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特表2024-539748二重特異性のＮＫ細胞アゴニスト及び製造方法並びに使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-29
(54)【発明の名称】二重特異性のＮＫ細胞アゴニスト及び製造方法並びに使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241022BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20241022BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20241022BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241022BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241022BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241022BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241022BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241022BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241022BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241022BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241022BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20241022BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241022BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20241022BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20241022BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241022BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241022BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20241022BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241022BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20241022BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20241022BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20241022BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241022BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241022BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241022BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20241022BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241022BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K16/28 ZNA
C07K14/705
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
A61P29/00
A61P35/00
A61P31/12
A61P31/04
A61P31/16
A61P31/20
A61P31/14
A61P35/02
A61P1/00
A61P11/00
A61P15/00
A61K35/12
A61K35/17
A61K35/76
A61K48/00
A61K39/395 N
A61K38/16
A61P43/00 105
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024546349
(86)(22)【出願日】2022-06-30
(85)【翻訳文提出日】2024-04-15
(86)【国際出願番号】 CN2022102876
(87)【国際公開番号】W WO2023115896
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】202111566165.1
(32)【優先日】2021-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524144280
【氏名又は名称】シャンハイ エヌケー セル テック カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118256
【弁理士】
【氏名又は名称】小野寺 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100166338
【弁理士】
【氏名又は名称】関口 正夫
(72)【発明者】
【氏名】シャオ ウェイファ
(72)【発明者】
【氏名】ティアン ジーガン
(72)【発明者】
【氏名】リー ヤンヤン
(72)【発明者】
【氏名】シエ シーチー
(72)【発明者】
【氏名】チェン ミンファ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA02
4C084BA08
4C084BA21
4C084BA22
4C084BA41
4C084CA26
4C084CA53
4C084NA14
4C084ZA591
4C084ZA592
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZB351
4C084ZB352
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC03
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB65
4C087BC83
4C087NA14
4C087ZA59
4C087ZA66
4C087ZA81
4C087ZB11
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZB33
4C087ZB35
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は生物医薬分野に関し、具体的に二重特異性のＮＫ細胞アゴニスト及び製造方法並びに使用に関する。本開示は、融合タンパク質を提供し、ＣＤ１６Ａ受容体と４－１ＢＢ受容体を標的として、新しい二重特異性のＮＫ細胞アゴニスト薬物、即ちｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを取得し、体外でＮＫ細胞を活性化して増幅する活性を有し、その抗ウイルスと抗腫瘍の能力を増強し、同時に、ＮＫ細胞の増殖を促進し、及びＴ細胞の機能を増強する潜在的な効果を有し、体外でＮＫ細胞を活性化して増幅する使用可能性があり、且つ増幅後のＮＫ細胞は比較的良い細胞毒性を有する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ１６Ａ単鎖抗体と４－１ＢＢＬ細胞外領域を含み、前記ＣＤ１６Ａ単鎖抗体は４－１ＢＢＬ細胞外領域に接続され、前記４－１ＢＢＬ細胞外領域は少なくとも１～３個の４－１ＢＢＬ細胞外ドメインを含む融合タンパク質。
【請求項2】
前記４－１ＢＢＬ細胞外領域は３個の４－１ＢＢＬ細胞外ドメインを含み、３個の前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインは順次接続される請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記ＣＤ１６Ａ単鎖抗体と４－１ＢＢＬ細胞外領域はフレキシブルジョイントを介して連結され、任意選択に、３個の前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインの間はフレキシブルジョイントを介して連結される請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記融合タンパク質は非哺乳細胞発現系によって発現され、任意選択に、前記非哺乳細胞発現系は原核発現系と低級真核発現系の少なくとも一方を含み、
任意選択に、前記非哺乳細胞発現系は大腸菌発現系と酵母発現系の少なくとも一方を含み、
任意選択に、前記酵母発現系はピキア酵母発現系を含む請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記ＣＤ１６Ａ単鎖抗体はＶＨ領域とＶＬ領域を含み、前記ＶＨ領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、前記ＶＬ領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、任意選択に、前記ＶＨ領域とＶＬ領域は第１のジョイントを介して接続され、
任意選択に、前記第１のジョイントはフレキシブルジョイントであり、
任意選択に、前記第１のジョイントの長さは１０～２０個のアミノ酸であり、
任意選択に、前記第１のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される請求項１～４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記ＶＨ領域またはＶＬ領域の一端と前記４－１ＢＢＬ細胞外領域は第２のジョイントを介して接続され、任意選択に、前記第２のジョイントはフレキシブルジョイントであり、
任意選択に、前記第２のジョイントの長さは１０～２０個のアミノ酸であり、
任意選択に、前記第２のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される請求項１～６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
３個の前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインはそれぞれ第３のジョイントと第４のジョイントを介して互いに接続され、前記第３のジョイントと第４のジョイントは同一または異なり、任意選択に、前記第３のジョイントと第４のジョイントはいずれもフレキシブルジョイントであり、
任意選択に、前記第３のジョイントと第４のジョイントの長さは１５～２５個のアミノ酸であり、
任意選択に、前記第３のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示され、
任意選択に、前記第４のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される請求項１～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記融合タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される請求項１～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項11】
前記核酸は酵母発現系コドンで最適化された核酸であり、任意選択に、前記核酸のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される請求項１０に記載の核酸。
【請求項12】
請求項１０または１１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項13】
請求項１０または１１に記載の核酸、請求項１２に記載の発現ベクターを担持したり、または請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現する組換え細胞。
【請求項14】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸、請求項１２に記載の発現ベクター、請求項１３に記載の組換え細胞の腫瘍や炎症性疾患の治療や予防に使用される薬物の製造における使用。
【請求項15】
前記腫瘍は、卵巣癌、肺癌、直腸癌、乳癌、白血病の少なくとも一方を含み、任意選択に、前記炎症性疾患は細菌またはウイルス感染を含み、
任意選択に、前記細菌感染は肺炎クレバー、リステリア菌、黄色ブドウ球菌感染症の少なくとも一方を含み、
任意選択に、前記ウイルス感染はＨＰＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルス感染の少なくとも一方を含む請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸、請求項１２に記載の発現ベクター、請求項１３に記載の組換え細胞の体外でのＮＫ細胞の培養増幅における使用。
【請求項17】
前記ＮＫ細胞は末梢血から由来するか、または幹細胞の誘導により得られ、任意選択に、前記ＮＫ細胞は、ヒト末梢血単一核細胞から由来するＮＫ細胞、ヒト臍帯血幹細胞誘導によるＮＫ細胞、ヒト胚性幹細胞誘導によるＮＫ細胞、ヒトｉＰＳＣ誘導によるＮＫ細胞の少なくとも一方を含む請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸、請求項１２に記載の発現ベクターまたは請求項１３に記載の組換え細胞を含む薬物組成物。
【請求項19】
前記薬物組成物は、腫瘍や炎症性疾患の治療や予防に使用され、任意選択に、前記腫瘍は、卵巣癌、肺癌、直腸癌、乳癌、白血病の少なくとも一方を含み
任意選択に、前記炎症性疾患は細菌またはウイルス感染を含み、
任意選択に、前記細菌感染は肺炎クレバー、リステリア菌、黄色ブドウ球菌感染症の少なくとも一方を含み、
任意選択に、前記ウイルス感染はＨＰＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルス感染の少なくとも一方を含む請求項１８に記載の薬物組成物。
【請求項20】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む試薬キット。
【請求項21】
前記試薬キットはＣＤ１６Ａ及び／又は４－１ＢＢを検出するために使用される請求項２０に記載の試薬キット。
【請求項22】
腫瘍または炎症性疾患を患っているまたは疑いのある被験者に、請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、
請求項１０または１１に記載の核酸、
請求項１２に記載の発現ベクター、
請求項１３に記載の組換え細胞、及び
請求項１８または１９に記載の薬物組成物の少なくとも一方を投与することを含む腫瘍または炎症性疾患を治療または予防する方法。
【請求項23】
前記腫瘍は、卵巣癌、肺癌、直腸癌、乳癌、白血病の少なくとも一方を含み、任意選択に、前記炎症性疾患は細菌またはウイルス感染を含み、
任意選択に、前記細菌感染は肺炎クレバー、リステリア菌、黄色ブドウ球菌感染症の少なくとも一方を含み
任意選択に、前記ウイルス感染はＨＰＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルス感染の少なくとも一方を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸、請求項１２に記載の発現ベクター、請求項１３に記載の組換え細胞、請求項１８または１９に記載の薬物組成物の腫瘍または炎症性疾患の治療または予防における使用。
【請求項25】
前記腫瘍は、卵巣癌、肺癌、直腸癌、乳癌、白血病の少なくとも一方を含み、任意選択に、前記炎症性疾患は細菌またはウイルス感染を含み、
任意選択に、前記細菌感染は肺炎クレバー、リステリア菌、黄色ブドウ球菌感染症の少なくとも一方を含み、
任意選択に、前記ウイルス感染はＨＰＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルス感染の少なくとも一方を含む請求項２４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は生物医薬分野に関し、具体的に、二重特異性のＮＫ細胞アゴニスト及び製造方法並びに使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＮＫ細胞は固有免疫系の主要な効果細胞であり、Ｔ細胞に比べて、ＮＫ細胞は予め刺激を必要とせず、パーフォリンとグラニュール酵素及び関連するメカニズムを使用することで、ＭＨＣ制限なしに腫瘍細胞とウイルス感染細胞を殺傷することができる。ＮＫ細胞は数多くの活性化性受容体を発現し、腫瘍細胞または感染細胞が生成したストレス性リガンドを効果的に識別することで、腫瘍細胞を効果的に殺傷することができるが、同時に腫瘍細胞も多くの免疫抑制性の分子を分泌して生成し、免疫抑制性の腫瘍微小環境を形成し、この環境にあるＮＫ細胞の活性及び抗腫瘍能力の発揮を抑制し、ＮＫ細胞を枯渇状態にする。現在、免疫検査点遮断、活性化性抗体、活性化性サイトカインなど、腫瘍微小環境におけるＮＫ細胞の枯渇を回復するための多くの方法もあり、これらの方法はＮＫ細胞に活性化信号を提供したり、腫瘍微小環境における抑制信号を遮断したり、ＮＫ細胞を正常な活性化状態に回復させたり、抗腫瘍または抗ウイルスの機能を発揮させたりすることができる。
【0003】
ＣＤ１６ＡはＮＫ細胞上で発現される重要な活性化受容体の一種であり、ＣＤ１６Ａがそのリガンドまたは抗体結合によって活性化されると、各種のカスケード活性化反応を誘導し、グラニュール酵素、パーフォリン、炎症性サイトカイン及びケモカインを放出し、これは、ＮＫ細胞に強力な活性化効果と抗腫瘍能力の増強をもたらすと同時に、４－１ＢＢ受容体発現を一時的に向上させる。４－１ＢＢ受容体はＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの１つであり、４－１ＢＢは主に活性化後のＮＫ細胞、Ｔ細胞上で三量体の形で発現し、そのリガンドは４－１ＢＢＬであり、現在発見されている唯一の天然に存在するリガンドでもあり、４－１ＢＢＬと４－１ＢＢが結合すると、４－１ＢＢ受容体が活性化され、この過程は、ＮＫ細胞に一定の活性化効果及びＡＤＣＣ効果の増強をもたらす。
【0004】
現在、ＮＫ細胞アゴニストに関する研究報告がまだ少なく、既存のＮＫ細胞アゴニストはＮＫ細胞を活性化する能力が限られ、さらに改善する余裕がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本開示は、関連技術における技術的問題の一つを少なくともある程度解決することを目的とする。このため、本開示の一つの目的は、ＣＤ１６Ａ受容体と４－１ＢＢ受容体を標的として、新しい二重特異性のＮＫ細胞アゴニスト薬物を取得し、ＮＫ細胞を活性化し、その抗ウイルスと抗腫瘍の能力を増強するために使用され、同時に、ＮＫ細胞の増殖を促進し、及びＴ細胞の機能を増強する潜在的な効果を有する融合タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
このため、本開示の第１態様は、融合タンパク質を提供する。本開示の実施手段によれば、前記融合タンパク質はＣＤ１６Ａ単鎖抗体と４－１ＢＢＬ細胞外領域を含み、前記ＣＤ１６Ａ単鎖抗体は４－１ＢＢＬ細胞外領域に接続され、前記４－１ＢＢＬ細胞外領域は少なくとも１～３個の４－１ＢＢＬ細胞外ドメインを含む。
【0007】
発明者らは、ＣＤ１６Ａ受容体と４－１ＢＢ受容体を標的として、単鎖ＣＤ１６Ａ抗体と４－１ＢＢＬの細胞外セグメント領域を選択し、新型二重特異性のＮＫ細胞アゴニスト薬物ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ／Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを設計することを発見した。このＮＫ細胞アゴニスト薬物は、単鎖ＣＤ１６Ａ抗体がＣＤ１６Ａ受容体を識別した後、融合タンパク質の他端の４－１ＢＢＬの細胞外セグメント領域によって４－１ＢＢ受容体を識別することにより、ＮＫ細胞の増殖が増加してしまう。単鎖のａｎｔｉ－ＣＤ１６Ａ抗体と１～３個、好ましく３個の４－１ＢＢＬ細胞外セグメントを接続し、構築した二重特異性のＮＫ細胞アゴニスト薬物は、ＮＫ細胞を活性化し、その抗ウイルスと抗腫瘍の能力を増強するために使用され、同時に、ＮＫ細胞の増殖を促進し、及びＴ細胞の機能を増強する潜在的な効果を有する。本開示によるｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ／Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質はＣＤ１６Ａ受容体と４－１ＢＢ受容体との結合によりＮＫ細胞の活性化を協力し、ＮＫ細胞の枯渇状態を逆転し、ＮＫ細胞の抗腫瘍能力を増強する。本開示によるｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ／Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質はＮＫ細胞を効果的に増幅し、ＮＫ細胞の純度と増幅倍数を高めることができる。
【0008】
本開示の実施手段によれば、前記融合タンパク質は、以下の付加的な技術的特徴のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【0009】
本開示の実施手段によれば、前記４－１ＢＢＬ細胞外領域は３個の４－１ＢＢＬ細胞外ドメインを含み、３個の前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインは順次接続される。
【0010】
３個の４－１ＢＢＬ細胞外ドメインはＣＤ１６Ａ単鎖抗体に連結されてｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを形成する。ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬは体外でＮＫ細胞を活性化して増幅させる活性を有し、且つ増幅後のＮＫ細胞は比較的に良い細胞毒性を持っている。
【0011】
本開示の実施手段によれば、前記ＣＤ１６Ａ単鎖抗体と４－１ＢＢＬ細胞外領域はフレキシブルジョイントを介して連結される。
【0012】
本開示の実施手段によれば、３個の前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインの間はフレキシブルジョイントを介して連結される。
【0013】
本開示の実施手段によれば、前記融合タンパク質は非哺乳細胞発現系によって発現される。
【0014】
本開示の実施手段によれば、前記非哺乳細胞発現系は原核発現系と低級真核発現系の少なくとも一方を含む。
【0015】
本開示の実施手段によれば、前記非哺乳細胞発現系は大腸菌発現系と酵母発現系の少なくとも一方を含む。
【0016】
本開示の実施手段によれば、前記酵母発現系はピキア酵母発現系を含む。
【0017】
本開示の実施手段によれば、前記ＣＤ１６Ａ単鎖抗体はＶＨ領域とＶＬ領域を含み、前記ＶＨ領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、前記ＶＬ領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
【0018】
本開示の実施手段によれば、前記ＶＨ領域とＶＬ領域は第１のジョイントを介して接続される。
【0019】
本開示の実施手段によれば、前記第１のジョイントはフレキシブルジョイントである。
【0020】
本開示の実施手段によれば、前記第１のジョイントの長さは１０～２０個のアミノ酸である。
【0021】
本開示の実施手段によれば、前記第１のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される。
【0022】
ＣＤ１６Ａ単鎖抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＡＹＹＹＤＦＡＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＣＤ１６Ａ単鎖抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、
ＳＹＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＴＩＳＣＧＧＨＮＩＧＳＫＮＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＮＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＮＹＳＶＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
第１のジョイントのアミノ酸配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＡＹＹＹＤＦＡＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＣＤ１６Ａ単鎖抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、
ＳＹＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＴＩＳＣＧＧＨＮＩＧＳＫＮＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＮＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＮＹＳＶＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
第１のジョイントのアミノ酸配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ。
【0023】
本開示の実施手段によれば、前記ＶＨ領域またはＶＬ領域の一端と前記４－１ＢＢＬ細胞外領域は第２のジョイントを介して接続される。
【0024】
本開示の実施手段によれば、前記第２のジョイントはフレキシブルジョイントである。
【0025】
本開示の実施手段によれば、前記第２のジョイントの長さは１０～２０個のアミノ酸である。
【0026】
本開示の実施手段によれば、前記第２のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
【0027】
第２のジョイントのアミノ酸配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示され、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ。
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ。
【0028】
本開示の実施手段によれば、前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される。
【0029】
４－１ＢＢＬ細胞外ドメインのアミノ酸配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示され、
ＲＥＧＰＥＬＳＰＤＤＰＡＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥ。
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【0030】
本開示の実施手段によれば、３個の前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインはそれぞれ第３のジョイントと第４のジョイントを介して互いに接続され、前記第３のジョイントと第４のジョイントは同一または異なる。
【0031】
本開示の実施手段によれば、前記第３のジョイントと第４のジョイントはいずれもフレキシブルジョイントである。
【0032】
本開示の実施手段によれば、前記第３のジョイントと第４のジョイントの長さは１５～２５個のアミノ酸である。
【0033】
本開示の実施手段によれば、前記第３のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される。
【0034】
本開示の実施手段によれば、前記第４のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される。
【0035】
第３のジョイントのアミノ酸配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示され、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
第４のジョイントのアミノ酸配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示され、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ。
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
第４のジョイントのアミノ酸配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示され、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ。
【0036】
本開示の実施手段によれば、前記融合タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される。
【0037】
融合タンパク質のアミノ酸配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示され、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＡＹＹＹＤＦＡＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＹＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＴＩＳＣＧＧＨＮＩＧＳＫＮＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＮＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＮＹＳＶＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＲＥＧＰＥＬＳＰＤＤＰＡＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＥＧＰＥＬＳＰＤＤＰＡＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＥＧＰＥＬＳＰＤＤＰＡＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥＨＨＨＨＨＨ
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【0038】
本開示の第２の態様は核酸を提供する。本開示の実施手段によれば、前記核酸は第１の態様に記載の融合タンパク質をコードする。
【0039】
本開示の実施手段によれば、前記核酸は酵母発現系のコドンによって最適化された核酸である。
【0040】
本開示の実施手段によれば、前記核酸のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される。
【0041】
コドンによって最適化されていない上記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示され、
ＣＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＴＣＴＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＴＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＴＡＣＴＡＴＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＴＡＴＧＣＴＣＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＡＧＧＴＡＧＡＧＴＴＡＣＴＡＴＧＡＣＴＡＧＡＧＡＴＡＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＡＣＴＧＴＴＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧＧＴＴＡＣＴＧＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＡＣＧＴＣＴＴＧＡＣＴＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＡＡＴＡＴＴＧＧＴＴＣＴＡＡＧＡＡＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴＣＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＣＡＡＧＡＧＡＣＣＡＴＣＴＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＡＡＴＴＣＴＧＧＴＡＡＴＡＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＣＡＡＧＴＴＴＧＧＧＡＴＡＡＴＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＡＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴｇｇａＧＧＴｇｇｃＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＣＧＡＧＧＧＴＣＣＣＧＡＧＣＴＴＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＴＡＣＴＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＣＴＡＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＴＴＴＣＡＣＴＴＧＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＧＧＡＡＣＴＣＧＧＣＣＴＴＣＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＴＧＧＧＣＧＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＣＣＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＴＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＧＧＧＡＣＴＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴｇｇａＧＧＴｇｇｃＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴｇｇａＧＧＴｇｇｃＧＧＴＴＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＴＣＣＣＧＡＧＣＴＴＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＴＡＣＴＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＣＴＡＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＴＴＴＣＡＣＴＴＧＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＧＧＡＡＣＴＣＧＧＣＣＴＴＣＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＴＧＧＧＣＧＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＣＣＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＴＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＧＧＧＡＣＴＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴｇｇａＧＧＴｇｇｃＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴｇｇａＧＧＴｇｇｃＧＧＴＴＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＴＣＣＣＧＡＧＣＴＴＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＴＡＣＴＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＣＴＡＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＴＴＴＣＡＣＴＴＧＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＧＧＡＡＣＴＣＧＧＣＣＴＴＣＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＣＣＴＧＧＧＣＧＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＣＣＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＴＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＧＧＧＡＣＴＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴ
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【0042】
コドンによって最適化された上記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示され、
ＣＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＴＡＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＡＴＡＣＴＡＴＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴＡＴＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＴＡＴＧＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＡＧＧＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＡＴＧＡＣＣＣＧＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＴＧＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣＡＴＡＣＴＡＴＴＡＣＧＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＡＣＧＴＣＴＴＧＡＣＴＣＡＡＣＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＴＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＣＡＴＡＡＴＡＴＡＧＧＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＡＣＡＡＧＣＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＴＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＣＧＧＧＴＡＡＴＡＣＴＧＣＴＡＣＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＧＣＧＧＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＣＧＡＧＧＣＧＧＡＴＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＧＧＡＴＡＡＴＴＡＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＴＣＧＧＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＣＡＧＴＧＴＴＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴｇｇａＧＧＴｇｇｃＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴＧＧＡＣＣＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＧＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＧＧＧＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＧＡＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＡＡＣＡＧＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＴＧＣＴＡＣＡＴＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＧＧＡＧＴＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＡＣＣＣＣＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴＧＧＡＣＣＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＧＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＧＧＧＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＧＡＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＡＡＣＡＧＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＴＧＣＴＡＣＡＴＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＧＧＡＧＴＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＡＣＣＣＣＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴＧＧＡＣＣＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＧＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＧＧＧＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＧＡＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＡＡＣＡＧＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＴＧＣＴＡＣＡＴＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＧＧＡＧＴＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＡＣＣＣＣＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴ
ＣＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＴＡＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＡＴＡＣＴＡＴＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴＡＴＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＴＡＴＧＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＡＧＧＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＡＴＧＡＣＣＣＧＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＴＧＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣＡＴＡＣＴＡＴＴＡＣＧＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＡＣＧＴＣＴＴＧＡＣＴＣＡＡＣＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＴＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＣＡＴＡＡＴＡＴＡＧＧＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＡＣＡＡＧＣＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＴＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＣＧＧＧＴＡＡＴＡＣＴＧＣＴＡＣＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＧＣＧＧＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＣＧＡＧＧＣＧＧＡＴＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＧＧＡＴＡＡＴＴＡＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＴＣＧＧＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＣＡＧＴＧＴＴＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴｇｇａＧＧＴｇｇｃＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴＧＧＡＣＣＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＧＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＧＧＧＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＧＡＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＡＡＣＡＧＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＴＧＣＴＡＣＡＴＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＧＧＡＧＴＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＡＣＣＣＣＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴＧＧＡＣＣＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＧＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＧＧＧＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＧＡＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＡＡＣＡＧＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＴＧＣＴＡＣＡＴＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＧＧＡＧＴＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＡＣＣＣＣＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴＧＧＡＣＣＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＧＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＧＧＧＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＡＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＧＡＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＡＡＣＡＧＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＴＧＣＴＡＣＡＴＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＧＧＡＧＴＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＡＣＣＣＣＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴ
【0043】
本開示の第３の態様が発現ベクターを提供する。本開示の実施手段によれば、前記発現ベクターは第２の態様に記載の核酸を含む。
【0044】
本開示の第４の態様は組換え細胞を提供する。本開示の実施手段によれば、前記組換え細胞は、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクターを担持したり、第１の態様に記載の融合タンパク質を発現したりする。
【0045】
本開示の第５の態様は第１の態様に記載の融合タンパク質、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクターまたは第４の態様に記載の組換え細胞の薬物の製造における使用を提供し、前記薬物は、腫瘍や炎症性疾患の治療や予防に使用される。
【0046】
本開示の実施手段によれば、前記腫瘍は、卵巣癌、肺癌、直腸癌、乳癌、白血病の少なくとも一方を含む。
【0047】
本開示の実施手段によれば、前記炎症性疾患は細菌またはウイルス感染を含む。
【0048】
本開示の実施手段によれば、前記細菌感染は肺炎クレバー、リステリア菌、黄色ブドウ球菌感染症の少なくとも一方を含む。
【0049】
本開示の実施手段によれば、前記ウイルス感染はＨＰＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルス感染のうちの少なくとも１つを含む。
【0050】
本開示の第６態様は第１の態様に記載の融合タンパク質、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクターまたは第４の態様に記載の組換え細胞の体外でのＮＫ細胞の培養増幅における使用を提供する。
【0051】
本開示の実施手段によれば、前記ＮＫ細胞は、末梢血から由来するか、幹細胞の誘導により得られる。本開示の実施手段によれば、前記ＮＫ細胞は、ヒト末梢血単一核細胞由来のＮＫ細胞、ヒト臍帯血幹細胞の誘導によるＮＫ細胞、ヒト胚性幹細胞誘導によるＮＫ細胞、ヒトｉＰＳＣ誘導によるＮＫ細胞の少なくとも一方を含む。
【0052】
本開示の第７態様は、薬物組成物を提供する。本開示の実施手段によれば、前記薬物組成物は、第１の態様に記載の融合タンパク質、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクターまたは第４の態様に記載の組換え細胞を含む。
【0053】
本開示の実施手段によれば、前記薬物組成物は、腫瘍や炎症性疾患の治療や予防に使用される。
【0054】
本開示の実施手段によれば、前記腫瘍は、卵巣癌、肺癌、直腸癌、乳癌、白血病の少なくとも一方を含む。
【0055】
本開示の実施手段によれば、前記炎症性疾患は細菌またはウイルス感染を含む。
【0056】
本開示の実施手段によれば、前記細菌感染は肺炎クレバー、リステリア菌、黄色ブドウ球菌感染症の少なくとも一方を含む。
【0057】
本開示の実施手段によれば、前記ウイルス感染はＨＰＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルス感染の少なくとも一方を含む。
【0058】
本開示の第８の態様は試薬キットを提供する。本開示の実施手段によれば、前記試薬キットは第１の態様に記載の融合タンパク質を含む。
【0059】
本開示の実施手段によれば、前記試薬キットはＣＤ１６Ａ及び／又は４－１ＢＢを検出するために使用される。
【0060】
本開示第９の態様は、腫瘍または炎症性疾患を治療または予防する方法を提供する。本開示の実施手段によれば、前記方法は、腫瘍または炎症性疾患を患っている、または疑いのある被験者に、
第１の態様に記載の融合タンパク質、
第２の態様に記載の核酸、
第３の態様に記載の発現ベクター、
第４の態様に記載の組換え細胞、及び
第７態様に記載の薬物組成物の少なくとも一方を投与するステップを含む。
第１の態様に記載の融合タンパク質、
第２の態様に記載の核酸、
第３の態様に記載の発現ベクター、
第４の態様に記載の組換え細胞、及び
第７態様に記載の薬物組成物の少なくとも一方を投与するステップを含む。
【0061】
本開示の実施手段によれば、前記腫瘍は、卵巣癌、肺癌、直腸癌、乳癌、白血病の少なくとも一方を含む。
【0062】
本開示の実施手段によれば、前記炎症性疾患は細菌またはウイルス感染を含む。
【0063】
本開示の実施手段によれば、前記細菌感染は肺炎クレバー、リステリア菌、黄色ブドウ球菌感染症の少なくとも一方を含む。
【0064】
本開示の実施手段によれば、前記ウイルス感染はＨＰＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルス感染の少なくとも一方を含む。
【0065】
本開示の第１０の態様は、第１の態様に記載の融合タンパク質、第２の態様に記載の核酸、第３の態様に記載の発現ベクター、第４の態様に記載の組換え細胞、第７態様に記載の薬物組成物の腫瘍または炎症性疾患の治療または予防における使用を提供する。
【0066】
本開示の実施手段によれば、前記腫瘍は、卵巣癌、肺癌、直腸癌、乳癌、白血病の少なくとも一方を含む。
【0067】
本開示の実施手段によれば、前記炎症性疾患は細菌またはウイルス感染を含む。
【0068】
本開示の実施手段によれば、前記細菌感染は肺炎クレバー、リステリア菌、黄色ブドウ球菌感染症の少なくとも一方を含む。
【0069】
本開示の実施手段によれば、前記ウイルス感染はＨＰＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルス感染の少なくとも一方を含む。
【0070】
本開示の付加的な態様と利点を以下の説明では部分的に示し、部分的に以下の説明から明らかになり、または本開示の実践を通じて了解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0071】
本開示の上記および／または付加的な態様と利点は、以下の図面を組み合わせた実施例の説明から明らかになり、理解しやすい。
【図1】タンパク質発現ベクター及びｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質の模式図である。
【図2】ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質発現クローンのスクリーニング結果であり、図（Ａ）はドットブロット（Ｄｏｔ Ｂｌｏｔ）結果であり、図（Ｂ）はウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）結果（抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体）である。
【図3】ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質の発酵発現結果であり、図（Ａ）は発酵プロセスパラメータのモニタリングであり、図（Ｂ）は標的タンパク質の蓄積時点検出結果である。
【図4】ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質の精製及び物理化学的同定であり、図（Ａ）はｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質純度ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出結果であり、図（Ｂ）はｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質の動的光散乱検出結果であり、図（Ｃ）はｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質のＨＰＬＣ検出結果である。
【図5】ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質の体外活性化ＮＫ細胞活性の検出結果である。
【図6】ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質の体外誘導によるＮＫ細胞の増幅及び増幅効果の評価結果であり、図（Ａ）はｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質の体外誘導によるＮＫ細胞の増幅後のＮＫ純度検出結果であり、図（Ｂ）はｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質の体外誘導によるＮＫ細胞の増幅倍数の検出結果であり、図（Ｃ）はｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質の体外誘導によるＮＫの増幅後の総細胞増幅倍数の検出結果であり、図（Ｄ）はｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質の体外誘導によるＮＫ細胞の増幅後細胞亜群の検出結果であり、図（Ｅ）はｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質の体外誘導によるＮＫ細胞の増幅後の細胞殺傷活性の検出結果である。
【発明を実施するための形態】
【0072】
以下、本開示の実施例を詳細に説明する。以下で説明される実施例は例示的なものであり、本開示を解釈するためにのみ使用され、本開示に対する制限として理解すべきではない。
【0073】
なお、「第１の」、「第２の」といった用語は目的を説明するためのものにすぎず、相対的に重要性を示す若しくは暗に示す、または技術的特徴を明示する数を暗に示すとみなすことはできない。したがって、「第１の」、「第２の」と限定している特徴は１つまたは複数の該特徴を含むことを明示するまたは暗に示すことができる。本開示の説明では、特に明確かつ具体的に限定している場合を除き、「複数」の概念は少なくとも２つ、例えば２つまたは３つである。
【0074】
本開示による幾つかの具体的な実施手段によれば、本開示は、融合タンパク質を提供し、ＣＤ１６Ａ単鎖抗体と４－１ＢＢＬ細胞外領域を含み、前記ＣＤ１６Ａ単鎖抗体は４－１ＢＢＬ細胞外領域に接続され、前記４－１ＢＢＬ細胞外領域は少なくとも１～３個の４－１ＢＢＬ細胞外ドメインを含む。例えば、前記４－１ＢＢＬ細胞外領域は３個の４－１ＢＢＬ細胞外ドメインを含み、３個の前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインは順次接続されて、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質を形成する。
【0075】
本開示による融合タンパク質は、ＣＤ１６Ａ受容体と４－１ＢＢ受容体を標的として、新しい二重特異性のＮＫ細胞アゴニスト薬物、即ちｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを取得し、体外でＮＫ細胞を活性化して増幅する活性を有し、その抗ウイルスと抗腫瘍の能力を増強し、同時に、ＮＫ細胞の増殖を促進し、及びＴ細胞の機能を増強する潜在的な効果を有し、且つ増幅後のＮＫ細胞は比較的良い細胞毒性を有する。
【0076】
ここで、「抗体」という用語は、特異的抗原と結合できる免疫球タンパク質分子である。２本の分子量が軽い軽鎖と２本の分子量が重い重鎖を含み、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）はジスルフィド結合で接続して１つのテトラペプチド鎖分子を形成する。ここで、ペプチド鎖のアミノ端（Ｎ端）アミノ酸配列の変化が大きく、可変領域（Ｖ領域）、カルボキシル端（Ｃ端）は相対的に安定であり、変化が小さく、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。Ｌ鎖とＨ鎖のＶ領域はそれぞれＶＬとＶＨと呼ばれ、Ｌ鎖のＣ領域はＣＬであり、Ｈ鎖のＣ領域はＣＨ１領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む。
【0077】
本開示において、末梢血単一核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）は末梢血中に単一核を有する細胞であり、リンパ球と単核細胞を含む。
【0078】
本開示による幾つかの具体的な実施手段によれば、前記第１、第２、第３、第４の連結ペプチドはグリシンとセリンからなる柔軟なポリペプチドである。
【0079】
本開示による幾つかの具体的な実施手段によれば、本開示による薬物組成物は、任意の溶媒、固体賦形剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、または他の液体賦形剤、分散剤、香味矯正剤または懸濁剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、防腐剤、固体結合剤、流動促進剤または潤滑剤等を含む薬学的に許容されるベクターをさらに含み、特有の標的剤形に適する。任意の従来の添加剤が本開示の融合タンパク質と相溶しない範囲、例えば生成された任意の不良な生物学的効果、または薬学的に許容される組成物の他の成分と有害な方法で生成された相互作用に加えて、その使用も本開示で考慮された範囲である。
【0080】
例えば、本開示の融合タンパク質は、非経口投与（例えば静脈内、皮下、腹膜内、筋肉内）に適した薬物組成物に組み込むことができる。これらの薬物組成物は様々な形態に製造することができる。例えば液体、半固体及び固体剤形などは、液体溶液（例えば、注射溶液と注入溶液）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム及び坐剤を含むが、これらに限定されない。前記融合タンパク質は静脈注入射または筋肉内または皮下注射によって投与することができる。
【0081】
ここで使用される用語「治療」と「予防」及びここに由来する単語は、１００％または完全な治療または予防を暗に示す必要がない。逆に、異なる程度の治療または予防が存在し、当業者は、前記治療または予防は潜在的な利益または治療効果があると考えている。そして、本開示による治療または予防は、癌など、治療または予防中の疾患の１つまたは複数の病患または症状の治療または予防を指す。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患またはその症状または疾患の発症を遅らせることを含むことができる。
【0082】
以下、本開示の実施例を詳細に説明する。以下で説明される実施例は例示的なものであり、本開示を解釈するためにのみ使用され、本開示に対する制限として理解すべきではない。実施例に具体的な技術または条件が示されない場合、当該分野の文献に記載されている技術または条件に従って、または製品の明細書に従って実行する必要がある。用いられる試薬または機器にメーカーが示されない場合、市販によって購入できる従来の製品である。
【0083】
実施例１．二重特異性ＮＫ細胞アゴニストｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬの融合タンパク質発現ベクターの構築
【0084】
１、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合遺伝子の取得
ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａの配列情報（ｓｃｆｖ－ＣＤ１６ＡはＶＨとＶＬを含み、且つＶＨとＶＬはｌｉｎｋｅｒ１を介して接続し、ＶＨのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、ＶＬのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、ｌｉｎｋｅｒ１のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される）を取得し、ＮＣＢＩから４－１ＢＢＬ細胞外セグメント７１－２５４配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される）を取得し、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａと３つの４－１ＢＢＬ細胞外セグメントをｌｉｎｋｅｒ２を介して接続し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される）、且つ３つの４－１ＢＢＬ細胞外セグメントドメインの間は順次ｌｉｎｋｅｒ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される）とｌｉｎｋｅｒ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される）を介して接続する。得られたコドンで最適化されていない元のｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。
ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａの配列情報（ｓｃｆｖ－ＣＤ１６ＡはＶＨとＶＬを含み、且つＶＨとＶＬはｌｉｎｋｅｒ１を介して接続し、ＶＨのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、ＶＬのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、ｌｉｎｋｅｒ１のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される）を取得し、ＮＣＢＩから４－１ＢＢＬ細胞外セグメント７１－２５４配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される）を取得し、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａと３つの４－１ＢＢＬ細胞外セグメントをｌｉｎｋｅｒ２を介して接続し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される）、且つ３つの４－１ＢＢＬ細胞外セグメントドメインの間は順次ｌｉｎｋｅｒ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される）とｌｉｎｋｅｒ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される）を介して接続する。得られたコドンで最適化されていない元のｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。
【0085】
元のｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合遺伝子配列を調整して改造し、ピキア酵母コドンによる最適化を行い、及び両端にＸｈｏｌとＮｏｔＩの２つの酵素切断部位を添加し、最適化して調整した後の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示され、その後、該遺伝子配列を全遺伝子合成し、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質遺伝子配列を得る。
【0086】
２、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質のピキア酵母発現ベクターの構築
前のステップで得られたｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質遺伝子配列とピキア酵母発現プラスミドＰＧＡＰｚα－ｒＤＮＡ－ＮＴＳはいずれも制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌとＮｏｔＩを使用して二重酵素切断を行う。酵素切断ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質遺伝子配列産物遺伝子はＰＣＲ産物回収試薬キットで回収（Ａｘｙｇｅｎ社）し、酵素切断プラスミドはＤＮＡゲル回収試薬キットで回収（Ａｘｙｇｅｎ社）し、操作手順は試薬キットの説明を参照する。回収によって得られた酵素切断後融合タンパク質遺伝子と酵素切断後ベクターはＴ４ ＤＮＡ連結酵素で接続する。酵素連結産物は大腸菌ＴＯＰ１０受容体細胞を形質転換する。形質転換操作手順は、１０μＬの酵素連結産物を１００μＬの大腸菌受容体に加え、均一に混合し、氷上で１５－３０分間静置し、５分おきに均等に弾き、その後、４２℃で９０秒熱刺激し、氷上で３～５分間静置し、４００ｕｌの抗生物質を含まないＬＢ液体培地を加え、３７℃でロッキングベッドで４５分間蘇生培養し、その後、Ｚｅｏｃｉｎ耐性プレートを塗布した。
前のステップで得られたｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質遺伝子配列とピキア酵母発現プラスミドＰＧＡＰｚα－ｒＤＮＡ－ＮＴＳはいずれも制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌとＮｏｔＩを使用して二重酵素切断を行う。酵素切断ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質遺伝子配列産物遺伝子はＰＣＲ産物回収試薬キットで回収（Ａｘｙｇｅｎ社）し、酵素切断プラスミドはＤＮＡゲル回収試薬キットで回収（Ａｘｙｇｅｎ社）し、操作手順は試薬キットの説明を参照する。回収によって得られた酵素切断後融合タンパク質遺伝子と酵素切断後ベクターはＴ４ ＤＮＡ連結酵素で接続する。酵素連結産物は大腸菌ＴＯＰ１０受容体細胞を形質転換する。形質転換操作手順は、１０μＬの酵素連結産物を１００μＬの大腸菌受容体に加え、均一に混合し、氷上で１５－３０分間静置し、５分おきに均等に弾き、その後、４２℃で９０秒熱刺激し、氷上で３～５分間静置し、４００ｕｌの抗生物質を含まないＬＢ液体培地を加え、３７℃でロッキングベッドで４５分間蘇生培養し、その後、Ｚｅｏｃｉｎ耐性プレートを塗布した。
【0087】
プレートにクローン菌コロニーを成長した後、単一のコロニークローンを選択してＬＺ液体培地（Ｚｅｏｃｉｎ耐性のＬＢ培地）を含む細胞培養チューブ内に入れて、３７℃で６－８ｈ培養し、その後、菌液をテンプレートとしてＰＣＲ同定を行い、得られた陽性クローンをＰＧＡＰ－ｚα－ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ（タンパク質発現ベクターは図１に示される）と命名し、陽性クローンに対応する菌液をプラスミド小量抽出試薬キットで抽出し、汎用生物と金唯智に送ってシーケンシングする。
【0088】
シーケンシング結果は理論的に予想される結果と一致し、クローン構築は正しい。
【0089】
実施例２．二重特異性ＮＫ細胞アゴニストｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬの融合タンパク質の発現と精製
【0090】
１、融合タンパク質発現
５０ｍＬのＬＺ液体培地を用いて実施例１で構築された陽性クローンを拡大培養し、中量の試薬キット（Ａｘｙｇｅｎ社）でプラスミドＰＧＡＰ－ｚ α－ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを抽出する。前のステップで調製された発現プラスミドＰＧＡＰｚ α－ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬをエンドヌクレアーゼＳｐｅＩで線形化し、エタノール沈殿により回収する。
５０ｍＬのＬＺ液体培地を用いて実施例１で構築された陽性クローンを拡大培養し、中量の試薬キット（Ａｘｙｇｅｎ社）でプラスミドＰＧＡＰ－ｚ α－ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを抽出する。前のステップで調製された発現プラスミドＰＧＡＰｚ α－ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬをエンドヌクレアーゼＳｐｅＩで線形化し、エタノール沈殿により回収する。
【0091】
エタノール沈殿ステップ：１）酵素切断反応系に２倍体積の無水エタノールと０．１倍体積の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、－２０℃で２時間以上沈殿させる。２）１２０００ｇを１０間遠心分離し、上澄みを廃棄する。３）３００μＬ、７０％のエタノールで再懸濁して沈殿させ、１２０００ｇを１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄する。４）３７℃で乾燥し、脱イオンで再懸濁して濃度を測定し、濃度を０．５－１．０μｇ／μＬに調整する。
【0092】
酵母受容体の製造：作製ステップ：１）凍結保存の良好なバステピキア酵母Ｘ３３菌株を取り、ＹＰＤプレートに線を引き、酵母培養タンクで３０℃恒温培養した。２）クローンが直径１ｍｍ程度に成長したら、クローンを液体４ｍＬＹＰＤ培地に取り出し、酵母をロッキングベッドで３０℃で恒温培養する。３）２４－４８時間培養する。該菌液１ｍＬを５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ培地に接種する。４）ＯＤ６００値が１－１．５に達すると、菌液を５０ｍＬの遠心分離管に移り、４℃で、１５００ｇの菌液を５分間遠心分離し、上澄みを廃棄する。５）５０ｍＬ氷水で再懸濁し、４℃で、１５００ｇを５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、１回繰り返す。６）５０ｍＬの１Ｍコールドソルビトールで再懸濁し、４℃で、１５００ｇを５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、１回繰り返す。７）５００μＬの１Ｍのコールドソルビトールで再懸濁した。
【0093】
電気形質転換ステップ：上記受容体細胞１００μＬを無菌予冷電気回転カップに入れ、その内に１０μＬの線形化プラスミド（５－１０μｇ）を加え、均一に混合する。電気回転計パラメータ：２０００Ｖ、２００Ω、２５μＦに設定する。電気回転し、電気回転した後に直ちに電気回転カップに１ｍのＬ１Ｍコールドソルビトールを加え、氷上で５～１０ｍｉｎ静置し、その後、全部の菌液を１ｍｌのＹＰＤを入れた５０ｍｌ遠心分離管に移り、３０℃で、２２５ｒｐｍ、２ｈ蘇生する。蘇生が終了した後、１００－１０００μＬの上記菌液を取ってＹＰＤＺ（Ｚｅｏｃｉｎ耐性を含むプレート）プレートに塗布し、プレートを３０℃の恒温酵母培養タンクに置いて培養する。
【0094】
陽性発現クローンスクリーニング：上記ＹＰＤＺプレートに酵母クローンを成長した後、若干のクローンを２ｍＬのＢＭＧＹ培地に選択して入れて、酵母をロッキングベッドで２８℃で菌液乳白まで恒温培養する。その中の１ｍＬの菌液を凍結保存して種を保存し、残りの１ｍＬの菌液１２０００ｇを５分間遠心分離した後、上澄みを取り、抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体を用いてＤｏｔ ｂｌｏｔ同定の初期スクリーニング（結果は図２に示される）を行い、発現量が相対的に高い酵母菌株を選別し、その後、発現量が相対的に高い酵母菌株（ｅ１、ｃ７、ｃ１１、ｄ１、ｆ１３）をｚｅｏｃｉｎを含むＹＰＤプレートに塗布し、クローンを成長した後にその中から複数のクローンを選択し、上記のように菌を振って菌液上澄みを取得し、Ａｎｔｉ－ｈｉｓ ｔａｇ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ同定分析を行い、高発現菌株をスクリーニングし、対応する菌株の残りの１ｍＬの菌液を凍結保存して種を保存し、この高発現菌株（ｆ１３－３）はｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ複合体タンパク質を発現できるピキア酵母菌株である。
【0095】
２、融合タンパク質の発酵、精製及び同定
発現菌株培養：組換え菌株の発酵はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の発酵指導マニュアルに従って行う。スクリーニングした高発現菌株を４ｍＬのＹＰＤ培地を含む細胞培養チューブに接種し、ＯＤ６００が２－６にするまで、３０℃でロッキングベッドで２４－４８時間培養し、即ち発酵一級種子液である。１ｍＬの該種子液を取って２００ｍＬのＢＭＧＹ培地を含むコーンボトルに移し入れ、３０℃でロッキングベッドで１２－２４時間培養し、即ち発酵二級種子液である。２００ｍＬの二級種子液を全部６ＬのＢＭＧＹ培地を含む発酵タンクに接種する。パラメータの設定：培養温度３０℃、ｐＨ６．０で、溶存酸素、回転速度などを監視し、発酵培養を開始する。菌体成長段階ではＢＭＧＹ培地を採用し、溶存酸素が急速上昇した場合、培地中の基礎グリセリンが消費され尽くし、グリセリンの添加を開始し、グリセリンの添加速度は７０ｍｌ／ｈであり、発酵温度を２５℃に調整し、発酵の終了まで続く。
発現菌株培養：組換え菌株の発酵はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の発酵指導マニュアルに従って行う。スクリーニングした高発現菌株を４ｍＬのＹＰＤ培地を含む細胞培養チューブに接種し、ＯＤ６００が２－６にするまで、３０℃でロッキングベッドで２４－４８時間培養し、即ち発酵一級種子液である。１ｍＬの該種子液を取って２００ｍＬのＢＭＧＹ培地を含むコーンボトルに移し入れ、３０℃でロッキングベッドで１２－２４時間培養し、即ち発酵二級種子液である。２００ｍＬの二級種子液を全部６ＬのＢＭＧＹ培地を含む発酵タンクに接種する。パラメータの設定：培養温度３０℃、ｐＨ６．０で、溶存酸素、回転速度などを監視し、発酵培養を開始する。菌体成長段階ではＢＭＧＹ培地を採用し、溶存酸素が急速上昇した場合、培地中の基礎グリセリンが消費され尽くし、グリセリンの添加を開始し、グリセリンの添加速度は７０ｍｌ／ｈであり、発酵温度を２５℃に調整し、発酵の終了まで続く。
【0096】
培養液清澄：発酵が終了した後、１００００ｇを３０分間遠心分離し、上澄みを収集し、０．２２μｍと５００ｋＤａマイクロフィルターで濾過清澄した後、その後ＰＨを７．４に調整する。
【0097】
タンパク質の捕獲：アフィニティカラムニッケルカラムを使用して組換え融合タンパク質を捕獲する。具体的なステップは以下の通りである。１）脱イオンでカラムを５カラムの体積洗い流す。２）ＰＢＳでカラムを３カラムの体積洗い流す。３）サンプルを添加する。４）サンプル添加が終了した後、ＰＢＳでカラムを３カラムの体積洗い流す。５）不純物洗浄：１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ溶液を用いてカラムを段階的に洗い流し、濃度当たりを１～１．５カラムの体積洗い流す。６）標的タンパク質を溶出し、溶出液は濃度が２００ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ溶液であり、収集した溶出液が濃縮した後に後続の精製に用いられる。
【0098】
細い精製：ＡＫＴＡ ＰＵＲＥ ２５を使用し、ＰＢＳ緩衝液でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００分子篩を平衡化させ、平衡化した後、中性溶出液にサンプルを添加し、ＰＢＳ緩衝液で洗い流した後に溶出サンプルを収集する。続いて、該サンプルを濃縮した後に同じ方法でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５分子篩を通過し、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ組換えタンパク質を得た。
【0099】
組換えタンパク質の同定：精製されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、動的光散乱同定する。
【0100】
図２は、ＹＰＤＺ耐性培養板でスクリーニングし、融合タンパク質の酵母発現菌株を取得することを示す。Ｄｏｔ ｂｌｏｔを用いて初期スクリーニングを行い、発現量が相対的に高いクローンを初めに取得することができ、その後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔによって確認して比較し、発現量が高い酵母発現クローンをスクリーニングすることができ、続いたタンパク質発現の精製に用いられる。
【0101】
図３は、発酵過程の各パラメータのモニタリングを示し、発酵過程全体が５０時間続いて、発酵過程が安定して繰り返しやすく、図３中の図Ａは、基礎グリセリン培養段階終了時からグリセリンを添加して誘導タンパク質発現（２０ｈ）を制限的に培養し、過程全体のタンパク質が蓄積し続け、４３～５０ｈタンパク質蓄積量はあまり差がなく、発酵終点（図３中の図Ｂはそれぞれ発酵２０ｈ、２８ｈ、３５ｈ、４３ｈ、５０ｈの発酵上澄み液中のｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ組換えタンパク質の量を示す）を判定し、
遠心分離濾過と２段階精製により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ同定により、タンパク質純度は９５％以上（図４中の図Ａと図Ｃ）に達することができ、且つｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬタンパク質分子量は約９５ｋＤａ程度で、予想通りであり、
動的光散乱同定により、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬの分子直径が約１０ｎｍ程度で、分子間の均一性が良い（図４中の図Ｂ）。
遠心分離濾過と２段階精製により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ同定により、タンパク質純度は９５％以上（図４中の図Ａと図Ｃ）に達することができ、且つｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬタンパク質分子量は約９５ｋＤａ程度で、予想通りであり、
動的光散乱同定により、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬの分子直径が約１０ｎｍ程度で、分子間の均一性が良い（図４中の図Ｂ）。
【0102】
実施例３、二重特異性ＮＫ細胞アゴニストｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬの融合タンパク質体外誘導ＮＫ細胞の活性化機能検証
【0103】
Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離法を用いてヒトＰＢＭＣを分離する。分離したＰＢＭＣを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０を用いて１．０×１０６個／ｍＬに希釈する。Ｔ２５培養ボトルに１０ｍＬの希釈後の細胞を添加する。１２時間培養した後、２０ｎＭの最終濃度で培養ボトルにｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質を添加する。２４時間培養した後、フローサイトメータでＮＫ細胞の表現型変化を検出する。
【0104】
結果は、図５に示され、対照群ＰＢＳと比べて、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質を添加した実験群では、ＮＫ細胞表面の主な活性化性分子、例えばＣＤ６９、ＮＫｐ３０及び殺傷性分子４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ、走化性分子ＣＸ３ＣＲ１の発現は顕著に上昇し、これによって、ＮＫ細胞がｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬ融合タンパク質によって効果的に活性化されると判断する。
【0105】
実施例４、二重特異性ＮＫ細胞アゴニストｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬの融合タンパク質体外誘導ＮＫ細胞増幅及び増幅効果の評価
【0106】
１、融合タンパク質増幅ＮＫ細胞の純度及び数の検出：
１）２４ｈ前に融合タンパク質でＴ７５培養ボトルを被覆し、ボトル当たり７．５ｍｌ被覆液を取り、ボトル体の底部を覆う。４℃の冷蔵庫で一晩被覆した。
２）血液試料からＰＢＭＣ細胞を分離した後、計数（マイレー計数器）し、ＰＢＭＣ細胞中の各細胞亜群の百分率を記録する。１．５＊１０６／ｍｌ密度（２０ｍｌ培養体積）に従って接種する。細胞総数は３０＊１０６である。これは、０日目である。同時に、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを含まないＫＢＭ５８１培地に１％のＩＬ２（１０００ＩＵ／ｍｌ）と５％の対応するＰＢＭＣの自己血漿を加える。
３）３日目、対応する培養体積１％のＩＬ２因子を補充する。
４）５日目、培地の色及びＴ７５ボトル体の底部細胞の壁貼り状態を観察し、必要に応じてｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを含む５～１０ｍｌのＫＢＭ５８１培地を補充して補液体積１％のＩＬ２（１０００ＩＵ／ｍｌ）因子を添加する。
５）６日目、サンプリングして計数し、細胞継代拡大培養（１．３＊１０６／ｍｌ）を行う。それに染色標識（ＣＤ３／ＣＤ４５／ＣＤ５６）を行い、フローサイトメータでそのＮＫ細胞亜群の百分率、ＣＤ５６＋細胞亜群の百分率を検出し、総細胞数を計算し、及びフロー純度検出結果からＮＫ細胞数を計算する。５日目以後、細胞継代拡大培養を行い、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを含む基礎培地を使用し、１％のＩＬ２と２％の自己血漿を添加する。
６）７日目、培地の色及びボトル体の細胞の壁貼り成長状態を観察し、必要に応じてＫＢＭ５８１培地を補充して補液体積１％のＩＬ２因子を添加する。
７）８日目、サンプリングして計数する。必要に応じて細胞継代拡大（Ｔ７５またはＴ１７５ボルト、１．４＊１０６／ｍｌ）を行って培地の１％のＩＬ２因子、２％の自己血漿を添加する。
８）９日目、培地の色及びボトル体の細胞の壁貼り成長状態を観察し、必要に応じて補液（補液体積１％のＩＬ２因子を添加する）する。
９）１０日目、サンプリングして計数し、細胞継代拡大培養（１．５＊１０６／ｍｌ）を行う。それに染色標識（ＣＤ３／ＣＤ４５／ＣＤ５６）を行い、フローサイトメータでそのＮＫ細胞亜群の百分率、ＣＤ５６＋細胞亜群の百分率を検出し、総細胞数を計算し、及びフロー純度検出結果からＮＫ細胞数を計算する。
１０）１２日目、培地の色及びボトル体の細胞の壁貼り成長状態を観察し、必要に応じて補液（補液体積１％のＩＬ２因子を添加する）する。
１１）１３日目、サンプリングして計数し、細胞継代拡大培養（１．５＊１０６／ｍｌ）を行う。それに染色標識（ＣＤ３／ＣＤ４５／ＣＤ５６）を行い、フローサイトメータでそのＮＫ細胞亜群の百分率、ＣＤ５６＋細胞亜群の百分率を検出し、総細胞数を計算し、及びフロー純度検出結果からＮＫ細胞数を計算する。
１２）１５日目、サンプリングして計数する。必要に応じて細胞継代拡大（Ｔ１７５ボルトまたは培養バッグ、１．５＊１０６／ｍｌ）を行い、培地の１％のＩＬ２因子を添加する。
１３）１７日目、サンプリングして計数し、それに染色標識（ＣＤ３／ＣＤ４５／ＣＤ５６）を行い、フローサイトメータでそのＮＫ細胞亜群の百分率、ＣＤ５６＋細胞亜群の百分率を検出し、総細胞数を計算し、及びフロー純度検出結果からＮＫ細胞数を計算する。０、６、１０、１３、１７日目のＮＫ純度及び細胞数に従ってＮＫ細胞の割合及び数の経時変化のグラフを作成する。
１）２４ｈ前に融合タンパク質でＴ７５培養ボトルを被覆し、ボトル当たり７．５ｍｌ被覆液を取り、ボトル体の底部を覆う。４℃の冷蔵庫で一晩被覆した。
２）血液試料からＰＢＭＣ細胞を分離した後、計数（マイレー計数器）し、ＰＢＭＣ細胞中の各細胞亜群の百分率を記録する。１．５＊１０６／ｍｌ密度（２０ｍｌ培養体積）に従って接種する。細胞総数は３０＊１０６である。これは、０日目である。同時に、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを含まないＫＢＭ５８１培地に１％のＩＬ２（１０００ＩＵ／ｍｌ）と５％の対応するＰＢＭＣの自己血漿を加える。
３）３日目、対応する培養体積１％のＩＬ２因子を補充する。
４）５日目、培地の色及びＴ７５ボトル体の底部細胞の壁貼り状態を観察し、必要に応じてｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを含む５～１０ｍｌのＫＢＭ５８１培地を補充して補液体積１％のＩＬ２（１０００ＩＵ／ｍｌ）因子を添加する。
５）６日目、サンプリングして計数し、細胞継代拡大培養（１．３＊１０６／ｍｌ）を行う。それに染色標識（ＣＤ３／ＣＤ４５／ＣＤ５６）を行い、フローサイトメータでそのＮＫ細胞亜群の百分率、ＣＤ５６＋細胞亜群の百分率を検出し、総細胞数を計算し、及びフロー純度検出結果からＮＫ細胞数を計算する。５日目以後、細胞継代拡大培養を行い、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを含む基礎培地を使用し、１％のＩＬ２と２％の自己血漿を添加する。
６）７日目、培地の色及びボトル体の細胞の壁貼り成長状態を観察し、必要に応じてＫＢＭ５８１培地を補充して補液体積１％のＩＬ２因子を添加する。
７）８日目、サンプリングして計数する。必要に応じて細胞継代拡大（Ｔ７５またはＴ１７５ボルト、１．４＊１０６／ｍｌ）を行って培地の１％のＩＬ２因子、２％の自己血漿を添加する。
８）９日目、培地の色及びボトル体の細胞の壁貼り成長状態を観察し、必要に応じて補液（補液体積１％のＩＬ２因子を添加する）する。
９）１０日目、サンプリングして計数し、細胞継代拡大培養（１．５＊１０６／ｍｌ）を行う。それに染色標識（ＣＤ３／ＣＤ４５／ＣＤ５６）を行い、フローサイトメータでそのＮＫ細胞亜群の百分率、ＣＤ５６＋細胞亜群の百分率を検出し、総細胞数を計算し、及びフロー純度検出結果からＮＫ細胞数を計算する。
１０）１２日目、培地の色及びボトル体の細胞の壁貼り成長状態を観察し、必要に応じて補液（補液体積１％のＩＬ２因子を添加する）する。
１１）１３日目、サンプリングして計数し、細胞継代拡大培養（１．５＊１０６／ｍｌ）を行う。それに染色標識（ＣＤ３／ＣＤ４５／ＣＤ５６）を行い、フローサイトメータでそのＮＫ細胞亜群の百分率、ＣＤ５６＋細胞亜群の百分率を検出し、総細胞数を計算し、及びフロー純度検出結果からＮＫ細胞数を計算する。
１２）１５日目、サンプリングして計数する。必要に応じて細胞継代拡大（Ｔ１７５ボルトまたは培養バッグ、１．５＊１０６／ｍｌ）を行い、培地の１％のＩＬ２因子を添加する。
１３）１７日目、サンプリングして計数し、それに染色標識（ＣＤ３／ＣＤ４５／ＣＤ５６）を行い、フローサイトメータでそのＮＫ細胞亜群の百分率、ＣＤ５６＋細胞亜群の百分率を検出し、総細胞数を計算し、及びフロー純度検出結果からＮＫ細胞数を計算する。０、６、１０、１３、１７日目のＮＫ純度及び細胞数に従ってＮＫ細胞の割合及び数の経時変化のグラフを作成する。
【0107】
２、融合タンパク質増幅ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の亜群分析
１）細胞内分子標識細胞モネンシン誘導：培養した細胞４×１０６個（２ｍｌ）を６ウェルプレートに入れ、モネンシン（０．５μｇ／μｌ）１０μｌ、３７℃で、５％ＣＯ２恒温培養タンク内で４時間誘導する。
２）単細胞懸濁液の製造：表面分子標識細胞から培養した細胞９．０×１０６個を取って１５ｍｌの遠心分離管に入れ、４００ｇを８分間遠心分離して細胞を収集し、１０ｍｌの１×ＰＢＳで２回洗浄し、最後に０．８１ｍｌの１×ＰＢＳで単細胞懸濁液に再懸濁した。細胞内分子標識細胞モネンシンの誘導が終了した後、５ｍｌの１×ＰＢＳで２回洗浄し、最後に１８０μｌの１×ＰＢＳで単細胞懸濁液に再懸濁した。
３）閉鎖：表面分子標識細胞に９０μｌのマウス血清を入れ、均一に混合し、細胞内分子標識細胞に２０μｌのマウス血清を入れ、均一に混合し、室温で１５～３０分間静置した。
４）抗体標識：閉鎖後の表面分子標識細胞を０．０９ｍｌ／チューブごとに９つのフローチューブに分注し、複数のバッチの細胞を同時に検出した場合、１－８チューブの細胞を複数のバッチの細胞と等量で混合して標識することができ、各チューブの細胞使用量は、０．８－１×１０６個であり、サンプル管１は表面分子標識であり、細胞使用量は０．８－１×１０６個である。サンプル管２は細胞内分子標識であり、細胞使用量は３－４×１０６個であり、対応する蛍光標識抗体を添加し、均一に混合した後に４℃の遮光下に３０分間（その間に１５分ごとに１回混合する）静置する。
１）細胞内分子標識細胞モネンシン誘導：培養した細胞４×１０６個（２ｍｌ）を６ウェルプレートに入れ、モネンシン（０．５μｇ／μｌ）１０μｌ、３７℃で、５％ＣＯ２恒温培養タンク内で４時間誘導する。
２）単細胞懸濁液の製造：表面分子標識細胞から培養した細胞９．０×１０６個を取って１５ｍｌの遠心分離管に入れ、４００ｇを８分間遠心分離して細胞を収集し、１０ｍｌの１×ＰＢＳで２回洗浄し、最後に０．８１ｍｌの１×ＰＢＳで単細胞懸濁液に再懸濁した。細胞内分子標識細胞モネンシンの誘導が終了した後、５ｍｌの１×ＰＢＳで２回洗浄し、最後に１８０μｌの１×ＰＢＳで単細胞懸濁液に再懸濁した。
３）閉鎖：表面分子標識細胞に９０μｌのマウス血清を入れ、均一に混合し、細胞内分子標識細胞に２０μｌのマウス血清を入れ、均一に混合し、室温で１５～３０分間静置した。
４）抗体標識：閉鎖後の表面分子標識細胞を０．０９ｍｌ／チューブごとに９つのフローチューブに分注し、複数のバッチの細胞を同時に検出した場合、１－８チューブの細胞を複数のバッチの細胞と等量で混合して標識することができ、各チューブの細胞使用量は、０．８－１×１０６個であり、サンプル管１は表面分子標識であり、細胞使用量は０．８－１×１０６個である。サンプル管２は細胞内分子標識であり、細胞使用量は３－４×１０６個であり、対応する蛍光標識抗体を添加し、均一に混合した後に４℃の遮光下に３０分間（その間に１５分ごとに１回混合する）静置する。
【0108】
【表1】
【0109】
５）洗浄：各チューブの表面分子標識細胞に１ｍｌの１×ＰＢＳを添加し、４℃で、４００ｇを８分間遠心分離して細胞を収集する。１ｍｌの１×ＰＢＳで２回繰り返して洗浄する。最後に、各チューブに２００ｕｌのＰＢＳを添加して標識後の細胞を再懸濁し、実験群にＤＡＰＩ（５０μｇ／ｍｌ，４０×）５μｌを添加し、チューブに移して上機で検出する。
６）検出：フローサイトメータは計器説明書に従って校正と調整を行う。空白対照チューブサンプルは、前方散乱および横方向散乱の電圧を調整するために使用される。単標対照サンプルは各チャンネルの蛍光補償を調整するために使用される。検出時に細胞ゲートを描写した後、各サンプルゲート内で１×１０４個の細胞を収集する。
６）検出：フローサイトメータは計器説明書に従って校正と調整を行う。空白対照チューブサンプルは、前方散乱および横方向散乱の電圧を調整するために使用される。単標対照サンプルは各チャンネルの蛍光補償を調整するために使用される。検出時に細胞ゲートを描写した後、各サンプルゲート内で１×１０４個の細胞を収集する。
【0110】
３、融合タンパク質増幅ＮＫ細胞の殺傷活性検出
【0111】
標的細胞（Ｋ５６２）懸濁液の製造
１）細胞計数：培養したＫ５６２細胞を０．５％のＦＢＳを含む１６４０培地（標的細胞に用いた培地）で再懸濁し、計数し、細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、
２）ＣＦＳＥ染色：細胞懸濁液にＣＦＳＥ（作動濃度が５μＭ）を添加し、直ちに１ｍＬのピペットで吹き付けて混合し、渦を十分に混ぜ合わせ、３７℃の培養タンクで遮光下で１５ｍｉｎインキュベートし、５ｍｉｎごとに渦を取り出して１回混ぜ合わせ、
３）染色終止：４℃で５倍体積の予冷した完全培地（標的細胞に用いた培地）を添加し、染色を終止し、５分間氷浴する。１４０ｇ、４℃で、５ｍｉｎ遠心分離し、
４）細胞洗浄：４℃で予冷した完全培地（標的細胞に用いた培地）で再懸濁し、細胞を１４０ｇ、４℃で、５ｍｉｎ遠心分離し、繰り返して２回洗浄し、
５）計数：細胞を再懸濁、計数し、細胞密度を２×１０５／ｍＬに調整し、
６）敷板：９６ウェルの円底板に各ウェルに１００μｌのＫ５６２懸濁液を添加し、ウェル当たりの最終細胞数は２００００個／ウェルである。
１）細胞計数：培養したＫ５６２細胞を０．５％のＦＢＳを含む１６４０培地（標的細胞に用いた培地）で再懸濁し、計数し、細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、
２）ＣＦＳＥ染色：細胞懸濁液にＣＦＳＥ（作動濃度が５μＭ）を添加し、直ちに１ｍＬのピペットで吹き付けて混合し、渦を十分に混ぜ合わせ、３７℃の培養タンクで遮光下で１５ｍｉｎインキュベートし、５ｍｉｎごとに渦を取り出して１回混ぜ合わせ、
３）染色終止：４℃で５倍体積の予冷した完全培地（標的細胞に用いた培地）を添加し、染色を終止し、５分間氷浴する。１４０ｇ、４℃で、５ｍｉｎ遠心分離し、
４）細胞洗浄：４℃で予冷した完全培地（標的細胞に用いた培地）で再懸濁し、細胞を１４０ｇ、４℃で、５ｍｉｎ遠心分離し、繰り返して２回洗浄し、
５）計数：細胞を再懸濁、計数し、細胞密度を２×１０５／ｍＬに調整し、
６）敷板：９６ウェルの円底板に各ウェルに１００μｌのＫ５６２懸濁液を添加し、ウェル当たりの最終細胞数は２００００個／ウェルである。
【0112】
ＮＫ細胞の準備と添加
７）適切なＮＫ細胞密度に調製し、
８）Ｅ－Ｐｌａｔｅ １６を取り出し、超清浄テーブルに置き、
９）１００μｌのＮＫ細胞懸濁液を異なるＣＤ５６＋：Ｋ５６２効果標的比（１：１、２：１、４：１、８：１）で培養板内に添加し、なお、３組の対照が更に設置され、即ち、ＣＦＳＥ染色のみの標的細胞（標的細胞の自然死亡率を検出する）、効果細胞のみ（効果細胞がＣＦＳＥ非特異的染色を含まないことを証明する）、標的細胞＋Ｔｗｅｅｎ－２０（標的細胞アポトーシスの陽性対照として）であり、
１０）共同インキュベートし、予め設計された順序で各ウェルにＮＫ細胞を添加する。１２０ｇ、室温で、２ｍｉｎ遠心分離し、有効標的細胞を十分に接触させる。３７℃の培養タンクに戻して４時間インキュベートした。
１１）インキュベートが終了した後、５μｌのＰＩを加え、均一に混合し、遮光下で５ｍｉｎインキュベートし、上機で検出する。
１２）結果分析：殺傷百分率＝［（実験群標の細胞死亡率（％）－標的細胞の死亡率（％））／（１００％－標的細胞の自然死亡率（％））］×１００％）
７）適切なＮＫ細胞密度に調製し、
８）Ｅ－Ｐｌａｔｅ １６を取り出し、超清浄テーブルに置き、
９）１００μｌのＮＫ細胞懸濁液を異なるＣＤ５６＋：Ｋ５６２効果標的比（１：１、２：１、４：１、８：１）で培養板内に添加し、なお、３組の対照が更に設置され、即ち、ＣＦＳＥ染色のみの標的細胞（標的細胞の自然死亡率を検出する）、効果細胞のみ（効果細胞がＣＦＳＥ非特異的染色を含まないことを証明する）、標的細胞＋Ｔｗｅｅｎ－２０（標的細胞アポトーシスの陽性対照として）であり、
１０）共同インキュベートし、予め設計された順序で各ウェルにＮＫ細胞を添加する。１２０ｇ、室温で、２ｍｉｎ遠心分離し、有効標的細胞を十分に接触させる。３７℃の培養タンクに戻して４時間インキュベートした。
１１）インキュベートが終了した後、５μｌのＰＩを加え、均一に混合し、遮光下で５ｍｉｎインキュベートし、上機で検出する。
１２）結果分析：殺傷百分率＝［（実験群標の細胞死亡率（％）－標的細胞の死亡率（％））／（１００％－標的細胞の自然死亡率（％））］×１００％）
【0113】
４、結果分析
図６の図Ａ～Ｃに示すように、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを使用してＰＢＭＣから由来するＮＫ細胞を増幅すると、ＮＫ細胞を効果的に増幅し、ＮＫ細胞の純度及び増幅倍数を向上させ、培養過程全体では最も高くＮＫ細胞の割合を６０％程度に達させることができ、
図６の図Ｄに示すように、増幅後の細胞を亜群分析し、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬによって処理増幅された後のＰＢＭＣ細胞は、ＮＫ細胞の割合が５５％に達し、ＮＫＴの割合が約２０％程度で、合計のＣＤ５６陽性細胞が約７５％程度であり、残りの細胞亜群は増幅後のＰＢＭＣ細胞の中での割合が低く、
図６の図Ｅに示すように、増幅後の細胞の細胞毒性を評価し、増幅後の細胞はＫ５６２細胞を効果的に殺傷することができる。
図６の図Ａ～Ｃに示すように、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬを使用してＰＢＭＣから由来するＮＫ細胞を増幅すると、ＮＫ細胞を効果的に増幅し、ＮＫ細胞の純度及び増幅倍数を向上させ、培養過程全体では最も高くＮＫ細胞の割合を６０％程度に達させることができ、
図６の図Ｄに示すように、増幅後の細胞を亜群分析し、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬによって処理増幅された後のＰＢＭＣ細胞は、ＮＫ細胞の割合が５５％に達し、ＮＫＴの割合が約２０％程度で、合計のＣＤ５６陽性細胞が約７５％程度であり、残りの細胞亜群は増幅後のＰＢＭＣ細胞の中での割合が低く、
図６の図Ｅに示すように、増幅後の細胞の細胞毒性を評価し、増幅後の細胞はＫ５６２細胞を効果的に殺傷することができる。
【0114】
以上のように、これらの結果から、ｓｃｆｖ－ＣＤ１６Ａ－Ｔｒｉｍｅｒ－４－１ＢＢＬは体外でＮＫ細胞活性化して増幅する活性を有し、且つ増幅後のＮＫ細胞は比較的に良い細胞毒性を持っていることを証明する。
【0115】
本明細書の説明では、「一実施例」、「いくつかの実施例」、「例」、「具体例」、または「いくつかの例」という参考用語などの説明は、該実施例または例を組み合わせて説明する具体的な特徴、構造、材料または特点は本発明の少なくとも１つの実施例または例に含まれる。本明細書では、上記用語例示的な叙述は必ずしも同じ実施例または例を対象とする必要がない。また、説明する具体的な特徴、構造、材料または特点はいずれかまたは複数の実施例または例では適切な方式で結合することができる。なお、互いに衝突しない場合、当業者は本明細書に説明される異なる実施例または例以及び異なる実施例または例の特徴を結合と組み合わせることができる。
【0116】
本開示の実施例を提示し記述したが、上記実施例は例示的なものであり、本開示を制限するためのものとして理解することができなく、当業者であれば、本開示の範囲で上記実施例について様々な変化、修正、置換および変形が可能であることが理解できる。
【0117】
関連出願の相互参照
本願は、２０２１年１２月２０日に中国国家知識産権局に提案された、特許出願番号が２０２１１１５６６１６５．１の特許出願の優先権と権益を主張し、その全部内容は参照によりここに組み込まれる。
本願は、２０２１年１２月２０日に中国国家知識産権局に提案された、特許出願番号が２０２１１１５６６１６５．１の特許出願の優先権と権益を主張し、その全部内容は参照によりここに組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ１６Ａ単鎖抗体と４－１ＢＢＬ細胞外領域を含み、前記ＣＤ１６Ａ単鎖抗体は４－１ＢＢＬ細胞外領域に接続され、前記４－１ＢＢＬ細胞外領域は少なくとも１～３個の４－１ＢＢＬ細胞外ドメインを含む融合タンパク質。
【請求項2】
前記４－１ＢＢＬ細胞外領域は３個の４－１ＢＢＬ細胞外ドメインを含み、３個の前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインは順次接続される請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記ＣＤ１６Ａ単鎖抗体と４－１ＢＢＬ細胞外領域はフレキシブルジョイントを介して連結され、任意選択に、３個の前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインの間はフレキシブルジョイントを介して連結される請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記融合タンパク質は非哺乳細胞発現系によって発現され、任意選択に、前記非哺乳細胞発現系は原核発現系と低級真核発現系の少なくとも一方を含み、
任意選択に、前記非哺乳細胞発現系は大腸菌発現系と酵母発現系の少なくとも一方を含み、
任意選択に、前記酵母発現系はピキア酵母発現系を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記ＣＤ１６Ａ単鎖抗体はＶＨ領域とＶＬ領域を含み、前記ＶＨ領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、前記ＶＬ領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、任意選択に、前記ＶＨ領域とＶＬ領域は第１のジョイントを介して接続され、
任意選択に、前記第１のジョイントはフレキシブルジョイントであり、
任意選択に、前記第１のジョイントの長さは１０～２０個のアミノ酸であり、
任意選択に、前記第１のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記ＶＨ領域またはＶＬ領域の一端と前記４－１ＢＢＬ細胞外領域は第２のジョイントを介して接続され、任意選択に、前記第２のジョイントはフレキシブルジョイントであり、
任意選択に、前記第２のジョイントの長さは１０～２０個のアミノ酸であり、
任意選択に、前記第２のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
３個の前記４－１ＢＢＬ細胞外ドメインはそれぞれ第３のジョイントと第４のジョイントを介して互いに接続され、前記第３のジョイントと第４のジョイントは同一または異なり、任意選択に、前記第３のジョイントと第４のジョイントはいずれもフレキシブルジョイントであり、
任意選択に、前記第３のジョイントと第４のジョイントの長さは１５～２５個のアミノ酸であり、
任意選択に、前記第３のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示され、
任意選択に、前記第４のジョイントのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記融合タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項11】
前記核酸は酵母発現系コドンで最適化された核酸であり、任意選択に、前記核酸のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される請求項１０に記載の核酸。
【請求項12】
請求項１０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項13】
請求項１０に記載の核酸を担持した融合タンパク質を発現する組換え細胞。
【請求項14】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸、請求項１２に記載の発現ベクター、請求項１３に記載の組換え細胞の腫瘍や炎症性疾患の治療や予防に使用される薬物の製造における使用。
【請求項15】
前記腫瘍は、卵巣癌、肺癌、直腸癌、乳癌、白血病の少なくとも一方を含み、任意選択に、前記炎症性疾患は細菌またはウイルス感染を含み、
任意選択に、細菌感染は肺炎クレバー、リステリア菌、黄色ブドウ球菌感染症の少なくとも一方を含み、
任意選択に、前記ウイルス感染はＨＰＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルス感染の少なくとも一方を含む請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸、請求項１２に記載の発現ベクター、請求項１３に記載の組換え細胞の体外でのＮＫ細胞の培養増幅における使用。
【請求項17】
前記ＮＫ細胞は末梢血から由来するか、または幹細胞の誘導により得られ、任意選択に、前記ＮＫ細胞は、ヒト末梢血単一核細胞から由来するＮＫ細胞、ヒト臍帯血幹細胞誘導によるＮＫ細胞、ヒト胚性幹細胞誘導によるＮＫ細胞、ヒトｉＰＳＣ誘導によるＮＫ細胞の少なくとも一方を含む請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
請求項１に記載の融合タンパク質を含む薬物組成物。
【請求項19】
前記薬物組成物は、腫瘍や炎症性疾患の治療や予防に使用され、任意選択に、前記腫瘍は、卵巣癌、肺癌、直腸癌、乳癌、白血病の少なくとも一方を含み
任意選択に、前記炎症性疾患は細菌またはウイルス感染を含み、
任意選択に、細菌感染は肺炎クレバー、リステリア菌、黄色ブドウ球菌感染症の少なくとも一方を含み、
任意選択に、前記ウイルス感染はＨＰＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルス感染の少なくとも一方を含む請求項１８に記載の薬物組成物。
【請求項20】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む試薬キット。
【請求項21】
前記試薬キットはＣＤ１６Ａ及び／又は４－１ＢＢを検出するために使用される請求項２０に記載の試薬キット。
【請求項22】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸、請求項１２に記載の発現ベクター、請求項１３に記載の組換え細胞、請求項１８または１９に記載の薬物組成物の腫瘍または炎症性疾患の治療または予防における使用。
【請求項23】
前記腫瘍は、卵巣癌、肺癌、直腸癌、乳癌、白血病の少なくとも一方を含み、任意選択に、前記炎症性疾患は細菌またはウイルス感染を含み、
任意選択に、細菌感染は肺炎クレバー、リステリア菌、黄色ブドウ球菌感染症の少なくとも一方を含み、
任意選択に、前記ウイルス感染はＨＰＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、コロナウイルス感染の少なくとも一方を含む請求項２２に記載の使用。
【国際調査報告】