特表 2024-539500 一体型デジタルＰＣＲ装置及びその制御方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】一体型デジタルＰＣＲ装置及びその制御方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20241018BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20241018BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12Q1/686 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024547817

(86)(22)【出願日】2022-11-09

(85)【翻訳文提出日】2024-04-23

(86)【国際出願番号】 CN2022130873

(87)【国際公開番号】W WO2023088146

(87)【国際公開日】2023-05-25

(31)【優先権主張番号】202111381197.4

(32)【優先日】2021-11-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524157589

【氏名又は名称】新▲い▼制造科技（北京）有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＴＡＲＧＥＴＩＮＧＯＮＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ （ＢＥＩＪＩＮＧ） ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】ＹＡＮＧ， Ｗｅｎｊｕｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ８， Ｎｏ． １， Ｃｈａｏｑｉａｎ Ｒｏａｄ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐａｒｋ Ｚｏｎｅ， Ｃｈａｎｇｐｉｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】蘇 世聖

(72)【発明者】

【氏名】劉 金偉

(72)【発明者】

【氏名】徐 波

(72)【発明者】

【氏名】韓 応敏

(72)【発明者】

【氏名】周 海余

(72)【発明者】

【氏名】杜 暁純

(72)【発明者】

【氏名】劉 暁彬

(72)【発明者】

【氏名】楊 文軍

(72)【発明者】

【氏名】王 勇斗

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS32

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、一体型デジタルＰＣＲ装置及びその制御方法を提供する。一体型デジタルＰＣＲ装置は、チップローディングモジュールと、液滴生成モジュールと、温度サイクルモジュールと、蛍光検出モジュールと、チップ廃棄モジュールと、スケジューリング機構とを含む。液滴生成モジュールは、微小液滴生成過程中に試料添加チャンバー内の試料から微小液滴を生成してから反応チャンバー内に移送して貯蔵することができる。温度サイクルモジュールは、反応チャンバー内の微小液滴の増幅を実現する。蛍光検出モジュールは、微小液滴検出過程中に、反応チャンバー内の微小液滴を蛍光検出領域に移送してから試料添加チャンバーに移送し、且つこの過程に微小液滴の蛍光検出を完了することができる。スケジューリング機構は、主制御モジュールの制御により、チップローディングモジュール、液滴生成モジュール、温度サイクルモジュール、蛍光検出モジュール、及びチップ廃棄モジュールの間に一体型微小液滴チップを移送するために使用され、且つ温度サイクルモジュール内の一体型微小液滴チップを上下に１８０°反転した後に蛍光検出モジュール内に移送することができる。本発明は、自動化及び統合の程度が高く、検出分析作業の効率を向上させ、人件費を削減することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

一体型デジタルＰＣＲ装置であって、チップローディングモジュール（２００）と、液滴生成モジュール（３００）と、温度サイクルモジュール（４００）と、蛍光検出モジュール（５００）と、チップ廃棄モジュール（６００）と、スケジューリング機構（７００）とを含み、
前記チップローディングモジュール（２００）は、試料が添加された一体型微小液滴チップ（１００）を置くために使用され、前記一体型微小液滴チップ（１００）はチップ本体（１）を含み、前記チップ本体（１）には、試料添加チャンバー（１２）、反応チャンバー（１１）、及び蛍光検出領域（３３）が構成され、
前記液滴生成モジュール（３００）は、前記一体型微小液滴チップ（１００）に油気を供給するために使用され、微小液滴生成過程中に前記試料添加チャンバー（１２）内の試料から微小液滴（４）を生成してから反応チャンバー（１１）内に移送して貯蔵することができ、
前記温度サイクルモジュール（４００）は、前記反応チャンバー（１１）内の微小液滴（４）を増幅するために、前記反応チャンバー（１１）内の微小液滴（４）に対する加熱冷却サイクルを形成するために使用され、
前記蛍光検出モジュール（５００）は、微小液滴検出過程中に前記反応チャンバー（１１）内の微小液滴（４）を前記蛍光検出領域（３３）に移送してから前記試料添加チャンバー（１２）に移送し、前記蛍光検出領域（３３）に位置する微小液滴（４）に対する蛍光検出を実行することができ、
前記チップ廃棄モジュール（６００）は、検出後の前記一体型微小液滴チップ（１００）を貯蔵するために使用され、
前記スケジューリング機構（７００）は、主制御モジュール（８００）の制御により、前記チップローディングモジュール（２００）、液滴生成モジュール（３００）、温度サイクルモジュール（４００）、蛍光検出モジュール（５００）、チップ廃棄モジュール（６００）の間に前記一体型微小液滴チップ（１００）を移送するために使用され、前記温度サイクルモジュール（４００）内の一体型微小液滴チップ（１００）を上下に１８０°反転した後に前記蛍光検出モジュール（５００）内に移送することができる、ことを特徴とする一体型デジタルＰＣＲ装置。

【請求項2】

前記一体型微小液滴チップ（１００）はチップ本体（１）を含み、前記チップ本体（１）内には、微小液滴生成構造、油液ポート（３１）、及び気液ポート（３２）が構成され、前記気液ポート（３２）は前記反応チャンバー（１１）と連通し、前記試料添加チャンバー（１２）は前記微小液滴生成構造と連通し、前記油液ポート（３１）は前記微小液滴生成構造と連通し、
前記一体型微小液滴チップ（１００）が前記液滴生成モジュール（３００）内に位置する場合、前記液滴生成モジュール（３００）は、前記試料添加チャンバー（１２）と前記気液ポート（３２）との間に第１圧力差を形成し、前記油液ポート（３１）と前記気液ポート（３２）との間に第２圧力差を形成することができ、前記第１圧力差と前記第２圧力差は、前記試料添加チャンバー（１２）内の試料と前記油液ポート（３１）の生成油をそれぞれ駆動して、前記微小液滴生成構造に進入させ、生成した微小液滴（４）は前記反応チャンバー（１１）内に進入し、貯蔵され、
前記一体型微小液滴チップ（１００）が前記蛍光検出モジュール（５００）内に位置する場合、前記液滴生成モジュール（３００）は、検出押し油（５）を駆動して前記気液ポート（３２）から前記反応チャンバー（１１）に進入させて、前記反応チャンバー（１１）内の微小液滴（４）を前記反応チャンバー（１１）から前記微小液滴生成構造に流出させることができ、前記液滴生成モジュール（３００）は、また、検出分離油を駆動して前記油液ポート（３１）から前記微小液滴生成構造に進入させることもでき、前記検出分離油は、前記反応チャンバー（１１）から前記微小液滴生成構造内に流出した微小液滴（４）を分離して列を形成し、前記蛍光検出領域（３３）に進入させる、ことを特徴とする請求項１に記載の一体型デジタルＰＣＲ装置。

【請求項3】

前記微小液滴生成構造は、油液管路（２１）と連通管路を含み、前記油液管路（２１）と前記連通管路は十字形に交差し、前記連通管路は、十字交差点の第１側に位置し前記反応チャンバー（１１）と連通する第１管路（２２）と、前記十字交差点の第２側に位置し前記試料添加チャンバー（１２）と連通する第２管路（２３）とを含み、前記油液ポート（３１）は油液管路（２１）と連通する、ことを特徴とする請求項２に記載の一体型デジタルＰＣＲ装置。

【請求項4】

前記チップ本体（１）の第１側面が水平方位に位置することを参照として、前記反応チャンバー（１１）と前記試料添加チャンバー（１２）は前記第１側面に位置し、前記反応チャンバー（１１）と前記チップ本体（１）の前記第１側面との接続ポート（１１１）は上向きに延び、且つ下部が小さく上部が大きいラッパ口を形成する、ことを特徴とする請求項３に記載の一体型デジタルＰＣＲ装置。

【請求項5】

前記反応チャンバー（１１）内には、下から上へ延びる気液管路（１１２）が構成され、前記気液管路（１１２）の下部口は前記気液ポート（３２）と連通し、前記気液管路（１１２）の上部口は、前記接続ポート（１１１）の上部口よりも高い、ことを特徴とする請求項４に記載の一体型デジタルＰＣＲ装置。

【請求項6】

前記第１管路（２２）と前記接続ポート（１１１）との間には微小液滴観測領域（３４）がある、ことを特徴とする請求項５に記載の一体型デジタルＰＣＲ装置。

【請求項7】

前記蛍光検出領域（３３）は、前記第２管路（２３）に位置する、ことを特徴とする請求項３に記載の一体型デジタルＰＣＲ装置。

【請求項8】

前記試料添加チャンバー（１２）は、開口チャンバー（１２１）と、前記開口チャンバー（１２１）の開口に密封接続された密封カバー（１２２）とを含み、且つ／又は、前記試料添加チャンバー（１２）には濾過膜又は排気孔が設けられる、ことを特徴とする請求項１に記載の一体型デジタルＰＣＲ装置。

【請求項9】

前記微小液滴（４）が前記反応チャンバー（１１）内に進入する前に、前記反応チャンバー（１１）内に軽油が予め配置される、ことを特徴とする請求項１に記載の一体型デジタルＰＣＲ装置。

【請求項10】

一体型デジタルＰＣＲ装置の制御方法であって、チップローディングステップと、液滴生成ステップと、温度サイクルステップと、蛍光検出ステップと、チップ廃棄ステップとを含み、
前記チップローディングステップでは、一体型微小液滴チップ（１００）をチップローディングモジュール（２００）内に置き、
前記液滴生成ステップでは、前記チップローディングモジュール（２００）内の一体型微小液滴チップ（１００）を液滴生成モジュール（３００）内に移送し、前記一体型微小液滴チップ（１００）の試料添加チャンバー（１２）内の試料を制御して微小液滴（４）を生成してから反応チャンバー（１１）内に貯蔵し、
前記温度サイクルステップでは、前記一体型微小液滴チップ（１００）を上下に１８０°反転した後、前記一体型微小液滴チップ（１００）の底部に位置する反応チャンバー（１１）内の微小液滴内の微小液滴（４）に対する加熱冷却サイクルを形成し、
前記蛍光検出ステップでは、前記反応チャンバー（１１）内の微小液滴の増幅が完了した後、前記反応チャンバー（１１）内の微小液滴を制御して蛍光検出領域（３３）に進入させ、蛍光検出を完了し、
前記チップ廃棄ステップでは、蛍光検出が完了した後の一体化微小液滴チップをチップ廃棄モジュール内に移送する、ことを特徴とする一体型デジタルＰＣＲ装置の制御方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、デジタルＰＣＲ分析装置の技術分野に属し、具体的には、一体型デジタルＰＣＲ装置及びその制御方法に関する。

【背景技術】

【0002】

デジタルＰＣＲは、最新の定量技術で、単一分子ＰＣＲ方法に基づいて計数する核酸定量であり、絶対定量の方法である。それは、主に現在の分析化学の人気の研究分野におけるマイクロフルイディクス又は微小滴化方法を採用して、大量の希釈後の核酸溶液をバイオチップの微小反応器又は微小滴に分散させる。各反応器の核酸テンプレートの数は１つ以下である。このようにしてＰＣＲサイクルを経た後、核酸分子テンプレートが１つある反応器は蛍光信号を発し、テンプレートのない反応器は蛍光信号を発しない。相対比と反応器の体積から、元の溶液の核酸濃度を推定することができる。従来のデジタルＰＣＲ分析装置は、機能が単一であり、１回の増幅と検出作業を完了するために複数の装置を手動で操作する必要がある。社会の発展に伴い、医療産業や科学研究分野では、ＰＣＲ分析のハイスループット、自動化、高速化、統合化に対するより高い要求が求められている。

【発明の概要】

【0003】

従って、本発明が解決しようとする技術的問題は、従来技術におけるデジタルＰＣＲ装置の機能が単一であり、１回の増幅と検出作業を完了するために複数の装置を手動で操作する必要があり、検出効率が低いという欠点を克服するために、一体型デジタルＰＣＲ装置及びその制御方法を提供することである。

【0004】

上記の問題を解決するために、本発明は一体型デジタルＰＣＲ装置を提供する。この一体型デジタルＰＣＲ装置は、チップローディングモジュールと、液滴生成モジュールと、温度サイクルモジュールと、蛍光検出モジュールと、チップ廃棄モジュールと、スケジューリング機構とを含む。前記チップローディングモジュールは、試料が添加された一体型微小液滴チップを置くために使用される。前記一体型微小液滴チップはチップ本体を含み、前記チップ本体には、試料添加チャンバー、反応チャンバー、及び蛍光検出領域が構成される。前記液滴生成モジュールは、前記一体型微小液滴チップに油気を供給するために使用され、微小液滴生成過程中に前記試料添加チャンバー内の試料から微小液滴を生成してから反応チャンバー内に移送して貯蔵することができる。前記温度サイクルモジュールは、前記反応チャンバー内の微小液滴を増幅するために、前記反応チャンバー内の微小液滴に対する加熱冷却サイクルを形成するために使用される。前記蛍光検出モジュールは、微小液滴検出過程中に前記反応チャンバー内の微小液滴を前記蛍光検出領域に移送してから前記試料添加チャンバーに移送し、前記蛍光検出領域に位置する微小液滴に対する蛍光検出を実行することができる。前記チップ廃棄モジュールは、検出後の前記一体型微小液滴チップを貯蔵するために使用される。前記スケジューリング機構は、主制御モジュールの制御により、前記チップローディングモジュール、液滴生成モジュール、温度サイクルモジュール、蛍光検出モジュール、及びチップ廃棄モジュールの間に一体型微小液滴チップを移送するために使用され、且つ前記温度サイクルモジュール内の一体型微小液滴チップを上下に１８０°反転した後に前記蛍光検出モジュール内に移送することができる。

【0005】

幾つかの実施形態では、前記一体型微小液滴チップはチップ本体を含み、前記チップ本体内には、微小液滴生成構造、油液ポート、及び気液ポートが構成される。前記気液ポートは前記反応チャンバーと連通し、前記試料添加チャンバーは前記微小液滴生成構造と連通し、前記油液ポートは前記微小液滴生成構造と連通する。前記一体型微小液滴チップが前記液滴生成モジュール内に位置する場合、前記液滴生成モジュールは、前記試料添加チャンバーと前記気液ポートとの間に第１圧力差を形成し、前記油液ポートと前記気液ポートとの間に第２圧力差を形成することができる。前記第１圧力差と前記第２圧力差は、前記試料添加チャンバー内の試料と前記油液ポートの生成油をそれぞれ駆動して、前記微小液滴生成構造に進入させる。生成した微小液滴は前記反応チャンバー内に進入し、貯蔵される。前記一体型微小液滴チップが前記蛍光検出モジュール内に位置する場合、前記蛍光検出モジュールは、検出押し油を駆動して前記気液ポートから前記反応チャンバーに進入させて、前記反応チャンバー内の微小液滴を前記反応チャンバーから前記微小液滴生成構造に流出させることができる。前記液滴生成モジュールは、また、検出分離油を駆動して前記油液ポートから前記微小液滴生成構造に進入させることもできる。前記検出分離油は、前記反応チャンバーから前記微小液滴生成構造内に流出した微小液滴を分離して列を形成し、前記蛍光検出領域に進入させる。

【0006】

幾つかの実施形態では、前記微小液滴生成構造は、油液管路と連通管路を含み、前記油液管路と前記連通管路は十字形に交差する。前記連通管路は、十字交差点の第１側に位置し前記反応チャンバーと連通する第１管路と、前記十字交差点の第２側に位置し前記試料添加チャンバーと連通する第２管路とを含む。前記油液ポートは油液管路と連通する。

【0007】

幾つかの実施形態では、前記チップ本体の第１側面が水平方位に位置することを参照として、前記反応チャンバーと前記試料添加チャンバーは前記第１側面に位置し、前記反応チャンバーと前記チップ本体の前記第１側面との接続ポートは上向きに延び、且つ下部が小さく上部が大きいラッパ口を形成する。

【0008】

幾つかの実施形態では、前記反応チャンバー内には、下から上へ延びる気液管路が構成され、前記気液管路の下部口は前記気液ポートと連通し、前記気液管路の上部口は前記接続ポートの上部口よりも高い。

【0009】

幾つかの実施形態では、前記第１管路と前記接続ポートとの間には微小液滴観測領域がある。

【0010】

幾つかの実施形態では、前記蛍光検出領域は前記第２管路に位置する。

【0011】

幾つかの実施形態では、前記試料添加チャンバーは、開口チャンバーと、前記開口チャンバーの開口に密封接続された密封カバーとを含む。且つ／又は、前記試料添加チャンバーには、濾過膜又は排気孔が設けられる。

【0012】

幾つかの実施形態では、前記微小液滴が前記反応チャンバー内に進入する前に、前記反応チャンバー内に軽油が予め配置される。

【0013】

本発明は一体型デジタルＰＣＲ装置の制御方法をさらに提供する。この方法は、チップローディングステップと、液滴生成ステップと、温度サイクルステップと、蛍光検出ステップと、チップ廃棄ステップとを含む。
前記チップローディングステップでは、一体型微小液滴チップをチップローディングモジュール内に置く。
前記液滴生成ステップでは、前記チップローディングモジュール内の一体型微小液滴チップを液滴生成モジュール内に移送し、前記一体型微小液滴チップの試料添加チャンバー内の試料を制御して、微小液滴を生成してから反応チャンバー内に貯蔵する。
前記温度サイクルステップでは、前記一体型微小液滴チップを上下に１８０°反転した後、前記一体型微小液滴チップの底部に位置する反応チャンバー内の微小液滴内の微小液滴に対する加熱冷却サイクルを形成する。
前記蛍光検出ステップでは、前記反応チャンバー内の微小液滴の増幅が完了した後、前記反応チャンバー内の微小液滴を制御して蛍光検出領域に進入させ、蛍光検出を完了する。
前記チップ廃棄ステップでは、蛍光検出が完了した後の一体化微小液滴チップをチップ廃棄モジュール内に移送する。

【0014】

本発明によって提供される一体型デジタルＰＣＲ装置及びその制御方法では、前記主制御モジュールの制御により、前記スケジューリング機構は前記一体型微小液滴チップを各機能モジュール間で協調動作させることができ、チップローディング、液滴生成、ＰＣＲ増幅、蛍光検出と分析からチップ廃棄までの全プロセス統合操作が実現され、自動化及び統合の程度が高く、検出分析作業の効率を向上させて、人件費を削減することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】本発明の実施例に係る一体型デジタルＰＣＲ装置の構造構成模式図である。

【図2】図１の一体型微小液滴チップの立体構造模式図である。

【図3】図２の微小液滴生成構造の構造模式図である。

【図4】微小液滴生成プロセスの模式図である。

【図5】生成された後に反応チャンバー内に貯蔵される微小液滴の模式図である。

【図6】図１の一体型微小液滴チップを上下に１８０°反転した後の反応チャンバー内の状態の模式図である。

【図7】図６の状態で反応チャンバー内に油液を導入した後の状態の模式図である（図中の矢印は微小液滴及び油液の流れ方向を示す）。

【図8】微小液滴が反応チャンバーから押し出された後の状態の模式図である。

【図9】図１の蛍光検出モジュールの動作光路原理の模式図である。

【図10】本発明の実施例に係るデジタルＰＣＲ装置の検出結果である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

図１～図１０を参照すると、本発明の実施例によれば、一体型デジタルＰＣＲ装置が提供される。一体型デジタルＰＣＲ装置は、チップローディングモジュール２００と、液滴生成モジュール３００と、温度サイクルモジュール４００と、蛍光検出モジュール５００と、チップ廃棄モジュール６００と、スケジューリング機構７００とを含む。前記チップローディングモジュール２００は、試料が添加された一体型微小液滴チップ１００を置くために使用される。前記一体型微小液滴チップ１００はチップ本体１を含み、前記チップ本体１には、試料添加チャンバー１２、反応チャンバー１１、及び蛍光検出領域３３が構成される。前記液滴生成モジュール３００は、前記一体型微小液滴チップ１００に油気（即ち、油液又は圧力気体）を供給するために使用され、微小液滴生成過程中に前記試料添加チャンバー１２内の試料から微小液滴４を生成してから反応チャンバー１１内に移送して貯蔵することができる。前記温度サイクルモジュール４００は、前記反応チャンバー１１内の微小液滴４を増幅するために、前記反応チャンバー１１内の微小液滴４に対する加熱冷却サイクルを形成するために使用される。前記蛍光検出モジュール５００は、微小液滴検出過程中に前記反応チャンバー１１内の微小液滴４を前記蛍光検出領域３３に移送してから前記試料添加チャンバー１２に移送し、前記蛍光検出領域３３に位置する微小液滴４に対する蛍光検出を実行することができる。前記チップ廃棄モジュール６００は、検出後の前記一体型微小液滴チップ１００を貯蔵するために使用される。前記スケジューリング機構７００は、主制御モジュール８００の制御により、前記チップローディングモジュール２００、液滴生成モジュール３００、温度サイクルモジュール４００、蛍光検出モジュール５００、チップ廃棄モジュール６００の間に前記一体型微小液滴チップ１００を移送するために使用され、前記温度サイクルモジュール４００内の一体型微小液滴チップ１００を上下に１８０°反転した後に前記蛍光検出モジュール５００内に移送することができる。この技術的解決策では、前記主制御モジュール８００の制御により、前記スケジューリング機構７００は前記一体型微小液滴チップ１００を各機能モジュール間で協調動作させることができ、チップローディング、液滴生成、ＰＣＲ増幅、蛍光検出と分析からチップ廃棄までの全プロセス統合操作が実現され、自動化及び統合の程度が高く、検出分析作業の効率を向上させて、人件費を削減することができる。さらに重要なことは、前記一体型微小液滴チップ１００を上下に１８０°反転させるように本発明のスケジューリング機構７００を構成することができるので、前記液滴生成、ＰＣＲ増幅及び蛍光検出分析の操作プロセスを同一のチップ即ち前記一体型微小液滴チップ１００に統合することができ、統合度及び自動化の程度をさらに向上させることができる。

【0017】

幾つかの実施形態では、前記一体型微小液滴チップ１００はチップ本体１を含み、前記チップ本体１内には、微小液滴生成構造、油液ポート３１、及び気液ポート３２が構成される。前記気液ポート３２は前記反応チャンバー１１と連通し、前記試料添加チャンバー１２は前記微小液滴生成構造と連通し、前記油液ポート３１は前記微小液滴生成構造と連通する。前記一体型微小液滴チップ１００が前記液滴生成モジュール３００内に位置する場合、前記液滴生成モジュール３００は、前記試料添加チャンバー１２と前記気液ポート３２との間に第１圧力差を形成し（即ち、前記液滴生成モジュール３００が有する気路は、前記試料添加チャンバー１２及び前記気液ポート３２と連通する）、前記油液ポート３１と前記気液ポート３２との間に第２圧力差を形成する（即ち、前記液滴生成モジュール３００が有する液路は、前記油液ポート３１及び前記気液ポート３２と連通する）ことができる。前記第１圧力差と前記第２圧力差は、それぞれ、前記試料添加チャンバー１２内の試料と前記油液ポート３１の生成油を駆動して前記微小液滴生成構造に進入させ、生成した微小液滴４は前記反応チャンバー１１内に進入し、貯蔵される。前記一体型微小液滴チップ１００が前記蛍光検出モジュール５００内に位置する場合、前記液滴生成モジュール３００は、検出押し油５を駆動して前記気液ポート３２から前記反応チャンバー１１に進入させて、前記反応チャンバー１１内の微小液滴４を前記反応チャンバー１１から前記微小液滴生成構造に流出させることができる。また、前記液滴生成モジュール３００は、検出分離油を駆動して前記油液ポート３１から前記微小液滴生成構造に進入させることもできる。前記検出分離油は、反応チャンバー１１から前記微小液滴生成構造内に流出した前記微小液滴４を分離して列を形成し、前記蛍光検出領域３３に進入させる。前記微小液滴生成構造に対する時分割多重化（前記一体型微小液滴チップ１００の反転前後を時分割境界とする）により、液滴の生成、増幅及び検出がすべて１枚のチップに統合されて、完全に統合され完全に密閉されたデジタルＰＣＲプロセスが実現される。液滴サイズが均一で、液滴数が制限されにくく、蛍光検出信号対ノイズ比が高いなどの利点を継承するだけでなく、チップ構造が複雑で、生成と検出が異なるチップで完了し、統合度が低く、自動化が難しいなどの元の困難も克服する。これは、デジタルＰＣＲ分野における重要な技術的進歩である。

【0018】

前記微小液滴生成構造の１つの具体的な実現形式として、前記微小液滴生成構造は、油液管路２１と連通管路を含み、前記油液管路２１と前記連通管路は十字形に交差し、前記連通管路は、十字交差点の第１側に位置し前記反応チャンバー１１と連通する第１管路２２と、前記十字交差点の第２側に位置し前記試料添加チャンバー１２と連通する第２管路２３とを含み、前記油液ポート３１は油液管路２１と連通する。

【0019】

幾つかの実施形態では、図２に示すように、前記チップ本体１の第１側面が水平方位に位置することを参照として、前記反応チャンバー１１と前記試料添加チャンバー１２は前記第１側面に位置し、前記反応チャンバー１１と前記チップ本体１の前記第１側面との接続ポート１１１は上向きに延び、且つ下部が小さく上部が大きいラッパ口を形成する。ラッパ口状の接続ポート１１１は、微小液滴４が第１管路２２から前記反応チャンバー１１に進入することを容易にすることができ、前記微小液滴４が前記反応チャンバー１１から前記第１管路２２に進入して、微小液滴４の滞留が防止されることを容易にすることもできる。なお、このときの前記反応チャンバー１１と試料添加チャンバー１２はいずれも前記チップ本体１の第１側面（具体的には頂面）に位置し、前記反応チャンバー１１内に進入した微小液滴４はすべて前記接続ポート１１１に集められ、ＰＣＲ増幅時に、前記チップ本体１全体を逆さにして即ち１８０°反転させて、微小液滴４を前記反応チャンバー１１の反応領域に位置させる必要がある。

【0020】

幾つかの実施形態では、前記反応チャンバー１１内には、下から上へ延びる気液管路１１２がさらに構成され、前記気液管路１１２の下部口は前記気液ポート３２と連通し、前記気液管路１１２の上部口は前記接続ポート１１１の上部口よりも高い。これにより、前記反応チャンバー１１内が負圧である場合、前記微小液滴生成構造によって生成された微小液滴４は、前記反応チャンバー１１に進入した後にさらに前記気液管路１１２から流出することを防止することができる。

【0021】

幾つかの実施形態では、前記第１管路２２と前記接続ポート１１１との間には微小液滴観測領域３４がある。前記微小液滴観測領域３４の流通面積は、前記第１管路２２の流通面積よりもはるかに大きい。即ち、前記微小液滴観測領域３４は、前記第１管路２２上の拡大領域（幅広）であり、この領域に進入する微小液滴４の流速を低下させ、外部カメラによる画像化を容易にし、液滴の形態を記録し、液滴生成プロセスの状態が正常であるか否かを判断することができる。

【0022】

一実施形態では、前記蛍光検出領域３３は前記第２管路２３に位置し、前記第２管路２３において、前記反応チャンバー１１内から流出した微小液滴４は、十字交差点を通過するときに、前記油液管路２１内の検出油の作用下で、適切な間隔を持った液滴列に分離することができ、それにより外部システムの作用下で蛍光検出が完了する。

【0023】

具体的な実施形態として、前記試料添加チャンバー１２は、開口チャンバー１２１と、前記開口チャンバー１２１の開口に密封接続された密封カバー１２２とを含み、オペレータが前記試料添加チャンバー１２に追加するのを容易にする。さらに、前記試料添加チャンバー１２には濾過膜又は排気孔が設けられる。試料添加チャンバー１２が廃液溜まりとなった場合（即ち、液滴チップが逆さまに反転された場合）、一定の空気が排出されて、前記試料添加チャンバー１２内の圧力の蓄積が防止される。

【0024】

幾つかの実施形態では、前記微小液滴４が前記反応チャンバー１１内に進入する前に、前記反応チャンバー１１内に軽油（即ち、密度が比較的小さい油液）が予め配置され、前記軽油が常に前記反応チャンバー１１内の微小液滴４の頂部に位置することが保証され、それによって増幅時の微小液滴の蒸発の問題が解決され、無熱蓋ＰＣＲが実現される。

【0025】

本発明の実施例によれば、一体型デジタルＰＣＲ装置の制御方法がさらに提供される。この方法は、チップローディングステップと、液滴生成ステップと、温度サイクルステップと、蛍光検出ステップと、チップ廃棄ステップとを含む。
前記チップローディングステップでは、一体型微小液滴１００をチップローディングモジュール２００内に置く。
前記液滴生成ステップでは、前記チップローディングモジュール２００内の一体型微小液滴チップ１００を液滴生成モジュール３００内に移送し、前記一体型微小液滴チップ１００の試料添加チャンバー１２内の試料を制御して、微小液滴４を生成してから反応チャンバー１１内に貯蔵する。
前記温度サイクルステップでは、前記一体型微小液滴チップ１００を上下に１８０°反転した後、前記一体型微小液滴チップ１００の底部に位置する反応チャンバー１１内の微小液滴内の微小液滴４に対する加熱冷却サイクルを形成する。
前記蛍光検出ステップでは、前記反応チャンバー１１内の微小液滴の増幅が完了した後、前記反応チャンバー１１内の微小液滴を制御して蛍光検出領域３３に進入させ、蛍光検出を完了する。
前記チップ廃棄ステップでは、蛍光検出が完了した後の一体化微小液滴チップをチップ廃棄モジュール内に移送する。

【0026】

本発明の一体型デジタルＰＣＲ装置の動作原理について、具体的な実施例を参照して以下にさらに説明する。

【0027】

第１ステップでは、まず、３０マイクロリットルのシステム（即ち、試料）を試料添加チャンバー１２に加え、３０マイクロリットルのＰＣＲシステムは、１０マイクロリットルのＢｉｏ－Ｒａｄ社のｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ、５マイクロリットルのＧＪＢ２遺伝子上流と下流プライマー試薬、及び１ｎｇのゲノムＤＮＡを含有する５マイクロリットルのテンプレートを含む。一体型微小液滴チップ１００全体は図２に示される。１枚のチップは、８つの平行し独立した液滴チップ構造を含み、それぞれの構造は、試料添加チャンバー１２、油液ポート３１、気液ポート３２、微小液滴生成構造、反応チャンバー１１を含む。次に、密封カバー１２２を密閉又は接着して、試料添加チャンバー１２を密封する。試料添加チャンバー１２には、濾過膜又は小径の排気孔を有することが好ましい。

【0028】

第２ステップでは、試料が添加された前記一体型微小液滴チップを、一体型デジタルＰＣＲ装置における前記チップローディングモジュール２００に手動で置き、その後、ドアを閉じ、装置のプロセスを開始する。

【0029】

第３ステップでは、前記スケジューリング機構７００が一体型微小液滴チップ１００の状態をスキャンして確認した後、スケジューリング機構７００は、前記チップローディングモジュール２００から一体型微小液滴チップ１００を掴み取って、液滴生成モジュール３００内に移送する。

【0030】

第４ステップでは、図３及び図４に示すように、前記液滴生成モジュール３００において微小液滴を調整する。まず、液滴生成に必要な生成油Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｉｌを油液ポート３１に供給する。生成油液には、液滴を安定化できる界面活性剤が含まれている。気液ポート３２に負圧を供給する。圧力の大きさは－ ２００ ｍＢａｒである。その結果、それと試料添加チャンバー１２及び油液ポート３１との間に圧力差が形成される。試料添加チャンバー１２は、微小液滴生成構造内の第２管路２３に接続され、油液ポート３１は、微小液滴生成構造内の油液管路２１に接続され、第１管路２２及び気液ポート３２はいずれも反応チャンバー１１に接続され、ここで、第１管路２２は接続ポート１１１に接続され、気液ポート３２は気液管路１１２に接続される。微小液滴生成構造の各部分は図２に示される。油液管路２１は２つの分岐を有する。２つの分岐は、それぞれ第２管路２３と第１管路２２の両側に位置し、いずれも油液ポート３１に接続される。圧力差の駆動により、反応系は第２管路２３に進入し、生成油は油液管路２１に進入し、十字構造で合流し、流体せん断力と表面張力の作用により、サイズが均一な油中水型微小液滴を形成する。十字での管路は、深さが約７０マイクロメートル、幅が８０マイクロメートル、液滴のサイズが約１００マイクロメートルである。微小液滴は第１管路２２に進入し、且つ微小液滴観測領域３４に進入した後に流速が遅くなり、密な液滴コミュニティを形成し、カメラによる画像化及び記録が容易になる。液滴生成プロセスの原理図は図４に示される。生成した液滴は、第１管路２２を流れた後、反応チャンバー１１の接続ポート１１１に達する。接続ポート１１１の底部にはスロープ構造（即ち、前述のラッパ口）があり、スロープの底部は第１管路２２と連通する。液滴生成プロセスが終了するとき、チップポートに加えられた圧力差が除去される。このとき、図５に示すように、液滴は依然として気液管路１１２の下方に位置しているはずである。

【0031】

第５ステップでは、微小液滴の調製が完了した後、前記スケジューリング機構７００は、チップを前記液滴生成モジュール３００から取り出し、図６に示すように、チップを上下に反転して、液滴を接続ポート１１１から反応領域に（即ち、前記接続ポート１１１から遠ざけて）移送する。

【0032】

第６ステップでは、前記スケジューリング機構７００は、反転されたチップを前記温度サイクルモジュール４００に置く。反応領域の構造は、例えば奥行きが深く、厚みが薄いフラットな設計など、熱伝達効率が高い設計を採用する必要がある。温度サイクルモジュール４００が左右両側から反応領域を加熱及び冷却するこれにより、温度伝導距離が短いだけでなく、接触面積が広いことが保証されて、効率的な熱伝達が実現される。本実施例では、温度サイクルプロセスは、９５℃で１０分間の予変性、次いで４０回の温度サイクルを行い、各サイクルは、９５℃で５秒間、６０℃で１５秒間、最後に４℃で保温する。蒸発を低減するために、反応チャンバー１１内に３０マイクロリットルの低密度揮発防止剤（例えば、前記の軽油）を事前に置くことができる。

【0033】

第７ステップでは、増幅反応が完了した後、スケジューリング機構７００は、チップを温度サイクルモジュール４００から前記蛍光検出モジュール５００内に移送して、微小液滴蛍光検出を実行する。蛍光検出モジュール５００は、気液ポート３２に検出油を注入し、反応チャンバー１１を連続的に満たす。図７に示すように、この過程において、液滴の液面は上昇を続け、そして接続ポート１１１のスロープによりガイドされて、第１管路２２に進入する。液滴が第１管路２２内の観測領域を通過するとき、増幅反応後の液滴の状態を評価するために、カメラを利用して液滴の明視野イメージングを実行することもできる。同時に、蛍光検出モジュール５００は、油液ポート３１に検出油を注入する。検出油は、油液管路２１を経由して、十字管路で液滴列と合流し、緊密に配列された液滴を、適切な間隔を持った液滴列に分離する。液滴列は、図８に示すように、第２管路２３に位置する蛍光検出領域３３を順に通過する。

【0034】

蛍光検出領域３３に対応する位置は、蛍光検出モジュール５００の蛍光検出焦点である。蛍光検出過程は図９に示される。蛍光検出モジュール５００の励起光源９１は、例えば波長４８８ｎｍ及び５３２ｎｍのレーザーやＬＥＤ狭帯域光などの励起光９２を、分光光路９４を介して蛍光検出領域３３に集束させる。液滴が蛍光検出領域３３を順に通過する過程において、液滴内で励起された蛍光９３も、分光光路９４によって受光され、蛍光検出ユニット９５に分配されて収集され、図１０に示すように、各液滴の蛍光情報が取得される。液滴の蛍光情報を用いて信号閾値を定め、液滴の陰性と陽性を区別し、ポアソン分布モデルを用いて、試料中の目標分子のコピー数を計算する。最終的に蛍光検出が完了した液滴は試料添加チャンバー１２に進入する。試料添加チャンバー１２は密封カバー１２２によって密封されたため、チップ外部の環境と接触することがなく、アエロゾール汚染の可能性が排除され、完全に密閉されたデジタルＰＣＲプロセスが実現される。

【0035】

第８ステップでは、すべての試料の検出が完了した後、スケジューリング機構７００は、チップを蛍光検出モジュール５００から取り出し、チップ廃棄モジュール６００内に移送して、デジタルＰＣＲ検出プロセス全体を完了する。

【0036】

当業者であれば、矛盾がない限り、上述の有利な方式を自由に組み合わせたり、重ね合わせたりできることを容易に理解することができる。

【0037】

上述は本発明の好適な実施形態に過ぎず、本発明はこれに限定されるものでなく、本発明の精神及び原則内に属する限り、行われる全ての修正、同等の置き換え、改善などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。以上は本発明の好ましい実施形態にすぎず、本発明の技術原理から逸脱することなく、幾つかの改良及び修飾を行うことができ、これらの改良及び変形も発明の保護範囲に含まれることは、当業者にとって明らかである。

【符号の説明】

【0038】

１、チップ本体；１１、反応チャンバー；１１１、接続ポート；１１２、気液管路；１２、試料添加チャンバー；１２１、開口チャンバー；１２２、密封カバー；２１、油液管路；２２、第１管路；２３、第２管路；３１、油液ポート；３２、気液ポート；３３、蛍光検出領域；３４、微小液滴観測領域；４、微小液滴；５、検出押し油；９１、励起光源；９２、励起光；９３、蛍光；９４、分光光路；９５、蛍光検出ユニット；１００、一体型微小液滴チップ；２００、チップローディングモジュール；３００、液滴生成モジュール；４００、温度サイクルモジュール；５００、蛍光検出モジュール；６００、チップ廃棄モジュール；７００、スケジューリング機構；８００、主制御モジュール。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】