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特表2024-539752豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-29
(54)【発明の名称】豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/295 20060101AFI20241022BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20241022BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20241022BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241022BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20241022BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241022BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20241022BHJP
C07K 14/30 20060101ALI20241022BHJP
【ＦＩ】
A61K39/295 ZNA
A61K39/00 J
A61K39/12
A61P31/04 171
A61P31/20
A61P37/04
C12N1/20 A
C07K14/30
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024547392
(86)(22)【出願日】2022-03-04
(85)【翻訳文提出日】2024-04-15
(86)【国際出願番号】 KR2022003112
(87)【国際公開番号】W WO2022186661
(87)【国際公開日】2022-09-09
(31)【優先権主張番号】10-2021-0028980
(32)【優先日】2021-03-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0073554
(32)【優先日】2021-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524144431
【氏名又は名称】イノバック
(71)【出願人】
【識別番号】524144442
【氏名又は名称】ケイエヌユーーインダストリー コオペレーション ファンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110003007
【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハン、テウク
(72)【発明者】
【氏名】キム、ギジュ
(72)【発明者】
【氏名】シン、ウソン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA37X
4B065AB10
4B065AC20
4B065BA30
4B065BD13
4B065CA45
4C085AA04
4C085AA38
4C085BA07
4C085BA51
4C085CC07
4C085CC08
4C085DD02
4C085DD24
4C085DD62
4C085DD86
4C085EE03
4C085FF17
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG08
4C085GG10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物およびこれを利用した感染予防方法に関し、本発明による多価ワクチン組成物は、実験動物と目的動物である豚で免疫反応の相互補完効果を示して抗原間の干渉現象が現れず、豚に接種したとき血清学的な水準で高い水準の抗体価および中和抗体価を誘導し、ＰＢＭＣでＭｈｐまたはＰＣＶ２感作に対して高い水準のＩＦＮ－γを生成したので、これを豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のために有用に活用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；
（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および
（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質；を含む、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物。
【請求項2】
前記組換えＰ９７タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の多価ワクチン組成物。
【請求項3】
前記豚サーコウイルス２型由来組換えタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の多価ワクチン組成物。
【請求項4】
前記豚マイコプラズマハイオニューモニエは、１×１０８～１×１０９ ＣＣＵ（Ｃｏｌｏｕｒ－ｃｈａｎｇｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）／ｍＬの濃度で含まれることを特徴とする、請求項１に記載の多価ワクチン組成物。
【請求項5】
前記豚マイコプラズマハイオリニスは、１×１０８～１×１０９ ＣＣＵ（Ｃｏｌｏｕｒ－ｃｈａｎｇｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）／ｍＬの濃度で含まれることを特徴とする、請求項１に記載の多価ワクチン組成物。
【請求項6】
前記豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質は、１０～１００μｇ／ｄｏｓｅの濃度で含まれることを特徴とする、請求項１に記載の多価ワクチン組成物。
【請求項7】
前記豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質は、０．１～１０００μｇ／ｄｏｓｅの濃度で含まれることを特徴とする、請求項１に記載の多価ワクチン組成物。
【請求項8】
前記豚マイコプラズマハイオニューモニエ菌株は、不活化したことを特徴とする、請求項１に記載の多価ワクチン組成物。
【請求項9】
前記豚マイコプラズマハイオリニス菌株は、不活化したことを特徴とする、請求項１に記載の多価ワクチン組成物。
【請求項10】
前記多価ワクチン組成物は、賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の多価ワクチン組成物。
【請求項11】
前記賦形剤は、ＩＭＳ１３１３であることを特徴とする、請求項１０に記載の多価ワクチン組成物。
【請求項12】
請求項１に記載の多価ワクチン組成物を豚に接種するステップ；を含む豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防方法。
【請求項13】
前記多価ワクチン組成物は、筋肉、皮下、経皮、静脈、鼻腔内、腹腔内および経口からなる群より選択された一つ以上の方法で接種することを特徴とする、請求項１２に記載の予防方法。
【請求項14】
（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；
（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質；を含む、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染による疾患予防用薬学的組成物。
【請求項15】
前記豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染による疾患は、豚呼吸器複合症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＰＲＤＣ）、豚流行性肺炎（ｅｎｚｏｏｔｉｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、ＥＰ）、離乳後多臓器性発育不良症候群（ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ ｗａｓｔｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＭＷＳ）、豚皮膚炎腎症症候群（ｐｏｒｃｉｎｅ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＤＮＳ）、母豚流産斃死症候群（ｓｏｗ ａｂｏｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＡＭＳ）、豚生殖器および呼吸器症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＲＲＳ）、仮性狂犬病（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）、グレーサー病（Ｇｌａｓｓｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、連鎖球菌性髄膜炎（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、サルモネラ症（ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、離乳後大腸菌症（ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）、食餌性肝臓症（ｄｉｅｔｅｔｉｃ ｈｅｐａｔｏｓｉｓ）、化膿性気管支肺炎（ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖｅ ｂｒｏｎｃｈｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ユースタキオ管（Ｅｕｓｔａｃｈｉａｎ ｔｕｂｅ）炎症、多発性漿膜炎（ｐｏｌｙｓｅｒｏｓｉｔｉｓ）、マイコプラズマ性肺炎および胸膜肺炎からなる群より選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１４に記載の薬学的組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
豚農家の生産低下を引き起こす感染性疾患に対する様々な原因のうちマイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）、マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）および豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）は最も危険性の高い原因として知られている。
マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）は、豚呼吸器複合症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＰＲＤＣ）および豚流行性肺炎（ｅｎｚｏｏｔｉｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、ＥＰ）と関連する呼吸器病原体であり、呼吸器線毛細胞に集落化をはじめとして感染を起こすので、豚マイコプラズマ性肺炎の原因菌として注目されている。マイコプラズマハイオニューモニエは、単一感染したときは乾性咳などの症状のみを表すが、他の呼吸器病原体と複合感染する場合、深刻な呼吸器症状を誘発し、マクロファージの活性を低下させ、他の病原体の侵入を防御する１次防御機能を喪失させるなど、追加病原菌感染の危険性をさらに増加させる。
マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）は、マイコプラズマハイオニューモニエに引き継いで豚の呼吸器伝染病で新たな役割をする病原体として台頭しており、豚生殖器呼吸器症ウイルスと混合感染で病症をさらに悪化させると報告されている。またマイコプラズマハイオリニスは、単独でもマイコプラズマハイオニューモニエで発現されるマイコプラズマ性病変を誘発することができると知られている。
一方、豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）は、離乳後多臓器性発育不良症候群（Ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ ｗａｓｔｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＭＷＳ）の原因体であって、感染豚は慢性的に萎縮豚になり、皮膚が青白く、リンパ節が大きくなることが特徴である。また、呼吸困難、慢性肺炎などの呼吸器症状と下痢、胃潰瘍のような消化器症状を表し、離乳子豚で高い斃死率（～５０％）を示すため、全世界的に高い経済的損失を招いている。ＰＣＶ２はこれ以外にも多数の他の感染を伴うが、環境と有機化合物に対する抵抗性が非常に強く、一般的な消毒剤に殺菌しないため、ワクチン接種だけが唯一の代案として知られている。
特に、既存の商用化ワクチンは、ＰＣＶ２ａ（またはＰＣＶ２ｂ）遺伝型ウイルスで製作されたが、２０１２年以降から新たに出現したＰＣＶ２ｄで遺伝型移動が発生し、最近にはＰＣＶ２ｄ遺伝型が９０％以上分離している。ＰＣＶ２ａ遺伝型は、ＰＣＶ２ｂと９１．４％、ＰＣＶ２ｄと９０．４％、ＰＣＶ２ｂ遺伝型は、ＰＣＶ２ｄと９３．９％の塩基配列相同性を有すると知られている。
このような養豚農家に大きい被害を誘発するマイコプラズマハイオニューモニエ、マイコプラズマハイオリニスまたは豚サーコウイルス２型の感染を防ぐために、現在不活化形態の単一（ｓｉｎｇｌｅ）または多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）ワクチンが商用化されて使用されている。特に、豚マイコプラズマ性肺炎予防において、このような不活化ワクチンは、利用できる唯一のワクチンである。しかし、商用化されたマイコプラズマハイオニューモニエ不活化ワクチンは、ほとんど接種後に抗体を形成することができず、臨床症状は緩和させることができるが、自然感染菌の伝播および呼吸器繊毛集落化を予防することができないという点で技術的限界点を示している。さらに、多価ワクチンの場合、混合されている個別抗原が互いに干渉現象を起こして効能を減少させることができる問題がある。
特に、マイコプラズマハイオニューモニエ、マイコプラズマハイオリニスおよび豚サーコウイルス２型は、様々な種類の亜種が存在して、これによる干渉現象の発生可能性が非常に高い。
したがって、豚マイコプラズマ感染、特に、マイコプラズマハイオニューモニエおよびマイコプラズマハイオリニスと既存に流行しているＰＣＶ２ｂおよび最近流行している豚サーコウイルス２ｄ遺伝型（ＰＣＶ２ｄ）を含むＰＣＶ２の自然感染を同時に予防し、効果的に抗体を形成することができるようにする新たな多価ワクチンの開発が要求されている。
マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）は、豚呼吸器複合症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＰＲＤＣ）および豚流行性肺炎（ｅｎｚｏｏｔｉｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、ＥＰ）と関連する呼吸器病原体であり、呼吸器線毛細胞に集落化をはじめとして感染を起こすので、豚マイコプラズマ性肺炎の原因菌として注目されている。マイコプラズマハイオニューモニエは、単一感染したときは乾性咳などの症状のみを表すが、他の呼吸器病原体と複合感染する場合、深刻な呼吸器症状を誘発し、マクロファージの活性を低下させ、他の病原体の侵入を防御する１次防御機能を喪失させるなど、追加病原菌感染の危険性をさらに増加させる。
マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）は、マイコプラズマハイオニューモニエに引き継いで豚の呼吸器伝染病で新たな役割をする病原体として台頭しており、豚生殖器呼吸器症ウイルスと混合感染で病症をさらに悪化させると報告されている。またマイコプラズマハイオリニスは、単独でもマイコプラズマハイオニューモニエで発現されるマイコプラズマ性病変を誘発することができると知られている。
一方、豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）は、離乳後多臓器性発育不良症候群（Ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ ｗａｓｔｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＭＷＳ）の原因体であって、感染豚は慢性的に萎縮豚になり、皮膚が青白く、リンパ節が大きくなることが特徴である。また、呼吸困難、慢性肺炎などの呼吸器症状と下痢、胃潰瘍のような消化器症状を表し、離乳子豚で高い斃死率（～５０％）を示すため、全世界的に高い経済的損失を招いている。ＰＣＶ２はこれ以外にも多数の他の感染を伴うが、環境と有機化合物に対する抵抗性が非常に強く、一般的な消毒剤に殺菌しないため、ワクチン接種だけが唯一の代案として知られている。
特に、既存の商用化ワクチンは、ＰＣＶ２ａ（またはＰＣＶ２ｂ）遺伝型ウイルスで製作されたが、２０１２年以降から新たに出現したＰＣＶ２ｄで遺伝型移動が発生し、最近にはＰＣＶ２ｄ遺伝型が９０％以上分離している。ＰＣＶ２ａ遺伝型は、ＰＣＶ２ｂと９１．４％、ＰＣＶ２ｄと９０．４％、ＰＣＶ２ｂ遺伝型は、ＰＣＶ２ｄと９３．９％の塩基配列相同性を有すると知られている。
このような養豚農家に大きい被害を誘発するマイコプラズマハイオニューモニエ、マイコプラズマハイオリニスまたは豚サーコウイルス２型の感染を防ぐために、現在不活化形態の単一（ｓｉｎｇｌｅ）または多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）ワクチンが商用化されて使用されている。特に、豚マイコプラズマ性肺炎予防において、このような不活化ワクチンは、利用できる唯一のワクチンである。しかし、商用化されたマイコプラズマハイオニューモニエ不活化ワクチンは、ほとんど接種後に抗体を形成することができず、臨床症状は緩和させることができるが、自然感染菌の伝播および呼吸器繊毛集落化を予防することができないという点で技術的限界点を示している。さらに、多価ワクチンの場合、混合されている個別抗原が互いに干渉現象を起こして効能を減少させることができる問題がある。
特に、マイコプラズマハイオニューモニエ、マイコプラズマハイオリニスおよび豚サーコウイルス２型は、様々な種類の亜種が存在して、これによる干渉現象の発生可能性が非常に高い。
したがって、豚マイコプラズマ感染、特に、マイコプラズマハイオニューモニエおよびマイコプラズマハイオリニスと既存に流行しているＰＣＶ２ｂおよび最近流行している豚サーコウイルス２ｄ遺伝型（ＰＣＶ２ｄ）を含むＰＣＶ２の自然感染を同時に予防し、効果的に抗体を形成することができるようにする新たな多価ワクチンの開発が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明者らは、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物を開発し、前記多価ワクチン組成物を接種した動物モデルで各抗原に対して抗体が優秀に生成されたことを確認して、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防方法を提供することである。
本発明のまた他の目的は、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染による疾患予防用薬学的組成物を提供することである。
したがって、本発明の目的は、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防方法を提供することである。
本発明のまた他の目的は、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染による疾患予防用薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0004】
前記目的を達成するために、本発明は、（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；(iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質；を含む、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物を提供する。
また、前記他の目的を達成するために、本発明は、本発明による多価ワクチン組成物を豚に接種するステップ；を含む、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防方法を提供する。
また、前記また他の目的を達成するために、本発明は、（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質；を含む、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染による疾患予防用薬学的組成物を提供する。
また、前記他の目的を達成するために、本発明は、本発明による多価ワクチン組成物を豚に接種するステップ；を含む、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防方法を提供する。
また、前記また他の目的を達成するために、本発明は、（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質；を含む、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染による疾患予防用薬学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【0005】
本発明によるＭｈｐ＋Ｍｈｒ＋組換えＰ９７タンパク質＋組換えＰＣＶ２カプシド抗原組み合わせの多価ワクチン組成物は、実験動物と目的動物である豚で免疫反応の相互補完効果を示して抗原間の干渉現象が現れず、豚に接種したとき血清学的な水準で各抗原に対する高い水準の抗体価および中和抗体価が誘導され、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣ）でＭｈｐまたはＰＣＶ２感作に対して高い水準のインターフェロンガンマ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、ＩＦＮ－γ）を生成し、目的動物である豚に接種し、攻撃接種時に副作用なしに優れた防御能を見せることを確認したところ、これを豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のために有用に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】本発明による組換えＰＣＶ２ｄカプシドタンパク質を透過電子顕微鏡で確認した結果である。
【図2】マウスに本発明による多価ワクチン組成物を接種し、Ｍｈｐに対する抗体価を確認した結果である。
【図3】マウスに本発明による多価ワクチン組成物を接種し、組換えＰ９７タンパク質に対する抗体価を確認した結果である。
【図4】マウスに本発明による多価ワクチン組成物を接種し、Ｍｈｒに対する抗体価を確認した結果である。
【図5】モルモットに本発明による多価ワクチン組成物およびＰＣＶ２単独ワクチンを接種し、組換えＰＣＶ２ｄカプシドタンパク質抗原に対する抗体価を確認した結果である。
【図6】モルモットに本発明による多価ワクチン組成物およびＰＣＶ２単独ワクチンを接種し、ＰＣＶ２ｂに対する中和抗体価を確認した結果である。
【図7】モルモットに本発明による多価ワクチン組成物およびＰＣＶ２単独ワクチンを接種し、ＰＣＶ２ｄに対する中和抗体価を確認した結果である。
【図8】豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、Ｍｈｐに対する抗体価を確認した結果である。
【図9】豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、組換えＰ９７タンパク質に対する抗体価を確認した結果である。
【図10】豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、Ｍｈｒに対する抗体価を確認した結果である。
【図11】豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、Ｍｈｐ感作によるインターフェロンガンマ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、ＩＦＮ－γ）分泌を確認した結果である。
【図12】豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、ＰＣＶ２感作によるＩＦＮ－γの分泌を確認した結果である。
【図13】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、体重変化を確認した結果である。
【図14】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、1日当たりの体重増加量（Ａｖｅｒａｇｅ ｄａｉｌｙ ｗｅｉｇｈｔ ｇａｉｎ、ＡＤＷＧ）を確認した結果である。
【図15】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、血清内ＰＣＶ２ｂ－特異的ＩｇＧ（ＰＣＶ２ｂ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ）抗体価を確認した結果である。
【図16】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、血清内ＰＣＶ２ｄ－特異的（ＰＣＶ２ｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ）抗体価を確認した結果である。
【図17】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、ＰＣＶ２ｂ中和抗体価を測定した結果である。
【図18】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、ＰＣＶ２ｄ中和抗体価を測定した結果である。
【図19】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、ＩＦＮ－γ分泌量を確認した結果である。
【図20】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、各実験群の血清検体のＰＣＶ２ ＤＮＡ複製（ｃｏｐｙ）数定量結果である。
【図21】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、各実験群の鼻腔検体のＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数定量結果である。
【図22】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、各実験群の直腸検体のＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数定量結果である。
【図23】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、各実験群の肺検体のＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数定量結果である。
【図24】本発明による多価ワクチン組成物の攻撃接種に対する防御能を確認したものであって、多価ワクチン組成物接種または未接種豚において、各実験群のリンパ節検体のＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数定量結果である。
【発明を実施するための形態】
【0007】
以下、本発明に対して詳しく説明する。
本発明は、（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質；を含む、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物を提供する。
本発明において、「ワクチン」は、抗原物質を含む獣医学用ワクチンであって、Ｍｈｐ、ＭｈｒまたはＰＣＶ２に対して特異的且つ能動または受動の免疫性を誘導するための目的で投与される。
一方、マイコプラズマハイオニューモニエの感染は、病原体が呼吸器上皮細胞の繊毛に付着するとともに開始される。付着因子（Ａｄｈｅｓｉｎ）Ｐ９７はマイコプラズマハイオニューモニエの膜表面タンパク質で免疫原性が高い抗原として知られている。Ｐ９７のＣ末端には、繰り返される区間で構成されたＲ１とＲ２部位が存在し、そのうちＲ１部位は宿主呼吸器繊毛の付着部位（ＡＡＫＰＶ／Ｅ）に結合する。結合されたマイコプラズマハイオニューモニエは、成長に必要なアミノ酸を宿主から得ることができ、傷ついた組織に侵入するために宿主の分子を多様に配列することができるようになる。一方、宿主は、抗体を生産して豚繊毛にマイコプラズマハイオニューモニエが付着することを妨げるか、付着した病原体の成長を阻害することができる。しかし、先行研究によれば、既存の常用ワクチンは、Ｐ９７に対する抗体を誘導することができないと報告されたことがある。
これにおいて、本発明の多価ワクチン組成物は、組換えＰ９７タンパク質を含んでＰ９７に対する抗体を誘導することができることを特徴とする。本発明において、ワクチン組成物に含まれる前記組換えＰ９７タンパク質は、豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来Ｐ９７遺伝子と大腸菌易熱性エンテロトキシンサブユニットＢ（Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｅａｔ－ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ、ｅｌｔｂ）遺伝子を融合して製造されることができる。より具体的に、Ｅ．ｃｏｌｉのｅｌｔｂとマイコプラズマハイオニューモニエＰ９７遺伝子のＣ－末端繰り返し配列であるＲ１とＲ１Ｒ２を融合させ、ＬＴＢと融合されたＰ９７遺伝子であるｌｔｂＲ１とｌｔｂＲ１Ｒ２を重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して製造されることができる。前記組換えＰ９７タンパク質は、下記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とすることができる。
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤＤＤＫＡＭＡＤＩＧＳＥＦＡＰＱＴＩＴＥＬＣＳＥＹＲＮＴＱＩＹＴＩＮＤＫＩＬＳＹＴＥＳＭＡＧＫＲＥＭＶＩＩＴＦＫＳＧＡＴＦＱＶＥＶＰＧＳＱＨＩＤＳＱＫＫＡＩＥＲＭＫＤＴＬＲＩＡＹＬＴＥＴＫＩＤＫＬＣＶＷＮＮＫＴＰＮＳＩＡＡＩＳＬＥＧＩＰＴＫＥＧＫＲＥＥＶＤＫＫＶＫＥＬＤＮＫＩＫＧＩＬＰＱＰＰＡＡＫＰＥＡＡＫＰＶＡＡＫＰＥＡＡＫＰＶＡＡＫＰＥＡＡＫＰＥＡＡＫＰＶＡＡＫＰＥＡＡＫＰＶＡＡＫＰＥＡＡＫＰＶＡＴＮＥＧＴＰＮＱＧＫＫＡＥＧＡＰＮＱＧＫＫＡＥＧＡＰＳＱＧＫＫＡＥＧＡＳＮＱＱＳＰＴＴＥＬＴＮＹＬＰＥＬＧＫＫＩＤＥＩＩＫＫＱＧＫＮＷＫＴＥＶＥＬＩＥＤＮＩＡＧＤＡＫＬＬＹＦＶＬＲＤＤＳＫＳＧＤＰＫＫＳＳＬＫＶＫＩＴＶＫＱＳＮＮＮＱＥＬＫＳＫ（配列番号１）．
本発明の組換えＰ９７タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、また好ましくは、少なくとも９９％の相同性を持つポリペプチドをすべて含むことができる。「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、タンパク質またはポリヌクレオチド配列間類似度の測定を意味する。これらのポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸の結実、付加または置換を有することができる。点数で付けられた２つの配列間相同性の程度は、一致度のパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）および／または配列の置換を保存することに基づく。
さらに、前記豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質は、下記のように製造することができる。豚の血清から分離したＰＣＶ２ｄ ＤＮＡのＯＲＦ２遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃ１ ｖｅｃｔｏｒ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）に挿入して組換えＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを製造した後、これをＥｘｐｉＳｆ９ ｃｅｌｌ（Ｇｉｂｃｏ）にトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して組換えバキュロウイルスを作製することができる。本発明のＰＣＶ２由来組換えタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とすることができる。
ＭＴＹＰＲＲＲＦＲＲＲＲＨＲＰＲＳＨＬＧＱＩＬＲＲＲＰＷＬＶＨＰＲＨＲＹＲＷＲＲＫＮＧＩＦＮＴＲＬＳＲＴＩＧＹＴＶＫＫＴＴＶＲＴＰＳＷＮＶＤＭＭＲＦＮＩＮＤＦＬＰＰＧＧＧＳＮＰＬＴＶＰＦＥＹＹＲＩＲＫＶＫＶＥＦＷＰＣＳＰＩＴＱＧＤＲＧＶＧＳＴＡＶＩＬＤＤＮＦＶＴＫＡＮＡＬＴＹＤＰＹＶＮＹＳＳＲＨＴＩＴＱＰＦＳＹＨＳＲＹＦＴＰＫＰＶＬＤＲＴＩＤＹＦＱＰＮＮＫＲＮＱＬＷＬＲＬＱＴＴＧＮＶＤＨＶＧＬＧＴＡＦＥＮＳＩＹＤＱＧＹＮＩＲＩＴＭＹＶＱＦＲＥＦＮＬＫＤＰＰＬＮＰＫ（配列番号２）．
本発明のＰＣＶ２由来組換えタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、また好ましくは、少なくとも９９％の相同性を持つポリペプチドをすべて含むことができる。「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、タンパク質またはポリヌクレオチド配列間類似度の測定を意味する。これらのポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸の結実、付加または置換を有することができる。点数で付けられた２つの配列間相同性の程度は、一致度のパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）および／または配列の置換を保存することに基づく。
本発明の組換えタンパク質は、ワクチンの製造に使用される場合、精製されたタンパク質形態でワクチンに添加されるか、大腸菌で発現して精製されない状態である溶菌液状態で含まれることができる。
本発明による多価ワクチン組成物に含まれるマイコプラズマハイオニューモニエ菌株および豚マイコプラズマハイオリニス菌株は、マイコプラズマ性肺病変を有する豚個体から分離するか、公知になっている菌株を制限なしに使用することができ、それぞれまたはすべて不活化したことを特徴とすることができ、不活化は、当分野に公知になっている方法を制限なしに使用することができる。
本発明による多価ワクチン組成物において、マイコプラズマハイオニューモニエは、１×１０８～１×１０９ ＣＣＵ（Ｃｏｌｏｕｒ－ｃｈａｎｇｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）／ｍＬの濃度でワクチンに含まれることができ、好ましくは１．５×１０８～５×１０８ ＣＣＵ／ｍＬ、さらに好ましくは２×１０８ ＣＣＵ／ｍＬの濃度で含まれることができる。このとき、ワクチン接種量は２ｍＬであることが好ましい。
本発明による多価ワクチン組成物において、マイコプラズマハイオリニスは、１×１０８～１×１０９ ＣＣＵ（Ｃｏｌｏｕｒ－ｃｈａｎｇｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）／ｍＬの濃度でワクチンに含まれることができ、好ましくは１．５×１０８～５×１０８ ＣＣＵ／ｍＬ、さらに好ましくは２×１０８ ＣＣＵ／ｍＬの濃度で含まれることができる。このとき、ワクチン接種量は２ｍＬであることが好ましい。
本発明による多価ワクチン組成物において、豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質は、１０～１００μｇ／ｄｏｓｅの濃度でワクチンに含まれることができ、好ましくは２０～５０μｇ／ｄｏｓｅ、さらに好ましくは最小２５μｇ／ｄｏｓｅの濃度で含まれることができる。このとき、ワクチン接種量は２ｍＬであることが好ましい。
本発明による多価ワクチン組成物において、豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質は、０．１～１０００μｇ／ｄｏｓｅの濃度でワクチンに含まれることができ、好ましくは１０～３０μｇ／ｄｏｓｅ、さらに好ましくは２０μｇ／ｄｏｓｅの濃度で含まれることができる。このとき、ワクチン接種量は２ｍＬであることが好ましい。
本発明の多価ワクチン組成物は、前記ワクチンの免疫原性を増進させて最小限の投与でも保護免疫を誘導することができる免疫強化剤であって、補助剤混合物および１つ以上の薬剤学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。前記「薬剤学的または獣医学的に許容される」とは、生理学的に許容されて動物に投与されるとき、通常的に胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似した反応を起こさない組成物を言う。前記担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アラビアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を有することができる。また、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿潤剤、香料、乳化剤および防腐剤などをさらに含むことができる。使用するに適した担体としては、食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、最小必須培地（ＭＥＭ）またはＨＥＰＥＳ緩衝液のＭＥＭを含む水性媒質を挙げることができるが、これに制限されるものではない。本発明の一実施例においては、安全性および免疫持続性を考慮してＩＭＳ系列賦形剤ＩＭＳ１３１３を使用した。
さらに、本発明の多価ワクチン組成物は、ワクチン組成物を構成するのに適切な一つ以上の免疫増強剤を含むことができる。
本発明の組成物に含まれることができる免疫増強剤は、注射した動物の免疫反応を増大させる物質を意味するものであって、多数の異なる免疫増強剤が技術分野の当業者に公知になっている。前記免疫増強剤は、フロイント完全および不完全免疫増強剤、ビタミンＥ、ノニオン性遮断ポリマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌ Ａ、鉱油および無鉱物油およびカーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、油中水型乳剤免疫増強剤などを含み、これに制限されるものではない。
また、本発明の多価ワクチン組成物は、哺乳動物に投与された後活性成分の迅速、持続または遅延した放出を提供することができるように当業界に公知になっている方法を使用して剤形化されることができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルション、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末などの形態であってよい。本発明の多価ワクチン組成物は、筋肉、皮下、経皮、静脈、鼻腔内、腹腔内または経口経路で投与されることができ、好ましくは、筋肉内または皮下経路で投与されることができる。ワクチンの投与量は、投与経路、動物の年齢、性別、体重および重症度などの様々な因子によって適切に選択されることができる。
また、本発明の多価ワクチン組成物は、組換えタンパク質Ｐ９７およびＰＣＶ２由来組換えタンパク質の製造のように本発明に特異的な方法を除いては、当該技術分野の標準方法によって製造されることができる。例えば、有機体は完全培地のような培養培地で増殖させることができ、有機体の増殖は色変化単位（ＣＣＵ）を測定するような標準技術でモニターして十分に高い力価が成就した場合に回収されることができる。ストック（ｓｔｏｃｋ）は剤形化のためにワクチンに含まれる前に通常の方法によって追加で濃縮されるか凍結乾燥させることができる。
また本発明は、本発明による多価ワクチン組成物を豚に接種するステップ；を含む豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防方法を提供する。
前記豚は、マイコプラズマおよび／または豚サーコウイルスに感染する可能性のある個体を制限なしに含むことができ、このような感染予防方法は、他の当分野に公知になっている治療方法または予防方法とともに並行して利用することができる。本発明において使用される用語「接種」は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
本発明による多価ワクチン組成物は、１～５週齢に１回接種を実施することができ、より好ましくは３週齢に１回接種を実施することができる。
本発明の予防方法は、豚において前記豚マイコプラズマ菌および／または豚サーコウイルスによって引き起こされる可能性のある感染性疾患の発病を予防することを目的とする。
また本発明は、（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質；を含む、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染による疾患予防用薬学的組成物を提供する。
前記豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染による疾患は、豚呼吸器複合症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＰＲＤＣ）、豚流行性肺炎（ｅｎｚｏｏｔｉｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、ＥＰ）、離乳後多臓器性発育不良症候群（ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ ｗａｓｔｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＭＷＳ）、豚皮膚炎腎症症候群（ｐｏｒｃｉｎｅ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＤＮＳ）、母豚流産斃死症候群（ｓｏｗ ａｂｏｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＡＭＳ）、豚生殖器および呼吸器症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＲＲＳ）、仮性狂犬病（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）、グレーサー病（Ｇｌａｓｓｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、連鎖球菌性髄膜炎（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、サルモネラ症（ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、離乳後大腸菌症（ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）、食餌性肝臓症（ｄｉｅｔｅｔｉｃ ｈｅｐａｔｏｓｉｓ）、化膿性気管支肺炎（ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖｅ ｂｒｏｎｃｈｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ユースタキオ管（Ｅｕｓｔａｃｈｉａｎ ｔｕｂｅ）炎症、多発性漿膜炎（ｐｏｌｙｓｅｒｏｓｉｔｉｓ）、マイコプラズマ性肺炎および胸膜肺炎からなる群より選択されたいずれか一つ以上であってよいが、これに制限されるものではない。
本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与が好ましい。
経口投与の場合、口腔内投与を含み、本発明の薬学的組成物は、これらに限定されるものではないが、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液剤を含んで経口的に許容される如何なる形態でも経口投与されることができる。
経口用錠剤の場合、よく使用される担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが含まれる。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤がまた典型的に添加される。カプセル型で経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥したトウモロコシデンプンが含まれる。水性懸濁液が経口投与されるとき、活性成分は乳化剤および懸濁化剤と配合される。必要な場合、甘味剤および／または風味剤および／または着色剤が添加されることができる。
口腔内投与のための薬学的組成物は、固体状の賦形剤とともに活性成分を混合することで製造することができ、精製または糖衣錠形態で製造するために顆粒形態で製造することができる。適した賦形剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトールのようなシュガー形態またはトウモロコシ、小麦粉、米、ジャガイモまたは他の植物からデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル－セルロースまたはナトリウムカルボキシメチルセルロースのようなセルロース、アラビアガム、トラガカントガムを含むガム類のようなカーボハイドレートまたはゼラチン、コラーゲンのようなタンパク質フィラーを使用することができる。必要な場合には、交差結合されたポリビニルピロリドン、寒天およびアルギン酸またはナトリウムアルギン酸のようなそれぞれの塩形態の崩壊剤または溶解剤を添加することができる。
本発明において、「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。
本発明の薬学的組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液であって、滅菌注射用製剤の形態であってよい。この懸濁液は、適した分散剤または湿潤剤（例、ツイン８０）および懸濁化剤を使用して本分野に公知になっている技術によって剤形されることができる。滅菌注射用製剤はまた無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例、１，３－ブタンジオール中の溶液）であってよい。許容的に使用され得るビヒクルおよび溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。また、滅菌不揮発性オイルが通常的に溶媒または懸濁化媒質として使用される。このような目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含んで刺激性の少ない如何なる不揮発性オイルも使用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸が薬剤学的に許容される天然オイル（例、オリーブ油またはヒマシ油）、特にこれらのポリオキシエチル化されたものと同様に注射製剤に有用である。さらに、非経口的投与の場合、本発明の薬学的組成物は水溶性溶液で製造することができる。好ましくは、ハンクス溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、リンゲル溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または物理的に緩衝した塩水のような物理的に適切な緩衝溶液を使用することができる。水溶性注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのように懸濁液の粘度を増加させ得る基質を添加することができる。付け加えて、活性成分の懸濁液は、適した油質の注入懸濁液（ｏｉｌｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）で製造されることができる。適した親脂性溶媒または担体は、ごま油のような脂肪酸またはエチルオレート、トリグリセリドまたはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。複数カチオン性非脂質アミノポリマー（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ ａｍｉｎｏ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）も運搬体として使用されることができる。任意で、懸濁液は化合物の溶解度を増加させて高濃度の溶液を製造するために適した安定化剤または薬剤を使用することができる。
本発明の薬学的組成物はまた直腸投与のための坐剤の形態で投与されることができる。これらの組成物は、本発明の（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質を混合した混合物と、室温で固形であり直腸温度では液状である適した非刺激性賦形剤を混合して製造することができる。このような物質としては、これらに限定されるものではないが、ココアバター、ミツロウおよびポリエチレングリコールが含まれる。
本発明の薬学的組成物を皮膚に局所的に適用する場合、前記薬学的組成物は担体に懸濁または溶解された活性成分を含有した適した軟膏で剤形されなければならない。本発明の（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；(iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質を混合した混合物を局所投与するための担体としては、これらに限定されるものではないが、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が含まれる。また本発明の薬学的組成物は、担体に懸濁または溶解された活性化合物を含有した適したローションまたはクリームで剤形されることができる。適した担体としては、これらに限定されるものではないが、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれる。本発明の薬学的組成物はまた直腸坐剤によって、また適した浣腸剤で下部腸管に局所適用することができる。局所適用された経皮パッチがまた本発明に含まれる。
本発明の薬学的組成物は、鼻内エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。このような組成物は、薬剤の分野によく知られている技術によって製造し、ベンジルアルコールまたは他の適した保存剤、生体利用率を増加させるための吸収促進剤、フルオロカーボンおよび／またはその他の本分野に知られている可溶化剤または分散剤を使用して塩水中の溶液として製造することができる。
特定個体に対する特定有効量は、使用された（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質を混合した混合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、規定食、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症を含む様々な要因によって変わることができる。
上述した本発明の内容は、互いに矛盾しない限り、互いに同一に適用され、当該技術分野における通常の技術者が適切な変更を加えて実施することもまた本発明の範疇に含まれる。
以下、本発明を実施例を通じて詳細に説明するが、本発明の範囲が下記実施例にのみ限定されるものではない。
本発明は、（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質；を含む、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のための多価ワクチン組成物を提供する。
本発明において、「ワクチン」は、抗原物質を含む獣医学用ワクチンであって、Ｍｈｐ、ＭｈｒまたはＰＣＶ２に対して特異的且つ能動または受動の免疫性を誘導するための目的で投与される。
一方、マイコプラズマハイオニューモニエの感染は、病原体が呼吸器上皮細胞の繊毛に付着するとともに開始される。付着因子（Ａｄｈｅｓｉｎ）Ｐ９７はマイコプラズマハイオニューモニエの膜表面タンパク質で免疫原性が高い抗原として知られている。Ｐ９７のＣ末端には、繰り返される区間で構成されたＲ１とＲ２部位が存在し、そのうちＲ１部位は宿主呼吸器繊毛の付着部位（ＡＡＫＰＶ／Ｅ）に結合する。結合されたマイコプラズマハイオニューモニエは、成長に必要なアミノ酸を宿主から得ることができ、傷ついた組織に侵入するために宿主の分子を多様に配列することができるようになる。一方、宿主は、抗体を生産して豚繊毛にマイコプラズマハイオニューモニエが付着することを妨げるか、付着した病原体の成長を阻害することができる。しかし、先行研究によれば、既存の常用ワクチンは、Ｐ９７に対する抗体を誘導することができないと報告されたことがある。
これにおいて、本発明の多価ワクチン組成物は、組換えＰ９７タンパク質を含んでＰ９７に対する抗体を誘導することができることを特徴とする。本発明において、ワクチン組成物に含まれる前記組換えＰ９７タンパク質は、豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来Ｐ９７遺伝子と大腸菌易熱性エンテロトキシンサブユニットＢ（Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｅａｔ－ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ、ｅｌｔｂ）遺伝子を融合して製造されることができる。より具体的に、Ｅ．ｃｏｌｉのｅｌｔｂとマイコプラズマハイオニューモニエＰ９７遺伝子のＣ－末端繰り返し配列であるＲ１とＲ１Ｒ２を融合させ、ＬＴＢと融合されたＰ９７遺伝子であるｌｔｂＲ１とｌｔｂＲ１Ｒ２を重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して製造されることができる。前記組換えＰ９７タンパク質は、下記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とすることができる。
ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤＤＤＫＡＭＡＤＩＧＳＥＦＡＰＱＴＩＴＥＬＣＳＥＹＲＮＴＱＩＹＴＩＮＤＫＩＬＳＹＴＥＳＭＡＧＫＲＥＭＶＩＩＴＦＫＳＧＡＴＦＱＶＥＶＰＧＳＱＨＩＤＳＱＫＫＡＩＥＲＭＫＤＴＬＲＩＡＹＬＴＥＴＫＩＤＫＬＣＶＷＮＮＫＴＰＮＳＩＡＡＩＳＬＥＧＩＰＴＫＥＧＫＲＥＥＶＤＫＫＶＫＥＬＤＮＫＩＫＧＩＬＰＱＰＰＡＡＫＰＥＡＡＫＰＶＡＡＫＰＥＡＡＫＰＶＡＡＫＰＥＡＡＫＰＥＡＡＫＰＶＡＡＫＰＥＡＡＫＰＶＡＡＫＰＥＡＡＫＰＶＡＴＮＥＧＴＰＮＱＧＫＫＡＥＧＡＰＮＱＧＫＫＡＥＧＡＰＳＱＧＫＫＡＥＧＡＳＮＱＱＳＰＴＴＥＬＴＮＹＬＰＥＬＧＫＫＩＤＥＩＩＫＫＱＧＫＮＷＫＴＥＶＥＬＩＥＤＮＩＡＧＤＡＫＬＬＹＦＶＬＲＤＤＳＫＳＧＤＰＫＫＳＳＬＫＶＫＩＴＶＫＱＳＮＮＮＱＥＬＫＳＫ（配列番号１）．
本発明の組換えＰ９７タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、また好ましくは、少なくとも９９％の相同性を持つポリペプチドをすべて含むことができる。「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、タンパク質またはポリヌクレオチド配列間類似度の測定を意味する。これらのポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸の結実、付加または置換を有することができる。点数で付けられた２つの配列間相同性の程度は、一致度のパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）および／または配列の置換を保存することに基づく。
さらに、前記豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質は、下記のように製造することができる。豚の血清から分離したＰＣＶ２ｄ ＤＮＡのＯＲＦ２遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃ１ ｖｅｃｔｏｒ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）に挿入して組換えＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを製造した後、これをＥｘｐｉＳｆ９ ｃｅｌｌ（Ｇｉｂｃｏ）にトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して組換えバキュロウイルスを作製することができる。本発明のＰＣＶ２由来組換えタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とすることができる。
ＭＴＹＰＲＲＲＦＲＲＲＲＨＲＰＲＳＨＬＧＱＩＬＲＲＲＰＷＬＶＨＰＲＨＲＹＲＷＲＲＫＮＧＩＦＮＴＲＬＳＲＴＩＧＹＴＶＫＫＴＴＶＲＴＰＳＷＮＶＤＭＭＲＦＮＩＮＤＦＬＰＰＧＧＧＳＮＰＬＴＶＰＦＥＹＹＲＩＲＫＶＫＶＥＦＷＰＣＳＰＩＴＱＧＤＲＧＶＧＳＴＡＶＩＬＤＤＮＦＶＴＫＡＮＡＬＴＹＤＰＹＶＮＹＳＳＲＨＴＩＴＱＰＦＳＹＨＳＲＹＦＴＰＫＰＶＬＤＲＴＩＤＹＦＱＰＮＮＫＲＮＱＬＷＬＲＬＱＴＴＧＮＶＤＨＶＧＬＧＴＡＦＥＮＳＩＹＤＱＧＹＮＩＲＩＴＭＹＶＱＦＲＥＦＮＬＫＤＰＰＬＮＰＫ（配列番号２）．
本発明のＰＣＶ２由来組換えタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、また好ましくは、少なくとも９９％の相同性を持つポリペプチドをすべて含むことができる。「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、タンパク質またはポリヌクレオチド配列間類似度の測定を意味する。これらのポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸の結実、付加または置換を有することができる。点数で付けられた２つの配列間相同性の程度は、一致度のパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）および／または配列の置換を保存することに基づく。
本発明の組換えタンパク質は、ワクチンの製造に使用される場合、精製されたタンパク質形態でワクチンに添加されるか、大腸菌で発現して精製されない状態である溶菌液状態で含まれることができる。
本発明による多価ワクチン組成物に含まれるマイコプラズマハイオニューモニエ菌株および豚マイコプラズマハイオリニス菌株は、マイコプラズマ性肺病変を有する豚個体から分離するか、公知になっている菌株を制限なしに使用することができ、それぞれまたはすべて不活化したことを特徴とすることができ、不活化は、当分野に公知になっている方法を制限なしに使用することができる。
本発明による多価ワクチン組成物において、マイコプラズマハイオニューモニエは、１×１０８～１×１０９ ＣＣＵ（Ｃｏｌｏｕｒ－ｃｈａｎｇｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）／ｍＬの濃度でワクチンに含まれることができ、好ましくは１．５×１０８～５×１０８ ＣＣＵ／ｍＬ、さらに好ましくは２×１０８ ＣＣＵ／ｍＬの濃度で含まれることができる。このとき、ワクチン接種量は２ｍＬであることが好ましい。
本発明による多価ワクチン組成物において、マイコプラズマハイオリニスは、１×１０８～１×１０９ ＣＣＵ（Ｃｏｌｏｕｒ－ｃｈａｎｇｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）／ｍＬの濃度でワクチンに含まれることができ、好ましくは１．５×１０８～５×１０８ ＣＣＵ／ｍＬ、さらに好ましくは２×１０８ ＣＣＵ／ｍＬの濃度で含まれることができる。このとき、ワクチン接種量は２ｍＬであることが好ましい。
本発明による多価ワクチン組成物において、豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質は、１０～１００μｇ／ｄｏｓｅの濃度でワクチンに含まれることができ、好ましくは２０～５０μｇ／ｄｏｓｅ、さらに好ましくは最小２５μｇ／ｄｏｓｅの濃度で含まれることができる。このとき、ワクチン接種量は２ｍＬであることが好ましい。
本発明による多価ワクチン組成物において、豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質は、０．１～１０００μｇ／ｄｏｓｅの濃度でワクチンに含まれることができ、好ましくは１０～３０μｇ／ｄｏｓｅ、さらに好ましくは２０μｇ／ｄｏｓｅの濃度で含まれることができる。このとき、ワクチン接種量は２ｍＬであることが好ましい。
本発明の多価ワクチン組成物は、前記ワクチンの免疫原性を増進させて最小限の投与でも保護免疫を誘導することができる免疫強化剤であって、補助剤混合物および１つ以上の薬剤学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。前記「薬剤学的または獣医学的に許容される」とは、生理学的に許容されて動物に投与されるとき、通常的に胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似した反応を起こさない組成物を言う。前記担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アラビアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を有することができる。また、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿潤剤、香料、乳化剤および防腐剤などをさらに含むことができる。使用するに適した担体としては、食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、最小必須培地（ＭＥＭ）またはＨＥＰＥＳ緩衝液のＭＥＭを含む水性媒質を挙げることができるが、これに制限されるものではない。本発明の一実施例においては、安全性および免疫持続性を考慮してＩＭＳ系列賦形剤ＩＭＳ１３１３を使用した。
さらに、本発明の多価ワクチン組成物は、ワクチン組成物を構成するのに適切な一つ以上の免疫増強剤を含むことができる。
本発明の組成物に含まれることができる免疫増強剤は、注射した動物の免疫反応を増大させる物質を意味するものであって、多数の異なる免疫増強剤が技術分野の当業者に公知になっている。前記免疫増強剤は、フロイント完全および不完全免疫増強剤、ビタミンＥ、ノニオン性遮断ポリマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌ Ａ、鉱油および無鉱物油およびカーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、油中水型乳剤免疫増強剤などを含み、これに制限されるものではない。
また、本発明の多価ワクチン組成物は、哺乳動物に投与された後活性成分の迅速、持続または遅延した放出を提供することができるように当業界に公知になっている方法を使用して剤形化されることができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルション、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末などの形態であってよい。本発明の多価ワクチン組成物は、筋肉、皮下、経皮、静脈、鼻腔内、腹腔内または経口経路で投与されることができ、好ましくは、筋肉内または皮下経路で投与されることができる。ワクチンの投与量は、投与経路、動物の年齢、性別、体重および重症度などの様々な因子によって適切に選択されることができる。
また、本発明の多価ワクチン組成物は、組換えタンパク質Ｐ９７およびＰＣＶ２由来組換えタンパク質の製造のように本発明に特異的な方法を除いては、当該技術分野の標準方法によって製造されることができる。例えば、有機体は完全培地のような培養培地で増殖させることができ、有機体の増殖は色変化単位（ＣＣＵ）を測定するような標準技術でモニターして十分に高い力価が成就した場合に回収されることができる。ストック（ｓｔｏｃｋ）は剤形化のためにワクチンに含まれる前に通常の方法によって追加で濃縮されるか凍結乾燥させることができる。
また本発明は、本発明による多価ワクチン組成物を豚に接種するステップ；を含む豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防方法を提供する。
前記豚は、マイコプラズマおよび／または豚サーコウイルスに感染する可能性のある個体を制限なしに含むことができ、このような感染予防方法は、他の当分野に公知になっている治療方法または予防方法とともに並行して利用することができる。本発明において使用される用語「接種」は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
本発明による多価ワクチン組成物は、１～５週齢に１回接種を実施することができ、より好ましくは３週齢に１回接種を実施することができる。
本発明の予防方法は、豚において前記豚マイコプラズマ菌および／または豚サーコウイルスによって引き起こされる可能性のある感染性疾患の発病を予防することを目的とする。
また本発明は、（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質；を含む、豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染による疾患予防用薬学的組成物を提供する。
前記豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染による疾患は、豚呼吸器複合症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＰＲＤＣ）、豚流行性肺炎（ｅｎｚｏｏｔｉｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、ＥＰ）、離乳後多臓器性発育不良症候群（ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ ｗａｓｔｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＭＷＳ）、豚皮膚炎腎症症候群（ｐｏｒｃｉｎｅ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＤＮＳ）、母豚流産斃死症候群（ｓｏｗ ａｂｏｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＡＭＳ）、豚生殖器および呼吸器症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＲＲＳ）、仮性狂犬病（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）、グレーサー病（Ｇｌａｓｓｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、連鎖球菌性髄膜炎（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、サルモネラ症（ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、離乳後大腸菌症（ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）、食餌性肝臓症（ｄｉｅｔｅｔｉｃ ｈｅｐａｔｏｓｉｓ）、化膿性気管支肺炎（ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖｅ ｂｒｏｎｃｈｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ユースタキオ管（Ｅｕｓｔａｃｈｉａｎ ｔｕｂｅ）炎症、多発性漿膜炎（ｐｏｌｙｓｅｒｏｓｉｔｉｓ）、マイコプラズマ性肺炎および胸膜肺炎からなる群より選択されたいずれか一つ以上であってよいが、これに制限されるものではない。
本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与が好ましい。
経口投与の場合、口腔内投与を含み、本発明の薬学的組成物は、これらに限定されるものではないが、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液剤を含んで経口的に許容される如何なる形態でも経口投与されることができる。
経口用錠剤の場合、よく使用される担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが含まれる。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤がまた典型的に添加される。カプセル型で経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥したトウモロコシデンプンが含まれる。水性懸濁液が経口投与されるとき、活性成分は乳化剤および懸濁化剤と配合される。必要な場合、甘味剤および／または風味剤および／または着色剤が添加されることができる。
口腔内投与のための薬学的組成物は、固体状の賦形剤とともに活性成分を混合することで製造することができ、精製または糖衣錠形態で製造するために顆粒形態で製造することができる。適した賦形剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトールのようなシュガー形態またはトウモロコシ、小麦粉、米、ジャガイモまたは他の植物からデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル－セルロースまたはナトリウムカルボキシメチルセルロースのようなセルロース、アラビアガム、トラガカントガムを含むガム類のようなカーボハイドレートまたはゼラチン、コラーゲンのようなタンパク質フィラーを使用することができる。必要な場合には、交差結合されたポリビニルピロリドン、寒天およびアルギン酸またはナトリウムアルギン酸のようなそれぞれの塩形態の崩壊剤または溶解剤を添加することができる。
本発明において、「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。
本発明の薬学的組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液であって、滅菌注射用製剤の形態であってよい。この懸濁液は、適した分散剤または湿潤剤（例、ツイン８０）および懸濁化剤を使用して本分野に公知になっている技術によって剤形されることができる。滅菌注射用製剤はまた無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例、１，３－ブタンジオール中の溶液）であってよい。許容的に使用され得るビヒクルおよび溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。また、滅菌不揮発性オイルが通常的に溶媒または懸濁化媒質として使用される。このような目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含んで刺激性の少ない如何なる不揮発性オイルも使用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸が薬剤学的に許容される天然オイル（例、オリーブ油またはヒマシ油）、特にこれらのポリオキシエチル化されたものと同様に注射製剤に有用である。さらに、非経口的投与の場合、本発明の薬学的組成物は水溶性溶液で製造することができる。好ましくは、ハンクス溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、リンゲル溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または物理的に緩衝した塩水のような物理的に適切な緩衝溶液を使用することができる。水溶性注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのように懸濁液の粘度を増加させ得る基質を添加することができる。付け加えて、活性成分の懸濁液は、適した油質の注入懸濁液（ｏｉｌｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）で製造されることができる。適した親脂性溶媒または担体は、ごま油のような脂肪酸またはエチルオレート、トリグリセリドまたはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。複数カチオン性非脂質アミノポリマー（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ ａｍｉｎｏ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）も運搬体として使用されることができる。任意で、懸濁液は化合物の溶解度を増加させて高濃度の溶液を製造するために適した安定化剤または薬剤を使用することができる。
本発明の薬学的組成物はまた直腸投与のための坐剤の形態で投与されることができる。これらの組成物は、本発明の（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質を混合した混合物と、室温で固形であり直腸温度では液状である適した非刺激性賦形剤を混合して製造することができる。このような物質としては、これらに限定されるものではないが、ココアバター、ミツロウおよびポリエチレングリコールが含まれる。
本発明の薬学的組成物を皮膚に局所的に適用する場合、前記薬学的組成物は担体に懸濁または溶解された活性成分を含有した適した軟膏で剤形されなければならない。本発明の（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；(iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質を混合した混合物を局所投与するための担体としては、これらに限定されるものではないが、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が含まれる。また本発明の薬学的組成物は、担体に懸濁または溶解された活性化合物を含有した適したローションまたはクリームで剤形されることができる。適した担体としては、これらに限定されるものではないが、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれる。本発明の薬学的組成物はまた直腸坐剤によって、また適した浣腸剤で下部腸管に局所適用することができる。局所適用された経皮パッチがまた本発明に含まれる。
本発明の薬学的組成物は、鼻内エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。このような組成物は、薬剤の分野によく知られている技術によって製造し、ベンジルアルコールまたは他の適した保存剤、生体利用率を増加させるための吸収促進剤、フルオロカーボンおよび／またはその他の本分野に知られている可溶化剤または分散剤を使用して塩水中の溶液として製造することができる。
特定個体に対する特定有効量は、使用された（i）豚マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｈｐ）菌株；（ii）豚マイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｈｒ）菌株；（iii）豚マイコプラズマハイオニューモニエ由来組換えＰ９７タンパク質；および（iv）豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）由来組換えタンパク質を混合した混合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、規定食、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症を含む様々な要因によって変わることができる。
上述した本発明の内容は、互いに矛盾しない限り、互いに同一に適用され、当該技術分野における通常の技術者が適切な変更を加えて実施することもまた本発明の範疇に含まれる。
以下、本発明を実施例を通じて詳細に説明するが、本発明の範囲が下記実施例にのみ限定されるものではない。
【0008】
実施例１．多価ワクチン組成物の抗原作製
１－１．マイコプラズマハイオニューモニエ不活化抗原の作製
マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、以下、Ｍｈｐ）とマイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、以下、Ｍｈｒ）菌株を豚のマイコプラズマ性肺病変を現わす肺から分離し、ＰＣＲを利用して各菌株に同定した。
分離したＭｈｐとＭｈｒ菌株は、Ｆｒｉｉｓ’培地を使用して５％ＣＯ２、３７℃の条件で３日間培養した。タンパク質パターン分析と多形成ＤＮＡの無作為増幅（Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ、ＲＡＰＤ）分析を通じて、分離した菌株がＭｈｐまたはＭｈｒであることを確認した。３日間培養された菌液はおおよそ０．１～５．０×１０９ＣＣＵ／ｍＬの細菌数を保有した。培養された菌液は、ｐＨを約７．８で合わせた後、ＢＥＩ（Ｂｉｎａｒｙ ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）のような不活化試薬を利用して最終４ｍＭの濃度で２０～２４時間の間菌の不活化を進行した。ＢＥＩは、培養液にＢＥＡ（Ｌ－ｂｒｏｍｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ））を添加して製造した。その後、中和試薬であるチオ硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ））を最終１６ｍＭの濃度で混合して２０～２４時間の間中和させ、不活化した培養液一部を新たな培地に添加して３７℃で最小１週間培養し、不活化したか確認した。不活化した培養液は、遠心分離法で濃縮してワクチン抗原として使用した。
１－２．組換えＭｈｐ Ｐ９７タンパク質抗原の作製
組換えＰ９７タンパク質は、マイコプラズマハイオニューモニエのＰ９７遺伝子にｅｌｔｂ遺伝子を融合した後、ｐＥＴ－３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）発現システムを利用して作製した。要約すると、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ－ｐｌｕｓ ＲＩＬ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に熱衝撃を利用して組換えプラスミドで形質転換させた後、５０μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｋａｎａｍｉｃｉｎ）が添加された１ＬのＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を混合して２０時間の間タンパク質発現を誘導した後に破砕し、遠心分離して上澄み液で組換えタンパク質が含まれた溶菌液を得た。
得られたタンパク質抗原は、下記２つの方法で精製した。第一に、組換えタンパク質が含まれた溶菌液をＮｉ－ＮＴＡコラムに親和力を利用して結合させた後、精製バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で５ＣＶ（コラムレジン容量（Ｃｏｌｕｍｎ ｒｅｓｉｎ ｖｏｌｕｍｅ）の５倍）だけ洗浄して結合しないタンパク質を除去した。以後、４０ｍＭのイミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）が含まれた精製バッファーで５ＣＶだけ非特異的結合したタンパク質を除去し、４００ｍＭのイミダゾールが含まれた精製バッファーで組換えＰ９７タンパク質抗原を溶出して回収した。回収したタンパク質は容量によって濾過して濃縮した。精製されたタンパク質抗原はＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）方法で定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）方法で純度を確認した。
第二に、組換えタンパク質が含まれた溶菌液のｐＨを６．０に適正し、約２時間の間撹拌して反応させた。以後、遠心分離してタンパク質抗原を沈殿させ、ｐＨ７．２のＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）を添加してタンパク質を回収した。精製されたタンパク質はＢＣＡ方法で定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法で純度を確認した。
上記のように精製された組換えＰ９７タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示した。
１－３．組換えＰＣＶ２ｄカプシドタンパク質抗原の作製
１－３－１．細胞および菌株準備
ＰＣＶ－ｆｒｅｅ ＰＫ－１５細胞は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＧｅｎＤＥＰＯＴ））と１％抗生剤－抗真菌溶液（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ））が添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＧｅｎＤＥＰＯＴ、Ｋａｔｙ、ＴＸ、ＵＳＡ））培地で３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。タンパク質発現に使用した昆虫細胞（ＥｘｐｉＳｆ９、Ｇｉｂｃｏ）は、２８℃、ｒｐｍ１００条件でＥｘｐｉＳｆ ＣＤ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して振とう培養した。
ＰＣＶ２ｄ遺伝型のＯＲＦ２塩基配列は、２０１７年忠清南道論山市に位置した養豚農家で分離したＰＣＶ２ｄのウイルスＤＮＡを鋳型として増幅され、ＰＣＶ２ｄに対するウイルス中和試験は、ＰＣＶ２に感染判定された豚のリンパ節と肺組織からＰＣＶ２ｄを分離および継代培養して使用した。
１－３－２．組換えバキュロウイルスの作製
組換えバキュロウイルスを製造企業が勧奨する使用者指針に沿ってバキュロウイルス発現システム（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ））を使用して作製した。要約すると、ＰＣＶ２ｄのＯＲＦ２遺伝子を順方向プライマー（５’－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＴＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧ－３’（配列番号３））と逆方向プライマー（５’－ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＧＧＧＴＴＡＡＧＴＧＧ－３’（配列番号４））をＴＯＰｓｉｍｐｌｅ ＤｙｅＭＩＸ－Ｆｏｒｔｅ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）のように使用して増幅した。増幅したＰＣＶ２カプシド（ＰＣＶ２ ＣＰ）遺伝子を制限酵素であるＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）で切断し、ＨｉＹｉｅｌｄ Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＲＢＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）を使用して精製した後、ｐＦａｓｔＢａｃ１（ｐＦＢ）（Ｇｉｂｃｏ）バキュロウイルスベクターにクローニングした。組換えｐＦＢ－２ｄＣＰをｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）に挿入して形質転換し、塩基配列を分析した。組換えｂａｃｍｉｄ ＤＮＡは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）を利用してＥｘｐｉＳｆ９細胞にトランスフェクションを実施した。これを２８℃、１００ｒｐｍ条件で５日間振とう培養してＰＣＶ２ｄ ＯＲＦ２を発現する組換えバキュロウイルス（Ｂａｃ－２ｄＣＰ）を確保した。Ｒｉｂｏｓｐｉｎ（商標）ｖＲＤ（ＧｅｎｅＡｌｌ）を利用してウイルスＤＮＡを抽出した後、リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｑＰＣＲ）で前記組換えバキュロウイルスの力価を測定したところ、１．４８×１０１１ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬを示した。
１－３－３．発現された組換えタンパク質の精製
ＥｘｐｉＳｆ９細胞に組換えバキュロウイルスを感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、ＭＯＩ）５の濃度で感染させた後、培養した。培養５日に１，０００×ｇの速度で５分間遠心分離して細胞を収穫した。発現された組換えタンパク質は、アニオン交換クロマトグラフィーコラムを使用して精製した。要約すると、収穫した細胞を５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２Ｏ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）が含まれた溶解バッファーに再懸濁させた。これを３０分間氷で反応させた後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。組換えタンパク質が含まれた上澄み液をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）イオン交換プラットホームで精製した後、０．２２μｍサイズのフィルターを通して濾過した。上記のように精製されたＰＣＶ２由来組換えタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に示した。
さらに、前記ＰＣＶ２由来組換えタンパク質を韓国基礎科学研究院の春川センターで透過電子顕微鏡（ＴＥＭ；ＪＥＭ－２１００Ｆ；ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を利用して観察したところ、図１のように、約１７ｎｍ直径のＰＣＶ２ウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＶＬＰ）が形成されたことを確認した。
１－３－４．組換えタンパク質発現分析
精製された組換えタンパク質を１２％ゲルに注入してＳＤＳ－ＰＡＧＥを施行し、半乾燥移送機器（ｓｅｍｉｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ））を利用してハイボンドポリビニルピロリドンメンブレイン（Ｈｙｂｏｎｄ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ））でトランスファーした。豚抗－ＰＣＶ２抗体（ｐｏｒｃｉｎｅ ａｎｔｉ－ＰＣＶ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５００希釈））とＨＲＰ－結合されたヤギ抗－豚ＩｇＧ抗体（ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｐｏｒｃｉｎｅ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ（（１：５，０００希釈）（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ、ＵＳＡ））を利用してウェスタンブロットを行ったところ、約２８ｋＤａのタンパク質バンドを確認した。
１－４．本発明による多価ワクチン組成物の製造
２×１０８ ＣＣＵ／ｄｏｓｅ以上濃度の前記実施例１－１を通じて製造したＭｈｐおよびＭｈｒ不活化菌株抗原と、前記実施例１－２を通じて製造した２５μｇ／ｄｏｓｅ以上濃度の組換えＰ９７タンパク質抗原、前記実施例１－３を通じて製造した２０μｇ／ｄｏｓｅ濃度の組換えＰＣＶ２ｄカプシドタンパク質抗原を２Ｘ ＰＢＳに混合した後（１ｍＬ／ｄｏｓｅ）、２０分以上撹拌して混合した。それから、同一容量の補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＭＳ１３１３、Ｓｅｐｐｉｃ））を追加し、２０分以上撹拌して多価ワクチン組成物を製造した。
１－１．マイコプラズマハイオニューモニエ不活化抗原の作製
マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、以下、Ｍｈｐ）とマイコプラズマハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、以下、Ｍｈｒ）菌株を豚のマイコプラズマ性肺病変を現わす肺から分離し、ＰＣＲを利用して各菌株に同定した。
分離したＭｈｐとＭｈｒ菌株は、Ｆｒｉｉｓ’培地を使用して５％ＣＯ２、３７℃の条件で３日間培養した。タンパク質パターン分析と多形成ＤＮＡの無作為増幅（Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ、ＲＡＰＤ）分析を通じて、分離した菌株がＭｈｐまたはＭｈｒであることを確認した。３日間培養された菌液はおおよそ０．１～５．０×１０９ＣＣＵ／ｍＬの細菌数を保有した。培養された菌液は、ｐＨを約７．８で合わせた後、ＢＥＩ（Ｂｉｎａｒｙ ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）のような不活化試薬を利用して最終４ｍＭの濃度で２０～２４時間の間菌の不活化を進行した。ＢＥＩは、培養液にＢＥＡ（Ｌ－ｂｒｏｍｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ））を添加して製造した。その後、中和試薬であるチオ硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ））を最終１６ｍＭの濃度で混合して２０～２４時間の間中和させ、不活化した培養液一部を新たな培地に添加して３７℃で最小１週間培養し、不活化したか確認した。不活化した培養液は、遠心分離法で濃縮してワクチン抗原として使用した。
１－２．組換えＭｈｐ Ｐ９７タンパク質抗原の作製
組換えＰ９７タンパク質は、マイコプラズマハイオニューモニエのＰ９７遺伝子にｅｌｔｂ遺伝子を融合した後、ｐＥＴ－３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）発現システムを利用して作製した。要約すると、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ－ｐｌｕｓ ＲＩＬ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に熱衝撃を利用して組換えプラスミドで形質転換させた後、５０μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｋａｎａｍｉｃｉｎ）が添加された１ＬのＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で培養した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を混合して２０時間の間タンパク質発現を誘導した後に破砕し、遠心分離して上澄み液で組換えタンパク質が含まれた溶菌液を得た。
得られたタンパク質抗原は、下記２つの方法で精製した。第一に、組換えタンパク質が含まれた溶菌液をＮｉ－ＮＴＡコラムに親和力を利用して結合させた後、精製バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で５ＣＶ（コラムレジン容量（Ｃｏｌｕｍｎ ｒｅｓｉｎ ｖｏｌｕｍｅ）の５倍）だけ洗浄して結合しないタンパク質を除去した。以後、４０ｍＭのイミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）が含まれた精製バッファーで５ＣＶだけ非特異的結合したタンパク質を除去し、４００ｍＭのイミダゾールが含まれた精製バッファーで組換えＰ９７タンパク質抗原を溶出して回収した。回収したタンパク質は容量によって濾過して濃縮した。精製されたタンパク質抗原はＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）方法で定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）方法で純度を確認した。
第二に、組換えタンパク質が含まれた溶菌液のｐＨを６．０に適正し、約２時間の間撹拌して反応させた。以後、遠心分離してタンパク質抗原を沈殿させ、ｐＨ７．２のＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）を添加してタンパク質を回収した。精製されたタンパク質はＢＣＡ方法で定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法で純度を確認した。
上記のように精製された組換えＰ９７タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示した。
１－３．組換えＰＣＶ２ｄカプシドタンパク質抗原の作製
１－３－１．細胞および菌株準備
ＰＣＶ－ｆｒｅｅ ＰＫ－１５細胞は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＧｅｎＤＥＰＯＴ））と１％抗生剤－抗真菌溶液（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ））が添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＧｅｎＤＥＰＯＴ、Ｋａｔｙ、ＴＸ、ＵＳＡ））培地で３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。タンパク質発現に使用した昆虫細胞（ＥｘｐｉＳｆ９、Ｇｉｂｃｏ）は、２８℃、ｒｐｍ１００条件でＥｘｐｉＳｆ ＣＤ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して振とう培養した。
ＰＣＶ２ｄ遺伝型のＯＲＦ２塩基配列は、２０１７年忠清南道論山市に位置した養豚農家で分離したＰＣＶ２ｄのウイルスＤＮＡを鋳型として増幅され、ＰＣＶ２ｄに対するウイルス中和試験は、ＰＣＶ２に感染判定された豚のリンパ節と肺組織からＰＣＶ２ｄを分離および継代培養して使用した。
１－３－２．組換えバキュロウイルスの作製
組換えバキュロウイルスを製造企業が勧奨する使用者指針に沿ってバキュロウイルス発現システム（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ））を使用して作製した。要約すると、ＰＣＶ２ｄのＯＲＦ２遺伝子を順方向プライマー（５’－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＴＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧ－３’（配列番号３））と逆方向プライマー（５’－ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＧＧＧＴＴＡＡＧＴＧＧ－３’（配列番号４））をＴＯＰｓｉｍｐｌｅ ＤｙｅＭＩＸ－Ｆｏｒｔｅ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）のように使用して増幅した。増幅したＰＣＶ２カプシド（ＰＣＶ２ ＣＰ）遺伝子を制限酵素であるＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）で切断し、ＨｉＹｉｅｌｄ Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＲＢＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）を使用して精製した後、ｐＦａｓｔＢａｃ１（ｐＦＢ）（Ｇｉｂｃｏ）バキュロウイルスベクターにクローニングした。組換えｐＦＢ－２ｄＣＰをｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）に挿入して形質転換し、塩基配列を分析した。組換えｂａｃｍｉｄ ＤＮＡは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）を利用してＥｘｐｉＳｆ９細胞にトランスフェクションを実施した。これを２８℃、１００ｒｐｍ条件で５日間振とう培養してＰＣＶ２ｄ ＯＲＦ２を発現する組換えバキュロウイルス（Ｂａｃ－２ｄＣＰ）を確保した。Ｒｉｂｏｓｐｉｎ（商標）ｖＲＤ（ＧｅｎｅＡｌｌ）を利用してウイルスＤＮＡを抽出した後、リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｑＰＣＲ）で前記組換えバキュロウイルスの力価を測定したところ、１．４８×１０１１ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬを示した。
１－３－３．発現された組換えタンパク質の精製
ＥｘｐｉＳｆ９細胞に組換えバキュロウイルスを感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、ＭＯＩ）５の濃度で感染させた後、培養した。培養５日に１，０００×ｇの速度で５分間遠心分離して細胞を収穫した。発現された組換えタンパク質は、アニオン交換クロマトグラフィーコラムを使用して精製した。要約すると、収穫した細胞を５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２Ｏ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）が含まれた溶解バッファーに再懸濁させた。これを３０分間氷で反応させた後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。組換えタンパク質が含まれた上澄み液をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）イオン交換プラットホームで精製した後、０．２２μｍサイズのフィルターを通して濾過した。上記のように精製されたＰＣＶ２由来組換えタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に示した。
さらに、前記ＰＣＶ２由来組換えタンパク質を韓国基礎科学研究院の春川センターで透過電子顕微鏡（ＴＥＭ；ＪＥＭ－２１００Ｆ；ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を利用して観察したところ、図１のように、約１７ｎｍ直径のＰＣＶ２ウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＶＬＰ）が形成されたことを確認した。
１－３－４．組換えタンパク質発現分析
精製された組換えタンパク質を１２％ゲルに注入してＳＤＳ－ＰＡＧＥを施行し、半乾燥移送機器（ｓｅｍｉｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ））を利用してハイボンドポリビニルピロリドンメンブレイン（Ｈｙｂｏｎｄ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ））でトランスファーした。豚抗－ＰＣＶ２抗体（ｐｏｒｃｉｎｅ ａｎｔｉ－ＰＣＶ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５００希釈））とＨＲＰ－結合されたヤギ抗－豚ＩｇＧ抗体（ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｐｏｒｃｉｎｅ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ（（１：５，０００希釈）（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ、ＵＳＡ））を利用してウェスタンブロットを行ったところ、約２８ｋＤａのタンパク質バンドを確認した。
１－４．本発明による多価ワクチン組成物の製造
２×１０８ ＣＣＵ／ｄｏｓｅ以上濃度の前記実施例１－１を通じて製造したＭｈｐおよびＭｈｒ不活化菌株抗原と、前記実施例１－２を通じて製造した２５μｇ／ｄｏｓｅ以上濃度の組換えＰ９７タンパク質抗原、前記実施例１－３を通じて製造した２０μｇ／ｄｏｓｅ濃度の組換えＰＣＶ２ｄカプシドタンパク質抗原を２Ｘ ＰＢＳに混合した後（１ｍＬ／ｄｏｓｅ）、２０分以上撹拌して混合した。それから、同一容量の補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＭＳ１３１３、Ｓｅｐｐｉｃ））を追加し、２０分以上撹拌して多価ワクチン組成物を製造した。
【0009】
実施例２．実験動物準備
２－１．マウス準備
体重１５ｇのＢＡＬＢ／ｃ雌マウス５匹に本発明による多価ワクチン組成物（Ｍｈｐ＋Ｍｈｒ＋組換えＰ９７タンパク質＋組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質組み合わせ）を接種した。本発明による多価ワクチン（豚容量の１／１０頭分である２００μＬ／ｄｏｓｅ）をマウス両方後足の太股筋肉内に接種した。血液サンプルは、接種後、０、２、４、６週に収集して血清学的分析のために－７０℃に保管してから実験に使用した。
２－２．モルモット準備
体重３００～３５０ｇのモルモット４匹に本発明による多価ワクチン組成物（Ｍｈｐ＋Ｍｈｒ＋組換えＰ９７タンパク質＋組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質組み合わせ）を接種した。さらに、モルモット４匹に対照群であるＰＣＶ２単独ワクチンを接種した。それぞれの実験群モルモット後足の太股筋肉内に各ワクチン（豚容量の１／２頭分である１ｍＬ／ｄｏｓｅ）を接種した。血液サンプルは、接種後、０、２、４、６週に収集して血清学的分析のために－７０℃に保管してから実験に使用した。
２－３．豚準備
体重５～８Ｋｇの豚５匹に本発明による多価ワクチン組成物（Ｍｈｐ＋Ｍｈｒ＋組換えＰ９７タンパク質＋組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質組み合わせ）を接種した。各豚の首部位筋肉内に本発明によるワクチン（２ｍＬ／ｄｏｓｅ）を接種した。血液サンプルは、接種後、０、４、９、１４、１７週に収集して血清学的分析のために－７０℃に保管してから実験に使用した。またサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）分析のために、接種後、０、４、９、１４週に頸静脈から採血して末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）を分離した後、抗原で刺激して形成されたＩＦＮ－γを分析した。
２－１．マウス準備
体重１５ｇのＢＡＬＢ／ｃ雌マウス５匹に本発明による多価ワクチン組成物（Ｍｈｐ＋Ｍｈｒ＋組換えＰ９７タンパク質＋組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質組み合わせ）を接種した。本発明による多価ワクチン（豚容量の１／１０頭分である２００μＬ／ｄｏｓｅ）をマウス両方後足の太股筋肉内に接種した。血液サンプルは、接種後、０、２、４、６週に収集して血清学的分析のために－７０℃に保管してから実験に使用した。
２－２．モルモット準備
体重３００～３５０ｇのモルモット４匹に本発明による多価ワクチン組成物（Ｍｈｐ＋Ｍｈｒ＋組換えＰ９７タンパク質＋組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質組み合わせ）を接種した。さらに、モルモット４匹に対照群であるＰＣＶ２単独ワクチンを接種した。それぞれの実験群モルモット後足の太股筋肉内に各ワクチン（豚容量の１／２頭分である１ｍＬ／ｄｏｓｅ）を接種した。血液サンプルは、接種後、０、２、４、６週に収集して血清学的分析のために－７０℃に保管してから実験に使用した。
２－３．豚準備
体重５～８Ｋｇの豚５匹に本発明による多価ワクチン組成物（Ｍｈｐ＋Ｍｈｒ＋組換えＰ９７タンパク質＋組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質組み合わせ）を接種した。各豚の首部位筋肉内に本発明によるワクチン（２ｍＬ／ｄｏｓｅ）を接種した。血液サンプルは、接種後、０、４、９、１４、１７週に収集して血清学的分析のために－７０℃に保管してから実験に使用した。またサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）分析のために、接種後、０、４、９、１４週に頸静脈から採血して末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）を分離した後、抗原で刺激して形成されたＩＦＮ－γを分析した。
【0010】
実施例３．本発明による多価ワクチン組成物の効果検定方法
３－１．酵素結合免疫吸着分析法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）
本発明による多価ワクチン組成物の接種による血清学的分析のために、間接酵素免疫測定法（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ）を行った。より具体的に、Ｍｈｐ（マウスから確認（組換えＰ４６タンパク質））、組換えＰ９７タンパク質（豚およびマウスから確認）、ＰＣＶ２（モルモットおよび豚から確認）に対する特異的なＩｇＧ抗体力価を調査した。要約すると、組換えＰ９７タンパク質（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、組換えＰ４６タンパク質（１２５ｎｇ／ｗｅｌｌ）または組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）をそれぞれの濃度で０．０５Ｍカーボネートバッファー（ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６））に希釈して９６－ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した後、４℃で１６時間の間コーティングした。各ウェルはＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、１％ＢＳＡが添加されたＰＢＳを添加した後、３７℃で２時間の間反応させた。その次に、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、１：１００に希釈した血清を１００μＬずつ分注し、３７℃で２時間の間反応させた。その後、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、プレートにＨＲＰ－結合されたヤギ抗－マウス（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ（または抗－モルモット（ａｎｔｉ－ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ）または抗－豚（ａｎｔｉ－ｐｉｇ））ＩｇＧ抗体（１：１０，０００希釈；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を分注し、３７℃で１時間の間反応させた。これをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、各ウェルにＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質（ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ、ＵＳＡ））を分注して５分間暗反応させ、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を中止させた。Ｅｐｏｃｈマイクロプレートリーダー（Ｅｐｏｃｈ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ））を使用して４５０ｎｍの波長で各プレートの吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ）を測定した。
また、本発明による多価ワクチンの接種による血清学的分析のためにサンドイッチＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）を行ってＭｈｒ Ｐ３７タンパク質（マウスおよび豚から確認）に特異的なＩｇＧ抗体力価を調査した。抗－Ｐ３７ ＩｇＧ（Ａｎｔｉ－Ｐ３７ ＩｇＧ（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ））を５００ｎｇ／ｍＬの濃度でカーボネートバッファーに希釈して９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した後、４℃で１６時間の間コーティングさせた。コーティング溶液を除去し、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、各ウェルにブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）として１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ－Ｔを２００μＬずつ分注した後、３７℃で４時間の間反応させた。ブロッキング溶液を除去し０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、組換えＰ３７タンパク質を５００ｎｇ／ｍＬでブロッキング溶液に希釈した後、各ウェルにこれを１００μＬずつ分注し、３７℃で１時間の間組換えＰ３７タンパク質と抗－Ｐ３７ＩｇＧを反応させた。その間、１０％ＦＢＳ溶液（１００ｎｇ Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物（ｌｙｓａｔｅ）とともに）にマウスまたは豚血清を１／１００に希釈し、３７℃で１時間の間反応させて検査血清を準備した。組換えＰ３７タンパク質溶液を除去し、０．０５％ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。検査血清を９０μＬずつ前記組換えＰ３７タンパク質と反応させたプレートの各ウェルに分注した後、３７℃で１時間の間反応させた。検査血清を除去し、０．０５％ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。抗－マウス（または抗－豚）ＩｇＧ ＨＲＰ結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を１０％ＦＢＳ溶液に１／２０，０００に希釈し、これを１００μＬずつそれぞれのウェルに入れた。３７℃で１時間の間反応させた後、溶液を除去し、０．０５％ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄した。その後、ＴＭＢ溶液１００μＬずつそれぞれのウェルに入れて常温で５分間暗反応させた。停止液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１００μＬずつ各ウェルに分注した後、直ちに４５０ｎｍで吸光度を測定した。
さらに、本発明による多価ワクチンの接種による血清学的分析のために、ＩＤＥＸＸ社のＭＨ ｋｉｔを使用してＭｈｐ（豚から確認）に特異的なＩｇＧ抗体力価を調査した。
３－２．ウイルス中和実験（Ｖｉｒｕｓ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ、ＶＮ ｔｅｓｔ）
ＰＣＶ２中和抗体は、免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ、ＩＦＡ）を利用して測定した。ワクチン接種後、モルモットまたは豚の０、２、４、６週血清を５６℃で３０分間加熱して非同化させた後、ＤＭＥＭに２進連続希釈し、これと同じ体積のＰＣＶ２ｂまたはＰＣＶ２ｄウイルス（２００×５０％組織培養感染量（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）、ＴＣＩＤ５０）を密度７０－８０％となるＰＫ－１５細胞に接種した後、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。７２時間後に感染した細胞を９０％アセトンで固定させ、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）－標識された抗－モルモット（または抗－豚）ＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加して反応した。中和抗体力価は、蛍光顕微鏡下に９０％以上のウイルス中和を示す最高血清の希釈倍数で決定した。
３－３．インターフェロンガンマ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、ＩＦＮ－γ）測定
豚における本発明による多価ワクチン組成物に対する細胞媒介性免疫反応を評価するために、ＩＦＮ－γ分泌量を調査した。本発明による多価ワクチン組成物を接種した後、０、４、９、１４週に血液から分離したＰＢＭＣにＭｈｐ不活化またはＰＣＶ２抗原で感作して７２時間の間反応させた。その上澄み液を分離して豚ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｏｆｅｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）でメーカーの指針に沿ってＩＦＮ－γ分泌量を測定した。
３－４．統計的分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｒａｐｈ－Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してデータを分析し、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較分析とともに一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して各グループを比較して対照群との有意な差を示した。Ｐ値が０．０５未満である場合、統計的に有意なものと見なした。
３－１．酵素結合免疫吸着分析法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）
本発明による多価ワクチン組成物の接種による血清学的分析のために、間接酵素免疫測定法（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ）を行った。より具体的に、Ｍｈｐ（マウスから確認（組換えＰ４６タンパク質））、組換えＰ９７タンパク質（豚およびマウスから確認）、ＰＣＶ２（モルモットおよび豚から確認）に対する特異的なＩｇＧ抗体力価を調査した。要約すると、組換えＰ９７タンパク質（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、組換えＰ４６タンパク質（１２５ｎｇ／ｗｅｌｌ）または組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）をそれぞれの濃度で０．０５Ｍカーボネートバッファー（ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６））に希釈して９６－ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した後、４℃で１６時間の間コーティングした。各ウェルはＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、１％ＢＳＡが添加されたＰＢＳを添加した後、３７℃で２時間の間反応させた。その次に、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、１：１００に希釈した血清を１００μＬずつ分注し、３７℃で２時間の間反応させた。その後、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、プレートにＨＲＰ－結合されたヤギ抗－マウス（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ（または抗－モルモット（ａｎｔｉ－ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ）または抗－豚（ａｎｔｉ－ｐｉｇ））ＩｇＧ抗体（１：１０，０００希釈；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を分注し、３７℃で１時間の間反応させた。これをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、各ウェルにＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質（ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ、ＵＳＡ））を分注して５分間暗反応させ、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を中止させた。Ｅｐｏｃｈマイクロプレートリーダー（Ｅｐｏｃｈ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ））を使用して４５０ｎｍの波長で各プレートの吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ）を測定した。
また、本発明による多価ワクチンの接種による血清学的分析のためにサンドイッチＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）を行ってＭｈｒ Ｐ３７タンパク質（マウスおよび豚から確認）に特異的なＩｇＧ抗体力価を調査した。抗－Ｐ３７ ＩｇＧ（Ａｎｔｉ－Ｐ３７ ＩｇＧ（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ））を５００ｎｇ／ｍＬの濃度でカーボネートバッファーに希釈して９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した後、４℃で１６時間の間コーティングさせた。コーティング溶液を除去し、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、各ウェルにブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）として１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ－Ｔを２００μＬずつ分注した後、３７℃で４時間の間反応させた。ブロッキング溶液を除去し０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、組換えＰ３７タンパク質を５００ｎｇ／ｍＬでブロッキング溶液に希釈した後、各ウェルにこれを１００μＬずつ分注し、３７℃で１時間の間組換えＰ３７タンパク質と抗－Ｐ３７ＩｇＧを反応させた。その間、１０％ＦＢＳ溶液（１００ｎｇ Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物（ｌｙｓａｔｅ）とともに）にマウスまたは豚血清を１／１００に希釈し、３７℃で１時間の間反応させて検査血清を準備した。組換えＰ３７タンパク質溶液を除去し、０．０５％ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。検査血清を９０μＬずつ前記組換えＰ３７タンパク質と反応させたプレートの各ウェルに分注した後、３７℃で１時間の間反応させた。検査血清を除去し、０．０５％ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。抗－マウス（または抗－豚）ＩｇＧ ＨＲＰ結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を１０％ＦＢＳ溶液に１／２０，０００に希釈し、これを１００μＬずつそれぞれのウェルに入れた。３７℃で１時間の間反応させた後、溶液を除去し、０．０５％ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄した。その後、ＴＭＢ溶液１００μＬずつそれぞれのウェルに入れて常温で５分間暗反応させた。停止液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１００μＬずつ各ウェルに分注した後、直ちに４５０ｎｍで吸光度を測定した。
さらに、本発明による多価ワクチンの接種による血清学的分析のために、ＩＤＥＸＸ社のＭＨ ｋｉｔを使用してＭｈｐ（豚から確認）に特異的なＩｇＧ抗体力価を調査した。
３－２．ウイルス中和実験（Ｖｉｒｕｓ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ、ＶＮ ｔｅｓｔ）
ＰＣＶ２中和抗体は、免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ、ＩＦＡ）を利用して測定した。ワクチン接種後、モルモットまたは豚の０、２、４、６週血清を５６℃で３０分間加熱して非同化させた後、ＤＭＥＭに２進連続希釈し、これと同じ体積のＰＣＶ２ｂまたはＰＣＶ２ｄウイルス（２００×５０％組織培養感染量（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）、ＴＣＩＤ５０）を密度７０－８０％となるＰＫ－１５細胞に接種した後、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。７２時間後に感染した細胞を９０％アセトンで固定させ、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）－標識された抗－モルモット（または抗－豚）ＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加して反応した。中和抗体力価は、蛍光顕微鏡下に９０％以上のウイルス中和を示す最高血清の希釈倍数で決定した。
３－３．インターフェロンガンマ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、ＩＦＮ－γ）測定
豚における本発明による多価ワクチン組成物に対する細胞媒介性免疫反応を評価するために、ＩＦＮ－γ分泌量を調査した。本発明による多価ワクチン組成物を接種した後、０、４、９、１４週に血液から分離したＰＢＭＣにＭｈｐ不活化またはＰＣＶ２抗原で感作して７２時間の間反応させた。その上澄み液を分離して豚ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｏｆｅｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）でメーカーの指針に沿ってＩＦＮ－γ分泌量を測定した。
３－４．統計的分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｒａｐｈ－Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してデータを分析し、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較分析とともに一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して各グループを比較して対照群との有意な差を示した。Ｐ値が０．０５未満である場合、統計的に有意なものと見なした。
【0011】
実施例４．マウスに接種後に抗体価確認
４－１．Ｍｈｐに対する抗体形成確認
豚マイコプラズマワクチン検定試験動物であるマウスに本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、２、４週目に採血してＭｈｐに対する抗体価を確認した。このために、Ｍｈｐのゲノムが暗号化すると知られている免疫優性タンパク質（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）である組換えＰ４６タンパク質に特異的なＩｇＧ抗体力価を測定した。その結果、図２のように、本発明による多価ワクチンがＭｈｐ、Ｍｈｒ、組換えＰ９７タンパク質および組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質をすべて含んでいるにもＭｈｐに対して正常に抗体が形成され、接種週目によって抗体力価が増加されることを確認した。したがって、本発明の多価ワクチンを接種時に多様な抗原による干渉現象が引き起こさないことを確認した。
４－２．Ｍｈｐ組換えＰ９７タンパク質に対する抗体価確認
豚マイコプラズマワクチン検定試験動物であるマウスに本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、２、４週目に採血して組換えＰ９７タンパク質に対する抗体価を確認した。その結果、図３に示したように、先立つ結果と同様に、組換えＰ９７タンパク質に対する抗体が正常に形成され、２週目に抗体生成が急激に増加し、４週目にも高い抗体価を見せることを確認した。
４－３．Ｍｈｒに対する抗体形成確認
豚マイコプラズマワクチン検定試験動物であるマウスに本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、２、４週目に採血した後、Ｍｈｒに対する抗体価を確認した。このために、Ｍｈｒのゲノムが暗号化すると知られている組換えＰ３７タンパク質に特異的なＩｇＧ抗体力価を測定した。その結果、図４のように、Ｍｈｒに対して正常に抗体が形成され、接種週目によって増加されることを確認した。
前記のような結果を通じて、本発明のＭｈｐ＋Ｍｈｒ＋組換えＰ９７タンパク質＋組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質組み合わせの多価ワクチン組成物は、豚マイコプラズマワクチン検定試験動物であるマウスで相互干渉現象を示さず、それぞれの抗原に対する抗体を効果的に形成することができることを確認した。
４－１．Ｍｈｐに対する抗体形成確認
豚マイコプラズマワクチン検定試験動物であるマウスに本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、２、４週目に採血してＭｈｐに対する抗体価を確認した。このために、Ｍｈｐのゲノムが暗号化すると知られている免疫優性タンパク質（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）である組換えＰ４６タンパク質に特異的なＩｇＧ抗体力価を測定した。その結果、図２のように、本発明による多価ワクチンがＭｈｐ、Ｍｈｒ、組換えＰ９７タンパク質および組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質をすべて含んでいるにもＭｈｐに対して正常に抗体が形成され、接種週目によって抗体力価が増加されることを確認した。したがって、本発明の多価ワクチンを接種時に多様な抗原による干渉現象が引き起こさないことを確認した。
４－２．Ｍｈｐ組換えＰ９７タンパク質に対する抗体価確認
豚マイコプラズマワクチン検定試験動物であるマウスに本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、２、４週目に採血して組換えＰ９７タンパク質に対する抗体価を確認した。その結果、図３に示したように、先立つ結果と同様に、組換えＰ９７タンパク質に対する抗体が正常に形成され、２週目に抗体生成が急激に増加し、４週目にも高い抗体価を見せることを確認した。
４－３．Ｍｈｒに対する抗体形成確認
豚マイコプラズマワクチン検定試験動物であるマウスに本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、２、４週目に採血した後、Ｍｈｒに対する抗体価を確認した。このために、Ｍｈｒのゲノムが暗号化すると知られている組換えＰ３７タンパク質に特異的なＩｇＧ抗体力価を測定した。その結果、図４のように、Ｍｈｒに対して正常に抗体が形成され、接種週目によって増加されることを確認した。
前記のような結果を通じて、本発明のＭｈｐ＋Ｍｈｒ＋組換えＰ９７タンパク質＋組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質組み合わせの多価ワクチン組成物は、豚マイコプラズマワクチン検定試験動物であるマウスで相互干渉現象を示さず、それぞれの抗原に対する抗体を効果的に形成することができることを確認した。
【0012】
実施例５．モルモットに接種後に抗体価確認
５－１．組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質抗原に対する抗体価確認
モルモットに本発明による多価ワクチン組成物またはＰＣＶ２単独ワクチンを接種し、０、２、４、６週目に採血した後、組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質抗原に対する抗体価を確認した。その結果、図５に示したように、本発明による多価ワクチン組成物は接種２週目にＰＣＶ２単独ワクチン接種群と比較して有意に高い水準のＩｇＧ抗体価を示した。接種４週目にすべての実験群が最も高いピーク（ｐｅａｋ）値を見せ、全体的な期間の間本発明による多価ワクチンを接種した実験群がさらに高い抗体価を見せた。したがって、ＰＣＶ２単独ワクチンより本発明による多価ワクチン組成物を接種する場合、さらに効果的に組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質抗原に対する抗体価が生成されることを確認した。
５－２．ＰＣＶ２ｂまたはＰＣＶ２ｄに対する中和抗体価確認
モルモットに本発明による多価ワクチン組成物またはＰＣＶ２単独ワクチンを接種し、０、２、４、６週目に採血した後、ＰＣＶ２ｂまたはＰＣＶ２ｄ遺伝型に対する中和抗体価を確認して図６および図７に示した。その結果、ＰＣＶ２単独ワクチン接種群対比、本発明による多価ワクチン組成物は接種後に全区間でＰＣＶ２ｂまたはＰＣＶ２ｄ遺伝型に対して同等または若干高い中和抗体価を誘導することを確認した。特に、ＰＣＶ２ｄに対する抗体価がＰＣＶ２ｂより高く示されることを確認した。
５－１．組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質抗原に対する抗体価確認
モルモットに本発明による多価ワクチン組成物またはＰＣＶ２単独ワクチンを接種し、０、２、４、６週目に採血した後、組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質抗原に対する抗体価を確認した。その結果、図５に示したように、本発明による多価ワクチン組成物は接種２週目にＰＣＶ２単独ワクチン接種群と比較して有意に高い水準のＩｇＧ抗体価を示した。接種４週目にすべての実験群が最も高いピーク（ｐｅａｋ）値を見せ、全体的な期間の間本発明による多価ワクチンを接種した実験群がさらに高い抗体価を見せた。したがって、ＰＣＶ２単独ワクチンより本発明による多価ワクチン組成物を接種する場合、さらに効果的に組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質抗原に対する抗体価が生成されることを確認した。
５－２．ＰＣＶ２ｂまたはＰＣＶ２ｄに対する中和抗体価確認
モルモットに本発明による多価ワクチン組成物またはＰＣＶ２単独ワクチンを接種し、０、２、４、６週目に採血した後、ＰＣＶ２ｂまたはＰＣＶ２ｄ遺伝型に対する中和抗体価を確認して図６および図７に示した。その結果、ＰＣＶ２単独ワクチン接種群対比、本発明による多価ワクチン組成物は接種後に全区間でＰＣＶ２ｂまたはＰＣＶ２ｄ遺伝型に対して同等または若干高い中和抗体価を誘導することを確認した。特に、ＰＣＶ２ｄに対する抗体価がＰＣＶ２ｂより高く示されることを確認した。
【0013】
実施例６．豚に接種後に抗体価確認
６－１．Ｍｈｐに対する抗体価確認
豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、９、１４、１７週目に採血してＭｈｐに対する抗体価を確認した。その結果、図８に示したように、本発明による多価ワクチン組成物は接種９週後から抗体価が増加し始めて１７週まで非常に高い抗体価を誘導することを確認した。
６－２．Ｍｈｐ組換えＰ９７に対する抗体価確認
豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、９、１４、１７週目に採血して組換えＰ９７タンパク質に対する抗体価を確認した。その結果、図９のように、接種４週間で非常に高い水準のＯＤ値を示して抗体が形成されることを確認した。特に、ＰＣＶ２抗原を追加することによるＰ９７抗原に対する抗体価を妨げる現象は現れないことを確認した。
６－３．Ｍｈｒに対する抗体確認
豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、９、１４、１７週目に採血した後、組換えＰ３７タンパク質に対する抗体価を確認して、Ｍｈｒに対する抗体形成を確認した。その結果、図１０に示したように、本発明による多価ワクチン組成物を接種したとき、Ｍｈｒ由来組換えＰ３７タンパク質に対する抗体を優秀に形成することを確認した。
６－４．Ｍｈｐ感作によるインターフェロンガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ（ＩＦＮ－ｇａｍｍａ、ＩＦＮ－γ））分泌確認
豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、９、１４週目に採血した後、Ｍｈｐ感作によるＩＦＮ－γ分泌を確認した。その結果、図１１のように、接種後９週目からＩＦＮ－γ分泌量が増加するとともに１４週目まで着実に増加する傾向を確認した。
６－５．ＰＣＶ２感作によるＩＦＮ－γ分泌確認
豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、９、１４週目に採血した後、ＰＣＶ２感作によるＩＦＮ－γ分泌を確認した。その結果、図１２に示したように、接種後９週目からＩＦＮ－γ分泌量が増加するとともに１４週目まで着実に増加する傾向を見せた。特に、ワクチン接種１４週後に高い水準のＩＦＮ－γが観察された。
６－１．Ｍｈｐに対する抗体価確認
豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、９、１４、１７週目に採血してＭｈｐに対する抗体価を確認した。その結果、図８に示したように、本発明による多価ワクチン組成物は接種９週後から抗体価が増加し始めて１７週まで非常に高い抗体価を誘導することを確認した。
６－２．Ｍｈｐ組換えＰ９７に対する抗体価確認
豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、９、１４、１７週目に採血して組換えＰ９７タンパク質に対する抗体価を確認した。その結果、図９のように、接種４週間で非常に高い水準のＯＤ値を示して抗体が形成されることを確認した。特に、ＰＣＶ２抗原を追加することによるＰ９７抗原に対する抗体価を妨げる現象は現れないことを確認した。
６－３．Ｍｈｒに対する抗体確認
豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、９、１４、１７週目に採血した後、組換えＰ３７タンパク質に対する抗体価を確認して、Ｍｈｒに対する抗体形成を確認した。その結果、図１０に示したように、本発明による多価ワクチン組成物を接種したとき、Ｍｈｒ由来組換えＰ３７タンパク質に対する抗体を優秀に形成することを確認した。
６－４．Ｍｈｐ感作によるインターフェロンガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ（ＩＦＮ－ｇａｍｍａ、ＩＦＮ－γ））分泌確認
豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、９、１４週目に採血した後、Ｍｈｐ感作によるＩＦＮ－γ分泌を確認した。その結果、図１１のように、接種後９週目からＩＦＮ－γ分泌量が増加するとともに１４週目まで着実に増加する傾向を確認した。
６－５．ＰＣＶ２感作によるＩＦＮ－γ分泌確認
豚に本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、９、１４週目に採血した後、ＰＣＶ２感作によるＩＦＮ－γ分泌を確認した。その結果、図１２に示したように、接種後９週目からＩＦＮ－γ分泌量が増加するとともに１４週目まで着実に増加する傾向を見せた。特に、ワクチン接種１４週後に高い水準のＩＦＮ－γが観察された。
【0014】
実施例７．本発明による多価ワクチン組成物の安全性評価
７－１．豚における多価ワクチン組成物接種
本発明による多価ワクチン組成物に対する安全性および防御能を評価するために、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）ミニブタ（Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｉｇ）を対象に下記のような条件の実験群を設定した。
子豚が３週齢になったとき採血した後、ワクチンを接種した（ワクチン接種後０週目）。さらに５週齢（ワクチン接種後２週目）、７週齢（ワクチン接種後４週目）、９週齢（ワクチン接種後６週目）、１１週齢（ワクチン接種後８週目）に採血した。また前記７週齢において、採血後に攻撃接種を実施し、１１週齢において、安楽死を進行してリンパ節および肺などの病変を確認した。前記攻撃接種としては、保有しているＰＣＶ２ｄ分離株（ＨＩＤ９０７１、（力価：１０５．５ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ））を鼻腔に２ｍＬ接種した。
前記接種容量と接種経路は、国家出荷検定試験基準を参考して設定し、より具体的に本発明による多価ワクチン組成物を子豚の右側首筋肉に１回（２ｍＬ／ｄｏｓｅ）接種した。前記攻撃接種は、ＰＣＶ２ｄ分離株２ｍＬを両方鼻腔を通じて１ｍＬずつ注入した。採血は、０、２ＷＰＶ（Ｗｅｅｋｓ ｐｏｓｔｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）に頸静脈を通じて５ｍＬずつ採血して血清を分離し、４、６、７、８ＷＰＶには頸静脈を通じて８ｍＬずつ採血してＰＢＭＣと血清を分離した。
７－２．体重測定
体重は、試験期間中に毎週各実験群の体重を測定した。測定された体重を利用して下記数学式１を通じて各個体当たりの1日当たりの体重増加量（Ａｖｅｒａｇｅ ｄａｉｌｙ ｗｅｉｇｈｔ ｇａｉｎ、ＡＤＷＧ）を分析した。
［数学式１］
1日当たりの体重増加量（Ａｖｅｒａｇｅ ｄａｉｌｙ ｗｅｉｇｈｔ ｇａｉｎ、ＡＤＷＧ）＝（測定週体重－以前週体重）／７ｄａｙｓ
体重測定結果、図１３および下記表２に示したように、ワクチン接種前（０ＷＰＶ）のすべての群は平均２．８２～３．３３Ｋｇの間の体重を示し、４ＷＰＶに本発明による多価ワクチン組成物接種群（以下、多価ワクチン接種群と記載）は平均５．１４Ｋｇで攻撃接種対照群（５．８７Ｋｇ）と陰性対照群（６．１０Ｋｇ）より若干低い体重を示した。しかし、攻撃接種後４週（８ＷＰＶ）の体重は攻撃接種対照群が平均９．０５Ｋｇで最も低く、多価ワクチン接種群は平均９．２９Ｋｇで陰性対照群と比較して類似した水準の体重を示した。
ＡＤＷＧ測定結果、図１４および下記表３に示したように、ワクチン接種から攻撃接種前まで（０－４ＷＰＶ）多価ワクチン接種群は平均ＡＤＷＧが８２．８６ｇで攻撃接種対照群（９０．４８ｇ）と陰性対照群（１０８．９３ｇ）と比較して大きい差異を示さなかった。しかし、攻撃接種以後から試験終了時まで（５－８ＷＰＶ）には攻撃接種対照群が平均１１３．６９ｇで最も低く、多価ワクチン接種群は平均ＡＤＷＧが１４８．２１ｇで陰性対照群（１１９．６４ｇ）と比較してさらに高い水準の体重増加量を示した。したがって、本発明による多価ワクチン組成物の接種によって食欲不振（低下）などの副作用がないことを確認した。
７－３．臨床症状または副作用が発生したか否か確認
本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、２４、４８時間後に直腸体温を測定した。さらに、７日間接種部位副作用および臨床副作用を観察した。
前記臨床副作用としては、食欲不振、活力減少、咳、呼吸困難、窒息、ショック、嘔吐、下痢に対して確認した。
体温測定結果、下記表４のように、本発明による多価ワクチン組成物を接種して４時間後に体温が多少上昇したが、２４時間、４８時間が過ぎた後には接種前の水準に降りたことを確認した。
さらに、臨床症状確認結果、本発明による多価ワクチン接種群はワクチン接種による如何なる臨床症状も見られなかった。そのため、本発明による多価ワクチン組成物は、体温および臨床症状に如何なる影響も及ぼさないことを確認した。
７－１．豚における多価ワクチン組成物接種
本発明による多価ワクチン組成物に対する安全性および防御能を評価するために、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）ミニブタ（Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｉｇ）を対象に下記のような条件の実験群を設定した。
【表1】
前記接種容量と接種経路は、国家出荷検定試験基準を参考して設定し、より具体的に本発明による多価ワクチン組成物を子豚の右側首筋肉に１回（２ｍＬ／ｄｏｓｅ）接種した。前記攻撃接種は、ＰＣＶ２ｄ分離株２ｍＬを両方鼻腔を通じて１ｍＬずつ注入した。採血は、０、２ＷＰＶ（Ｗｅｅｋｓ ｐｏｓｔｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）に頸静脈を通じて５ｍＬずつ採血して血清を分離し、４、６、７、８ＷＰＶには頸静脈を通じて８ｍＬずつ採血してＰＢＭＣと血清を分離した。
７－２．体重測定
体重は、試験期間中に毎週各実験群の体重を測定した。測定された体重を利用して下記数学式１を通じて各個体当たりの1日当たりの体重増加量（Ａｖｅｒａｇｅ ｄａｉｌｙ ｗｅｉｇｈｔ ｇａｉｎ、ＡＤＷＧ）を分析した。
［数学式１］
1日当たりの体重増加量（Ａｖｅｒａｇｅ ｄａｉｌｙ ｗｅｉｇｈｔ ｇａｉｎ、ＡＤＷＧ）＝（測定週体重－以前週体重）／７ｄａｙｓ
体重測定結果、図１３および下記表２に示したように、ワクチン接種前（０ＷＰＶ）のすべての群は平均２．８２～３．３３Ｋｇの間の体重を示し、４ＷＰＶに本発明による多価ワクチン組成物接種群（以下、多価ワクチン接種群と記載）は平均５．１４Ｋｇで攻撃接種対照群（５．８７Ｋｇ）と陰性対照群（６．１０Ｋｇ）より若干低い体重を示した。しかし、攻撃接種後４週（８ＷＰＶ）の体重は攻撃接種対照群が平均９．０５Ｋｇで最も低く、多価ワクチン接種群は平均９．２９Ｋｇで陰性対照群と比較して類似した水準の体重を示した。
【表2】
【表3】
本発明による多価ワクチン組成物を接種し、０、４、２４、４８時間後に直腸体温を測定した。さらに、７日間接種部位副作用および臨床副作用を観察した。
前記臨床副作用としては、食欲不振、活力減少、咳、呼吸困難、窒息、ショック、嘔吐、下痢に対して確認した。
体温測定結果、下記表４のように、本発明による多価ワクチン組成物を接種して４時間後に体温が多少上昇したが、２４時間、４８時間が過ぎた後には接種前の水準に降りたことを確認した。
【表4】
【0015】
実施例８．本発明の多価ワクチン組成物の防御能評価
８－１．免疫学的評価
８－１－１．ＰＣＶ２抗体価確認
間接蛍光抗体分析法（Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｓｔ、以下、ＩＦＡ）を利用して各実験群の血清内ＰＣＶ２ｂ－特異的ＩｇＧ（ＰＣＶ２ｂ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ）およびＰＣＶ２ｄ－特異的（ＰＣＶ２ｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ）抗体価を確認した。このとき、各実験群において、ワクチン接種時またはワクチン接種２、４、６、８週後に血清を採取して実験を行った。
先ず、２×１０４ ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌのＰＣＶ１－除外豚腎臓細胞（ＰＣＶ１－ｆｒｅｅ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）であるＰＫ－１５細胞と保有しているＰＣＶ２ｂ（ＨＩＤ９０２９）またはＰＣＶ２ｄ（ＨＩＤ９０７１）ウイルスを６００ ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈して９６－ウェルプレートにそれぞれ１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。
これを３７℃、５％ＣＯ２条件の培養器で２４時間培養した後、３００ｍＭグルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）を２００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して３０分間反応させた後、上澄み液を除去した。ＰＢＳを利用して３回洗浄した後、１％抗生剤－抗真菌溶液（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ））が添加されたＤＭＥＭを２００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、４日間培養した。上澄み液を除去し、ＰＢＳを利用して１回洗浄した。８０％アセトンを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した後、４℃で１時間固定した。
固定液を捨て、ＰＢＳを利用して１回洗浄した後、プレートを－２０℃に保管して抗体価検査に使用した。
豚血清試料をＤＭＥＭで２進希釈して準備し、これを固定したプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した後、３７℃で１時間の間反応させた。その後、ＰＢＳを利用して３回洗浄した。前記プレートに豚ＩｇＧ軽鎖および重鎖抗体（Ｐｉｇ ＩｇＧ－ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｇｏａｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ［Ｂｅｔｈｙｌ］）をＰＢＳに１：２００に希釈して１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で３０分間反応させた。その後、ＰＢＳを利用して１回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察してウイルスが増殖した最高希釈倍数の逆数を抗体価と判定した。これを通じて確認したＰＣＶ２ｂ－特異的ＩｇＧ抗体価確認結果は、下記表５および図１５に示した。図１５において、＊は、陰性対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．０５）、＃は、攻撃接種対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．０５）、＃＃は、攻撃接種対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．０１）。
その結果、ワクチン接種前（０ＷＰＶ）、すべての実験群は低い水準の抗体価を示した。本発明による多価ワクチン接種群は、２ＷＰＶから他の実験群に比べて有意性を持って（Ｐ＜０．０１）ＰＣＶ２ｂに特異的なＩｇＧ抗体価を誘導することを確認した。特に、攻撃接種以後にも継続して抗体価が上昇して、試験終了時までかなり高い水準のＩｇＧ抗体価を示した。
攻撃接種対照群は、６ＷＰＶから抗体価を誘導したが、本発明による多価ワクチン接種群と比較して有意性を持って（Ｐ＜０．０５）低い水準を示し、陰性対照群は、試験全区間で低い水準の抗体価を示した。
さらに、ＰＣＶ２ｄ特異的ＩｇＧ抗体価確認結果は、図１６および下記表６に示した。このとき、図１６において、＊＊＊は、陰性対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．００１）、＃＃＃は、攻撃接種対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．００１）。
その結果、ワクチン接種前（０ＷＰＶ）、すべての実験群は低い水準の抗体価を示した。本発明による多価ワクチン接種群は、２ＷＰＶから他の実験群に比べて有意性を持って（Ｐ＜０．００１）ＰＣＶ２ｄに特異的なＩｇＧ抗体価を誘導することを確認した。特に、攻撃接種以後にも継続して増加して試験終了時までかなり高い水準のＩｇＧ抗体価を示した。
攻撃接種対照群は、６ＷＰＶから抗体価を誘導したが、本発明による多価ワクチン接種群と比較して有意性を持って（Ｐ＜０．００１）低い水準を示し、陰性対照群は、試験全区間で低い水準の抗体価を示した。
８－１－２．ＰＣＶ２中和抗体価確認
各実験群の血清内中和抗体価確認は、次のように行った。先ず、各実験群の血清を５６℃で３０分間非同化した。９６－ウェルプレートの最初のウェルに前記血清５０μＬとＤＭＥＭ １５０μＬを分注して希釈した後、残りのウェルにＤＭＥＭを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して２進希釈した。保有しているＰＣＶ２ｂ（ＨＩＤ９０２９）またはＰＣＶ２ｄ（ＨＩＤ９０７１）ウイルスを４００ ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈した後、２進希釈された血清が入ったウェルに同量（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を分注し、３７℃で１時間の間反応させた。ＰＣＶ１－除外豚腎臓細胞（ＰＣＶ１－ｆｒｅｅ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）であるＰＫ－１５細胞を各ウェルに２×１０４ ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した。これを３７℃、５％ＣＯ２条件の培養器で２４時間培養した後、３００ｍＭグルコサミンを２００μＬ／ｗｅｌｌずつ３０分間処理した。その後、上澄み液を除去し、ＰＢＳを利用して３回洗浄した。その後、１％抗生剤－抗真菌溶液が添加されたＤＭＥＭを２００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して２日間培養した。培養後、免疫蛍光分析法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ）を次のように行った。
培養液を捨ててＰＢＳを利用して１回洗浄し、プレートを３７℃培養器に入れて３０分間乾燥した。乾燥したプレートに８０％アセトンを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した後、４℃で１時間固定した。その後、固定液を捨ててＰＢＳを利用して１回洗浄した。ＰＢＳに１：５００に希釈した豚抗－ＰＶ２抗血清（ａｎｔｉ－ＰＣＶ２ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で１時間の間反応させた。その後、ＰＢＳを利用して３回洗浄した。前記プレートに豚ＩｇＧ軽鎖および重鎖抗体（Ｐｉｇ ＩｇＧ－ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｇｏａｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ［Ｂｅｔｈｙｌ］）をＰＢＳに１：２００に希釈して１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で３０分間反応させた。その後、ＰＢＳを利用して１回洗浄して蛍光顕微鏡で観察した。このとき、ウイルス増殖を抑制した（１ｗｅｌｌ内で９０％抑制）最高血清希釈倍数の逆数を中和抗体価と判定した。これを通じて確認したＰＣＶ２ｂ中和抗体価測定結果は、図１７および下記表７に示した。図１７において、＊＊＊は、陰性対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．００１）、＃＃は、攻撃接種対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．０１）、＃＃＃は、攻撃接種対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．００１）。
その結果、ワクチン接種前（０ＷＰＶ）、すべての実験群は低い水準の中和抗体価を示した。本発明による多価ワクチン接種群は、２ＷＰＶからＰＣＶ２ｂに対して平均９．６以上の中和抗体価を見せ、ＰＣＶ２ｂに対する中和抗体が生成され始めることが分かった。さらに、６ＷＰＶには平均９２１．６以上の高い中和抗体価を示した。特に攻撃接種以後である４ＷＰＶからは中和抗体価が継続して増加して８ＷＰＶには平均１，４３３．６以上の高い水準の中和抗体価を示した。
攻撃接種対照群は、攻撃接種以後、中和抗体価が生成されたものの、８ＷＰＶに平均１０６．６７以上で、多価ワクチン接種群に比べて低い水準の中和抗体価を示し、陰性対照群は、試験全区間で非常に低い水準の中和抗体価を示した。
さらに、ＰＣＶ２ｄ中和抗体価測定結果は、図１８および下記表８に示した。このとき、図１８において、＊＊＊は、陰性対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．００１）、＃は、攻撃対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．０５）、＃＃＃は、攻撃接種対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．００１）。
その結果、ワクチン接種前（０ＷＰＶ）、すべての実験群は低い水準の中和抗体価を示した。多価ワクチン接種群は、２ＷＰＶからＰＣＶ２ｂに対して平均９．６以上の中和抗体価を見せ、ＰＣＶ２ｂに対する中和抗体が生成され始めることが分かった。さらに、６ＷＰＶには平均１，０２４以上に増加した高い中和抗体価を示した。特に、攻撃接種以後である４ＷＰＶから中和抗体価は継続して増加し、８ＷＰＶには平均２，２５２以上の非常に高い水準の中和抗体価を示した。
攻撃接種対照群は、攻撃接種以後に中和抗体価が生成されたものの、試験終了時に平均１７０．６７以上で、多価ワクチン接種群に比べて低い水準の中和抗体価を示し、陰性対照群は、試験全区間で非常に低い水準の中和抗体価を示した。
８－１－３．ＩＦＮ－γ分泌量確認
ＩＦＮ－γ分泌量確認のためにＰＢＭＣを分離し、これに抗原を感作した。フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）をチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に４ｍＬずつ分注して準備した。各実験群の血液４ｍＬとＰＢＳ ４ｍＬを新たなチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に混合して準備した。血液とＰＢＳ混合液をフィコールが入っているチューブにゆっくり移した後、８４０×ｇの速度で常温で３０分間遠心分離した。フィコールと血清の間に浮かんでいるＰＢＭＣをピペット（ｐｉｐｅｔ）を利用して分離した後、ＰＢＳ ４ｍＬが入っている新たなチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に移した。これを２１０×ｇの速度で常温で１０分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、ＰＢＭＣにＰＢＳ ３ｍＬを入れて再浮遊させた後、２１０×ｇの速度で常温で１０分間遠心分離した。上澄み液を除去し、上記と同様にＰＢＳに再浮遊させ、遠心分離して上澄み液を除去した。これにＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉ－ａｎｔｉ）１ｍＬを添加して細胞を浮遊した。ＰＢＭＣ １０μＬを１％トリパンブルー溶液（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と１：１で混合して細胞計数器で計数した後、９６－ウェルプレートに１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した。ＰＢＭＣ分注３０分後、組換えＰＣＶ２ｄタンパク質精製抗原（ｉｎ ＲＰＭＩ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して感作し、７２時間培養した後、１５，８００×ｇの速度で１０分間遠心分離して上澄み液を分離した。分離した上澄み液は回収して－７０℃に保管した。前記上澄み液に対してＩＦＮ－γ豚ＥＬＩＳＡキット（ＩＦＮ－γ Ｐｏｒｃｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＫＳＣ４０２１）を利用してメーカーの指針に沿ってＩＦＮ－γ分泌量を測定した。ＩＦＮ－γ分泌量測定結果は、図１９および下記表９に示した。
その結果、４ＷＰＶで本発明による多価ワクチン接種群は３０．６２ｐｇ／ｍＬでＰＣＶ２ｄ抗原に特異的なＩＦＮ－γが分泌し、全実験区間で有意な差異はなかった。これに対し、攻撃接種対照群と陰性対照群はＩＦＮ－γが測定されなかった。
８－２．攻撃接種ウイルスＤＮＡ定量
各実験群の血清、鼻腔検体（ｓｗａｂ）、直腸検体（ｓｗａｂ）、肺、リンパ節に対する攻撃接種ウイルスＤＮＡを定量評価した。先ず、各群別すべての個体の血液から血清を分離し、綿棒を利用して鼻腔および直腸検体を採取した。各検体を２ｍＬ Ｅ－チューブ（Ｅ－ｔｕｂｅ）に入れてＰＢＳ １ｍＬと十分にボルテッキシング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）して検体とＰＢＳを混合した。このとき、肺とリンパ節組織は２ｍＬ丸底Ｅ－チューブ（ｒｏｕｎｄ－ｂｏｔｔｏｍ Ｅ－ｔｕｂｅ）にＰＢＳを混合してビーズ（ｂｅａｄｓ）とともにＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩを利用して破砕した。
これを１０，０００×ｇで５分間遠心分離して上澄み液を分離した。その後、Ｇｅｎｅ－ｓｐｉｎ（商標）Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してｖｉｒａｌ ＤＮＡを分離した。ＰＣＶ２定量分析のためにＰＣＶ２に対するプライマー（順方向プライマー（５’－ＡＡＣＣＡＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＣ－３’（配列番号５））と逆方向プライマー（５’－ＴＴＧＡＧＧＡＧＴＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＣ－３’（配列番号６）））を使用してＲＴ－ｑＰＣＲを行った。
ＰＣＶ２検出のための試薬造成は表１０のとおりであり、表１１の条件に沿ってＲＴ－ｑＰＣＲを行った。
ＲＴ－ｑＰＣＲ遂行時、常に陰性対照群とＰＣＶ２ｄに対する標準サンプル（１０３～１０９ ＤＮＡ ｃｏｐｙ）を共に行った。ＲＴ－ｑＰＣＲ後、標準サンプルを通じて求めた標準定量曲線に代入してサンプルのＤＮＡ複製（ｃｏｐｙ）数を測定した。このとき、陰性対照群では如何なる増幅産物も観察されてはならない。試験サンプルの結果を整理してＰＣＶ２ｄ陽性と陰性有無を記録した。
８－２－１．血清、鼻腔および直腸検体の測定結果
血清でＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数定量結果（ウイルス血症（ｖｉｒｅｍｉａ））は、図２０および下記表１２に示した。図２０において、＊は、陰性対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．０５）。
その結果、ワクチン接種以後から攻撃接種前（４ＷＰＶ）まですべての実験群の血清でＰＣＶ２ ＤＮＡが検出されなかった。また攻撃接種以後にも、本発明による多価ワクチン接種群は陰性対照群と同一にウイルス血症が観察されなかった。しかし、攻撃接種対照群は、攻撃接種２週後（６ＷＰＶ）に５．６３（Ｌｏｇ１０）ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬのウイルス血症を示した。７ＷＰＶから８ＷＰＶではすべての実験群でウイルス血症が観察されなかった。
鼻腔と直腸でＰＣＶ２を定量した結果は、図２１および図２２、下記表１３および表１４に示した。図２１において、＊＊＊は、陰性対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．００１）。また、図２２において、＊は、陰性対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．０５）、＊＊＊は、陰性対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．００１）。また、表１３は、鼻腔でＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数を定量した結果であり、表１４は、直腸でＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数を定量した結果である。
その結果、ワクチン接種以後から攻撃接種前（４ＷＰＶ）まですべての実験群の血清でＰＣＶ２ ＤＮＡが検出されなかった。６ＷＰＶから攻撃接種対照群でのみＰＣＶ２ ＤＮＡが検出され、鼻腔と直腸でそれぞれ６．８８（Ｌｏｇ１０）と８．３６（Ｌｏｇ１０）ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬでかなり高い水準のＤＮＡが検出されて、他の群と比較したとき有意な差を見せ、８ＷＰＶまではＤＮＡが少しずつ減少する傾向を示した。
８－２－２．肺およびリンパ節検体の測定結果
試験終了時である８ＷＰＶにすべての実験群を安楽死させた後、採取した肺と鼠径部リンパ節組織でＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数を調査した結果は、図２３および図２４と下記表１５および表１６に示した。図２３において、＃＃は、攻撃接種対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．０１）。さらに、表１５は、肺でＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数を定量した結果であり、表１６は、リンパ節でＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数を定量した結果である。
その結果、肺で攻撃接種対照群は８．５６（Ｌｏｇ１０）ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬでかなり高い水準のＤＮＡ複製数を示したが、本発明による多価ワクチン接種群は５．５９（Ｌｏｇ１０）ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬで、攻撃接種対照群よりＤＮＡ複製数が１／１０３だけ減少して有意に低いＤＮＡ複製数を示した。
リンパ節で攻撃接種対照群は５．１７（Ｌｏｇ１０）ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬのＤＮＡ複製数を示したが、多価ワクチン接種群はＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数が確認されなかった。一方、陰性対照群では肺とリンパ節でＰＣＶ２ ＤＮＡが検出されなかった。
８－３．病理学的評価
８－３－１．肉眼評価
剖検および肉眼病変評価は、（株）オプティファームに依頼して進行し、その結果は下記表１７および表１８に示した。肉眼病変評価結果は表１７に示し、鼠径部リンパ節組織学的評価結果は表１８に示した。
肉眼所見観察結果、４つの実験群のうち攻撃接種対照群で変化が確認された。鼠径部浅層リンパ節（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｉｎｇｕｉｎａｌ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）は、実験群間に顕著なサイズ差を見せてはいないが、リンパ節サイズの測定で他の実験群より攻撃接種対照群の１番と２番個体のリンパ節が両方とも多少増加したことが示された。肺では前腹側葉を中心に紫赤色調の硬化巣（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）が形成されており、肺硬化巣は攻撃接種対照群の１番と２番個体でのみ確認された。さらに、攻撃接種対照群の２番個体は、心臓表面に乳白色調の繊維素（ｆｉｂｒｉｎ）と推定される炎症性滲出物による心膜癒着（ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）が観察された。その他の臓器で有意な肉眼的変化は観察されなかった。
８－３－２．組織病理学的および免疫組織化学的評価
各実験群の内部臓器の肉眼所見観察後、主要内部臓器を摘出して一部を１０％中性緩衝ホルマリン（Ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ、ＮＢＦ）溶液に固定した。
固定が完了した組織は、各臓器の断面を観察することができるようにトリミングし、一般的な組織処理方法に準じてパラフィン包埋し、約３～４μｍ厚さで薄切して組織スライドを作製した。スライドはＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ ｅｏｓｉｎ）染色した後、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３、Ｊａｐａｎ）を利用して検鏡した。
肺、リンパ節および扁桃追加組織切片は、各臓器内豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）の存在有無を確認するために、ＰＣＶ２に対する特異抗体を利用して免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）を行った。前記ＩＨＣ分析は、(株)オプティファームに依頼して分析した。前記結果は、下記表１９および表２０に示した。表１９はリンパ節、肺および腎臓の組織病理学的および免疫組織化学的評価結果であり、表２０は臓器の組織病理学的および免疫組織化学的評価結果である。
病理組織学的検査を進行したところ、一部リンパ節でリンパ球枯渇および組織球対置（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が観察された。前記所見は、リンパ濾胞内リンパ球の変性および壊死などでリンパ球の数的減少が示され、該当空間には炎症性反応の一環として組織球（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ）などの細胞が浸潤される特徴を見せる。前記所見は、離乳後子豚の豚サーコウイルス連関疾病（ＰＣＶＡＤ）と判断できる病理組織学的所見のうち一つであり、浸潤された組織球など病変を構成している細胞でウイルス抗原が検出されれば、ＰＣＶＡＤと確診することができる。肺では主に血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｐｅｒｉｂｒｏｎｃｈｉｏｌａｒ ｃｕｆｆｉｎｇ）、気管支関連リンパ組織増生（ＢＡＬＴ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、化膿性気管支間質性肺炎（ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖｅ ｂｒｏｎｃｈｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、細気管支内腔の分節化を伴う細気管支周囲結合組織増生（ｐｅｒｉｂｒｏｎｃｈｉｏｌａｒ ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ ｗｉｔｈ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌａｒ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）および肺浮腫（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｄｅｍａ）が確認された。この中で血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤は、ＰＣＶ２を始めとした一般的な呼吸器感染症初期に現れる変化であり、肺浮腫もまた初期炎症性反応の一環として解析されることができる。特徴的に、細気管支周囲結合組織増生は、細気管支周囲に繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）など結合組織を構成する細胞が増生される所見で、このような結合組織の増加がひどくなるほど細気管支内腔を圧迫して気道内腔が分節化したり閉鎖したりする。このような所見は、ＰＣＶＡＤでより頻繁に観察されるので、ＰＣＶ２感染を疑うことができる変化のうち一つとして知られている。前記列挙した気道周囲の炎症性変化と浮腫などの病変が深化すると、肺炎に進行され、本実施例においては、前腹側葉の硬化巣で化膿性気管支間質性肺炎が確認された。該当所見は、呼吸器ウイルスとともに２次呼吸器細菌の重複感染による結果と判断された。追加で気管支関連リンパ組織増生は、感染後に気道上皮層の慢性的な抗原刺激によって形成される所見である。肺炎や他の炎症性変化を伴わずに単独で観察される場合、大概呼吸器マイコプラズマ感染による変化と判断されている。さらに腎臓では皮質部位を中心に間質内炎症細胞浸潤（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が観察された。間質に浸潤された炎症細胞は、大部分単核炎症細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）で非化膿性炎症を形成し、ＰＣＶ２を始めとしたウイルス感染による変化として知られている。群別病理組織学的病変の出現様相を比較してみたところ、リンパ節所見は攻撃接種対照群でのみ観察された。リンパ球枯渇および組織球代置は、攻撃接種対照群の１番個体でのみ微弱な水準で観察され、ＰＣＶ２感染と判断されるリンパ節病変は、すべての実験個体で顕著でなかった。肺病変の場合、本発明による多価ワクチン接種群のすべての個体で軽度以下の血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤が観察された。また本発明による多価ワクチン接種群の２番と３番個体では、軽度以下のＢＡＬＴ増生が確認された。攻撃接種対照群の場合、全個体で重症度以上の血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤が確認された。攻撃接種対照群の１番個体は、前腹側葉を中心に重症度の化膿性気管支間質性肺炎が形成され、一部肺胞で微弱な水準の肺浮腫が伴われて全個体中で最もひどい所見を見せた。２番個体はひどい気道周辺の炎症細胞浸潤とともに軽度の細気管支周囲結合組織増生が伴われ、一部細気管支内腔が変形され、分節化されていた。肺胞でも重症度の肺浮腫所見が確認された。３番個体は重症度の血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤と微弱なＢＡＬＴ増生だけ観察され、攻撃接種対照群の３つの個体の中で最も弱い変化を見せた。陰性対照群では２つの個体とも軽度以下の血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤だけ観察された。腎臓では攻撃接種対照群でのみ重症度以下の間質内炎症細胞浸潤が局所ないし多病変性で観察された。病変は、攻撃接種対照群の１番個体で重症度水準で最も顕著であった。
さらに、鼠径部浅層リンパ節、肺および腎臓に対するＰＣＶ２のＩＨＣ結果、本発明による多価ワクチン接種群ではすべての臓器でＰＣＶ２抗原が検出されなかった。攻撃接種対照群は、１番と２番のリンパ節で少数細胞に限定された陽性反応を確認し、１番肺の病変に浸潤された一部細胞で軽度水準の陽性反応を確認した。腎臓組織では攻撃接種対照群のすべての個体で陽性反応を確認し、大部分間質内炎症病変を構成する一部細胞が陽性反応を見せた。陽性反応は、１番腎臓で軽度水準で、残りの個体は局所に限定された微弱な水準で観察された。陰性対照群では、すべての臓器でＰＣＶ２抗原が検出されなかった。
＊検出された個体数／総個体数
１）組織病理学的所見：（１＋）最小；（２＋）弱い；（３＋）普通；（４＋）酷い。２）免疫組織化学的所見：（－）ない；（＋）低い；（＋＋）中間；（＋＋＋＋）高い。
総合的に、本発明によるＭｈｐ＋Ｍｈｒ＋組換えＰ９７タンパク質＋組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質組み合わせの多価ワクチン組成物は、マウスとモルモットに接種時に免疫反応で相互補完効果を示し、特に、目的動物である豚に接種したとき血清学的な水準で高い水準の抗体価および中和抗体価を誘導し、ＰＢＭＣでＭｈｐまたはＰＣＶ２感作に対して高い水準のＩＦＮ－γを生成し、目的動物である豚に接種し攻撃接種時、副作用なしに優れた防御能を見せたので、これを豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のために有用に活用することができる。
８－１．免疫学的評価
８－１－１．ＰＣＶ２抗体価確認
間接蛍光抗体分析法（Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｓｔ、以下、ＩＦＡ）を利用して各実験群の血清内ＰＣＶ２ｂ－特異的ＩｇＧ（ＰＣＶ２ｂ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ）およびＰＣＶ２ｄ－特異的（ＰＣＶ２ｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ）抗体価を確認した。このとき、各実験群において、ワクチン接種時またはワクチン接種２、４、６、８週後に血清を採取して実験を行った。
先ず、２×１０４ ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌのＰＣＶ１－除外豚腎臓細胞（ＰＣＶ１－ｆｒｅｅ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）であるＰＫ－１５細胞と保有しているＰＣＶ２ｂ（ＨＩＤ９０２９）またはＰＣＶ２ｄ（ＨＩＤ９０７１）ウイルスを６００ ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈して９６－ウェルプレートにそれぞれ１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。
これを３７℃、５％ＣＯ２条件の培養器で２４時間培養した後、３００ｍＭグルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）を２００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して３０分間反応させた後、上澄み液を除去した。ＰＢＳを利用して３回洗浄した後、１％抗生剤－抗真菌溶液（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ））が添加されたＤＭＥＭを２００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、４日間培養した。上澄み液を除去し、ＰＢＳを利用して１回洗浄した。８０％アセトンを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した後、４℃で１時間固定した。
固定液を捨て、ＰＢＳを利用して１回洗浄した後、プレートを－２０℃に保管して抗体価検査に使用した。
豚血清試料をＤＭＥＭで２進希釈して準備し、これを固定したプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した後、３７℃で１時間の間反応させた。その後、ＰＢＳを利用して３回洗浄した。前記プレートに豚ＩｇＧ軽鎖および重鎖抗体（Ｐｉｇ ＩｇＧ－ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｇｏａｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ［Ｂｅｔｈｙｌ］）をＰＢＳに１：２００に希釈して１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で３０分間反応させた。その後、ＰＢＳを利用して１回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察してウイルスが増殖した最高希釈倍数の逆数を抗体価と判定した。これを通じて確認したＰＣＶ２ｂ－特異的ＩｇＧ抗体価確認結果は、下記表５および図１５に示した。図１５において、＊は、陰性対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．０５）、＃は、攻撃接種対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．０５）、＃＃は、攻撃接種対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．０１）。
その結果、ワクチン接種前（０ＷＰＶ）、すべての実験群は低い水準の抗体価を示した。本発明による多価ワクチン接種群は、２ＷＰＶから他の実験群に比べて有意性を持って（Ｐ＜０．０１）ＰＣＶ２ｂに特異的なＩｇＧ抗体価を誘導することを確認した。特に、攻撃接種以後にも継続して抗体価が上昇して、試験終了時までかなり高い水準のＩｇＧ抗体価を示した。
攻撃接種対照群は、６ＷＰＶから抗体価を誘導したが、本発明による多価ワクチン接種群と比較して有意性を持って（Ｐ＜０．０５）低い水準を示し、陰性対照群は、試験全区間で低い水準の抗体価を示した。
【表5】
その結果、ワクチン接種前（０ＷＰＶ）、すべての実験群は低い水準の抗体価を示した。本発明による多価ワクチン接種群は、２ＷＰＶから他の実験群に比べて有意性を持って（Ｐ＜０．００１）ＰＣＶ２ｄに特異的なＩｇＧ抗体価を誘導することを確認した。特に、攻撃接種以後にも継続して増加して試験終了時までかなり高い水準のＩｇＧ抗体価を示した。
攻撃接種対照群は、６ＷＰＶから抗体価を誘導したが、本発明による多価ワクチン接種群と比較して有意性を持って（Ｐ＜０．００１）低い水準を示し、陰性対照群は、試験全区間で低い水準の抗体価を示した。
【表6】
各実験群の血清内中和抗体価確認は、次のように行った。先ず、各実験群の血清を５６℃で３０分間非同化した。９６－ウェルプレートの最初のウェルに前記血清５０μＬとＤＭＥＭ １５０μＬを分注して希釈した後、残りのウェルにＤＭＥＭを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して２進希釈した。保有しているＰＣＶ２ｂ（ＨＩＤ９０２９）またはＰＣＶ２ｄ（ＨＩＤ９０７１）ウイルスを４００ ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈した後、２進希釈された血清が入ったウェルに同量（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を分注し、３７℃で１時間の間反応させた。ＰＣＶ１－除外豚腎臓細胞（ＰＣＶ１－ｆｒｅｅ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）であるＰＫ－１５細胞を各ウェルに２×１０４ ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した。これを３７℃、５％ＣＯ２条件の培養器で２４時間培養した後、３００ｍＭグルコサミンを２００μＬ／ｗｅｌｌずつ３０分間処理した。その後、上澄み液を除去し、ＰＢＳを利用して３回洗浄した。その後、１％抗生剤－抗真菌溶液が添加されたＤＭＥＭを２００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して２日間培養した。培養後、免疫蛍光分析法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ）を次のように行った。
培養液を捨ててＰＢＳを利用して１回洗浄し、プレートを３７℃培養器に入れて３０分間乾燥した。乾燥したプレートに８０％アセトンを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した後、４℃で１時間固定した。その後、固定液を捨ててＰＢＳを利用して１回洗浄した。ＰＢＳに１：５００に希釈した豚抗－ＰＶ２抗血清（ａｎｔｉ－ＰＣＶ２ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で１時間の間反応させた。その後、ＰＢＳを利用して３回洗浄した。前記プレートに豚ＩｇＧ軽鎖および重鎖抗体（Ｐｉｇ ＩｇＧ－ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｇｏａｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ＦＩＴＣ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ［Ｂｅｔｈｙｌ］）をＰＢＳに１：２００に希釈して１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で３０分間反応させた。その後、ＰＢＳを利用して１回洗浄して蛍光顕微鏡で観察した。このとき、ウイルス増殖を抑制した（１ｗｅｌｌ内で９０％抑制）最高血清希釈倍数の逆数を中和抗体価と判定した。これを通じて確認したＰＣＶ２ｂ中和抗体価測定結果は、図１７および下記表７に示した。図１７において、＊＊＊は、陰性対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．００１）、＃＃は、攻撃接種対照群と比較した結果であり（Ｐ＜０．０１）、＃＃＃は、攻撃接種対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．００１）。
その結果、ワクチン接種前（０ＷＰＶ）、すべての実験群は低い水準の中和抗体価を示した。本発明による多価ワクチン接種群は、２ＷＰＶからＰＣＶ２ｂに対して平均９．６以上の中和抗体価を見せ、ＰＣＶ２ｂに対する中和抗体が生成され始めることが分かった。さらに、６ＷＰＶには平均９２１．６以上の高い中和抗体価を示した。特に攻撃接種以後である４ＷＰＶからは中和抗体価が継続して増加して８ＷＰＶには平均１，４３３．６以上の高い水準の中和抗体価を示した。
攻撃接種対照群は、攻撃接種以後、中和抗体価が生成されたものの、８ＷＰＶに平均１０６．６７以上で、多価ワクチン接種群に比べて低い水準の中和抗体価を示し、陰性対照群は、試験全区間で非常に低い水準の中和抗体価を示した。
【表7】
その結果、ワクチン接種前（０ＷＰＶ）、すべての実験群は低い水準の中和抗体価を示した。多価ワクチン接種群は、２ＷＰＶからＰＣＶ２ｂに対して平均９．６以上の中和抗体価を見せ、ＰＣＶ２ｂに対する中和抗体が生成され始めることが分かった。さらに、６ＷＰＶには平均１，０２４以上に増加した高い中和抗体価を示した。特に、攻撃接種以後である４ＷＰＶから中和抗体価は継続して増加し、８ＷＰＶには平均２，２５２以上の非常に高い水準の中和抗体価を示した。
攻撃接種対照群は、攻撃接種以後に中和抗体価が生成されたものの、試験終了時に平均１７０．６７以上で、多価ワクチン接種群に比べて低い水準の中和抗体価を示し、陰性対照群は、試験全区間で非常に低い水準の中和抗体価を示した。
【表8】
ＩＦＮ－γ分泌量確認のためにＰＢＭＣを分離し、これに抗原を感作した。フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）をチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に４ｍＬずつ分注して準備した。各実験群の血液４ｍＬとＰＢＳ ４ｍＬを新たなチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に混合して準備した。血液とＰＢＳ混合液をフィコールが入っているチューブにゆっくり移した後、８４０×ｇの速度で常温で３０分間遠心分離した。フィコールと血清の間に浮かんでいるＰＢＭＣをピペット（ｐｉｐｅｔ）を利用して分離した後、ＰＢＳ ４ｍＬが入っている新たなチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に移した。これを２１０×ｇの速度で常温で１０分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、ＰＢＭＣにＰＢＳ ３ｍＬを入れて再浮遊させた後、２１０×ｇの速度で常温で１０分間遠心分離した。上澄み液を除去し、上記と同様にＰＢＳに再浮遊させ、遠心分離して上澄み液を除去した。これにＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉ－ａｎｔｉ）１ｍＬを添加して細胞を浮遊した。ＰＢＭＣ １０μＬを１％トリパンブルー溶液（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と１：１で混合して細胞計数器で計数した後、９６－ウェルプレートに１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した。ＰＢＭＣ分注３０分後、組換えＰＣＶ２ｄタンパク質精製抗原（ｉｎ ＲＰＭＩ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して感作し、７２時間培養した後、１５，８００×ｇの速度で１０分間遠心分離して上澄み液を分離した。分離した上澄み液は回収して－７０℃に保管した。前記上澄み液に対してＩＦＮ－γ豚ＥＬＩＳＡキット（ＩＦＮ－γ Ｐｏｒｃｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＫＳＣ４０２１）を利用してメーカーの指針に沿ってＩＦＮ－γ分泌量を測定した。ＩＦＮ－γ分泌量測定結果は、図１９および下記表９に示した。
その結果、４ＷＰＶで本発明による多価ワクチン接種群は３０．６２ｐｇ／ｍＬでＰＣＶ２ｄ抗原に特異的なＩＦＮ－γが分泌し、全実験区間で有意な差異はなかった。これに対し、攻撃接種対照群と陰性対照群はＩＦＮ－γが測定されなかった。
【表9】
各実験群の血清、鼻腔検体（ｓｗａｂ）、直腸検体（ｓｗａｂ）、肺、リンパ節に対する攻撃接種ウイルスＤＮＡを定量評価した。先ず、各群別すべての個体の血液から血清を分離し、綿棒を利用して鼻腔および直腸検体を採取した。各検体を２ｍＬ Ｅ－チューブ（Ｅ－ｔｕｂｅ）に入れてＰＢＳ １ｍＬと十分にボルテッキシング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）して検体とＰＢＳを混合した。このとき、肺とリンパ節組織は２ｍＬ丸底Ｅ－チューブ（ｒｏｕｎｄ－ｂｏｔｔｏｍ Ｅ－ｔｕｂｅ）にＰＢＳを混合してビーズ（ｂｅａｄｓ）とともにＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩを利用して破砕した。
これを１０，０００×ｇで５分間遠心分離して上澄み液を分離した。その後、Ｇｅｎｅ－ｓｐｉｎ（商標）Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してｖｉｒａｌ ＤＮＡを分離した。ＰＣＶ２定量分析のためにＰＣＶ２に対するプライマー（順方向プライマー（５’－ＡＡＣＣＡＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＣ－３’（配列番号５））と逆方向プライマー（５’－ＴＴＧＡＧＧＡＧＴＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＣ－３’（配列番号６）））を使用してＲＴ－ｑＰＣＲを行った。
ＰＣＶ２検出のための試薬造成は表１０のとおりであり、表１１の条件に沿ってＲＴ－ｑＰＣＲを行った。
【表10】
【表11】
８－２－１．血清、鼻腔および直腸検体の測定結果
血清でＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数定量結果（ウイルス血症（ｖｉｒｅｍｉａ））は、図２０および下記表１２に示した。図２０において、＊は、陰性対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．０５）。
その結果、ワクチン接種以後から攻撃接種前（４ＷＰＶ）まですべての実験群の血清でＰＣＶ２ ＤＮＡが検出されなかった。また攻撃接種以後にも、本発明による多価ワクチン接種群は陰性対照群と同一にウイルス血症が観察されなかった。しかし、攻撃接種対照群は、攻撃接種２週後（６ＷＰＶ）に５．６３（Ｌｏｇ１０）ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬのウイルス血症を示した。７ＷＰＶから８ＷＰＶではすべての実験群でウイルス血症が観察されなかった。
【表12】
その結果、ワクチン接種以後から攻撃接種前（４ＷＰＶ）まですべての実験群の血清でＰＣＶ２ ＤＮＡが検出されなかった。６ＷＰＶから攻撃接種対照群でのみＰＣＶ２ ＤＮＡが検出され、鼻腔と直腸でそれぞれ６．８８（Ｌｏｇ１０）と８．３６（Ｌｏｇ１０）ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬでかなり高い水準のＤＮＡが検出されて、他の群と比較したとき有意な差を見せ、８ＷＰＶまではＤＮＡが少しずつ減少する傾向を示した。
【表13】
【表14】
試験終了時である８ＷＰＶにすべての実験群を安楽死させた後、採取した肺と鼠径部リンパ節組織でＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数を調査した結果は、図２３および図２４と下記表１５および表１６に示した。図２３において、＃＃は、攻撃接種対照群と比較した結果である（Ｐ＜０．０１）。さらに、表１５は、肺でＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数を定量した結果であり、表１６は、リンパ節でＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数を定量した結果である。
その結果、肺で攻撃接種対照群は８．５６（Ｌｏｇ１０）ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬでかなり高い水準のＤＮＡ複製数を示したが、本発明による多価ワクチン接種群は５．５９（Ｌｏｇ１０）ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬで、攻撃接種対照群よりＤＮＡ複製数が１／１０３だけ減少して有意に低いＤＮＡ複製数を示した。
リンパ節で攻撃接種対照群は５．１７（Ｌｏｇ１０）ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬのＤＮＡ複製数を示したが、多価ワクチン接種群はＰＣＶ２ ＤＮＡ複製数が確認されなかった。一方、陰性対照群では肺とリンパ節でＰＣＶ２ ＤＮＡが検出されなかった。
【表15】
【表16】
８－３－１．肉眼評価
剖検および肉眼病変評価は、（株）オプティファームに依頼して進行し、その結果は下記表１７および表１８に示した。肉眼病変評価結果は表１７に示し、鼠径部リンパ節組織学的評価結果は表１８に示した。
肉眼所見観察結果、４つの実験群のうち攻撃接種対照群で変化が確認された。鼠径部浅層リンパ節（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｉｎｇｕｉｎａｌ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）は、実験群間に顕著なサイズ差を見せてはいないが、リンパ節サイズの測定で他の実験群より攻撃接種対照群の１番と２番個体のリンパ節が両方とも多少増加したことが示された。肺では前腹側葉を中心に紫赤色調の硬化巣（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）が形成されており、肺硬化巣は攻撃接種対照群の１番と２番個体でのみ確認された。さらに、攻撃接種対照群の２番個体は、心臓表面に乳白色調の繊維素（ｆｉｂｒｉｎ）と推定される炎症性滲出物による心膜癒着（ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）が観察された。その他の臓器で有意な肉眼的変化は観察されなかった。
【表17】
【表18】
各実験群の内部臓器の肉眼所見観察後、主要内部臓器を摘出して一部を１０％中性緩衝ホルマリン（Ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ、ＮＢＦ）溶液に固定した。
固定が完了した組織は、各臓器の断面を観察することができるようにトリミングし、一般的な組織処理方法に準じてパラフィン包埋し、約３～４μｍ厚さで薄切して組織スライドを作製した。スライドはＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ ｅｏｓｉｎ）染色した後、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３、Ｊａｐａｎ）を利用して検鏡した。
肺、リンパ節および扁桃追加組織切片は、各臓器内豚サーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２、ＰＣＶ２）の存在有無を確認するために、ＰＣＶ２に対する特異抗体を利用して免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）を行った。前記ＩＨＣ分析は、(株)オプティファームに依頼して分析した。前記結果は、下記表１９および表２０に示した。表１９はリンパ節、肺および腎臓の組織病理学的および免疫組織化学的評価結果であり、表２０は臓器の組織病理学的および免疫組織化学的評価結果である。
病理組織学的検査を進行したところ、一部リンパ節でリンパ球枯渇および組織球対置（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が観察された。前記所見は、リンパ濾胞内リンパ球の変性および壊死などでリンパ球の数的減少が示され、該当空間には炎症性反応の一環として組織球（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ）などの細胞が浸潤される特徴を見せる。前記所見は、離乳後子豚の豚サーコウイルス連関疾病（ＰＣＶＡＤ）と判断できる病理組織学的所見のうち一つであり、浸潤された組織球など病変を構成している細胞でウイルス抗原が検出されれば、ＰＣＶＡＤと確診することができる。肺では主に血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｐｅｒｉｂｒｏｎｃｈｉｏｌａｒ ｃｕｆｆｉｎｇ）、気管支関連リンパ組織増生（ＢＡＬＴ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、化膿性気管支間質性肺炎（ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖｅ ｂｒｏｎｃｈｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、細気管支内腔の分節化を伴う細気管支周囲結合組織増生（ｐｅｒｉｂｒｏｎｃｈｉｏｌａｒ ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ ｗｉｔｈ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌａｒ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）および肺浮腫（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｄｅｍａ）が確認された。この中で血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤は、ＰＣＶ２を始めとした一般的な呼吸器感染症初期に現れる変化であり、肺浮腫もまた初期炎症性反応の一環として解析されることができる。特徴的に、細気管支周囲結合組織増生は、細気管支周囲に繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）など結合組織を構成する細胞が増生される所見で、このような結合組織の増加がひどくなるほど細気管支内腔を圧迫して気道内腔が分節化したり閉鎖したりする。このような所見は、ＰＣＶＡＤでより頻繁に観察されるので、ＰＣＶ２感染を疑うことができる変化のうち一つとして知られている。前記列挙した気道周囲の炎症性変化と浮腫などの病変が深化すると、肺炎に進行され、本実施例においては、前腹側葉の硬化巣で化膿性気管支間質性肺炎が確認された。該当所見は、呼吸器ウイルスとともに２次呼吸器細菌の重複感染による結果と判断された。追加で気管支関連リンパ組織増生は、感染後に気道上皮層の慢性的な抗原刺激によって形成される所見である。肺炎や他の炎症性変化を伴わずに単独で観察される場合、大概呼吸器マイコプラズマ感染による変化と判断されている。さらに腎臓では皮質部位を中心に間質内炎症細胞浸潤（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が観察された。間質に浸潤された炎症細胞は、大部分単核炎症細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）で非化膿性炎症を形成し、ＰＣＶ２を始めとしたウイルス感染による変化として知られている。群別病理組織学的病変の出現様相を比較してみたところ、リンパ節所見は攻撃接種対照群でのみ観察された。リンパ球枯渇および組織球代置は、攻撃接種対照群の１番個体でのみ微弱な水準で観察され、ＰＣＶ２感染と判断されるリンパ節病変は、すべての実験個体で顕著でなかった。肺病変の場合、本発明による多価ワクチン接種群のすべての個体で軽度以下の血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤が観察された。また本発明による多価ワクチン接種群の２番と３番個体では、軽度以下のＢＡＬＴ増生が確認された。攻撃接種対照群の場合、全個体で重症度以上の血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤が確認された。攻撃接種対照群の１番個体は、前腹側葉を中心に重症度の化膿性気管支間質性肺炎が形成され、一部肺胞で微弱な水準の肺浮腫が伴われて全個体中で最もひどい所見を見せた。２番個体はひどい気道周辺の炎症細胞浸潤とともに軽度の細気管支周囲結合組織増生が伴われ、一部細気管支内腔が変形され、分節化されていた。肺胞でも重症度の肺浮腫所見が確認された。３番個体は重症度の血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤と微弱なＢＡＬＴ増生だけ観察され、攻撃接種対照群の３つの個体の中で最も弱い変化を見せた。陰性対照群では２つの個体とも軽度以下の血管および細気管支周囲炎症細胞浸潤だけ観察された。腎臓では攻撃接種対照群でのみ重症度以下の間質内炎症細胞浸潤が局所ないし多病変性で観察された。病変は、攻撃接種対照群の１番個体で重症度水準で最も顕著であった。
さらに、鼠径部浅層リンパ節、肺および腎臓に対するＰＣＶ２のＩＨＣ結果、本発明による多価ワクチン接種群ではすべての臓器でＰＣＶ２抗原が検出されなかった。攻撃接種対照群は、１番と２番のリンパ節で少数細胞に限定された陽性反応を確認し、１番肺の病変に浸潤された一部細胞で軽度水準の陽性反応を確認した。腎臓組織では攻撃接種対照群のすべての個体で陽性反応を確認し、大部分間質内炎症病変を構成する一部細胞が陽性反応を見せた。陽性反応は、１番腎臓で軽度水準で、残りの個体は局所に限定された微弱な水準で観察された。陰性対照群では、すべての臓器でＰＣＶ２抗原が検出されなかった。
【表19】
【表20】
総合的に、本発明によるＭｈｐ＋Ｍｈｒ＋組換えＰ９７タンパク質＋組換えＰＣＶ２カプシドタンパク質組み合わせの多価ワクチン組成物は、マウスとモルモットに接種時に免疫反応で相互補完効果を示し、特に、目的動物である豚に接種したとき血清学的な水準で高い水準の抗体価および中和抗体価を誘導し、ＰＢＭＣでＭｈｐまたはＰＣＶ２感作に対して高い水準のＩＦＮ－γを生成し、目的動物である豚に接種し攻撃接種時、副作用なしに優れた防御能を見せたので、これを豚マイコプラズマ菌および豚サーコウイルス感染予防のために有用に活用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
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【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】
【国際調査報告】