特表 2024-539652 新生児ＦＣ受容体をゲノム編集するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-29

(54)【発明の名称】新生児ＦＣ受容体をゲノム編集するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20241022BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 9/78 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241022BHJP

   A01K 67/0275 20240101ALI20241022BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20241022BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20241022BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20241022BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241022BHJP

   A61K 35/407 20150101ALI20241022BHJP

   A61K 35/44 20150101ALI20241022BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20241022BHJP

   A61K 35/36 20150101ALI20241022BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 5/077 20100101ALN20241022BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20241022BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N15/12 ZNA

C12N15/55

C12N9/78

C12N9/22

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A01K67/0275

C12N15/63 Z

C12N15/88 Z

C12N15/86 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/113 Z

C12N15/861 Z

C12N15/869 Z

A61K48/00

A61K9/16

A61K47/24

A61K47/10

A61K47/28

A61K47/18

A61K35/76

A61K35/407

A61K35/44

A61K35/28

A61K35/36

A61P43/00 105

A61P21/04

A61P7/06

A61P7/00

A61P25/00

A61P29/00

A61P17/00

A61P37/06

C12N5/077

C12N9/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522490

(86)(22)【出願日】2022-10-13

(85)【翻訳文提出日】2024-06-10

(86)【国際出願番号】 US2022078050

(87)【国際公開番号】W WO2023064858

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】63/255,290

(32)【優先日】2021-10-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】513283268

【氏名又は名称】アペリス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＰＥＬＬＩＳ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，ＩＮＣ．

(71)【出願人】

【識別番号】520439645

【氏名又は名称】ビーム セラピューティクス インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】フランソワ，セドリック

(72)【発明者】

【氏名】コレフ，マーティン

(72)【発明者】

【氏名】ジョンソン，レイ・ワン

(72)【発明者】

【氏名】ボーヌード，タンギス

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA31

4C076DD49

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE23

4C084AA13

4C084MA41

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA511

4C084ZA551

4C084ZA891

4C084ZA941

4C084ZB081

4C084ZB111

4C084ZB211

4C084ZC541

4C087AA01

4C087AA03

4C087BB44

4C087BB48

4C087BB52

4C087BB63

4C087BC83

4C087CA04

4C087CA08

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA51

4C087ZA55

4C087ZA89

4C087ZA94

4C087ZB08

4C087ZB11

4C087ZB21

4C087ZC54

(57)【要約】

本明細書に提供されるのは、新生児断片結晶化可能受容体（ＦｃＲｎ）タンパク質をコードする遺伝子および／または哺乳動物細胞におけるその発現もしくは活性を改変するための組成物および方法である。本明細書に開示される組成物および方法は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合する能力が低減したバリアントＦｃＲｎタンパク質を提供する。
【選択図】図２Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩｇＧ受容体およびトランスポーターのＦｃ断片（ＦｃＲｎ）ポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させる方法であって、前記方法が、前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドを、１つ以上のガイドポリヌクレオチドと、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む塩基エディターとを含む塩基エディター系、または前記塩基エディター系をコードする１つ以上のポリヌクレオチドと接触させるステップを含み、
（ａ）前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、表２Ｂに列挙されるスペーサー核酸配列の少なくとも１０から２３個の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含むか、または
（ｂ）前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、以下の参照配列：
ＦｃＲｎアミノ酸配列
ＡＥＳＨＬＳＬＬＹＨＬＴＡＶＳＳＰＡＰＧＴＰＡＦＷＶＳＧＷＬＧＰＱＱＹＬＳＹＮＳＬＲＧＥＡＥＰＣＧＡＷＶＷＥＮＱＶＳＷＹＷＥＫＥＴＴＤＬＲＩＫＥＫＬＦＬＥＡＦＫＡＬＧＧＫＧＰＹＴＬＱＧＬＬＧＣＥＬＧＰＤＮＴＳＶＰＴＡＫＦＡＬＮＧＥＥＦＭＮＦＤＬＫＱＧＴＷＧＧＤＷＰＥＡＬＡＩＳＱＲＷＱＱＱＤＫＡＡＮＫＥＬＴＦＬＬＦＳＣＰＨＲＬＲＥＨＬＥＲＧＲＧＮＬＥＷＫＥＰＰＳＭＲＬＫＡＲＰＳＳＰＧＦＳＶＬＴＣＳＡＦＳＦＹＰＰＥＬＱＬＲＦＬＲＮＧＬＡＡＧＴＧＱＧＤＦＧＰＮＳＤＧＳＦＨＡＳＳＳＬＴＶＫＳＧＤＥＨＨＹＣＣＩＶＱＨＡＧＬＡＱＰＬＲＶＥＬＥＳＰＡＫＳＳＶＬＶＶＧＩＶＩＧＶＬＬＬＴＡＡＡＶＧＧＡＬＬＷＲＲＭＲＳＧＬＰＡＰＷＩＳＬＲＧＤＤＴＧＶＬＬＰＴＰＧＥＡＱＤＡＤＬＫＤＶＮＶＩＰＡＴＡ（配列番号５３０）、または別のＦｃＲｎポリペプチド配列における対応する位置に対して、Ｆ１１０、Ｌ１１２、Ｎ１１３、Ｅ１１５、Ｅ１１６、Ｆ１１７、Ｍ１１８、Ｎ１１９、Ｄ１２１、Ｌ１２２、Ｔ１２６、Ｗ１２７、Ｇ１２８、Ｄ１３０、Ｗ１３１、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ａ１３４、Ｌ１３５、およびＩ１３７からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードするコドン中の核酸塩基の変化をもたらすように前記塩基エディターを標的化し、それによって前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させる、方法。

【請求項2】

前記核酸塩基の変化が、前記参照配列に対して、前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされる前記ＦｃＲｎポリペプチドにおける以下のアミノ酸変化のうちの１つ以上をもたらす、請求項１に記載の方法：Ｆ１１０Ｌ、Ｆ１１０Ｓ、Ｆ１１０Ｐ、Ｌ１１２Ｐ、Ｎ１１３Ｓ、Ｎ１１３Ｄ、．Ｅ１１５Ｇ、Ｅ１１５Ｋ、Ｅ１１６Ｇ、Ｅ１１６Ｋ、Ｅ１１６Ｑ、Ｆ１１７Ｐ、Ｍ１１８Ｎ、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｉ、Ｍ１１８Ｔ、Ｎ１１９Ｇ、Ｎ１１９Ｄ、Ｎ１１９Ｓ、Ｎ１１９Ｃ、Ｄ１２１Ｇ、Ｌ１２２Ｆ、Ｌ１２２Ａ、Ｌ１２２Ｐ、Ｔ１２６Ｉ、Ｔ１２６Ｓ、Ｔ１２６Ｎ、Ｔ１２６Ａ、Ｗ１２７Ｒ、Ｇ１２８Ｓ、Ｄ１３０Ｇ、Ｄ１３０Ｎ、Ｄ１３０Ｈ、Ｗ１３１Ｒ、Ｗ１３１Ｑ、Ｐ１３２Ｌ、Ｐ１３２Ｓ、Ｐ１３２Ｐ、Ｅ１３３Ｇ、Ａ１３４Ｖ、Ｌ１３５Ｐ、Ｉ１３７Ｖ、Ｉ１３７Ｔ。

【請求項3】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、前記参照配列中のアミノ酸Ｍ１１８またはＷ１３１をコードするコドン中の核酸塩基の変化をもたらすように前記塩基エディターを標的化する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記核酸塩基の変化が、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｉ、Ｍ１１８Ｔ、Ｗ１３１Ｒ、およびＷ１３１Ｑからなる群から選択される前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされる前記ＦｃＲｎポリペプチドにおけるアミノ酸変化をもたらす、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ＦｃＲｎポリペプチドにおける１つ以上のアミノ酸変化が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４への前記ＦｃＲｎポリペプチドの結合を低減または消失させる、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＦｃＲｎポリペプチドにおける前記１つ以上のアミノ酸変化が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４のＦｃ領域への前記ＦｃＲｎポリペプチドの結合を低減または消失させる、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４との結合について溶液中で、３０００ｎＭより大きいＫ_Ｄを有する、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

変化した核酸塩基を含む前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされる前記ＦｃＲｎポリペプチドが、アルブミンに結合可能である、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドが、アルブミンとの結合について溶液中で、２０００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドが、アルブミンとの結合について溶液中で、１０００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドの結合が、アルブミンとの結合について溶液中で、５００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基が、少なくとも約２０％の塩基編集効率で変化する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基が、少なくとも約４０％の塩基編集効率で変化する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基が、少なくとも約５０％の塩基編集効率で変化する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記デアミナーゼドメインが、ＤＮＡのシチジンまたはアデニンを脱アミノ化することができる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記デアミナーゼドメインが、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメインである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記アデノシンデアミナーゼが、前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドにおける標的Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記シチジンデアミナーゼが、前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドにおける標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換する、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記シチジンデアミナーゼドメインが、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼドメインまたはその誘導体である、請求項１６または請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記塩基エディターが、ＢＥ４塩基エディターである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記アデノシンデアミナーゼドメインが、ＴａｄＡデアミナーゼドメインである、請求項１６または請求項１７に記載の方法。

【請求項22】

前記デアミナーゼドメインが、アデノシンデアミナーゼドメインである、請求項１６、１７または２１に記載の方法。

【請求項23】

前記アデノシンデアミナーゼが、ＴａｄＡ^＊８またはＴａｄ^＊９バリアントである、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記アデノシンデアミナーゼが、ＴａｄＡ^＊８．１、ＴａｄＡ^＊８．２、ＴａｄＡ^＊８．３、ＴａｄＡ^＊８．４、ＴａｄＡ^＊８．５、ＴａｄＡ^＊８．６、ＴａｄＡ^＊８．７、ＴａｄＡ^＊８．８、ＴａｄＡ^＊８．９、ＴａｄＡ^＊８．１０、ＴａｄＡ^＊８．１１、ＴａｄＡ^＊８．１２、ＴａｄＡ^＊８．１３、ＴａｄＡ^＊８．１４、ＴａｄＡ^＊８．１５、ＴａｄＡ^＊８．１６、ＴａｄＡ^＊８．１７、ＴａｄＡ^＊８．１８、ＴａｄＡ^＊８．１９、ＴａｄＡ^＊８．２０、ＴａｄＡ^＊８．２１、ＴａｄＡ^＊８．２２、ＴａｄＡ^＊８．２３、またはＴａｄＡ^＊８．２４である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記デアミナーゼドメインが、単量体またはヘテロ二量体である、請求項１６、１７、または２１から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐが、ヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントである、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦポリヌクレオチド、またはそれらの機能的部分を含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、デッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、スタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、またはそれらのバリアントである、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、変化したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を有するＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９のバリアントを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９が、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＮＧＲＲＴ、およびＮＮＮＲＲＴからなる群から選択されるＰＡＭ配列に対する特異性を有し、Ｎが任意のヌクレオチドであり、ＲがＡまたはＧである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９を含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記塩基エディターが、１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含むか、または前記方法が、前記塩基エディターとトランスで細胞内でＵＧＩを発現させるステップをさらに含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記塩基エディターが、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記ＮＬＳが、バイパータイトＮＬＳである、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、以下のヌクレオチド配列のうちの１つを含むスキャフォールドを含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法：
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（ＳｐＣａｓ９スキャフォールド；配列番号３１７）、または
ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵ（ＳａＣａｓ９スキャフォールド；配列番号４３６）。

【請求項38】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、１つ以上の改変ヌクレオチドを含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記１つ以上の改変ポリヌクレオチドが、前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にある、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記１つ以上の改変ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチドである、請求項３８または請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、１９から２３ヌクレオチドからなるスペーサーを含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、１９または２０ヌクレオチドからなるスペーサーを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記塩基エディターが、前記デアミナーゼドメイン、前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン、および前記ガイドポリヌクレオチドを含む複合体を含むか、または前記塩基エディターが、前記デアミナーゼドメインに融合した前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインを含む融合タンパク質である、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドが細胞内にある、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記細胞が、肝細胞、内皮細胞、骨髄性細胞、または上皮細胞である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏである、請求項４４または請求項４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記細胞が対象内にある、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記対象が哺乳動物である、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記哺乳動物がヒトである、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法によって産生された細胞。

【請求項51】

ＩｇＧ受容体およびトランスポーターのＦｃ断片（ＦｃＲｎ）ポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させるための塩基エディター系であって、前記塩基エディター系が、（ｉ）１つ以上のガイドポリヌクレオチド、または前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、および（ｉｉ）核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、または前記塩基エディターをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含み、
（ａ）前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、表２Ｂに列挙されるスペーサー核酸配列の少なくとも１０から２３個の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含むか、または
（ｂ）前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、以下の参照配列：
ＦｃＲｎアミノ酸配列
ＡＥＳＨＬＳＬＬＹＨＬＴＡＶＳＳＰＡＰＧＴＰＡＦＷＶＳＧＷＬＧＰＱＱＹＬＳＹＮＳＬＲＧＥＡＥＰＣＧＡＷＶＷＥＮＱＶＳＷＹＷＥＫＥＴＴＤＬＲＩＫＥＫＬＦＬＥＡＦＫＡＬＧＧＫＧＰＹＴＬＱＧＬＬＧＣＥＬＧＰＤＮＴＳＶＰＴＡＫＦＡＬＮＧＥＥＦＭＮＦＤＬＫＱＧＴＷＧＧＤＷＰＥＡＬＡＩＳＱＲＷＱＱＱＤＫＡＡＮＫＥＬＴＦＬＬＦＳＣＰＨＲＬＲＥＨＬＥＲＧＲＧＮＬＥＷＫＥＰＰＳＭＲＬＫＡＲＰＳＳＰＧＦＳＶＬＴＣＳＡＦＳＦＹＰＰＥＬＱＬＲＦＬＲＮＧＬＡＡＧＴＧＱＧＤＦＧＰＮＳＤＧＳＦＨＡＳＳＳＬＴＶＫＳＧＤＥＨＨＹＣＣＩＶＱＨＡＧＬＡＱＰＬＲＶＥＬＥＳＰＡＫＳＳＶＬＶＶＧＩＶＩＧＶＬＬＬＴＡＡＡＶＧＧＡＬＬＷＲＲＭＲＳＧＬＰＡＰＷＩＳＬＲＧＤＤＴＧＶＬＬＰＴＰＧＥＡＱＤＡＤＬＫＤＶＮＶＩＰＡＴＡ（配列番号５３０）、または別のＦｃＲｎポリペプチド配列における対応する位置に対して、Ｆ１１０、Ｌ１１２、Ｎ１１３、Ｅ１１５、Ｅ１１６、Ｆ１１７、Ｍ１１８、Ｎ１１９、Ｄ１２１、Ｌ１２２、Ｔ１２６、Ｗ１２７、Ｇ１２８、Ｄ１３０、Ｗ１３１、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ａ１３４、Ｌ１３５、およびＩ１３７からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードするコドン中の核酸塩基の変化をもたらすように前記塩基エディターを標的化する、塩基エディター系。

【請求項52】

前記核酸塩基の変化が、前記参照配列に対して、前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされる前記ＦｃＲｎポリペプチドにおける以下のアミノ酸変化：Ｆ１１０Ｌ、Ｆ１１０Ｓ、Ｆ１１０Ｐ、Ｌ１１２Ｐ、Ｎ１１３Ｓ、Ｎ１１３Ｄ、．Ｅ１１５Ｇ、Ｅ１１５Ｋ、Ｅ１１６Ｇ、Ｅ１１６Ｋ、Ｅ１１６Ｑ、Ｆ１１７Ｐ、Ｍ１１８Ｎ、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｉ、Ｍ１１８Ｔ、Ｎ１１９Ｇ、Ｎ１１９Ｄ、Ｎ１１９Ｓ、Ｎ１１９Ｃ、Ｄ１２１Ｇ、Ｌ１２２Ｆ、Ｌ１２２Ａ、Ｌ１２２Ｐ、Ｔ１２６Ｉ、Ｔ１２６Ｓ、Ｔ１２６Ｎ、Ｔ１２６Ａ、Ｗ１２７Ｒ、Ｇ１２８Ｓ、Ｄ１３０Ｇ、Ｄ１３０Ｎ、Ｄ１３０Ｈ、Ｗ１３１Ｒ、Ｗ１３１Ｑ、Ｐ１３２Ｌ、Ｐ１３２Ｓ、Ｐ１３２Ｐ、Ｅ１３３Ｇ、Ａ１３４Ｖ、Ｌ１３５Ｐ、Ｉ１３７Ｖ、Ｉ１３７Ｔのうちの１つ以上をもたらす、請求項５１に記載の塩基エディター系。

【請求項53】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、前記参照配列中のアミノ酸Ｍ１１８またはＷ１３１をコードするコドン中の核酸塩基の変化をもたらすように前記塩基エディターを標的化する、請求項５１に記載の塩基エディター系。

【請求項54】

前記核酸塩基の変化が、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｉ、Ｍ１１８Ｔ、Ｗ１３１Ｒ、およびＷ１３１Ｑからなる群から選択される前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされる前記ＦｃＲｎポリペプチドにおけるアミノ酸変化をもたらす、請求項５３に記載の塩基エディター系。

【請求項55】

前記ＦｃＲｎポリペプチドにおける１つ以上のアミノ酸変化が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４への前記ＦｃＲｎポリペプチドの結合を低減または消失させる、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項56】

前記ＦｃＲｎポリペプチドにおける前記１つ以上のアミノ酸変化が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４のＦｃ領域への前記ＦｃＲｎポリペプチドの結合を低減または消失させる、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項57】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４との結合について溶液中で、３０００ｎＭより大きいＫ_Ｄを有する、請求項５６に記載の塩基エディター系。

【請求項58】

変化した核酸塩基を含む前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされる前記ＦｃＲｎポリペプチドが、アルブミンに結合可能である、請求項５２から５７のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項59】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドが、アルブミンとの結合について溶液中で、２０００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する、請求項５８に記載の塩基エディター系。

【請求項60】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドが、アルブミンとの結合について溶液中で、１０００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する、請求項５８に記載の塩基エディター系。

【請求項61】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドの結合が、アルブミンとの結合について溶液中で５００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する、請求項５８に記載の塩基エディター系。

【請求項62】

前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基が、少なくとも約２０％の塩基編集効率で変化する、請求項５１から６１のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項63】

前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基が、少なくとも約４０％の塩基編集効率で変化する、請求項５１から６２のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項64】

前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基が、少なくとも約５０％の塩基編集効率で変化する、請求項５１から６３のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項65】

前記デアミナーゼドメインが、ＤＮＡのシチジンまたはアデニンを脱アミノ化することができる、請求項５１から６４のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項66】

前記デアミナーゼドメインが、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメインである、請求項５１から８のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項67】

前記アデノシンデアミナーゼが、前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドにおける標的Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する、請求項６６に記載の塩基エディター系。

【請求項68】

前記シチジンデアミナーゼが、前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドにおける標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換する、請求項６６に記載の塩基エディター系。

【請求項69】

前記シチジンデアミナーゼドメインが、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼドメインまたはその誘導体である、請求項６６に記載の塩基エディター系。

【請求項70】

前記塩基エディターが、ＢＥ４塩基エディターである、請求項５１から６６のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項71】

前記アデノシンデアミナーゼドメインが、ＴａｄＡデアミナーゼドメインである、請求項６６または請求項６７に記載の塩基エディター系。

【請求項72】

前記デアミナーゼドメインが、アデノシンデアミナーゼドメインである、請求項５１から６７または請求項７１のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項73】

前記アデノシンデアミナーゼが、ＴａｄＡ^＊８またはＴａｄ^＊９バリアントである、請求項７２に記載の塩基エディター系。

【請求項74】

前記アデノシンデアミナーゼが、ＴａｄＡ^＊８．１、ＴａｄＡ^＊８．２、ＴａｄＡ^＊８．３、ＴａｄＡ^＊８．４、ＴａｄＡ^＊８．５、ＴａｄＡ^＊８．６、ＴａｄＡ^＊８．７、ＴａｄＡ^＊８．８、ＴａｄＡ^＊８．９、ＴａｄＡ^＊８．１０、ＴａｄＡ^＊８．１１、ＴａｄＡ^＊８．１２、ＴａｄＡ^＊８．１３、ＴａｄＡ^＊８．１４、ＴａｄＡ^＊８．１５、ＴａｄＡ^＊８．１６、ＴａｄＡ^＊８．１７、ＴａｄＡ^＊８．１８、ＴａｄＡ^＊８．１９、ＴａｄＡ^＊８．２０、ＴａｄＡ^＊８．２１、ＴａｄＡ^＊８．２２、ＴａｄＡ^＊８．２３、またはＴａｄＡ^＊８．２４である、請求項７２または請求項７３に記載の塩基エディター系。

【請求項75】

前記デアミナーゼドメインが、単量体またはヘテロ二量体である、請求項７２から７４のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項76】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２である、請求項５１から７５のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項77】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、ヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントである、請求項５１から７６のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項78】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦポリヌクレオチド、またはそれらの機能的部分を含む、請求項５１から７７のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項79】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、デッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含む、請求項５１から７８のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項80】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、スタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、またはそれらのバリアントである、請求項５１から７９のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項81】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、変化したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を有するＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９のバリアントを含む、請求項５１から８０に記載の塩基エディター系。

【請求項82】

前記ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９が、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＮＧＲＲＴ、およびＮＮＮＲＲＴからなる群から選択されるＰＡＭ配列に対する特異性を有し、Ｎが任意のヌクレオチドであり、ＲがＡまたはＧである、請求項８１に記載の塩基エディター系。

【請求項83】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９を含む、請求項５１から８２のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項84】

前記塩基エディターが、１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含むか、または前記塩基エディター系が、前記塩基エディターとトランスでＵＧＩをさらに含む、請求項５１から８３のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項85】

前記塩基エディターが、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項５１から８４のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項86】

前記ＮＬＳが、バイパータイトＮＬＳである、請求項８５に記載の塩基エディター系。

【請求項87】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、以下のヌクレオチド配列：
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（ＳｐＣａｓ９スキャフォールド；配列番号３１７）、または
ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵ（ＳａＣａｓ９スキャフォールド；配列番号４３６）
のうちの１つを含むスキャフォールドを含む、請求項５１から８６のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項88】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、１つ以上の改変ヌクレオチドを含む、請求項５１から８８のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項89】

前記１つ以上の改変ポリヌクレオチドが、前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にある、請求項８８に記載の塩基エディター系。

【請求項90】

前記１つ以上の改変ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチドである、請求項８８または請求項８９に記載の塩基エディター系。

【請求項91】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、１９から２３ヌクレオチドからなるスペーサーを含む、請求項８８から９０のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項92】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、１９または２０ヌクレオチドからなるスペーサーを含む、請求項９１に記載の塩基エディター系。

【請求項93】

前記塩基エディターが、前記デアミナーゼドメイン、前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン、および前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドを含む複合体を含むか、または前記塩基エディターが、前記デアミナーゼドメインに融合した前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインを含む融合タンパク質である、請求項５１から９２のいずれか一項に記載の塩基エディター系。

【請求項94】

請求項５１から９３のいずれか一項に記載の塩基エディター系をコードするポリヌクレオチド。

【請求項95】

請求項９４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項96】

前記ベクターが、脂質ナノ粒子を含む、請求項９５に記載のベクター。

【請求項97】

前記脂質ナノ粒子が、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、脂質－ポリエチレングリコールコンジュゲート、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される脂質を含む脂質単分子層を含む、請求項９６に記載のベクター。

【請求項98】

前記脂質単分子層がＰＥＧ化脂質を含む、請求項９７に記載のベクター。

【請求項99】

前記脂質単分子層がコレステロールをさらに含む、請求項９７または請求項９８に記載のベクター。

【請求項100】

前記脂質ナノ粒子が、Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（アルギノイルアミノ）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミニウムクロリドまたはジステアロイルアルギニルアンモニウムクロリド］（ＤＳＡＡ）；Ｎ，Ｎ－ジミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ６－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド（ＤＭＧＬＡ）；Ｎ，Ｎ－ジミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ２－グアニジノ－Ｌ－リシニル］アミノエチルアンモニウムクロリド；Ｎ，Ｎ－ジミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ２，Ｎ６－ジ－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド；Ｎ，Ｎ－ジ－ステアロイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ６－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド；Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ν，Ν－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｉ）；Ｎ－（ｌ，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；ｌ，３－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン、Ｎ－（ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１アンモニウムトリフルオロ－アセテート（ＤＯＳＰＡ）；ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ；ＤＭＤＨＰ；３－ｐ［４Ｎ－（Ｈ８Ｎ－ジグアニジノスペルミジン）－カルバモイル］コレステロール（ＢＧＳＣ）；３－Ｐ［Ｎ，Ｎ－ジグアニジノエチル－アミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＢＧＴＣ）；Ｎ，Ｎ＼Ｎ２，Ｎ３テトラ－メチルテトラパルミチルスペルミン（セルフェクチン）；Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシル－３－テトラデシル－アミノプロピオン－アミジン（ＣＬＯＮフェクチン）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；ｌ，３－ジオレオイルオキシ－２－（６－カルボキシスペルミル）－プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；４－（２，３－ビス－パルミトイルオキシ－プロピル）－１－メチル－ｌＨ－イミダゾール（ＤＰＩＭ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２，３－ジオレオイルオキシ－１，４－ブタンジアンモニウムヨージド）（Ｔｆｘ－５０）；１，２ジオレオイル－３－（４’－トリメチルアンモニオ）ブタノール－ｓｎ－グリセロール（ＤＯＢＴ）；トリメチルアンモニウム基が、ブタノールのスペーサーアームを介して、二重鎖（ＤＯＴＢの場合）またはコレステリル基（ＣｈＯＴＢの場合）のいずれかに結合しているコレステリル（４’トリメチルアンモニア）ブタノエート（ＣｈＯＴＢ）；ＤＬ－ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアミノプロピル－Ｐ－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩ）；ＤＬ－ｌ，２－０－ジオレオイル－３－ジメチルアミノプロピル－Ｐ－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩＥ）；ｌ，２－ジオレオイル－３－スクシニル－ｓｎ－グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）；コレステリルヘミスクシネートエステル（ＣｈＯＳＣ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）；ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）；コレステリル－３Ｐ－カルボキシル－アミド－エチレントリメチルアンモニウムヨージド；ｌ－ジメチルアミノ－３－トリメチルアンモニオ－ＤＬ－２－プロピル－コレステリルカルボキシレートヨージド；コレステリル－３－β－カルボキシアミドエチレンアミン；コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシンアミド－エチレントリメチルアンモニウムヨージド；ｌ－ジメチルアミノ－３－トリメチルアンモニオ－ＤＬ－２－プロピル－コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシネートヨージド；２－（２－トリメチルアンモニオ）－エチルメチルアミノエチル－コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシネートヨージド；３－β－Ν－（ポリエチレンイミン）－カルバモイルコレステロール、ＤＣ－コレステロール；Ｎ４－コレステリル－スペルミンＨＣｌ塩（ＧＬ６７）；Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）；およびそれらの組合せからなる群から選択されるイオン化カチオン性脂質を含む、請求項９６から９９のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項101】

前記ベクターが、ポリマーナノ粒子を含む、請求項９５に記載のベクター。

【請求項102】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項９５に記載のベクター。

【請求項103】

前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１０２に記載のベクター。

【請求項104】

請求項９４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９５から１０３のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。

【請求項105】

前記細胞が、肝細胞、内皮細胞、骨髄性細胞、または上皮細胞である、請求項１０４に記載の細胞。

【請求項106】

前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１０４または請求項１０５に記載の細胞。

【請求項107】

前記細胞がヒト細胞である、請求項１０６に記載の細胞。

【請求項108】

請求項５１から９３のいずれか一項に記載の塩基エディター系、請求項９４に記載のポリヌクレオチド、請求項９５から１０３のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１０４から１０７のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。

【請求項109】

請求項１０８に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項110】

免疫グロブリンＧによって媒介される自己免疫障害の治療を必要とする対象において免疫グロブリンＧによって媒介される自己免疫障害を治療する方法であって、１つ以上のガイドポリヌクレオチドと、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む塩基エディターとを含む塩基エディター系、または前記塩基エディター系をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、前記対象に投与することによって、前記対象においてＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させるステップを含み、
（ａ）前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、表２Ｂに列挙されるスペーサー核酸配列の少なくとも１０から２３個の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含むか、または
（ｂ）前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、以下の参照配列：
ＦｃＲｎアミノ酸配列
ＡＥＳＨＬＳＬＬＹＨＬＴＡＶＳＳＰＡＰＧＴＰＡＦＷＶＳＧＷＬＧＰＱＱＹＬＳＹＮＳＬＲＧＥＡＥＰＣＧＡＷＶＷＥＮＱＶＳＷＹＷＥＫＥＴＴＤＬＲＩＫＥＫＬＦＬＥＡＦＫＡＬＧＧＫＧＰＹＴＬＱＧＬＬＧＣＥＬＧＰＤＮＴＳＶＰＴＡＫＦＡＬＮＧＥＥＦＭＮＦＤＬＫＱＧＴＷＧＧＤＷＰＥＡＬＡＩＳＱＲＷＱＱＱＤＫＡＡＮＫＥＬＴＦＬＬＦＳＣＰＨＲＬＲＥＨＬＥＲＧＲＧＮＬＥＷＫＥＰＰＳＭＲＬＫＡＲＰＳＳＰＧＦＳＶＬＴＣＳＡＦＳＦＹＰＰＥＬＱＬＲＦＬＲＮＧＬＡＡＧＴＧＱＧＤＦＧＰＮＳＤＧＳＦＨＡＳＳＳＬＴＶＫＳＧＤＥＨＨＹＣＣＩＶＱＨＡＧＬＡＱＰＬＲＶＥＬＥＳＰＡＫＳＳＶＬＶＶＧＩＶＩＧＶＬＬＬＴＡＡＡＶＧＧＡＬＬＷＲＲＭＲＳＧＬＰＡＰＷＩＳＬＲＧＤＤＴＧＶＬＬＰＴＰＧＥＡＱＤＡＤＬＫＤＶＮＶＩＰＡＴＡ（配列番号４３６）、または別のＦｃＲｎポリペプチド配列における対応する位置に対して、Ｆ１１０、Ｌ１１２、Ｎ１１３、Ｅ１１５、Ｅ１１６、Ｆ１１７、Ｍ１１８、Ｎ１１９、Ｄ１２１、Ｌ１２２、Ｔ１２６、Ｗ１２７、Ｇ１２８、Ｄ１３０、Ｗ１３１、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ａ１３４、Ｌ１３５、およびＩ１３７からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードするコドン中の核酸塩基の変化をもたらすように前記塩基エディターを標的化し、それによって前記自己免疫障害を治療する、方法。

【請求項111】

前記核酸塩基の変化が、前記参照配列に対して、前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされる前記ＦｃＲｎポリペプチドにおける以下のアミノ酸変化：Ｆ１１０Ｌ、Ｆ１１０Ｓ、Ｆ１１０Ｐ、Ｌ１１２Ｐ、Ｎ１１３Ｓ、Ｎ１１３Ｄ、．Ｅ１１５Ｇ、Ｅ１１５Ｋ、Ｅ１１６Ｇ、Ｅ１１６Ｋ、Ｅ１１６Ｑ、Ｆ１１７Ｐ、Ｍ１１８Ｎ、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｉ、Ｍ１１８Ｔ、Ｎ１１９Ｇ、Ｎ１１９Ｄ、Ｎ１１９Ｓ、Ｎ１１９Ｃ、Ｄ１２１Ｇ、Ｌ１２２Ｆ、Ｌ１２２Ａ、Ｌ１２２Ｐ、Ｔ１２６Ｉ、Ｔ１２６Ｓ、Ｔ１２６Ｎ、Ｔ１２６Ａ、Ｗ１２７Ｒ、Ｇ１２８Ｓ、Ｄ１３０Ｇ、Ｄ１３０Ｎ、Ｄ１３０Ｈ、Ｗ１３１Ｒ、Ｗ１３１Ｑ、Ｐ１３２Ｌ、Ｐ１３２Ｓ、Ｐ１３２Ｐ、Ｅ１３３Ｇ、Ａ１３４Ｖ、Ｌ１３５Ｐ、Ｉ１３７Ｖ、Ｉ１３７Ｔのうちの１つ以上をもたらす、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、前記参照配列中のアミノ酸Ｍ１１８またはＷ１３１をコードするコドン中の核酸塩基の変化をもたらすように前記塩基エディターを標的化する、請求項１１０に記載の方法。

【請求項113】

前記核酸塩基の変化が、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｉ、Ｍ１１８Ｔ、Ｗ１３１Ｒ、およびＷ１３１Ｑからなる群から選択される前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされる前記ＦｃＲｎポリペプチドにおけるアミノ酸変化をもたらす、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記ＦｃＲｎポリペプチドにおける１つ以上のアミノ酸変化が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４への前記ＦｃＲｎポリペプチドの結合を低減または消失させる、請求項１１１から１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記ＦｃＲｎポリペプチドにおける前記１つ以上のアミノ酸変化が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４のＦｃ領域への前記ＦｃＲｎポリペプチドの結合を低減または消失させる、請求項１１１から１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４との結合について溶液中で、３０００ｎＭより大きいＫ_Ｄを有する、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

変化した核酸塩基を含む前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされる前記ＦｃＲｎポリペプチドが、アルブミンに結合可能である、請求項１１１から１１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドが、アルブミンとの結合について溶液中で、２０００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する、請求項１１７に記載の方法。

【請求項119】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドが、アルブミンとの結合について溶液中で、１０００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する、請求項１１７に記載の方法。

【請求項120】

前記１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ＦｃＲｎポリペプチドの結合が、アルブミンとの結合について溶液中で、５００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する、請求項１１７に記載の方法。

【請求項121】

前記対象における免疫グロブリンＧポリペプチドのレベルを少なくとも約２５％減少させるステップを含む、請求項１１０から１２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項122】

前記対象における免疫グロブリンＧポリペプチドのレベルを少なくとも約５０％減少させるステップを含む、請求項１１０から１２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項123】

前記対象における免疫グロブリンＧポリペプチドのレベルを少なくとも約７０％減少させるステップを含む、請求項１１０から１２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項124】

前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドの前記核酸塩基が、少なくとも約２０％の塩基編集効率で変化する、請求項１１０から１２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項125】

前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドの前記核酸塩基が、少なくとも約４０％の塩基編集効率で変化する、請求項１１０から１２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項126】

前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドの前記核酸塩基が、少なくとも約５０％の塩基編集効率で変化する、請求項１１０から１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項127】

前記障害が、重症筋無力症（ｇＭＧ）、温式自己免疫性溶血性貧血（ｗＡＩＨＡ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、グレーブス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、尋常性天疱瘡、ならびに胎児および新生児の溶血性疾患（ＨＤＦＮ）からなる群から選択される、請求項１１０から１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項128】

前記デアミナーゼドメインが、ＤＮＡのシチジンまたはアデニンを脱アミノ化することができる、請求項１１０から１２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項129】

前記デアミナーゼドメインが、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメインである、請求項１１０から１２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項130】

前記アデノシンデアミナーゼが、前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドにおける標的Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記シチジンデアミナーゼが、前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドにおける標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換する、請求項１２９に記載の方法。

【請求項132】

前記シチジンデアミナーゼドメインが、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼドメインまたはその誘導体である、請求項１２９または請求項１３１に記載の方法。

【請求項133】

前記塩基エディターが、ＢＥ４塩基エディターである、請求項１１０から１２９、請求項１３１、または請求項１３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項134】

前記アデノシンデアミナーゼドメインが、ＴａｄＡデアミナーゼドメインである、請求項１２９または請求項１３０に記載の方法。

【請求項135】

前記デアミナーゼドメインが、アデノシンデアミナーゼドメインである、請求項１２９、１３０、または１３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項136】

前記アデノシンデアミナーゼが、ＴａｄＡ^＊８またはＴａｄ^＊９バリアントである、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

前記アデノシンデアミナーゼが、ＴａｄＡ^＊８．１、ＴａｄＡ^＊８．２、ＴａｄＡ^＊８．３、ＴａｄＡ^＊８．４、ＴａｄＡ^＊８．５、ＴａｄＡ^＊８．６、ＴａｄＡ^＊８．７、ＴａｄＡ^＊８．８、ＴａｄＡ^＊８．９、ＴａｄＡ^＊８．１０、ＴａｄＡ^＊８．１１、ＴａｄＡ^＊８．１２、ＴａｄＡ^＊８．１３、ＴａｄＡ^＊８．１４、ＴａｄＡ^＊８．１５、ＴａｄＡ^＊８．１６、ＴａｄＡ^＊８．１７、ＴａｄＡ^＊８．１８、ＴａｄＡ^＊８．１９、ＴａｄＡ^＊８．２０、ＴａｄＡ^＊８．２１、ＴａｄＡ^＊８．２２、ＴａｄＡ^＊８．２３、またはＴａｄＡ^＊８．２４である、請求項１３５または請求項１３６に記載の方法。

【請求項138】

前記デアミナーゼドメインが、単量体またはヘテロ二量体である、請求項１１０から１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項139】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２である、請求項１１０から１３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、ヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントである、請求項１１０から１３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項141】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦポリヌクレオチド、またはそれらの機能的部分を含む、請求項１１０から１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項142】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、デッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含む、請求項１１０から１４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項143】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、スタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、またはそれらのバリアントである、請求項１１０から１４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項144】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、変化したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を有するＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９のバリアントを含む、請求項１４３に記載の方法。

【請求項145】

前記ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９が、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＮＧＲＲＴ、およびＮＮＮＲＲＴからなる群から選択されるＰＡＭ配列に対する特異性を有し、Ｎが任意のヌクレオチドであり、ＲがＡまたはＧである、請求項１４４に記載の方法。

【請求項146】

前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９を含む、請求項１１０から１４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項147】

前記塩基エディターが、１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含むか、または前記方法が、前記塩基エディターとトランスで細胞内でＵＧＩを発現させるステップをさらに含む、請求項１１０から１４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項148】

前記塩基エディターが、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項１１０から１４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項149】

前記ＮＬＳが、バイパータイトＮＬＳである、請求項１４８に記載の方法。

【請求項150】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、以下のヌクレオチド配列：
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（ＳｐＣａｓ９スキャフォールド；配列番号３１７）、または
ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵ（ＳａＣａｓ９スキャフォールド；配列番号４３６）
のうちの１つを含むスキャフォールドを含む、請求項１１０から１４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項151】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、１つ以上の改変ヌクレオチドを含む、請求項１１０から１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項152】

前記１つ以上の改変ポリヌクレオチドが、前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にある、請求項１５１に記載の方法。

【請求項153】

前記１つ以上の改変ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチドである、請求項１５１または請求項１５２に記載の方法。

【請求項154】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、１９から２３ヌクレオチドからなるスペーサーを含む、請求項１１０から１５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項155】

前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドが、１９または２０ヌクレオチドからなるスペーサーを含む、請求項１５４に記載の方法。

【請求項156】

前記塩基エディターが、前記デアミナーゼドメイン、前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン、および前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドを含む複合体を含むか、または前記塩基エディターが、前記デアミナーゼドメインに融合した前記ｎａｐＤＮＡｂｐドメインを含む融合タンパク質である、請求項１１０から１５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項157】

前記投与が局所投与である、請求項１１０から１５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項158】

前記投与が全身投与である、請求項１１０から１５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項159】

前記塩基エディター系が、ベクターを使用して前記対象に投与される、請求項１１０から１５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項160】

前記ベクターが脂質ナノ粒子である、請求項１５９に記載の方法。

【請求項161】

前記ベクターが肝臓を標的とする、請求項１５９または請求項１６０に記載の方法。

【請求項162】

前記対象が哺乳動物である、請求項１１０から１６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項163】

前記哺乳動物がヒトである、請求項１６２に記載の方法。

【請求項164】

上記請求項のいずれか一項に記載の方法における使用に適し、表２Ａまたは表２Ｂに列挙される配列を含むガイドポリヌクレオチドを含むキット。

【請求項165】

ＩｇＧ受容体およびトランスポーターのＦｃ断片（ＦｃＲｎ）ポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させる方法であって、前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドを、ｇＲＮＡ１５８３、ｇＲＮＡ１５７８、ｇＲＮＡ３２６５からなる群から選択される１つ以上のガイドポリヌクレオチド、またはそれらをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、ならびに核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、または前記塩基エディターをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む塩基エディター系と接触させるステップを含み；それによって前記ＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させる、方法。

【請求項166】

ｇＲＮＡ１５８３、ｇＲＮＡ１５７８、ｇＲＮＡ３２６５からなる群から選択される１つ以上のガイドポリヌクレオチド、またはそれらをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、ならびに核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、または前記塩基エディターをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む塩基エディター系。

【請求項167】

表２Ａまたは表２Ｂに列挙される配列を含むガイドポリヌクレオチド。

【請求項168】

哺乳動物細胞において新生児断片結晶化可能受容体（ＦｃＲｎ）タンパク質を改変する方法であって、前記細胞をガイドＲＮＡおよびゲノムエディターと接触させるステップを含み、前記ガイドＲＮＡが、ＦＣＧＲＴ遺伝子の一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、前記細胞において前記ＦＣＧＲＴ遺伝子の改変をもたらすように前記ゲノムエディターを標的化し、前記改変が、前記ＦＣＧＲＴ遺伝子によってコードされる前記ＦｃＲｎタンパク質のアミノ酸配列を変化させる、方法。

【請求項169】

前記ゲノムエディターが、塩基エディターまたはプライムエディターを含む、請求項１６８に記載の方法。

【請求項170】

ＩｇＧ媒介性自己免疫障害の治療を必要とする対象において、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害を治療する方法であって、前記対象の哺乳動物細胞において新生児断片結晶化可能受容体（ＦｃＲｎ）タンパク質を改変するステップを含む方法。

【請求項171】

前記ＦｃＲｎタンパク質を改変するステップが、前記対象の前記哺乳動物細胞においてＦＣＧＲＴ遺伝子をゲノム編集するステップを含む、請求項１７０に記載の方法。

【請求項172】

前記ゲノム編集するステップが、前記哺乳動物細胞をガイドＲＮＡおよびゲノムエディターと接触させるステップを含み、前記ガイドＲＮＡが、前記ＦＣＧＲＴ遺伝子の一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、前記細胞における前記ＦＣＧＲＴ遺伝子の改変をもたらすように前記ゲノムエディターを標的化し、前記改変が、前記ＦＣＧＲＴ遺伝子によってコードされる前記ＦｃＲｎタンパク質のアミノ酸配列を変化させる、請求項１７１に記載の方法。

【請求項173】

前記ゲノムエディターが、塩基エディターまたはプライムエディターを含む、請求項１７２に記載の方法。

【請求項174】

前記塩基エディターまたはプライムエディターが、ナノ粒子、ウイルスベクター、または電気穿孔を介して前記哺乳動物細胞に送達される、請求項１６９または請求項１７３に記載の方法。

【請求項175】

前記ナノ粒子が、金ナノ粒子、脂質ナノ粒子、またはポリマーナノ粒子である、請求項１７４に記載の方法。

【請求項176】

前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはセンダイウイルスから選択される、請求項１７４に記載の方法。

【請求項177】

前記改変されたＦｃＲｎタンパク質が、１つ以上の単一ヌクレオチド改変または変化を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項178】

前記改変されたＦｃＲｎが、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合する能力の低減を示す、先行する請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項179】

前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項180】

前記哺乳動物細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項181】

接触した細胞が、参照ＦｃＲｎタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含むバリアントＦｃＲｎタンパク質を発現する、請求項１６８から１８０のいずれかに記載の方法。

【請求項182】

前記ゲノムエディターが、核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメイン、および前記ＦＣＧＲＴ遺伝子における標的Ｃ－ＧをＴ－Ａに変換するか、または標的Ｇ－ＣをＡ－Ｔに変換するシチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターである、請求項１６８から１６９または１７２から１８１のいずれかに記載の方法。

【請求項183】

前記ゲノムエディターが、核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメイン、および前記ＦＣＧＲＴ遺伝子における標的Ａ－ＴをＧ－Ｃに変換するか、または標的Ｔ－ＡをＣ－Ｇに変換するアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターである、請求項１６８から１６９または１７２から１８１のいずれかに記載の方法。

【請求項184】

前記核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、触媒的に不活性化された（デッド）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含む、請求項１８２または請求項１８３に記載の方法。

【請求項185】

前記ゲノムエディターが、核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメインおよび逆転写酵素を含むプライムエディターであり、前記ガイドＲＮＡがプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）であり、前記プライムエディターが、前記ＦＣＧＲＴ遺伝子における１つ以上のヌクレオチドを異なるヌクレオチドに置き換える、請求項１６８から１６９または１７２から１８１のいずれかに記載の方法。

【請求項186】

前記核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、触媒的に不活性化された（デッド）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含む、請求項１８５に記載の方法。

【請求項187】

前記改変されたＦｃＲｎタンパク質が、１１２位のロイシン（Ｌ）、１１５位のグルタミン酸（Ｅ）、１１６位のグルタミン酸（Ｅ）、１３１位のトリプトファン（Ｗ）、１３２位のプロリン（Ｐ）、および１３３位のグルタミン酸（Ｅ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸において参照ＦｃＲｎタンパク質とは異なる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項188】

前記改変されたＦｃＲｎタンパク質が、図３に示される１つ以上の突然変異を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項189】

前記ガイドＲＮＡおよび前記ゲノムエディターが、ＦｃＲｎまたはアルブミンに結合するターゲティング部分にコンジュゲートしている、請求項１６８から１６９または１７２から１８８のいずれかに記載の方法。

【請求項190】

前記ターゲティング部分が、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＦｃＲｎに特異的に結合する抗体、アルブミンに特異的に結合する抗体、アルブミンに結合するペプチド、アルブミン、またはそれらの断片もしくは誘導体からなる群から選択される、請求項１８９に記載の方法。

【請求項191】

ガイドＲＮＡおよびゲノムエディターを含む組成物であって、前記ガイドＲＮＡがＦＣＧＲＴ遺伝子の一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、細胞内の前記ＦＣＧＲＴ遺伝子に改変をもたらすように塩基ゲノムエディターを標的化し、前記改変が、前記ＦＣＧＲＴ遺伝子によってコードされるＦｃＲＮタンパク質のアミノ酸配列を変化させる、組成物。

【請求項192】

ＦｃＲｎまたはアルブミンに結合するターゲティング部分を含む送達ビヒクルをさらに含む、請求項１９１に記載の組成物。

【請求項193】

前記ターゲティング部分が、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＦｃＲｎに特異的に結合する抗体、アルブミンに特異的に結合する抗体、アルブミンに結合するペプチド、アルブミン、またはそれらの断片もしくは誘導体からなる群から選択される、請求項１９２に記載の方法。

【請求項194】

脂質単分子層膜に包埋されたＩｇＧ抗体の少なくとも１つの断片結晶化可能（Ｆｃ）領域またはその機能的断片を含む脂質単分子層膜と、
前記脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスと
を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。

【請求項195】

前記脂質コアマトリクスが、少なくとも１つの核酸を含む、請求項１９４に記載のＬＮＰ。

【請求項196】

前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡからなる群から選択される、請求項１９５に記載のＬＮＰ。

【請求項197】

前記ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡである、請求項１９６に記載のＬＮＰ。

【請求項198】

前記ｓｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡが、ＦＣＧＲＴ遺伝子を改変またはサイレンシングする、請求項１９７に記載のＬＮＰ。

【請求項199】

前記脂質単分子層膜が、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、脂質－ポリエチレングリコールコンジュゲート、およびそれらの組合せからなる群から選択される脂質から構成される、請求項１９４から１９８のいずれかに記載のＬＮＰ。

【請求項200】

前記脂質単分子層膜の前記脂質の少なくとも一部がＰＥＧ化されている、請求項１９９に記載のＬＮＰ。

【請求項201】

前記脂質単分子層が、コレステロールをさらに含む、請求項１９９に記載のＬＮＰ。

【請求項202】

前記脂質コアマトリクスが、Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（アルギノイルアミノ）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミニウムクロリドまたはジステアロイルアルギニルアンモニウムクロリド］（ＤＳＡＡ）；Ｎ，Ｎ－ジミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ６－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド（ＤＭＧＬＡ）；Ｎ，Ｎ－ジミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ２－グアニジノ－Ｌ－リシニル］アミノエチルアンモニウムクロリド；Ｎ，Ｎ－ジミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ２，Ｎ６－ジ－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド；Ｎ，Ｎ－ジ－ステアロイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ６－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド；Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ν，Ν－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｉ）；Ｎ－（ｌ，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；ｌ，３－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン、Ｎ－（ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１アンモニウムトリフルオロ－アセテート（ＤＯＳＰＡ）；ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ；ＤＭＤＨＰ；３－ｐ［４Ｎ－（Ｈ８Ｎ－ジグアニジノスペルミジン）－カルバモイル］コレステロール（ＢＧＳＣ）；３－Ｐ［Ｎ，Ｎ－ジグアニジノエチル－アミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＢＧＴＣ）；Ｎ，Ｎ＼Ｎ２，Ｎ３テトラ－メチルテトラパルミチルスペルミン（セルフェクチン）；Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシル－３－テトラデシル－アミノプロピオン－アミジン（ＣＬＯＮフェクチン）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；ｌ，３－ジオレオイルオキシ－２－（６－カルボキシスペルミル）－プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；４－（２，３－ビス－パルミトイルオキシ－プロピル）－１－メチル－ｌＨ－イミダゾール（ＤＰＩＭ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２，３－ジオレオイルオキシ－１，４－ブタンジアンモニウムヨージド）（Ｔｆｘ－５０）；１，２ジオレオイル－３－（４’－トリメチルアンモニオ）ブタノール－ｓｎ－グリセロール（ＤＯＢＴ）；トリメチルアンモニウム基が、ブタノールのスペーサーアームを介して、二重鎖（ＤＯＴＢの場合）またはコレステリル基（ＣｈＯＴＢの場合）のいずれかに結合しているコレステリル（４’トリメチルアンモニア）ブタノエート（ＣｈＯＴＢ）；ＤＬ－ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアミノプロピル－Ｐ－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩ）；ＤＬ－ｌ，２－０－ジオレオイル－３－ジメチルアミノプロピル－Ｐ－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩＥ）；ｌ，２－ジオレオイル－３－スクシニル－ｓｎ－グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）；コレステリルヘミスクシネートエステル（ＣｈＯＳＣ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）；ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）；コレステリル－３Ｐ－カルボキシル－アミド－エチレントリメチルアンモニウムヨージド；ｌ－ジメチルアミノ－３－トリメチルアンモニオ－ＤＬ－２－プロピル－コレステリルカルボキシレートヨージド；コレステリル－３－β－カルボキシアミドエチレンアミン；コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシンアミド－エチレントリメチルアンモニウムヨージド；ｌ－ジメチルアミノ－３－トリメチルアンモニオ－ＤＬ－２－プロピル－コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシネートヨージド；２－（２－トリメチルアンモニオ）－エチルメチルアミノエチル－コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシネートヨージド；３－β－Ν－（ポリエチレンイミン）－カルバモイルコレステロール、ＤＣ－コレステロール；Ｎ４－コレステリル－スペルミンＨＣｌ塩（ＧＬ６７）；Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）；およびそれらの組合せからなる群から選択されるイオン化カチオン性脂質を含む、請求項１９４から２０１のいずれかに記載のＬＮＰ。

【請求項203】

請求項１９４から２０２のいずれかに記載の少なくとも１つのＬＮＰと、
少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と
を含む医薬組成物。

【請求項204】

ＩｇＧ媒介性自己免疫障害の治療を必要とする対象においてＩｇＧ媒介性自己免疫障害を治療する方法であって、請求項１９４から２０２のいずれかに記載のＬＮＰを前記対象に投与するステップを含む方法。

【請求項205】

細胞におけるＦｃＲｎをコードするゲノム配列の発現をサイレンシングするか、または改変する方法であって、前記細胞を請求項１９４から２０２のいずれかに記載のＬＮＰと接触させるステップを含む方法。

【請求項206】

ＦｃＲｎの改変が、アルブミンの半減期を妨げない、先行する請求項のいずれかに記載の方法または組成物。

【発明の詳細な説明】

【関連出願】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１３日に出願された米国仮出願第６３／２５５，２９０号に対する優先権およびその利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年１０月９日に作成された配列表ＸＭＬファイルは、１８０８０２＿０４９１０１＿ＰＣＴ＿ＳＬ．ｘｍｌと名前を付けられ、９７０，４８４バイトのサイズである。

【技術分野】

【0003】

本開示はゲノム編集の分野に関する。具体的には、本開示は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）遺伝子であるＦＣＧＲＴを編集、その発現を改変、および／またはそれをサイレンシングするための組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0004】

免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、体組織の感染を制御する場合に、血液循環および細胞外液中に見出される最も一般的な種類の抗体である。ＩｇＧは抗原に直接結合することができるが、ＩｇＧの断片結晶化可能（Ｆｃ）領域も細胞上の受容体に結合して免疫応答をもたらす。Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）のファミリーには、ＦＣＧＲＴ遺伝子によってコードされる非定型新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）が含まれる。ＦｃＲｎは、ＩｇＧおよびアルブミンを再循環させ、維持し、またＩｇＧおよびアルブミンを、極性化した細胞バリアを越えて輸送するように機能し、それによって循環中のＩｇＧおよびアルブミンの半減期を増加させる。ＦｃＲｎはまた、ＩｇＧ免疫複合体（ＩＣ）に由来するペプチドと相互作用し、その抗原提示を促進する。

【0005】

ＦｃＲｎは、母親から子どもへ母体ＩｇＧ抗体を輸送する受容体として最初に同定された。当初、ＦｃＲｎは胎児期および新生児期の間の胎盤および腸組織にのみ存在すると考えられていた。しかしながら、現在では、ＦｃＲｎは、上皮、内皮、および造血器由来の細胞を含む、全身の多くの組織において発現することが知られている。具体的には、上皮におけるＦｃＲｎ発現は、腸、胎盤、腎臓、および肝臓において検出されている。

【0006】

重症筋無力症、温式自己免疫性溶血性貧血（ｗＡＩＨＡ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、グレーブス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、尋常性天疱瘡、ならびに胎児および新生児の溶血性疾患（ＨＤＦＮ）を含め、いくつかの自己免疫障害が、自己抗原に対するＩｇＧの反応によって引き起こされる。ＦｃＲｎは循環中のＩｇＧレベルを維持するように機能するため、ＦｃＲｎはまた、このような自己免疫障害を引き起こす抗体の半減期を延長する。静注用免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）は、ＦｃＲｎのＩｇＧ再循環能力を飽和させ、ＦｃＲｎに結合する病原性ＩｇＧのレベルを低減させ、それによってＩｇＧ自己抗体のレベルの低減を促進する最近開発された治療法である。自己免疫障害を治療するための他の戦略には、自己抗原に対する炎症反応を低減させるために、より高い親和性の抗体の注射が含まれる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ＦｃＲｎ媒介性自己免疫障害の標的化治療のための改良された組成物および方法に対する必要性が存在している。

【課題を解決するための手段】

【0008】

発明の概要
本明細書に提供されるのは、ＩｇＧについての新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）タンパク質および／または哺乳動物細胞におけるその発現もしくは活性を改変するための組成物および方法である。本明細書に開示される組成物および方法は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合する能力が低減した、改変されたバリアントＦｃＲｎタンパク質の産生をもたらす。このような組成物および方法は、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害を改善するのに有用である。有利には、本明細書に開示される組成物および方法は、対象におけるアルブミン半減期を妨げることなく、ＩｇＧへのＦｃＲｎ結合を特異的に標的化する。

【0009】

したがって、一実施形態では、哺乳動物細胞においてＦｃＲｎタンパク質を改変する方法が提供され、この方法は、細胞をガイドＲＮＡおよびゲノムエディターと接触させるステップを含み、ガイドＲＮＡは、ＦＣＧＲＴ遺伝子の一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、細胞においてＦＣＧＲＴ遺伝子の改変をもたらすようにゲノムエディターを標的化し、改変は、ＦＣＧＲＴ遺伝子によってコードされるＦｃＲｎタンパク質のアミノ酸配列を変化させる。

【0010】

別の実施形態では、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害の治療を必要とする対象において、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害を治療する方法が提供され、この方法は、対象の哺乳動物細胞においてＦｃＲｎタンパク質を改変するステップを含む。

【0011】

別の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびゲノムエディターを含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡはＦＣＧＲＴ遺伝子の一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、細胞内のＦＣＧＲＴ遺伝子に改変をもたらすようにゲノムエディターを標的化し、改変は、ＦＣＧＲＴ遺伝子によってコードされるＦｃＲｎタンパク質のアミノ酸配列を変化させる。

【0012】

別の実施形態では、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片または他の標的化部分を組み込むために表面機能化された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が提供される。開示されるＬＮＰは、上皮表面上の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を標的化し、融合または内在化し、標的化細胞にそれらのペイロードを送達することができる。本明細書で開示されるＬＮＰは、ＦｃＲｎをサイレンシングするためのｓｉＲＮＡを含んでもよく、それによって循環中のＩｇＧの半減期を制限し、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害の治療を必要とする対象において、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害を治療する。

【0013】

別の実施形態では、脂質単分子層膜に包埋されたＩｇＧ抗体の少なくとも１つの断片結晶化可能（Ｆｃ）領域またはその機能的断片を含む脂質単分子層膜と；脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスとを含むＬＮＰが提供される。

【0014】

別の実施形態では、脂質単分子層膜に包埋されたＩｇＧ抗体の少なくとも１つの断片Ｆｃ領域またはその機能的断片を含む脂質単分子層膜と；脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスとを含むＬＮＰが提供され、脂質コアマトリクスは少なくとも１つの核酸を含む。

【0015】

別の実施形態では、脂質単分子層膜に包埋されたＩｇＧ抗体の少なくとも１つのＦｃ領域またはその機能的断片を含む脂質単分子層膜と；脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスとを含むＬＮＰが提供され、脂質コアマトリクスは、ＦＣＧＲＴ遺伝子の発現を調節するか、またはＦＣＧＲＴ遺伝子をサイレンシングする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡを含む。

【0016】

別の実施形態では、脂質単分子層膜に包埋されたＩｇＧ抗体の少なくとも１つのＦｃ領域またはその機能的断片を含む脂質単分子層膜と；脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスとを含む少なくとも１つのＬＮＰであって、脂質コアマトリクスが少なくとも１つの核酸を含む、少なくとも１つのＬＮＰと；少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。

【0017】

別の実施形態では、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害の治療を必要とする対象において、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害を治療する方法が提供され、この方法は、脂質単分子層膜に包埋されたＩｇＧ抗体の少なくとも１つのＦｃ領域もしくは本明細書に開示される他の標的化部分、またはその機能的断片を含む脂質単分子層膜と；脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスとを含むＬＮＰを対象に投与するステップを含み、脂質コアマトリクスは、ＦＣＧＲＴ遺伝子の発現を調節するか、またはＦＣＧＲＴ遺伝子をサイレンシングする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡを含む。

【0018】

別の実施形態では、細胞におけるＦｃＲｎ発現をサイレンシングする方法が提供され、この方法は、細胞を、脂質単分子層膜に包埋されたＩｇＧ抗体の少なくとも１つのＦｃ領域またはその機能的断片を含む脂質単分子層膜と；脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスとを含むＬＮＰと接触させるステップを含み、脂質コアマトリクスは、ＦＣＧＲＴ遺伝子をサイレンシングする少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む。一態様では、本開示は、ＩｇＧ受容体およびトランスポーターのＦｃ断片（ＦｃＲｎ）ポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させる方法を特徴とする。この方法は、ＦｃＲｎポリヌクレオチドを、１つもしくは複数のガイドポリヌクレオチドと、塩基エディターとを含む塩基エディター系、または塩基エディター系をコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドと接触させるステップを含み、それによってＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させる。塩基エディターは、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む。塩基エディター系では、
（ａ）１つ以上のガイドポリヌクレオチドは、表２Ｂに列挙されるスペーサー核酸配列の少なくとも１０から２３個の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含むか、または
（ｂ）１つもしくは複数のガイドポリヌクレオチドは、以下の参照配列：
ＦｃＲｎアミノ酸配列
ＡＥＳＨＬＳＬＬＹＨＬＴＡＶＳＳＰＡＰＧＴＰＡＦＷＶＳＧＷＬＧＰＱＱＹＬＳＹＮＳＬＲＧＥＡＥＰＣＧＡＷＶＷＥＮＱＶＳＷＹＷＥＫＥＴＴＤＬＲＩＫＥＫＬＦＬＥＡＦＫＡＬＧＧＫＧＰＹＴＬＱＧＬＬＧＣＥＬＧＰＤＮＴＳＶＰＴＡＫＦＡＬＮＧＥＥＦＭＮＦＤＬＫＱＧＴＷＧＧＤＷＰＥＡＬＡＩＳＱＲＷＱＱＱＤＫＡＡＮＫＥＬＴＦＬＬＦＳＣＰＨＲＬＲＥＨＬＥＲＧＲＧＮＬＥＷＫＥＰＰＳＭＲＬＫＡＲＰＳＳＰＧＦＳＶＬＴＣＳＡＦＳＦＹＰＰＥＬＱＬＲＦＬＲＮＧＬＡＡＧＴＧＱＧＤＦＧＰＮＳＤＧＳＦＨＡＳＳＳＬＴＶＫＳＧＤＥＨＨＹＣＣＩＶＱＨＡＧＬＡＱＰＬＲＶＥＬＥＳＰＡＫＳＳＶＬＶＶＧＩＶＩＧＶＬＬＬＴＡＡＡＶＧＧＡＬＬＷＲＲＭＲＳＧＬＰＡＰＷＩＳＬＲＧＤＤＴＧＶＬＬＰＴＰＧＥＡＱＤＡＤＬＫＤＶＮＶＩＰＡＴＡ（配列番号５３０）、または別のＦｃＲｎポリペプチド配列における対応する位置に対して、
Ｆ１１０、Ｌ１１２、Ｎ１１３、Ｅ１１５、Ｅ１１６、Ｆ１１７、Ｍ１１８、Ｎ１１９、Ｄ１２１、Ｌ１２２、Ｔ１２６、Ｗ１２７、Ｇ１２８、Ｄ１３０、Ｗ１３１、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ａ１３４、Ｌ１３５、およびＩ１３７のうちの１つ以上から選択されるアミノ酸残基をコードするコドン中の核酸塩基の変化をもたらすように塩基エディターを標的化する。

【0019】

別の態様では、本開示は、本開示の態様、またはその実施形態のいずれかの方法によって産生された細胞を特徴とする。

【0020】

別の態様では、本開示は、ＩｇＧ受容体およびトランスポーターのＦｃ断片（ＦｃＲｎ）ポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させるための塩基エディター系を特徴とする。塩基エディター系は、（ｉ）１つもしくは複数のガイドポリヌクレオチド、または１つもしくは複数のガイドポリヌクレオチドをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、または塩基エディターをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む。塩基エディター系では、
（ａ）１つ以上のガイドポリヌクレオチドは、表２Ｂに列挙されるスペーサー核酸配列の少なくとも１０から２３個の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含むか、または
（ｂ）１つもしくは複数のガイドポリヌクレオチドは、以下の参照配列：
ＦｃＲｎアミノ酸配列
ＡＥＳＨＬＳＬＬＹＨＬＴＡＶＳＳＰＡＰＧＴＰＡＦＷＶＳＧＷＬＧＰＱＱＹＬＳＹＮＳＬＲＧＥＡＥＰＣＧＡＷＶＷＥＮＱＶＳＷＹＷＥＫＥＴＴＤＬＲＩＫＥＫＬＦＬＥＡＦＫＡＬＧＧＫＧＰＹＴＬＱＧＬＬＧＣＥＬＧＰＤＮＴＳＶＰＴＡＫＦＡＬＮＧＥＥＦＭＮＦＤＬＫＱＧＴＷＧＧＤＷＰＥＡＬＡＩＳＱＲＷＱＱＱＤＫＡＡＮＫＥＬＴＦＬＬＦＳＣＰＨＲＬＲＥＨＬＥＲＧＲＧＮＬＥＷＫＥＰＰＳＭＲＬＫＡＲＰＳＳＰＧＦＳＶＬＴＣＳＡＦＳＦＹＰＰＥＬＱＬＲＦＬＲＮＧＬＡＡＧＴＧＱＧＤＦＧＰＮＳＤＧＳＦＨＡＳＳＳＬＴＶＫＳＧＤＥＨＨＹＣＣＩＶＱＨＡＧＬＡＱＰＬＲＶＥＬＥＳＰＡＫＳＳＶＬＶＶＧＩＶＩＧＶＬＬＬＴＡＡＡＶＧＧＡＬＬＷＲＲＭＲＳＧＬＰＡＰＷＩＳＬＲＧＤＤＴＧＶＬＬＰＴＰＧＥＡＱＤＡＤＬＫＤＶＮＶＩＰＡＴＡ（配列番号５３０）、または別のＦｃＲｎポリペプチド配列における対応する位置に対して、
Ｆ１１０、Ｌ１１２、Ｎ１１３、Ｅ１１５、Ｅ１１６、Ｆ１１７、Ｍ１１８、Ｎ１１９、Ｄ１２１、Ｌ１２２、Ｔ１２６、Ｗ１２７、Ｇ１２８、Ｄ１３０、Ｗ１３１、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ａ１３４、Ｌ１３５、およびＩ１３７のうちの１つ以上から選択されるアミノ酸残基をコードするコドン中の核酸塩基の変化をもたらすよう塩基エディターを標的化する。

【0021】

別の態様では、本開示は、本開示の態様、またはその実施形態のいずれかの塩基エディター系をコードするポリヌクレオチドを特徴とする。

【0022】

別の態様では、本開示は、本開示の態様、またはその実施形態のいずれかのポリヌクレオチドを含むベクターを特徴とする。

【0023】

別の態様では、本開示は、本開示の態様、またはその実施形態のいずれかのポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞を特徴とする。

【0024】

別の態様では、本開示は、本開示の態様、またはその実施形態のいずれかの塩基エディター系、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を含む組成物を特徴とする。

【0025】

別の態様では、本開示は、本開示の態様、またはその実施形態のいずれかの組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を特徴とする。

【0026】

別の態様では、本開示は、免疫グロブリンＧによって媒介される自己免疫障害の治療を必要とする対象において、免疫グロブリンＧによって媒介される自己免疫障害を治療する方法を特徴とする。この方法は、塩基エディター系、または塩基エディター系をコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを対象に投与することによって対象におけるＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させるステップを含み、それによって自己免疫障害を治療する。塩基エディター系は、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドおよび塩基エディターを含む。塩基エディターは、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む。塩基エディター系では、
（ａ）１つもしくは複数のガイドポリヌクレオチドは、表２Ｂに列挙されるスペーサー核酸配列の少なくとも１０から２３個の連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含むか；または
（ｂ）１つもしくは複数のガイドポリヌクレオチドは、以下の参照配列：
ＦｃＲｎアミノ酸配列
ＡＥＳＨＬＳＬＬＹＨＬＴＡＶＳＳＰＡＰＧＴＰＡＦＷＶＳＧＷＬＧＰＱＱＹＬＳＹＮＳＬＲＧＥＡＥＰＣＧＡＷＶＷＥＮＱＶＳＷＹＷＥＫＥＴＴＤＬＲＩＫＥＫＬＦＬＥＡＦＫＡＬＧＧＫＧＰＹＴＬＱＧＬＬＧＣＥＬＧＰＤＮＴＳＶＰＴＡＫＦＡＬＮＧＥＥＦＭＮＦＤＬＫＱＧＴＷＧＧＤＷＰＥＡＬＡＩＳＱＲＷＱＱＱＤＫＡＡＮＫＥＬＴＦＬＬＦＳＣＰＨＲＬＲＥＨＬＥＲＧＲＧＮＬＥＷＫＥＰＰＳＭＲＬＫＡＲＰＳＳＰＧＦＳＶＬＴＣＳＡＦＳＦＹＰＰＥＬＱＬＲＦＬＲＮＧＬＡＡＧＴＧＱＧＤＦＧＰＮＳＤＧＳＦＨＡＳＳＳＬＴＶＫＳＧＤＥＨＨＹＣＣＩＶＱＨＡＧＬＡＱＰＬＲＶＥＬＥＳＰＡＫＳＳＶＬＶＶＧＩＶＩＧＶＬＬＬＴＡＡＡＶＧＧＡＬＬＷＲＲＭＲＳＧＬＰＡＰＷＩＳＬＲＧＤＤＴＧＶＬＬＰＴＰＧＥＡＱＤＡＤＬＫＤＶＮＶＩＰＡＴＡ（配列番号４３６）、または別のＦｃＲｎポリペプチド配列における対応する位置に対して、
Ｆ１１０、Ｌ１１２、Ｎ１１３、Ｅ１１５、Ｅ１１６、Ｆ１１７、Ｍ１１８、Ｎ１１９、Ｄ１２１、Ｌ１２２、Ｔ１２６、Ｗ１２７、Ｇ１２８、Ｄ１３０、Ｗ１３１、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ａ１３４、Ｌ１３５、およびＩ１３７のうちの１つまたは複数から選択されるアミノ酸残基をコードするコドン中の核酸塩基の変化をもたらすように塩基エディターを標的化する。

【0027】

別の態様では、本開示は、本開示の態様、またはその実施形態のいずれかの方法における使用に適し、表２Ａまたは表２Ｂに列挙される配列を含むガイドポリヌクレオチドを含むキットを特徴とする。

【0028】

別の態様では、本開示は、ＩｇＧ受容体およびトランスポーターのＦｃ断片（ＦｃＲｎ）ポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させる方法を特徴とする。この方法は、ＦｃＲｎポリヌクレオチドを塩基エディター系と接触させるステップを含み、それによってＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基を変化させる。塩基エディター系は、ｇＲＮＡ１５８３、ｇＲＮＡ１５７８、ｇＲＮＡ３２６５のうちの１つもしくは複数から選択される１つもしくは複数のガイドポリヌクレオチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチド、ならびに核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、または塩基エディターをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む。

【0029】

別の態様では、本開示は、ｇＲＮＡ１５８３、ｇＲＮＡ１５７８、ｇＲＮＡ３２６５のうちの１つもしくは複数から選択される１つもしくは複数のガイドポリヌクレオチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチド、ならびに核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディター、または塩基エディターをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む塩基エディター系を特徴とする。

【0030】

別の態様では、本開示は、表２Ａまたは表２Ｂに列強される配列を含むガイドポリヌクレオチドを特徴とする。

【0031】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、核酸塩基の変化は、参照配列に対して、ＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされるＦｃＲｎポリペプチドにおける以下のアミノ酸変化：Ｆ１１０Ｌ、Ｆ１１０Ｓ、Ｆ１１０Ｐ、Ｌ１１２Ｐ、Ｎ１１３Ｓ、Ｎ１１３Ｄ、．Ｅ１１５Ｇ、Ｅ１１５Ｋ、Ｅ１１６Ｇ、Ｅ１１６Ｋ、Ｅ１１６Ｑ、Ｆ１１７Ｐ、Ｍ１１８Ｎ、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｉ、Ｍ１１８Ｔ、Ｎ１１９Ｇ、Ｎ１１９Ｄ、Ｎ１１９Ｓ、Ｎ１１９Ｃ、Ｄ１２１Ｇ、Ｌ１２２Ｆ、Ｌ１２２Ａ、Ｌ１２２Ｐ、Ｔ１２６Ｉ、Ｔ１２６Ｓ、Ｔ１２６Ｎ、Ｔ１２６Ａ、Ｗ１２７Ｒ、Ｇ１２８Ｓ、Ｄ１３０Ｇ、Ｄ１３０Ｎ、Ｄ１３０Ｈ、Ｗ１３１Ｒ、Ｗ１３１Ｑ、Ｐ１３２Ｌ、Ｐ１３２Ｓ、Ｐ１３２Ｐ、Ｅ１３３Ｇ、Ａ１３４Ｖ、Ｌ１３５Ｐ、Ｉ１３７Ｖ、Ｉ１３７Ｔのうちの１つまたは複数をもたらす。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、参照配列中のアミノ酸Ｍ１１８またはＷ１３１をコードするコドン中の核酸塩基の変化をもたらすように塩基エディターを標的化する。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、核酸塩基の変化は、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｖ、Ｍ１１８Ｉ、Ｍ１１８Ｔ、Ｗ１３１Ｒ、およびＷ１３１Ｑのうちの１つまたは複数から選択されるＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされるＦｃＲｎポリペプチドにおけるアミノ酸変化をもたらす。

【0032】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ＦｃＲｎポリペプチドにおける１つまたは複数のアミノ酸変化は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４へのＦｃＲｎポリペプチドの結合を低減または消失させる。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ＦｃＲｎポリペプチドにおける１つまたは複数のアミノ酸変化は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４のＦｃ領域へのＦｃＲｎポリペプチドの結合を低減または消失させる。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のアミノ酸変化を含むＦｃＲｎポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４との結合について溶液中で、３０００ｎＭより大きいＫ_Ｄを有する。

【0033】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、変化した核酸塩基を含むＦｃＲｎポリヌクレオチドによってコードされるＦｃＲｎポリペプチドは、アルブミンに結合可能である。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のアミノ酸変化を含むＦｃＲｎポリペプチドは、アルブミンとの結合について溶液中で、２０００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のアミノ酸変化を含むＦｃＲｎポリペプチドは、アルブミンとの結合について溶液中で、１０００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のアミノ酸変化を含むＦｃＲｎポリペプチドの結合は、アルブミンとの結合について溶液中で、５００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する。

【0034】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のアミノ酸変化を含むＦｃＲｎポリペプチドは、アルブミンとの結合について溶液中で、１つまたは複数のアミノ酸変化を含まないことを除いて、同じアミノ酸配列を有する参照ＦｃＲｎポリペプチドのＫ_Ｄの１．５倍以下のＫ_Ｄを有し得る。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のアミノ酸変化を含むＦｃＲｎポリペプチドは、アルブミンとの結合について溶液中で、１つまたは複数のアミノ酸変化を含まないことを除いて、同じアミノ酸配列を有する参照ＦｃＲｎポリペプチドのＫ_Ｄの０．５から１．５倍の間のＫ_Ｄを有し得る。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のアミノ酸変化を含むＦｃＲｎポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４との結合について溶液中で、１つまたは複数のアミノ酸変化を含まないことを除いて、同じアミノ酸配列を有する参照ＦｃＲｎポリペプチドのＫ_Ｄの少なくとも５倍のＫ_Ｄを有し得る。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のアミノ酸変化を含むＦｃＲｎポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４との結合について溶液中で、１つまたは複数のアミノ酸変化を含まないことを除いて、同じアミノ酸配列を有する参照ＦｃＲｎポリペプチドのＫ_Ｄの少なくとも１０倍のＫ_Ｄを有し得る。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のアミノ酸変化を含むＦｃＲｎポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるＳＰＲアッセイなどの適切なアッセイで測定して、検出可能なレベルでＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４に結合しない。

【0035】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基は、少なくとも約２０％の塩基編集効率で変化する。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基は、少なくとも約４０％の塩基編集効率で変化する。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ＦｃＲｎポリヌクレオチドの核酸塩基は、少なくとも約５０％の塩基編集効率で変化する。

【0036】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、デアミナーゼドメインは、ＤＮＡのシチジンまたはアデニンを脱アミノ化することができる。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、デアミナーゼドメインは、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメインである。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、アデノシンデアミナーゼは、ＦｃＲｎポリヌクレオチドにおける標的Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、シチジンデアミナーゼは、ＦｃＲｎポリヌクレオチドにおける標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換する。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼドメインまたはその誘導体である。

【0037】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、塩基エディターは、ＢＥ４塩基エディターである。

【0038】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、アデノシンデアミナーゼドメインは、ＴａｄＡデアミナーゼドメインである。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、デアミナーゼドメインは、アデノシンデアミナーゼドメインである。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ^＊８またはＴａｄ^＊９バリアントである。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ^＊８．１、ＴａｄＡ^＊８．２、ＴａｄＡ^＊８．３、ＴａｄＡ^＊８．４、ＴａｄＡ^＊８．５、ＴａｄＡ^＊８．６、ＴａｄＡ^＊８．７、ＴａｄＡ^＊８．８、ＴａｄＡ^＊８．９、ＴａｄＡ^＊８．１０、ＴａｄＡ^＊８．１１、ＴａｄＡ^＊８．１２、ＴａｄＡ^＊８．１３、ＴａｄＡ^＊８．１４、ＴａｄＡ^＊８．１５、ＴａｄＡ^＊８．１６、ＴａｄＡ^＊８．１７、ＴａｄＡ^＊８．１８、ＴａｄＡ^＊８．１９、ＴａｄＡ^＊８．２０、ＴａｄＡ^＊８．２１、ＴａｄＡ^＊８．２２、ＴａｄＡ^＊８．２３、またはＴａｄＡ^＊８．２４である。

【0039】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、デアミナーゼドメインは、単量体またはヘテロ二量体である。

【0040】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ｎａｐＤＮＡｂｐドメインは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２である。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ｎａｐＤＮＡｂｐドメインは、ヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントである。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ｎａｐＤＮＡｂｐドメインは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦポリヌクレオチド、またはそれらの機能的部分を含む。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ｎａｐＤＮＡｂｐドメインは、デッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含む。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ｎａｐＤＮＡｂｐドメインは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、またはそれらのバリアントである。

【0041】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ｎａｐＤＮＡｂｐドメインは、変化したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を有するＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９のバリアントを含む。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９は、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＮＧＲＲＴ、およびＮＮＮＲＲＴのうちの１つまたは複数から選択されるＰＡＭ配列に対する特異性を有し、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＲはＡまたはＧである。

【0042】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ｎａｐＤＮＡｂｐドメインは、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９を含む。

【0043】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、塩基エディターは、１つもしくは複数のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含むか、または方法は、塩基エディターとトランスで、細胞内でＵＧＩを発現させるステップをさらに含む。

【0044】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、塩基エディターは、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ＮＬＳは、二分ＮＬＳである。

【0045】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列のうちの１つを含むスキャフォールドを含む：
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（ＳｐＣａｓ９スキャフォールド；配列番号３１７）、または
ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵ（ＳａＣａｓ９スキャフォールド；配列番号４３６）。
本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含む。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の改変ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にある。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の改変ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチドである。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、１９から２３ヌクレオチドのみを含むスペーサーを含む。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、１９または２０ヌクレオチドのみを含むスペーサーを含む。

【0046】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、塩基エディターは、デアミナーゼドメイン、ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン、およびガイドポリヌクレオチドを含む複合体を含むか、または塩基エディターは、デアミナーゼドメインに融合したｎａｐＤＮＡｂｐドメインを含む融合タンパク質である。

【0047】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ＦｃＲｎポリヌクレオチドは細胞内にある。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、細胞は、肝細胞、内皮細胞、骨髄性細胞、または上皮細胞である。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏである。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、細胞は対象内にある。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、細胞は哺乳動物細胞である。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、細胞はヒト細胞である。

【0048】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、対象は哺乳動物である。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、哺乳動物はヒトである。

【0049】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、塩基エディターは、１つもしくは複数のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含むか、または塩基エディター系は、塩基エディターとトランスでＵＧＩをさらに含む。

【0050】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ベクターは、脂質ナノ粒子を含む。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、脂質ナノ粒子は、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、脂質－ポリエチレングリコールコンジュゲート、ならびにそれらの組合せのうちの１つまたは複数から選択される脂質を含む脂質単分子層を含む。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、脂質単分子層はＰＥＧ化脂質を含む。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、脂質単分子層はコレステロールをさらに含む。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、脂質ナノ粒子は、Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（アルギノイルアミノ）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミニウムクロリドまたはジステアロイルアルギニルアンモニウムクロリド］（ＤＳＡＡ）；Ｎ，Ｎ－ジミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ６－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド（ＤＭＧＬＡ）；Ｎ，Ｎ－ジミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ２－グアニジノ－Ｌ－リシニル］アミノエチルアンモニウムクロリド；Ｎ，Ｎ－ジミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ２，Ｎ６－ジ－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド；Ｎ，Ｎ－ジ－ステアロイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ６－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド；Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ν，Ν－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｉ）；Ｎ－（ｌ，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；ｌ，３－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン、Ｎ－（ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１アンモニウムトリフルオロ－アセテート（ＤＯＳＰＡ）；ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ；ＤＭＤＨＰ；３－ｐ［４Ｎ－（Ｈ８Ｎ－ジグアニジノスペルミジン）－カルバモイル］コレステロール（ＢＧＳＣ）；３－Ｐ［Ｎ，Ｎ－ジグアニジノエチル－アミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＢＧＴＣ）；Ｎ，Ｎ＼Ｎ２，Ｎ３テトラ－メチルテトラパルミチルスペルミン（セルフェクチン）；Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシル－３－テトラデシル－アミノプロピオン－アミジン（ＣＬＯＮフェクチン）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；ｌ，３－ジオレオイルオキシ－２－（６－カルボキシスペルミル）－プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；４－（２，３－ビス－パルミトイルオキシ－プロピル）－１－メチル－ｌＨ－イミダゾール（ＤＰＩＭ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２，３－ジオレオイルオキシ－１，４－ブタンジアンモニウムヨージド）（Ｔｆｘ－５０）；１，２ジオレオイル－３－（４’－トリメチルアンモニオ）ブタノール－ｓｎ－グリセロール（ＤＯＢＴ）；トリメチルアンモニウム基が、ブタノールのスペーサーアームを介して、二重鎖（ＤＯＴＢの場合）またはコレステリル基（ＣｈＯＴＢの場合）のいずれかに結合しているコレステリル（４’トリメチルアンモニア）ブタノエート（ＣｈＯＴＢ）；ＤＬ－ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアミノプロピル－Ｐ－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩ）；ＤＬ－ｌ，２－０－ジオレオイル－３－ジメチルアミノプロピル－Ｐ－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩＥ）；ｌ，２－ジオレオイル－３－スクシニル－ｓｎ－グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）；コレステリルヘミスクシネートエステル（ＣｈＯＳＣ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）；ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）；コレステリル－３Ｐ－カルボキシル－アミド－エチレントリメチルアンモニウムヨージド；ｌ－ジメチルアミノ－３－トリメチルアンモニオ－ＤＬ－２－プロピル－コレステリルカルボキシレートヨージド；コレステリル－３－β－カルボキシアミドエチレンアミン；コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシンアミド－エチレントリメチルアンモニウムヨージド；ｌ－ジメチルアミノ－３－トリメチルアンモニオ－ＤＬ－２－プロピル－コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシネートヨージド；２－（２－トリメチルアンモニオ）－エチルメチルアミノエチル－コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシネートヨージド；３－β－Ν－（ポリエチレンイミン）－カルバモイルコレステロール、ＤＣ－コレステロール；Ｎ４－コレステリル－スペルミンＨＣｌ塩（ＧＬ６７）；Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）；およびそれらの組合せのうちの１つまたは複数から選択されるイオン化カチオン性脂質を含む。

【0051】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ベクターは、ポリマーナノ粒子を含む。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ベクターは、ウイルスベクターである。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。

【0052】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、障害は、重症筋無力症（ｇＭＧ）、温式自己免疫性溶血性貧血（ｗＡＩＨＡ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、グレーブス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、尋常性天疱瘡、ならびに胎児および新生児の溶血性疾患（ＨＤＦＮ）のうちの１つまたは複数から選択される。

【0053】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、塩基エディターは、１つもしくは複数のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含むか、または方法は、塩基エディターとトランスで細胞内でＵＧＩを発現させるステップをさらに含む。

【0054】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、投与は局所投与である。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、投与は全身投与である。

【0055】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、塩基エディター系は、ベクターを使用して対象に投与される。

【0056】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ベクターは脂質ナノ粒子である。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、ベクターは肝臓を標的とする。

【0057】

本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、対象は哺乳動物である。本開示の態様、またはその実施形態のいずれかでは、哺乳動物はヒトである。

【0058】

これらおよび他の目的、特徴、実施形態、および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲を読めば、当業者には明らかになるであろう。

【0059】

定義
以下の用語は当該技術分野において十分に理解されていると考えられるが、現在開示されている主題の説明を容易にするために定義を示す。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本明細書で開示される主題が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

【0060】

以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版、１９９４年）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ版、１９８８年）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１年）；およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１年）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に指定のない限り、以下に属する意味を有する。

【0061】

別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分の量、反応条件などの特性、その他を表すすべての数値は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、反対の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載された数値パラメーターは、現在開示されている主題によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。

【0062】

本明細書を通じて与えられるすべての最大数値限定は、あたかもより低い数値限定が本明細書に明示的に記載されているかのように、すべてのそのようなより低い数値限定を含むことが理解されるべきである。本明細書を通じて与えられるすべての最小数値限定は、あたかもより高い数値限定が本明細書に明示的に記載されているかのように、すべてのそのようなより高い数値限定を含む。本明細書を通じて与えられるすべての数値範囲は、あたかもより狭い数値範囲がすべて本明細書に明示的に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲に含まれるすべてのそのようなより狭い数値範囲を含む。「アデニン」または「９Ｈ－プリン－６－アミン」とは、分子式Ｃ_５Ｈ_５Ｎ_５を有し、構造

【0063】

【化1】

【0064】

を有し、ＣＡＳ番号７３－２４－５に対応するプリン核酸塩基を意味する。

【0065】

「アデノシン」または「４－アミノ－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－２－イル］ピリミジン－２（１Ｈ）－オン」とは、構造

【0066】

【化2】

【0067】

を有し、ＣＡＳ番号６５－４６－３に対応する、グリコシド結合を介してリボース糖に結合したアデニン分子を意味する。その分子式はＣ_１０Ｈ_１３Ｎ_５Ｏ_４である。

【0068】

「アデノシンデアミナーゼ」または「アデニンデアミナーゼ」とは、アデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンからイノシンまたはデオキシアデノシンからデオキシイノシンへの加水分解的脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する。本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化型アデノシンデアミナーゼ）は、藻類、細菌、真菌、植物、無脊椎動物（例えば、昆虫）、および脊椎動物（例えば、両生類、哺乳動物）を含むが、これらに限定されない、任意の生物（例えば、真核生物、原核生物）に由来し得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、１つまたは複数の変化を有するアデノシンデアミナーゼバリアントであり、標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）中のアデニンおよびシトシンの両方を脱アミノ化することができ、「デュアルデアミナーゼ」と称され得る。デュアルデアミナーゼの非限定的な例としては、ＰＣＴ／ＵＳ２２／２２０５０に記載されているものが挙げられる。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＤＮＡのアデニンおよびシトシンの両方を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、一本鎖ＤＮＡのアデニンおよびシトシンの両方を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＲＮＡのアデニンおよびシトシンの両方を脱アミノ化することができる。実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１８１９２、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４９９７５、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１に記載されているものから選択される。

【0069】

「アデノシンデアミナーゼ活性」とは、ポリヌクレオチドにおけるアデニンまたはアデノシンからグアニンへの脱アミノ化を触媒することを意味する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼバリアントは、アデノシンデアミナーゼ活性（例えば、参照アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ^＊８．２０またはＴａｄＡ^＊８．１９）の活性の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）を維持する。

【0070】

「アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）」とは、アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターを意味する。

【0071】

「アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）ポリヌクレオチド」とは、ＡＢＥをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0072】

「アデノシン塩基エディター８（ＡＢＥ８）ポリペプチド」または「ＡＢＥ８」とは、表１５に列挙される変化の１つもしくは複数、表１５に列挙される変化の組合せの１つ、または表１５に列挙されるアミノ酸位置の１つもしくは複数における変化を含む、アデノシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼバリアントを含む、本明細書に定義される塩基エディターを意味し、そのような変化は、以下の参照配列：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号１）、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する位置に関連する。実施形態では、ＡＢＥ８は、配列番号１のアミノ酸８２および／または１６６における変化を含む。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、参照配列に対して、本明細書に記載されるようなさらなる変化を含む。

【0073】

「アデノシン塩基エディター８（ＡＢＥ８）ポリヌクレオチド」とは、ＡＢＥ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0074】

「投与する」とは、本明細書において、本明細書に記載される１つまたは複数の組成物を患者または対象に提供することを指す。例として、限定されないが、組成物の投与（例えば、注射）は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって実施され得る。１つまたは複数のこのような経路が利用され得る。非経口投与は、例えば、ボーラス注射によってでもよいか、または時間をかけて徐々に灌流することによってでもよい。一部の実施形態では、非経口投与は、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、腫瘍内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下（ｓｕｂｃｕｔｉｃｕｌａｒｌｙ）、関節内、被膜下、くも膜下、および胸骨内による注入または注射を含む。あるいは、または同時に、投与は経口経路によってでもよい。実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数の組成物は、網膜下または中心窩下注射によって投与される。一部の場合では、網膜下注射は、中心窩に水疱を形成する。

【0075】

「薬剤（ａｇｅｎｔ）」とは、任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。

【0076】

「アルブミンポリペプチド」とは、以下に提供される、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ２３７５４．１と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質、またはＦｃＲｎポリペプチドに結合可能なその断片を意味する。
＞ＣＡＡ２３７５４．１血清アルブミン［ホモサピエンス］
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＫＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号４２５）。

【0077】

「アルブミンポリヌクレオチド」とは、アルブミンポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにその発現に関連するイントロン、エクソン、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、および調節配列、またはそれらの断片を意味する。実施形態では、アルブミンポリヌクレオチドは、アルブミン発現に関連する、および／またはそれに必要なゲノム配列、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または遺伝子である。ホモサピエンス由来の例示的なアルブミンヌクレオチド配列が以下に提供される（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｖ００４９５．１：７６～１９０５）：
ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＡＧＣＴＣＧＧＣＴＴＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＴＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＣＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＡＴＴＧＧＴＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＴＡＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＧＧＴＡＴＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＡＴＧＴＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＣＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＧＴＴＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＡＴＣＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＧＡＡＴＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＡＣＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＣＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴＡＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＡＧＴＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＴＡＴＴＡＧＴＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＴＡＴＣＴＡＴＣＣＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＧＴＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＧＣＧＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＡＣＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＣＡＣＡＣＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡ（配列番号４２６）。

【0078】

「変化」または「改変」とは、本明細書に記載されるものなどの標準的な当該技術分野で公知の方法によって検出される、検体、遺伝子またはポリペプチドの発現レベル、構造または活性の変化を意味する。本明細書で使用される場合、変化は、発現レベルの変化（例えば、増加または減少）を含む。実施形態では、発現レベルの増加または減少は、１０％、２５％、４０％、５０％またはそれ以上である。一部の実施形態では、変化は、（例えば、遺伝子操作による）核酸塩基またはアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む。

【0079】

「改善する」とは、疾患の発症または進行を減少させる、抑制する、減衰させる、軽減する、停止させる、または安定化させることを意味する。

【0080】

「アナログ」とは、同一ではないが、類似した機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチドアナログは、対応する天然に存在するポリペプチドの生物活性を保持する一方で、天然に存在するポリペプチドと比較してアナログの機能を増強する特定の生化学的改変を有する。このような生化学的改変は、例えば、リガンド結合を変化させることなく、アナログのプロテアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を増加させることができる。アナログは非天然アミノ酸を含んでもよい。

【0081】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原に特異的に結合するか、または特定の抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン分子を指し、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重、三重および四重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ）、ならびに例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒｌｇＧ、およびｓｃＦｖ断片を含む、抗体の抗原結合断片を含む、ポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作された、およびその他の改変形態の抗体が含まれる。別段の指示がない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、無傷分子、ならびに標的タンパク質に特異的に結合することができる抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を含む）の両方を含むことを意味する。本明細書で使用される場合、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片とは、無傷抗体のＦｃ断片を欠く抗体断片を指す。

【0082】

抗体（免疫グロブリン）は、ジスルフィド結合によって一緒に連結された２つの重鎖、および２つの軽鎖を含み、各軽鎖は、「Ｙ」形状の構造でジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖と連結されている。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に複数の定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）は重鎖の可変ドメイン（ＶＬ）と整列しており、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列している。軽鎖および重鎖の各対の可変ドメインは抗原結合部位を形成する。重鎖のアイソタイプ（ガンマ、アルファ、デルタ、イプシロンまたはミュー）により、免疫グロブリンのクラス（それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ）が決定される。軽鎖は、すべての抗体クラスにおいて見出される２つのアイソタイプ（カッパ（κ）またはラムダ（λ））のいずれかである。「抗体」または「抗体（複数可）」という用語には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの無傷抗体、ならびに標的タンパク質に特異的に結合することができる、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片などの、タンパク質分解部分またはその断片が含まれる。抗体には、キメラ抗体；組換えおよび操作された抗体、ならびにそれらの抗原結合断片が含まれ得る。軽鎖および重鎖の両方の可変領域の全体または本質的に全体を含む例示的な機能的抗体断片は、以下のように定義される：（ｉ）２つの鎖として表される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域からなる、遺伝子操作された断片として定義される、Ｆｖ；（ｉｉ）適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む、遺伝子操作された一本鎖分子である、一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）；（ｉｉｉ）無傷抗体を酵素パパインで処理して、無傷軽鎖、ならびに重鎖の可変ドメインおよびＣＨ１ドメインからなる重鎖のＦｄ断片を生じることによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含む抗体分子の断片である、Ｆａｂ；（ｉｖ）無傷抗体を酵素ペプシンで処理し、次いで還元することによって得られる（１つの抗体分子あたり２つのＦａｂ’断片が生成される）、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含む抗体分子の断片である、Ｆａｂ’；ならびに（ｖ）無傷抗体を酵素ペプシンで処理することによって得られる（すなわち、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持されるＦａｂ’断片の二量体）、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含む抗体分子の断片である、Ｆ（ａｂ’）２。

【0083】

「塩基エディター（ＢＥ）」または「核酸塩基エディターポリペプチド（ＮＢＥ）」とは、ポリヌクレオチドに結合し、核酸塩基改変活性を有する薬剤を意味する。様々な実施形態では、塩基エディターは、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と合わさった核酸塩基改変ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）およびポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を含む。塩基エディターの代表的な核酸およびタンパク質配列には、配列番号２～１１に対応するものなどの、配列表に提供される任意の塩基エディター配列と約または少なくとも約８５％の配列同一性を有する配列が含まれる。

【0084】

「ＢＥ４シチジンデアミナーゼ（ＢＥ４）ポリペプチド」とは、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメイン、シチジンデアミナーゼドメイン、および２つのウラシルグリコシラーゼ阻害剤ドメイン（ＵＧＩ）を含む塩基エディターを意味する。実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）ポリペプチドである。シチジンデアミナーゼドメインの非限定的な例としては、ｒＡＰＯＢＥＣ、ｐｐＡＰＯＢＥＣ、ＲｒＡ３Ｆ、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、およびＳｓＡＰＯＢＥＣ３Ｂが挙げられる。

【0085】

「ＢＥ４シチジンデアミナーゼ（ＢＥ４）ポリヌクレオチド」とは、ＢＥ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0086】

「塩基編集活性」とは、ポリヌクレオチド内の塩基を化学的に変化させる作用を意味する。一実施形態では、第１の塩基が第２の塩基に変換される。一実施形態では、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性であり、例えば、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換する。別の実施形態では、塩基編集活性は、アデノシンまたはアデニンデアミナーゼ活性であり、例えば、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する。

【0087】

「塩基エディター系」という用語は、標的ヌクレオチド配列の核酸塩基を編集するための分子間複合体を指す。様々な実施形態では、塩基エディター（ＢＥ）系は、（１）標的ヌクレオチド配列中の核酸塩基を脱アミノ化するためのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン、デアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ）；および（２）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインと合わさった１つまたは複数のガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を含む。様々な実施形態では、塩基エディター（ＢＥ）系は、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼから選択される核酸塩基エディタードメイン、および核酸配列特異的結合活性を有するドメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディター系は、（１）標的ヌクレオチド配列中の１つまたは複数の核酸塩基を脱アミノ化するための、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む塩基エディター（ＢＥ）；ならびに（２）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと合わさった１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデニンまたはアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデニンもしくはアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）またはシチジンもしくはシトシン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディター系（例えば、シチジンデアミナーゼを含む塩基エディター系）は、イノシン塩基除去修復系を阻害するウラシルグリコシラーゼ阻害剤または他の薬剤もしくはペプチド（例えば、ＷＯ２０２２０１５９６９に提供されるようなウラシル安定化タンパク質であり、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含む。

【0088】

「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ドメイン」という用語は、Ｃａｓ９タンパク質、またはその断片（例えば、Ｃａｓ９、および／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインの活性、不活性、または部分的に活性なＤＮＡ切断ドメインを含むタンパク質）を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはまた、ｃａｓｎｌヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）関連ヌクレアーゼとも称されることがある。

【0089】

本明細書で互換的に使用される場合、「コード配列」または「タンパク質コード配列」という用語は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのセグメントを指す。コード配列はまた、オープンリーディングフレームとも称され得る。領域または配列は、開始コドンによって５’末端の近位に、および終止コドンによって３’末端の近位に境界付けられている。本明細書に記載される塩基エディターで有用な終止コドンとしては、以下が挙げられる：

【0090】

【表A】

【0091】

「複合体」とは、相互作用が分子間力に依存する２つ以上の分子の組合せを意味する。分子間力の非限定的な例としては、共有結合的相互作用および非共有結合的相互作用が挙げられる。非共有結合的相互作用の非限定的な例としては、水素結合、イオン結合、ハロゲン結合、疎水性結合、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子間相互作用、双極子誘起双極子相互作用、およびロンドン分散力）、ならびにπ効果が挙げられる。実施形態では、複合体は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または１つもしくは複数のポリペプチドと１つもしくは複数のポリヌクレオチドの組合せを含む。一実施形態では、複合体は、会合して塩基エディター（例えば、Ｃａｓ９などの核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質、およびデアミナーゼを含む塩基エディター）およびポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を形成する１つまたは複数のポリペプチドを含む。実施形態では、複合体は、水素結合によって一緒に保持される。塩基エディターの１つまたは複数の成分（例えば、デアミナーゼ、または核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質）は、共有結合的または非共有結合的に会合し得ることを理解されたい。一例として、塩基エディターは、（例えば、ペプチド結合により）核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質に共有結合したデアミナーゼを含み得る。あるいは、塩基エディターは、非共有結合的に会合するデアミナーゼおよび核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質を含み得る（例えば、塩基エディターの１つまたは複数の成分がトランスで供給され、直接またはタンパク質もしくは核酸などの別の分子を介して会合する場合）。実施形態では、複合体の１つまたは複数の成分は、水素結合によって一緒に保持される。

【0092】

「シトシン」または「４－アミノピリミジン－２（１Ｈ）－オン」とは、分子式Ｃ_４Ｈ_５Ｎ_３Ｏを有し、構造

【0093】

【化3】

【0094】

を有し、ＣＡＳ番号７１－３０－７に対応する、プリン核酸塩基を意味する。

【0095】

「シチジン」とは、構造

【0096】

【化4】

【0097】

を有し、ＣＡＳ番号６５－４６－３に対応する、グリコシド結合を介してリボース糖に結合したシトシン分子を意味する。その分子式はＣ_９Ｈ_１３Ｎ_３Ｏ_５である。

【0098】

「シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）」とは、シチジンデアミナーゼを含む塩基エディターを意味する。

【0099】

「シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）ポリヌクレオチド」とは、ＣＢＥをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0100】

「シチジンデアミナーゼ」または「シトシンデアミナーゼ」とは、シチジンまたはシトシンを脱アミノ化することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。実施形態では、シチジンまたはシトシンは、ポリヌクレオチドに存在する。一実施形態では、シチジンデアミナーゼは、シトシンをウラシルに、または５－メチルシトシンをチミンに変換する。「シチジンデアミナーゼ」および「シトシンデアミナーゼ」という用語は、本出願を通して互換的に使用される。ウミヤツメ（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ）シトシンデアミナーゼ１（ＰｍＣＤＡ１）（配列番号１３～１４）、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）（配列番号１５～２１）、およびＡＰＯＢＥＣ（例えば、配列番号１２～６１）は、例示的なシチジンデアミナーゼである。さらなる例示的なシチジンデアミナーゼ（ＣＤＡ）配列は、配列番号６２～６６および配列番号６７～１８９として配列表に提供される。シチジンデアミナーゼの非限定的な例としては、ＰＣＴ／ＵＳ２０／１６２８８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２１８７８、１８０８０２－０２１８０４／ＰＣＴ、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４８９６９、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４に記載されているものが挙げられる。「シトシンデアミナーゼ活性」とは、シトシンまたはシチジンの脱アミノ化を触媒することを意味する。一実施形態では、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ基をカルボニル基に変換する。実施形態では、シトシンデアミナーゼは、シトシンをウラシルに（すなわち、ＣをＵに）、または５－メチルシトシンをチミンに（すなわち、５ｍＣをＴに）変換する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるシトシンデアミナーゼは、参照シトシンデアミナーゼに対して増加したシトシンデアミナーゼ活性（例えば、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれ以上）を有する。

【0101】

本明細書で使用される場合、「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」という用語は、脱アミノ化反応を触媒するタンパク質またはその断片を指す。

【0102】

「検出する」とは、検出される検体の存在、非存在または量を特定することを指す。一実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける配列変化が検出される。別の実施形態では、インデルの存在が検出される。

【0103】

「疾患」とは、細胞、組織、または臓器の正常な機能を損傷または妨害するあらゆる状態または障害を意味する。例示的な疾患には、ＩｇＧによって媒介される自己免疫障害などの自己免疫障害が含まれる。自己免疫障害の非限定的な例としては、重症筋無力症（ｇＭＧ）、温式自己免疫性溶血性貧血（ｗＡＩＨＡ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、グレーブス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、尋常性天疱瘡、ならびに胎児および新生児の溶血性疾患（ＨＤＦＮ）が挙げられる。

【0104】

「有効量」とは、未治療（処置）の患者もしくは疾患を有していない個体、すなわち、健康な個体と比較して、疾患の症状を改善するのに必要な薬剤もしくは活性化合物、例えば、本明細書に記載される塩基エディターの量、または所望の生物学的応答を誘発するのに十分な薬剤もしくは活性化合物の量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実施するために使用される活性化合物の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、および一般的な健康状態に応じて異なる。最終的には、主治医または獣医師が適切な量および投薬量レジメンを決定する。そのような量は「有効」量と称される。一実施形態では、有効量は、細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの細胞）内の目的の遺伝子に変化を導入するのに十分な本発明の塩基エディターの量である。一実施形態では、有効量は、治療効果を達成するために必要な塩基エディターの量である。そのような治療効果は、対象、組織または臓器のすべての細胞における目的の遺伝子を変化させるのに十分である必要はなく、対象、組織または臓器に存在する細胞の約１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％またはそれ以上の目的の遺伝子を変化させるだけで十分である。一実施形態では、有効量は、疾患の１つまたは複数の症状を改善するのに十分である。

【0105】

「ＩｇＧについての新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）ポリペプチド」または「ＩｇＧ受容体およびトランスポーターのＦｃ断片（ＦＣＧＲＴ）ポリペプチド」とは、アルブミンに結合可能なＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１２９４９１またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。例示的なＦｃＲｎポリペプチド配列が以下に提供される。本開示を通して、ＦｃＲｎポリペプチド配列内のアミノ酸位置（例えば、Ｅ１１５（１３８）またはＥ１１５）に対して参照がなされる。別段の指示がない限り、このような参照は以下の配列を参照してなされ、括弧外の位置番号は、シグナルペプチドに対応する最初の２３個のアミノ酸が番号付けに含まれない、以下のＦｃＲｎ配列内の位置に対応し、括弧内の位置は、最初の２３個のアミノ酸が番号付けに含まれる、以下のＦｃＲｎ配列内の位置に対応する。

【0106】

【表B】

【0107】

「ＩｇＧ受容体およびトランスポーターのＦｃ断片（ＦｃＲｎ；ＦＣＧＲＴ）ポリヌクレオチド」または「ＩｇＧ受容体およびトランスポーターのＦｃ断片（ＦＣＧＲＴ）ポリヌクレオチド」は、ＦｃＲｎポリペプチド、ならびにその発現に関連するイントロン、エクソン、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、および調節配列をコードする核酸分子、またはそれらの断片を意味する。実施形態では、ＦｃＲｎポリヌクレオチドは、ＦｃＲｎ発現に関連する、および／またはそれに必要なゲノム配列、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または遺伝子である。ホモサピエンス由来の例示的なＦｃＲｎヌクレオチド配列が以下に提供される。ホモサピエンス由来のさらに例示的なＦｃＲｎヌクレオチド配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌ受託番号ＥＮＳＧ０００００２１１８９３に提供されている。
1 aggatgtgag agaggaactg gggtctccag tcacgggagc caggagccgg ccagggccgc
61 aggcaggaag ggagcgaggc tgaagggaac gtcgtcctct cagcatgggg gtcccgcggc
121 ctcagccctg ggcgctgggg ctcctgctct ttctccttcc tgggagcctg ggcgcagaaa
181 gccacctctc cctcctgtac caccttaccg cggtgtcctc gcctgccccg gggactcctg
241 ccttctgggt gtccggctgg ctgggcccgc agcagtacct gagctacaat agcctgcggg
301 gcgaggcgga gccctgtgga gcttgggtct gggaaaacca ggtgtcctgg tattgggaga
361 aagagaccac agatctgagg atcaaggaga agctctttct ggaagctttc aaagctttgg
421 ggggaaaagg tccctacact ctgcagggcc tgctgggctg tgaactgggc cctgacaaca
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541 agcagggcac ctggggtggg gactggcccg aggccctggc tatcagtcag cggtggcagc
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781 tctaccctcc ggagctgcaa cttcggttcc tgcggaatgg gctggccgct ggcaccggcc
841 agggtgactt cggccccaac agtgacggat ccttccacgc ctcgtcgtca ctaacagtca
901 aaagtggcga tgagcaccac tactgctgca ttgtgcagca cgcggggctg gcgcagcccc
961 tcagggtgga gctggaatct ccagccaagt cctccgtgct cgtggtggga atcgtcatcg
1021 gtgtcttgct actcacggca gcggctgtag gaggagctct gttgtggaga aggatgagga
1081 gtgggctgcc agccccttgg atctcccttc gtggagacga caccggggtc ctcctgccca
1141 ccccagggga ggcccaggat gctgatttga aggatgtaaa tgtgattcca gccaccgcct
1201 gaccatccgc cattccgact gctaaaagcg aatgtagtca ggcccctttc atgctgtgag
1261 acctcctgga acactggcat ctctgagcct ccagaagggg ttctgggcct agttgtcctc
1321 cctctggagc cccgtcctgt ggtctgcctc agtttcccct cctaatacat atggctgttt
1381 tccacctcga taatataaca cgagtttggg cccgaatcag tgtgttctca tcatttttca
1441 ggcaggggag gtaagggaat aagtcggggg actgaatggc ggctgggcct cggatctctc
1501 ctacaggtaa c（配列番号４２８）
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この部分は、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含む。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、断片は機能的断片である。「ガイドポリヌクレオチド」とは、標的配列に特異的であり、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）と複合体を形成することができるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド複合体を意味する。実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。ｇＲＮＡは、２つ以上のＲＮＡの複合体として、または単一のＲＮＡ分子として存在することができる。

【0108】

「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸塩基間の水素結合を意味し、この水素結合は、ワトソン－クリック水素結合、フーグスティーン水素結合、または逆フーグスティーン水素結合であり得る。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対になる相補的核酸塩基である。

【0109】

「免疫グロブリンガンマ１（ＩｇＧ１）ポリペプチド」とは、以下に提供される、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ７５０３０．１と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質、または免疫調節活性を有するその断片を意味する。ホモサピエンス由来の例示的なＩｇＧ１アミノ酸配列が図２Ａに提供される
＞ＣＡＡ７５０３０．１免疫グロブリンカッパ重鎖［ホモサピエンス］
ＭＥＦＧＬＲＷＶＦＬＶＡＩＬＫＤＶＱＣＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＹＳＳＦＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＶＷＶＳＲＩＮＰＤＧＲＩＴＶＹＡＤＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＴＲＦＬＥＬＴＳＲＧＱＭＤＱＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４２９）。

【0110】

「免疫グロブリンガンマ１（ＩｇＧ１）ポリヌクレオチド」とは、ＩｇＧ１ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにその発現に関連するイントロン、エクソン、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、および調節配列、またはそれらの断片を意味する。実施形態では、ＩｇＧ１ポリヌクレオチドは、ＩｇＧ１発現に関連する、および／またはそれに必要なゲノム配列、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または遺伝子である。ホモサピエンス由来の例示的なＩｇＧ１ヌクレオチド配列が以下に提供される（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｙ１４７３５．１：３６～１４５７）：
＞Ｙ１４７３５．１：３６～１４５７免疫グロブリンカッパ重鎖についてのホモサピエンスｍＲＮＡ
ＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＣＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＧＡＧＡＡＴＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＧＣＧＧＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＣＴＧＧＡＧＴＴＧＡＣＴＴＣＴＡＧＧＧＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ（配列番号４３０）。

【0111】

「免疫グロブリンガンマ２（ＩｇＧ２）ポリペプチド」とは、以下に提供される、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ５９３９３．１と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質、または免疫調節活性を有するその断片を意味する。ホモサピエンス由来の例示的なＩｇＧ２アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨ００５２７３．２：２１６～５０９、９０２～９３７、１０５６～１３８２、１４８０～１８０２を含み、以下、および図２Ａに提供される：
＞ＡＡＢ５９３９３．１免疫グロブリンガンマ－２重鎖、部分的［ホモサピエンス］
ＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４３１）。

【0112】

＞例示的なＩｇＧ２アミノ酸配列
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４３２）。

【0113】

「免疫グロブリンガンマ２（ＩｇＧ２）ポリヌクレオチド」とは、ＩｇＧ２ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにその発現に関連するイントロン、エクソン、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、および調節配列、またはそれらの断片を意味する。実施形態では、ＩｇＧ２ポリヌクレオチドは、ＩｇＧ２発現に関連する、および／またはそれに必要なゲノム配列、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または遺伝子である。ホモサピエンス由来の例示的なＩｇＧ２ヌクレオチド配列が以下に提供される（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＨ００５２７３．２：２１６～５０９、９０２～９３７、１０５６～１３８２、１４８０～１８０２）：
＞ＡＨ００５２７３．２：２１６～５０９、９０２～９３７、１０５６～１３８２、１４８０～１８０２ホモサピエンス免疫グロブリンガンマ－２重鎖（ＩｇＨ）、免疫グロブリンガンマ－４重鎖（ＩｇＨ）、免疫グロブリンイプシロン鎖定常領域（ＩｇＨ）、および免疫グロブリンアルファ－２重鎖（ＩｇＨ）遺伝子、部分的ｃｄｓ
ＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ（配列番号４３３）。

【0114】

「増加する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、もしくは１００％、または約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、もしくは約１００倍のプラスの変化を意味する。

【0115】

「塩基修復の阻害剤」、「塩基修復阻害剤」、「ＩＢＲ」という用語、またはそれらの文法的同等物は、核酸修復酵素、例えば、塩基除去修復酵素の活性を阻害することができるタンパク質を指す。

【0116】

「インテイン」とは、タンパク質のスプライシングとして知られているプロセスで、それ自体を切り出し、残りの断片（エクステイン）をペプチド結合で結合することができるタンパク質の断片である。

【0117】

「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、天然の状態で見出されるような、通常それに付随する成分が様々な程度で含まれていない物質を指す。「単離する」は、元の供給源または周囲環境からの分離の程度を示す。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を意味する。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、他の物質を十分に含まないため、不純物がタンパク質の生物学的特性に重大な影響を与えないか、または他の悪影響を引き起こすことはない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合には、細胞物質、ウイルス物質、もしくは培養培地を実質的に含まない場合に、または化学合成される場合には、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない場合に、精製されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル内に本質的に１つのバンドを生じさせることを意味し得る。改変、例えば、リン酸化またはグリコシル化を受ける可能性のあるタンパク質の場合、異なる改変により異なる単離タンパク質が生じる場合があり、これらは個別に精製することができる。

【0118】

「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいてその遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸分子を意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクター；自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるか；あるいは、他の配列から独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるｃＤＮＡまたはゲノムもしくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。さらに、この用語には、ＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子、および追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含まれる。

【0119】

「単離されたポリペプチド」とは、天然に付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然に会合しているタンパク質および天然に存在する有機分子を少なくとも６０重量％含まない場合、単離されている。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然源から抽出することによって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸を発現させることによって；またはタンパク質を化学的に合成することによって得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。

【0120】

本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つの部分を連結する分子を指す。一実施形態では、「リンカー」という用語は、共有結合リンカー（例えば、共有結合）または非共有結合リンカーを指す。

【0121】

「マーカー」とは、疾患または障害に関連する、発現、レベル、構造、または活性に変化を有する任意の検体、タンパク質、またはポリヌクレオチドを意味する。実施形態では、マーカーは、自己抗原に結合することができ、および／もしくは自己免疫疾患に関連するＩｇＧポリペプチド、またはＦｃＲｎポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「突然変異」または「変化」という用語は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列内の残基の別のヌクレオチドもしくは残基への置換、または配列内の１つもしくは複数のヌクレオチドもしくは残基の欠失もしくは挿入を指す。突然変異は、典型的には、本明細書において、元の残基を特定し、続いて配列内の残基の位置、および新たに置換された残基の同一性を特定することによって記載される。本明細書で提供されるアミノ酸置換（突然変異）を行うための様々な方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０１２））に提供されている。

【0122】

本明細書で使用される場合、「核酸」および「核酸分子」という用語は、核酸塩基および酸性部分、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを含む化合物を指す。典型的には、ポリマー核酸、例えば、３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は直鎖状分子であり、その分子内では隣接するヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して互いに連結している。一部の実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」とは、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも３つのヌクレオチドの列）を指すために互換的に使用され得る。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡを包含する。核酸は、例えば、ゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子に関して、天然に存在し得る。他方、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノム、またはその断片、あるいは合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得るか、または天然に存在しないヌクレオチドもしくはヌクレオシドを含み得る。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、および／または同様の用語には、核酸アナログ、例えば、ホスホジエステル骨格以外を有するアナログが含まれる。核酸は、天然源から精製されてもよく、組換え発現系を使用して産生されてもよく、必要に応じて、精製、化学合成などをされてもよい。適切な場合、例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、ヌクレオシドアナログ、例えば、化学的に改変された塩基または糖、および骨格の改変を有するアナログを含む。核酸配列は、別段の指示がない限り、５’から３’の方向で表される。一部の実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）；化学的に改変された塩基；生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレートされた塩基；改変された糖（２’－例えば、フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または改変されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合）であるか、またはそれを含む。

【0123】

「核局在化配列」、「核局在化シグナル」、または「ＮＬＳ」という用語は、細胞核へのタンパク質の移入を促進するアミノ酸配列を指す。核局在化配列は当該技術分野で公知であり、例えば、２０００年１１月２３日に出願され、２００１年５月３１日にＷＯ／２００１／０３８５４７として公開された、Ｐｌａｎｋらによる国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０００／０１１６９０に記載されており、その内容は、それらの例示的な核局在化配列の開示に関して参照により本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、ＮＬＳは、例えば、Ｋｏｂｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１８ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．４１７２に記載されている最適化されたＮＬＳである。一部の実施形態では、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９０）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１９１）、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号１９２）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号１９３）、ＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫ（配列番号１９４）、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９５）、またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号１９６）を含む。

【0124】

本明細書で互換的に使用される、「核酸塩基」、「窒素含有塩基」、または「塩基」という用語は、窒素を含有する生体化合物を指し、これはヌクレオシドを形成し、次いでヌクレオチドの成分となる。塩基対を形成し、互いに積み重なる核酸塩基の能力は、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などの長鎖ヘリカル構造を直接生じさせる。５つの核酸塩基、すなわち、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）は、一次または標準と呼ばれる。アデニンおよびグアニンはプリンに由来し、シトシン、ウラシル、およびチミンはピリミジンに由来する。ＤＮＡおよびＲＮＡはまた、改変された他の（一次ではない）塩基も含み得る。非限定的な例示的な改変された核酸塩基には、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロロウラシル、５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、および５－ヒドロメチルシトシンが含まれ得る。ヒポキサンチンおよびキサンチンは、変異原の存在によって生成され得るが、それらのどちらも脱アミノ化（アミン基のカルボニル基への置換）によって生成され得る。ヒポキサンチンはアデニンから改変され得る。キサンチンはグアニンから改変され得る。ウラシルはシトシンの脱アミノ化によって生じ得る。「ヌクレオシド」は、核酸塩基および五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）からなる。ヌクレオシドの例としては、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、およびデオキシシチジンが挙げられる。改変された核酸塩基を有するヌクレオシドの例としては、イノシン（Ｉ）、キサントシン（Ｘ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、およびプソイドウリジン（Ψ）が挙げられる。「ヌクレオチド」は、核酸塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）、および少なくとも１つのリン酸基からなる。改変された核酸塩基および／または改変された核酸塩基が含み得る化学改変の非限定的な例は、以下の通りである：プソイド－ウリジン、５－メチル－シトシン、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート、２’－Ｏ－メチルチオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－ＰＡＣＥ（ＭＰ）、２’－フルオロＲＮＡ（２’－Ｆ－ＲＮＡ）、拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、２’－Ｏ－メチル（「Ｍ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノアセテート（「ＭＳＰ」）、５－メトキシウリジン、ホスホロチオエート、およびＮ１－メチルプソイドウリジン。

【0125】

「核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質」または「ｎａｐＤＮＡｂｐ」という用語は、「ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン」と互換的に使用され、ｎａｐＤＮＡｂｐを特定の核酸配列に導く核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、例えば、ガイド核酸またはガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）と会合するタンパク質を指し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインはＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質をガイドＲＮＡに相補的な特定のＤＮＡ配列に導くガイドＲＮＡと会合することができる。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメイン、例えば、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、およびＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦ（Ｃａｓ１２ｊ／Ｃａｓファイ）が挙げられる。Ｃａｓ酵素の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦ、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、ＩＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｖ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらのホモログ、またはそれらの改変もしくは操作されたバージョンが挙げられる。他の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質も本開示の範囲内であるが、それらは本開示に具体的に列挙されていない場合がある。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａら「Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｗｈｅｒｅ ｆｒｏｍ Ｈｅｒｅ？」 ＣＲＩＳＰＲ Ｊ．２０１８年１０月；１：３２５～３３６．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｃｒｉｓｐｒ．２０１８．００３３；Ｙａｎら、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ」 Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１９年１月４日；３６３（６４２２）：８８～９１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｖ７２７１を参照されたく、各々の全内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。例示的な核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質および核酸プログラムマブルＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１９７～２３０、および３７８として配列表に提供される。

【0126】

本明細書で使用される場合、「核酸塩基編集ドメイン」または「核酸塩基編集タンパク質」という用語は、シトシン（もしくはシチジン）からウラシル（もしくはウリジン）またはチミン（もしくはチミジン）への、およびアデニン（もしくはアデノシン）からヒポキサンチン（もしくはイノシン）への脱アミノ化、ならびに鋳型化されていないヌクレオチドの付加および挿入などの、ＲＮＡまたはＤＮＡにおける核酸塩基改変を触媒することができるタンパク質または酵素を指す。一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメイン（例えば、アデニンデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼ；またはシチジンデアミナーゼもしくはシトシンデアミナーゼ）である。

【0127】

本明細書で使用される場合、「薬剤を得ること」のような「得ること」は、薬剤を合成すること、購入すること、または他の方法で取得することを含む。

【0128】

「対象」または「患者」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含むが、これらに限定されない、哺乳動物を意味する。実施形態では、哺乳動物は、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、げっ歯類、非ヒト霊長類、またはネコである。実施形態では、「患者」とは、疾患または障害を発症する可能性が平均よりも高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ラクダ、ラマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類（例えば、マウス、ウサギ、ラット、またはモルモット）、および本明細書に開示される治療法の恩恵を受けることができる他の哺乳動物であり得る。例示的なヒト患者は、男性および／または女性であり得る。

【0129】

「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」は、本明細書では、疾患もしくは障害を有すると診断されたか、それらのリスクがあるもしくはそれらを有するか、それらを有すると事前に判定されたか、またはそれらを有すると疑われる患者を指す。

【0130】

「病原性突然変異」、「病原性バリアント」、「病因性突然変異」、「病因性バリアント」、「有害突然変異」、または「素因となる突然変異」という用語は、疾患もしくは障害と関連するか、または特定の疾患もしくは障害に対する個体の感受性もしくは素因を増加させる遺伝子変化または突然変異を指す。一部の実施形態では、病原性突然変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質内の少なくとも１つの病原性アミノ酸によって置換された少なくとも１つの野生型アミノ酸を含む。

【0131】

「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」という用語、およびそれらの文法的同等物は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド（アミド）結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する、組換え、もしくは合成、またはそれらの任意の組合せであり得る。

【0132】

本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質に由来するタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。

【0133】

タンパク質または核酸に関して本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、天然には存在しないが、ヒトによる操作の産物であるタンパク質または核酸を指す。例えば、一部の実施形態では、組換えタンパク質または核酸分子は、任意の天然に存在する配列と比較して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの突然変異を含むアミノ酸またはヌクレオチド配列を含む。

【0134】

「低減する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％のマイナスの変化を意味する。

【0135】

「参照」とは、標準または対照条件を意味する。一実施形態では、参照は、野生型または健康な細胞である。他の実施形態では、限定されないが、参照は、試験条件に供されないか、またはプラセボもしくは通常の生理食塩水、培地、緩衝剤、および／もしくは目的のポリヌクレオチドを有さない対照ベクターに供される、未処理の細胞である。実施形態では、参照は、本明細書で提供される塩基エディター系、またはその成分と接触していない細胞または対象である。一部の場合では、参照は、対象においてＦｃＲｎの活性を妨げる薬剤（例えば、小分子薬物）を投与された細胞または対象である。一部の場合では、参照は、目的のアミノ酸残基における変化を含まないか、または本明細書で提供される変化をいずれも含まないＦｃＲｎポリペプチド（すなわち、野生型ＦｃＲｎポリペプチド配列）である。様々な例では、参照は、本明細書で提供される方法に従って変化されていない細胞である。

【0136】

「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される規定の配列である。参照配列は、指定の配列のサブセットまたは全体；例えば、全長のｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列であってもよい。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、または約１００アミノ酸である。核酸の場合、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、もしくは約３００ヌクレオチド、またはその付近もしくはその間の任意の整数である。一部の実施形態では、参照配列は、目的のタンパク質の野生型配列である。他の実施形態では、参照配列は、野生型タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。

【0137】

「ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ」および「ＲＮＡガイドヌクレアーゼ」という用語は、切断の標的ではない１つまたは複数のＲＮＡと複合体を形成するヌクレアーゼを指す。一部の実施形態では、ＲＮＡとの複合体の場合、ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ－ＲＮＡ複合体と称され得る。典型的には、結合したＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と称される。一部の実施形態では、ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼは、（ＣＲＩＳＰＲ会合系）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のＣａｓ９（Ｃｓｎ１）（例えば、配列番号１９７）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９（ＮｍｅＣａｓ９；配列番号２０８）、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９（配列番号２０９）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）（ＳｃｏＣａｓ９）、またはそれらの誘導体（例えば、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９またはｓｐＣａｓ９などの、Ｃａｓ９に対して少なくとも約８５％の配列同一性を有する配列）である。

【0138】

本明細書で使用される場合、「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体由来の重鎖および軽鎖の可変ドメインが結合して１つの鎖を形成している一本鎖Ｆｖ抗体を指す。ｓｃＦｖ断片は、リンカーによって分離された、抗体軽鎖の可変領域（ＶＬ）（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、および／またはＣＤＲ－Ｌ３）、および抗体重鎖の可変領域（ＶＨ）（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、および／またはＣＤＲ－Ｈ３）を含む単一のポリペプチド鎖を含む。ｓｃＦｖ断片のＶＬおよびＶＨ領域を結合するリンカーは、タンパク質を構成するアミノ酸から構成されるペプチドリンカーであり得る。代替リンカーが、タンパク質分解に対するｓｃＦｖ断片の耐性を増加させるために（例えば、Ｄ－アミノ酸を含むリンカー）、ｓｃＦｖ断片の溶解性を増強するために（例えば、ポリエチレングリコール含有リンカーまたは反復グリシンおよびセリン残基を含有するポリペプチドなどの親水性リンカー）、分子の生物物理学的安定性を改善するために（例えば、分子内または分子間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むリンカー）、またはｓｃＦｖ断片の免疫原性を減衰させるために（例えば、グリコシル化部位を含むリンカー）、使用されてもよい。本明細書に記載されるｓｃＦｖ分子の可変領域は、それらが由来する抗体分子とはアミノ酸配列が異なるように改変され得ることも、当業者によって理解されるであろう。例えば、対応する抗体によって認識される抗原に結合するｓｃＦｖの能力を維持または増強するように、アミノ酸残基における保存的置換または変化をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸置換が、（例えば、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基において）なされてもよい。

【0139】

「特異的に結合する」とは、核酸分子、ポリペプチド、ポリペプチド／ポリヌクレオチド複合体、化合物、または本発明のポリペプチドおよび／もしくは核酸分子を認識して結合するが、試料、例えば、生体試料中の他の分子を実質的に認識して結合しない分子を意味する。

【0140】

「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。一実施形態では、参照配列は、野生型のアミノ酸または核酸配列である。別の実施形態では、参照配列は、本明細書に記載されるアミノ酸配列または核酸配列のいずれか１つである。一実施形態では、そのような配列は、アミノ酸レベルまたは核酸レベルにおいて、比較に使用される配列と少なくとも約６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはさらに９９．９９％同一である。

【0141】

配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５の配列解析ソフトウェアパッケージ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および／または他の改変に対して相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列を照合する。保存的置換には、典型的には、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、密接に関連した配列を示すｅ^－３からｅ^－１００の間の確率スコアを用いたＢＬＡＳＴプログラムを使用してもよい。

【0142】

ＣＯＢＡＬＴが、例えば、以下のパラメーターとともに使用される：
ａ）アラインメントパラメーター：Ｇａｐペナルティ－１１、－１およびＥｎｄ－Ｇａｐペナルティ－５、－１、
ｂ）ＣＤＤパラメーター：ＲＰＳ ＢＬＡＳＴを使用；Ｂｌａｓｔ Ｅ値０．００３；保存された列を見つけて再計算、ならびに
ｃ）クエリクラスタリングパラメーター：クエリクラスターを使用；ワードサイズ４；最大クラスター距離０．８；Ａｌｐｈａｂｅｔ Ｒｅｇｕｌａｒ。

【0143】

ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅが、例えば、以下のパラメーターとともに使用される：
ａ）マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；
ｂ）ＧＡＰ ＯＰＥＮ：１０；
ｃ）ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ：０．５；
ｄ）ＯＵＴＰＵＴ ＦＯＲＭＡＴ：ｐａｉｒ；
ｅ）ＥＮＤ ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ：ｆａｌｓｅ；
ｆ）ＥＮＤ ＧＡＰ ＯＰＥＮ：１０；および
ｇ）ＥＮＤ ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ：０．５。

【0144】

本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその機能的断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示すであろう。内在性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその機能的断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には、実質的な同一性を示すであろう。内在性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、ペアが、様々なストリンジェンシー条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される遺伝子）、またはその一部の間で二本鎖分子を形成することを意味する。（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．およびＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照のこと）。

【0145】

例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ ＮａＣｌおよび７５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約５００ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約２５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満である。有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下では、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを得ることができる一方で、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下では、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを得ることができる。ストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度が含まれる。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの包含または除外などの様々な付加的パラメーターは、当業者に周知である。必要に応じて、これらの様々な条件を組み合わせることによって、様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および１％のＳＤＳ中にて３０℃で実施される。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中にて３７℃で実施される。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、および２００μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ中にて４２℃で実施される。これらの条件の有用な変形は、当業者には容易に明らかであろう。

【0146】

ほとんどの用途では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップのストリンジェンシーも様々に異なる。洗浄のストリンジェンシーの条件は、塩濃度および温度によって定義することができる。上記のように、洗浄のストリンジェンシーは、塩濃度を下げるか、または温度を上げることによって増加させることができる。例えば、洗浄ステップのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ ＮａＣｌおよび３ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、および最も好ましくは約１５ｍＭ ＮａＣｌおよび１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄ステップのストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、さらにより好ましくは少なくとも約６８℃の温度が含まれる。実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中にて２５℃で実施される。別の実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中にて４２Ｃで実施される。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中にて６８℃で実施される。これらの条件の追加の変形は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は当業者に周知であり、例えば、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０、１９７７年）；ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ ７２：３９６１、１９７５年）；Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１年）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８７年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。

【0147】

「スプリット」とは、２つ以上の断片に分割されることを意味する。

【0148】

「スプリットＣａｓ９タンパク質」または「スプリットＣａｓ９」とは、２つの別個のヌクレオチド配列によってコードされるＮ末端断片およびＣ末端断片として提供されるＣａｓ９タンパク質を指す。Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分に対応するポリペプチドは、スプライシングされて「再構成された」Ｃａｓ９タンパク質を形成し得る。

【0149】

「標的部位」という用語は、改変されている核酸分子内の配列を指す。実施形態では、改変は塩基の脱アミノ化である。デアミナーゼは、シチジンまたはアデニンデアミナーゼであり得る。デアミナーゼを含む融合タンパク質または塩基編集複合体は、ｄＣａｓ９－アデノシンデアミナーゼ融合タンパク質、Ｃａｓ１２ｂ－アデノシンデアミナーゼ融合体、または本明細書に開示される塩基エディターを含み得る。

【0150】

本明細書で使用される場合、「治療（処置）する」、「治療（処置）すること」、「治療（処置）」などの用語は、障害および／もしくはそれに関連する症状を低減および／もしくは改善させるか、または所望の薬理学的および／もしくは生理学的効果を得ることを指す。障害または状態を治療することは、障害、状態、またはそれらに関連する症状が完全に排除されることを、除外はしないものの、必ずしも必要としないことが理解されるであろう。一部の実施形態では、効果は治療的であり、すなわち、効果は、限定されないが、疾患および／または疾患に起因する有害な症状を、部分的または完全に、低減、減少、抑止、軽減、緩和、強度を低下させるか、または治癒する。一部の実施形態では、効果は予防的であり、すなわち、効果は、疾患または状態の発症または再発を防御または予防する。この目的のために、本明細書に開示される方法は、本明細書に記載される治療有効量の組成物を投与することを含む。

【0151】

「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤」または「ＵＧＩ」とは、ウラシル除去修復系を阻害する薬剤を意味する。シチジンデアミナーゼを含む塩基エディターは、シトシンをウラシルに変換し、それはその後ＤＮＡ複製または修復を通じてチミンに変換される。様々な実施形態では、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＧＩ）は、ＵをＣに戻して変化させる塩基除去修復を防止する。一部の例では、細胞および／またはポリヌクレオチドをＵＧＩおよび塩基エディターと接触させると、ＵをＣに戻して変化させる塩基除去修復が防止される。例示的なＵＧＩは、以下のようなアミノ酸配列を含む：
＞ｓｐｌＰ１４７３９ＩＵＮＧＩ＿ＢＰＰＢ２ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤
ＭＴＮＬＳＤＩＩＥＫＥＴＧＫＱＬＶＩＱＥＳＩＬＭＬＰＥＥＶＥＥＶＩＧＮＫＰＥＳＤＩＬＶＨＴＡＹＤＥＳＴＤＥＮＶＭＬＬＴＳＤＡＰＥＹＫＰＷＡＬＶＩＱＤＳＮＧＥＮＫＩＫＭＬ（配列番号２３１）。

【0152】

一部の実施形態では、ウラシル－除去修復系を阻害する薬剤は、ウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２２０１５９６９ Ａ１を参照のこと。

【0153】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、核酸配列を細胞に導入する手段を指す。ベクターには、プラスミド、トランスポゾン、ファージ、ウイルス、リポソーム、脂質ナノ粒子、およびエピソームが含まれる。「発現ベクター」は、レシピエント細胞において発現されるヌクレオチド配列を含む核酸配列である。発現ベクターは、哺乳動物細胞のゲノム内に、開始、終止、エンハンサー、プロモーター、および分泌配列などの導入配列の発現を促進および／または容易にするためのポリヌクレオチド配列および追加の核酸配列を含む。ベクターの例としては、核酸ベクター、例えば、プラスミドなどのＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルスまたは他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）が挙げられる。外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に送達するために、様々なベクターが開発されている。このような発現ベクターの例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ１９９４／１１０２６に開示されている。本明細書の一部の態様および実施形態のエディター、例えば、塩基エディターもしくはプライムエディター、および／またはガイドポリヌクレオチドの発現に使用できる特定のベクターには、遺伝子転写を指示するプロモーター領域およびエンハンサー領域などの調節配列を含むプラスミドが含まれる。抗体および抗体断片の発現のための他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を増強するか、または遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性もしくは核外輸送を改善するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列エレメントには、発現ベクター上に担持された遺伝子の効率的な転写を指示するために、例えば、５’および３’非翻訳領域、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、およびポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本明細書の一部の態様および実施形態の発現ベクターはまた、このようなベクターを含む細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含み得る。適切なマーカーの例としては、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはノーセオトリシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。

【0154】

本明細書で提供される範囲は、その範囲内のすべての値の簡略表記であることが理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０を含む群からの任意の数、数の組合せ、または下位範囲を含むことが理解される。

【0155】

本明細書の変数の任意の定義の中の化学基のリストの列挙は、任意の単一の基または列挙された基の組合せとしてその変数の定義を含む。本明細書の変数または態様についての実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせてその実施形態を含む。

【0156】

すべての用語は、当業者によって理解されているように理解されるものとして意図されている。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

【0157】

本出願では、単数形の使用は、別途明確に記載されない限り、複数形を含む。本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。本出願では、「または」の使用は、他に記載されない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる」などの他の形式の使用は、非制限的である。

【0158】

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの任意の形式の含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの任意の形式の有する（ｈａｖｉｎｇ））、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの任意の形式の含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ））または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの任意の形式の含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ））は、包括的または非制限的であり、引用していない追加のエレメントまたは方法ステップを除外しない。特定の成分またはエレメントを「含む」と指定された任意の実施形態はまた、一部の実施形態では、特定の成分またはエレメント「からなる」または「から本質的になる」としても企図される。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法または組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成することができる。

【0159】

「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、値の測定方法または決定方法、すなわち、測定系の限界に部分的に依存する。

【0160】

本明細書での言及「一部の実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」または「他の実施形態」とは、実施形態に関連して記載される特定の特性、構造、または特徴が、少なくとも一部の実施形態には含まれるが、本開示のすべての実施形態に含まれる必要はないことを意味する。

【図面の簡単な説明】

【0161】

【図1A】図１Ａおよび１Ｂは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２９：２８１９～２８２５（１９９９）から引用した３Ｄスティック構造およびプロットを提供し、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。図１Ａは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３Ｄスティック構造を提供する。図は、ＲＡＳＭＯＬプログラム（Ｒｏｇｅｒ Ｓａｙｌｅ、エディンバラ大学バイオインフォマティクス研究所、英国）を用いて作成した。図１Ｂは、マウスにおける組換えヒトＦｃ－ヒンジ誘導体およびＦｃ－パパイン断片のＦｃＲｎとＩｇＧとの相互作用を示す消失曲線を示すプロットを提供する。

【図1B】図１Ａの説明と同じ。

【図2A】図２Ａおよび２Ｂは、ＦｃＲｎに結合したＩｇＧ２の多重配列アラインメントおよびリボン構造を提供する。図２Ａは、重要な結合残基に下線を引いた、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のアミノ酸配列のアラインメントを提供する。図２Ｂは、ＦｃＲｎへのＩｇＧ２の結合を示すリボン構造を提供し、重要な残基が示される。以下の配列が、図２Ａにおいて上から下に描写されている：ＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４３４）およびＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４３５）。

【図2B】図２Ａの説明と同じ。

【図3A】図３Ａおよび３Ｂは、ＦｃＲｎ：ＩｇＧ界面に関するリボン構造を提供する。

【図3B】図３Ａの説明と同じ。

【図4】図４は、ＦｃＲｎ：ＩｇＧ結合部位に関するリボン構造を提供し、重要な残基が示されている。

【図5】図５は、ＩｇＧに結合したＦｃＲｎのリボン構造を提供し、ＩｇＧとの複合体を形成するために重要なＦｃＲｎアミノ酸の構造は、球体を使用して描写される。図５において、Ｗ１３１（ＩｇＧ結合のための重要な残基である）の位置を定めるのを助ける疎水性ポケットの一部を形成するアミノ酸は、最も明るいグレーの色合いの球体を使用して描写されるアミノ酸のクラスターとして示される。図５において、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ ＩｇＧ結合部位に対応するアミノ酸は、グレーの最も暗い色合いの球体のクラスターを使用して描写される。図５において、中性のｐＨにおける、ＩｇＧとＦｃＲｎとの間の複合体の安定化および低減した結合親和性に関連するアミノ酸は、中間的な灰色の色合いの球体を使用して描写される。球体を使用する図５に描写されるアミノ酸の変化は、様々な実施形態では、アルブミンのリサイクルおよびＦｃＲｎ発現を有利に保存しながら、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４への結合およびリサイクリングを低減させることができる。場合によっては、ＦｃＲｎのアミノ酸残基に対する変化は、ｉｎ ｖｉｖｏで循環するＩｇＧの＞５０％の低減と関連する。

【図6A-1】図６Ａおよび６Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｘ軸に示されたガイドポリヌクレオチドおよび塩基エディター（すなわち、ＡＢＥまたはＣＢＥ）を含む塩基編集系と接触させた場合に達成された塩基編集率を示す棒グラフを提供する。使用した塩基エディターは、ＳｐＣａｓ９－ＡＢＥ８．８、ｓｐＣａｓ９－ＢＥ４、ＶＲＱＲ ｓｐＣａｓ９－ＡＢＥ８．８、ＶＲＱＲ ｓｐＣａｓ９－ＢＥ４、ＫＫＨ－ｓａＣａｓ９－ＡＢＥ８．８、ＫＫＨ－ｓａＣａｓ９－ＢＥ４、ＳａＡＢＥ８．８、ＳａＢＥ４、およびｓｐＣａｓ９－ＡＢＥであった。塩基編集率は、塩基編集された細胞において観察された各々の特定のＦｃＲｎ変更または変更の組合せについて示される。図６Ａにおいて、４０％を超える塩基編集効率を達成した塩基編集系に対応するバーは、図６Ａにおいて影付きのボックスによって輪郭が示される。アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）とガイドＲＮＡ ｇＲＮＡ１５８３を含む塩基編集系は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において７０％を超える塩基編集効率を達成し、ＦｃＲｎにＷ１３１Ｒ変更を導入した。図６Ｂは、図６Ａに提示されたデータのサブセットを示す。図６Ｂの矢印は、Ｅ１１６ＫおよびＭ１１８Ｉを含む組み合わされたアミノ酸変化について測定された塩基編集効率に対応するバーを示す。図６Ａにおいて、右端の４つのバーは、陽性対照塩基エディター系に対応する。図６Ｂにおいて、右端の２つのバーは、陽性対照塩基エディター系に対応する。図６Ａにおいて、ｘ軸に沿って列挙されたアミノ酸位置は、ＦｃＲｎ ２３アミノ酸長シグナルペプチドの最初のアミノ酸から番号付けされる。

【図6A-2】図６Ａの続き。

【図6B】図６Ａ－１の説明と同じ。

【図7A】図７Ａ～７Ｄは、アルブミンまたはＩｇＧ１のＦｃＲｎポリペプチドへの結合についての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定からの結果を提供する。図７Ａおよび７Ｂは、ｘ軸に示される１０個の変更を含むＦｃＲｎポリペプチドへのアルブミンまたはＩｇＧ１の結合についての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定からの結果を示す棒グラフを提供する。１０個のＦｃＲｎバリアントはすべてアルブミン結合を維持した。図７Ａは、Ｘ軸に示される変更を含むＦｃＲｎポリペプチドへのアルブミンの結合の表面プラズモン共鳴測定を示す棒グラフを提供する。

【図7B】図７Ｂは、Ｘ軸に示される変更を含むＦｃＲｎポリペプチドへのＩｇＧ１結合の表面プラズモン共鳴測定を示す棒グラフを提供する。図７Ｂにおいて、矢印は、ＦｃＲｎによるＩｇＧ１結合の有意な低減に関連したアミノ酸変化を示す。評価したＦｃＲｎバリアントのうち４つは、ＩｇＧ結合の低減を示した。

【図7C】図７Ｃは、ＩｇＧへの野生型、Ｍ１１８Ｉ、およびＷ１３１Ｒ ＦｃＲｎの結合の比較を示す。測定は、表面上のＦｃＲｎ－ビオチンで行われた。ＩｇＧを指示された濃度で注射した。

【図7D】図７Ｄは、アルブミンへの野生型、Ｍ１１８Ｉ、およびＷ１３１Ｒの結合の比較を示す。測定は、表面上のＦｃＲｎ－ビオチンで行われた。アルブミンを指示された濃度で注射した。

【図8A】図８Ａ～８Ｃは、概略図および棒グラフを提供する。図８Ａは、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）共培養における塩基編集を評価するために使用される実験スキームを記述する概略図を提供する。図８Ａでは、「ＭＣ」は培地交換を示し、「ＴＦ」は塩基編集系によるトランスフェクションを示し、「ＮＧＳ」は次世代シークエンシングを示し、「ＲＴ－ｑＰＣＲ」は逆転写酵素定量的ポリメラーゼ連鎖反応を示す。トランスフェクション後の１０日目に次世代シークエンシングのために試料を回収し、トランスフェクション後の１３日目にＲＴ－ｑＰＣＲ測定のために試料を採取した。細胞を、亜飽和用量の塩基編集系（全部で６００ｎｇ、１６０ｎｇの末端改変ガイドポリヌクレオチド＋塩基エディターをコードする４５０ｎｇのｍＲＮＡを含む）を用いてトランスフェクトした。Ｗ１３１（１５４）Ｒ変更の創出を促進したｇＲＮＡ１５８３ガイドは、ＰＨＨ共培養系において良好に機能した。

【図8B】図８Ｂは、ｘ軸に示される特定のＦｃＲｎ変更に関連し、ｘ軸に示される塩基エディター系を用いて達成される塩基編集効率を示す棒グラフを提供する。図８Ｃは、トランスフェクトされた細胞から単離されたｍＲＮＡにおいて検出されたＦＣＧＲＴのエクソン５～６およびエクソン４～５のレベルを示す棒グラフを提供する。転写物レベルは、ＡＣＴＢについて測定した転写物レベルに対して正規化された。ｇＲＮＡ１５８３およびアデノシン塩基エディターを含む塩基エディター系を用いて編集された細胞は、未処理細胞およびガイドｓｇ２３を用いて編集された細胞と比較して、ＦｃＲｎ ｍＲＮＡ発現において約３０％の低減を示した。図８Ｂおよび８Ｃにおいて、ガイドｇ２３（あるいはｇＲＮＡ２３と呼ばれる）およびＡＢＥ塩基エディターを含む塩基エディター系を陽性対照として使用した。

【図8C】図８Ｃは、トランスフェクトされた細胞から単離されたｍＲＮＡにおいて検出されたＦＣＧＲＴのエクソン５～６およびエクソン４～５のレベルを示す棒グラフを提供する。転写物レベルは、ＡＣＴＢについて測定した転写物レベルに対して正規化された。ｇＲＮＡ１５８３およびアデノシン塩基エディターを含む塩基エディター系を用いて編集された細胞は、未処理細胞およびガイドｓｇ２３を用いて編集された細胞と比較して、ＦｃＲｎ ｍＲＮＡ発現において約３０％の低減を示した。図８Ｂおよび８Ｃにおいて、ガイドｇ２３（あるいはｇＲＮＡ２３と呼ばれる）およびＡＢＥ塩基エディターを含む塩基エディター系を陽性対照として使用した。

【図9A】図９Ａおよび９Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるスペーサー長の最適化に関する概略図および棒グラフを提供する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、アデノシン塩基エディターをコードするｍＲＮＡおよびｘ軸に示されるガイドＲＮＡをトランスフェクトした。これには、１９～２３ヌクレオチドの長さの異なるスペーサーが含まれた。図９Ａは、塩基編集効率におけるスペーサー長の影響を評価するための実験計画をまとめた概略図を提供する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を０日目に播種し、１日目に塩基エディター系でトランスフェクトした。培地を２日目に交換し、細胞由来のゲノムＤＮＡを次世代シークエンシングを用いて、トランスフェクションの７２時間後に配列決定した。図９Ｂは、示された塩基編集系用いて作製された示されたＦｃＲｎ変更に関連する塩基編集効率を示す。細胞を、亜飽和用量の塩基編集系（全部で６００ｎｇ、１６０ｎｇの末端改変ガイドポリヌクレオチド＋塩基編集体をコードする４５０ｎｇのｍＲＮＡを含む）を用いてトランスフェクトした。評価したすべてのスペーサー長は、達成された一次変更について同様の塩基編集効率を示した。

【図9B】図９Ａの説明と同じ。

【発明を実施するための形態】

【0162】

本発明は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）遺伝子であるＦＣＧＲＴを編集し、発現を改変し、および／またはサイレンシングするための組成物および方法を特徴とする。

【0163】

本発明は、少なくとも部分的には、細胞によってコードされるＦｃＲｎポリペプチドを変更するために塩基編集が使用され得、その結果、このポリペプチドは、アルブミンへの結合を維持しながら、ＩｇＧへの低減した結合を示すという発見に基づく。したがって、様々な実施形態では、本明細書において提供される方法および塩基編集系は、ＩｇＧへの結合を低減させる変更をＦｃＲｎに導入し、それによって、アルブミンサイクリングにおけるＦｃＲｎの有益な機能を維持しながら、治療を必要とする対象におけるＩｇＧ半減期を有利に低減させることによって、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害を治療するために使用することができる。

【0164】

したがって、本開示は、ＦｃＲｎ媒介自己免疫障害の治療のための改善された組成物および方法を提供する。

【0165】

本開示の主題の実施形態の詳細は、本書面に記載されている。この書面に記載される実施形態に対する改変、および他の実施形態が、この書面において提供される情報を検討した後、当業者には明らかになる。

【0166】

ゲノム編集では、標的遺伝子のヌクレオチド配列を欠失させ、置換し、または挿入することによって、遺伝物質を分子的に操作し、必要に応じて遺伝子の遺伝子突然変異の修正を行う。実施形態では、ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ系、塩基編集、プライム編集などを含む。

【0167】

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）系は、ウイルスに対する天然に存在する細菌および古細菌防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ系は、生細胞において、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）またはユーザー定義の遺伝子座でのＲＮＡ切断を導入することにより、ゲノム編集に適応されている。Ｐｏｒｔｏら、Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９：８３９～５９（２０２０）。ＣＲＩＳＰＲ法には、ガイドＲＮＡおよび核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメインＣａｓタンパク質の使用が含まれ、これらは一緒になって標的ヌクレオチド配列に切断を導入する。Ｃａｓタンパク質には、Ｃａｓ９、触媒的に不活性化された（死んだ）ｄＣａｓ９、ｎＣａｓ９（ニッカーゼ）、Ｃａｓ１２、およびＣａｓ１３が含まれる。非相同末端接続（ＮＨＥＪ）または相同指向性修復（ＨＤＲ）による切断の修復は、切断部位に挿入、欠失、または点突然変異を導入する。突然変異の非特異的性質は、標的ヌクレオチド配列にフレームシフトを導入し得る。

【0168】

塩基編集は、ＤＳＢを導入することなく、特定の遺伝子座における標的残基の直接変換を可能にする。塩基編集は、生細胞のＤＮＡまたはＲＮＡに単一ヌクレオチド改変を直接導入する。塩基エディターは、ＤＮＡおよびＲＮＡを標的とするものを含む。ＤＮＡ塩基エディターは、核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメインと、ＤＮＡの標的領域（例えばＦＣＧＲＴ遺伝子）において標的Ｃ－ＧをＴ－Ａに、もしくは標的Ｇ－ＣをＡ－Ｔに変換するシチジンデアミナーゼドメインと、またはＤＮＡの標的領域（例えばＦＣＧＲＴ遺伝子）において標的Ａ－ＴをＧ－Ｃに、もしくは標的Ｔ－ＡをＣ－Ｇに変換するアデノシンデアミナーゼドメインとを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含む。塩基編集技術は、例えば、Ｐｏｒｔｏら、（２０２０）に詳細に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、触媒的に不活性化された（死んだ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含む。

【0169】

プライム編集は、ＣＲＩＳＰＲの標的特異性を保持しながら、ガイドＲＮＡ（プライム編集ガイドＲＮＡ、または「ｐｅｇＲＮＡ」）から伸長する編集されたＲＮＡ鋳型と、ｎＣａｓ９に融合した逆転写酵素を組み込む。例えば、Ｓｃｈｏｌｅｆｉｅｌｄら、Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ：ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２８：３９６～４０１（２０２１）を参照されたい。ｎＣａｓ９はＤＳＢを導入しないが、代わりにＰＡＭ部位の上流にあるＤＮＡの非相補鎖にニックを入れる。このニッカーゼは、ｐｅｇＲＮＡのプライマー結合部位（ＰＢＳ）に結合する３’ＯＨを有するＤＮＡオーバーハングを露出させる。これは逆転写酵素用のプライマーとして機能し、編集されたｐｅｇＲＮＡの配列をコピーすることによって３’オーバーハングを埋める。５’オーバーハングを切り出し、鎖をライゲートして編集を完了する。プライム編集技術は、Ｓｃｈｏｌｅｆｉｅｌｄら（２０２１）に詳細に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、プライム編集は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメインおよび逆転写酵素を含み、ガイドＲＮＡはプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）であり、プライムエディターは、ＦＣＧＲＴ遺伝子中の１つまたは複数のヌクレオチドを異なるヌクレオチドで置き換える。実施形態では、核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、触媒的に不活性化された（死んだ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含む。

【0170】

別の実施形態では、哺乳動物細胞においてＦｃＲｎタンパク質を改変する方法であって、細胞をガイドＲＮＡおよびゲノムエディターと接触させるステップを含み、ガイドＲＮＡは、ＦＣＧＲＴ遺伝子の一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、細胞においてＦＣＧＲＴ遺伝子に改変をもたらすようにゲノムエディターを標的化し、この改変は、ＦＣＧＲＴ遺伝子によってコードされるＦｃＲｎタンパク質のアミノ酸配列を変化させる、方法が提供される。実施形態では、ゲノムエディターは、塩基エディターまたはプライムエディターを含む。

【0171】

別の実施形態では、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害の治療を必要とする対象において、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害を治療する方法であって、対象の哺乳動物細胞においてＦｃＲｎタンパク質を改変するステップを含む方法が提供される。特定の実施形態では、ＦｃＲｎタンパク質の改変は、対象の哺乳動物細胞においてＦＣＧＲＴ遺伝子をゲノム編集することを含む。必要に応じて、ゲノム編集は、哺乳動物細胞をガイドＲＮＡおよびゲノムエディターと接触させることを含み、ガイドＲＮＡは、ＦＣＧＲＴ遺伝子の一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、細胞内のＦＣＧＲＴ遺伝子に改変をもたらすようにゲノムエディターを標的化し、この改変は、ＦＣＧＲＴ遺伝子によってコードされるＦｃＲｎタンパク質のアミノ酸配列を変化させる。特定の実施形態では、ゲノムエディターは、塩基エディターまたはプライムエディターを含む。

【0172】

ゲノムエディターは、当該技術分野において公知である種々の送達技術を介して、目的の哺乳動物細胞に送達され得る。実施形態では、ゲノムエディターは、ナノ粒子、ウイルスベクター、または電気穿孔を介して哺乳動物細胞に送達される。本組成物および方法における使用に適切なナノ粒子は、無機ナノ粒子（例えば、金）、脂質ベースの粒子（例えば、脂質ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、細胞由来膜結合粒子など）、ペプチドナノ粒子、ポリマーナノ粒子などを含む。

【0173】

様々なウイルスベクターが当該技術分野において公知であり、本開示の組成物の送達における使用に適している。実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ、レンチウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ）、およびセンダイウイルスからなる群から選択される。

【0174】

本明細書に開示する組成物および方法は、ＦＣＧＲＴ遺伝子に１つまたは複数の単一ヌクレオチド改変を導入することにより、ＦｃＲｎタンパク質をコードしている核酸を改変する。実施形態では、改変またはバリアントＦｃＲｎタンパク質は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合する能力の低減を示す。さらなる実施形態では、改変またはバリアントＦｃＲｎタンパク質は、野生型ＦｃＲｎタンパク質などの参照ＦｃＲｎタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変化を含む。

【0175】

本開示の方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。すなわち、本明細書で開示する組成物は、対象に直接（例えば、静脈内に、または局所的に、注射、吸入などによって）投与することができ、または細胞、必要に応じて対象から得られた細胞に投与することができる。実施形態では、対象はヒトである。

【0176】

ＦＣＧＲＴ遺伝子に様々な改変を施して、本明細書に開示する改変されたＦｃＲｎタンパク質を提供することができる。実施形態では、改変されたＦｃＲｎタンパク質は、１１２位のロイシン（Ｌ）、１１５位のグルタミン酸（Ｅ）、１１６位のグルタミン酸（Ｅ）、１３１位のトリプトファン（Ｗ）、１３２位のプロリン（Ｐ）、および１３３位のグルタミン酸（Ｅ）からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸において参照ＦｃＲｎタンパク質と相違する。他の実施形態では、改変されたＦｃＲｎタンパク質は、図４に示すような１つまたは複数の突然変異を含む。

【0177】

必要に応じて、ゲノムエディターまたは送達ビヒクルは、ＦｃＲｎもしくはアルブミンと結合する標的化部分にコンジュゲートされるかまたは組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的化部分は、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＦｃＲｎに特異的に結合する抗体、アルブミンに特異的に結合する抗体、アルブミンに結合するペプチド、アルブミン、またはそれらの断片もしくは誘導体からなる群から選択される。

【0178】

追加の標的化部分には、限定されないが、ＦｃＲｎの細胞外ドメインと結合する、バリアントＦｃドメイン；抗体または他の特異的結合剤（例えば、アフィボディ、ダーピン、またはペプチド（ファージディスプレイなどのディスプレイ技術を使用して選択することができる）などの操作されたスキャフォールドタンパク質）；ＦｃＲＮと結合する能力を保持するアルブミンまたはその断片もしくはバリアントが含まれる。このアプローチにおいて、アルブミン（または断片／バリアント）はＦｃＲｎに結合し、送達ビヒクル／活性剤はアルブミン（または断片／バリアント）とともに内在化される。他の標的化部分には、アルブミンに結合するが、ＦｃＲｎへのアルブミンの結合を実質的に妨げない他の特異的結合剤（例えば、アフィボディまたはダーピンまたはペプチド（ファージディスプレイなどのディスプレイ技術を使用して選択され得る）などの操作されたスキャフォールドタンパク質）が含まれる。送達ビヒクルは、アルブミンがＦｃＲｎに結合した場合、アルブミンとともに細胞によって内在化される。

【0179】

また、ガイドＲＮＡおよびゲノムエディターを含む組成物であって、ガイドＲＮＡが、ＦＣＧＲＴ遺伝子の一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、細胞内のＦＣＧＲＴ遺伝子に改変をもたらすように塩基ゲノムエディターを標的化し、この改変が、ＦＣＧＲＴ遺伝子によってコードされるＦｃＲＮタンパク質のアミノ酸配列を変化させる、組成物が本明細書において提供される。開示される組成物は、本明細書に記載される送達ビヒクル、ならびに／またはＦｃＲｎおよび／もしくはアルブミンと結合する標的化部分をさらに含み得る。

【0180】

特定の実施形態では、本明細書で開示する送達ビヒクルは、ガイドＲＮＡおよびゲノムエディターまたはゲノムエディターをコードする核酸を含む。実施形態では、送達ビヒクルは、ＦｃＲｎおよび／またはアルブミンと結合する標的化部分を含む。

【0181】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン化可能な脂質単分子層シェルと、薬物または核酸などの親油性分子を可溶化することがきる脂質コアマトリクスを含む、球状のナノメートルスケールの粒子である。伝統的なＬＮＰはエンドサイトーシスを介して宿主細胞に取り込まれ、エンドソームから逃れ、宿主細胞の細胞質にそれらの積み荷を放出する。ＬＮＰは、一般に、安全であり、有効であり、産業的製造および薬物送達における臨床的使用に適すると考えられる。

【0182】

本開示のＬＮＰの実施態様には、脂質単分子層シェルに包埋されるかまたは組み込まれる、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域もしくはＦｃ領域の断片または他の標的化部分を含み、ＦｃＲｎ（ＦＣＧＲＴ遺伝子）の発現をサイレンシングまたはモジュレートするための核酸をコア内に封入する。ＬＮＰが上皮細胞の表面上のＦｃＲｎと接触した場合、Ｆｃ領域またはその断片はＦｃＲｎと結合し、ＬＮＰは細胞と融合するか、さもなければ内部移行し、そのペイロードを送達する。次に、放出された核酸は、ＦｃＲｎの発現をサイレンシングし、モジュレートし、または緩和し、これは、次に、宿主におけるＩｇＧ（しかしながら、好ましくはアルブミンではない）の循環の低減、ならびに自己免疫障害の症状および病状の低減を生じさせる。

【0183】

一実施形態では、脂質単分子層膜中に包埋された、ＩｇＧ抗体またはその機能的断片のうちの少なくとも１つのＦｃ領域を含む脂質単分子層膜；および脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスを含む、固体ＬＮＰが提供される。実施形態では、ＬＮＰの脂質コアは、少なくとも１つの核酸を含む。

【0184】

一実施形態では、ＬＮＰに組み込まれるＩｇＧまたはその断片は、ＩｇＧ１サブクラスである。特定の実施形態では、ＩｇＧ１またはその断片は、以下のアミノ酸置換を有する：２６５位のアスパラギン酸がアラニンに置換されるか、または２３８位のプロリンがアラニンに置換される。

【0185】

別の実施形態では、ＬＮＰに組み込まれるＩｇＧは、ＩｇＧ２サブクラスまたはその断片である。

【0186】

別の実施形態では、ＬＮＰに組み込まれるＩｇＧは、ＩｇＧ３サブクラスまたはその断片である。

【0187】

別の実施形態では、ＬＮＰに組み込まれるＩｇＧは、ＩｇＧ４サブクラスまたはその断片である。

【0188】

別の実施形態では、ＬＮＰに組み込まれるＩｇＧは、ＦｃＲｎ受容体を認識する。特定の実施形態では、ＩｇＧ１またはその断片は、以下のアミノ酸置換を有する：２６５位のアスパラギン酸がアラニンに置換されるか、または２３８位のプロリンがアラニンに置換される。

【0189】

別の実施形態では、ＩｇＧはＬＮＰに組み込まれておらず、ＦｃＲｎ受容体を認識する。特定の実施形態では、ＩｇＧ１またはその断片は、以下のアミノ酸置換を有する：２６５位のアスパラギン酸がアラニンに置換されるか、または２３８位のプロリンがアラニンに置換される。特定の実施形態では、ＩｇＧはペイロードを直接送達することができる。

【0190】

一部の実施形態では、操作されたＦｃバリアントは、天然に存在するＦｃ領域と比較して、塩基性ｐＨ（例えば、血液に典型的なｐＨ、例えば、７．３５～７．４５）でＦｃＲｎに対して増加した親和性を有する。

【0191】

実施形態では、ＬＮＰの脂質コアに組み込まれる核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。特定の実施形態では、核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ、ｐｅｇＲＮＡ、またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。非常に具体的な実施形態では、核酸はｓｉＲＮＡである。別の特定の実施形態では、核酸はガイドＲＮＡまたはｐｅｇＲＮＡである。別の実施形態では、核酸はゲノムエディターをコードする。

【0192】

実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１つまたは複数の遺伝子の発現をモジュレートするように機能的である。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＦＣＧＲＴ、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）をコードする遺伝子の発現をモジュレートする。

【0193】

実施形態では、ＬＮＰに組み込まれる核酸は、ゲノムエディターを標的として、ＦＣＧＲＴ、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）をコードする遺伝子を編集または改変するために機能的であるガイドＲＮＡである。ＦＣＧＲＴ遺伝子の適切な改変は、例えば、本開示の図４に示される。

【0194】

特定の実施形態では、５１位または６１位のトリプトファン残基および１６６位のヒスチジンは、これらのアミノ酸がヒト血清アルブミンの結合および半減期延長の原因となるため、改変されない。

【0195】

様々な脂質が、開示されるＬＮＰの脂質単分子層における使用に適している。実施形態では、脂質単分子層は、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、脂質－ポリエチレングリコールコンジュゲート、およびそれらの組合せからなる群から選択される脂質で構成される。実施形態では、ＬＮＰの免疫クリアランスの回避を促進するために、脂質単分子層の脂質を少なくとも部分的にＰＥＧ化することができる。実施形態では、脂質単分子層は、安定化剤としてコレステロールをさらに含み得る。

【0196】

開示されるＬＮＰの脂質コアマトリクスは、コア中の核酸と複合体化するのに適したカチオン性脂質を含む。本明細書で使用される場合、用語「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨで正味の正電荷を帯びるいくつかの脂質種のうちのいずれかを包含し、当業者に公知である任意の方法を使用して決定することができる。このような脂質は、限定されないが、２００９年５月１日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ」と題する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４２４７６で開示された式（Ｉ）のカチオン性脂質を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらには、限定されないが、Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（アルギノイルアミノ）エチル）Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミニウムクロリドまたはジステアロイルアルギニルアンモニウムクロリド］（ＤＳＡＡ）、Ｎ，Ｎ－ジ－ミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ６－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド（ＤＭＧＬＡ）、Ｎ，Ｎ－ジミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ２－グアニジノ－Ｌ－リシニル］アミノエチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ－ジミリストイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ２，Ｎ６－ジ－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド、およびＮ，Ｎ－ジ－ステアロイル－Ｎ－メチル－Ｎ－２［Ｎ’－（Ｎ６－グアニジノ－Ｌ－リシニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド（ＤＳＧＬＡ）が含まれる。本開示の脂質ナノ粒子のリポゾームまたは脂質二重層中に存在することができるカチオン性脂質の他の非限定的な例には、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）または他のＮ（Ｎ，Ｎ－ｌ－ジアルコキシ）－アルキル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－三置換アンモニウム界面活性剤；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ν，Ν－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＡＢ）；３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｉ）およびＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；１，３－ジオレイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１アンモニウムトリフルオロ－アセテート（ＤＯＳＰＡ）；ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ；ＤＭＤＨＰ；３－ｐ［４Ｎ－（Ｈ８Ｎ－ジグアニジノスペルミジン）－カルバモイル］コレステロール（ＢＧＳＣ）；３－Ｐ［Ｎ，Ｎ－ジグアニジノエチル－アミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＢＧＴＣ）；Ｎ，Ｎ＼Ｎ２，Ｎ３テトラ－メチルテトラパルミチルスペルミン（セルフェクチン）；Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシル－３－テトラデシル－アミノプロピオン－アミジン（ＣＬＯＮフェクチン）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；１，３－ジオレオイルオキシ－２－（６－カルボキスペルミル）－プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；４－（２，３－ビス－パルミトイルオキシ－プロピル）－１－メチル－１Ｈ－イミダゾール（ＤＰＩＭ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２，３ジオレオイルオキシ－１，４ブタンジアンモニウムヨージド（Ｔｆｘ－５０）；１，２－ジオレオイル－３－（４’－トリメチルアンモニオ）ブタノール－ｓｎ－グリセロール（ＤＯＢＴ）またはトリメチルアンモニウム基が、ブタノールスペーサーアームを介して、二重鎖（ＤＯＴＢについて）またはコレステリル基（ＣｈＯＴＢについて）のいずれかに結合しているコレステリル（４’－トリメチルアンモニア）ブタノエート（ＣｈＯＴＢ）；ＤＬ－１，２－ジオレオイル－３ジメチルアミノプロピル－Ｐ－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩ）またはＤＬ－１，２－０－ジオレオイル－３－ジメチルアミノプロピル－Ｐ－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩＥ）、または全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開番号ＷＯ９３／０３７０９に開示されるそのアナログ；１，２－ジオレオイル－３－スクシニル－ｓｎ－グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）；コレステリルヘミスクシネートエステル（ＣｈＯＳＣ）；リポポリアミン、例えば、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、または全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２８３，１８５号に開示されるカチオン性脂質；コレステリル－３Ｐ－カルボキシル－アミド－エチレントリメチルアンモニウムヨージド；１－ジメチルアミノ－３－トリメチルアンモニウム－ＤＬ－２－プロピル－コレステリルカルボキシレートヨージド；コレステリル－３－β－カルボキシアミドエチレンアミン；コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシンアミド－エチレントリメチルアンモニウムヨージド；１－ジメチルアミノ－３－トリメチルアンモニオ－ＤＬ－２－プロピル－コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシネートヨージド；２－（２－トリメチルアンモニオ）－エチルメチルアミノエチル－コレステリル－３－Ｐ－オキシスクシネートヨージド；３－β－Ν－（ポリエチレンイミン）－カルバモイルコレステロール、ＤＣ－コレステロール；およびＮ４－コレステリル－スペルミンＨＣｌ塩（ＧＬ６７）が含まれる。

【0197】

実施形態では、脂質コアマトリクスは、安定剤としてコレステロールをさらに含む。

【0198】

別の実施形態では、脂質単分子層膜に包埋されたＩｇＧ抗体の少なくとも１つのＦｃ領域またはその機能的断片を含む脂質単分子層膜と、脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスとを含む少なくとも１つのＬＮＰを含む医薬組成物が提供され、脂質コアマトリクスは、少なくとも１つの核酸と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む。

【0199】

必要に応じて、医薬組成物は、対象への局所投与または全身投与のために製剤化される。全身的にまたは所望の表面もしくは標的に併用療法の化合物を送達させるための投与には、限定されないが、注射、注入、点滴注入、および吸入投与を含み得る。注射には、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢のう内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、および関節内注射ならびに注入が含まれる。

【0200】

注射用の医薬組成物は、水性溶液または分散液、および滅菌した注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌した粉末を含む。静脈投与のために、適切な担体としては、限定されないが、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを組成物に含めることができる。得られた溶液は、そのまま使用するために包装されるかまたは凍結乾燥され得る。凍結乾燥した調製物は、後に、投与前に滅菌溶液と合わせられ得る。

【0201】

別の実施形態では、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害の治療することを必要とする対象におけるＩｇＧ媒介性自己免疫障害を治療する方法であって、脂質単分子層膜に包埋されたＩｇＧ抗体の少なくとも１つのＦｃ領域またはその機能的断片を含む脂質単分子層膜と、脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスとを含むＬＮＰを対象に投与するステップを含み、脂質コアマトリクスは、ＦＣＧＲＴ遺伝子の発現を緩和するかまたはＦＣＧＲＴ遺伝子をサイレンシングする、少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡを含む、方法が提供される。

【0202】

ＩｇＧ媒介性自己免疫障害には、限定されないが、重症筋無力症、温式自己免疫性溶血性貧血（ｗＡＩＨＡ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、グレーブス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、尋常性天疱瘡、ならびに胎児および新生児の溶血性疾患（ＨＤＦＮ）が含まれる。

【0203】

別の実施形態では、細胞においてＦｃＲｎ発現をサイレンシングする方法であって、細胞をＬＮＰと接触させるステップを含み、ＬＮＰは、脂質単分子層膜に包埋されたＩｇＧ抗体の少なくとも１つＦｃ領域またはその機能的断片を含む脂質単分子層膜と、脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスとを含み、脂質コアマトリクスは、ＦＣＧＲＴ遺伝子をサイレンシングする少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む、方法が提供される。実施形態では、本方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏである。

【0204】

ＦｃＲｎ
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（例えば、図１および２Ａを参照されたい）は、生体組織の感染を制御する血液循環および細胞外液中に見出される最も一般的な種類の抗体である。ＩｇＧは抗原と直接結合することができるが、新生児のＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）もまた細胞上の受容体と結合して免疫応答をもたらす。Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）のファミリーには、ＦＣＧＲＴ遺伝子によってコードされる非定型新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）が含まれる。ＦｃＲｎは、ＩｇＧおよびアルブミンを再循環させ、維持し、またＩｇＧおよびアルブミンを、極性化した細胞障壁を越えて輸送するように機能し、それによって、循環中のＩｇＧおよびアルブミンの半減期を増加させる。また、ＦｃＲｎはＩｇＧ免疫複合体（ＩＣ）に由来するペプチドと相互作用し、その抗原提示を促進する。

【0205】

ＦｃＲｎは、母親から子どもへの母親のＩｇＧ抗体を輸送し、母親から子どもにおいて受動体液性免疫を促進する受容体として最初に同定された。ＦｃＲｎは、単量体の免疫グロブリンガンマのＦｃ領域に結合し（図１Ｂおよび２Ｂ～５を参照されたい）、乳汁からのその選択的取り込みを媒介する。乳汁中のＩｇＧは、腸管上皮の頂端面に結合する。結果として生じたＦｃＲｎ－ＩｇＧ複合体は、腸管上皮を越えてトランスサイトーシスされ、ＩｇＧは、ＦｃＲｎから血液または組織液中に放出される。生涯を通じて、ＩｇＧを再利用し、循環中での半減期を延長することにより、効果的な体液性免疫に寄与する。機構的には、内皮細胞および造血細胞の酸性エンドソームにおいてＦｃＲｎと結合する単量体ＩｇＧは、細胞表面にリサイクルされ、循環中に放出される。

【0206】

当初、ＦｃＲｎは、胎児期および新生児期の胎盤および腸組織にのみ存在すると考えられていた。しかしながら、現在では、ＦｃＲｎは、上皮、内皮、および造血起源の細胞を含む全身の多くの組織で発現していることが公知である。具体的には、上皮におけるＦｃＲｎ発現は、腸、胎盤、腎臓、および肝臓において検出されている。

【0207】

機構的には、内皮細胞および造血細胞の酸性エンドソームにおいてＦｃＲｎと結合する単量体ＩｇＧは、細胞表面にリサイクルされ、そこで循環中に放出される。ＩｇＧに加えて、ＦｃＲｎは他の最も豊富な循環タンパク質アルブミン／ＡＬＢのホメオスタシスを調節する。

【0208】

ＦｃＲｎは多くの組織において発現される。例えば、ＦｃＲｎは、肝臓、肝細胞、およびミュラー細胞において発現される。ＦｃＲｎは、上皮、内皮、および骨髄系にも高度に発現し、適応免疫において複数の役割を果たす。骨髄細胞上では、ＦｃＲｎは古典的ＦｃγＲおよび補体とともに食作用と抗原提示の両方に関与する。足細胞（腎臓）では、ＦｃＲｎが糸球体基底膜からＩｇＧを再吸収し、糸球体疾患を引き起こす可能性のある免疫複合体の沈着を防ぐ。

【0209】

例えば、重症筋無力症（ｇＭＧ）、温式自己免疫性溶血性貧血（ｗＡＩＨＡ）、特発性血小板低減性紫斑病（ＩＴＰ）、グレーブス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、尋常性天疱瘡、ならびに胎児および新生児の溶血性疾患（ＨＤＦＮ）を含め、いくつかの自己免疫疾患が、自己抗原に対するＩｇＧの反応により引き起こされる。ＦｃＲｎは循環中のＩｇＧレベルを維持するために機能するため、ＦｃＲｎはこのような自己免疫疾患を引き起こす抗体の半減期も延長する。静注免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）は、ＦｃＲｎのＩｇＧリサイクリング能を飽和させ、ＦｃＲｎへの病原性ＩｇＧ結合のレベルを低減させることにより、ＩｇＧ自己抗体のレベル低減を促進する、最近開発された治療法である。

【0210】

Ｅｆｇａｒｔｉｇｉｍｏｄ（ＡＲＧＸ－１１３、ＶＹＶＧＡＲＴ）は、当初重症筋無力症（ｇＭＧ）を治療するためにＡｒｇｅｎｘにより開発されたＩＶ／ＳＣ治療薬である。Ｅｆｇａｒｔｉｇｉｍｏｄは、ＦｃＲｎに対する親和性が増加したＩｇＧ１ Ｆｃ断片である。Ｅｆｇａｒｔｉｇｉｍｏｄは、ＦｃＲｎに対するＩｇＧの接近を遮断し、その全血清半減期を低減させる。対象へのＥｆｇａｒｔｉｇｉｍｏｄの投与（１回のＩＶ注入を使用して約１０ｍｇ／ｋｇ／週を投与）は、対象におけるＩｇＧの５０～７０％の低減と関連している。

【0211】

ＦＣＧＲＴ遺伝子に様々な改変を施して、本明細書に開示する改変されたＦｃＲｎタンパク質を提供することができる。改変は、本明細書において提供される方法に従って改変されたＦｃＲｎタンパク質を含む対象において、ＩｇＧの血清半減期に影響を与える。実施形態では、改変されたＦｃＲｎタンパク質は、１１２位のロイシン（Ｌ）、１１５位のグルタミン酸（Ｅ）、１１６位のグルタミン酸（Ｅ）、１３１位のトリプトファン（Ｗ）、１３２位のプロリン（Ｐ）、および１３３位のグルタミン酸（Ｅ）からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸において参照ＦｃＲｎタンパク質と相違する。他の実施形態では、改変されたＦｃＲｎタンパク質は、表１、図２Ｂ、４～７Ｂ、８Ｂ、８Ｃおよび９Ｂのうちのいずれか１つに示されるような１つまたは複数の変更、ならびに／またはＭ１１８（１４１）位における変更（例えば、Ｍ１１８（１４１）Ｉ）を含む。

【0212】

【表1-1】

【0213】

【表1-2】

【0214】

一部の実施形態では、本開示の方法および組成物を使用して、以下のＦｃＲｎアミノ酸配列において下線または太字で示したアミノ酸の１つまたは複数に変更を導入し、

【0215】

【表C】

【0216】

実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＦｃＲｎの以下の特性：Ａ）ＦｃＲｎとＩｇＧとの間で形成される複合体の安定性（例えば、低減または増加）；Ｂ）中性ｐＨにおけるＩｇＧに対する結合親和性（例えば、低減または増加）；Ｃ）中性より低いかまたは高いｐＨにおけるＩｇＧに対する結合親和性（例えば、低減または増加）；Ｄ）Ｗ１３１の位置決め（例えば、ＩｇＧに対する結合を低減または増加するため）のうちの１つまたは複数を改変する変更を含むＦｃＲｎを産生するために使用される。

【0217】

特定の実施形態では、５１位または６１位のトリプトファン残基および１６６位のヒスチジンは、これらのアミノ酸がヒト血清アルブミンの結合および半減期延長の原因となるため、改変されない。

【0218】

別の実施形態では、細胞においてＦｃＲｎ発現をサイレンシングする方法であって、細胞をＬＮＰと接触させるステップを含み、ＬＮＰは、脂質単分子層膜に包埋された、ＩｇＧ抗体またはその機能的断片の少なくとも１つのＦｃ領域を含む脂質単分子層膜；および脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスを含み、脂質コアマトリクスは、ＦＣＧＲＴ遺伝子をサイレンシングする少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む、方法が提供される。実施形態では、本方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏである。

【0219】

標的遺伝子の編集
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子編集を生成するために、細胞（例えば、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、または骨髄性細胞などの対象由来の細胞）を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、１つまたは複数のガイドＲＮＡ、ならびに核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）およびシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼを含む核酸塩基エディターポリペプチドと接触させる。一部の実施形態では、編集される細胞を、少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させ、前記ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のガイドＲＮＡ、ならびに核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）およびシチジンデアミナーゼを含む核酸塩基エディターポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、１つまたは複数のヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ｇＲＮＡは細胞に直接添加される。一部の実施形態では、これらのヌクレオチドアナログは、細胞プロセスからのｇＲＮＡの分解を阻害することができる。

【0220】

様々な例では、スペーサー配列に５’および／または３’「Ｇ」ヌクレオチドを含めることが有利である。一部の実施形態では、例えば、本明細書で提供される任意のスペーサー配列またはガイドポリヌクレオチドは、５’「Ｇ」を含むか、またはさらに含み、その場合、一部の実施形態では、５’「Ｇ」は、標的配列に対して相補的であるか、または相補的ではない。一部の実施形態では、５’「Ｇ」を、５’「Ｇ」を既に含んでいないスペーサー配列に付加する。例えば、Ｕ６プロモーターは転写開始部位で「Ｇ」を好むため、Ｕ６プロモーターなどの制御下でガイドＲＮＡが発現する場合、ガイドＲＮＡに５’末端「Ｇ」を含めることは有利であり得る（Ｃｏｎｇ，Ｌ．ら「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９～８２３（２０１３年）ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照のこと）。一部の実施形態では、５’末端「Ｇ」を、プロモーターの制御下で発現させるガイドポリヌクレオチドに付加するが、ガイドポリヌクレオチドをプロモーターの制御下で発現させない場合またはそのときには、必要に応じて、ガイドポリヌクレオチドに付加しない。

【0221】

実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（ＳｐＣａｓ９スキャフォールド；配列番号３１７）および
ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵ（ＳａＣａｓ９スキャフォールド；配列番号４３６）
から選択されるヌクレオチド配列を含むスキャフォールドを含む。

【0222】

表２Ａおよび表２Ｂは、本開示の実施形態における使用に適した例示的なｇＲＮＡ配列（例えば、完全ガイド配列およびスペーサー配列）を提供する。

【0223】

【表2A-1】

【0224】

【表2A-2】

【0225】

【表2A-3】

【0226】

【表2A-4】

【0227】

【表2B-1】

【0228】

【表2B-2】

【0229】

核酸塩基エディター
ポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列を編集、改変または変化させる核酸塩基エディターは、本明細書に記載される方法および組成物において有用である。本明細書に記載される核酸塩基エディターは、典型的には、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインおよび核酸塩基編集ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ）を含む。ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、結合したガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）と合わさると、標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、それによって塩基エディターを、編集することが所望される標的核酸配列に局在化させることができる。

【0230】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される核酸塩基エディターは、塩基編集活性を改善する１つまたは複数の特徴を含む。例えば、本明細書で提供される核酸塩基エディターのいずれかは、低減したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９ドメインを含み得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される核酸塩基エディターのいずれかは、ヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と称される、二重鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を切断するＣａｓ９ドメインを有し得る。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、触媒残基（例えば、Ｈ８４０）の存在は、標的化された核酸塩基の反対側の非編集（例えば、非脱アミノ化）鎖を切断するＣａｓ９の活性を維持する。触媒残基の突然変異（例えば、Ｄ１０からＡ１０）は、標的化された残基（例えば、ＡまたはＣ）を含む編集（例えば、脱アミノ化）鎖の切断を阻止する。このようなＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡで定義された標的配列に基づく特定の位置で一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生成することができ、非編集鎖の修復につながり、最終的に非編集鎖上の核酸塩基の変化をもたらす。

【0231】

ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン
ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）に結合する。塩基エディターのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、それ自体、１つまたは複数のドメイン（例えば、１つまたは複数のヌクレアーゼドメイン）を含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸分子の一本鎖、または二本鎖核酸分子の両方の鎖を切断することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、標的ポリヌクレオチドの０、１つ、または２つの鎖を切断することができる。

【0232】

塩基エディターに組み込むことができるポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの非限定的な例としては、ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメイン、制限ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が挙げられる。一部の実施形態では、塩基エディターは、天然もしくは改変タンパク質またはその一部を含むポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含み、これは、結合したガイド核酸を介して、ＣＲＩＳＰＲ（すなわち、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）を媒介した核酸の改変中に核酸配列に結合することができる。そのようなタンパク質は、本明細書では「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」と称される。したがって、本明細書において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の全部または一部（例えば、機能的部分）を含むポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディター（すなわち、塩基エディターの「ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメイン」とも称される、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の全部または一部（例えば、機能的部分）をドメインとして含む塩基エディター）が開示される。塩基エディターに組み込まれたＣＲＩＳＰＲタンパク質由来のドメインは、野生型または天然バージョンのＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較して改変することができる。例えば、以下に記載するように、ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の野生型または天然バージョンと比較して、１つまたは複数の突然変異、挿入、欠失、再配列および／または組換えを含み得る。

【0233】

本明細書で使用され得るＣａｓタンパク質には、クラス１およびクラス２が含まれる。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１（例えば、配列番号２３２）、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、およびＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦ、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらのホモログ、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列で、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補体内で、一方または両方の鎖の切断を指示することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれ以上の塩基対内の一方または両方の鎖の切断を指示することができる。

【0234】

突然変異型ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に関して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２）またはＣａｓドメイン（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２）は、野生型の例示的なＣａｓポリペプチドまたはＣａｓドメインに対して、少なくともまたは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有するポリペプチドまたはドメインを指し得る。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２）は、欠失、挿入、置換、バリアント、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組合せなどのアミノ酸変化を含み得るＣａｓタンパク質の野生型または改変形態を指し得る。

【0235】

一部の実施形態では、塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓ：ＮＣ＿０１５６８３．１、ＮＣ＿０１７３１７．１）；コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓ：ＮＣ＿０１６７８２．１、ＮＣ＿０１６７８６．１）；スピロプラズマ・シルフィディコラ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０２１２８４．１）；プレボテラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０１７８６１．１）；スピロプラズマ・タイワネンセ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０２１８４６．１）；ストレプトコッカス・イニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０２１３１４．１）；ベルリエラ・バルティカ（Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０１８０１０．１）；サイクロフレクサス・トルクイズ（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０１８７２１．１）；ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＹＰ＿８２０８３２．１）；リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿４７２０７３．１）；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＹＰ＿００２３４４９００．１）；ナイセリア・メニンギティディス（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＹＰ＿００２３４２１００．１）；ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはスタフィロコッカス・アウレウス由来のＣａｓ９の全部または一部（例えば、機能的部分）を含み得る。

【0236】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼの配列および構造は当業者に周知である（例えば、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ Ｍｌ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ．」 Ｆｅｒｒｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４６５８～４６６３（２００１年）；「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ．」 Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２～６０７（２０１１年）；および「Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．」 Ｊｉｎｅｋ Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２１（２０１２年）を参照されたく、これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。Ｃａｓ９オルソログは、Ｓ．ピオゲネスおよびＳ．サーモフィルスを含むが、これらに限定されない、様々な種で記載されている。追加の適切なＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであり、そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列としては、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｒｈｕｎ、およびＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ、「Ｔｈｅ ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」（２０１３）ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：５、７２６～７３７に開示されている生物および遺伝子座に由来するＣａｓ９配列が挙げられ、これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0237】

高忠実度Ｃａｓ９ドメイン
本開示の一部の態様は、高忠実度Ｃａｓ９ドメインを提供する。高忠実度Ｃａｓ９ドメインは当該技術分野で公知であり、例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ら、「Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ．」 Ｎａｔｕｒｅ ５２９、４９０～４９５（２０１６年）；およびＳｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ら「Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１、８４～８８（２０１５年）に記載されており；各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。例示的な高忠実度Ｃａｓ９ドメインを、配列番号２３３として配列表に提供する。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９ドメインは、対応する野生型Ｃａｓ９ドメインと比較して、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖－リン酸骨格との間の静電相互作用を低下させる１つまたは複数の突然変異を含む操作されたＣａｓ９ドメインである。ＤＮＡの糖－リン酸骨格との静電相互作用を低下させた高忠実度Ｃａｓ９ドメインは、オフターゲット効果が少なくなる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、野生型Ｃａｓ９ドメイン（配列番号１９７および２００）は、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖－リン酸骨格との間の会合を低下させる１つまたは複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖－リン酸骨格との間の会合を少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、または少なくとも７０％低下させる１つまたは複数の突然変異を含む。

【0238】

一部の実施形態では、本明細書で提供されるＣａｓ９融合タンパク質または複合体のいずれかは、Ｄ１０Ａ、Ｎ４９７Ｘ、Ｒ６６１Ｘ、Ｑ６９５Ｘ、および／またはＱ９２６Ｘ突然変異のうちの１つもしくは複数、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９酵素は、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、または超高精度Ｃａｓ９バリアント（ＨｙｐａＣａｓ９）である。一部の実施形態では、改変されたＣａｓ９ ｅＳｐＣａｓ９（１．１）は、ＨＮＨ／ＲｕｖＣ溝と非標的ＤＮＡ鎖との間の相互作用を弱め、鎖分離およびオフターゲット部位での切断を防止するアラニン置換を含む。同様に、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１は、Ｃａｓ９とＤＮＡリン酸骨格との相互作用を破壊するアラニン置換を通じてオフターゲット編集を低下させる。ＨｙｐａＣａｓ９には、Ｃａｓ９の校正および標的識別を向上させるＲＥＣ３ドメインの突然変異（ＳｐＣａｓ９ Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ）が含まれる。３つの高忠実度酵素はすべて、野生型Ｃａｓ９よりも少ないオフターゲット編集を生成する。

【0239】

排他性が低減したＣａｓ９ドメイン
典型的には、Ｃａｓ９タンパク質、例えば、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」またはＰＡＭ様モチーフを必要とし、これはＣＲＩＳＰＲ細菌適応免疫系におけるＣａｓ９ヌクレアーゼによって標的化されるＤＮＡ配列の直後に続く２～６塩基対のＤＮＡ配列である。特定の核酸領域に結合するためにＮＧＧ ＰＡＭ配列の存在が必要であり、「ＮＧＧ」の「Ｎ」は、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）であり、Ｇはグアノシンである。これにより、ゲノム内の所望の塩基を編集する機能が制限され得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基編集融合タンパク質または複合体は、正確な位置、例えば、ＰＡＭの上流にある標的塩基を含む領域に配置される必要があり得る。例えば、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」 Ｎａｔｕｒｅ ５３３、４２０～４２４（２０１６年）を参照されたく、その全内容はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。ＰＡＭ配列に結合することができるｓｐＣａｓ９タンパク質の例示的なポリペプチド配列を、配列番号１９７、２０１、および２３４～２３７として配列表に提供する。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質または複合体のいずれかは、標準（例えば、ＮＧＧ）ＰＡＭ配列を含まないヌクレオチド配列に結合することができるＣａｓ９ドメインを含み得る。非標準ＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは当該技術分野で説明されており、当業者には明らかであろう。例えば、非標準ＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」 Ｎａｔｕｒｅ ５２３、４８１～４８５（２０１５）；およびＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ら、「Ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｂｙ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ＰＡＭ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３、１２９３～１２９８（２０１５）に記載されており；各々の全内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。

【0240】

ニッカーゼ
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ニッカーゼドメインを含む。本明細書において、「ニッカーゼ」という用語は、二重鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡ）中の二本鎖のうちの一本鎖のみを切断することができるヌクレアーゼドメインを含む、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを指す。一部の実施形態では、ニッカーゼは、活性型のポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインに１つまたは複数の突然変異を導入することによって、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの完全に触媒的に活性な（例えば、天然の）形態から誘導され得る。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインがＣａｓ９に由来するニッカーゼドメインを含む場合、Ｃａｓ９由来のニッカーゼドメインは、Ｄ１０Ａ突然変異および８４０位にヒスチジンを含み得る。そのような実施形態では、残基Ｈ８４０は触媒活性を保持しており、それによって核酸二重鎖の一本鎖を切断することができる。別の例では、Ｃａｓ９由来のニッカーゼドメインは、Ｈ８４０Ａ突然変異を含むが、１０位のアミノ酸残基はＤのままである。一部の実施形態では、ニッカーゼは、ニッカーゼ活性に必要のないヌクレアーゼドメインの全部または一部（例えば、機能的部分）を除去することにより、完全に触媒的に活性な（例えば、天然の）形態のポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインから誘導され得る。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインがＣａｓ９に由来するニッカーゼドメインを含む場合、Ｃａｓ９由来のニッカーゼドメインは、ＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインの全部または一部（例えば、機能的部分）の欠失を含み得る。

【0241】

一部の実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、以下のアミノ酸配列に対応するか、またはそれを含む：

【0242】

【表D】

【0243】

一部の実施形態では、ニッカーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９由来のニッカーゼドメイン、Ｃａｓ１２由来のニッカーゼドメイン）を含む塩基エディターによって切断される核酸二重鎖標的ポリヌクレオチド配列の鎖は、塩基エディターによって編集されない鎖である（すなわち、塩基エディターによって切断される鎖は、編集される塩基を含む鎖の反対側にある）。他の実施形態では、ニッカーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９由来のニッカーゼドメイン、Ｃａｓ１２由来のニッカーゼドメイン）を含む塩基エディターは、編集の標的とされているＤＮＡ分子の鎖を切断することができる。そのような実施形態では、非標的鎖は切断されない。

【0244】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性型（例えば、不活性化された）ＤＮＡ切断ドメインを有し、すなわち、Ｃａｓ９は、「ｎＣａｓ９」タンパク質（「ニッカーゼ」Ｃａｓ９のため）と称されるニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼは、二重鎖核酸分子（例えば、二重鎖ＤＮＡ分子）の１本の鎖のみを切断することができるＣａｓ９タンパク質であり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、二重鎖核酸分子の標的鎖を切断するが、これは、Ｃａｓ９ニッカーゼが、Ｃａｓ９に結合するｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と塩基対形成する（相補的である）鎖を切断することを意味する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｄ１０Ａ突然変異を含み、８４０位にヒスチジンを有する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、二重鎖核酸分子の非標的未塩基編集鎖を切断するが、これは、Ｃａｓ９ニッカーゼが、Ｃａｓ９に結合するｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と塩基対形成しない鎖を切断することを意味する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｈ８４０Ａ突然変異を含み、１０位にアスパラギン酸残基、または対応する突然変異を有する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、本明細書で提供されるＣａｓ９ニッカーゼのいずれか１つに対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる適切なＣａｓ９ニッカーゼは、本開示および当該技術分野の知識に基づいて当業者には明らかであり、本開示の範囲内である。

【0245】

例示的な触媒性Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ（配列番号２０１）
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能的なエンドヌクレアーゼドメイン：ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。Ｃａｓ９は、標的と結合すると構造変化を起こし、標的ＤＮＡの反対側の鎖を切断するようにヌクレアーゼドメインを配置する。Ｃａｓ９媒介性ＤＮＡ切断の最終結果は、標的ＤＮＡ（ＰＡＭ配列の約３～４ヌクレオチド上流）内の二本鎖切断（ＤＳＢ）である。結果として生じるＤＳＢは、次いで２つの一般的な修復経路：（１）効率的ではあるがエラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路；または（２）効率は低いが高忠実度の相同組換え修復（ＨＤＲ）経路のうちの１つによって修復される。

【0246】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は改変されたＣａｓ９である。所与のｇＲＮＡ標的化配列は、ゲノム全体に部分的な相同性が存在する追加の部位を有し得る。これらの部位はオフターゲットと呼ばれ、ｇＲＮＡを設計する際に考慮する必要がある。ｇＲＮＡ設計の最適化に加えて、Ｃａｓ９の改変によってＣＲＩＳＰＲ特異性を高めることもできる。Ｃａｓ９は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨの２つのヌクレアーゼドメインの活性を組み合わせて二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。ＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ突然変異体であるＣａｓ９ニッカーゼは１つのヌクレアーゼドメインを保持し、ＤＳＢではなくＤＮＡニックを生成する。ニッカーゼ系は、特定の遺伝子編集のためにＨＤＲ媒介性遺伝子編集と組み合わせることもできる。

【0247】

触媒的に不活性のヌクレアーゼ
触媒的に不活性の（すなわち、標的ポリヌクレオチド配列を切断することができない）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターもまた、本明細書で提供される。本明細書において、「触媒的に不活性」および「ヌクレアーゼ不活性」という用語は、核酸の鎖を切断することができないという結果をもたらす１つまたは複数の突然変異および／または欠失を有するポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを指すために互換的に使用される。一部の実施形態では、触媒的に不活性なポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン塩基エディターは、１つまたは複数のヌクレアーゼドメインにおける特定の点突然変異の結果として、ヌクレアーゼ活性を欠損し得る。例えば、Ｃａｓ９ドメインを含む塩基エディターの場合、Ｃａｓ９は、Ｄ１０Ａ突然変異およびＨ８４０Ａ突然変異の両方を含み得る。そのような突然変異は、両方のヌクレアーゼドメインを不活性化し、それによってヌクレアーゼ活性の喪失をもたらす。他の実施形態では、触媒的に不活性なポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、触媒ドメイン（例えば、ＲｕｖＣ１および／またはＨＮＨドメイン）の全部または一部（例えば、機能的部分）の１つまたは複数の欠失を含む。さらなる実施形態では、触媒的に不活性なポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、点突然変異（例えば、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ）、およびヌクレアーゼドメインの全部または一部（例えば、機能的部分）の欠失を含む。ｄＣａｓ９ドメインは当該技術分野で公知であり、例えば、Ｑｉら、「Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．」 Ｃｅｌｌ．２０１３；１５２（５）：１１７３～８３に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0248】

さらなる適切なヌクレアーゼ不活性型ｄＣａｓ９ドメインは、本開示および当該技術分野の知見に基づいて当業者には明らかであり、本開示の範囲内である。そのようなさらなる例示的な適切なヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインとしては、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、およびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ突然変異体ドメインが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｐｒａｓｈａｎｔら、ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１３；３１（９）：８３３～８３８を参照されたく、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。

【0249】

一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活性化する１つまたは複数の突然変異を有するＣａｓ９アミノ酸配列に対応するか、または部分的もしくは全体的にそれを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ突然変異およびＨ８４０Ｘ突然変異、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、Ｘは任意のアミノ酸変化である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ突然変異およびＨ８４０Ａ突然変異、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインは、クローニングベクターｐＰｌａｔＴＥＴ－ｇＲＮＡ２（受託番号ＢＡＶ５４１２４）に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0250】

一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低減している。例えば、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメインの機能を低減させる突然変異（アミノ酸置換）を有し得る。非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ（アミノ酸位置１０でアスパラギン酸からアラニンへ）を有し、したがって二本鎖ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低減している（したがって、バリアントＣａｓ９タンパク質が二本鎖標的核酸を切断する場合に二本鎖切断（ＤＳＢ）の代わりに一本鎖切断（ＳＳＢ）を生じさせる）（例えば、Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２年８月１７日；３３７（６０９６）：８１６～２１を参照のこと）。

【0251】

一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断することができるが、ガイド標的配列の相補鎖を切断する能力が低減している。例えば、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ＨＮＨドメイン（ＲｕｖＣ／ＨＮＨ／ＲｕｖＣドメインモチーフ）の機能を低減させる突然変異（アミノ酸置換）を有し得る。非限定的な例としては、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０でヒスチジンからアラニンへの）突然変異を有し、したがってガイド標的配列の非相補鎖を切断することができるが、ガイド標的配列の相補鎖を切断する能力が低減している（したがって、バリアントＣａｓ９タンパク質が二本鎖ガイド標的配列を切断する場合に、ＤＳＢではなくＳＳＢを生じさせる）。そのようなＣａｓ９タンパク質は、ガイド標的配列（例えば、一本鎖ガイド標的配列）を切断する能力が低減しているが、ガイド標的配列（例えば、一本鎖ガイド標的配列）に結合する能力を保持している。

【0252】

別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｗ４７６ＡおよびＷ１１２６Ａ突然変異を有し、それにより、ポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減している。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持している。

【0253】

別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ突然変異を有し、それにより、ポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減している。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持している。

【0254】

別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ、Ｗ４７６Ａ、およびＷ１１２６Ａ突然変異を有し、それにより、ポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減している。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持している。別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、Ｗ４７６Ａ、およびＷ１１２６Ａ突然変異を有し、それにより、ポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減している。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持している。一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９は、Ｃａｓ９ ＨＮＨドメイン（Ａ８４０Ｈ）の８４０位に触媒的Ｈｉｓ残基を回復させている。

【0255】

別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ突然変異を有し、それにより、ポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減している。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持している。別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ突然変異を有し、それにより、ポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減している。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持している。一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質がＷ４７６ＡおよびＷ１１２６Ａ突然変異を含む場合、またはバリアントＣａｓ９タンパク質がＰ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ突然変異を含む場合、バリアントＣａｓ９タンパク質はＰＡＭ配列に効率的に結合しない。したがって、一部のそのような実施形態では、そのようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法で使用される場合、その方法はＰＡＭ配列を必要としない。言い換えれば、一部の実施形態では、そのようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法で使用される場合、その方法はガイドＲＮＡを含むことができるが、その方法はＰＡＭ配列がなくても実施することができる（そして結合の特異性はしたがって、ガイドＲＮＡの標的化セグメントによって提供される）。他の残基は、上記の効果を達成するために突然変異させることができる（すなわち、１つまたは他のヌクレアーゼ部分を不活性化する）。非限定的な例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７を変化させる（すなわち、置換する）ことができる。また、アラニン置換以外の突然変異も適している。

【0256】

一部の実施形態では、触媒活性が低減したバリアントＣａｓ９タンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質が、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７突然変異を有する場合、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａ）、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡと相互作用する能力を保持している限り、依然として部位特異的な様式で標的ＤＮＡに結合することができる（なぜなら、依然としてガイドＲＮＡによって標的ＤＮＡ配列に誘導されるからである）。

【0257】

一部の実施形態では、バリアントＣａｓタンパク質は、ｓｐＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＥＲ、ｘＣａｓ９（ｓｐ）、ｓａＣａｓ９、ｓａＣａｓ９－ＫＫＨ、ｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、ｓｐＣａｓ９－ＬＲＫＩＱＫ、またはｓｐＣａｓ９－ＬＲＶＳＱＬであり得る。

【0258】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、スタフィロコッカス・アウレウス（ＳａＣａｓ９）由来のＣａｓ９ドメインである。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ＳａＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性ＳａＣａｓ９（ＳａＣａｓ９ｄ）、またはＳａＣａｓ９ニッカーゼ（ＳａＣａｓ９ｎ）である。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９は、Ｎ５７９Ａ突然変異、または本明細書とともに提出される配列表に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。

【0259】

一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、非標準ＰＡＭを有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶ ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、Ｅ７８１Ｘ、Ｎ９６７Ｘ、およびＲ１０１４Ｘ突然変異のうちの１つもしくは複数、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、Ｅ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、およびＲ１０１４Ｈ突然変異のうちの１つもしくは複数、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、Ｅ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、もしくはＲ１０１４Ｈ突然変異、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。

【0260】

一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体に存在するＣａｓ９ドメインの１つを、ＰＡＭ配列を必要としないガイドヌクレオチド配列－プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質ドメインで置き換えてもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９はＳａＣａｓ９である。ＳａＣａｓ９の残基Ａ５７９をＮ５７９から突然変異させて、ＳａＣａｓ９ニッカーゼを生成することができる。残基Ｋ７８１、Ｋ９６７、およびＨ１０１４を、Ｅ７８１、Ｎ９６７、およびＲ１０１４から突然変異させて、ＳａＫＫＨ Ｃａｓ９を生成することができる。

【0261】

一部の実施形態では、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（ＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲ）を含み、変化したＰＡＭ５’－ＮＧＣ－３’に対する特異性を有する改変ＳｐＣａｓ９を使用した。

【0262】

Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の代替としては、哺乳動物細胞において切断活性を示すＣｐｆ１ファミリー由来のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが挙げられ得る。プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１由来のＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に類似したＤＮＡ編集技術である。Ｃｐｆ１は、クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。この獲得免疫機構は、プレボテラ属およびフランシセラ属細菌において見出される。Ｃｐｆ１遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に関連しており、ガイドＲＮＡを使用してウイルスＤＮＡを見つけて切断するエンドヌクレアーゼをコードしている。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９よりも小型で単純なエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の制限の一部を克服している。Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは異なり、Ｃｐｆ１媒介性ＤＮＡ切断の結果、短い３’オーバーハングを有する二本鎖切断が生じる。Ｃｐｆ１の千鳥状切断パターンは、従来の制限酵素クローニングと同様に、遺伝子編集の効率を高めることができる指向性の遺伝子導入の可能性を広げる可能性がある。上記のＣａｓ９バリアントおよびオルソログと同様に、Ｃｐｆ１はまた、ＳｐＣａｓ９に好まれるＮＧＧ ＰＡＭ部位を欠くＡＴリッチ領域またはＡＴリッチゲノムまで、ＣＲＩＳＰＲによって標的化され得る部位の数を拡張することができる。Ｃｐｆ１遺伝子座は、混合アルファ／ベータドメイン、ＲｕｖＣ－Ｉ、その後にヘリックス領域、ＲｕｖＣ－ＩＩ、およびジンクフィンガー様ドメインを含む。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに類似したＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有する。

【0263】

さらに、Ｃａｓ９とは異なるＣｐｆ１は、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Ｃｐｆ１のＮ末端はＣａｓ９のアルファヘリックス認識ローブを有さない。Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓドメインアーキテクチャは、Ｃｐｆ１が機能的にユニークであり、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ系に分類されることを示している。Ｃｐｆ１遺伝子座は、ＩＩ型系よりもＩ型およびＩＩＩ型に類似したＣａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣａｓ４タンパク質をコードしている。機能的なＣｐｆ１は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要としないため、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｒＲＮＡ）のみが必要とされる。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９より小さいだけでなく、より小さいｓｇＲＮＡ分子（Ｃａｓ９の約半分のヌクレオチド）を有するため、これはゲノム編集に有利である。Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体は、Ｃａｓ９によって標的化されるＧ－リッチＰＡＭとは対照的に、プロトスペーサー隣接モチーフ５’－ＹＴＮ－３’または５’－ＴＴＮ－３’を識別することによって標的ＤＮＡまたはＲＮＡを切断する。ＰＡＭを識別した後、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドのオーバーハングを有する粘着末端様のＤＮＡ二本鎖切断を導入する。

【0264】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、変化したＰＡＭ配列に対する特異性を有するＣａｓ９バリアントである。一部の実施形態では、追加のＣａｓ９バリアントおよびＰＡＭ配列は、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＳｐＣａｓ９ ｖａｒｉａｎｔｓ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ ｎｏｎ－Ｇ ＰＡＭｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２０）に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、特定のＰＡＭ要件を有さない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアント、例えば、ＳｐＣａｓ９バリアントは、ＮＲＮＨ ＰＡＭに対する特異性を有し、Ｒは、ＡまたはＧであり、Ｈは、Ａ、Ｃ、またはＴである。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、ＰＡＭ配列ＡＡＡ、ＴＡＡ、ＣＡＡ、ＧＡＡ、ＴＡＴ、ＧＡＴ、またはＣＡＣに対する特異性を有する。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、１１１４、１１３４、１１３５、１１３７、１１３９、１１５１、１１８０、１１８８、１２１１、１２１８、１２１９、１２２１、１２４９、１２５６、１２６４、１２９０、１３１８、１３１７、１３２０、１３２１、１３２３、１３３２、１３３３、１３３５、１３３７、もしくは１３３９位、またはそれらの対応する位置にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、１１１４、１１３５、１２１８、１２１９、１２２１、１２４９、１３２０、１３２１、１３２３、１３３２、１３３３、１３３５、もしくは１３３７位、またはそれらの対応する位置にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、１１１４、１１３４、１１３５、１１３７、１１３９、１１５１、１１８０、１１８８、１２１１、１２１９、１２２１、１２５６、１２６４、１２９０、１３１８、１３１７、１３２０、１３２３、１３３３位、またはそれらの対応する位置にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、１１１４、１１３１、１１３５、１１５０、１１５６、１１８０、１１９１、１２１８、１２１９、１２２１、１２２７、１２４９、１２５３、１２８６、１２９３、１３２０、１３２１、１３３２、１３３５、１３３９位、またはそれらの対応する位置にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、１１１４、１１２７、１１３５、１１８０、１２０７、１２１９、１２３４、１２８６、１３０１、１３３２、１３３５、１３３７、１３３８、１３４９位、またはそれらの対応する位置にアミノ酸置換を含む。ＳｐＣａｓ９バリアントの例示的なアミノ酸置換およびＰＡＭ特異性を、表３Ａ～３Ｄに示す。

【0265】

【表3A】

【0266】

【表3B】

【0267】

【表3C】

【0268】

【表3D】

【0269】

改変されたＰＡＭ認識を有するさらなる例示的なＣａｓ９（例えば、ＳａＣａｓ９）ポリペプチドは、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら、「Ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｂｙ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ＰＡＭ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３３：１２９３～１２９８（２０１５年）ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３４０４に記載されており、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９２９Ｒ、Ｎ９６８Ｋ、および／またはＲ１０１５Ｈの変化のうちの１つまたは複数を含むＣａｓ９バリアント（例えば、ＳａＣａｓ９バリアント）は、参照ポリペプチド（例えば、ＳａＣａｓ９）と比較して、ＮＮＮＲＲＴまたはＮＮＨＲＲＴ ＰＡＭ配列に特異的であるか、または増加した編集活性に関連しており、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ＨはＧ以外の任意のヌクレオチド（すなわち、「非Ｇ」）を表し、Ｒはプリンを表す。実施形態では、Ｃａｓ９バリアント（例えば、ＳａＣａｓ９バリアント）は、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、およびＲ１０１５Ｈの変化、またはＥ７８２Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、およびＲ１０１５Ｈの変化を含む。

【0270】

一部の実施形態では、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の単一エフェクターである。微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の単一エフェクターには、限定されないが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、およびＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３が含まれる。典型的には、微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系はクラス１系およびクラス２系に分けられる。クラス１系はマルチサブユニットエフェクター複合体を有し、一方、クラス２系は単一のタンパク質エフェクターを有する。例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１は、クラス２エフェクターである。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１に加えて、３つの異なるクラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、およびＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３）が、Ｓｈｍａｋｏｖら、「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２０１５年１１月５日；６０（３）：３８５～３９７により記載され、その全内容はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。系の２つのエフェクター、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、およびＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３は、Ｃｐｆ１に関連するＲｕｖＣ様のエンドヌクレアーゼドメインを含む。第３の系は、２つの予測ＨＥＰＮ ＲＮａｓｅドメインを有するエフェクターを含む。成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの生成は、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１によるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの生成とは異なり、ｔｒａｃｒＲＮＡに依存しない。Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１は、ＤＮＡ切断に関して、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方に依存する。

【0271】

一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは循環置換である（例えば、配列番号２３８）。

【0272】

キメラ単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と複合体を形成しているアリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒａｓｔｒｉｓ）Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１（ＡａｃＣ２ｃ１）の結晶構造が報告されている。例えば、Ｌｉｕら、「Ｃ２ｃ１－ｓｇＲＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｒｅｖｅａｌｓ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２０１７年１月１９日；６５（２）：３１０～３２２を参照されたく、その全内容はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。結晶構造は、三元複合体として標的ＤＮＡに結合したアリシクロバチルス・アシドテレストリスＣ２ｃ１でも報告されている。例えば、Ｙａｎｇら、「ＰＡＭ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ Ｃ２Ｃ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ」、Ｃｅｌｌ、２０１６年１２月１５日；１６７（７）：１８１４～１８２８を参照されたく、その全内容はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。標的ＤＮＡ鎖と非標的ＤＮＡ鎖の両方で、単一のＲｕｖＣ触媒ポケット内に独立して配置され、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１媒介性の切断により、標的ＤＮＡのねじれ形の７か所のヌクレオチド切断を生じさせる、ＡａｃＣ２ｃ１の触媒能力のあるコンフォメーションが捕捉されている。Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１三元複合体と、以前に同定されたＣａｓ９およびＣｐｆ１の対応物との構造比較は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系で使用されるメカニズムの多様性を示している。

【0273】

一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質または複合体のいずれかの核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質であり得る。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１タンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書で提供されるｎａｐＤＮＡｂｐ配列のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３もまた、本開示に従って使用され得ることを理解すべきである。

【0274】

一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐとは、Ｃａｓ１２ｃを指す。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｃタンパク質は、Ｃａｓ１２ｃ１（配列番号２３９）またはＣａｓ１２ｃ１のバリアントである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ｃ２（配列番号２４０）またはＣａｓ１２ｃ２のバリアントである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、オレイフィルス種（Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．）ＨＩ０００９（すなわち、ＯｓｐＣａｓ１２ｃ；配列番号２４１）またはＯｓｐＣａｓ１２ｃのバリアント由来のＣａｓ１２ｃタンパク質である。これらのＣａｓ１２ｃ分子は、Ｙａｎら、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９年１月４日；３６３：８８～９１に記載されており、その全内容はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ２、またはＯｓｐＣａｓ１２ｃタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ２、またはＯｓｐＣａｓ１２ｃタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に記載の任意のＣａｓ１２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ２、またはＯｓｐＣａｓ１２ｃタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。他の細菌種に由来するＣａｓ１２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ２、またはＯｓｐＣａｓ１２ｃもまた、本開示に従って使用され得ることを理解すべきである。

【0275】

一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐとは、例えば、Ｙａｎら、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９年１月４日；３６３：８８～９１に記載されている、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉを指し；各々の全内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＣａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、およびＣａｓ１２ｉポリペプチド配列を、配列番号２４２～２４５として配列表に提供する。１０テラバイトを超える配列データを集約することにより、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、およびＣａｓ１２ｉを含む、以前に特徴付けられたクラスＶタンパク質と弱い類似性を示すＶ型Ｃａｓタンパク質の新しい分類が特定された。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ｇ、またはＣａｓ１２ｇのバリアントである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｈのバリアントである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ｉ、またはＣａｓ１２ｉのバリアントである。他のＲＮＡ誘導性ＤＮＡ結合タンパク質もｎａｐＤＮＡｂｐとして使用されてもよく、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に記載される任意のＣａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のＣａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉもまた、本開示に従って使用されてもよいことを理解すべきである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｉは、Ｃａｓ１２ｉ１またはＣａｓ１２ｉ２である。

【0276】

一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質または複合体のいずれかの核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦタンパク質であり得る。Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦは、Ｐａｕｓｃｈら、「ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓΦ ｆｒｏｍ ｈｕｇｅ ｐｈａｇｅｓ ｉｓ ａ ｈｙｐｅｒｃｏｍｐａｃｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｏｒ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０２０年７月１７日、Ｖｏｌ．３６９、Ｉｓｓｕｅ ６５０１、３３３～３３７頁に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ヌクレアーゼ不活性型（「デッド」）Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦタンパク質である。他の種に由来するＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦもまた、本開示に従って使用されてもよいことを理解すべきである。

【0277】

内部挿入を伴う融合タンパク質または複合体
本明細書において、核酸プログラマブル核酸結合タンパク質、例えば、ｎａｐＤＮＡｂｐに融合させた異種ポリペプチドを含む融合タンパク質または複合体が提供される。異種ポリペプチドは、天然型または野生型のｎａｐＤＮＡｂｐポリペプチド配列には見出されないポリペプチドであり得る。異種ポリペプチドは、ｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端、ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端でｎａｐＤＮＡｂｐに融合するか、またはｎａｐＤＮＡｂｐの内部位置に挿入することができる。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、デアミナーゼ（例えば、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼ）またはその機能的断片である。例えば、融合タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１）ポリペプチドのＮ末端断片およびＣ末端断片が隣接するデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１）である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０またはＴａｄＡ^＊８）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡは、ＴａｄＡ^＊８またはＴａｄＡ^＊９である。本明細書に記載されるＴａｄＡ配列（例えば、ＴａｄＡ７．１０またはＴａｄＡ^＊８）は、上記の融合タンパク質または複合体に適したデアミナーゼである。

【0278】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造：
ＮＨ２－［ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端断片］－［デアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端断片］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９のＮ末端断片］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９のＣ末端断片］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２のＮ末端断片］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２のＣ末端断片］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９のＮ末端断片］－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９のＣ末端断片］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２のＮ末端断片］－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２のＣ末端断片］－ＣＯＯＨ
を含み、式中、「］－［」の各インスタンスは、必要に応じたリンカーの存在である（すなわち、リンカーは必要に応じて存在する）。

【0279】

デアミナーゼは、循環置換デアミナーゼであり得る。例えば、デアミナーゼは、循環置換アデノシンデアミナーゼであり得る。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１１６、１３６、または６５で循環的に置換された循環置換ＴａｄＡである。

【0280】

融合タンパク質または複合体は、１つより多いデアミナーゼを含み得る。融合タンパク質または複合体は、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、１つまたは２つのデアミナーゼを含む。融合タンパク質または複合体内の２つまたはそれ以上のデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはそれらの組合せであり得る。２つまたはそれ以上のデアミナーゼは、ホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。２つまたはそれ以上のデアミナーゼは、ｎａｐＤＮＡｂｐにタンデムに挿入することができる。一部の実施形態では、２つまたはそれ以上のデアミナーゼは、ｎａｐＤＮＡｂｐにタンデムに存在していなくてもよい。

【0281】

一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体内のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはその断片である。Ｃａｓ９ポリペプチドは、バリアントＣａｓ９ポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ポリペプチドまたはその断片である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ポリペプチドまたはその断片である。融合タンパク質または複合体内のＣａｓ９ポリペプチドは、全長のＣａｓ９ポリペプチドであり得る。一部の場合では、融合タンパク質または複合体内のＣａｓ９ポリペプチドは、全長のＣａｓ９ポリペプチドでなくてもよい。Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、天然に存在するＣａｓ９タンパク質と比較して、Ｎ末端またはＣ末端で短縮され得る。Ｃａｓ９ポリペプチドは、循環的に置換されたＣａｓ９タンパク質であり得る。Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドの断片、一部、またはドメインであり得るが、それは依然として標的ポリヌクレオチドおよびガイド核酸配列に結合することができる。

【0282】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、スタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、または本明細書に記載されるＣａｓ９ポリペプチドのいずれかの断片もしくはバリアントである。

【0283】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ９内に挿入されたアデノシンデアミナーゼドメインおよびシチジンデアミナーゼドメインを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、シチジンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、シチジンデアミナーゼはＮ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、アデノシンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、アデノシンデアミナーゼはＮ末端に融合される。

【0284】

アデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼおよびＣａｓ９を有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下：
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（アデノシンデアミナーゼ）］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（アデノシンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ
のように提供される。

【0285】

一部の実施形態では、上記の一般的な構造で使用される「－」は、必要に応じたリンカーの存在を示す。

【0286】

様々な実施形態では、触媒ドメインは、アデノシンデアミナーゼ活性などのＤＮＡ改変活性（例えば、デアミナーゼ活性）を有する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡは、ＴａｄＡ^＊８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８はＣａｓ９内に融合され、シチジンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８はＣａｓ９内に融合され、シチジンデアミナーゼはＮ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、ＴａｄＡ^＊８はＣ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、ＴａｄＡ^＊８はＮ末端に融合される。ＴａｄＡ^＊８およびシチジンデアミナーゼおよびＣａｓ９を有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下：
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（ＴａｄＡ^＊８）］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（ＴａｄＡ^＊８）］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－［ＴａｄＡ^＊８］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［ＴａｄＡ^＊８］－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ
のように提供される。

【0287】

一部の実施形態では、上記の一般的な構造で使用される「－」は、必要に応じたリンカーの存在を示す。

【0288】

異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）を、適切な位置で、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１））に挿入することができ、例えば、それにより、ｎａｐＤＮＡｂｐは、標的ポリヌクレオチドおよびガイド核酸に結合する能力を保持する。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、デアミナーゼの機能（例えば、塩基編集活性）またはｎａｐＤＮＡｂｐの機能（例えば、標的核酸およびガイド核酸に結合する能力）を損なうことなく、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、結晶学的研究に示されるように、例えば、変性領域または高温因子もしくはＢ因子を含む領域でｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。あまり秩序化されていない、変性、または不定形のタンパク質の領域、例えば、溶媒に曝露された領域およびループを、構造または機能を損なうことなく挿入に使用することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、柔軟なループ領域または溶媒に曝露された領域のｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１ポリペプチドの柔軟なループに挿入する。

【0289】

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）の挿入位置を、Ｃａｓ９ポリペプチドの結晶構造のＢ因子分析によって決定する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、平均よりも高いＢ因子（例えば、全タンパク質または変性領域を含むタンパク質ドメインと比較して、より高いＢ因子）を含むＣａｓ９ポリペプチドの領域に挿入する。Ｂ因子または温度因子は、原子のそれらの平均位置からの変動を示すことができる（例えば、温度依存性の原子振動または結晶格子の静的無秩序性の結果として）。骨格原子の高いＢ因子（例えば、平均よりも高いＢ因子）は、比較的高い局所移動度を有する領域を示し得る。そのような領域は、構造または機能を損なうことなくデアミナーゼを挿入するために使用することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、全タンパク質について、平均Ｂ因子よりも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、または２００％超高いＢ因子を有するＣα原子を有する残基を有する位置に、挿入することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、残基を含むＣａｓ９タンパク質ドメインについて、平均Ｂ因子よりも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、または２００％超高いＢ因子を有するＣα原子を有する残基を有する位置に、挿入することができる。平均よりも高いＢ因子を含むＣａｓ９ポリペプチドの位置としては、例えば、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、残基７６８、７９２、１０５２、１０１５、１０２２、１０２６、１０２９、１０６７、１０４０、１０５４、１０６８、１２４６、１２４７、および１２４８が挙げられ得る。平均よりも高いＢ因子を含むＣａｓ９ポリペプチド領域としては、例えば、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、残基７９２～８７２、７９２～９０６、および２～７９１が挙げられ得る。

【0290】

異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、７６８、７９１、７９２、１０１５、１０１６、１０２２、１０２３、１０２６、１０２９、１０４０、１０５２、１０５４、１０６７、１０６８、１０６９、１２４６、１２４７、および１２４８からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基において、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。一部の実施形態では、異種ポリペプチドを、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸位置７６８～７６９、７９１～７９２、７９２～７９３、１０１５～１０１６、１０２２～１０２３、１０２６～１０２７、１０２９～１０３０、１０４０～１０４１、１０５２～１０５３、１０５４～１０５５、１０６７～１０６８、１０６８～１０６９、１２４７～１２４８、もしくは１２４８～１２４９、またはそれらの対応するアミノ酸位置の間に挿入する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドを、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸位置７６９～７７０、７９２～７９３、７９３～７９４、１０１６～１０１７、１０２３～１０２４、１０２７～１０２８、１０３０～１０３１、１０４１～１０４２、１０５３～１０５４、１０５５～１０５６、１０６８～１０６９、１０６９～１０７０、１２４８～１２４９、もしくは１２４９～１２５０、またはそれらの対応するアミノ酸位置の間に挿入する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、７６８、７９１、７９２、１０１５、１０１６、１０２２、１０２３、１０２６、１０２９、１０４０、１０５２、１０５４、１０６７、１０６８、１０６９、１２４６、１２４７、および１２４８からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を置換する。挿入位置に関する上記のＣａｓ９参照配列への参照は、例示を目的としていることを理解すべきである。本明細書で論じる挿入は、上記のＣａｓ９参照配列のＣａｓ９ポリペプチド配列に限定されないが、バリアントＣａｓ９ポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ヌクレアーゼドメインを欠くＣａｓ９バリアント、短縮型Ｃａｓ９、または部分的もしくは完全にＨＮＨドメインを欠くＣａｓ９ドメインにおける対応する位置での挿入を含む。

【0291】

異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、７６８、７９２、１０２２、１０２６、１０４０、１０６８、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基において、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。一部の実施形態では、異種ポリペプチドを、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸位置７６８～７６９、７９２～７９３、１０２２～１０２３、１０２６～１０２７、１０２９～１０３０、１０４０～１０４１、１０６８～１０６９、もしくは１２４７～１２４８、またはそれらの対応するアミノ酸位置の間に挿入する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドを、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸位置７６９～７７０、７９３～７９４、１０２３～１０２４、１０２７～１０２８、１０３０～１０３１、１０４１～１０４２、１０６９～１０７０、もしくは１２４８～１２４９、またはそれらの対応するアミノ酸位置の間に挿入する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、７６８、７９２、１０２２、１０２６、１０４０、１０６８、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を置換する。

【0292】

異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）を、本明細書に記載されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基において、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。実施形態では、異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、１００２、１００３、１０２５、１０５２～１０５６、１２４２～１２４７、１０６１～１０７７、９４３～９４７、６８６～６９１、５６９～５７８、５３０～５３９、および１０６０～１０７７からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基において、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、残基のＮ末端もしくはＣ末端に挿入するか、または残基を置き換えることができる。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、残基のＣ末端に挿入する。

【0293】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、残基７９２～８７２、７９２～９０６、もしくは２～７９１、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基の代わりに挿入する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼを、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼを、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＣ末端に挿入する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼを、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入して置換する。

【0294】

一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入する。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼを、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼを、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＣ末端に挿入する。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼを、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を挿入して置換する。

【0295】

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＣ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入して置換する。

【0296】

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基７９１に挿入するか、もしくはアミノ酸残基７９２、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基７９１のＮ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基７９２、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基７９１のＣ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基７９２、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基７９１に挿入して置換するか、もしくはアミノ酸残基７９２、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入して置換する。

【0297】

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＣ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入して置換する。

【0298】

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０２２に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０２３、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０２２のＮ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０２３、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０２２のＣ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０２３、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＣ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０２２を挿入して置換するか、もしくはアミノ酸残基１０２３、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を挿入して置換する。

【0299】

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０２６に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０２９、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０２６のＮ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０２９、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０２６のＣ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０２９、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＣ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０２６を挿入して置換するか、もしくはアミノ酸残基１０２９、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を挿入して置換する。

【0300】

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０４０、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０４０、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０４０、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＣ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０４０、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入して置換する。

【0301】

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０５２に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０５４、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０５２のＮ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０５４、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０５２のＣ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０５４、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＣ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０５２を挿入して置換するか、もしくはアミノ酸残基１０５４、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を挿入して置換する。

【0302】

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０６７に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０６８に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０６９、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０６７のＮ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０６８のＮ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０６９、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０６７のＣ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０６８のＣ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１０６９、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＣ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１０６７に挿入して置換するか、もしくはアミノ酸残基１０６８に挿入して置換するか、もしくはアミノ酸残基１０６９、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入して置換する。

【0303】

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１２４６に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１２４７に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１２４８、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１２４６のＮ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１２４７のＮ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１２４８、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＮ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１２４６のＣ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１２４７のＣ末端に挿入するか、もしくはアミノ酸残基１２４８、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基のＣ末端に挿入する。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、アミノ酸残基１２４６に挿入して置換するか、もしくはアミノ酸残基１２４７に挿入して置換するか、もしくはアミノ酸残基１２４８、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に挿入して置換する。

【0304】

一部の実施形態では、異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）を、Ｃａｓ９ポリペプチドの柔軟なループに挿入する。柔軟なループ部分は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、５３０～５３７、５６９～５７０、６８６～６９１、９４３～９４７、１００２～１０２５、１０５２～１０７７、１２３２～１２４７、もしくは１２９８～１３００、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基からなる群から選択され得る。柔軟なループ部分は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、１～５２９、５３８～５６８、５８０～６８５、６９２～９４２、９４８～１００１、１０２６～１０５１、１０７８～１２３１、もしくは１２４８～１２９７、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基からなる群から選択され得る。

【0305】

異種ポリペプチド（例えば、アデニンデアミナーゼ）を、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基：１０１７～１０６９、１２４２～１２４７、１０５２～１０５６、１０６０～１０７７、１００２～１００３、９４３～９４７、５３０～５３７、５６８～５７９、６８６～６９１、１２４２～１２４７、１２９８～１３００、１０６６～１０７７、１０５２～１０５６、もしくは１０６０～１０７７、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に対応するＣａｓ９ポリペプチド領域に挿入することができる。

【0306】

異種ポリペプチド（例えば、アデニンデアミナーゼ）を、Ｃａｓ９ポリペプチドの欠失領域の代わりに挿入することができる。欠失領域は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端部分に対応し得る。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、残基７９２～８７２、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に対応する。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、残基７９２～９０６、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に対応する。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、残基２～７９１、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に対応する。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、残基１０１７～１０６９、またはそれらの対応するアミノ酸残基に対応する。

【0307】

例示的な内部融合塩基エディターを、以下の表４に提供する：

【0308】

【表4】

【0309】

異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）を、Ｃａｓ９ポリペプチドの構造的または機能的ドメイン内に挿入することができる。異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）を、Ｃａｓ９ポリペプチドの２つの構造的または機能的ドメインの間に挿入することができる。異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）を、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドからドメインを欠失させた後、Ｃａｓ９ポリペプチドの構造的または機能的ドメインの代わりに挿入することができる。Ｃａｓ９ポリペプチドの構造的または機能的ドメインは、例えば、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、ＲｕｖＣ ＩＩＩ、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、ＰＩ、またはＨＮＨを含み得る。

【0310】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、ＲｕｖＣ ＩＩＩ、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、ＰＩ、またはＨＮＨドメインからなる群から選択される１つまたは複数のドメインを欠失している。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインを欠失している。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインを欠失している。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインの一部を欠失しており、それにより、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ活性が低減または無効化されている。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの欠失を含み、ヌクレアーゼドメインを置換するためにデアミナーゼを挿入する。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインを欠失させ、その場所にデアミナーゼを挿入する。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインの１つまたは複数を欠失させ、その場所にデアミナーゼを挿入する。

【0311】

異種ポリペプチドを含む融合タンパク質に、ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端およびＣ末端断片が隣接していてもよい。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端断片およびＣ末端断片が隣接するデアミナーゼを含む。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、標的ポリヌクレオチド配列に結合することができる。Ｎ末端断片のＣ末端またはＣ末端断片のＮ末端は、Ｃａｓ９ポリペプチドの柔軟なループの一部を含み得る。Ｎ末端断片のＣ末端またはＣ末端断片のＮ末端は、Ｃａｓ９ポリペプチドのアルファ－ヘリックス構造の一部を含み得る。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、ＤＮＡ結合ドメインを含み得る。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、ＲｕｖＣドメインを含み得る。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、ＨＮＨドメインを含み得る。一部の実施形態では、Ｎ末端断片およびＣ末端断片のいずれも、ＨＮＨドメインを含まない。

【0312】

一部の実施形態では、Ｎ末端Ｃａｓ９断片のＣ末端は、融合タンパク質が標的核酸塩基を脱アミノ化する際に標的核酸塩基に近接しているアミノ酸を含む。一部の実施形態では、Ｃ末端Ｃａｓ９断片のＮ末端は、融合タンパク質が標的核酸塩基を脱アミノ化する際に標的核酸塩基に近接しているアミノ酸を含む。標的核酸塩基と、Ｎ末端Ｃａｓ９断片のＣ末端またはＣ末端Ｃａｓ９断片のＮ末端のアミノ酸との間の近接性を得るために、異なるデアミナーゼの挿入位置は、異なり得る。例えば、デアミナーゼの挿入位置は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた、１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基であり得る。

【0313】

融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片（すなわち、融合タンパク質におけるデアミナーゼに隣接するＮ末端Ｃａｓ９断片）は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端を含み得る。融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、または１３００アミノ酸の長さを含み得る。融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基：１～５６、１～９５、１～２００、１～３００、１～４００、１～５００、１～６００、１～７００、１～７１８、１～７６５、１～７８０、１～９０６、１～９１８、もしくは１～１１００、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に対応する配列を含み得る。Ｎ末端Ｃａｓ９断片は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基：１～５６、１～９５、１～２００、１～３００、１～４００、１～５００、１～６００、１～７００、１～７１８、１～７６５、１～７８０、１～９０６、１～９１８、もしくは１～１１００、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を含む配列を含み得る。

【0314】

融合タンパク質のＣ末端Ｃａｓ９断片（すなわち、融合タンパク質におけるデアミナーゼに隣接するＣ末端Ｃａｓ９断片）は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＣ末端を含み得る。融合タンパク質のＣ末端Ｃａｓ９断片は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、または１３００アミノ酸の長さを含み得る。融合タンパク質のＣ末端Ｃａｓ９断片は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基：１０９９～１３６８、９１８～１３６８、９０６～１３６８、７８０～１３６８、７６５～１３６８、７１８～１３６８、９４～１３６８、もしくは５６～１３６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に対応する配列を含み得る。Ｎ末端Ｃａｓ９断片は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基：１０９９～１３６８、９１８～１３６８、９０６～１３６８、７８０～１３６８、７６５～１３６８、７１８～１３６８、９４～１３６８、もしくは５６～１３６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を含む配列を含み得る。

【0315】

融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片およびＣ末端Ｃａｓ９断片は一緒に、例えば、上記のＣａｓ９参照配列に記載されているように、全長の天然に存在するＣａｓ９ポリペプチド配列に対応しない場合がある。

【0316】

本明細書に記載される融合タンパク質または複合体は、ゲノム全体のスプリアス脱アミノ化の低減などの、非標的部位（例えば、オフターゲット部位）での脱アミノ化の低減を伴う標的化脱アミノ化をもたらすことができる。本明細書に記載される融合タンパク質または複合体は、非標的部位でのバイスタンダー脱アミノ化を低減して、標的化脱アミノ化をもたらすことができる。望ましくない脱アミノ化またはオフターゲット脱アミノ化を、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合したデアミナーゼを含む末端融合タンパク質に比べて、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減させることができる。望ましくない脱アミノ化またはオフターゲット脱アミノ化を、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合したデアミナーゼを含む末端融合タンパク質に比べて、１分の１以下、２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、１０分の１以下、１５分の１以下、２０分の１以下、３０分の１以下、４０分の１以下、５０分の１以下、６０分の１以下、７０分の１以下、８０分の１以下、９０分の１以下、または１００分の１以下に低減させることができる。

【0317】

一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体のデアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、Ｒループの範囲内で２つ以下の核酸塩基を脱アミノ化する。一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体のデアミナーゼは、Ｒループの範囲内で３つ以下の核酸塩基を脱アミノ化する。一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体のデアミナーゼは、Ｒループの範囲内で２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下の核酸塩基を脱アミノ化する。Ｒループは、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡ、またはＲＮＡ：ＲＮＡ相補構造を含み、一本鎖ＤＮＡと会合する三本鎖核酸構造である。本明細書で使用される場合、Ｒループは、標的ポリヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ複合体または塩基編集複合体と接触させる場合に形成され得、ガイドポリヌクレオチドの一部、例えば、ガイドＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド、例えば、標的ＤＮＡの一部とハイブリダイズし、置き換わる。一部の実施形態では、Ｒループは、スペーサー配列および標的ＤＮＡ相補配列のハイブリダイズした領域を含む。Ｒループ領域は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０核酸塩基対の長さであり得る。一部の実施形態では、Ｒループ領域は、長さが約２０核酸塩基対である。本明細書で使用される場合、Ｒループ領域は、ガイドポリヌクレオチドとハイブリダイズする標的ＤＮＡ鎖に限定されないことを理解すべきである。例えば、Ｒループ領域内の標的核酸塩基の編集は、ガイドＲＮＡに対する相補鎖を含むＤＮＡ鎖に対する編集であり得るか、またはガイドＲＮＡに相補的な鎖の反対側の鎖であるＤＮＡ鎖に対する編集であり得る。一部の実施形態では、Ｒループの領域での編集は、標的ＤＮＡ配列中のガイドＲＮＡに対する非相補鎖（プロトスペーサー鎖）上の核酸塩基を編集することを含む。

【0318】

本明細書に記載される融合タンパク質または複合体は、標準的な塩基編集とは異なる編集ウインドウで標的の脱アミノ化をもたらすことができる。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、標的ポリヌクレオチド配列中のＰＡＭ配列の約１～約２０塩基上流である。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、標的ポリヌクレオチド配列中のＰＡＭ配列の約２～約１２塩基上流である。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、ＰＡＭ配列から、約１～９塩基対、約２～１０塩基対、約３～１１塩基対、約４～１２塩基対、約５～１３塩基対、約６～１４塩基対、約７～１５塩基対、約８～１６塩基対、約９～１７塩基対、約１０～１８塩基対、約１１～１９塩基対、約１２～２０塩基対、約１～７塩基対、約２～８塩基対、約３～９塩基対、約４～１０塩基対、約５～１１塩基対、約６～１２塩基対、約７～１３塩基対、約８～１４塩基対、約９～１５塩基対、約１０～１６塩基対、約１１～１７塩基対、約１２～１８塩基対、約１３～１９塩基対、約１４～２０塩基対、約１～５塩基対、約２～６塩基対、約３～７塩基対、約４～８塩基対、約５～９塩基対、約６～１０塩基対、約７～１１塩基対、約８～１２塩基対、約９～１３塩基対、約１０～１４塩基対、約１１～１５塩基対、約１２～１６塩基対、約１３～１７塩基対、約１４～１８塩基対、約１５～１９塩基対、約１６～２０塩基対、約１～３塩基対、約２～４塩基対、約３～５塩基対、約４～６塩基対、約５～７塩基対、約６～８塩基対、約７～９塩基対、約８～１０塩基対、約９～１１塩基対、約１０～１２塩基対、約１１～１３塩基対、約１２～１４塩基対、約１３～１５塩基対、約１４～１６塩基対、約１５～１７塩基対、約１６～１８塩基対、約１７～１９塩基対、約１８～２０塩基対、離れているか、または上流にある。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、ＰＡＭ配列から、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０塩基対、またはそれ以上離れているか、または上流にある。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、ＰＡＭ配列から、約１、２、３、４、５、６、７、８、または９塩基対、上流にある。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、ＰＡＭ配列から、約２、３、４、または６塩基対、上流にある。

【0319】

融合タンパク質または複合体は、１つより多い異種ポリペプチドを含み得る。例えば、融合タンパク質または複合体は、１つもしくは複数のＵＧＩドメインおよび／または１つもしくは複数の核局在化シグナルをさらに含み得る。２つ以上の異種ドメインをタンデムに挿入することができる。２つ以上の異種ドメインを、ＮａｐＤＮＡｂｐ内でタンデムにならないような位置に挿入することができる。

【0320】

融合タンパク質は、デアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐポリペプチドとの間にリンカーを含み得る。リンカーは、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーであり得る。例えば、リンカーは、ＸＴＥＮ、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２４６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２４７）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号２４８）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号２４９）であり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端およびＣ末端断片を、リンカーでデアミナーゼに接続する。一部の実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端断片を、リンカーを用いずにデアミナーゼドメインに結合する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含むが、Ｃ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含まない。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含むが、Ｎ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含まない。

【0321】

一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体中のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ１２を特定の核酸配列に導く核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と会合することができる、Ｃａｓ１２ポリペプチド、例えば、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、またはそれらの断片である。Ｃａｓ１２ポリペプチドは、バリアントＣａｓ１２ポリペプチドであってもよい。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドのＮ末端断片またはＣ末端断片は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメインまたはＲｕｖＣドメインを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ１２ポリペプチドと触媒ドメインとの間にリンカーを含む。他の実施形態では、リンカーのアミノ酸配列は、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号２５０）または
ＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧ（配列番号２５１）
である。他の実施形態では、リンカーは剛直なリンカーである。上記態様の他の実施形態では、リンカーは、
ＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣ（配列番号２５２）または
ＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣ（配列番号２５３）
によってコードされる。

【0322】

Ｃａｓ１２ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端断片が隣接する異種触媒ドメインを含む融合タンパク質もまた、本明細書に記載される方法における塩基編集に有用である。Ｃａｓ１２および１つまたは複数のデアミナーゼドメイン、例えば、アデノシンデアミナーゼを含むか、またはＣａｓ１２配列が隣接するアデノシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質もまた、標的配列の高度に特異的かつ効率的な塩基編集に有用である。実施形態では、キメラＣａｓ１２融合タンパク質は、Ｃａｓ１２ポリペプチド内に挿入された異種触媒ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ１２内に挿入されたアデノシンデアミナーゼドメインおよびシチジンデアミナーゼドメインを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、シチジンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、シチジンデアミナーゼはＮ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、アデノシンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、アデノシンデアミナーゼはＮ末端に融合される。アデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼおよびＣａｓ１２を有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下：
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２（アデノシンデアミナーゼ）］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２（アデノシンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ
のように提供される。

【0323】

一部の実施形態では、上記の一般的な構造で使用される「－」は、必要に応じたリンカーの存在を示す。

【0324】

様々な実施形態では、触媒ドメインは、アデノシンデアミナーゼ活性などのＤＮＡ改変活性（例えば、デアミナーゼ活性）を有する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡは、ＴａｄＡ^＊８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８はＣａｓ１２内に融合され、シチジンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８はＣａｓ１２内に融合され、シチジンデアミナーゼはＮ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、ＴａｄＡ^＊８はＣ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、ＴａｄＡ^＊８はＮ末端に融合される。ＴａｄＡ^＊８およびシチジンデアミナーゼおよびＣａｓ１２を有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下：
Ｎ－［Ｃａｓ１２（ＴａｄＡ^＊８）］－［シチジンデアミナーゼ］－Ｃ；
Ｎ－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２（ＴａｄＡ^＊８）］－Ｃ；
Ｎ－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－［ＴａｄＡ^＊８］－Ｃ；または
Ｎ－［ＴａｄＡ^＊８］－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－Ｃ
のように提供される。

【0325】

一部の実施形態では、上記の一般的な構造で使用される「－」は、必要に応じたリンカーの存在を示す。

【0326】

他の実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは複数の触媒ドメインを含む。他の実施形態では、１つまたは複数の触媒ドメインの少なくとも１つを、Ｃａｓ１２ポリペプチド内に挿入するか、またはＣａｓ１２のＮ末端もしくはＣ末端に融合させる。他の実施形態では、１つまたは複数の触媒ドメインの少なくとも１つを、Ｃａｓ１２ポリペプチドのループ、アルファヘリックス領域、不定形部分、または溶媒にアクセス可能な部分内に挿入する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、またはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦである。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、バチルス・ヒサシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｓａｓｈｉｉ）Ｃａｓ１２ｂ、バチルス・サーモアミロボランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ）Ｃａｓ１２ｂ、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）Ｖ３－１３ Ｃａｓ１２ｂ、またはアリサイクロバチルス・アシジフィルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ１２ｂ（配列番号２５４）に対して、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、バチルス・ヒサシイＣａｓ１２ｂ（配列番号２５５）、バチルス・サーモアミロボランスＣａｓ１２ｂ、バチルス種Ｖ３－１３ Ｃａｓ１２ｂ、またはアリサイクロバチルス・アシジフィルスＣａｓ１２ｂに対して、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、バチルス・ヒサシイＣａｓ１２ｂ、バチルス・サーモアミロボランスＣａｓ１２ｂ（配列番号２５６）、バチルス種Ｖ３－１３ Ｃａｓ１２ｂ（配列番号２５７）、またはアリサイクロバチルス・アシジフィルスＣａｓ１２ｂに対して、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、バチルス・ヒサシイＣａｓ１２ｂ、バチルス・サーモアミロボランスＣａｓ１２ｂ、バチルス種Ｖ３－１３ Ｃａｓ１２ｂ、またはアリサイクロバチルス・アシジフィルスＣａｓ１２ｂの断片を含むか、または本質的にそれらからなる。実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、ＢｖＣａｓ１２ｂ（Ｖ４）を含み、これは、一部の実施形態では、５’ｍＲＮＡ Ｃａｐ－－－５’ＵＴＲ－－－ｂｈＣａｓ１２ｂ－－－終止配列－－－３’ＵＴＲ－－－１２０ポリＡテール（配列番号２５８～２６０）として表現される。

【0327】

他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸位置１５３～１５４、２５５～２５６、３０６～３０７、９８０～９８１、１０１９～１０２０、５３４～５３５、６０４～６０５、もしくは３４４～３４５、またはＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦの対応するアミノ酸残基の間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ１５３とＳ１５４との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ２５５とＥ２５６との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｄ９８０とＧ９８１との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ１０１９とＬ１０２０との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｆ５３４とＰ５３５との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ６０４とＧ６０５との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｈ３４４とＦ３４５との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸位置１４７と１４８との間、２４８と２４９との間、２９９と３００との間、９９１と９９２との間、もしくは１０３１と１０３２との間、またはＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦの対応するアミノ酸残基の間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ１４７とＤ１４８との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ２４８とＧ２４９との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ２９９とＥ３００との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ９９１とＥ９９２との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ１０３１とＭ１０３２との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸位置１５７と１５８との間、２５８と２５９との間、３１０と３１１との間、１００８と１００９との間、もしくは１０４４と１０４５との間、またはＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦの対応するアミノ酸残基の間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ１５７とＧ１５８との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｖ２５８とＧ２５９との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｄ３１０とＰ３１１との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ１００８とＥ１００９との間に挿入する。他の実施形態では、触媒ドメインを、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ１０４４とＫ１０４５との間に挿入する。

【0328】

他の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、核局在化シグナル（例えば、バイパータイト核局在化シグナル）を含む。他の実施形態では、核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号２６１）である。上記の態様の他の実施形態では、核局在化シグナルは、以下の配列によってコードされる：
ＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣ（配列番号２６２）。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインの触媒活性をサイレンシングする突然変異を含む。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂポリペプチドは、Ｄ５７４Ａ、Ｄ８２９Ａ、および／またはＤ９５２Ａ突然変異を含む。他の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、タグ（例えば、インフルエンザヘマグルチニンタグ）をさらに含む。

【0329】

一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、内部融合型核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン、例えば、アデノシンデアミナーゼドメインの全部または一部（例えば、機能的部分））を有するｎａｐＤＮＡｂｐドメイン（例えば、Ｃａｓ１２由来ドメイン）を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣａｓ１２ｂである。一部の実施形態では、塩基エディターは、以下の表５に提供される遺伝子座に挿入された内部融合ＴａｄＡ^＊８ドメインを有するＢｈＣａｓ１２ｂドメインを含む。

【0330】

【表5】

【0331】

非限定的な例として、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ^＊８．１３）をＢｈＣａｓ１２ｂに挿入して、核酸配列を効果的に編集する融合タンパク質（例えば、ＴａｄＡ^＊８．１３－ＢｈＣａｓ１２ｂ）を作製することができる。

【0332】

一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集系は、Ｃａｓ９に挿入されたＴａｄＡを有するＡＢＥである。Ｃａｓ９に挿入されたＴａｄＡを有する関連するＡＢＥのポリペプチド配列は、配列番号２６３～３０８として添付の配列表に提供される。

【0333】

一部の実施形態では、アデノシン塩基エディターを生成して、ＴａｄＡまたはそのバリアントを、識別された位置でＣａｓ９ポリペプチドに挿入した。

【0334】

例示的な、ただし非限定的な融合タンパク質は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１６２８５号および米国仮出願第６２／８５２，２２８号および同第６２／８５２，２２４号に記載されており、これらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0335】

ＡからＧへの編集
一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼドメインを含む。そのような塩基エディターのアデノシンデアミナーゼドメインは、Ａを脱アミノ化して、Ｇの塩基対形成特性を示すイノシン（Ｉ）を形成することにより、アデニン（Ａ）核酸塩基からグアニン（Ｇ）核酸塩基への編集を促進することができる。アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化（すなわち、アミン基を除去）することができる。一部の実施形態では、ＡからＧへの塩基エディターは、イノシン塩基除去修復の阻害剤、例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインまたは触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼをさらに含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、ＵＧＩドメインまたは触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼは、脱アミノ化されたアデノシン残基（例えば、イノシン）の塩基除去修復を阻害または防止することができ、これにより塩基エディターの活性または効率を向上させることができる。

【0336】

アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む任意のポリヌクレオチドに作用することができる。ある特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＲＮＡを含むポリヌクレオチドの標的Ａを脱アミノ化することができる。例えば、塩基エディターは、ＲＮＡポリヌクレオチドおよび／またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの標的Ａを脱アミノ化することができるアデノシンデアミナーゼドメインを含み得る。実施形態では、塩基エディターに組み込まれるアデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡ（ＡＤＡＲ、例えば、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２）またはｔＲＮＡ（ＡＤＡＴ）に作用するアデノシンデアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。アデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、ＤＮＡポリヌクレオチドのＡ核酸塩基を脱アミノ化することもできる。実施形態では、塩基エディターのアデノシンデアミナーゼドメインは、ＡＤＡＴがＤＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化できるようにする１つまたは複数の突然変異を含むＡＤＡＴの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。例えば、塩基エディターは、以下の突然変異：Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｉ１５６Ｆ、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異のうちの１つまたは複数を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥｃＴａｄＡ）由来のＡＤＡＴの全部または一部（例えば、機能的部分）を含み得る。例示的なＡＤＡＴホモログのポリペプチド配列を、配列番号１および３０９～３１５として配列表に提供する。

【0337】

アデノシンデアミナーゼは、任意の適切な生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））に由来し得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは原核生物由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは細菌由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、シェワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、またはバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは大腸菌由来である。一部の実施形態では、アデニンデアミナーゼは、本明細書で提供される突然変異のいずれかに対応する１つまたは複数の突然変異（例えば、ｅｃＴａｄＡにおける突然変異）を含む天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。任意の相同タンパク質における対応する残基は、例えば、配列アラインメントおよび相同残基の決定によって同定することができる。本明細書に記載される突然変異のいずれかに対応する任意の天然に存在するアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡと相同性を有する）の突然変異（例えば、ｅｃＴａｄＡにおいて同定された突然変異のいずれか）を、それに応じて生成することができる。

【0338】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかに記載のアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼは、１つまたは複数の突然変異（例えば、本明細書で提供される突然変異のいずれか）を含み得ることを理解すべきである。本開示は、特定割合の同一性に加えて、本明細書に記載される突然変異のいずれか、またはそれらの組合せを有する任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、参照配列、または本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上の突然変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、当該技術分野で公知の、または本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１７０個の同一の連続アミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。

【0339】

本明細書で提供される突然変異（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１）などのＴａｄＡ参照配列に基づく）のいずれかを、他のアデノシンデアミナーゼ、例えば、大腸菌ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）、Ｓ．アウレウスＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、細菌性アデノシンデアミナーゼ）に導入することができることを理解すべきである。一部の実施形態では、ＴａｄＡ参照配列は、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１）である。追加のデアミナーゼを同様にアラインして、本明細書で提供されるように突然変異させることができる相同アミノ酸残基を同定することができることは、当業者には明らかであろう。したがって、ＴａｄＡ参照配列で同定された突然変異のいずれも、相同アミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄａ）で行うことができる。本明細書で提供される突然変異のいずれも、ＴａｄＡ参照配列または別のアデノシンデアミナーゼにおいて個別に、または任意の組合せで行うことができることも理解すべきである。

【0340】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｇ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｖ、Ｄ１０８Ａ、もしくはＤ１０８Ｙ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。しかしながら、追加のデアミナーゼを同様にアラインして、本明細書に提供されるように突然変異させることができる相同アミノ酸残基を同定することができることを理解すべきである。

【0341】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｖ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含む。

【0342】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ１５５Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ１５５Ｄ、Ｅ１５５Ｇ、もしくはＥ１５５Ｖ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含む。

【0343】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１４７Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１４７Ｙ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含む。

【0344】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、もしくはＤ１４７Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ１５５Ｄ、Ｅ１５５Ｇ、またはＥ１５５Ｖ突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＤ１４７Ｙを含む。

【0345】

また、本明細書で提供される突然変異のいずれかは、ｅｃＴａｄＡまたは別のアデノシンデアミナーゼにおいて、個別に、または任意の組合せで作製することができることを理解すべきである。例えば、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、および／もしくはＤ１４７Ｙ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含み得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１）における以下の突然変異の群（突然変異の群は「；」で区切られる）、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む：Ｄ１０８ＮおよびＡ１０６Ｖ；Ｄ１０８ＮおよびＥ１５５Ｖ；Ｄ１０８ＮおよびＤ１４７Ｙ；Ａ１０６ＶおよびＥ１５５Ｖ；Ａ１０６ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ｅ１５５ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、およびＥ１５５Ｖ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ｅ１５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；ならびにＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ。しかしながら、本明細書で提供される対応する突然変異の任意の組合せを、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）において作製することができることを理解すべきである。

【0346】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））における突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異の組合せを含む：Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；またはＬ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｔ１７Ｘ、Ｌ１８Ｘ、Ｗ２３Ｘ、Ｌ３４Ｘ、Ｗ４５Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ａ５６Ｘ、Ｅ５９Ｘ、Ｅ８５Ｘ、Ｍ９４Ｘ、Ｉ９５Ｘ、Ｖ１０２Ｘ、Ｆ１０４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｋ１１０Ｘ、Ｍ１１８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ａ１３８Ｘ、Ｆ１４９Ｘ、Ｍ１５１Ｘ、Ｒ１５３Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｉ１５６Ｘ、および／またはＫ１５７Ｘ突然変異のうちの１つもしくは複数、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｔ１７Ｓ、Ｌ１８Ｅ、Ｗ２３Ｌ、Ｌ３４Ｓ、Ｗ４５Ｌ、Ｒ５１Ｈ、Ａ５６Ｅ、もしくはＡ５６Ｓ、Ｅ５９Ｇ、Ｅ８５Ｋ、もしくはＥ８５Ｇ、Ｍ９４Ｌ、Ｉ９５Ｌ、Ｖ１０２Ａ、Ｆ１０４Ｌ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｃ、もしくはＲ１０７Ｈ、もしくはＲ１０７Ｐ、Ｄ１０８Ｇ、もしくはＤ１０８Ｎ、もしくはＤ１０８Ｖ、もしくはＤ１０８Ａ、もしくはＤ１０８Ｙ、Ｋ１１０Ｉ、Ｍ１１８Ｋ、Ｎ１２７Ｓ、Ａ１３８Ｖ、Ｆ１４９Ｙ、Ｍ１５１Ｖ、Ｒ１５３Ｃ、Ｑ１５４Ｌ、Ｉ１５６Ｄ、および／またはＫ１５７Ｒ突然変異のうちの１つまたは複数、あるいは別のアデノシンデアミナーゼにおける１つまたは複数の対応する突然変異を含む。

【0347】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、および／もしくはＮ１２７Ｘ突然変異のうちの１つもしくは複数、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含み、Ｘは、任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、および／もしくはＮ１２７Ｓ突然変異のうちの１つもしくは複数、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含む。

【0348】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｋ１６１Ｘ、Ｑ１６３Ｘ、および／もしくはＴ１６６Ｘ突然変異のうちの１つもしくは複数、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｒ２６Ｗ、Ｍ６１Ｉ、Ｌ６８Ｑ、Ｍ７０Ｖ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｃ、Ｑ１５４ＨもしくはＱ１５４Ｒ、Ｅ１５５ＧもしくはＥ１５５ＶもしくはＥ１５５Ｄ、Ｋ１６１Ｑ、Ｑ１６３Ｈ、および／またはＴ１６６Ｐ突然変異のうちの１つまたは複数、あるいは別のアデノシンデアミナーゼにおける１つまたは複数の対応する突然変異を含む。

【0349】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、およびＱ１５４Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＱ１６３Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＴ１６６Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。

【0350】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、およびＤ１０８Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ８Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。

【0351】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、もしくは７つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。

【0352】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｃ、およびＱ１５４Ｈからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｍ６１Ｉ、Ｍ７０Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｑ１５４Ｒ、Ｅ１５５Ｇ、およびＱ１６３Ｈからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５Ｖ、およびＴ１６６Ｐからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５Ｄ、およびＫ１６１Ｑからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｒ２６Ｗ、Ｌ６８Ｑ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７Ｓ、およびＥ１５５Ｇからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含む。

【0353】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、別のアデノシンデアミナーゼにおける１つまたは複数の対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｇ、もしくはＤ１０８Ｖ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６ＶおよびＤ１０８Ｎ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１０７ＣおよびＤ１０８Ｎ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＱ１５４Ｈ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、およびＮ１２７Ｓ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含む。

【0354】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ｘ、Ｈ８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｉ１５６Ｘ、および／もしくはＫ１６０Ｘ突然変異のうちの１つもしくは複数、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ａ、Ｈ８Ｙ、Ｉ４９Ｆ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｎ１２７Ｓ、Ｉ１５６Ｆ、および／もしくはＫ１６０Ｓ突然変異のうちの１つもしくは複数、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における１つもしくは複数の対応する突然変異を含む。

【0355】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｌ８４Ｘ突然変異アデノシンデアミナーゼを含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＬ８４Ｆ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含む。

【0356】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ１２３Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ１２３Ｙ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0357】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＩ１５６Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＩ１５６Ｆ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0358】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＬ８４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＩ１５６Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、もしくは７つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、およびＫ１６０Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。

【0359】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＬ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、もしくは７つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ａ、Ｉ４９Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖからなる群から選択される１、２、３、４、５、または６つの突然変異を含む。

【0360】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、およびＫ１６０Ｓからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異もしくは複数の突然変異を含む。

【0361】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ａ１４２Ｘ、および／もしくはＡ１４３Ｘ突然変異のうちの１つもしくは複数、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５Ｓ、Ｅ２５Ｙ、Ｒ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６Ｌ、Ｒ２６Ｋ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７Ｈ、Ｒ１０７Ｓ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ、Ａ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑ、および／もしくはＡ１４３Ｒ突然変異のうちの１つもしくは複数、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列に対応する本明細書に記載される突然変異の１つもしくは複数、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含む。

【0362】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５Ｓ、もしくはＥ２５Ｙ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含む。

【0363】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ２６Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６Ｌ、もしくはＲ２６Ｋ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含む。

【0364】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１０７Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７Ｈ、もしくはＲ１０７Ｓ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含む。

【0365】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含む。

【0366】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４３Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑ、および／もしくはＡ１４３Ｒ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する突然変異を含む。

【0367】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｘ、Ｎ３７Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｎ７２Ｘ、Ｄ７７Ｘ、Ｅ１３４Ｘ、Ｓ１４６Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｋ１５７Ｘ、および／もしくはＫ１６１Ｘ突然変異のうちの１つもしくは複数、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｌ、Ｎ３７Ｔ、Ｎ３７Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｌ、Ｉ４９Ｖ、Ｒ５１Ｈ、Ｒ５１Ｌ、Ｍ７０Ｌ、Ｎ７２Ｓ、Ｄ７７Ｇ、Ｅ１３４Ｇ、Ｓ１４６Ｒ、Ｓ１４６Ｃ、Ｑ１５４Ｈ、Ｋ１５７Ｎ、および／もしくはＫ１６１Ｔ突然変異のうちの１つもしくは複数、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における１つもしくは複数の対応する突然変異を含む。

【0368】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｌ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0369】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＮ３７Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＮ３７ＴもしくはＮ３７Ｓ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0370】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８ＴもしくはＰ４８Ｌ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0371】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ５１Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ５１ＨもしくはＲ５１Ｌ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0372】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ１４６Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ１４６ＲもしくはＳ１４６Ｃ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0373】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＫ１５７Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＫ１５７Ｎ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0374】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、もしくはＰ４８Ａ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0375】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｎ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0376】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＷ２３Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＷ２３ＲもしくはＷ２３Ｌ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0377】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１５２Ｘ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１５２ＰもしくはＲ５２Ｈ突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。

【0378】

一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｈ３６Ｌ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６Ｆ、およびＫ１５７Ｎを含み得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列に関連する以下の突然変異の組合せを含み、組合せの各突然変異は、「＿」によって区切られ、突然変異の各組合せは、括弧の間にある：
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ）、
（Ｒ１０７Ｃ＿Ｄ１０８Ｎ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｑ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｍ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｋ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｉ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｆ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｍ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ５９Ａ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ５９Ａ ｃａｔデッド＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｙ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ）、
（Ｇ２２Ｐ＿Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ）、
（Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ＿Ｓ１３８Ａ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｇ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｒ２６Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｍ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｐ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｒ２６Ｃ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ａ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｎ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｅ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、（Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｎ３７Ｔ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｍ７０Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ３７Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ７２Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｅ１３４Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｎ３７Ｓ＿Ｒ５１Ｈ＿Ｄ７７Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｄ２４Ｇ＿Ｑ７１Ｒ＿Ｌ８４Ｆ＿Ｈ９６Ｌ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６０Ｅ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｇ６７Ｖ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｔ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｑ７１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｌ１３７Ｍ＿Ａ１４３Ｅ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｑ１５９Ｌ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ９１Ｔ＿Ｆ１０４Ｉ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ７２Ｄ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｇ１２５Ａ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ｓ９７Ｃ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｗ２３Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｄ２４Ｇ＿Ｐ４８Ｌ＿Ｑ７１Ｒ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｑ１５９Ｌ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｎ３７Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６０Ｅ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６０Ｅ）、（Ｒ７４Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ７４Ａ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ７４Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ｒ９８Ｑ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｒ１２９Ｑ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ａ１４２Ｎ）、
（Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｌ１５７Ｎ）、
（Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ａ１４２Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｓ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｓ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｗ２３Ｒ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｈ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ａ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ａ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｗ２３Ｒ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）。

【0379】

一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼはＴａｄＡバリアントである。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントはＴａｄＡ^＊７．１０である。特定の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、単一のＴａｄＡ^＊７．１０ドメインを含む（例えば、単量体として提供される）。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＴａｄＡ^＊７．１０およびＴａｄＡ（ｗｔ）を含み、これらはヘテロ二量体を形成することができる。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結されている、ＴａｄＡ^＊７．１０に連結された野生型ＴａｄＡを含む。

【0380】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊７．１０は、少なくとも１つの変化を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の配列の変化を含む：
ＴａｄＡ^＊７．１０
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号１）。

【0381】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊７．１０は、アミノ酸８２および／または１６６に変化を含む。特定の実施形態では、ＴａｄＡ^＊７．１０は、以下の変化のうちの１つまたは複数を含む：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／またはＱ１５４Ｒ。他の実施形態では、ＴａｄＡ^＊７．１０のバリアントは、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される変化の組合せを含む。

【0382】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊７．１０のバリアントは、Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、および／またはＤ１６７Ｎの群から選択される変化の１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊７．１０のバリアントは、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、ならびにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、およびＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を含む。他の実施形態では、ＴａｄＡ^＊７．１０のバリアントは、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される変化の組合せを含む。

【0383】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ^＊８）は欠失を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、Ｃ末端の欠失を含む。特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、残基１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、および１５７から始まるＣ末端の欠失を含む。

【0384】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ^＊８）は、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／またはＱ１５４Ｒのうちの１つまたは複数を含む単量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（ＴａｄＡ^＊８）は、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される変化の組合せを含む単量体である。

【0385】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、各々が以下の変化Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／またはＱ１５４Ｒのうちの１つまたは複数を有する２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）を含むホモ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、各々が、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される変化の組合せを有する２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）を含むホモ二量体である。

【0386】

他の実施形態では、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化：Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉおよび／またはＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を含むアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ^＊８）単量体を含む本開示の塩基エディター。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（ＴａｄＡ^＊８）単量体は、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ；およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される変化の組合せを含む。

【0387】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＭＳＰ８２８）は、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化、Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、および／またはＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を含む単量体である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＭＳＰ８２８）は、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、ならびにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、およびＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を含む単量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（ＴａｄＡバリアント）は、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される変化の組合せを含む単量体である。

【0388】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／またはＱ１５４Ｒのうちの１つまたは複数を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される変化の組合せを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体である。

【0389】

他の実施形態では、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、各々が以下の変化Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉおよび／またはＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を有する２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）を含むアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ^＊８）ホモ二量体を含む本開示の塩基エディター。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、各々が、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ；およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される変化の組合せを有する２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）を含むホモ二量体である。

【0390】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、各々が以下の変化Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、および／またはＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を有する２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０）を含むホモ二量体である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、各々が以下の変化Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、ならびにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、およびＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を有する２つのアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＭＳＰ８２８）を含むホモ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、各々が、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される変化の組合せを有する２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０）を含むホモ二量体である。

【0391】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ^＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／またはＱ１５４Ｒのうちの１つまたは複数を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ^＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される変化の組合せを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体である。

【0392】

他の実施形態では、塩基エディターは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉおよび／またはＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体を含む。他の実施形態では、塩基エディターは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ；およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される変化の組合せを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体を含む。

【0393】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、および／またはＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０）とのヘテロ二量体である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、ならびにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、およびＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を有するアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＭＳＰ８２８）とを含むヘテロ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される変化の組合せを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０）とのヘテロ二量体である。

【0394】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ^＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／またはＱ１５４Ｒのうちの１つまたは複数を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ^＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される変化の組合せを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体である。

【0395】

特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼヘテロ二量体は、ＴａｄＡ^＊８ドメインと、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．アウレウス）ＴａｄＡ、バチルス・サチリス（Ｂ．サチリス）ＴａｄＡ、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（Ｓ．ティフィムリウム）ＴａｄＡ、シェワネラ・プトレファシエンス（Ｓ．プトレファシエンス）ＴａｄＡ、ヘモフィルス・インフルエンザＦ３０３１（Ｈ．インフルエンザ）ＴａｄＡ、カウロバクター・クレセンタス（Ｃ．クレセンタス）ＴａｄＡ、ジオバクター・スルフレデュセンス（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）（Ｇ．スルフレデュセンス）ＴａｄＡ、またはＴａｄＡ^＊７．１０から選択されるアデノシンデアミナーゼドメインを含む。

【0396】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡ^＊８である。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはそれらの断片を含むか、または本質的にそれらからなるＴａｄＡ^＊８である：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＴＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号３１６）。

【0397】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８は短縮されている。一部の実施形態では、短縮型ＴａｄＡ^＊８は、全長ＴａｄＡ^＊８に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＮ末端アミノ酸残基を欠失している。一部の実施形態では、短縮型ＴａｄＡ^＊８は、全長ＴａｄＡ^＊８に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失している。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは全長ＴａｄＡ^＊８である。

【0398】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８は、ＴａｄＡ^＊８．１、ＴａｄＡ^＊８．２、ＴａｄＡ^＊８．３、ＴａｄＡ^＊８．４、ＴａｄＡ^＊８．５、ＴａｄＡ^＊８．６、ＴａｄＡ^＊８．７、ＴａｄＡ^＊８．８、ＴａｄＡ^＊８．９、ＴａｄＡ^＊８．１０、ＴａｄＡ^＊８．１１、ＴａｄＡ^＊８．１２、ＴａｄＡ^＊８．１３、ＴａｄＡ^＊８．１４、ＴａｄＡ^＊８．１５、ＴａｄＡ^＊８．１６、ＴａｄＡ^＊８．１７、ＴａｄＡ^＊８．１８、ＴａｄＡ^＊８．１９、ＴａｄＡ^＊８．２０、ＴａｄＡ^＊８．２１、ＴａｄＡ^＊８．２２、ＴａｄＡ^＊８．２３、またはＴａｄＡ^＊８．２４である。

【0399】

他の実施形態では、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化：Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉおよび／またはＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を含むアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ^＊８）単量体を含む本開示の塩基エディター。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（ＴａｄＡ^＊８）単量体は、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ；およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される変化の組合せを含む。

【0400】

他の実施形態では、塩基エディターは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉおよび／またはＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体を含む。他の実施形態では、塩基エディターは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ；およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される変化の組合せを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体を含む。

【0401】

他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ^＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉおよび／またはＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体を含む。他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ^＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ；およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される変化の組合せを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊８）とのヘテロ二量体を含む。

【0402】

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ^＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化Ｌ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｑ１５４Ｓ、Ｎ１５７Ｋ、および／またはＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０）とのヘテロ二量体である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ^＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、以下の変化Ｖ８２Ｇ、Ｙ１４７Ｔ／Ｄ、Ｑ１５４Ｓ、ならびにＬ３６Ｈ、Ｉ７６Ｙ、Ｆ１４９Ｙ、Ｎ１５７Ｋ、およびＤ１６７Ｎのうちの１つまたは複数を有するアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＭＳＰ８２８）とを含むヘテロ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ^＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｌ３６Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｇ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｑ１５４Ｓ＋Ｎ１５７Ｋ＋Ｄ１６７Ｎの群から選択される変化の組合せを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０）とのヘテロ二量体である。

【0403】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８は表６に示すバリアントである。表６は、ＴａｄＡアミノ酸配列における特定のアミノ酸位置番号、およびＴａｄＡ－７．１０アデノシンデアミナーゼにおけるそれらの位置に存在するアミノ酸を示す。表６はまた、Ｍ．Ｒｉｃｈｔｅｒら、２０２０年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０４５３－ｚ（この全内容は本明細書に参照により組み込まれる）に記載されているように、ファージ支援非連続進化（ＰＡＮＣＥ）およびファージ支援連続進化（ＰＡＣＥ）後のＴａｄＡ－７．１０に対するＴａｄＡバリアントのアミノ酸変化を示す。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８は、ＴａｄＡ^＊８ａ、ＴａｄＡ^＊８ｂ、ＴａｄＡ^＊８ｃ、ＴａｄＡ^＊８ｄ、またはＴａｄＡ^＊８ｅである。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８はＴａｄＡ^＊８ｅである。

【0404】

【表6】

【0405】

一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、表６．１に示すバリアントである。表６．１は、ＴａｄＡアミノ酸配列における特定のアミノ酸位置番号、およびＴａｄＡ^＊７．１０アデノシンデアミナーゼにおけるそれらの位置に存在するアミノ酸を示す。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＭＳＰ６０５、ＭＳＰ６８０、ＭＳＰ８２３、ＭＳＰ８２４、ＭＳＰ８２５、ＭＳＰ８２７、ＭＳＰ８２８、またはＭＳＰ８２９である。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントはＭＳＰ８２８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントはＭＳＰ８２９である。

【0406】

【表6-1】

【0407】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質または複合体は、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結されている、本明細書に記載されるアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ^＊８）に連結されている野生型ＴａｄＡを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、単一のＴａｄＡ^＊８ドメインを含む（例えば、単量体として提供される）。他の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、ＴａｄＡ^＊８およびＴａｄＡ（ｗｔ）を含み、これらはヘテロ二量体を形成することができる。

【0408】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかに記載のアミノ酸配列のいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼは、１つまたは複数の突然変異（例えば、本明細書で提供される突然変異のいずれか）を含み得ることを理解すべきである。本開示は、特定の割合の同一性に加えて、本明細書に記載される突然変異のいずれかまたはそれらの組合せを有する任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、参照配列、または本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上の突然変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、当該技術分野で公知の、または本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１７０個の同一の連続アミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。

【0409】

特定の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８は、太字で示される以下の位置のいずれかに１つまたは複数の突然変異を含む。他の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８は、下線で示される位置のいずれかに１つまたは複数の突然変異を含む：

【0410】

【表E】

【0411】

例えば、ＴａｄＡ^＊８は、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、アミノ酸位置８２および／もしくは１６６における変化（例えば、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ）を単独で、または以下のＹ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、および／もしくはＱ１５４Ｒのいずれか１つもしくは複数と組み合わせて含む。特定の実施形態では、変化の組合せは、ＴａｄＡ参照配列（例えば、ＴａｄＡ^＊７．１０（配列番号１））、または別のＴａｄＡにおける対応する突然変異に対して、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒの群から選択される。

【0412】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８は短縮されている。一部の実施形態では、短縮型ＴａｄＡ^＊８は、全長ＴａｄＡ^＊８に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＮ末端アミノ酸残基を欠失している。一部の実施形態では、短縮型ＴａｄＡ^＊８は、全長ＴａｄＡ^＊８に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失している。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは全長ＴａｄＡ^＊８である。

【0413】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質または複合体は、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結されている、本明細書に記載されるアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ^＊８）に連結されている野生型ＴａｄＡを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、単一のＴａｄＡ^＊８ドメインを含む（例えば、単量体として提供される）。他の実施形態では、塩基エディターは、ヘテロ二量体を形成することができるＴａｄＡ^＊８およびＴａｄＡ（ｗｔ）を含む。

【0414】

特定の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、単一の（例えば、単量体として提供される）ＴａｄＡ^＊８を含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８は、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結されている。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質または複合体は、ＴａｄＡ^＊８に連結されている野生型ＴａｄＡ（ＴａｄＡ（ｗｔ））のヘテロ二量体を含む。他の実施形態では、本発明の融合タンパク質または複合体は、ＴａｄＡ^＊８に連結されているＴａｄＡ^＊７．１０のヘテロ二量体として含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ^＊８バリアント単量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ^＊８とＴａｄＡ（ｗｔ）とのヘテロ二量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ^＊８とＴａｄＡ^＊７．１０とのヘテロ二量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ^＊８のヘテロ二量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８は、表６、１２、または１３から選択される。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、表１２、１３、または１５から選択される。

【0415】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡ^＊９バリアントである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の配列への参照とともに、以下に記載されるバリアントから選択されるＴａｄＡ^＊９バリアントである（ＴａｄＡ^＊７．１０と呼ばれる）：

【0416】

【表F】

【0417】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の変化：Ｒ２１Ｎ、Ｒ２３Ｈ、Ｅ２５Ｆ、Ｎ３８Ｇ、Ｌ５１Ｗ、Ｐ５４Ｃ、Ｍ７０Ｖ、Ｑ７１Ｍ、Ｎ７２Ｋ、Ｙ７３Ｓ、Ｖ８２Ｔ、Ｍ９４Ｖ、Ｐ１２４Ｗ、Ｔ１３３Ｋ、Ｄ１３９Ｌ、Ｄ１３９Ｍ、Ｃ１４６Ｒ、およびＡ１５８Ｋのうちの１つまたは複数を含む。１つまたは複数の変化は上記の配列に下線付きの太字で示される。

【0418】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の変化の組合せのうちの１つまたは複数を含む：Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｉ７６Ｙ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ；Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ；Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ；Ｉ７６Ｙ＿Ｖ８２Ｓ＿Ｙ１２３Ｈ＿Ｙ１４７Ｒ＿Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｈ１２３Ｈ；およびＶ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ。

【0419】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の変化の組合せのうちの１つまたは複数を含む：Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｌ５１Ｗ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｃ１４６Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ７３Ｓ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｐ５４Ｃ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｎ３８Ｇ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｌ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｑ７１Ｍ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｐ１２４Ｗ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｌ５１Ｗ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｃ１４６Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｐ５４Ｃ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ７３Ｓ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｎ３８Ｇ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｒ２３Ｈ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｒ２１Ｎ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ；Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｌ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；およびＭ７０Ｖ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｍ９４Ｖ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ。

【0420】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の変化の組合せのうちの１つまたは複数を含む：Ｑ７１Ｍ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｅ２５Ｆ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｎ３８Ｇ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｒ２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｐ５４Ｃ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｒ２１Ｎ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ７３Ｓ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｅ２５Ｆ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｎ３８Ｇ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｒ２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｐ５４Ｃ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｒ２１Ｎ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ７３Ｓ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；およびＶ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｎ７２Ｋ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｑ７１Ｍ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ；Ｍ７０Ｖ＋Ｑ７１Ｍ＋Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｎ７２Ｋ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｑ７１Ｍ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｍ７０Ｖ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｍ９４Ｖ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ；およびＭ７０Ｖ＋Ｑ７１Ｍ＋Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼを単量体として発現させる。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼをヘテロ二量体として発現させる。一部の実施形態では、デアミナーゼまたは他のポリペプチド配列は、例えば、融合タンパク質の成分として含まれる場合、メチオニンを欠いている。これにより、位置の番号付けが変化し得る。しかしながら、当業者であれば、そのような対応する突然変異、例えば、Ｙ７３ＳとＹ７２Ｓ、およびＤ１３９ＭとＤ１３８Ｍが同じ突然変異を指すことを理解するであろう。

【0421】

一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊９バリアントは、本明細書に記載される表１６に記載される変化を含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊９バリアントは単量体である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊９バリアントは、野生型ＴａｄＡアデノシンデアミナーゼを有するヘテロ二量体である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊９バリアントは、別のＴａｄＡバリアント（例えば、ＴａｄＡ^＊８、ＴａｄＡ^＊９）とのヘテロ二量体である。ＴａｄＡ^＊９アデノシンデアミナーゼのさらなる詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４９９７５号に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0422】

本明細書で提供される突然変異のいずれか、および任意の追加の突然変異（例えば、ｅｃＴａｄＡアミノ酸配列に基づく）は、任意の他のアデノシンデアミナーゼに導入することができる。本明細書で提供される突然変異のいずれも、ＴａｄＡ参照配列または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）において個別にまたは任意の組合せで作製することができる。

【0423】

ＡからＧへの核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＧａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」Ｎａｔｕｒｅ、５５１、４６４～４７１（２０１７年）に記載されており、その全内容はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。

【0424】

ＣからＴへの編集
一部の実施形態では、本明細書に開示される塩基エディターは、ポリヌクレオチドの標的シチジン（Ｃ）塩基を脱アミノ化して、チミンの塩基対形成特性を有するウリジン（Ｕ）を産生することができるシチジンデアミナーゼを含む融合タンパク質または複合体を含む。一部の実施形態では、例えば、ポリヌクレオチドが二本鎖（例えば、ＤＮＡ）である場合、次に、ウリジン塩基をチミジン塩基で置換して（例えば、細胞修復機構による）、Ｃ：ＧからＴ：Ａへの移行を生じさせることができる。他の実施形態では、塩基エディターによる核酸中のＣからＵへの脱アミノ化は、ＵからＴへの置換を伴うことはできない。

【0425】

Ｕを生じさせるための、ポリヌクレオチド中の標的Ｃの脱アミノ化は、本明細書に記載される塩基エディターによって実施され得る一種の塩基編集の非限定的な例である。別の例では、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、シトシン（Ｃ）塩基のグアニン（Ｇ）塩基への変換を媒介することができる。例えば、塩基エディターのシチジンデアミナーゼドメインによるシチジンの脱アミノ化によって産生されるポリヌクレオチドのＵは、塩基除去修復機構によって（例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）ドメインによって）ポリヌクレオチドから除去され得、脱塩基部位を産生する。次に、脱塩基部位の反対側の核酸塩基を、例えば損傷乗り越え型ポリメラーゼによって、Ｃなどの別の塩基で（例えば、塩基修復機構によって）置換することができる。脱塩基部位の反対側の核酸塩基がＣで置換されることは典型的であるが、他の置換（例えば、Ａ、ＧまたはＴ）もまた起こり得る。

【0426】

したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基エディターは、ポリヌクレオチド中の標的ＣをＵに脱アミノ化することができる脱アミノ化ドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼドメイン）を含む。さらに、以下に記載するように、塩基エディターは、脱アミノ化の結果生じたＵを、一部の実施形態ではＴまたはＧに変換することを促進する追加のドメインを含むことができる。例えば、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、ＵのＴによる置換を媒介し、ＣからＴへの塩基編集事象を完了するために、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインをさらに含むことができる。別の例では、塩基エディターは、本明細書に記載されるウラシル安定化タンパク質を含むことができる。別の例では、損傷乗り越え型ポリメラーゼは、脱塩基部位の反対側のＣの組み込みを促進することができる（すなわち、脱塩基部位でのＧの組み込みをもたらし、ＣからＧへの塩基編集事象を完了する）ため、塩基エディターは、ＣからＧへの塩基編集の効率を改善するために損傷乗り越え型ポリメラーゼを組み込むことができる。

【0427】

ドメインとしてシチジンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む任意のポリヌクレオチドにおいて標的Ｃを脱アミノ化することができる。代表的には、シチジンデアミナーゼは、ポリヌクレオチドの一本鎖部分との関連において位置するＣ核酸塩基を触媒する。一部の実施形態では、標的Ｃを含む全ポリヌクレオチドは、一本鎖であり得る。例えば、塩基エディターに組み込まれるシチジンデアミナーゼは、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドにおいて標的Ｃを脱アミノ化することができる。他の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、二本鎖ポリヌクレオチドに作用することができるが、標的Ｃは、脱アミノ化反応の時点で一本鎖状態にあるポリヌクレオチドの一部に位置することができる。例えば、ＮＡＧＰＢドメインがＣａｓ９ドメインを含む実施形態では、いくつかのヌクレオチドは、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－標的ＤＮＡ複合体の形成の間、対合しないまま残され得、Ｃａｓ９「Ｒループ複合体」の形成をもたらす。これらの不対ヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡのバブルを形成することができ、これは、一本鎖に特異的なヌクレオチドデアミナーゼ酵素（例えば、シチジンデアミナーゼ）の基質として働くことができる。

【0428】

一部の実施形態では、塩基エディターのシチジンデアミナーゼは、アポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。ＡＰＯＢＥＣは、進化的に保存されたシチジンデアミナーゼのファミリーである。このファミリーのメンバーはＣからＵへの編集酵素である。ＡＰＯＢＥＣ様タンパク質のＮ末端ドメインは触媒ドメインであり、一方、Ｃ末端ドメインは偽触媒ドメインである。より具体的には、触媒ドメインは亜鉛依存性シチジンデアミナーゼドメインであり、シチジン脱アミノ化に重要である。ＡＰＯＢＥＣファミリーのメンバーには、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（「ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ」は現在これを指す）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、および活性化誘導（シチジン）デアミナーゼが含まれる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）の全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）の全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。塩基エディターは、任意の適切な生物（例えば、ヒトまたはラット）由来のデアミナーゼを含み得ることが理解されるべきである。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、オランウータン、ワニ、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、またはマウス由来である。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ラット（例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１）に由来する。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、オランウータンポリペプチド（例えば、Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ（オランウータン）ＡＰＯＢＥＣ）に由来する。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、金鼻猿のポリペプチド（例えば、Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｒｏｘｅｌｌａｎａ（金鼻猿）ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ（Ａ３Ｆ））に由来する。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、アメリカワニのポリペプチド（例えば、Ａｌｌｉｇａｔｏｒ ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉｅｎｓｉｓ（アメリカワニ）ＡＰＯＢＥＣ１）に由来する。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ブタのポリペプチド（例えば、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ）に由来する。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ヒトＡＰＯＢＥＣ１である。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ｐｍＣＤＡ１である。

【0429】

本開示の態様に従ってＣａｓ９に融合することができる他の例示的デアミナーゼを以下に提供する。実施形態では、デアミナーゼは活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。一部の実施形態では、それぞれの配列の活性ドメイン、例えば、局在化シグナルを持たないドメイン（核局在化配列；核外搬出シグナル、細胞質局在化シグナルを持たない）を使用し得ることを理解されたい。

【0430】

本開示の一部の態様は、例えば、デアミナーゼドメインに点突然変異を作製することによって、本明細書に記載される融合タンパク質または複合体のいずれかのデアミナーゼドメイン触媒活性をモジュレートすることは、融合タンパク質（例えば、塩基エディター）または複合体のプロセッシビティに影響を及ぼすという認識に基づく。例えば、塩基編集融合タンパク質または複合体内のデアミナーゼドメインの触媒活性を低減させるが、消失させない突然変異は、デアミナーゼドメインが標的残基に隣接する残基の脱アミノ化を触媒する可能性を低くし、それによって脱アミノ化ウインドウを狭くすることができる。脱アミノ化ウインドウを狭くする能力は、特定の標的残基に隣接する残基の望ましくない脱アミノ化を防止することができ、これはオフ標的効果を低下または防止することができる。

【0431】

例えば、一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＨ１２１Ｘ、Ｈ１２２Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｒ１１８Ｘ、Ｗ９０Ｘ、Ｗ９０Ｘ、およびＲ１３２Ｘからなる群から選択される１つもしくは複数の突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＨ１２１Ｒ、Ｈ１２２Ｒ、Ｒ１２６Ａ、Ｒ１２６Ｅ、Ｒ１１８Ａ、Ｗ９０Ａ、Ｗ９０Ｙ、およびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つもしくは複数の突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含み得る。

【0432】

一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＤ３１６Ｘ、Ｄ３１７Ｘ、Ｒ３２０Ｘ、Ｒ３２０Ｘ、Ｒ３１３Ｘ、Ｗ２８５Ｘ、Ｗ２８５Ｘ、Ｒ３２６Ｘからなる群から選択される１つもしくは複数の突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、本明細書において提供される融合タンパク質または複合体はいずれも、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＤ３１６Ｒ、Ｄ３１７Ｒ、Ｒ３２０Ａ、Ｒ３２０Ｅ、Ｒ３１３Ａ、Ｗ２８５Ａ、Ｗ２８５Ｙ、Ｒ３２６Ｅからなる群から選択される１つもしくは複数の突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含む。

【0433】

一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＨ１２１ＲおよびＨ１２２Ｒ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１２６Ａ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１２６Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１１８Ａ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０Ａ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０Ｙ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１３２Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０ＹおよびＲ１２６Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１２６ＥおよびＲ１３２Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０ＹおよびＲ１３２Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０Ｙ、Ｒ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。

【0434】

一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＤ３１６ＲおよびＤ３１７Ｒ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される融合タンパク質または複合体はいずれも、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２０Ａ突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２０Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３１３Ａ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５Ａ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５Ｙ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２６Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５ＹおよびＲ３２０Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２０ＥおよびＲ３２６Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５ＹおよびＲ３２６Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５Ｙ、Ｒ３２０Ｅ、およびＲ３２６Ｅ突然変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つもしくは複数の対応する突然変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。

【0435】

いくつかの改変シチジンデアミナーゼが市販され、限定されないが、Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能であるＳａＢＥ３、ＳａＫＫＨ－ＢＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＥＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、およびＹＥＥ－ＢＥ３（プラスミド８５１６９、８５１７０、８５１７１、８５１７２、８５１７３、８５１７４、８５１７５、８５１７６、８５１７７）が含まれる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。

【0436】

一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質または複合体は、１つまたは複数のシチジンデアミナーゼドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるシチジンデアミナーゼは、シトシンまたは５－メチルシトシンをウラシルまたはチミンに脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、本明細書において提供されるシチジンデアミナーゼは、ＤＮＡにおけるシトシンを脱アミノ化することができる。シチジンデアミナーゼは、任意の適切な生物に由来し得る。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、本明細書において提供される突然変異のいずれかに対応する１つまたは複数の突然変異を含む天然に存在するシチジンデアミナーゼである。当業者は、例えば、配列アラインメントおよび相同な残基の決定によって、任意の相同なタンパク質における対応する残基を同定することができる。したがって、当業者は、本明細書に記載される突然変異のいずれかに対応する任意の天然に存在するシチジンデアミナーゼにおいて突然変異を生成し得る。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは原核生物由来である。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは細菌由来である。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは哺乳動物（例えば、ヒト）由来である。

【0437】

一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、本明細書に記載されるシチジンデアミナーゼアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるシチジンデアミナーゼは、１つまたは複数の突然変異（例えば、本明細書において提供される突然変異のいずれか）を含み得ることが理解されるべきである。一部の実施態様は、任意の先の態様の、または本明細書に記載されるシチジンデアミナーゼ核酸塩基エディターポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド分子を提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドンを最適化される。

【0438】

本開示は、ある特定の同一性パーセントを有する任意のデアミナーゼドメインに加えて、本明細書に記載される任意の突然変異またはそれらの組合せを提供する。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、参照配列、または本明細書において提供されるシチジンデアミナーゼのいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上の突然変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、当技術分野において公知であるか、または本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１７０個同一である連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。

【0439】

実施形態では、本発明の融合タンパク質は、２つ以上の核酸編集ドメインを含む。

【0440】

ＣからＴの核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）、およびＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ５３３、４２０～４２４（２０１６）に記載され、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0441】

ガイドポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、結合したガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）と合わさると、標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し（すなわち、結合したガイド核酸の塩基と標的ポリヌクレオチド配列の塩基との間の相補的な塩基対形成を介して）、それによって、編集が望まれる標的核酸配列に塩基エディターを局在化させることができる。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。

【0442】

ＣＲＩＳＰＲは、可動遺伝エレメント（ウイルス、転位エレメントおよび接合性プラスミド）に対する防御を提供する適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行する可動エレメントと相補的な配列、および標的侵入核酸を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは転写され、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系では、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの正確なプロセシングには、トランスにコードされた低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）およびＣａｓ９タンパク質が必要である。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼ３に助けられたプロセシングのガイドとして働く。その後、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーと相補的な直鎖状または環状ｄｓＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。ｃｒＲＮＡに相補的でない標的鎖は、まずエンドヌクレアーゼ的に切断され、次にエキソヌクレアーゼ的に３’－５’トリミングされる。自然界では、ＤＮＡ結合と切断には、典型的にはタンパク質と両方のＲＮＡが必要である。しかしながら、単一のガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」、または単に「ｇＲＮＡ」）は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方の側面を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作することができる。例えば、全体内容が参照により本明細書に組み込まれるＪｉｎｅｋ Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２１（２０１２）を参照されたい。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列中の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己と非自己を区別するのを助ける。例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ Ｍ１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ．」、Ｆｅｒｒｅｔｔｉ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４６５８～４６６３（２００１）；「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ．」、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２～６０７（２０１１）；および「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．」、Ｊｉｎｅｋ Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２１（２０１２）を参照されたい。

【0443】

ＰＡＭ配列は、当該技術分野において公知である任意のＰＡＭ配列であり得る。適切なＰＡＭ配列には、限定されないが、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＧＮ、ＮＧＴ、ＮＧＣＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＣＮ、ＮＧＣＧ、ＮＧＴＮ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＮＧＲＲ（Ｎ）、ＴＴＴＶ、ＴＹＣＶ、ＴＹＣＶ、ＴＡＴＶ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡＷ、またはＮＡＡＡＡＣが含まれる。Ｙはピリミジンであり；Ｎは任意のヌクレオチド塩基であり；ＷはＡまたはＴである。

【0444】

一実施形態では、本明細書に記載されるガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。一実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはｇＲＮＡである。ＲＮＡ／Ｃａｓ複合体は、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡに「ガイドする」のを助けることができる。Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーと相補的な直鎖状または環状ｄｓＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。ｃｒＲＮＡに相補的でない標的鎖は、まずエンドヌクレアーゼ的に切断され、次にエキソヌクレアーゼ的に３’－５’トリミングされる。自然界では、ＤＮＡ結合と切断には、典型的にはタンパク質と両方のＲＮＡが必要である。しかしながら、単一のガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」、または単に「ｇＲＮＡ」）は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方の側面を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作することができる。例えば、全体内容が参照により本明細書に組み込まれるＪｉｎｅｋ Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２１（２０１２）を参照されたい。

【0445】

一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つの単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」）である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、例えば、相補的な塩基対形成を介して互いに相互作用することができる２つ以上の個々のポリヌクレオチド（例えば、二重ガイドポリヌクレオチド、二重ｇＲＮＡ）を含む。例えば、ガイドポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得るか、または１つもしくは複数のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。

【0446】

一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を標的ヌクレオチド配列にガイドするためにＰＡＭ配列を必要としない。

【0447】

ガイドポリヌクレオチドは、天然または非天然の（または天然ではない）ヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸またはヌクレオチドアナログ）を含み得る。いくつかの場合において、ガイド核酸配列の標的化領域は、長さが少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドであり得る。ガイド核酸の標的化領域は、長さが１０～３０ヌクレオチドの間、または長さが１５～２５ヌクレオチドの間、または長さが１５～２０ヌクレオチドの間であり得る。

【0448】

一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターは、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチド（例えば、複数のｇＲＮＡ）を利用する。一部の実施形態では、単一のガイドポリヌクレオチドは、本明細書に記載される異なる塩基エディター用に利用される。例えば、単一のガイドポリヌクレオチドは、シチジン塩基エディターおよびアデノシン塩基エディター用に利用され得る。

【0449】

一部の実施形態では、本明細書に記載する方法は、操作されたＣａｓタンパク質を利用することができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は短い合成ＲＮＡであり、Ｃａｓ結合に必要なスキャフォールド配列と、改変されるべきゲノム標的を規定するユーザー定義の約２０ヌクレオチドのスペーサーで構成される。例示的なｇＲＮＡスキャフォールド配列は、配列表に配列番号３１７～３２７として提供される。したがって、当業者は、Ｃａｓタンパク質のゲノム標的を変化させることができ、特異性は、ｇＲＮＡ標的化配列が、ゲノムの残りと比較して、ゲノム標的に対してどれほど特異的であるかによって部分的に決定される。

【0450】

他の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、単一分子（すなわち、単一分子ガイド核酸）中に、核酸のポリヌクレオチド標的化部分と核酸のスキャフォールド部分の両方を含む。例えば、単一分子ガイドポリヌクレオチドは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）であり得る。本明細書において、ガイドポリヌクレオチド配列という用語は、塩基エディターと相互作用し、それを標的ポリヌクレオチド配列に方向付けることができる任意の単一、二重または多分子核酸を意図する。

【0451】

典型的には、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ｃｒＲＮＡ／ｔｒＲＮＡ複合体またはｇＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列を認識し、結合し得る配列を含む「ポリヌクレオチド標的化セグメント」、および塩基エディターのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン成分内のガイドポリヌクレオチドを安定化する「タンパク質結合セグメント」を含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのポリヌクレオチド標的化セグメントは、ＤＮＡポリヌクレオチドを認識し、結合し、それによって、ＤＮＡ中の塩基の編集を促進する。他の場合において、ガイドポリヌクレオチドのポリヌクレオチド標的化セグメントは、ＲＮＡポリヌクレオチドを認識し、結合し、それによって、ＲＮＡにおける塩基の編集を促進する。本明細書では、「セグメント」とは、分子のセクションまたは領域、例えば、ガイドポリヌクレオチド中のヌクレオチドの連続したストレッチを指す。セグメントはまた、セグメントが１を超える分子の領域を含み得るような複合体の領域／セクションを指す場合がある。例えば、ガイドポリヌクレオチドが複数の核酸分子を含む場合、タンパク質結合セグメントは、例えば、相補性の領域に沿ってハイブリダイズする複数の別々の分子の全部または一部（例えば、機能的部分）を含み得る。一部の実施形態では、２つの別々の分子を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、（ｉ）長さが１００塩基対である第１のＲＮＡ分子の塩基対４０～７５；および（ｉｉ）長さが５０塩基対である第２のＲＮＡ分子の塩基対１０～２５を含む。「セグメント」の定義は、特定の文脈において特に定義されない限り、特定数の全塩基対に限定されず、所与のＲＮＡ分子からの任意の特定数の塩基対に限定されず、複合体内の特定数の別々の分子に限定されず、任意の全長であるＲＮＡ分子の領域を含むことができ、他の分子に対して相補性を有する領域を含み得る。

【0452】

ガイドポリヌクレオチドは、化学的に合成することができ、酵素的に合成することができ、またはそれらの組合せであり得る。例えば、ｇＲＮＡは、標準的なホスホルアミダイトに基づく固相合成法を使用して合成することができる。あるいは、ｇＲＮＡは、ファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター制御配列に、ｇＲＮＡをコードしているＤＮＡを作動可能に連結させることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる。適切なファージプロモーター配列の例としては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーター配列、またはそれらのバリエーションが挙げられる。ｇＲＮＡが２つの別々の分子（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む実施形態では、ｃｒＲＮＡは化学合成することができ、ｔｒａｃｒＲＮＡは酵素的に合成することができる。

【0453】

ガイドポリヌクレオチドは、例えば、ｇＲＮＡをコードしているＤＮＡ、例えば、ｇＲＮＡをコードしている配列を含むＤＮＡベクターによって発現させることができる。ｇＲＮＡは、単独で、またはコードされた塩基エディターと一緒にコードされ得る。このようなＤＮＡ配列は、一緒にまたは別々に発現系（例えば、細胞）に導入され得る。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインおよびｇＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列を細胞に導入することができ、各ＤＮＡ配列は別々の分子の一部（例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインコード配列を含む１つのベクター、およびｇＲＮＡコード配列を含む第２のベクター）であり得るか、または両方が同じ分子の一部（例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインとｇＲＮＡとの両方のコード（および調節）配列を含む１つのベクター）であり得る。ＲＮＡは、合成ＤＮＡ分子、例えば、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片から転写することができる。ｇＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され得る。

【0454】

ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、３つの領域：染色体配列中の標的部位と相補的であり得る５’末端の第１の領域、ステムループ構造を形成し得る第２の内部領域、および二次構造を形成しないかまたは標的部位に結合しない第３の３’領域を含み得る。各ｇＲＮＡの第１の領域はまた、各ｇＲＮＡが融合タンパク質または複合体を特定の標的部位にガイドするように異なることができる。さらに、各ｇＲＮＡの第２および第３の領域は、すべてのｇＲＮＡにおいて同一であり得る。

【0455】

ｇＲＮＡの第１の領域またはガイドポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡの第１の領域が標的部位と塩基対を形成することができるように、染色体配列中の標的部位の配列と相補的であり得る。いくつかの場合において、ｇＲＮＡの第１の領域は、１０ヌクレオチド～２５ヌクレオチドまたは約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド（すなわち、１０ヌクレオチドからヌクレオチド；または約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド；または１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド；または約１０ヌクレオチド～２５ヌクレオチド）またはそれ以上を含む。例えば、ｇＲＮＡの第１の領域と染色体配列中の標的部位の間の塩基対合の領域は、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、もしくはそれ以上であるか、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、もしくはそれ以上であり得る。時には、ｇＲＮＡの第１の領域は、長さが１９、２０、もしくは２１ヌクレオチドであるか、または約１９、２０、もしくは２１ヌクレオチドであり得る。

【0456】

ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドはまた、二次構造を形成する第２の領域を含み得る。例えば、ｇＲＮＡによって形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含み得る。ループおよびステムの長さは変化し得る。例えば、ループは、長さが３～１０ヌクレオチドの範囲または約３～１０ヌクレオチドの範囲であり得、ステムは、長さが６～２０塩基対の範囲または約６～２０塩基対の範囲であり得る。ステムは、１～１０ヌクレオチドまたは約１０ヌクレオチドのうちの１つまたは複数のバルジを含み得る。第２の領域の全長は、長さが１６～６０ヌクレオチドの範囲または約１６～６０ヌクレオチドの範囲であり得る。例えば、ループは、長さが４ヌクレオチドであり得るかまたは約４ヌクレオチドであり得て、ステムは、長さが１２塩基対であり得るかまたは約１２塩基対であり得る。

【0457】

また、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、本質的に一本鎖であり得る第３の領域を３’末端に含むことができる。例えば、第３の領域は、時には、目的の細胞中のいずれの染色体配列とも相補的ではなく、時には、ｇＲＮＡの残りの部分とも相補的でない。さらに、第３の領域の長さは変化し得る。第３の領域は、長さが４ヌクレオチド超であるかまたは約４ヌクレオチド超であり得る。例えば、第３の領域の長さは、長さが５～６０ヌクレオチド、または約５～６０ヌクレオチドの範囲であり得る。

【0458】

ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、遺伝子標的の任意のエクソンまたはイントロンを標的化することができる。いくつかの場合において、ガイドは遺伝子のエクソン１または２を標的化することができ、別の場合において、ガイドは遺伝子のエクソン３または４を標的化することができる。一部の実施形態では、組成物は、すべてが同じエクソンを標的化する複数のｇＲＮＡ、または異なるエクソンを標的化する複数のｇＲＮＡを含む。遺伝子のエクソンおよび／またはイントロンを標的化することができる。

【0459】

ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチドまたは約２０未満のヌクレオチド（例えば、少なくとも約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチド）、または約１～１００ヌクレオチドの間のどこか（例えば、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００）の核酸配列を標的化することができる。標的核酸配列は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドの直ぐ５’側の２０塩基または約２０塩基であり得る。ｇＲＮＡは、核酸配列を標的化することができる。標的核酸は、少なくとも１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、もしくは１～１００のヌクレオチド、または少なくとも約１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、もしくは１～１００のヌクレオチドであり得る。

【0460】

ガイドポリヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡおよび標的化配列を選択、設計、および確認するための方法は、本明細書に記載され、当業者に公知である。例えば、核酸塩基エディター系におけるデアミナーゼドメイン（例えば、ＡＩＤドメイン）の潜在的な基質混乱の影響を最小化するために、脱アミノ化のために意図せずに標的化され得る残基（例えば、標的核酸遺伝子座内の一本鎖ＤＮＡ上に潜在的に存在し得るオフターゲットＣ残基）の数を最小化し得る。さらに、ソフトウェアツールは、標的核酸配列に対応するｇＲＮＡを最適化するために、例えば、ゲノムにわたる全オフターゲット活性を最小化するために使用され得る。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９を使用する各々の可能な標的化ドメイン選択について、ある特定数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）までのミスマッチ塩基対を含むすべてのオフターゲット配列（選択されたＰＡＭ、例えば、ＮＡＧまたはＮＧＧに先行する）をゲノムにわたって同定することができる。標的部位と相補的なｇＲＮＡの第１の領域が同定され得、すべての第１の領域（例えば、ｃｒＲＮＡ）は、その総予測オフターゲットスコアに従ってランク付けされ得る；トップランクの標的化ドメインは、最大のオンターゲット活性および最小のオフターゲット活性を有すると考えられるものを表す。ｇＲＮＡを標的とする候補は、当該技術分野において公知である方法および／または本明細書に記載する方法を使用することによって、機能的に評価することができる。

【0461】

非限定的な例として、Ｃａｓ９とともに使用するためのｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ中の標的ＤＮＡにハイブリダイズする配列は、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを用いて同定することができる。ｇＲＮＡ設計は、Ｂａｅ Ｓ．，Ｐａｒｋ Ｊ．、およびＫｉｍ Ｊ．－Ｓ．Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ：Ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｔｈａｔ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｃａｓ９ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０、１４７３～１４７５（２０１４）に記載される公共ツールｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒに基づくカスタムｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して行う。このソフトウェアは、ゲノム全体のオフターゲット傾向を計算した後、ガイドをスコア化する。典型的には、長さが１７～２４の範囲のガイドでは、完全なマッチから７ミスマッチの範囲の一致が考慮される。オフターゲット部位が計算によって決定されると、各ガイドについて合計スコアが計算され、ウェブインターフェースを使用して表にまとめられる。ＰＡＭ配列に隣接する潜在的な標的部位を同定することに加えて、ソフトウェアはまた、選択された標的部位から１、２、３または３を超えるヌクレオチドが異なるすべてのＰＡＭ隣接配列を同定する。標的核酸配列（例えば、標的遺伝子）についてのゲノムＤＮＡ配列を得ることができ、反復エレメントは、公衆に利用可能なツール、例えば、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを使用してスクリーニングされ得る。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、入力されたＤＮＡ配列から、複雑性の低い反復エレメントおよび領域を探索する。出力は、所定のクエリー配列に存在する反復の詳細な注釈である。

【0462】

同定後、ｇＲＮＡの第１の領域、例えば、ｃｒＲＮＡは、標的部位までの距離、それらの直交性、および関連ＰＡＭ配列との密接なマッチのための５’ヌクレオチドの存在（例えば、関連ＰＡＭを含むヒトゲノムにおける密接なマッチの同定に基づく５’Ｇ、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓについてはＮＧＧ ＰＡＭ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓについてはＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶ ＰＡＭ））に基づいて階層にランク付けされる。本明細書で使用される場合、直交性とは、標的配列に対して最小数のミスマッチを含むヒトゲノム中の配列数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、意図される標的以外にヒトゲノムにおいて同一の配列を有さず、標的配列において１つまたは２つのミスマッチを含むいずれの配列も有さない２０マー標的化ドメインを指すことがある。良好な直交性を有する標的化ドメインは、オフターゲットＤＮＡ切断を最小化するように選択され得る。

【0463】

次に、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ分子または非ＲＮＡ核酸分子、例えばＤＮＡ分子として細胞または胚に導入することができる。一実施形態では、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、目的の細胞または胚におけるｇＲＮＡの発現用のプロモーター制御配列に作動可能に連結される。ＲＮＡコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結することができる。ｇＲＮＡの発現に使用できるプラスミドベクターには、限定されないが、ｐｘ３３０ベクターおよびｐｘ３３３ベクターが含まれる。いくつかの場合において、プラスミドベクター（例えば、ｐｘ３３３ベクター）は、少なくとも２つのｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む。さらに、ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択マーカー配列（例えば、ＧＦＰまたはピューロマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含み得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ分子はまた、直鎖状であり得る。ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ分子はまた、環状であり得る。

【0464】

一部の実施形態では、レポーターシステムは、塩基編集活性を検出し、候補ガイドポリヌクレオチドを試験するために使用される。一部の実施形態では、レポーターシステムは、塩基編集活性がレポーター遺伝子の発現を導くレポーター遺伝子ベースのアッセイを含む。例えば、レポーターシステムは、不活性化開始コドン、例えば、鋳型鎖上の３’－ＴＡＣ－５’から３’－ＣＡＣ－５’への突然変異を含むレポーター遺伝子を含み得る。標的Ｃの脱アミノ化に成功すると、対応するｍＲＮＡは、５’－ＧＵＧ－３’の代わりに５’－ＡＵＧ－３’として転写され、レポーター遺伝子の翻訳を可能にする。適切なレポーター遺伝子は、当業者には明らかである。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、または発現が検出可能であり、当業者に明らかである任意の他の遺伝子をコードする遺伝子が挙げられる。レポーターシステムは、例えば、標的ＤＮＡ配列に関して、それぞれのデアミナーゼが標的化する残基を決定するために、多くの異なるｇＲＮＡを試験するために使用することができる。また、特定の塩基編集タンパク質、例えば、Ｃａｓ９デアミナーゼ融合タンパク質または複合体のオフターゲット効果を評価するために、非鋳型鎖を標的化するｓｇＲＮＡを試験することができる。一部の実施形態では、このようなｇＲＮＡは、突然変異した開始コドンがｇＲＮＡと塩基対を形成しないように設計することができる。ガイドポリヌクレオチドは、標準リボヌクレオチド、改変リボヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン）、リボヌクレオチド異性体、および／またはリボヌクレオチドアナログを含み得る。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ、Ｈａｌｏタグ、または適切な蛍光色素）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）、量子ドット、または金粒子であり得る。

【0465】

一部の実施形態では、塩基エディター系は、複数のガイドポリヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡを含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、塩基エディター系に含まれる１つまたは複数の標的遺伝子座（例えば、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも２０個のｇＲＮＡ、少なくとも３０個のｇＲＮＡ、少なくとも５０個のｇＲＮＡ）を標的化することができる。複数のｇＲＮＡ配列は、タンデムに配列され得、好ましくは、直接反復によって分離される。

【0466】

改変ポリヌクレオチド
発現、安定性、および／もしくはゲノム／塩基編集効率を増強するため、ならびに／または起こり得る毒性を低減させるために、塩基エディターをコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ）および／またはガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、例えば、プソイド－ウリジン、５－メチル－シトシン、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート、２’－Ｏ－メチルチオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－ＰＡＣＥ （ＭＰ）、２’－フルオロＲＮＡ（２’－Ｆ－ＲＮＡ）、＝拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、２’－Ｏ－メチル（「Ｍ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノアセテート（「ＭＳＰ」）、５－メトキシウリジン、ホスホロチオエート、およびＮ１－メチルプソイドウリジンを使用して、１つもしくは複数の改変ヌクレオチドおよび／または化学的改変を含むように改変することができる。化学的に保護されたｇＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで安定性および編集効率を増強することができる。化学改変されたｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを使用するための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれるＪｉａｎｇらによるＣｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｅｘｐａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｃｏｐｅ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，１９７９（２０２０）．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１５８９２－８、Ｃａｌｌｕｍら、Ｎ１－Ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍＲＮＡ ｓｗｉｔｃｈｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４８巻、６号、２０２０年４月６日、ｅ３５頁、およびＡｎｄｒｉｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、２１７巻、２０１５年１１月１０日、３３７～３４４頁に記載される。

【0467】

特定の実施形態では、化学的改変は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）改変である。改変されたガイドＲＮＡは、ｓａＣａｓ９の有効性、さらに特異性を改善し得る。個々の改変の効果は、使用される化学的改変の位置および組合せ、ならびに他の改変ヌクレオチドとの分子間および分子内相互作用に基づいて変化する。例として、Ｓ－ｃＥｔは、オリゴヌクレオチド分子内フォールディングを改善するために使用されている。

【0468】

一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドの５’末端および／または３’末端に１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドの５’末端および／または３’末端に２、３、４つまたはそれ以上の改変されたヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドの５’末端および／または３’末端に２、３、４つまたはそれ以上の改変されたヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドの５’末端に４つの改変されたヌクレオシド、および３’末端に４つの改変されたヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、改変されたヌクレオシドは、２’Ｏ－メチルまたはホスホロチオエートを含む。

【0469】

一部の実施形態では、ガイドは、少なくとも約５０％～７５％の改変ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイドは、少なくとも約８５％以上の改変ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端の少なくとも約１～５ヌクレオチドが改変され、ｇＲＮＡの３’末端の少なくとも約１～５ヌクレオチドが改変される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの５’および３’末端の各々における少なくとも約３～５の連続するヌクレオチドが改変される。一部の実施形態では、直接反復または対直接反復に存在するヌクレオチドの少なくとも約２０％が改変される。一部の実施形態では、直接反復または対直接反復に存在するヌクレオチドの少なくとも約５０％が改変される。一部の実施形態では、直接反復または対直接反復に存在するヌクレオチドの少なくとも約５０～７５％が改変される。一部の実施形態では、直接反復またはアンチ方向反復に存在するヌクレオチドの少なくとも約１００が改変される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡスキャフォールドに存在するヘアピンに存在するヌクレオチドの少なくとも約２０％以上が改変される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡスキャフォールドに存在するヘアピンに存在するヌクレオチドの少なくとも約５０％以上が改変される。一部の実施形態では、ガイドは、可変長スペーサーを含む。一部の実施形態では、ガイドは、２０～４０個のヌクレオチドのスペーサーを含む。一部の実施形態では、ガイドは、少なくとも約２０～２５個のヌクレオチドまたは少なくとも約３０～３５個のヌクレオチドを含むスペーサーを含む。一部の実施形態では、スペーサーは、改変ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイドは、以下のうちの２つ以上を含む：
ｇＲＮＡの５’末端の少なくとも約１～５個のヌクレオチドが改変され、ｇＲＮＡの３’末端の少なくとも約１～５個のヌクレオチドが改変される；
直接反復または対直接反復に存在する少なくとも約２０％のヌクレオチドが改変される；
直接反復または対直接反復に存在する少なくとも約５０～７５％のヌクレオチドが改変される；
ｇＲＮＡスキャフォールドに存在するヘアピンに存在する少なくとも約２０％以上のヌクレオチドが改変される；
可変長スペーサー；および
改変ヌクレオチドを含むスペーサー。

【0470】

実施形態では、ｇＲＮＡは、多数の改変ヌクレオチドおよび／または化学的改変（「重改変」）を含む。このような重改変は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで塩基編集を約２倍増加させることができる。このような改変について、ｍＮ＝２’－ＯＭｅ；Ｎｓ＝ホスホロチオエート（ＰＳ）であり、「Ｎ」は、当業者によって理解されるように、任意のヌクレオチドを表す。いくつかの場合において、ヌクレオチド（Ｎ）は、２つの改変、例えば、２’－ＯＭｅとＰＳ改変との両方を含み得る。例えば、ホスホロチオエートおよび２’ＯＭｅを有するヌクレオチドは「ｍＮｓ」と表され；互いに隣り合う２つの改変がある場合、表記は「ｍＮｓｍＮｓ」となる。

【0471】

改変ｇＲＮＡの一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’－Ｏ－メチルチオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－ＰＡＣＥ（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチルチオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、２’－フルオロＲＮＡ（２’－Ｆ－ＲＮＡ）、および拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）からなる群から選択される１つまたは複数の化学的改変を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチルまたはホスホロチオエート改変を含む。一実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート改変を含む。一実施形態では、改変は、塩基編集を少なくとも約２倍増加させる。

【0472】

ガイドポリヌクレオチドは、新しいまたは増強された特徴を有する核酸を提供するための１つまたは複数の改変を含み得る。ガイドポリヌクレオチドは、核酸親和性タグを含み得る。ガイドポリヌクレオチドは、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、および／または改変ヌクレオチドを含み得る。

【0473】

いくつかの場合において、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは改変を含み得る。改変は、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドの任意の位置で行うことができる。１を超える改変が、単一のｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドに対して行うことができる。ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、改変後に品質管理を受ける場合がある。いくつかの場合において、品質管理は、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＳ、またはそれらの任意の組合せを含み得る。

【0474】

ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドの改変は、置換、挿入、欠失、化学的改変、物理的改変、安定化、精製、またはそれらの任意の組合せであり得る。

【0475】

ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドはまた、５’アデニル酸、５’グアノシン－三リン酸キャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸、３’チオリン酸、５’リン酸、５’チオリン酸、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄＳｐａｃｅｒ、ＰＣスペーサー、ｒＳｐａｃｅｒ、スペーサー１８、スペーサー９、３’－３’改変、２’－Ｏ－メチルチオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－ＰＡＣＥ（ＭＰ）、および拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、５’－５’改変、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’－デオキシリボヌクレオシドアナログプリン、２’－デオキシリボヌクレオシドアナログピリミジン、リボヌクレオシドアナログ、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシドアナログ、糖改変アナログ、ウォブル／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’－フルオロＲＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホン酸、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、プソイドウリジン－５’－三リン酸、５’－メチルシチジン－５’－三リン酸、またはそれらの任意の組合せによって改変され得る。

【0476】

いくつかの場合において、改変は永続的である。他の場合において、改変は一時的である。いくつかの場合において、複数の改変がｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドに対して行われる。ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチド改変は、立体構造、極性、疎水性、化学反応性、塩基対相互作用、またはそれらの任意の組合せなどのヌクレオチドの物理化学的特性を変更させることができる。

【0477】

ガイドポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡおよびプロモーターをコードする配列を含む単離されたｇＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトすることにより、細胞中に移入することができる。ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドはまた、他の方法、例えば、ウイルス媒介遺伝子送達を使用することで、細胞に移入され得る。ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドを単離することができる。例えば、ｇＲＮＡは、単離されたＲＮＡの形態で細胞または生物にトランスフェクトすることができる。ｇＲＮＡは、当技術分野において公知である任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡのコード配列を含むプラスミドの形態ではなく、単離されたＲＮＡの形態で細胞に移入することができる。

【0478】

改変はまた、ホスホロチオエート置換物であり得る。いくつかの場合において、天然のホスホジエステル結合は、細胞ヌクレアーゼによる急速な分解を受けやすく、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合置換物を使用するヌクレオチド間連結の改変は、細胞分解による加水分解に対してより安定であり得る。改変は、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドの安定性を増加させることができる。改変はまた、生物活性を増強させることができる。いくつかの場合において、ホスホロチオエートで増強されたＲＮＡ ｇＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、仔ウシ血清ヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組合せを阻害することができる。これらの特性により、ＰＳ－ＲＮＡ ｇＲＮＡを、ヌクレアーゼへの曝露がｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで高い確率である適用において使用することが可能になる。例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、エキソヌクレアーゼ分解を阻害することができるｇＲＮＡの５’末端または３’末端の最後の３～５個のヌクレオチドの間に導入することができる。いくつかの場合において、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減させるために、ｇＲＮＡ全体にホスホロチオエート結合を付加することができる。

【0479】

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、塩基編集がスプライス部位（すなわち、スプライスアクセプター（ＳＡ）またはスプライスドナー（ＳＤ））の破壊をもたらすように設計される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、塩基編集が未熟な終止コドンを生じるように設計される。

【0480】

プロトスペーサー隣接モチーフ
用語「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」またはＰＡＭ様モチーフとは、ＣＲＩＳＰＲ細菌適応免疫系におけるＣａｓ９ヌクレアーゼによって標的とされるＤＮＡ配列の直後に続く２～６塩基対ＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、ＰＡＭは、５’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）であり得る。他の実施形態では、ＰＡＭは、３’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）であり得る。ＰＡＭ配列は標的化結合に必須であるが、正確な配列はＣａｓタンパク質の種類に依存する。ＰＡＭ配列は、当技術分野において公知である任意のＰＡＭ配列であり得る。適切なＰＡＭ配列には、限定されないが、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＧＮ、ＮＧＴ、ＮＧＴＴ、ＮＧＣＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＣＮ、ＮＧＣＧ、ＮＧＴＮ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＮＧＲＲ（Ｎ）、ＴＴＴＶ、ＴＹＣＶ、ＴＹＣＶ、ＴＡＴＶ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡＷ、またはＮＡＡＡＡＣが含まれる。Ｙはピリミジンであり、Ｎは任意のヌクレオチド塩基であり、ＷはＡまたはＴである。

【0481】

本明細書において提供される塩基エディターは、標準的または非標準的なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含むヌクレオチド配列に結合することができるＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインを含むことができる。ＰＡＭ部位は、標的ポリヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列である。本開示の一部の態様は、異なるＰＡＭ特異性を有するＣＲＩＳＰＲタンパク質の全部または一部（例えば、機能的部分）を含む塩基エディターを提供する。

【0482】

例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）などの典型的なＣａｓ９タンパク質は、特定の核酸領域に結合するために標準的なＮＧＧ ＰＡＭ配列を必要とし、「ＮＧＧ」の「Ｎ」はアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）であり、Ｇはグアニンである。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質特異的であり得、異なるＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインを含む異なる塩基エディター間で異なることができる。ＰＡＭは、標的配列の５’または３’であり得る。ＰＡＭは、標的配列の上流または下流であり得る。ＰＡＭは、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。しばしば、ＰＡＭは、長さが２～６個のヌクレオチドである。

【0483】

一部の実施形態では、ＰＡＭは、「ＮＲＮ」の「Ｎ」がアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、もしくはシトシン（Ｃ）であり、Ｒがアデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）である「ＮＲＮ」ＰＡＭであるか、またはＰＡＭは、ＮＹＮの「Ｎ」がアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、もしくはシトシン（Ｃ）であり、Ｙがシチジン（Ｃ）もしくはチミン（Ｔ）である「ＮＹＮ」ＰＡＭであり、例えば、全内容が参照により本明細書に組み込まれるＲ．Ｔ．Ｗａｌｔｏｎら、２０２０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂａ８８５３（２０２０）に記載される。

【0484】

いくつかのＰＡＭバリアントを以下の表７に記載する。

【0485】

【表7】

【0486】

一部の実施形態では、ＰＡＭはＮＧＣである。一部の実施形態では、ＮＧＣ ＰＡＭは、Ｃａｓ９バリアントによって認識される。一部の実施形態では、ＮＧＣ ＰＡＭ Ｃａｓ９バリアントは、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７）のＤ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（集合的に「ＭＱＫＦＲＡＥＲ」と呼ばれる）、または別のＣａｓ９における対応する突然変異から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７）のＤ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ（集合的にＶＲＱＲと呼ばれる）、または別のＣａｓ９における対応する突然変異から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７）のＤ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（集合的にＶＲＥＲと呼ばれる）、または別のＣａｓ９における対応する突然変異から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、ｓａＣａｓ９（配列番号２１８）のＥ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、およびＲ１０１５Ｈ（集合的にＫＨＨと呼ばれる）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７）のＤ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｓ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（集合的に「ＭＱＫＳＥＲ」と呼ばれる）、または別のＣａｓ９における対応する突然変異から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７）のＤ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｓ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（集合的に「ＭＱＫＳＥＲ」と呼ばれる）、または別のＣａｓ９における対応する突然変異から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。

【0487】

一部の実施形態では、ＰＡＭはＮＧＴである。一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭはＣａｓ９バリアントによって認識される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７）の１つまたは複数の残基１３３５、１３３７、１１３５、１１３６、１２１８、および／もしくは１２１９における標的化突然変異、または別のＣａｓ９における対応する突然変異によって生成される。一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭ Ｃａｓ９バリアントは、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７）の１つまたは複数の残基１２１９、１３３５、１３３７、１２１８における標的化突然変異、または別のＣａｓ９における対応する突然変異によって生成される。一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭ Ｃａｓ９バリアントは、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７）の１つまたは複数の残基１１３５、１１３６、１２１８、１２１９、および１３３５における標的化突然変異、または別のＣａｓ９における対応する突然変異によって生成される。一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭ Ｃａｓ９バリアントは、以下の表８Ａおよび８Ｂに提供される標的突然変異のセットから選択される。

【0488】

【表8A】

【0489】

【表8B】

【0490】

一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭ Ｃａｓ９バリアントは、表８Ａおよび表８Ｂのバリアント５、７、２８、３１、または３６から選択される。一部の実施形態では、バリアントは、ＮＧＴ ＰＡＭ認識を改善した。

【0491】

一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭ Ｃａｓ９バリアントは、残基１２１９、１３３５、１３３７、および／または１２１８に突然変異を有する。一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭ Ｃａｓ９バリアントは、以下の表９に提供されるバリアントから、改善された認識のための突然異で選択される。

【0492】

【表9】

【0493】

一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭ Ｃａｓ９バリアントは、以下の表１０に提供されるバリアントから選択される。

【0494】

【表10】

【0495】

一部の実施形態では、ＮＧＴＮ Ｃａｓ９バリアントは、バリアント１である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮ Ｃａｓ９バリアントは、バリアント２である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮ Ｃａｓ９バリアントは、バリアント３である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮ Ｃａｓ９バリアントは、バリアント４である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントは、バリアント５である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮ Ｃａｓ９バリアントは、バリアント６である。

【0496】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ドメイン（ＳｐＣａｓ９）である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ＳｐＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性ＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９ｄ）、またはＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（ＳｐＣａｓ９ｎ）である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、Ｄ９Ｘ突然変異、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここで、Ｘは、Ｄを除く任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、Ｄ９Ａ突然変異、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、非標準的なＰＡＭを有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、ＮＧＧ、ＮＧＡ、またはＮＧＣＧ ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合することができる。

【0497】

一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３７Ｘ突然変異、またはＸが任意のアミノ酸である、本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ突然変異、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ突然変異、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３７Ｘ突然変異、またはＸが任意のアミノ酸である、本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ突然変異、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ突然変異、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｘ、Ｇ１２１８Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３７Ｘ突然変異、またはＸが任意のアミノ酸である、本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ突然変異のうちの１つもしくは複数、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ突然変異、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。

【0498】

一部の例では、本明細書で開示される塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインによって認識されるＰＡＭは、塩基エディターをコードする挿入物（例えば、ＡＡＶ挿入物）に対する別々のオリゴヌクレオチド上で細胞に提供することができる。このような実施形態では、別々のオリゴヌクレオチド上にＰＡＭを提供することは、さもなければ切断することができないであろう標的配列の切断を可能にし得る。これは、隣接するＰＡＭは標的配列と同じポリヌクレオチド上に存在しないためである。

【0499】

実施形態では、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、ゲノム操作のためのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとして使用することができる。しかし、他のものも使用することができる。一部の実施形態では、異なるエンドヌクレアーゼを使用して、特定のゲノム標的を標的化することができる。一部の実施形態では、非ＮＧＧ ＰＡＭ配列を有する合成ＳｐＣａｓ９由来バリアントを使用することができる。さらに、様々な種由来の他のＣａｓ９オルソログが同定されており、これらの「非ＳｐＣａｓ９」は、同様に本開示に有用であり得る様々なＰＡＭ配列に結合することができる。例えば、ＳｐＣａｓ９の比較的大きなサイズ（約４ｋｂのコード配列）は、細胞内で効率的に発現することができないＳｐＣａｓ９ ｃＤＮＡを有するプラスミドをもたらす可能性がある。逆に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）のコード配列は、ＳｐＣａｓ９よりも約１キロベース短く、おそらく細胞内で効率的に発現させることができる。ＳｐＣａｓ９と同様に、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの哺乳動物細胞およびｉｎ ｖｉｖｏのマウスにおいて標的遺伝子を改変することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、異なるＰＡＭ配列を標的化することができる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えば、Ｃａｓ９ ＰＡＭ、５’－ＮＧＧに隣接することができる。他の実施形態では、他のＣａｓ９オルソログは、異なるＰＡＭ要件を有することができる。例えば、他のＰＡＭ、例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰＡＭ（ＣＲＩＳＰＲ１については５’－ＮＮＡＧＡＡ、およびＣＲＩＳＰＲ３については５’－ＮＧＧＮＧ）、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＰＡＭ（５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ）はまた、標的遺伝子に隣接して見出すことができる。

【0500】

一部の実施形態では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ系について、標的遺伝子配列は、５’－ＮＧＧ ＰＡＭに先行する（すなわち、５’にある）ことができ、２０ｎｔのガイドＲＮＡ配列は、ＰＡＭに隣接するＣａｓ９切断を媒介するために、反対鎖と塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、隣接する切断は、ＰＡＭの３塩基対上流であり得るか、または約３塩基対上流であり得る。一部の実施形態では、隣接する切断は、ＰＡＭの１０塩基対上流であり得るか、または約１０塩基対上流であり得る。一部の実施形態では、隣接する切断は、ＰＡＭの０～２０塩基対上流であり得るか、または約０～２０塩基対上流であり得る。例えば、隣接する切断は、ＰＡＭの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基対上流の隣であり得る。隣接する切断はまた、１～３０塩基対だけＰＡＭの下流にあり得る。ＰＡＭ配列に結合することができる例示的なＳｐＣａｓ９タンパク質の配列は以下の通りである。

【0501】

一部の実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９バリアントは、３’Ｈ（非Ｇ ＰＡＭ）が隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識することができる（表３Ａ～３Ｄを参照されたい）。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、ＮＲＮＨ ＰＡＭを認識する（ＲはＡまたはＧであり、ＨはＡ、ＣまたはＴである）。一部の実施形態では、非Ｇ ＰＡＭは、ＮＲＲＨ、ＮＲＴＨ、またはＮＲＣＨである（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＭｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＳｐＣａｓ９ ｖａｒｉａｎｔｓ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ ｎｏｎ－Ｇ ＰＡＭｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２０）を参照されたい）。

【0502】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、組換えＣａｓ９ドメインである。一部の実施形態では、組換えＣａｓ９ドメインは、ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ドメインである。一部の実施形態では、ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ＳｐｙＭａｃＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性ＳｐｙＭａｃＣａｓ９（ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ｄ）、またはＳｐｙＭａｃＣａｓ９ニッカーゼ（ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ｎ）である。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、非標準的なＰＡＭを有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、ＮＡＡ ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合することができる。

【0503】

天然の５’－ＮＡＡＮ－３’ＰＡＭ特異性を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅにおけるＳｐｙ Ｃａｓ９の例示的なＣａｓ９ Ａホモログの配列は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅらによる「Ａ Ｃａｓ９ ｗｉｔｈ ＰＡＭ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１１巻、記事番号２４７４（２０２０）に記載され、配列表には配列番号２３７として記載されている。

【0504】

一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、参照Ｃａｓ９配列（例えば、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７））、または別のＣａｓ９における対応する突然変異と比較して、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１２１８Ａ突然変異を有し、それにより、このポリペプチドは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを切断する能力が低減している。このようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を結合する能力を保持している。別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、参照Ｃａｓ９配列（例えば、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７））、または別のＣａｓ９における対応する突然変異と比較して、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１２１８Ａ突然変異を有し、それにより、このポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減している。このようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を結合する能力を保持している。一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質がＷ４７６ＡおよびＷ１１２６Ａ突然変異を有する場合、またはバリアントＣａｓ９タンパク質が、参照Ｃａｓ９配列（例えば、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７））または別のＣａｓ９中の対応する突然変異と比較して、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１２１８Ａ突然変異を有する場合、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列に効率的に結合しない。したがって、いくつかのこのような場合には、このようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法に使用される場合、本方法は、ＰＡＭ配列を必要としない。換言すれば、一部の実施形態では、このようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法に使用される場合、方法は、ガイドＲＮＡを含み得るが、方法は、ＰＡＭ配列の非存在下で行われ得る（したがって、結合の特異性はガイドＲＮＡの標的セグメントによって提供される）。他の残基は、上記の効果を達成するために突然変異され得る（すなわち、一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する）。非限定的な例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７は、参照Ｃａｓ９配列（例えば、ｓｐＣａｓ９（配列番号１９７））、または別のＣａｓ９における対応する突然変異と比較して変更（すなわち、置換）され得る。また、アラニン置換以外の突然変異が適切である。

【0505】

一部の実施形態では、塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、標準的なＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を有するＣａｓ９タンパク質の全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。他の実施形態では、塩基エディターのＣａｓ９由来ドメインは、非標準的なＰＡＭ配列を採用することができる。このような配列は、当技術分野において記載されており、当業者には明らかである。例えば、非標準的なＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ． Ｐ．ら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ ５２３、４８１～４８５（２０１５）；およびＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ら、「Ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｂｙ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ＰＡＭ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３、１２９３～１２９８（２０１５）；Ｒ．Ｔ．Ｗａｌｔｏｎら、「Ｕｎｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｎｅａｒ－ＰＡＭｌｅｓｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｖａｒｉａｎｔｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂａ８８５３（２０２０）；Ｈｕら、「Ｅｖｏｌｖｅｄ Ｃａｓ９ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ＰＡＭ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ＤＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、２０１８年４月５日、５５６（７６９９）、５７～６３；Ｍｉｌｌｅｒら、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＳｐＣａｓ９ ｖａｒｉａｎｔｓ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ ｎｏｎ－Ｇ ＰＡＭｓ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０２０年４月；３８（４）：４７１～４８１に記載されており、各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0506】

ＮａｐＤＮＡｂｐならびにシチジンデアミナーゼおよび／もしくはアデノシンデアミナーゼを含む融合タンパク質または複合体
本開示の一部の態様は、Ｃａｓ９ドメインまたは他の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２）および１つもしくは複数のシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質または複合体を提供する。Ｃａｓ９ドメインは、本明細書において提供されるＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）のいずれかであり得ることが理解されるべきである。一部の実施形態では、本明細書において提供されるＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）のいずれも、本明細書において提供されるシチジンデアミナーゼおよび／またはアデノシンデアミナーゼのいずれかと融合することができる。本明細書に開示される塩基エディターのドメインは、任意の順序で配列することができる。

【0507】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下のドメインＡ－Ｃ、Ａ－Ｄ、またはＡ－Ｅ：
ＮＨ_２－［Ａ－Ｂ－Ｃ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ_２－［Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ］－ＣＯＯＨ
を含み、ここで、ＡおよびＣ、またはＡ、ＣおよびＥは、各々、以下：
アデノシンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
シチジンデアミナーゼドメインまたはその活性断片
のうちの１つまたは複数を含み、
ここで、ＢまたはＢおよびＤは、各々、核酸配列特異的な結合活性を有する１つまたは複数のドメインを含む。

【0508】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造：
ＮＨ_２－［Ａｎ－Ｂｏ－Ｃｎ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［Ａｎ－Ｂｏ－Ｃｎ－Ｄｏ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ_２－［Ａｎ－Ｂｏ－Ｃｐ－Ｄｏ－Ｅｑ］－ＣＯＯＨ
を含み、ここで、ＡおよびＣ、またはＡ、ＣおよびＥは、各々、以下：
アデノシンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
シチジンデアミナーゼドメインまたはその活性断片
のうちの１つまたは複数を含み、
ここで、ｎは、１、２、３、４、または５の整数であり、ｐは、０、１、２、３、４、または５の整数であり、ｑは、０、１、２、３、４、または５の整数であり、ＢまたはＢおよびＤは、各々、核酸配列特異的な結合活性を有するドメインを含み、ｏは、１、２、３、４、または５の整数である。

【0509】

例えば、限定されないが、一部の実施形態では、融合タンパク質は、構造：
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ
を含む。

【0510】

一部の実施形態では、本明細書において提供されるＣａｓ１２ドメインまたはＣａｓ１２タンパク質のいずれも、本明細書において提供されるシチジンまたはアデノシンデアミナーゼのいずれかと融合することができる。例えば、限定されないが、一部の実施形態では、融合タンパク質は、構造：
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ
を含む。

【0511】

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡ^＊８である。例示的な融合タンパク質構造には、以下が含まれる：
ＮＨ２－［ＴａｄＡ^＊８］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［ＴａｄＡ^＊８］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［ＴａｄＡ^＊８］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［ＴａｄＡ^＊８］－ＣＯＯＨ。

【0512】

一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体のアデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ^＊８ならびにシチジンデアミナーゼおよび／またはアデノシンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊８は、ＴａｄＡ^＊８．１、ＴａｄＡ^＊８．２、ＴａｄＡ^＊８．３、ＴａｄＡ^＊８．４、ＴａｄＡ^＊８．５、ＴａｄＡ^＊８．６、ＴａｄＡ^＊８．７、ＴａｄＡ^＊８．８、ＴａｄＡ^＊８．９、ＴａｄＡ^＊８．１０、ＴａｄＡ^＊８．１１、ＴａｄＡ^＊８．１２、ＴａｄＡ^＊８．１３、ＴａｄＡ^＊８．１４、ＴａｄＡ^＊８．１５、ＴａｄＡ^＊８．１６、ＴａｄＡ^＊８．１７、ＴａｄＡ^＊８．１８、ＴａｄＡ^＊８．１９、ＴａｄＡ^＊８．２０、ＴａｄＡ^＊８．２１、ＴａｄＡ^＊８．２２、ＴａｄＡ^＊８．２３、またはＴａｄＡ^＊８．２４である。

【0513】

例示的な融合タンパク質構造には、以下が含まれる：
ＮＨ２－［ＴａｄＡ^＊８］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［ＴａｄＡ^＊８］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［ＴａｄＡ^＊８］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［ＴａｄＡ^＊８］－ＣＯＯＨ。

【0514】

一部の実施形態では、融合タンパク質のアデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ^＊９ならびにシチジンデアミナーゼおよび／またはアデノシンデアミナーゼを含む。例示的な融合タンパク質構造には、以下が含まれる：
ＮＨ２－［ＴａｄＡ^＊９］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［ＴａｄＡ^＊９］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［ＴａｄＡ^＊９］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［ＴａｄＡ^＊９］－ＣＯＯＨ。

【0515】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ポリペプチドのＮ末端断片およびＣ末端断片が隣接するデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ポリペプチドのＮ末端断片およびＣ末端断片が隣接するシチジンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ポリペプチドのＮ末端断片およびＣ末端断片が隣接するアデノシンデアミナーゼを含む。

【0516】

一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ドメイン）を含む融合タンパク質または複合体は、リンカー配列を含まない。一部の実施形態では、リンカーは、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐとの間に存在する。一部の実施形態では、上記の一般的な構造で使用される「－」は、リンカーの必要に応じた存在を示す。一部の実施形態では、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書において提供されるリンカーのいずれかを介して融合される。例えば、一部の実施形態では、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書において提供されるリンカーのいずれかを介して融合される。

【0517】

本開示の融合タンパク質または複合体は、１つまたは複数の追加の特徴を含み得ることが理解されるべきである。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、阻害剤、細胞質局在化配列、核輸出配列などの輸出配列、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質または複合体の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグを含み得る。本明細書において提供される適切なタンパク質タグは、限定されないが、ビオチンカルボキシラーゼ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグまたはＨｉｓタグとも呼ばれるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓ－タグ、Ｓｏｆｔａｇ（例えば、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３）、ストレップタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、およびＳＢＰタグを含む。追加の適切な配列は、当業者には明らかである。一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、１つまたは複数のＨｉｓタグを含む。

【0518】

例示的であるが非限定的な融合タンパク質は、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４４９３５、および第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１６２８８に記載される。

【0519】

核局在化配列（ＮＬＳ）を含む融合タンパク質または複合体
一部の実施形態では、本明細書において提供される融合タンパク質または複合体は、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５個）の核標的化配列、例えば、核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。一実施形態では、バイパータイトＮＬＳが使用される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＮＬＳを含むタンパク質の細胞核への（例えば、核輸送による）移入を促進するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ｎＣａｓ９ドメインまたはｄＣａｓ９ドメインのＣ末端またはＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、Ｃａｓ１２ドメインのＮ末端またはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼのＮ末端またはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、１つまたは複数のリンカーを介して融合タンパク質に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、リンカーなしで融合タンパク質に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、本明細書において提供または参照されるＮＬＳ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。追加の核局在化配列は、当技術分野において公知であり、当業者には明らかである。例えば、ＮＬＳ配列は、Ｐｌａｎｋら、ＰＣＴ／ＥＰ２０００／０１１６９０に記載され、その内容は、例示的な核局在化配列の開示について、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＮＬＳは、以下のアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３２８）、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９０）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１９１）、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号１９２）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号１９３）、ＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３２９）、またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号１９６）を含む。

【0520】

一部の実施形態では、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、およびＮＬＳを含む融合タンパク質または複合体は、リンカー配列を含まない。一部の実施形態では、１つまたは複数のドメインまたはタンパク質（例えば、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼ、Ｃａｓ９ドメインまたはＮＬＳ）の間にリンカー配列が存在する。一部の実施形態では、リンカーは、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼドメインとｎａｐＤＮＡｂｐとの間に存在する。一部の実施形態では、以下の一般的な構造で使用される「－」は、リンカーの必要に応じた存在を示す。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼならびにｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書において提供されるリンカーのいずれかを介して融合される。例えば、一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼならびにｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書において提供されるリンカーのいずれかを介して融合される。

【0521】

一部の実施形態では、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２）ドメインを有する例示的なｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２）融合タンパク質の全体構造は、以下の構造のいずれか１つを含み、ＮＬＳは核局在化配列（例えば、本明細書において提供される任意のＮＬＳ）であり、ＮＨ_２は融合タンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合タンパク質のＣ末端である：
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－ＮＬＳ［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－ＮＬＳ［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［アデノシンデアミナーゼ］［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ_２－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ。

【0522】

一部の実施形態では、ＮＬＳはリンカー中に存在するか、またはＮＬＳは、例えば、本明細書に記載されるリンカーに隣接している。バイパータイトＮＬＳは、比較的短いスペーサー配列によって隔てられた２つの塩基性アミノ酸クラスターを含む（したがって、バイパータイト、つまり２部分であるが、モノパータイトＮＬＳはそうではない）。ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号１９１）は、遍在するバイパータイトシグナルの原型である：約１０アミノ酸のスペーサーによって隔てられた、塩基性アミノ酸の２つのクラスター。例示的なバイパータイトＮＬＳの配列は以下の通りである：
ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３２８）。

【0523】

１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターが使用され得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のＮＬＳを使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端のまたはその近傍のＮＬＳ、カルボキシ末端のまたはその近傍の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくは、それを超えるＮＬＳ、またはそれらの任意の組み合わせ（例えば、アミノ末端の１つまたは複数のＮＬＳおよびカルボキシ末端の１つまたは複数のＮＬＳ）を含み得る。１を超えるＮＬＳが存在する場合、単一のＮＬＳが２つ以上のコピーで、および／または１つもしくは複数のコピーで存在する１つまたは複数の他のＮＬＳと組み合わせて存在することができるように、各々を他から独立して選択することができる。

【0524】

本方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、約６個のＮＬＳを含み得る。ＮＬＳに最も近いアミノ酸が、Ｎ末端またはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約５０アミノ酸以内、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、または５０アミノ酸以内である場合、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端の近くにあると考えられる。

【0525】

追加のドメイン
本明細書に記載される塩基エディターは、ポリヌクレオチドの核酸塩基の核酸塩基編集、改変または変更を促進することを助ける任意のドメインを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）、核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）、および１つまたは複数の追加のドメインを含む。一部の実施形態では、追加のドメインは、塩基エディターの酵素的または触媒的機能、塩基エディターの結合機能を促進することができ、または所望の塩基編集結果を妨害し得る細胞機構（例えば、酵素）の阻害物質であり得る。一部の実施形態では、塩基エディターは、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、または転写抑制因子ドメインを含む。

【0526】

一部の実施形態では、塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｕ：Ｇヘテロ二重鎖ＤＮＡの存在に対する細胞ＤＮＡ修復応答は、細胞中の核酸塩基編集効率の低下の原因となり得る。このような実施形態では、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は、細胞中のＤＮＡからのＵの除去を触媒することができ、これは、塩基除去修復（ＢＥＲ）を開始することができ、大部分はＵ：Ｇ対からＣ：Ｇ対への復帰をもたらす。このような実施形態では、ＢＥＲは、一本鎖を結合し、編集された塩基を遮断し、ＵＧＩを阻害し、ＢＥＲを阻害し、編集された塩基を保護し、および／または非編集鎖の修復を促進する１つまたは複数のドメインを含む塩基エディターにおいて阻害され得る。したがって、本開示は、ＵＧＩドメインおよび／またはウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）ドメインを含む塩基エディター融合タンパク質または複合体を意図する。

【0527】

一部の実施形態では、塩基エディターは、二本鎖切断（ＤＳＢ）結合タンパク質の全部または一部（例えば、機能的部分）をドメインとして含む。例えば、ＤＳＢ結合タンパク質は、ＤＳＢの末端に結合することができ、それらを分解から保護することができるバクテリオファージＭｕのＧａｍタンパク質を含むことができる。全内容が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）を参照されたい。

【0528】

さらに、一部の実施形態では、Ｇａｍタンパク質は、塩基エディターのＮ末端に融合され得る。一部の実施形態では、Ｇａｍタンパク質は、塩基エディターのＣ末端に融合され得る。バクテリオファージＭｕのＧａｍタンパク質は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の末端に結合し、それらを分解から保護することができる。一部の実施形態では、ＤＳＢの自由末端を結合するためにＧａｍを使用することは、塩基編集のプロセス中のインデル形成を低減させることができる。一部の実施形態では、１７４残基のＧａｍタンパク質が、塩基エディターのＮ末端に融合される。Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）を参照されたい。一部の実施形態では、突然変異（単数または複数）は、野生型ドメインと比較して、塩基エディタードメインの長さを変化させることができる。例えば、少なくとも１つのドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の欠失は、塩基エディターの長さを低減させることができる。別の場合において、突然変異（単数または複数）は、野生型ドメインと比較してドメインの長さを変化させない。例えば、いずれのドメインにおける置換も核酸エディターの長さを変化させない。

【0529】

すべてのドメインの長さが野生型ドメインと同じであるこのような塩基エディターの非限定的な例としては、以下が挙げられる：
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＵＧＩ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＵＧＩ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＵＧＩ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＵＧＩ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［ＵＧＩ］－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［ＵＧＩ］－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［ＵＧＩ］－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［ＵＧＩ］－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ。

【0530】

塩基エディター系
塩基エディター系を用いて核酸塩基を編集するためのシステム、組成物、および方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、塩基エディター系は、（１）核酸塩基を編集するためのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインおよび核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）を含む塩基エディター（ＢＥ）；および（２）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインと合わさったガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、塩基エディター系は、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）またはアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡまたはＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインはデアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼまたはシトシンデアミナーゼであり得る。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼであり得る。一部の実施形態では、アデノシン塩基エディターは、ＤＮＡ中のアデニンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ中のシチジンを脱アミノ化することができる。

【0531】

一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基編集系は、二本鎖ＤＮＡ切断を生成することなく、ドナーＤＮＡ鋳型を必要とせず、過剰な確率的挿入および欠失を誘導することなく、ＤＮＡにプログラマブル単一ヌクレオチド（Ｃ→ＴまたはＡ→Ｇ）の変化を誘導するために、触媒的に欠陥のあるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、デアミナーゼ（例えば、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼ）、および塩基除去修復の阻害剤を含む融合タンパク質または複合体を使用する、ゲノム編集へのアプローチを提供する。

【0532】

核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載され、各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、全内容が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ５３３、４２０～４２４（２０１６）；Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ５５１、４６４～４７１（２０１７）；およびＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）も参照されたい。

【0533】

本願明細書において提供される塩基エディター系の使用は、（ａ）対象のポリヌクレオチド（例えば、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ）の標的ヌクレオチド配列を核酸塩基エディター（例えば、アデノシン塩基エディターまたはシチジン塩基エディター）およびガイドポリ核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む塩基エディター系と接触させるステップであって、標的ヌクレオチド配列が標的化された核酸塩基対を含むステップと、（ｂ）前記標的領域の鎖分離を誘導するステップと、（ｃ）標的領域の一本鎖中の前記標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換するステップと、（ｄ）標的領域の１以下の鎖を切断するステップとを含み、第１のヌクレオ塩基と相補的な第３のヌクレオ塩基が第２のヌクレオ塩基と相補的な第４のヌクレオ塩基に置き換えられる。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が省略されることが理解されるべきである。一部の実施形態では、前記標的化された核酸塩基対は、１つまたは複数の遺伝子における複数の核酸塩基対である。一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディター系は、１つまたは複数の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集が可能である。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、同じ遺伝子に位置する。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は１つまたは複数の遺伝子に位置し、少なくとも１つの遺伝子は異なる遺伝子座に位置する。

【0534】

一部の実施形態では、切断された一本鎖（ニックの入った鎖）は、ガイド核酸にハイブリダイズされる。一部の実施形態では、切断された一本鎖は、第１の核酸塩基を含む鎖と反対である。一部の実施形態では、塩基エディターはＣａｓ９ドメインを含む。一部の実施形態では、第１の塩基はアデニンであり、第２の塩基はＧ、Ｃ、ＡまたはＴではない。一部の実施形態では、第２の塩基はイノシンである。

【0535】

一部の実施形態では、デアミナーゼを標的核酸配列に標的化するために、単一のガイドポリヌクレオチドを利用することができる。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドの単一対を利用して、異なるデアミナーゼを標的核酸配列に標的化し得る。

【0536】

塩基エディター系の成分（例えば、デアミナーゼドメイン、ガイドＲＮＡ、および／またはポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン）は、共有結合または非共有結合で互いに会合し得る。例えば、一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、必要に応じて、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインがポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）と複合体化している場合、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインによって標的ヌクレオチド配列に標的化することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合または連結することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインと非共有結合的に相互作用または会合することによって、デアミナーゼドメインを標的ヌクレオチド配列に標的化することができる。例えば、一部の実施形態では、核酸塩基編集成分（例えば、デアミナーゼ成分）は、対応する異種部分、抗原、またはポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの一部であるドメイン、および／またはそれと複合体を形成したガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）と相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる追加の異種部分またはドメインを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン、および／またはそれと複合体化したガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）は、対応する異種部分、抗原、または核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼ成分）の一部であるドメインと相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる追加の異種部分またはドメインを含む。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドと結合し、相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合し、相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチド、例えば、ラムダバクテリオファージ抗ターミネータータンパク質Ｎの２２アミノ酸ＲＮＡ結合ドメイン（Ｎ２２ｐ）、２Ｇ１２ ＩｇＧホモ二量体ドメイン、ＡＢＩ、抗体（例えば、塩基エディター系の成分またはその異種部分と結合する抗体）またはその断片（例えば、ＩｇＭ（ＭＨＤ２）またはＩｇＥ（ＥＨＤ２）の重鎖ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＧまたはＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭまたはＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ミニ抗体、および／またはＺＩＰ抗体）、バルナーゼ－バースター二量体ドメイン、Ｂｃｌ－ｘＬドメイン、カルシニューリンＡ（ＣＡＮ）ドメイン、心臓ホスホランバン膜貫通型五量体ドメイン、コラーゲンドメイン、Ｃｏｍ ＲＮＡ結合タンパク質ドメイン（例えば、ＳｆＭｕ Ｃｏｍコートタンパク質ドメイン、およびＳｆＭｕ Ｃｏｍ結合タンパク質ドメイン）、サイクロフィリン－Ｆａｓ融合タンパク質（ＣｙＰ－Ｆａｓ）ドメイン、Ｆａｂドメイン、Ｆｅドメイン、フィブリチンフォルドンドメイン、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメイン、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ結合ドメイン（ＦＲＢ）ドメイン、フォルドンドメイン、断片Ｘドメイン、ＧＡＩドメイン、ＧＩＤ１ドメイン、グリコホリンＡ膜貫通ドメイン、ＧｙｒＢドメイン、Ｈａｌｏタグ、ＨＩＶ Ｇｐ４１三量体化ドメイン、ＨＰＶ４５がんタンパク質Ｅ７ Ｃ末端二量体ドメイン、疎水性ポリペプチド、Ｋホモロジー（ＫＨ）ドメイン、Ｋｕタンパク質ドメイン（例えば、Ｋｕヘテロ二量体）、ロイシンジッパー、ＬＯＶドメイン、ミトコンドリアの抗ウイルスシグナル伝達タンパク質ＣＡＲＤフィラメントドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン（ＭＣＰ）、対応するＲＮＡモチーフ／アプタマーと結合する非天然ＲＮＡアプタマーリガンド、副甲状腺ホルモン二量体化ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）ドメイン、ＰＳＤ９５－Ｄｌｇｌ－ｚｏ－１（ＰＤＺ）ドメイン、ＰＹＬドメイン、ＳＮＡＰタグ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分、ＳｐｙＴａｇ部分、ストレプトアビジンドメイン、ストレプトアビジン－結合タンパク質ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）ドメイン、テロメラーゼＳｍ７タンパク質ドメイン（例えば、Ｓｍ７ホモ七量体または単量体のＳｍ様タンパク質）、および／またはそれらの断片が含まれる。実施形態では、追加の異種部分は、ＭＳ２ファージオペレーターステムループ（例えば、ＭＳ２、ＭＳ２ Ｃ－５突然変異体、またはＭＳ２ Ｆ－５突然変異体）、非天然ＲＮＡモチーフ、ＰＰ７オペレーターステムループ、ＳｆＭｕ ｐｈａｔｅ Ｃｏｍステムループ、滅菌アルファモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフ、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフなどのポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡモチーフ）、および／またはそれらの断片を含む。追加の異種部分の非限定的な例には、配列番号３８０、３８２、３８４、３８６～３８８のいずれか１つもしくは複数と少なくとも約８５％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片が含まれる。追加の異種部分の非限定的な例には、配列番号３７９、３８１、３８３、３８５のいずれか１つもしくは複数と少なくとも約８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片が含まれる。

【0537】

塩基エディター系は、ガイドポリヌクレオチド成分をさらに含み得る。塩基エディター系の成分は、共有結合、非共有相互作用、またはそれらの会合および相互作用の任意の組合せを介して、互いに会合され得ることが理解されるべきである。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ガイドポリヌクレオチドによって標的ヌクレオチド配列に標的化することができる。例えば、一部の実施形態では、塩基エディター系の核酸塩基編集成分（例えば、デアミナーゼ成分）は、ガイドポリヌクレオチドの異種部分もしくはセグメント（例えば、ポリヌクレオチドモチーフ）、または抗原と相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することができる追加の異種部分またはドメイン（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、追加の異種部分またはドメイン（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）は、デアミナーゼドメインに融合または連結することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドと結合するか、相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合するか、相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチド、例えば、ラムダバクテリオファージ抗ターミネータータンパク質Ｎの２２アミノ酸ＲＮＡ結合ドメイン（Ｎ２２ｐ）、２Ｇ１２ ＩｇＧホモ二量体ドメイン、ＡＢＩ、抗体（例えば、塩基エディター系の成分またはその異種部分と結合する抗体）またはその断片（例えば、ＩｇＭ（ＭＨＤ２）またはＩｇＥ（ＥＨＤ２）の重鎖ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＧまたはＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭまたはＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ミニ抗体、および／またはＺＩＰ抗体）、バルナーゼ－バースター二量体ドメイン、Ｂｃｌ－ｘＬドメイン、カルシニューリンＡ（ＣＡＮ）ドメイン、心臓ホスホランバン膜貫通型五量体ドメイン、コラーゲンドメイン、Ｃｏｍ ＲＮＡ結合タンパク質ドメイン（例えば、ＳｆＭｕ Ｃｏｍコートタンパク質ドメイン、およびＳｆＭｕ Ｃｏｍ結合タンパク質ドメイン）、サイクロフィリン－Ｆａｓ融合タンパク質（ＣｙＰ－Ｆａｓ）ドメイン、Ｆａｂドメイン、Ｆｅドメイン、フィブリチンフォルドンドメイン、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメイン、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ結合ドメイン（ＦＲＢ）ドメイン、フォルドンドメイン、断片Ｘドメイン、ＧＡＩドメイン、ＧＩＤ１ドメイン、グリコホリンＡ膜貫通ドメイン、ＧｙｒＢドメイン、Ｈａｌｏタグ、ＨＩＶ Ｇｐ４１三量体化ドメイン、ＨＰＶ４５がんタンパク質Ｅ７ Ｃ末端二量体ドメイン、疎水性ポリペプチド、Ｋホモロジー（ＫＨ）ドメイン、Ｋｕタンパク質ドメイン（例えば、Ｋｕヘテロ二量体）、ロイシンジッパー、ＬＯＶドメイン、ミトコンドリアの抗ウイルスシグナル伝達タンパク質ＣＡＲＤフィラメントドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン（ＭＣＰ）、対応するＲＮＡモチーフ／アプタマーと結合する非天然ＲＮＡアプタマーリガンド、副甲状腺ホルモン二量体化ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）ドメイン、ＰＳＤ９５－Ｄｌｇｌ－ｚｏ－１（ＰＤＺ）ドメイン、ＰＹＬドメイン、ＳＮＡＰタグ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分、ＳｐｙＴａｇ部分、ストレプトアビジンドメイン、ストレプトアビジン－結合タンパク質ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）ドメイン、テロメラーゼＳｍ７タンパク質ドメイン（例えば、Ｓｍ７ホモ七量体または単量体のＳｍ様タンパク質）、および／またはそれらの断片が含まれる。実施形態では、追加の異種部分は、ＭＳ２ファージオペレーターステムループ（例えば、ＭＳ２、ＭＳ２ Ｃ－５突然変異体、またはＭＳ２ Ｆ－５突然変異体）、非天然ＲＮＡモチーフ、ＰＰ７オペレーターステムループ、ＳｆＭｕ ｐｈａｔｅ Ｃｏｍステムループ、滅菌アルファモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフ、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフ、および／またはそれらの断片などのポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡモチーフ）を含む。追加の異種部分の非限定的な例には、配列番号３８０、３８２、３８４、３８６～３８８のいずれか１つもしくは複数と少なくとも約８５％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片が含まれる。追加の異種部分の非限定的な例には、配列番号３７９、３８１、３８３、３８５のいずれか１つもしくは複数と少なくとも約８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片が含まれる。

【0538】

一部の実施形態では、塩基エディター系は、塩基除去修復（ＢＥＲ）成分の阻害剤をさらに含み得る。塩基エディター系の成分は、共有結合、非共有相互作用、またはそれらの会合および相互作用の任意の組合せを介して、互いに会合され得ることが理解されるべきである。ＢＥＲ成分の阻害剤は、塩基除去修復阻害剤を含み得る。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害剤は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）であり得る。一部の実施形態では、ウラシル除去修復システムを阻害する薬剤は、ウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）である。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害剤は、イノシン塩基除去修復阻害剤であり得る。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害剤は、必要に応じて、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインが、ポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）と複合体を形成する場合、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインによって標的ヌクレオチド配列に標的化され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、塩基除去修復の阻害剤に融合または連結され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインおよび塩基除去修復の阻害剤に融合または連結され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、塩基除去修復の阻害剤と非共有的に相互作用するか、または会合することによって、塩基除去修復の阻害剤を標的ヌクレオチド配列に標的化し得る。例えば、一部の実施形態では、塩基除去修復成分の阻害剤は、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの一部である、対応する追加の異種部分、抗原、またはドメインと相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することができる追加の異種部分またはドメインを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン成分、および／またはそれと複合化されたガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）は、塩基除去修復成分の阻害剤の一部である対応する異種部分、抗原、またはドメインと相互作用し得るか、会合し得るか、または形成し得る追加の異種部分またはドメインを含む。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害剤は、ガイドポリヌクレオチドによって標的ヌクレオチド配列に標的化され得る。例えば、一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害剤は、ガイドポリヌクレオチドの一部またはセグメント（例えば、ポリヌクレオチドモチーフ）と相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することができる追加の異種部分またはドメイン（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドの追加の異種部分またはドメイン（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）は、塩基除去修復の阻害剤に融合または連結され得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合するか、相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチド、例えば、ラムダバクテリオファージ抗ターミネータータンパク質Ｎの２２アミノ酸ＲＮＡ結合ドメイン（Ｎ２２ｐ）、２Ｇ１２ ＩｇＧホモ二量体ドメイン、ＡＢＩ、抗体（例えば、塩基エディター系の成分またはその異種部分と結合する抗体）またはその断片（例えば、ＩｇＭ（ＭＨＤ２）またはＩｇＥ（ＥＨＤ２）の重鎖ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＧまたはＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭまたはＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ミニ抗体、および／またはＺＩＰ抗体）、バルナーゼ－バースター二量体ドメイン、Ｂｃｌ－ｘＬドメイン、カルシニューリンＡ（ＣＡＮ）ドメイン、心臓ホスホランバン膜貫通型五量体ドメイン、コラーゲンドメイン、Ｃｏｍ ＲＮＡ結合タンパク質ドメイン（例えば、ＳｆＭｕ Ｃｏｍコートタンパク質ドメイン、およびＳｆＭｕ Ｃｏｍ結合タンパク質ドメイン）、サイクロフィリン－Ｆａｓ融合タンパク質（ＣｙＰ－Ｆａｓ）ドメイン、Ｆａｂドメイン、Ｆｅドメイン、フィブリチンフォルドンドメイン、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメイン、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ結合ドメイン（ＦＲＢ）ドメイン、フォルドンドメイン、断片Ｘドメイン、ＧＡＩドメイン、ＧＩＤ１ドメイン、グリコホリンＡ膜貫通ドメイン、ＧｙｒＢドメイン、Ｈａｌｏタグ、ＨＩＶ Ｇｐ４１三量体化ドメイン、ＨＰＶ４５がんタンパク質Ｅ７ Ｃ末端二量体ドメイン、疎水性ポリペプチド、Ｋホモロジー（ＫＨ）ドメイン、Ｋｕタンパク質ドメイン（例えば、Ｋｕヘテロ二量体）、ロイシンジッパー、ＬＯＶドメイン、ミトコンドリアの抗ウイルスシグナル伝達タンパク質ＣＡＲＤフィラメントドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン（ＭＣＰ）、対応するＲＮＡモチーフ／アプタマーと結合する非天然ＲＮＡアプタマーリガンド、副甲状腺ホルモン二量体化ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）ドメイン、ＰＳＤ９５－Ｄｌｇｌ－ｚｏ－１（ＰＤＺ）ドメイン、ＰＹＬドメイン、ＳＮＡＰタグ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分、ＳｐｙＴａｇ部分、ストレプトアビジンドメイン、ストレプトアビジン－結合タンパク質ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）ドメイン、テロメラーゼＳｍ７タンパク質ドメイン（例えば、Ｓｍ７ホモ七量体または単量体のＳｍ様タンパク質）、および／またはそれらの断片が含まれる。実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡモチーフ）、例えば、ＭＳ２ファージオペレーターステムループ（例えば、ＭＳ２、ＭＳ２ Ｃ－５突然変異体、またはＭＳ２ Ｆ－５突然変異体）、非天然ＲＮＡモチーフ、ＰＰ７オペレーターステムループ、ＳｆＭｕ ｐｈａｔｅ Ｃｏｍステムループ、ステリルアルファモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフ、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフ、および／またはそれらの断片を含む。追加の異種部分の非限定的な例には、配列番号３８０、３８２、３８４、３８６～３８８のいずれか１つもしくは複数と少なくとも約８５％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの断片が含まれる。追加の異種部分の非限定的な例には、配列番号３７９、３８１、３８３、３８５のいずれか１つまたは複数と少なくとも約８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらの断片が含まれる。

【0539】

場合によっては、塩基編集系の成分は、ロイシンジッパードメイン（例えば、配列番号３８７および３８８）の相互作用を介して互いに会合している。いくつかの場合において、塩基編集系の成分は、約１、２（すなわち、二量体化）、３、４、５、６、７、８、９、１０個のポリペプチドドメイン単位、少なくとも約１、２（すなわち、二量体化）、３、４、５、６、７、８、９、１０個のポリペプチドドメイン単位、または約１、２（すなわち、二量体化）、３、４、５、６、７、８、９、１０個以下のポリペプチドドメイン単位を含むタンパク質複合体を形成するように会合するポリペプチドドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）を介して互いに会合し、必要に応じて、ポリペプチドドメインは、その活性を低減するかまたは消失させる変更を含み得る。

【0540】

場合によっては、塩基編集系の成分は、多量体抗体またはその断片（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＭ（ＭＨＤ２）またはＩｇＥ（ＥＨＤ２）の重鎖ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＧまたはＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭまたはＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、およびＦａｂ２）の相互作用を介して互いに会合する。場合によっては、抗体は、二量体、三量体、または四量体である。実施形態では、二量体抗体は、塩基編集系のポリペプチドまたはポリヌクレオチド成分と結合する。

【0541】

いくつかの場合において、塩基編集系の成分は、ポリヌクレオチド結合タンパク質ドメインとポリヌクレオチドとの相互作用を通して、互いに会合している。場合によっては、塩基編集系の成分は、１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質ドメインと、自己相補的および／または相互に相補的なポリヌクレオチドとの相互作用を通じて、互いに会合し、その結果、互いに対するポリヌクレオチドの相補的結合は、それらのそれぞれの結合したポリヌクレオチド結合タンパク質ドメインを関連させる。

【0542】

場合によっては、塩基編集系の成分は、ポリペプチドドメインと小分子（例えば、二量化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）、また「二量化物質」としても公知である）との相互作用を介して互いに会合する。ＣＩＤの非限定的な例としては、Ａｍａｒａら、「Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、ＰＮＡＳ、９４：１０６１８～１０６２３（１９９７）；およびＶｏβら、「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｎｄ ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２８：１９４～２０１（２０１５）に開示されるものが挙げられ、各々の開示はすべての目的についてそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。二量体化することができるポリペプチドおよびそれらの対応する二量体化剤の非限定的な例を以下の表１０．１に提供する。

【0543】

【表10-1】

【0544】

実施形態では、追加の異種部分はガイドＲＮＡ分子の一部である。場合によっては、追加の異種部分は、ＲＮＡモチーフを含むかまたはＲＮＡモチーフである。ＲＮＡモチーフは、ガイドＲＮＡ分子の５’もしくは３’末端、またはガイドＲＮＡ分子の種々の位置に配置され得る。実施形態では、ＲＮＡモチーフは、立体障害を低減させるためにガイドＲＮＡ内に位置し、必要に応じて、このような障害は、ＲＮＡスキャフォールドの他の嵩高いループに関連する。場合によっては、リンカーによってガイドＲＮＡの他の部分に連結されるＲＮＡモチーフを連結することが有利であり、リンカーは、長さが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上のヌクレオチド、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上のヌクレオチド、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド以下であり得る。必要に応じて、リンカーはＧＣに富むヌクレオチド配列を含む。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡモチーフの１、２、３、４、５、またはそれ以上のコピーを含むことができ、必要に応じてそれらは連続して配置され、および／または必要に応じてそれらは、それぞれリンカーによって互いに分離される。ＲＮＡモチーフは、本明細書に記載される任意の１つまたは複数のポリヌクレオチド改変を含み得る。ＲＮＡモチーフに対する適切な改変の非限定的な例としては、２’デオキシ－２－アミノプリン、２’リボース－２－アミノプリン、ホスホロチオエート改変、２’－Ｏメチル改変、２’－Ｆｌｕｒｏ改変およびＬＮＡ改変が挙げられる。有利なことに、改変は、安定性を増加させ、ＲＮＡモチーフによって形成されるヘアピンのより強い結合／折り畳み構造を促進するのに役立つ。

【0545】

一部の実施形態では、ＲＮＡモチーフは、伸長を含むように改変される。実施形態では、伸長は、約２、３、４、５、１０、１５、２０もしくは２５個のヌクレオチド、少なくとも約２、３、４、５、１０、１５、２０もしくは２５個のヌクレオチド、または約２、３、４、５、１０、１５、２０もしくは２５個以下のヌクレオチドを含む。場合によっては、伸長は、ＲＮＡモチーフによって形成されるステムの長さの変更（例えば、伸長または短縮）をもたらす。ＲＮＡモチーフによって形成されるステムは、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００個のヌクレオチド、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００個のヌクレオチド、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００個以下のヌクレオチドであることが有利であり得る。様々な実施形態では、伸長は、ＲＮＡモチーフの柔軟性を増加させ、および／または対応するＲＮＡモチーフとの結合を増加させる。

【0546】

一部の実施形態では、塩基エディターは、編集された鎖の塩基除去修復（ＢＥＲ）を阻害する。一部の実施形態では、塩基エディターは、編集されていない鎖を保護または結合する。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＵＧＩ活動またはＵＳＰ活性を含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターはニッカーゼ活性を含む。一部の実施形態では、意図される塩基対の編集は、ＰＡＭ部位の上流である。一部の実施形態では、意図される塩基対の編集は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である。一部の実施形態では、意図される塩基対の編集は、ＰＡＭ部位の下流である。一部の実施形態では、意図される編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である。

【0547】

一部の実施形態では、本方法は、標準的な（例えば、ＮＧＧ）ＰＡＭ部位を必要としない。一部の実施形態では、核酸塩基エディターはリンカーまたはスペーサーを含む。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは長さが１～２５アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは長さが５～２０アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸である。

【0548】

一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基編集融合タンパク質または複合体は、例えば、標的塩基が定義領域（例えば、「脱アミノ化ウインドウ」）内に配置される正確な位置に配置される必要がある。一部の実施形態では、標的は４塩基領域内にあり得る。一部の実施形態では、このような定義された標的領域は、ＰＡＭの約１５塩基上流であり得る。全内容が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ５３３、４２０～４２４（２０１６）；Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」 Ｎａｔｕｒｅ ５５１、４６４～４７１（２０１７）；およびＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）を参照されたい。

【0549】

一部の実施形態では、標的領域は標的ウインドウを含み、標的ウインドウは標的核酸塩基対を含む。一部の実施形態では、標的ウインドウは１～１０個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ウインドウは、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、意図される塩基対の編集は標的ウインドウ内である。一部の実施形態では、標的ウインドウは、意図される塩基対の編集を含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書において提供される塩基エディターのいずれかを使用して行われる。一部の実施形態では、標的ウインドウは脱アミノ化ウインドウである。脱アミノ化ウインドウは、塩基エディターが標的ヌクレオチドに作用して脱アミノ化する定義された領域であり得る。一部の実施形態では、脱アミノ化ウインドウは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基領域内にある。一部の実施形態では、脱アミノ化ウインドウは、ＰＡＭの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基上流である。

【0550】

本開示の塩基エディターは、標的ポリヌクレオチド配列の編集を促進する任意のドメイン、特徴またはアミノ酸配列を含み得る。例えば、一部の実施形態では、塩基エディターは、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターのＮＬＳは、デアミナーゼドメインとポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインとの間に位置する。一部の実施形態では、塩基エディターのＮＬＳは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのＣ末端に局在化する。

【0551】

融合タンパク質に含まれるタンパク質ドメインは、異種機能ドメインであり得る。融合タンパク質に含まれ得るタンパク質ドメインの非限定的な例としては、デアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼおよび／またはアデノシンデアミナーゼ）、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメイン、エピトープタグ、およびレポーター遺伝子配列が挙げられる。タンパク質ドメインは、例えば、以下の活性：転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、遺伝子サイレンシング活性、クロマチン改変活性、エピジェネティック改変活性、ヒストン改変活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性のうちの１つまたは複数を有する、異種機能ドメインであり得る。このような異種機能ドメインは、例えば、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンユビキチン化などをもたらす、標的ＤＮＡ（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質など）に関連する標的ポリペプチドの改変などの機能活性を付与することができる。付与される他の機能および／または活性には、トランスポーゼース活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、リガーゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱デニル化活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、ポリメラーゼ活性、ヘリカーゼ活性、またはヌクレアーゼ活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、または上記の任意の組合せが含まれ得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ヒストンデメチラーゼ、転写活性化因子またはデアミナーゼに融合される。

【0552】

さらに適切な融合パートナーには、限定されないが、境界エレメント（例えば、ＣＴＣＦ）、周辺動員を提供するタンパク質およびその断片（例えば、Ｌａｍｉｎ Ａ、Ｌａｍｉｎ Ｂなど）、ならびにタンパク質ドッキングエレメント（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌｌ／Ａｂｙｌなど）が含まれる。

【0553】

ドメインは、検出され得るか、またはエピトープタグ、レポータータンパク質、他の結合ドメインで標識され得る。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されないが、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。追加のタンパク質配列は、ＤＮＡ分子を結合するか、または他の細胞分子を結合するアミノ酸配列を含み、それらには、限定されないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合が含まれ得る。

【0554】

本明細書に開示される塩基エディターに存在することができる他の例示的な特徴は、細胞質局在化配列などの局在化配列、核輸出配列などの輸出配列、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質または複合体の可溶化、精製、もしくは検出に有用な配列タグである。本明細書において提供される適切なタンパク質タグには、限定されないが、ビオチンカルボキシラーゼ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグまたはＨｉｓタグとも呼ばれるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓ－タグ、Ｓｏｆｔａｇ（例えば、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３）、ｓｔｒｅｐタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、およびＳＢＰタグが含まれる。追加の適切な配列は、当業者には明らかである。一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体は、１つまたは複数のＨｉｓタグを含む。

【0555】

一部の実施形態では、非限定的な例示的シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）には、ＢＥ１（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥｎ－ｄＣａｓ９）、ＢＥ２（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥｎ－ｄＣａｓ９－ＵＧＩ）、ＢＥ３（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥｎ－ｄＣａｓ９（Ａ８４０Ｈ）－ＵＧＩ）、ＢＥ３－Ｇａｍ、ｓａＢＥ３、ｓａＢＥ４－Ｇａｍ、ＢＥ４、ＢＥ４－Ｇａｍ、ｓａＢＥ４、またはｓａＢ４Ｅ－Ｇａｍが含まれる。ＢＥ４はＡＰＯＢＥＣ１－Ｃａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）リンカーを３２アミノ酸に、Ｃａｓ９ｎ－ＵＧＩリンカーを９アミノ酸に伸長し、ＵＧＩの第２コピーを別の９アミノ酸リンカーとともに構築物のＣ末端に付加して単一の塩基エディター構築物にする。塩基エディターのｓａＢＥ３およびｓａＢＥ４は、より小さなＳ．ａｕｒｅｕｓＣａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）で置き換えたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）を有する。ＢＥ３－Ｇａｍ、ｓａＢＥ３－Ｇａｍ、ＢＥ４－Ｇａｍ、およびｓａＢＥ４－Ｇａｍは、１６アミノ酸のＸＴＥＮリンカーを介してＢＥ３、ｓａＢＥ３、ＢＥ４、およびｓａＢＥ４のＮ末端に融合したＧａｍタンパク質の１７４残基を有する。

【0556】

一部の実施形態では、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）は、ＤＮＡ中のアデニンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＢＥ３のＡＰＯＢＥＣ１成分を、天然もしくは操作された大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＴａｄＡ、ヒトＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡ、またはヒトＡＤＡＴ２で置き換えることによって生成される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、進化したＴａｄＡバリアントを含む。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ １．２（ＴａｄＡ^＊－ＸＴＥＮ－ｎＣａｓ９－ＮＬＳ）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ^＊は、Ａ１０６ＶおよびＤ１０８Ｎ突然変異を含む。

【0557】

一部の実施形態では、ＡＢＥは第２世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．１であり、これはＴａｄＡ^＊において追加の突然変異Ｄ１４７ＹおよびＥ１５５Ｖを含む（ＴａｄＡ^＊２．１）。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．２であり、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼの触媒的に不活性化されたバージョンに融合されたＡＢＥ２．１である（Ｅ１２５Ｑ突然変異を有するＡＡＧ）。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．３であり、大腸菌Ｅｎｄｏ Ｖの触媒的に不活性化された（Ｄ３５Ａ突然変異により不活性化された）バージョンに融合されたＡＢＥ２．１である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．６であり、これはＡＢＥ２．１においてリンカーの２倍の長さ（３２アミノ酸、（ＳＧＧＳ）_２（配列番号３３０）－ＸＴＥＮ－（ＳＧＧＳ）_２（配列番号３３０））のリンカーを有する。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．７であり、これは追加の野生型ＴａｄＡ単量体に繋がれたＡＢＥ２．１である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．８であり、これは追加のＴａｄＡ^＊２．１単量体で繋がれたＡＢＥ２．１である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．９であり、これは進化したＴａｄＡ（ＴａｄＡ^＊２．１）のＡＢＥ２．１のＮ末端への直接融合である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．１０であり、これは野生型ＴａｄＡのＡＢＥ２．１のＮ末端への直接融合である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．１１であり、これはＴａｄＡ^＊単量体のＮ末端に不活性化Ｅ５９Ａ突然変異を有するＡＢＥ２．９である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．１２であり、これは内部ＴａｄＡ^＊単量体において不活性化Ｅ５９Ａ突然変異を有するＡＢＥ２．９である。

【0558】

一部の実施形態では、ＡＢＥは第３世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ３．１であり、これは３つの追加のＴａｄＡ突然変異（Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、およびＩ１５６Ｆ）を有するＡＢＥ２．３である。

【0559】

一部の実施形態では、ＡＢＥは第４世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ４．３であり、これは追加のＴａｄＡ突然変異Ａ１４２Ｎを有するＡＢＥ３．１である（ＴａｄＡ^＊４．３）。

【0560】

一部の実施形態では、ＡＢＥは第５世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ５．１であり、これは生存クローン（Ｈ３６Ｌ、Ｒ５１Ｌ、Ｓ１４６ＣおよびＫ１５７Ｎ）からの突然変異のコンセンサスセットをＡＢＥ３．１にインポートすることによって生成される。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ５．３であり、これは内部進化したＴａｄＡ^＊に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥは、以下の表１１に示されるＡＢＥ５．２、ＡＢＥ５．４、ＡＢＥ５．５、ＡＢＥ５．６、ＡＢＥ５．７、ＡＢＥ５．８、ＡＢＥ５．９、ＡＢＥ５．１０、ＡＢＥ５．１１、ＡＢＥ５．１２、ＡＢＥ５．１３またはＡＢＥ５．１４である。一部の実施形態では、ＡＢＥは第６世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥは、以下の表１１に示されるＡＢＥ６．１、ＡＢＥ６．２、ＡＢＥ６．３、ＡＢＥ６．４、ＡＢＥ６．５またはＡＢＥ６．６である。一部の実施形態では、ＡＢＥは第７世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥは、以下の表１１に示されるＡＢＥ７．１、ＡＢＥ７．２、ＡＢＥ７．３、ＡＢＥ７．４、ＡＢＥ７．５、ＡＢＥ７．６、ＡＢＥ７．７、ＡＢＥ７．８、ＡＢＥ７．９またはＡＢＥ７．１０である。

【0561】

【表11-1】

【0562】

【表11-2】

【0563】

一部の実施形態では、塩基エディターは、第８世代のＡＢＥ（ＡＢＥ８）である。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＴａｄＡ^＊８バリアントを含む。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＴａｄＡ^＊８バリアントを含む単量体構築物を有する（「ＡＢＥ８．ｘ－ｍ」）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１－ｍであり、これはＹ１４７Ｔ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２－ｍであり、これはＹ１４７Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．３－ｍであり、これはＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．３）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．４－ｍであり、これはＹ１２３Ｈ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．４）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．５－ｍであり、これはＶ８２Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．５）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．６－ｍであり、これはＴ１６６Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．６）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．７－ｍであり、これはＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．７）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．８－ｍであり、これはＹ１４７Ｒ、Ｑ１５４ＲおよびＹ１２３Ｈ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．８）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．９－ｍであり、これはＹ１４７Ｒ、Ｑ１５４ＲおよびＩ７６Ｙ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．９）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１０－ｍであり、これはＹ１４７Ｒ、Ｑ１５４ＲおよびＴ１６６Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１０）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１１－ｍであり、これはＹ１４７ＴおよびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１１）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１２－ｍであり、これはＹ１４７ＴおよびＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１２）。

【0564】

一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１３－ｍであり、これは、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４ＲおよびＩ７６Ｙ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１３）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１４－ｍであり、これは、Ｉ７６ＹおよびＶ８２Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１４）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１５－ｍであり、これは、Ｖ８２ＳおよびＹ１４７Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１５）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１６－ｍであり、これは、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）およびＹ１４７Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１６）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１７－ｍであり、これは、Ｖ８２ＳおよびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１７）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１８－ｍであり、これは、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）およびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１８）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１９－ｍであり、これは、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７ＲおよびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１９）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２０－ｍであり、これは、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７ＲおよびＱ１５４Ｒ突然変異（を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有するＴａｄＡ^＊８．２０）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２１－ｍであり、これは、Ｙ１４７ＲおよびＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２１）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２２－ｍであり、これは、Ｖ８２ＳおよびＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２２）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２３－ｍであり、これは、Ｖ８２ＳおよびＹ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２３）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２４－ｍであり、これは、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、およびＹ１４７Ｔ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２４）。

【0565】

一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＴａｄＡ^＊８バリアントに融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（「ＡＢＥ８．ｘ－ｄ」）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１－ｄであり、これはＹ１４７Ｔ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２－ｄであり、これはＹ１４７Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．３－ｄであり、これはＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．３）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．４－ｄであり、これはＹ１２３Ｈ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．４）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．５－ｄであり、これはＶ８２Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．５）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．６－ｄであり、これはＴ１６６Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．６）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．７－ｄであり、これはＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．７）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．８－ｄであり、これはＹ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＹ１２３Ｈ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．８）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．９－ｄであり、これはＹ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．９）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１０－ｄであり、これは、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＴ１６６Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１０）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１１－ｄであり、これは、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１１）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１２－ｄであり、これは、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１２）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１３－ｄであり、これは、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１３）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１４－ｄであり、これは、Ｉ７６ＹおよびＶ８２Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１４）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１５－ｄであり、これは、Ｖ８２ＳおよびＹ１４７Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１５）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１６－ｄであり、これは、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）およびＹ１４７Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１６）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１７－ｄであり、これは、Ｖ８２ＳおよびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１７）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１８－ｄであり、これは、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）およびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１８）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１９－ｄであり、これは、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７ＲおよびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１９）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２０－ｄであり、これは、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７ＲおよびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２０）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２１－ｄであり、これは、Ｙ１４７ＲおよびＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２１）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２２－ｄであり、これは、Ｖ８２ＳおよびＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２２）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２３－ｄであり、これは、Ｖ８２ＳおよびＹ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２３）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２４－ｄであり、これは、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、およびＹ１４７Ｔ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２４）。

【0566】

一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＴａｄＡ^＊８バリアントに融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（「ＡＢＥ８．ｘ－７」）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１－７であり、これはＹ１４７Ｔ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２－７であり、これはＹ１４７Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．３－７であり、これはＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．３）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．４－７であり、これはＹ１２３Ｈ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．４）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．５－７であり、これはＶ８２Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．５）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．６－７であり、これはＴ１６６Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．６）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．７－７であり、これはＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．７）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．８－７であり、これはＹ１４７Ｒ、Ｑ１５４ＲおよびＹ１２３Ｈ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．８）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．９－７であり、これはＹ１４７Ｒ、Ｑ１５４ＲおよびＩ７６Ｙ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．９）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１０－７であり、これはＹ１４７Ｒ、Ｑ１５４ＲおよびＴ１６６Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１０）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１１－７であり、これはＹ１４７ＴおよびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１１）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１２－７であり、これはＹ１４７ＴおよびＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１２）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１３－７であり、これはＹ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４ＲおよびＩ７６Ｙ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１３）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１４－７であり、これはＩ７６ＹおよびＶ８２Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１４）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１５－７であり、これはＶ８２ＳおよびＹ１４７Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１５）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１６－７であり、これはＶ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）およびＹ１４７Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１６）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１７－７であり、これはＶ８２ＳおよびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１７）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１８－７であり、これはＶ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）およびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１８）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１９－７であり、これはＶ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７ＲおよびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．１９）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２０－７であり、これはＩ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７ＲおよびＱ１５４Ｒ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２０）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２１－７であり、これはＹ１４７ＲおよびＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２１）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２２－７であり、これはＶ８２ＳおよびＱ１５４Ｓ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２２）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２３－７であり、これはＶ８２ＳおよびＹ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２３）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２４－７であり、これはＶ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）およびＹ１４７Ｔ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８．２４）。

【0567】

一部の実施形態では、ＡＢＥは、以下の表１２に示されるＡＢＥ８．１－ｍ、ＡＢＥ８．２－ｍ、ＡＢＥ８．３－ｍ、ＡＢＥ８．４－ｍ、ＡＢＥ８．５－ｍ、ＡＢＥ８．６－ｍ、ＡＢＥ８．７－ｍ、ＡＢＥ８．８－ｍ、ＡＢＥ８．９－ｍ、ＡＢＥ８．１０－ｍ、ＡＢＥ８．１１－ｍ、ＡＢＥ８．１２－ｍ、ＡＢＥ８．１３－ｍ、ＡＢＥ８．１４－ｍ、ＡＢＥ８．１５－ｍ、ＡＢＥ８．１６－ｍ、ＡＢＥ８．１７－ｍ、ＡＢＥ８．１８－ｍ、ＡＢＥ８．１９－ｍ、ＡＢＥ８．２０－ｍ、ＡＢＥ８．２１－ｍ、ＡＢＥ８．２２－ｍ、ＡＢＥ８．２３－ｍ、ＡＢＥ８．２４－ｍ、ＡＢＥ８．１－ｄ、ＡＢＥ８．２－ｄ、ＡＢＥ８．３－ｄ、ＡＢＥ８．４－ｄ、ＡＢＥ８．５－ｄ、ＡＢＥ８．６－ｄ、ＡＢＥ８．７－ｄ、ＡＢＥ８．８－ｄ、ＡＢＥ８．９－ｄ、ＡＢＥ８．１０－ｄ、ＡＢＥ８．１１－ｄ、ＡＢＥ８．１２－ｄ、ＡＢＥ８．１３－ｄ、ＡＢＥ８．１４－ｄ、ＡＢＥ８．１５－ｄ、ＡＢＥ８．１６－ｄ、ＡＢＥ８．１７－ｄ、ＡＢＥ８．１８－ｄ、ＡＢＥ８．１９－ｄ、ＡＢＥ８．２０－ｄ、ＡＢＥ８．２１－ｄ、ＡＢＥ８．２２－ｄ、ＡＢＥ８．２３－ｄ、またはＡＢＥ８．２４－ｄである。

【0568】

【表12-1】

【0569】

【表12-2】

【0570】

一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ａ－ｍであり、これはＲ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ａ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｂ－ｍであり、これはＶ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｂ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｃ－ｍであり、これはＲ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｃ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｄ－ｍであり、これはＶ８８Ａ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９ＮおよびＦ１４９Ｙ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｄ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｅ－ｍであり、これは、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０を含む単量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｅ）。

【0571】

一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ａ－ｄであり、これはＲ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ａ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｂ－ｄであり、これはＶ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｂ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｃ－ｄであり、これはＲ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｃ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｄ－ｄであり、これはＶ８８Ａ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９ＮおよびＦ１４９Ｙ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｄ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｅ－ｄであり、これはＡ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合した野生型大腸菌ＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｅ）。

【0572】

一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ａ－７であり、これはＲ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ａ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｂ－７であり、これはＶ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｂ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｃ－７であり、これはＲ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｃ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｄ－７であり、これはＶ８８Ａ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９ＮおよびＦ１４９Ｙ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｄ）。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｅ－７であり、これはＡ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６ＩおよびＤ１６７Ｎ突然変異を有するＴａｄＡ^＊７．１０に融合したＴａｄＡ^＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する（ＴａｄＡ^＊８ｅ）。

【0573】

一部の実施形態では、ＡＢＥは、以下の表１３に示されるＡＢＥ８ａ－ｍ、ＡＢＥ８ｂ－ｍ、ＡＢＥ８ｃ－ｍ、ＡＢＥ８ｄ－ｍ、ＡＢＥ８ｅ－ｍ、ＡＢＥ８ａ－ｄ、ＡＢＥ８ｂ－ｄ、ＡＢＥ８ｃ－ｄ、ＡＢＥ８ｄ－ｄ、またはＡＢＥ８ｅ－ｄである。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ８ｅ－ｍまたはＡＢＥ８ｅ－ｄである。ＡＢＥ８ｅは、ＳｐＣａｓ９以外のＣａｓ同族体、例えば、ＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９－ＫＫＨ、Ｃａｓ１２ａ同族体、例えば、ＬｂＣａｓ１２ａ、ｅｎＡｓ－Ｃａｓ１２ａ、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ならびに円順列ＣＰ１０２８－ＳｐＣａｓ９およびＣＰ１０４１－ＳｐＣａｓ９とともに使用した場合、効率的なアデニン塩基編集活性と低いインデル形成とを示す。表１３においてＡＢＥ８ｅについて示される突然変異に加えて、オフターゲットＲＮＡおよびＤＮＡ編集は、Ｖ１０６Ｗ置換をＴａｄＡドメインに導入することによって低減された（全内容が参照により本明細書に組み込まれるＭ．Ｒｉｃｈｔｅｒら、２０２０、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０４５３－ｚに記載される）。

【0574】

【表13】

【0575】

一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ８）は、アデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ^＊８）を、円順列Ｃａｓ９（例えば、ＣＰ５またはＣＰ６）およびバイパータイト核局在化配列を含むスキャフォールドにクローニングすることによって作製される。一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、またはＡＢＥ８）はＮＧＣ ＰＡＭ ＣＰ５バリアント（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９またはｓｐＶＲＱＲ Ｃａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、またはＡＢＥ８）は、ＡＧＡ ＰＡＭ ＣＰ５バリアント（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９またはｓｐＶＲＱＲ Ｃａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、またはＡＢＥ８）はＮＧＣ ＰＡＭ ＣＰ６バリアント（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９またはｓｐＶＲＱＲ Ｃａｓ９）である。一部の実施形態では、核酸エディター（例えば、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、またはＡＢＥ８）はＡＧＡ ＰＡＭ ＣＰ６バリアント（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９またはｓｐＶＲＱＲ Ｃａｓ９）である。

【0576】

一部の実施形態では、ＡＢＥは、以下の表１４に示される遺伝子型を有する。

【0577】

【表14】

【0578】

以下の表１５に示されるように、４０のＡＢＥ８の遺伝子型を記載する。ＡＢＥの進化した大腸菌ＴａｄＡ部分における残基位置を示す。ＡＢＥ８の突然変異変化は、ＡＢＥ７．１０突然変異と異なる場合に示される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、以下の表１５に示されるＡＢＥのうちの１つの遺伝子型を有する。

【0579】

【表15-1】

【0580】

【表15-2】

【0581】

一部の実施形態では、塩基エディターはＡＢＥ８．１であり、これは、以下の配列もしくはアデノシンデアミナーゼ活性を有するその断片を含むか、または本質的にそれからなる：
＞ＡＢＥ８．１＿Ｙ１４７Ｔ＿ＣＰ５＿ＮＧＣ ＰＡＭ＿単量体

【0582】

【表G】

【0583】

上述の配列において、標準文字はアデノシンデアミナーゼ配列を示し、太字の配列はＣａｓ９に由来する配列を示し、斜体の配列はリンカー配列を示し、下線の配列はバイパータイト核局在化配列を示す。他のＡＢＥ８配列は、添付の配列表（配列番号３３２～３５４）に提供される。

【0584】

一部の実施形態では、塩基エディターは、第９世代のＡＢＥ（ＡＢＥ９）である。一部の実施形態では、ＡＢＥ９は、ＴａｄＡ^＊９バリアントを含む。ＡＢＥ９塩基エディターは、本明細書に記載されるように、ＡＢＥ７^＊１０参照配列と比較して改変を含む、アミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む。例示的なＡＢＥ９バリアントを表１６に列挙する。ＡＢＥ９塩基エディターの詳細は、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４９９７５に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0585】

【表16-1】

【0586】

【表16-2】

【0587】

一部の実施形態では、塩基エディターは、本明細書に記載されるように、ＡＢＥ７^＊１０参照配列と比較して改変を含む、アミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む。表１６．１で使用される用語「単量体」とは、記載された改変を含むＴａｄＡ^＊７．１０の単量体形態を指す。表１６．１で使用される用語「ヘテロ二量体」とは、記載される改変を含むＴａｄＡ^＊７．１０に融合された特定の野生型大腸菌ＴａｄＡアデノシンデアミナーゼを指す。

【0588】

【表16-3】

【0589】

一部の実施形態では、塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）またはウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）ドメインの全部または一部（例えば、機能的部分）を含むドメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、核酸ポリメラーゼの全部または一部（例えば、機能的部分）を含むドメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、ドメインとして、核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）の全部または一部（例えば、機能的部分）を含む。例えば、塩基エディターは、真核生物ＮＡＰの全部または一部（例えば、機能的部分）を含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、ＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、損傷乗り越え型ポリメラーゼ活性を有する。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、損傷乗り越え型ＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、またはポリメラーゼイータである。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、真核生物ポリメラーゼのアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、イータ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミュー、またはニュー成分である。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたＮＡＰまたはその一部は、核酸ポリメラーゼ（例えば、損傷乗り越え型ＤＮＡポリメラーゼ）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれる核酸ポリメラーゼまたはその一部は、損傷乗り越え型ＤＮＡポリメラーゼである。

【0590】

一部の実施形態では、塩基エディターのドメインは、複数のドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９に由来するポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターは、野生型または天然のＣａｓ９のＲＥＣローブおよびＮＵＣローブに対応するＲＥＣローブおよびＮＵＣローブを含み得る。別の例では、塩基エディターは、ＲｕｖＣＩドメイン、ＢＨドメイン、ＲＥＣ１ドメイン、ＲＥＣ２ドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、Ｌ１ドメイン、ＨＮＨドメイン、Ｌ２ドメイン、ＲｕｖＣＩＩＩドメイン、ＷＥＤドメイン、ＴＯＰＯドメイン、またはＣＴＤドメインのうちの１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターの１つまたは複数のドメインは、ドメインを含むポリペプチドの野生型バージョンと比較して突然変異（例えば、置換、挿入、欠失）を含む。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインのＨＮＨドメインは、Ｈ８４０Ａ置換を含み得る。別の例では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインのＲｕｖＣＩドメインは、Ｄ１０Ａ置換を含み得る。

【0591】

本明細書に開示される塩基エディターの異なるドメイン（例えば、隣接ドメイン）は、１つまたは複数のリンカードメイン（例えば、ＸＴＥＮリンカードメイン）を使用するかまたは使用せずに、互いに接続することができる。一部の実施形態では、リンカードメインは、結合（例えば、共有結合）、化学基、または２つの分子もしくは部分を連結する分子、例えば、融合タンパク質の２つのドメイン、例えば、第１のドメイン（例えば、Ｃａｓ９由来ドメイン）および第２のドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメイン）などであり得る。一部の実施形態では、リンカーは共有結合（例えば、炭素－炭素結合、ジスルフィド結合、炭素－ヘテロ原子結合など）である。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミド連結の炭素窒素結合である。ある特定の実施形態では、リンカーは、環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分枝もしくは非分枝の脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーは、ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）である。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸の単量体、二量体、またはポリマーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ－アラニン、３－アミノプロパン酸、４－アミノブタン酸、５－ペンタン酸など）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）の単量体、二量体、またはポリマーを含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、炭素環式部分（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤（例えば、チオール、アミノ）の結合を促進するための官能化部分を含み得る。任意の求電子剤をリンカーの一部として使用することができる。例示的な求電子剤としては、限定されないが、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートが挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含むＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼのｇＲＮＡ結合ドメインと、核酸編集タンパク質の触媒ドメインを接続する。一部の実施形態では、リンカーは、ｄＣａｓ９および第２のドメイン（例えば、ＵＧＩなど）を接続する。

【0592】

リンカー
ある特定の実施形態では、リンカーを使用して、本発明のペプチドまたはペプチドドメインのいずれかを連結することができる。リンカーは共有結合のような単純なものであり得るか、または長さが何原子のポリマーリンカーであり得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドであるかまたはアミノ酸に基づく。他の実施形態では、リンカーはペプチド様ではない。ある特定の実施形態では、リンカーは、共有結合（例えば、炭素－炭素結合、ジスルフィド結合、炭素－ヘテロ原子結合など）である。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミド連結の炭素－窒素結合である。ある特定の実施形態では、リンカーは、環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分枝もしくは非分枝の脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーは、ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）である。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸の単量体、二量体、またはポリマーを含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ－アラニン、３－アミノプロパン酸、４－アミノブタン酸、５－ペンタン酸など）を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）の単量体、二量体、またはポリマーを含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、炭素環式部分（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。他の実施形態では、リンカーは、アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤（例えば、チオール、アミノ）の結合を促進するための官能化部分を含み得る。任意の求電子剤をリンカーの一部として使用することができる。例示的な求電子剤としては、限定されないが、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートが挙げられる。

【0593】

典型的に、リンカーは、２つの基、分子、もしくは他の部分の間に位置するか、またはこれらに隣接して、共有結合を介してそれぞれに連結され、したがって、これら２つを連結する。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。一部の実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。一部の実施形態では、リンカーは、長さが２～１００個のアミノ酸、例えば、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、または１５０～２００個のアミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーは、長さが約３～約１０４個（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個）のアミノ酸である。
より長いまたはより短いリンカーもまた意図される。

【0594】

一部の実施形態では、本明細書において提供される融合タンパク質のいずれかは、リンカーを介して互いに融合されるシチジンまたはアデノシンデアミナーゼおよびＣａｓ９ドメインを含む。シチジンまたはアデノシンデアミナーゼとＣａｓ９ドメインとの間の種々のリンカー長および柔軟性が、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターのための活性に最適な長さを達成するために採用され得る（例えば、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２４６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２４７）、および（Ｇ）ｎの形態の非常に柔軟なリンカーから、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号２４８）、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３５５）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号２４９）の形態のより剛性なリンカーまでの範囲である（例えば、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ＪＰら、Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｔｏ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５７７～８２を参照されたい；全内容は参照により本明細書に組み込まれる）および（ＸＰ）ｎ）。一部の実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。一部の実施形態では、リンカーは（ＧＧＳ）ｎモチーフを含み、ｎは１、３または７である。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼと、本明細書において提供される融合タンパク質のいずれかのＣａｓ９ドメインとは、ＸＴＥＮリンカーとも呼ばれ得る、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号２４９）を含むリンカーを介して融合される。

【0595】

一部の実施形態では、塩基エディターのドメインは、以下のアミノ酸配列：
ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ（配列番号３５６）、
ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号３５７）、または
ＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３５８）
を含むリンカーを介して融合される。

【0596】

一部の実施形態では、塩基エディターのドメインは、ＸＴＥＮリンカーとも呼ばれ得る、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号２４９）を含むリンカーを介して融合される。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、長さが２４アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３５９）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、長さが４０アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列：ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号３６０）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、長さが６４アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列：ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号３６１）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、長さが９２アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳ（配列番号３６２）。

【0597】

一部の実施形態では、リンカーは、複数のプロリン残基を含み、長さが５～２１、５～１４、５～９、５～７個のアミノ酸であり、例えば、ＰＡＰＡＰ（配列番号３６３）、ＰＡＰＡＰＡ（配列番号３６４）、ＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号３６５）、ＰＡＰＡＰＡＰＡ（配列番号３６６）、Ｐ（ＡＰ）４（配列番号３６７）、Ｐ（ＡＰ）７（配列番号３６８）、Ｐ（ＡＰ）１０（配列番号３６９）である（例えば、Ｔａｎ Ｊ、Ｚｈａｎｇ Ｆ、Ｋａｒｃｈｅｒ Ｄ、Ｂｏｃｋ Ｒ．、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１９年１月２５日；１０（１）：４３９を参照されたい；全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。このようなプロリンに富むリンカーは「剛性」リンカーとも呼ばれる。

【0598】

別の実施形態では、塩基エディター系は、デアミナーゼ（ＤＮＡデアミナーゼ）、例えば、アデノシンまたはシチジンデアミナーゼと非共有結合的に相互作用し、バイスタンダーもしくは標的隣接効果を最小限または低減させながら、特定の編集のために標的ポリヌクレオチド配列中の標的核酸塩基にアデノシンまたはシチジンデアミナーゼを一時的に引き付ける成分（タンパク質）を含む。デアミナーゼ相互作用タンパク質を伴うこのような非共有結合系および方法は、ＤＮＡデアミナーゼを特定のゲノム標的核酸塩基に引き付けるのに役立ち、オンターゲットおよびターゲット隣接編集の事象を分断し、したがって、より正確な単一の塩基置換突然変異の達成を高める。実施形態では、デアミナーゼ相互作用タンパク質は、デアミナーゼの活性（触媒）部位が標的核酸塩基（例えば、それぞれ、アデノシンまたはシチジン）と係合するのを遮断または妨害することなく、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）と結合する。このようなシステムは、「ＭａｇｎＥｄｉｔ」と呼ばれ、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ複合体に繋がれた相互作用タンパク質を伴い、同時発現されたアデノシンまたはシチジンデアミナーゼ（外因性または内因性のいずれか）を引き付けて特定のゲノム標的部位を編集することができ、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＣａｎｎ，Ｊ．ら、２０２０、「ＭａｇｎＥｄｉｔ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｒｕｉｔ ＤＮＡ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｔｏ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｔａｒｇｅｔｓ」、Ｌｉｆｅ－Ｓｃｉｅｎｃｅ－Ａｌｌｉａｎｃｅ、３巻、４号（ｅ２０１９００６０６）、（ｄｏｉ １０．２６５０８／Ｉｓａ．２０１９００６０６）に記載される。実施形態では、ＤＮＡデアミナーゼは、本明細書に記載されるアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ^＊８）である。

【0599】

別の実施形態では、「Ｓｕｎｔａｇ」と呼ばれるシステムは、隣接する標的編集が低減した部位で塩基編集を達成するために、ポリヌクレオチド標的部位に塩基エディターのタンパク質（例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）成分またはその複数のコピーを動員するために使用される非共有結合的に相互作用する成分を伴う。例えば、各々内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＴａｎｅｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｅ．ら、「Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ」、Ｃｅｌｌ、２０１４年１０月２３日；１５９（３）：６３５～６４６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０３９；およびＨｕａｎｇ，Ｙ．－Ｈ．ら、２０１７、「ＤＮＡ ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＳｕｎＴａｇ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＭＴ３Ａ」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １８： １７６．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１７－１３０６－ｚに記載される。一実施形態では、ＤＮＡデアミナーゼは、本明細書に記載されるアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ^＊８）である。

【0600】

ガイドＲＮＡを有する核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質
細胞における塩基編集のための組成物および方法が、本明細書に提供される。ガイドポリ核酸配列、例えば、本明細書において提供されるガイドＲＮＡ配列、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、もしくはそれ以上のガイドＲＮＡの組合せを含む組成物が、本明細書にさらに提供される。一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基編集のための組成物は、塩基エディター、例えば、Ｃ塩基エディターまたはＡ塩基エディターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。例えば、塩基編集のための組成物は、ＢＥ、ＢＥ４、ＡＢＥ、および提供される１つまたは複数のガイドＲＮＡの組合せをコードするｍＲＮＡ配列を含み得る。塩基編集のための組成物は、塩基エディターポリペプチドと、本明細書において提供される任意のガイドＲＮＡの１つまたは複数の組合せとを含み得る。このような組成物を使用して、異なる送達アプローチ、例えば、電気穿孔、ヌクレオフェクション、ウイルス形質導入またはトランスフェクションにより、細胞内で塩基編集を行うことができる。一部の実施形態では、塩基編集のための組成物は、塩基エディターをコードするｍＲＮＡ配列、および電気穿孔のために本明細書において提供される１つまたは複数のガイドＲＮＡ配列の組合せを含む。

【0601】

本開示の一部の態様は、本明細書において提供される融合タンパク質または複合体のいずれか、および融合タンパク質または複合体の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメイン（例えば、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９、またはＣａｓ９ニッカーゼ）またはＣａｓ１２）に結合したガイドＲＮＡを含むシステムを提供する。これらの複合体はまたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）と呼ばれる。一部の実施形態では、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、長さが１５～１００ヌクレオチドであり、標的配列と相補的な少なくとも１０の連続するヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列と相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０の連続するヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、標的配列はＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、標的配列はＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、標的配列は、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、または動物のゲノム中の配列である。一部の実施形態では、標的配列は、ヒトのゲノム中の配列である。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、標準的なＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に直接隣接する。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、非標準的なＰＡＭ配列（例えば、表７に列挙される配列または５’－ＮＡＡ－３’）に直接隣接する。一部の実施形態では、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、目的の遺伝子（例えば、疾患または障害に関連する遺伝子）中の配列と相補的である。

【0602】

本開示の一部の態様は、本明細書において提供される融合タンパク質または複合体を使用する方法を提供する。例えば、本開示の一部の態様は、ＤＮＡ分子を本明細書において提供される融合タンパク質または複合体のいずれかと、および少なくとも１つのガイドＲＮＡと接触させるステップを含む方法であって、ガイドＲＮＡは、長さが約１５～１００ヌクレオチドであり、標的配列と相補的な少なくとも１０の連続ヌクレオチドの配列を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧ、またはＣＡＡ配列に直接隣接する。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、ＮＧＡ、ＮＧＣＧ、ＮＧＮ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＧＣＧ、ＮＧＣＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＴＮ、または５’（ＴＴＴＶ）配列に直接隣接する。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、例えば、ＴＴＮ、ＤＴＴＮ、ＧＴＴＮ、ＡＴＴＮ、ＡＴＴＣ、ＤＴＴＮＴ、ＷＴＴＮ、ＨＡＴＹ、ＴＴＴＮ、ＴＴＴＶ、ＴＴＴＣ、ＴＧ、ＲＴＲ、またはＹＴＮ ＰＡＭ部位に直接隣接する。

【0603】

それぞれの配列における特定の位置または残基の番号付けは、使用される特定のタンパク質および番号付けスキームに依存することが理解される。番号付けは、例えば、成熟タンパク質の前駆体と成熟タンパク質自体とで異なり、種間の配列の相違が番号付けに影響することがある。当業者は、当該技術分野において周知である方法によって、例えば、配列アラインメントおよび相同な残基の決定によって、任意の相同なタンパク質およびそれぞれのコードする核酸におけるそれぞれの残基を同定することができる。

【0604】

本明細書に開示される融合タンパク質または複合体のいずれかを標的部位、例えば、突然変異を含む部位または編集されるべき他の目的の部位に標的化するために、典型的には、融合タンパク質または複合体をガイドＲＮＡとともに同時に発現することが必要であることは、当業者には明らかである。本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、ガイドＲＮＡは、典型的には、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２）結合を可能にするｔｒａｃｒＲＮＡフレームワーク、およびｎａｐＤＮＡｂｐ：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質または複合体に配列特異性を付与するガイド配列を含む。あるいは、ガイドＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの核酸分子として別々に提供され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは構造を含み、ガイド配列は標的配列と相補的な配列を含む。ガイド配列は、典型的には、２０ヌクレオチド長である。ｎａｐＤＮＡｂｐ：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質または複合体を特定のゲノム標的部位に標的化するための適切なガイドＲＮＡの配列は、本開示に基づいて、当業者には明らかである。このような適切なガイドＲＮＡ配列は、典型的には、編集されるべき標的ヌクレオチドの上流または下流の５０ヌクレオチド以内の核酸配列と相補的なガイド配列を含む。提供される融合タンパク質または複合体のいずれかを特定の標的配列に標的化するのに適した一部の例示的なガイドＲＮＡ配列が、本明細書に提供される。

【0605】

ｓｇＲＮＡの異なる部分は、Ｃａｓ９（例えば、ＳｐｙＣａｓ９）および／またはＤＮＡ標的と相互作用する様々な特徴を形成することが予測される。天然のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖および単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内に、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ活性を指令する６つの保存されたモジュールが同定されている（Ｂｒｉｎｅｒら、Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｕｌｅｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｃａｓ９ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４年１０月２３日；５６（２）：３３３～３３９を参照されたい）。６つのモジュールは、ＤＮＡ標的化に関与するスペーサー、ＣＲＩＳＰＲリピート：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖によって形成される上部ステム、バルジ、下部ステム、ネクサス、およびｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端からのヘアピンを含む。上部ステムおよび下部ステムは、主に、リン酸骨格との配列非依存的な相互作用を介してＣａｓ９と相互作用する。一部の実施形態では、上部ステムは不要である。一部の実施形態では、下部ステムの基部における保存されたウラシルヌクレオチド配列は必要でない。バルジは、Ｃａｓ９のＲｅｃ１ドメインとの特異的な側鎖相互作用に関与する。Ｕ４４の核酸塩基はＴｙｒ３２５およびＨｉｓ３２８の側鎖と相互作用し、Ｇ４３はＴｙｒ３２９と相互作用する。ネクサスは、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９相互作用のコアを形成し、ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９と標的ＤＮＡとの両方との間の交点にある。Ａ５１およびＡ５２の核酸塩基はＰｈｅ１１０５の側鎖と相互作用し；Ｕ５６はＡｒｇ ４５７およびＡｓｎ４５９と相互作用し；Ｕ５９の核酸塩基はＡｒｇ７４、Ａｓｎ７７、Ｐｒｏ４７５、Ｌｅｕ４５５、Ｐｈｅ４４６およびＩｌｅ４４８の側鎖によって定義される疎水性ポケットに挿入し；Ｃ６０はＬｅｕ４５５、Ａｌａ４５６およびＡｓｎ４５９と相互作用し；Ｃ６１はＡｒｇ ７０の側鎖と相互作用し、順にＣ１５と相互作用する。一部の実施形態では、これらの突然変異の１つまたは複数は、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９相互作用を最適化するために、Ｃａｓ９（例えば、ｓｐｙＣａｓ９）に対するｓｇＲＮＡのバルジおよび／またはネクサスにおいて作製される。

【0606】

さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡネクサスとヘアピンは、Ｃａｓ９対合に重要であり、異なるＣａｓ９タンパク質を隔てる直交性障壁を越えるように交換することができ、これは直交性Ｃａｓ９タンパク質のさらなる利用に役立つ。一部の実施形態では、ネクサスおよびヘアピンは、直交Ｃａｓ９タンパク質を標的とするために交換される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、よりコンパクトであり、立体構造的に安定であるガイドＲＮＡを設計するのに、上部ステム、ヘアピン１、および／または下部ステムの配列柔軟性を必要としない。一部の実施形態では、様々なキメラガイドとともに単一のＣａｓ９を使用して、またはキメラｓｇＲＮＡの異なる組合せとともに直交系を同時に使用することにより、多重編集を最適化するようにモジュールを改変される。ガイド機能モジュールおよびその方法に関する詳細は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＢｒｉｎｅｒら、Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｕｌｅｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｃａｓ９ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４年１０月２３日；５６（２）：３３３～３３９に記載される。

【0607】

本明細書に開示する塩基エディターのドメインは、任意の順序で配列することができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２）およびデアミナーゼドメイン（例えば、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼ）を含む融合タンパク質を含む塩基エディターの非限定的な例は、以下のように配置することができる：
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［デアミナーゼ］－リンカー１－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［デアミナーゼ］－リンカー１－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー２－［ＵＧＩ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［デアミナーゼ］－リンカー１－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－リンカー１－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［デアミナーゼ］－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－［デアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［イノシンＢＥＲ阻害剤］－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［イノシンＢＥＲ阻害剤］ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ。

【0608】

一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基編集融合タンパク質または複合体は、例えば、標的塩基が定義される領域（例えば、「脱アミノ化ウインドウ」）内に配置される正確な位置に配置される必要がある。一部の実施形態では、標的は、４塩基領域内であり得る。一部の実施形態では、このような定義される標的領域は、ＰＡＭの約１５塩基上流であり得る。全内容が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ５３３、４２０～４２４（２０１６）；Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ５５１、４６４～４７１（２０１７）；およびＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）を参照されたい。

【0609】

定義された標的領域は、脱アミノ化ウインドウであり得る。脱アミノ化ウインドウは、塩基エディターが標的ヌクレオチドに作用して脱アミノ化する定義された領域であり得る。一部の実施形態では、脱アミノ化ウインドウは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基領域内である。一部の実施形態では、脱アミノ化ウインドウは、ＰＡＭの、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基上流である。

【0610】

本開示の塩基エディターは、標的ポリヌクレオチド配列の編集を促進する任意のドメイン、特徴またはアミノ酸配列を含み得る。例えば、一部の実施形態では、塩基エディターは、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターのＮＬＳは、デアミナーゼドメインとｎａｐＤＮＡｂｐドメインとの間に局在化する。一部の実施形態では、塩基エディターのＮＬＳは、ｎａｐＤＮＡｂｐドメインのＣ末端に局在化する。

【0611】

融合タンパク質または複合体に含まれ得るタンパク質ドメインの非限定的な例としては、デアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメイン、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および／または本明細書に記載される１つもしくは複数の活性を有するタンパク質ドメインが挙げられる。

【0612】

ドメインは、検出され得るか、またはエピトープタグ、レポータータンパク質、他の結合ドメインで標識され得る。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されないが、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。追加のタンパク質配列は、ＤＮＡ分子に結合するか、または他の細胞分子に結合するアミノ酸配列を含むことができ、限定されないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合を含む。

【0613】

シチジンまたはアデノシンデアミナーゼおよびＣａｓ９ドメインを含む融合タンパク質または複合体を使用する方法
本開示の一部の態様は、本明細書において提供される融合タンパク質または複合体を使用する方法を提供する。例えば、本開示の一部の態様は、ＤＮＡ分子を、本明細書において提供される融合タンパク質または複合体のいずれか、および本明細書に記載される少なくとも１つのガイドＲＮＡと接触させるステップを含む方法を提供する。

【0614】

一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質または複合体は、目的の標的遺伝子を編集するために使用される。特に、本明細書に記載されるシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターは、標的配列内に複数の突然変異を作製することができる。これらの突然変異は、標的の機能に影響を与えることがある。例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターは、調節領域を標的化するために使用される場合、調節領域の機能は変更され、下流のタンパク質の発現は低減または消失される。

【0615】

それぞれの配列における特定の位置または残基の番号付けは、使用される特定のタンパク質および番号付けスキームに依存することが理解される。番号付けは、例えば、成熟タンパク質の前駆体と成熟タンパク質自体とにおいて異なる可能性があり、種間の配列の相違が番号付けに影響することがある。当業者は、当該技術分野において周知である方法によって、例えば、配列アラインメントおよび相同な残基の決定によって、任意の相同なタンパク質およびそれぞれのコードする核酸におけるそれぞれの残基を同定することができる。

【0616】

本明細書に開示するように、Ｃａｓ９ドメインおよびシチジンまたはアデノシンデアミナーゼを含む融合タンパク質または複合体のいずれかを標的部位、例えば、編集されるべき突然変異を含む部位に標的化するために、融合タンパク質または複合体をガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡとともに同時発現することが典型的には必要であることは、当業者には明らかである。本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、ガイドＲＮＡは、典型的には、Ｃａｓ９結合を可能にするｔｒａｃｒＲＮＡフレームワーク、およびＣａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質または複合体に配列特異性を付与するガイド配列を含む。あるいは、ガイドＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの核酸分子として別々に提供され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは構造を含み、ガイド配列は標的配列と相補的な配列を含む。ガイド配列は、典型的には、２０ヌクレオチド長である。Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質または複合体を特定のゲノム標的部位に標的化するための適切なガイドＲＮＡの配列は、本開示に基づいて、当業者には明らかである。このような適切なガイドＲＮＡ配列は、典型的には、編集されるべき標的ヌクレオチドの上流または下流の５０ヌクレオチド以内の核酸配列と相補的なガイド配列を含む。提供される融合タンパク質または複合体のいずれかを特定の標的配列に標的化するのに適したいくつかの例示的なガイドＲＮＡ配列が、本明細書に提供される。

【0617】

多重編集
一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディター系は、１つもしくは複数の遺伝子またはポリヌクレオチド配列における複数の核酸塩基対の多重編集が可能である。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、同じ遺伝子または１つもしくは複数の遺伝子に位置し、少なくとも１つの遺伝子が異なる遺伝子座に位置する。一部の実施形態では、多重編集は、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、多重編集は、１つまたは複数の塩基エディター系を含む。一部の実施形態では、多重編集は、単一のガイドポリヌクレオチドまたは複数のガイドポリヌクレオチドを有する１つまたは複数の塩基エディター系を含む。一部の実施形態では、多重編集は、単一の塩基エディター系を有する１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにＰＡＭ配列を必要とするかまたは必要としない少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにＰＡＭ配列を必要としない少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにＰＡＭ配列を必要とする少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドとの混合物を含む。本明細書に記載される塩基エディターのいずれかを使用する多重編集の特徴は、本明細書において提供される任意の塩基エディターを使用する方法の任意の組合せに適用できることが理解されるべきである。また、本明細書に記載される塩基エディターのいずれかを使用する多重編集は、複数の核酸塩基対の一連の編集を含み得ることが理解されるべきである。

【0618】

一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は１つまたは複数の遺伝子中にある。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、同じ遺伝子にある。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子中の少なくとも１つの遺伝子は異なる遺伝子座に位置する。

【0619】

一部の実施形態では、編集は、少なくとも１つのタンパク質コード領域、少なくとも１つのタンパク質非コード領域、または少なくとも１つのタンパク質コード領域と少なくとも１つのタンパク質非コード領域とにおける複数の核酸塩基対の編集である。

【0620】

一部の実施形態では、編集は、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと合わせて行われる。一部の実施形態では、塩基エディター系は、１つまたは複数の塩基エディター系を含む。一部の実施形態では、塩基エディター系は、単一のガイドポリヌクレオチドまたは複数のガイドポリヌクレオチドと合わさった１つまたは複数の塩基エディター系を含む。一部の実施形態では、編集は、単一の塩基エディター系を有する１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドと合わせて行われる。一部の実施形態では、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにＰＡＭ配列を必要としない少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、または標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにＰＡＭ配列を必要とする少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、または標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにＰＡＭ配列を必要としない少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的化するためにＰＡＭ配列を必要とする少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドとの混合物と合わせて行われる。本明細書に記載される塩基エディターのいずれかを使用する多重編集の特徴は、本明細書において提供される塩基エディターのいずれかを使用するための方法の任意の組合せに適用し得ることが理解されるべきである。編集は、複数の核酸塩基対の一連の編集を含み得ることもまた理解されるべきである。

【0621】

一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集が可能な塩基エディター系は、ＡＢＥ７、ＡＢＥ８、および／またはＡＢＥ９塩基エディターのうちの１つを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む多重編集が可能な塩基エディター系は、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む多重編集が可能な塩基エディター系と比較して、より高い多重編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む多重編集が可能な塩基エディター系は、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む多重編集が可能な塩基エディター系と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１５５％、少なくとも１６０％、少なくとも１６５％、少なくとも１７０％、少なくとも１７５％、少なくとも１８０％、少なくとも１８５％、少なくとも１９０％、少なくとも１９５％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％高い、少なくとも３１０％、少なくとも３２０％、少なくとも３３０％、少なくとも３４０％、少なくとも３５０％、少なくとも３６０％、少なくとも３７０％、少なくとも３８０％、少なくとも３９０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％高い多重編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む多重編集が可能な塩基エディター系は、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む多重編集が可能な塩基エディター系と比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２倍、少なくとも３．３倍、少なくとも３．４倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、または少なくとも６．０倍高い多重編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集が可能な塩基エディター系の使用は、染色体転座のリスクまたは発生を含まない。

【0622】

塩基エディター効率
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法の目的は、遺伝子編集を介して遺伝子および／または遺伝子産物を変更することである。本明細書において提供される核酸塩基編集タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子編集に基づくヒトの治療のために使用することができる。当業者は、本明細書において提供される核酸塩基編集タンパク質、例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）および核酸塩基編集ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメイン）を含む融合タンパク質または複合体を使用して、ＡからＧまたはＣからＴにヌクレオチドを編集し得ることを理解する。

【0623】

有利なことに、本明細書において提供される塩基編集系は、二本鎖ＤＮＡ切断を生成することなく、ドナーＤＮＡ鋳型を必要とすることなく、ＣＲＩＳＰＲが行い得るような過剰な確率的挿入および欠失を誘導することなく、ゲノム編集を提供する。一部の実施形態では、本開示は、意図しない点突然変異などの意図しない突然変異を相当数生成することなく、核酸（例えば、対象のゲノム内の核酸）において、終止コドンなどの意図する突然変異を効率的に生成する塩基エディターを提供する。一部の実施形態では、意図される突然変異は、意図される突然変異を生成するように具体的に設計された、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）に結合した特定の塩基エディター（例えば、アデノシン塩基エディターまたはシチジン塩基エディター）によって生成される突然変異である。一部の実施形態では、意図される突然変異は、疾患または障害、例えば、自己免疫疾患に関連する標的抗原に関連する遺伝子におけるものである。一部の実施形態では、意図される突然変異は、疾患または障害、例えば、自己免疫疾患に関連する標的抗原に関連する遺伝子におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への点突然変異（例えば、ＳＮＰ）である。一部の実施形態では、意図される突然変異は、遺伝子のコード領域または非コード領域（例えば、調節領域またはエレメント）内のアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への点突然変異である。一部の実施形態では、意図される突然変異は、疾患または障害、例えば、自己免疫疾患に関連する標的抗原に関連する遺伝子におけるシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への点突然変異（例えば、ＳＮＰ）である。一部の実施形態では、意図される突然変異は、遺伝子のコード領域または非コード領域（例えば、調節領域またはエレメント）内のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への点突然変異である。一部の実施形態では、意図される突然変異は、終止コドンを生成する点突然変異、例えば、遺伝子のコード領域内の未成熟終止コドンを生成する点突然変異である。一部の実施形態では、意図される突然変異は、終止コドンを消失させる突然変異である。

【0624】

本発明の塩基エディターは、有意な比率のインデルを生成することなく、タンパク質をコードする特定のヌクレオチド塩基を有利に改変する。「インデル」とは、本明細書で使用される場合、核酸内のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。このような挿入または欠失は、遺伝子のコード領域内のフレームシフト突然変異を導き得る。一部の実施形態では、核酸中に多数の挿入または欠失（すなわち、インデル）を生成することなく、核酸内の特定のヌクレオチドを効率的に改変する（例えば、突然変異させる）塩基エディターを生成することが望ましい。一部の実施形態では、核酸中に多数の挿入または欠失（すなわち、インデル）を生成することなく、核酸内の特定のヌクレオチドを効率的に改変する（例えば、突然変異させるかまたはメチル化する）塩基エディターを生成することが望ましい。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターのいずれも、インデルに対して、より多くの比率の意図される改変（例えば、メチル化）を生成することができる。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターのいずれも、インデルに対して、より多くの比率の意図される改変（例えば、突然変異）を生成することができる。

【0625】

一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターは、１：１を超える意図された突然変異対インデルの比（すなわち、意図される点突然変異：意図されない点突然変異）を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターは、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１、少なくとも３．５：１、少なくとも４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３００：１、少なくとも４００：１、少なくとも５００：１、少なくとも６００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８００：１、少なくとも９００：１、または少なくとも１０００：１、またはそれ以上である意図される突然変異対インデルの比を生成することができる。意図される突然変異およびインデルの数は、任意の適切な方法を使用して決定され得る。

【0626】

一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターは、核酸の領域におけるインデルの形成を限定し得る。一部の実施形態では、この領域は、塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドにあるか、または塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド内の領域にある。一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターのいずれも、核酸の領域におけるインデルの形成を１％未満、１．５％未満、２％未満、２．５％未満、３％未満、３．５％未満、４％未満、４．５％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、または２０％未満に限定することができる。核酸領域で形成されるインデルの数は、核酸（例えば、細胞のゲノム内の核酸）が塩基エディターに曝露される時間の量に依存し得る。一部の実施形態では、インデルの数または比率は、核酸（例えば、細胞のゲノム内の核酸）を塩基エディターに曝露してから少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、または少なくとも１４日後に決定される。

【0627】

本開示の一部の態様は、本明細書において提供される塩基エディターのいずれも、かなりの数の意図されない突然変異（例えば、偽のオフターゲット編集またはバイスタンダー編集）を生成することなく、核酸（例えば、対象のゲノム内の核酸）において意図される突然変異を効率的に生成することができるという認識に基づく。一部の実施形態では、意図される突然変異は、意図される突然変異を生成するように具体的に設計された、ｇＲＮＡに結合する特定の塩基エディターによって生成される突然変異である。一部の実施形態では、意図される突然変異は、終止コドンを生じる突然変異、例えば、遺伝子のコード領域内の未成熟終止コドンを生じる突然変異である。一部の実施形態では、意図される突然変異は、終止コドンを消失させる突然変異である。一部の実施形態では、意図される突然変異は、遺伝子のスプライシングを変更させる突然変異である。一部の実施形態では、意図される突然変異は、遺伝子（例えば、遺伝子プロモーターまたは遺伝子抑制因子）の調節配列を変更させる突然変異である。一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターのいずれも、１：１を超える、意図された突然変異対意図されない突然変異の比（例えば、意図された突然変異：意図されない突然変異）を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターのいずれも、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１、少なくとも３．５：１、少なくとも４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも５００：１、もしくは少なくとも１０００：１、またはそれ以上である意図された突然変異対意図されない突然変異の比を生成することができる。本明細書に記載される塩基エディターの特徴は、融合タンパク質もしくは複合体のいずれか、または本明細書において提供される融合タンパク質もしくは複合体を使用する方法に適用され得ることが理解されるべきである。

【0628】

塩基編集は、しばしば、遺伝的改変、遺伝子改変および核酸配列の改変などの「改変」と呼ばれ、その改変が塩基編集改変であるという文脈に基づいて明確に理解することができる。したがって、塩基編集改変は、例えば、本開示を通して検討されるデアミナーゼ活性の結果としての、ヌクレオチド塩基レベルでの改変であり、これは次に、遺伝子配列の変化をもたらし、遺伝子産物に影響を及ぼし得る。したがって、本質的に、本明細書に記載される遺伝子編集改変は、構造的および／または機能的に、遺伝子の改変をもたらし得、遺伝子産物の発現が改変され得る、例えば、遺伝子の発現がノックアウトされる；あるいは逆に、増強され得る、または、いくつかの状況において、遺伝子機能または活性が改変され得る。本明細書に開示される方法を使用して、一部の実施形態では、塩基編集効率は、塩基編集が行われる遺伝子のノックダウン効率として決定され得、塩基編集は、遺伝子の発現をノックダウンすることを意図する。ノックダウンレベルは、任意の検出アッセイ、例えば、フローサイトメトリーによるタンパク質発現レベルのアッセイ；定量的ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、またはピロシークエンシングなどの任意の他の適切なアッセイなどのＲＮＡ発現を検出するためのアッセイなどによって発現レベルを決定することによって定量的に確認することができ、また、ヌクレオチド配列決定反応によって定性的に確認することができる。一部の実施形態では、塩基編集効率は、塩基編集が本明細書に記載される標的配列における変更を検出するために行われた細胞のゲノムを配列決定することによって決定することができる。

【0629】

一部の実施形態では、改変、例えば、一塩基編集は、遺伝子標的化発現の少なくとも１０％の低減をもたらす。一部の実施形態では、塩基編集効率は、遺伝子標的化発現の少なくとも１０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、遺伝子標的化発現の少なくとも２０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、遺伝子標的化発現の少なくとも３０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、遺伝子標的化発現の少なくとも４０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、遺伝子標的化発現の少なくとも５０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも６０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも７０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも８０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも９０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも９１％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも９２％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも９３％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも９４％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも９５％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも９６％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも９７％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも９８％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子の発現の少なくとも９９％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化される遺伝子のノックアウト（遺伝子発現の１００％ノックダウン）をもたらし得る。

【0630】

一部の実施形態では、塩基編集は、標的遺伝子の発現をわずか５％だけ低減させ得る標的遺伝子における変更を生じさせる。一部の実施形態では、塩基編集は、標的遺伝子の発現をわずか１０％だけ低減させ得る標的遺伝子における変更を生じさせる。一部の実施形態では、塩基編集は、標的遺伝子の発現をわずか２０％だけ低減させ得る標的遺伝子における変更を生じさせる。一部の実施形態では、塩基編集は、標的遺伝子の発現をわずか３０％だけ低減させ得る変更を生じさせる。一部の実施形態では、塩基編集は、標的遺伝子の発現をわずか４０％だけ低減させ得る変更を生じさせる。一部の実施形態では、塩基編集は、標的遺伝子の発現をわずか５０％だけ低減させ得る変更を生じさせる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、少なくとも２つの活性を有する遺伝子産物、例えば、タンパク質をコードする。一部の実施形態では、標的遺伝子の変更は、コードされた遺伝子産物が１つまたは複数の他の活性を効果的に行うことができるように十分な発現を維持しながら、コードされた遺伝子産物の少なくとも１つの望ましくない活性を低減させる。

【0631】

一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディター系のいずれも、標的ポリヌクレオチド配列において５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、または０．０１％未満のインデル形成をもたらす。

【0632】

一部の実施形態では、標的化改変、例えば、一塩基編集は、異なるガイドＲＮＡによる塩基編集のために、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の異なる内因性配列を標的化するために同時に使用される。一部の実施形態では、標的化改変、例えば、一塩基編集は、異なるガイドＲＮＡによる塩基編集のために、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上の異なる内因性遺伝子配列を連続的に標的化するために使用される。

【0633】

本開示の一部の態様は、本明細書において提供される塩基エディターのいずれも、意図されない点突然変異（すなわち、バイスタンダーの突然変異）などの有意な数の意図されない突然変異を生成することなく、核酸（例えば、対象のゲノム内の核酸）において、点突然変異などの意図される突然変異を効率的に生成することができるという認識に基づく。一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターのいずれも、少なくとも０．０１％の意図される突然変異（すなわち、少なくとも０．０１％の塩基編集効率）を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターのいずれも、少なくとも０．０１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の意図される突然変異を生成することができる。

【0634】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディター系のいずれも、標的ポリヌクレオチド配列において、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、または０．０１％未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディター系のいずれも、標的ポリヌクレオチド配列において０．８％未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディター系のいずれも、標的ポリヌクレオチド配列において多くとも０．８％のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディター系のいずれも、標的ポリヌクレオチド配列において０．３％未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディター系のいずれも、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む塩基エディター系と比較して、標的ポリヌクレオチド配列においてより低いインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディター系のいずれも、ＡＢＥ７．１０を含む塩基エディター系と比較して、標的ポリヌクレオチド配列においてより低いインデル形成をもたらす。

【0635】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディター系のいずれも、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む塩基エディター系と比較して、低減したインデル頻度を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８核酸エディターバリアントのうちの１つを含む核酸エディター系のいずれも、ＡＢＥ７塩基エディターの１つを含む塩基エディター系と比較して、インデル頻度において少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の低減を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディター系は、ＡＢＥ７．１０を含む塩基エディター系と比較して、インデル頻度において少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の低減を有する。

【0636】

本発明は、増加した効率および特異性を有するアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＡＢＥ８バリアント）を提供する。特に、本明細書に記載されるアデノシンデアミナーゼバリアントは、ポリヌクレオチド内の所望の塩基を編集する可能性が高く、変更されることを意図しない塩基（例えば、「バイスタンダー」）を編集する可能性は低い。

【0637】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基編集系のいずれも、低減したバイスタンダー編集または突然変異を有する。一部の実施形態では、意図しない編集または突然変異は、バイスタンダー突然変異またはバイスタンダー編集、例えば、標的ヌクレオチド配列の標的ウインドウにおける意図しないかまたは非標的な位置における標的塩基（例えば、ＡまたはＣ）の塩基編集である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基編集系のいずれも、ＡＢＥ７塩基エディターを含む塩基エディター系、例えば、ＡＢＥ７．１０と比較して、低減したバイスタンダー編集または突然変異を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基編集系のいずれも、ＡＢＥ７塩基エディターを含む塩基エディター系、例えばＡＢＥ７．１０と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減したバイスタンダー編集または突然変異を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基編集系のいずれも、ＡＢＥ７塩基エディターを含む塩基エディター系、例えば、ＡＢＥ７．１０と比較して、１．１分の１以下、１．２分の１以下、１．３分の１以下、１．４分の１以下、１．５分の１以下、１．６分の１以下、１．７分の１以下、１．８分の１以下、１．９分の１以下、２．０分の１以下、２．１分の１以下、２．２分の１以下、２．３分の１以下、２．４分の１以下、２．５分の１以下、２．６分の１以下、２．７分の１以下、２．８分の１以下、２．９分の１以下、または３．０分の１以下に低減したバイスタンダー編集または突然変異を有する。

【0638】

一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディター系のいずれも、１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、オフターゲットヌクレオチド）の７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、または０．０１％未満のバイスタンダー編集をもたらす。

【0639】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディター系のいずれも、低減した偽の編集を有する。一部の実施形態では、意図しない編集または突然変異は、偽の突然変異または偽の編集、例えば、ゲノムの意図しない領域または非標的領域における標的塩基（例えば、ＡまたはＣ）の非特異的編集またはガイド独立編集である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディター系のいずれも、ＡＢＥ７塩基エディター、例えば、ＡＢＥ７．１０を含む塩基エディター系と比較して、低減した偽の編集を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基編集系のいずれも、ＡＢＥ７塩基エディター、例えば、ＡＢＥ７．１０を含む塩基エディター系と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減した偽の編集を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基編集系のいずれも、ＡＢＥ７塩基エディターを含む塩基エディター系、例えば、ＡＢＥ７．１０と比較して、１．１分の１以下、１．２分の１以下、１．３分の１以下、１．４分の１以下、１．５分の１以下、１．６分の１以下、１．７分の１以下、１．８分の１以下、１．９分の１以下、２．０分の１以下、２．１分の１以下、２．２分の１以下、２．３分の１以下、２．４分の１以下、２．５分の１以下、２．６分の１以下、２．７分の１以下、２．８分の１以下、２．９分の１以下、または３．０分の１以下に低減した偽の編集を有する。

【0640】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の塩基編集効率を有する。一部の実施形態では、塩基編集効率は、細胞集団において編集された核酸塩基のパーセンテージを計算することによって測定することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、細胞集団において編集された核酸塩基によって測定した場合、少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の塩基編集効率を有する。

【0641】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、ＡＢＥ７塩基エディターと比較して、より高い塩基編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８核酸エディターバリアントのいずれも、ＡＢＥ７塩基エディター、例えば、ＡＢＥ７．１０と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１５５％、少なくとも１６０％、少なくとも１６５％、少なくとも１７０％、少なくとも１７５％、少なくとも１８０％、少なくとも１８５％、少なくとも１９０％、少なくとも１９５％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％、少なくとも３１０％、少なくとも３２０％、少なくとも３３０％、少なくとも３４０％、少なくとも３５０％、少なくとも３６０％、少なくとも３７０％、少なくとも３８０％、少なくとも３９０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％高い塩基編集効率を有する。

【0642】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、ＡＢＥ７塩基エディター、例えば、ＡＢＥ７．１０と比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２、少なくとも３．３倍、少なくとも３．４倍、少なくとも３．５倍、少なくとも３．６倍、少なくとも３．７倍、少なくとも３．８倍、少なくとも３．９倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．１倍、少なくとも４．２倍、少なくとも４．３倍、少なくとも４．４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも４．６倍、少なくとも４．７倍、少なくとも４．８倍、少なくとも４．９倍、または少なくとも５．０倍高い塩基編集効率を有する。

【0643】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のオンターゲット塩基編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、細胞集団において編集された標的核酸塩基によって測定した場合、少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のオンターゲット塩基編集効率を有する。

【0644】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、ＡＢＥ７塩基エディターと比較して、より高いオンターゲット塩基編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、ＡＢＥ７塩基エディター、例えば、ＡＢＥ７．１０と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１５５％、少なくとも１６０％、少なくとも１６５％、少なくとも１７０％、少なくとも１７５％、少なくとも１８０％、少なくとも１８５％、少なくとも１９０％、少なくとも１９５％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％、少なくとも３１０％、少なくとも３２０％、少なくとも３３０％、少なくとも３４０％、少なくとも３５０％、少なくとも３６０％、少なくとも３７０％、少なくとも３８０％、少なくとも３９０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％高いオンターゲット塩基編集効率を有する。

【0645】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、ＡＢＥ７塩基エディター、例えば、ＡＢＥ７．１０と比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２倍、少なくとも３．３倍、少なくとも３．４倍、少なくとも３．５倍、少なくとも３．６倍、少なくとも３．７倍、少なくとも３．８倍、少なくとも３．９倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．１倍、少なくとも４．２倍、少なくとも４．３倍、少なくとも４．４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも４．６倍、少なくとも４．７倍、少なくとも４．８倍、少なくとも４．９倍、または少なくとも５．０倍高いオンターゲット塩基編集効率を有する。

【0646】

本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントは、プラスミド、ベクター、ＬＮＰ複合体、またはｍＲＮＡを介して宿主細胞に送達することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、ｍＲＮＡとして宿主細胞に送達される。一部の実施形態では、核酸ベースの送達システム、例えば、ｍＲＮＡを介して送達されるＡＢＥ８塩基エディターは、編集された核酸塩基によって測定した場合、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のオンターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ系によって送達されるＡＢＥ８塩基エディターは、プラスミドまたはベクター系によって送達されるＡＢＥ８塩基エディターと比較して、より高い塩基編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、プラスミドまたはベクター系によって送達される場合と比較して、ｍＲＮＡ系によって送達される場合、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１５５％、少なくとも１６０％、少なくとも１６５％、少なくとも１７０％、少なくとも１７５％、少なくとも１８０％、少なくとも１８５％、少なくとも１９０％、少なくとも１９５％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％、少なくとも３１０％、少なくとも３２０％、少なくとも３３０％、少なくとも３４０％、少なくとも３５０％、少なくとも３６０％、少なくとも３７０％、少なくとも３８０％、少なくとも３９０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％高いオンターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、プラスミドまたはベクター系によって送達される場合と比較して、ｍＲＮＡ系によって送達される場合、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２倍、少なくとも３．３倍、少なくとも３．４倍、少なくとも３．５倍、少なくとも３．６倍、少なくとも３．７倍、少なくとも３．８倍、少なくとも３．９倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．１倍、少なくとも４．２倍、少なくとも４．３倍、少なくとも４．４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも４．６倍、少なくとも４．７倍、少なくとも４．８倍、少なくとも４．９倍、または少なくとも５．０倍高いオンターゲット編集効率を有する。

【0647】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む核酸エディター系のいずれも、標的ポリヌクレオチド配列において、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％、０．０２％未満、または０．０１％未満のオフターゲット編集をもたらす。

【0648】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、プラスミドまたはベクター系によって送達される場合と比較して、ｍＲＮＡ系によって送達される場合、ガイドされるオフターゲット編集効率が低い。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、プラスミドまたはベクター系によって送達される場合と比較して、ｍＲＮＡ系によって送達される場合、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％。または、少なくとも９９％低いガイドされるオフターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、プラスミドまたはベクター系によって送達される場合と比較して、ｍＲＮＡ系によって送達される場合、１．１分の１以下、１．２分の１以下、１．３分の１以下、１．４分の１以下、１．５分の１以下、１．６分の１以下、１．７分の１以下、１．８分の１以下、１．９分の１以下、２．０分の１以下、２．１分の１以下、２．２分の１以下、２．３分の１以下、２．４分の１以下、２．５分の１以下、２．６分の１以下、２．７分の１以下、２．８分の１以下、２．９分の１以下、または３．０分の１以下のガイドされるオフターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディター突然変異体のいずれも、プラスミドまたはベクター系によって送達される場合と比較して、ｍＲＮＡ系によって送達される場合、約２．２分の１以下に低減したガイドされるオフターゲット編集効率を有する。

【0649】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、プラスミドまたはベクター系によって送達される場合と比較して、ｍＲＮＡ系によって送達される場合、より低いガイド非依存的オフターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、プラスミドまたはベクター系によって送達される場合と比較して、ｍＲＮＡ系によって送達される場合、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低いガイド非依存性オフターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれも、プラスミドまたはベクター系によって送達される場合と比較して、ｍＲＮＡ系によって送達される場合、１．１分の１、１．２分の１以下、１．３分の１以下、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３．０倍、少なくとも５．０倍、少なくとも１０．０倍、少なくとも２０．０倍、少なくとも５０．０倍、少なくとも７０．０倍、少なくとも１００．０倍、少なくとも１２０．０倍、１３０．０分の１以下、または１５０．０分の１以下のガイド非依存性オフターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントは、プラスミドまたはベクター系によって送達される場合と比較して、ｍＲＮＡ系によって送達される場合、１３４．０分の１に低減したガイド非依存性オフターゲット編集効率（例えば、偽のＲＮＡ脱アミノ化）を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントは、ゲノム全体にわたるガイド非依存性突然変異率を増加させない。

【0650】

一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象（例えば、形質導入、トランスフェクション、電気穿孔、または任意の他の方法による）を使用して、細胞のゲノム内の５個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の６個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の７個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の電気穿孔事象を使用して、細胞のゲノム内の８個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の９個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の１０個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の２０個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の３０個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の４０個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の５０個の配列の塩基編集を標的化することができる。

【0651】

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法、例えば、塩基編集方法は、オフターゲット効果が最小限乃至全くない。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法、例えば、塩基編集方法は、染色体転座が最小限であるかまたは全くない。

【0652】

一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集方法は、少なくとも５０％の成功裏に編集された細胞集団（すなわち、成功裏に操作された細胞）をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集方法は、少なくとも５５％の成功裏に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集方法は、少なくとも６０％の成功裏に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集方法は、少なくとも６５％の成功裏に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集方法は、少なくとも７０％の成功裏に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集方法は、少なくとも７５％の成功裏に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集方法は、少なくとも８０％の成功裏に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集方法は、少なくとも８５％の成功裏に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集方法は、少なくとも９０％の成功裏に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集方法は、少なくとも９５％の成功裏に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される塩基編集方法は、首尾よく編集された細胞集団の約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％をもたらす。

【0653】

一部の実施形態では、塩基編集介入後の細胞集団中の生存細胞のパーセントは、塩基編集事象の時点で出発細胞集団の少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％より大きい。一部の実施形態では、編集後の細胞集団中の生存細胞のパーセントは、約７０％である。一部の実施形態では、編集後の細胞集団中の生存細胞のパーセントは、約７５％である。一部の実施形態では、編集後の細胞集団中の生存細胞のパーセントは、約８０％である。一部の実施形態では、上記のような細胞集団中の生存細胞のパーセントは、約８５％である。一部の実施形態では、上記のような細胞集団中の生存細胞のパーセントは、塩基編集事象の時点で集団中の細胞の約９０％、または約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。一部の実施形態では、操作された細胞集団は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、または約１００倍、ｉｎ ｖｉｔｒｏでさらに拡大することができる。

【0654】

実施形態では、細胞集団は、本開示の塩基エディター、複合体、または塩基エディター系と接触した細胞の集団である。

【0655】

意図される突然変異およびインデルの数は、例えば、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）；Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ５３３、４２０～４２４頁（２０１６）；Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ５５１、４６４～４７１（２０１７）；およびＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）に記載されるような、任意の適切な方法を使用して決定され得る；それらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0656】

一部の実施形態では、インデル頻度を計算するために、配列決定リードは、インデルが起こり得るウインドウの両側に隣接する２つの１０ｂｐ配列と正確に一致するものについてスキャンされる。正確な一致が見つからない場合、リードは分析から除外される。このインデルウインドウの長さが参照配列と正確に一致する場合、リードはインデルを含まないものとして分類される。インデルウインドウが参照配列より２塩基以上長いかまたは短い場合、配列決定リードは、それぞれ挿入または欠失として分類される。一部の実施形態では、本明細書において提供される塩基エディターは、核酸の領域におけるインデルの形成を限定し得る。一部の実施形態では、この領域は、塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドにあるか、または塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド内の領域にある。

【0657】

標的ヌクレオチド領域で形成されるインデルの数は、核酸（例えば、細胞のゲノム内の核酸）が塩基エディターに曝露される時間量に依存し得る。一部の実施形態では、インデルの数または比率は、標的ヌクレオチド配列（例えば、細胞のゲノム内の核酸）を塩基エディターに曝露してから少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、または少なくとも１４日後に決定される。本明細書に記載される塩基エディターの特徴は、融合タンパク質もしくは複合体のいずれか、または本明細書に提供される融合タンパク質もしくは複合体を使用する方法に適用され得ることが理解されるべきである。

【0658】

塩基エディターの効率性の詳細は、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載され、各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、全内容が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ５３３、４２０～４２４（２０１６）；Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ５５１、４６４～４７１（２０１７）；およびＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）を参照されたい。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法を使用する１つまたは複数の遺伝子における複数の核酸塩基対の編集は、少なくとも１つの意図される突然変異の形成をもたらす。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの意図される突然変異の前記形成は、遺伝子の正常な機能の破壊をもたらす。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの意図される突然変異の前記形成は、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の低減または消失をもたらす。多重編集は、本明細書において提供される任意の方法または方法の組合せを使用して達成し得ることが理解されるべきである。

【0659】

送達系
ポリヌクレオチド配列（例えば、ＦｃＲｎポリヌクレオチド配列）中の１つまたは複数のヌクレオチドを標的化する核酸塩基エディターの適合性は、本明細書に記載されるように評価することができる。一実施形態では、目的の単一の細胞型は、レポーター（例えば、ＧＦＰ）をコードする少量のベクターとともに、本明細書に記載される塩基編集系をコードする１つまたは複数の核酸分子を用いてトランスフェクトし、形質導入し、またはそうでなければ改変される。これらの細胞は、任意の肝細胞系（例えば、初代ヒト肝細胞）、内皮細胞系、上皮細胞系、または骨髄系細胞系を含む、当該技術分野において公知である任意の細胞系であり得る。あるいは、初代細胞（例えば、ヒト）を使用することができる。細胞はまた、対象または個体から、例えば、組織生検、手術、血液、血漿、血清、または他の生体液から得ることができる。このような細胞は、最終的な細胞標的に関連し得る。

【0660】

送達は、ウイルスベクターを使用して行うことができる。一実施形態では、トランスフェクションは、脂質トランスフェクション（例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅまたはＦｕｇｅｎｅ）を使用して、または電気穿孔によって行われ得る。トランスフェクション後、レポーター（例えば、ＧＦＰ）の発現を蛍光顕微鏡によってまたはフローサイトメトリーのいずれかによって決定して、一貫して高レベルのトランスフェクションを確認することができる。これらの予備的トランスフェクションは、エディターのどの組合せが最大の活性を与えるかを決定するために、異なる核酸塩基エディターを含み得る。この系は、１つまたは複数の異なるベクターを含み得る。一実施形態では、塩基エディターは、所望の細胞型、優先的には真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞の発現のために最適化されたコドンである。核酸塩基エディターの活性は、本明細書に記載されるように、すなわち、標的配列における変更を検出するために細胞のゲノムを配列決定することによって評価することができる。サンガー配列決定では、精製したＰＣＲアンプリコンをプラスミド骨格にクローニングし、形質転換し、ミニプレップし、単一のプライマーを用いて配列決定される。配列決定はまた、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術を使用して行うことができる。次世代シークエンシングを使用する場合、アンプリコンは意図する切断部位が非対称に配置された３００～５００ｂｐであり得る。ＰＣＲ後、次世代シークエンシングアダプターおよびバーコード（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ多重アダプターおよびインデックス）を、例えば、ハイスループットシークエンシング（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上）における使用のために、アンプリコンの末端に付加することができる。最初の試験において最大レベルの標的特異的な変更を誘導する融合タンパク質または複合体を、さらなる評価のために選択することができる。

【0661】

特定の実施形態では、核酸塩基エディターは、目的のポリヌクレオチドを標的化するために使用される。一実施形態では、本発明の核酸塩基エディターは、細胞のゲノム内の１つまたは複数の目的の核酸配列を標的化するために使用される１つまたは複数のガイドＲＮＡと合わせて細胞（例えば、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、骨髄性細胞、またはそれらの前駆細胞）に送達され、それによって標的遺伝子（例えば、ＦｃＲｎポリペプチドをコードする遺伝子）を変更する。一部の実施形態では、塩基エディターは、１つまたは複数のガイドＲＮＡによって標的化され、１つまたは複数の目的の遺伝子（例えば、ＦｃＲｎポリペプチドをコードする遺伝子）の配列に１つまたは複数の編集を導入する。

【0662】

一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、ヒト細胞、または哺乳動物細胞から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏである。一部の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｖｏである。

【0663】

塩基エディター系の核酸ベースの送達
本開示による塩基エディター系をコードする核酸分子は、当該技術分野において公知である方法によって、または本明細書に記載されるように、対象に投与され得るかまたはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に送達され得る。例えば、デアミナーゼ（例えば、シチジンまたはアデニンデアミナーゼ）を含む塩基エディター系は、ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）によって、または裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、脂質ナノ粒子、もしくは前述の組成の組合せによって送達され得る。

【0664】

有機または無機であり得るナノ粒子は、塩基エディター系またはその成分を送達するのに有用である。ナノ粒子は当技術分野において周知であり、任意の適切なナノ粒子を使用して、塩基エディター系もしくはその成分、またはこのような成分をコードしている核酸分子を送達することができる。一例では、有機（例えば、脂質および／またはポリマー）ナノ粒子は、本開示のある特定の実施形態における送達ビヒクルとしての使用に適している。ナノ粒子製剤および／または遺伝子導入に使用するための例示的な脂質を表１７（下記）に示す。

【0665】

【表17-1】

【0666】

【表17-2】

【0667】

表１８は、遺伝子導入および／またはナノ粒子製剤において使用するための例示的ポリマーを列挙する。

【0668】

【表18】

【0669】

表１９は、本明細書に記載される融合タンパク質または複合体をコードするポリヌクレオチドの送達方法を概説する。

【0670】

【表19】

【0671】

別の態様では、塩基エディター系成分またはこのような成分、例えば、Ｃａｓ９またはそのバリアントなどのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）、および目的の核酸配列を標的化するｇＲＮＡをコードする核酸の送達は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を細胞に送達することによって達成され得る。ＲＮＰは、標的化ｇＲＮＡと複合した、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含む。本明細書に記載されるＲＮＰまたはポリヌクレオチドは、例えば、その全体が参照により組み込まれるＺｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ら、２０１５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３３（１）：７３～８０によって報告されているように、電気穿孔、ヌクレオフェクション、またはカチオン性脂質媒介法などの既知の方法を使用して、細胞に送達することができる。ＲＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ塩基編集系、特に初代細胞などのトランスフェクトが困難な細胞における使用に有利である。さらに、ＲＮＰはまた、特に、ＣＲＩＳＰＲプラスミドにおいて使用され得る、例えば、ＣＭＶまたはＥＦ１Ａなどの真核生物プロモーターが十分に発現されない場合に、細胞中でのタンパク質発現に伴って生じ得る困難を緩和し得る。有利なことに、ＲＮＰの使用は、細胞への外来ＤＮＡの送達を必要としない。さらに、核酸結合タンパク質およびｇＲＮＡ複合体を含むＲＮＰは経時的に分解されるため、ＲＮＰの使用は、オフターゲット効果を限定する可能性を有する。プラスミドに基づく技術と同様の方法で、ＲＮＰを用いて結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９バリアント）を送達し、直接的な相同指向性修復（ＨＤＲ）を指令することができる。

【0672】

塩基エディター系をコードする核酸分子は、例えば、トランスフェクションもしくは電気穿孔によって、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡとして細胞（例えば、肝細胞もしくは肝臓の他の細胞、内皮細胞、上皮細胞、および骨髄細胞、またはそれらの前駆細胞）に直接送達され得るか、または標的細胞による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン）にコンジュゲートされ得る。塩基エディター系および／またはそれらの成分をコードするベクターもまた使用することができる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、塩基エディター系またはその機能的成分をコードするｍＲＮＡは、本明細書に記載される１つまたは複数のガイドＲＮＡとともに電気穿孔することができる。

【0673】

核酸ベクターは、本明細書に記載される融合タンパク質または複合体のドメインをコードする１つまたは複数の配列を含み得る。ベクターはまた、核局在化シグナル、核小体局在化シグナル、またはミトコンドリア局在化シグナルに作動可能に連結された塩基エディター系のタンパク質成分をコードし得る。一例として、ベクターは、１つまたは複数の核局在化配列（例えば、ＳＶ４０由来の核局在化配列）および１つまたは複数のデアミナーゼを含むＣａｓ９コード配列を含み得る。

【0674】

ベクターはまた、任意の適切な数の調節／制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。これらのエレメントは、当該技術分野において周知である。

【0675】

本開示によるベクターには、組換えウイルスベクターが含まれる。例示的なウイルスベクターは、本明細書の上記に記載されている。当該技術分野において公知である他のウイルスベクターもまた使用することができる。さらに、ウイルス粒子は、核酸および／またはタンパク質の形態で塩基エディター系成分を送達するために使用され得る。例えば、「空の」ウイルス粒子は、カーゴとして塩基エディター系または成分を含むように構築することができる。ウイルスベクターおよびウイルス粒子はまた、標的組織特異性を変更されるために標的化リガンドを組み込むように操作され得る。

【0676】

本明細書に記載されるベクターは、塩基エディター系またはその成分の発現を駆動するための調節エレメントを含み得る。このようなベクターには、逆方向長鎖末端反復配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ ＩＴＲ）が含まれる。ＡＡＶ－ＩＴＲの使用は、ベクター中の空間を占有し得るさらなるプロモーターエレメントの必要性を消失するために有利であり得る。解放された追加の空間は、ガイド核酸または選択可能マーカーなどの追加のエレメントの発現を駆動するために使用することができる。ＩＴＲ活性は、過剰発現による潜在的毒性を低減させるために使用することができる。

【0677】

任意の適切なプロモーターを使用して、塩基エディター系またはその成分、および適切な場合にはガイド核酸の発現を駆動することができる。普遍的発現のために、プロモーターは、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＣＢＨ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖または軽鎖を含む。脳または他のＣＮＳ細胞発現のために、適切なプロモーターは、すべてのニューロンについてシナプシンＩ、興奮性ニューロンについてＣａＭＫＩＩａｌｐｈａ、ＧＡＢＡ作動性ニューロンについてＧＡＤ６７またはＧＡＤ６５またはＶＧＡＴを含む。肝細胞発現について、適切なプロモーターは、アルブミンプロモーターを含む。肺細胞発現について、適切なプロモーターはＳＰ－Ｂを含む。内皮細胞について、適切なプロモーターはＩＣＡＭを含む。造血細胞発現について、適切なプロモーターは、ＩＦＮベータまたはＣＤ４５を含む。骨芽細胞発現について、適切なプロモーターは、ＯＧ－２を含み得る。

【0678】

一部の実施形態では、本開示の塩基エディター系は、別々のプロモーターが、同じ核酸分子内で塩基エディターおよび適合性ガイド核酸の発現を駆動することを可能にするのに十分に小さいサイズのものである。例えば、ベクターまたはウイルスベクターは、塩基エディターをコードする核酸に作動可能に連結された第１のプロモーター、およびガイド核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを含み得る。

【0679】

ガイド核酸の発現を駆動するために用いられるプロモーターは、Ｕ６またはＨ１などのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターの使用、およびｇＲＮＡアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を発現するためのイントロンカセットを含むことができる。

【0680】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質または複合体は、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ１０、およびそれらのバリアント）、または任意のウイルスベクターの適切なカプシドタンパク質に存在するポリヌクレオチドによってコードされる。したがって、一部の態様では、本開示は、融合タンパク質または複合体のウイルス送達に関する。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター（例えば、マロニーマウス白血病ウイルス、ＭＭＬ－Ｖ）、アデノウイルスベクター（例えば、ＡＤ１００）、レンチウイルスベクター（ＨＩＶおよびＦＩＶベースのベクター）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、Ｈｓｖ－２）が挙げられる。

【0681】

一部の態様では、細胞中の特定の遺伝子を編集するための本明細書に記載される方法は、細胞を遺伝的に改変するために使用され得る。

【0682】

ウイルスベクター
本明細書に記載される塩基エディターは、ウイルスベクターとともに送達され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される塩基エディターは、ウイルスベクターに含まれる核酸上にコードすることができる。一部の実施形態では、塩基エディター系の１つまたは複数の成分は、１つまたは複数のウイルスベクター上にコードされ得る。例えば、塩基エディターおよびガイド核酸は、単一のウイルスベクター上にコードされ得る。他の実施形態では、塩基エディターおよびガイド核酸は、異なるウイルスベクター上にコードされる。いずれの場合も、塩基エディターおよびガイド核酸は、各々、プロモーターおよびターミネーターに作動可能に連結することができる。ウイルスベクター上にコードされる成分の組合せは、選択されたウイルスベクターのカーゴサイズの制限によって決定することができる。

【0683】

塩基エディターを送達させるためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、培養中または宿主中の特定の細胞にウイルスを標的化し、ウイルスペイロードを核または宿主細胞ゲノムに輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、培養中の細胞、患者（ｉｎ ｖｉｖｏ）に直接投与することができ、またはそれらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を処理するために使用することができ、改変された細胞は、必要に応じて患者に（ｅｘ ｖｉｖｏ）投与することができる。従来のウイルスベースのシステムには、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純ヘルペスウイルスベクターが含まれ得る。宿主ゲノムにおける組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法で可能であり、しばしば挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において高い形質導入効率が観察されている。

【0684】

ウイルスベクターは、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＦＩＶベースのベクター）、アデノウイルス（例えば、ＡＤ１００）、レトロウイルス（例えば、マロニーマウス白血病ウイルス、ＭＭＬ－Ｖ）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、ＨＳＶ－２）、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または他のプラスミドもしくはウイルスベクター型、特に、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号（アデノウイルスについての処方、用量）、米国特許第８，４０４，６５８号（ＡＡＶについての処方、用量）および米国特許第５，８４６，９４６号（ＤＮＡプラスミドについての処方、用量）からの処方および用量、ならびにレンチウイルス、ＡＡＶおよびアデノウイルスを伴う臨床試験に関する臨床試験および刊行物からの処方および用量を使用することを含み得る。例えば、ＡＡＶについて、投与経路、処方および用量は、米国特許第８，４５４，９７２号およびＡＡＶを伴う臨床試験におけるようなものであり得る。アデノウイルスについて、投与経路、処方および用量は、米国特許第８，４０４，６５８号およびアデノウイルスを含む臨床試験におけるようなものであり得る。プラスミド送達について、投与経路、処方および用量は、米国特許第５，８４６，９４６号およびプラスミドを含む臨床研究におけるものと同じであり得る。用量は、平均的な７０ｋｇの個体（例えば、成人男性）に基づくかまたは外挿することができ、患者、対象、異なる体重および種の哺乳動物に対して調整することができる。投与の頻度は、患者または対象の年齢、性別、全身の健康状態、他の状態、および取り組まれている特定の状態または症状を含む通常の因子に応じて、医学または獣医学の医師（例えば、医師、獣医師）の範囲内である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射することができる。細胞型特異的な塩基編集について、塩基エディターおよび必要に応じたガイド核酸の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。

【0685】

レトロウイルスの親和性は、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって変更させることができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができ、典型的には高いウイルス力価を産生するレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列に対するパッケージング能力を有するシス作用性長鎖末端反復で構成される。最小のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次に、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで永続的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１～２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５～１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８～５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４～２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０～２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。

【0686】

レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターは、標的細胞への効率的な組込みのために所与の長さよりも小さいポリヌクレオチド配列を必要とし得る。例えば、９ｋｂを超える長さのレトロウイルスベクターは、より小さいサイズのものと比較して低いウイルス力価をもたらし得る。一部の態様では、本開示の塩基エディターは、レトロウイルスベクターを介した標的細胞への効率的なパッケージングおよび送達を可能にするのに十分なサイズのものである。一部の実施形態では、塩基エディターは、ガイド核酸および／または標的化可能なヌクレアーゼ系の他の成分と一緒に発現される場合でさえ、効率的なパッキングおよび送達を可能にするようなサイズのものである。

【0687】

パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするｐｓｉ．２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする細胞系を作製することによって作製される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要な最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるべきポリヌクレオチドのための発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、典型的にはパッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組込みに必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列を有するのみである。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子をコードするヘルパープラスミド、すなわちｒｅｐおよびｃａｐを含むが、ＩＴＲ配列を欠く細胞系にパッケージングすることができる。細胞系はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染させることもできる。ヘルパーウイルスはＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進することができる。いくつかの場合において、ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列の欠如のために、かなりの量がパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減することができる。

【0688】

一過性発現が好ましい適用において、アデノウイルスに基づく系が使用され得る。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高い力価およびレベルの発現が得られている。このベクターは比較的簡単な系で大量に産生させることができる。ＡＡＶベクターはまた、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療手順のために、標的核酸で細胞を形質導入するために使用され得る（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８～４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３～８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、いくつかの刊行物に記載され、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１～３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２～２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ および Ｍｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ ８１：６４６６～６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２～３８２８頁（１９８９）が含まれる。

【0689】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを使用して、目的の細胞を、本明細書において提供される塩基エディターまたは塩基エディター系をコードするポリヌクレオチドで形質導入する。ＡＡＶはパルボウイルスファミリーに属する小型の一本鎖ＤＮＡ依存性ウイルスである。４．７ｋｂの野生型（ｗｔ）ＡＡＶゲノムは、それぞれ４つの複製タンパク質と３つのカプシドタンパク質をコードする２つの遺伝子で構成され、１４５ｂｐの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が両側に隣接する。ビリオンは、同一のオープンリーディングフレームから１：１：１０の比率で産生されるが、異なるスプライシング（Ｖｐ１）および選択的翻訳開始部位（それぞれＶｐ２およびＶｐ３）から産生される３種類のカプシドタンパク質、Ｖｐ１、Ｖｐ２、およびＶｐ３で構成される。Ｖｐ３はビリオンの中で最も豊富なサブユニットであり、ウイルスの親和性を規定する細胞表面での受容体認識に関与する。ウイルス感染能に機能するホスホリパーゼドメインがＶｐ１の固有なＮ末端において同定されている。

【0690】

ｗｔ ＡＡＶと同様に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ベクター導入遺伝子カセットに隣接するシス作用性１４５ｂｐ ＩＴＲを利用し、外来ＤＮＡのパッケージングのために最大４．５ｋｂを提供する。感染に続いて、ｒＡＡＶは、本発明の融合タンパク質または複合体を発現することができ、環状の頭部対尾部コンカテマー中に存在するエピソームによって宿主ゲノムに組み込まれることなく持続することができる。この系を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのｒＡＡＶの成功例は非常に多いが、限定されたパッケージング能力は、遺伝子のコード配列の長さがｗｔ ＡＡＶゲノムのサイズに等しいか、またはそれより大きい場合、ＡＡＶ媒介性遺伝子送達の使用を限定してきた。

【0691】

ウイルスベクターは用途に応じて選択され得る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達では、ＡＡＶは他のウイルスベクターよりも有利であり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶは低毒性を可能にし、これは、免疫応答を活性化することができる細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法によるものであり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶは、宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異誘発を引き起こす確率が低い。アデノウイルスは、誘導する強い免疫原性反応のため、ワクチンとして一般的に使用されている。ウイルスベクターのパッケージング能力は、ベクターにパッケージングされ得る塩基エディターのサイズを限定し得る。

【0692】

ＡＡＶは、２つの１４５塩基の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．５Ｋｂまたは４．７５Ｋｂのパッケージング能力を有する。これは、開示された塩基エディターならびにプロモーターおよび転写ターミネーターが単一のウイルスベクターに適合できることを意味する。４．５または４．７５Ｋｂより大きい構築物は、有意に低減したウイルス産生を導き得る。例えば、ＳｐＣａｓ９は非常に大きく、遺伝子自体は４．１Ｋｂを超え、ＡＡＶへのパッキングを困難にしている。したがって、本開示の実施形態は、従来の塩基エディターよりも長さが短い、開示された塩基エディターを利用することを含む。一部の例では、塩基エディターは４ｋｂ未満である。開示された塩基エディターは、４．５ｋｂ、４．４ｋｂ、４．３ｋｂ、４．２ｋｂ、４．１ｋｂ、４ｋｂ、３．９ｋｂ、３．８ｋｂ、３．７ｋｂ、３．６ｋｂ、３．５ｋｂ、３．４ｋｂ、３．３ｋｂ、３．２ｋｂ、３．１ｋｂ、３ｋｂ、２．９ｋｂ、２．８ｋｂ、２．７ｋｂ、２．６ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、または１．５ｋｂ未満であり得る。一部の実施形態では、開示される塩基エディターは、長さが４．５ｋｂ以下である。

【0693】

ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはそれらの任意の組合せであり得る。標的化される細胞に関してＡＡＶのタイプを選択することができ、例えば、脳またはニューロン細胞を標的化するためのＡＡＶ血清型１、２、５またはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５もしくはそれらの任意の組合せを選択することができ、心臓組織を標的とするためのＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。これらの細胞に関するある特定のＡＡＶ血清型の表をＧｒｉｍｍ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７～５９１１（２００８））に見出すことができる。

【0694】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターを使用して、目的の細胞に、本明細書において提供される塩基エディターまたは塩基エディター系をコードするポリヌクレオチドを形質導入する。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、有糸分裂細胞と有糸分裂後細胞の両方に感染し、遺伝子を発現する能力を有する。最も一般的に公知であるレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して広範な細胞型を標的とする。

【0695】

レンチウイルスは、以下のようにして調製することができる。ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルス導入プラスミド骨格を含む）をクローニングした後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴは、Ｔ－７５フラスコに播種され、トランスフェクションする前日に、抗生物質を含まない１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で５０％コンフルエンスにされた。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞は、１０μｇのレンチウイルス導入プラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）および以下のパッケージングプラスミドでトランスフェクトされる：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－ｇシュードタイプ）、および７．５μｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）。トランスフェクションは、カチオン性脂質送達剤（５０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００および１００μｌのＰｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中で行うことができる。６時間後、培地は、１０％ウシ胎児血清を含む抗生物質を含まないＤＭＥＭに交換される。これらの方法は、細胞培養中に血清を使用するが、無血清の方法が好ましい。

【0696】

レンチウイルスは、以下のようにして精製することができる。ウイルス上清を４８時間後に採取する。上清から最初に破片を取り除き、０．４５μｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターを通して濾過する。次に、それらを超遠心分離機において２４，０００ｒｐｍで２時間回転させる。ウイルスペレットを５０μｌのＤＭＥＭ中に４℃で一晩再懸濁する。次に、それらを分注し、－８０℃で直ちに凍結する。

【0697】

別の実施形態では、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づく最小の非霊長類レンチウイルスベクターもまた意図される。別の実施形態では、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）は、網膜下注射を介して送達されることが意図される、血管新生抑制タンパク質エンドスタチンおよびアンジオスタチンを発現する、ウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子治療ベクターである。別の実施形態では、自己不活性化レンチウイルスベクターの使用が意図される。

【0698】

系の任意のＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡまたは塩基エディターをコードするｍＲＮＡを、ＲＮＡの形態で送達することができる。塩基エディターをコードするｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用して生成することができる。例えば、ヌクレアーゼのｍＲＮＡは、以下のエレメントを含むＰＣＲカセットを使用して合成することができる：Ｔ７プロモーター、必要に応じたｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）、ヌクレアーゼ配列、およびベータグロビン－ポリＡテール由来の３’ＵＴＲなどの３’ＵＴＲ。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写のために使用され得る。ガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）はまた、Ｔ７プロモーター、続いて配列「ＧＧ」およびガイドポリヌクレオチド配列を含むカセットからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用して転写され得る。

【0699】

発現を増強し、起こり得る毒性を低減するために、塩基エディターをコードする配列および／またはガイド核酸は、例えば、偽のＵまたは５－メチル－Ｃを使用して、１つまたは複数の改変されたヌクレオシドを含むように改変され得る。

【0700】

ＡＡＶベクターのパッケージング能力が小さいため、このサイズを超えるいくつかの遺伝子の送達および／または大きな生理的調節エレメントの使用は困難である。これらの課題は、例えば、送達されるタンパク質を２つ以上の断片に分割することによって対処することができ、Ｎ末端断片は分割インテイン－Ｎに融合され、Ｃ末端断片は分割インテイン－Ｃに融合される。次に、これらの断片を２つ以上のＡＡＶベクターにパッケージングする。本明細書で使用される場合、「インテイン」とは、隣接するＮ末端およびＣ末端エクステイン（例えば、結合される断片）をライゲートする自己スプライシングタンパク質イントロン（例えば、ペプチド）を指す。異種タンパク質断片を接続するためのある特定のインテインの使用は、例えば、Ｗｏｏｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（２１）；１４５１２～９（２０１４）に記載される。例えば、インテインＩｎｔＮとＩｎｔＣは、別々のタンパク質断片に融合した場合、互いに認識し合い、スプライシングによって切り離され、同時に、融合したタンパク質断片のＮ末端とＣ末端の隣接エクステインをライゲートし、それによって２つのタンパク質断片から全長タンパク質を再構成する。他の適切なインテインは、当業者には明らかである。

【0701】

本発明の融合タンパク質または複合体の断片は、長さが異なることができる。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが２アミノ酸～約１０００アミノ酸の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約５アミノ酸～約５００アミノ酸の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約２０アミノ酸～約２００アミノ酸の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約１０アミノ酸～約１００アミノ酸の範囲である。他の長さの適切なタンパク質断片は、当業者には明らかである。

【0702】

一実施形態では、二重ＡＡＶベクターは、大きな導入遺伝子発現カセットを２つの別々の半分（５’および３’末端、またはヘッドおよびテール）に分割することによって生成され、カセットの各半分は、（＜５ｋｂの）単一のＡＡＶベクターにパッケージされる。次に、全長導入遺伝子発現カセットの再構築は、両方の二重ＡＡＶベクターによる同じ細胞の同時感染後に達成され、続いて（１）５’と３’ゲノム間の相同組換え（ＨＲ）（二重ＡＡＶ重複ベクター）；（２）５’および３’ゲノムのＩＴＲ媒介性テール・ツー・ヘッドコンカテマー化（二重ＡＡＶトランススプライシングベクター）；または（３）これらの２つの機構の組合せ（二重ＡＡＶハイブリッドベクター）が行われる。ｉｎ ｖｉｖｏでの二重ＡＡＶベクターの使用は、全長タンパク質の発現をもたらす。二重ＡＡＶベクタープラットフォームの使用は、サイズが＞４．７ｋｂである導入遺伝子に対する効率的で実施可能な遺伝子導入戦略を表す。

【0703】

遺伝子導入のための非ウイルスプラットフォーム
目的の細胞中に異種ポリヌクレオチドを導入するための非ウイルスプラットフォームは、当該技術分野において公知である。

【0704】

例えば、本開示は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ｂ）リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－ＤＮＡ鋳型複合体を使用して、異種ポリヌクレオチドを細胞のゲノムに挿入する方法を提供し、ＲＮＰは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ヌクレアーゼドメインおよびガイドＲＮＡを含み、ガイドＲＮＡは、細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインは、標的領域を切断して、細胞のゲノム中に挿入部位を作り出す。次に、ＤＮＡ鋳型を使用して、異種ポリヌクレオチドを導入する。実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ鋳型であり、ＤＮＡ鋳型のサイズは、約２００ヌクレオチドであるか、または約２００ヌクレオチドより大きく、ＤＮＡ鋳型の５’および３’末端は、挿入部位に隣接するゲノム配列に相同であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、一本鎖環状ＤＮＡ鋳型である。実施形態では、複合体中のＲＮＰ対ＤＮＡ鋳型のモル比は、約３：１～約１００：１である。

【0705】

一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は直鎖状ＤＮＡ鋳型である。一部の例では、ＤＮＡ鋳型は一本鎖ＤＮＡ鋳型である。ある特定の実施形態では、一本鎖ＤＮＡ鋳型は、純粋な一本鎖ＤＮＡ鋳型である。一部の実施形態では、一本鎖ＤＮＡ鋳型は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である。

【0706】

一部の実施形態では、核酸配列は、非ウイルス送達を介して細胞のゲノムに挿入される。非ウイルス送達方法において、核酸は、裸のＤＮＡであるか、または非ウイルス性プラスミドもしくはベクター中にあり得る。

【0707】

一部の実施形態では、核酸は、（ａ）標的領域を切断してＴ細胞のゲノム中に挿入部位を作り出す標的化ヌクレアーゼ；および（ｂ）ＨＤＲによって挿入部位に組み込まれる核酸配列を細胞に導入することによって、細胞に挿入される。

【0708】

いくつかの場合において、核酸配列は、直鎖状ＤＮＡ鋳型として細胞に導入される。いくつかの場合において、核酸配列は、二本鎖ＤＮＡ鋳型として細胞に導入される。いくつかの場合において、ＤＮＡ鋳型は一本鎖ＤＮＡ鋳型である。いくつかの場合において、一本鎖ＤＮＡ鋳型は、純粋な一本鎖ＤＮＡ鋳型である。本明細書で使用される場合、「純粋な一本鎖ＤＮＡ」とは、ＤＮＡの他方の鎖または反対の鎖を実質的に欠く一本鎖ＤＮＡを意味する。「実質的に欠く」とは、純粋な一本鎖ＤＮＡが、ＤＮＡの別の鎖よりも少なくとも１００倍を超えて一方の鎖を欠くことを意味する。いくつかの場合において、ＤＮＡ鋳型は、二本鎖または一本鎖プラスミドまたはミニサークルである。

【0709】

他の実施形態では、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、最小のオフターゲット組込みで効率的なＨＤＲを産生することができる。一実施形態では、ｓｓＤＮＡファージは、長い環状ｓｓＤＮＡ（ｃｓｓＤＮＡ）ドナーを効率的であり、安価に産生するために使用される。これらのｃｓｓＤＮＡドナーは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ）とともに使用した場合、直鎖状ｓｓＤＮＡ（ｌｓｓＤＮＡ）ドナーよりも優れた組込み頻度で、効率的なＨＤＲ鋳型として役立つ。

【0710】

このような鋳型を組み込む方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許公開第２０１９０３８８４６９号、第２０２１０３８８３６２号、第２０２１０２０７１７４号、第２０２１０３５３６７８号、第２０２００３６２３５５号、および第２０２１０２２８６３１号に記載され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。また、Ｒｏｔｈ，Ｔ．Ｌら、Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗｉｔｈ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ． Ｎａｔ．Ｌｅｔｔ．５５９、４０５～４０９（２０１８）；Ｆｅｒｅｎｃｚｉら、Ｎａｔ ｏｍｍｕｎ １２、６７５１（２０２１）．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２１－２７００４－１；Ｚｈａｎｇら、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｂａｓｅｄ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｍｂｒｙｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ（２０２１）を参照されたい。

【0711】

インテイン（inteins）
インテイン（介在タンパク質：intervening protein）は、様々な多様な生物に見出される自己プロセシングドメインであり、タンパク質スプライシングとして公知であるプロセスを行う。タンパク質スプライシングは、ペプチド結合の切断と形成の両方で構成される多段階の生化学反応である。タンパク質スプライシングの内因性基質はインテインを含む生物に見られるタンパク質であるが、インテインは事実上あらゆるポリペプチド骨格を化学的に操作するためにも使用できる。

【0712】

タンパク質スプライシングでは、インテインは２つのペプチド結合を切断することによって、それ自身を前駆体ポリペプチドから切り出し、それによって新しいペプチド結合の形成を介して隣接するエクステイン（外部のタンパク質）配列をライゲートする。この再編成は、翻訳後（またはおそらく翻訳と同時に）に起こる。インテインを介したタンパク質のスプライシングは自発的に起こり、インテインドメインの折り畳みだけが必要である。

【0713】

インテインの約５％は分割インテインであり、Ｎ－インテインとＣ－インテインという２つの別々のポリペプチドとして転写および翻訳され、各々が１つのエクステインに融合する。翻訳されると、インテイン断片は自発的かつ非共有的に構築されて標準的なインテイン構造となり、トランスでタンパク質スプライシングを行う。タンパク質スプライシングの機構は、インテイン－エクステイン接合部での２つのペプチド結合の切断と、ＮとＣエクステインとの間の新しいペプチド結合の形成をもたらす一連のアシル転移反応を伴う。このプロセスは、Ｎ－エクステインとインテインとのＮ末端を接続するペプチド結合の活性化によって開始される。事実上すべてのインテインは、Ｃ末端Ｎエクステイン残基のカルボニル炭素を攻撃するシステインまたはセリンをＮ末端に有する。このＮからＯ／Ｓへのアシルシフトは、保存されたスレオニンおよびヒスチジン（ＴＸＸＨモチーフと呼ばれる）と、一般に見出されるアスパラギン酸によって促進され、直鎖状（チオ）エステル中間体の形成をもたらす。次に、この中間体は、システイン、セリン、またはスレオニンである最初のＣ－エクステイン残基（＋１）の求核攻撃によるｔｒａｎｓ－（チオ）エステル化を受ける。得られた分枝（チオ）エステル中間体は、インテインの高度に保存されたＣ末端アスパラギンの環化という固有の変換によって分解される。このプロセスは、ヒスチジン（高度に保存されたＨＮＦモチーフに見出される）と最終的なヒスチジンによって促進され、アスパラギン酸も関また与する。このスクシンイミド形成反応により、反応性複合体からインテインが切り出され、非ペプチド連結を介して結合したエクステインが残る。この構造はインテインとは無関係に安定なペプチド結合に急速に再配列する。一部の実施形態では、分割インテインは、Ｇｐ４１．１、ＩＭＰＤＨ．１、ＮｒｄＪ．１およびＧｐ４１．８から選択される（Ｃａｒｖａｊａｌ－Ｖａｌｌｅｊｏｓ，Ｐａｔｒｉｃｉａら、「Ｕｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｆｏｒ ｎｅｗ ｎａｔｕｒａｌ ｓｐｌｉｔ ｉｎｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｓｏｕｒｃｅｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７巻、３４（２０１２））。

【0714】

インテインの非限定的な例には、当該技術分野において公知である任意のインテインまたはインテイン対が含まれ、ｄｎａＥインテインに基づく合成インテイン、Ｃｆａ－Ｎ（例えば、分割インテイン－Ｎ）およびＣｆａ－Ｃ（例えば、分割インテイン－Ｃ）インテイン対が記載され（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｔｅｖｅｎｓら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１６年２月２４日；１３８（７）：２１６２～５）、およびＤｎａＥが含まれる。本開示に従って使用され得るインテインの対の非限定的な例としては、Ｃｆａ ＤｎａＥインテイン、Ｓｓｐ ＧｙｒＢインテイン、Ｓｓｐ ＤｎａＸインテイン、Ｔｅｒ ＤｎａＥ３インテイン、Ｔｅｒ ＴｈｙＸインテイン、Ｒｍａ ＤｎａＢインテイン、およびＣｎｅ Ｐｒｐ８インテイン（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３９４，６０４号に記載される）が挙げられる。インテインの例示的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列表に配列番号３７０～３７７で提供される。本開示の実施形態における使用に適切なインテインおよびその使用のための方法は、米国特許第１０，５２６，４０１号、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／０４５６３２、および米国特許出願公開番号ＵＳ２０２０／００５５９００に記載され、その全開示が、すべての目的のために、参照により全体が明細書に組み込まれる。

【0715】

インテイン対としての使用に適切なＮ－インテインおよびＣ－インテインについてのアミノ酸およびヌクレオチド配列のさらなる非限定的な例としては、以下の表２０Ａ～２０Ｃに列挙されるアミノ酸もしくはヌクレオチド配列、または分割インテイン対の一部として機能するその断片に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するものが挙げられる。

【0716】

【表20A-1】

【0717】

【表20A-2】

【0718】

【表20B】

【0719】

【表20C】

【0720】

インテイン－Ｎおよびインテイン－Ｃは、それぞれ、分割Ｃａｓ９のＮ末端部分および分割Ｃａｓ９のＣ末端部分に融合し、分割Ｃａｓ９のＮ末端部分および分割Ｃａｓ９のＣ末端部分を接続することができる。例えば、一部の実施形態では、インテイン－Ｎは、分割Ｃａｓ９のＮ末端部分のＣ末端に融合され、すなわち、Ｎ－［分割Ｃａｓ９のＮ末端部分］－［インテイン－Ｎ］－Ｃの構造を形成する。一部の実施形態では、インテイン－Ｃは、分割Ｃａｓ９のＣ末端部分のＮ末端に融合され、すなわち、Ｎ－［インテイン－Ｃ］－［分割Ｃａｓ９のＣ末端部分］－Ｃの構造を形成する。実施形態では、塩基エディターは、２つのポリヌクレオチドによってコードされ、一方のポリヌクレオチドは、インテイン－Ｎに融合した塩基エディターの断片をコードし、別のポリヌクレオチドは、インテイン－Ｃに融合した塩基エディターの断片をコードする。インテインが融合されるタンパク質（例えば、分割Ｃａｓ９）を接続するためのインテイン媒介性タンパク質スプライシングの機構は、当該技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｈａｈら、Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０１４；５（１）：４４６～４６１に記載される。インテインを設計および使用する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４００４３３６、ＷＯ２０１７１３２５８０、ＷＯ２０１３０４５６３２Ａ１、ＵＳ２０１５０３４４５４９、およびＵＳ２０１８０１２７７８０に記載される。

【0721】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の一部または断片はインテインに融合される。ヌクレアーゼは、インテインのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質または複合体の一部または断片はインテインに融合され、ＡＡＶカプシドタンパク質に融合される。インテイン、ヌクレアーゼおよびカプシドタンパク質は、任意の配置（例えば、ヌクレアーゼ－インテイン－カプシド、インテイン－ヌクレアーゼ－カプシド、カプシド－インテイン－ヌクレアーゼなど）で一緒に融合することができる。一部の実施形態では、塩基エディターのＮ末端断片（例えば、ＡＢＥ、ＣＢＥ）は、分割インテイン－Ｎに融合され、Ｃ末端断片は、分割インテイン－Ｃに融合される。一部の実施形態では、塩基エディターのＮ末端断片（例えば、ＡＢＥ、ＣＢＥ）は、分割インテイン－Ｎに融合され、Ｃ末端断片は、分割インテイン－Ｃに融合される。一部の実施形態では、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）のＮ末端断片は、分割インテイン－Ｎに融合され、Ｃ末端断片は、分割インテイン－Ｃに融合される。一部の実施形態では、デアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンまたはシチジンデアミナーゼ）のＮ末端断片を分割インテイン－Ｎに融合し、Ｃ末端断片を分割インテイン－Ｃに融合する。

【0722】

次に、これらの断片は、２つ以上のＡＡＶベクターにパッケージングされる。一部の実施形態では、インテインのＮ末端は融合タンパク質のＣ末端に融合され、インテインのＣ末端はＡＡＶカプシドタンパク質のＮ末端に融合される。

【0723】

一実施形態では、インテインは、ＡＡＶカプシドタンパク質に移植されるシチジンまたはアデノシン塩基エディタータンパク質の断片または部分を接続するために利用される。異種タンパク質断片を接続するためのある特定のインテインの使用は、例えば、Ｗｏｏｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（２１）；１４５１２～９（２０１４）に記載される。例えば、インテインＩｎｔＮとＩｎｔＣとは、別々のタンパク質断片に融合した場合、互いに認識し合い、スプライシングによって切り離され、同時に、融合したタンパク質断片のＮ末端とＣ末端の隣接エクステインをライゲートし、それによって２つのタンパク質断片から全長タンパク質を再構成する。他の適切なインテインは、当業者には明らかである。

【0724】

一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＳｐＣａｓ９の選択された領域内のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＣｙｓ残基でＮ末端およびＣ末端断片に分割された。これらの領域は、Ｃａｓ９結晶構造解析によって同定されたループ領域に対応する。

【0725】

各断片のＮ末端はインテイン－Ｎに融合され、各断片のＣ末端は、以下の配列（「Ｃａｓ９参照配列」と呼ばれる）において大文字で示されるアミノ酸位置Ｓ３０３、Ｔ３１０、Ｔ３１３、Ｓ３５５、Ａ４５６、Ｓ４６０、Ａ４６３、Ｔ４６６、Ｓ４６９、Ｔ４７２、Ｔ４７４、Ｃ５７４、Ｓ５７７、Ａ５８９、およびＳ５９０でインテインＣに融合される。

【0726】

【表H】

【0727】

医薬組成物
一部の態様では、本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ベクター、エディター、例えば、塩基エディター、エディター系、例えば、塩基エディター系、ガイドポリヌクレオチド、融合タンパク質、複合体、融合タンパク質－ガイドポリヌクレオチド複合体、ＬＮＰ、または細胞のいずれかを含む医薬組成物を提供する。

【0728】

本発明の医薬組成物は、公知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１版、２００５）を参照されたい。一般的に、ポリヌクレオチド、ベクター、エディター、エディター系、ガイドポリヌクレオチド、融合タンパク質、複合体、もしくは融合タンパク質－ガイドポリヌクレオチド複合体、ＬＮＰ、細胞、またはそれらの集団は、投与または保存の前に適切な担体と混合され、一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に受容可能な担体をさらに含む。適切な薬学的に許容される担体は、一般的に、医薬組成物を対象に投与することを補助するか、医薬組成物を送達可能な調製物に加工することを補助するか、または投与前に医薬組成物を貯蔵することを補助する不活性物質を含む。薬学的に許容される担体は、製剤の形態、均一性、粘性、ｐＨ、薬物動態、溶解性を安定化、最適化、またはそうでなければ変更し得る薬剤を含み得る。このような薬剤には、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、カプセル化剤、および皮膚浸透増強剤が含まれる。例えば、担体としては、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、スクロース、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびそれらの組合せが挙げられ得る。

【0729】

薬学的に許容される担体として役立ち得る物質の一部の非限定的な例示としては、（１）糖、例えば、ラクトース、ブドウ糖およびスクロース；（２）デンプン、例えば、コーンスターチおよびポテトスターチ；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末トラガント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えば、カカオ脂および坐薬蝋；（９）油、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質不含水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）増量剤、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸；（２３）血清アルコール、例えば、エタノール；および（２３）医薬製剤に採用される他の非毒性の適合性物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および酸化防止剤もまた、製剤中に存在することができる。

【0730】

医薬組成物は、約５．０～約８．０の範囲などの生理学的ｐＨを反映する所定のレベルに製剤のｐＨを維持するために、１つまたは複数のｐＨ緩衝化合物を含むことができる。水性液体製剤に使用されるｐＨ緩衝化合物は、ヒスチジンなどのアミノ酸もしくはアミノ酸の混合物、またはヒスチジンとグリシンとなどのアミノ酸の混合物であることができる。あるいは、ｐＨ緩衝化合物は、好ましくは、製剤のｐＨを約５．０～約８．０の範囲などの所定のレベルに維持し、カルシウムイオンをキレート化しない薬剤である。このようなｐＨ緩衝化合物の例証的な例には、限定されないが、イミダゾールおよび酢酸イオンが挙げられる。ｐＨ緩衝化合物は、製剤のｐＨを所定のレベルに維持するのに適した任意の量で存在し得る。

【0731】

医薬組成物はまた、１つまたは複数の浸透圧調節剤、すなわち、レシピエント個体の血流および血液細胞に受容可能なレベルまで製剤の浸透特性（例えば、張性、重量オスモル濃度、および／または浸透圧）を調節する化合物を含み得る。浸透圧調節剤は、カルシウムイオンをキレート化しない薬剤であり得る。浸透調節剤は、製剤の浸透特性を調節する、当業者に公知であるか、または入手可能な任意の化合物であることができる。当業者は、本発明の製剤における使用のための所与の浸透圧調節剤の適合性を経験的に決定し得る。浸透圧調節剤の適切なタイプの例証的な例としては、限定されないが、塩、例えば、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウム；糖、例えば、ショ糖、デキストロースおよびマンニトール；アミノ酸、例えば、グリシン；ならびにこれらの薬剤および／または薬剤のタイプの１つまたは複数の混合物が挙げられる。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性をモジュレートするのに十分な任意の濃度で存在し得る。

【0732】

本発明の医薬組成物には、疾患の治療に有用な少なくとも１つの追加の治療剤が含まれ得る。例えば、本明細書に記載される医薬組成物の一部の実施形態は、化学療法剤をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、サイトカインペプチドまたはサイトカインペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、免疫抑制剤をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、追加の治療剤とは別々に投与することができる。

【0733】

動物またはヒトに投与される任意の組成物について、および任意の特定の投与方法について、適切な動物モデル（例えば、マウスなどのげっ歯類）における致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定することなどによる毒性；ならびに適切な応答を発揮する、組成物の投薬量、その中の成分の濃度、および組成物を投与するタイミングを決定することができる。このような決定は、当業者の知識、本開示および本明細書に引用される文献から過度の実験を必要としない。

【0734】

一部の実施形態では、医薬組成物は、対象への送達のために製剤化される。本明細書に記載される医薬組成物を投与する適切な経路には、限定されないが、局所的、皮下的、経皮的、皮内的、表皮内的、病変内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉内、歯間、蝸牛内、経鼓室内、臓器内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内投与が含まれる。

【0735】

一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、関心のある部位（例えば、肝臓）に局所的に投与される。部位は、例えば、疾患部位または標的遺伝子が豊富に発現される部位であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、注射によって、カテーテルによって、坐薬によって、またはインプラントによって対象に投与され、インプラントは、シアラスチック膜などの膜、または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料である。

【0736】

他の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、制御放出系で送達される。一実施形態では、ポンプを使用することができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７～１５３３；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８９、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２１：５７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ ＲａｔｏｎＦｌａ．、１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ編集、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、１９８３、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい。Ｌｅｖｙら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。他の制御放出系は、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（上掲）に検討されている。

【0737】

一部の実施形態では、医薬組成物は、対象、例えば、ヒトへの静脈または皮下投与に適合した組成物として、日常的な手順に従って製剤化される。一部の実施形態では、注射による投与のための医薬組成物は、可溶化剤としての無菌等張使用の溶液、および注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬である。一般に、成分は個別にまたは一緒に混合された単位剤形として、例えば、活性剤の量を示すアンプルあるいはサシェットとして気密封入コンテナ内で乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。医薬品が点滴によって投与される場合、無菌の医薬品等級の水または生理食塩水を含む点滴ボトルで分注することができる。医薬組成物が注射によって投与される場合、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与前に混合され得るように提供され得る。

【0738】

全身投与のための医薬組成物は、液体、例えば、無菌生理食塩水、乳酸化リンゲル液またはハンクス液であり得る。さらに、医薬組成物は、固体形態であり得、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥した形態もまた企図される。医薬組成物は、脂質粒子または小胞、例えば、リポソームまたは微結晶内に含せることができ、非経口投与に適している。粒子は、組成物がその中に含まれる限り、単層または多層などの任意の適切な構造のものであり得る。化合物は、融合性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベル（５～１０モル％）のカチオン性脂質を含む「安定化されたプラスミド－脂質粒子」（ＳＰＬＰ）に捕捉され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングによって安定化され得る（Ｚｈａｎｇ Ｙ．Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９、６：１４３８～４７）。Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルスルフェート、または「ＤＯＴＡＰ」などの正に荷電した脂質は、このような粒子および小胞に特に好ましい。このような脂質粒子の調製は周知である。各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，８８０，６３５号；第４，９０６，４７７号；第４，９１１，９２８号；第４，９１７，９５１号；第４，９２０，０１６号；および第４，９２１，７５７号を参照されたい。

【0739】

本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、単位用量として投与またはパッケージングすることができる。用語「単位用量」は、本開示の医薬組成物に関して使用される場合、対象のための単位投薬量として適切な物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤、すなわち、担体、またはビヒクルとともに、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含む。

【0740】

さらに、医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥形態の本発明の化合物を含む容器、および（ｂ）薬学的に許容される希釈剤（例えば、本発明の凍結乾燥化合物の再構成または希釈のために使用される無菌なもの）を含む第２の容器を含む医薬キットとして提供され得る。必要に応じて、このような容器に、医薬品または生物学的製造品の製造、使用または販売を規制する政府当局が指示した形式の注意書きであって、ヒト投与用の製造、使用または販売行政当局による認可を反映する、注意書きが付随してもよい。

【0741】

別の態様では、上記の疾患の治療に有用な物質を含む製造品が含まれる。一部の実施形態では、製造品は容器およびラベルを含む。適切な容器には、限定されないが、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。一部の実施形態では、容器は、本明細書に記載される疾患を治療するのに有効な組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有することができる。例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであることができる。組成物中の活性剤は、本発明の化合物である。一部の実施形態では、容器上のまたは容器に付随するラベルは、組成物が選択した疾患を治療するために使用されることを示す。製造品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース液などの薬学的に許容される緩衝剤を含む第２の容器をさらに含むことができる。さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書付きのパッケージインサートを含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含み得る。

【0742】

一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質もしくはそれらをコードする核酸、ｇＲＮＡ、および／または複合体はいずれも、医薬組成物の一部として提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書において提供される融合タンパク質、核酸、または複合体のいずれかを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書において提供される複合体のいずれかを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ｇＲＮＡおよびカチオン性脂質と複合体を形成するＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質複合体を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ｇＲＮＡ、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質、カチオン性脂質、および薬学的に許容される賦形剤を含む。実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子および薬学的に許容される賦形剤を含む。実施形態では、脂質ナノ粒子は、本開示のｇＲＮＡ、塩基エディター、複合体、塩基エディター系、もしくはそれらの成分、および／またはそれをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。医薬組成物は、必要に応じて、１つまたは複数の追加の治療上有効な物質を含むことができる。

【0743】

一部の実施形態では、対象内で標的化ゲノム改変を行うために、本明細書において提供される組成物が、対象、例えば、ヒト対象に投与される。一部の実施形態では、細胞を対象から得て、本明細書において提供される医薬組成物のいずれかと接触させる。一部の実施形態では、対象から取り出され、医薬組成物とｅｘ ｖｉｖｏで接触された細胞は、必要に応じて、所望のゲノム改変が細胞において達成または検出された後に、対象に再導入される。ヌクレアーゼを含む医薬組成物を送達する方法は公知であり、例えば、すべての開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５０３，７１７号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，６０７，８８２号；第６，６８９，５５８号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号に記載される。本明細書に提供される医薬組成物の記載は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物に対して指向されるが、そのような組成物は一般に、例えば、獣医学的使用のために、あらゆる種類の動物または生物への投与に適していることが、当業者によって理解される。

【0744】

組成物を種々の動物への投与に好適とするために、ヒトへの投与に適した医薬組成物を改変することは、十分に理解され、普通に熟練した獣医学の薬理学者は、あったとしても単に通常の実験を伴って、このような改変を設計および／または実施し得る。医薬組成物の投与が意図される対象には、限定されないが、ヒトおよび／または他の霊長類；哺乳動物、家畜、ペット、ならびにウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラットなどの商業的に関連する哺乳動物；ならびに／または鳥類、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウなどの商業的に関連する鳥類が含まれる。

【0745】

本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において公知であるか、または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、このような調製方法は、活性成分（を賦形剤および／または１つもしくは複数の他の補助成分と会合させ、次に、必要および／または望ましい場合、製造品を所望の単回もしくは複数回用量単位に成形および／または包装するステップを含む。医薬製剤は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができ、本明細書で使用される場合、所望の特定の剤形に適するように、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などを含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６；全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤およびその調製のための公知の技術を開示する。ヌクレアーゼを含む医薬組成物を生成するためのさらなる適切な方法、試薬、賦形剤および溶媒については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５１３１（公開番号ＷＯ２０１１／０５３９８２Ａ８、２０１０年１１月２日出願）も参照されたい。

【0746】

任意の従来の賦形剤媒体が、例えば、任意の望ましくない生物学的効果を生じるか、またはそうでなければ医薬組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することによって、物質またはその誘導体と不適合である場合を除き、その使用は、本開示の範囲内にあることが意図される。

【0747】

上述のように、組成物は、有効量で投与することができる。有効量は、投与様式、治療される特定の状態、および所望の結果に依存する。それはまた、対象の状態のステージ、年齢および身体的状態、同時治療の性質、もしあれば、ならびに医師に十分に周知である同様の因子に依存し得る。治療用途では、医学的に望ましい結果を達成するのに十分な量である。

【0748】

一部の実施形態では、本開示による組成物は、様々な疾患、障害、および／または状態のいずれかの治療に使用することができる。

【0749】

治療方法
本発明の一部の態様は、必要とする対象を治療（処置）する方法であって、有効な治療量の本明細書に記載されるような医薬組成物を必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。より具体的には、治療方法は、医薬組成物の投与を必要とする対象に、本明細書において提供される１つまたは複数の作用物質を含む１つまたは複数の医薬組成物を投与するステップを含む。他の実施形態では、本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、塩基エディターポリペプチドおよび少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子を標的化することができる１つまたは複数のガイドＲＮＡを発現させるか、または細胞に導入するステップを含む。

【0750】

別の実施形態では、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害の治療を必要とする対象において、ＩｇＧ媒介性自己免疫障害を治療する方法であって、その中に埋め込まれた、少なくとも１つのＩｇＧ抗体またはその機能的断片のＦｃ領域を含む脂質単分子層膜；および脂質単分子層膜に封入された脂質コアマトリクスを含むＬＮＰを、対象に投与するステップを含み、脂質コアマトリクスは、ＦＣＧＲＴ遺伝子の発現を緩和するか、またはＦＣＧＲＴ遺伝子をサイレンシングする、少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡを含む、方法が提供される。

【0751】

当業者は、特定の実施形態で企図される医薬組成物の複数回投与が、所望の治療に影響を及ぼすために必要とされ得ることを認識する。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、１０年、またはそれ以上の期間にわたって、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回またはそれ以上、対象に投与され得る。このような方法のいずれかにおいて、本方法は、有効量のエディター系（例えば、塩基エディター系またはこのような系をコードするポリヌクレオチド）を対象に投与するステップを包含し得る。一部の実施形態では、単回投与は、所望の効果をもたらすのに十分である。一部の実施形態では、１～５回の投与が使用され得る。

【0752】

本明細書で企図される医薬組成物の投与は、限定されないが、注入、輸血、または非経口を含む従来の技術を使用して行うことができる。一部の実施形態では、非経口投与は、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、腫瘍内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、および胸骨内に注入または注射することを含む。

【0753】

一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物（例えば、塩基エディター系）は、ヒト対象の体重１キログラムあたり約０．５～３０ｍｇである投薬量で投与される。別の実施形態では、投与される組成物の量は、ヒト対象の体重１キログラムあたり約０．５～２０ｍｇである。別の実施形態では、投与される組成物の量は、ヒト対象の体重１キログラムあたり約０．５～１０ｍｇである。別の実施形態では、投与される組成物の量は、ヒト対象の体重１キログラムあたり約０．０４ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．１６ｍｇ、約０．３２ｍｇ、約０．６４ｍｇ、約１．２５ｍｇ、約１．２８ｍｇ、約１．９２ｍｇ、約２．５ｍｇ、約３．５６ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約５．０ｍｇ、約７．１２ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１４．２４ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、または約３０ｍｇである。別の実施形態では、投与される組成物の量は、ヒト対象の体重１キログラムあたり約１．９２ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１５．０ｍｇ、または約３０．０ｍｇであり、組成物は週に２回投与される。別の実施形態では、投与される組成物の量は、ヒト対象の体重１キログラムあたり約１．２８ｍｇ、約２．５６ｍｇ、約５．０ｍｇ、約１０ｍｇ、または約２０ｍｇであり、組成物は週に２回投与される。別の実施形態では、投与される組成物の量は、ヒト対象の体重１キログラムあたり約１．９２ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１５．０ｍｇ、または約３０．０ｍｇであり、組成物は週に１回投与される。別の実施形態では、投与される組成物の量は、ヒト対象の体重１キログラムあたり約１．２８ｍｇ、約２．５６ｍｇ、約５．０ｍｇ、約１０ｍｇ、または約２０ｍｇであり、組成物は週に１回投与される。別の実施形態では、投与される組成物の量は、ヒト対象の体重１キログラムあたり約１．９２ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１５．０ｍｇ、または約３０．０ｍｇであり、組成物は、１日１回、７日間に３回、５回、または７回投与される。別の実施形態では、組成物は、１日１回、７日間に７回、静脈内に投与される。別の実施形態では、投与される組成物の量は、ヒト対象の体重１キログラムあたり約１．２８ｍｇ、約２．５６ｍｇ、約５．０ｍｇ、約１０ｍｇ、または約２０ｍｇであり、組成物は、１日１回、７日間に３回、５回、または７回投与される。別の実施形態では、組成物は、１日１回、７日間に７回、静脈内に投与される。

【0754】

一部の実施形態では、組成物は、０．２５ｈ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、５ｈ、６ｈ、７ｈ、８ｈ、９ｈ、１０ｈ、１１ｈ、または１２ｈにわたって投与される。別の実施形態では、組成物は０．２５～２時間にわたって投与される。別の実施形態では、組成物は１時間にわたって徐々に投与される。別の実施形態では、組成物は２時間にわたって徐々に投与される。

【0755】

キット
本発明は、対象における自己免疫障害の治療のためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、ゲノムエディター系またはゲノムエディター系およびガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、例えば、キットは、塩基エディター系または塩基エディター系をコードするポリヌクレオチドを含み、塩基エディター系は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、デアミナーゼ、およびガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣａｓ９またはＣａｓ１２である。一部の実施形態では、ゲノムエディター、例えば、塩基エディターをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである。

【0756】

キットは、本明細書に記載されるゲノムエディター、ゲノムエディター系、塩基エディター、塩基エディター系および／または編集された細胞を使用するための書面の使用説明書をさらに含み得る。他の実施形態では、使用説明書は、以下：注意事項；警告；臨床研究；および／または参考文献のうちの少なくとも１つを含む。使用説明書は、容器（存在する場合）に直接印刷することができ、または容器に貼付したラベルとして印刷することができ、または容器にもしくは容器とともに供給される別のシート、パンフレット、カード、またはフォルダとして印刷することができる。さらなる実施形態では、キットは、適切な操作パラメーターのためのラベルまたは別々のインサート（パッケージインサート）の形態の使用説明書を含む。さらに別の実施形態では、キットは、検出、較正、または正規化のための標準として使用される、適切な陽性および陰性対照または対照試料を含む１つまたは複数の容器を含む。キットはさらに、（無菌）リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース液などの薬学的に許容される緩衝剤を含む第２の容器を含むことができる。それはさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書付きのパッケージインサートを含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含むことができる。

【0757】

本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を採用し、これらは十分に当業者の範囲内である。このような技術は、文献、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗｅｉｒ、１９９６）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓ、１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、１９９１）において十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、それ自体、本発明の製造および実施において考慮され得る。特定の実施形態に特に有用な技術は、以下のセクションにおいて検討される。

【0758】

以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法を作製および使用する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために提示され、本発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。

【0759】

実施例

【実施例1】

【0760】

実施例１：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＦｃＲｎポリヌクレオチドを変更するための塩基編集
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＦｃＲｎポリヌクレオチド配列を変更することができる塩基エディター系を開発するための実験を行った。ポリヌクレオチドの変更は、コードされたＦｃＲｎポリペプチド配列の変更をもたらした。理論に束縛されるつもりはないが、構造的洞察（２Ｂ－５を参照されたい）に基づいて選択されたポリペプチド変更は、３つのカテゴリー（表２１を参照されたい）に分類された：Ａ）ＦｃＲｎとＩｇＧとの複合体の安定化および／または中性ｐＨでのＩｇＧとの結合親和性に関与するアミノ酸残基；Ｂ）ｐＨ依存性ＦｃＲｎのＩｇＧ結合部位に対応するアミノ酸残基；およびＣ）Ｗ１３１（１５４）の位置がＩｇＧへの結合を促進するのを助ける疎水性ポケットに関連するアミノ酸残基。

【0761】

【表21】

【0762】

各々がガイドポリヌクレオチドおよび塩基エディターを含む塩基エディター系は、表２１に列挙される位置でＦｃＲｎ変更に対応するＦｃＲｎ遺伝子に対する塩基エディットを促進し、表２Ａおよび２Ｂに列挙されるガイド番号１～４０に対応させるように設計した。塩基編集効率は、以下のガイド（表２Ａおよび２Ｂを参照されたい）および表２Ｂに列挙されたそれらの対応する塩基エディターを含む塩基エディター系を使用して編集されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において測定された：ｇＲＮＡ１５６０
ｇＲＮＡ１５６１、ｇＲＮＡ１５６２、ｇＲＮＡ１５６３、ｇＲＮＡ１５６４、ｇＲＮＡ１５６５、ｇＲＮＡ１５６６、ｇＲＮＡ１５６７、ｇＲＮＡ１５６８、ｇＲＮＡ１５６９、ｇＲＮＡ１５７０、ｇＲＮＡ１５７１、ｇＲＮＡ１５７２、ｇＲＮＡ１５７３、ｇＲＮＡ１５７４、ｇＲＮＡ１５７５、ｇＲＮＡ１５７６、ｇＲＮＡ１５７７、ｇＲＮＡ１５７８、ｇＲＮＡ１５７９、ｇＲＮＡ１５８０、ｇＲＮＡ１５８１、ｇＲＮＡ１５８２、ｇＲＮＡ１５８３、ｇＲＮＡ１５８４、ｇＲＮＡ１５８７、ｇＲＮＡ１５８８、ｇＲＮＡ１５８９、ｇＲＮＡ１５９０、ｇＲＮＡ１５９１、ｇＲＮＡ１５９２、およびｇＲＮＡ１５９３。各塩基編集系について測定した塩基編集効率を図６Ａおよび６Ｂに示し、編集されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で観察された各アミノ酸変化または変更のセットについての塩基編集効率を別々に評価した。表２２は、評価された塩基エディター系に関連する主要およびバイスタンダーアミノ酸変化の概要を提供する。

【0763】

【表22】

【0764】

これらの実験では、以下の塩基エディター系を使用した。

【0765】

【表I】

【0766】

ＦｃＲｎの機能におけるアミノ酸変化の影響を決定するために、表面プラズモン共鳴を用いて実験を行い、以下の１０の変更：Ｄ１３０Ｇ、Ｗ１３１Ｒ、Ｄ１３０Ｎ、Ｄ１３０Ｈ、Ｆ１１０Ｌ、Ｅ１１６Ｋ、Ｅ１１５Ｋ、Ｅ１１６Ｑ、Ｍ１１８Ｉ、およびＥ１３３Ｋのうちの１つを含むＦｃＲｎポリペプチドへのＩｇＧ１およびアルブミンの結合を評価した。ＦｃＲｎタンパク質を以下のように産生した：ＥＸＰＩ２９３Ｆ細胞を、Ｅｘｐｉ２９３発現システムユーザーガイド（カタログ番号Ａ１４５２５、公開番号ＭＡＮ００１９４０２）に従ってトランスフェクトした。各構築物のプラスミド比は、ＦｃＲＮ（野生型または突然変異体）の細胞外ドメインおよびベータ２ミクログロブリン（野生型）（ＦｃＲＮが会合するタンパク質）について１：１であった。トランスフェクトされた細胞をトランスフェクト後さらに４日間培養し、その後、遠心分離（７０６８×ｇ、３０分間、室温）および０．２２μｍ ａＰＥＳ膜を通した無菌濾過によって採取した。物質を精製するまで４℃で保存した。精製はＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行われた。上記で概説したトランスフェクションステップからの採取材料を、１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号１７－５２４７－０１）を用いて精製した。

【0767】

ヒトＩｇＧ１－４およびアルブミン（Ｓｉｇｍａ Ａ９７３１）に対するＦｃＲｎバリアントの親和性は、Ｃ１センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａカタログ番号ＢＲ１００５４０）またはＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａカタログ番号ＢＲ１００３９９）を備えたＢｉａｃｏｒｅ ３０００装置を用いて、２５℃、流速３０μＬ／分でＳＰＲを用いて決定された。泳動緩衝剤は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＨＢＳ－ＥＰ）を含み、ＨＣｌの滴下添加によって最終ｐＨを５．８に調整し、次に滅菌濾過し、減圧下の超音波処理によって脱気した。野生型ＦｃＲｎは、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＦＣＮ－Ｈ５２Ｗ７）から購入し、上記のように産生された野生型および突然変異体ＦｃＲｎと比較した。実験は、１）表面上に固定化されたＦｃＲｎを用いるか、または２）固定化されたアルブミンおよびＩｇＧに結合する可溶性ＦｃＲｎを用いるかの２つの配向で行われた。両方の場合において、１分間の会合段階および５分間の解離段階を使用し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を注入して再生を行った。応答は、参照フローセル（固定化タンパク質なし）および同じフローセルに対するブランク注入から応答を差し引くことによって二重参照した。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ）ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルに反応を当てはめることによって、平衡および速度論的パラメーターを決定した。

【0768】

１）表面固定化ＦｃＲｎによるＳＰＲ測定
固定化のために、ＥＺ－リンクＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ビオチニル化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３１４２５）を用いて、製造業者の指示書に従ってＦｃＲｎをビオチン化したが、ＮＨＳ－ビオチンを１：１モル当量で含め、タンパク質をまばらにビオチン化したことは除く。ニュートラアビジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３１０００）を、０．１ＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および０．４Ｍの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で７分間、表面カルボキシレート基を活性化してＣ１ ＳＰＲチップ表面に共有結合的に固定化し、続いて１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中の１０μｇ／ｍｌのニュートラアビジンを３分間注射した。ニュートラアビジン固定化レベルは、約１０００ＲＵであった。活性化された表面は、１０ｗｔ％の３ｋＤａポリ（エチレングリコール）アミン（ＰＥＧ－アミン、ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号Ｍ－ＮＨ２ＨＣｌ－３０００）（ｐＨ８）の７分間注入によりクエンチされ、Ｃ１センサーチップ表面への非特異的結合を低減させることが見出された。次に、３０ＲＵの捕捉レベルに達するまで１μｇ／ｍｌ溶液を注入することによって、ビオチン化ＦｃＲｎをＳＰＲチップ上に捕捉した。ＩｇＧアイソタイプ１～４は、最大３μＭの範囲の濃度で注射し、アルブミンは最大３６μＭの濃度で注射した。

【0769】

２）表面固定化ＩｇＧとアルブミンによるＳＰＲ測定
ヒトＩｇＧおよびアルブミンを、上記のようにＮＨＳ／ＥＤＣ活性化によって、カルボキシメチルデキストラン含有（ＣＭ５）ＳＰＲチップ上に固定化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中で約１０００ＲＵまでＩｇＧまたはアルブミンを固定化した後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ９．５）を７分間注入して不活性化を行った。可溶性ＦｃＲｎを、結合について３μＭでスクリーニングし、最大１５μＭの濃度を、選択された突然変異体について試験した。

【0770】

評価した全１０個のＦｃＲｎポリペプチドがアルブミン結合を維持した（図７Ａ）。評価したＦｃＲｎポリペプチドのうちの４つ、すなわちＷ１３１Ｒ、Ｅ１１５Ｋ、Ｍ１１８Ｉ、およびＥ１３３Ｋは、低減したＩｇＧ結合を有した（図７Ｂ）。図７Ｃおよび７Ｄも参照されたい。表２３および２４は、変更Ｅ１３３Ｋ、Ｍ１１８Ｉ、およびＷ１３１Ｒのうちの１つを含む表面結合または非表面結合ＦｃＲｎポリペプチドによる、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはアルブミンの結合について決定されたＫＤ値を提供する。変更Ｗ１３１Ｒを含むＦｃＲｎポリペプチドは、ＩｇＧポリペプチドとの非結合を示したが、アルブミンとの結合は可能であった。ＦｃＲｎのＷ１３１Ｒバリアント体は、溶液中で、野生型ＦｃＲｎよりもアルブミンに対して高い結合親和性を示した。変更Ｍ１１８Ｉを含むＦｃＲｎポリペプチドは、ＩｇＧポリペプチドに対して中程度の親和性しか示さず、アルブミンと結合することができた。

【0771】

治療目的のためにＦｃＲｎポリペプチドのアミノ酸Ｍ１１８を変更することが有益であり得ることが確立されたため、ガイドＲＮＡ ｇＲＮＡ３２６５は、ＦｃＲｎポリヌクレオチドにおける対応する核酸塩基変更をもたらすための塩基エディター系を標的化するために設計した。ｇＲＮＡ３２６５は、ＦｃＲｎポリペプチドにおける変更Ｍ１１８（１４１）ＴおよびＦ１１７（１４０）Ｐを促進することが予測された。また、ｇＲＮＡ１５７８を含む塩基エディター系は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において標的ＦｃＲｎポリペプチド変更Ｍ１１８（１４１）Ｖについて約２１％の塩基編集効率を達成した（図６Ａを参照されたい）。

【0772】

【表23】

【0773】

【表24】

【実施例2】

【0774】

実施例２：初代ヒト肝細胞においてＦｃＲｎポリヌクレオチドを変更するための塩基編集
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）におけるＦｃＲｎポリヌクレオチドの塩基編集を評価するための実験を行った。実験のデザインを図８Ａに示す。初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）共培養物を、ｇＲＮＡ１５８３またはｇＲＮＡ１５８２（表２Ａおよび２Ｂを参照されたい）およびアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）を含む塩基エディター系と接触させた。細胞は、１５０ｎｇのガイドＲＮＡおよび塩基エディターをコードする４５０ｎｇのｍＲＮＡでトランスフェクトし、これは、塩基エディター系の亜飽和用量（合計６００ｎｇ）に達した。トランスフェクション後１０日で、各観察されたアミノ酸変化についての塩基編集効率を各塩基エディター系について評価した（図８Ｂ）。トランスフェクション後１３日目に、ＦｃＲｎ転写物レベルをＲＴ－ｑＰＣＲを用いて評価した（図８Ｃ）。ＦｃＲｎにおける標的アミノ酸変化がＷ１３１（１５４）ＲであるガイドｇＲＮＡ１５８３を含む塩基エディター系は、初代ヒト肝細胞において４０％を超える全塩基編集効率を達成した。また、ガイドｇＲＮＡ１５８３を用いて塩基編集した初代ヒト肝細胞におけるＦｃＲｎのｍＲＮＡ発現レベルは、未編集細胞について測定したｍＲＮＡ発現レベルの約７０％であった。

【実施例3】

【0775】

実施例３：ＦｃＲｎポリヌクレオチドを変更するための塩基編集における使用のためのガイドポリヌクレオチドの最適化
ＦｃＲｎポリペプチドにＷ１３１（１５４）Ｒ変更を導入することを標的化する塩基編集系を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において達成される塩基編集効率に対するスペーサー長の影響を評価するための実験を行った。１９ｎｔ～２３ｎｔの長さの範囲のスペーサーを含む以下のガイドポリヌクレオチドを調製した：ｇＲＮＡ３０２５（１９ｎｔスペーサー）、ｇＲＮＡ１５８３（２０ｎｔスペーサー）、ｇＲＮＡ３０２６（２１ｎｔスペーサー）、ｇＲＮＡ３０２７（２２ｎｔスペーサー）、およびｇＲＮＡ３０２８（２３ｎｔスペーサー）（表２Ａおよび２Ｂに列挙される配列を参照されたい）。実験設計を図９Ａに示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、播種後１日目に、１５０ｎｇのガイドポリヌクレオチドおよび４５０ｎｇのアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた。トランスフェクション後７２時間で、細胞を採取し、次世代シークエンシングを使用して、観察された各ＦｃＲｎアミノ酸変化について測定された各塩基エディター系についての塩基編集効率を評価した（図９Ｂ）。評価されたすべてのスペーサー長は、同様の塩基編集効率と関連していた。１９ヌクレオチドのスペーサー長を有するガイド（すなわち、ｇＲＮＡ３０２５）は、より長いスペーサーを含む評価された他のガイドのいずれよりもわずかに良好な塩基編集効率を有した。

【0776】

他の実施態様
上述の記載から、様々な用途および条件に適応するために、本明細書に記載された発明に対して変形および改変がなされ得ることは明らかである。このような実施形態はまた、以下の特許請求の範囲内である。

【0777】

本明細書における変数の任意の定義におけるエレメントの列挙の列挙は、任意の単一のエレメントまたは列挙されたエレメントの組合せ（またはサブコンビネーション）としてのその変数の定義を含む。本明細書に記載される実施形態の列挙は、いずれか１つの実施形態またはいずれかの他の実施形態もしくはその一部の組合せとしてその実施形態を含む。

【0778】

本明細書に言及されるすべての特許および刊行物は、あたかもそれぞれの独立した特許および刊行物が具体的に、および個々に参照によって組み込まれるように指示されたのと同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A-1】

【図6A-2】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【配列表】

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【国際調査報告】