特表 2024-539597 核酸シークエンシングにおけるサポニン化合物の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-29

(54)【発明の名称】核酸シークエンシングにおけるサポニン化合物の使用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20241022BHJP

   C07J 9/00 20060101ALI20241022BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20241022BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20241022BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20241022BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20241022BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20241022BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C07J9/00

C12Q1/6876 Z

C12M1/00 A

C12M1/34 Z

G01N33/50 P

G01N21/64 F

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520960

(86)(22)【出願日】2021-10-15

(85)【翻訳文提出日】2024-06-04

(86)【国際出願番号】 CN2021123966

(87)【国際公開番号】W WO2023060527

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/123011

(32)【優先日】2021-10-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516122667

【氏名又は名称】深▲セン▼華大智造科技股▲ふん▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＭＧＩ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】Ｍａｉｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄ Ｆｌｏｏｒ ｏｆ Ｎｏ．１１ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｂｅｉｓｈａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｚｏｎｅ，Ｙａｎｔｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０８３，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ジア， マン

(72)【発明者】

【氏名】メン， イーシン

(72)【発明者】

【氏名】スー， チョンジュン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， インファ

(72)【発明者】

【氏名】ワン， ジンジン

(72)【発明者】

【氏名】ゴン， メイファ

(72)【発明者】

【氏名】リ， ジグァン

【テーマコード（参考）】

2G043

2G045

4B029

4B063

4C091

【Ｆターム（参考）】

2G043AA04

2G043BA16

2G043CA04

2G043DA02

2G043EA01

2G043KA02

2G043KA09

2G045AA35

2G045BA11

2G045BB32

2G045DA12

2G045DA13

2G045DA14

2G045FA12

2G045FB01

2G045FB02

2G045FB12

4B029AA23

4B029BB16

4B029BB20

4B029CC03

4B029CC08

4B029FA12

4B029FA15

4B063QA13

4B063QQ28

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QQ53

4B063QQ62

4B063QQ75

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR36

4B063QR42

4B063QR45

4B063QR62

4B063QR84

4B063QX02

4C091AA01

4C091BB01

4C091CC01

4C091DD01

4C091EE04

4C091EE06

4C091FF02

4C091FF04

4C091FF06

4C091FF14

4C091GG03

4C091GG05

4C091HH01

4C091JJ03

4C091KK01

4C091LL02

4C091LL03

4C091LL06

4C091LL09

4C091MM01

4C091NN01

4C091PA02

4C091PA06

4C091PB05

4C091QQ01

(57)【要約】

本発明は、核酸シークエンシングの分野に関する。特に、本発明は、サポニン化合物を含むスキャニング試薬、スキャニング試薬を含むキット及びスキャニング試薬を使用することによる核酸シークエンシングのための方法に関する。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

サポニン化合物及びトリス緩衝溶液を含むスキャニング試薬であって、前記サポニン化合物が、以下の化合物：

【化1】

からなる群から選択される１種又は複数である、スキャニング試薬。

【請求項2】

前記サポニン化合物が０．０１～１０ｍＭ又は１０～１００ｍＭの濃度を有する、請求項１に記載のスキャニング試薬。

【請求項3】

前記スキャニング試薬が、さらなる光損傷保護剤、例えば、（±）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸、エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物、Ｌ－ジチオスレイトール又はこれらの任意の組み合わせをさらに含み、
好ましくは、前記スキャニング試薬が、（±）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸を含み、
好ましくは、前記スキャニング試薬が、（±）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸及びエチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物を含み、
好ましくは、前記スキャニング試薬が、（±）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸、エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物及びＬ－ジチオスレイトールを含み、
好ましくは、前記スキャニング試薬中の前記（±）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸、エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物又はＬ－ジチオスレイトールが、それぞれ独立に５～５０ｍＭの濃度を有する、請求項１又は２に記載のスキャニング試薬。

【請求項4】

前記スキャニング試薬が、塩化ナトリウム及び／又はＤＮＡ安定化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０）をさらに含み、
好ましくは、前記トリス緩衝溶液が水、トリス、塩化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ－２０及びトリス塩酸塩を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のスキャニング試薬。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載のスキャニング試薬の使用を含む、核酸シークエンシング方法。

【請求項6】

核酸シークエンシングにおける光損傷保護剤としてのサポニン化合物の使用であって、前記サポニン化合物が、ノトギンセノシドＲ１、ギンセノシドＲｇ１、ギンセノシドＲｄ、ギンセノシドＲｂ２、ギンセノシドＲｂ３、ギンセノシドＲｃ、ギンセノシドＲｆ及びギンセノシドＲｅからなる群から選択され、それらの構造式が請求項１に示されるとおりである、使用。

【請求項7】

請求項１～４のいずれか一項に記載のスキャニング試薬を含む、キット。

【請求項8】

シークエンスされる核酸分子と支持体を固定化するための試薬、ヌクレオチド重合を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合を行うためのポリメラーゼ、１種若しくは複数の緩衝溶液、１種若しくは複数の洗浄溶液、又はこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項７に記載のキット。

【請求項9】

標的ポリヌクレオチドの配列を決定するための、請求項１～４のいずれか一項に記載のスキャニング試薬又は請求項７若しくは８に記載のキットの使用。

【請求項10】

請求項１～４のいずれか一項に記載のスキャニング試薬を調製するための方法であって、前記スキャニング試薬の各成分を超純水に溶解させて、透明且つ均一な溶液を調製し、次いで、前記溶液を濾過するステップを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸シークエンシングの分野に関する。特に、本発明は、サポニン化合物を含むスキャニング試薬、核酸シークエンシングにおける光損傷保護剤としてのサポニン化合物の使用、及び核酸シークエンシング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

合成によるシークエンシングは、ポリヌクレオチドのシークエンシングの理論的基礎であり、シークエンシングプロセス中に塩基を同定することが極めて重要である。一般に、塩基の同定は、異なる塩基に標識された蛍光色素の種類を同定することによって、決定される。このプロセスは、ヌクレオチドを紫外～可視光に曝露して、蛍光色素中の発色団に蛍光を発光させ、次いで、蛍光シグナルを検出し、撮影し、それによって、蛍光色素の種類を決定することを含む。

【0003】

ＵＶ～可視範囲の波長のレーザーを光源として使用することができる。しかし、レーザーは、鋳型ヌクレオチドに対して損傷を引き起こす可能性があり、これは、ポリヌクレオチドのシークエンシング品質にひどく影響を及ぼす。

【0004】

塩基の同定で使用される緩衝溶液は、スキャニング試薬又は写真撮影試薬と呼ばれる。鋳型ヌクレオチドに対するレーザー損傷は、スキャニング試薬に光損傷保護剤を添加することによって防止することができる。しかし、従来技術では、スキャニング試薬中の光損傷保護剤成分の濃度は比較的高い。高濃度の光損傷保護剤の使用は、低温で保存されるか又は長期のシークエンシングプロセスを受ける場合に、スキャニング試薬中で塩沈殿を引き起こす可能性がある。さらに、長期の保存中に、いくつかの光損傷保護剤成分は、酸化した後に退色し、それによって、スキャニング品質、したがってポリヌクレオチドのシークエンシング品質に影響を及ぼす可能性がある。さらに、高濃度の光損傷保護剤の使用は製品原価を高める。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、光損傷保護剤としてサポニン化合物（例えば、ノトギンセノシド及びギンセノシド）を使用し、これは、非常に低い使用濃度で鋳型ヌクレオチドを依然として保護することができる。本発明で使用するサポニン化合物は、紫外及び可視光領域で吸収がなく、塩基認識シグナルを妨げず、長期保存中に酸化するとしても変色しない。

【0006】

本出願は以下の発明を提供する：
一態様では、本出願は、サポニン化合物及びトリス緩衝溶液を含むスキャニング試薬であって、サポニン化合物が、以下：

【化1】

からなる群から選択される１種又は複数の化合物である、スキャニング試薬を提供する。

【0007】

本発明では、トリス緩衝溶液は、緩衝系としてトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）を使用する緩衝溶液を指す。

【0008】

トリスは、生化学及び分子生物学で使用される緩衝溶液の調製で広く使用されている。トリスは弱塩基であり、トリス塩基の水溶液のｐＨは約１０．５である。ｐＨを所望の値に調整するために塩酸を添加することにより、そのｐＨの緩衝液を得ることができる。トリス及びその塩酸塩（トリス－ＨＣｌ）は、緩衝溶液を調製するために使用することもできる。

【0009】

トリス緩衝溶液の有効な緩衝範囲はｐＨ７．０～９．２の間である。トリス緩衝溶液は、核酸を溶解させるための溶媒として使用することができる。

【0010】

本発明では、サポニン化合物は、非常に低濃度で鋳型ヌクレオチドを保護することができる。いくつかの実施形態では、サポニン化合物は、０．０１～１０ｍＭ又は１０～１００ｍＭ、例えば、０．０１～０．０２ｍＭ、０．０２～０．０３ｍＭ、０．０３～０．０４ｍＭ、０．０４～０．０５ｍＭ、０．０５～０．０６ｍＭ、０．０６～０．０７ｍＭ、０．０７～０．０８ｍＭ、０．０８～０．０９ｍＭ、０．０９～０．１ｍＭ、０．１～０．２ｍＭ、０．２～０．３ｍＭ、０．３～０．４ｍＭ、０．４～０．５ｍＭ、０．５～０．６ｍＭ、０．６～０．７ｍＭ、０．７～０．８ｍＭ、０．８～０．９ｍＭ、０．９～１．０ｍＭ、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、９～１０ｍＭ、１０～２０ｍＭ、２０～３０ｍＭ、３０～４０ｍＭ、４０～５０ｍＭ、５０～６０ｍＭ、６０～７０ｍＭ、７０～８０ｍＭ、８０～９０ｍＭ又は９０～１００ｍＭの濃度を有する。

【0011】

いくつかの実施形態では、ノトギンセノシドＲ１は、０．０１～１０ｍＭ、例えば、０．０１～０．５ｍＭ、０．５～１ｍＭ、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ又は９～１０ｍＭの濃度を有していてもよい。

【0012】

いくつかの実施形態では、ギンセノシドＲｇ１は、１０～１００ｍＭ、例えば、１０～２０ｍＭ、２０～３０ｍＭ、３０～４０ｍＭ、４０～５０ｍＭ、５０～６０ｍＭ、６０～７０ｍＭ、７０～８０ｍＭ、８０～９０ｍＭ又は９０～１００ｍＭの濃度を有していてもよい。

【0013】

いくつかの実施形態では、スキャニング試薬は、さらなる光損傷保護剤、例えば、（±）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸（トロロクス（Ｔｒｏｌｏｘ））、エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物、Ｌ－ジチオスレイトール又はこれらの任意の組み合わせをさらに含む。１種より多い光損傷保護剤をスキャニング試薬に添加することは、ＤＮＡシークエンシングの品質を改善するのにより貢献するであろう。

【0014】

いくつかの実施形態では、スキャニング試薬はトロロクスを含み、例えば、ノトギンセノシドＲ１及びトロロクスを含むか又はギンセノシドＲｇ１及びトロロクスを含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、スキャニング試薬は、トロロクス及びエチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物を含み、例えば、ノトギンセノシドＲ１、トロロクス及びエチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物を含むか又はギンセノシドＲｇ１、トロロクス及びエチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、スキャニング試薬は、トロロクス、エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物及びＬ－ジチオスレイトールを含み、例えば、ノトギンセノシドＲ１、トロロクス、エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物及びＬ－ジチオスレイトールを含むか又はギンセノシドＲｇ１、トロロクス、エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物及びＬ－ジチオスレイトールを含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、スキャニング試薬中のトロロクス、エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物又はＬ－ジチオスレイトールはそれぞれ独立に５～５０ｍＭの濃度を有し、例えば、それぞれ独立に５～１０ｍＭ、１０～２０ｍＭ、２０～３０ｍＭ、３０～４０ｍＭ又は４０～５０ｍＭの濃度を有する。

【0018】

いくつかの実施形態では、スキャニング試薬は、塩化ナトリウム及び／又はＤＮＡ安定化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０）をさらに含む。塩化ナトリウムの役割は、塩溶液バックグラウンドを提供すること及びシークエンシングで使用されるプライマーを保護することである。

【0019】

いくつかの実施形態では、トリス緩衝溶液は、水、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基）、塩化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ－２０及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ヒドロクロリド）（トリス－ＨＣｌ）を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、トリス緩衝溶液は、以下の方法によって調製される：トリス塩基（粉末）、塩化ナトリウム（粉末）、Ｔｗｅｅｎ－２０及びトリス－ＨＣｌ（粉末）をある特定の比で超純水に溶解すること。

【0021】

いくつかの実施形態では、本発明のスキャニング試薬では、各成分の濃度は、以下の表に示されるとおりである。

【表1】

【0022】

別の態様では、本出願は、核酸シークエンシングにおける光損傷保護剤としてのサポニン化合物（例えば、ノトギンセノシド又はギンセノシド）の使用であって、サポニン化合物が、ノトギンセノシドＲ１、ギンセノシドＲｇ１、ギンセノシドＲｄ、ギンセノシドＲｂ２、ギンセノシドＲｂ３、ギンセノシドＲｃ、ギンセノシドＲｆ及びギンセノシドＲｅからなる群から選択され、各化合物の構造式が上記で示されるとおりである、使用を提供する。

【0023】

別の態様では、本出願は、本発明のスキャニング試薬を含むキットを提供する。

【0024】

いくつかの実施形態では、本発明のキットは、シークエンスされる核酸分子を支持体に固定化する（例えば、共有結合的若しくは非共有結合的な連結によって固定化する）ための試薬；ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー；ヌクレオチド重合反応のためのポリメラーゼ；１種若しくは複数の緩衝溶液；１種若しくは複数の洗浄溶液；又はこれらの任意の組み合わせをさらに含むことができる。

【0025】

いくつかの実施形態では、本発明のキットは、試料から核酸分子を抽出するための試薬及び／又は装置をさらに含むことができる。試料から核酸分子を抽出するための方法は、当技術分野で周知である。したがって、必要に応じて、本発明のキットにおいて、核酸分子を抽出するための様々な試薬及び／又は装置が配置されてもよく、例としては、細胞を破壊するための試薬、ＤＮＡを沈殿させるための試薬、ＤＮＡを洗浄するための試薬、ＤＮＡを溶解させるための試薬、ＲＮＡを沈殿させるための試薬、ＲＮＡを洗浄するための試薬、ＲＮＡを溶解させるための試薬、タンパク質を除去するための試薬、ＤＮＡを除去するための試薬（例えば、標的核酸分子がＲＮＡである場合）、ＲＮＡを除去するための試薬（例えば、標的核酸分子がＤＮＡである場合）及びこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。

【0026】

いくつかの実施形態では、本発明のキットは、核酸分子を前処理するための試薬をさらに含む。本発明のキットでは、核酸分子を前処理するための試薬はさらなる制限を受けず、実際の必要性に従って選択することができる。核酸分子を前処理するための試薬は、例えば、核酸分子を断片化するための試薬（例えば、ＤＮａｓｅＩ）、核酸分子の末端を補足するための試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼ）、アダプター分子、標識分子、アダプター分子を目的の核酸分子に連結するための試薬（例えば、リガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼ）、核酸の末端を修復するための試薬（例えば、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼ）、核酸分子を増幅するための試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ）、核酸分子を分離及び精製するための試薬（例えば、クロマトグラフィーカラム）並びにこれらの任意の組み合わせを含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、本発明のキットは、シークエンスされる核酸分子を固定化するための支持体をさらに含む。通常の状況下では、シークエンスされる核酸分子を固定化するために使用される支持体は、取扱いを容易にするために固相の状態である。したがって、本開示では、「支持体」は、時には、「固体支持体」又は「固相支持体」とも称される。しかし、本明細書で言及される「支持体」は、固体に限定されるのではく、半固体（例えば、ゲル）であってもよいことを理解されたい。

【0028】

本明細書で使用する場合、用語「装填される」、「固定化される」及び「付着させられる」は、核酸に関連して使用される場合、共有結合的又は非共有結合的な結合を介した、固体支持体への直接的又は間接的な付着を意味する。本開示のいくつかの実施形態では、本発明の方法は、共有結合的付着を介して固体支持体に核酸を固定化するステップを含む。典型的には、しかし、必要なことは、固体支持体を使用することが所望される条件下で（例えば、核酸増幅及び／又はシークエンシングを必要とする適用において）、核酸が、固体支持体に固定化又は付着させられたままであることだけである。いくつかの実施形態では、固体支持体へ核酸を固定化するステップは、捕獲プライマー又は増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを固体支持体に固定化するステップを含むことができ、その結果、３’末端が酵素による伸長に利用可能であり、プライマー配列の少なくとも一部が相補的核酸配列にハイブリダイズすることができ；次いで、固定化される核酸が、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、この場合、固定化されるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、３’－５’の方向であり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体に核酸を固定化するステップは、アミノ化修飾を介して核酸結合タンパク質を固体支持体に結合させ、核酸結合タンパク質を介して核酸分子を捕獲することを含むことができる。あるいは、装填は、塩基対合ハイブリダイゼーション以外の手段、例えば、上記の共有結合的付着によって、生じてもよい。固体支持体への核酸の付着の手段の非限定例は、核酸ハイブリダイゼーション、ビオチン－ストレプトアビジン結合、スルフヒドリル結合、光活性化結合、共有結合、抗体－抗原、ヒドロゲル又は他の多孔質ポリマーによる物理的閉じ込めなどを含む。核酸を固体支持体に固定化するための様々な例示的方法は、例えば、Ｇ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ－Ｔａｔｍａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００６、１７、８４１～８４８；Ｘｕ Ｘ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２８（２００６）９２８６～９２８７；米国特許出願、米国特許第５６３９６０３号、米国特許第５６４１６５８号、米国特許出願公開第２０１０２４８９９１号；国際特許出願、国際公開第２００１０６２９８２号、国際公開第２００１０１２８６２号、国際公開第２００７１１９３７号、国際公開第０００６７７０号に見出すことができ；すべての意図及び目的のために、特に、核酸が固定される固体支持体の調製及び形成に対するすべての教示のために、上記の文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0029】

本発明では、支持体は様々な適切な材料から作製することができる。そのような材料としては、例えば、無機物、天然ポリマー、合成ポリマー及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。具体例としては、限定されないが、セルロース、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース）、アクリル、ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼンなどと架橋したポリスチレン（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６４、３、１３８５～１３９０を参照されたい）、ポリアクリルアミド、ラテックス、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、天然スポンジ、金属プラスチック、架橋デキストラン（例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（商標））、アガロースゲル（例えば、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標））及び当業者に既知の他の支持体が挙げられる。

【0030】

いくつかの好ましい実施形態では、シークエンスされる核酸分子を固定化するために使用される支持体は、不活性な基材又はマトリックスを含む固体支持体（例えば、スライド、ポリマービーズなど）であってもよく、不活性な基材又はマトリックスは、例えば、ポリヌクレオチドなどの生体分子との共有結合的連結を可能にする活性基を含む中間材料の適用によって、官能化されている。そのような支持体の例としては、限定されないが、ガラスなどの不活性な基材に支持されるポリアクリルアミドヒドロゲル、特に、国際公開第２００５／０６５８１４号及び米国特許出願公開第２００８／０２８０７７３号に記載されているものが挙げられ、前述の特許出願の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。そのような実施形態では、生体分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、それ自体が基材又はマトリックス（例えば、ガラス基材）に非共有的に連結され得る中間材料（例えば、ヒドロゲル）に直接共有結合的に連結され得る。いくつかの好ましい実施形態では、支持体は、アビジン、アミノ、アクリルアミドシラン又はアルデヒドの化学基の層でその表面が修飾されているガラススライド又はシリコンチップである。

【0031】

本発明では、支持体又は固体支持体は、そのサイズ、形及び構成に制限されない。いくつかの実施形態では、支持体又は固体支持体は平面構造、例えば、スライド、チップ、マイクロチップ及び／又はアレイである。そのような支持体の表面は、平面層の形態であってもよい。

【0032】

いくつかの好ましい実施形態では、シークエンスされる核酸分子を固定化するために使用される支持体は、ビーズ又はウェルのアレイ（チップとも称される）である。アレイは、固体支持体調製するために本明細書で概要を述べる材料のうちのいずれかを使用して、調製することができ、好ましくは、アレイ上のビーズ又はウェルの表面は、核酸分子の固定化を容易にするように官能化される。アレイ上のビーズ又はウェルの数は制限されない。例えば、各アレイは、１０～１０^２、１０^２～１０^３、１０^３～１０^４、１０^４～１０^５、１０^５～１０^６、１０^６～１０^７、１０^７～１０^８、１０^８～１０^９、１０^１０～１０^１１、１０^１１～１０^１２個又はそれ以上のビーズ又はウェルを含むことができる。いくつかの例示的実施形態では、各ビーズ又はウェルの表面に１つ又は複数の核酸分子を固定化することができる。したがって、各アレイは、１０～１０^２、１０^２～１０^３、１０^３～１０^４、１０^４～１０^５、１０^５～１０^６、１０^６～１０^７、１０^７～１０^８、１０^８～１０^９、１０^１０～１０^１１、１０^１１～１０^１２個又はそれ以上の核酸分子を固定化することができる。したがって、そのようなアレイは、核酸分子のハイスループットシークエンシングのために特に好都合に使用することができる。

【0033】

いくつかの好ましい実施形態では、本発明のキットは、シークエンスされる核酸分子を支持体に固定化（例えば、共有結合的又は非共有結合的な連結を介した固定化）するための試薬をさらに含む。そのような試薬は、例えば、核酸分子（例えば、その５’末端）を活性化又は修飾するための試薬、例えば、リン酸、チオール、アミン、カルボン酸又はアルデヒド；支持体の表面を活性化又は修飾するための試薬、例えば、アミノ－アルコキシシラン（例えば、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、４－アミノブチルトリエトキシシランなど）；架橋剤、例えば、無水コハク酸、フェニルジイソチオシアネート（Ｇｕｏら、１９９４）、無水マイレン酸（Ｙａｎｇら、１９９８）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイルオキシ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ）、Ｎ－スクシンイミジル［４－ヨードアセチル］アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－γ－マレイミドブチリルオキシ－スクシンイミド（ＧＭＢＳ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；及びこれらの任意の組み合わせを含む。

【0034】

いくつかの好ましい実施形態では、本発明のキットは、ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマーをさらに含む。本発明では、プライマーは、標的核酸分子のある領域に特異的にアニールすることができる限り、さらなる制限を受けない。いくつかの例示的実施形態では、プライマーは、５～５０ｂｐ、例えば、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０ｂｐの長さを有していてもよい。いくつかの例示的実施形態では、プライマーは、天然に存在する又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。いくつかの例示的実施形態では、プライマーは、天然に存在するヌクレオチドを含むか又は天然に存在するヌクレオチドからなる。いくつかの例示的実施形態では、プライマーは、修飾されたヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。いくつかの好ましい実施形態では、プライマーは、ユニバーサルプライマー配列を含む。

【0035】

いくつかの好ましい実施形態では、本発明のキットは、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼをさらに含む。本発明では、様々な適切なポリメラーゼ使用して、重合反応を行うことができる。いくつかの例示的実施形態では、ポリメラーゼは、鋳型としてＤＮＡを使用して新しいＤＮＡ鎖を合成することができる（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）。いくつかの例示的実施形態では、ポリメラーゼは、鋳型としてＲＮＡを使用して新しいＤＮＡ鎖を合成することができる（例えば、逆転写酵素）。いくつかの例示的実施形態では、ポリメラーゼは、鋳型としてＤＮＡ又はＲＮＡを使用して新しいＲＮＡ鎖を合成することができる（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素からなる群から選択される。

【0036】

いくつかの好ましい実施形態では、本発明のキットは１種又は複数の切除試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、切除試薬は、エンドヌクレアーゼＩＶ及びアルカリホスファターゼからなる群から選択される。

【0037】

いくつかの好ましい実施形態では、本発明のキットは１種又は複数の緩衝溶液をさらに含む。そのような緩衝溶液は、限定されないが、ＤＮａｓｅＩ用の緩衝溶液、ＤＮＡポリメラーゼ用の緩衝溶液、リガーゼ用の緩衝溶液、核酸分子の溶出用の緩衝溶液及び核酸分子の溶解用の緩衝溶液、ヌクレオチド重合反応（例えば、ＰＣＲ）用の緩衝溶液並びにライゲーション反応用の緩衝溶液を含む。本発明のキットは、上記の緩衝溶液のいずれか１つ又は複数を含むことができる。

【0038】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ用の緩衝溶液は、一価塩イオン（例えば、ナトリウムイオン、塩化物イオン）及び／又は二価塩イオン（例えば、マグネシウムイオン、硫酸イオン、マンガンイオン）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝溶液中の一価塩イオン又は二価塩イオンは、１０μＭ～２００ｍＭ、例えば、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ又は２００ｍＭの濃度を有する。

【0039】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ用の緩衝溶液は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝溶液中のトリスは、１０ｍＭ～２００ｍＭ、例えば、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ又は２００ｍＭの濃度を有する。

【0040】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ用の緩衝溶液は、有機溶媒、例えば、ＤＭＳＯ又はグリセロール（グリセロール）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝溶液中の有機溶媒は、０．０１％～１０％、例えば、０．０１％、０．０２％、０．０５％、１％、２％、５％又は１０％の質量含有率を有する。

【0041】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ用の緩衝溶液は、７．０～９．０、例えば、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９又は９．０のｐＨを有する。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ用の緩衝溶液は、一価塩イオン（例えば、ナトリウムイオン、塩素イオン）、二価塩イオン（例えば、マグネシウムイオン、硫酸イオン、マンガンイオン）、トリス及び有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ又はグリセロール）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝溶液相は８．８のｐＨを有する。

【0043】

いくつかの好ましい実施形態では、本発明のキットは１種又は複数の洗浄溶液をさらに含む。そのような洗浄液の例は、限定されないが、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス－ＨＣｌ緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液などを含む。本発明のキットは、上記の洗浄溶液のいずれか１つ又は複数を含むことができる。

【0044】

別の態様では、本出願は、標的ポリヌクレオチドをシークエンシングするための本発明によるスキャニング試薬又はキットの使用を提供する。

【0045】

別の態様では、本出願は、本発明のスキャニング試薬を調製するための方法であって、スキャニング試薬の成分のそれぞれを超純水に溶解させて透明且つ均一な溶液を形成し、次いで、溶液を濾過して本発明のスキャニング試薬を得るステップを含む方法を提供する。溶解を補助するために超音波を使用することができる。

【0046】

別の態様では、本出願は、核酸をシークエンシングするための方法であって、本発明のスキャニング試薬を使用するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のシークエンシング方法は、スキャニング、撮影及び検出を行いながら伸長中の標的一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを合成するステップを含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、目的の一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法は、以下：
（ａ）二本鎖、ヌクレオチド、ポリメラーゼ及び切除試薬を提供するステップであって；二本鎖は、伸長中の核酸鎖及びシークエンスされる核酸分子を含むステップ；
（ｂ）以下のステップ（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む反応サイクルを行うステップ：
ステップ（ｉ）：ポリメラーゼを使用してヌクレオチドを伸長中の核酸鎖中に組み込んで、ブロッキング基及び検出可能な標識を含む核酸中間体を形成するステップ；
ステップ（ｉｉ）：核酸中間体上の検出可能な標識を検出するステップ；
ステップ（ｉｉｉ）：切除試薬を使用して、核酸中間体上のブロッキング基を除去するステップ
を含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、反応サイクルは、ステップ（ｉｖ）：切除試薬を使用して、核酸中間体上の検出可能な標識を除去するステップをさらに含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、方法は、以下：
ステップ１、調製したシークエンシングチップ上にＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）を装填するステップ；
ステップ２、ｄＮＴＰ分子の調製された混合溶液をチップ中にポンピングし、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、試験されるＤＮＡの相補鎖にｄＮＴＰを組み込むステップ；
ステップ３、撮影及びスキャニングステップ。ｄＮＴＰは蛍光基を有する修飾分子であるので、撮影のために励起波長のレーザーを使用し；レーザーはＤＮＡに対して光損傷効果があるので、撮影ステップの間に、光損傷保護剤を含むスキャニング試薬を添加するステップ；
ステップ４、切除試薬を使用して塩基末端蛍光基及び３’－ブロッキング基を除去し、溶出して、反応の次のラウンドのために、３’－ＯＨを曝露したままにするステップ；
ステップ５、写真の結果を解析して、試験される核酸分子の塩基配列を決定するステップ
のステップを含む。

【0050】

本発明では、核酸はヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチドは、糖、核酸塩基及び少なくとも１つのリン酸基を通常含む。ヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、修飾ペプチドヌクレオチド、修飾リン酸糖骨格ヌクレオチド及びこれらの混合物挙げられる。ヌクレオチドの例としては、例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）及びデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）が挙げられる。修飾核酸塩基を含むヌクレオチド類似体を本明細書に記載の方法で使用することもできる。ポリヌクレオチドに含まれ得る例示的修飾核酸塩基としては、天然の骨格を有するか又は同様の構造を有するかにかかわらず、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、２－アミノプリン、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、２－プロピルグアニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、１５－ハロゲン化ウラシル、１５－ハロゲン化シトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル、４－チオウラシル、８－ハロゲン化アデニン又はグアニン、８－アミノアデニン又はグアニン、８－チオアデニン又はグアニン、８－チオアルキルアデニン又はグアニン、８－ヒドロキシアデニン又はグアニン、５－ハロゲン化ウラシル又はシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、８－アザグアニン、８－ザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニンなどが挙げられる。当技術分野で既知であるように、アデノシン５’－ホスホリルスルフェートなどのヌクレオチド類似体などのある特定のヌクレオチド類似体は、ポリヌクレオチドに組み込むことができない。

【0051】

本発明の方法では、シークエンスされる核酸分子はその長さによって制限されない。いくつかの好ましい実施形態では、シークエンスされる核酸分子の長さは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ又は少なくとも２０００ｂｐであり得る。いくつかの好ましい実施形態では、シークエンスされる核酸分子の長さは、１０～２０ｂｐ、２０～３０ｂｐ、３０～４０ｂｐ、４０～５０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、１００～２００ｂｐ、２００～３００ｂｐ、３００～４００ｂｐ、４００～５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、１０００～２０００ｂｐ又は２０００ｂｐ超であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、シークエンスされる核酸分子の長さは、ハイスループットシークエンシングを容易にするために、１０～１０００ｂｐを有していてもよい。

【0052】

いくつかの好ましい実施形態では、核酸分子を支持体上に固定化するより前に、核酸分子を前処理することができる。そのような前処理は、限定されないが、核酸分子の断片化、末端のフィルイン、アダプターの付加、タグの付加、核酸分子の増幅、核酸分子の単離及び精製並びにこれらの任意の組み合わせを含む。

【0053】

本明細書で使用する場合、用語「ナノボール」は、例えば、内径が典型的には約１ｎｍ～約１０００ｎｍ、好ましくは、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの範囲である、コンパクトな（ほぼ）球状の形を有する巨大分子又は複合体を一般に指す。

【0054】

本明細書で使用する場合、用語「核酸ナノボール」は、一般に、複数コピーの標的核酸分子を含むコンカテマーである。これらの核酸コピーは、典型的には、ヌクレオチドの連続的な直鎖状に次々に配置されるが、本発明の核酸ナノボールは、本明細書に記載の方法を使用して任意の核酸分子から作製することもできる。ＤＮＡの一本鎖の性質とともに、このタンデムリピート構造は、ナノボールの折りたたみ構造をもたらす。一般に、核酸ナノボール中の複数コピーの標的核酸分子はそれぞれ、その増幅又はシークエンシングを容易にすることが既知の配列を有するリンカー配列を含む。各標的核酸分子のリンカー配列は通常同じであるが、異なっていてもよい。核酸ナノボールは、ＤＮＡナノボールを通常含み、これは、本明細書でＤＮＢ（ＤＮＡナノボール）とも称される。

【0055】

核酸ナノボールは、例えばローリングサークル複製（ＲＣＡ）を使用して、生成することができる。ＲＣＲプロセスは、Ｍ１３ゲノムの複数の連続したコピーを調製するために使用された（Ｂｌａｎｃｏら、（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：８９３５～８９４０）。この方法では、核酸は直鎖状コンカテマーで複製される。当業者なら、米国特許第５，４２６，１８０号、第５，８５４，０３３号、第６，１４３，４９５号及び第５，８７１，９２１号を含めたいくつかの参考文献で、ＲＣＲ反応ための条件及び試薬の選択に関する手引きを見つけることができ；すべての目的のために、特に、ＲＣＲ又は他の方法による核酸ナノボールの調製に関するすべての教示を利用する目的のために、これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0056】

核酸ナノボールは、本明細書に記載の固体支持体の表面に装填することができる。ナノボールは、任意の適切な方法によって固体支持体の表面に付着させることができ、そのような方法の非限定例としては、核酸ハイブリダイゼーション、ビオチン－ストレプトアビジンコンジュゲーション、スルフヒドリルコンジュゲーション、光活性化コンジュゲーション、共有結合的コンジュゲーション、抗体－抗原、ヒドロゲル若しくは他の多孔質ポリマーなどによる物理的閉じ込め又はそれらの組み合わせが挙げられる。ある場合には、ナノボールをヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡヌクレアーゼ）で消化して、より小型のナノボール又はナノボールの断片を生成することができる。

【0057】

いくつかの実施形態では、固体支持体の表面は、ポリヌクレオチド分子の相補的官能基と反応して、共有結合を形成する反応性官能基を有することができ、これは、例えば、マイクロアレイにｃＤＮＡを付着させるのと同じ技法を使用することによるものであり、この技法は、例えば、Ｓｍｉｒｎｏｖら（２００４）、Ｇｅｎｅｓ、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ＆Ｃａｎｃｅｒ、４０：７２～７７及びＢｅａｕｃａｇｅ（２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８：１２１３～１２４４で報告されており、これらの両方とも参照により本明細書に組み込まれる。ＤＮＢはまた、低濃度の様々な反応性官能基（例えば、－ＯＨ基）によって清潔なガラス表面などの疎水性表面に効果的に付着させることができる。表面上でポリヌクレオチド分子と反応性官能基の間に形成される共有結合を介した付着は、本明細書では、「化学的付着」とも称する。

【0058】

他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子を表面に吸着させることができる。本実施形態では、ポリヌクレオチドは、表面との非特異的相互作用を通じて、又は非共有結合的相互作用、例えば、水素結合、ファンデルワールス力などを通じて、固定化される。

【0059】

他の実施形態では、核酸ライブラリーは二本鎖核酸断片であってもよく、これは、固体支持体の表面に固定化されたオリゴヌクレオチドとのライゲーション反応を通じて固体支持体の表面に固定化され、次いで、ブリッジ増幅反応が行われて、シークエンシングライブラリーが調製される。

【発明の効果】

【0060】

有益効果
本発明は、以下の有益効果を達成することができる：
本発明は、核酸に対する光損傷保護剤としてサポニン化合物を使用し、サポニン化合物は、非常に低濃度であっても鋳型ヌクレオチドを保護することができる。本発明で使用するサポニン化合物は、紫外及び可視光領域で吸収がない。シークエンシング反応の複数ラウンド後でさえ、データ品質は依然として非常に高く、塩基認識シグナルへの干渉がなく、長期保存中の酸化によって引き起こされる退色現象がない。本発明の最適化されたスキャニング試薬を使用することによって、核酸シークエンシング、特に、ポリヌクレオチドシークエンシングの品質を大きく改善することができる。

【図面の簡単な説明】

【0061】

【図1】実施例におけるシークエンシング品質に対するスキャニング試薬組成の効果を示す図である。

【図2】実施例におけるシークエンシング品質に対するノトギンセノシドＲ１の濃度の効果を示す図である。

【図3】実施例におけるシークエンシング品質に対するトロロクスの濃度の効果を示す図である。

【図4】実施例におけるシークエンシング品質に対するＥＤＴＡ－４Ｎａの濃度の効果を示す図である。

【図5】実施例におけるシークエンシング品質に対するＤＴＴの濃度の効果を示す図である。

【図6】実施例におけるシークエンシング品質に対するギンセノシドＲｇ１の様々な濃度の効果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0062】

添付の図面及び実施例を参照して、本発明の実施形態を以下に詳細に記載する。しかし、以下の図面及び実施例は本発明を例示するために使用されるのみであり、本発明の範囲を限定しないことを当業者なら理解するであろう。本発明の様々な目的及び有利な態様は、添付の図面及び好ましい実施形態の以下の詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。

【0063】

実施例を参照して、本発明の実施形態を以下に詳細に記載するが、以下の実施例は、本発明を例示するために使用されるのみであり、本発明の範囲を限定すると考えるべきではないことを当業者なら理解するであろう。具体的な条件が実施例で明記されていない場合、その条件は、従来の条件又は製造者によって推奨される条件に従って行われるべきである。使用される試薬又は機器の製造者が示されない場合、これらはすべて、商業的に購入することができる従来の製品である。

【実施例】

【0064】

１．実験設備
ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシークエンサー、ＭＧＩＤＬ－２００Ｈローダー及びＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシークエンシングスライド。機器の励起波長は、それぞれ５３２ｎｍ及び６５０ｎｍである。

【0065】

２．実験で使用する試薬及び原材料
トリス塩基（粉末）、塩化ナトリウム（粉末）、Ｔｗｅｅｎ－２０、トリス－ＨＣｌ（粉末）、ノトギンセノシドＲ１、トロロクス、エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物、Ｌ－ジチオスレイトール、ギンセノシドＲｇ１。上記の試薬は、対応している（ｃｏｍｐｌｉａｎｔ）化学試薬供給会社から購入した。ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシークエンシングキットのカタログ番号は１００００１２５３６であり、ブランドはＭＧＩであった。標準ライブラリー試薬Ｖ３．０である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）一本鎖環状ＤＮＡを鋳型として使用し、プライマー配列は、ＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴであった。さらに、可逆的ブロッキング基修飾及びＣｙ５蛍光修飾の両方を有するアデニンヌクレオチド指すｄＡＴＰ－１；可逆的ブロッキング基修飾とＲＯＸ蛍光修飾の両方を有するチミンヌクレオシドを指すｄＴＴＰ－１；可逆的ブロッキング基修飾とＣｙ３蛍光修飾の両方を有するグアニンヌクレオチドを指すｄＧＴＰ－１；及び可逆的ブロッキング基修飾とＥＦ７００蛍光修飾の両方を有するシトシンヌクレオチドを指すｄＣＴＰ－１はすべて、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシークエンシングキットＭＧＩのものである。

【0066】

３．実験方法：
（ａ）スキャニング試薬の調製
トリス塩基（粉末）、塩化ナトリウム（粉末）、Ｔｗｅｅｎ－２０、トリス－ＨＣｌ（粉末）、ノトギンセノシドＲ１、トロロクス、エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物、Ｌ－ジチオスレイトール及びギンセノシドＲｇ１を、実験の各セットで必要とされる比に従って超純水に溶解した。２０分間の超音波により溶解を行い、上記の試薬を溶解して、透明且つ均一な溶液を形成し、後の使用のために、０．２２マイクロメートルの濾過膜を通してこの溶液を濾過した。

【0067】

（ｂ）ＤＮＡシークエンシング方法：
シークエンシングプロセス：第１のステップでは、調製したシークエンシングチップ上にＤＮＢナノボールを装填した。

【0068】

第２のステップでは、ｄＮＴＰ分子の調製された混合溶液をチップ中にポンピングし、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡ親鎖の相補鎖にｄＮＴＰを添加した。

【0069】

第３のステップでは、写真を撮り、スキャンした。ｄＮＴＰが、蛍光基を有する修飾分子であったので、励起波長のレーザーを使用して撮影した。レーザーがＤＮＡに光損傷を引き起こす可能性あったので、この撮影ステップで、スキャニング試薬を保護剤として使用した。撮影後、塩基の種類を特定した。

【0070】

第４のステップでは、塩基末端蛍光基及び３’－ブロッキング基を切除試薬で切除し、溶出し、反応の次のラウンドのために、３’－ＯＨを曝露させた。

【0071】

ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳハイスループットシークエンシングキットを使用し、キットの＃１０ウェル試薬をスキャニング試薬の対照として使用し、上記の実験プロセスに従って、ＭＧＩＳＥＱ－２０００ＲＳシークエンシングプラットフォームでＰＥ１００＋７０シークエンシングを行った。要するに、各実験群において、キットの＃１０ウェル中のスキャニング試薬を、研究の対象物として調製したスキャニング試薬と置き換え、次いで、各サイクルについてのＱ３０の低下及び各サイクルについてのシークエンシングエラー率曲線を計算して、シークエンシング品質を評価した。

【0072】

実験１：シークエンシング品質に対するスキャニング試薬組成の効果の評価
表１に示す組成に従って塩基緩衝溶液を調製し、この溶液は、全体積が１Ｌであり、ｐＨが７．０３であった。様々な化合物を塩基緩衝液に添加することによりスキャニング試薬を調製し、次いで、これらの試薬をシークエンシングに供した。シークエンシング実験の各セットで使用したスキャニング試薬の組成を表２に示した。その中で、ノトギンセノシドＲ１の濃度は１．７ｍＭであり、トロロクスの濃度は８ｍＭであり、ＥＤＴＡ－４Ｎａの濃度は１０ｍＭであり、Ｌ－ジチオスレイトールの濃度は８ｍＭであった。図１に、シークエンシング品質に対するスキャニング試薬組成の効果を示した。

【表2】

【表3】

【0073】

図１では、横軸はシークエンシングサイクル反応の数であり、縦軸は塩基精度が９９．９％を超える確率であった。曲線のデータの縦軸の値が大きいほど、シークエンシングの品質が高く、すなわち、傾きが上向きなほど、よいデータであった。溶液が塩基緩衝溶液であった条件下で、各単一因子実験（実験２～６を参照されたい）の最適化された結果を試験のためにスーパーインポーズし、この結果によって、最適化された濃度条件下で、塩基＋Ｓ＋Ｔ＋ＥＤＴＡ－４Ｎａが最もよいシークエンシング品質を示し、第１鎖及び第２鎖のすべてのＱ３０値並びに保持時間が最もよいことが示された。

【0074】

実験２～６では、単一因子実験を使用して、シークエンシング品質に対する様々な添加剤の濃度の効果を研究し、使用される塩基緩衝溶液の組成は実施例１のものと同じであった。

【0075】

実験２：シークエンシング品質に対するノトギンセノシドＲ１の濃度の効果の評価
様々な濃度のノトギンセノシドＲ１を塩基緩衝溶液に添加することによってスキャニング試薬を得て、これをシークエンシングに使用した。シークエンシング実験の各セットで使用したスキャニング試薬の組成を表３に示した。

【表4】

【0076】

図２に、シークエンシング品質に対するノトギンセノシドＲ１の濃度の効果を示した。図２から、シークエンシング品質は、ノトギンセノシドＲ１の濃度が１．７０ｍＭである場合により高く、第２鎖のＱ３０が緩徐に低下することが分かった。したがって、ノトギンセノシドＲ１の濃度が１．７０ｍＭであることが、シークエンシング品質を改善するのにより適していた。

【0077】

実験３：シークエンシング品質に対するトロロクスの濃度の効果の評価
様々な濃度のトロロクスを塩基緩衝溶液に添加することによってスキャニング試薬を得て、これをシークエンシングに使用した。シークエンシング実験の各セットで使用したスキャニング試薬の組成を表４に示した。

【表5】

【0078】

図３に、シークエンシング品質に対するトロロクスの濃度の効果を示した。図３から、シークエンシング品質は、トロロクスの濃度が８ｍＭである条件下でより高く、第２鎖のＱ３０は緩徐が低下することが分かった。したがって、トロロクスの濃度が８ｍＭであることが、シークエンシング品質を改善するのにより適していた。

【0079】

実験４：シークエンシング品質に対するＥＤＴＡ－４Ｎａの濃度の効果の評価
８ｍＭトロロクス、１．７ｍＭノトギンセノシドＲ１及び様々な濃度のＥＤＴＡ－４Ｎａを塩基緩衝溶液に添加することによってスキャニング試薬を得て、これをシークエンシングに使用した。ＥＤＴＡ－４Ｎａの濃度は、それぞれ、０ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ及び５０ｍＭであった。シークエンシング実験の各セットで使用したスキャニング試薬の組成を表５に示した。

【表6】

【0080】

図４に、シークエンシング品質に対するＥＤＴＡ－４Ｎａの効果を示した。図４から、シークエンシング品質は、ＥＤＴＡ－４Ｎａの濃度が１０ｍＭである場合により高く、第１鎖のＱ３０が最も高く、第２鎖のＱ３０は緩徐に低下することが分かった。したがって、ＥＤＴＡ－４Ｎａの濃度が１０ｍＭであることが、シークエンシング品質を改善するのにより適していた。
実験５：シークエンシング品質に対するＤＴＴ濃度の効果の評価
８．００ｍＭトロロクス、１．７０ｍＭノトギンセノシドＲ１及び様々な濃度のＤＴＴを塩基緩衝溶液に添加することによってスキャニング試薬を得て、これをシークエンシングに使用した。ＤＴＴの濃度は、それぞれ、０ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭであった。シークエンシング実験の各セットで使用したスキャニング試薬の組成を表６に示した。

【表7】

【0081】

図５に、シークエンシング品質に対するＤＴＴ濃度の効果を示した。図５から、シークエンシング品質は、ＤＴＴの濃度が１０ｍＭである場合により高いことが分かった。第１鎖及び第２鎖のＱ３０値に基づくと、ＤＴＴの濃度が８ｍＭであることが、シークエンシング品質を改善するのにより適していた。

【0082】

実験６：シークエンシング品質に対するギンセノシドＲｇ１の様々な濃度の効果の評価
塩基＋Ｓ＋Ｔ＋ＥＤＴＡ－４Ｎａ＋Ｄ溶液（塩基緩衝溶液＋１．７０ｍＭノトギンセノシドＲ１＋８．００ｍＭトロロクス＋１０．００ｍＭエチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩二水和物＋８．００ｍＭ Ｌ－ジチオスレイトール）を基に、様々な濃度のギンセノシドＲｇ１をこの溶液に添加することによってスキャニング試薬を得て、シークエンシングに使用した。ギンセノシドＲｇ１の濃度は、それぞれ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、４０ｍＭ及び６０ｍＭであった。シークエンシング実験の各セットで使用したスキャニング試薬の組成を表７に示した。標準的な市販キットのビタミンＣナトリウム塩を光損傷保護剤として使用した。本実験では、標準的なキットの＃１０ウェルを対照として使用した。

【表8】

【0083】

図６に、シークエンシング品質に対するギンセノシドＲｇ１の濃度の効果を示した。図６から、ギンセノシドＲｇ１の濃度が６０．００ｍＭである条件下で、光損傷保護剤としてビタミンＣナトリウム塩を使用したものと比較して、本発明のスキャニング試薬を使用した場合のシークエンシング品質が、効果がより高く、第１及び第２鎖のＱ３０値並びに保持時間が、対照群のビタミンＣナトリウム塩のものよりもすべて高いことが分かった。

【0084】

結論：最終的な最適化されたスキャニング試薬組成を表８に示した。

【表9】

【0085】

上記の実施例は本発明の技術的解決法を例示するためのみに使用されるが、それらを限定するものではない。本発明の技術的解決法の目的及び範囲を逸脱しない、本発明の技術的解決法の任意の修正又は等価な置き換えは、本発明の保護範囲内に入るものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】