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特表2024-539750２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノンアルキルアルコール誘導体及びその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-29

(54)【発明の名称】２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノンアルキルアルコール誘導体及びその使用

(51)【国際特許分類】

C07D 209/28 20060101AFI20241022BHJP

A61K 31/405 20060101ALI20241022BHJP

A61K 33/243 20190101ALI20241022BHJP

A61K 31/282 20060101ALI20241022BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20241022BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20241022BHJP

【ＦＩ】

C07D209/28 CSP

A61K31/405

A61K33/243

A61K31/282

A61P35/00

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024546353

(86)(22)【出願日】2022-10-14

(85)【翻訳文提出日】2024-06-14

(86)【国際出願番号】 CN2022125293

(87)【国際公開番号】W WO2023061464

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】202111202003.X

(32)【優先日】2021-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524144833

【氏名又は名称】北京安健熹医藥科技有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ

(72)【発明者】

【氏名】許耀

(72)【発明者】

【氏名】王海勇

(72)【発明者】

【氏名】米春来

(72)【発明者】

【氏名】梅運紅

【テーマコード（参考）】

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BC14

4C086HA12

4C086HA28

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA52

4C086MA55

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206JB16

4C206MA02

4C206MA04

4C206NA05

4C206ZB26

4C206ZC75

(57)【要約】

２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノンアルキルアルコール誘導体、該化合物を含有する医薬組成物、並びに腫瘍の予防及び治療における該化合物の使用が開示される。
［化１］

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）：

【化1】

の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体、又はそれらの混合物。

【請求項2】

請求項１に記載の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項3】

がんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における、請求項１に記載の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体、又は請求項２に記載の医薬組成物の使用。

【請求項4】

対象のがんを治療及び／又は予防する方法であって、請求項１に記載の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体、又は請求項２に記載の医薬組成物を上記対象に投与することを含む方法。

【請求項5】

がんの治療及び／又は予防に使用するための、請求項１に記載の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体、又は請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項6】

上記がんが、肺がん、胃がん、食道がん及び大腸がんから選択される、請求項３に記載の使用、又は請求項４に記載の方法、又は請求項５に記載の化合物又は組成物。

【請求項7】

上記式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを含む組合せ。

【請求項8】

請求項７に記載の組合せと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項9】

対象のがんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における、請求項７に記載の組合せ、又は請求項８に記載の医薬組成物の使用。

【請求項10】

治療で同時使用、逐次使用又は個別使用をするための複合製剤としての、上記式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを含む医薬品。

【請求項11】

患者のがんを治療及び／又は予防する方法であって、上記式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを対象又は患者に同時、逐次又は個別に投与することを含む方法。

【請求項12】

対象のがんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における、上記式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物との使用。

【請求項13】

対象で白金系薬物によって誘導される急性腎障害の軽減のための医薬の製造における、上記式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体の使用。

【請求項14】

対象で白金系薬物によって誘導される急性腎障害を軽減する方法であって、白金系薬物の投与と同時、逐次又は個別に上記式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体を投与することを含む方法。

【請求項15】

上記白金系薬物が、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン及びロプラチンから選択される、請求項７に記載の組合せ、請求項８に記載の医薬組成物、請求項１０に記載の医薬品、請求項１１に記載の方法、請求項１２に記載の使用、請求項１３に記載の使用、又は請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、医薬分野に関するものであり、より詳細には、２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノンアルキルアルコール誘導体、有効成分として該化合物を含む医薬組成物、並びに腫瘍の予防及び治療における該化合物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトの消費構造及びライフスタイルの変化、並びに生活環境の悪化に伴い、悪性腫瘍の発生率は急速に増加しており、ヒトの生命と健康を脅かす最大の脅威となっている。抗がん研究は、ライフサイエンスにおいて最も困難かつ重要な領域のうちの１つであり続けている。

【0003】

がんの標的薬物療法は素晴らしい進歩を遂げ、特に一部の肺がん及び非充実性悪性腫瘍の治療における第一選択となっている。ただし、診療には依然として主に細胞傷害性薬物が使用される。特に、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン及びロプラチンを含む白金系薬物は依然として、多くの一般的ながんにとっての一次治療薬である。しかしながら、白金系薬物は選択性に乏しく、強い副作用を有しており、とりわけ腎毒性は、最も一般的で影響が大きい副作用の１つである。シスプラチンによって引き起こされる腎毒性の発生率は２８～３６％であり、カルボプラチンでは２７％、ネダプラチンでは１０～１５％である。発生率及び障害の程度は投与量に比例しており、主な臨床症状は、血清クレアチニン及び尿素窒素などの増加である。

【0004】

したがって、より安全でより効果的な新規抗腫瘍薬、特に、白金系薬物の抗腫瘍効果を高め、白金系薬物の毒性作用及び副作用を減らすこともできる抗腫瘍薬物を発見することが期待されている。

【0005】

本開示は、２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノンアルキルアルコール誘導体を提供するが、これは、白金系薬物の抗腫瘍効果を高め、同時に白金系薬物の毒性作用及び副作用を減らすことができ、種々の腫瘍に対する優れた治療効果を有する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示の第１の態様は、式（Ｉ）：

【化1】

によって表される２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノンアルキルアルコール誘導体（「式（Ｉ）の化合物」、「Ｒ０１」若しくは「ＲＯ１」と簡潔に称される）、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体、又はそれらの混合物を提供する。

【0007】

本開示の第２の態様は、第１の態様の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体、及び薬学的に許容される賦形剤、及び任意選択的に他の治療薬を含む医薬組成物を提供する。

【0008】

本開示の第３の態様は、がんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における、第１の態様の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体、又は第２の態様の医薬組成物の使用に関するものである。

【0009】

本開示の第４の態様は、対象のがんを治療及び／又は予防する方法であって、第１の態様の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体、又は第２の態様の医薬組成物を上記対象に投与することを含む方法に関するものである。

【0010】

本開示の第５の態様は、がんの治療及び／又は予防において使用するための、第１の態様の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体、又は第２の態様の医薬組成物に関するものである。

【0011】

本開示の第６の態様は、上記がんが、肺がん、胃がん、食道がん及び大腸がんから選択される、第３の態様の使用、又は第４の態様の方法、又は第５の態様の使用のための化合物又は組成物に関するものである。

【0012】

本開示の第７の態様は、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを含む組合せに関するものである。

【0013】

本開示の第８の態様は、第７の態様の組合せと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物に関するものである。

【0014】

本開示の第９の態様は、がんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における第７の態様の組合せの使用に関するものである。

【0015】

本開示の第１０の態様は、治療で同時使用、逐次使用又は個別使用をするための複合製剤としての、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを含む医薬品に関するものである。

【0016】

本開示の第１１の態様は、がんを治療及び／又は予防する方法であって、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを患者に同時、逐次又は個別に投与することを含む方法に関するものである。

【0017】

本開示の第１２の態様は、がんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体の使用に関するものであり、上記治療は、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを患者に同時、逐次又は個別に投与することを含む。

【0018】

本開示の第１３の態様は、がんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物との使用に関するものである。

【0019】

本開示の第１４の態様は、がんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体の使用に関するものであり、上記医薬は、白金系薬物との併用療法で使用される。

【0020】

本開示の第１５の態様は、がんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における白金系薬物の使用に関するものであり、上記医薬は、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体との併用療法で使用される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】ＣＣＫ－８によって検出されたＡ５４９細胞増殖における式（Ｉ）の化合物の効果を示す。ここで、図１Ａは、細胞増殖活性における２４時間にわたりＡ５４９細胞と共培養された各種の濃度の式（Ｉ）の化合物の効果を示す。図１Ｂは、細胞増殖活性における４８時間にわたりＡ５４９細胞と共培養された各種の濃度の式（Ｉ）の化合物の効果を示す。図１Ｃは、細胞増殖活性における７２時間にわたりＡ５４９細胞と共培養された各種の濃度の式（Ｉ）の化合物の効果を示す。図１Ｄは、Ａ５４９細胞増殖活性における各種の時間の長さにわたり共培養された各種の濃度の式（Ｉ）の化合物の効果を示す。

【0022】

【図2】ＣＣＫ－８によって検出されたＮＣＩ－Ｈ４６０細胞増殖における式（Ｉ）の化合物の効果を示す。ここで、図２Ａは、細胞増殖活性における２４時間にわたりＮＣＩ－Ｈ４６０細胞と共培養された各種の濃度の式（Ｉ）の化合物の効果を示す。図２Ｂは、細胞増殖活性における４８時間にわたりＮＣＩ－Ｈ４６０細胞と共培養された各種の濃度の式（Ｉ）の化合物の効果を示す。図２Ｃは、細胞増殖活性における７２時間にわたりＮＣＩ－Ｈ４６０細胞と共培養された各種の濃度の式（Ｉ）の化合物の効果を示す。図２Ｄは、ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞増殖活性における各種の時間の長さにわたり共培養された各種の濃度の式（Ｉ）の化合物の効果を示す。

【0023】

【図3】ＥＤＵ増殖アッセイによって検出された肺がん細胞株の増殖における式（Ｉ）の化合物の効果を示す。１５０μＭの濃度の式（Ｉ）の化合物は、４２時間にわたって細胞と共培養された後、ＦＢＳ刺激ウェルのＦＢＳ濃度は２０％に上昇した。細胞を更に６時間培養した後、Ｃｅｌｌ－ＬｉｇｈｔＥＤＵＡｐｏｌｌｏ５６７キットを使用して検出した。図３Ａは、Ａ５４９細胞の増殖における式（Ｉ）の化合物の効果を示し、図３Ｂは、ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞の増殖における式（Ｉ）の化合物の効果を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。

【0024】

【図4】Ａ５４９細胞及びＮＣＩ－Ｈ４６０細胞のコロニー形成能における各種の濃度の式（Ｉ）の化合物の効果を示す。

【0025】

【図5】２４時間、４８時間及び７２時間にわたり各種の濃度の式（Ｉ）の化合物（０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ）で処理した後のＡ５４９細胞の細胞周期分布の代表的なフローサイトメトリプロファイルを示しており、式（Ｉ）の化合物が、Ａ５４９細胞のＳ期の割合の減少を誘導することが分かる。

【0026】

【図6】２４時間、４８時間及び７２時間にわたり各種の濃度の式（Ｉ）の化合物（０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ）で処理した後のＮＣＩ－Ｈ４６０細胞の細胞周期分布の代表的なフローサイトメトリプロファイルを示しており、式（Ｉ）の化合物が、ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞のＳ期の割合の減少を誘導することが分かる。

【0027】

【図7】各種の濃度の式（Ｉ）の化合物で処理した後、フローサイトメトリで検出されたＡ５４９細胞及びＮＣＩ－Ｈ４６０細胞のアポトーシスの変化の散布図を示す。図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ及び図７Ｄは、７２時間にわたり各種の濃度の式（Ｉ）の化合物（０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ）で処理したＡ５４９細胞の代表的な細胞アポトーシスプロットであり、図７Ｅ、図７Ｆ、図７Ｇ及び図７Ｈは、７２時間にわたり各種の濃度の式（Ｉ）の化合物（０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ）で処理したＮＣＩ－Ｈ４６０細胞の代表的な細胞アポトーシスプロットであり、図７Ｉは、各種の濃度で式（Ｉ）の化合物と共培養された後のＡ５４９細胞の総アポトーシス細胞の割合を示し、図７Ｇは、各種の濃度で式（Ｉ）の化合物と共培養された後のＮＣＩ－Ｈ４６０細胞の総アポトーシス細胞の割合を示す（＊＊Ｐ＜０．０１）。

【0028】

【図8】ＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍組織タンパク質のウェスタンブロット（Ａ）及びグレースケール分析（Ｂ）の結果を示す。ヌードマウスのＮＣＩ－Ｎ８７（３Ｄ＿ＰＮ１５４００４）移植腫瘍モデルでは、式（Ｉ）の化合物の溶液（２ｍｇ／ｋｇ）は、ｐ－ＶＥＧＦＲ２（ＮＳ）を下方制御し、ＶＥＧＦＲ２（Ｐ＜０．０５）及びＶＥＧＦＡ（Ｐ＜０．０５）を下方制御し、β－カテニン（Ｐ＜０．０５）及びサイクリンＤ１（ＮＳ）を下方制御し、ＰＣＮＡ（ＮＳ）を上方制御し、細胞周期調節タンパク質Ｐ２１（ＮＳ）を上方制御し、アポトーシス促進性Ｂａｘ（Ｐ＜０．０１）及び抗アポトーシスタンパク質であるサバイビン（Ｐ＜０．０５）を下方制御した。「ＮＳ」は、薬物投与群とブランク溶媒群との間に統計学的差が存在しなかったことを示し（Ｐ＞０．０５）、「＊」は、薬物投与群とブランク溶媒群との間に有意差が存在したことを示し（Ｐ＜０．０５）、「＊＊」は、薬物投与群とブランク溶媒群との間に高い有意差が存在したことを示す（Ｐ＜０．０１）。

【0029】

【図9】正常摂食したブランク対照群のマウスの糸球体及び尿細管が基本的には損傷を受けておらず、尿細管壁の一部の領域のみが薄くなり、わずかに損傷を受けたことを示している（写真は、ＰＡＳ染色し、２０倍に拡大したものである）。

【0030】

【図10】モデル群のマウスにシスプラチン１０ｍｇ／ｋｇを投与した後の尿細管上皮の重度の損失を示しており、細胞の刷子縁は失われ、多数のタンパク円柱が生じた（写真は、ＨＥ染色し、２０倍に拡大したものである）。

【0031】

【図11】陽性対照群のマウスが、シスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びアミフォスチン（５０ｍｇ／ｋｇ、シスプラチン投与の３０分前に腹腔内投与）を投与した後、わずかな尿細管損傷及びぼやけた尿細管上皮縁のみを発症したことを示す（写真は、ＨＥ染色し、４０倍に拡大したものである）。

【0032】

【図12】アッセイ群のマウスが、シスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＲ０１（６ｍｇ）を投与した後、重度の尿細管損傷、上皮細胞壊死及びわずかなタンパク円柱を発症したことを示す（写真は、ＨＥ染色し、４０倍に拡大したものである）。

【0033】

【図13】アッセイ群のマウスが、シスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＲ０１（１８ｍｇ）を投与した後、視認可能な上皮細胞壊死及びある程度の尿細管損傷を発症したことを示す（写真は、ＨＥ染色し、４０倍に拡大したものである）。

【0034】

【図14】アッセイ群のマウスが、シスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＲ０１（３６ｍｇ）を投与した後、尿細管腔拡大、上皮細胞壊死などを含むわずかな腎障害を発症したことを示す（写真は、ＨＥ染色し、４０倍に拡大したものである）。

【発明を実施するための形態】

【0035】

第１の態様では、本開示は、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体、又はそれらの混合物を提供する。

【0036】

第２の態様では、本開示は、式（Ｉ）の化合物と、任意選択的に薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0037】

第３の態様では、本開示は、式（Ｉ）の化合物、及び薬学的に許容される賦形剤、及び任意選択的に他の治療薬を含む医薬組成物を提供する。

【0038】

第４の態様では、本開示は、式（Ｉ）の化合物と、他の治療薬と、薬学的に許容される担体、アジュバント又はビヒクルとを含むキットを提供する。

【0039】

第５の態様では、本開示は、対象のがんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における式（Ｉ）の化合物の使用を提供する。

【0040】

第６の態様では、本開示は、対象のがんを治療及び／又は予防する方法であって、式（Ｉ）の化合物、又は本開示の組成物を上記対象に投与することを含む方法を提供する。

【0041】

第７の態様では、本開示は、対象のがんの治療及び／又は予防において使用するための、式（Ｉ）の化合物、又は本開示の組成物を提供する。

【0042】

第８の態様では、本開示は、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを含む組合せを提供する。

【0043】

第９の態様では、本開示は、第８の態様の組合せと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0044】

第１０の態様では、本開示は、対象のがんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における第８の態様の組合せの使用を提供する。

【0045】

第１１の態様では、本開示は、治療で同時使用、逐次使用又は個別使用をするための複合製剤としての、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを含む医薬品を提供する。

【0046】

第１２の態様では、本開示は、がんを治療及び／又は予防する方法であって、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを対象又は患者に同時、逐次又は個別に投与することを含む方法を提供する。

【0047】

第１３の態様では、本開示は、がんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体の使用を提供し、上記治療は、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを患者又は対象に同時、逐次又は個別に投与することを含む。

【0048】

第１４の態様では、本開示は、対象のがんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物との使用を提供する。

【0049】

第１５の態様では、本開示は、対象のがんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体の使用を提供し、上記医薬は、白金系薬物との併用療法で使用される。

【0050】

第１６の態様では、本開示は、対象のがんの治療及び／又は予防のための医薬の製造における白金系薬物の使用を提供し、上記医薬は、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体との併用療法で使用される。

【0051】

第１７の態様では、本開示は、対象で白金系薬物によって誘導される急性腎障害の軽減のための医薬品の製造における、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体の使用を提供する。

【0052】

第１８の態様では、本開示は、対象で白金系薬物によって誘導される急性腎障害を軽減する方法であって、上記白金系薬物の投与と同時、逐次又は個別に式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体を投与することを含む方法を提供する。

【0053】

上記態様では、上記白金系薬物は、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン及びロプラチンから選択される。

【0054】

上記態様では、上記がんは、肺がん、胃がん、食道がん及び大腸がんから選択される。

【0055】

本開示の他の目的及び利点は、当業者には、以下の特定の実施形態、実施例及び特許請求の範囲から明らかとなる。
定義

【0056】

「がん」という用語は、以下のがん：胃がん、肺がん、食道がん及び大腸がんを含むが、これらに限定されない。より具体的には、がんとしては、ＨＥＲ２過剰発現転移性胃腺がん又は食道胃接合部腺がん、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子の高感受性変異を有する非小細胞肺がん、白金含有化学療法中又は後に進行する局所進行性又は転移性扁平上皮組織型非小細胞肺がんなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0057】

本明細書で使用される「治療する」という用語は、この用語が適用される障害若しくは状態、又はかかる障害若しくは状態の１つ以上の症状の進行若しくは予防を逆転、軽減又は阻害することに関する。本明細書で使用される「治療」という名詞は、動詞である治療するという行為に関するものであり、これは先ほど定義した通りである。

【0058】

投与が企図される「対象」としては、ヒト（例えば、任意の年齢群の男性若しくは女性、例えば、小児の対象（例えば、乳児、小児、青少年）若しくは成人の対象（例えば、若年成人、中年成人若しくは高齢者））、並びに／又は非ヒト動物、例えば哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、カニグイザル、アカゲザル）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類、ネコ及び／若しくはイヌが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト動物である。「ヒト」、「患者」及び「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。

【0059】

「疾患」、「障害」及び「状態」は、本明細書では互換的に使用され得る。

【0060】

特段指示しない限り、本明細書で使用される「治療」という用語は、特定の疾患、障害若しくは状態を患っている対象における効果であって、該疾患、障害若しくは状態の重症度を低下させるか、又は該疾患、障害若しくは状態の進行を遅延若しくは緩慢にする効果を含む（「治療的治療」）。この用語はまた、対象が特定の疾患、障害若しくは状態を患い始める前に起こる効果を含む（「予防的治療」）。

【0061】

一般的に、化合物の「有効量」は、標的の生物学的応答を誘発させるのに十分な量を指す。当業者に理解されるように、本開示の化合物（すなわち、式（Ｉ）の化合物）の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、治療される疾患、投与様式、並びに対象の年齢、健康状態及び症状などの因子に応じて変化し得る。有効量は、治療有効量及び予防有効量を含む。

【0062】

特段指示しない限り、本明細書で使用される化合物の「治療有効量」は、疾患、障害若しくは状態を治療する過程において治療的利益をもたらすのに、又は該疾患、障害若しくは状態に関連する１つ以上の症状を遅延若しくは最小化するのに十分な量である。化合物の治療有効量は、単独で又は他の療法と組み合わせて使用される際に、疾患、障害若しくは状態の治療に治療的利益をもたらす治療薬の量を指す。「治療有効量」という用語は、治療全体を向上させるか、疾患又は状態の症状又は原因を軽減又は回避するか、又は他の治療薬の治療効果を増強する量を含み得る。

【0063】

特段指示しない限り、本明細書で使用される化合物の「予防有効量」は、疾患、障害若しくは状態を予防するのに十分な量、又は疾患、障害若しくは状態に関連する１つ以上の症状を予防するのに十分な量、又は疾患、障害若しくは状態の再発を予防するのに十分な量である。化合物の予防有効量は、単独で又は他の薬剤と組み合わせて使用される際に、疾患、障害又は状態の予防に予防的利益をもたらす治療薬の量を指す。「予防有効量」という用語は、予防全体を向上させる量、又は他の予防薬の予防効果を増強する量を含み得る。

【0064】

「組合せ」及び関連する用語は、本開示の化合物及び他の治療薬の同時投与又は逐次投与を指す。例えば、本開示の化合物は、他の治療薬と別々の単位投与量で同時若しくは逐次に投与されるか、又は他の治療薬と単一の単位投与量で同時に投与され得る。

【0065】

有機化合物が、反応するか、又は沈殿若しくは結晶化する溶媒と複合体を形成することができることは当業者によって理解されるであろう。これらの複合体は、「溶媒和物」として知られている。溶媒が水である場合、複合体は「水和物」として知られている。本開示は、本開示の化合物のすべての溶媒和物を包含する。

【0066】

「溶媒和物」という用語は、通常は加溶媒分解反応によって、溶媒と結合している化合物又はその塩の形態を指す。この物理的結合は、水素結合を含み得る。従来の溶媒としては、水、メタノール、エタノール、酢酸、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ジエチルエーテルなどが挙げられる。本明細書に記載の化合物は、例えば結晶形態で調製することができ、溶媒和され得る。好適な溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物が挙げられ、更に化学量論的溶媒和物と非化学量論的溶媒和物の両方を含む。いくつかの場合では、溶媒和物は、例えば１つ以上の溶媒分子が結晶固体の結晶格子へと組み込まれる場合に、単離可能となる。「溶媒和物」は、溶液相溶媒和物と単離可能な溶媒和物の両方を含む。代表的な溶媒和物としては、水和物、エタノレート及びメタノレートが挙げられる。

【0067】

「水和物」という用語は、水と結合している化合物を指す。一般には、化合物の水和物中に含有される水分子の数は、水和物の化合物分子の数に対して一定の比にある。したがって、化合物の水和物は、例えば一般式Ｒ・ｘＨ_２Ｏ（式中、Ｒは化合物であり、ｘは０よりも大きい数である）によって表され得る。所与の化合物は、一水和物（ｘは１である）、低級水和物（ｘは０よりも大きく、１よりも小さい数であり、例えば半水和物（Ｒ・０．５Ｈ_２Ｏ）である）、及び多水和物（ｘは１よりも大きな数であり、例えば二水和物（Ｒ・２Ｈ_２Ｏ）及び六水和物（Ｒ・６Ｈ_２Ｏ）である）などを含む、１種類を超える水和物を形成することができる。

【0068】

本開示の化合物は、非晶質又は結晶形態（多形）であり得る。更には、本開示の化合物は、１種以上の結晶形態で存在し得る。したがって、本開示は、本開示のその範囲内の化合物のすべての非晶質又は結晶形態を含む。「多形」という用語は、特定の結晶充填配置である化合物（又はその塩、水和物若しくは溶媒和物）の結晶形態を指す。すべての多形は、同じ元素組成を有する。異なる結晶形態は一般には、異なるＸ線回折パターン、赤外スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学的及び電気的特性、安定性、並びに溶解度を有する。再結晶溶媒、結晶化速度、保存温度及び他の要因によって、１つの結晶形態が大半を占め得る。化合物の様々な多形は、各種の条件下での結晶化によって調製することができる。

【0069】

本開示はまた、同位体（同位体変異体）で標識されている化合物を含む。該同位体は、式（Ｉ）に記載のものと等価であるが、１個以上の原子が、自然界では一般的な原子とは異なる原子質量又は質量数を有する原子で置換されている。本開示の化合物に導入され得る同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素の同位体、例えば、それぞれ^２Ｈ、^３Ｈ、^１３Ｃ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^１７Ｏ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１８Ｆ及び^３６Ｃｌが挙げられる。上記同位体及び／又は他の原子の他の同位体を含む本開示の化合物、そのプロドラッグ及び当該化合物又はプロドラッグの薬学的に許容される塩はすべて、本開示の範囲内である。放射性同位体（例えば、^３Ｈ及び^１４Ｃ）を組み込んだものなど、本開示のある特定の同位体標識化合物は、組織内の薬物及び／又は基質の分布を測定するのに使用され得る。^３Ｈであるトリチウム、及び^１４Ｃ同位体である炭素－１４は、調製と検出が容易であることから、依然として選択肢である。更には、^２Ｈである重水素などのより重い同位体で置換されると、インビボでの半減期の延長、又は投与量要件の減少など、より高い代謝安定性による治療的利益がもたらされ得るため、いくつかの場合では選択肢であり得る。本開示の式（Ｉ）の同位体標識化合物及びそのプロドラッグは一般的には、容易に利用可能な同位体標識試薬を使用して、以下の実施例及び調製例で開示されたスキーム及び／又は手順で非同位体標識試薬を置換することで調製され得る。

【0070】

加えて、プロドラッグもまた本開示の文脈内に含まれる。本明細書で使用される「プロドラッグ」という用語は、例えば血液中での加水分解により、インビボで医学的効果を有する活性形態へと変換される化合物を指す。薬学的に許容されるプロドラッグは、Ｔ．ＨｉｇｕｃｈｉａｎｄＶ．Ｓｔｅｌｌａ，ＰｒｏｄｒｕｇｓａｓＮｏｖｅｌＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，Ａ．Ｃ．Ｓ．ＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１４，ＥｄｗａｒｄＢ．Ｒｏｃｈｅ，ｅｄ．，ＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅＣａｒｒｉｅｒｓｉｎＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ，ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎｄＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，１９８７、及びＤ．Ｆｌｅｉｓｈｅｒ，Ｓ．ＲａｍｏｎａｎｄＨ．Ｂａｒｂｒａ ‘‘Ｉｍｐｒｏｖｅｄｏｒａｌｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｏｖｅｒｃｏｍｅｂｙｔｈｅｕｓｅｏｆｐｒｏｄｒｕｇｓ’’，ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ（１９９６）１９（２）１１５－１３０に記載されており、これらのそれぞれは本明細書中で援用される。

【0071】

プロドラッグは、本開示の任意の共有結合した化合物であり、これらは患者への投与時に体内で親化合物を放出する。プロドラッグは典型的には、通例の操作又は体内での分解のいずれかによって修飾が切断されて親化合物が得られるように官能基を修飾することによって調製される。プロドラッグとしては例えば、ヒドロキシ基、アミノ基又はスルフヒドリル基が任意の基に結合している本開示の化合物が挙げられるが、患者への該化合物の投与時にこの結合が切断されてヒドロキシ基、アミノ基又はスルフヒドリル基が形成され得る。そのため、プロドラッグの代表的な例としては、式（Ｉ）の化合物のヒドロキシ官能基、アミノ官能基又はスルフヒドリル官能基のアセテート／アセトアミド、ホルメート／ホルムアミド及びベンゾエート／ベンズアミド誘導体が挙げられる（が、これらに限定されない）。更には、カルボン酸（－ＣＯＯＨ）の場合には、メチルエステル及びエチルエステルなどのエステルが用いられ得る。エステルは、それ自体で活性であり得て、かつ／又はヒト体内のインビボ条件下で加水分解性であり得る。薬学的に許容され、インビボで加水分解性である好適なエステル基としては、ヒト体内で容易に分解されて親酸又はその塩を放出することができる基が挙げられる。

【0072】

本開示はまた、治療有効量の式（Ｉ）の化合物と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬製剤を提供する。これらの形態はすべて、本開示に属する。

【0073】

本明細書で使用される「医薬の製造」という用語は、医薬の製造の任意の段階での使用に加え、医薬として本開示の成分を直接使用することを含む。

【0074】

本明細書で使用される「併用療法」という用語は、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とが、同時ではない場合には時間制限内に逐次投与され、その結果、これら両方が同じ時間制限内で治療効果を有し得る療法を指す。

【0075】

上記のように、本開示の一態様は、治療で同時使用、逐次使用又は個別使用をするための複合製剤としての、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とを含む医薬品に関するものである。

【0076】

本明細書で使用される場合、「同時に」は、２つの薬剤の同時投与を指すが、「組合せ」という用語は、２つの薬剤を、同時ではない場合には時間制限内に「逐次」投与し、その結果、これら両方が同じ時間制限内で治療効果を有するのに好適であることを指す。そのため、最初に投与された薬剤の循環半減期がどちらも治療有効量で存在することを許す限り、「逐次」投与では、一方の薬剤を投与した５分後、１０分後又は約２、３時間後に他方の薬剤を投与することができる。各成分の投与間の遅延は、各成分の正確な性質、これらの相互作用、及びこれらそれぞれの半減期に応じて変化する。

【0077】

「組合せ」又は「逐次に」と比較すると、本明細書で使用される「個別に」は、一方の薬剤と他方の薬剤の投与間の明らかな間隔を指す。これはすなわち、第２の薬剤の投与時に、投与された第１の薬剤の治療有効量が血流中にもはや存在しないということである。

【0078】

別の代替的な実施形態では、個々の成分の投与と比較すると、治療量以下の式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、治療量以下の白金系薬物とがそれぞれ投与される。言い換えれば、組み合わせて投与されない場合、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とは、治療有効量で投与されない。

【0079】

代替的には、式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物とは、相乗的に相互作用する。本明細書で使用される「相乗」という用語は、組み合わせて使用される場合に、２成分による個々の効果の合計により得られる予想される効果よりも大きな効果を発揮する式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、白金系薬物との能力を指す。有利には、相乗相互作用によって、各成分がより低い投与量で患者に投与され、それによって同じ治療効果を発揮及び／又は維持しつつ、化学療法の毒性を低減することが可能となる。そのため、更に代替的な実施形態では、各成分は治療量以下で投与され得る。
医薬組成物及びキット

【0080】

別の態様では、本開示は、本開示の化合物（「有効成分」とも称される）と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、有効量の本開示の化合物を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の本開示の化合物を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、予防有効量の本開示の化合物を含む。

【0081】

本開示で使用するための薬学的に許容される賦形剤は、ともに製剤化された化合物の薬理学的活性を破壊しない非毒性担体、アジュバント又はビヒクルを指す。本開示の組成物で使用することができる薬学的に許容される担体、アジュバント又はビヒクルとしては、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清タンパク質など）、緩衝物質（リン酸塩など）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリドの混合物、水、塩又は電解質（硫酸プロタミンなど）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、シリカゲル、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びラノリンが挙げられる（が、これらに限定されない）。

【0082】

本開示はキット（例えば医薬パック）も含む。提供されるキットは、本開示の化合物と、他の治療薬と、本開示の化合物及び他の治療薬を含む第１及び第２の容器（例えば、バイアル、アンプル、瓶、シリンジ及び／若しくは分散可能なパッケージ、又は他の好適な容器）とを含み得る。いくつかの実施形態では、提供されるキットはまた、本開示の化合物及び／又は他の治療薬を希釈又は懸濁させるための薬学的に許容される賦形剤を含む第３の容器を任意選択的に含み得る。いくつかの実施形態では、第１の容器中に提供される本開示の化合物、及び第２の容器中に提供される他の治療薬は、組み合わせられて単位剤形を形成する。
投与

【0083】

本開示で提供される医薬組成物は、経口投与、非経口投与、吸入投与、局所投与、直腸投与、経鼻投与、頬側投与、膣内投与、インプラントによる投与、又は他の投与手段を含むが、これらに限定されない種々の経路で投与され得る。例えば、本明細書で使用される非経口投与としては、皮下投与、皮内投与、静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、動脈内投与、関節滑液嚢内投与、胸骨内投与、脳室内投与、病巣内投与、及び頭蓋内注射又は注入技術が挙げられる。

【0084】

一般的に、本明細書で提供される化合物は、有効量で投与される。実際に投与される化合物の量は典型的には、治療される状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、体重及び反応、患者の症状の重症度などを含む関連する状況に照らして、医師によって決定される。

【0085】

本開示に記載の状態を予防するために使用される場合、本明細書で提供される化合物は、典型的には医師の推奨に基づき、状態を発症するリスクがある対象へ投与され、医師の監督下、上述した投与量レベルで投与される。特定の状態を発症するリスクがある対象としては、一般的には、その症状の家族歴を有する対象、又は遺伝子検査若しくはスクリーニングによってその状態を特に発症しやすいと特定された対象が挙げられる。

【0086】

本明細書で提供される医薬組成物はまた、慢性的に投与（「慢性投与」）することができる。慢性投与とは、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、５年などの長期にわたる化合物又はその医薬組成物の投与を指すか、或いは対象の余命にわたってなど、無期限に連続して投与され得る。いくつかの実施形態では、慢性投与は、治療可能時間域内など、長期間、血中にて一定レベルの当該化合物を提供することを意図している。

【0087】

本開示の医薬組成物は、様々な投与方法を使用して更に送達され得る。例えば、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば血中の化合物濃度を有効レベルまで上昇させるために、ボーラス注射で投与され得る。ボーラス投与量は、全身における有効成分の所望の全身レベルに応じて変化する。例えば、筋肉内又は皮下ボーラス投与によって有効成分の徐放が可能となるが、静脈に直接送達されるボーラス（例えばＩＶ点滴）では、血中の有効成分濃度を有効レベルへと急速に上昇させる更に迅速な送達が可能となる。他の実施形態では、医薬組成物は、ＩＶ点滴などによる連続注入の形態で投与され、これによって対象体内での有効成分の定常状態濃度がもたらされ得る。更には、他の実施形態では、医薬組成物のボーラス投与量が最初に投与され、続いて連続注入が行われ得る。

【0088】

経口投与用の組成物は、バルク溶液若しくは懸濁液、又はバルク粉末の形態であり得る。だが、より一般的には、正確な投与を促進させるために、組成物は単位剤形で提供される。「単位剤形」という用語は、ヒト患者及び他の哺乳動物にとって単位投与量として好適である物理的な別個の単位であって、各単位が、好適な薬学的賦形剤とともに所望の治療効果を発揮するように計算された所定の量の有効成分を含有するものを指す。典型的な単位剤形としては、予め充填され、予め測定された液体組成物のアンプル若しくはシリンジ、又は固形組成物の場合には丸剤、錠剤、カプセル剤などが挙げられる。かかる組成物では、当該化合物は一般的には、微量成分（約０．１重量％～約５０重量％、又は代替的には約１重量％～約４０重量％）となり、残りは、所望の剤形を形成するのに有用な様々な担体又は賦形剤及び加工助剤である。

【0089】

経口投与については、代表的なスキームは、１日につき１～５回、特に２～４回、典型的には３回の経口投与である。これらの投与パターンを使用し、各投与によって、約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇの本開示の化合物がもたらされ、代替的な投与ではそれぞれ、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、特に約０．５～約２ｍｇ／ｋｇがもたらされる。

【0090】

注射投与量レベルは、約１～約１２０時間、特に２４～９６時間にわたってはすべて、約０．１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ～少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの範囲である。十分な定常状態レベルを達成するためには、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ以上の前負荷ボーラスもまた投与され得る。４０～８０ｋｇのヒト患者については、最大全投与量は約２ｇ／日を超えるべきではない。

【0091】

経口投与に好適な液体形態は、好適な水性又は非水性担体、緩衝液、懸濁剤及び分散剤、着色剤、フレーバー剤などを含み得る。固体形態は、例えば、以下の成分、又は同様の特性を有する化合物：結合剤（例えば、微結晶セルロース、トラガカントゴム若しくはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプン若しくはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ若しくはトウモロコシデンプン）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；流動化助剤（例えば、コロイド状シリカ）；甘味料（例えば、スクロース若しくはサッカリン）；又はフレーバー剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル若しくはオレンジフレーバー）のうちのいずれかを含み得る。

【0092】

注射可能な組成物は典型的には、注射可能な無菌生理食塩水若しくはリン酸緩衝食塩水、又は当技術分野で公知の他の注射可能な賦形剤に基づいている。前述のように、かかる組成物では、有効成分は典型的には微量成分（多くの場合、約０．０５～１０重量％）となり、残りは注射可能な賦形剤などである。

【0093】

経皮組成物は典型的には、有効成分を含有する局所用軟膏又はクリームとして製剤化される。軟膏として製剤化された場合には、有効成分は典型的には、パラフィン又は水混和性軟膏基剤と混合される。代替的には、有効成分は、水中油型クリーム基剤などとともにクリームとして製剤化され得る。かかる経皮製剤は当技術分野で周知であり、一般には、有効成分又は製剤が安定して皮膚浸透するのを増強するための他の成分を含む。かかる公知の経皮製剤及び成分はすべて、本開示の範囲内に含まれる。

【0094】

本開示の化合物はまた、経皮デバイスで投与され得る。そのため、経皮投与は、リザーバ若しくは多孔質膜型のパッチ、又は複数の固体基材のパッチを使用して達成され得る。

【0095】

経口投与、注射又は局所投与用の組成物の上記成分は、代表的なものにすぎない。他の材料及び加工技術などは、Ｓｅｃｔｉｏｎ８ｏｆＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａに記載されており、これは本明細書中で援用される。

【0096】

本開示の化合物はまた、持続放出形態で、又は持続放出送達系から投与され得る。代表的な持続放出材の説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに見出され得る。
治療

【0097】

したがって、本開示の化合物は、抗腫瘍薬としての価値を有する。特に、本開示の化合物は、固体及び／又は液体腫瘍疾患の封じ込め及び／又は治療における抗増殖薬、アポトーシス剤及び／又は抗侵襲薬としての価値を有する。特に、本開示の化合物は、胃がん、肺がんなどの予防又は治療に有用であることが期待される。

【0098】

患者のがんを治療するのに有用な抗がん効果としては、抗腫瘍効果、奏効率、疾患進行時間及び生存率が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の治療方法の抗腫瘍効果としては、腫瘍増殖の阻害、腫瘍増殖の遅延、腫瘍退縮、腫瘍縮小、治療中止後の腫瘍再生の延長、及び疾患進行の緩慢化が挙げられるが、これらに限定されない。抗がん効果は、予防的治療だけでなく、既存の疾患の治療も含む。

【0099】

本開示の化合物の有効量は一般的には、患者体重の１キログラムあたり０．０１ｍｇ～５０ｍｇの化合物、代替的には患者体重の１キログラムあたり０．１ｍｇ～２５ｍｇの化合物の平均１日投与量であり、単回用量又は複数回用量で投与される。一般的には、本開示の化合物は、患者あたり約１ｍｇ～約３５００ｍｇ、代替的には患者あたり１０ｍｇ～１０００ｍｇの１日投与量範囲でかかる治療の必要がある患者に投与され得る。例えば、各患者の１日投与量は、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、２４０ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、３６０ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ又は１０００ｍｇであり得る。これは、１日に１回以上、週に（若しくは数日間の間隔で）１回以上、又は断続的なスケジュールで投与され得る。例えば、化合物は、毎週（例えば、毎週月曜日）、連続して、又は数週間にわたって（４～１０週など）１日あたり１回以上投与され得る。代替的には、化合物は数日間（例えば２～１０日間）にわたって毎日投与された後、化合物が数日間（例えば１～３０日間）投与されなくともよく、サイクルは連続して、又は所与の回数（４～１０サイクルなど）で繰り返されてもよい。例えば、本発明の化合物は、５日間毎日投与され、続けて９日間休薬した後、５日間毎日投与され、続けて９日間休薬するなどされ、このサイクルを連続して、又は合計４～１０回繰り返してもよい。

【0100】

本開示の式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と組み合わせて使用される白金系薬物は、診療での一般的な投与量又は推奨投与量であることが推奨される。例えば、シスプラチンの一般的な投与量が５０～１００ｍｇ／ｍ^２であるか、又は毎日１５～２０ｍｇ／ｍ^２の静脈内注入が５日間継続され、どちらもが３～４週間にわたって繰り返し投与された。カルボプラチンについては、正常な腎機能を有する患者の推奨投与量が４００ｍｇ／ｍ^２であり、リスク因子を有する患者については、初回投与量を２０～２５％減少させることが推奨され、６５歳を超える患者については、初回投与量及びその後の治療投与量が、患者の健康状態に応じて調整されるべきである。ネダプラチンについては、治療の次過程前に３～４週間の間隔を設けて、用量あたり８０～１００ｍｇ／ｍ^２が投与される。オキサリプラチンについては、推奨投与量が単回用量として１３０ｍｇ／ｍ^２であって、大きな毒性が存在しない状態で３週間（２１日間）ごとに投与されるか、又は８５ｍｇ／ｍ^２であって、２週間ごとに繰り返される。ロバプラチンについては、推奨投与量が単回用量として５０ｍｇ／ｍ^２であり、次の使用前に血中毒性又は他の臨床的副作用からの完全回復が必要とされる。推奨される投与間隔は３週間である。副作用からの回復が緩慢である場合、投与間隔は延長することができる。

【0101】

本開示の式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体が白金系薬物と組み合わせて使用される場合、個々の成分を投与することと比較すると、治療量以下の式（Ｉ）の化合物、又はその溶媒和物、水和物、多形、プロドラッグ若しくは同位体変異体と、治療量以下の白金系薬物とが、それぞれ投与されてもよい。

【実施例】

【0102】

本明細書で使用される材料又は試薬は、市販のものであるか、又は当技術分野で一般的に知られている合成方法によって調製される。
実施例１：式（Ｉ）の化合物の合成

【化2】

【0103】

無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）、６－（１０－ヒドロキシデシル）－２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノン（３．３８ｇ、０．０１ｍｏｌ）及び濃硫酸（０．６ｍＬ）を丸底フラスコに入れ、混合物を撹拌して溶液を得た。次いで、４Ａモレキュラーシーブ（２．５ｇ）及び２－メチル－１－（４－クロロベンゾイル）－５－メトキシ－１Ｈ－インドール－３－酢酸（３．５７ｇ、０．０１ｍｏｌ）を加え、１０時間還流した後、濾過した。濾液を、適当な量の炭酸ナトリウム水溶液と飽和食塩水でそれぞれ洗浄し、次いで中性になるまで水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、黒色の粗生成物を得た。これをカラムクロマトグラフィーで精製して、３．９８ｇの褐色の固体（収率５９．７％及びＨＰＬＣ純度９７．９％）を得た。

【0104】

¹H-NMR (400 MHz, d⁶DMSO): δ 7.64-7.67(d, 2H), 7.45-7.48(d, 2H), 6.96 (s, 1H), 6.85-6.87(d, 1H), 6.65-6.67(d, 1H), 4.07-4.11(t, 2H), 3.98 (s, 6H), 3.83 (s, 3H), 3.66 (s, 2H), 2.42-2.46(t, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.0 (s, 3H), 1.58-1.64(m, 2H), 1.24-1.40(m, 14H).

【0105】

ESI-MS: 678.2 (M+1), 700.2 (M+23).
実施例２：腫瘍細胞増殖、腫瘍細胞周期及びアポトーシスにおける式（Ｉ）の化合物の効果に関する研究

【0106】

１．主な装置及び機器

【表1】

【0107】

２．試験試料及び細胞株

【0108】

ヒト肺がん細胞株Ａ５４９とＮＣＩ－Ｈ４６０との両方は、ＴｏｎｇｊｉＨｏｓｐｉｔａｌのＯｎｃｏｌｏｇｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔＬａｂｏｒａｔｏｒｙのセルバンクからのものであった。

【0109】

３．主なアッセイ試薬

【表2】

【0110】

４．関連溶液は、１０％ＢＳＡ（アルブミンウシｖ１ｇを超純水で１０ｍＬに希釈した）、ＴＢＳＴ（１０ｘＴＢＳ５０ｍＬ及びＴｗｅｅｎ２０５００μＬを超純水で５００ｍＬに希釈した）、細胞凍結保存溶液（ＲＰＭＩ－１６４０培地２８ｍＬ、ＦＢＳ８ｍＬ及びＤＭＳＯ４ｍＬから調製し、４℃で保存）並びに細胞溶解溶液（５００μＭＨＥＰＥＳ１ｍＬ、３Ｍ塩化ナトリウム５００μＬ、５００μＭＥＤＴＡ２０μＬ、５００μＭＥＧＴＡ２０μＬ、２０％トリトンＸ－１００２５０μＬ及びｄｄＨ_２Ｏ７．７ｍＬを混合し、混合物を各管に１ｍＬずつ分け、－２０℃で保存した。１ＭＤＴＴ（使用時に添加）１：１０００、１００μＭＰＭＳＦ（使用時に添加）１：１００、及び２５ｘカクテル（使用時に添加）１：２５）を含んでいた。

【0111】

式（Ｉ）の化合物の保存溶液：式（Ｉ）の化合物は有機溶媒に容易に溶解するため、溶媒としてＤＭＳＯ及びイソプロピルアルコールを３：７の比率で選択した。ＤＭＳＯ及びイソプロピルアルコールを含む容器を、生物学的安全キャビネットで開封した。１５ｍＬ遠心管を取り、ＤＭＳＯ３ｍＬ及びイソプロピルアルコール７ｍＬを加えて、混合溶媒を作製した。式（Ｉ）の化合物の分子量は６７８．２２ｇ／ｍｏｌである。式（Ｉ）の化合物の原薬４０．６９ｍｇを秤量し、混合溶媒４ｍＬを加えた。ピペッティングによって混合物を十分に混合した。薬物保存溶液は、換算すると１５０００μＭの濃度を有し、これを１．５ｍＬＥＰ管に分けた。これらに対して、マーカを用いて名称、濃度及び時間をマーキングし、４℃で保存した。使用時に必要とされる濃度に従って溶液を希釈した。

【0112】

５．アッセイ方法

【0113】

細胞培養

【0114】

（１）細胞回収

【0115】

前もって電動恒温水槽の電源を入れ、温度を３７℃に設定した。温度が設定温度に上昇したら、－８０℃の冷凍庫から細胞凍結保存管を取り出し、３７℃の水槽に入れた。凍結保存管を穏やかに振とうして、細胞を素早く融解させた。細胞凍結保存管を、速度を１２００ｒｐｍに設定した低速遠心分離機へと素早く投入し、５分間遠心分離にかけた。遠心分離後、７５％アルコールを凍結保存管の外側に噴霧した。凍結保存管を生物学的安全キャビネットで開封し、上清を真空吸引器で吸引した。新鮮な完全培地１ｍＬを、ピペットを使用して凍結保存管へとピペッティングして細胞を再懸濁させた。ピペッティングによる混合後、細胞懸濁液をＴ２５細胞培養フラスコ、又は直径６ｃｍの培養皿に移し、次いで新鮮な培地３ｍＬを加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータにて培養した。回収した細胞の接着及び増殖状態は翌日観察する必要があったが、必要に応じて細胞培地を変更した。

【0116】

（２）細胞培地の交換

【0117】

完全培地、ＰＢＳなどを３７℃の水浴に入れて、前もって数分間温め、次いで７５％アルコールを外側に噴霧した後に生物学的安全キャビネットに入れた。細胞を含有する６ｃｍ培養皿をインキュベータから取り出し、倒立型生物顕微鏡下で細胞状態を観察した。真空吸引器の電源を入れ、培養皿中の培地を吸引した。ＰＢＳを用いて培養皿を１、２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄した。完全培地３ｍＬを培養皿に加え、これを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータに入れて培養を継続した。

【0118】

（３）細胞継代及び凍結保存

【0119】

倒立型生物顕微鏡下で細胞増殖状態を観察した。細胞が培養フラスコの底面積の８０％～９０％に増殖した場合、細胞継代を必要とした。培養フラスコを生物学的安全キャビネットに入れた。真空吸引器の電源を入れ、真空吸引器を用いて古い培地を吸引した。適当な量のＰＢＳをピペットを用いて穏やかに加えて、細胞を１、２回すすぎ、ＰＢＳを廃棄した。適当な量のトリプシンを培養フラスコの底部に加え、培養フラスコを穏やかに振とうして、トリプシンで細胞表面を均一に覆い、３７℃のインキュベータに戻した。なお、各種の細胞の消化時間はわずかに異なっており、一般的には２～３分である。細胞が顕微鏡下で観察した際に解離し、丸形及び半透明であり、培養フラスコから脱着して流動する場合、トリプシン量の５～８倍の完全培地を加えて消化を終了させた。ピペットを用いて消化細胞をゆっくりとピペッティングして、消化細胞を単一細胞懸濁液に分散させ、これを４ｍＬ遠心管に移して、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。上清を廃棄し、完全培地を加えて細胞を再懸濁させた。適当な量の細胞懸濁液を必要に応じて培養フラスコに保持し、残った細胞懸濁液をクライオチューブに加えた。完全培地を培養フラスコに３ｍＬまで加えて培養を継続した。１：１の容量比で凍結保存溶液をクライオチューブに加え、次いでこれを－８０℃冷凍庫の凍結保存ボックスに入れ、細胞シートに更新情報を記録した。

【0120】

ＣＣＫ－８アッセイ

【0121】

（１）対数増殖期の細胞を採取し、消化して、細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液２０μＬをピペットを用いて採取し、細胞計数のためのＣｏｕｎｔＳｔａｒ使い捨て細胞計数プレートに加え、計数結果を記録した。細胞濃度を３０，０００～４０，０００細胞／ｍＬに調整した（注：各種の細胞は異なる増殖速度を有するため、各ウェルの細胞数はわずかに異なっていた）。

【0122】

（２）９６ウェルプレートを採取した。培養プレートの最も外側の円のウェルは蒸発及び乾燥しやすく、不正確な容量を生じて誤差を増大させるため、ＰＢＳ１００μＬを最も外側の円のウェルに加え、これらはアッセイウェルとしては使用しなかった。

【0123】

（３）調整した細胞懸濁液を、各ウェルに１００μＬとして９６ウェルプレートに加え、各ウェルで約３０００～４０００個の細胞が得られた。細胞培養のためにプレートを５％ＣＯ_２の条件下で３７℃のインキュベータに入れ、細胞が壁に付着したら薬物を加えた。

【0124】

（４）薬物希釈。濃度勾配を０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び２００μＭとして設定し、各濃度について三重反復とした。加えて、細胞を含まず、培地と薬物のみを含有するブランク対照ウェルも設定した。

【0125】

（５）プレートをそれぞれ２４時間、４８時間及び７２時間にわたってインキュベータでインキュベートした。設定時点に到達した後、９６ウェルプレートをインキュベータから取り出し、気泡を避けるよう注意しながらＣＣＫ－８試薬１０μＬを各ウェルに加えた。プレートを振とうして均一に混合し、インキュベータに戻して更に２時間にわたって培養した。

【0126】

（６）吸光度を検出するために、９６ウェルプレートを化学発光装置に入れ、４５０ｎｍでの吸光度値（ＯＤ値）を検出した。データを記録した。細胞生存率＝（アッセイウェルのＯＤ値－ブランク対照ウェルのＯＤ値）／（溶媒対照ウェルのＯＤ値－ブランク対照ウェルのＯＤ値）×１００％。

【0127】

（７）プロットするためにデータをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５にインポートした。ＩＣ５０値を計算し、曲線を引いた。

【0128】

細胞ＥＤＵ増殖アッセイ

【0129】

（１）対数増殖期の細胞を採取し、２４ウェル培養プレートにウェルあたり１×１０^４個の細胞として播種した。培養プレートを５％ＣＯ_２の条件下、３７℃のインキュベータで培養し、細胞が壁に付着したら、アッセイ設計に従い薬物を加えた。

【0130】

（２）薬物処理後、Ｃｅｌｌ－ＬｉｇｈｔＥＤＵＡｐｏｌｌｏ５６７キットを用意した。キットの試薬Ａを、１６４０完全培地で１０００：１の比率で希釈して、５０μＭＥＤＵ培地を調製した。このうち３００μＬを２４ウェルプレートの各ウェルに配置した。２４ウェルプレートをインキュベータから取り出し、元の培地を真空吸引器を用いて吸引した。ＥＤＵ培地３００μＬを各ウェルに加え、プレートを３７℃インキュベータに戻して２時間にわたって培養を継続した。培地を廃棄した。

【0131】

（３）ＰＢＳ約３００μＬを各ウェルに加えて、細胞を振とう機で洗浄した。細胞を各回５分間、合計で２回洗浄した。目的は、ＤＮＡに組み込まれなかったＥＤＵを溶出することであった。

【0132】

（４）４％パラホルムアルデヒド固定液１５０μＬを各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートしてから、固定液を廃棄した。

【0133】

（５）２ｍｇ／ｍＬグリシン１５０μＬを各ウェルに加え、振とう機上で５分間インキュベートした。次いで、グリシン溶液を廃棄した（このステップを使用して、余分なアルデヒド基を中和した）。

【0134】

（６）ＰＢＳ２００μＬを各ウェルに加えて、振とう機上で５分間洗浄してから、ＰＢＳを廃棄した。

【0135】

（７）ＰＢＳ中０．５％トリトン－Ｘ１００１５０μＬを各ウェルに加え、振とう機上で１０分間インキュベートした。ＰＢＳを加えて、５分間にわたって１回洗浄した。

【0136】

（８）Ａｐｏｌｌｏ染色反応溶液の調製。試薬Ｂ１４０μＬ、試薬Ｃ２８μＬ、試薬Ｄ９．３μＬ、試薬Ｅ２５ｍｇ及び脱イオン水２４００μＬを採取し、完全に混合した。調製したＡｐｏｌｌｏ染色反応溶液２００μＬを各ウェルに加え、振とう機上で室温で３０分間、暗所にてインキュベートした。次いで、染色反応溶液を廃棄した。

【0137】

（９）０．５％トリトン－Ｘ１００１５０μＬを各ウェルに加えて、脱水振とう機上で２～３回、各回１０分間洗浄し、透過液を廃棄した。メタノール１５０μＬを各ウェルに加えて、１、２回、各回５分間洗浄し、メタノールを廃棄した。次いでＰＢＳを加えて、５分間にわたって１回洗浄した。

【0138】

（１０）試薬Ｆを超純水で１００：１の比率にて希釈して、適当な量の核染色用１ｘＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２反応溶液を調製した。

【0139】

（１１）１ｘＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２反応溶液１２０μＬを各ウェルに加え、振とう機上で室温で３０分間、暗所にてインキュベートした。染色溶液を廃棄した。

【0140】

（１２）ＰＢＳ１５０μＬを各ウェルに加えて１回洗浄し、ＰＢＳを廃棄した。次いでＰＢＳ２００μＬを加え、プレートを倒立型蛍光顕微鏡に設置して写真を撮影した。２００ｘ視野下で各ウェルにつき６視野を撮影し、１００個の細胞中のＥＤＵ陽性細胞の割合を計算した。結果をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアにインポートして、ヒストグラムを作成した。

【0141】

コロニー形成アッセイ

【0142】

（１）細胞状態を顕微鏡下で観察した。対数増殖期の細胞を選択し、消化して、細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液２０μＬをピペットを用いて採取し、細胞計数のためのＣｏｕｎｔＳｔａｒ使い捨て細胞計数プレートに加え、計数結果を記録した。

【0143】

（２）コロニー形成アッセイのために６ウェル培養プレートを使用した。約１，０００個の細胞を各ウェルに播種し、完全培地を加えて、ウェルあたり２．５ｍＬの容量とした。細胞を８の字パターンで振とうして、細胞を均一に分散させた。翌日、各種の濃度（０μＭ、５０μＭ及び１５０μＭ）の式（Ｉ）の化合物を、アッセイ計画に従って対応するウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータで約２週間インキュベートした。視認可能なコロニーが現れたら、培養を終了した。

【0144】

（３）培養プレートを取り出し、古い培地を廃棄した。細胞をＰＢＳを用いて穏やかに２回洗浄した。

【0145】

（４）４％パラホルムアルデヒド固定液５００μＬを各ウェルに加えて、細胞を室温で１５分間固定し、次いで固定液を廃棄した。

【0146】

（５）０．１％クリスタルバイオレット溶液５００μＬを各ウェルに加え、細胞を室温で少なくとも１５分間染色した。クリスタルバイオレットを廃棄し、染色溶液を流水でゆっくりと洗い流した。プレートを反転させて室温で乾燥させ、写真を撮影した。

【0147】

細胞周期検出のためのフローサイトメトリ

【0148】

（１）細胞を６ウェルプレートに播種した。細胞の約５０％が付着して融合したら、０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭの濃度の式（Ｉ）の化合物をそれぞれ加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータに入れて培養を継続し、３つの時点をそれぞれ２４時間、４８時間及び７２時間と設定した。

【0149】

（２）指定の時点に到達した後、細胞培養プレートをインキュベータから取り出し、生物学的安全キャビネットに入れた。４ｍＬ遠心管を取り出してマーキングした。各ウェルの上清をピペッティングで取り出し、対応する４ｍＬ遠心管に加えた。細胞をＰＢＳを用いて穏やかに洗浄し、ＰＢＳを対応する遠心管に加えた。適当な量のトリプシンを各ウェルに加えて、細胞を消化した。細胞が適度に消化されたら、遠心管からの古い培地を対応するウェルに加えた。細胞をピペットを用いて穏やかにピペッティングして単一細胞懸濁液を形成し、これをピペッティングで元の遠心管に戻した。管を直ちに１５００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。次いで、上清を廃棄し、沈殿物を保持した。

【0150】

（３）予め冷却したＰＢＳ２ｍＬを遠心管に加え、１５００ｒｐｍで５分間再び遠心分離にかけた。上清を廃棄し、細胞片を除去した。

【0151】

（４）細胞をピペッティングしながら７５％エタノール１ｍＬを加えて、細胞を可能な限り単一になるようにした。次いで、細胞を４℃で一晩固定するか、又は長期保存（１週間保存可能）のために－２０℃で保存した。

【0152】

（５）固定された細胞を取り出し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。エタノールを廃棄し、予め冷却したＰＢＳを加えて細胞を洗浄した。次いで、細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけて、細胞に残留するエタノールを除去した。

【0153】

（６）ＷｕｈａｎＰｒｏｍｏｔｅｒＢｉｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．製の細胞周期検出キットを使用した。ＲＮａｓｅＡ１００μＬを加え、３７℃の水浴で３０分間インキュベートした。

【0154】

（７）ＰＩ４００μＬを加え、十分に混合し、４℃で３０分間、暗所にてインキュベートした。

【0155】

（８）アップフローサイトメトリで細胞周期を検出した。

【0156】

アポトーシス検出のためのフローサイトメトリ

【0157】

（１）細胞を６ウェルプレートに播種した。細胞増殖密度が適当となったら、４つの濃度（０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ）の式（Ｉ）の化合物を加え、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータに入れて、７２時間培養を継続した。

【0158】

（２）指定の時点に到達した後、細胞培養プレートをインキュベータから取り出し、生物学的安全キャビネットに入れた。４ｍＬ遠心管を取り出してマーキングした。６ウェルプレートの上清をピペッティングで取り出し、対応する４ｍＬ遠心管に加えた。細胞をＰＢＳを用いて穏やかに洗浄し、ＰＢＳを対応する遠心管に加えた。適当な量のトリプシンを各ウェルに加えて、細胞を消化した。細胞が適度に消化されたら、遠心管の液体を対応するウェルに加えた。細胞をピペットを用いて穏やかにピペッティングして細胞を分散させ、これをピペッティングで元の遠心管に戻した。管を直ちに１５００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。次いで、上清を廃棄し、沈殿物を保持した。

【0159】

（３）ＰＢＳ２ｍＬを遠心管に加え、これを１０００ｒｐｍで５分間再び遠心分離にかけた。上清を廃棄した。このステップを再度繰り返した。

【0160】

（４）細胞を１ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液を用いて懸濁させ、細胞濃度を約１×１０^６細胞／ｍＬに調整した。細胞懸濁液１００μＬをフローサイトメトリ管に加え、ＰＩ５μＬ及びアネキシンＶ－ＦＩＴＣ５μＬを各管に加えた。細胞を穏やかにボルテックスにかけ、室温で１５分間、暗所にてインキュベートした。

【0161】

（５）１ｘＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液４００μＬを各管に更に加え、フローサイトメータ上で検出を行った（検出は、１時間以内に完了させる必要があった）。

【0162】

６．結果

【0163】

式（Ｉ）の化合物は、肺がん細胞の増殖を阻害した。

【0164】

細胞増殖活性における、２４時間、４８時間及び７２時間にわたってＡ５４９細胞及びＮＣＩ－Ｈ４６０細胞と共培養した各種の濃度（０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び２００μＭ）の式（Ｉ）の化合物の効果を、ＣＣＫ－８方法で検出した。結果は、２４時間、４８時間及び７２時間にわたるＡ５４９細胞のＩＣ５０値が、それぞれ２１３．２±１．２２μＭ（図１Ａ）、５５．５±１．８４μＭ（図１Ｂ）及び３９．７±０．９８μＭ（図１Ｃ）であることを示した。式（Ｉ）の化合物によるＡ５４９細胞の阻害は、時間－濃度依存的であった。これはすなわち、式（Ｉ）の化合物の濃度が上昇するにつれて、阻害効果が増強し、時間が延長するにつれて、阻害効果がまた増強した。

【0165】

式（Ｉ）の化合物はまた、ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞の増殖においても阻害効果を有していた。結果は、２４時間、４８時間及び７２時間にわたるＮＣＩ－Ｈ４６０細胞のＩＣ５０値が、それぞれ１２５．３±１．０１μＭ（図２Ａ）、６６．４±０．８７μＭ（図２Ｂ）及び４８．５±１．１２μＭ（図２Ｃ）であることを示した。式（Ｉ）の化合物によるＮＣＩ－Ｈ４６０細胞増殖の阻害もまた、時間－濃度依存的であった。これはすなわち、濃度が上昇し、作用時間が延長するにつれて、阻害効果が増強した。

【0166】

ＤＮＡ合成の直接検出は、細胞増殖を検出するための最も正確な方法の１つである。ＥＤＵは、ＤＮＡ複製中に新しく合成されたＤＮＡ鎖に組み込まれ得るが、蛍光基が、「クリック」反応を介して、ＥＤＵを含有する新しく合成されたＤＮＡへと標識され、その結果、蛍光を検出することで、細胞の増殖を知ることができる。Ａ５４９細胞及びＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を、１５０μＭの濃度の式（Ｉ）の化合物で４８時間にわたって処理した。細胞増殖アッセイから、式（Ｉ）の化合物で処理した群では、ＣＴＬ（式（Ｉ）の化合物が０μＭであった）と比較して、増殖細胞の割合が著しく低下しており、その差は統計学的に有意であった（図３、Ｐ＜０．０１）。ＦＢＳ刺激によって細胞増殖が促進され得るが、式（Ｉ）の化合物は、高血清濃度の刺激条件によって引き起こされる細胞増殖効果を阻害することができる（Ｐ＜０．０５）。

【0167】

式（Ｉ）の化合物は、肺がん細胞のコロニー形成能を阻害した。

【0168】

細胞のコロニー形成能における式（Ｉ）の化合物の効果を明らかにするために、Ａ５４９細胞及びＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を６ウェルプレートに播種した。次いで、３つの異なる濃度（０μＭ、５０μＭ及び１５０μＭ）の式（Ｉ）の化合物を含有する培地を細胞と共培養した。図４に示されるように、０μＭと比較すると、薬物濃度が上昇するにつれ、２つの肺がん細胞のコロニー形成能は濃度依存的に著しく減少した（図４）。

【0169】

式（Ｉ）の化合物は、肺がん細胞のＳ期の割合を低下させた。

【0170】

前述のように、式（Ｉ）の化合物は、濃度依存的に肺がん細胞の増殖を効果的に阻害した。細胞増殖を阻害した理由を更に調査するために、フローサイトメトリ技術を使用して、式（Ｉ）の化合物で処理した肺がん細胞株の細胞周期分布を検出した。Ａ５４９細胞及びＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を、それぞれ２４時間、４８時間及び７２時間にわたり、各種の濃度（０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ）の式（Ｉ）の化合物を含有する培地で処理した。７５％エタノールで固定した後、細胞をＰＩで染色し、フローサイトメータで分析した。図５に示されるように、Ａ５４９細胞では、０μＭ群と比較すると、式（Ｉ）の化合物は、投与量依存的にＡ５４９細胞のＳ期の割合を低下させた。具体的には、式（Ｉ）の化合物での処理の２４時間後、０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ群の細胞のＳ期の割合は、それぞれ３１．９１％、２２．９４％、１２．５２％及び３．９２％であった。式（Ｉ）の化合物での処理の４８時間後、０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ群の細胞のＳ期の割合は、それぞれ２５．０９％、２４．７３％、１５．９６％及び４．３７％であった。式（Ｉ）の化合物での処理の７２時間後、０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ群の細胞のＳ期の割合は、それぞれ２０．６４％、１９．７７％、１０．６３％及び５．４２％であった。

【0171】

ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞の結果は、Ａ５４９細胞の結果と類似していた。結果を図６に示す。式（Ｉ）の化合物でのＮＣＩ－Ｈ４６０細胞の処理の２４時間後、０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ群のＳ期細胞の割合は、それぞれ２３．５７％、２６．０３％、１３．１５％及び９．７６％であった。式（Ｉ）の化合物での処理の４８時間後、０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ群のＳ期細胞の割合は、それぞれ２９．０９％、２９．６２％、１６．０２％及び０．９７％であった。式（Ｉ）の化合物での処理の７２時間後、０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ群のＳ期細胞の割合は、それぞれ２５．３３％、２１．６１％、２０．９８％及び３．３６％であった。

【0172】

式（Ｉ）の化合物は、肺がん細胞のアポトーシスを促進した。

【0173】

アポトーシス染色には、アネキシンＶ－ＦＩＴＣとＰＩ二重染色法を使用した。ＦＬ１チャネルをＦＩＴＣ用に選択し、ＦＬ２チャネルをＰＩ用に選択した。フローサイトメトリ分析を使用して、細胞アポトーシスを検出した。Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３及びＱ４は、それぞれ死細胞、後期アポトーシス細胞、早期アポトーシス細胞及び正常細胞を表すものであった（図７）。７２時間にわたり、各種の濃度（０μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び９０μＭ）の式（Ｉ）の化合物でＡ５４９細胞及びＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を処理した後、フローサイトメトリの結果は以下の通りである。表１及び表２は、各種の濃度の式（Ｉ）の化合物でＡ５４９細胞及びＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を処理した後の死細胞、後期アポトーシス細胞、早期アポトーシス細胞及び正常細胞の割合をそれぞれ示す。表１及び表２の結果に示されるように、式（Ｉ）の化合物の濃度が低い（１０μＭ、３０μＭ）場合、Ａ５４９細胞及びＮＣＩ－Ｈ４６０細胞中の早期アポトーシス細胞及び後期アポトーシス細胞の各割合は、対照群と比較してわずかに上昇したが、その差は統計学的に有意ではなかった。しかしながら、式（Ｉ）の化合物の濃度が９０μＭに増大した場合、Ａ５４９細胞及びＮＣＩ－Ｈ４６０細胞中の早期アポトーシス細胞及び後期アポトーシス細胞の各割合は、どちらも著しく上昇し、早期アポトーシス細胞の割合の上昇はより明白であった。

【表3】

【表4】

【0174】

表３は、Ａ５４９細胞及びＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を各種の濃度の式（Ｉ）の化合物で処理した後の全アポトーシスの割合の変化を示す。式（Ｉ）の化合物の濃度が９０μＭであった場合、細胞アポトーシスの割合は著しく上昇したが、この現象は、ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞と比較してＡ５４９細胞ではより明白であったことが分かる。

【表5】

実施例３ヌードマウスのヒト胃がんＮ８７移植腫瘍モデルのインビボ腫瘍増殖における、シスプラチンと比較した式（Ｉ）の化合物の阻害効果のアッセイ

【0175】

アッセイ動物

【0176】

メスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（６～７週齢）をＢｅｉｊｉｎｇＶｉｔａｌＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。マウスは、温度２０～２５℃、相対湿度４０～７０％、及び明所１２時間と暗所１２時間のサイクルでＳＰＦ動物室で飼育した。動物は、水及び食物を自由に摂取させた。約１週間の標準摂食後、獣医学検査後に健康状態が良好なマウスを本アッセイのために選択した。グループ分けの前に、マーカを使用して動物の尾の基部にマーキングを行った。グループ分けの後に、各動物は耳に切り込みを入れてマーキングした。

【0177】

シスプラチン（ＤＤＰ）調製

【0178】

溶液を各投与前に調製した。適当な量のＤＤＰを秤量し、ガラス瓶に入れた。次いで、適当な量の生理食塩水を瓶に加え、ボルテックス（５０～６０℃まで水浴で加温され得る）にかけて完全に薬物を溶解させた。ＤＤＰ濃度が０．５ｍｇ・ｍＬ^ー１である溶液を調製した。

【0179】

式（Ｉ）の化合物の投与製剤の調製

【0180】

適当な量の化合物を秤量し、適当な量のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を加えた。混合物をボルテックスにかけて、原液（８ｍｇ・ｍＬ^－１）を調製した。原液を１週間に１回調製し、各パッケージに分けてから２～８℃の冷蔵庫で保存した。各投与前に１管を取り出し、適当な量の３０％Ｓｏｌｕｔｏｌ及びＰＥＧ４００をボルテックスにかけながら加えた。混合物をボルテックスにかけ、十分に混合した。次いで、適当な量の生理食塩水を加え、十分に混合して、濃度が０．４ｍｇ・ｍＬ^－１である投与製剤を得た。そのＤＭＡ：３０％Ｓｏｌｕｔｏｌ：ＰＥＧ４００：生理食塩水の容量比は、５：２０：２０：５５であった。

【0181】

上述の投与製剤の試料は保持する必要があり、製剤の保持された試料の実際の濃度を測定した。

【0182】

移植可能な腫瘍細胞株

【0183】

ヒト胃がん細胞ＮＣＩ－Ｎ８７をＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓのセルバンクから得た（実験室では液体窒素で凍結保存）。

【0184】

ＮＣＩ－Ｎ８７細胞培養

【0185】

ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件下で１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で通例通りに培養した。細胞を０．２５％トリプシンで消化し、１：３～１：５の継代比で細胞増殖条件に従って継代した。

【0186】

動物モデルの調製

【0187】

対数増殖期のＮＣＩ－Ｎ８７細胞を採取して計数し、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁させ、細胞濃度を５×１０^７細胞／ｍＬに調整した。ピペットを用いて細胞をピペッティングしてこれらを均一に分散させ、細胞を５０ｍＬ遠心管に入れ、これをアイスボックスに入れた。１ｍＬシリンジを使用して細胞懸濁液を吸引し、これをヌードマウスの右前肢腋窩に皮下注射した。各動物に１００μＬ（５×１０^６細胞／マウス）を接種して、ヌードマウスのＮＣＩ－Ｎ８７移植腫瘍モデルを確立した。接種後、動物の状態及び腫瘍増殖を定期的に観察し、電子ノギスを使用して腫瘍径を測定した。データをＥｘｃｅｌスプレットシートに入力して、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が１００～３００ｍｍ^３に達したら、良好な健康状態で、類似した腫瘍体積を有する７２匹の動物を選択し、乱塊法を使用して９つの群に分けた（ｎ＝８）。グループ分けの日をアッセイの１日目（Ｄ１）と見なした。アッセイ開始後、腫瘍径を１週間に２回測定し、腫瘍体積を計算し、動物の体重も量って記録した。

【0188】

腫瘍体積（ＴＶ）の計算式は、以下：
ＴＶ（ｍｍ^３）＝ｌ×ｗ^２／２
（式中、ｌは、腫瘍の長径（ｍｍ）を表し、ｗは、腫瘍の短径（ｍｍ）を表す）である。

【0189】

動物のグループ分け及び薬物投与

【表6】

【0190】

アッセイの終了

【0191】

アッセイ最終日（Ｄ４４）に、投与の１時間後（Ｒ０１）にＣＯ_２吸入を用いて動物に麻酔をかけて屠殺し、腫瘍組織を採取して秤量し、写真撮影した。

【0192】

データ記録及び計算式

【0193】

腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）の計算式は、
ＴＧＩ（％）＝１００％×［１－（ＴＶ_ｔ（Ｔ）－ＴＶ_{ｉｎｉｔｉａｌ（Ｔ）}）／（ＴＶ_ｔ（Ｃ）－ＴＶ_{ｉｎｉｔｉａｌ（Ｃ）}）］
（式中、ＴＶ_ｔ（Ｔ）は、処理群において各回測定された腫瘍体積を表し、ＴＶ_{ｉｎｉｔｉａｌ（Ｔ）}は、投与のためにグループ分けされるときの処理群の腫瘍体積を表し、ＴＶ_ｔ（Ｃ）は、溶媒対照群において各回測定された腫瘍堆積を表し、ＴＶ_{ｉｎｉｔｉａｌ（Ｃ）}は、投与のためにグループ分けされるときの溶媒対照群の腫瘍体積を表す）である。

【0194】

動物の体重減少率の計算式は、
動物の体重減少率＝１００％×（ＢＷ_{ｉｎｉｔｉａｌ}－ＢＷ_ｔ）／ＢＷ_{ｉｎｉｔｉａｌ}
（式中、ＢＷ_ｔは、投与期間中に各回測定された動物の体重を表し、ＢＷ_{ｉｎｉｔｉａｌ}は、投与のためにグループ分けされるときの動物の体重を表す）である。

【0195】

統計分析方法

【0196】

アッセイデータを計算し、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ２００７ソフトウェアを使用して統計学的に処理した。特段明記しない限り、データを平均±標準誤差（平均±ＳＥ）として表し、ｔ検定を２群の比較のために使用した。

【0197】

アッセイの観察

【0198】

アッセイ中、実験者及び獣医師は、アッセイ動物の身体的兆候及び健康状態を連続して観察する必要があった。疼痛、抑うつ状態、活性の低下などの動物のパフォーマンス異常を元のアッセイ記録に記録した。アッセイ動物のパフォーマンス異常が、ＩＡＣＵＣ関連動物福祉文書の要件を逸脱する場合、獣医師は、アッセイを終了させるかどうかを決定し、アッセイ担当者に通告することができた。

【0199】

アッセイ結果は以下の通りである。

【表7】

【表8】

【0200】

注：「＊」は、溶媒対照群と比較して腫瘍体積に有意差が存在したことを示し（Ｐ＜０．０５）、「＊＊」は、溶媒対照群と比較して腫瘍体積に高い有意差が存在したことを示す（Ｐ＜０．０１）。

【0201】

本開示の式（Ｉ）の化合物は、一般的に使用される抗胃がん薬物であるシスプラチンよりも抗腫瘍効果が良好であり、シスプラチン群の動物の体重は、ブランク対照群と比較して著しく減少したが、本開示の化合物は、動物の体重に対しては著しい効果を有さなかったことが上記表から分かる。
実施例４複数の移植腫瘍組織におけるＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ／ｐ－ＶＥＧＦＲ及び他のタンパク質の発現の制御に関する定量的研究

【0202】

アッセイ目的

【0203】

本アッセイでは、式（Ｉ）の化合物の抗腫瘍機構を調査する目的で、ウェスタンブロット技術を使用して、実施例３のヌードマウスの消化管腫瘍ＮＣＩ－Ｎ８７移植腫瘍組織での腫瘍増殖及び阻害に関連するシグナル伝達経路における式（Ｉ）の化合物の効果を定量的に研究した。

【0204】

アッセイ材料

【0205】

腫瘍組織試験片は、実施例３の動物腫瘍試験片からのものであった。

【0206】

アッセイ方法

【0207】

ウェスタンブロット技術を使用して、腫瘍組織におけるＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ、サバイビン及び他のタンパク質の発現を定量的に検出した。使用した詳細なアッセイ方法及び材料については、参考文献（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ．Ｊｕｎｅ２０２０，Ｖｏｌｕｍｅ１８，Ｉｓｓｕｅ６，ｐａｇｅ９２６－９３７）及びＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙキットの説明書を参照されたい。本試験では、腫瘍組織タンパク質５０μｇを各ウェルに加え、抗体の作業濃度を説明書に従って希釈した。簡潔には、腫瘍組織を採取し、１％ＰＭＳＤ及び混合プロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡタンパク質溶解溶液で溶解し、１２０００ｘｇで２０分間遠心分離にかけて、上清を採取した。タンパク質の濃度をＢＣＡ法で検出した。１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから得たタンパク質を、セミドライエレクトロポレーションでＰＶＤＦ膜に移した。膜を高速ブロッキング緩衝液で１０分間ブロックし、対応する作業濃度の一次抗体を加え、４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。膜を３回洗浄した後、現像して保存し、グレースケール値をＩｍａｇｅｌａｂで分析した。抗ビンキュリン抗体を内部参照制御抗体として使用した。

【0208】

データ解析

【0209】

ウェスタンブロットバンドのグレースケールをＩｍａｇｅＪソフトウェアで計算し、関連する統計処理にはＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ５を使用した。２群間での比較には、両側ｔ検定を使用した。Ｐ＞０．０５は有意性がない（ＮＳ）ことを意味し、Ｐ＜０．０５は＊であり、Ｐ＜０．００１は＊＊であり、Ｐ＜０．００１は＊＊＊である。

【0210】

結果及び考察

【0211】

本アッセイは、ヌードマウスの消化管腫瘍ＮＣＩ－Ｎ８７移植腫瘍モデルでの式（Ｉ）の化合物の抗腫瘍機構を調査するが、これは、血管新生、細胞増殖及びアポトーシスを含む３つの側面から詳述される。

【0212】

ヌードマウスのＮＣＩ－Ｎ８７移植腫瘍での重要な標的タンパク質の発現における式（Ｉ）の化合物の効果と考えられる腫瘍阻害機構

【0213】

ヌードマウスのＮＣＩ－Ｎ８７移植腫瘍モデルにて、シスプラチン（ＤＤＰ）と式（Ｉ）の化合物の抗腫瘍効果を比較した。式（Ｉ）の化合物は、ｐ－ＶＥＧＦＲ２（ＮＳ）を下方制御し、ＶＥＧＦＲ２（Ｐ＜０．０５）及びＶＥＧＦＡ（Ｐ＜０．０５）を下方制御し、β－カテニン（Ｐ＜０．０５）及びサイクリンＤ１（ＮＳ）を下方制御し、ＰＣＮＡ（ＮＳ）を上方制御し、細胞周期調節タンパク質Ｐ２１（ＮＳ）を上方制御し、アポトーシス促進性Ｂａｘ（Ｐ＜０．０１）及び抗アポトーシスタンパク質であるサバイビン（Ｐ＜０．０５）を下方制御した。ＤＤＰは、ｐ－ＶＥＧＦＲ２（Ｐ＜０．０５）及びＶＥＧＦＡ（ＮＳ）を下方制御し、ＶＥＧＦＲ２（ＮＳ）、β－カテニン（Ｐ＜０．０５）及びサイクリンＤ１（ＮＳ）を上方制御し、アポトーシス阻害タンパク質であるサバイビン（ＮＳ）を下方制御し、細胞周期調節タンパク質Ｐ２１（Ｐ＜０．０５）を下方制御した。したがって、ヌードマウスのＮ８７移植腫瘍モデルでは、式（Ｉ）の化合物は、ＤＤＰと比較してより強力な血管新生阻害効果を示したため、より良好な抗腫瘍効果を有した（図８）。
実施例５：経口投与された試験試料の急性毒性アッセイ

【0214】

試験試料：式（Ｉ）の化合物

【0215】

試験試料の調製

【0216】

溶媒の調製方法及び保存

【0217】

一例として１０００ｍＬの調製を取り上げると、容器に最終容量として１０００ｍＬのマークをマーキングし、最終容量の約２／３の室温の純水を容器に最初に加えた。カルボキシメチルセルロースナトリウム５ｇを正確に秤量し、撹拌しながら容器に加えた。容量をマークに調整し、均一に分散するまで混合物を連続して撹拌して、所望の溶液を得た。

【0218】

溶液を２℃～８℃で２８日間、気密状態で保存した。

【0219】

賦形剤対照群の投与製剤の調製方法及び保存

【0220】

賦形剤対照群の投与製剤の調製：最終容量のマークを容器にマーキングし、必要な量の賦形剤を容器中に秤量した。最初に適当な量の溶媒を加え、撹拌し、完全に混合した後、溶媒を最終容量のマークまで更に加えて希釈し、混合した。視認で均一な製剤を得た。製剤を室温で２４時間、暗所にて気密状態で保存するか、又は２℃～８℃で８日間、暗所にて気密状態で保存した。

【0221】

試験試料の投与製剤の調製方法及び保存

【0222】

試験試料の投与製剤の秤量及び調製は、黄色灯下で実施する必要があった。

【0223】

試験試料の投与製剤の調製：式（Ｉ）の化合物と、エタノール／酢酸エチル（ｖ／ｖ、１／３）との１：１．５の比率での混合物を、室温にて超音波処理で溶解させた。式（Ｉ）の化合物の２．２５当量のＰＶＰを加え、混合物を室温で２０分間、激しく撹拌した。次いで、式（Ｉ）の化合物の２当量のラクトースを加え、混合物を室温で２０分間、激しく撹拌した。混合物を５０℃のオーブンで乾燥させた後に微粉砕して、式（Ｉ）の化合物の黄色の粉末製剤を得た。次いで、適当な量の式（Ｉ）の化合物の製剤を秤量し、適当な量の０．５％ＣＭＣ－Ｎａ水溶液を加えた。混合物をボルテックスにかけ、超音波処理を行って均一に混合して（必要に応じて、せん断乳化を実施し得る）、試験試料の投与製剤を得た。投与製剤を１週間に２回調製し、毎回３又は４日間の投与量を調製した。これを分け、後の使用のために０～８℃の冷蔵庫で保存した。試験試料を使用する際、最終容量のマークを容器にマーキングし、必要な量の試験試料を清浄で乾燥した容器中に秤量した（試験試料の秤量重量＝理論的投与量＊換算係数）。最初に適当な量の溶媒を加え、混合物を撹拌し、完全に混合し、必要に応じて超音波処理した。溶媒を最終容量マークまで更に加えて、希釈して均一に混合して、視認で均一な製剤を得た。方法論的検証を行ったところ、試験試料の投与製剤の濃度範囲は、０．１ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬであった。試験試料の投与製剤は、室温で暗所にて気密状態で保存される場合には２４時間以内は安定であり、２℃～８℃で暗所にて気密状態で保存される場合には８日以内は安定であった。

【0224】

投与製剤を各種の色のラベルで識別した。

【0225】

試験動物：

【0226】

種：ＩＣＲマウス

【0227】

グレード：ＳＰＦグレード

【0228】

使用される動物の数及び性別：４０匹、半数がオスで半数がメス

【0229】

体重：メス群の体重は２５．９～２９．７ｇであり、オス群の体重は２７．７～３０．８ｇであった

【0230】

投与時の日齢：３８～４４日（メス）、３１～４４日（オス）

【0231】

供給源：ＢｅｉｊｉｎｇＶｉｔａｌＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．

【0232】

ライセンス番号：ＳＣＸＫ（Ｊｉｎｇ）２０１６－０００６

【0233】

品質証明書番号：１１００１１２１１１００５１９５７８、１１００１１２１１１００５１９４１４

【0234】

投与量設定：

【表9】

【0235】

＊は、第２群～第４群では式（Ｉ）の化合物の量を表し、第１群では賦形剤の量を表す。

【0236】

投与

【0237】

投与経路：強制経口投与

【0238】

投与経路の選択理由：臨床使用を意図した経路と同様

【0239】

投与頻度：１回／日

【0240】

投与期間：１日

【0241】

投与量は、一晩絶食（飲水可能）後にＤ１に量った動物の体重に基づいて計算した。薬物投与の約２時間後に摂食させた。

【0242】

各群の投与製剤を室温で少なくとも１０分間撹拌し、投与前に目視にて均一に懸濁させた。投与製剤は、投与中に連続して撹拌する必要があった。

【0243】

観察指標：一般的な身体的兆候の観察、体重、食物摂取量、動物の解剖所見及び病理組織学的検査を含んでいた。

【0244】

アッセイ結果

【0245】

賦形剤対照群及び３００ｍｇ／ｋｇ／ｄ投与量群には死亡した動物がいななかった。１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄ投与量群のオスの動物一匹（３２０５番）がＤ３に死亡したことが認められたが、死亡前に明らかな異常は認められなかった。３０００ｍｇ／ｋｇ／ｄ投与量群のオスの動物一匹（４２０５番）がＤ２及びＤ３に立毛症状を有し、Ｄ４に死亡したことが認められた。グループ分けされるときの体重と比較すると、Ｄ３の動物の体重は、著しく減少した。上述の死亡した動物の解剖後、肉眼での観察では明らかな異常は認められなかった。

【0246】

一般的な身体的兆候の観察

【0247】

アッセイ中、賦形剤対照群及び３００ｍｇ／ｋｇ／ｄ投与量群の動物の臨床所見では、明らかな異常症状は認められなかった。１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄ投与量群ではオスの動物一匹が死亡したことが認められたが、死亡した動物では明らかな異常は認められなかった。明らかな異常症状は、他の動物の臨床所見では認められなかった。３０００ｍｇ／ｋｇ／ｄ投与量群ではオスの動物一匹が死亡したことが認められ、Ｄ２及びＤ３に立毛症状を有することが認められた。この群の他の動物は、Ｄ２～Ｄ７に立毛症状を有し、Ｄ８には正常に戻ったことが認められた。

【0248】

上記異常症状の発生率及び重症度は、用量反応関係にあると認められたが、これらは試験試料に関係すると考えられた。

【0249】

体重

【0250】

同じ期間のビヒクル対照群と比較すると、試験試料の各投与量群におけるメスの生存動物の体重に有意差は存在しなかった。試験試料の３０００ｍｇ／ｋｇ／ｄ投与量群のオスの動物は、Ｄ３に体重の著しい減少を示した（Ｐ＜０．０５）。他の期間での各投与量群のオスの生存動物の体重に有意差は存在しなかった。臨床症状の包括的な分析に基づき、これは試験試料に関係すると考えられた。

【0251】

食物摂取量測定

【0252】

各投与量群の動物の平均食物摂取量データを分析することで、各投与量群の食物摂取量がビヒクル対照群の食物摂取量と基本的に一致していたことが分かった。

【0253】

肉眼解剖学的検査

【0254】

各群の予期しない死亡動物及び生存動物に肉眼解剖を実施した。各群の動物の器官及び組織の色、体積、質感などにおいて、明らかな異常は肉眼観察では認められなかった。すなわち、明らかな異常毒性標的器官は肉眼観察では認められなかった。病理組織学的検査は実施しなかった。

【0255】

結論

【0256】

本アッセイの条件下では、１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄ及び３０００ｍｇ／ｋｇ／ｄ投与量群のそれぞれでオスの動物１匹が死亡した。３０００ｍｇ／ｋｇ／ｄ投与量群の動物すべてが立毛症状を示したが、８日目に正常に戻り、この群のオスの動物の体重は、投与後、３日目にわずかに減少した。各投与量群の動物の食物摂取量に明らかな異常は認められなかった。すべての動物を解剖したが、肉眼観察では明らかな異常は認められなかった。要約すると、式（Ｉ）の化合物の単回強制経口投与後のＩＣＲマウスの最大耐量（ＭＴＤ）は３００ｍｇ／ｋｇ／ｄであり、ＬＤ_５０は３０００ｍｇ／ｋｇよりも大きかったが、これは式（Ｉ）の化合物が非常に安全であることを示している。
実施例６：２週間にわたるＩＣＲマウスでの式（Ｉ）の化合物の繰り返し強制経口投与の毒性投与量探索アッセイ

【0257】

式（Ｉ）の化合物を１４日間にわたってＩＣＲマウスに連続して強制経口投与して、式（Ｉ）の化合物が引き起こし得る毒性反応の性質、程度及び時間－効果関係を評価し、その後の研究のための参照情報を得た。

【0258】

試験試料：投与製剤の調製

【0259】

試験試料の投与製剤の秤量及び調製は、黄色灯下で実施する必要があった。

【0260】

各投与量群の試験試料の投与製剤の調製：試験試料の調製は、実施例５と同じであった。試験試料の使用時、最終容量のマークを容器にマーキングし、必要な量の試験試料を容器中に秤量した（試験試料の秤量重量＝理論的投与量＊換算係数）。最初に適当な量の溶媒を加え、混合物を撹拌し、完全に混合し、必要に応じて超音波処理した。溶媒を最終容量のマークまで更に加えて、希釈して均一に混合して、視認で均一な製剤を得た。これに対して方法論的検証を行った。アッセイ結果から、０．１ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲を有する試験試料の投与製剤は、室温、暗所では２４時間以内は安定であった。０．０１ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲を有する試験試料の投与製剤は、２℃～８℃で暗所にて気密状態で保存される場合には８日以内は安定であった。

【表10】

【0261】

＊は、式（Ｉ）の化合物の量を表す。

【0262】

試験動物：

【表11】

【0263】

アッセイ方法

【0264】

飼育場所

【0265】

購入後、試験動物をＳＰＦ動物室で飼育した。試験機関の許可証番号はＳＹＸＫ（Ｌｕ）２０１８００３１であった。動物を、オスとメスとを分け、各ケージに５匹以下の動物を入れて、透明なマウスケージで飼育した。

【0266】

飼育環境及び条件

【0267】

１日あたり約１２時間光を供給した。研究関連活動の要求により、暗時を断続的に中断することができた。動物室の環境温度及び相対湿度をモニタリングして毎日記録し、それぞれ２０℃～２６℃、４０％～７０％に制御した。

【0268】

飼料及び水

【0269】

ＢｅｉｊｉｎｇＫｅａｏＸｉｅｌｉＦｅｅｄＣｏ．，Ｌｔｄ．からＳＰＦラット及びマウス用の成長及び繁殖飼料を購入した。動物は、食物を自由に摂取させた。

【0270】

ＢｅｉｊｉｎｇＫｅａｏＸｉｅｌｉＦｅｅｄＣｏ．，Ｌｔｄ．からコーンコブペレットの寝床を購入した。

【0271】

動物は、機関の逆浸透システムによって濾過及び滅菌した飲料水を自由に摂取した。

【0272】

購入した飼料バッチの品質検査報告書は、飼料供給業者から得た。他の検査頻度、検査指標及び検査要件をセンターのＳＯＰ要件に従って実施した。

【0273】

動物の検疫及び適応

【0274】

試験機関に到着した後、動物を検疫して適応させた。最新の動物健康状態スクリーニングに従い、プロジェクトリーダによる署名及び承認後に、１００匹の健康な動物（半数がオスであり、半数がメスである）をアッセイのために選択した。

【0275】

投与経路

【0276】

投与経路：強制経口

【0277】

投与経路の選択理由：臨床使用を意図した経路と同様

【0278】

投与頻度

【0279】

同じ投与期間を毎日維持しつつ、１日に１回投与

【0280】

投与サイクル

【0281】

１４日間にわたる連続投与

【0282】

投与

【0283】

投与量を、最新の動物体重に基づいて計算した。

【0284】

試験試料の投与製剤を、室温で少なくとも１０分間撹拌し、投与前に目視にて均一に懸濁させた。試験試料の投与製剤は、投与中に連続して撹拌する必要があった。

【0285】

観察指標：一般的な身体的兆候の観察、詳細な臨床所見、体重及び食物摂取量を含んでいた。

【0286】

結果：

【0287】

１．１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄ投与量群の合計４匹の動物は、Ｄ３～Ｄ６に死亡したことが認められた。この群の動物への投与を停止し、観察を継続した。

【0288】

２．１０００ｍｇ／ｋｇ投与量群では１３匹の動物が死亡したことが認められ、３００ｍｇ／ｋｇ投与量群では１０匹の動物が死亡したことが認められ、１００ｍｇ／ｋｇ投与量群では３匹の動物が死亡したことが認められた。５０ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇ投与量群では動物の死亡は認められなかった。

【0289】

３．異常反応は、１００ｍｇ／ｋｇ投与量群の生存動物、並びに５０ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇ投与量群の動物では認められず、それらの体重は正常に増加した。
実施例７：ヌードマウスのヒト胃がんＮＣＩ－Ｎ８７移植腫瘍モデルでの式（Ｉ）の化合物の単独、及びインビボでの腫瘍増殖での化学療法薬シスプラチン（ＤＤＰ）との組合せによる阻害効果のアッセイ

【0290】

アッセイ動物、ブランク溶媒調製、シスプラチン（ＤＤＰ）調製、式（Ｉ）の化合物の投与製剤の調製、移植可能な腫瘍細胞株、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞培養、動物モデル調製、アッセイ手順及び統計分析方法は、実施例３のものと同じであった。

【0291】

動物のグループ分け及び薬物投与

【表12】

【0292】

アッセイ結果は以下の通りである。

【表13】

【0293】

【表14】

【表15】

【0294】

上記データから、Ｒ０１単独では、本アッセイの条件下でのヌードマウスのＮＣＩ－Ｎ８７移植腫瘍の増殖において著しい阻害効果を有しており、その抗腫瘍効果は、ＤＤＰ単独で投与された群のものよりも大きかったことが分かる。３、６及び１６ｍｇ／ｋｇ（ＱＤ）の投与量でのＲ０１を、それぞれＤＤＰと組み合わせて使用した。すべての組合せは、ＤＤＰ単独よりも良好な有効性を有し、マウスにおける血清尿素レベルを低下させた。組合せ群における動物の血清尿素レベルは、Ｒ０１の投与量と負の相関を有していたが、これはＲ０１が、ＤＤＰによって引き起こされる腎障害にある特定の保護及び予防効果を有し得ることを示唆している。加えて、Ｒ０１（８ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ）＋ＤＤＰ群の有効性は、他の投与群よりもわずかに良好であるか、又はこれと同等であった。
実施例８：ヌードマウスのヒト食道がんＥＣＡ１０９移植腫瘍モデルでのインビボでの腫瘍増殖における式（Ｉ）の化合物とＤＤＰの相乗的阻害効果のアッセイ

【0295】

アッセイ動物、腫瘍体積（ＴＶ）の計算、アッセイの終了、データの記録、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）の計算式及び統計分析方法は、実施例３と同じであり、式（Ｉ）の化合物の投与製剤の調製は、実施例５と同じであった。

【0296】

ブランク溶媒調製

【0297】

適当な量のＣＭＣ－Ｎａ固体を秤量し、最初に適当な量の脱イオン水を加えた。混合物を、固体が完全に分散して均一に分布するまでボルテックスにかけて撹拌して、０．５％ＣＭＣ－Ｎａ水溶液を得た。これを冷蔵庫で２～８℃にて保存した。

【0298】

シスプラチン（ＤＤＰ）の投与試験溶液の調製

【0299】

適当な量のＤＤＰを秤量し、ガラス瓶に入れ、適当な量の生理食塩水を瓶に加えた。混合物をボルテックスにかけ、超音波処理を行って薬物を完全に溶解し、濃度が０．５ｍｇ／ｍＬであるＤＤＰ溶液を瓶で調製した。この溶液を各投与前に調製した。

【0300】

移植可能な腫瘍細胞株

【0301】

ヒト食道がん細胞ＥＣＡ１０９を、ＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのセルバンクから得た（ＣＣＴＣＣ、実験室では液体窒素で凍結保存）。

【0302】

細胞培養

【0303】

ＥＣＡ１０９細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件下で１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で通例通りに培養した。細胞を０．２５％トリプシンで消化し、１：３～１：６の継代比で細胞増殖条件に従って継代した。

【0304】

動物モデルの調製及び腫瘍体積の決定

【0305】

対数増殖期のＥＣＡ１０９細胞を採取して計数し、５０％の無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地及び５０％のＭａｔｒｉｇｅｌに再懸濁させ、細胞濃度を０．５×１０^８細胞／ｍＬに調整した。ピペットを用いて細胞をピペッティングして、これらを均一に分散させ、細胞を５０ｍＬ遠心管に入れ、これをアイスボックスに入れた。１ｍＬシリンジを使用して細胞懸濁液を吸引し、これをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右前肢腋窩に皮下注射した。各動物に２００μＬ（１．０×１０^７細胞／マウス）を接種して、ヌードマウスのＥＣＡ１０９移植腫瘍モデルを確立した。接種後、動物の状態及び腫瘍増殖を定期的に観察し、電子ノギスを使用して腫瘍径を測定した。データをＥｘｃｅｌスプレットシートに入力して、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が１００～３００ｍｍ^３に達したら、良好な健康状態で、類似した腫瘍体積を有する動物を選択し、乱塊法を使用して各群に分けた。グループ分けの日をアッセイの１日目（Ｄ１）と見なした。アッセイ開始後、腫瘍径を１週間に２回測定し、腫瘍体積を計算し、動物の体重も量って記録した。

【0306】

動物のグループ分け及び薬物投与

【表16】

【0307】

アッセイ結果は以下の通りである。

【表17】

【0308】

【表18】

【表19】

【0309】

上記データから、Ｒ０１製剤単独では、本アッセイの条件下でのヌードマウスのＥＣＡ１０９移植腫瘍の増殖において著しい阻害効果を有しており、その抗腫瘍効果は、ＤＤＰ単独で投与された群のものよりも大きかったことが分かる。投与量が１８ｍｇ／ｋｇであるＲ０１製剤をＤＤＰと組み合わせたが、これはＤＤＰ単独又はＲ０１単独よりも良好な有効性を有した。組合せ群での動物の体重減少率は、ＤＤＰ単独で投与された群のものと類似していたが、これはＲ０１とＤＤＰとの組合せが、ＤＤＰの毒性の増加をもたらさないことを示している。最終投与後の血清尿素試験の結果は、Ｒ０１製剤＋ＤＤＰ群での尿素レベルが、ＤＤＰ単独で投与された群よりも低いことを示したが、これはＲ０１製剤とＤＤＰとの組合せが、ＤＤＰ投与によって引き起こされる腎障害にある特定の保護又は軽減効果を有していたことを示している。
実施例９：ヌードマウスのヒト非小細胞肺がんＡ５４９移植腫瘍モデルにおけるインビボでの腫瘍増殖における式（Ｉ）の化合物とシスプラチンの相乗的阻害効果のアッセイ

【0310】

アッセイ動物（通常摂食時間が１０日間であることを除く）、ブランク溶媒の調製、シスプラチンの調製（３つの濃度を調製した：０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ又は０．７ｍｇ／ｍＬ）、腫瘍体積（ＴＶ）の計算、アッセイの終了、データの記録、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）の計算式、統計分析方法及びアッセイの観察は、実施例３と同じであり、式（Ｉ）の化合物の投与製剤の調製は、実施例５と同じであった。

【0311】

細胞株

【0312】

ヒト非小細胞肺がん細胞Ａ５４９をＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓのセルバンクから得た（ＣＡＳ、本アッセイでは液体窒素で凍結保存）。

【0313】

細胞培養

【0314】

Ａ５４９細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件下で１０％ウシ胎児血清を含有するＦ１２Ｋ培地で通例通りに培養した。細胞を０．２５％トリプシンで消化し、１：３～１：５の継代比で細胞増殖条件に従って週に２～３回継代した。

【0315】

動物モデルの調製及び腫瘍体積の決定

【0316】

アッセイのＤ１では、対数増殖期のＡ５４９細胞を採取して計数し、ＰＢＳに再懸濁させ、細胞濃度を８×１０^７細胞／ｍＬに調整した。ピペットを用いて細胞をピペッティングして、これらを均一に分散させ、細胞を５０ｍＬ遠心管に入れ、これをアイスボックスに入れた。１ｍＬシリンジを使用して細胞懸濁液を吸引し、これをヌードマウスの右前肢腋窩に皮下注射した。各動物に１００μＬ（８×１０^６細胞／マウス）を接種して、ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍モデルを確立した。接種後、動物の状態及び腫瘍増殖を定期的に観察した。Ｄ１８に、電子ノギスを使用して腫瘍径を測定した。データをＥｘｃｅｌスプレットシートに入力して、腫瘍体積を計算した。良好な健康状態で、類似した腫瘍体積（１０１～１５６ｍｍ^３）を有する担がんマウスを選択し、乱塊法を使用して各群に分けた。アッセイ開始後、腫瘍径を定期的に測定し、腫瘍体積を計算し、動物の体重も量って記録した。

【0317】

試料採取

【0318】

アッセイの最終日に、投与（Ｒ０１）の１時間後にＣＯ_２吸入麻酔を動物に用いた。心臓から血液を採取し、抗凝固のためにＥＤＴＡ－Ｋ２を全血の一部に加えた。血漿を４℃、１５００ｇで１０分間の遠心分離で分離した。血漿を採取し、－４０℃～－２０℃の冷凍庫で保存した（必要に応じて、血漿中薬物濃度の決定のためにこれを使用することができる）。その他の部分の全血には抗凝固剤を加えず、血液が凝固した後に遠心分離によって血清を分離し、これを血中尿素窒素の検出のために使用した。血液採取後、腫瘍組織を採取して秤量し、写真撮影した。次いで、腫瘍を二分割して液体窒素で素早く凍結保存し、保存のために－９０℃～－６０℃の冷凍庫に移した。両側の腎臓を採取し、１０％ホルマリンで固定した。

【0319】

動物のグループ分け及び薬物投与

【表20】

【0320】

アッセイ結果は以下の通りである。

【表21】

【0321】

【表22】

【表23】

【0322】

上記データから、投与量が４ｍｇ・ｋｇ^－１（ＱＷｍｇ）及び５／７／７／７ｍｇ・ｋｇ^－１（ＱＷ）であるＤＤＰは、ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍の増殖に著しい効果がなかったことが分かる。投与量が１８ｍｇ・ｋｇ^－１ＢＩＤ及び３６ｍｇ・ｋｇ^－１ＢＩＤであるＲ０１製剤単独は、ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍の増殖に著しい阻害効果を有していた。Ｒ０１製剤（１８ｍｇ・ｋｇ^－１ＢＩＤ）＋ＤＤＰ（５／７／７／７ｍｇ・ｋｇ^－１ＱＷ）及びＲ０１製剤（３６ｍｇ・ｋｇ^－１ＢＩＤ）＋ＤＤＰ（４ｍｇ・ｋｇ^－１ＱＷ）の各組合せ群は、ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍の増殖に著しい阻害効果を有していた。２つの組合せ群と対応する投与量のＤＤＰ単独で投与された群との相対的な腫瘍体積又は腫瘍重量には有意差（Ｐ＜０．０５）又は高い有意差（Ｐ＜０．０１）が存在した。各組合せ群の動物の体重減少率は、対応する投与量のＤＤＰ単独で投与された群と類似していたが、これはＲ０１とＤＤＰとの組合せがＤＤＰ毒性の増加をもたらさず、Ｒ０１が、ＤＤＰによって引き起こされる腎障害にある特定の保護効果を有し得ることを示している。
実施例１０：ヌードマウスのヒト大腸がんＨＴ２９移植腫瘍モデルでのインビボでの腫瘍増殖における式（Ｉ）の化合物とシスプラチンの相乗的阻害効果のアッセイ

【0323】

アッセイ動物、ブランク溶媒の調製、シスプラチン（ＤＤＰ）の調製、腫瘍体積（ＴＶ）の計算、アッセイの終了、データの記録、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）の計算式、統計分析方法及びアッセイの観察は、実施例３と同じであり、式（Ｉ）の化合物の投与製剤の調製は、実施例３と同じであった。

【0324】

細胞株

【0325】

ヒト大腸がん細胞株ＨＴ－２９をＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓのセルバンクから得た（ＣＡＳ、本アッセイでは液体窒素で凍結保存）。

【0326】

細胞培養

【0327】

ＨＴ－２９細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件下で１０％ウシ胎児血清を含有するＭｃＣｏｙ凍結保存培地で通例通りに培養した。細胞を０．２５％トリプシンで消化し、１：３～１：４の継代比で細胞増殖条件に従って継代した。

【0328】

動物モデルの調製及び腫瘍体積の決定

【0329】

アッセイのＤ１では、対数増殖期のＨＴ－２９細胞を採取して計数し、無血清ＭｃＣｏｙに再懸濁させ、細胞濃度を４×１０^７細胞／ｍＬに調整した。ピペットを用いて細胞をピペッティングして、これらを均一に分散させ、細胞を５０ｍＬ遠心管に入れ、これをアイスボックスに入れた。１ｍＬシリンジを使用して細胞懸濁液を吸引し、これをヌードマウスの右前肢腋窩に皮下注射した。各動物に１００μＬ（４×１０^６細胞／マウス）を接種して、ヌードマウスのＨＴ－２９移植腫瘍モデルを確立した。接種後、動物の状態及び腫瘍増殖を定期的に観察した。Ｄ１２に、電子ノギスを使用して腫瘍径を測定した。データをＥｘｃｅｌスプレットシートに入力して、腫瘍体積を計算した。良好な健康状態で、類似した腫瘍体積（１０３～１７９ｍｍ^３）を有する担がんマウスを選択し、乱塊法を使用して各群に分けた。アッセイ開始後、腫瘍径を定期的に測定し、腫瘍体積を計算し、動物の体重も量って記録した。

【0330】

動物のグループ分け及び薬物投与

【表24】

【0331】

アッセイ結果は以下の通りである。

【表25】

【表26】

【0332】

【0333】

上記表から、本開示の式（Ｉ）の化合物が、シスプラチンとの相乗的抗腫瘍効果を有し得ること、すなわち、併用投与によって作用のより速い発現、より良好な効果が得られ、安全性における著しい低下が見られないということが分かる。
実施例１１：主な標的器官における化学療法薬であるシスプラチンの毒性に対する式（１）の化合物の拮抗効果

【0334】

アッセイ目的

【0335】

このアッセイは、Ｒ０１が、マウスのシスプラチン誘発性急性腎障害を著しく減少させるかどうかを最終的に調べることと、シスプラチン誘発性腎障害に拮抗するために臨床的には第一選択で現在使用される最も確証的な薬物であるアミフォスチンと比較して、Ｒ０１がシスプラチン誘発性腎障害を保護する可能性を決定することとを目的とする。

【0336】

試験試料及び試薬

【0337】

Ｒ０１製剤：実施例５と同じ。

【0338】

アミフォスチン三水和物、バッチ番号：Ｚ２８Ｎ１１Ｒ１３２５９６、分子量：２６８．２７、含有量：９８％、ＳｈａｎｇｈａｉＹｕａｎｙｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

【0339】

シスプラチン（バッチ番号：６０１２００８０４、分子量：３００．０５、純度≧純度≧０５０８、換算係数：１）をＪｉａｎｇｓｕＨａｎｓｏｈＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＧｒｏｕｐＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。

【0340】

アッセイ動物

【0341】

４２匹のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週齢、体重１８～２０ｇ、証明書番号：１１４００７００２３８３６５）をＳｉＰｅｉＦｕ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓのＳＰＦグレードの動物室にて温度２０～２５℃、相対湿度４０～７０％、明所１２時間と暗所１２時間のサイクルで飼育した。動物は、水及び食物を自由に摂取させた。通常摂食の３日後、獣医学検査後に健康状態が良好なマウスを本アッセイのために選択した。グループ分けの前に、マーカを使用して動物の尾の基部にマーキングを行った。グループ分けの後に、各動物の耳に切り込みを入れてマーキングした（各群７匹のマウス）。

【0342】

アッセイ方法

【0343】

アッセイ動物のグループ分け

【0344】

アッセイ動物：適応摂食後の動物試験には、４２匹の７週齢のオスＣ５７マウスを使用した。

【0345】

第１群：ブランク対照群、

【0346】

第２群：陽性対照薬物シスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）、

【0347】

第３群：シスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）＋アミフォスチン（５０ｍｇ／ｋｇ、シスプラチン投与の３０分前に腹腔内投与、１回のみ投与）、

【0348】

第４群：シスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）＋Ｒ０１（６ｍｇ、ＢＩＤ、シスプラチンモデル化の３日前に投与）、

【0349】

第５群：シスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）＋Ｒ０１（１８ｍｇ、ＢＩＤ、シスプラチンモデル化の３日前に投与）、

【0350】

第６群：シスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）＋Ｒ０１（３６ｍｇ、ＢＩＤ、システプラチンモデル化の３日前に投与）。

【0351】

薬物の調製

【0352】

ブランク溶媒の調製：適当な量のカルボキシメチルセルロースナトリウムを採り、生理食塩水に加えて、カルボキシメチルセルロースナトリウムの０．５％溶液を調製した。これを高圧滅菌した。

【0353】

シスプラチン（ＤＤＰ）投与試験溶液の調製：シスプラチン製剤は溶液であるが、これを直接使用し、室温で暗所にて保存した。

【0354】

Ｒ０１製剤投与試験溶液の調製は、実施例５と同じであった：適当な量のＲ０１製剤を、アッセイで設定した３つの投与量に従ってそれぞれ秤量し、適当な量の０．５％ＣＭＣ－Ｎａ水溶液を加えた。混合物を、均一に混合されるまでボルテックスにかけて超音波処理して、それぞれ濃度が０．６ｍｇ・ｋｇ^－１、１．８ｍｇ・ｋｇ^－１及び３．６ｍｇ・ｋｇ^－１である投与試験溶液を得た。これらはすぐに使える状態であった。

【0355】

動物投与及び試料採取

【0356】

動物試験期間：７日間（適応摂食を除く）、以下、Ｄ１～Ｄ７と称する。

【0357】

シスプラチン投与方法：シスプラチン溶液（１０ｍｇ／ｋｇ）の１回腹腔内注射

【0358】

安楽死方法：安楽死の１２時間前に絶食し、眼球から血液を採取して安楽死を実施した。

【0359】

１．第１群は溶媒対照群であった：Ｎ＝７、すべてのマウスはオスであった（以下同じ）。

【0360】

ａ）Ｄ１～Ｄ６に、カルボキシメチルセルロースナトリウムの０．５％溶液を強制経口投与した（各動物について１日２回、午前午後間に８時間の間隔を設けた）。

【0361】

ｂ）Ｄ４に、生理食塩水を１回腹腔内注射した。

【0362】

ｃ）Ｄ７に、安楽死のために眼窩から血液を採取し（３００μＬの血清を抽出）、左腎をホルムアルデヒドで固定し、右腎を液体窒素中で保存した（ＷＢ試験を行ってもよい）。

【0363】

２．第２群はシスプラチン誘発性腎障害モデル群であった：Ｎ＝７。

【0364】

ａ）Ｄ１～Ｄ６に、カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を強制経口投与した（各動物について１日２回）。

【0365】

ｂ）Ｄ４に、シスプラチン１０ｍｇ／ｋｇを１回腹腔内注射した。

【0366】

ｃ）Ｄ７に、安楽死のために眼窩から血液を採取し（３００μＬの血清を抽出）、左腎をホルムアルデヒドで固定し、右腎を液体窒素中で保存した。

【0367】

３．第３群はシスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）＋アミフォスチン（５０ｍｇ／ｋｇ、シスプラチン投与の３０分前に腹腔内注射）群であった：Ｎ＝７。

【0368】

ａ）Ｄ４に、シスプラチン１０ｍｇ／ｋｇを１回腹腔内注射した（アミフォスチン５０ｍｇ／ｋｇを、シスプラチン投与の３０分前に腹腔内投与）。

【0369】

ｂ）Ｄ７に、安楽死のために眼窩から血液を採取し（３００μＬの血清を抽出）、左腎をホルムアルデヒドで固定し、右腎を液体窒素中で保存した。

【0370】

４．第４群～第６群はシスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）＋Ｒ０１（それぞれ６、１８、３６ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、シスプラチン投与の３日前に投与）群であった：Ｎ＝７。

【0371】

ａ）Ｄ１～Ｄ６に、Ｒ０１懸濁液を強制経口投与した（各動物について１日２回、午前午後間に８時間の間隔を設けた）。

【0372】

ｂ）Ｄ４に、シスプラチン１０ｍｇ／ｋｇを１回腹腔内注射した。

【0373】

ｃ）Ｄ７に、安楽死のために眼窩から血液を採取し（３００μＬの血清を抽出）、左腎をホルムアルデヒドで固定し、右腎を液体窒素中で保存した。

【0374】

試験項目

【0375】

１）末梢血血清中の尿素窒素濃度及びクレアチニン濃度を試験した。

【0376】

２）腎臓病理試験：ＨＥ、ＰＡＳ標本、スライド走査及び報告書発行

【0377】

３）安楽死前に各動物の体重を量って記録した。安楽死後、可能な限りすぐに２個の腎臓を秤量し、重量を記録した。次いで、２個の腎臓を素早く固定又は凍結保存し、マウスの腎係数を計算した（腎臓の重量／マウスの重量）。

【0378】

データ記録及び計算

【0379】

各群で投与のためにグループ分けされるときの動物の体重を記録した。アッセイ終了時に体重及び腎臓の重量も記録し、腎係数を計算した。試験に送られる血液試料中のクレアチニン及び尿素窒素値を記録した。腎臓をＨＥ及びＰＡＳで染色し、スライドを走査した。病理分析後に報告書を発行した。

【0380】

統計分析

【0381】

【0382】

アッセイ結果

【表27】

【表28】

【0383】

アッセイ前後の動物の体重の変化から、シスプラチンモデル化群の体重が、各群に薬物を投与したかどうかにかかわらず、著しく減少したことが分かる（Ｐ＜０．０１）。アミフォスチン群とＲ０１を使用した３つの群との間に有意差は存在しなかった。

【表29】

【表30】

【0384】

アッセイで測定した値によれば、モデル群の腎係数は著しく増加したが（Ｐ＜０．０１）、薬物投与群では有意差は存在しなかった。総じて、各薬物介入群の腎係数はブランク対照群と同等であり、アミフォスチン群とＲ０１を使用した３群との間に有意差は存在しなかった。特に、Ｒ０１の中投与量群及び高投与量群は、ブランク対照群とより類似していた。

【表31】

【0385】

アッセイで測定した値によれば、シスプラチンモデル化群の血清クレアチニン値は著しく増加した（Ｐ＜０．０１）。各薬物介入群の血清クレアチニン値はブランク対照群と同等であり、アミフォスチン群とＲ０１を使用した３群との間に有意差は存在しなかった。

【表32】

【0386】

アッセイで測定した値によれば、シスプラチンモデル化群の血清尿素窒素値は著しく増加した（Ｐ＜０．０５）。アミフォスチン群の尿素窒素値は、モデル群のものよりも著しく低く（Ｐ＜０．０１）、Ｒ０１高投与量群の尿素窒素値もまた、モデル群のものよりも著しく低かった（Ｐ＜０．０５）。Ｒ０１低投与量群及び中投与量群の尿素窒素濃度は、モデル群のものよりも低かったものの、有意差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。

【0387】

動物の腎臓の病理学的損傷

【表33】

【表34】

【0388】

病理学的説明及び典型的な写真

【0389】

ブランク対照群：通常通り飼育したブランク対照群の７匹の動物では、糸球体及び尿細管への損傷は基本的には存在せず、尿細管腔は狭かった。一部のマウスの糸球体周辺ではいくらかの炎症細胞の浸潤のみが見られた。典型的な写真は図９に示す通りである。

【0390】

シスプラチン誘発性腎障害モデル群（１０ｍｇ／ｋｇ）：この群は、動物が重度の腎機能障害を有するモデル群であった。生化学アッセイは、血中尿素窒素及びクレアチニン濃度の著しい上昇を示した。病理学的特性の観点から、糸球体への病理学的損傷は重症ではなく、糸球体収縮を呈したのは数匹の動物のみであった。主な損傷は尿細管領域であったが、尿細管上皮細胞の著しい壊死とタンパク円柱の出現を伴っていた。損傷は、輸入細動脈領域で主に生じた。総じて、尿細管細胞は粗い縁及びぼやけた縁を呈し、一部の動物では重度の病理学的損傷が認められた。視野全体にわたって多数のタンパク円柱が見られた。典型的な写真は図１０に示す通りである。

【0391】

シスプラチン＋アミフォスチン群：この群での腎障害の程度は著しく低下した。一部のマウスのみが軽微な損傷を受けたが、他の動物には基本的には明らかな病理学的損傷がなかった。典型的な写真は図１１に示す通りである。

【0392】

シスプラチン＋Ｒ０１６ｍｇ群：この群のすべての動物は、ある程度の腎障害を患い、そのうち２匹は重度の腎障害を患い、その他は軽度の損傷を受けた。損傷は主に尿細管領域であった。典型的な写真は図１２に示す通りである。

【0393】

シスプラチン＋Ｒ０１１８ｍｇ群：この群の動物では、基本的には腎臓への明らかな病理学的損傷が存在しなかった。１匹の動物のみ明らかな損傷があり、その他の動物は軽度の損傷があった。典型的な写真は図１３に示す通りである。

【0394】

シスプラチン＋Ｒ０１３６ｍｇ群：この群のマウス一匹のみが、腎臓にわずかな病理学的損傷があった。その他のすべての動物の病理学的構造は無傷であり、細胞構造は鮮明であった。典型的な写真は図１４に示す通りである。

【0395】

合計で６群のマウスをそれらの腎臓の病理学的損傷について評価した。ブランク対照群には肉眼で見える病理学的損傷がなく、組織形態は完全であった。シスプラチン腎障害モデル群には肉眼で見える著しい損傷があり、明らかな個体差が存在した。損傷の程度にはある程度の差があり、主な病理学的損傷は尿細管領域に存在した。シスプラチン＋アミフォスチン群の病理学的損傷は著しく減少したが、これは陽性対照シスプラチン群とは著しく異なっていた（Ｐ＜０．０１）。病理学的損傷の程度は、シスプラチン＋Ｒ０１（６ｍｇ）群及びシスプラチン＋Ｒ０１（１８ｍｇ）群では著しく低下した（Ｐ＜０．０５）。シスプラチン＋Ｒ０１（３６ｍｇ）群は、基本的には完全な腎組織形態、わずかな損傷（Ｐ＜０．０１）及び最良の効果を有していたが、これは基本的にはアミフォスチン群と類似していた。

【0396】

産業上の利用可能性

【0397】

本開示の２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノンアルキルアルコール誘導体は、優れた抗腫瘍効果と優れた安全性を有する。

【0398】

上記内容は、特定の代替的な実施形態に関連して本開示を更に詳細に説明したものであり、本開示の特定の実施形態がこれらの説明に限定されると結論付けることはできない。本開示が属する技術分野の当業者にとって、本開示の概念から逸脱しない限り、いくつかの単純な推論又は置換を行うことができるが、これらは本開示の保護範囲内にあると見なされるべきである。

【図1】