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特表2024-539497共鳴エネルギー転移に基づく全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブ、ならびにその調製方法及び応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-28
(54)【発明の名称】共鳴エネルギー転移に基づく全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブ、ならびにその調製方法及び応用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241018BHJP
C12N 9/88 20060101ALI20241018BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20241018BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241018BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20241018BHJP
C12N 15/60 20060101ALI20241018BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20241018BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241018BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241018BHJP
C12Q 1/66 20060101ALI20241018BHJP
C12Q 1/527 20060101ALI20241018BHJP
G01N 33/542 20060101ALI20241018BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20241018BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C12N9/88
C12N9/02
C12N15/62 Z
C12N15/53
C12N15/60
C12N15/867 Z
C12N5/10
C12Q1/02
C12Q1/66
C12Q1/527
G01N33/542 A
C12P21/02 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024547803
(86)(22)【出願日】2021-12-15
(85)【翻訳文提出日】2024-04-22
(86)【国際出願番号】 CN2021138560
(87)【国際公開番号】W WO2023070887
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】202111273571.9
(32)【優先日】2021-10-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524156249
【氏名又は名称】中科▲輔▼▲めい▼医科技（深▲せん▼）有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100130993
【弁理士】
【氏名又は名称】小原 弘揮
(72)【発明者】
【氏名】▲陳▼柳青
(72)【発明者】
【氏名】於邱黎▲陽▼
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ02
4B063QQ13
4B063QQ64
4B063QR02
4B063QR20
4B063QR65
4B063QR66
4B063QS32
4B063QS36
4B063QS39
4B063QX02
4B064AG01
4B064BH20
4B064CA19
4B064CB30
4B064CC24
4B064DA13
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD50
4B065CA24
4B065CA46
4B065CA52
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045DA89
4H045EA50
4H045EA61
4H045FA74
(57)【要約】
本発明に係る共鳴エネルギー転移に基づく全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブ、ならびにその調製方法及び応用は、具体的に、共鳴エネルギー転移ドナー、ＮＡＤ＋応答タンパク質及び共鳴エネルギー転移アクセプターから直列接続されてなる全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブであって、ＮＡＤ＋応答タンパク質は、ＤＮＡリガーゼの突然変異体であり、前記ＤＮＡリガーゼの突然変異体の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される通りであり、前記共鳴エネルギー転移ドナーは、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質から選ばれ、前記共鳴エネルギー転移アクセプターは、蛍光タンパク質ら選ばれ、かつ共鳴エネルギー転移アクセプターの蛍光タンパク質として、共鳴エネルギー転移ドナーの蛍光タンパク質と異なる、全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブを提供する。前記タンパク質プローブは、生細胞において合成し、生細胞中のＮＡＤ＋濃度を検出することに用いられ得る。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
共鳴エネルギー転移ドナー、ＮＡＤ＋応答タンパク質及び共鳴エネルギー転移アクセプターから直列接続されてなる全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブであって、ＮＡＤ＋応答タンパク質は、ＤＮＡリガーゼの突然変異体であり、前記ＤＮＡリガーゼの突然変異体の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される通りであり、
前記共鳴エネルギー転移ドナーは、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質から選ばれ、前記共鳴エネルギー転移アクセプターは、蛍光タンパク質ら選ばれ、かつ共鳴エネルギー転移アクセプターの蛍光タンパク質として、共鳴エネルギー転移ドナーの蛍光タンパク質と異なることを特徴とする、全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブ。
【請求項2】
前記共鳴エネルギー転移ドナーは、環状に配列される生物発光タンパク質ｃｐＮＬｕｃ又は緑色蛍光タンパク質ｍＮｅｏＧｒｅｅｎから選ばれ、好ましくは、環状に配列される生物発光タンパク質ｃｐＮＬｕｃは、Ｇ４Ｖ突然変異が組み込まれた生物発光タンパク質ｃｐＮＬｕｃであり、
より好ましくは、ｃｐＮＬｕｃの突然変異体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８であり、緑色蛍光タンパク質ｍＮｅｏＧｒｅｅｎの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３であることを特徴とする、請求項１に記載の全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブ。
【請求項3】
前記共鳴エネルギー転移アクセプターは、緑色蛍光タンパク質ｍＮｅｏＧｒｅｅｎ又は赤色蛍光タンパク質ｍＳｃａｒｌｅｔから選ばれ、好ましくは、赤色蛍光タンパク質ｍＳｃａｒｌｅｔはその中の残基Ｇ２２５を欠失させた赤色蛍光タンパク質ｍＳｃａｒｌｅｔであり、
より好ましくは、ｍＳｃａｒｌｅｔの突然変異体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２であり、緑色蛍光タンパク質ｍＮｅｏＧｒｅｅｎの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３であることを特徴とする、請求項１に記載の全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブ。
【請求項4】
前記ＮＡＤ＋タンパク質プローブは、ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体、ＬｉｇＡ突然変異体及びｃｐＮＬｕｃ突然変異体から直列接続されて構成され、もしくは、前記ＮＡＤ＋タンパク質プローブは、ｍＮｅｏＧｒｅｅｎ突然変異体、ＬｉｇＡ突然変異体及びｃｐＮＬｕｃ突然変異体から直列接続されて構成され、もしくは、
前記ＮＡＤ＋タンパク質プローブは、ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体、ＬｉｇＡ突然変異体及びｍＮｅｏＧｒｅｅｎ突然変異体タンパク質から構成され、
好ましくは、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１であることを特徴とする、請求項１に記載の全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブ。
【請求項5】
ＮＡＤ＋濃度を検出する薬剤の調製における請求項１～４の何れか１項に記載のＮＡＤ＋タンパク質プローブの使用。
【請求項6】
請求項１～４の何れか１項に記載のＮＡＤ＋タンパク質プローブを含むＮＡＤ＋濃度を検出する組成物であって、好ましくは、前記組成物に生物発光基質をさらに含むことを特徴とする、ＮＡＤ＋濃度を検出する組成物。
【請求項7】
請求項１～４の何れか１項に記載のＮＡＤ＋タンパク質プローブをコードするヌクレオチド配列。
【請求項8】
請求項７に記載のヌクレオチド配列を含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターは、レンチウイルス発現ベクターであることを特徴とする、ベクター。
【請求項9】
請求項１～４の何れか１項に記載のＮＡＤ＋タンパク質プローブを発現できる細胞であって、好ましくは、前記細胞は、生細胞に請求項８に記載のベクターを形質転換することで得られ、前記ベクターは細胞において請求項１～４の何れか１項に記載のＮＡＤ＋タンパク質プローブを翻訳して得ることができることを特徴とする、細胞。
【請求項10】
ＮＡＤ＋を調製研究する実験モデルにおける請求項９に記載の細胞の使用であって、好ましくは、前記実験モデルは、ＮＡＤ＋の合成及び代謝過程におけるアゴニスト又は阻害剤の研究に用いられることを特徴とする、ＮＡＤ＋を調製研究する実験モデルにおける請求項９に記載の細胞の使用。
【請求項11】
Ｓ１１）請求項１～４の何れか１項に記載のタンパク質プローブを用いて、ＮＡＤ＋濃度が検出される薬剤と混合させるステップと、Ｓ１２）それぞれ、プローブにおける共鳴エネルギー転移ドナー及び共鳴エネルギー転移アクセプターの最大発光波長で発光強度を検出し、両者の発光強度比を計算するステップと、
Ｓ１３）標準曲線に回帰して対応するＮＡＤ＋濃度を得るステップ、もしくは、
Ｓ１３）異なる時点での発光強度比を検出して、異なる時点でのＮＡＤ＋濃度変化のトレンドを得るステップ、もしくは、
Ｓ１３）異なる活性成分を添加した後、発光強度比の変化を検出し、異なる活性成分のＮＡＤ＋濃度変化に対する影響を得るステップと、を含むＮＡＤ＋濃度を検出する方法であって、
好ましくは、ステップＳ１１）では、前記タンパク質プローブにおける共鳴エネルギー転移ドナーがルシフェラーゼである場合、発光強度を検出する前に、さらに生物発光基質を添加する必要があり、
好ましくは、ステップＳ１３）では、標準曲線の調製方法として、異なる標準濃度のＮＡＤ＋を用い、それぞれステップＳ１１～Ｓ１２により、異なる濃度に対応するＮＡＤ＋が対応する発光強度比を検出し、ＮＡＤ＋濃度の対数値を横軸とし、発光強度比を縦軸として標準曲線を作成することを特徴とする、ＮＡＤ＋濃度を検出する方法。
【請求項12】
Ｓ２１）請求項８に記載のベクターをレンチウイルス感染法により供試細胞に形質転換し、蛍光タンパク質の蛍光シグナルをマーカーとして選別することにより、供試安定細胞株を得るステップと、Ｓ２２）それぞれ、ベクター中のヌクレオチドがコードするＮＡＤ＋タンパク質プローブにおける共鳴エネルギー転移ドナー及び共鳴エネルギー転移アクセプターの最大発光波長で発光強度を検出し、両者の発光強度比を計算するステップと、
Ｓ２３）標準曲線に回帰して対応する細胞におけるＮＡＤ＋濃度を得るステップ、もしくは、
Ｓ２３）異なる時点での発光強度比を検出し、異なる時点での細胞におけるＮＡＤ＋濃度変化のトレンドを得るステップ、もしくは、
Ｓ２３）異なる活性成分を添加した後、発光強度比の変化を検出し、異なる活性成分の細胞におけるＮＡＤ＋濃度変化に対する影響を得るステップと、を含むことを特徴とする、生細胞におけるＮＡＤ＋濃度を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の特許は、バイオプローブの分野に属し、具体的には、共鳴エネルギー転移に基づく全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブ、ならびにその調製方法及び応用に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、生物試料中のＮＡＤ＋の含有量は下記のような方法で検出され得る。
【0003】
１）ＮＡＤ＋比色キット：
【0004】
ＮＡＤ＋比色キットは、まず、酵素反応によりＮＡＤ＋を全てＮＡＤＨに転換した後、生成されたＮＡＤＨにより染料分子を還元してその吸光度を変え、最後に分光光度計により染料分子の濃度を決定して試料中のＮＡＤ＋濃度を推定する。
【0005】
２）高速液体クロマトグラフィー－質量分析法：
【0006】
高速液体クロマトグラフィー－質量分析法において、高速液体クロマトグラフィーにより供試試料中の異なる画分を単離するとともに、異なる画分の吸光強度を検出する。高速液体クロマトグラフィーと同時に、異なる画分はイオン化により質量分析計に入り、核細胞質比で異なる画分を定性し、イオン強度で異なる画分を定量する。
【0007】
３）蛍光強度変化に基づく蛍光タンパク質プローブ：
【0008】
タンパク質工学によりＮＡＤ＋を感知する蛍光タンパク質プローブを設計する。該方法は、通常ＮＡＤ＋感知タンパク質と蛍光タンパク質とを融合させ、ＮＡＤ＋感知タンパク質がＮＡＤ＋と特異的に結合した後で生成した立体配座の変化により、蛍光タンパク質の立体配座を調整し、さらに、蛍光タンパク質の量子収率等の光学的特徴に影響を与え、プローブ中の蛍光タンパク質によって発される蛍光シグナルの強さは、系中のＮＡＤ＋濃度によって変化する。
【0009】
４）共鳴エネルギー転移に基づく半合成ＮＡＤ＋タンパク質プローブ：
【0010】
該方法は、蛍光又は生物発光共鳴エネルギー転移原理によりＮＡＤ＋濃度を検出し、組み換えタンパク質（タンパク質部分）及び合成蛍光リガンド分子（合成部分）により共同で半合成タンパク質プローブを構築してＮＡＤ＋の検出を実現する。このようなプローブは、ルシフェラーゼ（又は蛍光タンパク質）、ＮＡＤ＋結合タンパク質及び自己マーカータンパク質によって融合されてなり、なかでも、自己マーカータンパク質には、共有結合を介して、１つの赤い発蛍光団と１つのＮＡＤ＋結合タンパク質のリガンドとを含む１つの合成分子が連結されている。ＮＡＤ＋結合タンパク質及びリガンドの親和力は、系中のＮＡＤ＋濃度によって調節されるので、自然状態で、センサータンパク質中のＮＡＤ＋結合タンパク質はリガンドと結合せず、プローブが開状態となり、発蛍光団とルシフェラーゼ（又は蛍光タンパク質）とが離間され、共鳴エネルギー移転が発生せず、プローブ全体はルシフェラーゼ（又は蛍光タンパク質）に固有の放出光を発する。系中のＮＡＤ＋濃度が上がる場合、ＮＡＤ＋結合タンパク質はリガンドと結合することで、発蛍光団はルシフェラーゼ（又は蛍光タンパク質）に近づき、共鳴エネルギー移転が発生して、プローブ全体は発蛍光団の赤色光を発する。該プローブの発光色は試料中のＮＡＤ＋濃度によって変化するので、ルシフェラーゼ（又は蛍光タンパク質）及び赤色発蛍光団の発光強度比を測定すれば、系中のＮＡＤ＋濃度を定量することができる。
【0011】
ＮＡＤ＋比色キット及び高速液体クロマトグラフィー－質量分析法では、何れも生細胞におけるＮＡＤ＋濃度を測定することができない。このような方法に基づく単回の検出に、多くの細胞（約１００万個）を分解させることが必要であり、この分解過程で細胞ＮＡＤ＋濃度の時間及び空間情報を失うと同時に、試料分解過程は細胞におけるＮＡＤ＋濃度を変化させて、正しくない結果を引き起こす。また、単一の試料の検出に１０～３０分間がかかり、大型計器に依存し、大量の試料の検出が大きく制限されているので、ＮＡＤ＋の代謝研究及び薬物開発の律速段階の一つである。
【0012】
蛍光プローブに基づく生細胞のＮＡＤ＋測定方法では、生細胞及び細胞下構造におけるＮＡＤ＋のダイナミック変化を長期間にわたって測定することは困難であり、主な原因は、現在蛍光プローブは蛍光マイクロイメージングのカウントに依存する必要があることで、蛍光の光毒性を誘発して生細胞を長期間にわたって測定しにくいことである。同時に、このようなプローブの使用は、蛍光顕微鏡等の大型精密計器に依存するので、大量の試料の検出が制限されている。また、このようなプローブは、単一波長の蛍光強度シグナルでＮＡＤ＋濃度を定量することにより、プローブ分子の発現量の動的差異はＮＡＤ＋の定量に著しく干渉している。従って、このようなプローブの使用過程で、校正治具として他の色の内部標準蛍光タンパク質に依存するので、このようなプローブの使用過程は複雑となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
共鳴エネルギー転移に基づく半合成ＮＡＤ＋タンパク質プローブは、共鳴エネルギー転移の原理によりＮＡＤ＋濃度を定量して、自己校正を実現し、単一波長に依存せず、二重波長光強度比で供試物の濃度を定量する。しかし、このタイプのプローブは組み換えタンパク質及び合成蛍光リガンド分子で共同で構成されるため、生細胞のＮＡＤ＋検出を行う場合、細胞はプローブの融合タンパク質部分のみを自律的に発現することができ、合成分子部分は細胞外で提供される必要がある。細胞外合成分子に対する依存により、多くの生細胞試料の長期間観察等の条件におけるこのようなプローブの応用は制限されている。
【課題を解決するための手段】
【0014】
プローブの機能上では、本発明は、１）プローブ構造の全遺伝子コードを実現し、合成蛍光リガンド分子の共鳴エネルギー転移に依存しないＮＡＤ＋の定量を完成させる。２）プローブシグナルの自己校正、即ち、二重波長光強度比に基づくＮＡＤ＋の定量を実現させる。
【0015】
本発明は、幾つかの共鳴エネルギー転移に基づく全遺伝子コードＮＡＤ＋分子プローブを提供する。該シリーズの分子プローブは、インビトロ及び細胞内でＮＡＤ＋分子に応答することができ、高特異性、適切なＣ５０値（５０％のプローブの立体配座変化を招く場合の供試物の濃度）及び高ダイナミックレンジ等のメリットを有する。
【0016】
本発明の一態様では、共鳴エネルギー転移ドナー、ＮＡＤ＋応答タンパク質及び共鳴エネルギー転移アクセプターから直列接続されてなる全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブであって、ＮＡＤ＋応答タンパク質は、ＤＮＡリガーゼの突然変異体であり、前記ＤＮＡリガーゼの突然変異体の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される通りであり、前記共鳴エネルギー転移ドナーは、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質から選ばれ、前記共鳴エネルギー転移アクセプターは、蛍光タンパク質ら選ばれ、かつ共鳴エネルギー転移アクセプターの蛍光タンパク質として、共鳴エネルギー転移ドナーの蛍光タンパク質と異なる全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブを提供する。
【0017】
さらに、共鳴エネルギー転移ドナーは、環状に配列される生物発光タンパク質ｃｐＮＬｕｃ（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ ｐｅｒｍｕｔｅｄ Ｎａｎｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）又は緑色蛍光タンパク質ｍＮｅｏＧｒｅｅｎから選ばれる。よりさらに、環状に配列される生物発光タンパク質ｃｐＮＬｕｃは、Ｇ４Ｖ突然変異が組み込まれた生物発光タンパク質ｃｐＮＬｕｃである。より好ましくは、ｃｐＮＬｕｃの突然変異体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８である。緑色蛍光タンパク質ｍＮｅｏＧｒｅｅｎの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３である。
【0018】
さらに、共鳴エネルギー転移アクセプターは、緑色蛍光タンパク質ｍＮｅｏＧｒｅｅｎ又は赤色蛍光タンパク質ｍＳｃａｒｌｅｔから選ばれる。よりさらに、赤色蛍光タンパク質ｍＳｃａｒｌｅｔはその中の残基Ｇ２２５を欠失させた赤色蛍光タンパク質ｍＳｃａｒｌｅｔである。より好ましくは、ｍＳｃａｒｌｅｔの突然変異体配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２である。緑色蛍光タンパク質ｍＮｅｏＧｒｅｅｎの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３である。
【0019】
さらに、前記ＮＡＤ＋タンパク質プローブは、ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体、ＬｉｇＡ突然変異体及びｃｐＮＬｕｃ突然変異体から直列接続されて構成され、好ましくは、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７である。
【0020】
さらに、前記ＮＡＤ＋タンパク質プローブは、ｍＮｅｏＧｒｅｅｎ突然変異体、ＬｉｇＡ突然変異体及びｃｐＮＬｕｃ突然変異体から直列接続されて構成され、好ましくは、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９である。
【0021】
さらに、前記ＮＡＤ＋タンパク質プローブは、ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体、ＬｉｇＡ突然変異体及びｍＮｅｏＧｒｅｅｎ突然変異体タンパク質から構成され、好ましくは、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１である。
【0022】
プローブの構造では、本発明は、１）立体配座がＮＡＤ＋によって激しく調節される１つのタンパク質ドメイン、即ち、ＮＡＤ＋応答タンパク質を設計し、２）ＮＡＤ＋応答タンパク質のＮ末端及びＣ末端を、それぞれ、共鳴エネルギー転移現象を形成できるドナー及びアクセプターと融合させる。該共鳴エネルギー転移ドナー及びアクセプターは、それぞれ、１つのルシフェラーゼと１つの蛍光タンパク質、又は２つの異なる色の蛍光タンパク質である。３）ＮＡＤ＋応答タンパク質と、共鳴エネルギー転移ドナーと、アクセプターとの間の連結方法を最適化して、プローブのダイナミックレンジを最大化する。４）ＮＡＤ＋応答タンパク質とＮＡＤ＋の結合サイトを最適化して、プローブがＮＡＤ＋を検出する濃度範囲を調整する。
【0023】
本発明の別の態様では、ＮＡＤ＋濃度を検出する薬剤の調製における上記ＮＡＤ＋タンパク質プローブの使用を提供する。
【0024】
本発明のまた別の態様では、上記ＮＡＤ＋分子プローブを含むＮＡＤ＋濃度を検出する組成物を提供する。
【0025】
さらに、前記組成物に緩衝液をさらに含む。
【0026】
さらに、前記組成物に生物発光基質、例えばＦｕｒｉｍａｚｉｎｅをさらに含む。
【0027】
本発明のさらに別の態様では、上記ＮＡＤ＋タンパク質プローブをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【0028】
本発明のさらに別の態様では、上記ヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【0029】
好ましくは、前記ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、例えばｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｎｅｏベクター又はｐｃＤＮＡ３．１ベクターである。
【0030】
本発明のさらに別の態様では、上記ＮＡＤ＋タンパク質プローブを発現できる細胞を提供する。
【0031】
好ましくは、前記細胞は、生細胞に上記ベクターを形質転換することで得られ、前記ベクターは細胞において上記ＮＡＤ＋タンパク質プローブを翻訳して得ることができる。
【0032】
好ましくは、前記生細胞は、ヒト又は動物の任意の細胞を選択することができ、例えばＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、及びＨｅｐ Ｇ２等から選ばれる。
【0033】
本発明のさらに別の態様では、ＮＡＤ＋を調製研究する実験モデルにおける上記細胞の使用を提供する。
【0034】
好ましくは、前記実験モデルは、ＮＡＤ＋アゴニスト又は阻害剤の研究に用いられる。
【0035】
本発明のさらに別の態様では、
【0036】
Ｓ１１）本発明の上記タンパク質プローブを用いて、ＮＡＤ＋濃度が検出される薬剤と混合させるステップと、
【0037】
Ｓ１２）それぞれ、プローブにおける共鳴エネルギー転移ドナー及び共鳴エネルギー転移アクセプターの最大発光波長で発光強度を検出し、両者の発光強度比を計算するステップと、
【0038】
Ｓ１３）標準曲線に回帰して対応するＮＡＤ＋濃度を得るステップ、もしくは、
【0039】
Ｓ１３）異なる時点での発光強度比を検出して、異なる時点でのＮＡＤ＋濃度変化のトレンドを得るステップ、もしくは、
【0040】
Ｓ１３）異なる活性成分を添加した後、発光強度比の変化を検出し、異なる活性成分のＮＡＤ＋濃度変化に対する影響を得るステップと、を含むＮＡＤ＋濃度を検出する方法を提供する。
【0041】
好ましくは、ステップＳ１１）では、前記タンパク質プローブにおける共鳴エネルギー転移ドナーがルシフェラーゼである場合、発光強度を検出する前に、さらに生物発光基質を添加する必要がある。
【0042】
好ましくは、ステップＳ１３）では、標準曲線の調製方法として、異なる標準濃度のＮＡＤ＋を用い、それぞれステップＳ１１～Ｓ１２により、異なる濃度に対応するＮＡＤ＋が対応する発光強度比を検出し、ＮＡＤ＋濃度の対数値を横軸とし、発光強度比を縦軸として標準曲線を作成する。
【0043】
本発明のさらに別の態様では、
【0044】
Ｓ２１）上記ベクターをレンチウイルス感染法により供試細胞に形質転換し、蛍光タンパク質の蛍光シグナルをマーカーとして選別することにより、供試安定細胞株を得るステップと、
【0045】
Ｓ２２）それぞれ、ベクター中のヌクレオチドがコードするＮＡＤ＋タンパク質プローブにおける共鳴エネルギー転移ドナー及び共鳴エネルギー転移アクセプターの最大発光波長で発光強度を検出し、両者の発光強度比を計算するステップと、
【0046】
Ｓ２３）標準曲線に回帰して対応する細胞におけるＮＡＤ＋濃度を得るステップ、もしくは、
【0047】
Ｓ２３）異なる時点での発光強度比を検出し、異なる時点での細胞におけるＮＡＤ＋濃度変化のトレンドを得るステップ、もしくは、
【0048】
Ｓ２３）異なる活性成分を添加した後、発光強度比の変化を検出し、異なる活性成分の細胞におけるＮＡＤ＋濃度変化に対する影響を得るステップと、を含む生細胞におけるＮＡＤ＋濃度を検出する方法を提供する。
【0049】
プローブの応用において、本発明は、ＮＡＤ＋共鳴エネルギー転移タンパク質プローブを安定発現した細胞株を構築して、生細胞におけるＮＡＤ＋濃度が特徴付けられている。
【発明の効果】
【0050】
本発明は、共鳴エネルギー転移に基づく全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブを新しく実現した。背景技術において、全遺伝子がコードするＮＡＤ＋タンパク質プローブは、共鳴エネルギー転移原理に基づくものではなく、蛍光タンパク質の放出光強度のみにより、ＮＡＤ＋定量を実現することができ、プローブ分子発現量の動的差異がＮＡＤ＋定量に与える著しい干渉を取り除きにくい。別の背景技術では、半合成設計を使用し、共鳴エネルギー転移に基づくＮＡＤ＋定量を実現し、プローブ分子の発現量による干渉を解決したが、非遺伝子コード合成分子に対する依存性により、生細胞における半合成プローブの使用が制限されている。半合成されたプローブ（そのうちの一部はアミノ酸配列ではなく、細胞においてコードすることができない）に対して、全遺伝子コード型プローブの難しい課題は、半合成プローブに匹敵する大きな立体配座変化を実現するための適切なタンパク質の断片及び設計方法を見つけにくいことである。しかし、本発明は、この課題を突破した。そして、本発明によって提供されるＮＡＤ＋タンパク質プローブは、共鳴エネルギー転移に基づくＮＡＤ＋定量及びプローブの全遺伝子コードを実現し、即ち、二重波長光強度比に基づくＮＡＤ＋定量などのプローブシグナルの自己校正を実現するだけでなく、合成蛍光リガンド分子に依存しない生細胞のＮＡＤ＋監視も実現する。
【0051】
同時に、本発明は、全く新しく、より良い機能を有するＮＡＤ＋タンパク質プローブのアミノ酸配列を明らかにしている。背景技術と比較して、本発明によって提供される全遺伝子コードＮＡＤ＋タンパク質プローブは、完全に異なるアミノ酸配列を有する。なかでも、本プローブによって使用されるＮＡＤ＋応答タンパク質は、全く新しく、ドメイン界面残基の突然変異（Ｒ６８Ｎ／Ｒ１６３Ｄ又はＲ６８Ｎ／Ｒ１６３Ｐ）を含有するＤＮＡリガーゼＬｉｇＡ突然変異体である。同時に、本プローブは、全く新しい連結方法を使用して、ＮＡＤ＋応答タンパク質と、共鳴エネルギー転移ドナーと、アクセプターとを直列接続させ、具体的には、ｍＳｃａｒｌｅｔの残基Ｇ２２５、ＬｉｇＡの残基Ｐ５、ｃｐＮｌｕｃの残基Ｇ１、Ｌ２及びＳ３を欠失させ、ｃｐＮｌｕｃ画分にＧ４Ｖ突然変異を組み込むと表現される。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1A】図１Ａは、本発明が共鳴エネルギー転移に基づくＮＡＤ＋分子プローブにより、ＮＡＤ＋分子濃度を検出する原理図である。本発明では、図１Ａに示すように、ＮＡＤ＋がタンパク質非結合ＮＡＤ＋分子に応答する場合、プローブ構造は「開」状態にあることで、共鳴エネルギー転移ドナーとアクセプターとの間の距離が遠く、共鳴エネルギー転移効率が低く、プローブ全体は共鳴エネルギー転移ドナーの光を発する。ＮＡＤ＋がタンパク質結合ＮＡＤ＋分子に応答した後、その立体配座は「開」状態から「閉」状態に移行することで、共鳴エネルギー転移ドナーとアクセプターとを近づけ、高い共鳴エネルギー転移効率となり、プローブは共鳴エネルギー転移アクセプターの光を発する。ＮＡＤ＋分子による共鳴エネルギー転移効率の変化は、最終的に、プローブにおける共鳴エネルギー転移ドナー及びアクセプターの放出波長強度の変化と表現される。該放出光強度比は、さらに系中のＮＡＤ＋分子の濃度を示すことができる。
【0053】
【0054】
【0055】
【0056】
【発明を実施するための形態】
【0057】
本発明の上記目的、特徴及びメリットをより明確で分かりやすくするために、以下、本発明の具体的実施の態様を詳しく説明するが、本発明の実施可能な範囲を限定するものと理解され得ない。
【0058】
実施例１ ＮＡＤ＋分子プローブの調製
【0059】
ＮＡＤ＋分子プローブを調製し、プローブ配列は以下のように示される。
【0060】
ＮＡＤＳ１．０の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される通りである。
【0061】
ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体－ＬｉｇＡ突然変異体－ｃｐＮｌｕｃ突然変異体。
【0062】
ＭＶＳＫＧＥＡＶＩＫＥＦＭＲＦＫＶＨＭＥＧＳＭＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＳＷＤＩＬＳＰＱＦＭＹＧＳＲＡＦＴＫＨＰＡＤＩＰＤＹＹＫＱＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＩＮＦＥＤＧＧＡＶＴＶＴＱＤＴＳＬＥＤＧＴＬＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＰＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＴＥＲＬＹＰＥＤＧＶＬＫＧＤＩＫＭＡＬＲＬＫＤＧＧＲＹＬＡＤＦＫＴＴＹＫＡＫＫＰＶＱＭＰＧＡＹＮＶＤＲＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＶＶＥＱＹＥＲＳＥＧＲＨＳＴＬＴＬＴＡＡＴＴＲＡＱＥＬＲＫＱＬＮＱＹＳＨＥＹＹＶＫＤＱＰＳＶＥＤＹＶＹＤＲＬＹＫＥＬＶＤＩＥＴＥＦＰＤＬＩＴＰＤＳＰＴＱＮＶＧＧＫＶＬＳＧＦＥＫＡＰＨＤＩＰＭＹＳＬＮＤＧＦＳＫＥＤＩＦＡＦＤＥＲＶＲＫＡＩＧＫＰＶＡＹＣＣＥＬＬＩＤＧＬＡＩＳＬＲＹＥＮＧＶＦＶＲＧＡＴＲＧＤＧＴＶＧＥＮＩＴＥＮＬＲＴＶＲＳＶＰＭＤＬＴＥＰＩＳＶＥＶＲＧＥＣＹＭＰＫＱＳＦＶＡＬＮＥＥＲＥＥＮＧＱＤＩＦＡＮＰＲＮＡＡＡＧＳＬＲＱＬＤＴＫＩＶＡＫＲＮＬＮＴＦＬＹＴＶＡＤＦＧＰＭＫＡＫＴＱＦＥＡＬＥＥＬＳＡＩＧＦＲＴＮＰＥＲＱＬＣＱＳＩＤＥＶＷＡＹＩＥＥＹＨＥＫＲＳＴＬＰＹＥＩＮＧＩＶＩＫＶＮＥＦＡＬＱＤＥＬＧＦＴＶＫＡＰＲＷＡＩＡＹＫＦＰＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡＧＧＴＧＧＳＧＧＴＧＧＳＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１
【0063】
なかでも、ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される通りである。ＭＶＳＫＧＥＡＶＩＫＥＦＭＲＦＫＶＨＭＥＧＳＭＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＳＷＤＩＬＳＰＱＦＭＹＧＳＲＡＦＴＫＨＰＡＤＩＰＤＹＹＫＱＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＮＦＥＤＧＧＡＶＴＶＴＱＤＴＳＬＥＤＧＴＬＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＰＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＴＥＲＬＹＰＥＤＧＶＬＫＧＤＩＫＭＡＬＲＬＫＤＧＧＲＹＬＡＤＦＫＴＴＹＫＡＫＫＰＶＱＭＰＧＡＹＮＶＤＲＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＶＶＥＱＹＥＲＳＥＧＲＨＳＴ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２
【0064】
ＬｉｇＡ突然変異体１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示される通りである。
【0065】
ＬＴＬＴＡＡＴＴＲＡＱＥＬＲＫＱＬＮＱＹＳＨＥＹＹＶＫＤＱＰＳＶＥＤＹＶＹＤＲＬＹＫＥＬＶＤＩＥＴＥＦＰＤＬＩＴＰＤＳＰＴＱＮＶＧＧＫＶＬＳＧＦＥＫＡＰＨＤＩＰＭＹＳＬＮＤＧＦＳＫＥＤＩＦＡＦＤＥＲＶＲＫＡＩＧＫＰＶＡＹＣＣＥＬＬＩＤＧＬＡＩＳＬＲＹＥＮＧＶＦＶＲＧＡＴＲＧＤＧＴＶＧＥＮＩＴＥＮＬＲＴＶＲＳＶＰＭＤＬＴＥＰＩＳＶＥＶＲＧＥＣＹＭＰＫＱＳＦＶＡＬＮＥＥＲＥＥＮＧＱＤＩＦＡＮＰＲＮＡＡＡＧＳＬＲＱＬＤＴＫＩＶＡＫＲＮＬＮＴＦＬＹＴＶＡＤＦＧＰＭＫＡＫＴＱＦＥＡＬＥＥＬＳＡＩＧＦＲＴＮＰＥＲＱＬＣＱＳＩＤＥＶＷＡＹＩＥＥＹＨＥＫＲＳＴＬＰＹＥＩＮＧＩＶＩＫＶＮＥＦＡＬＱＤＥＬＧＦＴＶＫＡＰＲＷＡＩＡＹＫＦＰ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３
【0066】
ｃｐＮｌｕｃ突然変異体１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される通りである。
【0067】
ＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡＧＧＴＧＧＳＧＧＴＧＧＳＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４
【0068】
ＮＡＤＳ１．１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示される通りである。
【0069】
ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体－ＬｉｇＡ突然変異体－ｃｐＮｌｕｃ突然変異体
【0070】
ＭＶＳＫＧＥＡＶＩＫＥＦＭＲＦＫＶＨＭＥＧＳＭＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＳＷＤＩＬＳＰＱＦＭＹＧＳＲＡＦＴＫＨＰＡＤＩＰＤＹＹＫＱＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＮＦＥＤＧＧＡＶＴＶＴＱＤＴＳＬＥＤＧＴＬＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＰＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＴＥＲＬＹＰＥＤＧＶＬＫＧＤＩＫＭＡＬＲＬＫＤＧＧＲＹＬＡＤＦＫＴＴＹＫＡＫＫＰＶＱＭＰＧＡＹＮＶＤＲＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＶＶＥＱＹＥＲＳＥＧＲＨＳＴＬＴＬＴＡＡＴＴＲＡＱＥＬＲＫＱＬＮＱＹＳＨＥＹＹＶＫＤＱＰＳＶＥＤＹＶＹＤＲＬＹＫＥＬＶＤＩＥＴＥＦＰＤＬＩＴＰＤＳＰＴＱＮＶＧＧＫＶＬＳＧＦＥＫＡＰＨＤＩＰＭＹＳＬＮＤＧＦＳＫＥＤＩＦＡＦＤＥＲＶＲＫＡＩＧＫＰＶＡＹＣＣＥＬＬＩＤＧＬＡＩＳＬＲＹＥＮＧＶＦＶＲＧＡＴＲＧＤＧＴＶＧＥＮＩＴＥＮＬＲＴＶＲＳＶＰＭＰＬＴＥＰＩＳＶＥＶＲＧＥＣＹＭＰＫＱＳＦＶＡＬＮＥＥＲＥＥＮＧＱＤＩＦＡＮＰＲＮＡＡＡＧＳＬＲＱＬＤＴＫＩＶＡＫＲＮＬＮＴＦＬＹＴＶＡＤＦＧＰＭＫＡＫＴＱＦＥＡＬＥＥＬＳＡＩＧＦＲＴＮＰＥＲＱＬＣＱＳＩＤＥＶＷＡＹＩＥＥＹＨＥＫＲＳＴＬＰＹＥＩＮＧＩＶＩＫＶＮＥＦＡＬＱＤＥＬＧＦＴＶＫＡＰＲＷＡＩＡＹＫＦＰＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡＧＧＴＧＧＳＧＧＴＧＧＳＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５
【0071】
ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される通りである。
【0072】
ＭＶＳＫＧＥＡＶＩＫＥＦＭＲＦＫＶＨＭＥＧＳＭＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＳＷＤＩＬＳＰＱＦＭＹＧＳＲＡＦＴＫＨＰＡＤＩＰＤＹＹＫＱＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＮＦＥＤＧＧＡＶＴＶＴＱＤＴＳＬＥＤＧＴＬＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＰＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＴＥＲＬＹＰＥＤＧＶＬＫＧＤＩＫＭＡＬＲＬＫＤＧＧＲＹＬＡＤＦＫＴＴＹＫＡＫＫＰＶＱＭＰＧＡＹＮＶＤＲＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＶＶＥＱＹＥＲＳＥＧＲＨＳＴ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２
【0073】
ＬｉｇＡ突然変異体２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される通りである。
【0074】
ＬＮＱＹＳＨＥＹＹＶＫＤＱＰＳＶＥＤＹＶＹＤＲＬＹＫＥＬＶＤＩＥＴＥＦＰＤＬＩＴＰＤＳＰＴＱＮＶＧＧＫＶＬＳＧＦＥＫＡＰＨＤＩＰＭＹＳＬＮＤＧＦＳＫＥＤＩＦＡＦＤＥＲＶＲＫＡＩＧＫＰＶＡＹＣＣＥＬＬＩＤＧＬＡＩＳＬＲＹＥＮＧＶＦＶＲＧＡＴＲＧＤＧＴＶＧＥＮＩＴＥＮＬＲＴＶＲＳＶＰＭＰＬＴＥＰＩＳＶＥＶＲＧＥＣＹＭＰＫＱＳＦＶＡＬＮＥＥＲＥＥＮＧＱＤＩＦＡＮＰＲＮＡＡＡＧＳＬＲＱＬＤＴＫＩＶＡＫＲＮＬＮＴＦＬＹＴＶＡＤＦＧＰＭＫＡＫＴＱＦＥＡＬＥＥＬＳＡＩＧＦＲＴＮＰＥＲＱＬＣＱＳＩＤＥＶＷＡＹＩＥＥＹＨＥＫＲＳＴＬＰＹＥＩＮＧＩＶＩＫＶＮＥＦＡＬＱＤＥＬＧＦＴＶＫＡＰＲＷＡＩＡＹＫＦＰ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６
【0075】
ｃｐＮｌｕｃ突然変異体１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される通りである。
【0076】
ＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡＧＧＴＧＧＳＧＧＴＧＧＳＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４．
【0077】
ＮＡＤＳ１．２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示される通りである。
【0078】
ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体－ＬｉｇＡ突然変異体－ｃｐＮｌｕｃ突然変異体
【0079】
ＭＶＳＫＧＥＡＶＩＫＥＦＭＲＦＫＶＨＭＥＧＳＭＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＳＷＤＩＬＳＰＱＦＭＹＧＳＲＡＦＴＫＨＰＡＤＩＰＤＹＹＫＱＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＮＦＥＤＧＧＡＶＴＶＴＱＤＴＳＬＥＤＧＴＬＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＰＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＴＥＲＬＹＰＥＤＧＶＬＫＧＤＩＫＭＡＬＲＬＫＤＧＧＲＹＬＡＤＦＫＴＴＹＫＡＫＫＰＶＱＭＰＧＡＹＮＶＤＲＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＶＶＥＱＹＥＲＳＥＧＲＨＳＴＬＴＬＴＡＡＴＴＲＡＱＥＬＲＫＱＬＮＱＹＳＨＥＹＹＶＫＤＱＰＳＶＥＤＹＶＹＤＲＬＹＫＥＬＶＤＩＥＴＥＦＰＤＬＩＴＰＤＳＰＴＱＮＶＧＧＫＶＬＳＧＦＥＫＡＰＨＤＩＰＭＹＳＬＮＤＧＦＳＫＥＤＩＦＡＦＤＥＲＶＲＫＡＩＧＫＰＶＡＹＣＣＥＬＬＩＤＧＬＡＩＳＬＲＹＥＮＧＶＦＶＲＧＡＴＲＧＤＧＴＶＧＥＮＩＴＥＮＬＲＴＶＲＳＶＰＭＤＬＴＥＰＩＳＶＥＶＲＧＥＣＹＭＰＫＱＳＦＶＡＬＮＥＥＲＥＥＮＧＱＤＩＦＡＮＰＲＮＡＡＧＳＬＲＱＬＤＴＫＩＶＡＫＲＮＬＮＴＦＬＹＴＶＡＤＦＧＰＭＫＡＫＴＱＦＥＡＬＥＥＬＳＡＩＧＦＲＴＮＰＥＲＱＬＣＱＳＩＤＥＶＷＡＹＩＥＥＹＨＥＫＲＳＴＬＰＹＥＩＮＧＩＶＩＫＶＮＥＦＡＬＱＤＥＬＧＦＴＶＫＡＰＲＷＡＩＡＹＫＦＰＶＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡＧＧＴＧＧＳＧＧＴＧＧＳＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７
【0080】
ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される通りである。
【0081】
ＭＶＳＫＧＥＡＶＩＫＥＦＭＲＦＫＶＨＭＥＧＳＭＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＳＷＤＩＬＳＰＱＦＭＹＧＳＲＡＦＴＫＨＰＡＤＩＰＤＹＹＫＱＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＮＦＥＤＧＧＡＶＴＶＴＱＤＴＳＬＥＤＧＴＬＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＰＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＴＥＲＬＹＰＥＤＧＶＬＫＧＤＩＫＭＡＬＲＬＫＤＧＧＲＹＬＡＤＦＫＴＴＹＫＡＫＫＰＶＱＭＰＧＡＹＮＶＤＲＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＶＶＥＱＹＥＲＳＥＧＲＨＳＴ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２
【0082】
ＬｉｇＡ突然変異体１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示される通りである。
【0083】
ＬＴＬＴＡＡＴＴＲＡＱＥＬＲＫＱＬＮＱＹＳＨＥＹＹＶＫＤＱＰＳＶＥＤＹＶＹＤＲＬＹＫＥＬＶＤＩＥＴＥＦＰＤＬＩＴＰＤＳＰＴＱＮＶＧＧＫＶＬＳＧＦＥＫＡＰＨＤＩＰＭＹＳＬＮＤＧＦＳＫＥＤＩＦＡＦＤＥＲＶＲＫＡＩＧＫＰＶＡＹＣＣＥＬＬＩＤＧＬＡＩＳＬＲＹＥＮＧＶＦＶＲＧＡＴＲＧＤＧＴＶＧＥＮＩＴＥＮＬＲＴＶＲＳＶＰＭＤＬＴＥＰＩＳＶＥＶＲＧＥＣＹＭＰＫＱＳＦＶＡＬＮＥＥＲＥＥＮＧＱＤＩＦＡＮＰＲＮＡＡＡＧＳＬＲＱＬＤＴＫＩＶＡＫＲＮＬＮＴＦＬＹＴＶＡＤＦＧＰＭＫＡＫＴＱＦＥＡＬＥＥＬＳＡＩＧＦＲＴＮＰＥＲＱＬＣＱＳＩＤＥＶＷＡＹＩＥＥＹＨＥＫＲＳＴＬＰＹＥＩＮＧＩＶＩＫＶＮＥＦＡＬＱＤＥＬＧＦＴＶＫＡＰＲＷＡＩＡＹＫＦＰ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３
【0084】
ｃｐＮｌｕｃ突然変異体２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される通りである。
【0085】
ＶＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡＧＧＴＧＧＳＧＧＴＧＧＳＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８
【0086】
ＮＡＤＳ２．０の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示される通りである。
【0087】
ｍＮｅｏＧｒｅｅｎ突然変異体－ＬｉｇＡ突然変異体－ｃｐＮｌｕｃ突然変異体
【0088】
ＭＡＳＬＰＡＴＨＥＬＨＩＦＧＳＩＮＧＶＤＦＤＭＶＧＱＧＴＧＮＰＮＤＧＹＥＥＬＮＬＫＳＴＫＧＤＬＱＦＳＰＷＩＬＶＰＨＩＧＹＧＦＨＱＹＬＰＹＰＤＧＭＳＰＦＱＡＡＭＶＤＧＳＧＹＱＶＨＲＴＭＱＦＥＤＧＡＳＬＴＶＮＹＲＹＴＹＥＧＳＨＩＫＧＥＡＱＶＫＧＴＧＦＰＡＤＧＰＶＭＴＮＳＬＴＡＡＤＷＣＲＳＫＫＴＹＰＮＤＫＴＩＩＳＴＦＫＷＳＹＴＴＧＮＧＫＲＹＲＳＴＡＲＴＴＹＴＦＡＫＰＭＡＡＮＹＬＫＮＱＰＭＹＶＦＲＫＴＥＬＫＨＳＫＴＥＬＮＦＫＥＷＱＫＡＦＴＤＫＬＴＬＴＡＡＴＴＲＡＱＥＬＲＫＱＬＮＱＹＳＨＥＹＹＶＫＤＱＰＳＶＥＤＹＶＹＤＲＬＹＫＥＬＶＤＩＥＴＥＦＰＤＬＩＴＰＤＳＰＴＱＮＶＧＧＫＶＬＳＧＦＥＫＡＰＨＤＩＰＭＹＳＬＮＤＧＦＳＫＥＤＩＦＡＦＤＥＲＶＲＫＡＩＧＫＰＶＡＹＣＣＥＬＬＩＤＧＬＡＩＳＬＲＹＥＮＧＶＦＶＲＧＡＴＲＧＤＧＴＶＧＥＮＩＴＥＮＬＲＴＶＲＳＶＰＭＤＬＴＥＰＩＳＶＥＶＲＧＥＣＹＭＰＫＱＳＦＶＡＬＮＥＥＲＥＥＮＧＱＤＩＦＡＮＰＲＮＡＡＡＧＳＬＲＱＬＤＴＫＩＶＡＫＲＮＬＮＴＦＬＹＴＶＡＤＦＧＰＭＫＡＫＴＱＦＥＡＬＥＥＬＳＡＩＧＦＲＴＮＰＥＲＱＬＣＱＳＩＤＥＶＷＡＹＩＥＥＹＨＥＫＲＳＴＬＰＹＥＩＮＧＩＶＩＫＶＮＥＦＡＬＱＤＥＬＧＦＴＶＫＡＰＲＷＡＩＡＹＫＦＰＶＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡＧＧＴＧＧＳＧＧＴＧＧＳＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９
【0089】
ｍＮｅｏＧｒｅｅｎ突然変異体１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示される通りである。
【0090】
ＭＡＳＬＰＡＴＨＥＬＨＩＦＧＳＩＮＧＶＤＦＤＭＶＧＱＧＴＧＮＰＮＤＧＹＥＥＬＮＬＫＳＴＫＧＤＬＱＦＳＰＷＩＬＶＰＨＩＧＹＧＦＨＱＹＬＰＹＰＤＧＭＳＰＦＱＡＡＭＶＤＧＳＧＹＱＶＨＲＴＭＱＦＥＤＧＡＳＬＴＶＮＹＲＹＴＹＥＧＳＨＩＫＧＥＡＱＶＫＧＴＧＦＰＡＤＧＰＶＭＴＮＳＬＴＡＡＤＷＣＲＳＫＫＴＹＰＮＤＫＴＩＩＳＴＦＫＷＳＹＴＴＧＮＧＫＲＹＲＳＴＡＲＴＴＹＴＦＡＫＰＭＡＡＮＹＬＫＮＱＰＭＹＶＦＲＫＴＥＬＫＨＳＫＴＥＬＮＦＫＥＷＱＫＡＦＴＤＫ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０
【0091】
ＬｉｇＡ突然変異体１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示される通りである。
【0092】
ＬＴＬＴＡＡＴＴＲＡＱＥＬＲＫＱＬＮＱＹＳＨＥＹＹＶＫＤＱＰＳＶＥＤＹＶＹＤＲＬＹＫＥＬＶＤＩＥＴＥＦＰＤＬＩＴＰＤＳＰＴＱＮＶＧＧＫＶＬＳＧＦＥＫＡＰＨＤＩＰＭＹＳＬＮＤＧＦＳＫＥＤＩＦＡＦＤＥＲＶＲＫＡＩＧＫＰＶＡＹＣＣＥＬＬＩＤＧＬＡＩＳＬＲＹＥＮＧＶＦＶＲＧＡＴＲＧＤＧＴＶＧＥＮＩＴＥＮＬＲＴＶＲＳＶＰＭＤＬＴＥＰＩＳＶＥＶＲＧＥＣＹＭＰＫＱＳＦＶＡＬＮＥＥＲＥＥＮＧＱＤＩＦＡＮＰＲＮＡＡＡＧＳＬＲＱＬＤＴＫＩＶＡＫＲＮＬＮＴＦＬＹＴＶＡＤＦＧＰＭＫＡＫＴＱＦＥＡＬＥＥＬＳＡＩＧＦＲＴＮＰＥＲＱＬＣＱＳＩＤＥＶＷＡＹＩＥＥＹＨＥＫＲＳＴＬＰＹＥＩＮＧＩＶＩＫＶＮＥＦＡＬＱＤＥＬＧＦＴＶＫＡＰＲＷＡＩＡＹＫＦＰ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３
【0093】
ｃｐＮｌｕｃ突然変異体２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される通りである。
【0094】
ＶＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡＧＧＴＧＧＳＧＧＴＧＧＳＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８
【0095】
ＮＡＤＳ３．０の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示される通りである。
【0096】
ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体－ＬｉｇＡ突然変異体－ｍＮｅｏＧｒｅｅｎ突然変異体
【0097】
ＭＶＳＫＧＥＡＶＩＫＥＦＭＲＦＫＶＨＭＥＧＳＭＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＳＷＤＩＬＳＰＱＦＭＹＧＳＲＡＦＴＫＨＰＡＤＩＰＤＹＹＫＱＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＮＦＥＤＧＧＡＶＴＶＴＱＤＴＳＬＥＤＧＴＬＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＰＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＴＥＲＬＹＰＥＤＧＶＬＫＧＤＩＫＭＡＬＲＬＫＤＧＧＲＹＬＡＤＦＫＴＴＹＫＡＫＫＰＶＱＭＰＧＡＹＮＶＤＲＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＶＶＥＱＹＥＲＳＥＧＲＨＬＴＬＴＬＴＡＡＴＴＲＡＱＥＬＲＫＱＬＮＱＹＳＨＥＹＹＶＫＤＱＰＳＶＥＤＹＶＹＤＲＬＹＫＥＬＶＤＩＥＴＥＦＰＤＬＩＴＰＤＳＰＴＱＮＶＧＧＫＶＬＳＧＦＥＫＡＰＨＤＩＰＭＹＳＬＮＤＧＦＳＫＥＤＩＦＡＦＤＥＲＶＲＫＡＩＧＫＰＶＡＹＣＣＥＬＬＩＤＧＬＡＩＳＬＲＹＥＮＧＶＦＶＲＧＡＴＲＧＤＧＴＶＧＥＮＩＴＥＮＬＲＴＶＲＳＶＰＭＤＬＴＥＰＩＳＶＥＶＲＧＥＣＹＭＰＫＱＳＦＶＡＬＮＥＥＲＥＥＮＧＱＤＩＦＡＮＰＲＮＡＡＡＧＳＬＲＱＬＤＴＫＩＶＡＫＲＮＬＮＴＦＬＹＴＶＡＤＦＧＰＭＫＡＫＴＱＦＥＡＬＥＥＬＳＡＩＧＦＲＴＮＰＥＲＱＬＣＱＳＩＤＥＶＷＡＹＩＥＥＹＨＥＫＲＳＴＬＰＹＥＩＮＧＩＶＩＫＶＮＥＦＡＬＱＤＥＬＧＦＴＶＫＡＰＲＷＡＩＡＹＫＦＰＰＰＡＴＨＥＬＨＩＦＧＳＩＮＧＶＤＦＤＭＶＧＱＧＴＧＮＰＮＤＧＹＥＥＬＮＬＫＳＴＫＧＤＬＱＦＳＰＷＩＬＶＰＨＩＧＹＧＦＨＱＹＬＰＹＰＤＧＭＳＰＦＱＡＡＭＶＤＧＳＧＹＱＶＨＲＴＭＱＦＥＤＧＡＳＬＴＶＮＹＲＹＴＹＥＧＳＨＩＫＧＥＡＱＶＫＧＴＧＦＰＡＤＧＰＶＭＴＮＳＬＴＡＡＤＷＣＲＳＫＫＴＹＰＮＤＫＴＩＩＳＴＦＫＷＳＹＴＴＧＮＧＫＲＹＲＳＴＡＲＴＴＹＴＦＡＫＰＭＡＡＮＹＬＫＮＱＰＭＹＶＦＲＫＴＥＬＫＨＳＫＴＥＬＮＦＫＥＷＱＫＡＦＴＤＶＭＧＭＤＥＬＹＫ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１
【0098】
ｍＳｃａｒｌｅｔ突然変異体２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示される通りである。
【0099】
ＭＶＳＫＧＥＡＶＩＫＥＦＭＲＦＫＶＨＭＥＧＳＭＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＳＷＤＩＬＳＰＱＦＭＹＧＳＲＡＦＴＫＨＰＡＤＩＰＤＹＹＫＱＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＮＦＥＤＧＧＡＶＴＶＴＱＤＴＳＬＥＤＧＴＬＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＰＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＴＥＲＬＹＰＥＤＧＶＬＫＧＤＩＫＭＡＬＲＬＫＤＧＧＲＹＬＡＤＦＫＴＴＹＫＡＫＫＰＶＱＭＰＧＡＹＮＶＤＲＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＶＶＥＱＹＥＲＳＥＧＲＨＬＴ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２
【0100】
ＬｉｇＡ突然変異体１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示される通りである。
【0101】
ＬＴＬＴＡＡＴＴＲＡＱＥＬＲＫＱＬＮＱＹＳＨＥＹＹＶＫＤＱＰＳＶＥＤＹＶＹＤＲＬＹＫＥＬＶＤＩＥＴＥＦＰＤＬＩＴＰＤＳＰＴＱＮＶＧＧＫＶＬＳＧＦＥＫＡＰＨＤＩＰＭＹＳＬＮＤＧＦＳＫＥＤＩＦＡＦＤＥＲＶＲＫＡＩＧＫＰＶＡＹＣＣＥＬＬＩＤＧＬＡＩＳＬＲＹＥＮＧＶＦＶＲＧＡＴＲＧＤＧＴＶＧＥＮＩＴＥＮＬＲＴＶＲＳＶＰＭＤＬＴＥＰＩＳＶＥＶＲＧＥＣＹＭＰＫＱＳＦＶＡＬＮＥＥＲＥＥＮＧＱＤＩＦＡＮＰＲＮＡＡＡＧＳＬＲＱＬＤＴＫＩＶＡＫＲＮＬＮＴＦＬＹＴＶＡＤＦＧＰＭＫＡＫＴＱＦＥＡＬＥＥＬＳＡＩＧＦＲＴＮＰＥＲＱＬＣＱＳＩＤＥＶＷＡＹＩＥＥＹＨＥＫＲＳＴＬＰＹＥＩＮＧＩＶＩＫＶＮＥＦＡＬＱＤＥＬＧＦＴＶＫＡＰＲＷＡＩＡＹＫＦＰ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３．
【0102】
ｍＮｅｏＧｒｅｅｎ突然変異体２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３に示される通りである。
【0103】
ＰＰＡＴＨＥＬＨＩＦＧＳＩＮＧＶＤＦＤＭＶＧＱＧＴＧＮＰＮＤＧＹＥＥＬＮＬＫＳＴＫＧＤＬＱＦＳＰＷＩＬＶＰＨＩＧＹＧＦＨＱＹＬＰＹＰＤＧＭＳＰＦＱＡＡＭＶＤＧＳＧＹＱＶＨＲＴＭＱＦＥＤＧＡＳＬＴＶＮＹＲＹＴＹＥＧＳＨＩＫＧＥＡＱＶＫＧＴＧＦＰＡＤＧＰＶＭＴＮＳＬＴＡＡＤＷＣＲＳＫＫＴＹＰＮＤＫＴＩＩＳＴＦＫＷＳＹＴＴＧＮＧＫＲＹＲＳＴＡＲＴＴＹＴＦＡＫＰＭＡＡＮＹＬＫＮＱＰＭＹＶＦＲＫＴＥＬＫＨＳＫＴＥＬＮＦＫＥＷＱＫＡＦＴＤＶＭＧＭＤＥＬＹＫ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３
【0104】
実施例２ 生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）に基づく全遺伝子コードＮＡＤ＋分子プローブは、試料中のＮＡＤ＋含有量の測定に用いられた。
【0105】
本発明によって提供されるＮＡＤ＋分子プローブＮＡＤＳ１．０、ＮＡＤＳ１．１、ＮＡＤＳ１．２、及びＮＡＤＳ２．０は、試料中のＮＡＤ＋含有量の測定に用いられ得ることを検証するために、以下のステップに示される滴定実験を行った。
【0106】
（１）以下の試料を調製した。
【0107】
プローブ溶液：ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）で、精製されたＮＡＤ＋分子プローブを４ｎＭまで希釈し、一時的にアイスボックスに置いて使用に備えた。
【0108】
ＮＡＤ＋溶液：３倍連続段階希釈法により、異なる濃度（５０ｍＭ、１６．７ｍＭ、５．５６ｍＭ、１．８５ｍＭ、６１７μＭ、２０６μＭ、６８．６μＭ及び２２．９μＭ）のＮＡＤ＋溶液を調製し、用いられる緩衝液は、アイスボックスに保管されるＨＥＰＥＳ緩衝液であった。
【0109】
生物発光基質溶液：水で生物発光基質溶液を１００倍希釈し、遮光でアイスボックスに保存された。
【0110】
（２）白い９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに、それぞれ８０μＬのプローブ溶液、１０μＬ ＮＡＤ＋溶液及び１０μＬの生物発光基質溶液を添加し、すぐにマルチチャンネルピペットで軽く複数回（少なくとも８回）吹き出し吸い込み、均一に混合した。Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ３多機能マイクロプレートリーダにより、発光モードで波長４４０ｎｍ及び波長５９０ｎｍ（ＮＡＤＳ１．０、ＮＡＤＳ１．１、及びＮＡＤＳ１．２）又は波長５１５ｎｍ（ＮＡＤＳ２．０）における光強度値を読み取り、５ｍｉｎ連続して監視し、該時間帯におけるアクセプター及びドナーの平均発光比を計算した。プローブの異なるＮＡＤ＋濃度における発光スペクトルは、波長範囲３６０～６５０ｎｍにおける光強度値を監視することにより得られた。
【0111】
図１Ｂから、異なるＮＡＤ＋濃度で、プローブＮＡＤＳ１．０、ＮＡＤＳ１．１、及びＮＡＤＳ１．２の５９０／４４０光強度比は異なり、一定のＮＡＤ＋濃度範囲（１０μＭ～１ｍＭ）において、濃度が高くなるに伴い大きくなることが判明した。図１Ｃは、異なる波長におけるスキャンスペクトルの結果を示し、５９０ｎｍ及び４４０ｎｍに、それぞれ、ドナー及びアクセプターの吸収ピークである２つの顕著な吸収ピークがあることが分かった。図ｌの結果から、本発明に係るプローブは、生理学的濃度範囲を定量測定することができるＮＡＤ＋分子であることも示されており、ＬｉｇＡ突然変異体に異なる突然変異を取り入れることにより、異なる親和力を生じるプローブのバージョンＮＡＤＳ１．０、ＮＡＤＳ１．１、及びＮＡＤＳ１．２を設計し、それらのＣ５０値（５０％プローブの立体配座変化をもたらす場合の供試物の濃度）は、それぞれ、２３５μＭ、３８８μＭ、及び１２６μＭであり、異なる濃度範囲のＮＡＤ＋を検出する場合に用いられ得た。
【0112】
図２にＮＡＤＳ２．０の結果が示されており、図２から、異なるＮＡＤ＋濃度で、プローブＮＡＤＳ２．０の５１５／４４０光強度値が異なり、一定のＮＡＤ＋濃度範囲（１０μＭ～１ｍＭ）において、濃度が高くなるに伴い大きくなることが判明した。図２Ｂは、異なる波長におけるスキャンスペクトルの結果を示し、５１５ｎｍ及び４４０ｎｍに２つの顕著な吸収ピークがあることが分かった。実施例の結果と同様に、本実施例に係るプローブは、同様に高ダイナミックレンジ（１．８倍）を有し、そのＣ５０値は３６４μＭであった。
【0113】
本発明のＮＡＤ＋分子プローブＮＡＤＳ１．０、ＮＡＤＳ１．１、ＮＡＤＳ１．２、及びＮＡＤＳ２．０は異なる波長において光強度比が異なることが示されており、異なる光強度比により回帰演算してＮＡＤ＋濃度を得ることができた。ＮＡＤ＋含有量の測定に用いられ得、測定できる濃度範囲は広かった。
【0114】
実施例３ 蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づく全遺伝子コードＮＡＤ＋分子プローブは、試料中のＮＡＤ＋含有量の測定に用いられた。
【0115】
本発明によって提供されるＮＡＤ＋分子プローブＮＡＤＳ３．０は、試料中のＮＡＤ＋含有量の測定に用いられ得ることを検証するために、以下のステップに示される滴定実験を行った。
【0116】
（１）以下の試料を調製した。
【0117】
プローブ溶液：ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）で、精製されたＮＡＤ＋分子プローブを２μＭまで希釈し、一時的にアイスボックスに置いて使用に備えた。
【0118】
ＮＡＤ＋溶液：３倍連続段階希釈法により、異なる濃度（５０ｍＭ、１６．７ｍＭ、５．５６ｍＭ、１．８５ｍＭ、６１７μＭ、２０６μＭ、６８．６μＭ及び２２．９μＭ）のＮＡＤ＋溶液を調製し、用いられる緩衝液は、アイスボックスに保管されるＨＥＰＥＳ緩衝液であった。
【0119】
（２）黒い９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに、それぞれ９０μＬのプローブ溶液及び１０μＬ ＮＡＤ＋溶液を添加し、すぐにマルチチャンネルピペットで軽く複数回（少なくとも８回）吹き出し吸い込み、均一に混合した。Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ３多機能マイクロプレートリーダにより、蛍光モードで、励起波長を４７０ｎｍとし、５１５ｎｍ及び５８５ｎｍにおける放出波長を測定し、５ｍｉｎ連続して監視し、該時間帯における５８５ｎｍ対５１５ｎｍの平均発光比を計算した。プローブの異なるＮＡＤ＋濃度における発光スペクトルは、波長範囲５００～６００ｎｍにおける放出光強度値を監視することにより得られた。
【0120】
図３から、異なるＮＡＤ＋濃度で、プローブＮＡＤＳ３．０の５８５／５１５の光強度比は異なり、一定のＮＡＤ＋濃度範囲（１０μＭ～１ｍＭ）において、濃度が高くなるに伴い大きくなることが判明した。本発明のＮＡＤ＋分子プローブＮＡＤＳ３．０は、ＮＡＤ＋含有量の測定に用いられ得ることが分かった。プローブＮＡＤＳ３．０は蛍光共鳴エネルギー転移に基づくＮＡＤ＋分子プローブであり、そのダイナミックレンジは１．２１倍であり、Ｃ５０値は１６２μＭであった。
【0121】
実施例４ ＮＡＤ＋分子プローブの異なるＮＡＤ＋類似体に対する応答。
【0122】
本発明によって提供されるＮＡＤ＋分子プローブが高選択性を有することを検証するために、ＮＡＤＳ１．２を例に以下のステップに示される滴定実験を行った。
【0123】
（１）以下の試料を調製した。
【0124】
プローブ溶液：ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）で、精製されたＮＡＤ＋分子プローブを４ｎＭまで希釈し、一時的にアイスボックスに置いて使用に備えた。
【0125】
ＮＡＤ＋及び類似体溶液：３倍連続段階希釈法により、異なる濃度（５０ｍＭ、１６．７ｍＭ、５．５６ｍＭ、１．８５ｍＭ、６１７μＭ、２０６μＭ、６８．６μＭ及び２２．９μＭ）のＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、及びＮＡＤＰＨ溶液、異なる濃度（１００ｍＭ、３３．３ｍＭ、１１．１ｍＭ、３．７ｍＭ、１．２３ｍＭ、４１２μＭ、１３７μＭ及び４５．７μＭ）のＮＡＤＨ、ＮＭＮ及びＮＲＨ溶液、異なる濃度（４０ｍＭ、１３．３ｍＭ、４．４ｍＭ、１．４ｍＭ、４９４μＭ、１６５μＭ、５４．９μＭ及び１８．３μＭ）のＮＡＭ溶液を調製し、用いられる緩衝液は、アイスボックスに保管されるＨＥＰＥＳ緩衝液であった。
【0126】
生物発光基質溶液：水で生物発光基質溶液を１００倍希釈し、遮光でアイスボックスに保存された。
【0127】
（２）白い９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに、それぞれ８０μＬのプローブ溶液、１０μＬ ＮＡＤ＋又はＮＡＤ＋類似体溶液及び１０μＬの生物発光基質溶液を添加し、すぐにマルチチャンネルピペットで軽く複数回（少なくとも８回）吹き出し吸い込み、均一に混合した。Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ３多機能マイクロプレートリーダにより、発光モードで波長４４０ｎｍ及び波長５９０ｎｍにおける光強度値を読み取り、５ｍｉｎ連続して監視し、該時間帯におけるアクセプター及びドナーの平均発光比を計算した。
【0128】
実験の結果を図４に示し、実験の結果から、本発明のプローブのＮＡＤ＋分子に対して高選択性を有することが示されている。プローブはＮＡＭ及びＮＡＤＰＨに応答しなかった。プローブはＮＡＤＨ及びＮＲＨに応答したが、Ｃ５０値が高かった（＞１ｍＭ）。プローブのＮＡＤＰ＋及びＮＭＮ分子に対する応答のダイナミックレンジが小さかった。
【0129】
実施例５ ＮＡＤ＋分子プローブを安定発現した哺乳動物細胞株は、生細胞におけるＮＡＤ＋濃度のダイナミック変化の測定に用いられた。
【0130】
本発明によって提供されるＮＡＤ＋分子プローブは、細胞におけるＮＡＤ＋分子濃度の変化を検出することができる。該プローブ（ＮＡＤＳ１．０）のコード遺伝子をｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｎｅｏベクターにクローンし、レンチウイルス法により、ＨＥＫ２９３安定細胞株を作製した。１００００細胞／ウェルの播種数でＨＥＫ２９３細胞を９６ウェル白い細胞培養プレートに蒔き、ＤＭＥＭ培地（高グルコース、フェノールレッドなし）の使用量は１００μＬであった。３７℃、５％ＣＯ２条件で２４ｈ培養した後、ＦＫ８６６（細胞におけるＮＡＤ＋レベルを効果的に低減できるＮＡＭＰＴ阻害剤）及びＮＲＨ（細胞におけるＮＡＤ＋レベルを効果的に向上できるＮＡＤ＋前駆体）で安定細胞株を処理し、最終濃度は、それぞれ、１０ｎｍ及び５０μＭであった。化合物で細胞を２４ｈ処理した後、ＤＭＥＭ培地（高グルコース、フェノールレッドなし）を新鮮な生物発光基質含有ＤＭＥＭ培地（高グルコース、フェノールレッドなし、生物発光基質を１０００倍希釈した）に切り替えた。Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ３多機能マイクロプレートリーダで５９０ｎｍ及び４４０ｎｍ波長の放出光強度を検出した。該プローブの検出原理に従い、５９０ｎｍ及び４４０ｎｍ波長の放出光強度比は生細胞中のＮＡＤ＋濃度を示した。検出した結果、ＦＫ８６６で処理された細胞の該比の低下は、細胞におけるＮＡＤ＋濃度の低下を示し、ＮＲＨで処理された細胞の該比の向上は、細胞におけるＮＡＤ＋濃度の向上を示すことが発見された。該変化は予想と一致しており、該ＮＡＤ＋プローブは細胞におけるＮＡＤ＋濃度の変化に応答できることが示されている（図５）。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】