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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-29
(54)【発明の名称】腫瘍モニタリングのための方法およびシステム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6886 20180101AFI20241022BHJP
G16B 25/10 20190101ALI20241022BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20241022BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20241022BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6886 Z
G16B25/10
C12M1/34 B
C12Q1/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024521051
(86)(22)【出願日】2022-10-07
(85)【翻訳文提出日】2024-06-05
(86)【国際出願番号】 EP2022077987
(87)【国際公開番号】W WO2023057641
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】2114434.0
(32)【優先日】2021-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】598176569
【氏名又は名称】キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100173565
【弁理士】
【氏名又は名称】末松 亮太
(74)【代理人】
【識別番号】100195408
【弁理士】
【氏名又は名称】武藤 陽子
(72)【発明者】
【氏名】フランケル，アレクサンダー・マーク
(72)【発明者】
【氏名】アボシュ，クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】スワントン，ロバート・チャールズ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB20
4B029FA15
4B063QA01
4B063QA17
4B063QA19
4B063QQ42
4B063QS36
4B063QS40
(57)【要約】
本発明は、対象における少なくとも１つの腫瘍特異的変異のがん細胞割合（ＣＣＦ）を推定するためのコンピュータにより実施される方法を提供する。腫瘍のクローン動態をモニタリングし、腫瘍の治療をモニタリングするための方法、およびがんを有する対象を治療するための方法、ならびに本発明の方法を実施するためのシステムも提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における少なくとも１つの腫瘍特異的変異のがん細胞割合（ＣＣＦ）を推定するためのコンピュータにより実施される方法であって、前記方法は、（ｉ）前記対象からの循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含むセルフリーＤＮＡを含む試料から得られた配列データを提供するステップであって、前記配列データは、前記腫瘍特異的変異を示す前記試料中のリードの総数を、前記腫瘍特異的変異の位置におけるリードの総数（変異型および生殖細胞系列）で除算したものに等しいバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）を含む、ステップと、
（ｉｉ）前記対象の腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む試料から得られた配列データを提供するステップであって、前記配列データは、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異の多重度と、前記腫瘍特異的変異の位置におけるコピー数（ＣＮｔｕｍｏｕｒ）とを含む、ステップと、
（ｉｉｉ）前記腫瘍特異的変異の前記位置における生殖細胞系列コピー数（ＣＮｎｏｒｍａｌ）を提供するステップと、
（ｉｖ）セルフリーＤＮＡを含む前記試料の純度の推定値を提供するステップであって、前記純度は、腫瘍細胞であるサンプリングされたＤＮＡに寄与する細胞の比率である、ステップと、
（ｖ）式：
【数1】
ＶＡＦは（ｉ）において提供され、多重度およびＣＮｔｕｍｏｕｒは（ｉｉ）において提供され、ＣＮｎｏｒｍａｌは（ｉｉｉ）において提供され、純度は（ｉｖ）において提供されるものである、ステップと
を含む、方法。
【請求項2】
セルフリーＤＮＡを含む前記試料の純度の推定値を提供するステップは、クローナル変異であると以前に判断された複数の更なる腫瘍特異的変異の各々について、前記セルフリーＤＮＡを含む試料中の前記更なる変異の前記ＶＡＦ、前記更なる変異の多重度、前記更なる変異の前記ＣＮｔｕｍｏｕｒ、および前記更なる変異の前記位置における前記ＣＮｎｏｒｍａｌを提供するステップと、
式：
【数2】
前記複数の更なる変異の各々の前記変異特異的純度値を平均することによって、前記試料の前記純度を推定するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異は、腫瘍細胞の単一のサブクローナル集団に属する少なくとも２、３、４個のまたは少なくとも５個の腫瘍特異的変異を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記単一のサブクローナル集団に属する前記腫瘍特異的変異の各々の前記推定ＣＣＦは、腫瘍細胞の前記サブクローナル集団のためのＣＣＦ推定値を提供するように平均される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
細胞の所与のサブクローナル集団からの前記腫瘍特異的変異を示す前記試料におけるリードの数が、真正である可能性が高いかまたは配列決定誤りに起因したものであるかを推定するために、バックグラウンド配列決定誤りの訂正が適用される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
（ｉ）前記サブクローナル集団からの前記腫瘍特異的変異を示す前記試料におけるリードの総数と、（ｉｉ）前記腫瘍特異的変異の各々の前記位置におけるバックグラウンド配列決定誤り率に、前記腫瘍特異的変異の各々の前記位置におけるリードの総数を乗算したものとを比較するために、統計的検定が適用される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
統計的検定のｐ値が０．０５よりも大きい場合、前記細胞のサブクローナル集団は、前記試料中にないとみなされる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記統計的検定は、二項検定、ポアソン検定、ウィルコクソンの１標本順位和検定、カイ二乗およびフィッシャーの正確検定からなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項9】
前記対象の腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む前記試料は、セルフリーＤＮＡを含む前記試料よりも早い時点に得られる、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
様々な時点に、前記対象からの、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含むセルフリーＤＮＡを含む複数の試料から得られた配列データが提供される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記様々な時点は、前記腫瘍の治療の過程中の様々な時点を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
セルフリーＤＮＡを含む前記または各試料の純度は、５％以下、例えば４％、３％、２％、１％または０．５％以下である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異は、ネオアンチゲンの疑いがあるものまたはネオアンチゲンとわかっているものを発生させ、かつ／または抗がん治療の標的を発生させる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
ユーザに、少なくとも１つの腫瘍特異的変異および／または少なくとも１つのクローナルもしくはサブクローナル腫瘍細胞集団の前記決定されたＣＣＦを提供することを更に含み、任意選択で、前記決定されたＣＣＦはユーザインタフェース上に表示されるか、またはネットワークを介して前記ユーザに送信される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
対象における少なくとも１つの腫瘍特異的変異のがん細胞割合（ＣＣＦ）を推定するための方法であって、前記方法は、前記対象から得られたｃｆＤＮＡ含有試料を提供するステップであって、前記試料はｃｔＤＮＡを含む、ステップと、
前記ｃｆＤＮＡ含有試料から、または前記ｃｆＤＮＡ含有試料から準備されたライブラリから、ＤＮＡを配列決定し、配列データを生成するステップと、
前記配列データを用いて請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法を実行し、それによって、前記対象における前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異のＣＣＦを推定するステップと
を含む、方法。
【請求項16】
前記対象の腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む試料を提供するステップと、腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む前記試料から、または腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む前記試料から準備されたライブラリから、ＤＮＡを配列決定し、腫瘍組織配列データを生成するステップと、
前記生成された腫瘍組織配列データを分析して、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異の多重度、および前記腫瘍特異的変異の位置におけるコピー数（ＣＮｔｕｍｏｕｒ）を決定するステップと
を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
対象における、少なくとも１つの腫瘍特異的変異、または前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異を有する腫瘍細胞の集団を、潜在的治療標的として同定するための方法であって、前記方法は、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法を少なくとも１回実行して、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異、または前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異を有する細胞の集団のＣＣＦを推定するステップと、
前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異、または前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異を有する細胞の集団を、
前記ＣＣＦが少なくとも０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または少なくとも０．９５であると推定されること、
前記ＣＣＦが、少なくとも２つの異なる時点において推定され、上昇していることがわかっていること、および、
前記ＣＣＦが、前記腫瘍の治療介入の前後に推定され、前記ＣＣＦが、前記治療介入後に減少していることがわかっていること
のうちの少なくとも１つが真であるならば、潜在的治療標的として選択するステップと
を含む、方法。
【請求項18】
腫瘍のクローン動態をモニタリングし、かつ／または前記腫瘍の治療をモニタリングするための方法であって、前記方法は、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法を実行して、同じ対象について２つ以上の時点に、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異、または前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異を有する細胞の集団の前記ＣＣＦを推定するステップと、
前記２つ以上の時点における前記推定ＣＣＦを追跡して、前記ＣＣＦの経時的変化をモニタリングするステップと
を含む、方法。
【請求項19】
少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のもしくは少なくとも２０個の腫瘍特異的変異のＣＣＦ、および／または前記腫瘍の細胞の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくは少なくとも２０個のクローン的に別個の集団のＣＣＦが推定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異は、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）、多重ヌクレオチドバリアント（ＭＮＶ）、欠失変異、挿入変異、インデル変異、転座、ミスセンス変異、転座、融合、スプライス部位変異、または腫瘍細胞の遺伝物質の他の変化からなる群から選択される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異の結果として、変異したＤＮＡがネオアンチゲンをエンコードし、かつ／または、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異は、抗がん治療の標的であるかもしくはこれをエンコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
がんを有する対象を治療するための方法であって、前記方法は、請求項２１に記載の方法を実行するステップであって、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異の前記推定ＣＣＦは、前記腫瘍特異的変異が、前記腫瘍内に、前記腫瘍特異的変異を治療の有効な標的にするのに十分なレベルでプレゼントにおいて存在することを示す、ステップと、
前記腫瘍特異的変異を標的にする抗がん治療を施すステップと
を含む、方法。
【請求項23】
前記ＣＣＦが少なくとも０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または少なくとも０．９５であると推定されること、前記ＣＣＦが、少なくとも２つの異なる時点において推定され、上昇していることがわかっていること、および、
前記ＣＣＦが、前記抗がん治療を施す前後に推定され、前記ＣＣＦが、前記治療を施した後に減少していることがわかっていること
のうちの少なくとも１つが真である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記対象における前記腫瘍は、転移したか、または転移が疑われ、前記対象は、１つまたは複数の腫瘍の外科的除去を目的とした治療を受け、
前記対象は、１つまたは複数の抗がん治療薬を用いて治療され、かつ／または
前記対象は、がんが再発したか、または前記対象はがん再発のリスクがあることが疑われる、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
プロセッサと、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法のステップを実行させる命令を含むコンピュータ可読媒体と
を備える、システム。
【請求項26】
１つまたは複数のプロセッサによって実行されると、前記１つまたは複数のプロセッサに、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法のステップを実行させる命令を含む、１つまたは複数のコンピュータ可読媒体。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年１０月８日に出願されたＧＢ２１１４４３４．０の優先権を主張し、その内容および要素は、参照によりあらゆる目的で本明細書に引用される。
本発明は、がん検出およびモニタリングに関し、特に、排他的ではないが、特定のゲノム事象を有する腫瘍における細胞のがん細胞割合（ＣＣＦ）を推定および／または定量化するための方法に関する。時間の経過に伴う腫瘍のクローンアーキテクチャを特定することにより、時間の経過に伴う治療耐性の追跡が容易になり、クローナルであるかまたは再発時にクローナルになり、したがって最適治療標的となる事象の正確な識別が可能になる。
本発明は、がん検出およびモニタリングに関し、特に、排他的ではないが、特定のゲノム事象を有する腫瘍における細胞のがん細胞割合（ＣＣＦ）を推定および／または定量化するための方法に関する。時間の経過に伴う腫瘍のクローンアーキテクチャを特定することにより、時間の経過に伴う治療耐性の追跡が容易になり、クローナルであるかまたは再発時にクローナルになり、したがって最適治療標的となる事象の正確な識別が可能になる。
【背景技術】
【0002】
抵抗性がん細胞集団の増生は、腫瘍学における治療の失敗の一般的なメカニズムである。効果的な個人化された薬剤は、全ての腫瘍細胞内に存在する異常を標的化することに依拠する。しかしながら、腫瘍は不均一であり、包括的な腫瘍組織サンプリングは多くの場合に不可能である。固形腫瘍の多領域サンプリングが可能である場合であっても、空間的に制約されたクローンが過剰サンプリングまたは過小サンプリングされる場合があるため、大きなサンプリングバイアスが存在する場合がある。リキッドバイオプシーは、疾患の経過を通じて定期的間隔で代表的な腫瘍サンプリングを提供する可能性を有するが、現在のクローナルデコンボリューション方法は、ほとんどの試料を局所化または微小残存病変（ＭＲＤ）設定において含む低腫瘍内容物試料（＜５％）において無効である。
【0003】
単一領域または多領域バルクＤＮＡ配列決定データからがんのサブクローンアーキテクチャを再構成するための多岐にわたるアルゴリズムが開発された（例えば、Ｌｉｕ，Ｌ．Ｙ．，Ｂｈａｎｄａｒｉ，Ｖ．，Ｓａｌｃｅｄｏ，Ａ．他「Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｓｕｂｃｌｏｎａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ（腫瘍サブクローナル再構成に対する変異検出の影響の定量化）」Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，６２４７（２０２０）を参照）。ヒトのがんにおける体細胞ＤＮＡ変化の絶対定量化およびＡＢＳＯＬＵＴＥアルゴリズムについては、Ｃａｒｔｅｒ他「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ネイチャーバイオテクノロジー）」２０１２，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．５，ｐｐ．４１３－４２１に記載されている。
【0004】
ＵＳ２０２０／０２４８２６６は、通常、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）等の腫瘍変異の多重ＰＣＲによる、対象が有する腫瘍のクローナル／サブクローナル変異プロファイルの理解、およびそれらのセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）における変異の検出に基づいて、腫瘍の再発を検出するための対象固有の方法を記述している。
【0005】
Ｆｒａｎｋｅｌｌ他、２０２２，［ａｂｓｔｒａｃｔ］．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０２２；２０２２ Ａｐｒ８－１３。Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＰＡ）：ＡＡＣＲ；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０２２；８２（１２＿Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ２１４４は、肺ＴＲＡＣＥＲｘにおけるｃｆＤＮＡを用いたクローン動態の全体サンプリングについて記載している。
【0006】
組織配列決定を用いて腫瘍のクローンアーキテクチャを特定するための方法が、過去１０年にわたって開発されてきた。しかしながら、これらの方法は、通例、それらの超低純度、すなわち、これらの試料における非常に低いパーセンテージ、通例＜１％のＤＮＡのみが腫瘍に由来することに起因して、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）試料に適用可能でない。これは、コピー数事象の正確な呼び出しを妨げ、ここで、全染色体または染色体の一部は増幅または削除されており、これは通例、全エクソームまたは全ゲノムのディープ配列決定であっても少なくとも１０％の細胞充実度を要求し、ゲノム事象（すなわち、ＣＣＦ）を有する腫瘍内の細胞のパーセンテージを正確に推定するために多数のこれらの事象を有するほとんどのがん腫において不可欠である。変異は、変異することが知られているゲノム位置の標的化された超ディープ配列決定を用いて超低細胞充実度試料において検出することができる。したがって、超低純度は、標準的なクローナリティ抽出方法を、大多数のｃｔＤＮＡ試料において適用不可能であるか大きく不正確なものにする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、上記の検討事項に鑑みて考案された。本発明は、腫瘍モニタリングおよびＣＣＦ推定の従来の方法に伴う問題を緩和し、特に、或る特定の関連する利点を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、一致した腫瘍組織配列決定から、各変異位置におけるコピー数状態、および各変異が属するクローン群の推定値を取得する方法を展開し、この情報を、組織クローナリティ抽出方法からの式の再構成およびバックグラウンド配列決定ノイズの推定値と共に用いて、クローンアーキテクチャを正確にデコンボリューションする。本明細書に詳細に説明されるように、がん細胞割合（ＣＣＦ）の結果として得られる推定値は、がんの治療および予後に関するサブクローナル腫瘍動態への実用的な洞察を提供することが可能である。いくつかの実施形態では、ＣＣＦのこれらの推定値は、サンプリングバイアスがより生じにくいため、組織サンプリングのみを用いて得られる推定値よりも優れている。
【0009】
したがって、本発明の第１の態様は、対象における少なくとも１つの腫瘍特異的変異のがん細胞割合（ＣＣＦ）を推定するためのコンピュータにより実施される方法を提供し、この方法は、
（ｉ）対象からの循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含むセルフリーＤＮＡを含む試料から得られた配列データを提供することであって、配列データは、腫瘍特異的変異を示す試料中のリードの総数を、腫瘍特異的変異の位置におけるリードの総数（変異型および生殖細胞系列）で除算したものに等しいバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）を含むことと、
（ｉｉ）対象の腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む試料から得られた配列データを提供することであって、配列データは、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異の多重度と、腫瘍特異的変異の位置におけるコピー数（ＣＮｔｕｍｏｕｒ）とを含むことと、
（ｉｉｉ）腫瘍特異的変異の位置における生殖細胞系列コピー数（ＣＮｎｏｒｍａｌ）を提供することと、
（ｉｖ）セルフリーＤＮＡを含む前記試料の純度の推定値を提供することであって、純度は、腫瘍細胞であるサンプリングされたＤＮＡに寄与する細胞の比率であることと、
（ｖ）式：
に従って、少なくとも１つの腫瘍特異的変異のＣＣＦの推定値を決定することであって、ここで、
ＶＡＦは（ｉ）において提供され、多重度およびＣＮｔｕｍｏｕｒは（ｉｉ）において提供され、ＣＮｎｏｒｍａｌは（ｉｉｉ）において提供され、純度は（ｉｖ）において提供されるものであることと
を含む。
（ｉ）対象からの循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含むセルフリーＤＮＡを含む試料から得られた配列データを提供することであって、配列データは、腫瘍特異的変異を示す試料中のリードの総数を、腫瘍特異的変異の位置におけるリードの総数（変異型および生殖細胞系列）で除算したものに等しいバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）を含むことと、
（ｉｉ）対象の腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む試料から得られた配列データを提供することであって、配列データは、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異の多重度と、腫瘍特異的変異の位置におけるコピー数（ＣＮｔｕｍｏｕｒ）とを含むことと、
（ｉｉｉ）腫瘍特異的変異の位置における生殖細胞系列コピー数（ＣＮｎｏｒｍａｌ）を提供することと、
（ｉｖ）セルフリーＤＮＡを含む前記試料の純度の推定値を提供することであって、純度は、腫瘍細胞であるサンプリングされたＤＮＡに寄与する細胞の比率であることと、
（ｖ）式：
【数1】
ＶＡＦは（ｉ）において提供され、多重度およびＣＮｔｕｍｏｕｒは（ｉｉ）において提供され、ＣＮｎｏｒｍａｌは（ｉｉｉ）において提供され、純度は（ｉｖ）において提供されるものであることと
を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、セルフリーＤＮＡを含む前記試料の純度の推定値を提供することは、
クローナル変異であると以前に判断された複数の更なる腫瘍特異的変異の各々について、セルフリーＤＮＡを含む試料中の更なる変異のＶＡＦ、更なる変異の多重度、更なる変異のＣＮｔｕｍｏｕｒ、および更なる変異の位置におけるＣＮｎｏｒｍａｌを提供することと、
式：
に従って、前記複数の更なる変異の各々の変異特異的純度を決定することと、
前記複数の更なる変異の各々の変異特異的純度値を組み合わせる（例えば、平均する）ことによって、前記試料の純度を推定することと
を含む。
クローナル変異であると以前に判断された複数の更なる腫瘍特異的変異の各々について、セルフリーＤＮＡを含む試料中の更なる変異のＶＡＦ、更なる変異の多重度、更なる変異のＣＮｔｕｍｏｕｒ、および更なる変異の位置におけるＣＮｎｏｒｍａｌを提供することと、
式：
【数2】
前記複数の更なる変異の各々の変異特異的純度値を組み合わせる（例えば、平均する）ことによって、前記試料の純度を推定することと
を含む。
【0011】
いくつかの場合、少なくとも１つの腫瘍特異的変異は、腫瘍細胞の単一のサブクローナル集団に属する少なくとも２つ、３つ、４つのまたは少なくとも５つの腫瘍特異的変異を含む。
【0012】
いくつかの場合、単一のサブクローナル集団に属する前記腫瘍特異的変異の各々の推定ＣＣＦは、腫瘍細胞のサブクローナル集団のためのＣＣＦ推定値を提供するように組み合わされる（例えば、平均される）。
【0013】
本発明の方法のステップの順序、およびステップの時間間隔は特に制限されていない。例えば、腫瘍組織試料およびセルフリーＤＮＡ試料を同時に取得することができることが特に考慮されている。これは、本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法が、腫瘍組織試料にのみ由来する変異またはがん細胞集団について行われるクローナリティの判断の信頼性を改善することができるという点で、特に利点を有することができる。いくつかの場合、セルフリーＤＮＡ試料（例えば、血漿試料）は、腫瘍組織試料と比較して、後の時点（例えば、数時間、数日、数か月または更には数年後）に取得することができる。複数のセルフリーＤＮＡ試料を、様々な時点に、例えば特にがん治療の文脈においてがんのモニタリングの一部として取得することができることが特に考慮されている。
【0014】
いくつかの場合、細胞の所与のサブクローナル集団からの腫瘍特異的変異を示す試料におけるリードの数が、真正である可能性が高いかまたは配列決定誤りに起因したものであるかを推定するために、バックグラウンド配列決定誤りの訂正が適用される。これは、（ｉ）サブクローナル集団からの腫瘍特異的変異を示す試料におけるリードの総数と、（ｉｉ）腫瘍特異的変異の各々の位置におけるバックグラウンド配列決定誤り率に、腫瘍特異的変異の各々の位置におけるリードの総数を乗算したものとを比較するために、統計的検定を適用することを伴うことができる。統計的検定を用いて、特定のサブクローナル集団が試料内に存在するか否かを判断することができ、例えば、統計的検定のｐ値が０．０５よりも高い場合、細胞のサブクローナル集団は、試料内に存在しないと考えることができる。いくつかの場合、統計的検定は、二項検定、ポアソン検定、ウィルコクソンの１標本順位和検定（予測バックグラウンド分布を用いる）、カイ二乗／フィッシャーの正確検定（予測基準およびバリアントカウントを、観測された基準およびバリアントカウントと比較する）からなる群から選択することができる。
【0015】
いくつかの場合、対象の腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む試料は、セルフリーＤＮＡを含む試料よりも早い時点に得られる。特に、組織生検を取得し、その後、１つまたは複数のリキッドバイオプシーが続き、本発明の方法を、経時的な特定の変異および／または腫瘍クローン集団のＣＣＦの変化を追跡するために適用することができる。
【0016】
いくつかの場合、様々な時点に、対象からの、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含むセルフリーＤＮＡを含む複数の試料から配列データが得られる。特に、様々な時点は、腫瘍の治療の過程中の様々な時点を含むことができる。
いくつかの場合、セルフリーＤＮＡを含む試料は、血漿試料、血液試料、尿試料または髄液（ＣＳＦ）試料等の液体試料であり得る。
いくつかの場合、セルフリーＤＮＡを含む試料は、血漿試料、血液試料、尿試料または髄液（ＣＳＦ）試料等の液体試料であり得る。
【0017】
いくつかの場合、セルフリーＤＮＡを含むそのまたは各試料の純度は、５％以下、例えば４％、３％、２％、１％または０．５％以下であり得る。本発明者らは、本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法が、いくつかの実施形態では、微小残存病変（ＭＲＤ）および術後がん治療の文脈において頻繁に遭遇するもの等の、低純度の試料における場合であっても、ＣＣＦの信頼性のある推定を可能にすることができることがわかった。
【0018】
いくつかの場合、少なくとも１つの腫瘍特異的変異は、ネオアンチゲンの疑いがあるものまたはネオアンチゲンとわかっているものを発生させ、かつ／または抗がん治療の標的を発生させる。当業者であれば理解するように、治療を受けている患者が特定の変異（例えば、ＥＧＦＲ変異）を有するとき、複数の抗がん剤が使用され、または優れた結果を示す。
【0019】
いくつかの場合、方法は、少なくとも１つの腫瘍特異的変異、および／または少なくとも１つのクローナルもしくはサブクローナル腫瘍細胞集団の決定されたＣＣＦをユーザに提供することを更に含む。これは、決定されたＣＣＦ（例えば、ＣＣＦまたはクローナリティの度合いの割合もしくは小数値または他のインジケーション）をユーザインタフェース上に表示するか、またはユーザに例えばネットワークを介して送信することを伴うことができる。
【0020】
第２の態様において、本発明は、対象における少なくとも１つの腫瘍特異的変異のがん細胞割合（ＣＣＦ）を推定するための方法を提供し、この方法は、
対象から得られたｃｆＤＮＡ含有試料を提供することであって、試料はｃｔＤＮＡを含むことと、
前記ｃｆＤＮＡ含有試料から、または前記ｃｆＤＮＡ含有試料から準備されたライブラリから、ＤＮＡを配列決定し、配列データを生成することと、
前記配列データを用いて本発明の第１の態様の方法を実行し、それによって、対象における少なくとも１つの腫瘍特異的変異のＣＣＦを推定することと
を含む。
対象から得られたｃｆＤＮＡ含有試料を提供することであって、試料はｃｔＤＮＡを含むことと、
前記ｃｆＤＮＡ含有試料から、または前記ｃｆＤＮＡ含有試料から準備されたライブラリから、ＤＮＡを配列決定し、配列データを生成することと、
前記配列データを用いて本発明の第１の態様の方法を実行し、それによって、対象における少なくとも１つの腫瘍特異的変異のＣＣＦを推定することと
を含む。
【0021】
いくつかの場合、方法は、
対象の腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む試料を提供することと、
腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む前記試料から、または腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む前記試料から準備されたライブラリから、ＤＮＡを配列決定し、腫瘍組織配列データを生成することと、
生成された腫瘍組織配列データを分析して、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異の多重度、および腫瘍特異的変異の位置におけるコピー数（ＣＮｔｕｍｏｕｒ）を決定することと
を更に含む。
対象の腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む試料を提供することと、
腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む前記試料から、または腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む前記試料から準備されたライブラリから、ＤＮＡを配列決定し、腫瘍組織配列データを生成することと、
生成された腫瘍組織配列データを分析して、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異の多重度、および腫瘍特異的変異の位置におけるコピー数（ＣＮｔｕｍｏｕｒ）を決定することと
を更に含む。
【0022】
第３の態様において、本発明は、対象における、少なくとも１つの腫瘍特異的変異、または前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異を有する腫瘍細胞の集団を、潜在的治療標的として同定するための方法を提供し、この方法は、
本発明の第１の態様の方法を少なくとも１回実行して、少なくとも１つの腫瘍特異的変異、または前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異を有する細胞の集団のＣＣＦを推定することと、
前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異、または前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異を有する細胞の集団を、
ＣＣＦが少なくとも０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または少なくとも０．９５であると推定されること、
ＣＣＦが、少なくとも２つの異なる時点において推定され、上昇していることがわかっていること、および、
ＣＣＦが、前記腫瘍の治療介入の前後に推定され、ＣＣＦが、前記治療介入後に減少していることがわかっていること
のうちの少なくとも１つが真であるならば、潜在的治療標的として選択することと
を含む。
本発明の第１の態様の方法を少なくとも１回実行して、少なくとも１つの腫瘍特異的変異、または前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異を有する細胞の集団のＣＣＦを推定することと、
前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異、または前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異を有する細胞の集団を、
ＣＣＦが少なくとも０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または少なくとも０．９５であると推定されること、
ＣＣＦが、少なくとも２つの異なる時点において推定され、上昇していることがわかっていること、および、
ＣＣＦが、前記腫瘍の治療介入の前後に推定され、ＣＣＦが、前記治療介入後に減少していることがわかっていること
のうちの少なくとも１つが真であるならば、潜在的治療標的として選択することと
を含む。
【0023】
第４の態様において、本発明は、腫瘍のクローン動態をモニタリングし、かつ／または腫瘍の治療をモニタリングするための方法を提供し、この方法は、
本発明の第１の態様の方法を実行して、同じ対象について２つ以上の時点に、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異、または少なくとも１つの腫瘍特異的変異を有する細胞の集団のＣＣＦを推定することと、
前記２つ以上の時点における推定ＣＣＦを追跡して、ＣＣＦの経時的変化をモニタリングすることと、
を含む。
本発明の第１の態様の方法を実行して、同じ対象について２つ以上の時点に、前記少なくとも１つの腫瘍特異的変異、または少なくとも１つの腫瘍特異的変異を有する細胞の集団のＣＣＦを推定することと、
前記２つ以上の時点における推定ＣＣＦを追跡して、ＣＣＦの経時的変化をモニタリングすることと、
を含む。
【0024】
いくつかの場合、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のもしくは少なくとも２０個の腫瘍特異的変異のＣＣＦ、および／または前記腫瘍の細胞の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくは少なくとも２０個のクローン的に別個の集団のＣＣＦが推定される。
【0025】
いくつかの場合、本発明の任意の態様によれば、少なくとも１つの腫瘍特異的変異は、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）、多重ヌクレオチドバリアント（ＭＮＶ）、欠失変異、挿入変異、インデル変異、転座、ミスセンス変異、転座、融合、スプライス部位変異、または腫瘍細胞の遺伝物質の他の変化からなる群から選択される。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法が、ＶＡＦおよびコピー数を或る精度で測定することができる任意の遺伝的変更に適用可能であると考える。これは、特に、ＳＮＶ、多重ヌクレオチドバリアント、小さな挿入／欠損および構造バリアントを含む。或る特定の実施形態において、本明細書に詳細に記載されるように、少なくとも１つの腫瘍特異的変異は単一ヌクレオチドバリアントである。
【0026】
いくつかの場合、少なくとも１つの腫瘍特異的変異の結果として、変異したＤＮＡがネオアンチゲンをエンコードし、かつ／または、少なくとも１つの腫瘍特異的変異は、抗がん治療の標的であるかもしくはこれをエンコードする。
【0027】
第５の態様において、本発明は、がんを有する対象を治療するための方法を提供し、この方法は、
本発明の任意の態様の方法を実行することであって、少なくとも１つの腫瘍特異的変異の推定ＣＣＦは、腫瘍特異的変異が、腫瘍内に、腫瘍特異的変異を治療の有効な標的にするのに十分なレベルでプレゼントにおいて存在することを示すことと、
前記腫瘍特異的変異を標的にする抗がん治療を施すことと
を含む。
本発明の任意の態様の方法を実行することであって、少なくとも１つの腫瘍特異的変異の推定ＣＣＦは、腫瘍特異的変異が、腫瘍内に、腫瘍特異的変異を治療の有効な標的にするのに十分なレベルでプレゼントにおいて存在することを示すことと、
前記腫瘍特異的変異を標的にする抗がん治療を施すことと
を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、
ＣＣＦが少なくとも０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または少なくとも０．９５であると推定されること、
ＣＣＦが、少なくとも２つの異なる時点において推定され、上昇していることがわかっていること、および、
ＣＣＦが、前記抗がん治療を施す前後に推定され、ＣＣＦが、前記治療を施した後に減少していることがわかっていること
のうちの少なくとも１つが真であり得る。
ＣＣＦが少なくとも０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または少なくとも０．９５であると推定されること、
ＣＣＦが、少なくとも２つの異なる時点において推定され、上昇していることがわかっていること、および、
ＣＣＦが、前記抗がん治療を施す前後に推定され、ＣＣＦが、前記治療を施した後に減少していることがわかっていること
のうちの少なくとも１つが真であり得る。
【0029】
いくつかの場合、対象の腫瘍は、転移したか、または転移が疑われ、対象は、１つまたは複数の腫瘍の外科的除去を目的とした治療を受け、対象は、１つまたは複数の抗がん治療薬を用いて治療され、かつ／または対象は、がんが再発したか、または対象はがん再発のリスクがあることが疑われる。
【0030】
第６の態様において、本発明はシステムを提供し、このシステムは、
プロセッサと、
プロセッサによって実行されると、プロセッサに、本発明の第１の態様の方法のステップを実行させる命令を含むコンピュータ可読媒体と
を備える。
プロセッサと、
プロセッサによって実行されると、プロセッサに、本発明の第１の態様の方法のステップを実行させる命令を含むコンピュータ可読媒体と
を備える。
【0031】
第７の態様において、本発明は、１つまたは複数のプロセッサによって実行されると、１つまたは複数のプロセッサに、本発明の第１の態様の方法のステップを実行させる命令を含む１つまたは複数のコンピュータ可読媒体を提供する。
【0032】
本発明の任意の態様によれば、対象は任意のがんを有し得る。いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍（原発および／または転移）であってもよい。いくつかの場合、がんは、がん細胞の少なくとも一部分のゲノムおよび／またはエクソーム中に、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００個のがん特異的変異（すなわち、対象の１つまたは複数の非がん細胞において見られるような対象の生殖細胞系列ゲノム配列と比較した変異）を有するがんであってもよい。
【0033】
いくつかの場合、がんは、肺がん（小細胞、非小細胞および中皮腫）、卵巣がん、乳がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞）、脳腫瘍（神経膠腫、星状細胞腫、膠芽腫）、黒色腫、メルケル細胞がん、明細胞腎細胞がん（ｃｃＲＣＣ）、リンパ腫、小腸がん（十二指腸および空腸）、白血病、膵臓がん、肝胆道腫瘍、胚細胞がん、前立腺がん、頭頸部がん、甲状腺がんおよび肉腫であってもよい。例えば、がんは、肺腺がんまたは肺扁平上皮がんなどの肺がんであってもよい。別の例として、がんは、黒色腫であってもよい。実施形態において、がんは、黒色腫、メルケル細胞がん、腎がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膀胱尿路上皮がん（ＢＬＡＣ）および頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣ）およびマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）高値がんから選択されてもよい。いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。他の実施形態において、がんは黒色腫である。
【0034】
本発明は、記載の態様および好ましい特徴の組み合わせが明確に許容不可能であるかまたは明確に回避される場合を除いて、そのような組み合わせを含む。
ここで、本発明の原理を示す実施形態および実験を、添付の図面を参照して説明する。
ここで、本発明の原理を示す実施形態および実験を、添付の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】ＥＣＬＩＰＳＥアーキテクチャの図式的概観図を示す。
【図2】組織サンプリングバイアス、および血漿サンプリングによるその組織サンプリングバイアスの潜在的回避の概略図を示す。
【図3】ＥＣＬＩＰＳＥを用いて（Ａ）またはＥＣＬＩＰＳＥを用いずに（Ｂ）手術前に取得された血漿中で測定されたがん細胞割合（ＣＣＦ）（ｙ軸）と、手術時に多領域組織サンプリングを用いて測定されたＣＣＦ（ｘ軸）と間の相関関係を示す。差し込み図は、ドットサイズによる血漿純度のスケールを示す。
【図4】（左）血漿中で検出されたクローンを、１つの領域に存在するか、または２つ以上の領域に存在するクローンのパーセンテージの棒グラフを示し、（右）血漿中で後続する変異数のボックスプロットを示す。
【図5】「勝者の呪い」効果の概略図の描写を示し、単一領域サブクローンは、組織サンプリングを用いて過剰サンプリングされている場合がある。
【図6】（左）（ＥＣＬＩＰＳＥを用いて）血漿から、および組織から決定されたＣＣＦのボックスプロットを示す。これは、検出された、単一の領域に特有のサブクローンについて、ＣＣＦが通例、右側に描写された組織サンプリングバイアス効果に起因して、組織中よりも血漿中において低いことがわかったことを示す。
【図7】血漿および組織サンプリングのＣＣＦボックスプロットを、腫瘍体積（＜２０ｃｍ３、＞２０ｃｍ３かつ＜１００ｃｍ３、または＞１００ｃｍ３）で分割したものを示す。
【図8】「クローナル錯覚」現象を克服するためのＥＣＬＩＰＳＥベースの血漿サンプリングの能力の描写を示す。
【図9】ｃｔＤＮＡおよびＥＣＬＩＰＳＥを用いた腫瘍クローン動態を追跡する例示的な事例を示す。
【図10】ｃｔＤＮＡおよびＥＣＬＩＰＳＥを用いた腫瘍クローン動態を追跡する例示的な事例を示し、ここでは、血漿サンプリングが、組織生体によって捕捉されていないサブクローン系統を検出することがわかった。
【図11】組織サンプリングと比較して、ＥＣＬＩＰＳＥを用いてｃｔＤＮＡリキッドバイオプシーによって追加のサブクローンが検出されたことを示す。
【図12】組織サンプリングと比較して、ＥＣＬＩＰＳＥを用いたｃｔＤＮＡサンプリングがよりクローン的に複雑なピクチャ（よりポリクローナルかつ多系統）を提供したことを示す。
【図13】これらの試料において得られる低いｃｔＤＮＡ割合にかかわらず、アジュバント化学療法および微小残存病変（ＭＲＤ）の設定においてＥＣＬＩＰＳＥによってｃｔＤＮＡを用いてクローン構造を追跡することが可能であったことを示す。
【図14】モノクローナル（青）、ポリクローナル（黄色）および多系統（赤）に分割された、全体生存（左）および再発後生存（右）についてのＫＭ生存曲線を示す。留意すべきことに、よりクローン的に複雑な腫瘍が、より攻撃的であることがわかった。
【図15】サブクローンサイズ（すなわち、ＥＣＬＩＰＳＥを用いて血漿ｃｔＤＮＡ試料を用いて計算されたＣＣＦ）と、転移能との間の関係を示す。転移に進むサブクローンは、原発腫瘍においてより大きかったサブクローンであり（Ａ）、転移を起こす患者は、それらの原発腫瘍においてより大きなサブクローンを有する傾向にある。
【図16】ｃｔＤＮＡおよびＥＣＬＩＰＳＥを用いた腫瘍クローン動態を追跡する更なる例示的な事例を示し、血漿サンプリングが、組織生体によって捕捉されていないサブクローン系統を検出することがわかった。手術後の示された時点における治療が示されている。
【図17】異なる転移性播種パターンを有する長手方向の進展の９つの例を示す。
【図19】臨床および他の要因を制御する全体生存の多変量モデルを示す。
【図20】サブクローンサイズ（すなわち、ＥＣＬＩＰＳＥを用いて血漿ｃｔＤＮＡ試料を用いて計算されたＣＣＦ）と、転移能との間の関係を示す。結果は、更なる情報（図１５を参照）を用いて再発サブクローンと非再発サブクローンとの間の差をより明確に示す。
【図21】（Ｐ＝０．０１における）各試料における配列決定およびバックグラウンドノイズの深さを所与として、平均サブクローンの存在を検出するのに必要とされる変異リードの推定数を試料ごとに示す。次に、リードの数は、以下にプロットされる各試料において検出可能な最小がん細胞割合を表すＥＣＬＩＰＳＥを用いてがん細胞割合に変換される。これは、０．１％において、本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法が、２０％のがん細胞割合においてサブクローンを検出することができ、それによって、ＥＣＬＩＰＳＥの検出限界（ＬＯＤ）のインジケーションを提供することを示す。
【図22】本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法が、少なくとも０．１％のｃｔＤＮＡ割合のｃｔＤＮＡ試料を特性評価することができるのに対し、標準的な方法は、少なくとも１０％のｃｔＤＮＡ割合を有する試料に限定されることを示す。この文脈において、クローン再構成の「標準的な方法」は、全エクソームまたは全ゲノムのいずれかの広い配列決定に依拠する、ＰｙＣｌｏｎｅ（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８８３）、ＤＰＣｌｕｓｔ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｗｅｄｇｅ－ｌａｂ／ｄｐｃｌｕｓｔ）、ＤｅＣｉＦｅｒ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｒａｐｈａｅｌ－ｇｒｏｕｐ／ｄｅｃｉｆｅｒ）等の腫瘍組織ベースのクローン構築の標準として用いられるものと考えられた。これらのおよび類似の方法は、クローン構造を決定するために血漿試料に適用され、最低でも＞１０％の腫瘍割合を要求する、唯一の有効性確認された方法である。例えば、去勢抵抗性転移性前立腺がんのＮａｔｕｒｅ、Ｈｅｒｂｅｒｔｓ他、２０２２における最近の論文は、それらの全ゲノム配列決定ベースのクローナリティ解析について、少なくとも３０％の腫瘍割合のｃｔＤＮＡ試料を有する患者のみを含んだ。 本発明によるｃｔＤＮＡ陽性試料の１６％のみが＞１０％のｃｔＤＮＡ割合であったが、６４％は少なくとも０．１％のｃｔＤＮＡ割合を有する。ＴＲＡＣＥＲｘの１７％のみが、１０％のｃｔＤＮＡ割合の再発時のｃｔＤＮＡ試料を有するのに対し、患者の７３％は再発時に＞０．１％のｃｔＤＮＡ試料を有する。したがって、ＥＣＬＩＰＳＥは、患者のはるかにより大きな割合が、ｃｔＤＮＡを用いて再発時にクローン的に特性評価されることを可能にする。
【図23】再発組織からの再発時のクローン構造を特性評価する問題を克服するための本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法の使用を示す。 再発組織生検を得て再発時のクローン構造を特性評価することは困難である。ＴＲＡＣＥＲｘでは、事例の４４％においてのみ再発生検を取得することが可能であるが、本発明者らは、これを、＞０．１％のｃｔＤＮＡ割合の血漿と組み合わせることによって、事例の８２％を特性評価することができた。これは、組織生検を補完するために、本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法をリキッドバイオプシー試料に適用することによって、再発クローナリティ特性評価を改善することができることを示す。
【図24】ＥＣＬＩＰＳＥが、１／３の患者が、再発時にクローナルボトルネックを受ける、すなわち、サブクローンががん細胞の１００％を占めるまで成長することを示す。これらの患者において、クローナル腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）は、（以前にサブクローナルであった変異がクローナルになるため）平均で２０％増大する。クローナルＴＭＢは、免疫療法反応のマーカーとして調査されている。これらのボトルネックは、臨床試験における治療標的化のために調査されているクローナルネオアンチゲンの数も増大させる。
【図25】「クローナル錯覚」現象を克服するためのＥＣＬＩＰＳＥベースの血漿サンプリングの能力の図を示す。パネル（Ａ）および（Ｂ）は、図８に示すデータを再現する。パネル（Ｃ）は、追加の解析の結果であり、血漿ＣＣＦを用いてクローナル対クローナル錯覚を予測するための０．８１のＡＵＣを示す。
【図26】ＤＮＡコピー数を考慮に入れることによって、ＥＣＬＩＰＳＥがｃｔＤＮＡ腫瘍純度（腫瘍細胞である、ｃｆＤＮＡが由来する細胞の割合）を測定することができ、入力ＤＮＡ質量および血漿体積と組み合わせて、患者から取得された血漿のミリリットルあたりに存在した正常（非腫瘍）ゲノムおよび腫瘍ゲノムの数の推定を可能にすることができることを示す。これは、本発明者らの知る限り、これまで推定されてこなかった。これは、腺がんにおいて、平均クローナルｖａｆ（当分野で用いられる共通尺度）を、ｃｔ走査により測定された腫瘍体積とより強く相関付け、コピー数および血漿体積について補正することにより、腺がんにおいてＥＣＬＩＰＳＥを用いて腫瘍疾患負荷量をより良好に測定することができることを示唆する。
【図27】は、異なるグランドトゥルース、ｃｔＤＮＡ割合、配列決定アッセイに入力されたナノグラムＤＮＡ、サブクローンごとに追跡される変異数、およびサブクローナルがん細胞割合にわたる、既知のアレル頻度でのスパイクイン（ｓｐｉｋｅ－ｉｎ）変異を有する計画的な（ｃｏｎｔｒｉｖｅｄ）ＤＮＡ試料の配列決定を用いた、本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法によるサブクローン検出の検出限界（ＬＯＤ）推定値を示す。 アレル頻度における異なるグランドトゥルーススパイクを有する試料の対からの変異は、インシリコで組み合わされ、単一のサブクローンを表すサブクローナル変異の各集合のグランドトゥルースクローナルｃｔＤＮＡ割合およびがん細胞割合を生成する、クローナルおよびサブクローナルバリアントとして指定された。３９８個の異なるスパイクイン実験（各々５０個の変異）からの異なる変異集合（各々が１つのサブクローンを形成する）を組み合わせて、グランドトゥルーススパイクインデータに基づいて７６，２３６個のサブクローンを生成し、これらの試料の配列決定において観測されたアレル頻度にＥＣＬＩＰＳＥを適用し、各サブクローンがＥＣＬＩＰＳＥによって検出可能であるか否か。条件ごとに１２個の複製が利用可能であり、複製について、検出されたサブクローンの％が計算され、複製にわたる検出率の平均および９５％信頼区間が計算される。
【発明を実施するための形態】
【0036】
ここで、本発明の態様および実施形態が、添付の図面を参照して論考される。更なる態様および実施形態は、当業者には明らかであろう。本文において言及される全ての文書は参照により本明細書に引用される。
【0037】
「試料」は、本明細書において用いられるとき、ゲノム配列決定（例えば、全ゲノム配列決定、全エクソーム配列決定）等のゲノム解析のためにゲノム材料が得ることができる、細胞または組織試料、生体液、抽出物（例えば、対象から得られたＤＮＡ抽出物）であり得る。試料は、対象から得られた細胞、組織、生体液試料であり得る（例えば、生検）。そのような試料は、「対象試料」と呼ぶことができる。特に、試料は、血液試料、または腫瘍試料、またはそれに由来する試料であり得る。試料は、対象から新しく得られた試料であってもよく、ゲノム解析を行う前に処理および／または保管された（例えば凍結されたか、固定されたか、または１つもしくは複数の精製、濃縮、もしくは抽出ステップに供された）試料であってもよい。試料は、細胞または組織培養試料であり得る。したがって、試料は、本明細書において記載されるとき、対象から得られた生体試料からのものであろうと、例えば細胞系から得られた試料からのものであろうと、細胞、またはそれに由来するゲノム材料を含む任意のタイプの試料を指すことができる。実施形態において、試料は、ヒト対象等の対象から得られた試料である。試料は、好ましくは、哺乳類（例えば、哺乳動物細胞試料、またはネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等の哺乳類対象からの試料等）から、好ましくはヒト（例えば、ヒト細胞試料またはヒト対象からの試料）からのものである。更に、試料は輸送および／もしくは保管することができ、回収は、ゲノム配列データの取得（例えば配列決定）の場所から離れた場所で行うことができ、かつ／または、本明細書に記載の任意のコンピュータにより実施される方法のステップは、試料回収の場所から離れた場所および／もしくはゲノムデータの取得（例えば配列決定）の位置から離れた場所で行うことができる（例えば、コンピュータにより実施される方法のステップは、例えば「クラウド」プロバイダによって、ネットワークコンピュータを用いて行うことができる）。
【0038】
対象は、固形腫瘍（原発および／または転移）を含むがんを有する場合がある。いくつかの場合、がんは、がん細胞の少なくとも一部分のゲノムおよび／またはエクソーム中に、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００個のがん特異的変異（すなわち、対象の１つまたは複数の非がん細胞において見られるような対象の生殖細胞系列ゲノム配列と比較した変異）を有するがんであってもよい。いくつかの場合、がんは、肺がん（小細胞、非小細胞および中皮腫）、卵巣がん、乳がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞）、脳腫瘍（神経膠腫、星状細胞腫、膠芽腫）、黒色腫、メルケル細胞がん、明細胞腎細胞がん（ｃｃＲＣＣ）、リンパ腫、小腸がん（十二指腸および空腸）、白血病、膵臓がん、肝胆道腫瘍、胚細胞がん、前立腺がん、頭頸部がん、甲状腺がんおよび肉腫から選択されてもよい。例えば、がんは、肺腺がんまたは肺扁平上皮がんなどの肺がんであってもよい。別の例として、がんは、黒色腫であってもよい。実施形態において、がんは、黒色腫、メルケル細胞がん、腎がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膀胱尿路上皮がん（ＢＬＡＣ）および頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣ）およびマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）高値がんから選択されてもよい。いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。他の実施形態において、がんは黒色腫である。
【0039】
「混合試料」は、複数の細胞型または複数の細胞型に由来する遺伝物質を含むことが想定される試料を指す。本開示の文脈において、混合試料は、典型的には、腫瘍細胞を含む試料であるか、または腫瘍細胞、もしくは腫瘍細胞に由来する遺伝物質を含むことが想定（予測）される。例えば腫瘍試料等の、対象から得られる試料は、典型的には、（１つまたは複数の精製および／または分離ステップを受けない限り）混合試料である。典型的には、試料は、腫瘍細胞および少なくとも１つの他の細胞型（および／またはそれに由来する遺伝物質）を含む。例えば、混合試料は腫瘍試料であってもよい。「腫瘍試料」は、腫瘍に由来する試料または腫瘍から得られた試料を指す。そのような試料は腫瘍細胞および正常（非腫瘍）細胞を含むことができる。正常細胞は、免疫細胞（例えば、リンパ球等）および／または他の正常（非腫瘍）細胞を含むことができる。そのような混合試料におけるリンパ球は、「腫瘍浸潤リンパ球」（ＴＩＬ）と呼ぶことができる。腫瘍は、固形腫瘍または非固形もしくは血液系腫瘍であってもよい。腫瘍試料は、原発腫瘍試料、腫瘍関連リンパ節試料、または対象からの転移部からの試料であってもよい。腫瘍細胞、または腫瘍細胞由来の遺伝物質を含む試料は、体液試料であってもよい。したがって、腫瘍細胞由来の遺伝物質は、エクソーム中の循環腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍ＤＮＡであってもよい。これの代わりに、またはこれに加えて、試料は循環腫瘍細胞を含んでもよい。混合試料は、遺伝物質を抽出するために処理された細胞、組織または体液の試料であってもよい。生体試料から遺伝物質を抽出するための方法が当該技術分野において既知である。混合試料は、試料内の複数の細胞型または複数の細胞型に由来する遺伝物質の比率を変更することができる１つまたは複数の処理ステップを経ている場合がある。例えば、腫瘍細胞を含む混合試料は、腫瘍細胞における試料を濃縮するように処理されている場合がある。したがって、精製された腫瘍細胞の試料は、試料が、特定の目的で、純粋である（すなわち、１または１００％の腫瘍割合を有する）ことが想定され得る場合であっても、少量の他の型の細胞が存在し得るということに基づいて、「混合試料」と呼ぶことができる。
【0040】
本明細書において用いられるとき、「組織試料」または「腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む試料」という用語は、１つまたは複数の細胞または細胞物質の一部分が腫瘍から抽出される、組織生検等の腫瘍組織から直接得られた試料、またはｃｔＤＮＡを含むセルフリーＤＮＡ（例えば、血漿試料）等の腫瘍組織から間接的に得られた試料を指すことができる。当業者には理解されるように、いくつかの場合、特に、セルフリーＤＮＡ試料の純度が低いとき、組織試料が腫瘍から直接得られることが望ましいか更には必須となる。しかしながら、腫瘍が大きいとき、および／またはより大量のｃｔＤＮＡをシェディングすることが知られるがんの型において等、純度が高い（例えば、＞１０％）場合、セルフリーＤＮＡ試料から、がん特異的な変異およびがん特異的体細胞コピー数変化を確実に特定することが可能となる。そのような実施形態において、比較的高い純度（例えば、＞１０％）でｃｔＤＮＡを含有するセルフリーＤＮＡ試料（例えば、血漿試料）を配列決定し、例えば、バリアントコール、コピー数特定を実行し、かつ／またはがん特異的変異を特定のがん細胞クローン集団に割り当てるのに十分な深さで、全エクソームまたは全ゲノム配列を得ることができる。したがって、本発明によれば、「腫瘍組織から得られたＤＮＡを含む試料」を参照するこれらのステップは、適切に高い純度（例えば、＞５％または＞１０％）のセルフリーＤＮＡ試料（例えば、ｃｔＤＮＡを含有する血漿試料）に関して行われた、例えばＣＮｔｕｍｏｕｒまたは多重度の決定を参照するように行うことができる。対象からの循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、および対応する決定（例えば、バリアントアレル頻度（ＶＡＦ））を含む、セルフリーＤＮＡを含む試料から得られた配列データを参照するこれらのステップは、同じセルフリーＤＮＡまたは異なるセルフリーＤＮＡ試料（後の試料または複数のセルフリーＤＮＡ試料等）から導くことができる。このようにして、腫瘍に関する「ベースライン」情報（例えば、複数のがん特異的変異のアイデンティティ、ならびにそれらの対応するＣＮｔｕｍｏｕｒおよび多重度値を含む）を、直接腫瘍組織試料から、または十分に高い純度の血漿試料から得ることができる。次に、腫瘍の特性およびクローン動態を、低純度（＜５％）の血漿試料、および本発明のＥＣＬＩＰＳ方法を用いて経時的に追跡および／またはモニタリングし、特に、がん細胞の特定の変異およびサブクローン集団のＣＣＦを推定し、特定の変異もしくはサブクローン集団の損失を特定し、かつ／または以前のサブクローン集団が有していた特定の変異または変異の集合がクローナルになった、すなわち、１００％から統計的に区別不可能なＣＣＦを有することを特定することができる。クローナル変異は、ＣＣＦデータにおいて観測されるノイズに依拠して、そのＣＣＦが或る特定の閾値未満に降下する場合、部分的にまたは完全に損失したものとして特定することができる。この閾値は、ノイズが非常に少ないデータにおいて０．８と高く、ノイズが大量のデータにおいて、高い特異性を保持するために０．２と低くなり得る。更に、腫瘍細胞のサブセット内にのみある（すなわち、サブクローナルである）ことが以前に推定された変異またはクローンは、１００％またはほぼ１００％の細胞（すなわち、クローナル）における腫瘍にわたって拡大し、優性になり得る。これは、変異のＣＣＦまたはクローン中の変異群のＣＣＦが、１００％のＣＣＦから、またはクローナル変異におけるＣＣＦから区別可能でない場合、ＥＣＬＩＰＳＥによって推定されるＣＣＦを用いて検出することができる。特に、ウィルコクソンの検定は、所与のサブクローンのＣＣＦを、クローナルであると推定される変異からのＣＣＦと比較するために実行することができる。結果として得られるＰ値が、選択された閾値を上回っている、例えば＞０．０５であり、このサブクローンの平均ＣＣＦが０．８を超えている場合、そのようなサブクローンにおける変異が、１００％またはほぼ１００％の細胞においてクローナルになる可能性が最も高いと推定することができ、これにより、例えば、これらの変異が、ネオアンチゲンであるかまたは他の形で治療的に作用可能である（例えば、ＥＧＦＲ変異）と判断される場合、より魅力的な治療標的となる。このようにして、本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法は、或る特定の実施形態において、経時的に、１つまたは複数の治療発明中、またはこれに続いて（手術により、または放射線、薬剤または免疫治療のいずれであろうと）、クローン動態およびがんの進化を追跡する比較的非侵襲的方法を提供することができる。
【0041】
「純度」という用語（場合によっては、「腫瘍純度」または「腫瘍割合」もしくは「試料細胞充実度」または異常細胞割合（ＡＣＦ）とも呼ばれる）は、腫瘍細胞である混合試料内のＤＮＡ含有細胞の比率、または試料内の腫瘍細胞および非腫瘍細胞からの遺伝物質の特定の混合物が結果として生じることが想定される等価な比率を指す。試料中の純度を決定するためのいくつかの方法が当該技術分野において既知である。例えば、細胞または組織試料の文脈において、純度は、病理スライド（例えば、試料の１つまたは複数の代表的エリア内の腫瘍細胞をカウントすることによる、ヘマトキシリン－エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色スライドまたは他の組織化学もしくは免疫組織化学的スライド）を解析することによって、またはフローサイトメトリー等の高スループットアッセイを用いて推定することができる。遺伝物質を含む試料の文脈において、純度は、例えばＡＳＣＡＴ（Ｖａｎ Ｌｏｏ他、２０１０）、ＡＢＳＯＬＵＴＥ（Ｃａｒｔｅｒ他、２０１２）、またはｉｃｈｏｒＣＮＡ（Ａｄａｌｓｔｅｉｎｓｓｏｎ他、２０１７）等の、腫瘍および生殖細胞系列ゲノムのデコンボリューションを試みる配列解析プロセスを用いて測定されてきた。有利には、純度は、本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法を用いて測定することができ、１つまたは複数の、好ましくはいくつかの腫瘍特異的変異は、腫瘍の全細胞内に存在するものとして、すなわち変異が真にクローナルであるものとして特定される。腫瘍変異がクローナルであるという判断は、ＰｙＣｌｏｎｅ（Ｒｏｔｈ、Ａ．、Ｋｈａｔｔｒａ、Ｊ，Ｙａｐ他「ＰｙＣｌｏｎｅ：ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｃｌｏｎａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ（ＰｙＣｌｏｎｅ：がんにおけるクローン集団の統計的推定）」Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，３９６－３９８（２０１４）、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８８３）またはＤＰｃｌｕｓｔ（Ｎｉｋ－Ｚａｉｎａｌ、Ｓｅｒｅｎａ他「Ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ２１ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ（２１の乳がんのライフヒストリー）」Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．１４９，５（２０１２）：９９４－１００７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１２．０４．０２３．）等の既知のツールを用いて行うことができる。本明細書に記載のように、変異がクローナルである、すなわち、ＣＣＦ＝１であることが既知である場合、式１Ａ（下記参照）は、所与のクローナル変異のＣＮｎｏｒｍａｌ、多重度、ＶＡＦおよびＣＮｔｕｍｏｕｒから純度を計算する式２（下記参照）を与えるように再構成することができる。式２によって与えられるような２つ以上の変異特異的純度値を組み合わせる（例えば、平均する）ことによって、純度が＜５％である場合であっても、試料純度の（例えば、ｃｆＤＮＡ含有試料の）信頼性のある尺度を導出することが可能である。
【0042】
「正常な試料」または「生殖細胞系列試料」は、腫瘍細胞、または腫瘍細胞に由来する遺伝物質を含まないことが想定される試料である。生殖細胞系列試料は、血液試料、組織試料、または対象からの末梢血単核細胞の試料等の精製された試料であってもよい。同様に、「正常」、「生殖細胞系列」、または「野生型」という用語は、配列または遺伝子型を指すとき、腫瘍細胞以外の細胞の配列／遺伝子型を指す。生殖細胞系列試料は、小さな比率の腫瘍細胞またはそれに由来する遺伝物質を含むことができ、それにもかかわらず、実用目的で、前記細胞または遺伝物質を含まないと想定することができる。換言すれば、全ての細胞または遺伝物質は正常であると想定することができ、かつ／または、この想定に適合しない配列データは無視することができる。
【0043】
「配列データ」という用語は、特定の配列を有する試料内のゲノム物質の存在および好ましくは量も示す情報を指す。そのような情報は、例えば次世代配列決定（ＮＧＳ）、例えば全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）、または捕捉ゲノム座位（標的化またはパネル配列決定）の配列決定等の配列決定技術を用いて、または、例えばコピー数変動アレイ、もしくは他の分子カウントアッセイ等のアレイ技術を用いて得ることができる。ＮＧＳ技術が用いられるとき、配列データは、特定の配列を有する配列決定リードの数のカウントを含むことができる。アレイ技術等の非デジタル技術が用いられるとき、配列データは、例えば適切な対照との比較により、特定の配列を有する試料における配列数を示す信号（例えば、強度値）を含むことができる。配列データは、当該技術分野における既知の方法（例えば、Ｂｏｗｔｉｅ（Ｌａｎｇｍｅａｄ他、２００９）等）を用いて、基準配列、例えば基準ゲノムにマッピングすることができる。したがって、配列決定リードまたは等価な非デジタル信号のカウントは、特定のゲノム位置（ここで、「ゲノム位置」は、配列データがマッピングされた基準ゲノムにおける位置を指す）に関連付けることができる。更に、ゲノム位置は、変異を含むことができ、この場合、配列決定リードまたは等価な非デジタル信号のカウントは、特定のゲノム位置における可能なバリアント（「アレル」とも呼ばれる）の各々に関連付けることができる。試料中の特定の位置における変異の存在を特定するプロセスは、「バリアントコール」と呼ばれ、当該技術分野において既知の方法（例えば、ＧＡＴＫ ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ、ｈｔｔｐｓ：／／ｇａｔｋ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｈｃ／ｅｎ－ｕｓ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／３６００３７２２５６３２－ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ等）を用いて行うことができる。例えば、配列データは、特定のゲノム位置における生殖細胞系列（「基準」と呼ばれる場合もある）アレルに一致するリード（または等価な非デジタル信号）数のカウントと、ゲノム位置における変異アレル（「代替アレル」と呼ばれる場合もある）に一致するリード（または等価な非デジタル信号）数のカウントとを含むことができる。
【0044】
更に、配列データを用いて、ゲノムに沿ったコピー数プロファイルを、当該技術分野において既知の方法を用いて推測することができる。コピー数プロファイルはアレル特異的であってもよい。本発明の文脈において、コピー数プロファイルはアレル特異的であり、かつ腫瘍／正常試料特異的である。換言すれば、本発明において用いられるコピー数プロファイルは、好ましくは、腫瘍および正常細胞の混合物を含む試料を解析し、試料中の腫瘍細胞および正常細胞のアレル特異的コピー数プロファイルを生成するように設計された方法を用いて得られる。混合試料のアレル特異的コピー数プロファイルは、例えばＡＳＣＡＴ（Ｖａｎ Ｌｏｏ他、２０１０）を用いて、配列データから（例えば、上記で説明したリードカウントを用いて）得ることができる。他の方法も既知であり、等しく適している。好ましくは、本発明の文脈において、アレル特異的コピー数プロファイルを得るのに用いられる方法は、複数の可能なコピー数解決および関連する品質／確信度メトリックを報告する方法である。例えば、ＡＳＣＡＴは、倍数性（セグメント特異的でない、全腫瘍試料の倍数性）、および対応するアレル特異的コピー数プロファイルが評価された純度の値の各組み合わせの適合度メトリックを出力する。そのような方法によって生成された腫瘍特異的コピー数は、腫瘍細胞集団全体の平均またはサマリーを表す（すなわち、腫瘍集団内の不均一性を考慮しない）ことに留意されたい。
【0045】
「総コピー数」という用語は、試料におけるゲノム領域の総コピー数を指す。「メジャーコピー数」という用語は、試料における最も優勢なアレルのコピー数を指す。逆に、「マイナーコピー数」という用語は、試料における最も優勢なアレル以外のアレルのコピー数を指す。別段の指示のない限り、これらの用語は、推測される腫瘍コピー数プロファイルについての推測されるメジャーおよびメジャーコピー数（および総コピー数）を指す。「正常コピー数」または「正常総コピー数」という用語は、試料における正常細胞内のゲノム領域のコピー数を指す。正常細胞は、通常、（細胞が遺伝的に雄性であり、かつ染色体が性染色体である場合を除いて）各染色体の２つのコピーを有し、このため、正常コピーの数は、実施形態において、（遺伝子領域がＸまたはＹ染色体上にあり、かつ解析中の試料が男性対象からのものである場合を除く、この場合、正常コピーの数は１に等しくなると想定され得る）２に等しくなると想定され得る。代替的に、特定の遺伝子領域の正常コピーの数は、正常試料を用いて決定されてもよい。
【0046】
「腫瘍特異的変異」、「体細胞変異」または単純に「変異」は、交換可能に用いられ、同じ対象からの健康な細胞と比較した、腫瘍細胞中のヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）における差を指す。ヌクレオチド配列における差の結果として、同じ対象からの健康な細胞によって表されないタンパク質の発現が生じる可能性がある。例えば、変異は、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）、多重ヌクレオチドバリアント（ＭＮＶ）、欠失変異、挿入変異、転座、ミスセンス変異、転座、融合、スプライス部位変異、または腫瘍細胞の遺伝物質の任意の他の変化であり得る。変異の結果として、同じ対象からの健康な細胞に存在しないタンパク質またはペプチドの発現が生じる場合がある。変異は、エクソーム配列決定、ＲＮＡ配列決定、全ゲノム配列決定および／または標的遺伝子パネル配列決定および／または単一遺伝子のルーチンサンガー配列決定、それに続く配列アライメント、ならびに腫瘍試料からのＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列と、基準試料または基準配列からのＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（例えば、生殖細胞系列ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列またはデータベースからの基準配列）との比較により特定することができる。適切な方法は当該技術分野において既知である。
【0047】
「インデル変異」は、有機体のヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）における塩基の挿入および／または欠損を指す。通常、インデル変異は、有機体のＤＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡにおいて生じる。インデル変異はフレームシフト型インデル変異であり得る。フレームシフト型インデル変異は、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠損によって生じるヌクレオチド配列のリーディングフレームの変化である。そのようなフレームシフト型インデル変異は、典型的には、対象における対応する健康な細胞における非変異ＤＮＡ／ＲＮＡによってエンコードされるポリペプチドと高度に別個の新規のオープンリーディングフレームを生成することができる。
【0048】
「ネオアンチゲン」（または「ネオ・アンチゲン」）とは、がん細胞内での変異の結果として生じる抗原のことである。したがって、ネオアンチゲンは、正常（すなわち、非腫瘍）細胞によって発現されない（または有意に低いレベルで発現される）。ネオアンチゲンは、ＭＨＣ分子に関して提示された場合、Ｔ細胞により認識され得る特異的なペプチドを生成するように処理され得る。ネオアンチゲンをがん免疫療法の基礎として使用してもよい。本明細書における「ネオアンチゲン」の言及は、ネオアンチゲン由来のペプチドも含むことが意図される。「ネオアンチゲン」という用語は、本明細書で使用されるとき、免疫原性であるネオアンチゲンの任意の部分を包含することが意図される。「抗原性」分子は、本明細書で言及されるとき、それ自体またはその一部が、適切な方法によって免疫系または免疫細胞に提示された場合、免疫反応を刺激することができる分子である。（特定のＨＬＡアレルによりエンコードされた）特定のＭＨＣ分子へのネオアンチゲンの結合は、当技術分野で既知の方法を使用して予測され得る。ＭＨＣ結合を予測する方法の例には、Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ他、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌ他およびＢｕｌｌｉｋ－Ｓｕｌｌｉｖａｎ他により記載されているものが挙げられる。例えば、ネオアンチゲンのＭＨＣ結合は、ｎｅｔＭＨＣ－３（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ他）およびｎｅｔＭＨＣｐａｎ４（Ｊｕｒｔｚ他）アルゴリズムを使用して予測される。特定のＭＨＣ分子に結合すると予測されたネオアンチゲンは、それによって、前記ＭＨＣ分子により細胞表面に提示されると予測される。
【0049】
「クローナルネオアンチゲン」とは、対象由来の１つまたは複数の試料中の本質的にあらゆる腫瘍細胞内に存在する（あるいは、試料中の腫瘍遺伝物質が由来する本質的にあらゆる腫瘍細胞内に存在すると推定され得る）変異から生じるネオアンチゲンのことである。同様に、「クローナル変異」とは、対象由来の１つまたは複数の試料中の本質的にあらゆる腫瘍細胞内に存在する（あるいは、試料中の腫瘍遺伝物質が由来する本質的にあらゆる腫瘍細胞内に存在すると推定され得る）変異のことである。したがって、クローナル変異は、対象由来の１つまたは複数の試料中のあらゆる腫瘍細胞内に存在する変異であり得る。「サブクローナル」ネオアンチゲンとは、対象由来の１つまたは複数の腫瘍試料中の細胞のサブセットまたは或る比率に存在する（または、試料中の腫瘍遺伝物質が由来する腫瘍細胞のサブセット内に存在すると推定され得る）変異から生じるネオアンチゲンのことである。同様に、「サブクローナル」変異とは、対象由来の１つまたは複数の腫瘍試料中の細胞のサブセットまたは或る比率に存在する（または、試料中の腫瘍遺伝物質が由来する腫瘍細胞のサブセット内に存在すると推定され得る）変異である。当業者が理解するように、ネオアンチゲンまたは変異は、対象からの１つまたは複数の試料との関連ではクローナルであり得るが、対象に存在し得る（例えば原発腫瘍および転移の全ての領域を含む）腫瘍細胞の集団全体との関連では、真にクローナルではないこともあり得る。したがって、クローナル変異とは、対象の腫瘍細胞の本質的にあらゆる腫瘍細胞に（すなわち、全ての腫瘍細胞に）存在する変異であるという意味で「真にクローナル」であり得る。これは、１つまたは複数の試料が、対象に存在する細胞のあらゆるサブセットを代表するわけではないこともあり得るためである。
【0050】
「がん細胞割合」（または「ＣＣＦ」）という用語は、変異を含む腫瘍細胞の比率を指す。本発明の文脈において、がん細胞割合は、１つまたは複数の試料に基づいて推定されてもよく、そのため対象における真のがん細胞割合と等しくない場合がある。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、本明細書に記載の本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法が、いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の所与の変異または所与のサブクローナル集団について、組織サンプリングのみに基づくＣＣＦ推定値で見られるよりも、より代表的でよってより正確なＣＣＦを提供することが可能であると考える。これは、ｃｆＤＮＡ含有試料（血漿試料等）のサンプリングが、サンプリングバイアスを最小限にする傾向があり、原理上、患者の１つまたは複数の腫瘍を構成する全ての細胞によってシェディングされたｃｔＤＮＡを捕捉するためである。それにもかかわらず、１つまたは複数の試料に基づいて推定されるがん細胞割合は、真である可能性が高いがん細胞割合の有用なインジケーションを提供することができる。
【0051】
がん免疫療法（または単純に「免疫療法」）は、免疫原性組成物（例えばワクチン）、免疫細胞を含む組成物、または例えば治療用抗体等の免疫活性薬物の対象への投与を含む治療手法を指す。「免疫療法」という用語は、治療用組成物それ自体も指し得る。本発明の文脈において、免疫療法は、典型的にはネオアンチゲンを標的にする。例えば、免疫原性組成物またはワクチンは、ネオアンチゲン、ネオアンチゲン提示細胞またはネオアンチゲンの発現に必要な材料を含み得る。別の例として、免疫細胞を含む組成物は、ネオアンチゲンを認識するＴ細胞および／またはＢ細胞を含み得る。免疫細胞は、腫瘍または他の組織（限定はされないが、リンパ節、血液または腹水を含む）から単離され、エキソビボまたはインビトロで拡大され、および対象に再投与されてもよい（「養子細胞療法」と称されるプロセス）。代わりに、またはそれに加えて、Ｔ細胞は、対象から単離し、ネオアンチゲンを標的にするように操作し（例えば、ネオアンチゲンに結合するキメラ抗原受容体の挿入により）、および対象に再投与することができる。別の例として、治療用抗体は、ネオアンチゲンを認識する抗体であってもよい。
【0052】
本明細書に記載されるとき、組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を更に含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、任意選択で、１つまたは複数の更なる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含んでもよい。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。
【0053】
「免疫細胞」への言及は、免疫系の細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞および樹状細胞を包含することが意図される。好ましい実施形態において、免疫細胞はＴ細胞である。ネオアンチゲンを認識する免疫細胞は、操作されたＴ細胞であってもよい。ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞は、ネオアンチゲンまたはネオアンチゲンペプチドに特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはネオアンチゲンもしくはネオアンチゲンペプチドに特異的に結合する親和性増強Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し得る（本明細書において以下で更に説明する）。例えば、Ｔ細胞は、ネオアンチゲンまたはネオアンチゲンペプチドに特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（例えば、ネオアンチゲンまたはネオアンチゲンペプチドに特異的に結合する親和性増強Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））を発現し得る。代替的に、ネオアンチゲンを認識する免疫細胞の集団は、腫瘍を有する対象から単離されたＴ細胞の集団であってもよい。例えば、Ｔ細胞集団は、例えば、対象の腫瘍試料、末梢血試料または他の組織からの試料等の、対象から単離された試料中にあるＴ細胞から作成されてもよい。Ｔ細胞集団は、ネオアンチゲンが同定される腫瘍からの試料から作成されてもよい。換言すれば、Ｔ細胞集団は、治療しようとする患者の腫瘍に由来する試料から単離されてもよく、ここでネオアンチゲンもまた、前記腫瘍からの試料から同定されている。Ｔ細胞集団は、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を含んでもよい。
【0054】
「抗体」（Ａｂ）という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す抗体断片を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、「抗体」と同義に用いられ得る。好適なネオアンチゲンが、例えば本開示による方法によって同定された後、当該技術分野において既知の方法を用いて抗体を作成することができる。
【0055】
「免疫原性組成物」は、対象において免疫応答を誘導することが可能な組成物である。この用語は、「ワクチン」という用語と同義的に使用される。本明細書に記載される免疫原性組成物またはワクチンは、対象における免疫反応の発生につながり得る。発生させることのできる「免疫反応」は、体液性および／もしくは細胞媒介性免疫、例えば抗体産生の刺激、またはワクチン中の抗原に対応する抗原をその表面上に発現する細胞を認識して破壊し得る（または他の方法で排除し得る）細胞傷害性細胞もしくはキラー細胞の刺激であってもよい。
【0056】
本明細書において用いられるとき、「治療」は、治療下の疾患の１つまたは複数の症状を治療前の症状と比べて低減し、軽減し、または消失させることを指す。「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ））は、疾患の症状の発生を遅延させるまたは予防することを指す。予防は、絶対的なもの（疾患が起こらないようにする）であってもよく、または一部の個体においてのみ、もしくは限られた時間にわたってのみ有効なものであってもよい。
【0057】
本明細書において用いられるとき、「コンピュータシステム」は、システムを具現化するか、または上記で説明した実施形態による方法を実行するためのハードウェア、ソフトウェアおよびデータストレージデバイスを含む。例えば、コンピュータシステムは、１つまたは複数の接続されたコンピューティングデバイスとして具現化することができる、中央処理ユニット（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段およびデータストレージを含むことができる。好ましくは、コンピュータシステムはディスプレイを有するか、または（例えばビジネスプロセスの設計において）視覚出力表示を提供するためのディスプレイを有するコンピューティングデバイスを備える。データストレージは、ＲＡＭ、ディスクドライブまたは他のコンピュータ可読媒体を含むことができる。コンピュータシステムは、ネットワークによって接続され、そのネットワークを介して互いに通信することが可能な複数のコンピューティングデバイスを含むことができる。コンピュータシステムがクラウドコンピュータからなるかまたはこれを備えることが明示的に予測される。
【0058】
本明細書において用いられるとき、「コンピュータ可読媒体」という用語は、限定ではないが、コンピュータまたはコンピュータシステムによって直接読み出し、アクセスすることができる任意の非一時的媒体を含む。媒体は、限定ではないが、フロッピーディスク、ハードディスクストレージ媒体および磁気テープ；光ディスクまたはＣＤ－ＲＯＭ等の光ストレージ媒体；ＲＡＭ、ＲＯＭおよびフラッシュメモリを含むメモリ等の電気ストレージ媒体；ならびに磁気／光ストレージ媒体等の上記のハイブリッドおよび組み合わせを含むことができる。
【0059】
用途
本明細書において図２および図３に示すように、本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法は、通常、より容易に得られた試料（例えば、血漿試料）から、ＣＣＦの信頼性のある、かつ多くの場合に改善された推定値を提供する。腫瘍組織試料内に存在しているかまたは存在していたがん特異的変異が、血漿試料には存在しないか否かを、統計的確信を持って判断する能力等の本方法の更なる特徴は、腫瘍のクローン動態のモニタリングを容易にする。したがって、本発明は、がん治療、がん管理、診断および予後判定の分野において相当な用途が見出される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの腫瘍特異的変異の結果として、変異したＤＮＡがネオアンチゲンをエンコードし、かつ／または、少なくとも１つの腫瘍特異的変異は、抗がん治療の標的であるかもしくはこれをエンコードする。クローナルであるかまたはクローナルになると予測されるネオアンチゲンは、典型的には、例えば、がんワクチン、Ｔ細胞治療、ＣＡＴ－Ｔ治療または他の細胞治療のより魅力的な標的となる。いくつかの場合、分岐／サブクローン集団においてのみ存在することが見出されるネオアンチゲンは、ネオアンチゲンを発生させる変異がクローナリティを増大させ、かつ／またはクローナリティに近づいているため、ワクチン、Ｔ細胞治療、ＣＡＲ－Ｔ等に適した標的とすることができる。他方で、本発明の方法を用いて、以前にクローナルであった変異がＣＣＦ＜１を有し、もはや良好な標的であるとして予測されないことを検出することができる。
本明細書において図２および図３に示すように、本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法は、通常、より容易に得られた試料（例えば、血漿試料）から、ＣＣＦの信頼性のある、かつ多くの場合に改善された推定値を提供する。腫瘍組織試料内に存在しているかまたは存在していたがん特異的変異が、血漿試料には存在しないか否かを、統計的確信を持って判断する能力等の本方法の更なる特徴は、腫瘍のクローン動態のモニタリングを容易にする。したがって、本発明は、がん治療、がん管理、診断および予後判定の分野において相当な用途が見出される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの腫瘍特異的変異の結果として、変異したＤＮＡがネオアンチゲンをエンコードし、かつ／または、少なくとも１つの腫瘍特異的変異は、抗がん治療の標的であるかもしくはこれをエンコードする。クローナルであるかまたはクローナルになると予測されるネオアンチゲンは、典型的には、例えば、がんワクチン、Ｔ細胞治療、ＣＡＴ－Ｔ治療または他の細胞治療のより魅力的な標的となる。いくつかの場合、分岐／サブクローン集団においてのみ存在することが見出されるネオアンチゲンは、ネオアンチゲンを発生させる変異がクローナリティを増大させ、かつ／またはクローナリティに近づいているため、ワクチン、Ｔ細胞治療、ＣＡＲ－Ｔ等に適した標的とすることができる。他方で、本発明の方法を用いて、以前にクローナルであった変異がＣＣＦ＜１を有し、もはや良好な標的であるとして予測されないことを検出することができる。
【0060】
当業者であれば理解するように、複数の最新の抗がん治療が承認されているが、治療を受けている対象が１つもしくは複数の特異的変異を有するがんを有するときである。そのような「標的化がん治療」は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｕｄｉｎｏ ＴＡ．「Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（標的化がん治療：次世代のがん治療）」Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；１２（１）：３－２０．ｄｏｉ：１０．２１７４／１５７０１６３８１２６６６１５０６０２１４４３１０．ＰＭＩＤ：２６０３３２３３に記載されている。本発明のＥＣＬＩＰＳＥ方法は、標的化がん治療の関連で使用法を見出すことができる。特に、１つまたは複数のがん特異的変異がそのような標的化治療の標的を表すとき、これらの変異を有するがん細胞のＣＣＦに関する情報が価値のある治療の洞察を提供する。例えば、治療標的である変異がクローナルであるか、またはクローナリティに近づいているという知識により、対応する治療を、この対象にとってより魅力的なものにすることができる。他方で、抗がん治療に対し耐性を与える変異の高ＣＣＦは、その治療をより魅力的でないものにし、かつ／または結果としてその対象の予後を悪化させる場合がある。
【0061】
特殊な形態で、もしくは開示の機能を実行する手段の観点で表される、上記の説明、もしくは以下の特許請求の範囲、もしくは添付の図面に開示される特徴、または開示される結果を得るための方法もしくはプロセスは、適宜、本発明をその多岐にわたる形態で実現するために、別個に、またはそのような特徴の任意の組み合わせで利用することができる。
【0062】
本発明は、上記で説明した例示的な実施形態と併せて説明されたが、多くの等価な変更および変形が、この開示を与えられた当業者には明らかとなろう。したがって、上記で示された本発明の例示的な実施形態は、限定ではなく例示であるとみなされる。本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、記載される実施形態に対する様々な変更を行うことができる。
【0063】
疑問を避けるために、本明細書に提供される理論的説明は、読み手の理解を改善する目的で提供される。本発明者はこれらの理論的説明のいずれにも束縛されることを望まない。
本明細書中で使用するセクションの見出しは構成目的のみであり、記載した主題を制限すると意図されるべきでない。
本明細書中で使用するセクションの見出しは構成目的のみであり、記載した主題を制限すると意図されるべきでない。
【0064】
後続の特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上特に必要としない限り、「備える」、「含む」およびこの変化形である「備えている」または「含んでいる」等は、記載されている整数もしくはステップまたは整数群もしくはステップ群を包含することを意味するが、他の整数もしくはステップまたは整数群もしくはステップ群を排除するものではないことが理解される。
【0065】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、文脈が明白に別途指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことに留意されるべきである。本明細書において、範囲を、「約」或る特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、と表現することができる。このような範囲が表現されるとき、別の実施形態は、その或る特定の値から、および／またはその別の特定の値までを含む。同様に、値が、前に「約」を使用して、近似値として表現される場合、その特定の値は別の実施形態を形成すると理解される。「約」という用語は、数値に関連して、任意選択であり、例えば、±１０％を意味する。
【実施例1】
【0066】
例示的なＥＣＬＩＰＳＥが作用した例
変異のＣＣＦを正確に推定するために、このため、クローンアーキテクチャおよびその動態を低純度のｃｔＤＮＡ試料において経時的に正確に推定するために、本発明者らは、一致した腫瘍組織配列決定から、各変異位置におけるコピー数状態、および各変異が属するクローン群の推定値をとる方法を展開し、この情報を、組織クローナリティ抽出方法からの式の再構成およびバックグラウンド配列決定ノイズの推定値と共に用いて、クローンアーキテクチャを正確にデコンボリューションする。より正確には、ＣＣＦは、以下の式を用いて推定することができる。
変異のＣＣＦを正確に推定するために、このため、クローンアーキテクチャおよびその動態を低純度のｃｔＤＮＡ試料において経時的に正確に推定するために、本発明者らは、一致した腫瘍組織配列決定から、各変異位置におけるコピー数状態、および各変異が属するクローン群の推定値をとる方法を展開し、この情報を、組織クローナリティ抽出方法からの式の再構成およびバックグラウンド配列決定ノイズの推定値と共に用いて、クローンアーキテクチャを正確にデコンボリューションする。より正確には、ＣＣＦは、以下の式を用いて推定することができる。
【0067】
【数3】
【0068】
式１Ａは、ＣＣＦについて、以下のように再整理することができる。
【数4】
【0069】
変異のＶＡＦ（バリアントアレル頻度）は、標的化ディープ配列決定を用いて、ｃｔＤＮＡデータから測定することができる。変異部位における変異の多重度、腫瘍コピー数および通常コピー数は、任意の時点からの腫瘍組織の全エクソーム配列決定から推定することができる。また、いずれの変異がクローナルであるかを、ｃｔＤＮＡにおけるＶＡＦ分布からの腫瘍組織および追加のフィルタを用いて判断することも可能である。このため、これらのクローナル変異（ここで、ＣＣＦ＝１）の場合、試料の純度は、この式を再整理することによって推定することができる。
【0070】
【数5】
【0071】
リキッドバイオプシーからのクローナリティの抽出（ＥＣＬＩＰＳＥ：Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ＬＩｑｕｉｄ ｂｉｏＰＳｉＥｓ）は、統計的検定を含む複数の他の推定を実行して、提供されたバックグラウンドノイズ推定値、および各サブクローンが（細胞の１００％において）クローナルであるかまたは（少数の細胞において）サブクローナルであるかの検定を用いて、存否または各試料における各サブクローンを推定することもできる。いくつかの場合、統計的検定は、二項検定、ポアソン検定、ウィルコクソンの１標本順位和検定（予測バックグラウンド分布を用いる）、カイ二乗検定およびフィッシャーの正確検定（予測基準およびバリアントカウントを、観測された基準およびバリアントカウントと比較する）からなる群から選択することができる。
表１は、（Ｒパッケージとして提供される）ＥＣＬＩＰＳＥツールに入力される代表的データの９個の列（１～９）を示す。
表１は、（Ｒパッケージとして提供される）ＥＣＬＩＰＳＥツールに入力される代表的データの９個の列（１～９）を示す。
【0072】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0073】
・列１は、変異ごとのｉｄである。また、染色体、位置および代替塩基も示される（例えば、１０：２８４４５５２５：Ｔは、染色体：１０、位置：２８４４５５２５、塩基：Ｔを示す）。
・列２は、血漿内の各変異について観測される変異リードの数である。
・列３は、血漿内の各変異位置の配列決定された深さである。
・列４は、血漿内の各変異のバックグラウンド誤り率（すなわち、各リードがこの変異を偶然含有する確率）である。
・列５は、変異が（全ての腫瘍細胞において）クローナルであるか否か（組織試料から測定される）を示す。変異がクローナルであるか否かの判断が以下に説明される。
・列６は、各変異がいずれのクローンに属するか（組織試料から測定される）を示す。各変異がいずれのクローンに属するかの決定は、以下に詳述するように行うことができる。
・列７は、変異の多重度（組織試料から測定される、変異のＤＮＡコピー数）を示す。
・列８は、変異した座位（組織試料から測定される）における腫瘍細胞における総コピー数（野生型および変異コピーの数）を示す。
・列９は、非腫瘍細胞における総コピー数を示す（正常細胞が２倍体であるであるため、これは通例２であると推定されるが、組織サンプルから測定されてもよい）。
・列２は、血漿内の各変異について観測される変異リードの数である。
・列３は、血漿内の各変異位置の配列決定された深さである。
・列４は、血漿内の各変異のバックグラウンド誤り率（すなわち、各リードがこの変異を偶然含有する確率）である。
・列５は、変異が（全ての腫瘍細胞において）クローナルであるか否か（組織試料から測定される）を示す。変異がクローナルであるか否かの判断が以下に説明される。
・列６は、各変異がいずれのクローンに属するか（組織試料から測定される）を示す。各変異がいずれのクローンに属するかの決定は、以下に詳述するように行うことができる。
・列７は、変異の多重度（組織試料から測定される、変異のＤＮＡコピー数）を示す。
・列８は、変異した座位（組織試料から測定される）における腫瘍細胞における総コピー数（野生型および変異コピーの数）を示す。
・列９は、非腫瘍細胞における総コピー数を示す（正常細胞が２倍体であるであるため、これは通例２であると推定されるが、組織サンプルから測定されてもよい）。
【0074】
バックグラウンド誤り率計算
この例について、バックグラウンド誤り率は、各血漿試料において配列決定された非変異ゲノム位置から計算された。本発明による血漿の配列決定は、腫瘍組織エクソーム配列決定において特定された既知の変異を標的化する。しかしながら、本発明者等は、これらの既知の変異のアップストリームおよびダウンストリームの数百の塩基対も配列決定した。組織エクソーム配列決定から変異されることがまだ知られていない血漿において配列決定された全ての位置を、非変異位置と呼ぶ。しかしながら、本明細書において、バックグラウンド誤りを、文献において既知の他の方法を用いて計算することができ、これを用いてＥＣＬＩＰＳＥに入力することができることが特に考慮されている。
この例について、バックグラウンド誤り率は、各血漿試料において配列決定された非変異ゲノム位置から計算された。本発明による血漿の配列決定は、腫瘍組織エクソーム配列決定において特定された既知の変異を標的化する。しかしながら、本発明者等は、これらの既知の変異のアップストリームおよびダウンストリームの数百の塩基対も配列決定した。組織エクソーム配列決定から変異されることがまだ知られていない血漿において配列決定された全ての位置を、非変異位置と呼ぶ。しかしながら、本明細書において、バックグラウンド誤りを、文献において既知の他の方法を用いて計算することができ、これを用いてＥＣＬＩＰＳＥに入力することができることが特に考慮されている。
【0075】
いずれの変異がいずれのクローン内にあるか、および変異がクローナルであるかクローナルでないかの判断
腫瘍組織の配列決定データにおいて、いずれの変異が何のクローンに属するかを判断するためのいくつかの方法が存在する。これらは全て、推定ＣＣＦに基づいた、これらの変異のクラスタ化に依存する。ＣＣＦは、上記で示すように式１Ｂを用いて計算された。ここで、コピー数および純度推定値は、エクソーム／全ゲノム中の生殖細胞系列単ヌクレオチド多態性の有効範囲を利用するＡＳＣＡＴ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＶａｎＬｏｏ－ｌａｂ／ａｓｃａｔ）等のツールの適用から得られる。本例において、これを行うためにＰｙＣｌｏｎｅが用いられた。ＰｙＣｌｏｎｅツールのガイドは、サイトｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｒｏｔｈ－Ｌａｂ／ｐｙｃｌｏｎｅ（参照により本明細書に引用される）において得ることができる。同様に必要な情報を提供するＰｙＣｌｏｎｅの代替は、ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｒａｐｈａｅｌ－ｇｒｏｕｐ／ｄｅｃｉｆｅｒ（参照により本明細書に引用される）に記載のＤｅｃｉｆｉｅｒと、ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｗｅｄｇｅ－ｌａｂ／ｄｐｃｌｕｓｔ（参照により本明細書に引用される）に記載のＤＰｃｌｕｓｔとを含む。
腫瘍組織の配列決定データにおいて、いずれの変異が何のクローンに属するかを判断するためのいくつかの方法が存在する。これらは全て、推定ＣＣＦに基づいた、これらの変異のクラスタ化に依存する。ＣＣＦは、上記で示すように式１Ｂを用いて計算された。ここで、コピー数および純度推定値は、エクソーム／全ゲノム中の生殖細胞系列単ヌクレオチド多態性の有効範囲を利用するＡＳＣＡＴ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＶａｎＬｏｏ－ｌａｂ／ａｓｃａｔ）等のツールの適用から得られる。本例において、これを行うためにＰｙＣｌｏｎｅが用いられた。ＰｙＣｌｏｎｅツールのガイドは、サイトｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｒｏｔｈ－Ｌａｂ／ｐｙｃｌｏｎｅ（参照により本明細書に引用される）において得ることができる。同様に必要な情報を提供するＰｙＣｌｏｎｅの代替は、ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｒａｐｈａｅｌ－ｇｒｏｕｐ／ｄｅｃｉｆｅｒ（参照により本明細書に引用される）に記載のＤｅｃｉｆｉｅｒと、ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｗｅｄｇｅ－ｌａｂ／ｄｐｃｌｕｓｔ（参照により本明細書に引用される）に記載のＤＰｃｌｕｓｔとを含む。
【0076】
ＰｙＣｌｏｎｅまたは類似の方法（ＤｅｃｉｆｅｒまたはＤＰｃｌｕｓｔ等）を用いてクローンアイデンティティが確認されると、これらのクローンのうちのいずれがクローナルクラスタであるか（このため、それに割り当てられた変異がクローナル変異である）の判断を、各クローンにおける全ての変異のＣＣＦ（がん細胞割合）の平均を計算し、最も高い平均ＣＣＦを有するクローンをクローナルであるものとして割り当てることによって行うことができる。
【0077】
表２は、ＥＣＬＩＰＳＥツールによって表１の入力データから計算された７つの列（１０～１６）を示す。
【表2-1】
【表2-2】
【0078】
・列１０は、各変異のバックグラウンド誤りに起因して偶然観測することが予期される変異したリードの数である。これは、表１の列３におけるエントリに表１の列４におけるエントリを乗算することによって計算される。
・列１１は、ヌル仮説が実際に真であるときに観測結果を得る確率を示す、クローンごとのＰ値であり、例えば低いＰ値（Ｐ＜０．０１）は、クローンが実際には存在しない場合、観測された数のバリアントを見つける可能性が非常に低いことを意味する。ＥＣＬＩＰＳＥ方法は、ユーザが適切な閾値を設定することを可能にするＰ値の読み出しを提供することができる。例えば、クローンは、Ｐ値が０．０５よりも大きいとき、またはＰ値が０．０１よりも大きいときに存在しないとみなされる場合がある。当業者であれば理解するように、選択されるＰ値の閾値は、検定数、および許容可能な型Ｉ／ＩＩの誤り全体に依拠して、行われる解析に対し調整されるべきである。
・列１１は、ヌル仮説が実際に真であるときに観測結果を得る確率を示す、クローンごとのＰ値であり、例えば低いＰ値（Ｐ＜０．０１）は、クローンが実際には存在しない場合、観測された数のバリアントを見つける可能性が非常に低いことを意味する。ＥＣＬＩＰＳＥ方法は、ユーザが適切な閾値を設定することを可能にするＰ値の読み出しを提供することができる。例えば、クローンは、Ｐ値が０．０５よりも大きいとき、またはＰ値が０．０１よりも大きいときに存在しないとみなされる場合がある。当業者であれば理解するように、選択されるＰ値の閾値は、検定数、および許容可能な型Ｉ／ＩＩの誤り全体に依拠して、行われる解析に対し調整されるべきである。
【0079】
これは、（表１における）列２を合算して、各クローンにおける全ての変異にわたって観測されたリードの総数（例えば、クローン１の場合、２０１５個のバリアントリード）を与え、（表２における）列１０を合算して、各クローン内の全ての変異にわたって偶然予期するリードの総数を与え、次に、統計的検定を適用することによって計算され、ここで、列１０の和はバックグラウンドラムダであり、列２の和は、推定雑音よりも多くの信号を有するか否か、このためクローンが存在するか否かについてＰ値を与えるための、各クローンの本発明による観測である。特に、統計的検定は、二項検定、ポアソン検定、ウィルコクソンの１標本順位和検定、またはカイ二乗／フィッシャーの正確検定であり得る。
【0080】
・列１２は、血漿における各変異のバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）であり、表１の列２におけるエントリを表１の列３のエントリによって除算することによって決定される。
・列１３は、純度の変異特異的推定値を示す。変異特異的純度推定値は、以前の組織サンプリングからクローナルであることが既知である（すなわち、表１の列５において、「クローナルであるか？」が「真」である）クローンの変異について式２に入力される、ＣＮｎｏｒｍの値（表１における列９）、多重度（表１における列７）、ＶＡＦ（表２における列１２）、およびＣＮｔｕｍ（表１における列８）から導かれる。式２の出力は、純度の変異特異的推定値である。
・列１３は、純度の変異特異的推定値を示す。変異特異的純度推定値は、以前の組織サンプリングからクローナルであることが既知である（すなわち、表１の列５において、「クローナルであるか？」が「真」である）クローンの変異について式２に入力される、ＣＮｎｏｒｍの値（表１における列９）、多重度（表１における列７）、ＶＡＦ（表２における列１２）、およびＣＮｔｕｍ（表１における列８）から導かれる。式２の出力は、純度の変異特異的推定値である。
【0081】
・列１４は、試料における全てのクローナル変異にわたる表２の列１３の平均、すなわち、血漿試料の純度の最終推定値である。
・列１５は、式１Ｂを適用することによる、変異ごとのがん細胞割合（ＣＣＦ）推定値である。すなわち、変異ごとに、表２の列１２からＶＡＦが取得され、表１の列７から多重度が取得され、表２の列１４から純度（Ｐ）が取得され（すなわち、血漿試料の純度の最終推定値）、表１の列８からＣＮｔｕｍが取得され、表１の列９からＣＮｎｏｒｍが取得される。
・列１５は、式１Ｂを適用することによる、変異ごとのがん細胞割合（ＣＣＦ）推定値である。すなわち、変異ごとに、表２の列１２からＶＡＦが取得され、表１の列７から多重度が取得され、表２の列１４から純度（Ｐ）が取得され（すなわち、血漿試料の純度の最終推定値）、表１の列８からＣＮｔｕｍが取得され、表１の列９からＣＮｎｏｒｍが取得される。
【0082】
・列１６は、所与のクローンにおける全ての変異にわたってＣＣＦを平均することによって計算されるＣＣＦのクローンレベル推定値を示す。
この例において、「クローナル＝真」を有するクローンについて予期されるように、クローン１の推定ＣＣＦが１に非常に近い（０．９９６）ことがわかる。クローン３の推定ＣＣＦは０．１５１であり、すなわち、約１５％である。クローン８の推定ＣＣＦはゼロに近く（０．０１）、これは、約０．３のＰ値が、クローンが存在する可能性が低いことを示すために予期される（観測されるバリアントリード数が、バックグラウンド配列決定誤り率の観点で、偶然のみに起因する可能性が高いことに起因する）。
この例において、「クローナル＝真」を有するクローンについて予期されるように、クローン１の推定ＣＣＦが１に非常に近い（０．９９６）ことがわかる。クローン３の推定ＣＣＦは０．１５１であり、すなわち、約１５％である。クローン８の推定ＣＣＦはゼロに近く（０．０１）、これは、約０．３のＰ値が、クローンが存在する可能性が低いことを示すために予期される（観測されるバリアントリード数が、バックグラウンド配列決定誤り率の観点で、偶然のみに起因する可能性が高いことに起因する）。
【0083】
試料は３．５％の腫瘍純度を有し、サブクローン３は、この血漿試料が取得された時点で腫瘍細胞の約１５％（列１６）に存在していた（列１１についてｐ値は非常に低い）と結論付けることができるため、これらの結果は、潜在的に作用可能な臨床知識をもたらす。これは、サブクローン３における変異が、ほとんどの細胞において存在しないため、この時点において不良な標的であったことを示すが、これは経時的に変化し得る。後に、血漿試料が本発明のＥＣＬＩＰＳＥパイプラインを通じて処理される場合、サブクローン３が真にクローナルとなり、次にそこでの変異が標的化可能となることがわかり得る。本例において、サブクローン８がこの試料内に存在しないという証拠が見られなかった（列１１－Ｐ値が過度に高い）。これは、サブクローン８が今後クローナルとなる（そしてその変異が標的化可能となる）可能性が低いことを意味する。
【実施例2】
【0084】
ＥＣＬＩＰＳＥ妥当性確認
背景：抵抗性がん細胞集団の増生は、腫瘍学における治療の失敗の一般的なメカニズムである。有効な個人化された薬剤は、全ての腫瘍細胞に存在する異常を対象とすることに頼るが、腫瘍は不均一であり、包括的な腫瘍組織サンプリングは多くの場合に不可能である。リキッドバイオプシーは、疾患の経過を通じて定期的間隔で代表的な腫瘍サンプリングを提供する可能性を有するが、現在のクローナルデコンボリューション方法は、ほとんどの資料を局所化または微小残存病変（ＭＲＤ）設定において含む低腫瘍内容物試料（＜５％）において無効である。
背景：抵抗性がん細胞集団の増生は、腫瘍学における治療の失敗の一般的なメカニズムである。有効な個人化された薬剤は、全ての腫瘍細胞に存在する異常を対象とすることに頼るが、腫瘍は不均一であり、包括的な腫瘍組織サンプリングは多くの場合に不可能である。リキッドバイオプシーは、疾患の経過を通じて定期的間隔で代表的な腫瘍サンプリングを提供する可能性を有するが、現在のクローナルデコンボリューション方法は、ほとんどの資料を局所化または微小残存病変（ＭＲＤ）設定において含む低腫瘍内容物試料（＜５％）において無効である。
【0085】
方法：本発明者等は、早期段階の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＳ）のＴＲＡＣＥＲｘ研究に登録した２０１人の患者からの１０９２の血漿試料を解析した。これらの患者は、原発腫瘍および再発組織の多領域全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）も受けた。個人化されたパネルは、２００の変異を標的にするように設計され、血漿を、２１４９Ｘのメジアン固有深さ（ｍｅｄｉａｎ ｕｎｉｑｕｅ ｄｅｐｔｈ）まで配列決定した。情報科学ツールＥＣＬＩＰＳＥ（リキッドバイオプシーからのクローナリティの抽出）は、血漿からのバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）およびバックグラウンドノイズ推定値を、腫瘍組織から呼び出された変異ごとのコピー数およびクローンアイデンティティと共に利用して、血漿試料収集時点の血漿試料純度、サブクローンの存否、およびがん細胞割合（ＣＣＦ）を正確に推定するように設計された。シミュレーションを用いて、本発明者らは、ＥＣＬＩＰＳＥが、０．２％の純度の１０％ＣＣＦのサブクローンを検出することが可能になったと推定した。＞０．２％の純度を有する試料（ＭＲＤ陽性試料の５２％）のみが、クローナリティ解析について検討された。
【0086】
結果：腫瘍内不均一性の代表的サンプリングのためのリキッドバイオプシーおよびＥＣＬＩＰＳＥの使用を有効性確認するために、本発明者らは、手術前に収集された血漿試料内のＥＣＬＩＰＳＥを用いたクローナルデコンボリューションを、手術時の多領域エクソーム配列決定を介して推定されたものと比較した。本発明者らは、これらの試料（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．６、平均純度＝１．４％）における血漿および組織において推定されたサブクローンのＣＣＦ間の１：１の相関を得たのに対し、血漿におけるＣＣＦのＶＡＦのみの推定値は、組織試料と比較したとき、ＣＣＦを体系的に過小評価し、潜在的治療標的を誤分類した。ＥＣＬＩＰＳＥは、腫瘍組織にわたって複数の領域に存在するサブクローンの９７％、および単一の領域に固有のサブクローンの６３％を検出した。単一の領域に固有のサブクローンにおけるＣＣＦ推定値を解析することにより、本発明者らは、血漿におけるＣＣＦが、組織（Ｐ＜０．００１、ＯＲ＝０．３３）、特に、より小さな比率の腫瘍組織がサンプリングされた、より大きな腫瘍（Ｐ＜０．００１、ＯＲ＝０．１６）において得られたものよりも一貫して低いことがわかった。この効果は、いくつかの腫瘍領域にわたって分散するサブクローンにおいて明らかでなかった。これは、血漿配列決定を用いて克服される、原発腫瘍における空間制約に起因したサンプリングバイアスと一貫している。バリアントが試料において偏在するが、サンプリングされていない腫瘍においては存在しない場合のクローナリティの錯覚は、単一組織領域サンプリングにおいて一般的である。本発明者らは、真のクローナル変異と比較して、各ＴＲＡＣＥＲｘ患者におけるランダムに選択された領域からのクローナル錯覚変異における大幅に低い血漿ＣＣＦを得て、多領域サンプリングを要求することなく、ネオアンチゲン等の適切な治療標的を区別した。２８人の患者において検出された転移におけるクローン構造は、再発時の組織およびｃｆＤＮＡサンプリングの双方と比較された。本発明者らは、対応するｃｆＤＮＡにおける再発組織において得られたサブクローンの２８／２９を検出した。再発組織に存在しない原発腫瘍からのｃｆＤＮＡにおいて追跡された１２５個のサブクローンのうち、本発明者らは、再発時にｃｆＤＮＡに存在する、７人の患者からの更なる８つのサブクローンを得た。ｃｆＤＮＡにおける再発点においてサブクローンとなるこれらの８つのサブクローンについて強力なバイアスが得られた（Ｐ＝０．００８、ＯＲ＝５．５）。加えて、不十分なサンプリングに起因して、これらのサブクローンに一致するこれらの７人の患者（Ｐ＝０．１９）において、より多くの数の非サンプリング転移部位が、組織において見逃される傾向がわかった。ポリクローナル再発を有する患者において、本発明者らは、経時的なクローン動態を観測した。そのうちのいくつかは治療と同時であった。最終的に、本発明者らは、再発患者において、転移性コンピテントサブクローンは、転移を有しないクローン（Ｐ＜０．００１、ＯＲ＝４．５）よりも、術前血漿において測定される、原発腫瘍における、より高いＣＣＦ、すなわちより大きなクローンサイズを有すること、および再発患者が、一般的に、非再発患者（Ｐ＝０．０４３）よりも、原発腫瘍において大きなサブクローンを有することがわかった。
【0087】
結論：本発明者らは、本発明によれば、血漿サンプリングが、情報ツールＥＣＬＩＰＳＥを用いて経時的に腫瘍のクローン構造を正確にプロファイルすることができ、転移の生物学的決定因子、治療に応じたクローン動態を明らかにし、全ての腫瘍細胞内に存在するバリアントに対する標的化治療をより良好に調整する可能性を有するというエビデンスを得た。
【実施例3】
【0088】
ＥＣＬＩＰＳＥを用いた血漿試料のクローナルデコンボリューション
超低細胞充実度の血漿試料においてクローナルデコンボリューションを行うという課題を克服するために、情報ツールＥＣＬＩＰＳＥ（リキッドバイオプシーからのクローナリティの抽出）が開発された。ＥＣＬＩＰＳＥは、超低純度試料の場合、いくつかのディープ標的化配列決定方法を、各変異のクローナルステータス、および腫瘍組織試料からのそのコピー数状態に関するデータと組み合わせて用いて評価することができる、血漿からの変異バリアントアレル頻度（ＶＡＦ）の尺度を用いる。図１を参照すると、右側に、各々が別個のクローンに属する４つの例示的な変異が示されている。この例において、腫瘍は８つの細胞を有する。青色の細胞はクローナルであり、２つの変異コピーを有し、他の３つの変異は、異なるコピー数ステータスを有する腫瘍細胞の異なるサブセットにある。予期されるように、がん細胞割合（ＣＣＦ）および変異および野生型コープ数は、これらのＤＮＡ分子が、底部に示されるように血漿内に押し出されるとき、バリアントアレル頻度（ＶＡＦ）に対し影響を有することがわかった。左上に示すように、これらのＶＡＦを、この場合ベースラインにおいて収集された、腫瘍組織からのこれらの異なる変異のコピー数およびクローナルステータスと共に観測し、次に、クローナル変異を用いて試料の純度を計算し、そこから経時的な血漿試料中の変異およびクローンについてＣＣＦを決定することができる。
超低細胞充実度の血漿試料においてクローナルデコンボリューションを行うという課題を克服するために、情報ツールＥＣＬＩＰＳＥ（リキッドバイオプシーからのクローナリティの抽出）が開発された。ＥＣＬＩＰＳＥは、超低純度試料の場合、いくつかのディープ標的化配列決定方法を、各変異のクローナルステータス、および腫瘍組織試料からのそのコピー数状態に関するデータと組み合わせて用いて評価することができる、血漿からの変異バリアントアレル頻度（ＶＡＦ）の尺度を用いる。図１を参照すると、右側に、各々が別個のクローンに属する４つの例示的な変異が示されている。この例において、腫瘍は８つの細胞を有する。青色の細胞はクローナルであり、２つの変異コピーを有し、他の３つの変異は、異なるコピー数ステータスを有する腫瘍細胞の異なるサブセットにある。予期されるように、がん細胞割合（ＣＣＦ）および変異および野生型コープ数は、これらのＤＮＡ分子が、底部に示されるように血漿内に押し出されるとき、バリアントアレル頻度（ＶＡＦ）に対し影響を有することがわかった。左上に示すように、これらのＶＡＦを、この場合ベースラインにおいて収集された、腫瘍組織からのこれらの異なる変異のコピー数およびクローナルステータスと共に観測し、次に、クローナル変異を用いて試料の純度を計算し、そこから経時的な血漿試料中の変異およびクローンについてＣＣＦを決定することができる。
【0089】
以下のステップは、ＥＣＬＩＰＳＥツールに必要な入力を得るための方法を概説する。ＥＣＬＩＰＳＥツールは、次に、所与の（例えば、サブクローナル）クローンのＣＣＦの推定値を出力する。
【0090】
１）少なくとも１つの腫瘍試料を収集する。
２）腫瘍試料からのＤＮＡ抽出および全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）（または全ゲノム配列決定（ＷＧＳ））。
３）変異およびコピー数呼び出しを（例えば、ＭｕｔｅｃｔおよびＡＳＣＡＴを用いて）実行し、これらの方法からの出力を用いて、いずれの変異がいずれのクローンに属するかを出力するＰｙＣｌｏｎｅ（またはＤｐｃｌｕｓｔ他）等のクローナルデコンボリューションツールを実行する。
２）腫瘍試料からのＤＮＡ抽出および全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）（または全ゲノム配列決定（ＷＧＳ））。
３）変異およびコピー数呼び出しを（例えば、ＭｕｔｅｃｔおよびＡＳＣＡＴを用いて）実行し、これらの方法からの出力を用いて、いずれの変異がいずれのクローンに属するかを出力するＰｙＣｌｏｎｅ（またはＤｐｃｌｕｓｔ他）等のクローナルデコンボリューションツールを実行する。
【0091】
４）これらの出力を用いて、いずれの変異がクローナルであるか、および各変異座位におけるコピー数を計算する。
５）この患者について、１つまたは複数の時点における１つまたは複数のｃｔＤＮＡ含有試料（例えば、血漿試料）を収集する。
５）この患者について、１つまたは複数の時点における１つまたは複数のｃｔＤＮＡ含有試料（例えば、血漿試料）を収集する。
【0092】
６）各血漿試料における組織配列決定から、関心対象の全ての変異（例えば、チロシンキナーゼ阻害薬に対する感受性を与えるもの等の、潜在的ネオアンチゲンまたは標的化可能変異）について、バリアントアレル変異（ＶＡＦ）を計算するためのアッセイを実行する。これは、（特に、高い腫瘍量およびｃｔＤＮＡ量を有する後期の患者の場合に）ＷＥＳとなり得るが、好ましくは、（例えば、より多岐にわたるがんタイプにわたるより早期の患者との関連で）ＡｒｃｈｅｒＤｘ ＭＲＤ方法のような誤り訂正された標的化ディープ配列決定方法であり得る。
【0093】
７）各変異のバックグラウンド配列決定ノイズを推定し、これに続いて、血漿において、ゲノム内の非変異位置を調べる（実施例１において「バックグラウンド誤り率計算」という見出しの下で示される詳細を参照）
８）ＥＣＬＩＰＳＥ情報ツールに、変異および合計コピー数、バックグラウンド配列決定ノイズ、各変異のクローンメンバーシップ、および血漿バリアントアレル頻度を入力する（実施例１を参照）。
８）ＥＣＬＩＰＳＥ情報ツールに、変異および合計コピー数、バックグラウンド配列決定ノイズ、各変異のクローンメンバーシップ、および血漿バリアントアレル頻度を入力する（実施例１を参照）。
【0094】
図２に示すように、血漿サンプリングは、多重領域組織サンプリングよりも更に多くの腫瘍の不均一性を捕捉する可能性を有する。特に、組織サンプリングの結果として、空間的に制約されたサブクローンが見逃される（例えば、紫色）または過大評価される（橙および茶）可能性が高いことに起因した大きなサンプリングバイアスが生じる可能性がある。他方で、腫瘍内の全てのまたは少なくともほとんどの細胞が、ｃｔＤＮＡを血漿内にシェディングし、このため、時間の経過に伴う、より代表的なサンプリングを可能にする。
【0095】
図３に示すように、本発明者らは、手術前に取得された血漿において測定されたＣＣＦ（ｙ軸）を、手術時に多領域組織配列決定を用いて測定されたＣＣＦ（ｘ軸）と比較した。左側のパネルは、本発明のＥＣＬＩＰＳＥツールが、血漿試料からＣＣＦを推定するのに用いられたデータを示す。右側のパネルは、血漿試料からのＣＣＦの推定においてＥＣＬＩＰＳＥが用いられなかったデータ（すなわち、ＣＣＦはＶＡＦのみ、すなわち、各サブクローンの平均ＶＡＦを、クローンクラスタの平均ＶＡＦで除算したもののみによって推定された）を示す（すなわち、コピー数非認識ＣＣＦ）。散布図の点は、個々の特許試料であり、散布図の点のサイズは、血漿純度に比例する（０．１％の純度から１０％の純度のインセットスケールを参照）。本発明者らは、血漿由来のＣＣＦ推定値と、多領域組織由来のＣＣＦ推定値との間の強力な相関が存在することがわかり、一般的に、各クローン内のクローンサイズまたは細胞数が、解放されるｃｔＤＮＡ量に対し強力な影響を有することを示唆し、ＣＣＦ推定のための方法としてＥＣＬＩＰＳＥの有効性を確認した。更に、本発明者らは、ＥＣＬＩＰＳＥがなければ、おそらくコピー数訂正の欠如に起因して、血漿中のより低いＣＣＦに向けた体系的バイアスが存在することがわかった。クローナル変異は、ゲノム倍加の前により頻繁に生じ、このため、より高いコピー数、このためより高いＶＡＦにある傾向にある。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、左側の外れ値が、原発腫瘍組織サンプリングにおける細胞ごとのｃｆＤＮＡシェディングまたはサンプリングバイアスにおけるいずれかの差によって生じ得ると考える。
【0096】
図４に示すように、本発明者らは、血漿試料内の任意のがん細胞割合においてサブクローンを検出する能力も評価した。このデータセットにおいて、方法が、０．２の純度の試料において１０％のＣＣＦでサブクローンを検出する能力を有することが推定された。クローンが原発腫瘍内の複数の試料にわたって存在するとき、血漿における非常に高い検出率が得られた。しかしながら、クローンが単一の試料に固有である場合、検出率はより低かった。いくつかの領域にわたって拡散した、見逃されたごく少数のサブクローンの試料において、これらのサブクローンにおける単一の変異のみを追跡したことがわかった。このため、これらの変異は、偽陽性である場合があるか、または実際には割り当てられたサブクローンのメンバーでない場合がある。しかしながら、試料固有のクローンにおいて、一般的に、より少ない数の変異が後続したが、多数の追跡された変異を有する多くのクローンが存在し、ここで、組織のＣＣＦは、これらを血漿中で検出することが可能であることを示唆した。図５に示すように、この発見の１つの説明は、これらの単一領域サブクローンが、原発腫瘍組織におけるサンプリングバイアスに起因して過剰サンプリングされ、実際には、組織から推定するよりもはるかに小さく、血漿におけるそれらの検出が困難になっているということである。サンプリングバイアスのこの特定の形態は、「勝者の呪い」効果として知られている。図６に示すように、そのようなサンプリングバイアスと一致して、ＤＯ検出する、単一の領域に固有のサブクローンの６０％において、それらのクローンサイズ（ＣＣＦ）が、組織におけるよりも、血漿において小さいことを通例推定する。図７を参照すると、これがサンプリングデバイスに起因していた場合に行う別の予測は、この効果が腫瘍サイズと共にスケーリングするというものである。すなわち、より大きな腫瘍において、配列決定のために捕捉された質量のより小さなパーセンテージを有する可能性が高く、これはひいては、より強力なサンプリングバイアスを予期することを意味する。これは、実際、本データにおいて見られるものである。腫瘍の多くが配列決定される小さな腫瘍において、血漿における推定クローンサイズ対組織サンプリングから推定されたものにおいてほとんど減少が見られない。他方で、１００ｃｍ３を上回るより大きな腫瘍において、組織におけるクローンサイズを６倍に過大評価している場合がある強力な効果が見られる。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、この発見が、ＥＣＬＩＰＳＥツールを用いて適切に処理された場合の血漿サンプリングに一致し、組織サンプリングによって得られたものよりも正確な腫瘍不均一性の読み取りおよびＣＣＦ推定値を与えると考える。これは、血漿サンプリングが腫瘍全体にわたる、はるかに大きく、かつより代表的な細胞プールから信号を導出することに起因し得る。換言すれば、ｃｔＤＮＡリキッドバイオプシーに加えてＥＣＬＩＰＳＥを使用することは、より侵襲的でないのみでなく、腫瘍の組織サンプリングよりも正確なＣＣＦの推定値を提供する可能性を有する。
【0097】
血漿を用いた代表的なサンプリングは、治療標的化のためのクローナル変異（例えば、免疫療法および／または細胞治療のために標的化可能であり得るネオアンチゲン）の正確な特定を可能にする。血漿サンプリングが、腫瘍質量のクローン組成物を良好に表すという上記の発見を考慮して、本発明者らは、血漿サンプリングを用いて、包括的腫瘍組織領域サンプリングか可能でない場合に、例えば、診断時に手術不能な患者において、ネオアジュバント療法の前に、または複数部位の転移が関与する再発時に、より正確にクローナリティを解消することが可能であり得ると考えた。現在、これらの状況において、単一の試料を用いて、患者をゲノムプロファイリングし、いくつかの場合、治療のための標的を選択する。しかしながら、そのような単一の試料は、サンプリングバイアスを高度に受けやすい場合があり、潜在的に、準最適な治療標的選択となる場合がある。
【0098】
図８Ａに示すように、単一の試料は通例、クローナル錯覚を導き、ここで、取得された試料の全ての細胞に存在する変異が腫瘍全体にわたって存在するわけではなく、このため、不良な治療標的となる。本発明者らは、患者ごとに単一の試料をランダムに選択し、その試料の全ての細胞内にあるように見える変異のみを検討することによって、ＴＲＡＣＥＲｘを単一の領域データセット内にシミュレートした。次に、これらの見かけ上のクローナル変異を、腫瘍全体にわたって真にクローナルの変異（図８Ｂの左を参照）と、クローナル錯覚を有し、実際にはサブクローナルであり、他の試料内に存在しない変異（図８Ｂの右を参照）とに分割し、ｙ軸上に推定がん細胞割合（ＣＣＦ）をプロットした。これらの場合、クローナル錯覚を有する変異が、血漿においてはるかに少ないＣＣＦを有することがわかった。なぜなら、血漿試料は、腫瘍全体にわたる細胞の比率をより良好に表すためである。これは、血漿試料が、治療標的が真にクローナルであるか否か、およびこのため治療標的化に値するか否かを判断するのに役立つことができることを示唆する。
【0099】
図９において、ＥＣＬＩＰＳＥを用いて時間経過に伴って追跡された腫瘍動態の例が見られる。このプロットにおいて、ｙ軸は異なるクローンのサイズおよび身体内の総腫瘍質量を示す。この場合、２つの異なるクローンが術後の腫瘍において優勢であることがわかる。また、免疫療法がこの患者に適用された後、赤色のクローンがより急速に複製し、青色のクローンを打ち負かす、適応度地形における変化が見られる。がん細胞割合を用いてこれを表す場合、すなわち、総腫瘍質量を無視する場合、ここで、より早期の低い細胞充実度の時点において、赤色のサブクローンの系統が術前の細胞に高い比率に存在するが、青色のサブクローンによって最初に打ち負かされることを見て取ることができる（図１０）。しかしながら、青色のクローンのＣＣＦは、次に、がん免疫学治療（ＩＯ）の適用時に縮小する。また、これを、このプロットの上に示す再発組織のクローン構造と比較することもできる。ここで、双方の系統は、手術時に多領域配列決定を用いて検出された原発腫瘍において表される。次に、後の時点において、青色ではなく、赤色および緑色の系統が検出され、青色の系統が、組織生検を用いてサンプリングされているのではなく、ｃｔＤＮＡを用いて捕捉された他の疾患部位に固有であることを示唆する。
【0100】
本発明者らが、ｃｔＤＮＡにおいて検出されたクローンと、ＴＲＡＣＥＲｘにおける再発組織プロファイルにおいて検出されたクローンとの間の一致を調べたとき、ｃｔＤＮＡ内で追跡されるサブクローンのほとんど全て（１つを除く）について、組織内で見つかったクローンが、ｃｔＤＮＡ内でも検出された。しかしながら、ｃｔＤＮＡは、検出されたサブクローンの数の２８％の増大をもたらす更なるサブクローンも特定した（図１１を参照）。これらの追加のサブクローンは、サンプリングされていない転位部に存在することができ、これをサポートすることにより、本発明者らは、ｃｔＤＮＡにおいて発見された更なるサブクローンを有する患者が、より多数のサンプリングされていない部位に向けて有意でない傾向を有し、また、これらのクローンは、組織サンプリングを用いて見逃された、これらと一致するｃｔＤＮＡを用いて腫瘍細胞のサブセットにおいてのみ推定される傾向を有したことがわかった。
【0101】
ＴＲＡＣＥＲｘにおいて、本発明者らは、がん転移のモードに強い関心を有する（図１２Ａを参照）。何人かの患者はモノクローナル再発を呈し、ここで、単一のサブクローンのみが全ての転移組織を播種した。いくつかはポリクローナル再発を呈し、ここで、複数の異なるクローンが転移組織または多系統再発を播種し、ここで、系統樹上の複数の異なる分岐からの複数のクローンが転移を播種する。本発明者らは、ｃｔＤＮＡを用いて検出された播種型と、組織サンプリングを用いて検出された播種型とを比較した。本発明者らは、概して、ｃｔＤＮＡがよりクローン的に複雑なピクチャを提供することがわかった。ここで、より多くの患者が、ｃｔＤＮＡにおいて検出された追加のサブクローンに起因して、ポリクローナルまたは多系統として分類された。これにもかかわらず、現在のデータに一致して、大多数の患者がモノクローナル疾患再発を有するように見える（図１２Ｂを参照）。
【0102】
図１３におけるプロットは、各患者を、ｘ軸にわたって時間が進む線として示し、試料は、検出された再発の型に従って着色されたドットとして表される。ほとんどの場合、再発タイプが検出されると、これは後続試料において一貫し、重要なことに、再発型は、これらの試料における低いｃｔＤＮＡ割合にもかかわらず、補助の最小残余疾患（ＭＲＤ）設定における臨床再発（灰色の垂直線によって示される）の前に多くの場合に正確に検出することができることを見て取ることができる。
【0103】
図１４に示すように、よりクローン的に複雑な腫瘍は、診断から、および再発後の双方で不良な生存結果を有する傾向にあり、これによりＭＲＤ検出後の更なる予後トリアージが可能になることを示唆する。
【0104】
ＣＣＦのＥＣＬＩＰＳＥ推定と結合した血漿サンプリングの使用は、本発明者らが、サブクローンサイズおよび転移能に関する興味深い洞察を行うことを導く。転移を播種するクローンの型に強力なバイアスを発見した（図１５Ｂを参照）。転移に進む患者において、再発クローンは、そうでないものより、はるかに高いがん細胞割合を血漿中に有する傾向にあることがわかった。これは、近時のサブクローナル拡張を受けたのが、転移の可能性が最も高い、最も大きいサブクローンであることを示唆する。転移患者および非転移患者におけるクローンサイズの分布も異なり、ここで、転移患者は、腫瘍内により大きなサブクローンが存在する傾向を有することもわかった（図１５Ａを参照）。
【0105】
参考文献
本発明、および本発明が関係する従来技術をより完全に説明および開示するために、複数の公開文献が上記で引用された。これらの参考文献の各々の全体が本明細書に引用される。
本発明、および本発明が関係する従来技術をより完全に説明および開示するために、複数の公開文献が上記で引用された。これらの参考文献の各々の全体が本明細書に引用される。
【0106】
標準的な分子生物学技法についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）」Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ ｅｄ．２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【国際調査報告】