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特表2024-539458破壊されたＴＤＰ－４３結合部位を有するヒト化スタスミン２マウスモデルに関連する方法および組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-28
(54)【発明の名称】破壊されたＴＤＰ－４３結合部位を有するヒト化スタスミン２マウスモデルに関連する方法および組成物
(51)【国際特許分類】
A01K 67/0278 20240101AFI20241018BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241018BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20241018BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241018BHJP
C07K 14/48 20060101ALI20241018BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241018BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20241018BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20241018BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241018BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241018BHJP
【ＦＩ】
A01K67/0278 ZNA
C12N15/12
C12N15/09 100
C12Q1/02
C07K14/48
A61K45/00
A61P21/00
A61P25/02
A61P25/00
A61K31/7088
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024529784
(86)(22)【出願日】2022-11-21
(85)【翻訳文提出日】2024-07-19
(86)【国際出願番号】 US2022080224
(87)【国際公開番号】W WO2023092118
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】63/282,023
(32)【優先日】2021-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】398066918
【氏名又は名称】ザ ジャクソン ラボラトリー
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＪＡＣＫＳＯＮ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ルッツ， キャスリーン マリー
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA07
4B063QQ02
4B063QQ43
4B063QQ53
4B063QS38
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA011
4C084ZA222
4C084ZA941
4C084ZC412
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZA22
4C086ZA94
4C086ZC41
4H045AA50
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA21
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、ヒトエクソン２ａポリヌクレオチド配列を含む内因性スタスミン２（Ｓｔｍｎ２）遺伝子を含むマウスモデルを提供する。本開示は、一部の態様において、Ｔａｒ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）タンパク質症（例えば、筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭型認知症）のマウスモデルを提供する。これらのマウスモデルは、そのようなタンパク質症におけるスタスミン－２（Ｓｔｍｎ２）遺伝子破壊を示す実験的証拠に部分的に基づく。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
外因性ポリヌクレオチド配列を含むヒト化スタスミン－２（Ｓｔｍｎ２）遺伝子を含むマウスであって、該外因性ポリヌクレオチド配列はヒトＳＴＭＮ２エクソン２ａ配列を含む、マウス。
【請求項2】
前記ヒトＳＴＭＮ２エクソン２ａ配列が約２００ヌクレオチド～約３００ヌクレオチドの長さ、必要に応じて約２２０ヌクレオチド～約２２５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載のマウス。
【請求項3】
前記外因性ポリヌクレオチド配列が、前記ヒトＳＴＭＮ２エクソン２ａ配列に隣接するヒトゲノムＤＮＡを含む、請求項１または２に記載のマウス。
【請求項4】
前記ヒトＳＴＭＮ２エクソン２ａ配列がヒトＭＳ２ステムループ配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のマウス。
【請求項5】
前記ヒトＭＳ２ステムループ配列が５’－ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴ－３’（配列番号４）の配列を含む、請求項４に記載のマウス。
【請求項6】
前記ヒトＭＳ２ステムループ配列がＴＤＰ－４３結合配列を置換する、請求項５に記載のマウス。
【請求項7】
前記ＴＤＰ－４３結合配列が５’－ＴＧＴＧＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧ－３’（配列番号５）の配列を含む、請求項６に記載のマウス。
【請求項8】
前記ヒトＳＴＭＮ２エクソン２ａ配列が、マウスＳｔｍｎ２遺伝子のイントロン１中にある、前記請求項のいずれか一項に記載のマウス。
【請求項9】
前記マウスがＣ５７ＢＬ／６遺伝的背景を有する、前記請求項のいずれか一項に記載のマウス。
【請求項10】
前記マウスの遺伝子型がＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｓｔｍｎ２ｅｍ８（ＳＴＭＮ２＊）Ｌｕｔｚｙ／Ｍｍｊａｘである、請求項９に記載のマウス。
【請求項11】
前記マウスがＴａｒ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）タンパク質症の１つまたは複数の症状を示し、必要に応じて、該ＴＤＰ－４３タンパク質症は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭変性症（ＦＴＤ）から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のマウス。
【請求項12】
候補治療剤を前記請求項のいずれか一項に記載のマウスに投与する工程、および改変された表現型について該マウスをアッセイする工程を含む、方法。
【請求項13】
前記候補治療剤がＳｔｍｎ２ ｍＲＮＡ前駆体の異常なスプライシング／潜在的スプライシングを遮断する、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記候補治療剤が、ヒトエクソン２ａポリヌクレオチド配列に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項15】
前記候補治療剤が小分子薬である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項16】
前記表現型が行動表現型、病理学的表現型、認知欠損、運動欠損、運動ニューロン変性、神経筋脱神経から選択される、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記表現型が運動欠損である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記運動欠損が振戦、麻痺、異常歩行、または下肢の握り行動から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記運動欠損がオープンフィールド分析、握力分析、またはロータロッド分析によってアッセイされる、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項20】
前記表現型が認知欠損である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法であって、外因性ポリヌクレオチド配列をマウスの内因性Ｓｔｍｎ２遺伝子のイントロンに、必要に応じて遺伝子編集技術を使用して、導入する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願）
本出願は、２０２１年１１月２２日に出願された米国特許仮出願第６３，２８２，０２３号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、この米国特許仮出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年１１月２２日に出願された米国特許仮出願第６３，２８２，０２３号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、この米国特許仮出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【0002】
（政府の実施権）
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ ＮＳ１２４２０３の下での政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ ＮＳ１２４２０３の下での政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【0003】
（電子配列表の参照）
電子配列表（Ｊ０２２７７０１０９ＷＯ００－ＳＥＱ－ＨＪＤ．ｘｍｌ；サイズ：１２，１４２バイト；作成日：２０２２年１１月２２日）の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
電子配列表（Ｊ０２２７７０１０９ＷＯ００－ＳＥＱ－ＨＪＤ．ｘｍｌ；サイズ：１２，１４２バイト；作成日：２０２２年１１月２２日）の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0004】
（背景）
神経変性障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭型認知症）は、世界中で数百万人の人々が罹患している。神経変性疾患は、脳または末梢神経系の神経細胞が経時的に機能を喪失する場合に生じ、最終的には死ぬ。今後４０年間にわたり、神経変性疾患の有病率は、米国において二倍になると推定される。処置は、神経変性疾患に関連する身体症状または精神症状の一部を軽減するのを助け得るが、疾患の進行を遅くするための方法は現在存在せず、既知の治療法は存在しない。治療アプローチを開発するために、神経変性疾患患者において観察される主要な疾患機構を再現する非ヒト動物モデルについての継続的な必要性が存在する。
神経変性障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭型認知症）は、世界中で数百万人の人々が罹患している。神経変性疾患は、脳または末梢神経系の神経細胞が経時的に機能を喪失する場合に生じ、最終的には死ぬ。今後４０年間にわたり、神経変性疾患の有病率は、米国において二倍になると推定される。処置は、神経変性疾患に関連する身体症状または精神症状の一部を軽減するのを助け得るが、疾患の進行を遅くするための方法は現在存在せず、既知の治療法は存在しない。治療アプローチを開発するために、神経変性疾患患者において観察される主要な疾患機構を再現する非ヒト動物モデルについての継続的な必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
（概要）
本開示は、一部の態様において、Ｔａｒ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）タンパク質症（例えば、筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭型認知症）のマウスモデルを提供する。これらのマウスモデルは、そのようなタンパク質症におけるスタスミン－２（Ｓｔｍｎ２）遺伝子破壊を示す実験的証拠に部分的に基づく。この遺伝子はそのｍＲＮＡの潜在的スプライシング（ｃｒｙｐｔｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を経て、切断型ｍＲＮＡを生じる。本明細書において記載されているマウスモデルは、広範な範囲の神経変性状態の中心となる疾患機構を再現し、このマウスモデルは、例えば、Ｓｔｍｎ２ ｍＲＮＡ前駆体の潜在的（異常な）スプライシングを遮断する薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または小分子薬）の同定を通じてＴＤＰ－４３タンパク質症における治療法を開発するために、使用され得る。
本開示は、一部の態様において、Ｔａｒ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）タンパク質症（例えば、筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭型認知症）のマウスモデルを提供する。これらのマウスモデルは、そのようなタンパク質症におけるスタスミン－２（Ｓｔｍｎ２）遺伝子破壊を示す実験的証拠に部分的に基づく。この遺伝子はそのｍＲＮＡの潜在的スプライシング（ｃｒｙｐｔｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を経て、切断型ｍＲＮＡを生じる。本明細書において記載されているマウスモデルは、広範な範囲の神経変性状態の中心となる疾患機構を再現し、このマウスモデルは、例えば、Ｓｔｍｎ２ ｍＲＮＡ前駆体の潜在的（異常な）スプライシングを遮断する薬剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または小分子薬）の同定を通じてＴＤＰ－４３タンパク質症における治療法を開発するために、使用され得る。
【0006】
本開示の一部の態様は、外因性ポリヌクレオチド配列を含むヒト化スタスミン－２（Ｓｔｍｎ２）遺伝子を含むＴａｒ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）タンパク質症のマウスモデルを提供し、その外因性ポリヌクレオチド配列はヒトＳＴＭＮ２エクソン２ａ配列を含む。
【0007】
一部の実施形態において、そのヒトＳＴＭＮ２エクソン２ａ配列は、約２００ヌクレオチド～約３００ヌクレオチドの長さ、必要に応じて約２２０ヌクレオチド～約２２５ヌクレオチド、好ましくは２２２ヌクレオチドの長さを有する。
【0008】
一部の実施形態において、その外因性ポリヌクレオチド配列は、そのヒトＳＴＭＮ２エクソン２ａ配列に隣接するヒトゲノムＤＮＡを含む。
【0009】
一部の実施形態において、そのヒトＳＴＭＮ２エクソン２ａ配列はヒトＭＳ２ステムループ配列を含む。
【0010】
一部の実施形態において、そのヒトＭＳ２ステムループ配列は５’－ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴ－３’（配列番号４）の配列を含む。
【0011】
一部の実施形態において、そのヒトＭＳ２ステムループ配列はＴＤＰ－４３結合配列を置換する。
【0012】
一部の実施形態において、そのＴＤＰ－４３結合配列は５’－ＴＧＴＧＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧ－３’（配列番号５）の配列を含む。
【0013】
一部の実施形態において、そのヒトＳＴＭＮ２エクソン２ａ配列はそのマウスＳｔｍｎ２遺伝子のイントロン１中にある。
【0014】
一部の実施形態において、そのマウスモデルはＣ５７ＢＬ／６遺伝的背景を有する。
【0015】
一部の実施形態において、そのマウスの遺伝子型はＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｓｔｍｎ２ｅｍ８（ＳＴＭＮ２＊）Ｌｕｔｚｙ／Ｍｍｊａｘである。
【0016】
一部の実施形態において、そのＴＤＰ－４３タンパク質症は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭変性症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＦＴＤ）から選択される。
【0017】
他の態様は、候補治療剤を先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスに投与する工程、および改変された表現型についてそのマウスをアッセイする工程を含む、方法を提供する。
【0018】
一部の実施形態において、その候補治療剤は、Ｓｔｍｎ２ ｍＲＮＡ前駆体の異常なスプライシング／潜在的スプライシングを遮断する。
【0019】
一部の実施形態において、その候補治療剤は、そのヒトエクソン２ａポリヌクレオチド配列に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。
【0020】
一部の実施形態において、その候補治療剤は小分子薬である。
【0021】
一部の実施形態において、その表現型は、行動表現型、病理学的表現型、認知欠損、運動欠損、運動ニューロン変性、神経筋脱神経から選択される。
【0022】
一部の実施形態において、その表現型は運動欠損である。
【0023】
一部の実施形態において、その運動欠損は、振戦、麻痺、異常歩行、または下肢の握り行動（ｈｉｎｄｌｉｍｂ ｃｌａｓｐｉｎｇ）から選択される。
【0024】
一部の実施形態において、その運動欠損は、オープンフィールド分析、握力分析、またはロータロッド分析によってアッセイされる。
【0025】
一部の実施形態において、その表現型は認知欠損である。
【0026】
さらに他の態様は、請求項１～１１のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法を提供し、その方法は、その外因性ポリヌクレオチド配列をそのマウスの内因性Ｓｔｍｎ２遺伝子のイントロンに、必要に応じて遺伝子編集技術を使用して、導入する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図2】図２Ａは、ヒトＳＴＭＮ２のイントロン１の３９４塩基対セグメントを含むマウスＳｔｍｎ２アレルの模式図を示す。この改変されたアレルは、本明細書において「ヒト化マウスＳｔｍｎ２アレル」と呼ばれる。図２Ｂは、ヒトＴＤＰ－４３結合部位がＭＳ２結合部位によって置換されてエクソン２（上から下へ、配列番号５および配列番号４）の構成的含有をもたらした、ヒト化マウスＳｔｍｎ２アレルの模式図を示す。
【図3】図３Ａ～図３Ｄは、ヒト化Ｓｔｍｎ２マウス（すなわち、ヒト化マウスＳｔｍｎ２アレルを含むマウス）の作製およびインビトロ確認に関連する模式図およびデータを示す。一次皮質ニューロンが、スタスミン－２マウス遺伝子のイントロン１内にヒトエクソン２ａゲノム領域を保有するように編集されたマウス胚（Ｓｔｍｎ２Ｈｕｍ／＋マウス）から作製され、マウスＴＤＰ－４３を標的とするＲＮａｓｅ－Ｈ依存型ＡＳＯを１μＭまたは３μＭ用いて１２日間処理された（図３Ａ）。定量ＲＴ－ＰＣＲはＴＤＰ－４３の効率的減少を示し（図３Ｂ）、これは全長スタスミン－２ ｍＲＮＡのレベル減少をもたらす（条件１つ当たりの生物学的反復ｎ＝３（図３Ｃ）；＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析）。スタスミン－２の減少は、ＴＤＰ－４３喪失の際にマウスエクソン１とヒトエクソン２ａとの間の異常なスプライシングによって媒介され、ヘテロ接合性Ｓｔｍｎ２Ｈｕｍ／＋に由来するニューロンにおいてＲＴ－ＰＣＲによって検出されるが野生型胚に由来するニューロンでは検出されない（図３Ｄ）。
【図4】図４Ａ～図４Ｃは、ＴＤＰ－４３結合部位がＭＳ２部位によって置換されたヒトエクソン２ａを含むように編集されたマウス神経芽腫細胞からのデータを示し、これらは、Ｓｔｍｎ２の構成的ミススプライシングおよび減少を示す。野生型（ＷＴ）同系クローンと比較してＴＤＰ－４３結合部位を含まないヒトエクソン２ａ（図２Ｂを参照のこと）を一方のアレル（Ｈｅｔ）または両方のアレル（Ｈｏｍｏ）中に導入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集後の、Ｎ２Ａ神経芽腫クローンにおける全長マウスＳｔｍｎ２についての定量ＲＴ－ＰＣＲ（図４Ａ）（＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析）。ヘテロ接合性クローンおよびホモ接合性クローンにおけるマウスエクソン１とヒトエクソン２ａとの間の構成的スプライシングを示すＲＴ－ＰＣＲ（図４Ｂ）。スタスミン－２ ｍＲＮＡの構成的ミススプライシングおよびレベル減少は、ヘテロ接合性細胞およびホモ接合性細胞において、それぞれ、ＳＴＭＮ２タンパク質の５０％減少または完全喪失をもたらす（図４Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【0028】
（詳細な説明）
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンの早発性喪失が致死性麻痺をもたらす疾患）は、前頭側頭変性症（ＦＴＤ）（行動機能障害および言語機能障害によって特徴付けられる神経変性障害）と臨床的、遺伝的、および病理学的な重複を有すると、現在認識されている。運動ニューロンまたは皮質ニューロンの加齢依存的機能障害の基礎をなすものは、未解明のままである。ＡＬＳおよびＦＴＤの細胞機構を理解することへの目印となる寄与が、ＡＬＳのほとんどの場合（＞９５％）ならびにＦＴＤ患者の約５０％における、罹患ニューロンからのＲＮＡ結合タンパク質ＴＤＰ－４３の細胞質での蓄積および核での喪失という発見から生じた。ＴＤＰ－４３の破壊は、孤発性形態および家族性形態の両方のＡＬＳならびにＦＴＤ（ＴＤＰ－４３をコードする遺伝子（ＴＡＲＤＢＰ）およびプログラニュリンをコードする遺伝子（ＧＲＮ）における変異を有する患者ならびにＣ９ＯＲＦ７２遺伝子においてＧ４Ｃ２反復伸長を有する患者を含む）において、共通する病理学的特徴を示す。ＴＤＰ－４３病理は、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ならびに種々の形態のパーキンソニズムおよび認知症が挙げられる広範囲の神経変性状態（ＴＤＰ－４３タンパク質症と呼ばれる）において報告されている。３０％を超える患者が、アルツハイマー病または辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症（ｌｉｍｂｉｃ－ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ＴＤＰ－４３ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）を有する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンの早発性喪失が致死性麻痺をもたらす疾患）は、前頭側頭変性症（ＦＴＤ）（行動機能障害および言語機能障害によって特徴付けられる神経変性障害）と臨床的、遺伝的、および病理学的な重複を有すると、現在認識されている。運動ニューロンまたは皮質ニューロンの加齢依存的機能障害の基礎をなすものは、未解明のままである。ＡＬＳおよびＦＴＤの細胞機構を理解することへの目印となる寄与が、ＡＬＳのほとんどの場合（＞９５％）ならびにＦＴＤ患者の約５０％における、罹患ニューロンからのＲＮＡ結合タンパク質ＴＤＰ－４３の細胞質での蓄積および核での喪失という発見から生じた。ＴＤＰ－４３の破壊は、孤発性形態および家族性形態の両方のＡＬＳならびにＦＴＤ（ＴＤＰ－４３をコードする遺伝子（ＴＡＲＤＢＰ）およびプログラニュリンをコードする遺伝子（ＧＲＮ）における変異を有する患者ならびにＣ９ＯＲＦ７２遺伝子においてＧ４Ｃ２反復伸長を有する患者を含む）において、共通する病理学的特徴を示す。ＴＤＰ－４３病理は、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ならびに種々の形態のパーキンソニズムおよび認知症が挙げられる広範囲の神経変性状態（ＴＤＰ－４３タンパク質症と呼ばれる）において報告されている。３０％を超える患者が、アルツハイマー病または辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症（ｌｉｍｂｉｃ－ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ＴＤＰ－４３ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）を有する。
【0029】
広範に発現され主に核の、ＴＤＰ－４３は、ＲＮＡ代謝調節の種々の局面において役割を果たすＲＮＡ結合タンパク質である。患者において、このタンパク質は、罹患していないニューロンの核において検出可能であるが、細胞質凝集物を含むニューロンにおいて核から除去され、これは、ＴＤＰ－４３機能喪失が、ＡＬＳ病因およびＦＴＤ病因の基礎をなす疾患機構の重要な側面であることを強く支持する証拠である。ゲノムワイドアプローチが使用されて、数千個のＲＮＡ標的上でのＴＤＰ－４３の結合部位（好ましい結合部位としてＧＵリッチ配列を有する）を規定し、マウス転写物およびヒト転写物のＲＮＡスプライシングおよび発現に対するＴＤＰ－４３破壊の影響を規定した。
【0030】
ＴＤＰ－４３は必須タンパク質であり、マウスにおけるその広範な欠失は胚致死性である。ヒトＴＤＰ－４３を発現する多数のトランスジェニック齧歯類が、疾患を引き起こす変異を含んで、または疾患を引き起こす変異を含まずに、種々のプロモーター下で、作製されている。ＴＤＰ－４３の過剰発現は、変異の存在とは無関係にいくつかの致死性表現型を誘導する。しかし、内因性ＴＤＰ－４３に近いレベルを発現するマウスは、変異体および加齢に非依存的な神経学的表現型（軽度の運動欠損および認知欠損、運動ニューロン変性、ならびに神経筋脱神経が挙げられるが、麻痺も寿命の減少も含まない）を発現する。
【0031】
ＴＤＰ－４３タンパク質症の動物モデル化の重要な警告事項は、ＴＤＰ－４３によって結合されるＲＮＡのレパートリーが種間で異なり、ＴＤＰ－４３機能障害によって誘発されるＲＮＡプロセシングの変化がマウスとヒトとの間で異なることである。実際、最近のデータは、ＴＤＰ－４３破壊によって最も影響を受けるヒトＲＮＡは神経成長関連因子スタスミン－２（ＳＣＧ１０としても知られる）をコードするが、スタスミン－２ ＲＮＡは齧歯類においてＴＤＰ－４３によって結合も調節もされないことを示す。スタスミン－２の異常なプロセシングは、ＴＤＰ－４３導入遺伝子を発現するマウスまたはＴＤＰ－４３欠損性マウスにおいて再現されず、その理由は、ヒトスタスミン－２遺伝子のイントロン１中の潜在的ポリアデニル化シグナルおよび３つのＧＵリッチＴＤＰ－４３結合部位が、対応するマウスイントロンでは見出されないからである（図１Ａおよび図１Ｂ）。一貫して、スタスミン－２ ｍＲＮＡ前駆体はマウスにおいてＴＤＰ－４３によって結合されず、スタスミン－２ ｍＲＮＡレベルは、マウスＮ２Ａ細胞および野生型マウスの中枢神経系において、ＴＤＰ－４３のｓｉＲＮＡ媒介性減少またはＡＳＯ媒介性減少後に変化しない。Ｍｅｌａｍｅｄら、（２０１９）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【0032】
（Ｉ．Ｔａｒ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）およびスタスミン－２）
いくつかの神経変性疾患の共通する神経病理学的特徴はＴａｒ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の誤った局在化および凝集であり、このタンパク質は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）ファミリーのメンバーであり、通常は中枢系全体にわたって核で広範に発現される。ＴＤＰ－４３の通常の機能および神経変性の病因におけるその役割に関する徹底的な調査は、ＴＤＰ－４３摂動が神経毒性をもたらす種々の経路を同定した。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭葉変性症（ＦＴＤ）におけるユビキチン化細胞質封入体の主要成分として元々同定されたので、ＴＤＰ－４病理は、アルツハイマー病ならびにパーキンソン病およびハンチントン病、さらに変性筋疾患封入体ミオパチーのかなりの比率の症例の神経病理学的的特徴として現在認識されている（Ｇｌａｓｓ ＪＤ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、２０２０年１１月２日；１３０（１１）：５６７７～５６８０を参照のこと）。
いくつかの神経変性疾患の共通する神経病理学的特徴はＴａｒ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の誤った局在化および凝集であり、このタンパク質は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）ファミリーのメンバーであり、通常は中枢系全体にわたって核で広範に発現される。ＴＤＰ－４３の通常の機能および神経変性の病因におけるその役割に関する徹底的な調査は、ＴＤＰ－４３摂動が神経毒性をもたらす種々の経路を同定した。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭葉変性症（ＦＴＤ）におけるユビキチン化細胞質封入体の主要成分として元々同定されたので、ＴＤＰ－４病理は、アルツハイマー病ならびにパーキンソン病およびハンチントン病、さらに変性筋疾患封入体ミオパチーのかなりの比率の症例の神経病理学的的特徴として現在認識されている（Ｇｌａｓｓ ＪＤ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、２０２０年１１月２日；１３０（１１）：５６７７～５６８０を参照のこと）。
【0033】
ＴＤＰ－４３は転写サプレッサーである。ＴＤＰ－４３の非存在下で、すなわち、ＴＤＰ－４３が細胞質へと誤った場所に局在化するのでＴＤＰ－４３が核から除去された場合に、潜在的エクソンが露出され転写されて、ＡＬＳモデルにおいて神経毒性をもたらす異常なｍＲＮＡを生じる。最近、このＴＤＰ－４３サプレッサー機能は、タンパク質スタスミン－２（ＳＴＭＮ２）のｍＲＮＡ前駆体において潜在的初期ポリアデニル化部位を抑制することに特に関係付けられた。ＴＤＰ－４３の喪失は、未成熟ポリＡテールの組込みを可能にして、切断型で非機能的形態のＳＴＭＮ２を生じる（Ｋｌｉｍ ＪＲら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１９；２２（２）：１６７～１７９およびＭｅｌａｍｅｄ Ｚら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１９；２２（２）：１８０～１９０）。ＳＴＭＮ２は、軸索の伸長および維持に必須である高度に保存された細胞質タンパク質である。ＳＴＭＮ２ノックアウトマウスは遅発性の主に運動の軸索障害を発症し（Ｌｉｅｄｔｋｅ Ｗら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．、２００２；１６０（２）：４６９～４８０）、これは、ヒトＡＬＳにおいて見られるものと類似する。
【0034】
スタスミン遺伝子ファミリーの４つのメンバー（別々のゲノム座位から各々がコードされる）のうち、スタスミン－２は、マウスおよびヒトの両方の運動ニューロンにおいて最も顕著に発現される。実際、スタスミン－２は、ＡＬＳにおいて特に影響を受けるこのニューロン集団において最も濃縮されるｍＲＮＡの上位２５種の一つである。スタスミン－２は、おそらく、軸索成長円錐において微小管動態を促進することによって、神経突起成長４８において重要な役割を果たすと提唱されている。それはα／β－チューブリンダイマーに結合する。それは、軸索再生に必須であることが示された。軸索損傷の際に、スタスミン－２はアップレギュレートされ、軸索を再生する成長円錐に動員される。それは、成体マウスにおいて神経筋接合部（ＮＭＪ）の運動軸索終末で蓄積することが、決定された。
【0035】
例示的なヒトスタスミン－２タンパク質配列は以下である：
【化1】
【0036】
例示的なマウススタスミン－２タンパク質配列は以下である：
【化2】
【0037】
一部の実施形態において、本明細書において提供されているマウス（マウスモデル）は、遺伝子型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｓｔｍｎ２ｅｍ８（ＳＴＭＮ２＊）Ｌｕｔｚｙ／Ｍｍｊａｘ（一般名Ｓｔｍｎ２ｅｍ８（ＳＴＭＮ２＊）、例えば、ＭＭＲＲＣ系統番号０６９７９２－ＪＡＸ）を有する。Ｓｔｍｎ２ｅｍ８（ＳＴＭＮ２＊）は、ヒトＳＴＭＮ２エクソン２ａの２２２ヌクレオチドを保有するスタスミン様２（Ｓｔｍｎ２）遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９により作製された変異体である。そのＳＴＭＮ２配列は、ヒトＭＳ２ステムループ配列を含みＴＤＰ－４３結合エレメントを置換するように、改変されている。これらのマウスは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の前臨床研究において有用であり得る。
【0038】
そのＳｔｍｎ２ｅｍ８（ＳＴＭＮ２＊）アレルは、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ媒介性ゲノム編集を使用して作製された。ガイドＲＮＡが、スタスミン様２遺伝子（Ｓｔｍｎ２）のイントロン１を標的として改変型ヒトＳＭＮＴ２エクソン２ａを挿入するように、選択された。この系統中のヒト化／変異体エクソン２ａは、２２２ヌクレオチド長であり、エクソン２ａの５’および３’にそれぞれ位置する１４９１ｂｐおよび１５４８ｂｐのヒトゲノムＤＮＡが両側に隣接している。その１９ヌクレオチドＭＳ２ステムループは配列５’－ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴ－３’（配列番号４）を含む。これは、エクソン２ａ含有マウス－ヒトハイブリッドＳＴＭＮ２未成熟終止ｍＲＮＡ転写物の３’－ＵＴＲにおいて２４ヌクレオチドＴＤＰ－４３結合配列５’－ＴＧＴＧＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧ－３’（配列番号５）を置換するために使用された。そのドナープラスミド、両方のガイドおよびｃａｓ９ヌクレアーゼが１細胞Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ接合子に導入され、偽妊娠雌に移入された。そのドナープラスミド中に存在する隣接するマウスイントロン１配列はＮ２Ａ細胞株に由来したことに留意されたい。その左アーム中には、Ｅｎｓｅｍｂｌにおいて報告されているＣ５７ＢＬ／６Ｊ配列間で異なる３つのＳＮＰが存在する。これらのＳＮＰのいずれかがエクソン２ａの使用に影響を与えるとは、予期されていない。子孫がＤＮＡ配列決定によってスクリーニングされて、正確に標的とされた仔が同定され、その後、それらの仔が、生殖系列伝達のためにＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと繁殖させた。そのアレルを保有する正確に標的とされた単一の樹立系統（ｆｏｕｎｄｅｒ）に由来するＮ１子孫が、コロニーを確立するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊと少なくとも２世代の間、戻し交雑された。
【0039】
マウス中のヒト化エクソン２Ａ（変異体ＴＤＰ－４３）の予想ゲノム配列：
【化3-1】
【化3-2】
【0040】
その挿入されたＭＳ２結合配列ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴ（配列番号４）は、配列ＴＧＴＧＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧ（配列番号５）の置換によってＴＤＰ－４３結合エレメントを破壊する。
【0041】
そのヒトエクソン２Ａ配列は以下の配列を含む：
【化4】
【0042】
そのポリＡシグナル配列はＡＴＴＡＡＡである。
【0043】
そのＭｕｔプライマー結合部位は、ＣＣＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＧＣＴＣＴＧＧＴ（配列番号７）およびＧＧＡＡＧＴＣＡＡＣＣＴＡＣＡＧＡＴＣＡＧＡＡＡ（配列番号８）である。
【0044】
その隣接マウスイントロン配列に下線を付している。
【0045】
以下の２つの独立した戦略が、ＴＤＰ－４３が減少される場合に最も影響を受けるヒトＲＮＡであるスタスミン－２をコードするｍＲＮＡを同定するために使用されてきた：１）ヒト神経細胞株におけるｓｉＲＮＡによるＴＤＰ－４３の枯渇；および（２）ＡＬＳを引き起こす変異ＴＤＰ－４３Ｎ３５２Ｓを両方の内因性ＴＤＰ－４３遺伝子座に導入するためのゲノム編集。ＲＮＡｓｅｑを使用すると、スタスミン－２は、ＴＤＰ－４３の減少によって最も影響を受けたｍＲＮＡであり、２２ｋＤスタスミン－２タンパク質の対応するほぼ完全な喪失を伴った（Ｍｅｌａｍｅｄ Ｚら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１９；２２（２）：１８０～１９０）。そのスタスミン－２遺伝子は、５つの注釈付きエクソンを含む。しかし、ＴＤＰ－４３の減少または変異は新規なスプライシングされたエクソンを誘導し、ＲＮＡ－ｓｅｑ読取りはイントロン１内にマッピングされた（Ｍｅｌａｍｅｄ Ｚら、２０１９）。この新規なエクソン（本明細書において「エクソン２ａ」と呼ぶ）は、野生型細胞には存在しなかったが、ＴＤＰ－４３が枯渇された場合または内因性ＴＤＰ－４３がＮ３５２Ｓ変異を保有するように編集された場合のいずれかで出現した。潜在的３’スプライス部位の使用は、ＴＤＰ－４３枯渇後またはＴＤＰ－４３Ｎ３５２Ｓ変異の存在下でＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞中でエクソン２ａに連結されたエクソン１を含むＲＮＡを生じた（ＲＴ－によって確認した）が、なんらかの下流エクソン２に連結されたエクソン２ａを含むＲＮＡは、何も同定されなかった。むしろ、エクソン２ａの３’境界は、通常はイントロン１であるものの内部で潜在的ポリアデニル化部位の使用によって生成されることが、決定された（Ｍｅｌａｍｅｄ Ｚ，ら、２０１９）。ＴＤＰ－４３の可能性のある結合部位に印を付ける３つの「ＧＵＧＵＧＵ」ヘキサマーが、潜在的３’スプライス部位と、未成熟ポリＡ部位との間の領域において同定された。その使用がエクソン２ａを生成する。実際、ヒトＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞中のＴＤＰ－４３についての紫外線架橋免疫沈降法（ｉＣＬＩＰ）データの分析は、ＴＤＰ－４３がこれらの３つのＧＵＧＵＧＵ配列（スタスミン－２ ｍＲＮＡ前駆体に結合するＴＤＰ－４３の唯一の部位群）でスタスミン－２ ｍＲＮＡ前駆体に結合することを確認し（図１ｅ）、これにより、そのｍＲＮＡ前駆体とＴＤＰ－４３との物理的相互作用を確認した。まとめると、ＴＤＰ－４３の減少または疾患関連変異はヒトスタスミン－２ ｍＲＮＡ前駆体の異常なスプライシングおよび未成熟ポリアデニル化を駆動し、それにより、スタスミン－２生成をサイレンシングする（Ｍｅｌａｍｅｄ Ｚら、２０１９）。
【0046】
（ＩＩ．マウスモデル）
本明細書において、簡潔性のために、「マウス」および「マウスモデル」（例えば、ヒト状態の代替物）への言及がなされる。これらの用語は、特に言及されない限りは、本明細書全体を通じて「齧歯類」および「齧歯類モデル」（マウス、ラットおよび他の齧歯類の種が挙げられる）を含むために交換可能に使用され得ることが、理解されるべきである。
本明細書において、簡潔性のために、「マウス」および「マウスモデル」（例えば、ヒト状態の代替物）への言及がなされる。これらの用語は、特に言及されない限りは、本明細書全体を通じて「齧歯類」および「齧歯類モデル」（マウス、ラットおよび他の齧歯類の種が挙げられる）を含むために交換可能に使用され得ることが、理解されるべきである。
【0047】
本明細書において使用されている標準的な遺伝学的命名法は種々の齧歯類系統についての独特な識別を提供し、その系統記号は、使用される系統またはストックの型についての基本情報およびその系統の遺伝的内容を伝えることもまた、理解されるべきである。系統およびストックを記号化するための規則は、マウスの遺伝学的命名法の標準化に関する国際委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｍｉｃｅ）によって公表されている。これらの規則は、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＧＤ；ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ）からオンラインで入手可能である。これらの規則は、印刷版で刊行された（Ｌｙｏｎら、１９９６）。系統記号は、代表的には、施設登録コード（ラボコード（Ｌａｂ Ｃｏｄｅ））を含む。その登録簿は、米国科学アカデミー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）にある実験動物研究協会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＬＡＲ）で維持される。ラボコード（Ｌａｂ Ｃｏｄｅ）は、ＩＬＡＲのウェブサイト（ｎａｓ．ｅｄｕ／ｃｌｓ／ｉｌａｒｈｏｍｅ．ｎｓｆ）にて電子的に入手され得る。Ｄａｖｉｓｓｏｎ ＭＴ、Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｒａｔｓ／Ｗｈａｔ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ａｎ Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ－Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＵＳ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（ＤＣ）：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ（ＵＳ）；１９９９もまた、参照のこと。
【0048】
本明細書において提供されているマウスモデルは、外因性ヒトスタスミン－２ポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子改変された内因性スタスミン－２遺伝子（本明細書において「ヒト化スタスミン－２遺伝子」と呼ばれる）を発現する、トランスジェニックマウスモデルである。トランスジェニックマウスは、そのゲノム中に（組み込まれた）外因性核酸（例えば、導入遺伝子または導入遺伝子領域）を有するマウスである。
【0049】
トランスジェニックマウスを作製する方法は周知である。トランスジェニックマウスの作製のために使用される３つの従来の方法としては、ＤＮＡマイクロインジェクション（ＧｏｒｄｏｎおよびＲｕｄｄｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８１：２１４：１２４４～１２４（参照により本明細書に援用される））、胚性幹細胞媒介性遺伝子移入（Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８６、８３：９０６５～９０６９（参照により本明細書に援用される））およびレトロウイルス媒介性遺伝子移入（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９７６、７３：１２６０～１２６４（参照により本明細書に援用される））が挙げられ、これらのいずれかが、本明細書において提示されているとおりに使用され得る。例えば、クラスター化された規則的に間隔を空けたパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用するゲノム編集方法が、本明細書の他の箇所に記載されている。
【0050】
受精した胚（例えば、１細胞胚（例えば、接合子）または多細胞胚（例えば、接合子後の発生段階、例えば、胚盤胞）への核酸の送達後に、その受精した胚は偽妊娠雌に移入され、その後、これは子孫を出産する。ヒト化スタスミン－２遺伝子をコードする核酸の有無は、例えば、多数の遺伝子型決定法（例えば、配列決定および／またはゲノムＰＣＲ）を使用して確認され得る。
【0051】
（ＩＩＩ．核酸：操作および送達）
本明細書において提供されている核酸は、一部の実施形態において、操作されている。操作された核酸とは、天然では存在しない核酸（例えば、互いに共有結合された少なくとも２個のヌクレオチドであり、一部の場合では、ホスホジエステル結合（ホスホジエステル骨格と呼ばれる）を含む）である。操作された核酸としては、組換え核酸および合成核酸が挙げられる。組換え核酸とは、２つの別々の生物（例えば、ヒトおよびマウス）に由来する核酸（例えば、単離された核酸、合成核酸またはそれらの組合せ）を連結することによって構築された分子である。合成核酸とは、増幅されているか、または化学的にかもしくは他の手段によって合成されている分子である。合成核酸としては、化学的に改変されているかまたは別の方法で改変されているが、天然に存在する核酸分子と塩基対形成（結合）し得る、核酸が挙げられる。組換え核酸および合成核酸としてはまた、上記のいずれかの複製から生じる分子が挙げられる。
本明細書において提供されている核酸は、一部の実施形態において、操作されている。操作された核酸とは、天然では存在しない核酸（例えば、互いに共有結合された少なくとも２個のヌクレオチドであり、一部の場合では、ホスホジエステル結合（ホスホジエステル骨格と呼ばれる）を含む）である。操作された核酸としては、組換え核酸および合成核酸が挙げられる。組換え核酸とは、２つの別々の生物（例えば、ヒトおよびマウス）に由来する核酸（例えば、単離された核酸、合成核酸またはそれらの組合せ）を連結することによって構築された分子である。合成核酸とは、増幅されているか、または化学的にかもしくは他の手段によって合成されている分子である。合成核酸としては、化学的に改変されているかまたは別の方法で改変されているが、天然に存在する核酸分子と塩基対形成（結合）し得る、核酸が挙げられる。組換え核酸および合成核酸としてはまた、上記のいずれかの複製から生じる分子が挙げられる。
【0052】
操作された核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡとｃＤＮＡとの組合せ）、ＲＮＡまたはハイブリッド分子を含み得、例えば、その核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチド（例えば、人工または天然）との任意の組合せ、ならびに２種以上の塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンが挙げられる）の任意の組合せを含む。
【0053】
一部の実施形態において、核酸は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。ｃＤＮＡは、逆転写酵素によって触媒される反応において、一本鎖ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））テンプレートから合成される。
【0054】
本開示の操作された核酸は、標準的な分子生物学の方法を使用して作製され得る（例えば、ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２０１２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。一部の実施形態において、核酸は、ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ（例えば、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、３４３～３４５、２００９；およびＧｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、９０１～９０３、２０１０（その各々が本明細書に参照により援用される）を参照のこと）を使用して作製される。ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）は、代表的には、単一試験管反応において、５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの３’伸長活性およびＤＮＡリガーゼ活性という、３種の酵素活性を使用する。その５’エキソヌクレアーゼ活性は、５’末端配列を部分的に切断（ｃｈｅｗ ｂａｃｋ）し、その相補配列をアニーリングのために露出させる。その後、そのポリメラーゼ活性は、アニールされたドメインにある間隙を埋める。その後、ＤＮＡリガーゼが、そのニックを塞ぎ、ＤＮＡフラグメントを一緒に共有結合する。隣接するフラグメントの重複配列は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙにおいて使用される重複配列よりもかなり長く、したがって、より高い割合の正確なアセンブリを生じる。操作された核酸を作製する他の方法が、本開示にしたがって使用され得る。
【0055】
遺伝子はヌクレオチドの明瞭な配列であり、そのヌクレオチドの順序は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド中のモノマーの順序を決定する。遺伝子は、代表的にはタンパク質をコードする。遺伝子は、内因性（宿主生物に天然で存在する）であってもよく、外因性（宿主生物に天然で移入されるかもしくは遺伝子操作を通じて移入される）であってもよい。アレルは、変異によって生じ染色体上の同じ座位において見出される、遺伝子の２種以上の選択的形態のうちの一つである。遺伝子は、一部の実施形態において、プロモーター配列、コード領域（例えば、エクソン）、非コード領域（例えば、イントロン）、および調節領域（調節配列とも呼ばれる）を含む。
【0056】
ヒト遺伝子を含むマウスは、ヒト導入遺伝子を含むと考えられる。導入遺伝子は、宿主生物にとって外因性である遺伝子である。すなわち、導入遺伝子は、宿主生物に天然で移入されたかまたは遺伝子操作を通じて移入された、遺伝子である。導入遺伝子は、その宿主生物（その導入遺伝子を含む生物（例えば、マウス））に天然では存在しない。
【0057】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始するヌクレオチド配列（例えば、ＡＴＧ）である。プロモーターは、代表的には、転写開始部位からすぐ上流（その５’末端）に位置する。一部の実施形態において、プロモーターは内因性プロモーターである。内因性プロモーターは、その宿主動物に天然で存在するプロモーターである。
【0058】
オープンリーディングフレームは、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）で始まり終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）で終わる連続する一続きのコドンであり、ポリペプチド（例えば、タンパク質）をコードする。オープンリーディングフレームは、あるプロモーターがそのオープンリーディングフレームの転写を調節する場合には、そのプロモーターに作動可能に連結されている。
【0059】
エクソンは、遺伝子のうちのアミノ酸をコードする領域である。イントロン（および他の非コードＤＮＡ）は、遺伝子のうちのアミノ酸をコードしない領域である。
【0060】
生成物（例えば、タンパク質）をコードするヌクレオチド配列は、一部の実施形態において、２００塩基対（ｂｐ）～１００キロベース（ｋｂ）の長さを有する。そのヌクレオチド配列は、一部の実施形態において、少なくとも１０ｋｂの長さを有する。例えば、そのヌクレオチド配列は、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、または少なくとも３５ｋｂの長さを有し得る。一部の実施形態において、そのヌクレオチド配列は、１０ｋｂ～１００ｋｂ、１０ｋｂ～７５ｋｂ、１０ｋｂ～５０ｋｂ、１０ｋｂ～３０ｋｂ、２０ｋｂ～１００ｋｂ、２０ｋｂ～７５ｋｂ、２０ｋｂ～５０ｋｂ、２０ｋｂ～３０ｋｂ、３０ｋｂ～１００ｋｂ、３０ｋｂ～７５ｋｂ、または３０ｋｂ～５０ｋｂの長さを有する。
【0061】
本明細書において提供されている核酸のいずれか１つは、２００ｂｐ～５００ｋｂ、２００ｂｐ～２５０ｋｂ、または２００ｂｐ～１００ｋｂの長さを有し得る。核酸は、一部の実施形態において、少なくとも１０ｋｂの長さを有する。例えば、核酸は、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、または少なくとも５００ｋｂの長さを有し得る。一部の実施形態において、核酸は、１０ｋｂ～５００ｋｂ、２０ｋｂ～４００ｋｂ、１０ｋｂ～３００ｋｂ、１０ｋｂ～２００ｋｂ、または１０ｋｂ～１００ｋｂの長さを有する。一部の実施形態において、核酸は、１０ｋｂ～１００ｋｂ、１０ｋｂ～７５ｋｂ、１０ｋｂ～５０ｋｂ、１０ｋｂ～３０ｋｂ、２０ｋｂ～１００ｋｂ、２０ｋｂ～７５ｋｂ、２０ｋｂ～５０ｋｂ、２０ｋｂ～３０ｋｂ、３０ｋｂ～１００ｋｂ、３０ｋｂ～７５ｋｂ、または３０ｋｂ～５０ｋｂの長さを有する。核酸は、環状であってもよく、直鎖状であってもよい。
【0062】
本明細書において記載されている核酸は、一部の実施形態において、改変を含む。改変とは、核酸に関して言えば、対応する野生型核酸（例えば、天然に存在する核酸）と比較したその核酸のあらゆる操作である。したがって、ゲノム改変とは、ゲノム中の対応する野生型核酸（例えば、天然に存在する（改変されていない）核酸）と比較した、ゲノム中の（例えば、コード領域中、非コード領域中、および／または調節領域中の）核酸のあらゆる操作である。核酸（例えば、ゲノム）改変の非限定的例としては、欠失、挿入、「インデル」（欠失および挿入）、ならびに置換（例えば、点変異）が挙げられる。一部の実施形態において、遺伝子における欠失、挿入、インデル、または他の改変は、その遺伝子が機能的生成物（例えば、タンパク質）をもはやコードしないように、フレームシフト変異を生じる。改変はまた、化学的改変、例えば、少なくとも１核酸塩基の化学的改変を含む。核酸改変の方法（例えば、遺伝子不活性化を生じる方法）は公知であり、その方法としては、ＲＮＡ干渉、化学的改変、および遺伝子編集（例えば、リコンビナーゼまたは他のプログラム可能なヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、および／もしくはＺＦＮ）を使用する）が挙げられるが、それらに限定されない。
【0063】
核酸（例えば、遺伝子のアレルまたはアレル（複数））は、検出可能なレベルの機能的遺伝子生成物（例えば、機能的タンパク質）をその核酸が生成しないように、改変され得る。したがって、不活性化されたアレルとは、検出可能なレベルの機能的遺伝子生成物（例えば、機能的タンパク質）を生成しないアレルである。タンパク質の検出可能なレベルとは、標準的なタンパク質検出アッセイ（例えば、フローサイトメトリーおよび／またはＥＬＩＳＡ）を使用して検出されるタンパク質のあらゆるレベルである。一部の実施形態において、不活性化されたアレルは、転写されない。一部の実施形態において、不活性化されたアレルは、機能的タンパク質をコードしない。
【0064】
核酸の送達のために使用されるベクターとしては、ミニサークル、プラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および酵母人工染色体が挙げられる。しかし、ベクターは必要ではない可能性があることが、理解されるべきである。例えば、環状化核酸または直鎖状核酸が、そのベクター骨格を用いずに胚に送達され得る。ベクター骨格は小さく（約４ｋｂ）、一方、環状化されるドナーＤＮＡは、例えば、＞１００ｂｐ～５０ｋｂの範囲であり得る。
【0065】
トランスジェニックマウスの作製のために核酸をマウス胚に送達するための方法としては、エレクトロポレーション（例えば、Ｗａｎｇ Ｗら、Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１６；４３（５）：３１９～２７；ＷＯ２０１６／０５４０３２；およびＷＯ２０１７／１２４０８６（それらの各々が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）、ＤＮＡマイクロインジェクション（例えば、ＧｏｒｄｏｎおよびＲｕｄｄｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８１：２１４：１２４４～１２４（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）、胚性幹細胞媒介性遺伝子移入（例えば、Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８６；８３：９０６５～９０６９（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）、ならびにレトロウイルス媒介性遺伝子移入（例えば、Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９７６；７３：１２６０～１２６４（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されず、これらの各々が、本明細書において提示されているとおりに使用され得る。
【0066】
（ＩＶ．ゲノム編集方法）
操作された核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ドナーポリヌクレオチド、および他の核酸コード配列など）は、任意の適切な方法を使用して胚のゲノムに導入され得る。本出願は、例えば、トランスジェニック齧歯類を作製するために胚のゲノムに核酸を導入するための、種々の遺伝子編集技術の使用を企図する。非限定的例としては、プログラム可能なヌクレアーゼベースのシステム、例えば、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。例えば、Ｃａｒｒｏｌｌ Ｄ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１１；１８８（４）：７７３～７８２；Ｊｏｕｎｇ ＪＫら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２０１３；１４（１）：４９～５５；およびＧａｊ Ｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１３年７月；３１（７）：３９７～４０５（これらの各々が本明細書に参照により援用される）を参照のこと。
操作された核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ドナーポリヌクレオチド、および他の核酸コード配列など）は、任意の適切な方法を使用して胚のゲノムに導入され得る。本出願は、例えば、トランスジェニック齧歯類を作製するために胚のゲノムに核酸を導入するための、種々の遺伝子編集技術の使用を企図する。非限定的例としては、プログラム可能なヌクレアーゼベースのシステム、例えば、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。例えば、Ｃａｒｒｏｌｌ Ｄ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１１；１８８（４）：７７３～７８２；Ｊｏｕｎｇ ＪＫら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２０１３；１４（１）：４９～５５；およびＧａｊ Ｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１３年７月；３１（７）：３９７～４０５（これらの各々が本明細書に参照により援用される）を参照のこと。
【0067】
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムが、本明細書において提供されているマウス胚のゲノムを編集するために使用される。例えば、Ｈａｒｍｓ ＤＷら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．、２０１４；８３：１５．７．１～１５．７．２７；およびＩｎｕｉ Ｍら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．、２０１４；４：５３９６（これらの各々が本明細書に参照により援用される）を参照のこと。例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡもしくはＣａｓ９タンパク質、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および／またはドナー核酸が、１細胞（接合子）期もしくはより後期のマウス胚に直接送達（例えば、注射もしくはエレクトロポレーション）され得、相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進し、例えば、操作された核酸（例えば、ドナー核酸）をゲノム中に導入し得る。
【0068】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、遺伝子編集のためのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして別目的で利用されていた、原核生物中の天然に存在する防御機構である。操作されたＣＲＩＳＰＲシステムは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）という２種の主要成分を含む。このｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ結合のための足場配列と、改変されるべきゲノム標的（例えば、遺伝子）を規定するユーザーが規定したヌクレオチドスペーサー（例えば、約１５～２５ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド）とから構成された、短い合成ＲＮＡである。したがって、そのｇＲＮＡ中に存在する標的配列を単に変更することによって、そのＣａｓタンパク質のゲノム標的を変更し得る。一部の実施形態において、そのＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＮＧＧ ＰＡＭ）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＮＮＧＲＲＴもしくはＮＮＧＲＲ（Ｎ） ＰＡＭ）に由来するが、他のＣａｓ９ホモログ、Ｃａｓ９オルソログ、および／またはＣａｓ９バリアント（例えば、Ｃａｓ９の進化したバージョン）が、本明細書において提供されているとおり使用され得る。本明細書において提供されているとおり使用され得るＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのさらなる非限定的例としては、Ｃｐｆ１（ＴＴＮ ＰＡＭ）；ＳｐＣａｓ９ Ｄ１１３５Ｅバリアント（ＮＧＧ（減少したＮＡＧ結合）ＰＡＭ）；ＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲバリアント（ＮＧＣＧ ＰＡＭ）；ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲバリアント（ＮＧＡＧ ＰＡＭ）；ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲバリアント（ＮＧＡＮまたはＮＧＮＧ ＰＡＭ）；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＭ）のＣａｓ９（ＮＮＮＮＧＡＴＴ ＰＡＭ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＳＴ）のＣａｓ９（ＮＮＡＧＡＡＷ ＰＡＭ）；およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＴＤ）のＣａｓ９（ＮＡＡＡＡＣ）が挙げられる。一部の実施形態において、そのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、およびＣ２ｃ３から選択される。一部の実施形態において、そのＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９である。
【0069】
ガイドＲＮＡは、標的核酸配列にハイブリダイズ（結合）する少なくとも１つのスペーサー配列と、そのエンドヌクレアーゼに結合してそのエンドヌクレアーゼをその標的核酸配列へと誘導するＣＲＩＳＰＲ反復配列とを、含む。当業者によって理解されるとおり、各ｇＲＮＡは、そのゲノム標的配列に対して相補的なスペーサー配列を含むように設計される。例えば、Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２；３３７：８１６～８２１およびＤｅｌｔｃｈｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ、２１００；４７１：６０２～６０７（これらの各々が本明細書に参照により援用される）を参照のこと。
【0070】
一部の実施形態において、そのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとそのｇＲＮＡとは、胚への送達の前に、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成するように複合体化される。
【0071】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはそのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸の濃度は、変化し得る。一部の実施形態において、その濃度は、１００ｎｇ／μｌ～１０００ｎｇ／μｌである。例えば、その濃度は、１００ｎｇ／μｌ、１５０ｎｇ／μｌ、２００ｎｇ／μｌ、２５０ｎｇ／μｌ、３００ｎｇ／μｌ、３５０ｎｇ／μｌ、４００ｎｇ／μｌ、４５０ｎｇ／μｌ、５００ｎｇ／μｌ、５５０ｎｇ／μｌ、６００ｎｇ／μｌ、６５０ｎｇ／μｌ、７００ｎｇ／μｌ、７５０ｎｇ／μｌ、８００ｎｇ／μｌ、８５０ｎｇ／μｌ、９００ｎｇ／μｌ、９５０ｎｇ／μｌ、または１０００ｎｇ／μｌであり得る。一部の実施形態において、その濃度は、１００ｎｇ／μｌ～５００ｎｇ／μｌ、または２００ｎｇ／μｌ～５００ｎｇ／μｌである。
【0072】
ｇＲＮＡの濃度もまた、変化し得る。一部の実施形態において、その濃度は、２００ｎｇ／μｌ～２０００ｎｇ／μｌである。例えば、その濃度は、２００ｎｇ／μｌ、３００ｎｇ／μｌ、４００ｎｇ／μｌ、５００ｎｇ／μｌ、６００ｎｇ／μｌ、７００ｎｇ／μｌ、８００ｎｇ／μｌ、９００ｎｇ／μｌ、１０００ｎｇ／μｌ、１１００ｎｇ／μｌ、１２００ｎｇ／μｌ、１３００ｎｇ／μｌ、１４００ｎｇ／μｌ、１５００ｎｇ／μｌ、１６００ｎｇ／μｌ、１７００ｎｇ／μｌ、１７００ｎｇ／μｌ、１９００ｎｇ／μｌ、または２０００ｎｇ／μｌであり得る。一部の実施形態において、その濃度は、５００ｎｇ／μｌ～１０００ｎｇ／μｌである。一部の実施形態において、その濃度は、１００ｎｇ／μｌ～１０００ｎｇ／μｌである。例えば、その濃度は、１００ｎｇ／μｌ、１５０ｎｇ／μｌ、２００ｎｇ／μｌ、２５０ｎｇ／μｌ、３００ｎｇ／μｌ、３５０ｎｇ／μｌ、４００ｎｇ／μｌ、４５０ｎｇ／μｌ、５００ｎｇ／μｌ、５５０ｎｇ／μｌ、６００ｎｇ／μｌ、６５０ｎｇ／μｌ、７００ｎｇ／μｌ、７５０ｎｇ／μｌ、８００ｎｇ／μｌ、８５０ｎｇ／μｌ、９００ｎｇ／μｌ、９５０ｎｇ／μｌ、または１０００ｎｇ／μｌであり得る。
【0073】
一部の実施形態において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはそのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸の濃度と、ｇＲＮＡの濃度との比は、２：１である。他の実施形態において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはそのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸の濃度と、ｇＲＮＡの濃度との比は、１：１である。
【0074】
ドナー核酸は、代表的には、ホモロジーアームが両側に隣接している目的の配列を含む。ホモロジーアームは、ゲノム座位中に位置するゲノムＤＮＡ領域と相同なｓｓＤＮＡ領域である。一方のホモロジーアームは（目的の配列が導入される）目的のゲノム領域の左（５’）側に位置し（左ホモロジーアーム）、別のホモロジーアームは目的のゲノム領域の右（３’）側に位置する（右ホモロジーアーム）。これらのホモロジーアームは、そのｓｓＤＮＡドナーとゲノム座位との間での相同組換えを可能にして、（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して）目的のゲノム座位への目的の配列の挿入をもたらす。
【0075】
そのホモロジーアームは、長さが変化し得る。例えば、各ホモロジーアーム（左アームおよび右ホモロジーアーム）は、２０ヌクレオチド塩基～１０００ヌクレオチド塩基の長さを有し得る。一部の実施形態において、各ホモロジーアームは、２０ヌクレオチド塩基～２００ヌクレオチド塩基、２０ヌクレオチド塩基～３００ヌクレオチド塩基、２０ヌクレオチド塩基～４００ヌクレオチド塩基、２０ヌクレオチド塩基～５００ヌクレオチド塩基、２０ヌクレオチド塩基～６００ヌクレオチド塩基、２０ヌクレオチド塩基～７００ヌクレオチド塩基、２０ヌクレオチド塩基～８００ヌクレオチド塩基、または２０ヌクレオチド塩基～９００ヌクレオチド塩基の長さを有する。一部の実施形態において、各ホモロジーアームは、２０ヌクレオチド塩基、３０ヌクレオチド塩基、４０ヌクレオチド塩基、５０ヌクレオチド塩基、６０ヌクレオチド塩基、７０ヌクレオチド塩基、８０ヌクレオチド塩基、９０ヌクレオチド塩基、１００ヌクレオチド塩基、１５０ヌクレオチド塩基、２００ヌクレオチド塩基、２５０ヌクレオチド塩基、３００ヌクレオチド塩基、３５０ヌクレオチド塩基、４００ヌクレオチド塩基、４５０ヌクレオチド塩基、５００ヌクレオチド塩基、５５０ヌクレオチド塩基、６００ヌクレオチド塩基、６５０ヌクレオチド塩基、７００ヌクレオチド塩基、７５０ヌクレオチド塩基、８００ヌクレオチド塩基、８５０ヌクレオチド塩基、９００ヌクレオチド塩基、９５０ヌクレオチド塩基、または１０００ヌクレオチド塩基の長さを有する。一部の実施形態において、一方のホモロジーアームの長さは、もう一方のホモロジーアームの長さとは異なる。例えば、一方のホモロジーアームは２０ヌクレオチド塩基の長さを有し得、もう一方のホモロジーアームは５０ヌクレオチド塩基の長さを有し得る。一部の実施形態において、そのドナーＤＮＡは一本鎖である。一部の実施形態において、そのドナーＤＮＡは二本鎖である。一部の実施形態において、そのドナーＤＮＡは、例えば、ホスホロチオエート化を介して、改変される。他の改変が、なされ得る。
【0076】
（Ｖ．使用の方法）
本明細書において提供されているマウスモデルは、一部の実施形態において、スタスミン－２がどのように神経機能に寄与するのかを決定するために、使用され得る。他の実施形態において、そのマウスモデルは、神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、および種々の形態のパーキンソニズムなどが挙げられる、ＴＤＰ－４３タンパク質症など）を処置するための治療アプローチを開発するために使用され得る。したがって、一部の態様において、マウスモデルに候補治療剤分子を投与する工程、およびそのマウスにおける改変された表現型についてアッセイする工程を含む、方法が、本明細書において提供される。
本明細書において提供されているマウスモデルは、一部の実施形態において、スタスミン－２がどのように神経機能に寄与するのかを決定するために、使用され得る。他の実施形態において、そのマウスモデルは、神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、および種々の形態のパーキンソニズムなどが挙げられる、ＴＤＰ－４３タンパク質症など）を処置するための治療アプローチを開発するために使用され得る。したがって、一部の態様において、マウスモデルに候補治療剤分子を投与する工程、およびそのマウスにおける改変された表現型についてアッセイする工程を含む、方法が、本明細書において提供される。
【0077】
神経変性疾患のための遺伝子療法の最も有望な橋渡し戦略の中では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が、致死性遺伝子発現またはＲＮＡプロセシング欠陥を矯正することによって寿命を伸ばす実行可能な治療アプローチとして出現してきた。ＡＳＯはその相補的標的ＲＮＡ分子に結合する化学的に改変された短い一本鎖核酸であり、ＡＳＯは、改変されていないＡＳＯについて、細胞エンドヌクレアーゼであるリボヌクレアーゼＨによってＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドとして認識されるキメラ二重鎖を生成して、その標的ＲＮＡの切断および分解をもたらすが、ＡＳＯ６２はそうしない。スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子中に変異を有する家族性ＡＬＳ患者の処置のための現在臨床治験中の、中枢神経系におけるＡＳＯ投与という先駆的努力において、ＳＯＤ１をコードするｍＲＮＡを低下させると、疾患進行の顕著な緩徐化をもたらした。それ以来、ＡＳＯは、いくつかの神経学的疾患（ハンチントン病、Ｃ９ＯＲＦ７２－ＡＬＳ／ＦＴＤ６７－７０、タウオパチー、孤発性ＡＬＳおよび脊髄小脳失調症、バッテン病、およびペリツェウス・メルツバッハ病が挙げられる）の遺伝的原因を標的とするために利用されてきた。リボヌクレアーゼＨによって認識されないように改変された場合、ＡＳＯはｍＲＮＡ前駆体プロセシングを調節し得る。実際、致死性神経発達疾患である脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）についての最初の処置は、この戦略を使用する。ＳＭＡ薬物であるスピンラザ（Ｓｐｉｎｒａｚａ）（ヌシネルセン（Ｎｕｓｉｎｅｒｓｅｎ）としても知られている）は、リボヌクレアーゼＨ酵素を動員することなくその標的化ｍＲＮＡに結合する、化学的に改変されたＡＳＯベースの薬物であり、スプライシング調節をもたらすが、ｍＲＮＡ分解はもたらさない。
【0078】
スタスミン－２レベルの減少は、ＡＬＳ／ＦＴＤの特徴であり、孤発性ＡＬＳおよびＦＴＤについて現在知られている最も有望な治療的遺伝子標的のうちの一つである。本明細書において提供されているマウスモデルは、一部の実施形態において、スタスミン－２ ｍＲＮＡ前駆体の異常なスプライシングを遮断することによってスタスミン－２レベルを回復するように標的化された、アンチセンスＡＳＯベースの治療法を開発するために使用され得る。ＳＭＡにおいてＳＭＮ２ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングにおけるＡＳＯ媒介性変化を連想させるアプローチを使用して、例えば、これらのマウスモデルは、孤発性および家族性のＡＬＳ／ＦＴＤにおいてスタスミン－２ ＡＳＯの治療能力を試験するために使用され得る。
【0079】
本開示の候補治療剤分子としてはまた、スタスミン－２ ｍＲＮＡ前駆体またはスタスミン－２ ｍＲＮＡのスプライシングの推定または既知の小分子調節因子（例えば、インヒビター、薬物）が挙げられる。
【0080】
マウス表現型における改変（変化）をアッセイすることまたは評価することは、神経変性疾患モデルに関連する種々の表現型と同様に、公知である。その表現型は、例えば、行動表現型または病理学的（例えば、神経病理学的)表現型であり得る（例えば、Ｋａｎｇ Ｊ．ら、ＳＴＡＲ Ｐｒｏｔｏｃ．、２０２１年７月７日；２（３）：１００６５４）を参照のこと。Ｊａｎｕｓ Ｃら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２０１０；６０２：３２３～４５；Ｃｈｏｉ Ｊ．ら、ＮＭＲ Ｂｉｏｍｅｄ．、２００７；２０：２６～２３７；ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔａａｙ Ｆ．ら、Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｆｕｎｃｔ．、２００９年２月２５日；５：１１もまた、参照のこと。
【0081】
一部の実施形態において、その表現型は運動欠損である。運動欠損の非限定的な例としては、振戦、麻痺、異常歩行、および下肢の握り行動が挙げられる。一部の実施形態において、その運動欠損は、オープンフィールド分析、握力分析、またはロータロッド分析によってアッセイされる。
【0082】
一部の実施形態において、その表現型は認知欠損である（例えば、Ｈｏｌｔｅｒ Ｓ．ら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｕｓｅ Ｂｉｏｌ．、２０１５年１２月２日；５（４）：３３１～３５８を参照のこと）。
【0083】
評価され得る他の表現型としては、運動ニューロン変性および／または神経筋脱神経が挙げられる。
【0084】
（さらなる実施形態）
以下の番号を付けた実施形態が、本開示によって包含される：
１． 切断型スタスミン－２メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をコードする核酸を含むマウス。
２． 上記切断型スタスミン－２ ｍＲＮＡが、内因性マウススタスミン－２遺伝子のエクソン２～エクソン５によってコードされるポリヌクレオチド配列を欠く、実施形態１に記載のマウス。
３． 上記切断型スタスミン－２ ｍＲＮＡが、ヒトスタスミン－２ ｍＲＮＡの領域を含む、実施形態１または２に記載のマウス。
４． 上記ヒトスタスミン－２ ｍＲＮＡの領域がヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３に記載のマウス。
５． ヒトスタスミン－２遺伝子の領域を含む核酸を含むマウス。
６． 上記領域がヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列とポリアデニル化配列とを含む、実施形態５に記載のマウス。
７． 内因性スタスミン－２遺伝子座を含むマウスであって、当該内因性スタスミン－２遺伝子座は、ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列と、必要に応じてポリアデニル化配列とを含む核酸を含む、マウス。
８． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列が３５０ヌクレオチド塩基対～４５０ヌクレオチド塩基対の長さを有する、実施形態４、６、または７に記載のマウス。
９． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列が、配列番号６のヌクレオチド配列、または配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一性もしくは少なくとも９５％同一性を有する配列を含む、実施形態８に記載のマウス。
１０． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列が上記内因性スタスミン－２遺伝子座のイントロン領域中にある、実施形態４または６～９のいずれか１つに記載のマウス。
１１． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列が上記内因性スタスミン－２遺伝子座のエクソン１とエクソン２との間にある、実施形態１０に記載のマウス。
１２． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列がＴａｒ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）結合部位を含む、実施形態４または６～１１のいずれか１つに記載のマウス。
１３． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列が、ＴＤＰ－４３に結合しない改変型ＴＤＰ－４３結合部位を含む、実施形態４または６～１１のいずれか１つに記載のマウス。
１４． 実施形態１～１３のいずれか１つに記載のマウスに候補治療剤分子を投与する工程；および
当該マウスにおける改変された表現型についてアッセイする工程
を含む、方法。
１５． 上記候補治療剤分子がＳｔｍｎ２ ｍＲＮＡ前駆体の異常なスプライシングを遮断する、実施形態１４に記載の方法。
１６． 上記候補治療剤が、上記ヒトエクソン２ａポリヌクレオチド配列に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、実施形態１４または１５に記載の方法。
１７． 上記候補治療剤が小分子薬である、実施形態１４または１５に記載の方法。
１８． 上記表現型が行動表現型または病理学的表現型である、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９． 上記表現型が運動欠損である、実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０． 上記運動欠損が振戦、麻痺、異常歩行、または下肢の握り行動から選択される、実施形態１９に記載の方法。
２１． 上記運動欠損がオープンフィールド分析、握力分析、またはロータロッド分析によってアッセイされる、実施形態１９または２０に記載の方法。
２２． 上記表現型が認知欠損である、実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の方法。
２３． 上記表現型が運動ニューロン変性および／または神経筋脱神経である、実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の方法。
２４． 実施形態１～１３のいずれか１つに記載のマウスを作製する方法であって、上記核酸を上記マウスのゲノムに導入する工程を含む、方法。
以下の番号を付けた実施形態が、本開示によって包含される：
１． 切断型スタスミン－２メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をコードする核酸を含むマウス。
２． 上記切断型スタスミン－２ ｍＲＮＡが、内因性マウススタスミン－２遺伝子のエクソン２～エクソン５によってコードされるポリヌクレオチド配列を欠く、実施形態１に記載のマウス。
３． 上記切断型スタスミン－２ ｍＲＮＡが、ヒトスタスミン－２ ｍＲＮＡの領域を含む、実施形態１または２に記載のマウス。
４． 上記ヒトスタスミン－２ ｍＲＮＡの領域がヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３に記載のマウス。
５． ヒトスタスミン－２遺伝子の領域を含む核酸を含むマウス。
６． 上記領域がヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列とポリアデニル化配列とを含む、実施形態５に記載のマウス。
７． 内因性スタスミン－２遺伝子座を含むマウスであって、当該内因性スタスミン－２遺伝子座は、ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列と、必要に応じてポリアデニル化配列とを含む核酸を含む、マウス。
８． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列が３５０ヌクレオチド塩基対～４５０ヌクレオチド塩基対の長さを有する、実施形態４、６、または７に記載のマウス。
９． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列が、配列番号６のヌクレオチド配列、または配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一性もしくは少なくとも９５％同一性を有する配列を含む、実施形態８に記載のマウス。
１０． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列が上記内因性スタスミン－２遺伝子座のイントロン領域中にある、実施形態４または６～９のいずれか１つに記載のマウス。
１１． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列が上記内因性スタスミン－２遺伝子座のエクソン１とエクソン２との間にある、実施形態１０に記載のマウス。
１２． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列がＴａｒ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）結合部位を含む、実施形態４または６～１１のいずれか１つに記載のマウス。
１３． 上記ヒトスタスミン－２エクソン２ａポリヌクレオチド配列が、ＴＤＰ－４３に結合しない改変型ＴＤＰ－４３結合部位を含む、実施形態４または６～１１のいずれか１つに記載のマウス。
１４． 実施形態１～１３のいずれか１つに記載のマウスに候補治療剤分子を投与する工程；および
当該マウスにおける改変された表現型についてアッセイする工程
を含む、方法。
１５． 上記候補治療剤分子がＳｔｍｎ２ ｍＲＮＡ前駆体の異常なスプライシングを遮断する、実施形態１４に記載の方法。
１６． 上記候補治療剤が、上記ヒトエクソン２ａポリヌクレオチド配列に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、実施形態１４または１５に記載の方法。
１７． 上記候補治療剤が小分子薬である、実施形態１４または１５に記載の方法。
１８． 上記表現型が行動表現型または病理学的表現型である、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９． 上記表現型が運動欠損である、実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０． 上記運動欠損が振戦、麻痺、異常歩行、または下肢の握り行動から選択される、実施形態１９に記載の方法。
２１． 上記運動欠損がオープンフィールド分析、握力分析、またはロータロッド分析によってアッセイされる、実施形態１９または２０に記載の方法。
２２． 上記表現型が認知欠損である、実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の方法。
２３． 上記表現型が運動ニューロン変性および／または神経筋脱神経である、実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の方法。
２４． 実施形態１～１３のいずれか１つに記載のマウスを作製する方法であって、上記核酸を上記マウスのゲノムに導入する工程を含む、方法。
【実施例】
【0085】
（実施例１．ノックインヒト化Ｓｔｍｎ２マウスの作製）
スタスミン－２がどのように神経機能に寄与するかを決定するため、およびＡＬＳおよびＦＴＤにおけるスタスミン－２レベルの回復に基づく治療アプローチを開発するために、当該分野は、ヒトにおいて当てはまることが実証されているとおり、スタスミン－２転写物のプロセシングがＴＤＰ－４３機能に依存的である、より忠実な動物モデルを必要する。本実施例において、スタスミン－２遺伝子のイントロン１の一部をヒト化したＡＬＳ／ＦＴＤマウスモデルを、作製した。このアプローチを使用して、種々のＡＬＳ／ＦＴＤモデルにおけるＴＤＰ－４３機能障害の程度を評価し得、異常なスタスミン－２ ｍＲＮＡプロセシングが神経変性に寄与するか否かを確立し得る。
スタスミン－２がどのように神経機能に寄与するかを決定するため、およびＡＬＳおよびＦＴＤにおけるスタスミン－２レベルの回復に基づく治療アプローチを開発するために、当該分野は、ヒトにおいて当てはまることが実証されているとおり、スタスミン－２転写物のプロセシングがＴＤＰ－４３機能に依存的である、より忠実な動物モデルを必要する。本実施例において、スタスミン－２遺伝子のイントロン１の一部をヒト化したＡＬＳ／ＦＴＤマウスモデルを、作製した。このアプローチを使用して、種々のＡＬＳ／ＦＴＤモデルにおけるＴＤＰ－４３機能障害の程度を評価し得、異常なスタスミン－２ ｍＲＮＡプロセシングが神経変性に寄与するか否かを確立し得る。
【0086】
上記のとおり、そのマウスＳｔｍｎ２遺伝子は、ヒトエクソン２ａの正確なホモログを含まない。しかし、それは、そのＳｔｍｎ２遺伝子のイントロン１内に、推定上の（しかし、使用されない）スプライス配列を含む偽エクソン２ａ領域を含むが、それは、ＴＤＰ－４３結合配列およびポリアデニル化シグナルの両方を欠く。ＴＤＰ－４３依存的な潜在的スプライシングおよび未成熟ポリアデニル化駆動性スタスミン－２喪失を再現する齧歯類モデルを作製するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、偽エクソン２ａを含むマウスイントロン１の４７９ヌクレオチド（ｎｔ）領域を、７５個の隣接塩基および９２個の隣接塩基とともに２２７塩基のヒトエクソン２ａを含む３９４ｎｔヒト配列で置換した（図２Ａ）。正確なゲノム編集を、ショートレンジおよびロングレンジのＰＣＲとその後の配列決定とによって確認した。その後、ヘテロ接合性ヒト化Ｓｔｍｎ２マウスおよびホモ接合性ヒト化Ｓｔｍｎ２マウス（本明細書においてＳｔｍｎ２Ｈｕｍ／＋およびＳｔｍｎ２Ｈｕｍ／Ｈｕｍと呼ぶ）の両方が生存可能であり繁殖能力があることを、決定した。これらのＳｔｍｎ２Ｈｕｍ／＋マウスに由来する培養した一次皮質ニューロンを使用して（図３Ａ）、ヒト化Ｓｔｍｎ２ ｍＲＮＡ前駆体のプロセシングがＴＤＰ－４３依存的であると確認した。実際、これらのヒト化一次ニューロンにおけるＴＤＰ－４３のＡＳＯ媒介性減少（図３Ｂ）は全長スタスミン－２ ｍＲＮＡの減少を誘発し（図３Ｃ）、潜在的スプライス部位およびポリアデニル化部位の両方が使用されて切断型Ｓｔｍｎ２ ｍＲＮＡが生成された（ここで、マウスエクソン１がスプライシングされてヒトエクソン２ａになった－図３Ｄ）。
【0087】
（実施例２．スタスミン－２ ｍＲＮＡ前駆体の潜在的スプライシング／ポリアデニル化の確認）
インビトロ予備結果は、内因性マウススタスミン－２遺伝子におけるヒトエクソン２ａ配列の挿入がスタスミン－２ ｍＲＮＡ前駆体プロセシングのＴＤＰ－４３依存性を効率的に再現することを強く支持するが、この結果を、Ｐ１ Ｓｔｍｎ２Ｈｕｍ／Ｈｕｍ仔においてＴＤＰ－４３ ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶ９のＩＣＶ注射を使用して、成体神経系で確認する。組織を注射の４週間後に採集して、イムノブロットおよび定量ＲＴ－ＰＣＲによってＴＤＰ－４３および全長スタスミン－２のＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを測定する。切断型エクソン２ａ含有Ｓｔｍｎ２ ＲＮＡの作製を、皮質、海馬および小脳から抽出したＲＮＡで評価する（１群当たりｎ＝６）。ＴＤＰ－４３のｓｈＲＮＡ媒介性減少の代替法は、成体マウスにおいてマウスＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを標的とするＡＳＯのＩＣＶ注射を使用することであり、これは、忍容性が良好であり中枢神経系におけるＴＤＰ－４３レベルを一時的に減少させると以前に報告された方法である。
インビトロ予備結果は、内因性マウススタスミン－２遺伝子におけるヒトエクソン２ａ配列の挿入がスタスミン－２ ｍＲＮＡ前駆体プロセシングのＴＤＰ－４３依存性を効率的に再現することを強く支持するが、この結果を、Ｐ１ Ｓｔｍｎ２Ｈｕｍ／Ｈｕｍ仔においてＴＤＰ－４３ ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶ９のＩＣＶ注射を使用して、成体神経系で確認する。組織を注射の４週間後に採集して、イムノブロットおよび定量ＲＴ－ＰＣＲによってＴＤＰ－４３および全長スタスミン－２のＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを測定する。切断型エクソン２ａ含有Ｓｔｍｎ２ ＲＮＡの作製を、皮質、海馬および小脳から抽出したＲＮＡで評価する（１群当たりｎ＝６）。ＴＤＰ－４３のｓｈＲＮＡ媒介性減少の代替法は、成体マウスにおいてマウスＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡを標的とするＡＳＯのＩＣＶ注射を使用することであり、これは、忍容性が良好であり中枢神経系におけるＴＤＰ－４３レベルを一時的に減少させると以前に報告された方法である。
【0088】
（実施例３．Ｓｔｍｎ２へのＴＤＰ－４３の結合を遮断すると、ヒト化エクソン２ａを含むマウス細胞においてＳｔｍｎ２の構成的ミススプライシングおよび減少を誘導する）
マウス内因性遺伝子におけるエクソン２ａをコードする領域のヒト化（図２Ａ）は、ＴＤＰ－４３減少の際に潜在的スプライシングを誘導した（図３Ａ～図３Ｄ）。しかし、そのような細胞系を越えての本質的確認は、哺乳動物神経系の真のインビボでの状況でスタスミン－２潜在的スプライシングを標的とする最も効率的なＡＳＯの同定を可能にすることである。このことを達成するために、スタスミン－２を標的とする薬物のインビボスクリーニングを、ＴＤＰ－４３破壊を必要としない構成的スタスミン－２ミススプライシングを含むマウスモデルによって促進する。このために、試験を実施して、ＴＤＰ－４３結合部位を変異させると、ヒト化エクソン２ａを保有するように操作したマウスＮ２ａ神経細胞においてスタスミン－２ミスプロセシングをもたらしたか否かを決定した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９操作アプローチを使用して、ＴＤＰ－４３によって結合された３つのＧＵモチーフを含む２４ヌクレオチドを、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）によって高親和性で結合されるＲＮＡステムループ構造を採用することが公知である１９ヌクレオチドＭＳ２アプタマー配列で置換した（図２Ｂ）。そのキメラヒト／マウス内因性スタスミン－２遺伝子の一方のアレルまたは両方のアレル中のＴＤＰ－４３結合部位を変異させると（図２Ｂ）、切断型スタスミン－２転写物の長期的生成（図４Ｂ）および全長スタスミン－２ ｍＲＮＡレベルの減少（図４Ａ）および全長スタスミン－２タンパク質レベルの減少（図４Ｃ）をもたらした。したがって、スタスミン－２ミスプロセシングを標的とする薬物の効率的なインビボ試験のための新規マウスモデルを、作製した。
マウス内因性遺伝子におけるエクソン２ａをコードする領域のヒト化（図２Ａ）は、ＴＤＰ－４３減少の際に潜在的スプライシングを誘導した（図３Ａ～図３Ｄ）。しかし、そのような細胞系を越えての本質的確認は、哺乳動物神経系の真のインビボでの状況でスタスミン－２潜在的スプライシングを標的とする最も効率的なＡＳＯの同定を可能にすることである。このことを達成するために、スタスミン－２を標的とする薬物のインビボスクリーニングを、ＴＤＰ－４３破壊を必要としない構成的スタスミン－２ミススプライシングを含むマウスモデルによって促進する。このために、試験を実施して、ＴＤＰ－４３結合部位を変異させると、ヒト化エクソン２ａを保有するように操作したマウスＮ２ａ神経細胞においてスタスミン－２ミスプロセシングをもたらしたか否かを決定した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９操作アプローチを使用して、ＴＤＰ－４３によって結合された３つのＧＵモチーフを含む２４ヌクレオチドを、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）によって高親和性で結合されるＲＮＡステムループ構造を採用することが公知である１９ヌクレオチドＭＳ２アプタマー配列で置換した（図２Ｂ）。そのキメラヒト／マウス内因性スタスミン－２遺伝子の一方のアレルまたは両方のアレル中のＴＤＰ－４３結合部位を変異させると（図２Ｂ）、切断型スタスミン－２転写物の長期的生成（図４Ｂ）および全長スタスミン－２ ｍＲＮＡレベルの減少（図４Ａ）および全長スタスミン－２タンパク質レベルの減少（図４Ｃ）をもたらした。したがって、スタスミン－２ミスプロセシングを標的とする薬物の効率的なインビボ試験のための新規マウスモデルを、作製した。
【0089】
３つのＴＤＰ－４３結合部位を含むエクソン２ａの２４塩基セグメントを１９塩基ＭＳ２結合部位で置換したヒト化スタスミン－２アレルを含む、マウスを作製した（図２Ｂ）。２匹の樹立系統を同定した。系統を現在増殖中である。これらを用いて、ヘテロ接合性マウスおよびホモ接合性マウス（Ｓｔｍｎ２Ｈｕｍ－ΔＧＵ／＋およびＳｔｍｎ２Ｈｕｍ－ΔＧＵ／Ｈｕｍ－ΔＧＵ）の生存能力を決定し、その後、ＲＮＡおよびタンパク質を１月齢動物の種々の脳領域から抽出して（１群当たりｎ＝５、両方の性別）、Ｎ２ａ細胞において観察される（図４Ａ～図４Ｃ）とおり、スタスミン－２がＴＤＰ－４３機能とは無関係にミスプロセシングされるか否かを決定する。
【0090】
本明細書において開示されているすべての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して参照により援用され、一部の場合では、それはその文書の全体を含み得る。
【0091】
本明細書および特許請求の範囲において文書中で使用される不定冠詞「ある（１つの）（ａ）」および「ある（１つの）（ａｎ）」は、特に反対の明示がなければ、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【0092】
特に反対の明示がなければ、本文書において特許請求される１つよりも多い工程または動作を含むあらゆる方法において、その方法の工程または動作の順序は、その方法の工程または動作が記載されている順序には必ずしも限定されないこともまた、理解されるべきである。
【0093】
特許請求の範囲ならびに上記の本明細書において、すべての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などは、非限定的であり、すなわち、含むが、それらに限定されないことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」および「から本質的になる」のみは、米国特許庁の特許審査手続きのマニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）のセクション２１１１．０３に示されるとおり、それぞれ、限定的移行句または半限定的移行句である。
【0094】
数値の前にある用語「約」および「実質的に」は、記載された数値の±１０％を意味する。
【0095】
一定範囲の値が提供される場合、その範囲の上端と下端との間（上端および下端を含む）の各値が、本出願において具体的に企図され記載されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】