特表 2024-539462 機能性ヒト神経組織を印刷するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】機能性ヒト神経組織を印刷するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0793 20100101AFI20241018BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20241018BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0793

C12Q1/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024529904

(86)(22)【出願日】2022-11-18

(85)【翻訳文提出日】2024-07-22

(86)【国際出願番号】 US2022050433

(87)【国際公開番号】W WO2023091681

(87)【国際公開日】2023-05-25

(31)【優先権主張番号】63/280,886

(32)【優先日】2021-11-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591013274

【氏名又は名称】ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション

(71)【出願人】

【識別番号】524189845

【氏名又は名称】チャン ス－チュン

(71)【出願人】

【識別番号】524189856

【氏名又は名称】ヤン ユアンウェイ

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】チャン ス－チュン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ユアンウェイ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QQ61

4B063QQ79

4B063QR66

4B063QR72

4B063QS28

4B063QS32

4B063QS36

4B063QX02

4B065AA93X

4B065AB01

4B065BC46

4B065BD22

4B065BD39

4B065BD44

4B065BD50

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

本開示は、概して、神経組織構築物を調製するための方法及び組成物に関する。特に、本明細書には、グルタミン酸作動性皮質前駆細胞、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞、及びバイオインクを使用して神経組織構築物を生成するための方法が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経組織構築物を生成する方法であって、
（ａ） 好適な表面上に、混合物を含むバンドをバイオプリントすることによって水平堆積させる工程であって、前記混合物が、
（ｉ）グルタミン酸作動性皮質前駆細胞、
（ｉｉ）ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞、及び
（ｉｉｉ）バイオインク、を含む工程と、
（ｂ） （ａ）の堆積工程を複数回繰り返して、複数のバンドを形成する工程と、
（ｃ） 前記細胞が神経組織構築物を形成することを可能にするために、前記堆積した複数のバンドを成熟させる工程と、を含む、方法。

【請求項2】

前記バイオインクが、ヒドロゲル及びヒアルロン酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ヒドロゲルが、フィブリノーゲン及びトロンビンを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ヒドロゲルが、プロテアーゼ阻害剤を更に含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ヒドロゲルが、前記堆積工程の各々の後に架橋剤を使用して架橋される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記架橋剤が、緩衝液ＣａＣｌ₂、トロンビン、及びトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記複数のバンドが、物理的に分離されている、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記複数のバンドの各々が、約５０μｍの水平方向の厚さを有する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記グルタミン酸作動性皮質前駆細胞及び前記ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞が、４：１の比率で前記混合物中に存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記グルタミン酸作動性皮質神経前駆細胞が、２１日目のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性皮質神経前駆細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞が、２１日目のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来のＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記混合物が、星状細胞前駆細胞を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記グルタミン酸作動性皮質前駆細胞、前記ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞、及び前記星状細胞前駆細胞が、５：１：４の比率で前記混合物中に存在する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記混合物が、ミクログリア細胞を更に含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記神経組織構築物が、機能的ニューラルネットワークを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記機能的ニューラルネットワークが、約２週間～約４週間以内に形成される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記神経組織構築物が、機能的神経グリアネットワークを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項18】

前記機能的神経グリアネットワークが、約２週間～約４週間以内に形成される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記成熟が、２％Ｂ－２７、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＲＯＣＫ阻害剤、又はγ－セクレターゼ及びノッチ経路阻害剤のうちの少なくとも一つを含む神経基本培地中で起こる、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

請求項１に記載の方法によって作製される神経組織構築物。

【請求項21】

試験剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ） 請求項１に記載の神経組織構築物上に試験剤を堆積させる工程と、
（ｂ） 前記接触した神経組織構築物の機能的パラメータを測定する工程と、
（ｃ） 前記機能的パラメータを、前記試験剤と接触していない神経組織構築物で測定されたパラメータと比較する工程であって、前記試験剤と接触した後の前記機能的パラメータの調節が、前記試験剤が候補治療薬であることを示す、工程と、を含む、方法。

【請求項22】

前記試験剤が、（ｉ）有機化合物、（ｉｉ）核酸、（ｉｉｉ）ペプチド、（ｉｉｉ）ポリペプチド、又は（ｉｖ）抗体である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記神経組織構築物が、ＤＡＲＰＰ３２⁺線条体中型有棘神経細胞を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記神経組織構築物中の皮質ニューロンが、ＣｈＲ２－ＥＹＦＰを発現し、線条体ニューロンが、赤色カルシウム指示薬ｊＲＧＥＣＯ１ｂを発現する、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

請求項２３に記載の方法によって作製される神経組織構築物。

【請求項26】

前記神経組織構築物の前記細胞が、前記試験剤に応答する検出可能なマーカーを発現する、請求項２１に記載の方法。

【請求項27】

前記検出可能なマーカーが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＣｈＲ２－ＥＹＦＰ、又は赤色カルシウム指示薬ｊＲＧＥＣＯ１ｂを含むがこれらに限定されない、請求項２６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年１１月１８日出願の米国仮特許出願第６３／２８０，８８６号に対する優先権を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0002】

コンピュータ可読フォームは、電子提出によって本出願とともに出願され、その全体が参照により本出願に組み込まれる。コンピュータ可読フォームは、ファイル名「Ｍｕｓｃｌｅ＿Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ１．ａｖｉ」で、サイズが１２２メガバイトである２０２２年１１月１７日に作成された第一のファイル、及びファイル名「Ｍｕｓｃｌｅ＿Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ２．ａｖｉ」で、サイズが８８メガバイトである２０２２年１１月１７日に作成された第二のファイルに含まれる。

【0003】

本開示は、概して、神経組織構築物を調製するための方法及び組成物、特に機能的連結性を有する脳領域特異的組織を作製するための方法に関する。

【背景技術】

【0004】

ヒト脳は、特殊な神経細胞及びグリア細胞によって形成され、これは記憶、意識、言語、及び思考を含む基本的な機能のためのニューラルネットワークを形成する。神経グリアネットワークの研究は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を含む神経学的疾患を探索するために不可欠である。

【0005】

従来、このような研究は、生きているヒト神経組織の信頼できるモデルの欠如が原因で困難であることが証明されてきた。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から生成される脳オルガノイドは、潜在的な解決策を提示する。しかしながら、オルガノイドにおける機能的ニューラルネットワークの形成には、多くの場合、数か月、場合によっては１年以上かかり、アセンブロイド間で形成される回路は、これまでのところランダムに位置付けられている。オルガノイド系を相補する潜在的な方法は、３Ｄバイオプリンティングであり、これにより、生細胞及びヒドロゲルの堆積を空間的に制御することによってヒト組織の組み立てが可能になり、生物学的に複雑な細胞構築を生成する。神経組織の印刷が探索されているが、印刷された組織は機能的ニューロンネットワークを示さない。

【0006】

したがって、当技術分野において、ニューロンサブタイプ及びグリアサブタイプを含み、ニューロン間、並びにその中のニューロンとグリアとの間に機能的ネットワークを形成する、神経組織を迅速かつ確実に組み立てるためのプラットフォームを生成するための試薬及び方法に対するニーズが依然として存在する。

【発明の概要】

【0007】

本開示は、ニューロン間、及びニューロンとグリアとの間に、急速に、すなわち、数週間以内に機能的ネットワークを形成するニューロンサブタイプ及びグリアサブタイプを含む神経組織を組み立てるための試薬及び方法を記載する。本開示は、神経組織構築物を調製するための方法及び組成物を提供し、特に、機能的結合性を有する脳領域特異的組織を作製するための方法及び組成物を提供する。特に、本明細書には、グルタミン酸作動性皮質前駆細胞、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞、及びバイオインクを使用して神経組織構築物を生成するための方法が提供される。本発明は更に、アレキサンダー病（ＡｘＤ）及び他の神経変性障害に対するヒトニューラルネットワークをモデル化し、ＡｘＤ及び他の神経変性障害に対する治療剤をスクリーニングするための治療方法を提供する。

【0008】

本明細書は、神経組織構築物を生成する方法であって、
（ａ）好適な表面上に、混合物を含むバンドをバイオプリントすることによって水平に堆積させることであって、混合物は、
（ｉ） グルタミン酸作動性皮質前駆細胞、
（ｉｉ） ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞、及び
（ｉｉｉ） バイオインク、を含み、
（ｂ） （ａ）の堆積工程を複数回繰り返して、複数のバンドを形成することと、
（ｃ） 細胞が神経組織構築物を形成することを可能にするために、堆積した複数のバンドを成熟させることと、を含む、方法を提供する。

【0009】

また、本明細書は、試験剤をスクリーニングする方法が提供しており、方法は、（ａ）本明細書に開示される神経組織構築物上に試験剤を堆積させることと、（ｂ）接触した神経組織構築物の機能的パラメータを測定することと、（ｃ）機能的パラメータを、試験剤と接触していない神経組織構築物で測定されたパラメータと比較することと、を含み、試験剤との接触後の機能的パラメータの調節は、試験剤が候補治療薬であることを示す。

【0010】

本発明のこれら及びその他の特徴、目的、利点は、以下の説明からより良く理解されるであろう。説明において、添付図面への参照がなされ、添付図面は本明細書の一部を形成し、添付図面において本発明の実施形態が、限定ではなく例示として示されている。好ましい実施形態の説明は、本発明を限定することを意図するものではなく、すべての変更、均等物、代替物を網羅する。従って、本発明の範囲を解釈するためには、本明細書に列挙される特許請求の範囲を参照すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１Ａ～１Ｂは、２１日目のｈＰＳＣからの分化皮質前駆細胞についての神経マーカーＦＯＸＧ１及びＰＡＸ６の免疫蛍光及び定量化を示す。

【図2】図２Ａ～２Ｂは、２１日目のｈＰＳＣからの分化ＧＡＢＡ介在ニューロン前駆細胞に対するマーカーＮＫＸ２．１及びＧＡＢＡの免疫蛍光及び定量化を示す。

【図3】図３Ａ～３Ｂは、ｈＰＳＣからの分化星状細胞前駆細胞に対するマーカーＳ１００β及びＧＦＡＰの免疫蛍光及び定量化を示す。

【図4】図４は、フィブリノーゲン及びトロンビンの異なる組成物のゲル化時間を示す。一定濃度のフィブリノゲン（５又は２．５ｍｇ／ｍＬ）では、ゲル化時間は、トロンビンのレベルの増加と共に減少した。０．５Ｕトロンビンでは、ゲル化時間もフィブリノーゲン濃度の増加と共に減少した。

【図5】図５は、フィブリンゲル中の培養神経前駆細胞（ＮＰＣ）の設計を概説する概略図を示す。

【図6A】図６Ａ～６Ｅは、異なる濃度のフィブリンゲルで増殖するＮＰＣを示す。図６Ａは、１Ｕで固定トロンビン濃度を有する異なる濃度のフィブリノーゲン（２．５、５、１０ｍｇ／ｍＬ）での細胞増殖、及び２．５ｍｇ／ｍＬで固定フィブリノーゲン濃度を有する異なる濃度のトロンビン（１、５、１０Ｕ／ｍＬ）での細胞増殖の明相画像を示す。

【図6B】図６Ｂは、異なる濃度のフィブリノゲン及びトロンビンでの神経系細胞増殖の細胞生存率（生細胞の割合）を示す（一元配置分散分析、相互作用Ｆ（４、３８）＝２９．２５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、相互作用Ｆ（２、２４）＝１１．３２、＊＊Ｐ＜０．０１、独立ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５）。

【図6C】図６Ｃは、異なる濃度のフィブリノゲン及びトロンビンでの神経系細胞増殖の細胞生存率（生細胞の割合）を示す（一元配置分散分析、相互作用Ｆ（４、３８）＝２９．２５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、相互作用Ｆ（２、２４）＝１１．３２、＊＊Ｐ＜０．０１、独立ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５）。

【図6D】図６Ｄは、６時間７日目にフィブリンゲル中で増殖した神経細胞の生きた染色及び死んだ染色（緑色：「生きた染色」、赤色：「死んだ染色」）を示す。

【図6E】図６Ｅは、異なる時点（ｎ＝９又は１０）での神経細胞の生存率（生細胞の割合）を示す。

【図7A】図７Ａ～７Ｂは、フィブリンゲル中で成長したＮＰＣを示す。図７Ａは、１か月の時点でのフィブリンゲル中で成長したＮＰＣの明相画像を示す。

【図7B】図７Ｂは、ゲル中の４日目の神経マーカーＴＵＪ１、ＯＴＸ２、及びＭＡＰ２の免疫染色を示す。Ｈｏｅ： Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２．

【図8A】図８Ａ～８Ｆは、フィブリンヒドロゲル中でのヒト神経細胞の生存及び分化を示す。図８Ａは、ニューロンが錐体の形態を有し、ゲル中で１か月増殖した後、ＧＦＰによって明らかにされた樹状構造を形成したことを示す。

【図8B】図８Ｂは、３９日目の神経マーカーＭＡＰ２及びＮｅｕＮの免疫染色を示す。

【図8C】図８Ｃは、フィブリンゲル中での４日目、１９日目及び３９日目のＴＵＪ１、ＭＡＰ２、及びＮｅｕＮ（ｎ＝１０）の発現の定量分析を示す。ＴＵＪ１、４日目対１９日目、多重ｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１、４日目対３９日目、多重ｔ検定、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ＭＡＰ２、４日目対１９日目、多重ｔ検定、＊＊＊ Ｐ ＜ ０．００１、４日目対３９日目、多重ｔ検定、＊＊＊＊ Ｐ ＜ ０．０００１。ＮｅｕＮ、４日目対１９日目、多重ｔ検定、＊＊＊ Ｐ ＜ ０．００１；４日目対３９日目、多重ｔ検定、＊＊＊＊ Ｐ ＜ ０．０００１。

【図8D】図８Ｄは、ゲル中での４０日目にＭＡＰ２を有する樹状突起棘マーカーであるドレブリンの免疫染色を示す。

【図8E】図８Ｅは、フィブリンゲル中での３５日目にＴＵＪ１又はＭＡＰ２を有するシナプスｖＧｌｕｔ１、ＳＹＮ１の免疫染色を示す。

【図8F】図８Ｆは、フィブリンゲル中での３５日目にＴＵＪ１又はＭＡＰ２を有するシナプスｖＧｌｕｔ１、ＳＹＮ１の免疫染色を示す。Ｈｏｅ： Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２． スケールバー、２００μｍ（ｃ）、２０μｍ（ｉ）、１０μｍ（ｈ、ｊ）。

【図9】図９は、本明細書に開示される印刷プロセスの設計を示す概略図である。

【図10A】図１０Ａ～１０Ｅは、本明細書に開示される方法に従って生成された印刷構造を示す。図１０Ａは、２４ウェルプレート内の試験用バイオインクを使用した印刷構造（５×２．５×０．５ｍｍ）の概要を示す。

【図10B】図１０Ｂは、印刷の７日後に緑色－赤色の層状パターンを有する印刷された神経組織を示す。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、単量体赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ及びＭＡＰ２の免疫染色である。

【図10C】図１０Ｃは、ヒアルロン酸及びフィブリンゲルをバイオインクとして使用した印刷された層の明相画像を示す。

【図10D】図１０Ｄは、印刷後７日目にＭＡＰ２染色を用いたＧＦＰ⁺層及びＧＦＰ^-層の免疫染色を示す。

【図10E】図１０Ｅは、２層にわたるＳＹＮ１の免疫染色を示す。Ｄａｆ、フィブリンゲル中での成長後の日数。Ｈｏｅ： Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２．

【図11】図１１は、印刷された神経組織の３Ｄ再構成を示す。印刷された神経組織の３Ｄ画像（印刷後２０日）を、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＭＡＰ２について染色した。挿入図は、右側に分割チャネル、下部に３Ｄ再構成ビューで拡大されている。Ｈｏｅ： Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２．

【図12A】図１２Ａ～１２Ｂは、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン及びグルタミン酸ニューロンの印刷された組織への組み込みを示す。図１２Ａは、実施例１に開示された実験の設計を示す概略図である。

【図12B】図１２Ｂは、印刷の３日後のＧＡＢＡ及びＭＡＰ２を用いた組織の免疫染色を示す。スケールバーは１００μｍ、Ｈｏｅ： Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２．

【図13A】図１３Ａ～１３Ｂは、印刷された組織のシナプス形成を示す。図１３Ａは、印刷後２０日目のＳＹＮ１及びＰＳＤ９５点に対する皮質及びＭＧＥ前駆細胞を有する印刷された組織の免疫染色を示す。

【図13B】図１３Ｂは、印刷後３０日目にＭＡＰ２を用いたシナプスマーカーＳＹＮ１、ｖＧＡＴ及びＰＳＤ９５の免疫染色を示す。

【図14A】図１４Ａ～１４Ｆは、印刷された組織の電気生理学的記録を示す。図１４Ａは、印刷された組織の電気生理学的記録を示す概略図である。

【図14B】図１４Ｂは、２１日目のＧｌｕｔ及びＧＡＢＡニューロンが組み込まれた印刷された組織からのグルタミン酸皮質細胞の自発的活動電位（ｓＡＰ）を示す。

【図14C】図１４Ｃは、印刷後５週時点での、Ｇｌｕｔニューロンのみ又はＧｌｕｔ及びＧＡＢＡ（Ｇｌｕｔ＋ＧＡＢＡ）組織を有する組織におけるグルタミン酸作動性ニューロンから記録された増殖した潜在的幹細胞（ＥＰＳＣ）の代表的なトレースを示す。

【図14D】図１４Ｄは、印刷の５週間後の異なる群についてのＥＰＳＣ頻度の定量分析を示す（ｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１）。

【図14E】図１４Ｅは、印刷後５週時点でのＧｌｕｔニューロンのみ又はＧｌｕｔ及びＧＡＢＡニューロン（Ｇｌｕｔ＋ＧＡＢＡ）を有する印刷された組織におけるグルタミン酸作動性ニューロンから記録されたＩＰＳＣの代表的なトレースを示す。

【図14F】図１４Ｆは、印刷の５週間後の異なる群についてのＩＰＳＣ頻度の定量分析を示す（ｔ検定、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。

【図15A】図１５Ａ～１５Ｂは、印刷された組織におけるニューロンの成熟を示す。図１５Ａは、印刷後３０日目のＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ及びＭＡＰ２の印刷された組織の免疫染色を示す。

【図15B】図１５Ｂは、ニューロンの９０％超がＮｅｕＮ⁺であることを示したＮｅｕＮ発現の定量分析を示す。

【図16A】図１６Ａ～１６Ｇは、ニューロン及び星状細胞の印刷された組織への組み込みを示す。図１６Ａは、実施例１に開示された実験の設計を示す概略図である。

【図16B】図１６Ｂは、ＧＦＡＰ及びＭＡＰ２の組織の免疫染色を示す（印刷の３日後）。

【図16C】図１６Ｃは、印刷後６０日目のＧＦＡＰ及びＭＡＰ２の印刷された組織における星状細胞及びニューロンの免疫染色を示す。

【図16D】図１６Ｄは、６０日目の印刷された組織におけるＧＦＡＰの染色を伴う星状細胞の３Ｄ形態を示す。

【図16E】図１６Ｅは、６０日目のＧＬＴ－１及びＧＦＡＰを用いた組織の免疫染色を示す。

【図16F】図１６Ｆは、印刷後３０日目のＧＦＰ－ＧＣａＭＰ６及びｍＣｈｅｒｒｙの免疫染色を示す。

【図16G】図１６Ｇは、ｆからの３Ｄイメージングを示す。Ｈｏｅ： Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２． スケールバー、１００μｍ（ｂ）、１０μｍ（ｄ）。

【図17A】図１７Ａ～１７Ｈは、印刷された組織のカルシウム及びグルタミン酸塩のライブイメージングを示す。図１７Ａは、ニューロン及び星状細胞を有する印刷された組織のカルシウムイメージングを示す概略図である。ニューロンはｍＣｈｅｒｒｙ標識化され、星状細胞は印刷前にＧＣａＭＰ６に感染した。

【図17B】図１７Ｂは、高濃度のＫＣｌ溶液を用いた刺激に応答する印刷された組織中の細胞を示す。

【図17C】図１７Ｃは、ＧＣａＭＰ６イメージングの代表的なトレースを示す。ＲＯＩ１～６はＧＣａＭＰ６－星状細胞を示し、ＲＯＩ７、８はｍＣｈｅｒｒｙ－ニューロンを示した。ＲＯＩ、関心領域。

【図17D】図１７Ｄは、印刷後２週、４週、及び６週での組織におけるΔＦ／Ｆの総ＧＣａＭＰ６振幅を示す（一元配置分散分析、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。

【図17E】図１７Ｅは、ニューロン及び星状細胞を用いた印刷された組織のグルタミン酸イメージングを示す概略図である。ニューロンはｍＣｈｅｒｒｙ標識され、星状細胞は印刷前にｉＧｌｕＳｎＦＲに感染させた。

【図17F】図１７Ｆは、高濃度ＫＣｌ溶液を用いた刺激に応答する印刷された組織中の細胞を示す。

【図17G】図１７Ｇは、ｉＧｌｕＳｎＦＲ撮像の代表的なトレースを示す。ＲＯＩ１－５は、ｉＧｌｕＳｎＦＲ－星状細胞を示した。

【図17H】図１７Ｈは、印刷後２週及び４週での組織におけるΔＦ／Ｆの総ｉＧｌｕＳｎＦＲ振幅を示す（ｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１）。

【図18A】図１８Ａ～１８Ｅは、アレキサンダー病（ＡｘＤ）における３Ｄ印刷の適用を示す。図１８Ａは、実施例２に開示された実験の設計を示す概略図である。

【図18B】図１８Ｂは、ＧＦＡＰの対照組織及びＡｘＤ組織の免疫染色を示し、印刷後６０日目のＧＦＡＰ繊維の凝集を示す。白色の三角形は、ＧＦＡＰ凝集体を示す。

【図18C】図１８Ｃは、印刷後２０日目のＧＬＴ－１、ＧＦＡＰ、及びＭＡＰ２の対照組織及びＡｘＤ組織の免疫染色を示す。

【図18D】図１８Ｄは、ＳＹＮ１、ＧＦＡＰ及びＭＡＰ２（印刷後３０日）の組織の免疫染色を示す。

【図18E】図１８Ｅは、ＳＹＮ１点密度の定量分析を示す（ｔ検定、＊＊＊＊Ｐ ＜ ０．０００１）。Ｈｏｅ： Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２． スケールバー、５μｍ（ｂ）、２０μｍ（ｄ）、５０μｍ（ｃ）。

【図19A】図１９Ａ～１９Ｇは、モデル化アレキサンダー病における機能的特徴を示す。図１９Ａは、ＡｘＤモデルの印刷された組織のカルシウムイメージングを示す概略図である。健康なニューロンをｍＣｈｅｒｒｙ標識し、ＡｘＤ又は対照星状細胞を印刷前にＧＣａＭＰ６に感染させた。

【図19B】図１９Ｂは、対照及びＡｘＤからのＧＣａＭＰ６シグナルのΔＦ／Ｆを示すヒートマップである。

【図19C】図１９Ｃは、対照組織及びＡｘＤ組織における経時的なΔＦ／Ｆの総ＧＣａＭＰ６振幅を示す（多重ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【図19D】図１９Ｄは、ＡｘＤモデルの印刷された組織のグルタミン酸撮像を示す概略図である。健康なニューロンをｍＣｈｅｒｒｙ標識し、ＡｘＤ又は対照星状細胞を印刷前にｉＧｌｕＳｎＦＲに感染させた。

【図19E】図１９Ｅは、高濃度ＫＣｌ溶液を用いた刺激に応答する印刷された組織中の細胞を示す。

【図19F】図１９Ｆは、対照組織及びＡｘＤ組織からのｉＧｌｕＳｎＦＲ変化（ΔＦ／Ｆ）の代表的なトレースを示す。

【図19G】図１９Ｇは、印刷後２週及び４週での対照組織及びＡｘＤ組織におけるΔＦ／Ｆの総ｉＧｌｕＳｎＦＲ振幅を示す（多重ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。スケールバーは１００μｍである。

【図20】図２０は、印刷された組織におけるニューロン、星状細胞、及びミクログリアの組み込みを示す。Ｉｂａ１、ＧＦＡＰ、及びＭＡＰ２の免疫染色は、印刷３日後に印刷された組織内のニューロン、星状細胞、及びミクログリアの存在を示す。

【図21】図２１は、ヒトＰＳＣから産生された分化型線条体前駆細胞からの免疫蛍光マーカーＤＡＲＰＰ３２、ＧＡＢＡ、及びＧＡＤ６７を示す顕微鏡写真を示す。

【図22A】図２２Ａ及び２２Ｂは、印刷された皮質線条体組織の特徴付けを示す顕微鏡写真である。図２２Ａは、印刷５日後のＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＤＡＲＰＰ３２染色について印刷された皮質線条体組織の代表的な画像を示すが、

【図22B】図２２Ｂは、印刷２週間後のＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＭＡＰ２について印刷された組織の免疫染色を示す。

【図23A】図２３Ａ、２３Ｂ、及び２３Ｃは、皮質線条体組織の印刷の計画及び実行を図示する。図２３Ａは、皮質－線条体組織を印刷するための実験設計を示す概略図である。

【図23B】図２３Ｂは、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの組織の免疫染色を示し、印刷後１５日での印刷された皮質線条体層の存在を示す（スケールバー、１００μｍ）。

【図23C】図２３Ｃは、皮質－線条体層の境界を横切る神経突起の存在を示し、矢印は、印刷後２１日でのＧＦＰ⁺皮質神経突起とｍＣｈｅｒｒｙ⁺線条体ニューロンとの間の接触を示す。Ｈｏｅ， Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２．

【図24A】図２４Ａ～図２４Ｅは、印刷された皮質線条体組織のカルシウムイメージングを示す。図２４Ａは、皮質ニューロン及び線条体ニューロンを有する印刷された組織のカルシウムイメージングを示す概略図である。皮質ニューロンはＣｈＲ２細胞であり、線条体ニューロンは非着色であり、印刷前にレンチウイルス－ｊＲＧＥＣＯ１ｂに感染させた。

【図24B】図２４Ｂは、光刺激に応答する印刷された組織（印刷後２週間）の顕微鏡写真であり、刺激前後のｊＲＧＥＣＯ１ｂシグナル（赤色）の変化を示す。

【図24C】図２４Ｃは、二つの関心領域からのカルシウムイメージングの代表的なトレースを示す。ＲＯＩ、関心領域。

【図24D】図２４Ｄは、これらの実験で得られたカルシウムイメージングの総トレースを示す。

【図24E】図２４Ｅは、光刺激後の組織におけるΔＦ／Ｆの総ｊＲＧＥＣＯ１ｂ振幅を示す（５つの異なるバッチからの２１個のサンプル）。

【図25A】図２５Ａ～図２５Ｆは、印刷された皮質線条体組織の機能的特徴を示す。図２５Ａは、印刷された皮質－線条体組織における光遺伝学的活性化を伴う全細胞パッチクランプ記録を示す概略図である。皮質ニューロンはＣｈＲ２細胞であり、線条体ニューロンはｍＣｈｅｒｒｙ標識化された。

【図25B】図２５Ｂは、光刺激によって印刷された組織内の線条体ニューロンの自然活動電位、ＥＰＳＰ、及びＥＰＳＣの代表的な電気生理学的トレースである。

【図25C】図２５Ｃは、光刺激によって印刷された組織内の線条体ニューロンの自然活動電位、ＥＰＳＰ、及びＥＰＳＣの代表的な電気生理学的トレースである。

【図25D】図２５Ｄは、光刺激によって印刷された組織内の線条体ニューロンの自然活動電位、ＥＰＳＰ、及びＥＰＳＣの代表的な電気生理学的トレースである。

【図25E】図２５Ｅは、ＥＰＳＣ記録に対する光刺激を有する応答性の細胞の割合を示す。

【図25F】図２５Ｆは、光刺激の前、間、及び後のＥＰＳＣ頻度の定量分析を示す棒グラフである（対応ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（三つの異なるバッチからのニューロン）。

【図26】図２６は、依然として、印刷された皮質－筋肉組織の収縮を示すビデオ録画からのフレームである。印刷後３０日目における印刷された筋組織における筋細胞収縮の時間経過。赤い矢印は、筋細胞の動きを示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本開示は、概して、神経組織構築物を調製するための方法及び組成物に関する。特に、本明細書には、グルタミン酸作動性皮質前駆細胞、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞、及びバイオインクを使用して神経組織構築物を生成するための方法が提供される。これらの神経組織構築物は、ニューラルネットワークの配線の理解、病理学的プロセスのモデル化、及び薬物試験のためのプラットフォームとしての役割を果たすのに有用である。

【0013】

特許及び特許出願を含むがしかしこれに限定されない、本明細書に引用されるすべての出版物は、本出願にその全体が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0014】

本開示の原理の理解を促進する目的で、ここで実施形態を参照し、特定の言語を使用してそれを説明する。それにもかかわらず、本開示の範囲を制限することは意図されず、本明細書に例示されるように、本開示のこうした変更及びさらなる修正は、本開示が関連する当業者に通常起こるであろうように企図されることが理解されるであろう。

【0015】

定義
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的な目的語のうちの一つ又は二つ以上（すなわち、少なくとも一つ）を指すために使用される。一例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、少なくとも１つの要素を意味し、２つ以上の要素を含むことができる。

【0016】

「約」は、所与の値が、所望の結果に影響を与えることなく、エンドポイントを「わずかに上回る」又は「わずかに下回る」ことができることを提供することによって、数値範囲のエンドポイントに柔軟性を提供するために使用される。数値と関連した「約」という用語は、数値が数値の±５％以内で変化し得ることを意味する。

【0017】

本明細書全体を通して、文脈が別途必要としない限り、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語、並びに変形（例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」）は、記載された構成要素、特徴、要素、又は構成要素、特徴、要素、又はステップのうちのステップもしくはグループを含めることを意味するが、任意の他の整数、又は整数又はステップのうちのステップもしくはグループを除外するものではないことが理解されるであろう。

【0018】

本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、関連する列挙された品目のうちの一つ又は複数の可能性のあるあらゆる組み合わせだけでなく、代替（「又は」）で解釈される組み合わせの欠如を意味するとともに、それを包含する。

【0019】

本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書に別段の示唆がない限り、その範囲内に収まる各別個の値に個別に言及する簡潔な方法として機能することが単に意図されているだけである。更に、各別個の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。例えば、範囲が１～５０として記載される場合、２～４、１０～３０、又は１～３などの値が本開示で明示的に列挙されることが意図される。これらは、具体的に意図されているものの例に過ぎず、列挙された最低値と最高値との間の数値の全ての可能な組み合わせは、本開示に明示的に記載されるとみなされるべきである。

【0020】

「接触」という用語は、少なくとも一つの物質の別の物質への物理的な接触を含む。

【0021】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0022】

特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、神経組織構築物を生成する方法であって、
（ａ） 好適な表面上に、混合物を含むバンドをバイオプリントすることによって水平に堆積させることであって、混合物は、
（ｉ） グルタミン酸作動性皮質前駆細胞、
（ｉｉ） ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞、及び
（ｉｉｉ） バイオインク、を含み、
（ｂ） （ａ）の堆積工程を複数回繰り返して、複数のバンドを形成することと、
（ｃ）細胞が神経組織構築物を形成することを可能にするために、堆積した複数のバンドを成熟させることと、を含む、方法を提供する。

【0023】

本明細書で使用される場合、「バイオインク」は、バイオプリンティングで使用するための液体、半固体、又は固体組成物を意味する。一部の実施形態では、バイオインクは、押出成形化合物（すなわち、バイオインクの押出成形特性を修正する化合物）を含む。押出成形化合物の例としては、ゲル、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸系ゲル、界面活性剤ポリオール（例えば、プルロニック(登録商標)Ｆ－１２７又はＰＦ－１２７）、熱応答性ポリマー、ヒアルロン酸、アルギン酸、細胞外基質成分（及びその誘導体）、コラーゲン、ゼラチン、他の生体適合性天然又は合成ポリマー、ナノファイバー、及び自己組織化ナノファイバーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0024】

一部の実施形態では、バイオインクは、ヒドロゲル及びヒアルロン酸を含む。適切なヒドロゲルには、フィブリノーゲン、コラーゲン、ヒアルロン酸、ヒアルロナン、フィブリン、トロンビン、アルギン酸、アガロース、キトサン、及びそれらの組み合わせに由来するものが含まれる。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、フィブリノーゲン及びトロンビンを含む。特定の実施形態では、ヒドロゲルは、２．５ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン及び０．５Ｕのトロンビンを含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、セリン阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤を更に含む。特定の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、いくつかのセリンプロテアーゼ、具体的にはトリプシン、キモトリプシン、及びプラスミンを阻害するアプロチニンである。

【0026】

特定の実施形態では、前駆細胞は、約１×１０⁶／ｍＬ、約１×１０⁷／ｍＬ、約１×１０⁸／ｍＬ、又は約１×１０⁹／ｍＬの密度でヒドロゲル及びヒアルロン酸と混合される。

【0027】

いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、架橋可能な構成要素を含む。例えば、いくつかの実施形態では、好適なヒドロゲルは、フィブリノーゲン含有の架橋可能なヒドロゲルを含む。様々な実施形態では、好適なヒドロゲルは、約０．１、０．５、１、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、又はそれ以上のパーセントのフィブリノゲンを含む。様々な実施形態では、好適なヒドロゲルは、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０パーセント以上のフィブリノゲンを含む。一部の実施形態では、バイオプリンティング後、構築物は、ＣａＣｌ₂、トロンビン、及びトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）を含む溶液などのヒドロゲルを化学的に架橋するために、薬剤と共にインキュベートされる。

【0028】

本明細書で使用される場合、バイオプリントとは、自動又は半自動のコンピュータ支援三次元プロトタイピング装置（例えば、バイオプリンター）と互換性のある方法論を介して、前駆細胞及びバイオインクを含む混合物の正確な堆積を利用することを意味する。

【0029】

一部の実施形態では、複数のバンドが、好適な表面上に互いに隣り合ってバイオプリントされて、神経組織構築物を形成する。様々な実施形態では、２層、３層、４層、５層、６層、７層、８層、９層、１０層、１１層、１２層、１３層、１４層、１５層、又はそれ以上の層がバイオプリントされて、神経組織構築物を形成する。

【0030】

特定の実施形態では、バンドは、５０００（Ｌ）×５００（Ｗ）×５０（Ｈ）μｍの寸法で一度に一つの層が水平に印刷される。典型的には、混合物の帯は、約１００μｍ以下、約７５μｍ以下、約５０μｍｃｍ以下の水平厚さを有する。特定の実施形態では、バンドは水平方向に約５０μｍの厚さを有する。

【0031】

本明細書で使用される場合、「好適な表面」とは、神経前駆細胞の付着、移動、増殖、及び／又は成熟を支持する表面を指す。

【0032】

特定の実施形態では、複数のバンドは物理的に分離される。印刷された層の混合を防止するために、例えば、トロンビンなどの架橋剤を混合物の堆積の直後に添加して、次の層を印刷する前に所望の形状を形成することができる。

【0033】

特定の実施形態では、バイオプリントに使用される混合物は、グルタミン酸作動性皮質前駆細胞、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞、及びバイオインクを含む。特定の実施形態では、混合物は、星状細胞前駆細胞を更に含む。特定の実施形態では、混合物は、ミクログリア細胞を更に含む。

【0034】

一部の事例では、本明細書に提供される方法で使用するための前駆細胞は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の方向性のある分化によって取得される。胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む多能性幹細胞は、グルタミン酸作動性皮質前駆細胞、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞、及び星状細胞前駆細胞を産生するために使用され得る。

【0035】

本明細書で使用される場合、多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）という用語は、自己再生を継続することができ、適切な条件下で、三つの胚葉すべての細胞に分化することができる細胞を意味する。ｈＰＳＣは、ＳＯＸ２⁺及びＯＣＴ４⁺を含む遺伝子発現プロファイルを示す。ヒトＰＳＣ（ｈＰＳＣ）の例としては、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）が挙げられる。ＥＳＣは、ＷｉＣｅｌｌ研究所（ウィスコンシン州マディソン）などの供給源から市販されている。本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ細胞」は、効力決定因子の特定のセットに関して変化する場合がある、及びそれらを単離するために使用される培養条件に関して変化する場合がある、しかしそれにもかかわらず、それらのそれぞれの分化した元の体細胞と実質的に遺伝的に同一である、及び本明細書で説明されているよう、ＥＳＣなどの、より高い効力の細胞と類似する特性を示す、多能性細胞又は多能性細胞の集団を指す。例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７－１９２０ （２００７）を参照。

【0036】

本明細書で使用される神経前駆細胞は、異なる段階由来であってもよい。特定の実施形態では、グルタミン酸作動性皮質神経前駆細胞は、２１日目のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性皮質神経前駆細胞である。特定の実施形態では、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞は、２１日目のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来のＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞である。

【0037】

特定の実施形態では、グルタミン酸作動性皮質前駆細胞及びＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞は、４：１の比率で混合物中に存在する。特定の実施形態では、グルタミン酸作動性皮質前駆細胞、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞、及び星状細胞前駆細胞は、５：１：４の比率で混合物中に存在する。

【0038】

細胞が神経組織構築物を形成することを可能にするように、堆積された複数のバンドを成熟させることは、任意の好適な培地中で行われ得る。好適な培地としては、例えば、神経基本培地が挙げられる。特定の実施形態では、神経組織構築物は、機能的ニューラルネットワーク及び／又は機能的神経膠細胞ネットワークを形成するのに十分な時間、例えば、培養物中で少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも３週間、又は少なくとも４週間培養される。特定の実施形態では、ニューロン基本培地は、２％Ｂ－２７、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＲＯＣＫ阻害剤、又はγ－セクレターゼ及びノッチ経路阻害剤のうちの少なくとも一つを含む。

【0039】

印刷された神経系構築物の機能評価は、全細胞パッチクランプなどの電気生理学的記録を含み得る。機能的神経組織構築物は、例えば、内向きＮａ⁺及び外向きＫ⁺電流、印刷後の自発的活動電位（ｓＡＰ）、並びに興奮性及び阻害性のシナプス後電流を有する。星状細胞を含む機能的神経組織構築物は、神経興奮に応答して、星状細胞におけるカルシウム流動及びグルタミン酸取り込みを有する。

【0040】

また、本明細書に開示の方法によって産生される神経組織構築物が本明細書に提供されている。

【0041】

特定の実施形態では、本明細書において、試験剤をスクリーニングする方法が開示され、方法は、本明細書に開示される神経組織構築物上にバイオプリントすることによって、試験剤を堆積させることと、前記接触した神経組織構築物の機能的パラメータを測定することと、機能的パラメータを、試験剤と接触していない神経組織構築物で測定されたパラメータと比較することと、を含み、試験剤との接触後の前記機能的パラメータの調節が、前記試験剤が候補治療薬であることを示す。

【0042】

一部の実施形態では、試験剤は、試験剤が生理学的に許容可能な状態から離れて機能的パラメータを調節するとき、神経毒性を有することを特徴とし得る。

【0043】

いくつかの実施形態では、神経組織構築物の細胞は、試験剤に応答する検出可能なマーカーを発現する。こうした検出可能なマーカーの例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＣｈＲ２－ＥＹＦＰ（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， ｉＳｃｉｅｎｃｅ ２３： １００８２９を参照）、並びに赤色カルシウム指示薬ｊＲＧＥＣＯ１ｂ（Ｄａｎａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｅｌｉｆｅ ５）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0044】

試験剤とは、特定の表現型エンドポイントを変更する能力について評価される分子を指す。試験剤の例としては、（ｉ）約６００ダルトン未満の分子量の有機化合物、（ｉｉ）核酸、（ｉｉｉ）ペプチド（ステープルペプチドを含む）、（ｉｖ）ポリペプチド、及び（ｖ）抗体又はその抗原結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。

【0045】

本開示に従って利用される場合、別段の指示がない限り、すべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有すると理解されるべきである。文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

【0046】

本開示を限定することなく、本開示のいくつかの実施形態を、例示の目的で以下に記述する。

【実施例】

【0047】

以下の実施例は、本開示の具体的な実施形態、及びその様々な使用の例示である。これらは説明的な目的でのみ記載され、またいかなるやり方でも本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0048】

実施例１：神経組織構築物の生成
神経前駆細胞及び星状細胞前駆細胞は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、ヒト多能性幹細胞（ヒトＰＳＣ）から生成された。ヒトＰＳＣから分化した前駆細胞を分析し、免疫蛍光法によって特徴付けた。

【0049】

第一に、ヒトＥＳＣ（Ｈ９、ＧＦＰ－Ｈ９、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｈ９）を、幹細胞増殖培地中のマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー上に、又はＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、バンクーバー、カナダ）中のマトリゲル被覆プレート上に、前述のように維持した（Ｌｉ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １１， ９９８－１００８， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１８．０８．０１９ （２０１８）、Ｙａｎ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７３， ２３１－２４２， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１５．０９．０２０ （２０１５））。ＭＥＦフィーダーベースの培養については、細胞を、ディスパーゼ（１ｍｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ）を使用して、照射ＭＥＦ（ＷｉＣｅｌｌ）の単層上にプレーティングすることによって毎週継代した。ｈＰＳＣ培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地（Ｇｉｂｃｏ）、２０％ノックアウト血清置換（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ ｂ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、及び４ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から構成された。ＴｅＳＲ－Ｅ８培地ベースの培養については、細胞を、アキュターゼ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）によって６～７日ごとに継代し、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ）の存在下で単層培養のためにマトリゲル被覆６ウェルプレート上に播種して、細胞生存を促進した。

【0050】

皮質神経前駆物質の生成は、前述のように実施された（Ｙａｎ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ ４２， １１４－１２６， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２０１６．０６．０２７（２０１６）、Ｃｈａｍｂｅｒｓ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７， ２７５－２８０， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１５２９ （２００９）、Ｙａｎ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ， ｄｏｉ：１０．１０８９／ｔｅｎ．ＴＥＡ．２０１７．０４２３ （２０１８））。簡潔に述べると、ｈＰＳＣ を、１ｍＬの ＴｅＳＲＥ８培地中、１ウェル当たり３．０～３．５×１０⁵細胞で超低付着（ＵＬＡ）２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｉｎｃ．、コーニング、ニューヨーク州）に播種し、２日間増殖させた。ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（１０μＭ）を播種中に添加し、２４時間後に除去した。次いで、培養物を、ダルベッコ変法イーグル培地／栄養素混合物Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）＋２％Ｂ２７マイナスビタミンＡ無血清サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） から構成される神経分化培地に切り替えた。神経培地中、１日目に、細胞 を二重ＳＭＡＤシグナル伝達 阻害剤：１０μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ）及び１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９（Ｓｉｇｍａ）で処理した。７日後、細胞をシクロパミン（１μＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＦＧＦ－２（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び上皮成長因子（ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に更に８日間インキュベートした。細胞培養物を、懸濁培養で２１日目までＦＧＦ－２中で維持し、印刷のためにアキュターゼによって分離した。２１日目の皮質前駆細胞は、図１に見られるように、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、及びＭＡＰ２の染色によって特徴付けられた。

【0051】

ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの分化は、以前に開発されたプロトコルに基づくものであった（Ｌｉｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ８， １６７０－１６７９， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１３．１０６ （２０１３）、Ｌｉｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１， ４４０－４４７， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２５６５ （２０１３））。上記の神経分化の７日後、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）活性化剤パルモルファミン（１μＭ、Ｓｉｇｍａ）を添加した。２１日目に、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞も、印刷のために単一細胞に解離した。２１日目のＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆細胞は、図２に見られるように、ＮＫＸ２．１、ＧＡＢＡ、ＴＵＪ１、及びＭＡＰ２の染色によって特徴付けられた。

【0052】

星状細胞前駆細胞の生成は、前述のように実施された（Ｌｉ，Ｘ．ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １１， ９９８－１００８， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１８．０８．０１９ （２０１８）、Ｋｒｅｎｃｉｋ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９， ５２８－５３４， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１８７７ （２０１１））。上述の２１日目の神経球を、ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、又はＦＢＳ（ＦＢＳ、１０％、Ｇｉｂｃｏ）の存在下でラミニン基質と結合した単一細胞にアキュターゼで解離した。そして、単一の星状細胞前駆細胞を、印刷のために調製した。星状細胞前駆細胞は、図３に見られるように、Ｓ１００β及びＧＦＡＰの染色によって特徴付けられた。

【0053】

分化細胞を特徴付けし、免疫蛍光法によって分析した。簡潔に述べると、カバーリップ／ウェル上の細胞をＰＢＳですすぎ、４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定した。ＰＢＳで２回リンスした後、細胞を０．３％トリトンで１０分間処理し、続いて１０％ロバ血清で１時間処理した後、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を、二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに室温で１時間インキュベートした。核をＨｏｅｃｈｓｔ（Ｈｏ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ－Ｓｉレーザー走査共焦点顕微鏡（ニコン、東京、日本）を用いて画像を撮影した。使用した一次抗体には以下が含まれる：ウサギ抗ＦＯＸＧ１（１：１００、ａｂ１８２５９、Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＰＡＸ６（１：５０００、ＰＡＸ６、ＤＳＨＢ）、ウサギ抗ＴＵＪ１（１：１００００、ＰＢＲ－４３５Ｐ、Ｃｏｖａｎｃｅ）、マウス抗ＴＵＪ１（１：１０００、ａｂ１１７９８８、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＭＡＰ２（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＭＡＰ２（１：１０００、Ｍ１４０６－２ＭＬ Ｓｉｇｍａ）、ニワトリ抗ＭＡＰ２（１：５０００、ａｂ５３９２、Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：５００、ＭＡＢ３７７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ドレブリン（１：１０００、ＡＢ１０１４０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ｖＧｌｕｔ１（１：１０００、１３５３０３、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ウサギ抗ＳＹＮ１（１：１０００、１０６－００３、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウス抗ＰＳＤ９５（１：５００、１２４０１１、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウス抗ゲフィリン（１：５００、１４７０１１、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ウサギ抗ｖＧＡＴ（１：１０００、１３１００２、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ウサギ抗ＧＡＢＡ（１：１０００、Ａ２０５２、Ｓｉｇｍａ）、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：１０００、Ｚ０３３４２９、Ｄａｋｏ）、マウス抗ＧＦＡＰ（１：１０００、ＩＦ０３Ｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗Ｓ１００β（１：１０００、ａｂ１１１７８、Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＧＬＴ１（１：５００、６１１６５４、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ヤギ抗ＯＴＸ２（１：１０００、ＡＦ１９７９、Ｒ＆Ｄ）、マウス抗ＮＫＸ２．１（１：５００、ＭＡＢ５４６０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ＳＯＸ２（１：５００、ＡＢ５６０３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ＴＢＲ１（１：１０００、ａｂ３１９４０、Ａｂｃａｍ）、ラット抗ＣＴＩＰ２（１：１０００、ａｂ１８４６５、Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＳＡＴＢ２（１： ２５、ａｂ５１５０２、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗カルレチニン（１：１０００、２６２４－１、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ウサギ抗カルビジン（１：１０００、ａｂ２５０８５、Ａｂｃａｍ）、マウス抗パルブミン（１：５００、ＭＡＢ１５７２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ラット抗ソマトスタチン（１：２００、ＭＡＢ３５４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。同様の密度のＨｏｅｃｈｓｔ＋細胞を含有する領域におけるカバーリップ全体にわたって核染色のために蛍光フィルタ下で複数のフィールドをランダムに選択し、総細胞を計数した。蛍光フィルタをイメージング中にシフトさせて、同じ方法で同じフィールドで異なる抗体によって標識された細胞を計数した。定量的データを３回繰り返した。

【0054】

フィブリノゲン及びトロンビンの最適な濃度を、ｈＰＳＣ由来の皮質神経前駆細胞（ＮＰＣ）の生存を測定することによって特定した。フィブリンゲルをフィブリノーゲン及びトロンビンから調製した。５０ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、１００Ｕのトロンビン、２５０ｍＭのＣａＣｌ２（１００×）、及び１０ｍｇ／ｍＬのアプロチニン（２０×）の原液を、以下の様式で調製した。フィブリノーゲン（Ｆ３８７９、Ｓｉｇｍａ）を、カルシウム及びマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に３７℃で４時間溶解した。溶液を滅菌濾過し、使用のために－８０℃で保存した。ＣａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）を脱イオン（ＤＩ）水に溶解し、使用のために濾過した。トロンビン（Ｔ７００９、Ｓｉｇｎａ）をＤＰＢＳに溶解させ、滅菌濾過した。溶液を、使用まで－２０℃で保存した。アプロチニン（Ａ１１５３、Ｓｉｇｍａ）をＤＰＢＳに溶解し、使用まで－２０℃で保存した。

【0055】

フィブリンゲルのゲル化試験は、以前の報告（Ｋｕｂｏｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ Ｂ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ３８， １０３－１０９， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｏｌｓｕｒｆｂ．２００４．０２．０１７ （２００４）； Ｓｐｒｏｕｌ， Ｅ． Ｐ．， Ｈａｎｎａｎ， Ｒ． Ｔ． ＆ Ｂｒｏｗｎ， Ａ． Ｃ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １７５８， ８５－９９， ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－４９３９－７７４１－３＿７ （２０１８））から修正された。異なる濃度のフィブリノゲン溶液及びトロンビン溶液を調製した。１μＬのフィブリノゲン溶液をカバースライド上に滴下し、同体積のトロンビンとよく混合した。ゲル化を試験するために、２μＬのピペットチップをゲルに接触させ、ゲルが固体であるかどうかを確認した（ピペットチップによって液体を採取することはできなかった）。トロンビンの添加及びゲルの形成からの時間を記録し、ゲル化時間として定義した。フィブリノゲン及びトロンビンの異なる組成物のゲル化時間を図４に示す。一定濃度のフィブリノゲン（５又は２．５ｍｇ／ｍＬ）では、ゲル化時間は、トロンビンのレベルの増加と共に減少した。０．５Ｕトロンビンでは、フィブリノーゲン濃度の増加と共にゲル化時間も減少した。２．５ｍｇ／ｍＬフィブリノゲン及び０．５Ｕトロンビンをヒドロゲル構築物に使用し、２４ウェルプレートを印刷するのに十分であった約１４５±１０秒のゲル化時間を得た。

【0056】

フィブリンゲル中での細胞培養については、１×１０⁶の密度で解離したｈＰＳＣ－ＮＰＣを、図５に示すように、以下の濃度（１、２．５、５、１０、及び２０ｍｇ／ｍＬ）でフィブリノーゲンと混合した。ゲル分解を防止するために０．５ｍｇ／ｍＬのアプロチニンを添加した。１μＬのフィブリノーゲンを豊富に含む細胞を、ポリＯコーティングプレート上にＲＴ（室温）で滴下した。次いで、２．５ｍＭのＣａＣｌ₂を含む１μＬの異なる濃度のトロンビン（０．５、１、２．５、５、及び１０Ｕ）溶液を添加し、細胞－フィブリノーゲン溶液と混合した。ゲル化後に新鮮な培地を加えた。細胞をフィブリンゲル構築物に封入し、特徴付けのために３７℃のインキュベータで培養した。生／死アッセイからの全細胞に対する生細胞のパーセントによって示される細胞生存率は、２．５ｍｇ／ｍｌの固定フィブリノーゲン濃度でトロンビン濃度が増加するにつれて減少したが、図６に示すように、一定の低濃度のトロンビン（０．５Ｕ）でのフィブリノーゲン濃度の増加による影響を受けなかった。しかしながら、細胞は、より高いフィブリノーゲンレベルで凝集する傾向があった。したがって、０．５又は１Ｕのトロンビンを有する２．５又は５ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンを使用して、最適なゲル化時間を特定した。

【0057】

細胞生存率を、生／死アッセイによって測定した。簡潔に述べると、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）染色キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、細胞生存率を評価した。採取直後に、細胞を、１μＭのカルセインＡＭ及び２μＭのエチジウムホモ二量体Ｉを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、試料の代表的な画像を撮影した。Ｉｍａｇｅ－ＪのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して、生きた細胞（緑色）及び死んだ細胞（赤色）の数を各領域で計数した。１つの試料の５つの画像からの生／死細胞数を平均化して、各データ点を得、５つの試料を使用して生存率を決定した。

【0058】

神経組織印刷の特別な要件は、バイオインクが神経突起の成長及びシナプス形成を支持することである。皮質ＮＰＣは、ＧＦＰ標識ｈＥＳＣ又はｍＣｈｅｒｒｙ標識ｈＥＳＣから２１日間分化され、図１に示されるように前脳皮質前駆細胞マーカーＦＯＸＧ１及びＰＡＸ６を発現した。フィブリンゲル中で培養されたとき、前駆細胞は、４日目に早くもプロセスベアリングのＴＵＪ１陽性ニューロンとなり、図７及び図８に示すように、成熟神経マーカーＭＡＰ２及びＮｅｕＮを漸進的に発現させた。多くのニューロンは、ゲル中での培養の１か月後に錐体の形態を示した。重要なことに、ニューロンは、ＧＦＰ標識によって明らかにされた微細な樹状構造を有する精緻な神経突起を拡張した。これは、４０日目の樹状突起棘マーカーであるドレブリンについて陽性の染色によって確認された。ｖＧｌｕｔ１及びシナプシン（ＳＹＮ１）の染色によって識別されたシナプス点を、ＴＵＪ１⁺又はＭＡＰ２⁺神経突起で３５日目に観察した。まとめると、フィブリンゲルは、皮質ニューロンの成熟及びシナプス形成を支持した。

【0059】

フィブリンが神経細胞の成長、成熟、及び機能を支持したことが実証された後、細胞を印刷してパターン化された構造を作製した。脳は、シナプスによって互いに結合される層又は核に組織化される。したがって、構造が維持されている間に、印刷された神経前駆細胞が成熟し、層にわたってシナプスを形成する、層状神経組織を構築することを探求した。「組織ブロック」を切片化する必要性を避けて、層を明らかにするために、かつ約５０ｕｍの厚さの顕微鏡による直接的な生きた状態での観察を容易にするために、セル層、又は「バンド」を水平に順次印刷した。これらの水平のバンドは、９０°回転すると、図９に示すように垂直の層を示す。

【0060】

印刷手順は、図９に示すように実施された。簡潔に述べると、プリンターはＣＥＬＬＩＮＫ（登録商標）、ＩＮＫＲＥＤＩＢＬＥ＋（商標）及びＢｉｏＸ（商標）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ／ｂｉｏ－ｘ／）からのものであった。プリンターには２つ又は３つの印刷ヘッドがあり、複数のタイプのセルを同時に堆積させることができる。分配装置をプリンターに接続して、異なる内径を有するマイクロノズルを通して異なるバイオインクを押し出した。印刷前に、ＵＶ光を５分間オンにして、印刷のための滅菌環境を作った。細胞を豊富に含むバイオインクを用いた印刷については、５ｍｍ／秒の印刷速度（ライン分注印刷モード）、及び３０Ｇのブラント針（ＮＺ５３００５０５００１、Ｃｅｌｌｉｎｋ、内径１５０μｍ）又は２７Ｇのブラント針（ＮＺ６２７０５０５００１、Ｃｅｌｌｉｎｋ、内径２００μｍ）を使用した５０ｋＰａの印刷圧力を使用した。すべての印刷経路は、３つのモデルからのソフトウェアＳｌｉｃ３Ｒによって生成されたＧコードコマンドを使用して制御された。

【0061】

印刷用のバイオインクを、ヒアルロン酸（ＨＡ）及びフィブリンゲルから調製した。簡潔に述べると、１：１の体積比で、ＨＡ（５３７４７、Ｓｉｇｍａ）及び１０ｍｇ／ｍＬフィブリノゲンからバイオインクを作製した。３％（ｗ／ｖ）ＨＡを３７℃のＤＰＢＳ中で調製し、完全に溶解するまで撹拌した。印刷を室温で行った。印刷後、ヒドロゲルをトロンビン＋トランスグルタミナーゼ（ＴＧ）＋ＣａＣｌ₂で室温で３～５分間架橋した。そして３７℃のインキュベータでの架橋後に新鮮な培地を加えて、特徴付けを行った。

【0062】

ＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙで標識されたｈＰＳＣ由来ＮＰＣを、バイオインク中で解離し、図１０に示すように、２４ウェルプレートの１ウェルにおいて、５０００（Ｌ）×５００（Ｗ）×５０（Ｈ）μｍの寸法で一度に１つの層を印刷した。印刷された層の混合を防止するために、セル－ゲル混合物の堆積の直後に架橋剤－トロンビンを添加して、次の層を印刷する前に設計された形状を形成した。実際に、一つの層のＧＦＰ細胞は、印刷後７日目に次のｍＣｈｅｒｒｙ細胞から十分に分離された。印刷された神経前駆細胞は、細胞周期終了を促進する化合物Ｅの存在下で規則的な分化培地中で３日間培養されたとき、ＭＡＰ２陽性となり、層内及び層をまたいでニューロンプロセスが延長した。印刷された細胞は大部分が、代替的な赤色及び緑色のバンドによって示されるように、指定された領域内に留まった。長期の培養にわたり、多細胞の厚さを有する層状構造が保持され、一方で神経突起がより多くなり、シナプスの形成を伴う層を交差させた。３Ｄ再構成は、図１１に示すように、複数の細胞を深さで明らかにした。したがって、印刷された組織は、神経前駆細胞が成熟し、ニューラルネットワークを形成する安定した構造を保持した。

【0063】

着色された細胞（ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ標識）又は非標識化細胞を使用して層状組織を印刷するために、神経細胞（グルタミン酸神経前駆細胞、ＧＡＢＡ神経前駆細胞、星状細胞前駆細胞）を解離し、濾過して、単一細胞を作製した。これらを別個に調製し、１×１０⁷／ｍＬの密度でＨＡ＋ＦＮバイオインクで充填した。ゲルを豊富に含む細胞を二つの異なるノズルに送達し、ポリＯ被覆カバーリップ上に堆積させた。印刷直後に架橋溶液を加えた。ゲル化を室温で行った。印刷した組織を、以下の実験のために新鮮な神経分化培地中、３７℃でインキュベートした。

【0064】

脳は、異なるニューロンタイプ間の相互作用を通して機能する。大脳皮質では、二つの主要なニューロンタイプ、ＧＡＢＡ介在ニューロン及びグルタミン酸ニューロンは、シナプスであり、互いに相互作用する。ＧＡＢＡ介在ニューロン及びグルタミン酸ニューロンが印刷された組織に組み込まれて機能的シナプスを形成するかどうかを決定するために、図１２に示すように、ＧＦＰ⁺及びＧＦＰ^- ｈＰＳＣからのＭＧＥ（ＧＡＢＡ）及び皮質（グルタミン酸）前駆細胞を生成し、２つの前駆細胞集団を１：４の比率で混合して、大脳皮質におけるニューロン及び皮質突起ニューロンの比を模倣し、その後で印刷した^18、19。より良好な可視化のために、２層組織を印刷し、一方の層はＧＦＰ細胞であり、他方の層は非着色細胞であり、各層は同じ比率の介在ニューロン及び皮質突起ニューロンを含有していた。皮質突起ニューロンのみを有する印刷された組織を、参照として使用した。ＧＦＰ⁺層及びＧＦＰ^-層の両方が、ＧＡＢＡ⁺ニューロン及びＭＡＰ２⁺総ニューロンの均一な分布を示した。

【0065】

神経組織印刷の最も困難な態様は、機能的ネットワークの形成である。図１３に示すように、シナプス前マーカー及びシナプス後マーカー、ＳＹＮ１及びＰＳＤ９５の共発現は、印刷後２０日目という早期に観察され、シナプスの形成を示した。ＧＡＢＡ作動性ニューロンはまた、阻害性プレシナプスタンパク質ｖＧＡＴの発現によって示されるようにシナプスを形成した。これらの観察は、印刷された神経組織の興奮性シナプス及び阻害性シナプスの形成を示唆する。

【0066】

印刷された神経組織は、電気生理学的記録によるなどの機能評価を可能にする。ＧＦＰ－グルタミン酸作動性皮質前駆細胞を、図１４に示すように、非着色のＭＧＥ ＧＡＢＡ作動性前駆細胞で印刷した。全細胞パッチクランプは、グルタミン酸作動性ニューロンが、図１４Ｂに示すように、印刷の約３週間後に自発的活動電位（ｓＡＰ）を示したことを示した。重要なことに、グルタミン酸作動性ニューロンは、興奮性及び阻害性のシナプス後電流（ＥＰＳＣ及びＩＰＳＣ）を示し、グルタミン酸ニューロンとＧＡＢＡ介在ニューロンとの間の機能的ネットワークの形成を示唆している。更に、これらの細胞は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンと一緒に印刷すると、より多くのＥＰＳＣ及びＩＰＳＣを受けた。これらの結果は、皮質突起ニューロン及びＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの機能的成熟、並びに印刷された組織における機能的ニューラルネットワークの形成を確認した。

【0067】

全細胞パッチクランプ記録は、ヒトＰＳＣ由来の皮質グルタミン酸作動性ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンから作成された。浴溶液は、１３５ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１ｍＭのグルコース、１０ｍＭのスクロース、ｐＨ７．４から構成された。記録ピペットを、１２０ｍＭのＤ－グルコン酸カリウム、１ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、１０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、４ｍＭのＡＴＰ－Ｍｇ、０．３ｍＭのＧＴＰ－Ｎａ、１０ｍＭのホスホクレアチン、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２、２８０～２９０ｍＯｓｍ／Ｌを含有する細胞内溶液で充填した。簡潔に述べると、ニューロンを－７０ｍＶに保持して、電圧クランプモデルを用いてＮａ＋／Ｋ＋チャネル活性を記録した。活動電位を記録するために、細胞を、電流クランプモデルを用いて、及び５０ｐＡ～＋５０ｐＡの注入電流のステップで、０ｐＡに保持した。自発性興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）及び自発性抑制性電流（ｓＩＰＳＣ）を、ギャップフリーモードでそれぞれ－７０ｍＶ及び０ｍＶの保持電位で記録した。ｓＥＰＳＣは、グルタミン酸受容体拮抗薬６－シアノ－７－ニトロキノキサリン－２，３－ジオン（ＣＮＱＸ、１０μＭ）及びＤ－（－）－２－アミノ－５－ホスホノペンタン酸（Ｄ－ＡＰＶ、５０μＭ）の適用によって遮断された。ｓＩＰＳＣは、ＧＡＢＡＡ受容体拮抗薬ビククリン（１０μＭ）の適用によって遮断された。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１ＷＩ顕微鏡を使用してニューロンを可視化した。ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国カリフォルニア州サニーベール）を使用して、電圧クランプ及び電流クランプ記録を調査した。Ｄｉｇｉｄａｔａ １５５０Ｂアナログデジタル変換器（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して４ｋＨＺで信号を濾過し、さらなる分析のために保存した。データは、Ｃａｍｐｌｆｉｔ １１．０．３（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、米国カリフォルニア州）、ＣｏｒｅｌＤｒａｗ ２０１９（Ｃｏｒｅｌ、カナダ）、Ｉｇｏｒ ４．０（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ、Ｎａｋｅｏ Ｏｓｗｅｇｏ、米国オレゴン州）で分析された。

【0068】

適切なニューロンネットワーク機能は、星状細胞を含むグリアの存在を必要とする。次に、ｈＰＳＣ由来の星状細胞前駆細胞を、上記のグルタミン酸ニューロン及びＧＡＢＡ介在ニューロンに４：５：１の比率で組み込んだ。ＧＦＰ⁺細胞及びＧＦＰ^-細胞からなる二層組織も印刷され、各層は、図１６に示すように三つの細胞型を有していた。ＧＦＡＰ⁺星状細胞及びＭＡＰ２⁺ニューロンは、印刷された組織全体に分布した。

【0069】

ニューロン及び星状細胞の両方を有する印刷では、ニューロンの大部分は、図１５に示すように、印刷後３０日目にＮｅｕＮ⁺ニューロン（＞９０％）となり、印刷された組織におけるニューロン成熟の強化を示した。特に、星状細胞は、より精緻なプロセスで漸進的に成熟したが、これは２Ｄ培養ではあまり見られない。ＧＦＡＰ染色は星状細胞のプロセスの広範な分岐を示したが、ＧＦＰ標識化は微細なプロセス及びそのシートを明らかにした。特に、３Ｄ可視化は、星状細胞の分岐がｍＣｈｅｒｒｙ⁺ニューロンプロセスと絡み合ったことを示し、ニューロンと星状細胞の近接した相互作用を示唆した。

【0070】

星状細胞は、神経シグナルに応答してカルシウムシグナルを生成し、これがニューロンネットワークを調節することを可能にする。星状細胞が印刷されたニューラルネットワークに機能的に組み込まれるかどうかを決定するために、ｍＣｈｅｒｒｙ－ニューロンを、図１７に示される蛍光カルシウムセンサーであるＧＣａＭＰ６に感染させた星状細胞で印刷した。ニューロンを脱分極する高濃度ＫＣｌ溶液（６７ｎＭ）の適用は、印刷された組織内の星状細胞においてカルシウム応答を誘発する。ＧＣａＭＰ６シグナルの合計ΔＦ／Ｆは、印刷後２～６週間に増加した。したがって、印刷された組織中のニューロン及び星状細胞は機能的に接続された。

【0071】

星状細胞の最も重要な機能の１つは、シナプス間隙に放出されるグルタミン酸のような神経伝達物質をリサイクルすることである。実際に、非着色ｈＰＳＣから印刷された星状細胞は、図１６Ｅに示すように、印刷後４０日目にＧＬＴ－１（グルタミン酸トランスポーター１）又は興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＡＡＴ２）を発現し、星状細胞の成熟を示唆している。ニューロンと星状細胞との間のネットワークを、図１７に示すように、グルタミン酸インジケータｉＧｌｕＳｎＦＲのライブイメージングを使用して調べた。再び、皮質ニューロンを誘発してグルタミン酸を放出するＫＣｌ溶液を適用すると、星状細胞におけるｉＧｌｕＳｎＦＲシグナルが誘発された。ｉＧｌｕＳｎＦＲシグナルの合計ΔＦ／Ｆは、印刷後２～４週間に増加した。これらの観察は、星状細胞が印刷された組織内のニューロンから放出されたグルタミン酸を摂取することを示した。

【0072】

カルシウム及びグルタミン酸塩のライブイメージングを以下のように行った。簡潔に述べると、１８０日目のヒトＰＳＣ由来星状細胞前駆細胞を、Ｌｅｎｔｉ－ＧＣａＭＰ６又はＬｅｎｔｉ－ｉＧｌｕＳｎＦＲに感染させた。３日後に、ウイルス感染星状細胞に、ｈＰＳＣ由来皮質前駆細胞及びＭＧＥ前駆細胞を４：５：１の比で印刷した。カルシウム又はグルタミン酸の撮像を、記載されたように行った（Ｓｌｏａｎ， Ｓ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｎ ９５， ７７９－７９０ ｅ７７６， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１７．０７．０３５ （２０１７））。簡潔に述べると、印刷された組織を低カリウムタイロード液（低ＫＣｌ）（２ｍＭ ＫＣｌ、１２９ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３０ｍＭグルコース、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％及びウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、溶液と共に３７℃で３０分間インキュベートした。撮像時、試料を共焦点蛍光顕微鏡（Ａ１、Ｎｉｋｏｎ）の段階上に配置した。次いで、高カリウムタイロード液（高－ＫＣｌ）（６７ｍＭ ＫＣｌ、６７ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３０ｍＭグルコース、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％及びウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）を適用した。対照として、ウイルス感染星状細胞前駆細胞も単独で培養し、高ＫＣｌ溶液を適用した。ＩｍａｇｅＪを以下の分析に使用した。蛍光変化は、ΔＦ／Ｆ（ｔ）＝（Ｆ₀－Ｆ（ｔ））／Ｆ₀として定義され、式中、Ｆ₀は、低ＫＣｌ溶液中の試料のイメージング領域の平均蛍光強度であり、Ｆ（ｔ）は、所与の時間での蛍光強度であった。印刷された組織のΔＦ／Ｆを、対照のΔＦ／Ｆの比較によって正規化した。

【0073】

実施例２：アレキサンダー病における印刷におけるニューロン－星状細胞の相互作用
印刷内の機能的神経グリアネットワークは、病理学的プロセスを調べるための理想的なモデルを提示する。一例として、アレキサンダー病（ＡｘＤ）を、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子の変異によって引き起こされる神経変性疾患であるニューロン－星状細胞の相互作用を、図１６に記載されるものと類似した印刷で評価した。この場合には、（グルタミン酸及びＧＡＢＡ）ニューロンは、正常なｈＥＳＣ（Ｈ９）に由来するのに対し、星状細胞は、ＡｘＤ（Ｒ８８Ｃ変異）又は同系（ＣＲＩＳＰＲによって補正された変異）ｉＰＳＣのいずれかに由来する（Ｊｏｎｅｓ， Ｊ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２５， ９４７－９５８ ｅ９４４， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１８．０９．０８３ （２０１８））。印刷後、同系対照からのサンプルと比較して、ＡｘＤ星状細胞は、図１８に示すように細胞内にＧＦＡＰ凝集を示し、これはＡｘＤの病理学的特徴を再現する。印刷されたＡｘＤ組織は、印刷後２０日目に対照と比較して、ＧＬＴ－１の発現が少ないことを示した。印刷の３０日後までに、ＭＡＰ２⁺ニューロン及びＧＦＡＰ⁺星状細胞は、精緻なプロセス及びシナプシンの発現を有する複雑な形態を示した。興味深いことに、ＡｘＤ組織は、同系の星状細胞を有する組織よりも有意に低減されたシナプス点密度を有し、シナプス形成に対するＡｘＤ星状細胞の支持効果が低いことを示唆している。

【0074】

以前には、ＡｘＤ患者の星状細胞は、純粋な２Ｄ培養物においてカルシウム波を伝搬させることはできなかったことが示されている（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２５， ９４７－９５８ ｅ９４４， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１８．０９．０８３ （２０１８））。ＡｘＤ星状細胞が神経機能に対する応答を変化させるかどうかを決定するために、図１９に示すように、ＧＣａＭＰ６に以前に感染させたＡｘＤ又は同系星状細胞と共に印刷物を使用した。脱分極を誘導することによってニューロン機能を刺激する高ＫＣｌ（６７ｎＭ）は、同系星状細胞において堅実なＣａ⁺応答を惹起させた。対照的に、ＡｘＤ星状細胞は、同系対照よりも有意に少ないカルシウム応答を示した。ＡｘＤ星状細胞についてのＧＣａＭＰ６シグナルの総ΔＦ／Ｆは、対照の経時的なものと比較して、ＫＣｌ刺激後にはずっと低かった。ＡｘＤにおける神経グリア接続を、図１９に示すように、ｉＧｌｕＳｎＦＲによるグルタミン酸塩のライブイメージングを使用して調査した。高ＫＣｌを用いたニューロン刺激時、ＡｘＤ組織は、同系対照と比較して、ｉＧｌｕＳｎＦＲシグナルの変化が少ないことを示した。ＡｘＤ星状細胞のｉＧｌｕＳｎＦＲシグナルの総ΔＦ／Ｆは、同系組織のものと比較して、印刷後２～４週間で有意に低かった。これらの結果は、疾患に関連する機能的表現型が、印刷されたヒト神経組織において容易に表示されることを示す。

【0075】

ミクログリアはまた、図２０に示すように神経組織に印刷された。免疫染色は、ミクログリア、ニューロン、及び星状細胞が組織内で生存したことを示した。

【0076】

実施例３：機能的脳領域特異的組織の分化
本明細書に開示されるシステムを含む試薬及び方法を使用して、ヒト皮質線条体組織を作製し、皮質突起ニューロンをＤＡＲＰＰ３２⁺線条体中型有棘神経細胞で印刷することによって、ヒトの脳内の皮質線条体回路を模倣した。

【0077】

線条体ＤＡＲＰＰ３２⁺ニューロン又は中型有棘細胞を、Ｍａ ｅｔ ａｌ ．， ２０１２ （Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １０： ４５５．４６４）に記載されるように生成した。簡潔に述べると、４０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ Ｃ２５ＩＩ）Ｎ末端タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４６４－ＳＨ－０２５／ＣＦ）を、二重ＳＭＡＤ（ｓｍａｌｌ ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ ｆａｍｉｌｙ）シグナル伝達 阻害剤治療の一週間後、７日目から２５日目まで神経分化培地に加えた。２５日目に、これらの線条体前駆細胞をバルプロ酸（ＶＰＡ）（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ）で５日間処理し、単一線条体ニューロンを印刷用に調製した。これらの幹細胞由来の線条体ニューロンは、図２１ａ～ｃの免疫蛍光顕微鏡写真の後に示されるように、高レベルのＤＡＲＰＰ３２（＞９０％）を有するＧＡＢＡ、ＣＡＤ６７の発現を示した。

【0078】

ニューロンは、同じ脳領域で互いに連接するだけでなく、核又は層間で互いに結合する。印刷後、皮質ニューロンはＧＦＰを発現し、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＤＡＲＰＰ３２を発現する線条体ニューロンは、顕著な組織分離を示した。両方のニューロンタイプは、図２２ｂに示すように、２週間の印刷でＭＡＰ２の発現と共に成熟し、ＧＦＰ皮質ニューロン及びｍＣｈｅｒｒｙ線条体ニューロンをバイオプリントするための実験プロトコルを例示する。印刷された皮質及び線条体ニューロン層は、印刷後１５日間良好に維持され、皮質ニューロンは線条体ニューロン層に向かって突出し、線条体ニューロンは、図２３ｂに示すように、皮質ニューロンドメインに向かってそれらのプロセスを拡張した。突出した皮質神経突起（軸索）は、線条体神経突起との物理的接触を形成し、接続の形成を示した。

【0079】

印刷された皮質組織中のニューロンが線条体組織中のニューロンと機能的シナプス結合を形成したかどうかを決定するために、皮質ニューロンはＣｈＲ２－ＥＹＦＰを発現して印刷され（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， ｉＳｃｉｅｎｃｅ ２３： １００８２９を参照）、線条体ニューロンは赤色カルシウム指示薬ｊＲＧＥＣＯ１ｂを発現して印刷された（Ｄａｎａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｅｌｉｆｅ ５）。４７０ｎｍ光の適用は、図２４に示すように、印刷の２週間後に線条体ニューロン層においてＣｈＲ２－ＥＹＦＰ皮質ニューロンが誘発したカルシウム応答を刺激することが見出された。皮質層から遠い線条体ニューロンでさえも、カルシウム応答の増加を示した。図２４ｅに示すように、線条体ニューロン層全体のカルシウムシグナルの総ΔＦ／Ｆは、刺激と共に有意に増加し、皮質ニューロン層と線条体ニューロン層の機能的結合がこれらの印刷された組織で生成されたことを示唆している。

【0080】

印刷された皮質－線条体組織の機能的結合は、電気生理学的記録によって更に特徴付けられた。図２５ａに示すように、皮質ニューロンはＣｈＲ２－ＥＹＦＰを発現して印刷され、線条体ニューロンはｍＣｈｅｒｒｙを発現して印刷された。ＣｈＲ２刺激については、皿から５ｍｍの光刺激繊維を置いた。光ファイバケーブルに結合されたカスタムメイドのＬＥＤデバイス（１ワット、４７０ｎｍ、Ｃｒｅｅ ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｉｎｃ．）を使用して、刺激を達成した。印刷された皮質線条体組織については、印刷後約５週間で、青色光刺激（ベースライン）前、青色光刺激（３０～６０秒、４７０ｎｍ、０．４ｍＷ／ｍｍ²）前、及び青色光刺激後に、電圧クランプモード下で、自発的活動電位、ＥＰＳＰＳ及びＥＰＳＣを記録した。印刷した皮質線条体組織中のｍＣｈｅｒｒｙ線条体ニューロンを、記録のために無作為に選択した。図２５ｅに示すように、５６％を超える線条体ニューロンが光刺激で応答を示した。また、ＥＰＳＣの頻度は刺激と共に増加し、印刷された皮質線条体組織における機能的ネットワーク形成を示している。

【0081】

図２６ａ～図２６ｄは、図２８の赤い矢印で示すように、印刷された皮質－筋組織が印刷の１か月後に収縮及び弛緩した筋細胞を示す。したがって、本発明による印刷された皮質－筋肉組織は、生物学的機能を示し、本発明は、複数の脳領域特異的組織を他の組織と組み立てて機能的結合を形成するために利用され得ることを示す。

【0082】

本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、及び特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

【0083】

当業者であれば、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記述される特定の実施形態に対する数多くの均等物を認識する、又は確認することができるであろう。本明細書に記載の本実施形態の範囲は、上記の記述に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載の通りである。当業者であれば、以下の特許請求の範囲に定義される通り、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本明細書に対する様々な変更及び修正を行うことができることを理解するであろう。当業者であれば、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記述される特定の実施形態に対する数多くの均等物を認識する、又は確認することができるであろう。本明細書に記載の本実施形態の範囲は、上記の記述に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載の通りである。当業者であれば、以下の特許請求の範囲に定義される通り、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本明細書に対する様々な変更及び修正を行うことができることを理解するであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図16G】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【図17F】

【図17G】

【図17H】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図19E】

【図19F】

【図19G】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図24D】

【図24E】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図25E】

【図25F】

【図26】

【国際調査報告】