(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-29
(54)【発明の名称】操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアント
(51)【国際特許分類】
C12N 9/12 20060101AFI20241022BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20241022BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241022BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20241022BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241022BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241022BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241022BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241022BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241022BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20241022BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20241022BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20241022BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241022BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20241022BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20241022BHJP
【ＦＩ】
C12N9/12
C12N15/54 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/113 Z
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
C12P21/02 A
C07K1/14
C12Q1/6844 Z
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6876 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024522281
(86)(22)【出願日】2022-10-14
(85)【翻訳文提出日】2024-06-11
(86)【国際出願番号】 US2022078169
(87)【国際公開番号】W WO2023064938
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】63/256,492
(32)【優先日】2021-10-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】502427921
【氏名又は名称】コデクシス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】バームデス， エリカ
(72)【発明者】
【氏名】エルガート， デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】クルーズ， ニッキ ディー．
(72)【発明者】
【氏名】ミラー， マシュー ジー．
(72)【発明者】
【氏名】ミッチェル， ヴェスナ
(72)【発明者】
【氏名】ネイザー， ジョヴァナ
(72)【発明者】
【氏名】スブラマニアン， ナンディタ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS32
4B063QX02
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE02
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045DA89
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA15
(57)【要約】
本開示は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本開示はまた、診断および他の目的で、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドまたはその組成物を使用する方法を提供する。本開示は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本開示はまた、診断および他の目的での、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物を使用する方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片であって、前記ポリペプチド配列が、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する前記参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する前記参照配列と比べて１個または複数の置換を含む、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片。
【請求項2】
配列番号２の残基１２～８５０に対応する前記参照配列または配列番号２に対応する前記参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列が、配列番号２の残基１２～８５０に対応する前記参照配列または配列番号２に対応する前記参照配列と比べて１個または複数の置換を含む、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項3】
配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する前記参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する前記参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列が、配列番号２の残基１２～８５０に対応する前記参照配列または配列番号２に対応する前記参照配列と比べて１個または複数の置換を含む、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項4】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置１５、１６、２０、２１、２２、４０、４１、５２、５７、５８、７３、８５、８７、８８、９１、１０２、１０９、１３２、１５７、１７７、１８６、２００、２１３、２１７、２３１、２３２、２４２、２４３、２６２、２６３、２６４、２６５、２７３、２９９、３２１、３２２、３２８、３８４、３８６、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、４４０、４７６、４８０、４９１、４９５、４９８、５０３、５０４、５０６、５０７、５０８、５１１、５１４、５２０、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６２、５６３、５６６、５７０、５７２、５８１、５８２、５８４、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６１６、６６５、６７１、６７４、６７５、６７７、６８４、６８８、６９６、７０４、７０５、７０６、７２８、７３５、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５３、７５５、７５６、７６２、７６３、７６４、７６６、７７２、７７３、７７９、７９３、８０３、８１４、８２０、または８４９またはそれらの組合せに少なくとも置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項２または３に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項5】
前記ポリペプチド配列が、少なくとも置換１５Ａ／Ｇ／Ｋ／Ｎ、１６Ｒ、２０Ａ／Ｃ、２１Ｋ／Ｑ／Ｓ、２２Ｋ、４０Ａ、４１Ｆ、５２Ｒ、５７Ｔ、５８Ｎ、７３Ａ、８５Ｅ／Ｐ／Ｒ／Ｓ、８７Ｎ、８８Ｔ、９１Ｋ、１０２Ｖ／Ｍ／Ｓ、１０９Ｐ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、１８６Ｅ、２００Ｖ、２１３Ｐ、２１７Ｅ、２３１Ｅ、２３２Ｃ、２４２Ｑ、２４３Ｌ／Ｓ、２６２Ｌ、２６３Ａ、２６４Ｔ、２６５Ｉ、２７３Ｍ、２９９Ｎ、３２１Ｇ、３２２Ｎ／Ｓ、３２８Ｉ、３８４Ｙ、３８６Ｖ、４０１ Ａ／Ｇ／Ｉ、４０２Ｇ／Ｒ、４０３Ｌ／Ｒ、４０４Ｓ／Ｔ、４０６Ｋ／Ｑ、４０７Ｒ／Ｗ、４４０Ｇ、４７６Ｉ／Ｎ、４８０Ｅ／Ｖ／Ｗ、４９１Ｇ、４９５Ｅ／Ｍ／Ｓ、４９８Ｄ、５０３Ｉ／Ｖ、５０４Ｍ、５０６Ｐ、５０７Ｋ、５０８Ｈ、５１１Ｍ、５１４Ｆ、５２０Ｐ、５２１Ｇ／Ｗ／Ｙ、５２３Ａ／Ｋ／Ｖ、５２４Ｇ／Ｋ／Ｑ、５２５Ｌ／Ｖ、５２６Ｔ、５２７Ｖ／Ｗ、５２８Ａ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、５２９Ｓ、５３０Ｇ／Ｐ／Ｒ／Ｗ、５３３Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、５３４Ｈ／Ｗ、５３５Ｋ、５３６Ｒ、５３７Ｇ／Ｌ／Ｗ、５３８Ａ、５３９Ｌ／Ｒ、５４０Ｈ／Ｖ、５４２Ｇ／Ｍ／Ｔ／Ｗ、５５３Ｆ／Ｋ／Ｎ／Ｒ、５５４Ｅ、５５５Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｗ、５５６Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｗ、５５７Ｇ／Ｈ、５５８Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｑ、５５９Ｄ／Ｇ／Ｐ、５６０Ｇ／Ｍ、５６２Ｓ、５６３Ｌ、５６６Ａ、５７０Ｒ、５７２Ｉ、５８１Ａ、５８２Ｆ、５８４Ｎ、５８５ＫＲ、５８６Ｍ、５８７Ｑ／Ｓ、５８９Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、５９２Ｇ／Ｔ／Ｖ、５９３Ｎ、５９４Ｃ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、５９５Ａ／Ｐ／Ｒ、５９６Ｌ／Ｒ／Ｗ、５９７Ｅ、５９９Ｇ／Ｓ／Ｔ、６０１Ｍ／Ｐ、６０２Ｖ、６０３Ｇ／Ｖ／Ｗ、６０５Ｅ／Ａ、６０７Ｎ、６１６Ａ、６６５Ｖ、６７１Ｅ／Ｒ、６７４Ｔ、６７５Ｌ、６７７Ｍ、６８４Ｖ、６８８Ｉ、６９６Ｈ／Ｖ、７０４Ｐ、７０５Ｗ、７０６Ｅ、７２８Ｋ、７３５Ｇ／Ｌ、７４７Ｔ、７４８Ｙ、７４９Ｌ／Ｒ／Ｔ、７５０Ｓ／Ｐ、７５１Ｈ、７５３Ｋ／Ｖ、７５５Ｐ、７５６Ｎ／Ｔ、７６２Ｍ／Ｑ／Ｖ、７６３Ｇ／Ｙ、７６４Ａ／Ｉ／Ｖ、７６６Ｙ、７７２Ｉ、７７３Ｒ、７７９Ｉ、７９３Ｇ、８０３Ｃ／Ｒ、８１４Ｅ、８２０Ａ、または８４９Ｔまたはそれらの組合せを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２と比べたものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項6】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置４０、８５、１０２、１３２、１５７、１７７、２６２、２６３、５０３、５２１、７４８もしくは７５０またはそれらの組合せに少なくとも置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項請求項２～４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項7】
前記ポリペプチド配列が、少なくとも置換４０Ａ、８５Ｅ、１０２Ｓ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、２６２Ｌ、２６３Ａ、５２１Ｇ、７４８Ｙもしくは７５０Ｓまたはそれらの組合せを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項６に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項8】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置２１３／５０３／５０８／５８４／７４８、４０／１３２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８、１３２、４０／１３２／５０３／７４８、４０／１３２／１５７／５０３／５６２、４０／１３２／２１３／７４８／８１４、１３２／１５７／５６２／５８４、１３２／５８４／７４８、４０／１３２／２３１／６８４／７４８、４０／１３２、４０／４１／１３２／５６２／６８４／７４８、４１／２１３／２３１／５０３／６５０／６７４／７４８、１３２／２３１／５０３／７４８、４０／１３２／１５７／５０３、５０３／７４８／８１４、４０／１３２／２３１／５０３／６７４／７４８、４０／８８／１３２／５０３／６８４／７４８、１３２／１５７／２１３／６７４／７４８／８１４、１５７／２６３／７４８、４０／７４８、４１／１５７／２３１／２６２／７４８／８１４、４０／２１３／５０３／５６２／５８４／７４８、５２３／５２４、４０／１３２／５０３／５１４／６５０／６７４、４０／１３２／１５７／２１３／２３１、４１／２１３／５２０／８１４、４０／４１／１５７／２３１／５０３、４０／１５７／５０３、４０／１３２／５６２／７４８、１３２／７４８、４０／４１／１３２／５６２／７４８、８８／２１３／５０３／５８４／６８４／７４８、５７／５８／５２３／６１６／６７７、４０／２１３／２３１／５０３／５１４／５６２／７４８、１３２／５６２、２１３／５０３／６５０、４０／４１／８８／２３１／７４８／８１４、４１／２１３／２６２／５６２、４１／８８／２３１／７４８、２１３／２６３／７４８、４０／１５７／２１３、１５７／５２０、４０／１３２／２６３／５０３／６７４／８１４、４０／４１、５２４／６６５／７５６、５８／１８６／２１７／５２３／５２４／６７７、４０／４１／７４８、１３２／５１４、５２０、４１／２１３／５０３／５６２、２３１／５０３／７４８／７７２、５０３／５６２、７３／２３２／５１４／５８４／８１４、５８／５０７／６１６、１３２／２６２／５２０／５６２／６８４／７４８、８８／５６２／８１４、４１／８８／１５７／８１４、８８／１５７／２１３／６７４／６８４、５７／５８／５２３／７７９、４０／１３２／１５７／５１４／５２０／６８４、４０／４１／２１３／６８４／７７２、４０／４１／２３１／５０３／８１４、８８／２１３／５０３／５８４／８１４、４０／４１／１３２／５６２／５８４、４１／８８／２１３／２３１／５０３／６５０／７４８、４０／５０３、４０／１３２／２１３／２３１／５２０／５６２／６５０／８１４、４０／４１／１３２／２３１／２６２／５０３／５６２／５８４／７４８／８１４、５７／５８／２６４／２６５／５２４／６８８、８８／１３２／１５７／２６２／２６３／５２０／５６２、８８／１３２／１５７／２６２／５０３／５１４／５６２／６５０、４０／５８４／６７４／７４８、４０／４１／１３２／２６３／５０３、５８４／７４８、４０／２１３／６７４、４０／４１／８８Ｔ／１３２／５０３／５６２／５８４／７４８、８８／２１３／５１４／５６２／７４８／８１４、２６３／５２０／８１４、４０／４１／８８／１５７に少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項9】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置２２／４０７、３２８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、５０３、５０４、５０６、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６３、５８１、５８２、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９２、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６９６、７４７、７４９、７５１、７６２、７６３、７６４、７６６、７７３、または８０３に少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項10】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置１５、２０、２１、５２、８５、８７、９１、１０２、２４３、３２１、３２２、３８４、４０４、４７６、４８０、４８０、４９５、５４２、５７０、６７１、６７５、７０４、７２８、７３５、７５３、７５５、７６２、７６４、７９３、８２０、１６／７３５、７５０／８４９、５２４／５８１、４０３／４０４／５２４／５４２／５５５／７６２／７６４、４０４／５２４／５４２／５８９／７６２／７６４、５２４／５４２／５８１／７６２／７６４、５４２／７６２／７６４に少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項11】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置７５０／８２０、２１／５２、２０／２１／８５／３２２／４７６／４９５、２０／８５／２００／３２２／４７６／４９５／７５０、４７６／７５０、２０Ｃ／４７６、２０／３２２／３８６、８５／３２２／４７６、５２／３２２／４９８／７５０、２０／３２２／４７６／８２０、８５／４７６／４９５／８２０、２１／８５／３２２／８２０、２０／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／８２０、２０／３２２、２１／８２０／８４９、４７６、３２２／８２０、２１／３２２／３８６／８２０、３２２／３８６／４９５、８５／３８６／４９５／７５０、２０／８５／４７６／７５０、２０／３８６／４７６、８５／３２２／３８６／４７６／４９５、２０／４９５／８２０、７５０、２１／３２２／４９５、５２／３８６／４９５／８２０、２１／３２２、８５／３２２／７５０／８２０、２０／５２／８５、２１／５２／５７２、２０／８５／４９５／８４９、８５／７５０、２１／４９５／８２０、２７３／３２２／８４９、４９５、３２２／７５０／８２０、５２／４７６／４９５／５６６／７５０／８４９、３８６／４９５、４９５／８２０、２１／３２２／４９５／７５０／８２０、２１／８５／３２２／３８６／４９５／８２０／８４９、４７６／４９５／７５０、３８６／８４９、４７６／４９５、８５／４７６／８４９、２１／３２２／７５０、２０／８５／５６６／８２０、または３８６／７５０／８４９に少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項12】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置２９９／３８６／５６６／８２０、４７６／８２０／８４９、２１／３２２／４７６／４９５／８２０、１７７、２１／４９５、４７６／８２０、２０／５２／２９９、５２／２９９、３２２／８２０、２０／８２０、２０／２９９／３８６／４７６、３８６／４７６／８２０、４７６／４９５／８２０、３８６／４７６／４９５、２０／２１／２９９／３２２／３８６、３２２／３８６／４９５、２１／２９９／３２２／４７６／４９５／８２０、２１／２９９／３８６／８２０、２９９／４７６／８２０、２０／２１、２１／８５／１０２／７５０、７０５、２１／３８６／４７６／８２０、８２０、２１／２９９／３２２、２０／２１／３２２／３８６／８２０、２９９、２１／２９９／３８６／４７６、１０９、３２２／４９５、４９１、５２／８２０、２１／３８６／８２０、２０／２１／４９５、２１／２９９／３２２／４９５／５６６／８２０、２０／２１／２９９／４９５、７５６、３８６／８２０、４９５、５１１、２１／５２／２４２／３８６／４９５／８２０、２９９／４７６／４９５、７０６、２１／２９９／３８６／４７６／４９５、２１／２９９／３２２／４９５、２１／４７６／８４９、２９９／３２２／４７６／８２０、２１／５２／２９９／３２２／８２０、２０／２１／５６６、２０／５２、３２２／３８６／４９５／５６６／８２０、２１／２９９、２１／２９９／３８６、３８６／８４９、５２／４７６、５２／２９９／３２２／３８６／４９５、または４４０に置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項13】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置２２／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４Ｇ／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５６０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６９６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７４９、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７５１、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６２、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６６、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７７３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／８０３、４０／１３２／１５７／６０５／２６２／２６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／５２１／７４８、または４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／５５３／７４８に少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項14】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／４０４／５２１／５２４／５４２／５５５／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／５２１／５２４／５４２／５８９／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５２４／５４２／５８１／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５４２／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／５２１／５４２／７４８／７６２、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５２４／５８１／７４８、１６／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／８２０、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７９３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５５、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７２８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／６７５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／６７１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５７０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４８０／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３８４／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２１／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２４３／２６２／２６３／５２１／７４８、１５／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／９１／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８７／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８５／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２０／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２１／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、または４０／５２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８に少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項15】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／８４９、２０／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５７２／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／８４９、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／８２０／８４９、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２７３／３２２／５２１／７４８／８４９、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８４９、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８４９、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５６６／７４８／８２０、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９８／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８／８２０、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８／８２０、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８４９、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２００／２６３／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、または２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／８２０／８４９に少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項16】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０／８４９、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／１７７／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、５２／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０５／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／５２１／７４８／７５０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１０９／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９１／５２１／７４８／７５０、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／７５６、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５１１／５２１／７４８／７５０、２１／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２４２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０６／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５６６／７４８／７５０、２０／４０／５２／／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、または４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４４０／５２１／７４８／７５０に少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２の前記参照配列と比べたものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項17】
配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項18】
配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列が、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する前記参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する前記参照配列と比べて１個または複数の置換を含む、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項19】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置１５、１６、２０、２１、２２、４０、４１、５２、５７、５８、７３、８５、８７、８８、９１、１０２、１０９、１３２、１５７、１７７、１８６、２００、２１３、２１７、２３１、２３２、２４２、２４３、２６２、２６３、２６４、２６５、２７３、２９９、３２１、３２２、３２８、３８４、３８６、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、４４０、４７６、４８０、４９１、４９５、４９８、５０３、５０４、５０６、５０７、５０８、５１１、５１４、５２０、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６２、５６３、５６６、５７０、５７２、５８１、５８２、５８４、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６１６、６６５、６７１、６７４、６７５、６７７、６８４、６８８、６９６、７０４、７０５、７０６、７２８、７３５、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５３、７５５、７５６、７６２、７６３、７６４、７６６、７７２、７７３、７７９、７９３、８０３、８１４、８２０、または８４９またはそれらの組合せに少なくとも置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号８、３３２、４６２または６０６の前記参照配列と比べたものである、請求項１８に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項20】
前記ポリペプチド配列が、少なくともアミノ酸残基１５Ａ／Ｇ／Ｋ／Ｎ、１６Ｒ、２０Ａ／Ｃ、２１Ｋ／Ｑ／Ｓ、２２Ｋ、４０Ａ、４１Ｆ、５２Ｒ、５７Ｔ、５８Ｎ、７３Ａ、８５Ｅ／Ｐ／Ｒ／Ｓ、８７Ｎ、８８Ｔ、９１Ｋ、１０２Ｖ／Ｍ／Ｓ、１０９Ｐ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、１８６Ｅ、２００Ｖ、２１３Ｐ、２１７Ｅ、２３１Ｅ、２３２Ｃ、２４２Ｑ、２４３Ｌ／Ｓ、２６２Ｌ、２６３Ａ、２６４Ｔ、２６５Ｉ、２７３Ｍ、２９９Ｎ、３２１Ｇ、３２２Ｎ／Ｓ、３２８Ｉ、３８４Ｙ、３８６Ｖ、４０１ Ａ／Ｇ／Ｉ、４０２Ｇ／Ｒ、４０３Ｌ／Ｒ、４０４Ｓ／Ｔ、４０６Ｋ／Ｑ、４０７Ｒ／Ｗ、４４０Ｇ、４７６Ｉ／Ｎ、４８０Ｅ／Ｖ／Ｗ、４９１Ｇ、４９５Ｅ／Ｍ／Ｓ、４９８Ｄ、５０３Ｉ／Ｖ、５０４Ｍ、５０６Ｐ、５０７Ｋ、５０８Ｈ、５１１Ｍ、５１４Ｆ、５２０Ｐ、５２１Ｇ／Ｗ／Ｙ、５２３Ａ／Ｋ／Ｖ、５２４Ｇ／Ｋ／Ｑ、５２５Ｌ／Ｖ、５２６Ｔ、５２７Ｖ／Ｗ、５２８Ａ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、５２９Ｓ、５３０Ｇ／Ｐ／Ｒ／Ｗ、５３３Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、５３４Ｈ／Ｗ、５３５Ｋ、５３６Ｒ、５３７Ｇ／Ｌ／Ｗ、５３８Ａ、５３９Ｌ／Ｒ、５４０Ｈ／Ｖ、５４２Ｇ／Ｍ／Ｔ／Ｗ、５５３Ｆ／Ｋ／Ｎ／Ｒ、５５４Ｅ、５５５Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｗ、５５６Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｗ、５５７Ｇ／Ｈ、５５８Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｑ、５５９Ｄ／Ｇ／Ｐ、５６０Ｇ／Ｍ、５６２Ｓ、５６３Ｌ、５６６Ａ、５７０Ｒ、５７２Ｉ、５８１Ａ、５８２Ｆ、５８４Ｎ、５８５ＫＲ、５８６Ｍ、５８７Ｑ／Ｓ、５８９Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、５９２Ｇ／Ｔ／Ｖ、５９３Ｎ、５９４Ｃ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、５９５Ａ／Ｐ／Ｒ、５９６Ｌ／Ｒ／Ｗ、５９７Ｅ、５９９Ｇ／Ｓ／Ｔ、６０１Ｍ／Ｐ、６０２Ｖ、６０３Ｇ／Ｖ／Ｗ、６０５Ｅ／Ａ、６０７Ｎ、６１６Ａ、６６５Ｖ、６７１Ｅ／Ｒ、６７４Ｔ、６７５Ｌ、６７７Ｍ、６８４Ｖ、６８８Ｉ、６９６Ｈ／Ｖ、７０４Ｐ、７０５Ｗ、７０６Ｅ、７２８Ｋ、７３５Ｇ／Ｌ、７４７Ｔ、７４８Ｙ、７４９Ｌ／Ｒ／Ｔ、７５０Ｓ／Ｐ、７５１Ｈ、７５３Ｋ／Ｖ、７５５Ｐ、７５６Ｎ／Ｔ、７６２Ｍ／Ｑ／Ｖ、７６３Ｇ／Ｙ、７６４Ａ／Ｉ／Ｖ、７６６Ｙ、７７２Ｉ、７７３Ｒ、７７９Ｉ、７９３Ｇ、８０３Ｃ／Ｒ、８１４Ｅ、８２０Ａ、または８４９Ｔまたはそれらの組合せを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号８、３３２、４６２または６０６の前記参照配列と比べたものである、請求項１８～１９のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項21】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置４０、８５、１０２、１３２、１５７、１７７、２６２、２６３、５２１、７４８もしくは７５０またはそれらの組合せに少なくとも置換を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項22】
前記ポリペプチド配列が、少なくともアミノ酸残基４０Ａ、８５Ｅ、１０２Ｓ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、２６２Ｌ、２６３Ａ、５２１Ｇ、７４８Ｙもしくは７５０Ｓまたはそれらの組合せを含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項23】
配列番号８の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列が、配列番号８の残基１２～８５０に対応する前記参照配列または配列番号８に対応する前記参照配列と比べて１個または複数の置換を含む、請求項１８に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項24】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置２２／４０７、３２８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、５０３、５０４、５０６、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６３、５８１、５８２、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９２、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６９６、７４７、７４９、７５１、７６２、７６３、７６４、７６６、７７３、８０３、４０３／５５３またはそれらの組合せに少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号８の前記参照配列と比べたものである、請求項１８または２３に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項25】
配列番号３３２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号３３２に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列が、配列番号３３２の残基１２～８５０に対応する前記参照配列または配列番号３３２に対応する前記参照配列と比べて１個または複数の置換を含む、請求項１８に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項26】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置１５、２０、２１、５２、８５、８７、９１、１０２、２４３、３２１、３２２、３８４、４０４、４７６、４８０、４８０、４９５、５４２、５７０、６７１、６７５、７０４、７２８、７３５、７５３、７５５、７６２、７６４、７９３、８２０、１６／７３５、７５０／８４９、５２４／５８１、４０３／４０４／５２４／５４２／５５５／７６２／７６４、４０４／５２４／５４２／５８９／７６２／７６４、５２４／５４２／５８１／７６２／７６４、または５４２／７６２／７６４に少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号３３２の前記参照配列と比べたものである、請求項１８または２５に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項27】
配列番号４６２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号４６２に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列が、配列番号４６２の残基１２～８５０に対応する前記参照配列または配列番号４６２に対応する前記参照配列と比べて１個または複数の置換を含む、請求項１８に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項28】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置７５０／８２０、２１／５２、２０／２１／８５／３２２／４７６／４９５、２０／８５／２００／３２２／４７６／４９５／７５０、４７６／７５０、２０／４７６、２０／３２２／３８６、８５／３２２／４７６、５２／３２２／４９８／７５０、２０／３２２／４７６／８２０、８５／４７６／４９５／８２０、２１／８５／３２２／８２０、２０／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／８２０、２０／３２２、２１／８２０／８４９、４７６、３２２／８２０、２１／３２２／３８６／８２０、３２２／３８６／４９５、８５／３８６／４９５／７５０、２０／８５／４７６／７５０、２０／３８６／４７６、８５／３２２／３８６／４７６／４９５、２０／４９５／８２０、７５０、２１／３２２／４９５、５２／３８６／４９５／８２０、２１／３２２、８５／３２２／７５０／８２０、２０／５２／８５、２１／５２／５７２、２０／８５／４９５／８４９、８５／７５０、２１／４９５／８２０、２７３／３２２／８４９、４９５、３２２／７５０／８２０、５２／４７６／４９５／５６６／７５０／８４９、３８６／４９５、４９５／８２０、２１／３２２／４９５／７５０／８２０、２１／８５／３２２／３８６／４９５／８２０／８４９、４７６／４９５／７５０、３８６／８４９、４７６／４９５、８５／４７６／８４９、２１／３２２／７５０、２０／８５／５６６／８２０、または３８６／７５０／８４９に少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号４６２の前記参照配列と比べたものである、請求項１８または２７に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項29】
配列番号６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列が、配列番号６０６の残基１２～８５０に対応する前記参照配列または配列番号６０６に対応する前記参照配列と比べて１個または複数の置換を含む、請求項１８に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項30】
前記ポリペプチド配列が、アミノ酸位置２９９／３８６／５６６／８２０、４７６／８２０／８４９、２１／３２２／４７６／４９５／８２０、１７７、２１／４９５、４７６／８２０、２０／５２／２９９、５２／２９９、３２２／８２０、２０／８２０、２０／２９９／３８６／４７６、３８６／４７６／８２０、４７６／４９５／８２０、３８６／４７６／４９５、２０／２１／２９９／３２２／３８６、３２２／３８６／４９５、２１／２９９／３２２／４７６／４９５／８２０、２１／２９９／３８６／８２０、２９９／４７６／８２０、２０／２１、２１／８５／１０２／７５０、７０５、２１／３８６／４７６／８２０、８２０、２１／２９９／３２２、２０／２１／３２２／３８６／８２０、２９９、２１／２９９／３８６／４７６、１０９、３２２／４９５、４９１、５２／８２０、２１／３８６／８２０、２０／２１／４９５、２１／２９９／３２２／４９５／５６６／８２０、２０／２１／２９９／４９５、７５６、３８６／８２０、４９５、５１１、２１／５２／２４２／３８６／４９５／８２０、２９９／４７６／４９５、７０６、２１／２９９／３８６／４７６／４９５、２１／２９９／３２２／４９５、２１／４７６／８４９、２９９／３２２／４７６／８２０、２１／５２／２９９／３２２／８２０、２０／２１／５６６、２０／５２、３２２／３８６／４９５／５６６／８２０、２１／２９９、２１／２９９／３８６、３８６／８４９、５２／４７６、５２／２９９／３２２／３８６／４９５、４４０またはそれらの組合せに少なくとも置換または置換セットを含み、前記アミノ酸位置が、配列番号６０６の前記参照配列と比べたものである、請求項１８または２９に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項31】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に提供される置換または置換セットを含むポリペプチド配列を含み、前記置換または置換セットが、配列番号２、８、３３２、４６２または６０６の前記参照配列と比べたものである、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項32】
表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントの残基１２～８５０を含む配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項33】
表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントの配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項34】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６５、５６４、５６６、５６８、５７０、５７２、５７４、５７６、５７８、５８０、５８２、５８４、５８６、５８８、５９０、５９２、５９４、５９６、５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６６、７６８、または７７０の残基１２～８５０を含むポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の置換を必要に応じて有する、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項35】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６５、５６４、５６６、５６８、５７０、５７２、５７４、５７６、５７８、５８０、５８２、５８４、５８６、５８８、５９０、５９２、５９４、５９６、５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６６、７６８、または７７０を含むポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチドが、必要に応じて、前記ポリペプチド配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の置換を有する、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項36】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド配列に１、２、３、４、最大５個の置換を有する、請求項３４～３５のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項37】
前記置換が、保存的置換を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項38】
前記ポリペプチド配列が、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０を含む配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６を含む配列を含む、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項39】
融合タンパク質である、請求項１～３８のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項40】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項41】
参照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも１種の改善された特性を有する、請求項１～４０のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項42】
前記参照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、増加した活性、増加した安定性、増加した熱安定性、増加した処理能力、増加した忠実度およびＰＣＲ反応における増加した産物収量から選択される少なくとも１種の改善された特性を有する、請求項４１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項43】
前記参照ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する前記配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する前記配列を有する、請求項４１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項44】
精製されている、請求項１～４３のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項45】
請求項１～４３のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする、組換えポリヌクレオチド。
【請求項46】
配列番号１、７、３３１、４６１もしくは６０５のヌクレオチド残基３４～２５５０に対応する参照ポリヌクレオチド配列または配列番号１、７、３３１、４６１もしくは６０５に対応する参照ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有する配列を含み、前記組換えポリヌクレオチドが、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片をコードする、請求項４５に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項47】
前記ポリヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、請求項４５～４６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項48】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号７、３３１、４６１もしくは６０５のヌクレオチド残基３４～２５５０を含むか、または配列番号７、３３１、４６１もしくは６０５を含む、請求項４６に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項49】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、４８９、４９１、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、５１１、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５２３、５２５、５２７、５２９、５３１、５３３、５３５、５３７、５３９、５４１、５４３、５４５、５４７、５４９、５５１、５５３、５５５、５５７、５５９、５６１、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３、５７５、５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９、５９１、５９３、５９５、５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５６、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、または７６９のヌクレオチド残基３４～２５５０を含む、請求項４５に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項50】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、４８９、４９１、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、５１１、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５２３、５２５、５２７、５２９、５３１、５３３、５３５、５３７、５３９、５４１、５４３、５４５、５４７、５４９、５５１、５５３、５５５、５５７、５５９、５６１、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３、５７５、５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９、５９１、５９３、５９５、５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５６、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、または７６９を含む、請求項４５に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項51】
請求項４５～５０のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項52】
前記ポリヌクレオチドが、制御配列に作動可能に連結されている、請求項５１に記載の発現ベクター。
【請求項53】
前記制御配列が、プロモーターを含む、請求項５１または５２に記載の発現ベクター。
【請求項54】
請求項４５～５０のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドまたは請求項５１～５３のいずれか一項に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項55】
宿主細胞において操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを産生する方法であって、少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼが産生されるような適した培養条件下で、請求項５４に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項56】
前記培養物および／または宿主細胞から少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼを回収することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼを精製するステップをさらに含む、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項58】
請求項１～４４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼを含む組成物。
【請求項59】
バッファー、ヌクレオチド基質および／またはオリゴヌクレオチドプライマー基質のうち１種または複数をさらに含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項60】
標的ＤＮＡの相補的ＤＮＡを調製する方法であって、基質の存在下、前記標的ＤＮＡの全てまたは部分に対する相補的ＤＮＡの産生に適した条件下で、標的ＤＮＡを、請求項１～４４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼと接触させることを含む方法。
【請求項61】
標的ＤＮＡの存在を検出するための方法であって、基質の存在下、前記標的ＤＮＡの全てまたは部分に相補的なＤＮＡのＤＮＡポリメラーゼ媒介産生に適した条件下で、標的ＤＮＡを含有することが疑われる試料を、請求項１～４４のいずれか一項に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼと接触させることと、前記相補的ＤＮＡの存在を検出することとを含む方法。
【請求項62】
前記相補的ＤＮＡが、前記相補的ＤＮＡを増幅することにより検出される、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または等温増幅によるものである、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記等温増幅が、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）によるものである、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
標的ＤＮＡを増幅する方法であって、基質の存在下、標的ＤＮＡの増幅に適した条件下で、前記標的ＤＮＡを、請求項１～４４のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼと接触させることを含む方法。
【請求項66】
前記条件が、ポリメラーゼ連鎖反応のためのものである、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記条件が、ＬＡＭＰのためのものである、請求項６５に記載の方法。
【請求項68】
標的ＤＮＡを配列決定する方法であって、配列決定に適切な基質の存在下、標的ＤＮＡの相補的ＤＮＡのＤＮＡポリメラーゼ媒介伸長に適した条件下で、前記標的ＤＮＡを、請求項１～４４のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼと接触させることと、前記標的ＤＮＡの配列を決定することとを含む方法。
【請求項69】
請求項１～４４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼを含むキット。
【請求項70】
バッファー、ヌクレオチド基質および／またはオリゴヌクレオチドプライマー基質のうち１種または複数をさらに含む、請求項６９に記載のキット。
【請求項71】
第２のＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項６９～７０のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年１０月１５日に出願された米国特許仮出願第６３／２５６，４９２号に基づく利益を主張する。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年１０月１５日に出願された米国特許仮出願第６３／２５６，４９２号に基づく利益を主張する。
【0002】
配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
２０２２年１０月１４日に作成され、２．２１Ｍバイトのファイルサイズを有する、ファイル名ＣＸ９－２１８ＷＯ１＿ＳＴ２６．ｘｍｌとしてＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で本明細書と併せて提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
２０２２年１０月１４日に作成され、２．２１Ｍバイトのファイルサイズを有する、ファイル名ＣＸ９－２１８ＷＯ１＿ＳＴ２６．ｘｍｌとしてＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で本明細書と併せて提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
技術分野
本開示は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、診断、分子生物学的ツールおよび他の目的での、組換えＤＮＡポリメラーゼまたはその組成物の使用のための方法を提供する。
本開示は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、診断、分子生物学的ツールおよび他の目的での、組換えＤＮＡポリメラーゼまたはその組成物の使用のための方法を提供する。
【背景技術】
【0004】
背景
ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチドからＤＮＡを合成する酵素である。このような酵素は、ＤＮＡ複製に必須である。異なる特性を表示し、異なる型の生物において見出される、様々な型のＤＮＡポリメラーゼが存在する。好熱性生物から得られるポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列決定、ならびに他の診断的、分子生物学的および法医学的適用を含むがこれらに限定されない、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ方法における広範囲に及ぶ極めて重要な用途を見出した。多数の市販の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが存在するが、当技術分野において、依然として、改善された特性、例えば、増強された処理能力および／または忠実度を有する熱安定性酵素の必要がある。
ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチドからＤＮＡを合成する酵素である。このような酵素は、ＤＮＡ複製に必須である。異なる特性を表示し、異なる型の生物において見出される、様々な型のＤＮＡポリメラーゼが存在する。好熱性生物から得られるポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列決定、ならびに他の診断的、分子生物学的および法医学的適用を含むがこれらに限定されない、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ方法における広範囲に及ぶ極めて重要な用途を見出した。多数の市販の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが存在するが、当技術分野において、依然として、改善された特性、例えば、増強された処理能力および／または忠実度を有する熱安定性酵素の必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
概要
本開示は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本開示はまた、診断および他の目的での、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物を使用する方法を提供する。
本開示は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本開示はまた、診断および他の目的での、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物を使用する方法を提供する。
【0006】
一態様では、本開示は、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片であって、ポリペプチド配列が、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む、組換え逆転写酵素またはその機能性断片を提供する。
【0007】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片は、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0008】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片は、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0009】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置１５、１６、２０、２１、２２、４０、４１、５２、５７、５８、７３、８５、８７、８８、９１、１０２、１０９、１３２、１５７、１７７、１８６、２００、２１３、２１７、２３１、２３２、２４２、２４３、２６２、２６３、２６４、２６５、２７３、２９９、３２１、３２２、３２８、３８４、３８６、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、４４０、４７６、４８０、４９１、４９５、４９８、５０３、５０４、５０６、５０７、５０８、５１１、５１４、５２０、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６２、５６３、５６６、５７０、５７２、５８１、５８２、５８４、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６１６、６６５、６７１、６７４、６７５、６７７、６８４、６８８、６９６、７０４、７０５、７０６、７２８、７３５、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５３、７５５、７５６、７６２、７６３、７６４、７６６、７７２、７７３、７７９、７９３、８０３、８１４、８２０、または８４９またはそれらの組合せに少なくとも置換を含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0010】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換１５Ａ／Ｇ／Ｋ／Ｎ、１６Ｒ、２０Ａ／Ｃ、２１Ｋ／Ｑ／Ｓ、２２Ｋ、４０Ａ、４１Ｆ、５２Ｒ、５７Ｔ、５８Ｎ、７３Ａ、８５Ｅ／Ｐ／Ｒ／Ｓ、８７Ｎ、８８Ｔ、９１Ｋ、１０２Ｖ／Ｍ／Ｓ、１０９Ｐ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、１８６Ｅ、２００Ｖ、２１３Ｐ、２１７Ｅ、２３１Ｅ、２３２Ｃ、２４２Ｑ、２４３Ｌ／Ｓ、２６２Ｌ、２６３Ａ、２６４Ｔ、２６５Ｉ、２７３Ｍ、２９９Ｎ、３２１Ｇ、３２２Ｎ／Ｓ、３２８Ｉ、３８４Ｙ、３８６Ｖ、４０１Ａ／Ｇ／Ｉ、４０２Ｇ／Ｒ、４０３Ｌ／Ｒ、４０４Ｓ／Ｔ、４０６Ｋ／Ｑ、４０７Ｒ／Ｗ、４４０Ｇ、４７６Ｉ／Ｎ、４８０Ｅ／Ｖ／Ｗ、４９１Ｇ、４９５Ｅ／Ｍ／Ｓ、４９８Ｄ、５０３Ｉ／Ｖ、５０４Ｍ、５０６Ｐ、５０７Ｋ、５０８Ｈ、５１１Ｍ、５１４Ｆ、５２０Ｐ、５２１Ｇ／Ｗ／Ｙ、５２３Ａ／Ｋ／Ｖ、５２４Ｇ／Ｋ／Ｑ、５２５Ｌ／Ｖ、５２６Ｔ、５２７Ｖ／Ｗ、５２８Ａ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、５２９Ｓ、５３０Ｇ／Ｐ／Ｒ／Ｗ、５３３Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、５３４Ｈ／Ｗ、５３５Ｋ、５３６Ｒ、５３７Ｇ／Ｌ／Ｗ、５３８Ａ、５３９Ｌ／Ｒ、５４０Ｈ／Ｖ、５４２Ｇ／Ｍ／Ｔ／Ｗ、５５３Ｆ／Ｋ／Ｎ／Ｒ、５５４Ｅ、５５５Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｗ、５５６Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｗ、５５７Ｇ／Ｈ、５５８Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｑ、５５９Ｄ／Ｇ／Ｐ、５６０Ｇ／Ｍ、５６２Ｓ、５６３Ｌ、５６６Ａ、５７０Ｒ、５７２Ｉ、５８１Ａ、５８２Ｆ、５８４Ｎ、５８５ＫＲ、５８６Ｍ、５８７Ｑ、５８７Ｓ、５８９Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、５９２Ｇ／Ｔ／Ｖ、５９３Ｎ、５９４Ｃ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、５９５Ａ／Ｐ／Ｒ、５９６Ｌ／Ｒ／Ｗ、５９７Ｅ、５９９Ｇ／Ｓ／Ｔ、６０１Ｍ／Ｐ、６０２Ｖ、６０３Ｇ／Ｖ／Ｗ、６０５Ｅ／Ａ、６０７Ｎ、６１６Ａ、６６５Ｖ、６７１Ｅ／Ｒ、６７４Ｔ、６７５Ｌ、６７７Ｍ、６８４Ｖ、６８８Ｉ、６９６Ｈ／Ｖ、７０４Ｐ、７０５Ｗ、７０６Ｅ、７２８Ｋ、７３５Ｇ／Ｌ、７４７Ｔ、７４８Ｙ、７４９Ｌ／Ｒ／Ｔ、７５０Ｓ／Ｐ、７５１Ｈ、７５３Ｋ／Ｖ、７５５Ｐ、７５６Ｎ／Ｔ、７６２Ｍ／Ｑ／Ｖ、７６３Ｇ／Ｙ、７６４Ａ／Ｉ／Ｖ、７６６Ｙ、７７２Ｉ、７７３Ｒ、７７９Ｉ、７９３Ｇ、８０３Ｃ／Ｒ、８１４Ｅ、８２０Ａ、または８４９Ｔまたはそれらの組合せを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0011】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０、８５、１０２、１３２、１５７、１７７、２６２、２６３、７４８、５２１もしくは７５０またはそれらの組合せに少なくとも置換を含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、少なくとも置換４０Ａ、８５Ｅ、１０２Ｓ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、２６２Ｌ、２６３Ａ、７４８Ｙ、５２１Ｇもしくは７５０Ｓまたはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、少なくとも置換Ｓ４０Ａ、Ｐ８５Ｅ、Ｖ１０２Ｓ、Ｖ１３２Ｙ、Ｓ１５７Ｇ、Ｒ１７７Ｔ、Ｉ２６２Ｌ、Ｓ２６３Ａ、Ｈ７４８Ｙ、Ａ５２１ＧもしくはＰ７５０Ｓまたはそれらの組合せを含む。
【0012】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２１３／５０３／５０８／５８４／７４８、４０／１３２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８、１３２、４０／１３２／５０３／７４８、４０／１３２／１５７／５０３／５６２、４０／１３２／２１３／７４８／８１４、１３２／１５７／５６２／５８４、１３２／５８４／７４８、４０／１３２／２３１／６８４／７４８、４０／１３２、４０／４１／１３２／５６２／６８４／７４８、４１／２１３／２３１／５０３／６５０／６７４／７４８、１３２／２３１／５０３／７４８、４０／１３２／１５７／５０３、５０３／７４８／８１４、４０／１３２／２３１／５０３／６７４／７４８、４０／８８／１３２／５０３／６８４／７４８、１３２／１５７／２１３／６７４／７４８／８１４、１５７／２６３／７４８、４０／７４８、４１／１５７／２３１／２６２／７４８／８１４、４０／２１３／５０３／５６２／５８４／７４８、５２３／５２４、４０／１３２／５０３／５１４／６５０／６７４、４０／１３２／１５７／２１３／２３１、４１／２１３／５２０／８１４、４０／４１／１５７／２３１／５０３、４０／１５７／５０３、４０／１３２／５６２／７４８、１３２／７４８、４０／４１／１３２／５６２／７４８、８８／２１３／５０３／５８４／６８４／７４８、５７／５８／５２３／６１６／６７７、４０／２１３／２３１／５０３／５１４／５６２／７４８、１３２／５６２、２１３／５０３／６５０、４０／４１／８８／２３１／７４８／８１４、４１／２１３／２６２／５６２、４１／８８／２３１／７４８、２１３／２６３／７４８、４０／１５７／２１３、１５７／５２０、４０／１３２／２６３／５０３／６７４／８１４、４０／４１、５２４／６６５／７５６、５８／１８６／２１７／５２３／５２４／６７７、４０／４１／７４８、１３２／５１４、５２０、４１／２１３／５０３／５６２、２３１／５０３／７４８／７７２、５０３／５６２、７３／２３２／５１４／５８４／８１４、５８／５０７／６１６、１３２／２６２／５２０／５６２／６８４／７４８、８８／５６２／８１４、４１／８８／１５７／８１４、８８／１５７／２１３／６７４／６８４、５７／５８／５２３／７７９、４０／１３２／１５７／５１４／５２０／６８４、４０／４１／２１３／６８４／７７２、４０／４１／２３１／５０３／８１４、８８／２１３／５０３／５８４／８１４、４０／４１／１３２／５６２／５８４、４１／８８／２１３／２３１／５０３／６５０／７４８、４０／５０３、４０／１３２／２１３／２３１／５２０／５６２／６５０／８１４、４０／４１／１３２／２３１／２６２／５０３／５６２／５８４／７４８／８１４、５７／５８／２６４／２６５／５２４／６８８、８８／１３２／１５７／２６２／２６３／５２０／５６２、８８／１３２／１５７／２６２／５０３／５１４／５６２／６５０、４０／５８４／６７４／７４８、４０／４１／１３２／２６３／５０３、５８４／７４８、４０／２１３／６７４、４０／４１／８８Ｔ／１３２／５０３／５６２／５８４／７４８、８８／２１３／５１４／５６２／７４８／８１４、２６３／５２０／８１４、または４０／４１／８８／１５７に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0013】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２２／４０７、３２８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、５０３、５０４、５０６、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６３、５８１、５８２、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９２、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６９６、７４７、７４９、７５１、７６２、７６３、７６４、７６６、７７３、または８０３に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0014】
一部の実施形態では、一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、アミノ酸位置７５０／８２０、２１／５２、２０／２１／８５／３２２／４７６／４９５、２０／８５／２００／３２２／４７６／４９５／７５０、４７６／７５０、２０／４７６、２０／３２２／３８６、８５／３２２／４７６、５２／３２２／４９８／７５０、２０／３２２／４７６／８２０、８５／４７６／４９５／８２０、２１／８５／３２２／８２０、２０／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／８２０、２０／３２２、２１／８２０／８４９、４７６、３２２／８２０、２１／３２２／３８６／８２０、３２２／３８６／４９５、８５／３８６／４９５／７５０、２０／８５／４７６／７５０、２０／３８６／４７６、８５／３２２／３８６／４７６／４９５、２０／４９５／８２０、７５０、２１／３２２／４９５、５２／３８６／４９５／８２０、２１／３２２、８５／３２２／７５０／８２０、２０／５２／８５、２１／５２／５７２、２０／８５／４９５／８４９、８５／７５０、２１／４９５／８２０、２７３／３２２／８４９、４９５、３２２／７５０／８２０、５２／４７６／４９５／５６６／７５０／８４９、３８６／４９５、４９５／８２０、２１／３２２／４９５／７５０／８２０、２１／８５／３２２／３８６／４９５／８２０／８４９、４７６／４９５／７５０、３８６／８４９、４７６／４９５、８５／４７６／８４９、２１／３２２／７５０、２０／８５／５６６／８２０、または３８６／７５０／８４９に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0015】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２９９／３８６／５６６／８２０、４７６／８２０／８４９、２１／３２２／４７６／４９５／８２０、１７７、２１／４９５、４７６／８２０、２０／５２／２９９、５２／２９９、３２２／８２０、２０／８２０、２０／２９９／３８６／４７６、３８６／４７６／８２０、４７６／４９５／８２０、３８６／４７６／４９５、２０／２１／２９９／３２２／３８６、３２２／３８６／４９５、２１／２９９／３２２／４７６／４９５／８２０、２１／２９９／３８６／８２０、２９９／４７６／８２０、２０／２１、２１／８５／１０２／７５０、７０５、２１／３８６／４７６／８２０、８２０、２１／２９９／３２２、２０／２１／３２２／３８６／８２０、２９９、２１／２９９／３８６／４７６、１０９、３２２／４９５、４９１、５２／８２０、２１／３８６／８２０、２０／２１／４９５、２１／２９９／３２２／４９５／５６６／８２０、２０／２１／２９９／４９５、７５６、３８６／８２０、４９５、５１１、２１／５２／２４２／３８６／４９５／８２０、２９９／４７６／４９５、７０６、２１／２９９／３８６／４７６／４９５、２１／２９９／３２２／４９５、２１／４７６／８４９、２９９／３２２／４７６／８２０、２１／５２／２９９／３２２／８２０、２０／２１／５６６、２０／５２、３２２／３８６／４９５／５６６／８２０、２１／２９９、２１／２９９／３８６、３８６／８４９、５２／４７６、５２／２９９／３２２／３８６／４９５、４４０またはそれらの組合せに少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0016】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２２／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５６０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６９６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７４９、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７５１、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６２、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６６、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７７３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／８０３、４０／１３２／１５７／６０５／２６２／２６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／５２１／７４８、または４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／５５３／７４８に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0017】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／４０４／５２１／５２４／５４２／５５５／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／５２１／５２４／５４２／５８９／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５２４／５４２／５８１／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５４２／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／５２１／５４２／７４８／７６２、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５２４／５８１／７４８、１６／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／８２０、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７９３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５５、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７２８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／６７５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／６７１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５７０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４８０／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３８４／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２１／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２４３／２６２／２６３／５２１／７４８、１５／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／９１／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８７／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８５／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２０／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２１／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、または４０／５２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0018】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／８４９、２０／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５７２／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／８４９、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／８２０／８４９、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２７３／３２２／５２１／７４８／８４９、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８４９、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８４９、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５６６／７４８／８２０、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９８／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８／８２０、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８／８２０、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８４９、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２００／２６３／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、または２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／８２０／８４９に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0019】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０／８４９、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／１７７／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、５２／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０５／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／５２１／７４８／７５０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１０９／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９１／５２１／７４８／７５０、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／７５６、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５１１／５２１／７４８／７５０、２１／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２４２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０６／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５６６／７４８／７５０、２０／４０／５２／／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、または４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４４０／５２１／７４８／７５０に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0020】
一部の実施形態では、本開示の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【0021】
一部の実施形態では、本開示の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0022】
一部の実施形態では、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０を含む参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の参照配列に対して上述の配列同一性を有する操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置１５、１６、２０、２１、２２、４０、４１、５２、５７、５８、７３、８５、８７、８８、９１、１０２、１０９、１３２、１５７、１７７、１８６、２００、２１３、２１７、２３１、２３２、２４２、２４３、２６２、２６３、２６４、２６５、２７３、２９９、３２１、３２２、３２８、３８４、３８６、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、４４０、４７６、４８０、４９１、４９５、４９８、５０３、５０４、５０６、５０７、５０８、５１１、５１４、５２０、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６２、５６３、５６６、５７０、５７２、５８１、５８２、５８４、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６１６、６６５、６７１、６７４、６７５、６７７、６８４、６８８、６９６、７０４、７０５、７０６、７２８、７３５、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５３、７５５、７５６、７６２、７６３、７６４、７６６、７７２、７７３、７７９、７９３、８０３、８１４、８２０、または８４９またはそれらの組合せに少なくとも置換を含み、アミノ酸位置は、配列番号８、３３２、４６２または６０６の参照配列と比べたものである。
【0023】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくともアミノ酸残基１５Ａ／Ｇ／Ｋ／Ｎ、１６Ｒ、２０Ａ／Ｃ、２１Ｋ／Ｑ／Ｓ、２２Ｋ、４０Ａ、４１Ｆ、５２Ｒ、５７Ｔ、５８Ｎ、７３Ａ、８５Ｅ／Ｐ／Ｒ／Ｓ、８７Ｎ、８８Ｔ、９１Ｋ、１０２Ｖ／Ｍ／Ｓ、１０９Ｐ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、１８６Ｅ、２００Ｖ、２１３Ｐ、２１７Ｅ、２３１Ｅ、２３２Ｃ、２４２Ｑ、２４３Ｌ／Ｓ、２６２Ｌ、２６３Ａ、２６４Ｔ、２６５Ｉ、２７３Ｍ、２９９Ｎ、３２１Ｇ、３２２Ｎ／Ｓ、３２８Ｉ、３８４Ｙ、３８６Ｖ、４０１ Ａ／Ｇ／Ｉ、４０２Ｇ／Ｒ、４０３Ｌ／Ｒ、４０４Ｓ／Ｔ、４０６Ｋ／Ｑ、４０７Ｒ／Ｗ、４４０Ｇ、４７６Ｉ／Ｎ、４８０Ｅ／Ｖ／Ｗ、４９１Ｇ、４９５Ｅ／Ｍ／Ｓ、４９８Ｄ、５０３Ｉ／Ｖ、５０４Ｍ、５０６Ｐ、５０７Ｋ、５０８Ｈ、５１１Ｍ、５１４Ｆ、５２０Ｐ、５２１Ｇ／Ｗ／Ｙ、５２３Ａ／Ｋ／Ｖ、５２４Ｇ／Ｋ／Ｑ、５２５Ｌ／Ｖ、５２６Ｔ、５２７Ｖ／Ｗ、５２８Ａ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、５２９Ｓ、５３０Ｇ／Ｐ／Ｒ／Ｗ、５３３Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、５３４Ｈ／Ｗ、５３５Ｋ、５３６Ｒ、５３７Ｇ／Ｌ／Ｗ、５３８Ａ、５３９Ｌ／Ｒ、５４０Ｈ／Ｖ、５４２Ｇ／Ｍ／Ｔ／Ｗ、５５３Ｆ／Ｋ／Ｎ／Ｒ、５５４Ｅ、５５５Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｗ、５５６Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｗ、５５７Ｇ／Ｈ、５５８Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｑ、５５９Ｄ／Ｇ／Ｐ、５６０Ｇ／Ｍ、５６２Ｓ、５６３Ｌ、５６６Ａ、５７０Ｒ、５７２Ｉ、５８１Ａ、５８２Ｆ、５８４Ｎ、５８５ＫＲ、５８６Ｍ、５８７Ｑ／Ｓ、５８９Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、５９２Ｇ／Ｔ／Ｖ、５９３Ｎ、５９４Ｃ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、５９５Ａ／Ｐ／Ｒ、５９６Ｌ／Ｒ／Ｗ、５９７Ｅ、５９９Ｇ／Ｓ／Ｔ、６０１Ｍ／Ｐ、６０２Ｖ、６０３Ｇ／Ｖ／Ｗ、６０５Ｅ／Ａ、６０７Ｎ、６１６Ａ、６６５Ｖ、６７１Ｅ／Ｒ、６７４Ｔ、６７５Ｌ、６７７Ｍ、６８４Ｖ、６８８Ｉ、６９６Ｈ／Ｖ、７０４Ｐ、７０５Ｗ、７０６Ｅ、７２８Ｋ、７３５Ｇ／Ｌ、７４７Ｔ、７４８Ｙ、７４９Ｌ／Ｒ／Ｔ、７５０Ｓ／Ｐ、７５１Ｈ、７５３Ｋ／Ｖ、７５５Ｐ、７５６Ｎ／Ｔ、７６２Ｍ／Ｑ／Ｖ、７６３Ｇ／Ｙ、７６４Ａ／Ｉ／Ｖ、７６６Ｙ、７７２Ｉ、７７３Ｒ、７７９Ｉ、７９３Ｇ、８０３Ｃ／Ｒ、８１４Ｅ、８２０Ａ、または８４９Ｔまたはそれらの組合せを含み、アミノ酸位置は、配列番号８、３３２、４６２または６０６の参照配列と比べたものである。
【0024】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０、８５、１０２、１３２、１５７、１７７、２６２、２６３、５２１、７４８、または７５０またはそれらの組合せに少なくとも置換を含む。
【0025】
一部の実施形態では、本開示の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号８の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列が、配列番号８の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0026】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２２／４０７、３２８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、５０３、５０４、５０６、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６３、５８１、５８２、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９２、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６９６、７４７、７４９、７５１、７６２、７６３、７６４、７６６、７７３、または８０３またはそれらの組合せに少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号８の参照配列と比べたものである。
【0027】
一部の実施形態では、本開示の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３３２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号３３２に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号３３２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号３３２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0028】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置１５、２０、２１、５２、８５、８７、９１、１０２、２４３、３２１、３２２、３８４、４０４、４７６、４８０、４８０、４９５、５４２、５７０、６７１、６７５、７０４、７２８、７３５、７５３、７５５、７６２、７６４、７９３、８２０、１６／７３５、７５０／８４９、５２４／５８１、４０３／４０４／５２４／５４２／５５５／７６２／７６４、４０４／５２４／５４２／５８９／７６２／７６４、５２４／５４２／５８１／７６２／７６４、または５４２／７６２／７６４に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３３２の参照配列と比べたものである。
【0029】
一部の実施形態では、本開示の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４６２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号４６２に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号４６２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号４６２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0030】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置７５０／８２０、２１／５２、２０／２１／８５／３２２／４７６／４９５、２０／８５／２００／３２２／４７６／４９５／７５０、４７６／７５０、２０／４７６、２０／３２２／３８６、８５／３２２／４７６、５２／３２２／４９８／７５０、２０／３２２／４７６／８２０、８５／４７６／４９５／８２０、２１／８５／３２２／８２０、２０／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／８２０、２０／３２２、２１／８２０／８４９、４７６、３２２／８２０、２１／３２２／３８６／８２０、３２２／３８６／４９５、８５／３８６／４９５／７５０、２０／８５／４７６／７５０、２０／３８６／４７６、８５／３２２／３８６／４７６／４９５、２０／４９５／８２０、７５０、２１／３２２／４９５、５２／３８６／４９５／８２０、２１／３２２、８５／３２２／７５０／８２０、２０／５２／８５、２１／５２／５７２、２０／８５／４９５／８４９、８５／７５０、２１／４９５／８２０、２７３／３２２／８４９、４９５、３２２／７５０／８２０、５２／４７６／４９５／５６６／７５０／８４９、３８６／４９５、４９５／８２０、２１／３２２／４９５／７５０／８２０、２１／８５／３２２／３８６／４９５／８２０／８４９、４７６／４９５／７５０、３８６／８４９、４７６／４９５、８５／４７６／８４９、２１／３２２／７５０、２０／８５／５６６／８２０、または３８６／７５０／８４９に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号４６２の参照配列と比べたものである。
【0031】
一部の実施形態では、本開示の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号６０６に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0032】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２９９／３８６／５６６／８２０、４７６／８２０／８４９、２１／３２２／４７６／４９５／８２０、１７７、２１／４９５、４７６／８２０、２０／５２／２９９、５２／２９９、３２２／８２０、２０／８２０、２０／２９９／３８６／４７６、３８６／４７６／８２０、４７６／４９５／８２０、３８６／４７６／４９５、２０／２１／２９９／３２２／３８６、３２２／３８６／４９５、２１／２９９／３２２／４７６／４９５／８２０、２１／２９９／３８６／８２０、２９９／４７６／８２０、２０／２１、２１／８５／１０２／７５０、７０５、２１／３８６／４７６／８２０、８２０、２１／２９９／３２２、２０／２１／３２２／３８６／８２０、２９９、２１／２９９／３８６／４７６、１０９、３２２／４９５、４９１、５２／８２０、２１／３８６／８２０、２０／２１／４９５、２１／２９９／３２２／４９５／５６６／８２０、２０／２１／２９９／４９５、７５６、３８６／８２０、４９５、５１１、２１／５２／２４２／３８６／４９５／８２０、２９９／４７６／４９５、７０６、２１／２９９／３８６／４７６／４９５、２１／２９９／３２２／４９５、２１／４７６／８４９、２９９／３２２／４７６／８２０、２１／５２／２９９／３２２／８２０、２０／２１／５６６、２０／５２、３２２／３８６／４９５／５６６／８２０、２１／２９９、２１／２９９／３８６、３８６／８４９、５２／４７６、５２／２９９／３２２／３８６／４９５、４４０またはそれらの組合せに少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６０６の参照配列と比べたものである。
【0033】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に提供される置換または置換セットを含むポリペプチド配列を含み、置換または置換セットは、配列番号２、８、３３２、４６２または６０６の参照配列と比べたものである。
【0034】
一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントの残基１２～８５０を含む参照配列または表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される少なくとも１種の操作されたバリアントの参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【0035】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４～７７０のうち偶数番号の配列から選択される配列の残基１２～８５０を含むポリペプチド配列を含み、ポリペプチドは、必要に応じて、ポリペプチド配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の置換を有する。
【0036】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４～７７０のうち偶数番号の配列から選択される配列を含むポリペプチド配列を含み、ポリペプチドは、必要に応じて、ポリペプチド配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の置換を有する。
【0037】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０を含む配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６を含む配列を含むポリペプチド配列を含む。
【0038】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、参照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも１種の改善された特性を有する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、参照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、増加した活性を示すか、またはポリメラーゼ連鎖反応におけるより多い産物収量を産生する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、参照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、増加した忠実度を示す。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、参照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、増加した熱安定性を示す。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、比較対照ＤＮＡポリメラーゼよりも増加した処理能力を示す。一部の実施形態では、参照または比較対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する配列を有するＤＮＡポリメラーゼ；または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する配列を有するＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、参照または比較対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２の残基１２～８５０に対応する配列を有するＤＮＡポリメラーゼ；または配列番号２に対応する配列を有するＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、参照または比較対照ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１由来のＢ群ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される野生型ＤＮＡポリメラーゼである。
【0039】
一部のさらなる実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、精製されている。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、溶液で提供されるか、または基材、例えば、固体基材もしくは膜もしくは粒子の表面に固定される。
【0040】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される操作されたＤＮＡポリメラーゼのいずれかをコードする組換えポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片をコードし、ポリペプチド配列は、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0041】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、上述および本明細書に記載される通り、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片をコードし、ポリペプチド配列は、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0042】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号１、５、２１、２３、２５、２７もしくは８２３のヌクレオチド残基３４～２５５０に対応する参照ポリヌクレオチド配列または配列番号１、５、２１、２３、２５、２７もしくは８２３に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有する配列を含み、ポリヌクレオチドは、操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号１、５、２１、２３、２５、２７または８２３のヌクレオチド残基３４～２５５０を含む配列を含む。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号１、５、２１、２３、２５、２７または８２３を含む配列を含む。
【0043】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号３～７６９から選択される奇数番号のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド残基３４～２５５０に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有する配列を含み、ポリヌクレオチドは、操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号３～７６９から選択される奇数番号のポリヌクレオチド配列に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有する配列を含み、ポリヌクレオチドは、操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。
【0044】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号３～７６９から選択される奇数番号のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド残基３４～２５５０を含む配列を含む。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号３～７６９から選択される奇数番号のポリヌクレオチド配列を含む配列を含む。
【0045】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、生物、例えば、細菌細胞または哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。
【0046】
さらなる態様では、本開示は、操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする本明細書に提供される少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、制御配列に作動可能に連結されている（is operablelinked to）。一部の実施形態では、制御配列は、プロモーターを含む。
【0047】
さらなる態様では、本開示はまた、本明細書に提供される少なくとも１種の組換えポリヌクレオチドまたは発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌、真菌または哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉまたはＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓである。
【0048】
別の態様では、本開示は、宿主細胞において操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを産生する方法であって、少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼが産生されるような適した培養条件下で、本明細書に提供される宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、培養物および／または宿主細胞から操作されたＤＮＡポリメラーゼを回収することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、操作されたＤＮＡポリメラーゼを精製するステップをさらに含む。
【0049】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、少なくともバッファーを含む。一部の実施形態では、組成物は、１種または複数のＤＮＡポリメラーゼ基質、例えば、ヌクレオチド基質および／またはオリゴヌクレオチドプライマー基質をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＤＮＡ鋳型、例えば、標的ＤＮＡをさらに含む。
【0050】
さらなる態様では、本開示は、全体または部分的に標的ＤＮＡの相補的ＤＮＡコピーを調製する方法における操作されたＤＮＡポリメラーゼの使用を提供する。一部の実施形態では、本開示は、全体または部分的に標的ＤＮＡの相補的ＤＮＡを調製する方法であって、適切な基質の存在下、標的ＤＮＡに相補的なＤＮＡのＤＮＡポリメラーゼ媒介産生に適した条件下で、標的ＤＮＡを本明細書に記載されている操作されたＤＮＡポリメラーゼと接触させることを含む方法を提供する。
【0051】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、標的ＤＮＡの検出に使用され、方法は、適切な基質の存在下、全体または部分的に、標的ＤＮＡに相補的なＤＮＡのＤＮＡポリメラーゼ媒介産生に適した条件下で、標的ＤＮＡを含有することが疑われる試料を、本開示の操作されたＤＮＡポリメラーゼと接触させることと、相補的ＤＮＡの存在を検出することとを含む。一部の実施形態では、試料は、生体試料である。一部の実施形態では、相補的ＤＮＡを検出することは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＬＡＭＰ等により、相補的ＤＮＡを増幅することによるものである。一部の実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲ等により、操作されたＤＮＡポリメラーゼを逆転写酵素と共に使用して、標的ＲＮＡを検出することができる。
【0052】
さらなる態様では、本開示はまた、本明細書に開示される少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、バッファー、ヌクレオチド基質および／またはオリゴヌクレオチドプライマー基質のうち１種または複数をさらに含むことができる。一部の実施形態では、キットは、鋳型ＤＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、第２のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、別の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素を含むことができる。
【発明を実施するための形態】
【0053】
詳細な説明
本開示は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、診断および他の目的での、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物の使用のための方法を提供する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、特に、低濃度のＤＮＡインプット、ハイスループット解析および／または配列決定反応条件が関与する条件下で、増強された重合活性、高い複製忠実度および／または高い処理能力を提供する。
本開示は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、診断および他の目的での、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物の使用のための方法を提供する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、特に、低濃度のＤＮＡインプット、ハイスループット解析および／または配列決定反応条件が関与する条件下で、増強された重合活性、高い複製忠実度および／または高い処理能力を提供する。
【0054】
一部の実施形態では、本開示の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、セルフリーＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ、循環腫瘍細胞から単離されたＤＮＡ、循環胎児ＤＮＡ、ウイルスに感染した細胞、細針吸引液、またはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）、レーザーキャプチャー顕微鏡法もしくはマイクロ流体デバイスによって単離された単一細胞から単離されたＤＮＡを含む、試料由来の少量のＤＮＡを使用した診断および研究適用における用途を見出す。しかし、低いＤＮＡ濃度の試料を含むいかなる適切な試料も、本発明での使用を見出しているので、本発明で使用される試料が、いずれか特定の試料型に限定されることは意図されない。
略語および定義
略語および定義
【0055】
他に定義されていなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用されている命名法ならびに後述する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の研究室手順は、当技術分野で周知かつ一般的に用いられているものである。そのような技法は、周知であり、当業者にとって周知の多数のテキストおよび参考文献に記載されている。標準技法またはその修正版が、化学合成および化学分析に使用される。
【0056】
本明細書に記載されている方法および材料と同様のまたは均等ないかなる適した方法および材料も本発明の実施における用途を見出すが、一部の方法および材料が本明細書に記載されている。方法論、プロトコールおよび試薬は、それらが当業者によって使用される文脈に応じて変動し得るため、本発明が、記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことを理解されたい。したがって、直ぐ下に定義される用語は、本出願を全体として参照することにより、より十分に説明される。上記および下記の両方で本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより明確に参照により本明細書に組み込まれる。
【0057】
本明細書で使用される場合、単数形「ある（a）」、「ある（an）」および「その（the）」は、文脈が明らかにそれ以外のことを示さない限り、複数形の参照を含む。
【0058】
本明細書で使用される場合、用語「を含む（comprising）」およびその同族語は、それらの包括的な意味で使用される（すなわち、用語「を含む（including）」およびその対応する同族語と等価である）。
【0059】
実施形態の記載が、用語「を含む（comprising）」およびその同族語を使用する場合、この実施形態は、言葉「から本質的になる（consisting essentially of）」または「からなる（consisting of）」を使用して記載されてもよいことをさらに理解されたい。
【0060】
数的範囲は、範囲を定義する数を包括する。よって、本明細書に開示されるあらゆる数値的範囲は、そのようなより広い数値的範囲内に収まるあらゆるより狭い数値的範囲を、あたかもそのようなより狭い数値的範囲が全て本明細書に明確に書かれているかのように包含することが意図される。本明細書に開示されるあらゆる最大の（または最小の）数値的限界が、あらゆるより低い（またはより高い）数値的限界を、あたかもそのようなより低い（またはより高い）数値的限界が本明細書に明確に書かれているかのように含むことも意図される。
【0061】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の値に許容される誤差を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値範囲の０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％以内を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の１、２、３または４標準偏差以内を意味する。
【0062】
さらに、本明細書に提供される見出しは、本出願を全体として参照することにより得られる本発明の様々な態様または実施形態の限定ではない。したがって、直ぐ下に定義される用語は、本出願を全体として参照することにより、より十分に定義される。にもかかわらず、本発明の理解を容易にするため、多数の用語が下に定義される。
【0063】
他に指示がなければ、それぞれ、核酸は、５’から３’への方向性で左から右に書かれる；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシへの方向性で左から右に書かれる。
【0064】
本明細書で使用される場合、「ＥＣ」番号は、国際生化学分子生物学連合の命名法委員会（Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology）（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学的分類は、触媒する化学反応に基づく酵素の数値的分類システムである。
【0065】
本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）を指し、そのバイオレポジトリーコレクションは、遺伝子および株を含む。
【0066】
本明細書で使用される場合、「ＮＣＢＩ」は、国立生物学情報センター（National Center for Biological Information）およびその中に提供される配列データベースを指す。
【0067】
本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を指す。
【0068】
本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡ」は、リボ核酸を指す。
【0069】
本明細書で使用される場合、用語「融合タンパク質」および「キメラタンパク質」および「キメラ」は、別々のタンパク質を本来コードした２個またはそれよりも多い遺伝子の接合により作り出された、ハイブリッドタンパク質を指す。一部の実施形態では、融合タンパク質は、組換え技術（例えば、当技術分野で公知の分子生物学技法）によって作り出される。
【0070】
本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸を重合する酵素のクラスを指す。ポリメラーゼは、相補的核酸鎖を合成するために鋳型核酸鎖を使用する。鋳型鎖および合成された核酸鎖は独立して、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る。当技術分野で公知のポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌＩ、Ｔ． ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素）を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、ポリメラーゼは、ポリメラーゼの所望の酵素機能を実行するのに十分なアミノ酸を含有するポリペプチドまたはタンパク質である。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ネイティブ酵素に見出されるアミノ酸の全てを含有する訳ではないが、ポリメラーゼが、５’－３’重合、５’－３’エキソヌクレアーゼおよび３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を含むがこれらに限定されない所望の触媒活性を実行することを可能にするのに十分なアミノ酸のみを含有する。
【0071】
本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡポリメラーゼ活性」、「合成活性」および「ポリメラーゼ活性」は、本明細書で互換的に使用されており、デオキシヌクレオシド三リン酸の取込みによって新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素の能力を指す。
【0072】
本明細書で使用される場合、用語「二重鎖」および「ｄｓ」は、それらの配列が相補的であり（ＡはＴと対形成し、ＣはＧと対形成する）、逆平行の５’から３’への方向性で配置され、核酸塩基（すなわち、アデニン［Ａ］、グアニン［Ｇ］、シトシン［Ｃ］およびチミン［Ｔ］）の間の水素結合によって一体に保持された、２本の一本鎖ポリヌクレオチドで構成された二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）分子を指す。
【0073】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さにも翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にも関係なく、アミド結合によって共有結合により連結された少なくとも２個のアミノ酸のポリマーを表示するように互換的に使用される。
【0074】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、その一般的に知られた３文字記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学的命名法委員会によって推奨される１文字記号のいずれかによって本明細書において言及される。同様に、ヌクレオチドは、その一般的に容認される一文字コードによって言及され得る。遺伝子にコードされたアミノ酸のために使用される略語は、従来のものであり、次の通りである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。３文字略語が使用される場合、特に「Ｌ」もしくは「Ｄ」が先行しない限り、または略語が使用される文脈から明らかでない限り、アミノ酸は、α－炭素（Ｃα）に関してＬ－またはＤ－立体配置のどちらでもよい。例えば、「Ａｌａ」が、α－炭素に関する立体配置を特定せずにアラニンを指定する一方で、「Ｄ－Ａｌａ」および「Ｌ－Ａｌａ」は、それぞれＤ－アラニンおよびＬ－アラニンを指定する。１文字略語が使用される場合、大文字は、α－炭素に関してＬ－立体配置のアミノ酸を指定し、小文字は、α－炭素に関してＤ－立体配置のアミノ酸を指定する。例えば、「Ａ」は、Ｌ－アラニンを指定し、「ａ」は、Ｄ－アラニンを指定する。ポリペプチド配列が、一連の１文字または３文字略語（またはそれらの混合物）として提示される場合、配列は、一般的な慣例に従ってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）への方向で提示される。
【0075】
遺伝子コードヌクレオシドのために使用される略語は、従来のものであり、次の通りである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。特に明記されない限り、省略されたヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのどちらでもよい。ヌクレオシドは、個々のベースでまたは集合体ベースで、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかであると特定することができる。核酸配列が、一連の１文字略語として提示される場合、配列は、一般的な慣例に従って５’から３’への方向で提示され、リン酸は示されない。
【0076】
本明細書で使用される場合、用語「操作された（engineered）」、「組換え」、「天然に存在しない」および「バリアント」は、細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、本来であれば自然界に存在しないであろう様式で修飾された、または天然もしくはネイティブ形態と同一であるが、合成材料から産生もしくは得られたおよび／もしくは組換え技法を使用した操作（manipulation）によって産生もしくは得られた、材料の天然またはネイティブ形態に対応する材料または材料（a material or a material）を指す。
【0077】
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、自然界に見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界の供給源から単離することができ、ヒトによる操作によって意図的に修飾されていない、生物中に存在する配列である。
【0078】
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸の部分（例えば、遺伝子）を指す。
【0079】
本明細書で使用される場合、用語「パーセント（％）配列同一性」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの間の比較を指し、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列のために参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列にある位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより、計算することができる。その代わりに、パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列にある位置の数を決定するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基をギャップ入りで整列させて、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより、計算することができる。当業者は、２つの配列の整列に利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを十分に理解している。比較のための配列の最適な整列は、例えば、当技術分野で公知の通り、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 1981, 2:482）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性整列アルゴリズム（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 1970, 48:443）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:2444）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化インプリメンテーション（例えば、ＧＣＧ ＷｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって行うことができる。パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム（例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215:403-410；およびAltschul et al., Nucleic Acids Res., 1977, 3389-3402を参照）を含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）ウェブサイトにより公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと整列されたときにマッチするかまたはある正の値の閾値スコア「Ｔ」を満たす、クエリー配列における長さ「Ｗ」の短いワードを同定することにより、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を先ず同定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al、上記を参照）。これらの初期隣接ワードヒットは、これらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシーズとして作用する。次いでワードヒットは、累積アライメントスコアを増加させ得る限りにおいて、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーター「Ｍ」（マッチする残基のペアのための報酬スコア；常に＞０）および「Ｎ」（ミスマッチする残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの伸長は、次の場合に停止される：累積アライメントスコアが、その最大達成値から含量「Ｘ」だけ下落する；１つもしくは複数の負のスコアリングの残基整列の蓄積により、累積スコアがゼロもしくはそれ未満に進む；またはどちらかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（例えば、Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 89:10915を参照）を使用する。配列整列および％配列同一性の例示的な決定は、提供されるデフォルトパラメーターを使用して、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
【0080】
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５残基の長さ、少なくとも５０残基の長さ、少なくとも１００残基の長さ、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、（１）２つの配列の間で同様である配列（すなわち、完全配列の部分）を含むことができ、（２）２つの配列の間で多岐にわたる配列をさらに含むことができるため、２つの（またはそれよりも多い）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は典型的に、配列類似性の局所領域を同定および比較するために「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較することにより実行される。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくことができ、参照配列は、一次配列の１個または複数の変化を有することができる配列である。例えば、語句「Ｘ２００に対応する残基にバリンを有する配列番号２に基づく参照配列」（または「位置２００に対応する残基にバリンを有する配列番号２に基づく参照配列」）は、配列番号２における位置Ｘ２００における対応する残基（例えば、アラニン）がバリンに変更された参照配列を指す。
【0081】
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の隣接したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、配列は、少なくとも２０個の隣接したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウにおける配列の部分は、２つの配列の最適な整列のために参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウは、２０個の隣接した残基よりも長くてもよく、必要に応じて３０、４０、５０、１００個またはそれよりも長いウィンドウを含む。
【0082】
本明細書で使用される場合、「に対応する」、「を参照して」および「と比べて」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されるときの、指定された参照配列の残基の番号付けを指す。換言すると、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的位置よりもむしろ、参照配列に関して指定される。例えば、操作されたＤＮＡポリメラーゼの配列等、所与のアミノ酸配列は、２つの配列の間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することにより、参照配列と整列させることができる。このような場合、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それが整列された参照配列に関して行われる。一部の実施形態では、配列は、タグ付けされる（例えば、ヒスチジンタグを）。
【0083】
本明細書で使用される場合、「変異」は、核酸配列の変更を指す。一部の実施形態では、変異は、コードされるポリペプチド配列に変化をもたらす（すなわち、変異がない本来の配列と比較して）。一部の実施形態では、変異は、異なるアミノ酸が産生されるような置換を含む（例えば、トリプトファンによるアスパラギン酸の置換）。一部の代替実施形態では、変異は、本来のポリペプチド配列にアミノ酸が付加されるような付加を含む。一部のさらなる実施形態では、変異は、本来のポリペプチド配列からアミノ酸が欠失されるような欠失を含む。いかなる数の変異が所与の配列に存在してもよい。
【0084】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸差」および「残基差」は、参照配列における対応する位置におけるアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差を指す。アミノ酸差の位置は一般に、「Ｘｎ」と本明細書で称され、ｎは、残基差が基づく参照配列における対応する位置を指す。例えば、「配列番号２と比較した位置Ｘ２００における残基差」（または「配列番号２と比較した位置２００における残基差」）は、配列番号２の位置２００に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差を指す。よって、配列番号２の参照ポリペプチドが、位置２００にアラニンを有する場合、「配列番号２と比較した位置Ｘ２００における残基差」は、配列番号２の位置２００に対応するポリペプチドの位置におけるアラニン以外のいずれかの残基のアミノ酸置換を指す。本明細書における多くの例では、ある位置における特異的アミノ酸残基差は、「ＸｎＹ」として示され、「Ｘｎ」は、参照ポリペプチド（上に記載される通り）の対応する残基および位置を指定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドに見出されるアミノ酸の一文字識別子である（すなわち、参照ポリペプチド中とは異なる残基）。一部の例では（例えば、実施例中の表における）、本開示はまた、従来の表示法「ＡｎＢ」によって表示される特異的アミノ酸差を提供し、Ａは、参照配列における残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列における残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列における残基置換の一文字識別子である。一部の例では、本開示のポリペプチドは、指定された位置のリストによって示される、参照配列と比べた１個または複数のアミノ酸残基差を含むことができ、残基差は、参照配列と比べて存在する。一部の実施形態では、ポリペプチドの特異的残基位置において２種以上のアミノ酸を使用することができる場合、使用することができる様々なアミノ酸残基は、「／」によって分離される（例えば、Ｘ１５Ａ／Ｘ１５Ｇ、Ｘ１５Ａ／Ｇ、またはＶ１５Ａ／Ｇまたは１５Ａ／Ｇ）。本開示は、保存的および非保存的アミノ酸置換のいずれか一方／または両方、ならびに配列におけるアミノ酸の挿入および欠失を含む、１個または複数のアミノ酸差を含む操作されたポリペプチド配列を含む。
【0085】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸置換セット」および「置換セット」は、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換の群を指す。一部の実施形態では、置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれよりも多いアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、置換セットは、実施例中の表のいずれかに収載されているバリアントＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。これらの置換セットにおいて、個々の置換は、セミコロン（「；」；例えば、Ｖ１５Ｇ；Ｌ２０Ａ；Ｆ２１Ｋ）またはスラッシュ（「／」；例えば、Ｖ１５Ｇ／Ｌ２０Ａ／Ｆ２１Ｋまたは１５Ｇ／２０Ａ／２１Ｋ）によって分離される。一部の実施形態では、「置換」は、アミノ酸の欠失を含む。
【0086】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、ある残基の、同様の側鎖を有する異なる残基による置換を指し、よって典型的に、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、アミノ酸の同じまたは同様の定義されたクラス内のアミノ酸による置換を伴う。例としてであって限定ではなく、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸で置換され得（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸で置換され（例えば、セリンおよびスレオニン）；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸で置換され（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖（basis side chain）を有する別のアミノ酸で置換され（例えば、リシンおよびアルギニン）；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸で置換され（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）；疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置き換えられる。
【0087】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸による置換を指す。非保存的置換は、定義された群内ではなく定義された群間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換の区域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンに代えたプロリン）；（ｂ）電荷もしくは疎水性；および／または（ｃ）側鎖の嵩に影響を与えることができる。例としてであって限定ではなく、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸；小型のアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸を含む。
【0088】
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の除去による、ポリペプチドに対する修飾を指す。欠失は、操作されたポリメラーゼ酵素の酵素活性を保持しつつおよび／または改善された特性を保持しつつ、１個もしくはそれよりも多いアミノ酸、２個もしくはそれよりも多いアミノ酸、５個もしくはそれよりも多いアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、１５個もしくはそれよりも多いアミノ酸または２０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大１０％、またはアミノ酸の総数の最大２０％の除去を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分に向けることができる。様々な実施形態では、欠失は、連続的セグメントを含むことができるか、または非連続的であり得る。欠失は、「－」によって示され、置換セットに存在し得る。
【0089】
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の付加による、ポリペプチドに対する修飾を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分に、またはカルボキシもしくはアミノ末端に為すことができる。挿入は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知の通り、融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の隣接したセグメントであり得る、または天然に存在するポリペプチドにおけるアミノ酸のうち１個もしくは複数によって分離され得る。
【0090】
本明細書で使用される場合、「機能性断片」および「生物活性断片」は、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端欠失（複数可）ならびに／または内部欠失を有するが、残っているアミノ酸配列が、それが比較されている配列（例えば、本発明の全長の操作されたＤＮＡポリメラーゼ）における対応する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持する、ポリペプチドを指すように本明細書で互換的に使用される。
【0091】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、天然ではそれに付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されたポリペプチドを包括する。組換えＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、細胞内に存在してもよく、細胞培地中に存在してもよく、またはライセートもしくは単離された調製物等の様々な形態で調製されてもよい。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供される組換えＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。
【0092】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢な種である（すなわち、モル濃度または重量ベースで、組成物中のいかなる他の個々の巨大分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、対象種が、モルまたは％重量で、存在する巨大分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なＤＮＡポリメラーゼ組成物は、組成物中に存在するモルまたは％重量で全巨大分子種の約６０％またはそれよりも多く、約７０％またはそれよりも多く、約８０％またはそれよりも多く、約９０％またはそれよりも多く、約９５％またはそれよりも多くおよび約９８％またはそれよりも多くを構成する。一部の実施形態では、対象種は、本質的に均一（すなわち、従来の検出方法により組成物中に夾雑物種を検出することができない）になるまで精製され、組成物は、単一の巨大分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、巨大分子種と考慮されない。一部の実施形態では、単離された組換えＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【0093】
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、参照ＤＮＡポリメラーゼポリペプチド、例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼポリペプチド（例えば、配列番号２の残基１２～８５０の野生型ＤＮＡポリメラーゼポリペプチド配列）または別の操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドと比較して、いずれかの酵素特性における改善を示す操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを指す。改善された特性は、増加したタンパク質発現、増加した熱活性、増加した熱安定性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性および／または親和性、増加した比活性、基質および／または最終産物阻害に対する増加した抵抗性、増加した化学的安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性ｐＨに対する増加した耐性、タンパク質分解活性に対する増加した耐性（すなわち、タンパク質分解に対する低減された感受性）、増加した溶解性、増加した忠実度、増加した処理能力、ならびに変更された温度プロファイル等の特性を含むがこれらに限定されない。
【0094】
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」および「増強された触媒活性」は、参照ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび／または別の操作されたＤＮＡポリメラーゼ）と比較した、比活性（例えば、産生された産物／時間／タンパク質重量）の増加および／または基質から産物へのパーセント変換（例えば、指定量のＤＮＡポリメラーゼを使用した、指定期間における出発量の基質から産物へのパーセント変換）の増加によって表すことができる、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの改善された特性を指す。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に提供されている。その変化が増加した酵素活性をもたらし得る、Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的酵素特性を含む、酵素活性に関するいずれかの特性が影響され得る。酵素活性における改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドが由来する天然に存在するＤＮＡポリメラーゼまたは別の操作されたＤＮＡポリメラーゼの２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれよりも多い酵素活性までもの多さであり得る。
【0095】
本明細書で使用される場合、本明細書で互換的に使用される用語「タンパク質分解活性」および「タンパク質分解」は、タンパク質の、より小型のポリペプチドまたはアミノ酸への分解を指す。タンパク質の分解は一般に、プロテアーゼ（プロテイナーゼ）酵素によるペプチド結合の加水分解の結果である。プロテアーゼ酵素は、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ；カルボキシペプチダーゼＡおよびＢならびにペプチダーゼ（例えば、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼおよびエンテロペプチダーゼ）を含むがこれらに限定されない。
【0096】
本明細書で使用される場合、語句「タンパク質分解に対する感受性を低減させること」および「タンパク質分解感受性を低減させること」は本明細書で互換的に使用され、本発明による操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドが、１種または複数のプロテアーゼによる処理後に、標準アッセイ（例えば、実施例に開示される通り）において、参照ＤＮＡポリメラーゼと比較してより高い酵素活性を有することを意味する。
【0097】
本明細書で使用される場合、「変換」は、基質（複数可）から対応する産物（複数可）への酵素変換（または生体内変換）を指す。「パーセント変換」は、ある期間内に指定条件下で産物へと変換される基質のパーセントを指す。よって、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、ある特定の期間における基質から産物への「パーセント変換」として表現することができる。
【0098】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件等のハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で実行され、続いて、様々だがより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡに対して約６０％同一性、好ましくは約７５％同一性、約８５％同一性を有し、標的ポリヌクレオチドに対して約９０％を超える同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハルト（Denhart）溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーションと、それに続く４２℃で０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおける洗浄と等価な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、定義されたポリヌクレオチド配列の溶液条件下で決定される熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満である条件を一般に指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．０１８Ｍ ＮａＣｌにおいて安定したハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、本明細書で企図される場合、ハイブリッドは、６５℃で０．０１８Ｍ ＮａＣｌにおいて安定していなければ、高ストリンジェンシー条件下で安定しない）。例えば、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハルト（Denhart）溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳと等価な条件におけるハイブリダイゼーションと、それに続く６５℃で０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳにおける洗浄によって、高ストリンジェンシー条件を提供することができる。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣにおいてハイブリダイズし、６５℃で０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣにおいて洗浄することと等価な条件でハイブリダイズすることを含む。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件と共に、中程度にストリンジェントな条件は、上に引用されている参考文献に記載されている。
【0099】
本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」は、コードされるタンパク質が、特定の生物においてより効率的に発現されるような、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、当該生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。大部分のアミノ酸が、「同義」または「同義的」コドンと呼ばれる、いくつかのコドンによって表されるという点において、遺伝暗号は縮重であるが、特定の生物によるコドン使用が、非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏りがあることが周知である。このコドン使用バイアスは、所与の遺伝子、共通機能または祖先起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質対低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの集合したタンパク質コーディング領域を参照したときに、より高いことがある。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化される。
【0100】
本明細書で使用される場合、「制御配列」は本明細書において、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要なまたは有利なあらゆる構成成分を含むことを指す。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとってネイティブまたは外来性であり得る。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターを含むがこれらに限定されない。最低でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。一部の実施形態では、制御配列には、ポリペプチドをコードする核酸配列のコーディング領域と制御配列とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的で、リンカーが提供される。
【0101】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、制御配列が、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を方向付けるまたは調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドと相対的な位置で適切に置かれた（すなわち、機能的な関係性で）立体配置として言及される。
【0102】
本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」は、コード配列等、目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、トランケート型およびハイブリッドプロモーターを含む、選ばれた宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、宿主細胞にとって同種または異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【0103】
本明細書で使用される場合、「適した反応条件」または「適した条件」は、酵素変換反応溶液（例えば、酵素ローディング、基質ローディング、温度、ｐＨ、バッファー、共溶媒等の範囲）における条件を指し、この条件下で、本開示のＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、基質を所望の産物化合物に変換することができる。例示的な「適した反応条件」は、本明細書に提供される（実施例を参照）。
【0104】
本明細書で使用される場合、「化合物ローディング」または「酵素ローディング」等における「ローディング」は、反応開始時の反応混合物における構成成分の濃度または量を指す。酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドによって作用される化合物または分子を指す。
【0105】
本明細書で使用される場合、酵素変換プロセスの文脈における「産物」は、鋳型、例えば、基質におけるＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの作用から生じる化合物または分子を指す。
【0106】
本明細書で使用される場合、「培養すること」は、いずれか適した培地（例えば、液体、ゲルまたは固体）を使用する適切な条件下で微生物細胞の集団を成長させることを指す。
【0107】
組換えポリペプチド（例えば、ＤＮＡポリメラーゼバリアント）は、当技術分野で公知のいずれか適した方法を使用して産生することができる。例えば、当業者にとって周知の多種多様な異なる変異誘発技法が存在する。加えて、多くの商業的分子生物学サプライヤーから変異誘発キットも入手できる。定義されたアミノ酸における特異的置換（部位特異的）、遺伝子の局在化領域における特異的もしくはランダム変異（位置特異的）または遺伝子全体にわたるランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行うための方法が利用できる。ＰＣＲを使用した一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリングおよび化学的飽和変異誘発、または当技術分野で公知のいずれかの他の適した方法を含むがこれらに限定されない、酵素バリアントを生成するための多数の適した方法が当業者にとって公知である。ＤＮＡおよびタンパク質操作に使用される方法の非限定的な例は、次の特許に提供されている：米国特許第６，１１７，６７９号；米国特許第６，４２０，１７５号；米国特許第６，３７６，２４６号；米国特許第６，５８６，１８２号；米国特許第７，７４７，３９１号；米国特許第７，７４７，３９３号；米国特許第７，７８３，４２８号；および米国特許第８，３８３，３４６号。バリアントは、産生された後に、いずれか所望の特性（例えば、高いもしくは増加した活性または低いもしくは低減された活性、増加した熱的活性、増加した熱的安定性、および／または酸性ｐＨ安定性等）についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えＤＮＡポリメラーゼポリペプチド」（「操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド」、「操作されたＤＮＡポリメラーゼ」、「バリアントＤＮＡポリメラーゼ」および「ＤＮＡポリメラーゼバリアント」とも本明細書で称される）は用途を見出す。
【0108】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、細胞にＤＮＡ配列を導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列においてコードされたポリペプチドの適した宿主における発現をもたらすことができる適した制御配列に作動可能に連結された発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
【0109】
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
【0110】
本明細書で使用される場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を指す。この用語が、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを包含することが意図される。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
【0111】
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列等）は、それが作動可能に連結されている別の配列にとって、この２つの配列が自然界で会合していない場合、「異種」である。
【0112】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書に提供されるＤＮＡ（例えば、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド配列）を含む発現ベクターのための適した宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法を使用して構築されたベクターで形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核細胞である。
【0113】
本明細書で使用される場合、用語「アナログ」は、参照ポリペプチドと７０％超の配列同一性だが１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超の配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含むがこれらに限定されない天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、アナログは、１個または複数のＤ－アミノ酸残基、および２個またはそれよりも多いアミノ酸残基の間の非ペプチド結合も含む。
【0114】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、所望の結果を生じるのに十分な量を意味する。当業者は、ルーチンの実験を使用することにより、有効量を決定することができる。
【0115】
用語「単離された」および「精製された」は、それが天然で会合している少なくとも１種の他の構成成分から除去された分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチド等）または他の構成成分を指すように使用される。用語「精製された」は、絶対的な純度を要求せず、むしろ、相対的な定義として意図される。
【0116】
本明細書で使用される場合、「セルフリーＤＮＡ」は、血流中を自由に循環しているＤＮＡを指し、細胞に含有されておらず、細胞に会合してもいない。一部の実施形態では、セルフリーＤＮＡは、正常体細胞もしくは生殖系列細胞、がん細胞、胎児細胞、微生物細胞またはウイルスから本来得られたおよび放出されたＤＮＡを含む。
【0117】
本明細書で使用される場合、「増幅」は、核酸複製を指す。一部の実施形態では、この用語は、特異的鋳型核酸の複製を指す。
【0118】
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」および「ＰＣＲ」は、これにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８８４，２０２号に記載されている方法を指す。このような方法は、クローニングも精製も要求されることなく、混合物または精製されたＤＮＡにおける標的配列のセグメントまたは標的配列全体の濃度の増加における用途を見出す。一連の変性、アニーリングおよび伸長は、「サイクル」を構成する。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長のステップを何回も反復して（すなわち、複数のサイクルが使用される）、高濃度の増幅されたＤＮＡを得ることができる。プロセスは、当技術分野で周知であり、方法が最初に記載されて以来、長年にわたり多数の変形形態が開発された。ＰＣＲにより、単一コピーの特異的標的配列を、標識プローブとのハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマーの取込みとそれに続くアビジン－酵素コンジュゲート検出、増幅されたセグメントへの３２Ｐ標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰ）の取込み等を含むがこれらに限定されない、いくつかの異なる方法論によって検出可能なレベルまで増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、増幅に適しているいかなるオリゴヌクレオチド配列を、プライマーの適切なセットを用いるＰＣＲを使用してコピーすることもできる（can be copies）。ＰＣＲ産物は、増幅のための鋳型として機能することもできる。
【0119】
本明細書で使用される場合、「標的」は、ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法を参照して使用される場合、相補的ＤＮＡの調製のための核酸の領域を指す。「標的」は、ＤＮＡポリメラーゼを使用した方法において、存在する他の核酸から選別される。一部の実施形態では、「セグメント」は、標的配列内の核酸の領域である。
【0120】
本明細書で使用される場合、「標的ＤＮＡ」は、ＤＮＡポリメラーゼの文脈で使用される場合、相補的ＤＮＡコピーの調製のための目標であるＤＮＡ、その全てまたは部分を指す。標的ＤＮＡは、ＤＮＡ配列の全体、またはその部分、例えば、ＤＮＡ配列のセグメントであり得る。
【0121】
本明細書で使用される場合、「標的ＲＮＡ」は、相補的ＤＮＡコピーの調製のための目標であるＲＮＡ、その全てまたは部分を指す。標的ＲＮＡは、ＲＮＡ配列の全体、またはその部分、例えば、ＲＮＡ配列のセグメントであり得る。
【0122】
本明細書で使用される場合、「試料鋳型」は、標的核酸の存在について解析される試料に起源をもつ核酸を指す。対照的に、「バックグラウンド鋳型」は、試料内に存在しても存在しなくてもよい試料鋳型以外の核酸を指す。バックグラウンド鋳型は、試料中に偶発的に含まれ得、それは持ち越し汚染（carryover）に起因し得る、またはそこから標的核酸が精製される核酸夾雑物の存在が原因となり得る。例えば、一部の実施形態では、検出されるべきもの以外の生物由来の核酸は、検査試料においてバックグラウンドとして存在し得る。しかし、本発明が、いずれか具体的な核酸試料または鋳型に限定されることは意図されない。
【0123】
本明細書で使用される場合、「増幅可能な核酸」は、ＰＣＲを含むがこれらに限定されない、いずれかの増幅方法によって増幅され得る核酸に関して使用される。大部分の実施形態では、増幅可能な核酸は、試料鋳型を含む。
【0124】
本明細書で使用される場合、「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲ断片」および「増幅産物」は、変性、アニーリングおよび伸長のステップを典型的に含む２回またはそれよりも多いサイクルのＰＣＲ増幅（または文脈によって示される他の増幅方法）の後に得られる、結果として生じる化合物を指す。この用語は、１種または複数の標的配列の１種または複数のセグメントの増幅が存在した状況を包含する。
【0125】
本明細書で使用される場合、「増幅試薬」および「ＰＣＲ試薬」は、プライマー、核酸鋳型および増幅酵素を除いた、増幅に必要とされる試薬（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、バッファー等）を指す。典型的には、増幅試薬は、他の反応構成成分と共に、反応容器（例えば、試験管、マイクロウェル等）内に置かれるおよび含有される。いずれか適した試薬は、本発明における用途を見出すため、本発明が、いずれか具体的な増幅試薬に限定されることは意図されない。
【0126】
本明細書で使用される場合、「プライマー」は、天然に存在するか、または合成により、組換えによりもしくは増幅によって産生されるかにかかわらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれたときに（すなわち、ヌクレオチドおよび誘導剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、ならびに適した温度およびｐＨで）、核酸合成の開始点として作用することができる、オリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。大部分の実施形態では、プライマーは、一本鎖である（primers asingle-stranded）が、一部の実施形態では、二本鎖である。一部の実施形態では、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長産物の合成をプライムするのに十分な長さのものである。正確なプライマーの長さは、当業者にとって公知の通り、多くの因子に依存する。
【0127】
本明細書で使用される場合、「プローブ」は、天然に存在するか、または合成により、組換えによりもしくは増幅によって産生されるかにかかわらず、目的の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは、目的の特定の遺伝子配列の検出、同定および／または単離における用途を見出す。一部の実施形態では、プローブは、適した検出系（例えば、蛍光、放射性、発光、酵素および他の系）におけるプローブの検出に役立つ「レポーター分子」（「標識」とも称される）で標識される。本発明が、いずれか特定の検出系または標識に限定されることは意図されない。プライマー、デオキシリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオシドは、標識を含有することができる。実際に、本発明の標識された組成物が、いずれか特定の構成成分に限定されることは意図されない。説明的な標識は、３２Ｐ、３５Ｓおよび蛍光分子（例えば、緑色蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない蛍光色素）を含むがこれらに限定されない。
【0128】
本明細書で使用される場合、「忠実度」は、ポリメラーゼを参照して使用される場合、鋳型鎖と比べた、合成されたＤＮＡ鎖における相補的塩基の鋳型指向性取込みの精度を指すことが意図される。典型的には、忠実度は、新たに合成された核酸鎖における不正確な塩基の取込みの頻度に基づき測定される。不正確な塩基の取込みは、点変異、挿入または欠失をもたらし得る。忠実度は、当技術分野で公知のいずれかの方法に従って計算することができる（例えば、Tindall and Kunkel, Biochem., 1988, 27:6008-6013；およびBarnes, Gene,1992, 112:29-35を参照）。ポリメラーゼまたはポリメラーゼバリアントは、高い忠実度または低い忠実度のいずれかを示し得る。本明細書で使用される場合、「高い忠実度」は、所定の値を超える正確な塩基取込みの頻度を有するポリメラーゼを指す。本明細書で使用される場合、用語「低い忠実度」は、所定の値よりも低い正確な塩基取込みの頻度を有するポリメラーゼを指す。一部の実施形態では、所定の値は、公知ポリメラーゼ（すなわち、参照ポリメラーゼ）の正確な塩基取込みの所望の頻度または忠実度である。
【0129】
本明細書で使用される場合、「変更された忠実度」は、ポリメラーゼバリアントが由来する親ポリメラーゼの忠実度とは異なる、ポリメラーゼバリアントの忠実度を指す。一部の実施形態では、変更された忠実度は、親ポリメラーゼの忠実度よりも高く、一方、一部の他の実施形態では、変更された忠実度は、親ポリメラーゼの忠実度よりも低い。変更された忠実度は、当技術分野で公知のいずれか適したアッセイを使用して、親およびバリアントポリメラーゼをアッセイし、それらの活性を比較することにより決定することができる。
【0130】
本明細書で使用される場合、用語「処理能力」は、鋳型または基質への結合を維持し、複数の修飾反応を実行するＤＮＡポリメラーゼ等の核酸修飾酵素の能力を指す。処理能力は一般に、結合事象当たりで起こる触媒事象の数によって測定される。
【0131】
本明細書で使用される場合、「変更された処理能力」は、バリアントが由来する親ポリメラーゼの処理能力とは異なるポリメラーゼまたはそのバリアントの処理能力を指す。一部の実施形態では、変更された処理能力は、親酵素の処理能力よりも高く、一方、一部の他の実施形態では、変更された処理能力は、親酵素の処理能力よりも低い。変更された処理能力は、当技術分野で公知のいずれか適したアッセイを使用して、親およびバリアント酵素をアッセイし、それらの活性を比較することにより決定することができる。
【0132】
用語「対象」は、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、コンパニオンアニマルおよび実験動物（例えば、齧歯類およびウサギ類（lagamorph））を包含する。この用語が、雌と共に雄を包含することが意図される。
【0133】
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、疾患について評価されている、疾患について処置されているまたは疾患を経験しているいずれかの対象を意味する。
【0134】
本明細書で使用される場合、用語「試料」は、例えば、標的核酸の存在を検出するため、または配列決定もしくはｃＤＮＡライブラリーの生成のための標的核酸のＤＮＡコピーを調製するため等、ＤＮＡポリメラーゼとの反応のための材料または物質を指す。一部の実施形態では、試料は、生体組織または体液の試料を指す、「生体試料」である。そのような試料は、典型的にヒトに由来するが、非ヒト霊長類または齧歯類、例えば、マウスおよびラットから単離された組織を含み、生検および剖検試料等の組織の切片、組織学的目的で採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、涙、粘液、毛髪、皮膚等を含む。「生体試料」は、生物由来の細胞または細胞集団またはある含量の組織もしくは体液も指す。一部の実施形態では、生体試料は、動物から除去されているが、用語「生体試料」は、ｉｎ ｖｉｖｏで、すなわち、動物から除去されずに解析される細胞または組織を指すこともできる。典型的には、「生体試料」は、動物由来のまたは生物の細胞を含有するが、この用語は、血液、唾液または尿の非細胞性画分等の非細胞性生物学的材料を指すこともできる。組織生検、血液試料、頬側掻爬物、唾液試料または乳頭分泌物を含むがこれらに限定されない、多数の型の生体試料を、本開示における酵素、組成物および方法と共に使用することができる。本明細書で使用される場合、「組織生検」は、診断解析のために動物、好ましくはヒトから除去されたある量の組織を指す。がん患者において、組織を腫瘍から除去し、腫瘍内の細胞の解析を可能にすることができる。「組織生検」は、いずれかの型の生検、例えば、針生検、細針生検、外科的生検等を指すことができる。
操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド
操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド
【0135】
本開示は、改善された特性を有するように操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドバリアントを提供する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドバリアントは、標的ＤＮＡ標的／鋳型の相補的ＤＮＡを調製することを含む、ポリメラーゼ反応の実行において有用である。操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントは、配列決定（例えば、ＮＧＳ配列決定）における等、全体または部分的なＤＮＡ鋳型からの相補的ＤＮＡの効率的な創製、増幅（例えば、ＰＣＲ）、および標的核酸を検出するため等、診断方法における用途を見出す。このような操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントは、溶液中と共に、固定による実施形態において使用することができる。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、非融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドとして調製および使用することができる。
【0136】
本明細書における一部の実施形態では、特定のＤＮＡポリメラーゼバリアント（すなわち、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド）が、野生型ＤＮＡポリメラーゼまたは参照ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの配列における特定のアミノ酸残基の修飾を参照することによって言及される場合、等価な位置（複数可）（それぞれのアミノ酸配列の間の必要に応じたアミノ酸配列整列から決定される）において修飾された別のＤＮＡポリメラーゼのバリアントが、本明細書に包含されることを理解されたい。例えば、配列番号（SEQ ID）２を参照して番号付けされた指定のアミノ酸位置（複数可）における置換については、別の参照配列、例えば、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０を含む参照配列、または例えば、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の参照配列について等価なアミノ酸位置（複数可）を容易に確かめることができる。
【0137】
一態様では、本開示は、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片であって、ポリペプチド配列が、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片を提供する。
【0138】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片は、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0139】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片は、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列に対して少なくとも８０％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0140】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片は、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0141】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片は、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントの残基１２～８５０に対応する参照配列または表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントに対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0142】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置１５、１６、２０、２１、２２、４０、４１、５２、５７、５８、７３、８５、８７、８８、９１、１０２、１０９、１３２、１５７、１７７、１８６、２００、２１３、２１７、２３１、２３２、２４２、２４３、２６２、２６３、２６４、２６５、２７３、２９９、３２１、３２２、３２８、３８４、３８６、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、４４０、４７６、４８０、４９１、４９５、４９８、５０３、５０４、５０６、５０７、５０８、５１１、５１４、５２０、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６２、５６３、５６６、５７０、５７２、５８１、５８２、５８４、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６１６、６６５、６７１、６７４、６７５、６７７、６８４、６８８、６９６、７０４、７０５、７０６、７２８、７３５、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５３、７５５、７５６、７６２、７６３、７６４、７６６、７７２、７７３、７７９、７９３、８０３、８１４、８２０、８４９またはそれらの組合せに少なくとも置換を含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0143】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換１５Ａ／Ｇ／Ｋ／Ｎ、１６Ｒ、２０Ａ／Ｃ、２１Ｋ／Ｑ／Ｓ、２２Ｋ、４０Ａ、４１Ｆ、５２Ｒ、５７Ｔ、５８Ｎ、７３Ａ、８５Ｅ／Ｐ／Ｒ／Ｓ、８７Ｎ、８８Ｔ、９１Ｋ、１０２Ｖ／Ｍ／Ｓ、１０９Ｐ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、１８６Ｅ、２００Ｖ、２１３Ｐ、２１７Ｅ、２３１Ｅ、２３２Ｃ、２４２Ｑ、２４３Ｌ／Ｓ、２６２Ｌ、２６３Ａ、２６４Ｔ、２６５Ｉ、２７３Ｍ、２９９Ｎ、３２１Ｇ、３２２Ｎ／Ｓ、３２８Ｉ、３８４Ｙ、３８６Ｖ、４０１ Ａ／Ｇ／Ｉ、４０２Ｇ／Ｒ、４０３Ｌ／Ｒ、４０４Ｓ／Ｔ、４０６Ｋ／Ｑ、４０７Ｒ／Ｗ、４４０Ｇ、４７６Ｉ／Ｎ、４８０Ｅ／Ｖ／Ｗ、４９１Ｇ、４９５Ｅ／Ｍ／Ｓ、４９８Ｄ、５０３Ｉ／Ｖ、５０４Ｍ、５０６Ｐ、５０７Ｋ、５０８Ｈ、５１１Ｍ、５１４Ｆ、５２０Ｐ、５２１Ｇ／Ｗ／Ｙ、５２３Ａ／Ｋ／Ｖ、５２４Ｇ／Ｋ／Ｑ、５２５Ｌ／Ｖ、５２６Ｔ、５２７Ｖ／Ｗ、５２８Ａ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、５２９Ｓ、５３０Ｇ／Ｐ／Ｒ／Ｗ、５３３Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、５３４Ｈ／Ｗ、５３５Ｋ、５３６Ｒ、５３７Ｇ／Ｌ／Ｗ、５３８Ａ、５３９Ｌ／Ｒ、５４０Ｈ／Ｖ、５４２Ｇ／Ｍ／Ｔ／Ｗ、５５３Ｆ／Ｋ／Ｎ／Ｒ、５５４Ｅ、５５５Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｗ、５５６Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｗ、５５７Ｇ／Ｈ、５５８Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｑ、５５９Ｄ／Ｇ／Ｐ、５６０Ｇ／Ｍ、５６２Ｓ、５６３Ｌ、５６６Ａ、５７０Ｒ、５７２Ｉ、５８１Ａ、５８２Ｆ、５８４Ｎ、５８５ＫＲ、５８６Ｍ、５８７Ｑ／Ｓ、５８９Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、５９２Ｇ／Ｔ／Ｖ、５９３Ｎ、５９４Ｃ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、５９５Ａ／Ｐ／Ｒ、５９６Ｌ／Ｒ／Ｗ、５９７Ｅ、５９９Ｇ／Ｓ／Ｔ、６０１Ｍ／Ｐ、６０２Ｖ、６０３Ｇ／Ｖ／Ｗ、６０５Ｅ／Ａ、６０７Ｎ、６１６Ａ、６６５Ｖ、６７１Ｅ／Ｒ、６７４Ｔ、６７５Ｌ、６７７Ｍ、６８４Ｖ、６８８Ｉ、６９６Ｈ／Ｖ、７０４Ｐ、７０５Ｗ、７０６Ｅ、７２８Ｋ、７３５Ｇ／Ｌ、７４７Ｔ、７４８Ｙ、７４９Ｌ／Ｒ／Ｔ、７５０Ｓ／Ｐ、７５１Ｈ、７５３Ｋ／Ｖ、７５５Ｐ、７５６Ｎ／Ｔ、７６２Ｍ／Ｑ／Ｖ、７６３Ｇ／Ｙ、７６４Ａ／Ｉ／Ｖ、７６６Ｙ、７７２Ｉ、７７３Ｒ、７７９Ｉ、７９３Ｇ、８０３Ｃ／Ｒ、８１４Ｅ、８２０Ａ、８４９Ｔまたはそれらの組合せを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0144】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換Ｖ１５Ａ／Ｇ／Ｋ／Ｎ、Ｑ１６Ｒ、Ｌ２０Ａ／Ｃ、Ｆ２１Ｋ／Ｑ／Ｓ、Ｑ２２Ｋ、Ｓ４０Ａ、Ｙ４１Ｆ、Ｓ５２Ｒ、Ｖ５７Ｔ、Ｈ５８Ｎ、Ｅ７３Ａ、Ｐ８５Ｅ／Ｐ／Ｒ／Ｓ、Ｐ８７Ｎ、Ｓ８８Ｔ、Ｈ９１Ｋ、Ｓ１０２Ｖ／Ｍ／Ｓ、Ｋ１０９Ｐ、Ｖ１３２Ｙ、Ｓ１５７Ｇ、Ｒ１７７Ｔ、Ｑ１８６Ｅ、Ａ２００Ｖ、Ｒ２１３Ｐ、Ａ２１７Ｅ、Ｄ２３１Ｅ、Ｒ２３２Ｃ、Ｐ２４２Ｑ、Ｐ２４３Ｌ／Ｓ、Ｉ２６２Ｌ、Ｓ２６３Ａ、Ｒ２６４Ｔ、Ｍ２６５Ｉ、Ｖ２７３Ｍ、Ｔ２９９Ｎ、Ｅ３２１Ｇ、Ｒ３２２Ｎ／Ｓ、Ｖ３２８Ｉ、Ｒ３８４Ｙ、Ｒ３８６Ｖ、Ｓ４０１Ａ／Ｇ／Ｉ、Ｎ４０２Ｇ／Ｒ、Ｎ４０３Ｌ／Ｒ、Ｑ４０４Ｓ／Ｔ、Ａ４０６Ｋ／Ｑ、Ｓ４０７Ｒ／Ｗ、Ｅ４４０Ｇ、Ｌ４７６Ｉ／Ｎ、Ｑ４８０Ｅ／Ｖ／Ｗ、Ａ４９１Ｇ、Ｒ４９５Ｅ／Ｍ／Ｓ、Ｇ４９８Ｄ、Ｌ５０３Ｉ／Ｖ、Ｎ５０４Ｍ、Ｒ５０６Ｐ、Ｄ５０７Ｋ、Ｑ５０８Ｈ、Ｔ５１１Ｍ、Ｙ５１４Ｆ、Ａ５２０Ｐ、Ａ５２１Ｇ／Ｗ／Ｙ、Ｒ５２３Ａ／Ｋ／Ｖ、Ｒ５２４Ｇ／Ｋ／Ｑ、Ｔ５２５Ｌ／Ｖ、Ａ５２６Ｔ、Ｋ５２７Ｖ／Ｗ、Ｔ５２８Ａ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、Ｇ５２９Ｓ、Ｋ５３０Ｇ／Ｐ／Ｒ／Ｗ、Ｔ５３３Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、Ｓ５３４Ｈ／Ｗ、Ａ５３５Ｋ、Ｓ５３６Ｒ、Ｖ５３７Ｇ／Ｌ／Ｗ、Ｌ５３８Ａ、Ｅ５３９Ｌ／Ｒ、Ｔ５４０Ｈ／Ｖ、Ｒ５４２Ｇ／Ｍ／Ｔ／Ｗ、Ｑ５５３Ｆ／Ｋ／Ｎ／Ｒ、Ｙ５５４Ｅ、Ｒ５５５Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｗ、Ｅ５５６Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｗ、Ｌ５５７Ｇ／Ｈ、Ａ５５８Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｑ、Ｋ５５９Ｄ／Ｇ／Ｐ、Ｌ５６０Ｇ／Ｍ、Ｇ５６２Ｓ、Ｔ５６３Ｌ、Ｄ５６６Ａ、Ｋ５７０Ｒ、Ｖ５７２Ｉ、Ｔ５８１Ａ、Ｒ５８２Ｆ、Ｈ５８４Ｎ、Ｑ５８５Ｋ／Ｒ、Ｔ５８６Ｍ、Ｇ５８７Ｑ／Ｓ、Ａ５８９Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｒ５９２Ｇ／Ｔ／Ｖ、Ｌ５９３Ｎ、Ｓ５９４Ｃ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｓ５９５Ａ／Ｐ／Ｒ、Ｓ５９６Ｌ／Ｒ／Ｗ、Ｄ５９７Ｅ、Ｎ５９９Ｇ／Ｓ／Ｔ、Ｑ６０１Ｍ／Ｐ、Ｎ６０２Ｖ、Ｉ６０３Ｇ／Ｖ／Ｗ、Ｉ６０５Ｅ／Ａ、Ｔ６０７Ｎ、Ｇ６１６Ａ、Ｍ６６５Ｖ、Ｖ６７１Ｅ／Ｒ、Ｄ６７４Ｔ、Ｐ６７５Ｌ、Ｒ６７７Ｍ、Ｉ６８４Ｖ、Ｖ６８８Ｉ、Ｒ６９６Ｈ／Ｖ、Ｄ７０４Ｐ、Ｙ７０５Ｗ、Ｇ７０６Ｅ、Ｒ７２８Ｋ、Ｅ７３５Ｇ／Ｌ、Ｒ７４７Ｔ、Ｈ７４８Ｙ、Ｖ７４９Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｐ７５０Ｓ／Ｐ、Ｅ７５１Ｈ、Ｌ７５３Ｋ／Ｖ、Ｋ７５５Ｐ、Ａ７５６Ｎ／Ｔ、Ａ７６２Ｍ／Ｑ／Ｖ、Ａ７６３Ｇ／Ｙ、Ｅ７６４Ａ／Ｉ／Ｖ、Ｖ７６６Ｙ、Ｖ７７２Ｉ、Ｑ７７３Ｒ、Ｌ７７９Ｉ、Ｐ７９３Ｇ、Ｈ８０３Ｃ／Ｒ、Ｒ８１４Ｅ、Ｒ８２０Ａ、Ａ８４９Ｔまたはそれらの組合せを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0145】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０、８５、１０２、１３２、１５７、１７７、２６２、２６３、５２１、７４８もしくは７５０またはそれらの組合せに少なくとも置換を含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置８５に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置１０２に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置１３２に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置１５７に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置１７７に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２６２に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２６３に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置５０３に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置５２１に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置７４８に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置７５０に少なくとも置換を含む。
【0146】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０、１３２、１５７、２６２、２６３または７４８に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０、１３２、１５７、２６２、２６３、５０３および７４８に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０、１０２、１３２、１５７、２６２、２６３、５２１または７４８に少なくとも置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０、８５、１０２、１３２、１５７、１７７、２６２、２６３、５２１、７４８または７５０に少なくとも置換を含む。
【0147】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換４０Ａ、８５Ｅ／Ｐ／Ｒ／Ｓ、１０２Ｖ／Ｍ／Ｓ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、２６２Ｌ、２６３Ａ、５２１Ｇ／Ｗ／Ｙ、７４８Ｙ、または７５０Ｓ／Ｐまたはそれらの組合せを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換Ｓ４０Ａ、Ｐ８５Ｅ／Ｐ／Ｒ／Ｓ、Ｓ１０２Ｖ／Ｍ／Ｓ、Ｖ１３２Ｙ、Ｓ１５７Ｇ、Ｒ１７７Ｔ、Ｉ２６２Ｌ、Ｓ２６３Ａ、Ａ５２１Ｇ／Ｗ／Ｙ、Ｈ７４８Ｙ、またはＰ７５０Ｓまたはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、アミノ酸位置４０、８５、１０２、１３２、１５７、２６２、２６３、５２１、７４８または７５０に１個または複数の置換を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼについて、置換は、前述、例えば、４０Ａ、８５Ｅ／Ｐ／Ｒ／Ｓ、１０２Ｖ／Ｍ／Ｓ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、２６２Ｌ、２６３Ａ、５２１Ｇ／Ｗ／Ｙ、７４８Ｙ、および／または７５０Ｓ／Ｐ．から選択することができる。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換４０Ａ、８５Ｅ、１０２Ｓ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、２６２Ｌ、２６３Ａ、５２１Ｇ、７４８Ｙ、または７５０Ｓまたはそれらの組合せを含む。
【0148】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２１３／５０３／５０８／５８４／７４８、４０／１３２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８、１３２、４０／１３２／５０３／７４８、４０／１３２／１５７／５０３／５６２、４０／１３２／２１３／７４８／８１４、１３２／１５７／５６２／５８４、１３２／５８４／７４８、４０／１３２／２３１／６８４／７４８、４０／１３２、４０／４１／１３２／５６２／６８４／７４８、４１／２１３／２３１／５０３／６５０／６７４／７４８、１３２／２３１／５０３／７４８、４０／１３２／１５７／５０３、５０３／７４８／８１４、４０／１３２／２３１／５０３／６７４／７４８、４０／８８／１３２／５０３／６８４／７４８、１３２／１５７／２１３／６７４／７４８／８１４、１５７／２６３／７４８、４０／７４８、４１／１５７／２３１／２６２／７４８／８１４、４０／２１３／５０３／５６２／５８４／７４８、５２３／５２４、４０／１３２／５０３／５１４／６５０／６７４、４０／１３２／１５７／２１３／２３１、４１／２１３／５２０／８１４、４０／４１／１５７／２３１／５０３、４０／１５７／５０３、４０／１３２／５６２／７４８、１３２／７４８、４０／４１／１３２／５６２／７４８、８８／２１３／５０３／５８４／６８４／７４８、５７／５８／５２３／６１６／６７７、４０／２１３／２３１／５０３／５１４／５６２／７４８、１３２／５６２、２１３／５０３／６５０、４０／４１／８８／２３１／７４８／８１４、４１／２１３／２６２／５６２、４１／８８／２３１／７４８、２１３／２６３／７４８、４０／１５７／２１３、１５７／５２０、４０／１３２／２６３／５０３／６７４／８１４、４０／４１、５２４／６６５／７５６、５８／１８６／２１７／５２３／５２４／６７７、４０／４１／７４８、１３２／５１４、５２０、４１／２１３／５０３／５６２、２３１／５０３／７４８／７７２、５０３／５６２、７３／２３２／５１４／５８４／８１４、５８／５０７／６１６、１３２／２６２／５２０／５６２／６８４／７４８、８８／５６２／８１４、４１／８８／１５７／８１４、８８／１５７／２１３／６７４／６８４、５７／５８／５２３／７７９、４０／１３２／１５７／５１４／５２０／６８４、４０／４１／２１３／６８４／７７２、４０／４１／２３１／５０３／８１４、８８／２１３／５０３／５８４／８１４、４０／４１／１３２／５６２／５８４、４１／８８／２１３／２３１／５０３／６５０／７４８、４０／５０３、４０／１３２／２１３／２３１／５２０／５６２／６５０／８１４、４０／４１／１３２／２３１／２６２／５０３／５６２／５８４／７４８／８１４、５７／５８／２６４／２６５／５２４／６８８、８８／１３２／１５７／２６２／２６３／５２０／５６２、８８／１３２／１５７／２６２／５０３／５１４／５６２／６５０、４０／５８４／６７４／７４８、４０／４１／１３２／２６３／５０３、５８４／７４８、４０／２１３／６７４、４０／４１／８８Ｔ／１３２／５０３／５６２／５８４／７４８、８８／２１３／５１４／５６２／７４８／８１４、２６３／５２０／８１４、または４０／４１／８８／１５７に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0149】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セット２１３Ｐ／５０３Ｉ／５０８Ｈ／５８４Ｎ／７４８Ｙ；４０Ａ／１３２Ｙ／７４８Ｙ；４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ；１３２Ｙ；４０Ａ／１３２Ｙ／５０３Ｉ／７４８Ｙ；４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／５０３Ｉ／５６２Ｓ；４０Ａ／１３２Ｙ／２１３Ｐ／７４８Ｙ／８１４Ｅ；１３２Ｙ／１５７Ｇ／５６２Ｓ／５８４Ｎ；１３２Ｙ／５８４Ｎ／７４８Ｙ；４０Ａ／１３２Ｙ／２３１Ｅ／６８４Ｖ／７４８Ｙ；４０Ａ／１３２Ｙ；４０Ａ／４１Ｆ／１３２Ｙ／５６２Ｓ／６８４Ｖ／７４８Ｙ；４１Ｆ／２１３Ｐ／２３１Ｅ／５０３Ｉ／６５０Ａ／６７４Ｔ／７４８Ｙ；１３２Ｙ／２３１Ｅ／５０３Ｉ／７４８Ｙ；４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／５０３Ｉ；５０３Ｉ／７４８Ｙ／８１４Ｅ；４０Ａ／１３２Ｙ／２３１Ｅ／５０３Ｉ／６７４Ｔ／７４８Ｙ；４０Ａ／８８Ｔ／１３２Ｙ／５０３Ｉ／６８４Ｖ／７４８Ｙ；１３２Ｙ／１５７Ｇ／２１３Ｐ／６７４Ｔ／７４８Ｙ／８１４Ｅ；１５７Ｇ／２６３Ａ／７４８Ｙ；４０Ａ／７４８Ｙ；４１Ｆ／１５７Ｇ／２３１Ｅ／２６２Ｌ／７４８Ｙ／８１４Ｅ；４０Ａ／２１３Ｐ／５０３Ｉ／５６２Ｓ／５８４Ｎ／７４８Ｙ；５２３Ｋ／５２４Ｋ；４０Ａ／１３２Ｙ／５０３Ｉ／５１４Ｆ／６５０Ａ／６７４Ｔ；４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２１３Ｐ／２３１Ｅ；４１Ｆ／２１３Ｐ／５２０Ｐ／８１４Ｅ；４０Ａ／４１Ｆ／１５７Ｇ／２３１Ｅ／５０３Ｉ；４０Ａ／１５７Ｇ／５０３Ｉ；４０Ａ／１３２Ｙ／５６２Ｓ／７４８Ｙ；１３２Ｙ／７４８Ｙ；４０Ａ／４１Ｆ／１３２Ｙ／５６２Ｓ／７４８Ｙ；８８Ｔ／２１３Ｐ／５０３Ｉ／５８４Ｎ／６８４Ｖ／７４８Ｙ；５７Ｔ／５８Ｎ／５２３Ｋ／６１６Ａ／６７７Ｍ；４０Ａ／２１３Ｐ／２３１Ｅ／５０３Ｉ／５１４Ｆ／５６２Ｓ／７４８Ｙ；１３２Ｙ／５６２Ｓ；２１３Ｐ／５０３Ｉ／６５０Ａ；４０Ａ／４１Ｆ／８８Ｔ／２３１Ｅ／７４８Ｙ／８１４Ｅ；４１Ｆ／２１３Ｐ／２６２Ｌ／５６２Ｓ；４１Ｆ／８８Ｔ／２３１Ｅ／７４８Ｙ；２１３Ｐ／２６３Ａ／７４８Ｙ；４０Ａ／１５７Ｇ／２１３Ｐ；１５７Ｇ／５２０Ｐ；４０Ａ／１３２Ｙ／２６３Ａ／５０３Ｉ／６７４Ｔ／８１４Ｅ；４０Ａ／４１Ｆ；５２４Ｋ／６６５Ｖ／７５６Ｎ；５８Ｎ／１８６Ｅ／２１７Ｅ／Ｒ５２３Ｋ／Ｒ５２４Ｋ／Ｒ６７７Ｍ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／７４８Ｙ；１３２Ｙ／５１４Ｆ；５２０Ｐ；４１Ｆ／２１３Ｐ／５０３Ｉ／５６２Ｓ；２３１Ｅ／５０３Ｉ／７４８Ｙ／７７２Ｉ；５０３Ｉ／５６２Ｓ；７３Ａ／２３２Ｃ／５１４Ｆ／５８４Ｎ／８１４Ｅ；５８Ｎ／５０７Ｋ／６１６Ａ；１３２Ｙ／２６２Ｌ／５２０Ｐ／５６２Ｓ／６８４Ｖ／７４８Ｙ；８８Ｔ／５６２Ｓ／８１４Ｅ；４１Ｆ／８８Ｔ／１５７Ｇ／８１４Ｅ；８８Ｔ／１５７Ｇ／２１３Ｐ／６７４Ｔ／６８４Ｖ；５７Ｔ／５８Ｎ／５２３Ｋ／７７９Ｉ；４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／５１４Ｆ／５２０Ｐ／６８４Ｖ；４０Ａ／４１Ｆ／２１３Ｐ／６８４Ｖ／７７２Ｉ；４０Ａ／４１Ｆ／２３１Ｅ／５０３Ｉ／８１４Ｅ；８８Ｔ／２１３Ｐ／５０３Ｉ／５８４Ｎ／８１４Ｅ；４０Ａ／４１Ｆ／１３２Ｙ／５６２Ｓ／５８４Ｎ；４１Ｆ／８８Ｔ／２１３Ｐ／２３１Ｅ／５０３Ｉ／６５０Ａ／７４８Ｙ；４０Ａ／５０３Ｉ；４０Ａ／１３２Ｙ／２１３Ｐ／２３１Ｅ／５２０Ｐ／５６２Ｓ／６５０Ａ／８１４Ｅ；４０Ａ／４１Ｆ／１３２Ｙ／２３１Ｅ／２６２Ｌ／５０３Ｉ／５６２Ｓ／５８４Ｎ／７４８Ｙ／８１４Ｅ；５７Ｔ／５８Ｎ／２６４Ｔ／２６５Ｉ／５２４Ｋ／６８８Ｉ；８８Ｔ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２０Ｐ／５６２Ｓ；８８Ｔ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／５０３Ｉ／５１４Ｆ／５６２Ｓ／６５０Ａ；４０Ａ／５８４Ｎ／６７４Ｔ／７４８Ｙ；４０Ａ／４１Ｆ／１３２Ｙ／２６３Ａ／５０３Ｉ；５８４Ｎ／７４８Ｙ；４０Ａ／２１３Ｐ／６７４Ｔ；４０Ａ／４１Ｆ／８８Ｔ／１３２Ｙ／５０３Ｉ／５６２Ｓ／５８４Ｎ／７４８Ｙ；８８Ｔ／２１３Ｐ／５１４Ｆ／５６２Ｓ／７４８Ｙ／８１４Ｅ；２６３Ａ／５２０Ｐ／８１４Ｅ；４０Ａ／４１Ｆ／８８Ｔ／１５７Ｇ；またはそれらの組合せを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0150】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セットＲ２１３Ｐ／Ｌ５０３Ｉ／Ｑ５０８Ｈ／Ｈ５８４Ｎ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ；Ｖ１３２Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｌ５０３Ｉ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｌ５０３Ｉ／Ｇ５６２Ｓ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｒ２１３Ｐ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８１４Ｅ；Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｇ５６２Ｓ／Ｈ５８４Ｎ；Ｖ１３２Ｙ／Ｈ５８４Ｎ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｄ２３１Ｅ／Ｉ６８４Ｖ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｖ１３２Ｙ／Ｇ５６２Ｓ／Ｉ６８４Ｖ／Ｈ７４８Ｙ；Ｙ４１Ｆ／Ｒ２１３Ｐ／Ｄ２３１Ｅ／Ｌ５０３Ｉ／Ｉ６５０Ａ／Ｄ６７４Ｔ／Ｈ７４８Ｙ；Ｖ１３２Ｙ／Ｄ２３１Ｅ／Ｌ５０３Ｉ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｌ５０３Ｉ；Ｌ５０３Ｉ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８１４Ｅ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｄ２３１Ｅ／Ｌ５０３Ｉ／Ｄ６７４Ｔ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｓ８８Ｔ／Ｖ１３２Ｙ／Ｌ５０３Ｉ／Ｉ６８４Ｖ／Ｈ７４８Ｙ；Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｒ２１３Ｐ／Ｄ６７４Ｔ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８１４Ｅ；Ｓ１５７Ｇ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｈ７４８Ｙ；Ｙ４１Ｆ／Ｓ１５７Ｇ／Ｄ２３１Ｅ／Ｉ２６２Ｌ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８１４Ｅ；Ｓ４０Ａ／Ｒ２１３Ｐ／Ｌ５０３Ｉ／Ｇ５６２Ｓ／Ｈ５８４Ｎ／Ｈ７４８Ｙ；Ｒ５２３Ｋ／Ｒ５２４Ｋ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｌ５０３Ｉ／Ｙ５１４Ｆ／Ｉ６５０Ａ／Ｄ６７４Ｔ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｒ２１３Ｐ／Ｄ２３１Ｅ；Ｙ４１Ｆ／Ｒ２１３Ｐ／Ａ５２０Ｐ／Ｒ８１４Ｅ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｓ１５７Ｇ／Ｄ２３１Ｅ／Ｌ５０３Ｉ；Ｓ４０Ａ／Ｓ１５７Ｇ／Ｌ５０３Ｉ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｇ５６２Ｓ／Ｈ７４８Ｙ；Ｖ１３２Ｙ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｖ１３２Ｙ／Ｇ５６２Ｓ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ８８Ｔ／Ｒ２１３Ｐ／Ｌ５０３Ｉ／Ｈ５８４Ｎ／Ｉ６８４Ｖ／Ｈ７４８Ｙ；Ｖ５７Ｔ／Ｈ５８Ｎ／Ｒ５２３Ｋ／Ｇ６１６Ａ／Ｒ６７７Ｍ；Ｓ４０Ａ／Ｒ２１３Ｐ／Ｄ２３１Ｅ／Ｌ５０３Ｉ／Ｙ５１４Ｆ／Ｇ５６２Ｓ／Ｈ７４８Ｙ；Ｖ１３２Ｙ／Ｇ５６２Ｓ；Ｒ２１３Ｐ／Ｌ５０３Ｉ／Ｉ６５０Ａ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｓ８８Ｔ／Ｄ２３１Ｅ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８１４Ｅ；Ｙ４１Ｆ／Ｒ２１３Ｐ／Ｉ２６２Ｌ／Ｇ５６２Ｓ；Ｙ４１Ｆ／Ｓ８８Ｔ／Ｄ２３１Ｅ／Ｈ７４８Ｙ；Ｒ２１３Ｐ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｓ１５７Ｇ／Ｒ２１３Ｐ；Ｓ１５７Ｇ／Ａ５２０Ｐ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ５０３Ｉ／Ｄ６７４Ｔ／Ｒ８１４Ｅ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ；Ｒ５２４Ｋ／Ｍ６６５Ｖ／Ａ７５６Ｎ；Ｈ５８Ｎ／Ｑ１８６Ｅ／Ａ２１７Ｅ／Ｒ５２３Ｋ／Ｒ５２４Ｋ／Ｒ６７７Ｍ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｈ７４８Ｙ；Ｖ１３２Ｙ／Ｙ５１４Ｆ；Ａ５２０Ｐ；Ｙ４１Ｆ／Ｒ２１３Ｐ／Ｌ５０３Ｉ／Ｇ５６２Ｓ；Ｄ２３１Ｅ／Ｌ５０３Ｉ／Ｈ７４８Ｙ／Ｖ７７２Ｉ；Ｌ５０３Ｉ／Ｇ５６２Ｓ；Ｅ７３Ａ／Ｒ２３２Ｃ／Ｙ５１４Ｆ／Ｈ５８４Ｎ／Ｒ８１４Ｅ；Ｈ５８Ｎ／Ｄ５０７Ｋ／Ｇ６１６Ａ；Ｖ１３２Ｙ／Ｉ２６２Ｌ／Ａ５２０Ｐ／Ｇ５６２Ｓ／Ｉ６８４Ｖ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ８８Ｔ／Ｇ５６２Ｓ／Ｒ８１４Ｅ；Ｙ４１Ｆ／Ｓ８８Ｔ／Ｓ１５７Ｇ／Ｒ８１４Ｅ；Ｓ８８Ｔ／Ｓ１５７Ｇ／Ｒ２１３Ｐ／Ｄ６７４Ｔ／Ｉ６８４Ｖ；Ｖ５７Ｔ／Ｈ５８Ｎ／Ｒ５２３Ｋ／Ｌ７７９Ｉ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｙ５１４Ｆ／Ａ５２０Ｐ／Ｉ６８４Ｖ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｒ２１３Ｐ／Ｉ６８４Ｖ／Ｖ７７２Ｉ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｄ２３１Ｅ／Ｌ５０３Ｉ／Ｒ８１４Ｅ；Ｓ８８Ｔ／Ｒ２１３Ｐ／Ｌ５０３Ｉ／Ｈ５８４Ｎ／Ｒ８１４Ｅ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｖ１３２Ｙ／Ｇ５６２Ｓ／Ｈ５８４Ｎ；Ｙ４１Ｆ／Ｓ８８Ｔ／Ｒ２１３Ｐ／Ｄ２３１Ｅ／Ｌ５０３Ｉ／Ｉ６５０Ａ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｌ５０３Ｉ；Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｒ２１３Ｐ／Ｄ２３１Ｅ／Ａ５２０Ｐ／Ｇ５６２Ｓ／Ｉ６５０Ａ／Ｒ８１４Ｅ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｖ１３２Ｙ／Ｄ２３１Ｅ／Ｉ２６２Ｌ／Ｌ５０３Ｉ／Ｇ５６２Ｓ／Ｈ５８４Ｎ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８１４Ｅ；Ｖ５７Ｔ／Ｈ５８Ｎ／Ｒ２６４Ｔ／Ｍ２６５Ｉ／Ｒ５２４Ｋ／Ｖ６８８Ｉ；Ｓ８８Ｔ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２０Ｐ／Ｇ５６２Ｓ；Ｓ８８Ｔ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｌ５０３Ｉ／Ｙ５１４Ｆ／Ｇ５６２Ｓ／Ｉ６５０Ａ；Ｓ４０Ａ／Ｈ５８４Ｎ／Ｄ６７４Ｔ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ５０３Ｉ；Ｈ５８４Ｎ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ４０Ａ／Ｒ２１３Ｐ／Ｄ６７４Ｔ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｓ８８Ｔ／Ｖ１３２Ｙ／Ｌ５０３Ｉ／Ｇ５６２Ｓ／Ｈ５８４Ｎ／Ｈ７４８Ｙ；Ｓ８８Ｔ／Ｒ２１３Ｐ／Ｙ５１４Ｆ／Ｇ５６２Ｓ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８１４Ｅ；Ｓ２６３Ａ／Ａ５２０Ｐ／Ｒ８１４Ｅ；Ｓ４０Ａ／Ｙ４１Ｆ／Ｓ８８Ｔ／Ｓ１５７Ｇ；またはそれらの組合せを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0151】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２２／４０７、３２８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、５０３、５０４、５０６、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６３、５８１、５８２、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９２、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６９６、７４７、７４９、７５１、７６２、７６３、７６４、７６６、７７３、８０３またはそれらの組合せに少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0152】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セット５９９Ｓ、５３０Ｇ、５９６Ｌ、６９６Ｈ、５４２Ｗ、５３０Ｒ、５５３Ｆ、５３３Ｖ、５５５Ｍ、５９４Ｖ、５９４Ｗ、５３６Ｒ、５８５Ｋ、４０１Ｇ、５９７Ｅ、５５３Ｋ、４０２Ｒ、７６３Ｙ、７６２Ｖ、６０５Ｅ、５３０Ｐ、５０６Ｐ、５８９Ｇ、５５８Ｓ、５５３Ｎ、５５９Ｐ、７５１Ｈ、５８９Ｓ、７４７Ｔ、５６０Ｍ、６９６Ｖ、５４０Ｖ、５９４Ｃ、５５６Ｗ、５８９Ｒ、４０７Ｗ、５５７Ｈ、５５９Ｇ、５９９Ｔ、５２１Ｙ、６０５Ａ、５５９Ｄ、５３４Ｈ、５９２Ｇ、５３３Ｐ、５２９Ｓ、５２４Ｇ、７４９Ｒ、７６６Ｙ、５５６Ｐ、５９５Ｐ、５３３Ｑ、６０３Ｖ、５３７Ｇ、５８９Ｗ、５９８Ｗ、２２Ｋ／４０７Ｒ、５５５Ｗ、５３９Ｒ、５３１Ｑ、５８１Ａ、８０３Ｒ、５３８Ａ、４０４Ｔ、４０６Ｑ、５３７Ｌ、５９５Ｒ、５３４Ｗ、４０４Ｓ、５９２Ｖ、５２１Ｗ、６０３Ｇ、４０１Ｉ、５９５Ａ、７６２Ｑ、５３０Ｗ、５５８Ｖ、５２７Ｗ、５９６Ｗ、６０３Ｗ、５２８Ｗ、５０４Ｍ、５８７Ｑ、５８７Ｓ、５２３Ｖ、５２１Ｇ、５５８Ｒ、５５８Ｑ、５９３Ｎ、５２５Ｖ、７４９Ｌ、５０３Ｖ、５２７Ｖ、５５４Ｅ、５３５Ｋ、５９２Ｔ、５２８Ａ、５８５Ｒ、４０１Ａ、５８６Ｍ、７６４Ｉ、５５６Ｍ、７６３Ｇ、４０６Ｋ、５８２Ｆ、５４０Ｈ、５６０Ｇ、４０２Ｇ、５９４Ｑ、５３９Ｌ、６０２Ｖ、５２３Ａ、７４９Ｔ、５４２Ｔ、７６４Ａ、５２３Ｋ、６０７Ｎ、５２５Ｌ、４０３Ｌ、５２６Ｔ、５２８Ｒ、５９９Ｇ、５３７Ｗ、８０３Ｃ、５５６Ｆ、５５７Ｇ、６０１Ｍ、５９６Ｒ、５６３Ｌ、６０１Ｐ、７７３Ｒ、５５３Ｒ、５４２Ｍ、５９４Ｔ、５３３Ｌ、３２８Ｉ、５５５Ｋ、５４２Ｇ、または ５２８Ｑまたはそれらの組合せを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0153】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セットＮ５９９Ｓ、Ｋ５３０Ｇ、Ｓ５９６Ｌ、Ｒ６９６Ｈ、Ｒ５４２Ｗ、Ｋ５３０Ｒ、Ｑ５５３Ｆ、Ｔ５３３Ｖ、Ｒ５５５Ｍ、Ｓ５９４Ｖ、Ｓ５９４Ｗ、Ｓ５３６Ｒ、Ｑ５８５Ｋ、Ｓ４０１Ｇ、Ｄ５９７Ｅ、Ｑ５５３Ｋ、Ｎ４０２Ｒ、Ａ７６３Ｙ、Ａ７６２Ｖ、Ｉ６０５Ｅ、Ｋ５３０Ｐ、Ｒ５０６Ｐ、Ａ５８９Ｇ、Ａ５５８Ｓ、Ｑ５５３Ｎ、Ｋ５５９Ｐ、Ｅ７５１Ｈ、Ａ５８９Ｓ、Ｒ７４７Ｔ、Ｌ５６０Ｍ、Ｒ６９６Ｖ、Ｔ５４０Ｖ、Ｓ５９４Ｃ、Ｅ５５６Ｗ、Ａ５８９Ｒ、Ｓ４０７Ｗ、Ｌ５５７Ｈ、Ｋ５５９Ｇ、Ｎ５９９Ｔ、Ａ５２１Ｙ、Ｉ６０５Ａ、Ｋ５５９Ｄ、Ｓ５３４Ｈ、Ｒ５９２Ｇ、Ｔ５３３Ｐ、Ｇ５２９Ｓ、Ｒ５２４Ｇ、Ｖ７４９Ｒ、Ｖ７６６Ｙ、Ｅ５５６Ｐ、Ｓ５９５Ｐ、Ｔ５３３Ｑ、Ｉ６０３Ｖ、Ｖ５３７Ｇ、Ａ５８９Ｗ、Ｐ５９８Ｗ、Ｑ２２Ｋ／Ｓ４０７Ｒ、Ｒ５５５Ｗ、Ｅ５３９Ｒ、Ｒ５３１Ｑ、Ｔ５８１Ａ、Ｈ８０３Ｒ、Ｌ５３８Ａ、Ｑ４０４Ｔ、Ａ４０６Ｑ、Ｖ５３７Ｌ、Ｓ５９５Ｒ、Ｓ５３４Ｗ、Ｑ４０４Ｓ、Ｒ５９２Ｖ、Ａ５２１Ｗ、Ｉ６０３Ｇ、Ｓ４０１Ｉ、Ｓ５９５Ａ、Ａ７６２Ｑ、Ｋ５３０Ｗ、Ａ５５８Ｖ、Ｋ５２７Ｗ、Ｓ５９６Ｗ、Ｉ６０３Ｗ、Ｔ５２８Ｗ、Ｎ５０４Ｍ、Ｇ５８７Ｑ、Ｇ５８７Ｓ、Ｒ５２３Ｖ、Ａ５２１Ｇ、Ａ５５８Ｒ、Ａ５５８Ｑ、Ｌ５９３Ｎ、Ｔ５２５Ｖ、Ｖ７４９Ｌ、Ｌ５０３Ｖ、Ｋ５２７Ｖ、Ｙ５５４Ｅ、Ａ５３５Ｋ、Ｒ５９２Ｔ、Ｔ５２８Ａ、Ｑ５８５Ｒ、Ｓ４０１Ａ、Ｔ５８６Ｍ、Ｅ７６４Ｉ、Ｅ５５６Ｍ、Ａ７６３Ｇ、Ａ４０６Ｋ、Ｒ５８２Ｆ、Ｔ５４０Ｈ、Ｌ５６０Ｇ、Ｎ４０２Ｇ、Ｓ５９４Ｑ、Ｅ５３９Ｌ、Ｎ６０２Ｖ、Ｒ５２３Ａ、Ｖ７４９Ｔ、Ｒ５４２Ｔ、Ｅ７６４Ａ、Ｒ５２３Ｋ、Ｔ６０７Ｎ、Ｔ５２５Ｌ、Ｎ４０３Ｌ、Ａ５２６Ｔ、Ｔ５２８Ｒ、Ｎ５９９Ｇ、Ｖ５３７Ｗ、Ｈ８０３Ｃ、Ｅ５５６Ｆ、Ｌ５５７Ｇ、Ｑ６０１Ｍ、Ｓ５９６Ｒ、Ｔ５６３Ｌ、Ｑ６０１Ｐ、Ｑ７７３Ｒ、Ｑ５５３Ｒ、Ｒ５４２Ｍ、Ｓ５９４Ｔ、Ｔ５３３Ｌ、Ｖ３２８Ｉ、Ｒ５５５Ｋ、Ｒ５４２Ｇ、Ｔ５２８Ｑまたはそれらの組合せを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0154】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置１５、２０、２１、５２、８５、８７、９１、１０２、２４３、３２１、３２２、３８４、４０４、４７６、４８０、４８０、４９５、５４２、５７０、６７１、６７５、７０４、７２８、７３５、７５３、７５５、７６２、７６４、７９３、８２０、１６／７３５、７５０／８４９、５２４／５８１、４０３／４０４／５２４／５４２／５５５／７６２／７６４、４０４／５２４／５４２／５８９／７６２／７６４、５２４／５４２／５８１／７６２／７６４、５４２／７６２／７６４に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0155】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セット４０４Ｓ、５４２Ｇ、７６２Ｍ、５２４Ｑ／５４２Ｇ／５８１Ａ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、４０４Ｓ／５２４Ｑ／５４２Ｇ／５８９Ｌ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、７６４Ｖ、４０３Ｒ／４０４Ｓ／５２４Ｑ／５４２Ｇ／５５５Ｈ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、４７６Ｎ、５４２Ｇ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、７２８Ｋ、５２Ｒ、４７６Ｉ、６７５Ｌ、７５０Ｓ／８４９Ｔ、１０２Ｓ、２１Ｃ、７５５Ｐ、２１Ｓ、３２１Ｇ、２０Ａ、２１Ｋ、８７Ｎ、２０Ｃ、１６Ｒ／７３５Ｌ、２１Ｑ、７０４Ｐ、７３５Ｇ、３８４Ｙ、４８０Ｗ、１０２Ｍ、７９３Ｇ、３２２Ｓ、３２２Ｎ、５７０Ｒ、４８０Ｖ、７５３Ｖ、７５３Ｋ、５２４Ｑ／５８１Ａ、９１Ｋ、２４３Ｌ、２４３Ｓ、６７１Ｅ、８５Ｓ、４９５Ｍ、１５Ａ、１５Ｎ、１５Ｋ、８２０Ａ、４９５Ｅ、８５Ｅ、８５Ｒ、４８０Ｅ、１５Ｇ、または ６７１Ｒを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0156】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セットＱ４０４Ｓ、Ｒ５４２Ｇ、Ａ７６２Ｍ、Ｒ５２４Ｑ／Ｒ５４２Ｇ／Ｔ５８１Ａ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｑ４０４Ｓ／Ｒ５２４Ｑ／Ｒ５４２Ｇ／Ａ５８９Ｌ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｅ７６４Ｖ、Ｎ４０３Ｒ／Ｑ４０４Ｓ／Ｒ５２４Ｑ／Ｒ５４２Ｇ／Ｒ５５５Ｈ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｌ４７６Ｎ、Ｒ５４２Ｇ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｒ７２８Ｋ、Ｓ５２Ｒ、Ｌ４７６Ｉ、Ｐ６７５Ｌ、Ｐ７５０Ｓ／Ａ８４９Ｔ、Ｖ１０２Ｓ、Ｆ２１Ｃ、Ｋ７５５Ｐ、Ｆ２１Ｓ、Ｅ３２１Ｇ、Ｌ２０Ａ、Ｆ２１Ｋ、Ｐ８７Ｎ、Ｌ２０Ｃ、Ｑ１６Ｒ／Ｅ７３５Ｌ、Ｆ２１Ｑ、Ｄ７０４Ｐ、Ｅ７３５Ｇ、Ｒ３８４Ｙ、Ｑ４８０Ｗ、Ｖ１０２Ｍ、Ｐ７９３Ｇ、Ｒ３２２Ｓ、Ｒ３２２Ｎ、Ｋ５７０Ｒ、Ｑ４８０Ｖ、Ｌ７５３Ｖ、Ｌ７５３Ｋ、Ｒ５２４Ｑ／Ｔ５８１Ａ、Ｈ９１Ｋ、Ｐ２４３Ｌ、Ｐ２４３Ｓ、Ｖ６７１Ｅ、Ｐ８５Ｓ、Ｒ４９５Ｍ、Ｖ１５Ａ、Ｖ１５Ｎ、Ｖ１５Ｋ、Ｒ８２０Ａ、Ｒ４９５Ｅ、Ｐ８５Ｅ、Ｐ８５Ｒ、Ｑ４８０Ｅ、Ｖ１５Ｇ、または Ｖ６７１Ｒを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0157】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置７５０／８２０、２１／５２、２０／２１／８５／３２２／４７６／４９５、２０／８５／２００／３２２／４７６／４９５／７５０、４７６／７５０、２０Ｃ／４７６、２０／３２２／３８６、８５／３２２／４７６、５２／３２２／４９８／７５０、２０／３２２／４７６／８２０、８５／４７６／４９５／８２０、２１／８５／３２２／８２０、２０／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／８２０、２０／３２２、２１／８２０／８４９、４７６、３２２／８２０、２１／３２２／３８６／８２０、３２２／３８６／４９５、８５／３８６／４９５／７５０、２０／８５／４７６／７５０、２０／３８６／４７６、８５／３２２／３８６／４７６／４９５、２０／４９５／８２０、７５０、２１／３２２／４９５、５２／３８６／４９５／８２０、２１／３２２、８５／３２２／７５０／８２０、２０／５２／８５、２１／５２／５７２、２０／８５／４９５／８４９、８５／７５０、２１／４９５／８２０、２７３／３２２／８４９、４９５、３２２／７５０／８２０、５２／４７６／４９５／５６６／７５０／８４９、３８６／４９５、４９５／８２０、２１／３２２／４９５／７５０／８２０、２１／８５／３２２／３８６／４９５／８２０／８４９、４７６／４９５／７５０、３８６／８４９、４７６／４９５、８５／４７６／８４９、２１／３２２／７５０、２０／８５／５６６／８２０、または ３８６／７５０／８４９に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0158】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セット７５０Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／５２Ｒ、２０Ｃ／２１Ｃ／８５Ｅ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ、２０Ｃ／８５Ｅ／２００Ｖ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｓ／７５０Ｓ、４７６Ｎ／７５０Ｓ、２０Ｃ／４７６Ｎ、２０Ｃ／３２２Ｎ／３８６Ｖ、８５Ｅ／３２２Ｎ／４７６Ｎ、５２Ｒ／３２２Ｎ／４９８Ｄ／７５０Ｓ、２０Ｃ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／８２０Ａ、８５Ｅ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／８２０Ａ、２１Ｃ／８５Ｅ／３２２Ｎ／８２０Ａ、２０Ｃ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／８２０Ａ、２０Ｃ／３２２Ｎ、２１Ｃ／８２０Ａ／８４９Ｔ、４７６Ｎ、３２２Ｎ／８２０Ａ、２１Ｃ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／８２０Ａ、３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ、８５Ｅ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／７５０Ｓ、２０Ｃ／８５Ｅ／４７６Ｎ／７５０Ｓ、２０Ｃ／３８６Ｖ／４７６Ｎ、８５Ｅ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｓ、２０Ｃ／４９５Ｅ／８２０Ａ、７５０Ｓ、２１Ｃ／３２２Ｎ／４９５Ｅ、５２Ｒ／３８６Ｖ／４９５Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／３２２Ｎ、８５Ｅ／３２２Ｎ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２０Ｃ／５２Ｒ／８５Ｅ、２１Ｃ／５２Ｒ／５７２Ｉ、２０Ｃ／８５Ｅ／４９５Ｅ／８４９Ｔ、８５Ｅ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４９５Ｅ／８２０Ａ、２７３Ｍ／３２２Ｎ／８４９Ｔ、４９５Ｅ、３２２Ｎ／７５０Ｓ／８２０Ａ、５２Ｒ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５６６Ａ／７５０Ｓ／８４９Ｔ、３８６Ｖ／４９５Ｅ、４９５Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／３２２Ｎ／４９５Ｅ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／８５Ｅ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｓ／８２０Ａ／８４９Ｔ、４９５Ｓ、４７６Ｎ／４９５Ｅ／７５０Ｓ、３８６Ｖ／８４９Ｔ、４７６Ｎ／４９５Ｅ、８５Ｅ／４７６Ｎ／８４９Ｔ、２１Ｃ／３２２Ｎ／７５０Ｓ、２０Ｃ／８５Ｅ／５６６Ａ／８２０Ａ、または ３８６Ｖ／７５０Ｓ／８４９Ｔを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0159】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セットＰ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ５２Ｒ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｌ２０Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ａ２００Ｖ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｓ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ４７６Ｎ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｌ４７６Ｎ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ、Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ、Ｓ５２Ｒ／Ｒ３２２Ｎ／Ｇ４９８Ｄ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｐ８５Ｅ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ３２２Ｎ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ８２０Ａ／Ａ８４９Ｔ、Ｌ４７６Ｎ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ８２０Ａ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ、Ｐ８５Ｅ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｌ４７６Ｎ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ、Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｓ５２Ｒ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ、Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ８５Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ５２Ｒ／Ｖ５７２Ｉ、Ｌ２０Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ８４９Ｔ、Ｐ８５Ｅ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｖ２７３Ｍ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ８４９Ｔ、Ｒ４９５Ｅ、Ｒ３２２Ｎ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ５２Ｒ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｄ５６６Ａ／Ｐ７５０Ｓ／Ａ８４９Ｔ、Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ、Ｒ４９５Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｓ／Ｒ８２０Ａ／Ａ８４９Ｔ、Ｒ４９５Ｓ、Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｐ７５０Ｓ、Ｒ３８６Ｖ／Ａ８４９Ｔ、Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｐ８５Ｅ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ８４９Ｔ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｄ５６６Ａ／Ｒ８２０Ａ、または Ｒ３８６Ｖ／Ｐ７５０Ｓ／Ａ８４９Ｔを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0160】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２９９／３８６／５６６／８２０、４７６／８２０／８４９、２１／３２２／４７６／４９５／８２０、１７７、２１／４９５、４７６／８２０、２０／５２／２９９、５２／２９９、３２２／８２０、２０／８２０、２０／２９９／３８６／４７６、３８６／４７６／８２０、４７６／４９５／８２０、３８６／４７６／４９５、２０／２１／２９９／３２２／３８６、３２２／３８６／４９５、２１／２９９／３２２／４７６／４９５／８２０、２１／２９９／３８６／８２０、２９９／４７６／８２０、２０／２１、２１／８５／１０２／７５０、７０５、２１／３８６／４７６／８２０、８２０、２１／２９９／３２２、２０／２１／３２２／３８６／８２０、２９９、２１／２９９／３８６／４７６、１０９、３２２／４９５、４９１、５２／８２０、２１／３８６／８２０、２０／２１／４９５、２１／２９９／３２２／４９５／５６６／８２０、２０／２１／２９９／４９５、７５６、３８６／８２０、４９５、５１１、２１／５２／２４２／３８６／４９５／８２０、２９９／４７６／４９５、７０６、２１／２９９／３８６／４７６／４９５、２１／２９９／３２２／４９５、２１／４７６／８４９、２９９／３２２／４７６／８２０、２１／５２／２９９／３２２／８２０、２０／２１／５６６、２０／５２、３２２／３８６／４９５／５６６／８２０、２１／２９９、２１／２９９／３８６、３８６／８４９、５２／４７６、５２／２９９／３２２／３８６／４９５、または ４４０に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0161】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セット２９９Ｎ／３８６Ｖ／５６６Ａ／８２０Ａ、４７６Ｎ／８２０Ａ／８４９Ｔ、２１Ｃ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／８２０Ａ、１７７Ｔ、２１Ｃ／４９５Ｅ、４７６Ｎ／８２０Ａ、２０Ｃ／５２Ｒ／２９９Ｎ、５２Ｒ／２９９Ｎ、３２２Ｎ／８２０Ａ、２０Ｃ／８２０Ａ、２０Ｃ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ、３８６Ｖ／４７６Ｎ／８２０Ａ、４７６Ｎ／４９５Ｅ／８２０Ａ、３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｅ、２０Ｃ／２１Ｃ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／３８６Ｖ、３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／８２０Ａ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／８２０Ａ、２９９Ｎ／４７６Ｎ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ、２１Ｃ／８５Ｐ／１０２Ｖ／７５０Ｐ、７０５Ｗ、２１Ｃ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／８２０Ａ、８２０Ａ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３２２Ｎ、２０Ｃ／２１Ｃ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／８２０Ａ、２９９Ｎ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ、１０９Ｐ、３２２Ｎ／４９５Ｅ、４９１Ｇ、５２Ｒ／８２０Ａ、２１Ｃ／３８６Ｖ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ／４９５Ｅ、２１Ｃ／Ｔ９９Ｎ／３２２Ｎ／４９５Ｅ／５６６Ａ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ／２９９Ｎ／４９５Ｅ、７５６Ｔ、３８６Ｖ／８２０Ａ、４９５Ｅ、５１１Ｍ、２１Ｃ／５２Ｒ／２４２Ｑ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／８２０Ａ、２９９Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ、７０６Ｅ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｅ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／４９５Ｅ、２１Ｃ／４７６Ｎ／８４９Ｔ、２９９Ｎ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／８２０Ａ、２１Ｃ／５２Ｒ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ／５６６Ａ、２０Ｃ／５２Ｒ、３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／５６６Ａ／８２０Ａ、２１Ｃ／２９９Ｎ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３８６Ｖ、３８６Ｖ／８４９Ｔ、５２Ｒ／４７６Ｎ、５２Ｒ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ、または ４４０Ｇを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0162】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セットＴ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｄ５６６Ａ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ／Ａ８４９Ｔ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｒ１７７Ｔ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ４９５Ｅ、Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ５２Ｒ／Ｔ２９９Ｎ、Ｓ５２Ｒ／Ｔ２９９Ｎ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ、Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ８２０Ａ、Ｔ２９９Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ、Ｆ２１Ｃ／Ｅ８５Ｐ／Ｓ１０２Ｖ／Ｓ７５０Ｐ、Ｙ７０５Ｗ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ８２０Ａ、Ｔ２９９Ｎ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ、Ｋ１０９Ｐ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ａ４９１Ｇ、Ｓ５２Ｒ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｒ４９５Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｄ５６６Ａ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ａ７５６Ｔ、Ｒ３８６Ｖ／Ｒ８２０Ａ、Ｒ４９５Ｅ、Ｔ５１１Ｍ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ２４２Ｑ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｔ２９９Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｇ７０６Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ８４９Ｔ、Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ５２Ｒ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｄ５６６Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ５２Ｒ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ｄ５６６Ａ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ、Ｒ３８６Ｖ／Ａ８４９Ｔ、Ｓ５２Ｒ／Ｌ４７６Ｎ、Ｓ５２Ｒ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ、または Ｅ４４０Ｇを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0163】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２２／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５６０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６９６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７４９、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７５１、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６２、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６６、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７７３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／８０３、４０／１３２／１５７／６０５／２６２／２６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／５２１／７４８、または ４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／５５３／７４８に少なくとも置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0164】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換セット４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９９Ｓ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３０Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９６Ｌ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／６９６Ｈ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５４２Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３０Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５３Ｆ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３３Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５５Ｍ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９４Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９４Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３６Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５８５Ｋ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９７Ｅ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５３Ｋ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０２Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７６３Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７６２Ｖ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／６０５Ｅ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３０Ｐ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５０６Ｐ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５８９Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５８Ｓ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５３Ｎ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７５１Ｈ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５８９Ｓ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４７Ｔ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５６０Ｍ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／６９６Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５４０Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９４Ｃ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５６Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５８９Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０７Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５７Ｈ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５９Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９９Ｔ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｙ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／６０５Ａ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５９Ｄ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３４Ｈ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９２Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３３Ｐ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２９Ｓ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２４Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７４９Ｒ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７６６Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５６Ｐ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９５Ｐ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３３Ｑ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／６０３Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３７Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５８９Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９８Ｗ／７４８Ｙ、２２Ｋ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０７Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５５Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３９Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３１Ｑ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５８１Ａ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／８０３Ｒ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３８Ａ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０４Ｔ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０６Ｑ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３７Ｌ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９５Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３４Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０４Ｓ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９２Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／６０３Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０１Ｉ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９５Ａ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７６２Ｑ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／５３０Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５８Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２７Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／５９６Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／６０３Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２８Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５０４Ｍ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５８７Ｑ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２３Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５８Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９３Ｎ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７ＧＩ２６２Ｌ／２６３Ａ／５２５Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７４９Ｌ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５０３Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２７Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５４Ｅ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３５Ｋ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９２Ｔ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２８Ａ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５８５Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０１Ａ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５８６Ｍ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７６４Ｉ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５６Ｍ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７６３Ｇ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０６Ｋ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５８２Ｆ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５４０Ｈ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５６０Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０２Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９４Ｑ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３９Ｌ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／６０２Ｖ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２３Ａ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７４９Ｔ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５４２Ｔ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７６４Ａ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２３Ｋ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／６０７Ｎ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２５Ｌ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０３Ｌ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２６Ｔ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２８Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９９Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３７Ｗ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／８０３Ｃ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５６Ｆ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５７Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／６０１Ｍ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９６Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５６３Ｌ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／６０１Ｐ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７７３Ｒ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５３Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５４２Ｍ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５９４Ｔ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５３３Ｌ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２８Ｉ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５５Ｋ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５４２Ｇ／７４８Ｙ、または ４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２８Ｑ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５８７Ｓ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５５８Ｑ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０３Ｒ／５２１Ａ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７６２Ｍ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／７４８Ｙ／７６４Ｖ、または ４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０３Ｒ／５５３Ｋ／７４８Ｙを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0165】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セットＳ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ５９９Ｓ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｋ５３０Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９６Ｌ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ６９６Ｈ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５４２Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｋ５３０Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ５５３Ｆ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５３３Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５５５Ｍ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９４Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９４Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５３６Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ５８５Ｋ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ４０１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｄ５９７Ｅ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ５５３Ｋ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ４０２Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ７６３Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ７６２Ｖ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｉ６０５Ｅ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｋ５３０Ｐ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５０６Ｐ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５８９Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５５８Ｓ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ５５３Ｎ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｋ５５９Ｐ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｅ７５１Ｈ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５８９Ｓ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ７４７Ｔ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ５６０Ｍ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ６９６Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５４０Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９４Ｃ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｅ５５６Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５８９Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ４０７Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ５５７Ｈ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｋ５５９Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ５９９Ｔ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｙ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ６０５Ａ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｋ５５９Ｄ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５３４Ｈ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５９２Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５３３Ｐ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｇ５２９Ｓ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５２４Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｖ７４９Ｒ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｖ７６６Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｅ５５６Ｐ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９５Ｐ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５３３Ｑ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｉ６０３Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｖ５３７Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５８９Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｐ５９８Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｑ２２Ｋ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ４０７Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５５５Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｅ５３９Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５３１Ｑ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５８１Ａ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｈ８０３Ｒ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ５３８Ａ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ４０４Ｔ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ４０６Ｑ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｖ５３７Ｌ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９５Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５３４Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ４０４Ｓ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５９２Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｉ６０３Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ４０１Ｉ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９５Ａ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ７６２Ｑ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｋ５３０Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５５８Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｋ５２７Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９６Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｉ６０３Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５２８Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ５０４Ｍ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｇ５８７Ｑ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５２３Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５５８Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ５９３Ｎ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５２５Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｖ７４９Ｌ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ５０３Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｋ５２７Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｙ５５４Ｅ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５３５Ｋ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５９２Ｔ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５２８Ａ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ５８５Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ４０１Ａ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５８６Ｍ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｅ７６４Ｉ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｅ５５６Ｍ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ７６３Ｇ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ４０６Ｋ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５８２Ｆ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５４０Ｈ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ５６０Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ４０２Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９４Ｑ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｅ５３９Ｌ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ６０２Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５２３Ａ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｖ７４９Ｔ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５４２Ｔ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｅ７６４Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５２３Ｋ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ６０７Ｎ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５２５Ｌ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ４０３Ｌ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２６Ｔ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５２８Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ５９９Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｖ５３７Ｗ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｈ８０３Ｃ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｅ５５６Ｆ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ
／Ｓ２６３Ａ／Ｌ５５７Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ６０１Ｍ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９６Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５６３Ｌ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ６０１Ｐ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｑ７７３Ｒ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ５５３Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５４２Ｍ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９４Ｔ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５３３Ｌ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｖ３２８Ｉ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５５５Ｋ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５４２Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５２８Ｑ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｇ５８７Ｓ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５５８Ｑ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ４０３Ｒ／Ｇ５２１Ａ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ７６２Ｍ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｅ７６４Ｖ、またはＳ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ４０３Ｒ／Ｑ５５３Ｋ／Ｈ７４８Ｙを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
／Ｓ２６３Ａ／Ｌ５５７Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ６０１Ｍ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９６Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５６３Ｌ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ６０１Ｐ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｑ７７３Ｒ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ５５３Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５４２Ｍ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｓ５９４Ｔ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５３３Ｌ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｖ３２８Ｉ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５５５Ｋ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ５４２Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５２８Ｑ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｇ５８７Ｓ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５５８Ｑ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ４０３Ｒ／Ｇ５２１Ａ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ７６２Ｍ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｅ７６４Ｖ、またはＳ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ４０３Ｒ／Ｑ５５３Ｋ／Ｈ７４８Ｙを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0166】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／４０４／５２１／５２４／５４２／５５５／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／５２１／５２４／５４２／５８９／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５２４／５４２／５８１／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５４２／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／５２１／５４２／７４８／７６２、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５２４／５８１／７４８、１６／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／８２０、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７９３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５５、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７２８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／６７５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／６７１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５７０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４８０／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３８４／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２１／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２４３／２６２／２６３／５２１／７４８、１５／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／９１／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８７／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８５／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２０／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２１／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、または４０／５２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８に少なくとも置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0167】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換セット４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０４Ｓ／５２１Ｇ／５４２Ｇ／７４８Ｙ／７６２Ｍ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／５２４Ｑ／５４２Ｇ／５８１Ａ／７４８Ｙ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０４Ｓ／５２１Ｇ／５２４Ｑ／５４２Ｇ／５８９Ｌ／７４８Ｙ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７６４Ｖ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４０３Ｒ／４０４Ｓ／５２１Ｇ／５２４Ｑ／５４２Ｇ／５５５Ｈ／７４８Ｙ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／５４２Ｇ／７４８Ｙ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７２８Ｋ、４０Ａ／５２Ｒ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｉ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／６７５Ｌ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８４９Ｔ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、２１Ｃ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５５Ｐ、２１Ｓ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２１Ｇ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、２０Ａ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、２１Ｋ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／８７Ｎ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、２０Ｃ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、１６Ｒ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７３５Ｌ／７４８Ｙ、２１Ｑ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７０４Ｐ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７３５Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８４Ｙ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４８０Ｗ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／Ｖ１０２Ｍ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７９３Ｇ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｓ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／５７０Ｒ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４８０Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５３Ｖ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５３Ｋ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／Ｒ５２４Ｑ／５８１Ａ／７４８Ｙ、４０Ａ／９１Ｋ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２４３Ｌ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２４３Ｓ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／６７１Ｅ／７４８Ｙ、４０Ａ／８５Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９５Ｍ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、１５Ａ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、１５Ｎ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、１５Ｋ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／、４０Ａ／８５Ｅ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／８５Ｒ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４８０Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、１５Ｇ／４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、または４０Ａ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／６７１Ｒ／７４８Ｙを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0168】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換セットＳ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ４０４Ｓ／Ａ５２１Ｇ／Ｒ５４２Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ７６２Ｍ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｒ５２４Ｑ／Ｒ５４２Ｇ／Ｔ５８１Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ４０４Ｓ／Ａ５２１Ｇ／Ｒ５２４Ｑ／Ｒ５４２Ｇ／Ａ５８９Ｌ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｅ７６４Ｖ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｎ４０３Ｒ／Ｑ４０４Ｓ／Ａ５２１Ｇ／Ｒ５２４Ｑ／Ｒ５４２Ｇ／Ｒ５５５Ｈ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｒ５４２Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ７２８Ｋ、Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｉ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｐ６７５Ｌ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ａ８４９Ｔ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｋ７５５Ｐ、Ｆ２１Ｓ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｅ３２１Ｇ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｌ２０Ａ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｆ２１Ｋ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８７Ｎ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｑ１６Ｒ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｅ７３５Ｌ／Ｈ７４８Ｙ、Ｆ２１Ｑ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｄ７０４Ｐ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｅ７３５Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８４Ｙ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ４８０Ｗ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｍ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７９３Ｇ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｓ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｋ５７０Ｒ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ４８０Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｌ７５３Ｖ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｌ７５３Ｋ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｒ５２４Ｑ／Ｔ５８１Ａ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｈ９１Ｋ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｐ２４３Ｌ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｐ２４３Ｓ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｖ６７１Ｅ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ４９５Ｍ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｖ１５Ａ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｖ１５Ｎ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｖ１５Ｋ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ４９５Ｅ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｒ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｑ４８０Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｖ１５Ｇ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｖ６７１Ｒ／Ｈ７４８Ｙを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0169】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／８４９、２０／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５７２／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／８４９、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／８２０／８４９、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２７３／３２２／５２１／７４８／８４９、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８４９、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８４９、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５６６／７４８／８２０、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９８／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８／８２０、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８／８２０、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８４９、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２００／２６３／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、または２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／８２０／８４９に少なくとも置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0170】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換セット４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／４０Ａ／５２Ｒ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、２０Ｃ／２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、２０Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２００Ｖ／２６３Ａ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｓ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２０Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、２０Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／５２Ｒ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／４９８Ｄ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２０Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ、２０Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、２０Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、２１Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ／８４９Ｔ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ、２１Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２０Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２０Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｓ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、２０Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／５２Ｒ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／４９５Ｓ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ、２１Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２０Ｃ／４０Ａ／５２Ｒ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ 、２１Ｃ／４０Ａ／５２Ｒ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／５７２Ｉ／７４８Ｙ、２０Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８４９Ｔ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２７３Ｍ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８４９Ｔ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、４０Ａ／５２Ｒ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／５６６Ａ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８４９Ｔ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９５Ｓ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ、２１Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｓ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８２０Ａ／８４９Ｔ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９５Ｓ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８４９Ｔ、４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／８４９Ｔ、２１Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２０Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／５６６Ａ／７４８Ｙ／８２０Ａ、または４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８４９Ｔを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0171】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換セットＳ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ａ２００Ｖ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｓ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｇ４９８Ｄ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ／Ａ８４９Ｔ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｓ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｓ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ 、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｖ５７２Ｉ／Ｈ７４８Ｙ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ８４９Ｔ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｖ２７３Ｍ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ８４９Ｔ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｄ５６６Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ａ８４９Ｔ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ４９５Ｓ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｓ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ／Ａ８４９Ｔ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ４９５Ｓ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ８４９Ｔ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ａ８４９Ｔ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｄ５６６Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ａ８４９Ｔを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0172】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０／８４９、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／１７７／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、５２／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０５／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／５２１／７４８／７５０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１０９／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９１／５２１／７４８／７５０、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／７５６、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５１１／５２１／７４８／７５０、２１／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２４２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０６／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５６６／７４８／７５０、２０／４０／５２／／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、または４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４４０／５２１／７４８／７５０に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0173】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セット４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／５６６Ａ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ／８４９Ｔ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／１７７Ｔ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２０Ｃ／４０Ａ／５２Ｒ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、５２Ｒ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２０Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２０Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２０Ｃ／２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７０５Ｗ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２０Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１０９Ｐ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９１Ｇ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／５２Ｒ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／５６６Ａ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／７５６Ｔ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５１１Ｍ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／５２Ｒ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２４２Ｑ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７０６Ｅ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８４９Ｔ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／４０Ａ／５２Ｒ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／５６６Ａ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２０Ｃ／４０Ａ／５２Ｒ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／５６６Ａ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／３８６Ｖ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８４９Ｔ、４０Ａ／５２Ｒ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４７６Ｎ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、４０Ａ／５２Ｒ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓ、または４０Ａ／８５Ｅ／１０２Ｓ／１３２Ｙ／１５７Ｇ／２６２Ｌ／２６３Ａ／４４０Ｇ／５２１Ｇ／７４８Ｙ／７５０Ｓを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0174】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セットＳ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｄ５６６Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ／Ａ８４９Ｔ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｒ１７７Ｔ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ５２Ｒ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ 、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｙ７０５Ｗ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｋ１０９Ｐ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ４９１Ｇ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｄ５６６Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ａ７５６Ｔ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ５１１Ｍ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｐ２４２Ｑ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ；Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｇ７０６Ｅ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ａ８４９Ｔ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｄ５６６Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｄ５６６Ａ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｒ３８６Ｖ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ／Ａ８４９Ｔ、Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、Ｓ４０Ａ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓ、またはＳ４０Ａ／Ｐ８５Ｅ／Ｖ１０２Ｓ／Ｖ１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｉ２６２Ｌ／Ｓ２６３Ａ／４４０／Ａ５２１Ｇ／Ｈ７４８Ｙ／Ｐ７５０Ｓを含み、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0175】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその断片は、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【0176】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその断片は、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含むが、ただし、ポリペプチド配列が、配列番号２の残基１２～８５０に対応する配列を含まないことを条件とする。
【0177】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0178】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号８の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0179】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号３３２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号３３２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0180】
前述の一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置１５、１６、２０、２１、２２、４０、４１、５２、５７、５８、７３、８５、８７、８８、９１、１０２、１０９、１３２、１５７、１７７、１８６、２００、２１３、２１７、２３１、２３２、２４２、２４３、２６２、２６３、２６４、２６５、２７３、２９９、３２１、３２２、３２８、３８４、３８６、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、４４０、４７６、４８０、４９１、４９５、４９８、５０３、５０４、５０６、５０７、５０８、５１１、５１４、５２０、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６２、５６３、５６６、５７０、５７２、５８１、５８２、５８４、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６１６、６６５、６７１、６７４、６７５、６７７、６８４、６８８、６９６、７０４、７０５、７０６、７２８、７３５、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５３、７５５、７５６、７６２、７６３、７６４、７６６、７７２、７７３、７７９、７９３、８０３、８１４、８２０、または８４９またはそれらの組合せに少なくとも置換を含み、アミノ酸位置は、配列番号８、３３２、４６２または６０６の参照配列と比べたものである。
【0181】
前述の一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくともアミノ酸残基１５Ａ／Ｇ／Ｋ／Ｎ、１６Ｒ、２０Ａ／Ｃ、２１Ｋ／Ｑ／Ｓ、２２Ｋ、４０Ａ、４１Ｆ、５２Ｒ、５７Ｔ、５８Ｎ、７３Ａ、８５Ｅ／Ｐ／Ｒ／Ｓ、８７Ｎ、８８Ｔ、９１Ｋ、１０２Ｖ／Ｍ／Ｓ、１０９Ｐ、１３２Ｙ、１５７Ｇ、１７７Ｔ、１８６Ｅ、２００Ｖ、２１３Ｐ、２１７Ｅ、２３１Ｅ、２３２Ｃ、２４２Ｑ、２４３Ｌ／Ｓ、２６２Ｌ、２６３Ａ、２６４Ｔ、２６５Ｉ、２７３Ｍ、２９９Ｎ、３２１Ｇ、３２２Ｎ／Ｓ、３２８Ｉ、３８４Ｙ、３８６Ｖ、４０１ Ａ／Ｇ／Ｉ、４０２Ｇ／Ｒ、４０３Ｌ／Ｒ、４０４Ｓ／Ｔ、４０６Ｋ／Ｑ、４０７Ｒ／Ｗ、４４０Ｇ、４７６Ｉ／Ｎ、４８０Ｅ／Ｖ／Ｗ、４９１Ｇ、４９５Ｅ／Ｍ／Ｓ、４９８Ｄ、５０３Ｉ／Ｖ、５０４Ｍ、５０６Ｐ、５０７Ｋ、５０８Ｈ、５１１Ｍ、５１４Ｆ、５２０Ｐ、５２１Ｇ／Ｗ／Ｙ、５２３Ａ／Ｋ／Ｖ、５２４Ｇ／Ｋ／Ｑ、５２５Ｌ／Ｖ、５２６Ｔ、５２７Ｖ／Ｗ、５２８Ａ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、５２９Ｓ、５３０Ｇ／Ｐ／Ｒ／Ｗ、５３３Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、５３４Ｈ／Ｗ、５３５Ｋ、５３６Ｒ、５３７Ｇ／Ｌ／Ｗ、５３８Ａ、５３９Ｌ／Ｒ、５４０Ｈ／Ｖ、５４２Ｇ／Ｍ／Ｔ／Ｗ、５５３Ｆ／Ｋ／Ｎ／Ｒ、５５４Ｅ、５５５Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｗ、５５６Ｆ／Ｍ／Ｐ／Ｗ、５５７Ｇ／Ｈ、５５８Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｑ、５５９Ｄ／Ｇ／Ｐ、５６０Ｇ／Ｍ、５６２Ｓ、５６３Ｌ、５６６Ａ、５７０Ｒ、５７２Ｉ、５８１Ａ、５８２Ｆ、５８４Ｎ、５８５ＫＲ、５８６Ｍ、５８７Ｑ／Ｓ、５８９Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、５９２Ｇ／Ｔ／Ｖ、５９３Ｎ、５９４Ｃ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、５９５Ａ／Ｐ／Ｒ、５９６Ｌ／Ｒ／Ｗ、５９７Ｅ、５９９Ｇ／Ｓ／Ｔ、６０１Ｍ／Ｐ、６０２Ｖ、６０３Ｇ／Ｖ／Ｗ、６０５Ｅ／Ａ、６０７Ｎ、６１６Ａ、６６５Ｖ、６７１Ｅ／Ｒ、６７４Ｔ、６７５Ｌ、６７７Ｍ、６８４Ｖ、６８８Ｉ、６９６Ｈ／Ｖ、７０４Ｐ、７０５Ｗ、７０６Ｅ、７２８Ｋ、７３５Ｇ／Ｌ、７４７Ｔ、７４８Ｙ、７４９Ｌ／Ｒ／Ｔ、７５０Ｓ／Ｐ、７５１Ｈ、７５３Ｋ／Ｖ、７５５Ｐ、７５６Ｎ／Ｔ、７６２Ｍ／Ｑ／Ｖ、７６３Ｇ／Ｙ、７６４Ａ／Ｉ／Ｖ、７６６Ｙ、７７２Ｉ、７７３Ｒ、７７９Ｉ、７９３Ｇ、８０３Ｃ／Ｒ、８１４Ｅ、８２０Ａ、または８４９Ｔまたはそれらの組合せを含み、アミノ酸位置は、配列番号８、３３２、４６２または６０６の参照配列と比べたものである。
【0182】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置４０、８５、１０２、１３２、１５７、１７７、２６２、２６３、５２１、７４８もしくは７５０またはそれらの組合せに少なくとも置換を含み、アミノ酸位置は、配列番号８、３３２、４６２または６０６の参照配列と比べたものである。
【0183】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくともアミノ酸残基４０Ａ、８５Ｅ、１０２Ｓ、１３２Ｙ、１７７Ｔ、１５７Ｇ、２６２Ｌ、２６３Ａ、５２１Ｇ、７４８Ｙもしくは７５０Ｓまたはそれらの組合せを含み、アミノ酸位置は、配列番号８、３３２、４６２または６０６の参照配列と比べたものである。
【0184】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号８の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号８の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0185】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２２／４０７、３２８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、５０３、５０４、５０６、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６３、５８１、５８２、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９２、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６９６、７４７、７４９、７５１、７６２、７６３、７６４、７６６、７７３、８０３、または４０３／５５３に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号８の参照配列と比べたものである。
【0186】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セット５９９Ｓ、５３０Ｇ、５９６Ｌ、６９６Ｈ、５４２Ｗ、５３０Ｒ、５５３Ｆ、５３３Ｖ、５５５Ｍ、５９４Ｖ、５９４Ｗ、５３６Ｒ、５８５Ｋ、４０１Ｇ、５９７Ｅ、５５３Ｋ、４０２Ｒ、７６３Ｙ、７６２Ｖ、６０５Ｅ、５３０Ｐ、５０６Ｐ、５８９Ｇ、５５８Ｓ、５５３Ｎ、５５９Ｐ、７５１Ｈ、５８９Ｓ、７４７Ｔ、５６０Ｍ、６９６Ｖ、５４０Ｖ、５９４Ｃ、５５６Ｗ、５８９Ｒ、４０７Ｗ、５５７Ｈ、５５９Ｇ、５９９Ｔ、５２１Ｙ、６０５Ａ、５５９Ｄ、５３４Ｈ、５９２Ｇ、５３３Ｐ、５２９Ｓ、５２４Ｇ、７４９Ｒ、７６６Ｙ、５５６Ｐ、５９５Ｐ、５３３Ｑ、６０３Ｖ、５３７Ｇ、５８９Ｗ、５９８Ｗ、２２Ｋ／４０７Ｒ、５５５Ｗ、５３９Ｒ、５３１Ｑ、５８１Ａ、８０３Ｒ、５３８Ａ、４０４Ｔ、４０６Ｑ、５３７Ｌ、５９５Ｒ、５３４Ｗ、４０４Ｓ、５９２Ｖ、５２１Ｗ、６０３Ｇ、４０１Ｉ、５９５Ａ、７６２Ｑ、５３０Ｗ、５５８Ｖ、５２７Ｗ、５９６Ｗ、６０３Ｗ、５２８Ｗ、５０４Ｍ、５８７Ｑ、５８７Ｓ、５２３Ｖ、５２１Ｇ、５５８Ｒ、５５８Ｑ、５９３Ｎ、５２５Ｖ、７４９Ｌ、５０３Ｖ、５２７Ｖ、５５４Ｅ、５３５Ｋ、５９２Ｔ、５２８Ａ、５８５Ｒ、４０１Ａ、５８６Ｍ、７６４Ｉ、５５６Ｍ、７６３Ｇ、４０６Ｋ、５８２Ｆ、５４０Ｈ、５６０Ｇ、４０２Ｇ、５９４Ｑ、５３９Ｌ、６０２Ｖ、５２３Ａ、７４９Ｔ、５４２Ｔ、７６４Ａ、５２３Ｋ、６０７Ｎ、５２５Ｌ、４０３Ｌ、５２６Ｔ、５２８Ｒ、５９９Ｇ、５３７Ｗ、８０３Ｃ、５５６Ｆ、５５７Ｇ、６０１Ｍ、５９６Ｒ、５６３Ｌ、６０１Ｐ、７７３Ｒ、５５３Ｒ、５４２Ｍ、５９４Ｔ、５３３Ｌ、３２８Ｉ、５５５Ｋ、５４２Ｇ、５２８Ｑ、または４０３Ｒ／５５３Ｋを含み、アミノ酸位置は、配列番号８の参照配列と比べたものである。
【0187】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セットＮ５９９Ｓ、Ｋ５３０Ｇ、Ｓ５９６Ｌ、Ｒ６９６Ｈ、Ｒ５４２Ｗ、Ｋ５３０Ｒ、Ｑ５５３Ｆ、Ｔ５３３Ｖ、Ｒ５５５Ｍ、Ｓ５９４Ｖ、Ｓ５９４Ｗ、Ｓ５３６Ｒ、Ｑ５８５Ｋ、Ｓ４０１Ｇ、Ｄ５９７Ｅ、Ｑ５５３Ｋ、Ｎ４０２Ｒ、Ａ７６３Ｙ、Ａ７６２Ｖ、Ｉ６０５Ｅ、Ｋ５３０Ｐ、Ｒ５０６Ｐ、Ａ５８９Ｇ、Ａ５５８Ｓ、Ｑ５５３Ｎ、Ｋ５５９Ｐ、Ｅ７５１Ｈ、Ａ５８９Ｓ、Ｒ７４７Ｔ、Ｌ５６０Ｍ、Ｒ６９６Ｖ、Ｔ５４０Ｖ、Ｓ５９４Ｃ、Ｅ５５６Ｗ、Ａ５８９Ｒ、Ｓ４０７Ｗ、Ｌ５５７Ｈ、Ｋ５５９Ｇ、Ｎ５９９Ｔ、Ａ５２１Ｙ、Ｉ６０５Ａ、Ｋ５５９Ｄ、Ｓ５３４Ｈ、Ｒ５９２Ｇ、Ｔ５３３Ｐ、Ｇ５２９Ｓ、Ｒ５２４Ｇ、Ｖ７４９Ｒ、Ｖ７６６Ｙ、Ｅ５５６Ｐ、Ｓ５９５Ｐ、Ｔ５３３Ｑ、Ｉ６０３Ｖ、Ｖ５３７Ｇ、Ａ５８９Ｗ、Ｐ５９８Ｗ、Ｑ２２Ｋ／Ｓ４０７Ｒ、Ｒ５５５Ｗ、Ｅ５３９Ｒ、Ｒ５３１Ｑ、Ｔ５８１Ａ、Ｈ８０３Ｒ、Ｌ５３８Ａ、Ｑ４０４Ｔ、Ａ４０６Ｑ、Ｖ５３７Ｌ、Ｓ５９５Ｒ、Ｓ５３４Ｗ、Ｑ４０４Ｓ、Ｒ５９２Ｖ、Ａ５２１Ｗ、Ｉ６０３Ｇ、Ｓ４０１Ｉ、Ｓ５９５Ａ、Ａ７６２Ｑ、Ｋ５３０Ｗ、Ａ５５８Ｖ、Ｋ５２７Ｗ、Ｓ５９６Ｗ、Ｉ６０３Ｗ、Ｔ５２８Ｗ、Ｎ５０４Ｍ、Ｇ５８７Ｑ、Ｇ５８７Ｓ、Ｒ５２３Ｖ、Ａ５２１Ｇ、Ａ５５８Ｒ、Ａ５５８Ｑ、Ｌ５９３Ｎ、Ｔ５２５Ｖ、Ｖ７４９Ｌ、Ｌ５０３Ｖ、Ｋ５２７Ｖ、Ｙ５５４Ｅ、Ａ５３５Ｋ、Ｒ５９２Ｔ、Ｔ５２８Ａ、Ｑ５８５Ｒ、Ｓ４０１Ａ、Ｔ５８６Ｍ、Ｅ７６４Ｉ、Ｅ５５６Ｍ、Ａ７６３Ｇ、Ａ４０６Ｋ、Ｒ５８２Ｆ、Ｔ５４０Ｈ、Ｌ５６０Ｇ、Ｎ４０２Ｇ、Ｓ５９４Ｑ、Ｅ５３９Ｌ、Ｎ６０２Ｖ、Ｒ５２３Ａ、Ｖ７４９Ｔ、Ｒ５４２Ｔ、Ｅ７６４Ａ、Ｒ５２３Ｋ、Ｔ６０７Ｎ、Ｔ５２５Ｌ、Ｎ４０３Ｌ、Ａ５２６Ｔ、Ｔ５２８Ｒ、Ｎ５９９Ｇ、Ｖ５３７Ｗ、Ｈ８０３Ｃ、Ｅ５５６Ｆ、Ｌ５５７Ｇ、Ｑ６０１Ｍ、Ｓ５９６Ｒ、Ｔ５６３Ｌ、Ｑ６０１Ｐ、Ｑ７７３Ｒ、Ｑ５５３Ｒ、Ｒ５４２Ｍ、Ｓ５９４Ｔ、Ｔ５３３Ｌ、Ｖ３２８Ｉ、Ｒ５５５Ｋ、Ｒ５４２Ｇ、Ｔ５２８Ｑ、またはＮ４０３Ｒ／Ｑ５５３Ｋを含み、アミノ酸位置は、配列番号８の参照配列と比べたものである。
【0188】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３３２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号３３２に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号３３２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号３３２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0189】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置１５、２０、２１、５２、８５、８７、９１、１０２、２４３、３２１、３２２、３８４、４０４、４７６、４８０、４８０、４９５、５４２、５７０、６７１、６７５、７０４、７２８、７３５、７５３、７５５、７６２、７６４、７９３、８２０、１６／７３５、７５０／８４９、５２４／５８１、４０３／４０４／５２４／５４２／５５５／７６２／７６４、４０４／５２４／５４２／５８９／７６２／７６４、５２４／５４２／５８１／７６２／７６４、５４２／７６２／７６４に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３３２の参照配列と比べたものである。
【0190】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セット４０４Ｓ、５４２Ｇ、７６２Ｍ、５２４Ｑ／５４２Ｇ／５８１Ａ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、４０４Ｓ／５２４Ｑ／５４２Ｇ／５８９Ｌ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、７６４Ｖ、４０３Ｒ／４０４Ｓ／５２４Ｑ／５４２Ｇ／５５５Ｈ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、４７６Ｎ、５４２Ｇ／７６２Ｍ／７６４Ｖ、７２８Ｋ、５２Ｒ、４７６Ｉ、６７５Ｌ、７５０Ｓ／８４９Ｔ、１０２Ｓ、２１Ｃ、７５５Ｐ、２１Ｓ、３２１Ｇ、２０Ａ、２１Ｋ、８７Ｎ、２０Ｃ、１６Ｒ／７３５Ｌ、２１Ｑ、７０４Ｐ、７３５Ｇ、３８４Ｙ、４８０Ｗ、１０２Ｍ、７９３Ｇ、３２２Ｓ、３２２Ｎ、５７０Ｒ、４８０Ｖ、７５３Ｖ、７５３Ｋ、５２４Ｑ／５８１Ａ、９１Ｋ、２４３Ｌ、２４３Ｓ、６７１Ｅ、８５Ｓ、４９５Ｍ、１５Ａ、１５Ｎ、１５Ｋ、８２０Ａ、４９５Ｅ、８５Ｅ、８５Ｒ、４８０Ｅ、１５Ｇ、または６７１Ｒを含み、アミノ酸位置は、配列番号３３２の参照配列と比べたものである。
【0191】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セットＱ４０４Ｓ、Ｒ５４２Ｇ、Ａ７６２Ｍ、Ｒ５２４Ｑ／Ｒ５４２Ｇ／Ｔ５８１Ａ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｑ４０４Ｓ／Ｒ５２４Ｑ／Ｒ５４２Ｇ／Ａ５８９Ｌ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｅ７６４Ｖ、Ｎ４０３Ｒ／Ｑ４０４Ｓ／Ｒ５２４Ｑ／Ｒ５４２Ｇ／Ｒ５５５Ｈ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｌ４７６Ｎ、Ｒ５４２Ｇ／Ａ７６２Ｍ／Ｅ７６４Ｖ、Ｒ７２８Ｋ、Ｓ５２Ｒ、Ｌ４７６Ｉ、Ｐ６７５Ｌ、Ｐ７５０Ｓ／Ａ８４９Ｔ、Ｖ１０２Ｓ、Ｆ２１Ｃ、Ｋ７５５Ｐ、Ｆ２１Ｓ、Ｅ３２１Ｇ、Ｌ２０Ａ、Ｆ２１Ｋ、Ｐ８７Ｎ、Ｌ２０Ｃ、Ｑ１６Ｒ／Ｅ７３５Ｌ、Ｆ２１Ｑ、Ｄ７０４Ｐ、Ｅ７３５Ｇ、Ｒ３８４Ｙ、Ｑ４８０Ｗ、Ｖ１０２Ｍ、Ｐ７９３Ｇ、Ｒ３２２Ｓ、Ｒ３２２Ｎ、Ｋ５７０Ｒ、Ｑ４８０Ｖ、Ｌ７５３Ｖ、Ｌ７５３Ｋ、Ｒ５２４Ｑ／Ｔ５８１Ａ、Ｈ９１Ｋ、Ｐ２４３Ｌ、Ｐ２４３Ｓ、Ｖ６７１Ｅ、Ｐ８５Ｓ、Ｒ４９５Ｍ、Ｖ１５Ａ、Ｖ１５Ｎ、Ｖ１５Ｋ、Ｒ８２０Ａ、Ｒ４９５Ｅ、Ｐ８５Ｅ、Ｐ８５Ｒ、Ｑ４８０Ｅ、Ｖ１５Ｇ、またはＶ６７１Ｒを含み、アミノ酸位置は、配列番号３３２の参照配列と比べたものである。
【0192】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４６２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号４６２に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号４６２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号４６２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0193】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置７５０／８２０、２１／５２、２０／２１／８５／３２２／４７６／４９５、２０／８５／２００／３２２／４７６／４９５／７５０、４７６／７５０、２０／４７６、２０／３２２／３８６、８５／３２２／４７６、５２／３２２／４９８／７５０、２０／３２２／４７６／８２０、８５／４７６／４９５／８２０、２１／８５／３２２／８２０、２０／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／８２０、２０／３２２、２１／８２０／８４９、４７６、３２２／８２０、２１／３２２／３８６／８２０、３２２／３８６／４９５、８５／３８６／４９５／７５０、２０／８５／４７６／７５０、２０／３８６／４７６、８５／３２２／３８６／４７６／４９５、２０／４９５／８２０、７５０、２１／３２２／４９５、５２／３８６／４９５／８２０、２１／３２２、８５／３２２／７５０／８２０、２０／５２／８５、２１／５２／５７２、２０／８５／４９５／８４９、８５／７５０、２１／４９５／８２０、２７３／３２２／８４９、４９５、３２２／７５０／８２０、５２／４７６／４９５／５６６／７５０／８４９、３８６／４９５、４９５／８２０、２１／３２２／４９５／７５０／８２０、２１／８５／３２２／３８６／４９５／８２０／８４９、４７６／４９５／７５０、３８６／８４９、４７６／４９５、８５／４７６／８４９、２１／３２２／７５０、２０／８５／５６６／８２０、３８６／７５０／８４９またはそれらの組合せに少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号４６２の参照配列と比べたものである。
【0194】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セット７５０Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／５２Ｒ、２０Ｃ／２１Ｃ／８５Ｅ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ、２０Ｃ／８５Ｅ／２００Ｖ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｓ／７５０Ｓ、４７６Ｎ／７５０Ｓ、２０Ｃ／４７６Ｎ、２０Ｃ／３２２Ｎ／３８６Ｖ、８５Ｅ／３２２Ｎ／４７６Ｎ、５２Ｒ／３２２Ｎ／４９８Ｄ／７５０Ｓ、２０Ｃ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／８２０Ａ、８５Ｅ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／８２０Ａ、２１Ｃ／８５Ｅ／３２２Ｎ／８２０Ａ、２０Ｃ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／８２０Ａ、２０Ｃ／３２２Ｎ、２１Ｃ／８２０Ａ／８４９Ｔ、４７６Ｎ、３２２Ｎ／８２０Ａ、２１Ｃ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／８２０Ａ、３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ、８５Ｅ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／７５０Ｓ、２０Ｃ／８５Ｅ／４７６Ｎ／７５０Ｓ、２０Ｃ／３８６Ｖ／４７６Ｎ、８５Ｅ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｓ、２０Ｃ／４９５Ｅ／８２０Ａ、７５０Ｓ、２１Ｃ／３２２Ｎ／４９５Ｅ、５２Ｒ／３８６Ｖ／４９５Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／３２２Ｎ、８５Ｅ／３２２Ｎ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２０Ｃ／５２Ｒ／８５Ｅ、２１Ｃ／５２Ｒ／５７２Ｉ、２０Ｃ／８５Ｅ／４９５Ｅ／８４９Ｔ、８５Ｅ／７５０Ｓ、２１Ｃ／４９５Ｅ／８２０Ａ、２７３Ｍ／３２２Ｎ／８４９Ｔ、４９５Ｅ、３２２Ｎ／７５０Ｓ／８２０Ａ、５２Ｒ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／５６６Ａ／７５０Ｓ／８４９Ｔ、３８６Ｖ／４９５Ｅ、４９５Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／３２２Ｎ／４９５Ｅ／７５０Ｓ／８２０Ａ、２１Ｃ／８５Ｅ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｓ／８２０Ａ／８４９Ｔ、４９５Ｓ、４７６Ｎ／４９５Ｅ／７５０Ｓ、３８６Ｖ／８４９Ｔ、４７６Ｎ／４９５Ｅ、８５Ｅ／４７６Ｎ／８４９Ｔ、２１Ｃ／３２２Ｎ／７５０Ｓ、２０Ｃ／８５Ｅ／５６６Ａ／８２０Ａ、または３８６Ｖ／７５０Ｓ／８４９Ｔを含み、アミノ酸位置は、配列番号４６２の参照配列と比べたものである。
【0195】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セットＰ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ５２Ｒ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｌ２０Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ａ２００Ｖ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｓ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ４７６Ｎ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｌ４７６Ｎ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ、Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ、Ｓ５２Ｒ／Ｒ３２２Ｎ／Ｇ４９８Ｄ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｐ８５Ｅ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ３２２Ｎ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ８２０Ａ／Ａ８４９Ｔ、Ｌ４７６Ｎ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ８２０Ａ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ、Ｐ８５Ｅ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｌ４７６Ｎ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ、Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｓ５２Ｒ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ、Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ８５Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ５２Ｒ／Ｖ５７２Ｉ、Ｌ２０Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｒ４９５Ｅ／Ａ８４９Ｔ、Ｐ８５Ｅ／Ｐ７５０Ｓ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｖ２７３Ｍ／Ｒ３２２Ｎ／Ａ８４９Ｔ、Ｒ４９５Ｅ、Ｒ３２２Ｎ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｓ５２Ｒ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｄ５６６Ａ／Ｐ７５０Ｓ／Ａ８４９Ｔ、Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ、Ｒ４９５Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｐ７５０Ｓ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｓ／Ｒ８２０Ａ／Ａ８４９Ｔ、Ｒ４９５Ｓ、Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｐ７５０Ｓ、Ｒ３８６Ｖ／Ａ８４９Ｔ、Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｐ８５Ｅ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ８４９Ｔ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｐ７５０Ｓ、Ｌ２０Ｃ／Ｐ８５Ｅ／Ｄ５６６Ａ／Ｒ８２０Ａ、またはＲ３８６Ｖ／Ｐ７５０Ｓ／Ａ８４９Ｔを含み、アミノ酸位置は、配列番号４６２の参照配列と比べたものである。
【0196】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、配列番号６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号６０６に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0197】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、アミノ酸位置２９９／３８６／５６６／８２０、４７６／８２０／８４９、２１／３２２／４７６／４９５／８２０、１７７、２１／４９５、４７６／８２０、２０／５２／２９９、５２／２９９、３２２／８２０、２０／８２０、２０／２９９／３８６／４７６、３８６／４７６／８２０、４７６／４９５／８２０、３８６／４７６／４９５、２０／２１／２９９／３２２／３８６、３２２／３８６／４９５、２１／２９９／３２２／４７６／４９５／８２０、２１／２９９／３８６／８２０、２９９／４７６／８２０、２０／２１、２１／８５／１０２／７５０、７０５、２１／３８６／４７６／８２０、８２０、２１／２９９／３２２、２０／２１／３２２／３８６／８２０、２９９、２１／２９９／３８６／４７６、１０９、３２２／４９５、４９１、５２／８２０、２１／３８６／８２０、２０／２１／４９５、２１／２９９／３２２／４９５／５６６／８２０、２０／２１／２９９／４９５、７５６、３８６／８２０、４９５、５１１、２１／５２／２４２／３８６／４９５／８２０、２９９／４７６／４９５、７０６、２１／２９９／３８６／４７６／４９５、２１／２９９／３２２／４９５、２１／４７６／８４９、２９９／３２２／４７６／８２０、２１／５２／２９９／３２２／８２０、２０／２１／５６６、２０／５２、３２２／３８６／４９５／５６６／８２０、２１／２９９、２１／２９９／３８６、３８６／８４９、５２／４７６、５２／２９９／３２２／３８６／４９５、または４４０に少なくとも置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６０６の参照配列と比べたものである。
【0198】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セット２９９Ｎ／３８６Ｖ／５６６Ａ／８２０Ａ、４７６Ｎ／８２０Ａ／８４９Ｔ、２１Ｃ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／８２０Ａ、１７７Ｔ、２１Ｃ／４９５Ｅ、４７６Ｎ／８２０Ａ、２０Ｃ／５２Ｒ／２９９Ｎ、５２Ｒ／２９９Ｎ、３２２Ｎ／８２０Ａ、２０Ｃ／８２０Ａ、２０Ｃ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ、３８６Ｖ／４７６Ｎ／８２０Ａ、４７６Ｎ／４９５Ｅ／８２０Ａ、３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｅ、２０Ｃ／２１Ｃ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／３８６Ｖ、３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ／８２０Ａ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／８２０Ａ、２９９Ｎ／４７６Ｎ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ、２１Ｃ／８５Ｐ／１０２Ｖ／７５０Ｐ、７０５Ｗ、２１Ｃ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／８２０Ａ、８２０Ａ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３２２Ｎ、２０Ｃ／２１Ｃ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／８２０Ａ、２９９Ｎ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ、１０９Ｐ、３２２Ｎ／４９５Ｅ、４９１Ｇ、５２Ｒ／８２０Ａ、２１Ｃ／３８６Ｖ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ／４９５Ｅ、２１Ｃ／Ｔ９９Ｎ／３２２Ｎ／４９５Ｅ／５６６Ａ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ／２９９Ｎ／４９５Ｅ、７５６Ｔ、３８６Ｖ／８２０Ａ、４９５Ｅ、５１１Ｍ、２１Ｃ／５２Ｒ／２４２Ｑ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／８２０Ａ、２９９Ｎ／４７６Ｎ／４９５Ｅ、７０６Ｅ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３８６Ｖ／４７６Ｎ／４９５Ｅ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／４９５Ｅ、２１Ｃ／４７６Ｎ／８４９Ｔ、２９９Ｎ／３２２Ｎ／４７６Ｎ／８２０Ａ、２１Ｃ／５２Ｒ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／８２０Ａ、２０Ｃ／２１Ｃ／５６６Ａ、２０Ｃ／５２Ｒ、３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ／５６６Ａ／８２０Ａ、２１Ｃ／２９９Ｎ、２１Ｃ／２９９Ｎ／３８６Ｖ、３８６Ｖ／８４９Ｔ、５２Ｒ／４７６Ｎ、５２Ｒ／２９９Ｎ／３２２Ｎ／３８６Ｖ／４９５Ｅ、または４４０Ｇを含み、アミノ酸位置は、配列番号６０６の参照配列と比べたものである。
【0199】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、少なくとも置換または置換セットＴ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｄ５６６Ａ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ／Ａ８４９Ｔ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｒ１７７Ｔ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ４９５Ｅ、Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ５２Ｒ／Ｔ２９９Ｎ、Ｓ５２Ｒ／Ｔ２９９Ｎ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ、Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ８２０Ａ、Ｔ２９９Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ、Ｆ２１Ｃ／Ｅ８５Ｐ／Ｓ１０２Ｖ／Ｓ７５０Ｐ、Ｙ７０５Ｗ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ８２０Ａ、Ｔ２９９Ｎ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ、Ｋ１０９Ｐ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ａ４９１Ｇ、Ｓ５２Ｒ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｒ４９５Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ／Ｄ５６６Ａ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ａ７５６Ｔ、Ｒ３８６Ｖ／Ｒ８２０Ａ、Ｒ４９５Ｅ、Ｔ５１１Ｍ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ５２Ｒ／Ｐ２４２Ｑ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ｒ８２０Ａ、Ｔ２９９Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｇ７０６Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ４９５Ｅ、Ｆ２１Ｃ／Ｌ４７６Ｎ／Ａ８４９Ｔ、Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｌ４７６Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｓ５２Ｒ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ８２０Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｆ２１Ｃ／Ｄ５６６Ａ、Ｌ２０Ｃ／Ｓ５２Ｒ、Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ／Ｄ５６６Ａ／Ｒ８２０Ａ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ、Ｆ２１Ｃ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３８６Ｖ、Ｒ３８６Ｖ／Ａ８４９Ｔ、Ｓ５２Ｒ／Ｌ４７６Ｎ、Ｓ５２Ｒ／Ｔ２９９Ｎ／Ｒ３２２Ｎ／Ｒ３８６Ｖ／Ｒ４９５Ｅ、またはＥ４４０Ｇを含み、アミノ酸位置は、配列番号６０６の参照配列と比べたものである。
【0200】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に提供される少なくとも１個のアミノ酸位置における置換を含むポリペプチド配列を含み、置換は、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列と比べたものである。
【0201】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に提供される少なくとも１個の置換を含むポリペプチド配列を含み、置換は、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０を含む参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の参照配列と比べたものである。
【0202】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に提供される少なくとも置換または置換セットを含むポリペプチド配列を含み、置換または置換セットは、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０を含む参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の参照配列と比べたものである。
【0203】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される偶数番号の配列番号の残基１２～８５０に対応する参照配列または表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される偶数番号の配列番号の参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される偶数番号の配列番号の残基１２～８５０を含むポリペプチド配列または表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される偶数番号の配列番号を含むポリペプチド配列を含む。
【0204】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６５、５６４、５６６、５６８、５７０、５７２、５７４、５７６、５７８、５８０、５８２、５８４、５８６、５８８、５９０、５９２、５９４、５９６、５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７７６２、７６４、７６６、７６８、または７７０の残基１２～８５０に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【0205】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６５、５６４、５６６、５６８、５７０、５７２、５７４、５７６、５７８、５８０、５８２、５８４、５８６、５８８、５９０、５９２、５９４、５９６、５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７７６２、７６４、７６６、７６８、または７７０の残基１２～８５０を含むポリペプチド配列またはその断片を含み、ポリペプチドは、必要に応じて、ポリペプチド配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の置換を有する。
【0206】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６５、５６４、５６６、５６８、５７０、５７２、５７４、５７６、５７８、５８０、５８２、５８４、５８６、５８８、５９０、５９２、５９４、５９６、５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７７６２、７６４、７６６、７６８、または７７０に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を含むポリペプチド配列を含む。
【0207】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６５、５６４、５６６、５６８、５７０、５７２、５７４、５７６、５７８、５８０、５８２、５８４、５８６、５８８、５９０、５９２、５９４、５９６、５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７７６２、７６４、７６６、７６８、または７７０を含むポリペプチド配列またはその断片を含み、ポリペプチドは、必要に応じて、ポリペプチド配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の置換を有する。
【0208】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、ポリペプチド配列に１、２、３、４または最大５個の置換を有する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、ポリペプチド配列に１、２、３または４個の置換を有する。一部の実施形態では、置換は、非保存的または保存的置換を含む。一部の実施形態では、置換は、保存的置換を含む。一部の実施形態では、置換は、非保存的置換を含む。一部の実施形態では、非保存的および保存的置換に関するガイダンスは、実施例中を含む本明細書に開示されるバリアントによって提供される。
【0209】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２、８、３３２、４６２または６０６の残基１２～８５０を含むポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、必要に応じて、ポリペプチド配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の置換を有する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２、８、３３２、４６２または６０６を含むポリペプチド配列を含み、ポリペプチド配列は、必要に応じて、ポリペプチド配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の置換を有する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、ポリペプチド配列に１、２、３、４、最大５個の置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、ポリペプチド配列に１、２、３または４個の置換を含む。
【0210】
実施例および表を含む本明細書における記載が、特異的アミノ酸配列特色を、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの機能活性／特性と相関させる構造情報を提供することが明らかである。この構造－機能相関情報は、配列番号２、８、３３２、４６２または６０６の参照操作されたポリペプチドと比べた特異的アミノ酸残基差の形態で提供されると共に、例示的な操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドについての実験的に決定された活性データに関連付けられる。そのような情報は、操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントの調製において実行される置換に関するガイダンスおよび情報を提供する。
【0211】
一部の実施形態では、本開示の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、参照または比較対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも１種の改善された特性を有する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、参照または比較対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、増加した活性；増加したＤＮＡ産物収量；増加した熱安定性；増加した処理能力；増加した忠実度；増加したＤＮＡ鋳型感度、およびＰＣＲ反応における増加した産物収量から選択される改善された特性のうち１種または複数を有する。一部の実施形態では、参照または比較対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する配列を有する。一部の実施形態では、参照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２の残基１２～８５０に対応する配列または配列番号２に対応する配列を有する。一部の実施形態では、参照または比較対照ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１由来のＢ群ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される野生型ＤＮＡポリメラーゼである。
【0212】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、単離された組成物である。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、本明細書にさらに考察される通り、精製された組成物である。
【0213】
一部の実施形態では、本開示はさらに、本明細書に記載されている操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの機能性断片または生物活性断片を提供する。よって、操作されたＤＮＡポリメラーゼの本明細書におけるありとあらゆる実施形態について、操作されたＤＮＡポリメラーゼの機能性断片または生物活性断片が、本明細書により提供される。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼの機能性断片または生物活性断片は、それが由来したＤＮＡポリメラーゼポリペプチド（すなわち、親ＤＮＡポリメラーゼ）の活性の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を含む。
【0214】
一部の実施形態では、機能性断片または生物活性断片は、ＤＮＡポリメラーゼの親配列の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を含む。一部の実施形態では、機能性断片は、５個未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満および５０個未満のアミノ酸がトランケートされる。
【0215】
一部の実施形態では、本明細書における操作されたＤＮＡポリメラーゼの機能性断片は、操作されたＤＮＡポリメラーゼの親配列の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。一部の実施形態では、機能性断片は、５個未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、５０個未満、５５個未満、６０個未満、６５個未満または７０個未満のアミノ酸がトランケートされる。
【0216】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの機能性断片または生物活性断片は、本明細書に記載されている操作されたＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に少なくとも置換または置換セットを含む。したがって、一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼの機能性断片または生物活性断片は、親操作されたＤＮＡポリメラーゼにおける置換または置換セットに関連する増強または改善された特性を表示する。
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞
【0217】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されている操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御する１種または複数の異種調節配列に機能的に連結されて、ポリペプチドを発現することができるＤＮＡポリメラーゼを作り出す。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド（複数可）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、適切な宿主細胞に導入されて、対応するＤＮＡポリメラーゼポリペプチド（複数可）を発現する。
【0218】
当業者には明らかとなるが、タンパク質配列の利用能および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識は、対象ポリペプチドをコードすることができるあらゆるポリヌクレオチドの記載を提供する。同じアミノ酸が代替または同義的コドンによってコードされる、遺伝暗号の縮重は、その全てが本開示の操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする、極めて多数の核酸が作製されることを可能にする。よって、本開示は、可能なコドン選択に基づき組合せを選択することにより、本明細書に記載されている操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする、作製することができる操作されたＤＮＡポリメラーゼポリヌクレオチドのありとあらゆる可能な変形形態の産生のための方法および組成物を提供し、組換えポリヌクレオチドのそのような変形形態は全て、実施例に（例えば、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１）および配列表に提示されているアミノ酸配列を含む、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチドについて具体的に開示されていると考慮されるべきである。
【0219】
一部の実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質産生のための選ばれた宿主細胞による利用のために最適化される。例えば、細菌において使用される好まれるコドンは典型的に、細菌における発現のために使用され、哺乳動物細胞において使用される好まれるコドンは典型的に、哺乳動物細胞における発現のために使用される。結果的に、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、全長コーディング領域におけるコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％超に好まれるコドンを含有する。
【0220】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド酸配列（polypeptide acidsequence）を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、ポリペプチド配列は、配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２、８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0221】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列に対して少なくとも少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド酸配列（polypeptide acid sequence）を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、ポリペプチド配列は、本明細書に記載されている通り、配列番号２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0222】
上に記載される通り、一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置１５、１６、２０、２１、２２、４０、４１、５２、５７、５８、７３、８５、８７、８８、９１、１０２、１０９、１３２、１５７、１７７、１８６、２００、２１３、２１７、２３１、２３２、２４２、２４３、２６２、２６３、２６４、２６５、２７３、２９９、３２１、３２２、３２８、３８４、３８６、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、４４０、４７６、４８０、４９１、４９５、４９８、５０３、５０４、５０６、５０７、５０８、５１１、５１４、５２０、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６２、５６３、５６６、５７０、５７２、５８１、５８２、５８４、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６１６、６６５、６７１、６７４、６７５、６７７、６８４、６８８、６９６、７０４、７０５、７０６、７２８、７３５、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５３、７５５、７５６、７６２、７６３、７６４、７６６、７７２、７７３、７７９、７９３、８０３、８１４、８２０、または８４９またはそれらの組合せに少なくとも置換を含むポリペプチド酸配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0223】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置４０、８５、１０２、１３２、１５７、１７７、２６２、２６３、５０３、５２１、７４８、または７５０またはそれらの組合せに少なくとも置換を含むポリペプチド酸配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードし、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0224】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置２１３／５０３／５０８／５８４／７４８、４０／１３２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８、１３２、４０／１３２／５０３／７４８、４０／１３２／１５７／５０３／５６２、４０／１３２／２１３／７４８／８１４、１３２／１５７／５６２／５８４、１３２／５８４／７４８、４０／１３２／Ｄ２３１Ｅ／Ｉ６８４Ｖ／Ｈ７４８Ｙ、４０／１３２、４０／４１／１３２／５６２／６８４／７４８、４１／２１３／２３１／５０３／６５０／６７４／７４８、１３２／２３１／５０３／７４８、４０／１３２Ｙ／Ｓ１５７Ｇ／Ｌ５０３Ｉ、５０３／７４８／８１４、４０／１３２／２３１／５０３／６７４／７４８、４０／８８／１３２／５０３／６８４／７４８、１３２／１５７／２１３／６７４／７４８／８１４、１５７／２６３／７４８、４０／７４８、４１／１５７／２３１／２６２／７４８／８１４、４０／２１３／５０３／５６２／５８４／７４８、５２３／５２４、４０／１３２／５０３／５１４／６５０／６７４、４０／１３２／１５７／２１３／２３１、４１／２１３／５２０／８１４、４０／４１／１５７／２３１／５０３、４０／１５７／５０３、４０／１３２／５６２／７４８、１３２／７４８、４０／４１／１３２／５６２／７４８、８８／２１３／５０３／５８４／６８４／７４８、５７／５８／５２３／６１６／６７７、４０／２１３／２３１／５０３／５１４／５６２／７４８、１３２／５６２、２１３／５０３／６５０、４０／４１／８８／２３１／７４８／８１４、４１／２１３／２６２／５６２、４１／８８／２３１／７４８、２１３／２６３／７４８、４０／１５７／２１３、１５７／５２０、４０／１３２／２６３／５０３／６７４／８１４、４０／４１、５２４／６６５／７５６、５８／１８６／２１７／５２３／５２４／６７７、４０／４１／７４８、１３２／５１４、５２０、４１／２１３／５０３／５６２、２３１／５０３／７４８／７７２、５０３／５６２、７３／２３２／５１４／５８４／８１４、５８／５０７／６１６、１３２／２６２／５２０／５６２／６８４／７４８、８８／５６２／８１４、４１／８８／１５７／８１４、８８／１５７／２１３／６７４／６８４、５７／５８／５２３／７７９、４０／１３２／１５７／５１４／５２０／６８４、４０／４１／２１３／６８４／７７２、４０／４１／２３１／５０３／８１４、８８／２１３／５０３／５８４／８１４、４０／４１／１３２／５６２／５８４、４１／８８／２１３／２３１／５０３／６５０／７４８、４０／５０３、４０／１３２／２１３／２３１／５２０／５６２／６５０／８１４、４０／４１／１３２／２３１／２６２／５０３／５６２／５８４／７４８／８１４、５７／５８／２６４／２６５／５２４／６８８、８８／１３２／１５７／２６２／２６３／５２０／５６２、８８／１３２／１５７／２６２／５０３／５１４／５６２／６５０、４０／５８４／６７４／７４８、４０／４１／１３２／２６３／５０３、５８４／７４８、４０／２１３／６７４、４０／４１／８８Ｔ／１３２／５０３／５６２／５８４／７４８、８８／２１３／５１４／５６２／７４８／８１４、２６３／５２０／８１４、または４０／４１／８８／１５７に少なくとも置換または置換セットを含むポリペプチド酸配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードし、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0225】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置２２／４０７、３２８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、５０３、５０４、５０６、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６３、５８１、５８２、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９２、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６９６、７４７、７４９、７５１、７６２、７６３、７６４、７６６、７７３、８０３またはそれらの組合せに少なくとも置換または置換セットを含むポリペプチド酸配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードし、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0226】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置１５、２０、２１、５２、８５、８７、９１、１０２、２４３、３２１、３２２、３８４、４０４、４７６、４８０、４８０、４９５、５４２、５７０、６７１、６７５、７０４、７２８、７３５、７５３、７５５、７６２、７６４、７９３、８２０、１６／７３５、７５０／８４９、５２４／５８１、４０３／４０４／５２４／５４２／５５５／７６２／７６４、４０４／５２４／５４２／５８９／７６２／７６４、５２４／５４２／５８１／７６２／７６４、または５４２／７６２／７６４に少なくとも置換または置換セットを含むポリペプチド酸配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードし、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0227】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置７５０／８２０、２１／５２、２０／２１／８５／３２２／４７６／４９５、２０／８５／２００／３２２／４７６／４９５／７５０、４７６／７５０、２０Ｃ／４７６、２０／３２２／３８６、８５／３２２／４７６、５２／３２２／４９８／７５０、２０／３２２／４７６／８２０、８５／４７６／４９５／８２０、２１／８５／３２２／８２０、２０／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／８２０、２０／３２２、２１／８２０／８４９、４７６、３２２／８２０、２１／３２２／３８６／８２０、３２２／３８６／４９５、８５／３８６／４９５／７５０、２０／８５／４７６／７５０、２０／３８６／４７６、８５／３２２／３８６／４７６／４９５、２０／４９５／８２０、７５０、２１／３２２／４９５、５２／３８６／４９５／８２０、２１／３２２、８５／３２２／７５０／８２０、２０／５２／８５、２１／５２／５７２、２０／８５／４９５／８４９、８５／７５０、２１／４９５／８２０、２７３／３２２／８４９、４９５、３２２／７５０／８２０、５２／４７６／４９５／５６６／７５０／８４９、３８６／４９５、４９５／８２０、２１／３２２／４９５／７５０／８２０、２１／８５／３２２／３８６／４９５／８２０／８４９、４７６／４９５／７５０、３８６／８４９、４７６／４９５、８５／４７６／８４９、２１／３２２／７５０、２０／８５／５６６／８２０、３８６／７５０／８４９またはそれらの組合せに少なくとも置換または置換セットを含むポリペプチド酸配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードし、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0228】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置２９９／３８６／５６６／８２０、４７６／８２０／８４９、２１／３２２／４７６／４９５／８２０、１７７、２１／４９５、４７６／８２０、２０／５２／２９９、５２／２９９、３２２／８２０、２０／８２０、２０／２９９／３８６／４７６、３８６／４７６／８２０、４７６／４９５／８２０、３８６／４７６／４９５、２０／２１／２９９／３２２／３８６、３２２／３８６／４９５、２１／２９９／３２２／４７６／４９５／８２０、２１／２９９／３８６／８２０、２９９／４７６／８２０、２０／２１、２１／８５／１０２／７５０、７０５、２１／３８６／４７６／８２０、８２０、２１／２９９／３２２、２０／２１／３２２／３８６／８２０、２９９、２１／２９９／３８６／４７６、１０９、３２２／４９５、４９１、５２／８２０、２１／３８６／８２０、２０／２１／４９５、２１／２９９／３２２／４９５／５６６／８２０、２０／２１／２９９／４９５、７５６、３８６／８２０、４９５、５１１、２１／５２／２４２／３８６／４９５／８２０、２９９／４７６／４９５、７０６、２１／２９９／３８６／４７６／４９５、２１／２９９／３２２／４９５、２１／４７６／８４９、２９９／３２２／４７６／８２０、２１／５２／２９９／３２２／８２０、２０／２１／５６６、２０／５２、３２２／３８６／４９５／５６６／８２０、２１／２９９、２１／２９９／３８６、３８６／８４９、５２／４７６、５２／２９９／３２２／３８６／４９５、または４４０に少なくとも置換または置換セットを含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードし、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0229】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置２２／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５０６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５３９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５５９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５６０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５８９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９８／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５９９／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０２／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６０７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／６９６／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４７／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７４９、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７５１、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６２、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７６６、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／７７３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／７４８／８０３、４０／１３２／１５７／６０５／２６２／２６３／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／５２１／７４８、または４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／５５３／７４８に置換または置換セットを含む操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードし、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0230】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０３／４０４／５２１／５２４／５４２／５５５／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／５２１／５２４／５４２／５８９／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５２４／５４２／５８１／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５４２／７４８／７６２／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４０４／５２１／５４２／７４８／７６２、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５２４／５８１／７４８、１６／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／８２０、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７９３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７６４、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５５、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５３、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７３５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７２８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０４／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／６７５／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／６７１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５７０／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４８０／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３８４／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２６２／２６３／３２１／５２１／７４８、４０／１３２／１５７／２４３／２６２／２６３／５２１／７４８、１５／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／９１／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８７／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８５／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２０／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２１／４０／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、または４０／５２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８に置換または置換セットを含む操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードし、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0231】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／８４９、２０／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５７２／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／８４９、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／８２０／８４９、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２７３／３２２／５２１／７４８／８４９、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８４９、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／８４９、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５６６／７４８／８２０、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９８／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８／８２０、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８／８２０、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４７６／４９５Ｓ／５２１／７４８、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８、２０／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８、４０／５２／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８４９、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２００／２６３／３２２／４７６／４９５Ｓ／５２１／７４８／７５０、または２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／８２０／８４９に置換または置換セットを含む操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードし、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0232】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０／８４９、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／１７７／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、５２／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／５２１／７４８Ｙ／７５０Ｓ／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、２１／４０／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０５／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／５２１／７４８／７５０、２０／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１０９／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９１／５２１／７４８／７５０、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０／７５６、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５１１／５２１／７４８／７５０、２１／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２４２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０／８２０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７０６／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／４７６／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４９５／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／４７６／５２１／７４８／７５０／８２０、２１／４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／５２１／７４８／７５０／８２０、２０／２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／５６６／７４８／７５０、２０／４０／５２／／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３２２／３８６／４９５／５２１／５６６／７４８／７５０／８２０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／５２１／７４８／７５０、２１／４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３８６／５２１／７４８／７５０、４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／３８６／５２１／７４８／７５０／８４９、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４７６／５２１／７４８／７５０、４０／５２／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／２９９／３２２／３８６／４９５／５２１／７４８／７５０、または４０／８５／１０２／１３２／１５７／２６２／２６３／４４０／５２１／７４８／７５０に置換または置換セットを含む操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードし、アミノ酸位置は、配列番号２の参照配列と比べたものである。
【0233】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。
【0234】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、ポリペプチド配列は、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0235】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、ポリペプチド配列は、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含むが、ただし、ポリペプチド配列が、配列番号２の残基１２～８５０を含む配列を含まないことを条件とする。
【0236】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置１５、１６、２０、２１、２２、４０、４１、５２、５７、５８、７３、８５、８７、８８、９１、１０２、１０９、１３２、１５７、１７７、１８６、２００、２１３、２１７、２３１、２３２、２４２、２４３、２６２、２６３、２６４、２６５、２７３、２９９、３２１、３２２、３２８、３８４、３８６、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、４４０、４７６、４８０、４９１、４９５、４９８、５０３、５０４、５０６、５０７、５０８、５１１、５１４、５２０、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６２、５６３、５６６、５７０、５７２、５８１、５８２、５８４、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６１６、６６５、６７１、６７４、６７５、６７７、６８４、６８８、６９６、７０４、７０５、７０６、７２８、７３５、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５３、７５５、７５６、７６２、７６３、７６４、７６６、７７２、７７３、７７９、７９３、８０３、８１４、８２０、または８４９またはそれらの組合せに少なくとも置換を含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、アミノ酸位置は、配列番号８、３３２、４６２または６０６の参照配列と比べたものである。
【0237】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置４０、８５、１０２、１３２、１５７、１７７、２６２、２６３、５２１、７４８もしくは７５０またはそれらの組合せに少なくとも置換を含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。
【0238】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、ポリペプチド配列は、配列番号８の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号８に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0239】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置２２／４０７、３２８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０６、４０７、５０３、５０４、５０６、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６３、５８１、５８２、５８５、５８６、５８７、５８９、５９２、５９２、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０１、６０２、６０３、６０５、６０７、６９６、７４７、７４９、７５１、７６２、７６３、７６４、７６６、７７３、８０３、または４０３／５５３に少なくとも置換または置換セットを含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、アミノ酸位置は、配列番号８の参照配列と比べたものである。
【0240】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号３３２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号３３２に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、ポリペプチド配列は、配列番号３３２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号３３２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0241】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置１５、２０、２１、５２、８５、８７、９１、１０２、２４３、３２１、３２２、３８４、４０４、４７６、４８０、４８０、４９５、５４２、５７０、６７１、６７５、７０４、７２８、７３５、７５３、７５５、７６２、７６４、７９３、８２０、１６／７３５、７５０／８４９、５２４／５８１、４０３／４０４／５２４／５４２／５５５／７６２／７６４、４０４／５２４／５４２／５８９／７６２／７６４、５２４／５４２／５８１／７６２／７６４、または５４２／７６２／７６４に少なくとも置換または置換セットを含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、アミノ酸位置は、配列番号３３２の参照配列と比べたものである。
【0242】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号４６２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号４６２に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、ポリペプチド配列は、配列番号４６２の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号４６２に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0243】
一部の実施形態では（ｎ ｓｏｍｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置７５０／８２０、２１／５２、２０／２１／８５／３２２／４７６／４９５、２０／８５／２００／３２２／４７６／４９５／７５０、４７６／７５０、２０／４７６、２０／３２２／３８６、８５／３２２／４７６、５２／３２２／４９８／７５０、２０／３２２／４７６／８２０、８５／４７６／４９５／８２０、２１／８５／３２２／８２０、２０／２９９／３２２／３８６／４７６／４９５／８２０、２０／３２２、２１／８２０／８４９、４７６、３２２／８２０、２１／３２２／３８６／８２０、３２２／３８６／４９５、８５／３８６／４９５／７５０、２０／８５／４７６／７５０、２０／３８６／４７６、８５／３２２／３８６／４７６／４９５、２０／４９５／８２０、７５０、２１／３２２／４９５、５２／３８６／４９５／８２０、２１／３２２、８５／３２２／７５０／８２０、２０／５２／８５、２１／５２／５７２、２０／８５／４９５／８４９、８５／７５０、２１／４９５／８２０、２７３／３２２／８４９、４９５、３２２／７５０／８２０、５２／４７６／４９５／５６６／７５０／８４９、３８６／４９５、４９５／８２０、２１／３２２／４９５／７５０／８２０、２１／８５／３２２／３８６／４９５／８２０／８４９、４７６／４９５／７５０、３８６／８４９、４７６／４９５、８５／４７６／８４９、２１／３２２／７５０、２０／８５／５６６／８２０、または３８６／７５０／８４９に少なくとも置換または置換セットを含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、アミノ酸位置は、配列番号４６２の参照配列と比べたものである。
【0244】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号６０６に対応する参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、ポリペプチド配列は、配列番号６０６の残基１２～８５０に対応する参照配列または配列番号６０６に対応する参照配列と比べて１個または複数の置換を含む。
【0245】
組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置２９９／３８６／５６６／８２０、４７６／８２０／８４９、２１／３２２／４７６／４９５／８２０、１７７、２１／４９５、４７６／８２０、２０／５２／２９９、５２／２９９、３２２／８２０、２０／８２０、２０／２９９／３８６／４７６、３８６／４７６／８２０、４７６／４９５／８２０、３８６／４７６／４９５、２０／２１／２９９／３２２／３８６、３２２／３８６／４９５、２１／２９９／３２２／４７６／４９５／８２０、２１／２９９／３８６／８２０、２９９／４７６／８２０、２０／２１、２１／８５／１０２／７５０、７０５、２１／３８６／４７６／８２０、８２０、２１／２９９／３２２、２０／２１／３２２／３８６／８２０、２９９、２１／２９９／３８６／４７６、１０９、３２２／４９５、４９１、５２／８２０、２１／３８６／８２０、２０／２１／４９５、２１／２９９／３２２／４９５／５６６／８２０、２０／２１／２９９／４９５、７５６、３８６／８２０、４９５、５１１、２１／５２／２４２／３８６／４９５／８２０、２９９／４７６／４９５、７０６、２１／２９９／３８６／４７６／４９５、２１／２９９／３２２／４９５、２１／４７６／８４９、２９９／３２２／４７６／８２０、２１／５２／２９９／３２２／８２０、２０／２１／５６６、２０／５２、３２２／３８６／４９５／５６６／８２０、２１／２９９、２１／２９９／３８６、３８６／８４９、５２／４７６、５２／２９９／３２２／３８６／４９５、４４０またはそれらの組合せに少なくとも置換または置換セットを含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、アミノ酸位置は、配列番号６０６の参照配列と比べたものである。
【0246】
一部の実施形態では、前述実施形態のそれぞれについて、置換または置換セットのための本明細書に記載されている特異的アミノ酸置換は、コードされた逆転写酵素ポリペプチドのために使用することができる。
【0247】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に提供される少なくとも１個のアミノ酸位置に少なくとも置換を含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、置換は、配列番号２、８、３３２、４６２または６０６と比べたものである。
【0248】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に提供される少なくとも１個の置換を含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、置換は、配列番号２、８、３３２、４６２または６０６と比べたものである。
【0249】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、バリアント毎に表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に提供される少なくとも置換または置換セットを含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、置換または置換セットは、配列番号２、８、３３２、４６２または６０６と比べたものである。
【0250】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される偶数番号の配列番号の残基１２～８５０を含む配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される偶数番号の配列番号の配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される偶数番号の配列番号の残基１２～８５０を含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示される偶数番号の配列番号を含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。
【0251】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６５、５６４、５６６、５６８、５７０、５７２、５７４、５７６、５７８、５８０、５８２、５８４、５８６、５８８、５９０、５９２、５９４、５９６、５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６６、７６８、または７７０の残基１２～８５０を含むポリペプチド配列、またはその断片を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、ポリペプチド配列は、必要に応じて、ポリペプチド配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の置換を有する。
【0252】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６５、５６４、５６６、５６８、５７０、５７２、５７４、５７６、５７８、５８０、５８２、５８４、５８６、５８８、５９０、５９２、５９４、５９６、５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２、７３４、７３６、７３８、７４０、７４２、７４４、７４６、７４８、７５０、７５２、７５４、７５６、７５８、７６０、７６２、７６４、７６６、７６８、または７７０を含むポリペプチド配列、またはその断片を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードし、ポリペプチド配列は、必要に応じて、ポリペプチド配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の置換を有する。
【0253】
一部の実施形態では、コードされる操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、ポリペプチド配列に１、２、３、４、最大５個の置換を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、ポリペプチド配列に１、２、３または４個の置換を含む。一部の実施形態では、置換は、非保存的または保存的置換を含む。一部の実施形態では、置換は、保存的置換を含む。一部の実施形態では、置換は、非保存的置換を含む。一部の実施形態では、非保存的および保存的置換に関するガイダンスは、本明細書に開示されるバリアントによって提供される。
【0254】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６の残基１２～８５０を含むポリペプチド配列または配列番号８、３３２、４６２もしくは６０６を含むポリペプチド配列を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードし、ポリペプチド配列は、必要に応じて、ポリペプチド配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の置換を有する。一部の実施形態では、コードされるＤＮＡポリメラーゼは、ポリペプチド配列に１、２、３、４、最大５個の置換を含む。一部の実施形態では、コードされるＤＮＡポリメラーゼは、ポリペプチド配列に１、２、３または４個の置換を含む。
【0255】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド残基３４～２５５０を含む参照ポリヌクレオチド配列または配列番号１の参照ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、組換えポリヌクレオチドは、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片をコードし、操作されたＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列は、配列番号２の残基１２～８５０を含む参照配列または配列番号２の参照配列と比べて、１個または複数のアミノ酸位置に１個または複数の置換を含む。
【0256】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号７、３３１、４６１もしくは６０５のヌクレオチド残基３４～２５５０を含む参照ポリヌクレオチド配列または配列番号７、３３１、４６１もしくは６０５の参照ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、組換えポリヌクレオチドは、操作されたＤＮＡポリメラーゼまたはその機能性断片をコードする。
【0257】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、４８９、４９１、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、５１１、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５２３、５２５、５２７、５２９、５３１、５３３、５３５、５３７、５３９、５４１、５４３、５４５、５４７、５４９、５５１、５５３、５５５、５５７、５５９、５６１、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３、５７５、５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９、５９１、５９３、５９５、５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５６、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、または７６９のヌクレオチド残基３４～２５５０に対応するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、本明細書に記載されている通り、ポリヌクレオチドは、操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。
【0258】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、４８９、４９１、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、５１１、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５２３、５２５、５２７、５２９、５３１、５３３、５３５、５３７、５３９、５４１、５４３、５４５、５４７、５４９、５５１、５５３、５５５、５５７、５５９、５６１、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３、５７５、５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９、５９１、５９３、５９５、５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５６、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、または７６９のヌクレオチド残基３４～２５５０を含むポリヌクレオチド配列を含む。
【0259】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、４８９、４９１、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、５１１、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５２３、５２５、５２７、５２９、５３１、５３３、５３５、５３７、５３９、５４１、５４３、５４５、５４７、５４９、５５１、５５３、５５５、５５７、５５９、５６１、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３、５７５、５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９、５９１、５９３、５９５、５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５６、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、または７６９に対応するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、組換えポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている通り、操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。
【0260】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、４８９、４９１、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、５１１、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５２３、５２５、５２７、５２９、５３１、５３３、５３５、５３７、５３９、５４１、５４３、５４５、５４７、５４９、５５１、５５３、５５５、５５７、５５９、５６１、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３、５７５、５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９、５９１、５９３、５９５、５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５６、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５、６８７、６８９、６９１、６９３、６９５、６９７、６９９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１１、７１３、７１５、７１７、７１９、７２１、７２３、７２５、７２７、７２９、７３１、７３３、７３５、７３７、７３９、７４１、７４３、７４５、７４７、７４９、７５１、７５３、７５５、７５７、７５９、７６１、７６３、７６５、７６７、または７６９を含む配列を含む。
【0261】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼをコードし、高度にストリンジェントな条件下で、操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする本明細書に記載されている参照ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号１、７、３３１、４６１もしくは６０５の残基残基３４～２５５０に、または配列番号１、７、３３１、４６１もしくは６０５に対応する配列に、またはそれらの相補体に、または本明細書に提供される他の操作されたＤＮＡポリメラーゼのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列に対応する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼをコードし、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１～７６９の奇数番号の配列（seqeunce）の残基３４～２５５０に対応する配列を含む参照ポリヌクレオチドまたは配列番号１～７６９の奇数番号の配列に対応する配列を含む参照ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。
【0262】
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に示されるいずれかの位置から選択される残基位置に、配列番号２，８、３３２、４６２または６０６と比較して１個または複数の残基差を有するアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼをコードする。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号１、７、３３１、４６１もしくは６０５の残基３４～２５５０に対応する参照配列または配列番号１、７、３３１、４６１もしくは６０５に対応する参照配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。一部の追加の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に提供されるポリヌクレオチド配列の残基３４～２５５０に対応するまたは表４．１、５．１、６．１、７．１および８．１に提供されるポリヌクレオチド配列に対応する少なくとも１種のポリヌクレオチド参照配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多い配列同一性を有する配列を含む。
【0263】
一部の実施形態では、本明細書における操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの発現を容易にする種々の仕方で操作される。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するための１種または複数の制御配列が存在する、発現ベクターを含む。ベクターへのその挿入に先立つ単離されたポリヌクレオチドの操作は、利用される発現ベクターに応じて望ましいかまたは必要となる場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾するための技法は、当技術分野で周知である。
【0264】
一部の実施形態では、制御配列は、とりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターを含む。一部の実施形態では、適したプロモーターは、宿主細胞選択に基づき選択される。細菌宿主細胞のため、本開示の核酸構築物の転写を方向付けるのに適したプロモーターは、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ（agarase）遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成（maltogenic）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子ならびに原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1978, 75:3727-3731を参照）から得られるプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1983, 80: 21-25を参照）を含むがこれらに限定されない。糸状真菌宿主細胞のための例示的なプロモーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ（acetamidase）およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター（例えば、ＷＯ９６／００７８７を参照）ならびにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにこれらの変異体、トランケートおよびハイブリッドプロモーターを含むがこれらに限定されない。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来することができる（can be from the genes can be from the genes）。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、当技術分野で公知である（例えば、Romanos et al., Yeast, 1992, 8:423-488を参照）。
【0265】
一部の実施形態では、制御配列は、適した転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終結するために宿主細胞によって認識される配列）でもある。一部の実施形態では、ターミネーター配列は、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選ばれた宿主細胞において機能的であるいずれか適したターミネーターは、本発明における用途を見出す。細菌発現のため、転写ターミネーターは、Ｒｈｏ転写因子に頼るＲｈｏ依存性ターミネーター、または転写因子を要求しないＲｈｏ非依存性もしくは内因性ターミネーターであり得る。例示的な細菌転写ターミネーターは、Peters et al., J Mol Biol., 2011, 412(5):793-813に記載されている。糸状真菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当技術分野で公知である（例えば、Romanos et al.、上記を参照）。
【0266】
一部の実施形態では、制御配列は、適したリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）でもある。一部の実施形態では、リーダー配列は、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選ばれた宿主細胞において機能的であるいずれか適したリーダー配列は、本発明における用途を見出す。糸状真菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適したリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【0267】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結されており、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される、配列）でもある。選ばれた宿主細胞において機能的であるいずれか適したポリアデニル化配列は、本発明における用途を見出す。糸状真菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼの遺伝子を含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、公知である（例えば、Guo and Sherman, Mol. Cell. Biol., 1995, 15:5983-5990を参照）。
【0268】
一部の実施形態では、制御配列は、ｍＲＮＡ輸送および翻訳ならびにｍＲＮＡ半減期に関与するタンパク質への結合を媒介する、タンパク質コーディング核酸配列の３’末端に作動可能に連結される配列である、３’非翻訳核酸領域およびポリアデニル化テイル核酸配列を含む。選ばれた宿主細胞において機能的であるいずれかのポリアデニル化配列および３’ＵＴＲを本発明において使用することができる。糸状真菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼの遺伝子に由来するものを含むがこれらに限定されない。
【0269】
一部の実施形態では、制御配列は、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路へと方向付ける、コーディング領域）でもある。一部の実施形態では、核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコーディング領域のセグメントと翻訳読み枠内で天然に連結されたシグナルペプチドコーディング領域を固有に含有する。その代わりに、一部の実施形態では、コード配列の５’末端は、コード配列にとって外来性であるシグナルペプチドコーディング領域を含有する。選ばれた宿主細胞の分泌経路へと発現されたポリペプチドを方向付けるいずれか適したシグナルペプチドコーディング領域は、操作されたポリペプチド（複数可）の発現のための用途を見出す。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得られるものを含むがこれらに限定されないシグナルペプチドコーディング領域である。さらに別のシグナルペプチドは、当技術分野で公知である（例えば、Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 1993, 57:109-137を参照）。一部の実施形態では、糸状真菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域を含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子に由来するものを含むがこれらに限定されない。
【0270】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコーディング領域でもある。結果として生じるポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「チモーゲン」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコーディング領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子を含むがこれらに限定されないいずれか適した供給源から得ることができる（例えば、ＷＯ９５／３３８３６を参照）。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
【0271】
一部の実施形態では、調節配列も利用される。このような配列は、宿主細胞の成長と比べたポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節性化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をオンまたはオフにさせる系である。原核生物宿主細胞において、適した調節配列は、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系を含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞において、適した調節系は、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を含むがこれらに限定されない。糸状真菌において、適した調節配列は、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターを含むがこれらに限定されない。
【0272】
別の態様では、本開示は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、それが導入されることになる宿主の型に応じて、１個または複数の発現調節領域、例えば、プロモーターおよびターミネーター、複製起点等とを含む、組換え発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている様々な核酸および制御配列は、一緒に接合されて（すなわち、作動可能に連結）、１個または複数の簡便な制限部位を含む組換え発現ベクターを産生して、そのような部位におけるＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする。その代わりに、一部の実施形態では、本発明の核酸配列は、発現のための適切なベクターに核酸配列またはこの配列を含む核酸構築物を挿入することにより発現される。発現ベクターの創製が関与する一部の実施形態では、コード配列は、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、ベクター内に配置される。
【0273】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され、ＤＮＡポリメラーゼポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、いずれか適したベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は典型的に、ベクターが導入されることになる宿主細胞とベクターとの適合性に依存する。ベクターは、直鎖状または閉環状プラスミドであり得る。
【0274】
一部の実施形態では、発現ベクターは、自律的に複製するベクター（すなわち、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体等、その複製が染色体の複製に依存しない染色体外の実体として存在するベクター）である。ベクターは、自己複製を保証するためのいずれかの手段を含有することができる。一部の代替実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるベクターである。さらに、一部の実施形態では、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入されるべき総ＤＮＡを合わせて含有する２種もしくはそれよりも多いベクターもしくはプラスミド、および／またはトランスポゾンが利用される。
【0275】
一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１個または複数の選択可能マーカーを含有する。「選択可能マーカー」は、その産物が殺生物剤またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、原栄養性から栄養要求株へなどを提供する、遺伝子である。細菌選択可能マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン抵抗性等の抗生物質抵抗性を付与するマーカーを含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための適したマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３を含むがこれらに限定されない。糸状真菌宿主細胞における使用のための選択可能マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ． ｏｒｚｙａｅに由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ． ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓに由来）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ． ｏｒｚｙａｅに由来）、ｓＣ（硫酸アデニリルトランスフェラーゼ（adenyltransferase））およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物を含むがこれらに限定されない。
【0276】
別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドであって、宿主細胞における操作されたＤＮＡポリメラーゼの酵素（複数可）の発現のための１個または複数の制御配列に機能的に連結されているポリヌクレオチド（複数可）を含む宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現における使用に適した宿主細胞は、当技術分野で周知であり、細菌細胞、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞を含むがこれらに限定されない。例示的な宿主細胞は、様々なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）も含む。
【0277】
したがって、別の態様では、本開示は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの発現に適した条件下で、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されているＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを単離および／または精製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉまたはＢ ｓｕｂｔｉｌｉｓである。
【0278】
宿主細胞のための適切な培養培地および成長条件は、当技術分野で周知である。ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドを細胞に導入するためのいずれか適した方法が、本発明における用途を見出すことが企図される。適した技法は、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合を含むがこれらに限定されない。
【0279】
本明細書に開示される特性を有する操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、天然に存在するまたは操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載されているいずれか適した変異誘発および／または指向性進化方法に供することにより得ることができる。例示的な指向性進化技法は、変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリング（例えば、Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91:10747-10751；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号を参照）である。使用することができる他の指向性進化手順は、とりわけ、スタガード（staggered）伸長プロセス（StEP）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Zhao et al., Nat. Biotechnol., 1998, 16:258-261を参照）、変異原性ＰＣＲ（例えば、Caldwell et al., PCR Methods Appl., 1994, 3:S136-S140を参照）およびカセット変異誘発（例えば、Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93:3525-3529を参照）を含む。
【0280】
例えば、変異誘発および指向性進化方法を、ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドに容易に適用して、発現、スクリーニングおよびアッセイすることができるバリアントライブラリーを生成することができる。いずれか適した変異誘発および指向性進化方法は、本発明における用途を見出し、当技術分野で周知である（例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６０５，７９３、５，８１１，２３８、５，８３０，７２１、５，８３４，２５２、５，８３７，４５８、５，９２８，９０５、６，０９６，５４８、６，１１７，６７９、６，１３２，９７０、６，１６５，７９３、６，１８０，４０６、６，２５１，６７４、６，２６５，２０１、６，２７７，６３８、６，２８７，８６１、６，２８７，８６２、６，２９１，２４２、６，２９７，０５３、６，３０３，３４４、６，３０９，８８３、６，３１９，７１３、６，３１９，７１４、６，３２３，０３０、６，３２６，２０４、６，３３５，１６０、６，３３５，１９８、６，３４４，３５６、６，３５２，８５９、６，３５５，４８４、６，３５８，７４０、６，３５８，７４２、６，３６５，３７７、６，３６５，４０８、６，３６８，８６１、６，３７２，４９７、６，３３７，１８６、６，３７６，２４６、６，３７９，９６４、６，３８７，７０２、６，３９１，５５２、６，３９１，６４０、６，３９５，５４７、６，４０６，８５５、６，４０６，９１０、６，４１３，７４５、６，４１３，７７４、６，４２０，１７５、６，４２３，５４２、６，４２６，２２４、６，４３６，６７５、６，４４４，４６８、６，４５５，２５３、６，４７９，６５２、６，４８２，６４７、６，４８３，０１１、６，４８４，１０５、６，４８９，１４６、６，５００，６１７、６，５００，６３９、６，５０６，６０２、６，５０６，６０３、６，５１８，０６５、６，５１９，０６５、６，５２１，４５３、６，５２８，３１１、６，５３７，７４６、６，５７３，０９８、６，５７６，４６７、６，５７９，６７８、６，５８６，１８２、６，６０２，９８６、６，６０５，４３０、６，６１３，５１４、６，６５３，０７２、６，６８６，５１５、６，７０３，２４０、６，７１６，６３１、６，８２５，００１、６，９０２，９２２、６，９１７，８８２、６，９４６，２９６、６，９６１，６６４、６，９９５，０１７、７，０２４，３１２、７，０５８，５１５、７，１０５，２９７、７，１４８，０５４、７，２２０，５６６、７，２８８，３７５、７，３８４，３８７、７，４２１，３４７、７，４３０，４７７、７，４６２，４６９、７，５３４，５６４、７，６２０，５００、７，６２０，５０２、７，６２９，１７０、７，７０２，４６４、７，７４７，３９１、７，７４７，３９３、７，７５１，９８６、７，７７６，５９８、７，７８３，４２８、７，７９５，０３０、７，８５３，４１０、７，８６８，１３８、７，７８３，４２８、７，８７３，４７７、７，８７３，４９９、７，９０４，２４９、７，９５７，９１２、７，９８１，６１４、８，０１４，９６１、８，０２９，９８８、８，０４８，６７４、８，０５８，００１、８，０７６，１３８、８，１０８，１５０、８，１７０，８０６、８，２２４，５８０、８，３７７，６８１、８，３８３，３４６、８，４５７，９０３、８，５０４，４９８、８，５８９，０８５、８，７６２，０６６、８，７６８，８７１、９，５９３，３２６、９，６６５，６９４、９，６８４，７７１号ならびにあらゆる関連ＰＣＴおよび非ＵＳ対応物；Ling et al., Anal. Biochem., 1997, 254(2):157-78；Dale et al., Meth. Mol. Biol., 1996, 57:369-74；Smith, Ann. Rev. Genet., 1985, 19:423-462；Botstein et al., Science, 1985, 229:1193-1201；Carter, Biochem. J., 1986, 237:1-7；Kramer et al., Cell, 1984, 38:879-887；Wells et al., Gene, 1985, 34:315-323；Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 1999, 3:284-290；Christians et al., Nat. Biotechnol., 1999, 17:259-264；Crameri et al., Nature, 1998, 391:288-291；Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 1997, 15:436-438；Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94:4504-4509；Crameri et al., Nat. Biotechnol., 1996, 14:315-319；Stemmer, Nature, 1994, 370:389-391；Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1994, 91:10747-10751；ＥＰ３０４９９７３；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；ＷＯ２００９／１５２３３６；およびＷＯ２０１５／０４８５７３を参照）。
【0281】
一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られるタンパク質バリアントは、酵素調製物を定義された温度（または他のアッセイ条件）に供し、熱処理または他の適したアッセイ条件後に残っている酵素活性の量を測定することによりスクリーニングされる。次に、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを、遺伝子から単離し、配列決定して、ヌクレオチド配列変化（あるとすれば）を同定し、宿主細胞において酵素を発現するために使用される。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、当技術分野で公知のいずれか適した方法（例えば、標準生化学技法、例えば、ＨＰＬＣ解析）を使用して実行することができる。
【0282】
公知配列の操作されたポリペプチドのため、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知合成方法に従って標準固相方法によって調製することができる。一部の実施形態では、最大約１００塩基の断片を個々に合成し、次いで接合して（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション方法、またはポリメラーゼ媒介方法により）、いずれか所望の連続的配列を形成することができる。例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、自動合成方法において典型的に実施される通り、古典的ホスホラミダイト方法（例えば、Beaucage et al., Tet. Lett., 1981, 22:1859-69；およびMatthes et al., EMBO J., 1984, 3:801-05を参照）を使用した化学合成によって調製することができる。ホスホラミダイト方法に従って、オリゴヌクレオチドは合成される（例えば、自動ＤＮＡ合成機において、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、適切なベクターにクローニングされる）。
【0283】
したがって、一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）本明細書に記載されているいずれかのバリアントのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを発現させることとを含むことができる。方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、必要に応じて、１個または数個の（例えば、最大３、４、５または最大１０個の）アミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有することができる。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５または１～５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、置換は、保存的または非保存的置換である。
【0284】
発現された操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、本明細書に記載されているアッセイおよび条件を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知のいずれか適したアッセイを使用して、いずれか所望の改善された特性または特性の組合せ（例えば、活性、選択性、忠実度、安定性、熱安定性、様々なｐＨレベルに対する耐性、プロテアーゼ感受性等）について評価することができる。
【0285】
一部の実施形態では、宿主細胞において発現された操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのいずれかは、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のための周知技法のうちいずれか１種または複数を使用して、細胞および／または培養培地から回収される。
【0286】
ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法は、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および親和性クロマトグラフィーを含む。特定の酵素を精製するための条件は、部分的に、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状等の因子に依存し、当業者には明らかである。一部の実施形態では、親和性技法を使用して、改善されたＤＮＡポリメラーゼの酵素を単離することができる。親和性クロマトグラフィー精製のため、目的のＤＮＡポリメラーゼポリペプチドに特異的に結合するいずれかの抗体が、用途を見出すことができる。抗体の産生のため、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらに限定されない様々な宿主動物は、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドまたはその断片による注射によって免疫される。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドまたは断片を、側鎖官能基または側鎖官能基に結合させたリンカーによって、適した担体、例えば、ＢＳＡに結合させる。
【0287】
一部の実施形態では、単離または精製された操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを、他の成分および化合物と組み合わせて、異なる適用および使用に適切な操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含む組成物および製剤を提供する（例えば、診断方法および組成物）。一部の実施形態では、組成物は、本開示の少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、組成物は、バッファーをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、基質、例えば、ヌクレオチド基質（例えば、ｄＮＴＰ、ｄＮＴＰアナログおよび／または修飾されたｄＮＴＰ）、および／または例えば標的核酸に相補的な、少なくとも１種のプライマーをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、標的ＤＮＡ鋳型をさらに含む。
【0288】
一部の実施形態では、組成物は、操作されたＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第２のＤＮＡポリメラーゼ）をさらに含むことができる。一部の実施形態では、第２のＤＮＡポリメラーゼは、第２の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑもしくはＰｆｕポリメラーゼ、または逆転写酵素、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ結合反応において有用なそれである。一部の実施形態では、組成物は、例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲ反応において、形成された産物の量を検出および／または定量化するための、プローブまたは指標、例えば、核酸結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）を含む。
操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの使用およびキット
操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの使用およびキット
【0289】
別の態様では、本開示は、標的核酸の存在を検出するためおよび核酸の直接的／間接的配列決定のため等、診断および分子生物学的目的での操作されたＤＮＡポリメラーゼの使用を提供する。
【0290】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、標的ＤＮＡの相補的ＤＮＡの調製において使用される。一部の実施形態では、標的ＤＮＡの相補的ＤＮＡを調製する方法は、相補的ＤＮＡの産生に十分な基質の存在下、標的ＤＮＡの全てまたは部分に対する（すなわち、全体または部分的に）相補的ＤＮＡの産生に適した反応条件下で、標的ＤＮＡを、本明細書に記載されている操作されたＤＮＡポリメラーゼと接触させることを含む（comprises contact）。本明細書に考察され、当技術分野で公知の通り、基質は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のためのヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）、および／またはオリゴヌクレオチドプライマーを含む。プライマーは、ＤＮＡライブラリーの生成のため等、標的核酸の特異的配列に対するものかまたはランダムプライマーであり得る。
【0291】
一部の実施形態では、標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ（例えば、血液／血清から得られる）、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡまたはウイルスＤＮＡを含むがこれらに限定されない、操作されたＤＮＡポリメラーゼのための鋳型として適切ないずれかのＤＮＡである。
【0292】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む標的核酸の存在を検出するための、診断適用において有用である。一部の実施形態では、標的ＤＮＡの存在を検出するための方法は、基質の存在下、標的ＤＮＡの全てまたは部分に（すなわち、全体または部分的に）相補的なＤＮＡのＤＮＡポリメラーゼ媒介産生に適した条件下で、標的ＤＮＡを含有することが疑われる試料を、本明細書に記載されている操作されたＤＮＡポリメラーゼと反応させることと、相補的ＤＮＡの存在を検出することとを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、逆転写酵素を使用して標的ＲＮＡに相補的な対応する標的ＤＮＡを産生することにより検出することができる。
【0293】
一部の実施形態では、試料は、標的核酸を含有することが疑われるいずれかの材料または物質であり得る。一部の実施形態では、試料は、生体試料、例えば、生検および剖検試料、組織学的目的で採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、涙、粘液、毛髪、皮膚等である。一部の実施形態では、生体試料は、細胞またはウイルス、例えば細菌培養物、ウイルス培養物または細胞培養物に由来する細胞またはウイルスである。一部の実施形態では、試料は、水、下水、表面、空気、濾液等に由来する、環境試料である。
【0294】
標的ＤＮＡを検出するための一部の実施形態では、相補的ＤＮＡ産物の検出は、当技術分野における公知方法によって実現することができる。一部の実施形態では、相補的ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または等温増幅等により、相補的ＤＮＡを増幅することにより検出される。一部の実施形態では、適した等温増幅は、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）による。標的ＲＮＡの存在を検出するための一部の実施形態では、逆転写酵素による反応は、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅反応とは別々に行われる。一部の実施形態では、増幅がＰＣＲによるものである場合、逆転写酵素反応およびＰＣＲは、１ステップＲＴ－ＰＣＲである（すなわち、単一の反応において同時に実行される）。一部の実施形態では、増幅がＰＣＲによるものである場合、逆転写酵素反応およびＰＣＲは、２ステップＲＴ－ＰＣＲである（すなわち、別々に実行される）。
【0295】
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、核酸を配列決定するために使用される。ＤＮＡを配列決定するための様々な方法、特に、ＮＧＳ配列決定方法が、当技術分野で周知である。
【0296】
さらなる態様では、本開示は、本明細書に開示される少なくとも１種の操作されたＤＮＡポリメラーゼを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、バッファー、ヌクレオチド基質および／またはオリゴヌクレオチドプライマーのうち１種または複数をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、例えば、標的核酸の異なる部分に対する、複数の（例えば、２種またはそれよりも多い）オリゴヌクレオチドプライマーを含むことができる。一部の実施形態では、キットは、鋳型ＤＮＡまたは標的ＤＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、例えば、共役ＲＴ－ＰＣＲ反応のための、第２のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑもしくはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素を含む。
【実施例】
【0297】
実験および達成された結果を含む、次の実施例は、単なる説明目的で提供されており、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0298】
後述する実験の開示において、次の略語を適用する：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈ（ｓ）およびｈｒ（ｓ）（時間）；Ω（オーム）；μｆ（マイクロファラッド）；Ｕ（ユニット）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｒｃｆ（相対遠心力）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド毎平方インチ）；℃（摂氏度）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＮＧＳ（次世代配列決定）；ｄｓ（二本鎖）；ｓｓ（一本鎖）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；Ｅ． ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（一般的に使用される研究室Ｅ． ｃｏｌｉ株、Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＭＣＹＰ（ｍｉｃｒｏｃｙｐ）；ｄｄＨ２Ｏ（再蒸留水）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＤＴＴ（ジチオスレイトール）；ＣＡＭ（クロラムフェニコール）；ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）；ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）；ｅＧＦＰ（増強ＧＦＰ）；ＤｓＲｅｄ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．から単離された赤色蛍光タンパク質）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照を上回る改善倍率）；ＬＢ（ルリア・ベルターニ（Luria-Bertani））；ＳＰＲＩ（固相可逆的固定）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｉｎｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ）；Ｃｏｖａｒｉｓ（Ｃｏｖａｒｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）；ＭａｇＢｉｏ（ＭａｇＢｉｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）；Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）；Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｋｕｈｎｅｒ（Ａｄｏｌｆ Ｋｕｈｎｅｒ、ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｚｙｍｏ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡの一部）；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）；ならびにＢｉｏ－Ｒａｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。
（実施例１）
組換えポリメラーゼ遺伝子を含有するＥ． ｃｏｌｉ発現宿主
（実施例１）
組換えポリメラーゼ遺伝子を含有するＥ． ｃｏｌｉ発現宿主
【0299】
本開示のバリアントの産生に使用される初期ポリメラーゼの酵素は、ｌａｃｌリプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターに機能的に連結された、発現ベクターｐＣＫ１１０９００（米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号の図３を参照）にクローニングされた配列番号２であった。発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール抵抗性遺伝子も含有する。その結果得られるプラスミドを、当技術分野で公知の標準方法を使用してＥ． ｃｏｌｉ Ｗ３１１０に形質転換した。当技術分野で公知の通り、クロラムフェニコール選択に細胞を付すことにより、形質転換体を単離した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３を参照）。
（実施例２）
ＨＴＰポリメラーゼ含有湿潤細胞ペレットの調製
（実施例２）
ＨＴＰポリメラーゼ含有湿潤細胞ペレットの調製
【0300】
モノクローナルコロニーから得た組換えポリメラーゼコード遺伝子を含有するＥ． ｃｏｌｉ細胞を、９６ウェルのシャローウェルのマイクロタイタープレートのウェル内の１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有する１８０μｌのＬＢに接種した。プレートをＯ２透過性シールで密封し、一晩、３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％湿度で培養物を成長させた。次に、細胞培養物のそれぞれの１０μｌを、３９０ｍＬ ＴＢおよび３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭを含有する９６ウェルのディープウェルのプレートのウェルに移した。ディープウェルのプレートをＯ２透過性シールで密封し、３０℃、２５０ｒｐｍおよび８５％湿度で、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまでインキュベートした。次に、ＩＰＴＧによって細胞培養物を１ｍＭの最終濃度まで誘導し、本来使用されるものと同じ条件下で一晩インキュベートした。次に、４，０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を使用して、細胞をペレットにした。上清を廃棄し、溶解前に、ペレットを－８０℃で凍結した。
（実施例３）
ＨＴＰ ポリメラーゼ含有細胞ライセートの調製
（実施例３）
ＨＴＰ ポリメラーゼ含有細胞ライセートの調製
【0301】
先ず、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５および２０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する３００μｌのバッファーを、実施例２に記載されている通りに産生された各ウェル内の細胞ペーストに添加した。卓上振とう機で振盪することにより、細胞を再懸濁した。再懸濁された細胞を９６ウェルハードシェルプレートに移し、サーモサイクラー（thermocycler）において８０℃で６０分溶解した。次に、プレートを３０分、４，０００ｒｐｍおよび４０℃で遠心分離した。澄んだ上清を生体触媒反応において使用して、その活性、ＤＮＡ感度および熱安定性レベルを決定した。
（実施例４）
ＰＣＲ増幅活性における配列番号２を上回る改善
（実施例４）
ＰＣＲ増幅活性における配列番号２を上回る改善
【0302】
ｐＣＫベクターにおけるベータ－ラクタム（lactam）断片（ｐＣＫ－ベータラクタマーゼ）と、プライマーＳｅｑＦ１（ＣＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＣＣＧＣＣＴＣ）（配列番号７７１）およびＳｅｑＲ１（ＣＡＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＡＴＣＣＡＧＴＧＡ）（配列番号７７２）を使用したＰＣＲアッセイにおいて野生型酵素ポリメラーゼ活性をスクリーニングした後に、配列番号２を親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載されている通りにＨＴＰで産生し、可溶性ライセートを、実施例３に記載されている通りに生成した。５ｎｇ／ｕＬ ｐＣＫ－ベータラクタマーゼ、５００ｎＭ ＳｅｑＦ１およびＳｅｑＲ１プライマー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、Ｐｆｕバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ．）、５体積％ＨＴＰライセートを含む２０μＬ反応液において、各バリアントをスクリーニングした。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒ Ｎｅｘｕｓ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒにおいてＰＣＲサイクリングを実行した（９５℃で２分、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分を３０サイクル）。
【0303】
配列番号２と比べた活性（親を上回る活性改善倍率、ＦＩＯＰ）は、配列番号２と比べた産物濃度（ｎｇ／ｕｌ）として計算し、表４．１に示した。
（実施例５）
ｑＰＣＲ酵素活性における配列番号８を上回る改善
【表4-1-1】
【表4-1-2】
【表4-1-3】
（実施例５）
ｑＰＣＲ酵素活性における配列番号８を上回る改善
【0304】
ＤＮＡポリメラーゼバリアント配列番号８を、本ラウンドの指向性進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載されている通りにＨＴＰで産生し、可溶性ライセートを、実施例３に記載されている通りに生成した。ヌクレオカプシド遺伝子を含有する１ｎｇ／ｕＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＤＮＡ断片（ＩＤＴカタログ＃＞ＣＡＴ＿１０００６６２５＿２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ＿Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、５００ｎＭ Ｎ１プライマー、１２５ｎＭプローブ（ＣＤＣ ＥＵＡアッセイ、カタログ＃２０１９－ｎＣｏＶＥＵＡ－０１）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、ＲＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、１２．５体積％ＨＴＰライセートを含む２０μＬ反応液、およびＣＦＸ３８４ ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）におけるｑＰＣＲサイクリング（９５℃で２分、９５℃で３秒、５５℃で３０秒を４５サイクル）において、各バリアントをスクリーニングした。
【0305】
配列番号８の参照ポリペプチドと比べて増加した活性（活性ＦＩＯＰ）は、配列番号８のＣｔ値（臨界閾値）と比較した、バリアントによって形成されるＣｔ値の逆数として計算し、表５．１に示した。
（実施例６）
ＤＮＡ活性および安定性における配列番号３３２を上回る改善
【表5-1-1】
【表5-1-2】
【表5-1-3】
【表5-1-4】
【表5-1-5】
【表5-1-6】
（実施例６）
ＤＮＡ活性および安定性における配列番号３３２を上回る改善
【0306】
ＤＮＡポリメラーゼバリアント配列番号３３２を、本ラウンドの指向性進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載されている通りにＨＴＰで産生し、可溶性ライセートを、実施例３に記載されている通りに生成した。ヌクレオカプシド遺伝子の転写物を含有する１ｎｇ／ｕＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＤＮＡ断片（ＩＤＴカタログ＃＞ＣＡＴ＿１０００６６２５＿２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ＿Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、５００ｎＭ Ｎ１プライマー、１２５ｎＭプローブ（ＣＤＣ ＥＵＡアッセイ、カタログ＃２０１９－ｎＣｏＶＥＵＡ－０１）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、ＲＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、６体積％ＨＴＰライセートを含む２０μＬ反応液において、各バリアントをスクリーニングした。ＣＦＸ３８４ ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）において６２．５℃で３０分インキュベートし、続いてサイクリング（９５℃で２分、９５℃で３秒、５５℃で３０秒を４５サイクル）を行うことにより、ｑＰＣＲを実行した。
【0307】
配列番号３３２と比べた酵素活性（活性ＦＩＯＰ）は、配列番号３３２のＣｔ値（臨界閾値）の逆数を上回る、バリアントによって形成されるＣｔ値の逆数として計算し、表６．１に示した。
（実施例７）
安定性および活性における配列番号４６２を上回る改善
【表6-1-1】
【表6-1-2】
【表6-1-3】
（実施例７）
安定性および活性における配列番号４６２を上回る改善
【0308】
ＤＮＡポリメラーゼバリアント配列番号４６２を、本ラウンドの指向性進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載されている通りにＨＴＰで産生し、可溶性ライセートを、実施例３に記載されている通りに生成した。ヌクレオカプシド遺伝子の転写物を含有する０．２ｎｇ／ｕＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＤＮＡ断片（ＩＤＴカタログ＃＞ＣＡＴ＿１０００６６２５＿２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ＿Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、５００ｎＭ Ｎ１プライマー、１２５ｎＭプローブ（ＣＤＣ ＥＵＡアッセイ、カタログ＃２０１９－ｎＣｏＶＥＵＡ－０１）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、ＲＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、６体積％ＨＴＰライセートで構成された２０μＬ反応液において、各バリアントをスクリーニングし、ＣＦＸ３８４ ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）における６２．５℃で３０分のインキュベーションと、それに続くｑＰＣＲサイクリング（９５℃で２分、９５℃で３秒、５５℃で３０秒を４５サイクル）によってｑＰＣＲを実行した。
【0309】
配列番号４６２と比べたポリメラーゼ安定性および活性（処理能力ＦＩＯＰ）は、配列番号４６２のＣｔ値（臨界閾値）の逆数を上回る、バリアントによって形成されるＣｔ値の逆数として計算し、表７．１に示した。
（実施例８）
活性および感度における配列番号６０６を上回る改善
【表7-1-1】
【表7-1-2】
【表7-1-3】
【表7-1-4】
（実施例８）
活性および感度における配列番号６０６を上回る改善
【0310】
配列番号６０６を、本ラウンドの指向性進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載されている通りにＨＴＰで産生し、可溶性ライセートを、実施例３に記載されている通りに生成した。ヌクレオカプシド遺伝子を含有する０．１２５ｎｇ／ｕＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＤＮＡ断片（ＩＤＴカタログ＃＞ＣＡＴ＿１０００６６２５＿２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ＿Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、５００ｎＭ Ｎ１プライマー、１２５ｎＭプローブ（ＣＤＣ ＥＵＡアッセイ、カタログ＃２０１９－ｎＣｏＶＥＵＡ－０１）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、ＲＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、１．５体積％ＨＴＰライセートで構成された２０μＬ反応液において、各バリアントをスクリーニングし、ＣＦＸ３８４ ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）において６２．５℃で３０分インキュベートし、続いてｑＰＣＲサイクリング（９５℃で２分、９５℃で３秒、５５℃で３０秒を４５サイクル）を行うことにより、ｑＰＣＲを実行した。
【0311】
配列番号６０６と比べたポリメラーゼ安定性および活性（処理能力ＦＩＯＰ）は、配列番号６０６のＣｔ値（臨界閾値）の逆数を上回る、バリアントによって形成されるＣｔ値の逆数として計算し、表８．１に示した。
【表8-1-1】
【表8-1-2】
【表8-1-3】
【表8-1-4】
【0312】
具体的な実施形態を参照して本発明について記載してきたが、様々な変更を行うことができ、均等物を代用にして、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスステップ（単数または複数）に適応させ、これにより、特許請求される範囲から逸脱することなく本発明の利益を達成することができる。
【0313】
あらゆる目的のため、本開示に引用されているありとあらゆる刊行物および特許文書は、あたかもそのような刊行物または文書のそれぞれが参照により本明細書に組み込まれると具体的にかつ個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文書の引用は、そのような文書のいずれかが関連先行技術であることの指示として意図されることもなければ、その内容または日付に関する承認を構成することもない。
【配列表】
【国際調査報告】