特表 2024-539622 グルコアミラーゼバリアント及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-29

(54)【発明の名称】グルコアミラーゼバリアント及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/34 20060101AFI20241022BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241022BHJP

   C12P 19/02 20060101ALI20241022BHJP

   C12P 7/04 20060101ALI20241022BHJP

【ＦＩ】

C12N9/34 ZNA

C12N15/56

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12P19/02

C12P7/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522109

(86)(22)【出願日】2022-10-14

(85)【翻訳文提出日】2024-05-31

(86)【国際出願番号】 US2022078121

(87)【国際公開番号】W WO2023064905

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/124148

(32)【優先日】2021-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】509240479

【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク

(74)【代理人】

【識別番号】110003579

【氏名又は名称】弁理士法人山崎国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100118647

【弁理士】

【氏名又は名称】赤松 利昭

(74)【代理人】

【識別番号】100123892

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 忠雄

(74)【代理人】

【識別番号】100169993

【弁理士】

【氏名又は名称】今井 千裕

(74)【代理人】

【識別番号】100173978

【弁理士】

【氏名又は名称】朴 志恩

(72)【発明者】

【氏名】シェファーズ、マーティン

(72)【発明者】

【氏名】イアンクー、スヴェトラーナ ローラ

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン ブリュッセル－ツヴァイネン、マルコ

(72)【発明者】

【氏名】クルイトフ、ポーリアン

(72)【発明者】

【氏名】ゾルグ、ロビン

(72)【発明者】

【氏名】タン、ゾンメイ

(72)【発明者】

【氏名】チャン、シェンホン

(72)【発明者】

【氏名】シャン、ユエペン

(72)【発明者】

【氏名】コザック、バーバラ

(72)【発明者】

【氏名】ニコラエフ、イゴール

(72)【発明者】

【氏名】ラッシラ、ジョナサン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AF02

4B064CA21

4B064CB07

4B064CD19

4B065AA66Y

4B065AA70X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA32

(57)【要約】

本明細書中に記載されるのは、とりわけ、グルコアミラーゼバリアント、及びこれを用いてデンプン基質を糖化する方法である。さらに、本開示はまた、発酵産物を生成するプロセス、及び動物におけるデンプン消化率を増大させる方法、並びに前記グルコアミラーゼバリアントを用いて発酵飲料を製造する方法に関する。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号４の位置２０、２１、２３、３７、４９、５１、５２、６６、６７、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９２、９４、１０２、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１４３、１５６、１５７、１５８、１６４、１６５、１６６、１７２、１９２、２０３、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５２、２５３、２７４、２７８、２８１、２９０、３０２、３１０、３２１、３３８、３４１、３５０、３５１、３５２、３５４、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１６、４１８、４２２、４３０、４３４、４４０、４４１、４４４、４４５、及び／若しくは４４９、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応する残基位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼバリアント又はその断片。

【請求項2】

前記等価の位置は、配列同一性によって決定され、前記親グルコアミラーゼは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、又は３７との少なくとも８０％の配列同一性且つ１００％未満の配列同一性を有する、請求項１に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項3】

前記等価の位置は、配列同一性によって決定され、前記親グルコアミラーゼは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、又は３７を含む、請求項２に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項4】

前記親グルコアミラーゼは、ケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群グルコアミラーゼである、請求項１～３のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項5】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｐ；Ｘ０２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ；Ｘ０２３Ｌ／Ｍ；Ｘ０３７Ｃ／Ｎ；Ｘ０４９Ｗ；Ｘ０５１Ｋ／Ｌ／Ｖ／Ｙ；Ｘ０５２Ｆ／Ｎ／Ｐ；Ｘ６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ；Ｘ０６７Ａ／Ｃ／Ｍ；Ｘ０６９Ａ／Ｃ／Ｋ；Ｘ０７３Ｎ／Ｐ；Ｘ０７７Ｍ／Ｐ／Ｓ；Ｘ０７９Ｃ／Ｒ／Ｔ；Ｘ０８０Ｈ／Ｋ／Ｎ；Ｘ０８１Ｎ／Ｓ；Ｘ０８４Ｌ／Ｖ；Ｘ０９２Ｃ／Ｉ／Ｍ；Ｘ０９４Ａ／Ｇ／Ｙ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ；Ｘ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ；Ｘ１３４Ｑ／Ｓ／Ｗ；Ｘ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｘ１４１Ｆ／Ｋ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１５６Ｃ／Ｐ；Ｘ１５７Ａ／Ｉ；Ｘ１５８Ａ／Ｙ；Ｘ１６４Ｌ／Ｔ；Ｘ１６５Ｉ／Ｔ／Ｗ；Ｘ１６６Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｒ；Ｘ１７２Ｇ／Ｌ；Ｘ１９２Ｆ／Ｒ；Ｘ２０３Ｃ／Ｍ／Ｑ／Ｗ／Ｙ；Ｘ２１０Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｗ；Ｘ２１３Ｈ／Ｒ；Ｘ２１４Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｔ／Ｙ；Ｘ２１５Ｃ／Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｒ／Ｖ／Ｗ；Ｘ２１８Ｆ／Ａ／Ｈ／Ｋ／Ｑ／Ｖ／Ｙ；Ｘ２２１Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｘ２２２Ｃ／Ｍ／Ｖ；Ｘ２３３Ｍ／ＰＴ／Ｙ；Ｘ２３５Ｆ／Ｙ；Ｘ２３６Ａ／Ｑ／Ｓ；Ｇ２３８Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｖ；Ｘ２４３Ａ／Ｐ／Ｓ；Ｘ２５２Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｔ；Ｘ２５３Ｋ／Ｖ；Ｘ２７４Ａ／Ｄ／Ｋ；Ｘ２７８Ａ；Ｘ２８１Ｄ／Ｐ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ；Ｘ３１０Ｔ／Ｖ／Ｙ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３３８Ｉ；Ｘ３４１Ｍ／Ｔ；Ｘ３５０Ｔ／Ｃ／Ｅ／Ｉ；Ｘ３５１Ｅ／Ｖ；Ｘ３５２Ｄ／Ｎ／Ｓ；Ｘ３５４Ｌ／Ｍ；Ｘ３７０Ｍ／Ｎ／Ｒ；Ｘ３９０Ｄ／Ｅ／Ｌ；Ｘ４０３Ｇ／Ｋ／Ｒ；Ｘ４０４Ｋ／Ｍ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｘ４１６Ｃ／Ｙ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４２２Ａ／Ｆ／Ｖ；Ｘ４３０Ａ／Ｑ；Ｘ４３４Ｓ；Ｘ４４０Ｇ／Ｈ／Ｌ；Ｘ４４１Ｌ／Ｓ／Ｗ；Ｘ４４４Ｌ／Ｐ／Ｓ；Ｘ４４５Ｍ／Ｙ；及び／又はＸ４４９Ｌの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項１～４のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項6】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｐ；Ｋ０２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ；Ｅ０２３Ｌ／Ｍ；Ｅ０３７Ｃ；Ｓ０４９Ｗ；Ａ０５１Ｋ／Ｌ／Ｖ／Ｙ；Ｇ０５２Ｆ／Ｎ／Ｐ；Ｘ６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ；Ｓ０６７Ａ／Ｃ／Ｍ；Ｖ０６９Ａ／Ｃ／Ｋ；Ｋ０７３Ｎ／Ｐ；Ｔ０７７Ｍ／Ｐ／Ｓ；Ａ０７９Ｃ／Ｒ／Ｔ；Ｇ０８０Ｈ／Ｋ／Ｎ；Ｄ０８１Ｎ／Ｓ；Ｉ０８４Ｌ／Ｖ；Ｖ０９２Ｃ／Ｉ／Ｍ；Ｆ０９４Ａ／Ｇ／Ｙ；Ｘ１０２Ｇ；Ｓ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ；Ｔ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ；Ｅ１３４Ｑ／Ｓ／Ｗ；Ｍ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｌ１４１Ｆ／Ｋ；Ａ１４３Ｇ；Ｆ１５６Ｃ／Ｐ；Ｔ１５７Ａ／Ｉ；Ｎ１５８Ａ／Ｙ；Ｉ１６４Ｌ／Ｔ；Ｙ１６５Ｉ／Ｔ／Ｗ；Ｋ１６６Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｒ；Ｖ１７２Ｇ／Ｌ；Ｙ１９２Ｆ／Ｒ；Ｄ２０３Ｃ／Ｍ／Ｑ／Ｗ／Ｙ；Ｒ２１０Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｗ；Ｄ２１３Ｈ／Ｒ；Ｎ２１４Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｙ；Ｓ２１５Ｃ／Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｒ／Ｖ／Ｗ；Ａ２１８Ｆ／Ａ／Ｈ／Ｋ／Ｑ／Ｖ／Ｙ；Ｓ２２１Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｇ２２２Ｃ／Ｍ／Ｖ；Ｓ２３３Ｍ／ＰＴ／Ｙ；Ｗ２３５Ｆ／Ｙ；Ｄ２３６Ａ／Ｑ／Ｓ；Ｇ２３８Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｖ；Ｔ２４３Ａ／Ｐ／Ｓ；Ｖ２５２Ｆ／Ｈ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ａ／Ｄ／Ｋ；Ｐ２７８Ａ；Ｅ２８１Ｄ／Ｐ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ；Ｎ３１０Ｔ／Ｖ／Ｙ；Ｎ３２１Ｄ；Ｆ３３８Ｉ；Ｌ３４１Ｍ／Ｔ；Ｋ３５０Ｃ／Ｅ／Ｉ；Ｎ３５１Ｅ／Ｖ；Ｔ３５２Ｄ／Ｎ／Ｓ；Ｖ３５４Ｌ／Ｍ；Ｓ３７０Ｍ／Ｎ／Ｒ；Ｓ３９０Ｄ／Ｅ／Ｌ；Ｑ４０３Ｇ／Ｋ／Ｒ；Ｙ４０４Ｋ／Ｍ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｆ４１６Ｃ／Ｙ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ｙ４２２Ａ／Ｆ／Ｖ；Ｔ４３０Ａ／Ｑ；Ａ４３４Ｓ；Ａ４４０Ｇ／Ｈ／Ｌ；Ｑ４４１Ｌ／Ｓ／Ｗ；Ａ４４４Ｌ／Ｐ／Ｓ；Ｇ４４５Ｍ／Ｙ；及び／又はＦ４４９Ｌの１つ以上を含む、請求項５に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項7】

前記バリアントは、配列番号４の位置２０、２１、５１、７９、８０、９２、１０２、１２１、１４０、１４３、１５７、１５８、１６５、１６６、１９２、２０３、２１０、２１３、２１４、２１５、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５２、２７４、２７８、２８１、２９０、３０２、３１０、３２１、３４１、３５０、３５２、３５４、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１８、４４０、４４１、及び／若しくは４４４に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、前記置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、マルトースの加水分解の向上を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項8】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ａ／Ｐ；Ｘ０２１Ｓ；Ｘ０５１Ｌ／Ｖ；Ｘ０７９Ｃ／Ｔ；Ｘ０８０Ｋ；Ｘ０９２Ｍ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１２１Ｇ／Ｐ／Ｍ；Ｘ１４０Ｉ／Ｃ；Ｘ１４０Ｃ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６５Ｗ；Ｘ１６６Ｇ／Ｒ／Ｆ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２０３Ｗ；Ｘ２１０Ｌ；Ｘ２１３Ｒ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ；Ｘ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｘ２２１Ｒ／Ｔ／Ｍ；Ｘ２２２Ｍ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｙ／Ｐ；Ｘ２３５Ｙ；Ｘ２３６Ａ／Ｑ；Ｘ２３８Ｓ／Ｈ；Ｘ２４３Ｅ／Ｖ；Ｘ２５２Ｃ／Ｆ；Ｘ２７４Ａ；Ｘ２７８Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｋ／Ｖ／Ｐ／Ｓ／Ｗ；Ｘ３１０Ｔ／Ｙ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３４１Ｍ；Ｘ３５０Ｉ／Ｔ；Ｘ３５２Ｄ；Ｘ３５４Ｌ／Ｍ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｅ；Ｘ４０３Ｇ／Ｒ；Ｘ４０４Ｋ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｘ４１８Ｗ／Ｅ；Ｘ４４０Ｇ／Ｈ；Ｘ４４１Ｓ；及び／又はＸ４４４Ｌの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項７に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項9】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ａ／Ｐ；Ｋ０２１Ｓ；Ａ０５１Ｌ／Ｖ；Ａ０７９Ｃ／Ｔ；Ｇ０８０Ｋ；Ｖ０９２Ｍ；Ｘ１０２Ｇ；Ｔ１２１Ｇ／Ｐ／Ｍ；Ｍ１４０Ｉ／Ｃ；Ｍ１４０Ｃ；Ａ１４３Ｇ；Ｔ１５７Ｉ；Ｎ１５８Ａ；Ｙ１６５Ｗ；Ｋ１６６Ｇ／Ｒ／Ｆ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２０３Ｗ；Ｒ２１０Ｌ；Ｄ２１３Ｒ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ；Ｓ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｓ２２１Ｒ／Ｔ／Ｍ；Ｇ２２２Ｍ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｙ／Ｐ；Ｗ２３５Ｙ；Ｄ２３６Ａ／Ｑ；Ｇ２３８Ｓ／Ｈ；Ｔ２４３Ｅ／Ｖ；Ｖ２５２Ｃ／Ｆ；Ｇ２７４Ａ；Ｐ２７８Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｋ／Ｖ／Ｐ／Ｓ／Ｗ；Ｎ３１０Ｔ／Ｙ；Ｎ３２１Ｄ；Ｌ３４１Ｍ；Ｋ３５０Ｉ／Ｔ；Ｔ３５２Ｄ；Ｖ３５４Ｌ／Ｍ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｅ；Ｑ４０３Ｇ／Ｒ；Ｙ４０４Ｋ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｒ４１８Ｗ／Ｅ；Ａ４４０Ｇ／Ｈ；Ｑ４４１Ｓ；及び／又はＡ４４４Ｌの１つ以上を含む、請求項８に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項10】

前記バリアントは、配列番号４の位置２０、２１、２３、３７、５１、５２、６７、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９２、９４、１０２、１１９、１２１、１４０、１４１、１４３、１６４、１６５、１６６、１７２、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３６、２３８、２５２、２５３、２７４、２８１、２９０、３０２、３２１、３４１、３５０、３５１、３５２、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１８、４３０、４４０、４４４、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、前記置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、パノースの加水分解の向上を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項11】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ｐ／Ａ；Ｘ０２１Ｔ／Ｗ／Ｍ；Ｘ０２３Ｍ／Ｌ；Ｘ０３７Ｃ；Ｘ０５１Ｌ／Ｖ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６７Ｃ；Ｘ０６９Ｃ／Ａ；Ｘ０７３Ｎ；Ｘ０７７Ｓ；Ｘ０７９Ｃ；Ｘ０８０Ｈ／Ｋ；Ｘ０８１Ｎ；Ｘ０８４Ｖ／Ｌ；Ｘ０９２Ｃ；Ｘ０９４Ｙ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１１９Ｇ；Ｘ１２１Ｍ／Ｌ／Ｇ／Ｐ；Ｘ１４０Ｃ／Ｑ／Ｉ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１６４Ｌ；Ｘ１６５Ｗ／Ｔ；Ｘ１６６Ｒ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ２１０Ｌ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ；Ｘ２１５Ｄ；Ｘ２１８Ｑ／Ａ／Ｖ／Ｙ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｔ／Ｐ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２３８Ｈ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２７４Ｄ／Ｋ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｑ／Ｖ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３４１Ｍ／Ｔ；Ｘ３５０Ｃ／Ｔ；Ｘ３５１Ｅ；Ｘ３５２Ｄ／Ｎ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｘ４０３Ｇ；Ｘ４０３Ｒ／Ｋ；Ｘ４０４Ｍ／Ｋ；Ｘ４０５Ｓ／Ｑ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４３０Ａ；Ｘ４４０Ｇ；Ｘ４４４Ｐ；及び／又はＸ４４５Ｙ／Ｍの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項１０に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項12】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ｐ／Ａ；Ｋ０２１Ｔ／Ｗ／Ｍ；Ｅ０２３Ｍ／Ｌ；Ｅ０３７Ｃ；Ａ０５１Ｌ／Ｖ；Ｇ０５２Ｎ；Ｓ０６７Ｃ；Ｖ０６９Ｃ／Ａ；Ｋ０７３Ｎ；Ｔ０７７Ｓ；Ａ０７９Ｃ；Ｇ０８０Ｈ／Ｋ；Ｄ０８１Ｎ；Ｉ０８４Ｖ／Ｌ；Ｖ０９２Ｃ；Ｆ０９４Ｙ；Ｘ１０２Ｇ；Ｓ１１９Ｇ；Ｔ１２１Ｍ／Ｌ／Ｇ／Ｐ；Ｍ１４０Ｃ／Ｑ／Ｉ；Ｌ１４１Ｆ；Ａ１４３Ｇ；Ｉ１６４Ｌ；Ｙ１６５Ｗ／Ｔ；Ｋ１６６Ｒ；Ｖ１７２Ｇ；Ｒ２１０Ｌ；Ｄ２１３Ｈ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ；Ｓ２１５Ｄ；Ｓ２１８Ｑ／Ａ／Ｖ／Ｙ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｔ／Ｐ；Ｄ２３６Ｑ；Ｇ２３８Ｈ；Ｖ２５２Ｆ；Ｇ２７４Ｄ／Ｋ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｑ／Ｖ；Ｎ３２１Ｄ；Ｌ３４１Ｍ／Ｔ；Ｋ３５０Ｃ／Ｔ；Ｎ３５１Ｅ；Ｔ３５２Ｄ／Ｎ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｑ４０３Ｇ；Ｑ４０３Ｒ／Ｋ；Ｙ４０４Ｍ／Ｋ；Ｈ４０５Ｓ／Ｑ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ｔ４３０Ａ；Ａ４４０Ｇ；Ａ４４４Ｐ；及び／又はＧ４４５Ｙ／Ｍの１つ以上を含む、請求項１１に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項13】

前記バリアントは、配列番号４の位置２０、５１、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９４、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１４３、１５６、１５８、１６５、１６６、２０３、２１０、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２５２、２５３、２７４、２７８、２８１、２９０、３０２、３１０、３２１、３４１、３５０、３５２、３５４、３７０、３９０、４１６、４１８、４３４、４４０、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、前記置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、プルランの加水分解の向上を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項14】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ｆ／Ａ／Ｇ；Ｘ０５１Ｋ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｐ／Ｎ；Ｘ０７７Ｍ／Ｐ；Ｘ０７９Ｃ／Ｔ；Ｘ０８０Ｋ；Ｘ０８１Ｎ；Ｘ０８４Ｖ／Ｌ；Ｘ０９４Ｇ／Ａ；Ｘ１１９Ｇ／Ｄ；Ｘ１２１Ｌ／Ｍ；Ｘ１３４Ｓ；Ｘ１４０Ｉ／Ｃ／Ｑ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１５６Ｐ／Ｃ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６５Ｔ；Ｘ１６６Ｈ／Ａ／Ｆ；Ｘ２０３Ｃ／Ｑ／Ｗ／Ｙ；Ｘ２１０Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｎ／Ａ／Ｉ；Ｘ２１４Ａ／Ｙ／Ｌ／Ｃ；Ｘ２１５Ｖ／Ｃ／Ｗ／Ｄ／Ｈ；Ｘ２１８Ｖ／Ｋ／Ａ／Ｑ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ；Ｘ２３５Ｙ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２５２Ｆ／Ｈ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ｋ／Ｄ；Ｘ２７８Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ；Ｘ３０２Ｐ／Ｓ／Ｖ；Ｘ３１０Ｔ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３４１Ｍ；Ｘ３５０Ｉ／Ｔ；Ｘ３５２Ｄ／Ｓ；Ｘ３５４Ｌ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｘ４０４Ｋ；Ｘ４１６Ｙ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４３４Ｓ；Ｘ４４０Ｇ；及び／又はＸ４４５Ｍの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項１３に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項15】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ｆ／Ａ／Ｇ；Ａ０５１Ｋ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｐ／Ｎ；Ｔ０７７Ｍ／Ｐ；Ａ０７９Ｔ；Ｇ０８０Ｋ；Ｄ０８１Ｎ；Ｉ０８４Ｖ／Ｌ；Ｆ０９４Ｇ／Ａ；Ｓ１１９Ｇ／Ｄ；Ｔ１２１Ｌ／Ｍ；Ｅ１３４Ｓ；Ｍ１４０Ｉ／Ｃ／Ｑ；Ｌ１４１Ｆ；Ａ１４３Ｇ；Ｆ１５６Ｐ／Ｃ；Ｎ１５８Ａ；Ｙ１６５Ｔ；Ｋ１６６Ｈ／Ａ／Ｆ；Ｄ２０３Ｃ／Ｑ／Ｗ／Ｙ；Ｒ２１０Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｎ／Ａ／Ｉ；Ｎ２１４Ａ／Ｙ／Ｌ／Ｃ；Ｓ２１５Ｖ／Ｃ／Ｗ／Ｄ／Ｈ；Ｓ２１８Ｖ／Ｋ／Ａ／Ｑ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ；Ｗ２３５Ｙ；Ｄ２３６Ｑ；Ｖ２５２Ｆ／Ｈ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ｋ／Ｄ；Ｐ２７８Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ；Ｎ３０２Ｐ／Ｓ／Ｖ；Ｎ３１０Ｔ；Ｎ３２１Ｄ；Ｌ３４１Ｍ；Ｋ３５０Ｉ／Ｔ；Ｔ３５２Ｄ／Ｓ；Ｖ３５４Ｌ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｙ４０４Ｋ；Ｆ４１６Ｙ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ａ４３４Ｓ；Ａ４４０Ｇ；及び／又はＧ４４５Ｍの１つ以上を含む、請求項１４に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項16】

前記バリアントは、配列番号４の位置２１、２３、３７、５２、６６、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９２、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１５７、１５８、１６４、１６５、２１０、２１３、２１４、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２４３、２５２、２５３、２７４、２８１、２９０、３０２、３４１、３５０、３５１、３５２、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１６、４１８、４２２、４４０、４４１、４４４、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、可溶性デンプンの糖化について、前記置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、より高い性能指数（ＰＩ）を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項17】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２１Ｔ；Ｘ０２３Ｍ／Ｌ；Ｘ０３７Ｃ；Ｘ０５２Ｎ／Ｆ；Ｘ０６６Ａ／Ｆ／Ｔ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｎ／Ｐ；Ｘ０７７Ｐ／Ｍ／Ｓ；Ｘ０７９Ｒ；Ｘ０８０Ｎ／Ｈ／Ｋ；Ｘ０８１Ｎ／Ｓ；Ｘ０８４Ｌ／Ｖ；Ｘ０９２Ｉ；Ｘ１１９Ａ／Ｇ；Ｘ１２１Ｍ／Ｌ；Ｘ１３４Ｓ／Ｑ；Ｘ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｘ１４１Ｆ／Ｋ；Ｘ１５７Ａ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６４Ｌ／Ｔ；Ｘ１６５Ｗ／Ｔ；Ｘ２１０Ｗ／Ｇ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１４Ｇ／Ｙ；Ｘ２１８Ｑ／Ｆ／Ａ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ；Ｘ２３５Ｆ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２４３Ａ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ｄ／Ｋ／Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｗ／Ｓ／Ｑ／Ｋ；Ｘ３４１Ｍ／Ｔ；Ｘ３５０Ｃ／Ｅ；Ｘ３５１Ｅ；Ｘ３５２Ｄ／Ｎ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｌ；Ｘ４０３Ｇ／Ｒ／Ｋ；Ｘ４０４Ｉ／Ｍ／Ｋ；Ｘ４０５Ｓ；Ｘ４１６Ｃ／Ｙ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４４０Ｇ；Ｘ４４１Ｌ；Ｘ４４４Ｓ／Ｐ；及び／又はＸ４４５Ｍの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項１６に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項18】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｋ０２１Ｔ；Ｅ０２３Ｍ／Ｌ；Ｅ０３７Ｃ；Ｇ０５２Ｎ／Ｆ；Ｖ０６６Ａ／Ｆ／Ｔ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｎ／Ｐ；Ｔ０７７Ｐ／Ｍ／Ｓ；Ａ０７９Ｒ；Ｇ０８０Ｎ／Ｈ／Ｋ；Ｄ０８１Ｎ／Ｓ；Ｉ０８４Ｌ／Ｖ；Ｖ０９２Ｉ；Ｓ１１９Ａ／Ｇ；Ｔ１２１Ｍ／Ｌ；Ｅ１３４Ｓ／Ｑ；Ｍ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｌ１４１Ｆ／Ｋ；Ｔ１５７Ａ；Ｎ１５８Ａ；Ｉ１６４Ｌ／Ｔ；Ｙ１６５Ｗ／Ｔ；Ｒ２１０Ｗ／Ｇ；Ｄ２１３Ｈ；Ｎ２１４Ｇ／Ｙ；Ｓ２１８Ｑ／Ｆ／Ａ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ；Ｗ２３５Ｆ；Ｄ２３６Ｑ；Ｔ２４３Ａ；Ｖ２５２Ｆ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ｄ／Ｋ／Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｗ／Ｓ／Ｑ／Ｋ；Ｌ３４１Ｍ／Ｔ；Ｋ３５０Ｃ／Ｅ；Ｎ３５１Ｅ；Ｔ３５２Ｄ／Ｎ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｌ；Ｑ４０３Ｇ／Ｒ／Ｋ；Ｙ４０４Ｍ／Ｋ；Ｈ４０５Ｓ；Ｆ４１６Ｃ／Ｙ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ｙ４２２Ａ；Ａ４４０Ｇ；Ｑ４４１Ｌ；Ａ４４４Ｓ／Ｐ；及び／又はＧ４４５Ｍの１つ以上を含む、請求項１７に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項19】

前記バリアントは、配列番号４の位置２０、２１、５１、６７、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、１０２、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１４３、１５６、１５７、１５８、１６５、１６６、１７２、１９２、２０３、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２５２、２７４、２８１、２９０、３０２、３１０、３２１、３４１、３５０、３５１、３５２、３５４、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１８、４２２、４３４、４４０、４４４、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、前記置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、マルトデキストリンの加水分解の向上を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項20】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ｐ／Ａ／Ｅ；Ｘ０２１Ｓ／Ｍ；Ｘ０５１Ｖ／Ｌ／Ｋ／Ｙ；Ｘ０６７Ａ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｐ／Ｎ；Ｘ０７７Ｐ／Ｍ；Ｘ０７９Ｃ／Ｔ；Ｘ０８０Ｋ／Ｈ；Ｘ０８１Ｎ；Ｘ０８４Ｌ／Ｖ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１１９Ｇ；Ｘ１２１Ｍ／Ｇ／Ｖ／Ｐ；Ｘ１３４Ｓ／Ｑ；Ｘ１４０Ｃ／Ｉ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１５６Ｐ／Ｃ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６５Ｗ／Ｔ；Ｘ１６６Ｇ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２０３Ｗ／Ｃ／Ｍ；Ｘ２１０Ｌ／Ｍ；Ｘ２１３Ｒ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ；Ｘ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｘ２１８Ｖ／Ｙ／Ｑ；Ｘ２２１Ｒ／Ｔ；Ｘ２２２Ｍ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ／Ｙ；Ｘ２３５Ｙ；Ｘ２３６Ｑ／Ａ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２７４Ｋ／Ａ／Ｄ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｐ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｑ／Ｗ；Ｘ３１０Ｔ／Ｙ；Ｘ３４１Ｍ；Ｘ３５０Ｉ／Ｔ；Ｘ３５１Ｖ；Ｘ３５２Ｄ；Ｘ３５４Ｌ／Ｍ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｅ／Ｌ／Ｄ；Ｘ４０３Ｋ／Ｒ／Ｇ；Ｘ４０４Ｋ／Ｍ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｘ４１８Ｗ／Ｅ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４３４Ｓ；Ｘ４４０Ｇ／Ｈ；Ｘ４４４Ｐ；及び／又はＸ４４５Ｍの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項１９に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項21】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ｐ／Ａ／Ｅ；Ｋ０２１Ｓ／Ｍ；Ａ０５１Ｖ／Ｌ／Ｋ／Ｙ；Ｓ０６７Ａ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｐ／Ｎ；Ｔ０７７Ｐ／Ｍ；Ａ０７９Ｃ／Ｔ；Ｇ０８０Ｋ／Ｈ；Ｄ０８１Ｎ；Ｉ０８４Ｌ／Ｖ；Ｐ１０２Ｇ；Ｓ１１９Ｇ；Ｔ１２１Ｍ／Ｇ／Ｖ／Ｐ；Ｅ１３４Ｓ／Ｑ；Ｍ１４０Ｃ／Ｉ；Ｌ１４１Ｆ；Ａ１４３Ｇ；Ｆ１５６Ｐ／Ｃ；Ｔ１５７Ｉ；Ｎ１５８Ａ；Ｙ１６５Ｗ／Ｔ；Ｋ１６６Ｇ；Ｖ１７２Ｇ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２０３Ｗ／Ｃ／Ｍ；Ｒ２１０Ｌ／Ｍ；Ｄ２１３Ｒ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ；Ｓ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｓ２１８Ｖ／Ｙ／Ｑ；Ｓ２２１Ｒ／Ｔ；Ｇ２２２Ｍ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ／Ｙ；Ｗ２３５Ｙ；Ｄ２３６Ｑ／Ａ；Ｖ２５２Ｆ；Ｇ２７４Ｋ／Ａ／Ｄ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｐ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｑ／Ｗ；Ｎ３１０Ｔ／Ｙ；Ｎ３２１Ｄ；Ｌ３４１Ｍ；Ｋ３５０Ｉ／Ｔ；Ｎ３５１Ｖ；Ｔ３５２Ｄ；Ｖ３５４Ｌ／Ｍ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｅ／Ｌ／Ｄ；Ｑ４０３Ｋ／Ｒ／Ｇ；Ｙ４０４Ｋ／Ｍ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｒ４１８Ｗ／Ｅ；Ｙ４２２Ａ；Ａ４３４Ｓ；Ａ４４０Ｇ／Ｈ；Ａ４４４Ｐ；及び／又はＧ４４５Ｍの１つ以上を含む、請求項２０に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項22】

前記バリアントは、配列番号４の位置２３、５１、５２、６６、６７、７７、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１５６、１５７、１６５、１９２、２１３、２２１、２２２、２３３、２３６、２５２、２８１、２９０、３０２、３５０、３５２、３７０、３９０、４０３、４０４、４１６、及び／若しくは４２２に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、前記置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、熱安定性の向上を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項23】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２３Ｍ；Ｘ０５１Ｙ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｘ０６７Ｃ；Ｘ０７７Ｐ；Ｘ１１９Ａ；Ｘ１２１Ｍ；Ｘ１３４Ｓ；Ｘ１４０Ｉ／Ｃ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１５６Ｃ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１６５Ｗ／Ｉ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２１３Ｒ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ；Ｘ２３３Ｍ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｖ；Ｘ３０２Ｈ／Ｑ／Ｗ／Ｓ／Ｋ；Ｘ３５０Ｅ／Ｃ；Ｘ３５２Ｄ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｌ／Ｄ；Ｘ４０３Ｒ；Ｘ４０４Ｋ／Ｍ；Ｘ４１６Ｙ；及び／又はＸ４２２Ａ／Ｖの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項２２に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項24】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｅ０２３Ｍ；Ａ０５１Ｙ；Ｇ０５２Ｎ；Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｓ０６７Ｃ；Ｔ０７７Ｐ；Ｓ１１９Ａ；Ｔ１２１Ｍ；Ｅ１３４Ｓ；Ｍ１４０Ｉ／Ｃ；Ｌ１４１Ｆ；Ｆ１５６Ｃ；Ｔ１５７Ｉ；Ｙ１６５Ｗ／Ｉ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２１３Ｒ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ；Ｓ２３３Ｍ；Ｄ２３６Ｑ；Ｖ２５２Ｆ；Ｅ２５３Ｆ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｖ；Ｎ３０２Ｈ／Ｑ／Ｗ／Ｓ／Ｋ；Ｋ３５０Ｅ／Ｃ；Ｔ３５２Ｄ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｌ／Ｄ；Ｑ４０３Ｒ；Ｙ４０４Ｋ／Ｍ；Ｆ４１６Ｙ；及び／又はＹ４２２Ａ／Ｖの１つ以上を含む、請求項２３に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項25】

前記バリアントは、配列番号４の位置４９、５１、５２、６６、６９、７７、８０、９４、１１９、１３４、１５８、１６４、１６５、１７２、１９２、２１３、２１５、２１８、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５３、２７４、３０２、３３８、４０３、４０５、４１６、４１８、４２２、４３０、４４０、４４１、４４４、４４５、及び／若しくは４４９に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、前記置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、重合度（ＤＰ）が２以上である糖へのより少ない転換を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項26】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０４９Ｗ；Ｘ０５１Ｙ；Ｘ０５２Ｐ；Ｘ６６Ｐ；Ｘ０６９Ｋ／Ｃ；Ｘ０７７Ｐ／Ｍ；Ｘ０８０Ｈ；Ｘ０９４Ａ／Ｇ；Ｘ１１９Ｄ；Ｘ１３４Ｗ／Ｑ；Ｘ１５８Ｙ；Ｘ１６４Ｔ／Ｌ；Ｘ１６５Ｗ／Ｉ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ１９２Ｒ／Ｆ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１５Ｒ；Ｘ２１８Ｋ；Ｘ２２２Ｃ；Ｘ２３３Ｔ／Ｐ；Ｘ２３５Ｆ；Ｘ２３６Ａ；Ｘ２３８Ｈ／Ｓ／Ｎ；Ｘ２４３Ｐ／Ｓ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ｋ／Ａ；Ｘ３０２Ｈ／Ｆ／Ｐ／Ｍ／Ｑ／Ｔ；Ｘ３３８Ｉ；Ｘ４０３Ｇ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ；Ｘ４１６Ｃ／Ｙ；Ｘ４１６Ｙ；Ｘ４１８Ｗ／Ｅ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４３０Ａ／Ｑ；Ｘ４４０Ｌ／Ｈ；Ｘ４４１Ｗ／Ｌ；Ｘ４４４Ｌ／Ｐ；Ｘ４４５Ｙ；及び／又はＸ４４９Ｌの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項２５に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項27】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０４９Ｗ；Ａ０５１Ｙ；Ｇ０５２Ｐ；Ｖ６６Ｐ；Ｖ０６９Ｋ／Ｃ；Ｔ０７７Ｐ／Ｍ；Ｇ０８０Ｈ；Ｆ０９４Ａ／Ｇ；Ｓ１１９Ｄ；Ｅ１３４Ｗ／Ｑ；Ｎ１５８Ｙ；Ｉ１６４Ｔ／Ｌ；Ｙ１６５Ｗ／Ｉ；Ｖ１７２Ｇ；Ｙ１９２Ｒ／Ｆ；Ｄ２１３Ｈ；Ｓ２１５Ｒ；Ｓ２１８Ｋ；Ｇ２２２Ｃ；Ｓ２３３Ｔ／Ｐ；Ｗ２３５Ｆ；Ｄ２３６Ａ；Ｇ２３８Ｈ／Ｓ／Ｎ；Ｔ２４３Ｐ／Ｓ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ｋ／Ａ；Ｎ３０２Ｈ／Ｆ／Ｐ／Ｍ／Ｑ／Ｔ；Ｆ３３８Ｉ；Ｑ４０３Ｇ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ；Ｆ４１６Ｃ／Ｙ；Ｆ４１６Ｙ；Ｒ４１８Ｗ／Ｅ；Ｙ４２２Ａ；Ｔ４３０Ａ／Ｑ；Ａ４４０Ｌ／Ｈ；Ｑ４４１Ｗ／Ｌ；Ａ４４４Ｌ／Ｐ；Ｇ４４５Ｙ；及び／又はＦ４４９Ｌの１つ以上を含む、請求項２６に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項28】

前記バリアントは、配列番号４の位置２１、２３、５１、５２、６６、６７、７９、８１、９２、１１９、１４０、１５８、１６４、１７２、１９２、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５３、２８１、２９０、３０２、３１０、３５１、３５２、３５４、３７０、４０３、４１６、４２２、４３０、４４１、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、前記置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、グルコースの糖化収率の向上を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項29】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２１Ｓ／Ｗ；Ｘ０２３Ｌ；Ｘ０５１Ｙ／Ｋ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６６／Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｘ０６７Ｍ／Ｃ／Ａ；Ｘ０７９Ｒ；Ｘ０８１Ｓ；Ｘ０９２Ｃ／Ｍ；Ｘ１１９Ａ；Ｘ１４０Ｉ；Ｘ１５８Ａ／Ｙ；Ｘ１６４Ｌ；Ｘ１７２Ｌ／Ｇ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２１０Ｗ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１４Ｙ；Ｘ２１５Ｆ／Ｃ／Ｒ；Ｘ２１８Ｈ／Ｋ／Ａ；Ｘ２２１Ｍ／Ｔ；Ｘ２２２Ｖ；Ｘ２３３Ｔ；Ｘ２３５Ｙ／Ｆ；Ｘ２３６Ｓ／Ａ；Ｘ２３８Ｔ／Ｖ／Ｍ；Ｘ２４３Ａ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２８１Ｐ／Ｄ；Ｘ２９０Ｖ；Ｘ３０２Ｋ／Ｑ／Ｈ／Ｗ；Ｘ３１０Ｖ／Ｔ；Ｘ３５１Ｖ；Ｘ３５２Ｓ；Ｘ３５４Ｌ；Ｘ３７０Ｒ；Ｘ４０３Ｋ；Ｘ４１６Ｙ；Ｘ４２２Ｆ；Ｘ４３０Ａ；Ｘ４４１Ｌ；及び／又はＸ４４５Ｙの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項２８に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項30】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｋ０２１Ｓ／Ｗ；Ｅ０２３Ｌ；Ａ０５１Ｙ／Ｋ；Ｇ０５２Ｎ；Ｖ０６６／Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｓ０６７Ｍ／Ｃ／Ａ；Ａ０７９Ｒ；Ｄ０８１Ｓ；Ｖ０９２Ｃ／Ｍ；Ｓ１１９Ａ；Ｍ１４０Ｉ；Ｎ１５８Ａ／Ｙ；Ｉ１６４Ｌ；Ｖ１７２Ｌ／Ｇ；Ｙ１９２Ｆ；Ｒ２１０Ｗ；Ｄ２１３Ｈ；Ｎ２１４Ｙ；Ｓ２１５Ｆ／Ｃ／Ｒ；Ｓ２１８Ｈ／Ｋ／Ａ；Ｓ２２１Ｍ／Ｔ；Ｇ２２２Ｖ；Ｓ２３３Ｔ；Ｗ２３５Ｙ／Ｆ；Ｄ２３６Ｓ／Ａ；Ｇ２３８Ｔ／Ｖ／Ｍ；Ｔ２４３Ａ；Ｅ２５３Ｋ；Ｅ２８１Ｐ／Ｄ；Ｆ２９０Ｖ；Ｎ３０２Ｋ／Ｑ／Ｈ／Ｗ；Ｎ３１０Ｖ／Ｔ；Ｎ３５１Ｖ；Ｔ３５２Ｓ；Ｖ３５４Ｌ；Ｓ３７０Ｒ；Ｑ４０３Ｋ；Ｆ４１６Ｙ；Ｙ４２２Ｆ；Ｔ４３０Ａ；Ｑ４４１Ｌ；及び／又はＧ４４５Ｙの１つ以上を含む、請求項２９に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項31】

前記バリアントは、配列番号４の位置２０、２１、２３、３７、５１、５２、６６、６７、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９２、９４、１０２、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１５６、１５７、１５８、１６４、１６５、１６６、１７２、１９２、２０３、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５２、２５３、２７４、２７８、２８１、２９０、３０２、３１０、３４１、３５０、３５１、３５２、３５４、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１６、４１８、４２２、４３０、４４０、４４１、４４４、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、前記置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼと比較した、ｉ）マルトースの加水分解の向上；ｉｉ）パノースの加水分解の向上；ｉｉｉ）プルランの加水分解の向上；ｉｖ）可溶性デンプンの加水分解の向上；ｖ）マルトデキストリンの加水分解の向上；ｖｉ）熱安定性の向上；ｖｉｉ）ＤＰが２以上の糖へのより少ない転換；及び／又はｖｉｉｉ）グルコースの糖化収率の向上の２つ以上を示す、請求項１～２９のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項32】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ａ／Ｐ；Ｘ０２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ；Ｘ０２３Ｌ／Ｍ；Ｘ０３７Ｃ；Ｘ０５１Ｋ／Ｌ／Ｖ／Ｙ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｘ０６７Ａ／Ｃ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｎ／Ｐ；Ｘ０７７Ｍ／Ｐ／Ｓ；Ｘ０７９Ｒ／Ｔ；Ｘ０８０Ｈ／Ｋ；Ｘ０８１Ｎ／Ｓ；Ｘ０８４Ｌ／Ｖ；Ｘ０９２Ｃ／Ｍ；Ｘ０９４Ａ／Ｇ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ；Ｘ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ；Ｘ１３４Ｑ／Ｓ；Ｘ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１５６Ｃ／Ｐ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１５８Ａ／Ｙ；Ｘ１６４Ｌ／Ｔ；Ｘ１６５Ｉ／Ｔ／Ｗ；Ｘ１６６Ｇ／Ｆ／Ｒ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２０３Ｃ／Ｗ；Ｘ２１０Ｌ／Ｍ／Ｗ；Ｘ２１３Ｈ／Ｒ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ／Ｙ；Ｘ２１５Ｃ／Ｄ／Ｆ／Ｒ；Ｘ２１８Ａ／Ｋ／Ｑ／Ｖ／Ｙ；Ｘ２２１Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｘ２２２Ｃ／Ｍ／Ｖ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｙ；Ｘ２３５Ｆ／Ｙ；Ｘ２３６Ａ／Ｑ；Ｘ２３８Ｈ／Ｓ；Ｘ２４３Ａ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ａ／Ｄ／Ｋ；Ｘ２７８Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ２９０Ｖ；Ｘ３０２Ｈ／Ｋ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ；Ｘ３１０Ｔ／Ｙ；Ｘ３４１Ｍ／Ｔ；Ｘ３５０Ｃ／Ｅ／Ｉ；Ｘ３５１Ｅ／Ｖ；Ｘ３５２Ｄ／Ｎ／Ｓ；Ｘ３５４Ｌ／Ｍ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｅ／Ｌ；Ｘ４０３Ｇ／Ｋ／Ｒ；Ｘ４０４Ｋ／Ｍ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｘ４１６Ｃ／Ｙ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４３０Ａ；Ｘ４４０Ｇ／Ｈ；Ｘ４４１Ｌ；Ｘ４４４Ｌ／Ｐ；及び／又はＸ４４５Ｍ／Ｙの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項３１に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項33】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ａ／Ｅ／Ｐ；Ｋ０２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ；Ｅ０２３Ｌ／Ｍ；Ｅ０３７Ｃ；Ａ０５１Ｋ／Ｌ／Ｖ／Ｙ；Ｇ０５２Ｎ；Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｓ０６７Ａ／Ｃ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｎ／Ｐ；Ｔ０７７Ｍ／Ｐ／Ｓ；Ａ０７９Ｒ／Ｔ；Ｇ０８０Ｈ／Ｋ；Ｄ０８１Ｎ／Ｓ；Ｉ０８４Ｌ／Ｖ；Ｖ０９２Ｃ／Ｍ；Ｆ０９４Ａ／Ｇ；Ｐ１０２Ｇ；Ｓ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ；Ｔ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ；Ｅ１３４Ｑ／Ｓ；Ｍ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｌ１４１Ｆ；Ｆ１５６Ｃ／Ｐ；Ｔ１５７Ｉ；Ｎ１５８Ａ／Ｙ；Ｉ１６４Ｌ／Ｔ；Ｙ１６５Ｉ／Ｔ／Ｗ；Ｋ１６６Ｇ／Ｆ／Ｒ；Ｖ１７２Ｇ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２０３Ｃ／Ｗ；Ｒ２１０Ｌ／Ｍ／Ｗ；Ｄ２１３Ｈ／Ｒ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ／Ｙ；Ｓ２１５Ｃ／Ｄ／Ｆ／Ｒ；Ｓ２１８Ａ／Ｋ／Ｑ／Ｖ／Ｙ；Ｓ２２１Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｇ２２２Ｃ／Ｍ／Ｖ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｙ；Ｗ２３５Ｆ／Ｙ；Ｄ２３６Ａ／Ｑ；Ｇ２３８Ｈ／Ｓ；Ｔ２４３Ａ；Ｖ２５２Ｆ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ａ／Ｄ／Ｋ；Ｐ２７８Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｆ２９０Ｖ；Ｎ３０２Ｈ／Ｋ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ；Ｎ３１０Ｔ／Ｙ；Ｌ３４１Ｍ／Ｔ；Ｋ３５０Ｃ／Ｅ／Ｉ；Ｎ３５１Ｅ／Ｖ；Ｔ３５２Ｄ／Ｎ／Ｓ；Ｖ３５４Ｌ／Ｍ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｅ／Ｌ；Ｑ４０３Ｇ／Ｋ／Ｒ；Ｙ４０４Ｋ／Ｍ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｆ４１６Ｃ／Ｙ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ｙ４２２Ａ；Ｔ４３０Ａ；Ａ４４０Ｇ／Ｈ；Ｑ４４１Ｌ；Ａ４４４Ｌ／Ｐ；及び／又はＧ４４５Ｍ／Ｙの１つ以上を含む、請求項３２に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項34】

前記バリアントは、ａ）Ｘ２３６Ｓ及びＸ２８１Ｄ；ｂ）Ｘ２１５Ｒ及びＸ４４１Ｗ；ｃ）Ｘ３２１Ｄ及びＸ４３４Ｓ；ｄ）Ｘ１４３Ｇ及びＸ４３４Ｓ；ｅ）Ｘ０７９Ｃ及びＸ１４３Ｇ；ｆ）Ｘ３５０Ｔ及びＸ４３４Ｓ；ｇ）Ｘ３５１Ｅ及びＸ４０３Ｋ；ｈ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ０８４Ｌ；ｉ）Ｘ２４３Ｐ及びＸ２９０Ｖ；ｊ）Ｘ２９０Ｖ及びＸ３５０Ｅ；ｋ）Ｘ３０２Ｋ及びＸ４４１Ｗ；ｌ）Ｘ１５６Ｃ及びＸ４０４Ｋ；ｍ）Ｘ０６７Ｍ及びＸ４０４Ｋ；ｎ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ１４１Ｆ；ｏ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ３５１Ｅ；ｐ）Ｘ２３３Ｍ及びＸ４４５Ｙ；ｑ）Ｘ０６６Ｃ及びＸ２３３Ｍ；ｒ）Ｘ２１８Ｈ及びＸ２９０Ｖ；ｓ）Ｘ０６７Ｍ及びＸ３０２Ｈ；ｔ）Ｘ０６６Ｃ及びＸ１１９Ａ；ｕ）Ｘ２４３Ｐ及びＸ４４５Ｙ；ｖ）Ｘ１９２Ｆ及びＸ２４３Ｐ；ｗ）Ｘ１５６Ｃ及びＸ２４３Ｐ；ｘ）Ｘ０２３Ｌ及びＸ０６６Ｃ；ｙ）Ｘ０２３Ｌ－Ｘ１１９Ａ；ｚ）Ｘ０２０Ｅ及びＸ１９２Ｆ；ａａ）Ｘ１９２Ｆ及びＸ３１０Ｖ；ｂｂ）Ｘ０２３Ｍ及びＸ３０２Ｈ；ｃｃ）Ｘ１９２Ｆ及びＸ４１６Ｙ；ｄｄ）Ｘ１１９Ａ及びＸ３０２Ｈ；ｅｅ）Ｘ２３５Ｙ及びＸ４１６Ｙ；ｆｆ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ４０４Ｋ；ｇｇ）Ｘ０２３Ｍ及びＸ４４９Ｙ；ｈｈ）Ｘ１５８Ａ及びＸ１７２Ｌ；ｉｉ）Ｘ１７２Ｌ及びＸ２９０Ｖ；ｊｊ）Ｘ０２３Ｍ及びＸ２１０Ｌ；ｋｋ）Ｘ２１０Ｌ及びＸ４４９Ｙ；ｌｌ）Ｘ１５７Ｉ及びＸ２８１Ｄ；ｍｍ）Ｘ１６４Ｔ及びＸ２１５Ｒ；ｎｎ）Ｘ１４０Ｃ及びＸ４２２Ｖ；ｏｏ）Ｘ１１９Ａ及びＸ３０２Ｋ；又はｐｐ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ４１６Ｙを含む２つ以上のアミノ酸置換を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項35】

前記２つ以上のアミノ酸置換は、ａ）Ｄ２３６Ｓ及びＥ２８１Ｄ；ｂ）Ｓ２１５Ｒ及びＱ４４１Ｗ；ｃ）Ｎ３２１Ｄ及びＡ４３４Ｓ；ｄ）Ａ１４３Ｇ及びＡ４３４Ｓ；ｅ）Ａ０７９Ｃ及びＡ１４３Ｇ；ｆ）Ｋ３５０Ｔ及びＡ４３４Ｓ；ｇ）Ｎ３５１Ｅ及びＱ４０３Ｋ；ｈ）Ｇ０５２Ｎ及びＩ０８４Ｌ；ｉ）Ｔ２４３Ｐ及びＦ２９０Ｖ；ｊ）Ｆ２９０Ｖ及びＫ３５０Ｅ；ｋ）Ｎ３０２Ｋ及びＱ４４１Ｗ；ｌ）Ｆ１５６Ｃ及びＹ４０４Ｋ；ｍ）Ｓ０６７Ｍ及びＹ４０４Ｋ；ｎ）Ｇ０５２Ｎ及びＬ１４１Ｆ；ｏ）Ｇ０５２Ｎ及びＮ３５１Ｅ；ｐ）Ｓ２３３Ｍ及びＧ４４５Ｙ；ｑ）Ａ０６６Ｃ及びＳ２３３Ｍ；ｒ）Ｓ２１８Ｈ及びＦ２９０Ｖ；ｓ）Ｓ０６７Ｍ及びＮ３０２Ｈ；ｔ）Ａ０６６Ｃ及びＳ１１９Ａ；ｕ）Ｔ２４３Ｐ及びＧ４４５Ｙ；ｖ）Ｙ１９２Ｆ及びＴ２４３Ｐ；ｗ）Ｆ１５６Ｃ及びＴ２４３Ｐ；ｘ）Ｅ０２３Ｌ及びＡ０６６Ｃ；ｙ）Ｅ０２３Ｌ及びＳ１１９Ａ；ｚ）Ｓ０２０Ｅ及びＹ１９２Ｆ；ａａ）Ｙ１９２Ｆ及びＮ３１０Ｖ；ｂｂ）Ｅ０２３Ｍ及びＮ３０２Ｈ；ｃｃ）Ｙ１９２Ｆ及びＦ４１６Ｙ；ｄｄ）Ｓ１１９Ａ及びＮ３０２Ｈ；ｅｅ）Ｗ２３５Ｙ及びＦ４１６Ｙ；ｆｆ）Ｇ０５２Ｎ及びＹ４０４Ｋ；ｇｇ）Ｅ０２３Ｍ及びＦ４４９Ｙ；ｈｈ）Ｎ１５８Ａ及びＶ１７２Ｌ；ｉｉ）Ｖ１７２Ｌ及びＦ２９０Ｖ；ｊｊ）Ｅ０２３Ｍ及びＲ２１０Ｌ；ｋｋ）Ｒ２１０Ｌ及びＦ４４９Ｙ；ｌｌ）Ｔ１５７Ｉ及びＥ２８１Ｄ；ｍｍ）Ｉ１６４Ｔ及びＳ２１５Ｒ；ｎｎ）Ｍ１４０Ｃ及びＹ４２２Ｖ；ｏｏ）Ｓ１１９Ａ及びＮ３０２Ｋ；又はｐｐ）Ｇ０５２Ｎ及びＦ４１６Ｙを含む、請求項３４に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項36】

前記バリアントは、ａ）Ｘ１４１Ｆ、Ｘ２８１Ｄ、及びＸ４４１Ｗ；ｂ）Ｘ１４３Ｇ、Ｘ３２１Ｄ、及びＸ４３４Ｓ；ｃ）Ｘ３２１Ｄ、Ｘ３５０Ｔ、及びＸ４３４Ｓ；ｄ）Ｘ０６７Ｍ、Ｘ１５８Ａ、及びＸ２８１Ｄ；ｅ）Ｘ１５６Ｃ、Ｘ１９２Ｆ、及びＸ４０３Ｋ；ｆ）Ｘ０５２Ｎ、Ｘ１４０Ｃ、及びＸ４２２Ｖ；ｇ）Ｘ０６６Ｃ、Ｘ１１９Ａ、及びＸ１６４Ｔ；ｈ）Ｘ０６６Ｃ、Ｘ２３３Ｍ、及びＸ４４５Ｙ；ｉ）Ｘ１５６Ｃ、Ｘ１９２Ｆ、及びＸ２４３Ｐ；ｊ）Ｘ０２３Ｌ、Ｘ０６６Ｃ、及びＸ１１９Ａ；ｋ）Ｘ０２３Ｍ、Ｘ１１９Ａ、及びＸ４０４Ｋ；ｌ）Ｘ３１０Ｖ、Ｘ４１６Ｙ、及びＸ４４５Ｙ；ｍ）Ｘ１５８Ａ、Ｘ２２１Ｒ、及びＸ２９０Ｖ；ｎ）Ｘ０２３Ｍ、Ｘ０５２Ｎ、及びＸ４０４Ｋ；ｏ）Ｘ０８１Ｓ、Ｘ１５７Ｉ、及びＸ２３６Ｓ；ｐ）Ｘ２４３Ｐ、Ｘ３０２Ｋ、及びＸ４１６Ｙ；ｑ）Ｘ１４０Ｃ、Ｘ３０２Ｋ、及びＸ４２２Ｖ；又はｒ）Ｘ０５２Ｎ、Ｘ４１６Ｙ、及びＸ４４５Ｙを含む３つ以上のアミノ酸置換を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項37】

前記３つ以上アミノ酸置換は、ａ）Ｌ１４１Ｆ、Ｅ２８１Ｄ、及びＱ４４１Ｗ；ｂ）Ａ１４３Ｇ、Ｎ３２１Ｄ、及びＡ４３４Ｓ；ｃ）Ｎ３２１Ｄ、Ｋ３５０Ｔ、及びＡ４３４Ｓ；ｄ）Ｓ０６７Ｍ、Ｎ１５８Ａ、及びＥ２８１Ｄ；ｅ）Ｆ１５６Ｃ、Ｙ１９２Ｆ、及びＱ４０３Ｋ；ｆ）Ｇ０５２Ｎ、Ｍ１４０Ｃ、及びＹ４２２Ｖ；ｇ）Ａ０６６Ｃ、Ｓ１１９Ａ、及びＩ１６４Ｔ；ｈ）Ａ０６６Ｃ、Ｓ２３３Ｍ、及びＧ４４５Ｙ；ｉ）Ｆ１５６Ｃ、Ｙ１９２Ｆ、及びＴ２４３Ｐ；ｊ）Ｅ０２３Ｌ、Ａ０６６Ｃ、及びＳ１１９Ａ；ｋ）Ｅ０２３Ｍ、Ｓ１１９Ａ、及びＹ４０４Ｋ；ｌ）Ｎ３１０Ｖ、Ｆ４１６Ｙ、及びＧ４４５Ｙ；ｍ）Ｎ１５８Ａ、Ｓ２２１Ｒ、及びＦ２９０Ｖ；ｎ）Ｅ０２３Ｍ、Ｇ０５２Ｎ、及びＹ４０４Ｋ；ｏ）Ｄ０８１Ｓ、Ｔ１５７Ｉ、及びＤ２３６Ｓ；ｐ）Ｔ２４３Ｐ、Ｎ３０２Ｋ、及びＦ４１６Ｙ；ｑ）Ｍ１４０Ｃ、Ｎ３０２Ｋ、及びＹ４２２Ｖ；又はｒ）Ｇ０５２Ｎ、Ｆ４１６Ｙ、及びＧ４４５Ｙを含む、請求項３６に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項38】

前記バリアントは、ａ）Ｘ２１５Ｒ、Ｘ２３６Ｓ、Ｘ２８１Ｄ、及びＸ４４１Ｗ；ｂ）Ｘ０５２Ｎ、Ｘ０８４Ｌ、Ｘ１４０Ｃ、及びＸ４２２Ｖ；ｃ）Ｘ０２０Ｅ、Ｘ１５６Ｃ、Ｘ１９２Ｆ、及びＸ２４３Ｐ；ｄ）Ｘ０２３Ｍ、Ｘ２２１Ｒ、及びＸ４０４Ｋ；ｅ）Ｘ１５８Ａ、Ｘ１７２Ｌ、Ｘ２２１Ｒ、及びＸ２９０Ｖ；ｆ）Ｘ１４０Ｃ、Ｘ１６５Ｗ、Ｘ３０２Ｋ、及びＸ４２２Ｖ；又はｇ）Ｘ１１９Ａ、Ｘ２５３Ｆ、Ｘ３１０Ｖ、及びＸ４０３Ｋを含む４つ以上のアミノ酸置換を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項39】

前記４つ以上アミノ酸置換は、ａ）Ｓ２１５Ｒ、Ｄ２３６Ｓ、Ｅ２８１Ｄ、及びＱ４４１Ｗ；ｂ）Ｇ０５２Ｎ、Ｉ０８４Ｌ、Ｍ１４０Ｃ、及びＹ４２２Ｖ；ｃ）Ｓ０２０Ｅ、Ｆ１５６Ｃ、Ｙ１９２Ｆ、及びＴ２４３Ｐ；ｄ）Ｅ０２３Ｍ、Ｓ１１９Ａ、Ｓ２２１Ｒ、及びＹ４０４Ｋ；ｅ）Ｎ１５８Ａ、Ｖ１７２Ｌ、Ｓ２２１Ｒ、及びＦ２９０Ｖ；ｆ）Ｍ１４０Ｃ、Ｙ１６５Ｗ、Ｎ３０２Ｋ、及びＹ４２２Ｖ；又はｇ）Ｓ１１９Ａ、Ｅ２５３Ｆ、Ｎ３１０Ｖ、及びＱ４０３Ｋを含む、請求項３８に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項40】

前記バリアントは、Ｘ０６７Ｍ、Ｘ１５７Ｉ、Ｘ２１８Ｈ、Ｘ３０２Ｈ、及びＸ４１６Ｙを含む５つ以上のアミノ酸置換を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項41】

前記５つ以上アミノ酸置換は、Ｓ０６７Ｍ、Ｔ１５７Ｉ、Ｓ２１８Ｈ、Ｎ３０２Ｈ、及びＦ４１６Ｙを含む、請求項４０に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項42】

前記バリアントグルコアミラーゼは、前記置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較した、ｉ）マルトースの加水分解の向上；ｉｉ）パノースの加水分解の向上；ｉｉｉ）プルランの加水分解の向上；ｉｖ）可溶性デンプンの加水分解の向上；ｖ）マルトデキストリンの加水分解の向上；ｖｉ）熱安定性の向上；ｖｉｉ）ＤＰが２以上の糖へのより少ない転換；及び／又はｖｉｉｉ）グルコースの糖化収率の向上の１つ以上を示す、請求項３４～４１のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項43】

前記バリアントは、配列番号３、配列番号４の位置ａ）６６、６７、及び６９；ｂ）１０２、１１９、及び１２１；並びに／若しくはｃ）１４３、１５６、１６４、１９２、及び２３３に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置にて置換を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項44】

前記バリアントは、ａ）Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ、Ｘ０６７Ａ／Ｃ／Ｍ、及びＸ０６９Ａ／Ｃ／Ｋ；ｂ）Ｘ１０２Ｐ／Ｇ、Ｘ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ、Ｘ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ；並びに／又はｃ）Ｘ１４３Ｇ、Ｘ１５６Ｃ／Ｐ、Ｘ１６４Ｌ／Ｔ、Ｘ１９２Ｆ／Ｒ、及びＸ２３３Ｍ／ＰＴ／Ｙを含むアミノ酸置換を含む、請求項４３に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項45】

前記バリアントは、ａ）Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ、Ｓ０６７Ａ／Ｃ／Ｍ、及びＶ０６９Ａ／Ｃ／Ｋ；ｂ）Ｓ１０２Ｐ／Ｇ、Ｓ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ、Ｔ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ；並びに／又はｃ）Ａ１４３Ｇ、Ｆ１５６Ｃ／Ｐ、Ｉ１６４Ｌ／Ｔ、Ｙ１９２Ｆ／Ｒ、及びＳ２３３Ｍ／ＰＴ／Ｙを含むアミノ酸置換を含む、請求項４４に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項46】

配列番号４の位置６６及び／若しくは１０２、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応する１つ以上の残基位置にてアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項47】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ及び／又はＸ１０２Ｐ／Ｇを含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である、請求項４６に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項48】

前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ及び／又はＳ１０２Ｐ／Ｇを含む、請求項４７に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項49】

配列番号４の位置Ｎ０７５及び／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にてＮ結合グリコシル化を含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項50】

配列番号４の位置８１、８３、１５３、３７０、若しくは３７２に対応する残基位置及び／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換をさらに含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、前記置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼと比較した、グリコシル化の増大及び熱安定性の増大を示す、請求項１～４９のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアント。

【請求項51】

前記１つ以上の置換は、位置Ｄ８１Ｎ、Ｋ８３Ｔ、Ａ１５３Ｔ、Ｓ３７０Ｎ、及び／又はＡ３７２Ｓにて１つ以上の置換を含む、請求項５０に記載のグルコアミラーゼ。

【請求項52】

請求項１～５１のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド。

【請求項53】

請求項５２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項54】

請求項５２に記載のポリヌクレオチド又は請求項５３に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項55】

細菌宿主細胞又は真菌宿主細胞である、請求項５４に記載の宿主細胞。

【請求項56】

アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属種、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属種、又はサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種である、請求項５４又は５５に記載の宿主細胞。

【請求項57】

請求項１～５１のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアントを含む酵素組成物。

【請求項58】

デンプン転化プロセスに用いられる、請求項５７に記載の酵素組成物。

【請求項59】

動物飼料製剤に用いられる、請求項５７に記載の酵素組成物。

【請求項60】

アルコール発酵プロセスに用いられる、請求項５７に記載の酵素組成物。

【請求項61】

発酵飲料を製造するためのプロセスに用いられる、請求項５７に記載の酵素組成物。

【請求項62】

宿主細胞においてバリアントグルコアミラーゼを生成する方法であって、ａ）請求項５３に記載のベクターにより形質転換した宿主細胞を、培養培地中で、前記グルコアミラーゼバリアントの生成に適した条件の下で培養することと；ｂ）前記バリアントを生成することとを含む方法。

【請求項63】

前記培養培地から前記グルコアミラーゼバリアントを回収することをさらに含む、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記宿主細胞は、細菌宿主細胞又は真菌宿主細胞である、請求項６２又は６３に記載の方法。

【請求項65】

前記宿主細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属種、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属種、又はサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種である、請求項６２～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

デンプンを含む組成物を糖化して、グルコースを含む組成物を生成する方法であって： ａ）デンプン組成物を、請求項１～５１のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼバリアントと接触させることと；ｂ）前記デンプン組成物を糖化して、前記グルコース組成物を生成することとを含む方法。

【請求項67】

デンプンを含む前記組成物は、液化デンプン、ゼラチン化デンプン、又は顆粒状デンプンを含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

ｃ）前記デンプン組成物をアルファ－アミラーゼと接触させることをさらに含む、請求項６６又は６７に記載の方法。

【請求項69】

ｄ）前記デンプン組成物をプルラナーゼと接触させることをさらに含む、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

ｅ）前記グルコース組成物を発酵させて、発酵産物を生成することをさらに含む、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記発酵産物はアルコールである、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記アルコールは、エタノール又はブタノールである、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

ｆ）追加のグルコアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、β－アミラーゼ、追加のα－アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、ベータ－グルコシダーゼ、リアーゼ、ヒドロラーゼ、又はそれらの組合せの１つ以上を、前記デンプン組成物に加えることをさらに含む、請求項６６～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記発酵は、同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応である、請求項６６～７３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１２４１４８号明細書の優先権を主張し、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子配列表の参照
電子配列表（ＮＢ４２０４３－ＷＯ－ＰＣＴ２＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ；サイズ：６２，０００バイト；作成日： ２０２２年１０月１１日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、グルコアミラーゼバリアントを含む組成物、及びデンプン基質を糖化する方法、並びにこれらを用いて発酵産物を生成する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

グルコアミラーゼ（１，４－アルファ－Ｄ－グルカングルコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．３）は、デンプン又は関連するオリゴ糖分子及び多糖分子の非還元末端からのＤ－グルコースの放出を触媒する酵素である。グルコアミラーゼは、いくつかの糸状菌及び酵母により産生される。

【0005】

グルコアミラーゼの主な用途は、部分的にプロセシングされたデンプン／デキストリンの、数多くの発酵プロセスに必須の基質であるグルコースへの糖化である。その後、グルコースは、発酵生物を用いて、発酵産物に直接的又は間接的に変換され得る。市販の発酵産物の例として、アルコール（例えば、エタノール、メタノール、ブタノール、１，３－プロパンジオール）；有機酸（例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、グルコナート、乳酸、コハク酸、２，５－ジケト－Ｄ－グルコン酸）；ケトン（例えばアセトン）；アミノ酸（例えばグルタミン酸）；気体（例えば、Ｈ_２及びＣＯ_２）、及びより複雑な化合物が挙げられる。

【0006】

また、最終産物は、シロップであり得る。例えば、最終産物は、グルコースであり得るが、例えばグルコースイソメラーゼによって、フルクトースに、又はほぼ等量のグルコース及びフルクトースで構成される混合物にも変換され得る。この混合物、又はフルクトースがさらに富化した混合物は、世界中で商業化されている、最も一般的に用いられている高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）である。

【0007】

多様な群の微生物がグルコアミラーゼを産生することが報告されているが、商業目的のためのグルコアミラーゼは、大量の酵素を細胞外に分泌することから、従来、糸状菌を使用して生成されてきた。しかしながら、商業的に用いられる真菌性グルコアミラーゼは、例えば、緩徐な触媒活性、又は加工費を増大させる安定性の欠如等の、ある種の限界がある。

【0008】

そこで、糖化の効率を向上させて、発酵産物の高収率を実現するのに、新規なグルコアミラーゼ及びグルコアミラーゼバリアントが必要とされ続けている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本開示は、組換え宿主細胞、グルコアミラーゼを含む組成物、及びグルコアミラーゼを用いてデンプン基質を糖化する方法に関する。さらに、本開示はまた、発酵産物を生成するプロセス、及び動物におけるデンプン消化率を増大させる方法、並びに発酵飲料を製造する方法に関する。

【0010】

したがって、一部の態様において、本明細書中で提供されるのは、配列番号４の位置２０、２１、２３、３７、４９、５１、５２、６６、６７、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９２、９４、１０２、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１４３、１５６、１５７、１５８、１６４、１６５、１６６、１７２、１９２、２０３、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５２、２５３、２７４、２７８、２８１、２９０、３０２、３１０、３２１、３３８、３４１、３５０、３５１、３５２、３５４、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１６、４１８、４２２、４３０、４３４、４４０、４４１、４４４、４４５、及び／若しくは４４９、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応する残基位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼバリアント又はその断片である。一部の実施形態において、等価の位置は、配列同一性によって決定され、前記親グルコアミラーゼは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、又は３７との少なくとも８０％の配列同一性且つ１００％未満の配列同一性を有する。一部の実施形態において、等価の位置は、配列同一性によって決定され、親グルコアミラーゼは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、又は３７を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、親グルコアミラーゼは、ケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群グルコアミラーゼである。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｐ；Ｘ０２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ；Ｘ０２３Ｌ／Ｍ；Ｘ０３７Ｃ／Ｎ；Ｘ０４９Ｗ；Ｘ０５１Ｋ／Ｌ／Ｖ／Ｙ；Ｘ０５２Ｆ／Ｎ／Ｐ；Ｘ６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ；Ｘ０６７Ａ／Ｃ／Ｍ；Ｘ０６９Ａ／Ｃ／Ｋ；Ｘ０７３Ｎ／Ｐ；Ｘ０７７Ｍ／Ｐ／Ｓ；Ｘ０７９Ｃ／Ｒ／Ｔ；Ｘ０８０Ｈ／Ｋ／Ｎ；Ｘ０８１Ｎ／Ｓ；Ｘ０８４Ｌ／Ｖ；Ｘ０９２Ｃ／Ｉ／Ｍ；Ｘ０９４Ａ／Ｇ／Ｙ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ；Ｘ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ；Ｘ１３４Ｑ／Ｓ／Ｗ；Ｘ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｘ１４１Ｆ／Ｋ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１５６Ｃ／Ｐ；Ｘ１５７Ａ／Ｉ；Ｘ１５８Ａ／Ｙ；Ｘ１６４Ｌ／Ｔ；Ｘ１６５Ｉ／Ｔ／Ｗ；Ｘ１６６Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｒ；Ｘ１７２Ｇ／Ｌ；Ｘ１９２Ｆ／Ｒ；Ｘ２０３Ｃ／Ｍ／Ｑ／Ｗ／Ｙ；Ｘ２１０Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｗ；Ｘ２１３Ｈ／Ｒ；Ｘ２１４Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｔ／Ｙ；Ｘ２１５Ｃ／Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｒ／Ｖ／Ｗ；Ｘ２１８Ｆ／Ａ／Ｈ／Ｋ／Ｑ／Ｖ／Ｙ；Ｘ２２１Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｘ２２２Ｃ／Ｍ／Ｖ；Ｘ２３３Ｍ／ＰＴ／Ｙ；Ｘ２３５Ｆ／Ｙ；Ｘ２３６Ａ／Ｑ／Ｓ；Ｇ２３８Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｖ；Ｘ２４３Ａ／Ｐ／Ｓ；Ｘ２５２Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｔ；Ｘ２５３Ｋ／Ｖ；Ｘ２７４Ａ／Ｄ／Ｋ；Ｘ２７８Ａ；Ｘ２８１Ｄ／Ｐ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ；Ｘ３１０Ｔ／Ｖ／Ｙ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３３８Ｉ；Ｘ３４１Ｍ／Ｔ；Ｘ３５０Ｔ／Ｃ／Ｅ／Ｉ；Ｘ３５１Ｅ／Ｖ；Ｘ３５２Ｄ／Ｎ／Ｓ；Ｘ３５４Ｌ／Ｍ；Ｘ３７０Ｍ／Ｎ／Ｒ；Ｘ３９０Ｄ／Ｅ／Ｌ；Ｘ４０３Ｇ／Ｋ／Ｒ；Ｘ４０４Ｋ／Ｍ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｘ４１６Ｃ／Ｙ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４２２Ａ／Ｆ／Ｖ；Ｘ４３０Ａ／Ｑ；Ｘ４３４Ｓ；Ｘ４４０Ｇ／Ｈ／Ｌ；Ｘ４４１Ｌ／Ｓ／Ｗ；Ｘ４４４Ｌ／Ｐ／Ｓ；Ｘ４４５Ｍ／Ｙ；及び／又はＸ４４９Ｌの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｐ；Ｋ０２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ；Ｅ０２３Ｌ／Ｍ；Ｅ０３７Ｃ；Ｓ０４９Ｗ；Ａ０５１Ｋ／Ｌ／Ｖ／Ｙ；Ｇ０５２Ｆ／Ｎ／Ｐ；Ｘ６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ；Ｓ０６７Ａ／Ｃ／Ｍ；Ｖ０６９Ａ／Ｃ／Ｋ；Ｋ０７３Ｎ／Ｐ；Ｔ０７７Ｍ／Ｐ／Ｓ；Ａ０７９Ｃ／Ｒ／Ｔ；Ｇ０８０Ｈ／Ｋ／Ｎ；Ｄ０８１Ｎ／Ｓ；Ｉ０８４Ｌ／Ｖ；Ｖ０９２Ｃ／Ｉ／Ｍ；Ｆ０９４Ａ／Ｇ／Ｙ；Ｘ１０２Ｇ；Ｓ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ；Ｔ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ；Ｅ１３４Ｑ／Ｓ／Ｗ；Ｍ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｌ１４１Ｆ／Ｋ；Ａ１４３Ｇ；Ｆ１５６Ｃ／Ｐ；Ｔ１５７Ａ／Ｉ；Ｎ１５８Ａ／Ｙ；Ｉ１６４Ｌ／Ｔ；Ｙ１６５Ｉ／Ｔ／Ｗ；Ｋ１６６Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｒ；Ｖ１７２Ｇ／Ｌ；Ｙ１９２Ｆ／Ｒ；Ｄ２０３Ｃ／Ｍ／Ｑ／Ｗ／Ｙ；Ｒ２１０Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｗ；Ｄ２１３Ｈ／Ｒ；Ｎ２１４Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｙ；Ｓ２１５Ｃ／Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｒ／Ｖ／Ｗ；Ａ２１８Ｆ／Ａ／Ｈ／Ｋ／Ｑ／Ｖ／Ｙ；Ｓ２２１Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｇ２２２Ｃ／Ｍ／Ｖ；Ｓ２３３Ｍ／ＰＴ／Ｙ；Ｗ２３５Ｆ／Ｙ；Ｄ２３６Ａ／Ｑ／Ｓ；Ｇ２３８Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｖ；Ｔ２４３Ａ／Ｐ／Ｓ；Ｖ２５２Ｆ／Ｈ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ａ／Ｄ／Ｋ；Ｐ２７８Ａ；Ｅ２８１Ｄ／Ｐ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ；Ｎ３１０Ｔ／Ｖ／Ｙ；Ｎ３２１Ｄ；Ｆ３３８Ｉ；Ｌ３４１Ｍ／Ｔ；Ｋ３５０Ｃ／Ｅ／Ｉ；Ｎ３５１Ｅ／Ｖ；Ｔ３５２Ｄ／Ｎ／Ｓ；Ｖ３５４Ｌ／Ｍ；Ｓ３７０Ｍ／Ｎ／Ｒ；Ｓ３９０Ｄ／Ｅ／Ｌ；Ｑ４０３Ｇ／Ｋ／Ｒ；Ｙ４０４Ｋ／Ｍ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｆ４１６Ｃ／Ｙ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ｙ４２２Ａ／Ｆ／Ｖ；Ｔ４３０Ａ／Ｑ；Ａ４３４Ｓ；Ａ４４０Ｇ／Ｈ／Ｌ；Ｑ４４１Ｌ／Ｓ／Ｗ；Ａ４４４Ｌ／Ｐ／Ｓ；Ｇ４４５Ｍ／Ｙ；及び／又はＦ４４９Ｌの１つ以上を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、配列番号４の位置２０、２１、５１、７９、８０、９２、１０２、１２１、１４０、１４３、１５７、１５８、１６５、１６６、１９２、２０３、２１０、２１３、２１４、２１５、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５２、２７４、２７８、２８１、２９０、３０２、３１０、３２１、３４１、３５０、３５２、３５４、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１８、４４０、４４１、及び／若しくは４４４に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、当該置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、マルトースの加水分解の向上を示す。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ａ／Ｐ；Ｘ０２１Ｓ；Ｘ０５１Ｌ／Ｖ；Ｘ０７９Ｃ／Ｔ；Ｘ０８０Ｋ；Ｘ０９２Ｍ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１２１Ｇ／Ｐ／Ｍ；Ｘ１４０Ｉ／Ｃ；Ｘ１４０Ｃ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６５Ｗ；Ｘ１６６Ｇ／Ｒ／Ｆ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２０３Ｗ；Ｘ２１０Ｌ；Ｘ２１３Ｒ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ；Ｘ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｘ２２１Ｒ／Ｔ／Ｍ；Ｘ２２２Ｍ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｙ／Ｐ；Ｘ２３５Ｙ；Ｘ２３６Ａ／Ｑ；Ｘ２３８Ｓ／Ｈ；Ｘ２４３Ｅ／Ｖ；Ｘ２５２Ｃ／Ｆ；Ｘ２７４Ａ；Ｘ２７８Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｋ／Ｖ／Ｐ／Ｓ／Ｗ；Ｘ３１０Ｔ／Ｙ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３４１Ｍ；Ｘ３５０Ｉ／Ｔ；Ｘ３５２Ｄ；Ｘ３５４Ｌ／Ｍ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｅ；Ｘ４０３Ｇ／Ｒ；Ｘ４０４Ｋ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｘ４１８Ｗ／Ｅ；Ｘ４４０Ｇ／Ｈ；Ｘ４４１Ｓ；及び／又はＸ４４４Ｌの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ａ／Ｐ；Ｋ０２１Ｓ；Ａ０５１Ｌ／Ｖ；Ａ０７９Ｃ／Ｔ；Ｇ０８０Ｋ；Ｖ０９２Ｍ；Ｘ１０２Ｇ；Ｔ１２１Ｇ／Ｐ／Ｍ；Ｍ１４０Ｉ／Ｃ；Ｍ１４０Ｃ；Ａ１４３Ｇ；Ｔ１５７Ｉ；Ｎ１５８Ａ；Ｙ１６５Ｗ；Ｋ１６６Ｇ／Ｒ／Ｆ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２０３Ｗ；Ｒ２１０Ｌ；Ｄ２１３Ｒ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ；Ｓ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｓ２２１Ｒ／Ｔ／Ｍ；Ｇ２２２Ｍ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｙ／Ｐ；Ｗ２３５Ｙ；Ｄ２３６Ａ／Ｑ；Ｇ２３８Ｓ／Ｈ；Ｔ２４３Ｅ／Ｖ；Ｖ２５２Ｃ／Ｆ；Ｇ２７４Ａ；Ｐ２７８Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｋ／Ｖ／Ｐ／Ｓ／Ｗ；Ｎ３１０Ｔ／Ｙ；Ｎ３２１Ｄ；Ｌ３４１Ｍ；Ｋ３５０Ｉ／Ｔ；Ｔ３５２Ｄ；Ｖ３５４Ｌ／Ｍ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｅ；Ｑ４０３Ｇ／Ｒ；Ｙ４０４Ｋ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｒ４１８Ｗ／Ｅ；Ａ４４０Ｇ／Ｈ；Ｑ４４１Ｓ；及び／又はＡ４４４Ｌの１つ以上を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、配列番号４の位置２０、２１、２３、３７、５１、５２、６７、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９２、９４、１０２、１１９、１２１、１４０、１４１、１４３、１６４、１６５、１６６、１７２、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３６、２３８、２５２、２５３、２７４、２８１、２９０、３０２、３２１、３４１、３５０、３５１、３５２、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１８、４３０、４４０、４４４、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、当該置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、パノースの加水分解の向上を示す。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ｐ／Ａ；Ｘ０２１Ｔ／Ｗ／Ｍ；Ｘ０２３Ｍ／Ｌ；Ｘ０３７Ｃ；Ｘ０５１Ｌ／Ｖ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６７Ｃ；Ｘ０６９Ｃ／Ａ；Ｘ０７３Ｎ；Ｘ０７７Ｓ；Ｘ０７９Ｃ；Ｘ０８０Ｈ／Ｋ；Ｘ０８１Ｎ；Ｘ０８４Ｖ／Ｌ；Ｘ０９２Ｃ；Ｘ０９４Ｙ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１１９Ｇ；Ｘ１２１Ｍ／Ｌ／Ｇ／Ｐ；Ｘ１４０Ｃ／Ｑ／Ｉ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１６４Ｌ；Ｘ１６５Ｗ／Ｔ；Ｘ１６６Ｒ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ２１０Ｌ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ；Ｘ２１５Ｄ；Ｘ２１８Ｑ／Ａ／Ｖ／Ｙ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｔ／Ｐ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２３８Ｈ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２７４Ｄ／Ｋ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｑ／Ｖ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３４１Ｍ／Ｔ；Ｘ３５０Ｃ／Ｔ；Ｘ３５１Ｅ；Ｘ３５２Ｄ／Ｎ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｘ４０３Ｇ；Ｘ４０３Ｒ／Ｋ；Ｘ４０４Ｍ／Ｋ；Ｘ４０５Ｓ／Ｑ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４３０Ａ；Ｘ４４０Ｇ；Ｘ４４４Ｐ；及び／又はＸ４４５Ｙ／Ｍの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ｐ／Ａ；Ｋ０２１Ｔ／Ｗ／Ｍ；Ｅ０２３Ｍ／Ｌ；Ｅ０３７Ｃ；Ａ０５１Ｌ／Ｖ；Ｇ０５２Ｎ；Ｓ０６７Ｃ；Ｖ０６９Ｃ／Ａ；Ｋ０７３Ｎ；Ｔ０７７Ｓ；Ａ０７９Ｃ；Ｇ０８０Ｈ／Ｋ；Ｄ０８１Ｎ；Ｉ０８４Ｖ／Ｌ；Ｖ０９２Ｃ；Ｆ０９４Ｙ；Ｘ１０２Ｇ；Ｓ１１９Ｇ；Ｔ１２１Ｍ／Ｌ／Ｇ／Ｐ；Ｍ１４０Ｃ／Ｑ／Ｉ；Ｌ１４１Ｆ；Ａ１４３Ｇ；Ｉ１６４Ｌ；Ｙ１６５Ｗ／Ｔ；Ｋ１６６Ｒ；Ｖ１７２Ｇ；Ｒ２１０Ｌ；Ｄ２１３Ｈ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ；Ｓ２１５Ｄ；Ｓ２１８Ｑ／Ａ／Ｖ／Ｙ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｔ／Ｐ；Ｄ２３６Ｑ；Ｇ２３８Ｈ；Ｖ２５２Ｆ；Ｇ２７４Ｄ／Ｋ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｑ／Ｖ；Ｎ３２１Ｄ；Ｌ３４１Ｍ／Ｔ；Ｋ３５０Ｃ／Ｔ；Ｎ３５１Ｅ；Ｔ３５２Ｄ／Ｎ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｑ４０３Ｇ；Ｑ４０３Ｒ／Ｋ；Ｙ４０４Ｍ／Ｋ；Ｈ４０５Ｓ／Ｑ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ｔ４３０Ａ；Ａ４４０Ｇ；Ａ４４４Ｐ；及び／又はＧ４４５Ｙ／Ｍの１つ以上を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、配
列番号４の位置２０、５１、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９４、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１４３、１５６、１５８、１６５、１６６、２０３、２１０、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２５２、２５３、２７４、２７８、２８１、２９０、３０２、３１０、３２１、３４１、３５０、３５２、３５４、３７０、３９０、４１６、４１８、４３４、４４０、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、当該置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、プルランの加水分解の向上を示す。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ｆ／Ａ／Ｇ；Ｘ０５１Ｋ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｐ／Ｎ；Ｘ０７７Ｍ／Ｐ；Ｘ０７９Ｃ／Ｔ；Ｘ０８０Ｋ；Ｘ０８１Ｎ；Ｘ０８４Ｖ／Ｌ；Ｘ０９４Ｇ／Ａ；Ｘ１１９Ｇ／Ｄ；Ｘ１２１Ｌ／Ｍ；Ｘ１３４Ｓ；Ｘ１４０Ｉ／Ｃ／Ｑ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１５６Ｐ／Ｃ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６５Ｔ；Ｘ１６６Ｈ／Ａ／Ｆ；Ｘ２０３Ｃ／Ｑ／Ｗ／Ｙ；Ｘ２１０Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｎ／Ａ／Ｉ；Ｘ２１４Ａ／Ｙ／Ｌ／Ｃ；Ｘ２１５Ｖ／Ｃ／Ｗ／Ｄ／Ｈ；Ｘ２１８Ｖ／Ｋ／Ａ／Ｑ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ；Ｘ２３５Ｙ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２５２Ｆ／Ｈ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ｋ／Ｄ；Ｘ２７８Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ；Ｘ３０２Ｐ／Ｓ／Ｖ；Ｘ３１０Ｔ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３４１Ｍ；Ｘ３５０Ｉ／Ｔ；Ｘ３５２Ｄ／Ｓ；Ｘ３５４Ｌ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｘ４０４Ｋ；Ｘ４１６Ｙ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４３４Ｓ；Ｘ４４０Ｇ；及び／又はＸ４４５Ｍの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ｆ／Ａ／Ｇ；Ａ０５１Ｋ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｐ／Ｎ；Ｔ０７７Ｍ／Ｐ；Ａ０７９Ｔ；Ｇ０８０Ｋ；Ｄ０８１Ｎ；Ｉ０８４Ｖ／Ｌ；Ｆ０９４Ｇ／Ａ；Ｓ１１９Ｇ／Ｄ；Ｔ１２１Ｌ／Ｍ；Ｅ１３４Ｓ；Ｍ１４０Ｉ／Ｃ／Ｑ；Ｌ１４１Ｆ；Ａ１４３Ｇ；Ｆ１５６Ｐ／Ｃ；Ｎ１５８Ａ；Ｙ１６５Ｔ；Ｋ１６６Ｈ／Ａ／Ｆ；Ｄ２０３Ｃ／Ｑ／Ｗ／Ｙ；Ｒ２１０Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｎ／Ａ／Ｉ；Ｎ２１４Ａ／Ｙ／Ｌ／Ｃ；Ｓ２１５Ｖ／Ｃ／Ｗ／Ｄ／Ｈ；Ｓ２１８Ｖ／Ｋ／Ａ／Ｑ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ；Ｗ２３５Ｙ；Ｄ２３６Ｑ；Ｖ２５２Ｆ／Ｈ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ｋ／Ｄ；Ｐ２７８Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ；Ｎ３０２Ｐ／Ｓ／Ｖ；Ｎ３１０Ｔ；Ｎ３２１Ｄ；Ｌ３４１Ｍ；Ｋ３５０Ｉ／Ｔ；Ｔ３５２Ｄ／Ｓ；Ｖ３５４Ｌ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｙ４０４Ｋ；Ｆ４１６Ｙ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ａ４３４Ｓ；Ａ４４０Ｇ；及び／又はＧ４４５Ｍの１つ以上を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、配列番号４の位置２１、２３、３７、５２、６６、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９２、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１５７、１５８、１６４、１６５、２１０、２１３、２１４、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２４３、２５２、２５３、２７４、２８１、２９０、３０２、３４１、３５０、３５１、３５２、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１６、４１８、４２２、４４０、４４１、４４４、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、可溶性デンプンの糖化について、当該置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、より高い性能指数（ＰＩ）を示す。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２１Ｔ；Ｘ０２３Ｍ／Ｌ；Ｘ０３７Ｃ；Ｘ０５２Ｎ／Ｆ；Ｘ０６６Ａ／Ｆ／Ｔ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｎ／Ｐ；Ｘ０７７Ｐ／Ｍ／Ｓ；Ｘ０７９Ｒ；Ｘ０８０Ｎ／Ｈ／Ｋ；Ｘ０８１Ｎ／Ｓ；Ｘ０８４Ｌ／Ｖ；Ｘ０９２Ｉ；Ｘ１１９Ａ／Ｇ；Ｘ１２１Ｍ／Ｌ；Ｘ１３４Ｓ／Ｑ；Ｘ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｘ１４１Ｆ／Ｋ；Ｘ１５７Ａ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６４Ｌ／Ｔ；Ｘ１６５Ｗ／Ｔ；Ｘ２１０Ｗ／Ｇ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１４Ｇ／Ｙ；Ｘ２１８Ｑ／Ｆ／Ａ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ；Ｘ２３５Ｆ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２４３Ａ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ｄ／Ｋ／Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｗ／Ｓ／Ｑ／Ｋ；Ｘ３４１Ｍ／Ｔ；Ｘ３５０Ｃ／Ｅ；Ｘ３５１Ｅ；Ｘ３５２Ｄ／Ｎ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｌ；Ｘ４０３Ｇ／Ｒ／Ｋ；Ｘ４０４Ｉ／Ｍ／Ｋ；Ｘ４０５Ｓ；Ｘ４１６Ｃ／Ｙ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４４０Ｇ；Ｘ４４１Ｌ；Ｘ４４４Ｓ／Ｐ；及び／又はＸ４４５Ｍの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｋ０２１Ｔ；Ｅ０２３Ｍ／Ｌ；Ｅ０３７Ｃ；Ｇ０５２Ｎ／Ｆ；Ｖ０６６Ａ／Ｆ／Ｔ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｎ／Ｐ；Ｔ０７７Ｐ／Ｍ／Ｓ；Ａ０７９Ｒ；Ｇ０８０Ｎ／Ｈ／Ｋ；Ｄ０８１Ｎ／Ｓ；Ｉ０８４Ｌ／Ｖ；Ｖ０９２Ｉ；Ｓ１１９Ａ／Ｇ；Ｔ１２１Ｍ／Ｌ；Ｅ１３４Ｓ／Ｑ；Ｍ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｌ１４１Ｆ／Ｋ；Ｔ１５７Ａ；Ｎ１５８Ａ；Ｉ１６４Ｌ／Ｔ；Ｙ１６５Ｗ／Ｔ；Ｒ２１０Ｗ／Ｇ；Ｄ２１３Ｈ；Ｎ２１４Ｇ／Ｙ；Ｓ２１８Ｑ／Ｆ／Ａ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ；Ｗ２３５Ｆ；Ｄ２３６Ｑ；Ｔ２４３Ａ；Ｖ２５２Ｆ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ｄ／Ｋ／Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｗ／Ｓ／Ｑ／Ｋ；Ｌ３４１Ｍ／Ｔ；Ｋ３５０Ｃ／Ｅ；Ｎ３５１Ｅ；Ｔ３５２Ｄ／Ｎ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｌ；Ｑ４０３Ｇ／Ｒ／Ｋ；Ｙ４０４Ｍ／Ｋ；Ｈ４０５Ｓ；Ｆ４１６Ｃ／Ｙ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ｙ４２２Ａ；Ａ４４０Ｇ；Ｑ４４１Ｌ；Ａ４４４Ｓ／Ｐ；及び／又はＧ４４５Ｍの１つ以上を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、配列番号４の位置２０、２１、５１、６７、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、１０２、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１４３、１５６、１５７、１５８、１６５、１６６、１７２、１９２、２０３、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２５２、２７４、２８１、２９０、３０２、３１０、３２１、３４１、３５０、３５１、３５２、３５４、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１８、４２２、４３４、４４０、４４４、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、当該置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、マルトデキストリンの加水分解の向上を示す。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ｐ／Ａ／Ｅ；Ｘ０２１Ｓ／Ｍ；Ｘ０５１Ｖ／Ｌ／Ｋ／Ｙ；Ｘ０６７Ａ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｐ／Ｎ；Ｘ０７７Ｐ／Ｍ；Ｘ０７９Ｃ／Ｔ；Ｘ０８０Ｋ／Ｈ；Ｘ０８１Ｎ；Ｘ０８４Ｌ／Ｖ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１１９Ｇ；Ｘ１２１Ｍ／Ｇ／Ｖ／Ｐ；Ｘ１３４Ｓ／Ｑ；Ｘ１４０Ｃ／Ｉ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１５６Ｐ／Ｃ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６５Ｗ／Ｔ；Ｘ１６６Ｇ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２０３Ｗ／Ｃ／Ｍ；Ｘ２１０Ｌ／Ｍ；Ｘ２１３Ｒ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ；Ｘ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｘ２１８Ｖ／Ｙ／Ｑ；Ｘ２２１Ｒ／Ｔ；Ｘ２２２Ｍ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ／Ｙ；Ｘ２３５Ｙ；Ｘ２３６Ｑ／Ａ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２７４Ｋ／Ａ／Ｄ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｐ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｑ／Ｗ；Ｘ３１０Ｔ／Ｙ；Ｘ３４１Ｍ；Ｘ３５０Ｉ／Ｔ；Ｘ３５１Ｖ；Ｘ３５２Ｄ；Ｘ３５４Ｌ／Ｍ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｅ／Ｌ／Ｄ；Ｘ４０３Ｋ／Ｒ／Ｇ；Ｘ４０４Ｋ／Ｍ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｘ４１８Ｗ／Ｅ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４３４Ｓ；Ｘ４４０Ｇ／Ｈ；Ｘ４４４Ｐ；及び／又はＸ４４５Ｍの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ｐ／Ａ／Ｅ；Ｋ０２１Ｓ／Ｍ；Ａ０５１Ｖ／Ｌ／Ｋ／Ｙ；Ｓ０６７Ａ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｐ／Ｎ；Ｔ０７７Ｐ／Ｍ；Ａ０７９Ｃ／Ｔ；Ｇ０８０Ｋ／Ｈ；Ｄ０８１Ｎ；Ｉ０８４Ｌ／Ｖ；Ｐ１０２Ｇ；Ｓ１１９Ｇ；Ｔ１２１Ｍ／Ｇ／Ｖ／Ｐ；Ｅ１３４Ｓ／Ｑ；Ｍ１４０Ｃ／Ｉ；Ｌ１４１Ｆ；Ａ１４３Ｇ；Ｆ１５６Ｐ／Ｃ；Ｔ１５７Ｉ；Ｎ１５８Ａ；Ｙ１６５Ｗ／Ｔ；Ｋ１６６Ｇ；Ｖ１７２Ｇ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２０３Ｗ／Ｃ／Ｍ；Ｒ２１０Ｌ／Ｍ；Ｄ２１３Ｒ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ；Ｓ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｓ２１８Ｖ／Ｙ／Ｑ；Ｓ２２１Ｒ／Ｔ；Ｇ２２２Ｍ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ／Ｙ；Ｗ２３５Ｙ；Ｄ２３６Ｑ／Ａ；Ｖ２５２Ｆ；Ｇ２７４Ｋ／Ａ／Ｄ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｐ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｑ／Ｗ；Ｎ３１０Ｔ／Ｙ；Ｎ３２１Ｄ；Ｌ３４１Ｍ；Ｋ３５０Ｉ／Ｔ；Ｎ３５１Ｖ；Ｔ３５２Ｄ；Ｖ３５４Ｌ／Ｍ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｅ／Ｌ／Ｄ；Ｑ４０３Ｋ／Ｒ／Ｇ；Ｙ４０４Ｋ／Ｍ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｒ４１８Ｗ／Ｅ；Ｙ４２２Ａ；Ａ４３４Ｓ；Ａ４４０Ｇ／Ｈ；Ａ４４４Ｐ；及び／又はＧ４４５Ｍの１つ以上を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、配列番号４の位置２３、５１、５２、６６、６７、７７、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１５６、１５７、１６５、１９２、２１３、２２１、２２２、２３３、２３６、２５２、２８１、２９０、３０２、３５０、３５２、３７０、３９０、４０３、４０４、４１６、及び／若しくは４２２に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、当該置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、熱安定性の向上を示す。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２３Ｍ；Ｘ０５１Ｙ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｘ０６７Ｃ；Ｘ０７７Ｐ；Ｘ１１９Ａ；Ｘ１２１Ｍ；Ｘ１３４Ｓ；Ｘ１４０Ｉ／Ｃ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１５６Ｃ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１６５Ｗ／Ｉ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２１３Ｒ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ；Ｘ２３３Ｍ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｖ；Ｘ３０２Ｈ／Ｑ／Ｗ／Ｓ／Ｋ；Ｘ３５０Ｅ／Ｃ；Ｘ３５２Ｄ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｌ／Ｄ；Ｘ４０３Ｒ；Ｘ４０４Ｋ／Ｍ；Ｘ４１６Ｙ；及び／又はＸ４２２Ａ／Ｖの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｅ０２３Ｍ；Ａ０５１Ｙ；Ｇ０５２Ｎ；Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｓ０６７Ｃ；Ｔ０７７Ｐ；Ｓ１１９Ａ；Ｔ１２１Ｍ；Ｅ１３４Ｓ；Ｍ１４０Ｉ／Ｃ；Ｌ１４１Ｆ；Ｆ１５６Ｃ；Ｔ１５７Ｉ；Ｙ１６５Ｗ／Ｉ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２１３Ｒ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ；Ｓ２３３Ｍ；Ｄ２３６Ｑ；Ｖ２５２Ｆ；Ｅ２５３Ｆ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｖ；Ｎ３０２Ｈ／Ｑ／Ｗ／Ｓ／Ｋ；Ｋ３５０Ｅ／Ｃ；Ｔ３５２Ｄ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｌ／Ｄ；Ｑ４０３Ｒ；Ｙ４０４Ｋ／Ｍ；Ｆ４１６Ｙ；及び／又はＹ４２２Ａ／Ｖの１つ以上を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、配列番号４の位置４９、５１、５２、６６、６９、７７、８０、９４、１１９、１３４、１５８、１６４、１６５、１７２、１９２、２１３、２１５、２１８、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５３、２７４、３０２、３３８、４０３、４０５、４１６、４１８、４２２、４３０、４４０、４４１、４４４、４４５、及び／若し
くは４４９に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、当該置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼ又はその断片と比較して、重合度（ＤＰ）が２以上である糖へのより少ない転換を示す。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０４９Ｗ；Ｘ０５１Ｙ；Ｘ０５２Ｐ；Ｘ６６Ｐ；Ｘ０６９Ｋ／Ｃ；Ｘ０７７Ｐ／Ｍ；Ｘ０８０Ｈ；Ｘ０９４Ａ／Ｇ；Ｘ１１９Ｄ；Ｘ１３４Ｗ／Ｑ；Ｘ１５８Ｙ；Ｘ１６４Ｔ／Ｌ；Ｘ１６５Ｗ／Ｉ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ１９２Ｒ／Ｆ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１５Ｒ；Ｘ２１８Ｋ；Ｘ２２２Ｃ；Ｘ２３３Ｔ／Ｐ；Ｘ２３５Ｆ；Ｘ２３６Ａ；Ｘ２３８Ｈ／Ｓ／Ｎ；Ｘ２４３Ｐ／Ｓ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ｋ／Ａ；Ｘ３０２Ｈ／Ｆ／Ｐ／Ｍ／Ｑ／Ｔ；Ｘ３３８Ｉ；Ｘ４０３Ｇ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ；Ｘ４１６Ｃ／Ｙ；Ｘ４１６Ｙ；Ｘ４１８Ｗ／Ｅ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４３０Ａ／Ｑ；Ｘ４４０Ｌ／Ｈ；Ｘ４４１Ｗ／Ｌ；Ｘ４４４Ｌ／Ｐ；Ｘ４４５Ｙ；及び／又はＸ４４９Ｌの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０４９Ｗ；Ａ０５１Ｙ；Ｇ０５２Ｐ；Ｖ６６Ｐ；Ｖ０６９Ｋ／Ｃ；Ｔ０７７Ｐ／Ｍ；Ｇ０８０Ｈ；Ｆ０９４Ａ／Ｇ；Ｓ１１９Ｄ；Ｅ１３４Ｗ／Ｑ；Ｎ１５８Ｙ；Ｉ１６４Ｔ／Ｌ；Ｙ１６５Ｗ／Ｉ；Ｖ１７２Ｇ；Ｙ１９２Ｒ／Ｆ；Ｄ２１３Ｈ；Ｓ２１５Ｒ；Ｓ２１８Ｋ；Ｇ２２２Ｃ；Ｓ２３３Ｔ／Ｐ；Ｗ２３５Ｆ；Ｄ２３６Ａ；Ｇ２３８Ｈ／Ｓ／Ｎ；Ｔ２４３Ｐ／Ｓ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ｋ／Ａ；Ｎ３０２Ｈ／Ｆ／Ｐ／Ｍ／Ｑ／Ｔ；Ｆ３３８Ｉ；Ｑ４０３Ｇ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ；Ｆ４１６Ｃ／Ｙ；Ｆ４１６Ｙ；Ｒ４１８Ｗ／Ｅ；Ｙ４２２Ａ；Ｔ４３０Ａ／Ｑ；Ａ４４０Ｌ／Ｈ；Ｑ４４１Ｗ／Ｌ；Ａ４４４Ｌ／Ｐ；Ｇ４４５Ｙ；及び／又はＦ４４９Ｌの１つ以上を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、配列番号４の位置２１、２３、５１、５２、６６、６７、７９、８１、９２、１１９、１４０、１５８、１６４、１７２、１９２、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５３、２８１、２９０、３０２、３１０、３５１、３５２、３５４、３７０、４０３、４１６、４２２、４３０、４４１、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、当該置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、グルコースの糖化収率の向上を示す。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２１Ｓ／Ｗ；Ｘ０２３Ｌ；Ｘ０５１Ｙ／Ｋ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６６／Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｘ０６７Ｍ／Ｃ／Ａ；Ｘ０７９Ｒ；Ｘ０８１Ｓ；Ｘ０９２Ｃ／Ｍ；Ｘ１１９Ａ；Ｘ１４０Ｉ；Ｘ１５８Ａ／Ｙ；Ｘ１６４Ｌ；Ｘ１７２Ｌ／Ｇ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２１０Ｗ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１４Ｙ；Ｘ２１５Ｆ／Ｃ／Ｒ；Ｘ２１８Ｈ／Ｋ／Ａ；Ｘ２２１Ｍ／Ｔ；Ｘ２２２Ｖ；Ｘ２３３Ｔ；Ｘ２３５Ｙ／Ｆ；Ｘ２３６Ｓ／Ａ；Ｘ２３８Ｔ／Ｖ／Ｍ；Ｘ２４３Ａ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２８１Ｐ／Ｄ；Ｘ２９０Ｖ；Ｘ３０２Ｋ／Ｑ／Ｈ／Ｗ；Ｘ３１０Ｖ／Ｔ；Ｘ３５１Ｖ；Ｘ３５２Ｓ；Ｘ３５４Ｌ；Ｘ３７０Ｒ；Ｘ４０３Ｋ；Ｘ４１６Ｙ；Ｘ４２２Ｆ；Ｘ４３０Ａ；Ｘ４４１Ｌ；及び／又はＸ４４５Ｙの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｋ０２１Ｓ／Ｗ；Ｅ０２３Ｌ；Ａ０５１Ｙ／Ｋ；Ｇ０５２Ｎ；Ｖ０６６／Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｓ０６７Ｍ／Ｃ／Ａ；Ａ０７９Ｒ；Ｄ０８１Ｓ；Ｖ０９２Ｃ／Ｍ；Ｓ１１９Ａ；Ｍ１４０Ｉ；Ｎ１５８Ａ／Ｙ；Ｉ１６４Ｌ；Ｖ１７２Ｌ／Ｇ；Ｙ１９２Ｆ；Ｒ２１０Ｗ；Ｄ２１３Ｈ；Ｎ２１４Ｙ；Ｓ２１５Ｆ／Ｃ／Ｒ；Ｓ２１８Ｈ／Ｋ／Ａ；Ｓ２２１Ｍ／Ｔ；Ｇ２２２Ｖ；Ｓ２３３Ｔ；Ｗ２３５Ｙ／Ｆ；Ｄ２３６Ｓ／Ａ；Ｇ２３８Ｔ／Ｖ／Ｍ；Ｔ２４３Ａ；Ｅ２５３Ｋ；Ｅ２８１Ｐ／Ｄ；Ｆ２９０Ｖ；Ｎ３０２Ｋ／Ｑ／Ｈ／Ｗ；Ｎ３１０Ｖ／Ｔ；Ｎ３５１Ｖ；Ｔ３５２Ｓ；Ｖ３５４Ｌ；Ｓ３７０Ｒ；Ｑ４０３Ｋ；Ｆ４１６Ｙ；Ｙ４２２Ｆ；Ｔ４３０Ａ；Ｑ４４１Ｌ；及び／又はＧ４４５Ｙの１つ以上を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、配列番号４の位置２０、２１、２３、３７、５１、５２、６６、６７、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９２、９４、１０２、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１５６、１５７、１５８、１６４、１６５、１６６、１７２、１９２、２０３、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５２、２５３、２７４、２７８、２８１、２９０、３０２、３１０、３４１、３５０、３５１、３５２、３５４、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１６、４１８、４２２、４３０、４４０、４４１、４４４、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、当該置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼと比較した、ｉ）マルトースの加水分解の向上；ｉｉ）パノースの加水分解の向上；ｉｉｉ）プルランの加水分解の向上；ｉｖ）可溶性デンプンの加水分解の向上；ｖ）マルトデキストリンの加水分解の向上；ｖｉ）熱安定性の向上；ｖｉｉ）ＤＰが２以上の糖へのより少ない転換；及び／又はｖｉｉｉ）グルコースの糖化収率の向上の２つ以上を示す。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０２０Ａ／Ｐ；Ｘ０２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ；Ｘ０２３Ｌ／Ｍ；Ｘ０３７Ｃ；Ｘ０５１Ｋ／Ｌ／Ｖ／Ｙ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｘ０６７Ａ／Ｃ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｎ／Ｐ；Ｘ０７７Ｍ／Ｐ／Ｓ；Ｘ０７９Ｒ／Ｔ；Ｘ０８０Ｈ／Ｋ；Ｘ０８１Ｎ／Ｓ；Ｘ０８４Ｌ／Ｖ；Ｘ０９２Ｃ／Ｍ；Ｘ０９４Ａ／Ｇ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ；Ｘ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ；Ｘ１３４Ｑ／Ｓ；Ｘ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１５６Ｃ／Ｐ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１５８Ａ／Ｙ；Ｘ１６４Ｌ／Ｔ；Ｘ１６５Ｉ／Ｔ／Ｗ；Ｘ１６６Ｇ／Ｆ／Ｒ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２０３Ｃ／Ｗ；Ｘ２１０Ｌ／Ｍ／Ｗ；Ｘ２１３Ｈ／Ｒ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ／Ｙ；Ｘ２１５Ｃ／Ｄ／Ｆ／Ｒ；Ｘ２１８Ａ／Ｋ／Ｑ／Ｖ／Ｙ；Ｘ２２１Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｘ２２２Ｃ／Ｍ／Ｖ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｙ；Ｘ２３５Ｆ／Ｙ；Ｘ２３６Ａ／Ｑ；Ｘ２３８Ｈ／Ｓ；Ｘ２４３Ａ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ａ／Ｄ／Ｋ；Ｘ２７８Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ２９０Ｖ；Ｘ３０２Ｈ／Ｋ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ；Ｘ３１０Ｔ／Ｙ；Ｘ３４１Ｍ／Ｔ；Ｘ３５０Ｃ／Ｅ／Ｉ；Ｘ３５１Ｅ／Ｖ；Ｘ３５２Ｄ／Ｎ／Ｓ；Ｘ３５４Ｌ／Ｍ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｅ／Ｌ；Ｘ４０３Ｇ／Ｋ／Ｒ；Ｘ４０４Ｋ／Ｍ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｘ４１６Ｃ／Ｙ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４３０Ａ；Ｘ４４０Ｇ／Ｈ；Ｘ４４１Ｌ；Ｘ４４４Ｌ／Ｐ；及び／又はＸ４４５Ｍ／Ｙの１つ以上を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０２０Ａ／Ｅ／Ｐ；Ｋ０２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ；Ｅ０２３Ｌ／Ｍ；Ｅ０３７Ｃ；Ａ０５１Ｋ／Ｌ／Ｖ／Ｙ；Ｇ０５２Ｎ；Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｓ０６７Ａ／Ｃ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｎ／Ｐ；Ｔ０７７Ｍ／Ｐ／Ｓ；Ａ０７９Ｒ／Ｔ；Ｇ０８０Ｈ／Ｋ；Ｄ０８１Ｎ／Ｓ；Ｉ０８４Ｌ／Ｖ；Ｖ０９２Ｃ／Ｍ；Ｆ０９４Ａ／Ｇ；Ｐ１０２Ｇ；Ｓ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ；Ｔ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ；Ｅ１３４Ｑ／Ｓ；Ｍ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｌ１４１Ｆ；Ｆ１５６Ｃ／Ｐ；Ｔ１５７Ｉ；Ｎ１５８Ａ／Ｙ；Ｉ１６４Ｌ／Ｔ；Ｙ１６５Ｉ／Ｔ／Ｗ；Ｋ１６６Ｇ／Ｆ／Ｒ；Ｖ１７２Ｇ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２０３Ｃ／Ｗ；Ｒ２１０Ｌ／Ｍ／Ｗ；Ｄ２１３Ｈ／Ｒ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ／Ｙ；Ｓ２１５Ｃ／Ｄ／Ｆ／Ｒ；Ｓ２１８Ａ／Ｋ／Ｑ／Ｖ／Ｙ；Ｓ２２１Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｇ２２２Ｃ／Ｍ／Ｖ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｙ；Ｗ２３５Ｆ／Ｙ；Ｄ２３６Ａ／Ｑ；Ｇ２３８Ｈ／Ｓ；Ｔ２４３Ａ；Ｖ２５２Ｆ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ａ／Ｄ／Ｋ；Ｐ２７８Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｆ２９０Ｖ；Ｎ３０２Ｈ／Ｋ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ；Ｎ３１０Ｔ／Ｙ；Ｌ３４１Ｍ／Ｔ；Ｋ３５０Ｃ／Ｅ／Ｉ；Ｎ３５１Ｅ／Ｖ；Ｔ３５２Ｄ／Ｎ／Ｓ；Ｖ３５４Ｌ／Ｍ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｅ／Ｌ；Ｑ４０３Ｇ／Ｋ／Ｒ；Ｙ４０４Ｋ／Ｍ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｆ４１６Ｃ／Ｙ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ｙ４２２Ａ；Ｔ４３０Ａ；Ａ４４０Ｇ／Ｈ；Ｑ４４１Ｌ；Ａ４４４Ｌ／Ｐ；及び／又はＧ４４５Ｍ／Ｙの１つ以上を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、ａ）Ｘ２３６Ｓ及びＸ２８１Ｄ；ｂ）Ｘ２１５Ｒ及びＸ４４１Ｗ；ｃ）Ｘ３２１Ｄ及びＸ４３４Ｓ；ｄ）Ｘ１４３Ｇ及びＸ４３４Ｓ；ｅ）Ｘ０７９Ｃ及びＸ１４３Ｇ；ｆ）Ｘ３５０Ｔ及びＸ４３４Ｓ；ｇ）Ｘ３５１Ｅ及びＸ４０３Ｋ；ｈ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ０８４Ｌ；ｉ）Ｘ２４３Ｐ及びＸ２９０Ｖ；ｊ）Ｘ２９０Ｖ及びＸ３５０Ｅ；ｋ）Ｘ３０２Ｋ及びＸ４４１Ｗ；ｌ）Ｘ１５６Ｃ及びＸ４０４Ｋ；ｍ）Ｘ０６７Ｍ及びＸ４０４Ｋ；ｎ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ１４１Ｆ；ｏ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ３５１Ｅ；ｐ）Ｘ２３３Ｍ及びＸ４４５Ｙ；ｑ）Ｘ０６６Ｃ及びＸ２３３Ｍ；ｒ）Ｘ２１８Ｈ及びＸ２９０Ｖ；ｓ）Ｘ０６７Ｍ及びＸ３０２Ｈ；ｔ）Ｘ０６６Ｃ及びＸ１１９Ａ；ｕ）Ｘ２４３Ｐ及びＸ４４５Ｙ；ｖ）Ｘ１９２Ｆ及びＸ２４３Ｐ；ｗ）Ｘ１５６Ｃ及びＸ２４３Ｐ；ｘ）Ｘ０２３Ｌ及びＸ０６６Ｃ；ｙ）Ｘ０２３Ｌ－Ｘ１１９Ａ；ｚ）Ｘ０２０Ｅ及びＸ１９２Ｆ；ａａ）Ｘ１９２Ｆ及びＸ３１０Ｖ；ｂｂ）Ｘ０２３Ｍ及びＸ３０２Ｈ；ｃｃ）Ｘ１９２Ｆ及びＸ４１６Ｙ；ｄｄ）Ｘ１１９Ａ及びＸ３０２Ｈ；ｅｅ）Ｘ２３５Ｙ及びＸ４１６Ｙ；ｆｆ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ４０４Ｋ；ｇｇ）Ｘ０２３Ｍ及びＸ４４９Ｙ；ｈｈ）Ｘ１５８Ａ及びＸ１７２Ｌ；ｉｉ）Ｘ１７２Ｌ及びＸ２９０Ｖ；ｊｊ）Ｘ０２３Ｍ及びＸ２１０Ｌ；ｋｋ）Ｘ２１０Ｌ及びＸ４４９Ｙ；ｌｌ）Ｘ１５７Ｉ及びＸ２８１Ｄ；ｍｍ）Ｘ１６４Ｔ及びＸ２１５Ｒ；ｎｎ）Ｘ１４０Ｃ及びＸ４２２Ｖ；ｏｏ）Ｘ１１９Ａ及びＸ３０２Ｋ；又はｐｐ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ４１６Ｙを含む２つ以上のアミノ酸置換を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記２つ以上のアミノ酸置換は、ａ）Ｄ２３６Ｓ及びＥ２８１Ｄ；ｂ）Ｓ２１５Ｒ及びＱ４４１Ｗ；ｃ）Ｎ３２１Ｄ及びＡ４３４Ｓ；ｄ）Ａ１４３Ｇ及びＡ４３４Ｓ；ｅ）Ａ０７９Ｃ及びＡ１４３Ｇ；ｆ）Ｋ３５０Ｔ及びＡ４３４Ｓ；ｇ）Ｎ３５１Ｅ及びＱ４０３Ｋ；ｈ）Ｇ０５２Ｎ及びＩ０８４Ｌ；ｉ）Ｔ２４３Ｐ及びＦ２９０Ｖ；ｊ）Ｆ２９０Ｖ及びＫ３５０Ｅ；ｋ）Ｎ３０２Ｋ及びＱ４４１Ｗ；ｌ）Ｆ１５６Ｃ及びＹ４０４Ｋ；ｍ）Ｓ０６７Ｍ及びＹ４０４Ｋ；ｎ）Ｇ０５２Ｎ及びＬ１４１Ｆ；ｏ）Ｇ０５２Ｎ及びＮ３５１Ｅ；ｐ）Ｓ２３３Ｍ及びＧ４４５Ｙ；ｑ）Ａ０６６Ｃ及びＳ２３３Ｍ；ｒ）Ｓ２１８Ｈ及びＦ２９０Ｖ；ｓ）Ｓ０６７Ｍ及びＮ３０２Ｈ；ｔ）Ａ０６６Ｃ及びＳ１１９Ａ；ｕ）Ｔ２４３Ｐ及びＧ４４５Ｙ；ｖ）Ｙ１９２Ｆ及びＴ２４３Ｐ；ｗ）Ｆ１５６Ｃ及びＴ２４３Ｐ；ｘ）Ｅ０２３Ｌ及びＡ０６６Ｃ；ｙ）Ｅ０２３Ｌ及びＳ１１９Ａ；ｚ）Ｓ０２０Ｅ及びＹ１９２Ｆ；ａａ）Ｙ１９２Ｆ及びＮ３１０Ｖ；ｂｂ）Ｅ０２３Ｍ及びＮ３０２Ｈ；ｃｃ）Ｙ１９２Ｆ及びＦ４１６Ｙ；ｄｄ）Ｓ１１９Ａ及びＮ３０２Ｈ；ｅｅ）Ｗ２３５Ｙ及びＦ４１６Ｙ；ｆｆ）Ｇ０５２Ｎ及びＹ４０
４Ｋ；ｇｇ）Ｅ０２３Ｍ及びＦ４４９Ｙ；ｈｈ）Ｎ１５８Ａ及びＶ１７２Ｌ；ｉｉ）Ｖ１７２Ｌ及びＦ２９０Ｖ；ｊｊ）Ｅ０２３Ｍ及びＲ２１０Ｌ；ｋｋ）Ｒ２１０Ｌ及びＦ４４９Ｙ；ｌｌ）Ｔ１５７Ｉ及びＥ２８１Ｄ；ｍｍ）Ｉ１６４Ｔ及びＳ２１５Ｒ；ｎｎ）Ｍ１４０Ｃ及びＹ４２２Ｖ；ｏｏ）Ｓ１１９Ａ及びＮ３０２Ｋ；又はｐｐ）Ｇ０５２Ｎ及びＦ４１６Ｙを含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、ａ）Ｘ１４１Ｆ、Ｘ２８１Ｄ、及びＸ４４１Ｗ；ｂ）Ｘ１４３Ｇ、Ｘ３２１Ｄ、及びＸ４３４Ｓ；ｃ）Ｘ３２１Ｄ、Ｘ３５０Ｔ、及びＸ４３４Ｓ；ｄ）Ｘ０６７Ｍ、Ｘ１５８Ａ、及びＸ２８１Ｄ；ｅ）Ｘ１５６Ｃ、Ｘ１９２Ｆ、及びＸ４０３Ｋ；ｆ）Ｘ０５２Ｎ、Ｘ１４０Ｃ、及びＸ４２２Ｖ；ｇ）Ｘ０６６Ｃ、Ｘ１１９Ａ、及びＸ１６４Ｔ；ｈ）Ｘ０６６Ｃ、Ｘ２３３Ｍ、及びＸ４４５Ｙ；ｉ）Ｘ１５６Ｃ、Ｘ１９２Ｆ、及びＸ２４３Ｐ；ｊ）Ｘ０２３Ｌ、Ｘ０６６Ｃ、及びＸ１１９Ａ；ｋ）Ｘ０２３Ｍ、Ｘ１１９Ａ、及びＸ４０４Ｋ；ｌ）Ｘ３１０Ｖ、Ｘ４１６Ｙ、及びＸ４４５Ｙ；ｍ）Ｘ１５８Ａ、Ｘ２２１Ｒ、及びＸ２９０Ｖ；ｎ）Ｘ０２３Ｍ、Ｘ０５２Ｎ、及びＸ４０４Ｋ；ｏ）Ｘ０８１Ｓ、Ｘ１５７Ｉ、及びＸ２３６Ｓ；ｐ）Ｘ２４３Ｐ、Ｘ３０２Ｋ、及びＸ４１６Ｙ；ｑ）Ｘ１４０Ｃ、Ｘ３０２Ｋ、及びＸ４２２Ｖ；又はｒ）Ｘ０５２Ｎ、Ｘ４１６Ｙ、及びＸ４４５Ｙを含む３つ以上のアミノ酸置換を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記３つ以上アミノ酸置換は、ａ）Ｌ１４１Ｆ、Ｅ２８１Ｄ、及びＱ４４１Ｗ；ｂ）Ａ１４３Ｇ、Ｎ３２１Ｄ、及びＡ４３４Ｓ；ｃ）Ｎ３２１Ｄ、Ｋ３５０Ｔ、及びＡ４３４Ｓ；ｄ）Ｓ０６７Ｍ、Ｎ１５８Ａ、及びＥ２８１Ｄ；ｅ）Ｆ１５６Ｃ、Ｙ１９２Ｆ、及びＱ４０３Ｋ；ｆ）Ｇ０５２Ｎ、Ｍ１４０Ｃ、及びＹ４２２Ｖ；ｇ）Ａ０６６Ｃ、Ｓ１１９Ａ、及びＩ１６４Ｔ；ｈ）Ａ０６６Ｃ、Ｓ２３３Ｍ、及びＧ４４５Ｙ；ｉ）Ｆ１５６Ｃ、Ｙ１９２Ｆ、及びＴ２４３Ｐ；ｊ）Ｅ０２３Ｌ、Ａ０６６Ｃ、及びＳ１１９Ａ；ｋ）Ｅ０２３Ｍ、Ｓ１１９Ａ、及びＹ４０４Ｋ；ｌ）Ｎ３１０Ｖ、Ｆ４１６Ｙ、及びＧ４４５Ｙ；ｍ）Ｎ１５８Ａ、Ｓ２２１Ｒ、及びＦ２９０Ｖ；ｎ）Ｅ０２３Ｍ、Ｇ０５２Ｎ、及びＹ４０４Ｋ；ｏ）Ｄ０８１Ｓ、Ｔ１５７Ｉ、及びＤ２３６Ｓ；ｐ）Ｔ２４３Ｐ、Ｎ３０２Ｋ、及びＦ４１６Ｙ；ｑ）Ｍ１４０Ｃ、Ｎ３０２Ｋ、及びＹ４２２Ｖ；又はｒ）Ｇ０５２Ｎ、Ｆ４１６Ｙ、及びＧ４４５Ｙを含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、ａ）Ｘ２１５Ｒ、Ｘ２３６Ｓ、Ｘ２８１Ｄ、及びＸ４４１Ｗ；ｂ）Ｘ０５２Ｎ、Ｘ０８４Ｌ、Ｘ１４０Ｃ、及びＸ４２２Ｖ；ｃ）Ｘ０２０Ｅ、Ｘ１５６Ｃ、Ｘ１９２Ｆ、及びＸ２４３Ｐ；ｄ）Ｘ０２３Ｍ、Ｘ２２１Ｒ、及びＸ４０４Ｋ；ｅ）Ｘ１５８Ａ、Ｘ１７２Ｌ、Ｘ２２１Ｒ、及びＸ２９０Ｖ；ｆ）Ｘ１４０Ｃ、Ｘ１６５Ｗ、Ｘ３０２Ｋ、及びＸ４２２Ｖ；又はｇ）Ｘ１１９Ａ、Ｘ２５３Ｆ、Ｘ３１０Ｖ、及びＸ４０３Ｋを含む４つ以上のアミノ酸置換を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記４つ以上アミノ酸置換は、ａ）Ｓ２１５Ｒ、Ｄ２３６Ｓ、Ｅ２８１Ｄ、及びＱ４４１Ｗ；ｂ）Ｇ０５２Ｎ、Ｉ０８４Ｌ、Ｍ１４０Ｃ、及びＹ４２２Ｖ；ｃ）Ｓ０２０Ｅ、Ｆ１５６Ｃ、Ｙ１９２Ｆ、及びＴ２４３Ｐ；ｄ）Ｅ０２３Ｍ、Ｓ１１９Ａ、Ｓ２２１Ｒ、及びＹ４０４Ｋ；ｅ）Ｎ１５８Ａ、Ｖ１７２Ｌ、Ｓ２２１Ｒ、及びＦ２９０Ｖ；ｆ）Ｍ１４０Ｃ、Ｙ１６５Ｗ、Ｎ３０２Ｋ、及びＹ４２２Ｖ；又はｇ）Ｓ１１９Ａ、Ｅ２５３Ｆ、Ｎ３１０Ｖ、及びＱ４０３Ｋを含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、Ｘ０６７Ｍ、Ｘ１５７Ｉ、Ｘ２１８Ｈ、Ｘ３０２Ｈ、及びＸ４１６Ｙを含む５つ以上のアミノ酸置換を含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記５つ以上アミノ酸置換は、Ｓ０６７Ｍ、Ｔ１５７Ｉ、Ｓ２１８Ｈ、Ｎ３０２Ｈ、及びＦ４１６Ｙを含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントグルコアミラーゼは、当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較した、ｉ）マルトースの加水分解の向上；ｉｉ）パノースの加水分解の向上；ｉｉｉ）プルランの加水分解の向上；ｉｖ）可溶性デンプンの糖化のより高いＰＩ（すなわち、可溶性デンプン又はその断片の加水分解の向上）；ｖ）マルトデキストリンの加水分解の向上；ｖｉ）熱安定性の向上；ｖｉｉ）ＤＰが２以上の糖へのより少ない転換；及び／又はｖｉｉｉ）グルコースの糖化収率の向上の１つ以上を示す。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記バリアントは、配列番号３、配列番号４の位置ａ）６６、６７、及び６９；ｂ）１０２、１１９、及び１２１；並びに／若しくはｃ）１４３、１５６、１６４、１９２、及び２３３に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片内の等価の位置にて置換を含む。一部の実施形態において、前記バリアントは、ａ）Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ、Ｘ０６７Ａ／Ｃ／Ｍ、及びＸ０６９Ａ／Ｃ／Ｋ；ｂ）Ｘ１０２Ｐ／Ｇ、Ｘ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ、Ｘ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ；並びに／又はｃ）Ｘ１４３Ｇ、Ｘ１５６Ｃ／Ｐ、Ｘ１６４Ｌ／Ｔ、Ｘ１９２Ｆ／Ｒ、及びＸ２３３Ｍ／ＰＴ／Ｙを含むアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、前記バリアントは、ａ）Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ、Ｓ０６７Ａ／Ｃ／Ｍ、及びＶ０６９Ａ／Ｃ／Ｋ；ｂ）Ｓ１０２Ｐ／Ｇ、Ｓ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ、Ｔ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｖ；並びに／又はｃ）Ａ１４３Ｇ、Ｆ１５６Ｃ／Ｐ、Ｉ１６４Ｌ／Ｔ、Ｙ１９２Ｆ／Ｒ、及びＳ２３３Ｍ／ＰＴ／Ｙを含むアミノ酸置換を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、グルコアミラーゼバリアントはさらに、配列番号４の位置６６及び／若しくは１０２、並びに／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応する１つ以上の残基位置にてアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ及び／又はＸ１０２Ｐ／Ｇを含み、Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ及び／又はＳ１０２Ｐ／Ｇを含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、グルコアミラーゼバリアントは、配列番号４の位置Ｎ０７５及び／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にてＮ結合グリコシル化を含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、グルコアミラーゼバリアントはさらに、配列番号４の位置８１、８３、１５３、３７０、若しくは３７２に対応する残基位置及び／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にて１つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントグルコアミラーゼは、当該置換の１つ以上を欠いている親グルコアミラーゼと比較した、グリコシル化の増大及び熱安定性の増大を示す。一部の実施形態において、前記１つ以上の置換は、位置Ｄ８１Ｎ、Ｋ８３Ｔ、Ａ１５３Ｔ、Ｓ３７０Ｎ、及び／又はＡ３７２Ｓにて１つ以上の置換を含む。

【0011】

他の態様において、本明細書中で提供されるのは、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドである。

【0012】

別の態様において、本明細書中で提供されるのは、本明細書中で開示されるポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターである。

【0013】

更なる態様において、本明細書中で提供されるのは、本明細書中で開示されるポリヌクレオチドのいずれか、又は本明細書中で開示されるベクターのいずれかを含む宿主細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、細菌宿主細胞又は真菌宿主細胞である。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、宿主細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属種、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属種、又はサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種である。

【0014】

他の態様において、本明細書中で提供されるのは、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントのいずれかを含む酵素組成物である。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記組成物は、デンプン転化プロセスに用いられる。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記組成物は、動物飼料製剤に用いられる。本明細書で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記組成物は、アルコール発酵プロセスに用いられる。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、前記組成物は、発酵飲料を製造するためのプロセスに用いられる。

【0015】

更なる追加の態様において、本明細書中で提供されるのは、宿主細胞においてバリアントグルコアミラーゼを生成する方法であって、ａ）本明細書中で開示されるベクターのいずれかにより形質転換した宿主細胞を、培養培地中で、前記グルコアミラーゼバリアントの生成に適した条件の下で培養することと；ｂ）前記バリアントを生成することとを含む方法である。一部の実施形態において、方法はさらに、前記培養培地からグルコアミラーゼバリアントを回収することを含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、宿主細胞は、細菌宿主細胞又は真菌宿主細胞である。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、宿主細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属種、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属種、又はサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種である。

【0016】

別の態様において、本明細書中で提供されるのは、デンプンを含む組成物を糖化して、グルコースを含む組成物を生成する方法であって： ａ）デンプン組成物を、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントポリペプチドのいずれかと接触させることと；ｂ）デンプン組成物を糖化して、前記グルコース組成物を生成することとを含む方法である。一部の実施形態において、デンプンを含む前記組成物は、液化デンプン、ゼラチン化デンプン、又は顆粒状デンプンを含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、当該方法はさらに、ｃ）デンプン組成物をアルファ－アミラーゼと接触させることを含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、当該方法はさらに、ｄ）デンプン組成物をプルラナーゼと接触させることを含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、当該方法はさらに、ｅ）グルコース組成物を発酵させて、発酵産物を生成することを含む。一部の実施形態において、発酵産物はアルコールである。一部の実施形態において、アルコールは、エタノール又はブタノールである。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、当該方法はさらに、ｆ）追加のグルコアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、β－アミラーゼ、追加のα－アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、ベータ－グルコシダーゼ、リアーゼ、ヒドロラーゼ、又はそれらの組合せの１つ以上を、前記デンプン組成物に加えることを含む。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の実施形態において、発酵は、同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応である。

【0017】

本明細書中に記載される態様及び実施形態は各々、その実施形態又は態様の状況から明示的又は明確に排除されない限り、一緒に用いることができる。

【0018】

本明細書の全体を通して、種々の特許、特許出願、及び他のタイプの刊行物（例えば、学術論文、電子データベース入力等）が参照される。本明細書中で引用される全ての特許、特許出願、及び他の刊行物の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群グルコアミラーゼの多重アミノ酸配列アラインメントを示す。

【0020】

【図2】予測される成熟ケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群グルコアミラーゼ及び他の真菌グルコアミラーゼの系統図を示す。

【0021】

【図3】ＳｖａＧＡ１ｖ２について決定したＸ線回折構造に基づくＡｓｎ７５グリコシル化の部位にて示される電子密度（２ｆｏ－ｆｃ）の画像を示す。

【0022】

【図4】ＳｖａＧＡ１ｖ２について決定したＸ線回折構造に基づく、残基Ａｓｎ７５のグリカン鎖の、タンパク質との相互作用の画像を示す。水素結合相互作用（＜３．３Å）を破線により示す。

【0023】

【図5】濃い灰色で強調するのは、ＳｖａＧＡ１ｖ２について決定したＸ線回折構造に基づく、保存Ａｓｐ６３側鎖、並びに位置６６、６７、及び６９の性能向上変異を含有するヘリックスである画像を示す。

【0024】

【図6】黒色で強調するのは、ＳｖａＧＡ１ｖ２について決定したＸ線回折構造に基づく、残基１００～１２９のループ、予想される一般的な酸残基、保存Ａｓｐ側鎖、及び性能向上変異のアミノ酸位置である画像を示す。

【0025】

【図7】ＳｖａＧＡ１ｖ２について決定したＸ線回折構造に基づいて、残基Ａｓｎ７５のグリカン鎖と会合した４つのヘリックス束を、濃い灰色で強調している一方、いくつかの性能向上変異のアミノ酸位置を、黒色の球体で示す画像を示す。Ａｓｎ７５グリカンを、黒色に着色した棒モデルで示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本開示は、組換え宿主細胞、グルコアミラーゼを含む組成物、及びグルコアミラーゼを用いてデンプン基質を糖化する方法に関する。さらに、本開示はまた、発酵産物を生成するプロセス及び動物におけるデンプン消化率を増大させる方法、並びに発酵飲料を製造する方法に関する。

【0027】

Ｉ．定義
本組成物及び方法を詳細に説明する前に、以下の用語及び略語を定義する。

【0028】

別段の定義がされてない限り、用いられる全ての技術用語及び科学用語は、関連する科学分野における通常の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｋｈａｍ，Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本発明を説明する用語の多くの通常の意味を提供する。

【0029】

用語「グルコアミラーゼ（１，４－アルファ－Ｄ－グルカングルコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．３）活性」は、本明細書中で、デンプン又は関連するオリゴ糖分子及び多糖分子の非還元末端からのＤ－グルコースの放出を触媒する酵素活性として定義される。

【0030】

本明細書中で用いられる用語「グルコアミラーゼバリアント」は、所定の親グルコアミラーゼアミノ酸配列において少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個）のアミノ酸置換を有する、天然に存在しないグルコアミラーゼを意味する。

【0031】

ポリペプチド（グルコアミラーゼ等）に関連する用語「野生型」は、１つ以上のアミノ酸位置にて人為的な置換、挿入、又は欠失を含まない、天然に存在するポリペプチドを指す。しかしながら、別の実施形態において、野生型グルコアミラーゼの非限定の例として、配列番号４～３７が挙げられる。

【0032】

用語、ポリペプチド（グルコアミラーゼ等）に関連する「親」、「親の」、又は「参照」は、野生型ポリペプチドを指し得、又は１つ以上のアミノ酸置換が導入されたポリペプチドであって、その後、更なるアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個のアミノ酸置換）を有したポリペプチドの性能特性を比較するために参照として用いられる、１つ以上のアミノ酸置換が導入されたポリペプチドを指し得る。一部の実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号２、３、５、又は６である。他の実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号４～３７である。

【0033】

用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」と同義語であり、互換的に用いられる。そのようなアミノ酸配列は、活性を示す場合、「酵素」と呼ばれ得る。アミノ酸残基について従来の１文字コード又は３文字コードが用いられ、アミノ酸配列は、標準のアミノからカルボキシ末端方向（すなわち、Ｎ→Ｃ）で表される。

【0034】

用語「成熟ポリペプチド」は、本明細書中で、翻訳及び任意の翻訳後修飾（Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端トランケーション、グリコシル化、リン酸化等）後のその最終形態にあるポリペプチドと定義される。一態様において、予測される成熟ポリペプチドは、ＳｉｇｎａｌＰソフトウェアバージョン４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：７８５－７８６）の分析に基づく配列番号４である。別の態様において、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置２０～４６８を含む。別の態様において、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置２１～４６８を含む。別の態様において、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置２２～４６８を含む。別の態様において、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置２３～４６８を含む。別の態様において、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置２４～４６８を含む。別の態様において、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置２５～４６８を含む。

【0035】

「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、細胞の外部へのタンパク質の分泌を促進する、タンパク質のＮ末端部分に付着しているアミノ酸の配列である。細胞外タンパク質の成熟形態は、分泌プロセス中に切断して除かれるシグナル配列が欠如している。一部の実施形態において、配列番号３４は、シグナルペプチドである。他の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置１～２０を含む。他の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置１～２１を含む。他の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置１～２２を含む。他の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置１～２３を含む。他の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置１～２４を含む。

【0036】

用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドをコードすることができるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖、及び合成分子を包含するのに交換可能に用いることができる。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、化学的に修飾されていてもよい。遺伝暗号が縮重しているため、特定のアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンを使用することができ、本発明の組成物及び方法は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。特に明記しない限り、核酸配列は、５’－から－３’の方向に表示される。

【0037】

用語「コード配列」は、ポリヌクレオチド配列であって、当該ポリヌクレオチド配列のタンパク質産物のアミノ酸配列を直接指定するポリヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定され、当該オープンリーディングフレームは、通常、ＡＴＧ開始コドン又は代替開始コドン（ＧＴＧ及びＴＴＧ等）で始まり、そして終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ等）で終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ヌクレオチド配列、又は組換えヌクレオチド配列であり得る。

【0038】

用語「ｃＤＮＡ」は、本明細書中で、真核細胞から得られるスプライシングされた成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写によって調製することができるＤＮＡ分子として定義される。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次ＲＮＡ転写産物は、スプライシングされた成熟ｍＲＮＡとして現れる前の一連の工程を通してプロセシングされるｍＲＮＡの前駆体である。これらの工程には、スプライシングと呼ばれるプロセスによるイントロン配列の除去が含まれる。したがって、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡは、いかなるイントロン配列も欠いている。

【0039】

「合成」分子は、生物によってではなくインビトロ化学合成又は酵素合成によって生成される。

【0040】

「宿主株」又は「宿主細胞」とは、関心対象のポリペプチド（例えばグルコアミラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ファージ、ウイルス、又は他のＤＮＡ構築物が導入された生物である。例示的な宿主株は、関心対象のポリペプチドを発現し、且つ／又は糖を発酵させることができる微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌、及び酵母）である。用語「宿主細胞」は、細胞から作出されたプロトプラストを含む。

【0041】

本明細書中で用いられる用語「グリコシル化」は、グリカンの、分子、例えばタンパク質、例えばバリアントグルコアミラーゼへの付着を指す。グリコシル化は、酵素反応であり得る。形成された付着は、共有結合を介したものであり得る。フレーズ「高度にグリコシル化された」は、多くの部位において、そして全て又はほぼ全ての利用可能なグリコシル化部位、例えばＮ結合グリコシル化部位にてグリコシル化されている酵素等の分子を指す。代わりに、又は加えて、フレーズ「高度にグリコシル化された」は、全て又は実質的に全てのＮ結合グリコシル化部位にて広範な解糖分岐（特定のＮ結合グリコシル化部位と会合した解糖部分のサイズ及び数等）を指し得る。一部の実施形態において、操作されたグルコアミラーゼポリペプチドは、全て又は実質的に全てのコンセンサスＮ結合グリコシル化部位（すなわち、ＮＸＳ／ＴコンセンサスＮ結合グリコシル化部位（Ｘは、プロリン以外のあらゆるアミノ酸である））にてグリコシル化されている。グルコアミラーゼは、種々の程度のグリコシル化を有し得る。そのようなグリコシル化は、貯蔵中及び使用中の安定性を向上させ得ることが知られている。更なる実施形態において、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上）のコンセンサスＮ結合グリコシル化部位（すなわち、ＮＸＳ／ＴコンセンサスＮ結合グリコシル化部位（Ｘは、プロリン以外のあらゆるアミノ酸である））は、例えば、限定されないが、熱安定性、活性、又は糖化収率を向上させるといった、グルコアミラーゼの１つ以上の性質を向上させるために、グルコアミラーゼ（バリアントグルコアミラーゼ等）中に導入することができる。

【0042】

本明細書中で用いられる用語「グリカン」は、多糖若しくはオリゴ糖、又は糖タンパク質等の複合糖質の炭水化物部分を指す。グリカンは、単糖残基のホモポリマー又はヘテロポリマーであり得る。それらは、直鎖分子又は分岐分子であり得る。

【0043】

用語「発現」は、核酸配列に基づいてポリペプチドが生成されるプロセスを指す。当該プロセスは、転写及び翻訳の双方を含む。

【0044】

用語「ベクター」は、核酸を１種以上の細胞型中に導入するように設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターとして、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等が挙げられる。

【0045】

「発現ベクター」は、適切な宿主中でＤＮＡの発現を生じさせることができる適切な制御配列にコード配列が作動可能に連結されている関心対象のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を指す。そのような制御配列として、転写を生じさせるプロモータ、転写を制御する任意選択のオペレータ配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサ、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列が挙げられ得る。

【0046】

用語「制御配列」は、本明細書中で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての構成要素を含むものであると定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して在来若しくは外来であり得るか、又は互いに在来若しくは外来であり得る。そのような制御配列として、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネータが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列として、プロモータ、並びに転写停止シグナル及び翻訳停止シグナルが挙げられる。制御配列には、制御配列の、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域とのライゲーションを促進する特定の制限部位を導入する目的で、リンカーが提供され得る。

【0047】

用語「作動可能に連結された」は、特定の構成要素が、意図されるように機能することを許容する関係（並列が挙げられるが、これに限定されない）にあることを意味する。例えば、調節配列は、コード配列に、コード配列の発現が調節配列の制御下にあるように作動可能に連結されている。

【0048】

用語「配列モチーフ」は、幅広く広がっており、且つ生物学的有意性を有することが証明されているか、又は推定されるヌクレオチド配列パターン又はアミノ酸配列パターンである。本発明では、配列モチーフは、ケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群グルコアミラーゼ内で特定されたアミノ酸配列モチーフである。

【0049】

「生物学的に活性な」は、酵素活性等の特定の生物活性を有する配列を指す。

【0050】

用語「比活性」は、特定の条件下で、単位時間あたりで酵素又は酵素調製物によって生成物に変換させることのできる基質のモル数を指す。比活性は、一般に、単位数（Ｕ）／タンパク質ｍｇとして表される。

【0051】

本明細書中で用いられる用語「配列同一性」は、２つのポリペプチド配列間又は２つの核酸配列間の配列同一性のパーセンテージを指す。２つのアミノ酸配列の、又は２つの核酸配列の同一性パーセントを判定するために、配列は、最適な比較を目的にアラインされる（例えば、ギャップを、第１のアミノ酸配列又は核酸配列内に、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアラインメントのために導入することができる）。続いて、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有される場合、分子は、当該位置にて同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、当該配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の重なり合う位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態において、２つの配列は、同じ長さである。また、２つの配列間の同一性パーセントの判定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学アルゴリズムの好ましい非限定の例が、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４－２２６８のアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５８７７におけるように改変）である。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定したＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータにより実行して、本出願の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、例えば、スコア－５０、ワード長＝３に設定したＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータにより実行して、本明細書中に記載されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的にギャップ入りアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されるように利用することができる。これ以外にも、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係（Ｉｄ．）を検出する繰返し検索を実行することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴの）デフォルトパラメータを用いることができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照）。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の好ましい非限定の例として、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するのにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を用いることができる。タンパク質配列の多重アラインメントを作成するのに用いることができる別のコンピュータプログラムとして、ＭＵＳＣＬＥがある。ＭＵＳＣＬＥアルゴリズムの要素として、ｋマーカウンティングを用いるファストディスタンス推定、対数期待スコアと言われる新しいプロファイル関数を用いるプログレッシブアラインメント、及びツリー依存性制限パーティショニングを用いるリファインメントが挙げられる。このプログラムは、ＭＵＳＣＬＥ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：１７９２－１７９７中で公開されるＲｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｅｄｇａｒ（２００４）による、高精度且つ高スループットの多重配列アラインメント に記載されている。２つの配列間の同一性パーセントを、ギャップを許容する、又はしない、上述のものに類似した技術を用いて判定することができる。同一性パーセントを算出する際に、典型的には、完全一致のみをカウントする。

【0052】

用語「相同配列」は、本明細書中で、グルコアミラーゼ、例えば配列番号４のグルコアミラーゼによるｔｆａｓｔｙサーチ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，１９９９，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓ．Ｍｉｓｅｎｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｋｒａｗｅｔｚ，ｅｄ．，ｐｐ．１８５－２１９）において、Ｅ値（又は期待スコア）が０．００１未満である予測タンパク質と定義される。

【0053】

本明細書中で用いられる「等価の位置」は、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列の、グルコアミラーゼバリアントとのアラインメント、及び親グルコアミラーゼの三次元構造の、三次元空間のバリアントグルコアミラーゼのものとのアラインメントに基づく、２つのアミノ酸配列に共通である位置を意味する。

【0054】

アミノ酸残基の位置に関連して本明細書中で用いられる「に対応している」又は「に対応する」又は「対応する」は、タンパク質若しくはペプチド中の列挙される位置のアミノ酸残基、又はタンパク質若しくはペプチド中の列挙される残基と類似の、相同の、若しくは等価のアミノ酸残基を指す。本明細書中で用いられる「対応する領域」は、一般に、関連タンパク質又は参照タンパク質における類似の位置を指す。

【0055】

本明細書中で用いられる「性能指数」又は「ＰＩ」は、親分子と比較した、酵素の単位あたりの計算された活性を指す。本明細書中で開示される実施形態のいずれかの一部の態様において、性能指数の計算に用いられる親分子は、グルコアミラーゼである。一部の実施形態において、親分子は、定義によって、性能指数が１である。他の実施形態において、１を超える性能指数（ＰＩ＞１．０）は、親分子と比較した、グルコアミラーゼバリアントの活性の向上を示す。

【0056】

本明細書中で用いられる「転換糖」は、（本明細書中で「転換」と定義されるプロセスにおいて）単糖が、触媒（例えば酸）の存在下で、別の単糖（時折、二糖）と縮合して、オリゴ糖、例えば、（主に）二糖又は（稀に）三糖を形成する場合に形成される糖である。結果として、多くの場合、転換糖は、元々のデンプン組成物内に存在しない結合リンケージを有する。転換糖の例として、例えば、キシロビオース（（１，１）、（１，２）、（１，３）、及び（１，４）－結合キシロビオースのα形態及びβ形態の双方）、Ｏ－α－Ｄ－キシロピラノシル－α－Ｄ－キシロピラノシド、３－Ｏ－α－Ｄ－キシロピラノシル－Ｄ－キシロース、２－Ｏ－α－Ｄ－キシロピラノシル－Ｄ－キシロース、４－Ｏ－α－Ｄ－キシロピラノシル－Ｄ－キシロース、マルトース、イソマルトース、セロビオース、ゲンチオビオース、１，６－アンヒドロ－β－Ｄ－グルコフラノース、コージビオース、ソホロース、ニゲロース、ラミナラビオース（ｌａｍｉｎａｒａｂｉｏｓｅ）、及びそれらのあらゆる組合せが挙げられる。転換糖は典型的に非発酵性であるので、糖化反応の廃棄物と考えられる。

【0057】

フレーズ「同時糖化発酵（ＳＳＦ）」は、微生物、例えばエタノール生産微生物、及び少なくとも１種の酵素、例えばアミラーゼが、同じプロセス工程中に存在する、生化学物質の生成におけるプロセスを指す。ＳＳＦとして、同じ反応容器内での、（粒状、液化、又は可溶化）デンプン基質の、グルコースが挙げられる糖への同時性の加水分解、及び糖の、アルコール又は他の生化学物質若しくは生体物質への発酵が挙げられる。

【0058】

「スラリー」とは、水中に不溶性デンプン顆粒を含有する水性混合物である。

【0059】

用語「総糖含量」は、単糖、オリゴ糖、及び多糖が挙げられるデンプン組成物中に存在する総可溶性糖含量を指す。

【0060】

用語「乾燥固体」（ｄｓ）は、水中に溶解した乾燥固体、水中に分散した乾燥固体、又は双方の組合せを指す。ゆえに、乾燥固体として、顆粒状デンプン、及びその加水分解生成物（グルコースが挙げられる）が挙げられる。

【0061】

用語「高ＤＳ」は、乾燥固体含量が３８％（ｗｔ／ｗｔ）を超える水性デンプンスラリーを指す。

【0062】

「重合度（ＤＰ）」は、所定の糖中のアンヒドログルコピラノース単位数（ｎ）を指す。ＤＰ１の例として、グルコース及びフルクトース等の単糖がある。ＤＰ２の例として、マルトース及びスクロース等の二糖がある。ＤＰ４＋（＞ＤＰ３）は、重合度が３を超えるポリマーを意味する。

【0063】

用語「接触」は、基質に作用する酵素又は基質を発酵させる発酵生物等の、期待される結果に影響を及ぼすほど十分に近接した、参照される構成要素（酵素、基質、及び発酵生物が挙げられるが、これらに限定されない）の配置を指す。

【0064】

本明細書中で用いられる用語「酵母細胞」、「酵母菌株」、又は単純に「酵母」は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門及び担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門由来の生物を指す。例示的な酵母は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目由来の出芽酵母である。酵母の特定の例として、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種があり、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるがこれに限定されない。酵母として、燃料アルコールの生成に用いられる生物、及び飲料アルコールの生成に用いられる生物が挙げられ、特徴的なテイストのビール、ワイン、及びその他の発酵飲料を製造するのに用いられる特殊且つ自社所有の酵母菌株が挙げられる。

【0065】

「エタノール生産微生物」は、糖又は他の炭水化物をエタノールに変換させる能力を備える微生物を指す。

【0066】

用語「生化学物質」は、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタ－ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、オメガ３脂肪酸、ブタノール、イソ－ブタノール、アミノ酸、リシン、イタコン酸、他の有機酸、１，３－プロパンジオール、ビタミン、若しくはイソプレン、又は他の生体材料等の微生物の代謝産物を指す。

【0067】

脱分岐酵素（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１、プルラン６－グルカノヒドロラーゼ）とも呼ばれる用語「プルラナーゼ」は、アミロペクチン分子中のアルファ１－６グルコシド結合を加水分解することができる。

【0068】

本明細書中で、ある特定の範囲が、用語「約」によって先行される数値により示される。用語「約」は、本明細書中で、これが先行する正確な数、並びに当該用語が先行する数に近いか、又は近似する数についての文字通りの支持（ｌｉｔｅｒａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ）を提供するのに用いられる。ある数が、具体的に列挙された数に近い数又は近似的な数であるかの判定では、列挙されていない近い数又は近似的な数は、これが示されている文脈において、具体的に列挙される数の実質的な均等物を提供する数であり得る。例えば、ある数値に関して、用語「約」は、当該用語が文脈において別途明確に定義されていない限り、当該数値の－１５％～＋１５％の範囲を指す。

【0069】

本明細書で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈において特に明示的に示されていない限り、複数の指示対象を含む。

【0070】

特許請求の範囲は、任意選択のいかなる要素も排除するように記載され得ることにもさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素を列挙するか、又は「消極的な」限定を用いる状況において、「唯一の（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」等の排他的な術語の使用の先行詞（ａｎｔｅｃｅｄｅｎｔ ｂａｓｉｓ）としての役目を果たすことが意図されている。

【0071】

用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及びその同種の語は、その包括的な意味で用いられる。すなわち、用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及びその対応する同種の語と等価である。さらに、本明細書中で用いられる用語「を含む」は、用語「を含む」の前の構成要素を含むが、これに限定されないことを意味することに留意されたい。用語「を含む」の前の構成要素は、必要とされるか、又は必須であるが、当該構成要素を含む組成物は、他の非必須又は任意選択の構成要素をさらに含み得る。

【0072】

本明細書中で用いられる用語「から本質的になる」は、当該用語の前の構成要素が、総組成物の３０重量％未満の総量で、他の知られている構成要素の存在下にあり、そして当該構成要素の作用又は活性に寄与も干渉もしない組成物を指すことにも留意されたい。

【0073】

本明細書中で用いられる用語「からなる」は、用語「からなる」の前の構成要素を含み、且つこれに限定されることを意味することにも留意されたい。したがって、用語「からなる」の前の構成要素は、必要とされるか、又は必須であり、且つ他の構成要素は、その組成物中に存在しない。

【0074】

本明細書の全体を通して示される個々の上限のあらゆる数値は、より低い数値の全ての限界を、そのようなより低い数値の限界が、本明細書中に明示されているかの如く含むことが意図されている。本明細書の全体を通して示される個々の下限のあらゆる数値は、より高い数値の全ての限界を、そのようなより高い数値の限界が、本明細書中に明示されているかの如く含む。本明細書の全体を通して示される全ての数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入るより狭い全ての数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲が、本明細書中に全て明示されているかの如く含む。

【0075】

本明細書において別途定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

【0076】

本明細書の全体を通して、用語の他の定義が出現する場合がある。

【0077】

ＩＩ．グルコアミラーゼ活性を有するバリアントポリペプチド
第１の態様において、本発明は、グルコアミラーゼ活性を有し、且つ少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、表１に示される置換のいずれか）を有する、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、又は３７のポリペプチドとの好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、そしてさらには少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントポリペプチドに関する。別の態様において、本明細書中で提供されるのは、配列番号２のアミノ酸位置２０～４６８、配列番号２のアミノ酸位置２１～４６８、配列番号２のアミノ酸位置２２～４６８、配列番号２のアミノ酸位置２３～４６８、アミノ酸配列２のアミノ酸位置２４～４６８、又は配列番号２のアミノ酸位置２５～４６８を含むポリペプチドとの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、そしてさらには少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

【0078】

一部の実施形態において、バリアントポリペプチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、又は３７のポリペプチドとの少なくとも６０％且つ１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置２０～４６８、配列番号２のアミノ酸位置２１～４６８、配列番号２のアミノ酸位置２２～４６８、配列番号２のアミノ酸位置２３～４６８、配列番号２のアミノ酸位置２４～４６８、又は配列番号２のアミノ酸位置２５～４６８を含むポリペプチドとの少なくとも６０％且つ１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、天然に存在しない（すなわち、自然界に発生せず、且つ人間の独創性の産物である）。

【0079】

一部の実施形態において、本発明のグルコアミラーゼバリアントポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド、配列番号３のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、配列番号５～３７のポリペプチドのいずれか１つ、配列番号２のアミノ酸位置２０～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２１～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２２～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２３～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２４～４６８を含むポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸位置２５～４６８を含むポリペプチドと、１０個以下のアミノ酸、９つ以下のアミノ酸、８つ以下のアミノ酸、７つ以下のアミノ酸、６つ以下のアミノ酸、５つ以下のアミノ酸、４つ以下のアミノ酸、３つ以下のアミノ酸、２つ以下のアミノ酸、そしてさらに１つ以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む相同ポリペプチドである。

【0080】

一部の実施形態において、本発明のバリアントポリペプチドは、ＣｌｕｓｔａｌＸ Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｓｅｃｕｒｅ：／／ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１７８４６０３６によって予測された、配列番号４のアミノ酸１８～４４９を含む触媒領域である。

【0081】

一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、プルラン及び／又はパノース及び／又はマルトデキストリン加水分解活性を有する。

【0082】

別の態様において、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントは、一部の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号５～３７のアミノ酸配列のいずれか１つ、配列番号２のアミノ酸位置２０～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２１～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２２～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２３～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２４～４６８を含むポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸位置２５～４６８を含むポリペプチドと比較して、１つ又はいくつかのアミノ酸残基の保存的置換を含み得る。典型的な保存的アミノ酸置換が、以下に列挙される。保存的置換（すなわち、変異）は、遺伝子操作によって作製され得るものもあるが、他の手段によって合成アミノ酸をポリペプチド中に導入することによって作製されるものもある。

【0083】

一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、グルコアミラーゼ活性を有する、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、若しくは３７のポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２０～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２１～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２２～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２３～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２４～４６８を含むポリペプチド、若しくは配列番号２のアミノ酸位置２５～４６８を含むポリペプチド、又はその断片のバリアントである。バリアントグルコアミラーゼは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、若しくは３７のアミノ酸配列、又はその相同配列と比較して、１つ以上のアミノ酸残基の欠失、置換（例えば、表１に示すアミノ酸置換のいずれか）、挿入、又は付加を含み得る。全ての場合において、表現「１つ以上のアミノ酸残基」は、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、又は５０個以上、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、又はそれを超えるアミノ酸残基を指す。配列番号２のポリペプチド、配列番号３のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、配列番号５～３７のポリペプチドのいずれか１つ、配列番号２のアミノ酸位置２０～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２１～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２２～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２３～４６８を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸位置２４～４６８を含むポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸位置２５～４６８を含むポリペプチドのアミノ酸置換（例えば、表１に示すアミノ酸置換のいずれか）、欠失、及び／又は挿入は、多くとも５０個、多くとも４０個、多くとも３０個、多くとも２０個、多くとも１９個、多くとも１８個、多くとも１７個、多くとも１６個、多くとも１５個、多くとも１４個、多くとも１３個、多くとも１２個、多くとも１１個、多くとも１０個、多くとも９つ、多くとも８つ、多くとも７つ、多くとも６つ、多くとも５つ、多くとも４つ、多くとも３つ、多くとも２つ、そしてさらに多くとも１つであり得る。

【0084】

一部の実施形態において、バリアント変更は、配列番号４のポリペプチドの位置１０２に対応する位置での、又は配列番号５～３７のいずれか１つの対応する位置での置換を含むか、又はこれからなる。一部の実施形態において、配列番号４のポリペプチドの位置１０２に対応する位置の、又は配列番号５～３７のいずれか１つの対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌにより置換されている。一部の実施形態において、バリアント変更は、配列番号４のポリペプチドの、又は配列番号５～３７のいずれか１つの対応する位置での置換Ｓ１０２Ｐを含むか、又はこれからなる。更なる実施形態において、バリアントは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる。

【0085】

一部の実施形態において、バリアント変更は、配列番号４のポリペプチドの位置６６に対応する位置での、又は配列番号２～３７のいずれか１つの対応する位置での置換を含むか、又はこれからなる。一部の実施形態において、配列番号４のポリペプチドの位置６６に対応する位置の、又は配列番号２～３７のいずれか１つの対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒにより置換されている。一部の実施形態において、バリアント変更は、配列番号４のポリペプチドの、又は配列番号２～３７のいずれか１つの対応する位置での置換Ｖ６６Ａを含むか、又はこれからなる。

【0086】

別の実施形態において、バリアント変更は、配列番号４のポリペプチドの位置６６及び位置１０２に対応する位置での、又は配列番号２～３７のいずれか１つの対応する位置での置換を含むか、又はこれからなる。一部の実施形態において、バリアント変更は、配列番号４のポリペプチドの、又は配列番号２～３７のいずれか１つの対応する位置での置換Ｖ６６Ａ及びＳ１０２Ｐを含むか、又はこれからなる。

【0087】

これ以外にも、アミノ酸変化は、ポリペプチドの物理化学的特性が変更されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変化は、ポリペプチドの熱安定性を向上させ得る、基質特異性を変更させ得る、最適ｐＨを変化させ得る等である。

【0088】

一実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントは、１つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、より大きな範囲（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、又はそれを超える％のいずれか（これらのパーセンテージの間に入る値を含む）だけ大きな範囲）まで二糖（例えばマルトース）を加水分解することができる。バリアントグルコアミラーゼは、配列番号４の位置２０、２１、５１、６６、７９、８０、９２、１０２、１２１、１４０、１４３、１５７、１５８、１６５、１６６、１９２、２０３、２１０、２１３、２１４、２１５、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５２、２７４、２７８、２８１、２９０、３０２、３１０、３２１、３４１、３５０、３５２、３５４、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１８、４４０、４４１、及び／若しくは４４４に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置にて、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、又は４８個のアミノ酸置換のいずれか）を有し得る。特定の位置での１つ以上の置換は、Ｘ０２０Ａ／Ｐ；Ｘ０２１Ｓ；Ｘ０５１Ｌ／Ｖ；Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ；Ｘ０７９Ｃ／Ｔ；Ｘ０８０Ｋ；Ｘ０９２Ｍ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１２１Ｇ／Ｐ／Ｍ；Ｘ１４０Ｉ／Ｃ；Ｘ１４０Ｃ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６５Ｗ；Ｘ１６６Ｇ／Ｒ／Ｆ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２０３Ｗ；Ｘ２１０Ｌ；Ｘ２１３Ｒ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ；Ｘ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｘ２２１Ｒ／Ｔ／Ｍ；Ｘ２２２Ｍ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｙ／Ｐ；Ｘ２３５Ｙ；Ｘ２３６Ａ／Ｑ；Ｘ２３８Ｓ／Ｈ；Ｘ２４３Ｅ／Ｖ；Ｘ２５２Ｃ／Ｆ；Ｘ２７４Ａ；Ｘ２７８Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｋ／Ｖ／Ｐ／Ｓ／Ｗ；Ｘ３１０Ｔ／Ｙ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３４１Ｍ；Ｘ３５０Ｉ／Ｔ；Ｘ３５２Ｄ；Ｘ３５４Ｌ／Ｍ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｅ；Ｘ４０３Ｇ／Ｒ；Ｘ４０４Ｋ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｘ４１８Ｗ／Ｅ；Ｘ４４０Ｇ／Ｈ；Ｘ４４１Ｓ；及び／若しくはＸ４４４Ｌ（Ｘは、親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）の１つ以上、又はＳ０２０Ａ／Ｐ；Ｋ０２１Ｓ；Ａ０５１Ｌ／Ｖ；Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｗ；Ａ０７９Ｃ／Ｔ；Ｇ０８０Ｋ；Ｖ０９２Ｍ；Ｐ１０２Ｇ；Ｔ１２１Ｇ／Ｐ／Ｍ；Ｍ１４０Ｉ／Ｃ；Ｍ１４０Ｃ；Ｔ１５７Ｉ；Ｎ１５８Ａ；Ｙ１６５Ｗ；Ｋ１６６Ｇ／Ｒ／Ｆ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２０３Ｗ；Ｒ２１０Ｌ；Ｄ２１３Ｒ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ；Ｓ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｓ２２１Ｒ／Ｔ／Ｍ；Ｇ２２２Ｍ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｙ／Ｐ；Ｗ２３５Ｙ；Ｄ２３６Ａ／Ｑ；Ｇ２３８Ｓ／Ｈ；Ｔ２４３Ｅ／Ｖ；Ｖ２５２Ｃ／Ｆ；Ｇ２７４Ａ；Ｐ２７８Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｋ／Ｖ／Ｐ／Ｓ／Ｗ；Ｎ３１０Ｔ／Ｙ；Ｌ３４１Ｍ；Ｋ３５０Ｉ；Ｔ３５２Ｄ；Ｖ３５４Ｌ／Ｍ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｅ；Ｑ４０３Ｇ／Ｒ；Ｙ４０４Ｋ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｒ４１８Ｗ／Ｅ；Ａ４４０Ｇ／Ｈ；Ｑ４４１Ｓ；及び／若しくはＡ４４４Ｌの１つ以上を含み得る。当該技術において知られているあらゆるアッセイを用いて、二糖（例えばマルトース）の加水分解を判定することができ、実施例のセクションに記載されるアッセイが挙げられる。

【0089】

更なる実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントは、１つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、より大きな範囲（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、又はそれを超える％のいずれか（これらのパーセンテージの間に入る値を含む）だけ大きな範囲）までパノースを加水分解することができる。パノースは、デンプン分解酵素の活性の特性を表すのを助力するのに基質として一般的に用いられる、アルファ－１，６グリコシド結合によってグルコース分子に結合したマルトース分子を構成する三糖である。バリアントグルコアミラーゼは、配列番号４の位置２０、２１、２３、３７、５１、５２、６７、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９２、９４、１０２、１１９、１２１、１４０、１４１、１４３、１６４、１６５、１６６、１７２、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３６、２３８、２５２、２５３、２７４、２８１、２９０、３０２、３２１、３４１、３５０、３５１、３５２、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１８、４３０、４４０、４４４、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置にて、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、又は５５個のアミノ酸置換のいずれか）を有し得る。特定の位置での１つ以上の置換は、Ｘ０２０Ｐ／Ａ；Ｘ０２１Ｔ／Ｗ／Ｍ；Ｘ０２３Ｍ／Ｌ；Ｘ０３７Ｃ；Ｘ０５１Ｌ／Ｖ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６７Ｃ；Ｘ０６９Ｃ／Ａ；Ｘ０７３Ｎ；Ｘ０７７Ｓ；Ｘ０７９Ｃ；Ｘ０８０Ｈ／Ｋ；Ｘ０８１Ｎ；Ｘ０８４Ｖ／Ｌ；Ｘ０９２Ｃ；Ｘ０９４Ｙ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１１９Ｇ；Ｘ１２１Ｍ／Ｌ／Ｇ／Ｐ；Ｘ１４０Ｃ／Ｑ／Ｉ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１６４Ｌ；Ｘ１６５Ｗ／Ｔ；Ｘ１６６Ｒ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ２１０Ｌ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ；Ｘ２１５Ｄ；Ｘ２１８Ｑ／Ａ／Ｖ／Ｙ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｔ／Ｐ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２３８Ｈ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２７４Ｄ／Ｋ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｑ／Ｖ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３４１Ｍ／Ｔ；Ｘ３５０Ｃ／Ｔ；Ｘ３５１Ｅ；Ｘ３５２Ｄ／Ｎ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｘ４０３Ｇ；Ｘ４０３Ｒ／Ｋ；Ｘ４０４Ｍ／Ｋ；Ｘ４０５Ｓ／Ｑ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４３０Ａ；Ｘ４４０Ｇ；Ｘ４４４Ｐ；及び／若しくはＸ４４５Ｙ／Ｍ（Ｘは、親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）の１つ以上、又はＳ０２０Ｐ／Ａ；Ｋ０２１Ｔ／Ｗ／Ｍ；Ｅ０２３Ｍ／Ｌ；Ｅ０３７Ｃ；Ａ０５１Ｌ／Ｖ；Ｇ０５２Ｎ；Ｓ０６７Ｃ；Ｖ０６９Ｃ／Ａ；Ｋ０７３Ｎ；Ｔ０７７Ｓ；Ａ０７９Ｃ；Ｇ０８０Ｈ／Ｋ；Ｄ０８１Ｎ；Ｉ０８４Ｖ／Ｌ；Ｖ０９２Ｃ；Ｆ０９４Ｙ；Ｘ１０２Ｇ；Ｓ１１９Ｇ；Ｔ１２１Ｍ／Ｌ／Ｇ／Ｐ；Ｍ１４０Ｃ／Ｑ／Ｉ；Ｌ１４１Ｆ；Ａ１４３Ｇ；Ｉ１６４Ｌ；Ｙ１６５Ｗ／Ｔ；Ｋ１６６Ｒ；Ｖ１７２Ｇ；Ｒ２１０Ｌ；Ｄ２１３Ｈ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ；Ｓ２１５Ｄ；Ｓ２１８Ｑ／Ａ／Ｖ／Ｙ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｔ／Ｐ；Ｄ２３６Ｑ；Ｇ２３８Ｈ；Ｖ２５２Ｆ；Ｇ２７４Ｄ／Ｋ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｑ／Ｖ；Ｎ３２１Ｄ；Ｌ３４１Ｍ／Ｔ；Ｋ３５０Ｃ／Ｔ；Ｎ３５１Ｅ；Ｔ３５２Ｄ／Ｎ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｑ４０３Ｇ；Ｑ４０３Ｒ／Ｋ；Ｙ４０４Ｍ／Ｋ；Ｈ４０５Ｓ／Ｑ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ｔ４３０Ａ；Ａ４４０Ｇ；Ａ４４４Ｐ；及び／若しくはＧ４４５Ｙ／Ｍの１つ以上を含み得る。当該技術において知られているあらゆるアッセイを用いて、パノースの加水分解を判定することができ、実施例のセクションに記載されるアッセイが挙げられる。

【0090】

別の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントは、１つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、より大きな範囲（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、又はそれを超える％のいずれか（これらのパーセンテージの間に入る値を含む）だけ大きな範囲）までプルランを加水分解することができる。プルランは、マルトトリオース単位（別名α－１，４－；α－１，６－グルカン）からなる多糖ポリマーである。マルトトリオース内の３つのグルコース単位は、α－１，４グリコシド結合によって連結されているが、連続マルトトリオース単位は、α－１，６グリコシド結合によって互いに連結されている。プルランは、デンプン内のアルファ１－６結合を加水分解することができるグルコアミラーゼを特定するのに基質として一般的に用いられる。バリアントグルコアミラーゼは、配列番号４の位置２０、５１、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９４、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１４３、１５６、１５８、１６５、１６６、２０３、２１０、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２５２、２５３、２７４、２７８、２８１、２９０、３０２、３１０、３２１、３４１、３５０、３５２、３５４、３７０、３９０、４１６、４１８、４３４、４４０、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置にて、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９個のアミノ酸置換のいずれか）を有し得る。特定の位置での１つ以上の置換は、Ｘ０２０Ｆ／Ａ／Ｇ；Ｘ０５１Ｋ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｐ／Ｎ；Ｘ０７７Ｍ／Ｐ；Ｘ０７９Ｃ／Ｔ；Ｘ０８０Ｋ；Ｘ０８１Ｎ；Ｘ０８４Ｖ／Ｌ；Ｘ０９４Ｇ／Ａ；Ｘ１１９Ｇ／Ｄ；Ｘ１２１Ｌ／Ｍ；Ｘ１３４Ｓ；Ｘ１４０Ｉ／Ｃ／Ｑ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１５６Ｐ／Ｃ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６５Ｔ；Ｘ１６６Ｈ／Ａ／Ｆ；Ｘ２０３Ｃ／Ｑ／Ｗ／Ｙ；Ｘ２１０Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｎ／Ａ／Ｉ；Ｘ２１４Ａ／Ｙ／Ｌ／Ｃ；Ｘ２１５Ｖ／Ｃ／Ｗ／Ｄ／Ｈ；Ｘ２１８Ｖ／Ｋ／Ａ／Ｑ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ；Ｘ２３５Ｙ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２５２Ｆ／Ｈ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ｋ／Ｄ；Ｘ２７８Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ；Ｘ３０２Ｐ／Ｓ／Ｖ；Ｘ３１０Ｔ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３４１Ｍ；Ｘ３５０Ｉ／Ｔ；Ｘ３５２Ｄ／Ｓ；Ｘ３５４Ｌ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｘ４０４Ｋ；Ｘ４１６Ｙ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４３４Ｓ；Ｘ４４０Ｇ；及び／若しくはＸ４４５Ｍ（Ｘは、親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）の１つ以上、又はＳ０２０Ｆ／Ａ／Ｇ；Ａ０５１Ｋ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｐ／Ｎ；Ｔ０７７Ｍ／Ｐ；Ａ０７９Ｃ／Ｔ；Ｇ０８０Ｋ；Ｄ０８１Ｎ；Ｉ０８４Ｖ／Ｌ；Ｆ０９４Ｇ／Ａ；Ｓ１１９Ｇ／Ｄ；Ｔ１２１Ｌ／Ｍ；Ｅ１３４Ｓ；Ｍ１４０Ｉ／Ｃ／Ｑ；Ｌ１４１Ｆ；Ａ１４３Ｇ；Ｆ１５６Ｐ／Ｃ；Ｎ１５８Ａ；Ｙ１６５Ｔ；Ｋ１６６Ｈ／Ａ／Ｆ；Ｄ２０３Ｃ／Ｑ／Ｗ／Ｙ；Ｒ２１０Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｎ／Ａ／Ｉ；Ｎ２１４Ａ／Ｙ／Ｌ／Ｃ；Ｓ２１５Ｖ／Ｃ／Ｗ／Ｄ／Ｈ；Ｓ２１８Ｖ／Ｋ／Ａ／Ｑ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ；Ｗ２３５Ｙ；Ｄ２３６Ｑ；Ｖ２５２Ｆ／Ｈ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ｋ／Ｄ；Ｐ２７８Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ；Ｎ３０２Ｐ／Ｓ／Ｖ；Ｎ３１０Ｔ；Ｎ３２１Ｄ；Ｌ３４１Ｍ；Ｋ３５０Ｉ／Ｔ；Ｔ３５２Ｄ／Ｓ；Ｖ３５４Ｌ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｌ／Ｅ；Ｙ４０４Ｋ；Ｆ４１６Ｙ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ａ４３４Ｓ；Ａ４４０Ｇ；及び／若しくはＧ４４５Ｍの１つ以上を含み得る。当該技術において知られているあらゆるアッセイを用いて、プルランの加水分解を判定することができ、実施例のセクションに記載されるアッセイが挙げられる。

【0091】

さらに別の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントは、１つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、可溶性デンプンの糖化について、より高い性能指数（ＰＩ）（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、又はそれを超える％のいずれか（これらのパーセンテージの間に入る値を含む）だけ高いＰＩ）（すなわち、可溶性デンプン又はその断片の加水分解の向上）を示すことができる。バリアントグルコアミラーゼは、配列番号４の位置２１、２３、３７、５２、６６、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９２、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１５７、１５８、１６４、１６５、２１０、２１３、２１４、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２４３、２５２、２５３、２７４、２８１、２９０、３０２、３４１、３５０、３５１、３５２、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１６、４１８、４２２、４４０、４４１、４４４、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置にて、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、又は５４個のアミノ酸置換のいずれか）を有し得る。特定の位置での１つ以上の置換は、Ｘ０２１Ｔ；Ｘ０２３Ｍ／Ｌ；Ｘ０３７Ｃ；Ｘ０５２Ｎ／Ｆ；Ｘ０６６Ａ／Ｆ／Ｔ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｎ／Ｐ；Ｘ０７７Ｐ／Ｍ／Ｓ；Ｘ０７９Ｒ；Ｘ０８０Ｎ／Ｈ／Ｋ；Ｘ０８１Ｎ／Ｓ；Ｘ０８４Ｌ／Ｖ；Ｘ０９２Ｉ；Ｘ１１９Ａ／Ｇ；Ｘ１２１Ｍ／Ｌ；Ｘ１３４Ｓ／Ｑ；Ｘ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｘ１４１Ｆ／Ｋ；Ｘ１５７Ａ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６４Ｌ／Ｔ；Ｘ１６５Ｗ／Ｔ；Ｘ２１０Ｗ／Ｇ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１４Ｇ／Ｙ；Ｘ２１８Ｑ／Ｆ／Ａ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ；Ｘ２３５Ｆ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２４３Ａ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ｄ／Ｋ／Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｗ／Ｓ／Ｑ／Ｋ；Ｘ３４１Ｍ／Ｔ；Ｘ３５０Ｃ／Ｅ；Ｘ３５１Ｅ；Ｘ３５２Ｄ／Ｎ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｌ；Ｘ４０３Ｇ／Ｒ／Ｋ；Ｘ４０４Ｍ／Ｋ；Ｘ４０５Ｓ；Ｘ４１６Ｃ／Ｙ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４４０Ｇ；Ｘ４４１Ｌ；Ｘ４４４Ｓ／Ｐ；及び／若しくはＸ４４５Ｍ（Ｘは、親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）の１つ以上、又はＫ０２１Ｔ；Ｅ０２３Ｍ／Ｌ；Ｅ０３７Ｃ；Ｇ０５２Ｎ／Ｆ；Ｖ０６６Ａ／Ｆ／Ｔ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｎ／Ｐ；Ｔ０７７Ｐ／Ｍ／Ｓ；Ａ０７９Ｒ；Ｇ０８０Ｎ／Ｈ／Ｋ；Ｄ０８１Ｎ／Ｓ；Ｉ０８４Ｌ／Ｖ；Ｖ０９２Ｉ；Ｓ１１９Ａ／Ｇ；Ｔ１２１Ｍ／Ｌ；Ｅ１３４Ｓ／Ｑ；Ｍ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｌ１４１Ｆ／Ｋ；Ｔ１５７Ａ；Ｎ１５８Ａ；Ｉ１６４Ｌ／Ｔ；Ｙ１６５Ｗ／Ｔ；Ｒ２１０Ｗ／Ｇ；Ｄ２１３Ｈ；Ｎ２１４Ｇ／Ｙ；Ｓ２１８Ｑ／Ｆ／Ａ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ／Ｖ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ；Ｗ２３５Ｆ；Ｄ２３６Ｑ；Ｔ２４３Ａ；Ｖ２５２Ｆ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ｄ／Ｋ／Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｗ／Ｓ／Ｑ／Ｋ；Ｌ３４１Ｍ／Ｔ；Ｋ３５０Ｃ／Ｅ；Ｎ３５１Ｅ；Ｔ３５２Ｄ／Ｎ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｌ；Ｑ４０３Ｇ／Ｒ／Ｋ；Ｙ４０４Ｍ／Ｋ；Ｈ４０５Ｓ；Ｆ４１６Ｃ／Ｙ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ｙ４２２Ａ；Ａ４４０Ｇ；Ｑ４４１Ｌ；Ａ４４４Ｓ／Ｐ；及び／若しくはＧ４４５Ｍの１つ以上を含み得る。ＰＩは、実施例のセクションに記載されるアッセイに基づいて求めることができる。

【0092】

他の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントは、１つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、マルトデキストリンの加水分解の向上（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、又はそれを超える％のいずれか（これらのパーセンテージの間に入る値を含む）の加水分解の向上）を示すことができる。マルトデキストリンは、可変長の鎖で連結されたＤ－グルコース単位からなる。グルコース単位は、主に、α（１→４）グリコシド結合により連結され、マルトデキストリンは、典型的に、３～１７のグルコース単位長の間で変動する鎖の混合物で構成される。マルトデキストリンは、アルファアミラーゼを用いて生成されるので、グルコアミラーゼ基質を模倣する。バリアントグルコアミラーゼは、配列番号４の位置２０、２１、５１、６７、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、１０２、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１４３、１５６、１５７、１５８、１６５、１６６、１７２、１９２、２０３、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２５２、２７４、２８１、２９０、３０２、３１０、３２１、３４１、３５０、３５１、３５２、３５４、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１８、４２２、４３４、４４０、４４４、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置にて、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、又は５７個のアミノ酸置換のいずれか）を有し得る。特定の位置での１つ以上の置換は、Ｘ０２０Ｐ／Ａ／Ｅ；Ｘ０２１Ｓ／Ｍ；Ｘ０５１Ｖ／Ｌ／Ｋ／Ｙ；Ｘ０６７Ａ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｐ／Ｎ；Ｘ０７７Ｐ／Ｍ；Ｘ０７９Ｃ／Ｔ；Ｘ０８０Ｋ／Ｈ；Ｘ０８１Ｎ；Ｘ０８４Ｌ／Ｖ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１１９Ｇ；Ｘ１２１Ｍ／Ｇ／Ｖ／Ｐ；Ｘ１３４Ｓ／Ｑ；Ｘ１４０Ｃ／Ｉ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１４３Ｇ；Ｘ１５６Ｐ／Ｃ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１５８Ａ；Ｘ１６５Ｗ／Ｔ；Ｘ１６６Ｇ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２０３Ｗ／Ｃ／Ｍ；Ｘ２１０Ｌ／Ｍ；Ｘ２１３Ｒ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ；Ｘ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｘ２１８Ｖ／Ｙ／Ｑ；Ｘ２２１Ｒ／Ｔ；Ｘ２２２Ｍ／Ｃ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ／Ｙ；Ｘ２３５Ｙ；Ｘ２３６Ｑ／Ａ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２７４Ｋ／Ａ／Ｄ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ３０２Ｐ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｑ／Ｗ；Ｘ３１０Ｔ／Ｙ；Ｘ３２１Ｄ；Ｘ３４１Ｍ；Ｘ３５０Ｉ／Ｔ；Ｘ３５１Ｖ；Ｘ３５２Ｄ；Ｘ３５４Ｌ／Ｍ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｅ／Ｌ／Ｄ；Ｘ４０３Ｋ／Ｒ／Ｇ；Ｘ４０４Ｋ／Ｍ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｘ４１８Ｗ／Ｅ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４３４Ｓ；Ｘ４４０Ｇ／Ｈ；Ｘ４４４Ｐ；及び／若しくはＸ４４５Ｍ；（Ｘは、親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）の１つ以上、又はＳ０２０Ｐ／Ａ／Ｅ；Ｋ０２１Ｓ／Ｍ；Ａ０５１Ｖ／Ｌ／Ｋ／Ｙ；Ｓ０６７Ａ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｐ／Ｎ；Ｔ０７７Ｐ／Ｍ；Ａ０７９Ｃ／Ｔ；Ｇ０８０Ｋ／Ｈ；Ｄ０８１Ｎ；Ｉ０８４Ｌ／Ｖ；Ｐ１０２Ｇ；Ｓ１１９Ｇ；Ｔ１２１Ｍ／Ｇ／Ｖ／Ｐ；Ｅ１３４Ｓ／Ｑ；Ｍ１４０Ｃ／Ｉ；Ｌ１４１Ｆ；Ａ１４３Ｇ；Ｆ１５６Ｐ／Ｃ；Ｔ１５７Ｉ；Ｎ１５８Ａ；Ｙ１６５Ｗ／Ｔ；Ｋ１６６Ｇ；Ｖ１７２Ｇ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２０３Ｗ／Ｃ／Ｍ；Ｒ２１０Ｌ／Ｍ；Ｄ２１３Ｒ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ；Ｓ２１５Ｄ／Ｃ／Ｆ；Ｓ２１８Ｖ／Ｙ／Ｑ；Ｓ２２１Ｒ／Ｔ；Ｇ２２２Ｍ／Ｃ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ／Ｙ；Ｗ２３５Ｙ；Ｄ２３６Ｑ／Ａ；Ｖ２５２Ｆ；Ｇ２７４Ｋ／Ａ／Ｄ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｎ３０２Ｐ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｑ／Ｗ；Ｎ３１０Ｔ／Ｙ；Ｎ３２１Ｄ；Ｌ３４１Ｍ；Ｋ３５０Ｉ／Ｔ；Ｎ３５１Ｖ；Ｔ３５２Ｄ；Ｖ３５４Ｌ／Ｍ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｅ／Ｌ／Ｄ；Ｑ４０３Ｋ／Ｒ／Ｇ；Ｙ４０４Ｋ／Ｍ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｒ４１８Ｗ／Ｅ；Ｙ４２２Ａ；Ａ４３４Ｓ；Ａ４４０Ｇ／Ｈ；Ａ４４４Ｐ；及び／若しくはＧ４４５Ｍの１つ以上を含み得る。当該技術において知られているあらゆるアッセイを用いて、マルトデキストリンの加水分解を判定することができ、実施例のセクションに記載されるアッセイが挙げられる。

【0093】

更なる実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントは、１つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、熱安定性の向上（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、又はそれを超える％のいずれか（これらのパーセンテージの間に入る値を含む）の熱安定性の向上）を示すことができる。バリアントグルコアミラーゼは、配列番号４の位置２３、５１、５２、６６、６７、７７、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１５６、１５７、１６５、１９２、２１３、２２１、２２２、２３３、２３６、２５２、２８１、２９０、３０２、３５０、３５２、３７０、３９０、４０３、４０４、４１６、及び／若しくは４２２に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置にて、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個のアミノ酸置換のいずれか）を有し得る。特定の位置での１つ以上の置換は、Ｘ０２３Ｍ；Ｘ０５１Ｙ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｘ０６７Ｃ；Ｘ０７７Ｐ；Ｘ１１９Ａ；Ｘ１２１Ｍ；Ｘ１３４Ｓ；Ｘ１４０Ｉ／Ｃ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１５６Ｃ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１６５Ｗ／Ｉ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２１３Ｒ；Ｘ２２１Ｒ；Ｘ２２２Ｍ；Ｘ２３３Ｍ；Ｘ２３６Ｑ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｖ；Ｘ３０２Ｈ／Ｑ／Ｗ／Ｓ／Ｋ；Ｘ３５０Ｅ／Ｃ；Ｘ３５２Ｄ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｌ／Ｄ；Ｘ４０３Ｒ；Ｘ４０４Ｋ／Ｍ；Ｘ４１６Ｙ；及び／若しくはＸ４２２Ａ／Ｖ（Ｘは、親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）の１つ以上、又はＥ０２３Ｍ；Ａ０５１Ｙ；Ｇ０５２Ｎ；Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｓ０６７Ｃ；Ｔ０７７Ｐ；Ｓ１１９Ａ；Ｔ１２１Ｍ；Ｅ１３４Ｓ；Ｍ１４０Ｉ／Ｃ；Ｌ１４１Ｆ；Ｆ１５６Ｃ；Ｔ１５７Ｉ；Ｙ１６５Ｗ／Ｉ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２１３Ｒ；Ｓ２２１Ｒ；Ｇ２２２Ｍ；Ｓ２３３Ｍ；Ｄ２３６Ｑ；Ｖ２５２Ｆ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｖ；Ｎ３０２Ｈ／Ｑ／Ｗ／Ｓ／Ｋ；Ｋ３５０Ｅ／Ｃ；Ｔ３５２Ｄ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｌ／Ｄ；Ｑ４０３Ｒ；Ｙ４０４Ｋ／Ｍ；Ｆ４１６Ｙ；及び／若しくはＹ４２２Ａ／Ｖの１つ以上を含み得る。当該技術において知られているあらゆるアッセイを用いて、ポリペプチドの熱安定性を判定することができ、実施例のセクションに記載されるアッセイが挙げられる。

【0094】

別の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントは、１つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、転換低下（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％のいずれか（これらのパーセンテージの間に入る値を含む）の転換低下）の向上を示すことができる。バリアントグルコアミラーゼは、配列番号４の位置４９、５１、５２、６６、６９、７７、８０、９４、１１９、１３４、１５８、１６４、１６５、１７２、１９２、２１３、２１５、２１８、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５３、２７４、３０２、３３８、４０３、４０５、４１６、４１８、４２２、４３０、４４０、４４１、４４４、４４５、及び／若しくは４４９に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置にて、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、又は４１個のアミノ酸置換のいずれか）を有し得る。特定の位置での１つ以上の置換は、ＸＳ０４９Ｗ；Ｘ０５１Ｙ；Ｘ０５２Ｐ；Ｘ０６６Ｐ；Ｘ０６９Ｋ／Ｃ；Ｘ０７７Ｐ／Ｍ；Ｘ０８０Ｈ；Ｘ０９４Ａ／Ｇ；Ｘ１１９Ｄ；Ｘ１３４Ｗ／Ｑ；Ｘ１５８Ｙ；Ｘ１６４Ｔ／Ｌ；Ｘ１６５Ｗ／Ｉ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ１９２Ｒ／Ｆ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１５Ｒ；Ｘ２１８Ｋ；Ｘ２２２Ｃ；Ｘ２３３Ｔ／Ｐ；Ｘ２３５Ｆ；Ｘ２３６Ａ；Ｘ２３８Ｈ／Ｓ／Ｎ；Ｘ２４３Ｐ／Ｓ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ｋ／Ａ；Ｘ３０２Ｈ／Ｆ／Ｐ／Ｍ／Ｑ／Ｔ；Ｘ３３８Ｉ；Ｘ４０３Ｇ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ；Ｘ４１６Ｃ／Ｙ；Ｘ４１６Ｙ；Ｘ４１８Ｗ／Ｅ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４３０Ａ／Ｑ；Ｘ４４０Ｌ／Ｈ；Ｘ４４１Ｗ／Ｌ；Ｘ４４４Ｌ／Ｐ；Ｘ４４５Ｙ；及び／若しくはＸ４４９Ｌ（Ｘは、親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）の１つ以上、又はＳ０４９Ｗ；Ａ０５１Ｙ；Ｇ０５２Ｐ；Ｖ０６６Ｐ；Ｖ０６９Ｋ／Ｃ；Ｔ０７７Ｐ／Ｍ；Ｇ０８０Ｈ；Ｆ０９４Ａ／Ｇ；Ｓ１１９Ｄ；Ｅ１３４Ｗ／Ｑ；Ｎ１５８Ｙ；Ｉ１６４Ｔ／Ｌ；Ｙ１６５Ｗ／Ｉ；Ｖ１７２Ｇ；Ｙ１９２Ｒ／Ｆ；Ｄ２１３Ｈ；Ｓ２１５Ｒ；Ｓ２１８Ｋ；Ｇ２２２Ｃ；Ｓ２３３Ｔ／Ｐ；Ｗ２３５Ｆ；Ｄ２３６Ａ；Ｇ２３８Ｈ／Ｓ／Ｎ；Ｔ２４３Ｐ／Ｓ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ｋ／Ａ；Ｎ３０２Ｈ／Ｆ／Ｐ／Ｍ／Ｑ／Ｔ；Ｆ３３８Ｉ；Ｑ４０３Ｇ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ；Ｆ４１６Ｃ／Ｙ；Ｆ４１６Ｙ；Ｒ４１８Ｗ／Ｅ；Ｙ４２２Ａ；Ｔ４３０Ａ／Ｑ；Ａ４４０Ｌ／Ｈ；Ｑ４４１Ｗ／Ｌ；Ａ４４４Ｌ／Ｐ；Ｇ４４５Ｙ；及び／若しくはＦ４４９Ｌの１つ以上を含み得る。当該技術において知られているあらゆるアッセイを用いて、糖化中の転換糖の形成を判定することができ、実施例のセクションに記載されるアッセイが挙げられる。

【0095】

更なる実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントは、１つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、糖化収率の向上（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、又はそれを超える％のいずれか（これらのパーセンテージの間に入る値を含む）の糖化収率の向上）を示すことができる。バリアントグルコアミラーゼは、配列番号４の位置２１、２３、５１、５２、６６、６７、７９、８１、９２、１１９、１４０、１５８、１６４、１７２、１９２、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５３、２８１、２９０、３０２、３１０、３５１、３５２、３５４、３７０、４０３、４１６、４２２、４３０、４４１、及び／若しくは４４５に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置にて、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は４３個のアミノ酸置換のいずれか）を有し得る。特定の位置での１つ以上の置換は、Ｘ０２１Ｓ／Ｗ；Ｘ０２３Ｌ；Ｘ０５１Ｙ／Ｋ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｘ０６７Ｍ／Ｃ／Ａ；Ｘ０７９Ｒ；Ｘ０８１Ｓ；Ｘ０９２Ｃ／Ｍ；Ｘ１１９Ａ；Ｘ１４０Ｉ；Ｘ１５８Ａ／Ｙ；Ｘ１６４Ｌ；Ｘ１７２Ｌ／Ｇ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２１０Ｗ；Ｘ２１３Ｈ；Ｘ２１４Ｙ；Ｘ２１５Ｆ／Ｃ／Ｒ；Ｘ２１８Ｈ／Ｋ／Ａ；Ｘ２２１Ｍ／Ｔ；Ｘ２２２Ｖ；Ｘ２３３Ｔ；Ｘ２３５Ｙ／Ｆ；Ｘ２３６Ｓ／Ａ；Ｘ２３８Ｔ／Ｖ／Ｍ；Ｘ２４３Ａ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２８１Ｐ／Ｄ；Ｘ２９０Ｖ；Ｘ３０２Ｋ／Ｑ／Ｈ／Ｗ；Ｘ３１０Ｖ／Ｔ；Ｘ３５１Ｖ；Ｘ３５２Ｓ；Ｘ３５４Ｌ；Ｘ３７０Ｒ；Ｘ４０３Ｋ；Ｘ４１６Ｙ；Ｘ４２２Ｆ；Ｘ４３０Ａ；Ｘ４４１Ｌ；及び／若しくはＸ４４５Ｙ（Ｘは、親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）の１つ以上、又はＫ０２１Ｓ／Ｗ；Ｅ０２３Ｌ；Ａ０５１Ｙ／Ｋ；Ｇ０５２Ｎ；Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｓ０６７Ｍ／Ｃ／Ａ；Ａ０７９Ｒ；Ｄ０８１Ｓ；Ｖ０９２Ｃ／Ｍ；Ｓ１１９Ａ；Ｍ１４０Ｉ；Ｎ１５８Ａ／Ｙ；Ｉ１６４Ｌ；Ｖ１７２Ｌ／Ｇ；Ｙ１９２Ｆ；Ｒ２１０Ｗ；Ｄ２１３Ｈ；Ｎ２１４Ｙ；Ｓ２１５Ｆ／Ｃ／Ｒ；Ｓ２１８Ｈ／Ｋ／Ａ；Ｓ２２１Ｍ／Ｔ；Ｇ２２２Ｖ；Ｓ２３３Ｔ；Ｗ２３５Ｙ／Ｆ；Ｄ２３６Ｓ／Ａ；Ｇ２３８Ｔ／Ｖ／Ｍ；Ｔ２４３Ａ；Ｅ２５３Ｋ；Ｅ２８１Ｐ／Ｄ；Ｆ２９０Ｖ；Ｎ３０２Ｋ／Ｑ／Ｈ／Ｗ；Ｎ３１０Ｖ／Ｔ；Ｎ３５１Ｖ；Ｔ３５２Ｓ；Ｖ３５４Ｌ；Ｓ３７０Ｒ；Ｑ４０３Ｋ；Ｆ４１６Ｙ；Ｙ４２２Ｆ；Ｔ４３０Ａ；Ｑ４４１Ｌ；及び／若しくはＧ４４５Ｙの１つ以上を含み得る。当該技術において知られているあらゆるアッセイを用いて、糖化収率を求めることができ、実施例のセクションに記載されるアッセイが挙げられる。

【0096】

したがって、更なる実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する、本明細書中で開示されるグルコアミラーゼバリアントは、１つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較して、向上（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、又はそれを超える％のいずれか（これらのパーセンテージの間に入る値を含む）の、ｉ）二糖（例えばマルトース）の加水分解の向上；ｉｉ）パノースのより大きな加水分解；ｉｉｉ）プルランのより大きな加水分解；ｉｖ）可溶性デンプンの糖化のより高いＰＩ（すなわち、可溶性デンプン又はその断片の加水分解の向上）；ｖ）マルトデキストリンの加水分解の向上；ｖｉ）熱安定性の向上；ｖｉｉ）ＤＰが２以上の糖へのより少ない転換；及び／又はｖｉｉｉ）グルコースの糖化収率の向上の２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、又は８つ）の向上）を示し得る。バリアントグルコアミラーゼは、配列番号４の位置２０、２１、２３、３７、５１、５２、６６、６７、６９、７３、７７、７９、８０、８１、８４、９２、９４、１０２、１１９、１２１、１３４、１４０、１４１、１５６、１５７、１５８、１６４、１６５、１６６、１７２、１９２、２０３、２１０、２１３、２１４、２１５、２１８、２２１、２２２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４３、２５２、２５３、２７４、２７８、２８１、２９０、３０２、３１０、３４１、３５０、３５１、３５２、３５４、３７０、３９０、４０３、４０４、４０５、４１６、４１８、４２２、４３０、４４０、４４１、４４４、４４５、及び／若しくは４４９に対応する残基位置、並びに／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置にて、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、又は７１個のアミノ酸置換のいずれか）を有し得る。特定の位置での１つ以上の置換は、Ｘ０２０Ａ／Ｐ；Ｘ０２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ；Ｘ０２３Ｌ／Ｍ；Ｘ０３７Ｃ；Ｘ０５１Ｋ／Ｌ／Ｖ／Ｙ；Ｘ０５２Ｎ；Ｘ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｘ０６７Ａ／Ｃ；Ｘ０６９Ｃ；Ｘ０７３Ｎ／Ｐ；Ｘ０７７Ｍ／Ｐ／Ｓ；Ｘ０７９Ｒ／Ｔ；Ｘ０８０Ｈ／Ｋ；Ｘ０８１Ｎ／Ｓ；Ｘ０８４Ｌ／Ｖ；Ｘ０９２Ｃ／Ｍ；Ｘ０９４Ａ／Ｇ；Ｘ１０２Ｇ；Ｘ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ；Ｘ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ；Ｘ１３４Ｑ／Ｓ；Ｘ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｘ１４１Ｆ；Ｘ１５６Ｃ／Ｐ；Ｘ１５７Ｉ；Ｘ１５８Ａ／Ｙ；Ｘ１６４Ｌ／Ｔ；Ｘ１６５Ｉ／Ｔ／Ｗ；Ｘ１６６Ｇ／Ｆ／Ｒ；Ｘ１７２Ｇ；Ｘ１９２Ｆ；Ｘ２０３Ｃ／Ｗ；Ｘ２１０Ｌ／Ｍ／Ｗ；Ｘ２１３Ｈ／Ｒ；Ｘ２１４Ａ／Ｅ／Ｙ；Ｘ２１５Ｃ／Ｄ／Ｆ／Ｒ；Ｘ２１８Ａ／Ｋ／Ｑ／Ｖ／Ｙ；Ｘ２２１Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｘ２２２Ｃ／Ｍ／Ｖ；Ｘ２３３Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｙ；Ｘ２３５Ｆ／Ｙ；Ｘ２３６Ａ／Ｑ；Ｘ２３８Ｈ／Ｓ；Ｘ２４３Ａ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２５３Ｋ；Ｘ２７４Ａ／Ｄ／Ｋ；Ｘ２７８Ａ；Ｘ２８１Ｄ；Ｘ２９０Ｍ／Ｖ；Ｘ２９０Ｖ；Ｘ３０２Ｈ／Ｋ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ；Ｘ３１０Ｔ／Ｙ；Ｘ３４１Ｍ／Ｔ；Ｘ３５０Ｃ／Ｅ／Ｉ；Ｘ３５１Ｅ／Ｖ；Ｘ３５２Ｄ／Ｎ／Ｓ；Ｘ３５４Ｌ／Ｍ；Ｘ３７０Ｍ；Ｘ３９０Ｄ／Ｅ／Ｌ；Ｘ４０３Ｇ／Ｋ／Ｒ；Ｘ４０４Ｉ／Ｋ／Ｍ；Ｘ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｘ４１６Ｃ／Ｙ；Ｘ４１８Ｅ／Ｗ；Ｘ４２２Ａ；Ｘ４３０Ａ；Ｘ４４０Ｇ／Ｈ；Ｘ４４１Ｌ；Ｘ４４４Ｌ／Ｐ；及び／若しくはＸ４４５Ｍ／Ｙ（Ｘは、親グルコアミラーゼ内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）の１つ以上、又はＳ０２０Ａ／Ｐ；Ｋ０２１Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ；Ｅ０２３Ｌ／Ｍ；Ｅ０３７Ｃ；Ａ０５１Ｋ／Ｌ／Ｖ／Ｙ；Ｇ０５２Ｎ；Ｖ０６６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｗ；Ｓ０６７Ａ／Ｃ；Ｖ０６９Ｃ；Ｋ０７３Ｎ／Ｐ；Ｔ０７７Ｍ／Ｐ／Ｓ；Ａ０７９Ｒ／Ｔ；Ｇ０８０Ｈ／Ｋ；Ｄ０８１Ｎ／Ｓ；Ｉ０８４Ｌ／Ｖ；Ｖ０９２Ｃ／Ｍ；Ｆ０９４Ａ／Ｇ；Ｐ１０２Ｇ；Ｓ１１９Ａ／Ｄ／Ｇ；Ｔ１２１Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ；Ｅ１３４Ｑ／Ｓ；Ｍ１４０Ｃ／Ｉ／Ｑ；Ｌ１４１Ｆ；Ｆ１５６Ｃ／Ｐ；Ｔ１５７Ｉ；Ｎ１５８Ａ／Ｙ；Ｉ１６４Ｌ／Ｔ；Ｙ１６５Ｉ／Ｔ／Ｗ；Ｋ１６６Ｇ／Ｆ／Ｒ；Ｖ１７２Ｇ；Ｙ１９２Ｆ；Ｄ２０３Ｃ／Ｗ；Ｒ２１０Ｌ／Ｍ／Ｗ；Ｄ２１３Ｈ／Ｒ；Ｎ２１４Ａ／Ｅ／Ｙ；Ｓ２１５Ｃ／Ｄ／Ｆ／Ｒ；Ｓ２１８Ａ／Ｋ／Ｑ／Ｖ／Ｙ；Ｓ２２１Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｇ２２２Ｃ／Ｍ／Ｖ；Ｓ２３３Ｍ／Ｐ／Ｔ／Ｙ；Ｗ２３５Ｆ／Ｙ；Ｄ２３６Ａ／Ｑ；Ｇ２３８Ｈ／Ｓ；Ｔ２４３Ａ；Ｖ２５２Ｆ；Ｅ２５３Ｋ；Ｇ２７４Ａ／Ｄ／Ｋ；Ｐ２７８Ａ；Ｅ２８１Ｄ；Ｆ２９０Ｍ／Ｖ；Ｆ２９０Ｖ；Ｎ３０２Ｈ／Ｋ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ；Ｎ３１０Ｔ／Ｙ；Ｌ３４１Ｍ／Ｔ；Ｋ３５０Ｃ／Ｅ／Ｉ；Ｎ３５１Ｅ／Ｖ；Ｔ３５２Ｄ／Ｎ／Ｓ；Ｖ３５４Ｌ／Ｍ；Ｓ３７０Ｍ；Ｓ３９０Ｄ／Ｅ／Ｌ；Ｑ４０３Ｇ／Ｋ／Ｒ；Ｙ４０４Ｉ／Ｋ／Ｍ；Ｈ４０５Ｑ／Ｓ／Ｙ；Ｆ４１６Ｃ／Ｙ；Ｒ４１８Ｅ／Ｗ；Ｙ４２２Ａ；Ｔ４３０Ａ；Ａ４４０Ｇ／Ｈ；Ｑ４４１Ｌ；Ａ４４４Ｌ／Ｐ；及び／若しくはＧ４４５Ｍ／Ｙの１つ以上を含み得る。

【0097】

複数のアミノ酸の置換（例えば、表１に示される置換のいずれか）、欠失、及び／又は挿入は、知られている変異誘発、組換え、及び／又はシャッフリング法に続いて、Ｒｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３－５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２－２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；又は国際公開第９５／２２６２５号パンフレットによって開示されているような関連するスクリーニング手順を用いて、実施且つ試験することができる。用いることができる他の方法として、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２－１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、及び領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。

【0098】

さらに、本明細書中で提供されるのは、追加の実施形態において、ａ）Ｘ２３６Ｓ及びＸ２８１Ｄ；ｂ）Ｘ２１５Ｒ及びＸ４４１Ｗ；ｃ）Ｘ３２１Ｄ及びＸ４３４Ｓ；ｄ）Ｘ１４３Ｇ及びＸ４３４Ｓ；ｅ）Ｘ０７９Ｃ及びＸ１４３Ｇ；ｆ）Ｘ３５０Ｔ及びＸ４３４Ｓ；ｇ）Ｘ３５１Ｅ及びＸ４０３Ｋ；ｈ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ０８４Ｌ；ｉ）Ｘ２４３Ｐ及びＸ２９０Ｖ；ｊ）Ｘ２９０Ｖ及びＸ３５０Ｅ；ｋ）Ｘ３０２Ｋ及びＸ４４１Ｗ；ｌ）Ｘ１５６Ｃ及びＸ４０４Ｋ；ｍ）Ｘ０６７Ｍ及びＸ４０４Ｋ；ｎ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ１４１Ｆ；ｏ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ３５１Ｅ；ｐ）Ｘ２３３Ｍ及びＸ４４５Ｙ；ｑ）Ｘ０６６Ｃ及びＸ２３３Ｍ；ｒ）Ｘ２１８Ｈ及びＸ２９０Ｖ；ｓ）Ｘ０６７Ｍ及びＸ３０２Ｈ；ｔ）Ｘ０６６Ｃ及びＸ１１９Ａ；ｕ）Ｘ２４３Ｐ及びＸ４４５Ｙ；ｖ）Ｘ１９２Ｆ及びＸ２４３Ｐ；ｗ）Ｘ１５６Ｃ及びＸ２４３Ｐ；ｘ）Ｘ０２３Ｌ及びＸ０６６Ｃ；ｙ）Ｘ０２３Ｌ－Ｘ１１９Ａ；ｚ）Ｘ０２０Ｅ及びＸ１９２Ｆ；ａａ）Ｘ１９２Ｆ及びＸ３１０Ｖ；ｂｂ）Ｘ０２３Ｍ及びＸ３０２Ｈ；ｃｃ）Ｘ１９２Ｆ及びＸ４１６Ｙ；ｄｄ）Ｘ１１９Ａ及びＸ３０２Ｈ；ｅｅ）Ｘ２３５Ｙ及びＸ４１６Ｙ；ｆｆ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ４０４Ｋ；ｇｇ）Ｘ０２３Ｍ及びＸ４４９Ｙ；ｈｈ）Ｘ１５８Ａ及びＸ１７２Ｌ；ｉｉ）Ｘ１７２Ｌ及びＸ２９０Ｖ；ｊｊ）Ｘ０２３Ｍ及びＸ２１０Ｌ；ｋｋ）Ｘ２１０Ｌ及びＸ４４９Ｙ；ｌｌ）Ｘ１５７Ｉ及びＸ２８１Ｄ；ｍｍ）Ｘ１６４Ｔ及びＸ２１５Ｒ；ｎｎ）Ｘ１４０Ｃ及びＸ４２２Ｖ；ｏｏ）Ｘ１１９Ａ及びＸ３０２Ｋ；又はｐｐ）Ｘ０５２Ｎ及びＸ４１６Ｙ（Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）に対応する残基位置での２つ以上の置換を有するグルコアミラーゼバリアントである。他の実施形態において、２つ以上のアミノ酸置換は、ａ）Ｄ２３６Ｓ及びＥ２８１Ｄ；ｂ）Ｓ２１５Ｒ及びＱ４４１Ｗ；ｃ）Ｎ３２１Ｄ及びＡ４３４Ｓ；ｄ）Ａ１４３Ｇ及びＡ４３４Ｓ；ｅ）Ａ０７９Ｃ及びＡ１４３Ｇ；ｆ）Ｋ３５０Ｔ及びＡ４３４Ｓ；ｇ）Ｎ３５１Ｅ及びＱ４０３Ｋ；ｈ）Ｇ０５２Ｎ及びＩ０８４Ｌ；ｉ）Ｔ２４３Ｐ及びＦ２９０Ｖ；ｊ）Ｆ２９０Ｖ及びＫ３５０Ｅ；ｋ）Ｎ３０２Ｋ及びＱ４４１Ｗ；ｌ）Ｆ１５６Ｃ及びＹ４０４Ｋ；ｍ）Ｓ０６７Ｍ及びＹ４０４Ｋ；ｎ）Ｇ０５２Ｎ及びＬ１４１Ｆ；ｏ）Ｇ０５２Ｎ及びＮ３５１Ｅ；ｐ）Ｓ２３３Ｍ及びＧ４４５Ｙ；ｑ）Ａ０６６Ｃ及びＳ２３３Ｍ；ｒ）Ｓ２１８Ｈ及びＦ２９０Ｖ；ｓ）Ｓ０６７Ｍ及びＮ３０２Ｈ；ｔ）Ａ０６６Ｃ及びＳ１１９Ａ；ｕ）Ｔ２４３Ｐ及びＧ４４５Ｙ；ｖ）Ｙ１９２Ｆ及びＴ２４３Ｐ；ｗ）Ｆ１５６Ｃ及びＴ２４３Ｐ；ｘ）Ｅ０２３Ｌ及びＡ０６６Ｃ；ｙ）Ｅ０２３Ｌ及びＳ１１９Ａ；ｚ）Ｓ０２０Ｅ及びＹ１９２Ｆ；ａａ）Ｙ１９２Ｆ及びＮ３１０Ｖ；ｂｂ）Ｅ０２３Ｍ及びＮ３０２Ｈ；ｃｃ）Ｙ１９２Ｆ及びＦ４１６Ｙ；ｄｄ）Ｓ１１９Ａ及びＮ３０２Ｈ；ｅｅ）Ｗ２３５Ｙ及びＦ４１６Ｙ；ｆｆ）Ｇ０５２Ｎ及びＹ４０４Ｋ；ｇｇ）Ｅ０２３Ｍ及びＦ４４９Ｙ；ｈｈ）Ｎ１５８Ａ及びＶ１７２Ｌ；ｉｉ）Ｖ１７２Ｌ及びＦ２９０Ｖ；ｊｊ）Ｅ０２３Ｍ及びＲ２１０Ｌ；ｋｋ）Ｒ２１０Ｌ及びＦ４４９Ｙ；ｌｌ）Ｔ１５７Ｉ及びＥ２８１Ｄ；ｍｍ）Ｉ１６４Ｔ及びＳ２１５Ｒ；ｎｎ）Ｍ１４０Ｃ及びＹ４２２Ｖ；ｏｏ）Ｓ１１９Ａ及びＮ３０２Ｋ；又はｐｐ）Ｇ０５２Ｎ及びＦ４１６Ｙであり得る。バリアントグルコアミラーゼは、２つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較した、ｉ）マルトースの加水分解の向上；ｉｉ）パノースの加水分解の向上；ｉｉｉ）プルランの加水分解の向上；ｉｖ）可溶性デンプンの糖化のより高いＰＩ（すなわち、可溶性デンプン又はその断片の加水分解の向上）；ｖ）マルトデキストリンの加水分解の向上；ｖｉ）熱安定性の向上；ｖｉｉ）ＤＰが２以上の糖へのより少ない転換；及び／又はｖｉｉｉ）グルコースの糖化収率の向上の１つ以上を示す。

【0099】

また、本明細書中で提供されるのは、追加の実施形態において、ａ）Ｘ１４１Ｆ、Ｘ２８１Ｄ、及びＸ４４１Ｗ；ｂ）Ｘ１４３Ｇ、Ｘ３２１Ｄ、及びＸ４３４Ｓ；ｃ）Ｘ３２１Ｄ、Ｘ３５０Ｔ、及びＸ４３４Ｓ；ｄ）Ｘ０６７Ｍ、Ｘ１５８Ａ、及びＸ２８１Ｄ；ｅ）Ｘ１５６Ｃ、Ｘ１９２Ｆ、及びＸ４０３Ｋ；ｆ）Ｘ０５２Ｎ、Ｘ１４０Ｃ、及びＸ４２２Ｖ；ｇ）Ｘ０６６Ｃ、Ｘ１１９Ａ、及びＸ１６４Ｔ；ｈ）Ｘ０６６Ｃ、Ｘ２３３Ｍ、及びＸ４４５Ｙ；ｉ）Ｘ１５６Ｃ、Ｘ１９２Ｆ、及びＸ２４３Ｐ；ｊ）Ｘ０２３Ｌ、Ｘ０６６Ｃ、及びＸ１１９Ａ；ｋ）Ｘ０２３Ｍ、Ｘ１１９Ａ、及びＸ４０４Ｋ；ｌ）Ｘ３１０Ｖ、Ｘ４１６Ｙ、及びＸ４４５Ｙ；ｍ）Ｘ１５８Ａ、Ｘ２２１Ｒ、及びＸ２９０Ｖ；ｎ）Ｘ０２３Ｍ、Ｘ０５２Ｎ、及びＸ４０４Ｋ；ｏ）Ｘ０８１Ｓ、Ｘ１５７Ｉ、及びＸ２３６Ｓ；ｐ）Ｘ２４３Ｐ、Ｘ３０２Ｋ、及びＸ４１６Ｙ；ｑ）Ｘ１４０Ｃ、Ｘ３０２Ｋ、及びＸ４２２Ｖ；又はｒ）Ｘ０５２Ｎ、Ｘ４１６Ｙ、及びＸ４４５Ｙ（Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）に対応する残基位置での３つ以上の置換を有するグルコアミラーゼバリアントである。他の実施形態において、３つ以上のアミノ酸置換は、ａ）Ｌ１４１Ｆ、Ｅ２８１Ｄ、及びＱ４４１Ｗ；ｂ）Ａ１４３Ｇ、Ｎ３２１Ｄ、及びＡ４３４Ｓ；ｃ）Ｎ３２１Ｄ、Ｋ３５０Ｔ、及びＡ４３４Ｓ；ｄ）Ｓ０６７Ｍ、Ｎ１５８Ａ、及びＥ２８１Ｄ；ｅ）Ｆ１５６Ｃ、Ｙ１９２Ｆ、及びＱ４０３Ｋ；ｆ）Ｇ０５２Ｎ、Ｍ１４０Ｃ、及びＹ４２２Ｖ；ｇ）Ａ０６６Ｃ、Ｓ１１９Ａ、及びＩ１６４Ｔ；ｈ）Ａ０６６Ｃ、Ｓ２３３Ｍ、及びＧ４４５Ｙ；ｉ）Ｆ１５６Ｃ、Ｙ１９２Ｆ、及びＴ２４３Ｐ；ｊ）Ｅ０２３Ｌ、Ａ０６６Ｃ、及びＳ１１９Ａ；ｋ）Ｅ０２３Ｍ、Ｓ１１９Ａ、及びＹ４０４Ｋ；ｌ）Ｎ３１０Ｖ、Ｆ４１６Ｙ、及びＧ４４５Ｙ；ｍ）Ｎ１５８Ａ、Ｓ２２１Ｒ、及びＦ２９０Ｖ；ｎ）Ｅ０２３Ｍ、Ｇ０５２Ｎ、及びＹ４０４Ｋ；ｏ）Ｄ０８１Ｓ、Ｔ１５７Ｉ、及びＤ２３６Ｓ；ｐ）Ｔ２４３Ｐ、Ｎ３０２Ｋ、及びＦ４１６Ｙ；ｑ）Ｍ１４０Ｃ、Ｎ３０２Ｋ、及びＹ４２２Ｖ；又はｒ）Ｇ０５２Ｎ、Ｆ４１６Ｙ、及びＧ４４５Ｙであり得る。バリアントグルコアミラーゼは、３つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較した、ｉ）マルトースの加水分解の向上；ｉｉ）パノースの加水分解の向上；ｉｉｉ）プルランの加水分解の向上；ｉｖ）可溶性デンプンの糖化のより高いＰＩ（すなわち、可溶性デンプン又はその断片の加水分解の向上）；ｖ）マルトデキストリンの加水分解の向上；ｖｉ）熱安定性の向上；ｖｉｉ）ＤＰが２以上の糖へのより少ない転換；及び／又はｖｉｉｉ）グルコースの糖化収率の向上の１つ以上を示す。

【0100】

加えて、本明細書中で提供されるのは、追加の実施形態において、ａ）Ｘ２１５Ｒ、Ｘ２３６Ｓ、Ｘ２８１Ｄ、及びＸ４４１Ｗ；ｂ）Ｘ０５２Ｎ、Ｘ０８４Ｌ、Ｘ１４０Ｃ、及びＸ４２２Ｖ；ｃ）Ｘ０２０Ｅ、Ｘ１５６Ｃ、Ｘ１９２Ｆ、及びＸ２４３Ｐ；ｄ）Ｘ０２３Ｍ、Ｘ２２１Ｒ、及びＸ４０４Ｋ；ｅ）Ｘ１５８Ａ、Ｘ１７２Ｌ、Ｘ２２１Ｒ、及びＸ２９０Ｖ；ｆ）Ｘ１４０Ｃ、Ｘ１６５Ｗ、Ｘ３０２Ｋ、及びＸ４２２Ｖ；又はｇ）Ｘ１１９Ａ、Ｘ２５３Ｆ、Ｘ３１０Ｖ、及びＸ４０３Ｋ（Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）に対応する残基位置での４つ以上の置換を有するグルコアミラーゼバリアントである。他の実施形態において、４つ以上のアミノ酸置換は、ａ）Ｓ２１５Ｒ、Ｄ２３６Ｓ、Ｅ２８１Ｄ、及びＱ４４１Ｗ；ｂ）Ｇ０５２Ｎ、Ｉ０８４Ｌ、Ｍ１４０Ｃ、及びＹ４２２Ｖ；ｃ）Ｓ０２０Ｅ、Ｆ１５６Ｃ、Ｙ１９２Ｆ、及びＴ２４３Ｐ；ｄ）Ｅ０２３Ｍ、Ｓ１１９Ａ、Ｓ２２１Ｒ、及びＹ４０４Ｋ；ｅ）Ｎ１５８Ａ、Ｖ１７２Ｌ、Ｓ２２１Ｒ、及びＦ２９０Ｖ；ｆ）Ｍ１４０Ｃ、Ｙ１６５Ｗ、Ｎ３０２Ｋ、及びＹ４２２Ｖ；又はｇ）Ｓ１１９Ａ、Ｅ２５３Ｆ、Ｎ３１０Ｖ、及びＱ４０３Ｋであり得る。バリアントグルコアミラーゼは、４つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較した、ｉ）マルトースの加水分解の向上；ｉｉ）パノースの加水分解の向上；ｉｉｉ）プルランの加水分解の向上；ｉｖ）可溶性デンプンの糖化のより高いＰＩ（すなわち、可溶性デンプン又はその断片の加水分解の向上）；ｖ）マルトデキストリンの加水分解の向上；ｖｉ）熱安定性の向上；ｖｉｉ）ＤＰが２以上の糖へのより少ない転換；及び／又はｖｉｉｉ）グルコースの糖化収率の向上の１つ以上を示す。

【0101】

さらに、本明細書中で提供されるのは、追加の実施形態において、Ｘ０６７Ｍ、Ｘ１５７Ｉ、Ｘ２１８Ｈ、Ｘ３０２Ｈ、及びＸ４１６Ｙ（Ｘは、配列番号４内の等価の位置及び／又は親グルコアミラーゼ若しくはその断片（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置に対応するあらゆるアミノ酸である）に対応する残基位置での５つ以上の置換を有するグルコアミラーゼバリアントである。他の実施形態において、４つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ０６７Ｍ、Ｔ１５７Ｉ、Ｓ２１８Ｈ、Ｎ３０２Ｈ、及びＦ４１６Ｙであり得る。バリアントグルコアミラーゼは、５つ以上の当該置換を欠いている親グルコアミラーゼと比較した、ｉ）マルトースの加水分解の向上；ｉｉ）パノースの加水分解の向上；ｉｉｉ）プルランの加水分解の向上；ｉｖ）可溶性デンプンの糖化のより高いＰＩ（すなわち、可溶性デンプン又はその断片の加水分解の向上）；ｖ）マルトデキストリンの加水分解の向上；ｖｉ）熱安定性の向上；ｖｉｉ）ＤＰが２以上の糖へのより少ない転換；及び／又はｖｉｉｉ）グルコースの糖化収率の向上の１つ以上を示す。

【0102】

更なる実施形態において、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個、又はそれを超える）のコンセンサスＮ結合グリコシル化部位（すなわち、ＮＸＳ／ＴコンセンサスＮ結合グリコシル化部位（Ｘは、プロリン以外のあらゆるアミノ酸であり得、Ｎ（Ａｓｐ）はグリコシル化されている））は、本明細書中で開示されるバリアントグルコアミラーゼのいずれか、又は配列番号４のグルコアミラーゼ中に導入されて、グルコアミラーゼの１つ以上の性質を向上させることができ、例えば、限定されないが、１つ以上の追加のグリコシル化部位を欠いている親グルコアミラーゼと比較した、ｉ）マルトースの加水分解の向上；ｉｉ）パノースの加水分解の向上；ｉｉｉ）プルランの加水分解の向上；ｉｖ）可溶性デンプンの糖化のより高いＰＩ（すなわち、可溶性デンプン又はその断片の加水分解の向上）；ｖ）マルトデキストリンの加水分解の向上；ｖｉ）熱安定性の向上；ｖｉｉ）ＤＰが２以上の糖へのより少ない転換；及び／又はｖｉｉｉ）グルコースの糖化収率の向上がある。バリアントグルコアミラーゼポリペプチド中にグリコシル化部位を導入するアミノ酸置換は、配列番号４の位置８１、８３、１５３、３７０、若しくは３７２に対応する残基位置、及び／又は親グルコアミラーゼ内の等価の位置にてなされ得る。一部の実施形態において、前記１つ以上の置換は、位置Ｄ８１Ｎ、Ｋ８３Ｔ、Ａ１５３Ｔ、Ｓ３７０Ｎ、及び／又はＡ３７２Ｓでの１つ以上の置換を含む。

【0103】

実施例７に示されるように、位置７５でのＡｓｎグリコシル化部位の置換が、触媒活性の大幅な減少の原因となることが観察された。したがって、一部の実施形態において、本明細書中で開示されるバリアントグルコアミラーゼは、配列番号４の位置Ｎ０７５及び／又は親グルコアミラーゼ（例えば、以下に限定されないが、配列番号２、配列番号３、又は配列番号５～３７のいずれか）内の等価の位置にて、Ｎ結合グリコシル化を有する。

【0104】

ＩＩＩ．グルコアミラーゼの生成
本明細書中で開示されるバリアントグルコアミラーゼは、例えば分泌又は細胞内発現によって、宿主細胞において産生され得る。グルコアミラーゼを含む培養細胞材料（例えば、全細胞ブロス）は、グルコアミラーゼの、細胞培地中への分泌後に得ることができる。任意選択により、グルコアミラーゼは、最終グルコアミラーゼの所望の純度に応じて、宿主細胞から単離され得るか、又はさらに細胞ブロスから単離され得る。グルコアミラーゼをコードする遺伝子は、当該技術において周知の方法に従って、クローニング且つ発現され得る。適切な宿主細胞として、細菌、真菌（酵母及び糸状菌を含む）、及び植物細胞（藻類を含む）が挙げられる。特に有用な宿主細胞として、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種（例えば、限定されないが、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ））、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種（例えばトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））、又はマイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属種（例えばマイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ））が挙げられる。他の宿主細胞として、細菌細胞、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種（例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属種が挙げられる。適切な酵母宿主生物が、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種又はサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種から選択され得、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又はシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する種、例えば分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）種が挙げられる。メチロトローフ酵母種であるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株を宿主生物として用いることができる。

【0105】

加えて、宿主は、１種以上のアクセサリ酵素、タンパク質、ペプチドを発現し得る。これらは、液化、糖化、発酵、ＳＳＦ、及び下流プロセスに有益であり得る。さらに、宿主細胞は、種々の原料を消化するのに用いられる酵素に加えて、エタノール及び他の生化学物質又は生体物質を産生し得る。そのような宿主細胞は、酵素を加える必要性を低減又は排除するために、発酵プロセス、又は同時糖化発酵プロセスに有用であり得る。

【0106】

Ａ．ベクター
本明細書中で開示されるバリアントグルコアミラーゼポリペプチドをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を、宿主細胞中での発現に適するように構築することができる。遺伝暗号の知られている縮重のおかげで、同一のアミノ酸配列をコードする様々なポリヌクレオチドを、ルーチン技術により設計且つ作製することができる。所望の宿主細胞に応じて、発現の試行前にコドン最適化が必要とされる場合があることも知られている。

【0107】

本開示のバリアントグルコアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ベクター中に組み込むことができる。ベクターを、知られている形質転換技術（例えば、以下に開示されるもの）を用いて宿主細胞に移すことができる。

【0108】

適切なベクターは、宿主細胞に形質転換され得、且つ／又は宿主細胞内で複製され得るものであり得る。例えば、本明細書中で開示されるバリアントグルコアミラーゼポリペプチドをコードする核酸を含むベクターは、当該ベクターの伝達（ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ）及び増幅（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）の手段としての細菌宿主細胞において形質転換且つ／又は複製され得る。また、当該ベクターは、コードポリヌクレオチドが機能的グルコアミラーゼ酵素として発現されるように、発現宿主に適切に形質転換され得る。

【0109】

代表的な有用なベクターとして、宿主のゲノム中に挿入され得るｐＴｒｅｘ３ｇＭ（米国特許出願公開第２０１３０３２３７９８号明細書参照）及びｐＴＴＴ（米国特許出願公開第２０１１００２０８９９号明細書参照）がある。ベクターｐＴｒｅｘ３ｇＭ及びｐＴＴＴは双方とも、これらが本発明のバリアントグルコアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、且つこれを発現するように、ルーチン技術により修飾され得る。

【0110】

発現ベクターは、通常、制御ヌクレオチド配列、例えば、プロモータ、オペレータ、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意選択でリプレッサ遺伝子、又は１つ以上のアクチベータ遺伝子を含む。加えて、発現ベクターは、ペルオキシソーム等の宿主細胞オルガネラ、又は特定の細胞コンパートメントにグルコアミラーゼを標的化することができるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る。制御配列の指向下での発現のため、バリアントグルコアミラーゼの核酸配列は、発現に関して適切な方法で、制御配列に作動可能に連結されている。

【0111】

本明細書中で開示されるバリアントグルコアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモータに作動可能に連結され得、これにより宿主細胞中での転写が可能となる。プロモータは、選択された宿主細胞中で転写活性を示すあらゆるＤＮＡ配列であり得、且つ宿主細胞に対して相同又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子由来であり得る。とりわけ細菌宿主中でグルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列の転写を指向するためのプロモータの例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモータ、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガロース遺伝子ｄａｇＡ又はｃｅｌＡプロモータ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモータ、バチルス・ステアロテェルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモータ、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモータ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモータ等が挙げられる。

【0112】

真菌宿主中での転写に有用なプロモータの例として、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α－アミラーゼ、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）酸安定性α－アミラーゼ、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ等をコードする遺伝子に由来するものが挙げられる。グルコアミラーゼをコードする遺伝子が、細菌種、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現される場合、適切なプロモータが、例えば、Ｔ７プロモータ及びファージラムダプロモータが挙げられるバクテリオファージプロモータから選択され得る。この方針に沿って、酵母種中での発現に適したプロモータの例として、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧａｌ１及びＧａｌ１０プロモータ、並びにピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞中での発現は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来の内因性誘導性プロモータであるｃｂｈ１を含むことが多い。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）４０（２）：１５８－６５参照。

【0113】

コード配列は、シグナル配列と作動可能に連結され得る。当該シグナル配列をコードするＤＮＡは、発現させる関心対象のバリアントグルコアミラーゼ遺伝子と天然に会合したＤＮＡ配列であってもよいし、当該バリアントグルコアミラーゼ（すなわち、バリアントが由来した種）とは異なる属又は種に由来してもよい。ＤＮＡ構築物又はベクターを含むシグナル配列及びプロモータ配列が、真菌宿主細胞中に導入され得、且つ同じ源に由来し得る。例えば、シグナル配列は、ｃｂｈ１プロモータに作動可能に連結されているトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１シグナル配列であり得る。

【0114】

また、発現ベクターは、適切な転写ターミネータと、真核生物中では、グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたポリアデニル化配列とを含み得る。終結配列及びポリアデニル化配列は、適切には、プロモータと同じ源に由来し得る。

【0115】

また、ベクターは、例えば、生成物が単離宿主細胞の欠陥を補完する遺伝子を含み得、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）若しくはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性、例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性、若しくはテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子である選択可能マーカーを含み得る。さらに、ベクターは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属選択マーカー（例えば、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、及びｘｘｓＣ）、ハイグロマイシン耐性を生じさせるマーカーを含んでもよいし、選択が、当該技術において知られている同時形質転換によって達成されてもよい。例えば、国際公開第９１／１７２４３号パンフレット参照。

【0116】

Ｂ．宿主細胞の形質転換及び培養
ＤＮＡ構築物又は発現ベクターのいずれかを含む単離細胞は、宿主細胞として、バリアントグルコアミラーゼの組換え生成に有利に用いられる。当該細胞は、当該酵素をコードするＤＮＡ構築物により、便宜的には当該ＤＮＡ構築物を宿主の染色体内に（１つ以上のコピー数で）組み込むことによって形質転換され得る。当該ＤＮＡ配列は細胞中で安定して維持され易いことから、この組込みは有利であると一般に考えられている。宿主の染色体中へのＤＮＡ構築物の組込みは、従来方法に従って、例えば相同組換え又は非相同組換えによって、実行され得る。これ以外にも、当該細胞は、様々なタイプの宿主細胞と関連した発現ベクターにより形質転換され得る。

【0117】

適切な細菌宿主生物の例として、グラム陽性細菌種、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（以前はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））・ステアロサーモフィラス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含むバチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；ストレプトマイセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）等のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属種；ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種を含む乳酸細菌種；ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）を含むラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種；ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種；ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属種；並びにレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種がある。これ以外にも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、又はシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に属するグラム陰性細菌種の株を宿主生物として選択することができる。

【0118】

適切な酵母宿主生物は、バイオテクノロジー関連の酵母種、例えば、以下に限定されないが：酵母種、例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属種、若しくはクリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイニア（Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種、又はサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又はシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する種、例えば分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）種から選択され得る。メチロトローフ酵母種であるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株が、宿主生物として用いられ得る。これ以外にも、宿主生物は、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種であり得る。

【0119】

糸状菌のうち適切な宿主生物として、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の種、例えば、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、又はアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）が挙げられる。これ以外にも、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）等のフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属種の株、又はリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）等のリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属種の株が、宿主生物として用いられ得る。他の適切な株として、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属及びムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の種が挙げられる。加えて、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種が、宿主として用いられ得る。真菌宿主細胞によって発現されるグルコアミラーゼは、グリコシル化され得、すなわちグリコシル部分を含むこととなる。グリコシル化パターンは、野生型グルコアミラーゼで存在するものと同じであり得るか、又は異なり得る。グリコシル化のタイプ及び／又は程度により、酵素的特性及び／又は生化学的特性の変化が付与され得る。

【0120】

発現宿主から遺伝子を欠失させ、そこで遺伝子欠損を、形質転換された発現ベクターによって治癒することができることが有利である。知られている方法を用いて、１つ以上の不活化遺伝子を有する真菌宿主細胞を得ることができる。非限定の一実施形態において、クローニングされた、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種又は他の糸状菌宿主から、任意の遺伝子（例えば、ｃｂｈ１遺伝子、ｃｂｈ２遺伝子、ｅｇｌ１遺伝子、及びｅｇｌ２遺伝子）を欠失させることができる。遺伝子欠失は、当該技術において知られている方法によって、不活化されるべき所望の遺伝子のある形態をプラスミド中に挿入することによって達成され得る。

【0121】

一般的な形質転換技術が、当該技術において知られている。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）参照。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属における異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書中で説明されている。また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属株の形質転換については、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：９９１－１００１参照。グルコアミラーゼをコードする核酸が宿主細胞の染色体中に安定的に組み込まれるベクターシステムによって、遺伝的に安定な形質転換体を構築することができる。次いで、知られている技術によって、形質転換体が選択且つ精製される。欠失プラスミドは、その後、所望の遺伝子コード領域の内部にある適切な制限酵素部位にて切断されて、遺伝子コード配列又はその部分は、選択可能マーカーにより置換される。欠失されるべき遺伝子の遺伝子座由来のフランキングＤＮＡ配列（好ましくは約０．５～２．０ｋｂ）は、マーカー遺伝子のいずれかの側に留まっている。適切な欠失プラスミドはその中に、一般に、フランキングＤＮＡ配列及び選択可能なマーカー遺伝子が挙げられる欠失される遺伝子を含有する断片が単一線形ピースとして取り除かれるのを可能にするための、固有の制限酵素部位が存在することとなる。

【0122】

用いた宿主細胞に応じて、転写後及び／又は翻訳後修飾がなされ得る。転写後及び／又は翻訳後修飾の非限定的な一例として、ポリペプチドの「クリッピング」又は「トランケーション」がある。別の例において、このクリッピングは、成熟グルコアミラーゼポリペプチドをとって、さらにＮ又はＣ末端アミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個、又はそれを超えるＮ又はＣ末端アミノ酸）を除去して、酵素活性を保持するグルコアミラーゼのトランケート形態を生成することであり得る。

【0123】

転写後又は翻訳後修飾の他の例として、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、脂質化、及びチロシン、セリン、又はトレオニンのリン酸化が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、タンパク質が受け得る転写後又は翻訳後修飾のタイプは、タンパク質が発現される宿主生物に依存し得ることを理解するであろう。

【0124】

発現後のポリペプチドの更なる配列修飾が起こり得る。配列修飾として、酸化、脱グリコシル化、糖化等が挙げられるが、これらに限定されない。グリケーションは、とりわけ３０℃を超える温度及び中性又はアルカリ性ｐＨにて、グルコース又は他の還元糖とのインキュベーションを受けた場合に、グルコアミラーゼの活性に影響を及ぼし得ることが知られている。リシン残基を排除するためのタンパク質工学は、そのような修飾を防止するために用いることができる。一例を、米国特許第８，５０７，２４０号明細書中で見出すことができる。例えば、酵母発現は、明白に分子量の増大を生じさせる高グリコシル化ポリペプチドを生じさせ得る。また、国際公開日が２０１３年８月１５日の国際公開第２０１３／１１９４７０号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）は、グリコシル化の増大に起因すると考えられる、安定性が増大したフィターゼに関する。

【0125】

Ｃ．発現及び発酵
本明細書中で開示されるバリアントグルコアミラーゼを生成する方法は、当該酵素の生成を促す条件下で宿主細胞を培養することと、当該細胞及び／又は培養培地から当該酵素を回収することとを含み得る。

【0126】

細胞を培養するのに用いられる培地は、宿主細胞を増殖させ、且つバリアントグルコアミラーゼポリペプチドの発現を得るのに適した従来のあらゆる培地であり得る。適切な培地及び培地構成要素は、商業的供給業者から入手可能であるか、又は公開されたレシピ（例えば、米国菌株保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログに記載されている）に従って調製され得る。

【0127】

当該技術において周知の発酵方法のいずれかを適切に用いて、上記のような形質転換真菌株又は誘導真菌株を発酵させることができる。一部の実施形態において、真菌細胞は、バッチ発酵条件下又は連続発酵条件下で増殖する。

【0128】

Ｄ．富化精製方法
分離技術及び濃縮技術が当該技術において知られており、従来の方法を用いて、本発明のバリアントグルコアミラーゼポリペプチドを含む濃縮溶液又はブロスを調製することができる。

【0129】

発酵後に発酵ブロスが得られ、微生物細胞、及び残留する生発酵材料等の種々の懸濁固体が、従来の分離技術によって除去されて、グルコアミラーゼ溶液が得られる。濾過、遠心分離、精密濾過、回転真空ドラム濾過、限外濾過、遠心分離に続いて、限外濾過、抽出、又はクロマトグラフィ等が一般に用いられる。

【0130】

時には、回収を最適化するために、グルコアミラーゼポリペプチドを含む溶液又はブロスを濃縮することが望ましい場合がある。未濃縮の溶液又はブロスの使用により、典型的には、富化又は精製された酵素沈殿物を集めるためのインキュベーション時間が増すであろう。

【0131】

ＩＶ．組成物
また、本発明は、ポリペプチド（グルコアミラーゼ等、例えば、本明細書中で開示されるバリアントグルコアミラーゼのいずれか）及び／又はデンプン基質を含む組成物に関する。一部の実施形態において、配列番号４（又は配列番号２～３０のいずれか）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントグルコアミラーゼもまた、酵素組成物中で用いることができる。好ましくは、組成物は、約４～４０℃の温度及び約３～７のｐＨにて、ローカラー（ｌｏｗ ｃｏｌｏｒ）、低臭気、及び許容できる貯蔵安定性等の所望の特徴を実現するように製剤化される。

【0132】

本組成物は、主要酵素構成要素として、本発明のバリアントグルコアミラーゼポリペプチドを含み得る。これ以外にも、本組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、ベータ－グルコシダーゼ、ベータ－アミラーゼ、イソアミラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、プルラナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、又はそれらの組合せ等の複数の酵素活性を含み得、これらは、当業者に周知の有効量で加えられ得る。

【0133】

本ポリペプチド組成物は、当該技術において知られている方法に従って調製され得、且つ液体組成物の形態又は乾燥組成物の形態であり得る。例えば、本バリアントグルコアミラーゼを含む組成物は、水性又は非水性の製剤、顆粒、粉末、ゲル、スラリー、ペースト等であり得、さらに、バッファ、塩、保存料、水、共溶媒、界面活性剤等と一緒に、本明細書中で列挙される追加の酵素のいずれか１つ以上を含み得る。そのような組成物は、スラリー、水浴、洗浄機、食品又は飲料製品等の中に既に存在する内在性酵素又は他の成分、例えば、内在性植物（藻類を含む）酵素、先行するプロセシング工程由来の残留酵素等と組み合わせて機能し得る。本組成物中に含まれるポリペプチドは、当該技術において知られている方法に従って安定化され得る。

【0134】

本組成物は、ポリペプチドを発現する細胞、例えば発酵から生成物を生成することができる細胞であり得る。そのような細胞は、適切な安定剤と共に液体形態又は乾燥形態で提供され得る。そのような細胞は、上記したもの等の追加のポリペプチドをさらに発現し得る。

【0135】

本発明のポリペプチド組成物の投与量、及び当該組成物を用いる他の条件は、当該技術において知られている方法に基づいて決定され得る。

【0136】

上記組成物は、液化、糖化、及び／又は発酵プロセス、好ましくはデンプン転化、とりわけシロップ及び発酵産物、例えばエタノールの生成に用いるのに適している。また、本組成物は、動物栄養素（例えば、動物飼料の構成要素）及び発酵飲料製品に用いるのに適している。

【0137】

Ｖ．使用及び方法
また、本発明は、液化プロセス、糖化プロセス、及び／又は発酵プロセスにおける本発明のバリアントグルコアミラーゼポリペプチド又は組成物の使用に関する。本バリアントグルコアミラーゼポリペプチド又は組成物は、単一のプロセス、例えば、液化プロセス、糖化プロセス、又は発酵プロセスに用いられ得る。また、本バリアントグルコアミラーゼポリペプチド又は組成物は、好ましくはデンプン転化に関連して、プロセスの組合せに用いられてもよく、例えば、液化糖化プロセスに用いられてもよいし、液化発酵プロセスに用いられてもよいし、糖化発酵プロセスに用いられてもよい。

【0138】

Ａ．糖化
液化デンプンは、任意選択により別の酵素の存在下で、アルファ－アミラーゼ及びバリアントグルコアミラーゼを用いて、より低いＤＰ（例えば、ＤＰ１＋ＤＰ２）の糖に富むシロップに糖化され得る。糖化生成物の正確な組成は、用いられる酵素の組合せ、及び加工デンプンの種類に依存する。有利には、提供されたバリアントグルコアミラーゼを用いて得られるシロップは、含有する糖化デンプン中の総オリゴ糖のＤＰ１の重量パーセントが９０％を超え得、例えば９０％～９８％又は９５％～９７％である。糖化デンプン中のＤＰ２の重量パーセントは、約３％未満、例えば、０～３％又は０～２．８％とできる限り低くてよい。

【0139】

液化は、一般に連続プロセスとして実行されるが、糖化は、バッチプロセスとして実施されることが多い。糖化条件は、液化物の性質、及び利用可能な酵素の種類に依存する。場合により、糖化プロセスは、約６０～６５℃の温度及び約４．０～４．５のｐＨ、例えばｐＨ４．３を含み得る。糖化は、例えば、約４０℃、約５０℃、又は約５５℃～約６０℃、又は約６５℃の温度にて実行することができ、液化物を冷却する必要がある。必要に応じて、ｐＨも調整されてよい。糖化は、通常、充填又は空にするのに数時間を要し得る撹拌槽中で実施される。酵素は、典型的には、タンクに充填されるに従い、乾燥固体に対して一定の割合で加えられるか、又は充填段階の開始時に単回量として加えられる。シロップを製造するための糖化反応は、典型的には約２４～７２時間、例えば２４～４８時間にわたって実施される。予備糖化が、同時糖化発酵（ＳＳＦ）において、糖化の前に、３０～６５℃、典型的には約６０℃の温度にて、典型的には４０～９０分間、加えられ得る。

【0140】

Ｂ．生デンプン加水分解
本発明は、生デンプン又は顆粒状デンプンからグルコース等を生成するための、本発明のバリアントグルコアミラーゼの使用を提供する。一般に、本発明のグルコアミラーゼを、単独で、又はアルファ－アミラーゼの存在下で、生デンプン加水分解（ＲＳＨ）プロセス又は顆粒状デンプンの加水分解（ＧＳＨ）プロセスで用いて、所望の糖及び発酵産物を生成することができる。顆粒状デンプンは、ゼラチン化温度未満で酵素加水分解によって可溶化される。そのような「低温」システム（「ノークック」又は「コールドクック」としても知られている）は、従来のシステムよりも高い濃度の乾燥固体（例えば最大４５％）をプロセシングすることができることが報告されている。

【0141】

「生デンプン加水分解」プロセス（ＲＳＨ）は、従来のデンプン処理プロセスと異なり、典型的には少なくともグルコアミラーゼ及び／又はアミラーゼの存在下で、デンプン基質のゼラチン化温度以下にて顆粒状デンプンを順次、又は同時に糖化且つ発酵させることを含む。

【0142】

また、本発明のバリアントグルコアミラーゼは、少なくとも４つのグルコシル残基を含む分子中のアルファ－（１，６）－グルコシド結合のみを加水分解する酵素と組み合わせて用いられ得る。好ましくは、本発明のバリアントグルコアミラーゼは、プルラナーゼ又はイソアミラーゼと組み合わせて用いられる。デンプンの脱分岐のためのイソアミラーゼ及びプルラナーゼの使用、酵素の分子特性、及びグルコアミラーゼとの酵素の潜在的使用は、Ｇ．Ｍ．Ａ．ｖａｎ Ｂｅｙｎｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｒｃｈ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５，１０１－１４２中で説明されている。

【0143】

Ｃ．発酵
可溶性デンプン加水分解物、特にグルコースに富むシロップは、典型的には３２℃前後、例えば３０℃～３５℃の温度にて、デンプン加水分解物を発酵生物と接触させることによって発酵させることができる。「発酵生物」とは、発酵プロセスでの使用に適しており、且つ所望の発酵産物を生成することができる、細菌及び真菌生物を含むあらゆる生物を指す。とりわけ適切な発酵生物は、グルコース又はマルトース等の糖を直接的又は間接的に所望の発酵産物へと発酵、すなわち変換することができる。発酵生物の例として、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを発現する酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及び細菌、例えばザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）が挙げられる。エタノール生産微生物は、キシロースをキシルロースに変換するキシロースレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼを発現し得る。例えば、高温に抵抗できるエタノール生産微生物の改良株が、当該技術において知られており、用いることができる。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｇｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ Ｘｕｅ Ｂａｏ２７：１０４９－５６参照。アルコール製造に用いることができる酵母として、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含むサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種、並びにクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラカンケア（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）属、及びシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種が挙げられるが、これらに限定されない。複数の酵母菌株は市販で入手できるが、それらの多くは、例えば高アルコール製造、急速な増殖速度等の所望の特性のために選択又は遺伝子操作されている。発酵の温度及びｐＨは、発酵生物に依存することとなる。発酵によってクエン酸及び乳酸等の他の代謝産物を生成する微生物も、当該技術において知られている。例えば、Ｐａｐａｇｉａｎｎｉ（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２５：２４４－６３；Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２７：１４５－５２参照。

【0144】

糖化プロセス及び発酵プロセスは、ＳＳＦプロセスとして実行され得る。ＳＳＦプロセスは、一部の実施形態において、ＳＳＦ全体を通してバリアントグルコアミラーゼを連続的に発現且つ分泌する真菌細胞により実施され得る。また、バリアントグルコアミラーゼを発現する真菌細胞は、発酵微生物、例えばエタノール生産微生物であり得る。ゆえに、エタノール製造が、外部からの酵素の添加が比較的少量で済むか、又はその必要がないほどに十分なバリアントグルコアミラーゼを発現する真菌細胞を用いて実行され得る。真菌宿主細胞は、適切に操作された真菌株から選択され得る。また、バリアントグルコアミラーゼに加えて、他の酵素を発現且つ分泌する真菌宿主細胞が用いられ得る。そのような細胞は、アミラーゼ及び／又はプルラナーゼ、フィターゼ、アルファ－グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、ベータ－アミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、他のヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、ベータ－グルコシダーゼ、ペクチナーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、又は他の酵素を発現し得る。発酵に続いて、その後のエタノールの回収が行われ得る。

【0145】

Ｄ．発酵産物
用語「発酵産物」は、発酵生物を用いる発酵プロセスを含むプロセスによって生成される生成物を意味する。本発明に従って意図される発酵産物として、アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセロール、メタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、グリセリン、ソルビトール、及びキシリトール）；有機酸（例えば、酢酸、アセトン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５－ジケト－Ｄ－グルコン酸、ギ酸、フマル酸、グルカル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタル酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、プロピオン酸、コハク酸、及びキシロン酸）；ケトン（例えばアセトン）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、セリン、及びトレオニン）；アルカン（例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、及びドデカン）；シクロアルカン（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、及びシクロオクタン）；アルケン（例えば、ペンテン、ヘキセン、ヘプテン、及びオクテン）；気体（例えば、メタン、水素（Ｈ_２）、二酸化炭素（ＣＯ_２）、及び一酸化炭素（ＣＯ））；抗生物質（例えば、ペニシリン及びテトラサイクリン）；酵素；ビタミン（例えば、リボフラビン、Ｂ_１２、ベータ－カロテン）；並びにホルモンが挙げられる。

【0146】

好ましい態様において、発酵産物は、エタノール、例えば燃料エタノール；飲用エタノール、すなわち飲用中性スピリット；又は工業用エタノール、若しくは飲用アルコール産業（例えば、ビール及びワイン）、乳業（例えば、発酵乳製品）、皮革産業、及びタバコ産業で用いられる製品である。用いられる好ましい発酵プロセスとして、当該技術において周知のアルコール発酵プロセスが挙げられる。好ましい発酵プロセスは、当該技術において周知の嫌気性発酵プロセスである。

【0147】

Ｅ．醸造
ビールを製造するプロセスが、当該技術において周知である。例えば、Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｋｕｎｚｅ（２００４）“Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｒｅｗｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｌｔｉｎｇ，”Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅａｃｈｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ），３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ参照。簡潔に記せば、当該プロセスは、（ａ）マッシュを調製することと、（ｂ）マッシュを濾過して麦芽汁を調製することと、（ｃ）麦芽汁を発酵させて、発酵飲料、例えばビールを得ることとを含む。

【0148】

バリアントグルコアミラーゼをアミラーゼ並びに任意選択でプルラナーゼ及び／又はイソアミラーゼと組み合わせて含む醸造組成物は、上記の工程（ａ）のマッシュに、すなわちマッシュの調製中に加えられ得る。代わりに、又は加えて、醸造組成物は、上記の工程（ｂ）のマッシュに、すなわちマッシュの濾過中に加えられ得る。代わりに、又は加えて、醸造組成物は、上記の工程（ｃ）の麦芽汁に、すなわち麦芽汁の発酵中に加えられ得る。

【0149】

Ｆ．動物の栄養
本明細書中に記載されるバリアントグルコアミラーゼ及び組成物は、デンプン消化率を増大させるために動物用の飼料添加剤として用いることができる。本明細書中に記載されるのは、動物におけるデンプン消化率を増大させるための方法である。

【0150】

用語「動物」は、動物界に属するあらゆる生物を指し、限定されないが、哺乳動物（ヒトを除く）、非ヒト動物、家庭内動物、家畜、農耕動物、動物園の動物、種畜等が挙げられる。例えば、全ての非反芻動物及び反芻動物を挙げることができる。一実施形態において、動物は、非反芻動物、すなわち単胃動物である。単胃動物の例として、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ等のブタ（ｐｉｇ，ｓｗｉｎｅ）；七面鳥、アヒル、鶏、ブロイラー、産卵鶏等の家禽類；サケ、マス、ティラピア、ナマズ、及びコイ等の魚；並びにエビ及びクルマエビ等の甲殻類が挙げられるが、これらに限定されない。更なる実施形態において、動物は、ウシ、幼ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、バイソン、アメリカヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーン、及びニルガイが挙げられるが、それらに限定されない反芻動物である。

【0151】

用語「動物飼料」、「飼料」、「飼料原料」、及び「家畜飼料」は、互換的に用いられており、ａ）穀類、例えば小粒穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライ麦、エンバク、及びそれらの組合せ）及び／又は大粒穀物（例えば、トウモロコシ若しくはソルガム）；ｂ）穀類の副産物、例えばトウモロコシグルテンミール、可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（ＤＤＧＳ）（特にトウモロコシベースの可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（ｃＤＤＧＳ）、小麦ふすま、小麦ミドリング粉、小麦ショーツ、米ふすま、もみ殻、エンバク殻、パーム核、及びシトラスパルプ；ｃ）ダイズ、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピン、エンドウ豆、ソラマメ、綿、菜種、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉及び骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエイ、コプラ、ゴマ等の供給源から得られるタンパク質；ｄ）植物源及び動物源から得られる油脂；並びに／又はｅ）ミネラル及びビタミンを含む群から選択される１種以上の飼料材料を含み得る。

【0152】

飼料中のデンプンの消化率は、高度に変動しやすく、デンプン及び飼料マトリックスの双方の物理的構造が挙げられるいくつかの因子に依存する。動物の飼料中のデンプン消化率は、飼料添加剤としての少なくとも１種のグルコアミラーゼの使用によって向上され得ることが見出されている。

【0153】

機能性飼料等の飼料として用いられるか、又は当該飼料の調製に用いられる場合には、本明細書の酵素又は飼料添加剤組成物は：栄養学的に許容される担体、栄養学的に許容される希釈剤、栄養学的に許容される賦形剤、栄養学的に許容されるアジュバント、栄養学的に有効な成分の１つ以上と組み合わせて用いられ得る。例えば、タンパク質、ペプチド、スクロース、ラクトース、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム、ソルビン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、ギ酸マグネシウム、ソルビン酸マグネシウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メチルパラベン、及びプロピルパラベンからなる群から選択される少なくとも１種の構成要素が挙げられ得る。

【0154】

また、本明細書中に記載される少なくとも１種のバリアントグルコアミラーゼ（又は本明細書中に記載される少なくとも１種のバリアントグルコアミラーゼを含む酵素組成物）を均質化して、粉末を製造することが可能である。当該粉末は、当該技術において知られている他の構成要素と混合され得る。任意選択により、飼料原料はまた、例えばカルシウム等の追加のミネラル、及び／又は追加のビタミンを含有し得る。一部の実施形態において、飼料原料はトウモロコシ大豆ミールミックスである。

【0155】

代替の好ましい実施形態において、少なくとも１種のグルコアミラーゼを含む酵素組成物は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレット（ＴＰＴ顆粒と称される）又は国際公開第１９９７／０１６０７６号パンフレット若しくは国際公開第１９９２／０１２６４５号パンフレットに記載されるような顆粒に製剤化され得る。「ＴＰＴ」は、熱防護技術を意味する。飼料添加剤組成物が顆粒に製剤化される場合には、当該顆粒は、タンパク質コアをおおってコーティングされた水和バリア塩を含む。そのような塩コーティングの利点は、耐熱性の向上、貯蔵安定性の向上、及び、塩コーティングがなければ酵素に悪影響を及ぼす他の飼料添加剤からの保護である。好ましくは、塩コーティングに用いられる塩は、２０℃にて水分活性が０．２５超又は恒湿が６０％超である。一部の実施形態において、当該塩コーティングは、Ｎａ_２ＳＯ_４を含む。

【0156】

これ以外にも、組成物は、消費に適した液体製剤中に存在し、好ましくは、そのような液体消費物は、以下： バッファ、塩、ソルビトール、及び／又はグリセロールの１種以上を含有する。

【0157】

飼料添加剤として用いられる、本明細書中に記載されるグルコアミラーゼのいずれかが、単独で用いられてもよいし、少なくとも１種の直接給餌微生物と組み合わせて用いられてもよい。ＤＦＭのカテゴリには、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、乳酸菌、及び酵母が含まれる。さらに、飼料添加剤として用いられる、本明細書中に記載されるグルコアミラーゼのいずれかが、単独で用いられてもよいし、例えば、桂皮アルデヒド及び／又はチモールといった少なくとも１種のエッセンシャルオイルと組み合わせて用いられてもよい。さらに、飼料添加剤として用いられる、本明細書中に記載されるグルコアミラーゼのいずれかが、単独で用いられてもよいし、少なくとも１種の追加の酵素と組み合わせて用いられてもよい。そのような酵素の例として、限定されないが、フィターゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、又は他のグルコアミラーゼが挙げられる。

【0158】

また、開示されるのは、動物飼料の栄養価を向上させる方法であって、本明細書中に記載されるバリアントグルコアミラーゼのいずれかの有効量が動物飼料に加えられ得る方法である。

【0159】

本明細書中で用いられるフレーズ「有効量」は、単独で、又は１種以上の他の活性剤（例えば、限定されないが、１種以上の追加の酵素、１種以上のＤＦＭ、１種以上の精油等）と組み合わせて、１つ以上の測定基準について動物に性能の向上を付与するのに必要とされる活性剤（例えば、本明細書中で開示されるバリアントグルコアミラーゼポリペプチドのいずれか）の量に関する。

【0160】

本明細書中で用いられる用語「動物の性能」は、限定されないが、飼料効率及び／又は動物の体重増加及び／又は飼料要求率及び／又は飼料中の栄養素の消化率及び／又は飼料中の可消化エネルギー若しくは代謝エネルギー及び／又は疾患の、若しくは対象の免疫応答による悪影響を回避する動物の能力等のあらゆる測定基準によって判定され得る。

【0161】

動物の性能の特徴として、体重；体重増加；嵩；体脂肪パーセンテージ；身長；体脂肪分布；成長；成長速度；卵のサイズ；卵の重量；卵の嵩；産卵率；ミネラル吸収；ミネラル排泄、ミネラル保持；骨密度；骨強度；飼料要求率（ＦＣＲ）；平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）；平均１日増量（ＡＤＧ）、銅、ナトリウム、リン、窒素、及びカルシウムのいずれか１種以上の保持及び／又は分泌；アミノ酸の保持又は吸収；無機質化、骨石灰化、屠体収量、並びに屠体品質が挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0162】

「１つ以上の評価指標の動物の性能の向上」が意味するのは、本明細書中に記載される飼料添加剤組成物を含む飼料の使用の結果として生じる、前記飼料添加剤組成物を含まない飼料と比較した、対象における飼料効率の増大及び／又は体重増加の増大及び／又は飼料要求率の減少及び／又は飼料中の栄養素若しくはエネルギーの消化率の向上及び／又は窒素保持の向上及び／又は壊疽性腸炎の悪影響を回避する能力の向上及び／又は免疫応答の向上である。

【0163】

本明細書中で引用される全ての参考文献は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本組成物及び方法、並びにそれらの利点についてさらに説明するために、以下の特定の実施例が、限定的ではなく例示的であるとの理解の下で提供される。

【実施例】

【0164】

実施例１
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）におけるケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群バリアントグルコアミラーゼの部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）の構築、形質転換、及び発現
ケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群バリアントグルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチド（発現カセットとして用いるコドン修飾配列）を、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によって合成して、ｐＩ１ｃ発現ベクターである、ｐＴＴＴの派生ベクター（米国特許出願公開第２０１１００２０８９９号明細書参照）（テロメア領域及びアセトアミダーゼマーカーを欠いている）中に挿入した。Ｇｅｎｅｒａｙ Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング試薬を、ベンダーによって説明されるように用いた。当該研究において、親グルコアミラーゼ分子の遺伝子配列は配列番号１であり、翻訳産物は配列番号２である。当該部位評価研究用の親グルコアミラーゼ分子の予測される成熟配列は、配列番号３である。

【0165】

ハイスループット形質転換、植菌、発酵、及び採取を含む全ての真菌操作を、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）内で実行した。プラスミドを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－プロトプラスト法を用いて、固形アガー上でのプレーティングを省略して、適切なＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主菌株中に形質転換させた。手短に、およそ０．５～２μｇのＤＮＡ、２×１０^６個のプロトプラスト、及び４ｐｍｏｌのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含有する、６０μＬの総容量の形質転換混合液を、１５０μＬの２５％ＰＥＧ溶液により処理した。プロトプラストを、０．７５Ｍソルビトールを含有する液体の選択増殖培地中で再生させて、浸透圧を維持した。再生した真菌培養物入りプレートを、５０ｍｍのスローを備えるシェーカーインキュベータ内で、２００ｒｐｍ、２８℃、湿度８０％にて４日間、真菌菌糸体が形成されるまで増殖させた。グルコアミラーゼバリアントの発現のために、この材料を用いて培養物を植菌した。

【0166】

グルコアミラーゼタンパク質を発現させるために、形質転換Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株を、以下のように培養した： ４０μｌの再生した形質転換体を用いて、グルコース、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＰＩＰＰＳバッファ（ｐＨ５．５）、塩、及び微量元素を含有する３６０μｌの培養培地に植菌した。培養物を、５０ｍｍのスローを備えるシェーカーインキュベータ内でインキュベートされる９６ウェルＭＴＰ内で、２６０ｒｐｍ、２８℃、湿度８０％にて増殖させた。前培養の２日後に、培養物を、上述のものに類似する培養培地に移した。そこでは、グルコースを、グルコース／ソホロース混合物に置き換えた。その後、９６ウェルＭＴＰを、５０ｍｍのスローを備えるシェーカーインキュベータ内で、２６０ｒｐｍ、２８℃、湿度８０％にてインキュベートした。５日間発酵させた後に、培養物を、親水性ＰＶＤＦ膜を用いる遠心分離によって濾過すると、澄明な上清が得られ、これを組換えグルコアミラーゼ酵素の分析に用いた。

【0167】

形質転換スクリーン由来の上清を、タンパク質定量化に供した。ＭＴＰ培養物由来の５μｌの澄明な培養上清のアリコートを、８０℃にてＺｏｒｂａｘ ３００ Ｃ３ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＨＤ ２．１×５０ｍｍ １．８－Ｍｉｃｒｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）カラム上に注入した。グルコアミラーゼを、バッファＡ（水中０．１％ＴＦＡ）及びバッファＢ（０．０７％ＴＦＡ、７０％アセトニトリル、３０％イソプロパノール）の３分の勾配により溶出した。グルコアミラーゼ濃度が知られている発酵サンプルの較正曲線（０～１０２４ｐｐｍ）を用いて、グルコアミラーゼタンパク質濃度を求めた。表１に報告する活性アッセイ（以下の実施例２）のために、サンプルを、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－８０を含有する２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファｐＨ４．５中で、糖化アッセイについて２００ｐｐｍ、転換アッセイについて４０ｐｐｍ、そして全ての比色ＡＢＴＳアッセイについて１５ｐｐｍの濃度に規格化した。濃度が０～８０ｐｐｍに及ぶ親分子の較正曲線を、性能指数（ＰＩ）算出用に、アッセイプレートに含めた。

【0168】

親グルコアミラーゼの培養上清の代表的なサンプルを、質量分析法（ＭＳ）によって分析した。ＭＳ分析の結果は、複数のポリペプチドの存在を示す。配列番号３の予測されるＣ末端が確認された一方、予測されるＮ末端のいくつかのトランケーションが検出された。Ｎ末端残基： １（配列番号５）、残基２（配列番号３５）、残基３（配列番号６）、残基５（配列番号３６）、及び残基６（配列番号３７）の後ろに、トランケーションが観察された。

【0169】

実施例２
糖化関連アッセイにおけるケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群グルコアミラーゼバリアントの酵素活性の評価
バリアント及び親分子（配列番号３）の糖化性能を、Ｔａｔｅ ＆ Ｌｙｌｅから購入した基質としてのＭａｌｔｏｓｗｅｅｔ Ｇ １２０（ＤＥ＝１１～１４）を用いて、ｐＨ４．５、６２℃にて４８時間にわたって評価した。糖化混合物の出発ＤＳ含量は、３４％であった。グルコアミラーゼの性能を、２８μｇ／ｄｓｇの投与量にて試験した。この評価のために、プルラナーゼＯＰＴＩＭＡＸ（商標）Ｌ １０００（ＩＦＦの製品）を、０．４３８ＡＳＰＵ／ＤＳｇにて投与し、アルファ－アミラーゼのアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）アミラーゼ（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４０９９４１５号パンフレットに記載）を、インキュベーション毎に０．２２７ＳＳＵ／ＤＳｇにて投与した。７５μｌのマルトデキストリン及び５μｌの糖化混合物（先に記載されるように、グルコアミラーゼ、アルファ－アミラーゼ、及びプルラナーゼ）からなる反応液を、ＭＴＰ中でｐＨ４．５、６２℃にて４８時間、９００ｒｐｍにて振盪させながらインキュベートした。全ての反応液を、１：４０の糖化シロップ対酸溶液の比率での５ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４の添加によってクエンチした。クエンチしたアリコートを、８０℃にて５．３分間実施する二重Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｒｅｚｅｘ－ＲＦＱ Ｆａｓｔ Ａｃｉｄ Ｈ＋（８％）１００×７．８ｍｍカラム（ｃａｔ＃ ００Ｄ－０２２３－Ｋ０）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ １２６０シリーズシステムを用いる産物形成用のＨＰＬＣによって分析した。この目的のために、５μＬのサンプルをカラム上に注入して、炭水化物を、移動相としての５ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４のアイソクラティック勾配により、１．０ｍＬ／分の流量にて分離した。オリゴ糖産物を、屈折率検出器を用いて検出した。標準を走らせて、関心対象の糖の各重合度（ＤＰ（ｎ））（ｎは糖の数を表し、例えば、ＤＰ３＋、ＤＰ３、ＤＰ２、及びＤＰ１である）の溶離時間を判定した。特定した糖化産物の総積分ピーク面積を用いて、各（オリゴ）糖の相対含量を算出した。糖化におけるＧＡバリアントの性能を、親分子（配列番号３）の性能に対して比較した。アミノ酸置換の、当該ＧＡプロパティに及ぼす影響を判定するために、親分子に対するグルコース収率の増大％を求めた。結果を表１に示す。０．５％よりも大きな値は、糖化に及ぼす変異のポジティブ効果と考える。

【0170】

比色読出しを用いた比活性の判定
グルコアミラーゼバリアントの比活性を、選択した基質からのグルコースの放出速度に基づいて、共役グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ（ＧＯＸ／ＨＲＰ）及び２，２’－アジノ－ビス３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５；１９８０：３８９－３９７）を用いて判定した。

【0171】

グルコアミラーゼ上清の５μｌアリコートを、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．５）を含有する２５μｌのフレッシュに調製した試薬Ａ溶液入りＭＴＰ（最終濃度は、２５Ｕ／ｍＬ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：Ｐ８３７５）、６２Ｕ／ｍＬ ＧＯＸ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：Ｇ７１４１）、及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ－８０であった）中で組み合わせた。反応を開始するために、５．４ｍｇ／ｍＬ ＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：Ａ１８８８）、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．５）、及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ－８０からなる２０μｌの基質含有試薬Ｂを加えた。種々のアッセイの最終基質濃度は： ４．６ｍＭマルトース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：４７２８８）、３０ｍＭパノース（Ｍｅｇａｚｙｍｅｓ、Ｏ－ＰＡＮ）、１％（ｗ／ｖ）の予備沸騰させたプルラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：Ｐ４５１６）、０．５％（ｗ／ｖ）の予備沸騰させた可溶性デンプン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：Ｓ９７６５）、及び１％（ｗ／ｖ）のマルトデキストリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：３１４１０）であった。試薬を激しく混合して、吸光度カイネティクスを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓのプレートリーダーを用いて、室温にて連続して撹拌しながら２３秒間隔で６分間、直ぐに読んだ。４０５ｎｍでの吸光度率の増大は、酵素の加水分解活性と比例する。反応を、三反復で走らせて、線形回帰を用いてサンプルのＶｏを求めた。このように生成したデータを用いて、各アッセイについての各サンプルの性能を算出した。等価タンパク質濃度での親ＧＡの予測される活性率で割った各バリアントの活性率を、性能指数（ＰＩ）と定義した。親のＰＩ値と等しいか、又はこれよりも１．１大きいＰＩ値を、分子の比活性に及ぼす有益な効果を有する変異の選択のためのカットオフとして用いた。結果を表１に示す。

【0172】

グルコアミラーゼバリアントの熱安定性の評価
１５ｐｐｍに設定したグルコアミラーゼバリアントサンプルを、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｐｒｏ ３８４（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により、３８４ウェルＰＣＲ ＭＴＰ内で５７℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＴＰを室温に冷却して、上述のＡＢＴＳ法を用いて、マルトデキストリン基質についての比活性を判定した。熱インキュベートしたサンプルの活性を非インキュベートサンプルの活性で割ることによって、グルコアミラーゼバリアントの残留活性（熱処理後に残留している活性）パーセント（％）を求めた。親酵素の熱安定性を５％超える熱安定性の向上は、分子の熱安定性に及ぼす有益な効果を有する変異の選択におけるカットオフとして用いた。熱安定性の結果を、残留活性％として表１に示す。

【0173】

グルコアミラーゼバリアントの転換反応の評価
３８４ウェルＭＴＰ内で６７μｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファｐＨ４．５中５０％（ｗ／ｖ）グルコースを１３μｌの酵素サンプルと組み合わせて、５０℃にて６６時間振盪させながらインキュベートすることによって、ＧＡバリアント毎のグルコース縮合活性（転換活性）を試験した。２．５μｌの反応カクテルを９７．５μｌの５ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４と混合することによって、反応をクエンチした。反応産物（グルコース及び縮合産物、例えば、ＤＰ２、ＤＰ３、及びＤＰ３＋）を、前述のＨＰＬＣ分析によって判定且つ定量化した。

【0174】

ＧＡバリアントの性能を、親分子（配列番号３）の性能に対して比較した。アミノ酸置換の、当該ＧＡプロパティに及ぼす影響を判定するために、縮合物％として表される親分子に対する転換収率（ＤＰ２）の減少を判定した。結果を表１に示す。減少した転換と等しいか、又は０．４よりも大きい値を、このアッセイの条件下での転換に及ぼすポジティブ効果と考える。

【0175】

なお、残留活性の比較について、用いた値は絶対（測定したとおり）である一方、転換反応について、そして糖化収率について、値を、収率パーセントの差異として算出する（例えば、バリアントＡ５１Ｙは、収率が、親ＧＡの９１．８％ＤＰ１に対して９３．２％ＤＰ１であるので、糖化収率に１．４％の収率の向上を付与する）。

【0176】

表１に記載されるケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群ＧＡバリアントは全て、親の配列である配列番号３と比較した場合に、少なくとも１つのプロパティの向上を提示し、アミノ酸置換毎に利益を示す。配列番号３は、位置１０２にてＰｒｏを有する配列番号４（ＳｖａＧＡ１）に等しい。細胞が表１においてブランクで表示される例は、利益（親に対する向上）が、当該特定の例について観察されなかったことを示す。例えば、＜１．０のＰＩ、熱安定性、残留活性％は、（アッセイプレート上の親対照と比較して）５％未満の向上であり、転換の減少及び糖化結果の向上はそれぞれ、親よりも０．４％未満又は０．５％超であった。親分子の熱安定性についての残留活性％の隣のアスタリスクは、これが、バリアント分子について実行した評価にわたる複数の試験の平均であることを表す。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【0177】

実施例３
グルコアミラーゼ配列の比較
多重アミノ酸配列アラインメントを、配列番号３（ＳｖａＧＡ１ｖ２）及び配列番号４（ＳｖａＧＡ１）の予測される成熟領域、並びに関連するグルコアミラーゼ： ＧＡＮ００８０８．１（配列番号７）、ＯＲＥ１４１５５．１（配列番号８）、ＲＣＨ８８９３９．１（配列番号９）、ＡｅｌＧＡ１（配列番号３１）、ＡｏｓＧＡ３（配列番号３０）、ＡｔｒＧＡ１（配列番号３３）、ＡｖａＧＡ１（配列番号３２）、ＢｃｉＧＡ１（配列番号１０）、ＢｃｉＧＡ２（配列番号１１）、ＢｐｏＧＡ１（配列番号１２）、ＣｃｕＧＡ１（配列番号１３）、ＣｕｍＧＡ１（配列番号２０）、ＤｅｌＧＡ１（配列番号１６）、ＦｓｐＧＡ３（配列番号１７）、ＧｐｅＧＡ１（配列番号１８）、ＭｃｉＧＡ３（配列番号１９）、ＭｃｉＧＡ５（配列番号１５）、ＭｃｏＧＡ１（配列番号２１）、ＰａｒＧＡ１（配列番号２２）、ＲｍｉＧＡ１（配列番号２３）、ＲｓｔＧＡ１（配列番号１４）、ＳｆｕＧＡ２（配列番号２４）、ＳｏｂＧＡ１（配列番号２９）、ＳｒａＧＡ１（配列番号２５）、ＳｒａＧＡ３（配列番号２６）、ＴｉｎＧＡ１（配列番号２７）、及びＺｍｅＧＡ１（配列番号２８）について構築して、これらの他のＧＡの配列に関して、配列番号３及び４の位置１から位置４４９までの対応するアミノ酸を決定した。これらの配列を、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ １０．２ソフトウェア内のＭＵＳＣＬＥアラインメントツールを用いて、デフォルトのパラメータでアラインした。多重配列アラインメントを、図１のパネルＡ～Ｈに示す。ＭＵＳＣＬＥアラインメントから算出したこれらのＧＡ間の配列同一性パーセントを、表２に示す。これらのケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群ＧＡ及び他のＧＡについての系統樹を、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ １０．２ソフトウェアを用いて生成して、図２に示す。

【表2】

【0178】

実施例４
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）におけるバリアントグルコアミラーゼのコンビナトリアルライブラリの構築、形質転換、及び発現
選択した変異の組合せを含有するグルコアミラーゼバリアントのＤＮＡ発現カセット（表１）を、上述のｐＩ１ｃベクター、並びにＳｅａｍｌｅｓｓクローニング及びアセンブリキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、メーカーのプロトコールに従って、標準的な分子生物学技術を用いて得た。

【0179】

プロトプラストの調製及び形質転換を、国際公開第２０１３／１０２６７４号パンフレットに記載されるように実行して、発現カセットを、真菌宿主ゲノム中の特定の位置に挿入した。インビトロでアセンブルしたＲＮＰ複合体を、実施例１に記載する形質転換混合物に加えた。続いてこれを、選択アガー最小培地入りの２４ウェルマイクロタイタープレート上にプレーティングした。形質転換体が増殖して、十分に芽胞形成すると、これをスクレイプして、フレッシュな選択アガープレート上に再パッチした。形質転換体をさらに培養して、培養上清を、実施例１に記載するように調製して、関心対象のグルコアミラーゼ酵素のタンパク質定量化サンプルを得た。タンパク質の定量化を、実施例１に記載するように実行した。

【0180】

実施例５
糖化関連アッセイにおける追加のケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群グルコアミラーゼバリアントの酵素活性の評価
活性アッセイのために、サンプルを、糖化アッセイ及び転換アッセイについて、０．００５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－８０を含有する２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファｐＨ４．５中で８０ｐｐｍの濃度に規格化した。１０ｐｐｍのＧＡ溶液を、全ての比色ＡＢＴＳ調薬アッセイ用に製造した。親分子（配列番号３４）のサンプルを、比較のためにアッセイプレート内に含めた。配列番号３４は、位置６６にてＡｌａ及び位置１０２にてＰｒｏを有する配列番号４（ＳｖａＧＡ１）に等しい。

【0181】

Ｔａｔｅ ＆ Ｌｙｌｅから購入した基質としてのＭａｌｔｏｓｗｅｅｔ Ｇ １２０（ＤＥ＝１１～１４）を用いた４８時間のインキュベーション後に、バリアント及び親分子（配列番号３４）の糖化性能を、ｐＨ４．５、６２℃にて評価した。糖化混合物の出発ＤＳ含量は、３４％であった。グルコアミラーゼの性能を、２９μｇ／ｄｓｇの投与量にて試験した。この評価のために、プルラナーゼＯＰＴＩＭＡＸ（商標）Ｌ ２５００を、０．４５４ＡＳＰＵ／ＤＳｇにて投与し、そしてアルファ－アミラーゼＧＣ６２６（商標）を、インキュベーション毎に０．０８８ＳＳＵ／ＤＳｇにて投与した。７０μｌのマルトデキストリン及び１２μｌの糖化混合物（グルコアミラーゼ、アルファ－アミラーゼ、及びプルラナーゼ）からなる反応液を、３８４ウェルＭＴＰ内でｐＨ４．５、６２℃にて４８時間、９００ｒｐｍにて振盪させながらインキュベートした。全ての反応液を、１：３３の糖化シロップ対酸溶液の比率での５ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４の添加によってクエンチした。クエンチしたアリコートを、８０℃にて５．３分間実施する二重Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｒｅｚｅｘ－ＲＦＱ Ｆａｓｔ Ａｃｉｄ Ｈ＋（８％）１００×７．８ｍｍカラム（ｃａｔ＃ ００Ｄ－０２２３－Ｋ０）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ １２６０シリーズシステムを用いる産物形成用のＨＰＬＣによって分析した。この目的のために、５μＬのサンプルをカラム上に注入して、炭水化物を、移動相としての５ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４のアイソクラティック勾配により、１．０ｍＬ／分の流量にて分離した。オリゴ糖産物を、屈折率検出器を用いて検出した。標準を走らせて、関心対象の糖の各重合度（ＤＰ（ｎ））（ｎは糖の数を表し、例えば、ＤＰ３＋、ＤＰ３、ＤＰ２、及びＤＰ１である）の溶離時間を判定した。特定した糖化産物の総積分ピーク面積を用いて、各（オリゴ）糖の相対含量を算出した。親に対するバリアントの糖化収率の向上を、グルコース％として表３に報告する。グルコースの少なくとも０．３％の増大の値を、所与の条件下での糖化のＧＡ性能に及ぼすポジティブ効果を有する変異についての選択カットオフとして用いた。

【0182】

比色読出しを用いた比活性の判定
グルコアミラーゼバリアントの比活性を、選択した基質からのグルコースの放出速度に基づいて、共役グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ（ＧＯＸ／ＨＲＰ）及び２，２’－アジノ－ビス３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５；１９８０：３８９－３９７）を用いて判定した。

【0183】

１０ｐｐｍのグルコアミラーゼ培養サンプルのアリコートを、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．５）を含有する５０μｌのフレッシュに調製した試薬Ａ溶液入り３８４ウェルＭＴＰ（最終濃度は、２５Ｕ／ｍＬ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：Ｐ８３７５）、６２Ｕ／ｍＬ ＧＯＸ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：Ｇ７１４１）、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ－８０であった）中で組み合わせた。種々の基質アッセイにおける最終酵素濃度は： マルトースアッセイにおいて１．６７ｐｐｍ、マルトデキストリンアッセイにおいて０．４３ｐｐｍ、パノースアッセイにおいて１．４３ｐｐｍ、プルランアッセイにおいて０．７２ｐｐｍ、そして可溶性デンプンアッセイにおいて０．３２ｐｐｍであった。反応を開始するために、３．２ｍｇ／ｍＬ ＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：Ａ１８８８）、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．５）、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ－８０からなる４０μｌの基質含有試薬Ｂを加えた。種々のアッセイの最終基質濃度は： ４．５ｍＭマルトース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：４７２８８）、１５ｍＭパノース（Ｍｅｇａｚｙｍｅｓ、Ｏ－ＰＡＮ）、１．５％（ｗ／ｖ）の予備沸騰させたプルラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：Ｐ４５１６）、０．５％（ｗ／ｖ）の予備沸騰させた可溶性デンプン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：Ｓ９７６５）、及び０．１２％（ｗ／ｖ）のマルトデキストリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄ．ｎｒ：３１４１０）であった。試薬を激しく混合して、吸光度カイネティクスを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓのプレートリーダーを用いて、室温にて１７秒間隔で３．５分間、４０５ｎｍにて直ぐに測定した。４０５ｎｍでの吸光度率の増大は、酵素の加水分解活性と比例する。反応を、三反復で走らせて、線形回帰を用いてサンプルのＶｏを求めた。このように生成したデータを用いて、各基質についての各サンプルの性能を算出した。サンプルのＶｏを親ＧＡのＶｏで割ることによって、各バリアントの性能を算出する。この比率を、性能指数（ＰＩ）と定義した。親ＧＡのＰＩ値と等しいか、又はこれよりも１．１大きいＰＩ値を、分子の比活性に及ぼす有益な効果を有する変異の選択のためのカットオフとして用いた。結果を表３に示す。

【0184】

グルコアミラーゼバリアントの熱安定性の評価
１０ｐｐｍに規格化したグルコアミラーゼバリアントタンパク質を、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｐｒｏ ３８４（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により、ＰＣＲ ＭＴＰ内で５８℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＴＰを室温に冷却して、上述のように用いて、マルトデキストリン－ＡＢＴＳ基質についての比活性を判定した。熱インキュベートしたサンプルの活性を非インキュベートサンプルの活性で割ることによって、グルコアミラーゼバリアントの残留活性（熱処理後に残留している活性）パーセント（％）を求めた。親酵素の熱安定性を３％超える熱安定性の向上は、分子の熱安定性に及ぼす有益な効果を有する変異の選択におけるカットオフとして用いた。結果を表３に示す。

【0185】

グルコアミラーゼバリアントの転換反応の評価
３８４ウェルＭＴＰ内で７０μｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファｐＨ４．５中４５％（ｗ／ｖ）グルコースを１０μｌの酵素サンプルと組み合わせて、５０℃にて６６時間振盪させながらインキュベートすることによって、ＧＡバリアント毎のグルコース縮合活性（転換活性）を試験した。３μｌの反応カクテルを９７μｌの５ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４と混合することによって、反応をクエンチした。反応産物（グルコース及び縮合産物、例えば、ＤＰ２、ＤＰ３、及びＤＰ３＋）を、前述のＨＰＬＣ分析によって判定且つ定量化した。

【0186】

ＧＡバリアントの性能を、親分子（配列番号３４）の性能に対して比較した。アミノ酸置換の、当該ＧＡプロパティに及ぼす影響を判定するために、縮合物％として表される転換収率（ＤＰ２）の減少を判定した。結果を表３に示す。ＤＰ２の０．１％以上の低下の値を、所与の条件下での転換に及ぼすポジティブ効果と考える。

【0187】

なお、転換反応について、そして糖化収率について、値を、収率パーセントの差異として算出する（例えば、バリアントｘは、収率が、親ＧＡの９４．８％ＤＰ１に対して９５．２％ＤＰ１であるので、糖化収率に０．４％の収率の向上を付与する）。

【表3-1】

【表3-2】

【0188】

表３に記載される全てのＳｖａＧａ１バリアントは、ＧＡ性能に関連する少なくとも１つのパラメータにおいて、親分子（ＳｖａＧＡ１＋６６Ａ／１０２Ｐ）と比較した場合に、性能を有意に向上させた。

【0189】

実施例６
サクセニア菌（Ｓａｋｓｅｎａｅａ ｖａｓｉｆｏｒｍｉｓ）Ｂ４０７８グルコアミラーゼのバリアントに及ぼすＮ－グリコシル化の効果
グルコアミラーゼＳｖａＧＡ１ｖ２（配列番号３）及びＳｖａＧＡ１ｖ３（配列番号３４）の性能に及ぼすＮ－グリコシル化の効果を調査するために、いくつかのバリアント配列を、当該技術において知られている分子生物学技術を用いて生成した。新しいＮ－グリコシル化部位を生成する潜在性を有するアミノ酸置換を、配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、及び４５に対応するバリアントにおいて評価した。

【0190】

ＧＡバリアント配列をコードするポリヌクレオチド（発現カセットとして用いるコドン修飾配列）を、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によって合成して、ｐＧＸ２５６発現ベクターである、ｐＴＴＴの派生ベクター（米国特許出願公開第２０１１００２０８９９号明細書参照）中に挿入した。全プラスミドを、プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５１：３９３－９９，２００２）を用いて、適切なトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株中に形質転換させた。国際公開第２０１６／１３８３１５号パンフレット中に記載されている方法によって、形質転換体を選択し、且つ発酵させた。これらの培養物由来の上清を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によってタンパク質の発現を確認した。

【0191】

真菌細胞培養物を、Ｌｖ ｅｔ ａｌ． （（２０１２）Ｐｌａｓｍｉｄｓ ６７：６７－７１）によって記載されるように、規定培地中で増殖させた。９６時間後、澄明になった培養ブロスを遠心分離によって収集した。グルコアミラーゼバリアントを、当該技術において知られている方法によって精製した。標的タンパク質を含有するカラムクロマトグラフィ画分をプールして、濃縮して、１０ＫのＭＷＣＯを備えるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５デバイスを用いて、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウムと平衡化させた。精製したサンプルは、およそ９９％純粋（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析による）であり、使用時まで－８０℃にて４０％グリセロール中に保存した。

【0192】

グルコアミラーゼの熱安定性の評価
表４に記載するＮ－グリコシル化バリアントの熱安定性を、５５℃にて４０分間の酵素サンプル（２０ｐｐｍ）の予備インキュベーションと比較した。４℃にて４０分間の予備インキュベーションを含めて、各グルコアミラーゼサンプルの１００％活性として設定した。続いて、予備インキュベーション後のグルコアミラーゼの残留活性を、共役グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ（ＧＯＸ／ＨＲＰ）及び２，２’－アジノ－ビス３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５；１９８０：３８９－３９７）を用いて測定した。１５ｍＬのコニカルチューブ中で９ｍＬの可溶性デンプン（水中１％、ｗ／ｗ）及び１ｍＬの０．５Ｍ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ４．５を混合することによって、基質溶液を調製した。５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）中に、ＡＢＴＳを含む共役酵素（ＧＯＸ／ＨＲＰ）溶液（最終濃度は、２．７４ｍｇ／ｍＬ ＡＢＴＳ、０．１Ｕ／ｍＬ ＨＲＰ、及び１Ｕ／ｍＬ ＧＯＸであった）を調製した。６００ｒｐｍで５０℃にて５分間予備インキュベートした９０μＬの基質溶液を含有する新しいマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６４１）中に、予備インキュベーション後のグルコアミラーゼサンプル（１０μＬ）を移した。反応を、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で振盪（６５０ｒｐｍ）させながら５０℃にて１０分間実行させてから、１０μＬの反応混合液を、新しいマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６４１）に迅速に移してから、９０μＬのＡＢＴＳ／ＧＯＸ／ＨＲＰ溶液を加えた。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて、１１秒間隔で５分間、４０５ｎｍの吸光度を直ぐに測定した。反応速度のアウトプット、Ｖｏを用いて、グルコアミラーゼ活性を示した。

【0193】

上述の方法を用いて、Ｎ－グリコシル化バリアントＳｖａＧＡ１ｖ２＿Ｄ８１Ｎ＿Ｋ８３Ｔ（配列番号３８）、ＳｖａＧＡ１ｖ２＿Ａ１５３Ｔ（配列番号３９）、ＳｖａＧＡ１ｖ２＿Ｓ３７０Ｎ＿Ａ３７２Ｓ（配列番号４０）、ＳｖａＧＡ１ｖ２＿Ｄ８１Ｎ＿Ｋ８３Ｔ＿Ａ１５３Ｔ（配列番号４１）、ＳｖａＧＡ１ｖ３＿Ｄ８１Ｎ＿Ｋ８３Ｔ（配列番号４２）、ＳｖａＧＡ１ｖ３＿Ａ１５３Ｔ（配列番号４３）、ＳｖａＧＡ１ｖ３＿Ｓ３７０Ｎ＿Ａ３７２Ｓ（配列番号４４）、及びＳｖａＧＡ１ｖ３＿Ｄ８１Ｎ＿Ｋ８３Ｔ＿Ａ１５３Ｔ（配列番号４５）の残留活性を、それぞれの親配列ＳｖａＧＡ１ｖ２（配列番号３）及びＳｖａＧＡ１ｖ３（配列番号３４）と比較して判定した。表４は、サクセニア菌（Ｓａｋｓｅｎａｅａ ｖａｓｉｆｏｒｍｉｓ）Ｂ４０７８グルコアミラーゼ骨格に及ぼすグリコシル化の影響を評価するために設計したバリアント間での熱安定性比較の結果を示す。ＧＡバリアントを、５５℃にて４０分間予備インキュベートしてから、ｐＨ４．５で５０℃にて１０分間、残留活性を測定した。

【表4】

【0194】

表４に示すように、Ｎ－グリコシル化バリアント、とりわけ置換Ｄ８１Ｎ＿Ｋ８３Ｔ＿Ａ１５３Ｔを有するバリアントは、その親分子よりも高い残留活性を示した。ＳｖａＧＡ１ｖ２＿Ｄ８１Ｎ＿Ｋ８３Ｔ＿Ａ１５３Ｔは、その活性の３３％を保持した一方、ＳｖａＧＡ１Ｖ２親は２１％を保持した。ＳｖａＧＡ１ｖ３＿Ｄ８１Ｎ＿Ｋ８３Ｔ＿Ａ１５３Ｔは、その親分子を上回り、親ＳｖａＧＡ１ｖ３の６６％に対して、７５％の残留活性を維持した。

【0195】

実施例７
ケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群グルコアミラーゼ及びバリアントの構造要素
位置７５でのＡｓｎグリコシル化部位の置換が、触媒活性の減少の原因となることが観察された。バリアントＳｖａＧＡ１ｖ２ Ｎ７５Ｄは、５５℃にて４０分間試験した場合に、親ＳｖａＧＡ１ｖ２タンパク質と比較して、活性のおよその５０％の減少を示す。寄託（ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ）時に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）における既存のグルコアミラーゼ構造は、Ａｓｎ７５又は構造的に等価の位置にてＮ－グリコシル化部位を含有しなかった。このグリコシル化部位は、実施例３に記載するグルコアミラーゼのケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目分岐群に集中している。相互作用が安定している追加のグルコアミラーゼを特定するために、非重複タンパク質配列のｎｒデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を、全てデフォルトのＢＬＡＳＴパラメータを用いて、クエリとしてのＳｖａＧＡ１ｖ２（配列番号３）配列によりサーチした。種々の真菌及び細菌の門由来の配列を含有する、トップ５００の配列を、ＭＯＥ ２０１９．０１０２（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）とアラインした。ＳｖａＧＡ１ｖ２（配列番号３）内のＡｓｎ９４と構造的に等価の位置にてＮ－グリコシル化モチーフＮ－Ｘ－（Ｓ／Ｔ）（Ｓｃｈｗａｒｚ ＆ Ａｅｂｉ，（２０１１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２１：５７６－５８２．）を含有する配列を特定した。結果として生じるソース生物は、ケカビ（Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔａ）門菌類及び他の一タイプの生物である単一の細菌種のみの５０種を含んだ。

【0196】

Ａｓｎ ７５でのグリコシル化由来の活性の向上の構造基礎を理解するために、結晶学的構造を決定した。国際公開第２０１１／０６３３０８号パンフレット及び国際公開第２０１６／１３８３１５号パンフレットに記載される、サクセニア菌（Ｓａｋｓｅｎａｅａ ｖａｓｉｆｏｒｍｉｓ）（ＳｖａＧＡ１ｖ２）（配列番号３）由来のグルコアミラーゼのバリアントを、標準的な方法を用いてクローニングして発現させた。発酵ブロスを、ＶｉｖａＦｌｏｗ ２００限外濾過デバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により濃縮した。１Ｍの最終濃度になるまで（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を加えた後に、濃縮物を、１Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）（バッファＡ）を補充した２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．０）により予備平衡化したＨｉＰｒｅｐ（商標）Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ １６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＵＳＡ）上にロードした。サンプルのローディング後、ＵＶ（Ａ２８０）ベースラインが安定するまで、コラムをバッファＡにより洗浄した。タンパク質の溶離を、５ｍＬ／分の流量にて２０分間、１００％バッファＡから１００％ ２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）（バッファＢ）までの勾配で始めた。標的タンパク質を含有する画分をプールして、濃縮して、１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５デバイス（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を介してバッファＢにバッファ交換した。

【0197】

結晶を、２．１３Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム三水和物、ｐＨ４．３の貯蔵溶液を用いるハンギングドロップ法によって成長させた。滴は、２μｌの１１．５ｍｇ／ｍＬタンパク質及び２μｌの貯蔵溶液を含有した。Ｃｒｙｏ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎは、貯蔵溶液中に１７％の総グリセロールを含んだ。

【0198】

生来の回折データを、Ａｃｃｅｌｅｒｏ Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによって実行される、ＢＬＵ－ＩＣＥデータ収集環境（Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｓｅｃｕｒｅ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／１２４０９６２８／）を用いるベースライン９－２のＳｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ（ＳＳＲＬ）にて収集した。データセットを、Ｐｉｌａｔｕｓ ６Ｍディテクタ（Ｄｅｃｔｒｉｓ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、１００Ｋにて収集した。データを、ＸＤＳ（Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｓｅｃｕｒｅ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／２０１２４６９２／）を用いて、０．９５Å解析度までプロセシングした。

【0199】

分子置換を、検索モデルとして相同性モデルを用いるＰｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔ．（２００７）． ４０，６５８－６７４）により実行した。相同性モデルを、サッカロマイコプシス・フィブリゲラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）、ＰＤＢコード２ＦＢＡ （Ｓｅｖｃｉｋ，ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＦＥＢＳ Ｊ ２７３：２１６１－２１７１）由来のグルコアミラーゼによるデフォルトパラメータを用いて、ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）により構築した。ＲＥＦＭＡＣ ５．８（Ｖａｇｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ６０：２２８４－２２９５）及びＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ ＆ Ｃｏｗｔａｎ（２００４）． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ６０，２１２６－２１３２）による１９ラウンドのリビルディング及びリファインメントを、等方性温度因子により実行してから、最終の３ラウンドのリファインメントを、異方性温度因子により実行した。リファインメントについての解析度範囲は、０．９７Å～４０．７０Åであった。最終リファインメント後、異方性温度因子、Ｒｗｏｒｋ＝０．１２及びＲｆｒｅｅ＝０．１４を用いた。最も高い解析度シェル（０．９７Å～０．９９５Å）では、Ｒｗｏｒｋ＝０．２９及びＲｆｒｅｅ＝０．３１であった。

【0200】

ＳｖａＧＡ１ｖ２（配列番号３）について決定したＸ線回折構造は、Ａｓｎ７５でのＮ－グリコシル化部位について、明らかな電子密度を示した。寄託時に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）における既存のグルコアミラーゼ構造は、Ａｓｎ７５又は構造的に等価の位置にてＮ－グリコシル化部位を含有しなかった。Ａｓｎ７５グリカンについての電子密度を図３に示す。構造は、４つのヘリックスをタンパク質表面に架橋する、グリカンの、タンパク質への水結合接触の広範囲にわたるネットワークを示す（図４）。表５は、原子及び接触距離を特定する。理論に拘束されるものではないが、Ａｓｎ７５グリカンとタンパク質鎖との間のこの広範囲にわたる水素結合ネットワークは、当該４つのタンパク質ヘリックスを安定させ、これが次に、基質結合部位用の構造アンカーを、そして触媒活性部位内で基質を安定させて配置する相互作用を提供すると提唱されている。

【表5】

【0201】

また、ＳｖａＧＡ１ｖ２（配列番号３）の構造は、実施例２及び５に記載する酵素バリアントの性能の増大についての合理的根拠を示唆している。特に、残基６０～７２にわたるヘリックスは、十分に研究されたグルコアミラーゼ（Ａｌｅｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：８３１９－８３２８）による触媒サイクルにおける発達中の（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）正電荷を安定させると予想される保存活性部位残基Ａｓｐ６２を含有する。使用性能を向上させるための、例えば位置６６、６７、及び６９での、このヘリックスの残基への変異を、実施例２及び５に示す。理論に拘束されるものではないが、これらの変異は、活性部位におけるヘリックスの位置を変更し得るので、発達中の正電荷の安定化の向上のために、Ａｓｐ６２の正確な配置を調整し得る。ヘリックス、保存Ａｓｐ６２側鎖、及び性能向上変異の部位を、図５に示す。

【0202】

追加の性能向上変異を、残基１００～１２９を含む基質結合ループに位置決めする。酵素の性能を向上させるような、特に位置１０２、１１９、及び１２１の変異を、実施例２及び５に示す。これらの残基が残基１００～１２９上にあるループは、活性部位の表面積の重要な部分を形成する。ループは、保存Ａｓｐ６２側鎖を有するヘリックスに直接隣接しており、さらに、水素結合を、グルコアミラーゼ触媒機構中の予想される一般的な酸であるＧｌｕ１８４に接触させる。理論に拘束されるものではないが、これらの位置における変異によって引き起こされるループの高次構造の変化が、使用性能を向上させる基質と比較して、一般的な酸の正確な位置決めの変更の原因となり得る。図６は、ループの位置、予想される一般的な酸残基、及び性能向上変異の位置を示す。

【0203】

別のセットの性能向上変異が、Ａｓｎ７５グリカンによって接触する４つのヘリックスの束の上にある。位置１４３、１５６、１６４、１９２、及び２３３における変異が、実施例５に示すように、性能の増大の原因となった。これらの変異を図７に示し、Ａｓｎ７５残基のグリカン鎖と会合した４つのヘリックス束を、濃い灰色で強調している。４つのヘリックス束は、活性部位において基質結合ループを固定するソリッド構造コアを提供する。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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【国際調査報告】