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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-28
(54)【発明の名称】アルファ－葉酸受容体に対する抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241018BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241018BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241018BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
A61P35/00
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024546361
(86)(22)【出願日】2022-10-17
(85)【翻訳文提出日】2024-06-14
(86)【国際出願番号】 EP2022078842
(87)【国際公開番号】W WO2023066866
(87)【国際公開日】2023-04-27
(31)【優先権主張番号】21425051.6
(32)【優先日】2021-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524149230
【氏名又は名称】フォンダチオーネ イエッレチチエッセ イスティテュート ナチオナーレ デイ ツモリ
(74)【代理人】
【識別番号】110001896
【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フィジニ、マリアンジェラ
(72)【発明者】
【氏名】カネヴァーリ、シルヴァーナ
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
(57)【要約】
α－葉酸受容体に高い特異性を有し、かつ、腫瘍の治療またはα－葉酸受容体の発現の増加を伴う他の疾患の治療に医学的に関心のあるものである新しい抗体が、記載される。本発明のすべての抗体は、ＶH領域およびＶL領域に同じ６つの特定のＣＤＲを共有し、これら６つのＣＤＲは、本発明において配列番号：１～６によって定められ、α葉酸受容体特異性を担う。１つの実施形態において、Ａタイプと同定されるこれら抗体のサブグループが、α－葉酸受容体への結合の長期にわたる持続期間によってさらに特徴づけられ、また、さらなる実施形態において、いくつかのアミノ酸修飾を伴いかつＢタイプとして同定される別のサブグループが、ヒトの治療に対する高められた適合性によって、また特徴づけられる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アルファ葉酸受容体（ＦＲα）に対するモノクロナール抗体であって、以下のＣＤＲ、
配列番号：１によって定められる、ＶHＣＤＲ１、
配列番号：２によって定められる、ＶHＣＤＲ２、
配列番号：３によって定められる、ＶHＣＤＲ３、
配列番号：４によって定められる、ＶLＣＤＲ１、
配列番号：５によって定められる、ＶLＣＤＲ２、および
配列番号：６によって定められる、ＶLＣＤＲ３、
を含み、
配列番号：７によって定められるＶHおよび配列番号：８によって定められるＶLを有する抗体を除く、
モノクロナール抗体。
【請求項2】
ＶHが１２０個のアミノ酸を含みかつ以下の表１に記載の条件のうちの少なくとも１０個の条件をさらに満たし、かつ、ＶLが１０７個のアミノ酸を含みかつ以下の表２に記載の条件のうちの少なくとも８個の条件をさらに満たす、請求項１記載のモノクロナール抗体。【表1】
【表2】
【請求項3】
ＶHは、前記表１の条件のうちの少なくとも１４個の条件を満たし、かつＶLは、前記表２の条件のうちの少なくとも１１個の条件を満たす、請求項２記載の抗体。
【請求項4】
前記ＶHにおいて以下のさらなる条件を含む、ヒトの治療に対する改善された適合性を有する請求項２～３記載の抗体。【請求項5】
前記ＶLにおいて以下のさらなる条件を含む、ヒトの治療に対する改善された適合性を有する請求項２～３記載の抗体。【請求項6】
ヒトの治療に対する改善された適合性を有する、請求項４および５の両方に記載の抗体。
【請求項7】
ＶHは、配列番号：９によって定められ、ＶLは、配列番号：１０によって定められる、請求項３記載の抗体。
【請求項8】
ＶHは、配列番号：１１によって定められ、ＶLは、配列番号：１２によって特定められる、請求項６記載の抗体。
【請求項9】
一本鎖抗体である、請求項１～８記載の抗体。
【請求項10】
腫瘍、またはＦＲαの細胞発現の増加によって特徴づけられる他の疾患に有効な基質に結合された形態である、請求項１～９記載の抗体。
【請求項11】
請求項１～１０記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項12】
治療における使用のための、請求項１～１０記載の抗体。
【請求項13】
腫瘍、またはＦＲαの細胞発現の増加によって特徴づけられる他の疾患の治療における使用のための、請求項１～１０記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒトの治療における使用のための抗体の分野に関し、α－葉酸受容体（ＦＲα）に特に向けられる抗体であって、腫瘍ならびに当該受容体の活性および発現に関連している他の疾患の治療において有用性を有する抗体の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
葉酸受容体α（ＦＲα）は、メトトレキサートおよびペメトレキセドなどの細胞内葉酸代謝を標的とする薬の開発の成功の後数十年、抗がんターゲットとして焦点が当てられてきた。ＦＲαへの結合は、葉酸が細胞に取り込まれるいくつかの方法のうちの１つである；この受容体は、卵巣がん、肺がん、および乳がんなどの固形腫瘍の領域において過剰発現するので、魅力的な抗がん剤の創薬標的である。さらにその上、抗体薬物複合体、低分子薬物複合体、放射性免疫複合体、および、より最近では、キメラ抗原受容体Ｔ細胞などのプラットフォームを用いて効果的な抗がん剤治療をそれらの標的腫瘍に対してより良くローカライズするためにＦＲαを使用することは、ＦＲαを過剰発現するがんの患者のアウトカムをさらに改善できる（Scaranti et al Nat Rev Clin Oncol 2020 Jun;17(6):349-359）。ＦＲαは、効果予測バイオマーカーの研究に役立てることもできる。
【0003】
ＦＲαは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合タンパク質であり、上皮性卵巣癌腫（ＥＯＣ）のうちの９０％超、胸膜中皮腫のような中胚葉由来のさまざまな腫瘍においても症例のうちの５０％超で、過剰発現されている（Salazar. M.D. et. al., Cancer Metastasis Rev. 2007 Mar; 26(1): 141-52）。がんにおけるＦＲαの機能は十分に理解されてはいないが、その過剰発現は、高められた腫瘍攻撃性に関連付けられ（Toffoli G et al., Int J Cancer. 1998 Apr 17;79(2):121-6.; Elnakat H et al., Adv Drug Deliv Rev. 2004 Apr 29;56(8):1067-84）、がん細胞への葉酸の供給を高めることによって増殖優位性を付与し得る（Bottero F et al., Cancer Res. 1993 Dec 1;53(23):5791-6）。
【0004】
葉酸受容体α（ＦＲα）は、多くの理由により有効な抗がん剤の標的である。これらの理由には、特定のがんの悪性組織における過剰発現と相まった非悪性組織における制限された発現、これにより、ＦＲαを、抗体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、二重特異性抗体（Canevari S. et al Cancer Immunol Immunother. 1997 Nov-Dec;45(3-4):187-9）、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞（Song DG et al. Blood. 2012 Jan 19;119(3):696-706; Song et al. Cancer Res. 2011 Jul 1;71(13):4617-27）などの複数のプラットフォームを用いる可能な標的とする、葉酸などの非生理的な葉酸塩に対する高いレベルの親和性、これにより、葉酸複合体を用いてそれを標的可能にすること、および、ＦＲαを過剰に発現するがん細胞におけるシグナル伝達物質および生存促進シグナル伝達への、限られた程度でのその関与、が含まれる。
【0005】
３つのマウス・モノクロナール抗体（ｍＡｂｓ）が、２つの独立した研究グループによって開発された：卵巣腫瘍細胞に高い親和性を有する、ＭＯｖ１８およびＭＯｖ１９（Miotti S et al., Int J Cancer. 1987 Mar 15;39(3):297-303）、ならびに、ＬＫ２６（Garin-Chesa P et al., Am J Pathol. 1993 Feb;142(2):557-67）、である。これらの抗体およびそれらの誘導体が、抗体に基づく多くの試験において、現在使用されている。すべてのこれらのｍＡＢｓは、ＦＲαに向けられるが、ＭＯｖ１８によって認識されるエピトープは、ＭＯｖ１９およびＬＫ２６によって認識されるエピトープとは異なる。ＭＯｖ１８およびＭＯｖ１９に関して、最初は、それらは、腫瘍レベルで放射性同位体を標的にする能力について評価され（Gadina M et al., Int J Rad Appl Instrum B. 1991;18(4):403-8.; Coliva A et al., Cancer Immunol Immunother. 2005 Dec;54(12):1200-13; Zacchetti A et al., Nucl Med Biol. 2009 Oct;36(7):759-70.）、その後、ＭＯｖ１８およびＭＯｖ１９のいくつかの異なる誘導体が、さまざまな治療応用において評価された。ｍＡｂであるＬＫ２６は、前臨床試験において、皮下異種移植腫瘍モデルにおける生体内での抗腫瘍活性について評価された（Ebel W et al., Cancer Immun. 2007 Mar 9;7:6.）が、マウス由来であったために、その臨床試験は行われなかった。マウスｍＡｂｓの治療上の使用における第１の制限するものは、それらタンパク質配列の免疫原生である。実際に、これらのｍＡＢｓは、後に続く治療応用のあいだにｍＡＢｓの効果を低減させるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）と呼ばれる免疫原生応答を引き起こし得る。第２の制限するものは、ヒトにおける比較的より速いクリアランスによる治療効果の低減であり、この治療効果の低減は、ＨＡＭＡ応答によって潜在的に改善される。第３は、マウスｍＡｂｓが比較的弱いエフェクター機能を示すことであり、エフェクター細胞または補体タンパク質をリクルートするその能力が、ヒトｍＡＢｓと比べて低減される（Presta L.G., Adv Drug Deliv Rev. 2006 Aug 7;58(5-6):640-56）。これらの制限するものを克服するために、キメラｍＡｂｓが設計され、それらは、マウスｍＡｂｓよりも低い免疫原生を示すけれども、当該キメラバージョンは、抗キメラｍＡｂ応答を引き起こすことができる。ヒト化は、治療用ｍＡｂｓの潜在的な免疫原生の低減へと導くことができる方法のうちの１つである。ファルレツズマブは、ＬＫ２６のヒト化されたバージョンであり、元のマウスｍＡｂと類似したＦＲαに対する高い親和性を有する試薬であり、ＡＤＣ抗体として、現在、臨床試験中である（Shimizu T et al. Clin Cancer Res. 2021 Jul 15;27(14):3905-3915）。
【発明の概要】
【0006】
ＦＲαに対する高い特異性を有し、抗腫瘍治療に有用であり、かつ、ＦＲαの発現が増大した細胞に関連する他の疾患の治療のための、モノクロナール抗体の新しいグループが、今、特定される。本発明のすべての抗体は、それらのＶH鎖またはＶL鎖の内部に位置しかつ配列番号：１～６によって特定される以下の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって特徴づけられる。前述の６つのＣＤＲを含む例示する抗体は、以下のように定められる：
抗体Ｉ）配列番号：９によって定められるＶHと、配列番号：１０によって定められるＶLと、を有し、コードしている対応するヌクレオチド配列は、配列番号：１３および配列番号：１４として提供される。
抗体ＩＩ）配列番号：１１によって定められるＶHと、配列番号：１２によって定められるＶLとを有する。
抗体Ｉ）配列番号：９によって定められるＶHと、配列番号：１０によって定められるＶLと、を有し、コードしている対応するヌクレオチド配列は、配列番号：１３および配列番号：１４として提供される。
抗体ＩＩ）配列番号：１１によって定められるＶHと、配列番号：１２によって定められるＶLとを有する。
【0007】
上記した６つのＣＤＲを含むモノクロナール抗体は、ＦＲαに対する特異性を示す：それらのペプチド構造、およびそれらのためのヌクレオチド配列のコードは、上記の技術においては決して開示されなかった。本願のモノクロナール抗体の好ましいサブグループは、本明細書において、「Ａタイプ」と呼ばれ、時間延長されたＦＲαへの結合というさらなる利点を示す：この特徴は、ＣＤＲ駆動型受容体特異性（即ち、標的細胞を非標的細胞と区別する能力）とは異なりかつ当該特異性に付加的であり、予想外に高い結合強度を意味する；この向上は、ＶH鎖およびＶL鎖において特異的なアミノ酸を導入することによって、上記のＣＤＲの外側に位置する領域において、即ち、ＣＤＲを修飾することなく、得られる。
【0008】
開発において、Ａタイプの抗体は、上記ＣＤＲの外側に位置するＶH鎖および／またはＶL鎖の他の部分において、即ち、ＣＤＲを修飾することなく、さらに修飾され、ヒト治療に対する向上された適合性を得る；抗体のこのサブグループは、本明細書においては、「Ｂタイプ」と定義される。
【0009】
本明細書において報告される抗体の結合の高い特異性および改善されたカイネティクスは、一本鎖の形態（ｓｃＦｖ）などの一価の抗体フラッグメントとして可変ドメインを使用する可能性とともに結果として生じる。ｓｃＦｖは、それらの標的（本明細書においては、腫瘍細胞の表面に発現されるＦＲα）に達するように腫瘍をよりよく貫通することができるので、エフェクター細胞のリクルートが必要でなければ、ｓｃＦｖの使用は、それらの縮小された大きさのために、関心のある抗腫瘍薬を運ぶのに理想的に適している。それにもかかわらず、本発明は、一本鎖抗体に限定されないが、標準的な免疫グロブリンにおける対応する可変ドメイン抗体も対象とする：これらは、それらの二価特性のために、ＦＲαに対するさらにより高い特異性を有すると期待される。
【0010】
本発明は、治療における使用のための、および、特に、ＦＲαの発現の増加を伴う他の疾患はもちろん腫瘍の治療のための上記したモノクロナール抗体に適用される。本発明は、本明細書に記載されるようなモノクロナール抗体を含む医薬組成物も含む。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A(i)】抗体Ｉ、ＦＡｂ－ＭＯｖ１８、ＦＡｂ－ＭＯｖ１９についてのＦＡＣＳ試験からの結果である。
【図1A(ii)】抗体Ｉ、ＦＡｂ－ＭＯｖ１８、ＦＡｂ－ＭＯｖ１９についてのＦＡＣＳ試験からの結果である。
【図1B(i)】抗体Ｉ、ＦＡｂ－ＭＯｖ１８、ＦＡｂ－ＭＯｖ１９についてのＦＡＣＳ試験からの結果である。
【図1B(ii)】抗体Ｉ、ＦＡｂ－ＭＯｖ１８、ＦＡｂ－ＭＯｖ１９についてのＦＡＣＳ試験からの結果である。
【図2(i)】抗体Ｉ、およびＦＡｂ－ＭＯｖ１８についてのＢｉａｃｏｒｅ結合試験からの結果であり、（Ａ）は、５０～０．４ｎＭでの希釈における抗体ＩのＦＲαについてのカイネティクスである。
【図2(ii)】抗体Ｉ、およびＦＡｂ－ＭＯｖ１８についてのＢｉａｃｏｒｅ結合試験からの結果であり、（Ｂ）は、５０～０．４ｎＭでの希釈における一価のＭＯｖ１８のＦＲαについてのカイネティクスである。
【図2(iii)】抗体Ｉ、およびＦＡｂ－ＭＯｖ１８についてのＢｉａｃｏｒｅ結合試験からの結果であり、（Ｃ）は、２００ｎＭの濃度での抗体Ｉの結合（青いレーン）とＦａｂ－ＭＯｖ１８の結合（緑のレーン）との比較である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
標準的な知識に従って、用語「モノクロナール抗体」は、本明細書において、分子量が高いペプチドであって、場合によっては３次元免疫グロブリン構造を有し、特定の抗原標的に対する特異性を有するペプチド、を指す。本抗体に対する関心のある抗原標的は、ＦＲαである。本抗体は、可変の高分子量の鎖（ＶH）と可変の低分子量の鎖（ＶL）とを含む可変領域（Ｆｖ）、を含む。それらは、定常の高／低分子量の鎖（ＣH／ＣL）を含む定常領域、を含むことも可能であり、定常領域は、抗体の標準的な配座に応じて構造が与えられかつ配置される。本記載において、それぞれのペプチド鎖を構成するアミノ酸の番号付けは、標準的な累進的なものである、即ち、ｎ個のアミノ酸を含むペプチド鎖に対して１からｎまで変動する。
【0013】
本発明の抗体は、本明細書において、ＦＲαに対する特異性を担うそれらの可変領域部分によって特徴づけられる。それらは、それらのＶHおよびＶL領域に含まれるそれらの６つのＣＤＲによって一般的に定められ、以下の配列番号：１～６によって同定される。
配列番号：１によって定められる、ＶHＣＤＲ１；
配列番号：２によって定められる、ＶHＣＤＲ２；
配列番号：３によって定められる、ＶHＣＤＲ３；
配列番号：４によって定められる、ＶLＣＤＲ１；
配列番号：５によって定められる、ＶLＣＤＲ２；
配列番号：６によって定められる、ＶLＣＤＲ３。
配列番号：１によって定められる、ＶHＣＤＲ１；
配列番号：２によって定められる、ＶHＣＤＲ２；
配列番号：３によって定められる、ＶHＣＤＲ３；
配列番号：４によって定められる、ＶLＣＤＲ１；
配列番号：５によって定められる、ＶLＣＤＲ２；
配列番号：６によって定められる、ＶLＣＤＲ３。
【0014】
ＶHＣＤＲ１は、好ましくは、抗体のＶHフレームワーク１とＶHフレームワーク２との間に位置する。
【0015】
ＶHＣＤＲ２は、好ましくは、抗体のＶHフレームワーク２とＶHフレームワーク３との間に位置する。
【0016】
ＶHＣＤＲ３は、好ましくは、抗体のＶHフレームワーク３とＶHフレームワーク４との間に位置する。
【0017】
ＶLＣＤＲ１は、好ましくは、抗体のＶLフレームワーク１とＶLフレームワーク２との間に位置する。
【0018】
ＶLＣＤＲ２は、好ましくは、抗体のＶLフレームワーク２とＶLフレームワーク３との間に位置する。
【0019】
ＶLＣＤＲ３は、好ましくは、抗体のＶLフレームワーク３とＶLフレームワーク４との間に位置する。
【0020】
上記に言及されたＶHフレームワーク１、２、３およびＶLフレームワーク１、２、３は、ＩＭＧＴ／Ｃｏｌｌｉｅｒ－ｄｅ－Ｐｅｒｌｅｓ（ドメインＶ）の標準的な抗体構造に従って定められるものである（Ruiz M, et al. Immunogenetics. 2002）。
【0021】
本モノクロナール抗体は、一本鎖、または古典的免疫グロブリン構造、を有することが可能であり、たとえば、古典的ＩｇＧフォーマットで変形される可変ドメインを含む：一本鎖コンフォメーションにおける場合には、６つのＣＤＲが、１個存在し；それが古典的免疫グロブリン構造にあれば、それらは、２個存在する。
【0022】
６つのＣＤＲによって定められるモノクロナール抗体が、本発明の主要な実施形態に相当する。これら抗体には、配列番号：７によって定められるＶHと配列番号：８によって定められるＶLとによって特徴づけられる抗体Ｍｏｖ１８は、含まれない。
【0023】
上記のＣＤＲの外側にあるＶH鎖とＶL鎖の特定の位置において特定のアミノ酸を含みかつ本明細書において「Ａタイプ」として定義される本抗体のサブグループは、ＦＲαへの長期にわたる結合という付加的な予期しない性質を示す。ＶHが１２０個のアミノ酸を含みかつ以下の表１に記載の条件のうちの少なくとも１０個の条件を満たし、かつ、同時に、ＶLが１０７個のアミノ酸を含みかつ以下の表２に記載の条件のうちの少なくとも８つの条件を満たす、という点で、これらＡタイプの抗体は、特徴づけられる。
【表1】
【表2】
【0024】
好ましい変形例において、Ａタイプの抗体は、表１および２のより多くの数の条件を満たし、特に：
ＶHは、表１の条件のうちの少なくとも１４個の条件を満たし、かつＶLは、表２の条件のうちの少なくとも１１個の条件を満たすか、
ＶHは、表１の条件のうちの少なくとも１５個の条件を満たし、かつＶLは、表２の条件のうちの少なくとも１２個の条件を満たすか、
ＶHは、表１の条件のうちの少なくとも１６個の条件を満たし、かつＶLは、表２の条件のうちの少なくとも１３個の条件を満たすか、
ＶHは、表１の条件のうちの少なくとも１７個の条件を満たし、かつＶLは、表２の条件のうちの少なくとも１４個の条件を満たすか、あるいは
ＶHは、表１の全ての条件を満たし、かつＶLは、表２の全ての条件を満たす。
ＶHは、表１の条件のうちの少なくとも１４個の条件を満たし、かつＶLは、表２の条件のうちの少なくとも１１個の条件を満たすか、
ＶHは、表１の条件のうちの少なくとも１５個の条件を満たし、かつＶLは、表２の条件のうちの少なくとも１２個の条件を満たすか、
ＶHは、表１の条件のうちの少なくとも１６個の条件を満たし、かつＶLは、表２の条件のうちの少なくとも１３個の条件を満たすか、
ＶHは、表１の条件のうちの少なくとも１７個の条件を満たし、かつＶLは、表２の条件のうちの少なくとも１４個の条件を満たすか、あるいは
ＶHは、表１の全ての条件を満たし、かつＶLは、表２の全ての条件を満たす。
【0025】
これらの基準を満たす、本明細書において抗体Ｉと呼ばれる好ましい抗体は、配列番号：９（ＶH）と配列番号：１０（ＶL）とによって特徴づけられる。
【0026】
本抗体に導入されるときに、また、Ａタイプの修飾が、抗体に、ヒト有機体との高められた程度の適合性を付与し、したがって、ヒトの治療において使用される時に自己免疫応答を生成するリスクは、伴ったとしても低いか、またはそのリスクを伴わない。
【0027】
好適な実施形態において、Ａタイプの抗体は、さらにより高い程度のヒト適合性を得るそれらのＶH鎖およびＶL鎖の非ＣＤＲ領域において、さらに修飾される。本明細書において「Ｂタイプ」のものと定義される抗体のこのサブグループは、ＶHにおいては表３の以下の修飾、および／または、ＶLにおいては表４の以下の修飾、を含む。
【表3】
【表4】
【0028】
好ましくは、Ｂタイプの抗体には、表３の修飾、および表４の修飾、の両方が含まれる。これらの基準を満たす、本明細書において抗体ＩＩと呼ばれる好ましい抗体は、配列番号：１１（ＶH）と配列番号：１２（ＶL）とによって特徴づけられる。
【0029】
本発明のさらなる目的は、治療における使用のための、特に、ＦＲαの発現の増加を伴う任意の他の疾患はもちろん腫瘍の治療のための上記したモノクロナール抗体を提供することである。標的とする好ましい腫瘍は、卵巣悪性腫瘍（たとえば、上皮性卵巣癌腫（ＥＯＣ））、および、中胚葉由来の腫瘍（たとえば、胸膜中皮腫）である。標的とする非限定的なさらなる腫瘍は、卵巣、子宮、および子宮頸部の非粘液性腺癌、精巣絨毛癌、トロホブラスト腫、上衣脳腫瘍、喉頭上皮腫瘍、下垂体腺癌、結腸、腎、乳腺、肺、および腎臓の腫瘍、などである。
【0030】
本発明のさらなる目的は、ＦＲαの発現の増加を伴う疾患に対して治療効果のある基質との本抗体の複合体である；当該複合体は、ＦＲαへの基質の標的とする配送に有用であり；可能な基質に関して、制限はない：それは、たとえば、薬物分子、細胞または細胞成分、ナノ粒子、など、であり得る；一般には、上記の薬物分子は、抗腫瘍薬物分子である。
【0031】
本発明は、抗体または本明細書に記載されるようなその複合体を含む医薬組成物も、含む。
【0032】
本発明およびその効果は、以下の非限定的な例によって、今回説明される。
【0033】
実験項
１．ＦＡＣＳ解析
一次抗体ＭＯｖ１８（配列番号：７～８）またはＭＯｖ１９、および抗体Ｉ（ＳｃＦｖ 配列番号：９～１０）（１０μｇ／ｍｌ）の一価の形態（Ｆａｂｓ）が、１００μｌのＰＢＳ＋０．０３％のＢＳＡにおいて腫瘍細胞（５×１０５）に添加され、当該混合物は、３０分間氷の上で培養された。結合が、（マウスの中で生成された）二次抗体の抗－Ｈｉｓタグによって、氷上で３０分間検出された。すべての抗体の結合が、Ａｌｅｘａ４８８結合抗マウス抗体を用いて、氷上３０分間で示された。各サンプルに対して、５０００個の細胞が、ＤＩＶＡソフトウェアを用いたＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏによって、解析された。スコアが、サンプルの平均蛍光と二次抗体のみの平均蛍光との比率として算出された。結果が図Ｉに提示される：試験された全ての抗体が、ＦＲαに対する特異性を示すことが理解できる。
１．ＦＡＣＳ解析
一次抗体ＭＯｖ１８（配列番号：７～８）またはＭＯｖ１９、および抗体Ｉ（ＳｃＦｖ 配列番号：９～１０）（１０μｇ／ｍｌ）の一価の形態（Ｆａｂｓ）が、１００μｌのＰＢＳ＋０．０３％のＢＳＡにおいて腫瘍細胞（５×１０５）に添加され、当該混合物は、３０分間氷の上で培養された。結合が、（マウスの中で生成された）二次抗体の抗－Ｈｉｓタグによって、氷上で３０分間検出された。すべての抗体の結合が、Ａｌｅｘａ４８８結合抗マウス抗体を用いて、氷上３０分間で示された。各サンプルに対して、５０００個の細胞が、ＤＩＶＡソフトウェアを用いたＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏによって、解析された。スコアが、サンプルの平均蛍光と二次抗体のみの平均蛍光との比率として算出された。結果が図Ｉに提示される：試験された全ての抗体が、ＦＲαに対する特異性を示すことが理解できる。
【0034】
２．Ｂｉａｃｏｒｅ結合試験
Ｂｉａｃｏｒｅは、生体分子相互作用の特性評価のための、表面プラズモン共鳴に基づく器具であり（Jason-Moller L et al Curr Protoc Protein Sci. 2006 Sep; Chapter 19: Unit 19.13）、今回の場合、抗体、ＦＲα．ＭＯｖ１８Ｆａｂ（配列番号：７～８）、および抗体Ｉ（ＳｃＦｖ、配列番号：９～１０）が、試験された。カイネティックス解析は、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００機器を用いて行われた。４００ＲＵのＦＲαが、アミンカップリングキットを用いてＣＭ５センサチップに共有結合され、１０ｍＭの酢酸ナトリウム中５μｇ／ｍｌの抗原濃度が用いられた。残りの活性基は、１．０Ｍのエタノールアミン ｐＨ８．５の注入によってブロックされた。５０から０．４ｎＭの異なる濃度の抗体ＩまたはＦａｂ’ＭＯｖ１８が、３０μｌ／分の流量で解析され、結合カイネティクスを決定するために、少なくとも５分間の解離が進行させられた。残りの結合は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．７を用いて、引き離された。それぞれの親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて、結合曲線から推定された。
Ｂｉａｃｏｒｅは、生体分子相互作用の特性評価のための、表面プラズモン共鳴に基づく器具であり（Jason-Moller L et al Curr Protoc Protein Sci. 2006 Sep; Chapter 19: Unit 19.13）、今回の場合、抗体、ＦＲα．ＭＯｖ１８Ｆａｂ（配列番号：７～８）、および抗体Ｉ（ＳｃＦｖ、配列番号：９～１０）が、試験された。カイネティックス解析は、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００機器を用いて行われた。４００ＲＵのＦＲαが、アミンカップリングキットを用いてＣＭ５センサチップに共有結合され、１０ｍＭの酢酸ナトリウム中５μｇ／ｍｌの抗原濃度が用いられた。残りの活性基は、１．０Ｍのエタノールアミン ｐＨ８．５の注入によってブロックされた。５０から０．４ｎＭの異なる濃度の抗体ＩまたはＦａｂ’ＭＯｖ１８が、３０μｌ／分の流量で解析され、結合カイネティクスを決定するために、少なくとも５分間の解離が進行させられた。残りの結合は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．７を用いて、引き離された。それぞれの親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて、結合曲線から推定された。
【0035】
結果が、図２に提示される：解離後１８０秒では、抗体Ｉは、ＭＯｖ１８ＦＡｂと比べてはるかにゆっくりとした解離カイネティクスを示した。特に、３００秒時点で、抗体Ｉの結合は、まだ、プラトーの約７５％であった一方で、ＭＯｖ１８ＦＡｂの結合は、ほぼゼロであった。さらに興味深いことに、３００秒時点の後、抗体Ｉの結合は、プラトーにまだ匹敵するレベルで定常状態に達し、抗体Ｉははるかにより強力でほとんど永久的な結合能力を示した一方で、ＭＯｖ１８ＦＡｂは結合能力を全く示さなかった。したがって、両方の抗体が、有用なＦＲα特異性を共有するけれども、抗体Ｉは、この受容体に対するはるかにより高い結合強度を示し、このことが、それを、この受容体の発現の増大によって特徴づけられる疾患の治療に対する改善された候補にする、ことが示される。
【0036】
３．ヒト化
ヒトへの適合性を高めるために、修飾が、抗体Ｉに導入された。抗体ＩＩ（配列番号：１１～１２）を結果として生じる以下の修飾、
ＶH：１１－Ｖ；６５－Ｑ；６７－Ｒ；８２－Ｅ；
ＶL：２４－Ｑ；７１－Ｆ；
は、抗体の構造的なコンフォメーションと、結果として生じるその結合プロファイルと、を維持しながら「大規模なレパトアデータに機械学習の手法を用いた抗体のヒト化」（Marks C et al Bioinformatics. 2021 Jun 10:btab434）に従って測定された適合性を高める際に、最適であることが判明した。
ヒトへの適合性を高めるために、修飾が、抗体Ｉに導入された。抗体ＩＩ（配列番号：１１～１２）を結果として生じる以下の修飾、
ＶH：１１－Ｖ；６５－Ｑ；６７－Ｒ；８２－Ｅ；
ＶL：２４－Ｑ；７１－Ｆ；
は、抗体の構造的なコンフォメーションと、結果として生じるその結合プロファイルと、を維持しながら「大規模なレパトアデータに機械学習の手法を用いた抗体のヒト化」（Marks C et al Bioinformatics. 2021 Jun 10:btab434）に従って測定された適合性を高める際に、最適であることが判明した。
【0037】
配列表
配列番号：１ Ｖ H ＣＤＲ１
ＤＹＩＦＴＮＹＤ
配列番号：２ Ｖ H ＣＤＲ２
ＩＤＰＲＳＧＫＳ
配列番号：３ Ｖ H ＣＤＲ３
ＡＴＭＹＹＹＧＳＳＰＰＭＤＹ
配列番号：４ Ｖ L ＣＤＲ１
ＱＤＩＮＮＦ
配列番号：５ Ｖ L ＣＤＲ２
ＹＴＳ
配列番号：６ Ｖ L ＣＤＲ３
ＱＱＳＳＴＩＰＲＴ
配列番号：７ Ｖ H Ｍｏｖ１８
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＤＹＩＦＴＮＹＤＩＴＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＤＰＲＳＧＫＳＹＹＮＥＫＦＫＧＫＳＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＴＭＹＹＹＧＳＳＰＰＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＲＲＥ
配列番号：８ Ｖ L Ｍｏｖ１８
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＮＮＦＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＩＮＬＥＱＥＤＩＡＩＹＦＣＱＱＳＳＴＩＰＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号：９ Ｖ H 抗体Ｉ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＤＹＩＦＴＮＹＤＩＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＤＰＲＳＧＫＳＹＹＮＥＫＦＫＧＫＳＴＬＴＡＤＫＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＴＭＹＹＹＧＳＳＰＰＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
配列番号：１０ Ｖ L 抗体Ｉ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＮＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＳＳＴＩＰＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号：１１ Ｖ H 抗体ＩＩ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＤＹＩＦＴＮＹＤＩＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＤＰＲＳＧＫＳＹＹＮＥＫＦＱＧＲＳＴＬＴＡＤＫＳＶＳＴＡＹＬＥＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＴＭＹＹＹＧＳＳＰＰＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
配列番号：１２ Ｖ L 抗体ＩＩ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＮＮＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＳＳＴＩＰＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号：１３ Ｖ H 抗体Ｉ（コードしているヌクレオチド配列）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＣＴＡＡＣＴＡＴＧＡＣＡＴＡＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡＧＴＧＧＴＡＡＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＡＴＧＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＣＧＧＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＡＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＣＡＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＣＣＣＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＣＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣ
配列番号：１４ Ｖ L 抗体Ｉ（コードしているヌクレオチド配列）
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配列番号：１ Ｖ H ＣＤＲ１
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配列番号：２ Ｖ H ＣＤＲ２
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配列番号：３ Ｖ H ＣＤＲ３
ＡＴＭＹＹＹＧＳＳＰＰＭＤＹ
配列番号：４ Ｖ L ＣＤＲ１
ＱＤＩＮＮＦ
配列番号：５ Ｖ L ＣＤＲ２
ＹＴＳ
配列番号：６ Ｖ L ＣＤＲ３
ＱＱＳＳＴＩＰＲＴ
配列番号：７ Ｖ H Ｍｏｖ１８
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配列番号：８ Ｖ L Ｍｏｖ１８
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配列番号：９ Ｖ H 抗体Ｉ
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配列番号：１０ Ｖ L 抗体Ｉ
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配列番号：１１ Ｖ H 抗体ＩＩ
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配列番号：１３ Ｖ H 抗体Ｉ（コードしているヌクレオチド配列）
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配列番号：１４ Ｖ L 抗体Ｉ（コードしているヌクレオチド配列）
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【図1A(i)】
【図1A(ii)】
【図1B(i)】
【図1B(ii)】
【図2(i)】
【図2(ii)】
【図2(iii)】
【配列表】
【国際調査報告】