特表2024-539512 | 知財ポータル「IP Force」

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特表2024-539512ＭＲＮＡワクチン組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-28

(54)【発明の名称】ＭＲＮＡワクチン組成物

(51)【国際特許分類】

A61K 48/00 20060101AFI20241018BHJP

C12N 15/50 20060101ALI20241018BHJP

C12N 15/113 20100101ALI20241018BHJP

A61K 47/44 20170101ALI20241018BHJP

A61K 47/28 20060101ALI20241018BHJP

A61K 39/215 20060101ALI20241018BHJP

A61K 9/127 20060101ALI20241018BHJP

A61K 9/51 20060101ALI20241018BHJP

A61K 47/46 20060101ALI20241018BHJP

A61K 9/107 20060101ALI20241018BHJP

A61K 9/133 20060101ALI20241018BHJP

A61K 47/22 20060101ALI20241018BHJP

A61K 9/19 20060101ALI20241018BHJP

A61K 47/26 20060101ALI20241018BHJP

A61K 47/10 20170101ALI20241018BHJP

A61K 47/34 20170101ALI20241018BHJP

A61K 47/12 20060101ALI20241018BHJP

A61K 47/02 20060101ALI20241018BHJP

A61K 39/145 20060101ALI20241018BHJP

A61K 39/12 20060101ALI20241018BHJP

A61K 39/29 20060101ALI20241018BHJP

A61K 39/21 20060101ALI20241018BHJP

A61K 39/235 20060101ALI20241018BHJP

A61K 39/155 20060101ALI20241018BHJP

A61P 37/04 20060101ALI20241018BHJP

A61P 31/12 20060101ALI20241018BHJP

A61P 31/14 20060101ALI20241018BHJP

A61P 31/16 20060101ALI20241018BHJP

A61P 31/20 20060101ALI20241018BHJP

A61P 31/18 20060101ALI20241018BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

C12N15/50 ZNA

C12N15/113 Z

A61K47/44

A61K47/28

A61K39/215

A61K9/127

A61K9/51

A61K47/46

A61K9/107

A61K9/133

A61K47/22

A61K9/19

A61K47/26

A61K47/10

A61K47/34

A61K47/12

A61K47/02

A61K39/145

A61K39/12

A61K39/29

A61K39/21

A61K39/235

A61K39/155

A61P37/04

A61P31/12

A61P31/14

A61P31/16

A61P31/20

A61P31/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024548515

(86)(22)【出願日】2022-10-19

(85)【翻訳文提出日】2024-06-24

(86)【国際出願番号】 US2022047107

(87)【国際公開番号】W WO2023069498

(87)【国際公開日】2023-04-27

(31)【優先権主張番号】63/270,964

(32)【優先日】2021-10-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/290,889

(32)【優先日】2021-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/320,647

(32)【優先日】2022-03-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524155747

【氏名又は名称】セイルバイオメディシンズインコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田七重

(74)【代理人】

【識別番号】100228005

【弁理士】

【氏名又は名称】澤田英之

(72)【発明者】

【氏名】モサヘブムニール

(72)【発明者】

【氏名】パテルシッダルト

(72)【発明者】

【氏名】アラファイマッド

(72)【発明者】

【氏名】ボゴラードローマン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

【Ｆターム（参考）】

4C076AA17

4C076AA19

4C076AA20

4C076AA30

4C076AA65

4C076BB13

4C076CC07

4C076CC35

4C076DD23

4C076DD38

4C076DD41

4C076DD50Z

4C076DD60

4C076DD60Z

4C076DD67

4C076DD70

4C076EE23

4C076EE51

4C076EE53

4C084AA13

4C084MA05

4C084MA22

4C084MA24

4C084MA38

4C084MA44

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB33

4C085AA03

4C085BA51

4C085BA55

4C085BA57

4C085BA65

4C085BA71

4C085BA77

4C085BA87

4C085DD84

4C085EE05

4C085GG01

(57)【要約】

天然の脂質およびイオン化可能な脂質を含む脂質再構成植物メッセンジャーパック（ＬＰＭＰ）内に製剤化された、一つまたは複数の抗原性ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを含む核酸ワクチン組成物が、本明細書に開示される。本開示はまた、イオン化可能な脂質の存在下で精製されたＰＭＰ脂質を含む膜を再構成して、イオン化可能な脂質を含むＬＰＭＰを生成すること、および一つまたは複数の抗原性ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドをＬＰＭＰに充填することを含む、核酸ワクチンを作製する方法を含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸ワクチンであって、
感染性疾患、障害、または状態を引き起こす感染因子に由来する一つまたは複数の抗原性ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを含み、
天然の脂質およびイオン化可能な脂質を含む脂質再構成植物メッセンジャーパック（ＬＰＭＰ）内に製剤化され、前記イオン化可能な脂質が、以下に挙げられる特徴：
（ｉ）少なくとも２つのイオン化可能なアミン、
（ｉｉ）少なくとも３つの脂質尾部であって、前記脂質尾部の各々が、少なくとも６個の炭素原子の長さである、脂質尾部、
（ｉｉｉ）約４．５～約７．５のｐＫａ、
（ｉｖ）少なくとも二個の原子の鎖によって分けられたイオン化可能なアミンおよびヘテロ有機基、ならびに
（ｖ）少なくとも１０のＮ：Ｐ比、のうちの二つ以上を有する、核酸ワクチン。

【請求項2】

前記天然の脂質が、レモンまたは藻類から抽出される、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項3】

前記ＬＰＭＰが、ステロールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートをさらに含む、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項4】

前記ＬＰＭＰが、約３５：５０：１２．５：２．５のモル比で、イオン化可能な脂質：天然脂質：ステロール：ＰＥＧ脂質を含む、請求項３に記載の核酸ワクチン。

【請求項5】

前記ＬＰＭＰが、約３５：２０：４２．５：２．５のモル比で、イオン化可能な脂質：天然脂質：ステロール：ＰＥＧ脂質を含む、請求項３に記載の核酸ワクチン。

【請求項6】

前記イオン化可能な脂質が、１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、ＭＤ１（ｃＫＫ－Ｅ１２）、ＯＦ２、ＥＰＣ、ＺＡ３－Ｅｐ１０、ＴＴ３、ＬＰ０１、５Ａ２－ＳＣ８、脂質５、ＳＭ－１０２（脂質Ｈ）、およびＡＬＣ－３１５からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項7】

前記イオン化可能な脂質が、

【化1】

（式中、ＲはＣ８－Ｃ１４アルキル基である）である、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項8】

前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項9】

前記抗原性ポリペプチドが、コロナウイルス、またはその断片もしくはサブユニットである、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項10】

前記抗原性ポリペプチドが、ＭＥＲＳウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）のスパイクタンパク質（Ｓ）、またはその断片もしくはサブユニットである、請求項９に記載の核酸ワクチン。

【請求項11】

前記抗原性ポリペプチドが、ＳＡＲＳウイルス、またはその断片もしくはサブユニットである、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項12】

前記抗原性ポリペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質である、請求項１１に記載の核酸ワクチン。

【請求項13】

前記抗原性ポリペプチドが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質である、請求項１２に記載の核酸ワクチン。

【請求項14】

前記ｍＲＮＡが、
（ａ）ＤＮＡ分子、または
（ｂ）ＴがＵで置換されているＲＮＡ分子、に由来する、請求項８に記載の核酸ワクチン。

【請求項15】

前記ＤＮＡ分子が、プロモーターをさらに含む、請求項１４に記載の核酸ワクチン。

【請求項16】

前記プロモーターが、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置する、請求項１５に記載の核酸ワクチン。

【請求項17】

前記プロモーターが、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、またはＳＰ６プロモーターである、請求項１４に記載の核酸ワクチン。

【請求項18】

前記ＲＮＡ分子が、自己複製ＲＮＡ分子である、請求項１４に記載の核酸ワクチン。

【請求項19】

前記ＲＮＡ分子が、５’キャップをさらに含む、請求項１４または請求項１８に記載の核酸ワクチン。

【請求項20】

前記５’キャップが、キャップ１構造、キャップ１（ｍ６Ａ）構造、キャップ２構造、キャップ３構造、キャップ０構造、または任意のその組み合わせを有する、請求項１９に記載の核酸ワクチン。

【請求項21】

前記ｍＲＮＡが、二重プロリン安定化変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、請求項８に記載の核酸ワクチン。

【請求項22】

前記二重プロリン安定化変異が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ糖タンパク質のＫ９８６およびＶ９８７に対応する位置にある、請求項２１に記載の核酸ワクチン。

【請求項23】

前記ｍＲＮＡが、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’ＵＴＲを含む、請求項８に記載の核酸ワクチン。

【請求項24】

前記５’ＵＴＲが、コザック配列を含む、請求項２３に記載の核酸ワクチン。

【請求項25】

前記３’ＵＴＲが、スプリットのアミノ末端エンハンサー（ＡＥＳ）に由来する配列を含む、請求項２３に記載の核酸ワクチン。

【請求項26】

前記３’ＵＴＲが、ミトコンドリアによりコードされた１２ＳｒＲＮＡ（ｍｔＲＮＲｌ）に由来する配列を含む、請求項２３に記載の核酸ワクチン。

【請求項27】

前記ｍＲＮＡが、ポリ（Ａ）配列を含む、請求項８に記載の核酸ワクチン。

【請求項28】

前記ポリ（Ａ）配列が、３０個のアデノシン残基の配列、１０個のヌクレオチドのリンカー配列、および７０個のアデノシン残基の配列からなる１１０個のヌクレオチド配列である、請求項２７に記載の核酸ワクチン。

【請求項29】

前記ＬＰＭＰが、リポプレックス、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー系担体、エクソソーム、ラメラ体、ミセル、およびエマルションからなる群から選択される親油性部分である、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項30】

前記ＬＰＭＰが、カチオン性リポソーム、ナノリポソーム、プロテオリポソーム、単層リポソーム、多層リポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、および多胞リポソームからなる群から選択されるリポソームである、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項31】

前記ＬＰＭＰが、脂質ナノ粒子である、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項32】

前記ＬＰＭＰが、約２００ｎｍ未満のサイズを有する、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項33】

前記ＬＰＭＰが、約１５０ｎｍ未満のサイズを有する、請求項３２に記載の核酸ワクチン。

【請求項34】

前記ＬＰＭＰが、約１００ｎｍ未満のサイズを有する、請求項３２に記載の核酸ワクチン。

【請求項35】

前記脂質ナノ粒子が、約５５ｎｍ～約８０ｎｍのサイズを有する、請求項３１に記載の核酸ワクチン。

【請求項36】

前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＰＥである、請求項３に記載の核酸ワクチン。

【請求項37】

前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＰＥＧ－ＤＭＧであり、前記ＰＥＧ－ＤＭＧが、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧまたはＰＥＧ２０００－ＰＥである、請求項３６に記載の核酸ワクチン。

【請求項38】

前記ＬＰＭＰが、
約２０モル％～約５０モル％の前記イオン化可能な脂質、
約２０モル％～約６０モル％の前記天然の脂質、
約７モル％～約２０モル％の前記ステロール、および
約０．５モル％～約３モル％の前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の核酸ワクチン。

【請求項39】

前記ＬＰＭＰが、
約３５モル％の前記イオン化可能な脂質、
約５０モル％の前記天然の脂質、
約１２．５モル％の前記ステロール、および
約２．５モル％の前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む、請求項３８に記載の核酸ワクチン。

【請求項40】

前記核酸ワクチンが、約５０：１～約１０：１の総脂質：ポリヌクレオチド重量比を有する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の核酸ワクチン。

【請求項41】

前記核酸ワクチンが、約４４：１～約２４：１の総脂質：ポリヌクレオチド重量比を有する、請求項４０に記載の核酸ワクチン。

【請求項42】

前記核酸ワクチンが、約４０：１～約２８：１の総脂質：ポリヌクレオチド重量比を有する、請求項４０に記載の核酸ワクチン。

【請求項43】

前記核酸ワクチンが、約３８：１～約３０：１の総脂質：ポリヌクレオチド重量比を有する、請求項４０に記載の核酸ワクチン。

【請求項44】

前記核酸ワクチンが、約３７：１～約３３：１の総脂質：ポリヌクレオチド重量比を有する、請求項４０に記載の核酸ワクチン。

【請求項45】

約７．０～約８．５のｐＨでＨＥＰＥＳまたはＴＲＩＳ緩衝液をさらに含む、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項46】

前記ＨＥＰＥＳまたはＴＲＩＳ緩衝液が、約７ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項47】

約２．０ｍｇ／ｍＬ～約４．０ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌをさらに含む、請求項４５または４６に記載の核酸ワクチン。

【請求項48】

一つまたは複数の凍結保護剤をさらに含む、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項49】

前記一つまたは複数の凍結保護剤が、スクロース、グリセロール、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項50】

前記核酸ワクチンが、約７０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースおよび約５０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬの濃度のグリセロールの組み合わせを含む、請求項４９に記載の核酸ワクチン。

【請求項51】

前記核酸ワクチンが、凍結乾燥組成物である、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項52】

前記凍結乾燥核酸ワクチンが、一つまたは複数のリオプロテクタントを含む、請求項５１に記載の核酸ワクチン。

【請求項53】

前記凍結乾燥核酸ワクチンが、ポロキサマー、ソルビン酸カリウム、スクロース、または任意のその組み合わせを含む、請求項５２に記載の核酸ワクチン。

【請求項54】

前記ポロキサマーが、ポロキサマー１８８である、請求項５３に記載の核酸ワクチン。

【請求項55】

前記凍結乾燥核酸ワクチンが、約０．０１～約１．０％ｗ／ｗの前記ポリヌクレオチドを含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の核酸ワクチン。

【請求項56】

前記凍結乾燥核酸ワクチンが、約１．０～約５．０％ｗ／ｗの脂質を含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の核酸ワクチン。

【請求項57】

前記凍結乾燥核酸ワクチンが、約０．５～約２．５％ｗ／ｗのＴＲＩＳ緩衝液を含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の核酸ワクチン。

【請求項58】

前記凍結乾燥核酸ワクチンが、約０．７５～約２．７５％ｗ／ｗのＮａＣｌを含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の核酸ワクチン。

【請求項59】

前記凍結乾燥核酸ワクチンが、約８５～約９５％ｗ／ｗの糖を含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の核酸ワクチン。

【請求項60】

前記糖が、スクロースである、請求項５９に記載の核酸ワクチン。

【請求項61】

前記凍結乾燥核酸ワクチンが、約０．０１～約１．０％ｗ／ｗのポロキサマーを含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の核酸ワクチン。

【請求項62】

前記ポロキサマーが、ポロキサマー１８８である、請求項６１に記載の核酸ワクチン。

【請求項63】

前記凍結乾燥核酸ワクチンが、約１．０～約５．０％ｗ／ｗのソルビン酸カリウムを含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の核酸ワクチン。

【請求項64】

前記感染因子が、ウイルスである、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項65】

前記感染因子が、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、蚊媒介性ウイルス、肝炎ウイルス、およびＨＩＶウイルスからなる群から選択されるウイルスである、請求項６４に記載の核酸ワクチン。

【請求項66】

前記感染因子が、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、およびパラインフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスである、請求項１に記載の核酸ワクチン。

【請求項67】

核酸ワクチンを製造する方法であって、
イオン化可能な脂質の存在下で精製されたＰＭＰ脂質を含む膜を再構成して、前記イオン化可能な脂質を含む脂質再構成植物メッセンジャーパック（ＬＰＭＰ）を生成することであって、前記イオン化可能な脂質が、以下に挙げられる特徴：
（ｉ）少なくとも２つのイオン化可能なアミン、
（ｉｉ）少なくとも３つの脂質尾部であって、前記脂質尾部の各々が、少なくとも６個の炭素原子の長さである、脂質尾部、
（ｉｉｉ）約４．５～約７．５のｐＫａ、
（ｉｖ）少なくとも二個の原子の鎖によって分けられたイオン化可能なアミンおよびヘテロ有機基、ならびに
（ｖ）少なくとも１０のＮ：Ｐ比、のうちの二つ以上を有する、生成することと、
感染性疾患、障害、または状態を引き起こす感染因子に由来する一つまたは複数の抗原性ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを、前記ＬＰＭＰに充填することと、を含む、方法。

【請求項68】

感染性疾患、障害、または状態の伝播を予防または低減する方法であって、
対象に請求項１に記載の核酸ワクチンを投与し、これにより、感染性疾患、障害、または状態の前記伝播を予防するか、または低減することを含む、方法。

【請求項69】

前記方法が、ワクチン接種された宿主からワクチン接種されていない宿主への前記感染因子の前記伝播を予防するか、または低減する、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記方法が、ワクチン接種された宿主からワクチン接種された宿主への前記感染因子の前記伝播を予防するか、または低減する、請求項６８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／２７０，９６４号、２０２１年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２９０，８８９号および２０２２年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／３２０，６４７号に対する優先権の利益を主張するものであり、その全てが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

新規のコロナウイルスによって引き起こされる新たに出現した急性呼吸器ウイルス感染症は、重大な公衆衛生上の懸念である。ＳＡＲＳＣｏＶ－２ウイルスが引き起こすパンデミック疾患は、世界保健機関（ＷＨＯ）によってＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス疾患２０１９）と名付けられた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる公衆衛生上の危機は、これらのウイルスに対する有効的で、容易に量産可能で、かつ安定したワクチン送達を迅速に開発することの重要性を増す。
ＲＮＡワクチンは、最近、有望視されている。したがって、より有効で、容易に量産可能で、かつ安定したワクチン送達のための強化されたＲＮＡ送達システムを開発するニーズが存在する。

【発明の概要】

【0003】

一態様では、感染性疾患、障害、または状態を引き起こす感染因子に由来する一つまたは複数の抗原性ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンが、本明細書に提供される。一つまたは複数のポリヌクレオチドは、天然の脂質およびイオン化可能な脂質を含む脂質再構成植物メッセンジャーパック（ＬＰＭＰ）内で製剤化される。イオン化可能な脂質は、以下に列挙される特徴：
（ｉ）少なくとも２つのイオン化可能なアミン、
（ｉｉ）少なくとも３つの脂質尾部であって、脂質尾部の各々が、少なくとも６個の炭素原子の長さである、脂質尾部、
（ｉｉｉ）約４．５～約７．５のｐＫａ、
（ｉｖ）少なくとも二個の原子の鎖によって分けられたイオン化可能なアミンおよびヘテロ有機基、ならびに
（ｖ）少なくとも１０のＮ：Ｐ比、のうちの二つ以上を有する。
別の態様では、核酸ワクチンを製造する方法が本明細書に提供される。方法は、イオン化可能な脂質の存在下で精製されたＰＭＰ脂質を含む膜を再構成して、イオン化可能な脂質を含む脂質再構成植物メッセンジャーパック（ＬＰＭＰ）を生成することを含む。イオン化可能な脂質は、以下に列挙される特徴：
（ｉ）少なくとも２つのイオン化可能なアミン、
（ｉｉ）少なくとも３つの脂質尾部であって、脂質尾部の各々が、少なくとも６個の炭素原子の長さである、脂質尾部、
（ｉｉｉ）約４．５～約７．５のｐＫａ、
（ｉｖ）少なくとも二個の原子の鎖によって分けられたイオン化可能なアミンおよびヘテロ有機基、ならびに
（ｖ）少なくとも１０のＮ：Ｐ比、のうちの二つ以上を有する。
方法は、感染性疾患、障害、または状態を引き起こす感染因子に由来する一つまたは複数の抗原性ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドをＬＰＭＰに充填することをさらに含む。

【0004】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一つまたは複数の野生型または操作された抗原（もしくは抗原に対する抗体）をコードするポリヌクレオチド構築物である。抗原は、感染因子に由来してもよい。一部の実施形態では、感染因子は、ウイルス、例えば、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、蚊媒介性ウイルス、肝炎ウイルス、およびＨＩＶウイルスからなる群から選択されるウイルスである。一部の実施形態では、感染因子は、ウイルス、例えば、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、またはパラインフルエンザウイルスである。例えば、感染因子は、ウイルスの一つまたは複数の株であってもよい。

【0005】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる抗原性ポリペプチドは、コロナウイルス、またはその断片もしくはサブユニットである。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＭＥＲＳウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、またはその断片もしくはサブユニットのスパイクタンパク質（Ｓ）である。
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＳＡＲＳウイルス、またはその断片もしくはサブユニットである。抗原性ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質であってもよい。一実施形態では、抗原性ポリペプチドは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質である。

【0006】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ前駆体、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）もしくはｍｉＲＮＡ前駆体、プラスミド、ダイサー基質低分子干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ピウィ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、リボザイム、デオキシリボザイム（ＤＮＡザイム）、アプタマー、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはこれらのＲＮＡのいずれかをコードするＤＮＡ分子であってもよい。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、（ａ）ＤＮＡ分子、または（ｂ）ＲＮＡ分子に由来する。ｍＲＮＡでは、Ｔは、Ｕで任意選択的に置換される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ分子に由来する。ＤＮＡ分子は、プロモーターをさらに含み得る。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、またはＳＰ６プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、５’ＵＴＲに位置する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子であってもよい。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子は、５’キャップをさらに含んでもよい。５’キャップは、キャップ１構造、キャップ１（ｍ６Ａ）構造、キャップ２構造、キャップ３構造、キャップ０構造、または任意のその組み合わせを有し得る。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、二重プロリン安定化変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。一実施形態では、二重プロリン安定化変異は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ糖タンパク質のＫ９８６およびＶ９８７に対応する位置にある。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’ＵＴＲを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを含む。５’ＵＴＲは、コザック配列を含み得る。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、スプリットのアミノ末端エンハンサー（ＡＥＳ）に由来する一つまたは複数の配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ミトコンドリアによりコードされた１２ＳｒＲＮＡ（ｍｔＲＮＲｌ）に由来する配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、３０個のアデノシン残基の配列、１０個のヌクレオチドのリンカー配列、および７０個のアデノシン残基の配列からなる１１０個のヌクレオチド配列である。

【0007】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質再構成植物メッセンジャーパック（ＬＰＭＰ）によって封入される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＬＰＭＰの表面に包埋される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＬＰＭＰの表面にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、脂質押し出しを含む方法によって生成される。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、水相を含むマイクロ流体装置においてＰＭＰの脂質抽出物を含む溶液を処理して、それによってＬＰＭＰを生成することを含む方法によって生成される。一部の実施形態では、水相は、ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰの天然脂質は、レモンまたは藻類から抽出される。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰのイオン化可能な脂質は、１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、ＭＤ１（ｃＫＫ－Ｅ１２）、ＯＦ２、ＥＰＣ、ＺＡ３－Ｅｐ１０、ＴＴ３、ＬＰ０１、５Ａ２－ＳＣ８、脂質５、ＳＭ－１０２（脂質Ｈ）、およびＡＬＣ－３１５からなる群から選択される。
一実施形態では、イオン化可能な脂質は、Ｃ１２－２００である。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、

【化1】

（Ｉ）、
（式中、ＲはＣ８－Ｃ１４アルキル基である）である。

【0008】

一部の実施形態では、再構成は、ステロールの存在下で行われ、それによって、天然の脂質、イオン化可能な脂質、およびステロールを含むＬＰＭＰが生成される。一部の実施形態では、ステロールは、コレステロールまたはシトステロールである。
一部の実施形態では、再構成は、ＰＥＧ化脂質（またはＰＥＧ－脂質コンジュゲート）の存在下で行われ、それによって、天然の脂質、イオン化可能な脂質、およびＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含むＬＰＭＰが生成される。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、Ｃ１４－ＰＥＧ２ｋ、Ｃ１８－ＰＥＧ２ｋ、またはＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋである。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＰＥである。一部の実施形態では、ＰＥＧ－ＤＭＧは、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧまたはＰＥＧ２０００－ＰＥである。

【0009】

一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、ステロールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートをさらに含む。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、
約２０モル％～約５０モル％のイオン化可能な脂質、
約２０モル％～約６０モル％の天然の脂質、
約７モル％～約２０モル％のステロール、および
約０．５モル％～約３モル％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、
約３５モル％のイオン化可能な脂質、
約５０モル％の天然の脂質、
約１２．５モル％のステロール、および
約２．５モル％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む。

【0010】

一実施形態では、ＬＰＭＰは、約３５：５０：１２．５：２．５のモル比でイオン化可能な脂質：天然脂質：ステロール：ＰＥＧ脂質を含む。一実施形態では、ＬＰＭＰは、約３５：２０：４２．５：２．５のモル比でイオン化可能な脂質：天然脂質：ステロール：ＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、
レモンまたは藻類から抽出された天然の脂質、
Ｃ１２－２００、
コレステロール、および
ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋを含む。
一実施形態では、ＬＰＭＰは、
レモンから抽出された天然の脂質、
Ｃ１２－２００、
コレステロール、および
ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋを含む。ＬＰＭＰは、約３５：５０：１２．５：２．５のモル比でＣ１２－２００：レモン脂質：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋを含んでもよい。
一実施形態では、ＬＰＭＰは、
藻類から抽出された天然の脂質、
Ｃ１２－２００、
コレステロール、および
ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋを含む。ＬＰＭＰは、約３５：２０：４２．５：２．５のモル比でＣ１２－２００：藻類脂質：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋを含んでもよい。

【0011】

一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、リポプレックス、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー系担体、エクソソーム、ラメラ体、ミセル、およびエマルションからなる群から選択される親油性部分である。一実施形態では、ＬＰＭＰは、カチオン性リポソーム、ナノリポソーム、プロテオリポソーム、単層リポソーム、多層リポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、および多胞リポソームからなる群から選択されるリポソームである。一実施形態では、ＬＰＭＰは、脂質ナノ粒子である。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、約２００ｎｍ未満のサイズを有する。一実施形態では、
ＬＰＭＰは、約１５０ｎｍ未満のサイズを有する。一実施形態では、ＬＰＭＰは、約１００ｎｍ未満のサイズを有する。一実施形態では、ＬＰＭＰは、約５５ｎｍ～約８０ｎｍのサイズを有する。

【0012】

一部の実施形態では、核酸ワクチンは、約５０：１～約１０：１の総脂質：ポリヌクレオチド重量比を有する。一実施形態では、核酸ワクチンは、約４４：１～約２４：１の総脂質：ポリヌクレオチド重量比を有する。一実施形態では、核酸ワクチンは、約４０：１～約２８：１の総脂質：ポリヌクレオチド重量比を有する。一実施形態では、核酸ワクチンは、約３８：１～約３０：１の総脂質：ポリヌクレオチド重量比を有する。一実施形態では、核酸ワクチンは、約３７：１～約３３：１の総脂質：ポリヌクレオチド重量比を有する。
一部の実施形態では、核酸ワクチン、例えば、水相は、ＨＥＰＥＳまたはＴＲＩＳ緩衝液をさらに含む。ＨＥＰＥＳまたはＴＲＩＳ緩衝液は、約７．０～約８．５のｐＨを有してもよい。ＨＥＰＥＳまたはＴＲＩＳ緩衝液は、約７ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬの濃度であり得る。水相は、約２．０ｍｇ／ｍＬ～約４．０ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌをさらに含んでもよい。
一部の実施形態では、核酸ワクチン、例えば、水相は、水、ＰＢＳ、またはクエン酸緩衝液をさらに含む。一実施形態では、水相は、約３．２のｐＨを有するクエン酸緩衝液を含む。
一部の実施形態では、水相および脂質溶液は、３：１の体積比で混合される。
一部の実施形態では、核酸ワクチンは、一つまたは複数の凍結保護剤をさらに含む。一つまたは複数の凍結保護剤は、スクロース、グリセロール、またはその組み合わせであってもよい。一実施形態では、核酸ワクチンは、約７０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースおよび約５０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬの濃度のグリセロールの組み合わせを含む。
一部の実施形態では、核酸ワクチンは、凍結乾燥組成物である。凍結乾燥核酸ワクチンは、一つまたは複数のリオプロテクタントを含んでもよい。凍結乾燥核酸ワクチンは、ポロキサマー、ソルビン酸カリウム、スクロース、または任意のその組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、凍結乾燥核酸ワクチンは、ポロキサマー、例えば、ポロキサマー１８８を含む。
一部の実施形態では、核酸ワクチンは、凍結乾燥組成物である。一実施形態では、凍結乾燥核酸ワクチンは、約０．０１～約１．０％ｗ／ｗのポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、凍結乾燥核酸ワクチンは、約１．０～約５．０％ｗ／ｗの脂質を含む。一実施形態では、凍結乾燥核酸ワクチンは、約０．５～約２．５％ｗ／ｗのＴＲＩＳ緩衝液を含む。一実施形態では、凍結乾燥核酸ワクチンは、約０．７５～約２．７５％ｗ／ｗのＮａＣｌを含む。一実施形態では、凍結乾燥核酸ワクチンは、約８５～約９５％ｗ／ｗの糖、例えば、スクロースを含む。一実施形態では、凍結乾燥核酸ワクチンは、約０．０１～約１．０％ｗ／ｗのポロキサマー、例えば、ポロキサマー１８８を含む。一実施形態では、凍結乾燥核酸ワクチンは、約１．０～約５．０％ｗ／ｗのソルビン酸カリウムを含む。

【0013】

本発明の態様はまた、感染性疾患、障害、または状態の伝播を予防または低減する方法を提供する。方法は、本発明の上記の態様に記載される核酸ワクチンを対象に投与し、それによって、感染性疾患、障害、または状態の伝播を予防または低減することを含む。一部の実施形態では、方法は、感染性疾患、障害、または状態の伝播を少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）低減する。あるいは、方法は、本発明の上記の態様に記載される核酸ワクチンを対象に投与し、それによって、感染性疾患、障害、または状態の別の対象への伝播レベルを１０％未満（例えば、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満）に低減する。

【0014】

定義
本明細書で使用される場合、「有効量」、「有効濃度」、または「有効な濃度」という用語は、列挙された結果をもたらすか、または標的生物内もしくは標的生物上の標的レベル（例えば、所定のレベルまたは閾値レベル）に達するのに十分なＬＰＭＰまたは核酸組成物の量を指す。
本明細書で使用される場合、「治療剤」という用語は、動物、例えば、哺乳類（例えば、ヒト）、動物病原体、または病原体ベクターに作用することができる薬剤、例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤、または防虫剤を指す。
本明細書で定義されるように、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、交換可能であり、長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００、またはそれ以上の核酸）に関わらず、直鎖もしくは分岐鎖、一本鎖もしくは二本鎖、またはそのハイブリッドであるＲＮＡまたはＤＮＡを指す。この用語はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを包含する。ヌクレオチドは、典型的には、ホスホジエステル結合によって核酸中で連結されるが、「核酸」という用語はまた、他のタイプの結合または骨格（例えば、とりわけ、ホスホラミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ－メチルホスホロアミデート、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオス核酸（ＴＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）結合または骨格）を有する核酸類似体も包含する。核酸は、一本鎖、二本鎖であってもよく、または一本鎖配列と二本鎖配列の両方の部分を含有してもよい。核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、ならびに例えば、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、および修飾塩基または非標準塩基（例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、および５ヒドロキシメチルシトシンを含む）を含む塩基の任意の組み合わせを含有し得る。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、５０、１００個、またはそれ以上のアミノ酸）、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）の存在もしくは不存在、または例えば、ペプチドに共有結合した一つまたは複数の非アミノアシル基（例えば、糖、脂質など）の存在に関わらず、天然または非天然に存在するアミノ酸（Ｄ－アミノ酸もしくはＬ－アミノ酸のいずれか）の任意の鎖を包含し、例えば、天然のタンパク質、合成、もしくは組換えポリペプチドおよびペプチド、ハイブリッド分子、ペプトイド、またはペプチドミメティックを含む。
本明細書で使用される場合、二つの配列間の「パーセント同一性」は、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載される、ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムによって決定される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公開されている。

【0015】

本明細書で使用される場合、「植物」という用語は、植物全体、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子、およびその子孫を指す。植物細胞には、種子、懸濁培養物、胚、毛様体領域、カルス組織、葉、根、新芽、配偶体、胞子体、花粉、および微小胞子由来の細胞が含まれるが、これらに限定されない。植物部分には、以下の、根、茎、新芽、葉、花粉、種子、果物、収穫された産物、腫瘍組織、樹液（例えば、木部汁液およびフロエムサップ）、ならびに様々な形態の細胞および培養物（例えば、単一細胞、原生生物、胚、およびカルス組織）を含むが、これらに限定されない分化した組織および未分化の組織が含まれる。植物組織は、植物内、または植物器官、組織、もしくは細胞培養物内にあってもよい。
本明細書で使用される場合、「修飾されたＰＭＰ」または「修飾されたＬＰＭＰ」という用語は、非修飾ＰＭＰまたはＬＰＭＰと比べて、ＰＭＰもしくはＬＰＭＰ、またはその部分もしくは構成成分の細胞取り込み（例えば、動物細胞取り込み、植物細胞取り込み、細菌細胞取り込み、または真菌細胞取り込み）を増加させることができる一つまたは複数の異種薬剤（例えば、一つまたは複数の外因性脂質、例えば、イオン化可能な脂質、例えば、イオン化可能な脂質ならびにステロールおよび／またはＰＥＧ化脂質を含むＰＭＰまたはＬＰＭＰ）キャップ、ＰＭＰまたはＬＰＭＰによる異種機能性剤（例えば、農薬または治療剤）の細胞への送達を可能にするか、または増加させることができるキャップ、ならびに／あるいは異種機能性剤（例えば、農薬または治療剤）の充填（例えば、充填効率または充填能力）を可能にするか、または増加させることができるキャップを含む複数のＰＭＰまたはＬＰＭＰを含む組成物を指す。ＰＭＰまたはＬＰＭＰは、インビトロまたはインビボで修飾され得る。
本明細書で使用される場合、「非修飾ＰＭＰ」または「非修飾ＬＰＭＰ」という用語は、ＰＭＰの細胞取り込み（例えば、動物細胞取り込み、植物細胞取り込み、細菌細胞取り込み、または真菌細胞取り込み）を増加させることができる異種細胞取り込み剤を欠く複数のＰＭＰまたはＬＰＭＰを含む組成物を指す。

【0016】

本明細書で使用される場合、「細胞取り込み」という用語は、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、または真菌細胞などの細胞による、ＰＭＰもしくはＬＰＭＰまたはその部分もしくは構成成分（例えば、ＰＭＰまたはＬＰＭＰによって担持されるポリヌクレオチド）の取り込みを指す。例えば、取り込みは、細胞外環境から細胞膜、細胞壁、細胞外基質に、もしくは細胞膜、細胞壁、細胞外基質を横切った、または細胞の細胞内環境への、ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）またはその構成成分の部分の移送を含み得る。ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）の細胞取り込みは、能動的または受動的な細胞機序を介して生じ得る。細胞取り込みには、ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）全体が、細胞によって取り込まれる、例えば、エンドサイトーシスによって取り込まれる態様が含まれる。一部の実施形態では、一つまたは複数のポリヌクレオチドは、エンドサイトーシスおよびエンドソームエスケープ後に標的細胞の細胞質に曝露される。一部の実施形態では、修飾されたＬＰＭＰ（例えば、イオン化可能な脂質を含むＬＰＭＰ、例えば、イオン化可能な脂質ならびにステロールおよび／またはＰＥＧ化脂質を含むＬＰＭＰ）は、非修飾ＬＰＭＰと比較して、エンドソームエスケープの増加した速度を有する。細胞取り込みはまた、ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）が、標的細胞の膜と融合する態様を含む。一部の実施形態では、一つまたは複数のポリヌクレオチドは、膜融合後に標的細胞の細胞質に曝露される。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、非修飾ＬＰＭＰと比較して、標的細胞の膜との融合速度が増加している（例えば、より融合性である）。
本明細書で使用される場合、「細胞透過剤」という用語は、薬剤と接触していない細胞と比較して、細胞取り込みの増加を促進する様式で、細胞（例えば、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、または真菌細胞）の細胞壁、細胞外基質、または細胞膜の特性（例えば、透過性）を変化させる薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、「植物細胞外小胞」、「植物ＥＶ」、または「ＥＶ」という用語は、植物に天然に存在する囲まれた脂質二重層構造を指す。任意選択的に、植物ＥＶは、一つまたは複数の植物ＥＶマーカーを含む。本明細書で使用される場合、「植物ＥＶマーカー」という用語は、添付に列挙される植物ＥＶマーカーのいずれかを含むが、これらに限定されない、植物タンパク質、植物核酸、植物小分子、植物脂質、またはその組み合わせなどの植物と天然に関連する構成成分を指す。ある場合では、植物ＥＶマーカーは、植物ＥＶの識別マーカーであるが、殺虫剤ではない。ある場合では、植物ＥＶマーカーは、植物ＥＶの識別マーカーであり、殺虫剤でもある（例えば、複数のＰＭＰもしくはＬＰＭＰと会合するか、もしくはそれによって封入されるか、または複数のＰＭＰもしくはＬＰＭＰと直接的に会合されないか、もしくはそれによって封入されないかのいずれか）。

【0017】

本明細書で使用される場合、用語「植物メッセンジャーパック」または「ＰＭＰ」は、植物源もしくはセグメント、部分、またはその抽出物と関連する脂質または非脂質構成成分（例えば、ペプチド、核酸、または小分子）を含む、植物源もしくはセグメント、部分、またはその抽出物に由来し（例えば、濃縮される、単離されるか、または精製される）、植物、植物部分、または植物細胞、原料植物からの一つまたは複数の混入物または望ましくない構成成分を取り除いている濃縮物または単離物から濃縮されている、単離されているか、または精製されている、直径約５～２０００ｎｍ（例えば、少なくとも５～１０００ｎｍ、少なくとも５～５００ｎｍ、少なくとも４００～５００ｎｍ、少なくとも２５～２５０ｎｍ、少なくとも５０～１５０ｎｍ、または少なくとも７０～１２０ｎｍ）である、脂質構造（例えば、脂質二重層、単層、多層構造、例えば、小胞脂質構造）を指す。ＰＭＰは、天然に存在するＥＶの高度に精製された調製物であってもよい。好ましくは、原料植物から少なくとも１％の混入物または望ましくない構成要素が除去される（例えば、原料植物、例えば、植物細胞壁の構成成分、ペクチン、植物小器官（例えば、ミトコンドリア、色素体などの葉緑体、白色体もしくはアミロプラスト、および核）、植物クロマチン（例えば、植物染色体）、または植物分子凝集体（例えば、タンパク質凝集体、タンパク質－核酸凝集体、リポタンパク質凝集体、もしくはリピドタンパク質構造）からの一つまたは複数の混入物または望ましくない構成成分の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％）。好ましくは、ＰＭＰは、重量（ｗ／ｗ）、分光イメージング（透過率％）、または伝導度（Ｓ／ｍ）によって測定される、原料植物からの一つまたは複数の混入物または望ましくない構成成分と比較して、少なくとも３０％純粋（例えば、少なくとも４０％純粋、少なくとも５０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも７０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９９％純粋、または１００％純粋）である。

【0018】

脂質再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）が本明細書で使用される。「脂質再構成ＰＭＰ」および「ＬＰＭＰ」という用語は、植物源に由来する（例えば、濃縮される、単離または精製される）脂質構造（例えば、脂質二重層、単層、多層構造、例えば、小胞脂質構造）に由来するＰＭＰを指し、脂質構造は、本明細書に記載される通り、破壊され（例えば脂質抽出によって破壊され）、標準的な方法を使用して液相（例えば、カーゴを含有する液相）中で再構築または再構成され、例えば、脂質膜水和および／または溶媒注入を含む方法によって再構成され、ＬＰＭＰが生成されるＰＭＰを指す。方法は、所望される場合、例えば、再構成ＰＭＰのサイズを低減するために、超音波処理、凍結／融解処理、および／または脂質押出成形をさらに含み得る。あるいは、ＬＰＭＰは、マイクロ流体装置（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）ＩＧＮＩＴＥ（商標）マイクロ流体機器（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）など）を使用して生成されてもよい。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、カチオン基（例えば、カチオン性頭部基）を含有する、正に荷電している両親媒性分子（例えば、脂質またはリピドイド）を指す。
本明細書で使用される場合、「イオン化可能な脂質」という用語は、所与の状態（例えば、ｐＨ）下で、イオン化され得る、例えば、解離されて、一つまたは複数の電荷を有する種を生成し得る基（例えば、頭部基）を含有する両親媒性分子（例えば、脂質またはリピドイド、例えば、合成脂質またはリピドイド）を指す。

【0019】

驚くべきことに、複数の不飽和部位、例えば、少なくとも二つまたは三つの不飽和部位を有するアルキル鎖を含むイオン化可能な脂質は、膜流動性が増加した脂質粒子を形成するのに特に有用であることが見出された。本明細書での使用に適した多数のイオン化可能な脂質および関連する類似体は、米国特許公開第２００６００８３７８０号および第２００６０２４０５５４号、米国特許第５，２０８，０３６号、第５，２６４，６１８号、第５，２７９，８３３号、第５，２８３，１８５号、第５，７５３，６１３号および第５，７８５，９９２号、ならびにＰＣＴ公開第９６／１０３９０号に記載されており、それらの開示は、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0020】

一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、ｐＨに応じて正に荷電した形態で存在するように解離することができるようにイオン化可能である。イオン化可能な脂質のイオン化は、異なるｐＨ条件下でイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子の表面電荷に影響を与える。脂質ナノ粒子の表面電荷は、順に、その血漿タンパク質吸収、血液クリアランス、および組織分布（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ３２：３－１７（１９９８））ならびに核酸の細胞内送達に影響し得るエンドソーム溶解性非二重層構造（Ｈａｆｅｚ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ８：１１８８－１１９６（２００１））を形成するその能力に影響し得る。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ約７）で概して中性であるが、酸性ｐＨまたは塩基性ｐＨで正味の電荷（複数可）を担持することができる脂質である。一実施形態では、イオン化可能な脂質は、ｐＨ約７で概して中性であるが、酸性ｐＨで正味の電荷（複数可）を担持することができる脂質である。一実施形態では、イオン化可能な脂質は、ｐＨ約７で概して中性であるが、塩基性ｐＨで正味の電荷（複数可）を担持することができる脂質である。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ約７）で正味の電荷（複数可）を概して担持するカチオン性脂質またはアニオン性脂質を含まない。

【0021】

本明細書で使用される場合、「リピドイド」という用語は、脂質の一つまたは複数の特徴を有する分子を指す。
本明細書で使用される場合、「安定なＬＰＭＰ製剤」という用語は、一定の期間（例えば、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも３０日間、少なくとも６０日間、または少なくとも９０日間）に渡り、任意選択的に、規定された温度範囲（例えば、少なくとも２４℃（例えば、少なくとも２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、もしくは３０℃の温度）、少なくとも２０℃（例えば、少なくとも２０℃、２１℃、２２℃、もしくは２３℃）、少なくとも４℃（例えば、少なくとも５℃、１０℃、もしくは１５℃）、少なくとも－２０℃（例えば、少なくとも－２０℃、－１５℃、－１０℃、－５℃、もしくは０℃）、または－８０℃（例えば、少なくとも－８０℃、－７０℃、－６０℃、－５０℃、－４０℃、もしくは－３０℃））で、ＬＰＭＰ製剤（例えば、産生もしくは製剤化時）におけるＬＰＭＰの数と比較して、ＬＰＭＰの最初の数（例えば、溶液１ｍＬ当たりのＬＰＭＰ）の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％）を保持するか、または任意選択的に、規定された温度範囲（例えば、少なくとも２４℃（例えば、少なくとも２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、もしくは３０℃）、少なくとも２０℃（例えば、少なくとも２０℃、２１℃、２２℃、もしくは２３℃）、少なくとも４℃（例えば、少なくとも５℃、１０℃、もしくは１５℃）、少なくとも－２０℃（例えば、少なくとも－２０℃、－１５℃、－１０℃、－５℃、もしくは０℃）、または－８０℃（例えば、少なくとも－８０℃、－７０℃、－６０℃、－５０℃、－４０℃、もしくは－３０℃）の温度）で、ＬＰＭＰ（例えば、産生もしくは製剤化時）におけるＬＰＭＰの最初の活性と比較して、その活性（例えば、ＬＰＭＰ内で製剤されたｍＲＮＡの細胞壁透過活性および／もしくは活性）の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％）を保持する、ＬＰＭＰ組成物を指す。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１Ａは、実施例２（表２）に従って調製されたＬＮＰの粒子と比較した、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ｒｅｃＰＭＰ１、ｒｅｃＬｅｍｏｎ）およびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（ｒｅｃＰＭＰ２、ｒｅｃＡｌｇａｅ）の粒子のサイズおよび多分散を示す。図１Ｂは、実施例２（表２）に従って調製されたＬＮＰの粒子と比較した、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ｒｅｃＰＭＰ１、ｒｅｃＬｅｍｏｎ）およびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（ｒｅｃＰＭＰ２、ｒｅｃＡｌｇａｅ）の封入効率を示す。

【図2】図２Ａ～２Ｃは、ハムスターにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの単回用量筋肉内ワクチン接種の６時間後および２４時間後のハムスターの血清中のサイトカインＩＬ６（図２Ａ）、ケモカインＣＸＣＬ１２（図２Ｂ）、およびサイトカインＳＣＦ（幹細胞因子）（図２Ｃ）のレベルを示す。二つのワクチン製剤ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ）およびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＡｌｇａｅＬＰＭＰ）を、０日目に投与した。対照は、０日目にＥＰＯｍＲＮＡを投与されたワクチン接種されていないハムスターであった。

【図3】図３Ａ～３Ｂは、ハムスターにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの単回用量筋肉内ワクチン接種後、１０日目のハムスターの血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ抗原（図３Ａ）およびＳ１ＲＢＤ抗原（図３Ｂ）に特異的な抗体（ＩｇＧ）のレベルを示す。二つのワクチン製剤ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ）およびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＡｌｇａｅＬＰＭＰ）を、０日目に投与した。対照は、０日目にＥＰＯｍＲＮＡを投与されたワクチン接種されていないハムスターであった。

【図4】図４は、ハムスターにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの筋肉内ワクチン接種後、２１日目のハムスターの血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１ＲＢＤ抗原に特異的な抗体（ＩｇＧ）のレベルを示す。二つのタイプのワクチン製剤を異なる投与量で、０日目に投与した：ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ、２０μｇ）およびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＡｌｇａｅＬＰＭＰ、２０μｇ）。対照は、０日目にＥＰＯｍＲＮＡを投与されたワクチン接種されていないハムスターであった。

【図5】図５は、ハムスターにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの筋肉内ワクチン接種後、３５日目のハムスターの血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株に対する中和抗体価のレベルを示す。二つのタイプのワクチン製剤を異なる投与量で、０日目に投与した：ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ、２０μｇ）およびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＡｌｇａｅＬＰＭＰ、２０μｇ）。対照は、０日目にＥＰＯｍＲＮＡを投与されたワクチン接種されていないハムスターであった。

【図6】図６は、ハムスターにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの筋肉内ワクチン接種後、３５日目のハムスターの脾臓中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ抗原に対するＴ細胞応答の結果を示す。二つのタイプのワクチン製剤を異なる投与量で、０日目に投与した：ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ、２０μｇ）およびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＡｌｇａｅＬＰＭＰ、２０μｇ）。対照は、０日目にＥＰＯｍＲＮＡを投与されたワクチン接種されていないハムスターであった。

【図7】図７Ａ～７Ｄは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷後の日数の関数としてのハムスターの体重の喪失の結果を示す（動物１匹当たり１０５ｐｆｕＴＣＩＤ５０の鼻腔内投与を介して２８日目に投与）。二つのタイプのワクチン製剤を異なる投与量で、０日目に投与した：ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ、図７Ａ、ＳｍＲＮＡ２０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ、図７Ｂ）およびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＡｌｇａｅＬＰＭＰ、図７Ｃ、ＳｍＲＮＡ２０μｇを含有するｒｅｃＡｌｇａｅＬＰＭＰ、図７Ｄ）。対照は、０日目にＥＰＯｍＲＮＡを投与されたワクチン接種されていないハムスターであった。

【図8】図８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷後の日数の関数としてのハムスターの体重の喪失の結果を示す（動物一匹当たり１０５ｐｆｕＴＣＩＤ５０の鼻腔内投与を介して２８日目に投与）。ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ）ワクチン製剤を０日目に投与した。対照は、０日目にＥＰＯｍＲＮＡを投与されたワクチン接種されていないハムスターであった。

【図9】図９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷の４日後のハムスターの肺における感染ウイルス粒子の結果を示す（動物一匹当たり１０５ｐｆｕＴＣＩＤ５０の鼻腔内投与を介して２８日目に投与）。ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ）ワクチン製剤を０日目に投与した。対照は、０日目にＥＰＯｍＲＮＡを投与されたワクチン接種されていないハムスターであった。

【図10】図１０Ａ～１０Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷の４日後のハムスターの肺（図１０Ａ）および鼻粘膜（図１０Ｂ）におけるウイルス負荷の結果を示す（動物一匹当たり１０５ｐｆｕＴＣＩＤ５０の鼻腔内投与を介して２８日目に投与）。ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ）ワクチン製剤を０日目に投与した。対照は、０日目にＥＰＯｍＲＮＡを投与されたワクチン接種されていないハムスターであった。

【図11】図１１Ａ～１１Ｂは、マウスにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの経口ワクチン接種後、１２日目のマウスの脾臓（図１１Ａ）およびマウスのパイエル板（図１１Ｂ）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ抗原に対するＴ細胞応答の結果を示す。ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ２００μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ）ワクチン製剤を０日目に投与した。対照はＰＢＳであった。

【図12】図１２Ａは、マウスにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ０．１μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ、１０μｇ）の鼻腔内ワクチン接種後の１２日目のマウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ抗原に対するＴ細胞応答の結果を示す。図１２Ｂは、マウスにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ０．１μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ、１０μｇ）の鼻腔内ワクチン接種後の１２日目のマウスにおける血中のサイトカインＴＮＦαのレベルを示す。対照はＰＢＳであった。

【図13】図１３は、マウスにＬＰＭＰ／ｍＲＮＡフルシフェラーゼ（ｍＲＮＡ５μｇを含有）の用量を静脈内投与した４時間後のマウス（ｎ＝２）の発光を測定することによって評価される、一定の期間に渡り（１日目、３０日目、６０日目）４℃で保存されたＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤の安定性を示す。ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡフルシフェラーゼＡ（ｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ）およびＬＰＭＰ／ｍＲＮＡフルシフェラーゼＢ（ｒｅｃＡｌｇａｅＬＰＭＰ）製剤を評価した。

【図14】図１４Ａは、マウスがＬＰＭＰ／ｍＲＮＡフルシフェラーゼ（ｍＲＮＡ０．２ｍｇ／ｋｇを含有）の用量で静脈内投与された６時間後のマウスの取得された画像と共に、一定の期間に渡り（１日目、７日目）凍結乾燥あり、凍結乾燥なしでのＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤の安定性を示す。ＲｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ／ｍＲＮＡフルシフェラーゼおよびｒｅｃＡｌａｇｅＬＰＭＰ／ｍＲＮＡフルシフェラーゼ製剤を評価した。図１４Ｂは、マウスがＬＰＭＰ／ｍＲＮＡフルシフェラーゼ（ｍＲＮＡ０．２ｍｇ／ｋｇを含有）の用量で静脈内投与された６時間後のマウスの取得された画像と共に、凍結乾燥あり、かつ４℃でのＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤の安定性を示す。ＲｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ／ｍＲＮＡフルシフェラーゼ製剤を評価した。

【図15】図１５は、筋肉内経路（０．４ｍｇ／ｋｇ）、鼻腔内経路（０．４ｍｇ／ｋｇ）、および経口経路（８ｍｇ／ｋｇ）を介したマウスにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２製剤の投与後のマウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ抗原に対する免疫応答を示す。ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ）ワクチン製剤を０日目に投与した。対照はＰＢＳであった。

【図16】図１６Ａ～１６Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の日数の関数としてのハムスターの体重の喪失の結果を示す（スキーム４を参照）。

【図17】図１７は、ハムスターにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの筋肉内ワクチン接種後、３５日目（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２経鼻負荷の７日後）のハムスターの血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ株に対する中和抗体価のレベルを示す。二つのタイプのワクチン製剤を異なる投与量で、０日目に投与した：ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ、２０μｇ）およびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＡｌｇａｅＬＰＭＰ、２０μｇ）。対照は、０日目にＥＰＯｍＲＮＡを投与された偽ワクチン接種されたハムスターであった。

【図18】図１８Ａ～Ｃは、０日目および２１日目のマウスにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ）の二回の筋肉内ワクチン接種の四週間後、４９日目のマウスの血液中の、それぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株、デルタ株、およびオミクロン株に対する中和抗体力価のレベルを示す。対照は、用量の緩衝液を投与した偽ワクチン接種したマウスであった。

【図19】図１９Ａ～Ｈは、マウスにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（ＳｍＲＮＡ１０μｇを含有するｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ）の単回用量筋肉内ワクチン接種の２、６、２４、および４８時間後のマウスにおける、それぞれ、サイトカインならびにケモカインＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１２、ＣＸＣＬ１０、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、およびＩＬ－１０の全身レベルを示す。対照は、０日目に用量の緩衝液を投与したワクチン接種していないマウスであった。

【発明を実施するための形態】

【0023】

感染性疾患、障害、または状態（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原などのコロナウイルス抗原）の抗原に対する強力な中和抗体を誘発する核酸ワクチン組成物（例えば、免疫化／免疫原性組成物）が、本明細書において特徴とされる。これらの核酸ワクチン組成物は、天然の脂質およびイオン化可能な脂質を含む脂質再構成植物メッセンジャーパック（ＬＰＭＰ）内に製剤化された、一つまたは複数の抗原性ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのＲＮＡ）を含む。抗原性ポリペプチドは、感染性疾患、障害、または状態を引き起こす感染因子に由来する。ＰＭＰは、植物細胞外小胞（ＥＶ）、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物から全体的または部分的に生成される脂質アセンブリである。ＬＰＭＰは、脂質構造に由来するＰＭＰであり、脂質構造は、破壊され、液相で再構築または再構成される。
本開示はまた、イオン化可能な脂質の存在下で精製されたＰＭＰ脂質を含む膜を再構成して、イオン化可能な脂質を含むＬＰＭＰを生成することと、および一つまたは複数の抗原性ポリペプチドで修飾された植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）をコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドをＬＰＭＰに充填することを含む、核酸ワクチンを作製する方法を含む。

【0024】

脂質再構成植物メッセンジャーパック（ＬＰＭＰ）
植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）
ＰＭＰは、植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物（例えば、脂質抽出物）を含む脂質（例えば、脂質二重層、単層、または多層構造）構造である。植物ＥＶは、植物で天然に生じ、直径が約５～２０００ｎｍである、囲まれた脂質二重層構造を指す。植物ＥＶは、様々な植物生合成経路に由来し得る。天然で、植物ＥＶは、植物アポプラストなどの植物の細胞内区画および細胞外区画、細胞膜の外側に位置し、連続した細胞壁および細胞外空間によって形成される区画に見出すことができる。あるいは、ＰＭＰは、植物細胞からの分泌時に細胞培養培地中に見られる濃縮された植物ＥＶであり得る。植物ＥＶは、植物から分離することができ、それによって、本明細書にさらに記述される様々な方法によってＰＭＰをもたらすことができる。さらに、ＰＭＰは、任意選択的に、インビボまたはインビトロで導入され得る治療剤を含み得る。
ＰＭＰは、植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含み得る。任意選択的に、ＰＭＰは、植物ＥＶに由来する脂質に加えて、外因性脂質（例えば、ステロール（例えば、コレステロールもしくはシトステロール）、イオン化可能な脂質、および／またはＰＥＧ化脂質）も含み得る。一部の実施形態では、植物ＥＶは、直径約５～１０００ｎｍである。例えば、ＰＭＰは、約５～５０ｎｍ、約５０～１００ｎｍ、約１００～１５０ｎｍ、約１５０～２００ｎｍ、約２００～２５０ｎｍ、約２５０～３００ｎｍ、約３００～３５０ｎｍ、約３５０～４００ｎｍ、約４００～４５０ｎｍ、約４５０～５００ｎｍ、約５００～５５０ｎｍ、約５５０～６００ｎｍ、約６００～６５０ｎｍ、約６５０～７００ｎｍ、約７００～７５０ｎｍ、約７５０～８００ｎｍ、約８００～８５０ｎｍ、約８５０～９００ｎｍ、約９００～９５０ｎｍ、約９５０～１０００ｎｍ、約１０００～１２５０ｎｍ、約１２５０～１５００ｎｍ、約１５００～１７５０ｎｍ、または約１７５０～２０００ｎｍの平均直径を有する植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含み得る。ある場合では、ＰＭＰは、約５～９５０ｎｍ、約５～９００ｎｍ、約５～８５０ｎｍ、約５～８００ｎｍ、約５～７５０ｎｍ、約５～７００ｎｍ、約５～６５０ｎｍ、約５～６００ｎｍ、約５～５５０ｎｍ、約５～５００ｎｍ、約５～４５０ｎｍ、約５～４００ｎｍ、約５～３５０ｎｍ、約５～３００ｎｍ、約５～２５０ｎｍ、約５～２００ｎｍ、約５～１５０ｎｍ、約５～１００ｎｍ、約５～５０ｎｍ、または約５～２５ｎｍの平均直径を有する植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含む。ある特定の場合では、植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物は、約５０～２００ｎｍの平均直径を有する。ある特定の場合では、植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物は、約５０～３００ｎｍの平均直径を有する。ある特定の場合では、植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物は、約２００～５００ｎｍの平均直径を有する。ある特定の場合では、植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物は、約３０～１５０ｎｍの平均直径を有する。

【0025】

ある場合では、ＰＭＰは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも５５０ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも６５０ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも７５０ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも８５０ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、少なくとも９５０ｎｍ、または少なくとも１０００ｎｍの平均直径を有する植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含んでもよい。ある場合では、ＰＭＰは、１０００ｎｍ未満、９５０ｎｍ未満、９００ｎｍ未満、８５０ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７５０ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６５０ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５５０ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４５０ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３５０ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、または５０ｎｍ未満の平均直径を有する植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含む。当該技術分野で標準的な様々な方法（例えば、動的光散乱法）を使用して、植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物の粒子直径を測定することができる。
ある場合では、ＰＭＰは、７７ｎｍ２～３．２×１０６ｎｍ２（例えば、７７～１００ｎｍ２、１００～１０００ｎｍ２、１０００～１×１０４ｎｍ２、１×１０４～１×１０５ｎｍ２、１×１０５～１×１０６ｎｍ２、または１×１０６～３．２×１０６ｎｍ２）の平均表面積を有する植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含み得る。ある場合では、ＰＭＰは、６５ｎｍ３～５．３×１０８ｎｍ３（例えば、６５～１００ｎｍ３、１００～１０００ｎｍ３、１０００～１×１０４ｎｍ３、１×１０４～１×１０５ｎｍ３、１×１０５～１×１０６ｎｍ３、１×１０６～１×１０７ｎｍ３、１×１０７～１×１０８ｎｍ３、１×１０８～５．３×１０８ｎｍ３）の平均体積を有する植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含み得る。ある場合では、ＰＭＰは、少なくとも７７ｎｍ２（例えば、少なくとも７７ｎｍ２、少なくとも１００ｎｍ２、少なくとも１０００ｎｍ２、少なくとも１×１０４ｎｍ２、少なくとも１×１０５ｎｍ２、少なくとも１×１０６ｎｍ２、または少なくとも２×１０６ｎｍ２）の平均表面積を有する植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含み得る。ある場合では、ＰＭＰは、少なくとも６５ｎｍ３（例えば、少なくとも６５ｎｍ３、少なくとも１００ｎｍ３、少なくとも１０００ｎｍ３、少なくとも１×１０４ｎｍ３、少なくとも１×１０５ｎｍ３、少なくとも１×１０６ｎｍ３、少なくとも１×１０７ｎｍ３、少なくとも１×１０８ｎｍ３、少なくとも２×１０８ｎｍ３、少なくとも３×１０８ｎｍ３、少なくとも４×１０８ｎｍ３、または少なくとも５×１０８ｎｍ３の平均体積を有する植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含み得る。

【0026】

ある場合では、ＰＭＰは、植物ＥＶまたはそのセグメント、抽出物、もしくは部分と同じサイズを有し得る。あるいは、ＰＭＰは、ＰＭＰが生成される初期植物ＥＶとは異なるサイズを有してもよい。例えば、ＰＭＰは、直径約５～２０００ｎｍの直径を有してもよい。例えば、ＰＭＰは、約５～５０ｎｍ、約５０～１００ｎｍ、約１００～１５０ｎｍ、約１５０～２００ｎｍ、約２００～２５０ｎｍ、約２５０～３００ｎｍ、約３００～３５０ｎｍ、約３５０～４００ｎｍ、約４００～４５０ｎｍ、約４５０～５００ｎｍ、約５００～５５０ｎｍ、約５５０～６００ｎｍ、約６００～６５０ｎｍ、約６５０～７００ｎｍ、約７００～７５０ｎｍ、約７５０～８００ｎｍ、約８００～８５０ｎｍ、約８５０～９００ｎｍ、約９００～９５０ｎｍ、約９５０～１０００ｎｍ、約１０００～１２００ｎｍ、約１２００～１４００ｎｍ、約１４００～１６００ｎｍ、約１６００～１８００ｎｍ、または約１８００～２０００ｎｍの平均直径を有し得る。ある場合では、ＰＭＰは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも５５０ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも６５０ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも７５０ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも８５０ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、少なくとも９５０ｎｍ、少なくとも１０００ｎｍ、少なくとも１２００ｎｍ、少なくとも１４００ｎｍ、少なくとも１６００ｎｍ、少なくとも１８００ｎｍ、または約２０００ｎｍの平均直径を有してもよい。当該技術分野で標準的な様々な方法（例えば、動的光散乱法）を使用して、ＰＭＰの粒子直径を測定することができる。ある場合では、ＰＭＰのサイズは、治療剤の負荷後、またはＰＭＰへの他の修飾後に決定される。
ある場合では、ＰＭＰは、７７ｎｍ２～１．３×１０７ｎｍ２（例えば、７７～１００ｎｍ２、１００～１０００ｎｍ２、１０００～１×１０４ｎｍ２、１×１０４～１×１０５ｎｍ２、１×１０５～１×１０６ｎｍ２、または１×１０６～１．３×１０７ｎｍ２）の平均表面積を有してもよい。ある場合では、ＰＭＰは、６５ｎｍ３～４．２×１０９ｎｍ３（例えば、６５～１００ｎｍ３、１００～１０００ｎｍ３、１０００～１×１０４ｎｍ３、１×１０４～１×１０５ｎｍ３、１×１０５～１×１０６ｎｍ３、１×１０６～１×１０７ｎｍ３、１×１０７～１×１０８ｎｍ３、１×１０８～１×１０９ｎｍ３、または１×１０９～４．２×１０９ｎｍ３）の平均体積を有してもよい。ある場合では、ＰＭＰは、少なくとも７７ｎｍ２（例えば、少なくとも７７ｎｍ２、少なくとも１００ｎｍ２、少なくとも１０００ｎｍ２、少なくとも１×１０４ｎｍ２、少なくとも１×１０５ｎｍ２、少なくとも１×１０６ｎｍ２、または少なくとも１×１０７ｎｍ２）の平均表面積を有する。ある場合では、ＰＭＰは、少なくとも６５ｎｍ３（例えば、少なくとも６５ｎｍ３、少なくとも１００ｎｍ３、少なくとも１０００ｎｍ３、少なくとも１×１０４ｎｍ３、少なくとも１×１０５ｎｍ３、少なくとも１×１０６ｎｍ３、少なくとも１×１０７ｎｍ３、少なくとも１×１０８ｎｍ３、少なくとも１×１０９ｎｍ３、少なくとも２×１０９ｎｍ３、少なくとも３×１０９ｎｍ３、または少なくとも４×１０９ｎｍ３）の平均体積を有する。

【0027】

ある場合では、ＰＭＰは、インタクトな植物ＥＶを含んでもよい。あるいは、ＰＭＰは、植物ＥＶの小胞の全表面積のセグメント、部分、または抽出物（例えば、小胞の全表面積の１００％未満（例えば、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満）を含むセグメント、部分、または抽出物）を含んでもよい。セグメント、部分、または抽出物は、円周セグメント、球状セグメント（例えば、半球）、曲線セグメント、直線セグメント、または平坦なセグメントなどの任意の形状であってもよい。セグメントが、小胞の球状セグメントである場合、球状セグメントは、一対の平行線に沿った球状小胞の分割から生じるもの、または一対の非平行線に沿った球状小胞の分割から生じるものを表し得る。したがって、複数のＰＭＰは、複数のインタクトな植物ＥＶ、複数の植物ＥＶセグメント、部分、もしくは抽出物、またはインタクトな植物ＥＶと植物ＥＶのセグメントの混合物を含み得る。当業者であれば、インタクトな植物ＥＶとセグメント化植物ＥＶの比が、使用される特定の単離方法に依存することを理解するであろう。例えば、植物、またはその部分を粉砕またはブレンドすることは、真空浸透などの非破壊抽出方法よりも高い割合の植物ＥＶセグメント、部分、または抽出物を含有するＰＭＰを生成し得る。

【0028】

ＰＭＰが、植物ＥＶのセグメント、部分、または抽出物を含む場合、ＥＶセグメント、部分、または抽出物は、インタクトな小胞の平均表面積よりも小さい平均表面積、例えば、７７ｎｍ２、１００ｎｍ２、１０００ｎｍ２、１×１０４ｎｍ２、１×１０５ｎｍ２、１×１０６ｎｍ２、または３．２×１０６ｎｍ２未満の平均表面積を有してもよい。ある場合では、ＥＶセグメント、部分、または抽出物は、７０ｎｍ２、６０ｎｍ２、５０ｎｍ２、４０ｎｍ２、３０ｎｍ２、２０ｎｍ２、または１０ｎｍ２未満の表面積を有する。ある場合では、ＰＭＰは、インタクトな小胞の平均体積よりも小さい平均体積、例えば、６５ｎｍ３、１００ｎｍ３、１０００ｎｍ３、１×１０４ｎｍ３、１×１０５ｎｍ３、１×１０６ｎｍ３、１×１０７ｎｍ３、１×１０８ｎｍ３、または５．３×１０８ｎｍ３を有する、植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含んでもよい。
ＰＭＰが、植物ＥＶの抽出物を含む場合、例えば、ＰＭＰが、植物ＥＶから抽出された（例えば、クロロホルムを用いて）脂質を含む場合、ＰＭＰは、植物ＥＶから抽出された（例えば、クロロホルムを用いて）脂質の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９％超を含み得る。複数のＰＭＰは、植物ＥＶセグメントおよび／もしくは植物ＥＶ抽出脂質またはその混合物を含み得る。

【0029】

ＰＭＰの生成
ＰＭＰは、植物組織または植物細胞を含む、植物、またはその一部に天然で生じる、植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分もしくは抽出物（例えば、脂質抽出物）から生成されてもよい。ＰＭＰを生成するための例示的な方法は、（ａ）植物体、またはその一部から初期試料を用意すること、植物またはその一部は、ＥＶを含む、および（ｂ）初期試料から粗ＰＭＰ画分を単離すること、粗ＰＭＰ画分は、初期試料中のレベルと比較して、低減したレベルの、植物またはその一部から少なくとも一つの混入物または望ましくない構成成分を有する、を含む。方法は、粗ＰＭＰ画分を精製し、それによって複数の純粋なＰＭＰを生成することを含む追加の工程（ｃ）をさらに含み得、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分中のレベルと比較して、低減したレベルの、植物またはその一部からの少なくとも一つの混入物または望ましくない構成成分を有する。各生成工程は、以下でさらに詳細に考察される。ＰＭＰの単離および精製に関する例示的な方法は、例えば、ＲｕｔｔｅｒａｎｄＩｎｎｅｓ，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８－７４１，２０１７；Ｒｕｔｔｅｒｅｔａｌ，Ｂｉｏ．Ｐｒｏｔｏｃ．７（１７）：ｅ２５３３，２０１７；Ｒｅｇｅｎｔｅｅｔａｌ，ＪｏｆＥｘｐ．Ｂｉｏｌ．６８（２０）：５４８５－５４９６，２０１７；Ｍｕｅｔａｌ，Ｍｏｌ．Ｎｕｔｒ．ＦｏｏｄＲｅｓ．，５８，１５６１－１５７３，２０１４、およびＲｅｇｅｎｔｅｅｔａｌ，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ．５８３：３３６３－３３６６，２００９において見られ、それらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

【0030】

ある場合では、複数のＰＭＰは、（ａ）植物、またはその一部から初期試料を用意すること、植物またはその一部は、ＥＶを含む、（ｂ）初期試料から粗ＰＭＰ画分を単離すること、粗ＰＭＰ画分は、初期試料中のレベルと比較して、低減したレベル（例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％減少しているレベル）の、植物またはその一部からの少なくとも一つの混入物または望ましくない構成成分を有する、および（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それによって複数の純粋なＰＭＰを精製すること、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分中のレベルと比較して、減少したレベル（例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％減少しているレベル）の、植物またはその一部からの少なくとも一つの混入物または望ましくない構成成分を有する、の工程を含むプロセスによって植物から単離されてもよい。

【0031】

ＰＭＰは、様々な植物から生成される植物ＥＶ、またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含み得る。ＰＭＰは、被子植物（単子葉および双子葉植物）、裸子植物、シダ類、イワヒバ科、ツクシ、古生マツバラン類、ヒカゲノカズラ科、藻類（例えば、単細胞または多細胞、例えば、古色素体類）、またはコケ類を含むが、これらに限定されない、植物（維管束または非維管束）の任意の属から生成され得る。ある特定の場合では、ＰＭＰは、維管束植物、例えば、単子葉もしくは双子葉植物または裸子植物を使用して産生され得る。例えば、ＰＭＰは、アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ、バナナ、大麦、アブラナ種（例えば、シロイヌナズナもしくはセイヨウアブラナ）、キャノーラ、トウゴマの種子、チコリー、キク、クローバー、ココア、コーヒー、綿、綿実、トウモロコシ、クランべ、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム、ヤマノイモ属、ユーカリ、フェスキュ、亜麻、グラジオラス、ライラック、亜麻仁、キビ、マスクメロン、マスタード、エンバク、アブラヤシ、菜種、パパイヤ、ピーナッツ、パイナップル、観葉植物、インゲンマメ属、ジャガイモ、菜種種子、米、ライ麦、ライグラス、ベニバナ、ゴマ、モロコシ、大豆、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、芝草、小麦もしくはレタスなどの植物作物、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科植物、リンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、ウォールナッツ、ヘーゼルなどの果実およびナッツの木、ブドウ、キウイ、ホップなどのツル植物、キイチゴ、ブラックベリー、グースベリーなどの低木果樹およびイバラ、トネリコ、マツ、モミ、カエデ、オーク、クリ、ポプラなどの森林樹を、アルファルファ、キャノーラ、トウゴマの種子、トウモロコシ、綿、クランべ、亜麻、亜麻仁、マスタード、アブラヤシ、菜種、ピーナッツ、ジャガイモ、米、ベニバナ、ゴマ、大豆、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト、または小麦と共に使用して生成され得る。
ＰＭＰは、植物全体（例えば、ロゼット全体または実生全体）を使用して、または代替的に一つまたは複数の植物の一部（例えば、葉、種子、根、果実、野菜、花粉、ふるい部汁液、もしくは木部汁液）から生成されてもよい。例えば、ＰＭＰは、苗条栄養器官／構造（例えば、葉、幹、もしくは塊茎）、根、花および花の器官／構造（例えば、花粉、苞、苞葉、萼片、花弁、雄ずい、心皮、葯、もしくは胚珠）、種子（胚、胚乳、もしくは種皮を含む）、果実（成熟子房）、樹液（例えば、師部もしくは木部汁液）、植物組織（例えば、導管組織、粉砕された組織、腫瘍組織など）、ならびに細胞（例えば、単一細胞、原生生物、胚、カルス組織、孔辺細胞、卵細胞など）、またはその子孫を使用して生成され得る。例えば、単離工程は、（ａ）植物、またはその一部を用意することを含んでもよい。一部の例では、植物の一部は、シロイヌナズナの葉である。植物は、発生のいずれの段階にあってもよい。例えば、ＰＭＰは、実生、例えば、１週齢、２週齢、３週齢、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、または８週齢の実生（例えば、シロイヌナズナの実生）を使用して生成され得る。他の例示的なＰＭＰとしては、根（例えば、ショウガの根）、果汁（例えば、グレープフルーツジュース）、野菜（例えば、ブロッコリー）、花粉（例えば、オリーブの花粉）、ふるい部汁液（例えば、シロイヌナズナのふるい部汁液）、または木部汁液（例えば、トマトの植物木部汁液）を使用して生成されるＰＭＰを挙げることができる。
一部の実施形態では、ＰＭＰは、藻類またはレモンから生成される。

【0032】

ＰＭＰは、様々な方法によって、植物、またはその一部を使用して生成することができる。植物のＥＶ含有アポプラスト画分、またはそうでなければ分泌されたＥＶを含むＰＭＰを含有する細胞外画分（例えば、細胞培養培地）の放出を可能にする任意の方法が、本方法に適している。ＥＶは、破壊的（例えば、植物、もしくは任意の植物の一部の粉砕もしくは混合）方法、または非破壊的（植物もしくは任意の植物の一部の洗浄もしくは真空浸透）方法のいずれかによって、植物または植物の一部から分離され得る。例えば、植物、またはその一部は、ＥＶを植物または植物の一部から単離し、それによってＰＭＰを生成するために、真空浸透、粉砕、混合、またはそれらの組み合わせであってもよい。例えば、単離工程は、植物（例えば、小胞単離緩衝液）を真空浸透させて、アポプラスト画分を放出し、収集することを含んでもよい。あるいは、単離工程は、ＥＶを放出し、それによってＰＭＰを生成するための植物を粉砕または混合を含んでもよい。
植物ＥＶを単離し、それによってＰＭＰを生成する際、ＰＭＰは、粗ＰＭＰ画分（例えば、アポプラスト画分）に分離または収集され得る。例えば、分離工程は、遠心分離（例えば、差動遠心分離もしくは超遠心分離）および／または濾過を使用して、複数のＰＭＰを粗ＰＭＰ画分に分離して、植物組織破片または植物細胞を含む、大きな混入物から植物ＰＭＰ含有画分を分離することを含み得る。したがって、粗ＰＭＰ画分は、植物または植物の一部からの初期試料と比較して、植物組織破片または植物細胞を含む、減少した数の大きな混入物を有することになる。使用される方法に応じて、粗ＰＭＰ画分は、植物または植物の一部からの初期試料と比較して、減少したレベルの植物細胞小器官（例えば、核、ミトコンドリア、または色素体）をさらに含んでもよい。

【0033】

ある場合では、単離工程は、遠心分離（例えば、差動遠心分離もしくは超遠心分離）および／または濾過を使用して、複数のＰＭＰを粗ＰＭＰ画分に分離して、植物細胞または細胞破片からＰＭＰ含有画分を分離することを含み得る。このような場合では、粗ＰＭＰ画分は、原料植物または植物の一部からの初期試料と比較して、減少した数の植物細胞または細胞破片を有することになる。
粗ＰＭＰ画分を、さらなる精製方法によってさらに精製して、複数の純粋なＰＭＰを生成することができる。例えば、粗ＰＭＰ画分は、超遠心分離によって、例えば、密度勾配（イオジキサノールもしくはスクロース）を使用して、および／または凝集化した構成成分を除去するための他のアプローチ（例えば、沈殿もしくはサイズ排除クロマトグラフィー）を使用して、他の植物構成成分から分離することができる。得られた純粋なＰＭＰは、前の分離工程中に生成された一つまたは複数の画分と比較して、または予め確立された閾値レベル、例えば、市販の出荷規格と比較して、減少したレベルの、原料植物からの混入物または他の望ましくない構成成分（例えば、タンパク質凝集体、核酸凝集体、タンパク質－核酸凝集体、遊離リポタンパク質、リピド－タンパク質構造などの一つまたは複数の非ＰＭＰ構成成分）、核、細胞壁構成成分、細胞小器官、またはその組み合わせ）を有してもよい。例えば、純粋なＰＭＰは、初期試料中のレベルと比較して、減少したレベル（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、もしくは１００％超、または約２倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、もしくは１００倍超）の、植物小器官または細胞壁構成成分を有してもよい。ある場合では、純粋なＰＭＰは、タンパク質凝集体、核酸凝集体、タンパク質－核酸凝集体、遊離リポタンパク質、リピド－タンパク質構造）、核、細胞壁構成成分、細胞小器官、またはその組み合わせなどの一つまたは複数の非ＰＭＰ構成成分を実質的に含まない（例えば、検出不可能なレベルを有する）。ＰＭＰは、例えば、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、または１×１０１３ＰＭＰ／ｍＬの濃度であってもよい。

【0034】

例えば、タンパク質凝集体は、ＰＭＰから除去されてもよい。例えば、ＰＭＰは、溶液中のタンパク質凝集体を沈殿させるために、ある範囲のｐＨ（例えば、ｐＨプローブを使用して測定される）を通して採取され得る。ｐＨは、例えば、水酸化ナトリウムまたは塩酸の添加により、例えば、ｐＨ３、ｐＨ５、ｐＨ７、ｐＨ９、またはｐＨ１１に調整することができる。溶液が、指定されるｐＨになると、濾過して粒子を除去することができる。あるいは、ＰＭＰは、ポリミン－Ｐまたはプラストール２６４０などの荷電ポリマーの添加を使用して凝集され得る。簡潔に述べると、ポリミン－Ｐまたはプラストール２６４０は、溶液に添加され、羽根車を用いて混合される。次いで、溶液を濾過して、粒子を除去することができる。あるいは、凝集体は、塩濃度を増加させることによって可溶化することができる。例えば、ＮａＣｌは、例えば、１ｍｏｌ／Ｌになるまで、ＰＭＰに添加することができる。次いで、溶液を濾過して、ＰＭＰを単離することができる。あるいは、凝集体は、温度を上昇させることによって可溶化される。例えば、ＰＭＰは、溶液が、例えば、５０℃の均一な温度に達するまで、混合下で５分間加熱され得る。次いで、ＰＭＰ混合物を濾過して、ＰＭＰを単離することができる。あるいは、ＰＭＰ溶液からの可溶性混入物は、標準的な手法に従ってサイズ排除クロマトグラフィーカラムによって分離することができ、ＰＭＰは、第一の画分で溶出するが、タンパク質およびリボ核タンパク質ならびに一部のリポタンパク質は、後で溶出される。タンパク質凝集体除去の効率は、ＢＣＡ／ブラッドフォードタンパク質定量を介してタンパク質凝集体の除去の前後のタンパク質濃度を測定し、比較することによって決定することができる。

【0035】

本明細書に記載される作製方法のいずれかは、当該技術分野で公知の任意の定量的または定性的な方法で補足されて、作製プロセスの任意の工程でＰＭＰを特徴付け、同定することができる。ＰＭＰは、ＰＭＰ収率、ＰＭＰ濃度、ＰＭＰ純度、ＰＭＰ組成、またはＰＭＰサイズを推定するための様々な分析方法によって特徴付けられ得る。ＰＭＰは、顕微鏡（例えば、透過電子顕微鏡）、動的光散乱、ナノ粒子追跡、分光法（例えば、フーリエ変換赤外分析）、または質量分析（タンパク質および脂質分析）などの、ＰＭＰの可視化、定量、または定性的特徴付け（例えば、組成物の同定）を可能にする、当該技術分野で公知の多数の方法によって評価することができる。ある特定の場合では、方法（例えば、質量分析）を使用して、添付に開示されるマーカーなどのＰＭＰ上に存在する植物ＥＶマーカーを同定してもよい。ＰＭＰ画分の分析および特徴付けを助けるために、ＰＭＰは、さらに標識または染色することができる。例えば、ＰＭＰは、３，３’－ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物（ＤＩＯＣ６）、蛍光親油性色素、ＰＫＨ６７（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて染色することができる。精巧な形態のナノ粒子追跡が存在しない場合、この比較的単純なアプローチは、総膜含有量を定量化し、ＰＭＰの濃度を間接的に測定するために使用することができる（ＲｕｔｔｅｒａｎｄＩｎｎｅｓ，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８－７４１，２０１７；Ｒｕｔｔｅｒｅｔａｌ，Ｂｉｏ．Ｐｒｏｔｏｃ．７（１７）：ｅ２５３３，２０１７）。より正確な測定のため、およびＰＭＰのサイズ分布を評価するために、ナノ粒子追跡を使用することができる。
生成プロセス中、ＰＭＰは、ＰＭＰが、対照または初期試料中のＥＶレベルと比較して、増加した濃度（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、もしくは１００％超、または約２倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、もしくは１００倍超）であるように、任意選択的に調製することができる。ＰＭＰは、約０．０１％～約１００％、約１％～約９９．９％、約０．１％～約１０％、約１％～約２５％、約１０％～約５０％、約５０％～約９９％、または約７５％～約１００％のうちのいずれか一つなどの、約０．１％～約１００％のＰＭＰ組成物を構成し得る。ある場合では、組成物は、例えば、重量／体積、ＰＭＰタンパク質組成物の割合、および／または脂質組成物の割合によって測定される（例えば、蛍光標識脂質を測定することによって）、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のＰＭＰのうちの少なくともいずれかを含む。ある場合では、濃縮された剤は、市販製品として使用され、例えば、最終ユーザーが、実質的により低い濃度の活性成分を有する希釈された剤を使用し得る。一部の実施形態では、組成物は、農業濃縮製剤、例えば、超低体積濃縮製剤として製剤化される。

【0036】

脂質再構成植物メッセンジャーパック（ＬＰＭＰ）
脂質再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）が本明細書で使用される。ＬＰＭＰは、植物源に由来する（例えば、濃縮される、単離または精製される）脂質構造（例えば、脂質二重層、単層、多層構造、例えば、小胞脂質構造）に由来するＰＭＰを指し、脂質構造は、本明細書に記載される通り、破壊され（例えば脂質抽出によって破壊され）、標準的な方法を使用して液相（例えば、カーゴを含有する液相）中で再構築または再構成され、例えば、脂質膜水和および／または溶媒注入を含む方法によって再構成され、ＬＰＭＰが生成される。方法は、所望される場合、例えば、再構成ＰＭＰのサイズを低減するために、超音波処理、凍結／融解処理、および／または脂質押出成形をさらに含み得る。あるいは、ＬＰＭＰは、マイクロ流体装置（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）ＩＧＮＩＴＥ（商標）マイクロ流体機器（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）など）を使用して生成されてもよい。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、（ａ）複数の精製されたＰＭＰ（例えば、本明細書の節ＩＡに記載されるように精製されたＰＭＰ）を用意すること、（ｂ）複数のＰＭＰを処理して、脂質膜を生成すること、（ｃ）有機溶媒または溶媒の組み合わせで脂質膜を再構成し、それによって脂質溶液を生成すること、（ｄ）水相を含むマイクロ流体装置中で工程（ｃ）の脂質溶液を処理し、それによってＬＰＭＰを生成する工程を含むプロセスによって生成される。
ある場合では、脂質膜を生成するために複数のＰＭＰを処理することは、複数のＰＭＰから脂質を抽出すること、例えば、Ｂｒｉｉｇｈ－Ｄｙｅｒ法（ＢｌｉｇｈａｎｄＤｙｅｒ，ＪＢｉｏｌｃｈｅｍＰｈｙｓｉｏｌ，３７：９１１－９１７，１９５９）を使用して脂質を抽出することを含む。抽出された脂質は、ストック溶液、例えば、クロロホルム：メタノール中の溶液として提供されてもよい。脂質膜を生成することは、例えば、不活性ガス（例えば、窒素）の流れによる溶媒の蒸発を含んでもよい。

【0037】

天然の脂質
ＬＰＭＰは、植物源（例えば、レモンまたは藻類）由来の脂質構造に由来する１０％～１００％の脂質を含んでもよく、例えば、植物源由来の脂質構造に由来する少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の脂質を含有してもよい。ＬＰＭＰは、植物源（例えば、レモンまたは藻類）由来の脂質構造に存在する脂質種の全てまたは画分を含んでもよく、例えば、植物源由来の脂質構造に存在する少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％の脂質種を含有してもよい。ＬＰＭＰは、植物源（例えば、レモンまたは藻類）由来の脂質構造に存在するタンパク質種のいずれも含まないか、その画分、またはすべてを含んでもよく、例えば、植物源（例えば、レモンまたは藻類）由来の脂質構造に存在するタンパク質種の０％、１％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、１００％未満、または１００％を含有してもよい。ある場合では、ＬＰＭＰの脂質二重層は、タンパク質を含有しない。ある場合では、ＬＰＭＰの脂質構造は、植物源由来の脂質構造と比較して、低減された量のタンパク質を含有する。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰの天然脂質は、レモンまたは藻類から抽出される。

【0038】

外因性脂質
ＬＰＭＰは、非修飾ＬＰＭＰと比較して、細胞取り込み（例えば、動物細胞の取り込み（例えば、哺乳類細胞の取り込み、例えば、ヒト細胞の取り込み）、植物細胞の取り込み、細菌細胞の取り込み、または真菌細胞の取り込み）を増加させることができる異種剤（例えば、細胞透過剤）を含有するように修飾されてもよい。例えば、修飾ＬＰＭＰは、イオン化可能な脂質などの植物細胞透過剤を含んでもよく（例えば、封入されてもよく、もしくはコンジュゲートされてもよい）、または植物細胞透過剤と共に製剤化されてもよい（例えば、植物細胞透過剤を含む溶液中に懸濁もしくは再懸濁されてもよい）。修飾ＬＰＭＰの各々は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％超のイオン化可能な脂質を含んでもよい。
ＬＰＭＰは、一つまたは複数の外因性脂質、例えば、植物に対して外因性である脂質（例えば、ＬＰＭＰが生成される植物または植物の一部ではない供給源に由来する）を含んでもよい。ＬＰＭＰの脂質組成物は、０％、１％未満、または少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９５％超の外因性脂質を含んでもよい。一部の例では、外因性脂質（例えば、イオン化可能な脂質）は、調製物中の総脂質の２５％または４０％（ｗ／ｗ）の量で添加される。一部の例では、外因性脂質は、工程（ｂ）の前に調製物に加えられ、例えば、工程（ｂ）の前に抽出されたＰＭＰ脂質と混合される。
例示的な外因性脂質としては、イオン化可能な脂質が挙げられる。
外因性脂質はまた、カチオン性脂質を含んでもよい。

【0039】

ある場合では、外因性脂質は、１，１‘－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ、エチルＰＣ、ＧＬ６７、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＭＤ１（ｃＫＫ－Ｅ１２）、ＯＦ２、ＥＰＣ、ＺＡ３－Ｅｐ１０、ＴＴ３、ＬＰ０１、５Ａ２－ＳＣ８、脂質５（Ｍｏｄｅｒｎａ）、カチオン性スルホンアミドアミノ脂質、両親媒性双性イオン性アミノ脂質、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＢＡＱ、ＹＳＫ０５、ＤＯＢＡＴ、ＤＯＢＡＱ、ＤＯＰＡＴ、ＤＯＭＰＡＱ、ＤＯＡＡＱ、ＤＭＡＰ－ＢＬＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＢＡＱ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＬ６７Ａ、および９８Ｎ１２－５またはその組み合わせから選択されるイオン化可能な脂質またはカチオン性脂質であってもよい。
一部の実施形態では、外因性脂質は、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＯＤＡＰ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ、エチルＰＣ、ＧＬ６７、ＫＣ２、ＭＤ１、ＯＦ２、ＥＰＣ、ＺＡ３－Ｅｐ１０、ＴＴ３、ＬＰ０１、５Ａ２－ＳＣ８、脂質５（Ｍｏｄｅｒｎａ）、カチオン性スルホンアミドアミノ脂質、および両親媒性双性イオン性アミノ脂質またはその組み合わせから選択されるイオン化可能な脂質またはカチオン性脂質であってもよい。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＯＤＡＰ、およびＤＣ－コレステロールまたはその組み合わせから選択される。ある場合では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能な脂質である。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、１，１‘－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）または（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）である。ある場合では、外因性脂質は、カチオン性脂質である。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＣ－コレステロールまたはジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）である。

【0040】

ある場合では、ＬＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％超のイオン化可能な脂質を含む。
ある場合では、ＬＰＭＰは、少なくとも０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９０％超のイオン化可能な脂質、例えば、１％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のイオン化可能な脂質、例えば、約３０％～７５％のイオン化可能な脂質（例えば、約３０％～７５％のイオン化可能な脂質）のモル比を含む。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、２５％のＣ１２－２００を含む。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、３５％のＣ１２－２００のモル比を含む。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、５０％のＣ１２－２００のモル比を含む。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、４０％のＭＣ３を含む。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、５０％のＣ１２－２００のモル比を含む。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、２０％または４０％のＤＣ－コレステロールを含む。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、２５％または４０％のＤＯＴＡＰを含む。

【0041】

薬剤は、全体としてＬＰＭＰの取り込みを増加させてもよく、またはＬＰＭＰによって担持されるＬＰＭＰ（例えば、核酸ワクチン）の部分もしくは構成成分の取り込みを増加させてもよい。細胞取り込みが増加する程度は、組成物が送達される植物または植物の一部、ＬＰＭＰ製剤、およびＬＰＭＰになされる他の修飾に応じて変化してもよく、例えば、修飾ＬＰＭＰは、非修飾ＬＰＭＰと比較して、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の増加した細胞取り込み（例えば、動物細胞の取り込み、植物細胞の取り込み、細菌細胞の取り込み、または真菌細胞の取り込み）を有してもよい。ある場合では、増加した細胞取り込みは、非修飾ＬＰＭＰと比較して、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、または１０００倍の増加した細胞取り込みである。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質で修飾されたＬＰＭＰは、イオン化可能な脂質で修飾されていないＬＰＭＰよりも、負に荷電したポリヌクレオチドをより効率的に封入する。一部の態様では、イオン化可能な脂質で修飾されたＬＰＭＰは、イオン化可能な脂質で修飾されていないＬＰＭＰと比較して、変化した生体内分布を有する。一部の態様では、イオン化可能な脂質で修飾されたＬＰＭＰは、イオン化可能な脂質で修飾されていないＬＰＭＰと比較して、標的細胞のエンドソーム膜との変化した（例えば、増加した）融合を有する。

【0042】

イオン化可能な脂質
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、以下に列挙される特徴：
（ｉ）少なくとも２つのイオン化可能なアミン（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または６つ超のイオン化可能なアミン、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、もしくは１２超のイオン化可能なアミン）、
（ｉｉ）少なくとも３つの脂質尾部（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または６つ超の脂質尾部、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１２超の脂質尾部）、脂質尾部の各は、独立して、少なくとも６個の炭素原子長（例えば、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、または１８個超の炭素原子長、例えば、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、または２５個超の炭素原子長）である、
（ｉｉｉ）約４．５～約７．５の酸解離定数（ｐＫａ）（例えば、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５のｐＫａ（例えば、約６．５～約７．５のｐＫａ（例えば、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、もしくは７．５のｐＫａ））、
（ｉｖ）イオン化可能なアミンおよびヘテロ有機基、ならびに
（ｖ）少なくとも１０のＮ：Ｐ（イオン化可能な脂質のアミン：ｍＲＮＡのリン酸塩）比、のうちの少なくとも一つ（例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、または五つすべて）を有する。

【0043】

一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、１‘－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、ＭＤ１（ｃＫＫ－Ｅ１２）、ＯＦ２、ＥＰＣ、ＺＡ３－Ｅｐ１０、ＴＴ３、ＬＰ０１、５Ａ２－ＳＣ８、脂質５（Ｍｏｄｅｒｎａ）、および９８Ｎ１２－５から選択されない。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、ＭＤ１（ｃＫＫ－Ｅ１２）、ＯＦ２、ＥＰＣ、ＺＡ３－Ｅｐ１０、ＴＴ３、ＬＰ０１、５Ａ２－ＳＣ８、脂質５、ＳＭ－１０２（脂質Ｈ）、およびＡＬＣ－３１５からなる群から選択される。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミンおよびヘテロ有機基である。一部の実施形態では、ヘテロ有機基は、ヒドロキシルである。一部の実施形態では、ヘテロ有機基は、水素結合ドナーを含む。一部の実施形態では、ヘテロ有機基は、水素結合アクセプターを含む。一部の実施形態では、ヘテロ有機基は、－ＯＨ、－ＳＨ、－（ＣＯ）Ｈ、－ＣＯ２Ｈ、－ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、任意選択的に置換されたＣ１－Ｃ６アルコキシ、またはフッ素である。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、少なくとも二個の原子の鎖によって分離されたイオン化可能なアミンおよびヘテロ有機基である。

【0044】

一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、以下の式Ｉ：

【化2】

（Ｉ）、
（式中、Ｒは、Ｃ８－Ｃ１４アルキル基である）によって表される。

【0045】

一部の実施形態では、ＬＰＭＰの脂質膜は、少なくとも３５％の式Ｉの脂質、例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９０％超の式Ｉの脂質、例えば、３５％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％の式Ｉの脂質を含む。
ある場合では、ＬＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％超のイオン化可能な脂質を含む。
ある場合では、ＬＰＭＰは、少なくとも０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９０％超のイオン化可能な脂質、例えば、１％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％のイオン化可能な脂質、例えば、約２５％～７５％のイオン化可能な脂質（例えば、約２５％～７５％のイオン化可能な脂質）のモル比を含む。

【0046】

本明細書に記載されるイオン化可能な脂質は、一つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、または６つ）の脂質尾部で置換された本明細書に記載のアミンコアを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるイオン化可能な脂質は、少なくとも３つの脂質尾部を含む。脂質尾部は、Ｃ８－Ｃ１８炭化水素（例えば、Ｃ６－Ｃ１８アルキルまたはＣ６－Ｃ１８アルカノイル）であってもよい。アミンコアは、窒素原子で一つまたは複数の脂質尾部で置換されてもよい（例えば、窒素原子に結合した一個の水素原子は、脂質尾部で置換されてもよい）。

【0047】

一部の実施形態では、アミンコアは、

【化3】

の構造を有する。
一部の実施形態では、アミンコアは、

【化4】

の構造を有する。
一部の実施形態では、アミンコアは、

【化5】

の構造を有する。
一部の実施形態では、アミンコアは、

【化6】

の構造を有する。
一部の実施形態では、アミンコアは、

【化7】

の構造を有する。
一部の実施形態では、アミンコアは、

【化8】

の構造を有する。
一部の実施形態では、アミンコアは、

【化9】

の構造を有する。
一部の実施形態では、アミンコアは、

【化10】

の構造を有する。

【0048】

核酸ワクチンにおける使用に適した他の脂質、ならびにその作製方法および使用方法としては、国際特許公開第２０１６／１１８７２５号に記載される脂質が挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化11】

の化合物構造を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0049】

核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に適した他の脂質としては、国際特許公開第２０１６／１１８７２４号に記載される脂質が挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化12】

の化合物構造を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0050】

核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に好適な他の脂質としては、１４，２５－ジトリデシル１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタンの式を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩が挙げられる。
核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に適した他の脂質としては、国際特許公開第２０１３／０６３４６８号および国際特許公開第２０１６／２０５６９１号に記載される脂質が挙げられ、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0051】

一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、以下の式：

【化13】

の脂質（式中、ＲＬの各例は、独立して、任意選択的に置換されたＣ６－Ｃ４０アルケニルである）、またはその薬学的に許容される塩を含む。
ある特定の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化14】

の化合物構造を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。
ある特定の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化15】

【化16】

【化17】

の化合物構造を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0052】

核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に適した他の脂質としては、国際特許公開第２０１５／１８４２５６号に記載される脂質が挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、以下の式：

【化18】

（式中、各Ｘは、独立して、ＯまたはＳであり、各Ｙは、独立して、ＯまたはＳであり、各ｍは、独立して、０～２０であり、各ｎは、独立して、１～６であり、各ＲＡは、独立して、水素、任意選択的に置換されたＣ１－５０アルキル、任意選択的に置換されたＣ２－５０アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２－５０アルキニル、任意選択的に置換されたＣ３－１０カルボシクリル、任意選択的に置換された３～１４員のヘテロシクリル、任意選択的に置換されたＣ６－１４アリール、任意選択的に置換された５～１４員のヘテロアリールまたはハロゲンであり、各ＲＢは、独立して、水素、任意選択的に置換されたＣ１－５０アルキル、任意選択的に置換されたＣ２－５０アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２－５０アルキニル、任意選択的に置換されたＣ３－１０カルボシクリル、任意選択的に置換された３～１４員のヘテロシクリル、任意選択的に置換されたＣ６－１４アリール、任意選択的に置換された５～１４員のヘテロアリールまたはハロゲンである）の脂質、またはその薬学的に許容される塩を含む。

【0053】

ある特定の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化19】

（標的２３）の化合物構造を有する脂質である「標的２３」、およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0054】

核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に適した他の脂質としては、国際特許公開第２０１６／００４２０２号に記載される脂質が挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化20】

の化合物構造を有する脂質、またはその薬学的に許容される塩を含む。
一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化21】

【化22】

の化合物構造を有する脂質、またはその薬学的に許容される塩を含む。

【0055】

核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に適した他の脂質としては、米国仮特許出願第６２／７５８，１７９号に記載される脂質が挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、以下の式：

【化23】

（式中、各Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ６脂肪族であり、各ｍは、独立して、１～４の値を有する整数であり、各Ａは、独立して、共有結合またはアリーレンであり、各Ｌ１は、独立して、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり、各Ｌ２は、独立して、Ｃ２－Ｃ１０脂肪族であり、各Ｘ１は、独立して、ＨまたはＯＨであり、各Ｒ３は、独立して、Ｃ６－Ｃ２０脂肪族である）の脂質、またはその薬学的に許容される塩を含む。
一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、以下の式：

【化24】

（化合物１）を有する脂質、またはその薬学的に許容される塩を含む。
一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、以下の式：

【化25】

（化合物２）を有する脂質、またはその薬学的に許容される塩を含む。
一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、以下の式：

【化26】

（化合物３）を有する脂質、またはその薬学的に許容される塩を含む。
核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に好適な他の脂質としては、Ｊ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ，Ｃｅｌｌ２０１０，１４１，２１０－２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載される脂質が挙げられ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0056】

ある特定の実施形態では、核酸ワクチンの脂質ならびにその製造方法および使用方法は、

【化27】

の化合物構造を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0057】

核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に適した他の脂質としては、国際特許公開第２０１５／１９９９５２号に記載される脂質が挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化28】

の化合物構造を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。
一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化29】

【化30】

【化31】

【化32】

【化33】

【化34】

【化35】

【化36】

【化37】

【化38】

【化39】

【化40】

の化合物構造を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0058】

核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に適した他の脂質としては、国際特許公開第２０１７／００４１４３号に記載される脂質が挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化41】

【化42】

【化43】

【化44】

【化45】

【化46】

【化47】

【化48】

【化49】

【化50】

【化51】

【化52】

【化53】

【化54】

【化55】

【化56】

【化57】

の化合物構造を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0059】

核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に適した他の脂質としては、国際特許公開第２０１７／０７５５３１号に記載される脂質が挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、以下の式：

【化58】

の脂質（式中、Ｌ１またはＬ２のうちの一つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２のうちの残りは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－もしくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり、Ｇ１およびＧ２は、各々独立して、置換されたＣ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルケニレンであり、Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり、Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり、Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ５は、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり、ｘは、０、１または２である）またはその薬学的に許容される塩を含む。

【0060】

核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に適した他の脂質としては、国際特許公開第２０１７／１１７５２８号に記載される脂質が挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化59】

【化60】

【化61】

の化合物構造を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0061】

核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に適した他の脂質としては、国際特許公開第２０１７／０４９２４５号に記載される脂質が挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法の脂質は、以下の式：

【化62】

のうちの一つの化合物、およびその薬学的に許容される塩を含む。これらの四つの式のうちのいずれか一つについて、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱおよび－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから独立して選択され、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、およびヘテロシクリルからなる群から選択され、ｎは、１、２、または３である。

【0062】

ある特定の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化63】

【化64】

【化65】

【化66】

の化合物構造を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0063】

核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法における使用に適した他の脂質としては、国際特許公開第２０１７／１７３０５４号および国際特許公開第２０１５／０９５３４０号に記載される脂質が挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、核酸ワクチンならびにその製造方法および使用方法は、

【化67】

【化68】

【化69】

【化70】

の化合物構造を有する脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0064】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＬＰＭＰは、国際公開第２０１６１１８７２４号、国際公開第２０１６１１８７２５号、国際公開第２０１６１８７５３１号、国際公開第２０１７１７６９７４号、国際公開第２０１８０７８０５３号、国際公開第２０１９０２７９９９号、国際公開第２０１９０３６０３０号、国際公開第２０１９０８９８２８号、国際公開第２０１９０９９５０１号、国際公開第２０２００７２６０５号、国際公開第２０２００８１９３８号、国際公開第２０２０１１８０４１号、国際公開第２０２０１４６８０５号、または国際公開第２０２０２１９８７６号号に記載されるイオン化可能な脂質を含んでもよく、それらに記載される通り、製剤化されてもよく、またはそれらに記載される組成物を含むか、もしくは含まれてもよく、その各々は、その全体が参照により組み込まれる。

【0065】

他の脂質および他の薬剤
外因性脂質は、細胞透過剤であってもよく、ＬＰＭＰによる細胞へのポリペプチドの送達を増加させることができてもよく、および／またはポリペプチドの充填（例えば、充填効率もしくは充填能）を増加させることができてもよい。さらなる例示的な外因性脂質としては、ステロールおよびＰＥＧ化脂質が挙げられる。
ＬＰＭＰは、ＬＰＭＰの機能的および構造的特徴をさらに変化させるために、他の構成成分（例えば、脂質、例えば、ステロール、例えば、コレステロール、または小分子）で修飾されてもよい。例えば、ＬＰＭＰは、ＬＰＭＰの安定性（例えば、室温で少なくとも一日間、および／または４℃で少なくとも一週間安定）を増加させる安定化分子でさらに修飾され得る。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、ステロール、例えば、シトステロール、シトスタノール、β－シトステロール、７α－ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、コレステロール（例えば、植物から単離されたヒツジコレステロールまたはコレステロール）、スチグマステロール、カンペステロール、フコステロール、または任意のステロールの類似体（例えば、グリコシド、エステル、もしくはペプチド）で修飾される。一部の例では、外因性ステロールは、工程（ｂ）の前に調製物に加えられ、例えば、工程（ｂ）の前に抽出されたＰＭＰ脂質と混合される。外因性ステロールは、調製物中の総脂質およびステロールの例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％超（ｗ／ｗ）の量で添加されてもよい。

【0066】

一部の実施形態では、ステロールは、コレステロールまたはシトステロールである。ある場合では、ＬＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６０％超のステロール（例えば、コレステロールまたはシトステロール）、例えば、１％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、または５０％～６０％のモル比のステロールを含む。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、約３５％～５０％のステロール（例えば、コレステロールまたはシトステロール）、例えば、約３６％、３８．５％、４２．５％、または４６．５％のモル比のステロールを含む。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、約２０％～４０％のステロールのモル比を含む。
一部の実施形態では、ステロールで修飾されているＬＰＭＰは、ステロールで修飾されていないＬＰＭＰと比較して、変化した安定性（例えば、増加した安定性）を有する。一部の態様では、ステロールで修飾されているＬＰＭＰは、ステロールで修飾されていないＬＰＭＰと比較して、標的細胞の膜とのより速い融合速度を有する。
ある場合では、ＬＰＭＰは、外因性脂質および外因性ステロールを含む。

【0067】

一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、ＰＥＧ化脂質で修飾される。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の長さは、１ｋＤａ～１０ｋＤａで変化することができ、一部の態様では、２ｋＤａの長さを有するＰＥＧが使用される。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、Ｃ１４－ＰＥＧ２ｋ、Ｃ１８－ＰＥＧ２ｋ、またはＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋである。ある場合では、ＬＰＭＰは、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または５０％超のＰＥＧ化脂質（例えば、Ｃ１４－ＰＥＧ２ｋ、Ｃ１８－ＰＥＧ２ｋ、またはＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋ）、例えば、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～１．５％、１．５％～２．５％、２．５％～３．５％、３．５％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、または３０％～５０％のモル比のＰＥＧ化脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、約０．１％～１０％のモル比のＰＥＧ化脂質（例えば、Ｃ１４－ＰＥＧ２ｋ、Ｃ１８－ＰＥＧ２ｋ、またはＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋ）、例えば、約１％～３％のＰＥＧ化脂質、例えば、約１．５％または約２．５％のＰＥＧ化脂質を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質で修飾されているＬＰＭＰは、ＰＥＧ化脂質で修飾されていないＬＰＭＰと比較して、変化した安定性（例えば、増加した安定性）を有する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質で修飾されているＬＰＭＰは、ＰＥＧ化脂質で修飾されていないＬＰＭＰと比較して、変化した粒子サイズを有する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質で修飾されているＬＰＭＰは、ＰＥＧ化脂質で修飾されていないＬＰＭＰと比較して、貪食されないようである。ＰＥＧ化脂質の添加はまた、ＧＩ管の安定性に影響を与え、粘液を通した粒子移入を増強し得る。ＰＥＧは、標的化部分を結合する方法として使用されてもよい。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、イオン化可能な脂質（例えば、Ｃ１２－２００またはＭＣ３）ならびにステロール（例えば、コレステロールもしくはシトステロール）とＰＥＧ化脂質（例えば、Ｃ１４－ＰＥＧ２ｋ、Ｃ１８－ＰＥＧ２ｋ、もしくはＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋ）の一方または両方で修飾される。

【0068】

一部の実施形態では、修飾ＬＰＭＰは、約５％～５０％のモル比のＬＰＭＰ脂質（例えば、約１０％～２０％のＬＰＭＰ脂質、例えば、約１０％、１２．５％、１６％、または２０％のＬＰＭＰ脂質）、約３０％～７５％のイオン化可能な脂質（例えば、約３５％または約５０％のイオン化可能な脂質）、約３５％～５０％のステロール（例えば、約３６％、３８．５％、４２．５％、または４６．５％のステロール）、および約０．１％～１０％のＰＥＧ化脂質（例えば、約１％～３％のＰＥＧ化脂質、例えば、約１．５％または約２．５％のＰＥＧ化脂質）を含む。
一部の実施形態では、修飾ＬＰＭＰは、約５％～６０％のモル比のＬＰＭＰ脂質（例えば、約１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、または５０％～６０％のＬＰＭＰ脂質、例えば、約１０％、１２．５％、１６％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％のＬＰＭＰ脂質）、約２５％～７５％のイオン化可能な脂質（例えば、約３５％または約５０％のイオン化可能な脂質）、約１０％～５０％のステロール（例えば、約１０％、１２．５％、１４％、１６％、１８％、２０％、３６％、３８．５％、４２．５％、または４６．５％のステロール）、および約０．１％～１０％のＰＥＧ化脂質（例えば、約０．５％～５％のＰＥＧ化脂質、例えば、約１％～３％のＰＥＧ化脂質、または約１．５％もしくは約２．５％のＰＥＧ化脂質）を含む。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質、ＬＰＭＰ脂質、ステロール、およびＰＥＧ化脂質は、修飾されたＰＭＰの脂質の、それぞれ、約２５％～７５％、約２０％～６０％、約１０％～４５％、および約０．５％～５％含む。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質、ＬＰＭＰ脂質、ステロール、およびＰＥＧ化脂質は、修飾されたＰＭＰの脂質の、それぞれ、約３０％～７５％、約２０％～５０％、約１０％～４５％、および約１％～５％含む。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質、ＬＰＭＰ脂質、ステロール、およびＰＥＧ化脂質は、修飾されたＰＭＰの脂質の、それぞれ、約３５％～７５％、約２０％～５０％、約１０％～４５％、および約１％～５％含む。

【0069】

一部の実施形態では、イオン化可能な脂質、ＬＰＭＰ脂質、ステロール、およびＰＥＧ化脂質は、約３５：５０：１２．５：２．５のモル比で製剤化される。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質、ＬＰＭＰ脂質、ステロール、およびＰＥＧ化脂質は、約３５：５０：１１．５：３．５のモル比で製剤化される。
一部の実施形態では、イオン化可能な脂質、ＬＰＭＰ脂質、ステロール、およびＰＥＧ化脂質は、約３５：２０：４２．５：２．５のモル比で製剤化される。

【0070】

一部の実施形態では、ＬＰＭＰは、イオン化可能な脂質（および／またはカチオン性脂質）で修飾されており、ステロールおよび／またはＰＥＧ化脂質は、イオン化可能な脂質（および／またはカチオン性脂質）ならびにステロールおよび／またはＰＥＧ化脂質で修飾されていないＬＰＭＰより、負に荷電したカーゴ（例えば、核酸）をより効率的に封入する。修飾ＬＰＭＰは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９％超である、カーゴ（例えば、核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）についての封入効率を有してもよく、例えば、５％～３０％、３０％～５０％、５０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～９５％、または９５％～１００％の封入効率を有してもよい。
修飾ＬＰＭＰの細胞取り込みは、当該技術分野で公知の様々な方法によって測定することができる。例えば、ＬＰＭＰ、またはその構成成分は、取り込みを確認するために、単離された細胞で検出されて得るマーカー（例えば、蛍光マーカー）で標識され得る。

【0071】

一部の実施形態では、本明細書に提供されるＬＰＭＰ製剤は、二つ以上の異なる修飾ＬＰＭＰを含み、例えば、異なる非修飾ＬＰＭＰ（例えば、二つ以上の異なる植物源由来の非修飾ＬＰＭＰ）に由来する修飾ＬＰＭＰを含み、ならびに／あるいは異なる種ならびに／または異なる比のイオン化可能な脂質、ステロール、および／もしくはＰＥＧ化脂質を含む修飾ＬＰＭＰを含む。
ある場合では、脂質膜が溶解される有機溶媒は、ジメチルホルムアミド：メタノール（ＤＭＦ：ＭｅＯＨ）である。あるいは、有機溶媒または溶媒の組み合わせは、例えば、アセトニトリル、アセトン、エタノール、メタノール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、１－ブタノール、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル：エタノール、アセトニトリル：メタノール、アセトン：メタノール、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル：プロパノール、テトラヒドロフラン：メタノール、ジメチルスルホキシド：メタノール、またはジメチルホルムアミド：メタノールであってもよい。
水相は、任意の適当な溶液、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、約３．２のｐＨを有するクエン酸緩衝液）、水、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。水相は、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ前駆体（例えば、ｄｓＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、またはプラスミド（ｐＤＮＡ））あるいは小分子をさらに含んでもよい。
脂質溶液および水相は、任意の適当な比でマイクロ流体装置内で混合されてもよい。一部の例では、水相および脂質溶液は、３：１の体積比で混合される。

【0072】

ＬＰＭＰは、任意選択的に、さらなる薬剤、例えば、細胞透過剤、治療剤、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または小分子を含んでもよい。ＬＰＭＰは、例えば、薬剤を封入すること、脂質二重層構造に薬剤を組み込むこと、または薬剤の脂質二重層構造の表面との会合（例えば、コンジュゲート化による）によって、標的植物への薬剤の送達を可能にするための様々な方法でさらなる薬剤を担持または会合させることができる。核酸分子は、インビボ（例えば、植物中）またはインビトロ（例えば、組織培養中、細胞培養中、もしくは合成的に組み込まれた）のいずれかでＬＰＭＰに組み込まれ得る。

【0073】

ゼータ電位
イオン化可能な脂質（例えば、Ｃ１２－２００またはＭＣ３）および任意選択的に、カチオン性脂質（例えば、ＤＣ－コレステロールまたはＤＯＴＡＰ）を含むＬＰＭＰは、例えば、カーゴの非存在下のとき－３０ｍＶ超、カーゴの非存在下のとき－２０ｍＶ超、－５ｍＶ超、０ｍＶ超、または約３０ｍｖのゼータ電位を有してもよい。一部のでは、ＬＰＭＰは、負のゼータ電位、例えば、カーゴの非存在下のとき、０ｍＶ未満、－１０ｍＶ未満、－２０ｍＶ未満、－３０ｍＶ未満、－４０ｍＶ未満、または－５０ｍＶ未満のゼータ電位を有する。一部の例では、ＬＰＭＰは、正のゼータ電位、例えば、カーゴの非存在下のとき、０ｍＶ超、１０ｍＶ超、２０ｍＶ超、３０ｍＶ超、４０ｍＶ超、または５０ｍＶ超のゼータ電位を有する。一部の例では、ＬＰＭＰは、約０のゼータ電位を有する。
ＬＰＭＰのゼータ電位は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して測定され得る。ゼータ電位は、概して、間接的に測定され、例えば、当該技術分野で公知の方法および技術、例えば、電気泳動移動度または動的電気泳動移動度を使用して得られたデータから理論モデルを使用して計算される。電気泳動移動度は、典型的には、マイクロ電気泳動、電気泳動光散乱、または調整可能な抵抗パルス感知を使用して測定される。電気泳動光散乱は、動的光散乱に基づく。典型的には、ゼータ電位は、光子相関分光法または準弾性光散乱としても知られる動的光散乱（ＤＬＳ）測定からアクセス可能である。

【0074】

植物ＥＶマーカー
核酸ワクチン中のＬＰＭＰならびにその製造方法および使用方法は、植物ＥＶを使用して生成されるＬＰＭＰを同定する、および／またはそのセグメント、部分、もしくは抽出物を含む、広範なマーカーを有してもよい。本明細書で使用される場合、「植物ＥＶマーカー」という用語は、植物タンパク質、植物核酸、植物小分子、植物脂質、またはその組み合わせなどの植物と天然に関連し、植物体中の植物ＥＶ内または上に取り込まれる構成成分を指す。植物ＥＶマーカーの例は、例えば、ＲｕｔｔｅｒａｎｄＩｎｎｅｓ，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８－７４１，２０１７；Ｒａｉｍｏｎｄｏｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．６（２３）：１９５１４，２０１５；Ｊｕｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ．２１（７）：１３４５－１３５７，２０１３；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ．２２（３）：５２２－５３４，２０１４；ａｎｄＲｅｇｅｎｔｅｅｔａｌ，ＪｏｆＥｘｐ．Ｂｉｏｌ．６８（２０）：５４８５－５４９６，２０１７；において見ることができ、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
適当な植物ＥＶマーカーのさらなる例としては、国際特許出願公開第２０２１／０４１３０１号に記載され、列挙されるものが挙げられ、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0075】

薬剤（例えば、核酸）の充填
ＬＰＭＰを、治療剤（例えば、核酸分子）を含むよう修飾して、核酸ワクチンが形成される。ＬＰＭＰは、例えば、薬剤を封入すること、脂質二重層構造に構成成分を組み込むこと、またはＬＰＭＰの脂質二重層構造の表面との構成成分の会合（例えば、コンジュゲート化による）によって、標的生物（例えば、標的動物）への薬剤の送達を可能にするための様々な方法でこのような薬剤を担持または会合させることができる。ある場合では、薬剤は、本明細書に記載されるように、ＬＰＭＰ製剤中に含まれる。
薬剤は、ＬＰＭＰと薬剤との間の直接的または間接的な会合を可能にする当該技術分野で公知の任意の方法によって、ＬＰＭＰ内または上に組み込まれるか、または充填され得る。薬剤は、インビボ方法（例えば、植物体中、例えば、薬剤を含むトランスジェニック植物からのＬＰＭＰの生成を通して）、またはインビトロ（例えば、組織培養中、もしくは細胞培養中）、あるいはインビボ方法とインビトロ方法の両方によってＬＰＭＰに組み込まれ得る。
ある場合では、ＬＰＭＰは、インビトロで充填される。物質は、物理的、化学的、および／または生物学的方法（例えば、組織培養中もしくは細胞培養中）を含むが、これらに限定されない、を使用して、ＬＰＭＰ上またはＬＰＭＰ内に充填されてもよい（例えば、それによって封入されてもよい）。例えば、薬剤は、エレクトロポレーション、超音波処理、受動的拡散、撹拌、脂質抽出、または押し出しのうちの一つまたは複数によってＬＰＭＰに導入されてもよい。ある場合では、薬剤は、マイクロ流体デバイスを使用して、例えば、ＬＰＭＰ脂質が有機相で提供され、異種機能性剤が水相で提供され、有機相および水相がマイクロ流体装置中で組み合わされて、異種機能性剤を含むＬＰＭＰを生成する方法を使用して、ＬＰＭＰに組み込まれる。充填されたＬＰＭＰは、ＨＰＬＣ（例えば、小分子を評価するため）、免疫ブロッティング（例えば、タンパク質を評価するため）、および／または定量的ＰＣＲ（例えば、ヌクレオチドを評価するため）などの様々な方法を使用して充填された薬剤の存在またはレベルを確認するために評価することができる。しかしながら、ＬＰＭＰへの対象の物質の装填は、上述の方法に限定されないことは、当業者によって理解されるべきである。

【0076】

ある場合では、薬剤は、ＬＰＭＰにコンジュゲートされてもよく、ここで、薬剤はＬＰＭＰに間接的または直接的に連結または結合される。例えば、一つまたは複数の薬剤は、一つまたは複数の薬剤が、ＬＰＭＰの脂質二重層に直接的に結合（例えば、共有結合またはイオン結合によって）されるように、ＬＰＭＰに化学的に連結され得る。ある場合では、ＬＰＭＰへの様々な薬剤のコンジュゲーションは、最初に、適当な溶媒中で適切な架橋剤（例えば、Ｎ－エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、これは概して、一級アミンとのアミド結合のためのカルボキシル活性化剤として利用され、リン酸基とも反応する）と一つまたは複数の薬剤を混合することによって達成することができる。薬剤が架橋剤に付着することを可能にするのに十分なインキュベーション期間後、次いで、架橋剤／薬剤混合物をＬＰＭＰと組み合わせ、さらにインキュベーション期間後、スクロース勾配（例えば、８、３０、４５、および６０％スクロース勾配）に供して、遊離薬剤および遊離ＬＰＭＰをＬＰＭＰにコンジュゲートされた薬剤から分離することができる。混合物をスクロース勾配と合わせる工程、および付随する遠心分離工程の一部として、次いで、薬剤にコンジュゲートされたＬＰＭＰは、スクロース勾配のバンドとして見られ、その結果、コンジュゲートされたＬＰＭＰを収集し、洗浄し、本明細書に記載される使用に適当な溶液中に溶解することができる。
ある場合では、ＬＰＭＰは、例えば、植物へのＬＰＭＰの送達前および送達後に、薬剤と安定的に関連付けられる。他の場合では、ＬＰＭＰは、例えば、植物へのＬＰＭＰの送達後に、薬剤がＬＰＭＰから解離されるように、薬剤と関連付けられる。

【0077】

ＬＰＭＰは充填され得るか、またはＬＰＭＰは、特定の薬剤または使用に応じて、様々な濃度の薬剤と共に製剤化され得る。例えば、ある場合では、本明細書に開示されるＬＰＭＰ製剤が、約０．００１、０．０１、０．１、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５（もしくは約０．００１～９５の任意の範囲）またはそれ以上の重量％の薬剤を含むように、ＬＰＭＰは、装填されるか、またはＬＰＭＰは、製剤化される。ある場合では、ＬＰＭＰ製剤が、約９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１．０、０．１、０．０１、０．００１（もしくは約９５～０．００１の任意の範囲）またはそれ以上の重量％の薬剤を含むように、ＬＰＭＰは、装填されるか、またはＬＰＭＰは、製剤化される。例えば、ＬＰＭＰ製剤は、約０．００１～約０．０１重量％、約０．０１～約０．１重量％、約０．１～約１重量％、約１～約５重量％、または約５～約１０重量％、約１０～約２０重量％の薬剤を含み得る。ある場合では、ＬＰＭＰは、約１、５、１０、５０、１００、２００、または５００、１，０００、２，０００（もしくは約１～２，０００の任意の範囲）またはそれ以上のμｇ／ｍｌの薬剤と共に、充填され得るか、またはＬＰＭは製剤化される。本発明のＬＰＭＰは、約２，０００、１，０００、５００、２００、１００、５０、１０、５、１（もしくは約２，０００～１の任意の範囲）またはそれ以上のμｇ／ｍｌの薬剤と共に、充填され得るか、またはＬＰＭＰは、製剤化され得る。
ある場合では、本明細書に開示されるＬＰＭＰ製剤が、少なくとも０．００１重量％、少なくとも０．０１重量％、少なくとも０．１重量％、少なくとも１．０重量％、少なくとも２重量％、少なくとも３重量％、少なくとも４重量％、少なくとも５重量％、少なくとも６重量％、少なくとも７重量％、少なくとも８重量％、少なくとも９重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％の薬剤を含むように、ＬＰＭＰは充填されるか、またはＬＰＭＰは製剤化される。ある場合では、ＬＰＭＰは、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、少なくとも１，０００μｇ／ｍｌ、少なくとも２，０００μｇ／ｍｌの薬剤と共に、充填され得るか、またはＬＰＭＰは、製剤化され得る。
ある場合では、ＬＰＭＰは、薬剤を含むか、または薬剤からなる溶液中にＬＰＭＰを懸濁すること、例えば、激しく混合することによってＬＰＭＰを懸濁または再懸濁することによって、薬剤と共に製剤化される。薬剤（例えば、細胞透過剤、例えば、核酸、酵素、界面活性剤、イオン、蛍光、または双性イオン性液体、またはイオン化可能な脂質）は、例えば、１％未満または少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％の溶液を含んでもよい。

【0078】

医薬製剤
修飾ＬＰＭＰは、例えば、動物（例えば、ヒト）への投与のために、医薬組成物（すなわち、核酸ワクチン組成物）に製剤化される。医薬組成物は、薬学的に許容し得る希釈剤、担体、および／または賦形剤と共に動物（例えば、ヒト）に投与されてもよい。投与様式および投与量に応じて、本明細書に記載される方法の医薬組成物は、容易な送達を可能にするために適当な医薬組成物に製剤化される。単回用量は、必要に応じて単位投与形態であってもよい。
一部の実施形態では、用量は、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上である。
一部の実施形態では、ワクチンは、一回、二回、三回、四回、またはそれ以上投与される。
ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、例えば、動物への経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与（例えば、注射もしくは点滴）、筋肉内投与、または皮下投与用に製剤化されてもよい。注射用製剤については、様々な有効な医薬担体が、当該技術分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄｅｄ．，（２０１２）およびＡＳＨＰＨａｎｄｂｏｏｋｏｎＩｎｊｅｃｔａｂｌｅＤｒｕｇｓ，１８ｔｈｅｄ．，（２０１４）を参照されたい）。

【0079】

適当な薬学的に許容し得る担体および賦形剤は、採用される用量および濃度でレシピエントに無毒性である。許容可能な担体および賦形剤は、リン酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳおよびＴＡＥなどの緩衝液、アスコルビン酸およびメチオニンなどの酸化防止剤、塩化ヘキサメトニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、レゾルシノール、および塩化ベンザルコニウムなどの保存剤、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン、および免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、およびリジンなどのアミノ酸、ならびにグルコース、マンノース、スクロース、およびソルビトールなどの炭水化物を含んでもよい。ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、従来の医薬慣習に従って製剤化されてもよい。製剤中の化合物の濃度は、投与されるべき有効な薬剤（例えば、ＬＰＭＰおよび核酸）の投与量、および投与経路を含む、多くの因子に応じて変動する。
動物への経口投与のため、ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、経口製剤の形態で調製することができる。経口使用のための製剤は、無毒性の薬学的に許容し得る賦形剤との混合物中に有効成分（複数可）を含有する錠剤、カプレット、カプセル剤、シロップ、または経口液体投薬形態を含み得る。これらの賦形剤は、例えば、不活性な希釈剤または充填剤（例えば、スクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモでんぷんを含むでんぷん、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、もしくはリン酸ナトリウム）、造粒剤および崩壊剤（例えば、微結晶セルロースを含むセルロース誘導体、ジャガイモでんぷんを含むでんぷん、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、もしくはアルギン酸）、結合剤（例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、でんぷん、アルファ化でんぷん、微結晶セルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、もしくはポリエチレングリコール）、ならびに平滑剤、滑剤、および抗接着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、もしくはタルク）であってもよい。他の薬学的に許容し得る賦形剤は、着色剤、香味剤、可塑剤、保水剤、緩衝剤などであり得る。経口使用のための製剤はまた、チュアブル錠剤、非チュアブル錠剤、カプレット、カプセル剤（例えば、有効成分が、不活性な固体希釈剤と混合されている、硬質ゼラチンカプセル剤として、または有効成分が、水もしくは油媒体と混合されている、軟質ゼラチンカプセルとして）として単位投薬形態で提供されてもよい。本明細書に開示される組成物はまた、即時放出製剤、延長放出、または徐放製剤をさらに含んでもよい。
動物への非経口投与のため、ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、液体溶液または懸濁液の形態で製剤化され、非経口投与経路（例えば、皮下、静脈内、または筋肉内）によって投与されてもよい。医薬組成物は、注射または注入のため製剤化され得る。非経口投与用の医薬組成物は、無菌の溶液または任意の薬学的に許容し得る液体をビヒクルとして使用して製剤化することができる。薬学的に許容し得るビヒクルとしては、滅菌水、生理食塩水、または細胞培養培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α改変イーグル培地（α－ＭＥＭ）、およびＦ－１２培地）が挙げられるが、これらに限定されない。製剤化方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｇｉｂｓｏｎ（ｅｄ．）ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（２ｎｄｅｄ．）Ｔａｙｌｏｒ＆ＦｒａｎｃｉｓＧｒｏｕｐ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ（２００９）を参照されたい。

【0080】

ポリヌクレオチド
ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、一つまたは複数の野生型または操作されたタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチドをコードする、一つまたは複数の核酸分子、例えば、ポリヌクレオチドを含む。例示的なポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチド構築物は、抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含む。
本明細書で使用され得るポリペプチドの例としては、酵素（例えば、代謝リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、ＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ、もしくはユビキチン化タンパク質）、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞透過性ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、もしくはジンクフィンガー）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー、またはシャペロンを挙げることができる。
本明細書に含まれるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドまたは組換え産生されたバリアントを含んでもよい。ある場合では、ポリペプチドは、機能的断片またはそのバリアント（例えば、酵素的に活性な断片もしくはそのバリアント）であってもよい。例えば、ポリペプチドは、例えば、特定の領域にわたって、または配列全体にわたって、本明細書に記載されるポリペプチドまたは天然に存在するポリペプチドの配列に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する、本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかの機能的に活性なバリアントであってもよい。ある場合では、ポリペプチドは、対象のタンパク質と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上）の同一性を有してもよい。
ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、１個のポリペプチド、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、またはそれ以上のポリペプチドのうち少なくとも約一つなどの、任意の数またはタイプ（例えば、クラス）のポリペプチドを含んでもよい。ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中の各ポリペプチドの適当な濃度は、有効性、ポリペプチドの安定性、製剤中の別個のポリペプチドの数、および製剤の適用方法などの要因に依存する。ある場合では、液体製剤中の各ポリペプチドは、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬである。ある場合では、固体製剤中の各ポリペプチドは、約０．１ｎｇ／ｇ～約１００ｍｇ／ｇである。

【0081】

ペプチドをコードする核酸
ある場合では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。ポリペプチドをコードする核酸は、約１０～約５０，０００ヌクレオチド長（ｎｔ）、約２５～約１００ｎｔ、約５０～約１５０ｎｔ、約１００～約２００ｎｔ、約１５０～約２５０ｎｔ、約２００～約３００ｎｔ、約２５０～約３５０ｎｔ、約３００～約５００ｎｔ、約１０～約１０００ｎｔ、約５０～約１０００ｎｔ、約１００～約１０００ｎｔ、約１０００～約２０００ｎｔ、約２０００～約３０００ｎｔ、約３０００～約４０００ｎｔ、約４０００～約５０００ｎｔ、約５０００～約６０００ｎｔ、約６０００～約７０００ｎｔ、約７０００～約８０００ｎｔ、約８０００～約９０００ｎｔ、約９０００～約１０，０００ｎｔ、約１０，０００～約１５，０００ｎｔ、約１０，０００～約２０，０００ｎｔ、約１０，０００～約２５，０００ｎｔ、約１０，０００～約３０，０００ｎｔ、約１０，０００～約４０，０００ｎｔ、約１０，０００～約４５，０００ｎｔ、約１０，０００～約５０，０００ｎｔ、またはその間の任意の範囲を有してもよい。
ＬＰＭＰ／核酸ワクチンはまた、対象の核酸配列の活性なバリアントを含んでもよい。ある場合では、核酸のバリアントは、例えば、特定された領域にわたって、または配列全体にわたって、対象の核酸の配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。ある場合では、本発明は、本明細書に記載される核酸バリアントによってコードされる活性ポリペプチドを含む。ある場合では、核酸のバリアントによってコードされる活性ポリペプチドは、例えば、特定された領域にわたって、またはアミノ酸配列全体にわたって、対象のポリペプチドの配列または天然に由来するポリペプチド配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
タンパク質をコードする核酸を発現するためのある特定の方法は、適切なプロモーターの制御下で、昆虫、酵母、植物、細菌、または他の細胞を含む細胞における発現を伴い得る。発現ベクターは、複製起源、好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の５’または３’隣接非転写配列などの非転写エレメント、ならびに５’または３’非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ならびに終結配列を含み得る。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起源、早期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位を使用して、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝子エレメントを提供し得る。細菌、真菌、酵母、および哺乳類細胞宿主と使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，２０１２に記載されている。

【0082】

組換え法を使用した遺伝子修飾は、当該技術分野で一般的に公知である。所望の遺伝子をコードする核酸配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすること、遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を導出すること、または標準的な技術を使用して、それを含有する細胞および組織から直接単離することなど、当該技術分野で公知の組換え方法を使用して取得することができる。あるいは、対象の遺伝子は、クローニングされるのではなく合成的に生成され得る。
天然核酸または合成核酸の発現は、典型的には、対象の遺伝子をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。発現ベクターは、細菌における複製および発現に好適であり得る。発現ベクターはまた、真核生物における複製および統合に好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターを含有する。
さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の上流の領域３０～１１０塩基対（ｂｐ）に位置するが、多数のプロモーターが、開始部位の下流に機能的エレメントも含有することが最近示されている。プロモーターエレメント間の間隔は、エレメントが互いに対して反転または移動されるとき、プロモーター機能が保持されるように、しばしば可撓性である。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に５０ｂｐ離れて増加させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために協働的または独立して機能し得るようである。

【0083】

適当なプロモーターの一例は、即時早期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それと作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現をもたらすことができる強力な構成的プロモーター配列である。適当なプロモーターの別の例は、伸長成長因子１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、サルウイルス４０（ＳＶ４０）早期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバールウイルス即時早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに非限定的に、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない、他の構成的プロモーター配列も使用されてもよい。
あるいは、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望ましいとき、作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができる分子スイッチ、または発現が望ましくないとき、発現をオフにすることができる分子スイッチをもたらす。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0084】

導入されるべき発現ベクターはまた、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれか、または両方を含有して、ウイルスベクターを通してトランスフェクトまたは感染されるように試みられる細胞集団からの発現細胞の同定および選択を容易にすることができる。他の態様では、選択可能なマーカーは、ＤＮＡの別個の片上に担持され、同時トランスフェクション手法で使用され得る。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞における発現を可能にするために、適切な調節配列に隣接してもよい。有用な選択可能なマーカーには、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、潜在的に形質転換された細胞を識別し、制御配列の機能性を評価するために使用され得る。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント源に存在しないか、またはレシピエント源によって発現され、その発現が、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって現れるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適当な時点でアッセイされる。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ４７９：７９－８２，２０００）。適当な発現系は周知であり、公知の技術を使用して調製されてもよく、または商業的に取得されてもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして同定される。かかるプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結されてもよく、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用されてもよい。
ある場合では、生物は、一つまたは複数のタンパク質の発現を変化させるために遺伝子修飾されてもよい。一つまたは複数のタンパク質の発現は、特定の時間、例えば、生物の発生または分化状態の間修飾されてもよい。一例において、一つまたは複数のタンパク質、例えば、活性、構造、または機能に影響を及ぼすタンパク質の発現を変化させるための組成物が提供される。一つまたは複数のタンパク質の発現は、特定の位置（複数可）に制限されてもよく、または生物全体にわたって広く広がり得る。

【0085】

ｍＲＮＡ
ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、ｍＲＮＡ分子、例えば、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を含んでもよい。ｍＲＮＡ分子は、合成および修飾（例えば、化学的に）され得る。ｍＲＮＡ分子は、インビトロで化学的に合成または転写され得る。ｍＲＮＡ分子は、プラスミド、例えば、ウイルスベクター、細菌ベクター、または真核生物発現ベクター上に配置され得る。一部の例では、ｍＲＮＡ分子は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または形質導入（例えば、アデノウイルスもしくはレンチウイルス形質導入）によって細胞に送達され得る。
ある場合では、本明細書に記載される修飾されたＲＮＡ剤は、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを有する。かかる修飾は公知であり、例えば、国際公開第２０１２／０１９１６８号に記載されている。追加の修飾は、例えば、国際公開第２０１５／０３８８９２号、国際公開第２０１５／０３８８９２号、国際公開第２０１５／０８９５１１号、国際公開第２０１５／１９６１３０号、国際公開第２０１５／１９６１１８号および国際公開第２０１５／１９６１２８Ａ２号に記載されており、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある場合では、対象のポリペプチドをコードする修飾されたＲＮＡは、一つまたは複数の末端修飾、例えば、５’キャップ構造および／またはポリＡテール（例えば、１００～２００ヌクレオチド長）を有する。５’キャップ構造は、ＣａｐＯ、Ｃａｐｌ、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎｌ－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、および２－アジド－グアノシンからなる群から選択され得る。ある場合では、修飾されたＲＮＡはまた、少なくとも一つのコザック配列を含む５’ＵＴＲ、および３’ＵＴＲを含有する。かかる修飾は公知であり、例えば、国際公開第２０１２／１３５８０５号および国際公開第２０１３／０５２５２３号に記載されており、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。追加の終結修飾は、例えば、国際公開第２０１４／１６４２５３号および国際公開第２０１６／０１１３０６、国際公開第２０１２／０４５０７５号、および国際公開第２０１４／０９３９２４号に記載されており、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。少なくとも一つの化学修飾を含み得るキャップされたＲＮＡ分子（例えば、修飾されたｍＲＮＡ）を合成するためのキメラ酵素は、国際公開第２０１４／０２８４２９号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ある場合では、修飾されたｍＲＮＡは、ポリＡ結合タンパク質と５’末端結合タンパク質との間の相互作用を支援する翻訳能力のある分子を生成するために、環化または連結されてもよい。環化または連結の機序は、少なくとも３つの異なる経路、１）化学的、２）酵素的および３）リボザイム触媒を介して生じ得る。新たに形成された５’－／３’－結合は、分子内または分子間であってもよい。かかる修飾は公知であり、例えば、国際公開第２０１３／１５１７３６号に記載されている。

【0086】

修飾されたＲＮＡを作製および精製する方法は公知であり、当該技術分野で開示されている。例えば、修飾されたＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）酵素合成のみを使用して作製される。ＩＶＴポリヌクレオチドを作製する方法は、当該技術分野で公知であり、国際公開第２０１３／１５１６６６号、国際公開第２０１３／１５１６６８号、国際公開第２０１３／１５１６６３号、国際公開第２０１３／１５１６６９号、国際公開第２０１３／１５１６７０号、国際公開第２０１３／１５１６６４号、国際公開第２０１３／１５１６６５号、国際公開第２０１３／１５１６７１号、国際公開第２０１３／１５１６７２号、国際公開第２０１３／１５１６６７号および国際公開第２０１３／１５１７３６号に記載されており、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。精製方法は、ＲＮＡ転写物が表面に結合するような条件下で、試料を複数のチミジンもしくはその誘導体および／または複数のウラシルもしくはその誘導体（ポリＴ／Ｕ）に連結された表面と接触させることによって、ポリＡテールを含むＲＮＡ転写物を精製すること、および量産可能な方法（国際公開第２０１４／１４４７６７号）を介して最大１０，０００ヌクレオチド長のより長いＲＮＡの分離を可能にするイオン（例えば、陰イオン）交換クロマトグラフィーを使用して、表面から精製されたＲＮＡ転写物を溶出すること（国際公開第２０１４／１５２０３１号）、および修飾されたｍＲＮＡ試料をＤＮＡｓｅ処理（国際公開第２０１４／１５２０３０号）に供することを含む。
修飾されたＲＮＡの製剤は、公知であり、例えば、国際公開第２０１３／０９０６４８号に記載されている。例えば、製剤は、ナノ粒子、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）微粒子、リピドイド、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単純な糖を含む）、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、フィブリン接着剤、フィブリンシーラント、フィブリノーゲン、トロンビン、急速に排除される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）およびその組み合わせであってもよいが、これらに限定されない。
ヒト疾患、抗体、ウイルス、および様々なインビボ設定の分野におけるポリペプチドをコードする修飾されたＲＮＡは公知であり、例えば、国際公開第２０１３／１５１６６６号の表６、国際公開第２０１３／１５１６６８号、国際公開第２０１３／１５１６６３号、国際公開第２０１３／１５１６６９号、国際公開第２０１３／１５１６７０号、国際公開第２０１３／１５１６６４号、国際公開第２０１３／１５１６６５号、国際公開第２０１３／１５１７３６号、国際公開第２０１３／１５１６７２号の表６および７、国際公開第２０１３／１５１６７１号の表６、１７８および１７９、国際公開第２０１３／１５１６６７号の表６、１８５および１８６に開示され、それらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前述のいずれかは、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドとして合成されてもよく、各々は、一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドまたは末端修飾を含んでもよい。

【0087】

阻害性ＲＮＡ
ある場合では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、阻害性ＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して作用する阻害性ＲＮＡ分子を含む。ある場合では、阻害性ＲＮＡ分子は、植物での遺伝子発現のレベルを減少させ、および／または植物でのタンパク質のレベルを減少させる。ある場合では、阻害性ＲＮＡ分子は、植物遺伝子の発現を阻害する。例えば、阻害性ＲＮＡ分子は、植物の遺伝子を標的とする短い干渉ＲＮＡもしくはその前駆体、小ヘアピンＲＮＡ、および／またはマイクロＲＮＡもしくはその前駆体を含み得る。特定のＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ分子は、典型的には、１５～５０塩基対（例えば、約１８～２５塩基対）を含有し、細胞内で発現された標的遺伝子のコード配列と同一（もしくは相補的）またはほぼ同一（もしくは実質的に相補的）な核酸塩基配列を有するＲＮＡまたはＲＮＡ様構造を含む。ＲＮＡｉ分子としては、限定されないが、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロ二本鎖、ダイサー基質、および多価ＲＮＡ干渉が挙げられる（米国特許第８，０８４，５９９号、第８，３４９，８０９号、第８，５１３，２０７号および第９，２００，２７６号、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。阻害性ＲＮＡ分子は、インビトロで化学的に合成または転写され得る。
阻害性ＲＮＡ分子の追加的な例には、国際特許出願公開第２０２１／０４１３０１号に詳細に記載されるものが含まれ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0088】

遺伝子編集
ある場合では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、遺伝子編集システムの構成成分を含んでもよい。例えば、薬剤は、植物の遺伝子に修飾（例えば、挿入、欠失（例えば、ノックアウト）、転座、逆位、点変異、または他の変異）を導入し得る。例示的な遺伝子編集システムとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化された制御間隔の短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムが挙げられる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲベースの方法は、例えば、Ｇａｊｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１（７）：３９７－４０５，２０１３に記載されている。
遺伝子編集システムの構成成分およびプロセスに関する更なる説明は、国際特許出願公開第２０２１／０４１３０１号に見出すことができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0089】

ウイルス感染のための核酸ワクチン
ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、様々なウイルス感染と闘うために、一つまたは複数の抗原性ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。一つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、感染性疾患、障害、または状態、例えば、ＲＮＡウイルスによって引き起こされるウイルス感染を引き起こす感染因子に由来する一つまたは複数の抗原性ポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、以下に記載されるウイルスの様々なタイプおよび株の一つまたは複数の野生型または操作された抗原（もしくは抗原に対する抗体）をコードする。

【0090】

ウイルス感染
ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、急性熱性咽頭炎、咽頭結膜発熱、表皮性ケラト結膜炎、乳児胃腸炎、コクサッキー感染症、感染性単核球症、バーキットリンパ腫、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌、一次ＨＳＶ－１感染（例えば、小児の歯肉炎、成人における扁桃炎および咽頭炎、角結膜炎）、潜伏ＨＳＶ－１感染（例えば、唇側ヘルペスおよび口唇ヘルペス）、一次ＨＳＶ－２感染、潜伏ＨＳＶ－２感染、無菌性髄膜炎、感染性単核球症、巨細胞封入体症、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、原発性滲出性リンパ腫、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、ライ症候群、はしか、感染後脳脊髄炎、ムンプス、過形成上皮病変（例えば、共通して平坦で足底および肛門性器疣贅、咽頭乳頭腫、疣贅状表皮発育異常症）、子宮頸癌、扁平上皮癌、クループ、肺炎、気管支炎、一般的な風邪、多発性脊髄炎、狂犬病、気管支炎、肺炎、インフルエンザ様症候群、肺炎を伴う重度の気管支炎、ゲルマンはしか、先天性風疹、水疱症、および帯状疱疹を含むが、これらに限定されない、ウイルス感染と関連する感染性疾患、障害、または状態と闘うのに好適であり得る。
例示的なウイルス感染因子としては、アデノウイルス、１型単純ヘルペス、２型単純ヘルペス、脳炎ウイルス、パピローマウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、８型ヒトヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、パルボウイルスＢ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重度の急性呼吸器症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウェストナイルウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＡもしくはＢ型インフルエンザウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎、ロタウイルス、オルビウイルス、コルチウイルス、ハンタウイルス、中東呼吸器コロナウイルス、チクングニアウイルスまたはバンナウイルスからなる群から選択されるウイルスの株が挙げられるが、これらに限定されない。

【0091】

感染因子は、以下の表のウイルスからなる群から選択されるウイルスの株であってもよい。

【表1-1】

【表1-2】

他の適当なウイルス感染およびウイルス感染因子は、米国特許出願公開第２０１９／００１５５０１号および米国特許第１１，００７，２６０号に記載されており、それらの両方は、参照によりその全体が組み込まれる。

【0092】

蚊媒介性ウイルス
デング熱。一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、デングウイルス（フラビウイルス）の株をコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、Ｅタンパク質ドメインＩＩＩ（ＤＥＮＶ１－４タンデムｍＲＮＡ）、Ｅタンパク質ドメインＩ／ＩＩヒンジ領域（ＤＥＮＶ１－４個々のｍＲＮＡ）、ｐｒＭタンパク質（ＤＥＮＶ１－４タンデムまたは個々のｍＲＮＡ）、およびＣタンパク質（ＤＥＮＶ１－４タンデムまたは単一ｍＲＮＡ）をコードする。
チクングニアウイルス一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、チクングニアウイルスの株をコードする。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、６Ｋ、およびＣ－Ｅ３－Ｅ２－６Ｋ－Ｅ１からなる群から選択されるチクングニアエンベロープおよび／またはキャプシド抗原性ポリペプチドをコードする。

【0093】

一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、以下の株および単離株：ＴＡ５３、ＳＡ７６、ＵＧ８２、３７９９７、ＩＮＤ－０６、Ｒｏｓｓ、Ｓ２７、Ｍ－７１３４２４、Ｅ１－Ａ２２６Ｖ、Ｅ１－Ｔ９８、ＩＮＤ－６３－ＷＢ１、Ｇｉｂｂｓ６３－２６３、ＴＨ３５、１－６３４０２９、ＡＦ１５５６１、ＩＮＤ－７３－ＭＨ５、６５３４９６、Ｃ０３９２－９５、Ｐ０７３１４６０、ＭＹ０２１１ＭＲ／０６／ＢＰ、ＳＶ０４４４－９５、Ｋ０１４６－９５、ＴＳＩ－ＧＳＤ－２１８－ＶＲ１、ＴＳＩ－ＧＳＤ－２１８、Ｍ１２７、Ｍ１２５、６４４１－８８、ＭＹ００３ＩＭＲ／０６／ＢＰ、ＭＹ００２１ＭＲ／０６／ＢＰ、ＴＲ２０６／Ｈ８０４１８７、ＭＹ／０６／３７３４８、ＭＹ／０６／３７３５０、ＮＣ／２０１１－５６８、１４５５－７５、ＲＳＵ１、０７０６ａＴｗ、ＩｎＤＲＥ５１ＣＨＩＫ、ＰＲ－Ｓ４、ＡＭＡ２７９８／Ｈ８０４２９８、Ｈｕ／８５／ＮＲ／００１、ＰｈＨ１５４８３、０７０６ａＴｗ、０８０２ａＴｗ、ＭＹ０１９ＩＭＲ／０６／ＢＰ、ＰＲ－Ｓ６、ＰＥＲ１６０／Ｈ８０３６０９、９９６５９、ＪＫＴ２３５７４、０８１１ａＴｗ、ＣＨＩＫ／ＳＢＹ６／１０、２００１９０８３２３－ＢＤＧＥ１、２００１９０７９８１－ＢＤＧＥ１、２００４９０４８９９－ＢＤＧＥ１、２００４９０４８７９－ＢＤＧＥ１、２００３９０２４５２－ＢＤＧＥ１、ＤＨ１３０００３、０８０４ａＴｗ、２００２９１８３１０－ＢＤＧＥ１、ＪＣ２０１２、ｃｈｉｋ－ｓｙ、３８０７、３４６２、Ｙａｐ１３－２１４８、ＰＲ－Ｓ５、０８０２ａＴｗ、ＭＹ０１９ＩＭＲ／０６／Ｂｐ、０７０６ａＴｗ、ＰｈＨ１５４８３、Ｈｕ／８５／ＮＲ／００１、ＣＨＩＫＶ－１３－１１２Ａ、ＩｎＤＲＥ４ＣＨＩＫ、０８０６ａＴｗ、０７１２ａＴｗ、３４１２－７８、Ｙａｐ１３－２０３９、ＬＥＩＶ－ＣＨＩＫＶ／Ｍｏｓｃｏｗ／１、ＤＨ１３０００３、および２００３９から選択されるチクングニアポリペプチドをコードする。

【0094】

ジカウイルス。一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ジカウイルス（フラビウイルス）の株をコードする。一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＭＲ７６６、ＳＰＨ２０１５、およびＡＣＤ７５８１９からなる群から選択されるＺＩＫＶ血清型由来のＺＩＫＶポリペプチドをコードする。
ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス。一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＶＥＥウイルスの株をコードする。
ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１１，００７，２６０号に記載されるように、さらなるタイプのウイルスおよび蚊媒介性ウイルスの株、またはその断片をコードし得る。

【0095】

インフルエンザ
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、インフルエンザウイルスの株をコードする。一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、インフルエンザＡもしくはインフルエンザＢの株またはその組み合わせをコードする。一部の実施形態では、インフルエンザＡまたはインフルエンザＢの株は、トリ、ブタ、ウマ、イヌ、ヒトまたは非ヒト霊長類に関連する。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ヘマグルチニンタンパク質またはその断片をコードする。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、またはその断片である。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、ヘッドドメイン（ＨＡ１）を含まない。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、ヘッドドメイン（ＨＡ１）の部分を含まない。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、細胞質ドメインを含まない。一部の実施形態では、ヘマグルチニンタンパク質は、細胞質ドメインの部分を含まない。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、切断型ヘマグルチニンタンパク質をコードする。一部の実施形態では、切断型ヘマグルチニンタンパク質は、膜貫通型ドメインの部分を含まない。一部の実施形態では、ウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、およびＨ１０Ｎ８からなる群から選択される。
ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２０１９／００１５５０１号に記載されるように、さらなるタイプのウイルスおよびインフルエンザウイルスの株、またはその断片をコードし得る。

【0096】

コロナウイルス
ベータコロナウイルス。一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ベータコロナウイルス（ＢｅｔａＣｏＶ）のスパイクタンパク質（Ｓ）、またはその断片もしくはサブユニットを含むペプチド／タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ベータコロナウイルス（ＢｅｔａＣｏＶ）のスパイクタンパク質（Ｓ）、またはその断片もしくはサブユニットを含むペプチド／タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，９３３，１２７号に記載されるように、異なるタイプのウイルス、またはその断片をコードし得る。

【0097】

中東呼吸器症候群コロナウイルス。一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＭＥＲＳコロナウイルスのスパイクタンパク質（Ｓ）、スパイクＳ１断片（Ｓ１）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）、および／もしくはヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、またはこれらのタンパク質のいずれか一つの断片もしくはバリアントを含むペプチド／タンパク質をコードする。
ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２０１９／０３５１０４８号に記載されるように、ＭＥＲＳコロナウイルスの異なる株、またはその断片をコードし得る。

【0098】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の一つまたは複数の野生型または操作された抗原（もしくは抗原に対する抗体）をコードする。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のオープンリーディングフレームは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の一つまたは複数の野生型または操作された抗原（もしくは抗原に対する抗体）をコードする。一部の実施形態では、オープンリーディングフレームは、コドン最適化される。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質（Ｓ）、膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、および／もしくはヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質、またはその断片もしくはバリアントを含むペプチド／タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質（Ｓ）、またはその断片もしくはバリアントを含むペプチド／タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質（Ｓ）の少なくとも一つまたは二つのドメイン、および全長未満のスパイクタンパク質をコードする。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、二重プロリン安定化変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）（またはそのオープンリーディングフレーム）は、
アルファ（系統Ｂ．１．１．７、Ｑ．１－Ｑ．８）、
ベータ（系統Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．３５１．２、Ｂ．１．３５１．３）、
デルタ
ガンマ（系統Ｐ．１、Ｐ．１．１、Ｐ．１．２）
イプシロン（系統Ｂ．１．４２７、Ｂ．１．４２９）
エータ（系統Ｂ．１．５２５）
イオタ（系統Ｂ．１．５２６）
カッパー（系統Ｂ．１．６１７．１）
Ｂ．１．６１７．３
ラムダ（系統Ｃ．３７）
ミュー（系統Ｂ．１．６２１、Ｂ．１．６２１．１）
ゼータ（系統Ｐ．２）からなる群から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの株またはバリアントをコードする。
オミクロン

【0099】

一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）（またはそのオープンリーディングフレーム）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質および／もしくはＲＢＤ、またはその断片をコードする。一部の実施形態では、Ｓ抗原および／またはそのＲＢＤ抗原断片は、Ｋ４１７ＮまたはＫ４１７Ｔ、Ｎ４３９Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｖ、Ｌ４５２Ｒ、Ｙ４５３Ｆ、Ｓ４７７ＧまたはＳ４７７Ｎ、Ｅ４８４ＱまたはＥ４８４Ｋ、Ｆ４９０Ｓ、Ｎ５０１ＳまたはＮ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｑ６７７ＰまたはＱ６７７Ｈ、Ｐ６８１ＨまたはＰ６８１Ｒからなる群から選択されるＲＢＤ内の一つまたは複数の変異を含む。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）（またはそのオープンリーディングフレーム）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質および／もしくはＲＢＤ、またはその断片をコードする。一部の実施形態では、Ｓ抗原は、例えば、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ変異（Ｓ－２Ｐバリアント）ならびに他のプロリン置換、特に、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９ＰおよびＡ９４２Ｐを含むスパイク三量体を安定化させる変異を含み、これらは、一緒に組み合わされて、複数のプロリン変異体、特に、ヘキサプロリンバリアント（ＨｅｘａＰｒｏ）を得ることができる。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）（またはそのオープンリーディングフレーム）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質および／もしくはＲＢＤ、またはその断片をコードする。一部の実施形態では、Ｓ抗原は、置換Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８ＨおよびＶ１１７６Ｆ、ならびに欠失デルタ６９～７０、デルタ１４４、デルタ２４２～２４４、およびデルタ２４６～２５２からなる群から選択される一つまたは複数の変異を含む。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチン中のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）（またはそのオープンリーディングフレーム）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質および／もしくはＲＢＤ、またはその断片をコードする。一部の実施形態では、Ｓ抗原またはそのＲＢＤ抗原断片は、以下の変異：Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ、Ｋ４１７ＴまたはＫ４１７Ｎ、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４３９Ｎ、Ｙ４５３Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｆ４９０Ｓ、およびＮ５０１Ｙ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４３９Ｎ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｆ４９０Ｓ、およびＮ５０１Ｙを含む。
追加の変異は、国際公開第２０２１／１５４７６３Ａ１号に見出され得、これは、参照によりその全体が組み込まれる。

【0100】

核酸配列
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる抗原性ポリペプチドは、コロナウイルス、またはその断片もしくはサブユニットである。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＭＥＲＳウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、またはその断片もしくはサブユニットのスパイクタンパク質（Ｓ）である。
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＳＡＲＳウイルス、またはその断片もしくはサブユニットである。抗原性ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質であってもよい。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ前駆体、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）もしくはｍｉＲＮＡ前駆体、プラスミド、ダイサー基質低分子干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ピウィ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、リボザイム、デオキシリボザイム（ＤＮＡザイム）、アプタマー、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはこれらのＲＮＡのいずれかをコードするＤＮＡ分子であってもよい。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コロナウイルス抗原バリアント（例えば、安定化されたプレ融合スパイクタンパク質などのバリアント三量体スパイクタンパク質）をコードする。抗原バリアントまたは他のポリペプチドバリアントは、そのアミノ酸配列が、野生型、天然、または参照配列とは異なる分子を指す。抗原／ポリペプチドバリアントは、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有し得る。通常、バリアントは、野生型、天然または参照配列と少なくとも５０％の同一性を有する。一部の実施形態では、バリアントは、野生型、天然、または参照配列と少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を共有する。

【0101】

本開示の核酸によってコードされるバリアント抗原／ポリペプチドは、例えば、対象における、それらの免疫原性を増強し、それらの発現を増強し、および／またはそれらの安定性もしくはＰＫ／ＰＤ特性を改善する、多数の望ましい特性のいずれかを付与するアミノ酸変化を含有し得る。バリアント抗原／ポリペプチドは、日常的な変異誘発技術を使用して作製され、必要に応じてアッセイされて、それらが所望の特性を有するかどうかを決定することができる。発現レベルおよび免疫原性を決定するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、そのようなアッセイの例は、実施例の項に記載される。同様に、タンパク質バリアントのＰＫ／ＰＤ特性は、当該技術分野で認識されている技術を使用して、例えば、経時的にワクチン接種された対象における抗原の発現を決定することによって、および／または誘導された免疫応答の耐久性を調べることによって測定することができる。バリアント核酸によってコードされるタンパク質（複数可）の安定性は、熱安定性または尿素変性時の安定性をアッセイすることによって測定されてもよく、またはインシリコ予測を使用して測定されてもよい。こうした実験およびインシリコ決定の方法は、当該技術分野で公知である。

【0102】

「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、二つ以上のポリペプチド（例えば、抗原）またはポリヌクレオチド（核酸）の配列間の関係を指す。同一性はまた、一連の二つ以上のアミノ酸残基または核酸残基間の一致の数によって決定される配列間またはその間の配列関連性の程度を指す。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって指定されるギャップアライメント（存在する場合）を有する二つ以上の配列のうちの小さい方の間の同一一致の割合を測定する。関連する抗原または核酸の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用する場合の「同一性の割合（％）」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント同一性を達成した後の、第二の配列のアミノ酸配列または核酸配列の残基と同一である候補アミノ酸配列または核酸配列の残基（アミノ酸残基もしくは核酸残基）の割合として定義される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知である。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算において導入されるギャップおよびペナルティによって値が異なる場合があることが理解される。概して、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、抗原）のバリアントは、本明細書に記載され、当業者に公知の配列アライメントプログラムおよびパラメータによって決定される、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが１００％未満の配列同一性を有する。アライメントのためのこのようなツールには、ＢＬＡＳＴスイート（ＳｔｅｐｈｅｎＦ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ（１９９７），“ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴａｎｄＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒａｍｓ”，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のものが含まれる。別の一般的な局所アライメント技術は、スミス－ウォーターマンアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｍｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）に基づく。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアライメント技術は、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａｇｅｎｅｒａｌｍｅｔｈｏｄａｐｐｌｉｃａｂｌｅｔｏｔｈｅｓｅａｒｃｈｆｏｒｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｗｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）である。より最近では、ニードルマン－ブンシュアルゴリズムを含む他の最適なグローバルアライメント方法よりも速く、ヌクレオチド配列およびタンパク質配列のグローバルアライメントを意図して産生する、高速最適グローバル配列アライメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されている。
したがって、参照配列、特に、本明細書に開示されるポリペプチド（例えば、抗原）配列に関して置換、挿入および／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、一つまたは複数のリジンなどの配列タグまたはアミノ酸は、ペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）付加することができる。配列タグは、ペプチド検出、精製または局在化に使用することができる。リジンは、ペプチド溶解度を増加させるため、またはビオチン化を可能にするために使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域およびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基は、切断型配列をもたらすように任意選択的に欠失されてもよい。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基またはＮ末端残基）は、例えば、可溶性または固体支持体に連結されたより大きな配列の一部としての配列の発現など、配列の使用に応じて代替的に欠失されてもよい。一部の実施形態では、シグナル配列、終結配列、膜貫通型ドメイン、リンカー、多量体形成ドメイン（例えば、フォールドン領域など）などの配列（またはそれをコードする）は、同一または類似の機能を達成する代替配列で置換されてもよい。一部の実施形態では、タンパク質のコア中の空洞は、例えば、より大きなアミノ酸を導入することによって、安定性を改善するために満たすことができる。他の実施形態では、埋め込み水素結合ネットワークは、安定性を改善するために疎水性残基で置換されてもよい。さらに他の実施形態では、グリコシル化部位は、除去され、適切な残基で置換されてもよい。こうした配列は、当業者に容易に識別可能である。本明細書に提供される配列の一部は、例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの調製に使用する前に、欠失され得る配列タグまたは末端ペプチド配列（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）を含有することも理解されるべきである。

【0103】

当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同タンパク質はまた、対象のコロナウイルス抗原の範囲内であるとみなされる。例えば、参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照抗原配列よりも少なくとも一つのアミノ酸残基分だけ短いが、そうでなければ同一である、ポリペプチド配列を意味する）が、本明細書に提供されるが、ただし、断片は、免疫原性であり、コロナウイルスに対する防御的免疫反応を付与することを条件とする。参照タンパク質と同一であるが、切断されているバリアントに加えて、一部の実施形態では、抗原は、本明細書に提供または参照される配列のいずれかに示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の変異を含む。抗原／抗原性ポリペプチドは、約４、６、または８アミノ酸から全長タンパク質までの長さの範囲であり得る。
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、構造タンパク質である。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、または膜タンパク質である。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、安定化されたプレ融合スパイクタンパク質である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、バリアント三量体スパイクタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。三量体スパイクタンパク質は、例えば、安定化されたプレ融合スパイクタンパク質を含み得る。一部の実施形態では、安定化されたプレ融合スパイクタンパク質は、二重プロリン（Ｓ２Ｐ）変異である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、コロナウイルス抗原（例えば、安定化されたプレ融合スパイクタンパク質などのバリアント三量体スパイクタンパク質）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、および／または５’キャップ類似体をさらに含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’ＵＴＲを含む。

【0104】

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも一つの）タンパク質（アミノ酸の天然に存在する、天然に存在しない、または修飾ポリマー）をコードし、コードされたタンパク質をインビトロ、インビボ、インサイチュ、またはエクスビボで産生するように翻訳され得る任意のＲＮＡである。当業者であれば、別段の記載がない限り、本出願に記載される核酸配列は、代表的なＤＮＡ配列中の「Ｔ」を列挙し得るが、配列が、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を表す場合、「Ｔ」は、「Ｕ」に置換されることを理解するであろう。したがって、本明細書の特定の配列識別番号によって開示され、特定されるＤＮＡのいずれかはまた、ＤＮＡに相補的な対応するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列も開示し、ＤＮＡ配列の各「Ｔ」は、「Ｕ」で置換される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、（ａ）ＤＮＡ分子、または（ｂ）ＲＮＡ分子に由来する。ｍＲＮＡでは、Ｔは、Ｕで任意選択的に置換される。
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧまたはＡＵＧ））から始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧもしくはＴＧＡ、またはＵＡＡ、ＵＡＧもしくはＵＧＡ）で終わるＤＮＡまたはＲＮＡの連続ストレッチである。ＯＲＦは、典型的にはタンパク質をコードする。本明細書に開示される配列は、追加のエレメント、例えば、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲをさらに含んでもよいが、それらのエレメントは、ＯＲＦとは異なり、本開示のポリヌクレオチドに必ずしも存在する必要はない。

【0105】

安定化エレメント
天然に存在する真核生物ｍＲＮＡ分子は、５’－キャップ構造または３’－ポリ（Ａ）テールなどの他の構造的特徴に加えて、その５’－末端（５’ＵＴＲ）および／またはそれらの３’－末端（３’ＵＴＲ）に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むが、これらに限定されない安定化エレメントを含有し得る。５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの両方は、典型的にはゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。５’－キャップおよび３’－ポリ（Ａ）テールなどの成熟ｍＲＮＡの特徴的構造的特性は、通常、ｍＲＮＡプロセシング中に転写された（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾、少なくとも一つの５’末端キャップを有する少なくとも一つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有し、脂質ナノ粒子内に製剤化される。ポリヌクレオチドの５’－キャッピングは、以下の化学ＲＮＡキャップ類似体を使用して、インビトロ転写反応中に同時に完了されて、製造業者のプロトコル：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ｔｈｅＡＲＣＡｃａｐ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）に従って５’－グアノシンキャップ構造を生成してもよい。修飾ＲＮＡの５’－キャッピングは、ＶａｃｃｉｎｉａＶｉｍｓＣａｐｐｉｎｇＥｎｚｙｍｅを使用して転写後に完了して、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を生成し得る。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素と２’－０メチル－トランスフェラーゼの両方を使用して生成され、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成することができる。キャップ２構造は、キャップ１の構造から生成され、続いて２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼを使用して５’－アンティピナルチメートヌクレオチドの２’－０－メチル化が行われてもよい。キャップ３構造は、キャップ２の構造から生成され、続いて２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼを使用して５’－プレアンティピナルチメートヌクレオチドの２’－０－メチル化が行われてもよい。酵素は、組換え源に由来し得る。

【0106】

３’－ポリ（Ａ）テールは、典型的には、転写されたｍＲＮＡの３’末端に付加されたアデニンヌクレオチドのストレッチである。それは、ある場合では、最大約４００個のアデニンヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、３’－ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須エレメントであり得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、安定化エレメントを含む。安定化エレメントは、例えば、ヒストンステムループを含み得る。３２ｋＤａタンパク質であるステム－ループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が、特定されている。これは、核と細胞質の両方におけるヒストンメッセージの３’末端のヒストンステムループと関連する。その発現レベルは、細胞周期によって調節され、ヒストンｍＲＮＡレベルも上昇するとき、Ｓ期の間にピークとなる。タンパク質は、Ｕ７ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰは、処理後にステムループと関連付けられ続け、次いで、細胞質において、成熟ヒストンｍＲＮＡのヒストンタンパク質への翻訳を刺激する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物および原生動物を介して保存され、ヒストンステム－ループへのその結合は、ループの構造に依存する。最小結合部位は、ステム－ループに対して５’に少なくとも三個のヌクレオチドおよび３’に二個のヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、コード領域、少なくとも一つのヒストンステムループ、および任意選択的に、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、概して、コードされたタンパク質の発現レベルを強化すべきである。コードされたタンパク質は、一部の実施形態では、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｂ－ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）、またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えば、アルファ－グロビン、ガラクトキナーゼおよびキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも一つのヒストンステムループとの組み合わせを含むが、両方とも天然での代替的な機序を表すが、相乗的に作用して、個々のエレメントのいずれかで観察されるレベルを超えてタンパク質発現を増加させる。ポリ（Ａ）と少なくとも一つのヒストンステム－ループの組み合わせの相乗効果は、エレメントの順序またはポリ（Ａ）配列の長さに依存しない。一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流エレメント」（ＨＤＥ）は、天然に存在するステム－ループ３’のおよそ１５～２０ヌクレオチドのプリンリッチポリヌクレオチド伸長を含み、これは、ヒストンプレｍＲＮＡの成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７ｓｎＲＮＡの結合部位を表す。一部の実施形態では、核酸は、イントロンを含まない。

【0107】

ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、修飾もしくは非修飾であってもよく、または活性化もしくは不活化されてもよい、エンハンサーおよび／またはプロモーター配列を含有してもよく、または含有しなくてもよい。一部の実施形態では、ヒストンステム－ループは、概して、ヒストン遺伝子に由来し、構造のループを形成する短い配列からなるスペーサーによって分離された二つの隣接する部分的または完全に逆相補的な配列の分子内塩基対形成を含む。不対ループ領域は、典型的には、ステムループエレメントのいずれかと塩基対形成することができない。これは、多くのＲＮＡ二次構造の主要な構成成分であるように、ＲＮＡにおいてより頻繁に起こるが、一本鎖ＤＮＡにも存在し得る。ステム－ループ構造の安定性は、概して、対形成された領域の長さ、ミスマッチまたはバルジの数、および塩基組成に依存する。一部の実施形態では、ホブル塩基対形成（非ワトソン・クリック塩基対形成）が生じ得る。一部の実施形態では、少なくとも一つのヒストンステム－ループ配列は、１５～４５長のヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、除去された一つまたは複数のＡＵリッチな配列を有する。ＡＵＲＥＳと呼ばれることもあるこれらの配列は、３’ＵＴＲに見られる不安定化配列である。ＡＵＲＥＳは、ＲＮＡワクチンから除去されてもよい。あるいは、ＡＵＲＥＳは、ＲＮＡワクチンに残ってもよい。

【0108】

シグナルペプチド
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、コロナウイルス抗原に融合されたシグナルペプチドをコードするＯＲＦを有する。タンパク質のＮ末端の１５～６０アミノ酸を含むシグナルペプチドは、典型的には、分泌経路上の膜にわたる転座に必要とされ、したがって、真核生物と原核生物の両方における分泌経路へのほとんどのタンパク質の侵入を普遍的に制御する。真核生物では、新生前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドは、リボソームを粗小胞体（ＥＲ）膜に向け、プロセシングのために成長ペプチド鎖のそれを超えた輸送を開始する。ＥＲプロセシングは、成熟タンパク質を産生し、シグナルペプチドは、典型的には、宿主細胞のＥＲ常在シグナルペプチダーゼによって前駆体タンパク質から切断されるか、またはそれらは、切断されず、膜アンカーとして機能する。シグナルペプチドはまた、細胞膜へのタンパク質の標的化を促進し得る。シグナルペプチドは、１５～６０アミノ酸長を有してもよい。例えば、シグナルペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸長を有し得る。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、２０～６０、２５～６０、３０～６０、３５～６０、４０～６０、４５～６０、５０～６０、５５～６０、１５～５５、２０～５５、２５～５５、３０～５５、３５～５５、４０～５５、４５～５５、５０～５５、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１５～４５、２０～４５、２５～４５、３０～４５、３５～４５、４０～４５、１５～４０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、３５～４０、１５～３５、２０～３５、２５～３５、３０～３５、１５～３０、２０～３０、２５～３０、１５～２５、２０～２５、または１５～２０アミノ酸長を有する。
異種遺伝子（天然でコロナウイルス抗原以外の遺伝子の発現を調節する）からのシグナルペプチドは、当該技術分野で公知であり、所望の特性について試験され、次いで本開示の核酸に組み込まれ得る。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、参照によりその全体が組み込まれる国際公開第２０２１／１５４７６３号に記載されるものを含んでもよい。

【0109】

融合タンパク質
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、抗原性融合タンパク質をコードする。したがって、コードされた抗原または複数の抗原は、一緒に結合された二つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質および／またはタンパク質断片）を含み得る。あるいは、タンパク質抗原が融合されるタンパク質は、それ自体に対する強い免疫応答を促進しないが、むしろコロナウイルス抗原に対する強い免疫応答を促進する。抗原融合タンパク質は、一部の実施形態では、各々の元のタンパク質からの機能的特性を保持する。

【0110】

スキャフォールド部分
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、一部の実施形態では、スキャフォールド部分に連結されたコロナウイルス抗原を含む融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、かかるスキャフォールド部分は、本開示の核酸によってコードされる抗原に所望の特性を付与する。例えば、スキャフォールドタンパク質は、例えば、抗原の構造を変更すること、抗原の取り込みおよびプロセシングを変更すること、ならびに／または抗原を結合パートナーに結合させることによって、抗原の免疫原性を改善してもよい。
一部の実施形態では、スキャフォールド部分は、免疫系の様々な細胞との最適な相互作用に非常に好適なサイズ範囲である直径１０～１５０ｎｍで、高度に対称的であり、安定しており、構造的に組織化されたタンパク質ナノ粒子に自己組織化することができるタンパク質である。一部の実施形態では、ウイルスタンパク質またはウイルス様粒子を使用して、安定なナノ粒子構造を形成することができる。こうしたウイルスタンパク質の例は、当該技術分野で公知である。例えば、一部の実施形態では、スキャフォールド部分は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。ＨＢｓＡｇは、平均直径約－２２ｎｍの球状粒子を形成し、核酸を欠き、したがって非感染性である（Ｌｏｐｅｚ－Ｓａｇａｓｅｔａ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ１４（２０１６）５８－６８）。一部の実施形態では、スキャフォールド部分は、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）であり、２４～３１ｎｍの直径の粒子に自己組織化され、これは、ＨＢＶ感染ヒト肝臓から得られたウイルスコアに類似している。ＨＢｃＡｇは、１８０個または２４０個のプロトマーに対応する、直径３００Ａおよび３６０Ａの異なるサイズの二つのクラスのナノ粒子に自己組織化される。一部の実施形態では、コロナウイルス抗原は、ＨＢｓＡＧまたはＨＢｃＡＧに融合されて、コロナウイルス抗原を示すナノ粒子の自己組織化を促進する。
一部の実施形態では、細菌タンパク質プラットフォームを使用してもよい。これらの自己組織化タンパク質の非限定的な例としては、フェリチン、ルマジンおよびエンカプスリンが挙げられる。
フェリチンは、その主な機能が、細胞内鉄貯蔵であるタンパク質である。フェリチンは、２４個のサブユニットから成り、各々が、四つのアルファ－ヘリックス束からなり、八面体対称性を有する四次構造に自己組織化する（ＣｈｏＫ．Ｊ．ｅｔａｌ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２００９；３９０：８３－９８）。フェリチンのいくつかの高分解能構造が決定され、これにより、ヘリコバクター・ピロリ・フェリチンが２４個の同一のプロトマーで成ることが確認されたが、動物では、単独で組み立てられるか、または異なる比率で２４個のサブユニットの粒子に組み合わせることができるフェリチン軽鎖および重鎖が存在する（ＧｒａｎｉｅｒＴ．ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＩｎｏｒｇＣｈｅｍ．２００３；８：１０５－１１１；ＦａｗｓｏｎＤ．Ｍ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９１；３４９：５４１－５４４）。フェリチンは、強固な熱安定性および化学的安定性を有するナノ粒子に自己組織化する。したがって、フェリチンナノ粒子は、抗原を担持し、曝露するのに十分に適している。

【0111】

フマジンシンターゼ（ＦＳ）はまた、抗原表示のためのナノ粒子プラットフォームとして十分に適している。リボフラビンの生合成における最後から二番目の触媒工程に関与するＦＳは、古細菌、細菌、真菌、植物、および真正細菌を含む広範な生物に存在する酵素である（ＷｅｂｅｒＳ．Ｅ．ＦｌａｖｉｎｓａｎｄＦｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｒｉｅｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．２０１４）。ＦＳ単量体は、１５０アミノ酸長であり、その側面に隣接するタンデムアルファらせん体とともにベータシートからなる。ＦＳについては、ホモペンタマーから、直径１５０Ａのカプシドを形成する１２個の五量体の対称的なアセンブリまでの、その形態学的汎用性を示している、多数の異なる四次元構造が報告されている。１００個を超えるサブユニットのＦＳケージさえも記載されている（ＺｈａｎｇＸ．ｅｔａｌ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２００６；３６２：７５３－７７０）。
サーモフィア・サーモトガ・マリティマから単離された新規のタンパク質ケージナノ粒子であるエンカプスリンも、自己組織化ナノ粒子の表面上に抗原を提示するためのプラットフォームとして使用され得る。エンカプスリンは、それぞれ、２０ｎｍおよび２４ｎｍの内径および外径を有する薄く、かつ正反対のＴ＝１対称なケージ構造を有する、同一の３１ｋＤａモノマーの６０コピーから組み立てられる（ＳｕｔｔｅｒＭ．ｅｔａｌ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ．２００８，１５：９３９－９４７）。Ｔ．マリティマにおけるエンカプスリンの正確な機能は、まだ明確には理解されていないが、その結晶構造は、最近解明されており、その機能は、酸化ストレス応答に関与するＤｙＰ（ペルオキシダーゼ脱色色素）およびＦｌｐ（フェリチン様タンパク質）などのタンパク質を封入する細胞区画と仮定されている（ＲａｈｍａｎｐｏｕｒＲ．ｅｔａｌ．ＦＥＢＳＪ．２０１３，２８０：２０９７－２１０４）。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、フォールドンドメインに融合されたコロナウイルス抗原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質）をコードする。フォールドンドメインは、例えば、バクテリオファージＴ４フィブリチンから得られてもよい（例えば、ＴａｏＹ，ｅｔａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１９９７Ｊｕｎ１５；５（６）：７８９－９８を参照）。

【0112】

リンカーおよび切断可能なペプチド
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、本明細書において融合タンパク質と称される、二つ以上のポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、融合タンパク質の少なくとも一つまたは各ドメインの間に位置するリンカーをさらにコードする。リンカーは、例えば、切断可能なリンカーまたはタンパク質分解酵素感受性リンカーであり得る。一部の実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、およびその組み合わせからなる群から選択される。２Ａペプチドと呼ばれる自己切断ペプチドリンカーのこのファミリーは、当該技術分野で説明されている（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳＯＮＥ６：ｅｌ８５５６を参照）。一部の実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカーである。一部の実施形態では、融合タンパク質は、構造：ドメイン－リンカー－ドメイン－リンカー－ドメインを有する、介在するリンカーを有する三つのドメインを含有する。
当該技術分野で公知の切断可能なリンカーは、本開示に関連して使用され得る。そのようなリンカーの例としては、Ｆ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカーが挙げられる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／１２７７５０号を参照のこと）。当業者であれば、他の当該技術分野で認識されているリンカーが、本開示の構築物（例えば、本開示の核酸によってコードされる）での使用に好適であり得ることを理解するであろう。同様に、当業者であれば、他のポリシストロニック構築物（同じ分子内で別々に一つより多くの抗原／ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）が、本明細書に提供される使用に好適であり得ることを理解するであろう。

【0113】

配列最適化
一部の実施形態では、本開示の抗原をコードするＯＲＦは、コドン最適化される。コドン最適化方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本明細書に提供される配列の任意の一つまたは複数のＯＲＦは、コドン最適化されてもよい。コドン最適化を、一部の実施形態では、使用して、標的生物および宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切なフォールディングを確実にし得るか、ＧＣ含量をバイアスして、ｍＲＮＡ安定性を増加させ得るか、もしくは二次構造を低減させ得る、遺伝子構築もしくは発現を損ない得るタンデム反復コドンもしくは塩基実行を最小化し得る、転写制御領域および翻訳制御領域をカスタマイズし得る、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去し得る、コードされたタンパク質（例えば、グリコシル化部位）において翻訳後修飾部位を除去／付加し得る、タンパク質ドメインを付加し得る、除去し得るか、もしくはシャッフルし得る、制限酵素部位を挿入し得るか、もしくは削除し得る、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾し得る、翻訳速度を調整して、タンパク質の様々なドメインを適切にフォールディングすることを可能にし得るか、またはポリヌクレオチド内の問題となる二次構造を低減し得るか、もしくは除去し得る。コドン最適化ツール、アルゴリズムおよびサービスは、当該技術分野で公知であり、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（ＭｅｎｌｏＰａｒｋＣＡ）および／または専有方法のサービスが挙げられる。一部の実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。
一部の実施形態では、コドン最適化配列は、天然に生じる、または野生型配列ＯＲＦ（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然に生じる、もしくは野生型ｍＲＮＡ配列）と９５％未満の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する、または野生型配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然に存在する、もしくは野生型ｍＲＮＡ配列）と９０％未満の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する、または野生型配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然に存在する、もしくは野生型ｍＲＮＡ配列）と８５％未満の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する、または野生型配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然に存在する、もしくは野生型ｍＲＮＡ配列）と８０％未満の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する、または野生型配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然に存在する、もしくは野生型ｍＲＮＡ配列）と７５％未満の配列同一性を共有する。

【0114】

一部の実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する、または野生型配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然に存在する、もしくは野生型ｍＲＮＡ配列）と６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する、または野生型配列（例えば、コロナウイルス抗原をコードする天然に存在する、もしくは野生型ｍＲＮＡ配列）と６５％～７５％または約８０％の配列同一性を共有する。
一部の実施形態では、コドン最適化配列は、非コドン最適化配列によってコードされるコロナウイルス抗原と同じくらいの免疫原性であるか、またはより高い（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、もしくは少なくとも２００％以上）免疫原性である抗原をコードする。哺乳類宿主細胞にトランスフェクトされたとき、修飾されたｍＲＮＡは、１２～１８時間、または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間、または７２時間超の安定性を有し、哺乳類宿主細胞によって発現することができる。
一部の実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、Ｇ／Ｃのレベルが強化されているＲＮＡであってもよい。核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含有量は、ＲＮＡの安定性に影響を与え得る。増加した量のグアニン（Ｇ）残基および／またはシトシン（Ｃ）残基を有するＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）ヌクレオチドおよびチミン（Ｔ）ヌクレオチドまたはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有するＲＮＡよりも機能的に安定であり得る。例として、国際公開第０２／０９８４４３号は、翻訳された領域における配列修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含有する医薬組成物を開示している。遺伝子コードの縮重により、修飾は、結果として生じるアミノ酸を変化させることなく、より高いＲＮＡ安定性を促進するものに既存のコドンを置換することによって機能する。アプローチは、ＲＮＡのコード領域に限定される。

【0115】

化学的に修飾されていないヌクレオチド
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、化学的に修飾されず、アデノシン、グアノシン、シトシンおよびウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のヌクレオチドおよびヌクレオシドは、転写ＲＮＡに存在するもの（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）などの標準的なヌクレオシド残基を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のヌクレオチドおよびヌクレオシドは、ＤＮＡに存在するもの（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ）などの標準的なデオキシリボヌクレオシドを含む。

【0116】

化学修飾
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、一部の実施形態では、コロナウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡを含み、核酸は、当該技術分野で公知の標準（非修飾）または修飾され得るヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のヌクレオチドおよびヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。かかる修飾されたヌクレオチドおよびヌクレオシドは、天然に存在する修飾されたヌクレオチドおよびヌクレオシド、または非天然に存在する修飾されたヌクレオチドおよびヌクレオシドであり得る。かかる修飾は、当該技術分野で認識されるヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドの糖、骨格、または核酸塩基部分における修飾を含み得る。
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の核酸は、標準的なヌクレオチドおよびヌクレオシド、天然に生じるヌクレオチドおよびヌクレオシド、非天然に生じるヌクレオチドおよびヌクレオシド、または任意のその組み合わせを含み得る。
ポリヌクレオチドの核酸（例えば、ＤＮＡ核酸およびｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、一部の実施形態では、様々な（二つより多くの）異なるタイプの標準的および／または修飾されたヌクレオチドならびにヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、核酸の特定の領域は、一つ、二つ、またはそれ以上の（任意選択的に、異なる）タイプの標準的なヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチドならびにヌクレオシドを含有する。
一部の実施形態では、細胞または生物に導入された修飾されたＲＮＡ核酸（例えば、修飾されたｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチドおよびヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ、細胞または生物における低減した分解を示す。
一部の実施形態では、細胞または生物に導入された修飾されたＲＮＡ核酸（例えば、修飾されたｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチドおよびヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ、細胞または生物における低減した免疫原性（例えば、低減した自然免疫応答）を示し得る。
核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、一部の実施形態では、所望の機能または特性を達成するために核酸の合成中または合成後に導入される非天然の修飾されたヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖上に存在してもよい。修飾は、鎖の末端もしくは鎖内の任意の他の場所に、化学合成を用いてまたはポリメラーゼ酵素を用いて導入されてもよい。核酸の領域のいずれかは、化学的に修飾されてもよい。

【0117】

本開示は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）の修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供する。ヌクレオシドは、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせた糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾されたヌクレオチドは、例えば、化学的、酵素的、または組み換え的に、一つまたは複数の修飾または非天然のヌクレオシドを含むように、任意の有用な方法によって合成され得る。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域または複数の領域を含み得る。こうした領域は、可変骨格結合を有してもよい。結合は、標準的なホスホジエステル結合であってもよく、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むことになる。
修飾されたヌクレオチド塩基対形成は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準的または修飾された塩基を含むヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチドの間に形成される塩基対も含有し、水素結合ドナーおよび水素結合アクセプターの配置が、例えば、少なくとも一つの化学修飾を有する核酸において、非標準塩基と標準塩基との間、または二つの相補的な非標準塩基構造との間の水素結合を可能にする。こうした非標準的な塩基対形成の一例は、修飾されたヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対形成である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせは、本開示の核酸に組み込まれてもよい。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、核酸の一つまたは複数またはすべてのウリジン位置にウリジンを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、特定の修飾のために均一に修飾される（例えば、完全に修飾され、配列全体にわたって修飾される）。例えば、核酸は、１－メチル－プソイドウリジンで均一に修飾することができ、これは、ｍＲＮＡ配列中の全てのウリジン残基が、１－メチル－プソイドウリジンで置換されていることを意味する。同様に、核酸は、上記の修飾された残基などの修飾された残基での置換によって、配列に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基に対して均一に修飾され得る。

【0118】

ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の核酸は、分子の全長に沿って部分的または完全に修飾され得る。例えば、一つまたは複数もしくはすべてまたは所与のタイプのヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃの任意の一つまたは複数、またはすべて）は、本開示の核酸、またはその所定の配列領域（例えば、ポリ（Ａ）テールを含むか、またはポリ（Ａ）テールを除外しているｍＲＮＡ中）で均一に修飾され得る。一部の実施形態では、本開示の核酸（またはその配列領域）中のすべてのヌクレオチドＸは、修飾されたヌクレオチドであり、式中、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか一つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣもしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか一つであってもよい。
核酸は、約１％～約１００％の修飾されたヌクレオチド（全体的なヌクレオチド含有量に関して、または一つまたは複数のタイプのヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、ＵもしくはＣのうちの任意の一つまたは複数に関して）あるいは任意の介在する割合（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、および９５％～１００％）で含有し得る。当然のことながら、任意の残りの割合は、非修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって説明される。
ｍＲＮＡは、最小１％および最大１００％の修飾されたヌクレオチド、または任意の介在する割合、例えば、少なくとも５％の修飾されたヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾されたヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾されたヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾されたヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾されたヌクレオチド、または少なくとも９０％の修飾されたヌクレオチドを含有してもよい。例えば、核酸は、修飾されたウラシルまたはシトシンなどの修飾されたピリミジンを含有してもよい。一部の実施形態では、核酸中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％は、修飾されたウラシル（例えば、５－置換ウラシル）で置換される。修飾されたウラシルは、単一の固有の構造を有する化合物によって置き換えられてもよく、または異なる構造（例えば、２、３、４、もしくはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられてもよい。一部の実施形態では、核酸中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％は、修飾されたシトシン（例えば、５－置換シトシン）で置換される。修飾されたシトシンは、単一の固有の構造を有する化合物によって置き換えられてもよく、または異なる構造（例えば、２、３、４、もしくはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられてもよい。

【0119】

非翻訳領域（ＵＴＲ）
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、非翻訳領域として作用または機能する一つまたは複数の領域または部分を含み得る。ｍＲＮＡが、少なくとも一つの対象の抗原をコードするように設計される場合、核酸は、これらの非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの一つまたは複数を含み得る。核酸の野生型非翻訳領域は、転写されるが、翻訳されない。ｍＲＮＡでは、５’ＵＴＲは、転写開始部位で始まり、開始コドンに続くが、開始コドンは含まず、一方で、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性および翻訳に関して、ＵＴＲが果たす調節的役割に関する証拠が増えつつある。ＵＴＲの調節特性は、とりわけ、分子の安定性を強化するために、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。特定の特性は、望ましくない器官部位に誤って向けられる場合、転写物の制御された下方制御を確実にするために組み込まれ得る。様々な５’ＵＴＲ配列および３’ＵＴＲ配列が、当該技術分野で公知であり、利用可能である。
５’ＵＴＲは、開始コドン（リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写物の第一のコドン）からすぐ上流（５’）にあるｍＲＮＡの領域である。５’ＵＴＲは、タンパク質をコードしない（非コードである）。天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特性を有する。それらは、リボソームが、多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般的に知られているコザック配列のような特性を有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、式中、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の上流の三つの塩基のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、その後に別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。

【0120】

一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、異種ＵＴＲであり、すなわち、異なるＯＲＦに関連する自然界で見られるＵＴＲである。別の実施形態では、５’ＵＴＲは、合成ＵＴＲであり、すなわち、自然界では生じない。合成ＵＴＲは、その特性を改善するために変異されたＵＴＲを含み、例えば、遺伝子発現を増加させるだけでなく、完全に合成であるＵＴＲも含む。例示的な５’ＵＴＲとしては、アフリカツメガエルもしくはヒト由来のａ－グロビンまたはｂ－グロビン（８２７８０６３、９０１２２１９）、ヒトチトクロームｂ－２４５ポリペプチド、およびヒドロキシステロイド（１７ｂ）脱水素酵素、ならびにタバコエッチウイルス（米国特許第８２７８０６３号、第９０１２２１９号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられる。ＣＭＶ即時早期１（ＩＥ１）遺伝子（ＵＳ２０１４／０２０６７５３、国際公開第２０１３／１８５０６９号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（国際公開第２０１４／１４４１９６号）も使用され得る。別の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジン管）を欠くＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ（例えば、国際公開第２０１５／１０１４１４、国際公開第２０１５／１０１４１５号、国際公開第２０１５／０６２７３８号、国際公開第２０１５／０２４６６７号、国際公開第２０１５／０２４６６７号）であり、リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメント（国際公開第２０１５／１０１４１４号、国際公開第２０１５／１０１４１５号、国際公開第２０１５／０６２７３８号）、ヒドロキシステロイド（１７－ｂ）脱水素酵素４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（国際公開第２０１５／０２４６６７号）、またはＡＴＰ５Ａ１の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（国際公開第２０１５／０２４６６７号）が使用され得る。一部の実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が、５’ＵＴＲの代わりに使用される。

【0121】

３’ＵＴＲは、終止コドン（翻訳の終結をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写物のコドン）からすぐ下流（３’）にあるｍＲＮＡの領域である。３’ＵＴＲは、タンパク質をコードしない（非コードである）。天然型または野生型の３’ＵＴＲは、それらに包埋されたアデノシンおよびウリジンの伸長を有することが知られている。これらのＡＵリッチな特性は、高い回転率を有する遺伝子において特に一般的である。それらの配列特性および機能的特性に基づいて、ＡＵリッチなエレメント（ＡＲＥ）は、三つのクラスに分けられ得（Ｃｈｅｎｅｔａｌ，１９９５）、ＣｌａｓｓＩＡＲＥは、Ｕリッチな領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散されたコピーを含有する。Ｃ－ＭｙｃおよびＭｙｏＤは、ＩクラスＡＲＥを含有する。クラスＩＩＡＲＥは、二つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。このタイプのＡＲＥを含有する分子は、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－αを含む。クラスＩＩＩＡＲＥＳは、十分に定義されていない。これらのＵリッチな領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ－Ｊｕｎおよびミオゲニンは、このクラスの二つのよく研究された例である。
ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを不安定化させることが知られているが、ＥＬＡＶファミリー、特に、ＨｕＲのメンバーは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが報告されている。ＨｕＲは、三つのクラスすべてのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲに操作すると、ＨｕＲ結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化がもたらされる。
３’ＵＴＲＡＵリッチなエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾を使用して、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の安定性を調節することができる。特定の核酸を操作するとき、ＡＲＥＤの一つまたは複数のコピーを導入して、本開示の核酸の安定性を低下させ、それによって翻訳を減少させ、結果として生じるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥＤは、細胞内安定性を増加させ、したがって、結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させるために、特定および除去または変異され得る。トランスフェクション実験は、本開示の核酸を使用して関連する細胞株で行うことができ、タンパク質産生は、トランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞は、異なるＡＲＥを操作している分子を用いて、ＥＬＩＳＡキットを使用することによって、関連するタンパク質にトランスフェクトされ、トランスフェクションの６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７日後に産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
３’ＵＴＲは、異種または合成であってもよい。３’ＵＴＲに関して、アフリカツメガエルｂ－グロビンＵＴＲおよびヒトｂ－グロビンＵＴＲを含むグロビンＵＴＲは、当該技術分野で公知である（８２７８０６３、９０１２２１９、ＵＳ２０１１／００８６９０７）。二つの連続するヒトｂ－グロビン３’ＵＴＲを尾部にクローニングすることによって、一部の細胞タイプにおいて安定性が強化された修飾されたｂ－グロビン構築物が開発されており、当該技術分野で周知である（ＵＳ２０１２／０１９５９３６、国際公開第２０１４／０７１９６３号）。さらに、ａ２－グロビン、アル－グロビン、ＵＴＲおよびその変異体も当該技術分野で公知である（国際公開第２０１５／１０１４１５号、国際公開第２０１５／０２４６６７号）。非特許文献のｍＲＮＡ構築物に記載される他の３’ＵＴＲとしては、ＣＹＢＡ（Ｆｅｒｉｚｉｅｔａｌ．，２０１５）およびアルブミン（Ｔｈｅｓｓｅｔａｌ．，２０１５）が挙げられる。他の例示的な３’ＵＴＲとしては、ウシまたはヒト成長ホルモン（野生型もしくは修飾型）（国際公開第２０１３／１８５０６９号、ＵＳ２０１４／０２０６７５３、国際公開第２０１４１５２７７４号）、ウサギｂグロビンおよびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ａ－グロビン３’ＵＴＲ、ならびにウイルスＶＥＥＶ３’ＵＴＲ配列も当該技術分野で公知である。一部の実施形態では、配列ＵＵＵＧＡＡＵＵ（国際公開第２０１４／１４４１９６号）が使用される。一部の実施形態では、ヒトおよびマウスリボソームタンパク質の３’ＵＴＲが使用される。他の例としては、ｒｐｓ９３’ＵＴＲ（国際公開第２０１５／１０１４１４号）、ＦＩＧ４（国際公開第２０１５／１０１４１５号）、およびヒトアルブミン７（国際公開第２０１５／１０１４１５号）が挙げられる。

【0122】

当業者であれば、異種または合成である５’ＵＴＲが、任意の所望される３’ＵＴＲ配列とともに使用され得ることを理解するであろう。例えば、異種５’ＵＴＲは、異種３’ＵＴＲを有する合成３’ＵＴＲとともに使用され得る。
非ＵＴＲ配列は、核酸内の領域または小領域として使用されてもよい。例えば、イントロンまたはイントロン配列の部分は、本開示の核酸の領域に組み込まれてもよい。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生ならびに核酸レベルを増加させ得る。

【0123】

特性の組み合わせは、隣接領域に含まれてもよく、他の特性内に含有されてもよい。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５’ＵＴＲおよび／またはポリＡテールの鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含有し得る３’ＵＴＲに隣接し得る。５’ＵＴＲは、米国特許出願公開第２０１０／０２９３６２５号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９１５５号に記載される５’ＵＴＲなどの同じおよび／または異なる遺伝子からの第一のポリヌクレオチド断片および第二のポリヌクレオチド断片を含んでもよく、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。当然のことながら、任意の遺伝子由来の任意のＵＴＲは、核酸の領域に組み込まれてもよい。さらに、任意の公知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用してもよい。また、野生型領域のバリアントではない人工ＵＴＲを提供することも、本開示の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその部分は、それらが選択された転写物と同じ配向に配置されてもよく、または配向もしくは位置を変更されてもよい。したがって、５’または３’ＵＴＲは、反転、短縮、延長され得、一つまたは複数の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで作製され得る。本明細書で使用される場合、ＵＴＲ配列に関する「変更された」という用語は、ＵＴＲが、参照配列に関して何らかの方法で変化されていることを意味する。例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲは、上記で教示されたように配向または位置の変化によって、野生型またはネイティブＵＴＲに対して変化し得るか、またはさらなるヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換または転位によって変化し得る。「修飾した」ＵＴＲ（３’または５’のいずれにしても）を生成するこれらの変更のいずれかは、バリアントＵＴＲを含む。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの二重、三重または四重ＵＴＲが使用され得る。本明細書で使用される場合、「二重」ＵＴＲは、同じＵＴＲの二つのコピーが、直列または実質的に直列のいずれかでコードされるものである。例えば、二重ベータ－グロビン３’ＵＴＲは、米国特許公開第２０１０／０１２９８７７号に記載されるように使用されてもよく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0124】

また、パターン化されたＵＴＲを有することも、本開示の範囲内である。本明細書で使用される場合、「パターン形成されたＵＴＲ」は、１回、２回、または３回超繰り返されたＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはそのバリアントなどの、繰り返しまたは交互のパターンを反映するＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。
一部の実施形態では、隣接領域は、タンパク質が、共通の機能、構造、特性または特徴を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、対象のポリペプチドは、特定の細胞、組織または発生中のある時点で発現されるタンパク質のファミリーに属し得る。これらの遺伝子のいずれかからのＵＴＲは、同じまたは異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換されて、新しいポリヌクレオチドを生成し得る。本明細書で使用される場合、「タンパク質のファミリー」は、最も広い意味で使用され、少なくとも一つの機能、構造、特性、局在化、起源、または発現パターンを共有する対象の二つ以上のポリペプチドの群を指す。

【0125】

非翻訳領域はまた、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）を含んでもよい。非限定的な例として、ＴＥＥは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００９／０２２６４７０号に記載されるもの、および当該技術分野で既知のものを含み得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチドをコードするＲＮＡｃＤＮＡのインビトロ転写は、インビトロ転写（ＩＶＴ）システムを使用して転写され得る。ＲＮＡのインビトロ転写は、当該技術分野で公知であり、国際公開第２０１４／１５２０２７号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡは、国際公開第２０１８／０５３２０９号および国際公開第２０１９／０３６６８２号に記載される方法のうちの任意の一つまたは複数に従って調製され、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＲＮＡ転写物は、インビトロ転写反応において非増幅直線化ＤＮＡ鋳型を使用して生成され、ＲＮＡ転写物を生成する。一部の実施形態では、鋳型ＤＮＡは、単離ＤＮＡである。一部の実施形態では、鋳型ＤＮＡは、ｃＤＮＡである。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、非限定的な、コロナウイルスｍＲＮＡの逆転写によって形成される。一部の実施形態では、細胞、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌、例えば、ＤＨ－１細胞は、プラスミドＤＮＡ鋳型でトランスフェクトされる。一部の実施形態では、トランスフェクトされた細胞を培養して、プラスミドＤＮＡを複製し、次いで単離され、精製される。一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、対象の遺伝子の５’側に位置し、作動可能に連結されたＴ７プロモーターを含む。
一部の実施形態では、インビトロ転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含有し、３’ＵＴＲおよびポリ（Ａ）テールをコードする。インビトロ転写鋳型の特定の核酸配列組成物および長さは、鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存する。

【0126】

「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写物の第一のコドン）から直接上流（すなわち、５’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。ＲＮＡ転写物が生成されるとき、５’ＵＴＲは、プロモーター配列を含み得る。かかるプロモーター配列は、当該技術分野で公知である。そのようなプロモーター配列は、本開示のワクチンには存在しないことは、理解されるべきである。
「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしない終始コドン（すなわち、翻訳の終始をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写物のコドン）から直接下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））から始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続的伸長であり、ポリペプチドをコードする。

【0127】

「ポリ（Ａ）テール」は、複数の連続的なアデノシン一リン酸を含有する３’ＵＴＲから下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域である。ポリ（Ａ）テールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。例えば、ポリ（Ａ）テールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０または３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含む。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、インビボ）では、ポリ（Ａ）テールは、例えば、細胞質内の酵素分解からｍＲＮＡを保護するように機能し、転写終結を目的とし、および／または核および翻訳からのｍＲＮＡの輸送を助ける。
一部の実施形態では、核酸は、２００～３，０００個のヌクレオチドを含む。例えば、核酸は、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００個のヌクレオチドを含み得る。

【0128】

インビトロ転写系は、典型的には、転写緩衝液、三リン酸ヌクレオチド（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、およびポリメラーゼを含む。
ＮＴＰは、社内で製造されてもよく、供給源から選択されてもよく、または本明細書に記載されるように合成されてもよい。ＮＴＰは、天然および非天然（修飾）ＮＴＰを含む本明細書に記載されるものから選択され得るが、これらに限定されない。
任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントが、本開示の方法で使用され得る。ポリメラーゼは、限定されないが、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、および／または変異ポリメラーゼ、例えば、非限定的に、化学修飾された核酸および／またはヌクレオチドを含む修飾された核酸および／または修飾されたヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼから選択され得る。一部の実施形態は、ＤＮａｓｅの使用を除外する。
一部の実施形態では、ＲＮＡ転写物は、酵素キャッピングを介してキャッピングされる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’末端キャップ、例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐを含む。

【0129】

化学合成
固相化学合成。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、固相技術を使用して全体的または部分的に製造され得る。核酸の固相化学合成は、分子が固体支持体上に固定化され、反応物溶液中で段階的に合成される自動方法である。固相合成は、核酸配列における化学修飾の部位特異的導入に有用である。
液相化学合成。モノマー構成ブロックの逐次的付加によるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の合成は、液相で行われてもよい。
合成方法の組み合わせ。上で考察された合成方法は各々、それ自体の利点および制限を有する。これらの方法を組み合わせて制限を克服する試みが行われている。こうした方法の組み合わせは、本開示の範囲内である。酵素ライゲーションと組み合わせた固相または液相化学合成の使用は、化学合成のみでは得られない長鎖核酸を生成する効率的な方法を提供する。

【0130】

核酸領域または小領域のライゲーション
リガーゼによる核酸の組み立ても、使用され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を介してポリヌクレオチド鎖の５’末端および３’末端の分子間ライゲーションを促進する。キメラポリヌクレオチドおよび／または環状核酸などの核酸は、一つまたは複数の領域または小領域のライゲーションによって調製されてもよい。ＤＮＡ断片は、リガーゼ触媒反応によって結合されて、異なる機能を有する組換えＤＮＡを生成することができる。二つのオリゴデオキシヌクレオチド、一つは５’ホスホリル基を有し、もう一つは遊離３’ヒドロキシル基を有し、ＤＮＡリガーゼの基質として機能する。

【0131】

精製
本明細書に記載される核酸の精製には、核酸のクリーンアップ、品質保証および品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、限定されるものではないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＧｅｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、ポリ－Ｔビーズ、ＬＮＡＴＭオリゴ－Ｔ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ、Ｖｅｄｂａｅｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、または強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などのＨＰＬＣベースの精製方法などの当該技術分野で公知の方法によって行われ得る。「精製された核酸」などの核酸に関連して使用されるとき、「精製された」という用語は、少なくとも一つの混入物から分離されるものを指す。「混入物」は、別のものを不適合、不純または劣ったものにする任意の物質である。したがって、精製された核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、天然で見出されるものとは異なる形態もしくは設定で、または処理もしくは精製方法に供される前に存在した形態もしくは設定とは異なる形態もしくは設定で存在する。
品質保証および／または品質管理チェックは、非限定的に、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析ＨＰＬＣなどの方法を使用して行われてもよい。
一部の実施形態では、核酸は、逆転写酵素－ＰＣＲを含むが、これに限定されない方法により配列決定されてもよい。

【0132】

定量化
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、エクソソーム内で、または一種または複数の体液からもたらされたとき、定量化され得る。体液は、抹消血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、ウシの体液または射精液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水および腹水、心膜液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便液、膵液、洞腔の洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液、および臍帯血を含む。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から採取され得る。
アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはその組み合わせを使用して行われてもよく、一方、エクソソームは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法などの免疫組織化学法を使用して単離されてもよい。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、差動遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収性捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはその組み合わせによって単離されてもよい。
これらの方法により、調査者は、残っている核酸または送達された核酸のレベルをリアルタイムで監視することができる。これは、本開示の核酸が、一部の実施形態では、構造的修飾または化学修飾により内因性形態とは異なるため、可能である。
一部の実施形態では、核酸は、非限定的に、紫外線可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を使用して定量されてもよい。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）である。定量化された核酸は、核酸が適切なサイズであり得るかどうかを決定し、核酸の分解が生じていないことを確認するために分析されてもよい。核酸の分解は、アガロースゲル電気泳動、非限定的に、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などのＨＰＬＣベースの精製方法などの方法によってチェックされ得る。

【0133】

多価ワクチン
ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、本明細書に提供されるように、同じ種もしくは異なる種の二つ以上の抗原をコードするＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、二つ以上のコロナウイルス抗原をコードするＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２種、またはそれ以上のコロナウイルス抗原をコードし得る。
一部の実施形態では、抗原をコードする二つ以上の異なるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、同じ脂質ナノ粒子に製剤化され得る。他の実施形態では、抗原をコードする二つ以上の異なるＲＮＡは、別個の脂質ナノ粒子（単一の脂質ナノ粒子で製剤化された各ＲＮＡ）において製剤化されてもよい。次いで、脂質ナノ粒子は、単一のワクチン組成物として合わされ、投与されてもよく（例えば、複数の抗原をコードする複数のＲＮＡを含む）、または別個に投与されてもよい。

【0134】

併用ワクチン
ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、本明細書に提供されるように、同じウイルス株もしくは異なるウイルス株の二つ以上の抗原をコードするＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含み得る。一つまたは複数のコロナウイルスおよび異なる生物の一つまたは複数の抗原をコードするＲＮＡを含む併用ワクチンも本明細書に提供される。したがって、本開示のワクチンは、同じ株／種のうちの一つまたは複数の抗原、または異なる株／種のうちの一つまたは複数の抗原、例えば、コロナウイルス感染のリスクが高い同じ地理的領域に見られる生物、またはコロナウイルスに曝露されたとき、個体が曝露される可能性が高い生物に対する免疫を誘導する抗原を標的とする併用ワクチンであってもよい。

【0135】

ワクチン投与
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与することができ、ＲＮＡポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されて、抗原性ポリペプチド（抗原）を産生する。組成物（例えば、ＲＮＡを含む）の「有効量」は、標的組織、標的細胞タイプ、投与手段、ＲＮＡの物理的特徴（例えば、修飾されたヌクレオシドの長さ、ヌクレオチド組成、および／または程度）、ワクチンの他の構成成分、ならびに対象の年齢、体重、身長、性別および全身健康状態などの他の決定因子に少なくとも部分的に基づく。典型的には、ＬＰＭＰ／核酸ワクチンの有効量は、対象の細胞における抗原産生の機能として誘導性またはブーストされた免疫応答をもたらす。一部の実施形態では、少なくとも一つの化学修飾を有するＲＮＡポリヌクレオチドを含有する組成物の有効量は、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも効率的である。抗原産生の増加は、細胞トランスフェクションの増加（ＲＮＡワクチンでトランスフェクトされた細胞の割合）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳および／もしくは発現の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾されたポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の期間の延長によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって示され得る。
「医薬組成物」という用語は、有効な剤と不活性または活性な担体との組み合わせを指し、組成物をインビボまたはエクスビボでの診断または治療用途に特に好適になる。対象に投与された後または対象に投与された際の「薬学的に許容し得る担体」は、望ましくない生理学的効果を引き起こさない。医薬組成物中の担体は、有効成分と適合性があり、それを安定化することができるという意味でも、「許容される」必要がある。一つまたは複数の可溶化剤は、有効な薬剤の送達のための医薬担体として利用され得る。薬学的に許容し得る担体の例としては、投薬形態として使用可能な組成物を達成するために、生体適合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、およびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。追加の適当な医薬担体および希釈剤、ならびにそれらの使用のための医薬的必要性は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、コロナウイルス感染の処置または予防に使用され得る。ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、健康な個体に、またはインキュベーション期間中もしくは症状の発症後の能動感染中の感染の初期に、能動免疫スキームの一部として予防的または治療的に投与されてもよい。一部の実施形態では、細胞、組織、または対象に提供されるＲＮＡの量は、免疫予防に有効な量であり得る。
ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、他の予防化合物または治療化合物と共に投与されてもよい。非限定的な例として、予防化合物または治療化合物は、アジュバントまたはブースターであってもよい。本明細書で使用される場合、ワクチンなどの予防的組成物を指すとき、「ブースター」という用語は、予防的（ワクチン）組成物の余分な投与を指す。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防組成物の早期投与後に投与されてもよい。予防組成物の初回投与とブースターとの間の投与時間は、非限定的に、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、３６時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、１０日間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１年間、１８ヶ月間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間、１１年間、１２年間、１３年間、１４年間、１５年間、１６年間、１７年間、１８年間、１９年間、２０年間、２５年間、３０年間、３５年間、４０年間、４５年間、５０年間、５５年間、６０年間、６５年間、７０年間、７５年間、８０年間、８５年間、９０年間、９５年間または９９年間超であってもよい。例示的な実施形態では、予防組成物の初回投与とブースターとの間の投与時間は、非限定的に、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、または１年間であってもよい。

【0136】

一部の実施形態では、ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、当該技術分野で公知の不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、鼻腔内または皮内投与されてもよい。
ＬＰＭＰ／核酸ワクチンは、感染の有病率または満たされていない医学的必要性の程度もしくはレベルに応じて、様々な状況で利用されてもよい。非限定的な例として、ＲＮＡワクチンを利用して、様々な感染性疾患を処置および／または予防してもよい。ＲＮＡワクチンは、はるかに大きな抗体価を生じ、免疫をより良好に中和し、より持続的な免疫応答を生じ、および／または市販のワクチンよりも早く応答を生じるという点で、優れた特性を有する。

【0137】

キット
本発明はまた、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物を有する容器を含むキットを提供する。キットは、本発明の方法に従って、ＰＭＰ組成物を植物に適用または送達するための指示材料をさらに含んでもよい。当業者であれば、本発明の方法においてＰＭＰ組成物を適用するための指示書は、任意の形態の指示書であり得ることを理解するであろう。こうした指示書には、書面による指示材料（ラベル、小冊子、パンフレットなど）、口頭の指示材料（音声カセットもしくはＣＤなど）、またはビデオ指示書（ビデオテープもしくはＤＶＤなど）が含まれるが、これらに限定されない。

【実施例】

【0138】

ここで一般的に説明する本発明について、本発明のある特定の態様および実施形態の例示のみを目的として含まれ、本発明を限定することを意図するものではない、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。

【0139】

実施例１：ＬＰＭＰの調製および修飾、ならびにｍＲＮＡを用いたＬＰＭＰの製剤化
植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）の調製、脂質再構成植物メッセンジャーパック（ＬＰＭＰ）を調製するためのＰＭＰの修飾、およびｍＲＮＡを用いたＰＭＰおよびＬＰＭＰの製剤化は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第２０２１／０４１３０１号に開示される方法を利用して達成されてもよい。
特に、実施例１．植物からの植物メッセンジャーパックの単離、実施例２．精製された植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）の生成、実施例３．植物メッセンジャーパックの特徴決定、実施例４．植物メッセンジャーパック安定性の特徴決定、実施例５．ＰＭＰのカーゴでの充填、実施例６．イオン性液体を用いたＰＭＰの製剤化によるＰＭＰ細胞取り込みの増加、実施例７．イオン化可能な脂質を使用したＰＭＰの修飾、実施例８．マイクロ流体を用いたＬＰＭＰの製剤化、実施例９．イオン化可能な脂質を使用した脂質－再構成ＰＭＰへのｍＲＮＡの装填および送達、実施例１０．イオン化可能な脂質修飾ありおよびなしの、天然および再構成ＰＭＰの細胞取り込み、実施例１１．カチオン性脂質を用いたＰＭＰの製剤化によるＰＭＰ細胞取り込みの増加、実施例１２．カチオン性脂質を使用したＰＭＰの修飾、実施例１３．カチオン性脂質を使用した脂質－再構成ＰＭＰへのｍＲＮＡ装填および送達、実施例１４．カチオン性脂質修飾ありおよびなしの、天然および再構成ＰＭＰの細胞取り込み、実施例１５．カチオン性脂質ＧＬ６７およびエチルＰＣを使用した充填の改善、実施例１６．ｍＲＮＡ充填のための脂質比の最適化、および実施例１７．プラスミド充填のための脂質比の最適化を含む、国際特許出願公開第２０２１／０４１３０１号の実施例１～１７に開示されるすべての実験プロトコルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0140】

実施例２：ワクチンの調製
ポリヌクレオチドの製造および特徴決定
ポリヌクレオチドおよび／またはその一部もしくは領域の製造は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第２０１４／１５２０２７号に教示される方法を利用して達成されてもよい。精製方法には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第２０１４／１５２０３０号および国際特許出願公開第２０１４／１５２０３１号において教示されるものが挙げられ得る。ポリヌクレオチドの検出および特徴決定方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第２０１４／１４４０３９号に教示されるように行われてもよい。ポリヌクレオチドの特徴決定は、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素配列決定、電荷分布分析、ＲＮＡ不純物の検出、または前述の二つ以上の任意の組み合わせを使用して達成され得る。「特徴決定すること」は、例えば、ＲＮＡ転写物配列を決定すること、ＲＮＡ転写物の純度を決定すること、またはＲＮＡ転写物の電荷不均一性を決定することを含む。このような方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第２０１４／１４４７１１号および国際特許出願公開第２０１４／１４４７６７号に教示される。
ｍＲＮＡ設計および修飾のさらなる詳細は、国際公開第２０２１／１５４７６３号および国際公開第２０２１／１８８９６９号に見られ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0141】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス生成
ＥｕｒｏｐｅａｎＶｉｒｕｓＡｒｃｈｉｖｅｇｌｏｂａｌ（ＥＶＡｇ）（ＧＩＳＡＩＤＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１７８７９、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｐｅａｎ－ｖｉｒｕｓ－ａｒｃｈｉｖｅ．ｃｏｍ／ｖｉｒｕｓ／ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２－ｓｔｒａｉｎ－ｓｌｏｖａｋｉａｓｋ－ｂｍｃ５２０２０）によって元々提供され、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞において生成し、力価決定したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株「Ｓｌｏｖａｋｉａ／ＳＫ－ＢＭＣ５／２０２０」を、ハムスター感染に使用した。系統は、ＧＨクレードに属していた。
ウイルス生成を、５０×１０６個のＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を播種したＴ１７５フラスコ中、および４０ｍＬの最終体積で行った。細胞数および生存率を、ＶｉＣｅｌｌ装置による０．２５％トリパンブルー排除アッセイによって評価した。４８時間の感染時間枠（０．００１～０．００５ＭＯＩのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを用いる）後、顕微鏡観察下で細胞変性作用を確認した。培養上清を回収し、遠心分離し（５０００ｇで５分）、分注した（１ｍＬアリコート）。
ウイルスストックＴＣＩＤ５０力価を、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞上で決定した。試験の約二時間前に、細胞を、９６ウェルプレートに、１ウェル当たり２×１０４細胞の密度で、２００μＬの体積の完全増殖培地（ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ）中に播種した。細胞を、３７℃で１時間、ウイルスストックの連続希釈（８回の反復、第１の希釈１：１００、５倍の連続希釈）で感染させた。新鮮な培地を７２時間加え、次いで、提供者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ社、参照番号Ｇ５４３０）に従ってＭＴＳ／ＰＭＳアッセイを行った。プレートを、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取り、データを記録した。感染性を、スピアマン・カーバー式に基づいてＴＣＩＤ５０／ｍＬ／７２時間として表した。

【0142】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）ｍＲＮＡ配列
この研究を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原などのコロナウイルス抗原（例えば、スパイク（Ｓ）タンパク質）をコードする表１のｍＲＮＡを含む候補コロナウイルスワクチンのハムスターおよび／またはマウスにおける免疫原性を試験するように設計した。

【表2】

【0143】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳｍＲＮＡを含むＬＰＭＰの製剤化
一般プロトコルおよび実験設計
植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）の調製、および脂質再構成植物メッセンジャーパック（ＬＰＭＰ）を調製するためのＰＭＰの修飾、ならびにｍＲＮＡを含むＰＭＰおよびＬＰＭＰの製剤化のプロトコルおよび詳細な実験手法は、国際特許出願公開第ＷＯ２０２１／０４１３０１号の実施例１～１７に開示されるすべての実験プロトコルを列挙する実施例１で考察されており、それらすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらのプロトコルおよび詳細な実験手法に従って、本実施例のｍＲＮＡで製剤化したＰＭＰ、ＬＰＭＰ、およびＰＭＰまたはＬＰＭＰを調製した。
簡潔に述べると、レモンおよび藻類からの粗植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）の単離および精製、ならびにこれらのＰＭＰの特徴決定は、以下に記載された植物源の試験デザインとプロトコルに従った。実施例１．植物からの植物メッセンジャーパックの単離、実施例２．精製された植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）の生成、実施例３．植物メッセンジャーパックの特徴決定、および実施例４．植物メッセンジャーパックの安定性の特徴決定、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開ＷＯ２０２１／０４１３０１のすべて。
コレステロールおよびＰＥＧ脂質を用いた天然ＰＭＰまたは再構成レモンもしくは藻類ＬＰＭＰの修飾は、以下に記載される植物源の試験デザインおよびプロトコルに従った。実施例６．イオン性液体を用いたＰＭＰの製剤化によるＰＭＰ細胞取り込みの増加、実施例７．イオン化可能な脂質を使用したＰＭＰの修飾、実施例１０．イオン化可能な脂質修飾ありおよびなしの、天然および再構成ＰＭＰの細胞取り込み、実施例１１．カチオン性脂質を用いたＰＭＰの製剤化によるＰＭＰ細胞取り込みの増加、実施例１２．カチオン性脂質を使用したＰＭＰの修飾、および実施例１４．カチオン性脂質修飾ありおよびなしの、天然および再構成ＰＭＰの細胞取り込み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開ＷＯ２０２１／０４１３０１のすべて。
ＰＭＰおよびｍＲＮＡを含むレモン－脂質－または藻類－脂質－再構成ＬＰＭＰの製剤化は、以下に記載した核酸充填の試験デザインおよびプロトコルに従った。実施例５．ＰＭＰのカーゴでの充填、実施例８．マイクロ流体を用いたＬＰＭＰの製剤化、実施例９．イオン化可能な脂質を使用した脂質－再構成ＰＭＰへのｍＲＮＡの充填および送達、実施例１３．カチオン性脂質を用いた脂質－再構成ＰＭＰへのｍＲＮＡ充填および送達、実施例１５．カチオン性脂質ＧＬ６７およびエチルＰＣを使用した充填の改善、実施例１６．ｍＲＮＡ充填のための脂質比の最適化、および実施例１７．プラスミド充填のための脂質比の最適化、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ２０２１／０４１３０１のすべて。

【0144】

ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡワクチンの製剤
本実施例は、ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡワクチン製剤用のｍＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）ｍＲＮＡ配列）を封入するための、イオン化可能な脂質、ステロール、およびＰＥＧ脂質を用いて製剤化したレモン脂質および藻類脂質再構成ＬＰＭＰの製剤を記載する。例えば、以下の表２に示す通り、レモン脂質再構成ＬＰＭＰを含むＬＰＭＰ／ｍＲＮＡワクチンを、典型的にはＡと称し、藻類脂質再構成ＬＰＭＰを含むＬＰＭＰ／ｍＲＮＡワクチンを、典型的にはＢと称す。
本実施例では、レモンおよび藻類ＰＭＰ脂質をＰＭＰ天然脂質として使用し、Ｃ１２－２００［１，１‘－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）］をイオン化可能な脂質として使用し、コレステロール（１４：０）をステロールとして使用し、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋをモデルＰＥＧ化脂質として使用し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）ｍＲＮＡ配列（本明細書に記載する）を充填したｍＲＮＡとして使用した。

【0145】

ＬＮＰ製剤。ＬＮＰ（脂質ナノ粒子）製剤を対照として調製して、イオン化可能な脂質：構造脂質：ステロール：ＰＥＧ脂質（Ｃ１２－２００：ＤＯＰＥ：コレステロール（１４：０）：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋ）を、それぞれ、３５：１６：４６．５：２．５のモル比で得た。この製剤を調製するために、上記の脂質をエタノール中に可溶化し、上記のモル比で混合し、エタノール（有機相）中で希釈して、５．５ｍＭの総脂質濃度を得た。ｍＲＮＡ溶液（水相）を、ＲＮＡｓｅを含まない水および１００ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ３で調製し、最終濃度５０ｍＭのクエン酸緩衝液を得た。製剤は、イオン化可能な脂質とｍＲＮＡの比率をイオン化可能な脂質窒素：ｍＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）で１５：１に維持した。
ＬＰＭＰ製剤。再構成したレモン（ｒｅｃＬｅｍｏｎ）ＬＰＭＰ製剤を調製して、イオン化可能な脂質：天然脂質：ステロール：ＰＥＧ脂質（Ｃ１２－２００：レモン脂質：コレステロール（１４：０）：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋ）を、それぞれ、３５：５０：１２．５：２．５のモル比で得た。この製剤を調製するために、上記の脂質を、４：１のＤＭＦ：メタノール中で可溶化したレモン脂質を除いてエタノール中で可溶化した。次いで、脂質を上記のモル比で混合し、希釈して、５．５ｍＭの総脂質濃度を得た。ｍＲＮＡ溶液（水相）を、ＲＮＡｓｅを含まない水および１００ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ３で調製し、最終濃度５０ｍＭのクエン酸緩衝液を得た。
再構成した藻類（ｒｅｃＡｌｇａｅ）ＬＰＭＰ製剤を調製して、イオン化可能な脂質：天然脂質：ステロール：ＰＥＧ脂質（Ｃ１２－２００：藻類脂質：コレステロール（１４：０）：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２ｋ）を、それぞれ、３５：２０：４２．５：２．５のモル比で得た。この製剤を調製するために、上記の脂質を、４：１のＤＭＦ：メタノール中で可溶化した藻類脂質を除いてエタノール中で可溶化した。次いで、脂質を上記のモル比で混合し、希釈して、５．５ｍＭの総脂質濃度を得た。ｍＲＮＡ溶液（水相）を、ＲＮＡｓｅを含まない水および１００ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ３で調製し、最終濃度５０ｍＭのクエン酸緩衝液を得た。
脂質混合物およびｍＲＮＡ溶液を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒＩｇｎｉｔｅ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＮａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で、それぞれ、体積比１：３で、総流量９ｍＬ／分で混合した。次いで、得られた製剤を、スライドＡ－ＬｙｚｅｒＧ２透析カセット（１０ｋＭＷＣＯ）に充填し、穏やかに撹拌しながら室温で４時間、２００倍の試料体積の１×ＰＢＳ中で透析した。ＰＢＳ溶液をリフレッシュし、製剤を穏やかに撹拌しながら４℃で少なくとも１４時間さらに透析した。次いで、透析した製剤を回収し、３０００×ｇでの遠心分離（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心分離フィルター、１００ｋＭＷＣＯ）によって濃縮した。
濃縮した粒子は、ＺｅｔａｓｉｚｅｒＵｌｔｒａ（ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）を使用して、サイズ、多分散性、および粒子濃度について特徴付けた。結果を図１Ａに示す。ｍＲＮＡ封入効率を、Ｑｕａｎｔ－ｉＴＲｉｂｏＧｒｅｅｎＲＮＡＡｓｓａｙＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって特徴付けた。結果を図１Ｂに示す。粒子を所望のｍＲＮＡ濃度に希釈して、ＰＢＳ中の最終１０％スクロース溶液を得た。次いで、製剤を液体窒素中で急速凍結した。

【0146】

得られたｍＲＮＡを含む製剤を、表２に示す。

【表3】

【0147】

実施例３：ワクチン接種およびコロナウイルス負荷設計
ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン製剤を、実施例２に従って得た。
例示的な試験試料は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む再構成レモン（ｒｅｃＬｅｍｏｎ）ＬＰＭＰ製剤（ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ）、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む再構成藻類（ｒｅｃＡｌｇａｅ）ＬＰＭＰ製剤（ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ）であった。

【0148】

ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの単回筋肉内ワクチン接種およびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを投与したハムスターのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２負荷の設計を、スキーム１に示す。

【化71】

スキーム１

【0149】

処置スケジュール
スキーム１に示すように、６～８週齢の健康なゴールデンシリアンハムスター（メス）を得た。動物を秤量し、次いで以下の表３に示すように、群に均一に割り当てた。
試験試料（対照ベクターおよびワクチンベクター）を凍結溶液として提供し、－２０℃で保存した。投与前、－４℃一晩解凍した後、接種を行った。試験試料（対照ベクターおよびワクチンベクター）を、表３の処置スケジュールに従って、一方の上大腿部に筋肉内（ＩＭ）経路を使用して注射した。

【表4】

＊ｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ＋ｍＲＮＡ－ＥＰＯ：対照ベクター（非ワクチン接種）
＊＊ｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ＋ｍＲＮＡ－Ｓ：ワクチンベクター（ｒｅｃＬｅｍｏｎＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン）
＊＊ｒｅｃＡｌｇａｅＬＰＭＰ＋ｍＲＮＡ－Ｓ：ワクチンベクター（ｒｅｃＡｌｇａｅＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン）
＊＊＊＊３０％の試験生成物過剰分（平均ハムスター重量１２０ｇ）を含む。

【0150】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷前の血液試料採取
４つの時点（０日目ｔ＋６時間／１日目／１０日目／２１日目）で、イソフルレン麻酔した動物の頸静脈での穿刺を介して血液を採取した。約３００μＬの血液を、血餅活性化因子とともに収集チューブに移し、３０分間凝血させた。次いで、チューブを遠心分離（２０００ｇ、１０分、室温）して、約１５０μＬの血清を得た。
０日目（ｔ＋６時間）、１０日目および２１日目に、３５日目で安楽死させるべき動物のある特定の群に対して血液試料採取手法を行った（７ｄｐｉ；ｎ＝４２）。表３を参照されたい。
１日目に、３２日目で安楽死させるべき動物のある特定の群に対して血液試料採取手法を行った（４ｄｐｉ；ｎ＝２１）。表３を参照されたい。
マルチプレックスＥＬＩＳＡおよび中和アッセイによる早期サイトカインおよびＥＰＯ発現（０日目／ｔ＋６／１日目）または抗体応答の評価のためにさらに使用するまで、血清試料をプロピレンチューブに－８０℃で保存した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷（２８日目）
すべての動物に、２８日目に、イソフルレン麻酔した動物に７０μＬ（鼻孔当たり３５μＬ）の総体積で鼻腔内経路（ＩＮ）によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を投与した。動物一匹当たり１０５ｐｆｕＴＣＩＤ５０の鼻腔内用量を投与した。
３２日目での動物の終末（４ｄｐｉ）
表３に示すように、ある特定の群の動物（ｎ＝２１）は、３２日目（すなわち、感染の４日後、ｄｐｉ）に終末安楽死を受けた。
鼻組織および肺組織（右上肺葉）を、４℃で一晩ＲＮＡ中に組織を入れることによって回収し、次いで、ｑＲＴ－ＰＣＲによるウイルス負荷およびサイトカイン応答プロファイリングの定量化のためのＲＮＡ抽出まで、－８０℃で保存した。中肺葉、大動脈後肺葉、右下肺葉を液体窒素で急速凍結し（一つのチューブ当たり一つの肺葉）、次いでウイルス感染粒子（ＴＣＩＤ５０）の定量まで－８０℃で保存した。
３５日目での動物の終末（７ｄｐｉ）
残りの動物（ｎ＝４２）は、３５日目に終末安楽死を受けた（すなわち、７ｄｐｉ）。最大最終血液試料採取を、肺および脾臓採取の前に行った（血清試料調製のため）。
左肺を、組織学のため少なくとも２４時間ホルマリンに入れた。
脾臓を、ＥＬＩＳＰＯＴＩＦＮγアッセイでさらに使用した。
マルチプレックスＥＬＩＳＡおよび中和アッセイによる抗体応答の評価のためにさらに使用するまで、血清試料をプロピレンチューブに－８０℃で保存した。

【0151】

血清サイトカインおよびＥＰＯ定量のためのＥＬＩＳＡ
血清（ＥＬＩＳＡ）中のサイトカインおよびＥＰＯレベルを定量し、２つの時点（０日目ｔ＋６時間および１日目）でモニタリングした。
Ｕ－ＰＬＥＸヒトＥＰＯアッセイキット（ＭＳＤ、参照番号Ｋ１５１ＶＸＫ）を使用して、時点（０日目ｔ＋６時間）で、ＥＰＯを評価した。
ハムスターインターロイキン６、ＩＬ－６ＥＬＩＳＡキット（Ｃｕｓａｂｉｏ、参照番号ＣＳＢ－Ｅ１４３０４Ｈａ）を使用して、２つの時点（０日目ｔ＋６時間および１日目）で、ＩＬ－６を評価した。
他のサイトカイン（例えば、ＣＸＣＬ－１２、ＳＣＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ２、ＩＬ４、ＭＣＰ１、およびＩＬ１８）を、２つの時点（０日目ｔ＋６時間および１日目）で評価した。対応するＥＬＩＳＡキットを、これらのサイトカインレベルのモニタリングに使用した。

【0152】

マルチプレックスＥＬＩＳＡによる抗体応答の評価（１０／２１／３５日目）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体応答（ＩｇＧ）の分析を、ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（キットＫ１５３８３Ｕ）のＶ－ＰＬＥＸＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パネル２プレートを使用して行った。マルチプレックスアプローチを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ、ＲＢＤおよびＮ抗原を標的とするハムスター抗体についての応答を定量化した。
プレートに、９６ウェルプレートのウェル内のスポット上の抗原を用意した。試料中の抗体は、スポット上の抗原に結合し、ＭＳＤＳＵＬＦＯ－ＴＡＧとコンジュゲートした抗ハムスターＩｇＧ抗体を検出に使用した。プレートを、ＭＳＤＳＵＬＦＯ－ＴＡＧから放射される光を測定するＭＥＳＯＱｕｉｃｋｐｌｅｘＳＱ１２０撮像装置で読み取った。
スポット１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク＝Ｔ４三量体形成ドメインを有する可溶性細胞外ドメイン、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ－ＴａｇおよびＨｉｓ－Ｔａｇ。
スポット３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド＝全長ヌクレオカプシド、Ｃ末端Ｈｉｓ－Ｔａｇ。
スポット１０：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１ＲＢＤ＝スパイク配列のＲ３１９－Ｆ５４１、Ｃ末端Ｈｉｓ－Ｔａｇ。

【0153】

中和抗体応答評価（１０／２１／３５日目）
血清試料を、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を用いた生きたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２細胞病原性ベースのアッセイを使用して、以下のように分析した。
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞をカウントし、その生存率を、ＶｉＣｅｌｌ装置による０．２５％トリパンブルー排除アッセイによって評価した。試験の約１６時間前に、細胞を、９６ウェルプレートに、１ウェル当たり２×１０４細胞の密度で、２００μＬの体積の完全増殖培地中に播種した。
中和抗体を含有する熱不活化血清（５６℃で３０分間）を最初に連続希釈し（３倍工程）、次いで、室温で３０分間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの１ウェル当たり０．０１ＭＯＩと混合（１：１ｖ：ｖ）し、血清中の抗体をウイルスに結合させた。ウイルスとの混合後の最初の最終血清希釈は、１：５であった。
ウイルス－抗体混合物（５０μＬ）を、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に添加し（細胞増殖培地を除去した後）、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートして、ウイルスを標的細胞に感染させた。
その後、１５０μＬの完全細胞増殖培地（２％ＦＢＳを含有する）を、各ウェルに添加した。次いで、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＮｏｎ－ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙを使用して、プレート顕色を行い、プロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照番号Ｇ５４３０）に従って行い、増殖アッセイにおける生細胞の数を決定した。
１００μＬの上清を除去した後、１００μＬの新鮮な培地および２０μＬのＭＴＳ／ＰＭＳ試薬を添加した。プレートを、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取った。
中和抗体力価（ＮＴ５０）を、ウイルス感染性の≧５０％阻害をもたらす最高血清希釈の逆数として定義する。

【0154】

抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＳＴ細胞応答のＥＬＩＳＰＯＴＩＦＮγ評価（３５日目）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対するＴ細胞応答を、ハムスターＥＬＩＳＰＯＴＩＦＮγアッセイ（Ｍａｂｔｅｃｈ社、参照番号３１０２－２Ａ）で評価した。
Ｔ細胞応答を、１１個のアミノ酸重複を有する特定の１５ｍｅｒペプチドスキャンプール（ＪＰＴ；ＰｅｐＭｉｘＳＡＲＳ－ＣＯＶ２Ｓｐｉｋｅ、参照ＰＭ－ＷＣＰＶ－Ｓ－２）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対して評価した。
脾細胞を、細胞ストレーナー上で単離し、赤血球溶解の前後に７０μｍフィルター上で濾過した。生脾細胞をカウントし、その生存率を、ＶｉＣｅｌｌ装置による０．２５％トリパンブルー排除アッセイによって評価した。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、二つの細胞密度（１ウェル当たり２００×１０３細胞および６０×１０３細胞）で三つ組で行い、異なる条件：培地のみ、陽性対照としてのＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（１μＭ）混合物、ペプチドプール（２μｇ／ｍＬ）を比較した。ＰＭＡ／イオノマイシン陽性対照については、より低い細胞密度を使用した（１ウェル当たり６０×１０３細胞および２０×１０３細胞）。
ＥＬＩＳＰＯＴ開始の２４時間後、ＩＦＮγ産生細胞が明らかになった。プレートを、ＡＩＤ（＃ＥＬＲ０８）ＥＬＩＰＯＴプレートリーダーを使用して分析した。

【0155】

臨床モニタリング－動物体重
動物の体重を、ワクチン接種後は週に一回、次いでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後は毎日モニタリングした。

【0156】

ゲノムｑＲＴ－ＰＣＲ（３２日目）による肺および鼻組織におけるウイルス負荷量決定（４ｄｐｉ）
ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルス負荷量の定量化を、ウイルスＯＲＦ１ａｂ遺伝子を使用して肺および鼻組織から行った。
ウイルスＲＮＡの抽出を、ＲＮＡ精製用の９６ウェルキットであるＭａｃｈｅｒｅｙＮａｇｅｌＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ９６ＲＮＡを使用して行った（参照７４０７０９．４）。ＲＮＡを、ｑＲＴ－ＰＣＲまで－８０℃で凍結した。
ＲＴを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍの高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（参照番号４３６８８１３）を用いて行った。
ＯＲＦ１ａｂ遺伝子を標的とするプライマー条件で定量的ＰＣＲによるｃＤＮＡ定量を行った。増幅を、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７Ｆｌｅｘおよび付随のソフトウェアを使用して行った。

【表5】

【0157】

肺におけるウイルスＴＣＩＤ５０決定（３２日目）（４ｄｐｉ）
５０％細胞傷害性（ＴＣＩＤ５０）アッセイを生じる組織培養感染用量は、ウイルスストックの感染性を評価するための定量的方法である。一つのＴＣＩＤ５０を、細胞の５０％の死を引き起こす病原体の量として定義し（ＲｅｅｄａｎｄＭｕｅｎｃｈ，１９３８）、ＴＣＩＤ５０は、培養中の細胞を死滅させるウイルスの能力に依存する。感染性を、スピアマン・カーバー式に基づいてＴＣＩＤ５０／ｍＬ／４８時間として表した。
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞をカウントし、その生存率を、ＶｉＣｅｌｌ装置による０．２５％トリパンブルー排除アッセイによって評価した。
試験の一日前に、細胞を、９６ウェルプレートに、１ウェル当たり２×１０４細胞の密度で、２００μＬの体積の完全増殖培地（ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ）中に播種した。
細胞を、３７℃で１時間、肺ホモジネート（三つ組）の連続希釈液で感染させた。新鮮な培地を４８時間添加した。
細胞感染の４８時間後、プロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ参照番号Ｇ５４３０）に従ってＭＴＳ／ＰＭＳアッセイを行った。すべての上清を廃棄した後、１００μＬの新鮮な培地および２０μＬのＭＴＳ／ＰＭＳ試薬を培養ウェルに添加した。最長４時間後、Ｅｌｉｓａプレートリーダーを使用して、プレートを読み取り、データを記録した（陰性細胞対照のＯＤ値＞１．５００）。

【0158】

実施例４：ハムスターのワクチン接種およびコロナウイルス負荷
二つのワクチン製剤：ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む再構成レモン（ｒｅｃＬｅｍｏｎ）ＬＰＭＰ製剤）およびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む再構成藻類（ｒｅｃＡｌｇａｅ）ＬＰＭＰ製剤）を、実施例２に従い調製した。
ワクチン接種およびコロナウイルス負荷のプロトコルは、実施例３に記載したものであった。これらのＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２製剤の投与は、表３に示す処置スケジュールに基づき、これらのハムスターのワクチン接種およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷の結果を図２～１０に示す。

【0159】

血清サイトカイン
ハムスターにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの単回用量筋肉内ワクチン接種の６時間後および２４時間後のハムスターの血清中のサイトカインＩＬ６（図２Ａ）、ケモカインＣＸＣＬ１２（図２Ｂ）、およびサイトカインＳＣＦ（幹細胞因子）（図２Ｃ）のレベルを評価し、モニターした。結果を図２にし、これは、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの単回用量筋肉内ワクチン接種が、ハムスターにおけるワクチン接種の６時間後および２４時間後に炎症促進性サイトカインおよびケモカインを誘発したことを示す。ハムスター血漿における投与の６時間後および２４時間後の検出可能なレベルのＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＭＣＰ１、ＴＮＦα、およびＩＬ１８は、見られなかった。しかしながら、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（１０μｇ）とＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（１０μｇ）の両方が、投与の６時間後および２４時間後に、あるレベルの炎症促進性サイトカインＩＬ６（図２Ａ）およびケモカインＣＸＣＬ１２（図２Ｂ）を誘導した。ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（１０μｇ）とＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ（１０μｇ）の両方がまた、投与の６時間後および２４時間後に、あるレベルのサイトカインＳＣＦ（幹細胞因子）を誘導した（図２Ｃ）。

【0160】

抗体および中和抗体応答
ハムスターにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの筋肉内ワクチン接種後、１０日目、２１日目、および３５日目でのハムスターの血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳおよびＳ１ＲＢＤ抗原を標的とする抗体応答（ＩｇＧ）を評価した。
図３Ａ～３Ｂは、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの単回用量筋肉内ワクチン接種が、ハムスターにおけるワクチン接種の１０日後に高レベルのＳ特異的およびＳ１ＲＢＤ特異的ＩｇＧを誘発したことを示す。ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンによって誘導された検出した高レベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターで観察したものに非常に近かった。二つのワクチン製剤のうち、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（レモン由来ＬＰＭＰ）ワクチンは、ハムスターにおけるワクチン接種の１０日後により高いレベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体を誘導した。
図４は、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの筋肉内ワクチン接種が、ハムスターにおけるワクチン接種の２１日後に非常に高レベルのＳ１ＲＢＤ特異的ＩｇＧを誘発したことを示す。ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンによって誘導された検出した高レベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターで観察したものに非常に近かった。また、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、比較的低いＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン投与量（ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ、２０μｇ）であっても、非常に高い力価のＲＢＤ特異的抗体（２１日目力価：１０７）を誘導した。
図５および図１７は、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの筋肉内ワクチン接種が、ハムスターにおける複数のウイルスバリアントに有効であったＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの筋肉内ワクチン接種の３５日後に、ハムスターの血清中に強固な中和抗体力価を誘導したことを示す。

【0161】

抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＳＴ細胞応答
図６は、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの筋肉内ワクチン接種が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質特異的Ｔ細胞を誘導したことを示す。

【0162】

ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを用いたハムスターのワクチン接種は、ハムスターをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷から保護した
ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンが、ハムスターをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷から保護する能力を、図７～１０に示す。
図７Ａ～７Ｄは、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン接種したハムスターが、堅牢なワクチン誘発性免疫応答を担持し、体重減少によって測定したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２負荷から保護されたことを示す。ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＡとＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂ製剤の両方について、単回用量（１０μｇ）の筋肉内ワクチン接種により、ハムスターをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷から保護した。
図８に示すように、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａワクチン製剤の単回用量（１０μｇ）の筋肉内ワクチン接種は、ハムスターにおいて堅牢なワクチン誘発性免疫応答を担持し、最良のベンチマーク（１１％体重の喪失）と同様のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷からのハムスターにおける保護を達成した。
図９に示すように、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａワクチン製剤の単回用量（１０μｇ）の筋肉内ワクチン接種は、感染の４日後にハムスターにおいて堅牢なワクチン誘発性免疫応答を担持し、肺内の感染性ウイルス粒子（ウイルスＴＣＩＤ５０によって決定する）を有意に減少させることによって、ハムスターをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷から保護した。
図１０Ａ～１０Ｂに示すように、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａワクチン製剤の単回用量（１０μｇ）の筋肉内ワクチン接種は、感染の４日後にハムスターにおいて堅牢なワクチン誘発性免疫応答を担持し、肺（図１０Ａ）および鼻軟膜（図１０Ｂ）内のウイルス負荷を有意に減少させることによって、ハムスターをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷から保護した。
まとめると、図８～図１０は、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａワクチン製剤の単回用量（１０μｇ）の筋肉内ワクチン接種が、体重の減少、肺中の感染性ウイルス粒子、ならびに肺と鼻粘膜の両方におけるウイルス負荷量によって測定し、ハムスターをＳＡＲＳ－ＣｏＶ２負荷から効果的に保護したことを示す。

【0163】

実施例５：マウスのワクチン接種およびコロナウイルス負荷
特異的でない場合、ワクチン接種およびコロナウイルス負荷ならびに免疫応答の特徴決定のプロトコルは、使用した動物が本実施例のマウスであったことを除いて、実施例３に記載したものと同様であった。
二つのワクチン製剤：ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＡおよびＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｂを実施例２に従い調製した。対照は、ＰＢＳであった。

【0164】

経口投与
三匹のマウスに、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ２００μｇを含有する）の単回投与を経口投与した。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＳＴ細胞応答を、１２日目でのＥＬＩＳＰＯＴＩＦＮγアッセイで評価した。抗体応答（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ）を、それぞれ、１２日目および２１日目に多重ＥＬＩＳＡによって評価した。
図１１Ａ～１１Ｂは、マウスにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ２００μｇを含有する）の経口ワクチン接種後、１２日目のマウスの脾臓（図１１Ａ）およびマウスのパイエル板（図１１Ｂ）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ抗原に対するＴ細胞応答の結果を示す。結果は、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａワクチン製剤の単回投与の経口ワクチン接種が、マウスにおいて全身および粘膜のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫応答を誘発したことを示す。ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａワクチン製剤の単回投与経口ワクチン接種はまた、パイエル板において粘膜ならびに細胞傷害性ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を誘導した。
さらに、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの経口ワクチン接種はまた、マウスにおけるワクチン接種の１２日後に高レベルのＳ特異的ＩｇＭを誘発し、マウスにおけるワクチン接種の２１日後に低レベルの抗原特異的ＩｇＧを誘発した。同様の経口ワクチン接種研究はまた、マウスの腸および肺において低レベルのＩｇＡを示した。

【0165】

鼻腔内投与
三匹のマウスに、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａワクチン接種（ＳｍＲＮＡ０．１μｇを含有する、１０μｇ）の単回投与を鼻腔内投与した。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＳＴ細胞応答を、１２日目でのＥＬＩＳＰＯＴＩＦＮγアッセイで評価した。血液中のサイトカインレベル（例えば、ＴＮＦα）（ＥＬＩＳＡ）を、１２日目に定量化した。
図１２Ａは、マウスにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ０．１μｇを含有する、１０ μｇ）の鼻腔内ワクチン接種後の１２日目のマウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ抗原に対するＴ細胞応答の結果を示す。図１２Ｂは、マウスにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡ０．１μｇを含有する、１０μｇ）の鼻腔内ワクチン接種後の１２日目のマウスにおける血中のサイトカインＴＮＦαのレベルを示す。
結果は、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａワクチン製剤の単回投与の鼻腔内ワクチン接種が、免疫の１２日後に全身ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク特異的Ｔ細胞を誘発したことを示す。

【0166】

筋肉内投与
マウスに、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａワクチン接種（ＳｍＲＮＡを含有する、１０μｇ）の単回投与又は２回投与を筋肉内投与した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオリジナル（ワシントン）、デルタ、およびオミクロンバリアントに対する中和抗体価を測定した。マウスに、０日目に１０μｇの用量を、２１日目に同用量の第二の用量を投与し、次いで、抗体価を、４９日目に第二の用量の四週間後に測定した。血液中のサイトカインレベル（ＭＳＤを介して測定した）を、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａワクチン接種（ＳｍＲＮＡを含有する、１０μｇ）の単回筋肉内投与の２、６、２４、および４８時間後に定量した。
図１８は、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの筋肉内ワクチン接種が、マウスの血液中で強固な中和抗体価を誘導し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の複数のバリアントに対して広く中和することができることを示す。
図１９は、マウスにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ａ（ＳｍＲＮＡを含有、１０μｇ）の筋肉内ワクチン接種の２、６、２４、および４８時間後のマウスの血液中の複数の循環サイトカインおよびケモカインのレベルの増加を通じて堅牢な免疫応答を示す。サイトカインの増加の多くは、Ｔ細胞応答および抗体クラスの切り替えに重要であり、両方とも、感染因子に対する免疫性を構築するのに必要な重要な態様である。

【0167】

実施例６．ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤の安定性
ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤の安定性を、ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡフルシフェラーゼ（ｍＲＮＡを含有する、５μｇ）の用量を静脈内投与した４時間後のマウス（ｎ＝２）の発光を測定することによって評価した。ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤（液体形態）を４℃で一定期間（１日目、３０日目、６０日目）保管した後、投与および測定を行った。
図１３に示すように、ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤は、液体形態で４℃で安定であった。
さらに、図１４Ａ～１４Ｂは、マウスにＬＰＭＰ／ｍＲＮＡフルシフェラーゼ（ｍＲＮＡ０．２ｍｇ／ｋｇを含有）の用量を静脈内投与した６時間後のマウスの取得した画像と共に、一定の期間に渡り（１日目、７日目）、凍結乾燥あり、凍結乾燥なしで４℃でのＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤の安定性を示す。図１４Ａ～１４Ｂに示すように、ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤は、４℃での安定性を達成するために必要な場合、凍結乾燥することができる。

【0168】

実施例７．ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤を用いたマウスの鼻腔内ワクチン接種
ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン製剤を、実施例２に従って得た。
例示的な試験した試料は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有する再構成レモン（ｒｅｃＬｅｍｏｎ）ＬＰＭＰ製剤（ｒｅｃＬｅｃｏｍＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）であった。
ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを投与したマウスのＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの単回鼻腔内ワクチン接種の設計を、スキーム２に示す。

【化72】

スキーム２

【0169】

粘膜経路を介した脂質再構成ＬＰＭＰワクチン製剤の効率を調べるために、マウスにＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（全長Ｓ１糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ）を鼻腔内投与した。エフェクター期およびメモリー期におけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンをコードするＳタンパク質ｍＲＮＡの免疫原性を調べるために、マウスに、０日目に投与し、マウスを、それぞれ、１２日目または２１日目に安楽死させた。血液、鼻洗浄液、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）液体および脾臓を採取し、回収し、抗原特異的Ｔ細胞およびＢ細胞応答について調べた。
抗原特異的Ｔ細胞の組織を調べるために、ＥＬＩＳｐｏｔｓを利用した。簡潔に述べると、脾臓からの単一細胞懸濁液を、Ｓタンパク質ペプチドでパルスした脾細胞、またはパルスしていない脾細胞と一晩共培養した。ＥＬＩＳｐｏｔｓ共培養単一細胞懸濁液を使用して、脾臓を、単一細胞に対して分泌されるエフェクターサイトカイン（ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ）の頻度について定量的に測定した。
血清、鼻洗浄液、およびＢＡＬ液中の抗原特異的免疫グロブリンを調べるために、ＭａｘｉｓｏｒｐプレートをコーティングしたＳ１タンパク質および受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ペプチドを利用した。簡潔に述べると、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、Ｓ１タンパク質ペプチドまたはＲＢＤペプチドのいずれかで一晩コーティングし、対応するＨＲＰコンジュゲート二次抗体およびテトラメチルベンジジン基質を使用して、ＩｇＡおよび総ＩｇＧを、血清、鼻洗浄液、およびＢＡＬ液中で測定した。
結果を図１５に示す。図１５に示すように、筋肉内経路（０．４ｍｇ／ｋｇ）、鼻腔内経路（０．４ｍｇ／ｋｇ）、および経口経路（８ｍｇ／ｋｇ）を介したマウスにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２製剤の投与後のマウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ抗原に対する免疫応答があった。

【0170】

これらの実施例のデータは、リンパ節への正確な生体内分布でプログラムすべきワクチン製剤の能力、肝臓の脱標的化、および全身曝露の最小化（肝臓を標的とすることが知られている標準ＬＮＰ／ｍＲＮＡ製剤と比較）を示した。
これらの実施例のデータはまた、ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤ワクチンの単回筋肉内用量が、単回用量で（２用量レジメンを使用したベンチマークに対して）良好なベンチマークレベルでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）から保護できたこと、約６０％少ないｍＲＮＡを用いたベンチマークよりも約１，０００倍高い抗体価を生じることができたこと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のバリアント（デルタおよびオミクロンを含む）に対して広く中和することができたこと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）伝播の予防のための全身および粘膜免疫を生じることができたことを示した。さらに、実施例は、設計により、改善された安全性特性（例えば、低い反応原性、低レベルの炎症マーカーまたは毒性マーカー）を示した。

【0171】

実施例８．ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤を用いた筋肉内ワクチン接種を用いたハムスター負荷モデルにおけるウイルス伝播の予防
ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン製剤を、実施例２に従って調製した。例示的な試験した試料は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有する再構成レモン（ｒｅｃＬｅｍｏｎ）ＬＰＭＰ製剤（ｒｅｃＬｅｃｏｍＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）であった。
ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤を用いたハムスター負荷モデルにおけるウイルス伝播の予防の試験設計を、スキーム３に示す。
ＬＰＭＰ／ｍＲＮＡ製剤での２用量の筋肉内ワクチン接種を用いたハムスター負荷モデルにおけるウイルス伝播の予防の試験設計を、スキーム４に示す。
結果を図１６Ａおよび１６Ｂに示す。体重は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）伝播研究におけるハムスターモデルの特徴的な測定値の一つである。図１６Ａに示すように、ハムスターにおけるＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２製剤の投与は、負荷の際にハムスターをＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染から完全に保護した。図１６Ｂに示すように、ＬＰＭＰ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２製剤でワクチン接種し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）を負荷したハムスターは、ウイルスをナイーブハムスターに感染させなかった。

【化73】