＡ合成の周知の方法は、ＲＮＡ合成にも有用である）。ポリリボヌクレオチドは酵素的に調製することもできる。天然に存在しない核酸塩基もポリヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号、Ｋａｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４：２２３８（１９５１）、Ｙａｍａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２５９９（１９６１）、Ｋｏｓｔｕｒｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３９４９（１９７４）、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６：６０３２（１９５４）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：７４－７５（２００５）、及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１３６８４－１３６８５（２００２）を参照されたい。

【0059】

様々な態様では、本開示のオリゴヌクレオチド（例えば、ｃＧＡＳ－活性化オリゴヌクレオチド）又はその修飾形態は、一般に、約５ヌクレオチド長～約５０００ヌクレオチド長である。様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、約５～約４０００ヌクレオチド長、約５～約３０００ヌクレオチド長、約５～約２０００ヌクレオチド長、約５～約１０００ヌクレオチド長、約５～約９００ヌクレオチド長、約５～約８００ヌクレオチド長、約５～約７００ヌクレオチド長、約５～約６００ヌクレオチド長、約５～約５００ヌクレオチド長、約５～約４５０ヌクレオチド長、約５～約４００ヌクレオチド長、約５～約３５０ヌクレオチド長、約５～約３００ヌクレオチド長、約５～約２５０ヌクレオチド長、約５～約２００ヌクレオチド長、約５～約１５０ヌクレオチド長、約５～約１００、約５～約９０ヌクレオチド長、約５～約８０ヌクレオチド長、約５～約７０ヌクレオチド長、約５～約６０ヌクレオチド長、約５～約５０ヌクレオチド長、約５～約４５ヌクレオチド長、約５～約４０ヌクレオチド長、約５～約３５ヌクレオチド長、約５～約３０ヌクレオチド長、約５～約２５ヌクレオチド長、約５～約２０ヌクレオチド長、約５～約１５ヌクレオチド長、約５～約１０ヌクレオチド長、約１０～約４０００ヌクレオチド長、約１０～約３０００ヌクレオチド長、約１０～約２０００ヌクレオチド長、約１０～約１０００ヌクレオチド長、約１０～約９００ヌクレオチド長、約１０～約８００ヌクレオチド長、約１０～約７００ヌクレオチド長、約１０～約６００ヌクレオチド長、約１０～約５００ヌクレオチド長、約１０～約４５０ヌクレオチド長、約１０～約４００ヌクレオチド長、約１０～約３５０ヌクレオチド長、約１０～約３００ヌクレオチド長、約１０～約２５０ヌクレオチド長、約１０～約２００ヌクレオチド長、約１０～約１５０ヌクレオチド長、約１０～約１００ヌクレオチド長、約１０～約９０ヌクレオチド長、約１０～約８０ヌクレオチド長、約１０～約７０ヌクレオチド長、約１０～約６０ヌクレオチド長、約１０～約５０ヌクレオチド長、約１０～約４５ヌクレオチド長、約１０～約４０ヌクレオチド長、約１０～約３５ヌクレオチド長、約１０～約３０ヌクレオチド長、約１０～約２５ヌクレオチド長、約１０～約２０ヌクレオチド長、約１０～約１５ヌクレオチド長、約１８～約２８ヌクレオチド長、約１５～約２６ヌクレオチド長、及びオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に具体的に開示されたサイズの中間にある全てのオリゴヌクレオチド長である。したがって、様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、又はそれ以上のヌクレオチド長であるか、又は少なくともそれらである。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、又はそれ以上のヌクレオチド長である。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、約５～約２５０ヌクレオチド長、約５～約２００ヌクレオチド長、約５～約１５０ヌクレオチド長、約５～約１００ヌクレオチド長、約５～約９０ヌクレオチド長、約５～約８０ヌクレオチド長、約５～約７０ヌクレオチド長、約５～約６０ヌクレオチド長、約５～約５０ヌクレオチド長、約５～約４５ヌクレオチド長、約５～約４０ヌクレオチド長、約５～約３５ヌクレオチド長、約５～約３０ヌクレオチド長、約５～約２５ヌクレオチド長、約５～約２０ヌクレオチド長、約５～約１５ヌクレオチド長、約５～約１０ヌクレオチド長、約１０～約２５０ヌクレオチド長、約１０～約２００ヌクレオチド長、約１０～約１５０ヌクレオチド長、約１０～約１００ヌクレオチド長、約１０～約９０ヌクレオチド長、約１０～約８０ヌクレオチド長、約１０～約６０ヌクレオチド長、約１０～約５０ヌクレオチド長、約１０～約４５ヌクレオチド長、約１０～約４０ヌクレオチド長、約１０～約３５ヌクレオチド長、約１０～約３０ヌクレオチド長、約１０～約２５ヌクレオチド長、約１０～約２０ヌクレオチド長、約１０～約１５ヌクレオチド長、約１５～約２５０ヌクレオチド長、約１５～約２００ヌクレオチド長、約１５～約１５０ヌクレオチド長、約１５～約１００ヌクレオチド長、約１５～約９０ヌクレオチド長、約１５～約８０ヌクレオチド長、約１５～約７０ヌクレオチド長、約１５～約６０ヌクレオチド長、約１５～約５０ヌクレオチド長、約１５～約４５ヌクレオチド長、約１５～約４０ヌクレオチド長、約１５～約３５ヌクレオチド長、約１５～約３０ヌクレオチド長、約１５～約２５ヌクレオチド長、約１５～約２０ヌクレオチド長、及びオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に具体的に開示されたサイズの中間にある全てのオリゴヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチド長であるか、又は少なくともそれである。前述の長さの各々は、ヌクレオチドの長さ（例えば、一本鎖核酸を指すとき）又は塩基対の長さ（例えば、ｃＧＡＳ活性化オリゴヌクレオチドなどの二本鎖核酸を指すとき）を指し得ることが理解されるであろう。様々な実施形態では、ＳＮＡのナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、全てが同じ長さ／配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、複数の中の少なくとも１個の他のオリゴヌクレオチドに対して異なる長さ及び／又は配列を有する１個以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、ｃＧＡＳ、又はＡＩＭ２（黒色腫－２には存在しない）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＡＩ（ＩＦＮ－調節因子のＤＮＡ依存性活性化因子）、又はＩＦＩ１６（インターフェロン－γ誘導性タンパク質１６）が挙げられるが、これらに限定されない、他の細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長であり、１個の以上の追加のオリゴヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドからなり、これらの各々が、ｃＧＡＳを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、ｃＧＡＳを活性化し、また、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化する二重機能性オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、細胞質ＤＮＡセンサー（例えば、限定するものではないが、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）、ＡＩＭ２（黒色腫２には存在しない）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＡＩ（ＩＦＮ調節因子のＤＮＡ依存性活性化因子）、ＩＦＩ１６（インターフェロンγ誘導性タンパク質１６）、又はそれらの組み合わせ）を活性化し、また、転写因子（例えば、限定するものではないが、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）、ｃＭｙｃ、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、又はそれらの組み合わせ）を不活性化する二重機能性オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、（ｉ）各々が環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチド、並びに（ｉｉ）シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、本開示のＳＮＡは、（ｉ）環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、（ｉｉｉ）各々がｃＧＡＳを活性化し、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、又は（ｉｖ）それらの組み合わせを含む、オリゴヌクレオチドのシェルを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、（ｉ）各々が細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチド、並びに（ｉｉ）転写因子を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、本開示のＳＮＡは、（ｉ）細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）転写因子を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、（ｉｉｉ）各々が細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、転写因子を不活性化する１個以上のオリゴヌクレオチド、又は（ｉｖ）それらの組み合わせを含む、オリゴヌクレオチドのシェルを含む。

【0060】

スペーサー。いくつかの態様及び実施形態では、ＳＮＡのナノ粒子コアに結合するオリゴヌクレオチドのシェル内の１個以上のオリゴヌクレオチドは、スペーサーを含む。いくつかの態様及び実施形態では、ＳＮＡのナノ粒子コアに結合するオリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、スペーサーを含む。本明細書で使用される場合、「スペーサー」は、ナノ粒子コアとオリゴヌクレオチドとの間の距離を増加させる、又は複数のコピーでナノ粒子コアに結合したときに個々のオリゴヌクレオチド間の距離を増加させる、又はＳＮＡの合成を向上させる役割を果たす部分を意味する。したがって、スペーサーは、オリゴヌクレオチドとナノ粒子コアとの間に位置することが企図される。いくつかの実施形態では、ＳＮＡのナノ粒子コアに封入されたオリゴヌクレオチドは、スペーサーを含む。

【0061】

いくつかの態様では、スペーサーは、存在する場合、有機部分である。いくつかの態様では、スペーサーは、水溶性ポリマー、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、エチルグリコール、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されないポリマーである。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、スペーサーは、オリゴ（エチレングリコール）ベースのスペーサーである。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、又はそれ以上のスペーサー（例えば、スペーサー－１８（ヘキサエチレングリコール））部分を含む。更なる実施形態では、スペーサーはアルカン系スペーサー（例えば、Ｃ１２）である。いくつかの実施形態では、スペーサーはオリゴヌクレオチドスペーサー（例えば、Ｔ５）である。オリゴヌクレオチドスペーサーは、ナノ粒子コア又は標的に結合するようになるオリゴヌクレオチドの能力を妨害しない任意の配列を有し得る。特定の態様では、オリゴヌクレオチドスペーサーの塩基は、全てのアデニル酸、全てのチミジル酸、全てのシチジル酸、全てのグアニル酸、全てのウリジル酸、又は全ての他のいくつかの修飾塩基である。

【0062】

様々な実施形態では、スペーサーの長さは、少なくとも約２ヌクレオチド、少なくとも約３ヌクレオチド、少なくとも約４ヌクレオチド、少なくとも約５ヌクレオチド、５～１０ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、又は更には３０ヌクレオチド超であるか、又はそれらに等しい。

【0063】

密度。ＳＮＡの外部表面上のオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの数は変動し得る。一般に、ナノ粒子を安定させるのに適当な表面密度、及びナノ粒子とオリゴヌクレオチドとの所望の組み合わせに対してそれを得るのに必要な条件は、実験的に決定することができる。いくつかの実施形態では、１個以上のオリゴヌクレオチドはまた、ナノ粒子コアに封入されている。ナノ粒子コアに封入されたオリゴヌクレオチドの数及び長さは、ナノ粒子コアの直径によってある程度決定され得る。同様に、ＳＮＡの外部表面上のオリゴヌクレオチドの数は、ナノ粒子コアの直径及び／又はオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列によってある程度決定され得る。一般に、少なくとも約２ｐモル／ｃｍ^２の表面密度が、安定なナノ粒子－オリゴヌクレオチド組成物を提供するのに適当である。いくつかの態様では、表面密度は、１５ｐモル／ｃｍ^２であるか、又は少なくともそれである。また、オリゴヌクレオチドが、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも４ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも６ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも７ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも８ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも９ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約１９ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約８０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２、又はそれ以上の表面密度でナノ粒子コアの外部表面に結合している方法も提供される。

【0064】

あるいは、ＳＮＡの外部表面上のオリゴヌクレオチドの密度は、ＳＮＡの外部表面上のオリゴヌクレオチドの数によって測定される。本開示のＳＮＡの外部表面上のオリゴヌクレオチドの表面密度に関して、本明細書に記載されるＳＮＡが、その外部表面上に約１～約２５０個のオリゴヌクレオチドを含むことが企図される。様々な実施形態では、ＳＮＡは、その表面上に、約１０～約２００個、又は約１０～約１９０個、又は約１０～約１８０個、又は約１０～約１７０個、又は約１０～約１６０個、又は約１０～約１５０個、又は約１０～約１４０個、又は約１０～約１３０個、又は約１０～約１２０個、又は約１０～約１１０個、又は約１０～約１００個、又は約１０～約９０個、又は約１０～約８０個、又は約１０～約７０個、又は１０～約６０個、又は約１０～約５０個、又は約１０～約４０個、又は約１０～約３０個、又は約１０～約２０個、又は約５０～約２００個、又は約５０～約１５０個、又は約５０～約１００個、又は約５０～約８０個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、ＳＮＡは、その表面上に、約４～約２５０個、又は約４～約２００個、又は約４～約１９０個、又は約４～約１８０個、又は約４～約１７０個、又は約４～約１６０個、又は約４～約１５０個、又は約４～約１４０個、又は約４～約１３０個、又は約４～約１２０個、又は約４～約１１０個、又は４～約１００個、又は約４～約９０個、又は約４～約８０個、又は約４～約７０個、又は４～約６０個、又は約４～約５０個、又は約４～約４０個、又は約４～約３０個、又は約４～約２０個、又は約４～約１０個、又は約５０～約２００個、又は約５０～約１５０個、又は約５０～約１００個、又は約５０～約８０個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＳＮＡは、その表面上に約８０～約１４０個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、ＳＮＡは、その表面上に、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、又は２５０個のポリヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、ＳＮＡは、その表面上の、５、１０、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、又は２５０個のポリヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、リポソームコア又は脂質ナノ粒子コアを含むＳＮＡ（これは、様々な実施形態では、直径約１５０ナノメートル若しくは約１５０ナノメートル未満、又は直径約１００ナノメートル若しくは約１００ナノメートル未満、又は直径約８０ナノメートル若しくは約８０ナノメートル未満、又は直径約７０ナノメートル若しくは約７０ナノメートル未満であり得る）は、その表面上に約１０～約２，０００個のオリゴヌクレオチド、又は約１０～約１，０００個のオリゴヌクレオチド、又は約１０～約８０個のオリゴヌクレオチド、又は約１０～約４０個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、金属（例えば、金）コアを含むＳＮＡは、その表面上に約７０～約１２０個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ）コアを含むＳＮＡは、その表面上に約７０個のオリゴヌクレオチドを含む。

【0065】

組成物
いくつかの態様では、本開示は、１つ又は複数の球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ又は複数の球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ又は複数の球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、（ｉ）環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、（ｉｉ）シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１５塩基対長である、１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ又は複数の球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、（ｉ）細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、（ｉｉ）転写因子を不活性化し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１５塩基対長である、１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ又は複数の球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ又は複数の球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、（ｉ）環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、（ｉｉ）シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を不活性化し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１５塩基対長である、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ又は複数の球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ又は複数の球状核酸（ＳＮＡ）を含む、組成物であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、複数の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これらの各々が、（ｉ）細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、（ｉｉ）転写因子を不活性化し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも１５塩基対長である、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、組成物を提供する。様々な実施形態では、細胞質ＤＮＡセンサーは、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）、ＡＩＭ２（黒色腫－２には存在しない）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＡＩ（ＩＦＮ－調節因子のＤＮＡ依存性活性化因子）、ＩＦＩ１６（インターフェロン－γ－誘導性タンパク質１６）、又はそれらの組み合わせである。本開示の態様又は実施形態のうちのいずれかでは、転写因子は、がんの進行を促進する。様々な実施形態では、転写因子は、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）、ｃＭｙｃ、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、又はそれらの組み合わせである。

【0066】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原性組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。「担体」という用語は、本明細書に記載されるＳＮＡが哺乳類対象に投与されるビヒクルを指す。担体という用語は、希釈剤、賦形剤、アジュバント、及びそれらの組み合わせを包含する。薬学的に許容される担体は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｂｙ Ｍａｒｔｉｎ，１９７５を参照されたい）。

【0067】

例示的な「希釈剤」としては、滅菌水、生理食塩溶液、及び緩衝液（例えば、ホスフェート、トリス、ボレート、スクシネート、又はヒスチジン）などの滅菌液体が挙げられる。例示的な「賦形剤」は、ワクチン安定性を強化し得る不活性物質であり、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）、炭水化物（例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、又はセルロース）、及びアルコール（例えば、グリセロール、ソルビトール、又はキシリトール）が挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントとしては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に関連抗原を標的化するワクチン送達系（例えば、エマルジョン、マイクロ粒子、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、又はリポソーム）、及び免疫刺激性アジュバントが挙げられる。

【0068】

抗原
様々な態様では、本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、二本鎖又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。本開示は、球状核酸（ＳＮＡ）であって、（ａ）ナノ粒子コアと、（ｂ）ナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェルであって、本明細書に記載される細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、かつ少なくとも１５塩基対長である、二本鎖又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのシェルと、を含む、球状核酸（ＳＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＡは、抗原を含む。様々な実施形態では、抗原は、ペプチド、タンパク質、抗原をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、抗原は、がん関連抗原である。更なる実施形態では、抗原は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、ネオ抗原、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、がんは、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、眼がん、肝臓がん、膵臓がん、喉頭がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、脳がん、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、抗原は、ＯＶＡ１、ＭＳＬＮ、Ｐ５３、Ｒａｓ、変異型ＩＤＨ１（ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ）、変異型テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ；Ｃ２２８Ｔ又はＣ２５０Ｔ）、黒色腫関連抗原、ＨＰＶ関連抗原、前立腺がん関連抗原、膠芽腫抗原、グレードＩＶ星細胞腫抗原、卵巣がん関連抗原、乳がん関連抗原、肝細胞がん腫関連抗原、大腸がん関連抗原、又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７核タンパク質である。

【0069】

いくつかの実施形態では、抗原は、ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、抗原は、ナノ粒子コアに封入されている抗原をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、抗原がナノ粒子コアの表面に結合しているか、抗原がオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに結合しているか、又はその両方である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０２０／０３８４１０４号を参照されたい）。更なる実施形態では、抗原は、（ｉ）ナノ粒子コア内に封入されており、（ｉｉ）ナノ粒子コアの表面に結合しており、及び／又はオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの実施形態では、抗原は、リンカーを介してナノ粒子コアの表面に結合している。

【0070】

障害を治療するためのＳＮＡの使用
いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＡは、障害を治療、軽減、改善するために使用される。したがって、いくつかの態様では、本開示は、障害（例えば、がん）を治療又は改善する方法であって、有効量の本開示のＳＮＡ又は組成物を、それを必要とする対象（例えば、ヒト対象）に投与することを含み、投与することが、障害を治療又は改善する、方法を提供する。様々な実施形態では、がんは、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、眼がん、肝臓がん、膵臓がん、喉頭がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、脳がん、又はそれらの組み合わせである。

【0071】

本開示のＳＮＡ及び組成物の投与は、単回用量又は複数回用量スケジュールを伴い得る。複数回用量スケジュールでは、様々な用量が、同じか又は異なるルートによって与えられ得る。

【0072】

遺伝子調節の方法
本開示のいくつかの態様では、本開示のＳＮＡに会合するオリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現を阻害する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＡは、ｃＧＡＳを活性化し、任意選択でＳＴＡＴ３を不活性化し、また、遺伝子阻害機能を有する。したがって、いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアの外部表面に結合しているオリゴヌクレオチドのシェルは、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）を活性化し、各々が少なくとも１５塩基対長である１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、標的遺伝子発現を阻害するように設計された１個以上の阻害性オリゴヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＡは、細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、任意選択で転写因子を不活性化し、また、遺伝子阻害機能を有する。更なる実施形態では、ナノ粒子コアの外部表面に結合しているオリゴヌクレオチドのシェルは、本明細書に記載される細胞質ＤＮＡセンサーを活性化し、各々が少なくとも１５塩基対長である１個以上の二本鎖及び／又は一本鎖ステムループＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、標的遺伝子発現を阻害するように設計された１個以上の阻害性オリゴヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現を阻害するように設計された１個以上の阻害性オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現を阻害するように設計された１個以上の阻害性オリゴヌクレオチドは、両方とも、ナノ粒子コアの外部表面に結合しており、ナノ粒子コアに封入されている。

【0073】

遺伝子産物の発現を阻害する方法には、標的遺伝子産物の発現が、ＳＮＡの不在下での遺伝子産物の発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％阻害されるものが含まれる。言い換えれば、提供される方法は、本質的に標的遺伝子産物の発現のあらゆる程度の阻害をもたらすものを包含する。

【0074】

阻害の程度は、体液試料若しくは生検試料から、又は当技術分野において周知の画像化技術により、インビボで決定される。あるいは、阻害の程度は、一般に、特定の種類のＳＮＡ及び特定のオリゴヌクレオチドの使用から生じるインビボで予想され得る阻害の程度の予測可能な尺度として、細胞培養アッセイにおいて決定される。

【0075】

様々な態様では、方法は、標的オリゴヌクレオチドに１００％相補的である、すなわち完全に一致するが、他の態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さにわたってポリヌクレオチドに少なくとも（以上を意味する）約９５％相補的、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子産物の所望の程度の阻害を達成することができる程度にオリゴヌクレオチドの長さにわたってポリヌクレオチドに少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％相補的である、オリゴヌクレオチドの使用を含む。

【0076】

相補性パーセントは、オリゴヌクレオチドの長さにわたって決定される。例えば、阻害性オリゴヌクレオチドの２０ヌクレオチドのうちの１８ヌクレオチドが全長１００ヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドの２０ヌクレオチド領域に相補的であるアンチセンス化合物を考えると、オリゴヌクレオチドは９０パーセント相補的であろう。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化されるか又は相補的ヌクレオチドが散在していてもよく、互いに又は相補的核酸塩基に隣接する必要はない。阻害性オリゴヌクレオチドの標的核酸の領域との相補性パーセントは、当技術分野で知られているＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）を使用して日常的に決定することができる。

【0077】

そのような方法で利用されるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかである。ＲＮＡは、調節機能を果たす阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）などの阻害性オリゴヌクレオチドであってもよく、様々な実施形態では、小阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、及びリボザイムからなる群から選択される。あるいは、ＲＮＡは、調節機能を果たすマイクロＲＮＡである。ＤＮＡは、いくつかの実施形態では、アンチセンス－ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）である。

【0078】

治療剤
本明細書で提供される技術は、広範な適用可能性を有する。本開示のＳＮＡ（例えば、ＳＮＡ^ＩＳＤ及びＳＮＡ^{ＩＳＤ／ＳＴＡＴ３ｉ}）は、広範囲の腫瘍型に対して一般化可能な抗腫瘍剤として使用することができるオリゴヌクレオチドベースの薬物の分類である。

【0079】

本開示によって企図される治療剤としては、限定するものではないが、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗体又は抗体断片、小分子、ペプチド、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

【0080】

本明細書で使用される「小分子」という用語は、化学化合物若しくは薬物、又は天然若しくは合成のいずれかの任意の他の低分子量有機化合物を指す。「低分子量」とは、１５００ダルトン未満、典型的には１００～７００ダルトンの分子量を有する化合物を意味する。

【0081】

いくつかの実施形態では、ＳＮＡは、放射線などの１つ以上の標準治療の治療剤と、抗ＰＤ１などのチェックポイント阻害剤、並びに抗ＣＤ７３（Ｔｙ／２３）及びＡ２ａＲ阻害剤ＳＣＨ５８２６１などの免疫抑制アデノシンシグナル伝達の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない、現存する免疫療法とを組み合わせて使用される。

【0082】

したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＳＮＡは、治療剤、又はその複数を更に含む。治療剤は、様々な実施形態では、ＳＮＡのナノ粒子コアの外部表面に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに単純に会合しており、かつ／又は治療剤はＳＮＡのナノ粒子コアに会合しており、かつ／又は治療剤はＳＮＡに封入されている。いくつかの実施形態では、治療剤は、ナノ粒子コアに結合していないオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの終端に会合している（例えば、オリゴヌクレオチドがその３’終端を通してナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの５’終端に会合している）。あるいは、いくつかの実施形態では、治療剤は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの終端に会合している（例えば、オリゴヌクレオチドがその３’終端を通してナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの３’終端に会合している）。いくつかの実施形態では、治療剤は、ＳＮＡのナノ粒子コアの外部表面に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに共有結合的に会合している。いくつかの実施形態では、治療剤は、ＳＮＡのナノ粒子コアの外部表面に結合しているリンカー又はスペーサーに共有結合的に会合している。いくつかの実施形態では、治療剤は、ＳＮＡのナノ粒子コアの外部表面に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに非共有結合的に会合している。しかしながら、本開示は、１つ以上の治療剤が、ＳＮＡのナノ粒子コアの外部表面に結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに共有結合的及び非共有結合的の両方で会合しているＳＮＡを提供することを理解されたい。また、非共有結合的な会合には、ハイブリダイゼーション、タンパク質結合、及び／又は疎水性相互作用が含まれることも理解されるであろう。いくつかの実施形態では、治療剤は、本開示のＳＮＡとは別個に投与される。したがって、いくつかの実施形態では、治療剤は、障害を治療するために、本開示のＳＮＡの前、後、又は同時に投与される。

【0083】

以下の実施例は、本開示によって企図される様々な実施形態を例解している。実施例は、本来、例示的なものであり、決して限定的であることを意図するものではない。

【実施例】

【0084】

実施例１
この実施例では、金ナノ粒子コア（ＳＮＡ^ＩＳＤ）上に高い表面密度でインターフェロン刺激性二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ（ＩＳＤ）を提示するｃＧＡＳ活性化ＳＮＡを合成し、特性評価した。本明細書で提供されるデータは、ＳＮＡ^ＩＳＤが、ＣＤＮよりもｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路をより強力に活性化し、ＩＲＦ及びＮＦ－κＢ依存性転写の下流誘導で頂点に達することを示した。免疫能力のあるＧＢＭ保有マウスに腫瘍内又は鼻腔内投与するとき、ＳＮＡ^ＩＳＤは、遊離ＩＳＤ^４５オリゴヌクレオチド又はＣＤＮよりも確実に腫瘍進行に拮抗し、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の特異的活性化を通して動物対象の長期生存を促進した。

【0085】

単機能性ｃＧＡＳ活性化ＳＮＡに加えて、ｃＧＡＳを活性化し、ＳＴＡＴ３マスター転写因子のトランス活性化活性を付随的に阻害することができる二峰性ＳＮＡを生成した。ｃＧＡＳによるＤＮＡ認識がオリゴヌクレオチド配列とは独立して起こるため、この目的のために、標準的なＩＳＤ ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、マスター転写因子ＳＴＡＴ３に結合し、それを隔離し、不活性化することが示されるオリゴヌクレオチドに置き換えた。二峰性ＳＮＡ^{ＩＳＤ／ＳＴＡＴ３ｉ}ＳＮＡは、インビトロでｃＧＡＳを活性化し、核転座及びＳＴＡＴ３の転写活性をブロックし、インビボで神経膠腫の進行に拮抗することを示した。

【0086】

ＩＳＤ４５－ＳＮＡの開発及び特性評価
４５ｂｐのＩＳＤオリゴヌクレオチドは、最も使用され、広く特性評価されたｃＧＡＳ活性化剤を表すため、ｃＧＡＳ活性化のためのＳＮＡアーキテクチャを活用するために、１３ｎｍの金ナノ粒子を４５塩基対（ｂｐ）のｄｓＩＳＤオリゴヌクレオチド（ＩＳＤ４５－ＳＮＡ、図１Ａ）とコンジュゲートすることによってＩＳＤ４５－ＳＮＡを合成した^７。「ｄｓＩＳＤ^４５」及び「ＩＳＤ４５」という用語は、本明細書で使用される場合には交換可能である。シトレート安定化金ナノ粒子を、Ｆｒｅｎｓ法を使用して調製した^{４、８、９}。チオール化されたｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、逆相高性能液体クロマトグラフィーを使用して精製し、塩化ナトリウムを塩エージングによって金ナノ粒子表面に共有結合的に結合した^{１０、１１}。電子顕微鏡及び動的光散乱により、ＳＮＡ^{ＩＳＤ－４５}形状及びサイズを確認した（１３ｎｍの金コア、ＤＮＡコロナを含んで直径７２ｎｍ）。加えて、ＯｌｉＧｒｅｅｎ蛍光アッセイを使用して融解曲線を生成し、ゼータ電位を決定することによって、オリゴヌクレオチドの組み込みを定量化した^{４、８、９}。ＳＮＡ^ＩＳＤによるｃＧＡＳ ＤＮＡ感知酵素の直接的な関与を評価するために、ヒト組換えｃＧＡＳ酵素を使用して、無細胞ｃＧＡＳ活性化アッセイを開発した（図１Ｂ）。組換えヒトｃＧＡＳ酵素、ＭｇＣｌ_２、ＡＴＰ、及びＧＴＰの混合物を、ｓｓＤＮＡ^４５、ＩＳＤ４５、ｃＧＡＭＰ、ｓｓＤＮＡ^４５－ＳＮＡｓ、又はＩＳＤ４５－ＳＮＡのいずれかとともにインキュベートした。ｃＧＡＳ酵素の不活性化時に、混合物をｃＧＡＳ欠損ＲＡＷ－Ｌｕｃｉａ（商標）マクロファージに添加し、ＩＲＦ誘導性Ｌｕｃｉａルシフェラーゼレポーターの安定した統合を担持して、ＩＲＦ誘導を発光測定的に定量化した。このマクロファージ株は、ｃＧＡＳ欠損のためにｃＧＡＭＰを合成することができない。図１Ｃに示されるように、ＩＳＤ４５－ＳＮＡは、遊離ＩＳＤ４５オリゴヌクレオチド又はｃＧＡＭＰトランスフェクト培養物と比較して、同様のレベルまでＩＲＦを活性化したが、ｓｓＤＮＡ^４５－ＳＮＡ治療マクロファージは同様のレベルまでＩＲＦを活性化しなかった。ＲＡＷ－Ｌｕｃｉａ（商標）マクロファージ及びヒト単球細胞株であるＴＨＰ－１細胞の両方において、遊離オリゴヌクレオチドと比較したとき、かつリポプレックス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００）トランスフェクション（ＴＦＸ）を介して送達された遊離オリゴヌクレオチドで達成された同様のレベルと比較したとき、特にマクロファージにおける確実な細胞取り込み（図２Ａ）を反映して、ＩＳＤ４５－ＳＮＡは、ＩＲＦを強力に活性化した。（図２Ｂ～Ｃ）。その後、機能性ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路成分に対するＩＲＦ誘導の依存性を、同質遺伝子ｃＧＡＳ－、ＳＴＩＮＧ－、及びＩＲＦ欠損マクロファージにおいて評価し（図２Ｄ）、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、又はＩＲＦの非存在下で、ＳＮＡ^{ＩＳＤ－４５}又はＩＳＤ－４５治療に応答するＩＲＦ誘導が鈍化したことを示した。加えて、ＥＬＩＳＡ及び抗体アレイを使用した多重サイトカインプロファイリングは、ＳＮＡ^ＩＳＤ治療に応答して、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、及びＣＣＬ２を含む、ＮＦ－κＢ－及びＳＴＡＴ６誘導性炎症誘発性サイトカインの確実な活性化を明らかにした（図２Ｅ～Ｆ）。重要なことに、遺伝子調節及びＴＬＲ９活性化ＳＮＡについて報告されているように、ＩＳＤ４５－ＳＮＡのｃＧＡＳ活性化特性は、ナノ粒子コアからではなく、高密度に機能化され、高度に配向された核酸シェルから生じる^{１２～１４}。１３ｎｍの金ベースのアーキテクチャ（図１及び２）と同様に、８０ｎｍのＰＬＧＡベースのコアを有するＩＳＤ４５－ＳＮＡ（図３Ａ）は、貪食及びスカベンジャー受容体依存性エンドサイトーシス（図３Ｂ）を介してマクロファージに入り、ｓｓＤＮＡ４５－ＳＮＡとは異なり、ＩＲＦ活性化を促進し（図３Ｃ）、現在非ＣＮＳ固形がんについての臨床試験中のＣＤＮであるＡｄｕｒｏＳ１００よりも高いＥＣ_５０値を示す（図３Ｄ）。

【0087】

ＩＳＤ４５－ＳＮＡは、腫瘍細胞生存率を低減するＭ１マクロファージ分極化を誘導し、インビボで腫瘍進行に拮抗した。
腫瘍に対する適応性Ｔ細胞応答を誘発することに加えて、いくつかの研究は、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路の活性化が、炎症誘発性Ｍ１分極化マクロファージの活性化を促進することによって、腫瘍成長に拮抗することを示した。ＧＢＭは、ほとんど、抗炎症性Ｍ０／２様表現型を有する腫瘍関連マクロファージで構成されているため、ＩＳＤ４５－ＳＮＡは、Ｍ０マクロファージをＭ１表現型に再教育することができるかどうかを調べた。ＲＡＷ－Ｂｌｕｅ（商標）マクロファージでは、ＩＳＤ４５－ＳＮＡの治療が、確実なＴＢＫ１リン酸化、その上、炎症誘発性マクロファージ状態の古典的なマーカーであるサイトカイン誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の誘導を引き起こしたが、ｓｓＤＮＡ^４５－ＳＮＡではその誘導を引き起こさなかった（図４Ａ）。それに対応して、ＳＮＡ^{ＩＳＤ－４５}は、マクロファージ上清（図４Ｂ）の亜硝酸塩レベルを増加させ、ＳＮＡ^{ＩＳＤ－４５}に曝露されたマクロファージからの条件培地で治療されるか、又はＳＮＡ^{ＩＳＤ－４５}に曝露されたマクロファージと共培養された腫瘍細胞は、腫瘍細胞の増殖及び生存率を低減した（図４Ｃ～Ｄ）。Ｇｄ（ＩＩＩ）で標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドで機能化されたＳＮＡのＭＲ撮像によって示されるように、腫瘍内に注射すると、ＳＮＡが広範囲に頭蓋内腫瘍に浸潤した（図４Ｅ）。ｃＧＡＳアゴニストＳＮＡがインビボでＧＢＭ腫瘍進行を低減するかどうかを調査するために、同系ルシフェラーゼ修飾ＣＴ２Ａ同所性生着モデルは、腫瘍細胞接種の７日後に、ｓｓＤＮＡ^４５－又はＩＳＤ４５－ＳＮＡ（０．１５ｍｇ／ｋｇのｄｓＤＮＡに対応する）のいずれかの単回腫瘍内投与を受けた。カプラン－マイヤー法を使用した動物対象生存の分析は、ＩＳＤ４５－ＳＮＡが、治療された雌動物対象の５０％超において、ＧＢＭ腫瘍進行を著しく遅らせ、長期生存を促進したが、ｓｓＤＮＡ^４５対照ＳＮＡではそうならなかったことを明らかにした（図４Ｆ）。

【0088】

ＩＳＤ４５－ＳＮＡの非侵襲的な鼻から脳への送達
腫瘍床への局所化されたＩＳＤ４５－ＳＮＡ送達は、血液脳関門を避け、全身曝露に起因する毒性を回避し、したがって、ＧＢＭ治療のための魅力的で転換可能な選択肢のままである。したがって、以下に記載されるように、ｃＧＡＳアゴニストＳＮＡの腫瘍内投与を探索し、最適化する。ｃＧＡＳアゴニストＳＮＡの直接的な腫瘍内投与に加えて、ＳＮＡ配合オリゴヌクレオチドの増加した安定性及びバイオアベイラビリティ、並びに腫瘍実質に浸潤するそれらの傾向を活かして、非侵襲的ＳＮＡの鼻から脳への送達を探索する。腫瘍内送達と同様に、鼻腔内送達は、血液脳関門を迂回し、全身曝露を最小限に抑える。更に、最近の前臨床及び臨床研究と合わせて、新しい鼻腔内送達技術の登場により、再発性ＧＢＭの治療のためのペリリルアルコール（ＮＥＯ１００）［現在、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で判定されている］を含む治療剤の広域スペクトルの送達のための鼻から脳への送達の安全性及び有効性、ＧＢＭ治療のための有望で非侵襲的な送達方法として信頼性が高い鼻腔内送達が実証されており、ＳＮＡの鼻から脳への送達を包括的に判定して最適化するための、助成金申請書に概説されている研究の動機付けとなっている。

【0089】

鼻腔内に投与された薬物は、鼻道をＣＮＳに接続する嗅神経及び三叉神経を伴う経路を通してＣＮＳに達する（図５Ａ）。Ａｕ含有量のＩＣＰ－ＭＳ分析は、鼻腔内に投与されたときに、投与された総ＩＳＤ４５－ＳＮＡ投与量の約１０％が腫瘍保有脳に蓄積されることを示した（図５Ｂ）。同様に、Ｃｙ５で標識された金ベースのＩＳＤ４５－ＳＮＡを使用すると（図５Ｃ）、蛍光顕微鏡撮像は、腫瘍要素内（図５Ｄ）及び三叉神経の神経上膜内のＳＮＡ蓄積（図５Ｅ）を明らかにした。同様に、Ｃｙ５で標識されたＰＬＧＡベースのＳＮＡ（図５Ｆ）は、脳蓄積を示し、Ｃｙ５で標識された構造は、嗅球及び頭蓋内腫瘍内の両方で検出可能であった（図５Ｇ～Ｈ）。ＩＳＤ４５－ＳＮＡはまた、三叉神経の神経上膜、神経周膜、及び比較的程度は低いが、神経内膜内に見出された（図５Ｉ）。これらのデータは、ＩＳＤ４５－ＳＮＡの鼻から脳への送達が少なくとも部分的に三叉神経の細胞外成分に沿って起こることを示唆していた。

【0090】

ＩＳＤ４５－ＳＮＡの鼻腔内投与は、ＳＴＩＮＧ依存性様式でＧＢＭ進行を低減し、免疫介在性チェックポイント阻害と組み合わせて長期生存を促進する。
ルシフェラーゼで標識されたＣＴ２Ａ腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６－ｗｔ又はＣ５７ＢＬ／６－ＳＴＩＮＧゴールデンチケット（ｇｔ／ｇｔ）同系宿主のいずれかに移植した。単回鼻腔内投与を介して送達されたＩＳＤ４５－ＳＮＡは、ＣＴ２Ａ保有Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにおいて、腫瘍進行を低減し、動物生存率を増加させ（図６Ａ）、ＳＴＩＮＧ欠損ｇｔ／ｇｔマウスにおいて、腫瘍進行に影響を与えなかった（図６Ｂ）。治療用ＳＮＡの利益は、現在臨床試験中の環状ジヌクレオチドであるＡＤＵ－Ｓ１００と比較して著しく高かった（図６Ｃ）。カプラン－マイヤー生存時間分析は、ＩＳＤ４５－ＳＮＡが、Ｃ５７ＢＬ／６野生型、特に、雄ではなく雌の動物対象における動物対象生存を延長し（図６Ｄ）、未治療又はｓｓＤＮＡ４５－ＳＮＡ治療マウスと比較したときに、腫瘍微小環境中の機能性ＳＴＩＮＧを欠くＣ５７ＢＬ／６宿主における生存を延長しなかったことを明らかにした（図６Ｅ～Ｆ）。ＩＳＤ４５－ＳＮＡ及び免疫介在性チェックポイント阻害（抗ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４）と併用治療したとき、１回の鼻腔内送達は、ほぼ全ての雌動物におけるＧＢＭ腫瘍発生を消失させた（図６Ｇ）が、雄マウスには影響を及ぼさなかった（図７Ａ）。対側半球に腫瘍細胞を注射した長期生存雌マウスの再試験は、長期抗腫瘍記憶を示す全てのマウスにおいて長期生存をもたらした（図７Ｂ）。

【0091】

直接的な腫瘍内投与を通してＳＮＡを注射したマウスにおける腫瘍関連及び末梢免疫系組成物の分析は、未治療、ｓｓＤＮＡ^４５－ＳＮＡ治療動物対象（図８Ｃ～Ｆ）と比較して、ＩＳＤ４５－ＳＮＡ治療マウスにおけるエフェクターＴ細胞（図８Ａ）、Ｍ１分極化マクロファージ（図８Ｂ）、及び活性化ＮＫ細胞集団の富化を明らかにした。これらのデータは、ＩＳＤ４５－ＳＮＡの抗腫瘍活性が、非侵襲的な鼻から脳への送達を考慮すると、ＣＤＮの抗腫瘍効果よりも大きく、腫瘍微小環境における機能的ＳＴＩＮＧを必要とし、雌の動物対象において選択的に免疫チェックポイント阻害と組み合わせることによって高めることができるが、雄では高めることができなかったことを示した。

【0092】

実施例２
二峰性ＩＳＤ４５／ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡの開発
シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、先天性及び適応性免疫の重要な転写調節因子、並びに作用可能な免疫標的としてのものである^１５。最近の研究は、ＳＴＩＮＧ経路の活性化に応答して抗腫瘍免疫を強化することができる免疫療法剤の新規分類としてのＳＴＡＴ３阻害剤を識別した^１５。ｄｓＤＮＡのｃＧＡＳとの関与を導く厳密な配列及び構造パラメータがないため、ｃＧＡＳ活性化に加えて、細胞質中にＳＴＡＴ３を隔離し、それが細胞核に転座して細胞核における転写を活性化するのを阻止するＳＴＡＴ３デコイオリゴヌクレオチドとして機能し得るオリゴヌクレオチドを配合されたＳＮＡ構造を調べた。ＩＳＤオリゴヌクレオチドのｃＧＡＳとの相互作用を定義する最近の研究は、ｃＧＡＭＰ１の合成を促進するために最低１５ｂｐの長さが必要であることを示唆し、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ依存性様式で、別様に不活性な鈍化した配列の免疫刺激効果を強化する不対のグアノシン三量体（Ｇ３）に隣接する回文配列を特定した。

【0093】

プロトタイプＩＳＤ４５－ＳＮＡの抗腫瘍免疫応答を増加させるために、ＳＴＡＴ３デコイ配列（ＩＳＤ１５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡ）と、ＳＴＡＴ３デコイ回文配列（ＩＳＤＧ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡ、図９Ａ）に隣接するＧ５反復エレメントを含有するヘアピン構造と、に由来する１５ｂｐのＩＳＤオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされたＳＮＡを設計した。改変されたゲルシフトアッセイ及びヒル－ラングミュアコンピューティングは、全てのＳＮＡが、０．１７～０．２４ｎＭの範囲のＫＤを有するｃＧＡＳと複合体を形成し（図９Ｂ、Ｃ）、ＩＳＤ１５ＳＴＡＴ３ｉ及びＩＳＤＧ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡの両方が、０．０４５及び０．０７ｎＭのＫＤを有するＳＴＡＴ３に直接結合するが、ＩＳＤ４５－ＳＮＡはそれに直接結合しないことを示した（図９Ｄ、Ｅ）。無細胞結合プロファイルと一致して、全てのＳＮＡアーキテクチャは、無細胞及び細胞ベースのＩＲＦ３レポーターアッセイ（図９Ｆ、Ｇ）の両方で評価されるように、ＩＲＦ３活性化を誘導したが、ＩＳＤ１５ＳＴＡＴ３ｉ及びＩＳＤＧ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡのみが、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ６レポーター細胞で評価されるように、ＩＬ－６レベルを抑制したが、ＩＳＤ４５－ＳＮＡはそれを抑制しなかった（図９Ｈ）。

【0094】

遺伝子学的に操作された膠芽腫マウスモデルに由来する腫瘍細胞球を使用したＣＴ２Ａ－及び進行性同系性同所性膠芽腫モデルにおける単機能性ＩＳＤ４５－ＳＮＡと比較した、二峰性ＩＳＤ^１５ＳＴＡＴ３ｉ及びＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡの治療効果を判定した。このモデルでは、神経膠腫の形成は、神経幹細胞及び神経膠腫幹細胞における多分化能と自己複製を調節するＳＴＡＲファミリーＲＮＡ結合タンパク質であるＱｕａｋｉｎｇ、並びにｐ５３及びＰＴＥＮ腫瘍抑制因子（遺伝子型：Ｎｅｓｔｉｎ－ＣｒｅＥＲ^Ｔ２；Ｑｋｉ^Ｌ／Ｌ；Ｐｔｅｎ^Ｌ／Ｌ；Ｔｒｐ５３^Ｌ／Ｌ、ＱＰＰモデルと称される）のタモキシフェン誘導性ＣＮＳ特異的欠失によって駆動される。ＱＰＰ腫瘍から単離され、同系宿主に同所的に移植された腫瘍神経球は、４０～７０日の潜時で膠芽腫腫瘍形成をもたらした。異なるＱＰＰ腫瘍に由来する腫瘍神経球培養物は、チェックポイント阻害に対する感受性のスペクトルを示した。ＱＰＰ４腫瘍は、チェックポイント阻害剤治療に耐性があったが、ＱＰＰ７細胞に由来する外植腫瘍モデルは、抗ＣＴＬＡ４に感受性があり、抗ＰＤ１遮断に対する感受性に向かう傾向を示した。チェックポイント阻害剤感受性ＣＴ２Ａ及びＱＰＰ７モデルでは、ＩＳＤ４５－ＳＮＡ及びＩＳＤ^１５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡｓが、雌の動物対象において強力に腫瘍進行に拮抗して生存を延長し、マウスの６０～８０％が長期生存を示した（雄はそれを示さず）が、ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡではそれを示さなかった（図１０Ａ、Ｂ）。チェックポイント遮断耐性ＱＰＰ４モデルでは、雌マウスのみを使用して、ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉでの治療が、マウスの３０％が長期生存を示す有意ではあるがより低い利益をもたらしたが、ＩＳＤ４５－ＳＮＡ及びＩＳＤ^１５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡではそれを示さなかった（図１０Ｃ）。

【0095】

ＳＮＡ治療に応答する免疫介在性変化は、性別特異的である。
ＳＮＡ－対対照治療された雄及び雌の動物対象における免疫介在性変化を定義するために、ＴＭＥの遺伝子発現分析を、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅプロファイリングパネルを使用して実行した。ＱＰＰ４腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、腫瘍細胞接種の８日後に、頭蓋内投与を介して、ＰＢＳ、ｓｓＤＮＡ４５－ＳＮＡ、ＩＳＤ４５－ＳＮＡ、ＩＳＤ^１５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡ、又はＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡで治療し、腫瘍移植の３０日後に、ＲＮＡを腫瘍浸潤免疫細胞から単離した。雌では、ｚスコアでランク付けされた遺伝子発現の教師なしクラスタリングは、ＳＮＡ治療が免疫活性化及び下方調節免疫抑制遺伝子を誘導することにより、治療群と対照群との間の明確な分離を明らかにした（図１１Ａ）。上方制御された遺伝子は、インターフェロン（Ｔｂｋ１、Ｉｒｆ３、Ｉｆｎｂ１、Ｉｆｎａ１）、Ｍ１分極化（Ｍｓｔ１ｒ、Ｍｘ１）、Ｔ細胞共刺激（Ｉｃａｍ、Ｎｃａｍ、Ｉｃｏｓｌ、ＣＤ２８）、Ｔ細胞活性化（ＣＤ６９）、及び免疫細胞移動（Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｘｃｌ１２、Ｃｓｆ１）の誘導因子を含む。加えて、活性化Ｍ２マクロファージ及び骨髄細胞（Ａｒｇ１、Ａｒｇ２、Ｍｓｒ１、ＩＬ－１０、ＣＣｌ１７、ＣＣｌ２２）によって発現された免疫抑制遺伝子、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞機能の抑制を担う遺伝子（Ｐｄｃｄ１、ＦｏｘＰ３、Ｖｅｇｆａ、Ｈｉｆ１ａ）を、ＰＢＳ及びｓｓＤＮＡ４５－ＳＮＡ対照と比較して、ＳＮＡ治療で大幅に下方調節した。全く対照的に、雄マウスにおけるＳＮＡ治療は、免疫チェックポイント受容体（Ｃｔｌａ４、Ｈａｖｃｒ２、Ｉｃｏｓ）、及び先天性免疫の活性化に必要な遺伝子（Ｉｓｇ２０、Ｉｓｇ１５、Ｃｘｃｌ１０）、及びＴ細胞（ＣＤ２８、ＣＤ３、Ｇｒｍｂ、ＣＤ８）を含む、幅広い遺伝子のアレイを下方調節した（図１１Ｂ）。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ遺伝子セット経路分析は、雌のＱＰＰ４神経膠腫モデルでは、ＩＳＤ^Ｇ５－ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡが、マクロファージ、小膠細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、及び白血球の機能、炎症、並びにケモカイン及びサイトカイン並びに病原体に対する応答に関係する２５／３０免疫細胞経路を上方制御し、ＩＳＤ４５－ＳＮＡ及びＩＳＤ^１５ＳＴＡＴ３ｉ ＳＮＡと比較したとき、ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡのより強力な炎症誘発性及び抗腫瘍活性を示すことを明らかにした（図１１Ｃ）。雄ＱＰＰ４では、ＩＳＤ^Ｇ５－ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡ及びＩＳＤ４５－ＳＮＡは、任意の免疫応答を誘発せず、全ての先天性及び適応性免疫メカニズムを下方制御した（３０／３０）（図１１Ｄ）。

【0096】

特にＩＳＤ^Ｇ５－ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡに応答して誘導された性的二形遺伝子シグネチャーを特性評価するために、全ての雌（ｎ＝３）及び雄（ｎ＝４）試料について教師なしクラスタリングを実行し（図１１Ｅ～Ｇ）、続いて遺伝子オントロジー経路分析を実行した。図１１Ｆに示されるように、ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡ治療により、適応性免疫応答の１５倍の富化がもたらされた。

【0097】

ＳＮＡ^{ＩＳＤ／ＳＴＡＴ３ｉ}治療に対する性的二型応答についての分子基礎を分析し始めるために、ＰＢＳ、ｓｓＤＮＡ４５－ＳＮＡ、又はＩＳＤ４５－ＳＮＡ（図１２Ｃ）のいずれかで治療した腫瘍保有マウスから単離した全脾臓（図１２Ａ）、ＢＭＤＭ（図１２Ｂ）、及びＴＡＭＣのｃＧＡＳタンパク質発現を、ウェスタンブロット分析及びフローサイトメトリー分析を使用して分析した。結果は、雄の免疫細胞に対して、雌の免疫細胞においてより高いｃＧＡＳ発現を示した。したがって、これらのデータは、ｃＧＡＳアゴニストＳＮＡ応答についての推定的な予測バイオマーカーとしてのｃＧＡＳ発現レベルを示唆している。

【0098】

考察
ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路の刺激は、Ｔ細胞の活性化及び腫瘍内への追跡を増加させ、骨髄細胞の免疫抑制表現型を逆転させる。合成環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）リガンドを使用したＳＴＩＮＧ受容体の直接的な標的化は、膠芽腫（ＧＢＭ）などのリンパ球減少型及び骨髄細胞豊富型腫瘍の治療のための魅力的な免疫療法戦略を表す。しかしながら、この手法は、特に、炎症及び免疫のマスター転写調節因子ＳＴＡＴ３（シグナル伝達兼転写活性化因子３）によって指揮されるものを含む、ＣＤＮの代謝不安定性、並びに腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における免疫回避性及びＳＴＩＮＧ阻害性メカニズムの存在によって限定される。ｃＧＡＳ抗腫瘍応答を活性化し、ＧＢＭ ＴＭＥにおけるＳＴＡＴ３駆動免疫抑制を同時に阻害するために、ＳＴＡＴ３デコイ配列を含有する放射状に配向されたＤＮＡオリゴヌクレオチドのシェルで高密度に機能化されたナノ粒子コアからなる球状核酸（ＳＮＡ）を生成した。ｃＧＡＳ及びＳＴＡＴ３タンパク質の多価及び高親和性結合を介した二峰性ＳＮＡアーキテクチャは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）を誘導し、ＳＴＡＴ３核の転座及びトランス活性化を阻止し、腫瘍細胞生存率を低減し、ＧＢＭ腫瘍微小環境における免疫活性化を促進し、強い抗腫瘍活性を誘発した。ＳＮＡ治療に応答する顕著な性的二型応答が観察され、雌の動物対象は二峰性ＳＮＡの治療効果を有していたが、雄はそれを有していなかった。これらの研究は、ＧＢＭにおける複数個の免疫経路を標的化するためのファーストインクラスのシングルエンティティ核酸治療剤としての多機能性ＳＮＡを確立した。

【0099】

ｃＧＡＳによるＤＮＡ認識は配列非依存性であるため、標準的なｃＧＡＳアゴニストオリゴヌクレオチド配列を、ＳＴＡＴ３に結合し、それを隔離することが知られている回文配列と置き換えることが、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路活性化を促進し、ＳＴＡＴ３機能を同時に阻害することができるＳＮＡアーキテクチャをもたらすかどうかを試験した（図９Ａ）。実際、ＩＳＤ^Ｇ５及びＩＳＤ^{Ｇ５／ＳＴＡＴ３ｉ}－ＳＮＡは、ＳＴＡＴ３レポーターアッセイによって評価されるように、ＳＴＡＴ３トランス活性化をブロックし（図９Ｂ）、ＩＲＦ活性化を促進した（図９Ｃ）。ＳＮＡ治療に応答して低減したＳＴＡＴ３トランス活性化活性と一致して、二峰性ＳＮＡは、細胞質中にｐＳＴＡＴ３を隔離し（図９Ｄ）、神経膠腫幹細胞培養物の球体サイズを低減し（図９Ｅ）、頭蓋内投与を介して投与されたときに、動物対象の生存を延長した（図９Ｆ）。

【0100】

材料及び方法
細胞株。Ｒａｗ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ、Ｒａｗ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ ｃＧＡＳ ＫＯ、及びＨＥＫ－ｂｌｕｅ ＳＴＡＴ３レポーター細胞株をＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入し、製造業者のプロトコルに従って培養した。ＱＰＰ４、ＱＰＰ７細胞株は、Ａｍｙ Ｈｅｉｍｂｅｒｇｅｒ博士の研究室によって生成され、寄贈された。ＱＰＰ腫瘍神経球を、遺伝子学的に操作されたマウスモデル（遺伝子型：Ｎｅｓｔｉｎ－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２；Ｑｕａｋｉｎｇ^Ｌ／Ｌ；ｐ５３^Ｌ／Ｌ；ＰＴＥＮ^Ｌ／Ｌ）において発生したＧＢＭ腫瘍から単離した。細胞を、ＥＧＦ（２０μＬ／１０ｍＬの培地）及びＦＧＦ（１０μＬ／１０ｍＬの培地）を補充したＮｅｕｒｏＣｕｌｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット（培地及びサプリメント、幹細胞）内に維持した。ＧＬ２６１－ｌｕｃ、ＧＬ２６１、及びＣＴ２Ａ細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に維持した。全ての培地に１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充し、細胞株を３７℃で５％ＣＯ２を有する加湿された環境で培養した。全ての細胞株を、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ｐｌｕｓ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ検出キット（Ｌｏｎｚａ）を使用して社内で、又はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＲ ＲＡＤＳ，ＭＡ ＵＳＡ）によってのいずれかで、マイコプラズマについて陰性であるかを試験した。

【0101】

インビボＳＮＡ試験のためのマウス腫瘍モデル。全ての動物を、承認された動物研究プロトコルの下で使用し、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設で維持し、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）の規則及びガイドラインに従って治療した。６～８週齢の雌又は雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、ＣＴ２Ａ（８×１０^４細胞／マウス）、ＱＰＰ７、又はＱＰＰ４細胞（１００×１０^４細胞／マウス）を頭蓋内に移植した。各マウスを、ケタミン／キシラジンの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を使用して麻酔し、手術領域をアルコール及びベタジンで清浄化した。頭皮に切開を行った後、矢状縫合の横右側に２ｍｍ及び冠状縫合の後ろに４ｍｍの超微細手術用ドリルを使用して、０．７ｍｍの穿頭孔を作成した。２５μＬのハミルトンシリンジに投入した細胞株を、定位フレーム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を使用して移植した。手術後、縫合糸で皮膚を閉じた。腫瘍移植後、マウスを対照群又は治療群（ｎ＝６～１０／群）にランダムに割り当てた。約１００ｍｍ^３の平均サイズに達すると、腫瘍を、ＰＢＳ、ｓｓＤＮＡ^Ｔ４５－ＳＮＡ、ＩＳＤ^４５－ＳＮＡｓ、ＳＴＡＴ３ｉ^１５－ＳＮＡ、ＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡナノ粒子製剤のいずれかの腫瘍内又は鼻腔内注射を介して治療した。マウスを、死亡の４８時間前に典型的に起こった神経学的機能障害（嗜眠、歩行不全、摂食不足、又は＞２０％の体重減少）の観察時に犠死させた。生存時間分析をカプラン－マイヤー法を使用して実行し、統計的有意性をログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて評価した。

【0102】

鼻腔内送達。ＩＳＤ^４５－ＳＮＡの治療有効性も、ＣＴ２Ａ（８×１０^４細胞／マウス）マウスモデルにおいて鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与時に判定した。頭蓋内腫瘍細胞移植の７日後に、滅菌生理食塩水又はＳＮＡ（マウスのｋｇ重量当たりのＡｕが１５μｍｏｌ）の１回用量を与えた。生理食塩水又はＳＮＡの２μＬ画分を、５分ごとに各鼻孔に与えた。

【0103】

カニューレ移植及び頭蓋内ＳＮＡ注射。マウスを、上述のようにケタミン／キシラジンで麻酔した。２６ゲージの滅菌プラスチックガイドカニューレを、穿頭孔を通る２ｍｍの深さで頭蓋骨に挿入した。移植したカニューレを固定し、外科用接着剤を塗布することによって皮膚を閉じた。標準的な術後ケアを、ＩＡＣＵＣ承認プロトコルに従って与えた。注射中、ガイドカニューレの先端を１ｍｍ越えて延在するように設計されたスリーブを備えた３３ゲージの滅菌ハミルトンシリンジを使用して、細胞を移植するか、又は滅菌０．９％生理食塩水で希釈した治療剤を注射した。注射後、カニューレを３３ゲージのダミーカニューレ又はキャップで覆った。

【0104】

ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析。１×１０^６のＱＰＰ４細胞を、６～８週齢の雄及び雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、上記のようにカニューレを介して頭蓋内に移植した。マウスを、腫瘍細胞注射の７日後に、滅菌ＰＢＳ、ｓｓＤＮＡ^Ｔ４５－ＳＮＡｓ、ＩＳＤ^４５－ＳＮＡ、又はＩＳＤ^Ｇ５ＳＴＡＴ３ｉ－ＳＮＡ（群当たりｎ＝４）で頭蓋内治療した。ＡｕＮＰの用量は、ｋｇ当たりＡｕが１５μｍｏｌであった。ＳＮＡ治療の３０日後に、マウスを安楽死させ、１５ｍＬのＤＰＢＳを心臓内で灌流させた。灌流させた脳組織を「マウス脳腫瘍解離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９６－７３０）で更に処理して、単離された単一細胞腫瘍細胞及び腫瘍浸潤免疫細胞懸濁液を得た。免疫細胞を、３０／７０Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって脳組織の残部から分離した。

【0105】

Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析のために、キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡミニキット）を使用して、総ＲＮＡを製造業者のプロトコルに従って抽出した。単離されたＲＮＡの品質管理を、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー及びＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行した。免疫細胞から単離されたＲＮＡを、ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｐａｎｅｌを使用してＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒによって分析した。簡潔に述べると、キャプチャプローブ及びレポータープローブを使用して、１５０ｎｇのＲＮＡを１６時間ハイブリダイゼーションした。次いで、ｎＣｏｎｔｅｒ（商標）ｐｒｅｐ－ｓｔａｔｉｏｎを使用して、試料をカートリッジ内に固定化した。デジタル画像を、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ機器内で処理し、各試料について５５５個の視野（ｆｏｖ）を収集した。レポータープローブカウント（すなわち、その遺伝子についての色分けされたバーコードが検出される回数）を、ｎＳｏｌｖｅｒ（商標）パッケージ（バージョン３．０）、Ａｄｖａｎｃｅｄ ｎＳｏｌｖｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓモジュール（バージョン１．０．３６）、及びＲＯＳＡＬＩＮＤソフトウェアを使用して分析した。ＱＣ、正規化、差次的発現、及び経路分析を、ｎＳｏｌｖｅｒ高度分析モジュール及びＲＯＳＡＬＩＮＤソフトウェアを使用して、製造業者によって与えられたガイダンスに従って実行した。倍率変化を、ＰＢＳ治療した腫瘍の平均正規化遺伝子発現値に対して比較することによって計算した。

【0106】

ｃＧＡＳ及びＳＴＡＴ３の関与を評価するためのインビトロ実験
電気泳動移動度シフトアッセイ。組換えヒトｃＧＡＳタンパク質（Ｃａｙｍａｎ）又は組換えヒトＳＴＡＴ３タンパク質を、緩衝液（２０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．２、試料体積５０ｕＬ）中で１時間、室温でＳＮＡとともにインキュベートした。反応物は、１５ｕモルのＡｕ及びｃＧＡＳ／ＳＴＡＴ３タンパク質（０．１ｕｇ～２ｕｇ）を含有していた。反応物を、１×ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲルに対する電気泳動によって分析した。ゲルの画像を、ＦＡＳＴブラスト選択を使用するＢｉｏｒａｄゲルドックシステムを使用してスキャンし、ＦＩＪＩを使用してＡｕバンド強度について分析した。

【0107】

ＩＲＦ３ルシフェラーゼレポーターアッセイ。ＩＲＦ３の活性化を測定するために、Ｒａｗ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）細胞を、３．０×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を、１５ｕモルのＡｕの濃度のＳＮＡ又はＰＢＳで治療した。２４時間のインキュベート後、上清を新しい白色透明ボトム９６ウェルプレートに移した。次いで、ルシフェラーゼ発光を、製造業者の推奨プロトコルに従って、ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃルシフェラーゼ試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）で記録した。

【0108】

ＩＬ－６レポーターアッセイ。ＳＴＡＴ３の活性化を測定するために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－６細胞を３．０×１０^４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌日、細胞を、１５ｕモルのＡｕの濃度でＳＮＡ又はＰＢＳとともに４時間インキュベートし、続いて１２時間のＩＬ－６（１．５ｎｇ／ｍＬ）治療した。ＩＬ－６刺激時に、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－６細胞は、ＳＴＡＴ３の活性化及びその後のＳＥＡＰの分泌を誘起する。ＳＴＡＴ３誘導ＳＥＡＰのレベルを、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液を使用して監視した。

【0109】

ｃＧＡＳ無細胞活性アッセイ。無細胞アッセイにおけるｃＧＡＳ活性の評価のために、６０ｎＭの組換えヒトｃＧＡＳタンパク質（Ｃａｙｍａｎ）を、反応緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）中のＡＴＰ（５ｍＭ）、ＧＴＰ（３００μＭ）、及びＳＮＡ（１５ｕモルのＡｕ）と混合した。３７℃で２時間インキュベートした後、反応混合物を９５℃で５分間加熱してタンパク質を変性させることによって反応を終了し、タンパク質を２０，０００×ｇで５分間遠心分離することによって除去した。上清を、Ｒａｗ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ ｃＧＡＳ ＫＯ Ｒａｗ Ｌｕｃｉａ Ｂｌｕｅマクロファージ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）にトランスフェクトした。細胞を３７℃で２４時間培養し、次いで発光を、製造業者の推奨プロトコルに従って、ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃルシフェラーゼ試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）で記録した。

【0110】

統計分析。全ての統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン９．０を使用して実行した。ノンパラメトリックな対応のないスチューデントｔ検定及びマン－ホイットニーＵ検定を使用して、２つの群間の差の有意性を評価した。全てのデータを平均±ＳＥＭとして報告した。複数個の群を、テューキーの多重比較事後検定とともに一元配置ＡＮＯＶＡで分析した。カプラン－マイヤープロットを生成して、異なる治療経過下での神経膠腫保有マウスの相対的な生存を決定した。ログランク法を使用して、曲線比較のためのｐ値を計算し、続いてボンフェローニ補正を行った。

【0111】

ｃＧＡＳ発現分析。ＰＢＳ、ｓｓＤＮＡ４５－ＳＮＡ、又はＩＳＤ４５－ＳＮＡで治療したＣＴ－２Ａ保有マウスを１５日目にＣＯ^２によって安楽死させ、５ｍＬのＤＰＢＳを心臓内で灌流させた。組織ホモジナイザー（Ｐｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍ ＰＴＦＥ乳棒）を使用して、脳／腫瘍単細胞懸濁液をＨａｎｋの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ，Ｇｉｂｃｏ）中で得て、続いて３０／７０Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってミエリン及び破片を除去した。神経膠腫浸潤免疫細胞を、表現型決定又はエクスビボ研究のために完全なＲＰＭＩ中に収集し、ｃＧＡＳ発現のために染色した。この細胞内染色のために、染色する前に、細胞をＳＴＩＭカクテル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で４時間治療した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中のＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ生存性染料（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、更に２回洗浄し、ＰＢＳ中で１：２００（最終濃度）に希釈したＣＤ１１ｂ及びＣＤ４５のための表面抗体のカクテルを用いて４℃で３０分間染色した。ｃＧＡＳの細胞内染色のために、細胞を固定し、透過化緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で一晩透過化し、ｃＧＡＳ抗ウサギ一次抗体を用いて室温で１時間インキュベートし、次いでヤギ抗ウサギＡＦ４８８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ａ－１１００８）を用いて１：２０００濃度で３０分間染色した。試料を洗浄し、Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｓ）で取得し、Ｃｙｔｏｂａｎｋ Ｖ７．３．０を使用して分析した。

【0112】

ｃＧＡＳウェスタンブロット分析のために、均質化された全脾臓又はマウスＢＭＤＭをＲＩＰＡ緩衝液中で溶解して、全細胞溶解物を生成し、ｃＧＡＳ及びβ－アクチン（ローティングコントロール）についてのウェスタンブロット分析に供した。
本明細書に開示される配列：

【表2】

参考文献
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８ Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ，Ｄ．Ａ．，Ｓｅｆｅｒｏｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｐｒｉｇｏｄｉｃｈ，Ａ．Ｅ．，Ｐａｔｅｌ，Ｐ．Ｃ． ＆ Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｓｉＲＮＡ－ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３１，２０７２－２０７３，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ８０８７１９ｐ（２００９）．２８４３４９６
９ Ｋｏｕｒｉ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ｍｉＲ－１８２ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｇｅｎｅｓ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２９，７３２－７４５，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．２５７３９４．１１４（２０１５）．４３８７７１５
１０ Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ． ＆ Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．Ａ ＤＮＡ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎｔｏ ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，６０７－６０９，ｄｏｉ：１０．１０３８／３８２６０７ａ０（１９９６）
１１ Ｒｏｓｉ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１２，１０２７－１０３０，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１２５５５９（２００６）
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１５ Ｔｒｉｐａｔｈｉ，Ｓ．，Ｎａｊｅｍ，Ｈ．，Ｍａｈａｊａｎ，Ａ．Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，Ｌｏｗ，Ｊ．Ｔ．，Ｓｔｅｇｈ，Ａ．Ｈ．，Ｃｕｒｒａｎ，Ｍ．Ａ．，Ａｓｈｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｊａｍｅｓ，Ｃ．Ｄ．，Ｈｅｉｍｂｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｂ．ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ ｐａｔｈｗａｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａ．Ｆ１０００Ｒｅｓ．１１：１０１０（２０２２）．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】